(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス株由来プロテインＬのκ鎖可変領域結合ドメインに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
（１）  配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（３）  上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【請求項２】
上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２〜２０のいずれかのアミノ酸配列である請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
【請求項３】
上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１６位または第１８位のいずれかの位置のアミノ酸残基が置換されている請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
【請求項４】
上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位がＨｉｓに、第１６位がＡｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓに、第１７位がＨｉｓに、第１８位がＡｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓに置換されている請求項１〜３のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
【請求項５】
上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
【請求項６】
上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である請求項１〜５のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
【請求項９】
免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項８に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に対する酸解離特性が改良された免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。【０００３】
抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。【０００４】
抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。【０００５】
ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ−κ結合ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ−κ結合ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合ドメインの数は４個である（非特許文献５〜７，特許文献１〜２）。そして、それら計９個のＶＬ−κ結合ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。【０００６】
ＰｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスもすでに複数市販されている。しかし、ＳｐＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１、特許文献３〜８）、ＰｐＬの場合にも、学術的に結合力や結合様式を解析することを目的とした変異導入の報告は複数存在し（非特許文献７〜９）、アフィニティリガンドとしての機能改変を意図した研究の報告も存在する（特許文献９）。しかし、ＳｐＡの場合に比較するとＰｐＬの変異導入報告例は限られており、特にアフィニティ分離マトリックスに吸着した抗体類の酸溶出ｐＨに関して、ＳｐＡの場合にはｐＨ３．５〜４．０で溶出できるという報告が複数あるが（非特許文献１，特許文献７〜８）、ＰｐＬの場合には改良の余地が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平７−５０６５７３号公報
【特許文献２】特表平７−５０７６８２号公報
【特許文献３】米国特許第５１４３８４４号公報
【特許文献４】特開２００６−３０４６３３号公報
【特許文献５】欧州特許第１１２３３８９号公報
【特許文献６】国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット
【特許文献７】米国公開第２００６／０１９４９５０号公報
【特許文献８】国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第００／１５８０３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁
【非特許文献２】Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁
【非特許文献３】Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁
【非特許文献４】Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁
【非特許文献５】Kastern W．ら，J．Biol．Chem．，1992，267巻，12820-12825頁
【非特許文献６】Murphy J．P．ら，Mol．Microbiol．, 1994，12巻，911-920頁
【非特許文献７】Housden N．G．ら，Biochemical Society Transactions，2003，31巻，716-718頁
【非特許文献８】Housden N．G．ら，J．Biol．Chem．，2004，279巻，9370-9378頁
【非特許文献９】Tadeo X．ら，Biophys．J．，2009，97巻，2595-2603頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、免疫グロブリンまたはその断片を精製するためのアフィニティ分離マトリックスは種々開発されている。アフィニティ分離マトリックスにより免疫グロブリンまたはその断片を精製するには、一般的に、中性の溶液とアフィニティ分離マトリックスとを接触させて免疫グロブリンまたはその断片を選択的に吸着させ、洗浄して不純物を除去し、次いで酸性の溶出液により吸着された免疫グロブリンまたはその断片を溶出する。この際、純度の高い目的化合物を得るには、選択的吸着力の高いアフィニティ分離マトリックスを用い、洗浄を十分に行う必要がある。そして、目的化合物を高い回収率で得るために、選択的吸着を確実に解離できる酸性ｐＨで溶出する必要がある。しかし、強い酸性条件下では、目的化合物である免疫グロブリンまたはその断片がダメージを受けるおそれがあった。【００１０】
そこで本発明の目的は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域ペプチドに対して優れた選択的吸着能を示す一方で、比較的高いｐＨの酸性溶出液により当該κ鎖可変領域ペプチドを放出可能な免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、プロテインＬ（ＰｐＬ）をリガンドとするアフィニティ分離マトリックスを予備的に評価した際に、軽鎖がκ鎖であるにもかかわらず、断片抗体の種類によってクロマトグラフィ・プロファイルが大きく異なることを発見した。具体的には、結合容量が高く、中間洗浄での漏出も見られない断片抗体に対しては、酸溶出時により強い酸が必要とされる傾向がある。本発明者は、上記課題を解決するために、ＰｐＬのκ鎖可変領域結合性ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、該変異体を、形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較検討する検討を行った。その結果、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のプロテインＬのκ鎖可変領域結合性ドメインに特定の変異を導入することにより上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成した。【００１２】
以下、本発明を示す。【００１３】
［１］  下記（１）〜（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
（１）  配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（３）  上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。【００１４】
［２］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２〜２０のいずれかのアミノ酸配列である上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。【００１５】
［３］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１６位または第１８位のいずれかの位置のアミノ酸残基が置換されている上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。【００１６】
［４］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位がＨｉｓに、第１６位がＡｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓに、第１７位がＨｉｓに、第１８位がＡｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓに置換されている上記［１］〜［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。【００１７】
［５］  上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。【００１８】
［６］  上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。【００１９】
［７］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。【００２０】
［８］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。【００２１】
［９］  免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［８］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。【００２２】
［１０］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。【００２３】
［１１］  上記［１０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。【００２４】
［１２］  上記［１１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によって得られたκ鎖可変領域結合性ペプチドを不溶性担体に固定化したアフィニティ分離マトリックスは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有タンパク質に対して優れた選択的吸着能を示す。その一方で、優れた酸解離特性という互いに相反する特性を示す。ここでの「優れた酸解離特性」とは、より中性側の酸性溶出条件でκ鎖可変領域含有タンパク質が解離され、且つ、κ鎖可変領域含有タンパク質を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピーク・プロファイルがよりシャープであるといった特性を指す。クロマトグラフィの溶出ピークがよりシャープになることで、より少ない容量の溶出液でより高濃度の抗体含有溶出液を回収可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＰｐＬ由来ＶＬ−κ結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図２】図２は、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドの作製方法を示す図である。
【図３】図３は、第１６位に変異を導入した各種ＬＢ５ｔ変異体をａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体に添加し、ｐＨ勾配にて溶出した際のアフィニティ精製クロマトグラフィのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、下記（１）〜（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドに関する。
（１）  配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
（３）  上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００２８】
「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００２９】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）に結合する（非特許文献５〜７）。
【００３０】
本発明に係るκ鎖可変領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＶＬ−κ鎖可変領域含有タンパク質は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ−κ鎖可変領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
【００３１】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
【００３２】
「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４〜６）。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と略記することがある。ＰｐＬ３１２のアミノ酸配列を配列番号１に、ＰｐＬ３３１６のアミノ酸配列を配列番号２に示す（シグナル配列も含む）。
【００３３】
ＰｐＬは、タンパク質中に７０〜８０残基からなる複数のＶＬ−κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１ドメイン（配列番号３）、Ｂ２ドメイン（配列番号４）、Ｂ３ドメイン（配列番号５）、Ｂ４ドメイン（配列番号６）、Ｂ５ドメイン（配列番号７）と呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１ドメイン（配列番号８）、Ｃ２ドメイン（配列番号９）、Ｃ３ドメイン（配列番号１０）、Ｃ４ドメイン（配列番号１１）と呼ぶ（非特許文献５〜６）。
【００３４】
これらの各種ＶＬ−κ結合性ドメインのアミノ酸配列アラインメントを図１に示す。図１中、非特許文献７〜８および特許文献９に倣って付与した残基番号を（）内に示した。Ｎ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端領域を欠失させた場合にも、ＶＬ−κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ−κ結合性を示す（非特許文献７）。したがって、例えば、Ｂ１ドメインに関しては配列番号１２のアミノ酸配列、Ｂ２ドメインに関しては配列番号１３のアミノ酸配列、Ｂ３ドメインに関しては配列番号１４のアミノ酸配列、Ｂ４ドメインに関しては配列番号１５のアミノ酸配列、Ｂ５ドメインに関しては配列番号１６のアミノ酸配列、Ｃ１ドメインに関しては配列番号１７のアミノ酸配列、Ｃ２ドメインに関しては配列番号１８のアミノ酸配列、Ｃ３ドメインに関しては配列番号１９のアミノ酸配列、Ｃ４ドメインに関しては配列番号２０のアミノ酸配列で示されるペプチドも、ＶＬ−κ結合性ドメインとして機能する。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であることも好ましい。また、本発明に適用するアミノ酸配列として、各種ドメイン（配列番号１２〜２０）に共通するアミノ酸残基を網羅的に含んだアミノ酸配列（配列番号２１）であることも好ましい。本明細書においては、配列番号２１のＮ末端を第１位と定義して、アミノ酸残基番号を付与する。図１には、この定義に従った残基番号も示し、さらに、各種ドメイン（配列番号１２〜２０）の第１位に位置するＶａｌから第６０位に位置するＡｌａまでを太字で示した。
【００３５】
本発明は、野生型のＰｐＬのＶＬ−κ結合ドメイン（Ｂ１〜Ｂ５、Ｃ１〜Ｃ４）のいずれかに対し、特定のアミノ酸置換変異を導入することによって、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質の酸解離ｐＨを、変異導入前に比べて中性側にシフトさせることを特徴とする技術である。
【００３６】
変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、より高ｐＨの酸性溶出条件でκ鎖可変領域ペプチドを解離し、且つ、κ鎖可変領域ペプチドを酸性条件下で溶出させたときの溶出ピークがよりシャープである。
【００３７】
本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は、配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基である。例えば、配列番号１２の第１５位はＧｌｎ、第１６位はＴｈｒ、第１７位はＡｌａ、第１８位はＧｌｕである。配列番号１２〜２０のアミノ酸配列において、第１５位はＧｌｎであり、第１７位はＡｌａである。また、第１６位はＣ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）においてはＡｓｎであり、第１８位はＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）においてはＴｈｒである。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号２１の第１５〜１８位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）、または、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。なお、非特許文献７〜８および特許文献９に記載の残基番号に従えば、本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は第３５位〜第３８位に相当する。
【００３８】
本発明に係る変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）は、上述の第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。置換される位置は、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位が好ましく、第１５位、第１６位および第１８位がより好ましく、第１６位および第１８位がさらに好ましく、第１６位が最も好ましい。
【００３９】
本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００４０】
変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。また、酸性条件でプロトネーションする官能基を側鎖に有するアミノ酸であるＨｉｓ、Ａｓｐ、および、Ｇｌｕを好適に用いることもできる。
【００４１】
第１５位で置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＨｉｓが好ましく、Ｈｉｓが特に好ましい。第１６位で置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ，Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓが好ましく、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓが好ましい。第１７位で置換されるアミノ酸の種類としては、ＧｌｕまたはＨｉｓが好ましく、Ｈｉｓが特に好ましい。第１８位で置換されるアミノ酸の種類としては、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓが好ましい。
【００４２】
変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（２）は、上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである。
【００４３】
上記の欠失、置換および／または付加の変異の数としては、１５以下または１０以下が好ましく、７以下、５以下または３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。本発明に係る変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置は、変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）で規定された第１５位、第１６位、第１７位および第１８位以外であれば、特に制限されない。アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。
【００４４】
配列番号１２〜２１のアミノ酸配列は、配列番号３〜１１のアミノ酸配列のＮ末端側の１０〜２０残基およびＣ末端側の１〜２残基を欠失させたアミノ酸配列である。したがって、実施形態の一つとして、Ｎ末端および／またはＣ末端へのアミノ酸の付加としては、これらのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を付加することが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｎ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、または、Ｇｌｕ−Ｇｌｎが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｃ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＧｌｙ−Ｃｙｓが挙げられる。
【００４５】
変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００４６】
本発明に係る変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００４７】
上記配列同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上が特に好ましい。上記配列同一性は、上述の通り、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って評価することができる。
【００４８】
本発明に係る変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）〜（３）は、免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＬ−κ）含有タンパク質に対する酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする。一般的に、強酸条件下や強塩基条件下では、分子表面電荷の変化や変性による立体構造の変化が要因となって、ペプチド間の結合は失われてしまう。「酸解離ｐＨ」とは、酸性側（値が７より小さいｐＨ）でその特異的結合が失われ解離するｐＨのことである。酸解離ｐＨは、本発明に係る変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）〜（３）をリガンドとするアフィニティ分離マトリックスに吸着したＶＬ−κ含有タンパク質を分離（溶出）することが可能な、最も高いｐＨ値ということができる。よって、本明細書においては、酸解離ｐＨと酸溶出ｐＨは、基本的には同義である。酸解離ｐＨが「変異導入前に比べて中性側にシフトする」というのは、結合の解離に必要なｐＨの数値が、変異導入前の方が小さく、変異導入後の方が大きいということを意味する。即ち、変異導入後の方がより弱い酸性溶液で結合が解離するということを意味する。
【００４９】
酸解離ｐＨの数値は、ＶＬ−κ含有タンパク質の種類、酸性溶液のバッファー成分の種類・濃度によっても変わり、アフィニティ分離マトリックスの場合には、水不溶性担体の種類・構造やリガンド固定化用リンカーの種類・構造によっても変わるので、一義的に数値の範囲で示すのは難しい。一般的には、本変異を導入する前の酸解離ｐＨは２．０以上３．５以下程度であるのが、本発明に係る変異を導入することによって、ｐＨ３．０以上４．５以下程度にシフトするが、これには限定されない。この条件下で溶出すると、抗体へのダメージが小さい（Ghose S. 他、Biotechnology amd bioengineering、2005年、92巻、6号）。本発明に係る変異を導入することによって、酸解離ｐＨは、ｐＨ値にして０．１以上中性側にシフトすることが好ましく、ｐＨ値にして０．２以上中性側にシフトすることがより好ましく、ｐＨ値にして０．３以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．４以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．５以上中性側にシフトすることがさらにより好ましい。
【００５０】
変異導入前後の酸解離ｐＨを評価する方法は、生体分子間相互作用を検出できる手法であれば特に限定はされないが、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができる。酸解離ｐＨの測定方法としては、例えば、結合する一方のペプチドをセンサーチップに固定化し、所望のｐＨに調整したもう一方のペプチド溶液を流路添加し、結合シグナルの有無を検出し、結合シグナルが検出できなくなるｐＨを評価すれば良いが、これに限定されない。別の方法としては、ペプチド溶液を添加した後に、所望のｐＨの緩衝液を添加し、添加した前後でのチップ上で解離せずに残った結合シグナルの変化を評価してもよい。測定条件としては、温度は２０〜４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨはｐＨ５〜８の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられ、酸性の場合には、酢酸、クエン酸、グリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液のＮａＣｌ濃度は、特に限定はされないが、０〜０．１５Ｍ程度が好ましく、特に解離状態を見るときは０Ｍが好ましい。この評価においては、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた評価では、変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを、チップに固定化する側（固相）としても良いし、流路添加する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドをチップに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、流路添加する際の濃度を揃えて変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを流路添加する方が好ましい。
【００５１】
酸解離ｐＨを評価する方法として、アフィニティ分離マトリックスを用いて、クロマトグラフィ・プロファイルを評価する方法も好ましい。例えば、結合する一方のペプチドをクロマトグラフィ用カラムに固定化し、そのカラムをクロマトグラフィ装置に接続した後で、もう一方のペプチド溶液をそのカラムに添加し、ｐＨを徐々に下げる直線勾配をかけて吸着したペプチドが溶出したピークトップのｐＨを評価すればよいが、これに限定されない。測定時の温度、緩衝液、塩濃度は上述の条件に従うのが好ましいが、特にこれには限定されない。例えば、きれいなｐＨ直線勾配を得る為に、結合用緩衝液（緩衝液Ａ）と解離用緩衝液（緩衝液Ｂ）の成分はｐＨ以外は同一とするのが好ましい。この評価においても、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。この評価系においても、変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを、カラムに固定化する側（固相）としても良いし、添加して溶出する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドをカラムに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、カラムに添加する際の濃度を揃えて変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを添加し、得られたクロマトグラフィ・プロファイルを重ねて比較する方が好ましい。
【００５２】
本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）〜（３）は、アフィニティ・リガンドとしてカラムに保持可能であり、優れたＶＬ−κ結合力を示す。ＶＬ−κ鎖可変領域に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステムなどのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。親和定数は、結合速度定数（ｋon）を解離速度定数（ｋoff）で割った値である（ＫA＝ｋon／ｋoff）。
【００５４】
本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドとＶＬ−κ鎖可変領域含有ペプチドとの親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＶＬ−κ鎖可変領域含有ペプチドを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、ＶＬ−κ鎖可変領域含有ペプチドとの親和定数（ＫA）が、１×１０6Ｍ-1以上であることが好ましく、５×１０6Ｍ-1以上であることがより好ましく、１×１０7Ｍ-1以上であることがさらにより好ましい。しかし、親和定数は、ＶＬ−κ鎖可変領域含有ペプチドの種類や、ＶＬ−κ結合ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
【００５５】
ＰｐＬは、ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。したがって、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、例えば１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、ＰｐＬ３１２のＢ１〜Ｂ４ドメイン、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１〜Ｃ４ドメインのいずれも含まなければ、複数種類のＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００５６】
本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチド多量体の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００５７】
その他、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドまたはその多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【００５８】
本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ−κ鎖可変領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
【００５９】
本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、本発明に係る上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とする。
【００６０】
本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
【００６１】
本発明において「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
【００６２】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００６３】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００６４】
上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性基材に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−）、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
【００６５】
本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
【００６６】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００６７】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ−κ鎖可変領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００６８】
本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ−κ含有タンパク質）をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ−κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
【００６９】
即ち、ＶＬ−κ含有タンパク質の溶液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、ＶＬ−κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ−κ含有タンパク質はカラム内の本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ−κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ−κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
【００７０】
特に、本発明のアフィニティ分離マトリックスでは、より中性側に近いｐＨの酸性緩衝液を溶出液として用いることが可能である。用いる酸性緩衝液としては、ｐＨ値がｐＨ３．０以上であることが好ましく、ｐＨ３．１以上であることがより好ましく、ｐＨ３．２以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．３以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．４以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．５以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．６以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．７以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．８以上であることがさらにより好ましい。用いる酸性緩衝液の上限は特に無いが、アフィニティ・クロマトグラフィにおける中間洗浄でｐＨ５．０程度で洗浄する場合や、精製後にウイルス除去のためにｐＨ３．８程度でインキュベーションする場合においては、用いる酸性緩衝液はｐＨ４．５以下であることが好ましく、ｐＨ４．０以下であることがより好ましい。
【００７１】
本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。
【００７２】
本発明は、上記変異型ＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００７３】
また、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００７４】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００７５】
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００７６】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
【００７７】
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が例えば９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００７８】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００７９】
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００８０】
本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明に係るペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
【００８１】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００８２】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００８３】
さらに、本発明に係るＶＬ−κ鎖可変領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
【００８５】
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００８６】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００８７】
本願は、２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５−１２６６４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５−１２６６４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８９】
以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号７で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５−Ｗｉｌｄ」で示す。また、本実施例においては、配列番号１６で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用しており、これを配列番号７と区別するため、「ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ」と表記する。変異Ｔ１６Ｈを導入したＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体は「ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ」と表記する。種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ１６ＨおよびＴ１８Ｄを導入したＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体は、「ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ／Ｔ１８Ｄ」と表記する。また、ドメイン数に関しては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。単ドメインからなる変異体の場合には、「ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．１ｄ」と表記する。【００９０】
実施例１：  各種改変型ＰｐＬのＶＬ−κ結合ペプチドの調製
（１）  発現プラスミド調製
ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２２）を設計した。なお、実験上の都合から、塩基配列は、Ｎ末端にＧｌｕ−Ｇｌｎが、および、Ｃ末端にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列をコードするように設計した。これらの１〜２残基の付加配列は、野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインに由来する。次に、発現プラスミドの作製方法を図２に示す。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２、または、ｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号２３）／ｆ１−２（配列番号２４）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号２５）／ｆ２−２（配列番号２６）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。【００９１】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットApplied Biosystems社製「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。【００９２】
各種ＬＢ５ｔ変異体をコードするＤＮＡに関しては、作製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを鋳型として、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１の５’側シークエンシング用ＤＮＡプライマーと配列番号２７〜３４の各々のＤＮＡプライマー（３’側）を用いたＰＣＲ反応によって、図２のｆ１に該当する二本鎖ＤＮＡを合成した。ＤＮＡプライマーＰＣＲ反応は、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い行った。この二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドも同じ制限酵素で切断し、両者をライゲーション反応することで、各種ＬＢ５ｔ変異体の発現プラスミドを調製した。各々の変異体を作るときに使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および、変異体のアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。【００９３】
【表１】
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【００９４】
（２）  タンパク質の発現と精製
上記（１）で得られた各種ＬＢ５ｔ変異体遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに２５℃にて１８時間培養した。【００９５】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。【００９６】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。【００９７】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質のＮ末端側には、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが付加された。したがって、例えば、ＬＢ５ｔ−Ｔ３６Ｈ．１ｄは、配列番号４６のアミノ酸配列に対し、Ｎ末端側にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎが、Ｃ末端側にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列のペプチドである。【００９８】
実施例２：  各種ＬＢ５ｔ変異体のａＲＳＶ−Ｆａｂへの親和性評価
（１）  ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメントの調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。具体的には、軽鎖がκ鎖からなる抗ＲＳＶモノクローナルＩｇＧ（一般名「パリビズマブ」，製品名「シナジス」，アッヴィ社）製剤を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティクロマトグラフィにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて精製し、ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液（ａＲＳＶ−Ｆａｂ）を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。【００９９】
（２）  各種ＬＢ５ｔ変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＬＢ５ｔ変異体のＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＬＢ５ｔ変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１または１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，１分間）および添加終了後（解離相，１分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ  ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ａＲＳＶ−Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。比較例２で測定した、野生型のＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの各種結合パラメータと共に、解析結果を表２に示す。【０１００】
【表２】
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【０１０１】
表２に示す結果のとおり、例えば変異体のａＲＳＶ−Ｆａｂへの親和定数ＫAは、野生型（変異前）に比較して、Ｔ１６Ａ、Ｔ１６Ｄ、Ｔ１６Ｈ、Ｔ１８ＨおよびＴ１８Ｑの変異を導入した場合には、ほぼ同等から約２倍となっており、ＶＬ−κ結合性が維持されていることを示す結果となった。Ｑ１５Ｈ、Ａ１７Ｈ、Ｔ１８Ｄの変異に関しては、親和定数ＫAは低下したが、その数値は１×１０6（１／Ｍ）以上である。ＶＬ−κ結合力は、リガンドとして相手分子をカラムに保持できれば良く、結合力が強過ぎると溶出には不利に働く可能性もあるので、１×１０6（１／Ｍ）以上であれば、十分機能すると考えられる。【０１０２】
実施例３：  各種ＬＢ５ｔ変異体のａＲＳＶ−Ｆａｂの酸解離ｐＨの評価
（１）  Ｆａｂフラグメント固定化担体の調製
カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例２で得られたａＲＳＶ−Ｆａｂを固定化したアフィニティ分離マトリックスを作製した。【０１０３】
水不溶性基材として、市販のプレパックカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製「Hitrap NHS activated HP」）１ｍＬを使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、カップリング目的官能基をアミノ基とするタンパク性リガンド固定化用の活性基が導入済みなので、製品マニュアルに従ってリガンドを固定化した。氷浴で冷やした１ｍＭ  ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流す操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。【０１０４】
その後すぐに、カップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）でａＲＳＶ−Ｆａｂを１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したリガンドをカラムに固定化した。【０１０５】
その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応ａＲＳＶ−Ｆａｂを回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ酢酸，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施した。【０１０６】
ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液を流す一連の操作は交互に３回ずつ行った。最後に標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティ分離カラムの作製を完了した。【０１０７】
（２）  Ｆａｂフラグメント固定化担体を用いたクロマトグラフィ実験
実施例１（２）で調製した各種ＬＢ５ｔ変異体を、実施例３（１）で調製したａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化カラムを利用したアフィニティ精製クロマトグラフィにより、ＬＢ５ｔ変異体の溶出ピークトップにおけるｐＨ（酸解離ｐＨ）を解析した。具体的には、クロマトシステムとしては、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用し、イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  クエン酸−クエン酸Ｎａ，ｐＨ５．５）にて平衡化したカラムに、約０．１ｍｇ／ｍＬに調整した各種ＬＢ５ｔ変異体のタンパク質溶液を０．１ｍＬ添加し、ｐＨ５．５からｐＨ２．５へのｐＨ直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Ａとイオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）を利用しており、カラムに２０カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Ｂの濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離ｐＨを評価した。実際のデータの一例として、各種ＬＢ５ｔの第１６位に変異を導入した変異体に関し、比較例３の野生型ＬＢ５ｔとの比較も出来る形で重ね合わせたクロマトグラフィのチャートを図３に示した。この実験において、本発明で得られた各種ＬＢ５ｔ変異体（ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ａ．１ｄ、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｄ．１ｄ、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．１ｄ）が、変異を導入していないＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄよりも早く溶出した。これは、より中性側に近いｐＨで各種ＬＢ５ｔ変異体が溶出されることを示している。即ち、本発明のペプチドは、ＶＬ−κ鎖可変領域含有タンパク質と解離するｐＨがより中性側に改変されたことを示すデータであるといえる。この実験系における、各々の溶出位置（ピークトップ）におけるｐＨ値を、比較例３の結果も併せて表３に示す。【０１０８】
【表３】
2016121703.tif 000004
【０１０９】
表３に示す結果のとおり、各々の変異体に関して、ＶＬ−κ鎖可変領域含有ペプチドと解離するｐＨがより中性側に改変された。【０１１０】
比較例１：  ＰｐＬの野生型Ｂ５ドメイン（ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
実施例１にて調製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。【０１１１】
比較例２：  ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ−Ｆａｂへの親和性評価
比較例１で調製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例２（１）で調製したＲＳＶ−Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、上記の表２に併せて示した。【０１１２】
比較例３：  ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ−Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価
比較例１で調製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例３（１）で調製したＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例３（２）と同様の手法にて酸解離ｐＨを解析した。その解析結果を、上記の表３に併せて示した。【０１１３】
実施例４：  ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型（ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄ）の調製
配列番号１に示されるＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号４６で示されるＢ５ドメイン変異体のアミノ酸配列を４個連結した配列番号５１のアミノ酸配列（「ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄ」）を設計した。配列番号５１のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号５２）を設計した。配列番号５２のＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号５３）の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＬＢ５ｔ−Ｔ３６Ｈ．４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を用いた。各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，「ＢｉｇＤｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。【０１１４】
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン  ３．０％，酵母エキス  ０．５％，グルコース  ３％，硫酸マグネシウム  ０．０１％，硫酸鉄  ０．００１％，塩化マンガン  ０．００１％，塩化亜鉛  ０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃でから５分間遠心分離するにより菌体を分離した。【０１１５】
得られた培養上清から、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ Ｓ（バイオラッド社）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを精製した。ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  ＳはＴｒｉｃｏｒｎ  １０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに酢酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換用緩衝液Ａと陽イオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを分取した。次に、Ｎｕｖｉａ  Ｑカラム（バイオラッド社）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを精製した。Ｎｕｖｉａ  ＱはＴｒｉｃｏｒｎ  １０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、分取したＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄ溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａにて平衡化したＮｕｖｉａ  Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換用緩衝液Ａと陰イオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．０Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ−Ｔ３６Ｈ．４ｄを分取した。分取したＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを再び超純水に透析し、ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄのみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、上記のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡａｖａｎｔ  ２５システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用して実施した。【０１１６】
実施例５：  ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型固定化担体の作製
実施例４で調製したＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを、水不溶性セルロース担体へ固定化した。水不溶性セルロース担体としては、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製，特開２００９−２４２７７０号公報またはＵＳ２００９００６２１１８Ａに記載に方法により得られるゲル）を使用した。この際、エポキシ法を固定化方法として利用した。【０１１７】
具体的には、担体２ｍＬ−ｇｅｌをガラスフィルターにうつし、１０ｍＬ超純水で３回洗浄した。その後、担体を遠沈管にうつし、所定量の１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを加え、３７℃で３０分攪拌した。３０分後、最終濃度が１Ｍとなるように９．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、３７℃で２時間攪拌し、担体をガラスフィルターにうつした。減圧により反応溶液を取り除き、ガラスフィルター上の担体を３０ｍＬの超純水で洗浄し、エポキシ化した担体を得た。【０１１８】
次に、エポキシ化した担体にＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを固定化する操作を行った。エポキシ化した担体１．５ｍＬを遠沈管に移し、さらにＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄ溶液を加えて３７℃で３０分間反応させた。反応後、終濃度が０．６Ｍになるように硫酸ナトリウム粉末を添加した。硫酸ナトリウム添加後、３７℃で２時間反応させた。反応後、担体をガラスフィルターにうつし、固定化緩衝液（１５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）５ｍＬで３回洗浄し、未反応ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄを回収した。次に、担体を５ｍＬの超純水で３回洗浄した後、チオグリセロール含有不活性化緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄した。担体をチオグリセロール含有不活性化緩衝液に懸濁させ回収した後、遠沈管にうつし２５℃で一晩反応させた。その後、担体をガラスフィルターにうつし、超純水および洗浄緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄後、遠沈管にうつし、２５℃で２０分間攪拌した。担体をガラスフィルターにうつし、超純水５ｍＬで３回洗浄した。さらに担体を超純水１０ｍＬ、２０％エタノール１０ｍＬで洗浄した後、２０％エタノール担体に懸濁し回収してＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄ固定化担体を得た。【０１１９】
回収した未反応ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応ＬＢ５ｔ−Ｔ３６Ｈ．４ｄの量を算出した。ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄの仕込み量と定量した未反応ＬＢ５ｔ−Ｔ３６Ｈ．４ｄの量の差からＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｈ．４ｄの固定化量を算出し、さらに担体の体積からリガンド密度を算出した。表４に作製した担体のリガンド密度を示す。【０１２０】
【表４】
2016121703.tif 000005
【０１２１】
実施例６：  ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型固定化担体を用いたクロマトグラフィー実験
実施例５で作製した担体１ｍＬ−ｇｅｌを充填したＴｒｉｃｏｒｎ  ５／５０  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）をクロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ  ２５に接続し、実施例２の（１）で調製したａＲＳＶ−Ｆａｂの溶出ピークトップにおけるｐＨ（酸解離ｐＨ）を解析した。具体的には、イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  クエン酸−クエン酸Ｎａ，ｐＨ５.０）にて平衡化したカラムに、１．０ｍｇ／ｍＬに調整したａＲＳＶ−Ｆａｂ溶液を１．０ｍＬ添加し、ｐＨ５．０からｐＨ２．４へのｐＨ直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Ａとイオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  クエン酸−クエン酸Ｎａ，ｐＨ２．４）を利用しており、カラムに２０カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Ｂの濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離ｐＨを評価した。結果を表５に示す。【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
表５に示す結果のとおり、本発明のＢ５ドメイン変異体を連結したペプチドを固定化したアフィニティー分離マトリックスは、比較的中性に近いｐＨでモノクローナルＦａｂを解離することができた。【０１２４】
実施例７：  各種ＶＬ−κ鎖結合ドメイン変異体の追加調製、および、ＶＬ−κ鎖可変領域を含むＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価
（１）  発現プラスミド調製、および、タンパク質の発現と精製
ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）、ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）、またはＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２０）の変異体の発現プラスミドを追加で調製した。ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのコードＤＮＡを有する変異導入用発現プラスミドは、表６に示す配列番号５４〜６１の一本鎖オリゴＤＮＡを用いて、実施例１（１）の記載と同様の手法にて調製した。調製した発現プラスミドにおいて目的のペプチドをコードするＤＮＡについて、ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄは配列番号６２の塩基配列、ＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄは配列番号６３の塩基配列であることを、実施例１（１）の記載と同様の手法にて、塩基配列解析で確認した。【０１２５】
【表６】
2016121703.tif 000007
【０１２６】
各種単ドメイン型ＶＬ−κ鎖結合ドメイン変異体の発現プラスミドに関しては、各々の対応する野生型の発現プラスミドを鋳型として、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１の５’側シークエンシング用ＤＮＡプライマーと配列番号６４〜６９の各々の３’側ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、図２のｆ１に該当する二本鎖ＤＮＡを合成し、実施例１（１）の記載と同様の手法にて調製した。各々の変異体を作製する際に使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および変異体のアミノ酸配列の配列番号を表７に示す。各種変異体に関し、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。【０１２７】
【表７】
2016121703.tif 000008
【０１２８】
（２）  各種ＶＬ−κ鎖結合ドメイン変異体のＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価
ａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体、またはａＩｇＥ−Ｆａｂ固定化担体を用いて、（１）にて調製した各種ＶＬ−κ鎖結合ドメイン変異体のＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価を行った。ａＩｇＥ−Ｆａｂは、抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名「オマリズマブ」，製品名「ゾレア」，ノバルティスファーマ社）より、実施例２（１）に記載の手法にて調製し、ａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体は実施例３（１）に記載の手法にて、市販のプレパックカラムに固定化することで調製した。各種ＶＬ−κ鎖結合ドメイン変異体のａＲＳＶ−ＦａｂまたはａＩｇＥ−Ｆａｂに対する酸解離ｐＨは、実施例３（２）記載と同様のクロマトグラフィ実験にて評価した。【０１２９】
最初に、ａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体を用いた評価結果、即ち、各々の溶出位置を示すピークトップにおけるｐＨ値を、比較例３および５の結果も併せて表８に示す。【０１３０】
【表８】
2016121703.tif 000009
【０１３１】
追加したＬＢ５ｔ変異体（ＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｉ．１ｄとＬＢ５ｔ−Ｔ１６Ｌ．１ｄ）も同様に、変異を導入していないＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄよりも中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。この結果は、変異アミノ酸の種類が疎水性アミノ酸であっても同様の効果が得られることを示している。実施例３の結果と併せて、本発明の本質が、アミノ酸置換変異を配列番号２１の第１５位〜第１８位に導入することにあることを示唆するデータであると言える。また、ＬＢ１ｔ変異体に関しても、本発明の変異を導入した変異体ＬＢ１ｔ−Ｅ１８Ｄ．１ｄが、変異を導入していないＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄよりも中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）とＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）の配列同一性は、６２．３％である。このように変異導入前の配列同一性が６０％程度であっても、ＶＬ−κ鎖結合ドメインとして機能するペプチドには、本発明が適用できることを示唆するデータと言える。【０１３２】
次に、ａＩｇＥ−Ｆａｂ固定化担体を用いた評価結果を、比較例３および５の結果も併せて表９に示す。【０１３３】
【表９】
2016121703.tif 000010
【０１３４】
上記実験結果と同様に、種類の異なるＶＬ−κ鎖可変領域含有タンパク質に対しても、本発明のペプチドは、変異を導入していないペプチドと比較して、中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。かかる結果は、本発明の変異の効果が、特定配列のＶＬ−κ鎖可変領域含有タンパク質に限定されていないことを示唆するデータと考えられる。また、Ｃ４ドメインをベースとした変異体でも同様の傾向が見られたことは、本発明の変異が、特定菌株のプロテインＬに限定されず、一般的なプロテインＬ、またはその類縁体と認知されるタンパク質にも、本発明が適用できることを示唆するデータと考えられる。【０１３５】
比較例４：  ＰｐＬの野生型Ｂ１ドメイン（ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）およびＣ４ドメイン（ＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
実施例７（１）にて調製したＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例７と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。【０１３６】
比較例５：  ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ−Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価、および、ＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのａＩｇＥ−Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価
比較例４で調製したＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例３（１）で調製したａＲＳＶ−Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例７（２）と同様の手法にて酸解離ｐＨを解析した。また、比較例４で調製したＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例７（２）で調製したａＩｇＥ−Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例７（２）と同様のクロマトグラフィ実験にて酸解離ｐＨを解析した。その解析結果を、上記の表８および表９に併せて示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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