(57)【要約】  シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することのできる制御方法を提供すること。  本発明に係る目的遺伝子の発現の制御方法の一態様は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む。
2014192765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む、前記目的遺伝子の発現の制御方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記プロモーターは、光応答性プロモーターである、制御方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記光応答性プロモーターが、配列番号１の１番目〜２３７番目で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する配列を有する、制御方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項において、
前記発現調節配列は、フィコシアニンβサブユニット（ｃｐｃＢ）の開始コドンから上流の５'非翻訳領域の塩基配列と、９０％以上の相同性を有する、制御方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記発現調節配列は、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列である、制御方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５において、
前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、
前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させる、制御方法。
【請求項７】
請求項６において、
前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲである、制御方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項において、
前記シアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp. JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種である、制御方法。
【請求項９】
配列番号１で表される、ＤＮＡ配列。
【請求項１０】
プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換されたシアノバクテリア。
【請求項１２】
目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む、当該目的物質の製造方法であって、
前記シアノバクテリアが、請求項１０に記載のＤＮＡ配列を保持し、
前記目的遺伝子の発現が調節される、製造方法。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、
前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させる、製造方法。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲである、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現の制御方法、目的物質の製造方法、および、それらに用いるＤＮＡ配列、発現ベクター、並びに、シアノバクテリアに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物により、持続的なエネルギー供給を目指したバイオ燃料関連化合物等の有用な物質生産を行うシステムが注目されている。シアノバクテリア等の光合成を行う原核生物は、このようなシステムにおける宿主生物として有用と目され、研究が盛んである。特に、シアノバクテリアのうち、Synechocystis sp. PCC6803なる株は、早期（５番目）にゲノムが解析された生物であり、その生化学的解析が進んでいるため、多くの研究者がバイオ燃料生産用の宿主として注目している。【０００３】
宿主として大腸菌を利用する場合には、プロモーターとして、ラクトースで誘導可能なlacプロモーター（Plac）、アラビノース誘導型のaraBADプロモーター等が用いられる。一方、Synechocystis sp. PCC6803等のシアノバクテリアを宿主として利用する場合には、プロモーターの選択の幅は制限される。例えば、Huangらによって、通常大腸菌で使われるプロモーターである、Placプロモーター、Ptetプロモーター、PRプロモーターは、シアノバクテリアであるSynechocystis sp. PCC6803中では機能しないことが示されている（非特許文献１）。【０００４】
また同文献においてHuangらは、誘導プロモーターPtrcプロモーターがシアノバクテリア中で機能することを見出しているが、誘導剤非存在下での発現レベルが高いことを問題として挙げている。さらにシアノバクテリアは、ラクトース、IPTG（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）、アラビノース等の糖または糖の誘導体をほとんど取り込まないため、非誘導時と比べた際の誘導時の発現レベルも低いことが示唆されている。【０００５】
Synechosystis sp. PCC6803中で機能するプロモーターとしては、Ni2+によって誘導可能なプロモーターが報告されている（非特許文献２）。しかし、Ni2+は重金属であるため、バイオ燃料生産を指向した大規模な培養を目標とする場合には、必ずしも適切な誘導剤とは言えない。【０００６】
シアノバクテリアは光合成を効率的に行うために、様々な光を受容し、遺伝子発現制御を行うシステムを有している。KehoeらはFremyella diplosiphonが有する赤色と緑色の光で遺伝子発現を受容するRcaE（センサーヒスチジンキナーゼ）を利用した発現制御システムを開示している（特許文献１）。また、Synechocystis sp. PCC6803中でも、多くの光センサータンパク質が報告されており、Hiroseらによって２００８年に緑色光を受容するセンサータンパク質CcaS（センサーヒスチジンキナーゼ）が報告されている（非特許文献３）。同文献では、CcaSは、緑色光を受容することで自己リン酸化し、CcaR（レスポンスレギュレーター）にリン酸基を転移させる。そして、係るリン酸化されたCcaRがDNA結合能を獲得し、cpcG2のプロモーターの下流の遺伝子の発現を促すことができる旨示唆されている。【０００７】
この出願は、平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネルギー創成のための基盤技術の創出」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／００９３０５１明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Huang et al. Nucleic Acids Res. 2010, 38(8) 2577-2593
【非特許文献２】Lopez-Maury et al. Mol. Microbiol. 2002, 43(1) 247-256
【非特許文献３】Hirose et al. PNAS 2008, 105(28) 9528-9533
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明者らは、合成生物学的アプローチを用い、光制御可能な合成藍藻（シアノバクテリア）を用いたバイオプロセスの構築を目指している。効率的なバイオ燃料生産を実現するためには、遺伝子の発現制御系が重要である。シアノバクテリアを利用して物質生産を行う上では、遺伝子発現制御を行うことは重要である。そして、光センサータンパク質を利用することで、任意の時間に遺伝子の発現のON/OFFをコントロールすることが出来ると考えられる。【００１１】
天然で機能している光センサーは、バクテリアの生存に必要なレベルで遺伝子発現をコントロールしているため、バイオ燃料を大量生産するには不向きな場合が多い。また、研究対象として、その代謝等の生化学的解析が進んでいるSynechocystis sp. PCC6803においてでさえ、遺伝子発現を制御する誘導型のプロモーターとして優れているものはほとんど見出されていない。【００１２】
一方、シアノバクテリアの遺伝子発現を行うためには、効率的な光合成に必要な赤色光以外の光を利用することが望ましいと考えられる。上記特許文献１のKehoeらによって開示されているRcaEは、赤色光を受容することで下流の遺伝子の発現を活性下する。またKehoeらが用いているF. diplosiphonでは、他の緑色光センシング系が知られているものの、詳細はわかっておらず、異種株では使用することが難しいと考えられる。【００１３】
発明者らは、上記非特許文献３に関し、cpcG2のプロモーターの下流にGFPuvをレポーター遺伝子として連結し評価したところ、その蛍光強度は、必ずしも高くないとの知見を得た。さらに、cpcG2のプロモーターの下流の遺伝子発現量は、Ptrcのプロモーターと比較して極端に低く、その上、CcaSは緑色光で活性化されるものの、効率的な増殖に必要な赤色光では不活化されることが報告されている。【００１４】
本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することのできる制御方法を提供することにある。また、本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化または抑制することのできる発現ベクターを提供することにある。さらに、本発明の幾つかの態様に係る目的の１つは、そのようなＤＮＡ配列を保持するシアノバクテリア、および該シアノバクテリアによる目的物質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は上述の課題の少なくとも一部を解決するために為されたものであり、以下の態様または適用例として実現することができる。【００１６】
［適用例１］本発明に係る目的遺伝子の発現の制御方法の一態様は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列を挿入することを含む。【００１７】
本適用例の制御方法によれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。【００１８】
［適用例２］適用例１において、前記プロモーターは、光応答性プロモーターであってもよい。【００１９】
［適用例３］適用例２において、前記光応答性プロモーターが、配列番号１の１番目〜２３７番目で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する配列を有してもよい。【００２０】
［適用例４］適用例１〜適用例３のいずれか１例において、前記発現調節配列は、フィコシアニンβサブユニット（ｃｐｃＢ）の開始コドンから上流の５'非翻訳領域の塩基配列と、９０％以上の相同性を有してもよい。【００２１】
［適用例５］適用例４において、前記発現調節配列は、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列であってもよい。【００２２】
［適用例６］適用例４または適用例５において、前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させてもよい。【００２３】
［適用例７］適用例６において、前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲであってもよい。【００２４】
［適用例８］適用例１〜適用例７のいずれか１例において、前記シアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp. JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。【００２５】
［適用例９］本発明に係るＤＮＡ配列の一態様は、配列番号１で表される。【００２６】
本適用例のＤＮＡ配列によれば、下流側に配置された目的遺伝子の発現量を大幅に制御することができる。【００２７】
［適用例１０］本発明に係る発現ベクターの一態様は、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる。【００２８】
本適用例の発現ベクターによれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。【００２９】
［適用例１１］本発明に係るシアノバクテリアの一態様は、適用例１０に記載の発現ベクターで形質転換されたものである。【００３０】
本適用例のシアノバクテリアによれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、当該シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。【００３１】
［適用例１２］本発明に係る目的物質の製造方法の一態様は、目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む、当該目的物質の製造方法であって、前記シアノバクテリアが、適用例１０に記載のＤＮＡ配列を保持し、前記目的遺伝子の発現が調節される。【００３２】
本適用例の製造方法によれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が調節されることにより、シアノバクテリアによる目的物質の生産量を制御することができる。【００３３】
［適用例１３］適用例１２において、前記シアノバクテリアが、さらに、外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を保持し、前記外因性遺伝子、および、前記目的遺伝子を共発現させてもよい。【００３４】
［適用例１４］適用例１３において、前記外因性遺伝子は、ｃｃａＲであってもよい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、シアノバクテリア中の目的遺伝子の発現を強化および／または抑制することができ、シアノバクテリア中の遺伝子の発現を容易に制御することができる。また、本発明によれば、シアノバクテリア中の遺伝子を非常に高い発現量で発現させることができる。さらに、本発明によれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の遺伝子発現を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。
【図２】図２は、cpcBの5'非翻訳領域を連結したことによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１として標準化した。
【図３】図３は、CcaR追加発現による発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。
【図４】図４は、cpcBの5'非翻訳領域とCcaR追加発現の組み合わせによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。
【図５】図５は、cpcBの5'非翻訳領域と開始コドンの間の距離と発現量の影響を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。それぞれの値は、PcpcG2を赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を１とし標準化した。
【図６】図６は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。
【図７】図７は、実験例に係る培養の際の光の照射を説明する概略図である。
【図８】図８は、cpcBの5'非翻訳領域とCcaR追加発現の組み合わせによる発現量向上を説明する図である。白は赤色光下で培養した際の蛍光強度、グレーは赤色光＋緑色光下で培養した際の蛍光強度を示す。グラフ中の左側は、図６の（ｄ）に示すベクターによる形質転換体、右側は、図６の（ｅ）に示すベクターによる形質転換体の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下に本発明のいくつかの実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
【００３８】
１．目的遺伝子の発現の制御方法
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として目的遺伝子を発現する方法であって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、前記目的遺伝子の開始コドンの上流側に、発現調節配列を挿入することを含む。
【００３９】
１．１．シアノバクテリア
シアノバクテリアは、光合成を行うことができる原核生物であり、真正細菌ドメインの一門を構成する。本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として該目的遺伝子の発現を制御する。
【００４０】
本実施形態において宿主として使用するシアノバクテリアとしては、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatusBP-1、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Chroococcacae、Stigonematacae、Mastigocladacae、Oscillatroriacae、Mastigocladus、Phormidium、Symploca、Aphanocapsa、Fisherella、等を例示することができる。
【００４１】
これらのシアノバクテリアのうち、Synechocystis sp. PCC6803、Nostoc punctiforme PCC 73102、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、およびSynechococcus sp.JA-3-3Abからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、本実施形態で宿主として使用するシアノバクテリアは、Synechocystis sp. PCC6803、および／またはNostoc punctiforme PCC 73102であることがより好ましい。
【００４２】
シアノバクテリアは、各種の遺伝子と、その発現を調節する各種のプロモーターを有している。シアノバクテリアにおいては、そのようなプロモーターには、光応答性プロモーターが含まれる。シアノバクテリアが有する光応答性プロモーターとしては、例えば、ＰｃｐｃＧ２、ＰｌｓｉＲ、等がある。なお、本明細書では、プロモーターを、「Ｐ」に遺伝子を表す記号の添字を付して表記することがある。
【００４３】
本実施形態の制御方法では、宿主のシアノバクテリアは、後述する発現ベクターによって形質転換されたものである。
【００４４】
１．２．目的遺伝子
本実施形態における目的遺伝子とは、本実施形態のシアノバクテリアによって目的物質を効率的に生産するために有用なタンパク質をコードする遺伝子のことをいう。目的遺伝子は、特に限定されず、宿主となるシアノバクテリアの内在性遺伝子であってもよいし、プラスミド等による形質転換で外部から導入された（外因性）遺伝子であってもよい。なお目的遺伝子には、開始コドンが存在する。
【００４５】
また、目的遺伝子がコードするタンパク質についても、特に限定されず、例えば、酵素、抗体、溶菌タンパク質、細胞凝集関連タンパク質等とすることができる。
【００４６】
本実施形態の制御方法では、目的遺伝子は、宿主となるシアノバクテリアの遺伝子の１種であってもよいし、複数種であってもよい。また、目的遺伝子は、外因性の遺伝子であってもよいし、内在性および外因性の遺伝子の両者を目的遺伝子としてもよい。
【００４７】
目的遺伝子の具体的な例としては、エタノールの生産に必要な酵素をコードするadhE、炭化水素合成関連酵素をコードするAcyl-ACP Reductase、およびAldehyde Decarbonylase、溶菌タンパク質をコードするホーリン、エンドライシン、細胞凝集関連タンパク質をコードするAntigen43、AIDA-I、tibA等を挙げることができる。
【００４８】
本明細書において、用語「外因性」とは、分子生物学的技法によって生物に導入した特定の遺伝子配列であり、野生型の細胞または生物のゲノムＤＮＡ中に存在するものと区別するために用いる。野生型の細胞または生物において、ゲノム中に存在するか否かを問わず、ゲノム中に存在する配列を、分子生物学的技法により導入した場合においても、外因性遺伝子とする。また遺伝子に関して、用語「内在性」は、所定の野生型の細胞または生物中に見つかり得る、ゲノムＤＮＡ中に存在する遺伝子配列をいう。
【００４９】
１．３．プロモーター
プロモーターとは、転写開始反応に関与するＤＮＡの領域であって、ＲＮＡポリメラーゼや転写因子が結合する領域のことをいう。本実施形態の制御方法におけるプロモーターとしては、所定の目的遺伝子に応じて適宜選択することができる。また、本明細書では、所定の目的遺伝子に対して、プロモーターとして機能する塩基配列であれば、特定の名称が与えられていなくてもプロモーターと称することがある。
【００５０】
プロモーターは、宿主となるシアノバクテリアに内在する、内在性プロモーターであってもよいし、外部から導入される（外因性）プロモーターであってもよい。また、形質転換されたシアノバクテリアにおいて、プロモーターの数は特に制限されず、目的遺伝子の数と同じであっても異なっていてもよい。
【００５１】
プロモーターとしては、例えば、光応答性プロモーターや、高温、低温、塩等のストレスによって、その下流側に配置された目的遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターが挙げられる。これらのうち、本実施形態の制御方法では、シアノバクテリアの内在性のプロモーターを利用できる観点から、光応答性プロモーターがより好ましい。なお、光応答性プロモーターを用いる場合には、外因性の光応答性プロモーターを宿主に導入してもよい。
【００５２】
本実施形態の制御方法に使用しうるプロモーターの具体例としては、ＰｃｐｃＧ２等が挙げられる。
【００５３】
本実施形態の制御方法においては、プロモーターとしては、ＰｃｐｃＧ２（配列番号１の１番目から２３７番目の塩基配列）と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を使用することが、緑色誘導の観点から、より好ましい。このようなプロモーターを選択すれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の目的遺伝子発現を制御することができる。
【００５４】
ここで「相同性」とは、２つのＤＮＡ間の配列の同一性または類似性をいう。「相同性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加または欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような相同性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。なお、相同性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベース等についても当業者には一般的に利用可能である。
【００５５】
１．４．発現調節配列
発現調節配列は、上述のプロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、上述の目的遺伝子の開始コドンの上流側に、挿入される。
【００５６】
発現調節配列は、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有する。発現調節配列の長さは、１３塩基以上４０塩基以下がより好ましく、１４塩基以上３５塩基以下がさらに好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がさらに好ましく、１８塩基以上２５塩基以下が特に好ましい。
【００５７】
発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより、本実施形態の制御方法において、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。すなわち、例えば、発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより目的遺伝子の発現量が増大する場合には、プロモーターの作動量に対する目的遺伝子の発現量の幅を大きくすることができる。また、例えば、発現調節配列が、１２塩基以上５０塩基以下の長さの塩基配列を有することにより目的遺伝子の発現量が減少する場合には、プロモーターの作動量に対する目的遺伝子の発現量の幅を小さくすることができる。これにより、例えば、宿主のシアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産量を制御することができる。
【００５８】
発現調節配列は、上述のプロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、上述の目的遺伝子の開始コドンの上流側に、当分野の定法により、挿入されることができる。
【００５９】
発現調節配列は、特定のＤＮＡ配列としてもよい。例えば、発現調節配列は、特定の遺伝子の開始コドンの上流の５’非翻訳領域の塩基配列とすることができる。発現調節配列を特定の遺伝子の５’非翻訳領域の塩基配列とすることにより、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。このような遺伝子としては、導入することによって宿主のシアノバクテリアが生存できる限り任意であるが、例えば、ｃｐｃＢ、ｐｓｂＡＩ等が挙げられる。
【００６０】
また、この場合、前記特定の遺伝子として、シアノバクテリアにおける発現量の大きい遺伝子を選ぶと、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。そのような遺伝子としては、ｃｐｃＢ、ｐｓｂＡＩ等が挙げられ、その開始コドンから上流の５’非翻訳領域の塩基配列、または、当該塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を発現調節配列とすることができる。さらに、発現調節配列として、フィコシアニンβサブユニットをコードするｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域を選択すると目的遺伝子の発現量を増大させることができる。さらにこの場合、当該発現調節配列が由来するシアノバクテリアの株としては、Synechocystis sp. PCC6803、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus elongatus PCC7942、Thermosynechococcus elongatus BP-1、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Nostoc sp. PCC 7120、およびSynechococcus sp. CC9311からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、より好ましくは、Synechococcus sp. NKBG15041c、Synechococcus sp. PCC7002、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Synechococcus sp. CC9311、特に好ましくは、Synechococcus sp. NKBG15041c、である。
【００６１】
表１に、上記例示した株の主なもののｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基程度の塩基配列を示す。なお、Synechococcus sp. NKBG15041cの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基は、表１中、配列番号２である。また、Synechococcus sp. PCC7002の開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基は、配列番号３２（TATAAGTAGGAGATAAAAAC）で表される。
【００６２】
【表１】
2014192765.tif 000003
【００６３】
表１をみると、８種の株において、ｃｐｃＢの開始コドンから上流の５’非翻訳領域の２０塩基程度の塩基配列の中央付近に共通する配列（以下これをコンセンサスという場合がある。）が存在している。上記８種の株に限らず、このようなコンセンサスが存在する株の群がある場合で、特定の株に由来する発現調節配列をその中から選択する場合には、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの距離（塩基数）を指標としてもよい。また、本明細書では、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの配列を「スペーサー」と称する場合がある。
【００６４】
この場合には、目的遺伝子の開始コドンからコンセンサスまでの距離（スペーサー）は、当該群においてより短いことが好ましい場合がある。例えば、表１の上段より７種の株を１群とした場合にはそのコンセンサスはAGGAGAであり、当該７種の株からこのような指標によって特定の株を選択する場合には、Synechococcus sp. NKBG15041cが選択される。
【００６５】
１．５．外因性遺伝子の共発現
本実施形態の目的遺伝子の発現制御方法において、上述の発現調節配列を挿入することに加えて、外因性遺伝子を共発現させてもよい。外因性遺伝子を共発現させると、目的遺伝子の発現量を増大させることができる場合がある。
【００６６】
共発現させる外因性遺伝子としては、導入することによって宿主のシアノバクテリアが生存できる限り任意であるが、例えば、ｃｃａＲ、ｃｃａＳ等が挙げられる。また、共発現させる外因性遺伝子の選択にあたっては、例えば、プロモーターからの転写に必要な因子、転写量を増強するという技術思想に基づくことができる。
【００６７】
共発現させる外因性遺伝子は、同一の発現ベクターによって宿主に導入されてもよいし、それぞれ別個の発現ベクターによって宿主に導入されてもよい。いずれの方法であっても目的遺伝子の発現量を制御することができるが、同一の発現ベクターによって宿主に導入する場合は、プラスミドを安定的に導入しやすいため、好ましい。
【００６８】
また、例えば、Synechocystis sp. PCC6803とNostoc punctiforme PCC 73102は、CcaSおよびCcaR（PcpcG2の制御を行う遺伝子）を有しているが、そのような遺伝子を有さない他のシアノバクテリアに対してCcaSおよびCcaRを導入するようにしてもよい。
【００６９】
１．６．その他の構成
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、上述の発現調節配列を挿入すること以外に、以下の構成を有してもよい。
【００７０】
本実施形態の制御方法等で用いられる遺伝子工学的技術は、例えば、Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．，Ｆ．，Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎ ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、及びＤ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ著、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＩＲＬ発行、１９８５年等に記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
【００７１】
１．６．１．発現ベクター
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、シアノバクテリアを宿主として用いられる発現ベクターを構築することを含んでもよい。発現ベクターは、宿主シアノバクテリアに遺伝子を運搬するＤＮＡ、言い換えればベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で当該遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとしては例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。本実施形態で使用するベクターの具体例としては、例えば、ｐＫＴ２３０、ｐＢＢＲ１２２等が挙げられる。また、プラスミドベクターの構築にあたっては、適宜の制限酵素を用いることができ、ＰＣＲ、インバースＰＣＲ、クローニング、リン酸化、脱リン酸化、二本鎖処理、ライゲーション、大腸菌等の形質転換等の工程を適宜含むことができる。
【００７２】
１．６．２．形質転換体
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、上述の発現ベクターを用いて宿主となるシアノバクテリアを形質転換することを含んでもよい。形質転換は、エレクトロポレーション等の定法にしたがって行うことができる。
【００７３】
１．６．３．培養
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、宿主となるシアノバクテリア（上記形質転換体）を培養することを含んでもよい。培養の条件としては、シアノバクテリアが生存できる条件であれば特に制限されず、シアノバクテリアに合わせて適宜選択される。培地についても特に制限はなく、固形培地、液体培地等を使用することができる。培養の条件についても特に制限されず、公知の条件にしたがうことができる。
【００７４】
１．６．４．誘導
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法は、プロモーターを活性化させ、目的遺伝子の発現を誘導することを含んでもよい。プロモーターの種類に応じて、例えば、培養の際、培地温度、培地濃度、組成を変化させたり、光を照射したりすることを含んでもよい。また、本実施形態において、プロモーターとして、光応答性プロモーターを使用する場合には、その特性に応じた波長域の光を照射してもよく、複数の互いに異なる波長域の光を照射してもよい。また、本実施形態において、プロモーターとして、光応答性プロモーターを使用する場合には、誘導との関連を問わず、例えばシアノバクテリアの増殖に適した波長域の光を照射してもよい。
【００７５】
１．７．作用効果
本実施形態の目的遺伝子の発現の制御方法によれば、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、発現調節配列が挿入されることにより、目的遺伝子の発現を容易に制御することができる。また、目的遺伝子を非常に高い発現量で発現させることができる。さらに、光応答性プロモーターである、ＰｃｐｃＧ２を選択すれば、光合成に重要でない光を用いて、シアノバクテリア中の目的遺伝子発現を制御することができる。
【００７６】
２．ＤＮＡ配列
目的遺伝子の開始コドンの上流に配置される、プロモーターから発現調節配列までの具体的なＤＮＡ配列としては、下記配列（配列番号１）の１番目〜２３７番目（下線）で表される配列が挙げられる。
【００７７】
AGCCCATTGTGCTTTTCTCTATCAACCTCAGCTTACCTGAAGGGGTGAACAGGTCTGGGTTAATTCATGTTGCGAAATGTAACAGTTTTAGTCGCATCAGCTAACTTTCCGATTTCTTTACGATTTTCTCCCCCTTTTCTTCAATTTTACTTTGTTAGGATCGCATTTTTAATGCCAACACATACCAGTTATTGGCTGGACATTAAACAACTTTTAAGTTTAATTACTAACTTTACATATAAGTAGGAGATAAAAAT
【００７８】
また、係るＤＮＡ配列は、目的遺伝子の発現に支障がない限り、塩基の変更、付加、または欠失が存在してもよい。したがって本実施形態のＤＮＡ配列としては、配列番号１の１番目〜２３７番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有する配列である。また特に、配列番号１の１０５番目から１２６番目の配列、２３８番目から２５７番目が重要である。したがって本実施形態のＤＮＡ配列としては、配列番号１の１０５番目〜１２６番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する配列がさらに好ましい。また、２３８番目〜２５７番目で表される配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する配列がさらに好ましい。
【００７９】
このようなＤＮＡ配列によれば、下流側に配置された目的遺伝子の発現量を大幅に増大させることができる。
【００８０】
３．発現ベクター
本実施形態の発現ベクターは、「１．６．１．発現ベクター」の項で述べたように構築された発現ベクターである。係る発現ベクターは、具体的には、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、１２塩基以上５０塩基以下の発現調節配列が挿入された配列を含み、シアノバクテリアに用いられる。
【００８１】
このような発現ベクターによってシアノバクテリアを形質転換すれば、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
【００８２】
なお、発現ベクターにおける、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。
【００８３】
４．シアノバクテリア
本実施形態に係るシアノバクテリアは、「１．１．シアノバクテリア」の項で述べたシアノバクテリアであって、プロモーターとして機能する塩基配列の下流側であって、目的遺伝子の開始コドンの上流側に、上述の発現調節配列が挿入された配列を保持したものである。
【００８４】
このようなシアノバクテリアによれば、目的遺伝子の発現量を広いレンジで調節・制御することができる。また、これにより、シアノバクテリアによる有用物質（目的物質）の生産を制御することができる。
【００８５】
なお、本実施形態に係るシアノバクテリアにおける、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。
【００８６】
５．目的物質の製造方法
本実施形態の目的物質の製造方法は、目的物質を産生する能力を有するシアノバクテリアを培地中に、緑色光および赤色光の照射により培養し、当該目的物質を生成させ、当該目的物質を採取することを含む。
【００８７】
本実施形態の製造方法によって製造される目的物質としては、バイオ燃料に関連する化合物（水素、エタノール、セルロース、２，３ブタンジオール、イソブチルアルデヒド、アルカン、アルケン、脂肪酸、トリグリセリド等）、バイオプラスチック（ポリヒドロキシ酪酸等）、酵素（グルコース脱水素酵素、ルシフェラーゼ等）、外来タンパク質産物（細胞凝集関連タンパク質、溶菌関連タンパク質等）、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ビタミン等が挙げられる。また、目的物質は、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質等であってもよいし、目的遺伝子の発現によって生じるタンパク質（酵素等）が触媒する反応等によって生じる物質であってもよい。
【００８８】
本実施形態の製造方法における、シアノバクテリア、光、培養、外因性遺伝子等については、既に述べた通りである。すなわち、本実施形態の製造方法における、プロモーター、目的遺伝子、発現調節配列、外因性遺伝子等は、「１．目的遺伝子の発現の制御方法」で説明したとおりであり、それらいずれの手法も適用しうる。例えば、本実施形態の製造方法において、シアノバクテリアに外因性遺伝子を含むＤＮＡ配列を導入し、外因性遺伝子および目的遺伝子を共発現させれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が増強される場合がある。また、例えば、本実施形態の製造方法において、当該外因性遺伝子としてｃｃａＲを選択すれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が増強される場合がある。
【００８９】
菌体や培養液等の培養物からの目的物質の採取は、通常には、イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施することができる。
【００９０】
本実施形態の製造方法によれば、シアノバクテリアの目的遺伝子の発現が調節されることにより、シアノバクテリアによる目的物質の生産量を制御することができる。
【００９１】
６．実験例
以下に実験例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実験例に何ら限定されるものではない。
【００９２】
６．１．プロトコル
以下に本実験例のシアノバクテリア（形質転換体）の作成、培養および評価に関するプロトコルを記載する。図１は、実験例に係る発現ベクターを説明する模式図である。
【００９３】
＜１＞
Synechocystis sp. PCC6803から
5'-TTTGAGCTCCTAAGCTCGAGGCAAATGG-3'（配列番号１０）、
5'-TTTAAGCTTCTAGTTTTTCCCTTGGCAC-3'（配列番号１１）
を用いて、ccaS-cpcG2-ccaRをpUC18ベクターにクローニングした。その後、SacIとHindIIIを用いて、cpcG2をGFPuvに置換し、pUC18-PccaR-ccaR-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSを構築した。ccaSとccaRのプロモーターはSynechocystis sp. PCC6803由来のものである。
【００９４】
＜２＞
転写終結因子を導入するため、下記プライマーを用いて増幅し、PstIとH indIIIを用いてpTrc99Aに導入した。
Primer Fw: 5'-GACCTGCAGGCGAAAAAACCCCGCCGAAGCGGGGTTTTTTGCGCTAAGCTCGAGGCAAATGGTTATAG-3'（配列番号１２）
Primer Rev: 5'-GCCAAGCTTCTAGTTTTTCCCTTGGCACAAAG-3'（配列番号１３）
【００９５】
＜３＞
ccaSとPcpcG2-GFPuv、ccaRとPcpcG2-GFPuv、およびPcpcG2-GFPuvを含む断片を下記のプライマーを用いて増幅し、制限酵素PstIを用いて広宿主域ベクターであるpKT230にクローニングし、pKT230-PcpcG2-GFPuv（図１（ａ））, pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS, pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRを構築した。PcpcG2-GFPuvの断片は、P CR後pGEM-T-Easy (Promega)に導入し、同プラスミドをPstIで切断後、広宿主域ベクターであるpKT230にクローニングした。
【００９６】
＜４＞
Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv)：AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG（配列番号１４）
Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv)：ATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACCTTAC（配列番号１５）
Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS): 5'-AACTGCAGTCCTCCACTAAAAGAATTCTCATAG-3'（配列番号１６）
Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaS)： GTAAAACGACGGCCAGT（配列番号１７）
Primer Fw (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR)：5'-AACTGCAGATATTAGCGAATCCCAGTAGAAAAACC-3'（配列番号１８）
Primer Rev (pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaR)：CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号１９）
【００９７】
＜５＞
PcpcG2-GFPuvのGFPの開始コドンの上流に合成したcpcBの5'側の非翻訳領域20塩基を以下の合成DNAと制限酵素NdeIを用いて導入した(PcpcG2-cpcB-GFPuv)（図１（ｂ））。合成DNAをリン酸化した後に、熱処理および徐冷によって二本鎖を形成させた。NdeIで切断したpKT230-PcpcG2-GFPを脱リン酸化した後に、二本鎖処理した合成DNAと混合し、ライゲーション、およびDH5αの形質転換を行い、目的のプラスミドを構築した。
合成DNA1: 5'-TATAAGTAGGAGATAAAAA-3'（配列番号２０）
合成DNA2：5'-TATTTTTATCTCCTACTTA-3'（配列番号２１）
【００９８】
＜６＞
pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRのGFPuvの開始コドンの上流に合成したPcpcBの5'側の非翻訳領域を上記の合成DNAを用いて導入した（図１（ｃ））。
【００９９】
＜７＞
PcpcBの配列を削るまたは付加し、異なる種間にあるcpcBの5'非翻訳領域と長さ（スペーサー）を 6、8、9塩基に合わせたものを構築するために、PcpcG2-cpcB-GFPuvを鋳型とし、前もって5'をリン酸化した下記のプライマーを用いてインバースPCRを行い、インバースPCR後に精製、ライゲーションし、DH5αを形質転換し、目的のプラスミドを構築した。
Primer Fw (6塩基): 5'-ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２２）
Primer Rev (6塩基):5'- TTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２３）
Primer Fw (8塩基): 5'-AATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２４）
Primer Rev (8塩基):5'- ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２５）
Primer Fw (9塩基):5'- AAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG-3'（配列番号２６）
Pri mer Rev (9塩基): 5'- ATTTTTATCTCCTACTTATATGTAAAGTTAGTAATTAAAC-3'（配列番号２７）
この工程で得られたプラスミドの配列を表２に示す。
【０１００】
【表２】
2014192765.tif 000004
【０１０１】
＜８＞
＜１＞〜＜７＞で構築したプラスミドベクターを用いて、Synechocystis sp. PCC6803をエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換後、660nm付近の赤色を含む、例えばPanasonic社製赤色LED基盤を用いて、光照射下で1週間程度、下記に示す組成のBG11固形培地を用いて培養を行った。この際に、50μg/mLのストレプトマイシンを用いて形質転換体を選択してある。得られたコロニーは25μg/mLのストレプトマイシンを含むBG11（組成は下記に示す）中に播種し、赤色光下で１週間静置培養した。その後、同様に赤色照射下でOD730が0.5〜1程度の値になるまでTAITEC社製のBR-42FL等を用いて振盪培養を行った。
【０１０２】
＜BG11固形培地＞
NaNO3          18mM
K2HPO4・3H2O    30mg/L
MgSO4・7H2O      75mg/L
CaCl2・2H2O      36mg/L
Citric acid      6mg/L
Ferric ammonium citrate    6mg/L
Na2EDTA      1mg/L
Na2CO3        20mg/L
Vitamin B12      0.01mg/L
Trace mix astro    1mL
1 M TES-KOH(pH7.4)    5 mL
チオ硫酸ナトリウム    3g/L
寒天    15g/L
蒸留水で1Lにメスアップ
【０１０３】
オートクレーブで滅菌後、滅菌シャーレに注ぎ、固形培地とした。この際に用いているTrace mix astroの組成は下記の通りである。
H3BO4      286mg
MnCl2・4H2O    181mg
ZnSO4・7H2O  22.2mg
Na2MgO4・2H2O  39mg
CuSO4・5H2O  7.9mg
Co(NO3)2・6H2O  4.94mg
蒸留水で100mLにメスアップ
【０１０４】
＜BG11液体培地＞
NaNO3  18mM
K2HPO4・3H2O  30mg/L
MgSO4・7H2O  75mg/L
CaCl2・2H2O  36mg/L
Citric acid  6mg/L
Ferric ammonium citrate  6mg/L
Na2EDTA  1mg/L
Na2CO3    20mg/L
Vitamin B12  0.01mg/L
Trace mix astro  1mL
1 M TES-KOH(pH7.4)  20 mL
蒸留水で1Lにメスアップ
【０１０５】
＜９＞
得られた形質転換体を、赤色照射下または、525nm付近の光を含む、例えば、日本医化器械製作所製の3in1LED照明ユニットを用い、緑色の光照射下で培養を行った。この際に緑色光照射する場合には赤色光を同時に照射した。
【０１０６】
＜１０＞
緑色光下で培養後、1 mLの培養液を13000g、5分の遠心分離により集菌した。集菌した菌体をBG11またはPBSで洗浄した後に、プレートリーダー(Varioskan Flash Multimode Reader, Thermo scientific) を用いて、蛍光強度を測定した。この際の励起光は395nm、蛍光は509nmとした。
【０１０７】
＜１１＞
また、(d) PcpcG2-cpcB（発現調節配列）-gfpmut3b, および(e) PcpcG2-cpcB（発現調節配列）-gfpmut3b-ccaR（非翻訳領域を56bp含む）のベクター（図６（ｄ）、図６（ｅ）参照）を構築し、Synechocystis sp. PCC 6803にエレクトロポレーションによって導入した。
【０１０８】
ここで、gfpmut3bは、上述のGFPuvと同様に、GFPの変異体であり、UV光による励起に特化したものがGFPuvであり、GFPの蛍光強度を高めたものがgfpmut3bである。また、この実験ではフローサイトメーターを利用するため、青色光レーザーで励起しやすくするためにgfpmut3bを用いた。GFPuv及びgfpmut3bの塩基配列は、それぞれ、配列番号３３及び配列番号３４に示した。
【０１０９】
導入後、BG11培地で赤色光下で培養した。培養後、50 mLのBG11 （100mLの三角フラスコ）にそれぞれの形質転換体について植菌を行い、赤色光下でOD730が0.5付近になるまで培養した。
【０１１０】
その後、図７に示すように、緑色光（中心波長５２０ｎｍ）を下方から、赤色光（中心波長６６０ｎｍ）を上方から照射し、培養を行った。
【０１１１】
適宜サンプリングし、遠心分離後、菌体をリン酸バッファーで洗浄した。洗浄後の菌体を１０５〜１０６cells/mLに希釈後、BD AccuriTM C6 フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー製、NJ、US）にて10000cellsの蛍光を測定した。測定時には青色光レーザーを用い、FL1フィルター（533±15 nm）を用いた。
【０１１２】
６．２．実験例の説明
緑色光センサーは、Synechocystis sp. PCC6803由来のものであり、CcaSとCcaRの二種のタンパク質によって構成される二成分制御系である。CcaSは緑色光を受容し、自己リン酸化する。CcaRは自己リン酸化されたCcaSからリン酸基を受け取り、活性型となる。活性型CcaRはDNA結合能を獲得し、cpcG2の上流に結合し、CpcG2の発現を促す。
【０１１３】
CcaSは緑色光で活性化し、赤色光で不活化する。しかし赤色は光合成に重要であるため、赤色と緑色を供に照射し、GFPの発現量を評価した。その結果、赤色照射下と比較し、高いGFPの発現が確認された。しかしその発現量は不十分であった。発明者らは、赤色光が光合成に重要な光であることから、赤色光と緑色光の両方を照射する必要があり、相対的に緑色光による誘導が僅かなものになったことによって、このような不十分な遺伝子発現となったものと考えている。
【０１１４】
プロモーターからの発現を評価するために、cpcG2のプロモーター(PcpcG2)の下流にレポーター遺伝子としてGFPuv（配列番号３３）を連結し、広宿主域ベクターに導入し、Synechocystis sp. PCC6803を形質転換した。
【０１１５】
また、同プロモーターに対し、シアノバクテリア中で高発現しているcpcBの5'非翻訳領域を連結した(PcpcG2-cpcB)。開始コドン周辺の5'非翻訳領域はタンパク質の翻訳に重要である。この際の5'非翻訳領域はSynechococcus sp. NKBG15041c株中のcpcB遺伝子の開始コドンから上流20bpの配列(TATAAGTAGGAGATAAAAAC)（配列番号２）を選択し、末尾のＣをＴに変更した配列番号２８の配列を評価に供した。PcpcG2-cpcBの下流に同様にGFPuvを連結し、広宿主域ベクターに導入した。
【０１１６】
それぞれの形質転換体を赤色光下で培養した。CcaSは赤色光で不活化されるために、PcpcG2からの漏出発現を抑制できる。ある程度増殖したところで緑色光および赤色光の二色の光を同時に照射し、経時的にGFPuvの蛍光強度を測定した。
【０１１７】
24時間後の蛍光強度の測定結果を図２に示す。PcpcG２単独でのGFPuvの蛍光を１とした場合に、Pcpc G2-cpcBは15〜25倍もの値を示し、その発現量は大幅に向上することが判明した。
【０１１８】
次に、転写量増強のために、転写因子であるCcaRをプラスミドベクターを用いてSynechocystis sp. PCC6803に導入し、先と同様に評価した(PcpcG2-cpcB+CcaR)。この評価結果を図３に示す。
【０１１９】
図３をみると、CcaRを導入することで、GFPuvの発現量が上昇したことがわかった。転写因子量を増強することで、転写量を上昇させられると考えられる。さらに、PcpcG2-cpcBを持つプラスミドベクターに対して、CcaRを導入したところ、その効果は相乗的であり、PcpcG2と比較して４０倍もの発現量向上をすることが判明した（図４）。
【０１２０】
更に、複数種のcpcBの5'非翻訳領域の配列を比較したところ、保存されているAGGAGAと開始コドンの距離（スペーサー）に違いが見られたため(表１、２参照)、長さの検討を試みたところ、７、８、９塩基（配列番号２６、２８、２９）の場合と比較し、６塩基（配列番号２７）の場合が一番高いことが判明した（図５）。
【０１２１】
更に、プラスミドベクター中のCcaRの導入位置による、GFP（変異体）の発現量の変化を確認した。すなわち、図４のPcpcG2-cpcB+CcaRは、図１（ｃ）に示すように、CcaRがPcpcG2の上流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換されているが、これと比較するために、図６（ｅ）に示すように、CcaRがPcpcG2の下流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換した場合について、gfpmut3b（変異体）（配列番号３４）の発現量の変化を調べた。図６（ｅ）に示すプラスミドベクターは、緑色光のセンサーシステムのプロモーター（PcpcG2）に、標的遺伝子（gfpmut3b）と一緒にCcaRが発現されるように構築されている点で、図１（ｃ）に示すプラスミドベクター（天然のプロモーターによってCcaRが発現されるように構築されている）と異なる。すなわち、図６（ｅ）に示すプラスミドベクターによるSynechocystis sp. PCC6803の形質転換体は、CcaRの発現が恒常的となっている。また、同時に図６（ｄ）に示すように、CcaRを導入しない場合のgfpmut3bの発現量を調べ、これらの結果を図８に併載した。
【０１２２】
図８をみると、緑色光および赤色光の照射で、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、導入されない場合に比較してgfpmut3bの発現量が３倍程度向上することが判明した。さらに、赤色光の照射では、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、導入されない場合に比較してgfpmut3bの発現量がほとんど増加しなかった。一方、CcaRがPcpcG2の上流側に位置するプラスミドベクターによって形質転換された場合（図４参照）には、赤色光の照射で、導入されない場合に比較してGFPuvの発現量が増加している。したがって、CcaRがPcpcG2の下流側に導入された場合には、赤色光の照射による目的遺伝子の発現量を抑えつつ、緑色光での発現量を向上できることが判明した。
【０１２３】
以上のように、本発明に係るプロモーターを用いることで、緑色を用いた有用物質生産コントロールまたは凝集・溶菌コントロール等を行うことができる可能性があることが判明した。
【０１２４】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
シアノバクテリアは、炭酸固定能に加え、優れたバイオ燃料関連化合物生産能力を有しているため、バイオ燃料関連化合物生産を行ううえで魅力的な宿主である。本発明はSynechocystis sp. PCC6803中で高発現可能な光制御型のプロモーターを提供するものであり、様々なバイオ燃料生産を行うために利用されることが期待できる。また、シアノバクテリアを利用した組み換えタンパク質生産にも応用が期待できる。本発明では、高発現可能な緑色光誘導型のプロモーターを開発しており、本プロモーターの強度は極めて高い。また、その発現量は緑色光の強度で容易に調節可能と予測されることから、バイオ燃料生産を行ううえで、有用なツールになることが期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１は、ｃｐｃＧ２プロモーターおよび発現調節配列の配列である。
配列番号１２は、フォワードプライマーの配列である。
配列番号１３は、リバースプライマーの配列である。
配列番号１４は、pKT230-PcpcG2-GFPuvフォワードプライマーの配列である。
配列番号１５は、pKT230-PcpcG2-GFPuvリバースプライマーの配列である。
配列番号１６は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSフォワードプライマーの配列である。
配列番号１７は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaS-ccaSリバースプライマーの配列である。
配列番号１８は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRフォワードプライマーの配列である。
配列番号１９は、pKT230-PcpcG2-GFPuv-PccaR-ccaRリバースプライマーの配列である。
配列番号２０は、DNA1の配列である。
配列番号２１は、DNA2の配列である。
配列番号２２は、6ntフォワードプライマーの配列である。
配列番号２３は、6ntリバースプライマーの配列である。
配列番号２４は、8ntフォワードプライマーの配列である。
配列番号２５は、8ntリバースプライマーの配列である。
配列番号２６は、9ntフォワードプライマーの配列である。
配列番号２７は、9ntリバースプライマーの配列である。
配列番号２８は、7ntの配列である。
配列番号２９は、6ntミュータントの配列である。
配列番号３０は、8ntミュータントの配列である。
配列番号３１は、9ntミュータントの配列である。
配列番号３３は、GFPuv（ミュータント）の配列である。
配列番号３４は、gfpmut3b（ミュータント）の配列である。
【図１】
2014192765.tif 000005
【図２】
2014192765.tif 000006
【図３】
2014192765.tif 000007
【図４】
2014192765.tif 000008
【図５】
2014192765.tif 000009
【図６】
2014192765.tif 000010
【図７】
2014192765.tif 000011
【図８】
2014192765.tif 000012
【配列表】
2014192765000001.app
【国際調査報告】
2014192765.tif 000013
2014192765.tif 000014
2014192765.tif 000015
2014192765.tif 000016