(57)【要約】  精度よく鋳型核酸を分析する分析方法を提供する。  前記鋳型核酸における標的配列、および前記標的配列に対する相補配列の増幅を行う増幅工程、プローブと前記増幅工程で得られた増幅産物との温度変化に伴う会合または会合体の解離を検出する検出工程を有する鋳型核酸の分析方法とする。前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、前記プライマーセットが、プライマーの３’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列を合成する第一プライマーと、前記相補配列を合成する第２プライマーとの組合せであり、前記第１プライマーと前記第２プライマーのうち、前記プローブがハイブリダイズする配列の合成を開始するプライマーは、プライマー領域とプローブ領域とを含み、前記プライマー領域の５’末端に、前記プローブ領域が直接的または間接的に連結されたターンバックプライマーであり、他方のプライマーは、前記ポリメラーゼを３’端よりプライミングさせる能力のあるプライマーであれば何でも良く、前記増幅工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域から前記標的配列または前記相補配列を伸長し、前記検出工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プローブを兼ね、前記工程で得られた増幅産物は、その分子内において、前記ターンバックプライマーの前記プローブ領域が、伸長された前記標的配列または前記相補配列に向かって折り返されることによって、前記プローブ領域と前記標的配列または前記相補配列との会合を検出する。
2016140070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸の分析方法であって、
前記鋳型核酸における標的配列、および前記標的配列に対する相補配列の増幅を行う増幅工程、および、
プローブと前記増幅工程で得られた増幅産物との温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合、または、前記プローブと前記増幅産物との会合体の温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う解離を検出する検出工程を有し、
下記（Ａ）〜（Ｅ）の少なくとも一つの条件を満たすことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ａ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、プライマーの３’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列を合成する第一プライマーと、前記相補配列を合成する第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーと前記第２プライマーのうち、前記プローブがハイブリダイズする配列の合成を開始するプライマーは、プライマー領域とプローブ領域とを含み、前記プライマー領域の５’末端に、前記プローブ領域が直接的または間接的に連結されたターンバックプライマーであり、他方のプライマーは、前記ポリメラーゼを３’端よりプライミングさせる能力のあるプライマーであれば何でも良く、
前記増幅工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域から前記標的配列または前記相補配列を伸長し、
前記検出工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プローブを兼ね、前記工程で得られた増幅産物は、その分子内において、前記ターンバックプライマーの前記プローブ領域が、伸長された前記標的配列または前記相補配列に向かって折り返されることによって、前記プローブ領域と前記標的配列または前記相補配列との会合を検出することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｂ）  前記検出工程が、高温温度点から低温温度点に向かって温度変化させ、前記温度変化に伴う前記プローブと前記増幅産物との会合を検出する工程を含むことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｃ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記プローブまたは前記（Ａ）の前記プローブ領域がハイブリダイズする配列を合成するポリメラーゼがプライミングするプライマーを、他方のプライマーよりも多く使用することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｄ）  前記プローブにおいて、前記標的配列または前記相補配列にハイブリダイズする領域の長さが、６〜１００塩基長であることを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｅ）  前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の上流領域と同じ配列を有し、
前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の下流領域に相補な配列を有し、
（ｅ１）または（ｅ２）を満たすことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（ｅ１）前記プローブが、前記標的配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の３’末端の下流側近傍に位置する。
（ｅ２）前記プローブが、前記相補配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端は、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の３’末端の下流側近傍に位置する。
【請求項２】
前記鋳型核酸の分析方法が、前記鋳型核酸における標的の核酸変異部位に存在する核酸変異を分析する方法であって、
前記標的配列が、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を有する標的配列であり、
前記増幅工程が、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を有する標的配列、および前記標的配列に対する相補配列の増幅を行う工程であり、
前記検出工程において、前記プローブと前記増幅工程で得られた増幅産物との温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化、もしくは塩濃度変化に伴う会合、または、前記プローブと前記増幅産物との会合体の温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化、もしくは塩濃度変化に伴う解離を検出する工程であり、
前記プローブは、前記核酸変異部位を含む前記標的配列または前記相補配列にハイブリダイズし、
前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とフルマッチの場合、または、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とそれとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なることにより、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できる、請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記（Ｂ）の条件を満たし、
前記高温温度点および前記低温温度点は、（ｂ１）または（ｂ２）を満たす、請求項２記載の分析方法。
（ｂ１）前記高温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でミスマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、前記低温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でフルマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも低温度領域にあるいずれかの温度点と定義される。
（ｂ２）前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合と、それとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合、
前記高温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に低いＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、
前記低温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に高いＴｍ値より低温度領域にあるいずれかの温度点である。
【請求項４】
前記（Ｅ）の条件を満たし、
前記任意部位が、前記核酸変異部位であり、
前記第１プライマーは、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の前記上流領域と同じ配列を有し、
前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の前記下流領域に相補的な配列を有する、請求項２または３記載の分析方法。
【請求項５】
前記増幅工程における増幅方法が、ＰＣＲである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記プローブが、Ｆｌｕｏｌｏｇｅｎｉｃプローブである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記プローブが、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を含み、前記２つ蛍光性原子団が、それぞれ、前記プローブ内の同一塩基または互いに隣接する２つの塩基に、リンカーを介して結合した構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記検出工程を、インターカレーターの存在下で行い、
前記インターカレーターは、前記プローブのハイブリダイゼーションにより形成された二重らせん構造に、インターカレーションしたときに発色する蛍光色素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記（Ａ）〜（Ｅ）の条件を、以下のいずれか一つの組合せで満たす、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ａ）と（Ｂ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｅ）との組合せ
【請求項１０】
前記検出工程を、ＤＭＳＯ、ベタイン、尿素、ホルムアミド、およびホルマリンからなる群から選択された少なくとも一つの添加剤の存在下で行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記（Ａ）の条件を満たし、
前記増幅工程を、ニッケースの存在下で行うことにより、もしくは、前記増幅工程後にニッケースを添加することにより、「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーから合成される核酸鎖」のいずれかの部分にニッケース認識配列をデザインし、
「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーから合成される核酸鎖」の相補鎖に、ニックを入れる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記（Ａ）の条件を満たし、
前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域の５’末端に、介在配列を介して、前記プローブ領域が間接的に連結されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の介在配列に、請求項１１のニッケースの認識配列が存在する、請求項１２記載の分析方法。
【請求項１４】
前記（Ａ）の条件を満たし、
（ａ１）、（ａ１’）、（ａ２）または（ａ２’）を満たす、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分析方法。
（ａ１）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
（ａ１’）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
（ａ２）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
（ａ２’）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
【請求項１５】
前記（Ｃ）の条件を満たし、
前記一方のプライマー（Ｍ）を、前記他方のプライマー（Ｓ）よりも高濃度のプライマーとし、そのモル比（Ｍ：Ｓ）をＸ：１とした時、Ｘの値が、１＜Ｘ≦１０６の範囲である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記プローブが、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団のセットを、少なくとも２セットを含むＦＲＥＴプローブ、または、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団セットを少なくとも１つ以上とエキシトン効果を示さない色素を１つ以上含むＦＲＥＴプローブであり、
前記２つのセットは、それぞれ、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団が、前記プローブ内の同一塩基に、リンカーを介して結合しているか、または、隣接する２つの塩基にそれぞれ結合しており、前記２つのセットは、前記プローブ内にＦＲＥＴ効果を示すように配置されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１７】
前記２つのセットのうち１セット（以下、一対の蛍光性原子団Ａと呼ぶ）が有する発光ピーク波長は、他方の１セット（以下、一対の蛍光性原子団Ｂと呼ぶ）が有する励起ピーク波長よりも短く、
前記一対の蛍光性原子団Ａと、前記一対の蛍光性原子団Ｂとは、ＦＲＥＴ効果を有する、請求項１６記載の分析方法。
【請求項１８】
前記一対の蛍光性原子団Ａを有する塩基と、前記一対の蛍光性原子団Ｂを有する塩基とは、前記一対の蛍光性原子団Ａと前記一対の蛍光性原子団ＢとがＦＲＥＴ効果を有するような距離で、前記プローブに含まれる、請求項１６または１７記載の分析方法。
【請求項１９】
前記一対の蛍光性原子団Ａを有する塩基と、前記一対の蛍光性原子団Ｂを有する塩基の間の距離は、１塩基〜１１塩基である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２０】
前記エキシトン効果を示す一対の蛍光性原子団を有する塩基は、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、または（１７ｂ）で表される構造を有する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の分析方法。
【化１６】
2016140070.tif 000030
【化１６ｂ】
2016140070.tif 000031
【化１７】
2016140070.tif 000032
【化１７ｂ】
2016140070.tif 000033
【請求項２１】
前記プローブが、非ヌクレオチド残基，修飾ヌクレオチド残基，および非天然主骨格の少なくとも一つを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記非天然主骨格が、ＬＮＡ、ＰＮＡ、および修飾型リン酸ジエステル結合をもつ核酸の少なくとも一つである、請求項２１記載の分析方法。
【請求項２３】
前記（Ａ）および（Ｃ）〜（Ｅ）の少なくとも一つの条件を満たし、
前記検出工程が、低温温度点から高温温度点に向かって温度変化させ、温度変化に伴う前記プローブと前記増幅産物との会合体の解離を検出する工程である、請求項１、２および４〜２２のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の分析方法を実行するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の分析方法を実行するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型核酸の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の解析において、プライマーを用いた鋳型核酸の増幅、および、得られた増幅産物とプローブとのハイブリダイズを利用する分析方法が、広く汎用されている。この方法によれば、例えば、標的配列の有無の分析（定性分析）、前記標的配列の量の分析（定量分析）、前記標的配列における多型部位のタイピング等を行うことができる。前記タイピングでは、例えば、前記多型部位の塩基の種類（例えば、野生型か変異型か）、接合型（ホモ接合型かヘテロ接合型か）等が決定できる。【０００３】
前記定性分析および前記定量分析は、例えば、以下のように行われる。まず、前記鋳型核酸について、プライマーセットを用いて標的配列を増幅する。そして、得られた増幅産物と、前記標的配列にハイブリダイズするプローブとを接触させ、前記両者の会合（ハイブリダイズによる二本鎖形成）または前記会合体の解離を検出する。前記会合または前記解離の有無によって、前記標的配列の有無が判断でき、前記会合の量または解離の量によって、前記標的配列の量が判断できる。【０００４】
また、タイピングの場合は、前記標的配列にハイブリダイズするプローブとして、前記多型部位の塩基の種類によって、前記多型部位に対してフルマッチまたはミスマッチとなるプローブを使用する。前記プローブは、フルマッチとの会合の方が、ミスマッチとの会合よりも、高い特異性すなわち高いＴｍ値を示す。そこで、前記プローブと前記標的配列とを接触させ、会合状態である低温域から、高温域への温度変化を行い、温度上昇に伴う前記会合体の解離をシグナルとして検出し、ミスマッチのＴｍ値とフルマッチのＴｍ値のいずれにおいて解離が生じたかを判断することによって、前記標的配列における前記多型部位をタイピングできる。前記判断は、通常、時間の変化量とシグナルの変化量との一次微分値をプロットした解離曲線（一次微分曲線）を用いて行われる。すなわち、前記解離曲線について、前記ミスマッチのＴｍ値と前記フルマッチのＴｍ値における解離を示すピークの有無を確認する。低い温度（ＴＬ）である前記ミスマッチのＴｍ値にピークがあれば、前記多型部位がミスマッチの塩基である標的配列と判断され、高い温度（ＴＨ）である前記フルマッチのＴｍ値を示すピークがあれば、前記多型部位がフルマッチの塩基である標的配列と判断され、また、１つのピークであれば、ホモ接合型と判断され、２つのピークであれば、ヘテロ接合型と判断される。【０００５】
しかしながら、このような増幅とプローブのハイブリダイゼーションとを用いた分析方法においては、例えば、以下のような問題がある。【０００６】
まず、前記プローブの非特異的結合によるバックグラウンドの上昇という問題である。すなわち、前記プローブが、前記標的配列以外の非標的配列にハイブリダイズした場合、この会合または前記会合体の解離も検出されることから、これによってバックグラウンドが上昇する。また、前記タイピングの場合、前記多型部位がフルマッチの標的配列であり且つホモ接合型であれば、前記融解曲線においては、高い温度（ＴＨ）のみに１つのピークがでることになる。しかしながら、図１（Ａ）に示すように、コントロールについても、前記ホモ接合型であるフルマッチの標的配列についても、低温域においてバックグラウンドの上昇がみられる場合がある。【０００７】
つぎに、前記融解曲線において、ピークの半値幅が広い、つまりピークがシャープでないという問題である。図１（Ｂ）に示すように、前記融解曲線においてピークが得られているものの、ピークがシャープではないため、所定の温度（ＴＨ）に特有のピークであるか否かの判断が困難な場合がある。【０００８】
つぎに、前記タイピングの場合に、前記フルマッチの標的配列のピークと前記ミスマッチの標的配列のピークとの間の距離が狭いという問題がある。図１（Ｃ）に示すように、温度（ＴＬ）と温度（ＴＨ）において、それぞれピークは見られるが、ピーク間の距離が狭いため、いずれの温度のピークであるかが判断し難い場合や、１つのピークか２つのピークかを判断しがたい場合がある。【０００９】
つぎに、前記ヘテロ接合型のタイピングの場合に、分離性が不十分であるという問題がある。図１（Ｄ）に示すように、高い温度（ＴＨ）においてピークがみられるが、低い温度（ＴＬ）においてピークが小さく、ヘテロ接合型か否かの判断が困難な場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、例えば、より精度に優れる、核酸変異部位における核酸変異の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、鋳型核酸の分析方法であって、
前記鋳型核酸における標的配列、および前記標的配列に対する相補配列の増幅を行う増幅工程、および、
プローブと前記増幅工程で得られた増幅産物との温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合、または、前記プローブと前記増幅産物との会合体の温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う解離を検出する検出工程を有し、
下記（Ａ）〜（Ｅ）の少なくとも一つの条件を満たすことを特徴とする。
（Ａ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、プライマーの３’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列を合成する第一プライマーと、前記相補配列を合成する第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーと前記第２プライマーのうち、前記プローブがハイブリダイズする配列の合成を開始するプライマーは、プライマー領域とプローブ領域とを含み、前記プライマー領域の５’末端に、前記プローブ領域が直接的または間接的に連結されたターンバックプライマーであり、他方のプライマーは、前記ポリメラーゼを３’端よりプライミングさせる能力のあるプライマーであれば何でも良く、
前記増幅工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域から前記標的配列または前記相補配列を伸長し、
前記検出工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プローブを兼ね、前記工程で得られた増幅産物は、その分子内において、前記ターンバックプライマーの前記プローブ領域が、伸長された前記標的配列または前記相補配列に向かって折り返されることによって、前記プローブ領域と前記標的配列または前記相補配列との会合を検出することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｂ）  前記検出工程が、高温温度点から低温温度点に向かって温度変化させ、前記温度変化に伴う前記プローブと前記増幅産物との会合を検出する工程を含むことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｃ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記プローブまたは前記（Ａ）の前記プローブ領域がハイブリダイズする配列を合成するポリメラーゼがプライミングするプライマーを、他方のプライマーよりも多く使用することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｄ）  前記プローブにおいて、前記標的配列または前記相補配列にハイブリダイズする領域の長さが、６〜１００塩基長であることを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（Ｅ）  前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の上流領域と同じ配列を有し、
前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の下流領域に相補な配列を有し、
（ｅ１）または（ｅ２）を満たすことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（ｅ１）前記プローブが、前記標的配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の３’末端の下流側近傍に位置する。
（ｅ２）前記プローブが、前記相補配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端は、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の３’末端の下流側近傍に位置する。【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記本発明の分析方法を実行するためのオリゴヌクレオチドである。【００１３】
本発明の装置は、前記本発明の分析方法を実行するための装置である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、前記鋳型核酸を精度よく分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、融解曲線の一例を示す図である。
【図２】図２は、本発明の分析方法による解析曲線の一例を示す図である。
【図３】図３は、本発明におけるプライマーおよびプローブの設計の概略を示す図である。
【図４】図４は、本発明におけるターンバックプライマーの概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の分析方法は、例えば前記鋳型核酸の分析方法が、前記鋳型核酸における標的の核酸変異部位に存在する核酸変異を分析する方法であって、
前記標的配列が、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を有する標的配列であり、
前記増幅工程が、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を有する標的配列、および前記標的配列に対する相補配列の増幅を行う工程であり、
前記検出工程において、前記プローブと前記増幅工程で得られた増幅産物との温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化、もしくは塩濃度変化に伴う会合、または、前記プローブと前記増幅産物との会合体の温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化、もしくは塩濃度変化に伴う解離を検出する工程であり、
前記プローブは、前記核酸変異部位を含む前記標的配列または前記相補配列にハイブリダイズし、
前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とフルマッチの場合、または、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とそれとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なることにより、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できる。
【００１７】
本発明の分析方法は、例えば、前記高温温度点および前記低温温度点は、（ｂ１）または（ｂ２）を満たす。
（ｂ１）前記高温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でミスマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのTm値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、前記低温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でフルマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのTm値よりも低温度領域にあるいずれかの温度点と定義される。
（ｂ２）前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合と、それとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合、
前記高温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に低いＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、
前記低温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に高いＴｍ値より低温度領域にあるいずれかの温度点である。
【００１８】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ｅ）の条件を満たし、
前記任意部位が、前記核酸変異部位であり、
前記第１プライマーは、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の前記上流領域と同じ配列を有し、
前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の前記下流領域に相補的な配列を有する。
【００１９】
本発明の分析方法において、例えば、前記増幅工程における増幅方法が、ＰＣＲである。
【００２０】
本発明の分析方法において、例えば、前記プローブが、Fluologenicプローブである。
【００２１】
本発明の分析方法において、例えば、前記プローブが、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を含み、前記２つ蛍光性原子団が、それぞれ、前記プローブ内の同一塩基または互いに隣接する２つの塩基に、リンカーを介して結合した構造を有する。
【００２２】
本発明の分析方法において、前記検出工程を、インターカレーターの存在下で行い、
前記インターカレーターは、前記プローブのハイブリダイゼーションにより形成された二重らせん構造に、インターカレーションしたときに発色する蛍光色素である。
【００２３】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ａ）〜（Ｅ）の条件を、以下のいずれか一つの組合せで満たす。
（Ａ）と（Ｂ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｅ）との組合せ
【００２４】
本発明の分析方法は、例えば、前記検出工程を、ＤＭＳＯ、ベタイン、尿素、ホルムアミド、およびホルマリンからなる群から選択された少なくとも一つの添加剤の存在下で行う。
【００２５】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ａ）の条件を満たし、前記増幅工程を、ニッケースの存在下で行うことにより、もしくは、前記増幅工程後にニッケースを添加することにより、「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーから合成される核酸鎖」のいずれかの部分にニッケース認識配列をデザインし、
「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーから合成される核酸鎖」の相補鎖に、ニックを入れる工程を含む。
【００２６】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ａ）の条件を満たし、前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域の５’末端に、介在配列を介して、前記プローブ領域が間接的に連結されている。
【００２７】
本発明の分析方法は、例えば、前記介在配列に、前記ニッケースの認識配列が存在する。
【００２８】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ａ）の条件を満たし、（ａ１）、（ａ１’）、（ａ２）または（ａ２’）を満たす。
（ａ１）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
（ａ１’）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
（ａ２）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
（ａ２’）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
【００２９】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ｃ）の条件を満たし、前記（Ｃ）の条件を満たし、
前記一方のプライマー（Ｍ）を、前記他方のプライマー（Ｓ）よりも高濃度のプライマーでとし、そのモル比（Ｍ：Ｓ）をＸ：１とした時、Ｘの値が、１＜Ｘ≦１０６の範囲である。
【００３０】
本発明の分析方法は、例えば、前記プローブが、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団のセットを、少なくとも２セットを含むＦＲＥＴプローブ、または、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団セットを少なくとも１つ以上とエキシトン効果を示さない色素を１つ以上含むＦＲＥＴプローブであり、
前記２つのセットは、それぞれ、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団が、前記プローブ内の同一塩基に、リンカーを介して結合しているか、または、隣接する２つの塩基にそれぞれ結合しており、前記２つのセットは、前記プローブ内にＦＲＥＴ効果を示すように配置されている。
【００３１】
本発明の分析方法は、例えば、前記プローブが、非ヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド残基および非天然主骨格の少なくとも一方を含む。
【００３２】
本発明の分析方法は、例えば、前記非天然主骨格が、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび修飾型リン酸ジエステル結合をもつ核酸の少なくとも一方である。
【００３３】
本発明の分析方法は、例えば、前記（Ａ）および（Ｃ）〜（Ｅ）の少なくとも一つの条件を満たし、
前記検出工程が、低温温度点から高温温度点に向かって温度変化させ、温度変化に伴う前記プローブと前記増幅産物との会合体の解離を検出する工程である。この場合、前記高温域および前記低温域は、例えば、（ｂ１）または（ｂ２）を満たす。
（ｂ１）前記高温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でミスマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのTm値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、前記低温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でフルマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのTm値よりも低温度領域にあるいずれかの温度点と定義される。
（ｂ２）前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合と、それとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合、
前記高温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に低いＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、
前記低温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に高いＴｍ値より低温度領域にあるいずれかの温度点である。
【００３４】
以下、本発明について具体例をあげて説明するが、本発明は、以下の説明により限定されない。
【００３５】
本発明の適用範囲は、プライマーを用いて得た増幅産物とプローブとの会合またはその会合体の解離の検出を利用する鋳型核酸の分析であればよく、鋳型核酸の分析内容は、特に制限されない。
【００３６】
本発明における鋳型核酸の分析としては、第１の例として、前記鋳型核酸の有無の分析（定性分析）または量の分析（定量分析）があげられる。この場合、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列を増幅させ、得られた増幅産物と前記プローブとの会合または前記会合体の解離を検出することで、前記鋳型核酸の有無または量を分析できる。
【００３７】
第２の例として、前記鋳型核酸における核酸変異部位に存在する核酸変異の分析、いわゆるタイピングが例示できる。前記核酸変異部位は、例えば、一塩基多型等の多型部位である。前記核酸変異の分析は、具体例として、前記核酸変異部位における野生型と変異型との判別、前記核酸変異部位における異なる変異型の判別、ホモ接合体とヘテロ接合体との判別等があげられる。この場合、前記鋳型核酸における標的配列およびその相補配列を増幅させ、得られた増幅物と前記プローブとの会合または前記会合体の解離を検出し、前記会合または前記解離が生じる条件（例えば、温度、ｐＨ、変性剤濃度、塩濃度等）から、前記核酸変異部位をタイピングできる。
【００３８】
本発明において、前記標的配列は、前記鋳型配列における任意部位を含む領域の配列であり、前記相補配列は、前記標的配列に対して相補的な配列である。本発明において、前記標的配列および前記相補配列は、前記増幅工程において増幅される。前記任意部位は、特に制限されない。
【００３９】
本発明をタイピングに適用する場合、前記任意部位は、例えば、核酸変異部位である。前記核酸変異部位は、例えば、鋳型核酸における、検出目的の核酸変異が存在する部位である。この場合、前記標的配列は、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位を含む領域の配列であり、前記相補配列は、前記標的配列に対して相補的な配列である。
【００４０】
本発明において、前記増幅工程は、核酸サンプルを用いて行うことができる。前記核酸サンプルは、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前者の場合、例えば、前記一本鎖核酸が前記鋳型核酸となる。後者の場合、例えば、前記二本鎖核酸を構成する一対の一本鎖核酸のうち、いずれの一本鎖核酸を、前記標的配列を含む鋳型核酸に設定してもよい。具体的には、前記一対の一本鎖核酸のうち、例えば、センス鎖を、前記標的配列を含む鋳型核酸に設定してもよいし、アンチセンス鎖を、前記標的配列を有する鋳型核酸に設定してもよい。
【００４１】
本発明において、前記増幅工程における増幅方法は、特に制限されない。前記増幅方法は、特に示さない限り、例えば、非等温増幅方法でもよいし、等温増幅方法でもよい。前記非等温増幅方法としては、例えば、ＰＣＲがあげられる。前記等温増幅方法は、例えば、SmartAmp法（NATURE  METHODS  (2007)  VOL.4  NO.3  p257、特許第3897805号）、ＳＤＡ（SDA；strand  displacement  amplification、特公平７−１１４７１８号公報）、改良ＳＤＡ法（米国特許第５８２４５１７号、国際公開第９９／０９２１１号、国際公開第９５／２５１８０号）、核酸配列増幅法（NASBA；nucleic  acid  sequence  based  amplification、日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＬＡＭＰ法（Lamp；Loop-Mediated  Isothermal  Amplification、日本国特許第３３１３３５８号、Nucleic  Acids  Research，2000，Vol.28，No.12，e63）、ＩＣＡＮ法（ICAN；Isothermal  and  Chimeric  primer-initiated  Amplification  of  Nucleic  acids、国際公開第０２／１６６３９号）、自立複製法（3SR；self-sustainedsequence  replication）法、ＴＭＡ（transcription-mediated  amplification）法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ（rolling  cycle  amplification）法等があげられる。
【００４２】
前記増幅工程は、反応液中で行われることが好ましい。前記反応液は、例えば、前記増幅方法の種類に応じて、適宜、必要な試薬を含む。前記反応液は、例えば、前記核酸サンプル（鋳型核酸）の他、例えば、プライマーセット、ポリメラーゼ等の酵素、増幅用のモノマー核酸（ｄＮＴＰ）、緩衝液等を含む。
【００４３】
前記増幅工程における増幅方法は、ＰＣＲが好ましい。ＰＣＲの工程および条件は、特に制限されず、従来の工程および条件が採用できる。ＰＣＲは、例えば、二本鎖核酸の解離工程、一本鎖核酸に対するプライマーのアニーリング工程、およびプライマーからの伸長工程を含み、各工程の条件は、適宜設定できる。
【００４４】
前記増幅工程は、例えば、プライマーセットを使用して行われる。前記プライマーセットは、例えば、プライマーの３’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列を合成する第１プライマーと、前記相補配列を合成する第２プライマーとの組合せである。前記プライマーセットは、例えば、前記鋳型核酸の配列に応じて適宜設定できる。
【００４５】
前記プライマーセットの設定は、例えば、図３が参照できる。図３は、前記鋳型核酸と前記プライマーセットとの関係を示す概略図である。図３において、白抜き領域は、前記鋳型核酸の対応箇所と同じ配列であることを意味し、黒塗領域は、前記鋳型核酸の対応箇所と相補の配列であることを意味する（以下、同様）。図３に示すように、前記第１プライマーは、例えば、前記鋳型核酸における任意部位（例えば、前記核酸変異部位）の上位領域と同じ配列を有する。前記第１プライマーの配列は、例えば、前記同じ配列のみでもよいし、前記同じ配列と他の配列とを含んでもよい。後者の場合、前記第１プライマーは、その３’末端領域に、前記同じ配列が配置されていることが好ましい。前記第２プライマーは、例えば、前記鋳型核酸における任意部位（例えば、前記核酸変異部位）の下流領域に相補な配列を有する。前記第２プライマーの配列は、例えば、前記相補な配列のみでもよいし、前記相補な配列と他の配列とを含んでもよい。後者の場合、前記第２プライマーは、その３’末端領域に、前記相補な配列が配置されていることが好ましい。
【００４６】
本発明において、前記検出工程で使用するプローブは、前記任意部位を含む前記標的配列にハイブリダイズするプローブでもよいし、前記相補配列にハイブリダイズするプローブでもよい。前記プローブは、例えば、前記鋳型核酸の配列に応じて適宜設定できる。前者のプローブは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズする配列を含む。前記プローブの配列は、前記ハイブリダイズする配列のみでもよいし、前記ハイブリダイズする配列と他の配列とを含んでもよい。後者のプローブは、例えば、前記相補配列にハイブリダイズする配列を含む。前記プローブの配列は、前記ハイブリダイズする配列のみでもよいし、前記ハイブリダイズする配列と他の配列とを含んでもよい。
【００４７】
前記プローブの設定は、例えば、図３が参照できる。図３は、前記鋳型核酸と前記プローブとの関係を示す概略図である。図３に示すように、前記プローブが、前記標的配列にハイブリダイズするプローブ（Ｔｓｅｑ用プローブ）の場合、例えば、前記鋳型核酸における任意部位Ｎ（例えば、前記核酸変異部位）を含む領域に相補的な配列を含むように設計できる。前記Ｔｓｅｑ用プローブにおいて、前記鋳型核酸の任意部位Ｎに対応する箇所は、任意部位Ｎに相補的なＮｃを有する。また、前記プローブが、前記相補配列にハイブリダイズするプローブ（Ｃｓｅｑ用プローブ）の場合、例えば、前記鋳型核酸における任意部位（例えば、前記核酸変異部位）を含む領域と同じ配列を含むように設計できる。
【００４８】
本発明をタイピングに適用する場合、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位の塩基は、例えば、野生型に設定してもよいし、変異型に設定してもよいし、複数の変異型が存在する場合は、いずれの変異型に設定してもよい。
【００４９】
本発明をタイピングに適用する場合、前記プローブは、例えば、タイピング用プローブということもできる。前記プローブは、例えば、以下に示す第１形態および第２形態があげられる。前記第１形態は、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とフルマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なり、その解離温度または会合温度により、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できるプローブである。前記第１形態のプローブによれば、前記解離温度または前記会合温度から、前記プローブが前記核酸変異部位とミスマッチかフルマッチかを判断できるため、その結果、前記核酸変異部位の塩基が、目的の変異か否か（例えば、変異型か野生型か）を検出できる。前記プローブが、例えば、変異型の前記核酸変異部位にフルマッチするプローブｍｔの場合、前記プローブｍｔは、前記核酸変異部位がミスマッチとなる野生型標的配列ｗｔよりも、前記核酸変異部位がフルマッチとなる変異型標的配列ｍｔに対して強い会合力を示す。このため、前記プローブｍｔと前記変異型標的配列ｍｔとの会合温度は、前記プローブｍｔと前記野生型標的配列ｗｔとの会合温度よりも、高くなる。
【００５０】
また、前記第２形態は、前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合とそれとはＴｍ（融解温度：Melting  Temperature）値が異なるミスマッチの場合で、解離温度または会合温度が異なり、その解離温度または会合温度により、前記核酸変異部位の核酸変異を検出できるプローブである。前記第２形態のプローブによれば、前記解離温度または前記会合温度から、前記プローブが前記核酸変異部位といずれのミスマッチであるかを判断できるため、その結果、前記核酸変異部位の塩基が、目的の変異か否か（例えば、変異型か野生型か）を検出できる。
【００５１】
前記検出工程は、前記プローブと前記増幅産物との間における会合またはその会合体の解離を検出する。このため、前記プローブは、例えば、前記会合体の状態と、前記会合体の解離の状態とで、シグナルの挙動が異なるものが好ましい。前記会合体の状態とは、例えば、前記プローブが前記増幅産物にハイブリダイゼーションして二本鎖（会合体）を形成した状態であり、前記会合体の解離の状態とは、例えば、前記プローブが、前記二本鎖から遊離して、一本鎖に戻った状態である。
【００５２】
前記シグナルの挙動が異なるとは、例えば、前記会合状態でシグナルを発し、前記解離状態でシグナルが消失または減衰する形態でもよいし、前記解離状態でシグナルを発し、前記解離状態でシグナルが消失または減衰する形態でもよい。本明細書においては、以下、前者の形態、すなわち、前記会合状態でシグナルを発し、前記解離状態でシグナルが消失または減衰する形態を例にあげるが、これには限定されず、後者の形態に読み替え可能である。
【００５３】
前記シグナルの種類は、特に制限されず、検出可能であればよく、例えば、蛍光、発光、発色等のシグナルがあげられ、前記検出工程においては、例えば、シグナル強度の測定により、前記会合または前記解離を検出できる。本明細書においては、以下、特に示さない限り、前記シグナルとして蛍光シグナルを例にあげるが、これには限定されず、例えば、発光、発色等のシグナルに読み替え可能である。
【００５４】
前記シグナルは、例えば、前記プローブ自身によるシグナルでもよいし、前記プローブ以外の試薬によるシグナルでもよい。前記シグナルを発するプローブとしては、特に制限されず、例えば、Fluologenicプローブ、エキシトンプローブ（Ｅプローブ）等があげられる。前記シグナルを発する試薬としては、例えば、インターカレーターがあげられる。
【００５５】
前記Fluologenicプローブは、例えば、二本鎖形成により、蛍光のシグナルを発生するプローブであり、具体的には、例えば、前記シグナルを発生する標識物質が結合した標識化プローブである。前記標識化プローブとしては、例えば、TaqMan（登録商標）プローブ等があげられる。また、本発明においては、前記プローブとして、前記Fluologenicプローブの他に、例えば、二本鎖形成により、発光のシグナルを発生する発光プローブ（ルミネッセンスプローブ）または発色のシグナルを発生する発色プローブ（カラリングプローブ）等の標識化プローブも使用できる。
【００５６】
前記Ｅプローブは、例えば、エキシトン効果を示す少なくとも２つの蛍光性原子団を含み、前記２つ蛍光性原子団が、それぞれ、前記プローブ内の同一塩基または互いに隣接する２つの塩基に、リンカーを介して結合したプローブである。
【００５７】
前記Ｅ−プローブは、例えば、特許第4370385号公報、国際公開公報ＷＯ２０１４／０１３９５４号パンフレットを参照できる。
【００５８】
前記Ｅプローブは、２個の蛍光性原子団（例えば、チアゾールオレンジやその類似物）が導入されたプローブであり、１本鎖の場合は、２個の蛍光性原子団がエキシプレックスを形成するエキシトン効果により、蛍光をほとんど発しないが、ターゲットとハイブリダイズさせると、２個の蛍光性原子団がお互いに離れ、エキシトン効果を解消することによって大きく蛍光を発するという性質を持つ。なお、「Ｅプローブ」は、株式会社ダナフォームの商品名（「Eprobe」は登録商標）であるが、本発明における「Ｅプローブ」は、「Ｅプローブ」または「Eprobe」の商品名を付された商品と同一であっても、同一でなくても良い。
【００５９】
前記Ｅプローブは、例えば、３’末端が、伸長不可なように修飾されてもよく、具体的には、例えば、３’末端をリンカーＯＨ基で化学修飾したものでもよい。
【００６０】
前記Ｅプローブにおいて、前記エキシトン効果を示す蛍光性原子団は、
（ｉ）一つの分子内の二つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには二つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
（ii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
（iii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記（ii）または（iii）の場合において、前記色素分子が、前記（ｉ）記載の分子であることが好ましい。
【００６１】
前記Ｅプローブにおいて、核酸分子の構造は、例えば、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む標識核酸であっても良い。また、これらの互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩も、本発明における標識核酸に含まれる。以下、蛍光性を示す原子団Ｚ１１およびＺ１２を有する、下記各式で表される構造を、「標識構造」といることがある。また、前記標識構造を含む前記標識核酸を「標識プローブ」ということがある。
【００６２】
【化１６】
2016140070.tif 000003
【化１６ｂ】
2016140070.tif 000004
【化１７】
2016140070.tif 000005
【化１７ｂ】
2016140070.tif 000006
【化１８】
2016140070.tif 000007
【化１８ｂ】
2016140070.tif 000008
【００６３】
式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【００６４】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、それぞれ２以上の整数であることが好ましい。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、上限は特に制限されないが、例えば１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
【００６５】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である。これにより、ターゲット配列と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えば、二重らせん構造となったときの蛍光の増大が大きく、ターゲット配列をいっそう効果的に検出することができる。
【００６６】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であればよく、特に制限されない。Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。DNA等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがDNAの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、DNA検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつDNAにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやCy3等の色素も挙げられる。
【００６７】
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団であることがより好ましい。
【化７】
2016140070.tif 000009
【化８】
2016140070.tif 000010
【化９】
2016140070.tif 000011
【００６８】
式（７）〜（９）中、
Ｘ１およびＸ２は、Ｓ、ＳｅまたはＯであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００６９】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。
【００７０】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。
【００７１】
Ｚ１１およびＺ１２は、前記式（７）〜（９）で表される場合は、例えば、それぞれ独立に、下記式（１９）または（２０）で示される基であることがより好ましい。
【化１９】
2016140070.tif 000012
【化２０】
2016140070.tif 000013
【００７２】
前記式（１９）および（２０）中、Ｘ１は−Ｓ−又は−Ｏ−を示す。Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、又はアミノ基を示す。Ｒ１１及びＲ１２の一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１およびＬ２に結合する連結基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の他方は水素原子、または低級アルキル基を示す。
【００７３】
また、Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記の各化学式のいずれかで表される原子団であることが特に好ましい。
【化１Ｚ】
2016140070.tif 000014
【化２Ｚ】
2016140070.tif 000015
【化３Ｚ】
2016140070.tif 000016
【化４Ｚ】
2016140070.tif 000017
【化５Ｚ】
2016140070.tif 000018
【化６Ｚ】
2016140070.tif 000019
【００７４】
上記各化学式中、
ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが特に好ましい。
【００７５】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｂは、天然核酸塩基骨格を有していても良いが、前述の通り、人工核酸塩基骨格を有していてもよい。例えば、Ｂが、Py（ピリミジン環）、Py  der.、Pu（プリン環）、またはPu  der.で表される構造であることが好ましい。ただし、
前記Pyとは、下記式（１１）で表記される6員環のうち、1位にＥと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py  der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、9位にＥと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu  der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【００７６】
【化１１−１２】
2016140070.tif 000020
【００７７】
また、前記Ｅｅプローブにおける前記核酸分子は、例えば、下記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４または１１４−２で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含んでいても良い。
【化１０６】
2016140070.tif 000021
【化１１０】
2016140070.tif 000022
【化１１３】
2016140070.tif 000023
【化１１７】
2016140070.tif 000024
【化１２０】
2016140070.tif 000025
【化１２２】
2016140070.tif 000026
【化１２３】
2016140070.tif 000027
【化１２４】
2016140070.tif 000028
【化１１４−２】
2016140070.tif 000029
【００７８】
上記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４および１１４−２中、リンカー長ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが好ましい。
【００７９】
前記Ｅプローブに含まれる前記標識構造の数は、特に限定されないが、例えば、１〜１００個程度、１から２０個程度である。また、前記Ｅプローブにおいて、前記標識構造が含まれる部位も特に制限されない。
【００８０】
前記インターカレーターを使用する場合、前記検出工程を、例えば、インターカレーターの存在下で行うことが好ましい。前記インターカレーターは、例えば、前記プローブのハイブリダイゼーションにより二本鎖（二重らせん構造）が形成されると、前記二本鎖にインターカレーションし、これによって発色する蛍光色素である。前記蛍光色素は、特に制限されず、例えば、SYBR（登録商標）Green等が使用できる。
【００８１】
前記プローブは、例えば、天然ヌクレオチド残基、非ヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド残基および非天然主骨格のいずれから構成されてもよく、いずれか一種類でもよいし、いずれか二種類でもよいし、前記三種類を含んでもよいし、前記四種類を含んでもよい。前記非天然主骨格は、特に制限されず、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡおよび修飾型リン酸ジエステル結合をもつ核酸等があげられる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、特に制限されず、Ｓ化ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基が硫黄原子（Ｓ）を含んでもよいし、硫黄原子（Ｓ）で修飾されてもよい。
【００８２】
前記プローブの基本骨格は、特に制限されず、例えば、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、または、これらキメラ分子のいずれであっても良いし、その他の構造であっても良い。また、前記核酸の基本骨格は、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記核酸は、本発明の核酸プローブの場合、例えば、塩基対結合を形成し得るものであればよく、核酸試料や標的核酸配列の場合、例えば、相補鎖合成のための鋳型として機能すればよい。このため、前記核酸は、例えば、部分的に、または、全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であってもよい。前記核酸を構成する人工塩基としては、例えば、2-amino-6-(N,N-dimethylamino)purinepyridin-2-one、5-methylpyridin-2-one、2-amino-6-(2-thienyl)purine、pyrrole-2-carbaldehyde、9-Methylimidazo[(4,5)-b]pyridine、5-iodo-2-oxo(1H)pyridine  2-oxo-(1H)pyridine、2-amino-6-(2-thiazolyl)purine、7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine等があげられるが、これには限定されない。
【００８３】
本発明において、「ヌクレオチド」とは、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよく、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれか一方から構成されてもよいし、両者を含んでもよい。前記プローブにおいて、核酸の構成塩基数は、特に制限されない。核酸という用語は、一般に、ポリヌクレオチドという用語と同義である。オリゴヌクレオチドという用語は、一般に、ポリヌクレオチドの中でも、特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には、例えば、２〜１００塩基長、より一般的には２〜５０塩基長程度のポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」と呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、本発明において、例えば、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびに、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。
【００８４】
前記ＰＮＡ（ペプチド核酸）は、一般に、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。前記ペプチド主鎖としては、例えば、アミド結合によって結合したN−(2−アミノエチル)グリシンの反復単位があげられる。PNAのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、例えば、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシン、チオウラシルおよび2,6−ジアミノプリン等の天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニン等の人工塩基があげられるが、これに限定されない。
【００８５】
前記ＬＮＡは、一般に、糖−リン酸骨格において、リボースの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子との間がメチレン架橋で結合された、２つの環状構造を持つ核酸である。ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドがＤＮＡとアニールすると、二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。ＬＮＡは、通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、例えば、オリゴヌクレオチドの設計条件によって、より確実、強固なハイブリダイゼーションが可能となる。
【００８６】
前記プローブに含まれる塩基数は、特に限定されず、例えば、５〜１００程度、６〜５０程度、６〜２５程度である。
【００８７】
前記検出工程は、前述のように、前記プローブと前記増幅産物とについて、温度変化、ｐＨ変化、変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合、またはその会合体の解離を検出する工程である。一般的に、配列が相補関係にある一対の一本鎖核酸は、前記各種変化に伴って、会合（二本鎖の形成）し、また、解離（二本鎖から一本鎖への解離）することが知られている。前記検出工程において、前記温度変化、ｐＨ変化、前記変性剤の濃度変化もしくは塩濃度変化に伴う会合またはその会合体の解離を検出する方法は、特に制限されない。
【００８８】
前記検出工程において、温度変化による会合を検出する場合、例えば、温度降下させながら各温度での前記シグナルを測定する。前記シグナルが会合により発生する場合、例えば、高温温度点から低温温度点に温度を降下させることで、相対的に高いＴｍ値を示すものから順に、前記プローブと前記増幅産物との間で会合が生じ、それに依存して前記シグナルが発生する。
【００８９】
他方、前記検出工程において、温度変化による解離を検出する場合、例えば、温度上昇させながら各温度での前記シグナルを測定する。前記シグナルが会合により発生する場合、例えば、低温温度点から高温温度点に温度を上昇させることで、相対的に低いＴｍ値を示すものから順に、前記プローブと前記増幅産物との会合が解離し、それに依存して前記シグナルが消失する。
【００９０】
前記高温温度点と前記低温温度点とは、特に制限されず、例えば、使用する前記プローブ、前記プローブがハイブリダイズする前記標的配列または前記相補配列等に応じて適宜決定でき、具体的には、例えば、これらのＴｍ値によって適宜設定できる。
【００９１】
本発明をタイピングに適用する場合、前記高温温度点と前記低温温度点とは、例えば、下記（ｂ１）または（ｂ２）の条件を満たすことが好ましい。
（ｂ１）前記高温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でミスマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、前記低温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でフルマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも低温度領域にあるいずれかの温度点と定義される。
（ｂ２）前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合と、それとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合、
前記高温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に低いＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、
前記低温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に高いＴｍ値より低温度領域にあるいずれかの温度点である。
【００９２】
前記検出工程において、ｐＨ変化による会合を検出する場合、例えば、ｐＨ降下させながら各ｐＨでの蛍光シグナルを測定する。前記シグナルが会合により発生する場合、例えば、高ｐＨ点から低ｐＨ点にｐＨを降下させることで、相対的に高いＴｍ値を示すものから順に、前記プローブと前記増幅産物との間で会合が生じ、それに依存してシグナルが発生する。他方、前記検出工程において、ｐＨ変化による前記会合体の解離を検出する場合、例えば、ｐＨ上昇させながら各ｐＨでの発光シグナルを測定する。前記シグナルが会合により発生する場合、例えば、低ｐＨ点から高ｐＨ点にｐＨを上昇させることで、相対的に低いＴｍ値を示すものから順に、前記プローブと前記増幅物との会合が解離し、それに依存してシグナルが消失する。
【００９３】
本発明の検出方法は、例えば、さらに、前記検出工程における検出結果に基づいて、会合曲線または融解曲線（解離曲線）を作成し、前記曲線から前記鋳型核酸を判定する判定工程を含んでもよい。ここで、前記鋳型核酸の判定とは、特に制限されないが、例えば、前述のように、前記鋳型核酸の有無の判定（定性分析）、前記鋳型核酸の量の判定（定量分析）、前記鋳型核酸における前記核酸変異部位における前記核酸変異部位の塩基の種類の判定（タイピング）があげられる。
【００９４】
前記検出工程における検出結果が、温度変化に伴う会合の場合、例えば、前記判定工程において、前記会合曲線を作成する。なお、前記検出結果が温度以外の変化（例えば、ｐＨ、変性剤濃度、塩濃度の変化等）に伴う会合の場合、以下の会合曲線の説明について、温度変化を、これらの変化に読み替え可能である。
【００９５】
前記会合曲線の作成方法は、特に制限されない。前記会合曲線は、例えば、会合していない前記プローブによるシグナル消失状態（シグナル非発生状態）から、前記プローブと前記増幅産物との会合（二本鎖形成）によるシグナル発生状態への変化に基づいて作成できる。具体的には、例えば、前記検出工程で得られた各温度でのシグナルの測定結果から、前記シグナルの変化量と時間の変化量との微分値（ｄＦ／ｄＴ）を求め、そして、温度と前記微分値（ｄＦＴ／ｄＴ）との相関関係を示す曲線を会合曲線として作成する。前記会合曲線は、例えば、正の一次微分曲線（ｄＦ／ｄＴ）でもよいし、負の一次微分曲線（−ｄＦ／ｄＴ）でもよいが、前記シグナルの発生を山型のピークで判断できることから、正の一次微分曲線が好ましい。なお、本明細書において、以下、前記会合曲線は、正の一次微分曲線を前提するため、ピークは、山型のピークを意味するが、本発明は、これには制限されず、例えば、負の一次微分曲線（−ｄＦ／ｄＴ）の場合、谷型のピークと読み替え可能である。
【００９６】
前記検出工程における検出結果が、温度変化に伴う前記会合体の解離の場合、例えば、前記判定工程において、前記融解曲線（解離曲線）を作成する。なお、前記検出結果が温度以外の変化（例えば、ｐＨ、変性剤濃度、塩濃度の変化等）に伴う解離の場合、以下の融解曲線の説明について、温度をｐＨ等に読み替え可能である。
【００９７】
前記融解曲線の作成方法は、特に制限されない。前記融解曲線は、例えば、前記プローブと前記増幅産物との会合（二本鎖形成）によるシグナル発生状態から、前記会合体の解離（二本鎖の解離）によるシグナル消失状態への変化に基づいて作成できる。具体的には、例えば、前記検出工程で得られた各温度でのシグナルの測定結果から、前記シグナルの変化量と時間の変化量との微分値（ｄＦ／ｄＴ）を求め、そして、温度と前記微分値（ｄＦＴ／ｄＴ）との相関関係を示す曲線を融解曲線として作成する。前記融解曲線は、例えば、正の一次微分曲線（ｄＦ／ｄＴ）でもよいし、負の一次微分曲線（−ｄＦ／ｄＴ）でもよいが、前記シグナルの消失を山型のピークで判断できることから、負の一次微分曲線が好ましい。なお、本明細書においては、以下、負の一次微分曲線を前提するため、ピークは、山型のピークを意味するが、本発明は、これには制限されず、例えば、正の一次微分曲線（ｄＦ／ｄＴ）の場合、谷型のピークと読み替え可能である。
【００９８】
前記判定工程では、例えば、作成した前記会合曲線または前記融解曲線について、ピークを確認する。前記鋳型核酸の分析が、前記鋳型核酸の定性分析または定量分析の場合、例えば、前記標的配列または前記相補配列と前記プローブとのＴｍ値において前記ピークが確認できれば、前記鋳型核酸が存在すると判定でき、前記ピークが確認できなければ、前記鋳型核酸が存在しないと判定できる。また、前記ピークの大きさによって、例えば、前記鋳型核酸の量を判定することもできる。他方、前記鋳型核酸の分析が、タイピングの場合、例えば、前記核酸変異部位の塩基に基づく各Ｔｍ値における前記ピークの有無から、前記核酸変異部位について、例えば、野生型か変異型か、複数の変異型が存在する場合はいずれの変異型か、ホモ接合型とヘテロ接合型のいずれか等を判定できる。以下、本明細書において、特に示さない限り、前記会合曲線および前記融解曲線を、解析曲線という。
【００９９】
本発明によれば、前記条件（Ａ）〜（Ｅ）の適宜選択することで、例えば、バックグランドの低下という第一の効果、ピークをシャープにするという第二の効果、ヘテロ接合型のピーク間の距離を広げるという第三の効果、および、ヘテロ接合型の分離性の向上という第四の効果のうち、所望の効果を奏することができる。
【０１００】
つぎに、本発明について、以下の実施形態をあげて説明する。以下の実施形態は、特に示さない限り、前記標的配列にハイブリダイズするプローブ（前記Ｔｓｅｑ用プローブ）を例にあげて説明するが、これには制限されず、Ｔｓｅｑ用プローブは、Ｃｓｅｑ用プローブに読み替え可能である。
【０１０１】
（実施形態１Ａ）
本実施形態は、前記（Ａ）の条件を満たす形態であり、具体的には、前記増幅工程において、前記プライマーとして、前記検出工程におけるプローブを兼ねるターンバックプライマーを使用する形態である。以下、ターンバックプライマーをＴＢプライマーともいう。
【０１０２】
（Ａ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、プライマーの３’端からプライミングするポリメラーゼが、前記標的配列を合成する第一プライマーと、前記相補配列を合成する第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーと前記第２プライマーのうち、前記プローブがハイブリダイズする配列の合成を開始するプライマーは、プライマー領域とプローブ領域とを含み、前記プライマー領域の５’末端に、前記プローブ領域が直接的または間接的に連結されたターンバックプライマーであり、他方のプライマーは、前記ポリメラーゼを３’端よりプライミングさせる能力のあるプライマーであれば何でも良く、
前記増幅工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プライマー領域から前記標的配列または前記相補配列を伸長し、
前記検出工程において、前記ターンバックプライマーは、前記プローブを兼ね、前記工程で得られた増幅産物は、その分子内において、前記ターンバックプライマーの前記プローブ領域が、伸長された前記標的配列または前記相補配列に向かって折り返されることによって、前記プローブ領域と前記標的配列または前記相補配列との会合を検出することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
【０１０３】
本実施形態においては、前記第１プライマーおよび前記第２プライマーのいずれか一方がＴＢプライマーであり、他方は、非ＴＢプライマーである。本実施形態は、前述のように、前記標的配列にハイブリダイズするプローブ（前記Ｔｓｅｑ用プローブ）を例にあげるため、以下、前記ＴＢプライマーとして、前記標的配列を合成する第１プライマーを例にあげて説明する。また、以下、前記鋳型核酸を、鋳型鎖といい、前記鋳型核酸に対して相補的な鎖を、相補鎖という。
【０１０４】
前記ＴＢプライマーについて、図４を用いて説明する。図４は、前記ＴＢプライマーの一例を示す概略図であり、図４（Ａ）は、前記標的配列を合成する第１プライマーであるＴＢプライマーと、前記相補鎖との関係を示す模式図であり、図４（Ｂ）は、前記増幅工程における前記ＴＢプライマーの伸長を示す模式図であり、図４（Ｃ）は、前記検出工程における前記ＴＢプライマーのターンバックを示す模式図である。
【０１０５】
図４（Ａ）に示すように、前記ＴＢプライマーは、プライマー領域（Ａｃ’）とプローブ領域（Ｂ’）とを含み、プライマー領域（Ａｃ’）の５’末端に、プローブ領域（Ｂ’）が連結されている。プローブ領域（Ｂ’）は、前記相補鎖における任意の領域（Ｂ）と同じ配列に設定され、プライマー領域（Ａｃ’）は、前記相補鎖における領域（Ｂ）の下流側の任意の領域（Ａ）にハイブリダイズする配列に設定される。
【０１０６】
前記ＴＢプライマーを増幅工程に使用すると、図４（Ａ）に示すように、まず、前記ＴＢプライマーは、プライマー領域（Ａｃ’）において、前記相補鎖の領域（Ａ）にアニーリングし、前記ＴＢプライマーの３’末端から伸長反応が開始される。得られる伸長鎖は、５’側が前記ＴＢプライマーであり、３’側が伸長領域であり、前記伸長領域には、前記相補鎖における領域（Ｂ）に対する相補領域（Ｂｃ）が含まれる。
【０１０７】
そして、前記検出工程において、前記伸長鎖は、その分子内で会合する。すなわち、前記伸長鎖におけるプローブ領域（Ｂ’）は、前記相補鎖における領域（Ｂ）と同じ配列であることから、前記伸長鎖における相補領域（Ｂｃ）と相補関係となる。このため、前記伸長鎖は、分子内で折り返しが生じ、そのプローブ領域（Ｂ’）と相補領域（Ｂｃ）とが、分子内会合する。前記検出工程においては、前記伸長鎖における前記分子内会合、またはその会合体の解離を検出する。
【０１０８】
本実施形態では、このようにＴＢプライマーを使用することにより、例えば、以下のような効果が得られる。
【０１０９】
まず、本実施形態によれば、前記第一の効果、すなわち、非特異的な検出の抑制という効果が得られ、これは、検出の特異性の向上ともいえる。この効果は、例えば、非特異的な検出が原因となるバックグラウンドの低下につながる。前記ＴＢプライマーを用いると、前記伸長鎖の分子内にプローブ領域（Ｂ’）と相補領域（Ｂｃ）とが共存するため、プローブと伸長鎖とが別分子である場合に比べて、ブラウン運動による両者の接触効率が極めて高くなる。このため、効率良くプローブ領域（Ｂ’）と相補領域（Ｂｃ）とをハイブリダイズすることができる。また、仮に、前記ＴＢプライマーが前記領域（Ａ）以外にアニーリングして、前記標的配列とは異なる非標的配列を非特異的に増幅した場合、その伸長鎖には、プローブ領域（Ｂ’）がハイブリダイズする相補領域（Ｂｃ）が存在しない。このため、非特異的な増幅が起きても、分子内でターンバックが生じないため、プローブ領域（Ｂ’）の非特異的な会合を防止できる。つまり、前記ＴＢプライマーが、所定の領域（Ａ）にアニーリングして目的の配列を合成した場合にのみ、前記伸長鎖の分子内会合が生じて、前記会合またはその会合体の解離を検出できるといえる。
【０１１０】
また、本実施形態によれば、前記第二の効果、すなわち、前記解析曲線におけるピークをシャープにすることができる。ピークをシャープにするとは、例えば、ピークの半値幅を狭めることを意味する。
【０１１１】
また、本実施形態によれば、前記第四の効果、すなわち、前記タイピングの際に、ヘテロ接合型のピークの分離性を向上することができる。
【０１１２】
本実施形態によれば、前記第一の効果、前記第二の効果、および前記第四の効果により、例えば、図２に示すようなピークが得られる。図２は、本実施形態により得られる解析曲線（例えば、融解曲線）の一例を示す図であり、変異型の前記核酸変異部位にフルマッチし且つ野生型の前記核酸変異部位にミスマッチするプローブを使用した例である。図２（Ａ）は、ホモ接合型の変異型標的配列の解析曲線であり、フルマッチの温度（ＴＨ）にシャープなピークが得られ、バックグランドも抑制されている。図２（Ｂ）は、ホモ接合型の野生型標的配列の解析曲線であり、ミスマッチの温度（ＴＬ）にシャープなピークが得られ、バックグランドも抑制されている。図２（Ｃ）は、ヘテロ接合型の標的配列の解析曲線であり、温度（ＴＨ）と温度（ＴＬ）のそれぞれにシャープなピークが得られ、バックグラウンドも抑制されている。
【０１１３】
本実施形態は、さらに、以下に示すような条件を備えてもよい。
【０１１４】
（Ａ−１）
本実施形態は、例えば、前記増幅工程を、ニッケースの存在下で行うことにより、もしくは、前記増幅工程後にニッケースを添加することにより、「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーとから合成される核酸鎖」のいずれかの部分にニッケース認識配列をデザインし、「前記ターンバックプライマーと前記ターンバックプライマーとから合成される核酸鎖」の相補鎖に、ニックを入れる工程を含む。前記ニッケースは、例えば、塩基配列中にニックを入れる酵素であり、特に制限されず、公知のものが使用できる。
【０１１５】
前記ＴＢプライマーと前記ＴＢプライマーから合成される核酸鎖において、前記認識配列をデザインする部分（位置）は、特に制限されない。
【０１１６】
本実施形態は、この条件を満たすことによって、以下の理由から、前記第一の効果、すなわち非特異的な検出の抑制を、さらに向上できる。前記増幅工程では、前記第１プライマーおよび前記第２プライマーを用いて、両方向の合成が行われる。このため、例えば、前記標的配列を合成するための第１プライマーが前記ＴＢプライマーの場合、前記ＴＢプライマーから得られた核酸鎖（伸長鎖）に対して、前記第２プライマーがアニーリングし、前記ＴＢプライマーに対する相補領域を含む核酸鎖（伸長鎖）が合成される場合がある。しかし、前記第２プライマーからの核酸鎖は、前記ＴＢプライマーに対する相補領域を含むことから、前記第２プライマーからの核酸鎖が、その相補領域において、前記ＴＢプライマーのプローブ領域とハイブリダイズする可能性がある。しかしながら、本実施形態によれば、「前記ＴＢプライマーと前記ＴＢプライマーから合成される核酸鎖」のいずれかの部分に前記認識配列をデザインしているため、「前記ＴＢプライマーと前記ＴＢプライマーから合成される核酸鎖」の相補鎖に、ニックを入れることができる。ニックが入ると、前記第２プライマーからの合成される核酸鎖は短くなるため、前記ＴＧプライマーに対するＴｍ値も十分に低くなる。したがって、前記第２プライマーからの伸長鎖と前記ＴＢプライマーとの非特異的なハイブリダイズによる検出への影響を、十分に抑制できる。
【０１１７】
（Ａ−２）
本実施形態において、前記ＴＢプライマーは、例えば、前記プライマー領域と前記プローブ領域とが、直接的に連結されても、間接的に連結されてもよい。前者の場合、前記プライマー領域と前記プローブ領域との間に、介在配列を有さない形態である。後者の場合、例えば、前記プライマー領域と前記プローブ領域との間に、介在配列を有する形態であり、具体的には、例えば、前記プライマー領域の５’末端に、介在配列を介して、前記プローブ領域が間接的に連結されている形態である。本実施形態において、前記ＴＢプライマーは、前記介在配列を有することが好ましい。前記介在配列を有することによって、前記ＴＢプライマーは、例えば、さらにターンバックしやすくなるため、本実施形態における前記第一の効果、前記第二の効果および前記第四の効果を、さらに向上できる。また、前記ＴＢプライマーが前記介在配列を有する場合、前記介在配列に、前記ニッケースの認識配列が存在することが好ましい。
【０１１８】
（Ａ−３）
本実施形態において、前記ＴＢプライマーは、例えば、（ａ１）、（ａ１’）、（ａ２）または（ａ２’）を満たすことが好ましい。前記ＴＢプライマーが、いずれかの条件を満たすことによって、例えば、さらにターンバックしやすくなるため、本実施形態における前記第一の効果、前記第二の効果および前記第四の効果を、さらに向上できる。
【０１１９】
（ａ１）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
【０１２０】
（ａ１’）前記第１プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（Ａｃ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（Ａｃ’）の塩基数をＸとし、前記相補配列における前記プライマー領域（Ａｃ’）がハイブリダイズする領域（Ａ）と前記プローブ（Ｂ’）がハイブリダイズする領域（Ｂ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
【０１２１】
（ａ２）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在しない場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとしたときに、
（Ｘ−Ｙ）／（Ｘ）が、−１〜１の範囲である。
【０１２２】
（ａ２’）前記第２プライマーが前記ターンバックプライマーであり、前記プライマー領域（ｃＡｃ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）との間に介在配列が存在する場合、
前記プライマー領域（ｃＡｃ’）の塩基数をＸとし、前記標的配列における前記プライマー領域（ｃＡｃ’）がハイブリダイズする領域（ｃＡ）と前記プローブ（ｃＢ’）がハイブリダイズする領域（ｃＢ）とに挟まれた領域の塩基数をＹとし、前記介在配列の塩基数をＹ’としたときに、
［Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）］／Ｘが、−１〜１の範囲である。
【０１２３】
前記（ａ１）または（ａ２）のように、前記介在配列が存在しない場合、（Ｘ−Ｙ）／Ｘは、下限が、例えば、−１．００以上、０．００以上、０．０５以上、０．１０以となり、上限は、例えば、１．００以下、０．７５以下、０．５０以下、０．２５以下となるように設計され、また、（Ｘ＋Ｙ）は、下限が、例えば、１５以上、２０以上、３０以上となり、上限は、例えば、５０以下、４８以下、４２以下となるように設計される。
【０１２４】
また、前記（ａ１’）または（ａ２’）のように、前記介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘは、下限が、例えば、−１．００以上、０．００以上、０．０５以上、０．１０以上となり、また、上限は、例えば、１．００以下、０．７５以下、０．５０以下、０．２５以下となるように設計され、また、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、下限が、例えば、１５以上、２０以上、３０以上となり、上限は、例えば、１００以下、７５以下、５０以下となるように設計される。
【０１２５】
前記ＴＢプライマーの長さは、特に制限されず、全長が、例えば、１５〜１００ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチドである。
【０１２６】
前記第１プライマーが前記ＴＢプライマーの場合、前記プライマー領域（ＡＣ’）と前記プローブ領域（Ｂ’）の長さは、それぞれ、例えば、５〜５０ヌクレオチド、７〜３０ヌクレオチドである。前記第２プライマーが前記ＴＢプライマーの場合、前記プライマー領域（ｃＡＣ’）と前記プローブ領域（ｃＢ’）の長さは、それぞれ、例えば、５〜５０ヌクレオチド、７〜３０ヌクレオチドである。
【０１２７】
（実施形態１Ｂ）
本実施形態は、前記（Ｂ）の条件を満たす形態であり、具体的には、前記検出工程が、高温温度点から低温温度点に向かって温度変化させ、前記温度変化に伴う前記プローブと前記増幅産物との会合を検出する工程を含むことを特徴とする鋳型核酸の分析方法である。
【０１２８】
本実施形態によれば、例えば、前記第一の効果、すなわち、非特異的な検出の抑制という効果が得られ、これは、検出の特異性の向上ともいえる。この効果は、例えば、非特異的な検出が原因となるバックグラウンドの低下につながる。
【０１２９】
相補関係にある一対の一本鎖核酸は、Ｔｍ値よりも低い温度域では会合するが、Ｔｍ値付近で前記会合体の解離が生じる。このため、プローブを用いた鋳型核酸の分析方法においては、会合状態とするために低温温度点を開始温度とし、温度を高温温度点に上昇させて会合を解離し、前記解離を検出している。前記Ｔｍ値は、例えば、会合する前記一対の一本鎖核酸の配列および長さ等によって異なり、互いの特異性が高い程、高いＴｍ値となる。このため、低温温度点から高温温度点への温度変化を行った場合、前記低温温度点において、低いＴｍ値である低い特異性の会合、つまり非特異的な会合が生じる。そして、前記低温温度点から高温温度点に上昇すると、これらの非特異的な会合体の解離も検出されるため、結果として、バックグラウンドが上昇する。これに対して、本実施形態は、高温温度点を開始温度として、低温温度点への温度低下させるため、前記プローブと前記増幅産物とは、開始温度では解離状態であり、温度低下に伴い、高いＴｍ値のものから会合していくことになる。前記検出工程では、この会合を検出することから、前述のような、非特異的な会合の影響によるバックグラウンドの上昇を防止できる。
【０１３０】
また、本実施形態によれば、前記第二の効果、すなわち、前記解析曲線におけるピークをシャープにすることができる。ピークをシャープにするとは、例えば、ピークの半値幅を狭めることを意味する。
【０１３１】
また、本実施形態によれば、前記第四の効果、すなわち、前記タイピングの際に、ヘテロ接合型のピークの分離性を向上することができる。
【０１３２】
前記鋳型核酸がヘテロ接合型の場合、前記プローブは、前記核酸変異部位がフルマッチである標的配列と前記核酸変異部位がミスマッチである標的配列の両方に会合するが、その会合体の解離は、相対的に、前者の方が高い温度で生じ、後者の方が低い温度で生じる。このため、前記タイピングにおいては、前記高い温度と前記低い温度での解離を検出することで、前記鋳型核酸がヘテロ接合型かホモ接合型かを判断できる。しかし、前記プローブは、前記核酸変異部位がミスマッチである標的配列よりも、前記核酸変異部位がフルマッチである標的配列に、優先的に結合しやすいため、前記プローブが、前記ミスマッチの標的配列に会合できない場合がある。この場合、前記鋳型核酸がヘテロ接合型であっても、前記フルマッチの標的配列しか検出できないおそれがある。これに対して、前記鋳型核酸がヘテロ接合型であっても、前記増幅産物の量と前記プローブの量とが１：１であれば、前記プローブは、前記フルマッチの標的配列および前記ミスマッチの標的配列の両方と会合することが可能である。そして、本実施形態によれば、前記プローブがハイブリダイズする配列の合成には、前記プライマー領域と前記プローブ領域とを含む前記ＴＢプライマーを使用するため、前記検出工程における前記プローブ（前記プローブ領域）と、前記増幅産物との比は、理論的に１：１となる。したがって、本実施形態によれば、前記鋳型核酸がヘテロ接合型であっても、前記フルマッチの標的配列と前記ミスマッチの標的配列の両方を検出することができ、ヘテロ接合型の分離性を向上することができる。
【０１３３】
前記高温温度点および前記低温温度点は、特に制限されず、例えば、前記プローブの長さおよび配列、前記プローブがハイブリダイズする前記標的配列または前記相補配列の長さおよび配列等に基づいて決定できる。
【０１３４】
前記鋳型核酸の分析がタイピングの場合、前記高温温度点および前記低温温度点は、例えば、（ｂ１）または（ｂ２）を満たすことが好ましい。
（ｂ１）前記高温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でミスマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、前記低温温度点は、「前記プローブ」と「前記プローブが前記核酸変異部位でフルマッチを示す前記標的配列」とのハイブリダイゼーションのＴｍ値よりも低温度領域にあるいずれかの温度点と定義される。
（ｂ２）前記プローブが前記核酸変異部位にミスマッチの場合と、それとはＴｍ値が異なるミスマッチの場合、
前記高温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に低いＴｍ値よりも高温度領域にあるいずれかの温度点であり、
前記低温温度点は、前記２つのＴｍ値のうち、相対的に高いＴｍ値より低温度領域にあるいずれかの温度点である。
【０１３５】
（実施形態１Ｃ）
本実施形態は、前記（Ｃ）の条件を満たす形態であり、具体的には、前記第１プライマーと前記第２プライマーとを、所定の割合で使用する形態である。
【０１３６】
（Ｃ）  前記増幅工程において、プライマーセットを使用し、
前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記プローブまたは前記（Ａ）の前記プローブ領域がハイブリダイズする配列を合成するポリメラーゼがプライミングするプライマーを、他方のプライマーよりも多く使用することを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
【０１３７】
本実施形態によれば、前記プローブがハイブリダイズする配列（例えば、標的配列）を合成する一方のプライマー（例えば、第１プライマー）を、他方のプライマー（例えば、第２プライマー）よりも多く使用することで、前者のプライマーによる伸長鎖、すなわち前記プローブがハイブリダイズする配列を、選択的に増加できる。これによって、本実施形態は、例えば、第一の効果、すなわち、非特異的な検出の抑制という効果が得られ、バックグラウンドを低下できる。
【０１３８】
また、本実施形態によれば、前記第二の効果、すなわち、前記解析曲線におけるピークをシャープにすることができる。ピークをシャープにするとは、例えば、ピークの半値幅を狭めることを意味する。
【０１３９】
また、本実施形態によれば、前記第四の効果、すなわち、前記タイピングの際に、ヘテロ接合型のピークの分離性を向上することができる。
【０１４０】
前記プローブがハイブリダイズする配列を合成する前記一方のプライマー（Ｍ）と前記他方のプライマー（Ｓ）の使用割合は、特に制限されないが、前記一方のプライマー（Ｍ）を、前記他方のプライマー（Ｓ）よりも高濃度のプライマーとし、そのモル比（Ｍ：Ｓ）をＸ：１とした時、Ｘの値が、例えば、１＜Ｘ≦１０６の範囲である。Ｘは、例えば、Ｘ≦１０３、Ｘ≦１０２、Ｘ≦１０、２≦Ｘ≦９、２≦Ｘ≦８、２≦Ｘ≦７、３≦Ｘ≦６である。
【０１４１】
（実施形態１Ｄ）
本実施形態は、前記（Ｄ）の条件を満たす形態であり、前記プローブは、例えば、前記Ｅプローブである。
【０１４２】
（Ｄ）  前記プローブにおいて、前記標的配列または前記相補配列にハイブリダイズする領域の長さが、６〜１００塩基長であることを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
【０１４３】
前記領域の長さは、例えば、６〜４０塩基長、６〜２５塩基長、９〜２０塩基長、１０〜１８塩基長である。
【０１４４】
本実施形態によれば、前記第三の効果、すなわち、前記タイピングの際に、ヘテロ接合型のピーク間の距離を広げることができる。
【０１４５】
また、本実施形態によれば、前記第四の効果、すなわち、前記タイピングの際に、ヘテロ接合型のピークの分離性を向上することができる。
【０１４６】
前記Ｅプローブは、同じ塩基長であり且つ前記エキシトン効果を示す前記蛍光性原子団が結合していないノーマルプローブよりも、高いＴｍ値を示す。このため、前記Ｅプローブを、前記ノーマルプローブと同じＴｍ値に設定する場合、前記Ｅプローブは、前記ノーマルプローブよりも短い塩基長にすることができる。仮に、前記ノーマルプローブが、２０塩基長であり、前記Ｅプローブが、１３塩基長であるとする。前者は、前記標的配列とフルマッチの場合、前記プローブと前記標的配列の関係は、２０塩基長／２０塩基長（＝１）で表され、前記標的配列とミスマッチの場合、前記プローブと前記標的配列の関係は、１９塩基長／２０塩基長（＝０．９５）で表される。他方、後者は、前記標的配列とフルマッチの場合、前記プローブと前記標的配列の関係は、１３塩基長／１３塩基長（＝１）で表され、前記標的配列とミスマッチの場合、前記プローブと前記標的配列の関係は、１２塩基長／１３塩基長（＝０．９２３）で表される。つまり、前記Ｅプローブの方が、フルマッチとミスマッチとの間の差が大きくなる。その結果、前記鋳型核酸がヘテロ接合型の場合、例えば、野生型を示すピークと変異型を示すピークとの差、すなわち距離を広げることができ、且つ、両ピークの分離性を向上することができる。
【０１４７】
（実施形態１Ｅ）
本実施形態は、前記（Ｅ）の条件を満たす形態であり、具体的には、前記プライマーセットを、前記標的配列または前記相補配列における前記プローブのハイブリダイズする領域に近づけて設計した形態である。
【０１４８】
（Ｅ）  前記プライマーセットが、前記標的配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第１プライマーと、前記相補配列を合成するポリメラーゼをプライミングする第２プライマーとの組合せであり、
前記第１プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の上流領域と同じ配列を有し、
前記第２プライマーは、前記鋳型核酸における任意部位の下流領域に相補な配列を有し、
（ｅ１）または（ｅ２）を満たすことを特徴とする鋳型核酸の分析方法。
（ｅ１）前記プローブが、前記標的配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の３’末端の下流側近傍に位置する。
（ｅ２）前記プローブが、前記相補配列にハイブリダイズするプローブであり、
前記鋳型核酸における前記上流領域は、その３’末端は、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の５’末端の上流側近傍に位置し、
前記鋳型核酸における前記下流領域は、その５’末端が、前記鋳型核酸における前記プローブと配列が重複する領域の３’末端の下流側近傍に位置する。
【０１４９】
前記標的配列にプローブをハイブリダイズさせる場合、相対的に長い標的配列に対する会合よりも、相対的に短い標的配列に対する会合の方が、Ｔｍ値が高く、特異性も高くなる。本実施形態の前記プライマーセットは、前述のように、前記標的配列または前記相補配列において前記プローブがハイブリダイズする領域の近傍にアニーリングするように設定されている。このため、本実施形態によれば、前記プライマーセットを用いた合成によって、より短い前記標的配列または前記相補配列を得ることができる。したがって、本実施形態によれば、より特異性の高い会合が可能となる。このため、本実施形態によれば、例えば、前記第一の効果、すなわち、非特異的な検出の抑制の効果が得られ、バックグラウンドを低下できる。
【０１５０】
また、本実施形態によれば、前記第二の効果、すなわち、前記解析曲線におけるピークをシャープにすることができる。
【０１５１】
（実施形態１Ｆ）
本発明の分析方法は、前記実施形態１Ａ〜１Ｅの各条件のうち、いずれか２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、または全ての実施形態を組合せた形態でもよい。前記組合せを、以下に示す。
（Ａ）と（Ｂ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）との組合せ
（Ａ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ａ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｄ）と（Ｅ）との組合せ
（Ｂ）と（Ｅ）との組合せ
【０１５２】
（実施形態１Ｇ）
本発明の分析方法は、例えば、さらに以下の条件を満たすことが好ましい。なお、以下の各条件は、例えば、前記実施形態１Ａ〜１Ｆのそれぞれに適用できる。
【０１５３】
前記検出工程は、例えば、前述のような添加剤（例えば、ＤＭＳＯ等）の存在下で行うことが好ましい。前記添加剤の共存により、例えば、低温域におけるバックグラウンドを抑制でき（前記第一の効果）、また、前記ピークをシャープにできる（前記第二の効果）。
【０１５４】
前記プローブは、例えば、前記非ヌクレオチド残基、前記修飾ヌクレオチド残基および前記非天然主骨格の少なくとも一つを含むことが好ましい。前記非ヌクレオチド残基、前記修飾ヌクレオチド残基および前記非天然主骨格は、例えば、前述の通りである。前記プローブが、これらのいずれかを含むことによって、前記プローブのＴｍ値を上げることができる。これによって、本実施形態は、例えば、前記ピークをシャープにでき（前記第二の効果）、また、ヘテロ接合型のピーク間の距離を広げることができる（前記第三の効果）。
【０１５５】
前記プローブは、例えば、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団のセットを、少なくとも２セットを含むＦＲＥＴプローブ、または、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団セットを少なくとも１つ以上とエキシトン効果を示さない色素を１つ以上含むＦＲＥＴプローブであり、
前記２つのセットは、それぞれ、エキシトン効果を示す２つの蛍光性原子団が、前記プローブ内の同一塩基に、リンカーを介して結合しているか、または、隣接する２つの塩基におそれぞれ結合しており、前記２つのセットは、前記プローブ内にＦＲＥＴ効果を示すように配置されている。前記プローブによれば、例えば、一方のセットが励起されて蛍光を発すると、その蛍光により他方のセットが励起されて異なる蛍光を発する。このため、前記プローブは、ＦＲＥＴ型プローブということができる。前記プローブによれば、例えば、前記プローブのＴｍ値を上げることができ、また、Ｓ／Ｎも向上する。これによって、本実施形態は、例えば、低温域におけるバックグラウンドを抑制でき（前記第一の効果）、前記ピークをシャープにでき（前記第二の効果）、また、前記タイピングにおいて、ヘテロ接合型のピーク間の距離を広げることができる（前記第三の効果）。
【０１５６】
前記ＦＲＥＴプローブは、例えば、前記２つのセットのうち１セット（以下、一対の蛍光性原子団Ａと呼ぶ）が有する発光ピーク波長は、他方の１セット（以下、一対の蛍光性原子団Ｂと呼ぶ）が有する励起ピーク波長よりも短く（特徴ａ）、前記一対の蛍光性原子団Ａと、前記一対の蛍光性原子団Ｂとは、ＦＲＥＴ効果を有する（特徴ｂ）。
【０１５７】
前記ＦＲＥＴプローブは、例えば、前記一対の蛍光性原子団Ａを有する塩基と、前記一対の蛍光性原子団Ｂを有する塩基とは、前記一対の蛍光性原子団Ａと前記一対の蛍光性原子団ＢとがＦＲＥＴ効果を有するような距離で、前記プローブに含まれる。
【０１５８】
前記ＦＲＥＴプローブにおいて、前記一対の蛍光性原子団Ａを有する塩基と、前記一対の蛍光性原子団Ｂを有する塩基の間の距離は、例えば、１塩基〜１１塩基である。
【０１５９】
前記ＦＲＥＴプローブにおいて、前記エキシトン効果を示す一対の蛍光性原子団を有する塩基は、例えば、前述の通りであり、前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、または（１７ｂ）で表される構造を有する。
【０１６０】
前記ＦＲＥＴプローブの塩基長は、例えば、４〜１００塩基長、１０〜５０塩基長、１０〜４０塩基長の範囲、１０〜３０塩基長の範囲である。塩基長は、例えば、用途により適切に選択される。前記ＦＲＥＴプローブが有するエキシントン効果を示す一対の蛍光性原子団の数は、特に制限されず、少なくとも２個であり、具体的には、２個、３個以上でもよい。実用上、ＦＲＥＴ効果を発揮するためには、エキシントン効果を示す一対の蛍光性原子団の数は、例えば、少なくとも２個であれば良いが、例えば、その用途、蛍光性原子団の種類、一対の蛍光性原子団の距離、ＦＲＥＴ効果の程度等を考慮して、３個でもよく、さらに４個以上でもよい。
【０１６１】
前記エキシトン効果によれば、例えば、一本鎖状態での蛍光強度を抑え、二重らせん構造を効果的に検出可能である。エキシトン効果（exciton  coupling）とは、例えば、複数の色素が並行に集合し、H会合体（H-aggregate）を形成することにより、ほとんど蛍光発光を示さなくなる効果である。この効果は、色素の励起状態が、Davydov  splittingにより２つのエネルギーレベルに分裂し、上位エネルギーレベルへの励起→下位エネルギーレベルへの内部変換（internal  conversion）→発光が熱的に禁制、という理由で生じると考えられる。ただし、これらの説明は、本発明を何ら制限しない。エキシトン効果が起こりうることは、H会合体を形成した色素の吸収バンドが単一の色素の吸収バンドより短い波長に現れることで確認できる。このような効果を示す色素としては、例えば、前述したチアゾールオレンジとその誘導体、チアゾールピンクとその誘導体、オキサゾールイエローとその誘導体、シアニンとその誘導体、ヘミシアニンとその誘導体、メチルレッドとその誘導体、ほか一般的にシアニン色素、アゾ色素と呼ばれる色素群が挙げられる。
【０１６２】
これらの色素は、例えば、二重らせんを形成したDNA-DNA二本鎖やDNA-RNA二本鎖、もしくはホスホチオエート核酸やPNA（ペプチド核酸）やロックト核酸（LNA）（BNA）のような人工核酸とDNAもしくはRNAによって形成される二本鎖にインターカレーションによって結合しやすい。これらのような色素複数個を一本鎖核酸に導入しておくと、通常の一本鎖状態（例えば、ハイブリダイゼーション前のプローブだけの状態）ではエキシトン効果によって強く消光されるが、標的のDNAもしくはRNAとハイブリダイゼーションすると、会合体が解除され、それぞれの色素がばらばらに二本鎖にインターカレーションする。このとき、色素間に電子的相互作用は無いので、エキシトン効果は生じず、強い蛍光発光を示す。このときの色素の吸収バンドは、単一の色素の吸収バンドと同じであり、色素間でエキシトン効果が生じていないことを示す。また、色素が二本鎖にインターカレーションしたときに、色素が本来有している構造上のねじれが解消されるので、蛍光発光をさらに強くすることがある。
【０１６３】
特徴（ａ）
一対の蛍光性原子団の１つ（一対の蛍光性原子団Ａ）が有する発光ピーク波長は、残りの一対の蛍光性原子団の１つ（一対の蛍光性原子団Ｂ）が有する励起ピーク波長より短い。発光ピーク波長は、一対の蛍光性原子団Ａが励起光を照射された際に生じる発光スペクトルのピーク波長を意味し、蛍光性原子団Ａの種類に応じて変化する。励起ピーク波長は、一対の蛍光性原子団Ｂが吸収し得る励起光スペクトルのピーク波長を意味し、蛍光性原子団Ｂの種類に応じて変化する。一対の蛍光性原子団Ａが有する発光ピーク波長及び一対の蛍光性原子団Ｂが有する励起ピーク波長にはそれぞれ制限はない。なお、前記ＦＲＥＴプローブを、蛍光標識の検出に用いる場合には、例えば、蛍光発光は、蛍光性原子団Ｂからのものであることから、検出に適した発光強度及び波長を有する蛍光性原子団Ｂを選択し、蛍光性原子団Ｂが有する励起ピーク波長を考慮した上で、蛍光性原子団Ａを選択することができる。また、蛍光性原子団Ａが有する発光ピーク波長と蛍光性原子団Ｂが有する励起ピーク波長の関係は、例えば、両者の間でえられるＦＲＥＴ効果を考慮の上決定することができる。尚、一対の蛍光性原子団Ａが有する２つの蛍光性原子団は、同一でも異なってもよく、一対の蛍光性原子団Ｂが有する２つの蛍光性原子団は、同一でも異なってもよい。一対の蛍光性原子団Ａが有する２つの蛍光性原子団および一対の蛍光性原子団Ｂが有する２つの蛍光性原子団は、いずれか一方が異なる場合、各蛍光性原子団は、一対の蛍光性原子団Ａが有する２つの蛍光性原子団の少なくとも一方の蛍光性原子団の発光ピーク波長が、一対の蛍光性原子団Ｂが有する２つの蛍光性原子団の少なくとも一方の蛍光性原子団の励起ピーク波長より短い。好ましくは、一対の蛍光性原子団Ａが有する両方の蛍光性原子団の発光ピーク波長が、一対の蛍光性原子団Ｂが有する両方の蛍光性原子団の励起ピーク波長より短い。
【０１６４】
特徴（ｂ）
一対の蛍光性原子団Ａと一対の蛍光性原子団Ｂとは、ＦＲＥＴ効果を示す。ＦＲＥＴ効果は、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence  resonance  energy  transfer）とも呼ばれ、近接した2個の発色団の間で励起エネルギーが、電磁波にならず電子の共鳴により直接移動する現象を言う。一方の発色団（供与体）で吸収された光のエネルギーによって他方の発色団（受容体）にエネルギーが移動し、受容体が蛍光分子の場合は受容体から蛍光が放射される。本発明の標識一本鎖核酸においては、一対の蛍光性原子団Ｂが有する励起ピーク波長より短い発光ピーク波長を有する一対の蛍光性原子団Ａを、一対の蛍光性原子団ＢとＦＲＥＴ効果を示すように配置する。一対の蛍光性原子団Ａと一対の蛍光性原子団ＢとがＦＲＥＴ効果を示す配置とは、例えば、一対の蛍光性原子団Ａを有する塩基と、一対の蛍光性原子団Ｂを有する塩基とが、一対の蛍光性原子団Ａと前記一対の蛍光性原子団ＢとがＦＲＥＴ効果を有するような距離で前記標識一本鎖核酸に含まれる場合である。一対の蛍光性原子団Ａと一対の蛍光性原子団Ｂとが、ＦＲＥＴ効果を有するような距離（塩基長）は、蛍光性原子団Ａ及びＢの種類や組合せにより異なるが、例えば、１塩基〜１１塩基であり、好ましくは２〜８塩基であり、さらに好ましくは２〜７塩基であり、より好ましくは２〜６塩基であり、さらに一層好ましくは２〜５塩基であり、より一層好ましくは３〜５塩基である。尚、ここで、１塩基の距離とは、一対の蛍光性原子団Ａと一対の蛍光性原子団Ｂとの間に、蛍光性原子団を有しない核酸が１つ存在することを意味する。蛍光性原子団Ａと蛍光性原子団Ｂとの組み合わせとしては、例えば、チアゾールオレンジ（D514）とチアゾールピンク（D570）またはD640との組み合わせ、D436とチアゾールオレンジ、チアゾールピンクまたはD640との組み合わせが挙げられる。
【０１６５】
前記ＦＲＥＴプローブは、例えば、上記特徴（ａ）および（ｂ）を満足することに加えて、任意で、一対の蛍光性原子団Ａおよび一対の蛍光性原子団Ｂのいずれの原子団も、前記ＦＲＥＴプローブの両末端から数えて２塩基以上内側に位置する塩基に位置することが好ましい。この特徴を満足することで、例えば、エキシントン効果とＦＲＥＴ効果の両方を、十分に発揮することができる。
【０１６６】
この出願は、２０１５年３月３日に出願された日本出願特願２０１５−０４１８１３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明によれば、鋳型核酸を精度よく分析できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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