(57)【要約】  複数の体液検体間でｍｉＲＮＡの発現量を比較解析する方法が開示されている。本発明の比較解析方法では、体液検体中の標的ｍｉＲＮＡの発現量と同時に測定された補正用内因性ｍｉＲＮＡの発現量を用いて、当該検体中の標的ｍｉＲＮＡの発現量を補正する。補正用内因性ｍｉＲＮＡとして、特定の１０種の補正用内因性ｍｉＲＮＡから選択される１又は複数のｍｉＲＮＡを用いる。本発明によれば、体液検体間での標的ｍｉＲＮＡの比較解析を従来よりも正確に実施できるようになる。
2016043170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析する方法であって、
複数の体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の体液検体から任意に選択された第１の体液検体について取得された補正用内因性miRNA発現量の代表値である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程が、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するための核酸プローブ及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をそれぞれシグナル強度測定値として得ることを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記代表値が、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNA発現量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
複数の体液検体における標的miRNAの発現量を比較解析するmiRNA発現解析装置であって、
複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む、前記装置。
【請求項８】
前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記記憶手段に記憶される、複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値は、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定された値である、請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターに、
複数の各体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を実行させるためのプログラム。
【請求項１１】
複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターを、
複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
として機能させるためのプログラム。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項１３】
複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の体液検体に含まれるmiRNAの発現量を比較解析するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
miRNA（マイクロRNA）は、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するｄｓRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは１５〜２５塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。【０００３】
近年、miRNAは細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その発現量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。miRNAは２０１４年６月現在、ヒトで2500種以上が存在し（miRBase release 20）、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAが血清・血漿中で発現を同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されている。【０００４】
一方、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う場合には、検体や実験者、実験条件により、得られるデータに誤差が生じる可能性があることが知られている。そのため、誤差を補正するためのデータ補正方法が考案されている。【０００５】
補正には、複数の遺伝子の発現データを一塊とし遺伝子発現データ群としてとらえた場合、遺伝子発現データ群全体の発現量には、いかなる検体であっても差がないという原理を前提とした方法が用いられている。この方法にはグローバルノーマライゼーション法、quantile法、lowess法、75 percentile法などが含まれる。【０００６】
また、検体間で発現量が同一である特定の遺伝子（ベータアクチンやGAPDHなど）に着目し、その遺伝子の検出値が一定になるように、検体ごとにデータを補正する方法も行われている。【０００７】
特定のmiRNAの発現量が一定になるように補正する方法として、検体で発現しているノンコーディングRNAのうち、さまざまな検体において発現量が一定であるとされる、ハウスキーピングRNA（U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNA）を用いて補正する方法が提案されている（特許文献１、特許文献２）。すなわち、特許文献１、特許文献２では、miRNAを検出する際に同時に検出した5S rRNAの検出値が全ての検体で一定となるような操作を行って、miRNAの検出結果を補正している。【０００８】
一方で、DNAマイクロアレイでは多数のmiRNAを同時に測定することから、限られた種類のハウスキーピングRNAのみを用いて補正する方法は正確性に欠けるとされ、miRNAと同時に複数のmRNAの発現量も測定し、これらの複数のmRNAの発現量を用いてmiRNAの補正を行うという方法が提言されている（特許文献３）。特許文献３では、miRNAを検出する際に同時に検出した複数のmRNAの検出値が全ての検体で一定となるような操作を行って、miRNAの検出結果を補正している。【０００９】
非特許文献１では、マウス血清中のmiRNA発現量の測定において、内因性miRNAを発現量の補正に利用し、その有効性を評価している。なお、内因性miRNAとは、対象とする検体中（非特許文献１の場合はマウス血清）に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAであることを示す。すなわち、非特許文献１では、補正用内因性miRNAの例としてmiR-16、miR-31、miR-223を用いて、マウス血清中のmiRNA発現量の補正を試みているが、これらのmiRNAの発現量は個体間で一定していなかったことから、内因性のmiRNAの発現量によって全体のデータ補正を行う方法は採用せず、外部から添加したRNAを基準物質としてデータ補正用に用いることを提案している。要するに、これらの内因性miRNAを用いてmiRNA発現量の補正をすることは適当ではないと結論している。【００１０】
非特許文献２では、ヒト血清中のmiRNAを定量RT-PCRやシークエンス法で検出するにあたり、let-7d、let-7g、let-7iを組み合わせて補正用内因性miRNAとして用いることを提唱している。すなわち、let-7d、let-7g、let-7iの発現量を検体間で一定にする操作を行うことで、測定対象とするmiRNAの発現量を補正している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−７５０９５号公報
【特許文献２】特開２００７−９７４２９号公報
【特許文献３】特開２０１４−７９９５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Roberts, T.C.ら、2014年、PLoS ONE、第9(2)巻、e89237
【非特許文献２】Chen, X.ら、2013年、PLoS ONE、第8(11)巻、e79652
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記のように、遺伝子発現を検出する場合、検体間で発現量の変動が少ない「ハウスキーピング遺伝子」の発現量を利用して、検出対象とする遺伝子の発現量を補正する方法が一般に用いられている。特によく知られているハウスキーピング遺伝子としては、ACTB、GAPDHなどが挙げられる。しかし、これらの遺伝子は、miRNAとは核酸長や発現量の絶対値が大きく異なっており、miRNAの発現量を補正する目的で使用することは好ましくない。【００１４】
そのため、従来、miRNAの発現量を検出する場合には、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAといったハウスキーピングRNAが主に補正用に用いられてきた。しかしながら、体液中のmiRNAの発現量を測定し、そのデータを補正しようとした場合、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAは、核内や細胞質内に存在するRNAであるため、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液においてはほとんど発現量を検出することができず、これらを体液中のmiRNAの発現量の検出補正のための指標とすることができないとされている。【００１５】
定量RT-PCR法によるmiRNAの発現量検出においては、血清や血漿中に存在するmiRNAを個別に解析して、検体間での発現量差がない「体液中ハウスキーピングmiRNA」を見出そうとする試みが実施されている。上記のとおり、非特許文献２では、ヒト血清中のmiRNAを定量RT-PCRやシークエンス法で検出するにあたり、let-7d、let-7g、let-7iを組み合わせて用いることを提唱している。しかしながら、これらのmiRNAがDNAマイクロアレイ法においても補正用内因性miRNAとして機能するか否かは不明である。すなわち、DNAマイクロアレイを用いた体液中のmiRNA解析においては、特定の補正用内因性miRNAを用いた有効な補正方法がなかった。【００１６】
一方、DNAマイクロアレイにおいて測定値の補正を実施する場合には、DNAマイクロアレイで測定可能な多数（数百〜数万）の遺伝子の全発現量（シグナル値）を用いて補正を行うことが一般に行われている。たとえば、グローバルノーマリゼーション法、クォンタイルノーマリゼーション法などが、その方法として挙げられる。【００１７】
ところで、miRNAの発現量から得られる基準値を指標とする場合、基準値を構成するための元データとなるmiRNAがいくつあれば、普遍的な補正用基準値を形成しうるのかという課題がある。特に、測定するmiRNAの数が数個〜数十個に限定された、特定用途向けのDNAマイクロアレイにおいては、グローバルノーマライゼーション法などを適用すると、不十分な補正結果をもたらす可能性が大きい。また、検体中の多数のmRNAの発現量を測定して、これを補正のための基準値とする特許文献３の方法は、組織や細胞由来のRNAについては有効であるが、体液中のmRNAの発現量は極めて低く、これらをmiRNAの発現量補正のための指標とすることは難しい。【００１８】
以上のとおり、複数の体液検体に含まれるmiRNAの発現量を測定し、比較解析しようとする場合に、その測定値を補正する有効な方法は見出されていない。特にDNAマイクロアレイにより少数の補正用内因性miRNAを用いて有効な補正を行うことができる方法は存在していない。本発明は、以上のような課題を解決しようとするものであり、特に検査・診断用途などの比較的少数のmiRNA測定用DNAマイクロアレイの実用化にきわめて重要な課題を解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下の発明を完成した。
(１)  複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析する方法であって、
複数の体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を含む、前記方法。
(２)  前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、(１)に記載の方法。
(３)  前記基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の体液検体から任意に選択された第１の体液検体について取得された補正用内因性miRNA発現量の代表値である、(１)又は(２)に記載の方法。
(４)  前記測定工程が、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するための核酸プローブ及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をそれぞれシグナル強度測定値として得ることを含む、(１)ないし(３)のいずれか１項に記載の方法。
(５)  前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、(１)ないし(４)のいずれか１項に記載の方法。
(６)  前記代表値が、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNA発現量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１)ないし(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)  複数の体液検体における標的miRNAの発現量を比較解析するmiRNA発現解析装置であって、
複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む、前記装置。
(８)  前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、(７)に記載の装置。
(９)  前記記憶手段に記憶される、複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値は、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定された値である、(７)又は(８)に記載の装置。
(１０)  複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターに、
複数の各体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を実行させるためのプログラム。
(１１)  複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターを、
複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
各体液検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
として機能させるためのプログラム。
(１２)  (１０)又は(１１)に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
(１３)  複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、複数の体液検体に含まれる標的miRNAの発現量を比較解析する場合、特にマイクロアレイ等を用いて多数のmiRNAの発現量を測定し、検体間でmiRNA発現量を比較する場合に、従来よりも正確にmiRNA発現量を補正することができる。本発明により、検体間での標的miRNAの比較解析がより正確に実施できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法の概念図である。
【図２】本発明の解析装置の構成の概略を示すブロック図である。
【図３】本発明による標的miRNAの発現量の補正処理のフローチャートの一例である。
【図４−１】実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｂ:hsa-miR-6085による補正、Ｃ：hsa-miR-1227-5pによる補正、Ｄ：hsa-miR-2861による補正、Ｅ：hsa-miR-149-3pによる補正、Ｆ：hsa-miR-4463による補正、Ｇ：hsa-miR-4508による補正
【図４−２】実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｈ：hsa-miR-6090による補正、Ｉ：hsa-miR-6775-5pによる補正、Ｊ：hsa-miR-6803-5pによる補正、Ｋ：hsa-miR-5787による補正
【図５】実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。
【図６】比較例１に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。
【図７】比較例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。
【図８−１】実施例４に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｂ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861の組合せによる補正、Ｃ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4508の組合せによる補正、Ｄ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｅ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4508の組合せによる補正
【図８−２】実施例４に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｆ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｇ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4508の組合せによる補正、Ｈ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｉ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4508、hsa-miR-4463の組合せによる補正
【発明を実施するための形態】
【００２２】
まず、本発明で行なう標的miRNAの補正方法の概念について、図１に基づいて説明する。図１では、体液検体中のRNAを標識し、複数種類の標的miRNAを捕捉するためのプローブ（以下、「標的miRNA捕捉プローブ」ともいう。）及び配列番号１〜１０に示すmiRNAから選択される１又は複数のmiRNA（以下、「補正用内因性miRNA」ともいう。）を捕捉するためのプローブ（以下、「補正用内因性miRNA捕捉プローブ」ともいう。）が固定されたマイクロアレイで検出した結果を、各miRNAの発現量の測定値であるシグナル値のヒストグラムによって模式的に示している。以下、標的miRNAを捕捉するためのプローブ又は補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブを、総じて「miRNA捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいう。
【００２３】
図１Ａでは、体液検体Ａ及び体液検体Ｂから抽出した検体の標的miRNAを、それぞれDNAマイクロアレイを用いて解析した結果を、ヒストグラムで示している。マイクロアレイに搭載されている複数の標的miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値、及び本発明の補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムをそれぞれ示している。体液検体Ａと体液検体Ｂでは、miRNAのヒストグラムが大きくずれている。このことから、検体間でmiRNAの発現量に大きな差があると解釈できる。一方、実験誤差により差が生じているとも解釈できる。どちらが正しいか、miRNAのヒストグラムのみからは判断することができない。
【００２４】
ところで、ここに体液中の存在量が常に一定である補正用内因性miRNAが存在する場合、この補正用内因性miRNAのシグナル値の値は検体間で一致するはずである。
【００２５】
図１Ａで示した、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは、体液検体Ａと体液検体Ｂでほぼ同じ分布を示している。すなわち、体液検体Ａと体液検体Ｂは正しく実験に供せられ、実験誤差はないと判断することができる。この場合には、体液検体ＡＢ間でmiRNAの発現量に大きな差があるということになり、体液検体間での比較をするに当たってmiRNAのシグナル値の補正は不要である。
【００２６】
図１Ｂでは、DNAマイクロアレイを用いて体液検体Ｃ及び体液検体Ｄを解析した結果を模式的に示している。標的miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値、及び補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値をそれぞれ示している。
【００２７】
体液検体Ｃと体液検体Ｄでは、miRNAのヒストグラムが同じような分布を示している。一方、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは、体液検体Ｃと体液検体Ｄでは大きくずれている。このことから体液検体Ｃと体液検体Ｄの検出結果には、何らかの原因によって実験誤差が生じていることが分かる。このような場合には体液検体ＣＤ間での比較をするに当たり、miRNAのシグナル値を適切に補正する必要がある。
【００２８】
本発明に従い、標的miRNAのシグナル値を補正した後のヒストグラムを図１Ｃに示した。補正の具体的な方法は後述の通りである。体液検体Ｃと体液検体Ｄの補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムが一致するよう、体液検体Ｃのデータを補正した。この補正により、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは体液検体Ｃと体液検体Ｄで一致するようになり、同じ補正係数を用いて補正された標的miRNA捕捉プローブのシグナル値のヒストグラムは、大きくずれてくる。つまり、検体ＣＤ間でも、標的miRNAの発現量には大きな差があるということになる。
【００２９】
ここでは２つの体液検体間でのmiRNAのシグナル値を補正する方法を示したが、比較する体液検体は２つに限らず、無限に比較することができる。３つ以上の体液検体を比較する場合には、例えば、あらかじめ補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られるシグナル値を、一定の数値（定数）と仮定しておき、この定数に対する、各体液検体の補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られるシグナル値の差又は比を計算して、その差を体液検体中の標的miRNAのシグナル値に対して加算もしくは減算するか、比の逆数を体液検体中の標的miRNAのシグナル値に対して乗算もしくは除算することで、容易に多数の検体間の補正を行うことができる。
【００３０】
本発明では、複数の検体間でmiRNAの発現量を比較解析する。検体数は２つでもよいし、３つ以上でもよい。
【００３１】
「miRNA」とは、生体内で作られる鎖長１５〜２５塩基程度の短鎖RNAを意味するノンコーディングRNA（ncRNA）の一種であり、mRNAの発現を調節する機能を有すると考えられている。miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは様々な生物でその存在が確認されている。
【００３２】
本発明を適用できる検体は、生体から分離された体液検体であり、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。比較解析する複数の検体は、異なる体液に由来する複数の検体でもよいし、異なる生体から分離された同一種類の体液に由来する複数の体液検体でもよい。
【００３３】
これらの検体からRNAを抽出し、このRNAを用いてmiRNAの発現量を測定する。そのようなRNAの抽出方法は公知であり（例えば、Favaloroらの方法（Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718-749 (1980)）等）、そのためのキットも各種市販されている（例えば、キアゲン社のmiRNeasy、東レ社の"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample等）。
【００３４】
本発明で「内因性」という場合、人工的に検体に添加されたものではなく、検体中に自然に存在することを意味する。たとえば「内因性miRNA」と言った場合、検体中に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAを示す。
【００３５】
＜測定工程＞
本発明の比較解析方法では、検体中の複数種類の標的miRNAの発現量の測定と同時に、1又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定も行なう。補正用内因性miRNAの発現量は、後述する通り、標的miRNAの発現量を補正するための補正係数の算出に使用される。複数のmiRNAの発現量の同時測定は、例えば、対象のmiRNAに特異的に結合するプローブを支持体上に固定化した、マイクロアレイ等のアレイチップを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより行なうことができる。本発明においては、複数の標的miRNA捕捉プローブと1又は複数の補正用内因性miRNA捕捉プローブとが固定化された支持体を含むアレイチップを用いればよい。
【００３６】
「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のmiRNAと直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸は、DNAやRNAのほか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００３７】
核酸プローブの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性と特異性を確保する観点から、検出対象とするmiRNAの長さ以上とすることが好ましい。通常、１７〜２５塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするmiRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
【００３８】
核酸プローブは、対象のmiRNAと完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象のmiRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
【００３９】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体RNAの検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
【００４０】
miRNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースから入手することができる。また、miRNAの配列情報は、例えばmiRBaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/）から入手することができる。補正用内因性miRNA捕捉プローブ、及び標的miRNA捕捉プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
【００４１】
支持体上に固定化されるmiRNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、miRNAの発現量を測定してもよいし、所望の数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよい。
【００４２】
捕捉プローブが整列固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えばスライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
【００４３】
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
【００４４】
前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Michelらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
【００４５】
後者の方法としては、廣田ら（特許第３９２２４５４号）の方法やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてＵＶ照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やＳＨ基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
【００４６】
支持体上に固定化された各miRNA捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、体液検体から抽出したRNAから、標識物質で標識された核酸試料（体液検体由来の核酸試料）を調製し、この標識核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。「体液検体由来の核酸試料」には、体液検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。標識された体液検体由来の核酸試料は、検体RNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよいし、また、検体RNAから調製されたcDNAやcRNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよい。
【００４７】
体液検体由来の核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、２００８年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、３’末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。
【００４８】
このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体RNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。
【００４９】
本発明では、複数の検体を用いるが、いずれにも同一の標識物質を用いてよい。
【００５０】
本発明において、使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、シグナルが検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
【００５２】
上記のようにして標識された体液検体由来の核酸試料を支持体上のmiRNA捕捉プローブと接触させ、核酸試料とプローブをハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
【００５３】
検出されたシグナル値は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られたシグナル値と、それ以外の位置から得られたシグナル値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
【００５４】
検出されたシグナル値に、バックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出したシグナル値から減算することもできる。その他、「藤淵航、堀本勝久編、マイクロアレイデータ統計解析プロトコール、羊土社、２００８年」に記載されている方法を用いても良い。
【００５５】
上記の方法によると、補正用内因性miRNA及び標的miRNAの発現量の測定値が、シグナル強度の測定値として得られる。
【００５６】
＜代表値取得工程＞
本発明の解析方法では、次いで、各検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する（代表値取得工程）。本発明における「対数値」とは、底が２の対数に変換された値を意味する。
【００５７】
複数の補正用内因性miRNAを使用する場合、代表値は、それら複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から算出された平均値又は中央値、好ましくは対数値で表された平均値又は中央値が採用される。補正用内因性miRNAを１つだけ使用する場合、当該補正用内因性miRNAの発現量の測定値、好ましくは該測定値の対数値がそのまま代表値として採用され得る。あるいは、後述する通り、１種類の補正用内因性miRNAに対して複数の捕捉プローブがスポットされているアレイチップを用いる場合には、それら複数のスポット（プローブ固定化領域）からのシグナル測定値より、平均値又は中央値、好ましくは対数値で表された平均値又は中央値を求め、代表値とすることができる。
【００５８】
「対数値で表された平均値」とは、複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値で求めた平均値を意味する。代表値が中央値の場合、「対数値で表された中央値」とは、複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値の中央値、又は補正用内因性miRNA発現量測定値の中央値を底が２の対数に変換した対数値を意味する。中央値の場合は、測定値の対数変換を先に行なっても後に行なっても同じ値が得られる。
【００５９】
平均値及び中央値は、実際に測定対象とした複数の補正用内因性miRNAの全ての測定値を用いて求めたものであってもよいし、該複数の補正用内因性miRNAのうちから抽出された一部の測定値を用いて求めたものであってもよい。例えば、マイクロアレイに搭載されている補正用内因性miRNA捕捉プローブで得られた全ての補正用内因性miRNAの測定値を用いて求めてもよいし、全補正用内因性miRNA捕捉プローブのうちの一部（例えば、マイクロアレイに搭載されている補正用内因性miRNA捕捉プローブが１０種であったとすると、そのうちの３種）を抽出して求めてもよい。また、１種の補正用内因性miRNAに対して複数スポットされている、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られる測定値であってもよい。例えば、比較解析すべき全ての検体に共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNA捕捉プローブ固定化領域のみを抽出して、補正用内因性miRNAの代表値を取得することができる。
【００６０】
次いで、代表値取得工程で得られた各検体の補正用内因性miRNAの代表値と、補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値とを用いて、標的miRNAの発現量の補正に用いる補正係数を取得する（補正係数取得工程）。この補正係数取得工程には、下記の補正係数取得工程−１又は補正係数取得工程−２の工程を適用しうる。
【００６１】
＜補正係数取得工程−１＞
補正係数取得工程−１は、補正用内因性miRNAの代表値と基準値との差を利用する方法である。本工程には、下記の１−１．基準検体取得法、又は１−２．固定数値補正法を適用し得る。
【００６２】
１−１．基準検体取得法
miRNAの検出対象とする複数の体液検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの１又はそれ以上の検体（第２以降の検体）が、「補正される検体」となる。
【００６３】
なお、本明細書において、「第２以降の検体」という語には、第２の検体も包含される。例えば、比較すべき複数の検体が２つであれば、補正される検体は第２の検体のみであり、比較すべき複数の検体が３つであれば、補正される検体は第２の検体及び第３の検体の２つである。
【００６４】
この方法では、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を「基準値」とする。当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の補正用内因性miRNAの代表値との差を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
【００６５】
具体的には、補正係数は、式１又は式１’で求められる。
【００６６】
ｃ1-1＝（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））
−（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）  ・・・式１
ｃ1-1’＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
−（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））  ・・・式１’
【００６７】
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式２又は式２’で求めることができる。
【００６８】
【数１】
2016043170.tif 000003
【００６９】
【数２】
2016043170.tif 000004
【００７０】
ここで、式２、式２’中、
ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
【００７１】
プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
【００７２】
式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
【００７３】
１−２．固定数値補正法
補正用内因性miRNAの代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値と、各検体由来の補正用内因性miRNAの代表値との差を得て、この差を補正係数として利用する。当該方法では、この固定した数値を「基準値」として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。なお、この場合、１−１．に示した「基準検体」は存在しないので、miRNAの検出対象とする複数の検体すべてが、「補正される検体」となる。
【００７４】
具体的には、補正係数は、式３又は式３’で求められる。
【００７５】
ｒ1-2＝（固定数値(基準値)）
−（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）  ・・・式３
ｒ1-2'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
−（固定数値(基準値)）  ・・・式３’
【００７６】
例えば、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式４又は式４’で求めることができる。
【００７７】
【数３】
2016043170.tif 000005
【００７８】
【数４】
2016043170.tif 000006
【００７９】
ここで、式４、式４’中、
αは基準値、
ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
【００８０】
プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
【００８１】
式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
【００８２】
固定数値補正法で基準値として用いる固定数値は、少なくとも１回の比較解析において、全ての検体に対して一貫して同一の数値を使用する限り、いかなる数値（ただし０以外）を用いてもよい。同一の発現測定システムを使用し、かつ、常に同一の数値を固定数値として使用することとすれば、別の日に発現量の測定を行なった体液検体の間でも比較解析が可能である。特に限定されないが、固定数値は、補正係数の取得に用いる１又は複数の補正用内因性miRNAが一般的にとり得る発現量の数値を採用し得る。発現量の測定に使用するシステムによってそのような一般的にとり得る数値は変動し得るため、使用するシステムに応じて固定数値は自由に選択できる。
【００８３】
例えば、１種類の補正用内因性miRNAを用いる場合、比較解析対象の複数の体液検体における当該補正用内因性miRNAの発現量の平均値を求め、これを固定数値として利用してもよい。３種類の補正用内因性miRNAを用いる場合、複数の体液検体におけるこれら３種のmiRNA全ての発現量の平均値を求め、これを固定数値として利用してもよい。また、多数の体液検体を用いて予め固定数値を定めておき、この固定数値をその後の解析に繰り返し使用してもよい。
【００８４】
＜補正係数取得工程−２＞
補正係数取得工程−２は、補正用内因性miRNAの代表値と基準値との比を利用する方法である。本工程には、下記の２−１．基準検体取得法、又は２−２．固定数値補正法を適用し得る。
【００８５】
２−１．基準検体取得法
miRNAの検出対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの第２以降の検体が、「補正される検体」となる。
【００８６】
この方法では、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を「基準値」とし、当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の補正用内因性miRNAの各代表値との比を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
【００８７】
具体的には、補正係数は、式５又は式５’で求められる。
【００８８】
ｃ2-1＝（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））
／（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）  ・・・式５
ｃ2-1'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
／（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））  ・・・式５’
【００８９】
例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、第２の検体のための補正係数は、式６又は式６’で求めることができる。
【００９０】
【数５】
2016043170.tif 000007
【００９１】
【数６】
2016043170.tif 000008
【００９２】
ここで、式６、式６’中、
ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
【００９３】
プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
【００９４】
式６及び式６’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
【００９５】
２−２．固定数値補正法
補正用内因性miRNAの代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値に対する、各検体由来の補正用内因性miRNAの代表値の比を得て、この比を補正係数として利用する。当該方法では、この固定した数値を「基準値」として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。なお、この場合、２−１．に示した「基準検体」は存在しないので、miRNAの検出対象とする複数の検体すべてが、「補正される検体」となる。
【００９６】
具体的には、補正係数は、式７又は式７’で求められる。
【００９７】
ｒ2-2＝（固定数値（基準値））
／（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）  ・・・式７
ｒ2-2'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
／（固定数値（基準値））  ・・・式７’
【００９８】
例えば、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式８又は式８’で求めることができる。
【００９９】
【数７】
2016043170.tif 000009
【０１００】
【数８】
2016043170.tif 000010
【０１０１】
ここで、式８、式８’中、
αは固定数値、
ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
【０１０２】
プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
【０１０３】
式８及び式８’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
【０１０４】
ここで基準値として用いる「固定数値」の詳細は、「１−２．固定数値補正法」における固定数値と同様である。
【０１０５】
次いで、補正係数取得工程−１又は補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて、補正工程−１又は補正工程−２の方法を利用して、補正される検体における標的miRNAの発現量の補正を行う。
【０１０６】
＜補正工程−１＞
補正工程−１は、補正係数取得工程−１で得られた補正係数を用いて標的miRNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的miRNAの発現量に補正係数を加算又は該発現量から補正係数を減算することによって補正を行なう。本工程には、補正係数取得工程−１の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
【０１０７】
１−１．基準検体取得法
第２以降の検体における標的miRNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的miRNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２1-1又はｃ２1-1’）を使用し、第３の検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３1-1又はｃ３1-1’）を使用する。
【０１０８】
補正係数として、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値から第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値に補正係数を加算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目のmiRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９によって求めることができる。
【０１０９】
【数９】
2016043170.tif 000011
【０１１０】
ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
【０１１１】
これとは逆に、補正係数として、第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値から、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１’の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値から補正係数を減算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９’によって求めることができる。
【０１１２】
【数１０】
2016043170.tif 000012
【０１１３】
ここで、Ｗｉの定義は上記式９に同じである。
【０１１４】
第２の検体において測定された標的miRNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値にｃ２を加算するか、又はｃ２’を減算すればよい。第３以降の検体についても同様である。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と基準値との差は当然０であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的miRNA発現量に０を加算又は減算するという計算を実施しても差し支えない。
【０１１５】
１−２．固定数値補正法
標的miRNA発現量の補正は、代表値と固定数値（基準値）との差によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ1-2又はｒ1-2’）を使用する。
【０１１６】
補正係数として、基準値から検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３の場合には、検体における各標的miRNAの発現量の測定値の対数値に補正係数を加算することにより、各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０によって求めることができる。
【０１１７】
【数１１】
2016043170.tif 000013
【０１１８】
ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
【０１１９】
これとは逆に、補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値から固定数値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３’の場合には、検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値から補正係数を減算することにより、各検体についての標的miRNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０’によって求めることができる。
【０１２０】
【数１２】
2016043170.tif 000014
【０１２１】
Ｗｉの定義は上記式１０に同じである。
【０１２２】
＜補正工程−２＞
補正工程−２は、補正係数取得工程−２で得られた補正係数を用いて標的miRNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的miRNAの発現量を補正係数で除算、又は該発現量に補正係数を乗算することによって補正を行なう。本工程にも、補正係数取得工程−２の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
【０１２３】
２−１．基準検体取得法
第２以降の検体における標的miRNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的miRNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２2-1又はｃ２2-1’）を使用し、第３の検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３2-1又はｃ３2-1’）を使用する。
【０１２４】
補正係数として、補正される第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１によって求めることができる。
【０１２５】
【数１３】
2016043170.tif 000015
【０１２６】
ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
【０１２７】
これとは逆に、補正係数として、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５’の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値を補正係数で除算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目のmiRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１’によって求めることができる。
【０１２８】
【数１４】
2016043170.tif 000016
【０１２９】
ここで、Ｗｉの定義は上記式１１に同じである。
【０１３０】
第２の検体において測定された標的miRNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値にc22-1を除算するか、又はc22-1'を乗算すればよい。第３以降の検体についても同様である。式５及び式１１の手順でも、式５’及び式１１’の手順でも、最終的に得られる補正済み標的miRNAの発現量Ｅｉの値は同じである。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と本方法における固定数値（基準値）との比は当然１であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的miRNA発現量に１を乗算又は該標的miRNA発現量を１で除算するという計算を実施しても差し支えない。
【０１３１】
２−２．固定数値補正法
標的miRNA発現量の補正は、固定数値（基準値）との比によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ2-2又はｒ2-2’）を使用する。
【０１３２】
補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７の場合には、検体における各標的miRNAの発現量の測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２によって求めることができる。
【０１３３】
【数１５】
2016043170.tif 000017
【０１３４】
ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
【０１３５】
これとは逆に、補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７’の場合には、検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値を補正係数で除算することにより、各検体についての標的miRNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２’によって求めることができる。
【０１３６】
【数１６】
2016043170.tif 000018
【０１３７】
ここで、Ｗｉの定義は上記式１２に同じである。
【０１３８】
＜比較解析工程＞
補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する。基準検体取得法により補正が実施される場合には、基準検体とした第１の検体の標的miRNA発現量は補正を受けていないため、例えば第１の検体と第２の検体との間の対比は、補正されていない第１の検体の標的miRNA発現量と、補正済みの第２の検体の標的miRNA発現量との間での対比となるが、対比する検体のうちの少なくとも１つは必ず補正された検体となる。従って、「補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する」という語には、補正されていない基準検体と補正された他の検体との間で対比する態様も包含される。
【０１３９】
比較解析工程自体は、従来法と同様に行なうことができる。例えば、スキャッタープロットと呼ばれる発現量データの散布図として比較解析結果を表すことができる。比較すべき検体が３つの場合、例えば、３つのうちのいずれか１つの検体と残りの各検体とを比較解析したスキャッタープロットを２つ（例えば、第１の検体−第２の検体間のスキャッタープロットと第１の検体−第３の検体間のスキャッタープロット）作成すればよく、必要に応じて、さらに残りの２つの検体間（前述の例の場合には、さらに第２の検体−第３の検体間）で比較解析したスキャッタープロットを作成してもよい。４つ以上の検体の比較解析も同様に行なうことができる。なお、３検体の比較解析であれば、３次元的にスキャッタープロットを作成することもできる。基準検体取得法の場合であっても、必ずしも基準検体と他の２検体とをそれぞれ比較しなければならないわけではなく、例えば第２の検体−基準検体間の比較と第２の検体−第３の検体間の比較を行なうこととしてもよい。
【０１４０】
また、補正済みの標的miRNA発現量により、いずれか１つの検体と残りの他の検体との間で標的miRNAの発現量の差を計算し、その差をもって対数化された変化倍率（fold-change）として比較解析結果を表してもよい。例えば、基準検体における標的miRNAの発現量（基準検体取得法の場合）又は第１の検体における補正済みの標的miRNAの発現量（固定数値補正法の場合）と、第２以降の検体における補正済みの標的miRNAの発現量との差を計算してよい。この場合も上述の場合と同様に、第１の検体と他の検体との差を計算することに限定されず、第２以降の検体のいずれか１つと他の検体との差を計算することとしてもよい。
【０１４１】
本発明のmiRNA発現解析装置は、上記本発明の比較解析法を実施する装置であって、
複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
各体液検体について、１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段；
補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む。
【０１４２】
ある１つの態様において、基準値は、任意に選択された第１の検体（基準検体）の補正用内因性miRNAの代表値であり、第２以降の体液検体において測定された標的miRNAの発現量が補正される。すなわち、この態様において、本発明のmiRNA発現解析装置は、
複数の検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段と；
各体液検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
任意に選択された第１の検体を基準検体とし、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を基準値として、当該基準値と残りの第２以降の検体の補正用内因性miRNA代表値との差又は比を、当該第２以降の検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
補正係数取得手段によって取得された第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段と；
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む。
【０１４３】
別の態様において、基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値であり、第１の検体を含む全ての検体について、標的miRNA発現量の補正が行われる。すなわち、この態様において、本発明のmiRNA発現解析装置は、
複数の体液検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段と；
各検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
固定数値を基準値として、当該基準値と各検体の補正用内因性miRNAの代表値との差又は比を、当該検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
補正係数取得手段によって取得された各検体のための補正係数をそれぞれ用いて、各検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段と；
補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段と
を含む。
【０１４４】
本発明の解析装置の一例の構成の概略を示すブロック図を図２に示す。本発明の解析装置１０は、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０を具備する。また、図３には、本発明による標的miRNAの発現量の補正処理のフローチャートの一例を示す。
【０１４５】
入力部１１０は、解析装置１０の動作に関わる情報を入力する手段である。キーボード等の従来公知の入力手段を好ましく用いることができる。マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより得られる発現量データは、例えば、本発明の装置とは別のスキャナー等の読取手段で読み取られ、数値データに変換された後、入力部１１０から当該数値データを解析装置１０に入力される。あるいは、スキャナー等の読取手段が、本発明の解析装置１０に含まれていてもよい（図示せず）。
【０１４６】
入力部１１０から入力された発現量データ、又は解析装置１０に組み込まれた読取手段によって読み取られ数値化された発現量データは、記憶部１４０に記憶される。この時、記憶部１４０は、複数の検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段として働く。
【０１４７】
記憶部１４０に格納された各検体の標的miRNA及び補正用内因性miRNAの発現量の測定値データは、変換部１６０により、底が２の対数に変換される。次いで、解析部１７０により、各検体について、対数変換された補正用内因性miRNAの発現量の測定値の代表値が取得される。代表値は、比較解析法についての説明で述べた通り、例えば１若しくは複数の補正用内因性miRNA発現量の平均値若しくは中央値（１種類の補正用内因性miRNAのみを補正に用いる場合でも、それを測定するためのプローブ固定化領域がアレイ上に複数個存在する場合には、代表値が平均値又は中央値となり得る）、又は特定の１種類の補正用内因性miRNAの測定値であり得る。
【０１４８】
代表値が取得された後、解析部１７０により、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値と第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値との差又は比が算出され、当該第２以降の検体のための補正係数がそれぞれ取得される。補正係数の取得の詳細は、比較解析法の＜補正係数取得工程＞で述べた通りである。なお、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体についても補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を取得する構成としても差し支えない。
【０１４９】
装置１０において、基準検体の選出は、装置１０を操作する者が入力部１１０から任意の１検体を指定することにより行なわれてよい。あるいは、装置１０が自動的に基準検体となる１検体を選出してもよい。例えば、入力部１１０からデータが入力され、記憶部１４０に最初にデータが記憶された検体が、装置１０によって基準検体として選出され得る。この基準検体の選出又は入力のステップは、図３では便宜的に代表値取得工程（Ｓ−３）の後に位置されているが、これに限定されず、より早いステップで、例えばデータの格納時に実行されてもよい。
【０１５０】
次いで、解析部１７０は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体で測定された標的miRNAの発現量データを補正する。補正操作の詳細は、比較解析法の＜補正工程＞で述べた通りである。なお、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体の標的miRNA発現量データについても、補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を用いた補正操作を実行することとしても差し支えない。
【０１５１】
次いで、解析部１７０により、基準検体の標的miRNA発現量と、第２以降の検体の補正済み標的miRNA発現量との対比が行なわれる。対比の結果は、出力部１３０によって、表示部１２０に出力され、表示される。さらに、プリンター等の出力装置や記録媒体等に対比結果が出力され得る。さらにまた、出力部１３０は、ネットワークを介して装置外部に存在するデータベース等の外部記憶装置に対比解析結果を出力するように構成することもできる。
【０１５２】
記憶部１４０は、複数の標的miRNAの発現量及び複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶するほか、上記の各工程で生じる中間の解析結果も適宜記憶する。
【０１５３】
装置１０の上記した各種動作は、制御部１５０によって制御される。具体的には、図２の破線矢印で示されるように、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０の各手段に対して、制御部１５０から制御情報が出力され、この制御情報に基づいて各手段が連携して動作し、装置１０全体が動作する。
【０１５４】
また、当該解析装置においては、基準検体の補正用内因性miRNA代表値を基準値として利用する代わりに、装置１０において、あらかじめ指定した固定数値を変換部１６０等に登録しておき、基準検体における補正用内因性miRNAの発現量の代表値に代わる基準値として利用してもよい。この場合の方法の詳細は、比較解析法の＜補正係数取得工程＞、＜補正工程＞に述べたとおりである。
【０１５５】
また、本発明は、コンピュータを上記した解析装置として機能させるためのプログラムを提供する。該プログラムは、具体的には、コンピュータを上記した各手段（すなわち、記憶手段、代表値取得手段、補正係数取得手段、補正手段、及び出力手段）として機能させるためのプログラムである。あるいはまた、本発明は、コンピュータに上記した本発明の比較解析方法の各工程を実行させるためのプログラムを提供する。比較解析方法には、上記した測定工程、代表値取得工程、補正係数取得工程、及び補正工程が含まれ、さらに、補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する比較解析工程が含まれ得る。これらのプログラムは、マイクロアレイ等により標的miRNAの発現量と同時に測定された補正用内因性miRNAの発現量のデータを用いて、標的miRNAの発現量の補正をコンピュータに実行させるプログラムである。
【０１５６】
さらにまた、本発明は、上記いずれかのプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
【０１５７】
「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO、DVD等の任意の「可搬用の物理媒体」（非一過性の記録媒体）であり得る。あるいは、LAN、WAN、インターネットに代表される、ネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」であり得る。
【０１５８】
「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、OS（Operating System）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【０１５９】
本発明は、複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブと複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップを提供する。当該チップについての好ましい条件は、本発明の比較解析方法において説明した通りである。
【０１６０】
本発明においては、以下に説明する配列番号１〜１０に示すmiRNAの少なくとも１つを、補正用内因性miRNAとして使用する。
【０１６１】
配列番号１は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023710で登録されているhsa-miR-6085の塩基配列である。本明細書において、「miR-6085遺伝子」又は「miR-6085」という用語は、配列番号１に記載のhsa-miR-6085やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6085遺伝子は、Voellenkle Cら、2012年、RNA、18巻、p.472-484に記載される方法によって得ることができる。
【０１６２】
配列番号２は、miRBaseにAccession No. MIMAT0022941で登録されているhsa-miR-1227-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-1227-5p遺伝子」又は「miR-1227-5p」という用語は、配列番号２に記載のhsa-miR-1227-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-1227-5p遺伝子は、Berezikov Eら、2007年、Molecular Cell、28巻、p.328-336に記載される方法によって得ることができる。
【０１６３】
配列番号３は、miRBaseにAccession No. MIMAT0013802で登録されているhsa-miR-2861の塩基配列である。本明細書において、「miR-2861遺伝子」又は「miR-2861」という用語は、配列番号３に記載のhsa-miR-2861やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-2861遺伝子は、Li Hら、2009年、Journal of Clinical Investigation、119巻、p.3666-3677に記載される方法によって得ることができる。
【０１６４】
配列番号４は、miRBaseにAccession No. MIMAT0004609で登録されているhsa-miR-149-3pの塩基配列である。本明細書において、「miR-149-3p遺伝子」又は「miR-149-3p」という用語は、配列番号４に記載のhsa-miR-149-3pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-149-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Current Biology、12巻、p.735-739に記載される方法によって得ることができる。
【０１６５】
配列番号５は、miRBaseにAccession No. MIMAT0018987で登録されているhsa-miR-4463の塩基配列である。本明細書において、「miR-4463遺伝子」又は「miR-4463」という用語は、配列番号５に記載のhsa-miR-4463やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-4463遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p.e118-e127に記載される方法によって得ることができる。
【０１６６】
配列番号６は、miRBaseにAccession No. MIMAT0019045で登録されているhsa-miR-4508の塩基配列である。本明細書において、「miR-4508遺伝子」又は「miR-4508」という用語は、配列番号６に記載のhsa-miR-4508やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-4508遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p.e118-e127に記載される方法によって得ることができる。
【０１６７】
配列番号７は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023715で登録されているhsa-miR-6090の塩基配列である。本明細書において、「miR-6090遺伝子」又は「miR-6090」という用語は、配列番号７に記載のhsa-miR-6090やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6090遺伝子は、Yoo JKら、2012年、Stem Cells and Development、21巻、p.2049-2057に記載される方法によって得ることができる。
【０１６８】
配列番号８は、miRBaseにAccession No. MIMAT0027450で登録されているhsa-miR-6775-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-6775-5p遺伝子」又は「miR-6775-5p」という用語は、配列番号８に記載のhsa-miR-6775-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6775-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Research、22巻、p.1634-1645に記載される方法によって得ることができる。
【０１６９】
配列番号９は、miRBaseにAccession No. MIMAT0027506で登録されているhsa-miR-6803-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-6803-5p遺伝子」又は「miR-6803-5p」という用語は、配列番号９に記載のhsa-miR-6803-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6803-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Research、22巻、p.1634-1645に記載される方法によって得ることができる。
【０１７０】
配列番号１０は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023252で登録されているhsa-miR-5787の塩基配列である。本明細書において、「miR-5787遺伝子」又は「miR-5787」という用語は、配列番号１０に記載のhsa-miR-5787やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-5787遺伝子は、Yoo Hら、2011年、Biochem Biophys Res Commun、415巻、p.567-572に記載される方法によって得ることができる。
【実施例】
【０１７１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【０１７２】
＜実施例１＞
以下の過程により、本発明で用いる補正用内因性miRNAを選択した。【０１７３】
（DNAマイクロアレイ）
東レ株式会社製の"3D-Gene" human miRNA oligo chip（miRBase release 20対応）を用いて以下の実験を行なった。【０１７４】
（検体RNAの調製）
検体RNAとして、健常ヒト血清１５７検体より、"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample kitを用いて抽出したRNAを用いた。得られた検体RNAを、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識した検体RNAは、"3D-Gene" miRNA chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナー（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。【０１７５】
（miRNAシグナル値の取得）
DNAマイクロアレイから得られたmiRNAのシグナル値を、底が２の対数に変換し、RNA抽出及び標識時に添加した外部標準核酸による実験誤差補正を行った。【０１７６】
（補正用内因性miRNAの取得）
得られた実験誤差補正済みの全157検体のmiRNAシグナル値について、geNorm法による検体間最少変動miRNAの抽出を行った。GeNorm法は、Vandesompeleらによって提唱された定量RT-PCR法における内因性ハウスキーピング遺伝子（リファレンス遺伝子）の探索法である（Genome Biology 2002, 3:research0034-research0034.11）。対象とする検体に特有の内因性ハウスキーピング遺伝子であるmRNAを選抜する方法として用いられる。具体的には同一の検体における、すべての検出対象の遺伝子のシグナル値について、２つの遺伝子のシグナル値の比を総当たりで計算する。次に、すべての遺伝子の組合せで得られた比の値（Ａ）について検体間での標準誤差を計算する。次に、特定の遺伝子について、他の遺伝子との関係で得られた標準誤差（Ｖ）の総和（Ｍ）を計算する。このＭ値が小さい遺伝子が、すぐれた内因性ハウスキーピング遺伝子とされる。【０１７７】
一方で、上述の計算法によって得られるＡ及びＶは、シグナル値が小さいほど、小さな値となり、見かけ上すぐれた内因性ハウスキーピング遺伝子となるとされる。今回用いたDNAマイクロアレイは、miRBase release 20に登録された全miRNAを網羅的に検出するため、このデータを用いてgeNorm法を実施すると、シグナル値が小さいmiRNAを優先的に選択してしまう。このような現象から、これまでgeNorm法によってDNAマイクロアレイ検出における内因性ハウスキーピング遺伝子を選択することは避けられてきた。【０１７８】
本実施例では、DNAマイクロアレイで検出されたmiRNAのうち、シグナル値が全検体の半数以上で６４を超える、安定して検出されるmiRNAのみをgeNorm法の適用の対象として選択した。さらにgeNorm法の特性として、同一検体内での遺伝子発現量比に基づいて内因性ハウスキーピング遺伝子を選択していることから、大きく発現パターンが異なる検体間での安定的発現量を示す遺伝子選択が難しいことを踏まえ、前もって実験誤差補正済みの全157検体の各miRNAシグナル値についてCV（標準誤差／平均値）を得て、CVが0.1以下であるmiRNAのみをgeNorm法の対象として選択した。その結果、2555種のmiRNA検出用プローブから得られたシグナル値のうち、281種のmiRNAを検出するプローブのシグナル値をgeNorm法の対象とすることが適当と考えられた。【０１７９】
実際にgeNorm法を適用した281種のmiRNAから、M値が小さい内因性ハウスキーピング遺伝子、すなわち補正用内因性miRNAとして利用可能である10種を選択した。この10種の補正用内因性miRNAの配列番号、miRNAの名前、miRBaseに登録されたMIMAT番号、geNormで計算したM値、塩基配列、及び配列中のグアニン・シトシンの割合（GC％）を表１に示す。【０１８０】
【表１】
2016043170.tif 000019
【０１８１】
DNAマイクロアレイによるmiRNAの検出は、標的のmiRNAとその標的miRNAを捕捉するためのプローブによる核酸二重鎖を形成するハイブリダイズ法によってなされるため、核酸二重鎖を安定化させるグアニン及びシトシンの含有量が高い配列が、特に安定的にDNAマイクロアレイによって検出されることが予想される。すなわち、グアニン及びシトシンの含有量が高い配列が内因性ハウスキーピング遺伝子として優先的に選択されると一般に想定される。しかしながら、表１に示すように、必ずしもgeNorm法によって選択された内因性ハウスキーピング遺伝子（補正用内因性miRNA）は、グアニン及びシトシンの含有率が高いとは言えなかった。逆にグアニン及びシトシンの含有率が高いmiRNAが優先的に内因性ハウスキーピング遺伝子（補正用内因性miRNA）となるという現象も見られなかった。【０１８２】
＜実施例２＞
選択した補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて、複数の体液検体の標的RNAの発現量補正を行った。【０１８３】
RNAの物質的不安定さから、RNA発現量を測定する場合、その品質が違う、すなわちRNAの分解度が異なる検体間での、絶対的な発現量比較を要求される場合がしばしばある。検体が体液の場合は特に、長時間室温に置かれた検体中の標的miRNA発現量を測定することで何等かの結果を得ようとする場合が想定される。【０１８４】
この時、血清中に含まれる特定の補正用内因性miRNAの量を基準としてRNAの分解度に応じた補正を行うことで、RNA品質に関わらず、miRNAの発現プロファイル（相対的なmiRNAの発現量比）について、絶対的な検体間比較が可能になると考えられる。【０１８５】
本実施例では、ヒトから採取した血清を各種条件で保存することによって、血清中に含まれるmiRNAの品質がさまざまなレベルにある血清を作成し、これらの血清由来の抽出RNA検体の測定値に対して本発明の補正方法を適用した。【０１８６】
（DNAマイクロアレイ）
東レ株式会社製の"3D-Gene" human miRNA oligo chip（miRBase release 20対応、東レ社）を用いて以下の実験を行なった。【０１８７】
（検体RNAの調製）
ヒト血清を採血、血清分離後に下記２種の条件に静置し、血清に含まれるRNAの品質を変化させた。２種の条件を以下に示す。１：血清分離後６時間室温に静置し、RNA抽出を行う。２：血清分離後２４時間２５℃に静置し、RNA抽出を行う。それぞれの条件で作成された血清から"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample kit RNAを用いて全RNAを抽出し、検体RNAとした。【０１８８】
得られた検体RNAをそれぞれ、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識した検体RNAは、"3D-Gene" human miRNA oligo chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナー（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。【０１８９】
（miRNAシグナル値の補正）
DNAマイクロアレイから得られたmiRNAのシグナル値を、底が２の対数に変換したシグナル値の分布（すなわち未補正の発現量シグナル値）を図４Ａに示す。これに対して、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値と、あらかじめ別に設定した固定数値である基準値によって補正された、補正済みシグナル値の分布を図４Ｂ〜Ｋに示す。図中、Day-0（破線）が条件１の検体RNAであり、Day-1_25℃（実線）が条件２の検体RNAである。【０１９０】
ここで、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値による補正は以下に示される方法によって行った。【０１９１】
配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAについて、それぞれ基準値として用いる固定数値を設定した。さらに、各検体について、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、この変換後のシグナル値を代表値として基準値との比をとり（基準値／代表値）、補正係数とした。補正係数は、配列番号１〜１０の補正用内因性miRNAそれぞれについて設定されたことになる。これらの補正係数を、補正用内因性miRNAごとに、各検体のすべてのmiRNAシグナル値に乗算することによって補正を行った。【０１９２】
その結果、図４Ｂ〜Ｋに示される通り、配列番号１〜１０に示す補正用内因性miRNAのいずれを単独で用いても、条件を変えた２種の検体の発現プロファイルを同一化させることが可能であった。【０１９３】
＜実施例３＞
実施例２に示すように、配列番号１〜１０の補正用内因性miRNAは、それぞれ単独でも十分な標的miRNAの発現量の補正効果を持つが、さらにこれらを組み合わせることによって、実験の不備等による一部の補正用内因性miRNAデータの損失が起こった場合によっても、これを補完できることが想定される。そこで、複数の補正用内因性miRNAを組み合わせて用いて標的miRNAの発現量の補正を行ない、補正の効果を確認した。検体は実施例２と同様のものを用いた。【０１９４】
配列番号２、４及び５の補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、この変換後のシグナル値の平均値又は中央値を得て、代表値とした。基準値としては固定数値を用いた。実施例２で調製した２種の検体を含む複数の血清RNA検体における３種類の補正用内因性miRNAの全ての発現量（対数変換後シグナル値）の平均値を求め、この平均値を固定数値（基準値）として用いた。各検体について、補正用内因性miRNAの代表値と基準値の比をとり（基準値／代表値）、当該検体のための補正係数とした。この補正係数を、対応する各検体の全ての標的miRNAシグナル値に乗算することにより、標的miRNAシグナル値の補正を行った。【０１９５】
図５は、補正用内因性miRNAの発現量の代表値として対数変換後シグナル値の平均値を用いた場合の、標的miRNAの補正済みシグナル値の分布である。配列番号１〜１０の補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて補正を行った実施例２と同様、複数の補正用内因性miRNAを組み合わせて用いて補正を行なった場合でも、各検体の標的miRNAの発現プロファイルを同一化させることが可能であった。【０１９６】
＜実施例４＞
実施例３に示すように、配列番号１〜１０の補正用内因性miRNAは、これらを組み合わせることによっても補正に有用である。この補正効果について、配列番号１〜１０のいずれを組み合わせても同様の効果を示すことを確認した。検体は実施例２と同様のものを用いた。【０１９７】
配列番号２、３、４、５及び６の補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、各検体について、任意の３種の補正用内因性miRNA変換後のシグナル値の平均値を得て、当該検体における代表値とした。基準値は固定数値とし、代表値取得に用いた３種の補正用内因性miRNAの対数変換後シグナル値の、実施例２で調製した２種の検体を含む複数の血清RNA検体での平均値を固定数値（基準値）として用いた。各検体について、代表値と基準値の比をとり（基準値／代表値）、当該検体のための補正係数とした。この補正係数を、対応する各検体の全ての標的miRNAシグナル値に乗算することによって、各検体のmiRNA発現量の補正を行った。【０１９８】
補正済みシグナル値の分布を図８に示す。図８Ａは未補正の発現量シグナル値の分布であり、図８Ｂ〜Ｉが補正済み発現量シグナル値の分布である。配列番号１〜１０の補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて補正を行った実施例２と同様、各検体の標的miRNAの発現プロファイルを同一化させることが可能であった。【０１９９】
＜比較例１＞
実施例１の検討を行ったとき、血清RNAから得られた検体RNAをそれぞれ、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識するステップにおいて、外部から添加する基準物質として２種の合成RNA配列（それぞれ20 mer、スパイクコントロール１及びスパイクコントロール２と称する）を添加した。これらの合成RNA配列は、血清由来のmiRNAと同様に蛍光標識され、"3D-Gene" human miRNA oligo chip（東レ社）によってシグナル量が検出された。そこで、スパイクコントロール１及びスパイクコントロール２のそれぞれ８点、計１６点のスポットから得られたシグナル値を底が２の対数に変換し、その中央値を得て、代表値とした。この代表値と、あらかじめ設定した固定数値（基準値）の比をとり（基準値／各検体の代表値）、各検体用の補正係数を得た。この補正係数を、各検体のすべてのmiRNAシグナル値に乗算することによって補正を行った。補正前のシグナル値の分布を図６Ａに、補正後のシグナル値の分布を図６Ｂに示す。標識時に外部より添加されたスパイクコントロールによる補正では、検体中の標的miRNAのシグナル値は十分に補正されていないことが示された。【０２００】
＜比較例２＞
これまで先行例によってmiRNAの発現量補正用として示されている、let-7d-5p、let-7g-5p、let-7i-5p、miR-16、miR-31、miR-223の、実施例２における発現量を表２に示す。has-miR-16-5p以外は、得られたシグナル値を底が２の対数に変換した場合、０〜５の範囲のシグナルしか示さず、発現量が十分でないという理由で、全miRNAの発現量を補正するための基準には適していなかった。また、hsa-miR-16-5pで補正した場合の補正シグナル値の分布を図７に示す。hsa-miR-16-5pの発現量による補正では、検体中の標的miRNAのシグナル値は十分に補正されていないことが示された。【０２０１】
【表２】
2016043170.tif 000020
【符号の説明】
【０２０２】
１０    装置
１１０  入力部
１２０  表示部
１３０  出力部
１４０  記憶部
１５０  制御部
１６０  変換部
１７０  解析部
【図１】
2016043170.tif 000021
【図２】
2016043170.tif 000022
【図３】
2016043170.tif 000023
【図４−１】
2016043170.tif 000024
【図４−２】
2016043170.tif 000025
【図５】
2016043170.tif 000026
【図６】
2016043170.tif 000027
【図７】
2016043170.tif 000028
【図８−１】
2016043170.tif 000029
【図８−２】
2016043170.tif 000030
【配列表】
2016043170000001.app
【国際調査報告】
2016043170.tif 000031
2016043170.tif 000032
2016043170.tif 000033
2016043170.tif 000034