(57)【要約】  本発明は、水不溶性タンパク質や水不溶性多糖類などの水不溶性高分子化合物を容易な操作で、かつ効率よく可溶化および低分子化し、新たな機能性材料を製造することを課題とする。  本発明によれば、次の各工程：水不溶性高分子化合物に固体酸触媒を接触させて加熱処理を行った後、上澄み液を回収する工程、上澄み液回収後の固体酸触媒に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、さらに上澄み液を回収する工程、該固体酸触媒を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する工程、回収した上澄み液と洗浄液を合わせて固体酸触媒に非吸着の画分を得る工程、該固体酸触媒から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して固体酸触媒に吸着した画分を得る工程を含む、水不溶性高分子化合物の分解物の製造方法が提供される。
2015098634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む水不溶性高分子化合物の分解物の製造方法：
(Ａ)水不溶性高分子化合物に固体酸触媒を接触させた後、加熱処理を行い、上澄み液を回収する工程、
(Ｂ)工程（Ａ）に続いて、該固体酸触媒に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、上澄み液を回収する工程、
(Ｃ)工程（Ｂ）に続いて、該固体酸触媒を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する工程、
(Ｄ)工程（Ａ）で回収した上澄み液と、工程（Ｂ）で回収した上澄み液と、工程（Ｃ）の洗浄液を合わせて固体酸触媒に非吸着の画分を得る工程、
(Ｅ)工程（Ｄ）に続いて、該固体酸触媒から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して固体酸触媒に吸着した画分を得る工程。
【請求項２】
水不溶性高分子化合物が、水不溶性タンパク質または水不溶性多糖類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水不溶性高分子化合物を固体酸触媒に接触させる前に水性媒体に浸潤させる工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水不溶性高分子化合物の量が、固体酸触媒に対して質量比で０．０１〜０．５倍である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程（Ａ）において、水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触時の水性媒体の量を固体酸触媒に対して質量比で１〜５０倍となるように調整する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記工程（Ａ）および（Ｂ）の加熱処理を、４０〜１６０℃で０．１〜１６８時間行う、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（Ａ）および（Ｂ）の操作を、非吸着画分における水不溶性高分子化合物の分解物の収率が５０％以上になるまでそれぞれ複数回繰り返す、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
固体酸触媒が、陽イオン交換体、ゼオライト、および珪藻土から成る群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水不溶性高分子化合物（タンパク質または多糖類）を可溶化および低分子化し、水不溶性高分子化合物（タンパク質または多糖類）の分解物を連続的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品、飲食品、化粧品の材料として、機能性タンパク質や機能性ペプチドが着目されている。なかでも、骨・関節疾患に伴う症状の緩和作用、美肌作用、骨形成作用などを有するコラーゲンおよびその分解物であるコラーゲンペプチドはその代表例として挙げられる。コラーゲンまたはコラーゲンペプチドの原料は、主に魚、牛、豚、鶏の皮、骨、腱などであるが、クラゲ類もその一つとして用いられており、クラゲ類を凍結・解凍・低温貯蔵・攪拌などの処理工程を経てクラゲ類から未変性のコラーゲンを効率的に回収する方法が提案されている（特許文献１、２等）。【０００３】
クラゲ類は、近年、日本沿岸各地での多量発生が深刻な社会問題となっており、漁業に多大な損害をもたらすほか、工場や発電所等の取水口に集まり、その除去や廃棄処理にコストがかかるため、上記のようにコラーゲン原料としてクラゲの有効利用が図れることが望ましい。これまでコラーゲン原料として用いられるクラゲ類は、小型で液化しやすいミズクラゲが主であり、ビゼンクラゲなどの大型でかつ水不溶性タンパク質が多いクラゲ類は有効利用されていないのが現状である。【０００４】
一般に、水不溶性タンパク質の可溶化および低分子化は、加熱処理、酸またはアルカリ処理、タンパク分解酵素（プロテアーゼ）処理などにより行われている。しかしながら、加熱処理はタンパク質の種類によって熱変性を受けるという問題がある。酸またはアルカリ処理ではアミノ酸を破壊してしまうおそれがあり、処理後の廃液処理にもコストや労力がかかる。また、タンパク分解酵素処理は、使用する酵素の至適条件に合わせるために温度やｐＨの設定・制御が必要であり、処理物に酵素が残存すると失活や酵素除去の操作も必要となる。【０００５】
また、固体酸触媒を用いてタンパク質を加水分解する方法が知られており（特許文献３）、クラゲコラーゲンペプチドの製造にも用いられている（特許文献４）。しかしながら、これらの例はいずれも可溶性タンパク質を対象とするものであり、水不溶性タンパク質の可溶化および低分子化を行ったものではない。【０００６】
一方、木質系バイオマス資源の有効活用として、セルロース、ヘミセルロース、リグニンから構成されるリグノセルロースの分解技術が検討されているが、上記の水不溶性タンパク質と同様の問題が存在する。例えば、リグノセルロースの分解技術として、酸糖化法や酵素糖化法があるが、硫酸を用いた酸糖化法では反応が速いという利点はあるものの、生成物（単糖）の過分解が問題となり、酸の廃液処理には環境負荷の問題がある。また、セルラーゼ酵素を用いた酵素糖化法では、環境負荷が少ないという利点はあるものの、セルロースはβ−グルコース分子が１，４グルコシド結合により重合した高分子同士が水素結合し、水に不溶性の強固な結晶構造を有していることから、セルラーゼ酵素との接触面積が少なく、反応が遅いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−０５１１９１号
【特許文献２】特開２００８−０３１１０６号
【特許文献３】特開２００９−１２０５１１号
【特許文献４】特開２０１３−９５７０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、水不溶性タンパク質や水不溶性多糖類などの水不溶性高分子化合物を容易な操作で、かつ効率よく可溶化および低分子化し、新たな機能性材料を製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、水不溶性タンパク質を固体酸触媒により処理したところ、水不溶性タンパク質分解物が、驚くべきことに、主に固体酸触媒の非吸着画分に得られることを見出した。そして、非吸着画分を回収する操作を繰り返した後、さらに固体酸触媒から溶出させた吸着画分も合わせることによって、水不溶性タンパク質分解物を高収率で連続的に製造することに成功し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の工程を含む水不溶性高分子化合物の分解物の製造方法：
(Ａ) 水不溶性高分子化合物に固体酸触媒を接触させた後、加熱処理を行い、上澄み液を回収する工程、
(Ｂ)工程（Ａ）に続いて、該固体酸触媒に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、上澄み液を回収する工程、
(Ｃ)工程（Ｂ）に続いて、該固体酸触媒を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する工程、
(Ｄ)工程（Ａ）で回収した上澄み液と、工程（Ｂ）で回収した上澄み液と、工程（Ｃ）の洗浄液を合わせて固体酸触媒に非吸着の画分を得る工程、
(Ｅ)工程（Ｄ）に続いて、該固体酸触媒から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して固体酸触媒に吸着した画分を得る工程。
（２）水不溶性高分子化合物が、水不溶性タンパク質または水不溶性多糖類である、（１）に記載の方法。
（３）水不溶性高分子化合物を固体酸触媒に接触させる前に水性媒体に浸潤させる工程をさらに含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）水不溶性高分子化合物の量が、固体酸触媒に対して質量比で０．０１〜０．５倍である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記工程（Ａ）において、水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触時の水性媒体の量を固体酸触媒に対して質量比で１〜５０倍となるように調整する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記工程（Ａ）および（Ｂ）の加熱処理を、４０〜１６０℃で０．１〜１６８時間行う、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記工程（Ａ）および（Ｂ）の操作を、非吸着画分における水不溶性高分子化合物の分解物の収率が５０％以上になるまでそれぞれ複数回繰り返す、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）固体酸触媒が、陽イオン交換体、ゼオライト、および珪藻土から成る群より選ばれる少なくとも１種である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、水不溶性高分子化合物の分解物の製造方法が提供される。本発明の方法を用いることによって、これまで有効利用できなかった材料から水不溶性高分子化合物の分解物を高効率かつ低コストで連続的に製造することが可能である。また、本発明の方法は、従来の加熱処理、酸またはアルカリ処理、タンパク分解または糖分解酵素処理とは異なって、高分子化合物の不要な変性がなく確実な加水分解処理が行え、製造工程において煩雑な操作や特別な制御の必要もない。【００１２】
本願は、２０１３年１２月２５日に出願された日本国特許出願２０１３−２６７６６２号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一態様である水不溶性タンパク質分解物の連続的製造方法の工程図を示す。
【図２】本発明の一態様である水不溶性タンパク質分解物の連続的製造方法における固体酸触媒非吸着画分（上澄み液）の回収方法の一態様を示す。
【図３】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ビゼンクラゲ傘部コラーゲンペプチド）の回収量の推移(図３ａ:反応時間24時間、図３ｂ：反応時間48時間）および反応時間による吸収量の比較（図３ｃ）を示す。
【図４】図４ａは、固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ビゼンクラゲ傘部コラーゲンペプチド）の分子量分布を示す（反応時間24時間、上の図：回収液１〜６回目、下の図：回収液７〜１２回目、プルラン標準品分子量M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。図４ｂは、固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ビゼンクラゲ傘部コラーゲンペプチド）の分子量分布を示す（反応時間48時間、プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図５】固体酸触媒吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ビゼンクラゲ傘部コラーゲンペプチド）の分子量分布を示す（上の図：反応時間24時間、下の図：反応時間48時間、プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図６】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（セリシンペプチド）の回収量の推移を示す。
【図７】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（セリシンペプチド）の分子量分布を示す（上の図：回収液１〜６回目、下の図：回収液７〜１２回目、プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図８】固体酸触媒吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（セリシンペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図９】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ケラチンペプチド）の分子量分布を示す（上の図：回収液１〜５回目、下の図：回収液６〜８回目、プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図１０】固体酸触媒吸着画分における水不溶性タンパク質分解物（ケラチンペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。
【図１１】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性多糖類分解物（寒天オリゴ糖）の回収量の推移を示す。
【図１２】固体酸触媒非吸着画分における水不溶性多糖類分解物（寒天オリゴ糖）の分子量分布を示す(対照物質M1: 5.9kDa（昭和電工社製Shodex STANDARD P-82, M2:３糖(ラフィノース), M3:２糖(スクロース), M4:１糖(グルコース))。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明について詳細に述べる。
本発明は、水不溶性高分子化合物の分解物の製造方法であって、以下の工程を包含する。図１にその製造工程の概略を示す。
(Ａ) 水不溶性高分子化合物に固体酸触媒を接触させた後、加熱処理を行い、上澄み液を回収する工程、
(Ｂ)工程（Ａ）に続いて、該固体酸触媒に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、上澄み液を回収する工程、
(Ｃ)工程（Ｂ）に続いて、該固体酸触媒を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する工程、
(Ｄ)工程（Ａ）で回収した上澄み液と、工程（Ｂ）で回収した上澄み液と、工程（Ｃ）の洗浄液を合わせて固体酸触媒に非吸着の画分を得る工程、
(Ｅ)工程（Ｄ）に続いて、該固体酸触媒から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して固体酸触媒に吸着した画分を得る工程。
【００１５】
本発明の方法に用いる「水不溶性高分子化合物」としては、水不溶性タンパク質または水不溶性多糖類が好ましい。また、本発明において「水不溶性高分子化合物の分解物」は、水不溶性高分子化合物が可溶化・分解されたものであればよく、平均分子量や分子量分布は問わない。
【００１６】
工程(Ａ)：
工程（Ａ）では、水不溶性高分子化合物に固体酸触媒を接触させた後、加熱処理を行い、上澄み液を回収する。本発明において「水不溶性」とは水に可溶化していない状態をいう。
【００１７】
水不溶性高分子化合物には水不溶性タンパク質または水不溶性多糖類が含まれ、動物性であっても植物性であってもよく、また種類も特に限定はされない。水不溶性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、セリシン、フィブロイン、ケラチン、カゼイン、アルブミン、グロブリン、エラスチン、ミオシン、アクチン、ホエータンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、胡麻タンパク質、卵タンパク質などが挙げられる。なかでも、クラゲ類のコラーゲンが好ましく、クラゲ類は、限定はされないが、鉢虫網（Scyphozoa）根口クラゲ目（Rhizostomeae)に属する、ビゼンクラゲ、エチゼンクラゲ、タコクラゲ、ムラサキクラゲ、エビクラゲ、イボクラゲ、スナイロクラゲ、サカサクラゲなどが挙げられる。また、水不溶性多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース、リグノセルロース、イヌリン、ペクチン、グルカン、カラギーナン、アガロース、キチン、キトサンなどが挙げられる。水不溶性高分子化合物原料は、固定酸触媒との接触による可溶化・低分子化を促進させるために、前処理として裁断機、ミンチ機、カッター等を用いて粗粉砕を行い、さらに粉末化しておくことが好ましい。粉末化は、例えば、ハンマーミル、ビーズミル、ローラーミル、ピンミル、ブレンダーなどの当業者が通常用いる機械により行うことができる。
【００１８】
上記のような前処理を行った水不溶性高分子化合物は、固体酸触媒との接触前に水性媒体に湿潤させてもよい。湿潤は水不溶性高分子化合物の種類によるが、１〜３６時間程度行うことが好ましい。
【００１９】
本発明において用いる固体酸触媒は、陽イオン交換体、ゼオライトおよび珪藻土からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、陽イオン交換体であることがより好ましい。これらの固体酸触媒は、１種のみを用いることも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２０】
陽イオン交換体は、スルホン基、カルボキシル基の少なくとも１種を有する樹脂であることが好ましく、スルホン基、カルボキシル基は、それぞれスルホプロピル基、カルボキシメチル基であってもよい。陽イオン交換体のカウンターイオンがプロトン以外である場合、プロトン型に置換した後に使用することが好ましい。スルホン酸型陽イオン交換体とは、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）を含む陽イオン交換能を有するイオン交換体であり、好ましい形態として、スルホン酸基を含む陽イオン交換樹脂およびスルホン酸基を含む陽イオン交換膜を挙げることができる。好ましい陽イオン交換樹脂としては、東ソー株式会社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｃ、ＳＰ−５５０Ｃ等のように親水性ビニルポリマーを基材として含むものや、ナフィオン（登録商標）等のようにパーフルオロスルホン酸を含むポリテトラフルオロエチレン共重合体を挙げることができる。
【００２１】
ゼオライトは、一般にゼオライト触媒として利用されているゼオライトであればいずれも用いることができ、特に限定はされないが、例えば、東ソー株式会社製ゼオラム（登録商標）などが挙げられる。
【００２２】
珪藻土は、酸触媒として機能し得るものであればいずれも用いることができ、特に限定はされないが、例えば、和光純薬工業株式会社製けいそう土（顆粒状）などが挙げられる。
【００２３】
本発明に用いる固体酸触媒の形状は、粒状、粉末状のいずれであってもよい。また、その平均粒子径は２μｍ〜２ｍｍ程度、イオン交換容量は０.０１〜１ｅｑ／Ｌ程度のものが好適に使用できる。
【００２４】
前記固体酸触媒は、多孔質体であることが好ましい。例えば前述の東ソー株式会社製ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０Ｃ、ＳＰ−５５０Ｃは、ゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤にイオン交換基としてスルホン酸基を導入した多孔質体である。多孔質体の細孔サイズは、対象とする水不溶性高分子化合物の分子量によって適切な細孔サイズが異なるが、例えば、０.０１〜０.７５μｍ、好ましくは０.０５〜０.６μｍである。
【００２５】
水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触時の水性媒体の量は、水不溶性高分子化合物の湿潤に用いる水性媒体も合わせて、固体酸触媒に対して質量比で１〜５０倍、好ましくは５〜１５倍である。本発明の方法では、水不溶性高分子化合物の分解物を主として固体酸触媒の非吸着画分（上澄み液）に回収するため、水性媒体の量が上記範囲を下回ると遠心分離操作が必要となり好ましくない。また、水性媒体の量が上記範囲を上回ると作業効率が悪くなるので好ましくない。本発明において、水不溶性高分子化合物の湿潤および水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触に用いられる水性媒体は、水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の反応を妨げるものでない限り特に限定されるものではないが、例えば、水（イオン交換水、精製水、ＲＯ水、水道水、井戸水など）、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩水溶液などが挙げられる。また、塩濃度は、1mM〜0.1M程度の低濃度であることが好ましい。
【００２６】
水不溶性高分子化合物の量は、固体酸触媒の触媒能に応じて適宜決定できるが、例えば、固体酸触媒に対して質量比で０．０１〜０．５倍、好ましくは０．０５〜０．２倍である。
【００２７】
固体酸触媒と水不溶性高分子化合物の接触した後の加熱処理は、水不溶性高分子化合物の可溶化および低分子化反応を良好に進行させるために必須である。加熱温度は、４０〜１６０℃、好ましくは６０〜１２０℃、より好ましくは８０〜１００℃であり、加熱時間は加熱温度に依存するが、０．１〜１６８時間、好ましくは１０〜７２時間、より好ましくは２４〜４８時間である。例えば、水不溶性高分子化合物が、水不溶性タンパク質である場合、その低分子化はペプチドまでの分解に留めることが重要であるが、高温で長時間処理した場合、水不溶性タンパク質がアミノ酸にまで加水分解されるおそれがあるため、処理温度が高温であるほど、処理時間を短時間とするのが好ましい。
【００２８】
本発明において水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触は、バッチ法で行うことが好ましい。バッチ法で行う際には、容器内の固体酸触媒と水不溶性高分子化合物をよく混合した後、加熱する。加熱は、容器を密栓した後に行うことが好ましい。加熱条件は、前述の通りである。バッチ法で使用する容器は１つであってもよく複数でもよい。
【００２９】
上記加熱処理を行った後、上澄み液を回収する。上澄み液の回収は、沈降分離、浮上分離、ろ過、膜分離、遠心分離などの方法により行うことができるが、沈降分離が簡便であり好ましい。上澄み液回収の方法の例を図２に示す。固体酸触媒は水性媒体よりも重いため静置すれば通常15分程度で沈殿するが、実操業では、タンク底より少し上（沈殿した固体酸触媒の位置より少し上）に排液バルブを設置し、そこから排液して上澄み液を回収すればよい。あるいは、水不溶性高分子化合物の分解物を含む上澄み液は通過させるが、固体酸触媒は通過させない孔径を有するフィルターをタンク底に設置し、そこから排液して上澄み液を回収することもできる。
【００３０】
本工程における上記の一連の操作（水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触、加熱処理、上澄み液の回収）は複数回行う。回数については水不溶性高分子化合物の種類や本工程の目標収率に応じて適宜変更できるが、４〜５回程度が例示できる。繰り返し回数は、本工程の上澄み液と次の工程（Ｂ）の上澄み液と次の工程（Ｃ）の洗浄液を合わせた非吸着画分における水不溶性高分子化合物の分解物の収率が、５０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上となるように決定すればよい。各回の水不溶性高分子化合物と固体酸触媒の接触は、固体酸触媒による水不溶性高分子化合物の可溶化・低分子化効率の観点から、処理すべき水不溶性高分子化合物の全量を等量ずつ分けて行うことが好ましい。
【００３１】
工程(Ｂ)：
工程（Ｂ）では、工程（Ａ）に続いて、該固体酸触媒に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、上澄み液を回収する。本工程により、工程（Ａ）で可溶化されずに固体酸触媒表面に付着している水不溶性高分子化合物を可溶化および低分子化して回収することができる。本工程の加熱処理は、前記の固体酸触媒と水不溶性高分子化合物の接触時の加熱処理条件（温度および時間）に従って行えばよい。また、本工程の回収操作も複数回行うことが好ましい。回数については水不溶性高分子化合物の種類、工程（Ａ）における水不溶性高分子化合物の分解物の収率、および最終的な目標収率に応じて適宜変更できるが、３〜６回程度が例示できる。繰り返し回数は、工程（Ａ）の上澄み液と工程（Ｂ）の上澄み液と次の工程（Ｃ）の洗浄液を合わせた非吸着画分における水不溶性高分子化合物の分解物の収率が、５０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上となるように決定すればよい。上澄み液の回収は、工程（Ａ）と同様に行えばよい。
【００３２】
工程(Ｃ）：
工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）に続いて、固体酸触媒を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する。本工程では加熱処理は行わず、固体酸触媒を水性媒体にて１回洗浄すればよい。
【００３３】
工程(Ｄ)：
工程（Ｄ）では、工程（Ａ）で回収した上澄み液と、工程（Ｂ）で回収した上澄み液と、工程（Ｃ）で回収した洗浄液を合わせて固体酸触媒に非吸着の画分を得る。本工程により、固体酸触媒との反応で可溶化・低分化し、かつ固体酸触媒に非吸着の水不溶性高分子化合物を高収率で得ることができる。
【００３４】
工程(Ｅ)：
工程（Ｅ)では、工程（Ｄ）に続いて、固体酸触媒から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して固体酸触媒に吸着した画分を得る。溶出には、塩化ナトリウムなどの塩を高濃度（0.1M以上）に含む水溶液または塩酸やトリフルオロ酢酸などの酸、トリエチルアミンなどの塩基などを用いることができる。本発明の方法によれば、上記工程（Ａ）から（Ｄ）までで水不溶性高分子化合物の分解物を高収率で得ることができるが、さらに本工程により、固体酸触媒との反応で可溶化・低分子化した水不溶性高分子化合物の分解物のうち、固体酸触媒に吸着した水不溶性高分子化合物の分解物をも得ることができ、さらに収率を向上させることができる。
【００３５】
工程（Ｄ）で得られた非吸着画分と、工程（Ｅ）で得られた吸着画分は、それぞれ乾燥して最終製品としてもよく、また、混合してから乾燥して最終製品としてもよい。乾燥方法としては、特に限定されるものではなく、自然乾燥、凍結乾燥、送風乾燥、温風乾燥、真空乾燥、マイクロ波照射による乾燥などの方法が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。【００３７】
（実施例１）ビゼンクラゲ傘部不溶性コラーゲンの可溶化・低分子化
(1) ビゼンクラゲ傘部不溶性コラーゲンの調製
福岡県柳川市、有明海にて採取したビゼンクラゲを傘部と口腕部に分離した。傘部の内側にある茶色い皮を剥いだ後、水道水で洗浄し、さらに微酸性電解水、オゾン水で洗浄殺菌した。個体を1kg切り取り、1mm〜1cmの角状断片に破砕した。ガーゼで濾過をし、不溶性コラーゲンを含む固体を得た。得られた固体を9倍量のRO水で懸濁し、濾過により固体を回収した。この操作をさらに2回繰り返し、洗浄・脱塩をした。回収した固体は凍結乾燥を行い、乾燥後にブレンダーにて粉末化し、不溶性コラーゲン粉末を得た。【００３８】
(2) 固体酸触媒によるビゼンクラゲ傘部不溶性コラーゲンの可溶化・低分子化
(2-1)反応時間24時間
(1)で調製した不溶性コラーゲン粉末1gを90mlのRO水で1晩湿潤させた後、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）10mlと混合し、よく撹拌した。80℃、24時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、コラーゲンペプチドを含む上澄み液を回収した。次に、(1)で調製したビゼンクラゲ傘部の不溶性コラーゲン粉末を上記と同様にして1晩湿潤させた後、前記の上澄み液回収後の陽イオン交換樹脂に添加し、RO水で100mlにメスアップした後、よく撹拌した。80℃、24時間反応させ、再び上澄み液を回収した。この操作をさらに3回繰り返した（回収1〜5回完了）。ビゼンクラゲ傘部の不溶性コラーゲン粉末は各回等量ずつ合計5g使用した。【００３９】
残った陽イオン交換樹脂にRO水を加え、100mlにメスアップし、よく撹拌した。80℃、24時間反応させた後、上澄み液を回収した。この操作をさらに6回繰り返した（回収6〜11回完了）。残った陽イオン交換樹脂を30 mlのRO水で洗浄した。回収した上澄み液と洗浄液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していない分子量（Mp）12kDa以下のコラーゲンペプチド液を得た。【００４０】
図３ａに、回収した上澄み液中のコラーゲンペプチド（非吸着ペプチド）の量の推移（反応時間24時間）を示した。【００４１】
次に、洗浄後の陽イオン交換樹脂に0.5M NaCl30mlを添加し、樹脂からコラーゲンペプチドを含む分解物を溶出させた。これをさらに3回繰り返し、全ての溶出液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していた分子量（Mp）12kDa以下のコラーゲンペプチド液を得た。【００４２】
(2-2)反応時間48時間
(1)で調製した不溶性コラーゲン粉末1gを90mlのRO水で1晩湿潤させた後、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）10mlと混合し、よく撹拌した。80℃、48時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、コラーゲンペプチドを含む上澄み液を回収した。次に、(1)で調製したビゼンクラゲ傘部の不溶性コラーゲン粉末を上記と同様にして1晩湿潤させた後、前記の上澄み液回収後の陽イオン交換樹脂に添加し、RO水で100mlにメスアップした後、よく撹拌した。80℃、48時間反応させ、再び上澄み液を回収した。この操作をさらに3回繰り返した（回収1〜5回完了）。ビゼンクラゲ傘部の不溶性コラーゲン粉末は各回等量ずつ合計5g使用した。【００４３】
残った陽イオン交換樹脂にRO水を加え、100mlにメスアップし、よく撹拌した。80℃、48時間反応させた後、上澄み液を回収した。この操作をさらに2回繰り返した（回収6〜8回完了）。残った陽イオン交換樹脂を80 mlのRO水で洗浄した。回収した上澄み液と洗浄液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していない分子量（Mp）12kDa以下のコラーゲンペプチド液を得た。【００４４】
図３ｂに、回収した上澄み液中のコラーゲンペプチド（非吸着ペプチド）の量の推移（反応時間48時間）を示した。【００４５】
次に、洗浄後の陽イオン交換樹脂に0.5M NaCl50mlを添加し、樹脂からコラーゲンペプチドを含む分解物を溶出させた。これをさらに2回繰り返し、全ての溶出液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していた分子量（Mp）12kDa以下のコラーゲンペプチド液を得た。【００４６】
(3)ペプチド混合物の定量
(3-1)コラーゲンペプチド標準サンプルの調製
ビゼンクラゲ傘部の不溶性コラーゲン粉末1gを100mlのRO水で1晩湿潤させた後、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）100gと混合し、よく撹拌した。80℃、24時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、RO水500mlで洗浄した。洗浄後の樹脂を5％トリエチルアミン/10％アセトニトリル100mlで3回抽出した。得られた抽出液を混合した後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固した抽出物をRO水で溶解し、凍結乾燥した。得られた乾燥物を3.00、1.50、0.75、0.375、0.188mg/mlとなるように調整し、コラーゲンペプチド定量用の標準検量線に用いた。【００４７】
(3-2)ペプチド量の測定
(2)で得られたコラーゲンペプチド量の測定は、PIERCE社製 BCA protein assay kitを使用した。BCA protein assay reagent AとBCA protein assay reagent Bを50：1で混合し、これをBCA reagentとした。サンプル100μlとBCA reagent 2mlを混合し、37℃で15分間インキュベートした後、562 nmで吸光度を測定した。吸光度測定には三紳社製デジタル比色計mini photo 10を使用した。(3-1）で作成したラーゲンペプチド標準検量線からペプチド量を算出した。【００４８】
24時間反応における測定結果を表１および表２に示す。回収した上澄み液中のコラーゲンペプチド(非吸着ペプチド）量は3.65g、収率は73％であった。また、回収した溶出液中のコラーゲンペプチド(吸着ペプチド）量は0.86 g、収率は17％であった。【００４９】
【表１】
2015098634.tif 000003
【００５０】
【表２】
2015098634.tif 000004
【００５１】
48時間反応における測定結果を表３および表４に示す。回収した上澄み液中のコラーゲンペプチド(非吸着ペプチド）量は3.58g、収率は72％であった。また、回収した溶出液中のコラーゲンペプチド(吸着ペプチド）量は0.77 g、収率は15％であった。【００５２】
【表３】
2015098634.tif 000005
【００５３】
【表４】
2015098634.tif 000006
【００５４】
上記のとおり、反応時間24時間と48時間では、収率には大きな差がないが、反応時間が48時間のほうが、回収回数が少なくてすみ、効率的であるといえる。【００５５】
(4)ペプチド混合物の分子量分布の解析
(2)で得られたコラーゲンペプチドの分子量分布はゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した。測定条件を以下に示す。
a) HPLC装置：ポンプGL Sciences社製 GL-7410、オートサンプラーGL Sciences 社製GL-7420、カラム恒温槽GL Sciences社製CO631C、UV検出器 島津社製SPD-10AVと日立社製L-4200、RI検出器GL Sciences社製GL-7454、真空デガッサーGastorr社製AG-14を用いた。
b) カラム：東ソー社製TSKgel G3000SWXL（7.8×300mm, 5μm）
c) 移動相：50mMリン酸ナトリウム緩衝液/50mM塩化ナトリウム（pH 7.0）
d) 流速：0.5ml/min
e) 温度：20℃
f) 測定波長：215nm、280nm
g) 分子量測定用標準品：昭和電工社製Shodex STANDARD P-82を0.1％となるように調製し、分子量測定用標準液とした。【００５６】
図４に、上澄み液中のコラーゲンペプチド（非吸着ペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。反応時間24時間では、回収１回目、２回目はプルラン分子量換算5.9kDa以下にシャープなピークが得られたが、それ以降は高分子側にブロードなピークが得られた(図４ａ）。反応時間48時間では、ピークが高分子側から低分子側に若干シフトした（図４ｂ）。【００５７】
図５に、溶出液中のコラーゲンペプチド（吸着ペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。吸着ペプチドは非吸着ペプチドよりも分子量が低く、ピークトップは5.9kDa以下であった。また、反応時間の影響は受けず、24時間反応と48時間反応でほぼ同じ分子量分布であった。【００５８】
（実施例２）セリシンの可溶化・低分子化
(1) 固体酸触媒によるセリシンの可溶化・低分子化
セリシン粉末（高原社製）1gを90mlのRO水で1晩湿潤させた後、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）10mlと混合し、よく撹拌した。80℃、24時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、セリシンペプチドを含む上澄み液を回収した。次にセリシン粉末を上記と同様にして1晩湿潤させた後、上記の上澄み液回収後の陽イオン交換樹脂に添加し、RO水で100mlにメスアップした後、よく撹拌した。80℃、24時間反応させ、再び上澄み液を回収した。この操作をさらに3回繰り返した（回収1〜5回完了）。セリシン粉末は各回等量ずつ合計5g使用した。残った陽イオン交換樹脂にRO水を加え、100mlにメスアップし、よく撹拌した。80℃、24時間反応させた後、上澄み液を回収した。この操作をさらに6回繰り返した（回収6〜11回完了）。残った陽イオン交換樹脂を60mlのRO水で洗浄した。回収した上澄み液と洗浄液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していない分子量（Mp）5.9kDa以下のセリシンペプチド液を得た。【００５９】
図６に、回収した上澄み液中のセリシンペプチド（非吸着ペプチド）の量の推移を示した。【００６０】
次に、洗浄後の陽イオン交換樹脂に0.5M NaCl 60mlを添加し、樹脂からセリシンペプチドを含む分解物を溶出させた。これをさらに3回繰り返し、全ての溶出液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していた分子量（Mp）5.9kDa以下のセリシンペプチド液を得た。【００６１】
(2)ペプチド混合物の定量
(2-1)セリシンペプチド標準サンプルの調製
(1)で得られた陽イオン交換樹脂に非吸着のセリシンペプチド液を凍結乾燥した。得られた乾燥物を0.75、0.375、0.188、0.094mg/mlとなるように調整し、セリシンペプチド定量用の標準検量線に用いた。【００６２】
(2-2)セリシンペプチド量の測定
(1)で得られたセリシンペプチド量の測定は、上記のセリシンペプチド定量用の標準検量線を用いる以外は、実施例１の(3-2)と同様にして行った。【００６３】
上記の測定結果を表５および表６に示す。回収した上澄み液中のセリシンペプチド（非吸着ペプチド）量は3.36g、収率は67％であった。また、回収した溶出液中のセリシンペプチド（吸着ペプチド）量は0.21g、収率は4％であった。【００６４】
【表５】
2015098634.tif 000007
【００６５】
【表６】
2015098634.tif 000008
【００６６】
(3)ペプチド混合物の分子量分布の解析
(1)で得られたセリシンペプチドの分子量分布は、実施例１と同様の測定条件に従い、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した。【００６７】
図７に、上澄み液中のセリシンペプチド（非吸着ペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。回収１回目、２回目はプルラン分子量換算5.9kDa以下に、シャープなピークが得られたが、それ以降は高分子側にブロードなピークが得られた。【００６８】
図８に、溶出液中のセリシンペプチド（吸着ペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。吸着ペプチドのピークトップは非吸着ペプチドの回収１〜２回目、７〜１２回目と大差はなかった。【００６９】
（実施例３）ケラチンの可溶化・低分子化
（1）固体酸触媒によるケラチンの可溶化・低分子化
ケラチン粉末（ナカライテスク）1gを90mlのRO水で1晩湿潤させた後、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）10mlと混合し、よく撹拌した。100℃、48時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、ケラチンペプチドを含む上澄み液を回収した。次にケラチン粉末を上記と同様にして1晩湿潤させた後、上記の上澄み液を回収後の陽イオン交換樹脂に添加し、RO水で100mlにメスアップした後、よく撹拌した。100℃、48時間反応させ、再び上澄み液を回収した。この操作をさらに3回繰り返した（回収1〜5回完了）。ケラチン粉末各回等量ずつ合計5g使用した。残った陽イオン交換樹脂にRO水を加え、100mlにメスアップし、よく撹拌した。100℃、48時間反応させた後、上澄み液を回収した。この操作をさらに2回繰り返した（回収6〜8回完了）。残った陽イオン交換樹脂を80mlのRO水で洗浄した。回収した上澄み液と洗浄液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していない分子量（Mp）5.9kDa以下のケラチンペプチド液を得た。【００７０】
次に、洗浄後の陽イオン交換樹脂に0.5M NaCl 50mlを添加し、樹脂からケラチンペプチドを含む分解物を溶出させた。これをさらに2回繰り返し、全ての溶出液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していた分子量（Mp）5.9kDa以下のケラチンペプチド液を得た。【００７１】
（2）ペプチド混合物の定量
（2-1）ケラチンペプチド標準サンプルの調製
(1)で得られたイオン交換樹脂に吸着していたケラチンペプチド液（溶出液）を凍結乾燥した。得られた乾燥物を0.75、0.375、0.188、0.094mg/mlとなるように調整し、ケラチンペプチド定量用の標準検量線に用いた。【００７２】
（2-2）ケラチンペプチド量の測定
(1)で得られたケラチンペプチドのうち、溶出液中のケラチンペプチドは、上記のケラチンペプチド定量用の標準検量線を用いる以外は、実施例1の（3-2）と同様にして行った。また、上澄み液（洗浄液を含む）中のケラチンペプチドは、上澄み液を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。【００７３】
回収した上澄み液中のケラチンペプチド（非吸着ペプチド）量は2.65g、収率53％であった。また、回収した溶出液中のケラチンペプチド（吸着ペプチド）量は0.20g、収率は4％であった。【００７４】
(3)ペプチド混合物の分子量分布の解析
(1)で得られたケラチンペプチドの分子量分布は、実施例１と同様の測定条件に従い、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した。【００７５】
図９に、上澄み液中のケラチンペプチド（非吸着ペプチド）の分子量分布を示す（プルラン標準品分子量 M1:112kDa, M2:47.3kDa, M3:22.8kDa, M4:11.8kDa, M5:5.9kDa)。回収１〜５回目、６〜８回目のいずれもプルラン分子量換算5.9kDa以下に、シャープなピークが得られた。【００７６】
図１０に、溶出液中のケラチンペプチド（吸着ペプチド）の分子量分布を示す。吸着ペプチドのピークトップは非吸着ペプチドと大差はなかった。【００７７】
（実施例４）寒天の可溶化・低分子化
（1）固体酸触媒による寒天の可溶化・低分子化
寒天粉末（関東化学）1gを90mlのRO水に懸濁し、陽イオン交換樹脂（TOYOPEARL SP-550C）10mlと混合し、よく撹拌した。100℃、24時間反応させ可溶化した後、冷却を行い、寒天オリゴ糖を含む上澄み液を回収した。次に寒天粉末を上記と同様にして1晩湿潤させた後、上記の上澄み液を回収後の陽イオン交換樹脂に添加し、RO水で100mlにメスアップした後、よく撹拌した。100℃、24時間反応させ、再び上澄み液を回収した。この操作をさらに3回繰り返した（回収1〜5回完了）。寒天粉末各回等量ずつ合計5g使用した。【００７８】
残った陽イオン交換樹脂にRO水を加え、100mlにメスアップし、よく撹拌した。100℃、24時間反応させた後、上澄み液を回収した。この操作をさらに2回繰り返した（回収6〜8回完了）。残った陽イオン交換樹脂を80mlのRO水で洗浄した。回収した上澄み液と洗浄液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していない寒天オリゴ糖液を得た。【００７９】
図１１に、回収した上澄み液中の寒天オリゴ糖（非吸着オリゴ糖）の量の推移を示した。【００８０】
次に、洗浄後のイオン交換樹脂に0.5M NaCl 50mlを添加し、樹脂から寒天オリゴ糖を含む分解物を溶出した。これをさらに2回繰り返し、全ての溶出液を混合し、陽イオン交換樹脂に吸着していた寒天オリゴ糖液を得た。【００８１】
（2）オリゴ糖混合物の定量
(1)で得られた寒天オリゴ糖のうち、上澄み液（洗浄液を含む）中の寒天オリゴ糖は、上澄み液を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。また、溶出液中の寒天オリゴ糖は、次に示すフェノール硫酸法により算出した。まず、サンプル1.0mlに5％フェノール液を1.0ml加え混合した。次に濃硫酸5.0mlを速やかに直接滴下するように加え混合した。室温にて10分放置し、その後は水浴中で10分冷却した。470nmにて吸光度を測定した。吸光度測定には三紳社製デジタル比色計mini photo 10を使用した。標準品には、50、100、150mg/mlに調製したグルコースを用い、標準検量線に用いた。【００８２】
上記の測定結果を表７に示す。回収した上澄み液中の寒天オリゴ糖（非吸着オリゴ糖）量は4.15g、収率83％であった。【００８３】
【表７】
2015098634.tif 000009
【００８４】
また、回収した溶出液中に寒天オリゴ糖は検出されず、収率0％であった。【００８５】
（3）オリゴ糖混合物の分子量分布の解析
（1）で得られた寒天オリゴ糖の分子量分布はゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した。測定には、カラムに東ソー社製TSKgel G-OLIGO-PW（7.8×300mm）を使用する以外は、実施例１と同様の測定条件に従い測定した。また、対照物質として分子量測定用標準品（昭和電工社製Shodex STANDARD P-82（分子量5.9kDa))、1糖(グルコース)、2糖(スクロース)、3糖(ラフィノース)用いた。【００８６】
図１２に、上澄み液中の寒天オリゴ糖（非吸着オリゴ糖）の分子量分布を示す（対照物質M1: 5.9kDa（M1:昭和電工社製Shodex STANDARD P-82, M2:３糖(ラフィノース), M3:２糖(スクロース), M4:１糖(グルコース)）。回収１〜５回目のいずれも3糖(ラフィノース)以上にブロードなピークに得られた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、医薬品、飲食品、化粧品等の材料となる機能性ペプチドまたは機能性オリゴ糖の製造分野において利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【図１】
2015098634.tif 000010
【図２】
2015098634.tif 000011
【図３】
2015098634.tif 000012
【図４】
2015098634.tif 000013
【図５】
2015098634.tif 000014
【図６】
2015098634.tif 000015
【図７】
2015098634.tif 000016
【図８】
2015098634.tif 000017
【図９】
2015098634.tif 000018
【図１０】
2015098634.tif 000019
【図１１】
2015098634.tif 000020
【図１２】
2015098634.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月10日(2015.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む水不溶性タンパク質の分解物の製造方法：
（Ａ）水不溶性タンパク質に陽イオン交換樹脂を接触させた後、加熱処理を行い、上澄み液を回収する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）に続いて、該陽イオン交換樹脂に水性媒体を加えて攪拌し、加熱処理した後、上澄み液を回収する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）に続いて、該陽イオン交換樹脂を水性媒体にて洗浄し、洗浄液を回収する工程、
（Ｄ）工程（Ａ）で回収した上澄み液と、工程（Ｂ）で回収した上澄み液と、工程（Ｃ）の洗浄液を合わせて陽イオン交換樹脂に非吸着の画分を得る工程、
（Ｅ）工程（Ｄ）に続いて、該陽イオン交換樹脂から吸着した成分を溶出し、溶出液を回収して陽イオン交換樹脂に吸着した画分を得る工程。
【請求項２】
水不溶性タンパク質が、コラーゲン、セリシン、フィブロイン、ケラチン、カゼイン、アルブミン、グロブリン、エラスチン、ミオシン、アクチン、ホエータンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質、胡麻タンパク質、または卵タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水不溶性タンパク質を陽イオン交換樹脂に接触させる前に水性媒体に浸潤させる工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水不溶性タンパク質の量が、陽イオン交換樹脂に対して質量比で０．０１〜０．５倍である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程（Ａ）において、水不溶性タンパク質と陽イオン交換樹脂の接触時の水性媒体の量を陽イオン交換樹脂に対して質量比で１〜５０倍となるように調整する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記工程（Ａ）および（Ｂ）の加熱処理を、４０〜１６０℃で０．１〜１６８時間行う、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（Ａ）および（Ｂ）の操作を、非吸着画分における水不溶性タンパク質の分解物の収率が５０％以上になるまでそれぞれ複数回繰り返す、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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