(57)【要約】分析に供される多数の試料の各々の由来を少ない種類の核酸を利用して正確に同定する。核酸を含む識別プローブ（１）を保持し、検体を支持する複数の支持体（２）を備え、識別プローブ（１）は、既知の塩基配列を有する少なくとも１種類の核酸を含むとともに支持体（２）毎に核酸の種類および量のうち少なくとも一方が異なり、検体に混合可能に支持体（２）に保持されている核酸分析キット（１００）を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む識別プローブを保持し、検体を支持する複数の支持体を備え、
前記識別プローブは、既知の塩基配列を有する少なくとも１種類の核酸を含むとともに前記支持体毎に前記核酸の種類および量のうち少なくとも一方が異なり、前記検体に混合可能に前記支持体に保持されている核酸分析キット。
【請求項２】
前記複数の支持体と、該複数の支持体の各々に保持されている前記識別プロ―ブの、前記核酸の種類および量の組み合わせとを対応付けた対応表を備える請求項１に記載の核酸分析キット。
【請求項３】
前記支持体が、前記検体を収容する容器であり、
前記識別プローブが、前記容器内に封入されている請求項１または請求項２に記載の核酸分析キット。
【請求項４】
所定の分割線に沿って複数のチップに分割可能であり、前記検体としての生体組織の切片が貼り付けられる基板を備え、
前記識別プローブが、前記複数のチップの各々に保持されている請求項１または請求項２に記載の核酸分析キット。
【請求項５】
前記核酸が、ＤＮＡである請求項１から請求項４のいずれかに記載の核酸分析キット。
【請求項６】
前記ＤＮＡの塩基長が、２０塩基以上５００塩基以下である請求項５に記載の核酸分析キット。
【請求項７】
各前記支持体に保持されている前記ＤＮＡの分子数が、１００分子以上１０００００分子以下である請求項５または請求項６に記載の核酸分析キット。
【請求項８】
既知の塩基配列を有する少なくとも１種類の核酸を含む識別プローブを複数の検体の各々に添加するプローブ添加工程と、
各前記検体に含まれる核酸を分析する核酸分析工程とを含み、
前記プローブ添加工程において、前記核酸の種類および量のうち少なくとも一方が互いに異なる前記識別プローブを前記複数の検体に添加し、
前記核酸分析工程において、各前記検体に添加された前記識別プローブに含まれる前記核酸の解析も行う核酸分析方法。
【請求項９】
前記プローブ添加工程において、前記識別プローブを収容する容器内に前記検体を投入する請求項８に記載の核酸分析方法。
【請求項１０】
前記プローブ添加工程において、前記識別プローブが点在して貼付された基板上に生体組織の切片を貼り付け、
前記切片が貼り付けられた基板を、一の識別プローブを含む複数のチップに前記切片とともに切断する切断工程をさらに含み、
前記核酸分析工程において、前記切断工程において得られた前記チップに付着した前記切片の一部分を分析する請求項８に記載の核酸分析方法。
【請求項１１】
前記プローブ添加工程において、生体組織の切片上に前記識別プローブを点在して貼付し、
前記識別プローブが貼付された前記切片を、一の識別プローブを含む複数の断片に切断する切断工程をさらに含み、
前記核酸分析工程において、前記切断工程において切断された前記切片の断片を分析する請求項８に記載の核酸分析方法。
【請求項１２】
前記切断工程の前に、前記切片に対して、標的核酸と相補的な既知の塩基配列を有する核酸プローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程をさらに含む請求項１０または請求項１１に記載の核酸分析方法。
【請求項１３】
前記核酸分析工程において、前記検体および前記識別プローブに含まれる核酸を、定量的核酸増幅法または核酸の定量が可能な塩基配列読み取り装置を用いて分析する請求項８から請求項１２のいずれかに記載の核酸分析方法。
【請求項１４】
前記識別プローブに含まれる前記核酸が、ＤＮＡである請求項８から請求項１３のいずれかに記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡの塩基長が、２０塩基以上５００塩基以下である請求項１４に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
各前記識別プローブに含まれる前記ＤＮＡの分子数が、１００分子以上１０００００分子以下である請求項１４または請求項１５に記載の核酸分析方法。
【請求項１７】
前記核酸分析工程において、各前記検体に添加された前記ＤＮＡを定量的核酸増幅法を用いて分析し、
前記定量的核酸増幅法における前記ＤＮＡの増幅率が、略同一である請求項１４から請求項１６のいずれかに記載の核酸分析方法。
【請求項１８】
前記核酸分析工程において、各前記検体に添加された前記ＤＮＡをＰＣＲ法を用いて分析し、
前記ＰＣＲ法における各前記ＤＮＡの増幅率の差が、１．９倍以下である請求項１７に記載の核酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析キットおよび核酸分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸分析において、検体を採取してから該検体に含まれる核酸を分析に供するまでの間に、検体からの核酸抽出等を行う前処理において多数回の容器の交換が行われる。通常、前処理を手作業で行う場合、容器の交換毎に交換前後の容器の対応付けを行うことによって、試料の取り違えを防止している。検体数が多い場合、容器の対応付けの作業は煩雑であり、試料の取り違えが発生する確率が高くなる。【０００３】
この試料の取り違えを防止する手段として、識別子プローブを検体に混合し、検体と一緒に識別子プローブを増幅する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この識別子プローブは、検体と同一のプライマによって増幅される領域に、個々の検体に付された個別コードにデコード可能な塩基配列を有している。したがって、検体を増幅した後、増幅産物に含まれている識別子プローブの個別コードをデコードすることによって、増幅産物がいずれの検体に由来しているかを特定することができる。【０００４】
一方、生体組織の切片に含まれる特定の分子の量または活性の空間分布を解析する方法として、標的の分子を認識するプローブを切片上の複数の位置に導入し、各プローブの切片上の位置を識別するタグを当該プローブに付す方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。分子と反応したプローブを切片から回収し、プローブに付されているタグを分析することによって、切片の各位置における標的の分子の量または活性を知ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−７４９６７号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０２４５１１１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１および２に記載の方法においては、検体毎に異なる塩基配列を有する識別子プローブまたはタグを用意する必要がある。すなわち、分析対象の検体の数が多い場合、多くの種類の識別子プローブまたはタグを用意しなければならないという不都合がある。【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、分析に供される多数の試料の各々の由来を少ない種類の核酸を利用して正確に同定することができる核酸分析キットおよび核酸分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、核酸を含む識別プローブを保持し、検体を支持する複数の支持体を備え、前記識別プローブは、既知の塩基配列を有する少なくとも１種類の核酸を含むとともに前記支持体毎に前記核酸の種類および量のうち少なくとも一方が異なり、前記検体に混合可能に前記支持体に保持されている核酸分析キットである。【０００９】
本発明の第１の態様によれば、複数の支持体の各々に検体を支持させると、支持体に保持されている識別プローブに含まれる識別用の核酸が検体に混合される。このときに各検体に混合される識別用の核酸の種類および量のうち少なくとも一方が、検体毎に互いに異なる。したがって、支持体に支持された各検体から調整された試料を核酸分析する際に、各試料に含まれている識別用の核酸も解析し、該核酸の種類および／または量の同定も行うことによって、当該識別用の核酸の種類および／または量に基づいて各試料がいずれの検体に由来するものであるかを正確に同定することができる。【００１０】
このように、各検体に混合される識別用の核酸の種類および量のうち少なくとも一方を異ならせることによって、多数の検体同士を互いに識別することができるので、識別プローブは、少ない種類の核酸を含んでいればよく、多数の試料の各々の由来を少ない種類の核酸を利用して正確に同定することができる。【００１１】
上記第１の態様においては、前記複数の支持体と、該複数の支持体の各々に保持されている前記識別プロ―ブの組成、すなわち前記核酸の種類および量の組み合わせとを対応付けた対応表を備えていてもよい。
このようにすることで、いずれの支持体にいずれの組成の識別プローブが保持されているかを、容易に把握することができる。【００１２】
上記第１の態様においては、前記支持体が、前記検体を収容する容器であり、前記識別プローブが、前記容器内に封入されていてもよい。
このようにすることで、容器に検体を投入するだけで検体に識別プローブを容易に混合することができる。【００１３】
上記第１の態様においては、所定の分割線に沿って複数のチップに分割可能であり、前記検体としての生体組織の切片が貼り付けられる基板を備え、前記識別プローブが、前記複数のチップの各々に保持されていてもよい。
このようにすることで、検体として生体組織の切片の一部分を分析する場合に、切片を基板に貼り付けた後に基板と切片とを分割線に沿って同時に分割することによって、１種類の識別プローブが混合した切片の断片を調製することができる。【００１４】
上記第１の態様においては、前記核酸が、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）であってもよい。
このようにすることで、検体に含まれているＤＮＡの分析に好適な構成とすることができる。【００１５】
上記第１の態様においては、前記核酸が、ＲＮＡ（リボ核酸）であってもよい。
検体の分析対象の核酸がＲＮＡである場合は、識別プローブに含まれる核酸がＲＮＡであることが望ましい。識別プローブがＲＮＡを含む場合、ＲＮＡ分解酵素によって分解されないように、修飾されたＲＮＡ、例えば、オリゴヌクレオチドの２’位置をメチル基に置換したもの等を用いても良い。【００１６】
上記第１の態様においては、前記核酸が、核酸類似物質であってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡまたはＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Bridged nucleic acid（ＢＮＡ）、2'-O,4'-C-Ethylene-bridged
Nucleic Acids（ＥＮＡ）天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチド、Hexitol Nucleic Acid（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。【００１７】
上記第１の態様においては、前記ＤＮＡの塩基長が、２０塩基以上５００塩基以下であってもよい。
このようにすることで、識別プローブの製造および核酸分析や前処理におけるＤＮＡの取り扱いを容易にすることができる。【００１８】
上記第１の態様においては、各前記支持体に保持されている前記ＤＮＡの分子数が、１００分子以上１０００００分子以下であってもよい。
このようにすることで、検体に含まれている核酸の分析に識別プローブが影響を与えることなく、識別プローブのＤＮＡの定量精度を確保することができる。【００１９】
本発明の第２の態様は、既知の塩基配列を有する少なくとも１種類の核酸を含む識別プローブを複数の検体の各々に添加するプローブ添加工程と、各前記検体に含まれる核酸を分析する核酸分析工程とを含み、前記プローブ添加工程において、前記核酸の種類および量のうち少なくとも一方が互いに異なる前記識別プローブを前記複数の検体に添加し、前記核酸分析工程において、各前記検体に添加された前記識別プローブに含まれる前記核酸の解析も行う核酸分析方法である。【００２０】
本発明の第２の態様によれば、プローブ添加工程において識別プローブを検体に添加した後に、核酸分析工程において、当該検体から調整された試料を核酸分析する際に、各試料に含まれている識別用の核酸も解析し、該核酸の種類および／または量の同定も行うことによって、当該識別用の核酸の種類および／または量に基づいて各試料がいずれの検体に由来するものであるかを正確に同定することができる。【００２１】
このように、各検体に添加される識別用の核酸の種類および量のうち少なくとも一方を異ならせることによって、多数の検体同士を互いに識別することができるので、識別プローブは、少ない種類の核酸を含んでいればよく、多数の試料の各々の由来を少ない種類の核酸を利用して正確に同定することができる。【００２２】
上記第２の態様においては、前記プローブ添加工程において、前記識別プローブを収容する容器内に前記検体を投入してもよい。
このようにすることで、容器に検体を投入するだけで検体に識別プローブを容易に添加することができる。【００２３】
上記第２の態様においては、前記プローブ添加工程において、前記識別プローブが点在して貼付された基板上に生体組織の切片を貼り付け、前記切片が貼り付けられた基板を、一の識別プローブを含む複数のチップに前記切片とともに切断する切断工程をさらに含み、前記核酸分析工程において、前記切断工程において得られた前記チップに付着した前記切片の一部分を分析してもよい。
このようにすることで、切片の各位置に存在する核酸を容易に分析することができる。【００２４】
上記第２の態様においては、前記プローブ添加工程において、生体組織の切片上に前記識別プローブを点在して貼付し、前記識別プローブが貼付された前記切片を、一の識別プローブを含む複数の断片に切断する切断工程をさらに含み、前記核酸分析工程において、前記切断工程において切断された前記切片の断片を分析してもよい。
このようにすることで、切片の各位置に存在する核酸を容易に分析することができる。【００２５】
上記第２の態様においては、前記切断工程の前に、前記切片に対して、標的核酸と相補的な既知の塩基配列を有する核酸プローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程をさらに含んでいてもよい。
このようにすることで、核酸分析工程において核酸プローブに基づいた標的核酸の検出が可能となり、標的核酸の検出感度を向上することができる。【００２６】
上記第２の態様においては、前記核酸分析工程において、前記検体および前記識別プローブに含まれる核酸を、定量的核酸増幅法または核酸の定量が可能な塩基配列読み取り装置を用いて分析してもよい。
このようにすることで、各検体由来の試料に含まれる核酸をより正確に定量することができる。【００２７】
上記第２の態様においては、前記識別プローブに含まれる前記核酸が、ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡの塩基長は、２０塩基以上５００塩基以下であることが好ましく、各前記識別プローブに含まれる前記ＤＮＡの分子数は、１００分子以上１０００００分子以下であることが好ましい。【００２８】
上記第２の態様においては、前記核酸分析工程において、各前記検体に添加された前記ＤＮＡを定量的核酸増幅法を用いて分析し、前記定量的核酸増幅法における前記ＤＮＡの増幅率が、略同一であってもよい。より好ましくは、前記定量的核酸増幅法がＰＣＲ（合成酵素連鎖反応）法であり、各前記ＤＮＡの増幅率の差が、１．９倍以下、さらに好ましくは１．１倍以下である。
このようにすることで、各検体由来の試料に含まれるＤＮＡをより正確に定量することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、分析に供される多数の試料の各々の由来を少ない種類の核酸を利用して正確に同定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る核酸分析キットの全体構成図である。
【図２】図１の核酸分析キットを使用した核酸分析方法を説明するフローチャートである。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る核酸分析キットの全体構成図である。
【図４Ａ】図３の核酸分析キットが備える基板の使用方法を説明する図であり、基板の分割前を示している。
【図４Ｂ】図３の核酸分析キットが備える基板の使用方法を説明する図であり、基板の分割後を示している。
【図５】図３の核酸分析キットを使用した核酸分析方法を説明するフローチャートである。
【図６】本発明の第３の実施形態に係る核酸分析方法であって、図３の核酸分析キットを使用したもう１つの核酸分析方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（第１の実施形態）
以下に、本発明の第１の実施形態に係る核酸分析キット１００およびこれを用いた核酸分析方法について図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る核酸分析キット１００は、図１に示されるように、識別プローブ１を封入している複数の容器（支持体）２と、各容器２に付された容器番号と各容器２に封入されている識別プローブ１の組成とを対応付けた対応表３とを備えている。
【００３２】
容器２は、例えば、一般に分子生物学実験で使用される１．５ｍＬのマイクロチューブである。識別プローブ１は、乾燥状態で容器２の底部の内面に貼付されている。
識別プローブ１は、互いに異なる既知の塩基配列を有する複数種類の核酸を含んでいる。これら複数種類の核酸は、容器２毎に互いに異なる配合比で混合されており、識別プローブ１の組成、すなわち、識別プローブ１に含まれる核酸の種類とその量は、容器２毎に異なっている。
【００３３】
本実施形態においては、核酸として、４種類のＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４を用いる場合について説明する。ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４は、各々４段階に異なる配合量で配合されている。すなわち、本例において、互いに異なる配合比を有する識別プローブ１を、４×４×４×４＝２５６種類調製可能であり、核酸分析キット１００が備える容器２の最大数は、２５６個である。
【００３４】
なお、識別プローブ１に含まれる核酸の種類は、検体の標的核酸の種類に応じて適宜選択可能であり、ＲＮＡ等の他の種類の核酸を用いてもよい。標的核酸がＤＮＡの場合は、識別プローブ１がＤＮＡを含むことが望ましく、標的核酸がＲＮＡである場合は、識別プローブ１がＲＮＡを含むことが望ましい。識別プローブ１がＲＮＡを含む場合、ＲＮＡが分解酵素によって分解されないように、修飾されたＲＮＡ、例えば、オリゴヌクレオチドの２’位置をメチル基に置換したもの等を用いても良い。
【００３５】
ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の塩基長は、合成および分析における取り扱いの容易さの観点から、１０塩基以上１０００塩基以下であることが好ましく、２０塩基以上５００塩基以下であることがさらに好ましい。また、各容器２に封入されるＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の総分子数は、後述する核酸分析工程において、標的とする核酸の分析にＤＮＡ１〜ＤＮＡ４が影響を与えることを防ぎつつ、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の定量性を十分に確保することができるように、１００分子以上１０００００分子以下であることが好ましい。ただし、核酸の分析方法の精度や感度に応じて識別プローブ１の総分子数をこの範囲外に設定することができることは言うまでもない。
【００３６】
対応表３には、各容器２内の識別プローブ１の組成、すなわち各識別プローブ１が含む核酸の種類およびその量として、核酸の種類（ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４）およびその配合比が、各容器２の容器番号と、１対１で対応付けられている。
【００３７】
次に、このように構成された核酸分析キット１００を用いた核酸分析方法について、図２のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る核酸分析キット１００を使用して検体に含まれる標的のＤＮＡを分析するには、まず、検体を容器２に投入し、該容器２内において検体と識別プローブ１とを十分に混合する（ステップＳ１、プローブ添加工程）。このときに、いずれの検体をいずれの容器番号の容器２に投入したかを記録しておく（ステップＳ２）。
【００３８】
次に、核酸分析のための前処理を、各検体に施す。例えば、検体が生体組織の断片や細胞等である場合、検体からＤＮＡを抽出する処理を行う。次に、前処理によって各検体から得られた試料を、定量的ＰＣＲ等の定量的核酸増幅法を用いて分析することによって、試料中に含まれている標的のＤＮＡを検出および定量する（ステップＳ３、核酸分析工程）。
【００３９】
ここで、各試料には、容器２に封入されていた識別プローブ１も、検体由来の標的のＤＮＡと共に存在している。ステップＳ３においては、標的のＤＮＡと一緒に、識別プローブ１を構成する４種類のＤＮＡ１〜ＤＮＡ４についても、検出および定量を実施する。したがって、４種類のＤＮＡ１〜ＤＮＡ４は、標的のＤＮＡ用のプライマによって増幅されるような塩基配列を有するか、または、ステップＳ３においてＤＮＡ１〜ＤＮＡ４用のプライマも添加される。これにより、各試料について、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比が得られる（ステップＳ４）。
【００４０】
ステップＳ３の定量的核酸増幅法においては、各試料中のＤＮＡ１〜ＤＮＡ４を略同一の増幅率で増幅することが好ましい。具体的には、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の増幅率の差は、１．９倍以下であることが好ましく、１．１倍以下であることがさらに好ましい。
【００４１】
次に、ステップＳ４において得られた各試料のＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比を対応表３と照合することで、各試料の由来がいずれの容器番号の容器２に投入された検体であるかを特定することができる（ステップＳ５）。
【００４２】
このように、本実施形態によれば、各検体から調製された試料に含まれている識別プローブ１を分析することによって、当該試料の由来を同定することができる。通常、分子生物学実験においては、検体を容器２に投入してから標的のＤＮＡの分析が完了するまでの間に、検体または該検体から得られた試料は、容器から他の容器へ多数回移し替えられる。本実施形態によれば、試料を移し替える際にいずれの試料をいずれの容器に移したかを記録せずとも、最終的に核酸分析に供される試料に含まれている識別プローブ１の配合比に基づいて、その試料の由来を正確に同定することができるという利点がある。
【００４３】
さらに、複数種類の核酸の配合量を異ならせることによって、十分に少ない種類の核酸を用いながらも、互いに識別可能な多くの種類の識別プローブ１を容易に製造することができ、多数の試料の由来を同定することができるという利点がある。
【００４４】
なお、本実施形態においては、定量的核酸増幅法を用いて核酸分析することとしたが、核酸分析の方法は、試料に含まれている特定の核酸について検出および定量可能であればよく、上記の定量的核酸増幅法に代えて、核酸の定量機能を有する塩基配列読み取り装置（ＤＮＡシーケンサ）を用いてもよい。
このようにしても、試料に含まれる標的のＤＮＡの検出および定量と同時に、識別プローブ１を構成するＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比も得ることができる。
【００４５】
（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態に係る核酸分析キット２００およびこれを用いた核酸分析方法について、図３から図５を参照して説明する。
なお、本実施形態においては、第１の実施形態と異なる点について主に説明し、第１の実施形態と共通する構成については同一の符号を付して説明を省略する。
【００４６】
本実施形態に係る核酸分析キット２００は、図３に示されるように、容器２に代えて、複数種類の識別プローブ１が貼付された基板４を備え、対応表３’には、各識別プローブ１の組成とその基板４における貼付位置とが対応付けられている点において、第１の実施形態と異なっている。
【００４７】
基板４は、カバーガラスのような、生体組織から切り出した切片を貼り付けるのに適した平板である。基板４は、その表面を碁盤の目状に複数の領域に分割する分割線４ａが設けられている。該分割線４ａによって分割された各領域には１種類の識別プローブ１が貼付されており、識別プローブ１に含まれるＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比は、各領域毎に互いに異なっている。識別プローブ１の基板４への貼付には、例えば、インクジェットプリンタ、または、ＤＮＡチップの製造に使用されるスポッタが用いられる。
【００４８】
本実施形態においては、第１の実施形態と同様に、４種類のＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４を各々４段階に異なる配合量で混合する場合を想定している。したがって、基板４は、分割線４ａによって２５６以下の数の領域に分割されていればよい。図３に示される基板４は、１０行×１０列に分割されて１００個の領域が形成されている。
【００４９】
対応表３’には、各領域の位置と、各領域に貼付されている識別プローブ１が有するＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比とが、１対１で対応付けられている。各領域の位置は、行番号ａ，ｂ，ｃ，…，ｊおよび列番号Ａ，Ｂ，…，Ｊを用いて特定されるようになっている。
【００５０】
次に、このように構成された核酸分析キット２００を用いた核酸分析方法について、図５のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る核酸分析キット２００を使用して生体組織の切片５に含まれる核酸を分析するには、図４Ａに示されるように、まず、生体組織から切り出した切片５を基板４に貼り付ける（ステップＳ２１、プローブ添加工程）。そして、図４Ｂに示されるように、分割線４ａに沿って基板４および切片５を切断することによって、少なくとも一部のチップに検体となる切片５の断片が付着した１００個のチップ（支持体）４ｂを得る（ステップＳ２２、切断工程）。
【００５１】
基板４および切片５を切断する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、予め切断されたチップ４ｂを伸展可能なシート上に２次元的に配列することによって基板４を形成し、切片５を基板４に貼付した後にシートを伸展させてチップ４ｂ同士を引き離すことによって、基板４および切片５を、チップ４ｂ間の境界からなる分割線４ａに沿って同時に切断することができる。
【００５２】
得られたチップ４ｂは各々、例えば、別々のマイクロチューブに投入され、チップ４ｂに付着している切片５の断片に核酸抽出等の前処理が施される。そして、前処理によって各検体から得られた試料を、第１の実施形態のステップＳ３と同様にして核酸分析することによって、試料中に含まれている標的のＤＮＡを検出および定量する（ステップＳ２３、核酸分析工程）。
【００５３】
ここで、切片５の各断片から調整された各試料には、基板４に貼付されていた１種類の識別プローブ１も、断片由来の標的のＤＮＡと共に存在している。したがって、上述したステップＳ３〜Ｓ５と同様にして、各試料について、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比が得られ（ステップＳ２４）、得られた各試料のＤＮＡ１〜ＤＮＡ４の配合比を対応表３’と照合することで、各試料の由来がいずれの位置の断片であるかを特定することができる（ステップＳ２５）。
本実施形態の効果は、上述の第１の実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００５４】
なお、本実施形態においては、基板４の各領域に識別プローブ１が貼付されていることとしたが、これに代えて、基板４に切片５を貼り付けた後に、上述のインクジェットプリンタまたはスポッタ等を用いて、切片５上に識別プローブ１を貼付してもよい。この場合も、分割線４ａによって分割された各領域に１種類ずつ識別プローブ１が含まれるように、識別プローブ１の貼付位置を決定する。
このようにしても、核酸分析に供された試料の各々が切片５のいずれの位置の断片に由来しているかを、各試料に含まれている識別プローブ１の組成に基づいて正確に特定することができる。
【００５５】
（第３の実施形態）
次に、本発明の第３の実施形態に係る核酸分析キットおよびこれを用いた核酸分析方法について、図６を参照して説明する。本実施形態は、第２の実施形態に係る核酸分析キット２００を用いたもう１つの核酸分析方法に関するものである。したがって、第２の実施形態と異なる点について主に説明し、第２の実施形態と共通する構成については同一の符号を付して説明を省略する。
【００５６】
本実施形態に係る核酸分析方法によれば、図６に示されるように、ステップＳ２１において切片５を基板４に貼り付けた後に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、切片５上で検出用のＤＮＡプローブ（核酸プローブ。以下、検出用プローブという。）を標的とするＲＮＡに会合させる（ステップＳ３１、ハイブリダイゼーション工程）。検出用プローブを会合させた後は、第２の実施形態と同様にして、切片５を分割および採取し（ステップＳ２２）、核酸分析し（ステップＳ２３）、識別プローブ１の配合比を取得し（ステップＳ２４）、対応表３’に基づいて検体を同定する（ステップＳ２５）。ただし、本実施形態では、ステップＳ２３において、検出用プローブについても分析を行い、ステップＳ２４において、各検体に含まれている検出用プローブの種類および量も取得する。
【００５７】
もし、予め識別プローブ１が貼付された基板４を使用するのではなく、基板４に切片５を貼付した後に識別プローブ１をインクジェットプリンタ等で貼付する場合は、ステップＳ３１のハイブリダイゼーションの後に、識別プローブ１の切片５への貼付を行う。
【００５８】
本実施形態に係る核酸分析方法によれば、第２の実施形態の効果に加えて、標的核酸を定量的核酸増幅法で解析する場合、既知の検出用プローブを用いることで、増幅効率を略同一にすることができ、検出精度を向上することができる。また、特に、標的核酸がＲＮＡである場合は、核酸分析の際にＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換することなく、定量的核酸増幅法およびＤＮＡシーケンサによる解析が可能となる。さらに、分解しやすいＲＮＡをＤＮＡに置換して検出することにより、検出の精度および感度を向上することができる。
【００５９】
なお、上述した第１から第３の実施形態においては、４種類の核酸を含む識別プローブ１について説明したが、識別プローブ１に含まれる核酸の種類の数は、これに限定されるものではなく、実用に適した数であればよい。例えば、第２の実施形態においては、インクジェットプリンタまたはスポッタの利用に適した数であることが好ましい。具体的には、識別プローブ１に含まれる核酸の種類の数は、４色用のインクジェットプリンタを使用する場合は、核酸の種類の数は４以下であることが好ましく、スポッタを使用する場合は、スポッタが備えるピンの数以下であることが好ましい。
【００６０】
また、上述した第１から第３の実施形態においては、核酸分析によってＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４の配合比を正確に得るために、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４の各々の配合量について、最小の配合量を１としたときに、２倍、３倍、４倍と異ならせることとした。ただし、試料に含まれているＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４の量を高い精度で検出可能である場合には、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３およびＤＮＡ４の各々の配合量をより小さい比率で変化させてもよい。
【００６１】
また、上述した第１から第３の実施形態においては、識別プローブ１が、複数種類の核酸を含むこととしたが、識別プローブ１は、分析対象の検体の数や核酸分析の定量精度等の条件によっては、１種類のみの核酸を含んでいてもよい。
すなわち、第１の実施形態を例に挙げると、核酸分析キット１００がｎ個（ｎは、自然数。）の容器２を備える場合に、１種類のみの核酸を含む識別プローブ１を各容器２に封入し、この核酸の量を容器２毎にｎ段階に異ならせればよい。
このようにしても、核酸分析に供された試料中の識別プローブ１を分析することによって、試料の由来を同定することができる。
【符号の説明】
【００６２】
１００，２００  核酸分析キット
１  識別プローブ
２  容器（支持体）
３，３’  対応表
４  基板
４ａ  分割線
４ｂ  チップ（支持体）
５  切片
Ｓ１，Ｓ２１  プローブ添加工程
Ｓ３，Ｓ２３  核酸分析工程
Ｓ２２  切断工程
Ｓ３１  ハイブリダイゼーション工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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