(57)【要約】  核酸系逆転写酵素阻害薬であるアバカビルが、正常細胞のＤＮＡ複製を阻害することなくｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＴＬ細胞に対して抗がん活性を発現することを見出した。アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体は、がん、特に乳がんや成人Ｔ細胞白血病等のＤＮＡ修復機構に異常を有するがんの予防または治療用医薬組成物の有効成分として有用である。
2014133085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんの予防または治療用である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんが、ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
肺がんまたはヒトＴ細胞白血病ウイルス１型感染に起因するがんの予防または治療用である請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
成人Ｔ細胞白血病の予防または治療用である請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせて使用される請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて使用される請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＤＮＡ切断作用を有する請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞周期停止作用および／またはアポトーシス誘発作用を有する請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防または治療用医薬組成物に関するものであり、詳細には、アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するがんの予防または治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸系逆転写酵素阻害薬（ＮＲＴＩ：Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitor）は、抗ヒト免疫不全ウイルス１型（以下「ＨＩＶ−１」と記す）薬として開発され、現在抗ＨＩＶ治療の核をなす薬剤として使用されている。しかしながら、そのプロトタイプであるジドブジン（ＡＺＴ）に関しては、ウイルスの逆転写のみならず、正常細胞のＤＮＡ複製阻害を惹き起こすことが知られている（非特許文献１参照）。一方、ＨＩＶ−１と同様のヒトレトロウイルスであるヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（以下「ＨＴＬＶ−１」と記す）に対して、各種の核酸系逆転写酵素阻害薬に抗ウイルス効果があることが知られている。さらに、ＨＴＬＶ−１感染に起因する成人Ｔ細胞白血病（Adult T cell Leukemia、以下「ＡＴＬ」と記す）の治療においてインターフェロン（ＩＦＮ）とジドブジンの併用療法が行なわれ、その効果が報告されている（非特許文献２、３参照）。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてジドブジンはＡＴＬ細胞に対して抗がん効果がないことが報告されており（非特許文献４参照）、ＡＴＬ細胞におけるジドブジンの作用機序は不明な点が多い。【０００３】
ＮＲＴＩの一種であるアバカビル（ＡＢＣ）は抗ＨＩＶ薬として臨床使用されており、抗ＨＴＬＶ−１効果を有することも報告されている（非特許文献５参照）。しかし、アバカビルの抗がん効果については知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Environ Mol Mutagenesis 48:215, 2007
【非特許文献２】NEJM 332:1744, 1995
【非特許文献３】J Clin Oncol 28:4177, 2010
【非特許文献４】Leukemia 14:716, 2000
【非特許文献５】J Infect Dis 188:424, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、正常細胞のＤＮＡ複製を阻害することなくｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＴＬ細胞に対して抗がん活性を発現する核酸系逆転写酵素阻害薬を見出し、当該核酸系逆転写酵素阻害薬を有効成分とし、正常細胞に対する副作用が軽減された新規ながんの予防または治療用医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するがんの予防または治療用医薬組成物。
［２］ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんの予防または治療用である前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんが、ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんである前記［２］に記載の医薬組成物。
［４］肺がんまたはヒトＴ細胞白血病ウイルス１型感染に起因するがんの予防または治療用である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］成人Ｔ細胞白血病の予防または治療用である前記［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］ＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせて使用される前記［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて使用される前記［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］ＤＮＡ切断作用を有する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］細胞周期停止作用および／またはアポトーシス誘発作用を有する前記［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、正常細胞のＤＮＡ複製を阻害せずに抗がん活性を発現するがんの予防または治療用医薬組成物、すなわち、正常細胞に対する副作用が軽減された新規ながんの予防または治療用医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用いて、ＨＴＬＶ−１産生細胞株ＭＴ２の細胞増殖およびウイルス産生量に対する効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）が細胞増殖の結果、（Ｂ）がウイルス産生量の結果を示す図である。
【図２】６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用いて、ＨＴＬＶ−１産生細胞株ＨＵＴ１０２（ＡＴＬ由来）の細胞増殖およびウイルス産生量に対する効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）が細胞増殖の結果、（Ｂ）がウイルス産生量の結果を示す図である。
【図３】６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用いて、ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ウイルス非産生ＡＴＬ細胞株）の細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）がＥＤ４０５１５（−）、（Ｂ）がＥＤ４０５１５（＋）、（Ｃ）がＳＹＫ−１１Ｌ（＋）、（Ｄ）がＡＴＬ４３Ｔの結果を示す図である。
【図４】６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用いて、ＨＴＬＶ−１非感染細胞株の細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）がＪｕｒｋａｔ、（Ｂ）がＫｉｔ２２５、（Ｃ）がＨ９、（Ｄ）がＳＵＤＨＬ６の結果を示す図である。
【図５】ＨＴＬＶ−１産生細胞株に対するアバカビルの用量依存的な細胞増殖抑制作用を確認した結果を示す図であり、（Ａ）がＭＴ２の結果、（Ｂ）がＨＵＴ１０２の結果を示す図である。
【図６】ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ウイルス非産生ＡＴＬ細胞株）に対するアバカビルの用量依存的な細胞増殖抑制作用を確認した結果を示す図であり、（Ａ）がＥＤ４０５１５（−）、（Ｂ）がＥＤ４０５１５（＋）、（Ｃ）がＳＹＫ−１１Ｌ（＋）、（Ｄ）がＡＴＬ４３Ｔの結果を示す図である。
【図７】ＡＴＬ細胞株の染色体に対するアバカビルの作用を検討した結果を示す図である。
【図８】ＡＴＬ細胞株に対するアバカビルの特異的ＤＮＡ修復タンパク質誘導作用を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はＲａｄ５１陽性細胞の割合を示し、（Ｂ）はγＨ２ＡＸ陽性細胞の割合を示し、（Ｃ）はＰＡＲＰ陽性細胞の割合を示す図である。
【図９】アバカビルのＡＴＬ細胞増殖抑制効果に対するＰＡＲＰ（poly（ADP-ribose）polymerase）阻害剤の影響を検討した結果を示す図である。
【図１０】ＡＴＬ細胞株の細胞周期に対するアバカビルの作用を検討した結果を示す図である。
【図１１】ＡＴＬ細胞株に対するアバカビルのアポトーシス誘発作用を検討した結果を示す図である。
【図１２】ＤＴ４０細胞由来ＤＮＡ修復酵素変異株の細胞増殖に対するアバカビルの効果を検討した結果を示す図である。
【図１３】ＨＴＬＶ−１感染細胞株のＴＤＰ１タンパク質の発現量をウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図１４】ＡＴＬ患者の末梢血単核球のＴＤＰ１発現量を健常人のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＤＰ１発現量と比較した結果を示す図であり、（Ａ）はウエスタンブロットの結果、（Ｂ）は定量ＰＣＲの結果である。
【図１５】ＨＴＬＶ−１非感染細胞株のＪｕｒｋａｔにＴＤＰ１のｓｉＲＮＡを導入して作製したＴＤＰ１ノックダウン細胞のＴＤＰ１発現量を測定した結果を示す図であり、（Ａ）は定量ＰＣＲの結果、（Ｂ）はウエスタンブロットの結果である。
【図１６】ＴＤＰ１ノックダウン細胞に対するアバカビルの細胞増殖抑制作用を確認した結果を示す図である。
【図１７】ＨＴＬＶ−１感染細胞株のＭＴ２にヒトＴＤＰ１発現用レンチウイルスベクターを導入して作製したＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞のＴＤＰ１タンパク質の発現量をウエスタンブロットにより検出した結果を示す図である。
【図１８】ＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞に対するアバカビルの細胞増殖抑制作用を確認した結果を示す図である。
【図１９】ＴＤＰ１の発現が欠失している肺がん細胞株に対するアバカビルの細胞増殖抑制作用を確認した結果を示す図である。
【図２０】ＨＴＬＶ−１感染細胞株のＭＴ２に対するアバカビルとトポイソメラーゼ阻害剤との併用効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はＣＰＴ−１１との併用の結果、（Ｂ）はＶＰ１６との併用の結果、（Ｃ）はＡＤＲとの併用の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、各種核酸系逆転写酵素阻害薬の中で、アバカビルがＨＴＬＶ−１感染細胞およびＡＴＬ細胞に対して最も強力な細胞増殖抑制効果を示すこと、この細胞増殖抑制効果はＨＴＬＶ−１非感染の細胞に対しては効果を示さないことを見出した。また、本発明者らは、アバカビルはＤＮＡ修復機構に作用しＤＮＡの二本鎖切断を生じさせること、ＰＡＲＰ阻害剤と相乗効果を示すこと、細胞周期停止およびアポトーシスを惹起することを見出した。さらに、本発明者らは、ＨＴＬＶ−１感染していない細胞であっても、ＤＮＡ修復機構に異常のあるがん細胞に対してアバカビルは細胞増殖抑制効果を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、ＤＮＡ修復酵素のＴＤＰ１の発現量が低下したがん細胞に対してアバカビルは細胞増殖抑制効果を示すことを見出し、トポイソメラーゼ阻害剤と相乗効果を示すことを見出した。
【００１０】
アバカビルは以下の化学構造を有し、化学名は（−）−（１Ｓ，４Ｒ）−４−［２−アミノ−６−（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル］−２−シクロペンテン−１−メタノール）である。
【００１１】
【化１】
2014133085.tif 000003
【００１２】
本明細書において「製薬上許容される誘導体」とは、哺乳動物等の生体に投与した際に意図した活性成分またはそのあらゆる活性代謝物または残基を、直接または間接的に提供することができるあらゆる製薬上許容される塩、溶媒和物、エステルまたはそのようなエステルの塩、その他あらゆる化合物を意味する。
【００１３】
アバカビルの製薬上許容される塩としては、例えば、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（例えば、テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等）、有機アミン（例えば、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等）の塩、酸付加物塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸塩）などが挙げられる。好ましくは、コハク酸塩およびヘミ硫酸塩である。
【００１４】
アバカビルは、欧州特許０４３４４５０またはＷＯ９５／２１１６１に記載の方法によって製造することができる。アバカビルのコハク酸塩はＷＯ９６／０６８４４に記載の方法によって調製することができる。アバカビルのヘミ硫酸塩は、ＷＯ９８／５２９４９に記載の方法によって調製することができる。
【００１５】
本発明の医薬組成物よる予防または治療対象のがんは、特に限定されないが、好ましくはＤＮＡ修復機構に異常を有するがんである。ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんとしては、例えば、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、大腸がん、肺がん、リンパ系白血病などが挙げられる。また、ＨＴＬＶ−１感染に起因するがんも、ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんに含まれる。したがって、ＨＴＬＶ−１感染に起因するがんは、本発明の医薬組成物による予防または治療対象として好適である。ＨＴＬＶ−１感染に起因するがんとしては、ＡＴＬが挙げられる。本願発明者らは、ＨＴＬＶ−１感染に起因するがん細胞において、ＤＮＡ修復酵素の一種であるＴＤＰ１の発現量が低下していることを確認した。したがって、本発明の医薬組成物は、ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんを対象とすることが好ましい。ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんとしては、例えばＡＴＬ、肺がんなどが挙げられる。ＴＤＰ１（Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1）はＤＮＡ修復タンパク質であり、特に一本鎖ＤＮＡ断裂の修復に関与していることが知られている。ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんであることは、がん細胞中のＴＤＰ１タンパク質量またはＴＤＰ１ ｍＲＮＡ量を公知の方法（例えばウエスタンブロット、定量ＲＴ−ＰＣＲなど）で測定し、ＤＮＡ修復機構に異常がない細胞のＴＤＰ１発現量と比較することにより確認することができる。
【００１６】
アバカビルは、ＨＴＬＶ−１感染非がん細胞であるＭＴ２細胞に対して強い細胞増殖抑制および強いウイルス産生抑制を示したことから、本発明の医薬組成物は、ＨＴＬＶ−１キャリアにおけるＡＴＬ発症の予防薬として、非常に有用である。
また、アバカビルは、ＨＴＬＶ−１感染非がん細胞であるＭＴ２細胞に対して強い細胞増殖抑制および強いウイルス産生抑制を示したことから、本発明の医薬組成物は、ＨＴＬＶ−１感染に起因するすべての疾患の予防および／または治療に有用である。ＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患としては、ＡＴＬ以外に、ＨＡＭ／ＴＳＰ（HTLV-I associated myelopathy、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症/tropical spastic paraparesis、熱帯性痙性対麻痺）、ＨＴＬＶ−１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｕｖｅｉｔｉｓ（ＨＴＬＶ−１関連ブドウ膜炎)、ＨＴＬＶ−１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ等の炎症性疾患が挙げられる。したがって、本発明には、アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物が含まれる。
【００１７】
アバカビルはＤＮＡ切断作用、特にＤＮＡの二本鎖切断作用を有するので、本発明の医薬組成物は、ＤＮＡ切断誘導剤またはＤＮＡの二本鎖切断誘導として有用である。また、アバカビルは細胞周期停止作用およびアポトーシス誘発作用を有するので、本発明の医薬組成物は、細胞周期停止誘導剤、アポトーシス誘発剤としても有用である。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分とし、製薬上許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００１９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００２０】
アバカビルは、抗ウイルス化学療法剤として臨床で広く使用されているので、本発明の医薬組成物はヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、安全に投与することができる。
【００２１】
アバカビルの投与量は、投与を受ける者の状態、対象がん種、症状、投与方法などにより変化するので、最終的に医師の判断に委ねられるが、経口投与の場合、通常、１日につき投与を受ける者の体重１ｋｇあたり約０．１〜１２０ｍｇの範囲であり、好ましくは１日につき投与を受ける者の体重１ｋｇあたり約３〜９０ｍｇの範囲であり、より好ましくは１日につき投与を受ける者の体重１ｋｇあたり約５〜６０ｍｇの範囲である。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、ＤＮＡ修復酵素阻害剤と併用することにより抗がん活性を相乗的に増強させることができる。ＤＮＡ修復酵素阻害剤としては、例えば、ＰＡＲＰ（poly（ADP-ribose）polymerase）阻害剤、ＴＤＰ１修復酵素阻害剤、複製ＤＮＡポリメラーゼ校正ヌクレアーゼに対する阻害剤、損傷乗越えＤＮＡポリメラーゼに対する阻害剤、ＡＴＲキナーゼ阻害薬などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはＰＡＲＰ阻害剤である。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、他のがん治療用薬剤と併用して用いることができる。他のがん治療用薬剤は特に限定されないが、例えば、化学療法剤、免疫療法剤またはホルモン療法剤と併用して用いることが好ましい。また、本発明のがんの予防または治療薬は、放射線療法と併用して用いることができる。
【００２４】
化学療法剤としては、特に限定されないが、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン等のアルキル化剤；例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、ペメトレキセド、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール、カペシタビン等）、アミノプテリン、ネルザラビン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン、ベンダムスチン等の代謝拮抗剤；例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン等の抗がん性抗生物質；例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン、イリノテカン、塩酸イリノテカン等の植物由来抗がん剤などが挙げられる。
【００２５】
免疫療法剤としては、特に限定されないが、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール、抗ＣＴＬＡ４抗体などが挙げられる。
【００２６】
ホルモン療法剤としては、特に限定されないが、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、アリルエストレノール、ゲストリノン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン等）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等）、５α−レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、エプリステリド等）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン等）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）などが挙げられる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、トポイソメラーゼ阻害剤と併用することが好ましい。本発明の医薬組成物は、トポイソメラーゼ阻害剤と併用することにより抗がん活性を相乗的に増強させることができる。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼの働きを阻害することにより薬剤がＤＮＡの切断部位に入り込み再結合を阻止するため、ＤＮＡが切断されたままの状態となり、がん細胞を死滅させる。本発明の医薬組成物との併用に適したトポイソメラーゼ阻害剤は特に限定されず、上記の作用機序を有する薬剤は、いずれも本発明の医薬組成物との併用に好適である。具体的には、例えば塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、エトポシド（ＶＰ１６）、塩酸ドキソルビシン（ＡＤＲ）、ノギテカン、塩酸ダウノルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン、イリノテカン、リン酸エトポシドなどが挙げられる。
【００２８】
本発明のがんの予防または治療薬と他のがん治療用薬剤または放射線療法とを併用することにより、（１）相乗効果が得られる、（２）投与量を軽減することができる、（３）治療期間を長く設定することができる、（４）治療効果の持続を図ることができる、等の効果が得られる。
【００２９】
本発明のがんの予防または治療薬と他のがん治療用薬剤とを併用する場合、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与対象の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、組み合わせ等により適宜選択することができる。
【００３０】
本発明には、以下の各発明も含まれる。
哺乳動物に対してアバカビルまたはその製薬上許容される誘導体の有効量を投与することを特徴とするがんの予防または治療方法。
がんの予防または治療に使用するためのアバカビルまたはその製薬上許容される誘導体。
がんの予防または治療用医薬を製造するための、アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体の使用。
哺乳動物に対してアバカビルまたはその製薬上許容される誘導体の有効量を投与することを特徴とするＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療方法。
ＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療に使用するためのアバカビルまたはその製薬上許容される誘導体。
ＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の予防または治療用医薬を製造するための、アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体の使用。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実験方法において特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition)", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore,J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Ltd. などの、当該技術分野における標準的なプロトコール集に記載の方法、またはそれらを改変した方法を用いた。【００３２】
〔実施例１：ＨＴＬＶ−１産生細胞株の細胞増殖およびウイルス産生に対する効果〕
（１）実験材料
ＨＴＬＶ−１産生細胞株として、ＭＴ２（ＨＴＬＶ-１によるトランスフォーム株、ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ１２１０）およびＨＵＴ１０２（ＡＴＬ由来細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ-１６２）を使用した。
核酸系逆転写酵素阻害薬として、アバカビル（ＡＢＣ）、ジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ＤＤＩ）、スタブジン（Ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）およびテノホビル（ＴＤＦ）の６種類を用いた。これらの核酸系逆転写酵素阻害薬はＤＭＳＯに溶解して培地に添加した。これらの核酸系逆転写酵素阻害薬は、米国ＮＩＨ ＡＩＤＳ ｒｅａｇｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍより入手した。【００３３】
（２）細胞増殖試験
各細胞の培地に各核酸系逆転写酵素阻害薬をそれぞれ１００μＭとなるように添加し、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、４時間（Ｄａｙ０）、４８時間（Ｄａｙ２）または９６時間（Ｄａｙ４）培養した。コントロールとしてＤＭＳＯのみを添加した溶媒対照を設けた。細胞増殖試験はＭＴＳアッセイにより実施した。すなわち、所定時間の培養後、細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を加え、４時間後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞増殖量は、Ｄａｙ０のコントロール（溶媒対照）の値を１としたときの相対比率で表した。【００３４】
（３）ウイルス量の測定
各細胞の培地に各核酸系逆転写酵素阻害薬をそれぞれ１００μＭとなるように加え、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、０時間（Ｄａｙ０）、４８時間（２日間）、９６時間（４日間）または１６８時間（７日間）培養し、それぞれの時点で培地を回収した。ＨＴＬＶ−１ Ｐ１９ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて、各時点で回収した培地中のウイルス量（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。【００３５】
（４）結果
ＭＴ２の結果を図１に、ＨＵＴ１０２の結果を図２に示した。図１および図２とも（Ａ）が細胞増殖の結果、（Ｂ）がウイルス産生量の結果である。図１および図２から明らかなように、用いた６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬の中で、アバカビル（図中ＡＢＣ）は両細胞株に対して細胞増殖およびウイルス産生を最も強く抑制した。【００３６】
〔実施例２：ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ウイルス非産生ＡＴＬ細胞株）の細胞増殖に対する効果〕
ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ウイルス非産生ＡＴＬ細胞株）として、ＥＤ４０５１５（−）、ＥＤ４０５１５（＋）、ＡＴＬ４３Ｔ（いずれも作製者の前田道之博士より供与）およびＳＹＫ−１１Ｌ（＋）（発明者らの研究室で作製）を使用した。
実施例１と同じ６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用い、実施例１と同じ方法で細胞増殖試験を実施した。【００３７】
結果を図３（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）がＥＤ４０５１５（−）、（Ｂ）がＥＤ４０５１５（＋）、（Ｃ）がＳＹＫ−１１Ｌ（＋）、（Ｄ）がＡＴＬ４３Ｔの結果である。図３（Ａ）〜（Ｄ）から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はすべての細胞株に対して強い細胞増殖抑制作用を示した。【００３８】
〔参考例１：ＨＴＬＶ−１非感染細胞株の細胞増殖に対する効果〕
ＨＴＬＶ−１非感染細胞株として、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞白血病細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１５２）、Ｋｉｔ２２５（慢性Ｔ細胞性白血病由来細胞株、発明者らの研究室にて樹立、Blood. 1987 Oct;70(4):1069-72.）、Ｈ９（皮膚Ｔ細胞リンパ腫由来細胞株、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１７６）およびＳＵＤＨＬ６（瀰漫性Ｂ細胞リンパ腫由来細胞株）を使用した。
実施例１と同じ６種類の核酸系逆転写酵素阻害薬を用い、実施例１と同じ方法で細胞増殖試験を実施した。【００３９】
結果を図４（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）がＪｕｒｋａｔ、（Ｂ）がＫｉｔ２２５、（Ｃ）がＨ９、（Ｄ）がＳＵＤＨＬ６の結果である。図４（Ａ）〜（Ｄ）から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はいずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制作用を示さなかった。【００４０】
〔実施例３：ＨＴＬＶ−１産生細胞株に対するアバカビルの細胞増殖抑制〕
実施例１で用いたＭＴ２およびＨＵＴ１０２に、アバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭの各濃度で添加し、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、４時間または４８時間培養した。所定時間の培養後、実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。細胞増殖量は、Ｄａｙ０のコントロール（溶媒対照）の値を１としたときの相対比率で表した。【００４１】
結果を図５（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）がＭＴ２の結果、（Ｂ）がＨＵＴ１０２の結果である。図５（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、アバカビルは両細胞株の細胞増殖を用量依存的に抑制した。【００４２】
〔実施例４：ＨＴＬＶ−１感染細胞株（ウイルス非産生ＡＴＬ細胞株）に対するアバカビルの細胞増殖抑制〕
実施例２で用いたＥＤ４０５１５（−）、ＥＤ４０５１５（＋）、ＳＹＫ−１１Ｌ（＋）およびＡＴＬ４３Ｔに、アバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭの各濃度で添加し、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、４時間（Ｄａｙ０）、４８時間（Ｄａｙ２）または９６時間（Ｄａｙ４）培養した。所定時間の培養後、実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。細胞増殖量は、Ｄａｙ０のコントロール（溶媒対照）の値を１としたときの相対比率で表した。【００４３】
結果を図６（Ａ）〜（Ｄ）に示した。（Ａ）がＥＤ４０５１５（−）、（Ｂ）がＥＤ４０５１５（＋）、（Ｃ）がＳＹＫ−１１Ｌ（＋）、（Ｄ）がＡＴＬ４３Ｔの結果である。図６（Ａ）〜（Ｄ）から明らかなように、アバカビルはすべての細胞株の細胞増殖を用量依存的に抑制した。【００４４】
実施例１〜４および参考例１の結果から、アバカビルは、ＨＴＬＶ−１感染細胞株においてウイルス産生を抑制するのみならず、ＡＴＬ細胞株を含むＨＴＬＶ−１感染細胞の細胞増殖を強く抑制することが示された。この効果は、他のＴ細胞白血病株やＢ細胞リンパ腫株においては見られず、ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株に特異的な効果であった。【００４５】
〔実施例５：ＡＴＬ細胞株の染色体に対するアバカビルの作用〕
ＡＴＬ細胞株であるＥＤ４０５１５（−）に、アバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭの各濃度で添加し、４８時間培養後、カルノア固定し、定法に従って染色体標本（ギムザ染色）を作製した。ＥＤ４０５１５（−）にジドブジンを１０μＭ、１００μＭの各濃度で添加したもの、非ＡＴＬ細胞株であるＪｕｒｋａｔにアバカビルを１００μＭの濃度で添加したものについても同様に染色体標本を作製した。１群あたり１００個以上の染色体像を光学顕微鏡で観察し、１箇所でも染色体断裂がある細胞を二本鎖切断（ＤＳＢ：double strand break）陽性と判定した。【００４６】
群ごとの二本鎖切断陽性細胞の割合を図７に示した。図７から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）は用量依存的に二本鎖切断陽性細胞の割合が増加させた。一方、ジドブジン（図中ＡＺＴ）はＡＴＬ細胞株の染色体に二本鎖切断を生じさせなかった。また、アバカビルは非ＡＴＬ細胞株であるＪｕｒｋａｔに二本鎖切断を生じさせなかった。【００４７】
〔実施例６：アバカビルによるＡＴＬ細胞株特異的ＤＮＡ修復タンパク質誘導作用〕
ＡＴＬ細胞株であるＥＤ４０５１５（−）または非ＡＴＬ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ＤＭＳＯ（溶媒対照）またはアバカビルを１００μＭの濃度で添加し、４８時間培養した。細胞をプレパラートに固定しＲａｄ５１、γＨ２ＡＸ、ＰＡＲＰを免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。１群当たり７０個以上の細胞を観察し、各タンパク質の陽性細胞の割合を算出した。Ｒａｄ５１は大腸菌のＲｅｃＡタンパク質のホモログであり、ＤＮＡの二本鎖切断の修復に関与するタンパク質である。γＨ２ＡＸはリン酸化ヒストンタンパク質であり、ＤＮＡの二本鎖切断の修復に関与するタンパク質である。ＰＡＲＰはポリＡＤＰ−リボース合成酵素であり、ＤＮＡの一本鎖切断の修復に関与するタンパク質である。【００４８】
結果を図８（Ａ）〜（Ｃ）に示した。（Ａ）はＲａｄ５１陽性細胞の割合を示す図であり、（Ｂ）はγＨ２ＡＸ陽性細胞の割合を示す図であり、（Ｃ）はＰＡＲＰ陽性細胞の割合を示す図である。図８（Ａ）〜（Ｃ）から、アバカビル（図中ＡＢＣ）はＡＴＬ細胞株に対して特異的にＲａｄ５１、γＨ２ＡＸ、ＰＡＲＰを誘導することが明らかとなった。この結果は、アバカビルが、ＡＴＬ細胞特異手的にＤＮＡの二本鎖切断を生じさせることを裏付けるものと考えられる。【００４９】
〔実施例７：アバカビルのＡＴＬ細胞増殖抑制効果に対するＰＡＲＰ阻害剤の影響〕
ＡＴＬ細胞株であるＥＤ４０５１５（−）または非ＡＴＬ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、アバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの各濃度で添加し、さらにＰＡＲＰ阻害剤であるＯｌａｐａｒｉｂを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの各濃度で添加して４８時間培養した。実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。細胞増殖量は、Ｄａｙ０のコントロール（溶媒対照）の値を１としたときの相対比率で表した。【００５０】
結果を図９（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＥＤ４０５１５（−）の結果であり、（Ｂ）はＪｕｒｋａｔの結果である。図９（Ａ）から明らかなように、Ｏｌａｐａｒｉｂはアバカビル（図中ＡＢＣ）によるＥＤ４０５１５（−）に対する細胞増殖抑制効果を用量依存的に増強した。一方、図９（Ｂ）から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はＪｕｒｋａｔの細胞増殖を抑制せず、ＯｌａｐａｒｉｂはＪｕｒｋａｔの細胞増殖に影響を及ぼさなかった。【００５１】
〔実施例８：ＡＴＬ細胞株の細胞周期に対するアバカビルの作用〕
ＡＴＬ細胞株であるＥＤ４０５１５（−）または非ＡＴＬ細胞株であるＪｕｒｋａｔに、ＤＭＳＯ（溶媒対照）、アドリアマイシン（ＡＤＲ、陽性対照）、アバカビル（１０μＭ、１００μＭ）を添加し、２４時間培養した。ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide：PI）で染色し、フローサイトメトリーで細胞周期を解析して、Ｇ０Ｇ１／Ｓ／Ｇ２期の細胞の割合を求めた。【００５２】
結果を図１０（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＥＤ４０５１５（−）の結果であり、（Ｂ）はＪｕｒｋａｔの結果である。図１０（Ａ）から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はＥＤ４０５１５（−）に対してＳ／Ｇ２期停止を惹起した。一方、図１０（Ｂ）から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はＪｕｒｋａｔの細胞周期に影響を及ぼさなかった。【００５３】
〔実施例９：ＡＴＬ細胞株に対するアバカビルのアポトーシス誘発作用〕
ＡＴＬ細胞株であるＥＤ４０５１５（−）に、ＤＭＳＯ（溶媒対照）、アドリアマイシン（ＡＤＲ、陽性対照）、アバカビル（１００μＭ）を添加し、２４時間または４８時間培養した。所定時間培養後、アネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーでアネキシンＶ陽性細胞を測定した。アネキシンＶ陽性細胞をアポトーシス細胞と評価した。【００５４】
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、アバカビル（図中ＡＢＣ）はＥＤ４０５１５（−）にアポトーシスを誘発することが示された。【００５５】
実施例５〜９の結果から、アバカビルは、ＡＴＬ細胞株に対して染色体断裂を誘導したが、非ＡＴＬ細胞株の染色体には影響しないことが示された。また、この効果は、従来ＤＮＡ障害の報告されている核酸系逆転写酵素阻害薬ジドブジンでは見られなかった。以上より、アバカビルはＡＴＬ細胞に特異的に染色体断裂を惹き起こし、またこの効果はアバカビル特異的なものであることが明らかとなった。さらにアバカビルは、ＡＴＬ細胞に細胞周期停止、アポトーシスを惹き起こすことが示された。【００５６】
〔実施例１０：ＤＴ４０細胞由来ＤＮＡ修復酵素変異株の細胞増殖に対するアバカビルの効果〕
ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞の野生株および各種ＤＮＡ修復酵素変異株を用いた。これらの細胞株は京都大学大学院医学研究科放射線遺伝学研究室から分与を受けることができる（参考文献：(1)Mol Cell Biol. 2001 Apr;21(8):2858-66. (2)PLoS Genet. 2011 Jul;7(7):e1002148. (3)Mol Cell Biol. 2008 Oct;28(19):6113-22. (4)J Biol Chem. 2012 Apr 13;287(16):12848-57.）。
各細胞の培地にアバカビルをそれぞれ２５μＭとなるように添加し、１×１０４個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、４８時間培養した。培養終了後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（商品名、プロメガ社製）を用い、ＡＴＰ法にて細胞増殖を測定した。【００５７】
結果を図１２に示した。図１２の縦軸（Log2 Gene/WT）は、ＤＮＡ修復酵素変異株のＡＴＰアッセイ値を野生株のＡＴＰアッセイ値で除し、そのｌｏｇ２を取って数値化したものである。具体的には、縦軸が−１であれば野生株と比較した増殖率が５０％、−２であれば野生株と比較した増殖率が２５％であることを示す。図１２から明らかなように、ＤＮＡ修復酵素であるＸＲＣＣ２、ＰＣＮＡ、ＢＲＣＡ１、ＴＤＰ１、ＧＥＮ１の各欠損ＤＴ４０細胞株に対して、アバカビルは細胞増殖抑制効果を示した。示していないが、他のいくつかのＤＮＡ修復酵素欠損ＤＴ４０細胞株に対しても、アバカビルは同様の細胞増殖抑制効果を示した。この結果から、アバカビルは、ＨＴＬＶ−１感染細胞に限らず、ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんの予防または治療に有用であることが示された。【００５８】
〔実施例１１：ＨＴＬＶ−１感染細胞株におけるＴＤＰ１の発現〕
ＨＴＬＶ−１感染細胞株として、ＥＤ４０５１５（−）、ＥＤ４０５１５（＋）、ＭＴ２、ＨＵＴ１０２、ＳＹ、ＳＹＫ−１１Ｌ（＋）およびＡＴＬ４３Ｔを使用した。対照としてＨＴＬＶ−１非感染細胞株のＪｕｒｋａｔを使用した。これらの細胞は、ＳＹ細胞を除き、実施例１，２または参考例１で使用した細胞と同じである。ＳＹは発明者らの研究室で作製したＨＴＬＶ−１感染細胞株である。定法に従って各細胞株を培養し、細胞溶解液を調製して細胞溶解液中のＴＤＰ１をウエスタンブロットで検出した。具体的には、各細胞株をそれぞれ溶解バッファー（MPER、1 mM PMSF、phosphatase inhibitor cocktail、プロテアーゼ阻害薬カクテル）で溶解し、ＳＤＳページで展開、メンブレンに転写して抗ラビットＴＤＰ１抗体（ab4166：Abcam）で検出した。【００５９】
結果を図１３に示した。図１３から明らかなように、ＨＴＬＶ−１感染細胞株ではＴＤＰ１タンパク質の発現が低下していることが示された。この結果から、ＨＴＬＶ−１感染細胞はＴＤＰ１が関与するＤＮＡ修復機構に異常を有していることが明らかとなった。【００６０】
〔実施例１２：ＡＴＬ患者細胞におけるＴＤＰ１の発現〕
１０例のＡＴＬ患者から採取した末梢血単核球および５名の健常人から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞を試験に供した。実施例１１と同じ方法でウエスタンブロットを実施した。また、各細胞株からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して定量ＰＣＲを行い、ＴＤＰ１のｍＲＮＡ量を定量した。具体的には、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Roche社）を使用してＲＮＡを抽出後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。以下のプライマーを使用して、ＴＤＰ１のｍＲＮＡ量を定量した。
TDP1_F：5’-AGGCAGCCTTGGACAGATT-3’（配列番号１）
TDP1_R：5’-GGTCAGCTGAGACTTCTGGC-3’（配列番号２）【００６１】
結果を図１４（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＡＴＬ患者２名および健常人２名のウエスタンブロットの結果、（Ｂ）はＡＴＬ患者１０名および健常人５名の定量ＰＣＲの結果である。図１４（Ａ）から明らかなように、ＡＴＬ患者の末梢血単核球から、ＴＤＰ１タンパク質は検出されなかった。また、図１４（Ｂ）から明らかなように、ＡＴＬ患者では、ＴＤＰ１ ｍＲＮＡの発現量が健常人と比較して有意に低下していることが示された。なお、（Ｂ）において、ＴＤＰ１ ｍＲＮＡの発現量は、健常人サンプルのうち１つのＴＤＰ１ ｍＲＮＡの発現量を１としたときの相対比率で表した。【００６２】
〔実施例１３：ＴＤＰ１のノックダウンによるアバカビル感受性の獲得〕
（１）ＴＤＰ１ノックダウン細胞の作製
ＨＴＬＶ−１非感染細胞株のＪｕｒｋａｔに、ＴＤＰ１のｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションで導入し、ＴＤＰ１ノックダウン細胞を作製した。具体的には、ｓｉＴＤＰ１ ＳＭＡＲＴ ＰＯＯＬ（Dharmacon）を購入し、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（LONZA）を使用し、ＡＭＡＸＡシステムでｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡ導入後２４時間目に、実施例１２と同じ方法で定量ＰＣＲを行い、ＴＤＰ１のｍＲＮＡ量を定量した。また、ｓｉＲＮＡ導入後７２時間目に細胞溶解液を調製して、実施例１１と同じ方法でウエスタンブロットを行い、ＴＤＰ１タンパク質の発現を検出した。いずれも実験もコントロールｓｉＲＮＡを導入したＪｕｒｋａｔ細胞をコントロールとした。なお、コントロールｓｉＲＮＡには、Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ ＮＥＧＡＴＩＶＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（invitrogen）を使用した。【００６３】
結果を図１５（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は定量ＰＣＲの結果であり、（Ｂ）はウエスタンブロットの結果である。図１５（Ａ）から明らかなように、ＴＤＰ１ノックダウン細胞のＴＤＰ１のｍＲＮＡ量は、コントロールと比較して大幅に減少していた。図１５（Ｂ）から明らかなように、ＴＤＰ１ノックダウン細胞のＴＤＰ１タンパク質の発現量は、コントロールと比較して大幅に減少していた。これらの結果から目的のＴＤＰ１ノックダウン細胞が作製できたことを確認した。【００６４】
（２）ＴＤＰ１ノックダウン細胞の細胞増殖に対するアバカビルの効果
ＪｕｒｋａｔにＴＤＰ１のｓｉＲＮＡを導入したＴＤＰ１ノックダウン細胞およびＪｕｒｋａｔにコントロールｓｉＲＮＡを導入したコントロール細胞を使用した。ｓｉＲＮＡ導入後、各細胞の培地にアバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）または３００μＭの濃度で添加し、４８時間培養した。実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。【００６５】
結果を図１６に示した。ＴＤＰ１ｓｉＲＮＡ導入細胞およびコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞とも、アバカビル（図中ＡＢＣ）非処理細胞の細胞増殖を１００％として、アバカビル処理細胞の細胞増殖を相対値で示した。図１６から明らかなように、ＴＤＰ１ｓｉＲＮＡを導入したＴＤＰ１ノックダウン細胞の細胞増殖は、コントロールｓｉＲＮＡ導入細胞の細胞増殖より有意に低かった。この結果から、アバカビルは、ＴＤＰ１の発現が低下しているがん細胞に対して有効であることが示された。【００６６】
〔実施例１４：ＭＴ２細胞へのＴＤＰ１導入によるアバカビル感受性の消失〕
（１）ＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞の作製
実施例１１においてＴＤＰ１タンパク質の発現の低下が確認されたＨＴＬＶ−１感染細胞株のＭＴ２に、ヒトＴＤＰ１発現用レンチウイルスベクターを導入し、ヒトＴＤＰ１タンパク質を過剰発現するＭＴ２細胞を作製した。コントロールには、空ベクター（ｍｏｃｋ）を導入した。ヒトＴＤＰ１発現用レンチウイルスベクターは、ＮＩＨより供与を受けた。定法に従って細胞を培養し、実施例１１と同じ方法でウエスタンブロットを行い、ＴＤＰ１タンパク質の発現を検出した。【００６７】
結果を図１７に示した。コントロール細胞（図中ｍｏｃｋ）ではＴＤＰ１タンパク質を検出できなかったが、ＴＤＰ１発現レンチウイルスベクターを導入した細胞（図中ＷＴ）ではＴＤＰ１が検出された。この結果から目的のＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞が作製できたことを確認した。【００６８】
（２）ＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞の細胞増殖に対するアバカビルの効果
ＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞およびコントロール細胞（ｍｏｃｋ）にそれぞれアバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭの各濃度で添加し、４８時間培養した。実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。【００６９】
結果を図１８に示した。アバカビル（図中ＡＢＣ）非処理のコントロール細胞（図中ｍｏｃｋ）の細胞増殖を１００％として、各処理群の細胞増殖を相対値で示した。図１８から明らかなように、ＴＤＰ１過剰発現ＭＴ２細胞（図中ＷＴ）はアバカビルの濃度を増加させても細胞増殖が抑制されなかった。すなわち、本来アバカビル感受性であるＭＴ２細胞にＴＤＰ１を過剰発現させると、アバカビル感受性が消失することが示された。【００７０】
〔実施例１５：肺がん細胞株の細胞増殖に対するアバカビルの効果〕
ＴＤＰ１の発現が欠失している肺がん細胞株としてＨＯＰ＿６２およびＮＣＩ＿Ｈ５２２を使用した。コントロールとしてＴＤＰ１が発現している肺がん細胞株ＮＣＩ＿Ｈ１２９９を用いた。ＨＯＰ＿６２およびＮＣＩ＿Ｈ５２２はＤｒ. Ｐｏｍｍｉｅｒより供与された（DNA Repair. 2014 Jan;13:1-9）。
各細胞にそれぞれアバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭの各濃度で添加し、３×１０３個／１００μＬ／ウェルで９６穴プレートに播き、４時間または７２時間培養した。所定時間の培養後、実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。細胞増殖量は、Ｄａｙ０のコントロール（溶媒対照）の値を１００％としたときの相対比率で表した。【００７１】
結果を図１９に示した。図１９から明らかなように、ＴＤＰ１の発現が欠失しているＨＯＰ＿６２およびＮＣＩ＿Ｈ５２２では、アバカビル濃度依存性に細胞増殖が抑制された。この結果から、アバカビルはＴＤＰ１の発現が低い肺がんに対して有効であることが示された。【００７２】
〔実施例１６：アバカビルとトポイソメラーゼ阻害剤との併用効果〕
ＨＴＬＶ−１感染細胞株であるＭＴ２細胞を用いた。アバカビルを０μＭ（ＤＭＳＯを添加）、１０μＭまたは２５μＭの各濃度で添加し、それぞれについて、さらにＣＰＴ−１１（一般名：イリノテカン）を０ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭまたは４００ｐＭの各濃度で添加して、４８時間培養した。別途、アバカビルを上記各濃度で添加したＭＴ２細胞のそれぞれについて、さらにＶＰ１６（一般名：エトポシド）を０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭまたは５００ｎＭの各濃度で添加して、４８時間培養した。別途、アバカビルを上記各濃度で添加したＭＴ２細胞のそれぞれについて、さらにＡＤＲ（一般名：ドキソルビシン）を０ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭまたは５０ｎＭの各濃度で添加して、４８時間培養した。実施例１と同様に細胞増殖試験用試薬Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（商品名、プロメガ社製）を用いてＭＴＳアッセイを実施した。【００７３】
結果を図２０（Ａ）〜（Ｃ）に示した。（Ａ）はアバカビル（図中ＡＢＣ）とＣＰＴ−１１との併用の結果、（Ｂ）はアバカビルとＶＰ１６との併用の結果、（Ｃ）はアバカビルとＡＤＲとの併用の結果である。グラフの縦軸は、薬剤添加時の細胞数を１としたときの増殖率を表す。図２０（Ａ）〜（Ｃ）からわかるように、いずれのトポイソメラーゼ阻害剤もアバカビルと併用することにより顕著にＭＴ２細胞の細胞増殖を抑制した。【００７４】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月25日(2014.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＤＮＡ修復機構に異常を有するがんの治療用医薬組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ修復機構に異常を有するがんが、ＴＤＰ１の発現量が低下しているがんである請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
肺がんまたはヒトＴ細胞白血病ウイルス１型感染に起因するがんの治療用である請求項２〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
成人Ｔ細胞白血病の治療用である請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせて使用される請求項２〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて使用される請求項２〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＤＮＡ切断作用を有する請求項２〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞周期停止作用および／またはアポトーシス誘発作用を有する請求項２〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−１感染に起因する疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１１】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＤＮＡ二本鎖切断誘導剤。
【請求項１２】
ＤＮＡ修復機構に異常を有するがん細胞のＤＮＡ二本鎖切断作用を有する請求項１１に記載のＤＮＡ二本鎖切断誘導剤。
【請求項１３】
アバカビルまたはその製薬上許容される誘導体を有効成分として含有するＤＮＡ修復機構に異常を有するがん細胞の増殖抑制剤。
【国際調査報告】
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