(57)【要約】  本発明は、新規な作用機序を有する、副作用が低減された、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤の提供を課題とする。鎖状飽和炭化水素基、鎖状不飽和炭化水素基、環式飽和炭化水素基、環式不飽和炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される少なくとも１種の脂溶性基の導入により脂溶性が高められたポリフェノール誘導体は、ネプリライシンの活性を増強する作用を有し、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤。
【請求項２】
ポリフェノール誘導体が、脂溶性ポリフェノール誘導体である、請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
脂溶性ポリフェノール誘導体が、脂溶性カテキン誘導体である、請求項２記載の薬剤。
【請求項４】
脂溶性カテキン誘導体が、式（Ｉ）で表される(−)−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、請求項３記載の薬剤。
【化１】
2016072522.tif 000026
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１+ｎ２+ｎ３+ｎ４は２以上である。）
【請求項５】
脂溶性カテキン誘導体が、式（ＩＩ）で表される(−)−エピガロカテキン誘導体又は(−)−エピカテキン誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、請求項３記載の薬剤。
【化２】
2016072522.tif 000027
（式中、ｍ１はＡ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｍ２はＢ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｍ３はＣ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜２の整数であり；ｍ１+ｍ２+ｍ３は２以上である。）
【請求項６】
脂溶性基が、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項７】
脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、請求項４又は５に記載の薬剤。
【請求項８】
脂溶性基がＡ環又はＡ’環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、請求項４〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、請求項４〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
Ｃ環又はＣ’環の４位にカルボニル基が存在する、請求項４〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、請求項２記載の薬剤。
【請求項１２】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の薬剤。
【化３】
2016072522.tif 000028
【化４】
2016072522.tif 000029
【請求項１３】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の薬剤。
【化５】
2016072522.tif 000030
【請求項１４】
ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)下記式
【化６】
2016072522.tif 000031
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項１記載の薬剤。
【請求項１５】
ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項１記載の薬剤。
【請求項１６】
ネプリライシン活性を増強することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１７】
ネプリライシン活性の増強が、ネプリライシンの細胞表面への顕在化を促進することによるものである、請求項１６記載の剤。
【請求項１８】
αセクレターゼ活性を増強することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１９】
βセクレターゼ活性を阻害することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２０】
ネプリライシン活性を増強する効果、αセクレターゼ活性を増強する効果及びβセクレターゼ活性を阻害する効果からなる群より選択される少なくとも１種の効果を有することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項２１】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強剤。
【請求項２２】
βセクレターゼ活性を阻害する効果を有する、請求項２１記載の剤。
【請求項２３】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、βセクレターゼ活性の阻害剤。
【請求項２４】
αセクレターゼ活性を増強する効果及び／又はβセクレターゼ活性を阻害する効果を有する、請求項２３記載の剤。
【請求項２５】
ポリフェノール誘導体が、脂溶性ポリフェノール誘導体である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項２６】
脂溶性ポリフェノール誘導体が、脂溶性カテキン誘導体である、請求項２５記載の剤。
【請求項２７】
脂溶性カテキン誘導体が、式（Ｉ）で表される(−)−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、請求項２６記載の剤。
【化７】
2016072522.tif 000032
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１+ｎ２+ｎ３+ｎ４は２以上である。）
【請求項２８】
脂溶性カテキン誘導体が、式（ＩＩ）で表される(−)−エピガロカテキン誘導体又は(−)−エピカテキン誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、請求項２６記載の剤。
【化８】
2016072522.tif 000033
（式中、ｍ１はＡ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｍ２はＢ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｍ３はＣ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜２の整数であり；ｍ１+ｍ２+ｍ３は２以上である。）
【請求項２９】
脂溶性基が、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される、請求項２７又は２８に記載の剤。
【請求項３０】
脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、請求項２７又は２８に記載の剤。
【請求項３１】
脂溶性基がＡ環又はＡ’環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項３２】
脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項３３】
Ｃ環又はＣ’環の４位にカルボニル基が存在する、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の剤。
【請求項３４】
脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、請求項２５記載の剤。
【請求項３５】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の剤。
【化９】
2016072522.tif 000034
【化１０】
2016072522.tif 000035
【請求項３６】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の剤。
【化１１】
2016072522.tif 000036
【請求項３７】
ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)下記式
【化１２】
2016072522.tif 000037
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項３８】
ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来の治療薬とは作用機序を異にする新規なアルツハイマー病（ＡＤ）治療薬に関する。詳細には、本発明は、アミロイドβペプチド（Ａβ）の分解システムを担うペプチダーゼであるネプリライシンの活性を増強する作用及び／又はアミロイドβペプチド産生阻害に貢献するαセクレターゼの活性を増強する作用に基づいたＡＤの予防及び／又は治療用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤは老年期認知症の主要因となる進行性の神経変性疾患であり、臨床症状が現れるまでには細胞外アミロイドβペプチドの蓄積→細胞内タウの凝集・蓄積→神経変性・神経細胞死という病理カスケードをたどる（アミロイド仮説）。それ故、ＡＤはＡβの蓄積から始まると考えられ、根本的治療のためにはＡβの産生阻害、分解促進、凝集抑制、凝集沈着物の除去により脳内からＡβを取り除く必要があり、このような抗Ａβ薬の開発の為に世界規模で競って研究が進められている。【０００３】
ＡＤの治療薬については、アリセプトなどのいくつかの薬剤が存在するものの、いずれも病状を緩和する効果を有するのみであり、根本的な治療薬にはなっていない。一方、Ａβの代謝研究では従来産生系に関わるβ及びγセクレターゼの解析が進められたため、ＡＤの創薬研究においてもこれらの酵素を標的とする阻害剤の開発が先行し、複数の薬剤について臨床試験が行われた。しかしながら、副作用の問題などで次々と開発が中止されているのが現状である。それ以外の作用点である凝集沈着物の除去（Ａβワクチン療法）や凝集抑制薬についても、臨床試験まで進んだものの、いずれの場合も副作用のため開発中止を余儀なくされている。【０００４】
脳内Ａβの分解システムについては、ネプリライシンと呼ばれるペプチダーゼが分解の責任酵素であることが報告されている（非特許文献１、２）。ネプリライシンは動物の種々の組織に存在する中性エンドペプチダーゼの一種であり、細胞外ドメインに触媒部位を有する膜結合型の酵素である。インビトロの実験では、エンケファリン、サブスタンスＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、エンドセリン等がネプリライシンの基質になり得ることが知られている。【０００５】
正常老化脳で観察されるＡβ蓄積やＡＤのアミロイド病態の進行と脳内のネプリライシンレベルの低下を関連づける結果が報告されている。正常マウスやＡＤモデルマウスの大脳皮質や海馬で加齢と共に発現レベルが顕著に低下する。最近では、ヒトの場合にも同様な低下が起こることが明らかにされ、ネプリライシンレベルの低下と不溶性画分のＡβ４２レベルが逆相関することが報告されている。【０００６】
ＡＤ脳におけるネプリライシンレベルの低下についてもまた、独立した複数の研究グループで一致した結果が報告されている。ＡＤの前段階の海馬および側頭葉で、ネプリライシンの発現量およびタンパク量が５０％近く低下していることが知られている。アミロイド病理に抵抗性を示す小脳ではネプリライシンの発現量は海馬や側頭葉に比較して高く、ネプリライシンの発現低下も認められない。一方で、アミロイド病理が進んだ剖検脳ではネプリライシンレベル低下はさらに強まって、対照群の７０％まで激減することが示されている。【０００７】
分解系に着目したＡＤ治療薬はＡＤの根本的治療薬として期待されているが、現在のところ、ネプリライシン遺伝子を利用したＡＤの遺伝子治療の試みがモデルマウスを用いて行われている段階に過ぎない。【０００８】
ポリフェノールは、抗酸化作用、コレステロール低下作用、抗菌作用などを有するとされ、健康維持に好影響を与えることが一般によく知られている。又、お茶由来成分のポリフェノールであるカテキンがＡＤに効くという報告もある（非特許文献３〜５）。ポリフェノールの１種であり、下記構造【０００９】
【化１】
2016072522.tif 000002
【００１０】
を有する(−)−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）は神経系細胞で中性エンドペプチダーゼの酵素活性を増大させることが報告されているが（非特許文献６〜９）、これらの実験では中性エンドペプチダーゼの一般的な人工基質を用いているので、実際にどの酵素に作用したものか不明である。ＥＧＣｇにアルキル鎖を付加し脂溶性（疎水性）を高め、生体内利用率（腸管での吸収効率や脳内移行性）を高めた誘導体が報告されている（特許文献１、非特許文献１０）。イチョウ葉等に含まれるポリフェノールであるアメントフラボンにはＡβ凝集抑制や細胞死保護効果が報告されている（非特許文献１１、１２）。多くの植物に含まれるポリフェノールであるアピゲニンにもＡβ凝集抑制効果が報告されている（非特許文献１３、１４）。イチゴ等に含まれるケンプフェロールにもＡβ産生抑制、Ａβ凝集抑制、細胞死保護効果が知られている。
しかしながら、いずれのポリフェノールについてもネプリライシンとの関係を示す論文はなく、また、該ポリフェノールを誘導体化することによってより優れた抗ＡＤ効果が得られることは記載も示唆もされていない。【００１１】
アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）を代謝する酵素としてα、β及びγセクレターゼが知られている。β及びγセクレターゼによってＡβが産生され、一方で、αセクレターゼはＡβの内部でＡＰＰを切断する。ＡＰＰがαセクレターゼで代謝されるとＡβが産生されないことから、αセクレターゼ活性の増強に着目したＡＤ治療薬もまた期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−１００５４０号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Iwata N et al., Nat Med. 2000 6(7):718-719.
【非特許文献２】Iwata N et al., Science. 2001 292(5521):1550-1552.
【非特許文献３】Mandel SA et al., CNS Neurosci Ther. 2008 14(4):352-365.
【非特許文献４】Kim J et al., J Neurochem. 2010 112(6):1415-1430.
【非特許文献５】Mecocci P et al., Front Pharmacol. 2014 5:147.
【非特許文献６】Kiss A et al., Pharmazie. 2006 61:66-69.
【非特許文献７】Melzig MF, JankaM, Phytomedicine. 2003 10:494-498.
【非特許文献８】Melzig MF, Escher F, Pharmazie. 2002 57:556-558.
【非特許文献９】Ayoub S, MelzigMF, J Pharm Pharmacol. 2006 58:495-501.
【非特許文献１０】Fudouji R et al., J Agric Food Chem. 2009 57(14):6417-6424.
【非特許文献１１】Thapa A, et al., Biochemistry. 2011 50(13):2445-2455.
【非特許文献１２】Kang SS, et al., Bioorg Med Chem Lett. 2005 15(15):3588-3591.
【非特許文献１３】Zhao L, et al., Molecules. 2013 18(8):9949-9965.
【非特許文献１４】Gauci AJ, et al., J Alzheimers Dis. 2011 27(4):767-779.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、新規な作用機序を有する、副作用が低減された、ＡＤの予防及び／又は治療用薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題に鑑み、ネプリライシン活性を増強する低分子化合物の探索を鋭意行ってきた結果、元来水溶性であるポリフェノールに対して脂溶性を高めることでネプリライシン活性を強力に増強する化合物を得ることに成功した。さらに該ポリフェノール誘導体はαセクレターゼ活性を増強する作用をも有する。これらの作用によってＡβの脳内蓄積を減らすことが可能となり、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下に示す通りである。
［１］ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤。
［１−１］ポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病の予防及び／又は治療方法。
［１−２］アルツハイマー病の予防及び／又は治療における使用の為のポリフェノール誘導体。
［２］ポリフェノール誘導体が、脂溶性ポリフェノール誘導体である、上記［１］記載の薬剤；上記［１−１］記載の方法；又は上記［１−２］記載の誘導体。
［３］脂溶性ポリフェノール誘導体が、脂溶性カテキン誘導体である、上記［２］記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［４］脂溶性カテキン誘導体が、式（Ｉ）で表される(−)−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、上記［３］記載の薬剤；方法；又は誘導体。【００１６】
【化２】
2016072522.tif 000003
【００１７】
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１+ｎ２+ｎ３+ｎ４は２以上である。）
［５］脂溶性カテキン誘導体が、式（ＩＩ）で表される(−)−エピガロカテキン誘導体又は(−)−エピカテキン誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、上記［３］記載の薬剤；方法；又は誘導体。【００１８】
【化３】
2016072522.tif 000004
【００１９】
（式中、ｍ１はＡ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｍ２はＢ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｍ３はＣ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜２の整数であり；ｍ１+ｍ２+ｍ３は２以上である。）
［６］脂溶性基が、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される、上記［４］又は［５］に記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［７］脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、上記［４］又は［５］に記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［８］脂溶性基がＡ環又はＡ’環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［９］脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１０］Ｃ環又はＣ’環の４位にカルボニル基が存在する、上記［４］〜［９］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１１］脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、上記［２］記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１２］ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、上記［１］記載の薬剤；上記［１−１］記載の方法；又は上記［１−２］記載の誘導体。【００２０】
【化４】
2016072522.tif 000005
【００２１】
【化５】
2016072522.tif 000006
【００２２】
［１３］ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、上記［１］記載の薬剤；上記［１−１］記載の方法；又は上記［１−２］記載の誘導体。【００２３】
【化６】
2016072522.tif 000007
【００２４】
［１４］ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)下記式【００２５】
【化７】
2016072522.tif 000008
【００２６】
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、上記［１］記載の薬剤；上記［１−１］記載の方法；又は上記［１−２］記載の誘導体。
［１５］ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、上記［１］記載の薬剤；上記［１−１］記載の方法；又は上記［１−２］記載の誘導体。
［１６］ネプリライシン活性を増強することを特徴とする、上記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［１５］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１７］ネプリライシン活性の増強が、ネプリライシンの細胞表面への顕在化を促進することによるものである、上記［１６］記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１８］αセクレターゼ活性を増強することを特徴とする、上記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［１７］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［１９］βセクレターゼ活性を阻害することを特徴とする、上記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［１８］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［２０］該ポリフェノール誘導体が、ネプリライシン活性を増強する効果、αセクレターゼ活性を増強する効果及びβセクレターゼ活性を阻害する効果からなる群より選択される少なくとも１種の効果を有することを特徴とする、上記［１］、［１−１］、［１−２］、［２］〜［１５］のいずれかに記載の薬剤；方法；又は誘導体。
［２１］ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強剤。
［２１−１］ポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性を増強する方法。
［２１−２］ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強における使用の為のポリフェノール誘導体。
［２２］βセクレターゼ活性を阻害する効果を有する、上記［２１］記載の剤。
［２２−１］ポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性を増強し、且つβセクレターゼ活性を阻害する方法。
［２２−２］ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強、並びにβセクレターゼ活性の阻害における使用の為のポリフェノール誘導体。
［２３］ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、βセクレターゼ活性の阻害剤。
［２３−１］ポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、βセクレターゼ活性を阻害する方法。
［２３−２］βセクレターゼ活性の阻害における使用の為のポリフェノール誘導体。
［２４］αセクレターゼ活性を増強する効果及び／又はβセクレターゼ活性を阻害する効果を有する、上記［２３］記載の剤。
［２５］ポリフェノール誘導体が、脂溶性ポリフェノール誘導体である、上記［２１］、［２１−１］、［２１−２］、［２２］、［２２−１］、［２２−２］、［２３］、［２３−１］、［２３−２］及び［２４］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
［２６］脂溶性ポリフェノール誘導体が、脂溶性カテキン誘導体である、上記［２５］記載の剤；方法；又は誘導体。
［２７］脂溶性カテキン誘導体が、式（Ｉ）で表される(−)−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、上記［２６］記載の剤；方法；又は誘導体。【００２７】
【化８】
2016072522.tif 000009
【００２８】
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１+ｎ２+ｎ３+ｎ４は２以上である。）
［２８］脂溶性カテキン誘導体が、式（ＩＩ）で表される(−)−エピガロカテキン誘導体又は(−)−エピカテキン誘導体に脂溶性基が導入された化合物である、上記［２６］記載の剤；方法；又は誘導体。【００２９】
【化９】
2016072522.tif 000010
【００３０】
（式中、ｍ１はＡ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｍ２はＢ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｍ３はＣ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜２の整数であり；ｍ１+ｍ２+ｍ３は２以上である。）
［２９］脂溶性基が、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される、上記［２７］又は［２８］に記載の剤；方法；又は誘導体。
［３０］脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、上記［２７］又は［２８］に記載の剤；方法；又は誘導体。
［３１］脂溶性基がＡ環又はＡ’環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、上記［２７］〜［３０］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
［３２］脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、上記［２７］〜［３０］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
［３３］Ｃ環又はＣ’環の４位にカルボニル基が存在する、上記［２７］〜［３２］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
［３４］脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として(−)−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、上記［２５］記載の剤；方法；又は誘導体。
［３５］ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、上記［２１］、［２１−１］、［２１−２］、［２２］、［２２−１］、［２２−２］、［２３］、［２３−１］、［２３−２］及び［２４］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。【００３１】
【化１０】
2016072522.tif 000011
【００３２】
【化１１】
2016072522.tif 000012
【００３３】
［３６］ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、上記［２１］、［２１−１］、［２１−２］、［２２］、［２２−１］、［２２−２］、［２３］、［２３−１］、［２３−２］及び［２４］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。【００３４】
【化１２】
2016072522.tif 000013
【００３５】
［３７］ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)下記式【００３６】
【化１３】
2016072522.tif 000014
【００３７】
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、上記［２１］、［２１−１］、［２１−２］、［２２］、［２２−１］、［２２−２］、［２３］、［２３−１］、［２３−２］及び［２４］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
［３８］ポリフェノール誘導体が、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、上記［２１］、［２１−１］、［２１−２］、［２２］、［２２−１］、［２２−２］、［２３］、［２３−１］、［２３−２］及び［２４］のいずれかに記載の剤；方法；又は誘導体。
【発明の効果】
【００３８】
Ａβの分解系に着目して得られた本発明は、ＡＤの根本的治療薬又は予防薬として使用できる。本発明はポリフェノール骨格を有し、今までの蓄積された研究成果を利用することができ、より安全且つ効果的な薬剤の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明のポリフェノール誘導体のネプリライシン活性増強作用を示したグラフである。ポリフェノール誘導体を添加していない場合のネプリライシン活性を１として評価した。各誘導体は、それぞれ１又は１０μＭの濃度で用いた。
【図２】本発明のポリフェノール誘導体のネプリライシン、αセクレターゼ、βセクレターゼ発現量及びＡＰＰ発現量に及ぼす影響を示した図である。上図はネプリライシンあるいは各ＡＰＰに対する特異抗体、あるいはＡＤＡＭ１０及びＢＡＣＥ１に対する特異抗体を用いて検出したウエスタンブロット像を示し、下図はそれを数値化したグラフである。ポリフェノール誘導体を添加していない場合（Control）の発現量を１とした。標準化の為にβ−ａｃｔｉｎの発現量も測定した。
【図３】本発明のポリフェノール誘導体のネプリライシン、αセクレターゼ、βセクレターゼのｍＲＮＡレベルでの発現量に及ぼす影響を示した図である。ネプリライシンｍＲＮＡの検出にはＭＭＥ遺伝子に対するプローブ及びプライマーセットを、αセクレターゼｍＲＮＡの検出にはＡＤＡＭ９、１０及び１７遺伝子に対するそれぞれのプローブ及びプライマーセットを、βセクレターゼｍＲＮＡの検出にはＢＡＣＥ１遺伝子に対するプローブ及びプライマーセットをそれぞれ用いて、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。ポリフェノール誘導体を添加していない場合（Control）の発現量を１とした。標準化の為にＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現量も測定した。
【図４】マウス初代培養細胞を用いたネプリライシンの活性染色の結果を示した図である。Ａ〜Ｃに、活性染色法により測定したネプリライシン活性の結果を示す。ポリフェノール誘導体を添加していない場合（DMSO）のシグナル強度を１とした。
【図５】各ポリフェノール誘導体についての、各要素の変動を模式的に示した図である。
【図６】βセクレターゼ阻害剤（ＢＳＩ）、γセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、本発明のポリフェノール誘導体（ＮＵＰ−１１）及びそれらの併用（Cocktail）によるＡＰＰｓα量、ＡＰＰｓβ量及びＡＰＰｓα／ＡＰＰｓβ（α／β）比に及ぼす影響を示した図である。試験化合物を添加していない場合（Control）の発現量を１とした。
【図７】βセクレターゼ阻害剤（ＢＳＩ）、γセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、本発明のポリフェノール誘導体（ＮＵＰ−１１）及びそれらの併用（Cocktail）によるアミロイドβの産生量（ｐＭ）に及ぼす影響を示した図である。
【図８】本発明のポリフェノール誘導体を直接海馬に注入した場合のネプリライシン活性に及ぼす影響を示した図である。ネプリライシン活性は、組織抽出液の一定蛋白量あたり１分間に基質を切断する量（nmol/mg protein/min）として表した。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明は、有効成分としてポリフェノール誘導体を用いる。
本発明における「ポリフェノール誘導体」とは、２個以上のフェノール性水酸基を持つ化合物及びその誘導体を意味し、ネプリライシン活性を増強させる効果、αセクレターゼ活性を増強させる効果及びβセクレターゼ活性を抑制する効果のいずれか１つ、好ましくは２つ、特に好ましくは３つを有していれば特に限定されない（以下、本発明のポリフェノール誘導体とも称する）。
【００４１】
ネプリライシンやαセクレターゼあるいはβセクレターゼの活性の測定は、ネプリライシンやαセクレターゼあるいはβセクレターゼをコードする遺伝子の発現量もしくは該遺伝子から翻訳された蛋白質を指標にすることができる。遺伝子の発現量はＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロット法等により、該遺伝子から翻訳された蛋白質量はＥＬＩＳＡやウエスタンブロット法等により測定することができる。あるいは酵素活性を直接測定することもできる。酵素活性は、一定時間内に分解される基質の量で提示することができる。
【００４２】
ネプリライシンの場合、その活性は、例えば、特開２００２−３４５９６号公報、特開２００４−１５１０７９号公報に記載の方法に従っても測定することができる。ネプリライシンの基質と薬剤未処置または薬剤処置した細胞（Ｈ４細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞などの株化培養細胞、ｉＰＳ細胞から分化誘導した神経細胞、マウスやラットなどの動物から調製した初代培養神経細胞など）や組織（マウスやラットなどの動物から調製した脳組織など）、前記細胞や組織の溶解液、または該細胞溶解液から精製したネプリライシン等を反応させ、試料中のネプリライシンが基質を切断する量（基質の分解量）によって評価される。基質としては、例えばＡβ、エンケファリン、サブスタンスＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、エンドセリン等に加え、ベンジルオキシカルボニル−アラニル−アラニル−ロイシル−パラニトロアニリド、ベンジルオキシカルボニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−パラニトロアニリド、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−ロイシル−パラニトロアニリド、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−フェニルアラニル−パラニトロアニリド、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−４−メトキシ−２−ナフチルアミド、グルタリル−アラニル−アラニル−フェニルアラニル−２−ナフチルアミド、サクシニル−アラニル−アラニル−フェニルアラニン−４−メチルクマリン−７−アミド、Ｍｃａ−ＲＰＰＧＦＳＡＦＫ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）−Ｄｎｐ−ＯＨ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．；配列番号１）や５−ＦＡＭ／ＱＸＬｔｍ５２０（ＡｎａＳｐｅｃ，  Ｉｎｃ．）等の合成基質が挙げられるが、これらに限定されない。反応条件は、使用する基質に応じて当業者が適宜選択できる。例えば、基質の濃度は、用いる基質により異なるが、０．１〜１０００μｇ／ｍｌとして反応を行えばよい。基質の濃度は反応系において、１〜１００μｇ／ｍｌであることが好ましく、３〜３０μｇ／ｍｌであるのが更に好ましい。反応温度は、２０℃〜４５℃が好ましく、２０℃〜４０℃が更に好ましい。反応時間は使用する基質および濃度等の反応系の条件により異なるが、例えば、５分〜２４時間の間で適宜選択すればよく、迅速性という点からは、５分〜６０分という短時間で測定できるような反応系を設定することが好ましい。反応は中性のｐＨ、すなわちｐＨ６〜９で行うことが好ましく、ｐＨ７〜８で行うことが更に好ましい。
【００４３】
基質の分解量の測定は、分解して得られる化合物の濃度を測定することであってもよい。方法は特に限定されないが、分解して得られた化合物の吸光度が増加する、分解して得られた化合物が蛍光を発する、もしくは分解して得られた化合物と試薬が反応して蛍光又は化学発光を発する場合、その蛍光強度又は化学発光強度を測定することで分解された量を測定することができる。他の態様として、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分析等により分析することもできるし、分解産物のペプチド断片や化学構造を特異的に認識する抗体を用いたイムノアッセイによっても分析できる。このとき、阻害剤（例えば、チオルファン）を加えた測定値により分解量を補正することが好ましい。ネプリライシンの活性は、単位細胞量あたりまたは総タンパク質あたりの基質の分解量としてもよい（Iwata, N., et al., J. Neurosci. 24(4):991-998, 2004; Ogawa, T., et al., J. Neurochem. 95(4):1156-1166, 2005）。
【００４４】
タンパク質レベルでのネプリライシンの発現量を測定する方法としては、前記細胞や組織の溶解液、または該細胞溶解液から精製したネプリライシン等を試料として、ネプリライシンに特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により解析できる。また、上記細胞や組織を固定した後、ネプリライシンに特異的な抗体を用いて、細胞、組織の免疫染色によっても解析できる（Fukami, S.,et al., Neurosci. Res. 43(1):39-56, 2002）。ｍRNAレベルでのネプリライシンの発現量を測定する方法としては、前記細胞や組織の溶解液を試料として、ネプリライシンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法により解析できる（Ogawa, T., et al., J. Neurochem. 95(4):1156-1166, 2005）。また、上記細胞や組織とネプリライシンに特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションし、オートラジオグラフィーや免疫組織化学的手法によっても解析できる。
【００４５】
αセクレターゼの場合、その活性は、例えば、既報（Lopez-Perez E., et al., J Neurochem, 2001）に従っても測定することができる。薬剤未処置または薬剤処置した細胞（Ｈ４細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞などの株化培養細胞、iPS細胞から分化誘導した神経細胞、マウスやラットなどの動物から調製した初代培養神経細胞など）や組織（マウスやラットなどの動物から調製した脳組織など）からαセクレターゼによって切断され、培養上清中または１０５，０００×ｇ上清に分泌されるＡＰＰの代謝物ＡＰＰｓα量をＡＰＰｓαのアミノ末端配列に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法(Yahata, N., et al., PLoS One. 6(9):e25788. 2011)やＥＬＩＳＡ法(Human sAPPα (highly sensitive) Assay Kit - IBL等, タカラバイオ)で定量することで評価される。または既報（Obregon D.F., et al., J Biol Chem, 2006）に従っても測定することができる。メタロプロテアーゼ以外の各プロテアーゼに対する阻害剤を含む細胞懸濁液とαセクレターゼ切断部位を模倣した蛍光人工基質ＭＣＡ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｄｎｐ−ＯＨ（配列番号２）やＡＰＰ、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２などのαセクレターゼの内在性基質のリコンビナント標品を反応させて基質を切断する量（基質の分解量）によっても評価される。基質の分解量の測定は、分解して得られる化合物の濃度を測定することであってもよい。方法は特に限定されないが、分解して得られた化合物の吸光度が増加する、分解して得られた化合物が蛍光を発する、もしくは分解して得られた化合物と試薬が反応して蛍光又は化学発光を発する場合、その蛍光強度又は化学発光強度を測定することで分解された量を測定することができる。他の態様として、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分析等により分析することもできるし、分解産物のペプチド断片や化学構造を特異的に認識する抗体を用いたイムノアッセイによっても分析できる。このとき、阻害剤（例えば、ＴＡＰＩ−１[ＴＮＦ−α  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１]またはＴＡＰＩ−２[ＴＮＦ−α  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−２]）を加えた測定値により分解量を補正することが好ましい。αセクレターゼの活性は、単位細胞量あたりまたは総タンパク質あたりの基質の分解量としてもよい（Iwata, N., et al., J. Neurosci. 24(4):991-998, 2004; Ogawa, T., et al., J. Neurochem. 95(4):1156-1166, 2005）。
【００４６】
タンパク質レベルでのαセクレターゼの発現量を測定する方法としては、前記細胞や組織の溶解液、または該細胞溶解液から精製したαセクレターゼ等を試料として、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法により解析できる（Yahata, N., et al., PLoS One. 6(9):e25788. 2011）。また、上記細胞や組織を固定した後、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７に特異的な抗体を用いて、細胞、組織の免疫染色によっても解析できる。ｍＲＮＡレベルでのαセクレターゼの発現量を測定する方法としては、前記細胞や組織の溶解液を試料として、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてノーザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法により解析できる（Ogawa, T., et al., J. Neurochem. 95(4):1156-1166, 2005）。また、上記細胞や組織とＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７に特異的な標識オリゴヌクレオチドプローブをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションし、オートラジオグラフィーや免疫組織化学的手法によっても解析できる。
【００４７】
βセクレターゼの場合も、αセクレターゼの場合と同様にして、βセクレターゼ切断部位を模倣した蛍光人工基質を用いてβセクレターゼ活性を測定することができ、また、ＢＡＣＥ１に特異的な抗体等のβセクレターゼに特異的な抗体を用いてタンパク質レベルでのβセクレターゼの発現量を測定することができる。
【００４８】
本発明のポリフェノール誘導体は、脂溶性が高められたもの、即ち脂溶性ポリフェノール誘導体であることが好ましい。より好ましくは脂溶性カテキン誘導体である。
【００４９】
脂溶性の程度は、ｌｏｇＰ(partition coefficient)等の分配係数によって数値化することができる。分配係数は、測定条件によって異なるが、例えば対照として（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）を用いた場合、本発明の脂溶性ポリフェノール誘導体のｌｏｇＰはＥＧＣｇのｌｏｇＰの１．８倍以上であることが好ましい。
【００５０】
一般に有機化合物における脂溶性の向上は、脂溶性基を該化合物に導入することによって行われる。「脂溶性基」とは脂質との親和性が強く、水との相互作用が小さい極性が低い置換基を意味し、例えば、鎖状炭化水素基（例、アルキル基等の鎖状飽和炭化水素基、アルケニル基等の鎖状不飽和炭化水素基）、環式炭化水素基（例、シクロアルキル基等の環式飽和炭化水素基、シクロアルケニル基等の環式不飽和炭化水素基）、芳香族炭化水素基（例、アリール基等）、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、及びそれらの２種以上が結合した基等が挙げられる。これらの基はそれぞれ置換基を有していてもよく、当該置換基が結合して環を構成することもできる。
【００５１】
「アルキル基」としては、直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられ、例えば、Ｃ３−３０アルキル基（例、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、１−メチルプロピル、ペンチル、イソペンチル、１，２−ジメチルプロピル、ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、１，２−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、ヘプチル、３−メチルヘキシル、オクチル、１−イソプロピル−３−メチルブチル、３−メチル−１−（１−メチルエチル）ブチル、２−エチルヘキシル、デシルおよび４−プロピルペンチル、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサニル等）が挙げられる。
【００５２】
「アルケニル基」としては、直鎖状もしくは分岐鎖状であって、前記した炭素数２以上のアルキル基に１個以上の二重結合などの不飽和基を有するものが挙げられ、具体的には、Ｃ３−３０アルケニル基（例、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、１−ヘキセニル、２，６−ジメチル−ヘプタ−１，５−ジエン−１−イル、３−フェニルプロペニル、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロペニル、ゲラニル−ゲラニル、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセニル、スクアレニル等）が挙げられる。
さらに当該基は、天然に存在する二重結合を有する鎖状不飽和炭化水素（例、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、テスタテルペン、トリテルペン等）の任意の水素原子を除去して誘導される基であってもよい。
【００５３】
「シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル（すなわち、Ｃ３−６シクロアルキル）、シクロへプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルなどのＣ３−３０シクロアルキル基が挙げられる。またこれらに加えて、ステロイドなどの天然のシクロアルカン化合物の任意の水素原子を除去して誘導される基であってもよい。
【００５４】
「シクロアルケニル基」としては、前記したシクロアルキル基に１個以上の二重結合などの不飽和基を有するものが挙げられ、具体的には、シクロプロペニル、シクロブチリル、シクロペンチニル、シクロヘキシニル、シクロへプチニル、シクロオクチニル、ビシクロ［２．２．２］オクチニルなどのＣ３−３０シクロアルケニル基が挙げられる。
またこれらに加えて、コレステリル、オレアノイル基といった天然のシクロアルケニル化合物の任意の水素原子を除去して誘導される基であってもよい。
【００５５】
「アリール基」としては、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
【００５６】
「脂溶性ビタミン残基」としては、脂溶性ビタミン由来の残基の他、脂溶性ビタミン中の官能基である水酸基、アルデヒド、カルボン酸を他の反応性官能基に適宜変換した誘導体由来の残基を用いることができる。脂溶性ビタミンとしては、レチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。
【００５７】
「ステロール残基」としては、例えばコレステリル基（コレステロール残基）、コレスタリル基（コレスタノール残基）、スチグマステリル基（スチグマステロール残基）、β−シトステリル基（β−シトステロール残基）、ラノステリル基（ラノステロール残基）、及びエルゴステリル基（エルゴステロール残基）等が挙げられる。
【００５８】
脂溶性基の導入は、通常当分野で用いられている方法及びそれに準じた方法によって行うことができる。例えばポリフェノールとしてカテキンやプロアントシアニジンを用いた場合、脂溶性基の導入は特許文献１に記載の方法によって実施することができる。
【００５９】
カテキンは緑茶の主成分であり、抗酸化作用、コレステロール低下作用、抗菌作用などを有するとされ、健康維持に好影響を与えることが一般的によく知られている。本発明における「カテキン」とは、公知のカテキン類（例、茶カテキン等）全てを含む。該カテキンは自体公知の方法で誘導体化されていてもよい。ここで「誘導体化」とは、例えば、メチル化、エステル化、アセトン付加、酸化的二量体化等、公知のカテキンを化学修飾することを通じて、その機能を改善することをいう。
【００６０】
特に、茶の渋み成分である茶カテキンとしては、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート等が挙げられる。また、酸化的二量体化されたカテキンとしては、紅茶のテアシネンシン類やテアフラビン類が挙げられる。
【００６１】
また、「プロアントシアニジン」とは、カテキン類がＣ−４位とＣ−８位との間で炭素−炭素結合した構造を持つ二量体〜重合体すべてを含む。さらに本発明におけるプロアントシアニジンは、上記のプロアントシアニジンが自体公知の方法で誘導体化されたものであってもよい。ここで「誘導体化」とは、例えば、メチル化、エステル化等、公知のプロアントシアニジンを化学修飾することを通じて、その機能を改善することをいう。
特に食品に含まれるプロアントシアニジンとしては、プロシアニジンＢ−１、プロシアニジンＢ−２、プロシアニジンＢ−３、プロシアニジンＢ−４、プロシアニジンＣ−１、プロデルフィニジンＢ−１、プロデルフィニジンＢ−２等が挙げられる。
【００６２】
本発明の脂溶性カテキン誘導体の好ましい一実施態様は、式（Ｉ）で表される（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に脂溶性基が導入された化合物（以下、式（Ｉ）化合物とも称する）である。
【００６３】
【化１４】
2016072522.tif 000015
【００６４】
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１+ｎ２+ｎ３+ｎ４は２以上である。）
ここで、ｎ１は好ましくは０〜２であり、より好ましくは２であり、いっそう好ましくはＡ環の５位と７位に水酸基が結合している。ｎ２は好ましくは０〜３であり、より好ましくは３であり、いっそう好ましくはＧ環の３”位、４”位及び５”位に水酸基が結合している。ｎ３は好ましくは０〜３であり、より好ましくは３であり、いっそう好ましくはＢ環の３’位、４’位及び５’位に水酸基が結合している。ｎ４は０であることが好ましい。
【００６５】
本発明の脂溶性カテキン誘導体の別の好ましい一実施態様は、式（ＩＩ）で表される(−)−エピガロカテキン誘導体又は(−)−エピカテキン誘導体に脂溶性基が導入された化合物（以下、式（ＩＩ）化合物とも称する）である。
【００６６】
【化１５】
2016072522.tif 000016
【００６７】
（式中、ｍ１はＡ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｍ２はＢ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｍ３はＣ’環に結合する水酸基の数を示し、０〜２の整数であり；ｍ１+ｍ２+ｍ３は２以上である。）
ここで、ｍ１は好ましくは０〜２であり、より好ましくは２であり、いっそう好ましくはＡ’環の５位と７位に水酸基が結合している。ｍ２は好ましくは０〜３であり、より好ましくは３であり、いっそう好ましくはＢ’環の３’位、４’位及び５’位に水酸基が結合している。ｍ３は０であることが好ましい。
【００６８】
式（Ｉ）化合物及び式（ＩＩ）化合物に導入される脂溶性基としては上述のものが挙げられるが、好ましくは置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基であり、より好ましくは、それぞれ置換基を有していてもよい、アルキル基及びアルケニル基である。導入される脂溶性基が複数ある場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００６９】
脂溶性基が有していてもよい置換基としては、水酸基で置換されていてもよい低級アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ１−６アルキル基）、カルボキシル基等が挙げられるがこれらに限定されない。脂溶性基及び／又は脂溶性基上の置換基と各環上の水酸基が一緒になって環を形成してもよい。
【００７０】
式（Ｉ）化合物において、脂溶性基は、Ａ環、Ｃ環、Ｂ環及びＧ環からなる群の１以上に導入され得、Ｃ−Ｃ結合で直接導入されても、別の結合を介して導入されてもよい。好ましくはＡ環にＣ−Ｃ結合で直接導入される。また脂溶性基の導入にはＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合が使用されないことが好ましい。
式（ＩＩ）化合物において、脂溶性基は、Ａ’環、Ｃ’環及びＢ’環からなる群の１以上に導入され得、Ｃ−Ｃ結合で直接導入されても、別の結合を介して導入されてもよい。好ましくはＡ’環にＣ−Ｃ結合で直接導入される。また脂溶性基の導入にはＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合が使用されないことが好ましい。
【００７１】
式（Ｉ）化合物及び式（ＩＩ）化合物において、Ｃ環又はＣ’環の４位にカルボニル基が存在する化合物もまた、本発明の脂溶性ポリフェノール誘導体として好ましい。
【００７２】
式（Ｉ）化合物中、Ａ環、Ｃ環、Ｂ環及びＧ環は、水酸基及び脂溶性基以外に置換基を有していてもよい。式（ＩＩ）化合物中、Ａ’環、Ｃ’環及びＢ’環は、水酸基及び脂溶性基以外に置換基を有していてもよい。各環が有していてもよい置換基としては、オキソ基等が挙げられるがこれに限定されない。
【００７３】
本発明のポリフェノール誘導体として好ましい化合物の具体例は以下の通りである。
【００７４】
【化１６】
2016072522.tif 000017
【００７５】
【化１７】
2016072522.tif 000018
【００７６】
なかでも、
【００７７】
【化１８】
2016072522.tif 000019
【００７８】
が好ましい。
【００７９】
本発明のポリフェノール誘導体の一例として、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)下記式
【００８０】
【化１９】
2016072522.tif 000020
【００８１】
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体が挙げられる。
ここで「炭化水素基」としては、鎖状飽和炭化水素基（例、アルキル基等）、鎖状不飽和炭化水素基（例、アルケニル基等）、環式飽和炭化水素基（例、シクロアルキル基等）、環式不飽和炭化水素基（例、シクロアルケニル基等）、芳香族炭化水素基（例、アリール基等）等が挙げられ、上記「脂溶性基」として例示した各基と同義である。
当該化合物は、具体的には、特許文献１に記載の方法によって製造することができる。
【００８２】
本発明のポリフェノール誘導体の一例として、(i)カテキン又はプロアントシアニジンと、(ii)２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オン、ペリルアルデヒド、又はアクロレインとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体が挙げられる。
当該化合物は、具体的には、特許文献１に記載の方法によって製造することができる。
【００８３】
当該化合物は、(i)と(ii)を結合させた生成物にさらに(ii)を結合させて製造することもできる。例えばカテキンとアクロレインを結合させて得られる物質にさらにアルコール類、アミン類、カルボン酸類、チオール類などを結合させることで製造することもできる（実施例参照）。
【００８４】
本発明のポリフェノール誘導体は塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例：塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例：酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸）との塩等が用いられる。
【００８５】
本発明のポリフェノール誘導体に、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体等の異性体を有する場合には、いずれか一方の異性体も、異性体の混合物も用いることができる。また、本発明のポリフェノール誘導体に、互変異性体等の構造異性体及び幾何異性体が存在する場合には、いずれの異性体も用いることができる。
【００８６】
本発明のポリフェノール誘導体は、同位元素（例、３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，１２５Ｉ等）等で標識されていてもよい。
【００８７】
本発明のポリフェノール誘導体は、ネプリライシン活性を増強させる効果及び／又はαセクレターゼ活性を増強させる効果、及び／又はβセクレターゼ活性を阻害する効果を有する為、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強剤、あるいはβセクレターゼ活性の阻害剤（以下、それぞれ本発明の増強剤、あるいは本発明の阻害剤とも称し、併せて本発明の剤とも称する）として有用である。また、該作用により本発明のポリフェノール誘導体はＡＤの予防及び／又は治療用薬剤（以下、本発明の薬剤とも称する）として有用である。本発明のポリフェノール誘導体、それを有効成分として含む剤及び薬剤を総称して本発明の医薬とも称する。本発明の剤は、ＡＤの予防及び／又は治療用薬剤としての用途に加え、ＡＤの発症機序の解明や新規な抗ＡＤ薬の開発に繋がるツールとなり得る。
さらに本発明は、本発明のポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病の予防及び／又は治療方法を提供することができる。
さらに本発明は、本発明のポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性を増強する方法を提供することができる。当該方法は、βセクレターゼ活性の阻害を伴っていてもよく、伴っていることが好ましい。
さらに本発明は、本発明のポリフェノール誘導体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、βセクレターゼ活性を阻害する方法を提供することができる。当該方法は、ネプリライシン活性及び／又はαセクレターゼ活性の増強を伴っていてもよく、伴っていることが好ましい。
また、本発明のポリフェノール誘導体は、ネプリライシン活性増強作用を有するので、ＡＤのみならず他のアミロイド病態を示す疾患やネプリライシンの基質ペプチドが関与する末梢組織の悪性腫瘍やがんにも適用できる。
【００８８】
本発明の医薬は有効成分がポリフェノール誘導体であることからその低毒性が期待できる。液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例：マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、サル、トリ等）に対して経口的または非経口的（例：血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。
【００８９】
本発明のポリフェノール誘導体は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。さらに、本発明のポリフェノール誘導体は、上記した個々のポリフェノール誘導体を所望により２種以上含む混合物の形態であってもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のポリフェノール誘導体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００９０】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、髄腔内注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の改善剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例：ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ポリフェノール誘導体を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
また、本発明のポリフェノール誘導体は、外科的手術等により脳内に直接投与することもできる。
【００９１】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００９２】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、有効成分であるポリフェノール誘導体の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。
【００９３】
本発明の医薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人のＡＤ治療・予防のために使用する場合には、本発明の医薬を１日量として、通常１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは１５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、経口投与するのが好都合である。他の投与経路の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００９４】
なお、前記した各組成物は、本発明のポリフェノール誘導体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００９５】
また、前記した各組成物は、本発明のポリフェノール誘導体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、該ポリフェノール誘導体以外の、ＡＤの予防及び／又は治療に有効な他の化合物を併用することができる（以下、併用化合物とも称する）。併用化合物としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン）やグルタミン酸のＮＭＤＡ受容体拮抗薬（メマンチン）等の既に日本で販売、認可されている薬剤に加え、近年研究が進められている、アミロイドワクチン、αセクレターゼ活性増強剤、βセクレターゼ阻害剤、γセクレターゼ阻害剤、γセクレターゼ調節剤等が挙げられる。
αセクレターゼ活性増強剤としては、特に限定されるものではないが、例えばレチノイド等が挙げられる。
βセクレターゼ阻害剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、β-secretase inhibitor IV、ＶＴＰ−３７９４８、Ｅ２６０９、ＪＮＪ−５４８６１９１１、ＬＹ３３１４８１４、サリドマイド、ＭＫ−８９３１等が挙げられる。γセクレターゼ阻害剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、Compound E、ＡＣＰＣ（(S,S)-2-aminocyclopentanecarboxylic acid）、セマガセスタット等が挙げられる。
γセクレターゼ調節剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、ピニトール、ＥＶＰ−０９６２等が挙げられる。アミロイドワクチンは、抗体を直接投与する受動免疫ワクチン又はＡβペプチドをアジュバントとともに投与する能動免疫ワクチンの何れも可能である。
特にβやγセクレターゼ阻害剤は、副作用が強い為、本発明のポリフェノール誘導体と組み合わせることにより、使用濃度を低減することができ、副作用のリスクを分散させることができる。
【００９６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。特に示されない場合、用いる試薬等は商業的に入手可能である。
【実施例】
【００９７】
実施例１
（材料と方法）
１．ポリフェノール誘導体
試験化合物として以下のポリフェノール誘導体を調製し、所定の濃度で用いた。また、各化合物のオクタノールに対する分配係数は既報（Fudouji, Rら, J. Agric. Food Chem. 57(14):6417-6424, 2009）に準じる。【００９８】
【表１−１】
2016072522.tif 000021
【００９９】
【表１−２】
2016072522.tif 000022
【０１００】
【表１−３】
2016072522.tif 000023
【０１０１】
カテキンとアクロレイン（Ａｃｒ）を結合させて得られる物質にさらにアルコール類、アミン類、カルボン酸類、チオール類などを結合させることで得られるポリフェノール誘導体として例えばＮＵＰ−Ｅ１５−１（ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｍｏｎｏＣ１５）やＮＵＰ−Ｅ１５−２（ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｄｉＣ１５）が挙げられるが、当該化合物は以下のようにして製造することができる。【０１０２】
【化２０】
2016072522.tif 000024
【０１０３】
エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ；１ｍｍｏｌ）をアクロレイン（２ｍｌ）に溶かし、７０℃で１時間加熱した。反応液はそのままエタノールで膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）に付し、エタノール、エタノール−アセトン−水混液（８：１：１，６：２：２，０：１：１，ｖ／ｖ／ｖ）で順次溶出しアクロレイン結合体（ＥＧＣｇ−Ａｃｒ；０．７８ｍｍｏｌ，７８％）を得た。次にアクロレイン結合体（１１４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）と１５−ヒドロキシペンタデカン酸（０．２ｍｍｏｌ）とをトリフルオロ酢酸（５％）を含むアセトン（２ｍｌ）に溶かし、６０℃で７時間加熱した。反応生成物はシリカゲルカラム（２ｃｍ×１０ｃｍ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：０，９０：１０，８５：１５，８０：２０，７５：２５，７０：３０、ｖ／ｖ）で分離してモノ置換体（ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｍｏｎｏＣ１５；４６．８ｍｇ，０．０８２ｍｍｏｌ，２９％）とジ置換体（ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｄｉＣ１５；１８．５ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ，９％）を得た。【０１０４】
ＥＧＣｇ−Ａｃｒ
白色無晶形粉末
［α］Ｄ２９-146.8(c=0.10,MeOH)
FAB-MS m/z: 571[M+H]+
HR-FAB-MS m/z: 571.1450[M+H]+(C28H27O13 requires 571.1452)
UV λmaxMeOHnm(logε): 210(3.87),275(2.98)
IR νmax cm-1: 3374,2954,2856,1688,1613,1534,1453.
1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ: 5.05(1H,br s,H-2),5.54(1H,br s,H-3),2.84(1H,br d,H-4),3.00(m,H-4), 6.56(2H,br s,B-ring,H-2,6),7.00(2H,br s,galloyl-H-2,6).5.54(2H,m,Acr-1,1'),1.87(4H,m,Acr-2,2'),2.56,2.75(m,Acr-3,3').
13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ: 77.7(C-2),69.1(C-3),28.0(C-4),99.6(C-4a),151.2(C-5),103.3(C-6),151.2(C-7),102.6(C-8),149.7(C-8a),130.8(B-ring C-1),106.4(B-ring C-2,6),146.2(B-ring C-3,5),133.0(B-ring C-4),121.8(galloyl C-1),109.7(galloylC-2,6),145.8(galloyl C-3,5),138.7(galloylC-4),166.2(galloylC-7).92.9(Acr-C-1,1'),26.7(Acr-C-2,2'),15.9(Acr-C-3,3').【０１０５】
ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｍｏｎｏＣ１５
白色無晶形粉末
[α]D29-102.7(c=0.10,MeOH)
FAB-MS m/z: 849[M+K]+
HR-FAB-MS m/z: 849.3092[M+K]+ (C43H54O15K requires 849.3100)
UV λmaxMeOH nm(logε): 209(3.89),275(3.01)
IR νmax cm-1: 3250,2923,2851,1682,1615,1536,1455.
1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ: 5.06(H-2),5.20,5.28(H-3),2.96(H-4),6.66(brs,B-ring H-2,6),6.99(brs,galloyl-C-2,6),5.54(m,Acr-H-1,1'),1.90(m,Acr-H-2,2'),2.60(m,Acr-H-3,3'),1.2-1.6(m,CH2)3.55,3.88(CH2-O-).
13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ: 77.6(C-2),68.5-69.3(C-3),28.0(C-4),100.0(C-4a),151.2(C-5),103.0-103.7(C-6,8),151.2(C-7),149.5(C-8a),130.9(B-ring C-1),106.4(B-ring C-2,6),146.2(B-ring C-3,5),132.9(B-ring C-4),121.7(galloyl C-1),110.0(galloylC-2,6),145.8(galloyl C-3,5),138.8(galloylC-4),166.2(galloylC-7).92.8,97.9(Acr-C-1,1'),26.8(Acr-C-2,2'),15.9(Acr-C-3,3'),175.0(COOH),25.6,26.7,29.2,29.6,29.8,30.0,30.2,30.4,34.2(CH2),68.5-69.3(CH2O).【０１０６】
ＥＧＣｇ−Ａｃｒ−ｄｉＣ１５
白色無晶形粉末
[α]D28-86.6(c=0.10,MeOH)
FAB-MS m/z: 1089[M+K]+
HR-FAB-MS m/z: 1089.5195[M+K]+(C58H82O17Krequires 1089.5189)
UV λmaxMeOH nm(logε): 209(3.77),275(3.05)
IR νmax cm-1: 3330,2924,2852,1703,1615,1536,1459.
1H-NMR(400MHz,acetone-d6)δ:5.04,5.08(H-2),5.20,5.26(H-3),2.90-3.10(H-4),6.66(brs,B-ring H-2,6),6.98,7.01(galloyl-C-2,6),5.55(m,Acr-H-1,1’),1.90(m,Acr-H-2,2’),2.50-2.85(m,Acr-H-3,3’),1.2-1.6(m,CH2)3.50-3.85(CH2-O-).
13C-NMR(100MHz,acetone-d6)δ:77.6(C-2),68.2-69.3(C-3),26.8(C-4),100.1(C-4a),151.2(C-5),103.2-103.8(C-6,8),151.2(C-7),149.2(C-8a),130.9(B-ring C-1),106.4(B-ring C-2,6),146.3(B-ring C-3,5),133.0(B-ring C-4),121.7(galloyl C-1),110.0(galloylC-2,6),145.8(galloyl C-3,5),138.7(galloylC-4),166.2,166.3(galloylC-7).97.7,97.9,98.4(Acr-C-1,1’),26.8(Acr-C-2,2’),15.5(Acr-C-3,3’),174.8(COOH),25.6,26.7,30.4,34.2(CH2,overlapped with solvent signals),68.2-69.3(CH2O).【０１０７】
２．サンプル調製
６穴プレートにＡＰＰ−Ｈ４細胞を１２×１０４  ｃｅｌｌｓ／１．５ｍＬの密度で播種し、１０％ウシ胎児血清(fetal bovine serum, FBS; Equitech-Bio, Inc. [Kerrville, TX, USA])、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン(Nacalai Tesque, Inc.)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM; Nacalai Tesque, Inc.)中で培養した。２４時間培養後、培養上清を除去し、血清使用量低減培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ(Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA)１ｍＬに交換した。そこに試験対象となるポリフェノール誘導体を１μＬ添加し、さらに４８時間培養した。培養後、培養上清を全量１．５ｍＬチューブに回収し、死細胞を除くために４，０００×ｇ／４℃／１０ｍｉｎで遠心分離し、上清８００μＬを新しいチューブに移した。培養上清はサンプル調製まで−８０℃で保存した。細胞は氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline, PBS）で2回洗浄した。その後、セルスクレーパーを用いてプレートから細胞をかきとった。細胞を１．５ｍＬチューブに回収して４，０００×ｇ／４℃／１０ｍｉｎで遠心分離を行った後、上清を除き、サンプル調製まで−８０℃で保存した。凍結した細胞は氷上において１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、protease inhibitor cocktail CompleteTMEDTA-free(Roche)および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む４０μＬの可溶化バッファーで溶解した。細胞溶解物は氷上で６０分間インキュベートした後、４℃、２１，９００×ｇで３０分間遠心分離し上清を回収し、可溶化細胞抽出液とした。
細胞抽出液の総タンパク濃度は、BSAを標準液として用いてＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ(Takara)によって決定した。また、用いた試験化合物の最終濃度は１μＭ、１０μＭであり、それぞれの溶媒を対照として定量を行った。【０１０８】
３．ネプリライシン活性の測定
細胞抽出液に含まれるネプリライシン依存的中性エンドペプチダーゼ活性は、間接的共役酵素アッセイ法を用いて蛍光定量的に測定した。中性エンドペプチダーゼの基質として、succinyl-Ala-Ala-Phe-7-amino-4-methylcoumarin(suc-AAF-AMC)(I-1315; Bachem)を用いた。最終濃度が基質０．１ｍＭ  ｓｕｃ−ＡＡＦ−ＡＭＣ、細胞抽出液のタンパク質１〜６μｇ、１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）となるように、合計５０μＬの反応液を調製した。基質を加えた時点を反応開始として３７℃で１時間反応させ、中性エンドペプチダーゼによる基質からのＰｈｅ−ＡＭＣ切り出しを行った．その後、反応液に０．１ｍｇ(0.4 units equivalent)/mL leucine aminopeptidase(L-5006; Sigma-Aldrich)、および０．２ｍＭホスホラミドン(4082; Peptide Institute)を含む溶液２．５μＬを加えた。３７℃で３０分間反応させ、アミノペプチダーゼによるＰｈｅ−ＡＭＣからのＰｈｅ（フェニルアラニン）残基の切り出しを行った。microplate spectrometer Infinite M-1000(Tecan)を用いて、half-well size 96-well black plate(#3695; Corning)上で励起波長３９０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍを測定することで、遊離したＡＭＣの蛍光強度を測定した。ネプリライシン依存的中性エンドペプチダーゼ活性は，ネプリライシン特異的阻害剤である１０μＭチオルファン(T-6031;Sigma-Aldrich)による活性の低下に基づいて決定した。【０１０９】
４．ネプリライシン、αセクレターゼ及びβセクレターゼ発現量の測定
前記細胞抽出液は、6×SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)sample buffer(Nacalai Tesque,Inc.)と５：１の割合で混合して５分間煮沸し、ネプリライシン、αセクレターゼ及びβセクレターゼタンパク質の検出サンプルとした。
１８穴コームを用いて７．５％アクリルアミドゲルを作製した。電気泳動に使用したラピタス・ミニスラブ電気泳動槽はAtto Corporation(Tokyo,Japan)から、パワーサプライはGE Healthcare UK Ltd.(Buckinghamshire,England)から購入した。
調製したサンプルを２０μＬずつ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。濃縮ゲルと分離ゲルの境までは５０Ｖ定電圧、その後は電圧を１００Ｖに変更し、色素がガラス板から流れるまで泳動した。ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(GE Healthcare UK Ltd.)をメタノールに２０秒間浸し、トランスファーバッファーに３０分間以上浸してＰＶＤＦ膜を親水化した。電気泳動後、ゲルをトランスファーバッファーに浸して振盪することによってＳＤＳを除いた。親水化したＰＶＤＦ膜とゲルを、トランスファーバッファーをしみ込ませた濾紙にはさみ、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜にタンク方式(Bio-Rad Laboratories,Inc,Hercules,CA,USA)で転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をウォッシュバッファーで洗浄し、一次抗体の非特異的結合を防ぐためにブロッキングバッファーに浸して室温で１時間ブロッキング反応を行った。その後、一次抗体(anti-CD10 mouse IgG monoclonal antibody [clone 56C6, NCL-CD10-270, Leica Biosystems, Ltd]１μｇ／ｍＬ、またはanti-human neprilysin polyclonal antibody [AF1182, R&D systems., Inc.]１μｇ／ｍＬ；ＦＬ−ＡＰＰ，anti-C-terminal region of human APP rabbit polyclonal antibody (A8717, Sigma-Aldrich)１μｇ／ｍＬ；ＡＤＡＭ１０，anti-ADAM 10 antibody, C-terminus (AB19031, Merck Millipore)；ＢＡＣＥ１，anti-BACE (Ab-2)(485-501) polyclonal antibody (PC529, Calbiochem)；β−ａｃｔｉｎ，anti-β-actin mouse monoclonal antibody (clone AC15, A5441,Sigma-Aldrich)）と反応させて４℃で１６時間以上抗原抗体反応を行った。反応後のＰＶＤＦ膜をウォッシュバッファーで洗浄し、一次抗体に対応する二次抗体horseradish peroxidase conjugated anti-mouseまたはanti-rabbit IgG (1:10,000; GE Healthcare UK Ltd.)を室温で１時間反応させ、ECL Select Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare UK Ltd.)を用いて検出を行った。
バンドのシグナル強度はデンシトメーターＬＡＳ−４０００(GE Healthcare UK Ltd.)および画像解析ソフトScience Laboratory 2003 Image Gauge Version 4.23(Fujifilm Holdings Corporation,Tokyo,Japan)を用いて定量した。【０１１０】
５．α及びβセクレターゼ活性の測定
前記培養上清は−８０℃から解凍後、6×SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)sample buffer(Nacalai Tesque,Inc.)と５：１の割合で混合して５分間煮沸し、ウエスタンブロット解析におけるαセクレターゼによるＡＰＰの代謝産物であるＡＰＰｓα、およびβセクレターゼによるＡＰＰの代謝産物であるＡＰＰｓβの検出サンプルとした。
１８穴コームを用いて７．５％アクリルアミドゲルを作製した。電気泳動に使用したラピタス・ミニスラブ電気泳動槽はAtto Corporation(Tokyo,Japan)から、パワーサプライはGE Healthcare UK Ltd.(Buckinghamshire,England)から購入した。
調製したサンプルを２０μＬずつ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。濃縮ゲルと分離ゲルの境までは５０Ｖ定電圧、その後は電圧を１００Ｖに変更し、色素がガラス板から流れるまで泳動した。ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(GE Healthcare UK Ltd.)をメタノールに２０秒間浸し、トランスファーバッファーに３０分間以上浸してＰＶＤＦ膜を親水化した。電気泳動後、ゲルをトランスファーバッファーに浸して振盪することによってＳＤＳを除いた。親水化したＰＶＤＦ膜とゲルを、トランスファーバッファーをしみ込ませた濾紙にはさみ、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜にタンク方式(Bio-Rad Laboratories,Inc,Hercules,CA,USA)で転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をウォッシュバッファーで洗浄し、一次抗体の非特的結合を防ぐためにブロッキングバッファーに浸して室温で１時間ブロッキング反応を行った。その後、一次抗体(ＡＰＰｓα，anti-human APPsα mouse monoclonal antibody(2B3, Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.,Gunma,Japan)３μｇ／ｍＬ；ＡＰＰｓβ，anti-APPsβ rabbit polyclonal antibody,1μg/mL）と反応させて４℃で１６時間以上抗原抗体反応を行った。反応後のＰＶＤＦ膜をウォッシュバッファーで洗浄し、一次抗体に対応する二次抗体horseradish peroxidase conjugated anti-mouseまたはanti-rabbit IgG (1:10,000; GE Healthcare UK Ltd.)を室温で１時間反応させ、ECL Select Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare UK Ltd.)を用いて検出を行った。
バンドのシグナル強度はデンシトメーターＬＡＳ−４０００(GE Healthcare UK Ltd.)および画像解析ソフトScience Laboratory 2003 Image Gauge Version 4.23(Fujifilm Holdings Corporation,Tokyo,Japan)を用いて定量した。抗体（rabbit anti-APPsβ）作製には、ＡＰＰｓβのＣ末端側のアミノ酸配列とハプテン抗原の融合物をウサギに免疫し、精製したものを用いた（Yahata, N., et al., PLoS One. 6(9):e25788. 2011）。【０１１１】
６．ネプリライシン、αセクレターゼ及びβセクレターゼｍＲＮＡ発現量の測定
上記２．と同様にして試験対象となる各ポリフェノール誘導体で処理・培養した細胞からHigh Pure RNA Isolation kit (Roche 11828665001)でtotal RNAを調製し、PrimeScript RT-PCR kit (TaKaRa RR014A)により逆転写反応させリアルタイムPCRのサンプル（cDNA）を得た。
調製したサンプルとPremix Ex taq (Perfect Real Time) (TaKaRaRR039A)とプローブ、プライマーをチューブ（TaKaRa SC910A）で混合し、Smart Cycler II System機（TaKaRa）でリアルタイムPCR反応（初期変性：95℃ 30秒、PCR反応：95℃ 5秒、60℃ 20秒、40 times）を行った。
プローブ及びプライマーセットを下記表２に示す。プローブの５’末端は蛍光物質ＦＡＭ、３’末端はクエンチャー物質ＴＡＭＲＡでそれぞれ修飾されている。【０１１２】
【表２】
2016072522.tif 000025
【０１１３】
７．統計解析
すべての実験データの数値は平均値（mean）±標準偏差（standard deviation, S.D.）で表した。p値はSigma Plot（Systat Software, Inc., Chicago, IL, USA）を用いてone-way ANOVA後、Student-Newman-Keulstestによる多重比較解析により求め、p<0.05で有意とした。【０１１４】
（結果）
ＥＧＣｇによるネプリライシン活性増強作用はコントロールの約１．５倍であるのに対してNUP-18では約３．８倍、NUP-11では約３．５倍、NUP-19では約２．７倍、NUP-16では約１．８倍、NUP-E15-1では約２．４倍、NUP-E15-2では約１．５であった（図１）。また、ネプリライシンのタンパク質レベルでの発現量は、NUP-18、NUP-11、NUP-19、NUP-16で、コントロールに対してそれぞれ約３．８倍、約３．３倍、約３．２倍、約１．８倍に増加した（図２）。ネプリライシンのｍＲＮＡレベルでの発現量は、NUP-11、NUP-19、NUP-E15-1、NUP-E15-2で、コントロールに対してそれぞれ約４倍、約２．１倍、約２．８倍、約７．９倍に増加した（図３）。
また、ＥＧＣｇとは構造的に異なるポリフェノールである化合物Amentoflavone、Baicalein、Kaempferol、Apigenin、Chrysin及びHonokiolのネプリライシン活性増強作用を調べたところ、コントロールに対してそれぞれ約２倍、約１．７倍、約１．５倍、約１．５倍、約１．４倍、約１．３であった（図１）。Resveratrolのネプリライシン活性増強作用は、コントロールに対して約１．４倍であった。
また、NUP-16、NUP-18は、αセクレターゼの活性をコントロールに対してそれぞれ約１．７倍、約１．２倍増強した。NUP-18、NUP-11、NUP-19は、βセクレターゼの活性をコントロールに対してそれぞれ約４３％、約４１％、約３７％阻害した。また、細胞外に分泌されたＡＰＰｓα/ＡＰＰｓβ比は、NUP-18、NUP-11、NUP-16、NUP-19でコントロールに対してそれぞれ約２．１倍、約２．０倍、約1．6倍、約1．4倍に上昇した（図２）。
ｍＲＮＡレベルでは、NUP-E15-1はＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７の発現をそれぞれ約１．８倍、約１．３倍、約２．２倍増加した。ＡＤＡＭ１７については、NUP-11、NUP-19、NUP-16、NUP-E15-2でも、コントロールに対してそれぞれ約２．４倍、約１．３倍、約１．２倍、約３．７倍に増加した。
以上の結果より、NUP-16はネプリライシンおよびαセクレターゼの両方の活性を増強するダブルモジュレーター、NUP-11とNUP-19はネプリライシンを増強し、βセクレターゼを阻害するダブルモジュレーター、NUP-18、NUP-E15-1及びNUP-E15-2はネプリライシンおよびαセクレターゼの両方の活性を増強し、かつβセクレターゼを阻害するトリプルモジュレーターであることがわかる。【０１１５】
実施例２
１．初代培養神経細胞のネプリライシン活性染色  
本法は、細胞膜表面に局在するネプリライシンの量を培養細胞を用いて測定する方法である。Ａβは細胞外に分泌されるため、ネプリライシンが細胞膜上に存在すればするほど、効率よくＡβの分解除去が可能になる。既報（特開２００４−１５１０７９；Saito T., Iwata N., et al., Nat. Med. 11(4), 434-439, 2005）に準じ、以下の手順で行った。
マウス胎仔大脳皮質および海馬から調製した神経細胞を培養、固定して、基質で反応させた。反応終了後、アミノペプチダーゼ・ホスホラミドン混合液およびニトロサリチルアルデヒド溶液を順次添加し反応させた。反応終了後の細胞について、共焦点レーザー顕微鏡下でアルゴンレーザーとローダミン用のフィルターを用いて陽性染色像を観察した。より簡便には、蛍光顕微鏡下でＦＩＴＣフィルターを用いて陽性染色像を観察することも可能である。ネプリライシンにより基質が分解されると不溶性の蛍光反応物が形成され、ネプリライシンの存在部位が黄色（疑似カラーであり、緑色でも良い）に視覚化される。この方法で細胞を染色する際、ネプリライシンの特異的阻害剤であるチオルファンを共存させると、陽性染色像が消失することから、マウス胎仔大脳皮質および海馬の初代培養神経細胞の細胞表面にネプリライシンが存在することが確認できる。【０１１６】
２．各種化合物によるネプリライシン酵素活性の誘導
マウス胎仔大脳皮質および海馬から調製した神経細胞を培養し、培養７日目から２１目に、所定の濃度で下記試験化合物を個々に添加し、さらに４８時間培養した。培養終了後、上記１．で示した方法により、マウス初代培養神経細胞のネプリライシン活性を視覚化して観察した。染色像を画像解析ソフトウェア（MetaMorph,ver. 7.7 (Universal Imaging Corporation, Downington, PA)）により定量化して検討した。非添加（ネガティブコントロール：ＤＭＳＯ）の細胞のシグナル強度を１とし、各試験化合物についての結果を相対的に表した。結果を図４に示す。また、ソマトスタチンは、内在性のネプリライシンの活性調節分子であることが知られており、ポジティブコントロールとして用いた。
（試験化合物）
第１群
NUP-6、NUP-11、NUP-19、NUP-16、NUP-15、NUP-18、EGCg
いずれの化合物も実施例１と同様にして調製し、最終濃度１０μＭで試験した。結果を図４Ａに示す。
第２群
Honokiol、Apigenin、Kaempferol、Baicalein、Chrysin、Amentoflavone、NUP-E15-1、NUP-E15-2
いずれの化合物も実施例１と同様にして調製し、最終濃度１０μＭで試験した。結果を図４Ｂに示す。
第３群
Minocycline（５μＭ）、Pioglitazone（１０μＭ）、Rosiglitazone（１０μＭ）、Chlorpromazine（１０μＭ）、Resveratrol（１０μＭ）、Somatostatin（１μＭ）、DYRK inhibitor Harmine（１μＭ）
いずれも市販品を用いて、DMSOに溶解して、カッコ内に示した最終濃度で試験した。結果を図４Ｃに示す。【０１１７】
３．結果
図４Ａ〜Ｃに、活性染色法により測定したネプリライシン活性の結果を示す。図５は、図１、２、３、４Ａ〜Ｃの結果に基づき、各ポリフェノール誘導体についての、各要素の変動を模式的に示した図である。
図４Ａ及びＢより本発明のポリフェノール誘導体で処理した場合、細胞膜へ移行したネプリライシンが増加すること、即ち、本発明のポリフェノール誘導体が、ネプリライシンの細胞膜へ輸送を促進することがわかった。Ａβは細胞外に分泌されるため、ネプリライシンが細胞膜上に存在すればするほど効率よくＡβの分解除去が可能になる。従って、ネプリライシンの細胞表面への顕在化を促進する作用を有し、分泌されたＡβを効率よく分解するように働く本発明のポリフェノール誘導体はアルツハイマー病の予防及び／又は治療に有用である。
図４Ｃより、Minocycline、Pioglitazone、Rosiglitazone、Chlorpromazine、Resveratrol、Somatostatin、及びDYRK inhibitor Harmineといった一連の化合物がネプリライシン活性増強作用を有することが確認された。【０１１８】
実施例３
βセクレターゼ阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤との併用によるカクテル療法
試験化合物としては、本発明のポリフェノール誘導体であるＮＵＰ−１１（実施例１で調製；１０μＭ）を用いた。βセクレターゼ阻害剤としてβ-secretase inhibitor IV (N-[(1S, 2R)-1-benzyl-3-(cyclopropylamino)-2-hydroxypropyl]-5-[methyl(methylsulfonyl)amino-N’-[(1R)-1-phenylethyl]isophthalamide（Merck KGaA；０．１μＭ）、γセクレターゼ阻害剤としてCompound E（(S,S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)-acetylamino]-N-(1-methyl-2-oxo-5-phenyl-2,3-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-yl)-propionamide）（Merck KGaA；０．１ｎＭ）を用いた。また、ＮＵＰ−１１（１０μＭ）、β-secretase inhibitor IV（０．１μＭ）及びCompound E（０．１ｎＭ）の３種全てを用いてカクテル療法を実施した。
実施例１と同様にして各試験化合物で処理した細胞の細胞抽出液中のＡＰＰｓα産生量、ＡＰＰｓβ産生量及びＡＰＰｓα／ＡＰＰｓβの割合を測定した。結果、本発明のポリフェノール誘導体は、低濃度のβセクレターゼ阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤と併用して、培養細胞に添加することでＡＰＰｓαレベルを上昇させ、ＡＰＰｓβレベルを低下させた（図６）。
さらにカクテル療法のアミロイドβ産生抑制効果について調べた。
実施例１と同様にしてＮＵＰ−１１、β-secretase inhibitor IV及びCompound Eの３種全てで同時に処理した細胞を用いて細胞抽出液を調製し、該抽出液中のＡβ量を測定した。
Ａβ産生は、既報（Iwata N., et al., Ｊ Neurosci 24(4), 991-998, 2004）に準じ、ＢＮＴ７７/ＢＡ２７モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡβ１−４０の量を測定することにより評価した。結果を図７に示す。
結果、本発明のポリフェノール誘導体、βセクレターゼ阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤を用いたカクテル療法は優れたアミロイドβ産生抑制作用を示した。【０１１９】
実施例４
脳内注入によるin vivoデータ
本発明のポリフェノール誘導体を直接脳内に注入し、そのネプリライシン活性に及ぼす影響を調べた。
既報（Iwata N., et al., Ｊ Neurosci 24(4), 991-998, 2004）に準じ、本発明のポリフェノール誘導体を所定の濃度で脳室内投与し、投与後の海馬組織から細胞抽出液を調製し、実施例１と同様にしてネプリライシン活性を測定することにより評価した。結果を図８に示す。
結果、本発明のポリフェノール誘導体は、in vivoにおいても優れたネプリライシン活性増強効果を示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号１：合成基質
配列番号２：合成基質
配列番号３：Hs_MME-プローブ
配列番号４：Hs_MME-プライマー（フォワード）
配列番号５：Hs_MME-プライマー（リバース）
配列番号６：Hs_ADAM9-プローブ
配列番号７：Hs_ADAM9-プライマー（フォワード）
配列番号８：Hs_ADAM9-プライマー（リバース）
配列番号９：Hs_ADAM10-プローブ
配列番号１０：Hs_ADAM10-プライマー（フォワード）
配列番号１１：Hs_ADAM10-プライマー（リバース）
配列番号１２：Hs_ADAM17-プローブ
配列番号１３：Hs_ADAM17-プライマー（フォワード）
配列番号１４：Hs_ADAM17-プライマー（リバース）
配列番号１５：Hs_BACE1-プローブ
配列番号１６：Hs_BACE1-プライマー（フォワード）
配列番号１７：Hs_BACE1-プライマー（リバース）
配列番号１８：Hs_GAPDH-プローブ
配列番号１９：Hs_GAPDH -プライマー（フォワード）
配列番号２０：Hs_GAPDH -プライマー（リバース）
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
加齢依存的に脳内のネプリライシンレベルが低下すること、及びＡＤ脳でネプリライシンレベルが低下すること、に示唆されるように、ＡＤ発症過程や加齢に伴う脳内Ａβレベルの上昇はネプリライシン活性の低下に起因する可能性がある。本発明はこのようなネプリライシン活性の低下を阻害する（ネプリライシン活性を増強する）ことで脳内のＡβ蓄積を抑制してＡＤ発症を予防し、又治療することが可能となる。
また、本発明のポリフェノール誘導体は食品や飲料に含めることにより健康食品・特定保健用食品として有用である。【０１２２】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−２２６２３６（出願日２０１４年１１月６日）及び特願２０１５−１９６２８２（出願日２０１５年１０月１日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2016072522.tif 000038
【図２】
2016072522.tif 000039
【図３】
2016072522.tif 000040
【図４】
2016072522.tif 000041
【図５】
2016072522.tif 000042
【図６】
2016072522.tif 000043
【図７】
2016072522.tif 000044
【図８】
2016072522.tif 000045
【配列表】
2016072522000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月8日(2016.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤であって、該ポリフェノール誘導体が、式（Ｉ）で表される（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される脂溶性基が導入された化合物である、薬剤。
【化１】
2016072522.tif 000046
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４は２以上である。）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、請求項１記載の薬剤。
【請求項８】
脂溶性基がＡ環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、請求項１又は７に記載の薬剤。
【請求項９】
脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、請求項１又は７に記載の薬剤。
【請求項１０】
Ｃ環の４位にカルボニル基が存在する、請求項１及び７〜９のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１１】
脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の薬剤。
【化２】
2016072522.tif 000047
【請求項１４】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、アルツハイマー病の予防及び／又は治療用薬剤であって、該ポリフェノール誘導体が、（ｉ）カテキン又はプロアントシアニジンと、（ｉｉ）下記式
【化３】
2016072522.tif 000048
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、薬剤。
【請求項１５】
ポリフェノール誘導体が、（ｉ）カテキン又はプロアントシアニジンと、（ｉｉ）２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項１４記載の薬剤。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、ネプリライシン活性を増強し、且つαセクレターゼ活性を増強する、及び／又はβセクレターゼ活性を阻害する薬剤であって、該ポリフェノール誘導体が、式（Ｉ）で表される（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体又は（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート誘導体に、それぞれ置換基を有していてもよい、鎖状炭化水素基、環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、脂溶性ビタミン残基及びステロール残基からなる群より選択される脂溶性基が導入された化合物である、薬剤。
【化４】
2016072522.tif 000049
（式中、ｎ１はＡ環に結合する水酸基の数を示し、０〜４の整数であり；ｎ２はＧ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ３はＢ環に結合する水酸基の数を示し、０〜５の整数であり；ｎ４はＣ環に結合する水酸基の数を示し、０又は１であり；ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＋ｎ４は２以上である。）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
脂溶性基が置換基を有していてもよい鎖状炭化水素基である、請求項２１に記載の剤。
【請求項３１】
脂溶性基がＡ環にＣ−Ｃ結合で直接導入されている、請求項２１又は３０に記載の剤。
【請求項３２】
脂溶性基の導入にＳ−エステル結合又はＯ−エステル結合を使用しない、請求項２１又は３０に記載の剤。
【請求項３３】
Ｃ環の４位にカルボニル基が存在する、請求項２１及び３０〜３２のいずれか１項に記載の剤。
【請求項３４】
脂溶性ポリフェノール誘導体の分配係数（ｌｏｇＰ）が、対照として（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートを用いた場合、その１．８倍以上であることを特徴とする、請求項２１記載の剤。
【請求項３５】
（削除）
【請求項３６】
ポリフェノール誘導体が、下記化合物群より選択される少なくとも１種である、請求項２１記載の剤。
【化５】
2016072522.tif 000050
【請求項３７】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する、ネプリライシン活性を増強し、且つαセクレターゼ活性を増強する、及び／又はβセクレターゼ活性を阻害する薬剤であって、該ポリフェノール誘導体が、（ｉ）カテキン又はプロアントシアニジンと、（ｉｉ）下記式
【化６】
2016072522.tif 000051
（式中、
Ｒ１は、炭化水素基を示し；
Ｒ２は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ３は、水素又は炭化水素基を示し；
Ｒ４は、水酸基を示し、あるいは
Ｒ３及びＲ４は、一緒になってケト基を示す）
で表される化合物を反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、薬剤。
【請求項３８】
ポリフェノール誘導体が、（ｉ）カテキン又はプロアントシアニジンと、（ｉｉ）２−ヘキセナール、２−ノネナール、シンナムアルデヒド、フェルラアルデヒド、ｐ−クマルアルデヒド、シトラール、シトロネラール、ゲラニアール、ゲラニオール、ファルネサール、ファルネソール、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデセナール、フィトール、３−ノネン−２−オンまたはペリルアルデヒドとを、酸を加えて反応させることによって製造されたカテキン誘導体またはプロアントシアニジン誘導体である、請求項３７記載の剤。
【国際調査報告】
2016072522.tif 000052
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