(57)【要約】  本発明の多色蛍光分析装置１は、複数の励起波長帯を有する励起光を試料ｓに照射する照射部４１と、励起光の照射により試料ｓから発せられた蛍光を含む光を導光すると共に、第１の出射部４２５ｂから出射する第１のファイバオプティックプレート４２４と、第１の出射部４２５ｂから出射した光を第２の入射部４３４ａから受け入れて導光すると共に、第２の出射部４３４ｂから上記光を出射する第２のファイバオプティックプレート４３１と、第２の出射部４３４ｂの端面上に設けられ、上記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ上記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と、誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に密着するように設けられ、誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過した光を検出する二次元検出部４３３とを備えている。
2016125236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする多色蛍光分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の誘電体多層膜干渉フィルタが第１の誘電体多層膜干渉フィルタであり、照射部が光源と前記光源から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる第２の誘電体多層膜干渉フィルタとを有している請求項１に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項３】
第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α２）が前記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、下記式（１）で表される関係を満たす請求項２に記載の多色蛍光分析装置。
【数１】
2016125236.tif 000011
（式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。）
【請求項４】
所定値（α）が０．１％である請求項３に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項５】
第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下である請求項３または請求項４に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項６】
第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角（θｍａｘ）が３０°である請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項７】
第２のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径が第１のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径より小さい請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項８】
各励起波長帯の励起光が順次照射される請求項３から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項９】
少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射される請求項３から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１０】
試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、前記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１１】
蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５である請求項１０に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１２】
第２の誘電体多層膜干渉フィルタが第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタを有し、
第１フィルタの透過率が、３８０〜３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０〜３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第２フィルタの透過率が、４７４〜４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４〜４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第３フィルタの透過率が、５６１〜５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１〜５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第４フィルタの透過率が、６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１〜６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
前記第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタが切り替えて用いられる請求項１１に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１３】
第２の誘電体多層膜干渉フィルタが単一のフィルタであり、前記第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が３８０〜３９６ｎｍ、４７４〜４９７ｎｍ、５６１〜５７５ｎｍおよび６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である請求項１１に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１４】
第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が、４３６〜４６２ｎｍ、５３６〜５４８ｎｍ、６２０〜６３２ｎｍおよび７１３〜８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である請求項１２または請求項１３に記載の多色蛍光分析装置。
【請求項１５】
第１のファイバオプティックプレートの試料が当接する側の面において、光ファイバのコア部端面にアミノシラン処理が施され、前記光ファイバの前記コア部端面以外の面にＨＭＤＳ処理が施されている請求項１０から請求項１４のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多色蛍光分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば生物学的試験において、蛍光色素でラベルされた多数の微小な試料に一括して励起光を照射し、上記蛍光色素が発した蛍光を検出して各試料を特定する分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
上記分析装置では、励起光を分離して特定の波長の蛍光のみを取り出すための交換式の干渉フィルタを備えており、この干渉フィルタを透過した蛍光を上記各試料に対応するよう配設された多数の光ファイバで導光し、これら光ファイバの他端に取り付けられた画像センサを用いて分析を行う。【０００４】
このような分析装置では、蛍光を導光する手段として多数の光ファイバが束ねられたファイバオプティックプレートが用いられており、束ねられた光ファイバにより伝送される蛍光を画像センサで二次元画像として一括処理して蛍光の有無を判別するため、同時に多数の試料について蛍光分析を行うことが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２４１９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えばＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（以下、「ＳＢＳ」ともいう）法を用いたＤＮＡの塩基配列分析に代表されるような異なる蛍光波長を有する複数の蛍光色素を含む試料を分析する場合、上述したような従来の分析装置では、分析対象とする蛍光色素ごとに干渉フィルタを交換しなければならず、繰り返し行われる塩基伸長反応のたびに干渉フィルタを交換するとなれば分析に膨大な時間を要してしまい、分析迅速化の要求を満足することができない。【０００７】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする多色蛍光分析装置、
（２）前記（１）に記載の誘電体多層膜干渉フィルタが第１の誘電体多層膜干渉フィルタであり、照射部が光源と前記光源から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる第２の誘電体多層膜干渉フィルタとを有している前記（１）に記載の多色蛍光分析装置、
（３）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α２）が前記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、下記式（１）で表される関係を満たす前記（２）に記載の多色蛍光分析装置、
【数１】
2016125236.tif 000003
（式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。）
（４）所定値（α）が０．１％である前記（３）に記載の多色蛍光分析装置、
（５）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下である前記（３）または（４）に記載の多色蛍光分析装置、
（６）第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角（θｍａｘ）が３０°である前記（３）から（５）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（７）第２のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径が第１のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径より小さい前記（１）から（６）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（８）各励起波長帯の励起光が順次照射される前記（３）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（９）少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射される前記（３）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（１０）試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、前記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる前記（１）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（１１）蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ およびＣｙ５．５である前記（１０）に記載の多色蛍光分析装置、
（１２）第２の誘電体多層膜干渉フィルタが第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタを有し、
第１フィルタの透過率が、３８０〜３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０〜３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第２フィルタの透過率が、４７４〜４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４〜４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第３フィルタの透過率が、５６１〜５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１〜５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
第４フィルタの透過率が、６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１〜６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
前記第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタが切り替えて用いられる前記（１１）に記載の多色蛍光分析装置、
（１３）第２の誘電体多層膜干渉フィルタが単一のフィルタであり、前記第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が３８０〜３９６ｎｍ、４７４〜４９７ｎｍ、５６１〜５７５ｎｍおよび６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である前記（１１）に記載の多色蛍光分析装置、
（１４）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が、４３６〜４６２ｎｍ、５３６〜５４８ｎｍ、６２０〜６３２ｎｍおよび７１３〜８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である前記（１２）または（１３）に記載の多色蛍光分析装置、並びに
（１５）第１のファイバオプティックプレートの試料が当接する側の面において、光ファイバのコア部端面にアミノシラン処理が施され、前記光ファイバの前記コア部端面以外の面にＨＭＤＳ処理が施されている前記（１０）から（１４）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置
に関する。【０００９】
なお、本明細書において、ファイバオプティックプレート（Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｐｌａｔｅ、以下「ＦＯＰ」ともいう）とは、多数の光ファイバが一体的に束ねられて当該光ファイバの軸方向の両端部が平面形状をなすものであり、上記光ファイバの一端から入射した光を上記光ファイバの他端に導光可能なデバイスを意味する。このファイバオプティックプレートは、ファイバオプティックテーパ（Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｔａｐｅｒ、以下「ＦＯＴ」ともいう）を含む概念である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することができる。したがって、当該多色蛍光分析装置は、例えば、複数の蛍光色素を同時に用いるようなＳＢＳ法を用いたＤＮＡの塩基配列分析などに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の多色蛍光分析装置の一実施形態を示す概略図である。
【図２】図１の多色蛍光分析装置における蛍光検出手段を示す概略図であって、（ａ）は試料が１個の状態、（ｂ）は試料が複数の状態をそれぞれ示す。
【図３】図２のフローチップの概略斜視図であって、（ａ）は分解した状態、（ｂ）は組み立てた状態をそれぞれ示す。
【図４】図２の蛍光検出手段を示す概略図であって、（ａ）はフローチップを装着する前の状態、（ｂ）はフローチップを装着した状態をそれぞれ示す。
【図５】図２の蛍光検出手段における蛍光の伝搬状態を示す概略図であって、（ａ）は第１および第２のファイバオプティックプレート内の伝搬状態、（ｂ）は第１および第２の光ファイバ内の伝搬状態をそれぞれ示す。
【図６】図２の蛍光検出手段において第１のファイバオプティックプレートへの蛍光の入射角をパラメータとした蛍光と励起光との関係を示す概略図であって、（ａ）は入射角が０°の状態、（ｂ）は入射角が変化したときの状態、（ｃ）は入射角が３０°の状態、（ｄ）は入射角が０°かつ短波長シフトを考慮した状態をそれぞれ示す。
【図７】図２の蛍光検出手段における照射部の一形態を具体化して示す概略図である。
【図８】図７の蛍光検出手段の照射部における各フィルタの概略透過特性図であって、（ａ）は第１フィルタの透過率、（ｂ）は第２フィルタの透過率、（ｃ）は第３フィルタの透過率、（ｄ）は第４フィルタの透過率、（ｅ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率をそれぞれ示す。
【図９】図２の蛍光検出手段における二次元検出部の一形態を説明するための概略図である。
【図１０】図９の蛍光検出手段における概略分光特性図であって、（ａ）は第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタにおいて短波長シフトを考慮していない特性、（ｂ）は第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタにおいて短波長シフトを考慮した特性、（ｃ）は各蛍光色素の蛍光スペクトルをそれぞれ示す。
【図１１】図２の蛍光検出手段における二次元検出部の概略特性図であって、（ａ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタを透過する蛍光スペクトル、（ｂ）は二次元検出部における各センサの波長特性をそれぞれ示す。
【図１２】図２の蛍光検出手段における二次元検出部の他の形態を示す概略図である。
【図１３】図１２の蛍光検出手段における二次元検出部の概略特性図であって、（ａ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタを透過する蛍光スペクトル、（ｂ）は二次元検出部における各センサの波長特性をそれぞれ示す。
【図１４】図２の蛍光検出手段における第２のファイバオプティックプレートとしてファイバオプティックテーパを採用したものの概略図である。
【図１５】図２の蛍光検出手段における照射部の光源としてＬＥＤを用いた一形態を示す概略図である。
【図１６】図１６の蛍光検出手段の照射部としてライトパイプを用いた一形態を示す概略図である。
【図１７】図１５の蛍光検出手段の照射部として複数セットの照射部を用いた一形態を示す概略図であって、（ａ）は正面図、（ｂ）は平面図をそれぞれ示す。
【図１８】図１５の蛍光検出手段の照射部を斜光照明とした一形態を示す概略図である。
【図１９】図２の蛍光検出手段における第１および第２のファイバオプティックプレートの他の形態を示す概略図であって、（ａ）は第１および第２のファイバオプティックプレートの断面図、（ｂ）は第１および第２の光ファイバの切断斜視図をそれぞれ示す。
【図２０】図２の蛍光検出手段における第１の誘電体多層膜干渉フィルタと二次元光センサとの間に光隔壁を設けた形態を示す概略図である。
【図２１】対物レンズを用いた多色蛍光分析装置における蛍光検出手段の一形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の多色蛍光分析装置は、励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする。
【００１３】
このように、当該多色蛍光分析装置は、上記照射部と、第１および第２のファイバオプティックプレートと、誘電体多層膜干渉フィルタと、二次元検出部とを備えているので、試料に含まれる複数の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる。これは、後述するように、励起光の波長帯と検出に用いる蛍光の波長帯とが重なるのを抑制することができ、その結果、蛍光のみを分光して分析精度を向上することができるためであると推察される。
【００１４】
本発明の多色蛍光分析装置は、上述したように試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する分析装置として用いられ、その分析対象となる試料は上記要件を満たす限り特に限定されないが、好適には、試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、上記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる。これにより、蛍光色素でラベルされた４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を迅速かつ正確に識別することができ、ＤＮＡの塩基配列を効率よく解読することができる。
【００１５】
以下に、本発明の多色蛍光分析装置を図面に基づいて説明するが、本発明は、当該図面に記載の実施態様のみに限定されるものではない。なお、以下の実施形態では、試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、ＳＢＳ反応方式を用いたＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる多色蛍光分析装置（以下、「ＤＮＡシーケンサ」ともいう）を例示して説明する。また、以下の実施形態では、第１のファイバオプティックプレートがフローチップの基板として用いられている。また、以下に示す実施形態では、第２の出射部の端面上に設けられている単一の誘電体多層膜干渉フィルタを第１の誘電体多層膜干渉フィルタと称する。
【００１６】
図１は、本発明の多色蛍光分析装置の一実施形態を示す概略図である。当該多色蛍光分析装置１は、図１に示すように、概略的に、試薬保管手段１０と、送液手段２０と、廃液保管手段３０と、蛍光検出手段４０とにより構成されている。
【００１７】
試薬保管手段１０は、ＤＮＡシーケンサに用いられる試薬等を保管する手段である。試薬保管手段１０は試薬カートリッジ１０１を備え、試薬カートリッジ１０１内にはプライマ試薬、ポリメラーゼ酵素、４種の蛍光色素を有するヌクレオチドを含んだ伸長試薬、保護基切断試薬、洗浄試薬、イメージング試薬等を各別に収納する複数の試薬保管容器１０２が格納されている。
【００１８】
送液手段２０は、試薬等を後述する後述するフローチップ４２内に供給すると共にフローチップ４２から排出された試薬等を後述する廃液保管手段３０に送液する手段である。送液手段２０は複数の試薬保管容器１０２の中からフローチップ４２へ供給する試薬等を選択的に切り替える切り替えバルブ２０１と、試薬等をフローチップ４２に送液する流路２０２と、フローチップ４２から排出された試薬等を廃液保管手段３０に送液する流路２０３とを備えている。また、流路２０３にはシリンジ２０４と２個の二方弁２０５、２０６が設けられ、これらを用いてフローチップ４２への試薬等の供給とフローチップ４２からの試薬等の排出とを行う。
【００１９】
廃液保管手段３０は、フローチップ４２から排出された試薬等の廃液を保管する手段である。具体的には、廃液保管手段３０は、送液手段２０の流路２０３端部から排出された廃液を受け入れる廃液タンク３０１と、廃液が廃液タンク３０１から漏れた場合の受け皿となる液受けトレイ３０２と、廃液の蒸散を防止する蓋３０３と、廃液タンク３０１の有無を監視するマイクロフォトセンサ３０４とにより構成されている。
【００２０】
蛍光検出手段４０は、照射部４１と、フローチップ４２と、蛍光検出部４３とを備えている。
【００２１】
照射部４１は、互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を試料ｓに照射する。照射部４１は、図２（ａ）に示すように、光源４１１と、放物面鏡４１２と、第１フライアイレンズ４１３と、第２フライアイレンズ４１４と、畳重レンズ４１５と、フィールドレンズ４１６と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７とを有している。
【００２２】
光源４１１は、励起用の光源である。この光源４１１は、励起光を生成するのに用いられる光を発する。光源４１１としては、通常キセノンショートアークランプが採用される。このキセノンショートアークランプはキセノンガス中での放電によって可視光領域に良好な連続スペクトルを有するので、複数の励起波長帯の光を発生させるための光源として好適な放電灯である。
【００２３】
放物面鏡４１２は、光源４１１から発せられた光を反射して平行光に変換する。第１フライアイレンズ４１３、第２フライアイレンズ４１４、畳重レンズ４１５およびフィールドレンズ４１６は、協働して放物面鏡４１２で変換された平行光を均一性を持つ平行光に変換する。ここで、畳重レンズ４１５は、第１フライアイレンズ４１３の各レンズセルの像をフィールドレンズ４１６上で重なり合わせ、第１フライアイレンズ４１３の各レンズセルの照度分布を重ね合わせることにより照度の均一化を実現している。
【００２４】
第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、光源４１１から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる。第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、具体的には、可視光に対して透明なガラス基板（不図示）と、このガラス基板上に形成された誘電体多層膜（不図示）とにより構成されている。
【００２５】
上記誘電体多層膜を構成する材料としては、例えば、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５等が挙げられる。当該誘電体多層膜は、上記材料の中から高屈折率材料と低屈折率材料とを選択し、これらを交互に１０〜４０層程度積層することで形成されている。各層の膜厚等は、当該誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を透過させる所望の波長帯に基づき適宜決定される。上記誘電体多層膜の全厚さは、通常１０μｍ程度である。上記誘電体多層膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンアシスト法、イオンプレーティング法、スパッタ法およびイオンアシステッド・イオンビームスパッタリング法が好ましく、真空蒸着法がより好ましい。上記形成方法とすることで、温度や湿度に対する良好な安定性、急峻な立ち上がり特性などの優れた光学特性を付与することができる。
【００２６】
このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を有していることで、例えば、従来から用いられている色素フィルタに比べて励起波長帯の波長範囲を峻別することができ、後述する第１の誘電体多層膜干渉フィルタにより励起光を確実に遮断して二次元検出部での蛍光検出精度を向上させることができる。
【００２７】
当該多色蛍光分析装置１では、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用い、各励起波長帯の励起光が順次試料ｓに照射される。具体的には、図７に示すように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、第１フィルタ４１７ａ、第２フィルタ４１７ｂ、第３フィルタ４１７ｃおよび第４フィルタ４１７ｄを有し、これら第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄが順次切り替えて用いられ、所定の励起波長帯の光を選択的に透過することで、透過した光を励起光として試料ｓに照射することができる。第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を構成する第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄはフィルタホイール４１８に取り付けられており、このフィルタホイール４１８が図示していない駆動装置を用いてが高速（例えば、５０ｍｓ以内に異なるフィルタに移動可能な程度の高速）に回転する。このように、各励起波長帯の励起光が順次照射されることで、各蛍光色素から発せられる蛍光を確実に識別することができる。
【００２８】
本実施形態の塩基配列の分析において好適に用いられる蛍光色素は、Ａｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５の４種である。Ａｌｅｘａ４０５はｄＣＴＰ、ＦＡＭはｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄはｄＧＴＰ、Ｃｙ５．５はｄＴＴＰにそれぞれ結合する。そのため、上記蛍光色素を励起可能な励起光を照射することで、当該蛍光色素が結合したヌクレオチド（以下、「蛍光ヌクレオチド」ともいう）から対応する蛍光が発せられ、この蛍光を検出することで塩基が解読される。このように、蛍光色素が上記色素であることで、４種のヌクレオチドを確実に識別することができ、これに対応するＤＮＡ断片中の塩基を正確に特定することができる。
【００２９】
上記４種の蛍光色素を励起させるため、第１フィルタ４１７ａの透過率は、３８０〜３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０〜３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第２フィルタ４１７ｂの透過率は、４７４〜４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４〜４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第３フィルタ４１７ｃの透過率は、５６１〜５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１〜５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第４フィルタ４１７ｄの透過率は、６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１〜６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満である。その結果、第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄの中から適当なフィルタを選択することで、３８０〜３９６ｎｍ（主としてＡｌｅｘａ４０５を励起）、４７４〜４９７ｎｍ（主としてＦＡＭを励起）、５６１〜５７５ｎｍ（主としてＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを励起）および６４１〜６５７ｎｍ（主としてＣｙ５．５を励起）の各励起波長帯の励起光を適宜得ることができる。なお、図８（ａ）〜（ｄ）において、符号６０１〜６０４は、それぞれ第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄの透過波長帯を示している。また、図８（ｅ）は、上記第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄを用いる場合の第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２（後述）の透過波長帯６０５を示している。このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が第１〜第４フィルタ４１７ａ〜４１７ｄを有し、各フィルタの透過率が上記要件を満たしていることで、上記４種の蛍光色素を効率よく励起および検出することができる。
【００３０】
なお、少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射されることも好ましい。これにより、上記励起波長帯に対応する複数の蛍光色素を同時に効率よく励起させることができ、蛍光分析を迅速に行うことができる。具体的には、用いる蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５である場合、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が単一のフィルタであり、図１０（ａ）、（ｂ）の符号７０１で示すように、この第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過率が３８０〜３９６ｎｍ、４７４〜４９７ｎｍ、５６１〜５７５ｎｍおよび６４１〜６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であることが好ましい。このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が単一のフィルタであり、かつ第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が上記複数の波長帯を透過させることで、上記４種の蛍光色素を同時により効率よく励起させることができ、蛍光分析をより迅速に行うことができる。
【００３１】
図３は、図２のフローチップの概略斜視図である。フローチップ４２は、図３に示すように、カバーガラス４２１と、スペーサ４２２と、基板４２３とを備えている。
【００３２】
カバーガラス４２１は、光透過性を有し、特に４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の可視光を透過する。カバーガラス４２１の材質としては、例えば、ガラス、石英、サファイヤ等が挙げられる。カバーガラス４２１は、フローチップ４２内の流路に試薬等の液体を注入する注入口４２１ａおよび使用済みの液体を排出する排出口４２１ｂを有している。
【００３３】
スペーサ４２２は、額縁状の周縁部を残して打ち抜き穴４２２ａが形成されている。このスペーサ４２２は、カバーガラス４２１と後述する基板４２３との間に挟み込まれ、これらと共に上記液体を試料ｓに供給する流路を形成する。スペーサ４２２は、通常ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて形成されている。スペーサ４２２の厚さは、試薬等の液体を円滑に流通させる観点から、通常３０〜１００μｍであり、好ましくは４０〜６０μｍであり、より好ましくは４５〜５５μｍである。
【００３４】
基板４２３は、試料ｓとなるＤＮＡ断片を固定する。基板４２３は、第１のファイバオプティックプレート４２４により構成されている。この第１のファイバオプティックプレート４２４は、図５（ａ）に示すように、試料ｓの少なくとも一部が当接し、励起光の照射により試料ｓから発せられた蛍光を含む光を第１の入射部４２５ａから受け入れて導光すると共に、第１の入射部４２５ａと反対側の第１の出射部４２５ｂから上記光を出射する。
【００３５】
第１のファイバオプティックプレート４２４は、光を導光する格子状に配設された多数の光ファイバ（以下、「第１の光ファイバ４２５」ともいう）と、これらの第１の光ファイバ４２５を覆い当該第１の光ファイバ４２５から漏れる光を吸収する吸収体ガラス（不図示）とから構成されている。第１の光ファイバ４２５は、図５（ｂ）に示すように、コア部４２６とこのコア部４２６を被覆するクラッド部４２７とから構成されている。これらコア部４２６およびクラッド部４２７は、それぞれコアガラスおよびクラッドガラスで形成されており、これら両ガラスは屈折率が異なっている。そのため、コア部４２６およびクラッド部４２７を構成するガラスの屈折率を適宜選択することで、両者の界面において全反射を生じさせることができ、第１の入射部４２５ａから受け入れた光を第１の光ファイバ４２５の光軸方向に導光させて第１の出射部４２５ｂに導びくことができる（図５（ａ）参照）。
【００３６】
また、各光ファイバ４２５は、第１のファイバオプティックプレート４２４の試料ｓが当接する側の面において、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面にアミノシラン処理が施され、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面以外の面にＨＭＤＳ処理（ヘキサメチルジシラザン処理）が施されている。このようにアミノシラン処理およびＨＭＤＳ処理を施されていることで、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面に形成されたアミノシランからなる膜（以下、アミノシランからなる膜が形成された領域を「スポット部」ともいう）上にＤＮＡ断片を強固に吸着させると共に、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面以外の面に形成された１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンからなる膜上へのＤＮＡ断片の吸着を抑制することができ、ＤＮＡ断片をコア部４２６端面上に選択的に固定することができる。この結果、ＤＮＡ断片から発せられた蛍光をコア部４２６端面を介して確実に取り込むことができる。なお、上記スポット部およびスポット部以外の領域の形成方法としては、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書に記載の方法を適用することができる。
【００３７】
本実施形態においては、第１の光ファイバ４２５の直径（クラッド部４２７の外径）は約１．４μｍであり、上記スポット部の直径が約０．３μｍである。このため試料ｓとなるＤＮＡ断片を適当な大きさとすることで、１本の第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面に１個のＤＮＡ断片を配置することができ、１個のＤＮＡ断片（試料ｓ）と１本の第１の光ファイバ４２５とを対応させることができる。
【００３８】
本実施形態で用いられるコアガラスおよびクラッドガラスの屈折率は、それぞれ１．８０、１．６７である。そのため、一般にシングルファイバの集光能力の指標となる開口数（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、下記式（２）を用いて０．６７と算出することができる。
【００３９】
【数２】
2016125236.tif 000004
【００４０】
上記式（２）中、ＮＡは、開口数である。ｎ２およびｎ３は、それぞれコアガラスおよびクラッドガラスの屈折率である。
【００４１】
ここで、本実施形態で用いられる試薬等の水溶液の屈折率（ｎ１）は１．３３である。そのため下記式（３）を用いて第１の入射部４２５ａにおける光の最大入射角が３０°と算出される。なお、下記式（３）中、θｍａｘは、最大入射角である。ＮＡは、上記式（２）と同義である。
【００４２】
【数３】
2016125236.tif 000005
【００４３】
そこで、本実施形態では、第１の光ファイバ４２５内に入射した光を全反射させながら導光して第１の出射部４２５ｂに到達させるためには、第１の入射部４２５ａにおける入射角（θ1）（図５（ｂ）参照）がθ1≦３０°の要件を満たす必要がある。他方、第１の入射部４２５ａにおける入射角（θ1）がθ1＞３０°の光線は、最大入射角（θｍａｘ）である３０°を超えているためにコア部４２６とクラッド部４２７との界面で全反射をすることができず、クラッド部４２７を通過して吸収体ガラスに吸収されてしまい、第１の出射部４２５ｂに到達することができない。
【００４４】
蛍光検出部４３は、図２（ａ）に示すように、第２のファイバオプティックプレート４３１と、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と、二次元検出部４３３とを備えている。
【００４５】
第２のファイバオプティックプレート４３１は、第１の出射部４２５ｂから出射した光を第２の入射部４３４ａから受け入れて導光すると共に、第２の入射部４３４ａと反対側の第２の出射部４３４ｂから上記光を出射する（図５（ａ）参照）。この第２のファイバオプティックプレート４３１は、第１のファイバオプティックプレート４２４と同様に、コア部４３５およびクラッド部４３６からなる光ファイバ（以下、「第２の光ファイバ４３４」ともいう）と、吸収体ガラス（不図示）とにより構成されている。また、図５（ａ）に示すように、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４の外径は同一であり、これら第１および第２の光ファイバ４２５、４３４どうしの光軸が一致し、かつ第１の出射部４２５ｂと第２の入射部４３４ａとが当接または近接するように配置されている。ここで、近接とは、第１の出射部４２５ｂから出射した光が漏光せずに第２の入射部４３４ａに受け入れられる範囲内で、第１の出射部４２５ｂと第２の入射部４３４ａとが離間している状態を意味する。なお、第２のファイバオプティックプレート４３１は、フローチップ４２を載置するための台座となっている。
【００４６】
なお、本実施形態では、上述したように、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４の外径が同一であるが、第２のファイバオプティックプレート４３１を構成する光ファイバ（第２の光ファイバ４３４）の外径が、第１のファイバオプティックプレート４２４を構成する光ファイバ（第１の光ファイバ４２５）の外径より小さいことも好ましい。これにより、隣接した複数の第１の光ファイバ４２５から出射される光が単一の第２の光ファイバ４３４に入射するの抑制することができ、蛍光検出における空間分解能を向上させることができる。
【００４７】
また、図１９（ｂ）に示すように、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６の直径は、第２に光ファイバ４３４のコア部４３５の直径よりも小さいことが好ましい。これにより、第１の出射部４２５ａにおける第１の光ファイバ４２５のコア部４２６から出射された光を第２の入射部４３４ａにおける第２の光ファイバ４３４のコア部４３５内に確実に伝達することができ、蛍光検出をより正確に行うことができる。
【００４８】
また、上述した第１および第２のファイバオプティックプレートとして、それぞれファイバオプティックテーパ（ＦＯＴ）を採用することもできる。図１４は、図２の蛍光検出手段における第２のファイバオプティックプレートとしてファイバオプティックテーパを採用したものの概略図である。ＦＯＴ４３７は、図１４に示すように、第２の入射部と第２の射出部との大きさが異なる第２の光ファイバを束ねたものであり、第２の入射部の像を拡大または縮小することができる。上記像の拡大率は、単純に１本の第２の光ファイバの両端面の直径の比となる。この比は、通常最大５倍程度である。なお、ＦＯＴは、第２の入射部と第２の射出部の大きさが異なるものの、第２の光ファイバの本数は同じである。
【００４９】
ＦＯＴは、例えば、円柱状のＦＯＰの中央部を加熱し、このＦＯＰの両末端に反対方向の力を加えること当該ＦＯＰの中央部を圧延する。次いで、圧延したＦＯＰの中央部を切断した後、切断面を研磨してＦＯＴの片面とすることで、二つの面の大きさが異なるＦＯＴを製造することができる。なお、ＦＯＴの光ファイバの形状は、上記圧延を制御することで、例えば円形から円形、円形から正方形、正方形から正方形、正方形から長方形など、自在に変更することができる。
【００５０】
このように、ＦＯＴは、第２の入射部と第２の射出部の大きさが異なるので、例えばイメージインテンシファイア（光増幅光学装置）など大口径を持つ撮像面を小さい撮像面を持つＣＭＯＳイメージセンサの各素子に直接カップリンングするときに用いられる。これにより、結合解像力を落とさずに明るい像を撮像素子に伝達することができる。また、第２の光ファイバの断面積が第２の出射部に向かって漸次大きくなる（図１４参照）場合、光の全反射の繰り返しに応じて第１の誘電体多層膜干渉フィルタへの入射角が小さくなる。これにより、第１の誘電体多層膜干渉フィルタへの入射角に伴う透過分光特性の短波長側へのシフト（以下、「短波長シフト」ともいう）を小さくすることができ、第２の入射部と第２の出射部とが同じ断面積である場合に比べて第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯を拡げることができる。
【００５１】
第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２は、第２の出射部４３４ｂの端面上に設けられ、蛍光の少なくとも一部を透過しかつ励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一のフィルタである。第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２は、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７と同様に、可視光に対して透明なガラス基板（不図示）と、このガラス基板上に形成された誘電体多層膜（不図示）とにより構成されている。但し、上記誘電体多層膜を構成する各層の膜厚や層数は、励起光を遮断しかつ所望の波長帯の光（蛍光の一部または全部）を透過できるように適宜決定される。これにより、励起光由来のノイズを抑制して蛍光検出をより正確に行うことができる。
【００５２】
なお、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７における各波長帯の透過性能を十分に発揮させるため、上記各フィルタへの入射角は、通常フィルタ面に対して０±５°であることが仕様として求められている。これは、上記フィルタへの入射角が増大すると、当該フィルタを透過する波長帯が短波長側にシフトするためである。この現象は下記式（４）で表される数式で表現することができる。
【００５３】
【数４】
2016125236.tif 000006
【００５４】
上記式（４）中、θは、入射角である。ｎｅｆｆは、実効的屈折率であり、それぞれのフィルタに特有の値である。λ０は、光線が入射角０°で入射するときの波長である。λ（θ）／λ０は、フィルタに入射する光線の入射角がθであるときに発生する短波長シフトの割合である。
【００５５】
上記式（４）において、フィルタの実効屈折率ｎｅｆｆを１．５とすると、例えば入射角が３０°（θ＝３０°）である場合、短波長シフトの割合（λ（θ）／λ０）は０．９４程度となる。これは、誘電体多層膜干渉フィルタを透過する波長帯が、入射角０°（θ＝０°）である場合に比べて０．０６波長（０．０６λ０）分、短波長側にシフトすることを意味する。
【００５６】
図６は、図２の蛍光検出手段において第１のファイバオプティックプレートへの蛍光の入射角をパラメータとした蛍光と励起光との関係を示す概略図である。この図は、蛍光色素としてＣｙ３を用いる場合の関係を示している。なお、符号５０３で表される特性はＣｙ３の蛍光スペクトルを示している。
【００５７】
本実施形態では、第１の光ファイバ４２５内に入射した光をコア部４２６、４３５内で全反射して伝搬させるため、最大３０°の入射角をもって第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射させる必要がある。この場合、図６（ｂ）に示すように、透過波長帯は入射角０°の光に比べて短波長側にシフトする（例えば、入射角０°での透過波長帯５０２が、入射角３０°では透過波長帯５０４に、入射角４０°では透過波長帯５０５にそれぞれシフトする）。そのため、例えば、上記入射角０°での透過波長帯５０２を有する第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を用いる場合、図６（ｃ）に示すように、上述した短波長シフトにより第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過波長帯５０１と最大入射角が３０°である第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過波長帯５０４とが重なってしまい、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２での励起光の一部透過により微弱な蛍光が強大な励起光に埋もれて上記蛍光を検出できなくなる虞がある。
【００５８】
そこで、あらかじめ上記短波長シフトを考慮して第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯を決定することが好ましい。上記両誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の関係としては、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過波長帯における光の透過率（α２）が上記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、上記式（１）で表される関係を満たすことが好ましい。
【００５９】
上記式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。
【００６０】
このように、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯が上記関係を満たすことで、短波長シフトが発生したとしても両透過波長帯が重なり合うのを防止することができ、蛍光と励起光とを確実に区別することができる。
【００６１】
ここで、所定値（α）は、０．１％であることが好ましい。このように所定値（α）を設定することで、透過光が短波長側にシフトしたとしても両透過波長帯が重なり合うのを効果的に防止することができ、蛍光と励起光とをより確実に区別することができる。
【００６２】
上記所定値（α）が０．１％であり、かつ上記式（１）の関係を満たす一例としては、例えば図６（ｄ）に示すように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の入射角０°での透過波長帯の立ち上がり波長が６００ｎｍ（符号５０６参照）であり、かつ第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７における励起光の透過波長帯の立ち下がり波長が５６０ｎｍであるものが挙げられる。
【００６３】
上記一例では、入射光が入射角０°で第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する場合、透過波長帯の立ち上がりは６００ｎｍであるが、入射光が入射角３０°である場合、上記立ち上がり波長は、上記式（１）の右辺から５６４ｎｍと算出される（ｎｅｆｆ＝１．５で計算）。ここで、励起光の透過波長帯の立ち下がり波長（λ２ｊ）を５６０ｎｍに設定した場合、上記立ち上がり波長は、上記式（１）の関係を満たすので、短波長シフトが発生した場合であっても、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯は重ならず、励起光の遮断によりＯＤ（光学濃度：Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）が６以上を維持して確実に微弱な蛍光を検出することができる。
【００６４】
なお、本実施形態では第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５である例について説明したが、本発明の多色蛍光分析装置では、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下であることが好ましい。このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）を上記範囲とすることで、短波長シフトが発生したとしても第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯が重なり合うのを効果的に防止することができ、蛍光と励起光とをさらに確実に区別することができる。上記実効屈折率としては、短波長シフトを低減する観点から、１．７以上２．２以下がより好ましく、２．０以上２．２以下がさらに好ましい。
【００６５】
また、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する光の最大入射角（θｍａｘ）は３０°であることが好ましい。このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２における最大入射角を上記値とすることで、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４で導光される光の損失を抑制することができ、蛍光をより確実に検出することができる。なお、最大入射角を上記値とすることは、導光される光の損失抑制の観点から、本実施形態のＤＮＡ断片の塩基配列の分析のように、第１の入射部４２５ａが水溶液や純水等の水を含む液体に接するような分析により有効である。上記最大入射角としては、２０°がより好ましく、１０°がさらに好ましい。
【００６６】
また、蛍光分析に用いられる蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５であり、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過率が３８０〜３９６ｎｍ、４７４〜４９７ｎｍ、５６１〜５７５ｎｍおよび６４１〜６５７ｎｍの波長において８５％以上、かつ上記波長以外の波長において０．１％未満である場合、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過率は、図１０（ｂ）に示すように、４３６〜４６２ｎｍ、５３６〜５４８ｎｍ、６２０〜６３２ｎｍおよび７１３〜８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であることが好ましい。
【００６７】
このような好適な構成は、上記Ａｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５の最大吸収波長および最大蛍光波長が、それぞれＡｌｅｘａ４０５について４０１ｎｍ、４２１ｎｍ、ＦＡＭについて４９４ｎｍ、５１８ｎｍ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄについて５９６ｎｍ、６１５ｎｍ、Ｃｙ５．５について６７５ｎｍ、６９４ｎｍである（蛍光波長については、図１０（ｃ）の符号７０４〜７０７参照）こと、並びに第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２への最大入射角が３０°である場合を考慮し、図１０（ａ）に示す第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯７０２の立ち上がり波長を長波長側に０．０６波長（０．０６λ０）分移動（符号７０３参照）させたことに基づくもである。
【００６８】
このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過率を上記波長帯とすることで、上記蛍光色素および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いた場合、例えば、入射光が最大３０°の入射角をもって第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する場合（短波長シフトが発生する場合）であっても、ＯＤ６の光学濃度で励起光を確実に遮断することができ、各蛍光色素をより確実に識別することができる。
【００６９】
その結果、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過する蛍光スペクトルは、図１１（ａ）に示すように、励起光がカットされたものとなる。なお、この図に示された蛍光スペクトルは、任意のＤＮＡ断片が上記４種の蛍光色素うちの特定種の蛍光色素を取り込む確率が２５％であって各ＤＮＡ断片に含まれる蛍光色素の数（蛍光分子数）を同数とし、かつ吸光係数、量子収率等を加味したものである。
【００７０】
二次元検出部４３３は、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に密着するように設けられ、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過した光（蛍光）を検出する。二次元検出部４３３としては、例えば、入射する光（蛍光）を検出可能な二次元光センサにより構成され、上記光（蛍光）を二次元画像として検出する。上記二次元光センサとしては、当該二次元光センサの受光面方向の同一位置での色分離ができる点から、光軸方向に波長分解能を持つ複層方式のＣＭＯＳイメージセンサが好ましい。このＣＭＯＳイメージセンサは、低価格化および小型化の観点からも好ましい。本実施形態では、空間分解能を最大限に高める目的で、ＣＭＯＳイメージセンサの画素の大きさと光ファイバの大きさ（外径）が同一となるように形成されている。なお、上記二次元光センサは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に接着剤で接合されている。
【００７１】
上記二次元光センサとしては、図９に示すように、例えば３層のセンサ（第１層センサ４３３ａ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃ）を備えている。これら各層のセンサは、検出する蛍光の波長に対応した検出感度のものが用いられる。例えば、本実施形態のような上記４種の蛍光色素を用いる場合、上記第１〜第３層センサ４３３ａ〜４３３ｃとしては、図１１（ｂ）に示すように、検出感度がそれぞれ５００ｎｍ、５８５ｎｍおよび６７５ｎｍにピークを有するものを採用することができる。
【００７２】
これら第１〜第３層センサ４３３ａ〜４３３ｃを用いて上述の図１１（ａ）に示す蛍光スペクトルを有する蛍光を検出した場合、各センサで検出される信号は表１に示す強度比となる。表１からも明らかなように、各信号の強度比として、例えば、第１層センサ４３３ａが８３％である場合はＡｌｅｘａ４０５、第１層センサ４３３ａおよび第２層センサ４３３ｂがそれぞれ４３％、４９％である場合はＦＡＭ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃがそれぞれ４６％、４６％である場合はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃがそれぞれ１４％、６６％である場合はＣｙ５．５と判定することができる。
【００７３】
【表１】
2016125236.tif 000007
【００７４】
また、上記二次元光センサとしては、図１２に示すように、例えば、４層のセンサ（第１層センサ４３３ａ’、第２層センサ４３３ｂ’、第３層センサ４３３ｃ’および第４層センサ４３３ｄ’）を備え、第１〜第４層センサ４３３ａ’〜４３３ｄ’の検出感度が、図１３（ｂ）に示すように、それぞれ４５０ｎｍ、５５０ｎｍ、６２５ｎｍおよび７２５ｎｍにピークを有するものを採用することもできる。
【００７５】
これら第１〜第４層センサ４３３ａ’〜４３３ｄ’を用いて図１３（ａ）に示す蛍光スペクトル（図１１（ａ）に示す蛍光スペクトルと同様の蛍光スペクトル）の蛍光を検出した場合、各センサで検出される信号は表２に示す強度比となる。表２からも明らかなように、各信号の強度比として、例えば、第１層センサ４３３ａ’が９８％である場合はＡｌｅｘａ４０５、第２層センサ４３３ｂ’が８３％である場合はＦＡＭ、第３層センサ４３３ｃ’が７８％である場合はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ、第４層センサ４３３ｄ’が９８％である場合はＣｙ５．５と判定することができる。
【００７６】
【表２】
2016125236.tif 000008
【００７７】
なお、蛍光検出部４３は、図２０に示すように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と二次元検出部４３３との間における隣接する画素どうしの境界部に、光を反射する光隔壁４３８を設けてもよい。これにより、二次元検出部４３３において、隣接する他の画素への光の回り込みを防止することができると共に集光効率を向上させることができ、結果として信号検出のＳ／Ｎ向上、ＤＮＡシーケンスの色分離能の向上、画素間のコンタミ低減に起因した１回の反応で検出可能な試料数の低下抑制を図ることができる。
【００７８】
光隔壁４３８としては、高反射率が得られる観点から、アルミニウム、銀、金、銅およびタングステン、並びにこれらの合金からなる薄膜が好ましく、信頼性および加工性向上の観点から、アルミニウム薄膜がより好ましい。光隔壁４３８の寸法としては、作製容易性向上の観点から、高さが５００ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であり、幅が２００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましい。このような光隔壁４３８は、例えば、ＣＶＤ法、スパッタ法等を用いて第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２上に上記材料を蒸着することで形成することができる。
【００７９】
次に、蛍光色素の種類を判定する方法について説明する。蛍光色素の種類を判定するには、まずクロストーク除去を行う。クロストーク除去は、例えば、上記表２に示すＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの場合、第１層〜第４層センサ４３３ａ’〜４３３ｄ’で検出される信号量は、それぞれ０．００、０．１１、０．７８、０．１１となる。これは、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ単色蛍光の主な成分は基本的に第３層センサ４３３ｃ’で検出できるものの、第１層センサ４３３ａ’、第２層センサ４３３ｂ’、第４層センサ４３３ｄ’でもＴｅｘａｓ  Ｒｅｄの蛍光がクロストークとして検出されてしまうということを意味している。これらの４種の蛍光色素の蛍光強度と４層のセンサ４３３ａ’〜４３３ｄ’が検出する信号量の関係は下記式（５）で表される行列式のようになる。
【００８０】
【数５】
2016125236.tif 000009
【００８１】
上記式（５）中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、それぞれ第１層センサ、第２層センサ、第３層センサおよび第４層センサが検出する信号量である。また、Ｄｙｅ１、Ｄｙｅ２、Ｄｙｅ３およびＤｙｅ４は、それぞれＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５が発する蛍光強度である。Ｗは、ｗｉｊ（ｉ＝１、２、３、４、ｊ＝１、２、３、４）を要素にもつ行列であり、上記蛍光強度と信号量とを関連づける行列である。
【００８２】
ここで、上述したクロストークを除去した蛍光強度は、Ｗの逆行列であるＷ−１を左から掛け合わせることで、下記式（６）のように求められる。
【００８３】
【数６】
2016125236.tif 000010
【００８４】
上記式（６）中、Ｄｙｅ１〜Ｄｙｅ４およびＳ１〜Ｓ４は、上記式（５）と同義である。Ｗ−１は、Ｗの逆行列である。
【００８５】
次いで得られた蛍光強度をノーマライズし、蛍光色素毎に異なる蛍光強度が等しくなるように変換する。以上のようにクロストーク除去等を行うことで、試料中に取り込まれた蛍光色素を効率よく識別することができる。
【００８６】
次に、当該多色蛍光分析装置１（ＤＮＡシーケンサ）を用いてＤＮＡシーケンスを行う方法について説明する。なお、ここで説明する多色蛍光分析装置１は、二次元光センサが４１メガの画素数を有するＣＭＯＳイメージセンサであり、このＣＭＯＳイメージセンサが光軸方向に波長分解能を有する４層のセンサ４３３ａ’〜４３３ｄ’を有しているものとする。また、基板４２３における１本の第１の光ファイバ４２５に対して試料ｓとなるＤＮＡ断片が１個のみ吸着し、かつ１本の第１の光ファイバ４２５と１本の第２の光ファイバ４３４とにより１つの光導波路が形成されていると共に、この光導波路１つに対してＣＭＯＳイメージセンサの１個の画素（図１４に示すような二次元光センサでは１つの画素群）が対応しているものとする。
【００８７】
まず、試料ｓとなるＤＮＡ断片の塩基配列を解析するためにＳＢＳ反応を基板４２３上で行う。上記反応に必要な試薬は、プライマ試薬、ポリメラーゼ酵素、４種の蛍光色素を有するヌクレオチドを含んだ伸長試薬、保護基切断試薬、洗浄試薬、イメージング試薬である。これらの試薬は、試薬カートリッジ１０１内の試薬保管容器１０２に格納されている。また、試薬カートリッジ１０１は、試薬ラック１０３に設置され、４℃に冷却されている。
【００８８】
冷却方法としては、例えば、ペルチェ素子１０４を用いてヒートブロック１０５およびヒートシンク１０６を冷却し、これらヒートシンク１０６等により冷却された空気をファン１０７で試薬ラック１０３内に送風して試薬を４℃に冷却する。なお、ペルチェ素子１０４からの排熱は、ファン１０８を用いて行う。
【００８９】
次いで、試薬ラック１０３内で４℃に冷却された試薬を流路２０２に導入する。このとき、切り替えバルブ２０１により切り替えることで、任意の試薬を流路２０２に導入することができる。流路２０２に導入された試薬は、フローチップ４２よりも下流側の流路２０３に配置されたシリンジ２０４を駆動させることで送液される。具体的には、流路２０３には２個の二方弁２０５、２０６が設置されており、シリンジ２０４に試薬等を吸引（フローチップ４２への試薬等の供給およびフローチップ４２からの使用済みの試薬等の排出）するときは、二方弁２０５を開かつ二方弁２０６を閉の状態でシリンジ２０４を駆動させる。
【００９０】
一方、シリンジ２０４内の試薬等（廃液）を廃液タンク３０１に排出するときは、二方弁２０５を閉かつ二方弁２０６を開の状態でシリンジ２０４を駆動させる。これにより、一つのシリンジ２０４で試薬の吸引および排出が可能となる。廃液となった試薬等は、廃液タンク３０１へ送液されて貯蔵される。この廃液タンク３０１は、廃液こぼれにより生じる感電、装置の錆、異臭の発生などを防止するために設けられている。廃液タンク３０１の有無はマイクロフォトセンサ３０４で監視される。
【００９１】
ここで、試薬等が供給されたフローチップ４２において行われるＳＢＳ反応について説明する。この反応方式では、フローチップ４２内に伸長試薬を送液する。この伸長試薬は、蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼを含んでいる。上記４種類の蛍光ヌクレオチドは、Ａｌｅｘａ４０５−ｄＣＴＰ、ＦＡＭ−ｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ｄＧＴＰおよびＣｙ５．５−ｄＴＴＰであり、各蛍光ヌクレオチドが上記伸長試薬中それぞれ２００ｎＭの濃度で含まれている。この伸長試薬は、伸長反応が効率よく行なわれるように、塩濃度、マグネシウム濃度およびｐＨが最適化されている。また、伸長試薬に含まれるポリメラーゼの作用により、ＤＮＡ断片内のプライマがハイブリダイズした箇所に、分析対象となる塩基に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基分だけ取り込まれる。なお、一度に２塩基分の蛍光ヌクレオチドが伸長しないのは、１塩基目の蛍光色素中に２塩基目の蛍光ヌクレオチドの伸長を阻害する部位が含まれているからである。
【００９２】
次いで、フローチップ４２内に洗浄試薬を送液する。この洗浄試薬を送液することで、フローチップ４２内に浮遊する反応に寄与しない蛍光ヌクレオチドが除去される。次いで、フローチップ４２内にメージング試薬を送液し、上記洗浄試薬を置換した後、蛍光検出を行う。蛍光検出後は、フローチップ４２内に保護基切断試薬を送液する。この保護基切断試薬を送液することで、蛍光ヌクレオチドから蛍光色素が切断され、次の伸長反応（２塩基目の蛍光ヌクレオチドの伸長反応）が可能となる。以降、上述した操作を繰り返すことで、ＤＮＡシーケンスを行うことができ、１個のＤＮＡ断片から５００塩基を超える塩基配列を解析することができる。
【００９３】
ここで、上記蛍光検出について、図２（ａ）を参照して説明する。当該多色蛍光分析装置１の蛍光検出手段において、光源から発せられた白色光は放物面鏡４１２で反射して平行光に変換される。平行光に変換された光は第１フライアイレンズ４１３により第２フライアイレンズ４１４上に光源像を結像させ、畳重レンズ４１５およびフィールドレンズ４１６を経て均一な平行光となる。この平行光は第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いて互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光に変換され（図１０（ｂ）の実線の特性参照）、試料ｓとなるＤＮＡ断片に取り込まれた４種類の蛍光ヌクレオチドをそれぞれ独立に励起する。その際、ＤＮＡ断片の塩基に相補的な蛍光ヌクレオチドが取り込まれるため、各蛍光ヌクレオチドに含まれる蛍光色素の種類に対応した蛍光が発せられる（図１０（ｃ）参照）。なお、ＤＮＡ断片から発せられる光には、上記蛍光の他に上記ＤＮＡ断片等で反射した励起光が含まれている。
【００９４】
この蛍光を含む光は上述した光導波路内を全反射しながら進行して第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に到達する。この光が第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を通過する際、当該第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過可能な波長帯の光のみが透過するため励起光は遮断され、蛍光のみが二次元検出部４３３に到達する。この二次元検出部４３３に到達した蛍光は、二次元光センサに設けられた４層のセンサ４３３ａ’〜４３３ｄ’により蛍光検出される。その際、蛍光色素の種類に応じて発せられる蛍光の波長が異なるため、第１〜第４層センサ４３３ａ’〜４３３ｄ’で検出される光の強度比の違いにより蛍光ヌクレオチドの種類を同定することができ、その結果、ＤＮＡ断片の塩基を決定することができる。
【００９５】
なお、上記方法を用いてＤＮＡシーケンスを行う場合、二次元光センサの各画素に１個のＤＮＡ断片を対応させるため、例えば、１個のＤＮＡ断片が５００塩基を有し、これを４１Ｍ画素のＣＭＯＳイメージセンサを用いて分析すると、結果として総読取塩基数は２０Ｇｂａｓｅとなる。また、１塩基あたりの取り込みに要するＳＢＳケミストリ時間を３分／ｂａｓｅ、イメージング時間を３秒とすると、５００塩基分の伸長反応を約１日で完了することができる。
【００９６】
なお、本発明は、上述した実施形態の構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【００９７】
例えば、上述の実施形態では、多色蛍光分析装置１として、試薬保管手段１０と、送液手段２０と、廃液保管手段３０と、蛍光検出手段４０とにより構成されているＤＮＡシーケンサを例示して説明したが、当該多色蛍光分析装置１はＤＮＡシーケンサ用に限定されず、例えば、試薬保管手段１０、送液手段２０および廃液保管手段３０を有していない多色蛍光分析装置も本発明が意図する範囲内である。
【００９８】
また、上述した実施形態では、励起光を得るために第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いたが、本発明の効果を損なわない限り、色素フィルタなどの他の手段を採用してもよい。
【００９９】
また、上述した実施形態では、蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＣｙ５．５の４種であるものについて説明したが、用いる蛍光色素の種類やその数は、試料に応じて適宜決定することができる。なお、互いに異なる蛍光色素が吸収するピーク波長どうしは、５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。また、互いに異なる蛍光色素が発する蛍光のピーク波長どうしは、５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
【０１００】
また、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７では、主として３８０〜３９６ｎｍ、４７４〜４９７ｎｍ、５６１〜５７５ｎｍおよび６４１〜６５７ｎｍの波長帯の光を透過するものについて説明したが、分析対象となる全ての蛍光色素を励起可能な励起光を発することができ、かつ第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２で上記励起光を遮断することができるようなものであれば、上記波長帯に限定されるものではない。なお、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を透過する互いに異なる波長帯は、それらの帯域が５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
【０１０１】
また、上述した第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２では、その透過率が４３６〜４６２ｎｍ、５３６〜５４８ｎｍ、６２０〜６３２ｎｍおよび７１３〜８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であるものを好適なフィルタとして説明したが、励起光を遮断することができれば、上記波長帯に限定されるものではない。なお、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過する互いに異なる波長帯は、それらの帯域が５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
【０１０２】
また、上述した実施形態では、二次元検出部４３３として、複数の層からなる二次元光センサについて説明したが、単一の層からなる二次元光センサを採用することもできる。このような二次元光センサとしては、例えば図１４に示すように、第２の光ファイバ４３４の１本に対して２×２画素の正方配列（例えば、ベイヤ配列など）した１つの画素群４３９が対応するように配置されたもの等が挙げられる。この場合、上記１つの画素群４３９を構成する４つの画素４３９ａ〜４３９ｄは、例えば、それぞれ図１３（ｂ）に示される第１〜第４層センサ４３３ａ’〜４３３ｄ’の波長特性と同様の波長特性を有する素子を用いることができる。上記二次元光センサとしては、例えば、公知の単板方式のカラーＣＭＯＳイメージセンサ等が採用される。
【０１０３】
また、上述した実施形態においては、光源４１１としてキセノンショートアークランプを用いた多色蛍光分析装置１について説明したが、高輝度ＬＥＤ等のＬＥＤを光源として用いてもよい。上記キセノンショートアークランプの寿命が５００〜１，０００時間であるのに対し、上記ＬＥＤの寿命は２０，０００時間超であり、多色蛍光分析装置１の生涯稼働時間を超えるので寿命に伴う光源の取り替えが不要となる。また、機械的なシャッタの不要化および低消費電力化を図ることができる。なお、このようなＬＥＤを用いる場合、キセノンショートアークランプが点光源であるのに対し、このＬＥＤは面光源であるため、図１５に示すように、平行光を得る目的で非球面レンズ４１９１が採用される。
【０１０４】
また、光源４１１としてＬＥＤを用いる場合、図１６に示すように、図１５で図示した非球面レンズ４１９１等の代替としてライトパイプ４１９２および非球面レンズ４１９３、４１９４を用いてもよい。ライトパイプ４１９２は、当該ライトパイプ４１９２の端面から入射した光を内部で全反射させることにより光を均一化する作用を有する。具体的には、例えば、ライトパイプ４１９２の光が入射する側の端面と上記ＬＥＤの発光面との間隔が１ｍｍ以内となるように近接させ、ライトパイプ４１９２の上記ＬＥＤと反対側に第１および第２の非球面レンズ４１９３、４１９４を配設する。これにより、ＬＥＤから発せられる光を効率良く集光し、かつ平行光に変換して第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７に光を導光することができる。
【０１０５】
また、上述した実施形態においては、１セットの照射部４１を備えている多色蛍光分析装置１について説明したが、複数セットの照射部を備えている多色蛍光分析装置であってもよい。具体的には、図１７（ａ）、（ｂ）に示すように、例えば、光源となるＬＥＤ４１１ａを半球面状に９個配設され、上記各ＬＥＤ４１１ａを有する９セットの照射部４１ａが設けられ、これらの照射部４１ａにより試料ｓに対して励起光を照射可能な多色蛍光分析装置１ａが挙げられる。これにより、試料ｓに照射される励起光の強度を増加させることができ、この励起光に対応した大きな強度の蛍光を得ることができる（この例では強度が９倍に増加）。なお、図２１に示すような対物レンズを用いた蛍光分析装置２では、対物レンズ２１とフローチップ２２とを０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度に接近させる必要があるため、上述のように複数セットの照射部を配設することが困難であった。
【０１０６】
また、上述した実施形態においては、照射部４１がフローチップ４２の基板４２３の板面に対して垂直方向に位置する多色蛍光分析装置１について説明したが、上記基板４２３に対して励起光を斜めに照射できるように、１セットまたは複数セットの照射部が配設されている多色蛍光分析装置であってもよい。具体的には、図１８（ａ）、（ｂ）に示すように、例えば、輪帯状にＬＥＤ４１１ｂを８個配設し、上記各ＬＥＤ４１１ｂを含む８セットの照射部４１ｂを設け、これらの照射部４１ｂにより基板４２３に対して励起光が所定の角度θ３で入射するように照射可能な多色蛍光分析装置１ｂが挙げられる。
【０１０７】
本実施形態のように多色蛍光分析装置１をＤＮＡシーケンサとして用いる場合、第１のファイバオプティックプレート４２４を構成する第１の光ファイバ４２５に入射する光線の入射角θ１がθ１≦３０°を満たす必要がある。そこで、励起光がフローチップ４２に入射する角度θ３をθ３＞３０°に限定することで、第１の光ファイバ４２５に入射する励起光が第１および第２の光ファイバ４２５、４３４内で全反射するのを抑制することができ、蛍光を確実に検出することができる。
【０１０８】
このような照明を斜光照明という。この斜光照明は特に１分子蛍光測定などに代表される微弱な蛍光の計測に有効である。ちなみに１分子の蛍光色素が発する総光子数は１０４〜１０５個である。一方、二次元光センサとして公知の高感度カメラを用いれば、バックグラウンドが十分低ければ光子を１００個受光できれば上記１分子を検出することができる。したがって、上記高感度カメラを用いることで１分子蛍光測定に必要な光子数は既に十分な数が確保されており、必要なのはバックグラウンド（背景光）の低減であることがわかる。本発明においては、励起光が背景光となる。そこで、上記多色蛍光分析装置１ｂとすることで、背景光となる励起光を除去することができ、蛍光を確実に検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することができる。したがって、当該多色蛍光分析装置は、例えば、複数の蛍光色素を同時に用いるようなＳＢＳ法を用いたＤＮＡの塩基配列分析などに好適に使用することができる。
【符号の説明】
【０１１０】
ｓ  試料
１、１ａ、１ｂ  多色蛍光分析装置
１０  試薬保管手段
２０  送液手段
３０  廃液保管手段
４０  蛍光検出手段
４１  照射部
４２  フローチップ
４３  蛍光検出部
４１１  光源
４１７  第２の誘電体多層膜干渉フィルタ
４１７ａ  第１フィルタ
４１７ｂ  第２フィルタ
４１７ｃ  第３フィルタ
４１７ｄ  第４フィルタ
４２３  基板
４２４  第１のファイバオプティックプレート
４２５  第１の光ファイバ
４２５ａ  第１の入射部
４２５ｂ  第１の出射部
４２６  コア部
４２７  クラッド部
４３１  第２のファイバオプティックプレート
４３２  誘電体多層膜干渉フィルタ（第１の誘電体多層膜干渉フィルタ）
４３３  二次元検出部
４３４  第２の光ファイバ
４３４ａ  第２の入射部
４３４ｂ  第２の出射部
４３５  コア部
４３６  クラッド部
【図１】
2016125236.tif 000012
【図２】
2016125236.tif 000013
【図３】
2016125236.tif 000014
【図４】
2016125236.tif 000015
【図５】
2016125236.tif 000016
【図６】
2016125236.tif 000017
【図７】
2016125236.tif 000018
【図８】
2016125236.tif 000019
【図９】
2016125236.tif 000020
【図１０】
2016125236.tif 000021
【図１１】
2016125236.tif 000022
【図１２】
2016125236.tif 000023
【図１３】
2016125236.tif 000024
【図１４】
2016125236.tif 000025
【図１５】
2016125236.tif 000026
【図１６】
2016125236.tif 000027
【図１７】
2016125236.tif 000028
【図１８】
2016125236.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
2016125236.tif 000031
【図２１】
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【国際調査報告】
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