(57)【要約】  本発明の課題は、グルタルアルデヒドを含まず、脳損傷に対して十分な治療効果を発揮できる脳損傷治療用細胞構造体、その製造方法及び脳損傷治療剤を提供することである。本発明によれば、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている脳損傷治療用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は前記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、脳損傷治療用細胞構造体が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている脳損傷治療用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は前記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項２】
前記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞及び／又は骨髄細胞を含む、請求項１に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項３】
１回の投与当たり投与される細胞数が、１．０×１０5 〜 １．０×１０7 個／ｋｇ体重である、請求項１又は２に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項４】
脳損傷が、脳外傷、低酸素性虚血性脳損傷、脳梗塞及び／又は脳卒中である、請求項１から３の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項５】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項６】
前記細胞構造体の厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から５の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項７】
前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項８】
前記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、請求項１から７の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項９】
前記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項８に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１０】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、前記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項１から９の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１１】
前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項１から１０の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１２】
前記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
前記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、請求項１から１１の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１３】
前記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；
前記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ；及び
前記工程ｂで得られた多孔質体を粉砕する工程ｃ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、請求項１から１２の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１４】
前記工程ａにおいて、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融より７℃低い温度以下となる、請求項１２又は１３に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１５】
前記細胞構造体が、前記生体親和性高分子ブロックと前記細胞とを混合し、１０時間以上培養することにより得られる細胞構造体である、請求項１から１４の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体を複数個融合することにより得られる、脳損傷治療用細胞構造体。
【請求項１７】
タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である生体親和性高分子ブロックと細胞とを混合し、１０時間以上培養する工程を含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１から１６の何れか一項に記載の脳損傷治療用細胞構造体を含む、脳損傷治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳損傷治療用細胞構造体、その製造方法、及び脳損傷治療剤に関する。詳しくは、本発明は、細胞間の隙間に生体親和性高分子ブロックが配置されている脳損傷治療用細胞構造体、その製造方法、及び脳損傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。これら新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。【０００３】
特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献２の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成が評価されている。【０００４】
また、細胞移植により疾患を治療することも報告されている。例えば、特許文献３には、細胞生理活性物質及び細胞を含む組成物が記載されており、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と血管内皮細胞による併用療法が脳組織の再生に有効であることが記載されている。また、特許文献４には、フィブリン、生体内分解性高分子及び細胞を含有する血管新生誘導剤が記載されている。さらに、特許文献５には、Notch遺伝子及び／又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を導入した骨髄間質細胞を生体適合性高分子に接着させた細胞含有組成物を用いて脳卒中などの中枢神経疾患を治療することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【特許文献２】特開２０１４−１２１１４号公報
【特許文献３】特開２００５−３５９４５号公報
【特許文献４】特開２００４−１４３０６７号公報
【特許文献５】特開２０１２−２１９１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１及び特許文献２の実施例に記載されている細胞構造体の高分子ブロックにおいては、高分子の架橋のためにグルタルアルデヒドが使用されている。人体に対する細胞移植治療のためには、グルタルアルデヒドを使用しない方法で作製した細胞構造体を使用することが望ましい。しかし、グルタルアルデヒドを使用しない方法で作製された細胞構造体の脳損傷治療に対する有効性については未だ報告がない。【０００７】
特許文献３には脳組織にＨＧＦと血管内皮細胞を投与する併用療法が記載されているが、脳梗塞後の運動機能の改善は評価されておらず、脳損傷に対して十分な治療効果が発揮されるかどうかは不明である。特許文献４に記載の血管新生誘導剤はフィブリンの使用を必須とするものであり、また脳梗塞後の運動機能の改善は評価されておらず、脳損傷に対して十分な治療効果が発揮されるかどうかは不明である。また、特許文献５に記載の組成物は、骨髄間質細胞にNotch遺伝子及び／又はNotchシグナル伝達関連遺伝子を導入することにより得られる細胞又は髄間質細胞を特殊な条件下で培養することにより得られる細胞という特定の性質を有する細胞を使用するものである。【０００８】
本発明は、グルタルアルデヒドを含まず、移植した細胞の壊死が抑制され（即ち、細胞生存率に優れる）、かつ脳損傷に対して十分な治療効果を発揮できる脳損傷治療用細胞構造体、その製造方法、及び脳損傷治療剤を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを使用して、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックを配置することによって細胞移植用細胞構造体を製造する際に、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である生体親和性高分子ブロックを使用することによって、移植した細胞の壊死が抑制される（即ち、細胞生存率に優れる）細胞構造体を提供できることを見出した。さらに本発明者らは、上記の細胞構造体を脳梗塞ラットに投与することによってラットの運動機能を改善できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている脳損傷治療用細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は上記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、脳損傷治療用細胞構造体。
（２）  上記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞及び／又は骨髄細胞を含む、（１）に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（３）  １回の投与当たり投与される細胞数が、１．０×１０5 〜 １．０×１０7 個／ｋｇ体重である、（１）又は（２）に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（４）  脳損傷が、脳外傷、低酸素性虚血性脳損傷、脳梗塞及び／又は脳卒中である、（１）から（３）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（５）  上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１）から（４）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（６）  上記細胞構造体の厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、（１）から（５）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（７）  上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１）から（６）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（８）  上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、（１）から（７）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（９）  上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（８）に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１０）  上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（１）から（９）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。【００１１】
（１１）  上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、（１）から（１０）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１２）  上記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、（１）から（１１）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１３）  上記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ；及び
上記工程ｂで得られた多孔質体を粉砕する工程ｃ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、（１）から（１２）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１４）  上記工程ａにおいて、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融より７℃低い温度以下となる、（１２）又は（１３）に記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１５）  上記細胞構造体が、上記生体親和性高分子ブロックと上記細胞とを混合し、１０時間以上培養することにより得られる細胞構造体である、（１）から（１４）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体。
（１６）  （１）から（１５）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体を複数個融合することにより得られる、脳損傷治療用細胞構造体。
（１７）  タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である生体親和性高分子ブロックと細胞とを混合し、１０時間以上培養する工程を含む、（１）から（１６）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体の製造方法。
（１８）  （１）から（１６）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体を含む、脳損傷治療剤。【００１２】
（１９）  （１）から（１６）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体を、脳損傷を有する患者に投与する工程を含む、脳損傷の治療方法。
（２０）  脳損傷治療剤の製造のための、（１）から（１６）の何れかに記載の脳損傷治療用細胞構造体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体及び脳損傷治療剤は、グルタルアルデヒドを使用することなく製造することができることから、人体に安全である。本発明の脳損傷治療用細胞構造体及び脳損傷治療剤は、移植した細胞の壊死が抑制され（即ち、細胞生存率に優れる）、脳梗塞などの脳損傷を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、in vitro ATPアッセイにおけるブロックによる違いを示す。
【図２】図２は、本発明で用いるブロック又は比較用ブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊中での細胞の生存状態の違い（２週間後）を示す。
【図３】図３は、本発明で用いるブロック群内間での移植細胞の生存状態を示す。ｈＭＳＣモザイク細胞塊中の生存とブロックサイズによる差を示す。
【図４】図４は、移植２週間後のｈＭＳＣモザイク細胞塊における血管形成を示す。
【図５】図５は、移植２週間後のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊における血管形成を示す。
【図６】図６は、多孔質体における各空孔サイズの空間占有率を示す。
【図７】図７は、ＣＢＥ３多孔質体のＨＥ断面画像及びポア形状と内部最高液温を示す。
【図８】図８は、棚板温度−４０℃（硝子板２．２ｍｍ）での内部最高液温の時間変化を示す。
【図９】図９は、ＣＢＥ３多孔質体の作製時の液温プロファイルを示す。
【図１０】図１０は、GFP発現ラットＭＳＣモザイク細胞塊の脳梗塞ラットへの投与による運動機能改善を示す。
【図１１】図１１は、ラット骨髄細胞モザイク細胞塊の脳梗塞ラットへの投与及びhMSCモザイク細胞塊の脳梗塞発症ヌードラットへの投与による運動機能改善を示す。
【図１２】図１２は、モザイク細胞塊の形成に必要な時間を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている脳損傷治療用細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は上記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、脳損傷治療用細胞構造体、その製造方法、並びに上記脳損傷治療用細胞構造体を含む脳損傷治療剤に関する。なお、本発明における細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
【００１６】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーンおよびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００１７】
リコンビナントペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン又はリコンビナントゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００１８】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基く、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００１９】
本発明で用いる生体親和性高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２０】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００２１】
本発明で用いる生体親和性高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２２】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用することが好ましい。本発明では、アルデヒド類又は縮合剤を使用しない架橋方法を使用することがより好ましい。即ち、本発明における生体親和性高分子ブロックは、好ましくは、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックであり、より好ましくは、アルデヒド類又は縮合剤を含まない生体親和性高分子ブロックである。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００２３】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２４】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００２５】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２６】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２７】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であり、より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であり、最も好ましくは１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００２８】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２９】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３０】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００３１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明で用いるリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３３】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３４】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００３５】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００３６】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００３８】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００３９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
【００４０】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４２】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状、粉状および多孔質状であり、より好ましくは不定形である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。
【００４３】
本発明における生体親和性高分子ブロックのタップ密度は、１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、好ましくは、２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下、より好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下、更に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
【００４４】
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在出来、細胞移植用細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００４５】
本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
【００４６】
本発明における生体親和性高分子ブロックの「断面積の平方根÷周囲長」は、０．０１以上０．１３以下であり、好ましくは、０．０２以上０．１２以下、より好ましくは０．０３以上０．１１５以下、更に好ましくは０．０５以上０．０９以下である。
【００４７】
生体親和性高分子ブロックの「断面積の平方根÷周囲長」とは、タップ密度と同様に、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。「断面積の平方根÷周囲長」が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞移植用細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００４８】
生体親和性高分子ブロックの、二次元断面像における「面積の平方根÷周囲長」とは、生体親和性高分子ブロックの断面標本を作製し、断面構造を確認することによって求めることができる。例えば、まず、生体親和性高分子ブロックの断面構造を薄切標本（例えばＨＥ染色標本）として用意する。この際、生体親和性高分子ブロックだけでも構わないし、生体親和性高分子ブロックと細胞を含む細胞構造体として断面構造を観察することでも構わない。一つの生体親和性高分子ブロックについて、その断面積及び周囲長を求め、その後、「断面積の平方根÷周囲長」を算出する。それを１０か所以上の複数個にわたって計測し、それらの平均値として「断面積の平方根÷周囲長」を得ることができる。
【００４９】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは２５μｍ以上１０６μｍ以下であり、また５０μｍ以上１２０μｍ以下であることも好ましい。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れた血管形成を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００５０】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００５１】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、上記（１−４）に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックが得られる限りは特に限定されない。例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより顆粒の形態とすることができ、これにより上記（１−４）に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００５２】
本発明における「多孔質体」としては好ましくは、１ｍｍ角の材料として用意した場合に、本体内部に複数の「１０μｍ以上５００μｍ以下の空孔」を有する材料で、かつその本体中で空孔の占める体積が５０％以上の材料を使用することができる。これらの材料において、内部の空孔は、互いに連通していてもよく、一部もしくは全部の空孔が材料表面に開口していてもよい。
【００５３】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する際に、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度（「溶媒融点−３℃」）以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状となる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度（「溶媒融点−３℃」）以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状となる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。
【００５４】
本発明においては、多孔質体の有する空孔の形状は、柱／平板孔であるよりも、球孔であることが好ましく、また、空孔のうち球孔の占める割合が５０％以上であることがさらに好ましい。
【００５５】
本発明では好ましくは、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度（「溶媒融点−３℃」）以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により、生体親和性高分子の多孔質体を製造することができる。上記工程によれば、空孔の内、球孔の占める割合が５０％以上とすることができるからである。
【００５６】
好ましくは、上記工程ｂで得られた多孔質体を粉砕する工程ｃを含めることができる。
より好ましくは、上記工程ａにおいて、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融より７℃低い温度（「溶媒融点−７℃」）以下となる凍結処理により凍結することができる。この工程によれば、空孔の内、球孔の占める割合が８０％以上とすることができるからである。
【００５７】
多孔質体の有する空孔の平均空孔サイズは、上記多孔質体の断面構造観察から得られる。まず、多孔質体の断面構造を薄切標本（例えばＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色標本）として用意する。その後、高分子で形成されている壁の内、明瞭な突起部については、最接突起部と繋ぎ、空孔を明瞭化させる。そうして得られた区切られた個々の空孔面積を計測し、その後、上記面積を円換算した場合の円直径を算出する。得られた円直径を空孔サイズとし、２０個以上の平均値を平均空孔サイズとすることができる。
【００５８】
本明細書中における、ある空孔サイズの空間占有率とは、ある空孔サイズを有す空孔が多孔質体中で、どれくらいの体積を占めているかという割合のことをいう。  具体的には、二次元断面画像から、ある空孔サイズの空孔が占める面積を全面積で除することにより、割合として求めることができる。また、用いる断面画像としては、実寸１．５ｍｍ大についての断面画像を利用することができる。
【００５９】
多孔質体の空孔サイズ２０μｍ〜２００μｍが占める空間占有率は、好ましくは８３％以上１００％以下であり、より好ましくは８５％以上１００％以下、さらに好ましくは９０％以上１００％以下、特に好ましくは９５％以上１００％以下である。
多孔質体の空孔サイズ３０μｍ〜１５０μｍが占める空間占有率は、好ましくは６０％以上１００％以下であり、より好ましくは７０％以上１００％以下、さらに好ましくは８０％以上１００％以下、特に好ましくは９０％以上１００％以下である。
【００６０】
多孔質体の空孔サイズ２０μｍ〜２００μｍが占める空間占有率、及び多孔質体の空孔サイズ３０μｍ〜１５０μｍが占める空間占有率とは、多孔質体中における空孔サイズ分布が所定の範囲に収まることを表している。つまり、上記多孔質体を粉砕することで得た高分子ブロックにおいて、サイズ２０μm〜２００μｍ大の高分子ブロックとした際、上記空孔サイズは、一つの高分子ブロックサイズと近いサイズであり、結果的に上記空孔サイズの割合が多い多孔質体では、粉砕後の高分子ブロックの構造が複雑となり、結果的にタップ密度や、「断面積の平方根÷周囲長」を小さくすることに繋がる。
【００６１】
空孔の形状については、個々の空孔について、長軸と短軸を求め、そこから「長軸÷短軸」を算出。それら「長軸÷短軸」が１以上２以下の場合を球孔、３以上の場合を柱／平板孔とすることができる。
【００６２】
本発明における多孔質体の空孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）を用いて、空孔率（P） = １−ρ/ρc （％）により求めることができる。嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めることができる。本発明における高分子多孔質体の空孔率は、好ましくは８１％以上９９．９９％以下であり、より好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。
【００６３】
（２）細胞
本発明で用いる細胞は、脳損傷の治療を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞（骨髄由来細胞）、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、神経、脳、又は骨髄に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、神経細胞、血管内皮細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。例えば、脳虚血・脳梗塞に対しては、神経前駆細胞、または、神経細胞に分化可能な細胞を投与することができる。
【００６４】
また本発明においては、血管系細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の万能細胞や、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような血管および血液を構成する細胞に、自然には分化しないものは含まれない。血管系細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞の具体例としては、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の何れでもよい。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞としては、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
【００６５】
本明細書において、非血管系細胞とは、上記の血管系細胞以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、または神経細胞を使用することができる。好ましくは、ＭＳＣまたはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、ＭＳＣである。
【００６６】
本発明で用いる細胞としては、神経系の遺伝子を発現している細胞を用いることができ、好ましくは神経系の遺伝子を発現しているＭＳＣを用いることができる。
神経系の遺伝子としては、Sox2, Nestin（ネスチン）, NeuroD1（Neurogenic differentiation 1）, GAD1（ＧＡＢＡ合成）, GRIA1（グルタミン酸受容体１）,GRIA2（グルタミン酸受容体２）, CHRM1（アセチルコリン受容体１）, GABRA1（ＧＡＢＡＡ受容体α１）, GABBR1（ＧＡＢＡＢ受容体１）, CHAT（アセチルコリン合成）, DDC（セロトニン/ＤＯＰＡ合成）,HTR1A（セロトニン受容体１Ａ）, HTR1B（セロトニン受容体１Ｂ）、HTR2A（セロトニン受容体２Ａ）, 5-HTT（セロトニントランスポーター）, Ascl1（神経幹細胞ニューロン分化マーカー）, Hes1（神経幹細胞アストロサイト分化マーカー）, 及びOlig2（神経幹細胞オリゴデンドロサイト分化マーカー）などが挙げられるが、特に限定されない。本発明で用いる細胞としては、上記した神経系の遺伝子のうちの１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種以上、特に好ましくは１０種以上、最も好ましくは１３種以上を発現している細胞（好ましくはＭＳＣ）を用いることができる。
【００６７】
例えば、Sox2, Nestin, NeuroD1, GAD1, GRIA1,GRIA2,GABRA1, GABBR1, DDC,HTR1B、HTR2A, 5-HTT, Hes1から選択される遺伝子のうちの１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種以上、特に好ましくは１０種以上、最も好ましくは１３種全てを発現している細胞（好ましくはＭＳＣ）を使用することができる。但し、本発明においては、上記遺伝子を発現していないＭＳＣ、又は上記遺伝子以外の神経系の遺伝子を発現しているＭＳＣを用いることもできる。
【００６８】
なお、細胞における特定の遺伝子の発現状態（発現の有無及び発現の程度）を測定するための方法は、当業者に公知であり、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、ノザンブロット法等の常法により測定することができる。
【００６９】
（３）脳損傷治療用細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体を形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能となる。これにより、本発明の脳損傷治療用細胞構造体を用いて、細胞移植を行うと、移植された細胞の壊死を抑制し、移植が可能となる。なお、ここでいう「壊死の抑制」とは、細胞構造体とせず、細胞のみを移植した場合と比較して、壊死の程度が低いことを意味する。
【００７０】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００７１】
また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００７２】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすること、移植された細胞の壊死を防止することを意味するものである。
【００７３】
脳損傷治療用細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、脳損傷治療用細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。脳損傷治療用細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、血管形成をより促進することができる。
【００７４】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「脳損傷治療用細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「脳損傷治療用細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００７５】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体においては、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００７６】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、血管新生因子を含んでいてもよい。ここで、血管新生因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを好適に挙げることができる。血管新生因子を含む細胞構造体の製造方法は、特に制限されないが、例えば、血管新生因子を含浸させた生体親和性高分子ブロックを使用することにより、製造することができる。血管新生を促進する観点からは、本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、血管新生因子を含むことが好ましい。
【００７７】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、非血管系細胞を含むものでもよい。また、細胞構造体を構成する細胞は、非血管系細胞のみでもよい。細胞として非血管系細胞のみを含む細胞構造体により、移植後、移植部位に、血管を形成することができる。また、細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む場合には、非血管系細胞のみで構成されている場合と比較して、より血管形成することが可能となり、好ましい。
本発明の脳損傷治療用細胞構造体としては、細胞構造体の内部において血管形成されているものも好ましい。
【００７８】
なお、本発明の脳損傷治療用細胞構造体としては、二種類以上の細胞を含み、かつ非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む細胞構造体を用いて、細胞構造体の内部に血管形成されたものも含む。
【００７９】
（４）脳損傷治療用細胞構造体の製造方法
本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の脳損傷治療用細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を促進又は制御することが好ましい。
【００８０】
本発明によれば、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である生体親和性高分子ブロックと細胞とを混合し、１０時間以上培養する工程を含む本発明の脳損傷治療用細胞構造体の製造方法が提供される。即ち、本発明の脳損傷治療用細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを混合し、１０時間以上培養することにより得たものであることが好ましく、１２時間以上培養することにより得たものであることがより好ましく、１５時間以上培養することにより得たものであることがさらに好ましく、１８時間以上培養することにより得たものであることが特に好ましい。なお、生体親和性高分子ブロックと細胞とを混合した後、遠心することなく上記した時間だけ培養することが好ましい。
【００８１】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００８２】
上記の方法で得られた細胞構造体（モザイク細胞塊）は、例えば、
（ａ）別々に調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００８３】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００８４】
別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記（ａ）に記載の通り細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の脳損傷治療用細胞構造体として使用することができる。
【００８５】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体の製造方法における「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００８６】
上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下であり、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下であり、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００８７】
上記した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法としては、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする方法を挙げることができる。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００８８】
融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【００８９】
上記により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００９０】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【００９１】
非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む場合の細胞構造体の製造方法として、例えば、下記（ａ）〜（ｃ）の製造方法を好適に挙げることができる。
（ａ）は非血管系細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。
（ｂ）は血管系細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。
（ｃ）は、非血管系細胞および血管系細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。
【００９２】
（５）細胞構造体の脳損傷治療用途、脳損傷治療剤及び脳損傷治療方法
上記した細胞構造体は、脳損傷の治療において使用することができる。即ち、本発明は、脳損傷の治療において使用するための細胞構造体、並びに上記した細胞構造体を含む脳損傷治療剤を提供するものである。
脳損傷とは、脳の機能に損傷が生じた状態を広く意味し、例えば、脳外傷、低酸素性虚血性脳損傷、脳梗塞及び／又は脳卒中などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体及び脳損傷治療剤の投与経路とは特に限定されず、全身投与（非経口投与など）でもよいし、局所投与（例えば、治療部位への移植など）でもよい。本発明の脳損傷治療用細胞構造体又は脳損傷治療剤の投与は、種々の方法により、例えば注射カニューレ、針またはシャントを介した注入により行うことができるが、これらに限定されない。本発明の脳損傷治療用細胞構造体又は脳損傷治療剤を全身投与する場合は、非経口投与、例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与又は皮下投与が好ましい。本発明の脳損傷治療用細胞構造体又は脳損傷治療剤は、治療部位（疾患部位、例えば、脳の病変部位など）に局所投与することもできる。局所投与の利点は、病変部位へ細胞をより精確にターゲッティングできることである。より好ましくは局所投与である。
【００９４】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体又は脳損傷治療を脳の病変部位に移植する場合、移植は、定位的外科手術を用いて実行することができる。この場合、患者は麻酔される。患者の頭部は核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）適合性定位枠中に置かれ、そしてマイクロインジェクターを有するマイクロポジショナーは頭蓋上に配置される。標的部位の真上の硬膜の領域を露出するために、歯科用ドリルまたはその他の適切な器具を用いて、患者の頭蓋骨にバー・ホール（burr hole）を作ることができる。
【００９５】
本発明の脳損傷治療用細胞構造体及び脳損傷治療剤における細胞数は、所望の治療効果が生じるよう算定された細胞数に設定することができる。本発明の脳損傷治療用細胞構造体及び脳損傷治療剤について、１回の投与当たりの細胞数は患者の体重１ｋｇ当たりで、好ましくは約１．０×１０4 〜 ５．０×１０7 個／ｋｇ体重であり、より好ましくは、約１．０×１０5 〜 １．０×１０7 個／ｋｇ体重であり、さらに好ましくは約１．０×１０6 〜 ６．０×１０6 個／ｋｇ体重である。
【００９６】
また本発明によれば、上記した本発明の脳損傷治療用細胞構造体を、脳損傷を有する患者に投与する工程を含む、脳損傷の治療方法が提供される。投与方法及び細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
さらに本発明によれば、脳損傷治療剤の製造のための、上記した本発明の脳損傷治療用細胞構造体の使用が提供される。細胞移植治療剤及び細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【００９７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９８】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下記載のＣＢＥ３を用意した（ＷＯ２００８／１０３０４１に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４、ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２、１／ＩＯＢ値：０．３２３【００９９】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【０１００】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体（高分子多孔質体）の作製
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。【０１０１】
ＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液を円筒形容器に流し込んだ。冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際、冷却棚板の温度、及び棚板と円筒形容器の間に挟む断熱板（硝子板）の厚さ、入れるＣＢＥ３水溶液の最終濃度、及び水溶液量を以下に記載の通り用意した。
条件ａ：棚板温度−４０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度１２質量％、水溶液量４ｍＬ。
条件ｂ：棚板温度−６０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度７．５質量％、水溶液量４ｍＬ。
条件ｃ：棚板温度−４０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４．０質量％、水溶液量４ｍＬ。【０１０２】
このようにして得た凍結ＣＢＥ３ブロックを凍結乾燥して、ＣＢＥ３多孔質体を得た。【０１０３】
[比較例１] リコンビナントペプチド単純凍結多孔質体の作製
５０℃で、２０００ｍｇのＣＢＥ３を１８ｍＬの超純水に溶解し、終濃度１０質量％のＣＢＥ３溶液を２０ｍＬ作製する。そのＣＢＥ３溶液を薄く伸ばして４mm厚程度の薄い板状のゲルを作製した。容器については、白い板に、シリコン枠（５ｃｍ×１０ｃｍ程度）をつけて、空気の隙間がないようにしっかりとシリコン枠を押し付けたものを使用した。上記の枠内へ上記のＣＢＥ３溶液（５０℃）を流し込んだ。液を流し込んだら、４℃へ移して約１時間ゲル化させ、固まっていることを確認した後、−８０℃へ移して、ゲルを３時間凍結させた。凍結後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＤＵ−１０００）で凍結乾燥を行った。尚、この時に得られた凍結乾燥体は多孔質体ではあり、平均ポアサイズが５７．３５μｍとなっていた。以後、これを単純凍結多孔質体と呼称する。【０１０４】
［実施例３］リコンビナントペプチド多孔質体の空孔サイズと空間占有率の評価
実施例２で得られたＣＢＥ３多孔質体および比較例１で得られた単純凍結多孔質体について、多孔質体の空孔サイズと空間占有率の評価を実施した。得られた多孔質体を１６０℃で２０時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤した。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色標本を作製した。  標本から実スケール１．５ｍｍ大の断面像を用意し、個々の空孔面積を計測し、その後、上記面積を円換算した場合の円直径を算出し、空孔サイズとした。この空孔の２０ヶ以上の平均値を平均空孔サイズとした。その結果、条件ａの多孔質体は６６．３９μｍ、条件ｂの多孔質体は６３．１７μｍ、条件ｃの多孔質体は５６．３６μｍであった。【０１０５】
算出した空孔サイズを元に、上記で用いた二次元断面画像から、ある空孔サイズの空孔が占める面積を全面積で除することにより、割合として求めた。その結果、実施例２で得られたＣＢＥ３多孔質体では２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は、条件ａの多孔質体は１００％、条件ｂの多孔質体は９９．９％、条件ｃの多孔質体は９９．９％であった。３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は、条件ａの多孔質体は９４．２％、条件ｂの多孔質体は９７．９％、条件ｃの多孔質体は９９．３％であった。【０１０６】
一方、比較例１で得られた単純凍結多孔質体では、空孔のサイズに大きくばらつきがあり、大きいサイズの集まった箇所と小さいサイズの集まった箇所が存在した。大きいサイズの箇所では、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は７４．３％であり、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は５５．８％であった。小さいサイズの集まった箇所では、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は８２．８％であり、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は５７．２％であった。大きいサイズの箇所と小さいサイズの箇所が半分ずつ混在することから、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は７８．６％であり、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は５６．５％となる（図６）。【０１０７】
[実施例４] リコンビナントペプチド多孔質体の空孔率測定
実施例２で得られたＣＢＥ３多孔質体について、空孔率を測定した。測定に当たっては、嵩密度（ρ）と真密度（ρｃ）を測定し、空孔率（Ｐ ＝ １−ρ/ρc（％））を求めた。ＣＢＥ３多孔質体の嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出した。真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めた。サンプル数（Ｎ）＝４の結果として、条件ｃの多孔質体では嵩密度が０．０５ｇ/ｃｍ3、真密度が１．２３ｇ/ｃｍ3、空孔率９６％（変動係数（CV）値は８％）であることが明らかになった。また、条件ａ及び条件ｂの多孔質体ではそれぞれ空孔率が８７％（CV値は１０％）及び９２％（CV値は７％）であることが分かった。【０１０８】
[実施例５] リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた条件ａ、条件ｂ及び条件ｃのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。  その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は２４時間、４８時間、５６時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、２８８時間の９種類を実施した）を施して、試料を得た。以下、条件ａの５３〜１０６μｍを「１２％中」、条件ｂの２５〜５３μｍを「７．５％小」、条件ｂの５３〜１０６μｍを「７．５％中」、条件ｂの１０６〜１８０μｍを「７．５％大」、条件ｃの５３〜１０６μｍを「４％中」と呼ぶ。【０１０９】
[比較例２]リコンビナントペプチドのＧＡ（グルタルアルデヒド）架橋μブロックの作製
特許文献５に記載されているグルタルアルデヒドを使用する比較例として、基材としてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、不定形のＧＡ架橋μブロックを作製した。１０００ｍｇのＣＢＥ３を９４４８μＬの超純水に溶解し、１mol／ＬのＨＣｌを１５２μＬ添加後、終濃度１．０質量％となるように、２５質量％グルタルアルデヒドを４００μＬ添加し、５０℃で３時間反応させ、架橋ゲルを作製した。この架橋ゲルを、１Ｌの０．２Ｍグリシン溶液へ浸漬し、４０℃２時間振とうさせた。その後、架橋ゲルを、５Ｌの超純水中で１時間振とう洗浄、超純水を新しい物へ置換し、再び洗浄１時間、を繰り返し、計６回洗浄した。洗浄後の架橋ゲルを、−８０℃で５時間凍結させた後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＤＵ−１０００）で凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍのＣＢＥ３・ＧＡ架橋μブロックを得た。【０１１０】
[比較例３] 比較用リコンビナントペプチドブロックの作製
比較例として、従来技術（特許文献５）から類推されるグルタルアルデヒドを含まない工程で作製した場合にできる比較用リコンビナントペプチドブロックを、以下に記載の通り作製した。基材としてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いてブロックを作製した。比較例１で得られた単純凍結多孔質体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。それを１６０℃のオーブンに入れ、７２時間熱架橋した。【０１１１】
[実施例６]リコンビナントペプチブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。【０１１２】
その結果、比較例２のブロックは７１５ｍｇ/ｃｍ3、比較例３のブロックは５２４ｍｇ/ｃｍ3であった。
一方、実施例５のブロックは「１２％中」が３７２ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％小」が２１３ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％中」が１８９ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％大」が１６３ｍｇ/ｃｍ3、「４％中」が９８ｍｇ/ｃｍ3であった。実施例５のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例３のブロックに対して、タップ密度は小さくなることが分かった。【０１１３】
[実施例７] リコンビナントペプチドブロックの二次元断面画像における「面積の平方根÷周囲長」の算出
ブロックの複雑性を示す指標として、ブロックの「面積の平方根」と「周囲長」の関係を求めた。すなわち、ブロックの「面積の平方根÷周囲長」の値が小さい方がより複雑であると言える。この値は、画像解析ソフトを用いて算出した。まず、ブロックの形が分かる画像を用意した。具体的に、本実施例では、水で良く膨潤させたブロック群を、ミクロトームで凍結切片にし、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色した標本を用いた。ブロック以外に細胞などが存在する場合は、photoshop（登録商標）で、自動選択ツールで製剤のみを抽出し、画像上にブロックのみとなるようにする。その画像を、Imagej（登録商標）を用いて、ブロックの面積と周囲長を求め、「面積の平方根÷周囲長」の値を算出した。ただし、１０μｍ以下のブロックは除いた。【０１１４】
その結果、比較例２のブロックは０．２４８、比較例３のブロックは０．１３９となった。
一方、実施例５のブロックは、「１２％中」が０．１１２、「７．５％小」が０．０８３、「７．５％中」が０．０８２、「７．５％大」が０．０７１、「４％中」が０．０６１であった。実施例５のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例３のブロックに対して、「面積の平方根÷周囲長」の値は小さくなり、また、タップ密度と相関があることも分かった。【０１１５】
[実施例８] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。【０１１６】
[比較例４] 比較用リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例３で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。【０１１７】
[比較例５] リコンビナントペプチドＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
比較用のグルタルアルデヒドを含むモザイク細胞塊を以下の通り作成した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したＧＡ架橋μブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＧＡ架橋μブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。【０１１８】
[実施例９] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ  serum supplement）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、扁平状の、ＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊がある２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。【０１１９】
[実施例１０] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
実施例８で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明用のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。【０１２０】
[実施例１１] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
実施例９で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明用のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。【０１２１】
[比較例６] 比較用リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例４で作製した２日目のモザイク細胞塊（比較用のＣＢＥ３ブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。【０１２２】
[比較例７] リコンビナントペプチドＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例５で作製した２日目のモザイク細胞塊（ＧＡ架橋μブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。【０１２３】
[実施例１２]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＴＰ  アッセイ
各モザイク細胞塊中の細胞が産生・保持しているＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を定量した。ＡＴＰは生物全般のエネルギー源として知られ、ＡＴＰ合成量・保持量を定量することで、細胞の代謝活性の状態、活動状態を知ることができる。測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。実施例８および比較例４、比較例５で作製したモザイク細胞塊について、ともにＤａｙ７のもので、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて、各モザイク細胞塊中のＡＴＰ量を定量した。その結果、ＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊に比べ、比較用のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊では、ＡＴＰ量が少ない結果となった。一方、本発明用のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊は、ＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりもＡＴＰ量が多いことが分かった。これは本発明用のＣＢＥ３ブロックが、「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」いずれの場合においても、同様に、ＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりも多くのＡＴＰを産生している結果となった（図１）。つまり、複雑な構造を持つ本発明用のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の方が、内部の細胞の生存状態が良好であることが明らかになった。【０１２４】
これらの結果をまとめると、ＧＡ架橋の比較例２の場合、タップ密度が７１５ｍｇ/ｃｍ3で性能が得られていたが、ＧＡを用いない比較例３では５２４ｍｇ/ｃｍ3でも性能が得られなかった。一方で、実施例５の「１２％中」：３７２ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％小」：２１３ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％中」：１８９ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％大」：１６３ｍｇ/ｃｍ3、「４％中」：９８ｍｇ/ｃｍ3で性能が得られていることから、ＧＡを用いない場合では、特にタップ密度が５００ｍｇ/ｃｍ3以下であることが重要だとわかる。
同様に、ＧＡ架橋の比較例２の場合、「面積の平方根÷周囲長」が０．２４８で性能が得られていたが、ＧＡ（グルタルアルデヒド）を用いない比較例３では０．１３９でも性能が得られなかった。一方で、実施例５の「１２％中」：０．１１２、「７．５％小」：０．０８３、「７．５％中」：０．０８２、「７．５％大」：０．０７１、「４％中」：０．０６１で性能が得られていることから、ＧＡを用いない場合では、特に「面積の平方根÷周囲長」が０．１３以下であることが重要だとわかる。【０１２５】
[実施例１３] リコンビナントペプチドブロックを用いた巨大モザイク細胞塊の作製
実施例１０のように１ｍｍのモザイク細胞塊を融合して、巨大なモザイク細胞塊を作製することは可能であるが、一度に巨大なモザイク細胞塊を作製できる方が、操作を簡便化できる。ここで、細胞の接着しない加工を施したスミロンセルタイトの９ｃｍシャーレに、を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））で１．５質量％アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ）溶液を５０ｍＬ入れた。その際、１ｃｍ四方の棒状にしたシリコンを５ｍｍ程度アガロース溶液中に浸るように固定し、アガロースが固まった後、シリコンを取り除き、アガロース中に１ｃｍ四方の窪みができた容器を作成した。そこに増殖培地を適量入れ、ゲルが乾かないように保存した。培地を取り除き、実施例５で作製したブロックの内、代表的な「７．５％中」１６ｍｇと、２５０万ｃｅｌｌｓのヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の懸濁物を窪みに入れ、その後静かに２５ｍＬの増殖培地を添加した。１日培養後、１ｃｍ四方、厚さ２−３ｍｍの巨大モザイク細胞塊を作製できた。これを、２５ｍＬの増殖培地を入れたスミロンセルタイトの９ｃｍシャーレに移し、さらに２日培養後、２５ｍＬの増殖培地を入れたスピナーフラスコに移して攪拌培養し、培養７日後のモザイク細胞塊の断面のＨＥ染色標本を作製した。その結果、培養７日後でも内部の細胞が生存していることを確認した。このように、細胞とブロックを混合し、型に流して培養することで、巨大なモザイク細胞塊を作製可能であることが明らかになった。また、この方法は、ＧＡ架橋μブロック、比較用ブロック及び本発明用のブロックの何れでも可能であり、ブロックの種類に依存しない。【０１２６】
[実施例１４]リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の移植
マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールズリバー）のオス、４〜６週齢のものを用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉からはがした後、実施例１０、実施例１１、比較例６、及び比較例７で作成したモザイク細胞塊をピンセットですくい、切れ込みから１．５ｃｍほど下腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。【０１２７】
[実施例１５] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の採取
解剖は移植から１週後及び２週後に行った。腹部の皮膚をはがし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約１平方ｃｍの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。【０１２８】
[実施例１６] 標本解析
モザイク細胞塊が付着した皮膚片および、移植前のモザイク細胞塊について組織切片を作製した。皮膚を４％パラホルムアルデヒドに浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った。【０１２９】
実施例１０の「７．５％中」、比較例６および比較例７を移植した２週間後のＨＥ標本を図２に示す。図２に記載の生存率は、全細胞数（生細胞数＋死細胞数）中の生細胞数の割合を示す。
比較例７のＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＡ：生細胞数１００個：生存率８０％）に比べ、比較例６のブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＢ：生細胞数３７個：生存率４５％）では、生細胞が少ないことが分かる。一方、実施例１０の本発明用のブロック（「７．５％中」）を用いたモザイク細胞塊（図２のＣ：生細胞数１１６個：生存率８４％）は、比較例６のブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＢ：生細胞数３７個：生存率４５％）に比べて、生細胞が多く、生存が良好であることが分かった。この結果は、実施例１２でのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果とも一致し、本発明用のブロックを採用することによって、移植した細胞の生存を良くすることが可能であることが分かった。【０１３０】
また、本発明用のブロック群内間での移植細胞の生存状態を図３に示す。図３に記載の生存率は、全細胞数（生細胞数＋死細胞数）中の生細胞数の割合を示す。
１０６〜１８０μｍサイズの「７．５％大」の生存率は５７％であり、「７．５％小」の生存率は６２％であり、「７．５％中」の生存率は８４％であり、「４％中」の生存率は８２％であった。即ち、本発明用のブロック群内間では、１０６〜１８０μｍサイズの「７．５％大」よりも、「７．５％小」、「７．５％中」、「４％中」が更に細胞の生存が良くなることが分かった（図３）。また、最上の移植結果をもたらすものとしては、「７．５％中」と「４％中」が、「７．５％小」よりも、移植細胞の生存が良いことも分かった（図３）。即ち、高分子ブロックのタップ密度又は高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が所定の範囲内となるような構造を有することが重要であり、中でも、「５３〜１０６μｍ」＞「２５〜５３μｍ」＞「１０６〜１８０μｍ」という順で移植後の細胞生存が良くなることも分かった。【０１３１】
また、この５３〜１０６μｍの大きさの本発明用のブロックを用いた実施例１０のモザイク細胞塊を移植した場合における移植２週間後のＨＥ標本を図４に示す。また、図４中の血管数を計測した結果、６３本／ｍｍ2であった。図４に示す通り、モザイク細胞塊内部に血管が誘引されていることも分かった。【０１３２】
さらに、実施例１１の内、代表的な「７．５％中」を用いた物について、血管系の細胞を入れたモザイク細胞塊を移植した場合における移植２週間後のＨＥ標本を図５に示す。図５中の血管数を計測した結果、１８０本／ｍｍ2であった。実施例１０を移植した場合に比べ、図５に示す通り、実施例１１の血管系の細胞を入れたモザイク細胞塊を移植した場合には、モザイク細胞塊内部により多くの血管が形成されていることが明らかになった。【０１３３】
[実施例１７]  ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊中のＥＣＦＣの割合と濃度の算出
実施例９の内、代表的な「７．５％中」を用いたモザイク細胞塊は、切片をｈＥＣＦＣ染色用にＣＤ３１抗体（EPT  Anti CD31/PECAM-1）にＤＡＢ発色を用いたキット（ダコLSAB2キット  ユニバーサル K0673  ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用）による免疫染色を行った。画像処理ソフトＩｍａｇｅＪ（登録商標）、ＣＤ３１抗体による染色方法を使用し、中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合を求めた。なお、ここでいう「中心部」とは上記定義したものである。
その結果、実施例９の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合は９９％であった。【０１３４】
さらに実施例９の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊について、上記のＣＤ３１抗体による染色と、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を重ね合わせることで、中心部に存在するｈＥＣＦＣの細胞密度を算出した。中心部の血管系の細胞密度は、実際に薄切標本の細胞数を数え、細胞数を体積で割って求めることができる。まず、Photoshopを用いて、上記２枚の画像を重ね合わせ、ＣＤ３１抗体による染色と重なったＨＥ染色の細胞核の数をカウントして細胞数を算出した。一方、体積は、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）を用いて中心部の面積を求め、その薄切標本の厚みの２μｍをかけることで求められた。
その結果、実施例９の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の細胞数は2.58×10-4cells/μm3であった。【０１３５】
[実施例１８] リコンビナントペプチド多孔質体（高分子多孔質体）の作製
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。【０１３６】
ＣＢＥ３を最終濃度７．５質量％としてリコンビナントペプチド水溶液を調製し、このリコンビナントペプチド水溶液を円筒形容器に流し込んだ。冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からリコンビナントペプチド水溶液を冷却した。この際、冷却棚板の温度、及び棚板と円筒形容器の間に挟む断熱板（硝子板）の厚さ、入れるリコンビナントペプチド水溶液量を変えることにより、液温の冷却過程を変えた。棚板温度は−４０℃と−６０℃と−８０℃、硝子板は０．７ｍｍと１．１ｍｍと２．２ｍｍ、リコンビナントペプチド水溶液量は４ｍＬと１２ｍＬと１６ｍＬ、それらの組合せを実施した。【０１３７】
また、それぞれの水溶液は、底面から冷却される為、円中心部の水表面温度が最も冷却されにくい。従って、その部分が、溶液内で最も温度の高い液温となるため、その部分の液温を測定した（以後、上記部分の液温のことを内部最高液温と呼称する）。【０１３８】
その結果、棚板温度−４０℃で硝子板２．２ｍｍの場合には、内部最高液温が−９．２℃となるまで、温度上昇が始まらず、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下の液温をとった状態である（図８）。この状態を経た後、−９．２℃で温度上昇がはじまり、凝固熱が発生したことがわかる（図８）。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている（図８）。測定している温度は氷内部の固体温度となる。つまり液温ではなくなる。  このように、凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」を経た後に凍結したかどうかが分かる。【０１３９】
この凝固熱が発生する瞬間の未凍結状態での内部最高液温を組合せの６種類について、測定すると、以下のようになった。
Ａ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−９．２℃
Ｂ  棚板温度-４０℃で硝子板１．１ｍｍ、液量４ｍＬは、−８．３℃
Ｃ  棚板温度-４０℃で硝子板０．７ｍｍ、液量４ｍＬは、−２．２℃
Ｄ  棚板温度-６０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−７．２℃
尚、ここでいうＤが実施例２でいうところの「条件ｂ」である。
Ｅ  棚板温度-８０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−３．９℃
Ｆ  棚板温度-８０℃で硝子板１．１ｍｍ、液量４ｍＬは、−３．１℃
Ｇ  棚板温度-８０℃で硝子板０．７ｍｍ、液量４ｍＬは、  ５．８℃
Ｈ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量１２ｍＬは、−６．５℃
Ｉ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量１６ｍＬは、−２．４℃【０１４０】
このことから、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＨが、未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下の液温をとる凍結工程による製造法である。（内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」の凍結リコンビナントペプチドブロック）
また、Ｃ、Ｇ及びＩが未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下の液温をとらない凍結工程による製造法である。（内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」の凍結リコンビナントペプチドブロック）【０１４１】
このようにして得た凍結リコンビナントペプチドブロックを凍結乾燥して、ＣＢＥ３多孔質体を得た。Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＨ由来を『内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」のＣＢＥ３多孔質体』、Ｃ、Ｇ及びＩ由来を『内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」のＣＢＥ３多孔質体』と呼ぶ。【０１４２】
［実施例１９］
実施例１８で得られたＣＢＥ３多孔質体について、多孔質の空孔サイズと空孔形状の評価を実施した。得られた多孔質体を１６０℃、２０時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色標本を作製した。
得られた標本の中心部分の画像を図７（内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」、と、内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」）に示した。その結果、内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」（Ｃ，Ｇ，Ｉ）では、空孔は８０％以上が柱／平板孔となり、球孔は２０％以下であった。一方、内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ）では、空孔は５０％以上が球孔となっていた。また、この内部最高液温≦「溶媒融点−７℃」（Ａ，Ｂ，Ｄ）では、空孔は８０％以上が球孔となっており、ほぼ全てが球孔で構成されていた。これにより、多孔質体の空孔形状を球孔にするには、未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下となることが重要で、更に「溶媒融点−７℃」以下とすることで、空孔の形状をほぼ全て球孔にすることができることが分かった。【０１４３】
Ａ〜Ｉについての空孔形状及び平均ポアサイズは、以下の通りである。
Ａ：球孔１００％、６２．７４μｍ
Ｂ：球孔１００％、６５．３６μｍ
Ｃ：柱／平板孔９０％、７９．１９μｍ
Ｄ：球孔１００％、６３．１７μｍ
Ｅ：球孔７０％、６９．４４μｍ
Ｆ：球孔５０％、５３．９８μｍ
Ｇ：柱／平板孔９０％、７９．４８μｍ
Ｈ：球孔８０％、７６．５８μｍ
Ｉ：柱／平板孔９０％、７９．６５μｍ【０１４４】
［実施例２０］リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例１９で得られたＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ及び５３〜１０６μｍのリコンビナントペプチドブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で７２時間、熱架橋を施して、試料を得た。これらの試料は、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であること、又は上記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であることを充足するものであった。これらの試料を使用して実施例８及び実施例１０と同じようにして作製したモザイク細胞塊ではＡ〜Ｉによらず、実施例１２と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、並びに実施例１４〜１６と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、比較用ブロックよりも高い性能（細胞の高い生存率）を示した。ただ、これらのＡ〜Ｉの中で性能差を見ると僅かな差が生じており、Ａ、Ｂ、Ｄが最も性能が高く、ついでＥ、Ｆ、Ｈ、その後にＣ、Ｇ、Ｉがくるという順番になっていた。つまり、これは多孔質体の空孔形状によって、性能差を生じうることを示している。実施例１６では、代表的な結果としてＤ（実施例２でいうところの「条件ｂ」）について詳細に記述している。【０１４５】
[実施例２１]  脳梗塞治療用：高分子溶液の凍結工程、および乾燥工程
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。【０１４６】
PTFE厚・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量８ｍＬ。
棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１４７】
[実施例２２] 脳梗塞治療用：各凍結工程での未凍結状態での内部最高液温測定
実施例２１の溶液内で、実施例１８と同様にして未凍結状態での内部最高液温を測定した。その結果、棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃度に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態となった。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かった。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる（図９を参照）。【０１４８】
図９から分かるように未凍結状態での内部最高液温は、−８．８℃であった。このことから、内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」となっていることが分かる。
一方、水面付近の内部最高液温（非冷却面液温）に対して、冷却側に最も近い位置の温度を冷却面液温、と定義し測定した場合の冷却面液温と内部最高液温（非冷却面液温）の差温を以下に記す。
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。尚、本発明で言うところの「直前の差温」とは、上記イベントの１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。【０１４９】
凝固熱発生直前、未凍結状態での内部最高液温（非冷却面液温）：−８．８℃
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．２℃
凝固熱発生直前の差温：１．１℃
（図９を参照）【０１５０】
[実施例２３] 脳梗塞治療用：ＣＢＥ３多孔質体からの高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）の作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２１で得られたＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、試料ＣＢＥ３ブロックを得た。以下、４８時間架橋を施した。尚、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られない為、ここでは４８時間架橋したものを代表として使用している。【０１５１】
[実施例２４]  脳梗塞治療用：ＣＢＥ３ブロックのタップ密度、
実施例２３で作製したＣＢＥ３ブロック（５３〜１０６μｍ）について、実施例６と同様にして、タップ密度を測定した。その結果、実施例２３のＣＢＥ３ブロックは１３５ｍｇ/ｃｍ3であった。このことから実施例２３のＣＢＥ３ブロックは実施例１２及び実施例２０でいうところの、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であることを充足するものであることが分かる。【０１５２】
[実施例２５]  脳梗塞治療用：ＣＢＥ３ブロックの二次元断面画像における「面積の平方根÷周囲長」の算出
実施例２３で作製したＣＢＥ３ブロック（５３〜１０６μｍ）について、実施例７と同様にして、「面積の平方根÷周囲長」の値を測定した。その結果、実施例２３のブロックは０．０５３であった。このことから実施例２３のＣＢＥ３ブロックは実施例１２及び実施例２０でいうところの、断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であることを充足するものであることが分かる。【０１５３】
[実施例２６]  ＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（GFP発現ラットMSC）
GFP(緑色蛍光タンパク質)発現ラット骨髄由来間葉系幹細胞（GFPラットMSC：Fischer 344 (F344) Rat Mesenchymal Stem Cells with GFP、CSC-C1313、Creative Bioarray）を推奨増殖培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例２３で作製したＣＢＥ３ブロック（５３〜１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった（GFP発現ラットMSCモザイク細胞塊、と呼称する）。尚、本モザイク細胞塊は、実施例１２と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、並びに実施例１４〜１６と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、実施例２０のＤを用いたモザイク細胞塊と同程度の高い性能（細胞の高い生存率）を示した。【０１５４】
[実施例２７]  ＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（SDラット骨髄細胞）
SD（Sprague-Dawley）ラット骨髄細胞（ラットBMSC、BMC01、コスモバイオ社）を推奨増殖培地（コスモバイオ社：骨髄細胞用培養メディウム、BMCM）にて１５万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例２３で作製したＣＢＥ３ブロック（５３−１０６μｍ）を０．１５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。尚、本モザイク細胞塊は、実施例１２と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、並びに実施例１４〜１６と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、実施例２０のＤを用いたモザイク細胞塊と同程度の高い性能（細胞の高い生存率）を示した。【０１５５】
[実施例２８]  ＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例２３で作製したＣＢＥ３ブロック（５３−１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。尚、本モザイク細胞塊は、実施例１２と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、並びに実施例１４〜１６と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、実施例２０のＤを用いたモザイク細胞塊と同程度の高い性能（細胞の高い生存率）を示した。【０１５６】
[比較例８]  細胞含有ＣＢＥ３スポンジ
実施例２１で得られたＣＢＥ３多孔質体をφ５ｍｍ×１ｍｍに成型し、ＣＢＥ３スポンジを得た。このＣＢＥ３スポンジに対して、GFP発現ラット骨髄由来間葉系幹細胞（GFPラットMSC：Fischer 344 (F344) Rat Mesenchymal Stem Cells with GFP、CSC-C1313、Creative Bioarray）を、推奨培地に懸濁した状態で１．２×１０4cells/個を播種し、２４日間培養することで０．５×１０6cells/個まで細胞を増殖させた。これにより細胞含有ＣＢＥ３スポンジを得た。【０１５７】
[実施例２９]  ラット脳梗塞動物モデル作製（MCAOモデルSDラット）
SDラット雄9週令に対して、「Neurosurgery. 68(6):1733-1742, June 2011, T Sugiyama et. al. Therapeutic Impact of Human Bone Marrow Stromal Cells Expanded by Animal Serum-Free Medium for Cerebral Infarct in Rats」の方法と同様にして、中大脳動脈閉塞術（MCAO）を施すことで右脳に脳梗塞を作製した。イソフルラン麻酔下で、ラット右側側頭部を開頭、頭蓋骨をあけて右脳側中大脳動脈を縫合糸で結紮した。視野内の血管をバイポーラコアレユレータで焼灼し、閉頭した。その後、頚動脈を90分間一時結紮し、血流を再開させることで、脳梗塞モデルを作製した。
なお、運動機能評価としては、Rotarodによる運動機能評価、または左旋回行動の改善を定量化することで評価した。Rotarodの評価は、4-40rpmへ300秒で加速していく設定とし、1日6回の試験を各回5分以上の間隔をあけて実施した。この6回の試験の平均値を、同個体の正常時の数値に対する割合（％）として評価した（正常ならば100%となる）。【０１５８】
また、左旋回行動については、本MCAOモデルが右脳に脳梗塞を作っていることから、左半身の機能低下が観察されることに基づいている。具体的には、ラットの前両足だけを地面に着け、後ろ両足が宙に浮いた状態で、最初にラットがどの方向に向いて歩いていくかを評価した。方向は左：−１点、まっすぐ：０点、右：０点として６回試験を行った平均値を数値化することで評価した。正常時のラットはまっすぐ進む為、０点となり、右脳梗塞を作ったラットでは左回りに動くため、−１点に近い値が出てくる。【０１５９】
[実施例３０] ラット脳梗塞動物モデル作製（MCAOモデルNudeラット）
免疫不全ヌード（Nude）ラット雄9週令に対して、実施例２９と同様にして、中大脳動脈閉塞術（MCAO）を施した右脳の脳梗塞を作製した。この運動機能評価も実施例２９と同様の方法で左旋回行動の評価を行った。【０１６０】
[実施例３１]  脳梗塞ラットへの、GFP発現ラットMSCのモザイク細胞塊、または細胞懸濁液、または細胞含有ＣＢＥ３スポンジの投与
実施例２９で作製したMCAOモデルSDラットに対して、発症後（MCAO処置後）7日の時に、実施例２６で作製したGFP発現ラットMSCモザイク細胞塊、また比較例として同じ細胞をPBS100μLに懸濁した状態の細胞懸濁液、また比較例８で作製した細胞含有ＣＢＥ３スポンジを局所投与として、脳損傷部位付近に直接埋殖することにより投与した。
投与した量は、GFP発現ラットMSCモザイク細胞塊は25個/匹（細胞数では0.5×106 cells/匹＝１．３４×１０6cells/kg体重）、細胞懸濁液は０．５×１０6cells/匹、細胞含有ＣＢＥ３スポンジは１個/匹（細胞数では０．５×１０6cells/匹）とし、投与群間で投与された細胞数を合わせた状態にて比較評価した。尚、動物の個体数は各群１０匹で実施した。【０１６１】
[実施例３２]  脳梗塞ラットの運動機能改善（GFP発現ラットMSCモザイク細胞塊）
実施例３１の結果、図１０に示す通り、GFP発現ラットMSCを細胞として用いた状態で、モザイク細胞塊では投与後（グラフで７日目に投与）に、１４日、２１日と非常に顕著な運動機能の改善が認められることが分かった。一方、比較として用いた細胞懸濁液投与では、投与後も運動機能の改善は全く確認されなかった。同様に、比較である細胞含有ＣＢＥ３スポンジでもモザイク細胞塊のような顕著な効果は確認されず、運動機能は横ばいのままであった。尚、モザイク細胞塊、及び細胞懸濁液の投与については、同じ実験を２回行っている為、グラフ中に「２回目」というデータを示している。
このことから、運動機能の改善効果の大きさは、「モザイク細胞塊」≫「細胞含有スポンジ」≧「細胞懸濁液」となることが分かった。また、梗塞発生から7日目という急性期において使用しても効果が得られることが分かった。これは48時間以内の超急性期でなくても効果が得られることを意味している。さらに、移植に用いたGFP発現ラットＭＳＣはFischerラット細胞であり、投与された脳梗塞ラットはSDラットであることから、他家（同種）細胞でも脳梗塞治療効果が得られることが分かった。【０１６２】
[実施例３３]  脳梗塞ラットへの、SDラット骨髄細胞のモザイク細胞塊、または細胞懸濁液の投与
実施例２９で作製したMCAOモデルSDラットに対して、発症後（MCAO処置後）7日の時に、実施例２７で作製したSDラット骨髄細胞モザイク細胞塊、また比較例として同じ細胞をPBS100μLに懸濁した状態の細胞懸濁液を局所投与として、脳損傷部位付近に直接注射器で注入することにより投与した。
投与した量は、SDラット骨髄細胞モザイク細胞塊は53個/匹、13個/匹（細胞数では１．６×１０6cells/匹＝４．３５×１０6cells/kg体重、０．３８×１０6cells/匹＝１．３３×１０6cells/kg体重）、細胞懸濁液は１．６×１０6cells/匹、０．３８×１０6cells/匹とし、投与群間で投与された細胞数を合わせた状態にて、細胞数を変えた比較評価を行った。尚、動物の個体数は各群１０匹で実施した。【０１６３】
[実施例３４]  脳梗塞ラットの運動機能改善（SDラット骨髄細胞モザイク細胞塊）
実施例３３の結果、図１１に示す通り、SDラット骨髄細胞を細胞として用いた状態で、モザイク細胞塊では投与後（グラフで７日目に投与）に、２１日、２８日、３５日と非常に顕著な左旋回行動の運動機能改善が認められる、と分かった。また、改善の効果は細胞数が多いモザイク細胞塊の方が高かった。  一方、比較として用いた細胞懸濁液投与では、少ない細胞数（０．３８×１０6cells/匹）群では全く運動機能の改善が見られなかった。また、多い細胞数（１．６×１０6cells/匹）を投与しても、細胞懸濁液群では、運動機能改善には限界があり、同数をモザイク細胞塊で投与した郡より顕著に改善が低いことはもとより、少ない細胞数のモザイク細胞塊群よりも運動機能改善が悪いことが明らかとなった。【０１６４】
結果をまとめると、運動機能の改善効果の大きさは、「細胞数多いモザイク細胞塊（１．６×１０6cells/匹）」＞「細胞数少ないモザイク細胞塊（０．３８×１０6cells/匹）」＞「細胞多い細胞懸濁液（１．６×１０6cells/匹）」≫「細胞少ない細胞懸濁液（０．３８×１０6cells/匹）」となった。【０１６５】
[実施例３５]  脳梗塞・免疫不全ラットへの、ｈＭＳＣのモザイク細胞塊の投与
実施例３０で作製したMCAOモデルNudeラット（免疫不全）に対して、発症後（MCAO処置後）7日の時に、実施例２８で作製したｈＭＳＣモザイク細胞塊を局所投与として、脳損傷部位付近に直接埋殖することにより投与した。投与した量は、ｈＭＳＣモザイク細胞塊は４５個/匹（細胞数では０．８９×１０6cells/匹＝５．５０×１０6cells/kg体重）とした。尚、動物の個体数は１０匹で実施した。【０１６６】
[実施例３６]  脳梗塞ラットの運動機能改善（ｈＭＳＣモザイク細胞塊）
実施例３５の結果、図１１に示す通り、ｈＭＳＣを細胞として用いた状態で、モザイク細胞塊では投与後（グラフで７日目に投与）に、１４日、２１日、２８日、３５日と非常に顕著な左旋回行動の運動機能改善が認められる、と分かった。
このことから、ヒトの細胞を用いた状態で、効果が確認できることが明らかとなった。同時に、移植に用いた細胞がヒト細胞であり、移植された側がラットであることから、免疫不全状態においては、異種細胞を用いても脳梗塞治療効果が得られることが分かった。【０１６７】
[実施例３７]  ｈＭＳＣの発現解析
実施例２８にて使用したｈＭＳＣについて、神経系の遺伝子発現を解析した。解析にはＲＴ−ＰＣＲ手法を用いた。プライマーはlife technologies applied biosystemsのTaqMan（登録商標） Gene Expression Assaysから購入した。解析した対象は、Sox2（Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：９１）, Nestin（ネスチン、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ０４１８７８３１＿ｇ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：５８）, NeuroD1（Neurogenic differentiation 1、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ０１９２２９９５＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：１１０）, GAD1（ＧＡＢＡ合成、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ０１０６５８９３＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：１００）, GRIA1（グルタミン酸受容体１、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００１８１３４８＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：８６）,GRIA2（グルタミン酸受容体２、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００１８１３３１＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：７１）, CHRM1（アセチルコリン受容体１、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００２６５１９５＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：８２）, GABRA1（ＧＡＢＡＡ受容体α１、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００９７１２２８＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：８２）, GABBR1（ＧＡＢＡＢ受容体１、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００５５９４８８＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：６８）, CHAT（アセチルコリン合成、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００２５２８４８＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：６４）, DDC（セロトニン/ＤＯＰＡ合成、Ｃａｔ．＃４３５１３７２  Ｈｓ０１１０５０４８＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：７０）,HTR1A（セロトニン受容体１Ａ、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００２６５０１４＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：７５）, HTR1B（セロトニン受容体１Ｂ、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００２６５２８６＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：６７）、HTR2A（セロトニン受容体２Ａ、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ０１０３３５２４＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：９９）, 5-HTT（セロトニントランスポーター、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００９８４３４９＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：５８）, Ascl1（神経幹細胞ニューロン分化マーカー、Ｃａｔ．＃４３５１３７２  Ｈｓ０４１８７５４６＿ｇ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：８１）, Hes1（神経幹細胞アストロサイト分化マーカー、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００１７２８７８＿ｍ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：７８）, 及びOlig2（神経幹細胞オリゴデンドロサイト分化マーカー、Ｃａｔ．＃４３３１１８２  Ｈｓ００３００１６４＿ｓ１  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｈｅ：８６）である。【０１６８】
尚、発現量との関係を知るために、通常濃度ＲＴ−ＰＣＲ（２００ｎｇの抽出ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った）、と高濃度ＲＴ−ＰＣＲ（１０００ｎｇの抽出ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った）を行い、発現の大小関係を調べた。【０１６９】
ＲＴ−ＰＣＲは以下の条件で行った。
細胞からのＲＮＡ抽出は抽出キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＸＳ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社＃Ｕ０９０２Ａ）を使用し、プロトコール通りに実施した。ＲＴ−ＰＣＲの試薬キットはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｄｙｅ  Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ  ＰＲ０５７Ａ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲのサーマルサイクラー条件は５０℃で３０分、９４℃で２分処理した後、「９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１５秒」を１サイクルとして、５０サイクル実施した。【０１７０】
結果は、表１にまとめた通りであった。尚、表中の記号は以下を意味する。
＋＋：通常PCR、高濃度PCRともに標的遺伝子を検出できた場合。
＋：通常PCRでは補足出来ないが、高濃度PCRで標的遺伝子を検出できた場合。
−：通常PCRでも高濃度PCRでも標的遺伝子を検出できなかった場合。
尚、検出出来たかどうかは、電気泳動によりバンドが目視確認出来たかどうかで判断した。【０１７１】
【表１】
2015194494.tif 000003
【０１７２】
［実施例３８］
実施例２６、２７及び２８においては、モザイク細胞塊は、ＣＢＥ３ブロックと細胞とを２４時間静置することにより形成させた。本実施例３８では、実施例２８と同様のＣＢＥ３ブロックと細胞とを用いて実施例２８と同様の条件において、モザイク細胞塊の形成に必要な時間を調べた。Ｕ字型プレートで使用して、細胞構造体（モザイク細胞塊）が形成される過程を顕微鏡で確認した。最初はＣＢＥ３ブロックと細胞とが分散しているが、その分散の広がりの長さを測定した結果を図１２に示す。図１２の縦軸の直径は、ブロックと細胞との広がりの長さを示す。細胞構造体を形成するにつれてブロックと細胞との広がりの長さ（直径）は短くなる。図１２の結果から分かるように、ＣＢＥ３ブロックと細胞を混合して、１、２、３、４、５、６及び７時間静置した状態では、本発明で言うモザイク細胞塊はできておらず、細胞とブロックとが別々の状態で存在していた。即ち、図１２において、１、２、３、４、５、６及び７時間静置した状態では、ブロックと細胞との広がりの長さが減少していることから、塊が一つにまとまっていないことが分かる。一方、１５、１８、２１、２３、２６、２９、４５及び６９時間静置した状態では、ブロックと細胞との広がり（直径）の長さが変化しなくなっていることから、一つのモザイク細胞塊の形成が終わっていたことが分かる。
【図１】
2015194494.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015194494.tif 000017
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