(57)【要約】  検出方法は、複数の凸部が、第１の方向に第１のピッチで配列され、第１の方向に交差する第２の方向に第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、回折格子の同一領域に固定された複数種類の捕捉体とを有するチップの回折格子に検体を提供して、複数の被検出物質を捕捉体に結合させる。次いで、複数の被検出物質を複数の蛍光物質でそれぞれ標識させる。次いで、平面視したときに第１の方向となるように、回折格子に第１波長の励起光を照射し、被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出することで被検出物質を検出する。次いで、平面視したときに第２の方向となるように、回折格子に第２波長の励起光を照射し、他の被検出物質を標識した他の蛍光物質から放出された蛍光を検出することで他の被検出物質を検出する。
2016125614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出方法であって、
複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、前記回折格子の前記第１捕捉体が固定されている領域に固定され、前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップの前記回折格子に前記検体を提供して、前記第１捕捉体と前記第１被検出物質とを結合させ、かつ前記第２捕捉体と前記第２被検出物質とを結合させる工程と、
前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１蛍光物質を提供して、前記第１被検出物質を前記第１蛍光物質で標識させる工程と、
前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第２蛍光物質を提供して、前記第２被検出物質を前記第２蛍光物質で標識させる工程と、
平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に第１波長の励起光を照射し、前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第１被検出物質を検出する工程と、
平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射し、前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第２被検出物質を検出する工程とを有する、
検出方法。
【請求項２】
前記第１波長および前記第２波長は、それぞれ４００〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記第１のピッチおよび前記第２のピッチは、それぞれ１００〜２０００ｎｍの範囲内である、請求項１または請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記凸部の高さは、１０〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出装置であって、
前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップを保持するチップホルダーと、
前記チップの同じ位置に対して、第１波長の励起光および前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射する光照射部と、
前記第１波長の励起光によって前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光と、前記第２波長の励起光によって前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光とをそれぞれ検出する光検出部と、を有し、
前記光検出部は、
前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記チップの表面における第１の方向に沿うように、前記チップに前記第１波長の励起光を照射したときに、前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出し、
前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に交差する前記チップの表面における第２の方向に沿うように、前記チップに前記第２波長の励起光を照射したときに、前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出する、
検出装置。
【請求項６】
前記チップホルダーは、前記チップの表面に対する法線を回転軸として、前記チップを回転可能に保持し、
前記光照射部は、前記第１波長の励起光および前記第２波長の励起光を同じ位置から前記チップに向かって照射する、
請求項５に記載の検出装置。
【請求項７】
前記光照射部は、
前記第１波長の励起光を照射するための第１光照射部と、
前記第１光照射部と異なる位置に配置され、前記第２波長の励起光を照射するための第２光照射部と、
を有する、
請求項５に記載の検出装置。
【請求項８】
前記第１波長および前記第２波長は、それぞれ４００〜１０００ｎｍの範囲内である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項９】
被検出物質を標識する蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて放出した蛍光を検出して、検体に含まれる被検出物質を検出するためのチップであって、
複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜を有し、
前記第１のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように第１波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（１）を満たし、
前記第２のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように前記第１波長と異なる第２波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（２）を満たす、
チップ。
【数１】
2016125614.tif 000009
［上記式（１）において、ω1は、第１波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ01は、第１波長の励起光の波数であり、θ1は、第１波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ1は、前記第１のピッチである。］
【数２】
2016125614.tif 000010
［上記式（２）において、ω2は、第２波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ02は、第２波長の励起光の波数であり、θ2は、第２波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ2は、前記第２のピッチである。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる２種類の被検出物質を検出する検出方法および検出装置、ならびに前記検出方法および検出装置において使用されうるチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface plasmon resonance：以下「ＳＰＲ」ともいう）を利用する検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。【０００３】
特許文献１に記載の検出方法では、基板と、基板上に配置された金属膜と、金属膜上の複数の領域にそれぞれ形成された複数の回折格子とを有するチップを使用する。複数の回折格子は、それぞれピッチの異なる複数のスリットを有している。各回折格子には、複数種類の被検出物質を捕捉するための複数種類の捕捉体がそれぞれ配置されている。そして、特許文献１に記載の検出方法では、複数種類の被検出物質をチップに固定された対応する複数種類の捕捉体にそれぞれ結合させる。次いで、各被検出物質を励起波長の異なる対応する蛍光物質で蛍光標識させる。次いで、表面プラズモン共鳴が生じるように、波長の異なる励起光を、チップを移動させてそれぞれの領域に照射する。そして、各領域で生じた蛍光を検出部で検出することで、複数種類の被検出物質を検出している。【０００４】
また、特許文献２に記載の検出方法では、基板と、基板上に配置された金属膜と、金属膜上に形成され、ピッチが異なる複数の回折格子が周方向に形成された平面視形状が円形のチップを使用する。そして、特許文献２に記載の検出方法では、複数種類の被検出物質を各回折格子にそれぞれ固定させる。次いで、表面プラズモン共鳴が生じるように複数種類の励起光を、チップを移動させてそれぞれの回折格子に照射する。そして、各回折格子で生じたラマン散乱光を検出部で検出することで、複数種類の被検出物質を検出している。【０００５】
さらに、特許文献３に記載の検出方法では、基体と、基体上に配置された金属膜と、金属膜上の複数の領域にそれぞれ形成された複数の回折格子とを有するチップを使用する。複数の回折格子は、それぞれピッチの異なる複数の溝を有している。各回折格子には、複数種類の被検出物質を捕捉するための複数種類の捕捉体がスポット状にそれぞれ配置されている。そして、特許文献３に記載の検出方法では、表面プラズモン共鳴が生じるように単一の光源から全スポットに対して単一の波長の入射光を照射する。そして、入射光の反射光を検出部で検出することで、数種類の被検出物質を同時に検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５０１３９１号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１１９３９１号
【特許文献３】特開２００３−１２１３５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１、２に記載の検出方法では、チップまたは検出部を金属膜の面方向に高精度に移動させる必要がある。また、被検出物質の検出条件によっては、チップまたは検出部を平面方向に垂直な方向に高精度で移動する必要がある。【０００８】
また、特許文献１〜３に記載の検出方法で使用されるチップは、複数の回折格子を金属膜上にそれぞれ形成しているため大きい。【０００９】
このように、特許文献１、２に記載の検出方法では、チップまたは検出部を平面方向および平面方向に垂直な方向に高精度で移動する必要があるため、検出装置が大型化してしまうという問題があった。一方、高精度にチップまたは検出部を移動できない場合には、被検出物質の検出精度が低下してしまう問題があった。また、金属膜に複数の回折格子を形成しているため大型化するとともに、大量の検体が必要であった。【００１０】
本発明の目的は、装置を小型化しつつ、少量の検体で複数の被検出物質を検出することができる検出方法および検出装置を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該検出方法および当該検出装置にも使用することができるチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出方法であって、複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、前記回折格子の前記第１捕捉体が固定されている領域に固定され、前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップの前記回折格子に前記検体を提供して、前記第１捕捉体と前記第１被検出物質とを結合させ、かつ前記第２捕捉体と前記第２被検出物質とを結合させる工程と、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１蛍光物質を提供して、前記第１被検出物質を前記第１蛍光物質で標識させる工程と、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第２蛍光物質を提供して、前記第２被検出物質を前記第２蛍光物質で標識させる工程と、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に第１波長の励起光を照射し、前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第１被検出物質を検出する工程と、平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように、前記回折格子の前記第１捕捉体および前記第２捕捉体が固定されている領域に前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射し、前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記第２被検出物質を検出する工程とを有する。【００１２】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、第１被検出物質を標識する第１蛍光物質と第２被検出物質を標識する第２蛍光物質とが、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されてそれぞれ放出した蛍光を検出して、検体に含まれる前記第１被検出物質および前記第２被検出物質を検出する検出装置であって、前記第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と前記第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とを有するチップを保持するチップホルダーと、前記チップの同じ位置に対して、第１波長の励起光および前記第１波長と異なる第２波長の励起光を照射する光照射部と、前記第１波長の励起光によって前記第１被検出物質を標識した前記第１蛍光物質から放出された蛍光と、前記第２波長の励起光によって前記第２被検出物質を標識した前記第２蛍光物質から放出された蛍光とをそれぞれ検出する光検出部と、を有し、前記光検出部は、前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記チップの表面における第１の方向に沿うように、前記チップに前記第１波長の励起光を照射したときに、前記第１蛍光物質から放出された蛍光を検出し、前記光照射部が、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に交差する前記チップの表面における第２の方向に沿うように、前記チップに前記第２波長の励起光を照射したときに、前記第２蛍光物質から放出された蛍光を検出する。【００１３】
さらに、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係るチップは、被検出物質を標識する蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて放出した蛍光を検出して、検体に含まれる被検出物質を検出するためのチップであって、複数の凸部が、第１の方向について第１のピッチで配列され、前記第１の方向に交差する第２の方向について第１のピッチと異なる第２のピッチで配列された回折格子を形成された金属膜を有し、前記第１のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第１の方向に沿うように第１波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（１）を満たし、前記第２のピッチは、平面視したときにその光軸が前記第２の方向に沿うように前記第１波長と異なる第２波長の励起光を前記回折格子に照射したときに、以下の式（２）を満たす。
【数１】
2016125614.tif 000003
［上記式（１）において、ω1は、第１波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ01は、第１波長の励起光の波数であり、θ1は、第１波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ1は、前記第１のピッチである。］
【数２】
2016125614.tif 000004
［上記式（２）において、ω2は、第２波長の励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、前記金属膜に面する媒質の誘電率であり、ε2は、前記金属膜の誘電率であり、ｋ02は、第２波長の励起光の波数であり、θ2は、第２波長の励起光の前記金属膜に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ2は、前記第２のピッチである。］
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、装置を大型化することなく、同一の場所に励起光を照射して複数の被検出物質を高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２は、チップの回折格子の部分拡大斜視図である。
【図３】図３Ａ、Ｂは、チップの断面図である。
【図４】図４は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。
【図５】図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
【図６】図６は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。
【図７】図７は、回折格子の他の形態を示す斜視図である。
【図８】図８は、回折格子の他の形態を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１７】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図（平面図）である。なお、図１では、回折格子１６の構成を明確にするため、凸部１８を拡大して示している。
【００１８】
図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置（検出装置）１００は、チップホルダー１１０、光照射部１２０、光検出部１３０および制御部１４０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０に回折格子１６を有するチップ１０を装着した状態で使用される。そこで、チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１９】
（チップの構成）
図２は、チップ１０の回折格子１６の部分拡大斜視図である。図３Ａは、チップ１０の断面図であり、図３Ｂは、チップ１０の他の形態であるチップ２０の断面図である。なお、図２では、基板１２および金属膜１４の断面を示すハッチングを省略している。
【００２０】
図２に示されるように、チップ１０は、基板１２および金属膜１４を有する。金属膜１４には、回折格子１６が形成されている。回折格子１６の同じ領域には第１捕捉体（例えば第１の１次抗体）および第２捕捉体（例えば第２の１次抗体）が固定化されており、この領域は、第１捕捉体と第１被検出物質とが結合するとともに、第２捕捉体と第２被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図２では、第１捕捉体、第２捕捉体、第１被検出物質および第２被検出物質を省略している。通常、チップ１０は、検出ごとに交換される。
【００２１】
基板１２は、金属膜１４の支持部材である。基板１２の材料は、金属膜１４を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板１２の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
【００２２】
金属膜１４は、基板１２上に配置されている。前述のとおり、金属膜１４には、回折格子１６が形成されている。金属膜１４に光を照射すると、金属膜１４中に生じる表面プラズモンと、回折格子１６により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。
【００２３】
金属膜１４の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１４の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜１４は、金薄膜である。金属膜１４の形成方法は、特に限定されない。金属膜１４の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１４の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２４】
金属膜１４（反応場）には、第１被検出物質を捕捉するための第１捕捉体と、第２被検出物質を捕捉するための第２捕捉体とが固定されている。第１捕捉体は、第１被検出物質に特異的に結合する。また、第２捕捉体は、第２被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、金属膜１４の同じ領域に、第１捕捉体および第２捕捉体が略均一に固定化されている。第１捕捉体および第２捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、第１捕捉体および第２捕捉体は、第１被検出物質および第２被検出物質にそれぞれ特異的な抗体（第１の１次抗体および第２の１次抗体）またはその断片、第１被検出物質および第２被検出物質にそれぞれ特異的に結合可能な酵素などである。
【００２５】
第１捕捉体および第２捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜１４の上に、第１捕捉体および第２捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）11−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、第１捕捉体および第２捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜１４に固定化し、この高分子に第１捕捉体および第２捕捉体を結合させてもよい。
【００２６】
図２に示されるように、回折格子１６は、複数の凸部１８を有する。回折格子１６は、金属膜１４に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。複数の凸部１８は、第１の方向について第１のピッチλ1で配列されている。また、複数の凸部１８は、第１の方向に交差する第２の方向について、第１のピッチλ1と異なる第２のピッチλ2で配列されている。ここで、「第１のピッチλ1」とは、第１の方向における回折格子１６の繰り返し単位の長さをいう。また、「第２のピッチλ2」とは、第２の方向における回折格子１６の繰り返し単位の長さをいう。第１のピッチλ1と、第２のピッチλ2とは、それぞれ１００〜２０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００２７】
凸部１８の平面視形状は、特に限定されない。本実施の形態では、凸部１８の平面視形状は、長方形である。また、本実施の形態では、平面視したときの各凸部１８の大きさは、すべて同じである。
【００２８】
第１の方向（図２のｘ方向）と、第２の方向（図２のｙ方向）とは、平面視したときに、第１の方向に沿う第１仮想直線Ｌ１と、第２の方向に沿う第２仮想直線Ｌ２とが交差するように設定される。また、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度は、特に限定されない。本実施の形態では、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度θは、９０°である。
【００２９】
また、第１の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第１高さｈ１は、全て同じ高さである。また、第２の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第２高さｈ２は、全て同じ高さである。さらに、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、同じ高さであってもよいし、異なる高さであってもよい。本実施の形態では、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、同じ高さである。また、第１高さｈ１と、第２高さｈ２とは、１０〜１０００ｎｍの範囲であることが好ましい。
【００３０】
回折格子１６の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板１２の上に金属膜１４を形成した後、金属膜１４に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板１２の上に、金属膜１４を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子１６を含む金属膜１４を形成することができる。
【００３１】
回折格子１６は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常は、回折格子１６は、液体を収容可能な空間に配置される。たとえば、回折格子１６は、図３Ａに示されるように、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。
【００３２】
ここで、回折格子１６に光（励起光）を照射したときにプラズモン共鳴が起こるための条件について説明する。
【００３３】
２種類の媒質の界面において、励起される表面プラズモンの波数ｋspは、以下の式（１）で表すことができる。なお、以下の式（１）において、ωは、励起光の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、媒質１（本実施の形態では水）の誘電率であり、ε2は、媒質２（本実施の形態では金属膜）の誘電率である。
【００３４】
【数３】
2016125614.tif 000005
【００３５】
そして、励起される表面プラズモンの波数ｋspが回折格子１６に対して、以下の式（２）を満たすときに表面プラズモン共鳴が起こる。なお、以下の式（２）において、ｋ0は、励起光の波数であり、θは、励起光の入射角であり、λは、回折格子１６の繰り返し単位の長さ（ピッチ）であり、ｍは、任意の整数である。
【００３６】
【数４】
2016125614.tif 000006
【００３７】
よって、本実施の形態に係る回折格子１６では、第１の方向において前述の式（１）および式（２）から導き出される以下の式（３）を満たすように第１のピッチλ1が設定され、第２の方向において前述の式（１）および式（２）から導き出される以下の式（４）を満たすように第２のピッチλ2が設定される。
【００３８】
【数５】
2016125614.tif 000007
［上記式（３）において、ω1は、第１波長の第１励起光α１の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、金属膜１４に面する媒質の誘電率であり、ε2は、金属膜１４の誘電率であり、ｋ01は、第１波長の第１励起光α１の波数であり、θ1は、第１波長の第１励起光α１の金属膜１４に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ1は、第１のピッチである。］
【００３９】
【数６】
2016125614.tif 000008
［上記式（４）において、ω2は、第２波長の第２励起光α２の角周波数であり、ｃは、光の速度であり、ε1は、金属膜１４に面する媒質の誘電率であり、ε2は、金属膜１４の誘電率であり、ｋ02は、第２波長の第２励起光α２の波数であり、θ2は、第２波長の第２励起光α２の金属膜１４に対する入射角であり、ｍは、任意の整数であり、λ2は、第２のピッチである。］
【００４０】
第１励起光α１は、平面視したときにその光軸が第１の方向に沿うように、金属膜１４に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。また、第２励起光α２は、平面視したときにその光軸が第２の方向に沿うように、金属膜１４に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このとき、第１励起光α１および第２励起光α２は、同じ領域に入射する。このように金属膜１４に対して第１励起光α１または第２励起光α２を表面プラズモン共鳴が生じる角度でそれぞれ照射することで、金属膜１４上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜１４上に存在する第１被検出物質を標識する第１蛍光物質および第２被検出物質を標識する第２蛍光物質が励起され、第１蛍光γ１および第２蛍光γ２がそれぞれ放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、第１蛍光物質から放出された第１蛍光γ１および第２蛍光物質から放出された第２蛍光γ２の光量をそれぞれ検出することで、第１被検出物質および第２被検出物質の存在または量を検出する。
【００４１】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０、光照射部１２０、光検出部１３０および制御部１４０を有する。
【００４２】
チップホルダー１１０は、チップ１０を保持する。チップホルダー１１０の形状は、チップ１０を保持することができ、かつ第１励起光α１、第２励起光α２、第１蛍光γ１および第２蛍光γ２の光路を妨げなければ特に限定されない。本実施の形態では、チップホルダー１１０は、上面が開放された箱状に形成されている。チップ１０は、チップホルダー１１０の内部に収容される。
【００４３】
光照射部１２０は、チップホルダー１１０に保持されたチップ１０（金属膜１４の回折格子１６）に第１励起光α１および第２励起光α２を出射する。第１蛍光γ１および第２蛍光γ２の測定時には、光照射部１２０は、金属膜１４に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、第１励起光α１および第２励起光α２を回折格子１６の同じ領域に向けて出射する。ここで「第１励起光」とは、第１蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、第１励起光α１は、回折格子１６（金属膜１４）に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、後述の第１蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１４の表面上に生じさせる光である。また、「第２励起光」とは、第２蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、第２励起光α２は、回折格子１６（金属膜１４）に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、後述の第２蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜１４の表面上に生じさせる光である。
【００４４】
光照射部１２０は、第１光出射ユニット（第１光照射部）１２１および第２光出射ユニット（第２光照射部）１２２を有する。第１光出射ユニット１２１は、第１光源ユニット１２３、第１角度調整機構１２４および第１光源制御部１２５を含む。また、第２光出射ユニット１２２は、第２光源ユニット１２６、第２角度調整機構１２７および第２光源制御部１２８を含む。
【００４５】
第１光源ユニット１２３は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第１励起光α１を、金属膜１４（回折格子１６）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第１光源ユニット１２３は、平面視したときに出射される光の光軸が第１の方向（図２のｘ方向）に沿うように配置されている。また、第２光源ユニット１２６は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の第２励起光α２を、金属膜１４（回折格子１６）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第２光源ユニット１２６は、平面視したときに出射される光の光軸が第２の方向（図２のｙ方向）に沿うように配置されている。第１光源ユニット１２３は、例えば、第１励起光α１の光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）をそれぞれ含む。また、第２光源ユニット１２６は、例えば、第２励起光α２の光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）をそれぞれ含む。第１光源ユニット１２３から出射される第１励起光α１の第１波長と、第２光源ユニット１２６から出射される第２励起光α２の第２波長は、互いに異なるが、いずれも４００〜１０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００４６】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子１６などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００４７】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２をコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２を中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの第１励起光α１および第２励起光α２は、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された第１励起光α１または第２励起光α２を完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜１４にＰ波成分が入射するように第１励起光α１または第２励起光α２の偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜１４の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、第１励起光α１または第２励起光α２のビーム径や輪郭形状などを調整する。ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、第１励起光α１または第２励起光α２から分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射される光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００４８】
第１角度調整機構１２４は、金属膜１４の表面への第１励起光α１の入射角を調整する。第１角度調整機構１２４は、金属膜１４表面の所定の位置に向けて所定の入射角で第１励起光α１を照射するために、第１励起光α１の光軸とチップ１０（金属膜１４）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整機構１２４は、第１励起光α１の光軸と金属膜１４の交点を通り、第１励起光α１の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１光源ユニット１２３を回動させる。また、第２角度調整機構１２７は、金属膜１４の表面への第２励起光α２の入射角を調整する。第２角度調整機構１２７は、金属膜１４表面の所定の位置に向けて所定の入射角で第２励起光α２を照射するために、第２励起光α２の光軸とチップ１０（金属膜１４）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第２角度調整機構１２７は、第２励起光α２の光軸と金属膜１４の交点を通り、第２励起光α２の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第２光源ユニット１２６を回動させる。
【００４９】
金属膜１４の表面に対する第１励起光α１の入射角のうち、第１プラズモン散乱光δ１の最大光量を得られる角度が第１増強角である。第１励起光α１の入射角を第１増強角に設定することで、高強度の第１蛍光γ１を測定することが可能となる。金属膜１４の表面に対する第２励起光α２の入射角のうち、第２プラズモン散乱光δ２の最大光量を得られる角度が第２増強角である。第２励起光α２の入射角を第２増強角に設定することで、高強度の第２蛍光γ２を測定することが可能となる。なお、金属膜１４の膜厚、流路内の液体の屈折率などにより、第１励起光α１または第２励起光α２の基本的な入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の種類および量などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。
【００５０】
第１光源制御部１２５は、第１光源ユニット１２３に含まれる各種機器を制御して、第１光源ユニット１２３の出射光（第１励起光α１）の出射を制御する。第２光源制御部１２８は、第２光源ユニット１２６に含まれる各種機器を制御して、第２光源ユニット１２６の出射光（第２励起光α２）の出射を制御する。第１光源制御部１２５および第２光源制御部１２８は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによってそれぞれ構成される。
【００５１】
光検出部１３０は、第１光検出ユニット１３１（第１光検出部）および第２光検出ユニット１３２（第２光検出部）を有する。第１光検出ユニット１３１は、第１被検出物質の検出時において金属膜１４の表面への第１励起光α１の照射によって生じた第１蛍光γ１と、第１増強角の測定時において金属膜１４の面への第１励起光α１の照射によって生じた第１プラズモン散乱光δ１とを検出する。第１光検出ユニット１３１は、第１光源ユニット１２３に対して、第１励起光α１の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第２光検出ユニット１３２は、第２被検出物質の検出時において金属膜１４の表面への第２励起光α２の照射によって生じた第２蛍光γ２と、第２増強角の測定時において金属膜１４の面への第２励起光α２の照射によって生じた第２プラズモン散乱光δ２とを検出する。第２光検出ユニット１３２は、第２光源ユニット１２６に対して、第２励起光α２の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第１光検出ユニット１３１は、第１受光センサー１３３、第３角度調整機構１３４および第１受光センサー制御部１３５を含む。また、第２光検出ユニット１３２は、第２受光センサー１３６、第４角度調整機構１３７および第２受光センサー制御部１３８を含む。
【００５２】
第１受光センサー１３３は、第１光源ユニット１２３が第１励起光α１を照射することにより生じる第１蛍光γ１または第１プラズモン散乱光δ１を検出する。また、第２受光センサー１３６は、第２光源ユニット１２６が第２励起光α２を照射することにより生じる第２蛍光γ２または第２プラズモン散乱光δ２を検出する。第１受光センサー１３３は、微小量の第１被検出物質からの微弱な第１蛍光γ１または第１プラズモン散乱光δ１を検出することが可能な高い感度を有する。第２受光センサー１３６は、微小量の第２被検出物質からの微弱な第２蛍光γ２または第２プラズモン散乱光δ２を検出することが可能な高い感度を有する。第１受光センサー１３３および第２受光センサー１３６は、例えば、それぞれ光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００５３】
第３角度調整機構１３４は、第１受光センサー１３３が第１蛍光γ１を検出できるように、第１受光センサー１３３の光軸を調整する。本実施の形態では、第３角度調整機構１３４は、第１蛍光γ１の光軸と金属膜１４の交点を通り、第１蛍光γ１の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。第４角度調整機構１３７は、第２受光センサー１３６が第２蛍光γ２を検出できるように、第２受光センサー１３６の光軸を調整する。本実施の形態では、第４角度調整機構１３７は、第２蛍光γ２の光軸と金属膜１４の交点を通り、第２蛍光γ２の光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第２受光センサー１３６を回動させる。
【００５４】
第１受光センサー制御部１３５は、第１受光センサー１３３の出力値の検出や、検出した出力値による第１受光センサー１３３の感度の管理、適切な出力値を得るための第１受光センサー１３３の感度の変更などを制御する。第２受光センサー制御部１３８は、第２受光センサー１３６の出力値の検出や、検出した出力値による第２受光センサー１３６の感度の管理、適切な出力値を得るための第２受光センサー１３６の感度の変更などを制御する。第１受光センサー制御部１３５および第２受光センサー制御部１３８は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによってそれぞれ構成される。
【００５５】
制御部１４０は、例えば、記憶部、処理部、演算装置、制御装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されており、第１角度調整機構１２４、第１光源制御部１２５、第２角度調整機構１２７、第２光源制御部１２８、第３角度調整機構１３４、第１受光センサー制御部１３５、第４角度調整機構１３７および第２受光センサー制御部１３８を制御する。
【００５６】
（検出装置の検出動作）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（実施の形態１に係る検出方法）について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、第１捕捉体として第１の１次抗体と、第２捕捉体として第２の１次抗体とが金属膜１４上の同じ領域に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体と、第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体とを使用している。
【００５７】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、チップ１０を準備して、チップホルダー１１０にチップ１０を設置する。また、チップ１０の金属膜１４上に保湿剤が存在する場合は、第１の１次抗体および第２の１次抗体が適切に第１被検出物質および第２被検出物質をそれぞれ捕捉できるように、金属膜１４上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５８】
次いで、第１励起光α１の入射角を決定する（工程Ｓ１２０）。具体的には、制御部１４０は、第１角度調整機構１２４を駆動して第１励起光α１の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第１プラズモン散乱光δ１を検出する。そして、第１プラズモン散乱光δ１の光量が最大となる角度を第１蛍光γ１測定時の第１励起光α１の入射角（第１増強角）とする。
【００５９】
次いで、第２励起光α２の入射角を決定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部１４０は、第２角度調整機構１２７を駆動して第２励起光α２の入射角を走査しながら、第４角度調整機構１３７を駆動して第２受光センサー１３６により第２プラズモン散乱光δ２を検出する。そして、第２プラズモン散乱光δ２の光量が最大となる角度を第２蛍光γ２測定時の第２励起光α２の入射角（第２増強角）とする。
【００６０】
なお、第１励起光α１の入射角の決定（工程Ｓ１２０）と第２励起光α２の入射角の決定（工程Ｓ１３０）との順番は、これに限定されない。たとえば、第２励起光α２の入射角を決定した後に、第１励起光α１の入射角を決定してもよい。
【００６１】
次いで、検体中の第１被検出物質と第１の１次抗体とを反応させるとともに、第２被検出物質と第２の１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１４０）。具体的には、金属膜１４上に検体を提供して、検体と第１の１次抗体および第２の１次抗体とを接触させる。検体中に第１被検出物質が存在する場合は、第１被検出物質の少なくとも一部は第１の１次抗体に結合する。また、検体中に第２被検出物質が存在する場合は、第２被検出物質の少なくとも一部は第２の１次抗体に結合する。この後、金属膜１４上を緩衝液などで洗浄して、第１の１次抗体または第２の１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００６２】
次いで、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質を第１蛍光物質で標識するとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質を第２蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１５０）。具体的には、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体および第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜１４上に提供して、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質と蛍光標識液とを接触させるとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、第１蛍光物質で標識された第１の２次抗体と、第２蛍光物質で標識された第２の２次抗体とを含む緩衝液である。第１被検出物質が第１の１次抗体に結合している場合は、第１被検出物質の少なくとも一部は、第１蛍光物質で標識される。また、第２被検出物質が第２の１次抗体に結合している場合は、第２被検出物質の少なくとも一部は、第２蛍光物質で標識される。第１蛍光物質または第２蛍光物質で標識した後は、金属膜１４上を緩衝液などで洗浄し、遊離の第１の２次抗体および第２の２抗体などを除去することが好ましい。
【００６３】
なお、１次反応（工程Ｓ１４０）と２次反応（工程Ｓ１５０）との順番は、これに限定されない。たとえば、第１被検出物質を第１の２次抗体に結合させるとともに、第２被検出物質を第２の２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１４上に提供してもよい。また、金属膜１４上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００６４】
次いで、第１被検出物質を検出する（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部１４０は、第１光源制御部１２５を駆動して第１励起光α１を工程Ｓ１２０で決定した入射角（第１増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第１受光センサー制御部１３５を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第１蛍光γ１の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。
【００６５】
次いで、第２被検出物質を検出する（工程Ｓ１７０）。具体的には、制御部１４０は、第２光源制御部１２８を駆動して第２励起光α２を工程Ｓ１３０で決定した入射角で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第２受光センサー制御部１３８を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第２蛍光γ２の強度を検出するように第２受光センサー１３６を制御する。
【００６６】
なお、制御部１４０は、２次反応（工程Ｓ１５０）の前にブランク値を測定してもよい。この場合、第１増強角で第１励起光α１を金属膜１４に照射し、第１受光センサー１３３の検出値を第１ブランク値とする。また、第２増強角で第２励起光α２を金属膜１４に照射し、第２受光センサー１３６の検出値を第２ブランク値とする。そして、第１被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１６０）では、第１蛍光γ１の検出値から第１ブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す第１蛍光γ１の量を算出する。また、第２被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１７０）では、第２蛍光γ２の検出値から第２ブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す第２蛍光γ２の量を算出する。
【００６７】
なお、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質と第１蛍光物質を含む蛍光標識液とを接触させて第１被検出物質を検出した後に、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質と第２蛍光物質を含む蛍光標識液とを接触させて第２被検出物質を検出してもよい。
【００６８】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、チップ１０上の１つの反応場（第１捕捉体および第２捕捉体が固定されている回折格子１６上の領域）において第１被検出物質および第２被検出物質を検出するため、装置およびチップ１０を大型化することなく少量の検体で、第１被検出物質および第２被検出物質を高感度に検出することができる。
【００６９】
［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、１つの光源ユニット２２３が波長の異なる第１励起光α１および第２励起光α２の両方を照射できる点において、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の構成については同一の符号を付してその説明を省略する。
【００７０】
図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図（平面図）である。なお、図５では、回折格子１６を明確にするため、凸部１８を拡大して示している。
【００７１】
図５に示されるように、ＳＰＦＳ装置２００は、チップホルダー２１０と、光照射部２２０、光検出部２３０、および制御部１４０とを有する。ＳＰＦＳ装置２００は、チップホルダー２１０に回折格子１６を有するチップ１０を装着した状態で使用される。
【００７２】
チップホルダー２１０は、チップ１０の表面に対する法線を回転軸として、チップ１０を回転可能に保持する。チップホルダー２１０の構成は、平面視したときにおける回折格子１６に対する励起光αの光軸の方向を変化させることができれば特に限定されない。たとえば、チップホルダー２１０には、モーターが接続されている。モーターは、前記法線を中心軸としてチップホルダー２１０を回転させることによりチップ１０が所定の角度だけ回転する。
【００７３】
光照射部２２０は、波長および光量が一定の第１励起光α１と、波長および光量が一定の第２励起光α２とを、チップ１０の金属膜１４（回折格子１６）に照射する。このとき、光照射部２２０は、金属膜１４中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子１６で生じるように、第１励起光α１および第２励起光α２を金属膜１４（回折格子１６）に照射する。なお、第１励起光α１の波長および第２励起光α２の波長は、互いに異なる。
【００７４】
光照射部２２０は、第３光源ユニット２２３、第１角度調整機構１２４および第３光源制御部２２５を含む。
【００７５】
第３光源ユニット２２３は、第１励起光α１と、第１励起光α１と異なる波長の第２励起光α２とを金属膜１４（回折格子１６）に向かって出射する。第３光源ユニット２２３の構成は、波長の異なる２種類の励起光を出射することができれば、特に限定されない。本実施の形態では、第３光源ユニット２２３には、２種類の波長の励起光が照射できるように２種類の光源が配置されている。また、第３光源ユニット２２３は、広い波長帯の光を出射する光源（例えば、白色光源など）と、複数のバンドパスフィルターとを備え、蛍光物質の励起波長に合わせてバンドパスフィルターを切り替えるように構成されていてもよい。
【００７６】
光検出部２３０は、例えば、第１受光センサー１３３、第３角度調整機構１３４および第３受光センサー制御部２３５を含む。光検出部２３０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。光検出部２３０は、光照射部２２０に対して、第１励起光α１（第２励起光α２）の光軸と金属膜１４との交点を通り、かつ金属膜１４の表面に対する法線を挟むように配置されている。第１受光センサー１３３は、第１プラズモン散乱光δ１、第２プラズモン散乱光δ２、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２をそれぞれ検出する。
【００７７】
第３角度調整機構１３４は、第１受光センサー１３３が第１プラズモン散乱光δ１、第２プラズモン散乱光δ２、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２を検出できるように、第１受光センサー１３３の光軸を調整する。第３角度調整機構１３４は、第１蛍光γ１の検出時には、第１蛍光γの光軸と金属膜１４の交点を通り、かつ第１蛍光γの光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。また、第３角度調整機構１３４は、第２蛍光γ２の検出時には、第２蛍光γの光軸と金属膜１４の交点を通り、かつ第２蛍光γの光軸に直交する金属膜１４上の軸を回転軸として第１受光センサー１３３を回動させる。
【００７８】
第１受光センサー１３３は、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２を検出して、金属膜１４上の蛍光像を検出する。また、第１受光センサー１３３は、第１プラズモン散乱光δ１または第２プラズモン散乱光δ２を検出する。
【００７９】
集光レンズ群（図示省略）は、チップ１０と第１受光センサー１３３との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜１４上の蛍光像を受光センサー１２７の受光面上に結像させる。
【００８０】
蛍光フィルター（図示省略）は、チップ１０と第１受光センサー１３３との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、第１受光センサー１３３に到達する光から蛍光γ以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、第１受光センサー１３３に到達する光の光量を調整したりする。本実施の形態では、蛍光フィルターとして、第１蛍光γ１または第２蛍光γ２をそれぞれ検出可能な蛍光フィルターが配置されている。
【００８１】
（検出装置の検出動作）
次に、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の検出動作（検出方法）について説明する。なお、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の検出動作と同じ工程は、同じ符号を付してその説明を省略する。
【００８２】
図６は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【００８３】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。
【００８４】
次いで、第１励起光αの入射角を決定する（工程Ｓ２２０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５により第１励起光α１のみを照射しつつ、第１角度調整機構１２４を駆動して第１励起光α１の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第１プラズモン散乱光δ１のみを検出する。そして、制御部１４０は、第１プラズモン散乱光δ１が最大となる角度を第１励起光α１の入射角（第１増強角）とする。
【００８５】
次いで、チップ１０を回転させる（工程Ｓ２３０）。具体的には、制御部１４０は、モーターを駆動して、第２励起光α２の光軸が第２の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。
【００８６】
次いで、第２励起光α２の入射角を決定する（工程Ｓ２４０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５により第２励起光α２のみを照射しつつ、第１角度調整機構１２４を駆動して第２励起光α２の入射角を走査しながら、第３角度調整機構１３４を駆動して第１受光センサー１３３により第２プラズモン散乱光δ２のみを検出する。そして、制御部１４０は、第２プラズモン散乱光δ２が最大となる角度を第２励起光α２の入射角（第２増強角）とする。
【００８７】
次いで、検体中の第１被検出物質と第１の１次抗体とを反応させるとともに、第２被検出物質と第２の１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１４０）。
【００８８】
次いで、第１の１次抗体に結合した第１被検出物質を第１蛍光物質で標識するとともに、第２の１次抗体に結合した第２被検出物質を第２蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１５０）。
【００８９】
次いで、制御部１４０は、モーターを駆動して、第１励起光α１の光軸が第１の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。
【００９０】
次いで、第１被検出物質を検出する（工程Ｓ２６０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５を駆動して第１励起光α１を工程Ｓ２２０で決定した入射角（第１増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第１受光センサー制御部１３５を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第１蛍光γ１の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。
【００９１】
次いで、チップを回転させる（工程Ｓ２７０）。具体的には、制御部１４０は、モーターを駆動して、第２励起光α２の光軸が第２の方向に沿うように、チップ１０（チップホルダー２１０）を回転させる。
【００９２】
次いで、第２被検出物質を検出する（工程Ｓ２８０）。具体的には、制御部１４０は、第３光源制御部２２５を駆動して第２励起光α２を工程Ｓ２４０で決定した入射角（第２増強角）で金属膜１４の所定の位置に照射させながら、第２受光センサー制御部１３８を駆動して金属膜１４（金属膜１４表面およびその近傍）上から放出される第２蛍光γ２の強度を検出するように第１受光センサー１３３を制御する。
【００９３】
なお、光照射部２２０は、第１励起光α１および第２励起光α２を同時に照射してもよい。この場合、制御部１４０は、第１励起光α１の入射角および第１プラズモン散乱光δ１の光量のデータと、第２励起光α２の入射角および第２プラズモン散乱光δ２の光量のデータとから、第１プラズモン散乱光δ１および第２プラズモン散乱光δ２のいずれもが増大する角度を第１励起光α１および第２励起光α２の入射角とする。そして、第１蛍光γ１を検出するときは、第１蛍光γ１の光路上には、第１蛍光γ１を検出できるように蛍光フィルターが配置される。第２蛍光γ２を検出するときは、第２蛍光γ２の光路上には、第２蛍光γ２を検出できるように蛍光フィルターが配置される。また、第１蛍光γ１を検出する時と第２蛍光γ２を検出する時とで入射角が同じである必要はなく、第１励起光α１に最適な入射角で第１励起光α１および第２励起光α２を照射して第１蛍光γ１を検出した後、第２励起光α２に最適な入射角で第１励起光α１および第２励起光α２を照射して第２蛍光γ２を検出してもよい。
【００９４】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の効果を有する。また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、装置をさらに小型化することができる。
【００９５】
なお、図７に示されるように、第１の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第１高さｈ１と、第２の方向における凸部１８間の凹部に対する凸部１８の第２高さｈ２とは、異なる高さであってもよい。さらに、図８（平面図）に示されるように、第１仮想直線Ｌ１と、第２仮想直線Ｌ２とのなす角度θは、垂直でなくてもよい。また、実施の形態１、２では、複数の凸部１８が第１の方向と第２の方向とに所定のピッチで配列されていたが、第１の方向と第２の方向とに加え、第１の方向と第２の方向に交差する第３の方向に所定のピッチで配列されていてもよい。この場合、第１被検出物質および第２被検出物質に加え、第３被検出物質も検出できる。
【００９６】
本出願は、２０１５年２月２日出願の特願２０１５−０１８３４８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明に係る検出方法および検出装置は、被検出物質を高い信頼性で測定することができる。よって、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
【符号の説明】
【００９８】
１０、２０  チップ
１２  基板
１４  金属膜
１６  回折格子
１８  凸部
１００、２００  ＳＰＦＳ装置（検出装置）
１１０  ２１０  チップホルダー
１２０、２２０  光照射部
１２１  第１光照射ユニット
１２２  第２光照射ユニット
１２３  第１光源ユニット
１２４  第１角度調整機構
１２５  第１光源制御部
１２６  第２光源ユニット
１２７  第２角度調整機構
１２８  第２光源制御部
１３０、２３０  光検出部
１３１  第１光検出ユニット
１３２  第２光検出ユニット
１３３  第１受光センサー
１３４  第３角度調整機構
１３５  第１受光センサー制御部
１３６  第２受光センサー
１３７  第４角度調整機構
１３８  第２受光センサー制御部
１４０  制御部
２２３  第３光源ユニット
２２５  第３光源制御部
２３５  第１受光センサー制御部
α１  第１励起光
α２  第２励起光
γ１  第１蛍光
γ２  第２蛍光
δ１  第１プラズモン散乱光
δ２  第２プラズモン散乱光
Ｌ１  第１仮想直線
Ｌ２  第２仮想直線
θ  第１仮想直線と第２仮想直線とのなす角度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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