(57)【要約】  RNautophagy/DNautophagyにより、リソソーム内への標的核酸の取り込みを促進して、異常核酸の分解を誘導するタンパク質を同定し、またそれコードする遺伝子を包含する発現ベクターを開発する。そして、それを抗ウイルス剤やリピート伸長病等の治療剤の有効成分として提供する。  SIDT2タンパク質、その活性変異体、又はそれらの活性断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で包含する発現ベクターを異常核酸分解誘導剤として提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はリソソームへの核酸輸送活性を有するその断片、をコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で包含する発現ベクターからなる異常核酸分解誘導剤。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を含む、請求項１に記載の異常核酸分解誘導剤。
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列に対して80％以上の同一性を有する塩基配列、及び
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列に対して高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項３】
前記発現ベクターが過剰発現ベクター、構成的発現ベクター、部位特異的発現ベクター又は誘導性発現ベクターである、請求項１又は２に記載の異常核酸分解誘導剤。
【請求項４】
前記異常核酸がウイルス核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の異常核酸分解誘導剤。
【請求項５】
前記異常核酸がリピート配列を含むRNAである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の異常核酸分解誘導剤。
【請求項６】
前記リピート配列がトリプレットリピート配列又はヘキサヌクレオチドリピート配列である、請求項５に記載の異常核酸分解誘導剤。
【請求項７】
請求項４に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分とする抗ウイルス剤。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分とするリピート伸長病治療剤。
【請求項９】
前記リピート伸長病が筋強直性ジストロフィー、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、球脊髄性筋委縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症、前頭側頭葉変性症又は筋委縮性側索硬化症である、請求項８に記載のリピート伸長病治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的とする異常核酸のリソソームへの取り込み及び分解を誘導することのできる異常核酸分解誘導剤、及びそれを有効成分とする抗ウイルス剤又はリピート伸長病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソームは、内部に多彩な加水分解酵素を有しているオルガネラであり、タンパク質、核酸、脂質、糖質など多種の生体高分子を分解することができることから細胞内分解の中心的な役割を果たしている。細胞質中の生体高分子やオルガネラをリソソームで分解するシステムは、総称してオートファジー（autophagy）と呼ばれている。【０００３】
本発明者らは、近年、リソソームがRNA及びDNA等の核酸をATP依存的に直接取り込み、分解する現象を発見し、それぞれRNautophagy及びDNautophagyと命名した（非特許文献１及び２）。また、本発明者らは、リソソーム膜上に存在する一回膜貫通型タンパク質LAMP2CをRNautophagy／DNautophagyシステムにおけるRNA/DNA受容体の１つとして同定した。LAMP2Cタンパク質は、RNA又はDNA中のG（グアニン）塩基の連続配列を少なくとも認識して結合することができる。このLAMP2Cタンパク質の塩基配列選択性により、RNautophagy／DNautophagyシステムは、少なくともGリッチ配列を有する核酸を標的としてリソソームに取り込むことが明らかとなった（非特許文献１〜３）。【０００４】
LAMP2Cは、神経細胞で非常に高く発現していることから、上記RNautophagy／DNautophagyシステムは、主に神経細胞で機能していることが示唆された（非特許文献１）。様々な神経変性疾患では、タンパク質やRNAの異常な発現又は蓄積が、病態や病因と関与することが多数報告されている。それ故に、もしもRNautophagy／DNautophagyシステムが神経細胞内における構成成分の分解メカニズムに関与し、神経細胞の恒常性維持や神経変性疾患の予防において寄与しているのであれば、RNautophagy／DNautophagyシステムを促進して原因タンパク質をコードする核酸を分解することによって神経変性疾患を効果的に治療できる。【０００５】
また、現在、病原性細菌に対しては有用な抗生物質が数多く開発されているが、病原性ウイルスに対する効果的な医薬品の種類は極めて限られている。一方で、ウイルスは、ウイルスゲノムが存在しなければ、たとえ感染しても複製ができないことから、その病原性も発揮できない。RNautophagy／DNautophagyシステムが細胞質中に侵入したウイルスゲノム等のウイルス由来の核酸を標的核酸として認識し、分解することができれば、当該システムを促進する因子は抗ウイルス剤にもなり得る。【０００６】
ところが、単にLAMP2Cを過剰発現させてもRNautophagy/DNautophagyシステムを強く促進させることはできない。これはRNautophagy/DNautophagyシステムにおいて標的核酸をリソソーム内に取り込む輸送体の発現量が律速となっていることが原因と考えられる。それ故に、輸送体を過剰発現することができれば、RNautophagy/DNautophagyシステムを効率良く促進させることができると予想された。しかし、これまでRNautophagy/DNautophagyシステムにおける輸送体の実体は明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (3):403-409.
【非特許文献２】Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (8):1167-1171.
【非特許文献３】Hase K., et al., 2015, Nucl. Acid Res. 43(13):6439-6449.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、RNautophagy/DNautophagyにおいて、リソソーム内への標的核酸の取り込みを促進し、標的核酸の分解を誘導できる輸送体タンパク質を同定し、それをコードする遺伝子を包含する発現ベクターを開発し、異常核酸分解誘導剤として提供すること、及びその異常核酸分解誘導剤を有効成分とする抗ウイルス剤やリピート伸長病治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、核酸をリソソーム内に輸送する分子の探索を行った。その結果、SIDT2（Systemic RNA Interference Deficient Transmenbrane 2）遺伝子を細胞内で発現させたときに、その細胞由来のリソソームによる核酸の取り込みが有意に増加し、また同時に該リソソーム内に取り込まれたRNAの分解量も増加することを見出した。SIDT2タンパク質は、SID-1膜貫通ファミリーに属する複数回膜貫通型タンパク質である。SID-1タンパク質は、線虫Caenorhabditis elegansの細胞膜に存在するRNAチャネルであり、哺乳類ではSIDT1タンパク質とSIDT2タンパク質の2種類のオルソログが存在する。SIDT1タンパク質は、免疫細胞の一つである樹状細胞で発現し、SID-1タンパク質と同様に細胞膜に存在する双方向RNAチャネルであることが知られている。一方、SIDT2タンパク質は、主にリソソームに局在することは知られていたが、その機能は全く不明であった。今回、本発明者らは、SIDT2タンパク質がRNautophagy/DNautophagyシステムにおいてリソソーム膜上でのRNA及び／又はDNAの取り込みに関与する輸送体タンパク質として機能することを初めて明らかにした。本発明は、当該知見に基づくものであって以下を提供する。【００１０】
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はリソソームへの核酸輸送活性を有するその断片、をコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で包含する発現ベクターからなる異常核酸分解誘導剤。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００１１】
（２）前記ポリヌクレオチドが以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を含む、（１）に記載の異常核酸分解誘導剤。
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列に対して80％以上の同一性を有する塩基配列、及び
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列に対して高ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列【００１２】
（３）前記発現ベクターが過剰発現ベクター、構成的発現ベクター、部位特異的発現ベクター又は誘導性発現ベクターである、（１）又は（２）に記載の異常核酸分解誘導剤。【００１３】
（４）前記異常核酸がウイルス核酸である、（１）〜（３）のいずれかに記載の異常核酸分解誘導剤。【００１４】
（５）前記異常核酸がリピート配列を含むRNAである、（１）〜（３）のいずれかに記載の異常核酸分解誘導剤。【００１５】
（６）前記リピート配列がトリプレットリピート配列又はヘキサヌクレオチドリピート配列である、（５）に記載の異常核酸分解誘導剤。【００１６】
（７）（４）に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分とする抗ウイルス剤。【００１７】
（８）（５）又は（６）に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分とするリピート伸長病治療剤。【００１８】
（９）前記リピート伸長病が筋強直性ジストロフィー、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、球脊髄性筋委縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症、前頭側頭葉変性症、又は筋委縮性側索硬化症である、（８）に記載のリピート伸長病治療剤。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-209340号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の異常核酸分解誘導剤は、RNautophagy/DNautophagyにおいて、リソソーム内への異常核酸の取り込み、及びリソソーム内での異常核酸の分解を誘導することができる。また、本発明の抗ウイルス剤やリピート伸長病等の治療剤を有効成分として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】SIDT2遺伝子の過剰発現によるRNA及びDNAのリソソームへの取り込み効果を示す図である。本発明の異常核酸分解誘導剤であるSIDT2過剰発現ベクターで処理したNeuro2a細胞由来の単離リソソームを用いたRNautophagy/DNautophagyアッセイの結果を示す。AはRNAの、またBはDNAの、取り込み結果である。
【図２】SIDT2遺伝子のノックダウンによるRNA及びDNAのリソソームへの取り込み効果を示す図である。AはhSIDT2 siRNAでノックダウンしたHeLa細胞（SIDT2 KD細胞）とコントロールsiRNA（EGFP siRNA）で処理したHeLa細胞（Cont細胞）由来のSIDT2タンパク質を免疫ブロッティングで検出して、定量化した後の、Cont細胞に対するSIDT2 KD細胞のSIDT2タンパク質量の相対値を示す。B及びCは、SIDT2遺伝子をノックダウンしたHeLa細胞由来の単離リソソームによるRNautophagy/DNautophagyアッセイの結果を示す。BはRNA、またCはDNAの取り込み結果である。
【図３】RNA分解率を示す図である。Aは本発明の異常核酸分解誘導剤であるSIDT2発現ベクターで処理し、SIDT2遺伝子を過剰発現したNeuro2a細胞由来の単離リソソームによるRNautophagy/DNautophagyアッセイの結果を示す。BはSIDT2発現ベクターで処理し、SIDT2遺伝子を過剰発現したNeuro2a細胞及びコントロール細胞由来のリソソームを破壊して、その溶解液を含むそれぞれの溶液中のRNA分解率を示す図である。図中の「***」はp<0.01を、また「n.s.」は有意差がないことを示す。
【図４】SIDT2遺伝子のノックダウンによるリソソーム中におけるRNA分解率を示す図である。図中の「***」はp<0.01を示す。
【図５】Ａは、実施例５で使用したウイルス核酸アナログであるpoly(I:C)のヌクレオチド配列を示す。Ｂ及びＣは、アガロースゲル電気泳動の結果で、poly(I:C)ヌクレオチドに相当する位置のバンドを示している。Ｂは、プルダウン法によるpoly(I:C)とLAMP2Cとの結合の結果を、そしてＣは、poly(I:C)のリソソームへの取り込みの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．異常核酸分解誘導剤
１−１．概要と定義
本発明の第１の発明は、異常核酸分解誘導剤である。本発明の異常核酸分解誘導剤は、SIDT2発現ベクターで構成され、細胞内の異常核酸のリソソーム分解を誘導することができる。
【００２３】
本発明において「異常核酸分解誘導剤」とは、細胞RNautophagy/DNautophagyシステムを介して、細胞中に存在する異常核酸のリソソームへの取り込みを促進して該異常核酸のリソソーム内での分解を誘導する薬剤をいう。
【００２４】
本発明において「異常核酸」とは異常核酸分解誘導剤の標的となる核酸であって、RNautophagy/DNautophagyシステムにおいて核酸結合レセプターとして機能するLANP2Cに認識され、結合するDNA又はRNAをいう。LANP2Cの細胞質側とDNA又はRNAの結合には配列親和性が見られ、この配列親和性がRNautophagy/DNautophagyシステムにおけるDNA又はRNAのリソソームへの取り込みの選択性と強く関連している（Hase K., et al., 2015, Nucl. Acid Res. 43(13):6439-6449）。一般に、LANP2C細胞質側は、Gリッチな配列、例えば、G（グアノシン）又はdG（デオキシグアノシン）を含む3塩基のRNA又はDNAの繰り返し配列、G又はdGを少なくとも連続して4以上、好ましくは5、6、又は7以上含むポリG又はポリdG配列を含んでなる単位配列の繰り返し配列、又はI（イノシン）又はdI（デオキシイノシン）を少なくとも連続して3以上、4以上又は5以上含むポリI又はポリdI配列を含む配列と高い結合性を有する。そのような塩基配列を有する具体例として、ウイルスゲノム又はウイルスゲノム由来の核酸（ウイルスRNA及びウイルスDNA)、3塩基の繰り返し配列（トリプレットリピート配列）を含むRNA、及びGGGGCCリピート配列を含むRNAが該当する。ウイルスゲノム由来の核酸には、I（イノシン）又はdI（デオキシイノシン）を含むRNA又はDNAが挙げられる。トリプレットリピート配列を含むRNAには、例えば、後述するトリプレットリピート病等の原因遺伝子の転写産物が挙げられる。また、GGGGCCリピート配列を含むRNAには、家族性の前頭側頭葉変性症及び筋萎縮性側索硬化症（ALS）の原因として知られるC9orf72遺伝子の転写産物が挙げられる。
【００２５】
１−２．構成
本発明の異常核酸分解誘導剤は、SIDT2タンパク質、その活性変異体、又はそれらの活性断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で包含する発現ベクターからなる。
【００２６】
（１）SIDT2タンパク質
SIDT2タンパク質には、例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列で示すポリペプチドからなるヒトSIDT2タンパク質が挙げられる。その他、RNautophagy/DNautophagyシステムにおいてヒトSIDT2タンパクと同様のRNA及び／又はDNAの取り込み活性を有する他生物種由来のSIDT2タンパク質オルソログも含まれる。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列からなり、ヒトSIDT2タンパク質と95.4％のアミノ酸同一性を有するマウス由来のSIDT2タンパク質、及び配列番号９に示すアミノ酸配列からなり、ヒトSIDT2タンパク質と91.3％のアミノ酸同一性を有するイヌ由来のSIDT2タンパク質等が挙げられる。
【００２７】
（２）SIDT2タンパク質の活性変異体
「SIDT2タンパク質の活性変異体」とは、前記SIDT2タンパク質の変異型タンパク質であって、RNautophagy/DNautophagyシステムにおいてSIDT2タンパクと同様のRNA及び／又はDNAの取り込み活性を有するポリペプチドをいう。例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１で示すアミノ酸配列に対して90％以上、95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。本明細書において「アミノ酸同一性」とは、二つのポリペプチドのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じて、いずれかのアミノ酸配列にギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、一方のポリペプチドの全アミノ酸数に対する他方のポリペプチドの同一アミノ酸の割合（％）をいう。％同一性は、相同性検索プログラムBLAST（Basic local alignment search tool；Altschul, S. F. et al，J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索等の公知のプログラムを用いて容易に決定できる。本明細書において「複数個のアミノ酸」とは、2〜60個、2〜45個、2〜30個、2〜14個、2〜10個、例えば、2〜8個、2〜6個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個のアミノ酸をいう。
【００２８】
（３）SIDT2タンパク質及びその活性変異体の活性断片
「SIDT2タンパク質及びその活性変異体の活性断片」とは、前記SIDT2タンパク質又はSIDT2タンパク質の活性変異体の一部であって、RNautophagy/DNautophagyシステムにおいてSIDT2タンパクと同様のRNA及び／又はDNAの取り込み活性を保持しているペプチド断片をいう。活性断片のアミノ酸長は、特に限定はしない。
【００２９】
（４）SIDT2遺伝子等
SIDT2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、SIDT2遺伝子と同義であり、原則としてDNAで構成される。SIDT2遺伝子には、例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるSIDT2タンパク質をコードする配列番号２で示す塩基配列からなるヒトSIDT2遺伝子が挙げられる。その他、配列番号７に示すアミノ酸配列からマウスSIDT2タンパク質をコードする配列番号８で示す塩基配列からなるマウスSIDT2遺伝子、そして配列番号９に示すアミノ酸配列からイヌSIDT2タンパク質をコードする配列番号１０で示す塩基配列からなるイヌSIDT2遺伝子も含まれる。
【００３０】
SIDT2タンパク質の活性変異体をコードするポリヌクレオチド、すなわち活性変異型SIDT2遺伝子には、例えば、配列番号２で示す塩基配列からなるヒトSIDT2遺伝子の変異型遺伝子が挙げられる。例えば、配列番号２で示す塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号２で示す塩基配列に対して95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の塩基同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号２で示す塩基配列からなるSIDT2遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸断片と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるポリヌクレオチドを包含する。本明細書において「塩基同一性」とは、二つのポリヌクレオチドの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じて、いずれかの塩基配列にギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、一方のポリヌクレオチドの全塩基数に対する他方のポリヌクレオチドの同一塩基の割合（％）をいう。％同一性は、相同性検索プログラムBLAST（Basic local alignment search tool；Altschul, S. F. et al，J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索等の公知のプログラムを用いて容易に決定できる。本明細書において「複数個の塩基」とは、2〜60個、2〜45個、2〜30個、2〜14個、2〜10個、例えば、2〜8個、2〜6個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個の塩基をいう。また、本明細書において「高ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない、高温かつ低塩濃度の条件をいう。例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、60℃〜68℃で1×SSC以下、好ましくは65℃〜70℃で0.1×SSC以下の条件をいう。
【００３１】
（５）発現ベクター
本明細書で「発現ベクター」とは、SIDT2遺伝子、活性変異型SID2遺伝子又はそれらの断片（以下、本明細書ではしばしば「SIDT2遺伝子等」と表記する）を発現可能な状態で包含し、SIDT2遺伝子等の発現を誘導できる発現系単位をいう。本発明の異常核酸分解誘導剤を構成する発現ベクターには、後述するプロモーターの種類によって、過剰発現ベクター、構成的発現ベクター、部位特異的発現ベクター又は誘導性発現ベクターが挙げられる。いずれの発現ベクターであってもよいが、特に好ましくは過剰発現ベクター又は構成的発現ベクターである。また、本明細書において「発現可能な状態」とは、所定条件下でSIDT2遺伝子等が宿主細胞内で転写され得る状態をいう。例えば、プロモーターとターミネーターの制御下にSIDT2遺伝子等を配置した状態が該当する。
【００３２】
発現ベクターは、遺伝子発現制御に必要な制御エレメントを必要に応じて含むことができる。制御エレメントには、前述の必須エレメントであるプロモーターとターミネーターの他、エンハンサーやポリA付加シグナルが挙げられる。
【００３３】
プロモーターは、宿主細胞内で作動可能でなければならない。通常は、宿主生物種又はその近縁種由来のプロモーターが好ましい。例えば、宿主がヒトであれば、プロモーターは、ヒト由来であることが好ましい。プロモーターには、発現パターンに応じて、過剰発現型プロモーター、継続的に、かつユビキタスに制御することのできる構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、又は誘導性プロモーター等が知られている。本発明の異常核酸分解誘導剤における発現ベクターには、いずれのプロモーターも使用することができる。ただし、部位特異的プロモーターであれば、異常核酸が存在又は発現する部位で特異的に発現を制御するプロモーターを使用する。
【００３４】
ターミネーターは、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターであり、より好ましくはプロモーターが由来する生物種のゲノム上で、そのプロモーターと組となっているターミネーターである。
【００３５】
発現ベクターは、必要に応じて、宿主細胞内に送達されたことを確認するための選抜又は標識マーカー遺伝子を含むこともできる。標識若しくは選抜マーカー遺伝子には、例えば、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、GUS、又はGFP）、又は酵素遺伝子が挙げられる。
【００３６】
発現用ベクターの種類は、本発明の異常核酸分解誘導剤を適用する宿主細胞内で複製及び発現が可能なプラスミド又はウイルスであれば、特に限定はしない。例えば、適用する宿主がヒトの場合には、アデノ随伴ウイルス（AAV)、アデノウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、センダイウイルス等のウイルスを使用することができる。この他、各ライフサイエンスメーカーから市販されている各種宿主用発現ベクターを利用することもできる。
【００３７】
２．抗ウイルス剤
２−１．概要
本発明の第２の発明は、抗ウイルス剤である。本発明の抗ウイルス剤は、第１の発明の異常核酸分解誘導剤を有効成分とし、異常核酸であるウイルスゲノム又はウイルスゲノム由来の核酸のリソソーム内への取り込みを誘導することによってウイルス感染を予防又は治療することができる。
【００３８】
２−２．構成
２−２−１．有効成分
本発明の抗ウイルス剤は、前記第１の発明に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分として包含する。抗ウイルス剤は、異なる異常核酸分解誘導剤を二以上含むことができる。
【００３９】
抗ウイルス剤に含まれる前記異常核酸分解誘導剤の量（含有量）は、標的ウイルスの種類、抗ウイルス剤の剤形、抗ウイルス剤の投与量、並びに後述する担体の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。通常は、単回投与量の抗ウイルス剤に有効量の異常核酸分解誘導剤が包含されるように調整する。「有効量」とは、異常核酸分解誘導剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。最終的には医師、獣医師又は薬剤師等の判断によって決定される。
【００４０】
本明細書において「被験体」とは、抗ウイルス剤の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、愛玩動物（イヌ、ネコ等）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等）等が該当する。好ましくはヒトである。「被験体の情報」とは、抗ウイルス剤を適用する生体の様々な個体情報である。例えば、被験体がヒトであれば、年齢、体重、性別、食生活、健康状態、疾患の進行度や重症度、薬剤感受性、併用薬物の有無等を含む。
【００４１】
２−２−２．担体
本発明の抗ウイルス剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
【００４２】
溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【００４３】
賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４５】
崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
【００４６】
充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。
【００４７】
乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
【００４８】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。
【００４９】
上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。
【００５０】
上記担体は、有効成分である異常核酸分解誘導剤の生体内での酵素等による分解を回避又は抑制する他、製剤化や投与方法を容易にし、剤形及び薬効を維持するために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
【００５１】
２−２−３．剤形
本発明の抗ウイルス剤の剤形は、有効成分である第１の発明に記載の異常核酸分解誘導剤を分解等により不活化させずに、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
【００５２】
抗ウイルス剤の適用対象となる疾患は、ウイルス性疾患である。ウイルスの感染が全身性である場合、有効成分の異常核酸分解誘導剤を全身に送達できればいかなる剤形であってもよい。また、ウイルスが特定の器官又は臓器に感染する場合、抗ウイルス剤は、その部位を標的として有効成分の異常核酸分解誘導剤を送達できれば剤形は問わない。
【００５３】
具体的な剤形は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。投与方法は、非経口投与と経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。
【００５４】
投与方法が非経口投与であれば、好ましい剤形は、対象部位への直接投与又は循環系を介した全身投与が可能な液剤である。液剤の例としては、注射剤が挙げられる。注射剤は、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００５５】
投与方法が経口投与であれば、好ましい剤形は、固形剤（錠剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、乳剤、シロップ剤を含む）が挙げられる。固形剤であれば、必要に応じて、当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。
【００５６】
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。本発明の抗ウイルス剤の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
【００５７】
２−２−４．投与方法
本発明の抗ウイルス剤の投与方法は、前述のように非経口投与と経口投与に大別することができる。経口投与法は一般に全身投与であるが、非経口投与法はさらに局所投与と全身投与に細分できる。具体的には、例えば、脳内注射による局所投与、又は血管内注射のような循環器内投与による全身投与が挙げられる。
【００５８】
本発明の抗ウイルス剤の投与方法は、疾患の発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。局所的投与又は全身投与のいずれであってもよい。有効成分である異常核酸分解誘導剤は、ウイルスゲノム等の異常核酸を包含する神経細胞に対しては作用するが、正常神経細胞に対しては作用しない。したがって、副作用による影響がないか又は極めて小さいことから疾患の発症箇所である脳に局所投与することができる。局所投与は、注射による投与が好ましい。全身投与には、例えば、血管内注射又は経口投与が採用できる。血管内注射は、血流を介して異常核酸分解誘導剤を全身に行き渡らせることが可能な点で便利である。ただし、この場合、ポリペプチドを構成成分とする異常核酸分解誘導剤が血液中で分解されず、かつ脳関門を通過して、標的細胞である脳神経細胞にまで送達される形態にすることが好ましい。例えば、神経細胞を標的とする1型、2型又は5型のアデノ随伴ウイルス（AAV)ベクターにmiR-132遺伝子又はmiR-212遺伝子を包含した異常核酸分解誘導剤であれば、AAV粒子により核酸分解を免れ、脳神経細胞にまで送達させることができる。
【００５９】
２−３．適用対象疾患
本発明の抗ウイルス剤の適用対象となる疾患は、前述のウイルス性疾患である。限定はしないが、例えば、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群、ウイルス性肝炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、エボラ出血熱等が挙げられる。
【００６０】
３．リピート伸長病治療剤
３−１．概要
本発明の第３の発明は、リピート伸長病治療剤である。本発明のリピート伸長病治療剤は、第１の発明の異常核酸分解誘導剤を有効成分とし、標的核酸であるリピート配列を有する転写産物（リピート核酸）をリソソーム内へ取り込み、その内部での該転写産物の分解を誘導することによってリピート伸長病を予防又は治療することができる。
【００６１】
３−２．構成
３−２−１．有効成分
本発明のリピート伸長病治療剤は、前記第１の発明に記載の異常核酸分解誘導剤を有効成分として包含する。リピート伸長病治療剤は、異なる異常核酸分解誘導剤を二以上含むことができる。
【００６２】
リピート伸長病治療剤に含まれる前記異常核酸分解誘導剤の含有量は、前記第２の発明の抗ウイルス剤における異常核酸分解誘導剤の含有量に準じる。
【００６３】
３−２−２．担体
本発明のリピート伸長病治療剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。担体は、前記第２の発明の抗ウイルス剤における担体と同様でよい。したがって、ここではその具体的な説明については省略する。
【００６４】
３−２−３．剤形
本発明のリピート伸長病治療剤の剤形は、有効成分である第１の発明に記載の異常核酸分解誘導剤が分解等により不活化させずに、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。
【００６５】
リピート伸長病治療剤の適用対象となるリピート伸長病は、主に神経細胞又は筋細胞で発症することから、異常核酸分解誘導剤を全身又は、神経細胞若しくは筋細胞に送達できればいかなる剤形であってもよい。基本的な剤形は、前記第２の発明の抗ウイルス剤の剤形に準じることから、ここではその具体的な説明については省略する。
【００６６】
３−２−４．投与方法
本発明のリピート伸長病治療剤の投与方法は、疾患の発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。局所的投与又は全身投与のいずれであってもよい。有効成分である異常核酸分解誘導剤は、神経細胞又は筋細胞に対して作用する。したがって、局所的投与の場合、疾患の発症箇所に局所投与してもよい。局所投与は、注射による投与が好ましい。全身投与には、例えば、血管内注射又は経口投与が採用できる。血管内注射は、血流を介して異常核酸分解誘導剤を全身に行き渡らせることが可能な点で便利である。ただし、脳神経細胞に投与する場合、異常核酸分解誘導剤が血液中で分解されず、かつ脳関門を通過して、標的細胞である脳神経細胞にまで送達される形態にすることが好ましい。例えば、神経細胞を標的とする1型、2型又は5型のアデノ随伴ウイルス（AAV)ベクターにmiR-132遺伝子又はmiR-212遺伝子を包含した異常核酸分解誘導剤であれば、AAV粒子により核酸分解を免れ、脳神経細胞にまで送達させることができる。
【００６７】
３−３．適用対象疾患
本発明のリピート伸長病治療剤は、リピート伸長病を適用対象とする。「リピート伸長病」（repeat expansion disease）とは、リピート配列を有する転写産物（mRNA）を原因とする疾患である。例えば、トリプレットリピート病や6塩基繰り返し病等が挙げられる。
【００６８】
トリプレットリピート病（triplet repeat disease）は、トリヌクレオチドリピート病（trinucleotide repeat disorder）又は3塩基繰り返し病とも呼ばれ、ゲノム内遺伝子及びその転写産物（pre-mRNA又はmRNA）に存在する3塩基のリピート配列が異常に伸長することにより、発病する疾病を総称して言う。遺伝子上でトリプレットリピート病を引き起こす場合のリピート部分の代表的な塩基配列としてCAGが挙げられる。このCAGが過伸長することによる疾病をCAGリピート病、あるいはCAGがコードするアミノ酸であるグルタミンが繰り返されることからポリグルタミン病と称される。CAGリピート病（ポリグルタミン病）には、ハンチントン病(Huntington disease)、脊髄小脳変性症（Spinocerebellar Degeneration；SCD）、球脊髄性筋委縮症（Spinal and Bulbar Muscular Atrophy；SBMA)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体委縮症（dentatorubropallidoluysial atrophy；DRPLA）が含まれる。その他、CGGリピートを原因とする脆弱X症候群（fragile X syndrome；FRAXA）、及びCTGリピートを原因とする筋強直性ジストロフィー(myotonic dystrophy;MD)も本発明のトリプレットリピート病治療剤の適用対象となるトリプレットリピート病である。
【００６９】
6塩基繰り返し病は、ヘキサヌクレオチドリピート病（hexanucleotide repeat disorder）とも呼ばれ、ゲノム内遺伝子及びその転写産物（pre-mRNA又はmRNA）に存在する6塩基のリピート配列が異常に伸長することにより、発病する疾病の総称である。代表的な6塩基リピートの塩基配列としてGGGGCCが挙げられる。この6塩基が過伸長することによって発症する疾患には、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis；ALSL)や前頭側頭型認知症（Frontotemporal lobar degeneration；FTLD）が挙げられる。
【実施例】
【００７０】
＜実施例１：SIDT2遺伝子の過剰発現によるRNA及びDNAのリソソームへの取り込み効果の検証＞
（目的）
SIDT2遺伝子を包含する過剰発現ベクターを導入した細胞におけるRNA及びDNAのリソソームへの取り込み効果についてRNautophagy／DNautophagyアッセイを用いて検証する。【００７１】
（方法）
マウスSIDT2 cDNAは、Thermo Scientific（MMM1013-020769049）から購入した。SIDT2過剰発現用のプラスミドは、pCI-neo (Promega)に、マウスSIDT2 cDNAを組み込むことにより作製した。得られたSIDT2発現ベクターをpCI-neo-mSIDT2とした。【００７２】
トランスフェクション用細胞にはマウス神経芽細胞種Neuro2a細胞を用いた。pCI-neo-mSIDT2のNeuro2a細胞へのトランスフェクションは、Lipofectamine LTX（Life Technologies）を用い、添付のプロトコールに従って行った。コントロールとして空ベクターpCI-neoをトランスフェクションした。pCI-neo-mSIDT2をトランスフェクションし、SIDT2を過剰発現させたNeuro2a細胞、及びそのコントロール細胞からリソソームを単離した。リソソームの単離は、Lysosome Enrichment Kit (Pierce, 89839)を用い、添付のプロトコールに従って行った。また、マウス脳から総RNAをTRIzol Reagent（Life Technologies）を用いて精製した。具体的な精製方法については、添付のプロトコールに従った。【００７３】
RNautophagy／DNautophagyアッセイの基本操作については、Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (3):403-409及びFujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (8):1167-1171に記載の方法に準じた。25〜50μgの単離リソソームと5μgの前記総RNA又は1μgのDNA（pCI-neo）を、energy regeneration system（10 mM ATP、10 mM MgCl、2 mM phosphocreatine、50μg/mL creatine phosphokinase）で終濃度が0.3M sucrose及び10 mM MOPS buffer (pH 7.0)となるように調製した30μLの溶液中で混合し、37℃で5分間インキュベートした。4℃に移して反応を停止した後、リソソームを遠心分離により取り除き、反応上清をアガロース電気泳動した。反応上清中に残存したRNA又はDNAはエチジウムブロマイドを用いてUV照射により検出した。核酸のバンドの定量はImageJ software ver.1.46r (National Institute of Health)を用いて行った。【００７４】
（結果）
図１に結果を示す。Aはマウス総RNAを標的核酸としたときの、またBはpCI-neoプラスミドDNAを標的核酸としたときの、結果である。Contは、コントロール細胞から単離したリソソームを用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイにおける核酸バンドの蛍光強度を、またSIDT2 o/eは、mSIDT2を過剰発現させたNeuro2a細胞から単離したリソソーム（SIDT2過剰発現サンプル）を用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイにおける核酸バンドの蛍光強度を示す。この図では、コントロールの蛍光強度を100としたときの、SIDT2過剰発現サンプルにおける蛍光強度の相対値で示している。図中の「***」は、p<0.01を示す。【００７５】
mSIDT2を過剰発現させたNeuro2a細胞由来のリソソームを用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイでは、反応溶液中の遊離RNA量及び遊離DNA量が、ATP存在下でいずれもコントロールと比較して有意に減少した。この結果は、SIDT2タンパク質の過剰発現によりRNA及びDNAのリソソームに取り込み量が促進されたことを示唆している。【００７６】
＜実施例２：SIDT2遺伝子のノックダウンによるRNA及びDNAのリソソームへの取り込み効果の検証＞
（目的）
実施例１とは逆に、細胞中の内因性SIDT2遺伝子の発現をノックダウンすることで、RNA及びDNAのリソソームへの取り込みが減少するか否かを確認する。【００７７】
（方法）
SIDT2遺伝子のノックダウン細胞にはHeLa細胞を用いた。また、HeLa細胞中のヒトSIDT2（hSIDT2)遺伝子の発現をノックダウンするためにhSIDT siRNAを用いた。hSIDT siRNAは、配列番号３からなるセンス鎖（5'-GAGGAUGACUACGACACAUUG-3'）及び配列番号４からなるアンチセンス鎖（5'-AUGUGUCGUAGUCAUCCUCCU-3')をそれぞれ合成し、アニーリングさせて調製した。コントロールsiRNAとして、EGFPを標的とするEGFP siRNAを用いた。EGFP siRNAは、配列番号５からなるセンス鎖（5'-CAGCACGACUUCUUCAAGUCC-3'）、配列番号６からなるアンチセンス鎖（5'-ACUUGAAGAAGUCGUGCUGCU-3'）を用いた。HeLa細胞への各siRNAの導入はLipofectamine RNAiMAX (Life Technologies)を用いた。具体的な導入方法は、添付のプロトコールに従った。【００７８】
hSIDT siRNAを導入してSIDT2遺伝子の発現をノックダウンしたHeLa細胞（SIDT2 KD細胞）におけるSIDT2タンパク質の減少を確認するために、SIDT2 KD細胞及びEGFP siRNAを導入したコントロール細胞（Cont細胞)中のSIDT2タンパク質を免疫ブロッティングにより検出し、定量化した。免疫ブロッティングの基本操作は、Kabuta T, et al., 2008, Hum. Mol. Genet., 17:1482-1496及びGreen, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法に従った。ブロッティングの一次抗体には、500倍希釈した抗SIDT2ヤギポリクロ―ナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）、1000倍希釈した抗SIDT2ウサギポリクロ―ナル抗体（Abcam）を用いた。ブロッティング溶液に一次抗体を加えて4℃で一晩インキュベートした後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution (Toyobo)を用いて、二次抗体である1000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG抗体（Pierce）又は1000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギIgG抗体（Pierce）によりSIDT2タンパク質を検出した。免疫反応シグナルはSuperSignal West Dura extended duration substrate（Pierce）を用いて可視化し、ケミルミネッセンス・イメージングシステム（ImageQuant LAS4000; Fujifilm）を用いて検出した。シグナル強度の定量化には、Image J software ver.1.46r（NIH)を用いた。【００７９】
また、SIDT2 KD細胞及びCont細胞から実施例１と同様の方法でリソソームを単離し、RNautophagy／DNautophagyアッセイを行った。【００８０】
（結果）
図２に結果を示す。Aは、免疫ブロッティングによりSIDT2タンパク質を定量化したときのコントロール細胞（Cont)に対するSIDT2ノックダウン細胞（SIDT2 KD）におけるSIDT2タンパク質量の相対値を示している。この図で示すように、SIDT2ノックダウン細胞では、hSIDT2 siRNAの導入によりSIDT2遺伝子の発現がノックダウンされ、細胞中のSIDT2タンパク質量が減少していることが確認された。また、Bはマウス総RNAを標的核酸としたときの、またCはpCI-neoプラスミドDNAを標的核酸としたときの、結果である。Contは、コントロール細胞から単離したリソソームを用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイにおける核酸バンドの蛍光強度を、またSIDT2 KDは、hSIDT2をノックダウンさせたHeLa細胞から単離したリソソーム（SIDT2過剰発現サンプル）を用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイにおける核酸バンドの蛍光強度を示す。この図では、コントロールの蛍光強度を100としたときの、SIDT2過剰発現サンプルにおける蛍光強度の相対値で示している。図中の「***」はp<0.01を、「**」はp<0.05を示す。【００８１】
HeLa細胞に内在するhSIDT2遺伝子の発現をノックダウンさせた細胞由来のリソソームを用いたRNautophagy／DNautophagyアッセイでは、実施例１の結果とは逆に反応溶液中の遊離RNA量及び遊離DNA量が、ATP存在下でいずれもコントロールと比較して有意に増加した。この結果は、SIDT2タンパク質量の減少によりRNA及びDNAのリソソームに取り込み量が低下したことを示唆している。【００８２】
以上の結果から、SIDT2タンパク質がRNautophagy/DNautophagyにおけるRNA/DNA輸送体として機能することが示された。【００８３】
＜実施例３：SIDT2過剰発現によるリソソームに取り込まれたRNAの分解の検証＞
（目的）
SIDT2遺伝子の過剰発現によりリソソームに取り込まれたRNAの分解の増大を確認する。【００８４】
（方法）
単離リソソームを用いたRNAの分解アッセイの基本操作は、Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (3):403-409及び実施例１に記載の方法に準じた。SIDT2を過剰発現した細胞及びコントロール細胞から単離した25〜50μgの単離リソソームと実施例１で調製した5μgのRNAを、energy regeneration system（10 mM ATP、10 mM MgCl、2 mM phosphocreatine、50μg/mL creatine phosphokinase）で終濃度が0.3M sucrose及び10 mM MOPS buffer (pH 7.0)となるように調製した30μLの溶液中で混合し、37℃で5分間インキュベートした。4℃に移して反応を停止した後、リソソームを含む反応溶液中から総RNAを抽出し、定量した。総RNAの抽出には、TRIzol Reagent（Life Technologies）を用いた。具体的な精製方法については、添付のプロトコールに従った。その後、精製した総RNAをアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイドにより染色した後、検出されたバンドをImageJ software ver.1.46r (National Institute of Health)で定量した。反応に用いたRNA量（5μg）から反応後にサンプル中に残存する総RNA量を減じて、リソソーム中で分解されたRNA量を算出した。【００８５】
また、導入したRNAがリソソーム外の溶液中で分解されていないことを確認するために、SIDT2を過剰発現した細胞及びコントロール細胞から単離したリソソーム25〜50μgを1% Triton X-100を含むリン酸クエン酸バッファー（ph5.0)で溶解により破壊し、それぞれから得られた溶解溶液中で上記と同様の方法でRNAの分解反応を行った後、溶解溶液中の総RNA量を定量した。【００８６】
（結果）
図３に結果を示す。Aは単離リソソームを用いたRNAの分解アッセイの結果を、Bはリソソーム溶解溶液を用いたRNAの分解アッセイの結果を、それぞれ示す。図３Aから、コントロールと比較してSIDT2を過剰発現した細胞由来のリソソーム内では、RNA分解が顕著に増加していることが示唆された。【００８７】
また図３BからSIDT2を過剰発現した細胞とコントロール細胞由来のリソソームを溶解した溶液間でRNAの分解量に差異がなかったことから、導入したRNAの分解は、リソソーム中で生じている事象であって、リソソーム外の溶液中では分解されていないことが立証された。【００８８】
以上の結果からSIDT2の過剰発現は、リソソーム中のヌクレアーゼ活性に影響せず、かつリソソームによるRNAの取り込みを誘導し、RNA分解量の増大をもたらすことが明らかとなった。【００８９】
＜実施例４：SIDT2遺伝子のノックダウン細胞におけるリソソームRNA分解の検証＞
（目的）
内因性SIDT2遺伝子の発現をノックダウンした細胞から単離したリソソーム内でのRNA分解について検証する。【００９０】
（方法）
SIDT2遺伝子のノックダウン細胞の調製における基本操作は実施例２に記載の方法に準じて行った。また、単離リソソームを用いたRNAの分解アッセイの基本操作は、実施例３に記載の方法に準じて行った。【００９１】
（結果）
図４に結果を示す。この図で示すようにRNA分解％は、コントロール細胞と比較してSIDT2遺伝子のノックダウン細胞において有意に減じている。この結果は、実施例３と同様にSIDT2遺伝子の過剰発現がリソソームによるRNA分解量を促進していることを示唆している。【００９２】
＜実施例５：Poly(I:C)とLAMP2Cとの結合及びリソソームへの取り込みの検証＞
（目的）
本発明の異常核酸分解誘導剤が抗ウイルス剤の有効成分となり得ることを検証する。【００９３】
（方法）
上述の実施例からRNautophagy／DNautophagyシステムにおいて、LAMP2Cに結合した核酸をリソソーム内に取り込むための輸送体としてSIDT2が機能していることが立証された。また、実施例１の結果から、SIDT2タンパク質の過剰発現によりRNA及びDNAのリソソームに取り込み量が促進されることも明らかになった。この結果は、SIDT2がLAMP2Cと結合し得る核酸のリソソームの取り込み促進剤として機能し得ることを示唆している。つまり、LAMP2Cがウイルス核酸と結合し得るのであれば、SIDT2の遺伝子発現系で構成される本発明の異常核酸分解誘導剤は抗ウイルス剤の有効成分となり得る。そこで、LAMP2Cがウイルス核酸と結合することをウイルス核酸アナログを用いて検証した。【００９４】
一般に、細胞内に侵入したウイルス核酸の一部は、イノシン（I)又はデオキシイノシン（dI）に変換されることが知られている。そこで、本実施例では、2本鎖のpoly(I:C)ヌクレオチド（配列番号１１）を、ウイルス核酸を模倣したアナログとして用い、LAMP2Cとの結合、及びリソソームへの取り込みについて検証した。（１）poly(I:C)とLAMP2Cとの結合
poly(I:C)（配列番号１１）は、Sigmaより購入した。【００９５】
poly(I:C)とLAMP2Cとの結合には、プルダウン解析法を用いた。Streptavidin Sepharose High Performance beads（GE healthcare）を3％の牛血清/PBSで4℃にて一晩ブロッキングを行い、その後、10 mgのpoly(I:C)と10 mgのビオチン結合型LAMP2Cと共に、0.05％ Triton X-100を含むPBS中で4℃にて2時間インキュベートした。ビオチン結合型ヒトLAMP2Cは、配列番号１２で示すアミノ酸配列からなるペプチドのN末端にビオチンが結合している。ビオチン結合型LAMP2Cの調製は、Fujiwara Y.らによる2文献（Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (3):403-409.及びFujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (8):1167-1171.）に記載の方法に準じた。また、N末端にビオチンが結合している配列番号１３で示すアミノ酸配列からなるペプチドを対照用に用いた。インキュベーション後、ビーズを0.05％ Triton X-100を含むPBSで3回洗浄し、ビーズを TRIzol Reagent (Life Technologies)により抽出を行って、ビーズと共にプルダウンしたpoly(I:C)を抽出した。抽出したpoly(I:C)をアガロースゲル電気泳動で分析した。（２）poly(I:C)のリソソームへの取り込み
poly(I:C)のリソソームへの取り込みは、単離リソソーム法を用いた。リソソームの単離は、以下の方法により行った。すなわち、Hela細胞をbuffer (0.25M sucrose, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), protease inhibitors)中でポリトロンホモジナイザーを用いて破砕した。破砕液を4℃にて、1000gで5分間遠心し、上清を4℃にて、7500gで10分間遠心した。さらにこの上清を4℃にて、15000gで10分間遠心し、得られたpelletを単離リソソーム（粗精製）として用いた。【００９６】
RNautophagy／DNautophagyアッセイの基本操作については、Fujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (3):403-409及びFujiwara Y.,et al., 2013, Autophagy. 9 (8):1167-1171に記載の方法に準じた。続いて、5〜10μgの単離リソソームと5μgのpoly(I:C)を、終濃度が0.3M sucrose及び10 mM MOPS buffer (pH 7.0)となるように調製した30μLの溶液中で、energy regeneration system（10 mM ATP、10 mM MgCl、2 mM phosphocreatine、50μg/mL creatine phosphokinase）を加えて（ATP+)、又は加えずに（ATP-)、混合し、37℃で5分間インキュベートした。その後、4℃に移して反応を停止した後、リソソームを遠心分離により取り除き、反応上清をアガロース電気泳動した。反応上清中に残存したRNA又はDNAはエチジウムブロマイドを用いてUV照射により検出した。【００９７】
（結果）
図５に結果を示す。Ａは、本実験で使用したウイルス核酸を模倣したpoly(I:C)ヌクレオチドの配列を示す。Ｂは、プルダウン法によるpoly(I:C)とLAMP2Cとの結合の結果を、そしてＣは、poly(I:C)のリソソームへの取り込みの結果を示す。Ｂより、poly(I:C)はLAMP2Cに結合することが明らかとなった。またCからpoly(I:C)はATP存在下でリソソームに取り込まれることが証明された。以上の結果から、LAMP2Cはウイルス核酸と選択的に結合することができ、またLAMP2Cに結合したウイルス核酸は、輸送体であるSIDT2によりリソソームに取り込まれることが示唆された。この結果は、本発明の異常核酸分解誘導剤が抗ウイルス剤の有効成分となり得ることを示唆している。【００９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2016056645.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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