(57)【要約】  検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型をその表面に備えるがん細胞検出用高分子膜及びその製造方法、並びに該高分子膜を用いたがん細胞検出装置が提供される。がん細胞検出用高分子膜は、例えば、検出対象であるがん細胞の存在下にモノマーを重合してがん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜を形成する工程と、がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を除去する工程とを含む製造方法によって得ることができる。
2015166977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞検出用の高分子膜であって、検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型をその表面に備える、高分子膜。
【請求項２】
膜厚が５μｍ以下である、請求項１に記載の高分子膜。
【請求項３】
検出対象であるがん細胞の存在下にモノマーを重合して前記がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜を形成する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を除去する工程と、
を含む製造方法によって得られる、請求項１に記載の高分子膜。
【請求項４】
前記除去する工程は、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜を過酸化処理して前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を放出させる工程と、
をこの順で含む、請求項３に記載の高分子膜。
【請求項５】
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程は、前記がん細胞含有高分子膜をヘパリンナトリウムで処理する工程を含む、請求項４に記載の高分子膜。
【請求項６】
前記モノマーが、ピロール、アニリン、チオフェン及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項３に記載の高分子膜。
【請求項７】
請求項１に記載の高分子膜を備える検出部と、
試料液中に含まれる前記検出対象であるがん細胞を前記高分子膜の前記表面の方向に誘導するための誘導部と、
前記鋳型への前記検出対象であるがん細胞の捕捉状態を検知するための検知部と、
を含む、がん細胞検出装置。
【請求項８】
前記誘導部は、１対の電極間に交流電圧を印加することによって、誘電泳動により前記検出対象であるがん細胞を前記高分子膜の前記表面の方向に誘導するものである、請求項７に記載のがん細胞検出装置。
【請求項９】
前記検知部は、水晶振動子を含み、
前記水晶振動子の共振周波数の変化から前記高分子膜の質量変化を測定して前記検出対象であるがん細胞の捕捉状態を検知する、請求項７に記載のがん細胞検出装置。
【請求項１０】
検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型をその表面に備えるがん細胞検出用の高分子膜の製造方法であって、
検出対象であるがん細胞の存在下にモノマーを重合して前記がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜を形成する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を除去する工程と、
を含む、製造方法。
【請求項１１】
前記除去する工程は、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜を過酸化処理して前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を放出させる工程と、
をこの順で含む、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程は、前記がん細胞含有高分子膜をヘパリンナトリウムで処理する工程を含む、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象となるがん細胞を特異的に検出することができる高分子膜及びその製造方法に関する。また本発明は、当該高分子膜を用いたがん細胞検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人の死亡原因はがんなどの悪性新生物によるものが最も多いと言われており、がん細胞の早期発見は死亡率低下のためにも非常に重要である。「がん」とは、一般的に悪性腫瘍のことを指し、由来する組織や細胞の種類によって、上皮細胞から生じる「がん腫」、結合組織や筋細胞からなる「肉腫」、造血細胞由来の「白血病」、神経系細胞由来のものなどに分類される。【０００３】
がん診断は従来、（１）放射線を発する検査薬を注射し、がんの存在する部位に濃縮された検査薬が発する放射線を特殊なカメラを用いて画像化することで外部からがん細胞を検出する陽電子放射断層撮影（Positron  Emission  Tomography:PET）法、（２）Ｘ線を使って身体の断面を撮影し、身体内部を画像化することでがん細胞を検出するコンピュータ断層撮影（Computed  Tomography:CT）法、（３）蛍光染色剤や抗原マーカーのような標識物質を用いて血液中に循環する腫瘍細胞（Circulating  Tumor  Cell：CTC）を検出するCTC検査法などがある。【０００４】
しかしながらPET法及びCT法は、放射線被爆の危険性がある、検査に多くの時間・費用を要する、大掛かりな装置を必要とする、特別な技師を必要とするなど、多くの問題点が指摘されている。この点、CTC検査法は、放射線被爆の危険性がなく大掛かりな装置も必要としないという利点があるが、標識物質を用いるため熟練技術者による検査が不可欠であり、検査の簡便性の面でなお改善の余地があった。【０００５】
ところで国際公開第２０１２／１２１２２９号（特許文献１）には、がん細胞のような細胞ではなく、細菌に代表される微生物を検出するためのセンサーとして、検出対象の微生物の立体構造に相補的な三次元構造を有する鋳型を備えるポリマー層を用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１２１２２９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来の課題に鑑み、本発明の目的は、非標識で迅速かつ簡便にがん細胞を検出することができる、がん細胞検出用の高分子膜及びその製造方法を提供することにある。また本発明の他の目的は、当該高分子膜を用いたがん細胞検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記特許文献１は、細菌に代表される微生物を検出対象としたときに、その微生物の鋳型を有する高分子膜が検出特異性に優れることを開示している。しかし、サイズが細菌よりも極めて大きく（１ケタ程度大きい）、かつ物質としてより柔らかいがん細胞を検出対象としたときに、細菌の場合と同様にがん細胞の鋳型を有する高分子膜を作製することができ、その高分子膜ががん細胞に対して良好な検出特異性（特異的に検出対象のがん細胞を検出する性質）を示すかどうかは当業者において予見することはできず、むしろ、細菌とがん細胞との上記相違点に鑑みれば、がん細胞の鋳型を有する高分子膜の実現性及びがん細胞の優れた検出特異性の発現は難しいというのが当業者にとっての通常の予測である。【０００９】
本発明は、上記のような当業者における通常の予測を覆し、検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型を備える高分子膜を現に実現することができ、かつこの高分子膜が優れた検出特異性を示すという画期的な研究結果に基づくものである。すなわち本発明は、以下のがん細胞検出用高分子膜、がん細胞検出装置、及びがん細胞検出用高分子膜の製造方法を提供する。【００１０】
［１］  がん細胞検出用の高分子膜であって、検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型をその表面に備える、高分子膜。【００１１】
［２］  膜厚が５μｍ以下である、［１］に記載の高分子膜。
［３］  検出対象であるがん細胞の存在下にモノマーを重合して前記がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜を形成する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を除去する工程と、
を含む製造方法によって得られる、［１］又は［２］に記載の高分子膜。【００１２】
［４］  前記除去する工程は、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜を過酸化処理して前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を放出させる工程と、
をこの順で含む、［３］に記載の高分子膜。【００１３】
［５］  前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程は、前記がん細胞含有高分子膜をヘパリンナトリウムで処理する工程を含む、［４］に記載の高分子膜。【００１４】
［６］  前記モノマーが、ピロール、アニリン、チオフェン及びそれらの誘導体からなる群から選択される、［３］〜［５］のいずれかに記載の高分子膜。【００１５】
［７］  ［１］〜［６］のいずれかに記載の高分子膜を備える検出部と、
試料液中に含まれる前記検出対象であるがん細胞を前記高分子膜の前記表面の方向に誘導するための誘導部と、
前記鋳型への前記検出対象であるがん細胞の捕捉状態を検知するための検知部と、
を含む、がん細胞検出装置。【００１６】
［８］  前記誘導部は、１対の電極間に交流電圧を印加することによって、誘電泳動により前記検出対象であるがん細胞を前記高分子膜の前記表面の方向に誘導するものである、［７］に記載のがん細胞検出装置。【００１７】
［９］  前記検知部は、水晶振動子を含み、
前記水晶振動子の共振周波数の変化から前記高分子膜の質量変化を測定して前記検出対象であるがん細胞の捕捉状態を検知する、［７］又は［８］に記載のがん細胞検出装置。【００１８】
［１０］  検出対象であるがん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型をその表面に備えるがん細胞検出用の高分子膜の製造方法であって、
検出対象であるがん細胞の存在下にモノマーを重合して前記がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜を形成する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を除去する工程と、
を含む、製造方法。【００１９】
［１１］  前記除去する工程は、
前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程と、
前記がん細胞含有高分子膜を過酸化処理して前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の少なくとも一部を放出させる工程と、
をこの順で含む、［１０］に記載の製造方法。【００２０】
［１２］  前記がん細胞含有高分子膜に取り込まれたがん細胞の体積を低減させるか、又は前記がん細胞含有高分子膜を形成する高分子膜とがん細胞との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和する工程は、前記がん細胞含有高分子膜をヘパリンナトリウムで処理する工程を含む、［１１］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、非標識で（すなわち、標識物質を用いることなく直接的に）、迅速かつ簡便に特定のがん細胞を検出することができる、がん細胞検出用の高分子膜、及びこれを用いた細胞検出装置を提供することができる。また本発明によれば、検出対象のがん細胞を特異的に（優れた選択性で）検出することができる、がん細胞検出用の高分子膜、及びこれを用いた細胞検出装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係るがん細胞検出用高分子膜を模式的に示す断面図である。
【図２】図１に示されるがん細胞検出用高分子膜の鋳型にがん細胞が捕捉された状態を模式的に示す断面図である。
【図３】本発明に係るがん細胞検出用高分子膜の製造方法の一例を模式的に示す断面図であり、（ａ）は重合工程前、（ｂ）は重合工程後、（ｃ）はがん細胞除去工程後の断面図である。
【図４】本発明に係るがん細胞検出装置の好適な一例の概略構成を示す模式図である。
【図５】白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭの電子顕微鏡写真である。
【図６】実施例１における重合工程後のポリピロール膜（がん細胞含有高分子膜）の表面の電子顕微鏡写真である。
【図７】実施例１の重合工程における時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図８】実施例１における過酸化工程後の過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜）の表面の電子顕微鏡写真である。
【図９】実施例１の過酸化工程における時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図１０】実施例１のがん細胞検出装置を用いたがん細胞検出実験の結果を示すグラフであり、がん細胞検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図１１】実施例１のがん細胞検出装置を用いたがん細胞検出実験の結果を示すグラフであり、がん細胞が標的がん細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭである場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦと、がん細胞が非標的がん細胞ＴＨＰ−１である場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦとを比較するグラフである。
【図１２】白血病細胞ＴＨＰ−１の電子顕微鏡写真である。
【図１３】実施例２における重合工程後のポリピロール膜（がん細胞含有高分子膜）の表面の電子顕微鏡写真である。
【図１４】実施例２の重合工程における時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図１５】実施例２における過酸化工程後の過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜）の表面の電子顕微鏡写真である。
【図１６】実施例２の過酸化工程における時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例２のがん細胞検出装置を用いたがん細胞検出実験の結果を示すグラフであり、がん細胞検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフである。
【図１８】実施例２のがん細胞検出装置を用いたがん細胞検出実験の結果を示すグラフであり、がん細胞が標的がん細胞ＴＨＰ−１である場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦと、がん細胞が非標的がん細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭである場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦとを比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜がん細胞検出用高分子膜及びその製造方法＞
図１は、本発明に係るがん細胞検出用高分子膜を模式的に示す断面図である。図１に示されるように、本発明に係るがん細胞検出用高分子膜１は、検出対象であるがん細胞（以下、「標的がん細胞」ともいう。）の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する複数の鋳型１ａをその表面に備えるものである。がん細胞検出用高分子膜１は、その鋳型１ａに標的がん細胞を取り込んでこれを捕捉することで当該がん細胞を検出する。がん細胞検出用高分子膜１の鋳型１ａに標的がん細胞２が捕捉された状態を断面模式図で図２に示した。
【００２４】
このように本発明に係るがん細胞検出用高分子膜１は、その鋳型１ａが標的がん細胞２の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有しているので、標的がん細胞２を選択性良く捕捉する一方で、この鋳型１ａの三次元構造に相補的でないがん細胞や他の物質を完全に又はほとんど捕捉せず、捕捉選択性に優れる。かかる性質により標的がん細胞２を特異的に検出することが可能となる。
【００２５】
なお、ここでいう「相補的」とは、現段階においては明確ではないが、標的がん細胞２の表面形状に関して相補的であること、及び／又は、標的がん細胞２の表面の分子レベルでの構造に関して相補的であることを包含し得る。
【００２６】
がん細胞検出用高分子膜１の膜厚は例えば０．１〜１０μｍ程度であることができ、５μｍ以下、さらには４μｍ以下であっても、がん細胞の優れた検出特異性を得ることができる。がん細胞のサイズ（直径又は最大径）は概して１０μｍ程度であることから、鋳型１ａは、標的がん細胞２の立体構造の５０％以下について相補的な三次元構造を有するものであってもよく、さらには４０％以下について相補的な三次元構造を有するものであってもよい。また、膜厚を５μｍ以下とすることは、製造容易性の面でも有利である。
【００２７】
一方、がん細胞検出用高分子膜１の製造容易性、取扱性、機械的強度及び検出特異性の観点から、がん細胞検出用高分子膜１の膜厚は１μｍ以上であることが好ましく、また鋳型１ａは、標的がん細胞２の表面分子構造を含む一部の立体構造について相補的な三次元構造を有することが好ましい。
【００２８】
がん細胞検出用高分子膜１の膜厚とは、鋳型１ａを有する表面であって鋳型１ａが形成されていない表面部分からこれに対向する表面までの距離をいう（図１に、がん細胞検出用高分子膜１の膜厚をＡで示している。）。膜厚Ａは、走査型電子顕微鏡、レーザー顕微鏡又は段差測定機で測定することができる。
【００２９】
がん細胞検出用高分子膜１が有する鋳型１ａの数は、製造容易性、機械的強度及び個々の鋳型１ａの独立性（２個以上の鋳型１ａが結合して別異の形状の鋳型が形成されることの抑制）の観点から、鋳型１ａが形成される表面１ｃｍ2あたり９×１０6個以下であることが好ましく、５×１０6個以下であることがより好ましく、３×１０6個以下であることがさらに好ましい。一方、鋳型１ａの数は、標的がん細胞２について十分な検出感度を得るために、上記表面１ｃｍ2あたり１×１０3個以上とすることが好ましく、１×１０4個以上とすることがより好ましい。
【００３０】
鋳型１ａが形成される表面１ｃｍ2あたりの鋳型１ａの数は、当該表面の任意の箇所について４００μｍ×３００μｍのＳＥＭ画像を取得し、その画像に含まれる鋳型１ａの数から求めることができる。
【００３１】
がん細胞検出用高分子膜１を構成する高分子は特に制限されず、各種の高分子を用いることができ、導電性の有無は問わない。ただし、好適に採用される後述の方法によってがん細胞検出用高分子膜１を製造する場合には、製造中間体として標的がん細胞２を取り込んだ高分子膜を効率的に形成できるよう、その原料として、重合反応によって導電性高分子を形成するモノマーを用いることが好ましい。導電性高分子を形成するモノマーとしては、ピロール、アニリン、チオフェン及びそれらの誘導体を挙げることができる。
【００３２】
標的がん細胞２としては、例えば以下に記載のがんに由来する細胞を挙げることができる。慢性白血病、急性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、原発性骨髄繊維症；神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞腫、希突起神経膠腫、非神経膠腫瘍、前庭神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫脳腫瘍；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌性腫瘍、及びカルチノイド又はランゲルハンス島細胞腫瘍のような膵臓がん；クッシング病、プロラクチン分泌性腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症のような下垂体がん；眼の黒色腫（例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫）及び網膜芽細胞腫のような眼のがん；扁平上皮細胞のがん腫、腺がん及び黒色腫のような膣がん；腺がん、小葉（小細胞）がん、腺管内がん、乳腺髄様がん、胸部粘液性がん、胸部管状腺がん、胸部乳頭がん、パジェット病及び炎症性乳がんのような胸部がん；骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜性骨肉腫、柔組織肉腫、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫のような骨組織及び結合組織肉腫；扁平上皮細胞のがん腫、黒色腫、腺がん、基底細胞のがん腫、肉腫、及びパジェット病のような外陰がん；扁平上皮細胞のがん腫、及び腺がんのような子宮頸がん；子宮内膜がん腫及び子宮肉腫のような子宮がん；腺がん、菌状（ポリープ状）、潰瘍状、表在性拡大、散在性拡大、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及びがん肉腫のような胃がん；結腸がん；直腸がん；肝細胞がん腫及び胚芽細胞腫のような肝臓がん、胆嚢がん；乳頭状、結節性のような胆管がん腫；非小細胞肺がん、扁平上皮細胞がん腫（類表皮がん腫）、腺がん、大細胞がん腫及び小細胞肺がんのような肺がん；褐色細胞腫及び副腎皮質がん腫のような副腎がん；乳頭状又は濾胞状甲状腺がん、髄様甲状腺がん及び未分化甲状腺がんのような甲状腺がん；卵巣上皮がん腫、境界領域腫瘍、生殖細胞腫瘍、及び間質性腫瘍のような卵巣がん；胚腫瘍、精上皮腫、未分化、精母細胞性、非セミノーマ、胎生期がん腫、奇形がん腫、絨毛がん腫（卵黄嚢腫瘍）、前立腺がん、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫のような睾丸がん；陰茎がん；扁平上皮細胞がん腫のような口腔がん；腎臓細胞がん、腺がん、副腎腫、線維肉腫、移行上皮細胞がん等の腎臓がん；ウィルムス腫瘍；移行上皮細胞がん腫、扁平上皮細胞がん、腺がん、がん肉腫のような膀胱がん；腺がん、粘液性類表皮がん腫、及び腺様嚢胞がん腫のような唾液腺がん；扁平上皮細胞がん及び疣贅のような咽頭がん；基底細胞がん腫、扁平上皮細胞がん腫及び黒色腫、表在性拡大性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端部黒子黒色腫のような皮膚がん；扁平上皮がん、腺がん、腺様嚢胞がん腫、粘液性類表皮がん腫、腺扁平上皮がん腫、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅がん腫、及び燕麦細胞（小細胞）がん腫のような食道がん。
【００３３】
標的がん細胞２の好ましい一例は、血液中に循環するがん細胞（腫瘍細胞）である。標的がん細胞２は２種以上あってもよく、この場合、がん細胞検出用高分子膜１には、２種以上の標的がん細胞２に対応する鋳型１ａを形成することができる。なお、がん細胞を含む細胞はその外表面にシアル酸やヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等の糖鎖由来のカルボキシル基や硫酸基を有しており、細胞表面は液中において当該カルボキシル基や硫酸基の電離によって負電荷を有している。
【００３４】
次に図３を参照しながら、がん細胞検出用高分子膜１の製造方法について説明する。がん細胞検出用高分子膜１は、次の工程：
標的がん細胞２の存在下にモノマーを重合して標的がん細胞２が取り込まれたがん細胞含有高分子膜５を形成する重合工程Ｓ１０１、及び
がん細胞含有高分子膜５に取り込まれた標的がん細胞２の少なくとも一部を除去するがん細胞除去工程Ｓ１０２
を含む方法によって好適に製造することができる。
【００３５】
この製造方法においてはまず、図３（ａ）に示すように、第１電極１１と、標的がん細胞２及びモノマー（ピロール等）を含む液１２とを用意し、液１２を第１電極１１上に接触させて配置する。液１２のモノマー濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ程度であることができ、標的がん細胞２の数は、１〜１０8個程度であることができる。
【００３６】
次いで重合工程Ｓ１０１において、第１電極１１を陽極とし、対電極（図示せず）を陰極とする電気分解を行い、モノマーの酸化的重合反応（電解重合反応）により、第１電極１１上に標的がん細胞２が取り込まれたがん細胞含有高分子膜５を形成する（図３（ｂ）参照）。モノマーが例えばピロールである場合、第１電極１１上に形成される高分子膜はポリピロールである。この重合工程Ｓ１０１でモノマーは第１電極１１に電子を放出するために、形成される高分子は陽電荷を有するところ、この陽電荷を補償するために、表面に負電荷を有する標的がん細胞２がドーパントアニオンとして効率的に高分子膜に取り込まれる。
【００３７】
重合工程Ｓ１０１における重合時間や、液１２中のモノマー濃度の調整などによって、最終的に得られるがん細胞検出用高分子膜１の膜厚を制御することが可能である。がん細胞検出用高分子膜１が有する鋳型１ａの数は、液１２中の標的がん細胞２の濃度や、モノマーと標的がん細胞２との濃度比などによって制御することが可能である。また鋳型１ａの数は、後述するがん細胞除去工程Ｓ１０２における標的がん細胞２の除去率（以下、「脱ドープ率」ともいう。）を調整することでも制御することが可能である。
【００３８】
次にがん細胞除去工程Ｓ１０２において、図３（ｃ）に示すように、がん細胞含有高分子膜５に取り込まれた標的がん細胞２の少なくとも一部を除去して、標的がん細胞２の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型１ａを備えたがん細胞検出用高分子膜１を得る。がん細胞検出用高分子膜１は、標的がん細胞２が除去されず標的がん細胞２が取り込まれた状態のままの鋳型１ａを部分的に有し得る。
【００３９】
標的がん細胞２の除去方法としては、次の方法を挙げることができる。
ａ）薬剤を用いて、がん細胞含有高分子膜５に取り込まれた標的がん細胞２を少なくとも部分的に溶解又は破壊し、その体積を低減させて除去する方法、
ｂ）浸透圧を利用して、がん細胞含有高分子膜５に取り込まれた標的がん細胞２の体積を低減させて除去する方法、
ｃ）薬剤を用いて、がん細胞含有高分子膜５を構成している高分子膜と標的がん細胞２との間の静電相互作用を少なくとも部分的に中和して除去する方法、
ｄ）方法ａ）〜ｃ）のいずれか１以上の処理を行った後、がん細胞含有高分子膜５を過酸化処理して除去する方法。
【００４０】
上記ａ）及びｂ）の方法は、取り込まれた標的がん細胞２のサイズを小さくして鋳型１ａからの標的がん細胞２の放出を生じやすくする方法である。方法ａ）で用いる薬剤としては、界面活性剤（非イオン性界面活性剤等）、キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ等）などを挙げることができる。
【００４１】
方法ｂ）としては、例えば塩化ナトリウムのような塩の溶液をがん細胞含有高分子膜５に接触させる方法を挙げることができる。方法ｃ）で用いる薬剤としては、がん細胞含有高分子膜５に取り込まれた標的がん細胞２が有する負電荷を少なくとも部分的に中和するカチオン性分子（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン）、がん細胞含有高分子膜５を構成している高分子膜の正電荷を少なくとも部分的に中和するアニオン性分子（例えば、ヘパリンナトリウム）が挙げられる。
【００４２】
方法ｄ）における過酸化処理により、がん細胞含有高分子膜５の高分子膜は電気的に中性となるため、効率的に鋳型１ａから標的がん細胞２を放出（脱ドープ）させることができる。がん細胞含有高分子膜５の高分子膜が例えばポリピロールである場合、この過酸化処理により高分子膜は過酸化ポリピロールとなる。過酸化処理は方法ａ）〜ｃ）のいずれか１以上の処理では有効に標的がん細胞２を除去できない場合に有用であり、方法ａ）〜ｃ）のいずれか１以上の処理によって効果的に標的がん細胞２を除去できる場合には必ずしも必要ではない。これとは逆に、可能な場合には、方法ａ）〜ｃ）を実施することなく過酸化処理のみによって標的がん細胞２を除去してもよい。
【００４３】
過酸化処理は、がん細胞検出用高分子膜１の硬化を生じさせるため、標的がん細胞２の除去によって形成された鋳型１ａの三次元構造を固定するうえでも有利である。過酸化処理は、例えば、高分子膜の表面に中性からアルカリ性の範囲内の液（この液は重合工程Ｓ１０１後の液１２を中性からアルカリ性の範囲内に調整したものであり得る。）を接触させた状態で、第１電極１１と対電極（図示せず）間に電圧を印加することにより行うことができる。
【００４４】
なお、がん細胞除去工程Ｓ１０２における上記方法ａ）〜ｄ）の処理とともに、加温処理、超音波処理等を組み合わせて行ってもよい。
【００４５】
重合工程Ｓ１０１における電解重合反応に用いる第１電極１１は特に限定されず、例えば金電極、金とクロムとの多層電極、金とチタンとの多層電極、銀電極、銀とクロムとの多層電極、銀とチタンとの多層電極、鉛電極、白金電極、カーボン電極等であることができる。第１電極１１のがん細胞含有高分子膜５が形成される面は、粗面化処理が施されていることが好ましい。粗面化処理により、がん細胞含有高分子膜５との密着性が向上し、安定してがん細胞検出用高分子膜１を製造することができる。また粗面化処理により、電極の表面積が拡大するという効果がある。例えば、第１電極１１として金電極を用いた場合、金電極表面にプラズマエッチングを施し、その後金ナノ粒子を固定することにより粗面化処理を行うことができる。第１電極１１の表面粗さは、中心線平均粗さで、例えば０．４〜５０μｍである。
【００４６】
＜がん細胞検出装置＞
本発明に係るがん細胞検出装置は、上述のがん細胞検出用高分子膜１を利用したものである。このため、本発明に係るがん細胞検出装置によれば、非標識で（すなわち、標識物質を用いることなく直接的に）、迅速かつ簡便に標的がん細胞２を検出することが可能であり、また、標的がん細胞２の検出特異性に優れている。
【００４７】
本発明に係るがん細胞検出装置は、鋳型１ａへの標的がん細胞２の捕捉状態に基づいて標的がん細胞２を検出する装置であり、好ましくは、上述のがん細胞検出用高分子膜１を備える検出部に加えて、鋳型１ａへの標的がん細胞２の捕捉状態を検知するための検知部をさらに備える。鋳型１ａへの標的がん細胞２の捕捉状態を検知するための検知部は、例えば、標的がん細胞２の捕捉により生じるがん細胞検出用高分子膜１の質量変化、導電特性変化、電気容量変化、光反射率変化、又は温度変化等を検知するものであることができる。このような捕捉状態の検知手法により、標的がん細胞２の迅速かつ簡便な検出が達成され得る。質量変化の検知方法の具体例として、水晶振動子を利用する方法、より具体的には水晶振動子の共振周波数の変化を検知する方法を挙げることができる。
【００４８】
検出部にあるがん細胞検出用高分子膜１の鋳型１ａへの標的がん細胞２の捕捉（取り込み）は、標的がん細胞２を含む試料液を、がん細胞検出用高分子膜１における鋳型１ａを有する表面に接触させることによって行うことが可能である。この場合において、標的がん細胞２が上記表面の方向へ移動する駆動力は、負に帯電している標的がん細胞２と正に帯電しているがん細胞検出用高分子膜１との静電相互作用、上記表面への標的がん細胞２の沈殿、試料液中での標的がん細胞２の拡散等であり得る。ただし、より効率的にかつ迅速に、さらには検出感度良く標的がん細胞２を検出できるようにするために、本発明に係るがん細胞検出装置は、試料液中に含まれる標的がん細胞２を上記表面の方向に誘導するための誘導部をさらに備えることが好ましい。このような標的がん細胞２の検出部への移動を促進させるための誘導部としては、誘電泳動を利用したもの、電気泳動を利用したもの、試料液に流れを生じさせるものなどを挙げることができる。
【００４９】
誘電泳動（Dielectrophoresis；DEP）とは、不均一な電場内にある粒子（微小物質）が、特定の電場とそれによって誘導される双極子モーメントの相互作用で移動する現象である。１対の電極間に交流電圧を印加することによって誘電泳動を生じさせることができる。
【００５０】
誘導部の作動により、試料液に含まれる標的がん細胞２（ただし、試料液が標的がん細胞２を含まないこともあり得るであろう。）は、検出部のがん細胞検出用高分子膜１の方向に誘引される。この際、標的がん細胞２だけでなく非標的がん細胞のような他の微小物質もがん細胞検出用高分子膜１の方向に誘引されるが、鋳型１ａの三次元構造と相補的な立体構造を有する標的がん細胞２が選択的に鋳型１ａ内に捕捉され、鋳型１ａと相補的でない非標的がん細胞のような他の微小物質は鋳型１ａ内に捕捉されない。
【００５１】
本発明に係るがん細胞検出装置の好ましい一例の概略構成を図４に示す。図４に示されるがん細胞検出装置１００は、がん細胞検出用高分子膜１を備える検出部に加えて、誘電泳動を利用する誘導部と、水晶振動子を利用する検知部とを含むものである。
【００５２】
より具体的に説明すると、がん細胞検出装置１００は、試料液４０を保持するセル（収容槽）２０；セル２０の底部において試料液４０に接触するように配置される検出部としてのがん細胞検出用高分子膜１；がん細胞検出用高分子膜１における鋳型１ａを有する側とは反対側の面に積層される第１電極１１、試料液４０内に浸漬される第２電極（第１対電極）３０、及び第１電極１１と第２電極３０とに接続される交流電源５０から構成される、誘電泳動を利用した誘導部；第１電極１１（誘導部の一方の電極との兼用である。）と水晶片６１と第３電極（第２対電極）６２との積層体である水晶振動子６０、発振回路６５、及び周波数カウンタを有するコントローラ６６から構成される、水晶振動子を利用した検知部を含む。第１電極１１には、上述したがん細胞検出用高分子膜１の製造方法に用いる第１電極をそのまま用いることができる。
【００５３】
水晶振動子６０は、水晶振動子マイクロバランス（Quartz  Crystal  Microbalance；QCM）法に適用される素子である。QCM法とは、水晶振動子の電極上に付着した物質の質量に応じて発振される共振周波数が定量的に減少する特性を利用し、ピコグラムからナノグラムレベルの微量な質量変化を共振周波数変化としてモニタリングすることでリアルタイムに質量変化を測定する方法である。
【００５４】
がん細胞検出装置１００を用いたがん細胞検出方法は、例えば次のとおりである。まず、セル２０内に試料液４０を添加する。そして、交流電源５０により、１対の電極間、すなわち第１電極１１と第２電極３０との間に交流電圧を印加することによって、試料液４０内に含まれる標的がん細胞２を誘電泳動により検出部であるがん細胞検出用高分子膜１の鋳型１ａを有する表面の方向に誘導する。なお、誘電泳動が有効に生じるように、第２電極３０の構成及び形状、印加電圧及び周波数値、試料液４０の組成等を適宜調整する。
【００５５】
一方、誘電泳動開始に合わせて、発振回路６５により第１電極１１と第３電極６２との間に交流電圧を印加し、水晶片６１を振動させて、共振周波数変化のモニタリングを行う。がん細胞検出用高分子膜１の鋳型１ａに標的がん細胞２が捕捉されると、水晶振動子６０上に置かれる物質の質量が増加し、これに伴って水晶振動子６０の共振周波数が減少する。水晶せん断応力＝２．９５×１０11ｇ／ｃｍ・ｓｅｃ2、基準周波数＝９．００ＭＨｚ、オーバートーン次数＝３であるので、水晶振動子６０の表面積＝０．１９６ｃｍ2、水晶振動子６０の密度＝２．６５ｇ／ｃｍ3において、質量変化Δｍ（ｐｇ）と共振周波数変化ΔＦ（Ｈｚ）との関係は次式：
Δｍ＝−３５７ΔＦ
で表される。
【００５６】
コントローラ６６内の周波数カウンタは、発振回路６５からの信号を受けて、共振周波数値を測定する。共振周波数値の変化から、質量変化、ひいては標的がん細胞２の捕捉状態を検出することができる。
【００５７】
なお、図４に示される装置と類似の装置を用いて、第１電極１１表面の粗面化処理、がん細胞含有高分子膜５の形成、及びがん細胞含有高分子膜５の過酸化処理等を実施することができる。例えば、がん細胞含有高分子膜５は、セル２０内に試料液４０の代わりに標的がん細胞２及びモノマーを含む液１２を添加し、交流電源５０に代えて直流電源を接続して電解重合反応を行うことにより形成することができる。この際、第１電極１１に加えて別途、参照極を液１２に浸漬して電位調整を行うことができる。水晶振動子６０を備える装置を用いてがん細胞含有高分子膜５の形成を実施することにより、共振周波数値の変化から、形成されるがん細胞含有高分子膜５の膜厚をモニタリングすることができるので、最終的に得られるがん細胞検出用高分子膜１の膜厚を制御しやすい。
【００５８】
同様に、がん細胞含有高分子膜５の過酸化処理においても、セル２０内に試料液４０の代わりに中性からアルカリ性の範囲内の液（又はがん細胞含有高分子膜５形成後の液１２を中性からアルカリ性の範囲内に調整したもの）を添加し、交流電源５０に代えて直流電源を接続し、直流電圧を印加すればよい。この際にも、第１電極１１に加えて別途、参照極を液１２に浸漬して電位調整を行うことができる。水晶振動子６０を備える装置を用いて過酸化処理を実施することにより、脱ドープ率（がん細胞除去工程Ｓ１０２における標的がん細胞２の除去率）をモニタリングすることができるとともに、これを容易に制御することができる。
【００５９】
本発明に係るがん細胞検出装置によれば、数分〜数１０分程度で標的がん細胞を検出することも可能であり、CTC検査法と比べてもはるかに迅速かつ簡便に標的がん細胞を検出することができる。CTC検査法との対比に関していえば、本発明に係るがん細胞検出装置及び検出法は、標識物質を用いないという点でも有利であり、熟練技術者による検出操作を必ずしも必要としない。
【００６０】
標的がん細胞の立体構造の一部分に相補的な三次元構造を有する鋳型を備える本発明の高分子膜は、がん細胞の検出用としては勿論であるが、がん細胞の回収、除去、濃縮、定量、がん細胞種の特定等にも用いることができる。また本発明の高分子膜は、正常細胞からがん細胞への形質転換をモニタリングするのにも用いることが可能である。さらに本発明の高分子膜は、赤血球や白血球の形状異常の検出にも用いることが可能である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００６２】
以下の実施例において、
・がん細胞含有高分子膜５及びがん細胞検出用高分子膜１の作製には、ポテンショスタットとして電気化学測定システム（ＡＬＳ社製「Ｍｏｄｅｌ８４２Ｂ」）を用いた。
・参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ）、第２電極（第１対電極）３０にはＰｔ棒（直径１ｍｍ、長さ４ｃｍ、（株）ニラコ製）を用いた。以下の実施例において、電位はこの参照電極の電位に対する値を記載している。
・水晶振動子６０には、第１電極１１と水晶片６１と第３電極（第２対電極）６２との積層体（電極面積０．１９６ｃｍ2、密度＝２．６５ｇ／ｃｍ3、基本振動周波数９ＭＨｚ、水晶せん断応力＝２．９５×１０11ｇ／ｃｍ・ｓｅｃ2、オーバートーン次数＝３、ＡＴカット、角型、（株）セイコー・イージー・アンドジー製）を用いた。第１電極１１及び第３電極６２はともに、水晶片６１側から順にＴｉ層（１００ｎｍ厚）、Ａｕ層（３００ｎｍ厚）を積層したものである。
・がん細胞含有高分子膜５及びがん細胞検出用高分子膜１の作製時における共振周波数変化（質量変化）は、水晶振動子マイクロバランス（（株）セイコー・イージー・アンドジー製「ＱＣＭ９３４」）を用いて測定した。
・交流電圧の発生には波形発生装置（７０７５，Ｈｉｏｋｉ，Ｊａｐａｎ）及び増幅器（ＨＡＳ  ４１０１，ＮＦ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
・使用した水はすべて、ろ過をした後、ｐＨ調整、逆浸透膜、イオン交換、紫外殺菌処理を行った超純水である。【００６３】
＜実施例１＞
（１）第１電極の粗面化処理
水晶振動子６０の第１電極１１の表面（Ａｕ層表面）に、過酸化ポリピロール膜との密着性向上のため、以下の手順に従って水晶振動子６０の第１電極１１表面の粗面化処理を行った。
１．  プラズマエッチング装置（ＳＥＤＥ／ｍｅｉｗａ  ｆｏｓｉｓ）により、Ａｕ層表面に対して３０秒間エッチング処理を行った。
２．  水晶振動子６０を、図４と同様の装置におけるセル２０（ウェル型セル、（株）セイコー・イージー・アンドジー製「ＱＡ−ＣＬ４」）の底部に設置した。その後、粒径３０ｎｍのクエン酸保護金ナノ粒子（０．０５７４ｗｔ％）を含む溶液５００μＬをセル２０に添加し、室温で２４時間放置して金ナノ粒子の第１電極１１の表面に付着させた。
３．  第１電極１１の表面を水で洗浄後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム水溶液（０．１Ｍ）９ｍＬ、塩化金（III）酸四塩化物水溶液（０．０１Ｍ）２５０μＬ、ＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ）５０μＬ、アスコルビン酸水溶液（０．１Ｍ）５０μＬを混合して得られた溶液５００μＬをセル２０に添加し、３０℃で２４時間静置して金ナノ粒子の固定化を行った。
４．  セル２０内の溶液を除去し、第１電極１１を水で洗浄した。【００６４】
（２）がん細胞の復元及び培養
がん細胞として、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ヒトＴリンパ球性白血病由来細胞株；ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１９８０）の凍結標本を独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  細胞材料開発室（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）より購入し、次の手順で復元及び培養を行った。以下の操作はすべてクリーンベンチ内で行った。
１．  ５６℃で３０分間インキュベートすることによって非働化したウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）１００ｍＬを細胞培養液（ＲＰＭＩ１６４０，Ｇｉｂｃｏ社）９００ｍＬに加え、室温で約１日静置して、血清入り細胞培養液（ＲＰＭＩ（＋））を調製した。２．  上記凍結標本の溶解物１ｍＬをＲＰＭＩ（＋）９ｍＬに分散させ、遠心分離後（１５００ｒｐｍ，３分）、上澄み液をデカンテーションにより除去した。沈殿物（細胞）にＲＰＭＩ（＋）１０ｍＬを加え、ピペッティングにより懸濁した。この細胞入りディッシュをＣＯ2インキュベータ（ＣＯ2濃度５％）内で約１〜２日間培養した（培地であるＲＰＭＩ（＋）の初期ｐＨ７．４、温度３７℃）。【００６５】
血球計算盤（サンリード硝子有限会社製）を用いて培養後の細胞数を測定したところ、２．０×１０6個／ｍＬであった（培養前：２．０×１０5個／ｍＬ）。Propidium  iodide染色によって、培養後の細胞の生存率は約９５％であることが共焦点レーザー顕微鏡観察により確認された。共焦点レーザー顕微鏡観察は、ＦＶ１２００（ＯＬＹＭＰＵＳ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。【００６６】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，Ｓ−４７００，Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて培養後のＣＣＲＦ−ＣＥＭの形状観察を行った。結果を図５に示す。ＣＣＲＦ−ＣＥＭは球状細胞であり、直径約８μｍであることが確認された。【００６７】
（３）標的がん細胞及びモノマーを含む液の調製
上記（２）で得られた培養後の細胞液１．０ｍＬを遠心分離後（３０００ｒｐｍ，１分）、上澄みをデカンテーションにより除去した。デカンテーション後の沈殿物（細胞）と、リン酸緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ２．５６）を含む０．１Ｍピロール水溶液０．５ｍＬとを混合して標的がん細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）及びピロールを含む液１２を得た。【００６８】
（４）がん細胞検出用高分子膜の作製
以下の手順に従って、水晶振動子６０の第１電極１１上にがん細胞検出用高分子膜１である過酸化ポリピロール膜を形成した。
１．  上記（１）で粗面化処理を施した水晶振動子６０がセル２０の底部に配置されている図４と同様の装置（ただし、交流電源５０に代えて直流電源を使用し、参照電極を備えている。）のセル２０内に、上記（３）で調製した５００μＬの液１２を添加し、液１２内に第２電極３０及び参照電極を差し込んだ。
２．  第１電極１１を作用極として、定電位電解(＋０．９７５Ｖ)することで第１電極１１上に、標的がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜５（ポリピロール膜）を形成した（重合工程）。重合工程の間、水晶振動子マイクロバランスを用いて水晶振動子６０の共振周波数変化ΔＦをモニタリングし、共振周波数変化ΔＦが−１４５ｋＨｚとなるまで定電位電解を行った。
３．  作製したがん細胞含有高分子膜５に非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，１０ｗｔ％）５００μＬを滴下し、室温で約１日放置した後、５ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウム水溶液５００μＬをさらに滴下し、室温で３時間静置して、高分子膜の正電荷緩和処理を行った。その後、セル２０内の溶液を全て除去し、ポリピロール膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
４．  セル２０内に０．１ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、この水溶液内に第２電極３０及び参照電極を差し込んだ。第１電極１１を作用極として、定電位＋０．９７５Ｖを２０分間印加することにより過酸化処理を施して、過酸化ポリピロール膜からなるがん細胞検出用高分子膜１を得た。過酸化処理の間、水晶振動子マイクロバランスを用いて水晶振動子６０の共振周波数変化ΔＦをモニタリングした。レーザー顕微鏡で測定したがん細胞検出用高分子膜１の膜厚は、２μｍであった。【００６９】
（５）がん細胞検出用高分子膜の作製に関する結果
図６に、重合工程後のポリピロール膜（がん細胞含有高分子膜５）の表面の電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡には、上述の走査型電子顕微鏡を用いた。ポリピロール膜の表面にＣＣＲＦ−ＣＥＭが取り込まれた様子が観察された。電子顕微鏡写真から、取り込まれた細胞数を求めたところ、１．６×１０6個／ｃｍ2であった。【００７０】
図７は、重合工程における時間と水晶振動子６０の共振周波数との関係を示すグラフである。定電位電解開始時点の時間を０秒とした。図７において縦軸は共振周波数である。重合工程における共振周波数変化ΔＦは−１４５ｋＨｚであった。これより、上記の質量変化Δｍと共振周波数変化ΔＦとの関係式に基づき、がん細胞含有高分子膜５の質量は５１．８μｇであると算出される。【００７１】
図８に、過酸化工程後の過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜１）の表面の電子顕微鏡写真を示す。鋳型内に取り込まれている細胞はあまり観察されず、膜表面に細胞の鋳型が形成されている。電子顕微鏡写真（サイズ：４００μｍ×３００μｍ）から、鋳型の数を求めたところ、１．５×１０6個／ｃｍ2であり、これは取り込まれた細胞数の９３％に相当する（脱ドープ率＝９３％）。【００７２】
図９は、過酸化工程における時間と水晶振動子６０の共振周波数との関係を示すグラフである。過酸化工程における定電位印加時点の時間を０秒とした。図９において縦軸は共振周波数である。ＣＣＲＦ−ＣＥＭを取り込んだポリピロール膜の過酸化が進むと、水晶振動子６０の共振周波数は時間経過とともに増加した。共振周波数の増加量が１００ｋＨｚであることから、上記の質量変化Δｍと共振周波数変化ΔＦとの関係式に基づき、高分子膜の質量減少量は３５．７μｇであると算出される。これは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭが鋳型から放出されたことによるものであると理解される。【００７３】
（６）標的がん細胞の検出実験
上記（４）で得られた過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜１）を備える図４に示される構成のがん細胞検出装置を用いて、以下の手順で、標的がん細胞であるＣＣＲＦ−ＣＥＭの検出実験を行った。上記（２）で得られた培養後の細胞液５００μＬ（細胞濃度：２．０×１０6個／ｍＬ）をセル２０内に添加した。その後、第１電極１１と第２電極３０との間に交流電圧を３００秒間印加し、誘電泳動によりＣＣＲＦ−ＣＥＭをがん細胞検出用高分子膜１の鋳型を有する表面へ誘導するとともに、交流電圧印加の間、水晶振動子マイクロバランスを用いて水晶振動子６０の共振周波数変化ΔＦをモニタリングした。共振周波数変化ΔＦは、細胞液の代わりにＰＢＳを添加した際のブランクをベースラインとし、測定開始後（交流電圧印加後）３００秒後の値をベースラインから差し引くことで求めた。交流電圧は、波形発生装置（７０７５，Ｈｉｏｋｉ，Ｊａｐａｎ）により交流電圧（波形：正弦波、電圧：０．２Ｖｐｐ、周波数：１０ＭＨｚ）を発生させ、これを増幅器（ＨＡＳ  ４１０１，ＮＦ，Ｊａｐａｎ）で電圧を１０倍に増幅し、２Ｖｐｐとして印加した。【００７４】
また、上記（２）で得られた培養後の細胞液を添加する代わりに、後述する実施例２の（２）で得られた培養後の細胞液（がん細胞として非標的がん細胞であるＴＨＰ−１を含む細胞液）を添加したこと以外は上記と同様にして検出実験を行った。【００７５】
（７）標的がん細胞の検出実験の結果
上記検出実験の結果を図１０〜図１１に示す。図１０は、各がん細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ又はＴＨＰ−１）検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフであり、細胞液の代わりにＰＢＳを添加した際のブランクの結果を併せて示している。図１０において縦軸は共振周波数である。図１１は、がん細胞が標的がん細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭである場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦと、がん細胞が非標的がん細胞ＴＨＰ−１である場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦとを比較するグラフである。【００７６】
図１０〜図１１に示されるように、ＣＣＲＦ−ＣＥＭを標的がん細胞とする高分子膜に対して、ＣＣＲＦ−ＣＥＭを添加した場合には共振周波数が大きく減少する一方、非標的がん細胞であるＴＨＰ−１を添加した場合には、ブランクと同様、共振周波数に変化はほとんど認められなかった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量増加を意味しており、ＣＣＲＦ−ＣＥＭを添加した場合の質量増加は、鋳型と適合するＣＣＲＦ−ＣＥＭの取り込みを意味している。一方、鋳型と適合しないＴＨＰ−１を添加した場合には、がん細胞の鋳型への取り込みはほとんど生じていない。このように、本実施例のがん細胞検出用高分子膜１は、がん細胞の種類を高精度に認識している（標的がん細胞を特異的に検出している）と判断できる。【００７７】
＜実施例２＞
（１）第１電極の粗面化処理
実施例１と同様にして、水晶振動子６０の第１電極１１表面の粗面化処理を行った。【００７８】
（２）がん細胞の復元及び培養
がん細胞として、ＴＨＰ−１（ヒト急性単球性白血病；ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１１８９）の凍結標本を独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  細胞材料開発室（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）より購入し、実施例１と同様の手順で復元及び培養を行った。【００７９】
血球計算盤（サンリード硝子有限会社製）を用いて培養後の細胞数を測定したところ、１．０×１０6個／ｍＬであった。Propidium  iodide染色によって、培養後の細胞の生存率は約９５％であることが共焦点レーザー顕微鏡観察により確認された。また、上述の走査型電子顕微鏡を用いて培養後のＴＨＰ−１の形状観察を行った。結果を図１２に示す。ＴＨＰ−１は球状細胞であり、直径約１０μｍであることが確認された。【００８０】
（３）標的がん細胞及びモノマーを含む液の調製
上記（２）で得られた培養後の細胞液１．０ｍＬを用いること以外は、実施例１と同様にして標的がん細胞（ＴＨＰ−１）及びピロールを含む液１２を得た。【００８１】
（４）がん細胞検出用高分子膜の作製
上記（３）で調製した液１２を用いること以外は、実施例１と同様にして、標的がん細胞が取り込まれたがん細胞含有高分子膜５（ポリピロール膜）を作製し、次いで過酸化ポリピロール膜からなるがん細胞検出用高分子膜１を作製した。本実施例においては、重合工程の間、水晶振動子マイクロバランスを用いて水晶振動子６０の共振周波数変化ΔＦをモニタリングし、共振周波数変化ΔＦが−１４０ｋＨｚとなるまで定電位電解を行った。レーザー顕微鏡で測定したがん細胞検出用高分子膜１の膜厚は、２μｍであった。【００８２】
（５）がん細胞検出用高分子膜の作製に関する結果
図１３に、重合工程後のポリピロール膜（がん細胞含有高分子膜５）の表面の電子顕微鏡写真を示す。電子顕微鏡には、上述の走査型電子顕微鏡を用いた。ポリピロール膜の表面にＴＨＰ−１が取り込まれた様子が観察された。電子顕微鏡写真から、取り込まれた細胞数を求めたところ、６．７×１０5個／ｃｍ2であった。【００８３】
図１４は、重合工程における時間と水晶振動子６０の共振周波数との関係を示すグラフである。定電位電解開始時点の時間を０秒とした。図１４において縦軸は共振周波数である。重合工程における共振周波数変化ΔＦは−１４０ｋＨｚであった。これより、上記の質量変化Δｍと共振周波数変化ΔＦとの関係式に基づき、がん細胞含有高分子膜５の質量は５０．０μｇであると算出される。【００８４】
図１５に、過酸化工程後の過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜１）の表面の電子顕微鏡写真を示す。鋳型内に取り込まれている細胞はあまり観察されず、膜表面に細胞の鋳型が形成されている。電子顕微鏡写真（サイズ：４００μｍ×３００μｍ）から、鋳型の数を求めたところ、６．０×１０5個／ｃｍ2であり、これは取り込まれた細胞数の９０％に相当する（脱ドープ率＝９０％）。【００８５】
図１６は、過酸化工程における時間と水晶振動子６０の共振周波数との関係を示すグラフである。過酸化工程における定電位印加時点の時間を０秒とした。図１６において縦軸は共振周波数である。ＴＨＰ−１を取り込んだポリピロール膜の過酸化が進むと、水晶振動子６０の共振周波数は時間経過とともに増加した。共振周波数の増加量が２０ｋＨｚであることから、上記の質量変化Δｍと共振周波数変化ΔＦとの関係式に基づき、高分子膜の質量減少量は７．１４μｇであると算出される。これは、ＴＨＰ−１が鋳型から放出されたことによるものであると理解される。【００８６】
（６）標的がん細胞の検出実験
標的がん細胞としてＴＨＰ−１を用いること以外は実施例１と同様にして、上記（４）で得られた過酸化ポリピロール膜（がん細胞検出用高分子膜１）を備える図４に示される構成のがん細胞検出装置を用いて、標的がん細胞の検出実験を行った。セル２０内に添加する細胞液としては上記（２）で得られた培養後の細胞液（細胞濃度：１．０×１０6個／ｍＬ）を用いた。【００８７】
また、上記（２）で得られた培養後の細胞液を添加する代わりに、実施例１の（２）で得られた培養後の細胞液（がん細胞として非標的がん細胞であるＣＣＲＦ−ＣＥＭを含む細胞液）を添加したこと以外は上記と同様にして検出実験を行った。【００８８】
（７）標的がん細胞の検出実験の結果
上記検出実験の結果を図１７〜図１８に示す。図１７は、各がん細胞（ＴＨＰ−１又はＣＣＲＦ−ＣＥＭ）検出時の交流電圧印加時間と水晶振動子の共振周波数との関係を示すグラフであり、細胞液の代わりにＰＢＳを添加した際のブランクの結果を併せて示している。図１７において縦軸は共振周波数である。図１８は、がん細胞が標的がん細胞ＴＨＰ−１である場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦと、がん細胞が非標的がん細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭである場合の交流電圧印加時間３００秒における共振周波数変化ΔＦとを比較するグラフである。【００８９】
図１７〜図１８に示されるように、ＴＨＰ−１を標的がん細胞とする高分子膜に対して、ＴＨＰ−１を添加した場合には共振周波数が大きく減少する一方、非標的がん細胞であるＣＣＲＦ−ＣＥＭを添加した場合には、ブランクと同様、共振周波数に変化はほとんど認められなかった。共振周波数の減少は水晶振動子表面の質量増加を意味しており、ＴＨＰ−１を添加した場合の質量増加は、鋳型と適合するＴＨＰ−１の取り込みを意味している。一方、鋳型と適合しないＣＣＲＦ−ＣＥＭを添加した場合には、がん細胞の鋳型への取り込みはほとんど生じていない。このように、本実施例のがん細胞検出用高分子膜１は、がん細胞の種類を高精度に認識している（標的がん細胞を特異的に検出している）と判断できる。
【符号の説明】
【００９０】
１  がん細胞検出用高分子膜、１ａ  鋳型、２  標的がん細胞、５  がん細胞含有高分子膜、１１  第１電極、１２  標的がん細胞及びモノマーを含む液、２０  セル、３０  第２電極（第１対電極）、４０  試料液、５０  交流電源、６０  水晶振動子、６１  水晶片、６２  第３電極（第２対電極）、６５  発振回路、６６  コントローラ、１００  がん細胞検出装置、Ａ  がん細胞検出用高分子膜の膜厚。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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