(57)【要約】本発明は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数を有する、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体、該抗体の製造方法、抗体と生体試料とを反応させて、インフルエンザウイルスを検出する方法、前記抗体を含むインフルエンザウイルス用医薬組成物に関する。
2014097762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数を有する、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体。
【請求項２】
解離定数が１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるにより産生される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体の断片。
【請求項１１】
請求項６に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１２】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマ。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
（ｂ）当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項６又は７に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物が、ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物である請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片と生体試料とを接触させて、インフルエンザウイルスを検出することを特徴とする、インフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項１７】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片を含む、インフルエンザウイルス検出用試薬。
【請求項２１】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項２１に記載の試薬。
【請求項２３】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片を含む、抗インフルエンザウイルス用医薬組成物。
【請求項２５】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高病原性トリインフルエンザに対する特異的かつ抗親和性の抗体、特に、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数を有するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ヒトは他の動物が感染したインフルエンザに感染することはなく、季節性と呼ばれるＡ香港型（Ｈ３Ｎ１）、Ａソ連型（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ型インフルエンザなどに感染する。しかし、近年、鳥感染型由来の高病原性のＡ型インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）がヒトに感染し、重篤な肺炎を発症することが問題となっている。ヒトではこれまでに感染歴がないことから、ひとたび高病原性のインフルエンザ感染がおこると、急速に感染が拡大する。従って、高病原性インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）の流行をいち早く診断し、防疫、予防、ワクチン投与を行うため、治療薬剤などの開発を急ぐことが重要である。また、近年、様々な地域で高病原性インフルエンザウイルス単離が成功し、様々なウイルス株（クレード）の抗原が明らかになっている。高病原性インフルエンザの流行においても季節性と同じように、パンデミックな流行がおこれば多様な変異株が出現する可能性が高いものと想定されている。そのため、むやみに抗インフルエンザ薬を投与することは極力さけなければならない。従って、高病原性インフルエンザ感染を迅速に、そして特異的に検出することのできる簡易検査試薬を作製しピンポイントの治療を集中的に行うことが喫緊の課題である。【０００３】
これまで、Ｈ５Ｎ１インフルエンザを検出するために特異的モノクローナル抗体が作製され、数多くの試みが行われている。例えば、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ感染経過後の末梢Ｂ細胞を不死化して作製したモノクローナル抗体（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ４：ｅ１７８，２００７（非特許文献１））、ファージディスプレイ法によるライブラリー技術により作製された抗体（Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０５：５９８６，２００８（非特許文献２）、Ｌｉｍ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．２００８，５：１３０（非特許文献３））、マウスまたはラットに対しＨ５Ｎ１抗原による免疫を行って細胞融合により作製された抗体（米国特許７，８７９，３２６号（特許文献１））などが挙げられ、その他にも、高病原性トリインフルエンザに対するモノクローナル抗体（第４６２５４８５号特許（特許文献２））がある。【０００４】
しかしながら、上記抗体は、広汎なウイルス株への反応性と検出感度について課題が残されている。例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓらの抗体（非特許文献１）は、ＢＦ−１からＢＦ−１９まで１１種類が報告されているが、報告ではウイルス中和活性は述べられているものの、迅速診断検出に必要な高感度を得る為に重要な抗体の親和性はＫＤ＝９．２５ｘ１０−７Ｍから２．０７ｘ１０−７Ｍの低レベルである。またＦｏｕｎｇらの報告（特許文献１）の抗体は、Ｈ５Ｎ１のペプチド断片を免疫原として用いた抗体であり、この抗体において対象となるエピトープは限定されている。抗体の活性はＥＬＩＳＡで測定した結果として示されているが、６Ｇ６抗体に関しては１０２４倍希釈でＯＤ＝０．６０４程度であり、７Ｆ６に至ってはＯＤ＝０．１３９であり、実際のウイルス粒子を対象とした測定系で親和性が高いとは言い難い。
このような状況から、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの各クレード（亜型）に対して同等かつ強力に認識して迅速に診断するために、より強力に抗原と結合することの出来る高親和性のモノクローナル抗体が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許７，８７９，３２６号
【特許文献２】第４６２５４８５号特許
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ４：ｅ１７８，２００７
【非特許文献２】Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０５：５９８６，２００８
【非特許文献３】Ｌｉｍ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．２００８，５：１３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高病原性インフルエンザに対する特異的かつ高親和性のモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、組換えワクシニアウイルスを用いて抗原を調製し、これをＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニックマウスに免疫することにより、高病原性トリインフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体を製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数を有する、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体。
（２）解離定数が１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍである、（１）に記載の抗体。
（３）インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである（１）に記載の抗体。
（４）インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである（３）に記載の抗体。
（５）インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である（４）に記載の抗体。
（６）抗体がモノクローナル抗体である（１）に記載の抗体。
（７）受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマにより産生される、（６）に記載の抗体。
（８）抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、（１）に記載の抗体。
（９）（１）に記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体の断片。
（１１）（６）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１２）受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマ。
（１３）（１）に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
（ｂ）当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
（１４）（６）又は（７）に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
（１５）非ヒト哺乳動物が、ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物である（１３）又は（１４）に記載の方法。
（１６）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体又は（１０）に記載の断片と生体試料とを接触させて、インフルエンザウイルスを検出することを特徴とする、インフルエンザウイルスの検出方法。
（１７）インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである（１６）に記載の方法。
（１８）インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである（１７）に記載の方法。
（１９）インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である（１８）に記載の方法。
（２０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体又は（１０）に記載の断片を含む、インフルエンザウイルス検出用試薬。
（２１）インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである（２０）に記載の試薬。
（２２）インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである（２１）に記載の試薬。
（２３）インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である（２２）に記載の試薬。
（２４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体又は（１０）に記載の断片を含む、抗インフルエンザウイルス用医薬組成物。
（２５）インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである（２４）に記載の医薬組成物。
（２６）インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである（２５）に記載の医薬組成物。
（２７）インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である（２６）に記載の医薬組成物。【００１０】
本発明により、高病原性トリインフルエンザウイルスに対する抗体が提供される。本発明の抗体は、高病原性トリインフルエンザウイルスに対し中和活性を示した。従って、本発明の抗体は、高病原性トリインフルエンザウイルスの検出用試薬として、あるいは高病原性トリインフルエンザウイルス感染の防御用医薬組成物として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＡタンパク質の精製結果を示す図である。
【図２】ＨＡタンパク質の三量体形成及び糖鎖修飾を示す図である。
【図３】本発明の抗体によるインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ｖａｃ−３に対する中和及び増殖阻害アッセイ結果を示す図である。
【図４】本発明の抗体による高病原性トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／０５に対する中和及び増殖阻害アッセイ結果を示す図である。
【図５】本発明の抗体による高病原性トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８に対する中和及び増殖阻害アッセイ結果を示す図である。
【図６】本発明の抗体による高病原性トリインフルエンザウイルス感染に対する治療効果を示す図である。
【図７】本発明の抗体による高病原性トリインフルエンザウイルス感染に対する治療効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１２−２７８２２８号明細書（出願日：２０１２年１２月２０日）の内容を包含する。
本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献、公開公報、特許公報およびその他の特許文献は、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。
【００１３】
１．概要
本発明は、解離定数（ＫＤ）が少なくとも１×１０−１０Ｍを有する、高病原性トリインフルエンザに対する高親和性抗体であり、広範なクレード種、例えばインドガン青海湖株、インドネシア株、安徽株、ベトナム株、モンゴル株及び北海道株に対して単一抗体で検出し、あるいは防御することができるものである。
高病原性トリインフルエンザは鶏等を媒介し、ヒトに感染する高度に致死的なインフルエンザとして季節性インフルエンザとは異なる流行をする。現在、国際的な高病原性トリインフルエンザの封じ込めと限定的なワクチン投与によって感染の抑制を行っているところである。この方策の鍵は、いち早く、強毒性インフルエンザの感染者を発見及び診断し、有効な治療と感染拡大防御への対策を図ることである。従って、できるだけ速やかに簡便かつ広い範囲の高病原性トリインフルエンザの全てを高感度で的確に診断することができ、普及可能な検査試薬が求められている。
本発明においては、ワクシニアウイルスを用いて発現させたヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を抗原として使用し、ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニックマウスによる高親和性モノクローナル抗体作製技術を用いることにより、高病原性トリインフルエンザウイルスを特異的に、しかも広範なクレード種、すなわちインドガン青海湖株（Ａ／Ｂａｒ−Ｈｅａｄｅｄ  ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／０５：ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１１９４／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４：ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）、北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）を、単一種類の抗体で全て検出することができる高親和性抗体を作製することに成功した。
【００１４】
２．本発明の抗体
本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＨ及びＶＬを介してＨＡタンパク質に結合する分子である。本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等のポリクローナル又はモノクローナル免疫グロブリン分子のいずれか、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４等のサブクラスを表す。また、本発明の抗体には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ及びｓｄＦｖ等の免疫グロブリン分子の機能性断片又はサブ配列も含まれる。
以下、本発明の抗体の製造方法について説明する。
【００１５】
２−１．抗原の調製
本発明において使用される抗原は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質である。このタンパク質は、ワクシニアウイルスを用いて発現させることができる。
＜インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの作製＞
ＨＡタンパク質遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）により登録されている。
例えば、Ｈ５の亜型、例えばＨ５Ｎ１の各クレードに属するインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に以下の通り登録されている。
クレード１：＿Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１０９／２００４＿ＥＦ５４１４０２
クレード２．１：＿Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５＿ＥＦ５４１３９４
クレード２．２：＿Ａ／ｂａｒ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５＿ＤＱ６５９３２７
クレード２．３：＿Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５＿ＤＱ３７１９２８
【００１６】
本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれるＨＡタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）としては、上記各遺伝子のほか、その一部やその変異配列も用いることができる。例えば、クレード１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ、クレード２．１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ、クレード２．２のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡ、クレード２．３のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの一部を欠損させたＤＮＡを用いることができる。
これらＨＡタンパク質遺伝子は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。
【００１７】
また、本発明においては、上記ＨＡタンパク質遺伝子（本明細書において、全長塩基配列、又はタンパク質のコード領域の塩基配列を指す。以下、他のＨＡタンパク質遺伝子についても同様。）のほか、その変異型遺伝子も使用することができる。例えば、ＥＦ５４１４０２に示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレード１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＥＦ５４１３９４に示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレード２．１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＤＱ６５９３２７に示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレード２．２のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＤＱ３７１９２８に示される塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレード２．３のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡなどを用いることができる。
【００１８】
ストリンジェントな条件としては、たとえば、０．１×ＳＳＣ〜１０×ＳＳＣ、０．１％〜１．０％ＳＤＳ及び２０℃〜８０℃の条件が挙げられ、より詳細には、３７℃〜５６℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０〜２０分の洗浄を１〜３回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））等を参照することができる。
【００１９】
また、ＥＦ５４１４０２に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、クレード１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＥＦ５４１３９４に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、クレード２．１のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＤＱ６５９３２７に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、クレード２．２のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡ、ＤＱ３７１９２８に示す塩基配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有し、かつ、クレード２．３のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡを用いることができる。
【００２０】
変異型遺伝子は、例えば、上記「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」等に記載の部位特異的変位誘発法、あるいは部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができる。このような変異導入用キットとしては、例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
【００２１】
従って、抗原として使用するＨＡタンパク質は、上記遺伝子情報を基に通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。
例えば、本発明においては、上記ＨＡタンパク質をコードするＤＮＡを、相同組換え用プラスミドに組み込んだ後に動物細胞に導入し、続いて親株であるワクシニアウイルスを当該動物細胞に感染させる。感染後、組換えワクシニアウイルスを培養してＨＡタンパク質を発現させればよい。ＨＡタンパク質は、ワクシニアウイルス感染前期から後期まで完全な糖修飾を受けた形で大量に発現することができる。
【００２２】
相同組換えプラスミドには、プロモーター、発現対象遺伝子などを含めることができる。また、動物細胞としては、ウサギ腎細胞、サル腎細胞、ヒト繊維芽細胞などが挙げられる。発現させたＨＡタンパク質は、Ｈｉｓタグなどを利用した公知手法により精製することができる。精製手法は限定されるものではなく、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製などが採用される。精製されたＨＡタンパク質が目的のものであることの確認は、例えばウエスタンブロッティング、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により行なうことができる。
組換えワクシニアウイルスにより発現されたＨＡタンパク質の大部分はインフルエンザウイルス粒子上のＨＡタンパク質と同様に三量体を形成するので、これを抗原として用いる。
【００２３】
２−２．免疫
前記のようにして作製したタンパク質をそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫し、抗体価を測定する。
免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。
本発明の好ましい態様において、本発明の抗体を作製するために、免疫する動物として、高特異性抗体産生能を有する「ＧＡＮＰ（登録商標）」と呼ばれるトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ＷＯ２００４／０４０９７１）を用いることもできる。
【００２４】
ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物とは、胚中心結合核タンパク質（Ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物であり、当該動物を所定の抗原で免疫することにより、当該抗原に対して高親和性あるいは高特異性抗体を産生することができる動物である（ＷＯ００／５０６１１号公報、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ａｐｒ  １５；１７４（８）：４４８５−９４．）。
例えばＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばマウス）は、上記公報又はＳａｋａｇｕｃｈｉらの文献に記載の方法により作製することが可能である。
【００２５】
抗原の動物１匹あたりの投与量は、全体で１０〜２０００μｇである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜４週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。
ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する場合は、吸光度レベルが低下するまで放置する必要がなく、一般的なモノクローナル抗体作製法の免疫間隔に従って、最終免疫まで行えばよい。
【００２６】
抗体価は、免疫した動物から採取した血液を用いて調べることができる。得られた血清を段階希釈し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））等で抗体価を測定する。
測定の結果、ＨＡタンパク質に対する抗体価の高い動物に最終免疫を施す。但し、抗原の免疫と抗体価の測定に関しては上記測定法に限定するものではない。
その後、最終免疫日から数日後に、好ましくは２〜５日後に免疫担当細胞（脾臓細胞等）又は所属リンパ節を摘出する。採血の間隔は、免疫して１〜４週間後、好ましくは１〜２週間後に行う。
【００２７】
２−３．ポリクローナル抗体の製造
本発明において、ポリクローナル抗体を取得する場合は、上記所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得る。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００２８】
２−４．モノクローナル抗体の製造
本発明のモノクローナル抗体を得る方法としては、まず、前記ＨＡタンパク質をＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばＢ細胞）を採取し、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２９】
（１）抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物等の動物の脾臓細胞若しくはリンパ節細胞又は脾臓若しくはリンパ節等から調製する。ＧＡＮＰトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた場合でも、上記と同様に脾臓細胞若しくはリンパ節細胞又は脾臓若しくはリンパ節等から抗体産生細胞を採取することができる。
リンパ節は、例えば鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節などが挙げられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが望ましい。必要に応じて、組織の残骸や赤血球をできる限り除去しておくことが好ましい。
【００３０】
（２）細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）やＰ３／ＮＳ  Ｉ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）等が挙げられる。
細胞融合は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等を含まないＤＭＥＭやＲＰＭＩ１６４０培地などの一般に市販されている培地で、１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞と１×１０５〜１×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合し（脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比は５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在下で融合を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量２００〜２００００ダルトンのポリエチレングリコールを使用することができる。
【００３１】
また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、融合させることもできる。さらに、センダイウイルスを用いて細胞を融合させることもできる。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることができる。
融合後、例えば１０〜２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで作製したＨＡＴ培地で細胞を希釈後、９６穴培養プレートの各ウェルに０．５〜３×１０５個ずつ細胞を播き込み、ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【００３２】
（３）ハイブリドーマの樹立
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から１０〜１４日後に、前記したようにＨＡＴ培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性９６穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、ＨＡに対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で行う。ＨＡに対する抗体産生陽性ウェルを確認できた後は、２４穴や１２穴培養プレートに細胞を移す。
【００３３】
ここで、培地はアミノプテリンを除いたＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン含有培地）に置き換えることが好ましい。ＨＴ培地は、細胞内に残留したアミノプテリンの影響がある間、サルベージ経路にプリンおよびピリミジンの前駆体を供給し続けるハイブリドーマの回復用培地として用いる。ＨＴ培地中でしばらく培養した後、再度培養上清中の抗体価を確認する。ハイブリドーマは融合細胞であるために不安定であり、すぐに抗体産生能が消失する可能性が高いため、２度目の抗体価の確認を行っておくことが好ましい。
本発明においてはＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）スパイク（Ｓ）蛋白とは交差反応せず、ＨＡに対して高い特異性を有するハイブリドーマを取得することが必要であるため、培養上清レベルで他のＳＡＲＳ  Ｓ蛋白との交差反応性をＥＬＩＳＡやＲＩＡ等で確認することが好ましい。
【００３４】
最終的に選択されたウェル内の細胞について、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を１０〜２０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、９６穴培養プレートの各ウェルに０．３〜２個入るように細胞を播き込む。９６穴培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、１つのウェルに入る細胞が１個である確率が高くなるようにするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く。細胞播き込み後、７〜１０日後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。このとき、３〜５日後にシングルコロニーであることを確認することが好ましい。回収した培養上清は、抗体価を確認する。ここでもＨＡに対して高い特異性を有し、かつＳＡＲＳ  Ｓ蛋白に対する交差反応性が低いクローンを選択する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。
【００３５】
（４）モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマ株から以下の方法でＨＡ特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を０．１〜４×１０５個／ｍＬで調製し、１〜２週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを０．１〜１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。
【００３６】
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。
抗体の精製方法は、ＨＡアフィニティカラムで精製する方法、硫安塩析分画からゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法等があり、これら公知の方法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３７】
（５）微生物の寄託
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「３Ｅ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」及び「７Ｇ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」と称し、いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）にブダペスト条約に基づき国際寄託した（原寄託日：２０１２年２月１日）。その受託番号は、「３Ｅ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６であり、「７Ｇ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７である。
また、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）は、「８Ｃ１（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」及び「１４Ａ７（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」と称し、いずれも、上記特許微生物寄託センターにブダペスト条約に基づき国際寄託した（原寄託日：２０１３年１０月１８日）。その受領番号は、「８Ｃ１（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７であり、「１４Ａ７（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８である。
【００３８】
２−５．抗体の性質
本発明の抗体は、ＨＡに対して特異的に結合し、高い親和性を示すものである。
「特異的」とは、免疫に使用したＨＡタンパク質のサブタイプ以外のサブタイプとは交差反応せず、免疫に使用したサブタイプタンパク質とのみ反応（結合・中和）することを意味する。例えば、サブタイプとしてＨ５Ｎ１のＨＡタンパク質を抗原として用いた場合は、本発明の抗体はＨ５亜型のタンパク質又はＨ５亜型のウイルスとのみ反応（結合・中和）し、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２などの他のサブタイプとの交差反応性がないことをいう。さらに、本発明の抗体は、同一のサブタイプ（例えばＨ５亜型）に属する限り、異なるクレード（例えばクレード１、２．１，、２．２、２．３）に対しても特異的に結合することができる。
結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
【００３９】
結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍又は１０００〜１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、ＨＡタンパク質の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、あるいは１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
【００４０】
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１〜１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。本明細書で規定される典型的な抗体のＫＤ値は、固相化された精製ＨＡタンパク質（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５）のＨＡ抗原の結合部位の半分（５０％）を飽和させるのに必要な抗体の濃度として定義される。
また、本発明の抗体は、複数種類のウイルス株に対して特異的に結合することができる。結合するウイルス株としては、Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｌｉａ／０３／２００５，Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８，Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−３／２００７が挙げられる。
【００４１】
２−６．抗体断片及び遺伝子組換え抗体
本発明においては、上記抗体の断片も提供する。ここで、本発明の抗体断片は、ＨＡに対する抗体であって、上記ＫＤ値を有するものである。
抗体の断片としては、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ′）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ′は、上記Ｆ（ａｂ′）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
【００４２】
ｓｃＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００４３】
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
当技術分野では、ヒト抗体若しくはそのコンセンサス残基、又はＣＤＲ領域に存在するアミノ酸残基が知られている（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９８７））。したがって、ヒト抗体には、１以上のアミノ酸残基が他のヒト抗体のいずれかに存在するアミノ酸と置換された抗体が含まれる。
【００４４】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えばＮａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）等を参照）。
【００４５】
ヒト化抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）、あるいは、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
【００４６】
また、本発明においては、本発明のハイブリドーマ（例えば受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマ）、又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４７】
２−７．本発明の抗体が結合する部位
さらに、本発明の抗ＨＡ抗体としては、例えば、本発明の抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、好ましくは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体が挙げられる。
本発明の抗ＨＡ抗体の結合する部位は、抗原であるＨＡの少なくとも一部であればよく限定はされない。
【００４８】
３．検出方法
ＨＡは、インフルエンザの臨床マーカーとして利用することができるため、本発明の抗体を生体試料と接触させ、生体試料中のＨＡを測定することにより、その測定結果を指標としてインフルエンザを検出又は診断することができる。
従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片と生体試料とを接触させて、インフルエンザウイルスを検出することを特徴とする、インフルエンザウイルスの検出方法を提供する。
まず、インフルエンザ患者、インフルエンザが疑われる患者、あるいは健康診断受診者等の被験者から被検対象である生体試料を採取し、ＨＡ測定試料を調製する。検出の対象となるインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルス又はサブタイプであり、インドガン青海湖株、インドネシア株、安徽株、ベトナム株などが挙げられる。サブタイプとしては、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ８、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１５Ｎ８又はＨ１６Ｎ３が挙げられ、これらの中から１種又は２種以上が選択される。特にインフルエンザＨ５亜型インフルエンザウイルス（例えばＨ５Ｎ１）であることが好ましい。
【００４９】
生体試料としては、血液、痰、唾液、咽頭ぬぐい液、鼻汁鼻かみ液、鼻腔吸引液等が挙げられる。
本発明の検出方法においては、上記抗体と生体試料とを接触させる。「接触」とは、本発明の抗体又はその断片（抗体等ともいう）と被検対象である生体試料とが結合ないし反応し得る状態となるように両者を同一環境下に置くことを意味し、例えば、抗体等が含まれる容器（ウェル）に生体試料を添加すること、生体試料が含まれる容器（ウェル）に抗体等を添加すること、あるいは抗体等と生体試料とを同一容器中で培養することなどを意味する。ＨＡの測定は、一般に行われるＥＬＩＳＡやＥＩＡ等によって行うことができ、特に限定されるものではない。
【００５０】
特に、インフルエンザ患者由来のＨＡには、上記アクセッション番号に示すＨＡタンパク質のアミノ酸配列が含まれているため、このアミノ酸配列に特異的に結合する本発明の抗体は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスを検出するのに特に好ましい。ＥＬＩＳＡによる検出の場合、陰性対照と比較してシグナル強度が強いときは、被検試料中にインフルエンザウイルスが含まれる（すなわち陽性である）と判断することができる。
【００５１】
４．本発明の抗体を含むキット、試薬
本発明においては、ＨＡに対する抗体をインフルエンザウイルスの検出用試薬又はキットとして使用することができる。
本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体）をインフルエンザの検出又は診断薬として用いる場合には、このモノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、モノクローナル抗体を酵素標識することもできる。標識酵素として、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。
【００５２】
本発明をキットに用いる場合には、本発明の抗体の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、抗原固相化マイクロプレート、抗体希釈溶液、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液、使用説明書などを含めることができる。また、反応の至適条件を与える緩衝液、反応生成物質の安定化に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などの反応媒体も本発明のキットに含まれ得る。
本発明においては、ＨＡのｍＲＮＡ又はＤＮＡを検出するため、ＰＣＲ法を採用することもできる。
ＰＣＲに使用するプライマーも、本発明の試薬又はキットに含めることができる。プライマーの設計の基礎とする領域はＨＡタンパク質を検出し得る限り、特に限定されるものではない。
プライマーの長さは、１８〜２４塩基、好ましくは２０〜２２塩基である。プライマーの塩基配列としては以下のものを例示することができる。
2014097762.tif 000003
【００５３】
５．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、抗インフルエンザウイルス用として使用され、インフルエンザの予防又は治療に有効である。
本発明においてインフルエンザの予防又は治療の対象となるインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルス又はサブタイプであり、インドガン青海湖株、インドネシア株、安徽株、ベトナム株などが挙げられる。サブタイプは、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ５、Ｈ５Ｎ８、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１５Ｎ８又はＨ１６Ｎ３から１種又は２種以上が選択される。中でもＨ５亜型インフルエンザウイルス（例えばＨ５Ｎ１）であることが好ましい。
【００５４】
本発明の抗体は、１以上のインフルエンザウイルス（分離株又はサブタイプ）に被験体が感染するのを予防し、又は当該感染に対する被験体の感受性を減少させることができる。また、インフルエンザ感染に付随する１以上の症状又は合併症、例えば、倦怠感、悪寒、発熱、体痛、頭痛、咳、咽頭痛、鼻閉、副鼻腔閉、肺炎、気管支炎、耳感染、耳痛等を軽減若しくは解消し、又はこれらの症状の憎悪を防止する。さらに、これらの症状に罹患している期間を短くすることも可能である。
【００５５】
本発明の抗体は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共に医薬組成物として投与することができ、またその投与は１回または数回に分けて行うことができる。
【００５６】
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口又は非経口的に投与することができる。
【００５７】
経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用することができる。崩壊剤としては、澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸複塩などが挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性懸濁液又はエリキシルにする場合は、必要により乳化剤、懸濁化剤を併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。
【００５８】
注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの抗体濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、被検者（例えばヒトインフルエンザ患者）に対し、１回の投与において１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの割合で、好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。
但し、投与量はこの範囲に限定されるものではなく、患者の体重および症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともある。
【００５９】
投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体又は粉末組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
ＨＡタンパク質に対する高親和性抗体の作製
（１）抗原の作製
リコンビナントワクシニアウイルス（ｒＶＶ）によるヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）Ｈ５Ｎ１抗原の大量精製を行った。相同組み換えベクターにＨ５Ｎ１インフルエンザＨＡ遺伝子を導入したリコンビナントプラスミドをウサギ腎細胞ＲＫ１３に遺伝子導入し、親株ワクシニアウイルスを感染させ、ＨＡを発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）を得た。哺乳類細胞に感染させた後、ＴＡＲＯＮカラムクロマトグラフィーを用いた常法によるＨｉｓ−Ｔａｇタンパク質精製をおこなった。【００６１】
＜実験手法＞
Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。プラスミドに挿入されているＨ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＦ５４１４０２、ＥＦ５４１３９４、ＤＱ６５９３７、ＤＱ３７１９２８）のＨＡタンパク質遺伝子を、ＰＣＲの鋳型に用いた。すなわち、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子のｃＤＮＡを鋳型とし、各遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子領域を調製した。
得られた断片をプラスミドｐＢＭＳＦ７Ｃ（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．１３８，ｐ．３１５−３３０，１９９４；特開平６−２３７７７３号公報参照）にクローニングした。
また、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域内に挿入されるものであり、ポックスウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス７．５ｋＤａタンパク質（ｐ７．５）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターを使用した。【００６２】
上記プラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製した。プラスミドベクターの宿主への導入は、弱毒ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株を感染した動物細胞中にプラスミドベクターｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．１、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．２、ｐＢＭＳＦ７Ｃ−ｍＣｌ２．３をそれぞれ導入することにより、ワクシニアウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子領域において相同組換えを引き起こし、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶのＨＡタンパク質遺伝子をそれぞれ発現する組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−Ｆｌｕ  ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ  ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．１）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ  ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．２）、ＲＶＶ−Ｆｌｕ  ＨＡ（Ｈ５−ｍＣｌ２．３）を作製した。
作製した組換えワクシニアウイルスをウサギ腎細胞株であるＲＫ−１３細胞に感染させることでＨＡ蛋白質を発現させた。続いて、ＴＡＲＯＮカラムクロマトグラフィーを用いた常法によるＨｉｓ−Ｔａｇを付加したＨＡタンパク質精製を行なった。【００６３】
＜精製結果＞
ＨＡタンパク質の精製結果（ウエスタンブロッティング及びＣＢＢ染色）を図１に示す。
また、得られた精製ＨＡタンパク質を「Ｈ５ｍｃｌ２．２抗原」とした。
ウエスタンブロッティング及びネイティブゲル電気泳動解析を行った結果、このタンパク質は、ウイルス粒子ヘマグルチン（ＨＡ）と同様に３量体を形成し糖鎖修飾を受けている抗原であることが確認された（図２）。図２において、左側のパネルはインフルエンザウイルス粒子を構成しているＨＡ蛋白質を示す図であり、中央のパネルはｒＶＶにより発現させた精製ＨＡタンパク質を示す図であり、右側のパネルは精製ＨＡタンパク質が糖鎖修飾を受けていることを示す図である。なお、精製蛋白収量は０．５−２ｍｇであった。【００６４】
（２）抗原の免疫
上記の通り得られた精製ＨＡタンパク質（Ｈ５ｍｃｌ２．２抗原）をＢａｌｂ／ｃ背景のＧＡＮＰ（登録商標）−トランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）に皮下免疫した。免疫方法は完全フロイントアジュバントに混和し、４週間後に不完全フロイントアジュバントに混和して追加免疫を行った。更に３回ブーストしたのち、最終免疫３日後に脾臓を摘出し、リンパ細胞を骨髄腫Ｐ３Ｕ１細胞とポリエチレングリコールを用いて融合した。融合後、骨髄腫１ｘ１０５細胞／ウェル相当で９６穴プレートに播種した。２ｘ１０５細胞／ウェルのマウス胸腺細胞をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞とリコンビナントＩＬ−６（０．２５ｕｎｉｔ／ｍｌ）をウェルに加え培養した。培養時にはＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選別を行った。【００６５】
（３）抗原特異的高親和性モノクローナル抗体のスクリーニング
ハイブリドーマ上清中の特異的抗体活性を、リコンビナント抗原によってＥＬＩＳＡ法を用い測定した。
通常の陰性コントロールおよび上清不添加の際のペルオキシダーゼ反応（基質はＯＰＤ）のＯＤ４８５測定値を基準として０．１以下を陰性とし、１．０以上を陽性クローンとして測定した。陽性クローンを再検査し、そのクローンを拡大培養し４８穴プレートで３日間培養し、その上清を採取し、再度活性がＯＤ４８５＞０．５であることを確認した後、限界希釈法にて５個／ウェル、２個／ウェルで９６穴プレートを用いてクローニングした。
クローニングは常法に従い、９６穴にマウス胸腺細胞４ｘ１０５個のフィーダー細胞存在下にリコンビナントＩＬ−６  ０．２５ｕｎｉｔ／ｍｌ存在下で細胞培養を行った。増殖クローンにオリジナル細胞と同等の活性を有するサブクローンを樹立、保存し、この後の解析に用いた。上記操作はＲＰＭＩ−１６４０、１０％−加熱非動化牛胎児血清、ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）培地を用いて行った。
得られたクローンを表１に示す。【００６６】
【表１】
2014097762.tif 000004
2014097762.tif 000005
表１において、「３Ｅ１０」「７Ｇ１０」「８Ｃ１」「１４Ａ７」と表示されたクローンは、それぞれ以下の受託番号又は受領番号を有する寄託クローンを表す。
「３Ｅ１０」  ：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６
「７Ｇ１０」  ：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７
「８Ｃ１」  ：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７
「１４Ａ７」  ：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８
【実施例２】
【００６７】
ＧＡＮＰ  Ｈ５モノクローナル抗体特異性評価
１．高病原性トリインフルエンザウイルスＨ５亜型のイムノクロマト診断開発に向けたモノクローナル抗体評価
＜方法＞
本実施例では、実施例１で作製したモノクローナル抗体の反応性評価を行った。
ウイルスに対する評価は、高病原性、低病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスの感染細胞に対する蛍光免疫染色を行い、他の株種についてはＨＡ組み換えタンパク質を用いＥＬＩＳＡ法にて検討した。
・蛍光免疫染色方法：細胞にウイルスを感染させ、ＰＦＡ固定後、抗体培養上清を反応させ蛍光顕微鏡にて染色像を観察。
・ＥＬＩＳＡ法：Ｈ５ＨＡ組み換えタンパク質をプレートへ固相化、抗体培養上清を反応させた。二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用し、化学発色後、吸光度を測定した。【００６８】
＜評価結果＞
表１に示す３５クローンのうち、１０クローンにおいてＨ５ウイルスＭｏｎｇｏｌｉａへ陽性反応を示し、その他はクローンにより異なる反応性が示された。
５Ｈ７−１１−１１−１のみＨ３Ｎ２ウイルス感染細胞での弱い反応性が認められた（表２）。
【表２】
2014097762.tif 000006
表２において、丸印（○）は陽性であることを、バツ印（×）は陰性であることを意味する。【００６９】
また、各抗体の解離定数をＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。結果を表３に示す。
【表３】
2014097762.tif 000007
【００７０】
２．イムノクロマト上での抗体組み合わせ評価
＜方法＞
表２に記載の１０クローンのうち９クローン、並びに表１に記載の７Ａ５−１及び２９．１８クローン（Ｂａｌｂ／ｃ由来の対照クローン）の１１クローンを用いて、イムノクロマトグラフィーストリップ上での抗体組み合わせ評価を行った。
抗原として、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスであるＭｏｎｇｏｌｉａ及びＨｏｋｋａｉｄｏ、並びに低病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスであるＶａｃ３を用い、それぞれ１×１０５〜１×１０７（ｐｆｕ／ｍｌ）の濃度でアドテック社製ウイルス抽出液に溶解し、添加した。１５分後に目視にて陽性ラインを評価した。【００７１】
＜評価結果＞
各抗体クローンと各ウイルス株との組み合わせ（９０通り）を検討した結果、Ｍｏｎｇｏｌｉａに対する強い陽性反応が認められるとともに弱いながらもＨｏｋｋａｉｄｏへの反応性を示した７キットを、固相化抗体と金コロイド標識抗体との候補抗体ペアとして選択した（表４）。
【表４】
2014097762.tif 000008
表４において、二重丸（◎）は色見本と比較して、強い反応を表し、丸（○）は同等の反応を表し、三角（△）は弱い反応を表し、バツ印（×）は反応しなかったことを表す。【００７２】
２−１  リコンビナントＨＡタンパク質を用いた特異性評価
＜方法＞
上記選択した７キットのうち、反応性の高い候補４キットを用い、Ｈ５亜型とその他の亜型リコンビナントＨＡタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）に対する特異性評価を行った。評価方法は、反応性がない０から８段階とし、数字が大きくなるほど陽性強度が増すものとした。また、色見本と比較して、強い反応を二重丸（◎）、弱い反応を三角（△）、反応しなかったことをバツ印（×）とした。【００７３】
＜評価結果＞
Ｈ５亜型に対して最も広い反応性を示すのは１７番（固相８Ｃ１−金コロイド標識５Ｈ７）であった。
候補イムノクロマトキットを用いたＨ５亜型特異性評価結果を表５に示す。
【表５】
2014097762.tif 000009
表５において、丸や三角等の記号は前記と同様である。また数字は色見本と比較したときのシグナルレベルを示す。【００７４】
また、候補イムノクロマトキットを用いた交差性評価結果を表６に示す。
【表６】
2014097762.tif 000010
【００７５】
２−２  蛍光標識を用いたイムノクロマト法によるＨ５亜型の認識
方法
反応性の特に高い二種類の組み合わせに対して、蛍光ラテックスビーズ（藤倉化成３６０２−６１３）を金コロイドの代わりに標識し、陽性シグナルを蛍光イムノクロマトリーダー（コニカミノルタ）によって判定した。測定対象はＨ５亜型の複数の種類のウイルスを用いた。【００７６】
標識法
０．３ｍｇの抗体を０．４％の蛍光ビーズ懸濁液１．３ｍｌと混ぜ合わせ、室温で１時間反応させた。遠心分離によって上清を破棄後、１％ＢＳＡ溶液を加え、１時間ブロッキングした。遠心分離によって上清を破棄後、ｐＨ７．７の０．１％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００溶液で洗浄し、ｐＨ７．７の１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、３７℃で４８時間インキュベートした。これによってできた蛍光ビーズ標識済み抗体を金コロイドの標識抗体の代わりに用いた。【００７７】
イムノクロマト法
１００μｌのＨ５亜型ウイルス懸濁液（１０５ｐｆｕ／反応）をストリップに滴下し、イムノクロマトリーダーにセットした。陽性反応はイムノクロマトリーダーによって１５分と２０分に測定される。シグナルとバックグラウンドの比（Ｓ／Ｂ値）が１を超した場合を陽性反応として測定した。【００７８】
結果
Ｎｏ．１７はユーラシアタイプのＨ５亜型を網羅して反応したが、北米タイプのＨ５亜型は認識できなかった（表７）。一方、Ｎｏ．４５はユーラシアタイプのＨ５亜型の一部は認識できなかったが、北米型は認識可能であった（表７）。
【表７】
2014097762.tif 000011
＋は陽性、−は陰性を示す。【００７９】
２−３  蛍光イムノクロマトを用いたＨ５亜型最小検出感度試験
方法
前述の蛍光イムノクロマト法でウイルスの最小検出量を測定した。
イムノクロマト法
多段階希釈した１００μｌのＨ５亜型ウイルス懸濁液をストリップに滴下し、イムノクロマトリーダーにセットした。陽性反応はイムノクロマトリーダーによって１５分と２０分に測定される。シグナルとバックグラウンドの比（Ｓ／Ｂ値）が１を超した場合を陽性反応として測定した。
測定限界
多段階希釈状態のウイルス量に対してのＳ／Ｂ値をプロットし近似線を引いた。これがカットオフ値であるＳ／Ｂ値＝１との交点を計算し、それを測定限界とした。【００８０】
結果
それぞれのキットの検出限界は表８の通りとなった。この感度は金コロイド法と比較して数十倍の感度上昇が見られた。
【表８】
2014097762.tif 000012
表中の数字は、ヒト反応に必要な最少感染価（ｐｆｕ）を表す。【００８１】
２−４  蛍光イムノクロマトを用いた非Ｈ５亜型ウイルスに対しての交差反応性試験
方法
前述の蛍光イムノクロマト法で非Ｈ５亜型ウイルスに対しての交差性を検討した。
イムノクロマト法
多段階希釈した１００μｌの非Ｈ５亜型ウイルス懸濁液（１０７ｐｆｕ／反応）をストリップに滴下し、イムノクロマトリーダーにセットした。陽性反応はイムノクロマトリーダーによって１５分と２０分に測定される。シグナルとバックグラウンドの比（Ｓ／Ｂ値）が１を超した場合を陽性反応として測定した。【００８２】
結果
非Ｈ５亜型のウイルスをＨ１からＨ１６亜型まで検討したが、交差性は見られなかった。本方法の特異性の高さが示された（表９）。
【表９】
2014097762.tif 000013
＋は陽性、−は陰性を示す。【００８３】
２−５  蛍光イムノクロマトを用いた非Ｈ５亜型ＨＡタンパクに対しての交差反応性試験
方法
前述の蛍光イムノクロマト法で非Ｈ５亜型ウイルス精製ＨＡタンパクに対しての交差性を検討した。
イムノクロマト法
多段階希釈した１００μｌの非Ｈ５亜型ウイルス懸濁液（１０７ｐｆｕ／反応）をストリップに滴下し、イムノクロマトリーダーにセットした。陽性反応はイムノクロマトリーダーによって１５分と２０分に測定される。シグナルとバックグラウンドの比（Ｓ／Ｂ値）が１を超した場合を陽性反応として測定した。【００８４】
結果
非Ｈ５亜型のウイルスのＨＡタンパクを複数検討したが、交差性は見られなかった。本方法の特異性の高さが示された（表１０）。
【表１０】
2014097762.tif 000014
以上のことから、本発明の抗体は、組み合わせ如何によってすべてのＨ５亜型を診断し得ることが示された。
【実施例３】
【００８５】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質に対するＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマクローンの中和・阻害活性の評価（１）
本実施例では、ＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマ培養上清の低病原性インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３株に対する中和・阻害活性の評価を行った。
＜方法＞
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３株に対する阻害試験を以下の手順で行った。
１）アッセイ３日前にＭＤＣＫ細胞を６ｗｅｌｌプレートへ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播いた。
２）１％ＢＳＡを含有するＭＥＭ培地で希釈したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（１×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）ウイルス液０．１ｍｌと、１００倍、１０００倍、１００００倍に希釈したハイブリドーマ培養上清０．１ｍｌとを混和し、３７℃で１時間中和反応を行った。
３）インフルエンザウイルス液とハイブリドーマ培養上清の混液０．１ｍｌを各ｗｅｌｌに加え、全体に行き渡らせた。
４）３７℃，１時間吸着した。１５分おきにプレートを揺らした。
５）ウイルス液を取り除き、ＢＳＡ（−）／ＭＥＭで１回洗浄した。
６）ハイブリドーマ培養上清１／１００、１／１０００、１／１００００量添加，１０μｇ／ｍｌアセチルトリプシン，０．８％アガロース加１％ＢＳＡ／ＭＥＭ  ２ｍｌを各ｗｅｌｌに加えた。
７）アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、ＣＯ２インキュベーターへ入れた。
８）３７℃，２日培養した。
９）１０％ホルマリンを加えた。室温，１時間固定した。
１０）ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
１１）１％クリスタルバイオレットで１時間染色した。
１２）水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。【００８６】
＜結果＞
図３に培養後のプレートの写真を示す。陰性コントロール（無添加）と比較して、３Ｅ１０，１０Ｂ９，１４Ａ７及び３Ｂ９では、プラークの大きさ及び数に明らかに差が見られた。なお、使用したウイルスの量を、Ｂａｃｋ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ（無添加）を行って確認したが、所定のウイルス量であった。
【実施例４】
【００８７】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質に対するＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマクローンの中和・阻害活性の評価（２）
本実施例では、抗体作製時に使用した抗原と同じＨ５Ｎ１クレード（ｃｌａｄｅ  ２．２）の高病原性トリインフルエンザウイルスを用いて、中和・阻害活性の評価を行った。実施例２又は３で中和活性を示したかあるいは免疫蛍光染色（ＩＦ），ＥＬＩＳＡで強い結合性を示した９種類（表２中、１２Ｂ１−２６−３１−１３を除く９種類）のＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマ培養上清の、高病原性トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／０５）株に対する中和・阻害活性について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価を行った。【００８８】
＜方法＞
実験はＰ３施設内で行った。ウイルス感染価はプラーク形成能によって決定した。
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／０５株に対する阻害試験を以下の手順で行った。
１）アッセイ３日前にＭＤＣＫ細胞を６ｗｅｌｌプレートへ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播いた。
２）１％ＢＳＡを含有するＭＥＭ培地で希釈したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（１×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）ウイルス液０．１ｍｌと、１００倍、１０００倍又は１００００倍に希釈したハイブリドーマ培養上清０．１ｍｌとを混和し、３７℃で１時間中和反応を行った。
３）インフルエンザウイルス液とハイブリドーマ培養上清の混液０．１ｍｌを各ｗｅｌｌに加え、全体に行き渡らせた。
４）３７℃，１時間吸着した。１５分おきにプレートを揺らした。
５）ウイルス液を取り除き、ＢＳＡ（−）／ＭＥＭで１回洗浄した。
６）ハイブリドーマ培養上清１／１００、１／１０００、１／１００００量添加，１０μｇ／ｍｌアセチルトリプシン，０．８％アガロース加１％ＢＳＡ／ＭＥＭ  ２ｍｌを各ｗｅｌｌに加えた。
７）アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、ＣＯ２インキュベーターへ入れた。
８）３７℃，３日培養した。
９）１０％ホルマリンを加えた。室温，１時間固定した。
１０）ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
１１）１％クリスタルバイオレットで１時間染色した。
１２）水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
Ｈ５Ｎ１のプラーク形成価を測定し、１プレート当り５０〜６０プラークを形成する希釈条件を決定した後、その条件でハイブリドーマ培養上清１００μｌをプレートに添加し、ウイルス感染を阻止する活性を中和活性として測定した。【００８９】
＜結果＞
結果を図４に示す。
図４において、各プレートの左上に記載の数字は、ハイブリドーマ培養上清（１〜４番）の１０−２，１０−３，１０−４希釈添加時のプラーク数を示している。コントロール群はＢａｃｋ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ（Ｂａｃｋ）とし、中和価測定に使用したウイルス液を原液（１倍）及び１０倍希釈で添加した。
また抗ウイルス効果のコントロールとしてリレンザ（グラクソ・スミスクライン）を１μＭ，０．１μＭ，０．０１μＭの濃度で添加し、プラークの出現が出来ることを確認した。
図４に示したように、３Ｂ９−１１−６−９，３Ｅ１０−８−１−１１，１０Ｂ９−６−３−３１，１４Ａ７−３−２１−１の４種類のクローンが高病原性トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／０５）株に対する中和・増殖阻害活性を示した。
【実施例５】
【００９０】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質に対するＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマクローンの中和・阻害活性の評価（３）
本実施例では、抗体作製時に使用した抗原と異なったＨ５Ｎ１クレード（ｃｌａｄｅ  ２．３．２）の高病原性トリインフルエンザウイルスを用いて実施した。実施例４で中和活性を示した３Ｂ９−１１−６−９，３Ｅ１０−８−１−１１，１０Ｂ９−６−３−３１，１４Ａ７−３−２１−１の４種類のＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマ腹水の高病原性トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８）株に対する中和・阻害活性の評価を行った。【００９１】
＜方法＞
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８株に対する阻害試験を以下の手順で行った。
１）アッセイ３日前にＭＤＣＫ細胞を６ｗｅｌｌプレートへ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播いた。
２）１％ＢＳＡを含有するＭＥＭ培地で希釈したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１（１×１０３ＰＦＵ／ｍｌ）ウイルス液０．１ｍｌと、１０００倍、１００００倍、１０００００倍に希釈したハイブリドーマ培養上清０．１ｍｌとを混和し、３７℃で１時間中和反応を行った。
３）インフルエンザウイルス液とハイブリドーマ培養上清の混液０．１ｍｌを各ｗｅｌｌに加え、全体に行き渡らせた。
４）３７℃，１時間吸着した。１５分おきにプレートを揺らした。
５）ウイルス液を取り除き、ＢＳＡ（−）／ＭＥＭで１回洗浄した。
６）ハイブリドーマ培養上清１／１０００、１／１００００、１／１０００００量添加，１０μｇ／ｍｌアセチルトリプシン，０．８％アガロース加１％ＢＳＡ／ＭＥＭ  ２ｍｌを各ｗｅｌｌに加えた。
７）アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、ＣＯ２インキュベーターへ入れた。
８）３７℃，３日培養した。
９）１０％ホルマリンを加えた。室温，１時間固定した。
１０）ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
１１）１％クリスタルバイオレットで１時間染色した。
１２）水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。【００９２】
＜結果＞
図５に示したように３Ｂ９−１１−６−９クローンが高病原性トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８）株に対する中和・増殖阻害活性を示した。
【実施例６】
【００９３】
ＨＡ蛋白／ＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマＩｇＧのマウスへの高病原性トリインフルエンザウイルス感染に対する防御効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（実施例５）において、３Ｂ９−１１−６−９クローンに、Ｈ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／０５（ｃｌａｄｅ２．２）株及びＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８株（ｃｌａｄｅ２．３．２）の高病原性トリインフルエンザウイルスに対する中和・増殖阻害活性が認められたので、本実施例では、高病原性トリインフルエンザウイルス感染マウスに対する治療効果（ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験）を検討した。【００９４】
＜方法＞
ハイブリドーマの投与７日前に  Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｘｎ１  ｎｕ／ｎｕ（７週令）マウスをプリスタンで処理し、７日後にマウス各４匹に５ｘ１０６個のハイブリドーマ細胞（３Ｂ９−１１−６−９）を腹腔内注入した。２週間後に腹水３５ｍｌ〜５０ｍｌを得て、ＩｇＧ抗体精製を行った。ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラムを用いて腹水から１２〜３０ｍｇのＩｇＧ抗体を精製した。
攻撃感染ウイルスとしてＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８（２００  ＰＦＵ／ｍｏｕｓｅ；３．３ＭＬＤ５０）を用い、動物としてＢａｌｂ／ｃマウス（８〜１０週令、♀）を用いた。実験群としてコントロールのＶｅｈｉｃｌｅ処理群は抗体精製時に用いた試薬を使用し（９３．５ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，６５．４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ＰＢＳ（−）＝０．８３６：１．１６４）、被検抗体は各群８匹を用いた。なお、感染３日後に４匹／群ずつ剖検し、実験終了時に４匹／群ずつ剖検した。
非感染（希釈液）接種群（一群４匹）は体重変化のモニタリングに用いた。抗体量は１５ｍｇ／ｋｇ／マウスとし、Ｄａｙ０（ウイルス感染直前）とＤａｙ２に眼窩静脈巣より投与した。図６パネルＡに方法を示した。【００９５】
＜結果＞
結果を図６に示す。
図６パネルＢには、インフルエンザウイルスによる攻撃感染後の体重の変化を示した。１４Ａ７−３−２１−１クローンを投与した感染マウス群（●）及びＶｅｈｉｃｌｅ（▲）を投与した感染マウス群では、感染６日以降に顕著な体重減少が認められた。これに対し、３Ｂ９−１１−６−９クローンを投与した感染マウス群（■）及び非感染マウス群（◆）では体重の低下は認められなかった。
図６パネルＣには、攻撃感染後の生存率の変化を示した。感染１１日において、１４Ａ７−３−２１−１クローンを投与した感染マウス群（●）では２５％の生存率、及びＶｅｈｉｃｌｅを投与した感染マウス群（▲）では５０％の生存率となった。これに対し、３Ｂ９−１１−６−９クローンを投与した感染マウス群（■）及び非感染マウス群（◆）では生存率の低下は認められなかった。
以上の結果から、Ｈ５Ｎ１高病原性トリインフルエンザウイルスに対して幅広い結合性を有する３Ｂ９−１１−６−９クローンは、高病原性トリインフルエンザウイルス感染に対しても顕著な治療効果を示した。
【実施例７】
【００９６】
ＨＡ蛋白／ＧＡＮＰ−Ｔｇマウス由来ハイブリドーマＩｇＧのマウスへの高病原性トリインフルエンザウイルス感染に対する防御効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（実施例６）において、３Ｂ９−１１−６−９クローンにＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８株（ｃｌａｄｅ２．３．２）の高病原性トリインフルエンザウイルスに対する治療効果を示したことが認められたので、本実施例では、高病原性トリインフルエンザウイルス感染後、４，６，８日後に抗体を投与してマウスに対する治療効果（ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験）を検討した。【００９７】
＜方法＞
ハイブリドーマの投与７日前にＣｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｘｎ１  ｎｕ／ｎｕ（７週令）マウスをプリスタンで処理し、７日後にマウス各４匹に５ｘ１０６個のハイブリドーマ細胞（３Ｂ９−１１−６−９）を腹腔内注入した。２週間後に腹水３５ｍｌ〜５０ｍｌを得て、ＩｇＧ抗体精製を行った。ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラムを用いて腹水から１２〜３０ｍｇのＩｇＧ抗体を精製した。
攻撃感染ウイルスとしてＨ５Ｎ１  Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／０８（２００  ＰＦＵ／ｍｏｕｓｅ；３．３ＭＬＤ５０）を用い、動物としてＢａｌｂ／ｃマウス（９週令、♀）を用いた。実験群としてコントロールのＶｅｈｉｃｌｅ処理群は抗体精製時に用いた試薬を使用し（９３．５ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，６５．４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ＰＢＳ（−）＝０．８３６：１．１６４）、被検抗体は各群５匹を用いた。実験終了時に生存個体は剖検した。
非感染（希釈液）接種群（一群４匹）は体重変化のモニタリングに用いた。抗体量は１５ｍｇ／ｋｇ／マウスとし、Ｄａｙ０、Ｄａｙ４、Ｄａｙ６、Ｄａｙ８に眼窩静脈巣より投与した。【００９８】
＜結果＞
結果を図７に示す。
図７は、抗ＨＡモノクローナル抗体投与による治療効果の検討結果を示す図である（ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ（Ｆｅｍａｌｅ，９−ｗｅｅｋ−ｏｌｄ）、Ｈ５Ｎ１  ＨＰＡＩＶ  ３００  ＰＦＵ、１５ｍｇ／ｋｇ  ３Ｂ９投与群）。
図７パネルＡには、インフルエンザウイルスによる攻撃感染後の体重の変化を示した。３Ｂ９−１１−６−９クローンをＤａｙ８に投与した感染マウス群（●）及び非投与を感染マウス群（□）では、感染６日以降に顕著な体重減少が認められた。これに対し、３Ｂ９−１１−６−９クローンをＤａｙ０に投与した感染マウス群（△）及び非感染マウス群（◆）では体重の低下は認められなかった。３Ｂ９−１１−６−９クローンをＤａｙ４（▲）及びにＤａｙ６（○）に投与した感染マウス群では一時的な体重の低下は認められなかった。
図７パネルＢには、攻撃感染後の生存率の変化を示した。感染１４日において、３Ｂ９−１１−６−９クローンを投与した感染マウス群Ｄａｙ０（△）、Ｄａｙ４（▲）、Ｄａｙ６（○）及びＤａｙ８に投与した感染マウス群（●）を示した。Ｄａｙ４（▲）７５％、Ｄａｙ６（○）５０％及びＤａｙ８（●）０％の生存率であった。これに対し、３Ｂ９−１１−６−９クローンをＤａｙ０（△）に投与した感染マウス群（■）及び非感染マウス群（◆）では生存率の低下は認められなかった。
以上の結果から、Ｈ５Ｎ１高病原性トリインフルエンザウイルスに対して幅広い結合性を有する３Ｂ９−１１−６−９クローンは、高病原性トリインフルエンザウイルス感染後の投与に対しても顕著な治療効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により、強毒性インフルエンザであるインドネシア株、安徽株、ベトナム株の全てを認識することのできる高親和性モノクローナル抗体（ＫＤ＝１ｘ１０？１０Ｍレベル）が提供される。本発明の抗体により、超高感度の診断キットを作製することが可能となる。また、様々なクレードのウイルスの検出のみならず、ウイルスの増殖阻害にも有効であることから、医療及び臨床検査に極めて有用である。
【受託番号】
【０１００】
ハイブリドーマ「３Ｅ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」及び「７Ｇ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」は、いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）にブダペスト条約に基づき国際寄託した（原寄託日：２０１２年２月１日）。
受託番号は、「３Ｅ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６であり、「７Ｇ１０（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７である。
ハイブリドーマ「８Ｃ１（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」及び「１４Ａ７（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」は、いずれも、上記特許微生物寄託センターにブダペスト条約に基づき国際寄託した（原寄託日：２０１３年１０月１８日）。
受領番号は、「８Ｃ１（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７であり、「１４Ａ７（ｒＶＶ  ｃｌ２．２）」についてはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
［配列表］
2014097762.tif 000015
【図７】
2014097762.tif 000016
【図１】
2014097762.tif 000017
【図２】
2014097762.tif 000018
【図３】
2014097762.tif 000019
【図４】
2014097762.tif 000020
【図５】
2014097762.tif 000021
【図６】
2014097762.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月16日(2014.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数を有する、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に対する抗体。
【請求項２】
解離定数が１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマにより産生される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体の断片。
【請求項１１】
請求項６に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１２】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１６若しくはＮＩＴＥ  ＢＰ−０１２１７、又は受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７若しくはＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３８であるハイブリドーマ。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、及び
（ｂ）当該非ヒト哺乳動物から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項６又は７に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物が、ＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物である請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片と生体試料とを接触させて、インフルエンザウイルスを検出することを特徴とする、インフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項１７】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片を含む、インフルエンザウイルス検出用試薬。
【請求項２１】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項２１に記載の試薬。
【請求項２３】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２２に記載の試薬。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１０に記載の断片を含む、抗インフルエンザウイルス用医薬組成物。
【請求項２５】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＨ５亜型ウイルスである請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
インフルエンザＨ５亜型ウイルスがインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスである請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
解離定数が少なくとも１．４×１０−１１Ｍを有する、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡタンパク質に対するモノクローナル抗体。
【請求項２９】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）である請求項２８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３０】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７であるハイブリドーマにより産生される、請求項２８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３１】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項２８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
請求項２８に記載のモノクローナル抗体が結合する部位に結合する抗体。
【請求項３３】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は請求項３２に記載の抗体の断片。
【請求項３４】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１７３７であるハイブリドーマ。
【請求項３５】
請求項２８に記載のモノクローナル抗体の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）組換えワクシニアウイルスを用いて発現させたインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を用いてＧＡＮＰ（登録商標）トランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫する工程、
（ｂ）前記免疫された非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を採取する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた融合細胞から抗体を採取する工程
を含む、前記方法。
【請求項３６】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項３２に記載の抗体又は請求項３３に記載の断片と生体試料とを接触させて、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスを検出することを特徴とする、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスの検出方法。
【請求項３７】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項３２に記載の抗体又は請求項３３に記載の断片を含む、インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス検出用試薬。
【請求項３９】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項３８に記載の試薬。
【請求項４０】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項３２に記載の抗体又は請求項３３に記載の断片を含む、抗インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルス用医薬組成物。
【請求項４１】
インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスが、インドガン青海湖株（ｃｌａｄｅ  ２．２）、インドネシア株（ｃｌａｄｅ  ２．１）、安徽株（ｃｌａｄｅ  ２．３）、ベトナム株（ｃｌａｄｅ  １）、モンゴル株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｍｏｎｇｏｌｉａ／３／２００５：ｃｌａｄｅ  ２．２）及び北海道株（Ａ／ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１／２００８：ｃｌａｄｅ  ２．３．２）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2014097762.tif 000023
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