(57)【要約】  迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出できる方法を提供することを目的とし、以下の工程（１）〜（３）（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。（２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程（３）増幅の有無を確認する工程を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）
（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
（２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
（３）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法。
【請求項２】
病原性真菌が、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項３】
病原性真菌が、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida  glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida  tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida  parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon  asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon  mucoides）およびフィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella  neoformans）からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項４】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１〜７に記載の塩基配列からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項５】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１に記載の塩基配列の２６０〜４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０〜７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０〜５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０〜５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０〜３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０〜４６０位および配列番号７に記載の塩基配列の２５０〜５１０位からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項６】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）〜（ｇ）
（ａ）カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号８〜１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｂ）カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１４〜１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１９〜２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号２４〜２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６〜４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｅ）トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５１〜５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｆ）トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５６〜５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｇ）フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号６１〜６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項７】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）’〜（ｇ）’
（ａ）’カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号８〜１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１〜１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｂ）’カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１４〜１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）’カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１９〜２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）’カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号２４〜２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、２８〜３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６〜５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｅ）’トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５１〜５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｆ）’トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５６〜６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｇ）’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号６１〜６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものである請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項８】
試料からＤＮＡを抽出する工程にプロテアーゼ処理を含むことを特徴とする請求項１記載の病原性真菌の一括検出方法。
【請求項９】
１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１０】
病原性真菌が、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１１】
病原性真菌が、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida  glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida  tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida  parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon  asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon  mucoides）およびフィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella  neoformans）からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１２】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１〜７の塩基配列からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１３】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域が、配列番号１に記載の塩基配列の２６０〜４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０〜７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０〜５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０〜５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０〜３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０〜４６０位および配列番号７に記載の塩基配列の２５０〜５１０位からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１４】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）〜（ｇ）
（ａ）カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号８〜１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｂ）カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１４〜１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１９〜２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号２４〜２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６〜４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｅ）トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５１〜５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｆ）トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５６〜５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｇ）フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号６１〜６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１５】
病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットが、以下の（ａ）’〜（ｇ）’
（ａ）’カンジダ・アルビカンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号８〜１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号８、９、１１〜１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｂ）’カンジダ・グラブラータ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１４〜１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｃ）’カンジダ・トロピカリス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号１９〜２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｄ）’カンジダ・パラプシローシス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号２４〜２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、２８〜３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号４６〜５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる１種以上
（ｅ）’トリコスポロン・アサヒ用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５１〜５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｆ）’トリコスポロン・ムコイデス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号５６〜６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
（ｇ）’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用ＬＡＭＰプライマーセット
配列番号６１〜６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものである請求項９記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット。
【請求項１６】
請求項９〜１５の何れかに記載の病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キット。
【請求項１７】
更に、核酸合成酵素と、核酸合成の基質を含む請求項１６に記載の病原性真菌の一括検出キット。
【請求項１８】
核酸合成酵素が鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼであり、核酸合成の基質がｄＮＴＰである請求項１７に記載の病原性真菌の一括検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ法を利用した迅速、簡便な病原性真菌の一括検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は糸状菌、酵母、キノコの総称であり、生活環境において幅広く存在している菌である。通常この真菌は人体に影響はないが、真菌の種類によっては、肺や肝臓等の臓器や手、足裏等の体表面に感染した場合、疾患を引き起こすことがある。特に、好中球減少症をはじめとした免疫不全の状態になると、いわゆる日和見感染を起こしやすい状態になることが知られている。【０００３】
これらの疾患のうち、真菌が肺や肝臓など、体の深部に入り込んで感染が起こっている状態を深在性真菌症という。深在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida  glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida  tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida  parapsilosis）等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon  asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon  mucoides）等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella  neoformans）等のフィロバシディエラ属の真菌等が知られている。【０００４】
また、真菌の体表面で感染が起こっている状態を表在性真菌症という。表在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、トリコフィトン・ルブラム（Trichophyton  rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton  mentagrophytes）等のトリコフィトン属の真菌が知られている。【０００５】
これら人体に疾患を引き起こす病原性の真菌を早期に検出することは非常に重要である。特に、食品分野において、製品出荷前に製品中に混入した病原性の真菌を迅速に検出することは、製品出荷停滞の縮減および生産効率の向上をはかる上で非常に重要である。【０００６】
これまで病原性の真菌の検出法として、分離培養する方法（特許文献１）や直接鏡検法（非特許文献１）、血清学的検査法（非特許文献１）、あるいはＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法（特許文献２、３）が従来から用いられている。分離培養法は、菌がごく少量であったとしても検出可能であるが、平板培地への集落形成には数日から場合によっては数週間を要するという時間的な問題があった。直接検鏡法は検体をそのまま、あるいは液体であれば遠心分離後の沈殿物を光学顕微鏡で直接、あるいはグラム染色やギムザ染色等を施して観察するものであるが、鏡検像のみで判断するため、検体によっては判断に迷うことがあり、熟練した技術が必要といった問題があった。ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked  ImmmunoSorbent  Assay）法やラテックス凝集（Latex  Agglutination）法などの血清学的検査は、病原性真菌が保持する糖タンパク質や細胞壁の構成成分等の抗原あるいは病原性真菌の代謝産物を検出する方法であり、迅速性や簡便性に優れた方法であるが、感度が低いことや、他の真菌との抗原一致によって偽陽性となる要因が複数存在するといった問題があった。ＰＣＲ法は真菌の核酸を鋳型とすることから、前記方法と比較して特異性が大幅に向上したが、核酸増幅に周期的な温度変化設定が必要なＰＣＲ反応、ＰＣＲ産物の電気泳動を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。また、この方法では１回の反応で１種類しか真菌が検出できず、複数種の真菌が検査対象の場合には、それぞれの菌種についてＰＣＲ法を実施しなければならなかった。さらに、複数の病原性真菌を一括で検出する手法として、複数のプライマーを反応液に混合してＰＣＲ反応を行うマルチプレックスＰＣＲ法と、マイクロプレートハイブリダイゼーションを組み合わせて用いる手法についても報告がされている（特許文献３）。しかしながら、この方法もＰＣＲ産物を用いた検出工程を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−２３９９８２号公報
【特許文献２】特開平８−８９２５４号公報
【特許文献３】特開２００８−５４５６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】深在性真菌症のガイドライン作成委員会編、「深在性真菌症の診断・治療ガイドライン２００７」、協和企画、２００７年２月、ｐ．４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法を利用し、これに用いるＬＡＭＰプライマーセットとして、１菌種の病原性真菌の特定の領域を増幅しうるＬＡＭＰプライマーセットを用いれば、これを２菌種分以上混合しても２菌種以上の病原性真菌を一括で検出できることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は以下の工程（１）〜（３）
（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
（２）１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
（３）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法である。【００１２】
また、本発明は１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットである。【００１３】
更に、本発明は上記病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キットである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の病原性真菌の一括検出方法は、感度よく、複数の病原性真菌を一括で検出することができる。【００１５】
また、本発明の病原性真菌の一括検出方法は、温度条件も一定であり、結果を目視でも確認できるため、従来行われていたＰＣＲ法等と比べて迅速であるのみならず、試験器具が揃わないような環境下でも簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。また、本発明により、病原性真菌の一括検出が可能な検出キットを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の病原性真菌の一括検出方法（以下、「本発明検出方法」という）は、以下の工程（１）〜（３）を含む。
（１）試料からＤＮＡを抽出する工程。
（２）１菌種の病原性真菌の１８Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＩＴＳ（内部転写スペーサー、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ）領域またはＩＧＳ（遺伝子間スペーサー、Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ）領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを２菌種分以上と、（１）で抽出したＤＮＡを用いてＬＡＭＰ反応を行う工程
（３）増幅の有無を確認する工程
【００１７】
本発明検出方法の工程（１）において用いられる試料としては、特に限定されないが、例えば、血液やバイオプシー（生検）などの臨床検体や、土壌などの環境試料、あるいは乳製品等の飲食品、飲食品の原材料等が挙げられる。これらの中でも、飲食品が好ましく、特に乳製品が好ましい。ここで、乳製品としては、乳由来成分を含むものであれば特に限定されず、例えば、牛乳、加工乳、乳飲料、クリーム、発酵乳、乳酸菌飲料、練乳、濃縮乳、粉乳、バター、チーズ、アイスクリーム、バターミルク等が挙げられる。これら乳製品には、最終製品のみならず、カゼイン、ホエー蛋白質、乳ペプチド、ラクトフェリン等の乳由来原料、乳酸菌による培養物等の中間加工処理物等も含まれる。
【００１８】
上記試料からＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、フェノールやクロロホルム、ベンジルクロライドなどの有機溶剤を用いて抽出する方法や、ガラスビーズ振盪により物理的に菌体を破砕する方法、アルカリを直接添加する方法、加熱処理による方法、あるいはプロテアーゼ処理法等の方法が挙げられる。また、試料からＤＮＡを抽出するにあたり、市販のＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。これらの方法の中でもプロテアーゼ処理を含む方法がＤＮＡの抽出の所要時間が短く、かつ抽出効率が高い点から好ましい。
【００１９】
具体的に、試料として乳製品を用いた場合に、プロテアーゼ処理法でＤＮＡを抽出する方法は次の通りである。乳製品をプロテアーゼで処理した後、遠心分離等により、プロテアーゼで消化されたタンパク質あるいはポリペプチドを除去する。その後、アルカリ溶液や緩衝バッファー等を添加し、加熱処理等によって菌体からＤＮＡを露出させる。加熱処理後の溶液、あるいはこれから更に遠心分離等によって不純物を除去した後の溶液をＤＮＡ溶液とする。使用するプロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜５００ｍｇ／ｍｌである。
【００２０】
本発明検出方法の工程（２）において用いられるＬＡＭＰプライマーセットは、１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するものである。これらの領域を用いることにより、２菌種以上のプライマーセットを組み合わせたとしても、菌種ごとのＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を特異的に増幅できる。
【００２１】
具体的に病原性真菌としては、深在性真菌症を引き起こす、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida  albicans）、カンジダ・グラブラータ（Candida  glabrata）、カンジダ・トロピカリス（Candida  tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida  parapsilosis）等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon  asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon  mucoides）等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（Filobasidiella  neoformans）等のフィロバシディエラ属の真菌、表在性真菌症を引き起こす、トリコフィトン・ルブラム（Trichophyton  rubrum）、トリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton  mentagrophytes）等のトリコフィトン属の真菌や、マラセチア・グロボーサ（Malassezia  globosa）、マラセチア・パチダーマティス（Malassezia  pachydermatis）等のマラセチア属の真菌が挙げられる。これらの病原性真菌の中でも、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれる２属以上が好ましく、特にカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・ムコイデスおよびフィロバシディエラ・ネオフォルマンスからなる群から選ばれる２種以上が好ましく、これらの全種がより好ましい。
【００２２】
これら病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットには、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰの４種類のプライマーが必須である。また、このＬＡＭＰプライマーセットには、検出時間を短縮するために、ＬＦ、ＬＢといったループプライマーを追加することが好ましい。プライマー設計のためには、まず、これらのプライマーが標的とする領域として、病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域の少なくとも一部を含む塩基配列から選択される標的領域の５’側から塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２およびＦ１を選択し、前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ１ｃを選択する。そして、前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃの相補的塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２、Ｂ１とし、前記Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１の相補的塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃとしたとき、それぞれのプライマーは以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかに該当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
（Ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列（ＢＩＰ）
（Ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列（Ｂ３）
（Ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列（ＦＩＰ）
（Ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列（Ｆ３）
（Ｅ）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列（ＬＢ）
（Ｆ）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列（ＬＦ）
【００２３】
前記のとおりＬＡＭＰ法で用いるプライマーは少なくとも４種類であり、その中には３５塩基以上の長いプライマーも含まれている。したがって、２菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合してＬＡＭＰ法を行う（マルチプレックスＬＡＭＰ）場合、他菌種のプライマー同士が二本鎖を形成してプライマーダイマーを形成し、ＬＡＭＰ反応が正常に進まないことが容易に予想される。しかしながら、本願発明の発明者らは、病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域の少なくとも一部を標的として、プライマーを設計し、当該プライマーを用いることにより、２菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合した場合でも、ＬＡＭＰ反応が正常に進み、標的菌種を特異的に検出することが可能であることを見出した。
なお、本願発明において、ＩＴＳ領域とはＩＴＳ１領域（１８Ｓ  ｒＤＮＡと５．８Ｓ  ｒＤＮＡの間に存在する）と、ＩＴＳ２領域（５．８Ｓ  ｒＤＮＡと２６Ｓ  ｒＤＮＡの間に存在する）の両方を含むものである。また、ＩＧＳ領域とはＩＧＳ１領域（２６Ｓ  ｒＤＮＡと５Ｓ  ｒＤＮＡの間に存在する）と、ＩＧＳ２領域（５Ｓ  ｒＤＮＡと１８Ｓ  ｒＤＮＡの間に存在する）の両方を含むものである。
【００２４】
本発明の病原性真菌検出用ＬＡＭＰプライマーセットを構成するプライマーは、病原性真菌およびこれに近縁な菌のＩＴＳ領域およびＩＧＳ領域の少なくとも一部を含む塩基配列情報を相同性解析し、病原性真菌のみ保持する塩基配列の少なくとも一部を含む塩基配列であることが好ましい。また、ＬＡＭＰプライマーセットの設計は、段落００２２に記載の領域を選択する以外は、例えば、ソフトウェアを用いて設計することができる。
具体的には、前記真菌の塩基配列情報を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋ）より入手し、ＭＡＦＦＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６（http://mafft.cbrc.jp/alignment/software）やＣｌｕｓｔａｌＷなどの相同性解析ソフトウェアを用いて解析を行い、病原性真菌のみが保持する塩基配列を見出すことにより、病原性真菌のみ保持する塩基配列情報を得ることができる。さらに、Ｗｅｂサイト上で提供されているＬＡＭＰプライマー設計ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖｅｒ．４．０（https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/））を用いて設計することができる。前記ソフトウェアにより、ループプライマーも設計することができる。
【００２５】
以下に具体的な病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域やＬＡＭＰプライマーセットについて説明する。
【００２６】
カンジダ・アルビカンスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号１に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EF567995）である。本発明検出方法においては、配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号１に記載の塩基配列の２６０〜４９０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００２７】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号８〜１１に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号８、９、１１、１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号８〜１２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号８、９、１１〜１３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００２８】
カンジダ・グラブラータのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号２に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AB032177）である。本発明検出方法においては、配列番号２に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号２に記載の塩基配列の５７０〜７９３位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００２９】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号１４〜１７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号１４〜１８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３０】
カンジダ・トロピカリスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号３に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AY939810）である。本発明検出方法においては、配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号３に記載の塩基配列の２８０〜５００位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００３１】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号１９〜２２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号１９〜２３に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３２】
カンジダ・パラプシローシスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号４に記載の塩基配列（アクセッションナンバー：AY391843）である。本発明検出方法においては、配列番号４に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号４に記載の塩基配列の２６０〜５７０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００３３】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号２４〜２７に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜３９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号４６〜４９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号２４〜２９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号２４〜２６、２８〜３０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３１〜３６に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号３２、３７〜４０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号４１〜４５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号４６〜５０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる１種以上を用いることが好ましい。
【００３４】
トリコスポロン・アサヒのＩＧＳ１領域を含む領域は、配列番号５記載の塩基配列（アクセッションナンバー：FJ754250）である。本発明検出方法においては、配列番号５に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号５記載の塩基配列の１３０〜３４０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００３５】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号５１〜５４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号５１〜５５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３６】
トリコスポロン・ムコイデスのＩＧＳ１領域を含む領域は、配列番号６記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EU934806）である。本発明検出方法においては、配列番号６に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号６記載の塩基配列の２２０〜４６０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００３７】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号５６〜５９に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号５６〜６０に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３８】
フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域を含む領域は、配列番号７記載の塩基配列（アクセッションナンバー：EU240005）である。本発明検出方法においては、配列番号７に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号７記載の塩基配列の２５０〜５１０位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。
【００３９】
この配列を増幅できるＬＡＭＰプライマーセットとしては、配列番号６１〜６４に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号６１〜６５に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００４０】
なお、前記のようにして設計されたＬＡＭＰプライマーセットを構成する各プライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて得ることもできるし、シグマアルドリッチジャパン社やライフテクノロジーズジャパン社などのＤＮＡ合成業者等に合成を依頼して得ることができる。
【００４１】
上記した１菌種の病原性真菌のＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するＬＡＭＰプライマーセットを、２菌種分以上、好ましくは４菌種分以上、特に好ましくは７菌種分以上用い、これを工程（１）で抽出したＤＮＡとＬＡＭＰ反応させる。ＬＡＭＰ反応の条件は、特に限定されず、公知の条件を用いることができる。
【００４２】
具体的に、ＬＡＭＰ反応は、上記ＬＡＭＰプライマーセット、工程（１）で抽出したＤＮＡ、核酸合成酵素、核酸合成の基質、その他必要により酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩やマンガン塩等）、酵素や鋳型ＤＮＡの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬等を含む反応液とし、これを５８〜６７℃、好ましくは６０〜６５℃で１〜１８０分間、好ましくは１０〜１２０分間維持することにより行われる。
【００４３】
前記ＬＡＭＰ反応に用いられるＤＮＡの核酸合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｃｓａ  ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７  ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。また、核酸合成の基質としては、例えば、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む）等が挙げられる。
【００４４】
本発明検出方法の工程（３）において増幅の有無の確認は、公知の方法で行うことができる。具体的に、ＬＡＭＰ法は増幅反応の副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成し、反応液が白濁するので目視や濁度計による測定で増幅があったことを確認することもできるし、また、反応液を電気泳動させればラダーパターンが存在するかどうかによって増幅があったことを確認することができる。さらに、反応液にエチジウムブロマイドを添加して増幅させた反応液にＵＶを照射することで蛍光強度が増強されるため、蛍光の有無によって増幅があったことを確認することができる。
【００４５】
以上説明した本発明検出方法は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。
【００４６】
また、本発明検出方法を実施するため、上記した病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセットを含むキットを用いることもできる。
【００４７】
上記したキットの好ましい態様としては、上記した病原性真菌の一括検出用ＬＡＭＰプライマーセット、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、核酸合成の基質と、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩やマンガン塩等）、酵素や鋳型ＤＮＡの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬、器具類等を含むものが挙げられる。また、本発明のキットには、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行していることを確認するための陽性対照を含んでいてもよい。陽性対照として、例えば本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含むＤＮＡ等が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００４９】
実  施  例  １
病原性真菌の特異的検出：
（１）ＬＡＭＰプライマーの設計および合成
まず、病原性真菌である、カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）、カンジダ・グラブラータ（C.  glabrata）、カンジダ・トロピカリス（C.  tropicalis）、カンジダ・パラプシローシス（C.  parapsilosis）、トリコスポロン・アサヒ（T.  asahii）、トリコスポロン・ムコイデス（T.  mucoides）、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス（F.  neoformans）、およびこれらに近縁の菌種の１８Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＩＴＳ領域、あるいは２６Ｓ−５Ｓ  ｒＤＮＡ  ＩＧＳ領域の塩基配列情報を、国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ／ＧｅｎＢａｎｋ）より入手した。ＭＡＦＦＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６（http://mafft.cbrc.jp/alignment/software）を用いてこれらをアライメント解析し、ＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域上の病原性真菌特異的な配列を抽出した。これらをもとに、ＩＴＳ領域またはＩＧＳ領域を含む領域の少なくとも一部を増幅できるＬＡＭＰプライマーを、配列番号１に記載の塩基配列の２６０〜４９０位、配列番号２に記載の塩基配列の５７０〜７９３位、配列番号３に記載の塩基配列の２８０〜５００位、配列番号４に記載の塩基配列の２６０〜５７０位、配列番号５に記載の塩基配列の１３０〜３４０位、配列番号６に記載の塩基配列の２２０〜４６０位、配列番号７に記載の塩基配列の２５０〜５１０位を増幅できるよう、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖｅｒ．  ４．０（https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/）を使用して設計した。設計したＬＡＭＰプライマーを表１に示した。ここでCalb-aは配列番号８〜１２、Cglaは配列番号１４〜１８、Ctroは配列番号１９〜２３、Cpar-bは配列番号２４〜２６、２８〜３０、Tasaは配列番号５１〜５５、Tmucは配列番号５６〜６０、Fneoは配列番号６１〜６５、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。なお、これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン社にＤＮＡ合成を依頼して得た。【００５０】
【表１】
2014133153.tif 000002
【００５１】
（２）病原性真菌からのＤＮＡ抽出
後記する表３に示した菌をそれぞれ生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が１.０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。この懸濁液から、ベンジルクロライド法によりＤＮＡを抽出した。【００５２】
具体的には、１ｍＬの菌体懸濁液を１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、２５０μＬ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ  ９.０］）、０.７ｇ  ガラスビーズ（φ０．１−０．２ｍｍ)、５００μＬ  ベンジルクロライドを添加し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１）にて強さ６.５で３０秒間激しく振とうした後、５０μＬ  １０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてＭｉｃｒｏｉｎｃｕｂａｔｏｒ（タイテック製）にて５０℃、２０分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後１５０μＬ  ３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清４００μＬを回収した。回収した上清に４００μＬ冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに３００μＬ冷７０％エタノールを添加して転倒混和後、１５,０００×ｇで３分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、５０μＬ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ  ８.０］で沈殿物を溶解させたものをＤＮＡ溶液とした。【００５３】
（３）ＬＡＭＰ法による病原性真菌の検出
上記（２）で抽出したＤＮＡは、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。ＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）および表１に記載の各プライマーセットをそれぞれ単独で用いて、前記キットに添付のプロトコールに従い、表２に記載の反応液を用いて、６２℃で９０分間反応させた。病原性真菌のＤＮＡの増幅評価は、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により、反応中の反応液の濁度上昇の有無で評価した（＋：６０分以内に濁度上昇あり（増幅あり）、−：９０分経過後も濁度上昇なし（増幅なし））。評価においては、濁度０.１を閾値とし、閾値に達した際の時間（Ｔｔ）を比較基準とした。この結果を表３に示した。【００５４】
【表２】
2014133153.tif 000003
【００５５】
【表３−１】
2014133153.tif 000004
【表３−２】
2014133153.tif 000005
【００５６】
上記結果より、各プライマーセットは、標的とした病原性真菌のＤＮＡ配列のみを増幅し、特異的に検出することができた。【００５７】
実  施  例  ２
ＬＡＭＰプライマーの検討：
カンジダ・アルビカンス（C.  albicans）に特異的なプライマーセットと、カンジダ・パラプシローシス（C.  parapsilosis）グループに特異的なプライマーセット候補を、それぞれの標的菌種の５．８Ｓ−２６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＩＴＳ２上に設計した。設計したプライマーを表４に示した。ここでCalb-aは配列番号８〜１２、Calb-bは配列番号８、９、１１〜１３、Cpar-aは配列番号２４〜２９、Cpar-bは配列番号２４〜２６、２８〜３０、Cpar-60は配列番号３１〜３６、Cpar-63は配列番号３２、３７〜４０、Cpar-65は配列番号４１〜４５、Cpar-68は配列番号４６〜５０、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。これらのプライマーセットを用いて、カンジダ・アルビカンス（YIT  8272T）あるいはカンジダ・パラプシローシス（YIT  10333T）より、実施例１と同様にして抽出したＤＮＡ１０ｎｇを鋳型に、６２℃で９０分間ＬＡＭＰ反応を実施して、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表５に示した。【００５８】
【表４】
2014133153.tif 000006
【００５９】
【表５】
2014133153.tif 000007
【００６０】
上記結果より、カンジダ・アルビカンスに特異的なプライマーセットでは、Calb-bよりCalb-aでＴｔが早く、カンジダ・パラプシローシスグループに特異的なプライマーセットでは、Cpar-bが最もＴｔが早いことが確認された。【００６１】
実  施  例  ３
マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検討（１）：
深在性カンジダ症起因菌および深在性トリコスポロン症起因菌による汚染をそれぞれ一回の反応で判定可能とするため、複数のプライマーセットを同一反応液に混合したｍＬＡＭＰ法を検討した。【００６２】
Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット４種（Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計２１本（mCan）)とそれぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬ(５０ｎｇ)を混合したｍＬＡＭＰ反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット２種（TasaおよびTmucのプライマー計１０本（mTri））を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表６に示した。【００６３】
実験は３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性とした。【００６４】
【表６】
2014133153.tif 000008
【００６５】
上記の結果より、標的菌種に近縁な４７菌種について交叉性を調べた結果、通常のＬＡＭＰ法と同様に、プライマーセットを複数組み合わせたｍＬＡＭＰにおいても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。【００６６】
実  施  例  ４
マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検討（２）：
深在性真菌症起因菌の検出を迅速にするために、７つのプライマーセットを同時に反応させ、ｍＬＡＭＰ法を行った。【００６７】
Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、表１に記載の７つのプライマーセット（Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、TasaおよびTmucのプライマー計３６本（7plex））と、それぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬ（５０ｎｇ）を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値（０.１）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。その結果を表７に示した。なお、反応は同一ＤＮＡ溶液について３連で実施した。【００６８】
【表７】
2014133153.tif 000009
【００６９】
上記の結果より、プライマーセットは７種組み合わせても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。【００７０】
実  施  例  ５
ＬＡＭＰ法の検出限界の検討：
標的菌種を１.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したＤＮＡ溶液をＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）にて５倍ないし１０倍で段階希釈した。ＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、表１に記載の７つのプライマーセット（Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、Tasa、Tmuc）をそれぞれ添加し、更にそれぞれ１菌種分の鋳型ＤＮＡ溶液５μＬを混合したＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表８に示した。【００７１】
【表８】
2014133153.tif 000010
【００７２】
ｑＰＣＲでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは１０１ｃｅｌｌ／ｍｌ相当ＤＮＡ、トリコスポロン・アサヒでは１０２ｃｅｌｌ／ｍｌ相当ＤＮＡと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法はｑＰＣＲ法より優れた検出感度をもつことがわかった。【００７３】
実  施  例  ６
マルチプレックスＬＡＭＰ（ｍＬＡＭＰ）法の検出限界の検討：
標的菌種を１.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したＤＮＡ溶液をＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０）にて５倍ないし１０倍で段階希釈した。ｍＬＡＭＰ反応は、Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学製）に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット４種（Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計２１本（mCan）)と鋳型ＤＮＡ溶液５μＬを混合したｍＬＡＭＰ反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット２種（TasaおよびTmucのプライマー計１０本（mTri））を混合したｍＬＡＭＰ反応液を用いて、Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＬＡ−２００：テラメックス製）により、６２℃で反応しながら、９０分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表９に示した。【００７４】
【表９】
2014133153.tif 000011
【００７５】
ｑＰＣＲでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは１０１ｃｅｌｌｓ／ｍｌ相当ＤＮＡ、トリコスポロン・アサヒでは１０２ｃｅｌｌｓ／ｍｌ相当ＤＮＡと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたｍＬＡＭＰ法はｑＰＣＲ法とほぼ同等の検出感度をもつことがわかった。【００７６】
実  施  例  ７
ＤＮＡ抽出方法の検討：
フィロバシディエラ・ネオフォルマンスを生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が１.０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように懸濁液を調製した。この懸濁液を１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した菌体ペレットに市販の乳製品乳酸菌飲料であるヤクルト（無脂乳固形分３．１％、乳脂肪０．１％、ヤクルト本社製）を１ｍｌ添加した。これを前記乳製品乳酸菌飲料で段階希釈して調製した、種々の濃度（１．０ｘ１０７〜１．０ｘ１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）のフィロバシディエラ・ネオフォルマンスを含む擬似汚染乳製品について以下の（１）〜（３）のＤＮＡの抽出方法について所要時間を検討した。またこれらの方法で擬似汚染乳製品から抽出したＤＮＡと、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用い、実施例６と同様にして検出感度を測定した。【００７７】
（１）ベンジルクロライド法
擬似汚染乳製品１ｍｌを１５,０００×ｇで５分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、２５０μＬ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ  ９.０］）、０.７ｇ  ガラスビーズ（φ０．１−０．２ｍｍ)、５００μＬ  ベンジルクロライドを添加し、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１）にて強さ６.５で３０秒間激しく振とうした後、５０μＬ  １０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてＭｉｃｒｏｉｎｃｕｂａｔｏｒ（タイテック製）にて５０℃、２０分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後１５０μＬ  ３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清４００μＬを回収した。回収した上清に４００μＬ冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、１５,０００×ｇで８分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに３００μＬ冷７０％エタノールを添加して転倒混和後、１５,０００×ｇで３分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、５０μＬ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ  ８.０］で沈殿物を溶解させたものをＤＮＡ溶液とした。【００７８】
（２）アルカリ直接添加法
擬似汚染乳製品１ｍｌに、アルカリ溶液（２５μｌ  ５Ｍ  ＮａＯＨ）を添加し、５分間、３７℃で反応したものを粗ＤＮＡ抽出液とした。【００７９】
（３）プロテアーゼ処理法
擬似汚染乳製品１ｍｌに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］に溶解したプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ（天野エンザイム製）を３８．３ｍｇ／ｍｌの濃度で１５０μｌ添加し、３分間、４５℃で反応後、２分間、１０，０００×ｇで遠心し、上清を除去した。これにアルカリ溶液（１０％  Ｃｈｅｌｅｘ−１００  ｒｅｓｉｎ  ｉｎ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  １１］）を添加し、５分間、１００℃で反応後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和した。これを１分間、２０，０００×ｇで遠心し、上清をＤＮＡ抽出液とした。【００８０】
ベンジルクロライド法でＤＮＡを抽出したところ抽出に９０分かかり、検出感度は１.９×１０２ｃｅｌｌ／ｍｌであった。また、アルカリ直接添加法でＤＮＡを抽出したところ抽出は１５分であったものの、検出感度は５.３×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌであった。一方、プロテアーゼ処理法でＤＮＡを抽出したところ抽出は１５分であり、検出感度は１.０×１０３ｃｅｌｌ／ｍｌであった。この結果より、抽出時間と検出感度から総合的に判定するとＤＮＡの抽出法としてはプロテアーゼ処理法が優れていることが分かった。【００８１】
実  施  例  ８
ループプライマーによる検出時間短縮の検討
実施例１と同様の方法で抽出したフィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用いて実施例１と同様の方法でＬＡＭＰ反応を行った。
また、Fneoプライマーセットに含まれる５種のプライマーのうち、Fneo-LB（ループプライマー）のみを除いたプライマーセットを用いて、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし同様にＬＡＭＰ反応を行った。
Ｌｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置（ＲＴ−１６０Ｃ：栄研化学製）により反応液の吸光度の微分値が閾値（０．００８）を越えた時間（Ｔｔ）を測定した。なお反応は同一ＤＮＡ希釈液について３連で実施した。
これらの結果を表１０に示す。【００８２】
【表１０】
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【００８３】
ループプライマーを用いた方が検出時間が短縮されることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができるので、病原性真菌を原因とする疾患の診断、予防や、病原性真菌に汚染された飲食品による出荷停滞の抑制等に利用することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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