(57)【要約】  安全性および有効性が高く低価で供給可能な潰瘍性大腸炎の予防または治療剤と新規フラーレン誘導体を提供する。  フラーレンの炭素クラスター骨格を構成する隣接結合炭素原子対の少なくとも1つに、次式(I)〜(III)：【化１】2014129513.tif 000047（AとBはフラーレン炭素クラスター骨格を構成し隣接して結合する炭素原子、R1は水素原子、−(CH2)lCOORa、または−CH((CH2)mCOORa)2、R2〜R5は水素原子、炭化水素基、または−(CH2)nCOORbを示す。R1〜R5は、−COOHが1個以上、−COORaおよび−COORbの合計が2〜4個となるように選択される。R6とR7は炭化水素基、R8〜R11は水素原子または炭化水素基、X-はアニオンを示す。）のいずれかで表わされる有機結合構造を有するフラーレン誘導体および薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する潰瘍性大腸炎の予防または治療剤。
2014129513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラーレンの炭素クラスター骨格を構成する隣接結合炭素原子対の少なくとも1つに、次式(I)〜(III)：
【化１】
2014129513.tif 000043
（式中、AおよびBはフラーレン炭素クラスター骨格を構成し隣接して結合する炭素原子を示し、R1は水素原子、−(CH2)lCOORa、または−CH((CH2)mCOORa)2（lは1〜6の整数を示し、mは0〜6の整数を示し、Raは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。）を示し、R2〜R5はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜10の炭化水素基、または−(CH2)nCOORb（nは0〜6の整数を示し、Rbは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。）を示す。R1〜R5は、−COOHが1個以上、−COORaおよび−COORbの合計が2〜4個となるように選択される。）
【化２】
2014129513.tif 000044
（式中、AおよびBは前記と同義である。）
【化３】
2014129513.tif 000045
（式中、AおよびBは前記と同義であり、R6およびR7は、それぞれ独立に炭素数1〜16の炭化水素基を示し、R8〜R11はそれぞれ独立に水素原子または炭素数1〜16の炭化水素基を示す。X-はアニオンを示す。）のいずれかで表わされる有機結合構造を有するフラーレン誘導体およびこれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する潰瘍性大腸炎の予防または治療剤。
【請求項２】
フラーレンの炭素クラスター骨格を構成する隣接結合炭素原子対の1つに、次式(IV)：
【化４】
2014129513.tif 000046
（式中、AおよびBはフラーレン炭素クラスター骨格を構成し隣接して結合する炭素原子を示し、R12は水素原子、−(CH2)lCOOH、または−CH((CH2)mCOOH)2を示す(lは1〜6の整数を示し、ｍは0〜6の整数を示す。)。R13とR14は、共に−(CH2)nCOOHであり(nは0〜6の整数を示す。)、かつR15とR16は、共に水素原子であるか、共に炭素数1〜3の炭化水素基である。）で表わされる有機結合構造を有するフラーレン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性大腸炎の予防または治療剤と新規フラーレン誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel Disease：IBD）は、大腸および小腸の粘膜に慢性の炎症または潰瘍を引き起こす原因不明の疾患の総称であり、例えば、潰瘍性大腸炎（Ulcerative Colitis： UC）、クローン病（Crohn’s Disease： CD）等が知られている。これらは厚生労働省により特定難治性疾患に指定されている。【０００３】
潰瘍性大腸炎は、大腸の粘膜にびらんや潰瘍ができる大腸の炎症性疾患であり、場合により下血を伴う下痢や、頻繁に起こる腹痛が特徴的な症状として現れる。病変は直腸から連続的に、そして上行性（口側）に広がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に拡がる。【０００４】
わが国の潰瘍性大腸炎の患者数は、近年では毎年およそ5,000人ずつ増加し、特定疾患医療受給者証交付件数によれば現在では100,000人を超えると報告され、米国では1,000,000人とも言われている。【０００５】
発症年齢のピークは男性で20〜24歳、女性では25〜29歳と若年層の羅患が多いが、若年者から高齢者まで発症する。【０００６】
その原因としては、腸内細菌の関与や本来は外敵から身を守る免疫機構が正常に機能しない自己免疫反応の異常、あるいは食生活の変化の関与等が考えられているが、まだ明らかにされていない。【０００７】
潰瘍性大腸炎の患者には、重症の場合や薬物療法が効かない場合には手術が必要となるが、原則的には薬による内科的治療が行われる。現在、潰瘍性大腸炎を完治に導く内科的治療は存在しないが、腸の炎症を抑制する有効な治療方法として、5-アミノサリチル酸(5-ASA)製剤、副腎皮質ステロイド剤、免疫調節剤等の薬物治療や血球成分除去療法等が知られている（特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５０９６１９号公報
【特許文献２】特表２００９−５４３８７３号公報
【特許文献３】特開２００４−２９２４４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非侵襲的で安全性が高く、患者によらず有効性を発揮できる治療薬を低薬価で提供することが望まれており、従来の内科的治療に用いられる治療薬においてもさらなる改善が期待されている。【００１０】
なお、特許文献３には、ピロリジン骨格等を有する各種のフラーレン誘導体が開示されているが、例えば、光学異性体のない2,2-ジカルボキシピロリジン骨格を有するフラーレン誘導体等については、具体的な裏付けをもって開示されていない。【００１１】
また、フラーレンはその球状の分子の構造から置換基がランダムに付加してしまい位置異性体が多く生じることが知られている。位置異性体は分子の形状が異なる事から生体への作用が異なる場合もあり、医薬品の分野ではこれらの異性体を減らす開発が続けられている。【００１２】
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、安全性および有効性が高く低価で供給可能な潰瘍性大腸炎の予防または治療剤と新規フラーレン誘導体を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題を解決するために、本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤は、フラーレンの炭素クラスター骨格を構成する隣接結合炭素原子対の少なくとも1つに、次式(I)〜(III)：【００１４】
【化１】
2014129513.tif 000003
【００１５】
（式中、AおよびBはフラーレン炭素クラスター骨格を構成し隣接して結合する炭素原子を示し、R1は水素原子、−(CH2)lCOORa、または−CH((CH2)mCOORa)2（lは1〜6の整数を示し、mは0〜6の整数を示し、Raは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。）を示し、R2〜R5はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜10の炭化水素基、または−(CH2)nCOORb（nは0〜6の整数を示し、Rbは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。）を示す。R1〜R5は、−COOHが1個以上、−COORaおよび−COORbの合計が2〜4個となるように選択される。）【００１６】
【化２】
2014129513.tif 000004
【００１７】
（式中、AおよびBは前記と同義である。）【００１８】
【化３】
2014129513.tif 000005
【００１９】
（式中、AおよびBは前記と同義であり、R6およびR7は、それぞれ独立に炭素数1〜16の炭化水素基を示し、R8〜R11はそれぞれ独立に水素原子または炭素数1〜16の炭化水素基を示す。X-はアニオンを示す。）のいずれかで表わされる有機結合構造を有するフラーレン誘導体およびこれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。【００２０】
本発明のフラーレン誘導体は、フラーレンの炭素クラスター骨格を構成する隣接結合炭素原子対の1つに、次式(IV)：【００２１】
【化４】
2014129513.tif 000006
【００２２】
（式中、AおよびBはフラーレン炭素クラスター骨格を構成し隣接して結合する炭素原子を示し、R12は水素原子、−(CH2)lCOOH、または−CH((CH2)mCOOH)2を示す(lは1〜6の整数を示し、mは0〜6の整数を示す。)。R13とR14は、共に−(CH2)nCOOHであり(nは0〜6の整数を示す。)、かつR15とR16は、共に水素原子であるか、共に炭素数1〜3の炭化水素基である。）で表わされる有機結合構造を有する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤は、安全性および有効性が高く、かつ低価で供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１（Caco2細胞）におけるIL-1β作用後の上清中のIL-8量のELISAによる測定結果（化合物3）を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるIL-1β作用後の上清中のIL-8量のELISAによる測定結果（化合物1〜6）を示すグラフである。
【図３】実施例２（RAW264.7細胞）におけるLDH活性の測定によるフラーレン誘導体等の細胞傷害性の測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例２におけるLDH活性の測定によるフラーレン誘導体等の細胞傷害性の測定結果（LPSを作用）を示すグラフである。
【図５】実施例３（RAW264.7細胞）における上清中のTNF-α量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図６】実施例３におけるLPS作用後の上清中のIL-6量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例３におけるLPS作用後の上清中のTNF-α量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例３におけるLPS作用後の上清中のIL-1β量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例３におけるLPS作用後の上清中のIP-10量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３におけるLPS作用後の上清中のIFN-β量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例３の結果を実施例１、２の結果とともに纏めた結果を示した図である。
【図１２】実施例４におけるPoly(I:C)作用後の上清中のTNF-α量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図１３】実施例４におけるPoly(I:C)作用後の上清中のIL-6量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図１４】実施例５におけるDSS投与群および非投与群のマウスの摘出した大腸におけるMPO活性の測定結果を示すグラフである。
【図１５】実施例６（Caco2細胞）におけるIL-1β作用後の上清中のIL-8量のELISAによる測定結果（化合物7〜12、化合物3）を示すグラフである。
【図１６】実施例７（Caco2細胞）におけるROSの測定結果を示すグラフである。
【図１７】実施例７（Caco2細胞）におけるIL-1β作用後の上清中のIL-8量のELISAによる測定結果を示すグラフである。
【図１８】実施例８におけるMLR（混合リンパ球反応）の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の炎症性腸疾患の予防または治療剤は、前記の式(I)〜(III)のいずれかで表わされる有機結合構造を有するフラーレン誘導体およびこれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有している。
【００２７】
このフラーレン誘導体における炭素クラスター骨格のフラーレンとしては、例えば、C60、C70、およびC60とC70との混合物等が挙げられる。また、それ以上の高次フラーレン等を含むものであってもよい。
【００２８】
薬理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アミン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
【００２９】
式(I)で表わされる有機結合構造を有しているフラーレン誘導体のうち、ピロリジン骨格の2位または5位に1つのカルボキシル基を有する化合物は、例えば、特許文献３（特開２００４−２９２４４３号公報）に記載の方法で合成することができる。式（I）で表わされる有機結合構造を有しているフラーレン誘導体のうち、その他の化合物や、式（IV）で表わされる有機結合構造を有する化合物は、後述の実施例の方法に準じて合成することができる。このフラーレン誘導体は、有機結合構造の数が好ましくは1〜2、位置異性体をなくすためにより好ましくは1である。さらにR13、R14または、R15、R16に同一の置換基を付加させる事によって光学異性体もなくすことが出来るためより有用である。式(I)中、R1は水素原子、−(CH2)lCOORa、または−CH((CH2)mCOORa)2（lは1〜6の整数を示し、mは0〜6の整数を示し、Raは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。lは好ましくは1〜3であり、mは好ましくは0〜3であり、Raの炭化水素基としては、好ましくは直鎖または分岐のアルキル基、特に直鎖のアルキル基である。R2〜R5はそれぞれ独立に水素原子、炭素数1〜10の炭化水素基、または−(CH2)nCOORb（nは0〜6の整数を示し、Rbは水素原子または炭素数1〜3の炭化水素基を示す。）を示す。nは好ましくは0〜3であり、R1〜R5は、−COOHが1個以上、−COORaおよび−COORbの合計が2〜4個となるように選択される。Rbの炭化水素基としては、好ましくは直鎖または分岐のアルキル基、特に直鎖のアルキル基である。
【００３０】
式(IV)中、R12は水素原子、−(CH2)lCOOH、または−CH((CH2)mCOOH)2を示す（lは1〜6の整数を示し、mは0〜6の整数を示す。）。ｌは好ましくは1〜3であり、ｍは好ましくは0〜3である。R13とR14は、共に−(CH2)nCOOHであり（nは0〜6の整数を示す。）、かつR15とR16は、共に水素原子であるか、共に炭素数1〜3の炭化水素基である。nは好ましくは0〜3であり、炭化水素基は、好ましくは直鎖または分岐のアルキル基、特に直鎖のアルキル基である。
【００３１】
式(II)で表わされる有機結合構造を有しているフラーレン誘導体は、例えば、特許文献３に記載の方法で合成することができる。このフラーレン誘導体は、有機結合構造の数が好ましくは1〜2、位置異性体をなくすためにより好ましくは1である。
【００３２】
式(III)で表わされる有機結合構造を有しているフラーレン誘導体は、例えば、特許文献３に記載の方法で合成することができる。このフラーレン誘導体は、有機結合構造の数が好ましくは1〜2、位置異性体をなくすためにより好ましくは1である。R6およびR7、R8〜R11の炭化水素基は、好ましくは炭素数1〜16の直鎖または分岐のアルキル基、特に直鎖のアルキル基で、炭素数1〜5の直鎖のアルキル基、中でも炭素数1〜3の直鎖のアルキル基が例示される。4級アミン塩の対イオンとしてのアニオンX-については薬理学的に許容されるものであれば各種のものであってよく、例えば、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、硫酸イオン等の無機酸イオン、有機酸イオン、錯イオン等が挙げられる。
【００３３】
本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤は、治療目的に応じて各種の薬学的投与形態とすることができ、具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤とすることができる。これらの投与剤は、薬学的に許容される担体等を用い、この分野で通常知られた慣用的な製剤方法により製剤化することができる。
【００３４】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、コーンスターチ、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を用いることができる。さらに、錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００３５】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン末、カンテン末等の崩壊剤等を用いることができる。
【００３６】
カプセル剤は常法に従い、上記で例示した各種の担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００３７】
経口用液体製剤とする場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を用い、常法により、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合、矯味剤としては、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が、緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３８】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を用いることができる。
【００３９】
注射剤とする場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば水、乳酸水溶液、エチルアルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を用いることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、またはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００４０】
さらに上記各製剤には必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や、他の医薬品を配合してもよい。本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤における有効成分のフラーレン誘導体およびその薬理学的に許容される塩の含有量は特に限定されず、適宜選択することができるが、いずれも通常製剤中1〜80質量％程度とするのが好ましい。
【００４１】
本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、患者の症状の程度等に応じて適宜決定される。例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤及び乳剤は経口投与される。注射剤は単独でまたはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。
【００４２】
本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択できる。本発明の有効成分であるフラーレン誘導体およびその薬理学的に許容される塩は、低毒性であるため、安全に使用することができ、その投与量は通常10〜4000mg／日程度、好ましくは100〜1000mg／日程度を目安とするのがよい。また、製剤としての本発明の潰瘍性大腸炎の予防または治療剤は、1日1回または2〜4回程度に分けて投与することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜実施例１＞
以下の実施例においては、プロリン型フラーレンを含む次の化合物1〜12を用いた。
化合物1（フラーレン誘導体）【００４４】
【化５】
2014129513.tif 000007
【００４５】
化合物2（フラーレン誘導体）【００４６】
【化６】
2014129513.tif 000008
【００４７】
化合物3（フラーレン誘導体）【００４８】
【化７】
2014129513.tif 000009
【００４９】
化合物4（フラーレン誘導体）【００５０】
【化８】
2014129513.tif 000010
【００５１】
化合物5（フラーレン誘導体）【００５２】
【化９】
2014129513.tif 000011
【００５３】
化合物6（プロリン誘導体）【００５４】
【化１０】
2014129513.tif 000012
【００５５】
化合物7（フラーレン誘導体）【００５６】
【化１１】
2014129513.tif 000013
【００５７】
化合物8（フラーレン誘導体）【００５８】
【化１２】
2014129513.tif 000014
【００５９】
化合物9（フラーレン誘導体）【００６０】
【化１３】
2014129513.tif 000015
【００６１】
化合物10（フラーレン誘導体）【００６２】
【化１４】
2014129513.tif 000016
【００６３】
化合物11（フラーレン誘導体）【００６４】
【化１５】
2014129513.tif 000017
【００６５】
化合物12（フラーレン誘導体）【００６６】
【化１６】
2014129513.tif 000018
【００６７】
上記のフラーレン誘導体（化合物1〜12）のうち、化合物1,3,4,5は、特許文献３に記載の方法に従って合成した。【００６８】
化合物2は、次の合成例１の手順で合成した。【００６９】
また新規化合物として、次の合成例２〜７の手順で化合物7〜12を合成した。
[合成例１]  2,5-Dicarboxypyrrolidino[60]fullerene (2)の合成（化合物2）【００７０】
【化１７】
2014129513.tif 000019
【００７１】
2,5-Di-tert-butoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (1)の合成
C60 (200 mg, 0.28 mmol) を脱水toluene (150 mL) に溶解し、glycine tert-butyl ester hydrochloride (2.12 g. 13 mmol, 45当量)、pyridine (1.0 mL, 13 mmol, 45当量) をmethanol (10 mL) に溶解し、それぞれ混合した。【００７２】
12日間、室温下、光 (USHIO Optical Modulex, 250 W, 超高圧水銀ランプ ; ファイバー, 900 mW/cm2) を照射した。TLC にて、C60 の残存が確認されたが、目的物が確認でき、多置換体の生成も確認されたことから反応を止めた。反応液を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (toluene 100% → toluene : ethyl acetate = 9 : 1) より精製し、1種類の茶褐色バンドを分取、溶媒を減圧留去した後、n-hexane により懸濁状態とし吸引ろ過によって、茶褐色固体を得た (94 mg、収率 35%)。1H-NMRおよびMALDI-TOF-MS より、得られた固体を目的物(1)と同定した（表１）。【００７３】
【表１】
2014129513.tif 000020
【００７４】
2,5-Dicarboxypyrrolidino[60]fullerene (2)の合成
1 (40 mg, 0.042 mmol) をo-dichlorobenzene (40 mL) に溶解し、trifluoromethanesulfonic acid (63 mg, 0.42 mmol, 10当量) を加えて、室温で23時間撹拌した。析出した固体を吸引濾取し、o-dichlorobenzene、toluene、1 M sodium hydrogen carbonate、水、1 M hydrochloric acid で洗浄し、茶褐色固体を得た (17 mg, 収率 47%)。1H-NMR および MALDI-TOF-MS より、得られた固体を目的物(2)と同定した（表２）。【００７５】
【表２】
2014129513.tif 000021
【００７６】
[合成例２]  2,2-Dicarboxypyrrolidino[60]fullerene (4)の合成（化合物7）【００７７】
【化１８】
2014129513.tif 000022
【００７８】
2,2-Diethoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (3)の合成
C60 (155 mg, 0.21 mmol) を脱水toluene 100 mLに溶解した。これに diethyl aminomalonate hydrochloride (89 mg, 0.42 mmol, 2当量) とparaformaldehyde (31 mg, 1.0 mmol, 5当量)を加えて80℃で3時間加熱撹拌を行った。反応の進行を TLC (toluene : ethyl acetate = 10 : 1)によって観察し、Rf = 0.66 付近に、目的化合物と思われるスポットを確認したので反応を止めた。反応液を水で 2回、飽和食塩水で 2回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下において溶媒を留去した。シリカゲルクロマトグラフィー(toluene → toluene : ethyl acetate = 10 : 1)によって精製し、茶褐色固体を70 mg (収率38 %) を得た。1H-NMRおよび MALDI-TOF-MSより、得られた固体を目的物(3)と同定した（表３）。【００７９】
【表３】
2014129513.tif 000023
【００８０】
2,2-Dicarboxypyrrolidino[60]fullerene (4)の合成
秤量した NaH (79 mg, 3.3 mmol, 50当量)をナスフラスコに入れ、ヘキサンで 3回洗浄を行った。そこに、脱水toluene 20 mLに溶解させた3 (60 mg, 0.066 mmol)を加え、45℃で4時間加熱撹拌を行った。熱いうちにmethanol、 続いて2 M HClを加え反応を止めた。析出した固体を吸引濾過により濾取し、茶色固体32 mg (収率 58%)を得た。1H-NMRおよび MALDI-TOF-MSより、得られた固体を目的物(4)と同定した（表４）。【００８１】
【表４】
2014129513.tif 000024
【００８２】
[合成例３]  2,2-Dicarboxy-N-(carboxymethyl)pyrrolidino[60]fullerene (3) の合成（化合物8）【００８３】
【化１９】
2014129513.tif 000025
【００８４】
上記に示す方法で合成を行った。まず、アミノマロン酸ジエチルとブロモ酢酸エチルの求核置換反応によりDiethyl (N-ethoxycarbonylmethyl)aminomalonate (1) を合成し反応に用いた。
Diethyl (N-ethoxycarbonylmethyl)aminomalonate (1) の合成
二頸ナスフラスコにブロモ酢酸エチル 526 μL (4.73 mmol, 1.0 当量) を加え、窒素置換を行った。三角フラスコにアミノマロン酸ジエチル塩酸塩 1.0 g (4.73 mmol) を量り取り、DMF 15 mL に溶解した。そこにトリエチルアミン 990μmL (7.09 mmol, 1.5 当量) を加えると白色の沈殿が生じたため、一度ろ過し、ろ液を二頸ナスフラスコにシリンジで少量ずつ滴下しながら60 oC で加熱撹拌した。16 時間後、TLC (n-hexane : ethyl acetate = 1:1) 及びニンヒドリン試薬にて反応の進行を確認したところ、目的物と思われるスポットを確認したため、撹拌を止め、反応液をろ過し、減圧下で溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexene : ethyl acetate = 100 : 1 → 10 : 1 → 3 : 2 → 1 : 1 → ethyl acetate) で精製し、無色油状液体 319.4 mg を得た。1H-NMR より、1 が生成していると判断した（表５）。【００８５】
【表５】
2014129513.tif 000026
【００８６】
2,2-Di(ethoxycarbonyl)-N-(ethoxycarbonylmethyl)pyrrolidino[60]fullerene (2) の合成
C60 120.4 mg (0.167 mmol) を脱水toluene 80 mLに溶解した。これに 1  159.6 mg (0.611 mmol, 3.6 当量) とパラホルムアルデヒド100.2 mg (3.34 mmol, 20 当量)を加えて80 oCで加熱撹拌を行った。1 時間後に反応液の色が茶色になったため、 TLC (toluene : ethyl acetate = 10 : 1)によって反応の進行を観察し、目的物と思われる茶色スポットを確認した。その後、反応温度を90 oC にし、3 時間加熱撹拌を続けた。TLC により、二付加体と思われるスポットを確認したため、C60 が少し残っていたが、撹拌を止めた。水で2 回、飽和食塩水 で2 回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去し、茶色固体 80.2 mg (Yield: 48 %) を得た。1H-NMR, MALDI-TOF-MS により2 であると判断した（表６）。【００８７】
【表６】
2014129513.tif 000027
【００８８】
2,2-Dicarboxy-N-(carboxymethyl)pyrrolidino[60]fullerene (3) の合成
秤量した NaH (46.7 mg, 1.95 mmol, 66 当量) をナスフラスコに入れ、脱水したn-hexaneで洗浄を行った。その後、合成した2 (29.3 mg, 0.03 mmol) を加え、50 oCで加熱撹拌を行い、1 時間後、メタノールで未反応のNaHを失活させた。1 M HCl を加えて反応液を酸性にした後、析出した固体を吸引濾過し、toluene, n-hexane, 1 M HCl により洗いこみ、真空乾燥を行い、茶色固体を 32.4 mg (Yield: 94 %)を得た。1H-NMR, ESI-TOF-MS を測定し、3 と同定した（表７）。【００８９】
【表７】
2014129513.tif 000028
【００９０】
[合成例４]  2,2-(Dicarboxymethyl)pyrrolodino[60]fullerene (5) の合成（化合物9）【００９１】
【化２０】
2014129513.tif 000029
【００９２】
2,2-Di(ethoxycarboxymethyl)pyrrolidino[60]fullerene (4) の合成
C60  268.0 mg (0.372 mmol) に脱水o-dichlorobenzene 150 mL を加え、超音波を照射した。少量のC60 が溶け残っていたがそのまま反応に用いた。これに glycine 83.8 mg (1.12 mmol, 3.0 当量) と 3-オキソグルタル酸ジエチル (338 μL, 1.86 mmol, 5.0 当量) を加えて200 °C で還流撹拌した。反応の進行を TLC (toluene : ethyl acetate = 10 : 1) によって観察し、目的物と思われるスポットを確認した。17 時間後に多置換体と思われるスポットが見られたため反応を停止した。水で2 回、飽和食塩水 で2 回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(toluene → toluene : ethyl acetate = 50 : 1) により精製し、茶色固体47.2 mg を得たが、TLC にて目的物とは異なるスポットが一つ確認できたため、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー(toluene → toluene : ethyl acetate = 50 : 1) により精製し茶色固体28.6 mg (収率 8.2%) で得た。1H-NMR, MALDI-TOF-MS により4であると判断した（表８）。【００９３】
【表８】
2014129513.tif 000030
【００９４】
2,2-Di(carboxymethyl)pyrrolidino[60]fullerene (5) の合成
秤量した NaH (63.6 mg, 1.59 mmol, 66 当量) をナスフラスコに入れ、脱水したn-hexaneで洗浄を行った。その後、4 (22.6 mg, 0.024 mmol) を加え、50 oCで加熱撹拌を行い、1 時間後、メタノールで未反応のNaHを失活させた。1 M HCl を加えて反応液を酸性にした後、析出した固体を吸引濾過し、toluene, n-hexane, 1 M HCl により洗いこみ、真空乾燥を行い、茶色固体を 26.1 mg (Yield: 99 %)を得た。1H-NMR, ESI-TOF-MS を測定し、5 と同定した（表９）。【００９５】
【表９】
2014129513.tif 000031
【００９６】
[合成例５]  2-Carboxy-N-ethoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60] fullerene (9)の合成（化合物10）【００９７】
【化２１】
2014129513.tif 000032
【００９８】
上記に示す方法で合成を行った。まず、原料のアルデヒドである 7 を合成し、C60とiminodiacetic acid diethyl ester を反応させて 8を得、t-ブチルエステルのみをTFMSAで加水分解し9を合成した。
Di-tert-butyl tartrate (6)の合成
N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide (10.0 g, 48.5 mmol, 3.0当量) 、copper(I) chloride (200 mg, 2 mmol, 0.14当量) をtert-butyl alcohol (4.4 g, 58.0 mmol, 3.6当量) に溶解させ、室温で5日間撹拌した。その後dichloromethane 70 mL、 L-tartaric acid (2.4 g, 16.0 mmol) を加え室温でさらに28時間撹拌した。反応液をセライトで濾過し、水，飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下にて留去した。得られた黄色液体についてシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n-hexane : ethyl acetate = 10 : 1 → 1 : 1) により精製し、白色固体di-tert-butyl tartrate (6) 1.27 g (4.85 mmol, 収率30 %) を得た（表１０）。【００９９】
【表１０】
2014129513.tif 000033
【０１００】
tert-Butyl glyoxylate (7)の合成
Di-tert-butyl tartrate (2.0 g, 7.6 mmol) をmethanol 10 mLに、sodium metaperiodate (1.5 g, 7.0 mmol, 0.9当量) を精製水 5 mLにそれぞれ溶解させ、それらを混合し0℃で60分間撹拌した。反応液をdichloromethaneで3回抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下にて留去した。tert-butyl glyoxylate (7)を黄色の油状物質として2.1 gを得た。1H-NMR(CDCl3)で目的物と思われるピーク (9.02 ppm(s, 1H, CHO)) が見られたため、不純物も含まれていたようだったがそのまま次の反応に用いた。
2-tert-Butoxycarbonyl-N-ethoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonyl-pyrrolidino[60]fullerene (8)の合成
C60 (200 mg, 278 μmol) をtolueneに溶解させ、iminodiacetic acid diethyl ester (86.4 μg, 467 μmol, 1.6当量)、tert-butyl glyoxylate (7) 1.0 gを加え、145℃で35分間還流した。有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去した。その後，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（toluene → toluene : ethyl acetate = 100 : 15）より、茶褐色固体2-tert-butoxycarbonyl-N-ethoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (8)を137 mg (134 μmol, 収率 49 ％) を得た（表１１）。【０１０１】
【表１１】
2014129513.tif 000034
【０１０２】
2-Carboxy-N-ethoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60]- fullerene (9) の合成
8 (150 mg，147 μmol) をtoluene 150 mLに溶解し、TFMSA (211 mg, 1.40 μmol, 9.5当量)を加えた。すぐに茶褐色固体が生じ5分後に反応を止めた。目的物を1M sodium hydrogencarbonate、水、1M hydrochloric acidの順に洗い吸引濾過し、70℃で1時間減圧乾燥し、茶褐色固体2-carboxy-N-ethoxycarbonylmethyl-5-ethoxy-carbonylpyrrolidino[60]fullerene (9)  116 mg (120 μmol，収率82 %) を得た（表１２）。【０１０３】
【表１２】
2014129513.tif 000035
【０１０４】
[合成例６]  2-Carboxy-N-carboxymethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (11) の合成（化合物11）
C60にdi-tert-butyl iminodiacetate、ethyl glyoxylateを反応させ10 を得、t-ブチルエステルのみをTFMSAで加水分解し、11を合成した。【０１０５】
【化２２】
2014129513.tif 000036
2-tert-Butoxycarbonyl-N-tert-butoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonyl-pyrrolidino[60] fullerene (10)の合成
C60 (300 mg, 417 μmol) をtoluene 500 mLに溶解し、di-tert -butyl iminodiacetate (200 mg, 815 μmol, 2当量) 、ethyl glyoxylate (500 μL, 842  μmol, 47 % content in toluene, 2当量)を加え、30分間還流した。反応液を水、飽和食塩水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下にて留去した。得られた固体についてシリカゲルカラムクロマトグラフィー (溶出溶媒  n-hexane : toluene = 1 : 1 → toluene → toluene : ethyl acetate = 100 : 5 ) により精製し、茶褐色固体2-tert-butoxycarbonyl-N-tert-butoxycarbonylmethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60] fullerene (10) 186 mg (1.07 mmol, 収率43 %) を得た（表１３）。【０１０６】
【表１３】
2014129513.tif 000037
【０１０７】
2-Carboxy-N-carboxymethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (11) の合成
10 (150 mg，143 μmol) をtoluene 150 mLに溶解し、TFMSA (215 mg, 1.43 μmol, 10当量)を加えた。すぐに茶褐色固体が生じ、溶液がやや茶色かったが5分後に反応を止めた。生成した茶褐色固体を吸引濾過し、残った酸の除去を目的に1 M sodium hydrogencarbonate、水、1 M hydrochloric acidの順に洗浄し、茶褐色固体2-carboxy-N-carboxymethyl-5-ethoxycarbonylpyrrolidino[60]fullerene (11)を203 mg (216 μmol, 収率151 %) を得た（表１４）。減圧下70℃で2時間減圧乾燥した。【０１０８】
【表１４】
2014129513.tif 000038
【０１０９】
[合成例７]  N-[1,3-di(carboxymethyl)propan-2-yl]pyrrolidino[60]fullerene (13) の合成（化合物12）【０１１０】
【化２３】
2014129513.tif 000039
N-[1,3-di(ethoxycarbonylmethyl)propan-2-yl]pyrrolidino[60]fullerene (12) の合成
C60 159.8 mg (0.219 mmol) を o-dichlorobenzene 70 mLに溶解した。これに 17 179.4 mg (0.875 mmol, 4.0 当量) とパラホルムアルデヒド 131.4 mg (4.38 mmol, 20.0 当量) を加えて200 °C で 20時間還流撹拌した。反応の進行を TLC (toluene : ethyl acetate = 10 : 1) によって観察し、20 と思われるスポットが確認出来た。原料のC60 は残っていたが、TLC でのスポットの濃さに変化が見られず、多置換体のスポットが現れたため、反応を止めた。水で2 回、飽和食塩水 で2 回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(toluene → toluene : ethyl acetate = 10 : 1) により精製し、茶色固体 41.1 mg (Yield: 20.0 %) を得た。1H-NMR, MALDI-TOF-MSの結果から、12 であると同定した（表１５）。【０１１１】
【表１５】
2014129513.tif 000040
【０１１２】
N-[1,3-di(carbonylmethyl)propan-2-yl]pyrrolidino[60]fullerene (13) の合成
秤量した NaH 80.7 mg (2.02 mmol, 66当量) をナスフラスコに入れ、n-hexaneで洗浄を行った。その後、脱水 toluene 50 mLに溶かした12  30.4 mg (0.031 mmol)を加え、60 oCで加熱撹拌を行った。1 時間後、反応液が熱いうちにメタノールで未反応のNaHを失活させた。このとき、茶色の沈殿が析出し、反応液は無色透明になった。反応液がさめた後、1 M HCl を加えた後、得られた沈殿を吸引濾過し、toluene, n-hexane, 1 M HCl で洗い、真空乾燥を行い、茶色固体を 8.3 mg (Yield: 30 %)を得た。1H-NMR, ESI-TOF-MS を測定した。1H-NMRの結果及び精密質量が理論値と一致したため、13 が生成していると判断した（表１６）。【０１１３】
【表１６】
2014129513.tif 000041
【０１１４】
次に、化合物1〜6を用いて次の評価を行った。【０１１５】
参照として、ネガティブコントロールとポジティブコントロール、C60、NAC、C60(OH)24、C60(OH)36についての結果も併せて示した。NAC (N-acetyl-L-cysteine)は、潰瘍性大腸炎の炎症を改善する効果があることが既に報告されており、水酸化フラーレンC60(OH)36については、本発明者らの研究によって、抗炎症作用を示唆する知見が既に得られている。【０１１６】
Caco2細胞（ヒト腸管上皮細胞株）を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えた後、30分後に炎症性サイトカインであるIL-1β（125 ng/mL）を作用させた。【０１１７】
24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のインターロイキン-8（IL-8）量をELISAにより測定した。その結果を図１、２に示す。図１はプロリン型フラーレン誘導体の化合物3の結果を示し、図２は化合物1〜6の結果を示す。【０１１８】
特定のフラーレン誘導体を添加することで、炎症性サイトカインであるIL-1β刺激によるIL-8の産生が濃度依存的に抑制される傾向が見られた。図１より、プロリン型フラーレン誘導体の化合物3は、水酸化フラーレンと比較してもIL-8の産生を有意に抑制した。これらのことは特定のフラーレン誘導体による抗炎症作用を示唆している。
＜実施例２＞
化合物1〜6の細胞傷害性をLDHアッセイにより評価した。RAW264.7細胞（マウスマクロファージ細胞株）を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えて24時間インキュベートした後、上清を回収した。一連の酵素反応によりNADHと水素イオンの存在下でテトラゾリウム塩INTがホルマザンに還元されることによるLDH活性をホルマザンの吸光度を測定することにより定量し細胞傷害性を評価した。その結果を図３に示す。【０１１９】
次に、RAW264.7細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えた後、30分後にLPS（lipopolysaccharide）1 μg/mLを作用させた。24時間後に上清を回収し、上記と同様に細胞傷害性を評価した。その結果を図４に示す。【０１２０】
フラーレン誘導体の化合物1〜5は、RAW264.7細胞に対して細胞傷害性をほとんど示さなかった。
＜実施例３＞
化合物1〜6にLPSを作用させ、各種のサイトカイン、ケモカインの産生傾向を評価した。【０１２１】
最初に、RAW264.7細胞（マウスマクロファージ細胞株）を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えて24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のTNF-α量をELISAにより評価した。その結果を図５に示す。【０１２２】
次に、RAW264.7細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えた後、30分後にLPS（1 μg/mL）を作用させた。24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のインターロイキン-6（IL-6）量をELISAにより測定した。その結果を図６に示す。また、同様にLPSを作用させ24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のTNF-α量を測定した結果を図７に、インターロイキン-1β（IL-1β）量を測定した結果を図８に、インターフェロンγ誘導タンパク-10（IP-10）量を測定した結果を図９に、インターフェロン-β（IFN-β）量を測定した結果を図１０に示す。【０１２３】
以上の実施例３の結果を実施例１、２の結果とともに図１１に纏めた。【０１２４】
細胞傷害性・サイトカイン・ケモカイン産生の傾向より、フラーレン誘導体の化合物1〜5は、水酸化フラーレンと比較しても、抗炎症作用を示唆した。中でも、RAW264.7細胞をLPS刺激した際の化合物1〜5の抗炎症作用を総合的に判断すると、化合物1〜5の中では化合物3（プロリン型C60誘導体）、化合物5（マロン酸C60誘導体）の結果が良好であった。
＜実施例４＞
RAW264.7細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類またはNACを加えた後、30分後にPoly(I:C)（polyinosinic-polycytidylic acid）20 μg/mLを作用させた。24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のTNF-α量を測定した結果を図１２に、上清中のIL-6量を測定した結果を図１３に示す。【０１２５】
特定のフラーレン誘導体を添加することで、Poly(I:C)刺激によるTNF-αの産生に変化は認められないものの、IL-6が濃度依存的に抑制される傾向が見られた。このことは特定のフラーレン誘導体による抗炎症作用を示唆している。
＜実施例５＞
潰瘍性大腸炎のin vivo薬効評価試験をDSS誘発マウス大腸炎モデルにより行った。炎症性腸疾患の研究には自然発症大腸炎モデル、化学的・免疫学的機序による大腸炎モデル、遺伝子改変による大腸炎モデルに至るまで、多種多様なモデルが考案されているが、DSS誘発マウス大腸炎モデルは、潰瘍性大腸炎の薬効評価研究に多く用いられているものであり、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）溶液をマウスに飲水させることにより大腸炎の誘発を惹起する方法である。【０１２６】
7週齢で購入したC57BL/6J系雄性マウス（SPF）を1週間予備飼育し、無作為に2群に分けた後、一方を対照群、他方をDSS投与群とした。DSS投与群には、DSS（分子量36,000〜40,000、MP Biomedicals）を超純水に2.5%濃度に溶解させ、飲料水として7日間、自由摂取させた。併せて、化合物3の0.5％DMSO溶液2.5mg/kgまたは0.5％DMSO溶液を10mL/kgで7日間腹腔投与した。最終日にマウスを安楽死させ、大腸組織を摘出後、大腸粘膜におけるMPO活性を測定し、一群5〜7匹により得られた値の群毎の平均値±標準誤差を算出した。【０１２７】
大腸粘膜におけるMPO活性は、解剖し大腸を回収した後、ホモジナイズし、遠心処理後、上清液について、ELISAにより測定した。MPO（Myeloperoxidase：抗酸化酵素ミエロペルオキシダーゼ）は、好中球と単球のみに存在し、過酸化水素と塩素イオンから次亜塩素酸が産生される反応を触媒する。その結果を図１４に示す。化合物3（図中「プロリン-3」）を投与した群では、潰瘍性大腸炎の指標であるMPOの産生を抑制する傾向を示し、好中球等の浸潤を抑制していることが示唆された。
＜実施例６＞
プロリン型フラーレン誘導体の化合物7〜12について、実施例１と同様にサイトカイン産生を指標とした薬効評価を行った。プロリン型フラーレン誘導体はDMSOに溶解したものを使用し、プロリン型フラーレン誘導体の化合物3についての評価も行った。【０１２８】
実施例１と同様に、Caco2細胞（ヒト腸管上皮細胞株）を96ウェルマイクロタイタープレートに播種し、各フラーレン類を加えた後、30分後に炎症性サイトカインであるIL-1β（125 ng/mL）を作用させた。24時間インキュベートした後、上清を回収し、上清中のインターロイキン-8（IL-8）量をELISAにより測定した。その結果を図１５に示す。図中Pro(7)〜Pro(12)は化合物7〜12を示し、Pro(3)は化合物3を示している。【０１２９】
特定のフラーレン誘導体を添加することで、炎症性サイトカインであるIL-1β刺激によるIL-8の産生が濃度依存的に抑制される傾向が見られた。これらのことは特定のフラーレン誘導体による抗炎症作用を示唆している。
＜実施例７＞
フラーレンの強力な炎症性サイトカイン抑制能と、抗酸化作用の関係を精査するため、NAC以外の抗酸化剤を用いてフラーレンの抗酸化作用や抗炎症作用を比較検討した。【０１３０】
【表１７】
2014129513.tif 000042
【０１３１】
ROS（活性酸素）量は蛍光プロープである2’,7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate（DCFH-DA; Cell Biolabs In、 USA）を用いて測定した。DCFH-DAは、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し、非蛍光型2’,7’-Dichlorodihydrofluorescin (DCFH)に変化する。さらにROSにより素早く酸化され、強く蛍光する2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein (DCF)に変化する。1.5×104 cellsとなるように96穴プレートに予め播種しておいたCaco-2細胞またはRAW264.7細胞に対して、培地を除去し、DCFH-DA（20μM）を含有したphenol red freeのD-MEMを添加し、37℃で30分間培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、各濃度に希釈したプロリン型C60フラーレン（化合物3）、5-ASA、BHA、およびNACを加えた。15分、30分、1、2、4、12、24時間の各時間において、励起波長485 nm、蛍光波長535 nmの蛍光量を測定した。ROSの測定結果を図１６に示す。また、実施例１と同様にCaco2細胞におけるIL-1β作用後の上清中のIL-8量をELISAにより測定した結果を図１７に示す。【０１３２】
抗酸化剤であるBHAや、抗酸化作用を示すことが報告されている炎症性腸疾患治療薬である5-ASAを用いて評価した結果、プロリン型フラーレンは、これら抗酸化物質と比較して、抗酸化作用は弱いにもかかわらず、IL-8の産生を強く抑制することが明らかとなり、抗炎症作用が強いことが明らかとなった。
＜実施例８＞
（MLR（混合リンパ球反応））
実験動物 
6-8週齡のC57BL/6 NCrマウス（雌性）およびBALB/cマウス（雌性）は、日本エスエルシー（Kyoto, Japan）より購入した。また、本研究における動物実験の飼育および実験は医薬基盤研究所の実験動物施設において行い、医薬基盤研究所・大阪大学動物実験規定に準じた。
脾細胞の調製方法 
脾臓を無菌的に摘出した後、70 μmセルストレイナー（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）上で細胞を分散させ、1500 rpm、10分、4℃の条件で遠心することで、脾細胞を回収した。細胞の回収には、56℃、30分間の非働化処理を行った10 % fetal bovine serum (FBS)、1 % antibiotics (Anti-Anti; Invitrogen, Carlsbad, CA)、50 μM 2-Mercaptoethanol (2-ME; GIBCO, Japan)、1×MEM Non-Essential Amino Acids (GIBCO)、0.2 mM L-グルタミンを含むRoswell Park Memorial Institute 1640培養液 (Wako, Osaka, Japan)を用いた。回収した脾細胞は155 mM NH4Cl（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）/10 mM KHCO3（Nacalai Tesque）/100 μM EDTA・2Na・2H2O（Nacalai Tesque）溶液で懸濁することで赤血球を除去した。さらに遠心操作を行った後、上記と同様の培養液で懸濁した。
MLR
未処置のBALB/cマウスの脾臓細胞（応答細胞）および、未処置のC57BL/6マウスの脾臓細胞（刺激細胞）を用いた。細胞回収方法は前述の脾細胞の調製方法に準じた。刺激細胞にはマイトマイシンＣ（和光純薬, 終濃度250 μg/mL）を添加し、37℃, 30分間反応させることで細胞増殖を停止させた。1500 rpm, 5分, 4℃の条件で遠心し、培養液で3回洗浄操作を行ったものを実験に供した。応答細胞は、前節の脾臓細胞回収に用いたRPMI1640培養液にて1x107cell/mLに調整し、刺激細胞は6x107 cells/mLに調整した。応答細胞懸濁液100 μLを96 well flat-bottom assay plate（Nunc., USA）に播種し、各サンプル懸濁液50 μLを添加して37℃、5 % CO2条件下で30分間反応させたのち、刺激細胞50 μLを添加した。37℃、5 % CO2条件下で4日間培養し、遠心して培養上清を回収した。
脾細胞培養上清サイトカインの測定 
IL-2 ELISA Ready-Set-Go!(R)キット（affimetrix）を用い、キットの使用方法に準じて測定を行った。【０１３３】
MLRの測定結果を図１８に示す。プロリン型フラーレン（化合物3）・水酸化フラーレン（OH=36）のいずれも、濃度依存的にリンパ球増殖活性を抑制した。IFN-γも同様に濃度依存的に産生が抑制されていた。同様の反応が、免疫抑制剤であるタクロリムス、シクロスポリンA、デキサメタゾン、ラパマイシンでも認められ、プロリン型フラーレンには免疫抑制剤様作用があることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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