(57)【要約】  培養しながら非破壊的に細胞シート厚さを計測する培養容器と計測装置を提供する。蓋４を有する培養容器は、その内部に設置される浮き具８を備え、浮き具は培養容器内の培地により浮上する構造を有する。また、この浮き具の高さ方向の位置変化を検出する発光素子１０Ａと受光素子１０Ｂを有するセンサヘッド１０と、センサヘッドの信号を処理するコントローラ１１とを備える細胞シート厚さ計測装置を構成する。
2016121095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蓋と、側壁と、培養面と、その内部に設置され、前記培養面上の培地により浮上可能な浮き具と、を備える、
ことを特徴とする培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の培養容器であって、
前記浮き具は、前記培養容器外部から高さ方向の位置変化を計測する印を有する、
ことを特徴とする培養容器。
【請求項３】
請求項１に記載の培養容器であって、
前記浮き具は、中空構造または発泡構造を有する、
ことを特徴とする培養容器。
【請求項４】
蓋と、側壁と、培養面と、その内部に設置され前記培養面上の培地により浮上可能な浮き具とを備える培養容器と、
前記培養容器の外部に設置され、前記浮き具の前記培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドと、
前記センサヘッドの計測信号を処理するコントローラと、を備える、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項５】
請求項４に記載の計測装置であって、
前記浮き具は、前記センサヘッドにより前記高さ方向の位置変化を計測する印を有する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項６】
請求項４に記載の計測装置であって、
前記浮き具は、中空構造または発泡構造を有する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項７】
請求項４に記載の計測装置であって、
前記センサヘッドは、前記浮き具にレーザー光を照射する発光素子と、前記浮き具からの反射レーザー光を受信する受光素子とを有する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項８】
請求項４に記載の計測装置であって、
複数の前記培養容器と、それぞれ対応する複数の前記センサヘッドを備え、
前記コントローラは、複数の前記浮き具の高さ方向の位置変化を同時に計測するよう制御する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項９】
請求項４に記載の計測装置であって、
複数の前記培養容器と、一つの前記センサヘッドと、前記センサヘッドを複数の前記培養容器各々の位置に移動する移動機構を備え、
前記コントローラは、複数の前記浮き具の高さ方向の位置変化を順次計測するよう前記移動機構を制御する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項１０】
培養面上の培地により浮上可能な浮き具をその内部に備える培養容器の外部に設置され、前記浮き具の前記培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドの計測信号に基づき、前記高さ方向の位置変化を計測しながら、細胞培養シートを培養する、
ことを特徴とする細胞培養シートの培養方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記浮き具は、前記センサヘッドにより前記高さ方向の位置変化を計測する印を有する、
ことを特徴とする培養方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の培養方法であって、
前記浮き具は、中空構造または発泡構造を有する、
ことを特徴とする培養方法。
【請求項１３】
培養面上の培地により浮上可能な浮き具をその内部に備える培養容器と、
前記培養容器の外部に設置され、前記浮き具の前記培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドと、
前記センサヘッドの計測信号を処理するコントローラと、
前記培養容器への前記培地の排出・注入を行う培地交換ユニットと、
前記培養容器への混合ガスの排出・注入を行う混合ガス交換ユニットとを、
前記コントローラと、前記培地交換ユニットと、前記混合ガス交換ユニットを制御する制御部と、を備える、
ことを特徴とする培養装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の培養装置であって、
前記培養容器で培養される細胞の顕微鏡画像を前記制御部に出力する顕微鏡を更に備える、
ことを特徴とする培養装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の培養装置であって、
複数個の前記培養容器と、少なくとも一個の前記センサヘッドを備え、
前記コントローラは、複数の前記培養容器の前記計測信号を順次処理する、
ことを特徴とする培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養及び細胞シート厚さを計測する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は障害や欠損を起こした細胞・組織・臓器の根本的治療を実現する革新的な医療として注目されている。再生医療に用いる再生組織は、患者自身あるいは他者の体内から採取した細胞を体外において精製し、増幅や組織化等の加工工程を経て製造し、患者体内へ移植する。組織工学技術は年々進歩しており、単一種の細胞をシート化する方法や複数の細胞種を立体的に配置し、人工的に器官を構築する方法が開発されている。特に細胞シートを用いた角膜、食道再生治療は進んでいる。細胞シートの移植前、移植に適する細胞シートの細胞数、生細胞率、厚さなどを計測評価し、基準をクリアしたものだけ移植に使用する。その中、細胞シートの厚さは作製した数枚の細胞シート中からサンプルを選んで破壊的な評価を行なわれてきた。【０００３】
特許文献１には、培養容器中の培地に基準物質を入れて屈折率に基づいて細胞の厚さを算出する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１０６２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献に記載されている細胞の厚さ評価方法では、細胞の密集状態（コンフルエント）、または何層の細胞が重なる状態の細胞シートへの適用は困難であった。【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決するための培養容器、計測装置、培養方法、及び培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するため、本発明においては、蓋と、側壁と、培養面と、その内部に設置され、前記培養面上の培地により浮上可能な浮き具とを備える培養容器を提供する。【０００８】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、蓋と、側壁と、培養面と、その内部に設置され、培養面上の培地により浮上可能な浮き具とを備える培養容器と、培養容器の外部に設置され、浮き具の培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドと、センサヘッドの計測信号を処理するコントローラとを備える計測装置を提供する。【０００９】
更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、培養面上の培地により浮上可能な浮き具をその内部に備える培養容器の外部に設置され、浮き具の培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドの計測信号に基づき、高さ方向の位置変化を計測しながら、細胞培養シートを培養する培養方法を提供する。【００１０】
また更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、培養面上の培地により浮上可能な浮き具をその内部に備える培養容器と、培養容器の外部に設置され、浮き具の培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドと、センサヘッドの計測信号を処理するコントローラと、培養容器への培地の排出・注入を行う培地交換ユニットと、培養容器への混合ガスの排出・注入を行う混合ガス交換ユニットと、コントローラと培地交換ユニットと混合ガス交換ユニットを制御する制御部とを備える培養装置を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培養しながら非破壊的に細胞シートの厚さを計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に係る培養容器の一構成例を示す図である。
【図２】実施例１に係る細胞シート厚さの計測原理を示す図である。
【図３】実施例１に係る細胞シート厚さ計測装置の一処理フロー例を示す図である。
【図４】実施例１に係る培養容器の他の構成例を示す図である。
【図５】実施例１に係る培養容器の他の構成例を示す図である。
【図６】実施例１に係る培養容器の他の構成例を示す図である。
【図７】実施例２に係る培養容器ベースの構成例を示す図である。
【図８】実施例２に係るセンサヘッド移動機構の構成例を示す図である。
【図９】実施例３に係る培養装置の一概略構成例を示す図である。
【図１０】実施例３に係る培養装置の制御系構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の種々の実施例を図面に従い説明する。なお、各実施例に対応する図面において、同一構成物は同一の数番を付した。
【実施例１】
【００１４】
実施例１は、培養しながら非破壊的に細胞シートの厚さを計測することを可能とする細胞培養容器、並びにそれを用いた細胞シート厚さ計測装置の実施例である。図１に基づいて、実施例１に係る培養容器と計測装置の一構成例を説明する。本実施例は、内部に設置される浮き具を有する培養容器の実施例であり、また、浮き具の高さ方向の位置変化を検出する発光素子と受光素子を有するセンサヘッドと、センサヘッドの信号を処理するコントローラとを備える細胞シート厚さ計測装置の実施例である。【００１５】
図１において、１は培養容器の正面断面図、２は培養容器の平面図、３は培養容器の側壁、４は培養容器の蓋、５は培養容器の培養面、６は培地、７は細胞、８は浮輪型の浮き具、１０はセンサヘッド、１０Ａは発光素子、１０Ｂは受光素子、１１は細胞シート厚さ計測装置として機能するコントローラである。【００１６】
本実施例の培養容器は、培養容器の側壁３、培養容器の蓋４、培養容器の培養面５、その内部に設置される浮き具８により構成される。浮き具８は、培養容器内の培地により浮上する構造と、培養容器外部から容器内部におけるその高さ方向の位置変化を計測するための印、すなわち、位置検出用参照部を有している。この印或いは位置検出用参照部は、例えば、浮き具として用いる樹脂に色素を含ませ、その底面を利用する、或いは浮き具の底面を着色することで形成可能である。【００１７】
この培養容器の培養空間内に培地６を注入し、細胞７を培養する。浮輪型の浮き具８は培養容器内に配置され、培地６により浮上可能である。浮き具８は後で詳述するように培養容器と同様の樹脂等で構成される。本実施例の細胞シート厚さ計測装置は、上述した培養容器と、さらにセンサヘッド１０とコントローラ１１を備えて構成される。センサヘッド１０は発光素子１０Ａ、受光素子１０Ｂにより構成される。このセンサヘッド１０は、浮き具８に光を照射する発光素子１０Ａと、浮き具からの反射光等の二次光を受信する受光素子１０Ｂとを有する。発光素子１０Ａから照射光線が発射され、浮き具８に当たって反射される反射光線は受光素子１０Ｂに検出できる。浮き具８の高さ位置が変動すると、受光素子１０Ｂに検出される反射光線９Ｂの角度が変わるため、この角度の変化により浮き具８の高さ位置変化を割り出すことが可能となる。【００１８】
以下、図２を用いて本実施例の細胞シート培養における細胞シート厚さの計測原理を順次説明する。
図２の（Ａ）は、図１に示した実施例の細胞播種前の図である。培地と細胞がない状態の浮き具８の位置をＴ０として計測する。次に、図２の（Ｂ）に示すように、細胞７と培地６を培養容器に注入し細胞を培養する。細胞が密集状態（コンフルエント）となり、細胞シートが形成される。培地がある状態では、浮き具８は培地の浮力により浮上する。図２の（Ｃ）は、培地排出後の図を示している。培地が排出後、浮き具８の下面が細胞シートの上面に接する状態となる。この状態の浮き具８の高さ位置をＴ１として計測し、Ｔ１と図２の（Ａ）で計測したＴ０の差分は細胞シートの厚さとなる。さらに、図２の（Ｄ）に示すように、培養を続けると細胞シートが厚くなり、その結果浮き具８の高さ位置Ｔ２が大きくなる。つまり、本実施例の構成の培養容器と計測装置を用いることにより、浮き具８の高さ位置Ｔの変化により、細胞シートの厚さを培養しながら計測することが可能となる。【００１９】
図３は、本実施例の培養容器と計測装置を用いて、細胞シート培養における細胞シート厚さ計測方法の一例を示すフロー図である。なお、このフローチャートの処理は、上述したコントローラ、或いは後で説明する制御端末で実行さるソフトウェアによって実現される。同図において、培養工程が開始されると、細胞播種の前に浮き具の高さ方向の初期位置を計測する（ＳＴ１）。その後、培養容器に細胞の懸濁液を注入し細胞を播種し（ＳＴ２）、さらに温度湿度など条件を調整し細胞を培養する（ＳＴ３）。【００２０】
続いて、所定培地交換時間になると、培養容器内の古い培地を培養容器から排出する（ＳＴ４）。それにより、浮き具が細胞上面に接し、浮き具の高さ方向の位置を計測する（ＳＴ５）。ＳＴ５とＳＴ１の計測差により細胞シートの厚さを割り出す（ＳＴ６）。そして所定細胞シートの厚さに達しているかを判別し（ＳＴ７）、所定値に達してなければ新培地を培養容器に注入し（ＳＴ８）、浮き具の高さ方向の位置を計測する（ＳＴ９）。ＳＴ９とＳＴ５の計測差により注入培地の深さを割り出し（ＳＴ１０）、培養を継続する（ＳＴ１１）。このことは、浮き具の高さ方向を計測する本実施例の構成によれば、培養された細胞シートの厚さを計測することに加え、注入した培地の深さを適宜計測することができるので、注入する培地量を調整することにより、効率的な細胞シート培養を行うことができる。上述したステップＳＴ４→ＳＴ１１を順次実行することにより、細胞シートを所定の厚さまで培養する。ＳＴ７で細胞シートが所定の厚さになったことを確認した後、新しい培地を培養容器に注入して（ＳＴ１２）、培養を終了する。【００２１】
図４、図５は本実施例で用いる浮き具の変形例を示す図である。図４は十字型浮き具１２、図５は網型浮き具１３の例を示す。このような形状の浮き具をもちいれば、細胞シートの外周だけではなく培養容器の中心部を含めた全面の厚さ分布を計測することが可能となる。【００２２】
図６は本実施例で用いるセンサヘッドの設置位置の変形例を示す図であり、センサヘッド１０を培養容器の上部に設置する構成図である。センサヘッド１０は培養容器の上部に設置しても前記と同様に細胞シートの厚さを計測することが可能となる。なお、センサヘッド１０は培養容器の側面に設置しても同様な計測は可能であることは言うまでもない。【００２３】
本実施例の細胞シート厚さ計測装置においては、浮き具部材は培地より比重の低い材料を使用することが望ましい。細胞培養によく使われている例えばポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）を利用する場合では、比重を培地の比重１より小さくするため、浮き具を中空構造や発泡構造で形成することが望ましい。さらに、上述の培養容器部材、浮き具部材を樹脂などの耐高湿度性、滅菌処理対応可能な材料を使用することが望ましい。それにより、γ線など滅菌対応とすることができ、理化学用途と再生医療用途に適用可能となる。【００２４】
本実施例のセンサヘッドは、レーザー光を利用する場合、培養する細胞への影響を低減するため、レーザー光は波長が３５０ｎｍ〜１０００ｎｍのパルス照射が望ましい。【００２５】
なお、本実施例では、浮き具の高さ位置検出にレーザー光等の光を用いたが、磁場、電場および接触式の原理にも適用できる。また、センサヘッドの定点計測を例として挙げたが、センサヘッドを可動機構に設置すれば、細胞シートの任意点の計測も可能である。更に、本実施例では、円形の培養皿を例として挙げたが、同様の原理で四角等の他の形状の培養皿にも適用できる。また更に、本実施例では、単層培養を例として挙げたが、同様の原理で２層培養の培養容器にも適用できる。【００２６】
以上詳述した実施例１の培養容器、計測装置によれば、培養しながら細胞シート厚さを非破壊的に計測することが可能となる。
【実施例２】
【００２７】
実施例２として、同時に複数個の細胞培養容器が設置される培養容器ベースにおける細胞シート厚さ計測を実施する計測装置の実施例を説明する。
図７は実施例２に係る培養容器ベースの一構成例を示す図である。同図において、センサヘッド１０等の培養容器ベース１４以外の部分については実施例１と同様の構成を備えるので、ここでは説明を省略する。本実施例の細胞シート厚さ計測用のセンサヘッドは、培養容器ベース１４中に埋め込む構造となる。センサ信号を処理するコントローラ１１は１個で複数のセンサヘッド１０の信号を処理することより、それぞれ培養容器の細胞シートの厚さをほぼ同時に計測することが可能となる。すなわち、コントローラ１１は、複数の培養容器の浮き具の高さ方向の位置変化を同時に計測するようセンサヘッドを制御している。【００２８】
図８は実施例２に係る培養容器ベースの他の構成例を示す図である。同図において、１５はセンサヘッドＸ軸移動機構、１５ＡはセンサヘッドＸ軸移動機構の移動方向、１６はセンサヘッドＹ軸移動機構、１６ＡはセンサヘッドＹ軸移動機構の移動方向である。一個の細胞シート厚さ計測用センサヘッド１０は、センサヘッドＸ軸移動機構１５とセンサヘッドＹ軸移動機構１６に搭載され、培養容器の底面の任意位置に移動して、複数の培養容器の細胞シートの厚さを計測することができる。すなわち、複数の培養容器と、一つのセンサヘッドを複数の培養容器各々の位置に移動する移動機構を備え、コントローラは、複数の培養容器の浮き具の高さ方向の位置変化を順次計測するよう移動機構を制御する。なお、同様の原理で移動機構が培養容器の上部に設置してもよい。【００２９】
実施例２によれば、複数の細胞シートを同時に培養しながら細胞シート厚さを非破壊的に計測することが可能となる。
【実施例３】
【００３０】
実施例３は、以上説明した各実施例の培養容器、及び細胞シート厚さ計測装置を用いる細胞シートの培養方法、培養装置の実施例である。すなわち、本実施例は、上述した培養容器への培地排出・注入を行う培地交換ユニット、混合ガス排出・注入を行う混合ガス交換ユニットを用いて培地交換を行い、細胞シートを培養する培養方法、培養装置の実施例であり、培養面上の培地により浮上可能な浮き具をその内部に備える培養容器と、培養容器の外部に設置され、浮き具の培養容器内部の高さ方向の位置変化を計測するセンサヘッドと、センサヘッドの計測信号を処理するコントローラと、培養容器への培地の排出・注入を行う培地交換ユニットと、培養容器への混合ガスの排出・注入を行う混合ガス交換ユニットと、コントローラと培地交換ユニットと混合ガス交換ユニットを制御する制御部とを備え、培地交換を行いながら、細胞シートを培養する自動培養装置の実施例である。【００３１】
図９は、本実施例の自動細胞培養装置の全体概略構成の一例を示す図である。図９の培養装置において、１７は顕微鏡、１７Ａは観察光源、１７Ｂはレンズ、１８は培養容器の培地排出口、１９は培養容器の培地注入口、２０は培地交換ユニット、２１は混合ガスの排気口、２２は混合ガスの送気口、２３は混合ガス交換ユニット、２４はインキュベータ、２５は温度制御ユニット、２６は湿度制御ユニット、２７は清浄度制御ユニット、２８は各ユニットを制御する制御部としての制御端末である。なお、図９、図１０において、コントローラ１１が制御端末２８に制御される別構成物として示されているが、コントローラ１１と制御端末２８を一体で構成された制御部とすることもできる。【００３２】
図１０は、本実施例の培養装置の制御系の一構成例を示すブロック図である。通常の中央処理部（ＣＰＵ）や記憶部、入出力インタフェース部、ネットワークインタフェース部等を備えるコンピュータ構成のパーソナルコンピュータ（ＰＣ)などを用いた制御端末２８により、先に説明した培地交換ユニット２０、混合ガス交換ユニット２３、温度制御ユニット２５、湿度制御ユニット２６、清浄度制御ユニット２７が制御される。制御部としての制御端末２８による細胞培養の処理フローの要部は、図３で説明した細胞シート厚さ計測フローと一致する。制御端末２８は、予め記憶部に記憶された制御用のソフトウェアを実行することにより、細胞シートの培養、厚さ計測等を行うよう制御する。そして、細胞シート厚さ計測装置として機能するコントローラ１１より、計測された細胞シート厚さのデータが、図示を省略した入出力インタフェース部から制御端末２８に入力され、図３のＳＴ７で説明したように、制御端末２８で細胞シート厚さが所定厚さに達したか否かを判別される。更に、顕微鏡１７より培養された細胞の顕微鏡画像が入力され、制御端末２８内、或いはネットワークインタフェース部を介して外部のサーバに送信され、種々の画像処理用のソフトウェアにより画像処理が実行される。【００３３】
本実施例の培養装置は、上述した実施例１、２同様、細胞シート厚さを非破壊的に計測しながら細胞培養を可能とすると共に、自動細胞播種、自動培地交換、自動観察などの機構を備えることにより、より均一な培養品質を管理することができる。【００３４】
以上、本発明の種々の実施例を説明したが、本発明の特徴を損なわない限り、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。【００３５】
更に、上述した各構成、機能、制御端末等は、それらの一部又は全部を実現するソフトウェアを作成する例を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００３６】
１  培養容器の正面断面
２  培養容器の平面
３  培養容器の側壁
４  培養容器の蓋
５  培養容器の培養面
６  培地
７  細胞
８  浮輪型の浮き具
９Ａ  照射光線
９Ｂ  反射光線
１０  センサヘッド
１１  コントローラ
１２  十字型の浮き具
１３  網型の浮き具
１４  培養容器ベース
１５  センサヘッドＸ軸移動機構
１６  センサヘッドＹ軸移動機構
１７  顕微鏡
１８  培養容器の排出口
１９  培養容器の注入口
２０  培地交換ユニット
２１  混合ガスの排気口
２２  混合ガスの送気口
２３  混合ガス交換ユニット
２４  インキュベータ
２５  温度制御ユニット
２６  湿度制御ユニット
２７  清浄度制御ユニット
２８  制御端末
【図１】
2016121095.tif 000003
【図２】
2016121095.tif 000004
【図３】
2016121095.tif 000005
【図４】
2016121095.tif 000006
【図５】
2016121095.tif 000007
【図６】
2016121095.tif 000008
【図７】
2016121095.tif 000009
【図８】
2016121095.tif 000010
【図９】
2016121095.tif 000011
【図１０】
2016121095.tif 000012
【国際調査報告】
2016121095.tif 000013
2016121095.tif 000014