(57)【要約】  本発明の課題は、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、溶解状態の水溶性薬物を内包し、かつ保管安定性に優れるリポソーム組成物及びその製造方法を提供することである。本発明によれば、有機溶媒に溶解して乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、リポソームが溶解状態の水溶性薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物及びその製造方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒に溶解して乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、リポソームが溶解状態の水溶性薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物。
【請求項２】
リポソームが、シングルラメラの構造を有する請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
リポソームの平均粒子径が、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１又は２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
リポソームが、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含む請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物。
【請求項６】
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する浸透圧調整工程
を有するリポソーム組成物の製造方法。
【請求項７】
乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる請求項６に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【請求項８】
薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う請求項６又は７に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポソーム組成物及びその製造方法に関する。本発明は、好適に医薬品用途として用いることのできるリポソーム組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソーム（以下、脂質小胞体ともいう）は、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。
リポソームは、バリア能、化合物保持能、生体適合性、粒径設定の自由度、易分解性、表面修飾性等の特徴を生かして、免疫センサー、人工赤血球、薬物送達システムのキャリヤーなど多様な応用が検討されてきた。キャリヤーの用途において、リポソームは、水溶性化合物、脂溶性低分子、高分子と幅広い物質を内包することができる。【０００３】
リポソームを特に薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、生体膜での透過の観点から、粒子サイズを２００ｎｍ程度以下にする必要がある。また、薬物送達システムのキャリヤーでは、哺乳類の体温である３７℃程度の温度条件下で分散性が良好な粒子を形成しているリポソームにする必要もある。特に、ナノサイズの微粒子については、凝集、沈降や薬物の漏出など様々な観点から、保存安定性を付与することが好ましい。【０００４】
薬物送達システムのキャリヤーとして、静脈内注射により薬剤（薬物を含むリポソームを含む溶液等）を投与する場合、静脈注射剤には高い安全性が求められる。クロロホルムなどの塩素系溶剤又は使用が認められていない分散剤（以下、分散剤は分散助剤なども含む）の添加剤は好ましくない。また、医薬品としての安定性の付与も必要であり、保管後の薬物の漏出、脂質の分解抑制などが求められる。さらに、無菌性を保証するために、無菌ろ過に対する適性も求められる。リポソームを医薬品として工業的規模で製造するには、上記のような観点を考慮に入れる必要がある。【０００５】
また、薬物送達システムでは、薬剤（薬物）を含むリポソーム組成物は、患部に薬剤を送達させて、必要とする薬物を必要な量を放出することが必要である。しかし、リポソーム組成物の薬物の放出し易さと保管安定性とを両立は相反する課題であり、これらを両立できることが望まれている。【０００６】
特許文献１には、脂質膜の乾燥固化工程を経ずに乳化法でリポソームを作製する製造方法が記載されている。乳化剤として、リポソーム脂質膜を破壊しない水溶性乳化剤、詳細には、非イオン性界面活性剤としてプルロニックを用いた製造方法が開示されている。一般に、界面活性剤は、リポソーム膜の強度に多大な影響を与えることが予想され、改善が必要になる。【０００７】
特許文献２には、膜の相転移温度が４０〜４５℃のスモール・ユニラメラ・ベシクルであるリポソーム内に、温血動物の生体液浸透圧よりも２．０〜５．０倍高張の薬物含有液を封入して成るリポソーム組成物が開示されている。また、このリポソーム組成物は、混合脂質膜の乾燥固化工程を経て得られるリポソーム組成物であることも開示されている。２．０〜５．０倍という高張の条件にすることで、このリポソーム組成物は、温熱療法のために、低温でのリリースを抑制し、高温で一気に放出させる性質を有している。低温におけるリリース抑制は数十分以内という短時間であり、混合脂質膜の乾燥固化工程を経た脂質膜では、その脆弱性のため、長期に渡る保管安定性や数十時間のオーダーでのリリース制御について言及はない。【０００８】
上記のいずれの文献において、実用上必要な長期の保存性を有し、かつ数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物及びその製造方法は十分確立されておらず、改良が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１３−０２２４８２号公報
【特許文献２】特開平０６−００９３７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
リポソームの脂質膜に薬物を吸着させて保持するような方式では、疎水性相互作用、静電相互作用などの強固な相互作用により、リポソーム外に薬物が放出されにくくなる。そのため、製造後のリポソーム組成物の構成が維持でき、長期の保管安定性を担保しやすい。
この場合、相互作用が強すぎるため、患部に薬物を放出させることが困難になる。そこで、薬物をリポソームの内水相に溶解状態で内包することが理想的であり、さらにリポソーム組成物を高張の条件にすることで、リポソーム組成物からの薬物の放出を促進し、より適したドラッグデリバリーが実現できる。ただし、高張の条件にすることで、リポソーム組成物から薬物が漏出し易くなり、長期の保管安定性を担保することが困難であった。【００１１】
また、効果的に患部に薬剤を送達させる場合、リポソームの平均粒子サイズが１００ｎｍ以下の微粒子であることが好ましい。しかし、微粒子化することで、リポソームの膜の湾曲（曲率）が大きくなり、薬物を内包させることが困難であった。【００１２】
本発明は、上記に鑑みて、実用上必要な長期の保存性を有し、かつ数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、内水相を高張にすることで適度な水溶性薬物の放出性能を付与しながらも、高い保管安定性を有し、かつ数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
有機溶媒に溶解して乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、リポソームが溶解状態の水溶性薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下である
リポソーム組成物である。【００１４】
本発明のリポソーム組成物において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、リポソームがシングルラメラの構造を有する。
好ましくは、リポソームの平均粒子径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
好ましくは、リポソームが、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含む。【００１５】
本発明は、上記に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物である。【００１６】
本発明は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する浸透圧調整工程
を有するリポソーム組成物の製造方法である。【００１７】
本発明のリポソーム組成物の製造方法において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる。
好ましくは、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリポソーム組成物によれば、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下という保管安定性に対して厳しい条件であっても、溶解状態の水溶性薬物を内包し、かつ保管安定性に優れるリポソーム組成物が提供できる。【００１９】
また、本発明のリポソーム組成物の別の態様によれば、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、溶解状態の水溶性薬物を内包し、かつ数十時間のオーダーでのリリース速度を達成できるリポソーム組成物が提供できる。【００２０】
また、本発明のリポソーム組成物の製造方法によれば、製造適性（例えば、無菌ろ過適性等）が良好で、平均粒子サイズが１００ｎｍ以下であり、粒子サイズ分布が均一な分布を示し、かつ保存安定性に優れたリポソーム組成物を得ることができる。【００２１】
さらに、本発明のリポソーム組成物の製造方法の別の態様によれば、医薬用途に適した、平均粒子サイズ及び粒子サイズ分布、製造適性（例えば、無菌ろ過適性等）、並びに製剤として必要な保存安定性を両立できる、溶解状態の水溶性薬物を内包しているリポソーム組成物を工業的規模で効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は乳化法で製造されたリポソーム（実施例１）のＤＳＣサーモグラムである。
【図２】図２はバンガム法で製造されたリポソーム（比較例１）のＤＳＣサーモグラムである。
【図３】図３はリポソームに内包された薬物量と経過時間の関係をプロットしたものである。
【図４】図４は外水相に存在する薬剤の存在率（未内包率）と経過時間の関係をプロットしたものである。
【図５】図５は体積平均粒子径と経過時間の関係をプロットしたものである。
【図６】図６は薬物放出率と経過時間の関係をプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明は、有機溶媒に溶解して乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、リポソームが溶解状態の水溶性薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物である。
【００２６】
（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
【００２７】
リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態などが挙げられ、これらの組合せでもよい。
【００２８】
リポソームの大きさ（平均粒子径）は特に限定されないが、２〜２００ｎｍであり、好ましくは５〜１５０ｎｍ、より好ましくは５〜１２０ｎｍであり、さらに好ましくは５〜１００ｎｍである。なお、本発明において、「平均粒子径」とは、光散乱法により測定されるリポソームの直径の平均値を意味する。
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
【００２９】
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものであれば任意に使用することができる。脂質として、具体的には、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種又は複数種の成分から構成されてよい。
【００３０】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、又はこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。これらのなかでも、水素添加大豆ホスファチジルコリンなどの水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましく、水素添加大豆ホスファチジルコリンがより好ましい。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。
【００３１】
リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、特に限定されないがリン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。
【００３２】
リン脂質以外の脂質が塩基性官能基を含む場合、例えば、脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。
【００３３】
コレステロール類としては、コレステロールを挙げることができる。平均粒子サイズが１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。しかし、漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋めるためにコレステロールなどを添加することが有効である。
【００３４】
リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸、ジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤などの添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
【００３５】
本発明のリポソームには、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体として、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類を親水性高分子で修飾することが含有することが好ましい。
【００３６】
親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は最も汎用であり、血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。
【００３７】
ＰＥＧの分子量は、特に限定されない。ＰＥＧの分子量は５００〜１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００〜７，０００ダルトン、より好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンである。
【００３８】
本発明のリポソームでは、リポソームに含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ＰＥＧ修飾脂質）を用いることが好ましい。ＰＥＧ修飾脂質としては、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）及びジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。これらのＰＥＧ修飾脂質は、全脂質量に対して０．３〜５０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％含有するように添加すればよい。
【００３９】
本発明のリポソームでは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（リポソームに含まれる主たる脂質）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（主たる脂質と併用する脂質）、及びコレステロールの脂質の組合せが好ましい。
【００４０】
（リポソームの膜の組成）
示差走査熱量測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＣ）によれば、測定物がもつ相転移温度又はＴｍが測定できる。相転移温度又はＴｍとは、リポソームの脂質二重膜において規則的な脂質を特徴とする低温のゲル相（固体−規則相）から、脂質が高い立体不規則性を有する（液体−不規則相）高温の流体相に移行する温度を意味する。具体的には、ＤＳＣサーモグラムによる相転移ピーク（脂質構造の破壊に由来する吸熱ピーク）の形状により、得られたリポソームの膜の組成の均一さを知ることができる。
【００４１】
示差走査熱量測定は、例えば、示差走査熱量計（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて行うことができる。示差走査熱量計は特に限定されることはなく、例えば、セイコーインスツル株式会社（ＳＩＩ）製のＤＳＣ１２０等が使用できる。リポソームのサンプルに対して、昇温速度は特に限定されることはないが、０．２℃／分から２０℃／分の昇温下で行うことができる。また、走査温度範囲は制限されることはなく、リポソームの相転移温度に応じて、所望する吸熱ピークが観察できる範囲であればよい。例としては、５℃付近から１００℃付近まで走査すればよい。
【００４２】
例えば、図１は、本発明の乳化法で製造されたリポソーム（実施例１）及びバンガム法で製造されたリポソーム（比較例１）に関して得られたＤＳＣサーモグラムである。内水相の浸透圧の高いリポソームにおいては、脂質膜の一部が指組みゲル相（ＬβＩ相）を形成することが知られており、指組みゲル相とラメラゲル（Ｌβ’相）の２成分に帰属される吸熱ピークが生じる。実施例１で得られたリポソームでは、明瞭な２つの吸熱ピークが得られたが、比較例１で得られたリポソームでは、吸熱ピークは２つに分離されなかった。これは、後者はリポソーム膜の組成が不均一であるため、個々のリポソーム粒子に対して指組みゲル相化が均一に起こらず、様々な吸熱ピークを持ったリポソーム粒子が存在することで見かけ上ひとつのピークになったためである。一方、本発明の実施例１では明瞭に２つのピークが示され、リポソーム膜の組成が均一であることが分かる。
【００４３】
（薬物）
本発明のリポソームは、薬物として水溶性薬物の少なくとも一つを含むことができる。
水溶性薬物の場合、リポソームの内水相に保持する形態が有利となるが、脂質二分子膜は薄く、やわらかいために薬物が漏出しやすくなることがある。しかし、本発明のリポソームの製造方法によれば、粒子径を１００ｎｍ程度以下にしても、安全性及び安定性を有するリポソームが製造できる。
【００４４】
薬剤に含まれる薬物は、リポソームに内包することのできる水溶性の薬物であればよく、具体的には、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、低分子化合物、糖類（オリゴ糖及び多糖）、高分子化合物、抗腫瘍剤、抗菌剤、造影剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、育毛剤等の生理活性又は薬理学的活性を有する水溶性の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームを薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、安定性の観点から、水溶性薬物は低分子化合物であることが好ましい。
【００４５】
水溶性薬物としては、具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンなどのアントラサイクリン系、シスプラチン、オキサリプラチンなどのシスプラチン系、パクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン系、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系、ブレオマイシンなどのブレオマイシン系、シロリムスなどのシロリムス系の抗がん剤、メトトレキセート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビンなどの代謝拮抗剤等が挙げられる。これらのなかでも、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ペメトレキセド等の水溶性薬物が好ましい。
【００４６】
（溶解状態で内包した水溶性薬物）
本発明のリポソームに内包した水溶性薬物は、リポソームの内水相に溶解状態で存在している。ここで、溶解状態とは、リポソームの体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで薬物結晶が観察されないこと、ＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合は、脂質膜が作る物理化学的な環境による溶解促進や、一部薬物が脂質膜に取り込まれるなどして大部分が溶解していることを示し、溶解状態で内包されたものとみなす。また、リポソーム内部で固体物を形成させて、薬物を封入させるローディング方法により内包したものは、水溶性の高い薬物であっても、本発明でいう溶解状態ではない。
【００４７】
溶解状態で内包させる水溶性薬物としては、水に対して１ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものがより好ましい。
【００４８】
（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソームの製造方法は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整するリモートローディング工程
を有するリポソーム組成物の製造方法である。リポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程等、他の工程を含んでよい。
【００４９】
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した混合脂質を乳化することでリポソームを形成する乳化工程では、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶剤を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
【００５０】
（乳化工程）
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化する。脂質が有機溶媒に溶解している油相及び水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相及び水相がＯ／Ｗ型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。又は、油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
【００５１】
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波又は機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理又はマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、薬物をローディングしない状態のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。
【００５２】
本発明では、撹拌の速度及び時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性及び安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ以上３５ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ以上３０ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることがより好ましい。
【００５３】
（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又はシクロヘキサンといった有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤をまったく用いないことがより好ましい。
【００５４】
水溶性有機溶媒は、特に限定されないが、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒は、具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類などが挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノール、及びｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
【００５５】
エステル系有機溶媒は、特に限定されないが、有機酸及びアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒は、具体的には、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチルがより好ましく、酢酸エチルがさらに好ましい。
【００５６】
水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合比率は、特に限定されないが質量比で、９０：１０〜３０：７０、好ましくは８０：２０〜４０：６０、より好ましくは８０：２０〜７０：３０であればよい。水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水又は緩衝液など下記に述べる水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば１〜３０質量％の範囲で加えられていてもよい。混合溶媒のｐＨは、特に限定されないが、３〜１０程度の範囲が好ましく、４〜９程度であることがより好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬剤などの生理活性物質などを含んでいてもよい。
【００５７】
水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、特に限定されないが質量比で、８０：２０〜７０：３０であることが好ましい。
【００５８】
脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、４０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、好ましくは４０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであればよい。
【００５９】
（水相）
水相とは、外水相及び内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドバッファーなどがあげられる。水相のｐＨは特に限定されないが、５〜９、好ましくは７〜８であればよい。例えば、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳともいう）及びトリス緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００６０】
（蒸発工程）
本発明では、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、及び油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。
【００６１】
蒸発工程における有機溶剤を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、及び真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
【００６２】
本発明では、有機溶剤を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶剤を蒸発させる工程の開始後から３０分間以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。
【００６３】
本発明の製造方法を実施する際の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃以上７０℃以下とすることが好ましい。
【００６４】
乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、又は濃度や浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過、凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。
【００６５】
得られたリポソームは、透析法、濾過法、エクストリュージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。本発明のリポソーム組成物の製造方法では、薬物をローディングしない状態の空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに調製することが好ましい。また、リポソーム内に内包された薬物と内包されない薬物とを分離するには、遠心分離法、透析法、ゲル濾過法等が利用できる。
【００６６】
（エクストリュージョン処理）
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液及びフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
【００６７】
（薬物ローディング工程）
本発明の薬物ローディング工程では、リポソームに水溶性薬物を封入させる場合、水和・膨潤させる水性媒体に薬物を溶解し、相転移温度以上での加熱、超音波処理又はエクストルージョン等の方法により薬物をリポソームの内水相に内包させることができる。また、脂質乳化時の水相に薬物を溶解させ内水相に内包させることもできる。
【００６８】
（浸透圧調整工程）
本発明では、浸透圧調整工程によって、リポソームの内水相を高張にすること（外水相との圧力差）によって、薬物が放出しやすくなる。浸透圧を設定することにより、リリース速度が制御できる。浸透圧調整工程として、特に限定されないが、薬物ローディング工程の後に透析などの方法が採用できる。これにより浸透圧を調整することができる。また、本発明では、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程（好ましくは内水相の浸透圧調整）を同時に行うことが、生産効率の観点から好ましい。
【００６９】
本発明では、放出（リリース）の制御することにより、例えば、ドラッグデリバリーシステムとして本発明のリポソームを用いた場合、ターゲットとする患部において、必要とする薬物を必要な量を放出することができる。ただし、高張のリポソームは、薬物を放出し易いという反面、保管時にも漏出し易くなるという、保管安定性との両立が困難である。本発明のリポソームの組成物によれば、乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームに対して、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるように設定することで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるという予想外の効果を有する。
【００７０】
一般に、内水相を高張にする方法としては、例えば、薬物が内包されていないリポソームの内水相と外水相とを高い浸透圧にして、その後、透析などで、外水相の浸透圧を低下させる方法がある。その場合、その後に行われる薬物ローディング工程において、内水相に含まれる薬物が漏出し、かつ内水相の浸透圧が低下することがある。
【００７１】
したがって、本発明では、薬物のローディングとともに、高い浸透圧の溶液で内水相を置換し、その後、透析により外水相の薬物の除去と外水相浸透圧の低下を同時に行うことで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。
【００７２】
本発明のリポソームでは、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、好ましくは２．５倍〜６倍であり、より好ましくは３倍〜５倍である。２倍以上にすることによって、リポソームの脂質二重膜は、二重膜構造又は指組み構造などの構造を示すことが一般的に知られている。内水相の浸透圧が外水相に対して２倍以上になると、リポソームは二重膜構造から指組み構造になり始める。本発明では、好適な指組み構造をとるために、各種脂質の条件を設定すればよいが、コレステロール比率の調整により制御することが好ましい。その結果、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。
【００７３】
最終的な薬物ローディング工程後に得られた液は、外水相と内水相の溶質が均一化されており、そのときの浸透圧を、完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧と定義できる。ただし、その後の外水相の透析による置換・浸透圧調整工程において、加熱操作は脂質の相転移以下に抑えるなど、内水相の溶質が充分に保持されている場合に限る。また外水相の浸透圧は、最終的な透析工程に用いる透析液の浸透圧で定義できる。ただし、透析液にて充分に置換できた場合に限る。また、リポソーム組成物の完成液について、遠心分離や限外ろ過を利用し、外水相の溶質の組成濃度と内水相の溶質の組成濃度を定量し、その組成液の浸透圧を計測することでも、内水相及び外水相の浸透圧を得ることができる。
【００７４】
浸透圧の計測は第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定法にしたがえばよい。具体的には水の凝固点（氷点）降下度測定により、オスモル濃度を求めることができる。また、水の凝固点降下度は溶質モル濃度で定義されるものであり、溶質モル濃度からもオスモル濃度を求めることができる。
【００７５】
本発明における外水相とは、リポソームの外側を占める水溶液である。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
【００７６】
本発明における外水相の持つ浸透圧は、投与に際して重要な影響を生体に及ぼす。体液の浸透圧から大きく離れる場合は、各組織での水分の移動を原因とした溶血や痛みが発生する。したがって、本発明における外水相の浸透圧は、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、もっとも好ましくは体液と等張である。
【００７７】
（無菌ろ過）
本発明のリポソーム組成物の製造方法によって得られた、リポソームを含む水溶液を医薬組成物とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。通常、ろ過工程において、ろ過滅菌フィルターへのリポソームが吸着又は凝集が発生することがある。しかし、本発明では、特定の平均粒子径及び均一な粒子径分布を有するリポソームが得られるため、ろ過を行う時に圧損などの影響が少ないという予想外の効果を有する。
【００７８】
リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程及び後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。
【００７９】
（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソームを含む水溶液は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
【００８０】
本発明によって得られるリポソームを含む水溶液に、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えてリポソーム組成物を含有する医薬組成物とすることができる。医薬組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、及びｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。
【００８１】
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００８２】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００８３】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ等が挙げられる。安定化剤及び酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
【００８４】
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウムなどが挙げられる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
【００８６】
特に、本発明では、医薬組成物に、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウム、塩酸などを含有することが好ましい。
【００８７】
医薬組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
【００８８】
医薬組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部及び薬液中のガスを窒素などの不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。
【００８９】
医薬組成物の投与方法は、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、髄腔内注射を選択することができる。リポソーム組成物の具体的な投与方法としては、シリンジ、点滴による投与が挙げられる。
【００９０】
医薬組成物に含まれる薬物の投与量は、通常、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかし、本発明のリポソーム組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のリポソーム組成物及びその製造方法では、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。本発明のリポソーム組成物は、医薬品、化粧品、食品など適用可能であり、特に医薬用途に有用である。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
溶剤組成における混合比は容量比を意味する。例えば、「エタノール／酢酸エチル＝９０／１０」は、容量比で９０％エタノール／１０％酢酸エチルを意味する。【００９３】
（実施例１）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧともいう）を７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６．６ｇ、２．０ｇ、４．３ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝３／１）４０５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【００９４】
ｂ）水相の調製
６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８６）を調製し水相とした。【００９５】
ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機にて、周速２０ｍ／ｓ、１３０００ｒｐｍにて３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤と水とを蒸発させ、乳化前の容積に対して約１／１０の体積になるまで濃縮し、薬物未内包リポソームを得た。このときの粒子径は６６．９ｎｍであった。【００９６】
ｄ）薬剤内包リポソームの調製
薬物ローディング
塩化ナトリウム８１．６３ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２９．０１ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．２９ｇを注射用水９４８ｇで溶解し、ＰＢＳとした。ゲムシタビン塩酸塩２９．５７ｇ、ＰＢＳ１２３．０９ｇ、日局注射用水１７２．５９ｇ、８Ｍ水酸化ナトリウム６．１７ｍＬを混合し、薬物溶液とした。つづいて、二つの容器にそれぞれ薬物溶液１３７．２ｍＬ、薬物未封入リポソーム１４０．０ｍＬ、８Ｍ水酸化ナトリウム２．８ｍＬを混合した。この液の浸透圧は１０３９ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧となる。次にこの液を７０℃で１０分間加熱した後４０℃まで冷却し、１０１８ｍＭスクロース／３７ｍＭヒスチジン溶液で希釈した。希釈後、ひとつにまとめ、薬物ローディング液とした。【００９７】
透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程より、ゲムシタビン塩酸塩濃度０．７１ｍｇ／ｍＬ、粒子径７５．７ｎｍ、内水相浸透圧１０３９ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．６倍の薬物内包リポソーム組成物を得た。【００９８】
（比較例１）バンガム法による薬物内包リポソームの作製
ａ）脂質薄膜の作製
ナス型フラスコに水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６６０ｍｇ、４３１ｍｇ、２０５ｍｇ取り、次いで有機溶媒（クロロホルム／メタノール＝５／１）２０ｍｌを加えて溶解させた。つづいて、エバポレーターにて有機溶媒を除去し、ナスフラスコの内壁面に脂質薄膜を得た。【００９９】
ｂ）水相の調製
６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８６）を調製し水相とした。【０１００】
ｃ）薬物未内包リポソームの調製
脂質薄膜が形成されたナスフラスコに水相を２０ｍＬ加え６０℃にて脂質薄膜を水和した後、超音波洗浄機にナスフラスコを浸し脂質薄膜を分散することで、粗大な薬物未内包リポソーム液を得た。エクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、０．２μｍフィルター及び０．０５μｍフィルターを順次通過させることで整粒し、薬物未内包リポソームを得た。得られた薬物未内包リポソームは、粒子径８３．２ｎｍであった。【０１０１】
ｄ）薬剤内包リポソームの調製
薬物ローディング
ゲムシタビン塩酸塩１．１ｇ、実施例１のｄ）で作製したＰＢＳ４．６ｇ、日局注射用水６．５ｇ、８Ｍ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを混合し、薬物溶液とした。つづいて、薬物溶液に薬物未封入リポソーム１２．１２ｇ、８Ｍ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを混合した。次にこの液を７０℃で１０分間加熱した後４０℃まで冷却した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は１０３９ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソーム組成液の内水相浸透圧となる。つづいて、実施例１のｄ）で作製したＰＢＳを２．７倍重量希釈し、薬物溶液を３倍希釈した。【０１０２】
透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程より、ゲムシタビン濃度１．０２ｍｇ／ｍＬ、粒子径８９．６ｎｍ、内水相浸透圧１０３９ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．６倍の薬物内包リポソーム組成物を得た。【０１０３】
ＤＳＣサーモグラム
図１は、乳化法で製造されたリポソーム（実施例１）で製造されたリポソーム（比較例１）のＤＳＣサーモグラムを示す。図２は、バンガム法で製造されたリポソーム（比較例１）のＤＳＣサーモグラムを示す。２０μＬの薬剤内包リポソーム液をアルミニウムハーメチックパン（Ｔｚｅｒｏ社製）に充填密封し、ＤＳＣ  Ｑ２０００（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）にて、０．５℃／分の走査速度で２５℃から７０℃まで測定を実施した。本発明の乳化法で製造されたリポソーム実施例１は、指組みゲル相を示すピーク及びラメラゲル相を示すピークの２つのピークが明瞭に示され、リポソーム膜の組成が均一であることが分かる。【０１０４】
（実施例２）
油相の調製において水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧをそれぞれ４９．９ｇ、６．１ｇ、１２．９ｇ用いたこと、水相／油相混合液を回転かき混ぜ式乳化機にて周速１９ｍ／ｓ、１２０００ｒｐｍにて３０分間混合したこと、薬物ローディング工程において実施例１のｄ）で作製したＰＢＳの代わりに１０×ＰＢＳ（ニッポンジーン社製）を使用し、２．７倍重量に希釈した実施例１のｄ）で作製したＰＢＳの代わりに１０×ＰＢＳ（ニッポンジーン社製）を用いたこと以外は実施例１同様に作製し、ゲムシタビン濃度０．７２ｍｇ／ｍＬ、粒子径８４ｎｍ、薬物未内包率２．１％、内水相浸透圧１０３９ｍＯｓｍ／ｋｇ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．６倍の薬物内包リポソーム組成物を得た。【０１０５】
保管安定性の測定
実施例２の薬物内包リポソームを２ｍＬガラスバイアルに充填し５℃にて保管し、一定の時点で試料として一部サンプリングを実施した。この試料を用いて、下記各種評価を実施し、本発明におけるリポソーム組成物の安定性を評価した。【０１０６】
薬物の安定性の測定
サンプリングした試料５０μＬをメタノールで２０倍希釈（体積）することでリポソームに内包された薬物を抽出した。つづいて、抽出液を水で１０倍希釈（体積）し、この液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量した結果を図３に示す。１２ヶ月の長期間に渡り、本発明のリポソーム組成物における薬物が充分に安定であることが分かった。【０１０７】
未内包率の測定
サンプリングした試料５０μＬを水で１０倍希釈（体積）し、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ、ミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、外水相に存在する薬剤の存在率（未内包率）を次の式により算出し、結果を図４に示す。【０１０８】
式：未内包率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×１０）÷製剤中薬物濃度×１００【０１０９】
驚くべきことに、１２ヶ月の長期間に渡り未内包率の変化がほとんどなく、本発明のリポソーム組成物の薬物が外水相に漏れずに充分に安定であることが分かった。【０１１０】
平均粒子径の測定
サンプリングした試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３３倍希釈（体積）し、ＦＰＡＲ−１０００ＡＳ（大塚電子社製）を用い、動的光散乱法にて体積平均粒子径を測定した。結果を図５に示す。【０１１１】
２４ヶ月の長期間に渡り粒子径の変化がほとんどなく、本発明のリポソーム組成物の粒子は充分に安定であることが分かった。【０１１２】
血漿中の薬物放出率の測定
サンプリングした試料５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。つづいて限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ、ミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、血漿中に放出された薬物放出率を次の式により算出した。
式：薬物放出率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×２０）÷製剤中薬物濃度×１００
結果を図６に示す。【０１１３】
驚くべきことに、２４ヶ月の長期間に渡り薬物放出率の変化がほとんどないことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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