(57)【要約】  本発明は、細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
DNA二本鎖構造を変化させる因子を、さらに該二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記DNAグリコシラーゼがシトシン-DNAグリコシラーゼ（CDG）活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）活性を有するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記CDG活性又はTDG活性を有するDNAグリコシラーゼが、ウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）の変異体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
さらに、無塩基部位への結合能を有するが、ヌクレアーゼ活性を欠損するAPエンドヌクレアーゼを、二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記DNAグリコシラーゼが、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低いものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記DNAグリコシラーゼが、CDG活性又はTDG活性を有する、ポックスウイルス科に属するウイルス由来のウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）の変異体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
さらに、A20タンパク質を二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAグリコシラーゼが、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が減弱された変異体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記DNAグリコシラーゼと、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する前記核酸配列認識モジュールの要素とが、それぞれ2つの断片に分断され、一方の断片同士と他方の断片同士とがそれぞれ結合して2つの部分的複合体を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングした場合に、該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、かつ該特異的な結合により該DNAグリコシラーゼが酵素活性を発揮し得るようになることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNAグリコシラーゼと直接的に結合する核酸配列認識モジュールの要素が、少なくとも１つのDNA切断能が失活したCasタンパク質である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記2つの部分的複合体が、別個の分子複合体として提供され、細胞内で両者が会合することによりリフォールディングされる、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が原核生物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が微生物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が植物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が動物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が脊椎動物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が哺乳類動物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
【請求項２８】
請求項２７記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAの二重鎖切断を伴わず（無切断もしくは一本鎖切断で）、また外来DNA断片の挿入を行わずに、脱塩基反応を利用してゲノムの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とする、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとの複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な生物種において目的の遺伝子・ゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。従来、ゲノム編集の手法としては、配列非依存的なDNA切断能を有する分子と配列認識能を有する分子とを組み合わせた人工ヌクレアーゼを利用する方法が提案されている（非特許文献１）。
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様（TAL）エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２）、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas（CRISPR-associated）タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法（特許文献３）などが報告されている。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法（特許文献４）も報告されている。
しかし、これらのゲノム編集技術は、基本的にDNA二重鎖切断（double-stranded DNA breaks : DSB）を前提としているが、想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、遺伝子治療における信頼性を損なったり、ヌクレオチド改変による生存細胞数が極めて少なかったり、霊長類卵細胞や単細胞微生物では遺伝子改変自体が困難であるといった共通の課題があった。【０００３】
一方、DSBを伴わずにヌクレオチド改変を行う方法として、DNAグリコシラーゼの利用が提案されている。例えば、特許文献５には、ヒトウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）に変異を導入することにより、一本鎖もしくは二本鎖DNAからチミン又はシトシン塩基を脱離させる活性（TDG活性又はCDG活性）を有する変異DNAグリコシラーゼを取得し、当該酵素を用いて、大腸菌への変異導入効率を改善したことが記載されている。
さらに、特許文献６及び非特許文献２には、酵母3-メチルアデニン-DNAグリコシラーゼ（MAG1）とTetリプレッサータンパク質（TetR）との融合タンパク質を用いることにより、TetRが特異的に認識するTetオペレーター（TetO）DNA配列を有するゲノム領域内への標的化されたヌクレオチド改変が可能であることが記載されている。しかしながら、MAG1は3-メチルアデニンを主とするアルキル化などの傷害を受けた特殊なDNA塩基を取り除くのが本来的な役割であり、正常な塩基、特にミスマッチのない塩基対から塩基を除去する能力は極めて低い。そのため、通常の細胞ではMAG1による変異導入効果を見ることは困難であり、塩基除去修復系の遺伝子を破壊した細胞でMAG1を過剰発現させることにより、ようやく検出できる程度の変異率しか得られていない。また、DNA修復系を弱めてしまうとゲノム全体の変異率も上がってしまうため、実用化には程遠かった。ところが、MAG1の代わりに、正常なシトシン塩基に作用するCDG活性を有する変異UDGをこの系に用いても、変異導入効率は増大しなかった（特許文献６、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第4968498号公報
【特許文献２】特表2013-513389号公報
【特許文献３】特表2010-519929号公報
【特許文献４】特開2013-128413号公報
【特許文献５】国際公開第97/25416号パンフレット
【特許文献６】国際公開第2014/127287号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
【非特許文献２】Shwan P. Finney-Manchester, Narendra Maheshri, (2013) Harnessing mutagenic homologous recombination for targeted mutagenesis in vivo by TaGTEAM, Nucleic Acids Research 41(9): e99
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、DSBないし外来DNA断片の挿入を伴わずに、即ち、二本鎖DNAを無切断もしくは一本鎖切断により遺伝子の特定配列の核酸塩基を改変する、新規なゲノム編集の手法、並びにそのための核酸配列認識モジュール及び変異導入酵素の複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは既に、脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼを用い、これとDNA配列認識能のある分子とを連結させることにより、DSBを伴うことなく、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変に成功したことを報告しているが（国際公開第2015/133554号）、デアミナーゼとは異なる変異導入傾向が得られること等を期待して、本発明では、DNAのN-グリコシド結合の加水分解による脱塩基反応を起こさせた後、細胞の修復過程における変異導入を誘発することを着想した。そこで、このような脱塩基反応を行う酵素として、酵母ミトコンドリアウラシル-DNAグリコシラーゼ（UNG1）の変異体であるCDG活性又はTDG活性を有する酵素を用いることを試みた。
本発明者らは、従来法（例えば、特許文献６及び非特許文献２を参照）がCDG活性を有する変異UDGを用いても変異導入効率を改善できなかった原因の1つは、当該酵素が二本鎖DNAの至る所で脱塩基を起こしてしまうために、細胞毒性が高く、当該酵素タンパク質を発現させること自体を困難にしていることにあると推測した。この仮説のもと、本発明者らは、CDG活性又はTDG活性を有する変異UDGに、さらにひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed (double-helical) DNA）への作用を低下させる変異を導入し、該変異酵素とDNA配列認識能のある分子とを連結させることにより、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変を行った。
具体的には、CRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）を用いて行った。即ち、改変しようとする遺伝子の標的配列と相補的な配列を含むゲノム特異的CRISPR-RNA:crRNA（gRNA）に、Casタンパク質をリクルートするためのRNA（trans-activating crRNA: tracrRNA）を連結したRNA分子をコードするDNAを作製し、他方で二本鎖DNAの両方の鎖の切断能を失活した変異Casタンパク質をコードするDNA（dCas）と変異CDG又はTDG遺伝子を連結したDNAを作製し、これらのDNAを、改変しようとする遺伝子を含む宿主酵母細胞に導入した。その結果、標的配列を含む目的遺伝子の数百ヌクレオチドの範囲内で、ランダムに変異を導入することに成功した。さらに、目的遺伝子内の複数の領域を標的化することにより、きわめて効率よく変異を導入することに成功した。即ち、DNAを導入した宿主細胞を非選択培地に播種し、無作為に選んだコロニーについて目的遺伝子の配列を調べた結果、ほとんど全てのコロニーについて変異が導入されていることを確認した。塩基除去修復系酵素であるAPエンドヌクレアーゼの機能欠損変異体を共発現させて、無塩基部位（AP部位）の修復エラーの頻度を高めることにより、変異導入効率はさらに向上した。【０００８】
また、異種生物由来の変異UDGを用いた系も酵母で機能することが確認された。意外にも、ワクシニアウイルス由来のUDG（vvUDG）は、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの作用を低下させる変異を導入せずとも、細胞毒性が生じず、基質特異性を変化させる変異のみを導入した変異UDGの方が、むしろ変異導入効率は高かった。即ち、vvUDGはひずみのない二重らせん構造のDNAへの作用が生来的に低い酵素であることが示唆された。このことは、vvUDGによる変異部位が標的配列内（即ち、一本鎖部分）の特定塩基に集中していることからも支持された。また、vvUDGの活性は、補助因子として知られるA20を共発現させることにより増大させることができた。【０００９】
本発明者らは、UDGへの変異導入以外に、該酵素による非特異的変異を低減させる手段として、スプリットCas9システムを利用することを着想した。スプリットCas9とは、Cas9タンパク質をN末断片とC末断片とに分断し、両者がgRNAとともに会合したときに初めて機能するように設計されたCas9のバリアントであるが（Nat Biotechnol. 33(2): 139-142 (2015); PNAS 112(10): 2984-2989 (2015)）、本発明者らは、dCas9のN末断片-変異UNG1のN末断片-dCas9のC末断片-変異UNG1のC末断片からなる1つの融合タンパク質としてスプリットdCas9-変異UNG1を発現させる系と、dCas9のN末断片-変異UNG1のC末断片と、変異UNG1のN末断片-dCas9のC末断片とを別個に発現させる系を構築し、Can1遺伝子内の配列を標的として、標的部位での変異及び非特異的変異の頻度、並びに細胞増殖を調べた。その結果、いずれの系においても、CDG活性を付与する変異（N222D）のみを導入した変異UNG1と、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの作用を低下させる変異（R308C）がさらに導入された変異UNG1との間で、非選択培地上での細胞生存率にほとんど差はなく、スプリット酵素の利用により、細胞毒性は大いに低減された。チアリジン耐性を指標とした非特異的変異の頻度も、スプリット酵素を用いると、R308変異の有無に依存せずに低減された。R308C変異を加えるとCDG活性も低下するため、本来の標的部位での変異導入効率はむしろ低下した。従って、スプリット酵素を使用する場合は、UDGにひずみのない二重らせん構造のDNAへの作用を低下させる変異を加えないことが好ましいことが示唆された。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
［２］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、上記［１］記載の方法。
［３］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記［１］記載の方法。
［４］DNA二本鎖構造を変化させる因子を、さらに該二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法。
［５］異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、上記［５］記載の方法。
［７］前記DNAグリコシラーゼがシトシン-DNAグリコシラーゼ（CDG）活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）活性を有するものである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記CDG活性又はTDG活性を有するDNAグリコシラーゼが、ウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）の変異体である、上記［７］記載の方法。
［９］さらに、無塩基部位への結合能を有するが、ヌクレアーゼ活性を欠損するAPエンドヌクレアーゼを、二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記DNAグリコシラーゼが、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低いものである、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記DNAグリコシラーゼが、CDG活性又はTDG活性を有する、ポックスウイルス科に属するウイルス由来のウラシル-DNAグリコシラーゼ（UDG）の変異体である、上記［１０］記載の方法。
［１２］さらに、A20タンパク質を二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記［１１］記載の方法。
［１３］前記DNAグリコシラーゼが、野生型に比べて、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が減弱された変異体である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記DNAグリコシラーゼと、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する前記核酸配列認識モジュールの要素とが、それぞれ2つの断片に分断され、一方の断片同士と他方の断片同士とがそれぞれ結合して2つの部分的複合体を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングした場合に、該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、かつ該特異的な結合により該DNAグリコシラーゼが酵素活性を発揮し得るようになることを特徴とする、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記DNAグリコシラーゼと直接的に結合する核酸配列認識モジュールの要素が、少なくとも１つのDNA切断能が失活したCasタンパク質である、上記［１４］記載の方法。
［１６］前記2つの部分的複合体が、別個の分子複合体として提供され、細胞内で両者が会合することによりリフォールディングされる、上記［１４］又は［１５］記載の方法。
［１７］二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記細胞が原核生物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［１９］前記細胞が真核生物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２０］前記細胞が微生物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２１］前記細胞が植物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２２］前記細胞が昆虫細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２３］前記細胞が動物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２４］前記細胞が脊椎動物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２５］前記細胞が哺乳類動物細胞である、上記［１７］記載の方法。
［２６］前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、上記［１８］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
［２８］上記［２７］記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のゲノム編集技術によれば、外来DNAの挿入もDNA二重鎖切断も伴わないため、安全性に優れており、従来法において遺伝子組み換えであるとして、生物学的あるいは法律的に議論があったケースにおいても、解決策となる可能性が少なからずある。また、変異導入の範囲を、標的配列を含む数百塩基に至る範囲まで適宜設定することが可能であり、これまではほとんど不可能であった特定の限定的な領域へのランダム変異導入による局所的な進化誘導にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ウラシル-DNAグリコシラーゼ変異体のDNA配列特異的ターゲッティングのメカニズムを示す模式図である。
【図２】図２は、DNAグリコシラーゼとCRISPR-Casシステムとを用いた本発明の遺伝子改変方法のメカニズムを示す模式図である。
【図３】図３は、CRISPR-Casシステムと出芽酵母由来の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼ（CDG活性を有し、かつひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低下している）とを組み合わせた本発明の遺伝子改変方法の効果を、出芽酵母を用いて実証した結果を示す図である。
【図４】図４は、CRISPR-Casシステムと出芽酵母由来の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼ（CDG活性又はTDG活性を有し、かつひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低下している）とを組み合わせた本発明の遺伝子改変方法の効果を、出芽酵母を用いて実証した結果を示す図である。
【図５】図５は、図４で得られたカナバニン耐性コロニーにおける変異部位の解析結果を示す図である。
【図６】図６は、出芽酵母由来の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼを用い、dCas9と、SH3ドメイン及びその結合リガンドを介して結合するように構築された発現コンストラクトを、2種のgRNAとともに出芽酵母に導入した結果を示す図である。
【図７】図７は、APエンドヌクレアーゼ（Ape1）変異体（E96Q, D210N）の共発現により、変異UNG1（図中「Ung」と表記される場合は、酵母由来UNG1を意味する。以下同じ）による変異導入効率が向上することを示す図である。
【図８】図８は、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異（L304A）を導入することにより、CDG活性（N222D）又はTDG活性（Y164A）を有する変異UNG1を導入した宿主酵母における細胞毒性を回避できることを示す図である。
【図９】図９は、異種生物（大腸菌及びワクシニアウイルス）由来の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼ（EcUDG及びvvUDG）を導入した酵母における生存率及び変異導入効率を示す図である。vvUDGでは、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異（R187C）を導入せずとも、宿主酵母において細胞毒性は生じなかった。A20タンパク質の共発現により、vvUDGによる変異導入効率は顕著に向上した。
【図１０】図１０は、酵母由来変異UNG1とワクシニアウイルス由来変異UDG（vvUDG）とによる標的ヌクレオチド配列及びその近傍における変異導入部位の比較図である。
【図１１】図１１は、スプリット酵素の利用により、変異UNG1による非特異的変異を低減させ得ることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、改変しようとする二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列及びその近傍の、一本鎖領域もしくは二重らせん構造の緩んだ領域内のヌクレオチドから塩基を除去することにより、細胞の塩基除去修復（BER）のエラーを利用して、該二本鎖DNAの該標的化された部位のヌクレオチドを改変する方法を提供する。当該方法は、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位、即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを、結果的に他のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明において、二本鎖DNAの「改変」とは、DNA鎖上のあるヌクレオチド（例えば、dC）が、他のヌクレオチド（例えば、dT、dA又はdG）に変換されるか、欠失すること、あるいはDNA鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変される二本鎖DNAは特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAである。また、二本鎖DNAの「標的化された部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（5’上流及び3’下流のいずれか一方又は両方）を意味し、その範囲は目的に応じて、1塩基〜数百塩基長の間で適宜調節することができる。
【００１５】
本発明において「核酸配列認識モジュール」とは、DNA鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結されたDNAグリコシラーゼが二本鎖DNAの標的化された部位に特異的に作用することを可能にする。
【００１６】
本発明において「DNAグリコシラーゼ」とは、DNAのN-グリコシド結合を加水分解する酵素を意味する。DNAグリコシラーゼは、本来BERにおいて傷害のある塩基をDNAから除去する役割を担うが、本発明においては、DNA中の正常な塩基（即ち、dC、dT、dA又はdG、あるいはそれらがエピジェネティック修飾を受けたもの）に作用し得るものが好ましい。本来は正常な塩基とは反応しないか、反応性が低いが、変異により正常な塩基に対する反応性を獲得、もしくは反応性が向上した変異DNAグリコシラーゼも、本発明におけるDNAグリコシラーゼに包含され、好ましく使用され得る。該酵素による脱塩基反応の結果生じた塩基の無い部位(apurinic/apyrimidic (AP) site)は、APエンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ等のBER経路の下流の酵素によって処理される。
また、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低い」とは、細胞の生存に影響を与えない程度に細胞毒性が抑えられる頻度でしか、ひずみのない二重らせん構造のDNAを形成する領域内での脱塩基反応を起こさないことを意味する。ここで「ひずみのない二重らせん構造のDNA」とは、強固な二重らせん構造を形成した状態にあること（即ち、unrelaxed double-helical DNA（又は単にunrelaxed DNAともいう））を意味し、対形成する塩基同士が完全に解離した一本鎖DNAの状態のみならず、塩基対は形成しているものの二重らせん構造がほどけた緩んだ二本鎖（relaxed double-stranded DNA）の状態のものも含まれない。ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとしては、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼや、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性を低下させる変異が導入された変異DNAグリコシラーゼ等が挙げられる。さらに、2つの断片に分断されたDNAグリコシラーゼであって、それぞれの断片が2つに分断された核酸配列認識モジュールのいずれか一方と結合して2つの複合体を形成し、両複合体がリフォールディングすると該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、該特異的な結合によって該DNAグリコシラーゼが脱塩基反応を触媒することが可能となるようにデザインされたスプリット酵素であるDNAグリコシラーゼも、本発明における「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼ」に包含される。
【００１７】
本発明において「核酸改変酵素複合体」とは、上記核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能が付与された、核酸の脱塩基反応を触媒する活性を有する分子複合体を意味する。ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとを単一の分子内に有するものも包含される。また、2つの断片に分断された核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼの一方の断片同士がそれぞれ連結された、2つの「部分的複合体」を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングすることによってヌクレオチド配列認識能と脱塩基反応の触媒活性とを獲得する分子複合体も、本発明における「核酸改変酵素複合体」に包含される。
【００１８】
本発明に用いられるDNAグリコシラーゼは、DNAのN-グリコシド結合を加水分解して塩基を脱離させる反応を触媒し得るものであれば特に制限はないが、ゲノム編集技術としての汎用性を高める意味で、正常な塩基（即ち、dC、dT、dA又はdG、あるいはそれらがエピジェネティック修飾を受けたもの、例えば、5-メチルシトシン等）に作用し得るものが好ましい。そのような酵素として、例えば、シトシンを脱離する反応を触媒するCDG活性を有する酵素、チミンを脱離する反応を触媒するTDG活性を有する酵素、5-メチルシトシンを脱離する反応を触媒する活性（5-mCDG活性）を有する酵素等が挙げられる。生来的にCDG活性を有するDNAグリコシラーゼはこれまでに報告されていないが、ほとんどの生物種において、DNA中に組み込まれたウラシルの除去を担う主要なUDGとして知られるUNG（真核生物の場合、ミトコンドリア局在性のUNG1と核局在性のUNG2の2つのスプライスバリアントがあり、各オルガネラ移行シグナルを含むN末端配列を除き、共通のアミノ酸配列を有する）の、ある特定のアミノ酸残基に変異を導入することにより、シチジン又はチミジンを基質として認識するCDG活性又はTDG活性を有する変異UDGを得ることができる（図１上段を参照）。より具体的には、例えば、酵母由来のUNG1（配列番号２; GenBank accession No. NP_013691）の場合、N末端から222番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換することにより（該変異体をN222Dともいう）、CDG活性を付与することが可能となり、164番目のチロシンをアラニンに置換することにより（該変異体をY164Aともいう）、TDG活性を付与することが可能となる（Kavli B. et al., EMBO J. (1996) 15(13): 3442-7）。本発明者らは、164番目のチロシンをグリシンで置換することにより（該変異体をY164Gともいう）、Y164A変異体より高いTDG活性を付与し得ることを新たに見出した。さらに、シトシンはウラシルの4位のカルボニル基がアミノ基に置換されたものであり、チミンはウラシルの5位がメチル化されたものであることから、222番目のアスパラギン残基と164番目のチロシン残基に二重変異（例えば、N222D/Y164A又はN222D/Y164G）を導入することにより、シトシンの5位がメチル化した5-メチルシトシンをDNAから脱離する活性（5-mCDG活性）を有するDNAグリコシラーゼを得ることができる。5-メチルシトシンを脱塩基できることにより、ゲノムDNAのメチル化状態を変化させ得るので、本発明のゲノム編集技術は、エピジェネティック修飾を変化させるエピゲノム編集をも可能にするものである。
尚、UNG2を用いる場合も、上記変異部位に対応するアミノ酸残基に同様の変異を導入することにより、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を有する変異UNGを得ることができる。
また、変異UNGは、正常な塩基に作用し得る限り、上記の部位が上記以外のアミノ酸で置換されたものであっても、あるいは上記以外の部位に変異が導入されたものであってもよい。変異UNGが正常な塩基に作用し得るか否かは、例えば、Kavli B. et al., EMBO J. (1996) 15(13): 3442-7に記載の方法によって確認することができる。
【００１９】
UNGの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌由来のung（Varshney, U. et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 7776-7784）、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のUNG1又はUNG2、あるいはウイルス（例、ポックスウイルス科（ワクシニアウイルス等）、ヘルペスウイルス科など）由来のUDGを用いることができる。例えば、ヒトUNG1及びUNG2のアミノ酸配列は、それぞれUniprotKB No. P13051-2及びP13051-1として参照することができる。また、大腸菌（K-12株）ungのアミノ酸配列はUniprotKB No. P12295として、ワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）UDGのアミノ酸配列はUniprotKB No. P20536として、それぞれ参照することができる。UNGのアミノ酸配列は生物種間で高度に保存されており、所望の生物由来のUNG1又はUNG2のアミノ酸配列を、上記の酵母UNG1のアミノ酸配列とアラインすることにより、対応する変異部位を同定することができる。例えば、ヒトUNG1の場合、酵母UNG1のN222に対応するアミノ酸は204番目のアスパラギン（N204）であり、Y164に対応するアミノ酸は147番目のチロシン（Y147）である。また、大腸菌ungの場合、酵母UNG1のN222に対応するアミノ酸は123番目のアスパラギン（N123）であり、Y164に対応するアミノ酸は66番目のチロシン（Y66）である。ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、サル痘ウイルス、鶏痘ウイルス、豚痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス等のポックスウイルス科ウイルス由来のUDGの場合、酵母UNG1のN222に対応するアミノ酸は120番目のアスパラギン（N120）であり、Y164に対応するアミノ酸は70番目のチロシン（Y70）である。
【００２０】
UNGは、一本鎖DNAからも、二本鎖DNAからもウラシルを除去することができるが、一本鎖DNAに対してより親和性が高い。この傾向は、CDG活性やTDG活性を付与された上記変異UNGについても同様である。しかしながら、シトシンやチミンはゲノムDNA中の至る所に存在するため、CDG活性又はTDG活性を有する変異UNGは、複製時のエラーやシトシンの脱アミノ化によりゲノムDNA中に稀に導入されるウラシルのみを基質とする野生型のUNGと異なり、核酸配列認識モジュールにより標的化されるヌクレオチド配列及びその近傍の二本鎖DNA中のあらゆる部位に作用してシトシン又はチミンを除去してしまい、強い細胞毒性を引き起こす。そのため、本発明で用いられるDNAグリコシラーゼは、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いものであることが求められる。DNAグリコシラーゼとして変異UNGを用いる場合、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異をさらに導入して、CDG活性やTDG活性を有する変異UNGによる脱塩基反応が弛緩した二本鎖又は一本鎖DNAの領域により選択的となるようにすることにより、該酵素による細胞毒性を回避することができる（図１中段を参照）。具体的には、例えばUNGの場合、in vitroで、U・A 25merの二本鎖DNAに対する反応性を、野生型の1/20以下、より好ましくは1/50以下、さらに好ましくは1/100以下に低下させる変異が挙げられるが、in vivoで致死的な細胞毒性を引き起こさない程度に、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低下している限り、in vitroでの反応性に制限されない。使用しようとするDNAグリコシラーゼが、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低い」ものであることは、例えば、該DNAグリコシラーゼを図２に記載されるコンストラクトに挿入し、ガイドRNAとともに、実施例１に記載の方法で目的の細胞に導入し、得られた形質転換体を培養して、その生存可能性を検証することにより確認することができる。あるいは、目安の１つとして、in vitroでの二本鎖DNAオリゴマーに対する反応性を、Chen, C.Y. et al. DNA Repair (Amst) (2005) 4(7): 793-805に記載の方法により評価することにより、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低い」DNAグリコシラーゼの候補をスクリーニングすることもできる。
上記の条件を充足するDNAグリコシラーゼとして、例えば、酵母由来のUNG1（配列番号２）の場合、N末端から304番目のロイシンをアラニンに置換した変異体が挙げられる（該変異体をL304Aともいう）（Slupphaug, G. et al. Nature (1996) 384(6604): 87-92）。あるいは、308番目のアルギニンをグルタミン酸又はシステインに置換した変異体（該変異体をそれぞれR308E、R308Cともいう）も、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が顕著に低下している（Chen, C.Y. et al. DNA Repair (Amst) (2005) 4(7): 793-805）。別の生物種由来のUNGを用いる場合、所望の生物由来のUNG1又はUNG2のアミノ酸配列を、上記の酵母UNG1のアミノ酸配列とアラインすることにより、対応する変異部位を同定することができる。例えば、ヒトUNG1の場合、酵母UNG1のL304に対応するアミノ酸は272番目のロイシン（L272）であり、R308に対応するアミノ酸は276番目のアルギニン（R276）である。また、大腸菌ungの場合、酵母UNG1のL304に対応するアミノ酸は191番目のロイシン（L191）であり、R308に対応するアミノ酸は195番目のアルギニン（R195）である。ワクシニアウイルスUDGの場合、酵母UNG1のR308に対応するアミノ酸は187番目のアルギニン（R187）である。
【００２１】
酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大腸菌、ヒト及びポックスウイルス科ウイルスの間におけるUNG1（ung）の基質特異性及びひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を変化させる変異の位置の対応を表１に示す。変異アミノ酸を一文字表記で示し、数字はN末端アミノ酸を1とした変異アミノ酸の位置を示す。
【００２２】
【表１】
2016072399.tif 000002
【００２３】
以上より、本発明で使用される「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼ」として、好ましくは、酵母UNG1のN222D/L304A二重変異体、N222D/R308E二重変異体、N222D/R308C二重変異体、Y164A/ L304A二重変異体、Y164A/R308E二重変異体、Y164A/R308C二重変異体、Y164G/ L304A二重変異体、Y164G/R308E二重変異体、Y164G/R308C二重変異体、N222D/Y164A/L304A三重変異体、N222D/Y164A/R308E三重変異体、N222D/Y164A/R308C三重変異体、N222D/Y164G/L304A三重変異体、N222D/Y164G/R308E三重変異体、N222D/Y164G/R308C三重変異体などが挙げられる。酵母UNG1に代えて別のUNGを用いる場合は、上記各変異体に対応するアミノ酸に、同様の変異が導入された変異体を用いればよい。
【００２４】
あるいは、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼ」として、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低く、弛緩二本鎖又は一本鎖DNAに対する選択性の高いDNAグリコシラーゼを用いることもできる。そのようなDNAグリコシラーゼとしては、例えば、UDG活性を有するSMUG1（Single strand-selective Monofunctional Uracil-DNA Glycosylase）を挙げることができる。SMUG1には、CDG活性やTDG活性を付与する変異は知られていないが、シトシンの脱アミノ化によって生じるウラシルの除去に重要であるとの報告がある（Nilsen, H. et al. EMBO J. (2001) 20: 4278-4286）。本発明者らは、シトシンをウラシルに変換し得るシチジンデアミナーゼと、本発明と同様の核酸配列認識モジュールとを組み合わせて、標的化されたヌクレオチド配列及びその近傍に特異的に変異を導入する方法を既に開発しているので（国際公開第2015/133554号）、当該技術と組み合わせることにより、ゲノムDNA中の標的化された部位において、人為的にシトシンをウラシルに変換した後、さらにSMUG1を作用させることで、該ウラシルをDNAから脱離させることもできる。SMUG1の由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のSMUG1を用いることができる。例えば、ヒトSMUG1の2つのアイソフォームのアミノ酸配列は、UniprotKB No. Q53HC7-1及びQ53HV7-2として参照することができる。また、シチジンデアミナーゼの由来も特に制限されないが、例えば、ヤツメウナギ由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1）、哺乳動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のAID（Activation-induced cytidine deaminase; AICDA）を用いることができる。例えば、PmCDA1のcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列は、GenBank accession No. EF094822及びABO15149を、ヒトAIDのcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列はGenBank accession No. NM_020661及びNP_065712を、それぞれ参照することができる。
【００２５】
別の好ましい実施態様において、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低いDNAグリコシラーゼとして、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス科に属するウイルス由来のUDGを挙げることができる。後述の実施例に示されるとおり、ワクシニアウイルス由来のUDG（vvUDG）は、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異（例、R187C）を導入せずとも、非選択培地上で、当該変異が導入された酵母UNG1や大腸菌ungと同等の生育を示すことから、宿主細胞において毒性を生じない程度に、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いものと考えられる。DNAグリコシラーゼとしてvvUDG等のポックスウイルス科ウイルス由来UDGを用いる場合、酵母UNG1におけるひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異に対応する変異（例、R187C）をさらに導入することもできるが、該UDGのCDG活性（N120D）やTDG活性（Y70A、Y70G）を低下させる場合には、当該変異を有しないことが望ましい。以上より、本発明で使用されるvvUDG等のポックスウイルス科ウイルス由来UDGとして、好ましくは、N120D変異体、Y70GもしくはY70A変異体、N120D/Y70G二重変異体もしくはN120D/Y70A二重変異体などが挙げられる。
【００２６】
DNAグリコシラーゼとして変異vvUDG等のポックスウイルス科ウイルス由来UDGを用いる場合、UDGと相互作用して、ウイルスDNAポリメラーゼのプロセッシビティ因子として働くヘテロダイマーを形成するA20タンパク質を、UDGとともに二本鎖DNAに接触させることが好ましい。A20タンパク質を併用すると変異UDGのCDG活性又はTDG活性が上昇するので、例えば、CDG活性（N120D）に比べてTDG活性（Y70G）が低い変異vvUDGの場合、A20タンパク質との併用により、チミンへの変異導入効率を向上させることができる。A20の由来は特に制限されないが、例えば、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、サル痘ウイルス、鶏痘ウイルス、豚痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス等のポックスウイルス科に属するウイルス由来のA20を用いることができる。例えば、ワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）A20のアミノ酸配列は、UniprotKB No. P20995として参照することができる。
【００２７】
さらに別の好ましい実施態様において、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとを、それぞれ2つの断片に分断し、その一方の断片同士を連結して2つの部分的複合体を形成させ、これらが会合して機能的な核酸配列認識モジュールが再構成され標的ヌクレオチド配列に結合すると、機能的なDNAグリコシラーゼが再構成されるようにデザインされたスプリット酵素を、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低いDNAグリコシラーゼとして用いることができる。該スプリット酵素においては、再構成されるDNAグリコシラーゼ自体はひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低減されていなくとも、標的ヌクレオチド配列と結合した場合にのみ酵素活性を発揮するので、結果的に該標的ヌクレオチド配列及びその近傍の一本鎖DNAもしくは弛緩した二本鎖DNA部分に選択的に作用することとなる。例えば、核酸配列認識モジュール及びDNAグリコシラーゼを、それぞれN末側断片とC末側断片とに分断し、例えばN末側断片同士を連結した部分的複合体と、C末側断片同士を連結した部分的複合体とを作製し（あるいは、核酸配列認識モジュールのN末側断片とDNAグリコシラーゼのC末側断片とを連結した部分的複合体と、DNAグリコシラーゼのN末側断片と核酸配列認識モジュールのC末側断片とを連結した部分的複合体とを作製し）、これらを会合させることにより機能的な核酸配列認識モジュール及び機能的なDNAグリコシラーゼを再構成させることができる。連結する断片の組み合わせは、2つの部分的複合体が会合した際に、機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なDNAグリコシラーゼとの複合体に再構成される限り、特に制限されない。また、2つの部分的複合体は、別個の分子として提供されてもよく、あるいは直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、1つの融合タンパク質として提供されてもよい。DNAグリコシラーゼの分断箇所は、分断された2つの断片が機能的なDNAグリコシラーゼに再構成され得る限り特に制限はなく、1か所で分断されてN末側断片とC末側断片としてもよいし、2か所以上で分断して生じる3以上の断片を適宜連結して2つの断片とすることもできる。種々のUDGタンパク質の3次元構造は公知であり、当業者であれば、当該情報に基づいて適宜分断箇所を選択することができる。例えば、酵母UNG1（配列番号２）の場合、N末から258番目と259番目のアミノ酸の間で、N末側断片（1-258）とC末側断片（259-359）とに分断することができる。
【００２８】
上述のように、塩基除去修復（BER）機構において、DNAグリコシラーゼによって塩基が除去されると、APエンドヌクレアーゼが無塩基部位（AP部位）にニックを入れ、さらにエキソヌクレアーゼによってAP部位は完全に除去される。AP部位が除去されると、DNAポリメラーゼが反対鎖の塩基を鋳型に新しく塩基を作り、最後にDNAリガーゼがニックを埋めて修復が完了する。酵素活性を失っているがAP部位への結合能を保持している変異APエンドヌクレアーゼは、競合的にBERを阻害することが知られている。従って、DNAグリコシラーゼとともに、該変異APエンドヌクレアーゼを二本鎖DNAに接触させることにより、宿主細胞内における内在のBER機構によるAP部位の修復が阻害されて、修復エラーの頻度、即ち変異導入効率が向上する。例えば、CDG活性（N222D）に比べてTDG活性（Y164G）が低い変異酵母UNG1の場合、変異APエンドヌクレアーゼとの併用により、チミンへの変異導入効率を向上させることができる。APエンドヌクレアーゼの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のAPエンドヌクレアーゼを用いることができる。例えば、ヒトApe1のアミノ酸配列は、UniprotKB No. P27695として参照することができる。酵素活性を失っているがAP部位への結合能を保持している変異APエンドヌクレアーゼの例としては、活性サイトや補因子であるMg結合サイトが変異したタンパク質が挙げられる。例えば、ヒトApe1の場合、E96Q、Y171A、Y171F、Y171H、D210N、D210A、N212A等が挙げられる。
【００２９】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールにより認識される、二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合し得る限り特に制限されず、二本鎖DNA中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールが特異的に結合するのに十分であればよく、例えば、哺乳動物のゲノムDNA中の特定の部位に変異を導入する場合、そのゲノムサイズに応じて、12ヌクレオチド以上、好ましくは15ヌクレオチド以上、より好ましくは17ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。
【００３０】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを含み、DNA二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、CRISPR-変異Cas、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等が挙げられる。
【００３１】
ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3〜6個連結させたものであり、9〜18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26: 695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記特許文献１を参照することができる。
【００３２】
TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12および13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、上記特許文献２を参照することができる。
【００３３】
PPRモチーフは、35アミノ酸からなり1つの核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの1、4及びii（-2）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、TALエフェクター同様、PPRモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なPPRタンパク質を作製することが可能である。PPRモチーフの作製の詳細については、上記特許文献４を参照することができる。
【００３４】
また、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のDNA結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、且つDNA二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。
【００３５】
上述のように、本発明の核酸改変酵素複合体に用いられるDNAグリコシラーゼは、好ましくはCDG活性又はTDG活性が賦与された変異UDG、より好ましくはUNGであるが、CDG活性又はTDG活性が標的化された部位の至る所で作用しないように、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いものである必要がある（図１中段を参照）。従って、該標的化された部位は、DNAグリコシラーゼとの接触に際して、該DNAグリコシラーゼが効率よく作用できるように、一本鎖DNAの状態にあるか、少なくとも強固な二重らせん構造がほどけた、緩んだDNA構造をとっていることが望ましい。核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合には、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAが、目的の二本鎖DNAの配列を認識して標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッドを形成することにより、該標的化された部位を一本鎖の状態、もしくは二重らせん構造がほどけた（弛緩した二本鎖）状態にするので、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼは、該標的化された部位のシトシンやチミンに選択的に作用して、当該塩基を除去することができる（図１下段を参照）。一方、核酸配列認識モジュールとして、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等を用いる場合には、該モジュール自体に二本鎖DNAの構造を変化させる（二重らせん構造のひずみを生じさせる）機能はないので、二本鎖DNAの構造を変化させる因子（例えば、ジャイレース、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ等）と組み合わせて、目的の二本鎖DNAに、本発明の核酸改変酵素複合体を接触させることが望ましい。
【００３６】
上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記DNAグリコシラーゼとの融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZドメイン、GKドメイン、GBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、DNAグリコシラーゼとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、DNAグリコシラーゼとにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
【００３７】
核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとが結合した複合体（融合タンパク質を含む。）を含んでなる本発明の核酸改変酵素複合体と、二本鎖DNAとの接触は、目的の二本鎖DNA（例、ゲノムDNA）を有する細胞に、該複合体又はそれをコードする核酸を導入することにより実施される。導入及び発現効率を考慮すると、核酸改変酵素複合体自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で細胞に導入し、細胞内で該複合体を発現させることが望ましい。変異APエンドヌクレアーゼやA20タンパク質等を併用する場合にも、それらをコードする核酸の形態で細胞に導入し、該細胞内で発現させることが望ましい。
従って、核酸配列認識モジュールと、DNAグリコシラーゼとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。RNAの場合は、好ましくは一本鎖RNAである。
【００３８】
核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとが、それぞれ2つの断片に分断され、その一方の断片同士が連結された2つの部分的複合体として提供される場合、例えば、核酸配列認識モジュールのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを、それぞれ適当なプライマーを用いてPCR法により調製し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを同様にして調製し、例えばN末側断片をコードするDNA同士、並びにC末側断片をコードするDNA同士を、常法を用いて連結して、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールのN末側断片をコードするDNAとDNAグリコシラーゼのC末側断片をコードするDNAとを連結し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAと核酸配列認識モジュールのC末側断片をコードするDNAとを連結することにより、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することもできる。連結する断片の組み合わせは、2つの部分的複合体が会合した際に、機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なDNAグリコシラーゼとの複合体に再構成される限り、特に制限されない。また、2つの部分的複合体は、別個の分子として発現させるだけでなく、それらをコードする核酸を直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、1つの融合タンパク質として発現させ、分子内会合により機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なDNAグリコシラーゼとの複合体を形成させるものであってもよい。
【００３９】
核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとが結合した本発明の複合体は、DNA二重鎖切断（DSB）を伴わないため、毒性の低いゲノム編集が可能であり、本発明の遺伝子改変方法は幅広い生物材料に適用することができる。従って、核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物、昆虫、植物など高等真核生物の細胞にいたるまで、あらゆる生物種の細胞をも包含し得る。
【００４０】
ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等の核酸配列認識モジュールをコードするDNAは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするDNAは、例えば、それらのcDNA配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（DNA結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするようにオリゴDNAプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。
DNAグリコシラーゼをコードするDNAも、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、酵母のUNG1をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. NM_001182379）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、酵母由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。
得られたcDNAを鋳型にして、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を付与する変異と、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異とを導入することにより、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼをコードする核酸を取得することができる。vvUDG等のように、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼの場合、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を付与する変異のみを導入することができる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー（例、GSリンカー、GGGARリンカー等）、スペーサー（例、FLAG配列等）及び/又は核移行シグナル（NLS）（目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。UNG1及びUNG2はそれぞれN末端にミトコンドリア移行シグナル及び核移行シグナルを有するので、それらをそのまま利用することもできる。あるいは、例えばUNG1を核ゲノムDNAを標的化したヌクレオチド改変に用いる場合、ミトコンドリア移行シグナルを除去して、別途核移行シグナルを連結することができる。
あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールとDNAグリコシラーゼとが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカー及び/又は核移行シグナルを連結することができる。
【００４１】
核酸配列認識モジュールをコードするDNA、DNAグリコシラーゼをコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするDNA配列を参照し、該DNA配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。
【００４２】
核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。
【００４３】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、複製起点などを含有しているものを用いることができる。
【００４４】
核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするRNAは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
【００４５】
核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとの複合体を細胞内で発現させることができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60，160 (1968)〕，エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research，9，309 (1981)〕，エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology，120，517 (1978)〕，エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology，41，459 (1969)〕，エシェリヒア・コリC600〔Genetics，39，440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔Gene，24，255 (1983)〕，バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry，95，87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036，ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
【００４６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞〔以上、In Vivo, 13, 213-217 (1977)〕などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature，315，592 (1985)〕。
【００４７】
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
【００４８】
植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などが用いられる。
【００４９】
上記いずれの宿主細胞も、半数体（一倍体）であってもよいし、倍数体（例、二倍体、三倍体、四倍体など）であってもよい。従来の変異導入手法では、原則として相同染色体の一本にのみしか変異が導入されず、ヘテロな遺伝子型になるため、優性変異でなければ所望の形質は発現せず、ホモ化するには手間と時間がかかり、不都合が多かった。これに対し、本発明によれば、ゲノム内の相同染色体上の対立遺伝子すべてに変異を導入することができるので、劣性変異であっても当代で所望の形質を発現させることができ、従来法の問題点を克服することができる点で極めて有用である。
【００５０】
発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、PEG法、CaCl2共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69，2110 (1972)やGene，17，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168，111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194，182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75，1929 (1978)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6，47-55 (1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology，52，456 (1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。
【００５１】
ベクターを導入した細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15〜約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
バチルス属菌の培養は、通常約30〜約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77，4505 (1980)〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Nature，195，788 (1962)〕に非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約30℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとの複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
【００５２】
核酸配列認識モジュール及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするRNAの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。RNA導入は1回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、2〜5回）繰り返して行うことができる。
【００５３】
細胞内に導入された発現ベクター又はRNA分子から、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとの複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖DNA（例、ゲノムDNA）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結されたDNAグリコシラーゼの作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で脱塩基反応が起こり、二本鎖DNAの一方の鎖に無塩基部位（AP部位）が生じる。すると、細胞内の塩基除去修復（BER）系が作動し、まずAPエンドヌクレアーゼがAP部位を認識してDNA片鎖のリン酸結合を切断し、エキソヌクレアーゼが脱塩基されたヌクレオチドを除去する。次にDNAポリメラーゼが反対鎖DNAを鋳型として新たにヌクレオチドを挿入し、最後にDNAリガーゼが繋ぎ目を修復する。このBERのいずれかの段階で修復ミスが起こることにより、種々の変異が導入される。上述のように、酵素活性を失っているがAP部位への結合能を保持する変異APエンドヌクレアーゼを併用することにより、細胞内のBER機構が阻害され、修復ミスの頻度、従って変異導入効率を向上させることができる。
【００５４】
ジンクフィンガーモチーフは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するジンクフィンガーの作製効率が高くなく、また、結合特異性の高いジンクフィンガーの選別が煩雑なため、実際に機能するジンクフィンガーモチーフを多数作製するのは容易ではない。TALエフェクターやPPRモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに比べて標的核酸配列認識の自由度が高いが、標的ヌクレオチド配列に応じて巨大なタンパク質をその都度設計し、構築する必要があるので、効率面で問題が残る。さらに、これらの核酸配列認識モジュールは、二本鎖DNAの構造を変化させる（二重らせん構造にひずみを生じさせる）機能を有しないので、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼが、標的化された部位において効率よく作用するためには、別個に二本鎖DNAの構造を変化させる因子を、目的の二本鎖DNAと接触させる必要があり、煩雑である。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができ、しかも、標的化された部位において、二本鎖DNAをほどいて一本鎖構造の領域と、それに隣接する緩んだ二本鎖DNA構造をとる領域とを生成するため、二本鎖DNAの構造を変化させる因子を組み合わせることなく、標的化された部位特異的にDNAグリコシラーゼを効率よく作用させることができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）が用いられる。
【００５５】
図２にCRISPR-変異Casを核酸配列認識モジュールとして用いた、本発明の二本鎖DNA改変方法の模式図を示す。
CRISPR-変異Casを用いた本発明の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイドRNAと、変異Casタンパク質のリクルートに必要なtracrRNAとからなるRNA分子と変異Casタンパク質との複合体として提供される。
【００５６】
本発明で使用されるCasタンパク質は、CRISPRシステムに属するものであれば特に制限はないが、好ましくはCas9である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはSpCas9である。本発明で用いられる変異Casとしては、Casタンパク質の二本鎖DNAの両方の鎖の切断能が失活したものと、一方の鎖の切断能のみを失活したニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠くD10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、ガイドRNAと相補鎖の切断能を欠くH840A変異体、さらにはその二重変異体を用いることができるが、他の変異Casも同様に用いることができる。
DNAグリコシラーゼは、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Casとの複合体として提供される。あるいは、DNAグリコシラーゼと変異Casとを、RNA aptamerであるMS2F6、PP7等とそれらとの結合タンパク質によるRNA scaffoldを利用して結合させることも出来る。ガイドRNAが標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、これに続くtracrRNAに変異CasがリクルートされてDNA切断部位認識配列PAM（プロトスペーサー アジェイセント モチーフ）（SpCas9を用いた場合、PAMはNGG（Nは任意の塩基）3塩基であり、理論上ゲノム上のどこでも標的化することができる）を認識するが、一方あるいは両方のDNAを切断することができず、変異Casに連結されたDNAグリコシラーゼの作用により、標的された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）で脱塩基が起こり、二本鎖DNA内にAP部位が生じる。これを修復しようとする細胞のBER系のエラーにより、種々の変異が導入される（例えば、図５参照）。
【００５７】
CRISPR-変異Casを核酸配列認識モジュールとして用いる場合でも、ジンクフィンガー等を核酸配列認識モジュールとして用いる場合と同様に、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとは、それらをコードする核酸の形態で、目的の二本鎖DNAを有する細胞に導入することが望ましい。
CasをコードするDNAは、DNAグリコシラーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Casは、クローン化されたCasをコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、Cas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいは変異CasをコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAやDNAグリコシラーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。例えば、SpCas9を真核細胞で発現のために最適化したCDS配列及びアミノ酸配列を配列番号３及び４に示す。配列番号３に示された配列中塩基番号29の「A」を「C」に変換すれば、D10A変異体をコードするDNAを得ることができ、塩基番号2518-2519の「CA」を「GC」に変換すればH840A変異体をコードするDNAを得ることができる。
変異CasをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAとは、融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。あるいは、変異CasをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAとを、それぞれ適当な箇所で2つの断片に分断し、それらの一方の断片同士を直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、核酸改変酵素複合体を2つの部分的複合体として発現させ、それらが細胞内で会合し、リフォールディングすることによって、特定の核酸配列認識能を有する機能的な変異Casを再構成させ、該変異Casが標的ヌクレオチド配列と結合した場合に、脱塩基反応触媒活性を有する機能的なDNAグリコシラーゼが再構成されるように設計してもよい。例えば、変異CasのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを、それぞれ適当なプライマーを用いてPCR法により調製し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを同様にして調製し、例えばN末側断片をコードするDNA同士、並びにC末側断片をコードするDNA同士を、常法を用いて連結して、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することができる。あるいは、変異CasのN末側断片をコードするDNAとDNAグリコシラーゼのC末側断片をコードするDNAとを連結し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAと変異CasのC末側断片をコードするDNAとを連結することにより、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することもできる。各部分的複合体は融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。また、2つの部分的複合体を1つの融合タンパク質として発現するように連結してもよい。。変異Casの分断箇所は、分断された2つの断片が標的ヌクレオチド配列を認識して結合するように再構成され得る限り特に制限はなく、1か所で分断されてN末側断片とC末側断片としてもよいし、2か所以上で分断して生じる3以上の断片を適宜連結して2つの断片とすることもできる。種々のCas9タンパク質の3次元構造は公知であり、当業者であれば、当該情報に基づいて適宜分断箇所を選択することができる。例えば、SpCas9の場合、N末から94番目から718番目のアミノ酸からなる領域が標的ヌクレオチド配列とガイドRNAの認識に関わるドメイン（REC）であり、1099番目からC末端のアミノ酸からなる領域がPAMとの相互作用に関わるドメイン（PI）であるので、RECドメイン内もしくはPIドメイン内の任意の部位、好ましくは構造を持たない領域内（例、N末から204番目と205番目のアミノ段の間（204..205）、N末から535番目と536番目のアミノ酸の間（535..536）など）で、N末側断片とC末側断片とに分断することができる（例えば、Nat Biotechnol. 33(2): 139-142 (2015)参照）。
【００５８】
得られた変異Cas及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAは、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。
一方、ガイドRNA及びtracrRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列（例えば、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt; 配列番号５）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。ガイドRNA及びtracrRNAをコードするDNAも、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、T6配列）を用いることが好ましい。
【００５９】
変異Cas及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするRNAは、例えば、上記した変異Cas及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
ガイドRNA-tracrRNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列とを連結したオリゴRNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
【００６０】
変異Cas及び/又はDNAグリコシラーゼをコードするDNAあるいはRNA、ガイドRNA-tracrRNA又はそれをコードするDNAは、宿主に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。
【００６１】
従来型の人工ヌクレアーゼでは、DNA二重鎖切断（DSB）を伴うため、ゲノム内の配列を標的とすると染色体の無秩序な切断（off-target切断）によると思われる増殖阻害と細胞死とが引き起こされる。この影響は多くの微生物・原核生物において特に致命的であり、応用性を阻んでいる。本発明では、変異導入をDNA切断ではなくDNA上の脱塩基反応によって行うため、毒性の大幅な軽減が実現できる。
尚、本発明の二本鎖DNAの改変では、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）以外で、該二本鎖DNAの切断が生じることを妨げない。しかしながら、本発明の最大の利点の1つが、off-target切断による毒性を回避することであり、原則的にいかなる生物種においても適用可能であることを考慮すれば、好ましい一実施態様においては、本発明の二本鎖DNAの改変は、選択された二本鎖DNAの標的化された部位のみならず、それ以外の部位でのDNA鎖切断も伴わない。
【００６２】
後述の実施例に示すとおり、近接する複数の標的ヌクレオチド配列に対して配列認識モジュールを作製し、同時に用いることにより、単独のヌクレオチド配列を標的とするよりも、変異導入効率を上昇させ得る。その効果は、両標的ヌクレオチド配列の一部が重複するような場合から、両者が600bp程度離れている場合でも同様に変異誘導が実現する。また、標的ヌクレオチド配列が同じ方向（同一鎖上に標的ヌクレオチド配列が存在する）である場合と、対向する（二本鎖DNAのそれぞれの鎖上に標的ヌクレオチド配列が存在する）場合のどちらでも起こり得る。
【００６３】
本発明のゲノム配列の改変方法は、適当な標的ヌクレオチド配列を選択すれば、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させたほぼすべての細胞で変異を導入することができる。そのため、従来のゲノム編集では必須であった選択マーカー遺伝子の挿入と選抜が不要である。これは遺伝子操作を劇的に簡便にすると同時に、外来DNAの組換え生物ではなくなるので、作物育種などの応用性が大きく広がる。
また、変異導入効率が極めて高く、かつマーカーによる選抜を必要としないことから、本発明のゲノム配列の改変方法においては、全く異なる位置の複数のDNA領域を標的として改変することが可能である。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列（１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよい。これらの目的遺伝子は同一染色体上にあってもよいし、別個の染色体上に位置していてもよい。）とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、DNAグリコシラーゼとが、核酸改変酵素複合体を形成する。ここでDNAグリコシラーゼは共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合、Casタンパク質とDNAグリコシラーゼとの複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ガイドRNA-tracrRNAとして、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する2以上のガイドRNAの各々と、tracrRNAとのキメラRNAを２種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやTALエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、DNAグリコシラーゼを融合させることができる。
【００６４】
本発明の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように該核酸改変酵素複合体をコードするDNAを含む発現ベクターや、該核酸改変酵素複合体をコードするRNAを宿主細胞に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上の核酸改変酵素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、宿主細胞内で自律複製可能な発現ベクター（プラスミド等）を導入することが確実であるが、該プラスミド等は外来DNAであるため、首尾よく変異導入が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。また、変異APエンドヌクレアーゼを併用する場合、該変異酵素は宿主細胞内のBER機構を阻害するので、標的領域以外での望ましくない自然突然変異を誘発するおそれがあるので、該変異酵素をコードするDNAを含むプラスミドも、所望の変異導入後、速やかに除去されるのが好ましい。従って、宿主細胞の種類等によって変動するが、例えば、発現ベクター導入から６時間〜２日間経過後に、当該技術分野で周知の種々のプラスミド除去法を用いて、宿主細胞から導入したプラスミドを除去することが望ましい。
あるいは、変異導入に十分な核酸改変酵素複合体の発現が得られる限り、宿主細胞内での自律複製能を有しない発現ベクター（例えば、宿主細胞で機能する複製起点及び/又は複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を欠くベクター等）や、RNAを用いて、一過的発現により目的の二本鎖DNAに変異を導入することもまた好ましい。
【００６５】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
後述の実施例では、以下のようにして実験を行った。
＜細胞株・培養・形質転換・発現誘導＞
出芽酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741株（ロイシン及びウラシル要求性）を用い、標準的なYPDA培地ないしSD培地の栄養要求性に合わせたDropout組成で培養した。培養は25℃から30℃の間で、寒天プレートでの静置培養または液体培地での振とう培養を行った。形質転換は酢酸リチウム法を用い、適切な栄養要求性に合わせたSD培地で選抜を行った。ガラクトースによる発現誘導には、適切なSD培地で一晩予備培養した後、炭素源を2%グルコースから2%ラフィノースに代えたSR培地に植え継いで一晩培養、さらに炭素源を0.2%ガラクトースに代えたSGal培地に植え継いで3時間から二晩程度培養して発現誘導を行った。
生存細胞数およびCan1変異率の測定には、細胞懸濁液をSDプレート培地およびSD-Arg+60mg/l Canavanineプレート培地あるいはSD+300mg/l Canavanineプレート培地に適宜希釈して塗布し、3日後に出現するコロニー数を生存細胞数としてカウントした。SDプレートでの生存コロニー数を全細胞数とし、Canavanineプレートでの生存コロニー数を耐性変異株数として、変異率を算出・評価した。変異導入箇所はコロニーPCR法によって各株のターゲット遺伝子領域を含むDNA断片を増幅した後DNAシーケンスを行い、Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/)の配列をベースにアラインメント解析を行って同定した。【００６７】
＜核酸操作＞
DNAは、PCR法、制限酵素処理、ライゲーション、Gibson Assembly法、人工化学合成のいずれかによって、加工・構築した。プラスミドは酵母・大腸菌シャトルベクターとしてロイシン選抜用のpRS315、およびウラシル選抜用のpRS426をバックボーンとして用いた。プラスミドは大腸菌株XL-10 goldないしDH5αで増幅し、酢酸リチウム法で酵母に導入した。【００６８】
＜コンストラクト＞
誘導発現には、ガラクトース誘導型で双方向性プロモーターである出芽酵母pGal1/10（配列番号６）を用いた。プロモーター下流にStreptococcus pyogenes由来のCas9遺伝子ORFを真核発現用にコドンを最適化されたもの（配列番号３）に核移行シグナル（ccc aag aag aag agg aag gtg; 配列番号７（PKKKRV; 配列番号８をコードする））を付加したものを繋ぎ、リンカー配列を介して野生型又は種々の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼ遺伝子（酵母Saccharomyces cerevisiae由来UNG1）のORF（野生型遺伝子のORFを配列番号１に示す。Y164A変異は、塩基番号490〜491のtaがgcに置換されたもの（ta490gc）；Y164G変異は、塩基番号490〜491のtaがggに置換されたもの(ta490gg)；N222D変異は、塩基番号664のaがgに置換されたもの（a664g）；L304A変異は、塩基番号910〜911のttがgcに置換されたもの（tt910gc）；R308E変異は、塩基番号922〜923のagがgaに置換されたもの（ag922ga）；R308C変異は、塩基番号922〜924のagaがtgtに置換されたもの（aga922tgt）である。）からミトコンドリア移行シグナルをコードする領域（塩基番号1〜60）を除いた配列を繋いで融合タンパク質として発現させた。比較のために、UNG1遺伝子の代わりにデアミナーゼ遺伝子（ヤツメウナギPetromyzon marinus由来PmCDA1）を繋いで融合タンパク質として発現させた。リンカー配列としては2xGSリンカー（ggt gga gga ggt tct； 配列番号９（GGGGS; 配列番号１０をコードする）の2回繰り返し）を用いた。ターミネーターとして出芽酵母由来のADH1ターミネーター（配列番号１１）およびTop2ターミネーター（配列番号１２）を繋いだ。またドメイン結合方式においては、Cas9遺伝子ORFを2xGSリンカーを介してSH3ドメイン（配列番号１３及び１４）に繋いだものを一つのタンパク質とし、変異酵母UNG1にSH3 ligand配列（配列番号１５及び１６）を付加したものを別のタンパク質としてGal1/10プロモーターの両方向に繋いで同時に発現させた。これらはpRS315プラスミドに組み込んだ。
Cas9において、第10番目のアスパラギン酸をアラニンに変換する変異（D10A、対応DNA配列変異a29c）および840番目のヒスチジンをアラニンに変換する変異(H840A、対応DNA配列変異ca2518gc)をそれぞれ片側のDNA鎖の切断能を除去するために導入した。
gRNAはtracrRNA（Streptococcus pyogenes由来; 配列番号５）とのキメラ構造としてSNR52プロモーター（配列番号１７）とSup4ターミネーター（配列番号１８）の間に配置し、pRS426プラスミドに組み込んだ。gRNA標的塩基配列は、CAN1遺伝子ORFの793-812 (aacccaggtgcctggggtcc; 配列番号１９) 及び767-786の相補鎖配列 (ataacggaatccaactgggc; 配列番号２０)を用いた。複数のターゲットを同時に発現させる場合にはプロモーターからターミネーターまでの配列を1セットとして複数を同一のプラスミドに組み込んだ。細胞にCas9-UNG1発現用プラスミドと共に導入し、細胞内にて発現させ、gRNA-tracrRNAとCas9-UNG1との複合体を形成させた。【００６９】
実施例１  変異ウラシル-DNAグリコシラーゼにCRISPR-CasのDNA配列認識能を連結することによるゲノム配列の改変（１）
変異ウラシル-DNAグリコシラーゼとCRISPR-Casの核酸配列認識能とを利用した本発明のゲノム配列の改変技術の効果を試験すべく、遺伝子欠損によりカナバニン耐性を生じるカナバニントランスポーターをコードするCAN1遺伝子への変異導入を試みた。gRNAとしてCAN1遺伝子ORFの793-812に相補的な配列及び767-786の相補鎖配列に相補的な配列を用い、これらにStreptococcus pyogenes由来tracrRNAを連結したキメラRNAの発現ベクターと、Streptococcus pyogenes由来Cas9（SpCas9）に変異(D10AおよびH840A)を導入してヌクレアーゼ活性を喪失させたdCas9に野生型及び種々の変異（N222D単独変異及びN222DとL304A、R308E又はR308C変異との二重変異）を導入した酵母由来UNG1を融合させたタンパク質を発現するベクターとを構築し、酢酸リチウム法で出芽酵母内に導入し、共発現させた。結果を図３に示す。カナバニン含有SDプレート上で培養すると、gRNA-tracrRNAとdCas9-変異UNG1（CDG活性を付与するN222D変異とひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるL304A、R308E又はR308C変異との二重変異体）とを導入発現させた細胞のみカナバニン耐性コロニーを形成した。N222D単独変異では細胞毒性が強く、細胞培養及び評価が困難であったため、結果は示していない。以上より、DNAグリコシラーゼのひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させることにより、標的特異的な変異導入が可能となることが示された。【００７０】
実施例２  変異ウラシル-DNAグリコシラーゼにCRISPR-CasのDNA配列認識能を連結することによるゲノム配列の改変（２）
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるR308C変異と、CDG活性を付与するN222D変異又はTDG活性を付与するY164AもしくはY164G変異との二重変異を導入した酵母UNG1を用いて、実施例１と同様の方法で、CAN1遺伝子への変異導入を試みた。結果を図４に示す。R308C N222Dは、デアミナーゼPmCDA1に匹敵する変異導入効率を達成でき、選抜無しでも変異株を所得できることが示された。R308C Y164Aでもカナバニン耐性コロニーが得られたことから、チミン塩基の編集が可能であることが示された。Y164G変異により変異導入効率が改善した。
次に、カナバニン耐性となった各クローンについてCan1遺伝子領域のシーケンス解析を行った。結果を図５に示す。２つの近接する標的部位（767-786、793-812）を中心として、ややランダムに変異が入っていた。これはデアミナーゼによるピンポイント変異導入（国際公開第2015-133554号）とは異なり、本発明のゲノム編集技術が、標的ヌクレオチド配列及びその周辺にランダムに変異を導入する用途に適していることを示唆している。想定通り、N222Dでは主にCないしGからの点変異であり、Y164A及びY164Gでは主にTないしAからの点変異であった。【００７１】
実施例３  異なる結合様式の使用
Cas9とDNAグリコシラーゼを融合タンパク質としてではなく、結合ドメインとそのリガンドを介して核酸改変酵素複合体形成させることによっても、標的化した遺伝子への変異導入が可能かどうかを調べた。Cas9としては実施例１で用いたdCas9を、DNAグリコシラーゼとして酵母UNG1変異体（N222DもしくはY164A変異と、R308EもしくはR308C変異との二重変異体）を用い、前者にSH3ドメイン、後者にその結合リガンドを融合して、図６に示すコンストラクトを作製した。また、実施例１と同様、CAN1遺伝子内配列をgRNAターゲットとして用い、これらのコンストラクトを出芽酵母に導入した。その結果、結合ドメインを介してdCas9とDNAグリコシラーゼを結合させた場合でも、CAN1遺伝子の標的化された部位に効率よく変異が導入された（図６）。【００７２】
実施例４  変異APエンドヌクレアーゼの共発現による変異導入効率の向上
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるR308C変異と、CDG活性を付与するN222D変異又はTDG活性を付与するY164G変異との二重変異を導入した酵母UNG1と、酵素活性を失っているがAP部位への結合を保持している変異ヒトAPE1（E96Q, D210N）とを用いて、実施例１と同様の方法で、CAN1遺伝子への変異導入を試みた。結果を図７に示す。変異APE1を共発現させると、単独では効率の低かったY164G, R308Cでもカナバニン耐性コロニー数が増加し、チミンを標的とする変異導入の効率が顕著に向上した。【００７３】
実施例５  ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異導入による細胞毒性の低減
UNG1におけるひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異（L304A）の有無が宿主酵母の生存率に及ぼす影響を調べた。結果を図８に示す。CDG活性（N222D）又はTDG活性（Y164A）を付与する変異のみを有する変異UNG1を導入された宿主酵母では、野生型UNG1を導入された酵母に比べて生存率が著しく低下した。これは、野生型UNG1はDNA中に稀に出現する異常塩基であるウラシルを除去するのに対し、CDG活性もしくはTDG活性を有する変異UNG1は、ゲノムDNA上の至る所でシトシンもしくはチミンを除去し、細胞の生存に望ましくない変異を生じるためであると推察される。一方、L304変異を導入してひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させると、宿主酵母の生存率は顕著に回復し、細胞毒性を回避することができた。【００７４】
実施例６  異種生物由来のウラシル-DNAグリコシラーゼの利用
酵母由来の変異UNG1に代えて、異種生物由来の変異UNG1を用いても、宿主酵母における標的化された変異導入が可能であるか否かを調べた。2種の大腸菌由来変異ung（EcUDG）（N123D/L191A二重変異体、Y66G/L191A二重変異体）と4種のワクシニアウイルス由来変異UDG（vvUDG）（N120D/R187C二重変異体、Y70G/R187C二重変異体、N120D変異体、Y70G変異体）を用いた。結果を図９に示す。EcUDG、vvUDGとも酵母で機能的であったが、変異導入効率は酵母UNG1に比べて低く、同種由来のDNAグリコシラーゼの使用が有利であることが示された。驚くべきことに、vvUDGでは、酵母UNG1のR308C変異に対応するR187C変異の有無に拘わらず、細胞毒性が生じないことが明らかとなった。シーケンス解析の結果、vvUDGによる変異は、R187C変異の有無に拘わらず、標的ヌクレオチド配列内の特定塩基に集中していたことから（図１０参照）、vvUDGは生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼであることが示唆された。vvUDGによる変異導入効率は、ウイルスDNAポリメラーゼにおいて、vvUDGと相互作用してプロセッシビティ因子として働くA20を共発現させることにより顕著に上昇した（図９）。【００７５】
実施例７  スプリット酵素の利用による非特異的変異の低減
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異、vvUDGのような生来的に二重らせん構造のDNAへの反応性が低いDNAグリコシラーゼの利用に加え、DNAグリコシラーゼによる非特異的変異を低減させる別の手段として、スプリット酵素技術の利用を試みた。図１１に示される種々のスプリット酵素をコードするDNAを含むプラスミドを、ガイドRNA-tracrRNAをコードするDNAを含むプラスミドとともに、実施例１と同様の方法で宿主酵母に導入し、非選択培地上での細胞数、カナバニン耐性（標的化された部位における変異）コロニー数、チアリジン耐性（非特的変異）コロニー数を調べた。いずれのスプリット酵素を用いた場合でも、非選択培地上での宿主酵母の生存率が、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異（R308C）を導入した変異UNG1を導入した場合と同等であったことから、スプリット酵素の利用により、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異を導入せずとも細胞毒性を十分に低減させ得ることが示され、非特異的変異を抑制できることが示唆された（図１１）。実際に、チアリジン耐性を指標とした非特異的変異の頻度は、スプリット酵素の利用により低減されていた（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、外来DNAの挿入もDNA二重鎖切断も伴わずに、安全に任意の生物種に部位特異的変異を導入することが可能となる。また、変異導入の範囲を標的ヌクレオチド配列とその周辺の数百塩基に至る範囲まで幅広く設定することが可能であり、これまでではほとんど不可能であった特定の限定的な領域へのランダム変異導入による局所的な進化誘導にも応用でき、極めて有用である。さらに、UNGにCDG活性を付与する変異とTDG活性を付与する変異とを導入すると、5-メチルシチジンを基質として脱塩基することが可能となるので、本発明によれば、領域特異的にメチル化状態を解除して遺伝子発現パターンを変化させるなど、エピゲノム情報を書き換えることができる。従って、人工的な細胞分化やがん細胞抑制、またゲノム配列を書き換えずに遺伝子機能を改変することなどが可能となる。【００７７】
本出願は、2014年11月4日付で日本国に出願された特願2014-224745を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。
【図５】
2016072399.tif 000003
【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月26日(2016.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、
該DNAグリコシラーゼが、シトシン-DNAグリコシラーゼ（CDG）活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）活性を有するUNGの変異体である、方法。
【請求項２】
前記CDG活性が、
(a) 配列番号２で示される酵母由来のUNG1（野生型UNG1）において、N末端から222番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGにおいて、(a)に対応する変異を導入すること、
により付与され、前記TDG活性が、
(c) 配列番号２で示される酵母由来のUNG1において、N末端から164番目のチロシンをアラニン若しくはグリシンに置換すること、又は
(d) 酵母由来のUNG1以外のUNGにおいて、(c)に対応する変異を導入すること
により付与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
DNA二本鎖構造を変化させる因子を、さらに該二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
さらに、無塩基部位への結合能を有するが、ヌクレアーゼ活性を欠損するAPエンドヌクレアーゼを、二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記DNAグリコシラーゼが、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低い、ポックスウイルス科に属するウイルス由来のUDGの変異体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポックスウイルス科に属するウイルスがワクシニアウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
さらに、A20タンパク質を二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記DNAグリコシラーゼが、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が減弱された変異体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体であって、野生型UNG1のN末端から304番目のアミノ酸に対応するロイシンがアラニンに、又はN末端から308番目のアミノ酸に対応するアルギニンがグルタミン酸若しくはシステインに置換されている変異体、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体であって、(a)に対応する変異を有する変異体
である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記DNAグリコシラーゼと、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する前記核酸配列認識モジュールの要素とが、それぞれ2つの断片に分断され、一方の断片同士と他方の断片同士とがそれぞれ結合して2つの部分的複合体を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングした場合に、該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、かつ該特異的な結合により該DNAグリコシラーゼが酵素活性を発揮し得るようになることを特徴とし、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する核酸配列認識モジュールの要素が、少なくとも１つのDNA切断能が失活したCasタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記2つの部分的複合体が、別個の分子複合体として提供され、細胞内で両者が会合することによりリフォールディングされる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体において、野生型UNG1のN末端から258番目と259番目のアミノ酸に対応するアミノ酸の間、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体において、(a)に対応するアミノ酸の間
で２つに分断されていることを特徴とする、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が原核生物細胞又は真核生物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が微生物細胞、植物細胞又は昆虫細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が動物細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記動物細胞が脊椎動物細胞である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA（unrelaxed DNA）への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体であって、該DNAグリコシラーゼが、シトシン-DNAグリコシラーゼ（CDG）活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ（TDG）活性を有するUNGの変異体であり、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
【請求項２５】
前記DNAグリコシラーゼが、ワクシニアウイルス由来のUDGの変異体であって、野生型UDGのN末端から120番目のアミノ酸に対応するアスパラギンがアスパラギン酸に、及び／又は70番目のアミノ酸に対応するチロシンがアラニン若しくはグリシンに置換されている変異体である、請求項２４記載の核酸改変酵素複合体。
【請求項２６】
前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体であって、配列番号２で示される野生型UNG1のN末端から222番目のアミノ酸に対応するアスパラギンがアスパラギン酸に、及び／又は164番目のアミノ酸に対応するチロシンがアラニン若しくはグリシンに置換されており、かつ304番目のアミノ酸に対応するロイシンがアラニンに、又は308番目のアミノ酸に対応するアルギニンがグルタミン酸若しくはシステインに置換されている変異体、あるいは
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体であって、(a)に対応する変異を有する変異体
である、請求項２４記載の核酸改変酵素複合体。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【国際調査報告】
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