(57)【要約】簡易な構成でオフ・ターゲット効果の抑制効果が得られるＲＮＡ干渉剤を提供する。このため、本開示は、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖として備えるＲＮＡ干渉剤とする。
2014084354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式（１）で表される、請求項１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【化１６】
2014084354.tif 000021
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基を表し、ｎは１又は２以上の整数を表す。）
【請求項３】
Ｙは炭素数が２の基を表す、請求項２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記式（１）は、以下の式で表される、請求項２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【化１７】
2014084354.tif 000022
【請求項５】
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備える、請求項１〜４のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
請求項１〜５のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチドであって前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備える、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項７】
前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドの３’末端には、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備える、請求項６に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項８】
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【化１８】
2014084354.tif 000023
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
【化１９】
2014084354.tif 000024
【請求項９】
ＲＮＡ干渉剤の製造方法であって、
３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖とガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、
を備える、製造方法。
【請求項１０】
以下の式で表される、オリゴヌクレオチド合成試薬。
【化２０】
2014084354.tif 000025
（式中、Ｙは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
【請求項１１】
遺伝子の機能の評価方法であって、
前記遺伝子を標的遺伝子として、請求項６〜８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
を備える、評価方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の請求項６〜８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、ＲＮＡ干渉（以下、単に、ＲＮＡｉともいう。）剤、その製造方法及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉは、配列特異的にｍＲＮＡの分解を生じさせ、ターゲットとなる遺伝子の発現を抑制することができる。ＲＮＡｉを引き起こすｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡは、技術としての簡便性及びその高い遺伝子抑制効果の観点から、遺伝子の機能解析や臨床応用が期待されている。【０００３】
ＲＮＡｉ経路では、通常、細胞内で二本鎖ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡがＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、一本鎖に解離する。そのままＲＩＳＣ中に残されて遺伝子発現に関与する鎖をガイド鎖（アンチセンス鎖）といい、他方、ＲＩＳＣから放出される他方の鎖をパッセンジャー鎖（センス鎖）という。ｓｉＲＮＡの場合には、ガイド鎖が正しくＲＩＳＣに取り込まれると、ガイド鎖を含むＲＩＳＣ複合体は、ガイド鎖と相補的な配列を有するターゲットｍＲＮＡを認識し、ａｇｏ２のスライサー活性によって標的ｍＲＮＡを切断する。また、ｍｉＲＮＡの場合には、標的ｍＲＮＡを認識し、翻訳過程を抑制する。こうした結果、ターゲット遺伝子の発現が抑制されると考えられている。【０００４】
ＲＩＳＣがこれら二本鎖のうちどのような機構で一方の鎖をガイド鎖として認識するかについては、二本鎖両末端の熱力学的安定性に起因すると推測されている。【０００５】
ここで、パッセンジャー鎖があたかもガイド鎖のように取り込まれうる場合もある。こうした場合には、いわゆるオフ・ターゲット効果が生じてしまう。オフ・ターゲット効果とは、ターゲット遺伝子以外の本来意図していない他の遺伝子を抑制してしまう現象をいう。ＲＮＡｉにおいては、パッセンジャー鎖がＲＩＳＣに取り込まれることで、パッセンジャー鎖の有する塩基配列（ガイド鎖と相補的である）が本来のターゲット遺伝子でない他の遺伝子のｍＲＮＡに対して作用して、その発現を抑制してしまうことが生じうる。【０００６】
こうしたオフ・ターゲット効果を抑制するための試みとして、パッセンジャー鎖に修飾ヌクレオチドを導入することが開示されている（特許文献１）。また、パッセンジャー鎖に不連続部位を設けることが開示されている（特許文献２）。さらに、センス鎖（パッセンジャー鎖）の一又は両方の末端のヌクレオチドの２’位の水酸基にメチル基等で修飾することで、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の取り込をＲＩＳＣへの取り込みを促進することなどが開示されている（特許文献３）。【０００７】
また、ＲＩＳＣのＰＡＺ（Piwi/Argonaute/Zwille）ドメインは、普遍的に疎水性ポケットを有することがわかっており、この疎水性ポケットにガイド鎖の３’−末端が相互作用することでガイド鎖−ＲＩＳＣ複合体が形成されることがわかっている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１０−５３８６７７号公報
【特許文献２】特表２００９−５３０３１９号公報
【特許文献３】特表２０１１−５１１６３６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J.B. Ma, K. Ye, D. J. Patel, Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429, 318-320 (2004)
【発明の概要】
【００１０】
しかしながら、パッセンジャー鎖への修飾ヌクレオチドの導入は通常煩雑であった。また、ＲＮＡｉによるターゲット遺伝子の抑制効果及びオフ・ターゲット効果の抑制効果の双方が十分に確保されているとはいえなかった。
【００１１】
そこで、本明細書の開示は、簡易な構成でオフ・ターゲット効果抑制効果が得られるＲＮＡ干渉剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＲＮＡ干渉において、本来ターゲット遺伝子でない他の遺伝子の発現を抑制してしまうオフ・ターゲット効果を抑制するには、パッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端のＰＡＺドメインへの取り込みを抑制することが有効であるという推論を立てた。そこで、ＲＮＡ二重鎖のガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖の３’末端に極性基を導入して、オフ・ターゲット効果の抑制について評価した。その結果、３’末端に極性基を導入した一本鎖ＲＮＡは、結果としてＲＮＡｉ効果を発揮しえないことがわかった。こうした知見に基づき、本明細書の開示は、以下の手段を提供する。【００１３】
本明細書の開示によれば、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドが提供される。前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式で表されていてもよい。【００１４】
【化１】
2014084354.tif 000003
（ただし、Ｘは、連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）Ｙは炭素数が２の基を表していてもよい。【００１５】
ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下の式で表されるユニットであってもよい。【００１６】
【化２】
2014084354.tif 000004
前記３’末端には、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備えることが好ましい。【００１７】
本明細書の開示によれば、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドであって前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、を備える、ＲＮＡ干渉剤が提供される。前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドの３’末端には、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えていてもよい。【００１８】
さらに、前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表されるものでもあってよい。【００１９】
【化３】
2014084354.tif 000005
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
【化４】
2014084354.tif 000006
【００２０】
本明細書の開示によれば、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖とガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、を備える、ＲＮＡ干渉剤の製造方法が提供される。【００２１】
本明細書の開示によれば、以下の式で表される、オリゴヌクレオチド合成試薬が提供される。【００２２】
【化５】
2014084354.tif 000007
（式中、Ｙは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホロアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）【００２３】
本明細書の開示によれば、遺伝子の機能の評価方法であって、前記遺伝子を標的遺伝子として、本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、を備える、評価方法が提供される。【００２４】
本明細書の開示によれば、ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。【００２５】
本明細書の開示によれば、ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本明細書に開示される一本鎖ＲＮＡの一例を示す図である。
【図２】本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の例を示す図である。
【図３】本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の作用の概要を示す図である。
【図４】実施例で作製したＲＮＡ干渉剤を示す図である。
【図５】ＲＮＡ干渉剤の評価結果を示す図である。
【図６】ＲＮＡ干渉剤の評価結果を示す図である。
【図７】マイクロアレイ解析における各アレイ（Ａ、Ｂ、Ｃ）間における相関の評価結果を示す図である。
【図８】フィルタリング指定地を１．１５としたときのマイクロアレイ解析結果を示す図である。
【図９】フィルタリング指定地を１としたときのマイクロアレイ解析結果を示す図である。
【図１０】ＲＮＡ干渉剤のセンス鎖によるオフ・ターゲット効果の抑制をアレイ上の９スポットについて評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書の開示は、ＲＮＡ干渉に用いられるＲＮＡ干渉剤、その製造方法並びにＲＮＡ干渉剤の利用等に関する。本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドをＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖として用いることで、パッセンジャー鎖によるオフ・ターゲット効果を抑制できる。
【００２８】
ＲＮＡ干渉剤のオフ・ターゲット効果が抑制されることで、遺伝子の機能解析や薬剤スクリーニングを高い信頼性を行うことができる。また、遺伝子治療も高い安全性で行うことができる。
【００２９】
また、ＲＮＡ干渉剤のオフ・ターゲット効果が抑制されることで、ガイド鎖におけるアンチセンス部位の選択の自由度を高めることができ、よりＲＮＡ干渉効果を高めることができる。
【００３０】
以下、本明細書の開示を、図１〜図３を適宜参照しながら詳細に説明する。
【００３１】
（一本鎖オリゴヌクレオチド）
本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドの一例を図１に示す。図１に示すように、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備えることができる。なお、図１においてはＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備えているが、典型例として示すものであり、これに限定する趣旨ではない。
【００３２】
本明細書に開示されるこの一本鎖オリゴヌクレオチドは、図２に示すように、ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖として用いられるものである。以下、本明細書に開示される一本鎖オリゴヌクレオチドを、パッセンジャーオリゴヌクレオチドともいう。
【００３３】
本明細書の開示は、ＲＮＡｉ経路において、ＲＩＳＣ中のＰＡＺドメイン構造に着目している。ＰＡＺドメインはｓｉＲＮＡの３’末端２塩基突出部位を認識する。ＰＡＺドメインは疎水性ポケットを有している。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、従来のｓｉＲＮＡの３’末端を構成しているＴＴなどに比較して、このポケットとの相互作用が弱まる構造を有するものであればよい。
【００３４】
ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、ＲＮＡ鎖の３’末端に２単位備えられたとき、ＲＩＳＣのＰＡＺドメインに対して、３’末端にＴＴを備える場合よりもＲＮＡ鎖を結合しにくくするユニットを意味している。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下のようにして取得できる。各一本鎖ＲＮＡの３’末端がそれぞれ２単位突出している二重鎖ＲＮＡのガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各３’末端をＴＴとした二重鎖ＲＮＡを対照ＲＮＡ二重鎖として準備する。また、ガイド鎖の３’末端に２単位のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を導入したこと以外は対照の二重鎖ＲＮＡとは同一の被験二重鎖ＲＮＡを準備する。そして、対照二重鎖ＲＮＡと被験二重鎖ＲＮＡを同等の条件で発現抑制の標的となる遺伝子を保持する細胞に導入したとき、対照二重鎖ＲＮＡよりも標的遺伝子の発現抑制効果が低くなるような被験二重鎖ＲＮＡの３’末端の候補をＰＡＺドメイン低親和性ユニットということができる。より具体的には、被験二重鎖ＲＮＡの導入量を高めても発現抑制効果が向上しないようなユニットをいう。
【００３５】
なお、上記細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよく、さらに、他の細胞であってもよい。
【００３６】
こうしたＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、極性基を含んでいることが好ましい。ＰＡＺドメインには、疎水性の高いユニットが高い親和性を有することが一般的に知られているからである。ＰＡＺドメインは、ｓｉＲＮＡのガイド鎖の３’末端の２塩基突出部位を認識する。ＲＩＳＣのＰＡＺドメインは、芳香環を有する疎水性残基が密集した疎水性ポケットを有しており、疎水性相互作用によりｓｉＲＮＡのガイド鎖の２塩基突出部位を認識すると考えられている。このため、パッセンジャー鎖の３’末端が、ガイド鎖の３’末端よりも疎水性ポケットとの相互作用を弱めるような構造をＰＡＺドメイン低親和性ユニットを備えるようにすればよい。こうした、構造としては、特に限定されないが、例えば、細胞内において、酸性を呈するカルボキシル基（-ＣＯＯＨ）、リン酸基（-ＰＯ3Ｈ、-ＰＯ3Ｈ-）などの酸性基や、細胞内において塩基性を呈するアミノ基（-ＮＨ2、―ＮＨ−）などの塩基性基が挙げられる。また、水酸基（-ＯＨ）やエーテル結合（−Ｏ−）などであってもよい。
【００３７】
好ましくは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、例えば、以下の式（１）で表される。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットが３’末端の端末にあるとき、以下の式の右端は、水素又はリン酸基である。
【００３８】
【化６】
2014084354.tif 000008
【００３９】
上記式（１）において、Ｘは、連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基である。また、上記式（１）においてｎはＰＡＺドメイン低親和性ユニットの個数を表し、１又は２以上の整数を表している。ｎが２以上のとき、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、連続して備えられる。こうしたＰＡＺドメイン低親和性ユニットによれば、簡易に合成できるとともに、効果的にパッセンジャーオリゴヌクレオチドのＰＡＺドメインへの結合を抑制できる。
【００４０】
連結基Ｘを含むＰＡＺドメイン低親和性ユニットとしては、例えば、以下に記載の二価の基が挙げられる。以下の式においてＲは、アルキル基やアシル基等の置換基を表し、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルキル基を備えるアシル基を表す。
【化７】
2014084354.tif 000009
【００４１】
Ｙは、炭素数が２以上の基であればよいが、好ましくは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表している。アルキレン基であることが好ましい。直鎖状であっても分岐状であってもよい。アルキレン基は、好ましくは、炭素数が１〜３個であり、より好ましくは、２個又は３個であり、一層好ましくは２個である。アルキレン基の水素原子は、置換されていてもよいが、置換されていないことが好ましい。
【００４２】
好ましいＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式で表される。以下の式において、Ｙ及びｎは、式（１）と同義であるが、Ｙは炭素数が１〜３個の無置換の直鎖状又は分岐状のアルキレン基である。より好ましくは炭素数が２個のエチレン基である。
【００４３】
【化８】
2014084354.tif 000010
【００４４】
ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端に１又は２個以上備えることができる。好ましくは、２個以上を備えることができる。ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、複数個備えるとき、連続して備えることが好ましい。また、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、４個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個である。なお、３’末端には、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットでないオリゴヌクレオチドを備えていてもよい。好ましくは、３’末端の端末から連続してＰＡＺドメイン低親和性ユニット備えている。
【００４５】
パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、こうした３’末端を備えることを特徴とする以外は、通常のパッセンジャーオリゴヌクレオチドとしての要素を備えることができる。すなわち、組み合わされるガイド鎖のアンチセンス部位と特異的にハイブリダイズするセンス部位を備えている。センス部位は、好ましくは、アンチセンス部位と完全に相補的なＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる塩基配列である。センス部位等においては、ＲＮＡ干渉剤としての安定性を高めることなどを目的として適宜修飾塩基のほか、ヌクレオシド誘導体などを用いることができる。
【００４６】
パッセンジャーオリゴヌクレオチドの長さは限定しないが、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを含み、当該１ユニットを１ヌクレオチドとしたとき、１９以上４９以下のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１９以上３０以下であり、さらに好ましくは１９以上２４以下であり、一層好ましくは１９以上２２以下である。最も好ましくは２１ヌクレオチドである。
【００４７】
図１に示すように、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットをその３’末端に有しているため、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端はＰＡＺドメインと結合しにくい。その結果、図２及び図３に示すように、パッセンジャーオリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖としてガイド鎖とともにＲＮＡ干渉剤を構成したとき、このパッセンジャー鎖は、ＲＩＳＣから選択的に放出されることになる。したがって、意図しない一本鎖（パッセンジャー鎖）−ＲＩＳＣが形成されない。このため、標的遺伝子以外の他の遺伝子の発現を抑制することがない。すなわち、パッセンジャーオリゴヌクレオチドによるターゲット効果（オフ・ターゲット効果）を抑制できる。
【００４８】
さらに、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、極性基を含む簡易な単位であるため、合成コストを低減できる。さらにまた、パッセンジャーオリゴヌクレオチドは３’末端のみに簡易な極性単位を備えることで、オフ・ターゲット効果を抑制できる。
【００４９】
こうしたパッセンジャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、後段にて詳述する。
【００５０】
（ＲＮＡ干渉剤）
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤は、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、パッセンジャーオリゴヌクレオチドと、を備えることができる。図２には、ＲＮＡ干渉剤の一例を示す。図２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれガイド鎖の３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えない形態及び当該ユニットを備える形態を示す。
【００５１】
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤によれば、パッセンジャーオリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖として備えているため、パッセンジャー鎖との意図しないＲＩＳＣ複合体の形成が抑制される（図３参照）。この結果、オフ・ターゲット効果が抑制される。結果として、高い選択性で標的遺伝子の発現を抑制できる。
【００５２】
ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖は、標的遺伝子の所定の塩基配列（センス配列）と特異的にハイブリダイズするアンチセンス部位を有している。ここでアンチセンス部位は標的遺伝子の塩基配列と好ましくは完全に相補的なＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる塩基配列を有している。ガイド鎖のアンチセンス部位等においては、ＲＮＡ干渉剤としての安定性を高めることなどを目的として適宜修飾塩基のほか、ヌクレオシド誘導体などを用いることができる。
【００５３】
ガイド鎖は、典型的には、パッセンジャー鎖とハイブリダイズ時においてパッセンジャー鎖の５’末端から１塩基又は２塩基以上（好ましくは２塩基）突出するダングリング末端を３’末端に備えている。ガイド鎖は、従来公知のｓｉＲＮＡと同様、その３’末端には、ＵＵないしＴＴなどのヌクレオチドを備えることができる。ガイド鎖の３’末端は、Ｕ、Ｔ、又はその他の塩基を１又は２以上組み合わせて備えることができる。
【００５４】
ＲＮＡ干渉剤のガイド鎖は、３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備えることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＲＮＡ鎖の３’末端に２単位備えられたとき、ＲＩＳＣのＰＡＺドメインに対して、３’末端にＴＴを備える場合よりも結合しやすいユニットを意味している。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、例えば、以下のようにして取得できる。各一本鎖ＲＮＡの３’末端がそれぞれ２単位突出している二重鎖ＲＮＡを構成するガイド鎖（所定の遺伝子のセンス鎖に対して相補的なＲＮＡ塩基配列を有する）及びパッセンジャー鎖の各３’末端をＴＴとした二重鎖ＲＮＡを対照ＲＮＡ二重鎖として準備する。また、ガイド鎖の３’末端に２単位のＰＡＺドメイン高親和性ユニット候補を導入したこと以外は対照の重鎖ＲＮＡとは同一の被験二重鎖ＲＮＡを準備する。そして、対照二重鎖ＲＮＡと被験二重鎖ＲＮＡを同様の条件で発現抑制の標的となる遺伝子を保持する細胞に導入したとき、対照二重鎖ＲＮＡよりも標的遺伝子の発現抑制効果が高くなるような被験二重鎖ＲＮＡの３’末端を構成するユニットをいう。より具体的には、被験二重鎖ＲＮＡの導入量を高めたら発現抑制効果も向上するようなユニットをいう。
【００５５】
ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットよりも発現抑制効果が高いということもできる。また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットよりも極性が低い（疎水性が高い）ユニットであるということもできる。
【００５６】
また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、そのバックボーンとして天然型ヌクレオチドの糖−リン酸骨格であってもよいし、その他の非天然骨格であってもよい。そして、当該ユニットは、天然型のヌクレオチドであってもよいし、修飾型ヌクレオチドであってもよいし、非ヌクレオチド化合物であってもよい。
【００５７】
こうしたＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ベンゼン様骨格を有する単位を好ましく用いることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、例えば以下の式（２）で表される。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットが３’末端の端末にあるとき、以下の式の右端は、水素又はリン酸基である。式（２）においてｍはＰＡＺドメイン高親和性ユニットの個数を表し、１又は２以上の整数を表している。ｍが２以上のとき、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、連続して備えられる。
【００５８】
【化９】
2014084354.tif 000011
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
【００５９】
【化１０】
2014084354.tif 000012
【００６０】
こうしたベンゼン様骨格を有する単位は、例えば、国際公開第ＷＯ2007/094135号等にその詳細が記載されており、当業者であれば、こうした単位をＰＡＺドメイン高親和性ユニットとして付与することができる。
【００６１】
ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、パッセンジャーオリゴヌクレオチドの３’末端に１又は２単位以上備えることができる。好ましくは、２個以上を備えることができる。ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、複数個備えるとき、連続して備えることが好ましい。また、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、４個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下であり、さらに好ましくは２個である。
【００６２】
（ＲＮＡ干渉剤の製造方法）
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤の製造方法は、パッセンジャーオリゴヌクレオチドと、ガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程を備えることができる。この製造方法によれば、オフ・ターゲット効果が抑制されたＲＮＡ干渉剤を簡易に製造することができる。
【００６３】
パッセンジャーオリゴヌクレオチドは、その３’末端の合成時に、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを付与するためのホスホアミダイト体やＣＰＧ試薬を用いることで、公知のホスホアミダイト法により合成することができる。
【００６４】
ＰＡＺドメイン低親和性ユニット付与のためのホスホアミダイト体やＣＰＧ試薬などのオリゴヌクレオチド合成用試薬としては、例えば以下の式で表される化合物を用いることができる。
【００６５】
【化１１】
2014084354.tif 000013
【００６６】
上記式において、Ｗ１は水素原子又は水酸基保護基を表すことができる。水酸基保護基としては、水酸基を意図しない反応から保護する基であればよい。こうした水酸基保護基としては、特に限定しないで従来公知の各種の水酸基保護基を用いることができる。本発明の好ましい保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＯＣ基）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基）、四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基である。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）から選択される。
【００６７】
また、Ｗ２は、水酸基保護基、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。Ｗ２がホスホルアミダイト基である化合物（アミダイト化合物）は、ホスホルアミダイト法によるホスホルアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホルアミダイト基は、以下の式で表すことができる。
【００６８】
【化１２】
2014084354.tif 000014
（式中、各Ｙ１は独立して、同一であっても異なっていてもよく、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基を表し、Ｙ２は、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基又は置換されていてもよいアルコキシル基を表す。）
【００６９】
上記式において、Ｙ１は、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられ、また、Ｙ２としては、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＥＣＮ、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２等が挙げられる。
【００７０】
また、Ｗ2がＣＰＧなどの固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、上記式において、Ｗ２が固相担体に結合された連結基である化合物は、ＰＡＺドメイン低親和性ユニットの−ＯＹＯ−部分が所定の固相用連結基を介して固相担体に結合されているため、この試薬をパッセンジャーオリゴヌクレオチドの核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。この試薬に対して−ＯＹＯ−部分を有するホスホアミダイト試薬でホスホアミダイト法等でＰＡＺドメイン低親和性ユニットを複数個連結していくことができる。
【００７１】
さらに、適数個のＰＡＺドメイン低親和性ユニットを付与したら、一般的に用いられるリボヌクレオチドのホスホアミダイト試薬を用いてセンス部位を含む所定長のオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００７２】
ここで、固相担体とは、一般に高分子担体が用いられ、例えば、ＣＰＧ（controlled pored glass）やＨＣＰ（highly cross-linked polystyrene）、ある種のゲルなどが挙げられる。また、固相担体には適切なスペーサーを有していてもよい。連結基は、固相担体と本化合物とを連結するリンカーである。こうした連結基としては、公知のコハク酸エステルリンカー、シュウ酸エステルリンカー、シランジイルリンカー、シリルリンカーなどを用いることができる。
【００７３】
このような式で表される試薬は既知の方法を組み合わせて合成される。例えば、以下のスキームで合成できる。
【００７４】
【化１３】
2014084354.tif 000015
【００７５】
ガイド鎖における３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを導入する場合には、既に説明したように公知の方法によりベンゼン様骨格単位を導入することができる。ガイド鎖におけるアンチセンス部は、標的とする遺伝子の塩基配列から適宜選択される。
【００７６】
（遺伝子の機能の評価方法）
本明細書に開示される遺伝子の機能解析方法は、前記遺伝子を標的遺伝子として、本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程と、を備えることができる。本評価方法によれば、オフ・ターゲット効果が抑制されているので、標的遺伝子のみの発現を高い選択性で抑制できる。この結果、遺伝子の評価を的確に行うことができる。
【００７７】
ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入するのにあたっては、既に知られている一般的な方法を採用できる。細胞としては、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。
【００７８】
細胞における変化を評価する工程における評価項目や評価方法は、標的遺伝子の種類等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、細胞における標的遺伝子の発現状態（発現が抑制されたか否か、その程度など）を評価することのほか、細胞における想定されうる生物学的、化学的及び／又は物理的な変化を検出することが挙げられる。細胞として生体内細胞を用いる場合には、当該細胞が存在する非ヒト動物における生物学的、化学的及び／又は物理的な変化を検出することが挙げられる。
【００７９】
（ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉制御剤のスクリーニング方法は、標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、を備えることができる。このスクリーニング方法によると、オフ・ターゲット効果が抑制されており、アンチセンス部位候補を備えるＲＮＡ干渉剤の標的遺伝子の発現抑制効果を的確に評価することができる。このため、ＲＮＡ干渉剤として有効なアンチセンス部位を効率的にスクリーニングできる。また、オフ・ターゲット効果が抑制され、かつ有効なアンチセンス部位を有するＲＮＡ干渉剤をスクリーニングできる。
【００８０】
ＲＮＡ干渉剤のパッセンジャー鎖としては、既に説明した各種態様のパッセンジャーオリゴヌクレオチドを用いることができる。ガイド鎖についても、同様である。アンチセンス部位は、ガイド鎖に備えられる。
【００８１】
ＲＮＡ干渉剤を導入する細胞は、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。
【００８２】
ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入する方法及び標的遺伝子の発現状態の評価は、当業者において周知であり、当業者であれば、標的遺伝子の種類やＲＮＡ干渉剤を導入する細胞の態様において適宜選択することができる。典型的には、実施例に示すようなルシフェラーゼアッセイ等を採用できる。
【００８３】
（ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法は、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、オフ・ターゲット効果の抑制に効果的なＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補をスクリーニングすることができ、オフ・ターゲット効果が抑制されたＲＮＡ干渉剤を得ることができる。典型的には、実施例に示すようなルシフェラーゼアッセイ等を採用できる。
【００８４】
ＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補としては、酸性基や塩基性基など極性を有するあるいは極性の高い基を含むユニットとすることができる。ＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補は、既に説明したＰＡＺドメイン低親和性ユニットの各種態様を適用してもよい。これにより、遺伝子の種類や細胞の種類に応じた最も効果的なＰＡＺドメイン低親和性ユニットをスクリーニングできる。
【００８５】
このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を導入する細胞は、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。また、このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入する方法及び標的遺伝子の発現状態の評価は、当業者において周知であり、当業者であれば、標的遺伝子の種類やＲＮＡ干渉剤を導入する細胞の態様において適宜選択することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、本明細書の開示を、具体例を挙げて説明する。
【実施例１】
【００８７】
（ＰＡＺドメイン低親和性ユニットのための試薬合成）
ＰＡＺドメイン低親和性ユニットのための、トリチル体（化合物６〜１０）アミダイト体（化合物１１〜１５）及びＣＰＧ試薬（化合物１６〜２０）を以下に示すスキームで合成した。【００８８】
【化１４】
2014084354.tif 000016
【００８９】
＜化合物6〜10の合成＞
スキームに示す化合物1〜5を出発原料とし、DMTrClにて片方の水酸基のトリチル保護を行い、トリチル体6〜10を得た。以下に、その詳細を説明する。なお、それぞれの反応は化合物別に行ったものである。【００９０】
良く乾燥したDMTrCl 1.00gにdry pyridine 30mLを加えて溶かし、そこに各々3当量分のエチレングリコール（化合物1、0.49mL）、プロパンジオール（化合物2、0.64mL）、ブタンジオール（化合物3、0.79mL）、ペンタンジオール（化合物4、0.93mL）、ヘキサンジオール（化合物5、1.05g）を加え、室温で3時間攪拌した。その後、酢酸エチルと蒸留水で分液し、有機層を飽和NaHCO3 aq.、飽和NaCl aq.で洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=3:1）にて単離精製し、目的化合物6（0.82g、76%）、7（0.67g、62%）、8（0.90g、77%）、9（0.71g、60%）、10（1.09g、88%）をそれぞれ得た。【００９１】
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ [ppm] ; 
(化合物6) : 7.45~7.20 ( 9H, m ), 6.83 ( 4H, d, J = 8.8 Hz ) , 3.79 ( 6H, s) , 3.73 ( 2H, m) , 3.26 ( 2H, t, J= 4.8 Hz ) 
(化合物7) : 7.43~7.20 ( 9H, m), 6.83 ( 4H, d, J = 8.4 Hz ) , 3.79 ( 6H, s) , 3.76 ( 2H, t, J = 5.8 Hz) , 3.28 ( 2H, t, J= 5.8 Hz ) , 1.85 ( 2H, q, J = 5.8 Hz )
(化合物8) : 7.44~7.20 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 7.6 Hz ) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.64 ( 2H, s ) , 3.11 ( 2H, s ) , 1.68 ( 4H, s )
(化合物9) : 7.44~7.20 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 8.8 Hz) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.63 ( 2H, q,  J = 6.1 Hz ) , 3.06 ( 2H, t, J = 6.4 Hz ) , 1.66~1.17 ( 6H, m )
(化合物10) : 7.43~7.18 ( 9H, m ), 6.82 ( 4H, d, J = 8.4 Hz ) , 3.79 ( 6H, s ) , 3.62 ( 2H, q, J = 5.6 Hz ) , 3.05 ( 2H, t, J = 6.0 Hz ) , 1.66~1.16 ( 8H, m )【００９２】
＜化合物11〜15の合成＞
トリチル体６〜１０の残った片方の水酸基を亜リン酸化しアミダイト体11〜15を得た。以下、詳細を説明する。なお、以下の反応は化合物別に行ったものである。また、グローブバック中、完全無水条件下で操作を行った。【００９３】
一晩真空乾燥した化合物6（0.294g）、同7（0.g）、同8（0.g）、同9（0.172g）、同10（0.g）をdry THFに溶解させ、各々DIPEA（3当量分）と亜リン酸化試薬（1.5当量分）を加えた。その後、グローブバックから取り出し、室温で0.5〜1時間攪拌した。TLC（Hex:EtOAc=2:1）により原料の消失を確認した。その後CHCl3と飽和NaHCO3 aqで抽出し、有機層を飽和NaCl aqで洗浄し、無水Na2SO4を加え乾燥した。溶媒を減圧留去後、中性シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=3:1）にて単離精製し、目的化合物11（0.82g、76%）、12（0.67g、62%）、13（0.90g、77%）、14（0.71g、60%）、15（1.09g、88%）を得た。
31P NMR（160MHz、CDCl3）[ppm] : 149.21（化合物11）、149.13（化合物12）、147.92（化合物13）、147.90（化合物14）、147.76（化合物15）【００９４】
＜CPG担体16〜20の作成＞
トリチル体6〜10からそれぞれスクシニル化を経てＣＰＧ樹脂に結合させることで、CPG試薬16〜20を得た。以下、詳細を説明する。【００９５】
一晩真空乾燥した化合物6（0.29g）、化合物7（0.30g）、化合物8（0.24g）、化合物9（0.09g）、化合物10（0.08g）をdry DMF （0.1Msolution） に溶解し、そこに0.5当量分のDMAPと3当量分の無水コハク酸を加えAr雰囲気下、室温で48〜72攪拌した。TLC（Hex:EtOAc=2:1）にて原料の消失を確認した。その後、EtOAcと飽和NaHCO3 aqで抽出し、有機層を飽和NaCl aqで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を減圧留去し、それぞれのスクシニル体化合物を得た。【００９６】
次いで、一晩真空乾燥したスクシニル体（上記のスクシニル化反応が100％の収率だったと仮定）をdry DMF（CPGに対して0.02M solution）に溶解し、CPG樹脂（76〜103μmol/g, 原料の1/4当量）を加えて溶液となじませた。この溶液にWSC（CPGに対して4eq）を加え、室温で72〜120h振とうした。この樹脂をpyridineで洗浄し、0.1M DMAP溶液（pyridine:無水酢酸=9:1）を15mL加え、室温で48h振とうした。さらに樹脂をpyridine、EtOH、acetonitrileで洗浄し、デシケーター中で一晩真空乾燥した。得られたCPG試薬１６〜２０の活性を測定した。活性値はCPG樹脂16：56.6 μmol/ g、同17：52.2 μmol/ g、同18：23.2 μmol/ g、同19：29.4 μmol/ g、同20：53.1 μmol/ gであった。【００９７】
なお、活性は以下の方法で測定した。すなわち、乾燥したCPG樹脂を6mgをガラスフィルターにのせ、HClO4 : EtOH＝3 : 2の溶液を流し込み、そのろ液のUV498nmの波長(DMTr基の波長)の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。【００９８】
【数１】
2014084354.tif 000017
【実施例２】
【００９９】
（オリゴヌクレオチドの合成及びＲＮＡ干渉剤の作製）
所定の３’末端ダングリングエンドを有するオリゴヌクレオチドを固相ホスホロアミダイト法に従って核酸自動合成機によって合成した。以下の表に示す３’ダングリング末端を有するガイド鎖（アンチセンス鎖）及びパッセンジャー鎖（センス鎖）をそれぞれ合成した。ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の各３’ダングリング末端以外の塩基配列を以下に示す。このＲＮＡ干渉剤は、ウミシイタケの蛍光タンパク質であるRenilla Luciferaseをコードする遺伝子の発現抑制を意図したものとなっている。【０１００】
また、３’末端に以下に示すＰＢを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖もWO2007/094135号パンフレットの記載に従い合成した。【０１０１】
【化１５】
2014084354.tif 000018
【０１０２】
こうして合成したアンチセンス鎖及びガイド鎖をそれぞれ等モル量ずつ合わせ、図４に示すように、各種態様のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の組み合わせでアニーリングすることにより、実施例及び比較例のＲＮＡ干渉剤を作製した。【０１０３】
ガイド鎖：５’−gua gga gua gug aaa ggc c-３’（配列番号１）
パッセンジャー鎖：５’−ggc cuu uca cua cuc cua c-３’（配列番号２）【０１０４】
なお、核酸の固相合成は、ホスホロアミダイト法に準じて行い、その後CPG樹脂からの切り出し及び保護基の除去を行い精製後（PAGEまたはHPLC）、MALDI-TOF/MSにて目的オリゴヌクレオチドの分子量を確認した。表１に、精製後のオリゴヌクレオチドの収量及び収率を以下に示す、【０１０５】
【表１】
2014084354.tif 000019
【実施例３】
【０１０６】
（評価）
実施例２で作製したＲＮＡ干渉剤の評価を以下のようにして行った。すなわち実施例及び比較例のＲＮＡ干渉剤を用い、HeLa細胞を用いたDual Luciferase repoter assayを行い、ノックダウン効果を評価した。合成したｓｉＲＮＡはRenilla Luciferaseをターゲットにしており、この遺伝子とコントロール遺伝子（firefly Luciferase）を発現するベクターとｓｉＲＮＡを同時にHeLa細胞にトランスフェクションすることで、そのノックダウン効果を測定した。なお、具体的操作及び試薬を以下に示す。また、結果を図５及び図６に示す。【０１０７】
（操作）
細胞をプレートに播種し（4〜5×103 cells/ well）、２４時間培養後、OPTI-MEMとtransfastを用いて各量のsiRNAとvectorをトランスフェクションした。トランスフェクション時間は、１時間で行った。２４時間培養後、培地を吸引し、その後、細胞を一晩 −８０℃で保存した。翌日、評価を行った。評価は、プロメガ社のプロトコールに従って行った。【０１０８】
（試薬等）
細胞：HeLa細胞
プレート：９６ウェルプレート（BD falcon)
培地：D-MEM(Wako)+10%BS(SIGMA) or OPTI-MEM (Invitrogen)
トランスフェクション試薬: transfastTM（0.1mM concentration, 0.3μL/ well）
siRNA : Renilla遺伝子を標的とするsiRNA（図示する各濃度）
ベクター: psiCHECKTM-2 Vectors (promega, 20ng/ well)
アッセイキット: Dual-GloTMLuciferase Assay System (promega)【０１０９】
図５及び図６に示すように、オリゴヌクレオチドの３’末端に極性の高いユニットを導入すると、当該オリゴヌクレオチドがガイド鎖として作用することが抑制されることがわかった。したがって、こうしたユニットをパッセンジャー鎖の３’末端に導入しておくことで、パッセンジャー鎖によるオフ・ターゲット効果が抑制されることがわかった。
【実施例４】
【０１１０】
本実施例では、マイクロアレイ解析を用いて、パッセンジャー鎖の３’末端への極性の高いパズドメイン低親和性ユニットを導入することによるパッセンジャーによるオフ・ターゲット効果の抑制効果を確認した。操作としては、細胞に本開示に係るＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ、実施例２及び３と同様にウミシイタケの蛍光タンパク質であるRenilla Luciferaseをコードする遺伝子の発現抑制を意図したもの）とコントロールｓｉＲＮＡを導入したのち、全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製してマイクロアレイで遺伝子発現を確認することにより行った。【０１１１】
（トランスフェクション）
10%BS含有細胞培養液（D-MEM、Wako）で継代培養を行っているHeLa細胞を用いた。トランスフェクション前日に24ウェルプレートに5000cells/wellになるように播種した。翌日、A：plasmid only（ネガティブコントロール）、B：plasmid + TT:TT siRNA(100nM)（ポジティブコントロール）、C：plasmid + TT:EE siRNA(100nM)（本開示のＲＮＡ干渉剤）の3つの条件でOPTI-MEM (Invitrogen) を用いてトランスフェクションを行った。なお、ＣのプラスミドにおけるTT:EEのEEは、エチレングリコールを２個連結していることを意味している。【０１１２】
トランスフェクションしたプラスミドはプロメガ社のpsi-check-2 vectorであり、用いたsiRNAの配列はアンチセンス鎖：5’- guaggaguagugaaaggcc -3’（配列番号１）、センス鎖：5’- ggccuuucacuacuccuac -3’（配列番号２）であった。1時間後に血清入りメディウム（500μl /well）を追加した。24時間経過後に細胞をトリプシン-EDTA溶液（Invitrogen）を用いて回収した。【０１１３】
（RNA抽出）
Qiagen社のRNeasy mini kitを用いて、推奨プロトコルを参考に回収した細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA溶液の吸光度を測定したところ、A：792.4ng/μl、B：941.6 ng/μl、C：642.8 ng/μlであった。【０１１４】
（マイクロアレイ解析）
細胞から抽出したtotal RNAをドライアイス入りの冷凍便で北海道システムサイエンス株式会社へ郵送し、マイクロアレイ解析（Agilent Techologies社のSurePrint G3 Human GE Ver. 2.0 8x60K 1color）を依頼した。この依頼解析にはtotal RNAの品質検査、total RNAからのcDNAの合成、cRNAのラベル（Cy3）化と増幅、ハイブリダイズ、スキャン作業は含まれていた。納品された生データをマイクロアレイデータ解析ソフトであるGeneSpring 12.5を用いて詳細解析した。まず、すべてのraw dataを75%tileでノーマライズ（チップ間補正）した。その後発現量でのフィルタリング（20-100%tile）を行った。【０１１５】
（ハウスキーピング遺伝子発現量の比較）
Agilent Techologies社のDNAマイクロアレイ上のスキーピング遺伝子は同一遺伝子であってもプローブ配列が違うチップが数箇所存在していたため、用いるアレイデータの信頼性の担保として比較を行った。その結果、条件Aを1とした場合、すべてのチップで比較発現量の値が0.85から1.15の幅であった。よって以後、この間の発現量の振れ幅は差がないものとして扱うこととした。逆に述べると、0.85倍以下もしくは1.15倍以上に発現量に増減があった遺伝子について、差があるものとして扱うこととした。【０１１６】
（マイクロアレイ解析結果とリアルタイムRT-PCRでの遺伝子発現相対定量結果の比較）
既述のA、B、Cの条件でトランスフェクションを行ったそれぞれの細胞からtotal RNAを抽出し、GAPDH遺伝子とNCF1遺伝子についてリアルタイムRT-PCR法を用いてCt値からの相対定量を行った。リアルタイムRT-PCR についてはTaKaRa社のOne Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (SYBR Green I検出系) を用い、推奨プロトコル通りにPCR反応を行った。その結果、GAPDH遺伝子をコントロールとした場合でNCF1遺伝子は図７の通り相関が見られることが確認できた。2つの遺伝子について、PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
GAPDH-For          TATAAATTGAGCCCGCAGCC（配列番号３）
GAPDH-Rev          CCATGGTGTCTGAGCGATGT（配列番号４）
NCF1-For           GAAGGTGTCCCCCATGACTG（配列番号５）
NCF1-Rev           TCCAGTGCATTTAAGGCGCA（配列番号６）【０１１７】
（マイクロアレイデータ解析による数的解釈1）
上述でフィルタリングをかけて得られたマイクロアレイデータから、fold change解析を行った。fold changeフィルタリング時の指定値は、ハウスキーピング遺伝子の発現量の比較結果から、1.15とした。結果を図８に示す。【０１１８】
その結果、A（ネガティブコントロール） vs B（ポジティブコントロール）（以下、Ａ／Ｂ）で発現量の差が認められた遺伝子は19955個であり、この内AよりBで発現量が減少した遺伝子（図中A/B up）は11658個、増加したもの（図中A/B down）は8297個であった。またＡ／Ｃ（本開示のＲＮＡ干渉剤）で発現量の差が認められた遺伝子数は19814であり、この内AよりCで発現量が減少した遺伝子（図中A/C up）は11631個、増加したもの図中A/C down）は8183個であった。この数値の相違がすべてセンス鎖によるオフ・ターゲット効果とその抑制結果に起因するとは言えない（アンチセンス鎖によるオフ・ターゲット効果も存在するため）が、コントロールをAとした場合、CよりBで発現抑制的に働く遺伝子が２７個存在することが判明し、本開示のＲＮＡ干渉剤によるオフ・ターゲット効果の抑制を確認できた。【０１１９】
（マイクロアレイデータ解析による数的解釈2）
また、図９のようにfold changeフィルタリングの指定値を1とした場合、総数44428遺伝子の内、AよりBで減少した遺伝子（図中A/B up）は26436、増加した遺伝子（図中A/B down）は17992であり、AよりCで減少した遺伝子（図中A/C up）は21476、増加した遺伝子（図中A/C down）は22952となった。既述の通りこの数値がすべてセンス鎖によるオフ・ターゲット効果とその抑制結果に起因するとは言えないが、コントロールをAとした場合、CよりBで発現抑制的に働く遺伝子が4960個存在することが判明し、本開示のＲＮＡ干渉剤によるオフ・ターゲット効果の抑制を確認できた。【０１２０】
（マイクロアレイデータ解析による特定遺伝子についての発現量の比較）
本開示のＲＮＡ干渉剤（Ｃ）のセンス鎖配列を用いたBLAST検索より、ターゲットとなり得る可能性の高い特定の遺伝子を同定した。それぞれの遺伝子についてマイクロアレイデータから発現量の比較を行った。１本鎖化されたsiRNAがターゲットmRNAを認識し切断する部位は、5’側から数えて10番目と11番目の間であることが既に分かっている。その部位とシード領域（2〜8番目）を含めた相補配列が一致する遺伝子4種類についてＡ〜Ｃ条件における発現強度を比較した（Ａを基準とした）。結果を図１０に示す。【０１２１】
図１０に示すように、上記遺伝子４種類に対応するマイクロアレイ上の９スポットに関し、Ｂのアレイ解析では蛍光強度が低かったのがＣのアレイ解析においては蛍光強度が増大し、Ａ（ネガティブコントロール）のアレイ解析結果に近づいた。これらの結果から、Ｃのマイクロアレイにおいてオフ・ターゲット効果の回避が確認された。マイクロアレイ上の各遺伝子検出用のプローブ配列（60mer（配列番号７〜１２）を以下に示す。
【０１２２】
【表２】
2014084354.tif 000020
【配列表フリーテキスト】
【０１２３】
配列番号１、２：ｓｉＲＮＡ
配列番号３〜６：プライマー
配列番号７〜１２:プローブ
【図１】
2014084354.tif 000026
【図２】
2014084354.tif 000027
【図３】
2014084354.tif 000028
【図４】
2014084354.tif 000029
【図５】
2014084354.tif 000030
【図６】
2014084354.tif 000031
【図７】
2014084354.tif 000032
【図８】
2014084354.tif 000033
【図９】
2014084354.tif 000034
【図１０】
2014084354.tif 000035
【配列表】
2014084354000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月11日(2014.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’末端に、以下の式（１）で表されるユニットを備える一本鎖オリゴヌクレオチドである、オフターゲット抑制剤。
【化１】
2014084354.tif 000036
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、ｎは２以上の整数を表す。）
【請求項２】
前記式（１）は、以下の式で表される、請求項１に記載のオフターゲット抑制剤。
【化２】
2014084354.tif 000037
【請求項３】
前記式（１）において、ｎは２である、請求項１又は２に記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項４】
前記式（１）において、Ｙが炭素数２のアルキレン基である、請求項３に記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項５】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉剤用のパッセンジャー鎖である、請求項１〜５のいずれかに記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項６】
３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備え、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
請求項１〜５のいずれかに記載のオフターゲット抑制剤であって、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備える、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項７】
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端に、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上をパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備え、
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＴＴと同等あるいはそれ以上ＰＡＺドメインより親和性が高く、前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、ＴＴよりもＰＡＺドメイン親和性が低い、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項８】
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式（１）で表される、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【化３】
2014084354.tif 000038
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、ｎは２以上の整数を表す。）
【請求項９】
前記式（１）は、以下の式で表される、請求項８に記載のＲＮＡ干渉剤。
【化４】
2014084354.tif 000039
【請求項１０】
前記式（１）において、ｎは２である、請求項８又は９に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１１】
前記式（１）において、Ｙが炭素数２のアルキレン基である、請求項８〜１０のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１２】
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、請求項７〜１１のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【化５】
2014084354.tif 000040
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。］
【化６】
2014084354.tif 000041
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉剤の製造方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端に、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上をパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、を準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、
を備える、製造方法。
【請求項１４】
以下の式で表される、オフターゲット抑制剤の製造用試薬。
【化７】
2014084354.tif 000042
（式中、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
【請求項１５】
遺伝子の機能の評価方法であって、
前記遺伝子を標的遺伝子として、請求項６〜１２のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
を備える、評価方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の請求項６〜１２のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖と、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月28日(2015.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’末端に、以下の式（１）で表されるユニットを備える一本鎖オリゴヌクレオチドである、オフターゲット抑制剤。
【化１】
2014084354.tif 000043
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、ｎは２以上の整数を表す。）
【請求項２】
前記式（１）は、以下の式で表される、請求項１に記載のオフターゲット抑制剤。
【化２】
2014084354.tif 000044
【請求項３】
前記式（１）において、ｎは２である、請求項１又は２に記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項４】
前記式（１）において、Ｙが炭素数２のアルキレン基である、請求項３に記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項５】
前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉剤用のパッセンジャー鎖である、請求項１〜４のいずれかに記載のオフターゲット抑制剤。
【請求項６】
３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備え、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
請求項１〜５のいずれかに記載のオフターゲット抑制剤であって、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備える、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項７】
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端に、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上をパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備え、
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、ＴＴと同等あるいはそれ以上ＰＡＺドメインより親和性が高く、前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、ＴＴよりもＰＡＺドメイン親和性が低い、ＲＮＡ干渉剤。
【請求項８】
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式（１）で表される、請求項７に記載のＲＮＡ干渉剤。
【化３】
2014084354.tif 000045
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、ｎは２以上の整数を表す。）
【請求項９】
前記式（１）は、以下の式で表される、請求項８に記載のＲＮＡ干渉剤。
【化４】
2014084354.tif 000046
【請求項１０】
前記式（１）において、ｎは２である、請求項８又は９に記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１１】
前記式（１）において、Ｙが炭素数２のアルキレン基である、請求項８〜１０のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【請求項１２】
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、請求項７〜１１のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤。
【化５】
2014084354.tif 000047
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
【化６】
2014084354.tif 000048
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉剤の製造方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端に、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上をパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、を準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、
を備える、製造方法。
【請求項１４】
以下の式で表される、オフターゲット抑制剤の製造用試薬。
【化７】
2014084354.tif 000049
（式中、Ｙは、炭素数が２又は３のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
【請求項１５】
遺伝子の機能の評価方法であって、
前記遺伝子を標的遺伝子として、請求項６〜１２のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
を備える、評価方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の請求項６〜１２のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、３’末端にＰＡＺドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖と、３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を導入する細胞は、生体外におけるヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む各種細胞が挙げられる。また、細胞は、非ヒト動物の生体内にある細胞であってもよい。また、このスクリーニング方法においても、ＲＮＡ干渉剤を細胞に導入する方法及び標的遺伝子の発現状態の評価は、当業者において周知であり、当業者であれば、標的遺伝子の種類やＲＮＡ干渉剤を導入する細胞の態様において適宜選択することができる。
なお、以下の項目は、本願に対応する国際出願の国際出願時における請求の範囲に記載の要素である。
（項目１）
３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットは、以下の式（１）で表される、項目１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
（化１６）
2014084354.tif 000050
（ただし、Ｘは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Ｙは、炭素数が２以上の基を表し、ｎは１又は２以上の整数を表す。）
（項目３）
Ｙは炭素数が２の基を表す、項目２に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
（項目４）
前記式（１）は、以下の式で表される、項目２又は３に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
（化１７）
2014084354.tif 000051
（項目５）
前記ＰＡＺドメイン低親和性ユニットを２個備える、項目１〜４のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
（項目６）
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
項目１〜５のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチドであって前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備える、ＲＮＡ干渉剤。
（項目７）
前記ガイド鎖オリゴヌクレオチドの３’末端には、ＰＡＺドメイン高親和性ユニットを備える、項目６に記載のＲＮＡ干渉剤。
（項目８）
前記ＰＡＺドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、項目７に記載のＲＮＡ干渉剤。
（化１８）
2014084354.tif 000052
［式中、Ａは独立して以下のいずれかの式を表し、ｍは１又は２以上の整数を表す。]
（化１９）
2014084354.tif 000053
（項目９）
ＲＮＡ干渉剤の製造方法であって、
３’末端にＰＡＺドメイン低親和性ユニットを１又は２以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドであるパッセンジャー鎖とガイド鎖とを準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖ＲＮＡを形成する工程、
を備える、製造方法。
（項目１０）
以下の式で表される、オリゴヌクレオチド合成試薬。
（化２０）
2014084354.tif 000054
（式中、Ｙは、炭素数が１以上４以下のアルキレン基を表し、Ｗ１は、水素原子又はヒドロキシル保護基を表し、Ｗ２は、水素原子、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。）
（項目１１）
遺伝子の機能の評価方法であって、
前記遺伝子を標的遺伝子として、項目６〜８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記遺伝子を保持する細胞に前記ＲＮＡ干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
を備える、評価方法。
（項目１２）
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の１又は２以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する１又は２以上の項目６〜８のいずれかに記載のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
（項目１３）
ＲＮＡ干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖と、３’末端に１又は２以上のＰＡＺドメイン低親和性ユニット候補を有するパッセンジャー鎖と、を有する１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を準備する工程と、
前記１又は２以上のＲＮＡ干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における変化を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【国際調査報告】
2014084354.tif 000055
2014084354.tif 000056
2014084354.tif 000057
2014084354.tif 000058