(57)【要約】  本発明は、培養細胞の分化を促進し得る方法、および、この方法に好適に用いられる培養細胞分化促進剤である。培養されている細胞に、脂環構造含有重合体成形体を接触させることで、細胞の分化が誘導される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養されている細胞に、脂環構造含有重合体成形体を接触させることを特徴とする培養細胞の分化促進方法。
【請求項２】
培養されている細胞が表皮細胞である請求項１に記載の培養細胞の分化促進方法。
【請求項３】
脂環構造含有重合体成形体からなる培養細胞分化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の分化促進方法、および培養細胞分化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの万能細胞や幹細胞を利用した再生医療が注目を集めている。万能細胞や幹細胞は、分化が進んでいない未分化状態の細胞といわれる。再生医療においては、これらの未分化状態の細胞を目的の臓器、組織、細胞へと分化させ、得られた臓器、組織、細胞を用いて、患者の治療が行われる。例えば、患者の皮膚の表皮組織から採取した幹細胞を用いた皮膚の再生医療や美容行為が実現している。【０００３】
皮膚の表皮は、真皮側から皮膚表面側の方向に、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、及び角質細胞を有し、基底細胞は、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞と分化しながら上層に移行し、最終的には垢となって剥がれ落ちる。【０００４】
皮膚の再生医療においては、被験者の皮膚の最表面の表皮組織から、基底細胞や有棘細胞を採取し、これらの細胞を培養容器内で培養して層状に増殖させながら、層の最外側の細胞が、顆粒細胞に分化し、次いで角質細胞に分化するように、分化誘導処理を施す。そして、この分化誘導処理により、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞の順に層状に増殖した細胞群（培養表皮）を、被験者の皮膚に移植する。
上記の分化誘導操作において、培養容器としては、一般に、親水化処理が施されたポリスチレン製のディッシュやフラスコ等が汎用されてきた。【０００５】
表皮を構成する細胞の内、基底細胞や有棘細胞は、カルシウムの濃度が増加する環境で、顆粒細胞、角質細胞に分化することが知られている。
また、顆粒細胞が角質細胞に分化する途中において、ケラチン、インボルクリン、ロリクリン等の、角質細胞を構成するタンパク質が生合成される。したがって、培養表皮を作製する際は、培養細胞中でこれらのタンパク質が生合成されることが重要である。なお、培養細胞内でこれらのタンパク質が生合成されていることは、各タンパク質に対応するｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。【０００６】
上記のように、皮膚の再生医療技術は進歩してきたものの、従来の培養表皮の作製方法は、手間ばかりでなく、時間も要するものであったため、培養表皮が移植手術に間に合わないことがあったり、培養表皮の作製に要する手間や時間に比例して高額な費用が発生したりするという問題があった。
したがって、培養細胞の分化をより促進し得る方法が望まれていた。【０００７】
角質細胞への分化を促進する方法としては、乳酸菌の乳発酵物を用いるものが知られている。特許文献１には、乳酸菌ラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて得られた乳発酵物をヒト正常表皮細胞の培養培地に添加することにより、表皮細胞の分化マーカーであるケラチンのｍＲＮＡが増加することが開示されている。また、この乳発酵物を経口摂取することで皮膚表皮の角質化が促進されることが示されている。
しかしながら、この乳発酵物には乳酸菌が含まれるため、再生医療用の細胞を培養する際に用いる培養培地にこの乳発酵物を混入させることは現実的ではない。【０００８】
また、サクランボ抽出物を用いて、表皮細胞の分化を促進する方法が知られている。特許文献２には、サクランボ抽出物を表皮細胞に与えることにより、分化過程で重要な成分であるケラチン１０とプロフィラグリンのｍＲＮＡ産生が亢進することが示されている。しかしながら、ケラチン１０とプロフィラグリンは、表皮細胞の分化過程の初期から中期にあたる有棘細胞内で合成されるものであり、サクランボ抽出物は、角質細胞への分化を促進するものではない。また、特許文献２に記載の技術は、化粧品などの外用剤を目的とするものであり、この知見を直ちに再生医療用の表皮細胞の分化の促進に適用することは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許ＷＯ２００６／１３７５１３号（ＵＳ２０１０／０１６６８７７）
【特許文献２】特開第２０１２−１６７０４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、かかる従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、培養細胞の分化をより促進し得る方法、および培養細胞分化促進剤、を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、分化の対象である細胞を、脂環構造含有重合体と接触させながら培養すると、分化マーカーであるｍＲＮＡが増加することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
かくして本発明によれば、下記（１）〜（２）の培養細胞の分化促進方法、および（３）の培養細胞分化促進剤、が提供される。
（１）培養されている細胞に、脂環構造含有重合体成形体を接触させることを特徴とする培養細胞の分化促進方法。
（２）培養されている細胞が表皮細胞である（１）に記載の培養細胞の分化促進方法。
（３）脂環構造含有重合体成形体からなる培養細胞分化促進剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、培養細胞の分化を促進し得る方法、および、この方法に好適に用いられる培養細胞分化促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ロリクリン発現量を示すグラフである。
【図２】図２は、ＧＡＴＡ３発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に用いる細胞は、分化可能な細胞であれば特に制限されない。分化可能な細胞としては、万能細胞；間葉系幹細胞等の各種の幹細胞；各種の前駆細胞；外胚葉、中胚葉または内胚葉から分化した細胞であって、終末分化状態ではない細胞；等が挙げられる。このような分化可能な細胞として、皮膚の表皮再生のための表皮細胞は好ましい例として挙げられる。表皮細胞は、真皮に接している表皮の基底細胞、基底の皮膚表面側にある有棘細胞、有棘細胞の皮膚表面側にある顆粒細胞のいずれであってもよい。表皮細胞は、皮膚治療の対象となる患者から採取したものが好ましい。
【００１６】
細胞を培養する際には、通常、液体培地が用いられる。
液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
ｐＨ緩衝作用を示す成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
液体培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０、ＨＡＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等の各種市販品を利用することができる。
【００１７】
液体培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、タンパク質等の誘導因子、分化誘導活性を有する低分子化合物、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。これらの中でも、分化誘導するための添加剤を配合することが好ましい。
分化誘導するための添加剤としては、細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチンなどの細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝または２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内またはミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクターなどと組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
これらの添加剤は、一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１８】
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。
例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
【００１９】
本発明に用いる脂環構造含有重合体成形体は、脂環構造含有重合体を任意の形状に成形してなるものである。
脂環構造含有重合体は、主鎖及び／又は側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性などの観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましい。
【００２０】
脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造などが挙げられるが、機械的強度、耐熱性などの観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
【００２１】
脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４〜３０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは５〜１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、及び成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
【００２２】
脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
【００２３】
脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体、及び（１）〜（４）の水素化物などが挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体及びその水素化物が好ましい。
【００２４】
（１）ノルボルネン系重合体
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
【００２５】
開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体及びノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、ならびにこれらの水素化物などが挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましい。
【００２６】
ノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、
７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ−３−エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
【００２７】
ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００２８】
ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００２９】
ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
【００３０】
ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
【００３１】
（２）単環の環状オレフィン系重合体
単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンなどの、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体
環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエンなどの環状共役ジエン系単量体を１，２−又は１，４−付加重合した重合体及びその水素化物などを用いることができる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサンなどのビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体及びその水素化物；スチレン、α−メチルスチレンなどのビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；などが挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
【００３２】
脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算の重量平均分子量は、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
【００３３】
脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１１５〜２５０℃、更に好ましくは１３０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２１に基づいて測定されたものである。
【００３４】
これらの脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００重量部に対して、通常２００重量部以下、好ましくは１５０重量部以下、より好ましくは１００重量部以下である。
脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると、細胞の分化促進性が低下するため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
【００３５】
脂環構造含有重合体の成形方法は、細胞と接触させる際に用いる脂環構造含有重合体成形体の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
こうして得られる成形体が、本発明の培養細胞分化促進剤である。
【００３６】
脂環構造含有重合体成形体の形状に格別な制限はなく、板状、粉状、粒状、紐状、シート状、その他いかなる形状であってもよい。また、その表面は平らであっても、凹凸形状を有していてもよいし、中空状の成形体であってもよい。また異なる形状の成形体を、接着剤等を介して又は介さずに組み合わせて別の成形体にすることもできる。
また、細胞と接触することができる限りにおいて、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどの培養容器；攪拌翼、攪拌子、バッフル、連結チューブなど培養装置の部品；ピペット、攪拌素子、フィルタ、セルスクレイパーなどの培養操作に用いる培養器具；等の一部又は全部を構成する部材であってもよい。
本発明の方法において、培養中の細胞は、それが接着型細胞であっても、浮遊細胞であっても、培地中に浮遊状態で生存する傾向がある。従って、脂環構造含有重合体成形体と細胞との接触方法の選択肢は広い。
【００３７】
本発明においては、成形体を培養細胞と接触させるに当たり、成形体を滅菌処理することが好ましい。滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。
また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理など培養容器に対して一般的に施す、滅菌目的以外の処理を行うこともできる。
【００３８】
培養細胞と本発明の培養細胞分化促進剤である脂環構造含有重合体成形体とを接触させる方法は、培養細胞分化促進剤の形状に応じて任意の方法を採用すればよい。例えば、細胞分化促進剤である脂環構造含有重合体成形体を混合した培地中で細胞を培養する方法；脂環構造含有重合体を用いて成形された培養容器内で細胞を培養する方法；脂環構造含有重合体を用いて成形された培養器具を用いて培養操作を行う方法；などが挙げられ、これらを組み合わせることもできる。
なお、細胞には、情報伝達能があるため、培養中の全ての培養細胞が脂環構造含有重合体成形体に接触する必要はなく、また、培養期間全体に渡って両者が接触している必要もない。但し、接触による効果は経時的に低下するため、接触時間は長い方が好ましい。
培養細胞と、脂環構造含有重合体成形体との接触温度は細胞が増殖できる温度であれば特に制限されない。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔製造例１〕
脂環構造含有重合体〔ノルボルネン系重合体（日本ゼオン社製、「ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ」；ノルボルネン系開環重合体水素化物）〕を用いた培養器具として、底面直径が３ｃｍの培養用ディッシュ（以下、「７９０Ｒ製ディッシュ」という）を以下の方法により作製した。
まず、射出成形法によりディッシュを成形した後、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）を用いたガス法により、７９０Ｒ製ディッシュの滅菌処理を行った。【００４０】
〔実施例１〕
ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製の３次元皮膚再生キットに用いられているヒト表皮角化細胞（ヒト表皮モデル作製用）を１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で、７９０Ｒ製ディッシュに蒔種して、ＣＯ２インキュベータ内で６日間培養を行った。以下、この試料を、「７９０Ｒ製ディッシュ試料」という。【００４１】
〔比較例１〕
実施例１において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、コーニング社製の細胞培養用ディッシュ〔ファルコン（登録商標）（型番３５３００１〕）（以下、「ポリスチレン製ディッシュ」という）を用いたことを除き、実施例１と同様にして、細胞を培養した。以下、この試料を、「ポリスチレン製ディッシュ試料」という。【００４２】
〔比較例２〕
実施例１、比較例１と同時に、分化誘導を以下の条件で施して細胞の培養を行った。
まず、表皮細胞を１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で、ポリスチレン製ディシュに蒔種して、ＣＯ２インキュベータ内で、上述の培養試料と並行して培養を開始し、培養経過１日目に、カルシウム剤として、塩化カルシウムを添加し、さらに５日間培養を行った。この試料を、「カルシウム添加ポリスチレン製ディシュ試料」という。【００４３】
〔細胞の分化状態の評価〕
実施例１、比較例１、２において、細胞の分化状態を評価するために、細胞内に発現している分化マーカーの分析を以下のように行った。分化マーカーとしては、表皮細胞の終末分化状態の細胞である角質細胞の構成タンパク質であるロリクリンを指標とした。【００４４】
培養期間経過後に、各試料から細胞を回収して、細胞内に含まれるロリクリンｍＲＮＡの量を以下のようにＲｅａｌ  ＴｉｍｅＰＣＲ法により定量した。内部標準としては、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを用いた。
細胞からのＲＮＡ抽出は、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ＲＮＡ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｋｉｔ  Ｓ（クラボウ社製）を用いた。ＲＮＡからＤＮＡへの変換は、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いる逆転写反応により行った。逆転写反応で調製したＤＮＡを鋳型としたＲｅａｌ  ＴｉｍｅＰＣＲは、ＰＣＲ−ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ社製）システムを用いて行った。【００４５】
培養実験は２回繰り返して、ロリクリンｍＲＮＡの発現量の平均値を用いて、カルシウム添加ポリスチレン製ディシュ試料（比較例２）のロリクリンｍＲＮＡ量を１．０とした場合の、７９０Ｒ製ディシュ試料（実施例１）のロリクリンｍＲＮＡの値とポリスチレン製ディッシュ試料（比較例１）のロリクリンｍＲＮＡの値を求めた。結果を表１に示す。【００４６】
【表１】
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【００４７】
比較例１と２の比較から、カルシウム剤を添加することで細胞の分化が促され、ロリクリンｍＲＮＡ量が大幅に増加することが分かる。
一方、７９０Ｒ製ディッシュ試料（実施例１）では、細胞の分化を促すカルシウム剤を添加していないが、そのロリクリンｍＲＮＡは、カルシウム剤を添加したスチレン製ディッシュ試料（比較例２）のロリクリンｍＲＮＡ量と同量以上になることから、脂環構造含有重合体成形体を接触させることで、培養細胞の分化が促進されることが分かる。【００４８】
〔実施例２〕
カルシウム剤存在下で細胞を培養する場合における、本発明の培養器具（培養細胞分化促進剤）の効果を評価するために、培養開始１日目に培地にカルシウム剤を添加したこと以外は、実施例１と同様にして細胞を培養し、分化マーカーのロリクリンのｍＲＮＡの発現量を定量した。
その結果、カルシウム添加ポリスチレン製ディシュ試料（比較例２）のロリクリンｍＲＮＡ量を１．０とした場合の、カルシウム添加７９０Ｒ製ディッシュ試料（実施例２）のロリクリンｍＲＮＡ量は２．３７９であり、実施例２において、ロリクリンｍＲＮＡ量が飛躍的に増加していることが分かった。【００４９】
これらの結果から、細胞が脂環構造含有重合体成形体に接触することで、分化するために必要な細胞内成分が、従来の方法よりも多く分泌させることができるため、分化誘導操作に必要な時間を短縮できることが期待できる。
また、ロリクリンは、角質層の主要な構成要素であり、角質細胞と脂質の多層構造を維持する役割を担う。ロリクリンが十分に発現すれば、表皮はよりきめ細やかになることが期待される。【００５０】
〔製造例２〜１１〕
製造例１において、ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒに代えて、三井化学社製「アペル（登録商標）ＡＰＬ６０１３Ｔ」（ノルボルネン系重合体）、ポリプラスチックス社製「トパス（登録商標）６０１３」（ノルボルネン系重合体）、ＪＳＲ社製「アートン（登録商標）Ｄ４５４０」（ノルボルネン系重合体）、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を用いたこと以外は、製造例１と同様にして底面直径が３ｃｍの培養用ディッシュを作製した。得られたディッシュを、それぞれ「アペル製ディッシュ」、「トパス製ディッシュ」、「アートン製ディッシュ」、「ポリカーボネート製ディッシュ」、「ＰＭＭＡ製ディッシュ」、「ポリスチレン製ディッシュ」、「ポリエチレン製ディッシュ」、「ポリプロピレン製ディッシュ」、「ＰＥＴ製ディッシュ」という。
また、ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ製のディッシュにプラズマ処理を施して、プラズマ表面処理済み７９０Ｒ製ディッシュを作製した。【００５１】
〔実施例３〕
７９０Ｒ製ディッシュに、ヒト表皮角化細胞（ヒト表皮モデル作製用）を、細胞密度１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し（試料繰り返しＮ＝１）、３７℃で６日間、５％ＣＯ２雰囲気で培養を行った。【００５２】
〔実施例４〜７〕
実施例３において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、それぞれ、プラズマ表面処理済み７９０Ｒ製ディッシュ、アペル製ディッシュ、トパス製ディッシュ、アートン製ディッシュを用いたこと以外は、実施例３と同様にして細胞培養を行った。【００５３】
〔比較例３〜９〕
実施例３において、７９０Ｒ製ディッシュに代えて、それぞれ、ベクトンデッキンソン社製ディッシュ〔ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）、ポリスチレン製ディッシュ、プラズマ処理品〕、ポリカーボネート製ディッシュ、ＰＭＭＡ製ディッシュ、ポリスチレン製ディッシュ、ポリエチレン製ディッシュ、ポリプロピレン製ディッシュ、ＰＥＴ製ディッシュを用いたこと以外は、実施例３と同様にして細胞培養を行った。【００５４】
実施例３〜７、比較例３〜９において、実施例１と同様の方法により、細胞からのＲＮＡ抽出、ＲＮＡからＤＮＡへの変換、ｍＲＮＡの発現の分析を行った。
なお、定量対象の遺伝子は、ロリクリン遺伝子とし、内部標準の遺伝子としてはＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、ロリクリン遺伝子の増幅信号を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅信号で除することにより標準化した。
比較例３のＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュで培養した細胞試料でのロリクリン遺伝子の発現量を１としたときの、各例におけるロリクリン遺伝子の発現量を図１に示す。
この結果から、ゼオネックス（登録商標）７９０Ｒ以外の脂環構造含有重合体製のディッシュでも、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュに比べ、約６倍のロリクリン遺伝子が発現している一方、脂環構造含有重合体以外の材料から得られたディッシュでの発現量は、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュに比べ、せいぜい２倍から３倍であり、脂環構造含有重合体は、角化細胞の分化誘導を促進する効果があることが分かる。【００５５】
角化細胞への分化誘導を行う培養条件での角化細胞における分化誘導遺伝子の発現状態の差異を評価するため、実施例３〜７、比較例３〜９で培養した細胞を用いて、角化細胞への分化を進める遺伝子であるＧＡＴＡ３の発現の差異を比較した。
定量対象の遺伝子は、ＧＡＴＡ３遺伝子とし、内部標準の遺伝子としてはＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、ＧＡＴＡ３遺伝子の増幅信号を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅信号で除することにより標準化した。
比較例３のＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュで培養した細胞試料でのＧＡＴＡ３遺伝子の発現量を１としたときの、各例におけるＧＡＴＡ遺伝子の発現量を図２に示す。
この結果から、ポリカーボネート製ディッシュ、ＰＭＭＡ製ディッシュ、及びポリプロピレン製ディッシュを用いた場合の発現量は、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュのものと同等であり、ポリスチレン製ディッシュ、ポリエチレン製ディッシュ、及びＰＥＴ製ディッシュを用いた場合の発現量は、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュよりも少なく、分化誘導が抑制されていることが分かる。
一方、脂環構造含有重合体製のディッシュでは、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュに比べ、１．３〜１．５倍のＧＡＴＡ３遺伝子が発現している。
７９０製ディッシュについては、プラズマ表面処理の有無に依らず、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）ディッシュに比較して、１．３倍以上のＧＡＴＡ３遺伝子が増加していることから、脂環構造含有重合体は、角化細胞の分化誘導を促進する効果があることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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