(57)【要約】  肝臓感染ステージのマラリア原虫が次のステージに至るために必須のタンパク質を同定すること、このタンパク質を阻害する化合物を検索するための試験方法を提供すること、及び該タンパク質を阻害することで、マラリア原虫の感染を阻害する化合物を提供することを課題とする。  マラリア原虫が肝臓感染ステージの中期から後期において宿主細胞内で特異的に発現するLS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害するか否かを評価することを特徴とするマラリア原虫の感染阻害物質の試験方法によって達成される。【選択図】          図２
2014084333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリア原虫が肝臓感染ステージの中期から後期において宿主細胞内で特異的に発現するLS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害するか否かを評価することを特徴とするマラリア原虫の感染阻害物質の試験方法。
【請求項２】
上記試験方法が、肝臓由来の培養細胞を用いる in vitro（イン・ビトロ）法であることを特徴とする請求項１に記載のマラリア原虫の感染阻害物質の試験方法。
【請求項３】
前記肝臓由来の培養細胞が細胞株であり、Alexander cells, HepG2, HLE, HLF, huH-1, HUH-6, HUH-7, JHH-1, JHH-2, JHH-4, JHH-5, JHH-6, JHH-7, LI90, PLC/PRF/5, Hepa1-6, 3'-mRLh-2, 3'-mRLN-30, 3'-mRLN-31, Ac2F, AH601, AH66tc, AH70Btc, ARLJ301-3, BRL-3A, dRLa-74, dRLh-84, dRLN-4, dRLN-6, dRLN-9, FAA-HTC1, FF101, FLS3, FLS5, IAR-20, JTC-16P3, M, M.P3, NCTC clone1469, RI-T, RL-34, RLC-10P3, RLN-8, RLN-10, RLN-B2, RLN-J-5-2, TLR2, TLR3,及びWB-F344からなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項２に記載の感染阻害物質の試験方法。
【請求項４】
上記試験方法が、齧歯類を用いるin vivo（イン・ビボ）法であることを特徴とする請求項１に記載のマラリア原虫の感染阻害物質の試験方法。
【請求項５】
メロゾイト形成の確認時間が、マラリア原虫の感染24時間後〜60時間後の間であることを特徴とする請求項３または４に記載の感染阻害物質の試験方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の感染阻害物質の試験方法を実施するための試験キット。
【請求項７】
請求項６に記載の試験キットであって、請求項３に記載された細胞株のうちの一つと、培養プレートと、マラリア原虫とを含むことを特徴とする試験キット。
【請求項８】
LISP2を抗原として含むことを特徴とするマラリアワクチン。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の試験方法によって検出されて、LISP2の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害するマラリア原虫の感染阻害物質。
【請求項１０】
マラリア原虫が肝臓感染ステージの中期から後期において宿主細胞内で特異的に発現するLS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害するマラリア原虫の感染阻害物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫肝臓ステージの感染に関わる原虫蛋白質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは年間約5億人の感染者と約200万人の死者を出し、HIV、結核と並ぶ世界3大感染症の一つである。現在、薬剤耐性原虫の地球規模での蔓延により治療は困難な状況にある。即ち、殆ど全ての抗マラリア薬（クロロキン、メフロキン、ファンシダール等）に対する耐性原虫が分布拡大し、有効性が低下している。
肝臓感染ステージ（liver stage (LS)）は、マラリア原虫がヒトに寄生する際の最初のステージである。マラリア原虫に寄生された蚊がヒトを刺すと、スポロゾイトが皮内に注入される。スポロゾイトは肝臓に移動した後、肝細胞中に寄生胞（parasitophorous vacuole(PV)）を形成して侵入し、肝臓感染ステージへと進む。肝臓感染ステージのマラリア原虫は、最終的に数千個のメロゾイトへと変化し、血中に放出された後に、赤血球に感染する。
肝細胞はマラリア原虫に対する感染防御の最前線である。肝細胞はマラリア原虫感染に対する免疫システムを持ち（Bongfen et al., 2007; Chakravarty et al., 2007; Cockburn et al., 2011：先行技術文献については、末尾にまとめて示した。）、インターフェロンやTNF-αなどのサイトカインに応答することで、細胞中のマラリア原虫を排除することが知られている（Depinay et al., 2011）。また、寄生された肝細胞が、アポトーシスを起こすことで、赤血球への感染拡大が抑制されることも知られている（van de Sand et al., 2005）。マラリア感染時には原虫と宿主の肝細胞との間にはダイナミックな相互作用が存在すると考えられる。しかし、肝臓感染ステージでのマラリア原虫と肝細胞との相互作用については、ほとんど知られていない。特に、マラリア原虫が宿主細胞内で感染を維持する機構、及びそのために重要な遺伝子については、多くが未知のままである。【０００３】
ヒトのマラリア感染症において最も重篤な影響を与える熱帯熱マラリア原虫が赤血球内に寄生するときには、マラリア原虫から宿主の赤血球に対して多くのタンパク質が輸送されることが知られている（Maier et al., 2009; Crabb et al., 2010; Haase ＆ de Koning-Ward, 2010）。これらのタンパク質は、様々な方法で赤血球を修飾し、その内部環境をマラリア原虫に適するように変化させる。また、これらのタンパク質には、赤血球表面上のこぶ状構造形成に関与するもの（Moxon et al., 2011）、マウアーズ・クレフト（Maurer’s clefts）と呼ばれる膜構造形成に関与するもの（Lanzer et al., 2006; Tilley et al., 2008; Sam-Yellowe, 2009）、宿主細胞の細胞質に原虫タンパク質を輸送するために重要なものなどがある。これらのタンパク質はまた、宿主細胞から栄養を得るためにも重要な働きをしていると考えられている（Maier et al., 2008）。これに対し、肝臓感染ステージのマラリア原虫については、宿主の肝細胞にタンパク質を輸送するという明らかなデータは得られていない。【０００４】
スポロゾイトのメジャーな表面タンパク質であるCircumsporozoite (CS) タンパク質は、肝細胞の細胞質に輸送される唯一のマラリア原虫タンパク質として知られている。CSタンパク質は、スポロゾイトの侵入から数時間後に、肝細胞の細胞質に観察される（Khan et al., 1992; Singh et al., 2007; Cockburn et al., 2011）。但し、肝臓感染ステージのマラリア原虫によっても生産されるのかについては不明である（Singh et al., 2007）。また、中期から後期の肝臓感染ステージのマラリア原虫によって生産され、肝細胞の細胞質に輸送されるタンパク質については知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、肝臓感染ステージのマラリア原虫が次のステージに至るために必須のタンパク質を同定すること、このタンパク質を阻害する化合物を検索するための試験方法を提供すること、及び該タンパク質を阻害することで、マラリア原虫の感染を阻害する化合物を提供することである。
また、発明者らは、人工染色体をマラリア原虫に導入して、原虫で直接遺伝子ライブラリーを作製してスクリーニングすることにより耐性遺伝子を同定する技術を開発した。このような手法はマラリア原虫を含む全ての病原性真核生物において例が無く、極めて独創的なものである。本手法を使用すれば僅か数週間で耐性遺伝子を同定することが可能となり、前述の抗マラリア薬に対する耐性遺伝子の同定が期待される。
本研究において、我々は肝臓感染ステージのマラリア原虫特異的なタンパク質として、LS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）を同定した。LISP2は、肝臓感染ステージのマラリア原虫において、最も多量なタンパク質の一つである。LISP2は中期から後期の肝臓感染ステージで生産され、分泌小胞によってPVに運搬された後、宿主細胞の細胞質と核に運搬される。我々の知見によれば、これは中期から後期の肝臓感染ステージのマラリア原虫によって生産され宿主細胞に輸送されるタンパク質として、最初に報告されるものである。なお、特許文献１には、LISP2を血液ステージにおける接着タンパク質と考え、診断治療に役立てることができると考えている。しかしながら、本蛋白質は、実際は血液ステージには発現されておらず、肝臓での利用を目的とする本発明とは全く関係しない。
LISP2欠損型は、通常の繁殖ステージを経て、メロゾイトに至る。しかし、ほとんどのLISP2欠損型は、メロゾイトに変形するときに阻害作用を受けて、赤血球に侵入する機能を欠く異常メロゾイトとなってしまう。本研究において、外来のLISP2が宿主の肝細胞と直接的に作用することによって、マラリア原虫の増殖に寄与することが示された。
この知見に基づけば、LISP2を阻害する化合物は、マラリア原虫の感染を阻害する薬物となり、LISP2を抗原とするワクチンはマラリア原虫の感染を阻止するマラリアワクチンとして利用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
こうして本発明に係るマラリア原虫の感染阻害物質の試験方法は、マラリア原虫が肝臓感染ステージの中期から後期において宿主細胞内で特異的に発現するLS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害するか否かを評価することを特徴とする。
上記試験方法は、肝臓由来の培養細胞を用いるin vitro（イン・ビトロ）法であることが好ましい。そのような培養細胞としては、例えば初代培養細胞または細胞株を用いることができる。細胞株を用いる場合には、ヒト由来のもの（例えば、Alexander cells, HepG2, HLE, HLF, huH-1, HUH-6, HUH-7, JHH-1, JHH-2, JHH-4, JHH-5, JHH-6, JHH-7, LI90, PLC/PRF/5などが例示される）、または齧歯類由来のもの（ラット、マウス由来のもの（例えば、Hepa1-6, 3'-mRLh-2, 3'-mRLN-30, 3'-mRLN-31, Ac2F, AH601, AH66tc, AH70Btc, ARLJ301-3, BRL-3A, dRLa-74, dRLh-84, dRLN-4, dRLN-6, dRLN-9, FAA-HTC1, FF101, FLS3, FLS5, IAR-20, JTC-16P3, M, M.P3, NCTC clone1469, RI-T, RL-34, RLC-10P3, RLN-8, RLN-10, RLN-B2, RLN-J-5-2, TLR2, TLR3, WB-F344などが例示される）を使用できる。【０００７】
また、上記試験方法は、齧歯類を用いる in vivo（イン・ビボ）法であることが好ましい。そのような齧歯類として、ラット、またはマウスを例示できる。
LISP2は、宿主の肝細胞において、マラリア原虫の肝臓感染ステージの中期から後期に発現されて、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成に必須のタンパク質である。このため、LISP2の作用を抑制することで、メロゾイト形成を阻害できる。このため、本発明において「LISP2の作用を抑制する」とは、LISP2の転写・翻訳・宿主細胞への輸送・宿主細胞内における局在分布のための輸送・他の分子との相互作用によるLISP2のタンパク質の作用の発揮などのいずれ一つまたは二つ以上の作用点を妨害することにより、その作用を発揮させなくすることを意味する。すなわち、そのような物質の働きとしては、例えばLISP2の発現プロモータの制御、転写阻害、翻訳後修飾の阻害、宿主細胞への輸送の阻害、宿主細胞内における局在分布のための輸送の阻害、他の分子との相互作用の阻害などが例示される。
また、LISP2の作用を抑制するために阻害物質が存在すべき時間は、上記いずれかの作用点によって異なる。このため、マラリア原虫を宿主に感染させる前、感染と同時、感染から数時間後〜60時間後までのいずれかの段階で効果を発生し得る。本願発明では、阻害物質の存在時期についても、適切な評価を行い得る。【０００８】
別の発明に係るマラリアワクチンは、LISP2を抗原として含むことを特徴とする。特に、ヒトに対するマラリアワクチンを提供するためには、各種のマラリア原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、サルマラリア原虫（P. knowlesi）、ネズミマラリア原虫（P. berghei, P. yoelii）など）のLISP2を抗原として使用する。LISP2は、その全部または一部を抗原として使用できる。LISP2の全部または一部を単独または適当なアジュバント（免疫補助剤）を添加してマラリアワクチンとできる。
また、別の発明に係るマラリア原虫の感染阻害物質は、上記試験方法によって検出されて、LISP2の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害することを特徴とする。
また、別の発明に関するマラリア原虫の感染阻害物質であって、マラリア原虫が肝臓感染ステージの中期から後期において宿主細胞内で特異的に発現するLS特異的タンパク質2（LS-specific protein 2 (LISP2)）の作用を抑制することにより、マラリア原虫の肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成を阻害することを特徴とする。
上記感染阻害物質としては、低分子化合物、高分子化合物、核酸（DNA、RNA、DNA-RNAハイブリッドを含む。また、一重鎖、二重鎖、三重鎖の形態を含む。重合度としては、１個〜数千個のものを含む。）、タンパク質（抗体（同種、異種、またはハイブリッドされたものを含む。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む）などが含まれる。
【発明の効果】
【０００９】
このように、本発明によれば、LISP2が、マラリア原虫によって肝臓感染ステージに発現され、かつ肝細胞内に輸送されることで、マラリア原虫が肝細胞内での増殖に極めて重要な働きをしていることが証明された。LISP2が肝細胞の細胞質に存在することは、薬剤やワクチンの標的になりやすいことを意味する。
また、LISP2を阻害する化合物を検索するための試験方法によって、マラリア原虫の感染を阻害する化合物を検索できる。そのような化合物は、マラリア原虫の感染を阻害する医薬品として提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】セントロメアプラスミドを用いたプロモーターアッセイの概要を示す図である。LISP2の発現は、セントロメアプラスミド Pcen-rep GFP及びPcen-rep DLを用いたプロモーターアッセイによって実施した。  (A)本研究に用いた構築物のプラスミドマップである。LISP2遺伝子の上流1.2kb領域をGFP遺伝子（左側）または蛍ルシフェラーゼ遺伝子（右側）の上流側に挿入した。選択用マーカーとしてヒトDHFRを使用し、マラリア原虫の伸長因子プロモータによって発現させた。  (B)血液ステージ、オオキネート、オオシスト、及びオオシスト・スポロゾイトの代表的なイメージ写真である。白いバーは、10μmのスケールである。
【図２】LISP2は、肝臓感染ステージにおいて特異的に発現され、分泌される推定タンパク質であることを説明する図である。  (A)ネズミマラリア原虫（P. berghei）LISP2の構造を示すイメージ図である。LISP2は、2172個のアミノ酸からなり、N末端にシグナル配列を有し、約70個のアミノ酸を単位として長大な複数回の繰り返し部分を持つタンパク質である。反復配列は、図中の長方形にて示した。  (B)マラリア原虫のライフサイクル中において、LISP2の発現をレポーター遺伝子としてGFPを用いたプロモーターアッセイによって調べた。レポーター構築物には、セントロメアプラスミドPcen rep-GFPを使用し、LISP2遺伝子の1.2kb上流領域をGFP遺伝子の上流に組み込んだ。写真図として、唾液腺中スポロゾイト及び肝臓感染ステージの代表的なイメージを示した。肝臓感染ステージには、HepG2細胞を用いた。GFP発現は、感染36時間後に初めて認められた。GFP発現は、血液ステージ又は蚊内ステージでは認められなかった（図１を参照）。白いバーは、10μmのスケールである。  (C)LISP2プロモータの活性を、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いて評価した。肝臓感染ステージには、HepG2細胞を用い、横軸に示した時間で回収した。3個の独立したサンプルの平均値とS.E.を示した。  (D)肝臓における肝臓感染ステージのLISP2の発現プロファイルを定量的RT-PCR法で調べた。ラット静脈内に唾液腺中スポロゾイトを投与し、横軸に示した時間で肝臓を回収した。グラフには、マラリア原虫（P. berghei）HSP70を内部標準として比較したLISP2の相対発現量を示した。
【図３】マラリア原虫間のLISP2のアミノ酸配列を比較した図である。LISP2において最も良く保存されたアミノ酸配列部位を相異なるマラリア原虫（P. berghei [Pb]：配列番号２２, P. falciparum [Pf]：配列番号５７, P. vivax [Pv]：配列番号５８, and P. knowlesi [Pk]：配列番号５９）間で比較した。「*」は、4種間において保存されたアミノ酸を示す。四角内の配列部分は、予想される6-システインドメインを示す。
【図４】6-システインドメインであると予想された部位のアミノ酸配列をマラリア原虫（Plasmodium berghei）LISP2：配列番号２２と、他のP. berghei 6-システインファミリータンパク質との間で比較した図である。上側は、LISP2とp230 (PBANKA_030610：配列番号６０)を比較した結果を、下側は、LISP2とp41 (PBANKA_100260：配列番号６１)を比較した結果を示す。「*」は、保存されたアミノ酸を示す。6-システインモチーフのシステイン残基は、高度に保存されていた（四角で示す）。
【図５】LISP2は肝臓への感染に必須であることを示す図である。  (A)LISP2遺伝子の破戒の様子を示す。選択マーカ遺伝子としてP. berghei DHFR-ts（PbDHFR-ts）遺伝子を含むターゲティング構築物を相同組換えによって、LISP2座位に組み込んだ。構築物へのPbDHFR-tsの組換えは、PCR及びサザンブロット（右側）によって解析した。LISP2(-)は、LISP2変異型を示す。  (B)唾液腺中スポロゾイト接種後のラットの寄生虫血症の様子を示すグラフである。野生型またはLISP2変異型マラリア原虫の唾液腺中スポロゾイトをラットの静脈内に投与した。  (C)唾液腺中スポロゾイトをラットに投与し、投与24時間後に肝臓を採取した。肝臓感染ステージ原虫の負荷を、P. berghei 18S rRNAに対するプライマーを用いた定量的RT-PCRによって評価した。グラフには、ラットGADPHと比較したときのP. berghei 18S rRNAの相対量を示した。
【図６】LISP2は、メロゾイトに変化するために必須であることを示すデータである。  (A)スポロゾイトの投与後、培養細胞中の肝臓感染ステージの個数を調べたグラフである。野生型（WT）またはLISP2変異型（LISP2(-)）のスポロゾイト（3 × 104 per well）をHepG2細胞に添加した後、8穴チャンバースライドにて培養し、横軸に示すスポロゾイト添加後の時間に肝臓感染ステージのマラリア原虫の個数を計数した。  (B)スポロゾイト接種65時間後の野生型（WT）またはLISP2変異型（LISP2(-)）の肝臓感染ステージのマラリア原虫の代表的なイメージを示す顕微鏡写真図である。核をDAPIで染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。LISP2変異型の肝臓感染ステージのマラリア原虫は、娘細胞に分裂したが、メロゾイトに発展する前に進展が阻害された（図７を参照）。白いバーは、10μmを示す。  (C)野生型およびLISP2変異型のマラリア原虫の肝臓感染ステージにおける異型核の数と割合をスポロゾイト(5×104 per well)の投与77時間後に比較した。データは、独立した4回の実験の平均値とS.E.で示した。マラリア原虫は、Cytomereステージまで進展（メロブラスト形成を完了）したものの、メロゾイトとなるために必要な核分裂を完了できず、融合したまたは圧縮した様子の核を持つものを”異常な核を有する”と判断した。Cytomereステージへの進展に失敗したマラリア原虫については、一般的な培養細胞においてもCytomereステージへの進展に失敗することがありうることから、”異常である”とは判断しなかった。  (D)野生型（WT）またはLISP2変異型（LISP2(-)）のマラリア原虫肝臓感染ステージを培養し、培地中に放出されたメロゾイトをラット静脈内にを投与したときのラット血中の感染赤血球率を示すグラフである。スポロゾイトを培養細胞に接種し60時間後〜66時間後の各ウェルから培地を合計4回分取した。メロゾイトを培地から遠心分離により回収し、ラットに注射した。各ラットの感染赤血球率を縦軸に、メロゾイト投与からの時間を横軸に示した。LISP2変異型（LISP2(-)）において感染可能なメロゾイトの産生が著しく低下していることがわかった
【図７】LISP2変異型のマラリア原虫の多くは、メロゾイトに変化することが出来なかったことを示す顕微鏡写真図である。肝臓感染ステージのマラリア原虫をHepG2細胞で培養し、培地中に放出されたメロゾイトを各培地から回収し、マウスに投与した。本試験の後、LISP2変異型マラリア原虫の培地中（69時間後）に残っている肝臓感染ステージをDAPIで染色し、落射蛍光顕微鏡下で観察した。LISP2変異型マラリア原虫の多くには、異型の核が観察された（矢印）。
【図８】mCherryを融合させたLISP2の発現プロファイルと細胞内局在を示す図面である。  (A)mCherry融合LISP2を発現するマラリア原虫の遺伝子構造を示す。mCherry遺伝子およびヒトDHFR-TS遺伝子（選択マーカー）を含むターゲティング構築物は、ダブルクロスオーバー相同組換えによりGFP発現マラリア原虫のLISP2遺伝子座の3'部分に挿入した。構築物への挿入配列は、PCR及びサザンブロット（右側）によって解析した。  (B)肝臓感染ステージにおけるmCherry融合LISP2の発現を調べた顕微鏡写真図である。肝臓感染ステージのマラリア原虫は、HepG2細胞で培養し、共焦点顕微鏡で観察した。DAPI, GFP, mCherry 及びこれらを重ねて示したイメージである。白いバーは、10μmを示す。
【図９】LISP2::mCherry変異型マラリア原虫が、肝臓中で通常に発達することを示すグラフである。野生型またはLISP2::mCherry変異型マラリア原虫の唾液腺中スポロゾイトをラット静脈内に投与した。LISP2::mCherry変異型マラリア原虫の肝臓への感染能力は、ラットへの投与後の寄生虫血症によって評価した。
【図１０】mCherry融合LISP2は、血液ステージ及び蚊内ステージでは発現しないことを示す顕微鏡写真図である。上段には、507株で伸長因子プロモーターの制御下において構成的に活性化したGFPの蛍光イメージを示す。下段には、上段の視野における赤色蛍光イメージを示す。mCherry融合LISP2のシグナルは、いずれのステージにおいても観察されなかった。白いバーは、10μmを示す。
【図１１】LISP2は、LISP1によって囲まれる分泌小胞によって運搬されることを示す顕微鏡写真図である。mCherry融合LISP2を発現している肝臓感染ステージのマラリア原虫を感染42時間後(A)、感染53時間後(B,C)に、抗mCherry抗体（赤色）と抗LISP1抗体（緑色）で染色した。核はDAPIで染色した。(A)の右側は、左側の写真中において、赤色（LISP2-mCherry）と緑色（LISP1）を重ね合わせて拡大表示したものである。(B)及び(C)は、別々の肝臓感染ステージのマラリア原虫のイメージである。白いバーは、10μmを示す。
【図１２】抗LISP2抗体が、LISP2変異型のマラリア原虫と反応しないことを示す顕微鏡写真図である。LISP2変異型の肝臓感染ステージのマラリア原虫を感染させて48時間後に共焦点顕微鏡で観察した写真図である。マラリア原虫を図１３と同じ抗LISP2抗体で免疫蛍光染色した。FITC及びDAPI画像を示した。白いバーは、10μmを示す。
【図１３】LISP2は宿主細胞に運搬され、核及び細胞質に分布することを示す顕微鏡写真図である。  (A)肝臓感染ステージのマラリア原虫を感染後48時間目に落射蛍光顕微鏡法によって観察した免疫蛍光染色顕微鏡像である。肝臓感染ステージのマラリア原虫はHepG2細胞で培養した。左側はLISP2リピート領域に対する抗体とFITCを結合した二次抗体で染色した像である。DAPIで核を染色したイメージを右側に示した。オープン矢印は肝臓感染ステージのマラリア原虫を、クローズ矢印は宿主細胞の核を示す。白いバーは、10μmを示す。  (B)さまざまな発達段階における肝臓感染ステージのマラリア原虫を共焦点顕微鏡で観察した写真である。培養した肝臓ステージマラリア原虫を感染24時間後（早期シゾント）、36時間後（発達中のシゾント）、48時間後（成熟シゾント）、及び55時間後（Cytomereステージ）において、(A)と同様に抗LISP2抗体で蛍光免疫染色した。FITC（緑色）、DAPI（青色）及び両者を重ね合わせたイメージを示した。白いバーは、10μmを示す。
【図１４】LISP2は、in vivo で肝細胞の細胞質と核にエクスポートされることを示す顕微鏡写真図である。ラットの静脈に野生型スポロゾイトを注射し、48時間後にリン酸緩衝生理食塩水を環流させて肝臓を採取し、ホルムアルデヒドで固定した。固定した肝臓から20μmの凍結切片を調製し、抗LISP2抗体で免疫染色を行った。共焦点顕微鏡を用いて観察した。核はDAPIで染色した。
【図１５】肝臓感染ステージのマラリア原虫をウエスタンブロットした写真図である。  (A)LISP2:: mCherry型、野生型、及びLISP2変異型 [LISP2（-）]のマラリア原虫をHepG2細胞で培養し、SDSサンプル緩衝液中で溶解することにより宿主細胞と共に回収した。感染48時間後に、LISP2反復領域に対する抗体（左側）またはmCherryに対する抗体（右側）を用いてウエスタンブロット解析を行った。黒丸で示すバンドは、LISP2::mCherry型マラリア原虫において、mCherryとLISP2に対する抗体を用いて検出された150kDaのものである。白丸で示すバンドは、野生型マラリア原虫において、LISP2に対する抗体を用いて検出された120kDaのものである。矢印で示すメジャーバンドは、野生型及びLISP2::mCherry型の両方のマラリア原虫において、LISP2反復領域に対する抗体を用いて検出された30kDaのものである。  (B)野生型スポロゾイト接種から24、36及び48時間後にLISP2反復領域に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行ったものである。白丸は30kDaのバンドを、矢印は120 kDaのバンドを示す。「LS」は肝臓感染ステージを、「LS(-)」は非感染HepG2細胞（ネガティブコントロール）を意味する。
【図１６】LISP2を抗原としたワクチンを投与したときの結果を示すグラフである。ワクチンによって免疫化されたマウス（LISP2-4）は、ワクチン無投与マウス（Control-1）に比べて、マラリア原虫の感染が50％抑制された。
【図１７】LISP2を抗原としたDNAワクチンを投与したときの結果を示すグラフである。ワクチンによって免疫化されたマウス（DNA vaccine）は、ワクチン無投与マウス（control）に比べて、マラリア原虫の感染が70％抑制された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
Ａ．LISP2の特徴を評価するための試験及び結果
＜試験方法＞
１．マラリア原虫の調製
全ての実験において、マラリア原虫として、「Plasmodium berghei ANKA」を用いた。スポロゾイトの調製のために、マラリア媒介蚊（Anopheles stephensi mosquitoes）をマラリア感染マウス（6〜10週齢、雌性Balb/cマウス、SLCより購入）から吸血させマラリア原虫を感染させ、20℃に保持した。オオシストと唾液腺中スポロゾイトは、それぞれマラリア媒介蚊が感染血液を吸血した後の14日目と24日目に回収した。ラットに感染させるために、滑走運動を確認した後の唾液腺中スポロゾイトを静脈内投与した。肝臓感染ステージのマラリア原虫を調製するために、唾液腺中スポロゾイトを回収し、8穴チャンバースライドに播種したHepG2細胞に添加した。室温にて、140×g、2分間遠心沈降した後、スライドを37℃にて30分間インキュベーションすることで細胞に感染させた。肝臓感染ステージのマラリア原虫は、10% FCSと3mg/mlグルコースを含有するRPMI1640培地を用い、5% CO2を含む大気中、37℃にて培養した。培地は、1日に2回ずつ交換した。
なお、本試験においては、ラットを宿主とするマラリア原虫（P. berghei）を用いている。これは、ヒトを宿主とするマラリア原虫を用いた試験系を実施できないこと、及びP. bergheiを用いた試験系において認められた結果は、ヒトマラリアにおいても同様に認められるという理由によるものである。
【００１２】
２．RT-PCR
唾液腺中スポロゾイトをラットに静脈内投与し、24時間後、36時間後、48時間後、及び60時間後に、肝臓をPBSにて環流した後、採取した。各肝臓から全RNAを抽出し、RT-PCR解析を行った。本研究において用いたプライマー配列を表１に示した。
【表１】
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【００１３】
３．抗LISP2抗体の調製
組換えGST融合タンパク質は、以下のようにして調整した。LISP2のリピート領域を含むゲノム配列をPCRにて増幅し、そのフラグメントをGEXベクター（GE Healthcare, Piscataway, NJ）にサブクローニングした。組換えGST融合タンパク質を大腸菌DH5αにて生産させた後、グルタチオン・セファロース・カラムにかけて精製し、ウサギの免疫に用いた。組換えGSTによって抗GST抗体を吸着した後、ウサギ抗血清から抗LISP2抗体を組換えタンパク質を結合させたセファロースカラムを用いて精製した。発現用プラスミドの調製に用いたプライマー配列は、表１に示した。
【００１４】
４．PACを用いたプロモーターアッセイ
マーカー遺伝子としてGFPを用いたプロモーターアッセイは、マラリア・セントロメア・プラスミド Pcen rep-GFPを用いて、既報の方法に基づいて実施した（Yuda et al., 2009）。LISP2の上流1.2-kb領域をアッセイに使用した。デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイには、マラリア・セントロメア・プラスミドPcen rep-DLと、デュアル・ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイシステム（Promega, Madison, WI）を使用した。これらのアッセイに使用した構築物は、図１に示した。構築物の作成に使用したプライマーは、表１に示した。
【００１５】
５．免疫細胞化学
免疫細胞化学には、8穴チャンバースライドを4％パラホルムアルデヒドで室温にて10分間固定した後、冷メタノールで10分間固定したものを使用した。スライドは、使用するまで−80℃にて保存した。保存したサンプルは、PBSにて洗浄後、BSA含有PBSにてブロッキングし、抗LISP2抗体と共に1時間インキュベーションした。その後、スライドをPBSにて2回洗浄し、DAPI（1mg/ml）とFITC結合二次抗体と共にインキュベーションした。二重免疫蛍光染色は、赤色蛍光タンパク対するラットモノクローナル抗体と抗LISP1ウサギポリクローナル抗体を用いて行った(Ishino et al., 2009)。ラットモノクローナル抗体は、クロモテック(Munich, Germany)から購入した。ラット肝スライスは、既報に従って調製した（Ishino et al., 2005）。
【００１６】
６．ウエスタンブロット解析
唾液腺中スポロゾイトを8穴チャンバースライドに播種したHepG2細胞に添加し、培養した。各ウエル中の感染HepG2細胞は、溶解した後に5%SDSを含むSDS-PAGE用緩衝液に回収した。ウエスタンブロット解析のために、サンプルをβメルカプトエタノールにて還元し、グラジエントゲル（5%〜20%）を用いて電気泳動した後、ナイロンメンブレン(Clear Blot Membrane-P, ATTO, Tokyo, Japan)上にセミドライブロッティングによって転写した。転写後のメンブレンをスキムミルクでブロックし、一次抗体とインキュベーションした後、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体で処理した。
【００１７】
７．蛍光タンパク質結合LISP2発現マラリア原虫の調製
mCherry融合LISP2を発現するマラリア原虫（Plasmodium berghei： LISP2::mCherry parasites）は、既報においてGFP融合タンパク質を発現するマラリア原虫を調製した際に使用した方法(Yuda et al., 2009)と基本的に同じ方法を用いて、常時GFPを発現するトランスジェニック・マラリア原虫株（P. berghei 507 line）を用いて調製した。mCherry遺伝子は、LISP2遺伝子の末端部分に融合させた。
８．LISP2のターゲティング
マラリア原虫（Plasmodium berghei）におけるターゲティングは、既報においてピリメタミン耐性選択マーカーとして、マラリア原虫ジヒドロ葉酸還元酵素・チミジル酸合成酵素（DHFR-TS）遺伝子を用いた方法(Yuda et al., 1999)と基本的に同じ方法を用いて実施した。ターゲティング用の構築物の調製に用いたプライマー配列は、表１に示した。
【００１８】
＜試験結果＞
１．LISP2は肝臓感染ステージのマラリア原虫において発現される分泌蛋白様分子である
既報に示すように、宿主への侵入から31時間後に肝臓感染ステージのマラリア原虫からcDNAライブラリーを調製した（Ishino et al., 2009）。このライブラリーをランダムDNAシークエンスに供し、ラット肝細胞に由来する転写物を除いた上で、約3000個のP. berghei 由来シークエンスデータを得た（このデータは、PlasmoDB(http://PlasmoDB.org)から得られる）。これらのシークエンスデータをP. berghe遺伝子（PlasmoDB）と比較し、対応するシークエンスデータ数の多い順に各遺伝子を並べた。表２に示すように、PBANKA_100300（配列番号２１（塩基配列）、配列番号２２（アミノ酸配列））は上位から２番目に位置し（62個のシークエンスデータ）、肝臓感染ステージにおいては、最も多く転写されているものの一つであった。PBANKA_100300は、2172個のアミノ酸をコードするタンパク質であり、およそ1000個のアミノ酸から構成される長大なリピート領域を持っている（図２(A)）。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
この領域には、56個のアミノ酸モチーフを単位とする12のコピーを有するいくつかのリピートモチーフからなる。signal P や TMpred プログラムなどの様々な構造解析ソフトウエアを用いて、このアミノ酸配列解析を行ったところ、N末端シグナル配列を有するものの、その他の膜関連モチーフ（例えば、膜貫通ドメインやGPIアンカーモチーフなど）については認められなかったことから、このタンパク質は、分泌タンパク質であろうと判断した（図２(A)）。PBANKA_100300遺伝子の相同分子は、遺伝子配列が既知の全てのマラリア原虫種に認められた。これらの相同分子は、全て長大なリピート領域を有する分泌タンパクであった。BLASTプログラムを用いて、PBANKA_100300遺伝子のアミノ酸配列と相同分子のアミノ酸配列とを比較したところ、最も保存されている領域は、リピート領域のC末端部分であった（図２(A)及び図３）。InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan)を用いて機能モチーフ解析を行ったところ、この領域中に、プラスモジウム6-システインモチーフドメイン（Plasmodium 6-cysteine motif domain）が認められたが（図３）、相同性はそれほど高くなかった（E-value = 1.57e-04）。予想された6-システインモチーフドメインを他のマラリア原虫種のものと比較した結果を図４に示した。
【００２１】
熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の相同性分子(PFD0260c)には、多くの非同義性一塩基多型（SNPs）が認められた(PlasmoDB)。非同義性一塩基多型のほとんどは、6-システインモチーフ周辺に位置していたことから、この領域は宿主免疫機構によって強い選択的圧力を受けていると考えられた。PBANKA_100300は肝臓感染ステージのマラリア原虫において多量に発現されていることから、このタンパク質について更なる探求を行った。既報において本発明者は、肝細胞中の寄生胞に関連するタンパク質であるマラリア原虫肝特異的タンパク質1（liver-specific protein 1 (LISP1)）が、肝臓感染ステージ特異的に発現し、肝臓感染ステージの進展に関与していると報告した(Ishino et al., 2009)。LISP1遺伝子の発現はスポロゾイトでは認められず、感染後24時間の初期分裂体において、その発現が認められた。以下に示すように、PBANKA_100300の発現は、肝臓感染ステージのマラリア原虫において認められ、その発現パターンは、LISP1と類似していた。そこで、このタンパク質をLISP2と命名した。
【００２２】
２．LISP2は、中期または後期の肝臓感染ステージにおいて特異的に検出される
次に、レポーター遺伝子としてGFPを含むセントロメアプラスミドPcen rep-GFPを用いてプロモーターアッセイを行った。このプラスミドには、LISP2コード領域の1.2-kbp上流の調節領域にGFPが配置されている。血液ステージのマラリア原虫にレポーター遺伝子を組み込み、ピリメタミンで選択した後、GFPの発現をマラリア原虫の生活環を通して観察した（図１及び図２）。GFPの蛍光シグナルは、マラリア原虫の血液ステージ、蚊の体内のステージ（接合子、接合子嚢、接合子嚢中スポロゾイト、唾液腺中スポロゾイトを含む）では認められなかった。HepG2細胞内における肝臓感染ステージのマラリア原虫では、感染後36時間後(hpi)にGFPシグナルが観察され、48時間目（hpi）まで増強した（図２(B)）。この結果より、LISP2は、肝臓感染ステージのマラリア原虫において特異的に発現することが分かった。更に、レポーター遺伝子として蛍ルシフェラーゼを含むセントロメアプラスミドPcen rep-Luc を用いたプロモーターアッセイによって、肝臓感染ステージにおけるLISP2の発現プロファイルを定量的に検討した（図２(C)）。このプラスミドを組み込んだマラリア原虫をHepG2細胞と共に培養した。12時間後から細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００２３】
唾液腺中スポロゾイトと初期の肝臓感染ステージ（early trophoziote）のマラリア原虫(0 hpi and 12 hpi)では、シグナル強度はバックグランド（非感染HepG2細胞）の2倍程度であった。24時間後（hpi）には、バックグランドの80倍まで増強し、36時間後には更に50倍となり、48時間後にピークとなった。このことより、LISP2は中期から後期の肝臓感染ステージにおいて発現することが分かった。このデータは、LISP2のプロモーターアッセイによる既報と矛盾しない（Helm et al., 2010）。次いで、リアルタイム逆転写PCR（RT-PCR）によって、in vivo でのLISP2の発現プロファイルを検討した。熱帯マラリア原虫をラット静脈内に投与し、接種から12時間後に肝臓を採取した。RT-PCRの結果は、内部標準としてHSP70を用いて標準化した（図２(D)）。LISP2は、接種12時間後からわずかに検出できた。LISP2の発現は、接種24時間後には100倍まで増加し、48時間後にピークとなった後、60時間後に至るまでに速やかに減少した。これらのデータから、LISP2は肝臓感染ステージ、特に中期から後期の肝臓感染ステージのマラリア原虫において特異的に発現することが分かった。
【００２４】
３．LISP2は肝臓への感染に重要である
肝臓感染ステージにおけるLISP2の役割を評価するために、LISP2を不活性化させた欠損型を作成した。LISP2遺伝子の5'末端と3'末端の間にピリメサミン耐性遺伝子（PbDHFR-ts）を組み込んだ（図５(A)）。この構築物をエレクトロポーレーションによって野生型メロゾイトに導入した。相同組換えによって、この構築物をLISP2座位に組み込んだマラリア原虫をピリメタミンによって選択した。こうして選択された原虫を、更に限界希釈法によって野生型原虫から分離した後、構築物が目的とする部位に組み込まれていることをサザンブロット（図５(A)）とPCRによって確認した。互いに独立に同定した2種類の組換え体を次の形態解析に供した。欠損型の無性生殖ステージは、野生型原虫と同等の速度で増殖した（図５(B)）。蚊の体内においても、変異型は、野生型と同様に、ほぼ同数程度の接合子嚢中スポロゾイト及び唾液腺中スポロゾイトを形成した（表３）。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
滑走運動を示すスポロゾイトの割合は、変異型においても正常であった（90%以上）次に、唾液腺中スポロゾイトをラット静脈内に投与し、ギムザ染色によって潜伏期間（スポロゾイトの投与から血液ステージまでの期間）を調べた（図５(B)）。変異型と野生型では、血中における増殖割合は類似していた（一日当たり10倍程度）が、潜伏期間は、変異型の方が野生型に比べると、1.5日ほど長かった。感染から4日後には、野生型も変異型も共に指数増殖期にあったが、野生型を感染させたマウスの寄生虫数は、変異型のものよりも30倍ほど多かった。この結果は、変異型マラリア原虫では、LISP2をなくすことにより、肝臓への感染が30倍ほど減少していることを示している。血液ステージにおいて変異型が遅れて認められたことが、肝細胞に侵入するスポロゾイトの能力低下によって引き起こされたという可能性を除くために、初期ステージ（スポロゾイト接種後24時間）におけるラット肝臓の原虫の原虫寄生量を野生型と変異型で比較した。唾液腺中スポロゾイトをラット静脈内に投与し、接種後24時間して肝臓を採取した。原虫18S rRNAをRT-PCRによって定量し、ラットGAPDH mRNAに基づいて標準化した。図５(C)に示すように、この時期では、原虫18S rRNAは野生型または変異型のマラリア原虫において、有意差は認められなかった。初期の肝臓感染ステージにおいては野生型と変異型では量的な差違が認められないことは、LISP2がスポロゾイト及び初期の肝臓感染ステージでは発現しないという知見と矛盾しない。また、LISP2を欠損すると肝臓感染ステージのマラリア原虫の進展が阻害されるということを示している。
【００２７】
４．変異型マラリア原虫では、肝臓感染ステージにおけるメロゾイト形成が障害されている
次に、HepG2細胞中において、肝臓感染ステージにある変異型マラリア原虫の表現型を調べた（図６(A)〜(C)）。まず、肝臓感染ステージのマラリア原虫の数を所定の時間毎に調べた（図６(A)）。感染後48時間までは、野生型と変異型の間に有意差は認められず、核の形態についても同様であった。しかしながら、感染から60時間後には、野生型マラリア原虫の数は、変異型の数に比べて、1/2〜1/3に減少した。更に、変異型を寄生させた細胞核では、不規則あるいは不定形を示し、核分裂が抑制されているようであった（図６(B)、図７）。図６(C)には、77時間後における培養細胞の異常な核を持つ肝臓感染ステージのマラリア原虫の割合を示した。異常な核を持つマラリア原虫の割合は、LISP2変異型の肝臓感染ステージのマラリア原虫の半分近くまで達した。このような原虫は、野生型では、ほとんど認められなかった。これらの結果より、野生型のマラリア原虫ではメロゾイトに進展し、培養液中に放出されたのに対し、変異型の多くではメロゾイトへの変化に失敗し、依然として培養細胞中に留まっているものと考えられた。
【００２８】
次に、野生型と変異型のマラリア原虫について、感染可能なメロゾイトの生産能力について比較した。肝臓感染ステージのマラリア原虫をHepG2細胞と共に培養し、培養液中に放出されたメロゾイトを回収した後、マウス静脈内に投与した。投与後のマウスの寄生虫血症の様子をギムザ染色によって毎日評価した。野生型を投与されたマウスでは投与後2日目で寄生虫血症が認められた一方、変異型を投与されたマウスでは、5〜6日目になって初めて寄生虫血症が認められた。投与後5日目には、野生型を投与されたマウスの寄生虫血症は、変異型を投与されたものの100倍程度も高値であった（図６(D)）。寄生虫血症の増加の様子は、野生型と変異型とで同等であったことから、変異型の肝臓感染ステージにおいて肝メロゾイトの生産数は、野生型に比べて1/100程度であったと考えられた。感染後69時間後には、変異型を感染させた培養細胞中に残っている肝臓感染ステージのマラリア原虫の数は、野生型を感染させた場合に比べると4倍程度となっており、このとき変異型を感染させた細胞の多くでは、細胞核が異型状となっていた（図７）。この結果は、前述の結果（図６(A)）と同様に、変異型のマラリア原虫では、肝臓感染ステージにおけるメロゾイトへの変化が抑制されたことによって、感染性が減少したものと考えられた。
【００２９】
５．LISP2は寄生胞に運搬される
LISP2の細胞内局在を解析するために、mCherry融合LISP2を発現するトランスジェニックマラリア原虫（LISP2::mCherry）を、GFPを恒常的に発現するP berghei 507cl1ライン(Janse et al., 2006)で作製した。mCherry遺伝子は、図８に示すように、相同組換えによって、LISP2コード配列の3'末端側に導入した。LISP2::mCherry変異型は、野生型と同様に、ラット及び蚊に感染したことから、mCherryを融合させてもLISP2の機能に影響を与えないことが分かった（表３、図９）。血液ステージ及び蚊内ステージでは、赤色蛍光は観察されなかった（図１０）。これは、前述のプロモーターアッセイの結果と矛盾しない。HepG2細胞内の肝臓感染ステージでは、感染12時間後においては赤色蛍光は観察されなかった。感染24時間後では、弱いmCherryシグナルが、GFPシグナル周辺ので観察された（図８(B)）。感染36時間後には、mCherryシグナルは、全肝臓感染ステージのマラリア原虫のPVMの周辺に観察された。分裂体ステージにおける小胞様の信号が増加したことから、この段階でLISP2が大量に生産されたことを示している。感染48時間後には、分裂体における蛍光シグナルの分布は、感染36時間後のものと類似していたが、一部は、既にcytomereステージ（成熟した分裂体がメロゾイトに変化するための分葉化の段階）へと進展していた。感染53時間後には、ほとんどのマラリア原虫は、cytomereステージにあり、PV内の赤色蛍光粒は有意に減少していた。蛍光シグナルは、cytomereステージの小葉構造の周囲に均等に分布していた。これらの結果は、LISP2が小胞体で合成された後に、分泌小胞によって、マラリア原虫の細胞質を通じて寄生胞に運ばれ、そこで放出されたことを示唆している。
【００３０】
６．LISP2は、LISP1を周囲に有する分泌小胞によって運搬される
LISP1は、中期から後期の肝臓感染ステージのマラリア原虫に特異的なPVMタンパク質である（Ishino et al., 2009）。LISP2と同様に、LISP1は分裂体によって生産され、マラリア原虫から分泌された後、PVMに運搬される。両タンパク質が同じ経路を通じて運搬されるか否かを確認するために、LISP2::mCherry変異型のマラリア原虫をmCherryとLISP1の両者で染色した（図１１(A)〜(C)）。感染42時間後には、分泌小胞の顆粒が、抗LISP1抗体によって、マラリア原虫内に検出された（図１１(A)）。抗mCherry抗体によって染色された顆粒が、抗LISP1抗体のイメージと重なったことから、LISP1とLISP2は同じ小胞によって運搬されることが示唆された。拡大して観察したところ、LISP1がLISP2を取り囲んでいることが明らかであったことから、LISP1が局在する膜が小胞を形成しているものと考えられた。抗LISP1抗体によって染色された膜は、PVMも取り囲んでいた。我々の知る限りでは、輸送小胞は、肝臓感染ステージにおいては、報告されていない。感染53時間後には、メロブラスト（meroblast）とPVMの間に形成された空隙は、LISP2によって満たされた（図１１(B)）。小胞は主にPVMに局在しており、抗LISP1抗体によって染色される膜によって囲まれていることは、感染42時間後と同様であった（図１１(C)）。このステージでは、感染42時間後に比べると、PVMは抗LISP1抗体によって、より明瞭に染色されたことから、LISP1がPMVに集積したことが示唆された。
【００３１】
７．LISP2は、宿主の細胞質に運搬される
更に、LISP2の発現と細胞内局在について、抗LISP2抗体を用いた免疫細胞化学によって検討を加えた。抗原として、組換えGST融合タンパク（LISP2の496位〜665位のアミノ酸に該当するタンパク質）を使用し、これをウサギに投与することで抗体を得た。LISP2に対する特異抗体は、ウサギ抗血清から組換えGST融合タンパク質を用いて、アフィニティカラムにより精製した。この抗体を用いて、感染48時間後に肝臓感染ステージのマラリア原虫を免疫染色した。感染したHepG2細胞と肝臓感染ステージのマラリア原虫については、強い蛍光シグナルが認められた（図13(A)）。この蛍光シグナルは、LISP2::mCherryを用いたときの蛍光シグナルのイメージと大きく異なっていた。未感染のHepG2細胞では蛍光が見られなかったが、感染した宿主細胞では複雑な形状が抗体によって明示された。このことは、LISP2が宿主細胞に運搬されて、細胞質全体に分布したことを示している。また、LISP2は、感染した全てのHepG2細胞の核内にも局在しており、そのシグナルは、細胞質からのシグナルよりも強かった。このようなLISP2の局在は、LISP2が宿主細胞の細胞質から核内に積極的に移行されたことを示している（図13(A)）。
【００３２】
細胞質及び核内の染色像は、肝臓感染ステージのマラリア原虫が発達しなかった僅かな割合の細胞（野生型のマラリア原虫において同様に認められる）を除き、全ての感染細胞において認められた。一方、LISP2変異型のマラリア原虫及び宿主細胞では、上記の染色像が得られなかった（図１２）。LISP2が宿主細胞の核輸送機構によって核内に輸送されているという可能性を評価するために、LISP2タンパク質の核内局在シグナル（nuclear localization signals (NLSs)）を調べた。PSORTII（http://psort.nibb.ac.jp:8800/; Nakai and Horton, 1999）による解析では、マラリア原虫LISP2の核内局在シグナルとして7個の候補が認められた。他のマラリア原虫の相同体についても同様の核内局在シグナルに関する候補があった（表４〜表６）。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
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【００３５】
【表６】
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【００３６】
次に、感染後の別の時間におけるLISP2の発現状態を調べた。感染12時間後では、宿主細胞には蛍光シグナルは認められなかった。感染24時間後では、LISP2は、肝臓感染ステージのマラリア原虫と、原虫周囲の寄生胞に局在していた（図１３）。感染36時間後では、LISP2は宿主細胞に認められたが、依然として多くのマラリア原虫と寄生胞にも観察された。感染36時間後の細胞の全てについては、細胞質と核が染色像を示したことは重要である。感染48時間後には、マラリア原虫の発達段階に応じて細胞間にバラツキが認められたものの、粒体の数は減少し、宿主細胞のシグナルは寄生胞内のシグナルよりも強くなった。感染55時間後には、ほとんどの寄生虫はcytomereステージへと変化し、LISP2::mCherryマラリア原虫を用いたときと同様に、宿主細胞内とcytomereを取り巻く寄生胞内でシグナルが観察された。一方、寄生虫内では、分泌小胞はほとんど観察されなかった（図１３）。上記データから、LISP2は分裂体ステージにおいて生産され、PVMを通じて速やかに宿主細胞に運ばれた後、細胞質と核に分布することが分かった。次に、 in vivo において、宿主細胞へのLISP2の輸送を調べた。ラットに対して、野生型スポロゾイトを静脈内投与し、投与48時間後に肝臓を採取した。肝スライスサンプルをLISP2抗体とDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。LISP2は、HepG2細胞を用いた観察データと同様に、感染した肝細胞の細胞質と核に認められた（図１４）。
【００３７】
８．LISP2は、宿主細胞への輸送前処理を受ける
LISP2::mCherryマラリア原虫では、mCherry蛍光シグナルは、寄生胞（parasitophorous vacuole：PV）の内部にのみ観察された。これに対し、免疫蛍光顕微鏡によれば、LISP2は宿主細胞に観察された。この知見より、LISP2はC末端部のプロセシングを受けた後に、宿主細胞に分泌されることを示している。この可能性を評価するために、野生型マラリア原虫とLISP2::mCherryマラリア原虫について、ウエスタンブロット解析を行った（図１５(A)、(B)）。感染48時間後に肝臓感染ステージのマラリア原虫に感染したHepG2細胞を未感染のHepG2細胞と共にSDSサンプルバッファーに溶解し、LISP2リピートに対する抗体又はmCherryに対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。抗LISP2リピート抗体を用いた場合には、野生型では、120-kDa（マイナーバンド）と30-kDa（メジャーバンド）の二つの特異的バンドが検出され、LISP2::mCherry型では、マイナーバンドが150-kDaに移動していた（図１５(A)）。未感染HepG2細胞、及びLISP2変異型マラリア原虫を感染させたHepG2細胞では、上記バンドは認められなかった。抗mCherry抗体を用いた場合には、LISP2::mCherry型を感染させた場合にのみ、150-kDaのバンドが検出された（図１５(B)）。これは、寄生胞中に検出されたmCherryシグナルが、このタンパク質に対応していること示すものである。
【００３８】
注目すべきなのは、120 kDaのバンドサイズは、LISP2のアミノ酸配列から推定した分子量の半分しかないことである（シグナル配列を除くと、240 kDaの予測となる）。このことは、LISP2がPVに転送される間にN末端領域がプロセシングされるか、LISP2が大きな反復領域において高度に偏ったアミノ酸組成を持つためにSDS-PAGEで異常な移動特性を有する（図２）ことを示している。これに対し、野生型及びLISP2::mCherry型のいずれでも観察された30-kDaのメジャーバンドは、抗LISP2抗体を用いた蛍光抗体法で宿主細胞に検出されたLISP2プロダクトに対応するものである。更に、スポロゾイトの感染から様々な時間において、ウエスタンブロット解析を実施した。感染24時間後では、弱い30-kDaバンドが観測された。感染36時間後には、30-kDaと120kDaの二本のバンドが検出された。120kDaを超えるところにいくつかのバンドが認められたことから、このタンパク質のN末端部分がプロセシングされているものと考えられた。このプロセシングによって、全長タンパク質は検出されなかった。この時間帯には、LISP2は主に分泌小胞内に観察されることから（図１３(B)）、LISP2の修飾は分泌小胞内で行われると考えられる感染48時間後には、120kDaを超える大きなバンドは検出されなかったことから、LISP2のプロセシングは完了したと考えられた。この知見は、同じ時間帯に、蛍光抗体法でほとんど輸送小胞（export vesicle）がマラリア原虫の内部に観察されないという結果と一致する。
【００３９】
＜考察＞
肝細胞に侵入したスポロゾイトは直ちに肝臓感染ステージとなり数日のうちに数万のメロゾイトを産出する。このような急激な肝細胞内での増殖を実現するために肝臓感染ステージの原虫が何らかの原虫蛋白を宿主肝細胞内に送り込み、細胞内環境を増殖に有利に改変していることは十分有り得る事である。しかしながらこれまでのところ肝臓感染ステージによって産生され宿主細胞に輸送される蛋白質は、スポロゾイト期と肝臓感染最初期に産生されるCSタンパク質以外報告されていない。LISP2は従って肝臓感染中期から後期にかけて産生され肝細胞に輸送されることが明らかとなった初めての原虫蛋白質である。
LISP2のノックアウト原虫の表現型の解析から、本蛋白質が肝細胞内でのマラリア原虫の増殖に極めて重要な役割を果たしていることが明らかになった。従ってLISP2の機能を阻害する薬剤はマラリア原虫の肝細胞内での増殖を阻止しすることができると考えられる。LISP2は初期分裂体によって産生されるが、興味深いことに、ノックアウト原虫において異常な表現型が観られるのはメロゾイトが形成される肝臓ステージ最後期である。この発現時期と表現型出現の時間差は、輸送されたLISP2がまず宿主細胞に働きかけ、その効果が後に寄生胞内で増殖する原虫に及ぼされることを示唆している。LISP2は肝細胞の核に働きかけ初期免疫に関与する遺伝子群の発現を阻害し原虫の増殖を助けるのかもしれない。または様々な宿主遺伝子の発現を抑制することで宿主細胞の蛋白産生を阻止し、それによって逆に宿主細胞の栄養素の原虫内への輸入を増加させるのかもしれない (Mikolajczak et al., 2007; Labaied et al., 2011). 
肝臓感染ステージはマラリア感染に対する感染阻止免疫が成立する唯一のステージであり (Nussenzweig et al., 1967)、また最も重要なワクチン標的ステージのひとつである。感染阻止免疫はマウスやヒトにおいてガンマ線による弱毒化スポロゾイト (Nussenzweig et al., 1967; Clyde, 1975)や遺伝子改変による弱毒化スポロゾイト(Mueller et al., 2005)を用いた実験で証明されている。この免疫においてはCD8+ T 細胞が重要な役割を演じており (Schofield et al., 1987; Weiss et al., 1988; Romero et al., 1989; Doolan and Hoffman, 2000; Morrot et al., 2005; Overstreet et al., 2008), 宿主肝細胞の細胞質に輸送された蛋白質が宿主免疫系に提示されてこれを活性化し、最終的に感染細胞の除去に至ると考えられている (Doolan et al., 1996; Bongfen et al., 2007; Chakravarty et al., 2007; Cockburn et al., 2011). これらの過去の研究はLISP2 が有望なワクチン候補抗原であることを意味している。実際熱帯熱マラリア原虫のLISP2にはアミノ酸変異を伴う１塩基置換（SNPs）が高頻度に存在しておりLISP2が宿主免疫の選択圧の影響を受けてきたことを強く示唆している。
【００４０】
Ｂ．LISP2の作用を阻害するための物質を見いだすための試験および結果
１．in vitro法
肝臓由来の培養細胞（例えば、HepG2）を適当な培養プレート（例えば、8穴チャンバープレート）中において、適当な培地（例えば、10% FCSと3mg/mlグルコースを含有するRPMI1640培地）を使用して培養する。次いで、この培養細胞に唾液腺中スポロゾイトを添加・感染させると共に、培養液中にLISP2の作用を抑制するか否かを評価する被験物質を添加する。マラリア原虫の感染24時間後〜60時間後（好ましくは、36時間後〜50時間後）に培養細胞内のマラリア原虫の様子を観察する。被験物質がLISP2の作用を抑制する場合には、メロゾイト形成が阻害されている。
このようにすれば、LISP2の作用を抑制することで、マラリア原虫の感染を阻害する物質の試験を行える。また、そのような物質は、マラリア原虫の感染に対する医薬品等として使用できる。
【００４１】
２．in vivo法
唾液腺中スポロゾイトを齧歯類（ラットまたはマウス）の静脈内に投与すると共に、LISP2の作用を抑制するか否かを評価する被験物質を投与する。マラリア原虫の投与24時間後〜60時間後（好ましくは、36時間後〜50時間後）に齧歯類の肝臓を採取し、その顕微鏡用スライス標本を作製し、顕微鏡にて細胞内のマラリア原虫の様子を観察する。被験物質がLISP2の作用を抑制する場合には、メロゾイト形成が阻害されている。
このようにすれば、LISP2の作用を抑制することで、マラリア原虫の感染を阻害する物質の試験を行える。また、そのような物質は、マラリア原虫の感染に対する医薬品等として使用できる。
【００４２】
Ｃ．マラリアワクチン
次に、LISP2を用いたマラリアワクチンについて説明する。
ラットを宿主とするP. bergheiをヒト肝臓由来の細胞株であるHepG2に感染させたところ、肝臓感染ステージにおいて、ラット・マウスと同様の病態を示した。また、各種のマラリア原虫（熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、サルマラリア原虫（P. knowlesi）、ネズミマラリア原虫（P. berghei, P. yoelii）など）においても、同様の肝臓感染ステージが認められる。このことより、これらのマラリア原虫のLISP2に相当するタンパク質（以下、「LISP2様タンパク質」という）が、肝臓感染ステージにおいて、上記実験結果と同じ働きを示すことが明らかである。このため、LISP2を抗原として用いたワクチンを提供することにより、マラリアワクチンとできる。
マラリア原虫のLISP2の全部または一部を抗原として使用する。LISP2様タンパク質抗原の製造方法については、従来公知の方法（例えば、各種発現用ベクター（プラスミド・コスミド・ウイルス・人工染色体）と各種細胞（大腸菌・バチルス・昆虫細胞・動物細胞株など）とを用いたタンパク質発現系、無細胞タンパク質合成系、化学合成など）を用いることができる。マラリアワクチンには、LISP2様タンパク質抗原を単独または適当なアジュバント（免疫補助剤）を添加して用いることができる。マラリアワクチンは、皮下注射、筋肉注射、経鼻接種、経口投与などの方法で接種できる。LISP2様タンパク質を含むマラリアワクチンを投与することにより、LISP2に対する免疫を獲得させられる。こうして、LISP2に対する細胞免疫または抗LISP2抗体を通じて、LISP2の作用を抑制できるので、マラリア原虫の感染を阻害できる。
【００４３】
次に、上記ワクチンの効果を詳細に検討した結果について説明する。
＜試験方法＞
１．LISP2を抗原とするマラリアワクチンの効果確認試験
組み換えアデノウイルスはクロンテック（タカラバイオ）Adeno-X Adenoviral System 3 (CMV,green) (コード：632267)を用いて作製した。アデノウイルスベクターはE1 E3 欠損型を用いた。Plasmodium YoeliiのLISP2アミノ酸1692-2030（配列番号６５）に対応する領域をウイルスベクター作製用コスミドベクターに組み込み大腸菌でクローニングした。クローニングの際には、2個のDNAプライマー（配列番号６２：gtaactataacggtcATGGAATACCTCTCATCACTCTCC、配列番号６３：attacctctttctccttaTCCTGAATAGATGATTTTTCCATTG）を用いた。これらのDNAプライマーを用いることにより、配列番号６４に示すDNA配列（オリジナルの配列は、DNA合成にて作成）を増幅して、組み込んだ。また、このとき発現されるアミノ酸配列を配列番号６５に示した。
クローニングされたDNAの塩基配列を確認後、Pac Iで処理して直鎖化し293細胞にトランスフェクションし組換えアデノウイルスを得た。
コントロールには、遺伝子を組み込んでいないオリジナルのウイルスを用いた（GFPのみ発現）。293細胞で増殖させウイルスタイターをあげた後、マウス（Balb/c 7週 メス）に1匹あたり1×109 pfu皮下注射し免疫した（各5匹）。皮下注射から2週間後にP. yoelii スポロゾイトをマウス1匹あたり100匹静注しチャレンジした。静注後2日目から採血し赤血球感染率により感染を評価した。
【００４４】
２．LISP2  DNAワクチンの効果確認試験
（１）ベクターの作製
Plasmodium yoelii LISP2の人工合成したDNA（アミノ酸1692-2030に対応。アミノ酸配列は配列番号６５に同じ。）をテンプレートにプライマーセット（配列は、配列番号６６：aaagctagcgccaccATGGAATACCTCTCATCACTCTCC、および配列番号６７：aaactcgaggttaTCCTGAATAGATGATTTTTCCATTGを使用）でPCRし、断片を増幅した。この断片をプラスミドベクターpcDNATM3.1 (Life Technologies) の NheI /XhoI サイトに挿入した。
（２）免疫
この発現プラスミド50μg と金粒子25mgを用いて遺伝子導入用パーティクルを作製し、HeliosR Gene Gun システム（BIO-RAD）を用いて遺伝子導入した。7週齡のBalb/c マウス腹部表面にLISP2発現用プラスミド及びコントロールプラスミド（インサートなし）を各5匹に打ち込んだ。2週間後にPlasmodium yoeliiのスポロゾイト（肝臓感染ステージ）を各100匹ずつ静注してチャレンジした。感染はスポロゾイト静注後2日目から赤血球への原虫感染率をギムザ染色してチェックした。
【００４５】
＜試験結果＞
１．LISP2を抗原とするマラリアワクチンの効果確認試験の結果
結果を図１６に示した。LISP2を含む組換えアデノウイルスを抗原としてマウスに免疫したところ、ワクチンを投与しないマウスに比べて、マラリア原虫の感染が50％抑制された。
２．LISP2  DNAワクチンの効果確認試験の結果
結果を図１７に示した。LISP2発現用DNAをワクチンとしてマウスに免役したところ、ワクチンを投与しないマウスに比べて、マラリア原虫の感染が70％抑制された。
このように本実施形態によれば、LISP2が、マラリア原虫によって肝臓感染ステージに発現され、かつ肝細胞内に輸送されることで、マラリア原虫が肝細胞内での増殖に極めて重要な働きをしていることが証明された。
また、LISP2を阻害する化合物を検索するための試験方法によって、マラリア原虫の感染を阻害する化合物を検索できる。そのような化合物は、マラリア原虫の感染を阻害する医薬品として提供できる。また、LISP2を抗原として使用したマラリアワクチンを提供できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４６】
【特許文献１】US 6310046 B1；Sequestrin of plasmodium falciparum
【非特許文献】
【００４７】
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【図１】
2014084333.tif 000009
【図２】
2014084333.tif 000010
【図３】
2014084333.tif 000011
【図４】
2014084333.tif 000012
【図５】
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【図６】
2014084333.tif 000014
【図７】
2014084333.tif 000015
【図８】
2014084333.tif 000016
【図９】
2014084333.tif 000017
【図１０】
2014084333.tif 000018
【図１１】
2014084333.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
2014084333.tif 000021
【図１４】
2014084333.tif 000022
【図１５】
2014084333.tif 000023
【図１６】
2014084333.tif 000024
【図１７】
2014084333.tif 000025
【配列表】
2014084333000001.app
【国際調査報告】
2014084333.tif 000026
2014084333.tif 000027
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