(57)【要約】  癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法を提供し、これらでは、特定のプライマーセットを用いて、Ｏｃｔ４遺伝子の転写産物を特異的に検出する。
2016159009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を備えていることを特徴とする癌検出キット：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【請求項２】
上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることを特徴とする請求項１に記載の癌検出キット。
【請求項３】
更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の癌検出キット。
【請求項４】
生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴とする、癌診断のためのデータの取得方法：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【請求項５】
上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることを特徴とする請求項４に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
【請求項６】
更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することを特徴とする請求項４または５に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌検出キット、および、癌診断のためのデータの取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏｃｔ４遺伝子（Octamer-binding transcription factor 4（別名：ＰＯＵ５Ｆ１、Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ３／４））がコードするタンパク質は、未分化全能性維持に関わる転写調節因子であり、当該タンパク質は、初期胚における全能性細胞やＥＳ細胞、出生後の生体における生殖幹細胞の中に観察される。また、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子がコードするタンパク質は、体細胞の初期化に不可欠な因子の一つとしても知られ、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）の樹立に用いられている。【０００３】
近年、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が癌細胞の指標になるのではないかと考えられ、多くの研究が展開されている。そして、胚性癌腫細胞や生殖癌細胞においては、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が、未分化性や悪性度に関係することが示唆されている（例えば、非特許文献１〜３参照）。【０００４】
上述した状況にあって、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を正確に検出することは重要であって、従来から、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、コンベンショナルＲＴ−ＰＣＲ法、または、抗体染色法などによって検出している（例えば、非特許文献４〜１３参照）。【０００５】
例えば、「Ｓｕｏ」、「Ｌｉｅｄｔｋｅ−１」、「Ｌｉｅｄｔｋｅ−２」、「Ａｔｌａｓｉ」と呼ばれるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法によってＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する方法が従来から知られている（例えば、非特許文献１４〜１６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gidekel S et al., Cancer Cell, 2003, 5, 361-70
【非特許文献２】Rijlaarsdam MA et al., Br J Cancer, 2011 Sep, 6, 105(6), 854-63
【非特許文献３】Bustamante-Marin X et al., Int J Dev Biol, 2013, 57(2-4), 201-10
【非特許文献４】Sotomayor P et al., Prostate, 2009, 69, 401-410
【非特許文献５】Schoenhals M et al., Biochem Biophys Res Commun, 2009, 383, 157-162
【非特許文献６】Atlasi Y et al., Stem Cells, 2008, 26, 3068-3074
【非特許文献７】Monsef N et al., Prostate, 2009, 69, 909-916
【非特許文献８】Looijenga LH et al., Cancer Res, 2003, 63, 2244-2250
【非特許文献９】Chen Z et al., J Surg Oncol, 2009, 99, 414-419
【非特許文献１０】Cheng L et al., J Pathol, 2007, 211, 1-9
【非特許文献１１】Atlasi Y et al., Int J Cancer, 2007, 120, 1598-1602
【非特許文献１２】Du Z et al., Glia, 2009, 57, 724-733
【非特許文献１３】Tai MK et al., Carcinogenesis, 2005, 26, 495-502
【非特許文献１４】Suo G et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Dec 2; 337(4):1047-51
【非特許文献１５】Liedtke S., Cell Stem Cell. 2007 Oct11; 1(4):364-6
【非特許文献１６】Atlasi Y et al., Stem Cells. 2008 Dec; 26(12):3068-74
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年の研究によって、ヒトゲノム上には、（ｉ）Ｏｃｔ４遺伝子と酷似した配列を有するＯｃｔ４偽遺伝子（pseudogene）が少なくとも６つ存在すること、（ｉｉ）Ｏｃｔ４偽遺伝子（pseudogene）の中にはＯｃｔ４遺伝子と、塩基配列の相同性が極めて高いものが存在すること（例えば、Ｏｃｔ４偽遺伝子であるＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４の塩基配列と、Ｏｃｔ４遺伝子の塩基配列との相同性は、略９７〜９８％である）、（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４偽遺伝子も転写され、その後、転写産物が翻訳される可能性があること、が示唆されている。【０００８】
そして、研究が進むにつれて、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を検出するための従来の方法は、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現をも検出しており、正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出できていないという大きな問題点を抱えていることが明らかになった。【０００９】
例えば、従来の抗体染色法は、検出に用いている抗体がＯｃｔ４遺伝子由来のタンパク質およびＯｃｔ４偽遺伝子由来のタンパク質の両方に結合するので、両方のタンパク質を検出しており、両者を区別できないという問題点を抱えている。また、従来のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、および、コンベンショナルＲＴ−ＰＣＲ法は、検出に用いているプライマーがＯｃｔ４遺伝子由来のｃＤＮＡおよびＯｃｔ４偽遺伝子由来のｃＤＮＡの両方にアニーリングするので、両方の遺伝子の発現を検出しており、両者を区別できないという問題点を抱えている。【００１０】
なお、従来のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、および、コンベンショナルＲＴ−ＰＣＲ法でも、何れの遺伝子が発現しているか確認することは可能ではあるが、この場合、ＰＣＲの増幅産物をクローニングし、その後、当該増幅産物の塩基配列をシークエンサーにて解読するという膨大な作業を必要とするという、大きな問題点を抱えている。【００１１】
更に、ＰＣＲの増幅効率には、ＰＣＲ反応に供するサンプル中のテンプレート（換言すれば、遺伝子の転写産物）の量が反映されるため、サンプル中にＯｃｔ４偽遺伝子に由来する転写産物が存在すると、Ｏｃｔ４遺伝子に由来する転写産物が検出できない可能性があるという、大きな問題点を抱えている。【００１２】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ｏｃｔ４遺伝子の発現を正確に検出できるプライマーセットを見出し、当該プライマーセットを癌（例えば、癌源細胞、癌幹細胞）の検出キット、および、癌診断（例えば、悪性度の診断、予後の判断、転移の早期診断）のためのデータの取得方法に利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物に関連して、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの非翻訳領域の塩基配列に注目し、まず、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域の塩基配列をできるだけ長く同定することを試みた。そして、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始点を決定するとともに、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域を決定した。そして、Ｏｃｔ４遺伝子の非翻訳領域とＯｃｔ４偽遺伝子の非翻訳領域とを比較した結果、Ｏｃｔ４遺伝子の非翻訳領域にのみ存在する特異的な領域を決定した。【００１４】
また、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型およびＢ型の転写産物に関連して、未知のスプライシングバリアントを見出し、当該スプライシングバリアントの塩基配列を決定した。【００１５】
そして、本発明者は、以下の（ａ）〜（ｄ）を見出し、本発明を完成させるに至った。つまり、
（ａ）Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの、新たに同定された５’末端側の非翻訳領域には、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域に対して、塩基配列の相同性がない領域が存在すること；
（ｂ）新たに同定された５’末端側の非翻訳領域内にフォワードプライマーを設定すれば、任意のリバースプライマー（例えば、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡに対して相同性が高いリバースプライマー）を用いたとしても、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せずに、Ｏｃｔ４遺伝子の発現（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物）のみを正確に検出できること；
（ｃ）通常は転写開始点の直ぐ近くにプライマーを設定することはないが、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物の場合、転写開始点の直ぐ近くにプライマーを設定すれば、当該プライマーが効果的に機能すること。【００１６】
（ｄ）新たに同定されたスプライシングバリアントの塩基配列に基づいてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設定すれば、Ｏｃｔ４遺伝子バリアント（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物）のすべてのタイプを正確に検出できること；
＜１＞本発明の癌検出キットは、上記課題を解決するために、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を備えていることを特徴としている：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。【００１７】
＜２＞本発明の癌検出キットでは、上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることが好ましい。【００１８】
＜３＞本発明の癌検出キットは、更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることが好ましい。【００１９】
＜４＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法は、上記課題を解決するために、生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。【００２０】
＜５＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法では、上記（α）のプライマーセットのリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であることが好ましい。【００２１】
＜６＞本発明の癌診断のためのデータの取得方法は、更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せず、正確にＯｃｔ４遺伝子（より具体的には、ヒトＯｃｔ４遺伝子）の発現のみを検出できるという効果を奏する。【００２３】
本発明は、特定の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーと対になる、リバースプライマーおよびフォワードプライマーの塩基配列を所望の塩基配列に設計することによって、所望のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出できるという効果を奏する。【００２４】
本発明は、癌診断（例えば、癌の早期診断、癌の悪性度の診断、予後の判断、転移の診断）のための正確なデータを取得できるという効果を奏する。【００２５】
本発明は、Ｏｃｔ４遺伝子の機能を標的とした、抗癌剤、癌の根治療法、および、癌の予防法、等の開発を可能にするという効果を奏する。【００２６】
本発明は、体細胞におけるＯｃｔ４遺伝子の未知の機能の解明のための正確なデータを取得できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、本発明の実施例に用いた各プライマーセットのデザインを示す図である。
【図２】本発明の実施例において、各プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図３】Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型のスプライシングバリアントの構造を示す図である。
【図４】Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型のスプライシングバリアントの構造を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、癌の悪性度とＯｃｔ４遺伝子の発現とが相関していることを示す、電気泳動の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙの結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例における、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙの結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例における、スプライシングバリアントを細胞内で強制発現したときに細胞内に実在するスプライシングバリアントを示す、電気泳動の結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例における、５’ＲＡＣＥにて特異的に増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、各プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、プライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、オステオポンチン遺伝子用のプライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】（ａ）は、本発明の実施例において、オステオポンチン遺伝子用のプライマーセットを用いて増幅された増幅産物の電気泳動の結果を示す図であり、（ｂ）は、当該プライマーセットの設計の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２９】
〔１．癌検出キット〕
本実施の形態の癌検出キットの検出対象である癌は、特に限定されず、あらゆる癌であり得る。例えば、乳癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、大腸癌、腎臓癌、または、脳腫瘍を挙げることができる。本実施の形態の癌検出キットは、悪性度の高い癌を、高感度にて検出することが可能である。
【００３０】
本実施の形態の癌検出キットは、プライマーセット（α）およびプライマーセット（β）の何れか１つ以上を備えているものである。以下では、プライマーセット（α）およびプライマーセット（β）の各々について説明する。
【００３１】
〔１−１．プライマーセット（α）〕
プライマーセット（α）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基（例えば、配列番号３５または３７にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基（例えば、配列番号１）、２８塩基、２９塩基、３０塩基、または、３１塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーである。
【００３２】
プライマーセット（α）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基（例えば、配列番号３５または３７にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基（例えば、配列番号１）、２８塩基、２９塩基、３０塩基、または、３１塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
【００３３】
配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの５’末端側の非翻訳領域に対応するポリヌクレオチドである。配列番号４１にて示される塩基配列は、Ｏｃｔ４偽遺伝子のｍＲＮＡの非翻訳領域の塩基配列に対して相同性がない。それ故に、プライマーセット（α）のフォワードプライマーを用いれば、任意のリバースプライマーを用いたとしても、Ｏｃｔ４偽遺伝子の発現を検出せずに、Ｏｃｔ４遺伝子の発現（特に、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物）のみを正確に検出できる。
【００３４】
プライマーセット（α）のフォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した１７塩基以上）を含むプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した１７塩基以上）からなるプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
【００３５】
当該フォワードプライマーが、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む場合、当該ヌクレオチドの数は特に限定されないが、より正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出するという観点から、５ｂａｓｅ以下が好ましく、４ｂａｓｅ以下がより好ましく、３ｂａｓｅ以下がより好ましく、２ｂａｓｅ以下がより好ましく、１ｂａｓｅ以下が最も好ましい。例えば、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの３’末端側に、「Ｃ」を連結してもよいし、当該「Ｃ」の３'末端側に更に「Ｔ」を連結してもよいし、当該「Ｔ」の３'末端側に更に「Ｃ」を連結してもよいし、当該「Ｃ」の３'末端側に更に「Ａ」を連結してもよいし、当該「Ａ」の３'末端側に更に「Ｔ」を連結してもよい。
【００３６】
プライマーセット（α）のリバースプライマーは、上述したフォワードプライマーと対になって、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。リバースプライマーの塩基配列を所望のデザインにすることによって（例えば、リバースプライマーの塩基配列を所望のエクソンに対応する塩基配列にすることによって）、Ａ型の複数のスプライシングバリアントの中から、特定のスプライシングバリアントのみを検出することができる。また、リバースプライマーの塩基配列は、異なるエクソン間をまたぐ塩基配列であってもよい。この場合、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡのＰＣＲ反応系への混入に起因する擬陽性を排除できるので、より好ましい。
【００３７】
より正確にＯｃｔ４遺伝子の発現を検出するという観点から、リバースプライマーは、フォワードプライマーと略同じ長さ、および／または、フォワードプライマーと略同じＧＣ含量を有するものであることが好ましい。
【００３８】
例えば、リバースプライマーの長さをＸ（ｂａｓｅ）、フォワードプライマーの長さをＹ（ｂａｓｅ）とすると、これらは、「Ｙ−５≦Ｘ≦Ｙ＋５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｙ−４≦Ｘ≦Ｙ＋４」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−３≦Ｘ≦Ｙ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−２≦Ｘ≦Ｙ＋２」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−１≦Ｘ≦Ｙ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
【００３９】
また、リバースプライマーのＧＣ含量をＡ（％）、フォワードプライマーのＧＣ含量をＢ（％）とすると、これらは、「Ｂ−１５≦Ａ≦Ｂ＋１５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｂ−１０≦Ａ≦Ｂ＋１０」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−５≦Ａ≦Ｂ＋５」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−３≦Ａ≦Ｂ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−１≦Ａ≦Ｂ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
【００４０】
より具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。
【００４１】
更に具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列内の、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、または、特定のエクソンの間に挿入される挿入配列、若しくは、特定のエクソンに隣接して挿入される挿入配列に対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。
【００４２】
また、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列内の、隣接する所望の領域の間をまたぐ塩基配列（例えば、エクソン１とエクソン２の間、エクソン２とエクソン３との間、エクソン３とエクソン３との間、またはエクソン４とエクソン５との間をまたぐ塩基配列；特定の２つのエクソンの間に挿入される挿入配列；若しくは、特定のエクソンに隣接して挿入される挿入配列）に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であってもよい。この場合、ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡのＰＣＲ反応系への混入に起因する擬陽性を排除できるので、より好ましい。
【００４３】
更に具体的に、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号２、配列番号４、配列番号３６、または、配列番号３８にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよいし、配列番号２、配列番号４、配列番号３６、または、配列番号３８にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。
【００４４】
また、上記プライマーセット（α）のリバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよい。
【００４５】
後述する実施例にて示すように、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物として、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４Ａ以外に、新規なスプライシングバリアントである、ｈＯｃｔ４Ａ１（配列番号２１）、ｈＯｃｔ４Ａ２（配列番号２２）、ｈＯｃｔ４Ａ３（配列番号２３）、ｈＯｃｔ４Ａ４（配列番号２４）、ｈＯｃｔ４Ａ５（配列番号２５）、および、ｈＯｃｔ４Ａ６（配列番号２６）を見出すことに成功した。
【００４６】
上記プライマーセット（α）のリバースプライマーが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部であれば、各々、特定のスプライシングバリアント（ｈＯｃｔ４Ａ１、ｈＯｃｔ４Ａ２、ｈＯｃｔ４Ａ３、ｈＯｃｔ４Ａ４、ｈＯｃｔ４Ａ５、または、ｈＯｃｔ４Ａ６）を特異的に検出することができる。なお、ＰＣＲの増幅産物をゲル電気泳動装置にて更に解析すれば、ゲル中における増幅産物の移動度の差に基づいて、特定のスプライシングバリアントを更に特異的に検出することができる。
【００４７】
〔１−２．プライマーセット（β）〕
プライマーセット（β）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーである。
【００４８】
プライマーセット（β）は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
【００４９】
配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡのエクソン２の５’末端よりも上流側の領域に対応するポリヌクレオチドである。一方、配列番号３４にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５、および、エクソン５の３’末端の更に下流側の領域に対応するポリヌクレオチドである。
【００５０】
配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４偽遺伝子の転写産物や、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物の中には存在しない。それ故に、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む（または、当該ポリヌクレオチドからなる）フォワードプライマーを用いることによって、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を特異的に検出することができる。
【００５１】
一方、配列番号３４にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドは、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の様々なスプライシングバリアントの中に、共通して存在する。それ故に、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含む（または、当該ポリヌクレオチドからなる）リバースプライマーを用いることによって、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の様々なスプライシングバリアントを網羅的に検出することができる。
【００５２】
プライマーセット（β）のフォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（例えば、連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）を含むプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上１３５塩基以下の任意の塩基数）からなるプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
【００５３】
プライマーセット（β）のリバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）を含むプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部分（連続した、１７塩基以上５３１塩基以下の任意の塩基数）からなるプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体を一部分として含むプライマーであってもよいし、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全体からなるプライマーであってもよい。
【００５４】
より具体的に、プライマーセット（β）のフォワードプライマーは、配列番号５にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、または、２７塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよいし、配列番号５にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、または、２７塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
【００５５】
一方、プライマーセット（β）のリバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、または、２６塩基）からなるポリヌクレオチドを含むプライマーであってもよいし、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチド（例えば、連続した任意の、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、または、２６塩基）からなるポリヌクレオチドからなるプライマーであってもよい。
【００５６】
より正確にＯｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を検出するという観点から、フォワードプライマーとリバースプライマーとは、略同じ長さ、および／または、略同じＧＣ含量を有するものであることが好ましい。
【００５７】
例えば、フォワードプライマーの長さをＸ（ｂａｓｅ）、リバースプライマーの長さをＹ（ｂａｓｅ）とすると、これらは、「Ｙ−５≦Ｘ≦Ｙ＋５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｙ−４≦Ｘ≦Ｙ＋４」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−３≦Ｘ≦Ｙ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−２≦Ｘ≦Ｙ＋２」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｙ−１≦Ｘ≦Ｙ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
【００５８】
また、フォワードプライマーのＧＣ含量をＡ（％）、リバースプライマーのＧＣ含量をＢ（％）とすると、これらは、「Ｂ−１５≦Ａ≦Ｂ＋１５」の関係式を満たすものであることが好ましく、「Ｂ−１０≦Ａ≦Ｂ＋１０」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−５≦Ａ≦Ｂ＋５」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−３≦Ａ≦Ｂ＋３」の関係式を満たすものであることがより好ましく、「Ｂ−１≦Ａ≦Ｂ＋１」の関係式を満たすものであることがより好ましい。
【００５９】
後述する実施例にて示すように、本発明者は、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物として、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４ＢおよびｈＯｃｔ４Ｂ１以外に、新規なスプライシングバリアントである、ｈＯｃｔ４Ｂ２（配列番号２７）、ｈＯｃｔ４Ｂ３（配列番号２８）、ｈＯｃｔ４Ｂ４（配列番号２９）、ｈＯｃｔ４Ｂ５（配列番号３０）、ｈＯｃｔ４Ｂ６（配列番号３１）、および、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ（配列番号３２）を見出すことに成功した。
【００６０】
上記プライマーセット（β）を用いれば、スプライシングバリアント（ｈＯｃｔ４Ｂ２、ｈＯｃｔ４Ｂ３、ｈＯｃｔ４Ｂ４、ｈＯｃｔ４Ｂ５、ｈＯｃｔ４Ｂ６、または、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ）を網羅的に検出することができる。なお、ＰＣＲの増幅産物をゲル電気泳動装置にて更に解析すれば、ゲル中における増幅産物の移動度の差に基づいて、特定のスプライシングバリアントを特異的に検出することができる。
【００６１】
〔１−３．その他の構成〕
本実施の形態の癌検出キットは、オステオポンチン（Osteopontin）遺伝子、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出するための構成を備えていてもよい。
【００６２】
後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定して、試験対象のサンプルを絞り込み、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば（例えば、同時に両方の確認を行えば）、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
【００６３】
オステオポンチン遺伝子の発現を検出する場合、オステオポンチンの、ａ型のスプライシングバリアントの発現、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの発現の何れを検出してもよいが、より精度の高い癌診断を実現するという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントの発現を検出することが好ましい。
【００６４】
オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチンタンパク質の発現を検出するための構成は、特に限定されないが、当該構成として、例えば、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体を挙げることができる。本実施の形態の癌検出キットが、（ｉ）のプライマーセットを備えていれば、例えばＰＣＲ法に基づいてオステオポンチン遺伝子の発現を検出することが可能であり、（ｉｉ）のプローブを備えていれば、例えばノーザンブロット法に基づいてオステオポンチン遺伝子の発現を検出することが可能であり、（ｉｉｉ）の抗オステオポンチン抗体を備えていれば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法に基づいてオステオポンチンタンパク質の発現を検出することが可能である。
【００６５】
（ｉ）のプライマーセットとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子の発現を検出することができるものであればよい。例えば、フォワードプライマーとしては、オステオポンチン遺伝子のセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、オステオポンチン遺伝子のアンチセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能である。更に具体的に、ａ型、ｂ型、およびｃ型のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出する観点から、フォワードプライマーとしては、配列番号４２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、配列番号４３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
【００６６】
３つのスプライシングバリアントのうちｃ型のスプライシングバリアントの発現を特異的に検出する観点から、フォワードプライマーとしては、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子のアンチセンス鎖の一部分からなるポリヌクレオチドを用いることが可能である。更に具体的に、フォワードプライマーとしては、配列番号４４に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能であり、リバースプライマーとしては、配列番号４５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
【００６７】
（ｉｉ）のプローブとしては、特に限定されず、オステオポンチン遺伝子の発現を検出することができるものであればよい。例えば、プローブとしては、オステオポンチン遺伝子由来のｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いることが可能である。
【００６８】
（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体としては、特に限定されず、オステオポンチンタンパク質を検出することができるものであればよい。例えば、周知の方法によって作製された、ポリクローナル抗体、または、モノクローナル抗体を用いることが可能である。なお、これら抗体のエピトープは、オステオポンチンタンパク質内に含まれるペプチドであればよく、その具体的なアミノ酸配列は、特に限定されない。
【００６９】
〔２．癌診断のためのデータの取得方法〕
本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【００７０】
プライマーセット（α）および（β）の構成については、〔１．癌検出キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００７１】
生体から採取されたサンプルとしては、特に限定されず、適宜、所望のサンプルを用いることができる。
【００７２】
例えば、生体から採取されたサンプルは、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織であってもよい。
【００７３】
また、生体から採取されたサンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡであってもよい。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて行うことができる。
【００７４】
また、生体から採取されたサンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、当該ｃＤＮＡをベクターに組み込んで作製されたｃＤＮＡライブラリーであってもよい。なお、ｃＤＮＡのベクターへの組み込みは、市販のキットを用いて行うことができる。
【００７５】
ポリメラーゼ連鎖反応の反応サイクル（例えば、アニーリング反応、伸長反応、および、変性反応からなる、反応サイクル）の具体的な構成（例えば、反応温度、および、反応時間）は、特に限定されず、用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に基づいて、適宜、設定すればよい。
【００７６】
本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を、電気泳動に供する工程を有していてもよい。当該構成であれば、生体から採取されたサンプル内に含まれるスプライシングバリアントに関する詳細な情報（例えば、スプライシングバリアントの有無、および、スプライシングバリアントの種類）を得ることができ、これによって、癌診断のためのより詳細なデータの取得が可能になる。
【００７７】
本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、更に、生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有していてもよい。
【００７８】
後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定し、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
【００７９】
当該工程は、〔１−３．その他の構成〕にて説明した構成を用い、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、または、ＥＬＩＳＡ法に基づいて行うことが可能である。
【００８０】
ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、および、ＥＬＩＳＡ法の具体的な方法は、周知の方法に従えばよい。
【００８１】
本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、例えば、以下の＜１＞または＜２＞構成であってもよい。なお、以下の構成においてオステオポンチン遺伝子およびオステオポンチン蛋白質は、ａ型のスプライシングバリアント、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの何れであってもよいが、より高い効果を得るという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントであることが好ましい。
【００８２】
＜１＞本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、最初に、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現を検出し、その後に、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現が陽性であったサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する構成であってもよい。当該構成であれば、迅速にが癌診断をすることができる。
【００８３】
＜２＞本実施の形態の癌診断のためのデータの取得方法は、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現、および、当該生体から採取されたサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を同時に検出する構成であってもよい。当該構成であれば、精度の高い癌診断をすることができる。
【００８４】
〔３．癌の診断方法〕
本実施の形態の癌の診断方法は、サンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴としている：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号３４にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【００８５】
プライマーセット（α）および（β）の構成については、〔１．癌検出キット〕の欄で説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００８６】
サンプルとしては、特に限定されず、適宜、所望のサンプルを用いることができる。
【００８７】
例えば、サンプルは、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織であってもよい。
【００８８】
また、サンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡであってもよい。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて行うことができる。
【００８９】
また、サンプルは、所望のサンプル（例えば、血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、および、組織など）からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得、当該ｃＤＮＡをベクターに組み込んで作製されたｃＤＮＡライブラリーであってもよい。なお、ｃＤＮＡのベクターへの組み込みは、市販のキットを用いて行うことができる。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応の反応サイクル（例えば、アニーリング反応、伸長反応、および、変性反応からなる、反応サイクル）の具体的な構成（例えば、反応温度、および、反応時間）は、特に限定されず、用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に基づいて、適宜、設定すればよい。
【００９１】
本実施の形態の癌の診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動に供する工程を有していてもよい。当該構成であれば、サンプル内に含まれるスプライシングバリアントに関する詳細な情報（例えば、スプライシングバリアントの有無、および、スプライシングバリアントの種類）を得ることができ、これによって、癌診断のためのより詳細なデータの取得が可能になる。
【００９２】
本実施の形態の癌の診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程から得られた結果に基づき、癌のリスクを判定する工程を有していてもよい。
【００９３】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程にて、サンプル内にスプライシングバリアントの存在が確認されれば「癌の危険性がある」と判定することができ、サンプル内に複数種類のスプライシングバリアントが存在することが確認されれば「癌の危険性が高い」と判定することができる。
【００９４】
また、ポリメラーゼ連鎖反応の反応産物を電気泳動に供する工程にて、サンプル内に特定のスプライシングバリアント（例えば、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ａ３、Ｏｃｔ４Ａ４、Ｏｃｔ４Ａ５、Ｏｃｔ４Ａ６、または、Ｏｃｔ４Ｂ５）の存在が確認されれば「癌の危険性がある」と判定することができ、サンプル内に特定のスプライシングバリアント（例えば、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ａ３、Ｏｃｔ４Ａ４、Ｏｃｔ４Ａ５、Ｏｃｔ４Ａ６、または、Ｏｃｔ４Ｂ５）を含む複数種類のスプライシングバリアントが存在することが確認されれば「癌の危険性が高い」と判定することができる。
【００９５】
本実施の形態の癌の診断方法は、更に、生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有していてもよい。
【００９６】
後述する実施例に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係がある。それ故に、例えば、初めにオステオポンチン遺伝子を発現しているサンプルを特定し、当該サンプルについてのみＯｃｔ４遺伝子の発現を確認すれば、極めて迅速な癌診断を実現することができる。また、サンプルに対して、Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認、および、オステオポンチン遺伝子の発現の確認の両方を行えば、極めて精度の高い癌診断を実現することができる。
【００９７】
当該工程は、〔１−３．その他の構成〕にて説明した構成を用い、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、または、ＥＬＩＳＡ法に基づいて行うことが可能である。
【００９８】
ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、および、ＥＬＩＳＡ法の具体的な方法は、周知の方法に従えばよい。
【００９９】
本実施の形態の癌の診断方法は、例えば、以下の＜１＞または＜２＞の構成であってもよい。なお、以下の構成においてオステオポンチン遺伝子およびオステオポンチン蛋白質は、ａ型のスプライシングバリアント、ｂ型のスプライシングバリアントの発現、または、ｃ型のスプライシングバリアントの何れであってもよいが、より高い効果を得るという観点から、ｃ型のスプライシングバリアントであることが好ましい。
【０１００】
＜１＞本実施の形態の癌の診断方法は、最初に、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現を検出し、その後に、オステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現が陽性であったサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を検出する構成であってもよい。当該構成であれば、迅速に癌診断をすることができる。
【０１０１】
＜２＞本実施の形態の癌の診断方法は、生体から採取されたサンプルにおけるオステオポンチン遺伝子またはオステオポンチン蛋白質の発現、および、当該生体から採取されたサンプルにおけるＯｃｔ４遺伝子の発現を同時に検出する構成であってもよい。当該構成であれば、精度の高い癌診断をすることができる。
【実施例】
【０１０２】
＜１．Ｏｃｔ４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始点の決定＞
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ヒトＰＡ−１細胞から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、逆転写反応にかけた。３種類のリバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲ反応に用いた酵素は、ｐｒｉｍｅｓｔａｒ（Ｔａｋａｒａ社）であった。【０１０３】
ＰＣＲ反応の増幅産物の電気泳動の像を図９に示す。【０１０４】
ＰＣＲ反応の増幅産物をＴＡ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した後、当該増幅産物の塩基配列をシークエンサーにて確認した。その結果、当該増幅産物は、配列番号１（配列番号３）にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んでいた。【０１０５】
＜２．プライマーセットの設計＞
表１、および、図１に、各プライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列に関する情報、および、各プライマーセットによって増幅されると考えられるＤＮＡの情報を記載する。【０１０６】
下記プライマーセットのうち、Ｓｅｔ  Ａ１およびＳｅｔ  Ａ２は、上述したプライマーセット（α）に対応するプライマーセットであり、Ｓｅｔ  Ｂは、上述したプライマーセット（β）に対応するプライマーセットである。【０１０７】
【表１】
2016159009.tif 000003
＜３．プライマーセットの増幅特異性＞
上述した各プライマーセットと、鋳型としてＯｃｔ４Ａ遺伝子のＡ型の転写産物に由来するｃＤＮＡ、または、Ｏｃｔ４偽遺伝子（具体的には、ＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４）と、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。【０１０８】
ＰＣＲ反応は、タカラバイオ株式会社製のプライム・スターまたはエメラルドアンプを用い、フォワードプライマー２５０μＭ、リバースプライマー２５０μＭ、鋳型１０ｆｇまたは１０ａｇ、その他の成分として、ＮＴＰ、および緩衝液を含む、２０μＬの反応溶液を用いて行った。【０１０９】
ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。【０１１０】
本実施例では、各プライマーセットについて、同一の反応サイクルにて、ＰＣＲ反応を行った。つまり、６８℃にて２分間のアニーリングおよび伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。【０１１１】
電気泳動の結果を図２に示す。【０１１２】
プライマーセットとしてＳｅｔ  １を用いた場合、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子のみならず、Ｏｃｔ４偽遺伝子も検出（増幅）されることが明らかになった。【０１１３】
プライマーセットとしてＳｅｔ  ２、Ｓｅｔ  ３、Ｌｉｅｄｔｋｅ−１、Ｌｉｅｄｔｋｅ−２、および、Ａｔｌａｓｉを用いた場合、Ｏｃｔ４Ａ遺伝子のみならず、Ｏｃｔ４偽遺伝子も検出（増幅）されることが明らかになった。【０１１４】
プライマーセットとしてＳｕｏを用いた場合、Ｏｃｔ４偽遺伝子を検出せずにＯｃｔ４Ａ遺伝子のみを検出できるが、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡとｍＲＮＡとを区別できないことが明らかになった。更に、プライマーセットとしてＳｕｏを用いた場合、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型のスプライシングバリアント同士を区別できないことが明らかになった。【０１１５】
プライマーセットとしてＳｅｔ  Ａ１、Ｓｅｔ  Ａ２、および、Ｓｅｔ  Ｂを用いた場合、Ｏｃｔ４偽遺伝子を検出せずにＯｃｔ４Ａ遺伝子のみを検出できること、および、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡとｍＲＮＡとを区別できることが明らかになった。更に、これらのプライマーセットであれば、スプライシングバリアントを網羅的に検出できることが明らかになった。【０１１６】
＜４．スプライシングバリアントの解析＞
プライマーセットとしてＳｅｔ  Ａ１またはＳｅｔ  Ｂと、鋳型として、様々な細胞（癌細胞（具体的には、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＨＥＣ２６５、ＨＥＣ１、ＨＥＣ５０Ｂ、ＴＴＡ１、Ａ５４９、Ｓ２、ＰＡ１、または、ＨＥＫ２９３Ｔ）、正常細胞（具体的には、ＡＲＰＥ−１９、ＨＦＦ、ＨＵＶＥＣ、または、ＨＡｏＳＭＣ））から精製したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡと、を用いてＰＣＲ反応行った。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用いて、当該キットに添付のプロトコールにしたがって行った。また、ＰＣＲ反応は、上述した＜２．プライマーセットの増幅特異性＞に記載の条件にて行った。【０１１７】
ＰＣＲ反応液を電気泳動に供し、電気泳動に用いたゲルからＰＣＲ増幅産物を切り出した。当該ＰＣＲ増幅産物を周知の方法にしたがって市販のベクターに挿入し、当該ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。大腸菌の形質転換体を培養および増殖させた後、当該大腸菌からベクターを精製し、当該ベクターに挿入されているＰＣＲ増幅産物の塩基配列を、市販のシークエンサーを用いて解析した。【０１１８】
Ｓｅｔ  Ａ１を用いて増幅されたＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析した結果、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４Ａ以外に、新規なスプライシングバリアントとして、ｈＯｃｔ４Ａ１（配列番号２１）、ｈＯｃｔ４Ａ２（配列番号２２）、ｈＯｃｔ４Ａ３（配列番号２３）、ｈＯｃｔ４Ａ４（配列番号２４）、ｈＯｃｔ４Ａ５（配列番号２５）、および、ｈＯｃｔ４Ａ６（配列番号２６）を見出すことに成功した。【０１１９】
Ｓｅｔ  Ｂを用いて増幅されたＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解析した結果、公知のスプライシングバリアントであるｈＯｃｔ４ＢおよびｈＯｃｔ４Ｂ１以外に、新規なスプライシングバリアントとして、ｈＯｃｔ４Ｂ２（配列番号２７）、ｈＯｃｔ４Ｂ３（配列番号２８）、ｈＯｃｔ４Ｂ４（配列番号２９）、ｈＯｃｔ４Ｂ５（配列番号３０）、ｈＯｃｔ４Ｂ６（配列番号３１）、および、ｈＯｃｔ４Ｂｎｓ（配列番号３２）を見出すことに成功した。【０１２０】
上述したスプライシングバリアントの構造の概略を、図３および４に示す。【０１２１】
更に、表２および３に、各細胞で検出されたスプライシングバリアントの種類と検出されたクローンの数とを示す。得られたクローンの塩基配列を決定したところ、すべてＯｃｔ４遺伝子の転写産物であることが判明し、偽遺伝子は一つも含まれていないことを確認した。表２および３から明らかなように、癌細胞では、様々なスプライシングバリアントが発現していることが明らかになった。一方、正常細胞では、Ｏｃｔ４  Ｂｎｓタイプ以外のＯｃｔ４遺伝子の発現が、ほとんど観察されなかった。【０１２２】
【表２】
2016159009.tif 000004
【０１２３】
【表３】
2016159009.tif 000005
＜５．悪性度の高い癌細胞におけるＯｃｔ４遺伝子の発現＞
プライマーセットとしてＳｅｔ  Ａ１またはＳｅｔ  Ｂと、鋳型として乳癌細胞であるＭＣＦ７または悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１から精製したｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡと、を用いてＰＣＲ反応行った。なお、ｍＲＮＡの精製、および、ｍＲＮＡの逆転写は、市販のキットを用い、当該キットに添付のプロトコールに従って行った。また、ＰＣＲ反応は、上述した＜２．プライマーセットの増幅特異性＞に記載の条件にて行った。その後、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。【０１２４】
電気泳動の結果を図５に示す。なお、図５において、「Ｘ」は、Ｓｅｔ  Ａ１の試験結果を示しており、「Ｙ」は、Ｓｅｔ  Ｂの試験結果を示している。【０１２５】
鋳型として乳癌細胞であるＭＣＦ７のｃＤＮＡを用いた場合、プライマーセットとしてＳｅｔ  Ａ１またはＳｅｔ  Ｂの何れを用いても、ＰＣＲ増幅産物の量が検出限界以下の量であった。一方、鋳型として悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１のｃＤＮＡを用いた場合、プライマーセットとしてＳｅｔ  Ａ１またはＳｅｔ  Ｂの何れを用いても、ＰＣＲ増幅産物が検出された（図５の１．４ｋｂｐのバンド（ｈＯｃｔ４Ａ）、および、１ｋｂｐのバンド（ｈＯｃｔ４Ｂ）を参照）。これらのことは、癌の悪性度と、Ｏｃｔ４遺伝子の発現強度とが、相関していることを示唆している。【０１２６】
＜６．癌細胞の悪性度と癌細胞の遊走能との関係＞
乳癌細胞であるＭＣＦ７と、悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１とを、別々に、シャーレ上に同じ細胞濃度（８×１０４個ｃｅｌｌ／ｃｍ２）にて捲き、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。培養を開始してから４８時間後に、シャーレ上に傷をつけ、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙを行った。【０１２７】
図６に、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙの結果を示す。シャーレ上に傷をつけてから、１８時間後、４４時間後、６４時間後、および、８８時間後の癌細胞の様子を観察した結果、悪性度の高い乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１は遊走能が高いが、悪性度の低い乳癌細胞であるＭＣＦ７は遊走能がほとんど無いことが明らかになった。【０１２８】
＜７．Ｏｃｔ４遺伝子の発現が遊走能に及ぼす影響＞
周知の方法にしたがって、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入した発現ベクターと、ｈＯｃｔ４Ａを挿入した発現ベクターとを作製した。なお、発現ベクターとしては、クローンテック株式会社製のｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターを用いた。【０１２９】
ＭＣＦ７を、シャーレ上に細胞濃度（６．６×１０４個ｃｅｌｌ／ｃｍ２）にて捲き、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。培養を開始してから２４時間後に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて常法に従い遺伝子導入を行い、さらに培養を続けた。遺伝子導入後３６時間培養後にシャーレ上に傷をつけ、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙを行った。【０１３０】
図７に、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙの結果を示す。シャーレ上に傷をつけてから、２４時間後、および、１４４時間後の様子を観察した結果、ｈＯｃｔ４Ａを挿入した発現ベクターが導入されたＭＣＦ７は遊走能が有意に促進されたが、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入した発現ベクターが導入されたＭＣＦ７は、野生型ＭＣＦ７と同様に遊走能がほとんど無いことが明らかになった。【０１３１】
＜８．発現するタンパク質に関する考察＞
各スプライシングバリアント（具体的には、Ｏｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２、Ｏｃｔ４Ｂ、Ｏｃｔ４Ｂ１、Ｏｃｔ４Ｂ２、Ｏｃｔ４Ｂ３、Ｏｃｔ４Ｂｎｓ）のｃＤＮＡを市販の発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入し、当該ＣＯＳ７細胞を培養した。【０１３２】
市販のキットを用いて培養後のＣＯＳ７細胞からｍＲＮＡを精製し、当該ｍＲＮＡに含まれているスプライシングバリアントのタイプを５’ＲＡＣＥ法により同定した。【０１３３】
Ａ型スプライシングバリアント（具体的にはＯｃｔ４Ａ、Ｏｃｔ４Ａ１、Ｏｃｔ４Ａ２）のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入した場合、Ｏｃｔ４ＡおよびＯｃｔ４Ａ２の場合はともにＯｃｔ４Ａのみの１種類の転写産物が検出されたのに対し、Ｏｃｔ４Ａ１の場合はＯｃｔ４Ａ１とその他サイズの小さいバンドが確認された。Ｏｃｔ４Ａの翻訳産物は３６０個のアミノ酸をもつ公知の蛋白質であり、Ｏｃｔ４Ａ１の翻訳産物はカルボキシル末端領域を大きく欠損した１６８個のアミノ酸を持つ新規蛋白質が生産されている可能性が明らかとなった。【０１３４】
スプライシングバリアント（具体的には、Ｏｃｔ４Ｂ、Ｏｃｔ４Ｂ１、Ｏｃｔ４Ｂ２、Ｏｃｔ４Ｂ３、Ｏｃｔ４Ｂｎｓ）のｃＤＮＡを挿入した発現ベクターをＣＯＳ７細胞に導入した場合、いずれの発現ベクターにおいても、Ｏｃｔ４ＢおよびＯｃｔ４Ｂ５の２種類のスプライシングバリアントしか検出されなかった（図８のＢａｎｄ  １、および、Ｂａｎｄ  ２参照）。【０１３５】
このことから、細胞内では、スプライシングバリアントは細胞内で更なる構造変化を受け、その結果、Ｏｃｔ４Ｂ型のタンパク質としては、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質が主として生産されている可能性があると考えられる。【０１３６】
Ｏｃｔ４ＢおよびＯｃｔ４Ｂ５の２種類のスプライシングバリアントでは、翻訳開始点と考えられるコドン、および、翻訳終了点と考えられるコドンが異なっており、これらのコドンに基づいて予測される翻訳産物であるタンパク質の大きさが異なっている。そして、実際に観察されるタンパク質の大きさは、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質の大きさに近いので、Ｏｃｔ４Ｂ５の翻訳産物であるタンパク質が主として生産されている可能性があると考えられる。【０１３７】
＜９．短いプライマーに関する考察＞
下記表４に記載の各プライマーセット（Ｓｅｔ  Ａ１−ｓｈｏｒｔ、Ｓｅｔ  Ａ２−ｓｈｏｒｔ）と、鋳型としてＯｃｔ４Ａ遺伝子のＡ型の転写産物に由来するｃＤＮＡ、または、Ｏｃｔ４偽遺伝子（具体的には、ＰＧ１、ＰＧ３およびＰＧ４）と、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。【０１３８】
ＰＣＲ反応は、タカラバイオ株式会社製のプライム・スターまたはエメラルドアンプを用い、フォワードプライマー２５０μＭ、リバースプライマー２５０μＭ、鋳型１０ｆｇまたは１０ａｇ、その他の成分として、ＮＴＰ、および緩衝液を含む、２０μＬの反応溶液を用いて行った。ＰＣＲ反応に用いた酵素は、ｅｍｅｒａｌｄ  ａｍｐ（Ｔａｋａｒａ社）であった。【０１３９】
ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。【０１４０】
反応サイクルとしては、５５℃にて１５秒間のアニーリング反応、７２℃にて２分間の伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。【０１４１】
試験結果を図１０に示す。図１０に示すように、１７ｂａｓｅというプライマーの長さは、Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を特異的に検出する上で、十分な長さであることが明らかになった。【０１４２】
下記表４に記載の各プライマーセット（Ｓｅｔ  Ｂ−ｓｈｏｒｔ）と、鋳型として、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ−１、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ−２、Ｏｃｔ４Ｂ  ｃＤＮＡ  １０ｆｇ、または、Ｏｃｔ４Ｂ  ｃＤＮＡ  １０ａｇと、を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の有無を、電気泳動によって確認した。【０１４３】
ＰＣＲ反応装置としては、ＡＢＩ株式会社製のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００装置を用いた。【０１４４】
反応サイクルとしては、５５℃にて１５秒間のアニーリング反応、７２℃にて２分間の伸長反応、および、９６℃にて３０秒間の変性反応からなるサイクルを３５回行う、反応サイクルを採用した。【０１４５】
試験結果を図１１に示す。なお、図１１において、レーン「１」、「２」、「３」および「４」の各々は、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ−１、ＰＡ１細胞由来ｃＤＮＡ−２、Ｏｃｔ４Ｂ  ｃＤＮＡ  １０ｆｇ、および、Ｏｃｔ４Ｂ  ｃＤＮＡ  １０ａｇの各々を用いた場合の試験結果を示している。【０１４６】
図１１に示すように、１７ｂａｓｅというプライマーの長さは、Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を特異的に検出する上で、十分な長さであることが明らかになった。【０１４７】
【表４】
2016159009.tif 000006
＜１０．Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現との相関関係＞
様々な、カルシノーマの細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＡ１、Ａ５４９）、正常な細胞株（ＡＲＰＥ−１９、ＨＦＦ、ＨＵＶＥＣ、ＨＡｏＳＭＣ）、および、正常な組織（monocyte、bone marrow）におけるＯｃｔ４遺伝子、および、オステオポンチン遺伝子の発現を、ＰＣＲ法によって確認した。なお、上述した細胞株および組織からのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、市販のキットを用いて、周知の方法にしたがって行った。【０１４８】
Ｏｃｔ４遺伝子の発現の確認には、図１および表１に記載のプライマーセットのうちＳｅｔ  Ａ１（配列番号１、配列番号２）を用いた。【０１４９】
一方、オステオポンチン遺伝子の発現の確認には、以下のフォワードプライマー（ＦＯ）およびリバースプライマー（ＲＶ）を用いた。
ＦＯ：5’−accatgagaattgcagtgatttgc−3’（配列番号４２）；
ＲＶ：5’−tcagtgaccagttcatcagattca−3’（配列番号４３）。【０１５０】
オステオポンチンには、３種類のスプライシングバリアントが存在することが知られている（例えば、（ａ）J Gastrointest Surg（2015）19, 639−650、（ｂ）Cancer Res; 75（6） March 15, 2015, 963−973、（ｃ）Mol Cancer Res; 9（3） March 2011, 280−293、（ｄ）Oncogene, 2006, 25, 2192−2202、参照）。【０１５１】
そこで、オステオポンチン遺伝子の発現の確認時には、ＰＣＲの増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して分離することにより、３つのスプライシングバリアントの何れが発現しているか確認した。なお、図１２にアガロースゲル電気泳動の像の一例を示す。図１２において、「ＳＰＰ１ａ」はａ型のスプライシングバリアントを示し、「ＳＰＰ１ｂ」はｂ型のスプライシングバリアントを示し、「ＳＰＰ１ｃ」はｃ型のスプライシングバリアントを示している。【０１５２】
下記の表５に、試験結果を示す。なお、表５において、「−」は、陰性（アガロースゲル電気泳動にて、バンドが検出されない）であることを示し、「±」は、弱陽性（アガロースゲル電気泳動にて、薄いバンドが検出される）であることを示し、「＋」は、陽性（アガロースゲル電気泳動にて、濃いバンドが検出される）であることを示している。また、「ａ」は、ａ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示し、「ｂ」は、ｂ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示し、「ｃ」は、ｃ型のスプライシングバリアントの発現が確認されたことを示している。【０１５３】
表５に示すように、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、オステオポンチン遺伝子の発現とには、高い相関関係があることが明らかになった。【０１５４】
具体的に、Ｏｃｔ４遺伝子の発現が確認されなかった細胞株および組織では、オステオポンチン遺伝子の発現もほとんど確認されなかった。【０１５５】
Ｏｃｔ４遺伝子の発現が弱く確認されたＨＦＦでは、オステオポンチン遺伝子の発現も確認されたが、ｃ型のスプライシングバリアントの発現は確認されなかった。このことは、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、ａ型、ｂ型およびｃ型のスプライシングバリアントの発現とには高い相関関係があり、Ｏｃｔ４遺伝子の発現と、ｃ型のスプライシングバリアントの発現とには特に高い相関関係があることを示している。【０１５６】
【表５】
2016159009.tif 000007
＜１１．オステオポンチン遺伝子のｃ型のスプライシングバリアントの発現の特異的な検出＞
オステオポンチン遺伝子の３つのスプライシングバリアントのうち、ｃ型のみを特異的に検出することが可能であるか否か、検討した。【０１５７】
ＰＡ−１細胞由来のｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマーとして後述するフォワードプライマー（ＳＳＰ１ｃ−ＦＯ）およびリバースプライマー（ＳＳＰ１ｃ−ＲＶ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。なお、当該ＰＣＲ反応では、９６℃にて３０秒間の変性反応、６０℃にて１５秒間のアニーリング反応、および、７２℃にて６０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを３５サイクル繰り返した。
ＳＳＰ１ｃ−ＦＯ：5’−AAGTTCTGAGGAAAAGCAGAATGCTGTGTC−3’（配列番号４４）；
ＳＳＰ１ｃ−ＲＶ：5’−TTTAATTGACCTCAGAAGATGCAC−3’（配列番号４５）。【０１５８】
なお、オステオポンチン遺伝子のｃ型のスプライシングバリアントには、エクソン４が存在しない。そこで、ＳＳＰ１ｃ−ＦＯの塩基配列として、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を用いた（図１３（ｂ）を参照）。【０１５９】
試験結果を図１３（ａ）に示す。図１３（ａ）において、「ＲＴ＋」は、逆転写酵素（Reverse Transcriptase）を用いた場合の試験結果を示し、「ＲＴ−」は、逆転写酵素を用いない場合の試験結果を示している。【０１６０】
図１３（ａ）に示すように、エクソン３とエクソン５との間をまたぐ塩基配列を有するフォワードプライマーを用いれば、オステオポンチン遺伝子の３つのスプライシングバリアントのうちｃ型を特異的に検出し得ることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、癌の検出に利用することができる。
【図１】
2016159009.tif 000008
【図３】
2016159009.tif 000009
【図４】
2016159009.tif 000010
【図２】
2016159009.tif 000011
【図５】
2016159009.tif 000012
【図６】
2016159009.tif 000013
【図７】
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【図８】
2016159009.tif 000015
【図９】
2016159009.tif 000016
【図１０】
2016159009.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
2016159009.tif 000019
【図１３】
2016159009.tif 000020
【配列表】
2016159009000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月29日(2016.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を備えていることを特徴とする癌検出キット：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部である、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【請求項２】
更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることを特徴とする請求項１に記載の癌検出キット。
【請求項３】
生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を有することを特徴とする、癌診断のためのデータの取得方法：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部である、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【請求項４】
更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することを特徴とする請求項３に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月16日(2017.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（α）のプライマーセットを備えていることを特徴とする癌検出キット：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部である、プライマーセット。
【請求項２】
更に、（ｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセット、（ｉｉ）オステオポンチン遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ、または、（ｉｉｉ）抗オステオポンチン抗体、を備えていることを特徴とする請求項１に記載の癌検出キット。
【請求項３】
生体から採取されたサンプルを鋳型として用い、かつ、下記（α）および（β）のプライマーセットの何れか１つ以上を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、および
上記工程によって得られた遺伝子増幅産物において、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２にて示される塩基配列を有するスプライシングバリアントのうちの一つ以上の有無を検出する工程、を有することを特徴とする、癌診断のためのデータの取得方法：
（α）Ｏｃｔ４遺伝子のＡ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号４１にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または、配列番号２６にて示される塩基配列内の、エクソン４またはエクソン５に対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部である、プライマーセット；
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【請求項４】
更に、上記生体から採取されたサンプルにおける、オステオポンチン遺伝子の発現、または、オステオポンチンタンパク質の発現を検出する工程を有することを特徴とする請求項３に記載の癌診断のためのデータの取得方法。
【請求項５】
更に、下記（β）のプライマーセットを備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の癌検出キット：
（β）Ｏｃｔ４遺伝子のＢ型の転写産物を増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるプライマーセットであって、当該フォワードプライマーは、配列番号３３にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーであり、当該リバースプライマーは、配列番号６にて示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの中の、連続した１７塩基以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを含むプライマーである、プライマーセット。
【国際調査報告】
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