(57)【要約】【課題】適度に曲げ強度を有し、かつ圧縮強度に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料を提供する。【解決手段】第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度および圧縮強度がそれぞれ、０．０５〜０．１６ＭＰａおよび０．３ＭＰａ以上であることを特徴とする多孔質複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度が０．０５〜０．１６ＭＰａであり、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上である多孔質複合体。
【請求項２】
気孔径が３〜９０μｍである、請求項１に記載の多孔質複合体。
【請求項３】
コラーゲンがタイプＩ又はタイプＩとタイプＩＩＩの混合物である、請求項１又は２に記載の多孔質複合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。
【請求項５】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５〜０．０６であり、ｐＨが６．０〜９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体を調製する工程、及び
（２）前記コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
【請求項６】
さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、請求項５に記載の多孔質複合体の製造方法。
【請求項７】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、及び
（２）前記懸濁液を、イオン強度が０．００５〜０．０６、ｐＨが６．０〜９．０に調整する工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。
【請求項８】
さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、請求項７に記載の多孔質複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質複合体、骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より使用されている骨再生材料としては、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）などのリン酸カルシウムが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）。【０００３】
近年、ＨＡの前駆物質である第８リン酸カルシウム（Octacalcium  phosphate、以下、「ＯＣＰ」という）は、ＨＡやβ−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）等の他のリン酸カルシウムに比して、骨再生の促進作用が高く、生体内での吸収性も高いことが分かってきた（例えば、特許文献１参照）。このようにＯＣＰは、リン酸カルシウムの中でも骨再生材料として特に優れた特性を有している。【０００４】
しかし、ＯＣＰは無機物であるために形状付与性に乏しい。このため、ＯＣＰ単独では、広範囲の骨欠損部の再生等への適用は難しい。そこで、ＯＣＰとコラーゲンとの複合体を骨再生材料として用いることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１６７４４５号公報
【特許文献２】特開２０１０−２７３８４７号公報
【特許文献３】特開２００３−２６０１２４号公報
【特許文献４】特開２００９−１３２６０１号公報
【特許文献５】特開２００５−２７９０７８号公報
【特許文献６】特開平５−０７０１１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
骨再生材料は、一般に不定形の骨欠損に適用される。このような目的で使用される骨再生材料には、骨再生促進能は言うまでもないが、良好な操作性も臨床的に要求される。例えば、（１）適度な曲げ強度を有し、ピンセット等で骨欠損部の形状に合わせて容易に加工できる、（２）適度な圧縮強度を有し、取り扱い時に破損等が生じないといった特徴が求められている。【０００７】
特許文献４には、機械的強度と生体親和性とを最適なバランスで有し、人工骨材、細胞の足場材等に好適なアパタイト／コラーゲン複合体繊維を含む多孔体が開示されている。このようなアパタイト／コラーゲン複合体繊維は、コラーゲンに微細なアパタイト粒子が沈着しているため、初期の機械的強度の面で有利であるが、一方で、その強度のためにピンセット等で容易に加工するのが困難であるという問題点がある。【０００８】
特許文献１には、第８リン酸カルシウムとコラーゲンからなり、形状付与性に優れた硬組織代替性担体材料が開示されている。このような硬組織代替性担体材料は柔軟性には優れるが、その気孔径が大きいため圧縮強度が低く、取り扱い時に破損等が生じ易いといった問題点がある。【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、従来よりも改善された曲げ強度および圧縮強度を有する、操作性の良好なＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、それを含む骨再生材料、および多孔質複合体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を鑑み、本発明者らが鋭意検討したところ、所定のイオン強度を有するコラーゲンを含む液体を用いることにより、所期の範囲内の曲げ強度及び圧縮強度を有し、その結果加工容易性と機械的強度を両立した多孔質複合体を見出した。本発明者らは更なる検討と改良を重ね、以下に代表される発明を提供する。【００１１】
［１］  第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含み、曲げ強度が０．０５〜０．１６ＭＰａであり、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上である多孔質複合体。
［２］  気孔径が３〜９０μｍである、［１］に記載の多孔質複合体。
［３］  コラーゲンがタイプＩ又はタイプＩとタイプＩＩＩの混合物である、［１］又は［２］に記載の多孔質複合体。【００１２】
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の多孔質複合体を含む骨再生材料。【００１３】
［５］  第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５〜０．０６であり、ｐＨが６．０〜９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体を調製する工程、及び
（２）前記コラーゲンを含むゲル、ゾル又は液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。【００１４】
［６］  さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、［５］に記載の多孔質複合体の製造方法。【００１５】
［７］  第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含む多孔質複合体の製造方法であって、
（１）コラーゲンを含む液体と第８リン酸カルシウムを混合した懸濁液を得る工程、及び
（２）前記懸濁液を、イオン強度が０．００５〜０．０６、ｐＨが６．０〜９．０に調整する工程、
を含むことを特徴とする、多孔質複合体の製造方法。【００１６】
［８］  さらに、（３）前記懸濁液を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後に、凍結乾燥する工程を含む、［７］に記載の多孔質複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、加工性に優れ、かつ破損しにくいという、従来よりも曲げ強度および圧縮強度の特性に優れたＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質複合体、及びそれを含む骨再生材料を提供することができる。加えて、本多孔質複合体は、タンパク分解酵素による分解を受けにくく、骨再生を要する部分により長く留まることができ、骨再生を促進することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】曲げ試験用のサンプル寸法を説明するための模式図である。
【図２】曲げ強度の測定方法を説明するための模式図である。
【図３】実施例１についての曲げ強度試験における応力−ひずみ曲線を示すグラフである。
【図４】圧縮強度の測定方法を説明するための模式図である
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［多孔質複合体］
本発明の多孔質複合体は、ＯＣＰとコラーゲンとを含む多孔質の複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）である。本発明の多孔質複合体の好ましい態様は、コラーゲンが３次元のスポンジ状構造を形成し、ＯＣＰが該スポンジ状構造中に少なくとも１００μｍ以上の顆粒として存在している多孔質複合体である。本発明の多孔質複合体からなる骨再生材料は、多孔質体構造によって、多孔質内部に骨芽細胞が侵入し、新生骨の形成を促進する内部骨形成を実現している。
【００２０】
ＯＣＰ（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）は、種々公知の方法によって調製することができ、例えば、LeGerosの滴下法（LeGeros  RZ，Calcif  Tissue  Int  37：194-197，1985）や特許文献６に開示される合成装置（三流管）を使用した方法などによって調製することができる。また、混合法によって調製することができ、具体的には、例えば、リン酸二水素ナトリウム水溶液と、酢酸カルシウム水溶液を適切な条件下で混合し、生成した沈殿物を回収することにより、ＯＣＰを得ることができる。沈殿物から得られたＯＣＰは、乾燥させ、電動ミル等を用い粉砕し、粒子状の粉体にして用いることが好ましい。粒径は１０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、更に好ましくは３００〜５００μｍに調製することが好ましい。粒径は、ふるい分け法によりふるいの目開きのサイズによって分級することができる。
【００２１】
コラーゲンとしては、その由来、性状などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、プロナーゼ等）で可溶化することにより得られ、テロペプチドが除去されている酵素可溶化コラーゲンが使用される。コラーゲンのタイプとしては、繊維性コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型コラーゲンが好ましく、生体内に大量に含まれるＩ型コラーゲン、又はＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの混合物が特に好ましい。原料としては、特に限定されないが、豚、牛などの皮膚、骨、腱などに由来するコラーゲンを好ましく用いることができる。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高いという特長を有し、特に酵素可溶化コラーゲンはアレルゲン性も低く好ましい。上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。
【００２２】
本発明の多孔質複合体において、ＯＣＰとコラーゲンの配合比は、所望する形状付与性、操作性、生体親和性などに応じて適宜調整することができる。コラーゲン１重量部に対するＯＣＰの配合比は、好ましくは０．５〜３５重量部、より好ましくは１〜２０重量部、更に好ましくは２〜１０重量部である。コラーゲン１に対してＯＣＰが０．５未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、また３５重量部を超えると形状付与性が低下するおそれがある。
【００２３】
本発明の多孔質複合体の曲げ強度は、０．０５〜０．１６ＭＰａであることが好ましい。より好ましくは０．０８〜０．１６ＭＰａである。曲げ強度が０．１６ＭＰａを超える場合、ピンセット等での容易な加工が困難となる傾向がある。すなわち、医師が多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、欠損部の大きさに応じて多孔質複合体を適当な大きさに調整する必要があるが、この際０．１６ＭＰａ以下であれば、ピンセット等で適度な応力を加えることにより、容易にカットすることができる。一方、曲げ強度が０．０５ＭＰａ未満である場合、容易に破断し易く、手術後の破損が生じ易くなる傾向がある。
【００２４】
本発明における曲げ強度は下記の方法により測定される。
（曲げ強度測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、図１に示す、厚さ（ｈ）４ｍｍ、幅（ｂ）１０ｍｍ、長さ３０ｍｍの直方体状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、引張・圧縮試験機（ロードセル容量：１ｋＮ）の支持台（支持台の半径Ｒ１＝５ｍｍ）に、支点間距離（Ｌ）が２０ｍｍとなるようサンプルをセットする。サンプルに荷重を加える治具である圧子は、半径Ｒ２＝５ｍｍの圧子を用いる。本測定は、図２に示すように、三点曲げ試験を行う。次いで、引張・圧縮試験機のクロスヘッドをサンプルが破断するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げる。なお、本試験において、「サンプルが破断した」とは、図３に示すように、応力−ひずみ曲線において荷重が急激に低下する点を意味する。
【００２５】
本発明における曲げ強度（σ）とは、サンプルの破断時荷重、サンプルの寸法および支点間距離とから、式１で表される。
σ＝３ＦＬ／２ｂｈ２  （式１）
σ：曲げ強度（Ｐａ）
Ｆ：破断時荷重（Ｎ）
Ｌ：支点間距離（ｍｍ）
ｂ：サンプルの幅（ｍｍ）
ｈ：サンプルの厚さ（ｍｍ）
【００２６】
本発明の多孔質複合体の圧縮強度は、好ましくは０．３ＭＰａ以上であり、より好ましくは０．３〜３．０ＭＰａ、更に好ましくは０．３〜１．０ＭＰａである。圧縮強度が０．３ＭＰａ未満である場合、多孔質複合体の操作性が低下する傾向がある。すなわち、本発明の多孔質複合体を骨欠損部に充填する際に、前記複合体が崩壊してしまったり、気孔が潰れてしまったりすると、その後の骨再生に悪影響を与えることになる。具体的には、さまざまな形状を有する骨欠損部に、医師が治具を用いて多孔質複合体を隙間なく充填する施術を行う際に、前記複合体の崩壊や気孔潰れが生じないことを示す指標が圧縮強度０．３ＭＰａ以上である。上限は特に定められるものではないが、骨欠損部への充填の際の操作容易性の観点から、３．０ＭＰａ以下であることが好ましい。
【００２７】
本発明における圧縮強度は下記の方法により測定される。
（圧縮強度測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料（サンプル）をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬する。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、引張・圧縮試験機（ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、円柱の上下方向に単軸荷重を負荷する。そして、段階的に荷重を変化させたときにサンプルが崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とする。「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を肉眼で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。
【００２８】
具体的には、図４を参照して、サンプルを試料台４１にセットした後、平型圧縮治具を装着したクロスヘッド４２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド４２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とする。
【００２９】
本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式２で表される。
Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ  （式２）
Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
Ｆ  ：崩壊時荷重（Ｎ）
Ｓ  ：サンプルの断面積（ｍ２）
なお、サンプルの断面積は、およそ（０．００４２５）２×３．１４＝５．６７×１０−５ｍ２である。
【００３０】
本発明の多孔質複合体は、多孔質複合体の気孔径が３〜９０μｍであることが好ましい。気孔径が９０μｍを超える場合、多孔質複合体の圧縮強度が低下する傾向がある。一方、気孔径が３μｍ未満である場合、骨芽細胞等の骨代謝系細胞の侵入が起こり難くなり、骨再生の促進作用が低下する恐れがある。本発明の多孔質複合体のより好ましい気孔径は５〜４０μｍである。
【００３１】
気孔径は水銀ポロシメーター（Mercury porosimeter）による細孔分布測定を用いて測定し、具体的には以下の方法により測定される。
（気孔径測定）
前処理として、サンプルを１２０℃で４時間恒温乾燥する。前処理後の各サンプルについて、以下の測定装置を用いた水銀圧入法により、以下の条件で細孔径０．００１８〜２００μｍの細孔分布を求める。
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定条件：サンプルと水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０−５Ｎで換算）
発明における気孔径とは、水銀圧入法による測定圧力から得られた細孔分布曲線において、最も大きな面積を有するピークの極大値を示す細孔直径の値である。
【００３２】
多孔質複合体の気孔率（空隙率）は８０〜９９％であることが好ましく、より好ましくは８５〜９８％である。気孔率は水銀圧入法による全細孔容積と見かけ密度を用いて下記の式により求められる。
気孔率(％)= 全細孔容積／｛（１／見かけ密度）＋全細孔容積｝×１００
【００３３】
本発明の多孔質複合体の形状は、直方体（ブロック体）、円柱体もしくはタブレット状、又は顆粒であることが好ましい。直方体である場合の大きさは５ｍｍ×５ｍｍ×５ｍｍ以上の大きさが好ましく、一般に上限は１００ｍｍ×１００ｍｍ×１００ｍｍ以内の範囲であることが好ましい。直方体は立方体に限られない。円筒状である場合の大きさは、直径が５〜５０ｍｍであることが好ましく、高さは１〜５０ｍｍの範囲であることが好ましい。顆粒状である場合、形状は球体に限られず不定形でもよいが、直径が０．１〜１０ｍｍであることが好ましい。
【００３４】
本発明の多孔質複合体は骨欠損部に補填することにより使用されるが、骨欠損部に十分な血液もしくは体液が認められる場合には、多孔質複合体をそのまま、もしくは適当な形状に切断し補填することができる。骨欠損部に十分な血液等が認められない、又は多孔質複合体を元の形状で補填できない場合は、多孔質複合体を血液もしくは生理食塩水等に浸漬し、多孔質複合体がスポンジ状の弾力性を示すことを確認した上で骨欠損部に補填することができる。
【００３５】
［多孔質複合体の製造方法］
本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンを混合する製造方法が好ましく、下記のような製造方法を用いることができる。公知の共沈法などによりＯＣＰをコラーゲンに析出させて複合化する方法は、曲げ強度が過度に高くなり容易な加工が困難となるおそれがある。
【００３６】
（ａ）ＯＣＰを混合して複合化する方法
まず、濃度を０．１〜５重量％、ｐＨを６．０〜９．０に調製し、ゲル化したコラーゲン溶液にＯＣＰを添加し、混練してＯＣＰとコラーゲンの混合物を作製する。次いで、当該混合物を適当な型に加えて成型し、凍結し、凍結乾燥することにより複合体を得る。得られた当該複合体は、必要に応じて、熱脱水架橋処理を施し、更に、慣用の滅菌法（例えば、γ線照射、電子線照射、エチレンオキサイドガス等）により滅菌する。
【００３７】
（ｂ）ＯＣＰ懸濁液を混合して複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にｐＨ５．５〜７．５に調整し、コラーゲンがゲル化する前にＯＣＰを添加して、コラーゲンとＯＣＰの懸濁液を調製する。その後、ｐＨを中性から弱アルカリ性に保持した状態で型に流し込み、形状を付与した後、適当な温度（例えば３７℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合担体とし、上記と同様に凍結乾燥および滅菌処理する。
【００３８】
本発明の多孔質複合体の製造方法は、コラーゲンを含む液体を、イオン強度が０．００５〜０．０６であり、ｐＨが６．０〜９．０となるよう調製し、コラーゲンを含むゲル、ゾルまたは液体を調製する工程を含むことが好ましい。イオン強度は０．００５〜０．０５であることがより好ましい。ｐＨは６．５〜８．０であることがより好ましい。前記（ａ）の方法において、本工程はＯＣＰを添加する前に行われ、前記（ｂ）の方法において、本工程はＯＣＰを添加しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を作製した後に行われる。イオン強度およびｐＨは、コラーゲンを蒸留水に溶解した液体に、慣用の緩衝液や塩類を添加することで調整することができる。例えば、緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッドバッファーであるＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられる。塩類としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム、水酸化ナトリウム、希塩酸などが挙げられる。
【００３９】
本発明において、イオン強度（μ）は式３により算出される。
μ＝１／２Σ（ｃｉｚｉ２）  （式３）
μ：イオン強度
ｃｉ：イオンのモル濃度
ｚｉ：イオンの電荷
例えば、後述する実施例１において存在する電解質は、コラーゲンに含有されるＮａＣｌおよびｐＨ調整で生じたＮａＣｌの合計０．０１ＭのＮａＣｌのみであったので、イオン強度は、１／２×（０．０１×１２＋０．０１×１２）＝０．０１である。
【００４０】
一般に、生理的な条件下で（イオン強度 約 ０．２程度、ｐＨ  ７．０付近）コラーゲンは効率的に自己組織化（線維化）することが知られている。本発明らは、コラーゲンを含む液体のイオン強度及びｐＨを本発明の所定の範囲内に調整することが、本多孔質複合体の圧縮強度及び曲げ強度の特性を決める上で重要な要素であることを見出した。本発明において、生理的なイオン強度よりも低い条件で線維化を行うことで、コラーゲン線維径、線維長、コラーゲン分子間の相互作用を適切に制御でき、好ましい曲げ強度が得られると考えられる。
【００４１】
本発明の多孔質複合体の製造方法は、ＯＣＰとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒に浸漬し急速凍結した後、凍結乾燥する工程を含むことが好ましい。液体冷媒は、第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体の凍結温度より低い温度の液体であり、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、液体窒素が挙げられる。該液体冷媒の温度は、好ましくは−２０℃以下であり、より好ましくは−４０℃以下であり、さらに好ましくは−８０℃以下である。
【００４２】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンとを含むゲル、ゾルまたは液体を液体冷媒浸漬によって急速に凍結させることにより、得られる多孔質複合体の気孔径を小さくすることができると考えられる。
【００４３】
本発明の多孔質複合体は、熱処理もしくは熱脱水架橋処理が施されていることが好ましい。熱処理により、ＯＣＰ分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり易くなり、骨再生が促進されると共に、コラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。
【００４４】
熱処理の温度は、好ましくは５０〜２００℃、より好ましくは６０〜１８０℃である。また、熱処理は、減圧条件下で行うことが好ましい。圧力は、好ましくは０〜３０００Ｐａ、より好ましくは０〜３００Ｐａである。熱処理の処理時間は、好ましくは２時間〜１０日間、より好ましくは１２時間〜５日間である。
【００４５】
上記方法により製造された多孔質複合体は、別の効果として、生分解性の速度を制御できる点でも優れている。本発明者らは、多孔質複合体製造時のコラーゲン懸濁液のイオン強度により、生分解性を制御できることを見出した。骨再生には数週間から数か月の期間を要するため、長い時間にわたり多孔質複合体が骨欠損部に存在し、骨再生の足場として留まることが好ましい。本製造方法によれば、生分解性を受けにくい多孔質複合体を提供できる。分解性の程度は可溶化タンパク割合により評価することができ、具体的には、多孔質複合体を０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液に浸漬し、３７℃、７２時間静置後、溶液中に存在する可溶化したコラーゲンのタンパク質についてＢＣＡ（Bicinchoninic Acid）プロテインアッセイを行ってタンパク量を測定する。その可溶化したタンパク量を元の多孔質複合体のコラーゲン重量で除して、可溶化タンパク割合（％）を求めることができる。本発明の多孔質複合体における好ましい可溶化タンパク割合は１．５％〜４．０％である。
【００４６】
［骨再生材料］
本発明は、さらに上記の多孔質複合体を含む骨再生材料に関する。骨再生材料は歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復、開頭、開胸術後の骨欠損修復などに用いることができる。例えば、歯科口腔外科領域においては、歯周病、嚢胞腔、萎縮歯槽堤、顎裂部、抜歯窩等により生じた骨欠損に対し、多孔質複合体からなる骨再生材料を補填することにより、数週間から数ヶ月には優れた骨再生効果が確認できる。整形外科領域においては、例えば骨腫瘍切除後の骨欠損、骨折等外傷により生じた骨欠損に対し、本骨再生材料を骨欠損部に補填し、骨再生を促進することができる。
【００４７】
骨再生材料は、ＯＣＰおよびコラーゲンの他に、例えば、骨形成能を有するサイトカイン(bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β１など)を含有していてもよく、係るサイトカインを含有させることにより、骨再生速度を速めることができる。
【００４８】
骨再生材料は、それ以外にも、この分野で慣用の配合成分を含ませることができる。かかる配合成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体等）、ＯＣＰ以外の生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ等）を挙げることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５０】
（実施例１）
（１）ＯＣＰの調製
まず、ＯＣＰ調製用の１液および２液を次の通り調製した。
［１液］リン酸二水素ナトリウム二水和物３１．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、１液を調製した。
［２液］酢酸カルシウム一水和物３５．２ｇを蒸留水２５００ｇに溶解し、２液を調製した。【００５１】
次に、１液をセパラブルフラスコに入れ、マントルヒーターにて７０℃に昇温した。次に、撹拌機（東京理化器械社製、ＭＡＺＥＬＡ  Ｚ）に撹拌翼（羽径１２ｃｍ）を取り付け、２５０ｒｐｍの速度で撹拌しながら、１液に対して２液を約２８ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下した。滴下終了後、１液と２液の混合液を７０℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間撹拌した。【００５２】
次に、上記混合液中に生成した沈殿物をメンブレンフィルター（孔径３μｍ、アドバンテック東洋社製、Ａ３００Ａ２９３Ｃ）を用いてろ過し、回収した。回収した沈殿物を蒸留水１５００ｍＬに分散させ、１５分間撹拌し洗浄した。同様のろ過、洗浄の工程をさらに３回繰り返した。【００５３】
次に、洗浄後の沈殿物を、恒温乾燥機を用いて３０℃で２４時間乾燥した。乾燥後の沈殿物を電動ミルにて粉砕した後、ふるいを用いて粒径を３００〜５００μｍに分級し、粉体を得た。最後に、得られた粉体に対して１２０℃で２時間の乾熱滅菌を行った。【００５４】
（２）ＯＣＰ／コラーゲン複合体（多孔質複合体）の調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。このとき、コラーゲン懸濁液のイオン強度は約０．０１であった。次いで、コラーゲン懸濁液にＯＣＰ（粒径３００〜５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加えた後、室温でさらに撹拌しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。【００５５】
次に、得られたＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。【００５６】
容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の−８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、実施例１の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。【００５７】
（実施例２）
実施例２では、多孔質複合体の調製の際に、ＮａＣｌ含量を減じたＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（減塩コラーゲン）用いた。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。なお、減塩コラーゲンは、下記の方法で調製した。
減塩コラーゲンの調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。ブタ真皮由来コラーゲンに含有されるＮａＣｌは４重量％であった。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約８．０に調整しコラーゲン懸濁液を得た。次に、コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。上清を完全に廃棄して得たコラーゲンゲルを−３５℃の冷凍庫を用いて凍結した。凍結体を凍結乾燥機により乾燥し、減塩コラーゲンを得た。減塩コラーゲンに含有されるＮａＣｌを原子吸光光度法（灰化）で測定すると、１重量％であった。【００５８】
（実施例３）
実施例３では、実施例１のコラーゲン懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．０５に調整した。それ以外は実施例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。【００５９】
（比較例１）
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）１重量部を４℃に冷却した蒸留水２００重量部に溶解し、約０．５重量％のコラーゲン溶液を得た。液温を４℃に保ちながらコラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを約７．４に調整しコラーゲン懸濁液を得た。これにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．１に調整した。次いで、コラーゲン懸濁液に実施例１で作製したＯＣＰ（粒径３００〜５００μｍ）をＯＣＰとコラーゲンが重量比で７７：２３となるように加えた後、室温でさらに撹拌しＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を得た。【００６０】
次に、得られたＯＣＰ／コラーゲン懸濁液を遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い７０００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、ＯＣＰ／コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが３重量％となるように上清を廃棄し、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを得た。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。【００６１】
容器を密閉し、被凍結体の容積に対して大過剰の−８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、比較例１の多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。【００６２】
（比較例２）
比較例２では、比較例１のコラーゲン懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えてイオン強度を０．１５に調整した。それ以外は比較例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。【００６３】
（比較例３）
比較例３では、液温を４℃に保ちながら約０．５重量％コラーゲン水溶液に水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨが約７．４、イオン強度が０．０１のコラーゲン懸濁液を得た。さらに、ＯＣＰ／コラーゲン複合ゲルを入れた容器を、−８０℃に冷却したメタノールに浸漬して急速に凍結する代わりに、−８０℃の冷凍庫に入れ凍結した。それ以外は比較例１と同じ方法により多孔質複合体（ＯＣＰ／コラーゲン複合体）を得た。【００６４】
（比較例４）
ヒドロキシアパタイト／コラーゲン複合体の調製
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（日本ハム社製、ＮＭＰコラーゲンＰＳ）を４℃に冷却した蒸留水に溶解し、約０．８重量％のコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液に、等量のリン酸水素２ナトリウムおよび塩化ナトリウムの混合液（３０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７０ｍＭ  ＮａＣｌ）を加え、撹拌し、コラーゲン懸濁液を得た。このとき、コラーゲン懸濁液のイオン強度は約０．０７であった。【００６５】
コラーゲン懸濁液をホモジナイズした後、遠心瓶に入れ、遠心分離機（トミー精工社製、ＧＲＸ−２５０）を用い２００００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。次いで、コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが５重量％となるように上清を廃棄し、５重量％コラーゲンゲルを得た。【００６６】
５重量％コラーゲンゲルに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（和光純薬工業社製、Ａｐａｔｉｔｅ ＨＡＰ，ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ）をＨＡとコラーゲンが重量比で６０：４０となるように加えた後、薬さじで混合した。これを円柱状の内部空間を有するプラスチック容器（内径８．５ｍｍ、容積約３．０ｃｍ３）または、直方体状の内部空間を有するプラスチック容器（１０ｍｍ×１０ｍｍ×５０ｍｍ）に入れて、２３０×ｇの遠心力で１分間遠心して脱泡した。【００６７】
容器を密閉し、−２０℃の冷凍庫に入れ凍結した。容器を開栓した後、凍結体を凍結乾燥機により乾燥（−１０℃、４８時間）させ成形した。次いで、これを減圧下、１５０℃で２４時間加熱し熱脱水架橋を行った。円柱体はメスで厚さ１５ｍｍに、直方体は、４ｍｍ×１０ｍｍ×３０ｍｍにカットした。最後に、電子線を照射（１５ｋＧｙ）し、滅菌を行った。このようにして、比較例４のＨＡ／コラーゲン複合体を得た。【００６８】
（比較例５）
比較例５では、遠心濃縮により５重量％コラーゲンゲルを得た後、これを再度ホモジナイズし、同様に２００００×ｇの遠心力で２０分間遠心した。最後に、コラーゲン懸濁液中のコラーゲンが１０重量％となるように上清を廃棄し、１０重量％コラーゲンゲルを得た。１０重量％コラーゲンゲルに、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）（和光純薬工業社製、Ａｐａｔｉｔｅ ＨＡＰ，ｍｏｎｏｃｌｉｎｉｃ）をＨＡとコラーゲンが重量比で２０：８０となるように加えた後、薬さじで混合した。それ以外の点は、比較例４と同様にして、比較例５のＨＡ／コラーゲン複合体を得た。【００６９】
実施例１〜３及び比較例１〜５について、各実施例及び比較例でサンプルを３つ作成した。各サンプルに対して曲げ強度および圧縮強度の測定を行い、それらの平均値をそれぞれ求めた。なお、実施例における曲げ強度及び圧縮強度の測定は、具体的に下記の方法により行った。【００７０】
（曲げ強度測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、図１に示す厚さ（ｈ）：４ｍｍ、幅（ｂ）：１０ｍｍ、長さ：３０ｍｍの直方体状試料を、リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、サンプル表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ−Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、図２に示すように荷重を負荷した。得られた応力−ひずみ曲線より曲げ強度を求めた。【００７１】
具体的には、図２を参照して、サンプル１を支持台２１（支持台の半径Ｒ１＝５ｍｍ）にセットした後、半径Ｒ２＝５ｍｍの圧子を装着したクロスヘッド２２をサンプルが破断するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げた。なお、本試験において、「サンプルが破断した」とは、図３に示すように、応力−ひずみ曲線において荷重が急激に低下する点を意味する。【００７２】
本発明における曲げ強度（σ）とは、サンプルの破断時荷重、サンプルの寸法および支点間距離とから、式４で表される。
σ＝３ＦＬ／２ｂｈ２  （式４）
σ：曲げ強度（Ｐａ）
Ｆ：破断時荷重（Ｎ）
Ｌ：支点間距離（ｍｍ）
ｂ：サンプルの幅（ｍｍ）
ｈ：サンプルの厚さ（ｍｍ）
なお、本試験における支点間距離は、２０ｍｍであった。【００７３】
（圧縮強度測定）
温度：２５℃、湿度：６５％の環境下、直径８．５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円柱状試料をリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）に３０分間浸漬した。その後、試料表面の水気を軽く拭い、精密万能試験機（オートグラフＡＧＳ−Ｊ、株式会社島津製作所製、ロードセル容量：１ｋＮ）を用いて、図４に示すように単軸荷重を負荷した。そして、段階的に荷重を変化させたときにサンプルが崩壊する最小荷重を崩壊時荷重とした。【００７４】
具体的には、図４を参照して、サンプル２を試料台４１にセットした後、平型圧縮治具を装着したクロスヘッド４２を１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で下げ、ロードセルが２．５Ｎを示した時にクロスヘッド４２を止めて荷重を解く。試料台のサンプルを観察し、崩壊していなければ、そのサンプルを試料台に戻して再びセットし、同様にロードセルが５Ｎを示すまでクロスヘッドを下げる。荷重を２．５Ｎずつ増加させて、この操作を繰り返し、初めてサンプルの崩壊を認めたときの荷重を崩壊時荷重とした。なお、本試験において、「サンプルの崩壊を認めた」とは、試料を肉眼で観察した時に明確な亀裂または剥がれが生じていることが確認されたことを意味する。【００７５】
本発明における圧縮強度は、上記崩壊時荷重とサンプルの断面積（円柱の厚さ方向に垂直な断面における断面積）とから、式５で表される。
Ｃｓ＝Ｆ／Ｓ  （式５）
Ｃｓ：圧縮強度（Ｐａ）
Ｆ  ：崩壊時荷重（Ｎ）
Ｓ  ：サンプルの断面積（ｍ２）
なお、サンプルの断面積は、およそ（０．００４２５）２×３．１４＝５．６７×１０−５ｍ２であった。【００７６】
上記実施例および比較例についての曲げ強度および圧縮強度の測定結果を表１に示す。【００７７】
【表１】
2016163396.tif 000002
【００７８】
表１に示される結果から、実施例１〜３のサンプル（多孔質複合体）は、曲げ強度が０．０５〜０．１６ＭＰａかつ圧縮強度が０．３ＭＰａ以上であり、従来の多孔質複合体と比較し、加工性および取扱性に優れていた。
比較例１および２のサンプルは、圧縮強度が０．３ＭＰａ以上で取扱性は十分であるが、コラーゲン線維化時のイオン強度が高いため、曲げ強度が０．１６ＭＰａより高くなっており、容易に加工することが困難であった。
比較例３のサンプルは、曲げ強度が適度な値であり、容易な加工を達成することは可能であるが、ＯＣＰとコラーゲンの複合ゲル凍結の際に、冷凍機による緩慢な気相冷却を用いているため、圧縮強度が０．３ＭＰａ未満となり取扱性に劣る結果となった。
比較例４および５のサンプルは、コラーゲン線維化時のイオン強度が高いため、曲げ強度が０．１６ＭＰａより高く、また、ＨＡとコラーゲンの複合ゲル凍結の際に、冷凍機による緩慢な気相冷却を用いているため、圧縮強度が０．３ＭＰａ未満となり加工性および取扱性に難があった。【００７９】
（分解性測定）
実施例１、実施例３、比較例１、比較例２の各サンプルについて、円柱体を厚さ約１０ｍｍにカットしたサンプルをコラゲナーゼ溶液に浸漬し、コラーゲンの可溶化タンパクの割合を測定して、多孔質複合体の生分解性を測定した。【００８０】
具体的には、実施例１、実施例３、比較例１、比較例２で作製した各サンプルについて、円柱体を厚さ約１０ｍｍにカットしたサンプルを、０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩ溶液（和光純薬工業社製、１８０Ｕｎｉｔ／ｍｇ）に浸漬し、３７℃で７２時間静置した。コントロールとして、サンプルを浸漬しないコラゲナーゼ溶液のみからなるものを、３７℃７２時間静置した。その後、溶液中に含まれる可溶化したタンパク量を測定するため、ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用い、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、ｉＭａｒｋ）により５７０ｎｍの吸光度を測定して、上清タンパク量（μｇ）を定量した。なお、標準物質はウシ血清アルブミンを使用した。定量した上清タンパク量をサンプルに含まれるコラーゲン重量（ｍｇ）で除して、可溶化タンパク割合（％）を求めた。なお、コラーゲン重量は約１０ｍｍの円柱体重量に０．２３を乗じて求めた。結果を表２に示す。【００８１】
【表２】
2016163396.tif 000003
【００８２】
表２に示される結果から、コラーゲン懸濁液のイオン強度と可溶化タンパク割合には正
の相関があり、イオン強度が高いほどコラゲナーゼによる分解を受け易い傾向があることが示された。多孔質複合体の分解性を抑制することで、骨欠損部に骨再生のための足場として長く留まることができ、より骨再生を促進する効果が期待される。【００８３】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の多孔質複合体及びそれを含む骨再生材料は、加工容易性と機械的強度を両立して優れた操作性を有し、かつ高い骨再生能を有することから、主に歯科口腔外科領域、整形外科領域における骨欠損修復に有用である。
【符号の説明】
【００８５】
１  曲げ試験用サンプル
２  圧縮試験用サンプル
２１  支持台
２２  圧子
４１  試料台
４２  クロスヘッド
【図１】
2016163396.tif 000004
【図２】
2016163396.tif 000005
【図３】
2016163396.tif 000006
【図４】
2016163396.tif 000007
【国際調査報告】
2016163396.tif 000008
2016163396.tif 000009
2016163396.tif 000010
2016163396.tif 000011
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