(57)【要約】  本発明の剤は、(1) ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体、(2) (1)の薬剤的に許容される塩、(3) (1)若しくは(2)の溶媒和物、のいずれかを有効成分とし、CR2B若しくはCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用の阻害、マクロファージの抑制、がん微小環境若しくは炎症性微小環境の構成細胞の制御、又は抗がん剤の抗がん活性の増強のために用いられる。また、ジスルフィラムの構造を改変した誘導体群より、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性がより低く且つフロント阻害活性がより高いジスルフィラム誘導体を同定することで、副作用を低減し薬効をさらに高めた化合物を提供することも可能である。
2016111307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、マクロファージ抑制剤。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項２】
マクロファージの遊走又は組織浸潤の抑制に用いられる請求項１記載の剤。
【請求項３】
炎症性疾患の炎症病変部又はがん病変部におけるマクロファージの浸潤の抑制に用いられる、請求項２記載の剤。
【請求項４】
下記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、がん微小環境又は炎症性微小環境の構成細胞の制御剤。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項５】
下記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、CCR2B又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用の阻害剤。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項６】
１種以上の抗がん剤と組み合わせて用いられる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
前記抗がん剤が抗体又はその抗原結合性断片である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
前記抗がん剤が、抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト、細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、並びに細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体及びその抗原結合性断片から選択される少なくとも１種である、請求項６記載の剤。
【請求項９】
抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに対する抗体及びその抗原結合性断片、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、並びに細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体及びその抗原結合性断片から選択される少なくとも１種である、請求項８記載の剤。
【請求項１０】
前記抗がん剤が、アンタゴニスト性抗PD-1抗体、及び細胞傷害活性を有する抗CD4抗体から選択される少なくとも１種である、請求項９記載の剤。
【請求項１１】
下記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、抗がん剤の抗がん活性の増強剤。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項１２】
フロントタンパク質の第564番〜第600番アミノ酸の領域を含むフロントタンパク質断片と、配列番号６に示すCCR2Bのアミノ酸配列中の第312番〜第323番アミノ酸の領域を含むCCR2B断片又は配列番号８に示すCCR5のアミノ酸配列中の第304番〜第315番アミノ酸の領域を含むCCR5断片を、ジスルフィラム誘導体のライブラリーとインキュベートする工程、及び
フロントタンパク質断片とCCR2B断片又はCCR5断片との間の結合を阻害する活性がジスルフィラムよりも高いジスルフィラム誘導体を選択する工程
を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上したジスルフィラム誘導体を同定する方法。
【請求項１３】
ジスルフィラム誘導体のアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性を測定し、該阻害活性がジスルフィラムよりも低いジスルフィラム誘導体を選択する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の方法により、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上したジスルフィラム誘導体を同定する工程、及び
同定されたジスルフィラム誘導体を製造する工程
を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用の阻害剤の製造方法。
【請求項１５】
フロントタンパク質の第564番〜第600番アミノ酸の領域を含むフロントタンパク質断片と、配列番号６に示すCCR2Bのアミノ酸配列中の第312番〜第323番アミノ酸の領域を含むCCR2B断片又は配列番号８に示すCCR5のアミノ酸配列中の第304番〜第315番アミノ酸の領域を含むCCR5断片を、フロント阻害剤候補化合物の誘導体のライブラリーとインキュベートする工程、及び
フロントタンパク質断片とCCR2B断片又はCCR5断片との間の結合を阻害する活性がもとの候補化合物よりも高い誘導体を選択する工程
を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上した化合物を同定する方法。
【請求項１６】
フロントタンパク質の原子座標の少なくとも一部を用いて、M564、T565、I568、A569、M575、L578、L600からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基で構成されるフロントタンパク質の結合ポケット構造をインシリコで構築し、化合物ライブラリーに対して前記結合ポケット構造との結合の強さを計算し、フロントタンパク質との安定な複合体を形成する化合物を選択することを含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用を阻害する物質を同定する方法。
【請求項１７】
フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5とが結合する結合ポケット構造に対し、候補化合物をインシリコで結合させ、結合の強さを計算することを含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用を阻害する物質の設計方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象に対し、下記(1)〜(3)のいずれかの有効量を投与することを含む、マクロファージを抑制する方法。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項１９】
それを必要とする対象に対し、下記(1)〜(3)のいずれかの有効量を投与することを含む、がん微小環境又は炎症性微小環境の構成細胞を抑制する方法。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項２０】
それを必要とする対象に対し、下記(1)〜(3)のいずれかの有効量を投与することを含む、CCR2B又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用を阻害する方法。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【請求項２１】
それを必要とする対象に対し、下記(1)〜(3)のいずれかの有効量を投与することを含む、抗がん剤の抗がん活性を増強する方法。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフロントタンパク質阻害剤、及び該阻害剤によるがん微小環境又は炎症性微小環境の構成細胞の制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
フロントタンパク質は、ケモカイン受容体CCR2及びCCR5の細胞内C末端領域に結合する細胞質タンパク質であり、マクロファージなどの遊走シグナルを正に制御する（特許文献１、非特許文献１、２）。本願発明者らのグループが発見した新規分子である。【０００３】
CCR2及びCCR5は、いずれもがん及び炎症性疾患に関与することが知られており、これら疾患の新規治療剤を目指してCCR2及びCCR5の阻害剤開発が世界的に進められているものの、いずれも難航している。既存のアプローチは、ケモカインCCL2と受容体CCR2との結合及びケモカインCCL3〜5と受容体CCR5との結合、並びに受容体下流のPI3K等によるシグナル伝達系をターゲットとしていた。ケモカイン受容体CCR2及びCCR5とフロントタンパク質との結合阻害は、新たな創薬ターゲットとして期待されている（非特許文献３、４）。【０００４】
本願発明者らはこれまでに、CCR2又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用を阻害する阻害剤として、下記の式で表される化合物又はその塩を有効成分として含む阻害剤を報告している（特許文献１）。【０００５】
【化１】
2016111307.tif 000003
（式中、x1およびx2は、同一または互いに異なるハロゲンであり、Rは、低級アルキルである。）【０００６】
一方、ジスルフィラムは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性を有し、肝臓におけるエタノール代謝を抑制して悪酔いの原因となるアセトアルデヒドを体内に蓄積させる。このため、ジスルフィラムを服用すると、少量のアルコールでも悪酔いの症状が生じるようになる。この作用を利用して、ジスルフィラムは慢性アルコール中毒に対する抗酒癖剤として用いられている。【０００７】
上記の作用の他、ジスルフィラムにはがん細胞にアポトーシスを誘導して増殖を抑制するとの報告もある（例えば、非特許文献５〜７）。さらに、ジスルフィラムが肝がん幹細胞を殺傷する作用を有するとの報告もある（特許文献２）。これらの報告はいずれも、がん細胞又はがん幹細胞そのものを殺傷する作用についての報告であり、このようながん細胞に対する直接的な作用から、一部ではがんを対象とした治験も実施されている（非特許文献８）。しかしながら、がん細胞の周辺に存在する免疫細胞や線維芽細胞、血管内皮細胞等の微小環境構成細胞に対するジスルフィラムの作用については何ら知られていない。炎症が関与する各種の疾患において、炎症性微小環境にジスルフィラムが及ぼす作用も何ら知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第5424960号
【特許文献２】特開2013-100268号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nat. Immunol. Vol.6, pp.827-835 (2005)
【非特許文献２】J Immunol. Vol.183, pp.6387-6394 (2009)
【非特許文献３】内分泌・糖尿病・代謝内科、35(6): 500-507 (2012)
【非特許文献４】がん基盤生物学−革新的シーズ育成に向けて−, 南山堂, 2013年, p.130-136
【非特許文献５】Cancer Research, Vol.66, pp.10425-10433 (2006)
【非特許文献６】Clinical Cancer Research, Vol.15, pp.6070-6078 (2009)
【非特許文献７】Molecular Cancer Therapeutics, Vol.1, pp.197-204 (2002)
【非特許文献８】The Oncologist, Vol.20, pp.366-367 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
がんの治療及び炎症が関与する各種の疾患の治療においては、病態の原因となる標的細胞に直接的に作用する薬剤のみならず、がん病変部を構成する細胞群及び炎症病変部を構成する細胞群の適切な制御が治療につながることが期待される。本発明は、がんや炎症性疾患に対する効果が公知のフロント阻害剤よりも高く、医薬としてより有用な物質を提供すること、そのような物質を提供するための新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、約13万種の低分子化合物のライブラリーを鋭意にスクリーニングし、フロントタンパク質を阻害する活性を有する物質を新たに同定し、該物質ががん細胞の周辺に存在する微小環境構成細胞の過剰な増生や蓄積、特にマクロファージの病変部への集積を抑制し、その結果、がん細胞の増殖や転移を抑制することができること、さらに、該物質は炎症部位へのマクロファージの集積や白血病細胞の遊走を抑制する作用も有し、炎症性疾患や液性がんに対しても有効であることを見出した。さらに、フロントタンパク質とCCR2との結合領域複合体の立体構造を同定し、さらに強力なフロント阻害剤の開発に有用な立体構造情報を取得し、本願発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、下記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、マクロファージ抑制剤を提供する。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物【００１３】
また、本発明は、上記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、がん微小環境又は炎症性微小環境の構成細胞の制御剤を提供する。さらに、本発明は、上記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、CCR2B又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用の阻害剤を提供する。さらに、本発明は、上記(1)〜(3)のいずれかを有効成分として含有する、抗がん剤の抗がん活性の増強剤を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、上記(1)〜(3)のいずれかの有効量を投与することを含む、マクロファージを抑制する方法、がん微小環境又は炎症性微小環境の構成細胞を抑制する方法、CCR2B又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用を阻害する方法、及び抗がん剤の抗がん活性を増強する方法を提供する。【００１４】
さらにまた、本発明は、フロントタンパク質の第564番〜第600番アミノ酸の領域を含むフロントタンパク質断片と、配列番号６に示すCCR2Bのアミノ酸配列中の第312番〜第323番アミノ酸の領域を含むCCR2B断片又は配列番号８に示すCCR5のアミノ酸配列中の第304番〜第315番アミノ酸の領域を含むCCR5断片を、ジスルフィラム誘導体のライブラリーとインキュベートする工程、及びフロントタンパク質断片とCCR2B断片又はCCR5断片との間の結合を阻害する活性がジスルフィラムよりも高いジスルフィラム誘導体を選択する工程を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上したジスルフィラム誘導体を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上したジスルフィラム誘導体を同定する工程、及び同定されたジスルフィラム誘導体を製造する工程を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用の阻害剤の製造方法を提供する。さらに、本発明は、フロントタンパク質の第564番〜第600番アミノ酸の領域を含むフロントタンパク質断片と、配列番号６に示すCCR2Bのアミノ酸配列中の第312番〜第323番アミノ酸の領域を含むCCR2B断片又は配列番号８に示すCCR5のアミノ酸配列中の第304番〜第315番アミノ酸の領域を含むCCR5断片を、フロント阻害剤候補化合物の誘導体のライブラリーとインキュベートする工程、及びフロントタンパク質断片とCCR2B断片又はCCR5断片との間の結合を阻害する活性がもとの候補化合物よりも高い誘導体を選択する工程を含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上した化合物を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、フロントタンパク質の原子座標の少なくとも一部を用いて、M564、T565、I568、A569、M575、L578、L600からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基で構成されるフロントタンパク質の結合ポケット構造をインシリコで構築し、化合物ライブラリーに対して前記結合ポケット構造との結合の強さを計算し、フロントタンパク質との安定な複合体を形成する化合物を選択することを含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用を阻害する物質を同定する方法を提供する。さらに、本発明は、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5とが結合する結合ポケット構造に対し、候補化合物をインシリコで結合させ、結合の強さを計算することを含む、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用を阻害する物質の設計方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、マクロファージに代表される微小環境構成細胞を抑制する新規な剤が提供された。本発明の剤は、がん細胞そのものを殺傷するのではなく、がん細胞の周辺に存在する微小環境構成細胞の過剰な増生や蓄積、特にはマクロファージの病変部への集積を抑制し、その結果、がん細胞の増殖や転移を抑制することができる。また、本発明の剤は、炎症部位へのマクロファージの集積や、白血病細胞の遊走も抑制する作用を有し、炎症性疾患や液性がんに対しても有効である。微小環境制御作用に基づくことで、様々ながん種およびその他の炎症性疾患に適用拡大が期待される。本発明の剤を公知の抗がん剤と併用することで、抗がん剤の抗がん効果を高めることができるため、抗がん剤単独では効果が得られなかった患者への適用拡大、抗がん剤の投与量を低減することによる副作用の軽減及び治療費の低減なども期待される。ジスルフィラムは従来より慢性アルコール中毒患者への抗酒癖剤として実用されているが、ジスルフィラムの構造を改変した誘導体群より、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性がより低く且つフロント阻害活性がより高いジスルフィラム誘導体を同定することで、副作用を低減し薬効をさらに高めた化合物を提供することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】(a) HTRF法に基づく結合阻害アッセイの結果である。ジスルフィラムはフロント−CCR2間及びフロント−CCR5間の相互作用を選択的に阻害する一方、p53-MDM2間の相互作用は阻害しなかった。(b) CCR2−フロント間の相互作用及びp53-MDM2間の相互作用に対するジスルフィラムの阻害パターンを示すグラフである。
【図２】(a) SPRによりフロントへのジスルフィラムの結合を調べた結果である。(b) NMR解析により同定されたフロントC末端断片上のジスルフィラム結合領域とジスルフィラムの複合体の立体構造モデルである。フロントC末端断片をリボンモデルで、ジスルフィラムを剛体球モデル図で示す。
【図３】ジスルフィラム含有食又はコントロール食を経口で与えたマウス群において腫瘍サイズを測定した結果である。＊はp<0.05で有意差あり。
【図４】腫瘍投与後9日目における肺における転移結節の写真、及び転移の計数結果のグラフである。
【図５】ジスルフィラム及び5FUの増殖阻害作用及び細胞傷害活性を調べた結果である。aはLLC腫瘍細胞、bはB16F10メラノーマ細胞。
【図６】野生型マウス及びフロント−GFPノックインマウスの腹膜炎症部位から採取した細胞について、各種免疫細胞の表面マーカーに対する抗体を用いたフローサイトメトリー解析により各細胞におけるフロント発現量を検出した結果である。グレーが野生型マウス由来の細胞、黒がGFPノックインマウス由来の細胞。
【図７】フロントをコンディショナルにノックアウトしたフロント欠損マウス（FNT-cKO）及び非欠損マウス（Flox/flox）にメラノーマ細胞を移植し、腫瘍体積(a)及び生存率(b)を調べた結果である。
【図８】フロント欠損マウス（FROUNT-cKO）及び非欠損マウス（Flox/flox）の肺転移モデルにおいて、肺への転移結節の数及びサイズを調べた結果である。
【図９】フロント欠損マウス（FROUNT-cKO）及び非欠損マウス（Flox/flox）の腹膜炎症部位から採取した細胞集団中のマクロファージ数（上段）及び好中球数（下段）である。
【図１０】ジスルフィラムを投与した野生型マウスの腹膜炎症部位から採取した細胞集団中のマクロファージ（左）及び好中球（右）の割合である。ジスルフィラムは図示した用量でマウスに投与した。
【図１１】ヒト白血球細胞株THP-1を用いて、ジスルフィラムの細胞遊走阻害活性をin vitroで調べた結果である。
【図１２】溶媒処理又はジスルフィラム処理したマウスの各群について、肺転移におけるマクロファージと好中球の数をフローサイトメトリーにより調べた結果（左）、及び転移結節周辺のマクロファージの蓄積を免疫組織染色により調べた結果（右）である。免疫染色像中の破線は腫瘍転移巣の位置を示す。
【図１３】ジスルフィラム（DSF）と抗PD-1抗体の併用効果をLLC担癌モデルで調べた結果である。左は腫瘍体積の経時的変化であり、右は腫瘍細胞移植後２６日目における腫瘍体積である。Cont/PBSは非投与群；DSF/PBSはDSF投与群；Cont/PD-1Abは抗PD-1抗体投与群；DSF/PD-1AbはDSF＋抗PD-1抗体併用群。
【図１４】ジスルフィラム（DSF）と抗PD-1抗体の併用効果をB16担癌モデルで調べた結果である。左は腫瘍体積の経時的変化であり、右は腫瘍細胞移植後２１日目における腫瘍体積である。Cont/PBSは非投与群；DSF/PBSはDSF投与群；Cont/PD-1Abは抗PD-1抗体投与群；DSF/PD-1AbはDSF＋抗PD-1抗体併用群。nsは有意差なし、＊はp<0.05で有意差あり。
【図１５】ジスルフィラム（DSF）と抗CD4抗体の併用効果をLLC担癌モデル（左）及びB16担癌モデル（右）で調べた結果である。Cont/PBSは非投与群；DSF/PBSはDSF投与群；Cont/CD4Abは抗CD4抗体投与群；DSF/CD4AbはDSF＋抗CD4抗体併用群。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明では、下記のいずれかを有効成分として用いる。
(1)  ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、若しくはジエチルジチオカルバメートの金属錯体
(2)  (1)の薬剤的に許容される塩
(3)  (1)若しくは(2)の溶媒和物
【００１８】
ジスルフィラムは、CCR2B及びCCR5とフロントタンパク質との間の結合（相互作用）を阻害する作用を有し、フロント阻害剤として利用できることが本願発明者らにより明らかとなった。ジスルフィラムは生体内で代謝されてジエチルジチオカルバメートを生じるが、ジエチルジチオカルバメートを生じる化合物であればフロント阻害作用及びそれによる細胞遊走阻害活性等を示すことが確認されている。
【００１９】
フロントタンパク質は本願発明者らにより同定されたタンパク質であり、その配列情報はNCBIのデータベースGenBankにAF498261やNM_024844のアクセッション番号で登録されている。配列表の配列番号１、２に示す配列は、AF498261で登録されているフロント遺伝子のcDNA及びこれにコードされるフロントタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２０】
CCR2にはC末端領域の異なるCCR2A及びCCR2Bの２つのアイソフォームが存在するが、主要なアイソフォームはCCR2Bである。フロントタンパク質は、CCR2B及びCCR5の細胞内C末端領域内の膜近位領域（CCR2BではEKFRRYLSVFFRKHIT（配列番号３）、CCR5ではEKFRNYLLVFFQKHIA（配列番号４））に結合することが確認されている（Biochem. J. (2014) 457, 313-322）。本明細書において、単に「CCR2」と言った場合、文脈からそうではないことが明らかな場合を除き、CCR2Bを意味する。配列番号５、６にCCR2Bの配列（GenBank NM_001123396.1）を、配列番号７、８にCCR5の配列（GenBank NM_000579.3）をそれぞれ示す。
【００２１】
ジスルフィラムは、フロントタンパク質の阻害により、がん及び炎症性疾患の病変部の微小環境を構成する細胞を制御する。従って、ジスルフィラムはこれら疾患の病変部微小環境の構成細胞の制御剤として用いることができる。なお、本発明において、「フロントタンパク質の阻害」、「フロント阻害」といった場合、フロントとCCR2又はCCR5との間の相互作用の阻害を意味する。
【００２２】
微小環境とは、２種以上の組織に由来する細胞が共存している生体内環境をいう。がんや炎症性疾患の病変部における微小環境を構成する細胞（本明細書において「微小環境構成細胞」と略記することがある）には、免疫細胞（マクロファージ、樹状細胞、T細胞、B細胞など）、線維芽細胞、血管内皮細胞、血管周皮細胞、炎症細胞（好酸球、マスト細胞、好中球、好塩基球など）、体性幹細胞などが包含される。本発明において、「がん微小環境構成細胞」といった場合、がん細胞以外の微小環境構成細胞を指す。
【００２３】
微小環境構成細胞の制御とは、主としてこれら細胞の抑制である。がん微小環境及び炎症性微小環境において、該環境を構成する細胞は、外部から該環境中への異常な浸潤・集積や、該環境中での異常な増生を示す。微小環境構成細胞の制御とは、そのような異常な浸潤及び増生を抑制することをいう。がん及び炎症性疾患の病変部の微小環境を構成する細胞を制御することにより、これら疾患を治療し、予防し、又は進行、増悪、転移、再発を防止することができる。
【００２４】
微小環境構成細胞の制御は、例えば、マクロファージの抑制であり得る。マクロファージの抑制には、マクロファージの遊走又は組織浸潤の抑制が包含される。マクロファージ等の免疫細胞の過剰な集積・浸潤が多くのがん及び炎症性疾患の発症、悪化、またがんにおいては転移の誘導などに関与していることが知られている。従って、がん及び炎症性疾患の病変部微小環境におけるマクロファージの浸潤を抑制することにより、これら疾患の治療、予防、進行防止、増悪防止、転移防止、再発防止等が可能である。もっとも、本発明の剤による微小環境構成細胞の制御作用はマクロファージの抑制に限定されるものではない。
【００２５】
ジスルフィラムは、CCR2及びCCR5の細胞内C末端領域に結合して下流にシグナルを伝達する機能を担うフロントタンパク質を阻害するので、CCR2若しくはCCR5又はこれらのリガンド（CCL2、CCL5）の関与が知られている、ないしはこれらに対する阻害剤（ケモカイン阻害剤）が有効であることが知られている各種のがん及び炎症性疾患に対し、本発明の剤は有効である。また、微小環境におけるフロントの発現があるがん及び炎症性疾患に対し、本発明の剤は有効であり、フロントの発現が高いほどより高い効果が得られると期待される。
【００２６】
対象となるがんには、固形がん及び液性がんの両者が包含される。また、原発性がん及び転移性がんの両者が包含される。具体例として、肺がん、メラノーマ、胃がん、大腸がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、食道がん、前立腺がん、悪性リンパ種、白血病などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、CCR2が関与するがんとしては、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、肺がん、骨髄腫、脳腫瘍などが知られており、CCR5が関与するがんとしては、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、骨髄腫などが知られている（Scholten DJ, et al., Br J Pharmacol, 165:1617-1643, 2012）。さらに、臨床試験に進んでいるケモカイン分野の抗がん剤としては、CCL2を標的とする転移性去勢抵抗性前立腺がんに対する抗がん剤、CCL5を標的とする非小細胞肺がんに対する抗がん剤、CCR2を標的とする転移性がんに対する抗がん剤、CCR5を標的とする進行大腸がんに対する抗がん剤などがある（がん基盤生物学−革新的シーズ育成に向けて−, 南山堂, 2013年, p.130-136）。これらのがんは、本発明で対象となる好ましい具体例である。
【００２７】
また、本発明において対象となる炎症性疾患は、典型的には慢性炎症性疾患である。具体例としては、関節リウマチ、線維症、腹膜炎、多発性硬化症、動脈硬化症、糖尿病、喘息、アルツハイマー、乾癬、アトピー、虚血性心疾患、脳血管障害等を挙げることができるが、これらに限定されない。CCR2、CCR5、CCL2及びCCL5の少なくともいずれかの関与が知られている炎症性疾患としては、動脈硬化症、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、２型糖尿病、炎症性腸疾患、慢性肝炎、腎炎、移植片対宿主病、慢性閉塞性肺疾患、喘息、後天性免疫不全症候群などが挙げられる（Scholten DJ, et al., Br J Pharmacol, 165:1617-1643, 2012; 臨床免疫・アレルギー科, 59(3):386-391, 2013）。その他、CCR2、CCR5、CCL2及びCCL5の少なくともいずれか、又はフロントが関与する炎症性疾患として、肺線維症及び肝線維症等の各種の線維化疾患、腹膜炎、アレルギー性気道過敏症なども挙げられる（日本臨牀70巻, 増刊号8, 365-371, 2012; 及び下記実施例）。これらの炎症性疾患は、本発明で対象となる好ましい具体例である。
【００２８】
ジエチルジチオカルバメートの金属錯体は、いずれの金属の錯体でもよい。具体例としては、亜鉛錯体、鉄(II)錯体、鉄(III)錯体、銅錯体、白金錯体などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、及びジエチルジチオカルバメートの金属錯体は、薬剤的に許容される塩の形態で用いてもよい。酸付加塩と塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩の具体例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩などの無機酸塩、並びにクエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、及びパラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、及びアンモニウム塩などの無機塩基塩、並びにトリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、及びジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩を挙げることができる。
【００３０】
また、ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、及びジエチルジチオカルバメートの金属錯体、並びにこれらの薬剤的に許容される塩は、溶媒和物の形態で用いてもよい。溶媒和物の具体例としては、水和物及びエタノール和物などを挙げることができるが、これらに限定されず、医薬として許容される溶媒との溶媒和物であればいかなるものであってもよい。
【００３１】
ジスルフィラム自体は公知の化合物であり、従来より慢性アルコール中毒に対する抗酒癖剤として用いられている。ジスルフィラムは日本薬局方収載の処方箋医薬品であり、製造方法も周知である。またジエチルジチオカルバメート及びその金属錯体や、上記したジスルフィラム等の薬剤的に許容される塩及び溶媒和物も、化学合成分野において公知の方法により製造することができる。
【００３２】
本発明の剤を医薬として用いる場合、投与経路は全身投与でも局所投与でもよく、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与の例として、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、経皮投与等を挙げることができる。病変部の近傍に局所投与してもよいし、がんに対して用いる場合には、腫瘍部近傍の所属リンパ節に投与してもよい。
【００３３】
本発明の剤を医薬として調製する場合、ジスルフィラム、ジエチルジチオカルバメート、及びジエチルジチオカルバメートの金属錯体、これら化合物の塩、並びにこれら化合物及びその塩の溶媒和物は、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤と適宜混合して製剤することができる。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤や、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。
【００３４】
徐放製剤化の技術も周知である。本発明の剤は、有効成分の血中濃度安定化及び維持のために徐放性（sustained release）製剤として提供してもよい。ここでいう徐放という語は、制御放出（controlled release）と同義であり、時限放出（delayed release）等も包含される。徐放化技術は、徐放性製剤の形態からシングルユニット型とマルチプルユニット型に分類され、また放出制御機構からリザーバー型、マトリックス型などに分類され、複数の機構を組み合わせたハイブリッド型も知られている。本発明の剤を徐放性製剤として調製する場合は、いずれの徐放化技術を用いてもよい。リポソーム等のDDSを利用したものであってもよい。錠剤、顆粒剤、カプセル剤等のいずれの剤形でも徐放性製剤として調製し得る。ジスルフィラムの徐放性製剤の具体例を挙げると、例えばWO 2012/076897 A1には、リポソームをDDSとしたジスルフィラムの製剤が記載されており、International Journal of Pharmaceutics 497 (2016) 3-11には、徐放性ポリマーとしてポリビニル酢酸−ポリビニルピロリドン混合物又はヒプロメロースを用いたジスルフィラムの固体分散体錠剤が記載されている。もっとも、ジスルフィラムの徐放性製剤はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００３５】
本発明の剤の投与量は、対象となるがん又は炎症性疾患の治療に有効な量であればよい。有効量は、病変部の大きさや症状、重篤度、患者の年齢や体重等に応じて適宜選択される。特に限定されないが、本発明の剤の投与量は、例えば成人（体重60kg）に対し、１回の投与当たり有効成分量として約0.001mg〜約10g程度、例えば約0.1mg〜約1000mg程度、又は約5mg〜約500mg程度、又は約5mg〜200mg程度の用量であり得る。１日の投与は１回でもよく、数回でもよい。また、治療期間中の投与は１回でもよく、あるいは数日間ないしはそれ以上の期間毎日、又は数日、数週若しくは数月おきに複数回投与してもよい。例えば１日に複数回（例えば２〜５回程度）の投与を治療期間中毎日継続してよい。下記実施例に記載される通り、ジスルフィラムのフロント阻害能はジスルフィラムがDDCに分解可能な形態で投与されることで得られ、下流の代謝産物ではフロント阻害能が失われることから、１日１回高用量で投与するよりも、頻回投与とすることが好ましい。もっとも、徐放性製剤の性能によっては投与回数の低減も可能である。
【００３６】
本発明の剤を投与する対象は哺乳動物であり、特に限定されないが、典型的にはヒトである。
【００３７】
本発明の剤は、公知の抗がん剤や抗炎症剤の少なくとも１種と組み合わせて用いることができる。「組み合わせて用いる」とは、本発明の剤と他の少なくとも１種の抗がん剤又は抗炎症剤を、患者に対し同時に、順次に、又は別々に投与することを意味する。組み合わせて用いられる複数の剤は、別々の製剤として提供されてもよいし、同時に投与される場合には、複数の剤の有効成分が同一の製剤中に含有された形態であってもよい。
【００３８】
「抗がん」という語には、がんの発生（初発、転移、再発）の抑制及び増殖の抑制が包含される。従って、「抗がん剤」には、がんの治療剤、予防剤、転移抑制剤、及び再発抑制剤が包含される。
【００３９】
本発明の剤と組み合わせて使用され得る抗がん剤は、抗体又はその抗原結合性断片であり得る。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、投与対象がヒトである場合、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、又はヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）を用いることが望ましい。
【００４０】
組み合わせて使用可能な抗がん剤の好ましい例として、免疫チェックポイントを標的とする抗がん剤を挙げることができる。免疫チェックポイントとは、免疫系が自己の体を攻撃しないための免疫逃避機構である。T細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現しているリガンドと相互作用する。T細胞はMHC分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体−リガンドの相互作用によりT細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には抑制性のものと共刺激性のものがあり、両者のバランスによってT細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。
【００４１】
がん細胞はこうした免疫チェックポイント機構を利用し、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現して免疫機能を抑制し、細胞傷害性T細胞による破壊から逃避している。従って、抑制性の免疫チェックポイント分子を阻害することで、がん細胞による免疫チェックポイント機構の利用を妨害し、CD8+ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することができる。
【００４２】
免疫チェックポイントを標的とした抗がん剤は、種々のものが開発され、世界各国で臨床試験が進み、実用化が進んでいる。抑制性の免疫チェックポイントポイントを阻害する薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤とも呼ばれ、免疫チェックポイント標的抗がん剤の中でも特に実用化が進んでいる。そのような免疫チェックポイント阻害剤の具体例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体やアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、さらには受容体PD-1のリガンドであるPD-L1、PD-L2に結合して受容体へのリガンドの結合を阻害する、抗PD-L1抗体及び抗PD-L2抗体を挙げることができる。
【００４３】
もっとも、免疫チェックポイントを標的とする抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤（抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト）に限定されるものではなく、共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストも本発明の剤と組み合わせて使用可能である。共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストを投与することで、免疫反応を促進し、それによりCD8+ T細胞によるがん細胞の殺傷を促進することも可能である。本発明の剤、免疫チェックポイント阻害剤、及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
本発明において、「免疫チェックポイント分子」という語には、免疫チェックポイントとして機能する受容体とリガンドの両者が包含される。
【００４５】
免疫チェックポイントを標的とする抗がん剤において、対象となり得る抑制性の免疫チェックポイント分子の具体例を挙げると、受容体としてはPD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA等を挙げることができ、リガンドとしてはPD-L1（PD-1のリガンド）、PD-L2（PD-1のリガンド）、CD80（CTLA-4のリガンド）、CD86（CTLA-4のリガンド）、GAL9（TIM-3のリガンド）、HVEM（BTLAのリガンド）等を挙げることができる。また、対象となり得る共刺激性の免疫チェックポイント分子の具体例を挙げると、受容体としてはCD137、OX40、GITR等を挙げることができ、リガンドとしてはCD137L（CD137のリガンド）、OX40L（OX40のリガンド）、TNFSF18（GITRのリガンド）等を挙げることができる。
【００４６】
本発明において、「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。
【００４７】
「抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト」は、抑制性の免疫チェックポイント受容体と結合するアンタゴニスト性抗体（例えば、アンタゴニスト性の抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、及び抗BTLA抗体等）；抑制性の免疫チェックポイントリガンドに結合して受容体への結合を阻害する抗体（例えば、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗GAL9抗体、抗HVEM抗体等）；抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。
【００４８】
「共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニスト」は、共刺激性の免疫チェックポイント受容体と結合する、アゴニスト活性を有する抗体（例えば、アゴニスト性の抗CD137抗体、抗OX40抗体、及び抗GITR抗体等）；共刺激性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化する作用を有する可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等であり得る。
【００４９】
抗体の製造方法、化学合成又は遺伝子工学的手法によるポリペプチドの製造方法は、この分野で周知の常法であり、当業者であれば、上記のような抑制性の免疫チェックポイント分子に対するアンタゴニスト及び共刺激性の免疫チェックポイント分子に対するアゴニストを常法により調製することができる。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法も、この分野で周知の方法として確立している。また、免疫チェックポイント分子を標的とする抗がん剤が抗体医薬である場合、抗体に代えて、Fab、F(ab')2、scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）等の抗原結合性断片を用いることもできるが、抗原結合性断片の製造方法も周知である。
【００５０】
組み合わせて使用可能な抗がん剤のさらなる好ましい例として、細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、並びに細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体及びその抗原結合性断片を挙げることができる。ここでいう細胞毒成分とは、生細胞を破壊する活性を有する物質をいい、生物由来の毒物、化学物質、放射性物質等が包含される。細胞傷害活性を有する抗CD4抗体や、細胞毒成分が結合された抗CD4抗体又はその抗原結合性断片が、血液がん及び固形がんを包含する各種のがんに対して抗腫瘍効果を奏することは公知である（例えばWO 2015/125652）。細胞障害活性は、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）でも補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）でもよいが、CD4+細胞に対し十分に高い殺傷能力を発揮できる、高い細胞傷害活性を有する抗体を用いる必要がある。
【００５１】
「高い細胞傷害活性」とは、ADCC活性の場合、公知の測定方法を用いてCD4発現細胞に対するADCC活性を測定したときに、ADCC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1よりも高いADCC活性を有することをいう。また、CDC活性の場合、公知の測定方法を用いて、同一の補体を用いた実験系でCD4発現細胞に対するCDC活性を測定したときに、CDC活性を有することが知られている公知の抗CD4抗体OKT4よりも強いCDC活性を示すことをいう。
【００５２】
好ましくは、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、公知の抗CD4抗体6G5やCE9.1の10倍以上、より好ましくは100倍以上のADCC活性を有するか、公知の抗CD4抗体OKT4の10倍以上、より好ましくは100倍以上のCDC活性を有する。ここでいう「10倍以上」とは、例えば、一定量の細胞に対して細胞傷害活性を示す抗体濃度の最小値が、公知の上記抗体のそれの1/10以下であることを意味する。なお、抗CD4抗体のCD4に対するアフィニティーについては、抗体結合活性KDが1×10-9 M程度以下であればよい。
【００５３】
抗体のADCC活性やCDC活性を測定方法は、Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)等に記載され公知であり、また市販のキット類も存在する。そのような市販のキットを用いて、公知の抗CD4抗体よりも細胞傷害活性が高いかどうかを評価してよい。市販のキットを用いた細胞傷害活性の測定方法の具体例が下記実施例に記載されている。あるいは、ヒト末梢血単核球と抗CD4抗体を混合して37℃で数時間反応させ、フローサイトメトリー解析により反応液中のCD8+細胞に対するCD3+細胞の割合を測定し、得られた測定値を、ADCC活性を有しない抗CD4抗体や上記した公知の抗CD4抗体を用いた場合の測定値と比較することにより、抗CD4抗体のADCC活性の強さを評価することができる。
【００５４】
高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体は、例えば、公知の手法により作出したモノクローナル抗CD4抗体又は既に確立されている公知の抗CD4抗体から、この分野で公知の手法によりその細胞傷害活性を高めることによって作出することができる。あるいは、細胞表面に発現するCD4を特異的に認識し、かつ強力な細胞傷害活性を有する抗CD4抗体が公知であれば、そのような抗体を本発明の剤の有効成分として利用してもよい。例えば、WO 2010/074266には、従来の抗CD4抗体よりもADCC活性が高められた抗CD4抗体が開示されている。
【００５５】
抗体の細胞傷害活性を高める手法も公知であり、いずれの手法を用いてもよい。公知の手法の具体例を挙げると、ADCC活性を増強する手法としては、抗体のFc部分に存在している糖鎖に含まれるフコース（コアフコース）を除去するポテリジェント（登録商標）技術（Yamane-Ohnuki N, Satoh M, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs 2009; 1: 230-236.）、フコース基質供与を遮る方法、抗体のFc部位に存在する糖鎖を変換する方法（M. Schuster et al., Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.）を挙げることができ、CDC活性を増強する手法としては、アイソタイプIgG1の一部にアイソタイプIgG3の配列を組み合わせてCDC活性を高めるコンプリジェント（登録商標）技術（Natsume A, In M, Takamura H, et al. Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872.）が知られている。さらに、ポテリジェント（登録商標）技術とコンプリジェント（登録商標）技術を組み合わせて、ADCC活性及びCDC活性の両者を高めることで抗体の細胞傷害活性を強力に高めるアクリタマブ（登録商標）技術も知られている（Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16）。
【００５６】
組み合わせて使用し得る抗がん剤は、特に限定されないが、例えば、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに対する抗体及びその抗原結合性断片、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、細胞傷害活性を有する抗CD4抗体、並びに細胞毒成分を結合させた抗CD4抗体及びその抗原結合性断片から選択される少なくとも１種；抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに対する抗体及びその抗原結合性断片、並びに細胞傷害活性を有する抗CD4抗体から選択される少なくとも１種；抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニスト性抗体及びその抗原結合性断片、並びに細胞傷害活性を有する抗CD4抗体から選択される少なくとも１種であり得る。抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニスト性抗体の特に好ましい例として、アンタゴニスト性抗PD-1抗体及びアンタゴニスト性抗CTLA-4抗体、とりわけアンタゴニスト性抗PD-1抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５７】
公知の抗がん剤や抗炎症剤と組み合わせて本発明の剤を使用する場合、それらの抗がん剤又は抗炎症剤は、単独でがんの治療又は炎症性疾患の治療に使用する場合と同様に使用してもよいが、本発明の剤との併用により効果が高まるため、投与量や投与回数、投与期間等を減じることも可能である。
【００５８】
抗がん剤と本発明の剤を組み合わせて用いることで、さらに高い抗がん効果が得られることから、本発明の剤は抗がん剤の抗がん活性を増強する効果を有すると理解することもできる。本発明の剤を抗がん剤の抗がん活性の増強剤として用いる場合、投与対象はがん患者であり、抗がん剤による治療を開始する又は現に受けている患者である。
【００５９】
ジスルフィラムに各種の化学的修飾を加えた構造を有する誘導体のライブラリーから、ジスルフィラムよりも薬効が高い誘導体を同定することにより、フロント阻害剤及び微小環境構成細胞の制御剤としてさらに優れた薬効を有する化合物を取得することができる。ジスルフィラムが有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性は、がん及び炎症性疾患患者に対して適用する際には副作用となるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性の低減も優れた誘導体選択の指標の一つとすることができる。
【００６０】
「誘導体」とは、元の化合物に様々な化学的修飾を加えて得られる、元の化合物と類似した構造を有する化合物であり、創薬におけるリード化合物の最適化の過程ではリード化合物の誘導体を周辺化合物と呼ぶこともある。そのような誘導体のライブラリーは、例えばコンビナトリアル・ケミストリーの手法を応用して調製することができる。ジエチルジチオカルバメートは、ジスルフィラムのS−S結合が切断された構造の化合物であり、本発明における「ジスルフィラム誘導体」との語にはジエチルジチオカルバメート誘導体も包含される。特に限定されないが、ジスルフィラム誘導体は、例えば下記式１又は式２で示す構造を有する化合物であり得る。
【００６１】
【化２】
2016111307.tif 000004
【００６２】
（式１中、
R1及びR2はそれぞれ独立して硫黄原子、酸素原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいメチル基であり、
R3〜R6はそれぞれ独立して水素原子、C1〜C5の直鎖アルキル基、又はC3〜C5の分枝アルキル基、例えばC1〜C3の直鎖アルキル基又はC3の分枝アルキル基である。アルキル基はハロゲン原子で置換されていてもよく、またアルキル基を構成する１以上の炭素原子は窒素原子、硫黄原子又は酸素原子で置き換わっていてもよい。）
【００６３】
【化３】
2016111307.tif 000005
【００６４】
（式２中、R1、R3及びR4は上記式１における定義と同じであり、Xは水素原子、ハロゲン原子、アルカリ金属原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいメチル基である。）
【００６５】
フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上したジスルフィラム誘導体を同定する方法は、例えば以下の工程を含み得る。
【００６６】
(1)  フロントタンパク質断片と、CCR2B断片又はCCR5断片を、ジスルフィラム誘導体のライブラリーとインキュベーションする。
【００６７】
フロントタンパク質がCCR2B又はCCR5と結合する結合ポケット構造は、後述する通り、M564、T565、I568、A569、M575、L578、L600の７残基のうちの少なくとも１つを含む複数のアミノ酸残基で構成されている。従って、少なくともこれら７残基を含む領域、すなわち第564番〜第600番アミノ酸を含む領域がフロントタンパク質断片として用いられる。過去に行なったHTRF実験により、第549番〜第656番アミノ酸領域からなる断片及び第532番〜第650番アミノ酸領域からなる断片がCCR2のC末側膜近位領域との結合能を有することが確認されているので（データ省略）、フロントタンパク質断片の例としては、第549番〜第650番アミノ酸の領域を含む断片、第549番〜第656番アミノ酸若しくは第532番〜第650番アミノ酸の領域を含む断片などを挙げることができる。あるいは、フロントタンパク質断片は、第500番〜第656番アミノ酸の領域を含む断片であり得る。
【００６８】
CCR2Bの第310番〜第325番アミノ酸の領域（EKFRRYLSVFFRKHIT）からなる断片は、ここで用いるCCR2B断片の特に好ましい一例であるが、末端の少数のアミノ酸残基を削った断片でもフロントとの結合能を有し得る。従って、CCR2B断片としては、配列番号６に示すCCR2Bのアミノ酸配列中の第312番〜第323番アミノ酸の領域を含む断片、例えば第310番〜第325番アミノ酸の領域を含む断片を用いることができる。
【００６９】
CCR5断片としては、特に好ましい一例として第302番〜第317番アミノ酸の領域（EKFRNYLLVFFQKHIA）からなる断片を挙げることができるが、やはり同様に、末端の少数のアミノ酸残基を削った断片でもフロントとの結合能を有し得る。従って、CCR5断片としては、配列番号８に示すCCR5のアミノ酸配列中の第304番〜第315番アミノ酸の領域を含む断片、例えば第302番〜第317番アミノ酸の領域を含む断片を用いることができる。
【００７０】
上記のようなタンパク質断片は、周知の化学合成法又は遺伝子工学的手法により調製することができる。
【００７１】
(2)  フロントタンパク質断片とCCR2B断片又はCCR5断片との間の結合を阻害する活性がジスルフィラムよりも高いジスルフィラム誘導体を選択する。当該工程は、周知の結合アッセイを用いて実施可能である。選択されたジスルフィラム誘導体は、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用阻害能が向上した、ひいてはがん又は炎症性疾患における病変部微小環境構成細胞の制御能が向上したジスルフィラム誘導体として有用である。
【００７２】
(3)  ジスルフィラム誘導体について、さらに、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害活性を調べ、該活性がもとのジスルフィラムよりも低い誘導体を選択する工程を実施してもよい。通常、上記(2)の後に当該工程が実施される。
【００７３】
スクリーニング等により見出されたジスルフィラム以外のフロント阻害剤候補物質についても、上記と同様に誘導体の合成展開及び結合阻害アッセイを行ない、フロント阻害能が向上した誘導体化合物を同定することができる。
【００７４】
上記により同定されたジスルフィラム誘導体等の誘導体化合物は、化学合成分野で周知の方法により製造することができる。当該誘導体は、CCR2B又はCCR5とフロントタンパク質との間の相互作用の阻害剤、マクロファージ浸潤抑制剤などの微小環境構成細胞の制御剤として、とりわけ医薬として、ジスルフィラムよりも優れた性能を有する。
【００７５】
また、本願発明者らにより、フロントタンパク質がCCR2Bと結合する領域の立体構造が原子座標レベルで初めて明らかにされた。フロントタンパク質の結合領域断片とCCR2Bの結合領域断片の結合状態のNMR解析により、結合ポケット構成残基候補として第564番メチオニン（M564）、第565番スレオニン（T565）、第568番イソロイシン（I568）、第569番アラニン（A569）、第575番メチオニン（M575）、第578番ロイシン（L578）、第600番ロイシン（L600）の７残基が特定されている。これら７残基は、複合体形成に伴うNMRシグナルの化学シフト変化が大きかった上位７残基であり、フロントがCCR2Bと結合する結合ポケットはこれら７残基のうちの少なくとも１つを含む複数の残基によって構成されている。CCR2B及びCCR5のフロントとの結合領域はほぼ同一の立体構造であり、CCR5もここで同定された結合ポケット構造に結合する。立体構造に基づくドラッグデザイン（SBDD: structure based drug design）やin silicoスクリーニングのための様々な手法が知られているので、フロントタンパク質の立体構造情報を活用することで、さらに強力なフロント阻害剤を開発することができる。表１には、上記７残基の原子座標データをプロテインデータバンクのフォーマットに準じて示す。
【００７６】
【表１−１】
2016111307.tif 000006
【００７７】
【表１−２】
2016111307.tif 000007
【００７８】
【表１−３】
2016111307.tif 000008
【００７９】
例えば、同定されたフロントタンパク質の原子座標の少なくとも一部を用いて、フロントタンパク質がCCR2Bと結合する結合ポケット構造をインシリコで構築し、化合物ライブラリーに対して当該結合ポケット構造との結合の強さを計算し、フロントタンパク質との安定な複合体を形成する化合物を選択することにより、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との間の相互作用を阻害する新たな物質を同定することができる。多数の化合物の構造情報が登録されたデータベースが公知であり、そのようなデータベースをここでいう化合物ライブラリーとして利用できる。ライブラリーに対する結合シミュレーションを行ない、結合エネルギー（化学的相互作用エネルギー）から結合の強さを評価して化合物を選択していくことで、フロントタンパク質がCCR2Bと結合する結合ポケット構造に強く結合できる（すなわち、フロントタンパク質とCCR2B又はCCR5との結合を阻害できる）と見込まれる化合物を選定することができる。
【００８０】
また、原子座標をもとに構築した、フロントタンパク質がCCR2Bと結合する結合ポケット構造に対し、候補化合物をインシリコで結合させ、結合エネルギー等の計算により結合の強さを評価することで、より安定な複合体を形成できるように候補化合物の分子設計を進めることができる。ジスルフィラムやその他の候補化合物をより望ましい構造に改変することが可能である。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、全ての動物実験は東京大学の動物実験委員会のガイドラインに従って実施した。【００８２】
1. ジスルフィラムはフロント−CCR2相互作用を阻害する
[方法]
HTRF法（Homogeneous Time Resolved Fluorescence）に基づくハイスループットスクリーニング
スクリーニングには、10mM又は2mM濃度でDMSOに溶解させた131,200種類の化合物を含む化合物ライブラリー（東京大学創薬オープンイノベーションセンターより入手）を用いた。HTRFアッセイは、384穴の低用量白色マイクロプレート（Corning Coaster社、カタログ番号3676）を用いて行なった。ウェル内で4μLの20nM GST融合FROUNTタンパク質（配列番号２のaa500-656にGSTを融合させた組換えポリペプチド）溶液、DMSO又は試験化合物を結合バッファー（10 mM HEPES [pH 7.4], 0.2 M フッ化カリウム, 10 mM NaCl, 0.1% Tween 20及び0.5% ウシ血清アルブミン [BSA]）と混合し、プレートを室温で30分間インキュベートした。インキュベーション後、終濃度250 nMのビオチン化CCR2 pro-Cペプチド（CCR2BのC末端領域内の16残基EKFRRYLSVFFRKHIT（配列番号３）をビオチン化したもの）、2.6 ngのユーロピウムクリプテート標識抗GST抗体、及び12.5 ngのハイグレードXL665結合ストレプトアビジンを各ウェルに添加した。室温で20時間インキュベートした後、マルチラベルカウンターEnVision（PerkinElmer社）を用いて放出波長620nm及び665nmでHTRFシグナルを測定した。【００８３】
HTRF法に基づく結合阻害アッセイ
上記と同様のHTRFアッセイにより、ジスルフィラムによるフロント−CCR2相互作用及びフロント−CCR5相互作用の阻害能を調べた。CCR5 pro-Cペプチドとして、CCR5のC末端領域内の16残基EKFRNYLLVFFQKHIA（配列番号４）を用いた。コントロールとして、フロントとCCR2、CCR5との間の相互作用と同様のへリックスペプチド−タンパク質相互作用ではあるがこれらとは無関係なp53-MDM2相互作用（MDM-2特異的阻害剤であるNutlinにより阻害される）を用いた。【００８４】
[結果]
ジスルフィラムはフロント−CCR2間及びフロント−CCR5間の相互作用を選択的に阻害する一方、p53-MDM2間の相互作用は阻害しなかった（図1a）。フロント−CCR2に対するジスルフィラムのIC50は42nMと算出され、p53-MDM2に対する阻害作用の約100倍であった（図1b）。【００８５】
ジスルフィラム（DSF）は生体内でグルタチオンレダクターゼによりS-S結合が分解され、ジメチルジチオカルバメート（DDC）を生じ、さらに代謝されてMe-DTCスルホキシド及びMe-DTCスルホンを生じる。これらの代謝物のフロント阻害能を調べた結果を表２に示す。DDCとしてジメチルジチオカルバミン酸ナトリウムを用いてフロント阻害能を調べたところ、IC50は137nMであった。Me-DTCはアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）阻害活性を有するがフロントは阻害せず、フロント阻害とALDH阻害の活性体は異なることが確認された。【００８６】
【表２】
2016111307.tif 000009
【００８７】
また、DDCの亜鉛錯体及び鉄(III)錯体についてもフロント阻害能を調べたところ、それぞれIC50は114.6nM及び9.2nMであった。ジスルフィラムのS-S結合が分解されないように改変した化合物（S-SをS-CH2-CH2-S又はS-CH2-Sに改変）では、フロント−CCR2間の相互作用を阻害する能力は失われた。【００８８】
[参考文献]
Toda, E. et al. Identification of a binding element for the cytoplasmic regulator FROUNT in the membrane-proximal C-terminal region of chemokine receptors CCR2 and CCR5. Biochem J 457, 313-322, doi:10.1042/BJ20130827 (2014).【００８９】
2. ジスルフィラムはフロントに直接結合する
[方法]
表面プラズモン共鳴法
フロントとライブラリーの化合物との間の相互作用は、BiacoreT100 (GE Healthcare社)を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により解析した。全長フロントタンパク質（配列番号２）（Esaki, K. et al. Protein Expr Purif 77, 86-91, (2011).）をCM5センサーチップに固定化して用いた。2％DMSOを含むHBS-EPバッファー（GE Healthcare社）中に段階的に希釈したジスルフィラムの溶液を、30μL/minの流速でセンサーチップにアプライした。結合から洗浄までの間のResonance Unit（RU）を測定し、結合動態を解析した。Biacore T100 evaluation softwareを用いてDMSOに対する溶媒補正を行なった。【００９０】
フロント結合領域複合体の立体構造のNMR解析
フロントタンパク質の第500番〜第656番アミノ酸の領域からなる断片と、16残基のCCR2 pro-C領域断片（配列番号３）とを調製し、両者の結合状態及びフロントタンパク質とジスルフィラムとの結合状態をNMR解析により調べた。【００９１】
[結果]
SPR実験により、ジスルフィラムがCCR2ではなくフロントタンパク質に直接結合していることが明らかとなった（図2a）。NMR解析では、フロント由来のシグナルがジスルフィラム添加により影響され、フロントとジスルフィラムが直接的に相互作用していることが示唆された（図2b）。また、ジスルフィラムの代謝産物であるジメチルジチオカルバメートもジスルフィラムと同じフロント上の結合部位に結合することが示唆された（データ省略）。【００９２】
NMRを用いた化学シフト摂動法による解析の結果、フロント−CCR2複合体形成に伴うNMRシグナルの化学シフト変化が大きかった残基は、M564、T565、I568、A569、M575、L578、L600であった。CCR2が結合するフロントタンパク質上の結合ポケットは、これら７残基のうちの少なくとも１つを含む複数の残基によって構成されていると考えられる。これら７残基の原子座標は上掲の表１に示した通りである。【００９３】
3. ジスルフィラムは腫瘍増生を抑制する
[方法]
腫瘍モデル
皮下での腫瘍の増殖を評価するため、LLC（ルイス肺癌）細胞（5×105）を50μLのPBSに懸濁してマウスの右側腹部に皮下注射した。週に2回、ノギスを用いて腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は下記の式により算出した。
腫瘍体積＝(腫瘍短径)2×腫瘍長径/2【００９４】
皮下腫瘍増殖モデルにおける抗腫瘍効果を調べるため、5％スクロース（和光）を添加したCE-2粉末飼料（日本クレア）にジスルフィラムを0.8 mg/gの量で添加し、腫瘍接種後４日目〜１１日目までの期間、毎日摂取させた。コントロール群には、スクロースを同量添加した飼料を与えた。【００９５】
[結果]
ジスルフィラムを経口で与えたマウス群では、コントロール群と比較して腫瘍体積が有意に減少していた（図3）。ジスルフィラムによりフロントを阻害することで、生体内に移植した肺癌細胞の増殖が抑制されることが明らかとなった。【００９６】
4. ジスルフィラムは腫瘍転移巣形成を抑制する
[方法]
肺転移モデルとして、1×106個のメラノーマ細胞B16F10を200μLのPBSに懸濁し、野生型C57BL/6マウスの尾静脈より投与した。阻害剤の投与は、腫瘍投与の1日前、30分前、及び1日後に行なった。コントロールとして、DMSO及びフッ化ピリミジン系の抗がん剤5-FUを投与した。腫瘍投与後9日目にマウスを安楽死させ、左心室からPBSを灌流させた後に肺を分離した。左葉中の目視可能な肺転移をカウントした。【００９７】
[結果]
腫瘍投与後9日目における転移結節の写真、及び転移の計数結果のグラフを図4に示す。ジスルフィラムは移植されたB16F10細胞による肺転移の形成を有意に低減した。【００９８】
5. ジスルフィラムは直接的な細胞殺傷作用に依らず腫瘍を抑制する
[方法]
細胞傷害性及び増殖アッセイ
阻害剤の細胞傷害性は、LDH Cytotoxicity Detection Kit（TaKaRa）を製造者の指示書に従い用いて調べた。簡潔には、腫瘍細胞を薬剤（ジスルフィラム、5FU）の存在下又は非存在下で72時間培養後、培養上清を回収し、損傷細胞から放出された乳酸脱水素酵素の濃度を調べた。細胞増殖の測定では、細胞を阻害剤と共にプレートウェル中で48時間インキュベートし、最後の30分の間にWST-1（同仁化学研究所）を培養液に添加、EnVision（PerkinElmer）を用いて各ウェルの650nm参照波長に対する450nmでの吸光度を測定し、フォルマザンレベルを検出した。【００９９】
[結果]
近年、ある種の腫瘍細胞に対しジスルフィラムが直接腫瘍細胞を殺傷する活性があることが報告されている（Chen, D., et al., Cancer Res 66, 10425-10433, (2006)、及びChiba, T. et al., PLoS One 9, e84807, (2014)）。ジスルフィラムの抗腫瘍活性が直接的な腫瘍細胞の殺傷によるものか否かを調べるため、細胞傷害性を有する抗がん剤である5FUとジスルフィラムの抗がん作用及び細胞傷害活性を比較した。その結果、ジスルフィラムは、5FUがLLC腫瘍細胞を完全に殺傷する濃度と同濃度において、細胞傷害活性を示さなかった（図5a）。5FUは、B16F10メラノーマ細胞に対しても細胞傷害活性及び増殖阻害作用を示したが、ジスルフィラムは同濃度においても腫瘍細胞に対して何らの作用も示さなかった（図5b）。また、図４に示される通り、5FUは腫瘍殺傷活性があるにもかかわらずB16F10腫瘍の転移を低減しなかったが、その一方、ジスルフィラムはそれと同じ用量で腫瘍の転移を効果的に減少させた。これらの結果は、ジスルフィラムが示すB16F10メラノーマ細胞及びLLC細胞に対する抗腫瘍効果は細胞傷害活性によるものではなく、宿主の腫瘍微小環境に対する作用によるものであることを示している。【０１００】
6. フロントはマクロファージに高発現している
[方法]
フロント-gfp-ノックインマウスの作出
常法により、マウスのゲノム上のフロントプロモーターの下流にGFP遺伝子を組み込み、フロント-gfpノックインマウスを作出した。【０１０１】
フローサイトメトリー
2 mLの4％チオグリコレートを腹腔内投与して腹膜炎を誘導したマウスより、腹膜の浸潤細胞を採取した。2％ウシ胎仔血清を添加したPBSにて細胞を洗浄、再懸濁し、70μmのストレイナーで濾過した。抗マウスCD16/32抗体（BD biosciences）でインキュベーションすることでFcレセプターをブロッキングした後、蛍光標識抗体で細胞を染色した。抗マウスCD11b-Pacific Blue、抗マウスLy6C-APC-Cy7、抗マウスLy6G-Alexa Fluor 700、抗マウスCD4-FITC及び抗マウスB220-PE-Cy7はBiolegendより購入した。抗マウスCD8-Pacific BlueはBD biosciencesより購入した。【０１０２】
[結果]
フロント−GFPノックインマウス由来の細胞のフローサイトメトリー解析によると、腹膜炎モデルの炎症部位にリクルートされた免疫細胞の中でも特にマクロファージにおいてフロントが高発現していた（図6）。CCL2で動員された細胞集団ではフロント高発現の単球／マクロファージが濃縮されており、その受容体であるCCR2を発現している細胞においてフロントが高発現していることが示された（データ省略）。【０１０３】
単球／マクロファージにおいてフロントが高発現していること、並びに単球／マクロファージ上で発現しているCCR2とCCR5に対する結合能をフロントが有することから（Toda, E. et al. J Immunol 183, 6387-6394, (2009)）、我々は次いで、炎症部及び腫瘍部へのマクロファージの浸潤にフロントの欠損が影響を及ぼすか否かを調べた。【０１０４】
7. フロント欠損マウスではがん増生及び転移が低下する
腫瘍微小環境におけるフロントの役割を調べるため、cre/loxPシステムを用いてフロントをノックアウトしたマウスを作出した。フロントは完全欠損で胎生致死となるため、タモキシフェン依存的に組み換え反応が誘導されるシステムを用いてコンディショナルなノックアウトを行なった。【０１０５】
フロント遺伝子のエクソン１５〜１９を含むゲノム領域をLoxPで挟み込んだターゲティングベクターをマウスに導入し、ヘテロのFNTfloxマウスを交配してホモのFNTflox/floxマウスを作出した。次いで、Creリコンビナーゼと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質Cre-ERが導入されたB6.Cg-Tg (CAG-cre/Esr1*)5Amc/Jマウス（Jaxon Laboratory）とFNTflox/floxマウスを交配し、タモキシフェン誘導性のフロントコンディショナルノックアウトマウスFNT-cKOを得た。FNT-cKOマウスをタモキシフェン処理することで、ゲノムDNA及びmRNAいずれにおいてもフロントの欠失が誘導された。タモキシフェン処理後のFNT-cKOマウスではフロントmRNAの発現は半分以下に抑制されることが確認された。【０１０６】
実験の6日前又は14日前より、クエン酸タモキシフェン（和光純薬）を0.4mg/1gCE-2の量で添加したCE-2粉末飼料（日本クレア）を8〜16週齢のFNTflox/floxマウス及びFNT-cKOマウスに与え、Creの発現を誘導した。サザンブロッティングにより組換えを確認した。【０１０７】
(1)  FNT-cKOマウスにおけるがん増生の低下
5×105個のB16メラノーマ細胞をFNTflox/floxマウス及びFNT-cKOマウスの右側腹部に移植し、その後週２回、腫瘍サイズをノギスで測定し、腫瘍体積を算出した。その結果、非ノックアウト（FNTflox/flox）マウスに比べてFNT-cKOマウスでは腫瘍の増殖が有意に抑制され、また生存率も向上することが明らかとなった（図7a, b）。【０１０８】
(2)  FNT-cKOマウスにおけるがん転移の低下
1×106個のB16メラノーマ細胞をFNTflox/floxマウス及びFNT-cKOマウスに静脈内投与し、投与8日目に肺の転移結節の数及びサイズを目視で確認した。その結果、転移結節の数もサイズもFNT-cKOマウスで有意に低下することが明らかとなった（図8a, b）。【０１０９】
8. フロント欠損マウスでは炎症部位へのマクロファージ浸潤が抑制される
[方法]
in vivo走化性アッセイ
FNTflox/floxマウス及びFNT-cKOマウスに4％チオグリコレート培地（Difco社）2mLを腹腔内投与することで腹膜炎を誘導させた。腹腔中に5mLの氷冷PBSを注入して穏やかにマッサージすることで、腹膜の浸潤細胞を収集した。収集した細胞集団を、0.1％FBSを含むPBSで洗浄し、フローサイトメトリー解析に付して細胞数及び細胞ポピュレーションを調べた。【０１１０】
[結果]
結果を図9に示す。フロント欠損マウスではマクロファージ数が低下しており、腹膜炎症部位へのマクロファージの浸潤が低下することが確認された（図9上段）。好中球数はフロント欠損マウスと非欠損マウスの間で差異がなかった（図9下段）。【０１１１】
9. ジスルフィラムは炎症部位へのマクロファージ浸潤を抑制する
[方法]
in vivo走化性アッセイ
野生型マウスに上記8と同様の処理を行ない、腹膜炎を誘導し、腹膜の浸潤細胞を収集した。収集した細胞集団を洗浄後、フローサイトメトリー解析により細胞数及び細胞ポピュレーションを調べた。ジスルフィラムの評価のため、DMSOに溶解し2％ Tween 80含有生理食塩水で希釈した、図示した濃度のジスルフィラムをチオグリコレート投与の1日前と30分前にマウスに投与した。【０１１２】
[結果]
フロント阻害剤であるジスルフィラムを野生型マウスに投与した場合でも、フロント欠損マウスと同様に、腹膜炎症部位へのマクロファージの浸潤は低下し、好中球の浸潤は影響されなかった（図10）。【０１１３】
10. ジスルフィラムは細胞遊走を阻害する
[方法]
in vitro走化性アッセイ
ヒト白血球細胞株THP-1を計数してBoydenバッファー（0.1% BSA含有RPMI培地）中に再懸濁し、走化性アッセイ前にジスルフィラムと共にプレインキュベートした。ポリカーボネートフィルターのポアサイズが5-μmである96ウェルのChemoTXケモタキシスチャンバー（Neuro probe）を用いて細胞遊走活性を測定した。プレートの下部チャンバー中にケモカインをアプライし、上部チャンバー上に細胞をアプライした。37℃、5％CO2で90分間インキュベートした後、フィルターを除去し、Cell Counting Kit F（同仁化学研究所）を用いて下部チャンバー中の遊走細胞数をカウントした。【０１１４】
[結果]
細胞毒性を示さない濃度（データ省略）でのジスルフィラム処理により、CCL2が媒介する細胞遊走が阻害された（図11）。【０１１５】
11. ジスルフィラムは腫瘍部位へのマクロファージ集積を抑制する
[方法]
フローサイトメトリー
上記4に記載した野生型マウスの肺転移モデル、又は上記7(2)に記載したFNT-cKOマウス及びFNTflox/floxマウスの肺転移モデルの肺細胞を、右下葉よりコラゲナーゼ及びDNaseで消化させて得た。2％ウシ胎仔血清を添加したPBSにて細胞を洗浄、再懸濁し、70μmのストレイナーで濾過した。抗マウスCD16/32抗体（BD biosciences）でインキュベーションすることでFcレセプターをブロッキングした後、蛍光標識抗体で細胞を染色した。抗マウスCD11b-Brilliant Violet 510、抗マウスLy6C-APC-Cy7、抗マウスLy6G-Alexa Fluor 700はBiolegendより購入した。染色した細胞は、Galliosフローサイトメーター(Beckman coulter)を用いて解析した。【０１１６】
免疫組織染色
マウスをPBSで灌流し、左肺を分離した。気管からOptimal Cutting Temperatureコンパウンド（OCT）（サクラファインテック）を注入し、OCT中に包埋して液体窒素で凍結させた。8μm厚の新鮮凍結切片を調製し、4％パラホルムアルデヒド−PBSで固定した。0.05% Tween 20−PBSで洗浄後、切片をBlocking One試薬（ナカライテスク）でブロッキングし、抗マウスF4/80抗体（BioLegend）及びAlexa Fluor 594 抗ラットIgG (Life technologies)で順次染色した。SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）により蛍光像を取得した。【０１１７】
[結果]
フロント阻害剤であるジスルフィラムを野生型マウスに投与すると、溶媒投与マウスと比較して、腫瘍部位へのマクロファージの集積が低下していた（図12）。フロント欠損マウスにおいても、非欠損マウスと比較してがん転移結節へのマクロファージの集積が有意に低下していた（データ省略）。【０１１８】
以上の通り、フロント阻害剤ジスルフィラムの投与を受けたマウスは、がん増生の抑制、がん転移の抑制、炎症部位へのマクロファージ浸潤抑制という、フロント欠損マウスと同様の表現型を示すことが確認された。【０１１９】
12. ジスルフィラムの抗PD-1抗体との併用効果
[方法]
抗がん剤とジスルフィラム（DSF）の併用の一例として、免疫チェックポイント分子をターゲットとする抗がん剤である抗PD-1抗体とDSFの併用効果をLLC担癌モデル及びB16担癌モデルで検討した。B16担癌モデルは、5×105個のB16メラノーマ細胞を野生型C57BL/6マウスの右側腹部に移植して作製した。LLC担癌モデルの作製は上記3.と同様に行なった。DSF添加飼料は上記3.と同様とした。【０１２０】
腫瘍細胞のマウスへの移植日を０日目とし、４日目より実験期間中毎日、DSF添加飼料又はコントロール飼料を給餌した。抗PD-1抗体（J43、BioXcell社製）は、５日目、８日目、１４日目及び１８日目に１回ずつ（合計４回）、0.2mgを腹腔内に投与した。抗体投与に対するコントロールとして、PBSを腹腔内に投与した。週に２回、腫瘍サイズをノギスで測定し、腫瘍体積を算出した。【０１２１】
[結果]
LLC担癌モデルでの結果を図13に示す。LLC担癌モデルにおいて、抗PD-1抗体とDSFは単独でもがん細胞の増生を抑制したが、併用により相加効果が見られ、抗PD-1抗体のがん増生抑制効果はDSFの併用により相加的に増強することが確認された。【０１２２】
B16担癌モデルでの結果を図14に示す。B16担癌モデルでは、抗PD-1抗体とDSFはいずれも単独投与ではがん増生抑制効果が有意なレベルでは認められなかったが、併用することで明らかにがん細胞の増生が抑制され、相乗的な効果が得られることが確認された。【０１２３】
13. ジスルフィラムの抗CD4抗体との併用効果
[方法]
抗がん剤とDSFの併用のさらなる一例として、高い細胞傷害活性を有する抗CD4抗体とDSFの併用効果をLLC担癌モデル及びB16担癌モデルで検討した。LLC担癌モデル及びB16担癌モデルは上記12.と同様に作製した。DSF添加飼料は上記12.と同様とした。腫瘍細胞の移植後、週に２回、腫瘍サイズをノギスで測定し、腫瘍体積を算出した。【０１２４】
腫瘍細胞のマウスへの移植日を０日目とし、４日目より実験期間中毎日、DSF添加飼料又はコントロール飼料を給餌した。抗CD4抗体（GK1.5、CDC活性によりマウス体内のCD4+ 細胞を枯渇させることができることが知られている抗体、BioXcell社製）は、５日目及び８日目に１回ずつ（合計２回）、0.2mgを腹腔内に投与した。抗体投与に対するコントロールとして、PBSを腹腔内に投与した。【０１２５】
[結果]
腫瘍体積を経時的に測定した結果を図15に示す。LLC担癌モデル（左）、B16担癌モデル（右）のいずれでも、抗CD4抗体によるがん増生抑制効果がDSFの併用により有意に増強することが確認された。
【図１】
2016111307.tif 000010
【図２】
2016111307.tif 000011
【図３】
2016111307.tif 000012
【図４】
2016111307.tif 000013
【図５】
2016111307.tif 000014
【図６】
2016111307.tif 000015
【図７】
2016111307.tif 000016
【図８】
2016111307.tif 000017
【図９】
2016111307.tif 000018
【図１０】
2016111307.tif 000019
【図１１】
2016111307.tif 000020
【図１２】
2016111307.tif 000021
【図１３】
2016111307.tif 000022
【図１４】
2016111307.tif 000023
【図１５】
2016111307.tif 000024
【配列表】
2016111307000001.app
【国際調査報告】
2016111307.tif 000025
2016111307.tif 000026
2016111307.tif 000027
2016111307.tif 000028