(57)【要約】  ポンプで送液される液体培地はチューブ内の移動中に気体との接触頻度が多く、送液の前後で液体培地のｐＨ値が変化しやすい課題がある。送液装置やそれを備えた細胞培養装置において、送液管７と気体バッグ１４を接続し、送液管７の中で送液する液体を、液体の質的変化を抑制する気体で挟むようにして送液する。さらに気体バッグと液体保持する容器８を接続し、容器の気相において、液体の質的変化を抑制する気体を保持する。
2016013070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を送液する送液管の一端に接続され、前記液体を受ける受容器と、
前記送液管の他端に接続され、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、
前記送液管で前記受容器に送液する前記液体を、前記気体で挟んで送液する送液機構部と、を備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項２】
請求項１に記載の送液装置であって、
前記液体を保持する液体ボトルと、
前記送液管を、前記液体ボトルに接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点を備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグの前記気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項３】
請求項２に記載の送液装置であって、
前記分岐点は、前記液体ボトルに保持された前記液体の液面より上方に設けられ、
前記液体ボトルに接続される流路内の前記液体が落差により前記液体ボトルに戻される際、当該流路は前記気体で満たされる、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項４】
請求項３に記載の送液装置であって、
前記送液機構部は、
前記液体ボトルを前記気体バッグに接続する気圧調整管と、
前記気圧調整管の開閉を制御するガス導通弁を更に備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項５】
請求項１に記載の送液装置であって、
逆止弁を有し、前記気体バッグに接続される気圧調整管を更に備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項６】
請求項１に記載の送液装置であって、
前記液体を保持する液体バッグと、
前記送液管を、前記液体バッグに接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点を備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグの前記気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項７】
請求項６に記載の送液装置であって、
前記分岐点は、前記液体バッグに保持された前記液体の液面より上方に設けられ、
前記液体バッグに接続される流路の前記液体が落差により前記液体バッグに戻される際、当該流路は前記気体で満たされる、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項８】
請求項１に記載の送液装置を用いる細胞培養装置であって、
前記受容器は細胞を培養する培養容器であり、前記液体は、前記細胞を培養する液体培地である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養装置であって、
前記気体は、所定濃度のＣＯ２ガスを含むガスである、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１０】
液体を保持する保持容器と、
前記液体を受ける受容器と、
送液管を用いて、前記保持容器の前記液体を前記受容器に送液する送液機構部と、
前記保持容器に接続され、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、を備え、
前記送液機構部は、前記保持容器の前記液体に接触する気相において、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の送液装置であって、
前記送液機構部は、
前記液体ボトルを前記気体バッグに接続する気圧調整管と、
前記気圧調整管の開閉を制御するガス導通弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１２】
請求項１０に記載の送液装置であって、
逆止弁を有し、前記気体バッグに接続される気圧調整管を備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１３】
請求項１０に記載の送液装置を用いる細胞培養装置であって、
前記受容器は細胞を培養する培養容器であり、前記液体は、前記細胞を培養する液体培地である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
請求項１０に記載の細胞培養装置であって、
前記液体の質的変化を抑制する気体は、所定濃度のＣＯ２ガスを含むガスである、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項１０に記載の細胞培養装置であって、
前記送液管を、前記液体ボトルに接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点とを備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグからの気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含み、
前記分岐点は、前記液体ボトルに保持された前記液体の液面より上方に設けられ、前記液体ボトルに接続される流路の前記液体が落差により前記液体ボトルに戻される際、当該流路は前記液体の質的変化を抑制する気体で満たされる、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する細胞培養装置に係り、特にその液体培地等の送液技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を構築して移植治療に用いる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Cell Processing Center：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で実施することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。【０００３】
これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成される。【０００４】
通常、培養時に手動で行う主な操作は、細胞を懸濁した液体培地を培養皿に送液する細胞播種作業と、培養中に定期的に実施する液体培地の交換作業である。この手動操作では使い捨ての分注チップを装着して使用する分注器あるいはメスピペッタを使用し、所定量の液体を定量分取し、液体ボトルの液体培地から培養皿への添加を実施する。分注とは、液体を定量して分取し、目的の場所に移送する２つの動作から成る。【０００５】
自動培養装置では、特許文献１に見るように、同様の分注器を機械化し手操作と同様の分取と移送の動作を連動して液体添加を行う方法があるが、装置全体を無菌環境に設置する必要から、装置は大型化する。一方、特許文献２に見るように、分注操作にポンプを使用した場合、液体ボトルから培養皿までの空間を使い捨てのチューブで接続し、ポンプによる定量と送液を同時に行う方法がある。この場合液体が送液されるチューブ内部を無菌状態に維持できればよく、自動化装置は小型化できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献２】特開２００７−２２２１２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
分注操作に伴う上述した２つの方法は、装置の大小の差の他に、分注しようとする液体に接触する気体との接触機会の頻度の違いがある。細胞培養に使用する液体培地の多くは培地のｐＨを制御するために重炭酸緩衝系と呼ばれるＮａＨＣＯ3などの塩基成分が含まれており、これらは大気（一般値としてＣＯ２０．０４％、Ｏ２２０％、Ｎ２７８％ほか）との接触によりｐＨ値が変化する。よって細胞培養では通常５％にＣＯ２の濃度を高めたＣＯ２インキュベータの庫内で保持し、培地に接する気相との接触で培養中のｐＨ値を制御している。なお、大気も混合ガスの１種であるが、本明細書では、両者の区別のため大気は前記の濃度に準じた濃度の気体を指し、ガスは大気以外で意図して調整されて混合された気体を指すこととする。【０００８】
第１の課題として、分注チップ或いはメスピペットなどの器具を用いた場合に比べ、液体のチューブ内の移動中に気体との接触頻度が多く、送液の前後で液体培地のｐＨ値が変化しやすい課題がある。特許文献２では、薬品の供給操作で送液チューブにインキュベータ内の空気が流入し、送液チューブの目詰まりが発生するのを防止する方法が記載されているが、送液する液体の質的変化抑制を目的としたものでなく、それを示唆する記載はない。【０００９】
手技培養に関しても通常は液体培地の交換作業は安全キャビネット内で無菌的ではあるが、大気環境下で行われ、分注作業によって液体培地と大気との接触は不可避であるので、熟練者は一度の処理数を制限するなどして分注の作業時間の短縮化を行っており、このような作業ノウハウが手技培養のばらつきを生じさせ、液体培地のｐＨ値が変化させることが課題となっている。【００１０】
第２の課題として、経時変化によって、交換用にストックされた液体培地のｐＨ値が変化する課題があった。具体的には細胞培養の工程では幾度となく古い培地を新しい培地に交換する作業を行うため、培養開始前に液体培地をふた付ボトルに大量に準備するが、経時変化によって準備された液体培地のｐＨ値が変化していた。大気環境下で行う培地交換作業では、液体培地を保持した培地ボトルのキャップの開閉を幾度となく行う。その際、液体培地の使用に伴って減量した相当の体積分の大気が培地ボトルに進入するので、培地ボトルのｐＨ値は次第に高くなる。熟練者は培地交換前に液体培地をＣＯ２インキュベータの庫内で保持して、ｐＨ調整を行うなどの方法を行っているが、このような作業ノウハウが手技培養のばらつきを生じさせ、大きく変化した液体培地のｐＨ値は、通常５％濃度のＣＯ２インキュベータでの換気では使用開始時のｐＨ値に回復しない場合があり、これらが細胞培養の再現性を損なう原因となっている。【００１１】
本発明の目的は、上記の課題を解決し、送液する液体培地の質的変化を抑制して、細胞培養を行うことを可能とする送液装置、及び細胞培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明においては、液体を送液する送液管の一端に接続され、液体を受ける受容器と、送液管の他端に接続され、液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、送液管で受容器に送液する液体を、液体の質的変化を抑制する気体で挟んで送液する送液機構部と、を備える構成の送液装置、及びそれを利用する細胞培養装置を提供する。【００１３】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、液体を保持する保持容器と、液体を受ける受容器と、送液管を用いて、保持容器の液体を受容器に送液する送液機構部と、保持容器に接続され、液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグとを備え、送液機構部は、保持容器の液体に接触する気相において、液体の質的変化を抑制する気体を保持する送液装置、及びそれを利用する細胞培養装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る送液装置によれば、送液する液体の質的変化が抑制される。また、送液された後の容器内での液体の質的変化が回避される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１に係る、送液装置の一構成例を示す図である。
【図２】実施例１に係る、送液装置の制御フローチャートの一例を示す図である。
【図３】実施例２に係る、送液装置の一構成例を示す図である。
【図４】実施例３に係る、細胞培養装置の一構成例を示す図である。
【図５】実施例３に係る、細胞培養装置の制御フローチャートの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【実施例１】
【００１７】
実施例１は、液体を送液する送液管の一端に接続され、液体を受ける受容器と、送液管の他端に接続され、液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、送液管で受容器に送液する液体を、液体の質的変化を抑制する気体で挟んで送液する送液機構部と、を備える構成の送液装置の実施例である。また、液体を保持する保持容器と、液体を受ける受容器と、送液管を用いて、保持容器の液体を受容器に送液する送液機構部と、保持容器に接続され、液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグとを備え、送液機構部は、保持容器の液体に接触する気相において、液体の質的変化を抑制する気体を保持する送液装置の実施例である。
以下、図１−図２を参照しながら、本実施例に係る送液装置の一構成例を順次説明する。【００１８】
図１は、本実施例の液体の落差を利用した送液装置の一構成例を示す図である。送液装置１において、２は液体を保持する液体ボトルであり、この液体ボトル２は、蓋により内部を気密に保持できる。３は蓋に設けた気圧調整のための気圧調整管であり、気圧調整管３の開閉を制御するガス導通弁４に接続され、ガス導入弁４を介して、後述する気体導入管１３に接続され、気体バック１４に接続される。ガス導通弁４に使用する弁機構は電磁弁が好適である。いわゆる電磁弁は電磁石の作用により開閉する部品にチューブを挟み込んで取り付け、電磁弁のＯＮ／ＯＦＦによりチューブを弾性変形させて管部を開放／閉止する機構である。以下の説明において、弁は電磁弁を意味することとする。【００１９】
液体ボトル２の蓋には、供給管５が設けられ、供給管５の一端は、液体ボトル２の内部に開口端を持ち、この開口端は液体に接して液体排出口となる。また、供給管５の他端は、後で説明する流路を分岐する分岐点１１に接続される。６は送液機構部の一部を構成するポンプであり、ポンプ６は、分岐点１１で供給管５に接続される送液管７の途中に設置され、その一端の送液管７は分岐点１１に接続され、もう一端は液体を受ける受容器８に接続する。受容器８は送液の目的先である培養容器などである。受容器８の蓋部分に送液管７と気圧調整管９が設けられ、気圧調整管９はメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタ１０を介して外気に開放されている。【００２０】
同図に明らかなように、流路を分岐する分岐点１１は液体ボトル２に保持された液体の液面より上方に設けられる。分岐点１１には、更に気体導入弁１２を介して気体導入管１３が接続される。気体導入弁１２は、分岐点１１と気体バッグ１４を接続する気体導入管１３を開閉する。気体バッグ１４には、送液する液体に対し、質的変化を抑制するガスを送液に必要な体積量以上のガス量を予め保持している。コントローラ１５は、ポンプ６、気体導入弁１２、及び図示を省略したがガス導通弁４をタイミングよく制御するよう動作する。【００２１】
すなわち、図１の構成にあって、送液管７は、分岐点１１において、液体ボトル２に接続される流路と、気体導入弁１２を介して気体バッグ１４に接続される流路に分岐接続する。気体で挟んで受容器に液体を送液する送液機構部は、送液管に設置されたポンプ６と、気体バッグの気体を分岐点に導入する気体導入弁１２、及びこれらを制御するコントローラ１５、更には気圧調整管３の開閉を制御するガス導通弁４などで構成される。分岐点１１は、液体ボトル２に保持された液体の液面より上方に設けられ、後で詳述すするように、液体ボトル２に接続される流路の液体が落差により液体ボトル２に戻される際、流路は前記の気体で満たされる。【００２２】
本実施例の送液装置１は以下のように定量と送液を行う。ポンプ６の流量をＱ（体積／時間）とする。まず、ガス導通弁４は閉止し、気体導入弁１２を開放して、ポンプ６を所定時間（パージ時間）稼働させると、分岐点１１を介して送液管７内の気体を送気し、気体に連なった気体バッグ１４内のガスが送液管７内を通過して管内を満たし、さらにガスが受容器８に到達し、元々は大気であった容器内の気相がガスで置換される。受容器８の体積の１００倍相当以上のガス量によって容器内の気相は概ね送気するガス濃度と同等となる。受容器８内が加圧されぬように容器内の過剰なガスは気圧調整管９からフィルタ１０を介して大気に放出される。【００２３】
次いで気体導入弁１２を閉止したのち、ガス導通弁４を開放してポンプ６を所定時間（送液時間）稼働させると、ポンプ６は供給管５内の気体を送気し、気体に連なった液体ボトル２内の液体が供給管５を通過して、送液が開始される。液体は分岐点１１を通過し、送液管７に到達する。ポンプ６の作動時間は、目的の液量Ａおよび分岐点１１から液体ボトル２内の液体の液面に相応する管の体積（以下戻り量とする）Ｂ、これらを足し合わせた総液量Ｃを流量Ｑで割った値（送液時間）である。所定時間後にポンプ６を停止すると、ポンプ６の内部構造により管は閉塞されており、液体は移動しない。液体ボトル２の気相には、供給管５を介して送液された液量に相当するガスが気体バッグ１４内より送気される。【００２４】
その後、気体導入弁１２を開放すると、気体バッグ１４よりガスが送気されて、分岐点１１位置から液体ボトル２間の供給管５にある液体（戻り量Ｂ）は、液体の落差から生じる位置エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。このとき供給管５にある液体に連なって移動する気体は、気体バッグ１４内のガスであり、分岐点１１から供給管５の管内はガスで満たされる。液体ボトル２内の気体は戻り量Ｂに相当する量が気圧調整管３とガス導通弁４より気体バッグ１４に移動される。【００２５】
一方、分岐点１１よりポンプ６側の送液管７内の液体は、前述のポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。次いでポンプ６を所定時間（排出時間）作動させると、分岐点１１より順次ガス導入がされるとともに液体が送液管７を移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後方が受容器８に到達すれば、目的の液量Ａが受容器８に保持される。一方でポンプ６は、その内部を液体の通過後も分岐点１２からのガスに圧力を与え続け、液体を後方から押し続けており、受容器８に液体到達後も、液体に続くガスが送液管７経由で受容器８に供給される。即ち、前述の排出時間は液体が送液管７から排出して送液管７の液体を空にする時間と、それに続くガスを送気して受容器８内に気体バッグ１４からのガスを供給する時間を合算したものである。【００２６】
図２に本実施例の送液装置のコントローラ１５等による制御フローチャートの一例を示す。初期条件として前記したガス導通弁４、気体導入弁１２は閉止、およびポンプ６は停止である。「ＳＴＡＲＴ」についで、気体導入弁１２を開放し（Ｓ１）、ポンプ６にパージ時間を与えて稼働させ、液体の質的変化を抑制するガスを注入し、送液管７および受容器８内部をガスで置換する（Ｓ２）。気体導入弁１２を閉止し（Ｓ３）、ガス導通弁４を開放し（Ｓ４）その後にポンプ６に送液時間を与え稼働させ、送液を実行する（Ｓ５）。次いで気体導入弁１２を開放し（Ｓ６）、その後ポンプ６に排出時間を与え稼働させる（Ｓ７）。任意時間後に気体導入弁１２を閉止し（Ｓ８）、ガス導通弁４を閉止する（Ｓ９）。次の送液操作がないかを確認し（Ｓ１０）、引き続き次の送液を行う場合は、最初に戻り操作を繰り返し、次の送液操作がない場合は終了（ＥＮＤ）する。【００２７】
本実施例の送液装置１を使用すれば、送液する液体の質的変化が抑制される。その理由は、送液する液体の質的変化を抑制するガスを気体バッグ１４に保持し、送液機構部を動作させれば、言い換えるなら気体導入弁１２を開放してポンプ６を作用すれば、送液の事前に送液管７と受容器８が抑制ガスで満たされる。その後、送液機構部を動作、即ち気体導入弁１２を閉止して、ポンプ６を作用すれば、液体ボトル２より液体が移動し、液体ボトル２より所定量が移動の後、気体導入弁１２を再度開放すれば、液体は進行方向と後方の両方を液体の質的変化を抑制するガスで挟まれて送液されるからである。【００２８】
加えて、本実施例の送液装置において、送液された直後の受容器８内での液体の質的変化が回避される理由は、前記した液体が進行方向と後方をガスで挟まれた状態より、ポンプ６を作用させて液体全量を受容器８に到達させる。このとき、ポンプ６は液体の通過後、液体の質的変化の抑制ガスに圧力を与え続け、液体を後方から押し続けているため、液体到達後も液体に続く抑制ガスが受容器８に供給され続けるから、送液された直後の受容器８内は液体と抑制ガスで満たされるので、液体は大気に接触されることがないからである。【００２９】
加えて、液体ボトル２での保管状態での液体の経時的な質的変化が抑制される。その理由は、送液操作によって液体ボトル２内の液体に接触する気相は、液体ボトル２内で液体表面と進行方向が抑制ガスで挟まれた状態で保管され、液体は大気への接触が低減されるからである。【００３０】
さらに次回の送液操作があるときは、初回の操作後は、供給管５の管はガス濃度が高くなっているので、液体の質的変化抑制にとってより有利である。これを利用すれば、初回の送液は使用せず、２回目の送液操作で得られた液体を採用して使用する運用も可能である。【００３１】
以上説明した本実施例の送液装置を、細胞培養における細胞を懸濁した液体培地または液体培地単体の送液に使用すれば、その効果はより顕著である。液体培地は大気との接触によりｐＨ値が変化するが、本実施例の装置構成において気体バッグ１４にｐＨ値の維持に適正なＣＯ２濃度のガスを保持し、図２に示した操作フローによって液体ボトル２から液体培地を送液すれば、液体培地は進行方向と後方を適正なＣＯ２濃度のガスで挟まれて送液されるので、送液中の液体培地のｐＨ値の変化を抑制できる。【００３２】
なお、上述したように送液機構部のポンプ６にはローラーポンプが好適であるが、ダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど他の方式のポンプでも適用できる。いわゆるしごきポンプ、チューブポンプともいうローラーポンプは、モータ回転軸に取り付けたローラーにチューブを巻きつけて、モータ回転によってチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構である。細胞培養装置では送液のチューブの滅菌性を確保する必要があり、使用ごとにチューブを交換可能であるローラーポンプは有用である。勿論、使用前に内部を滅菌可能であれば、どの様な送液ポンプも使用可能である。【００３３】
また、ポンプの停止時には内部の液体が移動しない構成が必要であるが、液体が移動する構成のポンプの使用時には、ポンプの前後いずれかに送液ボトル側への流れを制限する逆止弁を介して管路を構成すれば、本実施例の装置に適用できる。更に、受容器８に接続されたフィルタ１０は説明の簡略化のために弁を省略したが、気圧調整管９を開閉する弁や、逆止弁を設ければ送液後の受容器８は気密に維持でき、細胞を播種すれば培養容器として利用できる。【００３４】
本実施例の送液装置で、複数の容器に同じ液量を送液するときは、ポンプ６と受容器８の間に、図示しない容器の数に応じた分岐点とその各々に対応する容器開閉弁を設け、送液したい受容器８に接続された容器開閉弁のみ開放し、上記の操作を繰り返し実行すれば、同じ液量を送液できる。また送液ごとに排出管７をガスで通気して管路内に液体培地を保留させないため、乾燥環境下での送液操作であっても閉塞の恐れがない。【００３５】
また、本実施例の送液装置における気圧調整管３、送液管７、気体導入管１３に使用するチューブには、可とう性を有した樹脂材が好適であり、さらに内部をガスで通過させる必要から、ガス透過性が低いものがよく、エチルビニルアルコール（ＥＶＯＨ）やポリエステル、ポリ塩化ビニルなどが用いられる。チューブを電磁弁で閉止するには高弾性であるゴムを使用する必要があるが、ガス透過性の低いゴム素材は高価で種類が少ないので、ゴムの使用長は極力最小とすべきである。【００３６】
更に、本実施例の送液装置における気体バッグ１４の形状としては、気体導入管１３との接続部をもった袋状のものがより好適である。気体を保持するものとして、ボトル形状のものも使用できるが、所定のガスを所望のガス濃度で保持するには、大気からガスに置換する工程が必要となってガス濃度管理が容易ではなく、さらに過剰量を保持した際内部に圧力を保持するようになる点に留意しなければならない。気体バッグが袋形状のものであれば、ガスの充填の際は事前に押しつぶして内部の気体を排出し、その後に所望のガスを充填すれば、所望のガス濃度でその容積内にガスを保持することが容易である。また、過剰量を保持した際充填部位を切り離せば、過剰なガスは排出されてその内部は大気圧相当に保持される点も有用である。気体バッグの素材としては樹脂材が好適であり、さらに内部をガス保持させる必要から、ガス透過性が低いものがよく、エチルビニルアルコールやポリエステル、ポリ塩化ビニルなどが用いられる。【００３７】
以上説明した通り、実施例１に係る送液装置によれば、送液する液体の質的変化が抑制され、更に、送液された直後の容器内での液体の質的変化が回避される。
【実施例２】
【００３８】
続いて、図３を参照しながら、実施例２に係る送液装置の一構成例を説明する。実施例２の送液装置１６は、実施例１の液体ボトルに代え、液体バッグを用いる送液装置の実施例である。すなわち、液体を保持する液体バッグ１７と、送液管７を、液体バッグ１７に接続される流路と、気体バッグ１４に接続される流路に分岐接続する分岐点１１を備え、送液機構部は、送液管７に設置されたポンプ６と、気体バッグ１４からの気体を分岐点１１に導入する気体導入弁を含んでおり、分岐点１１は、液体バッグ１７に保持された液体の液面より上方に設けられ、液体バッグ１７に接続される流路の液体が落差により液体バッグ１７に戻される際、流路は前記の気体で満たされる。【００３９】
本実施例の送液装置においては、図３に示す様に、液体バッグ１７を用いるため、実施例１のように、気圧調整管３とガス導入弁４を利用しない。液体保持部に液体バッグ１７を使用するが、供給管５からコントローラ１５までは、第１の実施例の構成と同じであるので、共通する機構・動作は説明を省略する。【００４０】
実施例１の液体ボトル２を利用する場合は、蓋付ボトルのように固形した形状が液体を入れやすく、液量の確認も容易で便利であるのに対し、本実施例の袋状の液体バッグ１７を使用する場合は、次の効果がある。【００４１】
液体バッグ１７は、供給管５を有する袋状のものであって、密閉構造を有するので、液体の充填の際は事前に押しつぶして内部の気体を排出後に所望の液体を充填すれば、内部に大気の混入を制限して所望の液体だけをその容積内で保持することできる。一方、送液時には、実施例１同様、液体バッグ１７に保持された液体より高さが上方に分岐点１１が設けてあれば、液体の落差による戻り液は実施例１と同様に行われ、かつ液体バッグ１７内の液体の増減量分に相応する気圧調整は液体バッグ１７が変形することで調整される。【００４２】
よって、本実施例の構成の送液装置は、液体ボトルを使用した送液装置に比べ、内部に大気の混入を制限し液体と大気の接触頻度を最小化できるので、液体は大気に接触されることがなく、経時的な液体の質的変化がより回避されるという効果がある。
【実施例３】
【００４３】
本実施例は、実施例１で説明した送液装置を用いた細胞培養装置の実施例である。以下、図４、図５を用いて、受容器である細胞培養容器への液体培地の供給又は排出を行う送液制御機構を備えた細胞培養装置の実施例を説明する。【００４４】
図４は、実施例１で説明した送液装置を用いた細胞培養装置の一構成例を示す図である。同図において、細胞培養装置１８の恒温槽６３は、コントローラ６５の制御により細胞培養に最適な培養温度に維持され、その内部に培養容器３９を保持する。恒温槽６３と冷蔵庫６４内に設置された実施例１で説明した送液装置および培養容器は、接続された一体の流路として交換可能であり、培養作業ごとに一体の流路は取り外して、新たな流路を設置して使用する。【００４５】
本実施例の細胞培養装置の培養容器３９へ、液体を送液、または気体を送気する構成を説明する。細胞を懸濁した細胞懸濁液を保持する細胞バッグ２０は、その内部を気密に保持できる。その供給管２３の一端は、細胞バッグ２０の内部に開口端を持ち、保持した細胞懸濁液に接して液体排出口となる。供給管２３は開閉弁２４を介して、図１の分岐点１１に対応する流路を分岐する分岐点２５に接続される。【００４６】
分岐点２５は複数の分岐合流点であり、ひとつは気体導入管２８を制御する気体導入弁２７に接続され、ひとつは液体を供給する供給管３４を制御する供給弁３５に接続され、さらに下流の後述する換気分岐点２６からガス供給管５１に接続される。すなわち、送液管３８を、液体ボトル２０に接続される流路と、気体バッグ２９に接続される流路に分岐接続する分岐点２５とを備え、送液機構部は、送液管に設置されたポンプ３６と、気体バッグ２９からの気体を分岐点２５に導入する気体導入弁３５を含み、分岐点２５は、液体ボトル２０に保持された液体の液面より上方に設けられ、液体ボトル２０に接続される流路の液体が落差により液体ボトル２０に戻される際、流路は液体の質的変化を抑制する気体で満たされる。【００４７】
更に、供給弁３５に繋がる供給管３４は培地ボトル３３に接続される。培地ボトル３３は、実施例１の液体ボトル２に対応し、培地交換用の液体培地を保持する液体ボトルであり、低温保持する冷蔵庫６４内に保持される。細胞バッグ２０は、そのふた部に気圧調整のための気圧調整管２１を備え、気圧調整管２１にフィルタ、或いはガス導通弁２２が接続される。簡略化のため図示を省略したが、その開閉を制御可能なガス導通弁２２を用いる時は、図１のガス導通弁４と同様、ガス導通弁２２を介して、後述する気体導入管３１、気体バッグ２９に接続される。【００４８】
気体導入弁２７に繋がる気体導入管２８は、フィルタ３０を介して気体バッグ２９に接続され、実施例１の気体バッグ１４に相当する気体バッグ２９には細胞懸濁液または液体培地のｐＨ値の変化を抑制するガスを至適な濃度で保持することができる。本実施例の気体バッグ２９には気圧調整管３１を介して逆止弁３２が設けられ、逆止弁３２の開放端は恒温槽６３内の大気に開放している。チェックバルブとも呼ばれる逆止弁３２は内部の流体の流れる方向を一方向に制限するものであり、本実施例では気圧調整管３１から恒温槽６３の空間の方向にガスを流通する。分岐点２５は実施例１の分岐点１１同様、細胞バッグ２０に保持される液体の液面より上方に設けられ、かつ培地ボトル３３に保持する液体の液面より上方に設けられる。【００４９】
換気分岐点２６は送液ポンプ３６に接続される。また、送液ポンプ３６をバイパスするように第３ガス開閉弁３７が設けられ送液管３８に接続される。送液管３８に培養容器３９が接続される。換気分岐点２６から下流の流路を全て送液管と総称することもできる。【００５０】
培養容器３９は、外観が本体部とふた部からなる気密な容器であり、内観は本体部の内底部に細胞を保持して培養可能な容器である。ふた部には３つの貫通するポートが設けられており、それぞれ送液ポート４０と気圧調整ポート４１と排出ポート４２からなる。送液ポート４０は送液管３８に接続され、その開口端はふた部の内側近傍に設けられている。気圧調整ポート４１はその開口端はふた部の内側近傍に設けられ、気圧調整管４３に接続されている。気圧調整管４３は気圧調整弁４４により制御され、更にフィルタ４５を介して恒温槽６３の大気に開放されている。排出ポート４２は排出管４６に接続され、その開口端は内底面近傍に接して設けられている。【００５１】
気圧調整弁４４を開放し送液ポンプ３６が作用するとき、開閉弁２４だけが開放されていれば、細胞バッグ２０の細胞懸濁液を培養容器３９に送液し、培地開閉弁３５とガス導通弁２２だけが開放されていれば、培地ボトル３３の液体培地を培養容器３９に送液し、気体導入弁２７だけが開放されていれば、気体バッグ２９のガスを培養容器３９に送気する。このときいずれの場合も培養容器３９内にあった元々のガスは送液ポンプ３６の圧力によりフィルタ４５を介して、恒温槽６３の大気へ放出され、培養容器３９内は常圧に保持される。【００５２】
次に、培養容器３９より、容器内に保持されている液体または気体を排出する構成を説明する。培養容器３９に接続された排出管４６は、排出制御弁４７を介して排出ポンプ４８に接続され、排出ポンプ４８には排液管４９、排液バッグ５０が気密に接続されている。気体導入弁２７と第３ガス開閉弁３７を開放し排出ポンプ４８が作用するとき、排出制御弁４７が開放されていれば、培養容器３９の底部に保持された液体が排液バッグ４９に送液される。このとき培養容器３９内より排出ポンプ４８の吐出量に相当する液体と気体が減量し、排出ポンプ４８の圧力により気体バッグ２９からガスが培養容器３９に流入するので、培養容器３９内は常圧に保持される。【００５３】
培養容器３９の気相をガスで換気する構成を以下説明する。５９はガス混合機であり、上流には減圧調整された１００％ＣＯ２ボンベ６０と、窒素ボンベ６１とフィルタ６２に接続されており、大気に開放されたフィルタ６２より、フィルタ６２を介して清浄な空気を供給することができる。ガス混合機５９は任意のガス濃度を生成することが可能であり、一例として大気に対し５％ＣＯ２が必要なとき、フィルタ６２から供給される大気で１００％ＣＯ２ボンベ６０から供給されるＣＯ２ガスを希釈して目的のガス濃度が生成でき、また低酸素ガスとして５％ＣＯ２、１％Ｏ２ガスが必要なとき、窒素ボンベ６１で１００％ＣＯ２ボンベ６０から供給されるＣＯ２ガスを希釈して目的のガス濃度が生成できる。【００５４】
流量調整機５８は、フィルタ５４を介してガス混合機５９に接続されており、ガス混合機５９で目的のガス濃度に調整されたガスの流量を０から任意の量に制御することができる。流量調整機５８の流出側は分岐され、換気管５１を制御する第１ガス開閉弁５２および加湿管５５に接続される。加湿管５５は滅菌水を内部に保持した加湿ボトル５６に接続され、加湿ボトル５６に設けられた加湿管５７を制御する第２ガス開閉弁５３に接続される。第１ガス開閉弁５２と第２ガス開閉弁５３は合流して、換気管５１を通じて換気分岐点２６に接続される。【００５５】
細胞培養中の液体培地はｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的にＣＯ２ガスで液体培地の表面よりガス交換を行う必要がある。加えて液体培地の蒸発による液体培地成分の濃縮を防止する必要がある。培養容器３９の気相をガス交換および加湿を行うときは、第２ガス開閉弁５３と第３ガス開閉弁３７と気圧調整弁４４を開放した後、ガス混合機５９より調整されたガスが流量調整機５８の流量調節によって、適当な流量に制御されて、加湿管５５を経て加湿ボトル５６内の滅菌水を通過して加湿される。加湿ボトル５６内で泡末状となったＣＯ２ガスは、加湿ボトル５６内の気相に滞留し、加湿管５７から換気管５１、第３ガス開閉弁３７を経由し、培養容器３９に到達する。【００５６】
気体バッグ２９に所望のガス成分を必要量充填するときは、第１ガス開閉弁５２と気体導入弁２７を開放した後、ガス混合機５９より調整されたガスが流量調整機５８の流量調節によって、換気管５１、気体導入管２８を通過して気体バッグ２９に到達する。気体バッグ２９の体積は、１回の細胞培養に必要なガス量より大きい体積であることが望ましいが、何リッター（Ｌ）もの必要量が生じたとき、それに見合う空間体積を装置内部に保有することは装置が大型化する。よって培地交換の前に最小必要量のみ保持し、培養期間中は定期的に充填利用するほうが気体バッグは小さくできる。【００５７】
その際、充填時に過剰にガスを充填することは、気体バッグ２９に常圧よりも高い圧力を保持することなり、送液時における気体導入において、送液する液体にポンプの吐出圧力以外の外力をあたえてしまう。また前回使用後の残量を計算して補充量を決める方法、気体バッグの内部圧力センサを使用して送気量を管理する方法は制御を複雑化させる。本実施例では、過剰なガス量を充填したとき、気圧調整管３１を介して逆止弁３２が設けられているので、過剰なガスは逆止弁３２より恒温槽６３内の大気に放出され、気体バッグ２９の内圧が大気圧程度になったときガスの放出は停止される。つまり補充の際は気体バッグの前回残量に関わらず、常に一定量のガス量を保持することが可能である。【００５８】
続いて、本実施例における細胞培養装置の細胞培養の操作について説明する。図５は、コントローラ６５で制御される細胞培養装置における細胞培養の全体的な操作のフローチャートを示している。「ＳＴＡＲＴ」についで、恒温槽に流路を設置したのち（Ｓ０１）、別途準備した細胞懸濁液を保持する細胞バッグと、液体培地を保持した培地ボトル２０を流路に接続する（Ｓ０２）。次いで自動で気体バッグにガスを充填する（Ｓ０３）。培養容器にガスを送気したのち細胞懸濁液を送液する（Ｓ０４）。直ぐに培養容器に加湿されたガスを送気して、細胞に対し恒温維持して静置する（Ｓ０５）。細胞培養の進行状態によって、液体培地の交換を開始するかの判定を行う（Ｓ０６）。液体培地の交換に当たっては、気体バッグにガスを充填後（Ｓ０７）、培養容器の古い培地を排出したのち（Ｓ０８）、培地ボトルより新しい液体培地を送液する（Ｓ０９）。引き続き加湿ガスの送気と静置を行い（Ｓ１０）、細胞培養の進行状態によって、培養の継続判定を行い（Ｓ１１）、培地交換を再実行する。細胞培養の終了時には、自動培養を終了し、手作業で培養した細胞の取り出しを行い（Ｓ１２）、細菌増殖の有無を確認するため排液バッグを回収して（Ｓ１３）、使用済みの流路を恒温槽より取り外して終了（ＥＮＤ）する。【００５９】
以下に第３の実施例の細胞培養装置および送液装置を用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法の具体例、およびその結果について説明する。【００６０】
＜細胞培養装置および送液装置の構成＞
恒温槽には恒温培養器（東洋製作所社、型番ＴＶＨＡ６０ＷＡ１２Ａ）を使用し、庫内温度を３７°Ｃで運用し、冷蔵部には電子冷熱低温恒温器（東洋製作所社、型番ＴＨＳ０３０ＰＡ）を使用し、庫内温度を４°Ｃで運用した。【００６１】
電磁弁にはピンチバルブ（流体圧力０．１５ ＭＰａ、高砂電気工業社、型番ＰＳＫ−１６１５ＮＣ−９）を使用した。本電磁弁に対応する供給管にはシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ  サンゴバン社、型番３３５０）を使用した。各ポンプにはチューブポンプ（吐出/吸入圧力  ＋／−０．１ＭＰａ、 ウェルコ社、型番ＤＳＷ２−Ｓ１ＡＡ−ＷＰ）としごき用チューブとしてシリコンゴムチューブ（内径１／１６インチ、外径１／８インチ  サンゴバン社、型番３３５５Ｌ）を組み合わせて使用した。本品はローラー部が本体のモータ部から着脱可能であるので、シリコンゴムチューブ（１３ｃｍ長）をローラー部に巻きつけた状態で滅菌操作が可能である。本ポンプの流量は、ＤＣ１２Ｖ入力において、実測結果より０．１５ｍＬ/秒であった。【００６２】
細胞バッグにはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量１５０ｍＬ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０２６４３）を使用した。【００６３】
培地ボトルにはクローズドシステム  三角フラスコ（容量５００ｍＬ、コーニング社、型番＃１１４４０）を使用した。本品は予め滅菌された、容器部とふた部と、ふた部に設けられた気圧調整のための管路と、メッシュサイズ０．２２μｍのフィルタから成る。【００６４】
排液バッグにはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量０．５Ｌ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０２６７０）を使用した。【００６５】
気体バッグにはＦｌｅｘｂｏｙバッグ（ＥＶＡ、ＥＶＯＨ２重構造、容量１Ｌ、ザルトリウス社、型番＃ＦＦＢ１０３５４７）を使用し、ひとつのルアーポート部に接続した逆止弁にはチェックバルブ（アラム社、型番＃ＰＲＣ１５、クラック圧０．２〜１.５ｋＰａ）を使用した。【００６６】
加湿ボトルには、ガス洗浄瓶（容量５００ ｍＬ、アズワン社、型番６−１２９−０２）と、ガス交換部にはケラミフィルター（フィルタサイズ１５×１５ｍｍ、アズワン社、型番２−５５４−１０）を組み合わせて使用した。【００６７】
気体導入弁あるいは加湿ボトルの外気に接するフィルタにはミディザルト２０００（メッシュサイズ０．２２μｍ、ザルトリウス社、型番＃１７８０５−Ｅ）を使用した。【００６８】
電磁弁の閉止部位およびポンプ部のしごき部位以外のチューブには材質が塩化ビニルであるタイゴンＮＤ−１００（内径１／１６インチ、外径１／８インチ、サンゴバン社、型番  ＃ＡＤＦ００００２）を使用した。チューブの分岐、および接合部にはＳＭＣカップリング（ＣＰＣ社）シリーズを使用した。詳細には２分岐接合にＹ  Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＹ２９１）、直線連結にはＳｔｒａｉｇｈｔ  Ｆｉｔｔｉｎｇ（接合径１／１６インチ、型番＃ＨＳ２９１）を使用した。【００６９】
図４に示した培養容器３９はポリカーボネートを材料として射出成形により作製した。細胞を保持する容器面には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。【００７０】
＜閉鎖系流路の作製方法＞
以上の構成部品を安全キャビネット内で無菌的に組み立て流路を作成した。次いで、流路を滅菌バッグに入れて封止した後、ガンマ線滅菌処理業者に依頼して１５ｋＧｒｙの放射線滅菌処理を行った。【００７１】
＜角膜上皮細胞の準備＞
本具体例の角膜上皮細胞の培養方法のフローについて説明する。角膜上皮細胞はフナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、４×１０４／ｃｍ２となるように培地で懸濁して、細胞バッグ２０に保持した。培地には、５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を使用した。交換用培地はおなじくＫＣＭ培地５００ｍＬを培地ボトル３３に保持し、冷蔵庫６４に設置した。【００７２】
＜角膜上皮細胞の培養開始＞
図４に示した本実施例の装置に滅菌処理した流路を設置して、各々の電磁弁と細胞培養容器３９をゴムチューブで接続したのち、恒温槽を３７°Ｃに恒温保持した。上記準備した細胞バッグと培地ボトルを流路に接続したのち、自動培養操作を開始した。細胞懸濁液の送液量は１．５ｍＬであり、培地交換の送液量もこれと同様である。排出時は全量排出する目的から、上層からの排出量は３ｍＬとした。気体バッグに保持するガスと送気するガス濃度は、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、７８％Ｎ２とし、送気する加湿ガスには湿度９５％Ｈに制御し、その送気量は送気流量０.１Ｌ／分であり、培養容器の内容積２０ｃｍ３より過剰に注入することとし送気時間を２分（２００ｍＬ）とした。以上の動作フローチャートは図５の概要に従った。【００７３】
培地の交換は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目に各１回実施した。加湿ガスの送気は１日に４２回、２０分ごとに実施した。図示しない顕微鏡により細胞状態の観察は５日目より、毎日１回、培養容器の培養細胞面に対し各々１０エリア取得し、細胞育成状態の判断データとした。【００７４】
＜角膜上皮組織の回収方法＞
培養１６日目において培地交換操作の後、細胞培養を終了し、上記に従って培養容器を取り出した。安全キャビネット内に細胞培養容器を置き、室温（約２５°Ｃ）で３０分静置した。細胞の接着した容器を取り出し、その後、定法に従ってトリプシン処理を行い培養の表面より剥離回収した。【００７５】
＜対照実験方法＞
培養皿として３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。温度環境およびＣＯ２ガス環境は、ＣＯ２インキュベータ、型番ＭＣＯ１９−ＡＩＣ、三洋電機社を使用し、３７°Ｃ設定、湿度９５％Ｈ設定、ＣＯ２濃度５％設定により、細胞培養を実施した。対照とした細胞は上記と同じものを使用した。【００７６】
細胞播種および培地交換は手操作により実施し、滅菌された分注器（ピペットマン、ＧＩＬＳＯＮ社、型番  Ｐ５０００）を使用して上記と同じ液量を添加した。培地の交換頻度および間隔は上記実施例と同じとし、ＣＯ２ガスの制御は培養を通して同じ設定とした。なお、培地交換時は培養皿を３７°Ｃのホットプレート上に設置して作業実施して温度維持を図った。【００７７】
＜培養実験結果＞
本実施例の細胞培養装置で作製した角膜上皮細胞は、シート状細胞となって一定の厚みを有しており、安定した剥離回収が可能であった。育成過程の顕微鏡画像の比較においても、細胞の育成に異常はなかった。一方、対照実験により実施して回収された培養細胞とも形状としては同等であった。増殖後の細胞数も播種した細胞のおよそ５０倍（換算量）まで増殖し、対照実験結果に比べややよかった。【００７８】
角膜上皮組織の切片を作成しヘマトキシリン―エオジン染色、および免疫組織染色によって培養細胞を観察した結果、本実施例群、対照実験群とも上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリは、全ての細胞で発現していた。分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３は、基底層以外での細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、最表層に発現しており、これは２群において有意差は無かった。【００７９】
以上詳述した本実施例に記載の細胞培養装置によれば第１の課題である、送液する液体培地の質的な、特にｐＨ値の変化が抑制される。その理由は、気体バッグ２９には送液する液体培地の質的な、特にｐＨ値の変化を抑制するために好適な所定濃度のＣＯ２ガスを含むガスを保持し、気体導入弁２７を開放して送液ポンプ３６を作用すれば、送液の事前に送液管３８と培養容器３９をガスで満たすことができる。その後気体導入弁２７を閉止して、開閉弁２４を開放し、送液ポンプ３６を作用すれば、細胞バッグ２０より細胞懸濁液が移動し、細胞バッグ２０より所定量が移動ののち、気体導入弁２７を開放すれば、細胞懸濁液は進行方向と後方をガスで挟まれて送液されるからである。液体培地を送液するときは、同様に供給弁３５を開放し、送液ポンプ３６を作用すれば、培地ボトル３３より液体培地が移動し、培地ボトル３３より所定量が移動ののち、気体導入弁２７を開放すれば、液体培地は進行方向と後方をガスで挟まれて送液されるからである。【００８０】
加えて、送液された直後の容器内での細胞懸濁液または液体培地の質的特にｐＨ値の変化が回避される。その理由は、前記した液体が進行方向と後方をガスで挟まれた状態より、送液ポンプ３６を作用させて液体全量を容器３９に到達させる。このとき、送液ポンプ３６は細胞懸濁液または液体培地の通過後、ガスに圧力を与え続け、細胞懸濁液または液体培地を後方から押し続けている。細胞懸濁液または液体培地が培養容器３９に到達後も細胞懸濁液または液体培地に続くガスが容器３９に供給され続けるから、送液された直後の培養容器３９内は細胞懸濁液または液体培地とガスで満たされるので、細胞懸濁液または液体培地は大気に接触されることがないからである。【００８１】
さらに第２の課題である、保管状態での液体の経時的な質的特にｐＨ値の変化が抑制される。その理由は、送液操作によって培地ボトル３３内の液体培地に接触する気相は、進行方向がガスに接し、容器は大気の混入を制限した状態で保管されるので、液体培地は大気への接触が低減されるからである。【００８２】
さらに次回の送液操作があるときは、初回の操作後は供給管２３または３４の管内はガス濃度が高くなっているので、細胞懸濁液または液体培地の質的特にｐＨ値の変化の抑制にとってより有利である。これを利用すれば、初回の送液は使用せず、２回目の送液操作で得られた細胞懸濁液または液体培地を採用して使用する運用も可能である。【００８３】
さらに本実施例に記載の送液装置および細胞培養装置によれば次の効果を有している。本実施例では培養容器を恒温保持する恒温槽には一般のドライインキュベータを使用できる。手技培養で使用するＣＯ２インキュベータは恒温保持のほかに湿度維持機能とＣＯ２濃度維持機能を有し、一般に気密性が高く製作され、複数の制御回路を要するので高価である。また、湿度維持のために、培養エリア内に蒸発皿を設けて滅菌水の水位を管理し、時には補充を行うなどメンテナンスが必要である。ＣＯ２インキュベータ内部に機械装置を組み込んだ細胞培養装置の一例には、特許文献２記載の自動培養装置があるが、恒温保持がドライインキュベータであって、気体バッグを有し送液時にガスを送気する本実施例は次のような３つの利点を有している。【００８４】
１つは、ガスは大容量のＣＯ２インキュベータの空間より得るのではなく、送気元となるＣＯ2ボンベから直接送液に必要な量のみを保持するので、所定のガス濃度を容易に準備することができる。このことは培養開始時に流路を設置してから、培養開始までの緩和時間が短く短時間で送液が開始できる利点を有している。【００８５】
２つは、同様にガスは送気元となるＣＯ2ボンベ等から直接培養中のｐＨ値維持の送気を行うので、培養中のｐＨ値の変化に即応して、送気するガス濃度を即座に変更できる。また事前に液体培地のｐＨ値維持に適したガスを気体バッグに保持しているので、ＣＯ2ボンベ残量不足などの事態が生じても、ガスの供給元として代用できる。【００８６】
加えて自動培養中の不測の事態として、恒温槽の扉を開放して内部を点検する可能性があっても、培地のｐＨ値維持のためのガスは大容量のＣＯ２インキュベータの空間より得るのではなく、閉鎖された最小の空間より供給されるので、自動培養の環境変化の影響を受けにくい方法といえる。【００８７】
以上詳述したように、本発明に係る送液装置、細胞培養装置によれば、送液する液体の質的変化が抑制される。また、送液された直後の容器内での液体の質的変化が回避される。その理由は、気体バッグには送液する液体の質的変化を抑制するガスを保持し、送液の事前に送液管と目的の容器内をガスで満たすことができる。その後送液を開始し、液体保持容器より液体が移動せしめ、液体保持容器より所定液量が移動ののちのタイミングで気体バッグより送気することによって、液体は進行方向と後方を当該ガスで挟まれ送液されるからである。【００８８】
加えて、液体が進行方向と後方をガスで挟まれた状態より、送液を継続して液体全量を目的容器に到達させる。これ以降もガスを送気し続け、液体を後方から加圧すれば、液体到達後も液体に続くガスが目的容器に供給され続けるから、送液された直後の容器内部は液体とガスで満たされるので、液体は大気に接触されることがなく、液体の質的変化が回避されるからである。【００８９】
さらに、気体バッグと液体保持容器を接続して大気と遮断し続け、かつ液体の減量相当の前記ガスが、液体保持容器の気相に充填保持されるので、液体は大気に接触されることがないからである。【００９０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。【００９１】
また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。例えば、実施例３の細胞培養装置は、実施例１の送液装置を用いた構成としたが、実施例２の送液装置を用いる構成として細胞培養装置を構成することもできることは言うまでもない。【００９２】
更に、上述した各構成、機能、制御部、コントローラ等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いし、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成することによりソフトウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００９３】
１、１６  送液装置
２  液体ボトル
３、９、２１、３１、４３  気圧調整管
４、２２  ガス導通弁
５、２３、３４  供給管
６  ポンプ
７、３８  送液管
８  受容器
１０、３０、４５、５４、６２  フィルタ
１１、２５  分岐点
１２、２７  気体導入弁
１３、２８  気体導入管
１４、２９  気体バッグ
１５、６５  コントローラ
１７  液体バッグ
１８  細胞培養装置
２０  細胞バッグ
２２  ガス導通弁
２４  開閉弁
２６  換気分岐点
３２  逆止弁
３３  培地ボトル
３５  供給弁
３６  送液ポンプ
３７  第３ガス開閉弁
３９  培養容器
４０  送液ポート
４１  気圧調整ポート
４２  排出ポート
４４  気圧調整弁
４６  排出管
４７  排出制御弁
４８  排出ポンプ
４９  排液管
５０  排液バッグ
５１  換気管
５２  第１ガス開閉弁
５３  第２ガス開閉弁
５５  加湿管
５６  加湿ボトル
５７  加湿管
５８  流量調整機
５９  ガス混合機
６０  １００％ＣＯ２ボンベ
６１  窒素ボンベ
６３  恒温槽
６４  冷蔵庫
【図１】
2016013070.tif 000003
【図２】
2016013070.tif 000004
【図３】
2016013070.tif 000005
【図４】
2016013070.tif 000006
【図５】
2016013070.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成28年11月28日(2016.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を送液する送液管の一端に接続され、前記液体を受ける受容器と、
前記液体を保持する液体ボトルと、
前記送液管の他端に接続され、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、
前記送液管を、前記液体ボトルに接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点と、
前記送液管で前記受容器に送液する前記液体を、前記気体で挟んで送液する送液機構部と、を備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグの前記気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項２】
請求項１に記載の送液装置であって、
前記分岐点は、前記液体ボトルに保持された前記液体の液面より上方に設けられ、
前記液体ボトルに接続される流路内の前記液体が落差により前記液体ボトルに戻される際、当該流路は前記気体で満たされる、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項３】
請求項２に記載の送液装置であって、
前記送液機構部は、
前記液体ボトルを前記気体バッグに接続する気圧調整管と、
前記気圧調整管の開閉を制御するガス導通弁を更に備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項４】
請求項１に記載の送液装置であって、
逆止弁を有し、前記気体バッグに接続される気圧調整管を更に備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項５】
液体を送液する送液管の一端に接続され、前記液体を受ける受容器と、
前記送液管の他端に接続され、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、
前記送液管で前記受容器に送液する前記液体を、前記気体で挟んで送液する送液機構部と、
前記液体を保持する液体バッグと、
前記送液管を、前記液体バッグに接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点を備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグの前記気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項６】
請求項５に記載の送液装置であって、
前記分岐点は、前記液体バッグに保持された前記液体の液面より上方に設けられ、
前記液体バッグに接続される流路の前記液体が落差により前記液体バッグに戻される際、当該流路は前記気体で満たされる、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項７】
請求項１に記載の送液装置を用いる細胞培養装置であって、
前記受容器は細胞を培養する培養容器であり、前記液体は、前記細胞を培養する液体培地である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養装置であって、
前記気体は、所定濃度のＣＯ２ガスを含むガスである、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
液体を保持する保持容器と、
前記液体を受ける受容器と、
送液管を用いて、前記保持容器の前記液体を前記受容器に送液する送液機構部と、
前記保持容器に接続され、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する気体バッグと、
前記送液管を、前記保持容器に接続される流路と、前記気体バッグに接続される流路に分岐接続する分岐点と、を備え、
前記送液機構部は、前記送液管に設置されたポンプと、前記気体バッグからの気体を前記分岐点に導入する気体導入弁を含み、
前記分岐点は、前記保持容器に保持された前記液体の液面より上方に設けられ、前記保持容器に接続される流路の前記液体が落差により前記保持容器に戻される際、当該流路は前記液体の質的変化を抑制する気体で満たされ、
前記送液機構部は、前記保持容器の前記液体に接触する気相において、前記液体の質的変化を抑制する気体を保持する、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の送液装置であって、
前記送液機構部は、
前記保持容器を前記気体バッグに接続する気圧調整管と、
前記気圧調整管の開閉を制御するガス導通弁を含む、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の送液装置であって、
逆止弁を有し、前記気体バッグに接続される気圧調整管を備える、
ことを特徴とする送液装置。
【請求項１２】
請求項９に記載の送液装置を用いる細胞培養装置であって、
前記受容器は細胞を培養する培養容器であり、前記液体は、前記細胞を培養する液体培地である、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞培養装置であって、
前記液体の質的変化を抑制する気体は、所定濃度のＣＯ２ガスを含むガスである、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【国際調査報告】
2016013070.tif 000008
2016013070.tif 000009
2016013070.tif 000010
2016013070.tif 000011