(57)【要約】破骨細胞への効果を維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進することで、骨との結合を早い段階で確立することができる骨補填材を提供することを目的とする。本発明は、固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ型リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）相からなる骨補填材を提供する。本発明によれば、固溶している１価陽イオンの濃度が異なるβ−ＴＣＰ相の複合相とすることで、破骨細胞への効果を維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進し、骨との結合を早い段階で確立することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ型リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）相からなる骨補填材。
【請求項２】
前記固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ−ＴＣＰ相が、不均一に混相している請求項１に記載の骨補填材。
【請求項３】
1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰ相と、非固溶β−ＴＣＰ相と、を含む、請求項１に記載の骨補填材。
【請求項４】
前記１価陽イオンがナトリウムイオンである請求項１から３のいずれかに記載の骨補填材。
【請求項５】
固溶している１価陽イオンの濃度が異なるβ−ＴＣＰの粒子を混合し、所定の形状に成形した後、１１００℃以上１２００℃以下かつ５分以上６０分以下の条件で焼成してなる請求項１から４のいずれかに記載の骨補填材。
【請求項６】
前記所定の形状が、円柱体、直方体、多角柱体、球体、楕円体、顆粒、または三次元データを使用した骨欠損と正確に適合する形状である請求項６に記載の骨補填材。
【請求項７】
固溶している１価陽イオンの濃度が異なるβ−ＴＣＰの粒子を混合し、混合物を得る工程と、
前記混合物を所定の形状に成形した後、１１００℃以上１２００℃以下かつ５分以上６０分以下の条件で焼成する工程と、を含む、骨補填材の製造方法。
【請求項８】
前記所定の形状が、円柱体、直方体、多角柱体、球体、楕円体、顆粒、または三次元データを使用した骨欠損と正確に適合する形状である請求項７に記載の骨補填材の製造方法。
【請求項９】
前記所定の形状の成形が、加圧成形法または切削成形法、あるいはその組合せによって行われる請求項７または８に記載の骨補填材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨補填材とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨補填材は、事故や病気などにより欠損、喪失した骨の置換材料として用いられている。骨補填材にとって重要な機能は、骨補填材と周囲の骨組織がどれほど早く結合するのかという点にある。骨補填材と骨組織が結合するためには、（１）骨補填材の表面から溶出したカルシウムイオンによって、破骨細胞が骨補填材の近辺に遊走する、（２）破骨細胞が骨補填材の表面に接着し、骨補填材を溶解することで骨代謝サイクルを働かせる、という２ステップが必要である。すなわち、骨補填材の機能向上には、骨生成速度と、β−ＴＣＰの吸収速度とのバランスを制御することが要求される。【０００３】
β型リン酸三カルシウム（β-ＴＣＰ）は骨補填材として広く応用されている材料であり、破骨細胞を遊走させるのに十分な溶解性を持つ。しかし逆に、β−ＴＣＰからなる材料は、その表面の溶解性が高いため、破骨細胞がβ−ＴＣＰからなる材料の表面へ接着しづらく、破骨細胞の活性が十分に上昇しないという問題がある。そこで、ナトリウムイオンをはじめとする陽イオンをβ-ＴＣＰに置換・固溶させ、溶解性を低下させる取り組みがなされている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２５９０１６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ.  Ｙａｓｈｉｍａ,  Ａ.  Ｓａｋａｉ,  Ｔ.  Ｋａｍｉｙａｍａ,Ａ.  Ｈｏｓｈｉｋａｗａ,  “Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  β−ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃａ３（ＰＯ４）２  ｂｙ  ｎｅｕｔｒｏｎ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ“  ,Ｊ.  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｈｅｍ.，  １７５，２７２−２７７（２００３）.
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋａｔｓｕｍｉ,  Ｋｏｎｄｏ  Ｎａｏｋｉ,  Ｋｉｔａ  Ｈｉｄｅｋｉ,  Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｍａｓａｎｏｒｉ,  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｋａｚｕａｋｉ,  Ｔｏｄａ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ,  “Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｖａｌｅｎｔ  Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  β−Ｔｒｉｃａｌｃｉｕm  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ“,  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ,  Ｖｏｌ.８８（８）,  ｐｐ. ２３１５−２３１８（２００５）.
【非特許文献３】Ｋａｔｓｕｍｉ  ＹＯＳＨＩＤＡ，  Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ  ＦＵＫＵＨＡＲＡ,  Ｋａｚｕａｋｉ  ＨＡＳＨＩＭＯＴＯ,  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ  ＴＯＤＡ,  Ｍａｓａｍｉｔｓｕ  ＩＭＡＩ  ａｎｄ  Ｔｏｙｏｈｉｋｏ  ＹＡＮＯ，  “Ｓｉｎｔｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａl  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  β−Ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  Ｄｏｐｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｈ  Ｎａ  ａｎｄ  Ｍｇ  Ｉｏｎｓ“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｊａｐａｎ，  （Ｖｏｌ.１６）  Ｎｏ.３４０，ｐ.１６５−１７０（２００９）．
【非特許文献４】橋本和明，松本尚之，柴田裕史，「金属イオン置換によるリン酸三カルシウム系生体材料の物性制御」，材料の科学と工学，Vol. 49,  No. 6，ｐｐ.２５０−２５５（２０１２）．
【非特許文献５】Ｎａｏｙｕｋｉ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｋａｚｕａｋｉ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｏ  Ｔｏｄａ，  Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  β−ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｏｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ,  Ｖｏｌ.１１８，  Ｎｏ.１３７８（Ｊｕｎｅ），  Ｐ４５１−４５７（２０１０）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の骨補填材を用いた結果、破骨細胞の材料上での活性を上昇させることに成功した一方で、初期のカルシウムイオンの溶出量が不足し、生体内で破骨細胞を遊走させるのに十分ではないことが分かった。【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、破骨細胞への効果を維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進することで、骨との結合を早い段階で確立することができる骨補填材およびその製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ型リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）相からなる骨補填材を提供する。【０００９】
前記第１の態様によれば、固溶している１価陽イオンの濃度が異なるβ−ＴＣＰ相の複合相とすることで、破骨細胞への効果を維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進し、骨との結合を早い段階で確立することができる。【００１０】
前記第１の態様に係る骨補填材においては、前記固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ−ＴＣＰ相が、不均一に混相していてもよい。【００１１】
前記第１の態様に係る骨補填材が、1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰ相と、非固溶β−ＴＣＰ相を備えていてもよい。【００１２】
溶解性の高い非固溶β−ＴＣＰ相と溶解性の低い1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰ相とを組み合わせることで、破骨細胞を呼び寄せつつ、呼び寄せた破骨細胞を接着させることができる。【００１３】
すなわち、生体内では、生体吸収性の高い非固溶β−ＴＣＰ相と比べて、生体吸収性を制御した１価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相はゆっくりと溶解する。そのため、非固溶β−ＴＣＰ相の部分では骨代謝が促進され、一方で生体吸収性を制御した１価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相の部分ではゆっくりと骨代謝を起こすことができる。【００１４】
前記第１の態様においては、前記１価陽イオンがナトリウムイオンであってもよい。【００１５】
このようにすることで、生体への吸収速度を容易に制御できるだけでなく、骨補填材として重要な機能である骨形成能も優れた１価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相を得ることができる。【００１６】
前記第１の態様に係る骨補填材は、固溶している１価陽イオンの濃度が異なるβ−ＴＣＰの粒子を混合し、骨補填材として適した形状、すなわち円柱体、直方体、多角柱体、球体、楕円体、顆粒、もしくは三次元データを使用した骨欠損と正確に適合する形状へと、加圧成形法または切削成形法により成形した後、１１００℃以上１２００℃以下かつ５分以上６０分以下の条件で焼成して形成されてもよい。【００１７】
このようにすることで、１価の陽イオンが結晶内で拡散することなく焼結し、固溶している１価陽イオンの濃度が異なる複数のβ−ＴＣＰ相からなる複合体（ミクロドメイン構造）を形成させることができる。【００１８】
本発明の第２の態様は、1価陽イオン固溶β−ＴＣＰの粒子と非固溶β−ＴＣＰの粒子を混合し、混合物を得る工程と、骨補填材として適した形状、すなわち円柱体、直方体、多角柱体、球体、楕円体、顆粒、もしくは三次元データを使用した骨欠損と正確に適合する形状へと、加圧成形法または切削成形法により成形した後、１１００℃以上１２００℃以下かつ５分以上６０分以下の条件で焼成する工程と、を含む、骨補填材の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、破骨細胞への効果は維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進する骨補填材を得ることができる。すなわち、破骨細胞を呼び寄せるために溶解性の高い相と、破骨細胞が接着できる溶解性の低い相とからなる不均一な複合体である（ミクロドメイン構造を有する）骨補填材を得ることができるので、骨との結合を早い段階で確立することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（ａ）はβ−ＴＣＰの結晶構造を表す概念図であり、（ｂ）はβ−ＴＣＰの結晶構造を構成するカラムを示す概念図である。
【図２】β−ＴＣＰの結晶構造を構成するＡカラムにおいて、ナトリウムイオンの固溶形態を示す概念図である。
【図３】本発明に係る骨補填材の単相体の均一構造を示す概念図である。
【図４】本発明に係る骨補填材の複合体の不均一構造を示す概念図である。
【図５】本発明に係るβ−ＴＣＰおよび1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰの作製方法の概略スキームである。
【図６】本発明に係る1価陽イオン固溶β−ＴＣＰ複合体および1価陽イオン固溶β−ＴＣＰ単相体からなる骨補填材試料の製造方法の概略スキームである。
【図７】本発明に係る製造方法で製造した、４．６ｍｏｌ％単相体の電子線マイクロアナライザ（ＥＰＭＡ）の測定結果を示す図である。
【図８】本発明に係る製造方法で製造した、４．６ｍｏｌ％複合体のＥＰＭＡの測定結果を示す図である。
【図９】本発明に係る製造方法で製造した骨補填材の試料についての溶解性試験における測定結果を示すグラフである。
【図１０】本発明に係る製造方法で製造した骨補填材の試料の、溶解性試験後の試料の電子顕微鏡図であって、（ａ）および（ｂ）は４．６ｍｏｌ％単相体の、（ｃ）および（ｄ）は４．６ｍｏｌ％複合体の試験後の電子顕微鏡図である。
【図１１】本発明に係る製造方法で製造した骨補填材の試料についての、破骨細胞様細胞を用いたＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を示すグラフである。
【図１２】本発明に係る製造方法で製造した骨補填材の試料についての、破骨細胞様細胞を用いた実験における、ＴＲＡＰ活性値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
β−ＴＣＰの焼結過程において、１０００度から１２００度にかけて急激な体積収縮が起こる（収縮速度が最大になるのは１１００度）。この急激な体積収縮によって内部に取り残された空隙はそのまま閉気孔となり、β−ＴＣＰの緻密体を得ることの弊害となっている。これはβ−ＴＣＰ結晶構造中のＣａ位置に存在する空孔によるものと考えられる（非特許文献１、２）。また、ナトリウムイオンをはじめとする１価陽イオンは、β−ＴＣＰの空孔にも置換固溶するため、結晶内での拡散速度は大きく、焼結過程での粒成長も大きくなる（非特許文献３、４）。このため、従来の技術を用いてβ−ＴＣＰとナトリウムイオンを固溶限界以内の量で固溶させると、均一相を持つ材料しか得ることが出来なかった。
【００２２】
そこで発明者らは、骨補填材の製造プロセスと、不均一な複合体からなる骨補填材を製造するための焼結の温度および時間に関する研究を行い、固溶している１価陽イオンの濃度が異なる、複数のβ−ＴＣＰ相からなる不均一の複合体、より具体的には、一価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相とβ−ＴＣＰ相のミクロドメイン構造を持つ複合体を作製することに成功した。以下、本発明の一実施形態に係る骨補填材について、図面を参照して説明する。
【００２３】
なお、固溶とは、２種類以上の元素が互いに溶け合い、全体が均一の固相になることをいう。また、焼結体とは、融点よりも低い温度で加熱して固化したものをいう。
【００２４】
（１）固溶形態
本発明に係るβ−ＴＣＰは、結晶中のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）をナトリウムイオン（Ｎａ＋）で置換固溶したものと、固溶成分を含まないβ−ＴＣＰとの二相成分で形成されている。β−ＴＣＰの溶解性は、その結晶構造、結晶性（粒子サイズなど）から影響を受ける。したがって、結晶中の所定量のカルシウムイオンをナトリウムイオンで置換した固溶体を形成し、固溶成分を含まないβ−ＴＣＰとの混相にすることで、得られる複合体の溶解性を制御することができる。
図１Ａおよび図１Ｂに、β−ＴＣＰの結晶構造を示す。図１Ａに示すように、β−ＴＣＰの空間群はＲ３ｃで菱面体晶系に属する。格子定数は六方格子設定でａ＝１．０４３９ｎｍ、ｃ＝３．７３７５ｎｍである。図１Ｂに示すように、β−ＴＣＰは、結晶構造中に、ＣａとＰＯ４四面体からなる、結晶学的に独立なＡおよびＢの２本のカラムが存在し、これらのカラムがｃ軸に平行に存在している。Ａカラムは、ＰＯ４（１）−Ｃａ（４）−Ｃａ（５）−ＰＯ４（１）−□（□：空孔）−Ｃａ（５）の繰り返しである。Ｃａ（４）サイトは、席占有率が約０．５であるため、Ａカラムには空孔が存在する結晶構造となっている。Ｂカラムは、ＰＯ４（３）−Ｃａ（１）−Ｃａ（２）−Ｃａ（３）−ＰＯ４（２）−ＰＯ４（３）−Ｃａ（１）−Ｃａ（２）−Ｃａ（３）−ＰＯ４（２）の繰り返しであり、このカラムの３つのＣａサイトはｃ軸上にのらず、折れ線を形成する。つまり、β−ＴＣＰ中の単位格子中には、結晶学的に独立したＰＯ４サイトが３種類、Ｃａサイトが５種類存在する。
【００２５】
図２に示すように、ナトリウムイオンなど１価の陽イオン（Ｍ＋）は、ＡカラムのＣａ（４）サイトおよび空孔に、２Ｍ＋＝Ｃａ２＋イオン＋□（□：空孔）の形態で固溶し、その固溶限界は９．１ｍｏｌ％であることが分かっている。また、β−ＴＣＰへの陽イオンの固溶の程度が、焼結性や溶解性に影響を与えることが分かっている。したがって、本発明では、ナトリウムイオンなど１価の陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰを作成し、その１価陽イオンの固溶濃度が異なるβ−ＴＣＰを複数用いて、１価陽イオン固溶濃度の異なる複数の相が不均一に混相した複合体（複合体の概念図を図４に示す。）を形成することで、溶解性の制御を可能とする骨補填材を得る。なお，β−ＴＣＰ結晶構造のＡカラムのＣａ（４）サイトは酸化物イオンと平面三配位構造をとり，その結合力は弱いという特徴ある原子位置である。このサイトに１価の陽イオンを固溶させると配位構造は歪んだ六配位をとるものの、ほかのカルシウムサイトにくらべて構造の安定性は高くならない。このため、固溶濃度が異なり溶解性に違いを生じても，その複合体に脆弱化や機械的な強度低下などの問題が生じるほどの顕著な溶解特性の違いは生じない（非特許文献５）。
【００２６】
（２）β−ＴＣＰおよび1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰの作製
本発明に係る骨補填材の製造に用いる、ナトリウムイオンを固溶させていないβ−ＴＣＰ単相（０ｍｏｌ）、ナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相（４．６ｍｏｌ単相）、およびナトリウムイオンを９．１ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相（９．１ｍｏｌ）の作製は、既存の方法に従って行うことができる。一例を図４に示す。
【００２７】
リン酸源及びカルシウム源としてリン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）と、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）を出発原料として用い、一価陽イオン源としてＮａ２ＣＯ３を用いた。（Ｃａ＋Ｎａ＋□）／Ｐのモル比を１．５７１（構造中の□（空孔）を考慮した組成）と一定とし、Ｎａ（ｍｏｌ％）＝Ｎａ／（Ｃａ＋Ｎａ＋□）として所定固溶量の１価陽イオンを配合した（ナトリウムイオン量はβ−ＴＣＰの全陽イオン位置に対してのｍｏｌ％として表示した。このことからナトリウムイオン量の増加に伴い、カルシウムイオン量と□量は減少する）。上記出発原料を、エタノールなどの有機溶媒中、アルミナボールミルで４８時間湿式混合した。その後、ロータリーエバポレータを用いてエタノールを除去した。溶媒除去後の混合体を、９００度で１２時間、大気雰囲気下で仮焼した。ここで得られた仮焼体を、めのう乳鉢を用いて１時間乾式混合した。得られた混合体を、９００度で１２時間、大気雰囲気下で仮焼し、目的とするβ−ＴＣＰおよび所定固溶量の1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰを得た。
【００２８】
（３）４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体および４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体からなる骨補填材試料の製造
本発明に係る、ナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体（４．６ｍｏｌ単相体）、およびナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体（複合体）の製造は、既存の方法に従って行うことができる。一例を図５に示す。
【００２９】
上述した方法によって得られたβ−ＴＣＰおよび1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰを、出発原料として用いた。上記出発原料に１ｗｔ％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液を添加して原料粉体を凝集させた後、篩を用いて、粒径が１０８μｍとなるようにそれぞれ分級した。ナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体（複合体）を形成する場合には、ナトリウムイオンを固溶させていないβ−ＴＣＰと、ナトリウムイオンを９．１ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰとを、モル比が１：１となるように、分級した試料を混合（複合）した（混合工程）。得られた混合体および４．６ｍｏｌ単相体を、それぞれ、３２ＭＰａで１分間、一軸加圧成型して成型体を作製し、当該成型体を焼成し（焼成工程）、焼結体を得た。金型はφ１０ｍｍ×３ｍｍまたはφ６ｍｍ×１ｍｍを用いた。また、焼成は、昇温速度３℃／ｍｉｎ、焼成温度１１００度〜１２００度、保持時間５〜６０分、大気雰囲気中の条件下で行った。
【００３０】
得られた４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体および４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体の表面の電子線マイクロアナライザ画像を、それぞれ図７、図８に示す。単相体を示している図７においては、Ｎａ、ＰおよびＣａが、各画像全体に均一に広がっている。これに対して、複合体を示している図８においては、各画像中で、Ｎａ、ＰおよびＣａが局在している箇所とそうでない箇所とが混在している。このことから、上述した本発明に係る製造方法によって、β−ＴＣＰ相と１価のナトリウムイオンを固溶させたβ−ＴＣＰ相とが不均一に混相した骨補填材の試料が得られることが確認できる。
【００３１】
単相体からなる試料を作製する場合には、一般的には２４時間以上の焼結時間をとる。一方で、ナトリウムイオンをはじめとする１価陽イオンは、結晶内での拡散速度が大きいこと知られている。このため、従来の技術を用いてβ−ＴＣＰとナトリウムイオンを固溶させると、ナトリウムイオンが固溶体中で拡散し、結果として均一相からなる材料しか得ることが出来なかった。これに対して、本発明に係る製造方法によれば、５分−６０分の範囲で成型体を焼成することで、ナトリウムイオンを拡散させずに、目的とする複合体、すなわち、１価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相とβ−ＴＣＰ相とが不均一に混相したミクロドメイン構造を持つ複合体が得られることを確認できた。
【００３２】
また、本発明によれば、出発原料であるβ−ＴＣＰおよび1価陽イオンを固溶させたβ−ＴＣＰの分級プロセスにおいて、ふるいの目のサイズを調節することによって、形成するドメインのサイズをコントロールすることも可能となる。
【００３３】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体吸収性試験における溶解性）
上述した製造方法により得られた骨補填材の試料を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生体吸収性試験を行った。
【００３４】
ナトリウムイオンを固溶させていないβ−ＴＣＰ単相体（０ｍｏｌ）、ナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体（４．６ｍｏｌ単相）、ナトリウムイオンを９．１ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体（９．１ｍｏｌ）、およびナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体（複合体）の各試料を、ｐＨ５．５０の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液中にナイロン製テグスでつるして浸漬し、２５度で０−２４時間攪拌させながら、カルシウムイオンの溶出量を測定した。その結果を図９に示す。図９の横軸は測定時間を、縦軸はカルシウムイオンの溶出濃度を表している。図９中で、「０ｍｏｌ」はナトリウムイオンを固溶させていないβ−ＴＣＰ単相体を、「４．６ｍｏｌ」はナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体を、「９．１ｍｏｌ」はナトリウムイオンを９．１ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体を、「複合」はナトリウムイオンを４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体を、それぞれ意味している。
【００３５】
図９に示すように、本発明に係る複合体からなる骨補填材の試料の溶解性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体吸収性試験の初期において、具体的には、測定開始から１２時間経過するまでは、非固溶のβ−ＴＣＰと同程度の溶解性を示すことが分かった。すなわち、本発明に係る複合体からなる骨補填材は、破骨細胞を呼び寄せるために十分な溶解性を確保していることが確認できた。
【００３６】
（複合体（ドメイン構造）形成の確認）
また、上述した生体吸収性試験後の、４．６ｍｏｌ単相体および複合体試料の表面を、走査型電子顕微鏡で撮影した写真を図１０に示す。本発明に係る方法で製造した骨補填材の試料では、単相体試料（図１０（ａ）および（ｂ））の場合には、試料表面の凹凸がほぼ均一に広がっているのに対し、複合体試料（図１０（ｃ）および（ｄ））の場合には、大きく凹んだ部分と凹凸が少なく比較的平坦な部分とに分かれている。すなわち、本発明に係る方法で製造した骨補填材の試料は、本実験の条件下でβ−ＴＣＰの相のみが溶解した部分に、空間が形成されたことを示している。これにより、本発明に係る方法で製造した骨補填材は、各相が不均一に混相した複合体（ドメイン構造）となることが確認できた。
【００３７】
均一に混合された材料（単相体。概念図を図３に示した。）を用いる場合には、溶解が均一に進行することから、空間ができにくい。これに対して、本発明のように、溶解性の高いβ−ＴＣＰ相と、それよりも溶解性の低い１価陽イオン固溶β−ＴＣＰ相からなる不均一の混相（複合体）とすることで、溶解性の高いβ−ＴＣＰが先に溶解し、その溶解した部分に空間ができる。その空間において、新たな骨生成を起こすことができ、同時にリモルディングを進行させることができる。
【００３８】
（破骨細胞様細胞を用いた評価）
上述の方法により得られた、４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ複合体（複合体）、および４．６ｍｏｌ％固溶させたβ−ＴＣＰ単相体（単相体）からなる試料を用いて、破骨細胞様細胞を用いた評価試験を行った。複合体および単相体は、上述の方法により、１１５０度で１０分間焼成したものを用いた。
【００３９】
４８ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅを用い、複合体、単相体それぞれに、マウスの骨髄から樹立したマクロファージ様細胞であるＣ７細胞を、５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ播種し、３時間、１，２，３および７日間培養後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙとＴＲＡＰ染色法によって評価を行った。培地としては、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用い、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．５
ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦを添加した。分化誘導因子としては、２０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ１０−８Ｍ １α、２５（ＯＨ）２Ｄ３、および１０−７Ｍデキサメタゾンを用いた。評価に用いた試料のｎ数は１０である。
【００４０】
ＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を図１１に、ＴＲＡＰ染色法の結果を図１２に示す。複合体および単相体上での破骨細胞の活性は、双方でほぼ同一であった。また、統計学上、図１１および図１２において、複合体と単相体との各試験データでは、ｐ＜０．０５で有意な差はなかった。すなわち、本発明に係る複合体からなる骨補填材は、非固溶のβ−ＴＣＰと同程度の溶解性を維持しつつ、固溶単相体と同程度の破骨細胞活性を維持していることが分かった。
【００４１】
以上から、本発明により得られた複合体からなる骨補填材は、破骨細胞への効果は維持しつつ、カルシウムイオンの溶出を促進することができる。すなわち、本発明による骨補填材は、β−ＴＣＰと同様の溶解度を持つことで破骨細胞を呼び寄せることができ、かつ、１価陽イオン固溶β−ＴＣＰと同様の破骨細胞の活性をもつことで破骨細胞を接着させることできる。したがって、本発明に係る骨補填材は、骨との結合を早い段階で確立することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年5月25日(2015.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
前記所定の形状が、円柱体、直方体、多角柱体、球体、楕円体、顆粒、または三次元データを使用した骨欠損と正確に適合する形状である請求項５に記載の骨補填材。
【国際調査報告】
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