(57)【要約】本発明は、細胞担体として、適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度を併せ持った光分解性ゲルを製造できる光分解性架橋剤を提供する。本発明の光分解性架橋剤においては、３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖２、及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基３を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基４、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有している。
2014188911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
【請求項２】
前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である請求項１記載の光分解性架橋剤。
【請求項３】
前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１に記載の光分解性架橋剤。
【請求項４】
前記分岐鎖の数が４又は８である請求項１に記載の光分解性架橋剤。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコール主鎖が、ネオペンチル骨格を有する請求項１に記載の光分解性架橋剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲル。
【請求項７】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の光分解性ゲル。
【請求項８】
前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、請求項６に記載の光分解性ゲル。
【請求項９】
前記高分子化合物が、ゼラチンである、請求項６に記載の光分解性ゲル。
【請求項１０】
請求項６に記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
【請求項１１】
前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、請求項１０に記載の細胞培養器具。
【請求項１２】
請求項１０に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
【請求項１３】
請求項１０に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
【請求項１５】
（Ｉ）請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１６】
（Ｉ）細胞を内包させた、請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料工学の分野に属し、特に、複雑且つ微細な三次元組織体の製造に用いることができる光分解性架橋剤と、これを用いた、光分解性ゲル、細胞培養器具、細胞配列・分別装置、細胞配列方法、細胞分別方法、組織体形成方法および組織体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品を開発のコストはＥｒｏｏｍ’ｓ Ｌａｗという法則に従って指数関数的に増大しているという（非特許文献１）。臨床試験でドロップアウトする確率の高さが年々増大していることや（非特許文献２）、動物実験における種差の問題を考えると、培養細胞を用いたインビトロアッセイは今後ますます重要になってくると考えられる。
現在、細胞アッセイはハイスループットシステムの普及により、創薬スクリーニングの幅広い場面で利用されており、近年ではインクジェット方式などの液体ハンドリング技術が利用できるようになり、更なるハイスループット化が進んでいる。また、一度のアッセイでより多くの情報量を取得するハイコンテツ化へと技術のトレンドは移行してきている。
一方、一般的な細胞アッセイで利用されている単層培養においては、細胞周囲の環境が動物体内の環境と大きく異なっているため、培養細胞では本来体内で発現すべき機能の多くを喪失しているという問題があった。
次世代の細胞アッセイ技術では、生体内の三次元構造を模倣した組織体を人工的に再構成し、より機能の高い組織体を利用したより信頼性の高いアッセイを適用することで、より高いｖｉｖｏ−ｖｉｔｒｏ相関が期待されている。【０００３】
細胞培養方法の一つとして、ハイドロゲルを利用した方法が挙げられる。ハイドロゲルは、高い含水率、力学的性質の調整が容易、栄養素の拡散性に優れる等の細胞の担体として優れた特性を有している（非特許文献３）。
ハイドロゲルは、光分解性の基を分子内に組み込むことで光分解性が付与され、光による加工が可能な光分解性ゲルが開発されている。光分解性ゲルとしては、例えばポリエチレングリコールを主鎖とし、ニトロベンジル基を分子内に有するものがある（特許文献１及び非特許文献４）。このような構成を持った高分子モノマーから形成されるハイドロゲルの物性は、光照射によって時間的・空間的に制御可能であり（非特許文献５及び６）、光分解は生細胞との適合性が高い（非特許文献４及び７）。
しかし、これまでに報告されている光分解性ゲルは、ラジカル重合を利用してゲル化されるため、酸素の存在下で重合すると酸素の影響を受けて劣化することがある。また、ラジカルが細胞や生理活性物質にダメージを与えてしまう、また、主鎖として使用できる高分子化合物が、ラジカル重合できるモノマーの重合物に限定されるため、その利用が限定されてしまっている等の問題があった。
発明者らは、ラジカル重合を利用せず、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、光分解性ゲルを形成可能な光分解性架橋剤の開発を行ってきた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１０８０８７号公報
【特許文献２】特開２０１２−８０８４４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃａｎｎｅｌｌ， Ｊ． Ｗ． ｅｔ.ａｌ．, Ｎａｔ． Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． (２０１２) Ｖｏｌ．１１， ｐｐ.１９１−２００．
【非特許文献２】Ｐａｍｍｏｌｌｉ, Ｆ. ｅｔ.ａｌ., Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． （２０１１） Ｖｏｌ．１０， ｐｐ.４２８−４３８．
【非特許文献３】Ｄｒｕｒｙ， Ｊ． Ｌ． ａｎｄ Ｍｏｏｎｅｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （２００３） Ｖｏｌ．２４， ｐｐ.４３３７−４３５１.
【非特許文献４】Ｋｌｏｘｉｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ.ａｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） Ｖｏｌ．３２４， ｐｐ.５９−６３．
【非特許文献５】Ｋｌｏｘｉｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ.ａｌ．, Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ．（２０１０） Ｖｏｌ．２２, ｐｐ.６１−６６．
【非特許文献６】Ｗｏｎｇ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ.ａｌ．, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （２０１０） Ｖｏｌ．４３， ｐｐ.２８２４−２８３１．
【非特許文献７】Ｋｌｏｘｉｎ, Ａ． Ｍ．ｅｔ.ａｌ．, Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ（２０１０） Ｖｏｌ．３１, ｐｐ.１−８.
【非特許文献８】Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．, et al., Biotechnol. Bioeng. (2009) Vol.103, pp.552.
【非特許文献９】Ｎｉｃｈｏｌ，Ｊ．Ｗ．，et al., Biomaterials (2010) Vol.31, pp.5536.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の、ラジカル重合反応を用いずに重合可能な光分解性のゲルでは、ゲルが溶媒を吸収して膨潤することでゲルが崩れてしまい、意図した構造が構築できないことがある。またゲルの強度が低く、生体構造を再現するような複雑な三次元構造の作製が難しいという問題がある。ゲルの強度を容易に高める方法としては、ゲルを構成する化合物の濃度を上げてもよいが、濃度を上げるとゲルの含水率が下がってしまう。または、ゲルの強度を高めるために、価数を一定とした場合、ポリマーを構成する化合物の分子量を下げることでもゲルの強度を高めることができるがゲルの水に対する溶解度が低下してしまい、製造時および使用時において扱いにくく、またゲルの状態が不均一になりやすい。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞担体として適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度を併せ持った光分解性ゲルを製造できる光分解性架橋剤の提供を課題とする。
また、前記光分解性架橋剤を有する光分解性ゲル、該光分解性ゲルを有する細胞培養器具、該細胞培養器具を使用する細胞配列・分別装置、並びに該細胞培養器具を用いる細胞配列法、及び細胞分別方法、並びに該光分解性ゲルを用いた組織体及び組織体形成方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは鋭意検討し、光分解性架橋剤の分岐数を高めることでゲルの強度を高められ、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］３以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
［２］前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である［１］に記載の光分解性架橋剤。
［３］前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［１］又は［２］に記載の光分解性架橋剤。
［４］前記分岐鎖の数が４又は８である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［５］前記ポリエチレングリコールの主鎖が、ネオペンチル骨格を有する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［６］［１］〜［５］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲル。
［７］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、[６]に記載の光分解性ゲル。
［８］前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［９］前記高分子化合物が、ゼラチンである［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［１０］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
［１１］前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、［１０］に記載の細胞培養器具。
［１２］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
［１３］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
［１４］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
［１５］
（Ｉ）[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１６］
（Ｉ）細胞を内包させた、[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１７］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の光分解性架橋剤によれば、細胞担体として適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度とを併せ持った光分解性ゲルの製造が実現され、複雑かつ微細な三次元構造を有する組織体の形成および、より生体環境に近く信頼度の高い細胞アッセイ系が実現される。したがって本発明は、再生医療技術の発展および新規の医薬品開発に資する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の光分解性架橋剤の模式図である。
【図２】本発明の光分解性架橋剤の構造の説明図である。
【図３Ａ】本発明の光分解性ゲルの生成反応を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の一の態様における光分解性ゲルが、光分解性架橋剤とポリエチレングリコール誘導体との反応によって生成される状態を示す図である。
【図３Ｃ】本発明の別の態様における光分解性ゲルが、光分解性架橋剤とゼラチンとの反応によって生成される状態を示す図である。
【図４Ａ】本発明の光分解性ゲルの分解反応を示す図である。
【図４Ｂ】本発明の一の態様における光分解性ゲルが、光の照射により分解される様子を模式的に示す図である。
【図４Ｃ】本発明の別の態様における光分解性ゲルが、光の照射により分解される様子を模式的に示す図である。
【図５】本発明の細胞配列・分別装置の一例を示す構成図である。
【図６Ａ】本発明の細胞配列方法の一例を示す模式図である。
【図６Ｂ】本発明の細胞配列方法の別の例を示す模式図である。
【図７Ａ】本発明の細胞分別方法の一例を示す模式図である。
【図７Ｂ】本発明の細胞分別方法の別の例を示す模式図である。
【図８Ａ】本発明の組織体形成方法の第一の例を示す模式図である。
【図８Ｂ】本発明の組織体形成方法の第二の例を示す模式図である。
【図８Ｃ】本発明の組織体形成方法の第三の例を示す模式図である。
【図８Ｄ】本発明の組織体形成方法の第四の例を示す模式図である。
【図９Ａ】本発明の組織体形成方法の第五の例を示す模式図である。
【図９Ｂ】本発明の組織体形成方法の第六の例を示す模式図である。
【図９Ｃ】本発明の組織体形成方法の第七の例を示す模式図である。
【図１０】本発明の光分解性架橋剤の合成の一例を示す説明図である。
【図１１】光照射によってパターン分解された、本発明のゼラチンベースの光分解性ゲルの写真である。
【図１２】光照射によってパターン分解された、本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルの写真である。
【図１３Ａ】本発明の光分解性ゲルの、厚さ方向への分解深度の測定結果を示す図である（照射エネルギー：１．５Ｊ／ｃｍ２）。
【図１３Ｂ】本発明の光分解性ゲルの、厚さ方向への分解深度の測定結果を示す図である（照射エネルギー：９．０Ｊ／ｃｍ２）。
【図１３Ｃ】本発明の光分解性ゲルの、光分解後の、ゲル層平均深度の計測結果を示す図である。
【図１４Ａ】光分解性ゲル中に包埋された細胞の様子である（光照射前）。
【図１４Ｂ】光分解性ゲル中に包埋された細胞の様子である（光照射後；明視野観察）。
【図１４Ｃ】光分解性ゲル中に包埋された細胞の様子である（光照射後；蛍光観察）。
【図１５】異なる濃度の組成により調製した光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣｓ細胞の１日間培養の結果を示す図である。
【図１６Ａ】光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣｓ細胞の付着状態を位相コントラスト画像により観察した図である（培養期間１日）。
【図１６Ｂ】光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣｓ細胞の付着状態を位相コントラスト画像により観察した図である（培養期間３日）。
【図１６Ｃ】３日間の培養後のＨＵＶＥＣｓ細胞の生細胞を示す図である。
【図１６Ｄ】３日間の培養後のＨＵＶＥＣｓ細胞の死細胞を示す図である。
【図１７Ａ】ゼラチンと、濃度を変えた架橋剤とから調製した光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣｓ細胞についての位相コントラスト画像を示す図である。図中のバーは、400μｍである（培養期間１日）。
【図１７Ｂ】ゼラチンと、濃度を変えた架橋剤とから調製した光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣｓ細胞についての位相コントラスト画像を示す図である。図中のバーは、400μｍである（培養期間３日）。
【図１８Ａ】光照射とゲルの分解が細胞の生存度に与える影響を示す図である（光照射：0Ｊ/ｃｍ2）。図中のバーは、200μｍである。
【図１８Ｂ】光照射とゲルの分解が細胞の生存度に与える影響を示す図である（光照射：1.0Ｊ/ｃｍ2）。図中のバーは、200μｍである。
【図１８Ｃ】光照射とゲルの分解が細胞の生存度に与える影響を示す図である（光照射：2.0Ｊ/ｃｍ2）。図中のバーは、200μｍである。
【図１８Ｄ】光照射とゲルの分解が細胞の生存度に与える影響を示す図である（光照射：3.0Ｊ/ｃｍ2）。図中のバーは、200μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
《光分解性架橋剤》
【００１２】
本発明の光分解性架橋剤は、３分岐以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及びその末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を当該ベンジル基のベンゼン環に有する化合物である。
前記光分解性架橋剤としては、例えば、下記式一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１３】
【化１】
2014188911.tif 000003
【００１４】
前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。
Ｚは、光分解性のベンジル基を表し、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
該アルキル基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよい。
ｐは１以上の整数を表し、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよい。Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも３つ以上のＲがＺを含み、２つ以上のＲが−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚであることとする。
【００１５】
本発明の光分解性架橋剤は、３分岐以上の分岐鎖を有していることから、該分岐鎖の分岐末端に配置された活性エステル基と、該活性エステル基と反応する高分子化合物との間に形成される架橋点（架橋剤１分子あたり）が十分に多い。そのため、本発明の光分解性架橋剤は、適度な強度を持った光分解性ゲルを得ることを可能にする。また、本発明の光分解性架橋剤は、光分解性のニトロベンジル基を含む基を有していることから、伝統的なフォトリソグラフィーや近年の二光子励起加工法に代表されるような、光による微細加工技術を適応可能である。そのため、本発明の光分解性架橋剤は、光照射によってゲルの微細な加工が可能な光分解性ゲルを得ることを可能にする。したがって、本発明の光分解性架橋剤を用いれば、複雑且つ微細な三次元構造を有するゲルを構築することが可能である。
【００１６】
前記一般式（１）で表される光分解性架橋剤が含むポリエチレングリコール分岐鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数ｎは、２０から５００の範囲にあり、３０から２５０の範囲にあることがより好ましく、４０から１２５の範囲にあることがさらに好ましい。
エチレングリコールの繰り返し数を上記範囲に設定することで、ゲルの水に対する溶解度を高めることができ、製造時および使用時において扱いの容易で、状態の均一な光分解性ゲルを得ることができる。
【００１７】
前記一般式（１）において、Ｚは光分解性のベンジル基である。前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
係るベンジル基としては、下記一般式（２）又は（３）で表される基が好ましい。
【００１８】
【化２】
2014188911.tif 000004
【００１９】
前記一般式（２）〜（３）中、Ｂ１は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−で表される基を表し、ｍは、０〜５の整数を表し、５が好ましい。
星印は、エチレングリコールの酸素原子との結合位置を表す。
Ｒ５は、水素もしくは炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。Ｒ６は、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。Ｒ７は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体が好ましく、下記一般式（４）で表される誘導体がより好ましい。
【００２０】
【化３】
2014188911.tif 000005
【００２１】
前記一般式（４）中、星印は、ベンゼン環の炭素原子との結合位置を表す。ｑは１〜１０の整数を表し、１〜６が好ましく、２〜５がより好ましく、３が特に好ましい。
前記一般式（１）で表される化合物において、該化合物は、具体的には下記一般式（７）及び（８）で表される化合物であることが好ましい。
【００２２】
【化４】
2014188911.tif 000006
【００２３】
前記一般式（７）及び（８）中、ｎ、Ｚ、Ａ１、Ｒ１〜Ｒ４、及びｐは前記一般式（１）におけるものと同様である。
【００２４】
ｐが１の場合、前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（９）で表される化合物であることが好ましい。
【００２５】
【化５】
2014188911.tif 000007
【００２６】
前記一般式（９）中、Ｚ、Ａ１、及びＲ１〜Ｒ４は前記一般式（１）におけるものと同様である。
前記一般式（９）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１０）又は（１１）で表される化合物であることが好ましい。
【００２７】
【化６】
2014188911.tif 000008
【００２８】
前記一般式（１０）〜（１１）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
【００２９】
前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１２）で表される化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化７】
2014188911.tif 000009
【００３１】
前記一般式（１２）中、Ｚ、は前記一般式（１）におけるものと同様である。ｐ１は１以上の整数を表す。
【００３２】
前記一般式（１２）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１３）又は（１４）で表される化合物であることが好ましい。
【００３３】
【化８】
2014188911.tif 000010
【００３４】
前記一般式（１３）〜（１４）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
４分岐又は８分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は合成しやすく、また、入手も容易であることから、前記一般式（１）で表される化合物において、ポリエチレングリコールが４分岐又は８分岐（分岐鎖数が４つまたは８つ）であることが好ましい。
即ち、本発明の光分解性架橋剤としては、下記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物がより好ましい。
【００３５】
【化９】
2014188911.tif 000011
【００３６】
前記一般式（１５）〜（１６）中、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。
【００３７】
前記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物において、具体的には下記式（１７）又は（１８）で表される化合物であることが更に好ましい。
【００３８】
【化１０】
2014188911.tif 000012
【００３９】
また、前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有するものが好ましく、式（１７）、式（１８）で表される化合物が特に好ましい。
【００４０】
図１に、前記式（１７）で表される化合物の模式図を示す。図１に示されるように、光分解性架橋剤１は、分岐鎖状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２、及び分岐鎖状の主鎖２の末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基を含む基３と、ニトロベンジル基を含む基３の末端側に配置された活性エステル基４とからなり、４分岐のポリエチレングリコールの分岐鎖を有し、ポリエチレングリコールの分岐鎖が中心にネオペンチル骨格を有する。
図１および図２に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）を介して主鎖２に結合している。
【００４１】
《光分解性架橋剤の合成》
前記一般式（１）で表される化合物の製造方法について説明する。
前記一般式（１）で表される化合物は、３分岐以上の分岐鎖を有する、ポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を当該ベンジル基のベンゼン環に有する化合物である。以下に、前記分岐の末端に前記光分解性のベンジル基を配置し、前記ベンジル基に活性エステル基を配置する反応を説明する。
【００４２】
【化１１】
2014188911.tif 000013
【００４３】
式中Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。Ｒ７ａはアミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表す。
【００４４】
一般式（１−ｃ）で表される基は、一般式（１−ａ）で表される基と、一般式（１−ａ）で表される化合物に対して１．０〜２．０倍モル量の一般式（１９）で表される化合物とを、溶媒中、０〜２００℃の温度で数１０分〜２４時間処理し、溶媒を除去後、一般式（１−ｂ）で表される化合物を析出させ、精製後、一般式（１−ｂ）で表される化合物に対して、１．０〜２．０倍モル量の一般式（２０）で表される化合物とを、触媒の存在下、溶媒中、０〜２００℃の温度で数１０分〜２４時間処理し、単離することにより得られる。前記触媒としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が好ましい。
【００４５】
上記一般式（１−ａ）で表される基は、下記一般式（２１）であることが好ましい。
【００４６】
【化１２】
2014188911.tif 000014
【００４７】
前記一般式（２１）中、ｎ及びｍは前記一般式（１）〜（３）におけるものと同様である。
【００４８】
上記一般式（１−ｃ）で表される基は、下記一般式（２２）であることが好ましい。
【００４９】
【化１３】
2014188911.tif 000015
【００５０】
前記一般式（２２）中、ｎ、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（１）〜（４）におけるものと同様である。
【００５１】
《光分解性ゲル》
本発明の光分解性ゲルは、本発明の光分解性架橋剤、及び分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光分解性ゲルである。
高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００５２】
高分子化合物としては、分岐型のポリエチレングリコールもしくはその誘導体、またはタンパク質としてゼラチンがより好ましい。
【００５３】
ポリエチレングリコールは細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
【００５４】
ゼラチンの主成分であるコラーゲンは多細胞生物（動物）の細胞外基質の主成分であることから、細胞の足場タンパク質として好ましく、また、細胞の増殖、分化を促す場合があるために好ましい。用いられるゼラチンの種類は特に制限されないが、ウシ、又はブタ皮由来原料を酸処理して得られたｔｙｐｅＡゼラチンが好ましい。
ゼラチンの強度は特に制限されないが、２００〜４００ブルームが好ましく、２５０〜３５０ブルームがより好ましい。
【００５５】
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。
【００５６】
高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性ゲルとを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状のゲルの形成が容易である。
【００５７】
高分子化合物に対する光分解性架橋剤の添加量（光分解性架橋剤／高分子化合物）はゲル化する範囲で自由に設定することができるが、強度の高いゲルを調製するためには高分子化合物のアミノ基と光分解性架橋剤の活性エステル基のモル比で１：１程度であることが好ましい。高分子化合物と光分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のアミノ末端ポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用い、４分岐型の光分解性架橋剤を用いる場合は、モル比（高分子化合物：光分解性架橋剤）で４：１から１：４の範囲が好ましく、モル比で２：１から１：２の範囲がより好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光分解性ゲル中に２．５重量％以上含有されるように設定することが好ましく、ゼラチンの場合、光分解性ゲル中に１．０重量％以上含有されるように設定することが好ましい。
【００５８】
図３Ａは、光分解性架橋剤１の末端側に配置された活性エステル基４と高分子化合物のアミノ基８とが縮合してアミド結合９を形成し、架橋される反応を示すものである。
【００５９】
図３Ｂは、光分解性架橋剤と高分子化合物６とを反応させることによって、光分解性ゲル１０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物６は、末端にアミノ基８を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
高分子化合物６と光分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物６のアミノ基は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物６は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物６と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０が生成する。
【００６０】
図３Ｃは、光分解性架橋剤と高分子化合物７とを反応させることによって、光分解性ゲル１０’を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物７は、分子内にアミノ基８を有するゼラチンである。
高分子化合物７と光分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物７のアミノ基は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物７は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物７と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０’が生成する。
【００６１】
本発明の光分解性ゲルは、光の照射により光分解性架橋剤１が分解されることによって、分解される。
図４Ａは、光分解性架橋剤のニトロベンジル基の分解を示すものである。ニトロベンジル基を含む基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。
ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前記光照射によりニトロベンジル基を含む基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
図４Ｂと図４Ｃは、それぞれ光分解性ゲル１０と１０’が、光の照射により分解される様子を模式的に示すものである。光分解性ゲルが分解されることにより、光分解性ゲルは水に溶解する。
【００６２】
本発明によれば、前記構造を有する光分解性架橋剤を用いるので、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。
ラジカル重合を利用してゲル化される従来の光応答性ゲルおよび光分解性ゲルの製造工程は、重合の際に酸素が存在すると重合反応を阻害し、ゲル化が進行しない。この現象は特に薄膜状のゲルを調製する際に顕著になる。一方、本発明の光分解性架橋剤では、架橋反応時に酸素の影響を全く受けないため、このような重合反応阻害は起こらない。
ラジカル重合反応を利用する場合も無酸素雰囲気条件で反応を行えば薄膜状のゲルを調製することが可能となるかもしれないが、その場合には無酸素条件下で重合反応を行わせるための設備が必要となり、製造工程が複雑になる。
一方、本発明の光分解性架橋剤を用いると、無酸素雰囲気条件が必要ないため、薄膜状のゲルの製造工程が簡略であり、効率的かつ低コストで光分解性ゲルを調製できる。
また、本発明では、架橋反応にラジカル重合を利用しないため、ラジカルによってダメージを受けやすい物質を混合した状態で光分解性ゲルを調製することが可能となる。従って、光分解性ゲルを広範な用途、例えば細胞や生理活性物質を固定化する用途にも使用できる。また、ラジカル重合に対応できないモノマーの重合物も高分子化合物として使用できることから、高分子化合物の選択範囲が広いという利点もある。
【００６３】
本発明の光分解性ゲルは、適度な強度、及び光分解性を有しているため、伝統的なフォトリソグラフィーや近年の二光子励起加工法に代表されるような、光による微細加工技術を適応可能である。また、本発明の光分解性ゲルは、適度な強度を有しつつ細胞担体として適切な含水率を実現できる。したがって、本発明の光分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元構造を有する細胞担体として使用可能であり、非常に有用な材料である。
【００６４】
《細胞培養器具》
本発明の細胞培養器具は、本発明の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具である。
光分解性ゲル層の厚さは、１００ｎｍ〜１００μｍが好ましく、３００ｎｍ〜３０μｍがさらに好ましく、１０００ｎｍ〜１０μｍが特に好ましい。
【００６５】
細胞培養基材の構成材料としては、特に制限されず、プラスチック、ガラス、改質ガラス、金属等を挙げることができる。
プラスチックとして好適なものとしては、スチレン系樹脂（例えばポリスチレン（ＰＳ））、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ））、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン樹脂）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
細胞培養基材は、細胞培養に一般的に用いられる細胞培養ディッシュもしくはマイクロプレートと同様の構造の基材が好ましい。
細胞培養基材は、少なくとも表面が、ポリスチレンまたは細胞接着性材料からなることが好ましい。
【００６６】
細胞接着性材料としては、細胞接着性タンパク質又は細胞接着性ペプチドが好ましい。
細胞接着性タンパク質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンからなる群から選択された少なくとも１つであることがより好ましく、ゼラチンが特に好ましい。細胞接着性ペプチドは、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸というアミノ酸配列（ＲＧＤ配列）を有することが好ましい。
【００６７】
本発明の細胞培養器具は、本発明の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具である。本発明の光分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料である。本発明の光分解性ゲルのみを用いても細胞培養、及び加工を行うことは可能であるが、本発明の光分解性ゲルを細胞培養基材表面に形成させることで、細胞培養、及びゲルの加工がより容易となる。
【００６８】
《細胞配列・分別装置》
図５は、本発明の細胞配列・分別装置の一例であって、細胞培養器具１１を保持する保持台１２と、細胞培養器具１１に光を照射する照射部１３を備えている。
照射部１３は、光源（図示略）と、細胞培養器具１１の任意の一部領域にのみ光照射する照射領域調整部１４と、パソコンなどの制御部１５とを有する。
照射領域調整部１４は、所定のパターン１６をなす光を細胞培養器具１１に照射することができる。パターン１６は表示装置１７に表示される。
【００６９】
照射領域調整部１４は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ））とを備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１５からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光１８を細胞培養器具１１に照射できるようになっている。
照射領域調整部１４は、レンズ１９、ミラー２０、レンズ２１を経て、細胞培養器具１１の任意の領域に光１８を照射できる。細胞培養器具１１の任意形状の一部領域にのみ光１８を照射することもできるし、全領域に光１８を照射することもできる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光を細胞培養基材の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
【００７０】
図５に示す細胞配列・分別装置は、後述のように、光が照射される一部領域に細胞を配列する細胞配列装置としても使用できるし、前記光照射領域にある細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別する分別装置としても使用できる。
【００７１】
本発明の光分解性ゲルは、光照射により複雑且つ微細な三次元構造を構築可能でかつ細胞担体として使用可能な材料である。そのため、本発明の細胞配列・分別装置は、光による微細な加工技術と細胞培養技術とを組み合わせることで、三次元的で且つ精度の高い細胞配列、細胞培養、及び細胞分別を実現できる。また、細胞配列、細胞培養及び細胞分別を同時に行うことが可能であるため、三次元的な細胞状態を把握しつつ細胞を分別および配列させることが可能である。
【００７２】
《細胞配列および分別方法》
次に、本発明の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞とそれ（当該一部領域）以外の領域にある細胞とを分別する工程を有することを特徴とする細胞分別方法、及び、前記一部領域に細胞を配列する工程を有することを特徴とする細胞配列方法について説明する。
【００７３】
本発明において分別対象となる細胞は、特に限定されず、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
【００７４】
なお、本発明において、細胞が付着する（接着する）とは、例えば、培地や緩衝液等による洗浄等の一定の物理的刺激によってもその位置から移動しなくなることである。例えば、培地や緩衝液等の流れによる所定の剪断応力（例えば０．１〜１０Ｎ／ｍ２）の洗浄操作により移動しない状態を「接着状態」（付着状態）とすることができる。
【００７５】
本発明の細胞配列および分別方法は、細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解する方法であり、同時に、光分解性ゲルが加工されることを伴う。光分解性ゲル層の縦横方向（ＸＹ軸方向）に着目した場合、光分解性ゲルが選択的に分解されることで、光分解性ゲルが２次元的に加工される。光分解性ゲル層の厚さ方向（Ｚ軸方向）に着目した場合、光分解性ゲルが三次元的に加工される。
光を照射した部分に含まれる光分解性ゲル層は、全てのゲルを分解させてもよいし、すべてのゲルを分解させないで、Ｚ軸方向への分解深度を任意に変化させることが可能である。
【００７６】
（細胞配列方法）
以下、図６Ａを参照しつつ、第１の例の細胞配列方法を詳しく説明する。図６Ａは細胞培養器具３０の模式図である。
【００７７】
細胞培養基材３１の表面に光分解性ゲル層３２を形成する。細胞培養基材３１の表面は細胞接着性が低い材料、例えばガラス、シリコーン樹脂等であることが好ましい。光分解性ゲル層は、細胞接着性が高いことが好ましく、光分解性ゲル層に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物が、前記細胞接着性タンパク質であることが好ましい。
光分解性ゲル層３２は、光分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
【００７８】
細胞培養器具３０の光分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材３１表面から除去され、光分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。
細胞培養器具３０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層３２の表面３３及び光照射によって新たに形成された光分解性ゲル層表面３３’にのみ細胞３４は付着する。
光分解性ゲル層３２の表面３３、３３’に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光分解性ゲル層３２上に細胞３４を選択的に配列することができる。
【００７９】
以下、図６Ｂを参照しつつ、第２の例の細胞配列方法を詳しく説明する。図６Ｂは細胞培養器具４０の模式図である。
細胞培養基材４１の表面に光分解性ゲル層４２を形成する。細胞培養基材４１の表面は細胞接着性が高い材料、例えばポリスチレンであることが好ましい。細胞培養基材４１の表面が細胞接着性材料を含まない場合は、細胞培養基材４１上に、細胞接着性材料からなるコート層を形成させてもよい。
光分解性ゲル層４２は細胞接着性が低いことが好ましく、光分解性ゲル層４２に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、細胞接着性の低いタンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体が特に好ましい。
【００８０】
細胞培養器具４０の光分解性ゲル層４２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層４２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材４１表面から除去される。
細胞培養器具４０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層４２が失われた領域Ａ１の細胞培養基材４１の表面にのみ細胞３４は付着する。
細胞培養基材４１表面に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、領域Ａ１に細胞３４を選択的に配列することができる。
【００８１】
（細胞分別方法）
次に、図７Ａを参照しつつ、第１の例の細胞分別方法を詳しく説明する。図７Ａは細胞培養器具５０の模式図である。
【００８２】
細胞培養基材５１の表面に光分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光分解性ゲル層３２は、細胞接着性が高いことが好ましく、光分解性ゲル層３２に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物が、前記細胞接着性タンパク質であることが好ましい。
光分解性ゲル層３２は、光分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
【００８３】
光分解性ゲル層３２が細胞接着性材料を含まない場合は、光分解性ゲル層３２上に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させてもよい。
【００８４】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
【００８５】
細胞培養器具５０の光分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１の表面から除去され、光分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる。
【００８６】
以下、図７Ｂを参照しつつ、第２の例の細胞分別方法を詳しく説明する。図７Ｂは細胞培養器具６０の模式図である。
【００８７】
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４を内包した光分解性ゲル層６２を形成する。
細胞培養基材５１の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光分解性ゲル層６２に含まれる本発明の光分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物であれば特に制限されず、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体又はゼラチンであることがより好ましい。
【００８８】
細胞培養器具６０の光分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層６２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる。
【００８９】
上記細胞配列方法および細胞分別方法によれば、細胞培養器具１１の領域Ａ１にのみ光を照射するので、光照射による細胞３４への悪影響を極力抑えることができる。このため、細胞３４の細胞外マトリックスや膜タンパク質が損なわれるのを防止し、器官特異的機能を維持することができる。このため、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
また、領域Ａ１にのみの光照射によって細胞３４の分別を行うため、目的の細胞を精度よく分別することができる。
【００９０】
さらに、本発明の光分解性ゲルは、複雑かつ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料であるから、本発明の細胞配列方法および細胞分別方法によれば、三次元的で且つ精度の高い細胞配列、及び細胞分別を実現できる。
【００９１】
《組織体形成方法》
本発明における組織体とは、細胞が三次元的に集合した状態を指し、細胞間に本発明の光分解性ゲルを含んでもよい。前記細胞は本発明の光分解性ゲルを用いて任意の期間培養され、増殖させたり、所望の組織を形成したり、所望の状態に分化されることが好ましい。
【００９２】
本発明の組織体形成方法は光分解性ゲルを形成する工程を含む。光分解性ゲルの厚さは、ゲルに内包させた細胞が、Ｚ軸方向に少なくとも２細胞以上が配列可能であって、三次元組織体が形成可能な厚みである１０μｍ以上であることが好ましい。より具体的には、２０μｍ〜１０００μｍが好ましく、５０μｍ〜３００μｍがさらに好ましい。
【００９３】
本発明の組織体形成方法では、光分解性ゲルを形成した後に、光分解性ゲルへの光照射によって、光分解性ゲルの一部又は全部を分解し、組織体から光分解性ゲルの少なくとも一部を取り除くことができる。
【００９４】
なお、以下の組織体形成方法の説明では、本発明の細胞培養器具を用いる場合を説明するが、本発明の組織体形成方法は本発明の光分解性ゲルを用いていればよく、本発明の細胞培養器具を用いずに実施してもよい。
【００９５】
次に、以下の工程：
（Ｉ）本発明の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
【００９６】
上記（Ｉ）〜（ＩＶ）の工程の順番は、適宜入れ替えてもよく、また前記工程のうちの任意の工程を２回以上行ってもよい。
【００９７】
以下、図８Ａを参照しつつ、第１の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図８Ａは細胞培養器具３０の模式図である。
細胞培養基材３１および光分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
【００９８】
細胞培養器具３０の光分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材３１表面から除去され、光分解性ゲル層３２は三次元的に加工され、フォトマスクのパターンに対応した形状をとる。
細胞培養器具３０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層３２の表面３３及び光照射によって新たに形成された光分解性ゲル層表面３３’にのみ細胞３４は付着する。
光分解性ゲル層３２の表面３３、３３に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光分解性ゲル層３２上に細胞３４を選択的に配列することができる。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具３０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【００９９】
以下、図８Ｂを参照しつつ、第２の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図８Ｂは細胞培養器具４０の模式図である。
細胞培養基材４１の表面に光分解性ゲル層４２を形成する。
細胞培養基材４１および光分解性ゲル層４２は、第２の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
【０１００】
細胞は基質への接着依存性の増殖を示さないものが好ましく、例えば腫瘍細胞、血球系細胞、各種幹細胞等が挙げられる。
【０１０１】
細胞培養器具４０の光分解性ゲル層４２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲル層４２を分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材４１表面から除去され、光分解性ゲル層４２は三次元的に加工される。
細胞培養器具４０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層４２が失われた領域Ａ１の細胞培養基材４１表面にのみ細胞３４は付着する。
細胞培養基材４１表面に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、領域Ａ１に細胞３４を選択的に配列することができる。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光分解性ゲル層４２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具４０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１０２】
以下、図８Ｃを参照しつつ、第３の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図８Ｃは細胞培養器具５０の模式図である。
まず、細胞培養基材５１の表面に光分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１および光分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光分解性ゲル層３２上に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
【０１０３】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると光分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
細胞培養器具５０の光分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具５０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１０４】
以下、図８Ｄを参照しつつ、第４の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図８Ｄは細胞培養器具５０の模式図である。
まず、細胞培養基材５１の表面に光分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１および光分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光分解性ゲル層３２上に、光分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
【０１０５】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると、光分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
その後、細胞３４を培養し、細胞培養器具５０上に細胞層を形成することができる。
さらに、細胞培養器具５０の光分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、細胞培養器具５０上の細胞層から細胞を選択的に除去することができる。
また、細胞３４を加工後のゲル上でさらに培養させることで、細胞３４は加工された光分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具５０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１０６】
次に、以下の工程：
（Ｉ）細胞を内包させた前記光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
【０１０７】
上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程の順番は、適宜入れ替えてもよく、また前記工程のうちの任意の工程を２回以上行ってもよい。
【０１０８】
細胞培養基材５１および光分解性ゲル層６２は、第２の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。
【０１０９】
以下、図９Ａを参照しつつ、第５の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９Ａは細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４を内包した光分解性ゲル層６２を形成する。
【０１１０】
細胞培養器具６０の光分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層６２は三次元的に加工され、また、領域Ａ１の光分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光分解性ゲル層６２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１１１】
以下、図９Ｂを参照しつつ、第６の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９Ｂは細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４が内包された光分解性ゲル層６２を形成する。
その後、細胞３４を培養し、細胞培養器具６０上に三次元的に細胞塊を形成することができる。
細胞培養器具６０の光分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層６２は三次元的に加工され、また、領域Ａ１の光分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４が分別され、細胞培養器具６０上に三次元的に形成された細胞塊から細胞を取り除くことができる。その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光分解性ゲル層６２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１１２】
以下、図９Ｃを参照しつつ、第７の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９Ｃは細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４が内包された光分解性ゲル層６２を形成する。
【０１１３】
細胞培養器具６０の光分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光分解性ゲル層６２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、光照射により露出した細胞培養基材５１上又は光分解性ゲル層６２上に、細胞３４とは別の種類の細胞３４’を内包した光分解性ゲル層７２をさらに形成してもよい。
光分解性ゲル層６２及び７２は、例えば領域Ａ１とは異なる領域Ｂ１へ、フォトマスク３５を通して光照射することにより再度加工することができる。
その後、細胞３４、３４’を培養すると、細胞３４、３４’は加工された光分解性ゲル層６２、７２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
【０１１４】
本発明の光分解性ゲルは、複雑かつ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料であるから、本発明の組織体形成方法によれば、複雑かつ微細な三次元構造を有する組織体を形成可能である。また、より生体環境に近く信頼度の高い細胞アッセイ系が実現される。
【実施例】
【０１１５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１１６】
（実施例１）
［光分解性架橋剤の合成］
以下は、光分解性架橋剤（ＮＨＳ−ＰＤ−４ａｒｍＰＥＧ）の合成方法である。
Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（６６ ｇ）のＤＭＳＯ（１３０ ｍＬ）溶液に４−｛４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（２．７ ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約１３０ ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＨＳ（日油株式会社製、９．６ ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数時間〜３日間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のＴＨＦに溶解させ、氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。減圧下、乾燥させた析出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物のＴＨＦ溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を５％塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。析出物を減圧下乾燥後、目的化合物の光分解性架橋剤を９．８０ ｇ得た。
上記の過程と、得られた化合物を図１０に示す。
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）：１．３５ （ｍ, ２Ｈ）， １．５３ （ｄ, Ｊ ＝ ７．０９ Ｈｚ, ３Ｈ）， １．６０ （ｍ, ４Ｈ）， ２．１８ （ｂｒ ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．２８ （ｔｔ, Ｊ ＝ ７．３３， ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．８５ （ｂｒ ｓ, ４Ｈ）, ２．８８ （ｔ, Ｊ ＝ ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）,３．４１ （ｓ, ２Ｈ）, ３．４３ （ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４７‐３．８３  （ｍ，  Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）, ３．９４ （ｓ, ３Ｈ）, ４．１５ （ｔ,Ｊ ＝ ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．４９ （ｄｑ, Ｊ ＝ ７．５７, ７．０９ Ｈｚ，１Ｈ）, ６．３９ （ｂｒ ｄ, Ｊ ＝ ７．５７ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ, １Ｈ）, ７．５６ （ｓ, １Ｈ）.【０１１７】
（実施例２）
［光分解性ゲルの製造］（ゼラチン溶液）
ゼラチン（ＴｙｐｅＡ、３００ブルーム、ブタ皮由来）（Ｇｅｌｔｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｋｉｎｇｅｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ３００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）（５ｗ／ｖ％）
溶媒（リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）：０．３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＝１：１、ｐＨ７）上記の分量で、ゼラチンと溶媒を３７℃で撹拌混合した後、ゼラチン溶液を得た。
（光分解性架橋剤溶液）
光分解性架橋剤（実施例１で合成）  １０ｍＭ  （１２．１ｗ／ｖ％）
溶媒（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭフタル酸  水溶液）（光分解性ゲル溶液）ゼラチン溶液と光分解性架橋剤を等量で混合し、ゼラチンベースの光分解性ゲル溶液を得た。【０１１８】
（実施例３）
[ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液]
ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ（ＭＷ＝１０,０００）（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＰＡ、日油株式会社製）  １０ｍＭ  （１２．１ｗ／ｖ％）
溶媒（リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）：０．３Ｍ  ＨＥＰＥＳ＝１：１、ｐＨ７）上記の分量で、ＰＥＧと溶媒を混合し、ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液を得た。
[光分解性架橋剤溶液]
光分解性架橋剤（実施例１で合成）  １０ｍＭ  （１２．１ｗ／ｖ％）
溶媒（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭフタル酸  水溶液、ｐＨ４）（光分解性ゲル溶液）ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液と光分解性架橋剤を等量で混合し、ポリエチレングリコールベースの光分解性ゲル溶液を得た。【０１１９】
（実施例４）
実施例２のゼラチンベースの光分解性ゲル溶液（１０〜３０μＬ）をアミノコートされたスライドガラス（ＭＡＳコートスライドガラス、松浪硝子工業株式会社）に塗布した後に、スライドガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。ゲル層の厚みは、スライドガラス（厚さ：１５０μｍ）またはペットフィルム（厚さ：２５μｍ）により調節した。フォトリソグラフィー用のマスクは、パターンを３００ｄｐｉの解像度でフィルム印刷し、作成した。
上記のマスクを照射装置とスライドガラスの間に配置することで、ゲルを選択的に露光させ、光分解を行った。照射エネルギーは７．２〜９．０Ｊ／ｃｍ２で、所望のパターンにゲルが分解されるまで光照射を行った。光源は３５０〜３８５ｎｍで、３０ｍＷ／ｃｍ２のものを使用した。光照射により分解されたゲルは、蒸留水中で洗浄除去を行った。
図１１は、光照射によってパターン分解された、本発明のゼラチンベースの光分解性ゲルの写真である。本発明のゼラチンベースの光分解性ゲルは、領域Ａ１への選択的な光照射により、直径２０μｍまで高分解能（ＸＹ平面）で分解することが確認された。【０１２０】
（実施例５）
実施例３のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲル溶液（１０〜３０μＬ）をアミノコートされたスライドガラス（ＭＡＳコートスライドガラス、松浪硝子工業株式会社）に塗布した後に、スライドガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。ゲル層の厚みは、スライドガラス（厚さ：１５０μｍ）またはペットフィルム（厚さ：２５μｍ）により調節した。
マスクの作製と、ゲルの光分解は実施例４と同様に行った。
図１２は、光照射によってパターン分解された、本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルの写真である。本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルは、領域Ａ１への光照射により、直径２０μｍまで高分解能（ＸＹ平面）で分解することが確認された。【０１２１】
また、光分解性ゲルのＺ軸分解能について検証を行った。図１３Ａは、１．５Ｊ／ｃｍ２の照射エネルギーで領域Ａ１への光照射を行い、光分解を行ったゲルの状態の画像である。図１３Ｂは、９．０Ｊ／ｃｍ２の照射エネルギーで領域Ａ１への光照射を行い、光分解を行ったゲルの状態の画像である。光学顕微鏡によるゲル表面の観察結果を図１３Ａ上部パネル及び図１３Ｂ上部パネルに示す。このパターン分解したゲル表面に蛍光ビーズを局在化させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、ゲルの分解形状および分解深度を計測した。共焦点レーザー顕微鏡によって得られた画像データを図１３Ａの中部、下部パネル、及び図１３Ｂの中部、下部パネル、に示す。図１３Ａ中部パネルおよび図１３Ｂ中部パネル中の破線(ｉ)、(ｉｉ)および(ｉｉｉ)位置におけるＺ軸平面図を、それぞれ図１３Ａ下部パネルおよび図１３Ｂ下部パネルの(ｉ)、(ｉｉ)および(ｉｉｉ)に示す。
図１３Ｃには、０．９Ｊ／ｃｍ２、１．５Ｊ／ｃｍ２、３．０Ｊ／ｃｍ２および９．０Ｊ／ｃｍ２の照射エネルギーで領域Ａ１への光照射を行い、光分解を行った後の、ゲル層平均深度の計測結果（ｎ＝４）を表す。本発明のポリエチレングリコールベースの光分解性ゲルは、照射エネルギーが大きいほど、領域Ａ１でのＺ軸方向への分解深度が深くなり、９．０Ｊ／ｃｍ２の照射エネルギーでは、ゲル内部２１６μｍまで分解されていた。
これらの結果から、本発明の実施例４および実施例５の光分解性ゲルは、ＸＹＺのいずれの軸方向においても、光照射による微細加工が可能であることが確認された。【０１２２】
（実施例６）
［光分解性ゲルへの細胞の包埋］
実施例３のａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液に、細胞３４（マウス線維芽細胞：ＮＩＨ−３Ｔ３）を加え、実施例３と同様に光分解性架橋剤溶液を加え、細胞３４を含んだ光分解性ゲル溶液を得た。その後、スライドグラス上に細胞３４を内包したゲル層６２を形成させ、領域Ａ１への光照射によってパターン分解を行った。ゲル層の形成とゲルのパターン分解は実施例４と同様の方法により行った。
細胞３４を内包し、光照射を行ったゲル層６２に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（０．５μＬのエチジウムホモダイマー１、２．０μＬのカルセインＡＭを使用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製））を用いて染色し、細胞３４の生死状態を調べた。
染色により、生細胞は緑色蛍光を発し、死細胞は赤色蛍光を発する。
染色後の様子を図１４Ａ〜Ｃに示す。図１４Ａは光照射前のゲル層６２の蛍光観察画像である。図１４Ｂは光照射後のパターン形成されたゲル層６２の明視野観察の画像であり、図１４Ｃは図１４Ｂの蛍光観察画像である。光照射後のゲルにおいて、包埋された細胞３４のうち、７０％以上の細胞３４が緑色の蛍光を示した。したがって本発明の光分解性ゲル内に細胞３４を包埋し、光照射によってパターン形成を行った後であっても、細胞３４が良好な状態で生存可能なことが明らかである。
以上の結果より、本発明の光分解性架橋剤を用いた本発明の光分解性ゲルは、細胞をゲル内で生存させたまま微細な三次元構造を形成可能であることがわかった。したがって、本発明の光分解性架橋剤を用いた本発明の光分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元組織体の形成に好適な、非常に有用性の高い組織工学材料である。【０１２３】
（実施例７）
[光分解性ゲルの調製]
１０ｍＭ  ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ（ＭＷ＝９６１７、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．社製）、又は５％（ｗ/ｗ）ゼラチン（ＴｙｐｅＡ、３００ブルーム、ブタ皮由来）を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と０．３Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（和光純薬工業社製）（ｐＨ＝７．０）の等量混液を用いて調整することで、ベースポリマー溶液とした。また、合成したＮＨＳ−ＰＣ−４ａｒｍＰＥＧ架橋剤（１０ｍＭ、１２.１％ｗ/ｖ）を、１０ｍＭ  フタル酸緩衝液（ｐＨ４.０、和光純薬工業社製）により調整することで、架橋剤溶液とした。さらに調整した架橋剤溶液が、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（和光純薬工業社製）となるように調製した。なお、ゼラチン溶液は３７℃、その他の溶液は室温にて調整を行った。
ベースポリマー溶液及び架橋剤溶液を調整した後に、等量混合した。アミノコートされたスライドガラス（ＭＡＳコート、松浪硝子工業株式会社製）上に、光分解性ゲル溶液と架橋剤の混合溶液を、１０−３０μＬの液量でスライドガラス上に塗布した後に、カバーガラスで覆い、光分解性ゲル層を形成させた。その際、ゲル層の厚みは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（厚さ：２５μｍ）又はカバーガラス（厚さ：１５０μｍ）で調節した。【０１２４】
（実施例８）
[細胞培養]
次に、実施例７で調製した光分解性ゲル上における細胞挙動を評価するために、合成したゲル基剤上へヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を播種した。本評価には、ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ又はゼラチンをベースポリマーとして調製した光分解性ゲルを用いた。また、ＨＵＶＥＣ細胞の培養には、ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ-２培養液（クラボウ社製）（２％（ｖ/ｖ）  ウシ胎仔血清、１０ｎｇ/ｍＬのヒト表皮成長因子、１.３４μｇ/Ｌ  ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、５０μｇ/ｍＬ  ゲンタマイシン、５０ｎｇ/ｍＬ  アンフォテリシンＢ、５ｎｇ/ｍＬ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、１０μｇ/ｍＬ  ヘパリン含有））を用いて、５％ＣＯ2、３７℃環境下にて培養した。培養した細胞を０.１％  トリプシン含有ＤＰＢＳ溶液へ５分間暴露した後に、細胞回収を行い、最終的な細胞濃度が１.０×１０7細胞/ｍＬになるよう細胞懸濁液をＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ-２培養液にて調整した。
ａｍｉｎｏ−４ａｒｍＰＥＧ又はゼラチンで調製した光分解性ゲル上に、ＨＵＶＥＣ細胞を播種した。光分解性ゲル上に３５μＬの細胞懸濁液を用いて播種を行い、ゲル表面全体に細胞を広げた後に、培養器内で静置した。培養開始１時間後、光分解性ゲル表面へ接着しなかった細胞と過剰な培養液をピペットにより吸引除去し、３５ｍｍ2の培養皿に３ｍＬの培養液を加え、再び培養器内へ静置した。
培養開始１日目、又は３日目に、倒立型顕微鏡にて画像観察を行った。さらに培養３日目の細胞生死判定を行うために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（０．５μＬ  エチジウムホモダイマー１、２．０μ  ＬカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製））による細胞染色を行った。細胞染色液にて１０分間染色を行い、培養細胞をＤＰＢＳにより洗浄した後に、倒立型顕微鏡により明視野画像観察及び蛍光画像観察を行った。
また、光照射時の光毒性と合成したゲル分解物の毒性評価を行うために、上述した手法を用いて、同様に細胞生死判定を行った。２.５％（ｗ/ｖ）ゼラチンベースした光分解性ゲル溶液と、１.０％（ｗ／ｖ）ＮＨＳ−ＰＣ−４ａｒｍＰＥＧ架橋剤溶液により合成した光分解性ゲル上でＨＵＶＥＣ細胞を３日間培養した後に、パターン光照射（３６５ｎｍ、１２５ｍＷ/ｃｍ2、８−２４秒）を行い、さらに３７℃で３時間培養することで、ゲル分解物へ細胞暴露試験を行った。試料への光照射は、ＰＣ制御型マイクロプロジェクションシステム（ＤＥＳＭ−０１、エンジニアリングシステム社製）により行った（非特許文献８を参照）。【０１２５】
（結果）
本実施例では、光分解性ゲル上における細胞挙動を評価するために、モデル細胞としてＨＵＶＥＣ細胞による培養評価を行った。その結果、ａｍｉｎｏ−４ａｒｍＰＥＧにより調製した光分解性ゲル表面上へは、ほとんどＨＵＶＥＣ細胞が接着しなかった（図１５）。これはＰＥＧが細胞非接着性の基材であるためで考えらえる（非特許文献９を参照）。それに対して、ゼラチンにより調製したゲル表面上へは、すべてのＨＵＶＥＣ細胞が接着することが明らかとなった（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
図１６Ａ及び図１６Ｂの右パネル及び中央パネルに示されるよう、２.５％(ｗ/ｖ)ゼラチン溶液と１.０％（ｗ/ｖ）又は３.０％（ｗ/ｖ）架橋剤により調製したゼラチンベースの光分解性ゲル上では、培養開始３日目に顕著な細胞増殖が確認され、５.０％(ｗ/ｖ)架橋剤濃度を使用したゲルと比較して、細胞増殖に顕著な違いがみられる。本検討結果より、合成した光分解ゲル上における細胞挙動（基材への細胞接着、基材上での細胞伸長、及び基材上での細胞増殖）の相違は、光分解性架橋剤の濃度に起因する可能性が示唆された。
また同様の手法にて、１.２５％(ｗ/ｖ)ゼラチン溶液と０.５-２.５％（ｗ/ｖ）架橋剤により調製した光分解性ゲルでの細胞増殖を調べたところ、図１７Ｂに示したように、２.５％（ｗ/ｖ）ゼラチン溶液を用いた結果と同様の傾向が観察されたため、細胞増殖はゼラチン濃度に依存しないことが明らかとなった。本検討結果より、ゼラチン溶液により合成した光分解性ゲル上における細胞接着は、架橋剤濃度にのみ依存して変化すると考えられる。すなわち、ゼラチン基材上の未反応アミノ残基が影響を受けずに存在しているので、未反応アミノ酸残基が細胞接着と細胞増殖に重要であると考えられる。【０１２６】
（実施例９）
[ＨＵＶＥＣ細胞のパターニング]
２.５％（ｗ/ｖ）ゼラチン溶液と１.０％（ｗ/ｖ）架橋剤により調製した光分解性ゲル上でのＨＵＶＥＣ細胞のパターニングを検証するため、実施例８と同様に光分解性ゲル上で培養したＨＵＶＥＣ細胞に対して、フォトマスクを介した光照射（１.０〜３.０Ｊ/ｃｍ2）を行った。さらに、光照射時の光毒性とゲル分解物の細胞毒性を評価するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ａｓｓａｙ ｋｉｔによる細胞生死判定を行った。
（結果）
光照射後のゲルパターン分解により、ＨＵＶＥＣ細胞はゲル孔内へ落下し、中心から周辺へと移動した（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）。図に示される細胞のパターンは、ゲルの光分解によるものである。したがって、ゲル上における細胞制御をマイクロオーダーで実現できる可能性が示唆された。
さらにゲル上にて伸長した細胞に光照射を施した後に、細胞生死判定を行った結果、光照射領域上の細胞と非照射領域上における細胞で、細胞生死に大きな相違は確認されなかった（図１８Ｂ-図１８Ｄ）。すなわち、光照射とゲル分解は、細胞の生存へは影響しないことが明らかとなった。【０１２７】
以上の実施例においては、光分解性ゲルをａｍｉｎｏ−４ａｒｍＰＥＧとゼラチンから調製できること、アミノ部分を有する生体分子をそのまま利用して、光分解性ハイドロゲルを調製できることなどが示された。また、本願で示した光分解性架橋剤は、その他の天然のポリマー（コラーゲン、フィブロネクチン、キトサン等）との反応も可能であると思われ、様々な光分解性ヒドロゲルの調製の可能性を広げた。【０１２８】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
【符号の説明】
【０１３０】
１…光分解性架橋剤、２…主鎖、３…ニトロベンジル基を含む基、４…活性エステル基、５…アミド結合部、６…高分子化合物、７…高分子化合物、８…アミノ基、９…架橋剤と高分子化合物間のアミド結合、１０…光分解性ゲル、１１・３０・４０・５０・６０…細胞培養器具、３１・４１・５１…細胞培養基材、３２・４２・６２・７２…光分解性ゲル層、３３…光分解性ゲル層の表面、３４…細胞、３５…フォトマスク、Ａ１・Ｂ１…光が照射される一部領域。
【図１】
2014188911.tif 000016
【図２】
2014188911.tif 000017
【図３Ａ】
2014188911.tif 000018
【図３Ｂ】
2014188911.tif 000019
【図３Ｃ】
2014188911.tif 000020
【図４Ａ】
2014188911.tif 000021
【図４Ｂ】
2014188911.tif 000022
【図４Ｃ】
2014188911.tif 000023
【図５】
2014188911.tif 000024
【図６Ａ】
2014188911.tif 000025
【図６Ｂ】
2014188911.tif 000026
【図７Ａ】
2014188911.tif 000027
【図７Ｂ】
2014188911.tif 000028
【図８Ａ】
2014188911.tif 000029
【図８Ｂ】
2014188911.tif 000030
【図８Ｃ】
2014188911.tif 000031
【図８Ｄ】
2014188911.tif 000032
【図９Ａ】
2014188911.tif 000033
【図９Ｂ】
2014188911.tif 000034
【図９Ｃ】
2014188911.tif 000035
【図１０】
2014188911.tif 000036
【図１３Ｃ】
2014188911.tif 000037
【図１１】
2014188911.tif 000038
【図１２】
2014188911.tif 000039
【図１３Ａ】
2014188911.tif 000040
【図１３Ｂ】
2014188911.tif 000041
【図１４Ａ】
2014188911.tif 000042
【図１４Ｂ】
2014188911.tif 000043
【図１４Ｃ】
2014188911.tif 000044
【図１５】
2014188911.tif 000045
【図１６Ａ】
2014188911.tif 000046
【図１６Ｂ】
2014188911.tif 000047
【図１６Ｃ】
2014188911.tif 000048
【図１６Ｄ】
2014188911.tif 000049
【図１７Ａ】
2014188911.tif 000050
【図１７Ｂ】
2014188911.tif 000051
【図１８Ａ】
2014188911.tif 000052
【図１８Ｂ】
2014188911.tif 000053
【図１８Ｃ】
2014188911.tif 000054
【図１８Ｄ】
2014188911.tif 000055
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月11日(2015.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
【請求項２】
前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である請求項１記載の光分解性架橋剤。
【請求項３】
前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１又は２に記載の光分解性架橋剤。
【請求項４】
前記分岐鎖の数が４又は８である請求項１〜３のいずれか一項に記載の光分解性架橋剤。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコール主鎖が、ネオペンチル骨格を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の光分解性架橋剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物が、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基と前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合してアミド結合又はエステル結合を形成していることを特徴とする光分解性ゲル。
【請求項７】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の光分解性ゲル。
【請求項８】
前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、請求項６又は７に記載の光分解性ゲル。
【請求項９】
前記高分子化合物が、ゼラチンである、請求項６又は７に記載の光分解性ゲル。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
【請求項１１】
前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、請求項１０に記載の細胞培養器具。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
【請求項１５】
（Ｉ）請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１６】
（Ｉ）細胞を内包させた、請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１７】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明者らは鋭意検討し、光分解性架橋剤の分岐数を高めることでゲルの強度を高められ、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］３以上の分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖、及び前記分岐鎖を有するポリエチレングリコール主鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
［２］前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である［１］に記載の光分解性架橋剤。
［３］前記分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［１］又は［２］に記載の光分解性架橋剤。
［４］前記分岐鎖の数が４又は８である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［５］前記ポリエチレングリコールの主鎖が、ネオペンチル骨格を有する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［６］［１］〜［５］のいずれか１つに記載の光分解性架橋剤、及び分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物が、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基と前記光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合してアミド結合又はエステル結合を形成していることを特徴とする光分解性ゲル。
［７］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、[６]に記載の光分解性ゲル。
［８］前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［９］前記高分子化合物が、ゼラチンである［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［１０］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
［１１］前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、［１０］に記載の細胞培養器具。
［１２］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
［１３］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
［１４］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
［１５］
（Ｉ）[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１６］
（Ｉ）細胞を内包させた、[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１７］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月9日(2016.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール鎖を含む分岐鎖状の鎖状構造を有し、前記鎖状構造の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、前記末端の数が３以上であり、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
【請求項２】
前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である請求項１記載の光分解性架橋剤。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１又は２に記載の光分解性架橋剤。
【請求項４】
前記末端の数が４又は８である請求項１〜３のいずれか一項に記載の光分解性架橋剤。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコール鎖が、ネオペンチル骨格を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の光分解性架橋剤。
【請求項６】
分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、請求項１〜５のいずれか１項に記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
【請求項７】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の光分解性ゲル。
【請求項８】
前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、請求項６又は７に記載の光分解性ゲル。
【請求項９】
前記高分子化合物が、ゼラチンである、請求項６又は７に記載の光分解性ゲル。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
【請求項１１】
前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、請求項１０に記載の細胞培養器具。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
【請求項１５】
（Ｉ）請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１６】
（Ｉ）細胞を内包させた、請求項６に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１７】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明者らは鋭意検討し、光分解性架橋剤の分岐数を高めることでゲルの強度を高められ、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］ポリエチレングリコール鎖を含む分岐鎖状の鎖状構造を有し、前記鎖状構造の末端に配置された光分解性のベンジル基、を含み、前記末端の数が３以上であり、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を、当該ベンジル基のベンゼン環に有する、光分解性架橋剤。
［２］前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である［１］に記載の光分解性架橋剤。
［３］前記ポリエチレングリコール鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［１］又は［２］に記載の光分解性架橋剤。
［４］前記末端の数が４又は８である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［５］前記ポリエチレングリコール鎖が、ネオペンチル骨格を有する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［６］分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、前記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
［７］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、[６]に記載の光分解性ゲル。
［８］前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［９］前記高分子化合物が、ゼラチンである［６］又は［７］に記載の光分解性ゲル。
［１０］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
［１１］前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン系樹脂または細胞接着性材料からなる、［１０］に記載の細胞培養器具。
［１２］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具、及び該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する細胞配列・分別装置。
［１３］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
［１４］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
［１５］
（Ｉ）[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１６］
（Ｉ）細胞を内包させた、[６]に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
を含む、組織体形成方法。
［１７］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、
を含む組織体。
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月14日(2016.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物である光分解性架橋剤。
【化１】
2014188911.tif 000056
［前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｚは、光分解性のベンジル基を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を前記ベンジル基のベンゼン環に有し、前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であり、
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、
該アルキレン基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよく、
ｐは１以上の整数を表し、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１〜Ｒ４のうちの３つ以上がＺを含み、Ｒ１〜Ｒ４のうちの２つ以上が−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚである。］
【請求項２】
前記ポリエチレングリコール鎖の前記（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎで表されるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１に記載の光分解性架橋剤。
【請求項３】
前記Ｒ１〜Ｒ４で表される末端の数が４又は８であり、Ｒ１〜Ｒ４は−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚを表す請求項１又は２に記載の光分解性架橋剤。
【請求項４】
ネオペンチル骨格を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の光分解性架橋剤。
【請求項５】
分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、請求項１〜４のいずれか１項に記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
【請求項６】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の光分解性ゲル。
【請求項７】
前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、請求項５又は６に記載の光分解性ゲル。
【請求項８】
前記高分子化合物が、ゼラチンである、請求項５又は６に記載の光分解性ゲル。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
【請求項１０】
前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、請求項９に記載の細胞培養器具。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
【請求項１３】
請求項９又は１０に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
【請求項１４】
（Ｉ）請求項５〜８のいずれか一項に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１５】
（Ｉ）細胞を内包させた、請求項５〜８のいずれか一項に記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
【請求項１６】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の光分解性ゲル、及び細胞、を含む組織体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
発明者らは鋭意検討し、光分解性架橋剤の分岐数を高めることでゲルの強度を高められ、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］下記一般式（１）で表される化合物である光分解性架橋剤。
【化１】
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［前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
Ｚは、光分解性のベンジル基を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基と縮合反応可能な活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基を前記ベンジル基のベンゼン環に有し、前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体であり、
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、
該アルキレン基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよく、
ｐは１以上の整数を表し、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよく、
Ｒ１〜Ｒ４のうちの３つ以上がＺを含み、Ｒ１〜Ｒ４のうちの２つ以上が−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚである。］
［２］前記ポリエチレングリコール鎖の前記（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎで表されるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある前記［１］に記載の光分解性架橋剤。
［３］前記Ｒ１〜Ｒ４で表される末端の数が４又は８であり、Ｒ１〜Ｒ４は−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚを表す前記［１］又は［２］に記載の光分解性架橋剤。
［４］ネオペンチル骨格を有する前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の光分解性架橋剤。
［５］分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物の前記アミノ基又は前記ヒドロキシル基と、前記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の光分解性架橋剤の前記活性エステル基によるアミド結合又はエステル結合を有する光分解性ゲル。
［６］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである、前記［５］に記載の光分解性ゲル。
［７］前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である、前記［５］又は［６］に記載の光分解性ゲル。
［８］前記高分子化合物が、ゼラチンである、前記［５］又は［６］に記載の光分解性ゲル。
［９］前記［５］〜［８］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されている細胞培養器具。
［１０］前記細胞培養基材の少なくとも表面が、スチレン樹脂または細胞接着性材料からなる、前記［９］に記載の細胞培養器具。
［１１］前記［９］又は［１０］に記載の細胞培養器具、及び
該細胞培養器具に光を照射する照射部、
を備え、
前記照射部は、光源、及び前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部、を有する、
細胞配列・分別装置。
［１２］前記［９］又は［１０］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞、及び当該一部領域以外の領域にある細胞を分別する工程を有する、細胞分別方法。
［１３］前記［９］又は［１０］に記載の細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射し、前記一部領域の光分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列する工程を有する、細胞配列方法。
［１４］
（Ｉ）前記［５］〜［８］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの形状を規定する工程；
（ＩＩＩ）前記光分解性ゲルに細胞を播種する工程；及び
（ＩＶ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
［１５］
（Ｉ）細胞を内包させた、前記［５］〜［８］のいずれか一つに記載の光分解性ゲルを形成する工程；
（ＩＩ）光照射によって前記光分解性ゲルの構造を規定する工程；及び
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程；
を含む、組織体形成方法。
［１６］前記［５］〜［８］のいずれか一つに記載の光分解性ゲル、及び細胞、を含む組織体。
【国際調査報告】
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