(57)【要約】細胞外マトリックスが豊富で均質な三次元組織体を作製できるコートされた細胞を提供する。コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下であるコートされた細胞に関する。また、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を製造する方法であって、細胞とコラーゲンを含む溶液とを混合して細胞表面にコラーゲンを含む被膜を形成することを含み、コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下であるコートされた細胞の製造方法に関する。
2015072164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞。
【請求項２】
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１記載のコートされた細胞。
【請求項３】
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を製造する方法であって、
細胞とコラーゲンを含む溶液とを混合して細胞表面にコラーゲンを含む被膜を形成することを含み、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞の製造方法。
【請求項４】
三次元組織体を製造する方法であって、
請求項１又は２記載のコートされた細胞を三次元に配置して三次元組織体を形成することを含む、製造方法。
【請求項５】
細胞と、コラーゲンとを含む培養三次元組織体であって、
請求項４記載の製造方法により製造される、培養三次元組織体。
【請求項６】
細胞が三次元に配置された培養三次元組織体であって、
前記培養三次元組織体は、細胞とコラーゲンとを含む細胞層であって、かつ細胞密度の異なる細胞層を２以上備える、培養三次元組織体。
【請求項７】
前記隣接する細胞層の細胞密度は、２倍又はそれ以上異なる、請求項６記載の培養三次元組織体。
【請求項８】
前記細胞層の厚みは、１０μｍ以上である、請求項６又は７に記載の培養三次元組織体。
【請求項９】
三次元組織体を製造する方法であって、
コラーゲンを含む被膜でコートされた第１のコート細胞を準備すること、
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記第１のコート細胞とは被膜の厚みが異なる第２のコート細胞を準備すること、
前記第１のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に、前記第２のコート細胞を三次元に配置して第２の細胞層を形成することを含む、三次元組織体の製造方法。
【請求項１０】
さらに、前記第２の細胞層上に、細胞を配置することを含む、請求項９記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞は、第２のコート細胞とは異なる厚みのコラーゲンを含む被膜でコートされた細胞である、請求項９又は１０に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１２】
前記細胞層の形成は、多孔性基材に細胞を播種した後、多孔性基材内に細胞を保持させて培養する方法を除く、請求項９から１１のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外で細胞の三次元組織を構築する技術が知られている（例えば、特許文献１及び２）。特許文献１には、細胞層と、細胞外マトリックス成分層との形成を繰返し行うことによって、細胞が積層された三次元組織を製造する方法が開示されている。特許文献２には、培養細胞表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、細胞の三次元構造体を製造する方法が開示されている。その他には、コラーゲンゲルに細胞を播種し、培養することによって三次元構造体を製造する方法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許４９１９４６４号
【特許文献２】特開２０１２−１１５２５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１及び２の方法では、細胞外マトリックスが豊富な三次元組織体を製造することが困難であるという問題がある。また、コラーゲンゲルに細胞を播種して三次元構造体を作製する場合、コラーゲンの収縮により、コラーゲンゲルの変形及び基材からのコラーゲンゲルの解離が起こり、さらには三次元構造体における細胞の配置や細胞の密度が不均質となるという問題がある。【０００５】
研究を重ねた過程で、本発明者らは、豊富な細胞外マトリックスで被覆された細胞を用いれば、細胞外マトリックスが豊富で細胞の密度が均質な三次元組織体を作製できるとの知見を得た。そこで、本開示は、細胞外マトリックスでコートされた新たな細胞を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックスが豊富で細胞の密度が均質な三次元組織体を作製できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１のコートされた細胞の顕微鏡写真の一例を示す。
【図２】図２は、実施例３のコートされた細胞の顕微鏡写真の一例を示す。
【図３】図３は、実施例４の三次元組織体の位相差写真の一例を示す。
【図４】図４は、実施例５の三次元組織体の位相差写真の一例を示す。
【図５】図５は、実施例７の三次元組織体の位相差写真の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、豊富な細胞外マトリックスで被覆された細胞を用いれば、細胞外マトリックスが豊富で均質な三次元組織体を作製できる、との知見に基づく。また、本開示は、コラーゲンを用いて細胞表面を被覆することによって、従来では困難であった１μｍを超える厚みのコート層を細胞表面に形成できる、との知見に基づく。
【００１０】
コラーゲンを用いて細胞表面を被覆することによって、１μｍを超える厚みのコートを形成できるメカニズムは明らかではないが、以下のように推察される。すなわち、コラーゲン分子は、Gly-X-Yの繰返しからなるポリペプチド鎖（α鎖）が３本より合わさったTriple Helix構造を有している。生体内では、コラーゲン分子は線維を形成するとともに、その線維を安定化させるためにコラーゲン分子間に架橋結合が導入され不溶化（ゲル化）することが知られている。実験的には、コラーゲン分子を酸性水溶液に溶解し、リン酸イオンなど架橋に重要なイオンの共存下で中和することでコラーゲン分子が集合し、線維が形成されて不溶性のゲルが得られることが知られている。また、コラーゲン分子は細胞表面のインテグリン分子と特異的に相互作用することが知られている。コラーゲンはこのような性質を有することから、コラーゲンの酸性水溶液を細胞と混合し、ゲル化することによって、従来の方法では得られなかった厚みを有する被膜を細胞表面に形成できるものと考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１１】
［コートされた細胞］
本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記コラーゲンを含む被膜の厚みは１μｍを超え１００μｍ以下であるコートされた細胞（以下、「本開示のコートされた細胞」ともいう）に関する。本開示のコートされた細胞によれば、一又は複数の実施形態において、コラーゲン（細胞外マトリックス成分）が豊富で、かつ均質な三次元組織体を作製できうるという効果を奏する。本開示のコートされた細胞によれば、一又は複数の実施形態において、得られる三次元組織体の厚みをより制御できうるという効果を奏する。
【００１２】
本開示のコートされた細胞は、細胞と、コラーゲンを含む被膜（以下、「コラーゲン被膜」ともいう）とを有する。
【００１３】
細胞は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、培養細胞であってもよく、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、肝ガン細胞等のがん細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上を用いてもよい。
【００１４】
本開示において「コラーゲン被膜」とは、細胞表面をコートするコラーゲンを含む被膜をいう。コラーゲン被膜は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを主成分とする被膜であって、コラーゲン以外の成分を含んでいてもよい。本開示において「コラーゲンを主成分とする」とは、コラーゲン被膜に含まれる成分のうちコラーゲンの含有量が最も多いことをいう。コラーゲン被膜におけるコラーゲンの含有量は、一又は複数の実施形態において、４５重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、又は９０重量％以上である。また、コラーゲン被膜は、一又は複数の実施形態において、被膜に含まれるコラーゲンの少なくとも一部又はほぼ全てがゲル化したコラーゲンゲルを含み、コラーゲンゲル層ともいうことができる。コラーゲン以外の成分としては、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分、合成高分子、天然由来高分子、糖、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、微粒子、ウイルス、遺伝子、無機物、金属、及びイオン等が挙げられる。細胞外マトリックス成分としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン（分子量約５０万）、ビトロネクチン、ラミニン、ゼラチン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、及びヒアルロン酸等が挙げられる。
【００１５】
コラーゲン被膜に含まれるコラーゲンとしては、一又は複数の実施形態において、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲンコラーゲン、及びV型（又はAB）コラーゲンが挙げられる。コラーゲンは、一種類でもよいし、二種類以上を用いてもよい。中でも、生体とより同等の性質・機能を発揮可能な三次元組織体を作製する点からは、I型コラーゲン及びIV型コラーゲンが好ましい。また、可溶化が容易である点からは、I型コラーゲンが好ましい。コラーゲンの由来は特に制限されるものではなく、一又は複数の実施形態において、ヒト及びヒト以外の動物等が挙げられる。ヒト以外の動物としては、特に限定されず、例えば、ウシ、及びブタ等が挙げられる。また、コラーゲンは、人工コラーゲンであってもよい。
【００１６】
コラーゲン被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である。コラーゲン被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１．５μｍ以上又は２μｍ以上であり、また８０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下又は４０μｍ以下である。本開示において「コラーゲン被膜の厚み」とは、細胞表面を被覆するコラーゲンを含有する被膜の厚みをいう。コラーゲン被膜の厚みは、コートされた細胞の標識したコラーゲンを、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することによって測定できる。具体的には、コートされた細胞１個におけるコラーゲン被膜の厚みは、以下の方法により測定できる。
［コラーゲン被膜の厚みの測定］
コートされた細胞を下記条件で観察し、コラーゲン被膜を含むコートされた細胞の直径（Ｒ1）と、コラーゲン被膜を含まない細胞の直径（Ｒ0）とを測定し、それらを用いて下記式から算出する。測定は１個の細胞につき任意で３ヶ所選択し、その平均値をコラーゲン被膜の厚みとする。
コラーゲン被膜の厚み＝｛（Ｒ1）−（Ｒ0）｝／２
＜測定条件＞
測定器：共焦点レーザー顕微鏡（FV10i、オリンパス社製）
レンズ：６０倍
ズーム：１．０倍
測定波長：５２０ｎｍ
【００１７】
本開示のコートされた細胞は、一又は複数の実施形態において、コラーゲン被膜形成後における細胞生存率が高いという効果を奏する。細胞生存率は、一又は複数の実施形態において、８０％以上又は９０％以上であり、好ましくは９０％以上である。なお、細胞生存率は、実施例に記載の方法により測定できる。
【００１８】
本開示のコートされた細胞を三次元に配置して培養することによって、一又は複数の実施形態において、コラーゲン（生体マトリックス）が豊富な三次元組織体を簡便に製造できうる。コラーゲン（生体マトリックス）が豊富な三次元組織体としては、一又は複数の実施形態において、真皮層、角膜の実質組織、固形腫瘍の間質組織等が挙げられる。また、本開示のコートされた細胞によれば、一又は複数の実施形態において、従来では困難であった数百μｍオーダーの三次元組織体を簡便に製造できうる。本開示のコートされた細胞によれば、一又は複数の実施形態において、コラーゲン被膜の厚みで隣接する細胞間の距離及び／又は三次元組織体における細胞の密度を制御できることから、コラーゲンゲルに細胞を播種し培養したものと比較して、均質な三次元組織体を簡便に製造できうる。
【００１９】
［コートされた細胞の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を製造する方法であって、細胞とコラーゲンを含む溶液とを混合して細胞表面にコラーゲンを含む被膜を形成することを含み、前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞の製造方法（以下、「本開示のコートされた細胞の製造方法」ともいう）に関する。本開示のコートされた細胞の製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のコートされた細胞を製造することができる。
【００２０】
本開示のコートされた細胞の製造方法は、細胞と、コラーゲンを含む溶液（以下、「コラーゲン溶液」ともいう）とを混合して細胞表面にコラーゲン被膜を形成することを含む。細胞及びコラーゲンは、上述の通りである。
【００２１】
コラーゲン溶液におけるコラーゲン濃度は、一又は複数の実施形態において、０．００３〜３重量％であり、コラーゲン被膜形成時の細胞間の凝集を抑制し、かつ細胞表面により均一な厚みのコラーゲン被膜を形成させる点からは、０．０３〜０．３重量％が好ましく、１回のコラーゲン被膜の形成工程でより厚いコラーゲン被膜を形成させる点からは、０．１５〜０．３重量％が好ましい。コラーゲン溶液のｐＨは、一又は複数の実施形態において、３．０〜５．０である。
【００２２】
コラーゲン溶液は、コートされた細胞の生存率を向上させる点から、一又は複数の実施形態において、培地を含んでいてもよい。培地は、一又は複数の実施形態において、Eagle's MEM培地、Dulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RDMI、及びGlutaMax培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。
【００２３】
細胞と混合したコラーゲン溶液における細胞の濃度は、一又は複数の実施形態において、１×１０2〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０3〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、又は１×１０3〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、細胞表面により均一な厚みのコラーゲン被膜を形成させる点からは、５×１０5〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１回のコラーゲン被膜の形成工程でより厚いコラーゲン被膜を形成させる点からは、１×１０5〜３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましい。
【００２４】
コラーゲン被膜形成時の雰囲気温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃又は２０〜４０℃であり、細胞表面により均一な厚みのコラーゲン被膜を形成させる点から、２６〜４０℃、３０〜４０℃、３１〜３８℃、又は略３７℃が好ましい。
【００２５】
コラーゲン被膜の形成は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンのゲル化を促進し効率よくコラーゲン被膜を形成する点から、細胞を混合したコラーゲン溶液のｐＨを中性又はアルカリ性にすることを含むことが好ましい。ｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０〜７．４、６．０〜７．０、又７．０〜７．４である。
【００２６】
コラーゲン被膜の形成は、一又は複数の実施形態において、より均一な厚みのコラーゲン被膜を形成させる点からは、細胞を混合したコラーゲン溶液を回転攪拌することを含むことが好ましい。
【００２７】
回転攪拌における回転数は、一又は複数の実施形態において、１０〜１００ｒｐｍ又は１０〜５０ｒｐｍであり、細胞間の凝集を抑制し、かつ細胞表面により均一な厚みのコラーゲン被膜を形成させる点からは、３０〜５０ｒｐｍが好ましく、３０〜４０ｒｐｍ、又は４０〜５０ｒｐｍがより好ましい。また、１度のコラーゲン被膜の形成工程でより厚いコラーゲン被膜を形成させる点からは、１０〜３０ｒｍｍが好ましく、１０〜２０ｒｐｍ、又は２０〜３０ｒｐｍがより好ましい。
【００２８】
回転攪拌の時間は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５〜１５０分、１０〜１２０分、１０〜９０分又は１０〜６０分である。
【００２９】
本開示のコートされた細胞の製造方法においてコラーゲン被膜の形成を行う回数は特に制限されず、１回であってもよいし、２回以上の複数回であってもよい。コラーゲン被膜の形成を複数回行うことにより、一又は複数の実施形態において、効率よくコラーゲン被膜の厚みを制御でき、また、厚みが均一なコラーゲン被膜でコートされた細胞を効率よく作製できる。また、コラーゲン被膜の形成を複数回繰り返し行うことで、１回の被膜形成において形成されるコラーゲン被膜の厚みが厚くなる傾向がある。このため、厚みの大きなコラーゲン被膜を効率よく形成できる点から、コラーゲン被膜の形成は複数回繰り返し行うことが好ましい。
【００３０】
本開示のコートされた細胞の製造方法は、コラーゲンを用いて細胞表面にコートを行うことから、一又は複数の実施形態において、高い細胞生存率でコートされた細胞を製造できるという効果を奏する。本開示のコートされた細胞の製造方法における細胞生存率は、一又は複数の実施形態において、８０％以上、又は９０％以上である。なお、細胞生存率は、実施例に記載の方法により測定できる。
【００３１】
［三次元組織体］
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞と、コラーゲンとを含む三次元組織体（以下、「本開示の三次元組織体」ともいう）に関する。本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを介して細胞が三次元に配置されている。また、本開示の三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、本開示のコートされた細胞を三次元に配置することによって製造することができる。
【００３２】
本開示の三次元組織体における細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０5〜１×１０10ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3、１×１０5〜１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3、又は１×１０9〜１×１０10ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3である。本開示の三次元組織体における隣接する細胞間の距離は、一又は複数の実施形態において、１０μｍ以上又は１４μｍ以上であり、また、１００μｍ以下、５０μｍ以下、又は１５μｍ以下である。細胞間の距離は、一又は複数の実施形態において、１０〜１５μｍである。本開示の三次元組織体の厚みは、一又は複数の実施形態において、１０〜１０００μｍ又は５０〜５００μｍである。細胞間の距離は、実施例に記載の方法により測定できる。
【００３３】
本開示の三次元組織体は、後述する本開示の三次元組織体の製造方法によって製造できる。
【００３４】
［三次元組織体の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、三次元組織体を製造する方法であって、本開示のコートされた細胞を三次元に配置して三次元組織体を形成することを含む製造方法（以下「本開示の三次元組織体の製造方法」ともいう）に関する。本開示の三次元組織体の製造方法によれば、本開示の培養三次元組織体を簡便に製造できる。
【００３５】
本開示の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のコートされた細胞を三次元に配置して培養することを含む。コートされた細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、コートされた細胞を容器内に播種すること、及び容器内で積層された状態のコートされた細胞を培養することを含む。
【００３６】
コートされた細胞の播種は、一又は複数の実施形態において、コートされた細胞が少なくとも三次元に配置されるように行えばよい。播種時のコートされた細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、目的とする三次元組織体の厚み、培養する容器の大きさ等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2〜１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3、１×１０4〜１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3、又は１×１０5〜１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3である。培養温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。培養時間は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、１〜１６８時間、３〜２４時間、又は３〜１２時間である。培地は、一又は複数の実施形態において、Eagle's MEM培地、Dulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RDMI、及びGlutaMax培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。
【００３７】
本開示の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、本開示のコートされた細胞を製造することを含んでいてもよい。
【００３８】
本開示の三次元組織体の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、コラーゲン（生体マトリックス）が豊富な三次元組織体を簡便に製造できる。本開示の三次元組織体の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、従来では困難であった数百μｍオーダーの三次元組織体を簡便に製造できる。また、本開示の三次元組織体の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、コラーゲンゲルに細胞を播種し培養したものと比較して、均質な三次元組織体を簡便に製造できる。
【００３９】
［細胞−コラーゲンハイブリッド体］
本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンゲルと、コラーゲンゲル内に配置された本開示のコートされた細胞とを含む、細胞−コラーゲンハイブリッド体（以下、「本開示のハイブリッド体」ともいう）に関する。本開示のハイブリッド体は、コラーゲンゲル内に本開示のコートされた細胞を播種して培養することによって製造できる。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンゲル内で本開示のコートされた細胞を培養することを含む、細胞−コラーゲンハイブリッド体の製造方法に関する。
【００４０】
コラーゲンゲルは、一又は複数の実施形態において、公知のコラーゲンゲルが使用でき、コラーゲンの種類も特に制限されない。
【００４１】
本開示のハイブリッド体は、一又は複数の実施形態において、コートされた細胞を１つ含む。
【００４２】
［細胞密度の異なる細胞層を２以上備える培養三次元組織体］
本開示のコートされた細胞によれば、上述のとおり、コラーゲン被膜の厚みで隣接する細胞間の距離及び／又は三次元組織体における細胞の密度を制御することができる。このため、本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞が三次元に配置された培養三次元組織体であって、前記培養三次元組織体は、細胞とコラーゲンとを含む細胞層であって、かつ細胞密度の異なる細胞層を２以上備える培養三次元組織体（以下、「本開示の第２の培養三次元組織体」ともいう）に関する。本開示の第２の培養三次元組織体の細胞層は、一又は複数の実施形態において、本開示のコートされた細胞を用いて製造することができる。
【００４３】
本開示の第２の培養三次元組織体は、細胞とコラーゲンとを含む細胞層であって、細胞密度の異なる細胞層を２以上備える。各細胞層における細胞密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以上、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以上、１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以上又は１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以上であり、及び／又は１×１０10ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以下、１×１０9ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以下又は１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3以下である。本開示の第２の培養三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、細胞間距離が１０μｍ以上である細胞層を１又は２層以上有する。本開示の第２の培養三次元組織体は、一又は複数の実施形態において、細胞間距離が１０μｍ以上又は１４μｍ以上であり、及び／又は１００μｍ以下、５０μｍ以下又は１５μｍ以下である細胞層を有する。細胞密度及び細胞間距離は、実施例５に記載の方法により求めることができる。
【００４４】
本開示の第２の培養三次元組織体において、隣接する細胞層の細胞密度は、一又は複数の実施形態において、１．５倍以上、２．０倍以上、２．２倍以上又は２．４倍以上異なる。本開示の第２の培養三次元組織体において、各細胞層の厚みは、一又は複数の実施形態において、１０μｍ以上、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、又は６０μｍ以上であり、及び／又は９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下又は６００μｍ以下である。細胞層の厚みは、実施例５に記載の方法により測定できる。
【００４５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを含む被膜でコートされた第１のコート細胞を準備すること、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記第１のコート細胞とは被膜の厚みが異なる第２のコート細胞を準備すること、前記第１のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層を形成すること、及び前記細胞層上に、前記第２のコート細胞を三次元に配置して第２の細胞層を形成することを含む三次元組織体の製造方法（以下、「本開示の第２の三次元組織体の製造方法」ともいう）に関する。本開示の第２の三次元組織体の製造方法によれば、本開示の第２の培養三次元組織体を製造できる。
【００４６】
第１のコート細胞と第２のコート細胞とにおける被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、３．０倍以上、３．５倍以上、４．０倍以上又は４．５倍以上異なる。被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、第１のコート細胞の方が第２のコート細胞よりも大きくてもよいし、第２のコート細胞の方が第２のコート細胞よりも大きくてもよい。
【００４７】
本開示の第２の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、さらに、第２の細胞層上に細胞を配置することを含む。第２の細胞層上に配置する細胞としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞、コラーゲン以外の細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞、及びコートされていない細胞等が挙げられる。第２の細胞層上に配置する細胞がコラーゲンを含む被膜でコートされた細胞である場合、第２の細胞層上に、第２の細胞層とは異なる細胞密度の細胞層を容易に形成できる点から、一又は複数の実施形態において、第２のコート細胞とは異なる厚みのコラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であることが好ましい。
【００４８】
細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、多孔性基材内に細胞を保持させて培養することを含まないことが好ましい。本開示の第２の三次元組織体の製造方法は、一又は複数の実施形態において、多孔性基材に細胞を播種した後、多孔性基材内に細胞を保持させて培養する方法を除く。多孔性基材としては、一又は複数の実施形態において、コラーゲンゲル等が挙げられる。
【００４９】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［１］  コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞。
［２］  前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、［１］記載のコートされた細胞。
［３］  コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を製造する方法であって、
細胞とコラーゲンを含む溶液とを混合して細胞表面にコラーゲンを含む被膜を形成することを含み、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞の製造方法。
［４］  ［１］又は［２］に記載のコートされた細胞を製造する、［３］記載の製造方法。
［５］  三次元組織体を製造する方法であって、
［１］又は［２］記載のコートされた細胞を三次元に配置して三次元組織体を形成することを含む、製造方法。
［６］  細胞と、コラーゲンとを含む培養三次元組織体であって、［５］記載の製造方法により製造される、培養三次元組織体。
〔Ｂ１〕  細胞密度の異なる細胞層を２以上有する培養三次元組織体であって、
前記細胞層は、細胞とコラーゲンとを含み、前記細胞が三次元に配置された細胞層である、培養三次元組織体。
〔Ｂ２〕  前記隣接する細胞層の細胞密度は、２倍又はそれ以上異なる、〔Ｂ１〕記載の培養三次元組織体。
〔Ｂ３〕  前記細胞層の厚みは、１０μｍ以上である、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の培養三次元組織体。
〔Ｂ４〕  三次元組織体を製造する方法であって、
コラーゲンを含む被膜でコートされた第１のコート細胞を準備すること、
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記第１のコート細胞とは被膜の厚みが異なる第２のコート細胞を準備すること、
前記第１のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に、前記第２のコート細胞を三次元に配置して第２の細胞層を形成することを含む、三次元組織体の製造方法。
〔Ｂ５〕  さらに、前記第２の細胞層上に、細胞を配置することを含む、請求項９記載の三次元組織体の製造方法。
〔Ｂ６〕  前記細胞は、第２のコート細胞とは異なる厚みのコラーゲンを含む被膜でコートされた細胞である、〔Ｂ４〕又は〔Ｂ５〕に記載の三次元組織体の製造方法。
〔Ｂ７〕  前記細胞層の形成は、多孔性基材に細胞を播種した後、多孔性基材内に細胞を保持させて培養する方法を除く、〔Ｂ４〕から〔Ｂ６〕のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
【００５０】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
［コラーゲン被膜でコートされた細胞の調製］
NHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞、CAMBREX社製）を培地（DMEM、Invitrogen社製）で培養し、トリプシン処理(0.25％トリプシン、0.02%EDTA)(37℃、20分間)して細胞を回収した。
FITC（fluoresxein isothiocyanate）で標識したコラーゲン14μLとコラーゲン0.6mLとを混合してコラーゲン溶液（コラーゲン濃度：0.03wt%）を調製した。なお、コラーゲンとしては、Cellmatrix(R) Type1-A（商品名、新田ゼラチン株式会社製、Type-1コラーゲン）を使用した。
0.12mLの5×DMEM、8μLの1M NaOH及び0.6mLのNHDF（2×106cells）を混合し、それを0.4mLのコラーゲン溶液と混合した後、ローテータを用いて37℃で30分間回転攪拌（回転数：50rpm）してNHDF表面にコラーゲン被膜を形成した。ついで、PBSで3回洗浄後し、コラーゲン被膜でコートされた細胞を得た（コラーゲン被膜の厚み：2.5μm（n=30））。得られたコートされた細胞の顕微鏡写真を図１に示す。図１に示すように、得られたコートされた細胞は略球状で、コラーゲン被膜の厚みが略均一であり、細胞同士の凝集もほとんど見られなかった。なお、コラーゲン被膜の厚みは、以下のようにして測定した。【００５２】
［コラーゲン被膜の厚みの測定］
コートされた細胞を含むDMEM培地を極少量ガラスボトムディッシュに滴下し、ディッシュ上のコートされた細胞を下記条件で観察し、コラーゲン被膜を含むコートされた細胞の直径（Ｒ1）と、コラーゲン被膜を含まない細胞の直径（Ｒ0）とを測定し、それらを用いた下記式から算出した。測定は１個の細胞につき任意で３ヶ所選択し、３０個の細胞を同様に測定して厚みを算出し、その平均値を求めた。
コラーゲン被膜の厚み＝｛（Ｒ1）−（Ｒ0）｝／２
＜測定条件＞
測定器：共焦点レーザー顕微鏡（FV10i、オリンパス社製）
レンズ：６０倍
ズーム：１．０倍
測定波長：５２０ｎｍ【００５３】
（実施例２）
コラーゲン溶液に分散させる細胞の数、コラーゲン溶液の濃度、及び回転数を変化させた以外は、実施例１と同様にしてコラーゲン被膜の形成を１回行い、コラーゲン被膜でコートされた細胞を作製した。その結果、これらを変動させることによって、細胞表面に形成されるコラーゲン被膜の厚みを制御できることが確認できた(data not shown)。【００５４】
（実施例３）
実施例１と同様にして調製したＮＨＤＦを1×106cells/mlの濃度となるようにコラーゲン溶液に分散させ、ローテータを用いて37℃で15分間回転攪拌（回転数：50rpm）して、NHDF表面にコラーゲン被膜（1回目）を形成した（コラーゲン被膜の厚み：3.3μm（n=30））。PBSで3回洗浄後した後、2回目のコラーゲン被膜の形成を行った（コラーゲン被膜の厚み：14.9μm（n=30））。2回目のコラーゲン被膜の形成は、コラーゲン溶液にRhodamineで標識したフィブロネクチンを加えたものを使用した以外は１回目と同じ条件で行った。ついで、PBSで3回洗浄後した後、3回目のコラーゲン被膜（3回目）の形成を行った（コラーゲン被膜の厚み：30.3μm（n=30））。3回目のコラーゲン被膜の形成は、１回目と同じ条件で行った。得られたコートされた細胞の顕微鏡写真を図２に示す。図２に示すように、得られたコートされた細胞は略球状で、コラーゲン被膜の厚みが略均一であり、細胞同士の凝集も見られなかった。また、コラーゲン被膜形成時における細胞の生存率は95%以上であった。なお、生存率は、以下のようにして求めた。
［生存率の測定］
生存率は、コラーゲン被膜形成後における細胞の生存数を、トリパンブルー染色法を用いて確認し、下記式を用いて算出した。
生存率（％）＝（被膜形成後の生存数）／（被膜形成後の全（生＋死）細胞数）×100【００５５】
（実施例４）
［三次元組織体の作製］
24ウェル培養プレートに配置したインサートのメンブレンフィルタ上に、6×105個のコートされた細胞を播種し、DMEM培地を添加して37℃で12時間培養した。コートされた細胞（コラーゲン被膜の厚み：3.3μm（n=3））は、回転攪拌の時間を90分間とした以外は実施例１と同じ条件で調製したものを使用した。【００５６】
図３に得られた三次元組織体の位相差顕微鏡写真を示す。得られた三次元組織体は、厚みが78.08μmであり（NHDF：６層）、コラーゲン被膜を形成しない細胞を積層した場合と比較して、その厚みは2倍以上であった。また、得られた三次元組織体は、細胞の密度は2.3x109cells/cm3であり、隣接する細胞間の距離は１０〜１５μｍであった。図３に示すように、コラーゲン（生体マトリックス）が豊富であり、例えば、真皮層や角膜の間質組織等の組織に類似した構造を示していた。なお、細胞間距離及び積層された細胞層の数は以下のようにして求めた。
［積層された細胞層の数］
積層された細胞層の数は、ヘマトキシリン・エオジン（HE）により染色された組織切片写真で、核が観察される細胞を下部から上部まで見積もり、複数の平均値として算出した。
［細胞間距離の算出］
細胞間距離は、ヘマトキシリン・エオジン（HE）により染色された組織切片写真で、核が観察される隣接した細胞の核と核の間の距離を見積もり範囲を算出した。【００５７】
（実施例５）
コラーゲン被膜の厚みが異なる（3μm又は15μm）２種類のコートされたNHDFを調製した。この2種類の細胞を用いて三次元組織体を作製した。具体的には、24ウェル培養プレートに配置したインサートのメンブレンフィルタ上に、1×106個のコートされたNHDF（厚み:3μm）を播種し、DMEM培地を添加して37℃で24時間培養した（第１層の形成）。ついで、その上に、1×106個のコートされたNHDF（厚み:15μm）を播種し、37℃で24時間培養した（第２層の形成）後、1×106個のコートされたNHDF（厚み:3μm）を播種し、37℃で24時間培養した（第３層の形成）。得られた三次元組織体の位相差顕微鏡写真を図４に示す。得られた三次元組織体は、全体の厚みが535μmであり、各細胞層における細胞層の厚み、細胞密度及び細胞間距離は以下の通りであった。
第１層（厚み：120μm、細胞密度：2.9×107cells/cm3、細胞間距離：10±2μm）
第２層（厚み：300μm、細胞密度：1.2×107cells/cm3、細胞間距離：17±5μm）
第３層（厚み：115μm、細胞密度：3.1×107cells/cm3、細胞間距離：12±3μm）
図４に示すように、異なる厚みのコラーゲン被膜を有する細胞を用いることによって、三次元組織体内部の細胞密度を自在に制御することができ、内部の細胞密度が制御された三次元組織体を製造できた。
［細胞密度の測定］
細胞密度は、以下のようにして測定した。播種細胞数を、HE染色した組織切片写真より算出した平均値の厚さとインサートの底面積より算出した体積で割って求めた。
［細胞層の厚みの測定］
細胞層の厚みは、以下のようにして測定した。HE染色した組織切片写真の任意の10ヶ所以上の厚さを測定し、平均値を求めた。
［細胞間距離の測定］
細胞間距離は、以下のようにして測定した。HE染色した組織切片写真の任意の30ヶ所以上の細胞間距離を測定し、平均値を求めた。【００５８】
（実施例６）
［人工皮膚組織の作製］
２４ウェル培養プレートに配置したインサートのメンブレンフィルタ上に、1×106個のコラーゲン被膜（厚み：3μｍ）でコートされたNHDFを播種し、10%FBSを含むDMEM培地を添加して37℃で24時間培養して真皮組織層を形成した。真皮組織層上にケラチノサイトを3×105個播種し、37℃で２日間培養した。ついで、培地を角化培地（重層化培地）に交換し、インサートのメンブレンフィルタが角化培地の気液界面に位置するようにインサートを配置した。その状態で37℃で14日間気液培養することにより分化誘導を行い、真皮組織層と表皮層とを備える人工皮膚組織を作製した。【００５９】
（実施例７）
［人工肝組織の作製］
NHDFに替えてヒト正常肝細胞を使用した以外は実施例３と同様の条件で、ヒト正常肝細胞表面にコラーゲン被膜を形成し（1回）、コラーゲン被膜（厚み：3μm）でコートされたヒト正常肝細胞を調製した。
1×106個のコートされたヒト正常肝細胞と、1×105個のヒト間葉系幹細胞（コートなし)と、1×105個のヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）とを混合し、２４ウェル培養プレートに配置したインサートのメンブレンフィルタ上に播種し、10%FBSを含むDMEM培地を添加して37℃で24時間培養した。得られた三次元組織体（人工肝組織）の位相差顕微鏡写真（ヘマトキシリン・エオジン染色）を図５Ａ及びＢに示す。図５Ｂは図５Ａの部分拡大図である。図５Ａ及びＢに示すように、コラーゲン（生体マトリックス）が豊富であり、かつ細胞密度が均質な三次元組織体が作製できた。また、得られた三次元組織体は、幼弱ながらも毛細血管網が形成された。
【図１】
2015072164.tif 000003
【図２】
2015072164.tif 000004
【図３】
2015072164.tif 000005
【図４】
2015072164.tif 000006
【図５】
2015072164.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月22日(2014.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞。
【請求項２】
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１記載のコートされた細胞。
【請求項３】
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を製造する方法であって、
細胞とコラーゲンを含む溶液とを混合して細胞表面にコラーゲンを含む被膜を形成することを含み、
前記コラーゲンを含む被膜の厚みは、１μｍを超え１００μｍ以下である、コートされた細胞の製造方法。
【請求項４】
三次元組織体を製造する方法であって、
請求項１又は２記載のコートされた細胞を三次元に配置して三次元組織体を形成することを含む、製造方法。
【請求項５】
細胞と、コラーゲンとを含む培養三次元組織体であって、
請求項４記載の製造方法により製造される、培養三次元組織体。
【請求項６】
細胞が三次元に配置された培養三次元組織体であって、
前記培養三次元組織体は、細胞とコラーゲンとを含む細胞層であって、かつ細胞密度の異なる細胞層を２以上備える、培養三次元組織体。
【請求項７】
前記隣接する細胞層の細胞密度は、２倍又はそれ以上異なる、請求項６記載の培養三次元組織体。
【請求項８】
前記細胞層の厚みは、１０μｍ以上である、請求項６又は７に記載の培養三次元組織体。
【請求項９】
三次元組織体を製造する方法であって、
コラーゲンを含む被膜でコートされた第１のコート細胞を準備すること、
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記第１のコート細胞とは被膜の厚みが異なる第２のコート細胞を準備すること、
前記第１のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に、前記第２のコート細胞を三次元に配置して第２の細胞層を形成することを含む、三次元組織体の製造方法。
【請求項１０】
さらに、前記第２の細胞層上に、細胞を配置することを含む、請求項９記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１１】
前記細胞は、第２のコート細胞とは異なる厚みのコラーゲンを含む被膜でコートされた細胞である、請求項９又は１０に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１２】
前記細胞層の形成は、多孔性基材に細胞を播種した後、多孔性基材内に細胞を保持させて培養する方法を除く、請求項９から１１のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１３】
三次元組織体を製造する方法であって、
コラーゲンを含む被膜でコートされた第１のコート細胞を準備すること、
コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞であって、前記第１のコート細胞とは被膜の厚みが異なる第２のコート細胞を準備すること、
前記第１のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層を形成すること、及び
前記細胞層上に、前記第２のコート細胞を三次元に配置して第１の細胞層とは細胞密度の異なる第２の細胞層を形成することを含む、三次元組織体の製造方法。
【国際調査報告】
2015072164.tif 000008
2015072164.tif 000009
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