(57)【要約】【課題】薬物依存症、統合失調症、鬱病などの精神障害を体外診断するための検査方法および該検査に使用する検査キットの提供。【解決手段】被験体であるヒトまたはマウスなどで、Ｓｈａｔｉ遺伝子のメチル化状態を調べることにより、被験体が薬物依存症、統合失調症、鬱病など精神関連疾患に罹患しているか否か、それら疾患の病状の進行状況などを知ることができる。従って、薬物依存症、統合失調症、鬱病など精神関連疾患の治療や治療薬開発に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程、
（２）被験体から採取した試料のメチル化状態を、精神障害の個体および非精神障害の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と比較して、被験体が精神障害か否かを検査する検査工程、
を含むことを特徴とする精神障害の検査方法。
【請求項２】
精神障害が、薬物依存症、統合失調症、鬱病のいずれかにより生じたものである請求項１の精神障害の検査方法。
【請求項３】
試料が、哺乳動物から採取した生体試料であることを特徴とする請求項１または２に記載の精神障害の検査方法。
【請求項４】
生体試料が、げっ歯類またはヒトから採取した血液であることを特徴とする請求項３に記載の精神障害の検査方法。
【請求項５】
ＣｐＧアイランドは、配列番号１又は４に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかの項に記載の精神障害の検査方法。
【請求項６】
被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態検出用の、配列番号２，３、配列番号６，７、又は配列番号８，９のプライマーセットを含むことを特徴とする精神障害の検査用キット。
【請求項７】
被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程と、
精神障害の個体および非精神障害の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、被験化合物の非存在下における被験体から採取した試料のメチル化状態と被験化合物の存在下における被験体から採取した試料の前記メチル化状態とを比較して、被験化合物が精神障害の治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する評価工程と、
を含むことを特徴とする精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法。 
【請求項８】
精神障害が、薬物依存症、統合失調症、鬱病のいずれかにより生じたものである請求項７の精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法。
【請求項９】
試料が、動物から採取した生体試料であることを特徴とする請求項７または８に記載の精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法。
【請求項１０】
ＣｐＧアイランドは、配列番号１又は４に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項７〜９のいずれかの項に記載の精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神障害関連タンパク質Ｓｈａｔｉ遺伝子に係るＣｐＧアイランドのメチル化状態に基づく精神障害の検査方法および検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
精神が障害された疾患の多く、例えば、統合失調症や鬱病などは、思春期などの人生の早い時期に発症し、患者は薬物や行動療法などと共に一生その疾患と共に生きていかなければならず、日常生活や職業選択に制限が生じている。
このような疾患は、少しでも早い時期から治療を開始することが出来れば、疾病の悪化を食い止め、さらには回復の可能性を見出すこともできる。
鬱病や統合失調症の検査方法として、例えば、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソンI上流のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標とする検査方法が知られている（特許文献１）といった報告がなされている。【０００３】
一方、覚醒剤や麻薬による薬物依存症は大きな社会問題となっており、治療法の確立を目指して、依存形成に係わる機能分子の探索が行われた。
その結果、覚醒剤精神病モデルマウスの脳側坐核において高い発現量を示すＳｈａｔｉ (NCBIアクセスナンバーABA54615)が見出された（非特許文献１）。
また、Ｓｈａｔｉの核酸の検出による精神障害の診断が提案されている（特許文献２）。【０００４】
【特許文献１】WO2012/017867
【特許文献２】WO2006/093034
【非特許文献１】J. Neurosci., 27, 7604-7615, 2007
【非特許文献２】PLoS One, 6(8), e23881, 2011.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
エピジェネティクスは、遺伝子と環境の両方の要因によって初めて現れる症状を追究する分野であり、鬱病や統合失調症のような精神疾患との関連が注目されている (非特許文献２) 。
本発明は、薬物依存症、統合失調症、鬱病などの精神障害を体外診断するための検査方法および該検査に使用する検査キットを提供し、簡便にかつ早期に精神障害を発見する方法・ツール提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、エピジェネティクスの観点から、Ｓｈａｔｉの発現制御機構の解明を行い、ＳｈａｔｉにおけるＣｐＧアイランドのメチル化状態を指標とする精神障害の検査方法を確立し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。【０００７】
本発明の第１の発明は、以下の検出工程（１）および検査工程（２）を含むことを特徴とする精神障害の検査方法である。
（１）検出工程：被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態の検出。
（２）検査工程：被験体から採取した試料のメチル化状態を、精神障害の個体および非精神障害の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と比較して、被験体が精神障害か否かの検査。
ここで、精神障害は、薬物依存症、統合失調症、鬱病のいずれかにより生じたものであり、試料が、哺乳動物から採取した生体試料である。【０００８】
本発明の第２の発明は、被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態検出用の特定のプライマーセットを含むことを特徴とする精神障害疾患用の検査キットである。【０００９】
本発明の第３の発明は、以下の検出工程（３）および評価工程（４）を含むことを特徴とする精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法である。
（３）被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する検出工程。
（４）精神障害の個体および非精神障害の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、被験化合物の非存在下における被験体から採取した試料のメチル化状態と被験化合物の存在下における被験体から採取した試料の前記メチル化状態とを比較して、被験化合物が精神障害の治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する評価工程。
ここで、精神障害は、薬物依存症、統合失調症、鬱病のいずれかにより生じたものであり、試料が、哺乳動物から採取した生体試料である。
【発明の効果】
【００１０】
Ｓｈａｔｉ遺伝子のメチル化を指標とすることで、精神障害の状態を客観的判断することができる。
また、Ｓｈａｔｉ遺伝子のメチル化の指標とすることで、被験化合物が精神障害治療剤および／または予防剤となるか否かを評価することができる。
すなわち、臨床医等の主観的な判断によらずに精神障害治療剤および／または予防剤の評価ができるため、より正確な評価を行うことが可能となる。
Ｓｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおける個別のＣｐＧメチル化状態は、被検体が精神障害のときや、統合失調症の病態が進行すると、ＣｐＧのメチル化率が減少するので、その減少の程度を評価指標に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ターゲットマウスのＳｈａｔｉ  ＤＮＡ領域の概要である。
【図２】ゲル電気泳動によるマウスゲノムDNAの検出を示す図である。
【図３】ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の検出を示す図である。
【図４】シーケンススキャナによる配列解析の一例を示す図である。
【図５】血中におけるＳｈａｔｉのメチル化解析を示す図である。
【図６】側坐核におけるＳｈａｔｉのメチル化解析を示す図である。
【図７】ヒトのＳｈａｔｉ  ＤＮＡ領域の概要である。
【図８】ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の検出を示す図である。
【図９】ヒト血中におけるＳｈａｔｉメチル化解析を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の検出工程（１）または（３）において、被験体は、哺乳動物であれば、特に限定されないが、マウス、ラットなどげっ歯類；ウサギ；ネコ；イヌ；ヒトなどが挙げられる。好ましい、被験体は、げっ歯類またはヒトである。【００１３】
試料は、生体から採取された組織・血液であればよく、特に血液が好ましい。血液は、全血または血小板など特定の血液成分を使用すればよい。【００１４】
Ｓｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドは、Ｓｈａｔｉ遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドのメチル化ＤＮＡの割合を見ることができれば、特に限定されないが、例えば、ｍｏｕｓｅのＳｈａｔｉ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄである配列番号１又はｈｕｍａｎのＳｈａｔｉ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄである配列番号４の塩基配列を含むことが好ましい。【００１５】
Ｓｈａｔｉ  ＤＮＡのメチル化状態の検出に用いる方法は、メチル化ＤＮＡを濃縮する方法、バイサルファイト処理による塩基置換を利用する方法、メチル化感受性の制限酵素を利用する方法など、特に限定されないがバイサルファイト処理による塩基置換を利用する方法が好ましい。
バイサルファイト処理には、例えば、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの市販のキット品を用いればよい。【００１６】
メチル化状態の解析には、公知の方法を利用すればよいが、例えば、バイサルファイト処理後に、目的のＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、クローニングしてシーケンス解析を行えばよい。【００１７】
目的のＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅に使用するメチル化検出用および非メチル化検出用のプライマーの設計は、例えば、「Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ）」などを使用すればよい。
具体的なプライマーとしては、以下のものが挙げられる。【００１８】
配列番号１を目的のＤＮＡ領域する場合にバイサルファイト処理後に下記のプライマーセットを用いる
＜Ｓｈａｔｉ  ＢＳＰ  ｕｐ＞
配列：５’−ｇｇｇａｔｔｔａｇｇａｇａａｇｔｔａａｔｇｔｇ−３’（配列番号２）
＜Ｓｈａｔｉ  ＢＳＰ  ｄｏｗｎ＞
配列：５’−ａａａａａｃｃｃａｃａａｔａｃａｔａｃａｃｃｃ−３’（配列番号３）
配列番号４のｈｕｍａｎのＳｈａｔｉ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄを目的のＤＮＡ領域する場合に、バイサルファイト処理後の配列番号５のＤＮＡを解析領域として、下記のプライマーセットを用いるとよい。
Ｕｐ１５’−ｔｔａｔｇｔｇｇｇａｔｔｔｔｔａａａｇａ−３’（配列番号６）
Ｄｏｗｎ２５’−ａｃｃｔａａｃｃｃｃｃｔｔｃａａｔｔｃｔａｃ−３’（配列番号７）
又は
Ｕｐ４５’−ｇｇｇｇｔｇｇｔｇｔｔｇｇｇａｇｇ−３’（配列番号８）
Ｄｏｗｎ１５’−ａａａａｃｃｃａｃａａｔａｃａｔａｃａｃｃｃ−３’（配列番号９）【００１９】
上記のプライマーを使用したＰＣＲ増幅は、公知の方法で行えばよく、例えば、「Ｅｐｉ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ）」および「カスタムプライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）」を用いて「ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）」でＰＣＲを行えばよい。さらにＰＣＲ産物をゲル電気泳動に供し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）」などを用いて目的のバンドからＤＮＡを抽出すればよい。【００２０】
ＤＮＡのベクターへの組み込みと増幅は、公知の方法で行えばよく、例えば、「ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）」を用いてＤＮＡをベクターにライゲーションし、「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地中などで培養すればよい。
さらに、ボイリング法に準じて形質転換Ｅ．ｃｏｌｉからプラスミドＤＮＡを抽出し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により目的とするＤＮＡを精製すればよい。【００２１】
シークエンスの決定は、公知の方法で行えばよく、例えば、「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）」  を用い、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりシークエンス解析を行えばよい。【００２２】
本発明の検査工程（２）は、被験体から採取した試料のメチル化状態を、精神障害の個体および非精神障害の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態と比較して、被験体が精神障害か否かの検査を行う。
具体的には、例えば、被験体がヒトである場合、予め複数の精神障害の患者および健常者のメチル化状態のデータを収集しておき、当該平均データと比較することによって被験体が精神障害か否かを検査することができる。
さらには、例えば、複数種の精神障害毎の患者の平均データと比較し、いずれの精神障害に該当するか検査してもよい。
好ましくは、健常者、薬物依存患者、統合失調症患者、鬱病患者の平均データと比較することにより、被験体（対象者）がいずれに該当するかを検査する。
または、平均データでなくとも、多変量解析を用いることにより、いずれに該当するか検査することも可能である。【００２３】
本発明の評価工程（４）は、精神障害治療剤および／または予防剤の評価方法に関する。
具体的には、精神疾患の個体および非精神疾患の個体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標として、被験化合物非存在下の試料のメチル化状態と被験化合物存在下の試料のメチル化状態を比較し、被験化合物が精神障害治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する工程である。【００２４】
ここで、「被験化合物」とは、精神障害治療剤および／または予防剤となるか否かの評価（精神障害治療剤および／または予防剤のスクリーニングも含む）の対象となりうる、あらゆる物質を意味する。
例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。
また、精製されたものに限らず、未精製のものでも被験化合物として使用することができる。
また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体につき、評価をすることも可能である。【００２５】
評価工程（４）に先立って、まず、検出工程（３）を行う。被験化合物の非存在下および存在下において、被験体から採取した試料のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を検出する。
試料の採取、およびメチル化状態の検出手段などについては、検出工程（１）と同様である。【００２６】
精神障害のマウスやヒトの個体および非精神障害のマウスやヒトの個体から採取した当該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化状態を指標とし、このように検出した被験化合物の非存在下および存在下における試料のメチル化状態を比較する。
その結果から、被験化合物が精神障害治療剤および／または予防剤となるか否かを評価する。
具体的には、例えば、予め複数の精神障害のマウス・ヒトおよび健常のマウス・ヒトのメチル化状態のデータを収集しておき、当該平均データ等を指標とし、被験化合物の投与前後の試料のメチル化状態を比較する。
これにより、被験化合物が精神障害の治療剤および／または予防剤となるか否かを評価することができる。
好ましくは、精神障害治療剤および／または予防剤は、薬物依存症、統合失調症および鬱病の治療剤または予防剤である。
なお、平均データでなくとも、多変量解析により評価を行うことも可能である。【００２７】
上記のＳｈａｔｉ遺伝子のＣｐＧアイランドを検出するためのプライマーセットは、精神障害の検査用キットとすることができる。
キットには、プライマーセットの他、各メチル化状態の検出手段に合わせた、各種試薬、酵素、緩衝液、反応器材および／または説明書等が含まれてもよい。
【実施例１】
【００２８】
以下、本発明を参考例、実施例で説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００２９】
＜目的領域の決定とプライマー設計＞
（１）マウスＳｈａｔｉ  ＤＮＡの塩基配列は、「Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｓｉａ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）」の配列データを用いた。【００３０】
（２）バイサルファイト処理最適化のため、マウスＳｈａｔｉ  ＤＮＡ領域を切断しない制限酵素を「ＡｐＥ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｇｙｌａｂｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ／ｗａｙｎｅｄ／ａｐｅ／）」  を用いて検索した。
その結果、ＤｒａＩ（タカラバイオ）を見出した。
ＤｒａＩの（切断配列は、「ＴＴＴ／ＡＡＡ」である。【００３１】
（３）バイサルファイト処理を受けたＤＮＡに対するプライマーの設計を行った。設計には、「Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ）」を使用した。設計したプライマー以下のとおりである。【００３２】
＜Ｓｈａｔｉ  ＢＳＰ  ｕｐ＞
配列：５’−ＧＧＧＡＴＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＧ−３’
位置：−５６２〜−５３９
Ｔｍ値：５３〜５５℃【００３３】
＜Ｓｈａｔｉ  ＢＳＰ  ｄｏｗｎ＞
配列：５’−ＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＣＡＣＣＣ−３’
位置：＋８５４〜＋８７７
Ｔｍ値：５３〜５５℃【００３４】
（４）ＣｐＧアイランドの定義は、以下のとおりとした。
・％ＧＣ＞５０
・長さ：３００〜２０００ｂｐ
・Ｏｂｓｅｒｖｅｄ／Ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ＣｐＧ＞０．６
この条件の解析の結果、プロモーターにあたる−６４８からイントロンＩである＋１３４２までがＣｐＧアイランドとなった（図１）。【００３５】
＜モデルマウスの作成とＤＮＡ採取＞
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、８週齢、日本ＳＬＣ）に０．９％食塩液に溶解し１００μｇ／ｍＬとしたメタンフェタミンを１０ｍＬ／ｋｇで、一日一回、６日間皮下投与した。
対象群に対しては、０．９％食塩液（１０ｍＬ／ｋｇ）  を同様に投与した。
６日目の投与から２時間後にネンブタール  １０ｍＬ／ｋｇを腹腔内投与で麻酔を施し、心臓から血液を採取してヘパリンと混合して氷中で保存した。
この全血から「Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（キアゲン）」を用いてＤＮＡを抽出した。
全血から精製したマウスのＤＮＡは、ゲル電気泳動によってフラッシュされ、紫外線によって検出された（図２）。
また、側坐核の組織サンプルは、同マウスの全脳を摘出後、ブレインマトリックス(ニューロサイエンス社)を用いて分取し、「ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（シグマ）」を用いてＤＮＡを抽出した。
なお、これらの実験は、富山大学動物実験取扱規則に沿って行った。【００３６】
＜目的配列の増幅＞
（１）フェノール／クロロホルム抽出
マウス全血２００μＬに、トリス・フェノール／クロロホルム混合液２００μＬを加えて転倒混和し、４℃、２００００ｇで５分間遠心した。上澄みを新たなチューブに採取し、クロロホルムを等量加えて撹拌混合し、再度４℃、２００００ｇで５分間遠心し、上澄みを新たなチューブを採取した。【００３７】
（２）エタノール沈殿
上記の上澄み液２００μＬに、イソプロパノール２００μＬ、３Ｍ酢酸ナトリウム２０μＬを加えて転倒混和し、４℃で３０分間、または−２０℃で１０分間以上インキュベートした後、４℃、２００００ｇで２０分間遠心した。
上澄みをデカンテーションで捨て、７０％エタノールを１ｍＬ加えて撹拌混合し、４℃、２００００ｇで５分間遠心した。
上澄みをデカンテーションで捨て、逆さのままキムワイプ上で風乾した。
沈殿を長期保存の場合には、トリス／ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ）にて溶解し、シークエンスを行う場合は蒸留水で溶解した。【００３８】
（３）目的配列の増幅
バイサルファイト処理の最適化のため、ＤｒａＩ（タカラバイオ）でＤＮＡを分割し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡを「ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」を用いてバイサルファイト処理を行い、「Ｅｐｉ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ）」および「カスタムプライマー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）」を用いて「ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）」でＰＣＲを行った。
反応条件は、以下のとおり。
・９４℃で５分
・（９８℃で３０秒、５６．８℃で１分、７２℃で２分）を３５サイクル
・７２℃で７分
ＰＣＲ産物を１．５％ＴＢＥ（トリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ）緩衝液ゲルで泳動した。ＰＣＲ産物が検出され、ターゲットを絞ったＰＣＲ産物の長さは１４３８ｂｐであった（図３）。
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）」を用いて目的のバンドからＤＮＡを抽出した。【００３９】
＜ＤＮＡのベクターへの組み込みと増幅＞
（１）「ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）」を用いてＤＮＡをベクターにライゲーションし、「Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）」に形質転換した。
ＬＢ／Ａｍｐプレートに塗布して３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーをピックアップし、ＬＢ／Ａｍｐ液体培地中で培養した。ボイリング法に準じて形質転換Ｅ．ｃｏｌｉからプラスミドＤＮＡを抽出し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。【００４０】
＜シークエンス＞
「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）」を用い、Ｔ７またはＳＰ６プライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応条件は、以下のとおり。
・９６℃で１分
・（９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分）を２５サイクル
ＰＣＲ産物はエタノール沈殿を行った後、ＨｉＤｉ−ホルムアミドに溶解し、３１３０ジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりシークエンス反応を行った。
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりシークエンスを解析し、メチル化シトシンと非メチル化シトシン（チミン）を判別した（図４）。
メチル化パターンは、生理食塩水投与群（図４下）とメタンフェタミン投与群（図４上）で差が認められた。【００４１】
＜結果＞
転写開始点から−５３３〜−１５９の領域のＣｐＧメチル化を検索した。多くの位置でＣｐＧのメチル化が観察された。食塩液群とメタンフェタミン群での有意な差は、２番目のＣｐＧ（−５２５）でのみあった。
また、食塩液群（ＳＡＬＩＮＥ）の方がメタンフェタミン投与群（ＭＡＰ）より高いメチル化割合を示した（図５、図６）。
なお、メチル化を１００％、非メチル化を０％と示した。
【実施例２】
【００４２】
マウスの場合と同様にヒトでの目的領域の決定とプライマー設計を行い、ヒトのＤＮＡの配列番号４からなる塩基配列を目的領域して、バイサイルファイト処理し配列番号５からなる塩基配列を解析領域とした。
この結果、プロモーターにあたる−１７２６からイントロン２である＋２０１０までがＣｐＧアイランドとなった（図７）。【００４３】
プライマー配列番号６，７又は８，９の組み合せにてＰＣＲを行った（図８）。
さらにマウスの場合と同様にメチル化パターンの解析した結果を図９に示す。
Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａの方が明らかに Ｎｏｒｍｏｌの被検体よりもほぼ全てのメチル化可能部位においてメチル化が少なかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
被験体であるヒトまたはマウスなど動物の血液で、Ｓｈａｔｉ遺伝子のメチル化状態を調べることにより、被験体が薬物依存症、統合失調症、鬱病など精神関連疾患に罹患しているか否か、それら疾患の病状の進行状況などを知ることができる。
従って、薬物依存症、統合失調症、鬱病など精神関連疾患の治療や治療薬開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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