(57)【要約】  本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記糖化ペプチド水溶液は前記組成物を含有するものである、および（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程を具備する方法を提供する。本発明はまた、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素水を得る工程、および（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程を具備する方法を提供する。
2014192200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記糖化ペプチド水溶液は前記組成物を含有するものである、および
（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記カチオン性界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩、
２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム、および
２，２’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニリレン）ビス［３−（２−ベンゾチアゾリル）−５−［４−［Ｎ−［２−（ソジオオキシスルホニル）エチル］−Ｎ−（２−スルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム］からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル−バリン−ヒスチジンである、方法。
【請求項７】
試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素水を得る工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記界面活性剤が、第４級アンモニウム塩である、方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ｄｉニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩、
２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム、および
２，２’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニリレン）ビス［３−（２−ベンゾチアゾリル）−５−［４−［Ｎ−［２−（ソジオオキシスルホニル）エチル］−Ｎ−（２−スルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム］からなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル−バリン−ヒスチジンである、方法。
【請求項１３】
カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩を含有する、プロテアーゼを活性化するための組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビンを定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化ヘモグロビン（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、赤血球に含まれるヘモグロビンＡ（以下、「ＨｂＡ」という）にグルコースを非酵素的に結合することによって形成される糖化タンパク質の一種である。ＨｂＡ１ｃは、糖尿病マーカーとして用いられる。【０００３】
特許文献１は、酵素アッセイ法によって、ＨｂＡ１ｃを定量する方法を開示している。より具体的には、特許文献１に開示された方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を有する：
（ａ）プロテアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを分解し、フルクトシルペプチドを生成する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において生成されたフルクトシルペプチドを、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下、「ＦＰＯＸ」という）を用いて定量する工程。【０００４】
特許文献２も、フルクトシルペプチドを得る方法を開示している。この方法は、ＨｂＡ１ｃのようなタンパク質を含有する試料が、テトラゾリウム化合物の存在下においてプロテアーゼ処理に供されることを特徴とする。特許文献２は、さらに、テトラゾリウム化合物だけでなく界面活性剤がプロテアーゼ処理をより促進することを開示している。【０００５】
特許文献３も、フルクトシルペプチドを得る方法を開示している。この方法では、Ｈｂ１Ａｃが、イソチアゾリン誘導体および界面活性剤の存在下でプロテアーゼ処理に供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／００３７２４３号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１８６３４６号
【特許文献３】カナダ特許出願公開第２  ８０６  ２６１  Ａ号
【特許文献４】米国特許第７，２３５，３７８号
【特許文献５】米国特許第７，８５５，０７９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酵素アッセイ法では、工程（ａ）が速やかに実施されることが必要とされる。より詳細には、プロテアーゼによって引き起こされるＨｂＡ１ｃの分解速度をより向上させることが必要とされる。【０００８】
さらに、工程（ａ）において用いられた試薬が、工程（ｂ）に悪影響を与えてはならない。より詳細には、工程（ａ）において用いられた試薬が、ＦＰＯＸを不活性化してはならない。【０００９】
本発明の目的は、糖化ヘモグロビンを速やかに定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をＦＰＯＸ（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記溶液は前記組成物を含有するものである、および
（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法に関する。
本発明は、試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびＦＰＯＸ（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と混合し、過酸化水素水を得る工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備する、方法に関する。
本発明の趣旨は、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩を含有する、プロテアーゼを活性化するための組成物を含む。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、糖化ヘモグロビンを速やかに定量する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例１の結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例１の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２の結果を示す。
【図３】図３は、試験例３の結果を示す。
【図４】図４は、試験例４の結果を示す。
【図５】図５は、試験例５の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態が、以下、説明される。
【００１４】
（実施形態１）
まず、実施形態１が説明される。
【００１５】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、ＨｂＡ１ｃを含有する試料がカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下においてプロテアーゼと混合される。好ましくは、試料は水溶液である。
【００１６】
ＨｂＡ１ｃはプロテアーゼによって分解され、糖化ペプチドを生成する。糖化ペプチドの例は、フルクトシルペプチドである。フルクトシルペプチドの例は、フルクトシルバリンヒスチジン（以下、「Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ」という）である。このようにして、糖化ペプチドを含有する水溶液が得られる。
【００１７】
ＨｂＡ１ｃを含有する試料の例は、ヒト由来の血液である。ヒト由来の血液の希釈物もまた、ＨｂＡ１ｃを含有する試料に含まれる。
【００１８】
カチオン性界面活性剤の例は、第４級アンモニウム塩、アルキルアミン塩、またはピリジン誘導体である。好ましいカチオン性界面活性剤は、化学式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−により表される第４級アンモニウム塩である。
【００１９】
好ましくは、Ｒ１は、８以上１８以下の炭素数を有するアルキル基である。好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立してメチル基またはエチル基である。メチル基がさらにより好ましい。Ｘはハロゲンを表す。好ましくは、Ｘは塩素または臭素を表す。
【００２０】
好ましいカチオン性界面活性剤の例が以下に列記される。
トリメチルオクチルアンモニウムクロリド
トリメチルデシルアンモニウムクロリド
トリメチルドデシルアンモニウムクロリド
トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド
トリメチルセチルアンモニウムクロリド
トリメチルステアリルアンモニウムクロリド
トリメチルオクチルアンモニウムブロミド
トリメチルデシルアンモニウムブロミド
トリメチルドデシルアンモニウムブロミド
トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド
トリメチルセチルアンモニウムブロミド
トリメチルステアリルアンモニウムブロミド
【００２１】
好ましいテトラゾリウム塩の例が以下に列記される。
２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）
２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）
２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＷＳＴ−４）
２，２’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニリレン）ビス［３−（２−ベンゾチアゾリル）−５−［４−［Ｎ−［２−（ソジオオキシスルホニル）エチル］−Ｎ−（２−スルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム］（ＷＳＴ−５）
５−［２，４−ビス（ソジオオキシスルホニル）フェニル］−３−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム（ＷＳＴ−８）
２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−９）
２，５−ジ（４−ニトロフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１０）
２−（４−ニトロフェニル）−５−（２−スルホフェニル）−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム，ジナトリウム塩（ＷＳＴ−１１）
【００２２】
プロテアーゼの例は、サーモリシン、パパイン、キモトリプシン、スブチリシン、カスパーゼ、ペプシン、またはカテプシンＤである。サーモリシンおよびパパインが好ましい。
【００２３】
後述される試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ８〜Ａ１０およびＢ８〜Ｂ１０において実証されているように、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組合せが、ＨｂＡ１ｃの分解速度を顕著に向上させる。言い換えれば、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の相乗効果が、ＨｂＡ１ｃの分解速度を顕著に向上させる。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、および図２Ｂを参照のこと。
【００２４】
試験例１および試験例２にそれぞれ含まれる試料溶液Ａ１およびＢ１において実証されているように、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」という）のようなアニオン性界面活性剤も、ＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。しかし、本発明では、アニオン性界面活性剤は用いられてはならない。その理由は、工程（ｂ）の説明において記述される。
【００２５】
試験例１および試験例２にそれぞれ含まれる試料溶液Ａ２およびＢ２において実証されているように、カチオン性界面活性剤が単独で用いられた場合、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。同様に、試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ５〜Ａ７およびＢ５〜Ｂ７において実証されているように、テトラゾリウム塩が単独で用いられた場合でも、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。
【００２６】
試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ３、Ａ４、Ｂ３、およびＢ４において実証されているように、カチオン性界面活性剤に代えて非イオン性界面活性剤が用いられた場合、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。試験例１および試験例２に含まれる試料溶液Ａ１１〜Ａ１６およびＢ１１〜Ｂ１６において実証されているように、非イオン性界面活性剤がテトラゾリウム塩と組み合わせて用いられた場合でも、ＨｂＡ１ｃの分解速度は向上されない。
【００２７】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。
【００２８】
工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液は、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下、「ＦＰＯＸ」という）と混合される。特許文献２に開示されているように、糖化ペプチドはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素が発生する。工程（ａ）と同様、工程（ｂ）においても、糖化ペプチド水溶液はカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物を含有する。
【００２９】
後述される試験例３〜５に含まれる試料溶液Ｃ８〜Ｃ１０、Ｄ８〜Ｄ１０、およびＥ８〜Ｅ１０において実証されているように、カチオン性界面活性剤のみが用いられた場合（試料溶液Ｃ２、Ｄ２、およびＥ２を参照のこと）と比較して、カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物が用いられた場合、糖化ペプチドはＦＰＯＸとより速やかに反応する。
【００３０】
アニオン性界面活性剤は、ＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。しかし、後述される試験例３、４、および５に含まれる試料溶液Ｃ１、Ｄ１、およびＥ１において実証されているように、アニオン性界面活性剤はＦＰＯＸを不活性化する。そのため、アニオン性界面活性剤が用いられた場合、ＨｂＡ１ｃを定量することはできない。
【００３１】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。
【００３２】
工程（ｂ）において発生する過酸化水素の量は、特許文献４（特に第８欄、６〜３７行目）および特許文献５（特に第１０欄、６３行目〜第１１欄、７行目）に開示されているように、試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量に比例する。これらの特許文献は、出典明示により本明細書に組み込まれる。以下のホームページもまた、工程（ｂ）において発生する過酸化水素の量が試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量に比例することを開示している。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｋｉｓｕｉｍｅｄｉｃａｌ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ／ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｈｂａ１ｃ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
【００３３】
従って、過酸化水素の量を元に、予め得られた検量線を用いて、試料に含有されるＨｂＡ１ｃの量が算出される。このようにして、試料に含有されるＨｂＡ１ｃが定量される。言い換えれば、Ｈｂ１Ａｃ１の濃度が測定される。
【００３４】
（実施形態２）
次に、実施形態２が説明される。
【００３５】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、ＨｂＡ１ｃを含有する試料がカチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下においてプロテアーゼおよびＦＰＯＸと混合され、過酸化水素を得る。好ましくは、試料は水溶液である。
【００３６】
（工程（ｅ））
工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われる。工程（ｅ）では、工程（ｄ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、Ｈｂ１Ａｃが定量される。
【００３７】
工程（ｄ）では、工程（ａ）および工程（ｂ）が同時に行なわれる。工程（ｅ）は、工程（ｃ）と同一である。よって、工程（ｄ）及び工程（ｅ）の詳細な説明は省略される。
【００３８】
（試験例）
（試料溶液の調製）
ヒト全血（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を希釈して、１０倍希釈液を作成した。このようにして、ヘモグロビンを含む試料溶液を調製した。以下、この試料溶液は「試料溶液Ｐ」と呼ばれる。
【００３９】
（試験例１）
（試料溶液の調製）
以下の試料溶液Ａ１〜Ａ１６を調製した。比較用試料溶液ａ１も調製した。
用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
サーモリシン：和光純薬工業株式会社
ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：和光純薬工業株式会社
Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
ＷＳＴ−３：同仁化学研究所
ＷＳＴ−４：同仁化学研究所
ＷＳＴ−５：同仁化学研究所
（試料溶液Ａ１）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＳＤＳ  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ａ２）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
（試料溶液Ａ３）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ａ４）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ａ５）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−３  水溶液：２重量％
（試料溶液Ａ６）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ａ７）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ８）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ９）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ａ１０）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ１１）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ１２）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ａ１３）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ１４）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ａ１５）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ａ１６）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（比較用試料溶液ａ１）
試料溶液Ｐ
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
【００４０】
（サーモリシンを用いたＨｂＡ１ｃ分解反応）
試料溶液Ａ１〜Ａ１６および比較用試料溶液ａ１の温度は、３７℃に１０分間維持され、反応を生じさせた。
【００４１】
（分解反応進行状況の比較）
反応後、試料溶液Ａ１〜Ａ１６および比較用試料溶液ａ１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）供された。図１Ａおよび図１Ｂは、電気泳動パターンを示す。図１Ａおよび図１Ｂ中の「Ｍ」は、タンパク質マーカーを指し示す。
【００４２】
ＨｂＡ１ｃ分解の度合いは、電気泳動パターンに含まれるヘモグロビン分子領域に対応する６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さ（ｃｏｌｏｒ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に反映される。６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さが低下すると、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解している。
【００４３】
図１Ａおよび図１Ｂに示される電気泳動パターンから明らかなように、比較用試料溶液ａ１と比較して、試料溶液Ａ１、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０において、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解した。試料溶液Ａ２、Ａ５、Ａ６、およびＡ７と比較して、試料溶液Ａ８、Ａ９、およびＡ１０において、より多くのＨｂＡ１ｃが分解した。
【００４４】
ＳＤＳ（試料溶液Ａ１）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物（試料溶液Ａ８）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−４の組成物（試料溶液Ａ９）、ならびにＴＴＡＢおよびＷＳＴ−５の組成物（試料溶液Ａ１０）が、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００４５】
ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物（試料溶液Ａ８）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ−３が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ５）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００４６】
ＴＴＡＢとＷＳＴ−４の組成物（試料溶液Ａ９）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ−４が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ６）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００４７】
ＴＴＡＢとＷＳＴ−５の組成物（試料溶液Ａ１０）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ａ２）およびＷＳＴ−５が単独で用いられる場合（試料溶液Ａ７）と比較して、サーモリシンを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００４８】
（試験例２）
（試料溶液の調製）
試料溶液Ｂ１〜Ｂ１６が調製された。比較用試料溶液ｂ１も調製された。
用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
パパイン：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：和光純薬工業株式会社
Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
ＷＳＴ−３：同仁化学研究所
ＷＳＴ−４：同仁化学研究所
ＷＳＴ−５：同仁化学研究所
（試料溶液Ｂ１）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＳＤＳ  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ｂ２）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
（試料溶液Ｂ３）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ｂ４）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
（試料溶液Ｂ５）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−３  水溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ６）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ｂ７）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ８）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ９）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ｂ１０）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ１１）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ１２）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ｂ１３）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ１４）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
（試料溶液Ｂ１５）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
（試料溶液Ｂ１６）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
（比較用試料溶液ｂ１）
試料溶液Ｐ
パパイン  ＰＢＳ溶液：３００Ｕ／ｍＬ
【００４９】
（サーモリシンを用いたＨｂＡ１ｃ分解反応）
試料溶液Ｂ１〜Ｂ１６および比較用試料溶液ｂ１の温度は、３７℃に１０分間維持され、反応を生じさせた。
【００５０】
（分解反応進行状況の比較）
反応後、試料溶液Ｂ１〜Ｂ１６および比較用試料溶液ｂ１は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供された。図２Ａおよび図２Ｂは、電気泳動パターンを示す。図２Ａおよび図２Ｂ中の「Ｍ」は、タンパク質マーカーを指し示す。
【００５１】
ＨｂＡ１ｃ分解の度合いは、電気泳動パターンに含まれるヘモグロビン分子領域に対応する６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さ（ｃｏｌｏｒ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に反映される。６４．５ＫＤａ付近のバンドの色の濃さが低下すると、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解している。
【００５２】
図２Ａおよび図２Ｂに示される電気泳動パターンから明らかなように、比較用試料溶液ｂ１と比較して、試料溶液Ｂ１、Ｂ８、Ｂ９、およびＢ１０において、より多くの量のＨｂＡ１ｃが分解した。試料溶液Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、およびＢ７と比較して、試料溶液Ｂ９、Ｂ１０、およびＢ１１において、より多くのＨｂＡ１ｃが分解した。
【００５３】
ＳＤＳ（試料溶液Ｂ１）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物（試料溶液Ｂ８）、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−４の組成物（試料溶液Ｂ９）、ならびにＴＴＡＢおよびＷＳＴ−５の組成物（試料溶液Ｂ１０）が、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００５４】
ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物（試料溶液Ｂ８）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ−３が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ５）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００５５】
ＴＴＡＢとＷＳＴ−４の組成物（試料溶液Ｂ９）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ−４が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ６）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００５６】
ＴＴＡＢとＷＳＴ−５の組成物（試料溶液Ｂ１０）は、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ２）およびＷＳＴ−５が単独で用いられる場合（試料溶液Ｂ７）と比較して、パパインを用いるＨｂＡ１ｃの分解速度を向上させる。
【００５７】
（試験例３）
（試料溶液の調製）
試料溶液Ｃ１〜Ｃ１２が調製された。比較用試料溶液ｃ１も調製された。
用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
ＦＰＯＸ−ＣＥ：キッコーマン株式会社
ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
ＫＮ−１１１（発色色素）：同仁化学研究所
ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：和光純薬工業株式会社
Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
ＷＳＴ−３：同仁化学研究所
ＷＳＴ−４：同仁化学研究所
ＷＳＴ−５：同仁化学研究所
（試料溶液Ｃ１）
ＳＤＳ  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ２）
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ３）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ４）
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ５）
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ６）
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ７）
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ８）
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ９）
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ１０）
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ１１）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｃ１２）
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（比較用試料溶液ｃ１）
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
【００５８】
（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
試料溶液Ｃ１〜Ｃ１２および比較用試料溶液ｃ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
【００５９】
反応後、試料溶液Ｃ１〜Ｃ１２および比較用試料溶液ｃ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ  １ｍＭ  ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｃ１〜Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１が得られた。
【００６０】
（ＦＰＯＸ活性の評価）
波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｃ１〜Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ  Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図３は、結果を示す。
【００６１】
糖化ペプチドＦｒｕ−Ｖａｌ−ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ−１１１と反応し、発色色素ＫＮ−１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ−１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
【００６２】
図３に示されるように、混合溶液Ｃ１以外の全ての混合溶液Ｃ２〜Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｃ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｃ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｃ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｃ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
【００６３】
一方、試料溶液Ｃ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
【００６４】
このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｃ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの本願定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｃ２〜Ｃ１２および比較用混合溶液ｃ１の結果を参照のこと）。
【００６５】
図３から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｃ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ−５の組成物（混合溶液Ｃ８〜Ｃ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
【００６６】
（試験例４）
［試料溶液の調製］
試料溶液Ｄ１〜Ｄ１６が調製された。比較用試料溶液ｄ１もまた、調製された。
用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
ＦＰＯＸ−ＣＥ：キッコーマン株式会社
サーモリシン：和光純薬工業株式会社
ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
ＫＮ−１１１（発色色素）：同仁化学研究所
ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：和光純薬工業株式会社
Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
ＷＳＴ−３：同仁化学研究所
ＷＳＴ−４：同仁化学研究所
ＷＳＴ−５：同仁化学研究所
（試料溶液Ｄ１）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＳＤＳ  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ２）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ３）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ４）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ５）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ６）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ７）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ８）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ９）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ１０）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ１１）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｄ１２）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（比較用試料溶液ｄ１）
サーモリシン  ＰＢＳ溶液：１５０，０００Ｕ／ｍＬ
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
【００６７】
（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
試料溶液Ｄ１〜Ｄ１２および比較用試料溶液ｄ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
【００６８】
反応後、試料溶液Ｄ１〜Ｄ１２および比較用試料溶液ｄ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ  １ｍＭ  ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｄ１〜Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１が得られた。
【００６９】
（ＦＰＯＸ活性の評価）
波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｄ１〜Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ  Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図４は、結果を示す。
【００７０】
糖化ペプチドＦｒｕ−Ｖａｌ−ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ−１１１と反応し、発色色素ＫＮ−１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ−１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
【００７１】
図４に示されるように、混合溶液Ｄ１以外の全ての混合溶液Ｄ２〜Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｄ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｄ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｄ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｄ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
【００７２】
一方、試料溶液Ｄ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
【００７３】
このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｄ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｄ２〜Ｄ１２および比較用混合溶液ｄ１の結果を参照のこと）。サーモリシンもまた、ＦＰＯＸを不活性化しない。
【００７４】
図４から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｄ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ−５の組成物（混合溶液Ｄ８〜Ｄ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
【００７５】
（試験例５）
（試料溶液の調製）
試料溶液Ｅ１〜Ｅ１２が調製された。比較用試料溶液ｅ１もまた、調製された。
用いられた試薬の入手先は以下の通りである。
ＦＰＯＸ−ＣＥ：キッコーマン株式会社
パパイン：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社
ペルオキシダーゼ：和光純薬工業株式会社
ＫＮ−１１１（発色色素）：同仁化学研究所
ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド）：和光純薬工業株式会社
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：和光純薬工業株式会社
Ｔｗｅｅｎ２０：和光純薬工業株式会社
ＷＳＴ−３：同仁化学研究所
ＷＳＴ−４：同仁化学研究所
ＷＳＴ−５：同仁化学研究所
（試料溶液Ｅ１）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＳＤＳ  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ２）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ３）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ４）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ５）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ６）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ７）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ８）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ９）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−４  ＰＢＳ溶液：０．５重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ１０）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴＴＡＢ：１０重量％
ＷＳＴ−５  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ１１）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（試料溶液Ｅ１２）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ溶液：１０重量％
ＷＳＴ−３  ＰＢＳ溶液：２重量％
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
（比較用試料溶液ｅ１）
パパイン：３００Ｕ／ｍＬ
ＦＰＯＸ−ＣＥ  ＰＢＳ溶液：２８Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ：２０Ｕ／ｍＬ
ＫＮ−１１１：２ｍＭ
【００７６】
（糖化ペプチドのＦＰＯＸとの反応）
試料溶液Ｅ１〜Ｅ１２および比較用試料溶液ｅ１の温度が３７℃で１０分間維持され、反応を生じさせた。
【００７７】
反応後、試料溶液Ｅ１〜Ｅ１２および比較用試料溶液ｅ１（９５マイクロリットル）に、５マイクロリットルのＦｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ  １ｍＭ  ＰＢＳ溶液（株式会社ペプチド研究所社より入手可能）が添加された。このようにして、混合溶液Ｅ１〜Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１が得られた。
【００７８】
（ＦＰＯＸ活性の評価）
波長６６０ナノメートルでの混合溶液Ｅ１〜Ｅ１２および比較用混合溶液ｄ１の吸光度が、吸光度計（ＴＥＣＡＮ  Ｇｒｏｕｐ社より入手可能、商品名Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  Ｐｒｏ）を用いて、１分毎に測定した。図５は、結果を示す。
【００７９】
糖化ペプチドＦｒｕ−Ｖａｌ−ＨｉｓはＦＰＯＸと反応して、過酸化水素を発生させる。過酸化水素は、発色色素ＫＮ−１１１と反応し、発色色素ＫＮ−１１１を赤色に変化させる。従って、波長６６０ｎｍ（赤）での発色色素ＫＮ−１１１の吸光度を測定することによって、ＦＰＯＸ活性が評価される。
【００８０】
図５に示されるように、混合溶液Ｅ１以外の全ての混合溶液Ｅ２〜Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１において吸光度変化が観察された。その中でも、混合溶液Ｅ２を除き、吸光度変化は比較用混合試料ｅ１の吸光度変化と類似することが観察された。混合溶液Ｅ２の吸光度変化は、比較用混合試料ｅ１のそれと比べて緩やかであることが観察された。
【００８１】
一方、試料溶液Ｅ１においては、吸光度変化は全く観察されなかった。
【００８２】
このように、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳは、ＦＰＯＸを不活性化する（混合溶液Ｅ１の結果を参照のこと）。従って、ＳＤＳは、ＦＰＯＸを用いるＨｂＡ１ｃの定量方法に用いられない。一方、カチオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤は、ＦＰＯＸを不活性化しない（混合溶液Ｅ２〜Ｅ１２および比較用混合溶液ｅ１の結果を参照のこと）。パパインもまた、ＦＰＯＸを不活性化しない。
【００８３】
図５から明らかなように、ＴＴＡＢが単独で用いられる場合（混合溶液Ｅ２）と比較して、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−３の組成物、ＴＴＡＢおよびＷＳＴ−４の組成物、またはＴＴＡＢおよびＷＳＴ−５の組成物（混合溶液Ｅ８〜Ｅ１０）が用いられた場合に、ＦＰＯＸは糖化ペプチドとより速やかに反応する。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、糖尿病の診断に有用である。
【図１Ａ】
2014192200.tif 000003
【図１Ｂ】
2014192200.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月17日(2014.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼと混合し、糖化ペプチドを含有する糖化ペプチド水溶液を得る工程、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られた糖化ペプチド水溶液をフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素を得る工程、ここで、前記糖化ペプチド水溶液は前記組成物を含有するものである、および
（ｃ）工程（ｂ）において得られた過酸化水素水の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備し、
前記カチオン性界面活性剤は、化学式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−（Ｒ１は８以上１８以下の炭素数を有するアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して低級アルキル基であり、Ｘはハロゲンである。）により表される第４級アンモニウム塩である、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム、および２，２’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニリレン）ビス［３−（２−ベンゾチアゾリル）−５−［４−［Ｎ−［２−（ソジオオキシスルホニル）エチル］−Ｎ−（２−スルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム］からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル−バリン−ヒスチジンである、方法。
【請求項７】
試料に含有される糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を定量する方法であって、以下の工程：
（ａ）カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩の組成物の存在下において、前記試料をプロテアーゼおよびフルクトシルペプチドオキシダーゼと混合し、過酸化水素水を得る工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた過酸化水素の量に基づいて、前記糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の濃度を算出する工程
を具備し、
前記カチオン性界面活性剤は、化学式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−（Ｒ１は８以上１８以下の炭素数を有するアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して低級アルキル基であり、Ｘはハロゲンである。）により表される第４級アンモニウム塩である、
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記テトラゾリウム塩が、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ｄｉニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩、２−（２−ベンゾチアゾリル）−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−［（２−ソジオスルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム、および２，２’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニリレン）ビス［３−（２−ベンゾチアゾリル）−５−［４−［Ｎ−［２−（ソジオオキシスルホニル）エチル］−Ｎ−（２−スルホエチル）カルバモイル］フェニル］−２Ｈ−テトラゾール−３−イウム］からなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法であって、前記糖化ペプチドがフルクトシルペプチドである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記フルクトシルペプチドが、フルクトシル−バリン−ヒスチジンである、方法。
【請求項１３】
カチオン性界面活性剤およびテトラゾリウム塩を含有する、プロテアーゼを活性化するための組成物であって、
前記カチオン性界面活性剤は、化学式Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−（Ｒ１は８以上１８以下の炭素数を有するアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して低級アルキル基であり、Ｘはハロゲンである。）により表される第４級アンモニウム塩である、
組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、前記プロテアーゼが、サーモリシンおよびパパインからなる群から選択される、組成物。
【国際調査報告】
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2014192200.tif 000011
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