(57)【要約】本発明は、エキセンジン‐４のペプチド誘導体であるポリペプチド又はその塩であって、該ポリペプチドは、「Y-QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (I)」で表されるアミノ酸配列からなり、式(I)において、「Y-」は、Ｎ末端のα‐アミノ基が、「B-DLSK(II)」、「H2N-DLSX(III)」、「B-HGEGTFTSDLSK(IV)」又は「H2N-HGEGTFTSDLSX(V)」のいずれかで表されるアミノ酸配列のＣ末端のカルボキシル基とペプチド結合していることを示し、式 (II)及び(IV)において「B-」は、放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているＮ末端のα‐アミノ基を示し、式(III)及び(V)において「X」は、側鎖のアミノ基が放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているリジン残基を示し、前記「B-」のＮ末端のα‐アミノ基、及び、前記「X」のリジン残基の側鎖のアミノ基は、所定の一般式で表される放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されている、ポリペプチド又はその塩である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキセンジン‐４のペプチド誘導体であるポリペプチド又はその塩であって、
該ポリペプチドは、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなり、
Y-QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-CONH2  （Ｉ）（配列番号１）
前記式（Ｉ）において、
「Y-」は、Ｎ末端のα‐アミノ基が、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）で表されるアミノ酸配列のＣ末端のカルボキシル基とペプチド結合していることを示し、
B-DLSK    （ＩＩ）                （配列番号２）
H2N-DLSX    （ＩＩＩ）              （配列番号３）
B-HGEGTFTSDLSK    （ＩＶ）    （配列番号４）
H2N-HGEGTFTSDLSX    （Ｖ）      （配列番号５）
前記式（ＩＩ）及び（ＩＶ）において「B-」は、前記放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているＮ末端のα‐アミノ基を示し、
前記式（ＩＩＩ）及び（Ｖ）において「X」は、側鎖のアミノ基が前記放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているリジン残基を示し、
前記「B-」のＮ末端のα−アミノ基、及び、前記「X」のリジン残基の側鎖のアミノ基は、下記一般式（１）：
【化１】
2014178229.tif 000017
〔式中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は下記一般式（２）：
【化２】
2014178229.tif 000018
（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基である。〕
で表される放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されている、ポリペプチド又はその塩。
【請求項２】
前記式（Ｉ）において、「Y-」は、Ｎ末端のα‐アミノ基が、前記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列のＣ末端のカルボキシル基とペプチド結合していることを示し、前記一般式（１）中、ｎが１の整数であり、Ｌが炭素数１〜１５の直鎖又は分岐鎖のアルキル基である、請求項１に記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項３】
前記式（Ｉ）において、「Y-」は、Ｎ末端のα‐アミノ基が、前記式（Ｖ）で表されるアミノ酸配列のＣ末端のカルボキシル基とペプチド結合していることを示し、前記一般式（１）中、ｎが１の整数であり、Ｌが前記一般式（２）で表される基である、請求項１に記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項に記載のポリペプチドと、放射性ガリウムとの錯体。
【請求項５】
請求項４に記載の錯体を含む放射性医薬組成物。
【請求項６】
インスリノーマのイメージングに用いられる、請求項５に記載の放射性医薬組成物。
【請求項７】
請求項１乃至３いずれか一項に記載のポリペプチド又はその塩と、放射性ガリウムとを反応させて、請求項４記載の錯体を得る工程を含む、放射性ガリウム錯体の製造方法。
【請求項８】
請求項１乃至３いずれか一項に記載のポリペプチド又はその塩を備える、請求項４に記載の錯体を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性ガリウム結合部位を有するポリペプチド、及び、その放射性ガリウム錯体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリノーマは膵内分泌腫瘍の約７割を占め、インスリンを過剰産生する。インスリノーマの治療のための外科的切除を行う場合、膵臓に局在する腫瘍部位を同定する必要がある。その際の検査法は膵臓までカテーテルを挿入して行う必要があり、労力を要し、また患者にも負荷がかかる。そのため、非侵襲的に内分泌腫瘍の局在部位を同定可能な手法の開発が望まれている。【０００３】
例えば、特許文献１では、インスリノーマの非侵襲的に表示するため、Ｉｎ‐１１１などの放射性核種が導入された標識化分子がＣ末端に結合したＧＬＰ‐１、エキセンジン‐３及びエキセンジン‐４の放射性標識ペプチド誘導体を用い、これらをグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ‐１Ｒ）に結合させることが検討されている。インスリノーマは、ＧＬＰ‐１Ｒが過剰に発現している腫瘍であることが知られており、ＧＬＰ‐１Ｒに結合する薬剤により、インスリノーマがイメージングできることが期待される。【０００４】
また、ＧＬＰ‐１Ｒを発現する細胞は、インスリンを分泌することが知られている。そのため、ＧＬＰ‐１Ｒに結合する薬剤により、膵臓におけるインスリン産生細胞の密度をインビボおよびインビトロで可視化できることも期待される。特許文献１にも記載されるように、膵臓におけるＧＬＰ‐１受容体密度のイメージングは、医薬品による治療中及び治療後の糖尿病患者の場合は、特に重要である。【０００５】
特許文献２〜１０では、エキセンジン‐４に由来するポリペプチドを、フッ素‐１８や放射性ヨウ素で標識し、これにより膵島の非侵襲的な三次元イメージング、及び、膵島の定量用イメージングを行うことが検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５１１５５７号公報
【特許文献２】国際公開２０１０／０３２５０９号パンフレット
【特許文献３】国際公開２０１０／０３２８３３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２０１１／０２７５８４号パンフレット
【特許文献５】特開２０１１−２１９４５２号公報
【特許文献６】国際公開２０１１／０２７７３８号パンフレット
【特許文献７】国際公開２０１１／０４０４６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開２０１１／０７１０８３号パンフレット
【特許文献９】国際公開２０１２／０４６８４５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開２０１２／１０８４７６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、ガリウム‐６８は、半減期が６７．７分のポジトロン放出核種であり、フッ素‐１８のように、適度な半減期と定量性とを備えている。一方、ガリウム‐６８は、６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレーターにより産生することができるため、１８Ｆ標識化合物とは異なり、サイクロトロンを持たない施設においても、用時に調製が可能である。また、放射性ガリウムとして、ＳＰＥＣＴ用核種のガリウム‐６７も存在する。ガリウム‐６７は、半減期が３．２６日と長いことから、６８Ｇａ標識薬剤の基礎研究を容易にすることができる。【０００８】
しかしながら、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ‐１Ｒ）を標的とした放射性ガリウム標識リガンドは、未だ知られていない。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＧＬＰ‐１Ｒを標的とした放射性ガリウム標識リガンドを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面は、エキセンジン‐４のペプチド誘導体であるポリペプチド又はその塩であって、
該ポリペプチドは、下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなり、
Y-QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-CONH2  （Ｉ）（配列番号１）
前記式（Ｉ）において、
「Y-」は、Ｎ末端のα‐アミノ基が、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）で表されるアミノ酸配列のＣ末端のカルボキシル基とペプチド結合していることを示し、
B-DLSK    （ＩＩ）                （配列番号２）
H2N-DLSX    （ＩＩＩ）              （配列番号３）
B-HGEGTFTSDLSK    （ＩＶ）    （配列番号４）
H2N-HGEGTFTSDLSX    （Ｖ）      （配列番号５）
前記式（ＩＩ）及び（ＩＶ）において「B-」は、前記放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているＮ末端のα‐アミノ基を示し、
前記式（ＩＩＩ）及び（Ｖ）において「X」は、側鎖のアミノ基が前記放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されているリジン残基を示し、
前記「B-」のＮ末端のα−アミノ基、及び、前記「X」のリジン残基の側鎖のアミノ基は、下記一般式（１）：【００１１】
【化１】
2014178229.tif 000002
【００１２】
〔式中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は下記一般式（２）：
【化２】
2014178229.tif 000003
（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基である。〕
で表される放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾されている、ポリペプチド又はその塩を提供するものである。【００１３】
本発明の他の側面は、上記のポリペプチドと、放射性ガリウムとの錯体を提供するものである。【００１４】
また、本発明の他の側面は、上記の錯体を含む放射性医薬組成物を提供するものである。【００１５】
また、本発明の他の側面は、上記のポリペプチド又はその塩と、放射性ガリウムとを反応させて、上記の錯体を得る工程を含む、放射性ガリウム錯体の製造方法を提供するものである。【００１６】
また、本発明の他の側面は、上記のポリペプチド又はその塩を備える、上記の錯体を調製するためのキットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＧＬＰ‐１Ｒを標的とした放射性ガリウム標識リガンドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】血漿中の６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の安定性を示す図である。
【図２】６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）を投与したＩＮＳ‐１担がんマウスにおけるエキセンジン４（９‐３９）前投与の効果を示す図である。
【図３】６８Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４（９‐３９）を用いたＩＮＳ‐１担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。
【図４】６８Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）を用いたＩＮＳ‐１担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、置換基の構造化学式（上記一般式（１）又は一般式（２）など）中のアスタリスク（＊）は、分子の残部との結合点を示すものである。
【００２０】
［ポリペプチド又はその塩］
本発明は、エキセンジン‐４のペプチド誘導体であるポリペプチド又はその塩である。エキセンジン‐４は、アメリカ毒トカゲの唾液の分泌物からに含まれる血糖降下作用を持つホルモンであり、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストとして知られている。本発明に係るポリペプチド又はその塩は、エキセンジン‐４のアミノ酸配列、又は、Ｎ末端から８アミノ酸を欠失させたアミノ酸配列（すなわち、エキセンジン‐４（９−３９）：ＧＬＰ−１Ｒのアンタゴニストとして知られている。）の、Ｎ末端のα‐アミノ基、又は、９位のリジンの側鎖のアミノ基に放射性ガリウム結合部位を有する修飾基により修飾したものである。また、Ｃ末端のカルボキシル基は、ＧＬＰ‐１Ｒとの結合性の向上の観点から、アミノ基によりアミド化されている。
【００２１】
本発明において、「放射性ガリウム結合部位」とは、デフェロキサミンが導入された部位をいい、この部位は、３価の放射性ガリウムカチオンと配位結合することができる。放射性ガリウムとしては、Ｇａ‐６６、Ｇａ‐６７及びＧａ‐６８が挙げられる。好ましくは、Ｇａ‐６６及びＧａ‐６８であり、より好ましくは、Ｇａ‐６８である。Ｇａ‐６６は、９．５時間という比較的長い半減期をもち、４．２ＭｅＶという特異的に大きなエネルギーをもつ陽電子を放出する。そのため、Ｇａ‐６６は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）において有用な放射性核種である。また、Ｇａ‐６８は、半減期が６８分と短寿命であるが、多くの生化学的過程をＰＥＴによりインビボで非侵襲的に追跡するのに十分であるため、好ましい。一方、Ｇａ‐６７（半減期７８時間）は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）において有用な放射性核種である。
【００２２】
本発明において、「放射性ガリウム結合部位を有する修飾基」とは、放射性ガリウム結合部位に加え、Ｎ末端のα‐アミノ基又は９位のリジンの側鎖と放射性ガリウム結合部位との間を介在しているリンカーを有していることが好ましい。このリンカーは、アルキル基であってもよいし、ポリエチレングリコールリンカーであってもよいし、これらを両方含んでいてもよい。
【００２３】
すなわち、本発明は、上記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなる。式（Ｉ）中、Ｎ末端のα‐アミノ基（式（ＩＩ）及び式（ＩＶ）中の「B‐」）、又は、９位のリジン（式（ＩＩＩ）及び式（Ｖ）中の「X」）の側鎖のアミノ基は、上記の一般式（１）で表されるものであり、一般式（１）中、ｎは０又は１の整数であるが、１の整数が好ましい。
【００２４】
上記一般式（１）中、Ｌはリンカーを表し、具体的には、炭素数１〜１５のアルキル基又は一般式（２）で表される基である。Ｌが炭素数１〜１５のアルキル基であるとき、好ましくは炭素数１〜１５の直鎖のアルキル基であり、より好ましくは、炭素数１〜１０の直鎖のアルキル基であり、更に好ましくは、３〜７の直鎖のアルキル基である。Ｌが一般式（２）で表される基であるとき、一般式（２）中、ｍは１〜３０の整数であるが、好ましくは５〜２０の整数であり、より好ましくは１０〜１５の整数である。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドは、ＧＬＰ‐１Ｒへの親和性を高める観点から、式（Ｉ）中「Y-」が、式（ＩＩ）又は式（Ｖ）で表されるアミノ酸配列であることが好ましい。すなわち、下記一般式（３）（配列番号６）又は下記一般式（４）（配列番号７）で表されるポリペプチドが好ましい。
【００２６】
【化３】
2014178229.tif 000004
【００２７】
〔式（３）中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は上記一般式（２）（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基である。〕
【００２８】
【化４】
2014178229.tif 000005
【００２９】
〔式（４）中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は上記一般式（２）（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基である。〕
【００３０】
前述のとおり、一般式（３）及び（４）中、は０又は１の整数であるが、１の整数が好ましい。
【００３１】
上記式（Ｉ）において「Y-」が、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列であるとき、すなわち、本発明に係るポリペプチドが上記一般式（４）で表されるとき、一般式（１）及び一般式（４）中、ｎは１の整数であり、かつ、Ｌは炭素数１〜１５のアルキル基であることが好ましい。
【００３２】
上記式（Ｉ）において「Y-」が、式（Ｖ）で表されるアミノ酸配列であるとき、すなわち、本発明に係るポリペプチドが一般式（３）で表されるとき、一般式（１）及び一般式（３）中、ｎは１の整数であり、かつ、Ｌは上記一般式（２）（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基であることが好ましい。
【００３３】
本発明に係るポリペプチドは、塩を形成していてもよく、かかる塩が製薬学的に許容される塩において本発明に包含される。本発明の「塩」には、無機若しくは有機の酸、又は、無機若しくは有機の塩基から誘導されるものが挙げられる。具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ‐トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、マロン酸塩、ナフタレン‐２‐スルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アミン塩及びアンモニウム塩等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３４】
つづいて、本発明のポリペプチド又はその塩の製造方法について説明する。本発明のポリペプチド又はその塩は、定法に従ったペプチド合成により製造することができる。有機化学的ペプチド合成法として、固相合成法、及び、液相合成法が挙げられるが、固相合成法によるペプチド合成が好ましい。固相合成法では、固相担体にアミノ酸又はペプチドのＣ末端をリンカーを介して固定し、Ｎ末端側に順次アミノ酸を伸長させていく。
【００３５】
固相合成法によるペプチド合成法としては、Ｆｍｏｃ合成法及びＢｏｃ合成法が挙げられるが、Ｆｍｏｃ合成法が好ましい。Ｆｍｏｃ合成法では、Ｎ末端のα‐アミノ基がＦｍｏｃ（９‐フルオレニルメチルオキシカルボニル基）によって保護されたアミノ酸を用い、固相担体に固定されたアミノ酸のアミノ基と、Ｆｍｏｃ保護されたモノアミノ酸のカルボン酸との間にペプチド結合を形成させる方法である。固相担体に導入後にＦｍｏｃの脱保護及び洗浄と、Ｆｍｏｃ保護されたモノアミノ酸の付加とを繰り返すことにより、ペプチドを伸長する。このとき、側鎖に官能基があるアミノ酸については、官能基の種類に応じて保護基が導入されており、目的の長さまで伸長後にＮ末端のＦｍｏｃとともに、側鎖の官能基の保護基を脱保護して、目的のペプチドを得る。
【００３６】
このような固相ペプチド合成は、ペプチド自動合成装置を使用して行ってもよい。市販のペプチド自動合成装置としては、例えば、４３１Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳＳＭ‐８（島津製作所製）が挙げられる。
【００３７】
式（Ｉ）中「Y-」が、式（ＩＩ）又は（ＩＶ）のアミノ酸配列のポリペプチドの場合、「放射性ガリウム結合部位を有する修飾基」は、Ｆｍｏｃ保護したヒスチジン又はアスパラギン酸をペプチド結合させた後、Ｆｍｏｃの脱保護をして、Ｎ末端のα−アミノ基に導入すればよい。例えば、末端に保護アミノ基を有する、炭素数１〜１５の直鎖アルキルカルボン酸（例えば、グリシン、３‐アミノプロパン酸、４‐アミノブタン酸、５‐アミノペンタン酸、６‐アミノヘキサン酸、７‐アミノヘプタン酸、８‐アミノオクチル酸など）を導入した後、アミノ基を脱保護し、パライソチオシアネートベンジル‐デスフェロキサミン（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ）を導入する。その後、側鎖の官能基の脱保護を行うことにより、Ｎ末端のα−アミノ基に放射性ガリウム結合部位を有する修飾基が導入されたポリペプチドを得ることができる。
【００３８】
一方、式（Ｉ）中「Y-」が、式（ＩＩＩ）又は（Ｖ）のアミノ酸配列のポリペプチドの場合、エキセンジン‐４の９番目に相当するリジンの側鎖の官能基は、Ｎ末端のα−アミノ基の保護基、及び、他の側鎖の官能基を保護する保護基とは異なる条件で脱保護される保護基（例えば、トリチル基又はその誘導体、好ましくはトリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基）で保護されることが好ましい。ペプチド合成による伸長が終了した後、「放射性ガリウム結合部位を有する修飾基」を導入するリジンの側鎖のみを脱保護し、末端に保護アミノ基を有するアルキルリンカー若しくはポリエチレングリコールリンカーの導入後、リンカーの末端アミノ基を脱保護して、Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳを導入する。その後、Ｎ末端アミノ基、及び、側鎖の官能基の脱保護を行うことにより、エキセンジン‐４の９番目に相当するリジンに放射性ガリウム結合部位を有する修飾基が導入されたポリペプチドを得ることができる。
【００３９】
［放射性ガリウム錯体］
本発明に係るポリペプチド又はその塩は、放射性ガリウムと反応させることで、放射性ガリウム錯体を形成させることができる。例えば、上記一般式（３）で表されるポリペプチドは、３価の放射性ガリウムカチオンと反応させることで、下記一般式（５）で表される放射性ガリウム錯体（配列番号８）を形成させることができる。
【００４０】
【化５】
2014178229.tif 000006
【００４１】
〔式（５）中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は上記一般式（２）（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基であり、Ｇａ３＋は、３価の放射性ガリウムカチオンである。〕
【００４２】
また、上記一般式（４）で表されるポリペプチドは、３価の放射性ガリウムカチオンと作用させることで、下記一般式（６）で表される放射性ガリウム錯体（配列番号９）を形成させることができる。
【００４３】
【化６】
2014178229.tif 000007
【００４４】
〔式（６）中、ｎは０又は１の整数であり、Ｌは、炭素数１〜１５のアルキル基又は上記一般式（２）（式中、ｍは１〜３０の整数である。）で表される基であり、Ｇａ３＋は、３価の放射性ガリウムカチオンである。〕
【００４５】
３価の放射性ガリウムカチオンとしては、６６Ｇａ３＋、６７Ｇａ３＋及び６８Ｇａ３＋が挙げられる。好ましくは、６６Ｇａ３＋及び６８Ｇａ３＋であり、より好ましくは、６８Ｇａ３＋である。６６Ｇａ３＋及び６８Ｇａ３＋は、ＰＥＴ用のガリウム錯体の製造に適しており、一方、６７Ｇａ３＋は、ＳＰＥＣＴ用のガリウム錯体の製造に適している。
【００４６】
６６Ｇａ３＋は、サイクロトロンを用い、63Ｃｕ（α，ｎ）66Ｇａ、66Ｚｎ（ｐ，ｎ）66Ｇａ、68Ｚｎ（ｐ，３ｎ）66Ｇａ、及びnatＺｎ（ｐ，ｘ）66Ｇａ等の原子核反応を生じさせることにより生成される。ターゲットとの化学的分離を行うことで、錯体の製造に適した６６Ｇａ３＋が得られる。化学的分離としては、例えば、Ｌ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．２２，１９７１，７１０−７１３に記載されるように、イソプロピルエーテルとＨＣｌとを用いる溶剤−溶剤抽出法を用いて実施することができ、この場合、６６Ｇａ３＋は、亜鉛ターゲットから分離され［６６Ｇａ］塩化ガリウム（［６６Ｇａ］ＧａＣｌ３）として得ることができる。
【００４７】
６７Ｇａ３＋は、サイクロトロンを用い、66Ｚｎ（ｄ，ｎ）67Ｇａ、68Ｚｎ（ｐ，２ｎ）67Ｇａ、natＺｎ（ｐ，ｘ）67Ｇａ等の原子核反応を生じさせることにより生成される。亜鉛をターゲットとした場合、塩酸を使用することでターゲットから分離し、［６７Ｇａ］塩化ガリウム（［６７Ｇａ］ＧａＣｌ３）として得ることができる。また、［６７Ｇａ］クエン酸ガリウムは、医薬品として日本メジフィジックス（株）から市販されている。
【００４８】
６８Ｇａ３＋は、６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレーターから得られる。このようなジェネレーターは、例えば、Ｃ．Ｌｏｃ’ｈ ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１，１９８０，１７１−１７３に記載されたものや、エッカート＆ジーグラー社から市販されたもの（Ｏｂｎｉｎｓｋ  ６８Ｇｅ／６８Ｇａ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）がある。一般に、６８Ｇｅは、有機樹脂、或いは、二酸化スズ、二酸化アルミニウム又は二酸化チタンのような無機金属酸化物からなるカラムに充填されている。６８Ｇａ３＋は、例えば、塩酸を溶離剤としてカラムから溶出し、［６８Ｇａ］塩化ガリウム（［６８Ｇａ］ＧａＣｌ３）として得ることができる。
【００４９】
このようにして得られた３価の放射性ガリウムカチオンと、本発明に係るポリペプチドとを接触させることで、錯体を形成させることができる。好ましくは、３価の放射性ガリウムカチオンと、本発明に係るポリペプチドとは、溶剤中で混合させる。ｐＨ４〜６の弱酸性下で行うことがより好ましく、溶剤としては、例えば、グッド緩衝剤（Ｇｏｏｄ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒ：グットバッファー）を使用することができ、ＭＥＳ緩衝液を用いることが好ましい。このとき、ＭＥＭの濃度は、０．００１〜１０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。また、溶剤には、ツインなどの界面活性剤を添加することもでき、その濃度は、例えば、０．０１〜１体積％とすることができる。
【００５０】
溶剤を用いる場合、錯体反応液中のポリペプチド濃度は、例えば、０．０１〜１０００μｍｏｌ／Ｌとすることができるが、収率を向上させる観点から、０．１〜１００μｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００５１】
得られた放射性ガリウム錯体は、高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどにより精製することもできる。
【００５２】
［キット］
本発明に係る放射性ガリウム錯体は、本発明に係るポリペプチド又はその塩を含むキットを用いて調製されてもよい。このキットは、本発明のポリペプチド又はその塩をそのまま、あるいは、溶媒に溶解させた状態で備えている。本発明のポリペプチド又はその塩をそのまま備える場合、本発明のポリペプチド又はその塩は粉末状にすることができ、例えば、凍結乾燥された粉末であってもよい。
【００５３】
また、本発明に係るキットは、本発明のポリペプチドを収容する容器を備えていてもよい。かかる容器の形状としては、バイアル、シリンジ等が挙げられる。かかる容器の材料としては、ガラスであってもよいし、プラスチックであってもよいが、反応容器として使用し、溶媒、及び、放射性ガリウムを投入して容器内で錯体形成させる場合は、放射性ガリウムの吸着が少ない材料を用いることが好ましい。
【００５４】
また、本発明に係るキットは、本発明のポリペプチド又はその塩とは別個に溶剤を備えることができる。溶剤としては放射化学的収率を向上させるものが好ましく、例えば、グッド緩衝剤（Ｇｏｏｄ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒ：グットバッファー）が挙げられる。中でも、ＭＥＳ緩衝液が好ましい。
【００５５】
また、本発明に係るキットは、本発明の放射性ガリウム錯体の製造方法を記載した使用説明書を備えていてもよい。
【００５６】
［放射性医薬組成物］
本発明において、上記得られた放射性ガリウム錯体は、生体内への投与に適した形態に処方し、該錯体を有効成分として含む放射性医薬組成物とすることができる。この放射性医薬組成物には、薬理学的に許容される担体、希釈剤、エマルジョン、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色剤、安定化剤等の追加成分を含んでいても良い。
【００５７】
上記の放射性医薬組成物は、経口投与又は非経口投与の投与方法に使用することができるが、非経口投与の投与方法に使用できるものが好ましく、静脈内投与、動脈内投与、局所投与、腹腔又は胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮投与又は直腸内投与等に使用できる注射剤がより好ましい。このような注射剤は、上記の放射性ガリウム錯体を水、生理食塩液、又は、リンゲル液等に溶解させることで調製することができる。この放射性医薬組成物中の放射性ガリウム錯体の濃度は、放射性分解に対する安定性を確保できる濃度であればよい。
【００５８】
本発明の放射性医薬組成物は、ヒトを始めとする哺乳類動物に投与し、ＰＥＴやＳＰＥＣＴにより撮像することで、生体内のＧＬＰ‐１Ｒを非侵襲的に画像化することができる。したがって、インスリノーマのイメージングや、糖尿病の診断、治療、予防に有用である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。また、以下の実施例に記載した各ポリペプチドの合成例において、各ステップは、必要に応じて複数回繰り返し行い、他の合成において中間体等として用いる際に必要な量を確保した。【００６０】
実施例で使用する試薬及び装置は、以下のものを使用した。
以下合成及び評価するポリペプチドは、ペプチド自動合成機（４３１Ａ，アプライドバイオシステムズ社製）を用いて添付のソフトウェアに従い合成した。
液体クロマトグラム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）は、定速ポンプ（ＬＣ−１０ＡＰ，島津製作所製）に、分光光度検出器（ＳＰＤ−１０ＡＰ，島津製作所製）及びＭＳ検出器（ＭＳ−２０１０，島津製作所製）を用いて測定した。
質量分析（ＭＳ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−ＭＳ−ＱＰ  Ｐｌｕｓを用いて行った。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、定速ポンプ（ＬＣ−８Ａ又はＬＣ−２０Ａ，島津製作所製）に、分光光度検出器（ＳＰＤ−２０Ａ，島津製作所製）、及び、オンラインＮａＩ（Ｔｌ）シンチレーション検出器（ＮＤＷ−３５１Ｄ，Ａｌｏｋａ社）を接続した系を用いた。
６８Ｇａは、６８Ｇｅ／６８Ｇａ−ジェネレーター（Ｏｂｎｉｎｓｋ  ６８Ｇｅ／６８Ｇａ−Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、エッカート＆ジーグラー社製）より抽出したものを使用した。
［１２５Ｉ］Ｔｙｒ‐ＧＬＰ‐１（７−３６）は、パーキンエルマー社から購入したものを使用した。
放射能は、キュリーメーター（ＩＧＣ−７、ＡＬＯＫＡ社製）、オートウェルγカウンター（Ｗａｌｌａｃ  １４８０  ＷＩＺＡＲＤ  ３、パーキンエルマー社製）を用いて測定した。
ＰＥＴ／ＣＴ装置による画像の収集は、ＧＭＩ  ＦＸ−３３００  Ｐｒｅ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行い、データ解析には３Ｄ‐ＯＳＥＭを使用した。【００６１】
また、実施例の統計処理に関しては、データを平均値±標準偏差で表し、有意差検定はＴｕｋｅｙ‐Ｋｒａｍｅｒ法を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意とした。動物実験は京都大学動物実験委員会の承認を受けて行った。【００６２】
本明細書で使用する略語は、断りの無い限り以下を使用する。
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）：４-（２’，４’-ジメトキシフェニル‐Ｆｍｏｃ‐アミノメチル）‐フェノキシアセタミド‐ノルロイシル‐ＭＢＨＡ
ＨＢＴＵ：１-［ビスジメチルアミノメチレン］-１Ｈ-ベンゾトリアゾリウム-３-オキシド-ヘキサフルオロホスフェイト
ＨＯＢｔ：１-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｂｏｃ-ｍｉｎｉ-ＰＥＧ-３ＴＭ（商品名、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）：Ｂｏｃ‐１１‐アミノ‐３，６，９‐トリオキサウンデカン酸・ＤＣＨＡ
Ｂｏｃ：ブトキシカルボニル基
ＤＣＨＡ：ジシクロヘキシルアミン
ＮＭＰ：Ｎ‐メチルピロリドン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＤＴ：ドデカンチオール
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン
ＯＢｕ：ｔｅｒｔ‐ブチルエステル基
Ｔｒｔ：トリチル基
Ｐｄｆ：２，２，４，６，７‐ペンタメチルジヒドロベンゾフラン‐５‐スルホニル基
Ｍｍｔ：４‐メトキシトリチル基
Ｆｍｏｃ：９‐フルオレニルメチルオキシカルボニル基
ＰＥＧ１２：‐ＮＨ‐（Ｃ２Ｈ４Ｏ）１２‐Ｃ２Ｈ４‐Ｃ（Ｏ）‐
Ｆｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＯＨ：６‐（Ｆｍｏｃ‐アミノ）ヘキサン酸
Ａｈｘ：６‐アミノヘキサノイル
Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ：パライソチオシアネートベンジル‐デスフェロキサミン（下記式（７）で示す化合物、又は、その置換基）【００６３】
【化７】
2014178229.tif 000008
【００６４】
ＰＢＳ（−）：、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水
％ＩＤ／ｇ：％投与量／ｇ（％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ／ｇ）
ＯＳＥＭ：サブセット化による期待値最大化法（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｓｕｂｓｅｔ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）【００６５】
ＭＥＳ：２‐モルホリノエタンスルホン酸一水和物
ツイン８０（商品名）：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート
ＨＥＰＥＳ：２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
なお、アミノ酸は、特に言及しない限り、Ｌ体を使用した。【００６６】
（実施例１）Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の合成
エキセンジン‐４の１２位のリジン側鎖を、繰り返し数が１２であるポリエチレングリコールリンカーを介して、配位子としてデフェロキサミンで修飾した式（１１）で示すポリペプチド（配列番号１０、以下、「Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４」と略記する。）を以下の方法で合成した。【００６７】
【化８】
2014178229.tif 000009
【００６８】
１．保護ペプチド樹脂の合成
アプライドバイオシステムズ社製のペプチド自動合成機（４３１Ａ）を用いて添付のソフトウェアに従って１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させていく方法（固相合成法）により保護ペプチド樹脂の合成を行った。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎ（０．２５ｍｍｏｌスケール）を出発樹脂担体として使用し、Ｆｍｏｃ‐アミノ酸誘導体を上記ペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアに従って、活性化剤として、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔとＤＭＦに溶解して反応槽に加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体のうち、側鎖に官能基のあるアミノ酸はそれぞれＡｓｐ（ＯＢｕ），Ｓｅｒ（ＯＢｕ），Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｌｙｓ（Ｍｍｔ），Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｇｌｕ（ＯＢｕ），Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ａｓｎ（Ｔｒｔ）を用いた。配列に従って逐次アミノ酸を伸展して、下記式（１２）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１１）を得た。【００６９】
Ｂｏｃ‐ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ（Ｍｍｔ）ＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ‐Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（１２）【００７０】
上記式（１２）に示す保護ペプチド樹脂から、１．５体積％ＴＦＡ／５体積％ＴＩＳ／９３．５体積％ＤＣＭで処理してエキセンジン‐４の１２位のリジン側鎖のアミノ基を保護するＭｍｔ基を除去した後、Ｆｍｏｃ‐ＰＥＧ１２‐ＯＨ（Ｆｍｏｃ‐Ｎ‐ａｍｉｄｏ‐ｄＰＥＧ１２‐ａｃｉｄ，ＱＵＡＮＴＡ  Ｂｉｏ‐ｄｅｓｉｇｎ社製）をＨＡＴＵ−ＨＯＡｔ法で導入して、下記式（１３）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１２）を得た。【００７１】
Ｂｏｃ‐ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ（Ｆｍｏｃ‐ＰＥＧ１２‐）ＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ‐Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（１３）【００７２】
上記式（１３）に示す保護ペプチド樹脂から、リジン側鎖のアミノ基に導入された（Ｆｍｏｃ‐ＰＥＧ１２‐）のＦｍｏｃ基を２０体積％ピぺリジン／ＮＭＰを用いて除去した後、Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ（ｐ‐ＳＣＮ‐Ｂｎ‐Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）、及び、塩基としてＤＩＥＡを用いた縮合反応により導入して、下記式（１４）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１３）を得た。【００７３】
Ｂｏｃ‐ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫ（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐ＰＥＧ１２‐）ＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ‐Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（１４）【００７４】
２．脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂は、ＴＦＡを用いる定法の脱保護条件［ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ：９５／２．５／２．５／２．５（ｖ／ｖ）］下、室温で２時間処理し、脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時に行った。反応液から担体樹脂をろ別した後、ＴＦＡを留去し、残渣にエーテルを加え、析出した粗生成物の沈殿をろ取した。【００７５】
３．目的ペプチドの単離精製
得られた疎生成ペプチドをＨＰＬＣ分取装置（逆相カラム（ＯＤＳ）、３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１体積％ＴＦＡを含む水―アセトニトリルの溶出系（０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）でグラジエント）、流速３．５ｍＬ／分、溶出時間９．２分）で分取精製し、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、上記式（１１）で示すペプチドをＴＦＡ塩として得た。なお、上記式（１２）〜（１４）では、側鎖の保護基を省略した。【００７６】
（実施例２）６８Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の標識合成検討
実施例１で合成したＤｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４を０．０１ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で溶解させた溶液（５μｍｏｌ／Ｌ）２０μＬに６８Ｇｅ／６８Ｇａ‐ジェネレーターより抽出した６８Ｇａ溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液，２００μＬ）２０μＬを加えた。室温にて３０分間静置した。精製は、ＨＰＬＣ分析装置（ＬＣ−２０Ａ、島津製作所製）を用い、逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（１０×２５０ｍｍ）、ナカライテスク社製）を用いて行った。移動相は０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分とした（溶出時間９．２分）。【００７７】
（実施例３）６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の標識合成
Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４（１００μｍｏｌ／Ｌ）を３０μＬの０．０１ｍｏｌ／ＭＥＳ緩衝液（０．１体積％ツイン８０）に溶解させ、［６７Ｇａ］塩化ガリウムの溶液（４．７７ＭＢｑ，１μＬ）を加えた。室温にて５分間静置し、ＬＣ−ＭＳにて目的物の生成を確認した。精製は、ＨＰＬＣ分析装置（ＬＣ−２０Ａ、島津製作所製）を用い、逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ、１０×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いて行った。移動相は、０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分とした（溶出時間９．２分）。【００７８】
（実施例４）Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４（非標識体）の合成
［６７Ｇａ］塩化ガリウムに代えて、非放射性塩化ガリウムを用いた以外は実施例３と同様な操作をし、非放射性Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４を合成した。目的物の生成はＬＣ／ＭＳで同定し、逆相ＨＰＬＣにて精製した。【００７９】
（実施例５）（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の合成
エキセンジン‐４（９‐３９）のＮ末端を、ｎ‐ペンチルリンカーを介し、配位子としてデフェロキサミンで修飾した式（２１）で示すポリペプチド（配列番号１４、以下、「（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）」と略記する。）を以下の方法で合成した。【００８０】
【化９】
2014178229.tif 000010
【００８１】
１．保護ペプチド樹脂の合成
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  Ｒｅｓｉｎ（０．２５ｍｍｏｌスケール）を出発樹脂担体として使用し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体をペプチド合成機の反応容器にセットし、合成機に添付されているソフトウェアに従って、活性化剤であるＨＢＴＵ及びＨＯＢｔをＤＭＦに溶解して反応器に加えて反応させた。得られた樹脂をピペリジン含有Ｎ‐メチルピロリドン中で緩やかに攪拌してＦｍｏｃ基を除いて次のアミノ酸誘導体の縮合に進めた。使用したＦｍｏｃアミノ酸誘導体のうち、側鎖に官能基のあるアミノ酸はそれぞれＡｓｐ（ＯＢｕ）、Ｓｅｒ（ＯＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）及びＡｓｎ（Ｔｒｔ）を用いた。配列に従って逐次アミノ酸を伸展して、下記式（２２）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１５）を得た。【００８２】
Ｆｍｏｃ‐ＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ‐Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（２２）【００８３】
上記式（２２）で示す保護ペプチド樹脂からＦｍｏｃ基を除いてＦｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＯＨをＨＢＴＵ‐ＨＯＢｔ法で導入して、下記式（２３）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１６）を得た。【００８４】
Ｆｍｏｃ‐Ａｈｘ‐ＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ‐Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（２３）【００８５】
式（２３）で示す保護ペプチド樹脂からＦｍｏｃ基を除去した後、Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ（ｐ‐ＳＣＮ‐Ｂｎ‐Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）及びＤＩＥＡとの反応により下記式（２４）に示す保護ペプチド樹脂（配列番号１７）を得た。【００８６】
Ｄｆ‐Ａｈｘ‐ＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ（２４）【００８７】
２．脱保護と樹脂からの切り出し
得られた保護ペプチド樹脂を、ＴＦＡを用いる定法の脱保護条件［ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ：９５／２．５／２．５／２．５（ｖ／ｖ）］で室温で２時間処理し、脱保護と樹脂からのペプチドの切り離しを同時に行った。反応液から担体樹脂をろ別の後、ＴＦＡを留去し、残渣にエーテルを加えて得られる粗生成物の沈殿をろ取した。【００８８】
３．目的ペプチドの単離精製
得られた粗生成ペプチドをＨＰＬＣ分取装置（逆相カラム（ＯＤＳ、３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１体積％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルの系（０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分、溶出時間９．２分）で分取精製し、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的の式（２１）で表されるペプチドをＴＦＡ塩として得た。なお、上記式（２２）〜（２４）では、側鎖の保護基を省略した。【００８９】
（実施例６）６８Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の標識合成検討
実施例５で合成した（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）を標識前駆体とし、６８Ｇａによる標識条件の検討を行った。実施例５で合成した（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）を各種濃度（下記表１中「ペプチド濃度」のセルで示す。）のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で溶解させた溶液（０．５−５０μｍｏｌ／Ｌ）２０μＬに６８Ｇｅ／６８Ｇａ‐ジェネレーターより抽出した６８Ｇａ溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液，２００μＬ）２０μＬを加えた。室温にて３０分間静置した。精製は、ＨＰＬＣ分析装置（ＬＣ−２０Ａ、島津製作所製）を用い、逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（１０×２５０ｍｍ）、ナカライテスク社製）を用いて行った。移動相は０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分とした（溶出時間９．２分）。【００９０】
【表１】
2014178229.tif 000011
【００９１】
検討結果を表１に示す。ＭＥＳ緩衝液の濃度とツイン８０添加による放射化学的収率を検討した（表１、実験番号１−１０）。その結果、（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）濃度を５０μｍｏｌ／Ｌにした場合は、全ての条件において高い放射化学的収率が達成され、ＭＥＳ緩衝液濃度が高い条件（１．０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に放射化学的収率の低下する傾向が示された。ＭＥＳ緩衝液濃度条件を検討した結果、ＭＥＳ濃度を低くすると共に放射化学的収率が上昇する傾向が見られた（表１、実験番号５，６，８）。また、可溶化剤であるツイン８０添加による放射化学的収率を検討した結果、（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）濃度５０μｍｏｌ／Ｌでは放射化学的収率が共に高く、有意な違いは見られなかった（表１、実験番号１−４）。（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）濃度５μｍｏｌ／Ｌではツイン８０添加の有無により５．７％から８８．８％へと大幅な放射化学的収率の向上が示された（表１、実験番号６，７）。さらに比放射能の向上を目的として、（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）濃度を０．５μｍｏｌ／Ｌの条件にて標識検討を行ったが、６８Ｇａ標識体は低収率でしか得られなかった（表１、実験番号９，１０）。これらの結果より、０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に０．１体積％のツイン８０を添加した条件が最適なＧａ標識条件であることが明らかとなった。【００９２】
（実施例７）６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の標識合成
（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（５μｍｏｌ／Ｌ）３００μＬの０．１ｍｏｌ／ＭＥＳ緩衝液（０．１体積％ツイン８０）に溶解させ、［６７Ｇａ］塩化ガリウムの溶液（１４．８ＭＢｑ，４μＬ）を加えた。室温にて５分間静置し、ＬＣ−ＭＳにて目的物の生成を確認した。精製は、ＨＰＬＣ分析装置（ＬＣ−２０Ａ、島津製作所製）を用い、逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ、１０×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いて行った。移動相は、０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分とした（溶出時間９．２分）。【００９３】
（実施例８）Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（非標識体）の合成
［６７Ｇａ］塩化ガリウムに代えて、非放射性塩化ガリウムを用いた以外は実施例７と同様な操作をし、非放射性Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）を合成した。目的物の生成はＬＣ／ＭＳで同定し、逆相ＨＰＬＣにて精製した。ＨＰＬＣ条件は、実施例７と同条件とした。【００９４】
（実施例９）ＧＬＰ‐１Ｒへの親和性評価
Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４、及び、Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）のＧＬＰ‐１Ｒへの親和性は、ＧＬＰ−１受容体膜タンパクと競合リガンドとして［１２５Ｉ］Ｔｙｒ‐ＧＬＰ‐１（７−３６）を用いた結合阻害実験により評価した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ，５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム及び０．２体積％ＢＳＡの水溶液、ｐＨ７．４）１５５μＬ、実施例４で合成したＧａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４、実施例８で合成したＧａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）、ＧＬＰ‐１（７−３６）アミド（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ１（Ｈｕｍａｎ，７−３６  Ａｍｉｄｅ、ペプチド研究所製）、エキセンジン４アミド（Ｅｘｅｎｄｉｎ４，ＷＡＫＯ社製）又はエキセンジン４（９‐３９）アミド（Ｅｘｅｎｄｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ９‐３９，Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．製）の水溶液（０，１０−１１，１０−１０，１０−９，１０−８，１０−７，１０−６，１０−５ｍｏｌ／Ｌ）２０μＬ、［１２５Ｉ］Ｔｙｒ−ＧＬＰ−１（７−３６）（５ｎｍｏｌ／Ｌ）２０μＬ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＧＬＰ−１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、２００ユニット／１ｍＬ）５μＬを混合し、室温にて２時間震蕩した。震蕩した液はガラス繊維濾紙を用いたＢ／Ｆ分離を行い、濾紙をＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ，０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．１体積％ＢＳＡの水溶液，ｐＨ７．４）にて洗浄した。濾紙上に残った放射能をオートウェルγカウンターを用いて測定した。得られた測定結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて解析し、ＩＣ５０を算出した。【００９５】
【表２】
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【００９６】
結果を表２に示す。その結果、Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）は９．３２ｎｍｏｌ／Ｌと母体化合物であるエキセンジン４（９‐３９）アミド（３０．２４ｎｍｏｌ／Ｌ）よりも高い親和性を有していることが確認された。また、Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４は母体化合物であるエキセンジン４アミド（６．０９ｎｍｏｌ／Ｌ)よりも親和性に劣るが、エキセンジン４（９‐３９）アミド（３０．２４ｎｍｏｌ／Ｌ）よりは高い親和性を有していることが確認された。【００９７】
（実施例１０）血漿中安定性評価
生体内での６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の安定性を確認するために、インビトロにおける血漿中での安定性を評価した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（雄性、４週期）から血漿を採取し、３７℃にて１０分間振盪した。実施例７に示す方法で合成した６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（３７０ｋＢｑ／１０μＬ）を血漿（２００μＬ）と混和し、３７℃にて３０，６０，１２０，２４０分間振盪した。振盪液へメタノール（１００μＬ）を加え、血漿中タンパク成分を凝集させ、４℃にて１００００×ｇ、５分遠心し上清を得た。上清を、マイレクスフィルタ‐ＧＶ（１３ｍｍ）を用いてろ過し、Ｒａｄｉｏ‐ＨＰＬＣ分析装置（ＬＣ−２０Ａ、島津製作所製）を用い、逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ、１０×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）を用いて行った。移動相は、０．１体積％ＴＦＡ含有水：０．１体積％ＴＦＡ含有アセトニトリル（体積比）＝７０：３０（０．０１分）から１０：９０（２０分）へグラジエントし、流速３．５ｍＬ／分による分析から未変化体の割合を算出した。【００９８】
結果を図１に示す。その結果、２４０分後においても未変化体が７８％存在し、６８Ｇａの半減期とほぼ同時間の６０分後においても未変化体が９４％存在することが認められた。【００９９】
（実施例１１）正常マウスを用いた体内動態評価
実施例３に示す方法で合成した６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４、実施例７に示す方法で合成した６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の基礎評価として正常マウス（ｄｄＹマウス、６週齢、雄性）を用いた体内動態評価を実施した。取り扱いの容易さの観点から、本検討では、６８Ｇａの代わりに６７Ｇａを用いて検討した。無麻酔下において６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４又は６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（１８．５−３７．０ｋＢｑ／１００μＬ）をマウス尾静脈より投与した。投与後、５，１５，３０，６０，１２０分に各臓器（膵臓、血液、心臓、肺、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、腎臓）を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の結果を表３に示し、６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の結果を表４に示す。【０１００】
【表３】
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【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
（実施例１２）ＩＮＳ‐１担がんマウスを用いた体内動態評価
以下の方法で、腫瘍移植動物（ＩＮＳ‐１担がんマウス）を作製した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（雌性、４週齢）は、日本エスエルシー社より購入した。１２時間／１２時間の昼夜サイクル条件下で飼育し、飼料・水は自由に与えた。ＩＮＳ‐１細胞（京都大学大学院医学研究科糖尿病栄養内科学提供）はＰＢＳ（−）に懸濁し、右下肢に皮下移植した（２．５×１０６−５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬ  ＰＢＳ（−）／匹）。腫瘍体積は、（長さ）×（幅）２／２に基づき測定し、１００ｍｍ３以上になったマウスを評価に用いた。
上記作製したＩＮＳ‐１担がんマウスへ無麻酔下で６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４又は６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（１８．５−３７．０ｋＢｑ／１００μＬ）をマウス尾静脈より投与した。投与後、６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４については１５，３０，６０，１２０分、６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）については５，１５，３０，６０，１２０分にて屠殺し、各臓器（膵臓、血液、心臓、肺、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、腎臓、腫瘍、筋肉）を摘出した（ｎ＝５）。各臓器の重量と放射能とを測定し、測定値から減衰補正後の放射能を求めて、単位重量あたりの放射能から集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の結果を表５に示す。また、６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の結果を表６に示す。その結果、６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４では、投与後３０分において２６．２％ＩＤ／ｇと腫瘍への高い集積性が確認された（表５）。また、画像化に重要な膵臓の近接臓器比は、投与後３０分において腫瘍／膵臓比１．７１、腫瘍／血液比６．７５、腫瘍／肝臓比１７．３０と高い近接臓器比が得られることが認められた（表５）。また、６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）では、投与後３０分において１３．１％ＩＤ／ｇと腫瘍への高い集積性が確認された（表６）。また、画像化に重要な膵臓の近接臓器比は、投与後３０分において腫瘍／膵臓比２．８５、腫瘍／血液比２．６７、腫瘍／肝臓比１．６３と高い近接臓器比が得られることが認められた（表６）。【０１０６】
（実施例１３）ＩＮＳ‐１担がんマウスを用いた阻害評価
実施例１２における６７Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４の腫瘍への集積がＧＬＰ‐１Ｒ特異的な集積であることを検討するために、Ｅｘ４（９−３９）を前投与することによる集積量の変化を調べた。無麻酔下においてエキセンジン４（９−３９）（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ１（Ｈｕｍａｎ，７−３６  Ａｍｉｄｅ、ペプチド研究所社製）（２０μｇ／１００μＬ）を投与し、３０分後に６７Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（１８．５−３７．０ｋＢｑ／１００μＬ）を尾静脈より投与した。投与後３０分にて屠殺し各臓器を摘出し、各臓器の重量と放射能を測定し、単位重量あたりの放射能から集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。【０１０７】
結果を図２に示す。図中、「（−）Ｅｘ（９‐３９）」は、エキセンジン４（９−３９）を前投与しなかったマウスの結果であり、「（＋）Ｅｘ（９‐３９）」は、エキセンジン４（９−３９）を前投与したマウスの結果であり、その結果、腫瘍への集積は７７．６％（ｐ＜０．００１）、膵臓への集積は６５．８％（ｐ＜０．００１）と有意な減少が認められた。【０１０８】
（実施例１４）ＩＮＳ‐１担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴイメージング
実施例２に示す条件で合成した６８Ｇａ‐Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐（ＰＥＧ１２）１２‐Ｅｘ４（１８．５ＭＢｑ／５０μＬ）を、実施例１２に示す方法で作製したＩＮＳ‐１担がんマウスに、無麻酔下で静脈注射し、投与後５分からイソフルラン（２．０％）吸引麻酔し投与後２０分からＰＥＴ／ＣＴ装置（ＦＸ−３３００、ガンマ・メディカ社製）を用いて１０分間ＰＥＴ撮像した。その後、ＣＴ撮像（６０ｋＶ，３１０μＡ）を行った。画像再構成は３Ｄ‐ＯＳＥＭを用いて行った。【０１０９】
結果を図３に示す。図３（ａ）が冠状面画像であり、図３（ｂ）が矢状面画像であり、図３（ｃ）が横断画像を示す。その結果、右下肢に移植した腫瘍が描出された。【０１１０】
（実施例１５）ＩＮＳ‐１担がんマウスのＰＥＴ／ＣＴイメージング
実施例５で合成した（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）の０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）溶液（５μｍｏｌ／Ｌ）２００μＬに、ツイン８０を０．１体積％含有するように加えた後、６８Ｇｅ／６８Ｇａ‐ジェネレーターより抽出した［６８Ｇａ］塩化ガリウム溶液（２０９ＭＢｑ（５．６５ｍＣｉ）、２００μＬ）を加え、室温にて５分間静置した。精製は、実施例６に記載の通りに行った。得られた６８Ｇａ‐（Ｄｆ‐Ｂｚ‐ＮＣＳ‐Ａｈｘ）９‐Ｅｘ４（９‐３９）（１８．５ＭＢｑ／５０μＬ）を、実施例１２に示す方法で作製したＩＮＳ‐１担がんマウスに、無麻酔下で静脈注射し、投与後５分からイソフルラン（２．０％）吸引麻酔し投与後２０分からＰＥＴ／ＣＴ装置（ＦＸ−３３００、ガンマ・メディカ社製）を用いて１０分間ＰＥＴ撮像した。その後、ＣＴ撮像（６０ｋＶ，３１０μＡ）を行った。画像再構成は３Ｄ‐ＯＳＥＭを用いて行った。【０１１１】
結果を図４に横断画像を示す。その結果、横断画像において右下肢に移植した腫瘍が描出された。【０１１２】
以上、本発明の実施形態、及び、実施例について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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