(57)【要約】  不純物の非特異吸着が抑制され、かつ、長期保管による動的結合容量の低下が抑制された保存安定性に優れるアフィニティークロマトグラフィー用担体を提供すること。  （Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および  （Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、  エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、  前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、  前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、  アフィニティークロマトグラフィー用担体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項２】
前記共重合体が、（Ｍ−３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し４０質量部以下を更に含む、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
前記開環エポキシ基が、下記式（１）で表される基である、請求項１または２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【化１】
2015199196.tif 000006
［式（１）中、
Ｒ1は、炭素数１〜６の２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示し、
＊は、結合位置を示す。］
【請求項４】
Ｒ2が、下記式（２）で表されるものである、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【化２】
2015199196.tif 000007
［式（２）中、
Ｒ3は、炭素数１〜１０の２価または３価の有機基を示し、
ｎは、１または２を示し、
＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
【請求項５】
Ｘが、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、またはオキシ基（＞Ｏ）である、請求項３または４に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項６】
前記リガンドが、イムノグロブリン結合性タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項７】
前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項６に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項８】
前記固相担体が多孔質粒子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項９】
前記多孔質粒子の粒径が３５〜１００μｍである、請求項８に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填された、アフィニティークロマトグラフィーカラム。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法。
【請求項１２】
前記標的物質が、標的タンパク質である、請求項１１に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用担体に関する。特に、抗体などのタンパク質の精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。アフィニティークロマトグラフィー用担体は一般的に、標的物質と選択的に結合するリガンドを有する固相担体を含む。アフィニティークロマトグラフィーは、固相担体上のリガンドが標的物質に対して高い選択性を有するため、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーに比べて、優れた収率で且つ高速で経済的な精製が可能となる。
一般に、タンパク精製用のアフィニティークロマトグラフィーに求められる性能としては、（１）標的タンパク質以外の不純物を非特異吸着しないこと、（２）長期間の保管により結合容量が低下せず、保存安定性に優れること、（３）カラム操作する上で充分な機械的強度があること、などが挙げられる。【０００３】
こうしたなか、アフィニティークロマトグラフィー用担体の固相担体として、アガロース粒子（特許文献１、２）、スチレン−ジビニルベンゼンの共重合体からなる多孔質粒子（特許文献３、４）、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子（特許文献５、６）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５２３１４０号公報
【特許文献２】特表２００９−５２２５８０号公報
【特許文献３】特開平０８−２７８２９９号公報
【特許文献４】特表平１０−５０１１７３号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／１２５６７４号公報
【特許文献６】特開２０１２−１４１２１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、アガロース粒子は、一般に弾性率が低いため、高速で媒体を流したときにカラムの圧力が高くなるという欠点を有している。また、アガロース粒子は、一般に、天然の海草から長く複雑な工程を経て製造されるために、一定の品質のものが得られにくい。
また、スチレン−ジビニルベンゼンのような芳香族ビニル単量体の共重合体からなる多孔質粒子は、一般に耐アルカリ性に優れるが、親水性が低いために、リガンドの活性が低く、標的物質に対する動的結合容量が低いという欠点を有する。
さらに、メタクリレート系ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、高い親水性と機械的強度とを有しているものの、不純物の除去能については更なる改善が望まれていた。【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、不純物の非特異吸着が抑制され、かつ、長期保管による動的結合容量の低下が抑制された保存安定性に優れるアフィニティークロマトグラフィー用担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者は、鋭意検討した結果、エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位とポリビニル単量体に由来する構造単位をそれぞれ特定量含む共重合体を含有する固相担体と、前記固相担体に結合するリガンドと、開環エポキシ基とを有する特定のアフィニティークロマトグラフィー用担体が、標的物質の動的結合容量が高く、しかも不純物の除去能および保存安定性に優れること見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、＜１＞（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有する固相担体と、
エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基と、
前記固相担体に結合したリガンドと、を含むアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
前記アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下であることを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用担体を提供するものである。【０００９】
また、本発明は、＜２＞上記＜１＞のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填された、アフィニティークロマトグラフィーカラムを提供するものである。【００１０】
さらに、本発明は、＜３＞上記＜１＞のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、表面上のエポキシ基残存量が低減されており、しかも、開環エポキシ基によって高い親水性を備える。
したがって、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体によれば、非特異的に吸着する不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＤＮＡの除去能を改善することが可能となる。
また、リガンドの活性を高く保つことができるため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を、例えばイムノグロブリンの精製に用いた後で、更に長期間繰り返し使用してもイムノグロブリン等の動的結合容量が低下しにくく、低コストでイムノグロブリン精製が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体について、詳細に説明する。
【００１３】
〔アフィニティークロマトグラフィー用担体〕
＜固相担体の構成＞
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体は、
（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下、および
（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し０．５〜８０質量部を含む共重合体を含有し、
且つ、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を含むものである。固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。なお、固相担体は、上記共重合体以外に、天然高分子や合成高分子などを含んでいてもよい。
【００１４】
（（Ｍ−１）エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位）
エポキシ基含有モノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上のエポキシ基とを有する単量体である。エポキシ基含有ビニル単量体は、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量や、開環エポキシ基量を得るために利用可能である。
【００１５】
エポキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール等のヒドロキシ基非含有（メタ）アクリル酸エステル類；グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のヒドロキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族モノビニル化合物の他、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、防汚性や保存安定性等の観点から、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル（メタ）アクリレートが特に好ましい。なお、固相担体を順相懸濁重合により粒子状にする場合には、エポキシ基含有モノビニル単量体としては、開環エポキシ基量のコントロールが容易となることから水不溶性のものが好ましい。ここで水不溶性とは水１００ｍＬに対して室温（２５℃）で１０ｇ以上は溶解しないことをいう。なお、エポキシ基含有モノビニル単量体は市販品を用いてもよく、公知の方法に従い合成して使用してもよい。
【００１６】
エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し２０質量部を超えて、９９．５質量部以下である。当該含有量が２０質量部以下であると、開環エポキシ基の量が減ってリガンド結合後のアフィニティークロマトグラフィー用担体の親水性が低くなり、不純物の除去能が低くなる。一方、９９．５質量部を超えると、機械的強度が低くなり、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての取り扱いに耐えられなくなる。
エポキシ基含有モノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは２５質量部以上、より好ましくは３０質量部以上、さらに好ましくは４０質量部以上、特に好ましくは５０質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは９５質量部以下、より好ましくは９０質量部以下、さらに好ましくは８５質量部以下、特に好ましくは８０質量部以下である。
【００１７】
（（Ｍ−２）ポリビニル単量体に由来する構造単位）
ポリビニル単量体は、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有するビニル単量体である。以下、当該ポリビニル単量体を、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体と、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体とに分けて説明する。なお、ポリビニル単量体は、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００１８】
ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼンなどの芳香族ポリビニル化合物；ブタジエン、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリルなどのアリル化合物などが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体としては、（メタ）アクリル酸エステル類、芳香族ポリビニル化合物が好ましい。
また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２または３個がより好ましい。
【００１９】
ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類、多価アルコールの（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体としては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニル単量体に含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２または３個がより好ましい。
【００２０】
これらの中でも、ポリビニル単量体としては、比較的少量の使用で良好な多孔性と機械的強度が得られ、エポキシ基含有モノビニル単量体の使用量を制限することが少ないなどの観点から、ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体が好ましい。ヒドロキシ基非含有ポリビニル単量体の中でも、防汚性や保存安定性等の観点から、重合性ビニル基の個数が３個の（メタ）アクリル酸エステル類、重合性ビニル基の個数が２または３個の芳香族ポリビニル化合物が特に好ましい。特に好適な具体例としては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼンが挙げられる。
【００２１】
ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、全構造単位に対し０．５〜８０質量部である。ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量が０．５質量部未満であると、固相担体の機械的強度が低くなり、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての取り扱いに耐えられなくなる。また、８０質量部を超えると、親水性が低下して、ＨＣＰの低減効果が得られず、また、リガンドの活性が低下する。
ポリビニル単量体に由来する構造単位の含有量は、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは５質量部以上、より好ましくは１０質量部以上、さらに好ましくは１５質量部以上、さらに好ましくは２０質量部以上、特に好ましくは２５質量部以上であり、また、防汚性や保存安定性等の観点から、全構造単位に対し、好ましくは７０質量部以下、より好ましくは６５質量部以下、さらに好ましくは６０質量部以下、さらに好ましくは５０質量部以下、特に好ましくは４０質量部以下である。
【００２２】
（（Ｍ−３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位）
本発明で用いる固相担体に含まれる共重合体としては、上記構造単位（Ｍ−１）及び構造単位（Ｍ−２）に加えて、（Ｍ−３）エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位：全構造単位に対し４０質量部以下を更に含むものが好ましい。
【００２３】
エポキシ基を含有しないモノビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有し、エポキシ基を含有しないビニル単量体である。以下、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体単量体を、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体と、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体とに分けて説明する。
【００２４】
エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニル単量体としては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性単量体が好ましい。このような非イオン性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。なお、非イオン性単量体として、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレートのような疎水性（メタ）アクリレート類；スチレン、α−メチルスチレン、エチルビニルベンゼンのような芳香族ビニル化合物を用いてもよいが、精製時の不純物の非特異吸着を抑える観点から、このような単量体ではなく、上記で例示した単量体のうち、炭素数５以下のアルキル基またはアルコキシアルキル基を有するような（メタ）アクリル酸アルキルエステル類や、上記の（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
【００２５】
エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体としては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類などが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体に含まれるヒドロキシ基の個数としては、１分子中に、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。
【００２６】
これらの中でも、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体としては、防汚性等の観点から、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニル単量体が好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがより好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがさらに好ましく、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドが特に好ましい。
【００２７】
エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量としては、全構造単位に対し４０質量部以下が好ましい。当該含有量を４０質量部以下とすることにより、ヒドロキシ基含有物ビニル単量体の場合には多孔質粒子の親水性が向上し、凝集が抑制され、リガンドの活性が高くなり標的物質の動的結合量が改善される。また、機械的強度も改善される。上記構造単位の含有量としては、全構造単位に対し、より好ましくは３５質量部以下、さらに好ましくは３０質量部以下、さらに好ましくは２５質量部以下、特に好ましくは２０質量部以下である。また、エポキシ基を含有しないモノビニル単量体に由来する構造単位の含有量は０質量部でもよい。当該構造単位を含有する場合は、全構造単位に対し５質量部以上が好ましい。
【００２８】
上記構造単位（Ｍ−１）〜（Ｍ−３）の含有量の好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ−１）：全構造単位に対し４０〜９０質量部、構造単位（Ｍ−２）：全構造単位に対し１０〜６０質量部、構造単位（Ｍ−３）：全構造単位に対し０〜２５質量部であり、より好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ−１）：全構造単位に対し４０〜８０質量部、構造単位（Ｍ−２）：全構造単位に対し１５〜６０質量部、構造単位（Ｍ−３）：全構造単位に対し０〜２５質量部であり、特に好ましい組み合わせは、構造単位（Ｍ−１）：全構造単位に対し４０〜８０質量部、構造単位（Ｍ−２）：全構造単位に対し２０〜６０質量部、構造単位（Ｍ−３）：全構造単位に対し０〜２０質量部である。
【００２９】
（エポキシ基含有量）
リガンド結合前の固相担体に含まれるエポキシ基は、リガンドを結合するための官能基であり、また、さらに開環後にアフィニティークロマトグラフィー用担体としての親水性向上の元となる官能基である。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、好ましくは１〜６ｍｍｏｌ／ｇであり、さらに好ましくは２〜５ｍｍｏｌ／ｇであり、特に好ましくは２．５〜４ｍｍｏｌ／ｇである。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が１ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、リガンド結合後に得られる開環エポキシ基の量が適切な量となり、標的物質以外の不純物の除去能が向上する。リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量が６ｍｍｏｌ／ｇ以下であると、リガンド結合後のエポキシ基の残留量が減少し、アフィニティークロマトグラフィー用担体として保存した場合のリガンドの活性の低下が抑制され、繰り返し使用した際の標的物質の動的結合容量の低下も抑制される。
リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量は、エポキシ基含有モノビニル単量体の量、重合温度、重合時間、重合液のｐＨ、さらには、重合後の開環処理などによって、調整することが出来る。
【００３０】
＜固相担体の製造＞
固相担体の製造法を、固相担体が多孔質粒子である場合を例に挙げて説明する。
多孔質粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭５７−２４３６９号公報記載の二段膨潤重合法が挙げられる。重合に際しては、上記単量体に加えて、重合開始剤、多孔化剤、水系媒体、分散安定剤、界面活性剤、重合調整剤、重合禁止剤、シード粒子などを必要に応じて使用する。
【００３１】
多孔質粒子の製造における好ましい重合法は、単量体混合物と、多孔化剤とを必須成分とする水系混合物の懸濁重合法である。
【００３２】
また、懸濁重合の具体的な方法としては、例えば、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、単量体混合物および多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【００３３】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の合計使用量は、通常、単量体総量１００質量部に対して０．０１〜１０質量部程度である。
【００３４】
上記多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、単量体と共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や単量体混合物に可溶な線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。
【００３５】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、単量体総量１００質量部に対して４０〜４００質量部程度である。
【００３６】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。水系媒体の合計使用量は、単量体総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
【００３７】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【００３８】
また、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
【００３９】
また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。
また、重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【００４０】
重合完結後、得られた多孔質粒子に付着した水溶性高分子などを除くため、水および／または熱水を用いて洗浄することが好ましい。
また、シード粒子および／または多孔化剤の良溶媒を用いて洗浄することが、後述のリガンドの結合が容易となる点から、好ましい。洗浄溶媒としては、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどが好適に使用できる。また、必要に応じて、洗浄の前後に、超音波分散機などを用いて、多孔質粒子を分散してもよい。さらに、デカンテーション、ろ過、篩分級などの方法により、小粒子や粗大粒子を除去することが、圧力特性の向上や標的物質などの動的結合容量の向上の点から好ましい。
【００４１】
＜アフィニティークロマトグラフィー用担体の上記以外の構成＞
（開環エポキシ基）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、エポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は、上記共重合体を含有する固相担体にリガンドを結合した後に、該共重合体に含まれるエポキシ基、すなわち、リガンドと結合したエポキシ基以外の残余のエポキシ基を開環させて得ることができる。エポキシ基には上記の共重合体に含まれるものの他、エピクロロヒドリンやジグリシジルエーテル化合物等により、後から導入したエポキシ基も含まれ、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体の製造においてどの段階で導入されたかは問わない。
【００４２】
そして、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、固相担体の表面のエポキシ基がほとんど開環しており、アフィニティークロマトグラフィー用担体を高濃度の塩化物イオンと接触させ、残余のエポキシ基を開環させたときに放出される水酸化物イオンの量が著しく少ない。
そのため、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体を任意のカラム容器に充填し、カラムを２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、４０℃で７日間静置したときのカラム内のｐＨ上昇幅が２以下となるものである。斯かる構成により、不純物の除去能と保存安定性に優れたものとなる。上記ｐＨ上昇幅は、好ましくは１．９以下であり、不純物の除去能を更に改善させる場合には、１．７以下がより好ましい。また、ｐＨ上昇幅の下限値は特に限定されないが、例えば０．０１である。
【００４３】
上記ｐＨ上昇幅は、具体的には、以下の式から求めることができるものであり、より詳細には実施例に記載の方法で測定できる。また、本発明において、ｐＨ上昇幅の測定は新しいアフィニティークロマトグラフィー用担体に対して行う。新しいアフィニティークロマトグラフィー用担体とは、以前に使用されていない状態の担体を意味し、例えば抗体精製に使用するのであれば、抗体精製に使用する前の状態のものをいう。
（ｐＨ上昇幅）＝（負荷ｐＨ）−（初期ｐＨ）
【００４４】
上記式において「初期ｐＨ」は、２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をカラムに通液し、カラム内のｐＨが平衡に達したときのｐＨの値を意味する。
上記式において「負荷ｐＨ」は、初期ｐＨを測定してから４０℃の恒温器内で７日間静置した後、２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液をカラムに再度通液し、ｐＨが最も高くなったときのｐＨの値を意味する。
【００４５】
また、エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基としては、不純物の非特異吸着を防止すると共に、保存中にリガンドの活性が低下するのを防止する観点から、下記式（１）で表される基が好ましい。
【００４６】
【化１】
2015199196.tif 000002
【００４７】
［式（１）中、
Ｒ1は、炭素数１〜６の２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示し、
＊は、結合位置を示す。］
【００４８】
Ｒ1は、炭素数１〜６の２価の有機基を示す。当該有機基の炭素数としては、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１または２である。
また、上記２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられ、２価の炭化水素基が好ましい。
上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００４９】
Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜１０の１価の有機基を示すが、炭素数１〜１０の１価の有機基が好ましい。このような有機基としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量、防汚性の観点から、下記式（２）または（３）で表される有機基が好ましく、式（２）で表される有機基がより好ましい。
【００５０】
【化２】
2015199196.tif 000003
【００５１】
［式（２）中、
Ｒ3は、炭素数１〜１０の２価または３価の有機基を示し、
ｎは、１または２を示し、
＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
【００５２】
【化３】
2015199196.tif 000004
【００５３】
［式（３）中、
Ｒ4は、炭素数１〜１０の２価または３価の有機基を示し、
Ｙは、酸性基またはアミノ基を示し、
ｍは、１または２を示し、
＊＊は、式（１）中のＸとの結合位置を示す。］
【００５４】
式（２）中のＲ3、式（３）中のＲ4で示される２価または３価の有機基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量等の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５５】
また、上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量等の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５６】
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
【００５７】
また、上記３価の有機基としては、３価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００５８】
上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
【００５９】
式（２）中、ｎは、１または２を示すが、２が好ましい。
【００６０】
式（３）中、Ｙは、酸性基またはアミノ基を示すが、酸性基が好ましい。酸性基としては、カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩などが挙げられる。なお、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。
式（３）中、ｍは、１または２を示すが、１が好ましい。
【００６１】
Ｘは、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、イミノ基（＞ＮＨ）、またはオキシ基（＞Ｏ）を示すが、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、オキシ基（＞Ｏ）が好ましく、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）がより好ましく、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）が特に好ましい。
【００６２】
固相担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中、酸またはアルカリ存在下で攪拌する方法を挙げることができる。撹拌は、加熱して行ってもよく、室温で行ってもよい。
また、メルカプトエタノール、チオグリセロール、メルカプト酢酸やその塩、メルカプトコハク酸やその塩、メルカプトエタンスルホン酸やその塩、メルカプトプロパンスルホン酸やその塩などの親水性基を有するメルカプト化合物；モノエタノールアミン、グルコサミンなどの親水性基を有するアミン化合物；ジエチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類をエポキシ基を開環させるブロッキング剤として使用してもよい。なお、ここでいう親水性基としては、ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩等の酸性基などが挙げられる。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。
【００６３】
上記酸やアルカリ、ブロッキング剤の使用量は、残余のエポキシ基１モルに対し、通常０．１〜４０モル当量である。残余のエポキシ基はリガンドと多点結合して、保存中にリガンドの活性を低下させるため、２〜４０モル当量の過剰量にてブロッキングすることが好ましい。
【００６４】
また、開環反応の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、好ましくは１〜４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
また、必要に応じて塩基性触媒存在下でブロッキングを行ってもよい。斯かる塩基性触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミンなどが挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００６５】
好ましい開環エポキシ基は、固相担体に含まれるエポキシ基をメルカプト化合物および／または多価アルコール類により開環させて得られる開環エポキシ基であり、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が少なくなる上に、動的結合量が高くなるといった利点を有する。
また、メルカプト化合物をブロッキング剤として使用した場合、酸化剤を用いてチオ基をスルフィニル基に酸化し、さらに親水性を向上させることができる。
【００６６】
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜３モル当量である。
【００６７】
また、上記酸化反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常１〜５０質量倍程度であるが、好ましくは５〜１５質量倍である。
【００６８】
また、上記酸化反応の反応時間は特に限定されないが、通常１〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜９０℃程度である。
【００６９】
（リガンド）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、固相担体に結合したリガンドを含むものである。
リガンドは、標的物質に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
【００７０】
上記リガンドの中でも、イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
【００７１】
なお、本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合性タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。「イムノグロブリン結合」とはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特にＦｃフラグメントに結合することを表す。本発明において、アフィニティークロマトグラフィーに関連して使用される用語「リガンド」とは、アフィニティークロマトグラフィーの標的物質と結合する分子のことを表す。
【００７２】
上記リガンドと固相担体の結合方法としては、固相担体に含まれるエポキシ基をそのままリガンドとの結合部位として利用することが、プロセスとして簡便であり、好ましい。その他に、固相担体に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基をトシル基などで活性化してから、リガンドを結合する方法や、固相担体に含まれるエポキシ基または、当該エポキシ基の開環により生成する基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介して固相担体にリガンドを結合してもよい。リンカーとしては、ジグリシジルオキシアルカン、ポリアルキレングリコールジグリシジルエーテルなどのジグリシジルエーテル化合物が好ましい。
【００７３】
リガンドの結合条件は、リガンド結合前の固相担体のエポキシ基含有量、リガンドの種類により異なるが、当業者にとっての公知の方法を採用することができる。リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質のＮ末端のアミノ基、タンパク質に含まれるリジン、システインがエポキシとの反応点になりうる。タンパク質を結合する場合、例えば、タンパク質の等電点に近いバッファー類の水溶液を用い、必要により塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加し、タンパク質と固相担体を混合しながら、０〜４０℃で１〜４８時間反応させて、リガンドであるタンパク質を結合することができる。
【００７４】
リガンドの結合量は、リガンドの種類、標的物質の種類などによって、適宜調節されるが、プロテインＡのようなイムノグロブリン結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、固相担体１ｇ当たり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇである。プロテインＡのようなイムノグロブリン結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、固相担体１ｇ当たりのリガンドの結合量が１０ｍｇ以上であると動的結合容量に優れたものとなり、２００ｍｇ以下であると、結合した抗体の溶出のために使用する溶出液の量が特に適切な量となる。
【００７５】
（粒径、比表面積）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体が、多孔質粒子である場合、上記多孔質粒子の粒径は、通常、３５〜１００μｍであり、好ましくは４０〜８５μｍである。粒径が、３５μｍ以上であると、圧力特性に優れる。１００μｍ以下であると、動的結合容量が高い充填剤が得られる。
多孔質粒子の粒径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製ＬＳ１３  ３２０）により得られる体積平均粒子径を意味する。
【００７６】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を構成する固相担体が、多孔質粒子である場合、上記多孔質粒子の比表面積は、孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当するポアを測定したときに、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。比表面積が上記の範囲内であると、標的物質の動的結合容量が高いアフィニティークロマトグラフィー用担体が得られる。なお、本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータ（株式会社島津製作所製オートポアIV９５２０）により得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
【００７７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、不純物除去能が高く、しかも保存安定性に優れ、抗体などのタンパク質の精製に特に有用である。
【００７８】
〔アフィニティークロマトグラフィーカラム〕
本発明のアフィニティークロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されたものである。
【００７９】
〔標的物質の精製方法〕
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とするものである。
精製は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる以外は常法と同様であるが、例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。
本発明の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００８１】
（実施例１）
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．３６ｇ、亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１２．００ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２４．４３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、８６℃に温度を維持した。
（２）その後、８６℃に温度を維持し、３時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液を得た。
（３）改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製  ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ  硫酸ナトリウム／０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得、このプロテインＡ分散液に実施例１の工程（２）で得られた多孔質粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ相当）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
（４）生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）で洗浄した後、１．０Ｍ  硫酸水溶液（和光純薬工業社製）４０ｍＬに分散させ、４０℃で４時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１を得た。【００８２】
（実施例２）
実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）９．２０ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．５８ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）１．７３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）１９．５９ｇ及びアニソール（和光純薬工業社製）６．０５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ  ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤２を得た。【００８３】
（実施例３）
実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．１８ｇ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（東京化成工業社製）１．３６ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．０９ｇからなる単量体組成物を、４−メチル−２−ペンタノール（和光純薬工業製）２１．９７ｇ及び炭酸ジエチル（和光純薬工業製）２．９５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ−１）を、１．０Ｍ  １−チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ−２）を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤３を得た。【００８４】
（実施例４）
実施例３と同様の操作で得た、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子（ＰＡ−２）を、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させた。これに、３０％過酸化水素水０．４８ｇを添加し、２５℃で２４時間振とう撹拌した。さらに、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤４を得た。【００８５】
（実施例５）
実施例３と同様の操作で生成させたプロテインＡ固定粒子（ＰＡ−１）を、１．０Ｍ  １−チオグリセロール／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で４０時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤５を得た。【００８６】
（実施例６）
実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）５．２６ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．６３ｇ及びジビニルベンゼン（新日鐵化学社製）２．６３ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２５．００ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ  ２−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業社製）／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤６を得た。【００８７】
（実施例７）
実施例１の工程（１）において、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）４．７７ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）８．８６ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤７を得た。【００８８】
（実施例８）
実施例１の工程（１）において、ビニルベンジルグリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）３．４３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）４．１１ｇ及びエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）６．１７ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤８を得た。【００８９】
（比較例１）
実施例３において、プロテインＡ固定後に未反応のエポキシ基の開環を行わないこと以外は、実施例３と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤９を得た。【００９０】
（比較例２）
実施例１の工程（１）において、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（ダイセル社製）１．４１ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）８．４５ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．２３ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例１の工程（３）と同様の操作でプロテインＡを固定し、プロテインＡ固定粒子を生成させた。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ  １−チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で４時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１０を得た。【００９１】
（比較例３）
比較例２において、１．０Ｍ  １−チオグリセロール（旭化学工業社製）／０．１Ｍ  硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬにプロテインＡ固定粒子を分散させた後の振とう撹拌時間を、４時間から１７時間に変更した以外は、比較例２と同様の操作でアフィニティークロマトグラフィー用充填剤１１を得た。【００９２】
（比較例４）
実施例１の工程（１）において、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．３９ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．７９ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）９．７６ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例３と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１２を得た。【００９３】
試験例１  （エポキシ基含有量の定量）
実施例１〜８および比較例１〜４で得られたリガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量を定量した。
すなわち、塩化カルシウム水溶液に懸濁した多孔質粒子に塩酸を過剰に添加して塩酸を付加反応させることによりエポキシ基を開環し、残余の塩酸を過剰量の水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、フェノールフタレイン溶液を添加し、残余の水酸化ナトリウムを塩酸で逆滴定することにより定量した。なお、滴定の終点はフェノールフタレインの赤色が消えた時点とした。結果を表１に示す。【００９４】
試験例２  （残余のエポキシ基量の評価（ｐＨ上昇幅の測定））
実施例１〜８および比較例１〜４で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤をＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ  ５／５０カラムに充填高さ約５ｃｍで充填し、前記カラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓに接続してｐＨをモニタリングしながら２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を流速０．２ｍＬ／分にて通液し、カラム内のｐＨが平衡に達したときのｐＨの値を初期ｐＨとして記録した。さらに、前記緩衝液に置換した前記カラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓから取り外し、４０℃の恒温器内で７日間静置した。
その後、前記カラムを再びＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓに接続してｐＨをモニタリングしながら前記緩衝液を流速０．２ｍＬ／分にて通液し、ｐＨが最も高くなったときのｐＨの値を負荷ｐＨとして記録した。初期ｐＨと負荷ｐＨとの差をｐＨ上昇幅として求めた。なお、初期ｐＨ及び負荷ｐＨの測定は２３±１℃の恒温室内で実施した。結果を表１に示す。【００９５】
試験例３  （プロテインＡ結合量の定量）
実施例１〜８および比較例１〜４で得られたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表１に示す。【００９６】
試験例４  （ＤＢＣの測定および保存安定性の評価）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する実施例および比較例の各充填剤のＤＢＣを測定した。カラムは容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬにタンパク質を溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表１に示す。【００９７】
さらに、ＤＢＣ測定後のカラムを試験例２と同様に２ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で置換し、そのまま４０℃で７日間静置した。その後、再び上記と同様の条件でＤＢＣの測定を実施し、負荷ＤＢＣを求めた。負荷ＤＢＣ／初期ＤＢＣ×１００をＤＢＣ維持率として、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の保存安定性を評価した。なお、初期ＤＢＣ及び負荷ＤＢＣの測定は２３±１℃の恒温室内で実施した。結果を表１に示す。【００９８】
試験例５  （ＨＣＰの定量）
カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０  ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例及び比較例の各充填剤を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出した。結果を表１に示す。【００９９】
【表１】
2015199196.tif 000005
【０１００】
表１中の各記号は以下に示すとおりである。
（Ｍ−１）    ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート、ＨＢＡＧＥ：４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、ＶＢＧＥ：（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、ＭＥＴＨＢ：３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート
（Ｍ−２）    ＤＶＢ：ジビニルベンゼン、ＴＭＰ：トリメチロールプロパントリメタクリレート、ＧＬＤＭ：グリセリンジメタクリレート、ＥＤＭＡ：エチレングリコールジメタクリレート
（Ｍ−３）    ＥＶＢ：１−エチル−４−ビニルベンゼン、ＨＥＡＡ：Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）メタクリルアミド、ＧＬＭ：グリセロールモノメタクリレート
（開環に使用した化合物）    ＭＥ：２−メルカプトエタノール、ＴＧ：１−チオグリセロール、ＭＰＳＡ：２−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム
【国際調査報告】
2015199196.tif 000008
2015199196.tif 000009