(57)【要約】多孔質セルロース媒体の製造において、原料となるセルロースアセテートを溶解した溶液について、物質の移動を伴う反応を起こさせないゲル化を通じて多孔質セルロース媒体を作製する技術を提供する。具体的には、セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、温度を低下させることによりゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法を提供する。
2016013568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、温度を低下させることによりゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法。
【請求項２】
セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得る第一の工程と、得られた分散液の温度を低下させて前記組成物をゲル化させることにより前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる第二の工程と、得られたゲル化粒子に含まれるセルロースアセテートを加水分解する第三の工程を含む、球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
【請求項３】
前記第二の工程と第三の工程の間に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含む、請求項２に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
【請求項４】
前記分離溶媒が水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらの混合物である請求項３に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
【請求項５】
前記分散媒体に分散安定剤が添加されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
【請求項６】
前記分散媒体が、炭素数２０以上の炭化水素、シリコーンオイルまたはフッ素化炭加水素である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
【請求項７】
セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、温度を低下させることにより該成型容器内でゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む、多孔質セルロースモノリスの製造方法。
【請求項８】
前記均一組成物における有機溶媒が、沸点が１２０℃以上であり、水と混和し、飽和炭化水素と混和しないものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記均一組成物に含まれる有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記均一組成物が、０℃〜１００℃の温度範囲で、透明な流動性液体である温度範囲と、その温度範囲よりも低い温度で流動性を失う相転移温度を有するものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記セルロースアセテートが、セルロースジアセテート及びセルロースモノアセテートから選ばれる１以上である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース媒体、請求項２〜６のいずれか一項に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子、または請求項７に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロースモノリスに、アフィニティーリガンドを固定化する工程を含む、吸着体の製造方法。
【請求項１３】
アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体から選ばれる一種以上である、請求項１２に記載の吸着体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の製造方法を用いて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、吸着体に固定化されたアフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む、標的物質の精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質セルロース媒体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを代表とする多糖およびその誘導体は、さまざまな用途に利用されている。これらの微多孔質体は、それ自体が吸着剤となりうるし、またその表面に何らかの化学修飾を行うことにより、吸着や分離の機能が付与できる。
以下にそのひとつの例を挙げる。酵素利用の普及、バイオ医薬の開発などにより、タンパク質を始めとする生体高分子の分離精製は重要な技術的課題の一つとなっている。これを解決するための重要な手段がクロマトグラフィーである。クロマトグラフィーでは、目的物あるいは除去対象となる不純物と相互作用する何らかの原子団（しばしばこれをセレクタと呼ぶ）をマトリクスと呼ばれる固体に結合した分離剤が用いられる。
タンパク質の非特異吸着がないことは、生体高分子を分離するための材料として極めて重要な特性であり、そのために多糖類がマトリクスとして重用されている。また多糖類は分子内に水酸基を多く持つため、これを足場としてエーテル結合やエステル結合を介して容易にセレクタを結合することが出来、これも重用される大きい要因となっている。
また、生体高分子を分離精製するためには、一般的に、マトリクスに目的とする分子と何らかの親和性をもつセレクタを結合し、目的分子を吸着させた後に何らかの方法で吸着させた目的分子を遊離させて回収する方法を用いる。多量の目的分子を得るためには、多量のセレクタを結合することができ、さらにそのセレクタと分子量の大きい生体高分子を効率よく相互作用させるために、マトリクスが目的分子が自由に出入りできるような多孔質構造であることが求められる。言い換えれば、該マトリクスをカラムに充填してサイズ排除クロマトグラフィーを行ったときに、精製したい分子とリガンドを併せたサイズよりも大きい排除限界を示すことが必要である。
このようなマトリクスは、多くの場合、粒子としてカラムと呼ばれる管の中に充填して用いられる。しかし近年注目されている新たな形態はモノリスと呼ばれる一体の多孔質体である。これはキャピラーと呼ばれる細管や、あるいはカラムなどの容器に納めることにより、同じ用途に用いられる。しかし比較的薄く面積の大きいモノリスは、ろ過膜として使うことも出来る。【０００３】
このようなマトリクスの使いやすさの要因として、分離対象に対する選択性に加えて、その物理強度が挙げられる。すなわち、弾性率の低いマトリクスは、クロマトグラフィーやろ過において液体や気体を流したときに、圧縮変形や破断を被り、その結果クロマトグラフィーカラム内の液の流れが不均一になり、さらには閉塞することにより、カラムの分離効率を著しく低下させる。この点で、物理的強度の高さは重要な特性であり、この点において、セルロースは多糖類の中でも優れた材料となっている。
他にも、セルロースは多糖の一般的な特徴としてその表面にアルコール性水酸基を持つため、化学反応によって多様な原子団を結合することが可能であること、純度の高い素材が多量に、比較的安価に入手できることなどの利点がある。【０００４】
以上の理由から、生体高分子の分離精製を主目的とする多孔質セルロース粒子が開発されている。これを製造するための方法としては、セルロースを何らかの方法で溶かした後、再生する方法が多いが、有機酸エステルを出発原料にする方法がいくつか見られる。これは、セルロースそのものを直接溶解することは、特殊な溶媒を必要としたり、溶液の粘度が非常に高いなどの難しさがあるのに対し、有機酸エステルは多くの溶媒に溶かすことができること、セルロースの有機酸エステルが、さまざまな有機酸とのさまざまな結合率、また重合度で、安定した品質の下、工業的に供給されること、また容易にエステル結合を分解し、セルロースを再生できることなどの利点を利用したものである。【０００５】
そのようなセルロース粒子の製造方法として、例えば特許文献１には、セルロース有機酸エステルをハロゲン化炭化水素のような有機溶媒に溶解させた溶液を水性媒体中に分散してエステル溶液の微小液滴を形成させ、そこにアンモニウム塩などの加水分解促進剤を添加して該エステルの加水分解を行ってセルロース微小粒子を形成することが記載されている。
また、特許文献２には、セルロース脂肪酸エステルと、セルロース脂肪酸エステルのゲル化剤とを有機溶媒に溶解して溶液として、その溶液を水性媒体に撹拌添加して液滴を形成させ、さらに凝固促進剤を加えて液滴中のセルロース脂肪酸エステルをゲル粒子とし、生成した粒子からゲル化剤、凝固促進剤及び溶媒を除去することで、多孔球状粒子を製造する方法が記載されている。【０００６】
非特許文献１には、セルロースアセテートを水溶解性の有機溶媒（アセトンとＤＭＳＯの混合溶媒）に溶解させ、これを水に分散させることで、セルロールアセテートを含む溶液が水に接触して凝固し、多孔質の粒子を形成することが記載されている。
非特許文献２には、セルロースジアセテートを、ＤＭＳＯに溶解させ、その後無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌し、混合物を酸凝集浴槽（塩酸）に投入してセルロース粒子（ビーズ）を得ることが記載されている。また、ビーズの多孔性を高めるために、採取後のビーズを多量の温水に浸漬して硫酸ナトリウムを除去する手段が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６２−２７７４０１号
【特許文献２】特開昭６３−９５２３７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Chen, L. F.; Tsao, G. T. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, 1507
【非特許文献２】Bai, Y.-X.; Li, Y.-F. Carbohydr. Polym. 2006, 64, 402
【非特許文献３】A. J. Reuvers他, J. Polym. Sci., 1986, 24, 793
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１及び２の技術では、いずれの方法においても、ハロゲン化炭化水素を含む溶媒を用いており、粒子の作製の際にその溶媒の除去を気化で行うために、大きなエネルギーと、気化させた溶媒を回収するための装置が必要になる。また、特許文献２に記載のような凝固促進剤を用いた場合には、形成された液滴の中で凝固促進剤と接触した部分で緻密なセルロース脂肪酸エステルの膜が形成されることで、いびつな粒子形になることがある。また、特許文献２に記載のような物質の移動を伴うプロセスを利用する場合には、反応に偏りが生じる可能性がある。
また、非特許文献１では、形成させたビーズをホルムアルデヒドと塩酸を用いて架橋反応を起こさせてビーズを架橋させることが記載されており、非特許文献２では、粒子に細孔を設けるために細孔形成剤を用いることが記されており、いずれも粒子の形成の際にその表面を処理する工程を含ませており、多孔質セルロース粒子を得るためには、表面処理に用いた物質を除去する必要がある。【００１０】
本発明は、分離剤に応用できるような多孔質セルロース媒体の製造において、原料となるセルロースアセテートと、水と有機溶媒を含有する均一組成物について、系外への物質の移動を伴わずにゲル化することにより多孔質セルロースアセテートを得てから、これを加水分解することにより多孔質セルロース媒体を作製する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものである。水と有機溶媒とセルロースアセテートを含む均一組成物が、ある温度以下になると相転移（液状−ゲル状）を起こし、ゲル化することは論文に報告されている（非特許文献３）。
本発明者らは、この性質を利用すれば、上記組成物について物質の移動、例えば溶媒の蒸発、非溶媒（ゲル化剤）の添加などによらず、塊状、粒子状など、目的に応じた形状のゲルを得ることができ、その後加水分解することにより、多孔質構造を維持し優れた特質を持ったセルロース媒体が得られることを見出した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。【００１２】
［１］  セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、温度を低下させることによりゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む、多孔質セルロース媒体の製造方法。
［２］  セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得る第一の工程と、得られた分散液の温度を低下させて前記組成物をゲル化させることにより前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる第二の工程と、得られたゲル化粒子に含まれるセルロースアセテートを加水分解する第三の工程を含む、球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
［３］前記第二の工程と第三の工程の間に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含む、［２］に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
［４］  前記分離溶媒が水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらの混合物である［３］に記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
［５］  前記分散媒体に分散安定剤が添加されている、［２］〜［４］のいずれかに記載の球状多孔質セルロース粒子の製造方法。
［６］  前記分散媒体が、炭素数２０以上の炭化水素、シリコーンオイルまたはフッ素化炭加水素である、［２］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］  セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、温度を低下させることにより該成型容器内でゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む、多孔質セルロースモノリスの製造方法。
［８］  前記均一組成物における有機溶媒が、沸点が１２０℃以上であり、水と混和し、飽和炭化水素と混和しないものであることを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］  前記均一組成物に含まれる有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］  前記均一組成物が、０℃〜１００℃の温度範囲で、透明な流動性液体である温度範囲と、その温度範囲よりも低い温度で流動性を失う相転移温度を有するものである、［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記セルロースアセテートが、セルロースジアセテート及びセルロースモノアセテートから選ばれる１以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］  ［１］に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース媒体、［２］〜［６］のいずれかに記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子、または［７］に記載の製造方法を用いて得られた多孔質セルロースモノリスに、アフィニティーリガンドを固定化する工程を含む、吸着体の製造方法。
［１３］  アフィニティーリガンドが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体から選ばれる一種以上である、［１２］に記載の吸着体の製造方法。
［１４］  ［１２］または［１３］に記載の製造方法を用いて得られた吸着体と、標的物質を含む混合物とを接触させて、吸着体に固定化されたアフィニティーリガンドに標的物質を結合させる第一の工程と、吸着体のアフィニティーリガンドに結合した標的物質を分離する第二の工程を含む、標的物質の精製法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、多孔質セルロース粒子のような多孔質セルロース媒体の製造にあたり、セルロースアセテートを溶解させるためにハロゲン化炭化水素のような有機塩素系の溶媒を用いる必要がなくなるばかりでなく、セルロースアセテートを含む組成物をゲル化する際に、物質移動を伴わない温度の変化によるゲル化を利用するので、得られるセルロースアセテート媒体の細孔の大きさを均一にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例１）の光学顕微鏡写真である。
【図２】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例１）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】実施例１で得た多孔質セルロース粒子を用いて、標準ポリエチレンオキシドの分離を行って得た検量線を示す図である。
【図４】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例３）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例６）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例７）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例８）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図８】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例９）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図９】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例１０）の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１０】本発明の製造方法を用いて得られた多孔質セルロース粒子（実施例１１）の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の多孔質セルロース媒体の製造方法は、セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む均一組成物が、温度変化により、液体−ゲルの相転移を起こすものであることを利用し、温度変化により前記均一組成物からなるゲルを形成させ、次いでゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解してセルロースに変換するものである。
本発明において、温度変化による液体−ゲルの相転移とは、ある温度において流動性を持つ液状の組成物が、温度を変えたときに流動性を失う現象である。例えば温度が下がると粘度が高くなる現象は多くの均一溶液組成物に認められるが、液体からのゲル化においては流動性は完全になくなり、多くの場合白濁する。
本発明では、ゲル化を起こさせるための試薬等は添加せず、温度変化によりゲル化を起こさせる。
【００１６】
＜セルロースアセテート＞
本発明で用いるセルロースアセテートは、水と、有機溶媒と、当該セルロースアセテートを含む組成物が、温度によって相転移を起こすものであればいかなるものであってもよい。
セルロースアセテートの代表的物性として重合度と置換度を挙げることができる。
重合度については、得られる多孔質セルロース粒子の機械的強度を高め、使用時の溶媒等への溶出を防ぐために重量平均で５０以上であることが好ましい。一方、上限については入手可能なものであれば、いかなるものも使用できる。
【００１７】
置換度はセルロースアセテートの溶解性に強い影響を与える。
置換度とはセルロースのグルコース残基１個が有する３個の水酸基のうち、何個が置換されているかを示す数値であり、アセテートの場合には酢酸含量やアセチル基含量で表現される場合もあるが、これらは互いに換算することが出来る。一般的には置換度が２．８〜２．９付近のものがトリアセテート、２．５付近のものがジアセテートとして流通している。本発明においては相転移を起こす組成物を与えるものであれば、いかなる置換度のものであってもよい。置換度とは、セルロース中のグルコース残基１個が有する３個の水酸基のうち、他置換基に置き換えられている数の平均値である。
【００１８】
セルロースアセテートについて、一般に流通しているものには、繊維材料などとして汎用的に用いられるいわゆるセルロースジアセテート（中でも典型的な製品はアセチル置換度が２．５のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）５５％付近のもの）と、写真や液晶表示用のフィルム材料として用いられるトリアセテート（アセチル置換度が２．８〜２．９のものであり、酢酸の含量として表すと（酢化度）６０％付近のもの）がある。置換度が１付近のもの（モノアセテートと呼ばれるべきものであるが、一般に流通していないため、通称として確立されていない）は、水にも溶ける場合があり、極性溶媒系の選択肢が広い。このように、一般に流通していないグレードを得るには、例えば、それより置換度の高いセルロースアセテートの溶液に計算量の塩基を加えて加溶媒分解することや、その含水酢酸溶液を硫酸などの酸触媒によって加水分解し、適当なタイミングで反応を停止する（硫酸を中和する）ことなどによって得ることができる。例えば、ジアセテート（二酢酸セルロース）を出発物質に、グルコース単位当り１．５当量の塩基を作用させて得ることができる。塩基としては、中性分子であるため多くの有機溶媒にも混和しやすく、かつ反応が速やかなヒドラジン、ヒドロキシルアミンが使いやすいが、要は原料溶液と混和する塩基であれば、水酸化物、例えば第四級アンモニウム水酸化物なども利用できる。
アセチル化の程度におけるトリアセテート、ジアセテート、モノアセテートの境界は明確に区別されていないが、本発明においては、便宜上２．７以上をトリアセテート、１．５以上２．７未満をジアセテート、０．５以上、１．５未満をモノアセテートとする。
【００１９】
＜本発明における組成物＞
本発明の製造方法において用いる組成物は、前述したセルロースアセテートと有機溶媒と水を含有する均一組成物である。均一組成物とは、水と有機溶媒とセルロースアセテートが均一に混和している状態の組成物のことである。
本発明において、温度変化による液体−ゲルの相転移とは、ある温度において流動性を持つ液状の組成物が、温度を変えたときに流動性を失う現象である。
本発明では、この組成物の組成や、含有させるセルロースアセテートの重合度や置換度を適宜調整することで、液体−ゲルの相転移が起こる温度を調整することができる。
前記均一組成物が、０℃〜１００℃の温度範囲で、透明な流動性液体である温度範囲と、その温度範囲よりも低い温度で流動性を失う相転移温度を有するものであることが好ましい。
前記組成物におけるセルロースアセテート、有機溶媒、水の含有量は、該組成物が所定の温度範囲において相転移を起こすものであれば、いかなるものであってもよい。
該組成物におけるセルロースアセテートの含有量は、得られる多孔質セルロースが実用に適した細孔径と適度な硬さを有するためには、好ましくは１〜２０重量％であり、更に好ましくは５〜１５重量％であることが好ましい。
前記組成物に含有させる水と有機溶媒の比率については、ゲル化を起こさせるものであれば、任意の割合を採用することができる。例えば、重量比で１０：９０〜９０：１０である態様を挙げることができる。
【００２０】
本発明の製造方法に用いる前記組成物における有機溶媒の種類と水の重量組成比は、前記のように相転移を起こさせるものであればいかなるものであっても良い。前記の非特許文献３に報告されているＣＤＡに対するアセトン・水混合系、同じくジオキサン・水混合系を用いることも出来るが、これらの有機溶媒は、流動パラフィンにかなりの量が溶け込むことや、蒸気圧が高いことのため、分散処理の過程で温度以外の物質移動を伴なう要因で予期しないゲル化を起こしやすいなど、扱いにくい。したがって、流動パラフィンなどの非極性液体に対しても溶解性が低く、かつ蒸発による濃度変化が起きにくいことが望ましく、そのような属性を持つ溶媒としては、ヘキサンのような飽和炭化水素に対して均一に混和せず、沸点が１２０℃以上であるような有機溶媒が好ましい。
セルロースアセテート全般に対して溶解力が高く、且つ前記性質を備えた溶媒としては、非プロトン性極性溶媒といわれるものが多く該当し、ＤＭＳＯ、スルホラン、ジメチルスルホン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン、ヘキサメチルホスホロトリアミド、テトラメチルウレアなどから選択される一種以上が例示される。
【００２１】
実際の組成物として以下のような例を挙げることができる。
［セルロースモノアセテートを用いた場合の一例］
セルロースモノアセテートを５重量％、水５５重量％、ＤＭＳＯ４５重量％を含む組成物は、５５℃付近より高い温度では透明粘稠な液状を示し、この温度以下では白濁したゲル状となり、この変換は可逆的である。
［セルロースジアセテートを用いた場合の例］
セルロースジアセテート５重量％、水２０重量％、ＤＭＳＯ８０重量％含む組成物について、７０℃以上では液状、５０℃以下ではゲル状になり、この変化は可逆的であった。
セルロースジアセテート６．８重量％、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）７１．６重量％、水２１．６重量％を含む組成物について、２０℃以下ではゲル状、４０℃以上では透明液状となり、この変化は可逆的であった。
セルロースジアセテート７．７重量％、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド７３．７重量％、水１８．６重量％を含む組成物について、２０℃以下ではゲル状、５０℃以上では透明液状となり、この変化は可逆的であった。
【００２２】
前記の相転移の温度は、一般的に有機溶媒の比率が大きいと低くなり、水の比率が大きいと高くなる。
多孔質セルロース媒体の製造における取り扱いやすさにおいて好ましい相転移温度は、０℃から１００℃、更に好ましくは３０〜７０℃である。
【００２３】
＜加水分解＞
得られたセルロースアセテートを含む均一組成物からなるゲルは、そのゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解することにより親水性の高いセルロースに変換する。そのために、セルロースアセテートのアセチル基を除去する。
アセチル基の除去には、金属水酸化物（苛性ソーダ、苛性カリ）、四級アンモニウム水酸化物、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどと反応させる方法を用いることができる。またアミン類もこのアセチル基の除去のための反応に用いることができる。アミン類の例としては、アンモニア、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、グアニジン、アルキルアミン類などを挙げることができる。
反応条件については、上記化合物が有する溶媒に対する溶解性、反応速度が異なるため、一義的に決めることはできないが、公知の方法を用いることができ、利用目的にふさわしい程度にアセチル基が除かれていればよい。
【００２４】
反応終了後は、得られた多孔質セルロースに悪影響を及ぼさない溶媒で洗浄し、必要に応じて防腐剤を加える。
【００２５】
＜多孔質セルロース媒体の形状＞
本発明の製造方法により製造される多孔質セルロース媒体は、球状粒子としてもモノリスとしても利用できる。
球状粒子またはモノリスを作製する場合、上記の特定の組成物の温度を低下させてゲル化させた後、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解するというプロセスの本質的な違いはないが、形状を制御するためのプロセスは異なるものである。モノリスを製造するためには、任意形状を有する容器の中で前記均一組成物の相転移を起こさせるが、微粒子を製造するためには、通常、溶液状の均一組成物を、これと混和しない分散媒体の中に分散させた状態で温度変化させ、相転移を起こさせる。以下、これらの具体的な方法を簡単に説明する。
【００２６】
＜球状粒子＞
本発明の球状多孔質セルロース粒子の製造方法としては、セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を、該均一組成物と混和しない分散媒体に分散させて分散液を得る第一の工程と、得られた分散液の温度を低下させて前記組成物をゲル化させることにより前記組成物から構成されるゲル化粒子を形成させる第二の工程と、得られたゲル化粒子に含まれるセルロースアセテートを加水分解する第三の工程を含む態様をあげることができる。
また、前記第二の工程と第三の工程の間に、得られたゲル化粒子を分離するための分離溶媒を、ゲル化粒子が形成された分散液に添加して、分離溶媒中にゲル化粒子を分離する工程を含んでもよい。
本発明の球状多孔質セルロース粒子の製造方法においては、前記組成物を分散させるための分散媒体を用いる。本発明で用いることができる分散媒体としては、前記組成物中の水や有機溶媒と混和することによって前記組成物の意図しないゲル化や相転移温度の極端な変化を引き起こし、目的とする球状多孔質セルロース粒子の孔径に悪影響を与えるものでなければいかなるものであってもよい。
前記組成物を分散させた際に、前記組成物が凝集することを防ぐために、分散媒体は、組成物の分散時にある程度の粘度を有していることが好ましい。
分散媒体の粘度としては、２５℃において、０．２〜２０Ｐａ・ｓを挙げることができる。
分散媒体は、前記組成物に含まれる水や有機溶媒と混和しないように、非極性のものであることが好ましく、例えば、流動パラフィンやワセリンのような炭素数２０以上の炭化水素、シリコーンオイル、フッ素化炭化水素を挙げることができる。
ワセリンは特定の軟化温度以下にすると速やかに流動性を失うため、分散させたゲル化液の粒子が再凝集して塊を作りやすい場合には、まず軟化温度以上で分散液を調製し、これをまず軟化温度以下に下げ、ゲル化液滴同士が移動、接触できなくすることができ、粒子の収率を上げる目的に有効である。ワセリンの軟化温度は、その種類によって異なり、適宜選択することができる。
【００２７】
本発明におけるセルロースアセテートを含む組成物は、分散媒体に分散させた後、その温度を低下させてゲル化させるまでの間、分散状態を維持する必要がある。そのために、分散媒体に適当な分散安定剤を加えることが好ましい。
分散安定剤は前記組成物の分散状態の安定性を高め、組成物からなる粒子が凝集する速度を遅らせる効果があればいかなるものであってもよい。
そのような分散安定剤として、グリセリン、ソルビタン、ポリグリセリン、ショ糖などの多価アルコールと高級カルボン酸とのエステル、極性基を少量含む変性シリコーンなどを挙げることができ、それ以外の市販されている分散安定剤も使用することができる。
【００２８】
セルロースアセテートを含む前記組成物を、前記分散媒体に分散させる方法としては、すでにいろいろな提案が行われており、広い範囲の粒子径分布を与えるものから単分散の粒子径を与えるものなど、さまざまである。例えば、一般的にマイクロリアクターと称されるものを用い、液状の分散媒体を適当な速度で流す中に、より細いノズルからゲル化した均一組成物を注入する方法は、粒子径がそろったものを作るのに適している。
また孔径の一定な膜から本発明の流動性の均一組成物を分散媒体中に押し出す方法、一定の大きさの孔を開けた内筒に、本発明の流動性の均一組成物を入れ、これを分散媒体中で回転させ、ゲル化した均一組成物を遠心力で押し出す方法、一定の大きさのビーズを充填したカラムの中に必要に応じて分散安定剤を含む分散媒体と流動性の均一組成物を送液する方法、流動性の均一組成物を振動ノズルを通して分散媒体中に注入する方法、（超）音波を用いる方法など、さまざまな方法を用いることができる。
実施例においては、さまざまな粒子径の混合物を与えるが、もっとも簡単な撹拌による方法を例示する。これは前記均一組成物を前記分散媒体に添加した後、相転移温度以上の温度で撹拌混合することで、前記組成物から構成される概ね球状の粒子を生成させ、その後相転移温度以下に冷却することにより、分散液滴となった均一組成物をゲル化させるものである。撹拌混合の条件は目的とする平均粒子径に応じて適宜選べばよい。
【００２９】
なお、セルロースアセテートを含む前記組成物を前記分散媒体に添加する際の、前記分散媒体の温度については、前記組成物が液状を保つ温度にする態様を挙げることができる。具体的には分散媒体の温度を、前記組成物が相転移を起こす温度域よりも高い温度に設定する態様を挙げることができる。分散媒体をそのような温度に設定することで、前記組成物の撹拌混合が容易になる。一方で、流動性の均一組成物が相転位温度以上から以下になっても、ゲル化するまでには多少の時間を要するので、添加する際のゲル化液および/あるいは分散媒体の温度は必ずしも相転移温度以上である必要はない。
しかし、前記均一組成物が流動性を保っている状態で、前記均一組成物を分散媒体に添加し、分散することが好ましい。
この条件が満たされない場合には生成した粒子は不規則な破砕形状になり、クロマトグラフィーの目的には適さないものになる。ただし、ゲル状態で破砕、分散した後に相転移温度より温度を上げていったんゲルを融解し、再度温度を下げてゲル化させることも可能である。
最終的に前記分散媒体を前記組成物の相転移が起こる温度域よりも低い温度に冷却すると、前記組成物がゲル化する。
【００３０】
＜分離溶媒＞
この後のプロセスは特に限定されるものではないが、本発明の実施例においては、分散媒体からゲル化したセルロースアセテートを取り出すために分離溶媒を用いる態様を挙げることができる。
例えば、ゲル化された前記組成物から構成される粒子のうち、セルロースアセテートのみを分散媒体からゲル状粒子として分離させるために、分離溶媒を前記組成物が分散された分散媒体に添加する態様を挙げることができる。
分離溶媒としては、分散媒体とは混和せず、ゲル化した前記組成物のうち、セルロースアセテートは溶解しないが、水および該組成物中の有機溶媒とは混和するものを用いる。これにより、ゲル化した前記組成物のうち、セルロースアセテートがふたたび溶解することを防ぐことができる。
このような分離溶媒としては、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、アセトアミド、ホルムアミド、またはこれらの混合物を挙げることができる。
分散媒体中に分散した状態のセルロースアセテートゲルを直接ろ別することも出来るが、一般に分散媒体は粘度が高いため、ろ過において圧力がかかり、ゲル粒子を変形あるいは破壊する危険性が高くなる。分散媒体にこれと混和する低粘度の液体を加えることによってろ過時の圧力を下げることも可能である。
【００３１】
なお、分離溶媒には、セルロースアセテートを分解してセルロースに変換（脱アセチル化）するための試薬、例えば水酸化カリウムや水酸化ナトリウムのような金属水酸化物、アミン類のような塩基を添加し、分離の工程の際にセルロースに変化させる脱アセチル反応を行わせることが好ましい。
分離溶媒に塩基を添加せず、脱アセチル反応を行わない場合には、一旦分離させたセルロースアセテートからなるゲル状の粒子を採取した後、塩基と反応させることもできる。
脱アセチル反応を行わせた多孔質セルロース粒子は、水などを用いた適当な方法で洗浄し、通常水湿の状態で保存する。乾燥させる場合には糖類、グリセリンなどを適量加える。水湿で長期保存する場合には腐敗を防ぐためにアルコールやアジ化ナトリウムなどの防腐剤を加える。また、グリセリンや糖類、尿素などを加えた状態で乾燥することもできる。使用するときには、常法によってカラムに充填して用いる。
【００３２】
本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース粒子のうち、公知の適当な分級により、粒径（最大径）３０〜３００μｍの略球状〜球状の形状を有するものを選別して、それをクロマトグラフィー用の充填剤として用いることができる。クロマトグラフィーとしては、サイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。サイズ排除クロマトグラフィーに利用できることは、とりもなおさず、適当なリガンドを結合することによってサイズ排除以外のさまざまのモードによるクロマトグラフィー分離にも利用できることを示す。これらには、イオン交換、疎水性、アフィニティーなどのモードが含まれる。
一般に、バイオテクノロジーで製造するような高分子、例えばホルモン、酵素、抗体医薬などを分離精製するには、それらの物質が十分進入できるような大きさの細孔を持つマトリクスが好ましい。すなわち、該粒子を充填したカラムを用い、水を移動相としてゲルろ過クロマトグラフィーを行うと、ポリエチレングリコールの分子量に換算して概ね１０３〜１０７の範囲の何らかの分子量領域で分画が起きることが期待できる。実施例１のＧＰＣにおいて分子量１０４〜１０６の標準物質（ポリエチレングリコール）が異なった時間に溶出することは、本法によって作ることができるマトリクスの細孔径が、それら物質の分離精製に好適なものであることを示している。細孔の大きさは、ゲル化させる水、有機溶媒、セルロースアセテートを含む組成物中のセルロースアセテートの濃度を変えたり、ゲル化の条件（例えば、均一組成物の冷却速度の調整など）によって微調整することができる。
【００３３】
以下、アフィニティーのモードで用いる吸着体を作製する方法について説明する。
アフィニティーリガンドとしてタンパク質を用いることができる。本発明で用いることのできるタンパク質は、分子量３〜３００ｋＤａ、好ましくは３０〜１５０ｋＤａであって、分離対象とする例えば抗体のようなタンパク質に対して親和性のある物質が挙げられる。
これらの中でも、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びこれらの機能性変異体が抗体のタンパク質の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。
抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましい。
上記機能性変異体は、天然アミノ酸配列において少なくとも１つの変性を有し、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持しているタンパク質を指す。天然配列には、本来自然に発生するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸の変化としては、１つ以上のアミノ酸の別のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸の削除および／または１つ以上のアミノ酸の追加またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。天然配列に対して行われる追加、削除および置換の組合せのような態様も挙げられる。機能性変異体は、タンパク質の断片またはドメインを含むこともできる。機能性変異体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一であってもよく、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持している。
上記多孔質セルロース粒子に対するタンパク質の担持量は、多孔質セルロース粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。
また、多孔質セルロース粒子の体積１ｍｌあたり、１〜５０ｍｇである態様を挙げることができる。
【００３４】
本発明の製造方法で作製された多孔質セルロース媒体を製造する方法において、前記のアフィニティーリガンドを固定化する工程をさらに含ませることで、アフィニティーリガンドが結合した吸着体を作製することができる。
この吸着体は、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤としても利用することができる。
その製造工程としては、以下のような態様を挙げることができる。
まず、前記の製造方法で製造された多孔質セルロース媒体のうち、球状粒子のものについて、架橋剤を用いて架橋反応を起こさせる工程を含んでもよい。
架橋方法については特に制限されることはなく、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンやビスオキシランやポリオキシランのような架橋剤を用いることができる。
次に、架橋させたセルロース粒子について、活性化させる工程を含んでもよい。
活性化させるために、公知の反応性官能基を導入することにより活性化することができる。例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｎ,Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸エステル（ＤＳＣ）、エポキシド及び活性化カルボン酸（ＮＨＳエステル）などで活性化することで、多孔質セルロース粒子が元々持っている官能基よりリガンドとして固定化する化合物が反応しやすい官能基に変えることができる。そして、その後、リガンドとして固定化する化合物と反応させて、リガンドと多孔質セルロース粒子を固定化する工程を経て、吸着体を製造する方法を挙げることができる。
上記とは別に、吸着体の製造方法として、多孔質セルロース粒子とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することで、多孔質セルロース粒子とリガンドを固定化し、吸着体を得る方法が挙げられる。
【００３５】
多孔質セルロース粒子とアフィニティーリガンドとを結合させる別の態様として、セルロース、セルロース粒子にホルミル基を導入して、そのホルミル基とタンパク質のアミノ基とを反応させる態様を挙げることができる。
ホルミル基を導入する反応については、例えば、ビシナルの水酸基を持つ多糖類を過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法を挙げることができる。
また、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる各種スペーサーを介してホルミル基を導入する方法が挙げられる。例えば、スペーサーとしてグルコサミン等のようなアミノ糖を用いることができる。
そして、多孔質セルロース粒子のホルミル基と、プロテインＡのようなタンパク質を結合させる方法としては公知の方法を用いることができ、例えば、グルコサミン等のようなアミノ糖をスペーサーとして導入された多孔質セルロース粒子と、プロテインＡを含有する溶液とを反応させる態様を挙げることができる。そのような方法として例えば、特開２００８−２７９３６６号公報に記載の方法を挙げることができる。
【００３６】
＜モノリス＞
モノリスは、多孔質素材を一体の塊としたものである。前記の粒子状充填剤を用いたクロマトグラフィーにおいては、展開液は粒子の微細孔をも通過するが、より多く粒子間間隙を通過する。これに対しモノリスにおいては一体の多孔質体の微細孔を通過させる。したがって、一般的に粒子状充填剤の場合に比べて固形分含量を低めにして展開液の流れに対する抵抗を減らすようにする場合が多いが、ろ過材料として用いる場合を除けば本質的な分離のメカニズムは充填剤の場合とまったく変わりがない。
【００３７】
本発明の多孔質セルロースモノリスの製造方法は、セルロースアセテートと、有機溶媒と、水とを含む流動性の均一組成物を成型容器に入れ、温度を低下させることにより該成型容器内でゲル化させる工程と、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する工程を含む。
この方法で用いるセルロースアセテート、有機溶媒は球状粒子の作製に用いるものと同じものを使用できる。
【００３８】
液体クロマトグラフィーにおいては、分離剤の中のどの部分においても同様な速さで展開液が移動し、いわゆるピストン流を作ることが極めて重要である。充填剤においては個々の粒子の特性のばらつきが混合によって平均化されるため、多少の粒子間の性質の違いは許容され、しかし液の流れの大きい部分を担う粒子間空隙の均一性が重要となる。これには充填剤をカラムと呼ばれる容器に充填する際の技術が重要となる。
これに対してモノリスにおいては、生成する多孔質構造が、展開液の流れに対して直角の方向において均一であることと、モノリスと容器の間に液が流れやすい隙間ができないことがきわめて重要である。ここで述べた直角方向において均一な多孔質体を調製するには、ゲル化剤（沈殿剤）との接触や、公知技術である溶媒の蒸発によって行うことはできない。
【００３９】
本発明のセルロースアセテートの温度変化によるゲル化を用いる方法は、ゲル化速度に比べて原料組成物の温度の均一化が速ければ、均一なゲルを与えることができるため、モノリスを調製するには好適である。
モノリスを作製する際には、前記した水、有機溶媒及びセルロースアセテートと含む均一組成物を任意形状の成型容器に投入し、その後その温度を低下させることでその組成物からなるゲルを形成させ、これをそのまま、あるいは適当な方法によって乾燥させた後、得られたゲルに含まれるセルロースアセテートを加水分解する。加水分解に用いる塩基やその方法は、球状多孔質セルロース粒子を作製するのに用いた同じ塩基や方法を用いることができる。
【００４０】
調製したモノリスを評価するには、すでに述べたように適切な容器に隙間や局部的な圧密化がないように納める必要がある。このための方法は公知、非公知のどのようなものであってもよい。通常、ゲル化によってモノリスが生成するときには多少の収縮が起こり、容器との間に隙間ができることが多い。そのような場合、容器壁面をセルロース系物質と親和性の強い化学構造に修飾し（例えば表面にセルロースを結合する）、隙間ができないようにするか、あるいはゲルの環境変化による収縮・膨潤、あるいは容器のサイズをアジャスタブルにすることなどによって隙間なく納めることが可能になる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明の範囲がかかる実施例にのみ限定されないことはいうまでもない。【００４２】
＜実施例１＞
１．セルロースモノアセテート溶液の調製
１００℃で１時間真空乾燥したセルロースジアセテート（酢化度  ５４．７５％、６％アセトン溶液粘度０．１１７Ｐａ・ｓ（２５℃））１４．７０ｇを７８ｍＬのＤＭＳＯ（東京化成（株）製ＧＲグレード）に溶解した。別の容器にヒドラジン  モノヒドラート＞９８％ （東京化成（株）製）４．２０ｇ、ＤＭＳＯ１２．０１ｇを秤り取り、混合した後、全量を前記のセルロースジアセテート溶液に滴下し、沈殿を残さないように混合した。この液を１７時間、７０℃に保ち、セルロースモノアセテート溶液を得た。得られた液２０．２ｇに水１２．１ｇを加え、よくかき混ぜた後、温浴中に浸し、段階的に昇温、降温したところ、４０〜４５℃より高い温度では粘稠だが流動性のある透明な液体であったが、これ以下の温度では白濁して流動性を失った。【００４３】
２．多孔質セルロース粒子の調製
流動パラフィン（関東化学（株）製  比重０．８７、鹿１級）１５４ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）０．４１ｇをプラスチック（ＰＥ）容器に入れ、オーブン中で７０℃に保った。一方で、１で調製したセルロースモノアセテート溶液と水、おのおの６．６ｇを６０℃でよく混合し、室温に冷却すると白濁したゼリー状固体となった。これを上記の加温した流動パラフィンに投入し、３０分加温を継続した後、５分間、直径４ｃｍの撹拌羽根を用い、９５０−１０００ｒｐｍで撹拌した。得られた分散液を１Ｌビーカーに移し、水冷した。３時間２０℃に保った後、この中に水酸化カリウム０．７５ｇ、水２０ｇ、エタノール１５０ｍＬの混合液を加え、１時間、ゆっくり撹拌した。そのまま一夜静置すると、エタノールを主とする下層の底には、白い微粒子が沈降していることが認められた。図１に本沈殿の顕微鏡写真を示すが、ほぼ真球に近い形状であることが判る。また、この粒子を繰り返し水洗した後、水を３級ブチルアルコールに置換し、凍結乾燥した後に行った電子顕微鏡写真では、多孔質の表面が認められる（図２）。また、洗浄した粒子を１００℃で真空乾燥し、ＫＢｒディスク法で赤外吸収スペクトルを測定したが、アセチル基に基づく１７２０ｃｍ−１付近のカルボニル伸縮振動はまったく観察されなかった。【００４４】
３．サイズ排除クロマトグラフィー
同様にして得た粒子、３バッチをまとめ、水分散したままでステンレス製ふるいによって分級し、１５０μｍ〜１０６μｍの部分をまとめると、沈降体積は約１０ｍＬとなった。この約８ｍＬを内径１０ｍｍ、高さ１００ｍｍのカラムに充填し、下記の要領で、超純水を移動相とし、表１に示す標準ポリエチレンオキシドのサンプルを注入し、示差屈折検出器により検出した。常法に従って描いた検量線を図３に示す。
使用カラム        HR10/100（GEヘルスケア）
Tricorn10/100（GEヘルスケア）
流量             0.05ml/min  （分析時間180min〜240min)
◇PEO
溶離液           超純水（脱気）
標準物質（種類、濃度、打込量）【００４５】
【表１】
2016013568.tif 000003
【００４６】
＜実施例２＞
多孔質セルロース粒子の調製
ＶＴＲセルロースジアセテート（酢化度  ５４．７５％、６％アセトン溶液粘度０．１１７Ｐａ・ｓ（２５℃））  １６．２７ｇをＤＭＳＯ１８２．４９ｇに溶解した。本溶液３９．１９ｇをビーカーに採り、８０℃に加温しながらＤＭＳＯ１１．０１ｇと水１１．０１ｇの混合液を加え、かき混ぜた。透明な粘性液体を与えたが、室温に放冷するとゲル化した。
一方で、７５０ｍＬの流動パラフィン（関東化学 鹿１級）に乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）２．０４ｇを加え、９０℃に保温した。この中に前記のゲルを投入すると、ゲルは溶解し、下層にたまった。この液を入れた容器を８０℃の水浴に浸しながら、内容液に８０ｍｍφのディスパーサを挿入し、５分間４００ｒｐｍで回転、撹拌した。撹拌終了後、容器を水浴に浸し、冷却した。３時間後には容器底に粒状物と一部塊状の凝集物とが沈殿した。ここに、ＫＯＨ３．０９ｇを水５０ｍＬに溶かした溶液を加え、約１０ｒｐｍで緩やかに撹拌した。一夜放置した後に４００ｍＬの水を加えて緩やかに撹拌した後、下層を分液した。これを少量のドライアイスで中和した後、水で洗浄した。顕微鏡観察では、径約５０μｍの球状物であった。このものの赤外スペクトルには、アセチルエステルのカルボニル基を示す１７２０ｃｍ−１付近の吸収は認められなかった。【００４７】
＜実施例３＞
多孔質セルロース粒子の調製
セルロースジアセテート（酢化度  ５４．７５％、６％アセトン溶液粘度０．１１７Ｐａ・ｓ（２５℃））  ２．６０ｇをＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）２５．０１ｇと水５．００gに溶解した。本溶液を５５℃に加温しながらＮＭＰ３．７１ｇと水 ３．７０ｇの混合液を加え、かき混ぜた。透明な粘性液体を与えたが、氷浴で冷却するとゲル化した。
一方で、４００ｍＬの流動パラフィン（関東化学 鹿１級）に乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）０．６４ｇを加え、５５℃に保温した。この中に前記のゲルを投入すると、ゲルは溶解し、下層にたまった。この液を入れた容器を５５℃の水浴に浸しながら、内容液に８０ｍｍφのディスパーサを挿入し、１０分間３５０ｒｐｍで回転、撹拌した。撹拌終了後、容器を水浴に浸し、冷却した。２時間後には容器底に粒状物と一部塊状の凝集物とが沈殿した。ここに水２００ｍＬを加え、約１０ｒｐｍで穏やかに攪拌し、下層を分液した。ついで水２００ｍＬを加え、この操作を繰り返し下層にゲルを抽出した。これにＫＯＨ２．５１ｇを加え、緩やかに攪拌し、二夜放置した後に上澄みを廃棄した。残渣をグラスフィルターでろ別し、水で繰り返し洗浄した。得られた粒子の顕微鏡写真を図４に示すが、ほぼ真球に近い形状であることが判る。【００４８】
＜実施例４＞
多孔質セルロースジアセテートモノリスの調製
実施例１で用いたものと同じセルロースジアセテート６．８重量％、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）７１．６重量％、水２１．６重量％を含む組成物を内径１９ｍｍのガラス小瓶に満たし、６０℃で透明な溶液とした後、１５℃に放冷した。一夜後に組成物は白濁不透明の多孔質セルロースジアセテートのゲルとなっていた。これを繰り返し水で洗浄して得られた白色円柱状セルロースジアセテートは、直径が約１８ｍｍであった。【００４９】
多孔質セルロースモノリスの調製
得られた多孔質セルロースジアセテートモノリスの小片０．３８ｇを、水酸化カリウム０．２ｇ、水１ｍＬ、エタノール１０ｍＬよりなる液中に１昼夜浸した後、水で繰り返し洗浄した。得られたものは、大きさは水酸化カリウム処理前の約８５％に縮んでいたが、白色で形に全く変化はなかった。このモノリスの小片を切り取り、ろ紙上で転がして表面の付着水を除いた後に秤量すると１０４．９ｍｇであった。このものをポリスチレンの秤量皿に載せ９０℃のオーブンで１時間乾燥したところ、収縮した半透明の固い小片になっており、その重量は９．９ｍｇであり、更に乾燥を延長しても重量減少はなかった。これより、本モノリスの固形分率は９．４％であった。この乾燥されたモノリス片を破砕し、極く少量を定法により臭化カリウムと共にディスクに成型し、赤外吸収スペクトルを測定したが、アセチル基に基づく１７２０ｃｍ−１付近のカルボニル伸縮振動はまったく観察されず、セルロースに変換されていることが明らかであった。【００５０】
＜実施例５＞
多孔質セルロースアセテートモノリスおよびセルロースモノリスの調製
実施例１で用いたものと同じセルロースジアセテート７．７重量％、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７３．７重量％、水１８．６重量％を含む組成物について、実施例４と同じ操作によって、多孔質セルロースアセテートゲルを得た。このものは、水洗後の直径が約１７ｍｍであった。このモノリスの小片を実施例４と同じ条件で水酸化カリウム処理し、水洗したところ、大きさは７４％に縮んでいたが、形には変化のない白色固体となっており、その固形分率は１２．７％であった。赤外線吸収スペクトルにおいてアセチル基は検出されなかった。【００５１】
＜実施例６＞
１．多孔質セルロース粒子の調製
流動パラフィン（関東化学（株）製  比重０．８７、鹿１級）３８５ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）２．０５ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、水浴で６０℃に保った。一方で、実施例１−１で調製したセルロースモノアセテート溶液１６．５ｇ、ＤＭＳＯ３．５ｇ、水２４．５ｇを６０℃でよく混合した。これを上記の加温した流動パラフィンに投入し、１０分間加温を継続した後、５分間、直径６ｃｍの撹拌羽根を用い、２５０ｒｐｍで撹拌した。得られた分散液を平らな金属製容器に移し、氷冷した。３０分１０℃に保ってゲル化させた後、１Ｌ三角フラスコに移し、水酸化カリウム１．９ｇ、水２０ｇ、エタノール１５０ｍＬの混合液およびヘプタン１５０ｍＬを加え、１時間ゆっくり撹拌した。そのまま一夜静置した後、水を加えてゲル化した微粒子を含む下層を分離し、酢酸を加えて中和した後、得られた微粒子をエタノールと水で洗浄した。同様にして得た粒子の４バッチをまとめ、水分散したままでステンレス製ふるいによって分級し、５０−１０６μｍの部分をまとめると、沈降体積は約１０ｍＬとなった。【００５２】
２．架橋多孔質セルロース粒子の調製
１００ｍＬ三口フラスコに、実施例６−１で得られた多孔質セルロース粒子７．９ｍＬ、硫酸ナトリウム８．７ｇを水２３．６ｇに溶解した液を加え、５０℃で撹拌した。４５重量％水酸化ナトリウム水溶液０．４８ｇと水素化ホウ素ナトリウム７５ｍｇを加え、撹拌した。４５重量％水酸化ナトリウム水溶液４．８６ｇとエピクロロヒドリン４．９８ｇとをそれぞれ７等分した量を３０分おきにおよそ３時間かけて添加した。添加終了後、５０℃で１６時間反応させた。４０℃以下に冷却した後、酢酸０．５２ｇを加え、中和した。反応混合物をろ過して粒子を回収し、純水でろ過洗浄し、目的の架橋多孔質セルロース粒子を得た。【００５３】
３．架橋多孔質セルロース粒子へのプロテインＡ固定化とカラム作製
実施例６−２で得られた架橋多孔質セルロース粒子をグラスフィルターでろ別し、アセトニトリルで洗浄して、担体３．３ｍＬを得た。フラスコに担体を移液し、アセトニトリル２．５ｍＬと炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）５５ｍｇを含むアセトニトリル溶液１０ｍＬを加え、４℃、１８０ｒｐｍで振とうした。次いでＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン４１ｍｇを含むアセトニトリル溶液１ｍＬを加え２２時間振とうして反応させた。グラスフィルターでろ別して、アセトニトリル３０ｍＬ、５％酢酸を含むジオキサン３０ｍＬ、メタノール３０ｍＬ、２−プロパノール３０ｍＬの順に洗浄して活性化担体を得た。活性化担体１ｍＬをグラスフィルターに採取してカップリング緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で洗浄した。活性化担体をフラスコに移し、プロテインＡが５３．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液を１６８μＬ、カップリング緩衝液を２ｍＬ加え、５℃、１３０ｒｐｍで２２時間振とうして固定化した。グラスフィルターでろ別し、カップリング緩衝液で洗浄した。反応後のろ液をBradford法で測定した結果、プロテインＡが担体１ｍＬあたり９．０ｍｇ固定化されていることがわかった。次いでフラスコに担体を移し、１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８）２ｍＬを加え、２５℃、１３０ｒｐｍで２時間振とうして未反応活性基をマスクした。グラスフィルターでろ別し、洗浄液１（０．１Ｍトリス塩酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）、洗浄液２（０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．０）を交互に３サイクル洗浄した。固定化担体１ｍＬを純水で洗浄し、Tricorn 5/50 Columnにパッキングした。またSepharose 4FastFlow(GE Healthcare)も同様の操作でカラムを作製した（Protein A固定化量１０ｍｇ／ｍＬ)。【００５４】
４．プロテイン固定化カラムの抗体吸着容量
実施例６−３で作製したプロテインＡ固定化カラムを液体クロマトグラフィー装置AKTAexplore(GE Healthcare Bioscience)にセットし、吸着緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を１ｍＬ／ｍｉｎ.もしくは０．４ｍＬ／ｍｉｎ.の条件で流し平衡化させた後、１ｍｇ／ｍＬに調製したヒト血清由来γ-globulin（和光純薬）を注入した。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度の１５％に到達するまで注入を続けた後、吸着緩衝液で洗浄後、吸着緩衝液を２０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．４）へ置換した。
動的吸着容量（ＤＢＣ）は、溶出液の２８０ｎｍにおける非吸着成分を除いた吸光度が注入サンプルの吸光度の１０％に到達するまでに注入されたサンプル量から計算された。各固定化カラムのＤＢＣを表２に示した。【００５５】
【表２】
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【００５６】
＜実施例７＞
多孔質セルロース粒子の調製
流動パラフィン（関東化学（株）製  比重０．８７、鹿１級）７７１ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）４．１１ｇを１Ｌセパラブルフラスコに入れ、水浴で６０℃に保った。一方で、実施例１−１で調製したセルロースモノアセテート溶液３３ｇ、ＤＭＳＯ７ｇ、水４９ｇを６０℃でよく混合した。これを上記の加温した流動パラフィンに投入し、１０分間加温を継続した後、１０分間、直径６ｃｍの撹拌羽根を用い、２００ｒｐｍで撹拌した。得られた分散液を平らな金属製容器に移し、水冷した。１５分かけて２０℃まで冷却した後、水浴に少しずつ氷を加えながら、さらに１５分かけて１０℃まで冷却して、ゲル化させた。３０分１０℃に保った後、２Ｌ三角フラスコに移し、水酸化カリウム３．１ｇ、水２００ｇ、エタノール２００ｍＬの混合液およびヘプタン２００ｍＬを加え、１時間ゆっくり撹拌して微粒子を得た。そのまま一夜静置した後、水を加えてゲル化した微粒子が含まれる下層を分離し、酢酸を加えて中和した後、得られた微粒子をエタノールと水で洗浄した。水分散したままでステンレス製ふるいによって微粒子を分級し、５０−１０６μｍの部分をまとめると、沈降体積は約８ｍＬとなった。実施例６と同様の操作で架橋、プロテインＡを固定化して作製したカラムの動的吸着容量は、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ.で７ｍｇ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ.で１８ｍｇだった。【００５７】
＜実施例８＞
多孔質セルロース粒子の調製
流動パラフィン（関東化学（株）製  比重０．８７、鹿１級）１３ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）７５ｍｇを２０ｍＬサンプル管に入れ、水浴で６０℃に保った。一方で、実施例１−１で調製したセルロースモノアセテート溶液１．６５ｇ、ＤＭＳＯ０．３５ｇ、水２．４５ｇを６０℃でよく混合した。このセルロースモノアセテート溶液１．５ｇを上記の加温した流動パラフィンに投入し、５分間加温を継続した後、１分間手で振って撹拌した。サンプル管を氷冷し、３０分１０℃に保ち、ゲル化を行った後、１００ｍＬ三角フラスコに移し、水酸化カリウム０．１ｇ、水１ｇ、エタノール２０ｍＬの混合液およびヘプタン２０ｍＬを加え、１時間ゆっくり撹拌して微粒子を得た。そのまま一夜静置した後、水を加えて下層の微粒子を分離し、エタノールと水で洗浄した。【００５８】
＜実施例９＞
多孔質セルロース粒子の調製
流動パラフィン（関東化学（株）製  比重０．８７、鹿１級）１３ｇ、乳化剤ＴＳＧ１０（日本エマルジョン製）７５ｍｇを２０ｍＬサンプル管に入れ、水浴で６０℃に保った。一方で、実施例１−１で調製したセルロースモノアセテート溶液１．６５ｇ、ＤＭＳＯ０．３５ｇ、水２．４５ｇを６０℃でよく混合した。このセルロースモノアセテート溶液１．５ｇを上記の加温した流動パラフィンに投入し、５分間加温を継続した後、１分間手で振って撹拌した。サンプル管を水冷し、１５分かけて２０℃まで冷却した後、水浴に少しずつ氷を加えながら、さらに１５分かけて１０℃まで冷却した。３０分１０℃に保ち、ゲル化を行った後、１００ｍＬ三角フラスコに移し、水酸化カリウム０．１ｇ、水１ｇ、エタノール２０ｍＬの混合液およびヘプタン２０ｍＬを加え、1時間ゆっくり撹拌して微粒子を得た。そのまま一夜静置した後、水を加えて下層の微粒子を分離し、エタノールと水で洗浄した。【００５９】
＜実施例１０＞
多孔質セルロース粒子の調製
実施例９のセルロースモノアセテート溶液のＤＭＳＯをＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）に変更し、実施例９と同様の操作で多孔質セルロース粒子を調製した。【００６０】
＜実施例１１＞
多孔質セルロース粒子の調製
実施例９のセルロースモノアセテート溶液のＤＭＳＯをＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに変更し、実施例９と同様の操作で多孔質セルロース粒子を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の製造方法では、セルロースアセテートを含む特定の組成物が温度変化によりゲル化が起こる性質を利用して多孔質セルロース媒体の製造を行う。
セルロースアセテートのゲル化の過程において、細孔の大きさが均一になる。このことは、従来の多孔質セルロース媒体の製造方法において、細孔の形成の過程で溶媒の蒸発を起こさせ、物質の移動を生じさせる態様とは異なる。また、本発明の製造方法によれば、得られる多孔質セルロース媒体の細孔の大きさは数千Å程度の大きなものとなる。本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体の硬度は、従来から存在する市販品と同程度である。本発明の製造方法により得られた多孔質セルロース媒体は、その形状が球状粒子であっても、モノリスであっても、分離剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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