(57)【要約】本発明者らは、pIが低い抗体をプロテインAカラムを用いて精製し、酸性処理及び中和処理を行った後、一定期間経過してから、生じた抗体の会合体を除去する工程を行うことにより、その後の抗体の会合化を抑止できることを見出した。また本発明者らは、pIが低い抗体を陰イオン交換樹脂のBind/Eluteモード、さらには疎水性相互作用クロマトグラフィー或いはマルチモードクロマトグラフィー樹脂で精製することにより、従来よりも効率的に不純物の除去が可能になることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
【請求項２】
工程(a)が、pI値が3.0〜8.0である抗体をプロテインAカラムクロマトグラフィーにより精製した後に行うウイルス不活性化処理工程である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程(c)が、工程(b)で得られる中和組成物を中和後少なくとも1時間保持した後に会合体を除去する工程である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
会合体の除去を、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより行う、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗体のpI値が5.0〜7.5である、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗体のpI値が5.0〜6.5である、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法であって、
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷し、
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、を含む方法。
【請求項８】
工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程(b)の溶出溶液が、塩化ナトリウム、Tris塩、硫酸ナトリウム塩、リン酸ナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも1つを含む溶液である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)により得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含む溶出産物を疎水性リガンド及び/又はマルチモードリガンドを有する樹脂を用いるクロマトグラフィーに負荷しFlow through画分及び/又は溶出画分を取得する工程をさらに含む、請求項７乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
会合体の除去を請求項７乃至１０のいずれかに記載の方法で行うことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、抗IL-6レセプター抗体または抗IL-31レセプター抗体である、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法によって、抗体の会合体の含有割合が３％以下である、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を製造する方法。
【請求項１５】
pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物であって、抗体の会合体の含有割合が３％以下である組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法によって製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体含有組成物であって、会合体の含有割合が３％以下である組成物。
【請求項１７】
以下の工程を含む、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する医薬組成物を製造する方法：
１）請求項１４記載の製造方法により、pI値が3.0〜8.0である抗体及び／又は当該抗体を含有する組成物を製造する工程、及び
２）工程1)で製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体及び／又は当該抗体を含有する組成物を、医薬的に許容される担体及び／又は添加剤と混合して製剤化する工程。
【請求項１８】
pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から抗体の会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
【請求項１９】
pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)会合体の形成に十分な時間が経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体の精製方法に関し、特に等電点（pI）の低い抗体のための精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。【０００３】
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主細胞由来のタンパク質（Host cell proteins）やＤＮＡ、精製原材料の一つである樹脂リガンド断片、目的タンパク質由来の会合体や断片などを除去する必要がある。また、製剤のウイルス安全性担保の為に、精製工程は十分なウイルス除去能や不活化能を有することを示す必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１００ｐｇＤＮＡ／一投与量以下であることが、世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。また、ウイルスについては、培養液にレトロウイルス様粒子の存在が認められる場合は、精製工程におけるレトロウイルスの除去能や不活化能を考慮したうえで、１ virus particle／10の6乗投与量以下であることが世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地をアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはこれらの組合せで処理することにより不純物を除去している。また、近年は新たな精製リガンドの開発が進み、イオン交換作用に加えて疎水性相互作用の両作用を有するマルチモードクロマトグラフィーも精製に用いられるようになった。【０００４】
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られる抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィーによる処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
例えば、特表平５−５０４５７９号（特許文献１）では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。【０００５】
血中滞留性あるいは体内動態の向上を目的として、抗体の等電点（pI）を制御するためのアミノ酸置換技術、具体的には抗体の表面に露出しているアミノ酸残基を改変することにより抗体のpIを制御する技術が知られている（WO 07/114319（特許文献２））。天然の抗体の等電点(pI)はおおよそ7.5〜9.5の範囲であり比較的高いpIを有している。このような抗体のアミノ酸残基を改変してpIを低くすることにより、抗体の血漿中滞留性や半減期を伸ばすことが期待でき、医薬としての抗体の投与量の低減や投与間隔の延長に繋がる。
しかしこれまで、天然には存在しない低いpIを有する抗体に適した精製法の検討や、精製工程における低pI抗体特有の問題についての検討はなされていない。従って、この様な低pI抗体に適した精製方法については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平５−５０４５７９号
【特許文献２】WO 07/114319
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、特にpIが低い抗体を含む組成物から不純物を効率よく除去できる、抗体の精製法を提供することである。
一般的に、培養液中から抗体を粗精製する方法としては、プロテインAカラムを用いるのが主流である。この際、カラムからの溶出工程において酸性の溶液で溶出を行い、さらに必要に応じて酸を添加して、一定時間酸性状態を維持してウイルスの不活性化処理を行い、中和処理後直ちに次の精製工程に移るのが一般的である。【０００８】
本発明者らは、特に、pIが低い値に改変された抗体を通常の精製工程で精製した場合、精製工程終了後に新たな会合体が生じるという問題を見出した。この原因を検討した結果、当該抗体が一定時間酸性状態におかれてから中和処理がなされた場合、一部の抗体が一定の期間、徐々に不可逆的に会合化していくという現象を見出した。【０００９】
一般的な抗体はpI値が高く塩基性のため、Protein Aアフィニティー樹脂での精製後、塩基性の特性から陽イオン交換樹脂ではBind/Eluteモード、陰イオン交換樹脂ではPass throughモードでの精製を行っている。通常、陽イオン交換樹脂では会合体を除去することが、陰イオン交換樹脂ではDNA, Host cell protein, ウイルスといった不純物を吸着させて除去することが知られている。しかし、pIが低い値に改変された抗体の精製法の検討の中で、pIが低く改変された抗体については、従来の精製法では抗体の培養液中に含まれる不純物の除去効率が不十分であることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、pIが低い抗体をプロテインAカラムを用いて精製し、中和処理を行った後、一定期間経過してから、生じた抗体の会合体を除去する工程を行うことにより、その後の抗体の会合化を抑止できることを見出した。
また、pIが低い抗体を陰イオン交換樹脂のBind/Eluteモードで精製することにより、従来よりも効率的に不純物の除去が可能になることを見出した。また、陰イオン交換クロマトグラフィーに加え、マルチモードクロマトグラフィー或いは疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いることで、より一層の不純物の除去が可能となることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔１９〕を提供する。
〔１〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
〔２〕工程(a)が、pI値が3.0〜8.0である抗体をプロテインAカラムクロマトグラフィーにより精製した後に行うウイルス不活性化処理工程である、〔１〕記載の方法。
〔３〕工程(c)が、工程(b)で得られる中和組成物を中和後少なくとも1時間保持した後に会合体を除去する工程である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕会合体の除去を、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより行う、〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕抗体のpI値が5.0〜7.5である、〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕抗体のpI値が5.0〜6.5である、〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法であって、
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷し、
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、を含む方法。
〔８〕工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含む、〔７〕記載の方法。
〔９〕工程(b)の溶出溶液が、塩化ナトリウム、Tris塩、硫酸ナトリウム塩、リン酸ナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも1つを含む溶液である、〔７〕又は〔８〕記載の方法。
〔１０〕工程(b)により得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含む溶出産物を疎水性リガンド及び/又はマルチモードリガンドを有する樹脂を用いるクロマトグラフィーに負荷しFlow through画分及び/又は溶出画分を取得する工程をさらに含む、〔７〕乃至〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕会合体の除去を〔７〕乃至〔１０〕のいずれかに記載の方法で行うことを特徴とする、〔１〕乃至〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、〔１〕乃至〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕抗体が、抗IL-6レセプター抗体または抗IL-31レセプター抗体である、〔１〕乃至〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載の方法によって、抗体の会合体の含有割合が３％以下である、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を製造する方法。
〔１５〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物であって、抗体の会合体の含有割合が３％以下である組成物。
〔１６〕〔１４〕記載の方法によって製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体含有組成物であって、会合体の含有割合が３％以下である組成物。
〔１７〕以下の工程を含む、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する医薬組成物を製造する方法：
１）〔１４〕記載の製造方法により、pI値が3.0〜8.0である抗体及び／又は当該抗体を含有する組成物を製造する工程、及び
２）工程1)で製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体及び／又は当該抗体を含有する組成物を、医薬的に許容される担体及び／又は添加剤と混合して製剤化する工程。
〔１８〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から抗体の会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
〔１９〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)会合体の形成に十分な時間が経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、等電点（pI）の低い抗体を含有する組成物から当該抗体の会合体や不純物を除去する方法に関する。具体的には本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物からその会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明においては、工程(b)で得られる中和組成物中に生じる会合体の形成に十分な時間が経過した後、当該組成物から会合体を除去することにより、精製後の新たな会合体形成を抑制することができる。
具体的には、中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去することにより、精製後の新たな会合体形成を抑制することができる。
即ち、本発明の工程(c)は次のように言い換えることもできる。
・会合体の形成に十分な時間が経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において生じ得る会合体量に対し少なくとも80％以上の会合体が形成された後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物を少なくとも24時間保持した後に形成され得る会合体量に対し少なくとも80％以上の会合体が形成された後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において起こり得る会合体の形成が80％以上完了した後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において会合体の形成が完了する少なくとも1時間前に、当該組成物から会合体を除去する工程
【００１４】
また本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法であって、
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷する工程、及び
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、
を含む方法に関する。
上記方法においては、工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含むことができる。
【００１５】
本発明において、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物からその会合体を除去する方法は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体（抗体モノマー）を精製する方法、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法、pI値が3.0〜8.0の抗体の会合化を抑制する方法などと表現することもできる。
また、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体（抗体モノマー）を精製する方法、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体の会合体を除去する方法などと表現することもできる。
本発明においては、抗体を含有する組成物は抗体を含有する溶液、抗体の培養液、抗体の培養培地などと表現することもできる。
【００１６】
本発明で使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
【００１７】
本発明で使用されるモノクローナル抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、bispecific抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。さらに、血中滞留性や体内動態の改善を目的とした抗体分子の物性の改変（具体的には、等電点（pI）改変、Fc受容体の親和性改変等）を行うために抗体の定常領域等を人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。
【００１８】
また、本発明で使用される抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのIgG、IgA、IgD、IgE、IgMなどいずれのクラスでもよいが、IgG及びIgMが好ましい。
【００１９】
さらに本発明で使用される抗体には、定常領域と可変領域を有する抗体（wholeの抗体）だけでなく、Fv、Fab、F(ab)2などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカー等のリンカーで結合させた1価または2価以上の一本鎖Fv（scFv、sc(Fv)2）やscFvダイマーなどのDiabody等などの低分子化抗体なども含まれるが、wholeの抗体が好ましい。
【００２０】
上述した本発明で使用される抗体は、当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製することができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
【００２１】
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAを得たら、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００２２】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【００２３】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、WO 96/02576 参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００２４】
抗体の活性、物性、薬物動態、安全性等を改善するために抗体のアミノ酸を置換する技術としては、例えば以下に述べる技術も知られており、本発明で使用される抗体には、このようなアミノ酸の置換（欠損や付加も含む）を施された抗体も含まれる。
【００２５】
IgG抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化（Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.）をはじめとして、結合活性を増強させるための相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換によるaffinity maturation（Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.）、フレームワーク(FR)のアミノ酸置換による物理化学的安定性の向上（Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review）が報告されている。また、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換を施す技術として、抗体依存性細胞障害活性(ADCC)活性や補体依存性細胞障害活性(CDC)活性を増強させる技術が知られている（Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.）。さらに、このようなエフェクター機能を増強させるだけではなく、抗体の血中半減期を向上させるFcのアミノ酸置換の技術が報告されている（Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.、Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.）。さらには抗体の物性改善を目的とした定常領域の種々のアミノ酸置換技術も知られている（WO 09/41613）。
【００２６】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。本発明で使用される抗体には、このようなヒト抗体も含まれる。
【００２７】
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS，ミエローマ、BHK （baby hamster kidney），HeLa，Vero，(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana)属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。
【００２８】
さらに、本発明で使用される抗体には、抗体断片や低分子化抗体、並びに抗体修飾物が含まれる。例えば、抗体断片や低分子化抗体としてはFab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させた一価又は二価以上のシングルチェインFv(scFv、sc(Fv)2など) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
【００２９】
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性薬剤等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる（Farmaco. 1999 Aug 30;54(8):497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69.）。本発明で使用される抗体にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００３０】
本発明で使用される抗体としては、抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原モノクローナル抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗グリピカン-3 抗体、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子代替抗体、抗IL31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、ファクターIXとファクターXとのBi-specific抗体などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明で使用する好ましい再構成ヒト化抗体としては、ヒト化抗インターロイキン６（IL-6）レセプター抗体（トシリツマブ、hPM-1あるいはMRA）（WO92/19759参照）、ヒト化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体（WO98/14580参照）、ヒト化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）（WO98/13388を参照）、ヒト化抗組織因子抗体（WO99/51743参照）、抗グリピカン-3 ヒト化IgG1κ抗体（PCT/JP05/013103参照）、抗NR10ヒト化抗体（WO2009/072604参照）、ファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体などが挙げられるがこれらに限定されない。本発明で使用するヒト化抗体として特に好ましいのは、ヒト化抗IL-6レセプター抗体、抗NR10ヒト化抗体、及びファクターIXとファクターXとのBi-specificヒト化抗体である。
【００３２】
ヒトIgM抗体としては、抗ガングリオシドGM3組み換え型ヒトIgM抗体（WO05/05636参照）などが好ましい。
低分子化抗体としては、抗TPO受容体アゴニストDiabody（WO02/33072参照）、抗CD47アゴニストDiabody（WO01/66737参照）などが好ましい。
【００３３】
本発明において等電点の低い抗体（低pI抗体）とは、特に天然では存在し難い、低い等電点を有する抗体をいう。このような抗体の等電点としては例えば3.0〜8.0、好ましくは5.0〜7.5、さらに好ましくは5.0〜7.0、さらに好ましくは5.0〜6.8、さらに好ましくは5.0〜6.5、特に好ましくは5.0〜6.0が挙げられるがこれらに限定されない。なお、天然の（または通常の）抗体は、通常7.5〜9.5の範囲の等電点を有すると考えられる。
【００３４】
さらに本発明で使用される抗体としては、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基を改変することにより抗体のpIを低下させた、pI改変抗体が好ましい。このようなpI改変抗体とは、改変前の抗体のpIよりも1以上、好ましくは2以上、さらに好ましくは3以上、pIを低下させた抗体をいう。後述の実施例に記載されるように、Mab3（等電点：9.4）のアミノ酸配列を改変して等電点を制御したMab1の等電点は、5.8である。また、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した完全ヒト化NS22抗体（等電点：7.8）のアミノ酸配列を改変して等電点を制御したMab2の等電点は、5.6である。
【００３５】
等電点が改良された抗体としては、例えば、WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体であるMab1（H鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２）、抗NR10ヒト化抗体であり、WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した、完全ヒト化NS22抗体（H鎖／配列番号：３、L鎖／配列番号：４）などがあげられるがこれらに限定されない。
【００３６】
抗体の表面に露出しているアミノ酸残基としては、H鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるH1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H31, H39, H42, H43, H44, H46, H61, H62, H64, H65, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110, H112の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。またＬ鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるL1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L24, L27, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L53, L54, L55, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明において「改変」とは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等をいうが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
【００３８】
アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が存在することが知られている。一般的に、正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸（負電荷アミノ酸）としては、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）等が知られている。これら以外のアミノ酸は電荷を有さないアミノ酸として知られている。
【００３９】
本発明において改変後のアミノ酸残基としては、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から適宜選択されるが、特にこれらのアミノ酸に制限されない。
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）
【００４０】
また、改変前のアミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さないアミノ酸残基となるように改変することも好ましい態様の一つである。
すなわち、本発明における改変としては、（１）電荷を有するアミノ酸から電荷を有さないアミノ酸への置換、（２）電荷を有するアミノ酸から当該アミノ酸とは反対の電荷を有するアミノ酸への置換、（３）電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換が挙げられる。
【００４１】
等電点の値は、当業者公知の等電点電気泳動により測定することが可能である。また、理論等電点の値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア（Genetyx等）を用いて計算することができる。
【００４２】
アミノ酸残基の電荷が改変された抗体は、抗体をコードする核酸を改変し、当該核酸を宿主細胞で培養し、宿主細胞培養物から抗体を精製することによって取得することができる。本発明において「核酸を改変する」とは、改変によって導入されるアミノ酸残基に対応するコドンとなるよう核酸配列を改変することをいう。より具体的には、改変前のアミノ酸残基のコドンが改変によって導入されるアミノ酸残基のコドンになるように、核酸の塩基配列を改変することを言う。即ち、改変されるアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜行うことが可能である。
【００４３】
本発明の好ましい1つの様態では、以下の段階：
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、
を含む方法によって、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から生じる会合体を効率よく除去することができる。
本発明におけるpIが3.0〜8.0である抗体の会合体としては、1.5量体、二量体、三量体、四量体、五量体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明の方法によって、溶液中で生じる低pI抗体の会合体を効率よく除去でき、且つその後新たに会合体が生じるリスクが抑えられる。本発明において、抗体を含有する組成物を処理する酸性条件としては、通常pH 2.0〜4.0であり、好ましくはpH 3.0〜3.9で、さらに好ましくはpH 3.1〜3.8を例示することができるがこれらに限定されない。
抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する方法としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸など公知の酸を、抗体を含有する組成物に添加する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明においては、酸性条件で処理した抗体を含有する組成物を、一定時間保持することが好ましい。保持時間としては、例えば15分〜4時間、好ましくは30分〜2時間、さらに好ましくは1〜1.5時間が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明において、酸性組成物を中和する工程とは、酸性処理されたpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を中和する工程をいう。中和後のpHとしては、通常pH 4.5〜8.5、好ましくはpH 6.5〜8.5、さらに好ましくはpH 7.0〜8.5が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
本願の実施例の結果より、本発明の抗体の精製方法において、上記酸性組成物のpHを上昇させる工程（中和する工程など）を断続的に行う場合、その都度会合体が形成されていくことが判明した。従って、本発明の抗体の精製方法あるいは会合体の除去方法において、生成される抗体の会合体を除去する工程は、最終的にpHを上昇させる工程（中和する工程など）が終了した後に行われることが好ましい。また、会合体の除去を行った後に、再度pHを上昇させるような工程は行わないことが好ましい。
【００４７】
また本発明においては、抗体を含有する酸性組成物を中和し、抗体のpIよりも低いpHで当該組成物を一定時間保持した場合、当該組成物のpHを抗体のpIよりも高い値に調整し、当該組成物を一定時間保持する工程をさらに含むことができる。より具体的には、本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和し、抗体のpIよりも低いpHで当該組成物を保持する工程、
(c)工程(b)で得られる中和組成物のpHを、抗体のpIよりも高い値に調整する工程、及び、
(d)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、
を含む方法に関する。抗体のpIよりも低いpHとしては、抗体のpIよりも例えば0.3以上、好ましくは0.5以上、さらに好ましくは1.0以上低いpHを例示することができるがこれらに限定されない。一方、抗体のpIよりも高いpHとしては、抗体のpIよりも例えば0.3以上、好ましくは0.5以上、さらに好ましくは1.0以上高いpHを例示することができるがこれらに限定されない。また中和後の組成物を保持する時間としては、例えば1時間以上（例えば、1時間〜7日間、好ましくは1〜3日間）、好ましくは2時間以上（例えば2時間〜7日間、好ましくは2〜72時間）、さらに好ましくは6時間以上（例えば6時間〜7日間、好ましくは6〜72時間）、さらに好ましくは12時間以上（例えば12時間〜7日間、好ましくは12〜72時間）を例示することができるがこれらに限定されない。
【００４８】
中和は、緩衝液を用いて行うことができる。中和に用いる緩衝液としては、通常pH調整に用いられる緩衝液であれば特に制限はなく、例えば、トリス、リン酸水素2ナトリウムなどが挙げられ、好ましくは、トリスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の特徴は、抗体含有酸性溶液を中和した後、一定の時間継続的に、不可逆性の会合体が生成し続けることを初めて見出したところにある。このような現象はpIが改変されていない通常の抗体（pIが9前後の抗体）では見出されなかった現象である。不可逆性の会合体が生成される原因は明らかではないが、低pI抗体が酸性溶液中でストレスを受けることや、抗体のpI値の近辺での組成物のpHの調整もしくはpI値をまたいで組成物のpHの調整を行うことによる抗体分子の電荷の変化などが原因として考えられる。いずれにせよ本発明の方法では、酸性処理したpI値が3.0〜8.0である抗体を中和した後、一定の時間経過後に、生成した抗体の会合体を除去することにより、会合体除去後に新たな会合体が生じることを防ぐ。
【００５０】
より具体的には、中和後抗体の会合体の除去を行うまでの時間としては、通常1時間以上（例えば、1時間〜7日間、好ましくは1〜3日間）、好ましくは2時間以上（例えば2時間〜7日間、好ましくは2〜72時間）、さらに好ましくは6時間以上（例えば6時間〜7日間、好ましくは6〜72時間）、さらに好ましくは12時間以上（例えば12時間〜7日間、好ましくは12〜72時間）、特に好ましくは20時間、23時間、24時間もしくは66時間またはそれ以上を例示することができるがこれらに限定されない。
【００５１】
あるいは本発明においては、会合体の形成に十分な時間が経過した後、中和された組成物から会合体を除去する。本発明において会合体の形成に十分な時間とは、中和された組成物において会合体を形成することが期待される抗体が会合体を形成するのに必要な時間をいう。本発明の会合体の形成に十分な時間には、会合体を形成することが期待される全ての抗体が会合体を形成するのに必要な時間のみならず、会合体を形成することが期待される抗体のうち、少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の抗体が会合体を形成するのに必要な時間を含む。当業者であれば、実施例1で示された会合体の生成時間を考慮して、中和後、抗体の会合体の除去を行うまでの時間を設定することができる。
【００５２】
あるいは本発明においては、中和組成物において生じ得る会合体量に対し少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の会合体が形成された後、当該組成物から会合体を除去することもできる。本発明において、中和組成物において生じ得る会合体量とは、中和組成物において会合体を形成することが期待される抗体によって形成される会合体の量をいう。中和組成物において生じ得る会合体量としては、中和後、通常1時間以上（例えば、1時間〜7日間、好ましくは1〜3日間）、好ましくは2時間以上（例えば2時間〜7日間、好ましくは2〜72時間）、さらに好ましくは6時間以上（例えば6時間〜7日間、好ましくは6〜72時間）、特に好ましくは24時間保持した後に形成される会合体の量を例示することができるがこれらに限定されない。
【００５３】
あるいは本発明においては、中和組成物において起こり得る会合体の形成が少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の完了した後、当該組成物から会合体を除去することもできる。本発明において、中和組成物において起こり得る会合体の形成とは、会合体を形成することが期待される抗体が会合体を形成することをいう。
【００５４】
あるいは本発明においては、中和組成物において会合体の形成が完了する少なくとも1時間前に、当該組成物から会合体を除去することもできる。本発明において、会合体の形成が完了するとは、会合体を形成することが期待される抗体による会合体の形成が完了することをいう。本発明の会合体の形成の完了には、会合体を形成することが期待される全ての抗体が会合体を形成することのみならず、会合体を形成することが期待される抗体のうち、少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上の抗体が会合体の形成を完了することをいう。
【００５５】
抗体の会合体の形成が完了したか否かは、例えば、後述する実施例で示す方法のように、中和処理後経時的に本発明の中和組成物をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）にて分析し、生じる会合体量をプロットすることで確認することができる。
【００５６】
本発明においては、陰イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を用いて公知の方法により、生じた会合体を除去することができる。特に、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いることが好ましい。
また、後述する陰イオン交換クロマトグラフィーのBind/eluteモードによる精製工程を用いることにより、効率的に本発明の会合体を除去することができる。
【００５７】
本発明において陰イオン交換樹脂は、陰イオン交換作用を示す限り限定されない。陰イオン交換樹脂として
YMC-BioPro（ワイエムシィ社）、
Q Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Q Sepharose Fast Flow（GE Healthcare社）、
Q Sepharose XL（GE Healthcare社）、
Capto Q ImpRes（GE Healthcare社）、
Capto Q（GE Healthcare社）、
Capto DEAE（GE Healthcare社）、
SOURCE 30Q（GE Healthcare社）、
SOURCE 15Q（GE Healthcare社）、
POROS HQ（Life technologies社）、
POROS D（Life technologies社）、
POROS PI（Life technologies社）、
Eshumuno Q（Merck Millipore社）、
Fractogel TMAE（Merck Millipore社）、
Fractogel DEAE（Merck Millipore社）、
Macro-Prep Q（Bio-Rad Laboratories社）、
Macro-Prep DEAE（Bio-Rad Laboratories社）、
Giga Cap Q-650M（TOSOH社）、
Giga Cap DEAE-650M（TOSOH社）、
Q HyperCel（PALL社）
などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５８】
またハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーのための樹脂としては、
Ceramic Hydroxyapatite（Bio-Rad Laboratories社）、
Ceramic Fluoloapatite（Bio-Rad Laboratories社）、
MPC Ceramic Hydroxyfluoloapatite（Bio-Rad Laboratories社）、
HA Ultragel（PALL社）
などを例示することができるがこれらに限定されない。
【００５９】
またマルチモードクロマトグラフィーのための樹脂としては、
Capto Adhere（GE Healthcare社）、
Capto MMC（GE Healthcare社）、
Eshumuno HCX（Merck Millipore社）
を例示することができるがこれらに限定されない。
【００６０】
また疎水性相互作用クロマトグラフィーのための樹脂としては、
Phenyl Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Butyl Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Butyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Octyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Capto Phenyl ImpRes（GE Healthcare社）、
Capto Phenyl（GE Healthcare社）、
Capto Butyl（GE Healthcare社）、
Capto Octyl（GE Healthcare社）、
Fractogel Phenyl（Merck Millipore社）、
Fractogel Propyl（Merck Millipore社）、
TOYOPEARL Butyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Ether（TOSOH社）、
TOYOPEARL Hexyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Phenyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL PPG（TOSOH社）、
TOYOPEARL SuperButyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Butyl-600（TOSOH社）、
Macro-Prep HIC（Bio-Rad Laboratories社）
などを例示することができるがこれらに限定されない。
【００６１】
会合体が除去されたか否かは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）など当業者に公知の手法により判定することができるがこれに限定されない。
【００６２】
本発明においては、酸性条件で処理される抗体を含有する組成物は、プロテインAカラムクロマトグラフィーなど公知の精製方法により精製されたものであることができる。すなわち本発明の会合体の除去方法は、「(a) pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程」の前に、「pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物をプロテインAカラムクロマトグラフィーによる精製する工程」を含むことができる。
【００６３】
また本発明においては、pI値が3.0〜8.0である抗体の会合体を除去するための上述の工程(a)-(c)の後、後述の陰イオン交換クロマトグラフィーのBind/eluteモード（結合/溶出画分）による精製工程、及び／又は、マルチモードクロマトグラフィーのFlow throughモード（通過画分）或いは疎水性相互作用クロマトグラフィーのFlow throughモードによる精製工程を含むことができる。これらを組み合わせると、会合体以外の不純物の除去も含めて、効率的にpI値が3.0〜8.0である抗体を精製することができる。
【００６４】
すなわち、本発明は、以下の段階：
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷する工程、及び
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程
を含む方法によって、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を効率よく除去する方法に関する。
上記方法においては、付加的に、工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含むことができる。
【００６５】
後述のように本発明においては、さらには、陰イオン交換樹脂からの溶出画分を、マルチモードクロマトグラフィー或いは疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することもできる。これにより、不純物をより一層除去することができる。
【００６６】
除去される不純物は、目的のタンパク質以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、宿主細胞由来のタンパク質（Host cell proteins）やDNA、Protein A（カラムからの溶出物）、目的タンパク質由来の会合体や断片、ウイルス、エンドトキシン、培地成分であるHy-Fish(FL)、IGF、インスリン、抗生物質、消泡剤などを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明においては、好ましくはHost cell proteinsやDNA、Protein A、目的タンパク質由来の会合体（例えば抗体の会合体）、ウイルスを除去することができるがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明の方法によって除去されるウイルスは特に制限されない。本発明のウイルスには、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。ＤＮＡウイルスとしてMVMなどのパルボウイルス、ＲＮＡウイルスとしてMuLVなどのレトロウイルス、Reo 3などのレオウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法によって除去されるウイルスの具体的な例としては、例えば、MuLV、PRV、Reo 3、MVM、SV40、VSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、バルポなどのウイルス、好ましくは、MuLV、Reo 3、MVM、PRV、SV40などのウイルスを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６８】
本発明においては、低pI抗体の特徴を生かし、今までの比較的高いpIを有する抗体では達成し得なかった、陰イオンカラムのBind/Eluteモードによる抗体の精製方法を初めて確立した。また、これと合わせて、マルチモードクロマトグラフィー或いは疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いることで、より一層の不純物の除去が可能となる精製方法を初めて確立した。
【００６９】
本発明の方法において、陰イオン交換樹脂によりpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を精製する条件としては、通常、濃度1〜100 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、pHがpH 6からpH 9の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われる。好ましくは、濃度10〜50 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、pHがpH 7からpH 8の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われるがこれらに限定されない。
【００７０】
次いで、本発明の方法では、pI値が3.0〜8.0である抗体が吸着した陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含むことができる。洗浄は、通常の平衡化条件と同様の条件もしくは溶出される条件よりも低濃度或いは同等かそれより高いpHの緩衝液を用いて行われる。具体的には、濃度1〜100 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、pHがpH 6からpH 9の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われる。好ましくは、濃度10〜50 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、pHがpH 7からpH 8の緩衝液を用いて行われるがこれらに限定されない。
【００７１】
次に、本発明の方法では、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて陰イオン交換樹脂からBind/Eluteモードにより抗体を溶出させる。溶出条件としては、通常、濃度1〜500 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムを添加し、pHがpH 6からpH 9の緩衝液を用いて行われる。好ましくは、濃度10〜500 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに50〜500 mmol/Lの塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムを添加したpHがpH 7からpH 8の緩衝液を用いて行われるがこれらに限定されない。pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の塩濃度よりも高い塩濃度としては、例えば5mmol/L以上、好ましくは10mmol/L以上が挙げられるがこれらに限定されない。溶出溶液としては、塩化ナトリウム、Tris塩、硫酸ナトリウム塩、リン酸ナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも1つを含む溶液を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７２】
本発明においては、陰イオン交換樹脂から得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する溶出画分（溶出液）を、マルチモードクロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用と陰イオン交換作用の両作用を有する樹脂）を用いてさらに精製することもできる。
マルチモードクロマトグラフィー樹脂による抗体を含有する組成物の精製は、通常、濃度1〜500 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、アルギニンを添加しpHがpH 4からpH 9の緩衝液を用いて行われる。好ましくは、濃度10〜500 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに50〜500 mmol/Lの塩化ナトリウム及び／又は硫酸ナトリウムを添加したpHがpH 6からpH 7の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の方法により得られる陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をマルチモードクロマトグラフィーに負荷し、Flow through画分及び/又は溶出画分として、目的のpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する画分を得ることができる。通常、負荷画分は平衡化条件と同様のpHに予め調整され、必要に応じてさらに平衡化に用いる緩衝液と同様の塩が添加される。
本発明においてFlow through画分とは、カラムに負荷した画分のうち、カラムに吸着することなく回収される画分を指す（不純物がカラムに吸着し、目的物質はカラムに吸着しない）。一方溶出画分とは、カラムに負荷した画分のうち、負荷した画分の塩濃度よりも高い塩濃度の緩衝液を流して回収される画分を指す（目的物質が（場合によっては不純物も）カラムに吸着する）。
【００７４】
また本発明においては、陰イオン交換樹脂から得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する溶出画分（溶出液）を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてさらに精製することもできる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂による抗体を含有する組成物の精製は、通常、濃度1〜500 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、アルギニンを添加しpHがpH 4からpH 9の緩衝液を用いて行われる。好ましくは、濃度10〜500 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに50〜500 mmol/Lの塩化ナトリウム及び／又は硫酸ナトリウムを添加したpHが7から8の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われるがこれらに限定されない。
【００７５】
本発明の方法より得られる陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに負荷し、Flow through画分及び/又は溶出画分として、目的の抗体を含有する画分を得ることができる。通常、負荷画分は平衡化条件と同様のpHに予め調整され、必要に応じてさらに平衡化に用いる緩衝液と同様の塩が添加される。
本発明の方法において、緩衝液及び負荷画分を塩化物イオンを含まない組成にすることで緩衝液用タンク及び画分用タンクの防錆の効果が期待される。
【００７６】
本発明のpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法においては、陰イオン交換樹脂に負荷される組成物は、陰イオン交換樹脂に負荷する前に、プロテインAカラムクロマトグラフィーなど公知の精製方法により精製されたものであることができる。また陰イオン交換樹脂に負荷される組成物は、以下(a)-(c)を含む工程に供されたものであることができる。
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で保持する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程。
【００７７】
不純物が除去されたか否かの判定は、不純物がタンパク質の場合はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により行うことができるがこれらに限定されない。
またDNAの場合はqPCR法、スレッシュホールド法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
細胞由来タンパク質（Host cell protein/HCP)の場合は、抗HCP抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
プロテインAの場合は抗プロテインA抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
ウイルスの場合はqPCR法、組織感染法、プラーク法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
IGFの場合は抗IGF抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
インスリンの場合は抗インスリン抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
FLの場合は抗FL抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
消泡剤の場合はNMRにより行うことができるがこれらに限定されない。
エンドトキシンの場合は、カブトガニの血球抽出成分LAL（Limulus Amebocyte Lysate）を活性化する反応に基づき、比色法や比濁法により測定されるがこれらに限定されない。
抗生物質の場合はゲンタマイシンなどの抗生物質を特異的に認識する抗体を用いたELISA法により、その濃度を測定するがこれらに限定されない。
【００７８】
また本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体の製造方法であって、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体の会合体及び／又は不純物を除去する工程を含む方法に関する。また本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の製造方法に関する。当該方法は、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を取得する工程、及び
(b)本明細書に記載の精製方法等を用いて、工程(a)の組成物から、pI値が3.0〜8.0である抗体を精製する工程、
を含む。
【００７９】
抗体の精製には、抗体を含有する組成物から抗体の会合体及び／又は不純物を除去することが含まれる。本発明において得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含む組成物においては、会合体の含有割合は、例えば５％以下、好ましくは４％以下、特に好ましくは３％以下が挙げられるがこれらに限定されない。本発明において、会合体の含有割合とは、組成物に含まれる抗体に対する会合体を形成している抗体の割合をいう。
【００８０】
また本発明は、本明細書に記載の精製方法等あるいは製造方法によって得られるpI値が3.0〜8.0である抗体、あるいは当該抗体を含む組成物に関する。また本発明は、本明細書に記載の精製方法等あるいは製造方法によって得られるpI値が3.0〜8.0である抗体、あるいは当該抗体を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体及び／又は添加剤を含むことができる。
【００８１】
さらに本発明は、以下の工程を含む、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する医薬組成物を製造する方法に関する。
１）本明細書に記載の方法によりpI値が3.0〜8.0である抗体を取得する工程、及び
２）工程１）で製造したpI値が3.0〜8.0である抗体を、医薬的に許容される担体及び／又は添加剤と混合して製剤化する工程。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、溶液製剤（抗体含有溶液製剤）、あるいは凍結乾燥剤であることができる。本発明の溶液製剤には、凍結乾燥製剤の製造工程における凍結乾燥処理前の溶液または再溶解後の溶液も含まれる。本発明の溶液製剤は、製造過程に凍結乾燥工程を含むことなく製造される溶液製剤であることが好ましい。また本発明の凍結乾燥剤は、本発明の溶液製剤を当業者に公知の手法により凍結乾燥させることにより得ることができる。
【００８３】
また本発明の製剤には、必要に応じて、凍結保護剤、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の添加材や担体を含むことができる。
【００８４】
凍結保護剤として例えば、トレハロース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８５】
溶液補助剤として例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８６】
等張化剤として例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８７】
保存剤として例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８８】
吸着防止剤として例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８９】
含硫還元剤として例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
酸化防止剤として例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９１】
本発明の製剤は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、通常、非経口経路で投与される。具体的には、注射、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などにより投与される。注射剤型の例としては、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射などにより全身又は局所的に投与することができる。皮下注射の場合、注射液量の制限があるが1回あたりの抗体投与量を大量(100〜200 mg-程度)とすることができる。そのため、本発明の製剤は皮下投与（注射）用として特に適している。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９２】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００９３】
実施例1．ウイルス不活化及び中和後の保持による後工程での会合体形成抑制
本実施例においては以下の抗体を供した。
Mab1： WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、Mab3のアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体である。Mab1抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２で表される。
Mab2：WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した完全ヒト化NS22抗体である抗NR10（IL-31レセプター）抗体である。抗体クラスはIgG2で、アミノ酸配列を改変してpI値を5.6に低下させた抗体である。Mab2抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：３、L鎖／配列番号：４で表される。
Mab3：トシリツマブ（H鎖／配列番号：５、L鎖／配列番号：６）。pI値は9.4である。【００９４】
上記抗体は、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で精製し、下記の実施例の会合体除去評価に使用した。【００９５】
Mab1及びMab2をそれぞれ実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.8以下に30分以上保持した。保持した画分を1〜2 mol/L トリスにてpH 6.5以上に中和処理した。中和後の保持時間の異なる画分を用い、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法、或いは、陰イオン交換クロマトグラフィーを含む方法で会合体を除去し高純度に精製した。会合体を除去した画分をさらに保持して、精製後の保持時間に応じた会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【００９６】
ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーでは、Mab1については、10 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.5）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。10 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.5）でカラムを洗浄した後に、500 mmol/L NaCl, 10 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.5）により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。Mab2については10 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.5）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。100 mmol/L MES, 5 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.0）でカラムを洗浄した後に、200 mmol/L NaCl, 17.5 mmol/L リン酸緩衝液（pH 6.6）により塩濃度を上昇させることで溶出させた。【００９７】
陰イオン交換クロマトグラフィーでは、Mab1については、20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）でカラムを洗浄した後に、267 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。Mab2については20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）でカラムを洗浄した後に、350〜360 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0〜7.2）により塩濃度を上昇させることで溶出させた。
Mab3についても同様に塩酸で保持した後中和処理し，中和後の保持時間における会合体量を算出した。【００９８】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、各保持時間における抗体の会合体量を分析するために実施した。各サンプルを下記移動相により約1.0 g/Lとなるように希釈し、これらをG3000SWXLカラム（東ソー）により分析した。移動相には300 mmol/L NaClを含む50 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.5）を用い、流速0.5 ml/minにて分析した。単量体よりも早く溶出したピークを会合体として解析し、単量体と会合体の含量（%）を面積百分率法により算出した。【００９９】
Mab1及びMab2における、中和後の保持時間及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー実施後の会合体量（会合体の割合）を表１に示す。陰イオン交換クロマトグラフィー実施後の会合体量を表２に示す。Mab1、Mab2、Mab3における中和後の保持時間に応じた会合体量を表３に示す。これらの結果より、Mab1及びMab2いずれにおいても中和後すぐにクロマトグラフィーで会合体を除去しても、再度会合体が形成されるのに対して、中和後一定時間置いた後で精製することで、精製後の会合体増加はほとんど見られないことが明らかとなった。一方でMab3においては中和後の会合体の増加はみられておらず、次工程までの保持時間は必要ないと判断できる。【０１００】
【表１】
2015099165.tif 000002
【０１０１】
【表２】
2015099165.tif 000003
【０１０２】
【表３】
2015099165.tif 000004
※1  Low pH 3.1に1時間保持後pH7.0に中和（Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度：50mM）
※2  Low pH 3.1に1時間保持後pH7.0に中和（Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度：20mM）
※3  Low pH 3.6に1時間保持後pH7.0に中和（Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度：50mM）
※4  Low pH 3.4に1時間保持後pH7.0に中和（Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度：20mM）
※5  Low pH3.4に1時間保持後pH7.0に中和（Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の塩酸濃度：2.5mM）【０１０３】
実施例2．低pI抗体の精製プロセス 
実施例2-1．Mab1の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける塩化ナトリウム含有溶出液での会合体除去
抗IL-6レセプター抗体であるMab1は低pI(pI<8; pI 5.8)の改変抗体であり、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で高純度に精製し、下記の実施例の精製に用いた。
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後24時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表4に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）でカラムを洗浄した後に、20 mmol/L Tris-HCl, 100〜150 mmol/L NaCl緩衝液（pH 8.0）により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【０１０４】
【表４】
2015099165.tif 000005
【０１０５】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、各保持時間における抗体の会合体量を分析するために実施した。各サンプルを下記移動相により約1.0 g/Lとなるように希釈し、これらをG3000SWXLカラム（東ソー）により分析した。移動相には300 mmol/L NaClを含む50 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.5）を用い、流速0.5 ml/minにて分析した。単量体よりも早く溶出したピークを会合体として解析し、単量体と会合体の含量（%）を面積百分率法により算出した。【０１０６】
Mab1における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製後の会合体量を表5に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいてMab1の単量体と会合体が分離されることが明らかとなった。【０１０７】
【表５】
2015099165.tif 000006
【０１０８】
実施例2-2．Mab2の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける塩化ナトリウム含有溶出液での会合体除去
抗IL-31レセプター抗体であるMab2は低pI(pI<8; pI 5.6)の改変抗体であり、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aを含む当業者公知の方法で高純度に精製し、下記の実施例の精製に用いた。
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表6に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0或いは8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0）でカラムを洗浄した後に、20 mmol/L Tris-HCl, 200〜300 mmol/L NaCl緩衝液（pH 7.0）により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【０１０９】
【表６】
2015099165.tif 000007
【０１１０】
Mab2における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製後の会合体量を表7に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいてMab2の単量体と会合体が分離されることが明らかとなった。【０１１１】
【表７】
2015099165.tif 000008
【０１１２】
実施例2-3．Mab1の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける各種溶出液での会合体除去
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L HClを添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7.0以上に中和処理した。その後24時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表8に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）或いは20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）或いは20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）でカラムを洗浄した後に、240〜270 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 8.0）或いは40〜60 mmol/L リン酸ナトリウム緩衝液（pH 8.0）或いは20 mmol/L Tris-HClに20〜50 mmol/Lの 硫酸ナトリウムを含む緩衝液（pH 8.0）により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【０１１３】
【表８】
2015099165.tif 000009
【０１１４】
Mab1における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製後の会合体量を表9に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいてMab1の単量体と会合体が分離されることが明らかとなった。【０１１５】
【表９】
2015099165.tif 000010
【０１１６】
実施例2-4．Mab1の陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるトリス含有溶出液でのウイルスクリアランス能
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして市販のPOROS HQ樹脂（Life technologies社製）を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 7.8）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分にレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVを添加したものを負荷した。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 7.8）でカラムを洗浄した後に、225〜275 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 7.8）により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後に負荷画分と溶出画分のウイルス力価を測定してウイルス量を算出した。【０１１７】
Mab1における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製におけるウイルスクリアランス能を表10に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーによりTris-酢酸を用いて精製することで効果的にウイルスが除去されることが明らかとなった。【０１１８】
【表１０】
2015099165.tif 000011
【０１１９】
実施例2-5．Mab2の陰イオン交換クロマトグラフィーのトリス含有溶出液での会合体除去
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表11に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.0或いは8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 7.0或いは8.0）でカラムを洗浄した後に、300〜500 mmol/L Tris-酢酸（pH 7.0或いは8.0）により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【０１２０】
【表１１】
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【０１２１】
Mab2における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製後の会合体量を表12に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいてMab2の単量体と会合体が分離されることが明らかとなった。【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
実施例2-6．Mab2の陰イオン交換クロマトグラフィーのトリス含有溶出液でのウイルスクリアランス能
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして市販のPOROS PI樹脂（Life technologies社製）を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分にレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVを添加したものを負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）でカラムを洗浄した後に、470 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後に負荷画分と溶出画分のウイルス力価を測定してウイルス量を算出した。【０１２４】
Mab2における、陰イオン交換クロマトグラフィー精製におけるウイルスクリアランス能を表13に示す。この結果より、陰イオン交換クロマトグラフィーによりTris-HClを用いて精製することでウイルスが除去されることが明らかとなった。【０１２５】
【表１３】
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【０１２６】
実施例2-7．Mab1の陰イオン交換クロマトグラフィー及びマルチモードクロマトグラフィーでの精製
Mab1はCHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で高純度に精製したのち、実施例2-3及び2-4で示した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、下記の実施例の精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分に酢酸を用いてpH 6.5+/-0.3に調整した。マルチモードクロマトグラフィー（疎水＋陰イオン交換）の樹脂として市販のCapto Adhere（GE Healthcare社製）を用いて精製を行った。250+/-25 mmol/L Tris-酢酸緩衝液（pH 6.5）でカラムを平衡化した後に、pH調整した画分を負荷した。Flow through画分のMab1を回収した。【０１２７】
これら一連の精製により、工程由来不純物であるDNAを<1.0 pg/mg-Mab1（定量限界未満）、Host cell proteinsを<17 ng/mg-Mab1（定量限界未満）、leached Protein Aを<0.4 ng/mg-Mab1（定量限界未満）にまで除去するとともに実施例2-3に示すようにMab1の会合体除去が可能だった。ウイルスクリアランス能については実施例2-4に示す十分なウイルスクリアランス能に加えて、マルチモードクロマトグラフィー工程でもレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVにおいて5.42 Log10の高いウイルスクリアランス能を担保することが可能となった。
DNAは定量PCR法にて測定した。Host cell proteinsは抗Host cell proteins抗体を用いたELISA法にて測定した。leached Protein Aは抗Protein A抗体を用いたELISA法にて測定した。【０１２８】
実施例2-8．Mab2の陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーでの精製
Mab2をCHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aを含む当業者公知の方法で高純度に精製したのち、実施例2-2及び2-6で示した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、下記の実施例の精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分に塩（例えば硫酸ナトリウム）を終濃度が250 mmol/L以上となるように添加してpH 6.8〜8.0に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィーの樹脂（例えばPhenyl基を有する樹脂）を用いて精製を行った。添加した塩と同程度の濃度を含む緩衝液（pH6.8〜8.0）で平衡化した後に、画分を負荷し、Flow through画分のMab2を回収した。【０１２９】
これら一連の精製により、工程由来不純物であるDNAを1.9 pg/mg-Mab2、 Host cell proteinsを<8.0 ng/mg-Mab2（定量限界未満）、leached Protein Aを<0.4 ng/mg-Mab2（定量限界未満）にまで除去するとともに実施例2-2に示すようにMab2の会合体除去が可能だった。ウイルスクリアランス能については実施例2-6に示す十分なウイルスクリアランス能に加えて、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程でもレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVにおいて5.94 Log10、パルボウイルスのモデルウイルスであるMVMにおいて1.55 Log10の高いウイルスクリアランス能を担保することが可能となった。
DNAは定量PCR法にて測定した。Host cell proteinsは抗Host cell proteins抗体を用いたELISA法にて測定した。leached Protein Aは抗Protein A抗体を用いたELISA法にて測定した。【０１３０】
実施例3．ウイルス不活化後の中和後の保持pHの違いによる会合体形成
本実施例においては以下の抗体を供した。
Mab1： WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、Mab3のアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体である。Mab1抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２で表される。【０１３１】
上記抗体は、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で精製し、下記の実施例の会合体形成量評価に使用した。【０１３２】
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.8以下に30分以上保持した。保持した画分を2 mol/L トリスにて、当抗体のpIより低いpH5.0とpIより高い7.0で中和処理した。中和後、継時的にサンプリングを行い、会合体量を測定した。さらにpH5.0で中和したサンプルについては、22時間中和保持後にさらに2 mol/L トリスを添加して、pIより高い7.0に保持し、継時的にサンプリングを行い、会合体量を測定した。会合体量はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。【０１３３】
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、各保持時間における抗体の会合体量を分析するために実施した。各サンプルを下記移動相により約1.0 g/Lとなるように希釈し、これらをG3000SWXLカラム（東ソー）により分析した。移動相には300 mmol/L NaClを含む50 mmol/L リン酸緩衝液（pH7.5）を用い、流速0.5 ml/minにて分析した。単量体よりも早く溶出したピークを会合体として解析し、単量体と会合体の含量（%）を面積百分率法により算出した。【０１３４】
pH7.0で保持した場合の継時的な会合体増加量と、pH5.0で22時間保持した後にpH7.0で保持した場合の継時的な会合体増加量を表１４（pH 7.0で保持した場合）および表１５（pH5.0で22時間保持したのちに、pH7.0に上げた場合）に示す。これらの結果より、Mab1をpH5.0（Mab1のpIより低い）で中和し、継時的な会合体増加が安定したとしても、再びpHをｐH7.0（Mab1のpIよりも高い）に上昇させて保持すると再び継時的な会合体増加が見られ、一定時間保持したのちに安定することが明らかとなった。【０１３５】
【表１４】
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【０１３６】
【表１５】
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【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明により、特にpIが低い抗体を含有する組成物に含まれる抗体の会合体や不純物を効率よく除去できる精製法が提供された。本発明により、会合体の生成が抑制された抗体を含む製剤を提供することが可能となった。本発明の精製方法は、高い純度が求められるバイオ医薬品の製造において有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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