(57)【要約】  本発明は、生体触媒を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する過程において、ニトリルヒドラターゼの活性低下を抑制し、アミド化合物の生産性を改善する手法に関する。具体的には、ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒の存在下、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、該ニトリル化合物の亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下であることを特徴とするニトリル化合物を用いたアミド化合物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒の存在下、
ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、該ニトリル化合物中の亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下であることを特徴とする、
アミド化合物の製造方法。
【請求項２】
ニトリル化合物中の亜鉛濃度が０．１ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項３】
ニトリル化合物中の青酸濃度が１．５ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項４】
ニトリル化合物中の青酸濃度が０．５ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項３に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項５】
ニトリル化合物が精製工程を経たものである、請求項１〜４のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項６】
精製工程が、蒸留、アルカリ処理、イオン交換樹脂、及び吸着除去から選ばれる１又は２以上を含む、請求項５に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項７】
ニトリル化合物がアクリロニトリルであり、前記アミド化合物がアクリルアミドである、
請求項１〜６のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒がニトリルヒドラターゼ活性を有する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、又は微生物の菌体、あるいはそれらの処理物である、請求項１〜７のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項９】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス属細菌又は大腸菌である、請求項８に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項１０】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒が、ロドコッカス属細菌又はシュードノカルディア属細菌由来のニトリルヒドラターゼを発現する微生物の菌体である、請求項８又は９に記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項１１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒を、乾燥菌体として４〜２０質量％の濃度で存在させる、請求項１〜１０のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法で製造された、亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下であるアクリルアミド水溶液。
【請求項１３】
亜鉛濃度が０．１ｐｐｍ 以下である、請求項１２記載のアクリルアミド水溶液。
【請求項１４】
青酸濃度が１．５ｐｐｍ以下である、請求項１２又は１３記載のアクリルアミド水溶液。
【請求項１５】
青酸濃度が０．５ｐｐｍ以下である、請求項１２又は１３記載のアクリルアミド水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアミド化合物の製造方法に関し、詳しくは、生体触媒を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミド化合物については、産業上重要な物質として広範囲に使用されている。その用途としては、アクリルアミドでは排水処理用凝集剤、紙力増強剤、石油回収剤、メタアクリルアミドでは、塗料、接着剤等、幅広く用いられている。【０００３】
アミド化合物の製造方法としては、従来還元状態の銅を触媒として用い、ニトリル化合物を水和することにより、対応するアミド化合物を製造する工業的手法が用いられてきた。近年、微生物の持つ酵素の中にニトリル基を水和してアミド基に変換するニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素又は該酵素を有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が用いられている。この製造方法は従来の金属触媒を利用する手法より、反応条件が温和であり、ニトリル化合物からの対応するアミド化合物への高い転化率、高い選択性を持つことから、よりシンプルなプロセスが組みやすく、工業的にも優れた手法であると言える。【０００４】
ニトリルヒドラターゼを利用してアミド化合物を工業的に製造する際には、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率よく製造できることが重要である。よって、ニトリルヒドラターゼの酵素活性の向上（特許文献１）、温度による活性低下の抑制、アミド化合物耐性（特許文献２）などを目的とした提案が報告されている。他の手法として、ニトリル化合物中の活性に影響を与える有機性不純物を同定し、活性低下を抑制する報告がある（特許文献３〜５）。例えば、ニトリル化合物中に存在するベンゼンの濃度を低減させる手法(特許文献３)。また、ニトリル化合物中の青酸濃度を低減させる手法（特許文献４,５）が提示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２９５８１５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１７２２９５号公報
【特許文献３】国際公開２００７−０４３４６６号パンフレット
【特許文献４】特開平１１−１２３０９８号公報
【特許文献５】特開２００１−２８８１５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは酵素法によるアミド化合物の生産性の向上に関し種々検討していく中で、前記特許文献に開示されたニトリル中の不純物では説明のつかない酵素の失活が存在することが判明した。そこで、本発明では、生体触媒を用いてニトリル化合物からアミド化合物を製造する過程において、酵素の失活の原因物質を解明し除去することで、ニトリルヒドラターゼの活性低下を抑制し、アミド化合物の生産性を改善する手法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題の解決のため、検討を行った結果、生体触媒を用いてニトリル化合物からアミド化合物を効率的に製造する方法において、ニトリル化合物中の亜鉛濃度を低減することにより、アミド化合物を効率的に製造できることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１５］に関する。
［１］  ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒の存在下、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、該ニトリル化合物中の亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下、好ましくは０．３ｍｍｐ以下、より好ましくは０．２ｐｐｍ以下であることを特徴とする、アミド化合物の製造方法；
［２］  ニトリル化合物中の亜鉛濃度が０．１ｐｐｍ以下であることを特徴とする、［１］に記載のアミド化合物の製造方法；
［３］  ニトリル化合物中の青酸濃度が１．５ｐｐｍ以下、好ましくは１．０ｐｐｍ、より好ましくは０．８ｐｐｍ以下であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のアミド化合物の製造方法；
［４］  ニトリル化合物中の青酸濃度が０．５ｐｐｍ以下であることを特徴とする、［３］に記載のアミド化合物の製造方法；
［５］  ニトリル化合物が亜鉛及び青酸や他の不純物を低減する精製工程を経たものである、［１］〜［４］のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法；
［６］  精製工程が、蒸留、アルカリ処理、イオン交換樹脂、吸着除去（活性炭、活性アルミナ、ゼオライト、シリカゲル等の吸着剤による除去）から選ばれる１又は２以上を含むものである、［５］に記載のアミド化合物の製造方法；
［７］  ニトリル化合物がアクリロニトリルであり、前記アミド化合物がアクリルアミドである、［１］〜［６］のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法；
［８］  ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒がニトリルヒドラターゼ活性を有する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、又は微生物の菌体、あるいはそれらの処理物である、［１］〜［７］のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法；
［９］  ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス属細菌又は大腸菌である、［８］に記載のアミド化合物の製造方法；
［１０］  ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒が、ロドコッカス属細菌又はシュードノカルディア属細菌由来のニトリルヒドラターゼを発現する微生物の菌体である、［８］又は［９］に記載のアミド化合物の製造方法；
［１１］  ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒を、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％、更に好ましくは、８質量％の濃度で存在させる、［１］〜［１０］のいずれかに記載のアミド化合物の製造方法；
［１２］  ［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法で製造された、亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下、好ましくは０．３ｍｍｐ以下、より好ましくは０．２ｐｐｍ以下であるアクリルアミド水溶液；
［１３］  亜鉛濃度が０．１ｐｐｍ以下である、［１２］記載のアクリルアミド水溶液；
［１４］  青酸濃度が１．５ｐｐｍ以下、好ましくは０．８ｐｐｍ以下である、［１２］又は［１３］記載のアクリルアミド水溶液；
［１５］  青酸濃度が０．５ｐｐｍ以下である［１２］又は［１３］のアクリルアミド水溶液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼの活性低下を抑制し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率よく製造できる。【００１０】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１３−０３０１８８号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に発明の実施の形態について説明する。
（ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒）
本発明において、ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいう。ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒はニトリルヒドラターゼタンパク質そのものでもよいが、動物細胞、植物細胞、細胞小器官、又は微生物の菌体、及びそれらの処理物でもよい。
【００１２】
前記処理物としては、動物細胞、植物細胞、細胞小器官又は、微生物の菌体を破砕した破砕物、又は菌体から抽出された酵素（素酵素又は精製酵素）;動物細胞、植物細胞、細胞小器官、微生物の菌体又は酵素自体を担体に固定化したもの；等が挙げられる。
【００１３】
固定化方法としては、包括法、架橋法、担体結合法、等が挙げられる。包括法とは、高分子被膜によって被覆する方法である。架橋法とは、酵素を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法である。担体結合法とは、水不溶性の担体に酵素を結合させる方法である。
【００１４】
固定化に用いる単体（固定化担体）としては、例えば、ガスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラーギナン、アルギン酸、寒天及び、ゼラチン等が挙げられる。
【００１５】
このような微生物の代表例としては、例えばニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｕｓ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテリジューム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属等に属する微生物が挙げられる。
【００１６】
より具体的には、特公昭５６−１７９１８号公報に記載のノカルディアｓｐ．Ｎ−７７５、特公平０６−５５１４８号公報に記載のロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１、国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５４４５６号に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４株、特開平０５−３０９８２号公報に記載のクレブシエラｓｐ．ＭＣＩ２６０９、特開平０５−３０９８３号公報に記載のエアロモナスｓｐ．ＭＣＩ２６１４、特開平０５−３０９８４号公報に記載のシトロバクター・フロンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＭＣＩ２６１５、特開平０５−１０３６８１号公報に記載のアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＩＡＭ１３５７０及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｃｉｅｎｓ）、特開平０５−１６１４９５号公報に記載のキサントバクター・フラブス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖａｓ）ＪＣＭ１２０４、エルウィニア・ニグリフルエンス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｎｉｇｒｉｆｌｕｅｎｓ）ＭＡＦＦ０３−０１４３５、特開平０５−２３６９７５号公報に記載のエンテロバクターｓｐ．ＭＣＩ２７０７、特開平０５−２３６９７６号公報に記載のストレプトマイセスｓｐ．ＭＣＩ２６９１、特開平０５−２３６９７７号公報に記載のリゾビウムｓｐ．ＭＣＩ２６１０、リゾビウムｓｐ．ＭＣＩ２６４３、リゾビウム・ロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）ＩＡＭ１３５８８、リゾビウム・レグミノサーラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＩＡＭ１２６０９及びリゾビウム・メリオティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｒｉｏｔｉ）ＩＡＭ１２６１１、特開平０５−１５３８４号公報に記載のキャンディダ・グイリエモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＮＨ−２、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＮＨ−３及びクレブシエラ・ニュウモニアエ・スブスピーシス・ニュウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＨ−２６Ｔ２、特開平０６−１４７８６号公報に記載のアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−Ｃ１５−１、特開平０７−２５４９４号公報に記載のバチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）ＳＣ−Ｊ０５−１、特開平０８−５６６８４号公報に記載のシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＡＴＣＣ１９２８５、特開平０９−２７５９７８号公報に記載のシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＪＣＭ３０９５等を挙げることができる。
【００１７】
特公平０６−５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株は、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。
【００１８】
国際公開パンフレットＷＯ２００５／０５４４５６号に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＮＣＩＭＢ４１１６４株は、２００３年３月５日にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｌｔｄ.（ＮＣＩＭＢ）（ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ  Ｂｕｋｓｂｕｒｎ  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２１  ９ＹＡ）に受託番号ＮＣＩＭＢ４１１６４として寄託されている。
【００１９】
特開平０９−２７５９７８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５）は、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５」として、１９９６年２月７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託されている。
【００２０】
本発明においては、前記微生物から選択される１種を単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
さらにニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子は、通常の分子生物学的手法によって微生物細胞内に導入及び発現可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｊ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ”Ｍｏｌｅｒｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：A Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。すなわち、本発明においては、天然のニトリルヒドラターゼ（野生型）又はその変異体（改良型）をコードする核酸を微生物細胞内で発現させて得られる酵素を用いることもできる。本発明においては、前記酵素から選択される１種を単独で又は、２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等のＮＣＢＩのデータベースに公表されている。
【００２３】
例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１(ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８)由来のαサブユニットのアクセッション番号（Accession No.）は「Ｐ２１２１９」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「Ｐ２１２２０」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４） 由来のαサブユニットのアクセッション番号は「ＡＴＴ７９３４０」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「ＡＡＴ７９３３９」である。さらに、シュードモナス・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＪＣＭ３０９５由来のαサブユニットのアクセッション番号は「１ＩＲＥ Ａ」であり、βサブユニットのアクセッション番号は「１ＩＲＥＢ」である。
【００２４】
野生型のニトリルヒドラターゼ遺伝子が導入された形質転換体としては、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０７７０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４７５６）（特開平８−２６６２７７号公報）、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌ＭＴ１０８２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）（特開平９−２７５９７８号公報）、又はロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種のニトリルヒドラターゼ（特開平４−２１１３７９号公報）で形質転換した微生物が例示されるが、これらには限定されない。
【００２５】
野生型ニトリルヒドラターゼにアミノ酸置換を施した改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼが知られており（特開２０１０−１７２２９５号公報、特開２００７−１４３４０９号公報、特開２００７−０４３９１０号公報など）、本発明の方法においては、これらの改良型ニトリルヒドラターゼが導入された微生物を使用することもできる。
【００２６】
これらニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物、又はその処理物は、菌体調製直後にアミド合成反応に用いることは勿論、菌体調製後に保管し、必要に応じてアミド合成反応に使用することもできる。菌体を調製するための微生物の培養方法は、微生物の種類に応じて適宜選択できる。本培養の前に種培養を行ってもよい。
【００２７】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は、その処理物は、回分反応に使用することもでき、連続反応に使用することもできる。また、反応形式は流動床、固定床、懸濁床など、適切な形式を選択できる。その際の反応液中での該触媒温度は、水性媒体とニトリル化合物の混合に支障をきたさない限り特に限定されるものではない。
【００２８】
前記水性媒体とは、水、又はリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、アミド化合物、ニトリル化合物、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒等を適切な濃度で溶解させた水溶液(反応液全体)を指す。
【００２９】
本発明の製造方法における反応温度（反応混合物温度）は、限定はされないが、１０〜４０℃であることが好ましく、２０〜３５℃であることがより好ましい。反応温度が１０℃以上であれば、生体触媒の反応活性を充分に高められるだけでなく、冷却水温度を上げることができるため、冷凍機に替えて冷水塔を利用することができ、冷却水の冷却エネルギーを低減することができる。また、反応温度が４０℃以下であれば、微生物触媒の失活を抑制しやすい。
【００３０】
また、本発明の製造方法における反応時間は、限定はされないが、例えば、１〜５０時間であることが好ましく、より好ましくは３〜２０時間である。
【００３１】
培養液から分離し洗浄した休止菌体を化合物製造に用いる場合、懸濁させる休止菌体の乾燥菌体濃度は、乾燥菌体として４質量％以上、好ましくは５質量％以上である。但し、菌体濃度が２０質量％を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になることがある。従って、菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％、更に好ましくは、８質量％である。
【００３２】
（ニトリル化合物）
本発明の製造方法において原料として使用されるニトリル化合物とは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する触媒によりアミド化合物へ変換される化合物であれば特に限定されない。例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリルのような脂肪族飽和ニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリルのような脂肪族不飽和ニトリル、ベンゾニトリル、フタロジニトリルのような芳香族ニトリル及びニコチノニトリルのような複素環式ニトリルが挙げられる。本発明におけるニトリル化合物は、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル等のＣ２〜Ｃ４ のニトリル化合物であり、特により好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アセトニトリルが好適である。
【００３３】
（ニトリル化合物中の青酸の低減）
これらニトリル化合物は精製工程を経て市販製品となる。例えば、アクリロニトリルはプロピレンのアンモ酸化法により工業的に生産されており、青酸は他の副生物と共に反応後の蒸留精製による除去操作が行われている。この操作で除去されない青酸が製品中に含まれている。本発明の製造方法においては、原料のニトリル化合物に含まれる青酸の量を低減させることが好ましい。
【００３４】
本実施形態に用いるニトリル化合物中に残留する青酸のさらなる低減は化学的方法により行うことができる。その方法としては、ニトリル化合物の変性や製造されるアミド化合物の品質を低下させるような副生成物、不純物の増加に繋がらない方法が望ましく、例えば、イオン交換樹脂を用いる方法、ニトリル化合物が不飽和ニトリルである場合には、アルカリ条件下で該ニトリル化合物に青酸を付加させる方法等が挙げられる（特許文献４，５など）。
【００３５】
青酸の除去量は多い程よく、通常、ニトリル化合物中の青酸の濃度が好ましくは１．５ｐｐｍ以下、より好ましくは０．８ｐｐｍ、さらに好ましくは０．５ｐｐｍ以下となるように低減させる。青酸の濃度は検出限界以下でもよい。
【００３６】
アクリロニトリル中に含まれる青酸の濃度は、アルカリ溶液で抽出した後、硝酸銀を用いた滴定法で求めることができる。若しくは吸光光度法にて測定することができる。
【００３７】
（ニトリル化合物中の亜鉛の低減）
また、ニトリル化合物中に含まれる微量の不純物の一つとして亜鉛が挙げられる。例えば、アクリロニトリルでは、プロピレンのアンモ酸化法により工業的に製造されているが、ラインに含まれる微量の亜鉛が溶出するなどの理由により、市販のアクリロニトリルには亜鉛が含まれている。
【００３８】
本実施形態に用いるニトリル化合物中の亜鉛濃度は、反応速度の低下が抑制される濃度であればよく、通常、該ニトリル化合物中の亜鉛濃度は０．４ｐｐｍ以下、好ましくは、０．３ｐｐｍ以下、より好ましくは０．２ｐｐｍ、さらに好ましくは０．１ｐｐｍ以下である。ニトリル化合物から亜鉛を除去する方法は如何なる方法でもよく、例えば、蒸留、活性炭、活性アルミナ、ゼオライト、シリカゲル等による吸着除去、陰イオン交換樹脂等により行うことができる。
【００３９】
また、アクリロニトリル中の亜鉛濃度については誘導結合プラズマ発光分光分析器にて測定することができる。
【００４０】
上記のようにして、ニトリル化合物中の亜鉛濃度を低減させることにより、ニトリルヒドラターゼの活性低下を抑制し、アミド化合物合成における反応率を向上させることができる。亜鉛の低減効果は、ニトリル化合物に含まれる他の有機不純物（例えば、ベンゼン、青酸、アクロレイン、オキサゾール）を除去・低減させることで、さらに高い効果を上げることができる。
【００４１】
上記した亜鉛や不純物除去は、当該分野で周知の精製工程によって達成でき、上述した蒸留、アルカリ処理、吸着除去、陰イオン交換樹脂など様々な方法で実施することができる。
【００４２】
（高品位アクリルアミド水溶液）
本発明の方法により得られるアミド化合物、特にアクリルアミド化合物を含む水溶液は、亜鉛や、青酸等の有機不純物の濃度が低減された高品位アクリルアミド水溶液である。
【００４３】
本発明のアクリルアミド水溶液は、亜鉛濃度が０．４ｐｐｍ以下、好ましくは０．３ｐｐｍ以下、より好ましくは０．２ｐｐｍ以下、最も好ましくは０．１ｐｐｍ以下であり、さらに好ましくは、青酸濃度が１．５ｐｐｍ以下、好ましくは０．８ｐｐｍ以下、より好ましくは０．５ｐｐｍ以下である。本発明のアクリルアミド水溶液を用いれば、より高品位なアクリルアミド系重合体の製造が可能になる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例を挙げより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下％は質量基準である。【００４５】
［実施例１］
（菌体の調製）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８）
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロス Ｊ−１株［Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８）］を使用した。３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）にグルコース２．０％、ポリペプトン１．０％、グルタミン酸Ｎａ１％、リン酸水素カリウム０．２％、リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．１％、塩化コバルト０．０１％を水道水に溶解して調製した培地（ｐＨ７．０）２．５Ｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地に、Ｒｈｏｄｏｃｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１を２０ｍＬ接種し、遮光下で３５℃、２３０ｒｐｍ４２時間培養した。これを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体換算３％）とした。【００４６】
（アクリロニトリル中の亜鉛低減処理）
反応容器に活性炭（内部表面積１０００ｍ2／ｋｇ）１ｋｇを有する活性炭固定床吸着剤を投入し、反応器へ温度１０℃でアクリロニトリルを通過させた。反応器通過後のアクリロニトリルを回収し、誘導結合プラズマ発光分光分析器（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製  ＩＣＡＰ５７７  ）で測定したところ、検出下限の０．０７ｐｐｍ以下となった。【００４７】
（アクリロニトリル中の青酸低減処理）
使用する工業用アクリロニトリル（青酸５ｐｐｍ含有）１０Ｌに０．１Ｍの水酸化ナトリウムを５０ｇ添加し十分に攪拌溶解させ３０分間放置し、アルカリ処理を行った。その後、１Ｍのアクリル酸水溶液を１０ｇ添加して中和した。この処理によりアクリロニトリル中の青酸濃度は０．５ｐｐｍに低減した。なお、アクリロニトリル中の青酸濃度は吸光光度計（ＤＲ５００００１）（ＨＡＣＨ社）にて以下のように測定した。【００４８】
(青酸濃度測定方法)
試験管に９．６ｇの純水とアクリロニトリル０．４ｇを入れ２５℃で３０分間静置した。その後、ＨＡＣＨ分析キットにあるＣｙａｎｉＶｅｒ．３を入れて３０秒間ボルテックスしたのち、３０秒間静置した。ＣｙａｎｉＶｅｒ．４を加え１０秒間ボルテックスし、ＣｙａｎｉＶｅｒ．５を加えて２分間ボルテックスした。２５℃で３０分間静置したのち、吸光度を測定した。【００４９】
（アミド生成反応）
内容積１００ｍｌの蓋付ポリケース（新商器材社製）にリン酸緩衝液３．４ｇ、５０．５％アクリルアミド９３．１ｇ、アクリロニトリル３．０ｇを加え、３０℃に制御しながら攪拌した。これに前述の菌体０．１ｇを添加し、反応を開始した。６時間後、反応液を採取し、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰｏｒａＰａｃｋ−ＰＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製），１ｍ，２１０℃，キャリアガス：ヘリウム，検出器：ＦＩＤ）にてアクリロニトリルの濃度を測定した。反応開始前のアクリロニトリル濃度を１００％とし、反応後のアクリロニトリル濃度から反応率を求めた。その結果、８２．７％のアクリロニトリルがアクリルアミドに変換されていた。【００５０】
［実施例２］
実施例１で添加した水酸化ナトリウムと接触させる時間を調整し、アクリロニトリル中の青酸濃度を１．５ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、反応率は７６．０％であった。【００５１】
［実施例３］
アクリロニトリル中の青酸濃度を１．５ｐｐｍとし、また実施例１で反応器にアクリロニトリルを通過させる時間を調整し、亜鉛濃度を０．３ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、反応率は７１．７％であった。【００５２】
［実施例４］
アクリロニトリル中の青酸濃度を３．０ｐｐｍとし、亜鉛濃度を０．３ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に実験を行った。その結果、反応率は４２．３％であった。【００５３】
［比較例１］
アクリロニトリル中の青酸濃度を０．５ｐｐｍ、亜鉛濃度が０．５ｐｐｍとした以外は実施例１と同様に実験を行った。その結果、反応率は２１．８％であった。【００５４】
［比較例２］
アクリロニトリル中の青酸濃度が１．５ｐｐｍ、亜鉛濃度を０．５ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、反応率は１８．５％であった。【００５５】
［比較例３］
アクリロニトリル中の青酸濃度が２．０ｐｐｍ、亜鉛濃度を０．５ｐｐｍとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。その結果、反応率は１６．３％であった。【００５６】
［実施例５］
（菌体の調整）Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５
Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体には、特開２０１１−２００１３２号広報に記載のプラスミドｐｓｊ−Ｎ０２Ａを、記載の方法と同様にしてＡＴＣＣ１２６７４株に導入した、形質転換体Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐｓｊ−Ｎ０２Ａを用いた。５００ｍｌの三角フラスコにグルコース１５ｇ／Ｌ、酵母エキス1ｇ／Ｌ、グルタミン酸Ｎａ１０ｇ／Ｌ、リン酸水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／Ｌ、塩化コバルト１ｇ／Ｌを水道水にて溶解して調整した培地（ｐＨ７．０）２．５Ｌを入れ、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地にＡＴＣＣ１２６７４／ｐｓｊＮ−０２Ａを接種し、遮光下で３０℃、２３０ｒｐｍで７２時間培養した。【００５７】
（アクリロニトリル中の青酸低減処理）
実施例１と同様に、アクリロニトリル中の青酸濃度を０．５ｐｐｍ、亜鉛濃度を検出下限とした。【００５８】
（アミド生成反応）
反応液１００ｍｌ中のアクリルアミド濃度が２０％、アクリロニトリル濃度が３％となるように調整し、培養後の菌液を遠心分離にて１０倍に濃縮した触媒を３．５ｍｌ添加した。
上記方法以外は実施例１と同様に行った。５時間後のアクリロニトリルの減少量を反応量として測定したところ、１．７６［％］であり、これは比較例４の１．２７倍であった。【００５９】
［比較例４］
アクリロニトリル中の亜鉛濃度を０．５ｐｐｍとした以外は、実施例５と同様に実験を行った。５時間反応後のアクリロニトリルの反応量を測定したところ、１．３８［％］であった。【００６０】
［実施例６］
（菌体の調整)Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ４１１６４株
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ４１１６４株由来のニトリルヒドラターゼは特表２００７―５１２８２０に記載されている方法と同様に調整して調整した。リン酸水素二カリウム０．７、リン酸水素カリウム０．３、グルコース１０．０、ペプトン１．０、酵母エキス３．０、硫酸マグネシウム七水和物０．５、尿素５．０、塩化コバルト六水和物０．０１、全体で１Ｌとなる水道水、を含む４００ｍｌの培地を入れた２Ｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコで増殖させた。培地のｐＨを７．２に調整し、培養物を２８℃で５日間増殖させた。【００６１】
（アクリロニトリル中の青酸低減処理）
実施例１と同様に、アクリロニトリル中の青酸濃度を０．５ｐｐｍ、亜鉛濃度を検出下限とした。【００６２】
（アミド生成反応）
反応液１００ｍｌ中のアクリルアミド濃度が２０％、アクリロニトリル濃度が３％となるように調整し、培養後の菌液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．３倍に希釈した触媒を１．０ｍｌ添加した。上記方法以外は実施例１と同様に行った。５時間後のアクリロニトリルの減少量を反応量として測定したところ、２．１３[％]であった。これは比較例５の反応量の２．４７倍であった。【００６３】
［比較例５］
アクリロニトリル中の亜鉛濃度を５．５ｐｐｍとした以外は、実施例６と同様に実験を行った。５時間反応後のアクリロニトリルの減少量は０．８６[％]であった。【００６４】
下記表１に前記の各実施例と比較例についてまとめる。【００６５】
【表１】
2014129144.tif 000002
【００６６】
これら実施例から青酸濃度１．５ｐｐｍ以下でかつ、亜鉛濃度０．４ｐｐｍ以下としたとき、反応率が７０％以上となり反応性が高いことがわかる。特に実施例１のように青酸濃度０．５ｐｐｍ、亜鉛濃度０．１ｐｐｍ以下としたとき、より反応性が向上し、８０％以上の高反応率であった。よって、青酸及び亜鉛をともに低減した場合、さらに反応率が向上することがわかる。【００６７】
また、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＮＣＩＭＢ４１１６４株を触媒として利用した結果を表２、表３に示す。【００６８】
【表２】
2014129144.tif 000003
【００６９】
【表３】
2014129144.tif 000004
【００７０】
これら実施例及び比較例から青酸濃度０．５ｐｐｍの場合、亜鉛濃度０．１ｐｐｍ以下としたときのほうが亜鉛濃度５．５ｐｐｍの場合よりも、反応性が向上することがわかった。よって、これらの効果はニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属又はＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属に属する微生物に置いて有効であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ酵素の活性低下を抑制し、効率よくアミド化合物を得ることができる。【００７２】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月1日(2016.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒の存在下、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法において、反応率を向上させる方法であって、前記ニトリル化合物が活性炭による処理がされたニトリル化合物であり、該ニトリル化合物中の亜鉛濃度を０．４ｐｐｍ以下、及び、青酸濃度を１．５ｐｐｍ以下とすることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
ニトリル化合物中の亜鉛濃度が０．１ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニトリル化合物中の青酸濃度が０．５ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ニトリル化合物が精製工程を経たものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
精製工程が、蒸留、アルカリ処理、イオン交換樹脂、及び吸着除去から選ばれる１又は２以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ニトリル化合物がアクリロニトリルであり、前記アミド化合物がアクリルアミドである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒がロドコッカス属細菌又はシュードノカルディア属細菌由来のニトリルヒドラターゼを発現する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、又は微生物の菌体、あるいはそれらの処理物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒が、ロドコッカス属細菌又はシュードノカルディア属細菌由来のニトリルヒドラターゼを発現する微生物の菌体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する生体触媒を、乾燥菌体として４〜２０質量％の濃度で存在させる、請求項８に記載の方法。
【国際調査報告】
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