(57)【要約】  エビアレルゲンの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供する。  本発明のエビアレルゲン結合核酸は、エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とし、例えば、配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とするエビアレルゲン結合核酸分子。
【請求項２】
前記エビアレルゲンが、トロポミオシンまたはそのサブユニットである、請求項１記載のエビアレルゲン結合核酸分子。
【請求項３】
前記エビアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである、請求項１または２記載のエビアレルゲン結合核酸分子。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のエビアレルゲン結合核酸分子。
（ａ）配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項４記載のエビアレルゲン結合核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする、エビアレルゲン分析用センサ。
【請求項７】
さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む、請求項６記載のエビアレルゲン分析用センサ。
【請求項８】
前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである、請求項７記載のエビアレルゲン分析用センサ。
【請求項９】
さらに、ポルフェリンを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載のエビアレルゲン分析用センサ。
【請求項１０】
試料と請求項１から５のいずれか一項に記載のエビアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のエビアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする、エビアレルゲンの分析方法。
【請求項１１】
前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０記載のエビアレルゲンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
エビは、日常的に頻繁に摂取される食品であるが、近年、エビアレルギーの患者が増加しており、問題視されている。エビを原料とした加工食品は、数多く存在し、また、エビは、魚介類のエサであるため、魚介類を原料とした加工食品にもエビの成分が含まれていることがある。このため、加工食品やその製造ライン等においては、原料としてエビが混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。【０００３】
アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。エビに関しては、例えば、エビタンパク質であるトロポミオシンがアレルゲンとして知られている。トロポミオシンに対する分析方法として、ＥＬＩＳＡを用いた方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。【０００４】
しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Food  and  Agricultural  Immunology,  Vol  17,  pp43-52  (2006)
【非特許文献２】日本食品化学学会誌,  vol.16,  pp118-122  (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、エビアレルゲンの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。【０００８】
本発明のエビアレルゲン分析用センサは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のエビアレルゲンの分析方法は、試料と前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のエビアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のエビアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、エビアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるエビアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、エビアレルゲンに対する、アプタマーの結合能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンが、トロポミオシンまたはそのサブユニットである。
【００１３】
本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである。
【００１４】
本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【００１５】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。
【００１６】
本発明の分析用センサは、例えば、さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む。
【００１７】
本発明の分析用センサは、例えば、前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである。
【００１８】
本発明の分析用センサは、例えば、さらに、ポルフェリンを含む。
【００１９】
本発明の分析方法は、例えば、前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである。
【００２０】
（１）エビアレルゲン結合核酸分子
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、前述のように、エビアレルゲンに対する解離定数が、５０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の核酸分子は、例えば、エビの主要アレルゲンであるトロポミオシン、そのサブユニット、またはそのドメインに結合する。トロポミオシンの種類は、特に制限されず、種々のエビ由来のトロポミオシンがあげられる。前記エビは、例えば、クルマエビ科（Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）があげられ、具体例として、ウシエビ属（Ｐｅｎａｅｕｓ）、ヨシエビ属（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ）等があげられる。ウシエビ属の具体例として、ブラウンシュリンプ（Ｐｅｎａｅｕｓ ａｚｔｅｃｕｓ）、ショウナンエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）があげられ、ヨシエビ属の具体例として、ヨシエビ（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓ ｅｎｉｓ）があげられる。それぞれのエビのトロポミオシンの具体例として、Ｐｅｎ  ａ  １、Ｐｅｎ  ｉ  １、Ｍｅｔ  ｅ  １等があげられる。
【００２２】
前記エビアレルゲンは、例えば、加熱による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、いずれのアレルゲンに対しても結合可能である。
【００２３】
本発明の核酸分子は、前記エビアレルゲンに対する解離定数が、例えば、５０ｎＭ、４０ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記エビアレルゲンの検出限界濃度が、例えば、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、７５ｎＭである。
【００２４】
本発明の核酸分子は、前記トロポミオシンに対する解離定数が、例えば、５０ｎＭ、４０ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記トロポミオシンの検出限界濃度が、例えば、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、７５ｎＭである。
【００２５】
本発明の核酸分子と前記エビアレルゲンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface  Plasmon  resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名  BioRad社）が使用できる。
【００２６】
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子について、具体例を以下に示す。本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
（ａ）配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、エビアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
【００２７】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
【００２９】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１、２および３の少なくともいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
配列番号２および配列番号３は、それぞれ配列番号１の小型化配列である。前記表１において、配列番号１の下線部領域は、配列番号２の塩基配列に対応し、配列番号１の小文字領域は、配列番号３の塩基配列に対応する。図１に、前記配列番号１、２または３の塩基配列からなるポリヌクレオチドの推定二次構造を示すが、本発明は、これには制限されない。
【００３２】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、エビアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３３】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、エビアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００３４】
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００３５】
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００３６】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２〜２０、２〜１０、２または３である。
【００３７】
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜２０塩基長、３〜１２塩基長、５〜９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【００３８】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００３９】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００４０】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００４１】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜９１個、１〜３０個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１または２個である。
【００４２】
前記ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含んでもよい。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「−ＣＨ３」または「−Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
【００４３】
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
【００４４】
【化１】
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【化２】
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【００４５】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
【００４６】
前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’−デアザアデニン等があげられる。
【００４７】
前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’−デアザグアニン等があげられる。
【００４８】
前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’−メチルシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）等があげられる。
【００４９】
前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルチミン、５’−トリプタミノカルボニルチミン、５’−イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
【００５０】
前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’−ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’−トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’−イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
【００５１】
前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【００５２】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
【００５３】
前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【００５４】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００５５】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１〜９１個または１〜７８個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
【００５６】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１００個、１〜５０個、１〜３０個、１〜１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【００５７】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
【００５８】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜２００塩基長、１〜５０塩基長、１〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【００５９】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【００６０】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、エビアレルゲンであるトロポミオシンが好ましい。
【００６１】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記エビアレルゲンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記エビアレルゲンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記エビアレルゲンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
【００６２】
（２）エビアレルゲン分析用センサ
本発明のエビアレルゲン分析用センサは、前述のように、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のセンサは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【００６３】
本発明のセンサは、例えば、前記エビアレルゲン結合核酸分子に前記エビアレルゲンが結合した状態で、活性型となり、前記エビアレルゲン結合核酸分子に前記エビアレルゲンが未結合の状態で、不活性型となる、前記結合を検出する結合検出用核酸分子を、さらに含んでもよい。本発明のセンサは、前記結合検出用核酸分子を含む場合、前記結合検出用核酸分子が活性型であるか不活性型であるかによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無を確認でき、それによって、前記エビアレルゲンの有無を分析することができる。
【００６４】
前記結合検出用核酸分子としては、例えば、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子があげられる。前記Ｇカルテッド構造を形成する核酸分子は、例えば、Ｇカルテッド構造を形成した状態が、活性型であり、Ｇカルテッド構造を非形成の状態が、不活性型である。
【００６５】
前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子は、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅ等があげられ、好ましくはＤＮＡｚｙｍｅである。
【００６６】
Ｇカルテッド構造を形成した活性型ＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、酸化還元反応を触媒するペルオキシダーゼ様の活性を示す。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
【００６７】
この場合、本発明のセンサは、例えば、ポルフィリンを共存させることが好ましい。前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
【００６８】
また、Ｇカルテッド構造を形成した活性型のＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することで、蛍光を生じる。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ポルフィリンを共存させ、前記ＤＮＡｚｙｍｅと前記ポルフィリンとの複合体形成による蛍光を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
【００６９】
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）、Ｚｎ−ＤＩＧＰ、ＺｎＰＰ９およびＴＭＰｙＰ等が好ましい。
【００７０】
本発明のセンサは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
【００７１】
前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
【００７２】
（３）分析方法
本発明の分析方法は、前述のように、エビアレルゲンの分析方法であって、試料と前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のエビアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のエビアレルゲン分析用センサを使用してもよい。
【００７３】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、エビアレルゲンに特異的に結合することから、例えば、エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のエビアレルゲンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のエビアレルゲンの有無またはエビアレルゲンの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
【００７４】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
【００７５】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００７６】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のエビアレルゲンの有無または量を分析する工程を含む。
【００７７】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【００７８】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４〜３７℃、１８〜２５℃であり、接触時間は、例えば、１０〜１２０分、３０〜６０分である。
【００７９】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
【００８０】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のエビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のエビアレルゲンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のエビアレルゲンの量を分析（定量）できる。
【００８１】
そして、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にエビアレルゲンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にエビアレルゲンが存在すると判断できる。
【００８２】
前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記エビアレルゲンと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
【００８３】
前記蛍光偏光法による前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００８４】
前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記エビアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、エビアレルゲンと未結合の状態と、エビアレルゲンと結合した状態とを比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、エビアレルゲンと未結合の前記標識化核酸分子およびエビアレルゲンと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
【００８５】
前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
【００８６】
前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
【００８７】
前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０〜１０塩基長、０〜７塩基長、０〜５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
【００８８】
前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
【００８９】
前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０〜３０塩基長、１５〜２５塩基長、１８〜２４塩基長である。
【００９０】
前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
【００９１】
前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
【００９２】
前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の分析方法は、例えば、前記試料と前記標識化核酸分子とを接触させ、前記試料中のエビアレルゲンと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、エビアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
【００９３】
前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０〜６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０〜８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ〜５ナノ秒があげられる。
【００９４】
前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、エビアレルゲン未結合の基準、エビアレルゲン結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、エビアレルゲンが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、エビアレルゲンが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
【００９５】
前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、エビアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのエビアレルゲンが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、エビアレルゲンが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
【００９６】
また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、エビアレルゲンが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、エビアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのエビアレルゲンが存在すると判断できる。
【００９７】
また、前記基準は、エビアレルゲンの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のエビアレルゲンと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のエビアレルゲンに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるエビアレルゲンの量を判断することができる。
【００９８】
また、本発明の核酸分子として、前記本発明のエビアレルゲン分析用センサを使用する場合、例えば、酸化還元反応の検出または蛍光発生の検出によって、前記エビアレルゲンの検出を行うことができる。
【００９９】
前述のように、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテッド構造を形成し、ペルオキシダーゼ様の酸化還元反応の触媒活性を示す活性型となる。このため、前記酸化還元反応を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合を検出できる。この場合、例えば、前記酸化還元反応の基質を併用することが好ましい。
【０１００】
前記基質は、特に制限されず、例えば、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３−Ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６−Ｔｒｉｂｒｏｍｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  Ａｃｉｄ、２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。
【０１０１】
また、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記エビアレルゲン結合核酸分子への前記エビアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発生する。このため、前記蛍光を検出することによって、前記エビアレルゲン結合核酸分子へのエビアレルゲンを検出できる。
【０１０２】
（４）検出キット
本発明の検出キットは、前記本発明のエビアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記エビアレルゲンの検出等を行うことができる。
【０１０３】
本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記ポルフィリン、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【実施例】
【０１０４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１０５】
［実施例１］
各アプタマーについて、エビアレルゲンに対する結合能および動態パラメータを確認した。【０１０６】
（１）アプタマー
下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
【０１０７】
【表２】
2015166689.tif 000006
【０１０８】
前記アプタマーは、その末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡは、５’末端に付加した。【０１０９】
（２）試料
トロポミオシン（Ｍｅｔ  ｅ  １）にヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）付加した状態で、発現させ、これを試料として、以下の試験に使用した。前記トロポミオシンをコードする遺伝子の全長塩基配列および前記タンパク質の全長アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ２５４５６に登録された通りとし、前記Ｈｉｓタグは、１０個のＨｉｓが連続したペプチドとして、前記トロポミオシンのＮ末端に付加した。【０１１０】
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
結合能の解析には、ProteON  XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。【０１１１】
まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名  ProteOn  NLC  Sensor  Chip、BioRad社）を、前記ProteON  XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端または３’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。この結果を、前記アプタマーとタンパクの結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。前記試料の濃度は、３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、７５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８．７５ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０１１２】
前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ/Ｌ  ＭｇＣｌ２および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。【０１１３】
これらの結果を図２に示す。図２は、前記トロポミオシンに対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０〜１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である（以下、同様）。図２の各グラフにおいて、プロットは、上から、トロポミオシンタンパク質の濃度が３００ｎｍｏｌ／Ｌ、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、７５ｎｍｏｌ／Ｌ、３７．５ｎｍｏｌ／Ｌ、１８．７５ｎｍｏｌ／Ｌである。【０１１４】
図２に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記トロポミオシンに対して、結合性を示した。【０１１５】
また、前記図２のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。これらの結果を下記表３に示す。下記表３に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、トロポミオシンに対する解離定数（ＫＤ）は、５０ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。【０１１６】
【表３】
2015166689.tif 000007
【０１１７】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０１１８】
この出願は、２０１４年４月３０日に出願された日本出願特願２０１４−９４０５６を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、エビアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のエビアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、エビアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のエビアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるエビアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
【図１】
2015166689.tif 000008
【図２】
2015166689.tif 000009
【配列表】
2015166689000001.app
【国際調査報告】
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2015166689.tif 000011
2015166689.tif 000012
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