(57)【要約】  流体デバイスは、基板と、基板に設けられる流路と、流路と接続し、試料が導入される反応部と、第１の光の光エネルギーを熱エネルギーに変換し、生じた熱を反応部内の試料に伝達する変換部と、を備える。
2016121929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板に設けられる流路と、
前記流路と接続し、試料が導入される反応部と、
第１の光の光エネルギーを熱エネルギーに変換し、生じた熱を前記反応部内の試料に伝達する変換部と、
を備える流体デバイス。
【請求項２】
前記変換部は前記基板に設けられる
請求項１に記載の流体デバイス。
【請求項３】
前記変換部は、前記反応部の近傍、前記反応部の外側、あるいは前記反応部の内部に設けられ、前記反応部を局所的に加熱する
請求項１又は２に記載の流体デバイス。
【請求項４】
前記反応部は前記流路と接続する接続口を有する
請求項１から３のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項５】
前記接続口はバルブを備え、
前記反応部は、前記試料を導入後、前記バルブを閉じることによって、前記試料を保持することができる
請求項１から４のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項６】
前記反応部は、温度指標物質を含む試薬と前記試料とを収容する、
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項７】
前記反応部の近傍に配置され、前記試料の温度に相関して前記温度指標物質が発光する第２の光を透過する観察部を備える
請求項６に記載の流体デバイス。
【請求項８】
前記変換部に照射する光を第１方向から導入する光導入部を備え、
前記観察部は、前記第１方向とは異なる方向から前記第２の光を観察する
請求項７に記載の流体デバイス。
【請求項９】
前記観察部は、前記温度指標物質を励起する第３の光を透過する
請求項７又は請求項８に記載の流体デバイス。
【請求項１０】
前記基板に設けられ、前記変換部からの前記基板内への熱の拡散を抑制する熱保持部を備える
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１１】
前記変換部の熱伝導率は、前記試料の熱伝導率よりも低い、
請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１２】
前記光導入部は、入射した光を前記変換部に集光する集光部を備える
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１３】
前記試料の前処理が行われ、前記流路に接続する前処理部を備える
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の流体デバイス。
【請求項１４】
流路と、
前記流路に接続され、試料が導入される領域を有する反応部と、
前記試料が導入される領域とは異なる位置に設けられ、第１の光の光エネルギーを熱エネルギーに変換し、生じた熱を前記反応部内の試料に伝達する変換部と、
を備える流体デバイス。
【請求項１５】
前記変換部は、前記反応部または前記反応部の近傍に設けられる、
請求項１４に記載の流体デバイス。
【請求項１６】
試料の温度を制御する温度制御装置であって、
前記試料を収容する容器が設置される設置部と、
前記設置部の前記容器と接触する面に設けられた、光エネルギーを熱エネルギーに変換し、前記容器の特定領域を局所的に加熱する変換部と、
前記変換部に光を照射して前記試料を加熱させる照射部と、
を備える温度制御装置。
【請求項１７】
前記光を前記設置部に導光する導光路を備える、
請求項１６に記載の温度制御装置。
【請求項１８】
前記試料の温度を検出する検出部と、
前記検出部の検出結果に基づいて前記照射部による前記光の照射を制御する制御部とを備える
請求項１６又は請求項１７に記載の温度制御装置。
【請求項１９】
前記照射部が前記容器に前記光を照射する方向と、前記検出部が前記容器に第１波長帯域の光を照射する方向は異なる方向である
請求項１８に記載の温度制御装置。
【請求項２０】
前記検出部は、前記試料への第１波長帯域の光の照射により生じる第２波長帯域の光に関する情報と、予め求めた前記試料の温度と前記第２波長帯域の光に関する情報との相関関係に基づいて前記試料の温度を検出する
請求項１８又は請求項１９に記載の温度制御装置。
【請求項２１】
前記検出部の検出結果に基づいて照射される前記光のエネルギー量を制御する光制御部を備える
請求項１９から請求項２０のいずれか一項に記載の温度制御装置。
【請求項２２】
前記容器の少なくとも一部に接触し、前記試料の温度を調節する温度調節部を備える、
請求項１６から請求項２１のいずれか一項に記載の温度制御装置。
【請求項２３】
前記温度調節部は、一定温度域に保たれた恒温部を備える
請求項２２に記載の温度制御装置。
【請求項２４】
前記制御部は、前記光の照射のタイミングと前記温度調節部による温度調節とを一連の処理として制御する
請求項２２又は請求項２３に記載の温度制御装置。
【請求項２５】
容器中の試料の温度を制御する温度制御方法であって、
前記試料に熱伝達をし得る位置に配され、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に光を照射する照射工程と、
前記変換部に照射する前記光の照射を制御する制御工程と、
前記変換部において生じた熱によって、前記試料の温度を第１の温度域に昇温する加熱工程と、
前記試料の温度を前記第１の温度域よりも低い第２の温度域にする降温工程と、
を含む温度制御方法。
【請求項２６】
前記試料の温度を検出する検出工程を含み、
前記制御工程は、前記検出工程で検出した結果に基づいて前記光エネルギー量を制御する
請求項２５に記載の温度制御方法。
【請求項２７】
前記検出工程は、前記試料中の物質が発する光を検出することにより、前記試料の温度を検出する
請求項２６に記載の温度制御方法。
【請求項２８】
前記検出工程は、前記試料への第１波長帯域の光の照射により生じる第２波長帯域の光に関する情報と、予め求めた前記流路の温度と前記第２波長帯域の光に関する情報との相関関係に基づいて前記試料の温度を検出する
請求項２７に記載の温度制御方法。
【請求項２９】
前記照射工程が複数回実行されることによって、前記加熱工程と前記降温工程とが繰り返し行われることを含む
請求項２５から請求項２８のいずれか一項に記載の温度制御方法。
【請求項３０】
核酸増幅試薬を含む試料中の核酸を増幅する核酸増幅方法であって、
前記試料に接触するあるいは隣接する、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に第１の光を照射して、前記試料の温度を第１の温度域に昇温させる第１工程と、
前記試料の温度を前記第１の温度域より低い第２の温度域に降温させる第２工程と、
を含む核酸増幅方法。
【請求項３１】
前記第２工程は、前記核酸増幅試薬に含まれるプライマーと前記核酸とを反応させることを含む
請求項３０に記載の核酸増幅方法。
【請求項３２】
前記試料に含まれる試薬を励起する第２の光を照射して生じる第３の光を受光する検出工程を含み、
前記検出工程は、受光して得られる前記第３の光に関する情報と予め求めた前記試料の温度との相関関係に基づいて、前記第１の光の照射を制御することを含む
請求項３０又は請求項３１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３３】
前記第３の光に関する情報は、前記第３の光の強度を含む
請求項３２に記載の核酸増幅方法。
【請求項３４】
前記第１工程と前記第２工程とは、前記核酸を増幅させる温度サイクルの数に基づいて繰り返し行われる
請求項３０から請求項３３のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項３５】
核酸増幅試薬を含む試料中の核酸を増幅する核酸増幅装置であって、
前記試料を収容する容器が設置される設置部と、
前記試料に接触するあるいは隣接する、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に光を照射して前記試料を加熱させる照射部と、
前記容器の少なくとも一部に接触し、前記試料の温度を調節する温度調節部と、
前記照射部による前記光の照射を制御する制御部と、
を備える核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体デバイス、温度制御装置、温度制御方法、核酸増幅装置および核酸増幅方法に関するものである。
本願は、２０１５年１月３０日に出願された日本国特願２０１５−０１６７８５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、体外診断分野における試験の高速化、高効率化、および集積化、又は、検査機器の超小型化を目指したμ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)の開発などが注目を浴びており、世界的に活発な研究が進められている。【０００３】
μ−ＴＡＳは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストで使い捨てが可能なこと等、従来の検査機器に比べて優れている。
更に、高価な試薬を使用する場合や少量の多検体を検査する場合において、有用性が高い方法として注目されている。μ−ＴＡＳでの試料の分析にあたっては、デバイス内を流れる物質の混合、反応、分離、抽出等が行われる場合がある（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３２６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、上述したような従来技術では、物質を混合して反応させるのに適した温度に加熱する場合、反応させたい箇所以外も加熱されてしまう。目的としない箇所が加熱されることによって目的の反応試薬以外も加熱され、検体や他の試薬等に悪影響が生じて検出精度を低下させる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様に従えば、基板と、基板に設けられる流路と、流路と接続し、試料が導入される反応部と、第１の光の光エネルギーを熱エネルギーに変換し、生じた熱を反応部内の試料に伝達する変換部と、を備える流体デバイスが提供される。【０００７】
本発明の第２の態様に従えば、流路と、流路に接続され、試料が導入される領域を有する反応部と、前記試料が導入される領域とは異なる位置に設けられ、第１の光の光エネルギーを熱エネルギーに変換し、生じた熱を前記反応部内の試料に伝達する変換部と、を備える流体デバイスが提供される。【０００８】
本発明の第３の態様に従えば、試料の温度を制御する温度制御装置であって、試料を収容する容器が設置される設置部と、設置部の前記容器と接触する面に設けられた、光エネルギーを熱エネルギーに変換し、容器の特定領域を局所的に加熱する変換部と、変換部に光を照射して前記試料を加熱させる照射部と、を備える温度制御装置が提供される。【０００９】
本発明の第４の態様に従えば、容器中の試料の温度を制御する温度制御方法であって、試料に熱伝達をし得る位置に配され、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に光を照射する照射工程と、変換部に照射する前記光の照射を制御する制御工程と、変換部において生じた熱によって、試料の温度を第１の温度域に昇温する加熱工程と、試料の温度を第１の温度域よりも低い第２の温度域にする降温工程と、を含む温度制御方法が提供される。【００１０】
本発明の第５の態様に従えば、核酸増幅試薬を含む試料中の核酸を増幅する核酸増幅方法であって、試料に接触するあるいは隣接する、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に第１の光を照射して、試料の温度を第１の温度域に昇温させる第１工程と、試料の温度を前記第１の温度域より低い第２の温度域に降温させる第２工程と、を含む核酸増幅方法が提供される。【００１１】
本発明の第６の態様に従えば、核酸増幅試薬を含む試料中の核酸を増幅する核酸増幅装置であって、試料を収容する容器が設置される設置部と、試料に接触するあるいは隣接する、光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部に光を照射して試料を加熱させる照射部と、容器の少なくとも一部に接触し、試料の温度を調節する温度調節部と、照射部による光の照射を制御する制御部と、を備える核酸増幅装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第１実施形態に係る温度制御装置の概略的な断面図。
【図２】本発明の第１実施形態に係る温度と蛍光強度（ピーク強度）との相関関係を示す図。
【図３】本発明の第１実施形態に係る温度と蛍光強度（ピーク強度）との相関関係を示す図。
【図４】本発明の第１実施形態に係る経過時間と温度との相関関係を示す図。
【図５】第１実施形態の温度制御装置の変形例を示す断面図。
【図６】第２実施形態の温度制御装置の概略的な断面図。
【図７】第２実施形態の温度制御装置の変形例を示す断面図。
【図８】第３実施形態の温度制御装置の概略的な断面図。
【図９】第３実施形態の温度制御装置の変形例を示す断面図。
【図１０】第４実施形態の温度制御装置の概略的な断面図。
【図１１】第４実施形態の温度制御装置の変形例を示す断面図。
【図１２】第４実施形態の温度制御装置の変形例を示す断面図。
【図１３】第１実施形態の温度制御装置の変形例を示す模式図。
【図１４】第１実施形態の温度制御装置の変形例を示す模式図。
【図１５】本発明の第１実施形態に係る核酸増幅装置の概略的な断面図。
【図１６】本発明の第１実施形態に係る流体デバイスの外観斜視図。
【図１７】図１６におけるＢ−Ｂ線の断面図。
【図１８】本発明の第１実施形態に係る流体デバイスが備える流路ＣＮを模式的に示した平面図。
【図１９】本発明の第１実施形態に係る電気泳動の結果を示す図。
【図２０】第２実施形態に係る流体デバイス１Ａの外観斜視図。
【図２１】第３実施形態の流体デバイスおよび核酸増幅装置を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の流体デバイス、温度制御装置、温度制御方法、核酸増幅装置および核酸増幅方法の実施の形態を、図１から図２１を参照して説明する。
【００１４】
［温度制御装置の第１実施形態］
まず、温度制御装置の第１実施形態について説明する。
図１は、温度制御装置７０の概略的な構成を示す断面図である。
温度制御装置７０は、容器ＣＳ内の試料Ｓを温度制御する。容器ＣＳ内には収容部として反応部２１と流路２２とが設けられている。収容部には、試料Ｓが収容されている。温度制御装置７０は、第１温度制御部ＴＣ１、第２温度制御部（温度調節部）ＴＣ２、設置部４０、照射部５０および検出部６０を備えている。
【００１５】
容器ＣＳは、一例として、樹脂材で形成されている。容器ＣＳは、一例として、後述する励起光（第３の光、第１波長帯域の光）Ｌ１、蛍光（第２の光、第２波長帯域の光）Ｌ２、および赤外光（第１の光、エネルギー光）Ｌが透過する材料で形成されている。容器ＣＳは、例えば樹脂、一例としてポリカーボネート樹脂で形成されている。ポリカーボネート樹脂は、後述する、赤外光Ｌの波長、励起光Ｌ１の波長、および蛍光Ｌ２の波長で透過率９５％という特性を有している。容器ＣＳは、一例として、厚さ方向（Ｚ方向で）で分割した形状の２枚の基板を貼り合わせて形成することができる。収容部は、例えば、２つの基板の少なくとも一方に設けられた窪みにより形成される。収容部に収容される試料Ｓは、例えば流体、液体、気体などである。また、試料Ｓは、例えば核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、細胞外小胞体などの生体分子を含む。
【００１６】
収容部は、試料が移動する流路２２と、流路２２と接続する反応部（反応容器）２１とを備える。流路２２は、例えばマイクロ流路、ミリ流路、微小流路である。流路２２に導入された試料は、流路内を移動して反応部２１に流入する。あるいは、反応部２１で反応した試料は、反応部２１から流路２２に流出する。反応部は例えばバルブ又は壁などの仕切られた空間を有する部材、チャンバー、リザーバーなどである。反応部において、例えば試料と試薬との混合反応や、試料が核酸を含む場合には核酸増幅反応などの反応が行われる。
【００１７】
反応部２１は流路２２と接続する接続口を有していてもよい。接続口は、例えば試料の導入口や、試料の排出口である。接続口が導入口である場合、試料は流路２２を移動して、接続口を通じて、反応部２１に流入する。接続口が排出口である場合、試料は反応部２１から、接続口を通じて流路２２に排出される。流路２２と反応部２１との間にはバルブが備えられていてもよく、バルブは、接続口に設けられていてもよい。この場合、バルブが開いているとき、反応部２１は流路２２と挿通している。流路２２から試料を導入した後、バルブを閉じることで、反応部２１は独立した空間となる。そのため、反応部２１内の試料の効果的な加熱が実現できる。
【００１８】
以下の説明においては、図１に示す容器ＣＳの厚さ方向である鉛直方向をＺ方向（Ｚ軸）、容器ＣＳの長さ方向（図１の左右方向）をＸ方向（Ｘ軸）、Ｚ方向およびＸ方向と直交する方向をＹ方向（Ｙ軸）として適宜説明する。
【００１９】
設置部４０には、容器ＣＳが設置される。設置部４０は、後述する照射部又は温度調節部に対してＸＹＺ軸方向へ相対的に移動可能である。設置部４０は、容器ＣＳを支持してもよい。例えば、設置部４０は、容器ＣＳのＸ方向の両端部および＋Ｙ方向側の端部を−Ｚ方向側から支持する。設置部４０は、容器ＣＳの位置決めを行う位置決め部を備えていてもよい。設置部４０は、例えば位置決め部４１ａ、４１ｂを備えている（位置決め部４１ｂは後述）。位置決め部４１ａは、一例としてＺ方向に延びる円柱状に形成されている。容器ＣＳは、Ｘ方向両側の側面が位置決め部４１ａの間で保持されてＸ方向に位置決めされる。容器ＣＳは、＋Ｙ方向側の側面が位置決め部４１ｂに当接してＹ方向に位置決めされる。容器ＣＳは、位置決め部４１ａ、４１ｂに当接することによりＸ方向およびＹ方向に位置決めされる。
【００２０】
第１温度制御部ＴＣ１は、反応部２１において試料Ｓの温度を第１の温度域に加熱する。第１温度制御部ＴＣ１は、加熱部（変換部）ＨＴおよび光導入部ＬＩを備える。
【００２１】
加熱部ＨＴは反応部２１内の試料Ｓを加熱するのに適した位置に備えられる。一例として、加熱部ＨＴは、容器ＣＳと一体的に設けられている。加熱部ＨＴは、容器ＣＳにおける、例えば反応部２１の近傍、反応部２１の外側、反応部２１の周囲、反応部２１に接して、あるいは反応部２１内に存在する。図１に示される加熱部ＨＴは、反応部２１の−Ｚ方向側に対向して配置されている。加熱部ＨＴは、例えば、反応部２１との間に容器ＣＳの一部を介在させた状態で設けられている。加熱部ＨＴは、光エネルギーを熱エネルギーに変換する。このとき、光の例としては、赤外光、可視光、紫外光が挙げられる。加熱部ＨＴは、一例として、硬化性樹脂にカーボンブラックが分散された光吸収材で形成されている。加熱部ＨＴは、一例として、赤外光を吸収して熱を発生させる。加熱部ＨＴは、一例として、赤外光の光エネルギーを熱エネルギーに変換する変換部であり、光熱変換によって生じた熱を発する。加熱部ＨＴに光を照射することによって非接触に加熱できるため、電熱線などが不要な加熱となる。そのため、流体デバイスの設計の自由度を上げることが可能となる。また、照射した赤外光は加熱部ＨＴにおいて吸収される。そのため、後述する検出部６０に赤外光が到達することを抑えることができる。特に加熱部ＨＴがブラックカーボンであった場合、赤外光は効率よく加熱部ＨＴで吸収される。そのため、赤外光分離フィルターのダメージを抑えることが可能になる。このことによって赤外光の出力を上げられる。このように、反応部内の試料を効果的に加熱し、さらに反応部内の温度を検出することが可能となる。
【００２２】
加熱部ＨＴの熱伝導率は、試料、例えば後述するＰＣＲ反応液の熱伝導率よりも低くてもよい。この場合、加熱部で発生した熱は試料に効率よく伝達される。また、加熱部ＨＴの熱伝導率は、容器ＣＳを形成する樹脂材の熱伝導率よりも大きくてもよい。この場合、加熱部で発生した熱が樹脂材を通じて拡散することが抑えられる。なお、加熱部ＨＴの熱伝導率が試料の熱伝導率よりも低く、かつ、容器ＣＳを形成する樹脂材の熱伝導率よりも大きい場合、加熱部で発生した熱エネルギーは効率よく試料に伝達され、かつ、容器への熱拡散を抑えられ、反応部に熱を保持することが可能となる。よって、効率よく試料の加熱が可能となり、また、容器に加熱対象である試料以外の試薬が含まれた場合、その試薬の不要な加熱を防ぐことが可能となる。
【００２３】
第１の温度制御部ＴＣ１は、光の照射領域において熱へのエネルギー変換が生じるため、試料Ｓの特定領域のみを局所的に加熱する。容器ＣＳが、例えば流体デバイスであった場合に、流路の特定領域を部分的に加熱可能である。なお、容器ＣＳが少量であった場合、例えばミリスケールやマイクロスケールの体積であった場合、光を局所的に絞って照射したときにも、照射領域において発生した熱エネルギーによって試料Ｓが十分に加熱できる。
【００２４】
加熱部ＨＴに熱伝導率の高い光熱変換材料をもちい、加熱部の少なくとも一部に赤外線を照射することで、短時間で光熱変換材料に熱が拡散させることができる。このため、加熱部ＨＴにおける任意の２点間における熱勾配を縮小させ、液体容器の壁面を均一に加熱することが可能となる。このことから、突沸や気泡発生を防ぐことができる。
【００２５】
また、容器ＣＳは樹脂材を用いており、反応部に保持される液体が数μ〜数十μリットルであるので、壁面方向から加熱する場合、熱の広がり方は熱拡散によるものが支配的になる。そのため、加熱壁面からの距離に比例して液温が下がるような勾配を有しつつ、その勾配が徐々に解消されるように熱の拡散が生じる。このとき、容器が断熱構造になっていることにより、内部の液温は目標温度に到達しやすい。反応部における液体への熱拡散を効率よく生じさせるため、加熱部から一番遠い位置にある液までの距離をできるだけ小さくするとよい。一例として、壁面の加熱部が半球体の構造になっていることが考えられる。
【００２６】
なお、温度制御部ＴＣ１は、温度制御装置７０と一体型に備えられていてもよい。例えば、加熱部２１、光導入部ＬＩ、及び／又は温度保持部（蓄熱部、保温部）が、温度制御装置７０に設けられていてもよい。加熱部ＨＴは試料Ｓに熱伝達し得る位置に配されており、例えば温度制御装置７０と一体型に設けられていてもよい。図１３は、温度制御部ＴＣ１と一体型に備えられている温度制御装置７０の一例を示す模式図である。加熱部ＨＴは、温度制御装置７０の設置部４０ａに設置された容器ＣＳと接触する面に設けられる。温度制御装置７０は、照射部５０および光導入部ＬＩを備えている。光導入部ＬＩは、照射部５０が発光した赤外光Ｌを反射して加熱部ＨＴに導く反射部ＲＦ１、ＲＦ２を備えている。
【００２７】
また、加熱部ＨＴは容器ＣＳに備えられていてもよい。この場合、光導入部ＬＩとして、例えば光ファイバーが挙げられる。この場合、設置部は光ファイバーの挿入口を有していてもよい。加熱部２１は、光導入部ＬＩである光ファイバーの先端に設けられていてもよい。また、加熱部２１は、装置側の挿入口、または光の射出部に設けられていてもよい。また、加熱部２１は、容器ＣＳの載置面やその直交の面など、設置部に設けられていてもよい。
【００２８】
図１４は、光導入部ＬＩとして、光ファイバー５１を備える温度制御装置７０の一例を示す模式図である。図１４に示す温度制御装置７０は、設置部４０ａの底部から光ファイバー５１が突出している。光ファイバー５１の先端には、加熱部ＨＴが設けられている。容器ＣＳは、設置部４０ａに設置されたときに、光ファイバー５１と対向する位置に窪みＣＳｄを備えている。窪みＣＳｄの深さは、容器ＣＳが設置部４０ａに設置されたときに、光ファイバー５１の加熱部ＨＴが容器ＣＳに当接する深さに設定されている。
【００２９】
また、加熱部ＨＴの熱伝導率は、装置に備えられた光導入部の熱伝導率よりも大きくてもよい。この場合、加熱部で発生した熱が光導入部を通じて拡散することが抑えられ、加熱部で発生した熱エネルギーは効率よく試料に伝達される。特に、光導入部が光ファイバーであった場合には、光ファイバー材料の熱伝導率は加熱部ＨＴの熱伝導率と比較して低いため、金属電線を用いた場合と比較して効率的な加熱が実現可能である。また、加熱部ＨＴの熱伝導率は設置部や、加熱部ＨＴ近傍部（周辺部）と比較して、高くてもよい。
【００３０】
光導入部ＬＩは、外部からの光（例えば、後述する照射部から照射された光、紫外光、可視光、赤外光を含む光）を加熱部ＨＴに導入する。光導入部ＬＩは、例えば、外部からの光を導く導光路部（導波路）として作用する。光導入部ＬＩは、＋Ｚ方向側の端部が加熱部ＨＴに接続されている。光導入部ＬＩは、−Ｚ方向側の端部が容器ＣＳの−Ｚ方向側の裏面ＣＳｂに露出して設けられている。光導入部ＬＩは、加熱部ＨＴに導く光が透過する材料で形成されている。光導入部ＬＩは、一例として、ガラス材や石英等で形成されている。また、加熱部ＨＴは露出していてもよく、この場合光導入部ＬＩは基板に形成された凹部、あるいは孔である。
【００３１】
第２温度制御部ＴＣ２は、試料Ｓの温度を第１の温度域よりも低い第２の温度域にする。第２温度制御部ＴＣ２は、容器の少なくとも一部に接触し、試料の温度を制御する。第２温度制御部ＴＣ２は、例えば、一定温度域に保たれた恒温部ＧＨを備える。このとき、恒温部ＧＨの一定温度域は、第１の温度域よりも低い温度域である。恒温部ＧＨは、Ｘ方向およびＹ方向に関して反応部２１を含む範囲に設けられる。恒温部ＧＨは、例えば、容器ＣＳの表面ＣＳａに接触して設けられている。恒温部ＧＨは、一例として、石英基板表面にＩＴＯ膜が成膜されたガラスヒータで構成されている。恒温部ＧＨは、例えば、懸架部６５に支持されている。
【００３２】
照射部５０は、例えば、設置部４０に設置された容器ＣＳの−Ｚ方向側に配置されている。照射部５０は、光導入部ＬＩと対向する位置に配置されている。照射部５０は、制御部ＣＯＮＴの制御下で、一例として、波長９１５ｎｍの赤外光を発光する。照射部は、容器が反応部を有する場合、反応部に光を照射する。また、照射部は変換部の一部、変換部のみ、変換部と変換部の周囲に光が照射されるように、光を絞って照射してもよい。照射部５０は、一例として、光ファイバー５１と、光ファイバー５１の先端に設けられたコリメータレンズ５２とを備えている。
【００３３】
検出部６０は、例えば、反応部２１の＋Ｚ方向側に容器ＣＳおよび恒温部ＧＨと離間して配置されている。検出部６０は、一例として蛍光顕微鏡で構成される。検出部６０は、−Ｚ方向側に向けて、より詳細には反応部２１に向けて第１波長帯域の光Ｌ１（第３の光）を照射する。検出部６０は、一例として、波長４９０ｎｍの光を励起光（以下、励起光Ｌ１と称する）として照射する。検出部６０から照射された光は、容器において励起光を透過する観察部を通過し、反応部２１に当たる。反応部２１に向けた光Ｌ１の照射により生じる第２の波長帯域の光Ｌ２（以下、蛍光Ｌ２と称することがある）は観察部を通過し、検出部６０において受光される。第２の波長帯域の光は、反応容器において試料Ｓ中の物質によって発せられる。試料Ｓには第２の波長帯域の光を発する物質を含む試薬が加えられて混合しており、第２の波長帯域の光を発する物質が散乱や分散している。試料Ｓ中に存在する物質は、例えば、励起光Ｌ１を吸収し、第２の波長帯域の光Ｌ２を発光する。例えば試薬は温度指標物質であり、試料の温度に相関して発光する。そのため第２の波長帯域の光Ｌ２の情報に基づき、検出部では試料の温度を測定することができる。なお、第２の波長帯域の光Ｌ２は蛍光以外にも、リン光や、酵素反応に基づく発色・発光であってもよい。検出部６０は、受光した蛍光Ｌ２に関する情報として、例えば、蛍光Ｌ２のピーク強度を検出する。検出部６０は、予め求めた試料Ｓの温度と、蛍光Ｌ２のピーク強度との相関関係に基づいて試料の情報を検出する。検出部６０が検出した結果は制御部ＣＯＮＴに出力される。
【００３４】
反応部からのシグナルを効率よく検出するため、液体保持領域外からのノイズを防ぐような光学系を用いてもよい。たとえば、観察側の焦点深度がちょうど液体保持領域の厚みと同じかそれ以下にするように、レンズなどの光学部品を用いてもよい。特に、容器に透明な素材を用いた場合、位置が変わってもレンズの焦点位置を修正することでＳＮ比を保持した検出が可能となる。液体保持領域とは流路２１や反応部２２などの収容部であってよい。
また、カーボンブラックを使用した加熱部ＨＴが反応部の壁面や底面に位置する場合、検出光のバックグラウンドノイズを抑えることが可能となる。
【００３５】
また、試料Ｓ中に存在する物質が発する光を検出することによって、容器表面や試料表層の温度分布だけでなく、試料の内部（試料中）であっても、設定した測定点において温度の検出が可能である。たとえば、励起光Ｌ１の焦点を合わせる位置をずらしていくことによって、焦点以外の試料の温度の影響を受けずに、焦点を合わせた箇所の温度を計測しうる。
このように、光学的に反応部２１内の試料の温度を検出できるため、試料に対して非接触な温度検出が可能となる。
【００３６】
制御部ＣＯＮＴは、温度制御装置７０の動作を統括的に制御する。制御部ＣＯＮＴは、入力した検出部６０の検出結果に応じて、光制御部として照射部５０の動作を制御する。例えば、前記加熱部に照射する光の照射を制御する。また、例えば照射部から照射される光のエネルギー量、照射時間、照射頻度、タイミングなどについても制御部ＣＯＮＴで制御される。制御部ＣＯＮＴは、例えば照射光を規則的、または、不規則的に複数回照射する。制御部ＣＯＮＴは、照射光を周期的、間欠的に、繰返し照射してもよい。照射光を周期的に繰り返し照射することで、昇温工程と降温工程とを繰返し行うことが可能となる。この時、加熱と恒温とを繰り返す温度サイクルの回数を温度サイクル数と呼ぶ。
【００３７】
次に、上記構成の温度制御装置７０を用い試料Ｓの温度制御を行う手順について説明する。
まず、上記の容器ＣＳを設置部４０に設置する。このとき、容器ＣＳは、位置決め部４１ａ、４１ｂに当接することでＸ方向およびＹ方向に位置決めされた状態で設置部４０に設置される。容器ＣＳは、図１に示されるように、光導入部ＬＩが照射部５０とＺ方向で対向する。流体デバイス１は、検出部６０が反応部２１とＺ方向で対向する。容器ＣＳは、容器ＣＳの表面ＣＳａに恒温部ＧＨが当接する。
【００３８】
容器ＣＳが設置部４０に設置されると、恒温部ＧＨを作動させ、反応部２１および反応部２１内の試料Ｓを一定の温度域（第２の温度域）にする。本実施形態では、一例として、恒温部ＧＨを５５℃の一定温度に保つ。
【００３９】
次に、照射部５０から光導入部ＬＩに向けて赤外光Ｌを照射させる。光導入部ＬＩに入射した赤外光Ｌは、光導入部ＬＩを透過して加熱部ＨＴを照射する。加熱部ＨＴは、赤外光Ｌを吸収し熱を発する。より詳細には、加熱部ＨＴは、入射した赤外光Ｌの光エネルギーを熱エネルギーに変換し、光熱変換で生じた熱を発する。加熱部ＨＴで発生した熱は、容器ＣＳを介して主として反応部２１に伝達されることで、反応部２１内の試料Ｓが加熱される。照射部５０で生じた光を、容器ＣＳの一部に収束する調整部１１０（図１５等参照）を有していてもよい。調整部１１０としては、例えば集光光学系や、絞りや遮光シャッターのような部分的な遮光部でもよい。集光光学系の場合には、光の照射領域が、例えば、試料の一部、後述する変換部及び変換部周辺、反応部の一部、反応部の底面、等の容器ＣＳの一部に収束する収束角度に調整している。容器、変換部、試料に対する光の照射範囲は、選択的に変更しうる。
一例として、反応部２１に収容された試料に直接光を照射する場合は、調整部１１０によって試料のうち加熱したい箇所に集光させる。照射領域を試料の一部に限定することによって、目的とする部分のみに対し、局所的に試料を加熱することが可能となる。このことにより、効率的な試料の加熱が可能となり、容器ＣＳにおける別の領域の加熱を防ぐことができる。
【００４０】
試料Ｓは、予め温度が設定された恒温部ＧＨ（例えば、５５℃）によって一定温度域（例えば、約５０℃）に保たれている。制御部ＣＯＮＴは、照射部５０から照射する赤外光Ｌの照射量（光エネルギー量）を制御して、反応部２１内の試料Ｓの温度を調整する。本実施形態では、一例として、試料Ｓの温度を６０〜１００℃の範囲に制御する。制御部ＣＯＮＴは、赤外光Ｌの照射量を増加させることにより、加熱部ＨＴからの熱発生量を増加させ、試料Ｓを例えば６０℃以上の温度に加熱させる。また、制御部ＣＯＮＴは、赤外光Ｌの照射量を減少させることにより、加熱部ＨＴからの熱発生量を減少させ、試料Ｓを例えば１００℃以下の温度に降温させる。制御部ＣＯＮＴは、赤外光Ｌの照射量（照射エネルギー、照射光強度）を調整して、加熱部ＨＴによるＰＣＲ反応液の加熱と降温とを繰り返す温度サイクルで試料Ｓの温度を制御することが可能である。容器ＣＳは、加熱部の材料と比較して熱容量の大きい樹脂材で形成されているため、反応部２１の周辺の樹脂材（基板ＣＳ）が熱保持部（蓄熱部、保温部）として作用する。熱保持部は基板に設けられており、加熱部ＨＴから基板内への熱の拡散を抑制する効果がある。
【００４１】
なお、容器ＣＳが熱容量の小さい金属等の材料で形成されている場合には、加熱部ＨＴで生じた熱が拡散しないように、反応部２１の周辺に遮熱部や、蓄熱部や、断熱部を設けることが好ましい。一例として、反応部２１の周辺に樹脂材を設ける構成を採ることが好適である。これにより、反応部２１を効率よく加熱することができる。
【００４２】
本実施形態では、反応部２１内の試料Ｓの温度を計測し、計測した温度をフィードバックして、制御部ＣＯＮＴが赤外光Ｌの照射量を制御する。試料Ｓの温度の計測方法として、例えば光による計測が考えられる。例えば、本実施形態では、上述した励起光Ｌ１の照射により蛍光Ｌ２を発する試料Ｓを用いる。そして、検出部６０から恒温部ＧＨおよび、容器ＣＳにおける表面ＣＳａと反応部２１との間の観察部５５を介して反応部２１内の試料Ｓに励起光Ｌ１を照射し、発生した蛍光Ｌ２を、観察部５５および恒温部ＧＨを介して受光した結果に基づいて試料Ｓの温度を検出する。この場合、光によって試料Ｓを加熱し、光によって試料Ｓの温度を検出するため、装置構成の小型化や簡易化が実現し得る。なお、観察部は、例えば光を透過する透過部である。観察部は光の検出を容易にするため、凹部を形成していてもよい。この時、検出部と反応部との距離を近づけることが可能となる。なお、照射部が容器に赤外光を照射する方向と、検出部が容器に励起光Ｌ１を照射する方向とは同じ方向であってもよく、異なる方向であってもよい。
【００４３】
ここで、検出部６０によって検出される蛍光Ｌ２の強度は、試料Ｓの温度に応じて変化する。例えば、生体分子、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）試薬、温度依存性を有する蛍光色素が混合された試料Ｓを用いる。蛍光色素は、例えば、温度が上昇すると蛍光Ｌ２の強度が弱くなる特性を有している。検出部６０は、予め求めた試料Ｓの温度と蛍光Ｌ２のピーク強度（光の強度のピーク）との相関関係を保持している。検出部６０は、試料Ｓへの励起光Ｌ１の照射により生じた蛍光Ｌ２のピーク強度を検出し、検出したピーク強度と上記の相関関係とを用いて試料Ｓの温度を検出する。なお、第２の波長帯域の光Ｌ２はリン光であってもよく、その場合には試料Ｓは第１の波長帯域の光Ｌ１を照射することによりリン光を発光するリン光発光色素を含む。また、第２の波長帯域の光Ｌ２は酵素反応に基づく発色・発光であってもよく、その場合には試料ＳはＥＬＩＳＡ基質として化学発光基質（発色基質）を含む。また、ここでは試料Ｓの温度検出に用いられる第２の波長帯域の光Ｌ２の特性は、光の強度以外にも光の波長や寿命（蛍光寿命、リン光寿命）などが挙げられる。この場合、試料Ｓは温度に依存して、吸収光（励起光）の波長が変化する、発光波長が変化する、発光寿命が変化する、という特徴を有する試薬を含む。また、試料Ｓは、温度に依存して屈折率、反射率などの光学特性が変化する試薬を含んでいてもよい。観察部５５は、照射部５０から光導入部ＬＩに向けて赤外光Ｌを照射させる方向とは異なる方向から、蛍光Ｌを観察してもよい。
【００４４】
制御部ＣＯＮＴは、検出部６０によって検出された試料Ｓの温度から赤外光Ｌの照射量を求め照射部５０から照射させる。制御部ＣＯＮＴの制御下で、試料Ｓの温度に応じた照射量で照射部５０から赤外光Ｌが照射されることにより、反応部２１内の試料Ｓは温度調整される。
【００４５】
なお、試料Ｓの温度に応じた照射量で照射部５０から赤外光Ｌが照射されたにも拘わらず試料Ｓの温度が赤外光Ｌの照射量に対応した温度と差がある場合には、当該温度差を補正するように赤外光Ｌの照射量を調整すればよい。例えば、試料Ｓを温度Ｔｘとするために照射量ＬＶｘで赤外光Ｌを照射したときに、試料Ｓが温度Ｔｙとなった場合には（Ｔｘ≠Ｔｙ）、照射量ＬＶｙ＝ＬＶｘ × （Ｔｘ／Ｔｙ）で赤外光Ｌを照射すればよい。制御部は光の照射のタイミングと、温度調節部による温度調節とを一連の処理として制御してもよい。
【００４６】
（実施例）
一例として、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等のポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等のヌクレオチド、プライマーを含むＰＣＲ試薬と、温度依存性を有するスルホローダミンＢ等の蛍光色素と生体分子とが混合された試料Ｓに対して、加熱部ＨＴによる試料Ｓの加熱と降温とを繰り返す温度サイクルで試料Ｓの温度を６０〜１００℃の範囲に制御する。
図２は、試料Ｓの温度と蛍光強度（ピーク強度）との相関関係を示す図である。この相関関係は、蛍光強度をy、試料Ｓの温度をxとしたときに、下式で表される。
y=52799exp(-0.019x)
図２に示されるように、試料Ｓは、温度が上昇すると、励起光Ｌ１の照射により生じる蛍光Ｌ２の強度は弱くなる特性を有している。検出部６０は、保持している試料Ｓの温度と蛍光Ｌ２のピーク強度との相関関係と、検出したピーク強度とを用いて試料Ｓの温度を連続的に検出する。
【００４７】
制御部ＣＯＮＴは、検出部６０によって検出された試料Ｓの温度から、上述した温度サイクルで試料Ｓを加熱する赤外光Ｌの照射量を求め、照射部５０から赤外光Ｌを照射させる。図３に、経過時間と、そのときに検出される蛍光Ｌ２のピーク強度との関係を示す。このように、制御部ＣＯＮＴの制御下で、試料Ｓの温度に応じた照射量で照射部５０から赤外光Ｌが照射されることにより、反応部２１内の試料Ｓは、図４に示すように、上記温度サイクルで温度調整された。
【００４８】
以上のように、本実施形態では、容器ＣＳのうち、加熱部ＨＴ近傍の反応部２１に収容された試料Ｓを局所的に加熱できるため、容器ＣＳに収容された他の物体に加熱に起因する悪影響を及ぼすことを抑制できる。そのため、本実施形態では、検出精度の低下を抑制することができる。また、本実施形態では、光エネルギーを熱エネルギーに変換する加熱部ＨＴに赤外光Ｌを照射することにより、試料Ｓを加熱するための熱を容易に生じさせることが可能であるとともに、赤外光Ｌの照射を停止することにより、試料Ｓの加熱を抑えることも迅速、且つ容易に実施可能である。また、本実施形態では、試料Ｓの温度を検出し、検出した結果に応じて加熱部ＨＴへの赤外光Ｌの照射量を調節している。そのため、試料Ｓの温度をより高精度に制御することが可能になる。さらに、本実施形態では、試料Ｓの温度を蛍光Ｌ２のピーク強度を検出することで実現している。そのため、別途、温度検出用の機器を設ける必要がなくなり装置の小型化・低価格化に寄与できる。
【００４９】
また、本実施形態では、試料Ｓを所定の温度サイクルに温度調整する際に、温度サイクルの下限よりも僅かに低い温度に恒温部ＧＨの温度が保たれている。そのため、加熱部ＨＴが発生すべき熱量は温度サイクルをカバーする範囲のみで済み、温度制御が容易に行うことができる。本実施形態では、容器ＣＳが樹脂材で形成されている。そのため、成形が容易でコストを低減することが可能となり、容器ＣＳを使い捨てとすることができる。本実施形態では、恒温部ＧＨと加熱部ＨＴとが反応部２１を挟んでＺ方向の互いに逆側に設けられている。そのため、Ｚ方向の両側から反応部２１内の試料Ｓを加熱することができる。その結果、本実施形態では、試料Ｓに生じる温度分布を抑えることが可能となる。
【００５０】
上記の温度制御装置７０では、反応部２１が一つである構成を例示した。しかし、図５に示すように、容器ＣＳに複数（図５では二つ）の反応部２１１、２１２がそれぞれバルブ２１ａ、２１ｂの間、バルブ２１ｃ、２１ｄの間に設けられる構成についても、本発明を適用可能である。この構成では、反応部２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２を設ければよい。また、この構成では、入射した赤外光Ｌを二つに分岐する分岐光学系５７を光導入部として用いる。また、この構成では、赤外光Ｌを反射して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に導く反射部ＲＦが設けられている。恒温部ＧＨは、反応部２１１、２１２に跨る大きさを有し、反応部２１１、２１２を一括的に温度制御してもよい。また、恒温部ＧＨが反応部２１１と反応部２１２をそれぞれ別に温度調整してもよい。その場合、反応部２１１と反応部２１２とを別の温度に制御してもよい。制御部ＣＯＮＴは、照射部５０から二倍の照射量で赤外光Ｌを照射する。分岐光学系５７は、分岐した出射端が加熱部ＨＴ１、ＨＴ２の双方に接続される構成とすることで、加熱部ＨＴ１、ＨＴ２毎に光導入部および照射部５０を設ける場合と比較して容器ＣＳおよび照射部５０のコストダウンを図ることができる。また、複数の反応部２１１、２１２を設ける場合には、同じ種類の試料Ｓに対して併行して温度制御を行うこと、および種類が異なる試料Ｓに対して同時に温度制御を行うことができる。
【００５１】
［温度制御装置の第２実施形態］
次に、温度制御装置７０の第２実施形態およびその変形例について、図６および図７を参照して説明する。これらの図において、図１から図５に示した第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
【００５２】
図６に示すように、本実施形態では、容器ＣＳにＹ方向に延び容器ＣＳの側面ＣＳｃに端部が露出する光導入部５６が設けられている。光導入部５６としては、赤外光Ｌが透過可能な透過材を容器ＣＳに設ける構成や、光ファイバーを容器ＣＳに埋設する構成を採ることができる。光導入部５６を設ける場合には、照射部５０は側面ＣＳｃに露出する光導入部５６の端部と対向して配置する。また、照射部５０は、−Ｙ方向に赤外光Ｌを出射する。また、この構成では、赤外光Ｌを反射して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に導く反射部ＲＦが設けられている。この構成を採ることにより、温度制御装置７０の薄型化を図ることができる。すなわち、照射部５０と加熱部ＨＴがＺ方向に離間して配置されている第１実施形態の温度制御装置７０の構成と比べ、図６に示される温度制御装置７０の構成は、照射部５０から照射された赤外光Ｌが通過可能な光導入部５６が容器ＣＳ内に設けられているため、Ｚ方向において装置を薄くすることが可能である。また、光導入部５６の入射端の位置を高い自由度で設定することが可能になり、汎用性の高い温度制御装置７０を得ることができる。
【００５３】
また、光導入部５６を設ける構成を採る場合には、図７に示すように、容器ＣＳに複数（図７では二つ）の反応部２１１、２１２が設けられる構成についても、本発明を適用可能である。この構成では、反応部２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２を設ける。また、この構成では、光導入部５６は、加熱部ＨＴ１、ＨＴ２の双方に接続される構成とすることで、図６で示した温度制御装置７０と同様に、温度制御装置７０の薄型化や、光導入部５６の位置を高い自由度で設定することが可能になり、汎用性の高い温度制御装置７０が得られる。すなわち、照射部５０と加熱部ＨＴがＺ方向に離間して配置されている第１実施形態の温度制御装置７０の構成と比べ、図７に示される温度制御装置７０の構成は、照射部５０から照射された赤外光Ｌが通過可能な光導入部５６が容器ＣＳ内に設けられているため、Ｚ方向において装置を薄くすることが可能である。さらに、加熱部ＨＴ１、ＨＴ２の双方に対し一つの光導入部５６を設けることによって容器ＣＳおよび温度制御装置７０のコストダウンを図ることができる。すなわち、加熱部ＨＴ１及びＨＴ２のそれぞれに対して光導入部５６を設ける場合と比べて、図７に示される温度制御装置７０の構成は、一つの光導入部５６にて、加熱部ＨＴ１及びＨＴ２の双方に照射部５０から照射された赤外光Ｌを通過させることが可能であるため、コストダウンを図ることができる。
【００５４】
［温度制御装置の第３実施形態］
次に、温度制御装置７０の第３実施形態について、図８および図９を参照して説明する。これらの図において、図１から図５に示した第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
【００５５】
図８に示すように、本実施形態の温度制御装置７０は、加熱部ＨＴの−Ｚ方向側に光導入部としての集光部５９を備えている。集光部５９は、入射した光（赤外光Ｌ）を加熱部ＨＴに集光する。集光部５９は、＋Ｚ方向側の端面が加熱部ＨＴに接続されている。集光部５９は、−Ｚ方向側の面が容器ＣＳの裏面ＣＳｂと離間している。すなわち、集光部５９は容器ＣＳの内部に設けられている。
他の構成は、上記第１実施形態の温度制御装置７０と同様である。
【００５６】
上記構成の温度制御装置７０においては、照射部５０から加熱部ＨＴに向けて照射された赤外光Ｌは裏面ＣＳｂから容器ＣＳに入射する。容器ＣＳを介して集光部５９に入射した赤外光Ｌは、加熱部ＨＴに集光されて照射する。
【００５７】
このように、本実施形態では、上記第１実施形態と同様の作用・効果が得られることに加えて、照射する赤外光Ｌの光軸の位置がずれた場合や、光軸が裏面ＣＳｂに傾いて入射した場合、赤外光Ｌは集光部５９に集光されて加熱部ＨＴに照射される。そのため、加熱部ＨＴによる反応部２１の加熱の精度が低下することを抑制可能である。
【００５８】
なお、本実施形態においても、図９に示すように、容器ＣＳに複数（図９では二つ）の反応部２１１、２１２が設けられる構成についても、本発明を適用可能である。この構成では、反応部２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２と集光部５９１、５９２とを設ければよい。恒温部ＧＨは、反応部２１１、２１２に跨る大きさを有し、反応部２１１、２１２を一括的に加熱することでコストダウンが図れる。また、反応部２１１、２１２それぞれに対し、恒温部ＧＨが設けられていてもよい。
【００５９】
［温度制御装置の第４実施形態］
次に、温度制御装置７０の第４実施形態について、図１０から図１２を参照して説明する。これらの図において、図１から図５に示した第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
【００６０】
図１０に示すように、本実施形態の温度制御装置７０は、容器ＣＳの裏面ＣＳｂにおける加熱部ＨＴと対向する位置に集光部５９Ａが設けられている。集光部５９Ａに照射され集光された赤外光Ｌは、容器ＣＳを透過して加熱部ＨＴを照射する。本実施形態の温度制御装置７０では、反応部２１とは別の収容部、あるいは容器ＣＳ内の内層物の位置に制限されることなく集光部５９Ａを広い範囲に亘って設けることができる。そのため、赤外光Ｌの光軸位置および光軸の角度等の自由度を大きくすることができる。
【００６１】
容器ＣＳの裏面ＣＳｂに集光部５９Ａを設ける構成においても、図１１に示すように、容器ＣＳに複数（図１１では二つ）の反応部２１１、２１２が設けられる構成についても本発明を適用可能である。この構成では、反応部２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２と集光部５９Ａ１、５９Ａ２とを設ければよい。恒温部ＧＨは、反応部２１１、２１２に跨る大きさを有し、反応部２１１、２１２を一括的に加熱することでコストダウンの効果がある。
【００６２】
また、反応部２１１、２１２および集光部５９１、５９２を備えた容器ＣＳおよび温度制御装置７０の変形例としては、図１２に示すように、図５で示した分岐光学系５７を用い、分岐光学系５７の各出射端と加熱部ＨＴ１、ＨＴ２との間に集光部５９１、５９２を介在させる構成としてもよい。また、この構成では、赤外光Ｌを反射して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に導く反射部ＲＦが設けられている。この構成を採ることにより、入射した赤外光Ｌを集光して効果的に加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に照射させることができるともに、二つの加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に対し一つの光導入部が設けられているため容器ＣＳおよび温度制御装置７０のコストダウンを図ることができる。
【００６３】
[核酸増幅装置]
次に、上記第１実施形態の温度制御装置７０を備えた核酸増幅装置について、図１５から図１９を参照して説明する。温度制御装置７０は核酸増幅装置のサーマルサイクラーに適用することが可能である。これらの図において、図１から図５に示した第１実施形態の温度制御装置７０の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
【００６４】
ここでは、本発明に係る温度制御装置７０を、例えばＰＣＲ核酸増幅および核酸増幅検出に用いられる流体デバイスの温度制御に用いる場合について説明する。
図１５は、流体デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ））１を用いて核酸増幅検出を行う核酸増幅装置１００の概略的な構成を示す。図１５は、図１６におけるＡ−Ａ線の断面図である。流体デバイスは、試料や検体を保持する容器である。容器としては、後述する基板ＣＳの他に流体デバイスおよび試料ホルダが含まれ得る。図１６は、流体デバイス１の外観斜視図である。図１７は、図１６におけるＢ−Ｂ線の断面図である。なお、図１６においては、理解を容易にするために、後述する基板ＣＳを二点鎖線で示し、流路ＣＮを実線で示している。
【００６５】
［流体デバイスおよび核酸増幅装置の第１実施形態］
まず、流体デバイス１について説明する。
流体デバイス１は、容器ＣＳ内に収容された試料Ｓ中に含まれる核酸の増幅を行うデバイスである。以下、試料Ｓにエクソソームが含まれており、流体デバイス１を用いて、試料Ｓ中のエクソソームが内包する核酸を逆転写し、逆転写産物の核酸を増幅する態様について説明する。
【００６６】
エクソソームは、脂質二重膜で囲まれた直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞である。エクソソームは、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
エクソソームは、細胞の分泌物であり、分泌元の細胞由来の生体分子、例えばタンパク質、核酸、ｍｉＲＮＡなどを内包している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、ｍｉＲＮＡなどを発現している。
そのため、エクソソームに内包される生体分子を分析することで分泌元の細胞の異常を検出することができる。エクソソームに内包される生体分子を取り出す（抽出する）手段として、一例にはエクソソームの脂質二重膜の破砕などが挙げられる。
更に、エクソソームは、生体内で循環している血液、尿、唾液などの体液中で検出される。そのため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
【００６７】
流体デバイス１は、核酸増幅に係る流路ＣＮが形成された基板状の容器ＣＳ（以下、基板ＣＳと称する）、上述した加熱部ＨＴおよび光導入部ＬＩを備えている。なお流路ＣＮとは、基板ＣＳにおいて試料が移動するものに限られず、滞留（貯溜）されるものも含まれる。
【００６８】
図１８は、流体デバイス１が備える流路ＣＮを模式的に示した平面図である。
流体デバイス１は、エクソソーム精製部２、生体分子精製部３、混合部４、生体分子検出部２０を備えている。
【００６９】
エクソソーム精製部２は、エクソソームの固定と、エクソソームの破砕とを行う前処理部である。エクソソーム精製部２は、インレット２ａ、２ｂ、２ｃ、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエクソソーム固定部（第１の流路）２ｄ、エクソソーム固定部２ｄに流路５によって接続された廃液槽７を備えている。
【００７０】
エクソソーム精製部２は、導入する試薬別にインレットを備えている。エクソソーム精製部２は、洗浄液導入用インレット２ａ、サンプル導入用インレット２ｂおよび破砕液導入用インレット２ｃを備えている。洗浄液導入用インレット２ａは、基板ＣＳの＋Ｚ方向側の表面ＣＳａ（図１５および図１６参照）に開口している。洗浄液導入用インレット２ａには、開口を介して洗浄液が導入可能である。洗浄液導入用インレット２ａは、流路２ｈを介してエクソソーム固定部２ｄに接続されている。流路２ｈには、流路２ｈを開閉するバルブ２ｅが設けられている。
【００７１】
サンプル導入用インレット２ｂは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。サンプル導入用インレット２ｂには、開口を介してサンプル（試料）が導入可能である。サンプル導入用インレット２ｂは、流路２ｉを介してエクソソーム固定部２ｄに接続されている。流路２ｉには、流路２ｉを開閉するバルブ２ｆが設けられている。
【００７２】
破砕液導入用インレット２ｃは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。破砕液導入用インレット２ｃには、開口を介して破砕液が導入可能である。破砕液導入用インレット２ｃは、流路２ｊを介してエクソソーム固定部２ｄに接続されている。流路２ｊには、流路２ｊを開閉するバルブ２ｇが設けられている。
【００７３】
バルブ２ｈ〜２ｊ、５ａ、６ａ、９ａ、１０ａ、１１ａ、２１ａ、２１ｂは、例えば一例として空圧式バルブ、水圧式バルブ、機械式駆動バルブ等である。
【００７４】
エクソソーム固定部２ｄでは、エクソソームの固定処理、エクソソームの洗浄処理およびエクソソームの破砕処理の前処理が行われる。エクソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。エクソソーム固定部２ｄは、係る化合物を用いることにより、エクソソーム固定部２ｄ上に脂質二重膜を有するエクソソームを固定することができる。
【００７５】
尚、本明細書において、「エクソソーム固定部２ｄ上にエクソソームを固定する」とは、エクソソーム固定部にエクソソームを吸着させることも意味する。エクソソーム固定部２ｄは、サンプル中からのエクソソームの単離が可能である。
疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。飽和又は不飽和の炭化水素基としては、例えば、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が挙げられる。親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられる。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、例えば脂質−ＰＥＧ誘導体が挙げられる。
【００７６】
流路５は、中途で流路６に接続されている。流路５における流路６との接続部よりも廃液槽７側には、流路５を開閉するバルブ５ａが設けられている。流路６には、流路６を開閉するバルブ６ａが設けられている。
【００７７】
廃液槽７は、流路５と接続された側とは逆側の端部において吸引部Ｖａと接続されている。吸引部Ｖａは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。吸引部Ｖａは、一例として、外部吸引ポンプ（不図示）と接続されて負圧吸引される。
【００７８】
生体分子精製部３は、生体分子抽出液導入用インレット３ａ、フィルターインレット３ｂ、エア抜き部３ｃおよび廃液槽８を備えている。生体分子精製部３は前処理部の一つである。生体分子抽出液導入用インレット３ａは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。生体分子抽出液導入用インレット３ａには、開口を介して生体分子抽出液が導入可能である。生体分子抽出液導入用インレット３ａは、流路９を介してフィルターインレット３ｂに接続されている。流路９は、中途で流路６と接続されている。流路９における流路６との接続部よりも生体分子抽出液導入用インレット３ａ側には、流路９を開閉するバルブ９ａが設けられている。
【００７９】
フィルターインレット３ｂは、生体分子を捕捉するためのフィルターを備えている。フィルターは生体分子を固定可能なものであれば特に限定されない。一例として、生体分子が核酸である場合には核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エクソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、例えば、ｍｉＲＮＡが挙げられる。近年、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
【００８０】
フィルターインレット３ｂは、流路１０を介して廃液槽８に接続されている。流路１０は、中途で流路１１と接続されている。流路１０における流路１１との接続部よりも廃液槽８側には、流路１０を開閉するバルブ１０ａが設けられている。流路１１は、流路１１を開閉するバルブ１１ａが設けられている。
【００８１】
エア抜き部３ｃは、フィルターインレット３ｂから流路１１を介して導入される、生体分子を含む液体からエアを抜くためのインレットである。エア抜き部３ｃは、流路１３に接続されている。
【００８２】
廃液槽８は、流路１０と接続された側とは逆側の端部において吸引部Ｖｂと接続されている。吸引部Ｖｂは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。吸引部Ｖｂは、一例として、外部吸引ポンプ（不図示）と接続されて負圧吸引される。
【００８３】
混合部４は、試薬インレット４ａ、蛍光色素インレット４ｂ、混合流路１２を備えている。試薬インレット４ａは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。試薬インレット４ａには、開口を介してＰＣＲ試薬が導入可能である。試薬インレット４ａには、流路１４が接続されている。
【００８４】
蛍光色素インレット４ｂは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。蛍光色素インレット４ｂには、開口を介して蛍光色素が導入可能である。蛍光色素インレット４ｂは、流路１５を介して混合流路１２に接続されている。流路１５の中途には、流路１４が接続されている。流路１４の中途には、流路１３が接続されている。
【００８５】
混合流路１２は、エア抜き部３ｃから流路１３、１４、１５を介して導入される生体分子と、試薬インレット４ａから流路１４、１５を介して導入されるＰＣＲ試薬と、蛍光色素インレット４ｂから流路１５を介して導入される蛍光色素が混合される流路である。混合流路１２は、混合に必要な流路長を確保するために、生体分子検出部２０に向けて九十九折り状に蛇行している。
【００８６】
生体分子検出部２０は、上述した反応部２１である増幅流路（第２の流路；以下、増幅流路２１と称する）、流路２２を備えている。増幅流路２１は生体分子の増幅反応が行われる流路である。増幅流路２１は、一端が混合流路１２に接続され、他端が流路２２に接続されている。増幅流路２１の一端にはバルブ２１ａが設けられている。増幅流路２１の一端にはバルブ２１ｂが設けられている。バルブ２１ａ、バルブ２１ｂを閉じることによって、増幅流路２１は他の流路から独立する。流路２２は、増幅流路２１が接続された側とは逆側の端部において吸引部Ｖｃと接続されている。吸引部Ｖｃは、基板ＣＳの表面ＣＳａに開口している。吸引部Ｖｃは、一例として、外部吸引ポンプ（不図示）と接続されて負圧吸引される。
【００８７】
制御部ＣＯＮＴは、上述したバルブ５ａ、６ａ、９ａ、１０ａ、１１ａ、２１ａ、２１ｂの開閉動作、吸引部Ｖａ〜Ｖｃの吸引動作を制御する。制御部ＣＯＮＴは、懸架部６５に支持された導入部６６からサンプル導入用インレット２ｂへの試料Ｓの導入（供給）動作を制御する。制御部ＣＯＮＴは、洗浄液導入用インレット２ａへの洗浄液導入、破砕液導入用インレット２ｃへの破砕液導入、生体分子抽出液導入用インレット３ａへの生体分子抽出液導入、試薬インレット４ａへのＰＣＲ試薬導入、および蛍光色素インレット４ｂへの蛍光色素導入が自動導入である場合には、各インレットへの液体・試薬の導入（供給）を制御する。
【００８８】
次に、上記構成の流体デバイス１および核酸増幅装置１００を用いて核酸増幅を検出する手順の一例について説明する。なお、以下の説明では、上述したバルブ５ａ、６ａ、９ａ、１０ａ、１１ａ、２１ａ、２１ｂの開閉動作、吸引部Ｖａ〜Ｖｃの吸引動作、サンプル導入用インレット２ｂへの試料Ｓの導入、洗浄液導入用インレット２ａへの洗浄液導入、破砕液導入用インレット２ｃへの破砕液導入、生体分子抽出液導入用インレット３ａへの生体分子抽出液導入、試薬インレット４ａへのＰＣＲ試薬導入、および蛍光色素インレット４ｂへの蛍光色素導入は制御部ＣＯＮＴの制御下で行われるが、それについては適宜省略する。
【００８９】
まず、流体デバイス１が設置部４０に試料Ｓを設置する。恒温部ＧＨを作動させ、増幅流路２１を一定の温度域（第２の温度域）にする。上述したエクソソーム精製部２において、サンプル導入用インレット２ｂに試料Ｓを注入する。本実施形態では、一例として、恒温部ＧＨを５５℃の一定温度に保つ。
【００９０】
サンプル導入用インレット２ｂへの試料Ｓの導入は、シリンジ等を用いた手動でもよい。本実施形態では、図１５に示すように、制御部ＣＯＮＴの制御により懸架部６５に支持された導入部６６から試料Ｓを導入する。分析に用いられるサンプル量としては、一例として数μＬから数ｍＬであり、例えば１ｍＬ程度である。
【００９１】
試料Ｓとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエクソソームを含有するものであれば特に限定されない。例えば、試料Ｓの例としては、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、血液または尿はエクソソームを検出しやすい。更に、血液においては、血液から血球を分離して得られた血漿は、エクソソームが検出しやすい。
また、係る試料Ｓには、培養細胞が分泌したエクソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
【００９２】
サンプル導入用インレット２ｂにサンプルが導入されると、バルブ６ａを閉じた状態で流路２ｉのバルブ２ｆおよびバルブ５ａを開き、吸引部Ｖａからの負圧吸引によりサンプルをエクソソーム固定部２ｄに導入する。
【００９３】
検出対象の細胞としては、エクソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよい。本実施形態においては、エクソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエクソソームとの親和性が高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
【００９４】
エクソソーム固定部２ｄにエクソソームを特異的に結合させる観点から、エクソソーム固定部２ｄに非特異的吸着抑制部を設けてもよい。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理することが挙げられる。
【００９５】
エクソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエクソソームは、上述した疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエクソソームとの親和性が非常に高いため、サンプルをエクソソーム固定部２ｄに静置する必要はなく、連続的にエクソソーム固定部２ｄ上をサンプルが通過すると同時にサンプル中のエクソソームがエクソソーム固定部２ｄ上に捕捉される。
一例として、エクソソーム捕捉時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、捕捉に要する時間は１５秒程度である。エクソソーム固定部２ｄを通過した溶液は、流路５を通りバルブ５ａを介して廃液槽７へ送られる。
【００９６】
血液中には、エクソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞もエクソソーム固定部２ｄに固定される可能性がある。エクソソーム固定部２ｄからこれらの細胞外小胞を除去する観点から、エクソソーム固定部２ｄ上のエクソソームを洗浄してもよい。
【００９７】
一例として、図１８に示すように、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、吸引部Ｖａからの負圧吸引により洗浄液をエクソソーム固定部２ｄに導入する。
本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエクソソームとの結合が強力である。そのため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、ＰＢＳ洗浄液５００μＬを吸引圧力１〜３０ｋＰａで１５秒程度送液することにより洗浄される。エクソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ５ａを介して流路５から廃液槽７へ送られる。
【００９８】
次いで、エクソソーム固定部２ｄに固定されたエクソソームを破砕する。まず、流路２ｊ上のバルブ２ｇを開き、破砕液導入用インレット２ｃに破砕液を注入し、吸引部Ｖａからの負圧吸引により破砕液をエクソソーム固定部２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエクソソーム固定部２ｄを通ることにより、エクソソーム固定部２ｄ上に捕捉されたエクソソームが破砕され、エクソソームに内包される生体分子が放出される。
一例として、エクソソーム破砕時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、破砕に要する時間は３０秒程度である。エクソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ５ａを介して流路５から廃液槽７へ送られる。
【００９９】
バルブ５ａ、９ａ、１１ａを閉じ、バルブ６ａ、１０ａを開いた後に吸引部Ｖｂからの負圧吸引により、エクソソームから放出された生体分子は、エクソソーム破砕液とともに流路５、６、９を介して生体分子精製部３へ送られる。生体分子精製部３へ送られたエクソソーム破砕液は、フィルターインレット３ｂを通過することにより、フィルターインレット３ｂ上に生体分子が捕捉される。本実施形態において、フィルターインレット３ｂが固定する生体分子は核酸であることが好ましく、例えばｍｉＲＮＡである。フィルターインレット３ｂの一例としては、上述したように、流路上に埋め込まれたシリカメンブレンを備える。
一例として、エクソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、送液に要する時間は１分程度である。
【０１００】
フィルターインレット３ｂを通過した廃液は、流路１０を介して廃液槽８へ送られる。フィルターインレット３ｂに生体分子を固定した後には、フィルターインレット３ｂを洗浄し、目的とする生体分子以外の夾雑物を取り除いてもよい。フィルターインレット３ｂを洗浄する場合には、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、吸引部Ｖｂからの負圧吸引により洗浄液をフィルターインレット３ｂに導入すればよい。洗浄液としては、例えば７０％〜８０％程度のエタノールが挙げられる。一例として、洗浄時の洗浄液使用量は１ｍＬ程度であり、吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、洗浄液の送液に要する時間は１分程度である。
【０１０１】
後工程への生体分子洗浄液の持ち込みを防止するために、フィルターインレット３ｂを洗浄した後には、フィルターインレット３ｂを乾燥させてもよい。フィルターインレット３ｂを乾燥させるには、一例として、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入せずに吸引部Ｖｂからの負圧吸引により、洗浄液導入用インレット２ａから空気を吸引し、フィルターインレット３ｂを通過させることにより乾燥させる。一例として、フィルターインレット３ｂを乾燥する時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、乾燥に要する時間は２分程度である。
【０１０２】
次いで、フィルターインレット３ｂに固定された生体分子を溶出させる。生体分子の回収率を向上させるために、生体分子抽出液をフィルターインレット３ｂに導入した後、一定時間保持させてもよい。生体分子抽出液のフィルターインレット３ｂへの導入は、バルブ６ａ、１１ａを閉じ、バルブ９ａ、１０ａを開いた状態で、生体分子抽出液導入用インレット３ａに生体分子抽出液を注入し、吸引部Ｖｂからの負圧吸引により生体分子抽出液をフィルターインレット３ｂに導入する。一例として、吸引部Ｖｂは、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで生体分子抽出液を吸引し、生体分子抽出液がフィルターインレット３ｂに到達した時点で吸引を停止させ、３分程度保持する。一例として、生体分子抽出液は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒである。一例として、生体分子抽出液の使用量は３０μＬである。
【０１０３】
次いで、生体分子、ＰＣＲ試薬および蛍光色素を混合する。まず、バルブ１０ａを閉じ、バルブ１１ａ、２１ａ、２１ｂを開いた後に、試薬インレット４ａにＰＣＲ試薬を導入するとともに、蛍光色素インレット４ｂに蛍光色素を導入する。
【０１０４】
ＰＣＲ試薬としては、一例として、逆転写酵素等のポリメラーゼ、逆転写反応用のプライマー、ｄＮＴＰ等のヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用のプライマーを含む溶液が挙げられる。
蛍光色素としては、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ等のインターカレーターや、スルホローダミンＢ等の温度依存性の蛍光色素が挙げられる。スルホローダミンＢは蛍光強度の温度依存性を有するので、ＰＣＲ反応液の温度検出用試薬としても使用可能である。本実施形態では、蛍光強度の温度依存性を有する蛍光色素を用いる。
【０１０５】
試薬インレット４ａにＰＣＲ試薬を導入するとともに、蛍光色素インレット４ｂに蛍光色素を導入すると、吸引部Ｖｃからの負圧吸引により生体分子抽出液をフィルターインレット３ｂから流路１０、１１を介してエア抜き部３ｃに導入して、生体分子抽出液に含まれるエアを抜いた後に、流路１３、１４、１５を介して混合流路１２に導入する。また、吸引部Ｖｃからの負圧吸引により、試薬インレット４ａから流路１４、１５を介してＰＣＲ試薬を混合流路１２に導入する。また、吸引部Ｖｃからの負圧吸引により、蛍光色素インレット４ｂから流路１５を介して蛍光色素を混合流路１２に導入する。フィルターインレット３ｂから生体分子を回収する。一例として、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで生体分子抽出液、ＰＣＲ試薬および蛍光色素を３０秒かけて回収する。
【０１０６】
混合流路１２に導入された生体分子抽出液、ＰＣＲ試薬および蛍光色素は、意図しない核酸増幅を避けるため、１〜１０℃程度の低温に冷却されていることが好ましく、１〜４℃程度の低温に冷却されてもよい。
【０１０７】
生体分子抽出液、ＰＣＲ試薬および蛍光色素が混合されて得られたＰＣＲ反応液（試料）が増幅流路２１に導入されると、バルブ２１ａ、２１ｂを閉じて、ＰＣＲ反応液を密閉された増幅流路２１に保持させる。
【０１０８】
密閉された増幅流路２１にＰＣＲ反応液が保持されると、増幅反応のために照射部５０から光導入部ＬＩに向けて赤外光Ｌを照射させる。光導入部ＬＩに入射した赤外光Ｌは、光導入部ＬＩを透過して加熱部ＨＴを照射する。加熱部ＨＴは、赤外光Ｌを吸収し熱を発する。より詳細には、加熱部ＨＴは、入射した赤外光Ｌの光エネルギーを熱エネルギーに変換し、光熱変換で生じた熱を発する。
【０１０９】
加熱部ＨＴで発生した熱は、基板ＣＳを介して主として増幅流路２１に伝達されることで、増幅流路２１内のＰＣＲ反応液が加熱される。一例として、生体分子がｍｉＲＮＡであり、増幅流路２１においてｍｉＲＮＡから逆転写された核酸の増幅を行う場合について説明する。まず、ＰＣＲ反応液を加熱して５０℃程度に保温し逆転写反応を行う。この際、予め、転写プライマー結合のためのアダプター配列をｍｉＲＮＡに付加することを行ってもよい。次に、ＰＣＲ反応液の温度が第一の温度、例えば９２℃〜９５℃程度となるよう昇温させ、第一の温度でＰＣＲ反応液を５秒〜６０秒間程度を保温して２本鎖ＤＮＡを１本鎖に変性させる（変性）。次いで、ＰＣＲ反応液の温度が第二の温度、例えば５０℃〜６０℃程度となるまで降温し、第二の温度でＰＣＲ反応液を５秒〜６０秒間程度を保温してプライマーのオリゴヌクレオチドを１本鎖のＤＮＡに結合させる（アニーリング）。続いて、ＰＣＲ反応液の温度が第三の温度、例えば７２℃程度となるよう昇温させ、第三の温度でＰＣＲ反応液を保温し、ポリメラーゼにより１本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成させる（伸長反応）。ＰＣＲ反応液の昇温は、赤外光Ｌを加熱部ＨＴに照射し、入射した赤外光Ｌの光エネルギーを熱エネルギーに変換することで起こす。ＰＣＲ反応溶液の降温は自然放熱（自然冷却）でもよく、変性温度よりも低い温度に設定した温度調整部を用いて降温してもよい。合成に要する時間は１本鎖ＤＮＡの長さやポリメラーゼの伸長時間を考慮して適宜定めればよい。上記変性、アニーリング、伸長反応を１サイクルとして、２０〜５０回程度の温度サイクルを繰り返す。
【０１１０】
なお、上記例では、それぞれ変性、アニーリング、伸長反応のための３つの温度域でＰＣＲ反応液を保温する場合を示した。しかし、アニーリングを省略した２つの温度域でＰＣＲ反応液を保温することを１サイクルとしてもよい。この場合、一例として、まず赤外光Ｌを加熱部ＨＴに照射し、入射した赤外光Ｌの光エネルギーを熱エネルギーに変換することでＰＣＲ反応液の温度が第一の温度、例えば９２℃〜９５℃程度となるよう昇温させ、第一の温度でＰＣＲ反応液を５秒〜６０秒間程度を保温して２本鎖ＤＮＡを１本鎖に変性させる。その後、変性温度よりも低い温度に設定した温度調整部を用いて、あるいは自然放熱によって、ＰＣＲ反応液の温度が第三の温度の、例えば６８℃程度となるよう降温させ、第三の温度でＰＣＲ反応液を保温して、ポリメラーゼにより１本鎖ＤＮＡの相補鎖を合成させる。
【０１１１】
増幅流路２１のＰＣＲ反応液は、予め温度が５５℃に設定された恒温部ＧＨによって一定温度域（例えば、約５０℃）に保たれている。そのため、制御部ＣＯＮＴは、照射部５０から照射する赤外光Ｌの照射量（光エネルギー量）を制御して、増幅反応に適した温度に増幅流路２１のＰＣＲ反応液の温度を調整する。本実施形態では、上述したアニーリングを省略した２つの温度域でＰＣＲ反応液を保温することを１サイクルとした温度調整を行うものとして、ＰＣＲ反応液を６０〜１００℃の温度に制御する。制御部ＣＯＮＴは、赤外光Ｌの照射量を増加させることにより、加熱部ＨＴからの熱発生量を増加させＰＣＲ反応液を、例えば６０℃以上の温度に加熱させる。また、制御部ＣＯＮＴは、赤外光Ｌの照射量を減少させることにより、加熱部ＨＴからの熱発生量を減少させＰＣＲ反応液を、例えば１００℃以下の温度に降温させる。制御部ＣＯＮＴは、図４に示したように、赤外光Ｌの照射量を調整して加熱部ＨＴによるＰＣＲ反応液の加熱と降温とを繰り返す温度サイクルの確認を行い、ＰＣＲ反応液の温度を増幅反応に適した温度に保持させる。基板ＣＳは、熱容量の大きい樹脂材で形成されている。そのため、増幅流路２１の周辺の樹脂材（基板ＣＳ）が熱保持部として作用する。
【０１１２】
本実施形態では、増幅流路２１内のＰＣＲ反応液の温度を計測し、計測した温度をフィードバックして、制御部ＣＯＮＴが赤外光Ｌの照射量を制御する。本実施形態では、検出部６０から恒温部ＧＨおよび、基板ＣＳにおける表面ＣＳａと増幅流路２１との間の観察部５５を介して増幅流路５５内のＰＣＲ反応液に励起光Ｌ１を照射し、発生した蛍光Ｌ２を、観察部５５および恒温部ＧＨを介して受光した結果に基づいてＰＣＲ反応液の温度を検出する。
【０１１３】
上述したように、制御部ＣＯＮＴは、検出部６０によって検出されたＰＣＲ反応液の温度から赤外光Ｌの照射量を求め照射部５０から照射させる。制御部ＣＯＮＴの制御下で、ＰＣＲ反応液の温度に応じた照射量で照射部５０から赤外光Ｌが照射されることにより、増幅流路２１内のＰＣＲ反応液は、増幅反応に適した温度に調整される。
【０１１４】
このように、本発明によって、光を用いて温度制御可能な流体デバイス、温度制御装置、温度制御方法、核酸増幅装置および核酸増幅方法を提供することができる。
【０１１５】
（実施例）
［増幅反応検出］
増幅反応に用いた試薬類は、以下のとおりである。上記流体デバイスの第１の実施形態では、試料Ｓ中のエクソソームが内包する核酸に由来した核酸増幅を行う態様について説明した。本実施例では、増幅の鋳型となる核酸としてHuman Genomic DNAを容器ＣＳの反応部へ導入して、核酸増幅を行った。
イ) スルホローダミンＢ水溶液 
（濃度：８．９×１０−５ｍｏｌ／Ｌ，吸収極大波長：５６５ｎｍ）
ロ) PCR試薬組成
MightyAmp(登録商標) DNA Polymerase Ver.2 (Takara)   0.4 μL
MightyAmp(登録商標) Reaction Mix (Takara)            10 μL
Human Genomic DNA (Clontech, 636401)       1.0 μL (0.1μg)
βアクチンプライマー
Forward: 5’-TGTGGCATCCACGAAACTAC-3’                1.0 μL
Reverse: 5’-TGATCTCGTTCTGCATCCTG-3’                1.0 μL
Water (up to 20 μL)                                6.4 μL
【０１１６】
図１９は、上記の増幅反応の確認のために行った電気泳動の結果を示す図である。
ゲルの上部分には合計８つのレーンがある。向かって左から＃１〜＃８とする。＃２レーンに基準となるラダーマーカー５０ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ （Ｔａｋａｒａ）を、＃４レーンにネガティブコントロール（ＰＣＲサイクルなし）を、＃６レーンにＬＤ照射によるＰＣＲサイクルにかけたサンプルと電気泳動用色素６ｘＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ （Ｔｈｅｒｍｏ）とを混合したものを、それぞれ滴下した。＃６レーンに増幅断片バンドが観測された。バンドはラダーマーカーの１００〜１５０ｂｐの間に観測されたことから、設計したとおりのβアクチン遺伝子断片が増幅されたことが確認された。
【０１１７】
以上のように、本実施形態では、上述した温度制御装置７０を備えるため、流体デバイス１の流路ＣＮのうち、特定領域の増幅流路２１を局所的に加熱することができ、試料Ｓ、ＰＣＲ試薬、生体分子抽出液等の他の物体に加熱に起因する悪影響を及ぼすことなく、サーマルサイクラーとして所定のサイクルでＰＣＲ反応液を増幅反応に適した温度に加熱することが可能となる。そのため、本実施形態では、ＰＣＲ試薬、生体分子抽出液等の加熱に起因する検出精度の低下を抑制することができる。本実施形態では、光エネルギーを熱エネルギーに変換する加熱部ＨＴに赤外光を照射することにより、ＰＣＲ反応液を加熱するための熱を容易に生じさせることが可能である。
【０１１８】
また、本実施形態では、増幅流路２１における増幅反応に適した温度域（以下、反応温度域）の下限よりも僅かに低い温度に恒温部ＧＨの温度が保たれている。そのため、加熱部ＨＴが発生すべき熱量は反応温度域をカバーする範囲のみで済み、温度制御が容易に行うことができる。本実施形態では、基板ＣＳが樹脂材で形成されている。そのため、成形が容易でコストを低減することが可能となり、流体デバイス１を使い捨てとすることができる。本実施形態では、恒温部ＧＨと加熱部ＨＴとが増幅流路２１を挟んでＺ方向の互いに逆側に設けられている。そのため、Ｚ方向の両側から増幅流路２１内のＰＣＲ反応液を加熱することができる。その結果、本実施形態では、ＰＣＲ反応液に生じる温度分布を抑えることが可能となる。
【０１１９】
本実施形態の核酸増幅装置１００においては、図５から図７に示した温度制御装置７０および容器ＣＳを適用可能である。
【０１２０】
［流体デバイスおよび核酸増幅装置の第２実施形態］
次に、流体デバイス１Ａの第２実施形態について、図２０および図８を参照して説明する。図２０は、第２実施形態に係る流体デバイス１Ａの外観斜視図である。流体デバイス１Ａには、図８に示した温度制御装置７０が設けられている。
【０１２１】
上記構成の流体デバイス１Ａにおいては、照射部５０から加熱部ＨＴに向けて照射された赤外光Ｌは裏面ＣＳｂから基板ＣＳに入射する。基板ＣＳを介して集光部５９に入射した赤外光Ｌは、加熱部ＨＴに集光されて照射する。
【０１２２】
このように、本実施形態の流体デバイス１Ａでは、上記第１実施形態の流体デバイス１と同様の作用・効果が得られることに加えて、照射する赤外光Ｌの光軸の位置がずれたり、光軸が裏面ＣＳｂに傾いて入射した場合でも、赤外光Ｌは集光部５９に集光されて加熱部ＨＴに照射される。そのため、加熱部ＨＴによる増幅流路２１の加熱の精度が低下することを抑制可能である。
【０１２３】
なお、流体デバイス１Ａにおいても、図９に示すように、基板ＣＳに複数（図９では二つ）の増幅流路２１１、２１２が設けられる構成についても、本発明を適用可能である。この構成では、増幅流路２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２と集光部５９１、５９２とを設ければよい。恒温部ＧＨは、増幅流路２１１、２１２に跨る大きさを有し、増幅流路２１１、２１２を一括的に加熱することでコストダウンの効果がある。
【０１２４】
また、流体デバイス１Ａにおいては、図１０に示した温度制御装置７０のように、基板ＣＳの裏面ＣＳｂにおける加熱部ＨＴと対向する位置に設けられた集光部５９Ａを用いる構成であってもよい。この構成の流体デバイス１Ａでは、増幅流路２１とは別の流路の位置に制限されることなく集光部５９Ａを広い範囲に亘って設けることができる。そのため、赤外光Ｌの光軸位置および光軸の角度等の自由度を大きくすることができる。
【０１２５】
基板ＣＳの裏面ＣＳｂに集光部５９Ａを設ける構成においても、図１１に示した温度制御装置７０ように、基板ＣＳに複数（図１１では二つ）の増幅流路２１１、２１２が設けられる構成についても本発明を適用可能である。この構成では、増幅流路２１１、２１２のそれぞれに対応して加熱部ＨＴ１、ＨＴ２と集光部５９Ａ１、５９Ａ２とを設ければよい。恒温部ＧＨは、増幅流路２１１、２１２に跨る大きさを有し、増幅流路２１１、２１２を一括的に加熱することでコストダウンの効果がある。
【０１２６】
また、増幅流路２１１、２１２および集光部５９１、５９２を備えた流体デバイス１Ａの変形例としては、図１２に示に示した温度制御装置７０ように、図５で示した分岐光学系５７を用い、分岐光学系５７の各出射端と加熱部ＨＴ１、ＨＴ２との間に集光部５９１、５９２を介在させる構成としてもよい。この構成を採ることにより、入射した赤外光Ｌを集光して効果的に加熱部ＨＴ１、ＨＴ２に照射させることができるともに、加熱部ＨＴ１、ＨＴ２毎に光導入部を設ける場合と比較して基板ＣＳおよび流体デバイス１のコストダウンを図ることができる。
【０１２７】
［流体デバイスおよび核酸増幅装置の第３実施形態］
次に、流体デバイスおよび核酸増幅装置の第３実施形態について図２１を参照して説明する。上記第１および第２実施形態では、加熱部ＨＴが増幅流路２１と離間した位置に配置される構成を例示した。本実施形態では加熱部ＨＴが増幅流路２１内に設けられる構成について説明する。
【０１２８】
図２１に示す温度制御装置１００Ｂは、流体デバイス１Ｂを基板ＣＳの裏面ＣＳｂ側から放熱フィルムＦを介して加熱する第２温度制御部ＴＣ２を備えている。第２温度制御部ＴＣ２は、恒温部ＧＨ２、ポンプＰおよび熱源Ｔを備えている。恒温部ＧＨ２の内部には、裏面ＣＳｂと対向する表面ＧＨａに沿って流路ＧＨｂが設けられている。流路ＧＨｂは循環路となっている。流路ＧＨｂには、熱媒ＧＨｃが封入されている。流路ＧＨｂの一部には、トランジスタ等で構成される熱源Ｔが設けられている。熱源Ｔから発せられる熱で加熱された熱媒ＧＨｃは、ポンプＰの作動により流路ＧＨｂを流動（循環）する。加熱された熱媒ＧＨｃが流動することにより、恒温部ＧＨ２は、一例として５５℃に保たれる。
【０１２９】
流体デバイス１Ｂにおける基板２は、表面ＣＳａに窪み８０が設けられている。窪み８０の底面８０ａには、流路２１が設けられている。窪み８０には、基板ＣＳと同様に、赤外光Ｌ、励起光Ｌ１、蛍光Ｌ２を透過する材料で形成された板部材（観察部）８１が増幅流路２１の開口を閉塞するように嵌合して設けられている。板部材８１は、一例として、ポリカーボネート樹脂で形成されている。板部材８１の表面８１ａは、基板ＣＳの表面ＣＳａと面一である。
【０１３０】
加熱部ＨＴは、増幅流路２１の底部に設けられている。加熱部ＨＴは、増幅流路２１における−Ｚ方向側の端部に設けられている。すなわち、加熱部ＨＴは、Ｚ方向に関して増幅流路２１の一方側に設けられ、観察部である板部材８１は、Ｚ方向に関して増幅流路２１の他方側に設けられている。加熱部ＨＴは、放熱フィルムＦに接触して設けられている。放熱フィルムＦは、増幅流路２１と対向する領域を含む範囲に亘って、裏面ＣＳｂと接触して設けられている。加熱部ＨＴが、ＰＣＲ反応液との接触により悪影響が及ぼされる場合には、加熱部ＨＴを保護膜で被覆する事が好ましい。加熱部ＨＴを保護膜で被覆する場合は、赤外光Ｌを透過する保護膜を用いることが好ましい。
【０１３１】
本実施形態の検出部６０は、赤外光Ｌを照射する照射部５０として動作する。検出部６０は、赤外光Ｌ、励起光Ｌ１を流路２１に向けて−Ｚ方向側に照射する。すなわち、検出部６０が赤外光Ｌを照射する方向と励起光Ｌ１を照射する方向は同一方向、且つ同軸である。赤外光Ｌの光路には、少なくとも赤外光Ｌを加熱部ＨＴに集光させる一対のレンズ８２、８３が配置されている。
【０１３２】
上記構成の温度制御装置１００Ｂを用いて流体デバイス１Ｂの増幅流路２１のＰＣＲ反応液ＰＬを加熱するには、第２温度制御部ＴＣ２における恒温部ＧＨ２を一定の温度５５℃に保ち、放熱フィルムＦを介して基板ＣＳの増幅流路２１および増幅流路２１内のＰＣＲ溶液ＰＬを一定温度に加熱する。検出部６０は、赤外光Ｌを出射し、レンズ８２、８３および板部材８１を透過し集光された赤外光Ｌを加熱部ＨＴに照射することにより、赤外光Ｌの光エネルギーが熱エネルギーに変換され、変換で生じた熱によりＰＣＲ反応液ＰＬが加熱される。また、検出部６０は、赤外光Ｌとともに励起光Ｌ１を射出し、レンズ８２、８３および板部材８１を透過した励起光Ｌ１の照射によりＰＣＲ反応液ＰＬから生じた蛍光Ｌ２（図２０では不図示）を板部材８１およびレンズ８３、８２を介して受光する。
【０１３３】
上記第１実施形態で説明したように、検出部６０は、受光した蛍光Ｌ２のピーク強度に基づいてＰＣＲ反応液ＰＬの温度を検出する。制御部ＣＯＮＴは検出部６０が検出したＰＣＲ反応液ＰＬの温度に基づいて、検出部６０が発する赤外光Ｌの照射量を制御し、増幅反応に適した温度サイクルに調整する。
【０１３４】
このように、本実施形態では、上記第１実施形態と同様の作用・効果が得られることに加えて、加熱部ＨＴが増幅流路２１内に設けられている。そのため、応答性に優れた温度制御を実現することが可能になる。また、本実施形態では、加熱部ＨＴが増幅流路２１の底部に設けられている。そのため、ＰＣＲ反応液ＰＬに容易に対流を生じさせて攪拌することができ、増幅反応を促進させることが可能となる。また、本実施形態では、赤外光Ｌを加熱部ＨＴに集光させている。そのため、加熱部ＨＴから効果的に熱を生じさせることができるとともに、集光位置を制御することにより、ＰＣＲ反応液ＰＬに任意の温度勾配を付加して、所望位置および所望方向の対流を生じさせることも可能である。本実施形態では、赤外光Ｌおよび励起光Ｌ１を同一方向から照射しているため、装置の小型化に寄与できる。
【０１３５】
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
【０１３６】
例えば、流体デバイス１は、二つの基板が張り合わされて基板ＣＳが形成され、基板の一方にブラックカーボンが分散された樹脂材で設けられる構成であってもよい。この構成では、ブラックカーボンが分散された一方の基板の所定領域（例えば、増幅流路２１が存在する領域）に赤外光Ｌを照射して熱を生じさせ、増幅流路２１内の試料Ｓを局所的に加熱することができる。また、増幅流路２１の他の領域についても、例えば、移動ステージを用いて照射部５０および検出部６０に対して流体デバイス１、１Ａ、１Ｂを移動させることにより、任意の位置で試薬等を局所的に加熱することも可能である。
【０１３７】
また、上記実施形態では、加熱部ＨＴに赤外光Ｌを照射する構成を例示した。しかし、これに限られるものではなく、加熱部ＨＴが熱エネルギーに変換できる光であれば他の波長帯域の光を用いる構成であってもよい。この場合でも、検出部６０が照射する励起光Ｌ１および励起光Ｌ１の照射により生じる蛍光Ｌ２とは異なる波長帯域の光であることが好ましい。
【０１３８】
また、上記実施形態では、加熱部（変換部）としてブラックカーボンが分散された樹脂材を用いる構成を例示した。しかし、例えば、ブラックカーボンを含むビーズなどの固相が容器中に分散しているものを用いる構成としてもよい。
【０１３９】
また、上記実施形態では、本発明に係る流体デバイスを核酸増幅に用いる構成とした。しかし、これに限られるものではなく、光で温度を局所的に制御する技術の用途として、温度を一時的に上昇させることによる試薬反応の促進にも適用可能である。
【０１４０】
また、上記実施形態では、流体デバイスを用いて核酸増幅を行う構成を例示した。しかし、これに限定されずに、核酸の増幅を検出するデバイスとして用いることもできる。ＰＣＲ反応液が蛍光色素としてインターカレーターを含む場合には、増幅産物と蛍光試薬とがインターカーレーションし、核酸増幅と同時に、核酸増幅の蛍光検出が可能となる。
この場合には、例えば、ＰＣＲ反応液の温度検出用と核酸増幅検出用とで異なる波長帯域の蛍光を発光する蛍光色素を用い、検出部６０が各波長帯域の第１蛍光、第２蛍光を生じさせる、波長帯域の異なる第１励起光、第２励起光を照射する構成とし、波長帯域毎に個別に第１蛍光、第２蛍光を受光することにより、ＰＣＲ反応液の温度検出と核酸増幅の検出の両方を実施することが可能である。
このように、流体デバイス１、１Ａ、１Ｂは、核酸を増幅するデバイスとして用いることもできるし、核酸の増幅を検出するデバイスとして用いることもできる。
【０１４１】
温度調節部としては、ガラスヒータの他に、ヒーター、サーマルサイクラー、チラーなどを用いることが可能である。
【０１４２】
また、上記実施形態では、核酸を検出する構成を例示したが、核酸に限定されるものではなく、加熱処理が必要な流体デバイスおよび検出装置に広く適用可能である。
【符号の説明】
【０１４３】
１…流体デバイス、  ２ｄ…エクソソーム固定部（第１の流路）、  ２１…反応部、  ２２…流路、  ４０…設置部、  ５０…照射部、  ５５…観察部、  ５７…分岐光学系（光導入部）、  ５９、５９Ａ、５９１、５９２…集光部（光導入部）、  ６０…検出部、  ７０…温度制御装置、  ８１…板部材（観察部）、  １００…核酸増幅装置、  １１０…調整部、  ２１１、２１２…増幅流路（特定領域、第２の流路）、  ＣＮ…流路、  ＣＯＮＴ…制御部（光制御部）、  ＣＳ…基板（容器）、  ＧＨ…恒温部、  ＨＴ、ＨＴ１、ＨＴ２…加熱部（変換部）、  Ｌ…赤外光（エネルギー光）、  Ｌ１…励起光（第３の光、第１波長帯域の光）、  Ｌ２…蛍光（第２の光、第２波長帯域の光）、  ＬＩ…光導入部（導光部）、  Ｓ…サンプル（試料）、  ＴＣ１…第１温度制御部、  ＴＣ２…第２温度制御部（温度調節部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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