(57)【要約】  配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列からなるＨ鎖の相補性決定領域と、配列番号４〜６で示されるアミノ酸配列からなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト化抗体。本発明のヒト化抗体は、構造変化を起こしたトランスサイレチン（TTR）へ特異的に結合する活性やTTRの線維化を阻害する活性を有し、人体への適用に適したヒト化抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）の線維化を阻害する活性を持つヒト化抗体。
【請求項２】
構造変化を起こしたＴＴＲを特異的に認識する、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
ＴＴＲアミロイドと特異的に結合する、請求項１又は請求項２に記載のヒト化抗体
【請求項４】
２種類以上の変異ＴＴＲに由来するＴＴＲアミロイドと結合する、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
変異ＴＴＲが、Ｄ１８Ｇ、Ｖ３０Ｍ、Ｅ５４Ｋ、Ｌ５５Ｐ、Ｙ１１４Ｃ、Ｙ１１６ＳおよびＶ１２２Ｉからなる群から選択される変異を有するＴＴＲである、請求項４に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
ＴＴＲアミロイドの除去を促進する、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
ＴＴＲアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
エピトープがＴＴＲの１１８位から１２２位を含む配列である、請求項１から請求項７いずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
エピトープがＴＴＲの１１８位から１２２位である、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
ＴＴＲアミロイドーシスに対する治療効果及び／又は予防効果を有する、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、請求項１０に記載のヒト化抗体
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項１４】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項１６】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項１７】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項１８】
以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１５に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または請求項１７に記載のＨ鎖可変領域断片と、請求項１６に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または請求項１８に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ＴＴＲに対する抗体の１本鎖可変領域断片。
【請求項２０】
請求項１５に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または請求項１７に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、請求項１６に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または請求項１８に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、請求項１から請求項１２に記載のヒト化抗体又はその断片。
【請求項２１】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をコードする遺伝子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の遺伝子又は請求項２２に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項２４】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する器具。
【請求項２５】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを除去する担体。
【請求項２６】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する試薬。
【請求項２７】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシス診断薬。
【請求項２８】
ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、請求項２７に記載の診断薬。
【請求項２９】
ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、請求項２７に記載の診断薬。
【請求項３０】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲの線維化阻害剤。
【請求項３１】
請求項１から請求項２０のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシスを予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【請求項３２】
ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスサイレチン（TTR:transthyretin）のアミロイド線維の形成や組織への沈着を効果的に抑制する抗体ならびに、当該抗体を用いた治療法を提供する。本抗体療法は、正常型TTRには作用せず、異常型TTRのアミロイド形成のみを抑えるという新たな治療戦略に基づくものであり、安全性に優れた新規治療法になりうると期待される。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、線維構造を形成したタンパク質が全身の臓器に沈着することによって機能障害を引き起こす一連の疾患群であり、アルツハイマー型認知症やプリオン病などの様々な疾患が含まれる（非特許文献１）。【０００３】
家族性アミロイドポリニューロパチー（Familial Amyloidotic Polyneuropathy: FAP）は、TTR、アポリポタンパク質A1、ゲルソリンなどの遺伝子の点変異や欠失が原因となって起こる常染色体優性の遺伝性全身性アミロイドーシスである（非特許文献２）。この中で、TTRの遺伝的な変異によって起こるFAPが最も多い。変異型のTTRがアミロイド線維を形成し、通常、中年期以降に末梢神経や心臓、腎臓、消化管、眼、脳、髄膜といった、ほぼ全身の組織に沈着して機能不全を起こすことが知られている。患者の予後は非常に悪く、発症から10年程度で死に至る難病である。【０００４】
現在までに100を超えるTTR遺伝子の点変異や欠失が報告されている。中でも、TTRの30番目のバリンがメチオニンに変異したVal30Met変異（以下V30Mのように表記）が最も多く、患者はポルトガル、スウェーデン、日本に多い。ポルトガルに6,000人以上のFAP患者が確認されていること、未だFAPが調べられていないと考えられる地域も少なくなく、今後もFAP 患者群の世界的な発見が続くことが予想されていることから、全世界には1万人をゆうに上回る患者がいると考えられている。最近の研究から、FAPの臨床像（発症年齢や沈着臓器特異性など）はTTR遺伝子の変異の種類に大きく影響されることがわかってきている（非特許文献３）。例えばFAPの発症年齢に関しては、L55P変異は10代に発症する劇症型の臨床像をきたすが、V122I変異は60歳以降に発症する。一方でV30M変異では、若年で発症する病型と高齢で発症する病型の両方が存在することが知られている。沈着する臓器の特異性に関しては、D18G変異は脳や髄膜に沈着して中枢神経障害を引き起こす一方で、V30M変異は全身の組織に沈着し、末梢神経障害や心筋障害を引き起こす（非特許文献３、４）。【０００５】
TTRは、127個のアミノ酸からなる分子量14 kDaのタンパク質であり、内部に存在する8つのβ−ストランドが2つの逆平行β−シートを形成した構造を有する（非特許文献５）TTRの主な産生場所は肝臓であるが、脳室脈絡叢、網膜の網膜色素上皮細胞、脾臓などにおいても産生されている。TTRは通常、血中で分子量55 kDaの四量体を形成して安定な構造をとり、主に血中および髄液中で、ビタミンA-レチノール結合タンパク質複合体、および甲状腺ホルモンT4の輸送担体として機能している。その血中濃度は200-400 μg/mLと高いものの、半減期は2日と短い（非特許文献２〜６）。TTR四量体の中心部には2つの相同なT4結合部位が存在し、T4が結合することにより四量体構造は安定化されることが知られている（非特許文献３）。その他の機能として、インスリン分泌促進作用、脳神経保護作用、脂質代謝に関わる作用など様々な報告がなされている（非特許文献２）。一方で、TTR遺伝子をノックアウトしたマウスでは、血中のレチノールや甲状腺ホルモン濃度は低下するものの、生存率や繁殖能といった表現型に大きな変化は見られなかったことから（非特許文献７）、TTRが実際の生命活動の維持において直接必須なものであるかどうかは不明なままである。【０００６】
TTRのアミロイド形成には、四量体から単量体への解離と、単量体の構造変化が非常に重要なステップである（非特許文献３）。中でも、四量体から単量体への解離が反応の律速段階であることが明らかにされている。一方、TTRがアミロイドを形成して組織に沈着し、全身の臓器に障害を及ぼす過程で、組織に対して毒性を発揮する分子形態は完全には明らかにされていない。単量体、二量体などの低分子量オリゴマーが細胞毒性を有し、一方で100 kDa以上のTTRアミロイドは細胞毒性を有していないという報告もあり（非特許文献５）、毒性と分子形態との関連性の解明が待たれる。【０００７】
TTRの遺伝子異常に起因するFAPの治療戦略は主に以下の４種類に分類される。
（１）変異型TTRの産生レベルを抑制する
（２）変異型TTRを含むTTR四量体構造を安定化させる
（３）四量体から解離したTTRのアミロイド化を阻止する
（４）組織に沈着したTTRアミロイドを除去する【０００８】
血中TTRのほとんどが肝臓で産生されることから（非特許文献２）、この中で現在最も一般的な治療法は（１）に分類される肝移植である。肝移植を行うことで病態進行の遅延が見られるものの、免疫抑制剤を終生使用しなければならず、ドナーや患者への負担も大きい。更に、眼や心臓を含むいくつかの臓器での沈着は継続するため、これら臓器の症状が増悪する例が少なくないなど（非特許文献８）、問題点も多く、有効な治療法の開発が切望されている。【０００９】
肝移植以外の治療法として、（１）の戦略では、siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療法が臨床開発段階にあるが、いずれも変異型のみならず野生型TTRの産生も抑制してしまうため、長期にわたり使用した場合の安全性の評価は慎重になされるべきであろう。（２）の戦略では、TTR四量体のT4結合部位に結合することで四量体構造を安定化させる薬剤が開発されている。同戦略で開発された新薬VyndaquelRが2011年にEUで、2013年には日本国内で承認された。30ヵ月に及ぶ臨床試験の結果、VyndaqelRはFAP患者の末梢神経障害を遅らせる効果を示しているものの、症状の進行を完全に抑えるには至っていない（非特許文献９）。その他（３）や（４）の戦略においても、複数種類の薬剤が臨床開発段階にあるものの、いずれの治療法も根治療法にはなりえていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2010030203号公報
【特許文献２】国際公開WO03004647号公報
【特許文献３】特許公開2010-195710号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Glenner, G.G.: Amyloid deposits and amyloidosis: the beta-fibrilloses (second of two parts).: N Engl J Med, 302:1333-1343, 1980
【非特許文献２】Ando, Y. & Jono, H.: Pathogenesis and therapy for transthyretin related amyloidosis.: Rinsho Byori, 56:114-120, 2008
【非特許文献３】関島良樹: TTRアミロイド沈着の分子機構とその制御.: 医学のあゆみ, 229:349-356, 2009
【非特許文献４】本崎裕子, 山田正二: 家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)の分子疫学.: 医学のあゆみ, 229:357-362, 2009
【非特許文献５】Hou, X., Aguilar, M.I. & Small, D.H.: Transthyretin and familial amyloidotic polyneuropathy. Recent progress in understanding the molecular mechanism of neurodegeneration.: FEBS J, 274:1637-1650, 2007
【非特許文献６】Araki, S. & Ando, Y.: Transthyretin-related familial amyloidotic polyneuropathy -Progress in Kumamoto, Japan （1967-2012)-.: Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 86:694-706, 2010
【非特許文献７】Episkopou, V., Maeda, S., Nishiguchi, S., Shimada, K., Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E. & Robertson, E.J.: Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone.: Proc Natl Acad Sci U S A, 90:2375-2379, 1993
【非特許文献８】安東由喜雄: 家族性アミロイドポリニューロパチー（FAP)の肝移植とその他の治療.: 医学のあゆみ, 229:363-368, 2009
【非特許文献９】Said, G., Grippon, S. & Kirkpatrick, P.: Tafamidis.: Nat Rev Drug Discov, 11:185-186, 2012
【非特許文献１０】Goldsteins, G., Persson, H., Andersson, K., Olofsson, A., Dacklin, I., Edvinsson, A., Saraiva, M.J. & Lundgren, E.: Exposure of cryptic epitopes on transthyretin only in amyloid and in amyloidogenic mutants.: Proc Natl Acad Sci U S A, 96:3108-3113, 1999
【非特許文献１１】Terazaki, H., Ando, Y., Fernandes, R., Yamamura, K., Maeda, S. & Saraiva, M.J.: Immunization in familial amyloidotic polyneuropathy: counteracting deposition by immunization with a Y78F TTR mutant.: Lab Invest, 86:23-31, 2006
【非特許文献１２】Bergstroem, J., Engstroem, U., Yamashita, T., Ando, Y. & Westermark, P.: Surface exposed epitopes and structural heterogeneity of in vivo formed transthyretin amyloid fibrils.: Biochem Biophys Res Commun, 348:532-539, 2006
【非特許文献１３】Episkopou, V., Maeda, S., Nishiguchi, S., Shimada, K., Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E. & Robertson, E.J.: Disruption of the transthyretin gene results in mice with depressed levels of plasma retinol and thyroid hormone.: Proc Natl Acad Sci U S A, 90:2375-2379, 1993.
【非特許文献１４】Matsubara, K., Mizuguchi, M. & Kawano, K.: Expression of a synthetic gene encoding human transthyretin in Escherichia coli.: Protein Expr Purif, 30:55-61, 2003.
【非特許文献１５】Ueda, M., Ando, Y., Hakamata, Y., Nakamura, M., Yamashita, T., Obayashi, K., Himeno, S., Inoue, S., Sato, Y., Kaneko, T., Takamune, N., Misumi, S., Shoji, S., Uchino, M. & Kobayashi, E.: A transgenic rat with the human ATTR V30M: a novel tool for analyses of ATTR metabolisms.: Biochem Biophys Res Commun, 352:299-304, 2007.
【非特許文献１６】Senju, S., Haruta, M., Matsumura, K., Matsunaga, Y., Fukushima, S., Ikeda, T., Takamatsu, K., Irie, A. & Nishimura, Y.: Generation of dendritic cells and macrophages from human induced pluripotent stem cells aiming at cell therapy.: Gene Ther, 18:874-883, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
近年、免疫療法によるFAPの治療に注目が集まっている。TTRアミロイドが形成される過程で、TTRの構造変化に伴って新たなエピトープ（クリプティックエピトープ、Cryptic Epitope）が分子表面に露出することが明らかになってきた（非特許文献１０）。【００１３】
そこでTerazakiらは、Cryptic Epitopeの露出する変異として知られていたTTR Y78F変異体で、FAPのモデル動物であるヒトTTR V30M トランスジェニックマウス（hTTR Tgマウス）を免疫し、マウス組織へのTTRアミロイド沈着に対する影響を評価した（非特許文献１１）。その結果、TTR Y78F変異体で免疫したマウス群で、有意に抗TTR抗体の抗体価の上昇が確認され、それに伴って食道、胃および腸におけるTTR沈着量の減少が見られた。また、既にTTR沈着が見られる生後18ヵ月齢のhTTR Tgマウスを用いた同様の試験においても、Y78F免疫群で有意にTTRアミロイド沈着量の減少が見られた。以上の結果から、Cryptic Epitopeが露出するTTR変異体でマウスを免疫することにより、TTRに対する抗体がマウス体内で産生され、その結果TTRアミロイドの沈着が抑制された可能性が示唆された。【００１４】
一方でBergstroemらは、Cryptic Epitopeの１つであるTTR 115-124部位のペプチドでウサギを免疫し、抗TTR115-124 ポリクローナル抗体を調製した（非特許文献１２）。このポリクローナル抗体をhTTR V30Mトランスジェニックラットに投与し、ラット組織へのTTR沈着に及ぼす影響を評価したところ、ラット腸管におけるTTRの沈着量は、ポリクローナル抗体を投与した群で有意に減少していた（特許文献３）【００１５】
これらの結果から、TTRのCryptic Epitopeを特異的に認識する抗体が、TTRアミロイド（あるいはTTRアミロイドを構成する、構造変化を起こしたTTR）に特異的に結合し、TTRアミロイドの、形成阻害または除去の促進をしている可能性が考えられる。つまり、TTRのCryptic Epitopeを特異的に認識する抗体は、FAPの新規治療薬になりうる可能性が示唆される。【００１６】
こうしたコンセプトに基づく抗TTR抗体の研究は、BIOCODEX社により報告されている。同社はアミロイド形成性のTTRに特異的なマウスモノクローナル抗体AD7F6を、TTRノックアウトマウスを用いて作製し、FAP病態モデルであるTgマウス（ATTR V30M）を用いてTTRの組織沈着を抑制することを示した（特許文献１）。BIOCODEX社の特許はマウス抗体のアミノ酸配列をクレームしており、ヒトへの投与は困難である。また、本抗体に関しては、四量体構造をとったV30M変異体に対する反応性の有無については明言されていない。V30M変異を有するFAP患者においては、血中に存在するV30M変異体は四量体構造をとっているが、単量体に解離後その一部が構造変化を起こしてアミロイドを形成すると考えられている。よって、四量体構造をとったV30M変異体には反応せず、アミロイド化した（或いはアミロイドを形成する途中段階の）V30M変異体にのみ反応する抗体であることが、より効果的で安全な抗体療法を実現する上では必要な要件と考えられる。また、本抗体の反応性については、臨床サンプルとしてはV30Mキャリアの血清を用いているのみであるため、患者の体内に存在する組織沈着性のアミロイドとの反応性は不明である。【００１７】
同様なコンセプトに基づく抗TTR抗体の研究は、ポルトガルのPorto大学のグループからも報告されている（非特許文献１０）。構造変化を起こしたTTRに特異的なマウスモノクローナル抗体mAb 39-44及びmAb 56-61を作製したこと、これらが生体由来のV30M変異体のアミロイドと反応することが報告されている。しかし、これらはアミロイド形成に対して阻害作用を示さなかったことが明記されており、FAPの診断に利用できる可能性について言及されているのみである。【００１８】
上述のように、TTRのCryptic Epitopeをマウス（又はラット）へ免疫して得られたポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が、TTRの沈着を抑制することは報告されているが、構造変化を起こしたTTRへ特異的に結合する活性、TTRの線維化を阻害する活性を有する抗体や、人体への投与に適したヒト化抗体やヒト抗体は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、TTRアミロイドーシスでは、一部の四量体TTRが単量体へ解離後、単量体TTRが構造変化を起こし、アミロイドを形成する、その一方で、正常に機能する四量体TTRも存在すると考えた。そこで、本発明者らは、構造変化を起こしたTTRへ特異的に結合し、TTRの線維化を阻害する活性を有する抗体について検討を行った。また、最終的にTTRアミロイドーシスに対する抗体医療を目標として、上記の活性を有するヒト化抗体について鋭意検討を重ね、本発明を完成させるに至った。【００２０】
すなわち、本発明は、
（１）トランスサイレチン（ＴＴＲ）の線維化を阻害する活性を持つヒト化抗体；
（２）構造変化を起こしたＴＴＲを特異的に認識する、（１）に記載のヒト化抗体；
（３）ＴＴＲアミロイドと特異的に結合する、（１）又は（２）に記載のヒト化抗体；
（４）２種類以上の変異ＴＴＲに由来するＴＴＲアミロイドと結合する、（１）から（３）のいずれか一項に記載のヒト化抗体；
（５）変異ＴＴＲが、Ｄ１８Ｇ、Ｖ３０Ｍ、Ｅ５４Ｋ、Ｌ５５Ｐ、Ｙ１１４Ｃ、Ｙ１１６ＳおよびＶ１２２Ｉからなる群から選択される変異を有するＴＴＲである、（４）に記載のヒト化抗体；
（６）ＴＴＲアミロイドの除去を促進する、（１）から（５）のいずれか一項に記載のヒト化抗体；
（７）ＴＴＲアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する、（１）から（６）のいずれか一項に記載のヒト化抗体；
（８）エピトープがＴＴＲの１１８位から１２２位を含む配列である、（１）から（７）いずれか一項に記載のヒト化抗体；
（９）エピトープがＴＴＲの１１８位から１２２位である、（８）に記載のヒト化抗体；
（１０）ＴＴＲアミロイドーシスに対する治療効果及び／又は予防効果を有する、（１）から（９）のいずれか一項に記載のヒト化抗体；
（１１）ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、（１０）に記載のヒト化抗体；
（１２）ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、（１０）に記載のヒト化抗体；
（１３）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、（１）から（１２）のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１４）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、（１）から（１３）のいずれか一項に記載のヒト化抗体
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１６）以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド；
（１７）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド；
（１８）以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片；
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド；
（１９）（１５）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１７）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（１６）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１８）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ＴＴＲに対する抗体の１本鎖可変領域断片；
（２０）（１５）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１７）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（１６）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１８）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、（１）から（１２）に記載のヒト化抗体又はその断片；
（２１）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をコードする遺伝子；
（２２）（２１）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター；
（２３）（２１）に記載の遺伝子又は（２２）に記載の発現ベクターが導入された形質転換体；
（２４）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する器具；
（２５）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを除去する担体；
（２６）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドを検出する試薬；
（２７）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシス診断薬；
（２８）ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、（２７）に記載の診断薬；
（２９）ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、（２７）に記載の診断薬；
（３０）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲの線維化阻害剤；
（３１）（１）から（２０）のいずれか一項に記載の抗体又はその断片を含む、ＴＴＲアミロイドーシスを予防及び／又は治療するための医薬組成物；
（３２）ＴＴＲアミロイドーシスが家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、（３１）に記載の医薬組成物；
（３３）ＴＴＲアミロイドーシスが老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）である、（３１）に記載の医薬組成物
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明者らは，構造変化を起こしたTTRを特異的に認識するモノクローナル抗体を創出し，FAPの治療を可能にする抗体医薬開発への道を開くことに成功した．本発明の抗体は、TTRのアミロイド線維の形成や組織への沈着を効果的に抑制し、更に血中で機能する正常なTTRとは反応しないことから、安全性に優れた抗体医薬となることが期待される。また、作用メカニズムとして、（１）TTRのアミロイドの形成と組織沈着を抑制する、更には、（２）組織に沈着しているTTRアミロイドにも作用してクリアランスを促す、すなわち、一旦蓄積したアミロイドを減少させる、という２つの効果を期待することができる。そのような効果は、従来の技術や先行開発品では成しえないものであり、TTRアミロイドーシスに対する新規治療戦略としての本抗体療法に期待が持たれる。【００２２】
本発明の抗体は、上述のとおり、FAPに対して肝移植以外の新たな治療法を提供することが期待出来るだけでなく、老人性全身性アミロイドーシス（SSA）治療薬としての可能性も有する。TTRアミロイドーシスには、TTR遺伝子の変異が原因となって起こるFAPの他にも、野生型TTRが主に心臓にアミロイド沈着を起こすことにより発症するSSAが知られている。心臓におけるアルツハイマー病とも位置付けられている。アミロイド沈着は肺や血管壁、腎髄質などにも認められる。患者は、無症状であるか、心症状（緩徐進行性の心不全）を呈することが多く、手根管症候群を呈することもある。60歳代から発症が認められ、80歳以上ではおおよそ4人に1人が発症しているとも言われている。米国のみで40万人を超える患者推計値も報告されている。本疾患にも有効な治療法は確立されていない。本発明の抗体は野生型TTRの線維化を阻害する活性を有するため、SSAへの適用も期待される。【００２３】
本抗体製剤にはFAPのみならずTTRに起因する各種臓器に対するアミロイド形成性の疾患への適用が期待され、現在治療方法がない多くのこれらの疾患患者への治療貢献ができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（a）マウスT24抗体H鎖発現ベクターpKMA010-T24-mCg1、および（b）マウスT24抗体L鎖発現ベクターpKMA009-T24-mCkのマップを示す。
【図２】エピトープ解析の結果を示す。
【図３】表面プラズモン共鳴法を用いた反応特異性解析の結果を示す。（a）はRT24抗体、（b）はDako社製ポリクローナル抗体、（c）は陰性コントロール抗体での結果をそれぞれ示す。
【図４】患者血清への反応性解析の結果を示す。
【図５ａ】患者組織への反応性解析の結果を示す(パラフィン切片)。
【図５ｂ】患者組織への反応性解析の結果を示す(凍結切片)。
【図６】TTR線維への反応性解析の結果を示す。（a）は銀染色、（b）はウエスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。
【図７】TTR線維化阻害試験の結果を示す。（a）はRT24抗体、（b）はRT24-a抗体およびRT24-b抗体の結果をそれぞれ示す。
【図８】マクロファージ貪食能試験の結果を示す。（a）は未処理の精製V30M、（b）はTTR線維での結果をそれぞれ示す。
【図９】V30M Tgラットを用いた薬効評価試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の具体的態様について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
１．本発明の抗体およびその断片
本発明では、TTRの115-124位は正常型（四量体）TTRでは分子表面に出ていないが、TTRが線維化した場合に表面に露出してくることに着目し、TTR115-124を抗体作製の抗原として選択し、当該抗原をTTRノックアウトマウスへ免疫した後にマウス抗体を作製し、マウス抗体のアミノ酸配列をヒト化することでヒト化抗体を作製した。
【００２６】
TTR115-124を作製する方法は、化学合成でもよく、大腸菌などで発現させたものを精製してもかまわない。後者の場合には、ヒトTTRの塩基配列を鋳型として、115-124に相当する塩基配列が増幅されるよう設計したプライマーDNAを用いて、当該塩基配列を増幅する。そして、発現ベクターへ組み込んで、宿主（大腸菌など）へ導入する。宿主を用いてTTR115-124を発現させた後に精製し、抗原とする。化学合成や発現法で得られたTTR115-124は、担体タンパク質（KLH、BSAなど）と結合させた後にマウスへ免疫しても構わない。担体タンパク質を結合させる方法としては、Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA(Thermo)を用いた方法が例示される。TTR115-124は担体タンパク質へ一分子結合させても、二分子以上結合させても構わない。TTR115-124を担体タンパク質に結合される部位は、N末、C末、分子内のいずれの部位であっても構わない。
【００２７】
次に、マウス抗体を作製する方法を例示する。TTR115-124をTTRノックアウトマウスへ免疫する。TTRノックアウトマウスは、非特許文献13に記載された方法で作製しても構わない。TTR115-124を免疫する回数は２回以上が好ましく、各免疫は３週間程度空けることが好ましい。免疫回数や期間は、TTRに対する抗体価の上昇程度を確認しながら、適宜変更しても構わない。そして、マウスの脾臓から抗体産生細胞を回収し、定法のハイブリドーマ法によって抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマを作製する。そして、ハイブリドーマを限界希釈した後に培養し、培養上清を回収する。培養上清に含まれるマウス抗体を精製し、TTR115-124との反応性をELISA試験で検証する。ELISA試験の一例としては、TTR115-124を直接又は間接的にELISAプレート上へ固相化する。TTR115-124をプレートへ固相化する場合には、TTR115-124のN末端側、C末端側のどちらであっても構わない。次に、マウス抗体をプレートへ添加し、反応させる。そして、酵素標識された抗マウス抗体、基質の順にプレートへ添加し、基質を検出する方法が例示される。そうしたELISA試験を指標にして、TTR115-124に対する抗体を選抜する。
【００２８】
次に、TTRアミロイドに対して特異的に結合する抗体を選抜するステップを設けても構わない。TTRアミロイドへの結合性を検証する方法を例示する。TTRペプチドを酸性条件下で線維化を形成する期間で静置し、TTRアミロイドを形成させる。酸性条件や線維化を形成する期間は、TTRペプチドの種類によって適宜変更して構わない。TTRの線維化の有無は、チオフラビンTアッセイによって確認することが可能である。酸性条件として好ましくは、pH5.0以下、さらに好ましくはpH3.0-pH4.0である。線維化を形成する期間は好ましくは一晩である。そして、酸処理したTTR（TTRアミロイド）又は未処理のTTR（正常型TTR）をELISAプレートへ結合させ、次いでマウス抗体を反応させる。正常型TTRと比較して、TTRアミロイドに対する結合性が高い抗体を選抜しても構わない。
【００２９】
次に、マウス抗体からヒト化抗体を作製する方法を例示する。マウス抗体を産生するハイブリドーマからmRNAを回収した後に逆転写を行い、cDNAを作製する。cDNAを鋳型にしてVH領域とVL領域を増幅し、当該領域を適当なプラスミドへ導入した後、VH領域又はVL領域の塩基配列を解析する。そして、VH領域またはVL領域のうち、CDRに相当する部分（CDR1-3）を特定する。次に、マウス抗体におけるCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVH領域又はVL領域のアミノ酸配列へ移植するために、CDRの移植に適したヒト抗体を選択する。そして、ヒト抗体におけるVH領域又はVL領域のアミノ酸配列に対して、マウス抗体におけるCDR１-３のアミノ酸配列を挿入したアミノ酸配列を設計する。当該アミノ酸配列を塩基配列へ変換し、化学合成する。当該塩基配列をH鎖またはL鎖の定常領域をコードする塩基配列を含む発現ベクターへ挿入した発現ベクターを作製する。当該発現ベクターを適当な宿主（動物細胞）へ導入し、宿主を用いてヒト化抗体を発現させる。
【００３０】
本発明では、当該ヒト化抗体において、VH領域又はVL領域のフレームワーク部分についてアミノ酸配列を改変させたアミノ酸配列を設計し、改変アミノ酸配列に基づく塩基配列を化学合成した。そうして、上記の同様の方法で改変型のヒト化抗体を作製した。
【００３１】
上記のマウス抗体やヒト化抗体（それらを纏めて抗体と称する場合がある）についてエピトープを解析する方法を例示する。ヒトTTRの115-124位のアミノ酸配列のうち、１アミノ酸を改変させたヒトTTR改変体を作製する。定法のsite-directed mutagenesis法により改変体の遺伝子を作製し、発現ベクターに挿入後、適当な宿主（好ましくは大腸菌）を用いて発現させ精製する。そうした改変体としては、Y114C、S115A、Y116A、S117A、T118A、T119A、A120S、V121A、V122A、V122I、T123A、N124Aが例示される。定法のウェスタンブロッティング法を用いて、当該改変体をSDS-PAGEで電気泳動させた後、解析対象の抗体と反応させ、当該改変体と抗体の反応性を検出する。抗体との結合性が低下した改変体が存在する場合、改変した部分を抗体のエピトープ部分と考えても構わない。本発明の抗体は118−122位にエピトープ部分が存在していた。
【００３２】
上記のマウス抗体やヒト化抗体は、構造変化を起こしたTTRに対する特異的反応性、線維化したTTRとの反応性、TTR患者由来の組織に対する免疫染色、変異TTRの線維化に対する阻害活性、TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食作用の促進活性、FAPモデル動物を用いた薬効評価を行ってもかまわない。
【００３３】
構造変化を起こしたTTRに対する特異的反応性を解析する方法として、表面プラズモン共鳴法を用いた方法が例示される。野生型TTR四量体、変異TTR（V30Mなど）四量体、又は変異TTRアミロイドを作製する。野生型TTR四量体や変異TTR四量体を作製する方法としては、Matsubaraらの方法（非特許文献14）が例示される。変異TTRアミロイドを作製する方法としては、上記の四量体のTTRペプチドを3mg/mLに調整した後、等量の200mM酢酸バッファーと100mM NaClの溶液と混合し、37℃で16時間反応させる方法が例示される。反応後のTTRについては、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)によって蛍光強度を測定し、線維が形成されていることを確認しても構わない。
【００３４】
次に、これらの調整物をセンサーチップへ結合させる。そして、解析対象の抗体を流して、センサーチップと反応させることで、TTRと抗体の結合性がレスポンスユニット（RU）として表される。この場合に、変異TTRアミロイドに対するRUが、野生型TTR四量体や変異TTR四量体に対するRUよりも優位に高い抗体は、構造変化を起こしたTTRを特異的に認識していると考えられる。そうした四量体TTRと比較して、四量体以上の分子構造を有するTTR（例えば、TTRアミロイド）を特異的に認識する抗体を、構造変化を起こしたTTRを特異的に認識する抗体としても構わない。
【００３５】
変異TTRの線維化を阻害する活性を解析する方法を例示する。TTR及び評価抗体を含有する溶液に対して界面活性剤を終濃度0.01-1％となるように混合し、TTRが線維を形成する温度と時間静置する。そして、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)で蛍光強度を測定し、TTR線維化の程度を評価する。界面活性剤の種類は塩化ベンザルコニウム、デオキシコール酸ナトリウム、Zwittergent3-16、NP-40が例示される。特にデオキシコール酸が好ましい。終濃度0.01-1％が例示されるが、0.1％が特に好ましい。時間と温度は37℃で3〜4日間が例示されるが、時間や温度の組み合わせに応じて適宜変更しても構わない。本解析方法は中性付近のpHで解析を行えるため、評価抗体の変性を抑えた優れた評価系である。
【００３６】
TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食作用を解析する方法を例示する。FAP患者由来の皮膚組織から、定法に従ってヒトiPS細胞を作製し、更に定法に従ってiPS細胞をマクロファージに分化させる。TTR線維と分化させたマクロファージ5×104個を混合し、評価抗体を添加して、一定期間（例えば、3日間）培養する。培養後のTTR残量をELISA法で定量し、マクロファージによる貪食能を評価する。
【００３７】
本発明の抗体とTTRアミロイドとの反応性を解析する方法を例示する。野生型TTRや変異TTRをTTRが線維化する時間、酸性条件で処理し、TTR線維を作製する。線維化の時間は、pHやTTRの種類によって適宜選択することが可能である。酸処理後のサンプルをNative PAGEで泳動し、銀染色を行った後に、60kDaより高い位置にブロードなバンドが確認された場合には、TTRが線維化していることの指標としても構わない。そして、定法のウェスタンブロット法を用いて、TTRアミロイドをSDS-PAGEにて泳動し、解析対象の抗体を反応させ、検出する。酸処理していないTTR（線維化していないTTR）と比較して、TTRアミロイドに対する反応性が高い抗体を、TTRアミロイドに対する結合作用を有する抗体としても構わない。
【００３８】
FAPモデル動物を用いた薬効評価の方法を例示する。V30M Tgラット（非特許文献15、TTRのアミノ酸配列において30位をバリンからメチオニンに変異させたヒトTTRの遺伝子を導入したトランスジェニックラット）を用いて、一定量の評価抗体を（例えば、10mg/kg）、一定期間に亘り（例えば、6ヶ月間）、一定頻度で投与する（例えば、週１回）。投与後に剖検して大腸を採取し、ホルマリン固定を行う。固定した大腸組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製する。組織切片をPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)、HRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を用いて免疫染色し、大腸の筋層におけるTTR沈着の程度を数値化して群間での比較を行う。
【００３９】
本発明のヒト化抗体はTTRの線維化を阻害する活性、構造変化したTTRに対する特異な結合活性、マクロファージによるTTRアミロイドの貪食作用を促進する効果、TTRアミロイドに対する結合作用、FAPモデル動物に対する効果を有する。また、本発明の抗体についてエピトープを解析した結果、TTR118-122に存在していた。そのため、本発明には下記のヒト化抗体が含まれる。
（１）TTRの線維化を阻害する活性を持つ抗体。
（２）構造変化を起こしたTTRを特異的に認識し、かつ四量体の機能性TTRを認識しない抗体。
（３）TTRアミロイドと特異的に結合する抗体。
（４）TTRアミロイドの除去を促進する抗体。
（５）TTRアミロイドに対するマクロファージ貪食能を促進する抗体。
（６）TTRアミロイドーシスに対する治療効果及び／又は予防効果を有する抗体。
（７）TTR118-122をエピトープとするヒト化抗体。
上記の（１）から（７）の抗体は、（１）から（７）に記載される通り、一つの特徴を有してもよく、他の（１）から（７）に記載される特徴をあわせ持っていてもかまわない。
【００４０】
本発明のヒト化抗体ではVH領域又はVL領域上のCDR1-3のアミノ酸配列や塩基配列は下表となる。
【００４１】
【表１】
2015115331.tif 000002
【００４２】
そのため、本発明にはアミノ酸配列において下記の特徴を有するヒト化抗体が含まれる。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む、ヒト化抗体。
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
また、当該ヒト化抗体は、（１）から（７）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００４３】
本発明ではVH領域やVL領域のフレームワーク領域におけるアミノ酸配列を変異させたヒト化抗体を複数種類作製した。そうしたヒト化抗体の一例としては、下記のアミノ酸配列や塩基配列によってコードされたVH領域又はVL領域が例示される。
【００４４】
【表２】
2015115331.tif 000003
【００４５】
そのため、本発明には、下記のヒト化抗体が含まれる。
（９）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む、ヒト化抗体。
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
当該ヒト化抗体は、（１）から（８）に記載される特徴を併せ持っていても構わない。
【００４６】
本発明には下記のH鎖のCDRを含むH鎖可変領域断片が含まれる。
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片
（ａ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【００４７】
本発明には下記のL鎖のCDRを含むL鎖可変領域断片が含まれる。
（１１）以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片。
（ｃ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【００４８】
本発明には下記のH鎖可変領域断片が含まれる。
（１２）以下の（ｅ）又は（ｆ）のポリペプチドからなる、Ｈ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
【００４９】
本発明には下記のL鎖可変領域断片が含まれる。
（１３）以下の（ｇ）又は（ｈ）のポリペプチドからなる、Ｌ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＴＲに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【００５０】
本発明には下記の１本鎖可変領域断片が含まれる。
（１４）（１０）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１２）に記載のＨ鎖可変領域断片と、（１１）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１３）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ＴＴＲに対する抗体の１本鎖可変領域断片。
【００５１】
１本鎖可変領域断片において、H鎖可変領域断片とL鎖可変領域断片とを連結する場合、通常、適当なペプチドリンカーなどによって連結される。このペプチドリンカーとしては、例えば、10〜25アミノ酸残基からなる任意の1本鎖ペプチドが用いられる。
【００５２】
本発明には、下記のH鎖可変領域断片及び／又はL鎖可変領域断片にヒト由来の定常領域を連結した抗体またはその断片が含まれる。
（１５）（１０）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または（１２）に記載のＨ鎖可変領域断片、及び／又は、（１１）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または（１３）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、TTRに対するヒト由来の抗体またはその断片。
【００５３】
上記のヒト由来の定常領域を連結した抗体又はその断片は、Ｆab、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2や、少なくとも一部のFc部を有したscAb、またはscFvFc、さらには完全抗体であってもよい。なお、scAbとはscFvにL鎖またはH鎖の定常領域の一部のドメイン（Cドメイン）が結合したもの、scFvFcとはscFvにH鎖の定常領域の一部（Fc領域）が結合したものである。
【００５４】
また、上記抗体は、抗体と構造的に関連したタンパク質も包含し、免疫グロブリンの意味である。さらに、本発明の抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG又はIgMの何れのクラスでもよい。言い換えると、単量体であってもよいし、2量体、3量体、4量体、5量体といった多量体であってもよい。
【００５５】
ここで、上記「1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。したがって、例えば、上記（b）のポリペプチドは、上記（a）のポリペプチドの変異ペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００５６】
なお、上記「変異」は、後述のように本発明の抗体またはその断片を、医薬組成物として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断薬などとして利用する場合（ヒトに投与しない場合）には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するCDRの高次構造を維持する範囲で、変異を行うことが好ましい。
【００５７】
本発明の抗体およびその断片は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、HisやMyc、Flag等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の抗体およびその断片には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合されていてもよい。すなわち、本発明の抗体およびその断片は、修飾抗体であってもよい。この修飾剤としては、例えば、糖鎖や高分子などが挙げられる。糖鎖修飾を行った場合には、その糖鎖が何らかの生理活性を有する可能性があるが、ポリエチレングリコール（PEG）などの単純な高分子修飾を行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。さらに、PEG化によって肝臓での吸収を抑制したり、血中での安定性を向上したりする可能性がある。つまり、修飾剤としては、PEGなどの単純高分子が好ましい。
【００５９】
なお、本発明の抗体およびその断片の修飾剤による修飾は、前述の変異ペプチドの作製と同様に、治療薬として利用する場合には、ヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして利用する場合には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するCDRの高次構造を維持する範囲で、修飾することが好ましい。
【００６０】
２．本発明の遺伝子
本発明には、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子が含まれる。例えば、下記の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF）領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子などが含まれる。
（１）配列番号1〜3、及び／又は、配列番号4〜6を含む塩基配列
（２）配列番号7、及び／又は、配列番号8を含む塩基配列
【００６１】
上記の遺伝子は、本発明の抗体またはその断片をコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはその断片を発現させることができる。
【００６２】
さらに、上記の遺伝子は、上記１の抗体またはその断片をコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（UTR）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、配列番号７又は8に記載の配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。
【００６３】
本発明の遺伝子は、TTRアミロイドが関与する疾患において、遺伝子治療剤として利用しても構わない。この遺伝子治療剤は投与後に本発明の抗体またはその断片を体内で発現するように設計することによって、該治療剤を摂取後に体内で本発明の抗体またはその断片を形成させ、上記阻害剤と同様の効果を持たせても構わない。
【００６４】
３．本発明の組換え発現ベクター
本発明には、前記２の遺伝子、すなわち、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターが含まれる。例えば、配列番号7又は8に示される塩基配列を有するcDＮAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００６５】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００６６】
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係る抗体またはその断片とマーカータンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質GFP（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係る抗体またはその断片をGFP融合タンパク質として発現させてもよい。
【００６７】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopas laevis）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６８】
組換え発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DＥAＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６９】
本発明の形質転換体は、前記２の遺伝子、すなわち、上記１の抗体またはその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作手技）により、対象細胞（ホスト細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでもマウスは近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っており、実験動物・病態モデル動物として好ましい。
【００７０】
なお、上記１の抗体またはその断片は、本発明の組換え発現ベクターを用いて作製した、本発明の形質転換体によっても生産することが可能である。
【００７１】
４．本発明のヒト化抗体およびその断片の利用方法
本発明の抗体は、構造変化を起こしたTTR（例えば、TTRアミロイド）を特異的に認識し、TTRの線維化を阻害し、FAPに対する予防効果を発揮する。そのため、本発明は、TTRの構造変化を検出する器具、TTRアミロイドーシス（特にFAP）診断薬、TTRの線維化を阻害する薬剤、TTRアミロイドーシス（特にFAP）に対する予防及び／又は治療するための医薬組成物を含む。
【００７２】
本発明には、（1）の抗体またはその断片を含む、TTRの構造変化を検出する器具（TTRアミロイド検出器具）が含まれる。本発明の検出器具としては、例えば、構造変化したTTRへ特異的に結合する抗体またはその断片を基盤（担体）上に固定化した抗体チップや抗体カラム等が挙げられる。本発明の検出器具は、例えば、血液や尿などの試料中に含まれる構造変化したTTR（例えばTTRアミロイド）を検出する用途に用いても構わない。さらに、構造変化したTTR(TTRアミロイド)が関与する疾患の判定や治療効果を評価するための診断用途、治療用途で利用しても構わない。
【００７３】
また、本発明には、（１）の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドを除去する用途で使用される担体（TTRアミロイド除去担体）が含まれる。当該除去担体は、クロマトグラフィーにおいて通常使用される担体に対して、一般的な方法で抗体等を結合させることによって作成しても構わない。上記の除去用担体は、TTRアミロイドが原因となるアミロイドーシス患者から血液を採取し、その血液を除去用担体が充填されたカラムを通して、血中のTTRアミロイドを除去するといった用途が例示される。
【００７４】
さらに、本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドを検出するための試薬（TTRアミロイド検出用試薬）が含まれる。すなわち、これらの抗体またはその断片によるラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中のTTRを迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。この標識イムノアッセイでは、上記抗体またはその断片は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。また、これらの抗体およびその断片は、TTRアミロイドに特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応について標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のTTRアミロイドを精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。
【００７５】
本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドーシス診断薬が含まれる。本発明の診断薬による疾患を診断する方法は、被検試料（血液や体液、組織など）中のTTRアミロイド量を測定し、その測定結果に応じて疾患の診断を行うものである。なお、疾患は、TTRアミロイドが原因となる疾患が含まれる。そうした疾患としては、老人性全身性アミロイドーシス（SSA）、家族性アミロイドーシス（FAP）が例示される。
【００７６】
本発明の抗体はTTRの線維化を抑制する効果が確認された。そのため、本発明には、上記１の抗体またはその断片を含む、TTRの線維化を阻害する薬剤（線維化阻害剤）が含まれる。線維化阻害剤には、1種類以上の賦形剤、1種類以上の結合剤、1種類以上の崩壊剤、1種類以上の滑沢剤、1種類以上の緩衝剤などのように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
【００７７】
本発明の抗体は、TTRアミロイドーシスのモデル動物へ投与した場合に、効果が確認された。そのため、本発明は上記１の抗体またはその断片を含む、TTRアミロイドーシスに対する予防及び／又は治療を行うための医薬組成物が含まれる。当該医薬組成物は、1種類以上の賦形剤、1種類以上の結合剤、1種類以上の崩壊剤、1種類以上の滑沢剤、1種類以上の緩衝剤などのように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
【００７８】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
市販のキットあるいは試薬を用いた部分については、特に断りの無い限り添付のプロトコールにしたがって実験を行った。
【実施例１】
【００７９】
TTRペプチドのコンジュゲーション
ヒトTTR115-124ペプチド（配列番号９）に対してN末端あるいはC末端にシステインを付加したペプチドを化学合成によって作製した（SIGMA-ALDRICH社へ外注）。以下、N末端にシステインを付加させたTTR115-124ペプチドをTTR02ペプチド、C末端にシステインを付加させたTTR115-124ペプチドをTTR03ペプチドと呼ぶ。Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA(Thermo)を用いて、KLHあるいはBSAをTTR02/TTR03ペプチドのN末端又はC末端のシステインへコンジュゲートさせた。
【実施例２】
【００８０】
TTRペプチドのビオチン化
Biotin-PE-maleimide(同仁化学)を用いて、実施例１で合成した2種のTTR02、TTR03ペプチドをビオチン化した。ビオチン化後のTTR02、03ペプチドを、Superdex peptide (GE Healthcare)を用いてPBS(SIGMA)下でゲルろ過精製を行い、ビオチン化TTRペプチドとした。
【実施例３】
【００８１】
抗ヒトTTRモノクローナル抗体の調製
TTRノックアウトマウス（非特許文献１３、熊本大学より分与）に、KLHコンジュゲートTTR02ペプチド100μg/mLとFreund's Complete Adjuvant(DIFCO)を1:1で混合し、200μLでマウスを免疫した。１回目の免疫から2週間以上間隔を空け、KLHコンジュゲートしたTTR02ペプチドとFreund's InComplete Adjuvant(DIFCO)を混合し、マウスを免疫した。免疫後、１〜２週間おきに採血を実施し、抗体価が十分に上昇するまで上述と同じ条件でマウスを免疫した。抗体価はELISA法によって確認した。【００８２】
抗体価が十分に上昇したのを確認した後、マウスから脾細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3U1とPEG法で細胞融合を行った。融合後の細胞をHAT培地に懸濁し、96well Plateに播種した。HAT培地下で培養を継続することによりハイブリドーマのみを選択した。播種後7日〜11日目に、以下に示す方法で培養上清中に含まれる抗体の、ヒトTTRへの結合活性を評価した。
【実施例４】
【００８３】
抗TTR抗体の結合活性試験
取得したハイブリドーマが産生した抗体の抗原結合活性をELISA法で評価した。実施例１で作製したBSAコンジュゲートしたTTR02、03ペプチドをPBS(SIGMA)で2μg/mLに希釈し、Maxisorp Plate(Nunc)に各ウェル当り100μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってTTRペプチドを固相化した。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。取得したハイブリドーマの培養上清をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、1%BSA-PBSで5000倍希釈した検出抗体anti-mouse IgG(H+L)/HRP(Zymed)をプレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB(SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後に1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm/650nm)を測定した。【００８４】
その結果、ハイブリドーマT24においてTTRペプチドに対して優れた結合活性が見られた。
【実施例５】
【００８５】
抗TTR抗体遺伝子の取得
TTRペプチドへの結合活性を有する抗体を発現するハイブリドーマT24について、限界希釈法によってハイブリドーマのクローニングを行った。クローニング後のハイブリドーマ1×107cellsを出発材料とし、TRIzol(Invitrogen)を用いてtotal RNAを抽出した。total RNAを鋳型として、random primer (Invitrogen)、Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(GE Healthcare)を用いて、First-strand cDNAを調製した。次に、このcDNAを鋳型として用い、KabatらによるV領域及びJ領域の配列の分類(Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987)を参照してデザインしたリーダー領域に対するプライマーとJ領域に対するプライマーを用い、Ex-Taq(Takara)でVHおよびVL遺伝子断片を増幅した。増幅したVH領域やVL領域のDNAはpCR2.1-TOPO(Invitrogen)にTAクローニングを行い、抗TTR抗体の遺伝子配列を取得した。クローニングしたT24抗体のDNA塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems)およびGenetic analyzer ABI Prism 3100 (Applied biosystems)を用いて決定した。
【実施例６】
【００８６】
マウスT24抗体発現ベクターの構築
実施例５で取得した配列を元に、T24抗体発現ベクターを構築した。VH領域に関しては、実施例５で構築したT24VH挿入ベクターを鋳型として、T24VH-Fwプライマー（配列番号10）およびT24VH-Rvプライマー（配列番号11）を用いて、primestar GXL (Takara)を利用してPCR法によりVH領域を増幅した。VL領域に関しては、同様にT24VL挿入ベクターを鋳型として、T24VL-Fwプライマー（配列番号12）およびT24VL-Rvプライマー（配列番号13）を用いて増幅し、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)で精製した。VH領域増幅断片については、XhoI, NruI処理したpKMA010-mCg1ベクターに、VL領域増幅断片については、XhoI,BamHI処理したpKMA009-mCkベクターにそれぞれIn-fusion Enzyme (Clontech)を用いて導入し、マウス定常領域を持つT24抗体（以下マウスT24抗体）を発現するベクター（H鎖発現ベクターpKMA010-T24-mCg1及びL鎖発現ベクターpKMA009-T24-mCk）を構築した（図１）。pKMA010-T24-mCg1ベクターはCAGプロモーターの下流にマウスT24抗体H鎖の配列が挿入されており、薬剤耐性遺伝子としてDhfr遺伝子を有している。pKMA009-T24-mCkベクターは、CAGプロモーターの下流にマウスT24抗体L鎖の配列が挿入されたベクターである。pKMA010-T24-mCg1ベクター及びpKMA009-T24-mCkベクターを総じてマウスT24抗体発現ベクターと呼ぶ。
【実施例７】
【００８７】
T24抗体のヒト化
取得した抗TTR抗体をCDR Grafting法を用いてヒト化し、RT24抗体を作製した。T24抗体のVH領域又はVL領域におけるCDR1〜3はKabatのナンバリング法により決定した。当該CDR1〜3のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号１〜６に示す。ヒト抗体のVH領域又はVL領域のアミノ酸配列に対して、T24のCDR1〜3のアミノ酸配列を移植したアミノ酸配列を設計した。また、設計後のVH領域又はVL領域のフレームワーク領域において、数個のアミノ酸を改変させたアミノ酸配列もあわせて設計した。それらのアミノ酸配列をコードする塩基配列を化学合成した（タカラバイオ社へ外注）。それらの抗体の一つをRT24抗体とし、そのVH領域又はVL領域のアミノ酸配列および塩基配列を配列番号７、８に示す。ヒト定常領域を持つRT24抗体（以下ヒトRT24抗体）を発現するベクターを以下0の方法で構築した。化学合成したRT24の含まれたプラスミドをHindIIIおよびBamHIで消化し、RT24抗体のVH領域およびVL領域をコードする配列が含まれた領域を切り出した。切り出したRT24抗体のVH配列を、同じくHindIIIおよびBamHI消化処理したpUC-hCγ(発現ベクターpUC19にヒトCγ1遺伝子が挿入されたもの。ヒトCγ1遺伝子の上流には、制限酵素サイトSalI、HindIII及びBamHIサイトが、下流には制限酵素サイトSalIが挿入されている)に導入し、pUC-RT24-hCγ1を得た。同様に、切り出したRT24抗体のVL配列を、HindIII、BamHI処理したpUC-hCκ(発現ベクターpUC19にヒトCκ遺伝子が挿入されたもの。ヒトCκ遺伝子の上流には、制限酵素サイトSalI、HindIII及びBamHIサイトが、下流には制限酵素サイトSalIが挿入されている) に導入し、pUC-RT24-hCκを得た。pUC-RT24-hCγ1をSalIで処理し、同様にSalI処理した発現ベクターpCAGG-S1(Sal).dhfr.neo (特許文献2)に導入し、ヒトRT24抗体H鎖発現ベクターpCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1を構築した。pUC-RT24-hCκをSalIで処理し、同様にSalI処理した発現ベクターpCAGG-S1(Sal) (特許文献2)に導入し、ヒトRT24抗体L鎖発現ベクターpKMA009-RT24-hCkを構築した。pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1ベクターはCAGプロモーターの下流にヒトRT24抗体VH領域の配列及びヒトCγ1遺伝子が挿入されており、薬剤耐性遺伝子としてDhfr遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を有している。また、pKMA009-RT24-hCkベクターは、CAGプロモーターの下流にヒトRT24抗体VL領域の配列及びヒトCκ遺伝子が挿入されたベクターである。pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1ベクター、及びpKMA009-RT24-hCkベクターを総じてヒトRT24抗体発現ベクターと呼ぶ。【００８８】
引き続き、マウス定常領域を持つRT24抗体（以下キメラRT24抗体）を発現するベクターの構築を行った。VH領域に関しては、pCAGGS1.dhfr.neo-RT24-hCg1を鋳型として、pCAG-Fwプライマー（配列番号14）、およびT24VH-Rvプライマーを用いて、primestar GXL (Takara)を利用してPCR法によりVH領域を増幅した。VL領域に関しては、pKMA009-RT24-hCkをXbaI、BamHI処理し、RT24のVL領域を含む断片を切り出した。VH領域増幅断片については、XbaI、NruI処理したpKMA010-mCg1ベクターに、VL領域断片については、XbaI、BamHI処理したpKMA009-mCkベクターにそれぞれIn-fusion Enzyme (Clontech)を用いて導入し、キメラRT24抗体H鎖発現ベクターpKMA010-RT24-mCg1、およびキメラRT24抗体L鎖発現ベクターpKMA009-RT24-mCkを構築した。pKMA010-RT24-mCg1ベクターは、CAGプロモーターの下流にヒトRT24抗体VH領域の配列及びマウスCγ1遺伝子が挿入されており、薬剤耐性遺伝子としてDhfr遺伝子を有している。pKMA009-RT24-mCkベクターは、CAGプロモーターの下流にヒトRT24抗体VL領域の配列及びマウスCκ遺伝子が挿入されたベクターである。pKMA010-RT24-mCg1ベクター、及びpKMA009-RT24-mCkベクターを総じてキメラRT24抗体発現ベクターと呼ぶ。【００８９】
マウスT24抗体発現ベクター、キメラRT24抗体発現ベクター、ヒトRT24抗体発現ベクターをそれぞれFreestyle293F細胞(Invitrogen)にNeofection(アステック)を用いて遺伝子導入し、37℃ 8%CO2環境下において125rpmで振とう培養し、マウスT24抗体、キメラRT24抗体、又はヒトRT24抗体を分泌発現させた。培養5日目に上清を回収し、HiTrap rProteinA FF(GE Healthcare)を用いたクロマトグラフィー精製を行った。マウスT24抗体、キメラRT24抗体、又はヒトRT24抗体が含まれた溶出画分をPBS(SIGMA)に対して透析し、マウスT24抗体、キメラRT24抗体、又はヒトRT24抗体の抗体精製品とした。
【実施例８】
【００９０】
ヒトTTR遺伝子のクローニング
ヒトTTR発現ベクターを構築するにあたり、ヒトTTR遺伝子のクローニングを行った。Human liver Marathon-Ready cDNA(Clontech)を鋳型に、成熟型TTRの5´末端又は3´末端に設定したプライマー（TTR-F2：配列番号15、およびTTR-R：配列番号16）、及びEx-Taq(Takara)を用いてPCRを行った。PCR産物をpCR2.1-TOPOにTAクローニングした後、シークエンス解析によってヒトTTR遺伝子の塩基配列を確認した。配列が正しいことを確認した後、TTR遺伝子が挿入されたpCR2.1-TOPOをBamHIおよびHindIII処理して、TTR遺伝子をコードする配列が含まれた領域を切り出した。切り出した配列をBamHIおよびHindIII処理したpQE-30(QIAGEN)に導入し、野生型ヒトTTR発現ベクターを構築した。
【実施例９】
【００９１】
ヒトTTR変異体発現ベクターの構築
実施例８で構築した野生型ヒトTTR発現ベクターを鋳型に、site-directed mutagenesis法を用いてアミノ酸の点変異導入を行った。アミノ酸の点変異導入は、D18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、S115A、Y116S、S117A、T118A、T119A、A120S、V121I、V122A、V122I、T123A、N124Aの16種類についてそれぞれ実施した。上記16種類のTTR変異体をコードする配列をpQE-30にそれぞれ導入した。
【実施例１０】
【００９２】
RT24抗体のエピトープ解析
RT24抗体のエピトープを更に詳しく解析するために、本抗体の創出に用いたTTR115-124ぺプチド領域のアラニン置換変異体を用いて、RT24抗体の反応性解析を行った。実施例９で構築したTTR変異体発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicilin(50μg/mL) / Kanamycin(25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度10mMになるように添加し、一晩培養した。培養液を遠心し、沈殿画分をBugbuster(Merck)によって、可溶化した。可溶化した菌体液を8-16%SDS-PAGEゲルに泳動し、ゲルからImmobilon-P(Millipore)へ転写した。転写した膜に2%Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラRT24抗体を2%Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体HRP標識anti-mouse IgG(H+L)(AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)を2%Skimmilk-PBSTで5000倍希釈した後に膜へ添加し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue(ATTO)で発色させた。【００９３】
その結果、図２に示すように、RT24抗体は、TTR115-124部位の中でも特に118-122部位をエピトープとして認識することが明らかになった。
【実施例１１】
【００９４】
組換えTTR精製品の調製
Matsubaraらの方法（非特許文献14）を参考に、組換えTTR精製品の調製を行った。実施例８および９で構築した野生型TTR、又はD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122I TTR変異体を発現する発現ベクターを大腸菌株M15に形質転換し、20mLのLB / Ampicilin(50μg/mL) / Kanamycin(25μg/mL) で、37℃で培養した。O.D.600nm=0.5になった時点でIPTGを終濃度10mMになるように添加し、一晩培養した。培養液から菌体を遠心で回収し、BufferA(50mM PB + 0.3M NaCl + 10mM Imidazole + 20mM 2-Mercaptoethanol)に懸濁した。懸濁液を15分間ソニケーションし、更に遠心を行い、上清を回収した。上清をNi-NTA Agarose(QIAGEN)を用いてHis-tag精製を行い、組換えTTRの含まれた溶出画分を20mM NaHCO3に対して透析した。透析後の組換えTTRを、10 mM PB (pH7.5)下でSuperdex75(GE Healthcare)を用いてゲルろ過精製し、4量体TTR画分を組換えTTR精製品とした。
【実施例１２】
【００９５】
RT24抗体の反応特異性解析
RT24抗体のTTR 4量体に対する反応性を解析するため、表面プラズモン共鳴法を用いた反応特異性解析を行った。実施例１１で調製したV30M TTR精製品を3 mg/mLになるように10mM PB (pH7.5)で希釈し、等量の200 mM 酢酸バッファー + 100 mM NaCl (pH3.0)と混合して1.5mg/mLの濃度になるように調製し、37℃恒温槽で16時間反応させることでV30M TTR線維を調製した。反応後のTTRについては、ThioflavinT assayによって線維が形成されていることを確認した。ThioflavinT assayは、ThioflavinTが20μM、TTRが30〜60μg/mLになるように、50mM Glycine-NaOH Buffer(pH9.5)で希釈し、分光蛍光光度計FP-6500(JASCO) によって蛍光強度を測定することにより行った（励起波長 440 nm、蛍光波長 480 nm)。【００９６】
Biacore2000(GE Healthcare)を用い、Sensorchip CM5(GE Healthcare)にWT TTR4量体、V30M TTR4量体、V30M TTR線維（いずれも組換え体）を1000RU程度固相化した。リガンドの固相化は10mM 酢酸バッファー (pH6.0)で行った。HBS-EP Bufferで10 μg/mLに希釈したPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)、RT24抗体、陰性コントロール抗体を20μL/minで2分間泳動した。泳動後に解離を60分間行い、10 mM Gly-NaOH (pH9.0)で30秒間再生を行った。【００９７】
その結果、図３に示すように、RT24抗体は、WT TTRおよびV30M 4量体TTRには反応せず、V30M 線維を特異的に認識することが明らかとなった（a）。Dako社製ポリクローナル抗体ではWT TTRおよびV30M TTRと強く反応し、V30M TTR線維への反応性は弱く（b）、陰性コントロール抗体ではいずれのTTRに対しても反応を示さなかった（c）。
【実施例１３】
【００９８】
T24抗体の患者血清への反応性解析
T24抗体がFAP患者由来の血清に対して反応性を示すかどうかについて解析を行った。投与した抗体が患者血清中のヒトTTRを認識しないことが、FAP治療用の抗体として望ましい特性である。実施例１で調製したTTR02およびTTR03ペプチドのBSAコンジュゲート、健常人の血清、及びV30M TTR変異を有するFAP患者由来の血清を2μg/mLで、実施例12と同様にpH3.0処理を行った血清由来の野生型TTRの線維、及びFAP患者の腎臓から抽出したTTRアミロイドを約4μg/mLで、Maxisorp plate(Nunc)に各ウェル当り100μL添加し、抗原の固相化を行った。固相化したプレートに1%BSA-PBSを各ウェル当り300μL入れ、1時間室温でインキュベートすることによってプレートのブロッキングを行った。T24抗体を1%BSA-PBSで段階希釈し、プレートの各ウェルに100μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTでウェルを洗浄し、検出抗体anti-mouse IgG(H+L)/HRP(Zymed)をプレートの各ウェルに100 μLずつ加え、37℃でインキュベーションした。1時間後、PBSTで洗浄し、TMB(SIGMA)をプレートの各ウェルに100μLずつ加えることによって発色させた。30分後、1N 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で発色値(O.D.450nm)を測定した。【００９９】
その結果、図４に示すように、T24抗体は、TTRペプチドやFAP患者由来のTTRアミロイド、血清由来の野生型TTRを酸処理によりアミロイド化させたものには明らかな濃度依存的反応性を示したのに対し、健常者及びFAP患者由来の血清には明確な反応性を示さなかった。
【実施例１４】
【０１００】
T24抗体およびキメラRT24抗体の患者組織への反応性解析
V30M TTR保有FAP患者の心臓を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した心臓組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を4μmの厚さにスライスしてスライドグラスに接着させた後、脱パラフィン処理を行った。PBSで洗浄した後、0.1% 過よう酸二水和物に10分間浸透し、更にPBSで洗浄した。0.5% BSA-PBSで50倍希釈したRabbit serum (Dako)に室温で1時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。PBSで洗浄した後、一次抗体としてT24抗体/キメラRT24抗体/陰性コントロール抗体をそれぞれ0.5%BSA-PBSで10μg/mLに希釈し、4℃で一晩浸漬した。二次抗体としてHRP標識Rabbit anti-mouse IgG(Dako)を0.5%BSA-PBSで100倍希釈し、室温で1時間浸漬した。PBSで洗浄し、DABを用いて発色させた。ヘマトキシリン染色もあわせて行った。陽性コントロールでは、一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を用いて同様な処理を行った。また、ホルマリン固定によりTTRが変性し、立体構造が変化してしまう可能性を考慮し、V30M TTR保有FAP患者の心臓の凍結組織切片についても、同様に免疫染色を行った。さらに、アミロイド線維の存在を確認するために、Congo red染色も行った。Congo redはアミロイド線維に定着して短波長シフトを起こすことが知られている。【０１０１】
これらの解析の結果、図５に示すように、T24抗体およびRT24抗体はパラフィン切片（図５a）と凍結切片（図５b）のいずれにおいても、FAP患者由来の心臓に沈着したTTRを特異的に認識することが確認された。
【実施例１５】
【０１０２】
RT24抗体のTTR線維への反応性解析
実施例１１で調製したD18G、V30M、E54K、L55P、Y114C、Y116S、V122Iの7種類の変異TTR精製品、および野生型TTR精製品を、実施例12に示した方法でpH3.0環境下、37℃で一晩静置し、各種組換えTTR線維を調製した。組換えTTRを1.5μgずつ8-16％SDS-PAGEで泳動し（2枚）、1枚はSilver stain KANTO III（関東化学）を用いて銀染色を行った。残りの1枚はImmobilon-P(Millipore)に転写した。転写した膜に2%Skimmilk-PBSTを加え、室温で1時間振とうすることで膜のブロッキングを行った。キメラRT24抗体を2%Skimmilk-PBSTで1μg/mLの濃度に希釈し、10mLを膜へ添加して室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄し、検出抗体HRP標識anti-mouse IgG(H+L)(AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL)を2%Skimmilk-PBSTで5000倍希釈し、室温で1時間振とうした。PBSTで洗浄した後、Ez West Blue(ATTO)で発色させた。【０１０３】
その結果、図６に示すように、RT24抗体は、各種TTR線維を認識し、一方で線維化させていない野生型TTR精製品を認識しないことが明らかになった。
【実施例１６】
【０１０４】
V30M TTR線維化阻害活性測定系の構築
組換えV30M TTRを375μg/mLになるようにPBS(-)で希釈し、4種類の界面活性剤を終濃度が0.1%、0.01%、0.001%になるように混合した。使用する界面活性剤として、（１）塩化ベンザルコニウム(山善)、（２）デオキシコール酸ナトリウム(ナカライ)、（３）Zwittergent3-16(Carbiochem)、（４）NP-40(Wako)を用いた。37℃で4日間静置し、ThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)で蛍光強度を測定し、TTR線維化の程度を評価した。【０１０５】
ThioflavinT assayの結果いずれの界面活性剤でも、0.1%の濃度で用いた際にTTRの線維化が進行していた。中でも、デオキシコール酸ナトリウムを用いた時が、TTRの線維化が一番早く進行することを見出した。続いて、デオキシコール酸ナトリウムの最適な濃度について検討した。【０１０６】
組換えV30M TTRを375μg/mLになるようにPBS(-)で希釈し、デオキシコール酸ナトリウムの濃度が1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%になるように混合した。37℃で静置し、4日後、7日後にThioflavinT assayを行ってTTR線維化の程度を評価した【０１０７】
その結果、デオキシコール酸ナトリウム濃度は0.1%が最適であることが明らかになった。これまで、中性pH環境下でV30M TTRの線維化が進行する条件に関する報告はなされておらず、pH3.0といった酸性環境下にTTRを置くことで、TTRの線維化を進行させていた。一方で、抗体を酸性環境下に曝してしまうと抗体が変性し、その活性を失ってしまうことから、抗TTR抗体のTTR線維化阻害能を評価することは困難であった。今回デオキシコール酸を系に導入することで中性環境下でも V30M TTRの線維化が進行することを新たに見出し、抗TTR抗体の線維化阻害能を評価できる系の構築に成功した。
【実施例１７】
【０１０８】
RT24抗体のV30M TTR線維化阻害試験
V30M TTR精製品、及びRT24抗体又は陰性コントロール抗体のモル比が 10μM：0.01〜2μMになるように両者を混合し（TTR: 550μg/mL、抗体: 1.5〜300μg/mL）、PBS+0.1%デオキシコール酸ナトリウム環境下で37℃ 3日間静置した。静置後のサンプルを用いてThioflavinT assay(励起波長 440 nm, 蛍光波長 480 nm)を行い、蛍光強度を測定した。【０１０９】
その結果、図７に示すように、RT24抗体は抗体濃度依存的にV30M TTRの線維化を阻害する活性を有していることが明らかになった。更に、RT24抗体を元にフレームワーク領域のアミノ酸を数個改変した抗体RT24-a、RT24-bについても同様に線維化阻害試験を実施したところ、RT24と同様にV30M TTRの線維化阻害活性を有していた。抗TTR抗体のTTR線維化阻害活性を評価できる系はこれまで報告されていなかったことから、RT24抗体はV30M TTRの線維化を阻害する活性を持つ初めての抗体であるといえる。
【実施例１８】
【０１１０】
マクロファージ貪食能試験
マクロファージがTTR線維を貪食する際、RT24抗体がその能力を促進するかどうかについて、マクロファージ貪食能試験を行った。本試験は、TTR患者組織内に沈着しているTTRをマクロファージが除去する過程を模倣しており、RT24抗体の添加によってマクロファージの貪食活性が促進されれば、RT24抗体はヒト組織内でTTR沈着の除去を促進する活性を有していると期待される。【０１１１】
FAP患者由来の皮膚組織から、非特許文献１７に記載の方法に従ってヒトiPS細胞を作製し、更にマクロファージ（iPS-MP）に分化させた。1〜2×106個のiPS-MPを10cm dishにて、50ng/mL hGM-SCF及び25pg/mL M-CSF存在下で24 時間前培養した。iPS-MPをPBS 洗浄後、20μg/mLマイトマイシンCを含む培地にて37℃で10分間インキュベートし、細胞増殖能を停止させ、96wellプレートに5×104個/100μL/wellになるように加えた。未処理あるいは24 時間の酸処理を行なったV30M TTRを3.2μg/mLになるように培地で希釈後、50μLずつ添加した。さらに、PBS/RT24抗体/陰性コントロール抗体をそれぞれ40μg/mLになるように希釈し、50μLずつ添加した。37℃、5%CO2下で3日間培養した後、培養上清を回収した。【０１１２】
培養後のTTR残量を以下に記すELISA法で定量し、マクロファージによる貪食能を評価した。培養上清を5μLずつ96wellプレートに加え、さらにコーティング溶液（25mMの炭酸ナトリウムバッファー）を100μL加えた後、4℃で一晩静置した。PBSTで洗浄後、ブロッキング溶液（コーティング溶液に0.5%ゼラチンを溶かしたもの) を250μL加え、室温で1時間インキュベートした。PBST で洗浄後、Polyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)を0.05%ゼラチン-PBSTで1000倍希釈し、100μLずつ添加して室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、HRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を0.05%ゼラチン-PBSTで5000倍希釈し、100μLずつ添加して室温で1時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、100μLのSureBlue(KPL)で5分間発色し、100μLの1M塩酸で発色を停止させた。xMARK マイクロプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories)にて450nmの波長を測定した。【０１１３】
結果を図８に示す。未処理の精製V30Mに対しては、いずれの検体でもTTR残量に統計学的有意差は見られなかったのに対し（a）、TTR線維に対しては、PBS（none）と比較してRT24では統計学的に有意なTTR残量の減少が認められ（b）、RT24抗体はヒトiPS細胞分化マクロファージのTTR線維貪食作用を促進する活性を有していることが明らかになった。
【実施例１９】
【０１１４】
V30M Tgラットを用いた薬効評価試験
3ヶ月齢のV30M Tgラット（非特許文献15、TTRのアミノ酸配列において30位をバリンからメチオニンに変異させたヒトTTRの遺伝子を導入したトランスジェニックラット）を用いて、マウスT24抗体 10mg/kg あるいはPBSを各群4匹ずつ、3〜9ヶ月齢の6ヶ月間に亘り、週1回ずつ26回投与した。投与後に剖検して大腸を採取し、ホルマリン固定を行った。固定した大腸組織をパラフィンブロックに包埋し、組織切片を作製した。組織切片を一次抗体にPolyclonal Rabbit Anti-Human Prealbumin(Dako)を、二次抗体にHRP標識Goat anti-Rabbit IgG(Dako)を用いて免疫染色し、大腸の筋層におけるTTR沈着の程度を数値化して群間で比較した。【０１１５】
その結果、図９に示すように、PBS投与群と比較してT24抗体投与群では有意にTTR沈着が抑制されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明のヒト化抗トランスサイレチン抗体は、活性（TTR線維化阻害活性、マクロファージ貪食能促進活性等）および／または特異性（構造変化を起こしたTTR、TTR線維を特異的に認識する）に優れているため、TTRの構造変化や線維化が関与する様々な疾患に対して有効な薬剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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