(57)【要約】  本発明者は、従来は前立腺がんや子宮頸がんやの関連が報告されているデオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)遺伝子が、驚くべきことに動脈硬化及び消化器系がんと非常に良く連関し、所望する動脈硬化及び消化器系がんのマーカーとして用いることが可能であることを見出し、本発明を完成した。具体的には、本発明は、被験試料、好ましくは血液検体、におけるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現を当該被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の動脈硬化及び消化器系がんを検出する、動脈硬化及び消化器系がんの検出方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ(deoxyhypusine synthase)遺伝子の発現を当該被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として動脈硬化を検出する、動脈硬化の検出方法。
【請求項２】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことを特徴とする、請求項１に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項３】
標的ポリペプチドであるデオキシハイプシン・シンターゼの検出を、当該標的ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項２に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項４】
抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項５】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体を検出することにより行うことを特徴とする、請求項１に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項６】
デオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体を検出することを特徴とする、請求項５に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項７】
固定化物に含まれるデオキシハイプシン・シンターゼの一部のポリペプチドのアミノ酸数が、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることを特徴とする、請求項６に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項８】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことを特徴とする、請求項１に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項９】
標的核酸の検出は、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行われることを特徴とする、請求項８記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１０】
デオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を、遺伝子増幅法により増幅させてなる遺伝子増幅産物を、標的核酸として検出する、請求項８又は９に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１１】
被験試料は血液検体であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の動脈硬化の検出方法を行うための、動脈硬化検出用キット。
【請求項１３】
以下のステップ（ａ）〜（ｄ）を含む、固定化プレートの使用方法。
（ａ）人工的に調製したデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を固定化したプレートを、血液検体と接触させて、当該血液検体中のデオキシハイプシン・シンターゼに対する自己抗体と当該プレート上のデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部が結合した抗原抗体結合体の形成を、プレート上において行うステップ；
（ｂ）標識が人工的に付加された抗体結合性の二次抗体を、プレート上の上記抗原抗体結合体の自己抗体に結合させるステップ；
（ｃ）自己抗体に結合した上記二次抗体の標識をプレート上において顕在化させて、当該顕在化シグナルを検出するためにプレートを使用するステップ；
（ｄ）プレートより得られた当該顕在化シグナルの検出値をデオキシハイプシン・シンターゼに対する自己抗体の定量値としてカウントして、統計的に得られた動脈硬化に対する閾値よりも大きい場合の当該定量値を、上記血液検体における動脈硬化の指標とするステップ。
【請求項１４】
プレートに固定化されたデオキシハイプシン・シンターゼの一部のポリペプチドのアミノ酸数が、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の固定化プレートの使用方法。
【請求項１５】
被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ(deoxyhypusine synthase)遺伝子の発現を被験試料において確認を行い、当該遺伝子発現の亢進を指標として消化器系がんを検出する、がんの検出方法。
【請求項１６】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことを特徴とする、請求項１５に記載のがんの検出方法。
【請求項１７】
標的ポリペプチドであるデオキシハイプシン・シンターゼの検出を、当該標的ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項１６に記載のがんの検出方法。
【請求項１８】
抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載のがんの検出方法。
【請求項１９】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体を検出することにより行うことを特徴とする、請求項１５に記載のがんの検出方法。
【請求項２０】
デオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼに対する抗体を検出することを特徴とする、請求項１９に記載のがんの検出方法。
【請求項２１】
固定化物に含まれるデオキシハイプシン・シンターゼの一部のポリペプチドのアミノ酸数が、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることを特徴とする、請求項２０に記載のがんの検出方法。
【請求項２２】
前記検出方法において、標的遺伝子であるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことを特徴とする、請求項１５に記載のがんの検出方法。
【請求項２３】
標的核酸の検出は、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行われることを特徴とする、請求項２２記載のがんの検出方法。
【請求項２４】
デオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を、遺伝子増幅法により増幅させてなる遺伝子増幅産物を、標的核酸として検出する、請求項２２又は２３に記載のがんの検出方法。
【請求項２５】
被験試料は血液検体であることを特徴とする、請求項１５〜２４のいずれかに記載のがんの検出方法。
【請求項２６】
消化器系がんは食道がん又は大腸がんであることを特徴とする、請求項１５〜２５のいずれかに記載のがんの検出方法。
【請求項２７】
請求項１５〜２６のいずれかに記載のがんの検出方法を行うための、がん検出用キット。
【請求項２８】
以下のステップ（ａ）〜（ｄ）を含む、固定化プレートの使用方法。
（ａ）人工的に調製したデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部を固定化したプレートを、血液検体と接触させて、当該血液検体中のデオキシハイプシン・シンターゼに対する自己抗体と当該プレート上のデオキシハイプシン・シンターゼの全部又は一部が結合した抗原抗体結合体の形成を、プレート上において行うステップ；
（ｂ）標識が人工的に付加された抗体結合性の二次抗体を、プレート上の上記抗原抗体結合体の自己抗体に結合させるステップ；
（ｃ）自己抗体に結合した上記二次抗体の標識をプレート上において顕在化させて、当該顕在化シグナルを検出するためにプレートを使用するステップ；
（ｄ）プレートより得られた当該顕在化シグナルの検出値をデオキシハイプシン・シンターゼに対する自己抗体の定量値としてカウントして、統計的に得られた消化器系がんに対する閾値よりも大きい場合の当該定量値を、上記血液検体における消化器系がんの指標とするステップ。
【請求項２９】
プレートに固定化されたデオキシハイプシン・シンターゼの一部のポリペプチドのアミノ酸数が、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることを特徴とする、請求項２８に記載の固定化プレートの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［Ａ］  動脈硬化マーカーについて
本発明は、疾病の検出方法に関する発明であり、より具体的には、デオキシハイプシン・シンターゼ遺伝子を指標として用いる動脈硬化及びがんの検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、脳卒中や心筋梗塞等の循環器系疾患の基礎的な要因となるものであることは今や明らかなことであり、加齢に伴い、自ずとリスクが増大するものであるが、遺伝的な素因や生活習慣の乱れ等によっても発生リスクは変動し、増大する。【０００３】
動脈硬化を基礎にして起こる循環器系疾患は、患者本人やその家族にとって負担が重いものであるが、社会的にも医療費の増大につながり、その発生の予防や、適切な治療の手段の確立は、依然として重要な課題である。【０００４】
特に遺伝的な素因の特定は、これを特定することにより、早めの生活指導や、動脈硬化の予防薬や治療薬の投薬等の予防的な措置を適切に行うことを可能とするために、近年は益々重要視されつつある。【０００５】
［Ｂ］  がんマーカーについて
がんは、加齢に伴い、自ずとリスクが増大するものであるが、遺伝的な素因や生活習慣の乱れ等によっても発生リスクは変動し、増大する。【０００６】
高齢化社会に伴うがん患者の増加は、患者本人や家族にとって負担が重いものであるが、社会的にも医療費の増大につながり、その発生の予防や、適切な治療の手段の確立は、依然として重要な課題である。【０００７】
特に遺伝的な素因の特定は、これを特定することにより、早めの生活指導等の予防的な措置を適切に行うことを可能とするために、近年は益々重要視されつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１４２７７号公報
【特許文献２】特表２００６−５０７８１６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cracchiolo BM, Heller DS, Clement PM, Wolff EC, Park MH,Hanauske-Abel HM,“Eukaryotic initiation factor 5A-1(eIF5A-1) as a diagnostic marker for aberrant proliferation in intraepithelial neoplasia of the vulva.”Gynecol Oncol. 2004 94:217-22
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
［Ａ］  動脈硬化マーカーについて
動脈硬化の遺伝的素因は多種多様であり、動脈硬化を予見する上で必要十分な検出力を伴う、いわば「万能マーカー」としての特定の遺伝子マーカーの想定は困難である。【００１１】
そこで漏れの無い動脈硬化の遺伝子検査を実現するために、優れた判別力を伴う遺伝子マーカーをさらに見いだす必要がある。【００１２】
［Ｂ］  がんマーカーについて
食道がん、大腸がん等の消化器系のがんの一部は、他の種類のがんと比べて罹患率が依然として高いものであり、漏れの無い消化器系がんの遺伝子検査を実現するために、優れた判別力を伴う遺伝子マーカーをさらに見いだす必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［Ａ］  動脈硬化マーカーについて
今般本発明者は、従来は前立腺がんや子宮頸がんとの関係が報告されている遺伝子「デオキシハイプシン・シンターゼ(deoxyhypusine synthase)遺伝子」が、驚くべきことに動脈硬化と非常に良く連関し、所望する動脈硬化のマーカーとして用いることが可能であることを見出した。【００１４】
すなわち、本発明は、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ(以下、ＤＨＰＳともいう)遺伝子の発現を当該被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の動脈硬化を検出する、動脈硬化の検出方法（以下、本発明の動脈硬化検出方法ともいう）を提供する発明である。本発明の動脈硬化検出方法において用いる被験試料は血液検体であることが好適である。本発明の動脈硬化検出方法は、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現のデータ取得を行い、当該遺伝子発現の亢進が認められる場合に、動脈硬化の存在データとすることを特徴とするデータ取得方法、ということもできる。【００１５】
本発明の動脈硬化検出方法は、下記の３種類の態様（動脈硬化検出方法１〜３）に大別される。そして、これらの方法をキットを用いて行うことも可能である。【００１６】
（１）本発明の動脈硬化検出方法１
本発明の動脈硬化検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするＤＨＰＳ蛋白質の全部又は一部を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことができる。特に、当該ＤＨＰＳ蛋白質の全部又は一部の検出を、これと特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて行うことが好適である。【００１７】
（２）本発明の動脈硬化検出方法２
本発明の動脈硬化検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）を検出することにより行うことができる。当該自己抗体の検出は、例えば、ＤＨＰＳの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより行うことができる。前記の固定化物に含まれるＤＨＰＳの一部のポリペプチドのアミノ酸数は、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上、すなわち１８４アミノ酸以上とすることが可能であり、好適には１８６アミノ酸以上、さらに好適には１８７アミノ酸以上である。ポリペプチドの抗原性が確保されていることが前提であるが、ポリペプチド長が短い方がペプチド自体の安定性に優れ、かつ、固定化物の単位量当たりの固定化ペプチド数が大きくなり感度が向上する傾向がある。【００１８】
（３）本発明の動脈硬化検出方法３
本発明の動脈硬化検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことができる。当該標的核酸の検出は、例えば、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行うことができる。この場合、ＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により増幅させてなる遺伝子増幅産物を、標的核酸として検出することができる。【００１９】
（４）動脈硬化検出用キット
さらに本発明の動脈硬化検出方法は、これを実施する要素を備える動脈硬化検出用キットにより行うことが可能である。【００２０】
（５）固定化プレート
本発明は、さらに、以下のステップ（ａ）〜（ｄ）を含む、固定化プレートの使用方法を提供する。当該固定化プレートは、動脈硬化検出方法２を行う際に「ＤＨＰＳの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物」として用いられるものである。
（ａ）人工的に調製したＤＨＰＳの全部又は一部を固定化したプレートを、血液検体と接触させて、当該血液検体中のＤＨＰＳに対する自己抗体と当該プレート上のＤＨＰＳの全部又は一部が結合した抗原抗体結合体の形成を、プレート上において行うステップ；
（ｂ）標識が人工的に付加された抗体結合性の二次抗体を、プレート上の上記抗原抗体結合体の自己抗体に結合させるステップ；
（ｃ）自己抗体に結合した上記二次抗体の標識をプレート上において顕在化させて、当該顕在化シグナルを検出するためにプレートを使用するステップ；
（ｄ）プレートより得られた当該顕在化シグナルの検出値をＤＨＰＳに対する自己抗体の定量値としてカウントして、統計的に得られた動脈硬化に対する閾値よりも大きい場合の当該定量値を、上記血液検体における動脈硬化の指標とするステップ。【００２１】
上記プレートに固定化されたＤＨＰＳの一部のポリペプチドのアミノ酸数は、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることが好適であることは、上記の動脈硬化検出方法２における記載と同様である。【００２２】
ＤＨＰＳの全部又は一部を固定化するプレート（基板）としては、ガラススライド、多孔質ゲル、マイクロタイタープレート等が挙げられる。基板へのＤＨＰＳの全部又は一部の固定化法としては、公知の方法を用いることが可能であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、生化学的特異結合法等の抗体結合法等を行うことができる。さらに、用いる固定化法に適した基板を選択することも可能である。例えば、基板の表面における蛋白質の結合を促すために、その表面にアミノ基を導入したものを用いることが可能である。この場合、当該基板表面のアミノ基にグルタルアルデヒドを結合させ、この結合させたグルタルアルデヒドに、ＤＨＰＳの全部又は一部の末端アミノ基等を結合させる方法；当該基板表面のアミノ基に静電相互作用によりＤＨＰＳの全部又は一部を固定化する方法、等を行うことができる。また、蛋白質の固定化に適した基板の各種市販品を用いることも可能である。【００２３】
本発明の動脈硬化検出方法の標的要素である「デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)」は、前立腺がんや子宮頸がん（特許文献１、非特許文献１）やアポトーシス（特許文献２）に関連していることが知られている公知の酵素蛋白質であり、そのヒトにおけるアミノ酸配列は配列番号１であることが知られており（特許文献１）、これをコードするＤＨＰＳ遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２として知られている。さらに、ＤＨＰＳに対する抗体（モノクローナル抗体とポリクローナル抗体）も公知であり、常法によって製造することが可能であり、既に市販もなされている。本発明におけるＤＨＰＳ（ＤＨＰＳ蛋白質ともいう）とは、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、ＤＨＰＳのアミノ酸配列と相同性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の生物学的活性を有する、当該アミノ酸配列の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる蛋白質である。そして、本発明におけるＤＨＰＳ遺伝子は、上記のＤＨＰＳをコードする塩基配列を有する遺伝子である。【００２４】
特許文献１において開示されているように、ＤＨＰＳはスペルミジン存在下で、ｅＩＦ５Ａ(eukaryotic translation Initiation Factor 5A)をハイプシン化（活性化）する酵素であり、立体構造中に、酵素活性部位（本体構造）、鎖状構造、球状構造を有し、酵素活性部位と球状構造は、鎖状構造を介して繋がっている。立体構造解析などにより、酵素活性部位と球状構造は相互作用することが知られており、球状構造は酵素活性部位の偽基質であると推測されている。ハイプシン化は細胞増殖を含む細胞機能に必須であることが知られている。すなわち、ハイプシン化は、スペルミジンのブチルアミン部分を特異的リジン残基のε-アミノ基へＮＡＤ依存的に転移後、水酸化されるというｅＩＦ５Ａに固有の翻訳後修飾であり、酵母からヒトまで保存された生育に必須のものである。【００２５】
上記のようにＤＨＰＳは、特に前立腺がんや子宮頸がんのマーカーとしての応用可能性が認識されているが、動脈硬化のマーカーとしての開示は、示唆も含めてなされていない。【００２６】
［Ｂ］  がんマーカーについて
今般本発明者は、従来は前立腺がんや子宮頸がんとの関係が報告されている遺伝子「デオキシハイプシン・シンターゼ(deoxyhypusine synthase)遺伝子」が、驚くべきことに消化器系がんと非常に良く連関し、所望するがんマーカーとして用いることが可能であることを見出した。【００２７】
すなわち、本発明は、被験試料におけるデオキシハイプシン・シンターゼ（以下、ＤＨＰＳともいう）遺伝子の発現を当該被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として消化器系がんを検出する、がんの検出方法（以下、本発明のがん検出方法ともいう）を提供する発明である。本発明のがん検出方法において用いる被験試料は血液検体であることが好適である。本発明のがん検出方法は、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現のデータ取得を行い、当該遺伝子発現の亢進が認められる場合に、消化器系がんの存在データとすることを特徴とするデータの取得方法、ということもできる。【００２８】
本発明のがん検出方法は、下記の３種類の態様（がん検出方法１〜３）に大別される。そして、これらの方法をキットを用いて行うことも可能である。【００２９】
（１）本発明のがん検出方法１
本発明のがん検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするＤＨＰＳ蛋白質の全部又は一部を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことができる。特に、当該ＤＨＰＳ蛋白質の全部又は一部の検出を、これと特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて行うことが好適である。【００３０】
（２）本発明のがん検出方法２
本発明のがん検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）を検出することにより行うことができる。当該自己抗体の検出は、例えば、ＤＨＰＳの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより行うことができる。前記の固定化物に含まれるＤＨＰＳの一部のポリペプチドのアミノ酸数は、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上、すなわち１８４アミノ酸以上とすることが可能であり、好適には１８６アミノ酸以上、さらに好適には１８７アミノ酸以上である。ポリペプチドの抗原性が確保されていることが前提であるが、ポリペプチド長が短い方がペプチド自体の安定性に優れ、かつ、固定化物の単位量当たりの固定化ペプチド数が大きくなり感度が向上する傾向がある。【００３１】
（３）本発明のがん検出方法３
本発明のがん検出方法において、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことができる。当該標的核酸の検出は、例えば、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行うことができる。この場合、ＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子の全部又は一部に相補的な核酸を、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により増幅させてなる遺伝子増幅産物を、標的核酸として検出することができる。【００３２】
（４）がん検出用キット
さらに本発明のがん検出方法は、これを実施する要素を備えるがん検出用キットにより行うことが可能である。【００３３】
（５）固定化プレート
本発明は、さらに、以下のステップ（ａ）〜（ｄ）を含む、固定化プレートの使用方法を提供する。当該固定化プレートは、がん検出方法２を行う際に「ＤＨＰＳの全部又は一部を含むポリペプチドの固定化物」として用いられるものである。
（ａ）人工的に調製したＤＨＰＳの全部又は一部を固定化したプレートを、血液検体と接触させて、当該血液検体中のＤＨＰＳに対する自己抗体と当該プレート上のＤＨＰＳの全部又は一部が結合した抗原抗体結合体の形成を、プレート上において行うステップ；
（ｂ）標識が人工的に付加された抗体結合性の二次抗体を、プレート上の上記抗原抗体結合体の自己抗体に結合させるステップ；
（ｃ）自己抗体に結合した上記二次抗体の標識をプレート上において顕在化させて、当該顕在化シグナルを検出するためにプレートを使用するステップ；
（ｄ）プレートより得られた当該顕在化シグナルの検出値をＤＨＰＳに対する自己抗体の定量値としてカウントして、統計的に得られた消化器系がんに対する閾値よりも大きい場合の当該定量値を、上記血液検体における消化器系がんの指標とするステップ。
上記プレートに固定化されたＤＨＰＳの一部のポリペプチドのアミノ酸数は、当該全部のポリペプチドのアミノ酸数の１／２以上であることが好適であることは、上記のがん検出方法２における記載と同様である。【００３４】
ＤＨＰＳの全部又は一部を固定化するプレート（基板）としては、ガラススライド、多孔質ゲル、マイクロタイタープレート等が挙げられる。基板へのＤＨＰＳの全部又は一部の固定化法としては、公知の方法を用いることが可能であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、生化学的特異結合法等の抗体結合法等を行うことができる。さらに、用いる固定化法に適した基板を選択することも可能である。例えば、基板の表面における蛋白質の結合を促すために、その表面にアミノ基を導入したものを用いることが可能である。この場合、当該基板表面のアミノ基にグルタルアルデヒドを結合させ、この結合させたグルタルアルデヒドに、ＤＨＰＳの全部又は一部の末端アミノ基等を結合させる方法；当該基板表面のアミノ基に静電相互作用によりＤＨＰＳの全部又は一部を固定化する方法、等を行うことができる。また、蛋白質の固定化に適した基板の各種市販品を用いることも可能である。【００３５】
本発明のがん検出方法の標的要素である「デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)」は、前立腺がんや子宮頸がん（特許文献１、非特許文献１）やアポトーシス（特許文献２）に関連していることが知られている公知の酵素蛋白質であり、そのヒトにおけるアミノ酸配列は配列番号１であることが知られており（特許文献１）、これをコードするＤＨＰＳ遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２として知られている。さらに、ＤＨＰＳに対する抗体（モノクローナル抗体とポリクローナル抗体）も公知であり、常法によって製造することが可能であり、既に市販もなされている。本発明におけるＤＨＰＳ（ＤＨＰＳ蛋白質ともいう）とは、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、又は、ＤＨＰＳのアミノ酸配列と相同性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の生物学的活性を有する、当該アミノ酸配列の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる蛋白質である。そして、本発明におけるＤＨＰＳ遺伝子は、上記のＤＨＰＳをコードする塩基配列を有する遺伝子である。【００３６】
特許文献１において開示されているように、ＤＨＰＳはスペルミジン存在下で、ｅＩＦ５Ａ(eukaryotic translation Initiation Factor 5A)をハイプシン化（活性化）する酵素であり、立体構造中に、酵素活性部位（本体構造）、鎖状構造、球状構造を有し、酵素活性部位と球状構造は、鎖状構造を介して繋がっている。立体構造解析などにより、酵素活性部位と球状構造は相互作用することが知られており、球状構造は酵素活性部位の偽基質であると推測されている。ハイプシン化は細胞増殖を含む細胞機能に必須であることが知られている。すなわち、ハイプシン化は、スペルミジンのブチルアミン部分を特異的リジン残基のε-アミノ基へＮＡＤ依存的に転移後、水酸化されるというｅＩＦ５Ａに固有の翻訳後修飾であり、酵母からヒトまで保存された生育に必須のものである。【００３７】
上記のようにＤＨＰＳは、特に前立腺がんや子宮頸がんのマーカーとしての応用可能性が認識されているが、消化器系がんマーカーとしての開示は、示唆も含めてなされていない。【００３８】
消化器系がんとしては、食道がん、胃がん、十二指腸がん、大腸がん（直腸がん及び結腸がんを含む）、小腸がん、胆嚢がん、膵臓がん、及び肝臓がんを挙げることができるが、特に、食道がん、及び、大腸がんのマーカーとしてＤＨＰＳは有用である。
【発明の効果】
【００３９】
本発明により、被験試料中のデオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)遺伝子の発現に関する要素を基にした、動脈硬化の検出手段、及び、消化器系がんの検出手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】医療施設由来の血清検体において、急性期脳梗塞患者と健常人の間でＥＬＩＳＡ法を用いて検討したＤＨＰＳの自己抗体価の分布の第一の結果を、カットオフ値と共に示した図面である。
【図２】図１のＤＨＰＳの自己抗体価の分布に関するＲＯＣ曲線である。
【図３】医療施設由来の血清検体において、急性期脳梗塞患者と健常人の間でＥＬＩＳＡ法を用いて検討したＤＨＰＳの自己抗体価の分布の第二の結果を、カットオフ値と共に示した図面である。
【図４】図３のＤＨＰＳの自己抗体価の分布に関するＲＯＣ曲線である。
【図５】医療施設由来の血清検体において、既存の動脈硬化マーカーであるＣＲＰ値の陰性群と陽性群に分けて、さらにこれらの群の中の急性期脳梗塞患者群と健常人群の間でのＥＬＩＳＡ法によるＤＨＰＳの自己抗体価の分布を、第三の検討結果として示した図面である。
【図６】図５のＤＨＰＳの自己抗体価のうち、ＣＲＰ値の陰性群におけるＲＯＣ曲線である。
【図７】急性期脳梗塞患者の血清検体中のＤＨＰＳの自己抗体について、ウェスタンブロット法による検討を行った結果を示す電気泳動図である。
【図８】急性期脳梗塞患者の血清検体中の内在性のＤＨＰＳについて、ウェスタンブロット法で検出を行った結果を示す電気泳動図である。
【図９】医療施設由来の血清検体において、がん患者と健常人の間でＥＬＩＳＡ法を用いて検討したＤＨＰＳの自己抗体価の分布の結果を、カットオフ値と共に示した図面である。
【図１０】図９のＤＨＰＳの自己抗体価の分布に関するＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［Ａ］  本発明の動脈硬化検出方法について
（１）デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)遺伝子に関する材料の入手
上記のように、ヒト等においてＤＨＰＳの存在は公知であり、既にそのアミノ酸配列（ヒトについて、配列番号１）とこれをコードする塩基配列（例えば、配列番号２）は公知である。
【００４２】
これに基づき組換えＤＨＰＳを公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば上記塩基配列に基づいて、当該塩基配列の全部又は一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物をＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部として得て、これを用いて適切なベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択してクローニングを行い、さらに目的とするＤＨＰＳの全部又は一部を当該形質転換体、又は、当該形質転換体から得られたＤＨＰＳ遺伝子を遺伝子発現に適したベクターと宿主に対して適用した形質転換体においてＤＨＰＳ遺伝子の発現を行うことで、組換えＤＨＰＳを得ることができる。なお、上記のようにＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いずに、遺伝子ライブラリーの作製を経てＤＨＰＳ遺伝子のクローニングを行うこともできる。なお、組換えＤＨＰＳは、必要に応じて、点突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、段階的欠失遺伝子作製法等の遺伝子改変法を対象となるＤＨＰＳをコードする核酸において行うことにより、そのアミノ酸配列を天然型から改変することが可能である。
【００４３】
またＤＨＰＳの全部又は一部は、公知のペプチドの化学合成法に従い製造することが可能である。ペプチド合成に関しては、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法として、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能である。特に、長鎖を合成する場合はライゲーション法を用いることができる。
【００４４】
上記において得られるＤＨＰＳ遺伝子の他の用途として、例えば、ＤＨＰＳに対する抗体を遺伝子免疫法により製造する際に、利用することができる。また、本発明の動脈硬化検出方法において用いられる核酸プローブとして利用することが可能である。
【００４５】
さらに上記において得られるＤＨＰＳは、ＤＨＰＳに対する抗体を製造する際の免疫原、本発明の動脈硬化検出方法を自己抗体の検出により行う際の自己抗体の結合場、さらに、本発明の動脈硬化検出方法における標準物質等として用いることができる。
【００４６】
ＤＨＰＳに対する抗体は、常法を用いて製造することができる。すなわち、免疫動物に対して、免疫原であるＤＨＰＳ、又は、ＤＨＰＳ遺伝子を与えて、これにより免疫動物体内に生成する抗血清をポリクローナル抗体として得ることができる。また、モノクローナル抗体は、上記免疫動物からＢ細胞を得て、これを基にしたハイブリドーマを作製し、これを再び宿主動物に与えることにより、当該宿主動物により得ることができる。
【００４７】
上記において得られるＤＨＰＳ遺伝子、ＤＨＰＳ、及び、ＤＨＰＳに対する抗体においては、必要に応じて適切な修飾や処理を行うことも可能である。修飾としては、例えば、蛍光物質、色素、酵素、放射性物質等の標識物質の付加等、処理としては、例えば、抗体のフラグメント化等が挙げられる。
【００４８】
上記のＤＨＰＳ遺伝子に関する要素は、市販品を用いることも可能である。市販品には、既製品はもとより、注文に応じて製造される外注品も含まれる。
【００４９】
（２）本発明の動脈硬化検出方法１について
本発明の動脈硬化検出方法１は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の動脈硬化を検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするＤＨＰＳの全部又は一部（以下、本発明の動脈硬化検出方法においてＤＨＰＳｅｓと総称することもある）を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことを特徴とする。
【００５０】
すなわち被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量し、その定量値が、少なくとも動脈硬化が認められない者（以下、本発明の動脈硬化検出方法において動脈硬化健常者ともいう）の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈硬化を検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００５１】
被験試料におけるＤＨＰＳｅｓ量の動脈硬化健常者の標準値は、一般的な検査により動脈硬化が認められないと推定される者の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＨＰＳｅｓの定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
【００５２】
被験試料におけるＤＨＰＳｅｓの定量手段は特に限定されるものではないが、例えば、ＤＨＰＳｅｓと特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて行う定量手段、具体的には、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等が挙げられる。また、ＴＯＦ−ＭＡＳＳを用いてＤＨＰＳｅｓを直接定量することも可能である。ＥＩＡ法では、特に固定化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法が好適である。いずれの定量手段も、定量標的物質を被験試料中のＤＨＰＳｅｓとした場合の、確立した手段を用いて行うことができる。以下、これらのうちのいくつかについて簡単に説明する。
【００５３】
定量手段がＥＬＩＳＡ法である場合には、例えば、マイクロプレートに固定化したＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させて、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを固定化抗体に結合させ、この固定化抗体に結合したＤＨＰＳｅｓを、酵素標識した別のＤＨＰＳに対する抗体等を用いて検出することにより定量を行うことができる。また、固定化抗体と、被験試料及び酵素標識抗体を同時に反応させて、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量することも可能である。
【００５４】
定量手段が免疫沈降法である場合には、例えば、ビーズに固定化したＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させてＤＨＰＳｅｓを固定化抗体に結合させ、この固定化抗体に結合したＤＨＰＳｅｓを分離して、その分離物からＤＨＰＳｅｓを検出することにより定量を行うことができる。このＤＨＰＳｅｓの免疫沈降法による定量は、例えば、前記の分離物に対して電気泳動を行って、この電気泳動パターンの転写物に、ＤＨＰＳに対する標識抗体を作用させて、ＤＨＰＳｅｓのバンドを検出する、ウェスタンブロット法を用いて行うことができる。
【００５５】
さらに定量手段を、ウェスタンブロット法を主体とした方法とすることも可能である。例えば、被験試料から細胞を除いた細胞除外被験試料を、直接、電気泳動により分離し、その転写物に、ＤＨＰＳに対する標識抗体を作用させて、バンドを検出することにより、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量することができる。
【００５６】
定量手段がラテックス凝集比濁法である場合には、例えば、ラテックス粒子に結合させたＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させて、液相中で抗原抗体反応による免疫複合体の凝集塊を形成させ、その濁度の変化を測定することにより定量を行うことができる。
【００５７】
（３）本発明の動脈硬化検出方法２について
本発明の動脈硬化検出方法２は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の動脈硬化を検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）を検出することにより行うことを特徴とする検出方法である。
【００５８】
すなわち被験試料中のＤＨＰＳに対する自己抗体を定量し、その定量値が動脈硬化健常者の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈硬化を検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００５９】
被験試料におけるＤＨＰＳ自己抗体量の動脈硬化健常者の標準値は、一般的な検査により動脈硬化が認められないと推定される者の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＨＰＳ自己抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
【００６０】
当該自己抗体の定量は、例えば、ＤＨＰＳｅｓを含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより行うことができる。具体的には、間接蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量を行うことができる。いずれの定量手段も、定量標的物質を被験試料中のＤＨＰＳ自己抗体とした場合の、確立した手段を用いて行うことができる。例えば、間接蛍光抗体法（ＦＡＮＡ）では、ＤＨＰＳｅｓを固定化したプロテインアレイに被験試料を接触させて、固定化ＤＨＰＳｅｓと、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体を結合させて、形成された固定化ＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＤＨＰＳに対する自己抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法では、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、ＤＨＰＳｅｓをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、当該転写担体に被験試料を接触させて、当該転写担体上のＤＨＰＳｅｓと被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体の複合体を形成させて、当該複合体を検出することにより定量を行うことができる。比濁法や比朧法では、被験試料とＤＨＰＳｅｓを接触させることにより形成されたＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体を濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、ＤＨＰＳｅｓを結合させたラテックス粒子と被験試料とを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体を、ラテックス粒子に結合した自己抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、ＤＨＰＳｅｓ結合磁性粒子と被験試料を接触させて、磁性粒子上にＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量を行うことができる。
【００６１】
（４）本発明の動脈硬化検出方法３について
本発明の動脈硬化検出方法３は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の動脈硬化を検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことを特徴とする検出方法である。
【００６２】
例えば、被験試料中のＤＨＰＳｅｓをコードするｍＲＮＡ量を定量し、その定量値が、動脈硬化健常者の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳｅｓ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の動脈硬化を検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００６３】
被験試料中のＤＨＰＳｅｓをコードするｍＲＮＡ量検出の基となる核酸は、被験試料におけるＲＮＡを常法により抽出し、これをＤＮＡへの逆転写を行うことによりｃＤＮＡとして得ることができる。当該ｃＤＮＡに対して、ＤＨＰＳｅｓ遺伝子を増幅するための遺伝子増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法を行い（ＲＴ−ＰＣＲ法）、その基となるｍＲＮＡ量を示す度合い、例えば、特定のサイクル数の遺伝子増幅手段におけるＤＨＰＳｅｓ遺伝子のコピー数や、ＤＨＰＳｅｓ遺伝子のコピー数の増加スピード、等を把握することにより、被験試料中のＤＨＰＳｅｓ遺伝子の発現量を把握することができる。
【００６４】
当該標的核酸の検出は、例えば、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない、遺伝子増幅産物として得られた標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行うことができる。
【００６５】
当該シグナルの検出は、例えば、サザンブロット法により行うことができる。さらに、本発明の動脈硬化検出方法３の一連の工程をＲＴ−ＰＣＲ法を用いたリアルタイム分析等により行うことができる。
【００６６】
（５）本発明の動脈硬化検出用キット
本発明の動脈硬化検出用キットは、上述したように本発明の動脈硬化検出方法を行うための要素を備えるキットである。当該動脈硬化検出用キットの内容は、本発明の動脈硬化検出方法の態様や、目的、どの程度をキット化するかについての意図等により異なる。
【００６７】
例えば、本発明の動脈硬化検出方法１を行うための動脈硬化検出用キットにおいては、ＤＨＰＳに対する抗体を一次抗体として固定化したプレート、標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＥＬＩＳＡ法を行うためのキットの構成として挙げることができる。また、ＤＨＰＳに対する抗体を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。さらに、ＤＨＰＳに対する抗体を結合させた磁性粒子と、標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明の動脈硬化検出方法１の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、動脈硬化検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【００６８】
また、本発明の動脈硬化検出方法２を行うための動脈硬化検出用キットにおいては、例えば、ＤＨＰＳｅｓを固定化したプレート、標識がなされた自己抗体に対する二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＦＡＮＡ法やＥＬＩＳＡ法を行うためのキットの構成として挙げることができる。また、ＤＨＰＳｅｓを結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。さらに、ＤＨＰＳｅｓを結合させた磁性粒子と、標識がなされた自己抗体に対する二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明の動脈硬化検出方法２の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、動脈硬化検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【００６９】
さらに、本発明の動脈硬化検出方法３を行うための動脈硬化検出用キットにおいては、例えば、ｍＲＮＡを逆転写するための逆転写酵素と逆転写用プライマー、ＤＨＰＳｅｓをコードするｃＤＮＡを増幅するための遺伝子増幅用プライマー、遺伝子増幅産物を検出するための核酸プローブ、当該核酸プローブのシグナルを顕在化させるための試薬等を、キットの構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明の動脈硬化検出方法３の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、動脈硬化検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【００７０】
［Ｂ］  本発明のがん検出方法について
（１）デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＰＳ)遺伝子に関する材料の入手
上記のように、ヒト等においてＤＨＰＳの存在は公知であり、既にそのアミノ酸配列（ヒトについて、配列番号１）とこれをコードする塩基配列（例えば、配列番号２）は公知である。
【００７１】
これに基づき組換えＤＨＰＳを公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば上記塩基配列に基づいて、当該塩基配列の全部又は一部を有する二本鎖ＤＮＡを増幅するための核酸増幅用プライマーを設計し、当該増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等による遺伝子増幅産物をＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部として得て、これを用いて適切なベクターに組み込み、当該ベクターが組み込まれて形質転換した形質転換体を選択してクローニングを行い、さらに目的とするＤＨＰＳの全部又は一部を当該形質転換体、又は、当該形質転換体から得られたＤＨＰＳ遺伝子を遺伝子発現に適したベクターと宿主に対して適用した形質転換体においてＤＨＰＳ遺伝子の発現を行うことで、組換えＤＨＰＳを得ることができる。なお、上記のようにＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を用いずに、遺伝子ライブラリーの作製を経てＤＨＰＳ遺伝子のクローニングを行うこともできる。なお、組換えＤＨＰＳは、必要に応じて、点突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、段階的欠失遺伝子作製法等の遺伝子改変法を対象となるＤＨＰＳをコードする核酸において行うことにより、そのアミノ酸配列を天然型から改変することが可能である。
【００７２】
またＤＨＰＳの全部又は一部は、公知のペプチドの化学合成法に従い製造することが可能である。ペプチド合成に関しては、今や常法として確立している液相ペプチド合成法、又は、固相ペプチド合成法を用いて製造することが可能である。そして、一般的に好適な化学合成法として認識されている固相ペプチド合成法として、Ｂｏｃ固相法又はＦｍｏｃ固相法を用いることが可能である。特に、長鎖を合成する場合はライゲーション法を用いることができる。
【００７３】
上記において得られるＤＨＰＳ遺伝子の他の用途として、例えば、ＤＨＰＳに対する抗体を遺伝子免疫法により製造する際に、利用することができる。また、本発明のがん検出方法において用いられる核酸プローブとして利用することが可能である。
【００７４】
さらに上記において得られるＤＨＰＳは、ＤＨＰＳに対する抗体を製造する際の免疫原、本発明のがん検出方法を自己抗体の検出により行う際の自己抗体の結合場、さらに、本発明のがん検出方法における標準物質等として用いることができる。
【００７５】
ＤＨＰＳに対する抗体は、常法を用いて製造することができる。すなわち、免疫動物に対して、免疫原であるＤＨＰＳ、又は、ＤＨＰＳ遺伝子を与えて、これにより免疫動物体内に生成する抗血清をポリクローナル抗体として得ることができる。また、モノクローナル抗体は、上記免疫動物からＢ細胞を得て、これを基にしたハイブリドーマを作製し、これを再び宿主動物に与えることにより、当該宿主動物により得ることができる。
【００７６】
上記において得られるＤＨＰＳ遺伝子、ＤＨＰＳ、及び、ＤＨＰＳに対する抗体においては、必要に応じて適切な修飾や処理を行うことも可能である。修飾としては、例えば、蛍光物質、色素、酵素、放射性物質等の標識物質の付加等、処理としては、例えば、抗体のフラグメント化等が挙げられる。
【００７７】
上記のＤＨＰＳ遺伝子に関する要素は、市販品を用いることも可能である。市販品には、既製品はもとより、注文に応じて製造される外注品も含まれる。
【００７８】
（２）本発明のがん検出方法１について
本発明のがん検出方法１は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の消化器系がんを検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、当該遺伝子がコードするＤＨＰＳの全部又は一部（以下、本発明のがん検出方法においてＤＨＰＳｅｓと総称することもある）を標的ポリペプチドとして検出することにより行うことを特徴とする。
【００７９】
すなわち被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量し、その定量値が、少なくとも消化器系がんが認められない者（以下、本発明のがん検出方法において消化器系がん健常者ともいう）の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の消化器系がんを検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００８０】
被験試料におけるＤＨＰＳｅｓ量の消化器系がん健常者の標準値は、一般的な検査により消化器系がんが認められないと推定される者の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＨＰＳｅｓの定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
【００８１】
被験試料におけるＤＨＰＳｅｓの定量手段は特に限定されるものではないが、例えば、ＤＨＰＳｅｓと特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて行う定量手段、具体的には、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等が挙げられる。また、ＴＯＦ−ＭＡＳＳを用いてＤＨＰＳｅｓを直接定量することも可能である。ＥＩＡ法では、特に固定化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法が好適である。いずれの定量手段も、定量標的物質を被験試料中のＤＨＰＳｅｓとした場合の、確立した手段を用いて行うことができる。以下、これらのうちのいくつかについて簡単に説明する。
【００８２】
定量手段がＥＬＩＳＡ法である場合には、例えば、マイクロプレートに固定化したＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させて、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを固定化抗体に結合させ、この固定化抗体に結合したＤＨＰＳｅｓを、酵素標識した別のＤＨＰＳに対する抗体等を用いて検出することにより定量を行うことができる。また、固定化抗体と、被験試料及び酵素標識抗体を同時に反応させて、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量することも可能である。
【００８３】
定量手段が免疫沈降法である場合には、例えば、ビーズに固定化したＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させてＤＨＰＳｅｓを固定化抗体に結合させ、この固定化抗体に結合したＤＨＰＳｅｓを分離して、その分離物からＤＨＰＳｅｓを検出することにより定量を行うことができる。このＤＨＰＳｅｓの免疫沈降法による定量は、例えば、前記の分離物に対して電気泳動を行って、この電気泳動パターンの転写物に、ＤＨＰＳに対する標識抗体を作用させて、ＤＨＰＳｅｓのバンドを検出する、ウェスタンブロット法を用いて行うことができる。
【００８４】
さらに定量手段を、ウェスタンブロット法を主体とした方法とすることも可能である。例えば、被験試料から細胞を除いた細胞除外被験試料を、直接、電気泳動により分離し、その転写物に、ＤＨＰＳに対する標識抗体を作用させて、バンドを検出することにより、被験試料中のＤＨＰＳｅｓを定量することができる。
【００８５】
定量手段がラテックス凝集比濁法である場合には、例えば、ラテックス粒子に結合させたＤＨＰＳに対する抗体に、被験試料を接触させて、液相中で抗原抗体反応による免疫複合体の凝集塊を形成させ、その濁度の変化を測定することにより定量を行うことができる。
【００８６】
（３）本発明のがん検出方法２について
本発明のがん検出方法２は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の消化器系がんを検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）を検出することにより行うことを特徴とする検出方法である。
【００８７】
すなわち被験試料中のＤＨＰＳに対する自己抗体を定量し、その定量値が、消化器系がん健常者の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料提供者の消化器系がんを検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００８８】
被験試料におけるＤＨＰＳ自己抗体量の消化器系がん健常者の標準値は、一般的な検査により消化器系がんが認められないと推定される者の標本集団を設定し、当該標本集団における当該被験試料のＤＨＰＳ自己抗体の定量値を求め、これに統計処理を施して、平均、標準偏差等を求めることにより、カットオフ値を含めて導き出すことができる。
【００８９】
当該自己抗体の定量は、例えば、ＤＨＰＳｅｓを含むポリペプチドの固定化物に被験試料を接触させ、被験試料内のＤＨＰＳに対する抗体（自己抗体）の当該固定化ポリペプチドとの結合をシグナルとして検出することにより行うことができる。具体的には、間接蛍光抗体法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法（免疫ブロット法）、比濁法、比朧法、ラテックス凝集比濁法、ＣＬＥＩＡ法等の手段を用いて定量を行うことができる。いずれの定量手段も、定量標的物質を被験試料中のＤＨＰＳ自己抗体とした場合の、確立した手段を用いて行うことができる。例えば、間接蛍光抗体法（ＦＡＮＡ）では、ＤＨＰＳｅｓを固定化したプロテインアレイに被験試料を接触させて、固定化ＤＨＰＳｅｓと、被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体を結合させて、形成された固定化ＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体に対して、さらに蛍光標識を施した二次抗体を接触させて、ＤＨＰＳに対する自己抗体を定量することができる。ＥＬＩＳＡ法では、間接蛍光抗体法で用いる二次抗体の標識を酵素標識として定量を行うものである。二次抗体の標識は多様に選択可能である。ウェスタンブロット法では、ＤＨＰＳｅｓをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、ゲルからニトロセルロース膜等の担体に転写させ、当該転写担体に被験試料を接触させて、当該転写担体上のＤＨＰＳｅｓと被験試料中のＤＨＰＳに対する抗体の複合体を形成させて、当該複合体を検出することにより定量を行うことができる。比濁法や比朧法では、被験試料とＤＨＰＳｅｓを接触させることにより形成されたＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体を濁度（比濁法）や、散乱光強度の変化（比朧法）で検出することにより定量を行うことができる。ラテックス凝集比濁法では、ＤＨＰＳｅｓを結合させたラテックス粒子と被験試料とを接触させることにより、当該ラテックス粒子の凝集体を、ラテックス粒子に結合した自己抗体同士の相互作用により形成させて、これを検出することにより定量を行うことができる。ＣＬＥＩＡ法では、ＤＨＰＳｅｓ結合磁性粒子と被験試料を接触させて、磁性粒子上にＤＨＰＳｅｓ−抗ＤＨＰＳ抗体複合体を形成させて集磁を行い、未反応物を除去して、適切な蛍光化処理等を施して当該複合体を検出することにより定量を行うことができる。
【００９０】
（４）本発明のがん検出方法３について
本発明のがん検出方法３は、ＤＨＰＳ遺伝子の発現を被験試料において確認し、当該遺伝子発現の亢進を指標として被験者の消化器系がんを検出するに際して、標的遺伝子であるＤＨＰＳ遺伝子の発現の確認を、被験試料におけるＤＨＰＳ遺伝子の全部又は一部、あるいは、当該遺伝子に相補的な核酸を標的核酸として検出することにより行うことを特徴とする検出方法である。
【００９１】
例えば、被験試料中のＤＨＰＳｅｓをコードするｍＲＮＡ量を定量し、その定量値が、消化器系がん健常者の標準値よりも大きい場合に、被験試料提供者におけるＤＨＰＳｅｓ遺伝子の発現の亢進を認定し、これを指標として当該被験試料の提供者の消化器系がんを検出することが可能である。被験試料としては、血清検体、血漿検体、全血検体等の血液検体、さらに尿検体等を用いることができるが、血液検体が好適である。また、血液検体は適宜適切な処理、例えばヘパリン処理等がなされていてもよい。
【００９２】
被験試料中のＤＨＰＳｅｓをコードするｍＲＮＡ量検出の基となる核酸は、被験試料におけるＲＮＡを常法により抽出し、これをＤＮＡへの逆転写を行うことによりｃＤＮＡとして得ることができる。当該ｃＤＮＡに対して、ＤＨＰＳｅｓ遺伝子を増幅するための遺伝子増幅用プライマーを用いたＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法を行い（ＲＴ−ＰＣＲ法）、その基となるｍＲＮＡ量を示す度合い、例えば、特定のサイクル数の遺伝子増幅手段におけるＤＨＰＳｅｓ遺伝子のコピー数や、ＤＨＰＳｅｓ遺伝子のコピー数の増加スピード、等を把握することにより、被験試料中のＤＨＰＳｅｓ遺伝子の発現量を把握することができる。
【００９３】
当該標的核酸の検出は、例えば、当該標的核酸の塩基配列に相補的な配列の核酸を有する核酸プローブを、固定化された、又は、固定化されていない、遺伝子増幅産物として得られた標的核酸とハイブリダイズさせて、当該ハイブリダイズにより生ずるシグナルを検出することにより行うことができる。
【００９４】
当該シグナルの検出は、例えば、サザンブロット法により行うことができる。さらに、本発明のがん検出方法３の一連の工程をＲＴ−ＰＣＲ法を用いたリアルタイム分析等により行うことができる。
【００９５】
（５）本発明のがん検出用キット
本発明のがん検出用キットは、上述したように本発明のがん検出方法を行うための要素を備えるキットである。当該がん検出用キットの内容は、本発明のがん検出方法の態様や、目的、どの程度をキット化するかについての意図等により異なる。
【００９６】
例えば、本発明のがん検出方法１を行うためのがん検出用キットにおいては、ＤＨＰＳに対する抗体を一次抗体として固定化したプレート、標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＥＬＩＳＡ法を行うためのキットの構成として挙げることができる。また、ＤＨＰＳに対する抗体を結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。さらに、ＤＨＰＳに対する抗体を結合させた磁性粒子と、標識がなされた二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明のがん検出方法１の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、がん検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【００９７】
また、本発明のがん検出方法２を行うためのがん検出用キットにおいては、例えば、ＤＨＰＳｅｓを固定化したプレート、標識がなされた自己抗体に対する二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＦＡＮＡ法やＥＬＩＳＡ法を行うためのキットの構成として挙げることができる。また、ＤＨＰＳｅｓを結合させたラテックス粒子を、ラテックス凝集比濁法を行うためのキット構成として挙げることができる。さらに、ＤＨＰＳｅｓを結合させた磁性粒子と、標識がなされた自己抗体に対する二次抗体、二次抗体の標識を顕在化させるための試薬を備えた態様を、ＣＬＥＩＡ法を行うためのキット構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明のがん検出方法２の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、がん検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【００９８】
さらに、本発明のがん検出方法３を行うためのがん検出用キットにおいては、例えば、ｍＲＮＡを逆転写するための逆転写酵素と逆転写用プライマー、ＤＨＰＳｅｓをコードするｃＤＮＡを増幅するための遺伝子増幅用プライマー、遺伝子増幅産物を検出するための核酸プローブ、当該核酸プローブのシグナルを顕在化させるための試薬等を、キットの構成として挙げることができる。ここに挙げたこれらの構成はあくまでも例示であり、本発明のがん検出方法３の他の態様を行うためのキットも本発明の範囲に含まれる。さらに、ここに例示された上記の要素の構成をさらに少なくして、検査の外注又は自己調達の度合いを増やすように設定することも可能であり、逆に、希釈液や試薬用のチューブ等を構成として増やして、がん検出用キットの即時使用を設定することも可能である。また、具体的な検査態様に応じた他の要素を加味することも可能である。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明の実施例を開示する。
［Ａ］  本発明の動脈硬化検出方法について
［参考例］  ＤＨＰＳの動脈硬化マーカーとしてのスクリーニング
（１）約８０００種類の蛋白質が固定化されたプロテインアレイと、動脈硬化患者と健常人の血清検体を接触させて、当該検体中に存在する動脈硬化患者特有の自己抗体を、間接蛍光抗体法により検出した。その結果、約１５０種の候補自己抗体を特定し、それらの候補自己抗体の一つが、ＤＨＰＳに対する血清中の自己抗体である。ここで用いた動脈硬化患者の血清検体は、病院及び研究協力施設を受診した頸動脈狭窄症患者から得られたものである。【０１００】
なお、上記患者の評価においては外来受診者の中から、性別・年齢（±５歳）を動脈硬化患者と一致させたほぼ同数の正常被験者を基準（コントロール）として選択した。外来受診時又は入院時に、１）研究目的や研究協力の任意性等を本人、家族に説明し、インフォームド・コンセントを得た上で、２）家族歴・既往歴・飲酒や喫煙等のライフスタイル、作業態様に関する問診を行い、３）採血を行って血清と血球成分を分離凍結保存した。さらに、４）医師の診療録を基に、臨床的重症度、治療経過、血液検査所見等を記録した。解析対象の患者血液は血清分離後マイナス８０度にて研究開始まで凍結保存した。この被験者に関する取り扱いは、基本的に後述する例においても同様である。
（２）次に、上記の約１５０種の候補自己抗体に対してＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行った。これらの個々の候補自己抗体に対するＥＬＩＳＡ法の実施に先立ち、ＤＨＰＳを含む約１５０種の抗原蛋白質は、下記の工程を経て組換え蛋白質として得た。【０１０１】
まずはＰＣＲ法によりインサートを作製した。すなわち、あらかじめ発現ベクターｐＥＴ２８又はｐＧＥＸ−４Ｔへの組換えに適した制限酵素認識部位を持つプライマーを作製し、骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳより抽出したＲＮＡを鋳型に逆転写ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを作製し、さらにＰＣＲを行い全長のインサートを得た。このインサート及び発現ベクターを制限酵素処理し、Ligation-Convenience Kit（ニッポンジーン社）を用い、インサートと発現ベクターをライゲーションし、インサートを含むプラスミドを作製した。さらに、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ニッポンジーン社）を用いて組換え体に形質転換した。この形質転換体を抗生物質入りのＬＢ培地で培養し、ＩＰＴＧでインサートＤＮＡ由来蛋白質の発現を誘導した。この状態の形質転換された大腸菌を遠心分離回収後、可溶画分と不溶画分に分離し、さらに尿素を用い不溶画分の可溶化を行った。蛋白質はProBond Resin（Invitrogen社）及びGlutathione-Sepharose（GE Healthcare社）を用いて精製した。【０１０２】
このようにして得られた各種の精製組換え蛋白質を、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに５μｇ／ｍｌの濃度で注入し、一晩４℃で保存し、固定化させることにより、ＥＬＩＳＡ法に用いる組換え蛋白質を固定化した９６穴プレートを得た。【０１０３】
ＥＬＩＳＡ法では、この組換え蛋白質固定化プレートを、ＰＢＳ洗浄、２０％糖２０％合成ポリマー（日本油脂社）配合溶液でブロッキング後、患者血清、及び対照血清（健常者の血清）を２００倍希釈し、固定化した蛋白質と反応させ、次いで、ＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えた。最後に酵素発色基質を加えて発色させ、プレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍの吸収を測定した。【０１０４】
このＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより、約１５０種あった候補自己抗体（抗原蛋白質）は約４０種に絞られ、これらの中に本発明の主題であるＤＨＰＳが含まれていた。以下、実際にはＤＨＰＳ以外の自己抗体に対する検討も並行して行っているが、ここではＤＨＰＳのみに関して開示する。【０１０５】
［実施例Ａ−１］  ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討
ＥＬＩＳＡ法による検討は３回にわたって行った。
（ａ）ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討（１）
医療施設Ａにおいて、急性期脳梗塞患者７８例と、健常人５１例の血清検体を用いた。その結果を図１と図２において示す。図１は、患者群（患者）と健常人群（正常）におけるＤＨＰＳの自己抗体の抗体価の分布を示し、図２は本検討におけるＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を示している。【０１０６】
図１及び図２に基づき、検定によって導かれた結果を表１に示す。表１に示す通りに、カットオフ値は、約０．６９であり、図１において点線で示した。【０１０７】
【表１】
2016072464.tif 000002
【０１０８】
Ｐ値は０．０５（０．０１）よりも小さく、「ＤＨＰＳの血清抗体価は動脈硬化患者群において健常人群よりも大きい」ことについての有意差が認められた。【０１０９】
また上記カットオフ値における陽性率は約６９％であった。【０１１０】
（ｂ）ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討（２）
医療施設Ｂの急性期脳梗塞患者１１１例と医療施設Ｃの急性期脳梗塞患者４６例（計１５７例）と、医療施設Ａの健常人５１例の血清検体を用いた。その結果を図３と図４において示す。図３は、患者群（患者）と健常人群（正常）におけるＤＨＰＳの自己抗体の抗体価の分布を示し、図４は本検討におけるＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を示している。【０１１１】
図３及び図４に基づき、検定によって導かれた結果を表２に示す。表２に示す通りに、カットオフ値は、約０．６９であり、図３において点線で示した。【０１１２】
【表２】
2016072464.tif 000003
【０１１３】
Ｐ値は０．０５（０．０１）よりもはるかに小さく、「ＤＨＰＳの血清抗体価は動脈硬化患者群において健常人群よりも大きい」ことについての有意差が認められた。【０１１４】
また上記カットオフ値における陽性率は約７３％であった。【０１１５】
（ｃ）ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討（３）
本例においては、既存の動脈硬化マーカーの陽性群と陰性群における、ＤＨＰＳ自己抗体マーカーの動向についての検討を行った。既存の動脈硬化マーカーとしてはＣＲＰを用いた。ＣＲＰ（Ｃ-reactive protein）は、急性期蛋白質（acute phase reactant：ＡＰＲ）の一種であり、１９３０年にTilletらによって発見された肺炎双球菌から抽出されたＣ多糖体と沈降反応を起こす血清蛋白質である。近年、動脈硬化に伴う血管組織の炎症で、動脈硬化巣に浸潤した炎症性細胞から分泌される炎症性サイトカインにより、ＣＲＰが肝臓で産生されて増加することが知られており、さらにその濃度は血管内皮の機能障害の程度と相関し、その増加が狭心症や心筋梗塞を起こす危険因子とされている(Ridker PM:Circulation 103:1813,2002)。【０１１６】
本例におけるＣＲＰ測定の検体は、医療施設Ａから得られた８３例（急性期脳梗塞患者６５例、と健常人１８例）の血清検体を用いた。これらの全ての血清検体について、Ｃ反応性蛋白キット（ナノピア  積水メディカル社製）を用いてラテックス凝集比濁法によるＣＲＰの測定を行い、ＣＲＰのカットオフ値を０．２mg/dLとして分類した。すなわち、ＣＲＰ値が０．２mg/dLを超える群は「ＣＲＰ動脈硬化リスク群」として、０．２mg/dL以下の群は「ＣＲＰ動脈硬化非リスク群」として分類した。これらのＣＲＰによる分類別に上記患者群と健常人群を分けて、これらの血清検体中のＤＨＰＳに対する自己抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図５において示し、さらに０．２mg/dL以下の「ＣＲＰ動脈硬化非リスク群」のＲＯＣ曲線を図６において示した。【０１１７】
Ｐ値は０．００３であり、０．０５（０．０１）よりも明らかに小さかった。【０１１８】
また、陽性率は４６％であった。よって、ＣＲＰ値においては動脈硬化のリスクは薄いと扱われる群においても、ＤＨＰＳによる動脈硬化のテストを行うことによって、有意差を伴って動脈硬化を検出することが可能であることが認められた。【０１１９】
「ＣＲＰ動脈硬化リスク群」においては正常群の検体数が少ないために有意差検定は行わなかったが、図５からこの群においてもＤＨＰＳの自己抗体の定量が動脈硬化の検出に有効であることは一目瞭然である。【０１２０】
［実施例Ａ−２］ウェスタンブロット法による自己抗体の検討
上記参考例（２）に示した方法でインサートを作製し、それに基づく精製蛋白質を得た。すなわち、あらかじめ発現ベクターｐＥＴ２８又はｐＧＥＸ−４Ｔへの組換えに適した制限酵素認識部位を持つプライマーを作製し、骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳより抽出したＲＮＡを鋳型に逆転写ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを作製し、さらにＰＣＲを行い全長のインサートを得た。このインサート及び発現ベクターを制限酵素処理し、Ligation-Convenience Kit（ニッポンジーン社）を用い、インサートと発現ベクターをライゲーションし、インサートを含むプラスミドを作製した。そして、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ニッポンジーン社）を用いて組換え体に形質転換した。この形質転換体を抗生物質入りのＬＢ培地で培養し、ＩＰＴＧでインサートＤＮＡ由来蛋白質の発現を誘導した。この状態の形質転換された大腸菌を遠心分離回収後、可溶画分と不溶画分に分離し、さらに尿素を用い不溶画分の可溶化を行った。蛋白質はProBond Resin（Invitrogen社）及びGlutathione-Sepharose（GE Healthcare社）を用いて精製した。【０１２１】
この精製した蛋白質をＳＤＳサンプルバッファーにて変性させ、ウェスタン法のサンプルとした。１２％ポリアクリルアミドゲル上で前記サンプルを電気泳動後、転写装置でニトロセルロース膜に蛋白質を転写した。５％スキムミルクでブロッキング後、５００倍希釈した患者血清（検体１〜４）を一次抗体として加え、一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、２００００倍希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ab98633, Abcam社）を加え、３０分間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、発光試薬Immobilon Western（MILLIPORE社）を用いて発光させ、フィルムに露光させ現像した。【０１２２】
結果を図７の電気泳動図において示す。図７において、検体１、２、３、４は、医療施設Ａから提供された急性期脳梗塞患者の血清検体であり、蛋白質Ｈｉｓ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８４−３６９）のＥＬＩＳＡ測定値（自己抗体）は、検体１が３．６１、検体２が３．８２、検体３が３．６１、検体４が３．４７であった。また、蛋白質ＧＳＴ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８３−３６９）のＥＬＩＳＡ測定値（自己抗体）は、検体１が３．６０、検体２が２．６４、検体３が２．３３、検体４が２．４６であった。【０１２３】
下記表３−１〜表３−４は、各メンブレンマーカー７５ｋＤａのバンド強度を「１」とした場合の、検出バンド強度の比率を示している。表３−１は検体１についての結果であり、表３−２は検体２についての結果であり、表３−３は検体３についての結果であり、表３−４は検体４についての結果である。また、表中において、蛋白質Ｈｉｓ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８４−３６９）をHis-36Cと、蛋白質ＧＳＴ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８３−３６９）をGST-36Cと表記した。【０１２４】
【表３−１】
2016072464.tif 000004
【０１２５】
【表３−２】
2016072464.tif 000005
【０１２６】
【表３−３】
2016072464.tif 000006
【０１２７】
【表３−４】
2016072464.tif 000007
【０１２８】
上記の結果から、急性期脳梗塞患者検体血清である検体１、 検体２、 検体３、及び、検体４中の自己抗体は、蛋白質Ｈｉｓ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８４−３６９）と強い反応性を示したことが分かる。ウェスタンブロットの結果、目的バンドが自己抗体と反応していることを確認した。また、この際のバンドの強度から、ＥＬＩＳＡ法で高い測定値を示す検体ほど蛋白質Ｈｉｓ−ＤＨＰＳ（ａ．ａ．１８４−３６９）と高い反応性を示していることを確認した。【０１２９】
次に、これらの検体において内在性(endogenos)のＤＨＰＳの存在についての検討を、抗ＤＨＰＳ抗体を用いたウェスタンブロットにより検討した。具体的には、Ｈｉｓ−ＤＨＰＳ（配列番号１のａ．ａ．１−３６９）蛋白質（ポジティブコントロール）、及び、患者の血清検体（検体１〜４）をＳＤＳサンプルバッファーにて変性させ、ウェスタン法のサンプルとした。１０％ポリアクリルアミドゲル上で前記サンプルを電気泳動後、転写装置でニトロセルロース膜に蛋白質を転写した。５％スキムミルクでブロッキング後、５００倍希釈した抗ＤＨＰＳ抗体（H00001725-B02P, Abnova社）を一次抗体として加え、一夜インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、７５００倍希釈ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（NA931, GE Healthcare社）を加え、３０分間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、発光試薬Immobilon Western（MILLIPORE社）を用いて発光させ、フィルムに露光させ現像した。【０１３０】
結果を図８の電気泳動図に示す。これにより全ての検体について内在性のＤＨＰＳの存在を示唆するバンドが認められ、血中における内在性のＤＨＰＳの存在が強く示唆された。【０１３１】
［Ｂ］  本発明のがん検出方法について
［実施例Ｂ−１］  ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討
（１）検討手法
ＤＨＰＳの自己抗体の抗原蛋白質は、下記の工程を経て組換え蛋白質として得た。【０１３２】
まずはＰＣＲ法によりインサートを作製した。すなわち、あらかじめ発現ベクターｐＥＴ２８又はｐＧＥＸ−４Ｔへの組換えに適した制限酵素認識部位を持つプライマーを作製し、骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳより抽出したＲＮＡを鋳型に逆転写ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを作製し、さらにＰＣＲを行い全長のインサートを得た。このインサート及び発現ベクターを制限酵素処理し、Ligation-Convenience Kit（ニッポンジーン社）を用い、インサートと発現ベクターをライゲーションし、インサートを含むプラスミドを作製した。さらに、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ニッポンジーン社）を用いて組換え体に形質転換した。この形質転換体を抗生物質入りのＬＢ培地で培養し、ＩＰＴＧでインサートＤＮＡ由来蛋白質の発現を誘導した。この状態の形質転換された大腸菌を遠心分離回収後、可溶画分と不溶画分に分離し、さらに尿素を用い不溶画分の可溶化を行った。蛋白質はProBond Resin（Invitrogen社）及びGlutathione-Sepharose(GE Healthcare社)を用いて精製した。【０１３３】
このようにして得られた各種の精製組換え蛋白質を、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍｌの濃度で注入し、一晩４℃で保存し、固定化させることにより、ＥＬＩＳＡに用いる組換え蛋白質を固定化した９６穴プレートを得た。【０１３４】
ＥＬＩＳＡ法では、この組換え蛋白質固定化プレートを、ＰＢＳ洗浄、１０％ウシ胎児血清ＰＢＳ溶液でブロッキング後、患者血清、及び対照血清（健常者の血清）を２０００倍希釈し、固定化した蛋白質と反応させ、次いで、ＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えた。最後に酵素発色基質を加えて発色させ、プレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍの吸収を測定した。【０１３５】
（２）ＥＬＩＳＡ法による自己抗体の検討
医療施設Ｄにおける、食道がん患者６１例と、大腸がん患者１９例（がん患者計８０例）、加えて、医療施設Ａの健常人５１例の血清検体を用いた。その結果を図９と図１０において示す。図９は、患者群（患者）と健常人群（正常）におけるＤＨＰＳの自己抗体の抗体価の分布を示し、図１０は本検討におけるＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を示している。【０１３６】
上記図９と図１０に基づき、検定によって導かれた結果を表４に示す。表４に示す通りに、カットオフ値は、約０．６９であり、図９において点線で示した。【０１３７】
【表４】
2016072464.tif 000008
【０１３８】
Ｐ値は０．０５よりも小さく、「ＤＨＰＳの血清抗体価は大腸がんと食道がんの患者群において健常人群よりも大きい」ことについての有意差が認められた。【０１３９】
また上記カットオフ値における陽性率は８０％程度であった。
【図１】
2016072464.tif 000009
【図２】
2016072464.tif 000010
【図３】
2016072464.tif 000011
【図４】
2016072464.tif 000012
【図５】
2016072464.tif 000013
【図６】
2016072464.tif 000014
【図７】
2016072464.tif 000015
【図８】
2016072464.tif 000016
【図９】
2016072464.tif 000017
【図１０】
2016072464.tif 000018
【配列表】
2016072464000001.app
【国際調査報告】
2016072464.tif 000019
2016072464.tif 000020
2016072464.tif 000021
2016072464.tif 000022
2016072464.tif 000023
2016072464.tif 000024
2016072464.tif 000025