(57)【要約】  多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団を用いて、臨床に適用可能な安全でダメージが少ない心筋細胞集団を、短時間かつ簡便な操作で製造する方法を提供する。本発明は、（１）多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、（２）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および（３）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、を含む心筋細胞集団の製造方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、
（２）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
（３）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする心筋細胞集団の製造方法。
【請求項２】
さらに、分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記未分化細胞を除去する工程が、前記工程（１）と（２）の間に設けられ、
（Ａ）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１およびラミニンα３β３γ２からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
（Ｂ）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（２）および／または工程（Ａ）において、培養器の培養面または担体にコーティングされたラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、分化誘導された細胞集団を接触させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ラミニンＥ８フラグメントのコーティング濃度が０．１μｇ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（２）における接触時間が１５分〜１８０分である請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（Ａ）における接触時間が５分〜３０分である請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
心筋細胞集団における心筋細胞の純度が５０％〜９０％である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法であって、
工程１：ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程、および
工程２：前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記インテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞由来心筋細胞集団の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法として、例えば、フィーダー細胞上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、アクチビンＡとＢＭＰ４（Bone Morphogenetic Protein 4）を用いて分化誘導する方法（非特許文献１、２）、マトリゲル上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ−１およびＤＫＫ１を用いて分化誘導する方法（非特許文献３）、フィーダー細胞上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、バイオリアクターを用いて大量に分化誘導する方法（非特許文献３）などが報告されている。【０００３】
多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導を行った場合、通常その心筋細胞分化効率はロット間でバラツキがみられる。再生医療の移植細胞源として使用する場合、移植細胞の心筋細胞純度が基準値に満たない場合は心筋細胞を純化する必要が生じる。再生医療に用いるヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の純度については、必ずしも１００％を目指す必要は無く、７０％程度がむしろ機能的に良好であることが報告されている（非特許文献４）。それゆえ、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の純度が７０％に満たない細胞集団の心筋細胞の純度を７０％程度に向上させることは、特に細胞治療における移植細胞調製において意義が大きい。また、心筋細胞分化効率をロット間で同程度に調整することは困難であるため、創薬スクリーニング研究において分化効率のロット間差が結果の再現性に影響することが予想される。さらに、心筋細胞における薬剤応答性を鋭敏に検出するためには、心筋細胞以外の細胞によるバックグラウンド強度を最小限にする必要がある。【０００４】
分化誘導後の心筋細胞の純度を向上させる方法は、既にいくつか報告されており、大きく二つの方法に分類することができる。第一の方法は、細胞の栄養要求性を利用した方法、すなわち心筋細胞以外の細胞の生存に必要な栄養源を除いた培地で培養して心筋細胞以外の細胞を駆逐する方法である。例えば特許文献１には、低グルコース濃度の培地を用いて心筋細胞の純度を向上させる方法が記載されている。しかしながらこの方法は、心筋細胞以外の細胞のみならず、心筋細胞にもダメージが大きいことが懸念されている。また、心筋細胞の選抜に長時間（少なくとも数日間）を要するという問題もある。【０００５】
第二の方法は、心筋細胞に特異的な表面抗原や糖鎖に対する抗体で心筋細胞を分取する方法、すなわちフローサイトメトリーや磁気ビーズを用いる方法である。しかしながら、フローサイトメトリーで細胞を分取する場合、必要な細胞量に応じて相当の長時間を要するという問題がある。また、フローサイトメトリーや磁気ビーズを用いることにより、回収した細胞のダメージや汚染が懸念されるという問題がある。したがって、細胞移植のような大量の細胞が必要な場合にこの方法を採用することは現実的でない。さらに、この方法を用いた場合、抗体や磁気ビーズの残存を評価する必要があり、時間と手間を要する。仮に、磁気ビーズの残存が検出された場合には、移植細胞の安全性の担保が困難である。【０００６】
ヒト多能性幹細胞由来の分化細胞を純化して移植用の細胞を調製する理想的な方法とは、分化細胞の純度や細胞収量が向上しているだけでなく、移植を受けるヒトに対する安全性が担保されていると共に、移植後に生体内で目的の機能を発揮できる細胞を調製し得ることが必要不可欠である。さらに理想的には、細胞に与えるダメージが低く、かつ、短時間で大量の細胞を処理できるシンプルな方法であることが望ましい。しかしながら、現在報告されている方法では、臨床に適用可能な細胞を調製できるとは言い難い。それゆえ、臨床に適用可能な細胞、すなわち安全でダメージが少ない細胞を、簡便かつ大量に調製可能な新たな方法の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１４３９６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yang L et al., Nature, 2008 May 22;453(7194):524-8, doi: 10.1038/nature06894, Epub 2008 Apr 23
【非特許文献２】Takahashi K et al., Cell, 2007 Nov 30;131(5):861-72
【非特許文献３】Kawamura M et al., Circulation, 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
【非特許文献４】Thavandiran N et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 3;110(49):E4698-707, doi: 10.1073/pnas.1311120110, Epub 2013 Nov 19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団を用いて、臨床に適用可能な安全でダメージが少ない心筋細胞集団を、短時間かつ簡便な操作で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］（１）多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、（２）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および（３）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする心筋細胞集団の製造方法。
［２］さらに、分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含むことを特徴とする前記［１］に記載の製造方法。
［３］前記未分化細胞を除去する工程が、前記工程（１）と（２）の間に設けられ、（Ａ）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１およびラミニンα３β３γ２からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および（Ｂ）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする前記［２］に記載の製造方法。
［４］前記工程（２）および／または工程（Ａ）において、培養器の培養面または担体にコーティングされたラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、分化誘導された細胞集団を接触させることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである前記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ラミニンＥ８フラグメントのコーティング濃度が０．１μｇ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２である前記［５］に記載の製造方法。
［７］前記工程（２）における接触時間が１５分〜１８０分である前記［５］または［６］に記載の製造方法。
［８］前記工程（Ａ）における接触時間が５分〜３０分である前記［５］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］心筋細胞集団における心筋細胞の純度が５０％〜９０％である前記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法であって、工程１：ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程、および工程２：前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、を含むことを特徴とする方法。
［１１］前記インテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである前記［１０］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団を用いて、臨床に適用可能な安全でダメージが少ない心筋細胞集団を、短時間かつ簡便な操作で製造することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を、短時間かつ簡便な操作で向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトラミニンＥ８フラグメント（５１１Ｅ８、３１１Ｅ８、３３２Ｅ８）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における未分化細胞の除去を検討した結果を示す図である。
【図２】ヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントの未分化細胞に対する特異性をヒトラミニン２２１Ｅ８フラグメントと比較検討した結果を示す図である。
【図３】ヒトラミニンＥ８フラグメント（２２１Ｅ８、２１１Ｅ８、５１１Ｅ８）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における心筋細胞率の向上、および用いたヒトラミニンＥ８フラグメントの心筋細胞に対する特異性を検討した結果を示す図である。
【図４】ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団をヒトラミニン２２１Ｅ８フラグメントで処理し、経時的に付着細胞を回収して、付着細胞中の心筋細胞率を検討した結果を示す図である。
【図５】ヒトラミニンＥ８フラグメント（５１１Ｅ８、２２１Ｅ８、２１１Ｅ８）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における未分化細胞の除去に関し、処理時間（接触時間）を変えて検討した結果を示す図である。
【図６】ヒトラミニンＥ８フラグメント（５１１Ｅ８、２２１Ｅ８、２１１Ｅ８）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における心筋細胞の純化に関し、処理時間（接触時間）を変えて検討した結果を示す図である。
【図７】ヒトラミニンＥ８フラグメント（５１１Ｅ８、２２１Ｅ８、２１１Ｅ８）を用いて、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における心筋細胞の純化に関し、ヒトラミニンＥ８フラグメントのコーティング濃度を変えて検討した結果を示す図である。
【図８】ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における心筋細胞濃縮効果に関し、２２１Ｅ８処理と５１１Ｅ８処理を比較した結果を示す図である。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞に分化誘導した細胞集団における心筋細胞の純化に関し、２２１Ｅ８処理と無糖培地処理を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔心筋細胞集団の製造方法〕
本発明は、心筋細胞集団の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という。）を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程（１）、工程（２）および工程（３）を含むものであればよい。
（１）多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程
（２）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程
（３）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程
【００１４】
本発明の製造方法は、さらに多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含むことが好ましい。当該未分化細胞を除去する工程は、工程（１）と（２）の間に設けることが好ましい。多能性幹細胞由来の心筋細胞集団に残存する未分化細胞が少ないほど、移植細胞の安全性が向上すると考えられる。
また、本発明の製造方法は、工程（３）の後に、工程（３）で回収した細胞を培養する工程（４）を含んでもよい。
【００１５】
上記未分化細胞を除去する工程には、公知の未分化細胞除去方法を好適に用いることができる。公知の未分化細胞除去方法としては、国際公開ＷＯ２０１２／０５６９９７号に記載の方法、国際公開ＷＯ２０１２／１４７９９２号に記載の方法、国際公開ＷＯ２０１２／１３３６７４号に記載の方法、国際公開ＷＯ２０１２／０１２８０３号（特表２０１３−５３５１９４）に記載の方法、国際公開ＷＯ２０１２／０７８１５３号（特表２０１４−５０１５１８）に記載の方法、特開２０１３−１４３９６８号公報およびCell Stem Cell Vol.12 January 2013, Page 127-137に記載の方法、PNAS 2013 Aug 27;110(35):E3281-90に記載の方法などが挙げられる。
【００１６】
本発明の製造方法では、上記未分化細胞を除去する方法として、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を含む方法を用いることが好ましい。
（Ａ）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１およびラミニンα３β３γ２からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程
（Ｂ）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程
【００１７】
本発明の製造方法により製造される「心筋細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を含む細胞集団を意味する。「心筋細胞集団」の心筋細胞には、成熟心筋細胞および心筋前駆細胞の両方が含まれる。また「心筋細胞集団」には心筋細胞以外の細胞が含まれていてもよい。心筋細胞以外の細胞としては、例えば多能性幹細胞から心筋細胞への分化途中の細胞が挙げられる。また、多能性幹細胞から分化した血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、その他の細胞が含まれていてもよい。得られた心筋細胞集団は、臨床での移植治療用の心筋細胞集団として好適用いることができる。例えば、移植用心筋シートの作製、カテーテルや注射針を介して直接心臓に注入するために使用することができる。また、得られた心筋細胞集団は、創薬スクリーニング、発生研究等の研究用細胞としても非常に有用である。
【００１８】
本発明の製造方法に用いる多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。多能性幹細胞は、哺乳動物由来の幹細胞であることが好ましい。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。ヒト多能性幹細胞を用いることにより、ヒトに対して安全な心筋細胞集団を製造することができる。
【００１９】
ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体分子である。α鎖はα１〜α５の５種類、β鎖はβ１〜β３の３種類、γ鎖はγ１〜γ３の３種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも１２種類以上のアイソフォームが存在する。本発明の製造方法において、工程（２）で用いるラミニンは、心筋細胞の細胞表面に発現するインテグリンに対する結合特異性を有するラミニンが好ましい。
ラミニン結合性インテグリンにはα３β１、α６β１、α６β４およびα７β１がある（Hynes et al., Cell Vol.110, 673-687, 2002）。これらのインテグリンの生体内での発現部位にはそれぞれ特徴があり、筋組織にはインテグリンα７β１が選択的に発現していることが知られている。また、インテグリンα７β１には、α７鎖の選択的スプライシングにより生じるα７Ｘ１β１とα７Ｘ２β１の２つのタイプがあり、心筋細胞や骨格筋細胞ではα７Ｘ２β１が主に発現していることが報告されている（Israeli-rosenberg et al., Circ Res. 2014;114:572-586）。インテグリンα７Ｘ２β１に対して結合特異性が高いラミニンとしては、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１、ラミニンα１β２γ１が報告されている（Taniguchi et al., The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）。したがって、工程（２）では、インテグリンα７Ｘ２β１に対して結合特異性が高いラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１またはラミニンα１β２γ１を用いることが好ましい。以下、それぞれラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン１１１、ラミニン１２１と記す。
【００２０】
本発明の製造方法において、分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程の工程（Ａ）で用いるラミニンは、未分化の多能性幹細胞表面に発現するインテグリンに対する結合特異性を有するラミニンが好ましい。多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞はインテグリンの中でもα６β１を多く発現していることが知られている（Miyazaki T et al.,  Biochem. Biophys. Res. Commun., 375:27-32, 2008）。インテグリンα６β１に対して結合特異性の高いラミニンとしては、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β３γ２が報告されている（Nishiuchi et al., Matrix Biol., 25:189-197, 2006）。したがって、工程（Ａ）では、インテグリンα６β１に対して結合特異性が高いラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１またはラミニンα３β３γ２を用いることが好ましい。また、発明者らは、ラミニンα３β３γ２と同じα３鎖を含むラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１もインテグリンα６β１に対して結合特異性が高いことを確認しており、これらも工程（Ａ）で好ましく使用することができる。以下、それぞれラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン３３２、ラミニン３１１、ラミニン３２１と記す。
【００２１】
本発明の製造方法に用いるラミニンは全長ラミニンでもよく、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントでもよい。すなわち、全長α鎖、全長β鎖および全長γ鎖からなる全長ラミニンであってもよく、α鎖、β鎖およびγ鎖の少なくとも１つ以上が全長より短いフラグメントからなるラミニンフラグメントであってもよい。ラミニンフラグメントはヘテロ３量体を形成していることが好ましい。ラミニンフラグメントがインテグリン結合活性を有していることは、結合対象のインテグリンを用いた固相結合アッセイ等により確認することができる。ラミニンフラグメントがヘテロ３量体を形成していることは、ラミニンフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、バンドの数を検出すること等により確認できる。
【００２２】
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントとしては、ラミニンＥ８フラグメント（以下、「ラミニンＥ８」と記す）を好ましく用いることができる。ラミニンＥ８は、マウスラミニン１１１をエラスターゼで消化して得られたヘテロ３量体を形成しているフラグメントであり、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D et al., J. Cell Biol., 105:589-598, 1987）。マウスラミニン１１１以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１Ｅ８に相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン１１１以外のラミニンをエラスターゼで消化してラミニンＥ８を分離、同定した報告はない。したがって、本発明に用いられるラミニンＥ８は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するラミニンのフラグメントであればよい。
【００２３】
ラミニンまたはラミニンフラグメントの由来は特に限定されず、各種生物由来のラミニンまたはラミニンフラグメントを用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のラミニンまたはラミニンフラグメントである。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。なかでもヒト由来のラミニンフラグメントを用いることが特に好ましい。ヒトに対して安全な心筋細胞集団を製造するためには、製造工程において異種生物由来の成分の使用を排除することが求められることから、ヒト由来のラミニンフラグメントを用いることが好ましい。
【００２４】
ラミニンは天然型であってもよく、その生物学的活性を維持したまま、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。ラミニンの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニン高発現細胞から精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。ラミニンフラグメントの製造方法も特に限定されず、例えば、全長ラミニンをエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、ラミニンおよびラミニンフラグメントの両者とも、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００２５】
組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えラミニン、組換えラミニンフラグメントの製造方法としては、例えば、α鎖、β鎖およびγ鎖の各全長タンパク質または部分タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。組換えラミニン（全長）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004）の方法などが挙げられるが、これに限定されない。組換えラミニンフラグメント（ラミニンＥ８）の製造方法としては、例えばＩｄｏら（Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）の方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
主要な哺乳動物のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１に、ヒトを含む主な哺乳動物について、ラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。これら以外の各種生物由来のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００２７】
【表１】
2016043168.tif 000003
【００２８】
ラミニンＥ８は、α鎖のＣ末端フラグメントから球状ドメイン４および５が除かれたフラグメント（以下「α鎖Ｅ８」と記す）、β鎖のＣ末端フラグメント（以下「β鎖Ｅ８」と記す）およびγ鎖のＣ末端フラグメント（以下「γ鎖Ｅ８」と記す）が３量体を形成したフラグメントであり、３量体の分子量は約１５０〜約１７０ｋＤａである。α鎖Ｅ８は通常約７７０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側の約２３０アミノ酸が３量体形成に関わる。β鎖Ｅ８は通常約２２０〜約２３０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８は通常約２４０〜約２５０個のアミノ酸からなる。γ鎖Ｅ８のＣ末端部から３番目のグルタミン酸残基はラミニンＥ８のインテグリン結合活性に必須である（Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）。
【００２９】
本発明の工程（１）において、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法は、公知の分化誘導方法を好適に用いることができる。例えば、フィーダー細胞上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、アクチビンＡとＢＭＰ４（Bone Morphogenetic Protein 4）を用いて分化誘導する方法（非特許文献１、２）、マトリゲル上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ−１およびＤＫＫ１を用いて分化誘導する方法（非特許文献３）、フィーダー細胞上で維持培養したヒト多能性幹細胞を、バイオリアクターを用いて大量に分化誘導する方法（非特許文献３）、ヒト多能性幹細胞を既知組成添加因子のみで維持培養から分化誘導まで行う方法（国際公開ＷＯ２０１４／０７８４１４号）などが挙げられる。なかでも、ヒトへの移植が可能な心筋細胞集団の製造に適した分化誘導方法としては、例えば、上記国際公開ＷＯ２０１４／０７８４１４号に記載の方法、ヒトラミニン５１１Ｅ８上で維持培養したヒト多能性幹細胞（特開２０１１−０７８３７０号公報）を心筋細胞に分化誘導する方法などが挙げられる。
【００３０】
本発明の工程（２）および工程（Ａ）において、工程（１）で心筋細胞に分化誘導された細胞集団を、ラミニンまたはそのフラグメントと接触させる方法は特に限定されない。例えば、培養用シャーレ等の培養器の培養面にラミニンまたはそのフラグメントをコーティングし、そこに心筋細胞に分化誘導された細胞集団の細胞懸濁液を添加して、一定時間静置する方法が挙げられる。また、例えばビーズ等の担体にラミニンまたはそのフラグメントをコーティングし、この担体を心筋細胞に分化誘導された細胞集団の細胞懸濁液に投入して、一定時間静置する方法が挙げられる。また、例えば中空糸膜を担体として用い、中空糸膜の内部にラミニンまたはそのフラグメントをコーティングして、心筋細胞に分化誘導された細胞集団の細胞懸濁液を中空糸膜内に注入して通過させる方法等が挙げられる。
【００３１】
工程（２）および工程（Ａ）において、ラミニンまたはラミニンフラグメントのコーティング濃度は特に限定されず、工程（２）および工程（Ａ）の目的が達成できるコーティング濃度を適宜選択して使用すればよい。例えば、約０．１〜約２．０μｇ／ｃｍ２の範囲から選択することが好ましい。本発明の製造方法にラミニンＥ８を用いる場合、工程（２）および工程（Ａ）おいて、ラミニンＥ８のコーティング濃度は特に限定されないが、約０．１〜約２．０μｇ／ｃｍ２であることが好ましく、約０．２５〜約１．０μｇ／ｃｍ２であることがより好ましく、約０．５〜約１．０μｇ／ｃｍ２であることがさらに好ましい。
【００３２】
工程（２）および工程（Ａ）において、ラミニンまたはラミニンフラグメントと細胞を接触させる時間（ラミニン処理時間）は特に限定されず、用いたコーティング濃度に応じて工程（２）および工程（Ａ）の目的が達成できる時間を使用すればよい。本発明の製造方法にラミニンＥ８を用いる場合、工程（２）において、ラミニンＥ８と細胞の接触時間は特に限定されないが、約１５分〜約１８０分であることが好ましく、約１５分〜約１２０分であることがより好ましく、約１５分〜約６０分であることがさらに好ましく、約２５分〜約６０分であることがさらに好ましい。また、工程（Ａ）において、ラミニンＥ８と細胞の接触時間は特に限定されないが、約３０分以下であることが好ましく、約５分〜約３０分であることがより好ましく、約５分〜約１５分であることがさらに好ましい。
【００３３】
本発明の工程（３）において、ラミニンまたはラミニンフラグメントに付着した細胞を回収する方法は特に限定されず、付着細胞を剥離する公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、付着していない細胞を除去した後、ラミニンまたはラミニンフラグメントのコーティング面にＥＤＴＡ液を添加、またはＥＤＴＡ液中に担体を投入してピペッティング等することにより細胞を剥離させ、回収することができる。または、ＥＤＴＡ液の代わりにトリプシン液を用いて細胞を剥離することができる。また、工程（３）の後に回収した細胞を培養する工程（４）を行う場合は、付着していない細胞を除去するだけでもよい。
【００３４】
本発明の工程（Ｂ）において、ラミニンまたはラミニンフラグメントに付着しない細胞を回収する方法は特に限定されない。例えば、ラミニンまたはラミニンフラグメントをコーティングした培養器を用いた場合には、回収した培地およびコーティング表面をＰＢＳ等で数回洗浄した洗浄液に含まれる細胞を遠心分離等により回収することができる。ラミニンまたはラミニンフラグメントをコーティングした担体を細胞懸濁液に投入した場合には、担体を回収した細胞懸濁液に残っている細胞を遠心分離等により回収することができる。ラミニンまたはラミニンフラグメントをコーティングした中空糸膜を用いた場合には、中空糸膜を通過した細胞懸濁液を回収して遠心分離等により付着しない細胞を回収することができる。
【００３５】
本発明の製造方法において、工程（３）の後に、工程（３）で回収した細胞を培養する工程（４）を行う場合、培養方法は特に限定されず、公知の細胞培養方法から適宜選択することができる。好ましくは、心筋細胞の培養に適した培養方法である。例えば、工程（２）で用いたラミニンまたはラミニンフラグメントがコーティングされた培養器を用いて培養する方法が挙げられる。工程（３）において、ラミニン処理時間終了後に付着していない細胞を除去して付着細胞をプレートに残し、新たな培地を添加することにより工程（４）の培養に移行してもよい。培養期間は特に限定されず、目的の心筋細胞純度の心筋細胞集団を維持できる期間を適宜設定すればよい。
【００３６】
本発明の製造方法により製造される心筋細胞集団における心筋細胞の純度（心筋細胞率）は、少なくとも１０％以上が必要であり、３０％以上であることが好ましい。より好ましくは５０％〜９０％であり、さらに好ましくは６０％〜８０％である。心筋細胞集団における心筋細胞の純度（心筋細胞率）は、例えば心筋細胞集団中の心筋型トロポニンＴ陽性細胞の比率として、フローサイトメトリー等を用いて確認することができる。
【００３７】
本発明の製造方法により製造される心筋細胞集団における未分化細胞率は特に限定されない。本発明の製造方法において工程（１）と（２）の間に未分化細胞を除去する工程を行うことにより、未分化細胞を除去する工程を行わない場合と比べて、得られる心筋細胞集団中の未分化細胞を減少させることができるので、未分化細胞を除去する工程を行うことが好ましい。特に、未分化細胞を除去する工程として工程（Ａ）および工程（Ｂ）を採用することにより、得られる心筋細胞集団にダメージを与えることなく未分化細胞を除去することができる。心筋細胞集団の未分化細胞率は、例えば心筋細胞集団中のＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞の比率として、フローサイトメトリー等を用いて確認することができる。
【００３８】
本発明の製造方法では、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団をラミニンまたはラミニンフラグメントと接触させて付着細胞を回収する方法を採用しているため、他の製造方法と比べて以下の点で優れている。第一に、操作が簡便であり、かつ非常に短時間で行うことができることである。従来の製造方法では、心筋細胞とその他の細胞、特に未分化性を維持したままの細胞の間の代謝経路の差異を利用して心筋細胞を選別するため、選別操作に長時間（少なくとも数日間）を要する。この選別操作は細胞に対する負荷が大きく、選別された細胞のバイアビリティーの低下が避けられない。本発明の製造方法では、選別に要する時間が数分〜数時間と短く、選別操作による細胞への負荷はわずかである。第二に、インテグリンを介する基材への細胞の接着により目的に細胞を選別するため、細胞のバイアビリティーは損なわれるどころか、逆に向上することが期待できる。実際、ラミニンへのインテグリン依存的な細胞接着は細胞のアポトーシスを抑制して細胞の生存を維持するとともに、細胞増殖を促す細胞内シグナル伝達経路を活性化することが知られている（Gu J et al. The Journal of Biological Chemistry 277:19922-19928, 2002）。したがって、本発明の製造方法は、従来の方法と異なり、多能性幹細胞から分化誘導した心筋細胞集団を高いバイアビリティーを維持した状態で、かつ短時間で選別できるという大きな利点を有する。さらに、本発明の製造方法では、工程（２）の操作を連続して繰り返し行うこと、または、工程（２）および工程（３）の操作を連続して繰り返し行うことが容易であり、操作を連続して繰り返すことにより、得られる心筋細胞集団中の心筋細胞の純度を向上させることが容易である。このように、本発明の製造方法で製造される心筋細胞集団は、非常に安全性が高く、かつ、バイアビリティーの高い細胞であるので、移植用の心筋細胞集団として非常に優れている。
【００３９】
本発明の製造方法の工程（２）で用いるラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン１１１またはラミニンα１２１は、心筋細胞だけでなく、骨格筋細胞にも結合特異性を有しているので、工程（１）を多能性幹細胞を骨格筋細胞へ分化誘導する工程に変更することにより、骨格筋細胞の製造方法を提供することができる。
また、本発明の製造方法の工程（２）で用いるラミニンを細胞ごとに使い分けることにより、多能性幹細胞から分化誘導した様々な細胞を、当該ラミニンをコーティングした基材を用いて接着依存的に選別することが可能である。具体的には、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した肝臓前駆細胞はラミニン１１１にインテグリンα６β１依存的に接着することが報告されている（Takayama K. et al. Stem Cell Reports 1:322-335, 2013）。ラミニン１１１は再生肝において一過的に発現することが報告されている（Kikkawa Y et al. Experimental Cell Research 305:99-109, 2005）。これらの知見を踏まえて、ヒト多能性幹細胞から分化誘導した肝臓前駆細胞を、ラミニン１１１をコーティングした基材を使って選別し、純化することが可能である。すなわち、本発明の製造方法において、工程（１）を多能性幹細胞を肝臓前駆細胞へ分化誘導する工程に変更し、工程（２）で用いるラミニンをラミニン１１１に変更することにより、肝臓前駆細胞の製造方法を提供することができる。
【００４０】
〔心筋細胞の純度向上方法〕
本発明は、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法を提供する。本発明の心筋細胞の純度向上方法は、以下の工程１および工程２を含むものであればよい。
工程１：ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程
工程２：前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程
工程１および工程２の内容は、上記本発明の製造方法の工程（２）および工程（３）と同じである。本発明の心筋細胞の純度向上方法は、上記本発明の製造方法と同様に実施することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４２】
〔実験材料および方法〕
（１）ヒトラミニンＥ８
ヒトラミニン５１１Ｅ８、ヒトラミニン３３２Ｅ８、ヒトラミニン３１１Ｅ８、ヒトラミニン２２１Ｅ８およびヒトラミニン２１１Ｅ８の５種類のヒトラミニンＥ８を使用した。以下、実施例において、それぞれ５１１Ｅ８、３３２Ｅ８、３１１Ｅ８、２２１Ｅ８および２１１Ｅ８と略記する。
５１１Ｅ８は、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（商品名、株式会社ニッピ）を購入して使用した。５１１Ｅ８以外のラミニンＥ８は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007）、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（Yukimasa Taniguchi et al., The Journal of Biological Chemistry, 7820-7831, 2009）に記載の方法に従って作製した。すなわち、ヒトα３鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）発現ベクター、ヒトα２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６×Ｈｉｓタグを含む）発現ベクター、ヒトβ３鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）発現ベクター、ヒトβ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）発現ベクター、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）発現ベクター、ヒトγ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）発現ベクターおよびヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）発現ベクターをそれぞれ作成し、α鎖、β鎖およびγ鎖の組み合わせを選択して、ヒト腎臓由来２９３細胞にトランスフェクトし、７２時間培養を行った後、培養液を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅとＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。【００４３】
（２）培養皿のラミニンＥ８コーティング
培養皿には、６穴または１２穴マルチウェルプレート（ＢＤファルコン社）を用いた。ラミニンＥ８を所望の濃度にＰＢＳで希釈し、１ウェルあたり１ｍｌ（６穴）または０．４ｍｌ（１２穴）を添加した。３７℃で２時間以上静置した後、ラミニン液を除去し、ＰＢＳでプレート表面を２回洗浄した。培養皿のコーティングは、使用直前に行った。実施例１〜４および９では６穴マルチウェルプレートを用い、実施例５〜８では１２穴マルチウェルプレートを用いた。【００４４】
（３）ヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を理化学研究所から購入して使用した。Ｍａｔｓｕｕｒａら（Matsuura K et al., Biochem Biophys Res Commun, 2012 Aug 24;425(2):321-7, doi: 10.1016/j.bbrc.2012.07.089. Epub 2012 Jul 25）に記載の方法に従いリアクターを用いて心筋分化誘導を行った。具体的には、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ培地（リプロセル社）に５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したものを未分化維持培地として用い、マイトマイシンＣ処理を行ったＭＥＦ上で未分化２５３Ｇ１細胞を培養した。１０ｃｍ培養皿１０枚分の未分化２５３Ｇ１細胞を、剥離液（リプロセル社）を用いて回収し、１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加したｍＴｅＳＲ培地（ステムセルテクノロジーズ）１００ｍｌに懸濁した後、ベッセルに移し、バイオリアクター（エイブル社）で撹拌培養を開始した。１日後、培地からＹ２７６３２を除いた。１〜３日後に培地をＳｔｅｍＰｒｏ−３４（ライフテクノロジーズ）に置換し、３日〜４日後に０．５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加し、４〜７日後に１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４と５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと３ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを添加し、７〜９日後に４μＭのＩＷＲ-１を添加し、９日目以降は５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加して撹拌を続け、１６〜１８日後に細胞を回収した。【００４５】
（４）分化誘導後の細胞懸濁液の調製
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ液（ライフテクノロジーズ）を用いて細胞塊をほぐし、７０μｍのメッシュフィルターで濾過して細胞懸濁液を調製した。毎分１５００回転５分間遠心分離した。沈渣をＰＢＳで懸濁し、再度毎分１５００回転５分間遠心分離した。沈渣を１ｍｌ当り２０万個細胞になるように培地（１％ウシ血清アルブミン含ＤＭＥＭ）で懸濁した。【００４６】
（５）ラミニン処理
ラミニンＥ８でコーティングした６穴マルチウェルプレートに、１ウェル当り３ｍｌの細胞懸濁液（６０万個の細胞）を播種した。または、ラミニンＥ８でコーティングした１２穴マルチウェルプレートに、１ウェル当り１．２ｍｌの細胞懸濁液（２４万個の細胞）を播種した。一定の処理時間（接触時間）経過後、浮遊細胞および付着細胞を分別回収した。すなわち、培養上清を回収し、培養面をＰＢＳで洗浄して洗浄液を回収し、再度培養面をＰＢＳで洗浄して洗浄液を回収した。培養上清と２回の洗浄液に含まれる細胞を浮遊細胞とした。一方、ＰＢＳで２回洗浄した後の培養面にＥＤＴＡ液を添加しピペッティングにて剥離させて細胞を回収した。さらにＰＢＳで培養面を洗浄して洗浄液を回収した。ＥＤＴＡで剥離した細胞とその後の洗浄液中の細胞を付着細胞とした。
それぞれ遠心分離（毎分１５００回転５分間）の後、上清を除去した。沈渣を心筋型トロポニンＴ（心筋細胞を検出）またはＢＣ２ＬＣＮ（未分化細胞を検出）で染色し、フローサイトメトリーまたは免疫染色を用いて評価した。【００４７】
〔実施例１：５１１Ｅ８、３１１Ｅ８、３３２Ｅ８を用いた浮遊細胞における未分化細胞除去〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、５１１Ｅ８、３１１Ｅ８または３３２Ｅ８で３０分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。ラミニンＥ８の濃度は、０、１、２．５、５および１０μｇ／ｍｌ（０、０．１、０．２５、０．５および１μｇ／ｃｍ２）の５段階とした。回収した浮遊細胞および付着細胞におけるＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞率（未分化細胞率）をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図１に示した。上段が未分化細胞率であり、下段が細胞回収数である。図中ＬＮ５１１は５１１Ｅ８、ＬＮ３１１は３１１Ｅ８、ＬＮ３３２は３３２Ｅ８をそれぞれ表す。ラミニン処理前の未分化細胞率は１．７％であったのに対し、いずれのラミニンＥ８で処理した場合も、浮遊細胞中の未分化細胞率は濃度依存的に減少した。特に５１１Ｅ８では、低濃度でも未分化細胞率の減少を認め、コーティング濃度０．５μｇ／ｃｍ２の未分化細胞率は０．８％まで減少した。回収した浮遊細胞数は、いずれのラミニンＥ８で処理した場合も濃度依存的に減少した。【００４８】
〔実施例２：未分化細胞の５１１Ｅ８に対する特異性〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８または１μｇ／ｃｍ２の２２１Ｅ８で３０分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。回収した浮遊細胞および付着細胞におけるＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞率（未分化細胞率）をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図２に示した。図中ＬＮ５１１は５１１Ｅ８、ＬＮ２２１は２２１Ｅ８をそれぞれ表す。処理前は未分化細胞率が２．５％であったのに対し、０．５μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８で処理後の浮遊細胞における未分化細胞率は１．６％に低下した。また、付着細胞における未分化細胞率は３．７％に上昇した。一方、１μｇ／ｃｍ２のラミニン２２１で処理後の浮遊細胞および付着細胞における未分化細胞率はいずれも２．７％であった。【００４９】
〔実施例３：２２１Ｅ８、２１１Ｅ８、５１１Ｅ８を用いた心筋細胞分取および特異性〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、２２１Ｅ８、２１１Ｅ８または５１１Ｅ８で３０分間処理し、浮遊細胞および付着細胞をそれぞれ回収した。ラミニンＥ８のコーティング濃度は、０、０．２５、０．５、１および２μｇ／ｃｍ２の５段階とした。回収した浮遊細胞および付着細胞における心筋型トロポニンＴ陽性細胞率（心筋細胞率）をそれぞれフローサイトメトリーで評価した。
結果を図３に示した。上段が心筋型トロポニンＴ陽性細胞率（心筋細胞率）であり、下段が細胞回収数である。図中ＬＮ２２１は２２１Ｅ８、ＬＮ２１１は２１１Ｅ８、ＬＮ５１１は５１１Ｅ８をそれぞれ表す。ラミニン処理前の心筋細胞率は１８．５％であった。浮遊細胞における心筋細胞率は、いずれのラミニンＥ８で処理した場合も処理前の値とほぼ同等であったのに対し、２２１Ｅ８または２１１Ｅ８で処理した付着細胞における心筋細胞率は共に上昇した。一方、５１１Ｅ８で処理した場合は、付着細胞および浮遊細胞における心筋細胞率に大きな差は認められなかった。回収した付着細胞数は、いずれのラミニンＥ８で処理した場合も濃度依存的に上昇した。【００５０】
〔実施例４：２２１Ｅ８処理による付着細胞数および心筋細胞率の経時的変化〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度１μｇ／ｃｍ２の２２１Ｅ８で処理し、経時的に付着細胞を回収して、その細胞数と心筋細胞率（心筋型トロポニンＴ陽性細胞率）をフローサイトメトリーで評価した。
結果を図４Ａ、Ｂ、Ｃに示した。Ａは２２１Ｅ８の処理時間が１５、２０、２５および３０分の付着細胞数、Ｂは２２１Ｅ８の処理時間が０．５、１、８および２４時間の付着細胞数（Ａの実験とは別の実験の結果）、Ｃは２２１Ｅ８の処理時間が１５、２０、２５、３０および６０分の付着細胞数における心筋細胞率である。なお、接触時間０の心筋細胞率は２２１Ｅ８処理前の心筋細胞率である。付着細胞数は２２１Ｅ８の処理時間が１５〜３０分の間で経時的に増加し（図４Ａ）、１〜８時間で漸増した後、２４時間まで減少傾向にあった（図４Ｂ）。２２１Ｅ８の処理前の心筋細胞率は１６．１％であった。２２１Ｅ８の処理後１５分における心筋細胞率は３５．９％に上昇しており、その後経時的に減少傾向が認められた（図４Ｃ）。【００５１】
〔実施例５：５１１Ｅ８、２１１Ｅ８、２２１Ｅ８を用いた浮遊細胞における未分化細胞除去〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度１μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理し、処理開始から１５分、３０分、６０分、１２０分後に浮遊細胞を回収し、回収した浮遊細胞の細胞数と未分化細胞率（ＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞率）をフローサイトメトリーで評価した。未分化細胞率は処理前の未分化細胞数に対する変化率、すなわち処理後のＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞数を処理前のＢＣ２ＬＣＮ陽性細胞数で除算した値で表した。【００５２】
結果を図５Ａ、Ｂに示した。Ａは浮遊細胞における未分化細胞率の経時的変化を示し、Ｂは各回収時間における浮遊細胞数を示す。図中ＬＮ５１１は５１１Ｅ８、ＬＮ２２１は２２１Ｅ８、ＬＮ２１１は２１１Ｅ８、をそれぞれ表す。図５Ａに示したように、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した場合の未分化細胞率は、いずれの回収時間でもほぼ１以上であったが、５１１Ｅ８で処理した場合は、いずれの回収時間でも１未満であった。この結果から、浮遊細胞中の未分化細胞の除去に５１１Ｅ８処理が有効であることが示された。図５Ｂに示したように、回収した浮遊細胞数はいずれのラミニンにおいても接触時間依存的に減少したが、５１１Ｅ８を用いた場合は３０分以上接触させると浮遊細胞数が顕著に減少することが示された。この結果から、未分化細胞率の経時変化と浮遊細胞数の経時変化を考慮すれば、未分化細胞を除去する工程の工程（Ａ）において細胞とラミニンＥ８との接触時間は３０分以下が好ましく、１５分以下がより好ましいことが示唆された。【００５３】
〔実施例６：５１１Ｅ８、２１１Ｅ８、２２１Ｅ８を用いた心筋細胞純化：処理時間の検討〕
（１）処理時間（接触時間）による心筋細胞率および付着細胞数の変化
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度１μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理し、処理開始から１５分、３０分、６０分、１２０分後に付着細胞を回収し、回収した付着細胞の細胞数と心筋細胞率（心筋型トロポニンＴ陽性細胞率）をフローサイトメトリーで評価した。心筋細胞率は処理前の心筋細胞数に対する変化率、すなわち処理後の心筋型トロポニンＴ陽性細胞数を処理前の心筋型トロポニンＴ陽性細胞数で除算した値で表した。【００５４】
結果を図６Ａ、Ｂに示した。Ａは付着細胞における心筋細胞率の経時的変化を示し、Ｂは各回収時間における付着細胞数を示す。図中ＬＮ５１１は５１１Ｅ８、ＬＮ２２１は２２１Ｅ８、ＬＮ２１１は２１１Ｅ８、をそれぞれ表す。図６Ａに示したように、５１１Ｅ８で処理した場合の心筋細胞率は、いずれの回収時間でも１前後であったが、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した場合は、いずれの回収時間でも１を超えており、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理して付着細胞を回収することにより、心筋細胞の純度を向上させることができた。図６Ｂに示したように、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した場合の付着細胞数は、処理時間（接触時間）が６０分までは時間依存的に増加した。この結果から、工程（２）において細胞とラミニンＥ８との接触時間は、約３０分〜約６０分が好ましいことが示唆された。【００５５】
〔実施例７：５１１Ｅ８、２１１Ｅ８、２２１Ｅ８を用いた心筋細胞純化：ラミニンＥ８コーティング濃度の検討〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、５１１Ｅ８、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８を０．２５、０．５、１および２μｇ／ｃｍ２の４段階のコーティング濃度で処理し、処理開始から３０分後に付着細胞を回収し、回収した付着細胞の細胞数と心筋細胞率（心筋型トロポニンＴ陽性細胞率）をフローサイトメトリーで評価した。心筋細胞率は処理前の心筋細胞数に対する変化率、すなわち処理後の心筋型トロポニンＴ陽性細胞数を処理前の心筋型トロポニンＴ陽性細胞数で除算した値で表した。【００５６】
結果を図７Ａ、Ｂに示した。Ａは各コーティング濃度の付着細胞における心筋細胞率を示し、Ｂは各コーティング濃度における付着細胞数を示す。図中ＬＮ５１１は５１１Ｅ８、ＬＮ２２１は２２１Ｅ８、ＬＮ２１１は２１１Ｅ８、をそれぞれ表す。図７Ａに示したように、５１１Ｅ８で処理した場合の心筋細胞率は、いずれのコーティング濃度でも１前後であったが、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した場合は、いずれのコーティング濃度でも１を超えており、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理して付着細胞を回収することにより、心筋細胞の純度を向上させることができた。図７Ｂに示したように、２１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した場合の付着細胞数は、２１１Ｅ８の場合は０．５μｇ／ｃｍ２まで、２２１Ｅ８の場合は２μｇ／ｃｍ２まで、コーティング濃度依存的に増加した。この結果から、工程（２）におけるラミニンＥ８のコーティング濃度は約０．５〜約２μｇ／ｃｍ２が好ましいことが示唆された。【００５７】
〔実施例８：２２１Ｅ８による心筋細胞濃縮効果の確認〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、コーティング濃度１μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８または２２１Ｅ８で３０分間処理し、付着細胞を回収して心筋細胞率（心筋型トロポニンＴ陽性細胞率）をフローサイトメトリーで測定した。また、３０分間処理後浮遊細胞を除去し、１μｇ／ｃｍ２の５１１Ｅ８または２２１Ｅ８をコーティングしたプレートで付着細胞を３日間培養し、心筋型トロポニンＴ陽性細胞を免疫染色した。対比染色としてＤＡＰＩを用いて核染色を行った。【００５８】
結果を図８に示した。上段はフローサイトメトリーのチャート、中段は核染色の蛍光顕微鏡画像、下段は心筋型トロポニンＴ陽性細胞の蛍光顕微鏡画像である。図８に示したように、処理前の心筋細胞率は４３％であったのに対し、５１１Ｅ８で処理した後の接着細胞における心筋細胞率は２６％に低下した。一方、ラミニン２２１Ｅ８で処理した後の付着細胞における心筋細胞率は６７％に増加した。５１１Ｅ８または２２１Ｅ８で処理した後の接着細胞を培養したところ、核染色で検出される細胞数は、２２１Ｅ８で処理したほうが５１１Ｅ８で処理した場合よりも少なかったが、そのほとんどは心筋型トロポニンＴ陽性の細胞であった。一方、５１１Ｅ８で処理した細胞の中には、心筋型トロポニンＴ陽性細胞以外の細胞が多数存在していた。この結果は、２２１Ｅ８で処理することにより、心筋細胞を効率よく濃縮できることを示すものである。【００５９】
〔実施例９：２２１Ｅ８処理および無糖培地による心筋細胞純化の比較〕
２５３Ｇ１細胞を心筋細胞に分化誘導した後、すなわち、上記〔実験材料および方法〕の（３）の方法で１６〜１８日後に回収した細胞を等量ずつ２本に分け、一方は無糖培地処理に供し、他方は２２１Ｅ８処理に供した。
無糖培地処理はＴｏｈｙａｍａらの方法（Shugo Tohyama et al., Cell Stem Cell, 12, 127-137, 2013）に従って行った。すなわち、分化誘導後にトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行わず、胚様体のまま無糖培地、すなわちグルコースを含まないＤＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ）に４ｍＭの乳酸（和光純薬）を添加したもので６日間培養した。対照としては、上記無糖培地の代わりに通常培地（１％ウシ血清アルブミン含ＤＭＥＭ）を用いて培養した細胞を用いた。３時間後および３日後に培地を交換した。６日後に０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで胚様体をほぐし、細胞を回収した。
２２１Ｅ８処理群は０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで胚様体をほぐした後、２２１Ｅ８を１μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングしたプレートで処理した。対照としては、２２１Ｅ８の代わりにウシ胎児血清をコートしたプレート上で処理した細胞を用いた。処理開始から３時間後に非付着細胞を除去した。付着した細胞に新しい培地を加え、同一のプレート、すなわち２２１Ｅ８を１μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングしたプレートまたはウシ胎児血清をコーティングしたプレートで６日間培養した。３日後に培地交換を行い、６日後に０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理して細胞を回収した。
６日後に回収した各群の細胞について、心筋型トロポニンＴ陽性細胞率（心筋細胞率）およびＢＣ２ＬＣＮ陽性率（未分化細胞率）をフローサイトメトリーで評価した。【００６０】
結果を図９Ａ、Ｂ、Ｃに示した。Ａは回収細胞数、Ｂは心筋細胞率、Ｃは未分化細胞率をそれぞれ示す。図中、無糖培地群（no-glu）を黒塗り、２２１Ｅ８処理群を斜線入り、それぞれの対照群を白抜きの棒グラフで示した。
図９Ａに示したように、回収細胞数は胚様体のまま培養した無糖培地群およびその対照群では１０万個程度であったのに対し、接着培養を行った２２１Ｅ８処理群およびその対照群では１００万個以上と顕著に高く、無糖培地処理と比べて２２１Ｅ８処理は細胞毒性が低く、加えて心筋細胞の維持にも有効であることを示している。
図９Ｂに示したように、処理前の心筋細胞率は４２．１％であった（図９Ｂのグラフ上の横線）。６日間培養後の心筋細胞率は、無糖培地対照群（通常の胚様体培養）が２５．６％であったのに対し、無糖培地群は３８．７％に上昇した。また、２２１Ｅ８処理対照群（通常の接着培養）が４２．６％であったのに対し、２２１Ｅ８処理群は５７．２％に上昇した。いずれの処理も対照群と比較して心筋細胞率が上昇したが、２２１Ｅ８処理群の心筋細胞率は処理前の心筋細胞率より顕著に高くなっていた。
図９Ｃに示したように、６日間培養後の未分化細胞率は、無糖培地対照群（通常の胚様体培養）が１３．８％であったのに対し、無糖培地群は０．５％であった。また、２２１Ｅ８処理対照群（通常の接着培養）が１．４％であったのに対し、２２１Ｅ８処理群は０．４％であった。対照群と比較した場合、相対的な未分化細胞除去率は、無糖培地処理の方が２２１Ｅ８処理より高くなっているが、処理後の未分化細胞率はどちらも０．４％〜０．５％であり、未分化細胞の残存率という観点では両者はほぼ同等であった。【００６１】
以上の結果より、２２１Ｅ８処理は無糖培地処理と比べて回収細胞数が圧倒的に多く、加えて心筋細胞率が処理前よりも顕著に増加し、未分化細胞率は無糖培地処理と同程度であることから、２２１Ｅ８処理は無糖培地処理より心筋細胞の純化効率が圧倒的に高いことが明らかになった。すなわち、本願発明は、無糖培地を用いる方法よりも心筋細胞純化法として格段に優れていることが示された。【００６２】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月17日(2016.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する工程、
（２）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
（３）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含む移植治療用心筋細胞集団の製造方法であって、
前記工程（２）において、前記ラミニンもしくは前記フラグメントが培養面にコーティングされた培養器に前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液を添加して一定時間静置すること、前記ラミニンもしくは前記フラグメントがコーティングされた担体を前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液に投入して一定時間静置すること、または前記ラミニンもしくは前記フラグメントが内部にコーティングされた中空糸膜内に前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液を注入して通過させることにより、分化誘導された細胞集団を前記ラミニンもしくは前記フラグメントに接触させ、
前記工程（３）において、前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着していない細胞を除去した後に、付着した細胞を剥離することを特徴とする移植治療用心筋細胞集団の製造方法。
【請求項２】
さらに、前記工程（３）の後に、
（４）前記工程（３）で回収した細胞を培養する工程を含み、前記工程（３）において、前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着していない細胞を除去し、付着した細胞を剥離せずに培養を継続することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
さらに、前記工程（１）と（２）の間に、
（Ａ）分化誘導された細胞集団を、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１およびラミニンα３β３γ２からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
（Ｂ）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、
を含む分化誘導された細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含み、
前記工程（Ａ）において、前記ラミニンもしくは前記フラグメントが培養面にコーティングされた培養器に前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液を添加して一定時間静置すること、前記ラミニンもしくは前記フラグメントがコーティングされた担体を前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液に投入して一定時間静置すること、または前記ラミニンもしくは前記フラグメントが内部にコーティングされた中空糸膜内に前記工程（１）で得られた細胞集団の細胞懸濁液を注入して通過させることにより、分化誘導された細胞集団を前記ラミニンもしくは前記フラグメントに接触させ、
前記工程（Ｂ）において、回収した培地およびコーティング表面を洗浄した洗浄液に含まれる細胞を回収することを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
心筋細胞集団における心筋細胞の純度が６０％〜８０％である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ラミニンＥ８フラグメントのコーティング濃度が０．１μｇ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２であり、前記工程（２）における接触時間が１５分〜１８０分であり、前記工程（Ａ）における接触時間が５分〜３０分である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導された細胞集団における心筋細胞の純度を向上させる方法であって、
工程１：ラミニンα２β１γ１、ラミニンα２β２γ１、ラミニンα１β１γ１およびラミニンα１β２γ１からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと、前記細胞集団とを接触させる工程、および
工程２：前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着した細胞を回収する工程、
を含み、
前記工程１において、前記ラミニンもしくは前記フラグメントが培養面にコーティングされた培養器に前記細胞集団の細胞懸濁液を添加して一定時間静置すること、前記ラミニンもしくは前記フラグメントがコーティングされた担体を前記細胞集団の細胞懸濁液に投入して一定時間静置すること、または前記ラミニンもしくは前記フラグメントが内部にコーティングされた中空糸膜内に前記細胞集団の細胞懸濁液を注入して通過させることにより、前記細胞集団を前記ラミニンもしくは前記フラグメントに接触させ、
前記工程２において、前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着していない細胞を除去した後に、付着した細胞を剥離することを特徴とする方法。
【請求項８】
さらに、前記工程２の後に、
工程３：前記工程２で回収した細胞を培養する工程を含み、前記工程２において、前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着していない細胞を除去し、付着した細胞を剥離せずに培養を継続することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記工程１の前に、
（Ａ）前記細胞集団を、ラミニンα５β１γ１、ラミニンα５β２γ１、ラミニンα３β１γ１、ラミニンα３β２γ１およびラミニンα３β３γ２からなる群より選択されるラミニンまたは該ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントと接触させる工程、および
（Ｂ）前記ラミニンまたは前記フラグメントに付着しない細胞を回収する工程、
を含む前記細胞集団から未分化細胞を除去する工程を含み、
前記工程（Ａ）において、前記ラミニンもしくは前記フラグメントが培養面にコーティングされた培養器に前記細胞集団の細胞懸濁液を添加して一定時間静置すること、前記ラミニンもしくは前記フラグメントがコーティングされた担体を前記細胞集団の細胞懸濁液に投入して一定時間静置すること、または前記ラミニンもしくは前記フラグメントが内部にコーティングされた中空糸膜内に前記細胞集団の細胞懸濁液を注入して通過させることにより、前記細胞集団を前記ラミニンもしくは前記フラグメントに接触させ、
前記工程（Ｂ）において、回収した培地およびコーティング表面を洗浄した洗浄液に含まれる細胞を回収することを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ラミニンのインテグリン結合活性を有するフラグメントが、ラミニンＥ８フラグメントである請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ラミニンＥ８フラグメントのコーティング濃度が０．１μｇ／ｃｍ２〜２μｇ／ｃｍ２であり、前記工程１における接触時間が１５分〜１８０分であり、前記工程（Ａ）における接触時間が５分〜３０分である請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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