(57)【要約】【課題】胎盤周囲組織などに由来する幹細胞の選択的かつ高増幅する方法を提供する。【解決手段】胎盤・羊膜、臍帯などに由来する幹細胞を含む細胞集団をフィーダー細胞の存在下で、かつ、低細胞濃度で初期培養および継代培養することにより、胎盤・羊膜、臍帯など、胎盤などに由来する幹細胞を効率的に調製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）哺乳動物の胎盤または胎盤周囲組織から幹細胞を含む細胞集団を採取するステップと、（Ｂ）前記採取された細胞集団を、1〜５００／ｃｍ２の細胞濃度において播種し、フィーダー細胞の存在下に２〜３週間共培養（初期培養）するステップと、（Ｃ）前記初期培養された細胞集団を1〜５００／ｃｍ２細胞濃度において播種し、フィーダー細胞存在下に１週間に２回の培地交換を行う継代培養を２〜５回繰り返すステップと、（Ｄ）前記継代培養において円形状の形態を有する細胞のコロニーが形成されるまで共培養を維持するステップを含む、胎盤または胎盤周囲組織幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項２】
哺乳動物の胎盤または胎盤周囲組織が、胎盤周囲組織である請求項１に記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項３】
胎盤周囲組織が羊膜または臍帯である請求項２に記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項４】
羊膜がヒト羊膜である請求項３に記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項５】
初期培養および／または継代培養における共培養が、同一の培養皿で培養を行うものである、請求項１〜４のいずれかに記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項６】
初期培養および／または継代培養における共培養が、幹細胞を含む細胞集団とフィーダー細胞とが非接触の状態で培養を行うものである、請求項１〜４のいずれかに記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項７】
フィーダー細胞がマウス３Ｔ３である請求項１〜６のいずれかに記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【請求項８】
フィーダー細胞の濃度が３×１０２／ｃｍ２〜５×１０５／ｃｍ２、である請求項１〜７のいずれかに記載の幹細胞の選択的増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児育成に関与する組織（胎盤、羊膜、臍帯）から上皮系幹細胞および間葉系幹細胞を選択的に増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎児と母体の複合組織である胎盤および胎児組織である羊膜・臍帯は、胎児育成に関与する組織である。
胎盤は、胚および胎児の組織と母体の組織とが緊密に接着した複合組織であり、両者の間に物質の交換や細胞レベルの相互作用などの生理的に重要な役割を果たしている。
羊膜は、外胚葉由来の上皮細胞と中胚葉由来の間葉系細胞から構成される胚体外組織であり、多能性幹細胞としての特性を有する細胞群を含有することが確認されており、例えば、ヒト羊膜上皮由来幹細胞の肝細胞やインスリン産生細胞への分化、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の軟骨細胞や心筋細胞へ分化が知られている（特許文献１）。
臍帯は、外層を取り囲む羊膜とワルトンのゼリーと呼ばれる膠様組織及び臍動脈、臍静脈で構成される組織であり、ワルトンのゼリーには間葉系幹細胞が存在し、軟骨細胞、脂肪組織、骨に分化することが知られている（非特許文献１）。
胎盤は合胞体栄養細胞、Langhans細胞、線維芽細胞、組織球、脱落膜細胞など多数の細胞が含まれ、これらの細胞の中でＣＤ５９陽性を示す細胞が幹細胞として有望である。【０００３】
一方、放射線照射したヒトもしくはマウス細胞（フィーダー細胞）が、上皮細胞などを培養する際の増殖促進のために使用されている。
例えば、ＭＲＣ−５（ヒト胎児肺線維芽細胞）、３Ｔ３（マウス皮膚線維芽細胞）、ＳＴＯ（チオグアニン／ウワバイン耐性マウス胎児線維芽細胞）などが知られている。【０００４】
【特許文献１】日本国特開２００３−２３１６３９号公報
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０８０３７５
【非特許文献１】Cellular Reprograming, 14(5), 448-455 (2012).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒト胎盤およびその周囲組織は、出産後の排泄物として廃棄されるものであるので、生体材料として使用する上での倫理的問題が少ない。
また、胎盤周囲組織の中で羊膜は、免疫学的にも特殊な性質を有しており、免疫原性が低いため、他家移植による免疫拒絶反応も比較的穏やかであることが期待されているものの、羊膜由来細胞の細胞集団から、選択的に上皮系幹細胞や間葉系幹細胞を取得する技術や効率良く細胞を増幅する技術に関しては、改良技術が求められている。
同様に、胎盤周囲組織に含まれる種々の細胞から、選択的に間葉系幹細胞を収得し、効率良く細胞を増幅する技術に関し、改良技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況下、本発明者らは、哺乳動物の胎盤周囲組織の細胞、特に羊膜由来の間葉系細胞について、効率よく簡便に、長期間にわたり継代培養可能な増殖能と高い分化能を兼ね備えた間葉系幹細胞集団を調製する方法に関して、国際特許出願（特許文献２）を行うとともにさらに研究を進め、ヒト羊膜細胞から増殖能の高い上皮系幹細胞・間葉系幹細胞を選択的に取得することに成功し、本発明を完成するに至った。  
以下、本発明を詳細に説明する。【０００７】
本発明は、（Ａ）哺乳動物の胎盤または胎盤周囲組織から幹細胞を含む細胞集団を採取するステップと、（Ｂ）前記採取された細胞集団を、1〜５００／ｃｍ２の細胞濃度において播種し、フィーダー細胞の存在下に２〜３週間共培養（初期培養）するステップと、（Ｃ）前記初期培養された細胞集団を1〜５００／ｃｍ２細胞濃度において播種し、フィーダー細胞存在下に１週間に２回の培地交換を行う継代培養を２〜５回繰り返すステップと、（Ｄ）前記継代培養において円形状の形態を有する細胞のコロニーが形成されるまで同一の培養皿で培養を維持するステップを含む、胎盤または胎盤周囲組織幹細胞の選択的増幅方法を提供するものである。【０００８】
前記哺乳動物は、ヒトをはじめとする霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが挙げられるが、ヒトが好ましい。【０００９】
前記胎盤周囲組織は、羊膜および臍帯が挙げられるが、羊膜が好ましい。【００１０】
前記ステップ（Ｂ）および（Ｃ）における細胞濃度は、５〜５０／ｃｍ２であることが好ましい。【００１１】
前記ステップ（Ｂ）および（Ｃ）におけるフィーダー細胞は、ガンマ線など放射線で処理された、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、３Ｔ３Ｊ２などマウス３Ｔ３細胞が好ましい。【００１２】
本発明における共培養は、同一の培養皿で培養することが好ましいが、胎盤または胎盤周囲組織からの幹細胞を含む細胞集団とフィーダー細胞とが接触しないように膜などで隔壁を設けて（非接触の状態）培養してもよい。【００１３】
前記胎盤または胎盤周囲組織の幹細胞は、形態に関係なく、２０回以上の細胞分裂が可能であることが望ましい。【００１４】
胎盤周囲組織の一つである羊膜に由来の幹細胞は、円形状の形態、かつ２０回以上の細胞分裂（population doubling）が可能であることが望ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る幹細胞集団の調製方法は、高い分化能と増殖能を有する胎盤・胎盤周囲組織幹細胞、特に羊膜間葉系幹細胞集団・羊膜上皮系幹細胞集団を、哺乳動物の胎盤・胎盤周囲組織から効率よく簡便に調製することを可能とする。
また、本発明に係る方法により調製された羊膜幹細胞集団などの胎盤周囲組織幹細胞を用いることにより、倫理的問題が少なく、かつ、他家移植による免疫拒絶反応が少ない安全な再生医療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団の培養状態を示す図である。
【図２】ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団から形成された細胞集団（コロニー）の転写因子の発現（ｍＲＮＡ）を示す図である。（ａ）ヒト羊膜間葉系幹細胞コロニー／フィーダー細胞（３×１０４）（ｂ）ヒト羊膜間葉系幹細胞コロニー／フィーダー細胞（１×１０５）（ｃ）ヒト羊膜間葉系幹細胞コロニー／フィーダー細胞（３×１０５）（ｄ）フィーダー細胞（３Ｔ３−Ｊ２）のみをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「胎盤周囲組織」とは哺乳動物の発生過程において形成される、羊膜、臍帯など胎児育成に関与する組織である。
【００１８】
「羊膜」とは、哺乳動物の発生過程において形成される、胎子と羊水を包む膜である。本発明で使用される羊膜は、好ましくはヒトの羊膜である。
【００１９】
「細胞集団」とは、当該技術分野において通常理解される意味であり、複数の細胞の集まりのことである。
採取された羊膜幹細胞の細胞集団、臍帯及び胎盤周囲組織の細胞集団には、種々の増殖能、寿命、性質を有する細胞が混在している。
【００２０】
羊膜などの胎盤周囲組織は、通常の外科的手法により得ることができる。
または、分娩後に廃棄される胎盤から得ることも可能である。
ヒト胎盤周囲組織は、例えばインフォームドコンセントを得た妊婦から、帝王切開により採取することができる。
【００２１】
胎盤周囲組織の一つである羊膜の場合、本発明の方法では、ステップ（Ａ）として、哺乳動物の羊膜から幹細胞の細胞集団を採取する。
羊膜は、上皮細胞と間葉系細胞とから構成されている。
上皮系細胞は、例えば、羊膜をヒアルロニダーゼやデオキシリボヌクレアーゼなどの存在下に断片化し、トリプシンなどの酵素で羊膜組織片を消化し、得られた消化液を、ガーゼ等を使用したろ過処理したろ液から採取すればよい。
また、間葉系細胞は、上記したろ過処理でガーゼ等に残った羊膜組織片を、コラゲナーゼなどの酵素で羊膜組織片を消化し得られた消化液から採取すればよい。
また、哺乳動物の羊膜から幹細胞の細胞集団の採取は、特開２００３−２３１６３９号公報に記載される方法に準じて行うことができる。
【００２２】
胎盤周囲組織の一つである臍帯から幹細胞集団を採取する場合、外側の羊膜及び臍動脈、臍静脈を剥離する。
その他部位を細切し、トリプシン、コラゲナーゼなどの酵素で臍帯ワルトンのゼリーの断片を消化し、得られた消化液を、ガーゼ等を使用したろ過処理したろ液から採取すればよい。
【００２３】
胎盤から幹細胞集団を採取する場合、胎盤から充分に血液を除去した後、組織を細切し、ヒアルロニダーゼやデオキシリボヌクレアーゼなどの存在下に断片化し、トリプシンなどの酵素で羊膜組織片を消化し、得られた消化液を、ガーゼ等を使用したろ過処理したろ液から採取すればよい。
【００２４】
本発明方法では、フィーダー細胞を使用する。
このフィーダー細胞で好ましいものは、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、３Ｔ３Ｊ２などマウス３Ｔ３細胞であり、それはガンマ線など放射線で処理されたものである。
【００２５】
本発明方法で使用されるフィーダー細胞の濃度は、３×１０２／ｃｍ２〜５×１０５／ｃｍ２、好ましくは、３×１０３／ｃｍ２〜５×１０４／ｃｍ２である。
【００２６】
本発明の方法で得られる羊膜幹細胞は、円形状の形態、かつ５０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）が可能である。
【００２７】
本発明の方法で得られる臍帯幹細胞は、紡錘状の形態で、かつ浮遊培養により２０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）、幹細胞としての特性維持が可能である。
また、本発明の方法で得られる胎盤からの細胞集団は、形態に関係なく、かつ２０回以上の細胞分裂（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）が可能である。
【実施例１】
【００２８】
以下、本発明を参考例、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００２９】
＜羊膜幹細胞の細胞集団の調製＞
インフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、ヒト羊膜を入手した。
得られた羊膜から血液などを除去した後、直ちに０．０３％ヒアルロニダーゼと０．０２５％デオキシリボヌクレアーゼＩが入ったリン酸塩緩衝液に浸し、手術用ハサミにより断片化した。
その後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ／ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）溶液中、３７℃で３０分間インキュベートすることにより羊膜組織断片を消化し、消化溶液をガーゼで濾過する操作を６〜８回繰り返した。
この工程により、羊膜組織断片からヒト羊膜上皮幹細胞を含む細胞集団を採取した。【００３０】
ガーゼに残った羊膜組織断片を、０．０７５％コラゲナーゼ−０．００７５％ＤＮアーゼＩ／ＤＭＥＭ溶液中、３７℃で１５分間インキュベートすることにより消化した。
得られた消化溶液をガーゼで濾過し、ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取した。【００３１】
＜フィーダーの調製＞
マウス線維芽細胞３Ｔ３Ｊ２細胞を１０％牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。
３〜４日でコンフルエントになったところで０．０５％トリプシン、０．００４％ＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝液処理することにより剥離回収した。
回収した細胞で継代培養を行った。
０．０５％トリプシン、０．００４％ＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝液処理により剥離回収した３Ｔ３Ｊ２細胞を放射線処理（６０Ｇｒｙ）した後、１×１０４個／ｃｍ２で播種し、一晩培養したものをフィーダーとした。【００３２】
＜羊膜幹細胞の選択的増幅＞
ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団を５個／ｃｍ２〜５０個／ｃｍ２ディッシュで播種し、１０％牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中でフィーダー細胞存在下または不存在下に培養した。１週間に２回培地を交換する。７〜１０日後にコロニーが見えてくる（図１の初代培養）。
２０〜３０日間培養した後、０．０５％トリプシン、０．００４％ＥＤＴＡを含むリン酸塩緩衝液処理することにより剥離回収し、再度、上記と同条件で３Ｔ３Ｊ２細胞をフィーダー細胞として用いた上に播種すると７〜１０日後にコロニーが見えてくるようになる。これを繰り返す（図１の継代培養）。【００３３】
ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団は、初代培養では、紡錘形の細胞と円形の細胞が存在するが、継代を重ねることで、円形の細胞のみになっていった。
一方、ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団は、初代培養では、フィーダー細胞非存在下で増殖を示したが、継代を重ねるごとに、増殖しなくなった。【００３４】
ヒト羊膜間葉系幹細胞を含む細胞集団から形成された細胞集団（コロニー）は、ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ｍｙｃおよびＫＬＦ４などの転写因子のｍＲＮＡを発現する（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の方法は、長期間にわたり継代培養することができ、かつ、増殖能の高い胎盤・胎盤周囲組織の幹細胞、特に羊膜由来の上皮系幹細胞および間葉系幹細胞を調製できる。
本発明は、再生医療分野などにおいて利用される胎盤・胎盤周囲組織の幹細胞、特に羊膜由来幹細胞の効率的な調製に極めて有用な手段を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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