(57)【要約】  遺伝子組換えカイコにおいて、タンパク質の大量生産系として目的のタンパク質を絹糸腺で効率的に生産するために、絹糸腺特異的な主要タンパク質であるセリシン及び／又はフィブロインH鎖の遺伝子発現を簡便に、また効率的に抑制する方法を開発し、提供することを課題とする。  セリシン及び／又はフィブロインH鎖の反復配列領域を標的部位とするアンチセンスRNAをカイコ内で発現することのできるカイコ系統を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるカイコセリシン1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン1アンチセンスRNA、
配列番号４で示されるカイコセリシン2のアミノ酸配列において41位〜117位又は685位〜1359位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン2アンチセンスRNA、及び
配列番号８で示されるカイコセリシン3のアミノ酸配列において141位〜978位及び1031位〜1178位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン3アンチセンスRNA
からなる群より選択される少なくとも一のアンチセンスRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター、及び／又は
配列番号１２で示されるカイコフィブロインH鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むフィブロインH鎖アンチセンスRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター
を有効成分として含むカイコ絹糸腺における外因性遺伝子発現増強剤。
【請求項２】
セリシン1における反復単位が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、
セリシン2における反復単位が配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列からなり、
セリシン3における反復単位が配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列からなり、又は
フィブロインH鎖における反復単位が配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の外因性遺伝子発現増強剤。
【請求項３】
セリシン1アンチセンスRNAが配列番号３で示される塩基配列からなり、
セリシン2アンチセンスRNAが配列番号７で示される塩基配列からなり、
セリシン3アンチセンスRNAが配列番号１１で示される塩基配列からなり、
又は
フィブロインH鎖アンチセンスRNAが配列番号１４で示される塩基配列からなる、
請求項１に記載の外因性遺伝子発現増強剤。
【請求項４】
前記アンチセンスRNA発現ベクターが2つのサブユニットからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の外因性遺伝子発現増強剤。
【請求項５】
配列番号１で示されるカイコセリシン1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン1アンチセンスRNA、
配列番号４で示されるカイコセリシン2のアミノ酸配列において41位〜117位又は685位〜1359位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン2アンチセンスRNA、及び
配列番号８で示されるカイコセリシン3のアミノ酸配列において141位〜978位又は1031位〜1178位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むセリシン3アンチセンスRNA
からなる群より選択される少なくとも一のアンチセンスRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるアンチセンスRNA発現ベクター、及び／又は
配列番号１２で示されるカイコフィブロインH鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むアンチセンスRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるフィブロインH鎖アンチセンスRNA発現ベクター
を有する遺伝子組換えカイコ。
【請求項６】
セリシン１における反復単位が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、
セリシン２における反復単位が配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列からなり、
セリシン３における反復単位が配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列からなり、又は
フィブロインH鎖における反復単位が配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる、
請求項５に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項７】
セリシン１アンチセンスRNAが配列番号３で示される塩基配列からなり、
セリシン２アンチセンスRNAが配列番号６で示される塩基配列からなり、
セリシン３アンチセンスRNAが配列番号９で示される塩基配列からなり、
又は
フィブロインH鎖アンチセンスRNAが配列番号１４で示される塩基配列からなる、
請求項５に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項８】
前記アンチセンスRNA発現ベクターが2つのサブユニットからなる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項９】
前記2つのサブユニットが異なる染色体上に存在する、請求項８に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１０】
目的の外因性遺伝子を発現することのできる外因性遺伝子発現ベクターを有する、請求項５〜９のいずれか１項に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与する工程を含む遺伝子組換えカイコの作出方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコ絹糸腺を利用したタンパク質発現系において、アンチセンスRNA発現ベクターを有効成分とする外因性遺伝子発現増強剤、及び当該アンチセンスRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコに関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ（Bombyx mori）の絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成する能力を有している。また、カイコの絹糸腺は大型器官であるため摘出が容易であり、合成されたタンパク質は絹糸腺内腔に貯蔵されることから回収しやすいという利点もある。そのため、絹糸腺で目的のタンパク質を発現する遺伝子組換えカイコは、有用タンパク質や高機能シルク等の付加価値の高いタンパク質の大量生産系として有望視されている。【０００３】
カイコ絹糸腺は、形態学的には図１で示すような左右1対の器官であり、それぞれは、前部絹糸腺、中部絹糸腺、及び後部絹糸腺の3つの領域で構成されている。中部絹糸腺細胞内では、絹糸の被覆成分である水溶性のゼラチン様タンパク質、セリシン1（本明細書では、しばしば「Ser1」と略称する）、セリシン２（本明細書では、しばしば「Ser2」と略称する）及びセリシン3（本明細書では、しばしば「Ser3」と略称する）が合成されている（図１）。これらは、合成後に中部絹糸腺内腔中に分泌される。また、後部絹糸腺細胞内では、絹糸の繊維成分であるフィブロインを構成する3つの主要なタンパク質である、フィブロインH鎖（本明細書では、しばしば「Fib H」と略称する）、フィブロインL鎖（本明細書では、しばしば「Fib L」と略称する）、及びp25/FHX(以下、「p25」とする)が合成されている。これら3つのタンパク質は、Fib H：Fib L：p25＝6:6:1の比率で複合体（silk fibroin elementary unit；本明細書では、以下「SFEU複合体」と称する。）を形成し、後部絹糸腺内腔中に分泌される。その後、SFEU複合体は中部絹糸腺内腔に移行し、セリシンで被覆され、絹糸として前部絹糸腺から吐糸される（図１：非特許文献１）。したがって、カイコ絹糸腺をタンパク質発現系として利用する場合、中部絹糸腺又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子発現系を利用すればよいことになる。実際、これまでに中部絹糸腺を用いた組換えタンパク質発現システムとしてGAL4/UASシステム（非特許文献２）、又はSer1プロモーター及びHr3エンハンサーを組み合わせた系による大量発現方法（非特許文献３）が確立している。【０００４】
カイコ絹糸腺を利用したタンパク質発現系において、目的のタンパク質の生産効率を高めるためには、その遺伝子の発現量自体を向上させること、絹糸腺における他の主要タンパク質量を減少させることによって目的のタンパク質の発現量を相対的に上昇させること、及びカイコから目的のタンパク質を効率的に回収することが重要である。タンパク質の回収を阻害する要因の一つには、夾雑タンパク質の存在が挙げられる。例えば、絹糸腺における主要タンパク質であるフィブロインやセリシンが挙げられる。これらのタンパク質は、合成量が多く、かつ繊維質で、粘稠性や結晶性が高いことから、目的のタンパク質の抽出や精製の際にカラムやフィルターの閉塞原因となりやすい。そのため、タンパク質の効率的な回収には、それらの夾雑タンパク質の遺伝子発現を抑制する必要がある。一方で、カイコ絹糸腺で発現するこれらの遺伝子の過剰な発現抑制は、カイコの生育自体に影響を与え得ることから、その発現抑制を制御する技術が求められている。【０００５】
カイコ絹糸腺において内在性のフィブロイン又はセリシンの発現を抑制する方法には、既存の遺伝子突然変異系統を用いる方法と、それらの遺伝子の発現を人為的に抑制する方法がある。【０００６】
既存の遺伝子突然変異系統を用いる方法の例として、カイコでは、後部絹糸腺で発現するFib H鎖に異常があるNd系統や、Fib L鎖に異常があるNd-s系統及びNd-sD系統が知られている。Nd系統ではFib H鎖の発現が、またNd-s系統及びNd-sD系統ではFib L鎖の発現が、非常に低いことから、これらの系統を用いて目的のタンパク質を中部絹糸腺で発現させることでその発現量を向上することができる（特許文献１）。しかし、上記遺伝子突然変異系統は、中部絹糸腺で発現するSer1等の遺伝子発現までは抑制できず、また、カイコの中部絹糸腺で発現する遺伝子の突然変異系統等はこれまで報告されていない。【０００７】
人為的に遺伝子の発現を抑制する方法の例としては、RNAi（RNA inteference）法が挙げられる。RNAi法は、生体内において標的遺伝子の転写産物の分解を介して、その遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）する方法である。一般にRNAi法では、二本鎖RNAで構成されるsiRNA（small interfering RNA）又はmiRNA（micro RNA)、及び一本鎖RNAで構成され、自己折り畳み（self-folding）によって分子内に二本鎖RNA領域を形成するshRNA（short hairpin RNA）等のRNAi分子が用いられている。一方、一本鎖RNAで構成され、分子内二本鎖RNA領域を形成しないアンチセンスRNA（本明細書では、しばしば「asRNA」と表記する）も、標的mRNAとアニーリングして、最終的に二本鎖RNAと同じプロセスを経てRNAiによる遺伝子の発現抑制効果を奏し得る。しかし、他のRNAi分子と比較してその効果は非常に低いことから、ほとんど利用されていない（非特許文献４）。【０００８】
カイコをはじめとするチョウ目（Lepidoptera）の昆虫では、他の生物種と比較してRNAiによる遺伝子発現抑制の効果が一般的に低い（非特許文献５）。ただし、その効果は組織によって異なり、チョウ目であっても皮膚や絹糸腺では比較的高いことが知られている。例えば、Fib H鎖、Fib L鎖、及びSer1の二本鎖RNAをカイコの細胞内で発現させることにより、各遺伝子の発現を抑制できることが報告されている（特許文献２〜４）。しかし、これらの方法は、生体内で二本鎖RNAを発現及び構築させなければならず、また発現ベクターの作製や遺伝子組換えカイコ作出の工程が複雑で手間を要することから、製造コストが高くなるという問題がある。さらに、従来技術では、複数の遺伝子を組み合わせて、その発現を同時に抑制することは、非常に困難という問題がある。これらの問題は、一本鎖RNAで構成されるasRNAであれば解消し得る。ところが、カイコ絹糸腺内においてもasRNAによる遺伝子発現抑制の効果は非常に低く、二本鎖RNAと比較して数百分の1程度しかないことが報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2004-135528
【特許文献２】特表2006-521802
【特許文献３】特開2008-245623
【特許文献４】特開2011-103816
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Inoue S. et al., 2000, The Journal of Biological Chemistry, 275 (51): 40517-40528.
【非特許文献２】Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87.
【非特許文献３】Tomita M. et al., 2007, Transgenic Research, 16 (4):449-465.
【非特許文献４】Tavernarakis N. et al., 2000, Nature genetics, 24 180-183.
【非特許文献５】Terenius O. et al., 2011, Journal of Insect Physiology, (57):231-245
【非特許文献６】Isobe R. et al., 2002, Journal of insect biotechnology and sericology, 71, 43-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、目的のタンパク質の生産効率を高めるために、絹糸腺内在性の主要なタンパク質であって、夾雑タンパク質となり得るセリシン及び／又はFib H鎖の遺伝子発現を効率的に抑制する方法を開発し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、セリシンやFib H鎖のアミノ酸配列中に含まれる反復配列領域を直接的な標的領域とするasRNAをカイコの絹糸腺で発現させることで、asRNAであってもセリシンやFib H鎖の遺伝子発現を効率的に抑制できることを見出した。本発明は、当該研究結果に基づくものであって、以下を提供する。【００１３】
（１）配列番号１で示されるカイコSer1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer1 asRNA、配列番号４で示されるカイコSer2のアミノ酸配列において41位〜117位又は685位〜1359位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer2 asRNA、及び配列番号８で示されるカイコSer3のアミノ酸配列において141位〜978位又は1031位〜1178位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer3 asRNAからなる群より選択される少なくとも一のasRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるasRNA発現ベクター、及び／又は配列番号１２で示されるカイコFib H鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むFib-H asRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるasRNA発現ベクターを有効成分として含むカイコ絹糸腺における外因性遺伝子発現増強剤。【００１４】
（２）Ser1における反復単位が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、Ser2における反復単位が配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列からなり、Ser3における反復単位が配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列からなり、又はFib H鎖における反復単位が配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる、（１）に記載の外因性遺伝子発現増強剤。【００１５】
（３）Ser1に対するasRNAが配列番号３で示される塩基配列からなり、Ser2におけるasRNAが配列番号７で示される塩基配列からなり、Ser3におけるasRNAが配列番号１１で示される塩基配列からなり、又はFib H鎖asRNAが配列番号１４で示される塩基配列からなる、（１）に記載の外因性遺伝子発現増強剤。【００１６】
（４）前記asRNA発現ベクターが２つのサブユニットからなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の外因性遺伝子発現増強剤。【００１７】
（５）配列番号１で示されるカイコSer1のアミノ酸配列において628位〜1054位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer1 asRNA、配列番号４で示されるカイコSer2のアミノ酸配列において41位〜117位又は685位〜1359位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer2 asRNA、及び配列番号８で示されるカイコSer3のアミノ酸配列において141位〜978位又は1031位〜1178位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むSer3 asRNAからなる群より選択される少なくとも一のasRNAをカイコ中部絹糸腺特異的に発現することのできるasRNA発現ベクター、及び／又は配列番号１２で示されるカイコFib H鎖のアミノ酸配列において152位〜5203位の反復配列領域における少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列に相補的な配列を含むFib-H asRNAをカイコ後部絹糸腺特異的に発現することのできるasRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ。【００１８】
（６）Ser1における反復単位が配列番号２で示されるアミノ酸配列からなり、Ser2における反復単位が配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列からなり、Ser3における反復単位が配列番号９又は１０で示されるアミノ酸配列からなり、又はFib H鎖における反復単位が配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる、（５）に記載の外遺伝子組換えカイコ。【００１９】
（７）Ser1に対するasRNAが配列番号３で示される塩基配列からなり、Ser2におけるasRNAが配列番号７で示される塩基配列からなり、Ser3におけるasRNAが配列番号１１で示される塩基配列からなり、又はFib H鎖asRNAが配列番号１４で示される塩基配列からなる、（５）に記載の遺伝子組換えカイコ。【００２０】
（８）前記発現ベクターが2つのサブユニットからなる、（５）〜（７）のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。【００２１】
（９）前記２つのサブユニットが異なる染色体上に存在する、（８）に記載の遺伝子組換えカイコ。【００２２】
（１０）目的の外因性遺伝子を発現することのできる外因性遺伝子発現ベクターを有する、（５）〜（９）のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。【００２３】
（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載の外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与する工程を含む遺伝子組換えカイコの作出方法。【００２４】
（１２）（１０）に記載の遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドを製造する方法。【００２５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-222138号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の外因性遺伝子発現増強剤によれば、カイコに投与することで、タンパク質生産系のカイコにおいて夾雑タンパク質となり得るセリシンやFib H鎖の合成を抑制することができる。【００２７】
本発明の遺伝子組換えカイコによれば、セリシン及び／又はFib H鎖の合成が抑制されたカイコを提供することができる。また、絹糸腺で発現する外因性遺伝子をさらに有する遺伝子組換えカイコであれば、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドの生産効率及び回収率を高めることができる。【００２８】
本発明のペプチド製造方法によれば、本発明の遺伝子組換えカイコをタンパク質生産系として用いることで、付加価値の高いタンパク質を大量に、また比較的低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】カイコの絹糸腺及び各部位で発現するフィブロイン構成タンパク質と絹糸が吐糸されるまでの概念図を示す。
【図２】本発明の外因性遺伝子発現増強剤の有効成分であるasRNA発現ベクターが、2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合の第1サブユニットと第2サブユニットの構成例を示す図である。A〜Cは第1サブユニットの構成例である。Aは、後部絹糸腺プロモーター下に転写調節因子をコードするDNAとしてGAL4遺伝子を配置した後部絹糸腺GAL4発現ベクターの一部である。Bは、中部絹糸腺プロモーター下にGAL4遺伝子を配置した中部絹糸腺GAL4発現ベクターの一部である。Cは、中部絹糸腺と後部絹糸腺のそれぞれのプロモーター下にGAL4遺伝子を配置した中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターの一部である。D及びEは第2サブユニットの構成例である。Dは、GAL4の標的プロモーターであるUASプロモーターの下流にasRNAコードDNAを1つ有するasRNA発現ベクターの一部である。Eは、UASプロモーターの下流にasRNAコードDNAを2つタンデムで有するasRNA発現ベクターの一部である。各サブユニットにおいて白枠で示す3’UTRの矢印は、転写方向を示す。
【図３】実施例１等で用いたSer1 asRNAを発現する第2サブユニットの構成を示す図である。Aは5’Ser1 asRNAを発現するUAS-5’Ser1 asRNA発現ベクターである。また、Bは3’Ser1 asRNAを発現するUAS-3’Ser1 asRNA発現ベクターである。ここで、5’Ser1 asRNAは、反復配列領域を含まないSer1の5’領域を標的とする。また、3’Ser1 asRNAは、反復配列領域を含むSer1の3’領域を標的とする。Ser1 asRNAコードDNAの矢印は、転写方向を示す（以下、同様とする）。
【図４】実施例１等で用いたSer1 shRNAを発現する第2サブユニットの構成を示す図である。Aは5’Ser1 shRNAを発現するUAS-5’Ser1 shRNA発現ベクターである。また、Bは3’Ser1 shRNAを発現するUAS-3’Ser1 shRNA発現ベクターである。Ser1 shRNAは、Ser1センスRNA(Ser1 sRNA)、リンカー（アクチンイントロン）及びSer1 asRNAからなる。
【図５】実施例１等で用いた第1サブユニットの構成を示す図で、中部絹糸腺でGAL4遺伝子を発現する中部絹糸腺GAL4発現ベクターを示す。
【図６】図３及び図４で示した各第2サブユニットと図５で示した第1サブユニットを有する遺伝子組換えカイコにおけるSer1遺伝子の発現抑制を示す図である。図中上方に記載の％は、各群に示す3系統（1,2,3）の平均相対量である。
【図７】図３及び図４で示した各第2サブユニットと図５で示した第1サブユニットを有する遺伝子組換えカイコにおける繭タンパク質のSDS-PAGEを示す図である。
【図８】実施例２等で用いたFib-H asRNAを発現する第2サブユニットの構成を示す図である。AはFib-H1 asRNAを発現するUAS-Fib-H1 asRNA発現ベクターである。また、BはFib-H2 asRNAを発現するUAS- Fib-H2 asRNA発現ベクターである。Fib-H1とFib-H2は、標的とするFib H鎖の反復配列領域の長さが異なる。
【図９】実施例２等で用いた第1サブユニットの構成を示す図であって、後部絹糸腺でGAL4遺伝子を発現する後部絹糸腺GAL4発現ベクターを示す。
【図１０】図８で示した第2サブユニットと図９で示した第1サブユニットを有する遺伝子組換えカイコにおけるFib H鎖遺伝子の発現抑制を示す図である。
【図１１】図８で示した第2サブユニットと図９で示した第1サブユニットを有する遺伝子組換えカイコにおける絹糸腺タンパク質のSDS-PAGEを示す図である。
【図１２】実施例３等で用いた第2サブユニット（A）及び第1サブユニット（B）の構成を示す図である。Aで示す第2サブユニットは、UASプロモーターの下流にSer1 asRNAコードDNAとFib H asRNAコードDNAをタンデムに配置し、UASプロモーターの活性によりSer1 asRNAとFib H asRNAを同時に発現することができるUAS-3’Ser1-FibH asRNA発現ベクターである。またBは、中部絹糸腺プロモーターであるSerプロモーター（Ser-pro)と後部絹糸腺プロモーターであるFibHプロモーター（Fib-H pro)のそれぞれの下流にGAL4遺伝子を配置し、中部及び後部絹糸腺でGAL4遺伝子を同時発現する中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターである。
【図１３】第1サブユニットである図１２Bで示す中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクター、図５で示す中部絹糸腺GAL4発現ベクター、又は図９で示す後部絹糸腺GAL4発現ベクターと、第2サブユニットである図１２Aで示すUAS-3’Ser1-FibH asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコにおける絹糸腺タンパク質のSDS-PAGEを示す図である。
【図１４】外因性遺伝子発現ベクターの構成を示す図である。Aは、実施例４及び５で用いた外因性遺伝子発現ベクターのベース用発現ベクターである。Bは、Aの発現ベクターの標識遺伝子を3xP3-EGFPから3xP3-AmCyanに置換して実施例に用いたUAS-EGFP発現ベクターである。
【図１５】遺伝子組換えカイコ1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す図である。ここで用いた遺伝子組換えカイコは、第2サブユニットである図３で示すUAS-3’Ser1 asRNA発現ベクター又は図４で示したUAS-3’Ser1 shRNA発現ベクター、及び第1サブユニットである図５で示す中部絹糸腺GAL4発現ベクター、並びに外因性遺伝子発現ベクターである図１４で示すUAS-EGFP発現ベクターを有する。
【図１６】遺伝子組換えカイコ1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す図である。ここで用いた遺伝子組換えカイコは、図１２で示す、第2サブユニットであるUAS-3’Ser1-Fib-H asRNA発現ベクター及び第1サブユニットである中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクター、並びに図１４で示すUAS-EGFP発現ベクターを有する。
【図１７】Ser1 asRNA及びFib-H asRNAの発現による絹糸腺抽出液のゲル化抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
１．外因性遺伝子発現増強剤
１−１．概要
本発明の第１の態様は、外因性遺伝子発現増強剤である。本発明の外因性遺伝子発現増強剤は、カイコの絹糸腺で発現するセリシン遺伝子又はFib H鎖遺伝子を標的とするアンチセンスRNAの発現ベクターを有効成分として含むことを特徴とする。本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、カイコに投与することによって絹糸腺内でセリシン及び／又はFib H鎖の遺伝子発現を抑制することができる。
【００３１】
１−２．定義
本明細書において使用する主要な用語について、以下で定義する。
【００３２】
「外因性遺伝子」とは、人為的操作を介して外部から導入された外来性の遺伝子であって、カイコの絹糸腺内で発現可能な遺伝子をいう。本明細書における外因性遺伝子は、その起源が人為的操作を介して外部から導入された遺伝子である限り、組換え体の後代のように染色体内に挿入された状態で存在する遺伝子も含む。
【００３３】
「目的のペプチド」とは、前記外来性遺伝子にコードされたペプチドであって、カイコの絹糸腺を用いたタンパク質大量生産系において生産すべきペプチドをいう。本明細書において「ペプチド」と表記する場合には、2個以上のアミノ酸がアミド結合によって連結した分子である。したがって、ペプチドは、オリゴペプチド、及びタンパク質のようなポリペプチドを含む。ペプチドは、1遺伝子由来又はその遺伝子断片由来の他、複数の遺伝子の一部を連結したキメラ遺伝子由来のものを含む。また、ペプチドのアミノ酸長は、特に限定はしない。例えば、アミノ酸残基数が10〜10,000個であってもよい。本明細書における目的のペプチドの種類は特に限定はしないが、付加価値の高いタンパク質が好適である。例えば、インスリン、カルシトニン、パラトルモン及び成長ホルモンのようなペプチドホルモン、上皮成長因子（EGF）、繊維芽細胞成長因子（FGF）、インターロイキン（IL）、インターフェロン（IFN）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）及びトランスフォーミング成長因子β（TGF-β）のようなサイトカイン、免疫グロブリン、血清アルブミン、酵素、又はコラーゲン、あるいはそれらの断片（キメラペプチドを含む）が挙げられる。
【００３４】
「外因性遺伝子発現増強剤」とは、カイコに導入された外因性遺伝子の発現を増強する薬剤をいう。
【００３５】
「発現（を）増強（する）」とは、遺伝子、特に本明細書では外因性遺伝子の発現量を増加させることをいう。本明細書において発現増強は、（外因性）遺伝子の発現量の絶対量の増加及び相対量の増加を含む。ここで、「絶対量の増加」とは、（外因性）遺伝子の発現量自体が増加することをいう。「相対量の増加」とは、（外因性）遺伝子の絶対量に変化はないが、他の遺伝子の発現量の低下等により、目的のペプチドの回収量が相対的に増加することをいう。例えば、絹糸腺においてFib H鎖やセリシン等の夾雑タンパク質の遺伝子発現を抑制することによって、それらを抑制しないときと比較して、外因性遺伝子にコードされた目的のペプチドの回収量が相対的に増加することが挙げられる。
【００３６】
「遺伝子組換えカイコ」とは、遺伝子組換え技術を用いて作製した組換えDNAを有するカイコの遺伝子組換え体、又はその後代をいう。本発明の遺伝子組換えカイコは、特に本態様の外因性遺伝子発現増強剤の有効成分であるasRNA発現ベクターを宿主カイコに導入して得られる遺伝子組換え体、又はその後代を指すことが多い。
【００３７】
「絹糸腺」とは、絹糸を吐糸することのできる昆虫、すなわち絹糸虫が有する唾液腺の変化した管状器官であって、液状絹を産生、蓄積し、また分泌する機能を有する。絹糸腺は、主として絹糸虫の幼虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の3領域で構成されており、中部絹糸腺ではセリシンを、また後部絹糸腺ではFib H鎖、Fib L鎖及びp25を合成し、分泌する。
【００３８】
「セリシン（Ser)」は、先述のように絹糸の被覆成分である水溶性のゼラチン様タンパク質である（図１）。中部絹糸腺で合成され、中部絹糸腺内腔に分泌される。セリシンタンパク質にはSer1、Ser2、Ser3の各遺伝子から合成される複数の分子種が知られているが、本明細書で単に「セリシン」と記載した場合には、いずれの分子種も含む総称とする。
【００３９】
「フィブロインH鎖（Fib H）」は、前述のように絹糸の繊維成分であるフィブロインを構成する3つの主要なタンパク質の一つである（図１）。後部絹糸腺で合成され、フィブロインL鎖及びp25と共にSFEU複合体を形成した後、後部絹糸腺内腔中に分泌される。
【００４０】
１−３．構成
本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、アンチセンスRNA発現ベクターを必須成分として含む他、担体を選択成分として必要に応じて含む。以下、各成分について説明をする。
【００４１】
１−３−１．アンチセンスRNA発現ベクター
「アンチセンスRNA発現ベクター」（本明細書では、しばしば「asRNA発現ベクター」と表記する）は、本態様の外因性遺伝子発現増強剤における有効成分である。asRNA発現ベクターの母核には、様々な遺伝子発現ベクターを利用することができる。例えば、プラスミド若しくはバクミド（Bacmid）のような自律複製可能な発現ベクター、ウイルスベクター、又は染色体中に相同又は非相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主の染色体中に挿入した染色体の一部が挙げられる。また、asRNA発現ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターとすることもできる。
【００４２】
Ａ．asRNA発現ベクターの構成エレメント
asRNA発現ベクターは、カイコの絹糸腺内で標的遺伝子に対するasRNAを発現するように構成されている。発現ベクターの構成エレメントには、少なくとも一つのasRNAをコードするDNA、及び該asRNAの発現に必要なプロモーターを必須の構成エレメントとして含む。また、必要に応じて前記asRNAの発現に寄与し得る他の構成エレメントを含むことができる。ここで、他の構成エレメントとは、例えば、ターミネーター、標識遺伝子、エンハンサー、インスレーター、及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。さらに、asRNA発現ベクターが、後述する第1サブユニットと第2サブユニットの2つのユニットから構成される場合には、転写調節因子をコードするDNA及び該転写調節因子の標的プロモーターを必須の構成エレメントとして包含する。また、asRNAの発現に直接関与する構成エレメントではないが、外因性遺伝子を当該ベクターに含むこともできる。以下、各エレメントの構成について具体的に説明をする。
【００４３】
（１）アンチセンスRNAをコードするDNA（asRNAコードDNA）
アンチセンスRNAをコードするDNA（本明細書では、しばしば「asRNAコードDNA」と略称する）は、カイコの中部絹糸腺で特異的に発現するセリシン1〜3又は後部絹糸腺で特異的に発現するフィブロインH鎖遺伝子を標的とし、その発現を抑制するasRNAをコードしている。
【００４４】
セリシン１（Ser1）遺伝子を標的とするasRNA（Ser1 asRNA）は、配列番号１で示されるカイコSer1タンパク質の全長アミノ酸配列において628位〜1054位に存在する反復配列領域を標的とする。Ser1 asRNAの塩基配列は、この反復配列領域に含まれる少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列の相補配列を含む。Ser1の反復配列領域における反復単位は、配列番号２で示されるアミノ酸配列SX1SNTDX2SX1X3X4X5GSX6TSGGX1STYGYSSX7X8RX9GSVSX2TG及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はT又はS、X2はS又はA、X3はK又はD、X4はS、N又はL、X5はA又はT、X6はR又はS、X7はR、S又はD、X8はH、S又はN、そしてX9はG又はDを表す。
【００４５】
本明細書において「位相を変えた派生配列」とは、反復配列領域において反復単位の開始アミノ酸位置をずらした配列をいう。例えば、前記配列番号２で示される反復単位の位相を変えた派生配列としては、開始アミノ酸位置をC末端側に2アミノ酸ずらしたSNTから始まり、GSX1で終わる配列等が挙げられる。一般に反復単位は、反復配列領域内において連続して繰り返し現れるため、反復単位の開始アミノ酸が全体としてずれた場合であっても反復配列の実体は変わらない。したがって、反復単位の位相を変えた派生配列は、配列番号で具体的に示した反復単位と実質的に同じ反復単位と解することができる。Ser1 asRNAの塩基配列の具体例として、配列番号３で示される塩基配列が挙げられる。したがって、配列番号３で示される配列をコードするDNA配列が、Ser1 asRNAコードDNAの一つとなり得る。
【００４６】
セリシン2（Ser2）遺伝子を標的とするasRNA（Ser2 asRNA）は、配列番号４で示されるカイコSer2タンパク質の全長アミノ酸配列において41位〜117位及び685位〜1359位に存在する反復配列領域を標的とする。Ser2 asRNAの塩基配列は、この2領域のいずれかの反復配列領域に含まれる少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列の相補配列を含む。Ser2の反復配列領域における反復単位は、前記2領域のそれぞれに存在し、41位〜117位に存在する第1反復単位は、配列番号５で示されるアミノ酸配列KX1EX2X3KX4X5X6GX4及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はF、L又はV、X2はN又はA、X3はL、I又はA、X4はE又はD、X5はN又はK、X6はV又はAを表す。また、685位〜1359位に存在する第2反復単位は、配列番号６で示されるアミノ酸配列X1SX2SX3X4DX5X6KX7X8X9X10X11及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はG、R又はS、X2はS又はP、X3はD、H又はY、X4はK又はR、X5はS又はT、X6はE又はD、X7はA、V又はT、X8はK又はF、X9はP、H又はD、X10はN又はK、そしてX11はD、G又はNを表す。Ser2 asRNAの塩基配列の具体例として、配列番号７で示される塩基配列が挙げられる。したがって、配列番号７で示される配列をコードするDNA配列が、Ser2 asRNAコードDNAの一つとなり得る。
【００４７】
セリシン3（Ser3）遺伝子を標的とするasRNA（Ser3 asRNA）は、配列番号８で示されるカイコSer3タンパク質のアミノ酸配列において141位〜978位及び1031位〜1178位に存在する反復配列領域を標的とする。Ser3 asRNAの塩基配列は、この2領域のいずれかの反復配列領域に含まれる少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列の相補配列を含む。Ser3の反復配列領域における反復単位は、前記2領域のそれぞれに存在し、141位〜978位に存在する第1反復単位は、配列番号９で示されるアミノ酸配列SDDSSGATKGNSSKSSSSSQGX1SASSSSSX2EX3SSQSX4SNSSNNSKSSSQSSSX5X6NSSGSKGSGSEESSNGGSGSGRX7GSX8GX9X10DED及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はQ又はK、X2はD又はN、X3はK又はN、X4はS又はN、X5はS又はG、X6はQ、N又はK、X7はT又はN、X8はA又はV、X9はG又はE、そしてX10はT又はSを表す。また、1031位〜1178位に存在する第2反復単位は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列X1SX2SX3QAX4及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はS又はN、X2はR又はS、X3はQ又はK、そしてX4はQ又はHを表す。Ser3 asRNAの塩基配列の具体例として、配列番号１１で示される塩基配列が挙げられる。したがって、配列番号１１で示される配列をコードするDNA配列が、Ser1 asRNAコードDNAの一つとなり得る。
【００４８】
フィブロインH（Fib H）鎖遺伝子を標的とするasRNA（Fib-H asRNA）は、配列番号１２で示されるカイコFib Hタンパク質のアミノ酸配列において152位〜5203位に存在する反復配列領域を標的とする。Fib-H asRNAの塩基配列は、この反復配列領域に含まれる少なくとも一つの反復単位をコードする塩基配列の相補配列を含む。Fib Hの反復配列領域における反復単位は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列GX1GX1GX2及びその位相を変えた派生配列からなる。ここで、X1はA、V又はY、そしてX2はS又はYを表す。Fib H asRNAの塩基配列の具体例として、配列番号１４で示される塩基配列が挙げられる。したがって、配列番号１４で示される配列をコードするDNA配列が、Fib H asRNAコードDNAの一つとなり得る。
【００４９】
（２）プロモーター
プロモーターは、asRNA発現ベクターのasRNAコードDNAに作用して、前記asRNAを発現する必須の構成エレメントである。
【００５０】
asRNA発現ベクターに含まれるプロモーターの種類は、asRNAの標的遺伝子によって異なる。例えば、中部絹糸腺で発現するSer1〜Ser3の遺伝子を標的遺伝子とする場合には、中部絹糸腺で作動可能なプロモーターを用いる。そのようなプロモーターには、例えば、中部絹糸腺特異的プロモーターの他、ユビキタスに発現可能な過剰発現型プロモーター、構成的活性型プロモーター若しくは時期特異的活性型プロモーター、又は発現誘導型プロモーター等が挙げられる。好ましくは中部絹糸腺特異的プロモーターである。中でも中部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは特に好ましい。具体的には、例えば、Ser1〜Ser3の遺伝子プロモーター（本明細書では、それぞれ「Ser1プロモーター」、「Ser2プロモーター」、及び「Ser3プロモーター」と称する）が挙げられる。一方、後部絹糸腺で発現するFib H鎖遺伝子を標的遺伝子とする場合には、後部絹糸腺で作動可能なプロモーターを用いる。そのようなプロモーターには、例えば、後部絹糸腺特異的プロモーターの他、ユビキタスに発現可能な過剰発現型プロモーター、構成的活性型プロモーター若しくは時期特異的活性型プロモーター、又は発現誘導型プロモーター等が挙げられる。好ましくは後部絹糸腺特異的プロモーターである。中でも後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは特に好ましい。具体的には、例えば、フィブロイン構成タンパク質であるFib H、Fib L、又はp25の遺伝子プロモーター（本明細書では、それぞれ「Fib Hプロモーター」、「Fib Lプロモーター」、又は「p25プロモーター」と称する）が挙げられる。
【００５１】
プロモーターの由来生物種は、asRNA発現ベクターを導入するカイコの細胞内で作動可能である限り、特に限定はしない。例えば、絹糸虫由来の絹糸腺特異的プロモーターは好適である。一般に、中部絹糸腺特異的プロモーターや後部絹糸腺特異的プロモーターの塩基配列は、絹糸虫間で進化的に高度に保存されているため、asRNAの発現に用いるプロモーターがカイコと異なる絹糸虫由来であってもカイコの細胞内で機能し得るからである（Sezutsu H., et al., 2009, Journal of Insect Biotechnology and Sericology, 78 :1-10）。好適なプロモーターの生物種は、asRNA発現ベクターの宿主となるカイコと分類学上同じチョウ目（Lepidoptera）に属する種、より好ましくは同じカイコガ科(Bombycidae)に属する種、さらに好ましくは、例えばクワコ（Bombyx mandarina）のような同じ属に属する種である。最も好ましくはカイコである。
【００５２】
具体例として、以下のプロモーターを利用することができる。中部絹糸腺特異的プロモーターには、配列番号１５で示される塩基配列を含むカイコ由来のSer1プロモーター、配列番号１６で示される塩基配列を含むカイコ由来のSer2プロモーター、及び配列番号１７で示される塩基配列を含むカイコ由来のSer3プロモーター等を利用できる。また、後部絹糸腺特異的プロモーターには、配列番号１８で示される塩基配列を含むカイコ由来のFib Hプロモーター、配列番号１９で示される塩基配列を含むサクサン由来のFib Hプロモーター、配列番号２０で示される塩基配列を含むカイコ由来のFib Lプロモーター、配列番号２１で示される塩基配列を含むサクサン由来のFib Lプロモーター、及び配列番号２２で示される塩基配列を含むカイコ由来のp25プロモーター等を利用できる。
【００５３】
（３）ターミネーター
ターミネーターは、asRNA発現ベクターを導入する宿主の後部絹糸腺細胞内で、asRNAの転写を終結できる塩基配列で構成される。
【００５４】
（４）標識遺伝子
標識遺伝子は、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。標識タンパク質は、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるポリペプチドをいう。それ故、asRNA発現ベクターが標識遺伝子を含むことによって、asRNA発現ベクターを保有している遺伝子組換えカイコを標識タンパク質の活性に基づいて容易に判別することができる。ここで「活性に基づいて」とは「活性の検出結果に基づいて」という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出してもよいし、標識タンパク質の活性によって生成される色素のような代謝物を介して間接的に検出してもよい。検出は、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
【００５５】
標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によってその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。好ましくは検出に際して遺伝子組換えカイコに対する侵襲性が低い標識タンパク質である。例えば、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質、外部形態を制御するタンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、及び外部分泌タンパク質は、特定の条件下で視覚的に検出可能なことから、遺伝子組換えカイコに対する侵襲性が非常に低く、判別及び選抜が容易なことから特に好適である。
【００５６】
前記蛍光タンパク質は、特定波長の励起光を遺伝子組換えカイコに照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、AmCyan、RFP、DsRed（DsRed monomer、DsRed2のような派生物を含む）、YFP、GFP（EGFP、EYFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
【００５７】
前記色素合成タンパク質は、色素の生合成に関与するタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。好ましくは個体の外部色彩として表れる色素である。例えば、メラニン系色素（ドーパミンメラニンを含む）、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
【００５８】
前記発光タンパク質は、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、イクオリン、酵素としてのルシフェラーゼが挙げられる。
【００５９】
本明細書において外部分泌タンパク質とは、細胞外又は体外に分泌されるタンパク質であり、外分泌性酵素等が該当する。外分泌性酵素には、ブラストサイジンのような薬剤の分解又は不活化に寄与し、宿主に薬剤耐性を付与する酵素の他、消化酵素が該当する。
【００６０】
標識遺伝子は、asRNA発現ベクターにおいて、前述したプロモーターの下流に発現可能な状態で配置される。使用するプロモーターは、asRNAコードDNAと同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００６１】
（５）インスレーター
インスレーターは、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けずに安定的に制御できる配列である。例えば、ニワトリのcHS4配列やショウジョウバエのgypsy配列などが挙げられる。
【００６２】
（６）トランスポゾンの逆位末端反復配列
トランスポゾンの逆位末端反復配列(Inverted terminal repeat sequence)（Handler AM. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:7520-5）は、asRNA発現ベクターが組換え可能なasRNA発現ベクターの場合に含まれ得る。逆位末端反復配列は、asRNA発現ベクターの上流及び下流に配置される。トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner、minos等を用いることができる（Shimizu,K. et al., 2000, Insect Mol. Biol., 9, 277-281；Wang W. et al.,2000, Insect Mol Biol 9（2）:145-55）。
【００６３】
（７）転写調節因子をコードするDNA
「転写調節因子をコードするDNA」とは、後述する第1サブユニットの必須エレメントであって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるGAL4タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるtTA及びその変異体等が挙げられる。
【００６４】
（８）転写調節因子の標的プロモーター
「転写調節因子の標的プロモーター」とは、後述する第2サブユニットの必須エレメントであって、第1サブユニットにコードされた転写調節因子が結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がGAL4タンパク質の場合には、UAS（Upstream Activating Sequence）が使用される。
【００６５】
（９）外因性遺伝子
外因性遺伝子は、前記定義で述べたように、絹糸腺内で発現可能な外来性の遺伝子であって、目的のペプチドをコードする。本態様の外因性遺伝子発現増強剤に含まれるasRNA発現ベクターの本来の機能は、Ser1〜Ser3やFib H鎖等の標的遺伝子の発現を抑制するasRNAを発現することである。したがって、目的のペプチドをコードする外因性遺伝子は、asRNA発現ベクターの構成には直接関連はしない。しかし、asRNAの目的は、前記標的遺伝子の発現を抑制することによって、間接的に外因性遺伝子の発現を増強し、目的のペプチドを効率的に生産することである。つまり、外因性遺伝子は、本態様の外因性遺伝子発現増強剤がその効果を発揮する上で必要となる対象物である。それ故、本態様の外因性遺伝子発現増強剤を投与する宿主昆虫が絹糸腺内で発現可能な外因性遺伝子を有さない場合には、本発明の目的を十分に達成し得ない。目的のペプチドをコードする外因性遺伝子は、通常、後述する他の遺伝子発現ベクター（外因性遺伝子発現ベクター）に含まれ、asRNA発現ベクターとは独立に、同一の宿主昆虫に導入される。しかし、その対象物たる外因性遺伝子を発現可能な状態でasRNA発現ベクターに含んでいてもよい。asRNA発現ベクターが外因性遺伝子を含む場合、外因性遺伝子が絹糸腺内で発現可能なように、その上流には前述した中部絹糸腺特異的プロモーター及び／又は後部絹糸腺特異的プロモーターを配置すればよい。
【００６６】
Ｂ．asRNA発現ベクターのユニット構成
asRNA発現ベクターは、1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合と、2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
【００６７】
（１）1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合
asRNA発現ベクターが1つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、そのasRNA発現ベクターを含む外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与するだけで、カイコ細胞内で目的のasRNAを発現し得る。このようなasRNA発現ベクターは、asRNAを発現する上で必要な全ての構成エレメントを1つのユニット内に含む。すなわち、必須の構成エレメントであるプロモーター及びそのプロモーターの下流に機能的に結合したasRNAコードDNAからなる1組の発現システムを少なくとも１つ含む。この1組の発現システムは、1つのプロモーター制御下にasRNAコードDNAを1つ含む系であってもよいし、asRNAコードDNAを2以上含む系であってもよい。
【００６８】
（２）2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合（図２）
asRNA発現ベクターが第1サブユニット及び第2サブユニットの2つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、asRNAを発現する上で必須の構成エレメントは2つのユニットのそれぞれに分かれて存在している。それ故に、その2つがカイコ細胞内に存在してはじめて1つのasRNA発現ベクターとして機能し、目的のasRNAを発現し得る。各サブユニットは以下の構成を有する。
【００６９】
第1サブユニットは、プロモーター及び該プロモーターの下流に機能的に結合した前述の転写調節因子をコードするDNAを含んでなる。図２A〜Cに、第1サブユニットを例示する。第1サブユニットで使用するプロモーターは、前記asRNAコードDNAの発現を制御するプロモーターと同様に、カイコ絹糸腺で機能し得るプロモーターを使用する。例えば、図２Aに示す後部絹糸腺プロモーターのように、Fib H、Fib L、又はp25等の後部絹糸腺で特異的かつ大量に合成されるタンパク質の遺伝子プロモーターや、図２Bに示す中部絹糸腺プロモーターのように、セリシンタンパク質等の中部絹糸腺で特異的かつ大量に合成されるタンパク質の遺伝子プロモーターが挙げられる。図２Cに示すように、プロモーター及び転写調節因子をコードするDNAからなる組を第1サブユニット内に複数組有し、それぞれのプロモーターを後部絹糸腺プロモーター及び中部絹糸腺プロモーターのように異なる組み合わせとすることもできる。なお、図２A〜Cでは、転写調節因子をコードするDNAとして、GAL4遺伝子を例示している。
【００７０】
第2サブユニットは、前記第1サブユニットにコードされた前述の転写調節因子の標的プロモーター及びその標的プロモーターの下流に機能的に結合したasRNAコードDNAを含んでなる。図２D及びEに、第2サブユニットの一例を示す。図２Dでは、GAL4の標的プロモーターとして、UASを例示している。また、第2サブユニットは、図２Dのように1つの標的プロモーター制御下にasRNAコードDNAを1つ含む系の他、図２Eのように1つの標的プロモーター制御下にasRNAコードDNAを2以上含む系であってもよい。なお、asRNA発現ベクターが目的のペプチドをコードする外因性遺伝子を含む場合、第2サブユニットに含む方が好ましい。
【００７１】
本構成のasRNA発現ベクターは、前述のように第1及び第2のサブユニットの1組で機能する。絹糸腺発現プロモーターの活性化により第1サブユニットから発現した転写調節因子が第2サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的のasRNAを発現する。また、第2サブユニットは同一の又は異なるasRNAコードDNAを含む2以上のサブユニットで構成されていてもよい。この場合、1つの第１サブユニットから発現した転写調節因子は、複数の第2サブユニットの標的プロモーターを活性化することで、それぞれの第2サブユニットにコードされたasRNAを発現することができる。
【００７２】
本構成のasRNA発現ベクターは、第1サブユニットにコードされた転写調節因子を介して第2サブユニットのasRNAコードDNAの発現を増幅させることができる。したがって、第1サブユニットの絹糸腺発現プロモーターの発現能が高くない場合には特に好適である。
【００７３】
本構成のasRNA発現ベクターは、第2サブユニットにおけるasRNAコードDNA領域のみをカセット式に他のasRNAコードDNA領域と交換するだけで、第1サブユニットは共通使用が可能な場合がある。つまり、第1サブユニットは既存の遺伝子発現ベクターや、それを導入した遺伝子組換えカイコ系統を利用することもできる。それ故、2つの遺伝子発現ユニットで構成されるasRNA発現ベクターは、発現ユニットや遺伝子組換えカイコを製造するコスト面や労力面からも便利である。
【００７４】
なお、asRNA発現ベクターが第1サブユニット及び第2サブユニットの2つのサブユニットで構成される場合、本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、原則として第1サブユニットを有効成分として含む第1外因性遺伝子発現増強剤と、第2サブユニットを有効成分として含む第2外因性遺伝子発現増強剤の2剤1組で構成される。上述のように第１サブユニットは共通使用が可能であることから、第1外因性遺伝子発現増強剤と第2外因性遺伝子発現増強剤は必ずしも1対1対応である必要はなく、第1外因性遺伝子発現増強剤を共通剤として、第2外因性遺伝子発現増強剤のみを交換した、様々な2剤1組の組み合わせの構成とすることもできる。また、本態様の外因性遺伝子発現増強剤を投与する宿主昆虫が、第1サブユニットを染色体内に既に有する遺伝子組換え昆虫であれば、本態様の外因性遺伝子発現増強剤は、その第1サブユニットに対応する第2サブユニットを有効成分とする第２外因性遺伝子発現増強剤のみで構成され得る。
【００７５】
１−３−２．担体
本発明の外因性遺伝子発現増強剤は、必要に応じて許容可能な担体を含むことができる。「許容可能な担体」とは、昆虫学分野において通常使用する溶媒や補助剤等が挙げられる。
【００７６】
溶媒には、例えば、水若しくは水溶液、又はカイコに対して許容可能な有機溶剤が挙げられる。水溶液としては、例えば、バッファー（リン酸塩緩衝液や酢酸ナトリウム緩衝液等）、生理食塩水や等張液が挙げられる。通常は、水若しくは水溶液が用いられる。
【００７７】
補助剤には、例えば、ヘルパーベクターが挙げられる。ヘルパーベクターは、例えば、トランスポゾン転移酵素をコードするDNAを含む。外因性遺伝子発現増強剤の有効成分であるasRNA発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列を有する場合に、ヘルパーベクターがトランスポゾン転移酵素を生産することで、asRNA発現ベクターの宿主昆虫の染色体内への挿入が達成され得る。ヘルパーベクターとしては、宿主昆虫がカイコの場合であれば、例えば、pHA3PIGが挙げられる。その他の補助剤としてブドウ糖、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
【００７８】
２．遺伝子組換えカイコ
２−１．概要
本発明の第２の態様は、遺伝子組換えカイコである。本態様の遺伝子組換えカイコは、前記第１態様に記載のasRNA発現ベクターを有することを特徴とする。本態様の遺伝子組換えカイコがさらに外因性遺伝子発現ベクターを有する場合には、asRNA発現ベクターから発現したasRNAがその標的となるセリシン又はFib H鎖等の内在性遺伝子の発現を抑制する。それによって、外因性遺伝子にコードされた目的のペプチドをカイコ絹糸腺内で効率的に生産することができる。
【００７９】
２−２．構成
本発明の遺伝子組換えカイコは、前記第１態様に記載のasRNA発現ベクターを有する。asRNA発現ベクターの構成については、第１態様に記載のasRNA発現ベクターと同じであることからその説明を省略し、ここでは本態様の遺伝子組換えカイコに特有の構成について説明をする。
【００８０】
遺伝子組換えカイコにおいて、第１態様に記載のasRNA発現ベクターは、カイコ細胞内に一過的に存在してもよいし、また染色体中に導入された状態等で安定的かつ継続的に存在してもよい。通常は、安定的かつ継続的に存在することが好ましい。
【００８１】
遺伝子組換えカイコは、第１態様に記載の異なる2以上のasRNA発現ベクターを有することができる。例えば、遺伝子組換えカイコは、1つの遺伝子発現ユニットで構成される発現ベクターと、2つの遺伝子発現ユニットで構成される発現ベクターの両方を有してもよい。その場合、それぞれのasRNA発現ベクターは、同一の又は異なるasRNAコードDNAを含むことができる。
【００８２】
遺伝子発現ユニットが上記のように第1サブユニット及び第2サブユニットの2つで構成され、それぞれがカイコの染色体上に存在する場合、各サブユニットは同一染色体上に存在していてもよいし、異なる染色体上に存在していてもよい。各サブユニットが異なる染色体上に存在する場合、第1サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換えカイコの系統と第2サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換えカイコの系統とを交配することによって、F1で第1サブユニットと第2サブユニットを有する本発明の遺伝子組換えカイコを容易に得ることができる。この場合、前記第1サブユニットのみを有する遺伝子組換えカイコの系統は、第1態様に記載したように、様々な第2サブユニットのみを有する遺伝子組換えカイコの系統との交配に共通使用することができる。
【００８３】
一方、第1サブユニット及び第2サブユニットが同一染色体上に存在する場合には、継代過程で組換えによってそれぞれが分離しないように、サブユニット間の距離が近く、互いに連鎖している方が好ましい。
【００８４】
本態様の遺伝子組換えカイコは、目的のペプチドをコードする外因性遺伝子を必ずしも含んでいる必要はない。前述のように、asRNA発現ベクターを有することで標的遺伝子の発現を抑制するという、本態様の遺伝子組換えカイコとしての機能を有しているからである。ただし、asRNA発現ベクターを有するという構成のみでは、カイコ絹糸腺で外因性遺伝子にコードされた目的のペプチドの生産効率を高めるという本発明の目的を達成し得ない。カイコ絹糸腺で目的のペプチドの生産効率を高めるためには、本態様の遺伝子組換えカイコがその機能を発揮すべき対象物である外因性遺伝子の存在が必要となる。したがって、本態様の遺伝子組換えカイコをタンパク質の大量生産系として用いる場合には、asRNA発現ベクターに加えて、目的のペプチドをコードする外因性遺伝子の発現システム（外因性遺伝子発現ベクター）をさらに有する必要がある。外因性遺伝子発現ベクターは、必要に応じて本態様の遺伝子組換えカイコが保有するようにしておけばよい。なお、asRNA発現ベクターが目的のペプチドをコードする外因性遺伝子を含む場合には、本態様の遺伝子組換えカイコは、asRNA発現ベクターを有することで本発明の目的も同時に達成し得る。
【００８５】
２−３．作出方法
本態様の遺伝子組換えカイコの作出方法は、前記第1態様に記載の発現ベクターから目的のasRNAを発現できる組換えカイコを作成できる方法であれば、いかなる方法も採用可能であり、特に限定はしない。そのような組換えカイコを作出する方法として、例えば、前記第１態様の外因性遺伝子発現増強剤を宿主であるカイコに投与する方法や、第1態様に記載のasRNA発現ベクターの第1サブユニットと第2サブユニットを異なる染色体上に有する遺伝子組換えカイコを交配する方法が挙げられる。
【００８６】
前記第1態様の外因性遺伝子発現増強剤をカイコに投与する方法は、外因性遺伝子発現増強剤の有効成分であるasRNA発現ベクターをカイコに導入することのできる当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、第1態様の外因性遺伝子発現増強剤をカイコ卵に投与する場合、遺伝子発現ベクターをカイコに導入するTamuraらの方法（Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）を利用することができる。具体的には、包含するasRNA発現ベクターが適当な濃度となるように外因性遺伝子発現増強剤を水やバッファー等の溶媒によって溶解又は希釈して、投与溶液を調製する。ここで、asRNA発現ベクターがasRNAコードDNAの両端にトランスポゾンの逆位末端反復配列を有する場合には、投与溶液にトランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するヘルパーベクターを加えてカイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。この時に用いるカイコは、野生型カイコであってもよいし、カイコ絹糸腺で目的のペプチドを生産する外因性遺伝子発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコであってもよい。また、外因性遺伝子発現増強剤がヘルパーベクターを含む場合には、前記投与溶液をそのままカイコの発生初期卵にインジェクションすればよい。その後、選抜マーカーに基づいて形質転換体を選抜することによって、目的の遺伝子組換えカイコを得ることができる。この方法で得られた遺伝子組換えカイコでは、外因性遺伝子発現増強剤中のasRNA発現ベクターがトランスポゾンの逆位末端反復配列を介して染色体中に組み込まれている。この遺伝子組換えカイコを必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、染色体に挿入された発現ベクターのホモ接合体を得てもよい。
【００８７】
一方、第１態様に記載の発現ベクターの第1サブユニットと第2サブユニットを、それぞれ異なる染色体上に有する遺伝子組換えカイコを交配し、本発明の遺伝子組換えカイコを作出する方法も当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、まず、それぞれのサブユニットを含む第1外因性遺伝子発現増強剤と第2外因性遺伝子発現増強剤を、それぞれ別個のカイコに投与する。投入方法は、前記と同様に遺伝子発現ベクターをカイコに導入する方法、例えば、Tamuraらの方法によって行えばよい。この時に、例えば、染色体上に第1サブユニットを有する遺伝子組換えカイコが既に確立されており、それを利用できる場合には、その第1サブユニットに対応する第2サブユニットを含む第2外因性遺伝子発現増強剤のみをカイコに導入すればよい。例えば、セリシンプロモーターのような中部絹糸腺プロモーターの下流にGAL4タンパク質をコードする遺伝子を配置した第1サブユニットを染色体中に有する遺伝子組換えカイコが既に確立されており、それを利用可能な場合には、GAL4タンパク質の標的配列であるUASプロモーターの下流に目的のasRNAコードDNAを配置した第2サブユニットを有効成分として含む第2外因性遺伝子発現増強剤のみをカイコに投与して、第2サブユニットを染色体上に有する遺伝子組換えカイコを作出すればよい。得られたそれぞれのサブユニットを有する遺伝子組換えカイコは、兄妹交配又は同系交配を行い、各サブユニットに関してホモ接合体にしておくことが好ましい。次に、それぞれのサブユニットを有する遺伝子組換えカイコを交配して、2つのサブユニットを有するF1個体を選抜することによって、目的の遺伝子組換えカイコを得ることができる。選抜は、第1及び第2サブユニットのそれぞれの選抜マーカーに基づいて行えばよい。
【００８８】
本態様の遺伝子組換えカイコを作出後、必要に応じて外因性遺伝子発現ベクターをさらに導入することもできる。この場合、外因性遺伝子発現ベクターの本態様の遺伝子組換えカイコへの導入方法は、前記と同様の方法で行えばよい。
【００８９】
３．ペプチド製造方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、ペプチド製造方法である。本態様の製造方法によれば、遺伝子組換えカイコの絹糸腺で、セリシンやFib H鎖等の夾雑タンパク質の発現を抑制しながら、外因性遺伝子がコードする目的のペプチドを効率的に製造することができる。
【００９０】
３−２．材料 
本態様のペプチド製造方法では、タンパク質の大量生産系として遺伝子組換えカイコを用いる。本態様で用いる遺伝子組換えカイコは、第１態様に記載のasRNA発現ベクター、及び外因性遺伝子発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコである。つまり、外因性遺伝子発現ベクターを有する前記第２態様の遺伝子組換えカイコと換言することができる。
【００９１】
本態様で使用する遺伝子組換えカイコが有する外因性遺伝子発現ベクターは、本態様のペプチド製造方法において製造すべき目的のペプチドをコードする外因性遺伝子を包含する。
【００９２】
３−３．製造方法
本発明の製造方法は、飼育工程及び回収工程を含む。以下、各工程について説明をする。
【００９３】
（１）飼育工程
「飼育工程」とは、遺伝子組換えカイコを飼育する工程である。遺伝子組換えカイコの飼育方法については、当該分野で公知のカイコの飼育技術に従って飼育すればよい。例えば、「蚕種総論；高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を参照するとよい。飼料には、クワ属（Morus）の葉のような食草樹種の天然葉を用いてもよいし、シルクメイトL4M若しくは原蚕種1−3齢用（日本農産工業）のような人工飼料を用いてもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できる点から、人工飼料が好ましい。以下、遺伝子組換えカイコの簡単な飼育方法について、一例を挙げて説明する。
【００９４】
掃立ては、適当な頭数（例えば、4〜10頭）の同系の遺伝子組換えカイコの雌が産卵した卵で行う。孵化した幼虫は、卵台紙から蚕座である防乾紙（パラフィン加工紙）を敷いた容器内に移し、シルクメイト等の人工飼料を防乾紙上に並べて給餌する。餌の交換は、原則として1〜2齢では各1回、3齢では1〜3回行う。古い餌は食べ残しが多い場合には腐敗防止のため除去する。4〜5齢の壮カイコ幼虫時の飼育には、大型容器に移し、容器あたりの頭数を適宜調整する。湿度や容器内の状態により、容器に防乾紙、アクリル、又はメッシュ製のフタをしてもよい。飼育温度は、全齢を通して25〜28℃で飼育する。
【００９５】
（２）回収工程
「回収工程」とは、遺伝子組換えカイコの幼虫が絹糸腺内に蓄積した目的のペプチドを回収する工程である。
【００９６】
本態様で使用する遺伝子組換えカイコは、主に幼虫の終齢後期から外因性遺伝子が発現し、それがコードする目的のペプチドを絹糸腺細胞内に蓄積する。この遺伝子組換えカイコから目的のペプチドを回収する方法は限定しない。例えば、終齢後期から前蛹期に虫体から絹糸腺を摘出して、目的のペプチドを直接回収する方法が挙げられる。具体的方法は、当該分野で公知の方法によって達成することができる。例えば、終齢（5齢）6日目の吐糸直前カイコを氷上で麻酔にかけた後、背側を切開してピンセット等で絹糸腺を傷つけないように摘出すればよい（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂, 1970，pp．249-255参照）。摘出した絹糸腺を、例えば、前記抽出バッファー中で0〜10℃、好ましくは0〜5℃の温度下にて緩やかに振盪させて、目的のペプチドをバッファー中に溶出させることができる。目的のペプチドが熱感受性ペプチドでなければ、10〜40℃の温度下で行ってもよい。その後、遠心又は濾過によって組織片等の夾雑物を除去し、目的のペプチドを含む上清を回収すればよい。
【実施例】
【００９７】
＜実施例１：Ser1 asRNAによるSer1遺伝子の発現抑制＞
（目的）
中部絹糸腺特異的タンパク質であるセリシン1（Ser1）の遺伝子発現を、Ser1遺伝子に対するasRNAで抑制できることを立証する。【００９８】
（方法）
１．カイコ中部絹糸腺特異的発現ベクターの作製
カイコ中部絹糸腺特異的に発現可能な発現ベクターとして、Ser1遺伝子に対するasRNA（「Ser1 asRNA」と表記する）を発現するSer1 asRNA発現ベクター、及びSer1遺伝子に対するshRNA(「Ser1 shRNA」と表記する。なお、本明細書におけるshRNAは、ヘアピン構造を有するlong dsRNAも含むものとする。)を発現するSer1 shRNA発現ベクターを作製する。【００９９】
（１）UASバックボーンプラスミドの作製
pAmCyan1-N1(Takara)を鋳型として、AmCyankozakU（配列番号２３）及びSV40PCRL（配列番号２４）をプライマーペアに用いてPCR増幅し、pZErO-2ベクター(life technologies)へ挿入した。これをAmCyan/pZero2とする。【０１００】
また、pEYFP-N1(clonetech)を鋳型として、EYFPkozakU（配列番号２５）及びSV40PCRLをプライマーペアに用いてPCR増幅し、pZErO-2ベクター(life technologies)へ挿入した。これEYFP/pZero2とする。【０１０１】
AmCyan/pZero2とEYFP/pZero2をNcoI-NotIで切断し、得られたNcoI-NotI断片を
pBac[SerUAS/3xP3EGFP] (Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87)のNcoI-NotI部位へ挿入することによって、マーカー遺伝子をEGFPからAmCyan又はEYFPへ置換した。これらのプラスミドを、pBac[SerUAS/3xP3AmCyan]又はpBac[SerUAS/3xP3EYFP]とした。【０１０２】
（２）Ser1断片のクローニング
カイコ白/C系統の5齢6日目の中部絹糸腺から総RNAを抽出した（Isogen ニッポンジーン）。総RNAをoligo dT primer（プロメガ）と逆転写酵素(ReverTra Ace TOYOBO)を用いて逆転写し、cDNAを得た。得られたcDNAを鋳型として、SpeSer1B130U23（配列番号２６）及びBlnSer1B1636L23（配列番号２７）、並びにBlnSer1B130U23（配列番号２８）及びSpeSer1B1636L23（配列番号２９）の2種類のプライマーペアを用いてPCRを行い、Ser1の5’側の断片を得た。これらの核酸断片を、5’Ser1SB及び5’Ser1BSとした。【０１０３】
また、同様に得られたcDNAを鋳型として、SpeSer1B1531U24（配列番号３０）及びBlnSer1B3108L23（配列番号３１）、並びにBlnSer1B1531U24（配列番号３２）及びSpeSer1B3108L23（配列番号３３）の2種類のプライマーペアを用いてPCRを行い、Ser1の3’側の断片を得た。これらの核酸断片を3’Ser1SB及び3’Ser1BSとした。【０１０４】
（３）shRNAリンカーの作製
shRNAのループ部分に相当するリンカーを作製した。カイコ白/C系統のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーペアにBlnA3intU（配列番号３４）及びSpeA3IntL（配列番号３５）を用いてアクチン3のイントロンをPCR増幅した。得られた核酸断片をリンカーA3intBSとした。【０１０５】
（４）Ser1 asRNA発現ベクターの作製
上記（１）で作製したpBac[SerUAS/3xP3AmCyan]のBlnI部位に5’Ser1SBをBlnIが5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan]（図３A)とした。pBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan]は、反復配列領域を含まないSer1遺伝子の5’側領域を標的部位とする5’Ser1 asRNAを発現する5’Ser1 asRNA発現ベクターである。【０１０６】
また、pBac[SerUAS/3xP3EYFP]のBlnI部位に3’Ser1SBをBlnIが5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]（図３B)）とした。pBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]は、Ser1遺伝子の3’側に存在する反復配列領域を標的部位とする3’Ser1 asRNAを発現する3’Ser1 asRNA発現ベクターである。3’Ser1 asRNA発現ベクターは、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第2サブユニットに相当する。【０１０７】
（５）Ser1 shRNA発現ベクターの作製
5’Ser1 asRNA発現ベクターのBlnI部位にリンカーA3intBSをBlnI部位が5’側になるように挿入し、さらに5’Ser1BSをBlnI部位が5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan]（図４A）とした。pBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan]は、Ser1遺伝子の5’側領域を標的部位とする5’Ser1 shRNAを発現する5’Ser1 shRNA発現ベクターである。【０１０８】
また、3’Ser1 asRNA発現ベクターのBlnI部位にリンカーA3intBSをBlnI部位が5’側になるように挿入し、さらに3’Ser1BSをBlnI部位が5’側になるように挿入した。このプラスミドをpBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]（図４B）とした。pBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]は、Ser1遺伝子の3’側に存在する反復配列領域を標的部位とする3’Ser1 shRNAを発現する3’Ser1 shRNA発現ベクターである。【０１０９】
２．遺伝子組換えカイコの作出
（１）発現ベクターの導入
上記「１．カイコ中部絹糸腺特異的発現ベクターの作製」で作製したSer1 asRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-5’asSer1/3xP3AmCyan]、pBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]及びSer1 shRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-5’dsSer1/3xP3AmCyan]及びpBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]を、それぞれ別個にトランスポゾン転移酵素を発現するヘルパープラスミドpHA3PIG （Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）と1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は、25〜27℃の飼育室で全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した（Uchino K. et al., 2006, J Insect Biotechnol Sericol, 75:89-97）。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1卵をそれぞれの選抜マーカーである3xP3EYFPマーカー又は3xP3AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。【０１１０】
（２）中部絹糸腺GAL4系統との交配
上記「（１）発現ベクターの導入」で得られた各遺伝子組換えカイコ系統を3系統ずつ図５に示すpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2（Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87）を有する遺伝子組換えカイコ系統と交配した。ここで、pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2は、中部絹糸腺特異的にGAL4遺伝子を発現する中部絹糸腺GAL4発現ベクターで、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。F1個体において、Ser1 asRNA発現ベクター又はSer1 shRNA発現ベクター（第2サブユニット）、及びpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2（第1サブユニット）の両方を有する系統を、3xP3EYFPマーカー又は3xP3AmCyanマーカー、及び3xP3DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Ser1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを得た。第2サブユニットを有する遺伝子組換えカイコを3系統ずつ用いたことから、Ser1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコもそれぞれ3系統ずつ得た。【０１１１】
３．Ser1 mRNAの定量
上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出したSer1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて、各遺伝子組換えカイコの中部絹糸腺におけるSer1遺伝子の発現抑制効果について検証した。【０１１２】
各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から中部絹糸腺を摘出し、ISOGEN(ニッポンジーン)を用いて総RNAを抽出した。総RNAをoligo dT プライマー(プロメガ)と逆転写酵素(ReverTra Ace TOYOBO)を用いて逆転写し、cDNAを調製した。得られたcDNAを鋳型として、Ser1LC3364（配列番号３６）とSer1LC3528L（配列番号３７）のプライマーペアを用いて、Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green (ロシュ)によりSer1のmRNAの定量的PCRを行った。内部標準にはrp49LCF2（配列番号３８）とrp49LCR1（配列番号３９）のプライマー対を用いて、同様に定量的PCRを行った。【０１１３】
４．Ser1タンパク質量の検証
タンパク質レベルでもSer1タンパク質の合成が抑制されていることを、上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出したSer1 asRNA又はSer1 shRNAを中部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて確認した。各遺伝子組換えカイコを飼育して、繭を得た後、繭10 mgに対てし1 mLの50 mM Tris-HCl (PH8.0)/8 M 尿素/10 mM DTTを加え、80℃で5分間インキュベートすることにより、繭タンパク質を抽出した。繭タンパク質32.5μLに対し12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer（インビトロジェン）と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent（インビトロジェン）を加え、70℃で10分間加温してSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、EZ stain aqua（ATTO）で染色した。【０１１４】
（結果）
上記「３．Ser1 mRNAの定量」の結果を図６に示す。この図は、陰性対照の遺伝子組換えカイコ（図６の第2サブユニットを「−」で示した系統）のSer1 mRNA転写量を1としたときの相対値を表す。5’Ser1 shRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、3’Ser1 shRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、5’Ser1 asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコ、及び3’Ser1 asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコのいずれの群もSer1遺伝子に対する発現抑制が確認された。各群における3系統（第2サブユニット1、2、3に相当）のSer1mRNA量の平均相対値を上部に示した。【０１１５】
一本鎖RNAで構成され、分子内二本鎖RNA領域を形成しないasRNAのうち、5’Ser1 asRNAを発現する群は、従来説通り、分子内二本鎖RNA領域を形成するshRNAを発現する2群と比較して、Ser1遺伝子の発現抑制効果が非常に低かった。一方、Ser1の反復配列領域を標的部位とする3’Ser1 asRNAを発現する群は、asRNAであるにもかかわらず、shRNA以上のSer1遺伝子の発現抑制効果を示した。この結果は、Ser1タンパク質の反復配列領域を標的部位とするasRNAは、他の領域を標的部位とした場合よりも中部絹糸腺においてSer1タンパク質の遺伝子発現を効果的に抑制することを示している。【０１１６】
上記「４．Ser1タンパク質量の検証」の結果を図７に示す。各繭タンパク質の位置をSDS-PAGEの右に示した。Ser1タンパク質は選択的スプライシングにより、分子量の異なる2本のバンドとして表れる。第１サブユニットのみを有する遺伝子組換えカイコ系統（UAS -；GAL4 +）、及び第1サブユニットを有さず、第2サブユニットのみを有する遺伝子組換えカイコ系統（UAS 3；GAL4 -）を対照とした。【０１１７】
タンパク質レベルでもmRNAレベルの実験と同様の結果が得られた。すなわち、対照以外の全ての遺伝子組換えカイコでSer1タンパク質の合成が抑制されていることが確認された。一方、同じ繭タンパク質であるSer3タンパク質やFib H鎖タンパク質の合成量は対照と同程度であった。これは、Ser1 asRNA発現ベクター又はshRNA発現ベクターから発現するasRNA又はshRNAがSer1遺伝子の発現を特異的に抑制することを示している。【０１１８】
＜実施例２：Fib H鎖遺伝子に対するasRNAによるFib H遺伝子の発現抑制＞
（目的）
実施例１では、中部絹糸腺特異的なタンパク質Ser1の遺伝子に対するasRNAの発現抑制効果を立証した。そこで、本実施例では、後部絹糸腺特異的タンパク質であるフィブロインH（Fib H）鎖についても同様にFib H遺伝子の反復配列領域に対するasRNAでFib H遺伝子の発現を抑制できることを立証する。【０１１９】
（方法）
１．カイコ後部絹糸腺特異的発現ベクターの作製
カイコ後部絹糸腺特異的に発現可能な発現ベクターとして、Fib H鎖遺伝子に対するasRNAを発現するFib-H asRNA発現ベクターを作製する。【０１２０】
（１）UASバックボーンプラスミドの作製
BsmBIadapU（配列番号４０）とBsmBIadapL（配列番号４１）をアニーリングしてBsmBIアダプターを作製した。実施例１で作製したpBac[SerUAS/3xP3AmCyan]のBlnI部位にBsmBIアダプターを挿入した。得られたプラスミドをpBac[SerUAS-BsmBI/3xP3AmCyan]とした。【０１２１】
（２）Fib H鎖の反復配列領域のクローニング
カイコ大造系統のゲノムDNAをFibHU（配列番号４２）とFibHL（配列番号４３）のプライマーペアでPCRし、Fib H鎖遺伝子の反復配列領域を増幅した。得られた複数種の断片より選択した2断片をそれぞれFibH1、FibH2とする。FibH1(1196bp)とFibH2(1433bp)をBsmBIで切断し、前記pBac[SerUAS-BsmBI/3xP3AmCyan]のBsmBI部位にアンチセンス鎖を発現する方向で挿入した。得られたプラスミドをそれぞれpBac[SerUAS-asFib1/3xP3AmCyan]（図８A）及びpBac[SerUAS-asFib2/3xP3AmCyan]（図８B）とした。これらは、いずれもFib H鎖遺伝子の反復配列領域に対するasRNA（「Fib-H asRNA」と表記する）コードDNAを含むFib-H asRNA発現ベクターであって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。【０１２２】
２．組換えカイコの作出
（１）発現ベクターの導入
pBac[SerUAS-asFib1/3xP3AmCyan]及びpBac[SerUAS- asFib2/3xP3AmCyan]をそれぞれ前記ヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は、25〜27℃の飼育室で全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1卵を3xP3 AmCyanによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。FibH1及びFibH2の2群の遺伝子組換えカイコについて、それぞれ2系統及び3系統選択し、次の後部絹糸腺GAL4系統との交配に用いた。【０１２３】
（２）後部絹糸腺GAL4系統との交配
上で得られた遺伝子組換えカイコ系統をpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]（Sezutsu H. et al, 2009, Journal of Insect Biotechnology and sericology, 78,1-10）を有する遺伝子組換えカイコ系統と交配した。pBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]（図９）は、後部絹糸腺で活性を有するFib Hプロモーターの下流にGAL4遺伝子を連結した後部絹糸腺GAL4発現ベクターであって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。F1個体において、Fib-H asRNA発現ベクター（第2サブユニット）及びpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]（第1サブユニット）の両方を有する系統を、3xP3AmCyanマーカー及び3xP3DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Fib H鎖に対するasRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを得た。【０１２４】
３．Fib H鎖mRNAの定量
上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出したFib-H asRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて、後部絹糸腺におけるFib H鎖遺伝子発現の抑制効果について検証した。【０１２５】
各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から後部絹糸腺を摘出し、ISOGEN(ニッポンジーン)を用いて総RNAを抽出した。総RNAをoligo dTプライマー(プロメガ)と逆転写酵素(ReverTra Ace TOYOBO)を用いて逆転写し、cDNAを調製した。得られたcDNAを鋳型として、FibHLCU（配列番号４４）とFibHLCL（配列番号４５）のプライマーペアを用い、Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green (ロシュ)により、Fib H鎖のmRNAの定量的PCRを行った。内部標準にはrp49LCF2とrp49LCR1のプライマーペアを用いて、同様に定量的PCRを行った。【０１２６】
４．Fib H鎖タンパク質量の検証
タンパク質レベルでもFib H鎖タンパク質の合成が抑制されていることを、上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出したFib-H asRNAを後部絹糸腺特異的に発現する遺伝子組換えカイコを用いて確認した。各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、後部絹糸腺と中部絹糸腺に分離した。後部絹糸腺又は中部絹糸腺を1本あたり5 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8.0)/8 M 尿素/2% SDS/25 mM DTTに入れて、一晩、室温で振とうし、絹糸腺タンパク質を抽出した。Fib H鎖遺伝子が後部絹糸腺特異的に発現するにもかかわらず、中部絹糸腺のタンパク質についても検証する理由は、Fib H鎖タンパク質は、後部絹糸腺内で合成後に中部絹糸腺に移行するため、後部絹糸腺のみならず中部絹糸腺にも存在するからである。絹糸腺タンパク質5μLに対しH2O 27.5 μL、12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer（インビトロジェン）と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent（インビトロジェン）を加え、70℃で10分間加温しSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、EZ stain aqua（ATTO）で染色した。【０１２７】
（結果）
上記「３．Fib H鎖 mRNAの定量」の結果を図１０に示す。この図は、対照の遺伝子組換えカイコ（図１０の第2サブユニットを「−」で示した系統）のFib H鎖 mRNA転写量を1としたときの相対値を表す。Fib-H asRNA発現ベクターを有する遺伝子組換えカイコFibH1及びFibH2は、いずれもFib H鎖遺伝子の発現抑制が確認された。この結果は、カイコ絹糸腺タンパク質の反復配列領域に対するasRNAが中部絹糸腺特異的なタンパク質のみならず、後部絹糸腺特異的なタンパク質に対しても有効であることを示している。【０１２８】
上記「４．Fib H鎖タンパク質量の検証」の結果を図１１に示す。Fib H鎖タンパク質及びSer1タンパク質の位置をSDS-PAGEの右に示した。白/C系統は、本実施例の遺伝子組換えカイコのベースとなった非組換えカイコである。Nd系統はFib H鎖遺伝子の発現が低く、またNd-sD系統はFib L鎖遺伝子の発現が低い、カイコの変異系統である。なお、Nd系統及びNd-sD系統は、後部絹糸腺の退縮により、Fib H鎖及びFib L鎖遺伝子の双方の発現が減少する。遺伝子組換えカイコ系統（UAS -；GAL4 +）は、第1サブユニット（GAL4）のみを有し、第2サブユニット（UAS-FibH as mRNA）を有さないカイコである。これらは本実施例の対照である。【０１２９】
タンパク質レベルでもmRNAレベルの実験と同様の結果が得られた。すなわち、Fib-H asRNA発現ベクターの2つのサブユニットを有する遺伝子組換えカイコでは、いずれの系統も中部絹糸腺のFib H鎖タンパク質量が対照（UAS -；GAL4 +）と比較して顕著に減少した。これは、後部絹糸腺でFib-H asRNAの発現によりFib H鎖タンパク質の合成が抑制されて新たなFib H鎖タンパク質が合成されなくなった結果、後部絹糸腺内腔から中部絹糸腺内腔へ押し出されるFib H鎖タンパク質量が低下したことを示している。【０１３０】
一方、同じ絹糸腺タンパク質であるSer1タンパク質の中部絹糸腺での合成量は対照（UAS -；GAL4 +）と同程度であり、Fib-H asRNA発現ベクターから発現するFib-H asRNAがFib-H鎖遺伝子の発現を特異的に抑制することがタンパク質レベルでも示された。【０１３１】
＜実施例３：Ser1 asRNA及びFib-H asRNAによるSer1及びFib H鎖の遺伝子発現抑制＞
（目的）
Ser1及びFib Hのそれぞれの遺伝子の反復配列領域に対するasRNAを組み合わせて、同時に発現した場合にもSer1遺伝子とFib H鎖遺伝子の発現を同時に抑制できることを立証する。【０１３２】
（方法）
１．カイコ中部絹糸腺及び後部絹糸腺発現ベクターの作製
（１）Fib-H as RNA及びSer1 asRNAの同時発現UASベクター（UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクター）の作製
pBac[SerUAS-asFibH1/3xP3AmCyan]のBlnI部位に実施例1で調製した3’Ser1SBを挿入しpBac[SerUAS-3’asSer1_asFibH1/3xP3AmCyan]（図１２A）を作製した。このプラスミドはUASプロモーターの下流に3’Ser1 asRNAコードDNAとFib-H asRNAコードDNAをタンデムに配置した発現ベクター（UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクター）であって、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第2サブユニットに相当する。【０１３３】
（２）中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターの作製
AscI.adU（配列番号４６）とAscI.adL（配列番号４７）をアニーリングして、AscIアダプターを作製した。図９に示したpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]のAscI部位にAscIアダプターを挿入し、pBacFibH-pro GAL4_AscI-BlnI/3xP3DsRed2を作製した。さらにこのプラスミドのAscI-BlnI部位にpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2のAscI-SpeI断片を挿入して中部及び後部絹糸腺の両方でGAL4遺伝子を発現する中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターであるpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2（図１２B）を作製した。この発現ベクターは、本発明の外因性遺伝子発現増強剤を有効成分として含むasRNA発現ベクターの第1サブユニットに相当する。【０１３４】
２．組換えカイコの作出
（１）発現ベクターの導入
中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターであるpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2とUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクターであるpBac[SerUAS-3’asSer1_asFibH1/3xP3AmCyan]を、それぞれ別個に実施例1に記載のヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にそれぞれインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は25〜27℃の飼育室にて全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1から、中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターをインジェクションした中部＆後部絹糸腺GAL4系統は3xP3 DsRed2マーカーによる眼の蛍光の有無で、またUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA発現ベクターをインジェクションしたUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統は3xP3 AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で、それぞれ選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。【０１３５】
（２）中部＆後部絹糸腺GAL4系統とUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統の交配
中部＆後部絹糸腺GAL4系統とUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統を交配した。また、対照用として、実施例１で用いた中部絹糸腺GAL4発現ベクターpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する遺伝子組換えカイコ系統、又は実施例２で用いた後部絹糸腺GAL4発現ベクターpBac[BmFibHL-GAL4/3xP3-DsRed]を有する遺伝子組換えカイコ系統とSer1-FibH1 asRNA系統とを交配した。F1個体において、中部＆後部絹糸腺GAL4系統及びUAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統の両方を有する系統を3xP3DsRed2マーカー及び3xP3AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、Fib-H asRNA及びSer1 asRNAを中部絹糸腺及び／又は後部絹糸腺で同時に発現する遺伝子組換えカイコを得た。【０１３６】
３．Ser1タンパク質量及びFib H鎖タンパク質量の検証
上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出した遺伝子組換えカイコを用いてSer1タンパク質量及びFib H鎖タンパク質量について検証した。各遺伝子組換えカイコの5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、後部絹糸腺と中部絹糸腺に分離した。後部絹糸腺又は中部絹糸腺を1本あたり5 mLの20 mM Tris-HCl(pH 8.0)/8 M 尿素/2% SDS/25 mM DTTに入れ、一晩、室温で振とうし、絹糸腺タンパク質を抽出した。絹糸腺タンパク質5μLにH2O 27.5 μL、12.5μLのNuPAGE LDS Sample Buffer（インビトロジェン）と5μLのNuPAGE Sample Reducing Agent（インビトロジェン）を加え、70℃で10分間加温しSDS化した。SDS化したサンプルを4% SDS-PAGEゲルを用いて電気泳動した後、CBCで染色した。【０１３７】
（結果）
図１３に結果を示す。第1サブユニットに後部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、対照（UAS -；GAL4 +）と比較して中部絹糸腺におけるFib H鎖タンパク質量が減少した。これは、実施例２の結果と一致するまた、第1サブユニットに中部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、中部絹糸腺におけるSer1タンパク質がほとんど失われた。これは、中部絹糸腺発現用GAL4ベクターにより、中部絹糸腺でSer1 asRNAが発現し、Ser1遺伝子の発現を抑制したことを示している。一方、第1サブユニットに中部＆後部絹糸腺発現用GAL4ベクターを用いた場合、中部及び後部絹糸腺の両方でFib-H asRNAとSer1 asRNAが発現する。それにより、Ser1遺伝子とFib H鎖遺伝子の両方が同時に、かつ効率的に発現抑制された。【０１３８】
＜実施例４：Ser1 asRNAによる外因性遺伝子の発現増強＞
（目的）
実施例１及び３から、Ser1 asRNAによりSer1遺伝子の発現が抑制されることが立証された。そこで、Ser1遺伝子の発現抑制により、外因性遺伝子の発現を増強できることを立証する。【０１３９】
（方法）
１．外因性遺伝子発現ベクターの作製
実施例１で作製したUASバックボーンプラスミドAmCyan/pZero2をNcoI-NotIで切断し、AmCyan遺伝子断片を切り出した。得られた断片をpBac[SerUAS-ser_int-EGFP/3xP3EGFP] （図１４A） (Tatematsu K. et al., 2010, Transgenic Research, 19(3):473-87)のNcoI-NotI部位へ挿入した。これによりpBac[SerUAS-ser_int-EGFP/3xP3EGFP]における標識遺伝子をEGFPからAmCyanに置換した。得られたUAS-EGFP発現ベクターをpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyan（図１４B）とした。【０１４０】
２．組換えカイコの作出
（１）外因性遺伝子発現ベクターの導入
前記「１．外因性遺伝子発現ベクターの作製」で作製したUAS-EGFP発現ベクターpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyanを、実施例１に記載のヘルパープラスミドpHA3PIGと1:1の割合で混合し、産卵後2〜8時間のw1-pnd系統のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵を加湿状態下、25℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫は25〜27℃の飼育室にて全齢を人工飼料（シルクメイト原種1-3齢S、日本農産工）で飼育した。人工飼料は2〜3日毎に交換した。羽化後、兄妹交配を行った。得られたF1を3xP3 AmCyanマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、遺伝子組換えカイコ系統を得た。この遺伝子組換えカイコ系統をUAS-EGFP系統とした。【０１４１】
（２）中部絹糸腺GAL4系統、3’Ser1 asRNA系統及びUAS-EGFP系統の交配
中部絹糸腺発現用GAL4ベクターとしてpBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する中部絹糸腺GAL4系統（第1サブユニット系統に相当）と、3’Ser1 asRNA発現ベクターpBac[SerUAS-3’asSer1/3xP3EYFP]を有するUAS-3’Ser asRNA系統（第2サブユニット系統に相当）、及び「（１）外因性遺伝子発現ベクターの導入」で得たpBacSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyanを有するUAS-EGFP系統の交配を行った。比較用として、前記中部絹糸腺GAL4系統と、3’Ser1 shRNA発現ベクターpBac[SerUAS-3’dsSer1/3xP3EYFP]を有するUAS-3’Ser shRNA系統、及び前記UAS-EGFP系統の交配を行った。また、陰性対照用として、前記中部絹糸腺GAL4系統と前記UAS-EGFP系統のみの交配を行った。一個体に3種類の遺伝子発現ベクターを有する系統、又は2種類の遺伝子発現ベクターを有する陰性対照用系統を、それぞれの発現ベクターのマーカーに基づいて眼の蛍光の有無により選抜した。これによって、中部絹糸腺特異的にEGFP遺伝子を発現し、かつSer1遺伝子の発現抑制を起こす系統と起こさない系統を得た。【０１４２】
３．絹糸腺におけるEGFPタンパク質の定量
上記「２．遺伝子組換えカイコの作出」で作出した各遺伝子組換えカイコを用いてEGFPタンパク質量について検証した。5齢6日目の幼虫から中部絹糸腺を摘出し、1本当たり10 mLのPBS(pH 7.2)/1%Tween20/0.05%アジ化ナトリウムに入れて、室温で24時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、2,000×g で10分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のEGFPタンパク質濃度をReacti-Bind Anti-GFP Coated Plates（PIERCE）で測定した。具体的にはReacti-Bind Anti-GFP Coated Platesに上清液を100 μL添加し、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)を添加して、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad)を用いて発色反応を行い、1N 硫酸を加えて反応を停止させた。発色をplate reader (SpectraMax 250; Molecular Devices)で定量した。リコンビナントGFPタンパク質（タカラバイオ; Z2373N）の系列希釈液（1-400pg/μL）を用いて標準曲線を作製した。【０１４３】
（結果）
図１５に各系統の1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す。3’Ser1 asRNAを発現する系統は、対照（図１５の「−」）と比較して、約2倍のEGFPタンパク質量の上昇を示した。これは、中部絹糸腺でSer1遺伝子の反復配列領域に対する3’Ser1 asRNAが発現することによってSer1遺伝子の発現が抑制された結果、外因性遺伝子（ここではEGFP遺伝子）の発現が増強したことを示している。一方、3’Ser1 shRNAによるSer1遺伝子の発現抑制でもEGFPタンパク質量は増加したが、3’Ser1 asRNAと比較して、その増加量は低かった。【０１４４】
＜実施例５：Ser1 asRNA及びFib-H asRNAの発現による外因性遺伝子の発現増強＞
（目的）
Ser1 asRNA及びFib-H asRNAを組み合わせて発現し、Ser1遺伝子とFib H遺伝子の発現を同時に抑制することにより、外因性遺伝子の発現をより増強できることを検証した。【０１４５】
（方法）
１．組換えカイコの作出
実施例３で調製した中部＆後部絹糸腺GAL4発現ベクターpBacFibH-pro GAL4_Ser-pro GAL4/3xP3DsRed2を有する中部＆後部絹糸腺GAL4系統、UAS-3’Ser1-FibH1 asRNA系統及び実施例４で調製したUAS-EGFP系統を交配した。また、対照用として、中部＆後部絹糸腺GAL4系統とUAS-EGFP系統のみを交配した。各発現ベクターのマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、絹糸腺特異的にEGFPを発現し、かつ、Fib-H asRNA及びSer1 asRNAを中部絹糸腺及び／又は後部絹糸腺で同時に発現する遺伝子組換えカイコをそれぞれ3系統得た。【０１４６】
２．絹糸腺におけるEGFPタンパク質の定量
上記「１．遺伝子組換えカイコの作出」で作出した各遺伝子組換えカイコを用いて、EGFPタンパク質量について検証した。5齢6日目の幼虫から絹糸腺を摘出し、1本当たり20 mLのPBS(pH 7.2)/1%Tween20/0.05%アジ化ナトリウムに入れて、室温で24時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、2,000×g で10分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のEGFPタンパク質濃度をReacti-Bind Anti-GFP Coated Plates（PIERCE）で測定した。具体的にはReacti-Bind Anti-GFP Coated Platesに上清液を100 μL添加し、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)を添加して、室温で1時間静置した。PBS/0.05% Tween 20で3回洗浄した後、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad)を用いて発色反応を行い、1N 硫酸を加えて反応を停止させた。発色をplate reader (SpectraMax 250; Molecular Devices)で定量した。リコンビナントGFPタンパク質（タカラバイオ; Z2373N）の系列希釈液（1-400pg/μL）を用いて標準曲線を作製した。【０１４７】
（結果）
図１６に各系統1個体あたりのEGFPタンパク質量を示す。3’Ser1 asRNA及びFib-H asRNAを発現する系統では、それらの遺伝子の発現を抑制していない陰性対照（図１７の「−」）と比較して、絹糸腺で高いEGFPタンパク質量が認められた。この結果は、中部絹糸腺及び後部絹糸腺の主要なタンパク質であるSer1及びFib H鎖の合成がそれぞれのasRNAによって抑制されることで、外因性遺伝子（ここではEGFP遺伝子）の発現が増強したことを示している。【０１４８】
＜実施例６：Ser1 asRNA及びFib-H asRNAの発現による夾雑タンパク質の減少＞
（目的）
目的のペプチドの抽出を阻害するゲル状の夾雑タンパク質（主としてセリシンとフィブロインから構成される）がSer1 asRNA及びFib-H asRNAを発現することによって、減少することを確認した。【０１４９】
（方法）
実施例５で作出した遺伝子組換えカイコと同じ系統の5令6日目の幼虫各3頭から中部及び後部絹糸腺を摘出した。1頭分の中部及び後部絹糸腺をまとめて4 mLのPBSに入れ、4℃で一晩転倒撹拌を行った。4℃、5,000 rpmで遠心し、得られた上清を15 mLチューブへ入れ、4℃で48時間静置した。チューブを上下転倒させ、落下した液量を計測し、元の液量に対して何％の液体が落下したかを計算した。【０１５０】
（結果）
図１７に結果を示す。Ser1及びFib H鎖遺伝子の発現を抑制していない陰性対照では上清がゲル化し、白濁した。その結果、チューブを上下転倒させても抽出液は全く落下してこなかった。一方、Ser1 as RNAとFib-H as RNAを発現する系統由来の試料では、上清はゲル化せず、液体のままであった。チューブを上下転倒させると、平均98％の抽出液が落下した。これらの結果は、Ser1 as RNA及びFib-H as RNAでSer1遺伝子及びFib H鎖遺伝子の発現をそれぞれ抑制することによって、絹糸腺抽出液のゲル化の原因となる夾雑タンパク質を効率的に除去できることが示された。【０１５１】
なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015060159.tif 000020
2015060159.tif 000021
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