(57)【要約】本発明は、新規な中胚葉細胞の製造方法、および当該方法により得られた中胚葉細胞を含有する移植用材料を提供することを目的とする。本発明はまた、新規な造血細胞の製造方法、および当該方法により得られた造血細胞を含む血液疾患治療剤を提供することを目的とし、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養することを含む、中胚葉細胞および／または造血細胞の新規な製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。
2015199127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から中胚葉細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養して中胚葉細胞を誘導することを含む、方法。
【請求項２】
前記中胚葉細胞が、KDR陽性CD34陽性細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記三次元支持体が、コラーゲンスポンジである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲンスポンジが、ポリエチレンテレフタレート繊維で補強されたコラーゲンスポンジである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞と三次元支持体との接触が、三次元支持体の表面および／または内部で生じる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養する工程が、下記の工程を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法：
(i) 多能性幹細胞をBMP4を含有する培地中で培養する工程、および
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程。
【請求項７】
前記工程(i)および(ii)の培養期間が、それぞれ１〜５日および０．５〜３日である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(i)および(ii)の培養期間が、それぞれ３日および１日である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程(i)の前に、多能性幹細胞を三次元支持体と接触させて前培養を行う、請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、小塊または単一細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が、単一細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造された、三次元支持体に支持された中胚葉細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の三次元支持体に支持された中胚葉細胞を含有する、移植用材料。
【請求項１５】
１またはそれ以上の三次元支持体を保持している培養容器であって、該三次元支持体に中胚葉細胞が支持されており、ここで、該中胚葉細胞が請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造された細胞である、培養容器。
【請求項１６】
以下の工程を含む造血細胞を製造する方法；
（a）請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により中胚葉細胞を三次元支持体と接触させて製造する工程、および
（b）得られた三次元支持体に保持された中胚葉細胞を培養容器中で培養することにより造血細胞に誘導する工程。
【請求項１７】
前記造血細胞が、骨髄系細胞、単球系細胞または赤血球系細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記造血細胞が、骨髄系細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記造血細胞が、単球系細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記造血細胞が、赤血球系細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
工程（b）が三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3Lおよびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
工程（b）が下記の工程を含む、請求項１９に記載の方法：
(i) 三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3LおよびTPOを含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3L、TPOおよびM-CSFを含有する培地中で培養する工程、および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をFlt3L、M-CSFおよびGM-CSFを含有する培地中で培養する工程 。
【請求項２３】
工程（b）が三次元支持体に保持された中胚葉細胞をerythropoietin（EPO）およびSCFを含有する培地中で培養する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
工程（b）の培養期間が１６〜４１日である、請求項２１または２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（b）の培養期間が３１日である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記工程(i)、(ii)および(iii)の培養期間が、それぞれ２〜５日、２〜５日および８〜３３日である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程(i)、(ii)および(iii)の培養期間が、それぞれ３日、３日および２３日である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１６から２７のいずれか１項に記載の方法で製造された造血細胞を含有する、血液疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な中胚葉細胞の製造方法、当該方法により得られた三次元支持体に支持された中胚葉細胞、および当該三次元支持体に支持された中胚葉細胞を含有する移植用材料、ならびに中胚葉細胞を支持した複数の三次元支持体を保持する培養容器に関する。本発明はまた、新規な造血細胞の製造方法、および当該方法により得られた造血細胞を含む血液疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病に代表される血液関連疾患の治療や外科的な治療においては、その治療に必要な量の血液細胞を安定に増幅し、供給することは極めて重要なことである。そのため、これまでに多くの医療関係者によって、血液細胞を確保するための種々の手段が講じられてきた。例えば、ドナーからの献血による採取や、臍帯血または骨髄細胞から分化誘導させることが従来から行われてきた。
最近では、胚性幹細胞（ES細胞）や体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹（iPS）細胞（特許文献１および２）などの多能性を有する細胞を用いて、血球を産生する元となる造血幹細胞や造血前駆細胞、あるいはさらに成熟した赤血球や好中球などを効率的に増幅することが試みられている。
ES細胞やiPS細胞から造血幹細胞や造血前駆細胞への分化誘導法としては、これまでに、胚様体の形成とサイトカインの添加による方法（非特許文献１〜３）、異種由来のストローマ細胞との共培養法（非特許文献４）、無血清培地を用いる方法（特許文献３）などが報告されている。赤血球への分化誘導法も同様に、非特許文献１〜４、特許文献３などにより報告されており、好中球への分化誘導法は、非特許文献３、５などにおいて報告されている。
しかしながら、血液細胞を多量にかつ安定的に供給できるようにするためには、血液細胞への分化誘導法についてさらなる改善の必要があり、医療応用に適した新たな技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】USP 5,843,780
【特許文献２】WO 2007/069666
【特許文献３】WO2011/115308
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chadwick et al. Blood 2003, 102:906-15
【非特許文献２】Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62
【非特許文献３】Saeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67
【非特許文献４】Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77
【非特許文献５】Morishima et al. J Cell Physiol. 2011 May;226(5):1283-91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、新規な中胚葉細胞の製造方法、当該方法により得られた三次元支持体に支持された中胚葉細胞、および当該三次元支持体に支持された中胚葉細胞を含有する移植用材料、ならびに中胚葉細胞を支持した複数の三次元支持体を保持する培養容器を提供することにある。本発明の課題はまた、新規な造血細胞の製造方法、および当該方法により得られた造血細胞を含む血液疾患治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞を三次元支持体との接触条件下で培養することにより、中胚葉細胞および／または造血細胞へ分化誘導させることに成功した。また、同様に、中胚葉細胞を三次元支持体との接触条件下で培養することにより、造血細胞へ分化誘導させることに成功した。さらに本発明者らは、多能性幹細胞および／または中胚葉細胞を三次元支持体との接触条件下で培養することにより、長期間に渡って、安定的に造血細胞を供給できることを初めて見出した。本発明は、そのような知見に基づいて完成されたものである。【０００７】
すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
（１）多能性幹細胞から中胚葉細胞を製造する方法であって、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養して中胚葉細胞を誘導することを含む、方法。
（２）前記中胚葉細胞が、KDR陽性CD34陽性細胞である、（１）に記載の方法。
（３）前記三次元支持体が、コラーゲンスポンジである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記コラーゲンスポンジが、ポリエチレンテレフタレート繊維で補強されたコラーゲンスポンジである、（３）に記載の方法。
（５）前記多能性幹細胞と三次元支持体との接触が、三次元支持体の表面および／または内部で生じる、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養する工程が、下記の工程を含む、（１）から（５）のいずれかに記載の方法：
(i) 多能性幹細胞をBMP4を含有する培地中で培養する工程、および
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程。
（７）前記工程(i)および(ii)の培養期間が、それぞれ１〜５日および０．５〜３日である、（６）に記載の方法。
（８）前記工程(i)および(ii)の培養期間が、それぞれ３日および１日である、（７）に記載の方法。
（９）前記工程(i)の前に、多能性幹細胞を三次元支持体と接触させて前培養を行う、（６）から（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、（１）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記多能性幹細胞が、小塊または単一細胞である、（１）から（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記多能性幹細胞が、単一細胞である、（１１）に記載の方法。
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の方法により製造された、三次元支持体に支持された中胚葉細胞。
（１４）（１３）に記載の三次元支持体に支持された中胚葉細胞を含有する、移植用材料。
（１５）１またはそれ以上の三次元支持体を保持している培養容器であって、該三次元支持体に中胚葉細胞が支持されており、ここで、該中胚葉細胞が（１）から（１２）のいずれかに記載の方法により製造された細胞である、培養容器。
（１６）以下の工程を含む造血細胞を製造する方法；
（a）（１）から（１２）のいずれかに記載の方法により中胚葉細胞を三次元支持体と接触させて製造する工程、および
（b）得られた三次元支持体に保持された中胚葉細胞を培養容器中で培養することにより造血細胞に誘導する工程。
（１７）前記造血細胞が、骨髄系細胞、単球系細胞または赤血球系細胞である、（１６）に記載の方法。
（１８）前記造血細胞が、骨髄系細胞である、（１６）または（１７）に記載の方法。
（１９）前記造血細胞が、単球系細胞である、（１６）または（１７）に記載の方法。
（２０）前記造血細胞が、赤血球系細胞である、（１６）または（１７）に記載の方法。
（２１）工程（b）が三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3Lおよびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程を含む、（１８）に記載の方法。
（２２）工程（b）が下記の工程を含む、（１９）に記載の方法：
(i) 三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3LおよびTPOを含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3L、TPOおよびM-CSFを含有する培地中で培養する工程、および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をFlt3L、M-CSFおよびGM-CSFを含有する培地中で培養する工程 。
（２３）工程（b）が三次元支持体に保持された中胚葉細胞をerythropoietin（EPO）およびSCFを含有する培地中で培養する工程を含む、（２０）に記載の方法。
（２４）工程（b）の培養期間が１６〜４１日である、（２１）または（２３）に記載の方法。
（２５）工程（b）の培養期間が３１日である、（２４）に記載の方法。
（２６）前記工程(i)、(ii)および(iii)の培養期間が、それぞれ２〜５日、２〜５日および８〜３３日である、（２２）に記載の方法。
（２７）前記工程(i)、(ii)および(iii)の培養期間が、それぞれ３日、３日および２３日である、（２６）に記載の方法。
（２８）（１６）から（２７）のいずれかに記載の方法で製造された造血細胞を含有する、血液疾患治療剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、造血細胞を多量にかつ安定的に供給することができる。特に、多能性幹細胞の単一細胞の形態で分化誘導を行った際にその効果をより発揮することができ、種々の血液疾患の治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、未分化多能性幹細胞（PSC）の小塊からの造血細胞分化の結果を示す。(a) CS 上でのPSC小塊の顕微鏡像を示す写真。矢印は、PSC（KhES1）の各小塊を示す。スケールバーは、500 μmである。 (b) ６日目におけるKhES1から分化誘導した造血前駆細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。フローサイトメトリー解析には、下記の抗体が使用された：KDR (CD309)-Alexa fluor 647（Biolegend）、CD34-PE（BD Biosciences）およびCD45-PE（BD Biosciences）。死細胞および残骸はDAPI染色により除外している。(c) ６日目におけるKDR陽性CD34陽性造血前駆細胞の割合を示す。エラーバーは、標準偏差（S.D.）を示す。すべてのデータは、少なくとも独立した３回の実験を代表したものである。
【図２】図２は、特定の造血細胞系列への分化の結果を示す。(a, b) 骨髄系細胞への分化の結果を示す。(a)は、フローサイトメトリーの結果を示し、(b)は、ギムザ染色（May-Giemsa staining）の結果を示す写真。(b)のスケールバーは、20 μmである。(c, d) 単球系細胞への分化の結果を示す。(c)は、フローサイトメトリーの結果を示し、(d)は、ギムザ染色（May-Giemsa staining）の結果を示す写真。(d)のスケールバーは、20 μmである。(e, f) 赤血球系細胞への分化の結果を示す。(e)は、フローサイトメトリーの結果を示し、(f)は、ギムザ染色（May-Giemsa staining）の結果を示す写真。(f)のスケールバーは、20 μmである。(g) 培養期間に応じて回収された造血細胞の数を示す。すべてのデータは、少なくとも独立した３回の実験を代表したものである。フローサイトメトリー解析には、下記の抗体が使用された：CD43-APC（BD Biosciences）、CD45-PE（BD Biosciences）、CD71-APC（BD Biosciences）、CD235a-PE（BD Biosciences）およびCD14-APC（Beckman Coulter）。（h）は、フローサイトメトリーの結果を示す。（i）は、コロニー形成試験の結果を示す。CFU-Gは顆粒球のコロニー形成ユニットを示し、CFU-GMは顆粒球マクロファージのコロニー形成ユニットを示し、BFU-Eは赤芽球のバースト形成ユニットを示す。
【図３】図３は、単一の未分化PSCからの造血細胞分化の結果を示す。(a) 分化開始時におけるCS の顕微鏡像を示す写真。明瞭な細胞の凝集体は観察されていない。スケールバーは、500 μmである。(b-e) ６日目におけるKhES1から分化誘導した造血前駆細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。死細胞および残骸はDAPI染色により除外している。(b)は、全細胞数を示し、 (c) は、CD34陽性KDR陽性造血前駆細胞（HPC）の割合を示し 、(d) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの数を示し、(e)は、フローサイトメトリーの結果を示す。(f) ３８日目における骨髄系細胞についてのフローサイトメトリーの結果を示す。 (g) ６日目におけるKhES1から分化誘導した造血前駆細胞のギムザ染色の結果を示す写真。スケールバーは、20 μmである。(h-j, q) ６日目における201B7から分化誘導した造血前駆細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。死細胞および残骸はDAPI染色により除外している。(h)は、全細胞数を示し、 (i) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの割合を示し 、(j) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの数を示し、(q)は、フローサイトメトリーの結果を示す。(k-m, r) ６日目における402B2から分化誘導した造血前駆細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。死細胞および残骸はDAPI染色により除外している。(k)は、全細胞数を示し、 (l) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの割合を示し、(m) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの数を示し、(r)は、フローサイトメトリーの結果を示す。(n-p, s) ６日目におけるCB-A11から分化誘導した造血前駆細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。死細胞および残骸はDAPI染色により除外している。(n)は、全細胞数を示し、(o) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの割合を示し、(p) は、CD34陽性KDR陽性 HPCの数を示し、(s)は、フローサイトメトリーの結果を示す。すべてのデータは、少なくとも独立した３回の実験を代表したものである。フローサイトメトリー解析には、下記の抗体が使用された：KDR (CD309)-Alexa fluor 647（Biolegend）、CD34-PE（BD Biosciences）、CD43-APC（BD Biosciences）およびCD45-PE（BD Biosciences）。
【図４】図４は、走査型電子顕微鏡（SEM）により得られた画像の結果を示す写真。(a) 細胞を播種する前のCSの画像を示す。(b) ４１日目におけるPSCの小塊から分化誘導した後のCSの画像を示す。(c) ２１日目における単一PSCから分化誘導した後のCSの画像を示す。(d,e) ４１日目におけるPSCの小塊から分化誘導した細胞の画像を示す。(f,g) ２１日目における単一PSCから分化誘導した細胞の画像を示す。PSCとして、すべてKhES1が使用された。
【図５】図５は、フラスコ内で複数のCSを用いて培養を行った結果を示す。(a)は、培養から回収された造血細胞の数を示す。(b, c) 培養により得られた骨髄系細胞についての結果を示す。(b)は、フローサイトメトリーの結果を示し、(c)は、ギムザ染色の結果を示す写真。(b)のフローサイトメトリー解析には、下記の抗体が使用された：CD43-APC（BD Biosciences）およびCD45-PE（BD Biosciences）。(c)のスケールバーは、20 μmである。
【図６】図６は、未分化多能性幹細胞（PSC）の小塊からCSを用いて誘導した造血細胞に対するPCRの結果を示す。分化誘導前（D0）および分化誘導6日目（D6）の細胞に対して、多能性細胞特異的マーカーとしてのZFP42およびNanog、ならびに、中胚葉前駆細胞特異的マーカーとしてのTおよびMIXL1、造血前駆細胞特異的マーカーとしてのRUNX1、ならびに内皮前駆細胞マーカーとしてのAPLNRおよびCDH5の遺伝子発現量を測定した。
【図７】図７は、分化誘導後のCSの免疫染色の結果を示す写真。（a）は、CSにおける免疫染色を行った部位を図示しており、（b）は、（a）におけるB部位のCD45抗体による免疫染色像を示し、（c）は、（a）におけるC部位のヘマトキシリン-エオシン染色像、マッソントリクローム染色像、CD34抗体による免疫染色像およびCD45抗体による免疫染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、新規な造血細胞の製造方法、および当該方法により得られた造血細胞を含む血液疾患治療剤を提供する。本発明はまた、新規な中胚葉細胞の製造方法、および当該方法により得られた三次元支持体に支持された中胚葉細胞を提供する。さらに本発明は、中胚葉細胞を支持した複数の三次元支持体を保持する培養容器を提供する。本発明の一つの態様において、本発明の方法により製造される細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であり得る。多能性幹細胞は、特に限定されることはないが、例えば、下記のものが挙げられる。
【００１１】
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞（「PSC」ともいう）は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）、人工多能性幹（iPS）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞およびiPS細胞である。
【００１２】
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
【００１３】
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
【００１４】
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
【００１５】
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、5% CO2、湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
【００１６】
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
【００１７】
ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
【００１８】
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹橋正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
【００１９】
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
【００２０】
(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
【００２１】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore)、HuSH 29mershRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【００２２】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えば、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００２３】
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
【００２４】
また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
【００２５】
iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
【００２６】
培養法の例としては、例えば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
【００２７】
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
【００２８】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
【００２９】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００３０】
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
【００３１】
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００３２】
また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
【００３３】
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している  （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
【００３４】
(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
【００３５】
＜多能性幹細胞から中胚葉細胞を誘導する方法＞
本発明において「中胚葉細胞」は、中胚葉を構成する細胞群であり、発生の過程で体腔およびそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管や脾臓、腎臓および尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）をつくる能力を有する細胞群を意味する。本発明における「中胚葉細胞」は、例えば、T(Brachyuryと同義)、VEGF receptor-2(KDR)、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1、SDF1およびCD34のようなマーカーの発現により示される。好ましくは、KDRおよびCD34を発現する細胞である。本発明における「中胚葉細胞」は、別段の断りがない限り、造血細胞への分化能を有する造血幹細胞や造血前駆細胞を包含し得る。
【００３６】
本発明において「造血幹細胞」は、T細胞、B細胞、赤血球、血小板、好酸球、単球、好中球、好塩基球などの成熟血液細胞を作り出す能力を有し、かつ自己複製能を有する細胞を意味する。一方、「造血前駆細胞」（「HPC」ともいう）は、「造血幹細胞」より分化が進み、細胞の分化の方向が決定した細胞を意味する。これらの細胞は、KDR、CD34、CD90およびCD117のようなマーカーの発現により検出され得るが、マーカーはこれらに限定されない。本明細書における「造血前駆細胞」は、特に断りがない限り、「造血幹細胞」と区別するものではない。
【００３７】
本発明において分化誘導された中胚葉細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。中胚葉細胞が他の細胞種を含む細胞集団である場合、中胚葉細胞はその中に３０％以上含まれることが好ましく、５０％以上含まれることがより好ましい。
【００３８】
本発明において、中胚葉細胞への分化誘導は、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で培養することにより行われる。本発明における「三次元支持体」は、培養液中で細胞を保持し得る三次元の物質（すなわち、細胞の足場を提供する物質）であれば何でもよく、例えば、コラーゲンスポンジ、アガロースゲル、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、およびPGA、PLA、PLGAなどの生体材料、ならびにこれらの混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、コラーゲンスポンジが用いられる。
【００３９】
コラーゲンスポンジは、さらにその強度を補う目的で、補強材を有することが好ましい。コラーゲンスポンジの補強材は、別段限定されないが、例えば、グリコール酸、乳酸、ジオキサノン、カプロラクトンなど、またはそれらの共重合体、またはそれらの編物、織物、不織布、その他のシート状繊維材料などが挙げられる。本発明において、好ましい補強材は、ポリエチレンテレフタレート繊維である。上記補強材による補強の方法としては特に限定されず、例えば、コラーゲンスポンジの片面または両面に補強材を積層してもよく、コラーゲンスポンジを製造する際に、コラーゲンスポンジ中に補強材が形成されるようにしてもよい。本発明におけるコラーゲンスポンジは、例えば、MedGEL社（#PETcol-24W）などから入手することが可能である。
【００４０】
本発明における三次元支持体は、細胞がその内部まで入り込めるように多孔質構造を有していることが望ましい。この場合において、細胞は、三次元支持体の表面および内部のいずれかまたは両方において存在することができ、その位置において分化誘導操作に供され得る。例えば、三次元支持体がコラーゲンスポンジである場合、多孔質のポアサイズは、例えば、5μｍ〜1000μｍの範囲内であり、好ましくは、50μｍ〜500μｍ、より好ましくは、200μmであり得る。
【００４１】
本明細書において「（多能性幹／中胚葉）細胞と三次元支持体との接触」とは、当該細胞と三次元支持体とが何らかの相互作用をし得るまでの距離で近接していることを意味する。
したがって、本明細書において「（多能性幹／中胚葉）細胞を三次元支持体との接触下で培養する」とは、当該細胞が三次元支持体と何らかの相互作用をし得るまでの距離で近接している状態で培養することを意味する。「（多能性幹／中胚葉）細胞と三次元支持体との接触」は、例えば、物理的な形態のもの、あるいは化学的な形態のものなどが挙げられるが、別段限定されない。好ましくは、細胞側の受容体を介した支持体との結合が挙げられる。
【００４２】
多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化誘導方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法を用いることができる。
【００４３】
本発明において、中胚葉細胞を誘導する際に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、mTeSR1培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、Mouse Embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM)、およびこれらの混合培地などが包含される。本発明において、好ましくは、mTeSR1培地および／またはStemPro34培地が使用される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００４４】
本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００４５】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００４６】
中胚葉細胞への分化誘導因子としては、例えば、BMP4、VEGF、bFGF、SCFなどを挙げることができるがこれらに限定されることなく、中胚葉細胞の分化誘導工程に使用され得ることが既知なあらゆる因子、および将来的に中胚葉細胞の分化誘導工程に使用され得ることが同定されたあらゆる因子が包含される。
【００４７】
本発明において、中胚葉細胞への分化誘導は、例えば、下記の工程により行うことができる：
(i) 多能性幹細胞を三次元支持体との接触下でBMP4を含有する培地中で培養する工程、および
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程。
【００４８】
前記工程(i)において用いられる基礎培地は、好ましくは、mTeSR1培地であり、前記工程(ii)において用いられる基礎培地は、好ましくは、StemPro34培地であり得る。
【００４９】
培地における中胚葉細胞への分化誘導因子の濃度は、目的の細胞を誘導できる濃度であればいくらでもよい。
【００５０】
前記工程(i)の培地におけるBMP4の濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/ml の範囲内であり、例えば、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、80ng/mlである。
【００５１】
前記工程(ii)の培地におけるVEGFの濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/ml の範囲内であり、例えば、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、80ng/mlである。
【００５２】
前記工程(ii)の培地におけるbFGFの濃度は、例えば、1ng/ml〜100ng/ml の範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、100ng/ml、であるがこれらに限定されない。好ましくは、各工程で25ng/mlである。
【００５３】
前記工程(ii)の培地におけるSCFの濃度は、例えば、1ng/ml〜250ng/ml の範囲内であり、例えば、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/ml、210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml、240ng/ml、250ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００５４】
前記工程(i)の培養時間は、例えば、１０日以下の培養であり、好ましくは、１〜５日であり、特に好ましくは、３日である。
【００５５】
前記工程(ii)の培養時間は、例えば、５日以下の培養であり、好ましくは、０．５〜３日であり、特に好ましくは、１日である。
【００５６】
前記工程(i)の多能性幹細胞は、複数の多能性幹細胞が集合した小塊の形態であってもよく、あるいは単一細胞にまで解離された形態であってもよい。好ましくは、単一細胞にまで解離された形態である。したがって、本発明においてはさらに、前記工程(i)の前に、多能性幹細胞を小塊または単一細胞の形態まで解離する工程を含むことができる。
【００５７】
多能性幹細胞を小塊または単一細胞の形態まで解離する工程は、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)、Accumax(TM)、CTK溶液など）、コラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液、酵素不含の分離溶液（例えば、EDTA溶液）などを用いて行うことができる。多能性幹細胞を小塊まで解離する場合、好ましくは、CTK溶液および力学的に分離する方法の組み合わせ（例えば、CTK溶液による解離後、ピペッティング操作で目的のサイズの小塊まで解離する）であり、単一細胞の形態まで解離する場合、好ましくは、CTK溶液、Accumaxおよび力学的に分離する方法の組み合わせ（例えば、CTK溶液による解離後、続いてAccumaxによる解離を行い、最後にピペッティング操作で単一細胞まで解離する）であり得る。解離工程において、細胞の死滅を防ぐ目的で、解離溶液にROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００５８】
多能性幹細胞の小塊が用いられる場合、そのサイズは、別段限定されないが、例えば、100μm〜1000μm、好ましくは、200μm〜800μm、特に好ましくは、300μm〜500μmであり得る。
【００５９】
本発明においては、上記解離後の多能性幹細胞（小塊または単一細胞）を三次元支持体との接触下で非分化誘導条件で一定期間培養した後、中胚葉細胞への分化誘導条件で培養してもよい。このような前培養工程は、多能性幹細胞と三次元支持体との接着状態を適当なものとするために行われるものであり、この目的を達成し得る限りにおいて、任意の培養条件を採用することができる。
【００６０】
前培養工程における培地は、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、mTeSR1培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、Mouse Embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM)、およびこれらの混合培地などが挙げられるがこれらに限定されない。本工程において、好ましくは、mTeSR1培地が使用される。本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよく、例えば、Y-27632が本工程において使用され得る。培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００６１】
前培養工程の培養時間は、多能性幹細胞の小塊の場合、例えば、5日以下の培養であり、好ましくは、0.5〜3日であり、特に好ましくは、1日である。単一の多能性幹細胞の場合、例えば、6日以下の培養であり、好ましくは、1〜4日であり、特に好ましくは、2日である。後者の場合において、培養工程の途中で、培地を新鮮な培地と交換することが好ましい。交換される新鮮な培地としては、例えば、mTeSR1が挙げられるがこれに限定されない。
【００６２】
本発明において、上記各工程間における培地の交換は、三次元支持体はそのままで培地のみを取り換えることにより行ってもよく、あるいは三次元支持体を新しい培地が入った容器に移動させることにより行ってもよい。好ましくは、三次元支持体を容器に移動させることにより行われる。
【００６３】
＜中胚葉細胞から造血細胞を誘導する方法＞
本発明において「造血細胞」は、血液系列にコミットしたあらゆる種類の細胞を意味する。好ましくは、本発明における「造血細胞」は、中胚葉細胞から血液系列にコミットした任意の細胞であり得る。本発明における「造血細胞」としては、例えば、骨髄系細胞、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球系細胞、赤芽球、赤血球、単球系細胞、単球、マクロファージ、巨核球、血小板、樹状細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において「造血細胞」は、好ましくは、骨髄系細胞、単球系細胞または赤血球系細胞であり得る。本明細書における「造血細胞」は、特に断りがない限り、「血液細胞」と同義で使用される。
【００６４】
本発明において、造血細胞への分化誘導は、上記方法で得られた三次元支持体に保持された中胚葉細胞を培養容器中で培養することにより行われる。得られた造血細胞は培養上清より回収することができる。
【００６５】
（１）中胚葉細胞から骨髄系細胞を誘導する方法
本発明において「骨髄系細胞」は、中胚葉細胞から骨髄系系列への運命がコミットされた一連の細胞を意味し、例えば、好中球、好酸球、好塩基球などが挙げられるがこれに限定されない。本発明において「好中球」は、中性色素により染色される特殊顆粒を有する顆粒球の一種である。本発明において「好酸球」は、major basic protein (MBP) 、eosinophil cationic protein (ECP)、eosinophil peroxidase (EPO)、eosinophil-derived neurotoxin (EDN)をその顆粒内に有する細胞であり、より好ましくは、secretory immunoglobulin A (sIgA)の刺激によりEDNを放出する能力と、IL-5、EotaxinおよびfMLPの刺激により遊走能とを有する細胞である。本発明において「好塩基球」は、塩基性色素による染色により暗紫色に染まる大型の顆粒を有する細胞を意味する。これらの細胞は、CD43、CD45、CD19、CD13、CD33、MPOなどのマーカーの発現により検出され得る（マーカーの種類は限定されない）。本発明において「骨髄系細胞」は、好ましくは、CD43陽性CD45陽性の細胞であり得る。
【００６６】
本発明において分化誘導された骨髄系細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。骨髄系細胞が他の細胞種を含む細胞集団である場合、骨髄系細胞はその中に３０％以上含まれることが好ましく、５０％以上含まれることがより好ましい。
【００６７】
本工程では、中胚葉細胞を骨髄系細胞へ分化誘導する培地を用いて培養することができる。本工程における中胚葉細胞は、上述したとおり、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で中胚葉細胞まで分化誘導させた状態のものが好ましいが、任意の方法で分化誘導された中胚葉細胞を本工程の直前に三次元支持体と接触させたものであってもよい。
【００６８】
本発明において、骨髄系細胞を誘導する際に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、mTeSR1培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、Mouse Embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM)、およびこれらの混合培地などが包含される。本発明において、好ましくは、StemPro34培地が使用される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００６９】
本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００７０】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００７１】
骨髄系細胞への分化誘導因子としては、例えば、ステムセルファクター(Stem Cell Factor（SCF）)、インターロイキン類、トロンボポエチン（Thrombopoietin（TPO））およびFlt3リガンドなどがある。ここで、インターロイキン類は、白血球から分泌されるタンパク質で、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、およびIL-9などを含む30種以上がある。本発明において、中胚葉細胞から骨髄系細胞への分化誘導は、好ましくは、SCF、IL-3、Flt3LおよびTPOのうち少なくとも１つを含む培地中で培養することにより行うことができる。
【００７２】
本発明において、骨髄系細胞への分化誘導は、例えば、下記の工程により行うことができる：三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3Lおよびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程。
【００７３】
前記工程において用いられる基礎培地は、好ましくは、StemPro34培地であり得る。
【００７４】
培地における骨髄系細胞への分化誘導因子の濃度は、目的の細胞を誘導できる濃度であればいくらでもよい。
【００７５】
培地におけるSCFの濃度は、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００７６】
培地におけるIL-3の濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００７７】
培地におけるFlt3Lの濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００７８】
培地におけるTPOの濃度は、1ng/ml〜20ng/mlの範囲内であり、例えば、、1ng/ml 、2ng/ml 、3ng/ml 、4ng/ml 、5ng/ml 、6ng/ml 、7ng/ml、8ng/ml 、9ng/ml 、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、5ng/mlである。
【００７９】
本工程の培養時間は、例えば、60日以下の培養であり、好ましくは、１６〜４１日であり、特に好ましくは、31日である。
【００８０】
（２）中胚葉細胞から単球系細胞を誘導する方法
本発明において「単球系細胞」は、中胚葉細胞から単球系系列への運命がコミットされた一連の細胞を意味し、例えば、単球、マクロファージなどが挙げられるがこれに限定されない。本発明において「単球」および「マクロファージ」は、いずれも白血球細胞の一種であり、異物を貪食し、抗原提示する能力を有する細胞である。これらの細胞は、CD14、CD16、CD45、CD68などのマーカーの発現により検出され得る（マーカーの種類は限定されない）。本発明において「単球系細胞」は、好ましくは、CD14陽性CD45陽性の細胞であり得る。
【００８１】
本発明において分化誘導された単球系細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。単球系細胞が他の細胞種を含む細胞集団である場合、単球系細胞はその中に３０％以上含まれることが好ましく、５０％以上含まれることがより好ましい。
【００８２】
本工程では、中胚葉細胞を単球系細胞へ分化誘導する培地を用いて培養することができる。本工程における中胚葉細胞は、上述したとおり、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で中胚葉細胞まで分化誘導させた状態のものが好ましいが、任意の方法で分化誘導された中胚葉細胞を本工程の直前に三次元支持体と接触させたものであってもよい。
【００８３】
本発明において、単球系細胞を誘導する際に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、mTeSR1培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、Mouse Embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM)、およびこれらの混合培地などが包含される。本発明において、好ましくは、StemPro34培地が使用される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００８４】
本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００８５】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００８６】
単球系細胞への分化誘導因子としては、例えば、SCF、IL-3、Flt3L、TPO、M-CSF、GM-CSFなどを挙げることができるがこれらに限定されることなく、単球系細胞の分化誘導工程に使用され得ることが既知なあらゆる因子、および将来的に単球系細胞の分化誘導工程に使用され得ることが同定されたあらゆる因子が包含される。
【００８７】
本発明において、単球系細胞への分化誘導は、例えば、下記の工程により行うことができる：
(i) 三次元支持体に保持された中胚葉細胞をSCF、IL-3、Flt3LおよびTPOを含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3L、TPOおよびM-CSFを含有する培地中で培養する工程、および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をFlt3L、M-CSFおよびGM-CSFを含有する培地中で培養する工程 。
【００８８】
前記工程(i)〜(iii)において用いられる基礎培地は、好ましくは、StemPro34培地であり得る。
【００８９】
培地における単球系細胞への分化誘導因子の濃度は、目的の細胞を誘導できる濃度であればいくらでもよい。
【００９０】
前記工程(i)および(ii)の培地におけるSCFの濃度は、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200
ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００９１】
前記工程(i)および(ii)の培地におけるIL-3の濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００９２】
前記工程(i)〜(iii)の培地におけるFlt3Lの濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００９３】
前記工程(i)および(ii)の培地における培地におけるTPOの濃度は、1ng/ml〜20ng/mlの範囲内であり、例えば、、1ng/ml 、2ng/ml 、3ng/ml 、4ng/ml 、5ng/ml 、6ng/ml 、7ng/ml、8ng/ml 、9ng/ml 、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、5ng/mlである。
【００９４】
前記工程 (ii)および（iii）の培地におけるM-CSFの濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００９５】
前記工程(iii)の培地におけるGM-CSFの濃度は、例えば、1ng/ml〜100ng/ml の範囲内であり、例えば、1ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、各工程で25ng/mlである。
【００９６】
前記工程(i)の培養時間は、例えば、10日以下の培養であり、好ましくは、2〜5日であり、特に好ましくは、3日である。
【００９７】
前記工程(ii)の培養時間は、例えば、10日以下の培養であり、好ましくは、2〜5日であり、特に好ましくは、3日である。
【００９８】
前記工程(iii)の培養時間は、例えば、40日以下の培養であり、好ましくは、8〜33日であり、特に好ましくは、23日である。
【００９９】
本発明において、各工程間における培地の交換は、三次元支持体はそのままで培地のみを取り換えることにより行ってもよく、あるいは三次元支持体を新しい培地が入った容器に移動させることにより行ってもよい。好ましくは、三次元支持体を容器に移動させることにより行われる。
【０１００】
（３）中胚葉細胞から赤血球系細胞を誘導する方法
本発明において「赤血球系細胞」は、中胚葉細胞から赤血球系列への運命がコミットされた一連の細胞を意味し、例えば、赤血球が挙げられるがこれに限定されない。本発明において「赤血球」は、ヘモグロビンに富んだ細胞を意味し、ヘモグロビンのα-グロビン、ε-グロビン、γ-グロビン、β-グロビン、CD235aなどのマーカーの発現により検出され得る。成熟した赤血球において好ましいマーカーは、α-グロビンおよびβ-グロビンであり得る（マーカーの種類は限定されない）。また、FACSにより赤血球を分離する場合において好ましいマーカーは、CD235aであり得る。本発明において「赤血球系細胞」は、好ましくは、CD71陽性CD235a陽性の細胞であり得る。
【０１０１】
本発明において分化誘導された赤血球系細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。赤血球系細胞が他の細胞種を含む細胞集団である場合、赤血球系細胞はその中に３０％以上含まれることが好ましく、５０％以上含まれることがより好ましい。
【０１０２】
本工程では、中胚葉細胞を赤血球系細胞へ分化誘導する培地を用いて培養することができる。本工程における中胚葉細胞は、上述したとおり、多能性幹細胞を三次元支持体との接触下で中胚葉細胞まで分化誘導させた状態のものが好ましいが、任意の方法で分化誘導された中胚葉細胞を本工程の直前に三次元支持体と接触させたものであってもよい。
【０１０３】
本発明において、赤血球系細胞を誘導する際に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、mTeSR1培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（Invitrogen）、Mouse Embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM)、およびこれらの混合培地などが包含される。本発明において、好ましくは、StemPro34培地が使用される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【０１０４】
本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【０１０５】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【０１０６】
赤血球系細胞への分化誘導因子としては、例えば、ステムセルファクター(Stem Cell Factor（SCF）)、コロニー刺激因子（Coloney-Stimulating Factor (CSF)）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte- (G-)CSF）、エリスロポエチン（Erythropoietin (EPO)）、インターロイキン類、トロンボポエチン（Thrombopoietin（TPO））およびFlt3リガンドなどがある。ここで、インターロイキン類は、白血球から分泌されるタンパク質で、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、およびIL-9などを含む30種以上がある。本発明において、中胚葉細胞から赤血球系細胞への分化誘導は、好ましくは、EPO、IL-3およびSCFのうち少なくとも１つを含む培地中で培養することにより行うことができる。
【０１０７】
本発明において、赤血球系細胞への分化誘導は、例えば、下記の工程により行うことができる：三次元支持体に保持された中胚葉細胞をerythropoietin（EPO）およびSCFを含有する培地中で培養する工程。
【０１０８】
前記工程において用いられる基礎培地は、好ましくは、StemPro34培地であり得る。
【０１０９】
培地における赤血球系細胞への分化誘導因子の濃度は、目的の細胞を誘導できる濃度であればいくらでもよい。
【０１１０】
培地におけるEPOの濃度は、例えば、1U/ml〜20U/mlの範囲内であり、例えば、1U/ml、2U/ml、3U/ml、4U/ml、5U/ml、6U/ml、7U/ml、8U/ml、9U/ml、10U/ml、12U/ml、14U/ml、16U/ml、18U/ml、20U/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、5U/mlである。
【０１１１】
培地におけるSCFの濃度は、例えば、1ng/ml〜200ng/mlの範囲内であり、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、140ng/ml、160ng/ml、180ng/ml、200ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【０１１２】
本工程の培養時間は、例えば、60日以下の培養であり、好ましくは、１６〜４１日であり、特に好ましくは、31日である。
【０１１３】
＜多能性幹細胞から造血細胞を誘導する方法＞
本発明において、上記の＜多能性幹細胞から中胚葉細胞を誘導する方法＞と＜中胚葉細胞から造血細胞を誘導する方法＞とを組み合わせて、多能性幹細胞から造血細胞を誘導することができる。その場合の分化誘導条件は、例えば、下記の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
多能性幹細胞から骨髄系細胞を誘導する方法として、下記の工程：
(i) 多能性幹細胞を三次元支持体との接触下でBMP4を含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程、
および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3Lおよびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程
を含む方法が例示される。
【０１１５】
多能性幹細胞から単球系細胞を誘導する方法として、下記の工程：
(i) 多能性幹細胞を三次元支持体との接触下でBMP4を含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程、
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3LおよびTPOを含有する培地中で培養する工程、
(iv) 工程(iii)で得られた細胞をSCF、IL-3、Flt3L、TPOおよびM-CSFを含有する培地中で培養する工程、および
(v) 工程(iv)で得られた細胞をFlt3L、M-CSFおよびGM-CSFを含有する培地中で培養する工程を含む方法が例示される。
【０１１６】
多能性幹細胞から赤血球系細胞を誘導する方法として、下記の工程：
(i) 多能性幹細胞を三次元支持体との接触下でBMP4を含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をVEGF、bFGFおよびSCFを含有する培地中で培養する工程、
および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をerythropoietin（EPO）およびSCFを含有する培地中で培養する工程
を含む方法が例示される。
【０１１７】
分化誘導因子の濃度、培養期間、その他の培養条件については、上記したものの他、本願出願前に当分野において公知であった任意の技術を用いて行うことができる。
【０１１８】
＜疾患の治療剤＞
本発明は、疾患の治療剤として、(A)本発明の方法により製造された中胚葉細胞を含有する三次元支持体を含有する移植用材料、または（B）本発明の方法により製造された造血細胞を含有する血液疾患の治療剤を提供する。本発明の方法によって得られる三次元支持体内の中胚葉細胞および／または造血細胞は、当該治療の対象となる患者本人に由来するものであってもよいし、他の個体に由来するものであってもよい。好ましくは、当該治療の対象となる患者本人に由来するものである。三次元支持体内の中胚葉細胞および／または造血細胞が他の個体に由来するものである場合、拒絶反応が起こらないという観点から、HLAの型が同一である他人から体細胞を採取することが好ましい。
【０１１９】
（A）の態様において、本発明における薬剤は、中胚葉細胞を含有する三次元支持体を単独で含んでいてもよく、または中胚葉細胞を含有する三次元支持体と共に緩衝液や抗生物質、その他の医薬添加物等を含んでいてもよい。例えば、本発明における薬剤は、三次元支持体の中に含まれる細胞のレシピエント組織への生着を促す目的で、フィブロネクチン、ラミニン、合成ポリマー（例えば、ポリ乳酸）等の足場材料（スキャホールド）をさらに含んでいてもよい。あるいは、本発明における薬剤は、中胚葉細胞以外の任意の細胞（複数も可）を含んでいてもよい。（B）の態様において、本発明における薬剤は、誘導した造血細胞を単独で含んでいてもよく、または造血細胞と共に緩衝液や抗生物質、その他の医薬添加物等や造血細胞以外の任意の細胞（複数も可）を含んでいてもよい。
【０１２０】
本発明における薬剤は、広く血液疾患の治療剤として有効である。具体的には、本発明における治療剤の対象疾患として、先天性貧血、再生不良性貧血、自己免疫性貧血、骨髄異形成症候群（MDS）、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、各種の癌または腫瘍に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、癌化学療法もしくは放射線療法に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、急性放射性症候群、骨髄・臍帯血・末梢血移植後の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の回復遅延、輸血に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、白血病（急性骨髄性白血病 (AML)、急性リンパ性白血病 (ALL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)を含む）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、遺伝性血液疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明において薬剤の患者への投与経路は、特に限定されない。（A）の態様において、好ましくは、移植により患者へ投与される。その場合には、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様の方法で行うことができる。本発明において、薬剤の投与（移植）は、所望の効果を得るために、同部分へ数回の配置を行うこともできる。数回の配置を行う場合、所望の細胞が組織へ生着するために十分な時間をおいて行うことが望ましい。（B）の態様において、例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、脳内への投与形態が例示できる。好ましい投与経路は、静脈内または骨髄内であり得る。（B）の態様においても（A）の態様と同様に、本発明の方法によって得られた造血細胞は、移植治療において用いることも可能であり、その場合には、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様の方法で行うことができる。
【０１２２】
本発明の薬剤の患者への投与量／移植量は、治療すべき病態の種類、症状および疾患の重篤度、患者年齢、性別もしくは体重、投与法／移植法などにより異なるので一義的には言えないが、医師が前記状況を考慮して判断することにより、適宜適当な投与量／移植量を決定することができる。
【０１２３】
＜培養の大規模化＞
本発明において、造血細胞を大量に得るために、容器に入ることができる大きさの一つまたは複数の三次元支持体を一つの培養容器に入れて培養することができる。本工程において、三次元支持体は、多能性幹細胞および／または中胚葉細胞を保持した状態のものが使用される。例えば、上記したような、多能性幹細胞と接触させた分化誘導前の三次元支持体や多能性幹細胞を三次元支持体と接触させた条件下で中胚葉細胞まで分化させた状態の三次元支持体などが使用され得る。この場合、中胚葉細胞に分化させる元となる多能性幹細胞は、小塊または単一細胞のいずれの形態であってもよく、好ましくは、単一細胞の形態であり得る。本工程において使用される培養容器は、当分野において通常使用されるような任意の容器を用いることができ、例えば、シャーレ、フラスコ、培養タンクなどが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、大量の細胞の培養が可能となる体積の大きな容器が使用され得る。大量培養において使用される培地は、上記した中胚葉細胞または造血細胞への分化誘導において使用されるものと同じ培地が使用され得る。上記の方法で得られる造血細胞をさらに成熟化した造血細胞とするために、本願出願日前に知られていた任意の分化誘導法による培地を使用することも可能である。大量培養のための培養条件としては、例えば、静置培養、振盪培養、撹拌培養などが採用され得る。好ましくは、細胞が効率良く培地成分に接し得る振盪培養または撹拌培養が使用される。
【０１２４】
製造された造血細胞の回収は、造血細胞を含んだ培地を回収することによって行われ得る。培地を繰り返し回収することにより、大量の造血細胞の回収が可能となる。培地の回収は、手動で行ってもよく、あるいは自動回収装置を備えた機器等を用いて行ってもよい。好ましくは、自動回収装置を備えた機器等により行われる。造血細胞回収の別の方法としては、三次元支持体に接着している細胞を集める方法が挙げられる。この場合、回収した三次元支持体を物理学的にもしくは酵素学的に処理することにより、細胞を三次元支持体から解離させて回収することができる。造血細胞の培地からの回収および三次元支持体からの回収は、どちらか一方のみが行われてもよく、両方が行われてもよい。浮遊細胞のほとんどが造血細胞であることから、培地から回収する方が効率よく造血細胞を回収できるという観点から、三次元支持体を培養した培地を回収する方が好ましい。回収された造血細胞は、使用目的に応じて、そのまま用いられてもよく、あるいは精製してから用いられてもよい。
【０１２５】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
多能性幹細胞
ヒトES細胞（KhES1株）およびヒトiPS細胞（201B7株、409B2株およびCB-A11株）として以下の株を用いた。
（１）KhES1株
ヒトES細胞は、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センターによって樹立されたKhES1株を用い、従来の方法で培養した（Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006）。ヒトES細胞の使用は、文部科学省(MEXT)による承認の下に行われた。
（２）201B7株
201B7株は、Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007に記載の方法で作製された。
（３）409B2株
Okita. K, et al., Stem Cells. 2012 Nov 29.に記載の方法に基づき、ヒト皮膚細胞にエピソーマルベクター（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)を電気穿孔法で遺伝子導入し、マイトマイシン処理したマウス胎仔線維芽細胞フィーダー上で培養することにより、iPS細胞株を作製した。培養は、従来の方法で行った (Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007およびNakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26: 101-6, 2008)。
（４）CB-A11株
Yanagimachi, M. D. et al., PLoS ONE, 8(4): e59243, 2013に記載の方法に基づき、臍帯血造血細胞からiPS細胞株を作製した。得られたiPS細胞株は、5 ng/mL bFGFを補充した霊長類ES Cell Medium (ReproCELL)中、分裂不活性SNLフィーダー細胞上で維持培養するか、またはmTeSR1無血清培地 (STEMCELL Technologies)中、growth factor-reduced Matrigel (Becton-Dickinson)で被覆した組織培養皿上で維持培養を行った。培地は、毎日交換した。【０１２７】
コラーゲンスポンジの調製
ポリエチレンテレフタレート(PET)繊維の組み込みにより機械的に補強したコラーゲンスポンジ(PETCol-24w、以下「CS」という)を、MedGEL44から購入した。気泡を取り除くために、多能性幹細胞用の維持培地を10 mL加えた50 mLコニカルチューブ(Becton-Dickinson)に6個のCSを入れて、10000 rpmで5分間、遠心分離した。遠心分離後、スパチュラでCSを取り出して、24ウェルプレートに入れて以下の実験に用いた。【０１２８】
実施例２
多能性幹細胞の小塊からの造血細胞の誘導
（１）多能性幹細胞の小塊からの中胚葉細胞の誘導
三次元支持体（CS）を用いた培養条件下で多能性幹細胞の小塊から中胚葉細胞を誘導できるか否かを検討するために、下記の実験を行った。簡潔には、KhES1株、201B7株、409B2株およびCB-A11株のそれぞれを、室温で1分間、CTK溶液にて処理し、次いでphosphate-buffered saline (PBS)で2回洗浄した。次いで、スクラッパーを用いて、各細胞株を培養プレートから引き剥がし、1.5 mL mTeSR1培地を加えた後に、各細胞株を15mLコニカルチューブ(Becton-Dickinson)に回収して、直径300-500 μmの小塊になるまでピペッティングにより解離した。チューブを1分間立てた状態にしておき、各細胞株の小塊を沈殿させた。その後、上清を除去し、各細胞株の小塊を回収した。続いて、各細胞株の小塊を24ウェルプレート内に配置されたCS上に播種した。CSは、実施例１の方法で調製したものを用いた。未分化多能性幹細胞用の維持培地（mTeSR1）を用いて一晩インキュベートした後、分化培地（BMP4を補充したmTeSR1）を入れておいた12ウェルプレートにCSを移した。【０１２９】
培地およびサイトカインの種類は、以前に記載されたとおりに決定された（Niwa, A. et al. PloS one 6, e22261, 2011およびYanagimachi, M. D. et al., PLoS ONE, 8(4): e59243, 2013）。簡潔には、最初の0〜3日目に、80 ng/mL BMP4 (R&D Systems)を補充したmTeSR1培地中で培養し、原条細胞を誘導した。次いで、4日目に、mTeSR1培地を、80 ng/mL VEGF (R&D Systems)、25 ng/mL bFGF (Wako)および100 ng/mL SCF (R&D Systems)からなるサイトカインカクテルを補充したStemPro-34無血清培地（2 mM glutaMAX (Invitrogen)含有）(Gibco)に交換した。【０１３０】
分化開始から6日目に、細胞の回収を行った。簡潔には、CS上の接着細胞を回収するために、CSをコニカルチューブ(Becton-Dickinson)の側壁に置き、7000 rpmで10秒間遠心分離して、CSから水を抜いた。次いで、1 mL Accmax (Innovative Cell Technologies, Inc.)をCSに加えた。37℃で10分間インキュベートした後、9 mL PBSをウェルに加えて、混合した。スパチュラを用いてCSを圧搾した後にチューブから取り出し、続いて、1500 rpmで5分間、チューブを遠心分離し、細胞ペレットを得た。浮遊細胞を回収するために、CSを他のウェルに移してから残りの培地を回収し、1500 rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。【０１３１】
続いて、回収された細胞をフローサイトメトリー解析にかけて、KDR陽性CD34陽性CD45陰性細胞の割合を測定した。簡潔には、MACS QuantTM Analyzer (Miltenyi Biotec)を用いて、フローサイトメトリー解析のデータを収集し、FlowJo software package (Treestar)により解析を行った。【０１３２】
その結果、分化6日目において、KhES1株、201B7株、409B2株およびCB-A11株のすべての細胞株から、KDR陽性CD34陽性HPCが得られた（図1c）。この分化誘導効率は、以前に報告された2Dマトリゲル法（Niwa, A. et al. PloS one 6, e22261, 2011およびYanagimachi, M. D. et al., PLoS ONE, 8(4): e59243, 2013）を用いた場合に匹敵するものであった。
さらに、得られたHPC（D6）および誘導前の多能性幹細胞株（KhES1株またはCB-A11株）において、各マーカー遺伝子（多能性幹細胞特異的マーカーとしてのZFP42およびNanog、ならびに、中胚葉前駆細胞特異的マーカーとしてのTおよびMIXL1、造血前駆細胞特異的マーカーとしてのRUNX1、ならびに内皮前駆細胞マーカーとしてのAPLNRおよびCDH5）を定量PCRで測定した（図６）。その結果、得られたHPCにおいて、ZFP42およびNanogはほとんどその発現が確認されず、T、MIXL1、RUNX1、APLNRおよびCDH5は発現が上昇することが確認された。これらの結果より、本方法で得られた細胞は、造血系中胚葉前駆細胞に誘導され、多能性幹細胞の残存はほとんどないことが確認された。【０１３３】
（２）中胚葉細胞から造血細胞の誘導
上記（１）で得られた中胚葉細胞を、特定のサイトカインの組み合わせを添加した培地中で培養することにより、特定の異なる造血細胞へ分化誘導させた。簡潔には、分化誘導開始から6日目に、培地を、異なるセットのサイトカインを含むStemPro-34無血清培地に交換し、特定の造血細胞系列へ分化させた。骨髄系細胞誘導のために、50 ng/mL SCF (R&D Systems)、50 ng/mL IL-3 (R&D Systems)、5 ng/mL TPO (R&D Systems)および50 ng/mL FL3 (R&D Systems)を添加したStemPro-34無血清培地を用いて培養し、その間4日毎に培地を交換した。単球系細胞誘導のために、6〜9日目まで、50 ng/mL SCF (R&D Systems)、50 ng/mL IL-3 (R&D Systems)、5 ng/mL TPO (R&D Systems)および50 ng/mL FL3 (R&D Systems)を添加したStemPro-34無血清培地を用いて培養した。10日目に、培地を、50 ng/mL SCF (R&D Systems)、50 ng/mL IL-3 (R&D Systems)、5 ng/mL TPO (R&D Systems)、50 ng/mL M-CSF (R&D Systems)および50 ng/mL FL3 (R&D Systems) を添加したStemPro-34無血清培地に交換した。14日目に、培地を、50 ng/mL FL3 (R&D Systems)、25 ng/mL GM-CSF (R&D Systems)および50 ng/mL M-CSF (R&D Systems)を添加したStemPro-34無血清培地に交換した。赤血球系細胞誘導のために、5 IU/mL EPO (EMD Biosciences)、50 ng/mL IL-3 (R&D Systems)および50 ng/mL SCF (R&D Systems)を添加したStemPro-34無血清培地を用いて培養し、その間2日毎に培地を交換した。最初の分化誘導開始（0日目）から14日目以降は、2-5日毎に、CSを、新鮮な培地を入れたウェルに移した。CSを新たなウェルに移す度に、移した後の培地を繰り返し回収した（22日目、27日目、32日目、37日目、42日目、47日目）。【０１３４】
回収された細胞をフローサイトメトリー解析にかけた。簡潔には、MACS QuantTM Analyzer (Miltenyi Biotec)を用いて、フローサイトメトリー解析のデータを収集し、FlowJo software package (Treestar)により解析を行った。また、ギムザ染色により、得られた細胞の形態を観察した。ギムザ染色は、CYTOSPIN 4 (Thermo Scientific)により、ガラススライド上に細胞を播種し、製造者の指示に従って、May-Grunwald-Giemsa染色液(MERCK)で染色することにより行った。【０１３５】
その結果、約20日目あたりから培養培地中に浮遊造血細胞が放出され始めた。骨髄系細胞への分化誘導においては、ほぼ100%の浮遊細胞が、造血細胞マーカーである CD43+CD45+を示し（図2a）、それらのいくつかは、好中球様またはマクロファージ様の形態を示した（図2b）。造血細胞は、40日以上の間、繰り返し回収することができた（図2c）。単球系細胞への分化誘導においては、回収された生細胞は、ほとんどCD14+CD45+であり、単球/マクロファージ様の外観を示した（図2dおよびe）。赤血球系細胞への分化誘導においては、CD71+CD235a+赤血球系細胞が得られた（図2f）。これらの細胞は、高いN/C比を有する好塩基性細胞質を有しており、赤血球前駆細胞と一致していた（図2g）。全体として、CSによる培養系は、多能性幹細胞の小塊を造血細胞系列へ分化させることができることが示された。
さらに、CS上の細胞を回収し、CD34+前駆細胞およびCD45+造血系細胞が実際に培養されていることを確認した（図２h）。さらに、本方法により得られる造血系細胞を評価するため、コロニー形成試験を行ったところ、CSを用いて誘導されたコロニーは３７日までコロニー形成能を有していることが確認された（図２i）。得られた細胞は、骨髄性細胞への誘導傾向が見られた。【０１３６】
実施例３
単一多能性幹細胞からの造血細胞の誘導
（１）単一多能性幹細胞からの中胚葉細胞の誘導
CSの平均ポアサイズは約200 μmであるため、PSCの小塊はCS内に浸透していないと考えられた。そこで、CSの三次元構造を利用するために、CSが単一細胞にまで解離されたPSCの造血細胞分化を支持し得るか否かについて検討を行った。簡潔には、KhES1株、201B7株、409B2株およびCB-A11株のそれぞれを、室温で1分間、CTK溶液にて処理し、次いでphosphate-buffered saline (PBS)で2回洗浄した。次いで、1 mL Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いて、37℃で10分間処理し、T1000ピペット先端で解離して、9 mL PBSを加えた15  mLコニカルチューブ(Becton-Dickinson)に回収した。その後、細胞を2回洗浄して、Accumax内に含まれるコラゲナーゼを除去し、1500 rpmで5分間遠心分離した。続いて、細胞ペレットを、10 mM Y27632 (abcam)を含む500-1000 μLのmTeSR1に懸濁した。それぞれの細胞株を含む50 μLの細胞懸濁物を、24ウェルプレート内に配置させておいたCSの中央に穏やかに滴下した。CSは、実施例１の方法で調製したものを用いた。翌日に、1mlの未分化多能性幹細胞用の維持培地（mTeSR1）を加えて、さらに1日間培養した後、分化培地（BMP4を補充したmTeSR1）を入れておいた12ウェルプレートにCSを移した。その後の分化工程は、実施例２と同様の方法により行った。【０１３７】
その結果、6日目において、KhES1株、201B7株、409B2株およびCB-A11株のすべての細胞株から、KDR陽性CD34陽性 HPCが得られた（図3b-eおよびg-s）。
また、1個のCSあたりの最適な未分化多能性幹細胞の数を決定するために、いくつかの出発細胞数で検討を行ったところ、KhES1株では、1個のCSあたり1×105個の細胞数のときに、最大のKDR陽性CD34陽性 HPCの産生が観察されたが（図3b-d）、これらの結果は、細胞株間で異なっていた（図3b-dおよびh-p）。【０１３８】
（２）中胚葉細胞から造血細胞の誘導
実施例２と同様の方法により、骨髄系細胞への分化誘導を行った。その結果、多能性幹細胞の小塊を用いた場合と同様に、約20日目あたりから培養培地中に浮遊造血細胞が放出され始めた。骨髄系細胞への分化誘導においては、浮遊生細胞は、骨髄様表面マーカーおよび形態を示した（図3fおよびg）。【０１３９】
実施例４
走査型顕微鏡および免疫染色法による観察
分化した細胞同士の相互作用や分化した細胞のスキャフォールド内での分布状況を評価するために、実施例２および３の方法によりそれぞれ小塊および単一細胞から分化誘導させた造血細胞について走査型顕微鏡による観察を行った。簡潔には、細胞を播種する前のCS、４１日間PSCの小塊を分化させた後のCS、２１日間単一PSCを分化させた後のCS、４１日間PSCの小塊を分化させた後のCS、および２１日間単一PSCを分化させた後のCSのそれぞれを、4% paraformaldehydeおよび2% glutaraldehydeを用いて、4℃で一晩、固定した。1% OsO4で3時間の後固定（post-fixation）を行った後、CSを脱水して乾燥させ、プラチナパラジウムの薄層でコートした。その後、Hitachi S-4700走査型電子顕微鏡(Hitachi, Tokyo, Japan)を用いて、標本を観察した。なお、PSCとしては、すべてKhES1が使用された。
その結果、コラーゲン繊維は、細胞内コラゲナーゼの影響で、分化の間に徐々に崩壊していた（図4a-c）。PSCの小塊を分化させたとき、球状の造血様細胞がPET繊維を取り囲むように凝集していた（図4d）。興味深いことに、これらの造血細胞はまた、PET繊維を架橋するシート様細胞に接着していた（図4e）。これらの構造はまた、単一細胞から分化させたときにおいても観察された（図4fおよびg）。全体的に、走査型顕微鏡による観察は、CS上の造血細胞ニッチが、PET繊維、造血細胞および非造血系支持細胞が緊密な位置関係を有しながら配置されていることを明らかにした。興味深いことに、このニッチを構成する要素は、以前に報告された（Leisten I, et al., Biomaterials.33(6):1736-47 (2012)）インビトロでの造血微小環境と一致していた。
さらに、CS内部の細胞の特性を調べるため、CSごとに免疫染色を行ったところ、CD34+細胞およびコラーゲン繊維が嚢状（sac状）構造を形成し、CD45+細胞がCSの空洞内に取り込まれていることが確認された（図７a〜ｃ）。【０１４０】
実施例５
造血細胞の大規模誘導
本発明によるCSを用いた培養法が大規模浮遊培養に適用できるか否かを検討するために、50 mLのフラスコを用いて実験を行った。簡潔には、実施例２の方法により、複数のCS上でPSC（KhES1）の小塊を分化誘導し、分化の１８日目において、骨髄系サイトカインカクテルを含む25 mLの培地を入れた50 mLフラスコ（組織培養T75 flask (Becton-Dickinson)）に12個のCSを一緒に移した。その後、CSを浮遊培養条件下で培養し、培地交換の度に浮遊細胞を回収した。浮遊細胞の回収は、フラスコを穏やかに懸濁して浮遊細胞を含む培地を回収し、次いで、遠心分離することにより行った。２週間にわたり浮遊細胞を繰り返し回収した結果、100万個の細胞が12個のCSより回収された（図5a）。回収された細胞の多くは、CD43陽性CD45陽性細胞であり、それらの形態は、未成熟な骨髄系細胞と一致していた（図5bおよびc）。すなわち、このことは、CSによる分化誘導系が、多能性幹細胞から造血細胞を誘導する際の大規模化に適用可能であることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、造血細胞を多量にかつ安定的に供給する方法を提供するものである。したがって、種々の血液疾患の治療が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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