(57)【要約】  新規で且つ実用的なシロスタゾールの薬効評価方法を取得する。  トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を用いた、シロスタゾールの薬効評価方法を用いる。又は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を、シロスタゾール服用患者の血液由来サンプルに接触させる工程を含む、血小板機能測定法を用いてもよい。
2016121738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を用いた、シロスタゾールの薬効評価方法。
【請求項２】
トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を、血液由来サンプルに接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記血液由来サンプルが、シロスタゾール服用患者の血液由来サンプルである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記血液由来サンプルが、シロスタゾールとシロスタゾール以外の抗血小板薬とを投与された患者の血液由来サンプルである、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を、シロスタゾール服用患者の血液由来サンプルに接触させる工程を含む、血小板機能測定法。
【請求項６】
トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を含む、シロスタゾールの薬効評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロスタゾールの薬効評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾールなどの抗血小板薬は脳梗塞、又は心筋梗塞の二次予防に用いられている。また、ステント治療ではそれらの2剤あるいは3剤を併用した治療が行われている。これら抗血小板薬の薬効評価は、それぞれの作用機序に基づいて実施されている（非特許文献1）。具体的には、抗血小板薬を投与後の患者血中の血小板に対して、抗血小板薬の作用機序に応じた血小板活性化試薬を作用させ、血小板凝集率を測定する。【０００３】
例えば、アスピリン（シクロオキシゲナーゼ1阻害剤）の薬効評価は、血小板活性化試薬であるアラキドン酸（シクロオキシゲナーゼ1によってプロスタノイドに代謝される物質）を患者の血小板に作用させ、血小板凝集率を測定することで実施できる。この際、血小板凝集率が低ければ、薬効があると判断できる。【０００４】
抗血小板薬の薬効評価に用いる血小板活性化試薬としては、アスピリンではアラキドン酸が、クロピドグレルではADPあるいはADP＋PGE1が用いられている。【０００５】
また、非特許文献2では、シロスタゾールの薬効評価に用いる血小板活性化試薬として、アラキドン酸ナトリウムが使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"抗血小板療法における血小板凝集能検査を利用した薬効モニタリングの実際." 佐藤金夫., 血栓止血誌17: 424-429, 2006.
【非特許文献２】"Platelet aggregometry in the presence of PGE(1) provides a reliable method for cilostazol monitoring. " Satoh et al., Thromb Res. 2012 Oct;130(4):616-21.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記非特許文献2では、血小板活性化試薬としてアラキドン酸ナトリウムを使用していることから、シロスタゾールだけでなく、アスピリンを服用時にも血小板凝集の抑制がみられる。そのため、アスピリンとの薬剤併用療法の際には、シロスタゾールの薬効をモニタリングすることができなかった。【０００８】
また本願発明者らは、後述する実施例に記載のように、血小板活性化試薬であるエピネフリンとCRPについて、シロスタゾール薬効評価系への適用を試みた。しかしながら、エピネフリンは個人差が大きく、実用性が無かった。また、CRPはシロスタゾールの有無で変化が見られなかった。【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規で且つ実用的なシロスタゾールの薬効評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、後述する実施例に記載の通り、シロスタゾールを服用している患者の血液に、トロンビン受容体活性化試薬とcAMP増加試薬とを作用させたところ、血小板凝集が有意に抑制されることを見出した。即ち、トロンビン受容体活性化試薬とcAMP増加試薬によって、シロスタゾールの薬効評価ができた。そして、この知見に基づき、本発明を完成させた。【００１１】
即ち本発明の一態様によれば、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を用いた、シロスタゾールの薬効評価方法が提供される。この方法を用いれば、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。また、血小板活性化試薬であるトロンビン受容体活性化試薬は、アスピリンからの影響を実質的に受けない。そのため、患者がシロスタゾールとアスピリンを併用している場合でも、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。【００１２】
また本発明の一態様によれば、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬をシロスタゾール服用患者の血液由来サンプルに接触させる工程を含む、血小板機能測定法が提供される。この方法を用いれば、シロスタゾール服用患者の血小板機能を測定できる。【００１３】
また本発明の一態様によれば、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を含む、シロスタゾールの薬効評価用キットが提供される。このキットを用いれば、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、実用的なシロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、in vitro実験における、VerifyNowを用いた血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【図２】図2は、ex vivo実験における、VerifyNowを用いた血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【図３】図3は、ex vivo実験における、VerifyNowを用いた血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【図４】図4は、ex vivo実験における、AG-10を用いた血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【図５】図5は、ex vivo実験における、AG-10を用いた血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【図６】図6は、血小板凝集反応の個人差を調べた結果を表した図である。
【図７】図7は、CRPを使用した場合の血小板凝集能の測定結果を表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。【００１７】
本発明の一実施形態は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を用いた、シロスタゾールの薬効評価方法である。この方法を用いれば、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。また、血小板活性化試薬であるトロンビン受容体活性化試薬は、アスピリンからの影響を実質的に受けない。そのため、患者がシロスタゾールとアスピリンを併用している場合でも、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。【００１８】
血小板活性化レベルの測定は、例えば、吸光度法、電気抵抗法、血栓形成能測定法、スクリーンフィルター法、プラビーズカラム法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、又はELISA法で行なってもよい。吸光度法は、例えば、血液サンプル（例えば、全血又は多血小板血漿（PRP））をキュベットに入れ、さらに血小板活性化物質を添加することで生成する血小板凝集を、光透過性（吸光度）の変化でモニタすることによって行なうことができる。このとき、乏血小板血漿（PPP）の透過率を100％に設定してもよい。なお、スクリーンフィルター法では、PRPを分離せずに全血のまま測定することができる。【００１９】
電気抵抗法には、例えば、multiplate analyzer（Dynabyte medical, Munich, Germany）を利用できる。multiplate analyzerは電気抵抗法を原理とする全血血小板凝集能測定装置である（Can et al., Thromb Res. 2010 Apr;125(4):e132-7.）。概要は、例えば、以下の通りである。一対の電極を装着した測定セルに血液を加え、撹拌条件下に電極間の電気抵抗を測定する。血小板活性化によって血小板が電極上に粘着・凝集するため電気抵抗が変化する。この電気抵抗の変化を、メーカーが設定した任意の単位に変換して血小板凝集能の指標とし、この指標を縦軸、時間を横軸として曲線を描き、曲線下面積（Area under the aggregation curve; AUCa）で血小板凝集能を評価する。具体的な操作は特に限定されないが、例えば、取扱説明書に従い以下の手順で行ってもよい。即ち、ヒルジン処理した血液300μlを測定キュベットに入れ、続いて等量の生理食塩水を加えて37℃で3分間加温する。続いて3μMシロスタゾールを加えて2分加温し、9.4nM PGE1（ADPtestHS）を加えてさらに2分間加温する。血小板活性化物質としてTRAPで血小板凝集を惹起させ、血小板凝集能を6分間測定する。【００２０】
血栓形成測定法には、例えば、Total Thrombus-formation Analysis System（T-TAS; 藤森工業株式会社、東京）を利用できる。T-TASは、血流下に血小板機能を解析する装置で、血液送液ポンプの圧力上昇からマイクロチップ内の血栓形成過程を評価するシステムである（Hosokawa et al., Microvasc Res. 2012 Mar;83(2):154-61.）。具体的な操作は特に限定されないが、例えば、取扱説明書に従い以下の手順で行ってもよい。ヒルジン処理した血液320μlをリザーバーに分注してキャップをかぶせ、圧力センサー取り付けられた送液ポンプを接続する。液流は、例えば、12μl/min及び24μl/minに設定して測定する。それぞれズリ応力は、例えば、1000s-1、2000s-1に相当する。マイクロチップ内には幅40μm、深さ40μmのキャピラリーが25本刻まれており、底面には血管内皮下組織の構成成分であるコラーゲンが塗布されている。この領域を血液が通過する際にコラーゲンとの接触により血小板が活性化されて血栓が形成される。血栓形成に伴って血液流路が小さくなるため、送液ポンプの圧力は上昇する。送液開始から30秒間をベースラインとして圧力を計測し、このベースライン圧力から10kPa上昇した時間を閉塞開始時間（T10）、ベースライン圧力から80kPa上昇した時間を閉塞時間（T80）、この間の圧力変化を縦軸、時間を横軸として描かれる圧力曲線の曲線下面積（Area under the puressure curve; AUCp）と定義し、AUCpを血栓形成の指標として評価する。【００２１】
血小板活性化レベルの測定は、全血を測定試料とする測定法を使用してもよい。このとき、測定原理は、例えば、凝集、ずり応力惹起凝集、粘着/凝集、蛋白リン酸化等を利用できる。検出原理は、例えば、濁度、電気抵抗、圧力、閉塞時間、血小板数の減少、表面占有率、フローサイトメトリー、フィルター圧、又はELISA等を利用できる。これらの原理を利用できる装置としては、例えば、全血凝集計を使用できる。全血凝集計は、例えば、VerifyNow (Accumetrics)、Platelet Function Analyzer (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)、multiplate (Dynabyte)、Plateletworks (Helena Laboratories)、Impact cone and plate (let) analyzer (DiaMed)、WBAアナライザー（アイエスケー(株)）等を挙げることができる。また、VASPのリン酸化レベルを知るためにフローサイトメトリー法やウエスタンブロット法を挙げることができる．使用する血液量としては、例えば、0.01、0.1、1、10、100、1000、又は10000μL/測定であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００２２】
本発明の一実施形態において「薬効評価方法」は、（i）患者にシロスタゾールを投与する工程、（ii）上記患者から血液を取得する工程、（iii）上記患者の血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬とを接触させ、混合液を調製する工程、又は（iv）上記混合液の血小板活性化レベルを測定する工程、を含んでいてもよい。上記工程(iii)では、血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬とを接触させた後に、血液由来サンプルと、cAMP増加試薬とを接触させてもよく、その逆の順番で接触処理を行なってもよく、また、同時に接触処理を行ってもよい。なお、以上又は以下において、薬効評価方法で採用する工程は、血小板機能測定法にも採用できる。【００２３】
また上記薬効評価方法は、(v)シロスタゾール非投与の患者から血液を取得する工程、(vi)上記患者から血液を取得する工程、(vii)上記患者の血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬とを接触させ、混合液を調製する工程、又は（viii）上記混合液の血小板活性化レベルを測定する工程、を含んでいてもよい。なお、非投与は、投与前を含む。【００２４】
また上記薬効評価方法は、(ix)上記(vii)の混合液と、上記（iii）の混合液との血小板活性化レベルを比較する工程、を含んでいてもよい。また上記薬効評価方法は、(x)上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(vii)の混合液の血小板活性化レベルよりも小さいときに、シロスタゾールが患者に有効と評価する工程、を含んでいてもよい。このとき、上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(vii)の混合液の血小板活性化レベルに比べて、例えば、0.9、0.7、0.5，0.3、0.1倍以下、又は0倍のときに、シロスタゾールが患者に有効と評価してもよい。【００２５】
また上記薬効評価方法は、(xi)シロスタゾール投与後の患者から血液を取得する工程、又は(xii)上記患者の血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬とを接触させ、混合液を調製する工程、を含んでいてもよい。【００２６】
また上記薬効評価方法は、(xiii)上記(xii)の混合液と、上記（iii）の混合液との血小板活性化レベルを比較する工程、を含んでいてもよい。また上記薬効評価方法は、(xiv)上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(xii)の混合液の血小板活性化レベルよりも小さいときに、抗血小板薬が患者に有効と評価する工程、を含んでいてもよい。このとき、上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(xii)の混合液の血小板活性化レベルに比べて、例えば、0.9、0.7、0.5，0.3、0.1倍以下、又は0倍のときに、抗血小板薬が患者に有効と評価してもよい。【００２７】
また上記薬効評価方法は、上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが所定の閾値よりも低いときに、抗血小板薬が患者に有効と評価する工程、を含んでいてもよい。血小板活性化レベルは、例えば、血小板凝集能測定装置を用いて測定してもよい。【００２８】
また上記薬効評価方法は、血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬との混合液を静置する工程を含んでいてもよい。静置時間は、例えば、0、0.1、0.5、1、2、3、5、又は10分以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００２９】
また上記薬効評価方法は、患者の血液と、血液抗凝固剤とを混合する工程を含んでいてもよい。血液抗凝固剤は、例えば、クエン酸ナトリウムであってもよい。また上記薬効評価方法は、患者の血液を凝固しない状態に保つ工程を含んでいてもよい。また上記薬効評価方法は、患者の血液と、血液抗凝固剤とを混合せずに、血液を採取後にすぐに測定してもよい。【００３０】
また上記薬効評価方法は、（xv）シロスタゾールとは異なる第二の抗血小板薬を患者に投与する工程、（xvi）上記患者から血液を取得する工程、（xvii）上記患者の血液由来サンプルと、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬とを接触させ、混合液を調製する工程、又は(xviii)上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(xvii)の混合液の血小板活性化レベルよりも小さいときに、シロスタゾールが患者に有効と評価する工程、を含んでいてもよい。このとき、上記（iii）の混合液の血小板活性化レベルが、上記(xvii)の混合液の血小板活性化レベルに比べて、例えば、0.9、0.7、0.5，0.3、0.1倍以下、又は0倍のときに、シロスタゾールが患者に有効と評価してもよい。なお、上記（i）の抗血小板薬と、上記第二の抗血小板薬は、薬理作用が異なる抗血小板薬であってもよい。また、上記（i）、(v)、及び(xi)患者は、同一又は異なっていてもよい。上記「取得」は、例えば、注射による採取を含む。上記「接触」は、例えば、混合を含む。【００３１】
また上記薬効評価方法は、患者の血液から、血液由来サンプルを調製する工程を含んでいてもよい。本発明の一実施形態において「血液由来サンプル」又は「血液サンプル」は、例えば、全血、又はPRPを含む。また血液由来サンプルは、例えば、人工的に作成された血液であってもよい。また血液由来サンプルは、例えば、試験用容器、チューブ、又はキュベットに収容された状態であってもよい。【００３２】
また上記薬効評価方法は、患者の血液から、PRPを調製する工程、PRPとトロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬とを接触させ、混合液を調製する工程、又は混合液の血小板活性化レベルを測定する工程、を含んでいてもよい。PRPは、例えば、血液を遠心分離することによって得ることができる。遠心分離の遠心力は、例えば、50、100、500、1000、5000、又は10000gであってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。遠心分離の時間は、0.01、0.1、1、10、又は15分間であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００３３】
また上記薬効評価方法は、患者の血液から、PPPを調製する工程、を含んでいてよい。PPPは、例えば、血液を遠心分離することによって得ることができる。遠心分離の遠心力は、例えば、500、1000、1500、2000、3000、4000、10000、又は30000gであってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。遠心分離の時間は、0.01、0.1、1、5、10、12、15、又は20分間であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記薬効評価方法において、血小板活性化レベルの測定は、例えば、in vitro又はex vivoで行ってもよい。【００３４】
本発明の一実施形態において「試薬」は、その用途や形態が限定されるものではなく、例えば、薬理活性を有する物質、又は薬剤であってもよい。また試薬の形態は、例えば、乾燥品（例えば、粉末）、溶液、容器（例えば、プラスチック容器）への固相化状態等であってもよい。試薬は、トロンビン受容体活性化試薬又はcAMP増加試薬に、さらに任意の水溶液（例えば、緩衝液）、添加剤、又は担体を混合することで調製してもよい。【００３５】
本発明の一実施形態において「血小板活性化試薬」は、血小板機能を活性化する作用を有する試薬、又は血小板凝集を促進する作用を有する試薬を含む。【００３６】
本発明の一実施形態において「トロンビン受容体活性化試薬」は、例えば、TRAP（Thrombin Receptor Activating Peptide）、トロンビン、もしくはトロンビン受容体を活性化させるそれらの誘導体、又はそれらの塩もしくは溶媒和物を含む。シロスタゾールの薬効評価は、薬効評価に用いる試薬の作用機序に依存するが、これらはいずれもトロンビン受容体を活性化させるという同じメカニズムを有しているので、cAMP増加試薬と組み合わせて使用することで、シロスタゾールの薬効評価を実現できる。なお、TRAPの誘導体は、iso-TRAPを含む。iso-TRAPは、例えば、Multiple Peptide Systems等から購入できる。誘導体は、修飾体を含む。シロスタゾールの薬効評価の感度の観点からは、特にTRAP又はiso-TRAPが好ましい。TRAPのアミノ酸配列は、例えば、SFLLRN（配列番号1）である。【００３７】
本発明の一実施形態において「cAMP増加試薬」は、血小板内cAMP量を増加させる作用を有する試薬を含む。このcAMP増加試薬は、例えば、PGE1、PGI2、フォルスコリン、Dibutyryl-cAMP、ベラプロスト、リマプロスト アルファデクス、もしくはcAMP量を増加させるそれらの誘導体、又はそれらの塩もしくは溶媒和物を含む。シロスタゾールの薬効評価は、薬効評価に用いる試薬の作用機序に依存するが、これらはいずれもcAMP量を増加させるという同じメカニズムを有しているので、トロンビン受容体活性化試薬と組み合わせて使用することで、シロスタゾールの薬効評価を実現できる。なお、シロスタゾールの薬効評価の感度の観点からは、特にPGE1が好ましい。【００３８】
血小板機能測定時の、上記（iv）の混合液中のトロンビン受容体活性化試薬又はcAMP増加試薬の1つ当たりの濃度は、血小板機能を活性化する十分量であってもよい。この濃度は、例えば、0.001、0.01、0.1、1、5、10、30、50、100、300、500、又は1000μM以下、あるいは0.01、0.1、1、又は10U/ml以下、であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００３９】
本発明の一実施形態において「抗血小板薬」は、血小板の機能を抑制する薬剤を含む。抗血小板薬は、虚血性疾患治療薬、血栓治療薬、塞栓治療薬、又は血流障害治療薬を含む。【００４０】
上記抗血小板薬の投与量は、例えば、0.00001、0.0001、0.001、1、10、又は50mg/kg体重であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。又は、0.001、0.01、1、10、100、200、又は400mg/1回であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。投与回数は、1、2、3、4回/日（又は週、月）であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また、上記抗血小板薬の投与は、2剤以上の併用投与であってもよい。投与方法は、例えば、経口投与又は静脈内投与であってもよい。【００４１】
本発明の一実施形態は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を含む、シロスタゾールの薬効評価用キットである。このキットを用いて、患者の血液由来サンプルの血小板凝集レベルを測定することによって、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。また、血小板活性化試薬であるトロンビン受容体活性化試薬は、アスピリンからの影響を実質的に受けない。そのため、患者がシロスタゾールとアスピリンを併用している場合でも、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。なお、本発明の一実施形態において「キット」の形態は特に限定されず、例えば、カクテル試薬を含む。【００４２】
本発明の一実施形態は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を含む、シロスタゾールの薬効評価用のカクテル試薬である。このカクテル試薬は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を混合することで調製できる。このカクテル試薬を用いて、患者サンプルの血小板活性化レベルを測定することによって、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。また、血小板活性化試薬であるトロンビン受容体活性化試薬は、アスピリンからの影響を実質的に受けない。そのため、患者がシロスタゾールとアスピリンを併用している場合でも、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。上記キット又はカクテル試薬中のトロンビン受容体活性化試薬又はcAMP増加試薬の含有量は、血小板機能を活性化する十分量であってもよい。【００４３】
本発明の一実施形態は、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬をシロスタゾール服用患者の血液由来サンプルに接触させる工程を含む、血小板機能測定法である。この測定法を用いて、患者サンプルの血小板活性化レベルを測定することによって、シロスタゾール服用患者の血小板機能を測定できる。また、血小板活性化試薬であるトロンビン受容体活性化試薬は、アスピリンからの影響を実質的に受けない。そのため、患者がシロスタゾールとアスピリンを併用している場合でも、シロスタゾールの薬効評価を行なうことができる。【００４４】
本発明の一実施形態は、上記いずれかの実施形態に係る薬効評価方法により薬効評価を受けた患者に、シロスタゾールを投与する工程を含む、疾患の治療方法である。上記患者は、例えば、シロスタゾールが有効と評価された患者を含む。上記疾患は、例えば、シロスタゾールにより治療可能な疾患を含む。また上記疾患は、例えば、血小板機能亢進に基づく疾患を含む。また上記疾患は、例えば、梗塞、虚血性諸症状、又はそれらに基づく疾患を含む。上記それらの基づく疾患は、例えば、潰瘍を含む。上記治療方法は、再発抑制方法又は予防方法を含む。上記治療方法における投与量は、薬効評価結果に基づいて調整された投与量であってもよい。また本発明一実施形態は、上記いずれかの実施形態に係る薬効評価方法により、シロスタゾールが有効と評価されなかった患者に、シロスタゾール以外の抗血小板薬を投与する工程を含む、疾患の治療方法である。【００４５】
なお、上記の薬効評価法に係る種々の詳細な実施形態は、上記のキット、カクテル試薬、血小板機能測定法、及び治療方法においても適用可能である。【００４６】
本発明の一実施形態において「患者」は、例えば、血小板機能亢進に伴う症状を発症している、発症する可能性がある患者、又は発症する可能性があると診断された患者であってもよい。血小板機能亢進に伴う症状は、例えば、虚血性疾患、血栓、塞栓、又は血流障害を含む。また患者は、ヒト、又はヒトを除く哺乳類（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、又はチンパンジー等の1種以上）を含む。【００４７】
また患者は、抗血小板薬を投与された患者、投与される予定の患者であってもよい。また患者は、シロスタゾールを投与された患者、投与される予定の患者であってもよい。また患者は、シロスタゾールと、シロスタゾール以外の抗血小板薬とを投与された患者、投与される予定の患者であってもよい。また患者は、シロスタゾールと、シロスタゾール以外の抗血小板薬との併用療法を受けている患者であってもよい。併用療法は、2剤以上の薬物を患者に投与する医療方法を含む。患者に2剤以上の薬物が投与される間隔は、一般的な併用療法で採用される間隔であってもよい。この間隔は、例えば、同時又は一定期間内であってもよい。一定期間は、例えば、1〜24時間、1〜28日間、1〜6ヶ月間、1〜30年以内であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００４８】
上記のシロスタゾール以外の抗血小板薬は、例えば、血小板活性化シグナル抑制剤、又は血小板抑制シグナル増強剤を含む。血小板活性化シグナル抑制剤は、例えば、アラキドン酸代謝阻害薬、ADP受容体阻害薬、GPIIb/IIIa阻害薬、セロトニン受容体阻害薬、GPIb/IX/V阻害薬、又はGPVI阻害薬を含む。アラキドン酸代謝阻害薬は、例えば、アセチルサリチル酸（アスピリン）、オザグレルナトリウム（オザグレル）、又はエイコサペンタエン酸等を含む（括弧内は、販売名の例。以下同様。）。ADP受容体阻害薬は、例えば、チエノピリジン系薬剤を含む。チエノピリジン系薬剤は、例えば、チクロピジン塩酸塩（パナルジン）、又はクロピドグレル硫酸塩（プラビックス）、プラスグレル塩酸塩（エフィエント）を含む。セロトニン受容体阻害薬は、例えば、サルポグレラート塩酸塩（アンプラーグ）を含む。【００４９】
上記血小板抑制シグナル増強剤は、例えば、PGl2誘導体、PGE1誘導体、又はアデノシン再吸収抑制剤を含む。PGl2誘導体は、例えば、ベラプロストナトリウム（ドルナー）を含む。PGE1誘導体は、例えば、リマプロスト アルファデクス（オパルモン）を含む。アデノシン再吸収抑制剤は、例えば、ジピリダモール（ペルサンチン）を含む。またシロスタゾール以外の抗血小板薬は、1又は2剤以上の抗血小板薬であってもよい。本明細書において「2剤以上」とは、2、3、4、又は5剤以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００５０】
本明細書において引用しているあらゆる刊行物、公報類（特許、又は特許出願）は、その全体を参照により援用する。【００５１】
本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。本明細書において「A〜B」は、A以上B以下を意味するものとする。【００５２】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５４】
＜実施例1＞
1）試薬および材料
cAMP増加試薬であるプロスタグランジンE1（PGE1）はCayman Chemical Company( MI, USA)から購入した。シロスタゾールは大塚製薬株式会社から供与された。VerifyNow IIb/IIIaカセットはAccumetrics (CA, USA)から購入した。カルシウムキレート作用のあるクエン酸ナトリウム（血液抗凝固剤）入り真空採血管はニプロ株式会社（大阪）から購入した。【００５５】
2）採血と測定試料
対象は、in vitro実験では、2週間以内に薬剤を服用していない健常成人、又は2週間以内に抗血小板薬を服用していない脳梗塞発症時の患者とした。ex vivo実験では、抗血小板薬としてシロスタゾール、アスピリン、クロピドグレルの1〜3剤（実験系により異なる）を服用している脳梗塞患者とした。【００５６】
上記対象者の血液を、クエン酸ナトリウム入り真空採血管に採取した。このとき、3.2%クエン酸ナトリウムと血液とが1:9の割合になるように行なった。VerifyNowによる測定には全血のままを使用した。AG-10による測定には多血小板血漿（PRP）を使用した。このPRPは、全血を900rpmで10分間遠心して作製した。また、更に3000rpmで10分間遠心することで乏血小板血漿（PPP）を作製した。【００５７】
3）VerifyNowによる血小板凝集能の測定
VerifyNow（Accumetrics, CA, USA）は吸光度法を原理とする全血血小板凝集能測定装置である。血小板凝集能の測定系には、トロンビン受容体活性化試薬であるiso-TRAP（iso-トロンビン受容体活性化ペプチド）が封入されているVerifyNow GPIIb/IIIa assay用の専用カセットを使用した。測定は取扱説明書に従って測定した。【００５８】
3-1）in vitro実験
VerifyNowに上記専用カセットをセットした後、血液の入った採血管に3μMシロスタゾールを加えて室温で2分静置し、PGE1を加えてさらに2分間静置した。この採血管を専用カセットに挿入すると自動的に血液が吸引されて測定が開始され、規定の時間が経過後に結果が出力される。測定結果はメーカーが設定した任意の単位であるPAU（Platelet Aggregation Units）で表示され、この数値で血小板凝集能を評価した（図1参照）。その結果、TARP及びPGE1を使用すると、シロスタゾール存在時に、非存在時に比べて血小板凝集が有意に抑制されていた。【００５９】
3-2）ex vivo実験（単回投与）
シロスタゾール100mgを単回投与した患者を対象者とした。対象者の血液の入った採血管にPGE1を加えて2分間静置し、上記専用カセットに挿入して測定した（図2参照）。その結果、TARP及びPGE1を使用すると、シロスタゾール服用後に、服用前に比べて血小板凝集が有意に抑制されていた。【００６０】
3-2）ex vivo実験（連続投与）
対象者は、救急搬送された脳梗塞患者で、治療開始前にシロスタゾール服用前の血小板凝集能測定のための採血をおこなった。その後、脳梗塞に対する治療をおこない、シロスタゾールの単独服用（50〜150mg/day）を二週間以上継続した患者で、シロスタゾール服薬後（1時間30分〜3時間15分）に採血をおこない、上記専用カセットを使用して血小板凝集能を測定した（図3参照）。その結果、シロスタゾール服用前の血小板凝集能はPGE1非存在下（221±37 PAU）の血小板凝集能と比較して、3nM PGE1で241±55 PAU、10nM PGE1で192±55 PAUとなり、抑制は認められなかった。一方、シロスタゾール服薬後のPGE1非存在下（238±56 PAU）の血小板凝集能と比較して、3nM PGE1で153±52 PAU、10nM PGE1で60±29 PAUとなり、有意な抑制が見られた。【００６１】
4）AG-10による血小板凝集能の測定
血小板凝集能測定装置AG-10（興和(株)）を使用した。血液は、抗血小板薬服薬前、又は服薬2時間後のものを用いた。キュベットにPPPを300μL加えて測定し、PPPの透過率を100％に設定した。キュベットにPRPを300μL加えて37℃で2分間加温した後、AG-10にキュベットをセットして透過率を0％に設定した。スタートボタンを押して測定を開始し、30秒後に血小板活性化試薬を加え5分間、血小板凝集能を測定した。本測定はex vivo実験で行い、キュベットをセットする前に、PRPにPGE1を加え2分間放置してから測定を開始した。【００６２】
血小板活性化試薬には、TRAP（トロンビン受容体活性化ペプチド）、CRP（collagen related peptide）、エピネフリンを使用し、測定データは最大凝集率（％）で評価した。また、TRAPとCRPについては、健常人の血液を使用して、血小板凝集反応の個人差を調べた。以上の結果を図4〜7に示す。図4、5において、TRAP濃度はそれぞれ50μM、30μMを使用した。図7において、「シロスタゾールなし」は、アスピリン、クロピドグレルのうちの1剤あるいは2剤を投与されている患者群を意味している。「シロスタゾールあり」は、シロスタゾールに加えて、アスピリン、クロピドグレルのうちの1剤あるいは2剤を投与されている患者群を意味している。【００６３】
図4、5からわかるように、TARP及びPGE1を使用すると、シロスタゾール服用後に、服用前に比べて血小板凝集が有意に抑制されていた。また図6からわかるように、TRAPを使用した場合はエピネフリンに比べて顕著に個人差が小さく、安定した血小板反応性を示した。また図7からわかるように、CRPを使用した場合は血小板凝集が有意に抑制されなかった。【００６４】
以上の結果から、トロンビン受容体活性化試薬及びcAMP増加試薬を用いることで、シロスタゾールの薬効評価ができることが明らかとなった。また、この評価系は個人差が顕著に小さいことが明らかになった。加えて、TRAPはそのメカニズム上、アスピリン等の影響を受けないため、アスピリン等との併用投与時においてもシロスタゾールの薬効評価が可能となる。【００６５】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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