(57)【要約】  Ｐ−Ｃ（Ｆ）−Ｐの炭素原子にアルキルアミン側鎖を付加した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸、複素環基の置換したアミノ基又は窒素原子を含有する複素環基を付加した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸、及び、それらの酸部分をＰＯＭ基やｎ−ブタノイルオキシメチル（ＢｕＯＭ）基等のアルコキシメチル基でエステル化した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体、即ち、下記一般式（Ｉ）：2016125757.tif 000024（式中、各記号の意味は明細書中に定義される通りである）で表されるフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する優れた細胞障害性を有するＶγ２Ｖδ２型Ｔ細胞受容体を発現する末梢血γδ型Ｔ細胞を効率的に増殖誘導可能で、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を感作し、γδ型Ｔ細胞による細胞障害性を惹起することができる。
2016125757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2016125757.tif 000022
（式中、Ｃｙはフェニル基又は複素環基であり、Ｙは水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、水酸基、ハロゲン原子若しくはアルコキシ基で置換されてもよいアリール基、又は、アラルキルオキシ基であり、Ｆはフッ素原子であり、Ｐはリン原子を表し、Ｒは水素原子又はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は、同一又は互いに異なって、水素原子又はアルキルカルボニルオキシアルキル基であり、ｊは０又は１の数を表し、ｍは０又は１の数を表し、ｎは１〜６の整数を表す。ただし、Ｃｙが３−ピリジル基であり、ｍが１であり、ｎが１であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である場合を除く）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ｃｙがフェニル基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ｃｙが窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる１〜３個の原子を含む５〜１０員環の複素環基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、Ｃｙが窒素原子及び硫黄原子から選ばれる１又は２個の原子を含む５又は６員環の複素環基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｃｙがイミダゾリル基、チアゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、又は７−アザインドリル基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、Ｙが水素原子、Ｃ１−３アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基又はフェニル基であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
一般式（Ｉ）において、ｊが1であり、Ｃｙがイミダゾリル基であり、Ｙが水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、Ｙが水素原子又はＣ１−３アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、Ｙが水素原子であり、Ｒが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、ＹがＣ１−３アルキル基であり、ＲがＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）において、ｊが1であり、Ｃｙがイミダゾリル基であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
下記式で表される化合物のいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩：
【化２】
2016125757.tif 000023
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１４】
抗腫瘍細胞剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
抗ウイルス感染細胞剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
リンパ球処理剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする体内におけるリンパ球の処理方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする腫瘍細胞及びウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするがんおよびウイルス感染症の治療方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体外においてγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体から採取したγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることにより、γδ型Ｔ細胞を増殖及び／又は誘導させる工程、及び、当該γδ型Ｔ細胞を生体に戻す工程を含む腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フッ素含有型ビスホスホン酸誘導体及びその用途に関する。より詳細には、本発明はフッ素含有型ビスホスホン酸、フッ素含有型ビスホスホン酸エステル誘導体及び当該誘導体を有効成分とする医薬組成物、リンパ球処理剤、抗腫瘍免疫細胞療法剤、抗ウイルス感染症免疫細胞療法剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスホスホン酸はＰ−Ｃ−Ｐ骨格を有する一群の化合物であり、骨組織移行性及び骨親和性が高い。また、エチドロン酸やクロドロン酸など第一世代のビスホスホン酸は、液相エンドサイトーシス作用により破骨細胞などのモノサイト系細胞に選択的に取り込まれると、ATP類縁体へ代謝変換され、ATP受容体に拮抗的に作用するようになり、細胞障害性を示す。このように、第一世代のビスホスホン酸は、破骨細胞に細胞死を誘導することにより、骨吸収作用を抑制する。これらの性質を利用し、ビスホスホン酸が種々の骨関連疾患に適用されている。具体的には、骨粗鬆症、変形性骨炎、骨形成不全症、悪性腫瘍の際の高カルシウム血症など、骨の脆弱性やカルシウム濃度変動に関わる疾患の予防や治療薬として用いられている。また、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸など第二世代に属するビスホスホン酸、および、リセドロン酸、ゾレドロン酸などの第三世代に属するビスホスホン酸は、側鎖に窒素原子を含有しており、窒素含有型ビスホスホン酸と呼ばれる。これらのビスホスホン酸は、破骨細胞などのモノサイト系細胞に選択的に取り込まれると、ファーネシル二リン酸合成酵素を特異的に阻害し、細胞障害性を示す。その性質を利用して、種々の窒素含有型ビスホスホン酸が骨粗鬆症や悪性腫瘍の際の高カルシウム血症改善薬として用いられている。また最近、閉経前エストロゲン感受性初期乳がん症例や多発性骨髄腫に対する内分泌療法や化学療法において、ゾレドロン酸をアジュバント療法薬として用いると無病生存期間が優位に延長されることが報告された（非特許文献１，２）。これは、窒素含有型ビスホスホン酸が、腫瘍細胞に対して直接、及び／あるいは免疫細胞の活性化を介した間接的細胞障害作用を有し、抗腫瘍効果を示すためと考えられている。【０００３】
例えば、生体に投与されたエチドロン酸やクロドロン酸の一部は、液相エンドサイトーシス作用により細胞内に取り込まれ、ヌクレオシド一リン酸に転移し、ヌクレオシド三リン酸類縁化合物に転換される。この代謝産物は、ヌクレオシド三リン酸の高エネルギーリン酸結合を利用した生体酵素反応を拮抗的に阻害することが示されている。取り込む細胞が破骨細胞の場合には、骨吸収が抑制され、血漿中のカルシウム濃度が低下する。腫瘍細胞の場合には、腫瘍細胞が傷害され、直接的な抗腫瘍効果が期待される。【０００４】
また、細胞内に移行した第二世代および第三世代の窒素含有型ビスホスホン酸は、コレステロールなどのイソプレノイド系代謝産物の生合成経路に関与するファーネシル二リン酸合成酵素を阻害することが示されている。かかる酵素は、イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸からゲラニル二リン酸を合成する反応と、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸からファーネシル二リン酸を合成する反応を触媒する。従って、ファーネシル二リン酸合成酵素の阻害により、ゲラニル二リン酸の下流に位置する代謝経路が遮断されるとともに、酵素の基質となるイソペンテニル二リン酸が蓄積すると考えられる。ゲラニル二リン酸の下流に位置する生合成経路が遮断されると、イソプレノイド系化合物である、コレステロール、脂溶性ビタミン類、胆汁酸、リポタンパク質などが生合成されず、腫瘍細胞の増殖が抑制されると考えられる。【０００５】
通常、ファーネシル二リン酸合成酵素により生合成されるファーネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸の、イソプレニル基は、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｐ、Ｒａｂ、ＲａｃなどのいわゆるスモールＧタンパク質に転移される。このように、イソプレニル基が転移したスモールＧタンパク質は、イソプレニル基が細胞膜アンカーとして機能するため、スモールＧタンパク質の本来の作用部位である細胞膜へと移行し、細胞の増殖、接着など、重要な生理機能を発揮する。しかし、ゾレドロン酸などの窒素含有型ビスホスホン酸がファーネシル二リン酸合成酵素を阻害すると、このイソプレニル基転移が阻害されるため、スモールＧタンパク質の膜移行が阻止され、結果的に腫瘍細胞の増殖が阻害される。これが、窒素含有型ビスホスホン酸の示す直接的抗腫瘍効果を説明するメカニズムの一つである。【０００６】
さらに、ファーネシル二リン酸合成酵素が阻害されると、その基質であるイソペンテニル二リン酸の細胞内濃度が上昇する。このイソペンテニル二リン酸の細胞内濃度上昇は、ブチロフィリン３Ａ１膜貫通型タンパク質に感知され、その変化をＶγ２Ｖδ２型のＴ細胞受容体を有するγδ型Ｔ細胞が認識する(非特許文献３，４)。その結果、γδ型Ｔ細胞が脱顆粒を起こし、パーフォリン及びグランザイムＢを放出し、腫瘍細胞やウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導する。このようにして、窒素含有型ビスホスホン酸は、免疫細胞の活性化を介して、間接的に腫瘍細胞やウイルス感染細胞を効率的に障害することが示されている。【０００７】
上記のような窒素含有型ビスホスホン酸による直接的及び間接的な細胞障害性は、傷害される細胞にどの程度取り込まれるか、そして、どの程度ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害できるかに依存する。ところが、現在臨床適応になっているビスホスホン酸はいずれも骨事象の改善を目的として合成されたため、破骨細胞の作用部位である骨への親和性と、破骨細胞に対する細胞毒性を指標に化合物合成、及び、スクリーニングが行われた。しかし、腫瘍およびウイルス感染に対する薬剤の開発においては、骨移行性の高さは、逆に、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞への到達性を低下させる要因となる。【０００８】
従って、直接的な細胞障害性の改善を目的とする場合には、骨移行性の低減を一つの目標とする必要がある。一方、免疫エフェクターであるγδ型Ｔ細胞の活性化の改善を目的とする場合には、抗原提示細胞となるモノサイト系の細胞への取り込み、及び、γδ型Ｔ細胞の活性化能を指標として薬剤開発を行う必要がある。このように、骨吸収抑制を指標としない化合物スクリーニングを行うためには、これまでのビスホスホン酸とは異なる基本骨格を有するビスホスホン酸の系統的合成が必要となる。【０００９】
現在、上市されている低分子薬剤のうち３割程度がフッ素を基本骨格に有している。フッ素原子を含有することがなぜ薬剤の優位性に繋がるのかについては、完全には解明されていない。しかし、これまで、ビスホスホン酸の開発段階でフッ素含有型のビスホスホン酸はリセドロン酸のＰ−Ｃ−Ｐ骨格のＣに結合する水酸基をフッ素に置換したもののみである。これは、ビスホスホン酸において、フッ素原子の導入が合成的に困難であることが起因している。従って、一連のフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体の合成経路を開拓し、系統的に合成し、その生理活性を検討することは、ビスホスホン酸の医薬開発において重要な研究展開となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】N. Engl. J. Med., 360(7):679-691 February 12, 2009
【非特許文献２】Lancet 376: 1989-1999 2010
【非特許文献３】N. Engl. J. Med., 340(9):737-738 Marh 4, 1999
【非特許文献４】J. Immunol.191:1029-1042 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する優れた細胞障害性を有するＶγ２Ｖδ２型Ｔ細胞受容体を発現する末梢血γδ型Ｔ細胞を効率的に増殖誘導可能で、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を感作し、γδ型Ｔ細胞による細胞障害性を惹起し得る新規なフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｐ−Ｃ（Ｆ）−Ｐの基本骨格を有する一連のフッ素含有型ビスホスホン酸がモノサイトを感作し、γδ型Ｔ細胞を増殖誘導可能なこと、および、同化合物群が、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を感作し、γδ型Ｔ細胞の有する細胞障害性に対する感受性を亢進させ得ることを知得し、本発明を完成するに至った。具体的には、Ｐ−Ｃ（Ｆ）−Ｐの炭素原子にアルキルアミン側鎖を付加した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸、複素環基の置換したアミノ基又は窒素原子を含有する複素環基を付加した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸、及び、それらの酸部分をピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）基やｎ−ブタノイルオキシメチル（ＢｕＯＭ）基等のアルコキシメチル基でエステル化した一連のフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を合成し、それら新規化合物が有するγδ型Ｔ細胞増殖誘導能、および、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞感作能の検証を行った。即ち本発明は、以下に示す通りである。【００１３】
［１］下記一般式（Ｉ）：【００１４】
【化１】
2016125757.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｃｙはフェニル基又は複素環基であり、Ｙは水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、水酸基、ハロゲン原子若しくはアルコキシ基で置換されてもよいアリール基、又は、アラルキルオキシ基であり、Ｆはフッ素原子であり、Ｐはリン原子を表し、Ｒは水素原子又はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は、同一又は互いに異なって、水素原子又はアルキルカルボニルオキシアルキル基であり、ｊは０又は１の数を表し、ｍは０又は１の数を表し、ｎは１〜６の整数を表す。ただし、Ｃｙが３−ピリジル基であり、ｍが１であり、ｎが１であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である場合を除く）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
［２］一般式（Ｉ）において、Ｃｙがフェニル基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［３］一般式（Ｉ）において、Ｃｙが窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる１〜３個の原子を含む５〜１０員環の複素環基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［４］一般式（Ｉ）において、Ｃｙが窒素原子及び硫黄原子から選ばれる１又は２個の原子を含む５又は６員環の複素環基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［５］一般式（Ｉ）において、Ｃｙがイミダゾリル基、チアゾリル基、ピリジル基、ピリミジル基、又は７−アザインドリル基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［６］一般式（Ｉ）において、Ｙが水素原子、Ｃ１−３アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基又はフェニル基であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［７］一般式（Ｉ）において、ｊが1であり、Ｃｙがイミダゾリル基であり、Ｙが水素原子又はハロゲン原子であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［８］一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、Ｙが水素原子又はＣ１−３アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はＣ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［９］一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、Ｙが水素原子であり、Ｒが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［１０］一般式（Ｉ）において、ｊが０であり、ＹがＣ１−３アルキル基であり、ＲがＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［１１］一般式（Ｉ）において、ｊが1であり、Ｃｙがイミダゾリル基であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、水素原子又はピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）基である、上記［１］記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
［１２］下記式で表される化合物のいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩：【００１６】
【化２】
2016125757.tif 000004
【００１７】
［１３］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
［１４］抗腫瘍細胞剤である、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］抗ウイルス感染細胞剤である、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１６］リンパ球処理剤である、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１７］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする体内におけるリンパ球の処理方法。
［１８］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
［１９］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする腫瘍細胞及びウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
［２０］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするがんおよびウイルス感染症の治療方法。
［２１］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体外においてγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
［２２］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体から採取したγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることにより、γδ型Ｔ細胞を増殖及び／又は誘導させる工程、及び、当該γδ型Ｔ細胞を生体に戻す工程を含む腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、本明細書において、本発明化合物、あるいは本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体とも称する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を末梢血単核球に作用させ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）とともに１１日間培養すると、全細胞の９０％以上がＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞になる。そして、これら増殖誘導されたＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞は、種々の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に対して細胞傷害能を呈する。さらに、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞による認識能が増強され、より細胞障害性を受けやすくなる。すなわち、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞が感作され、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞に傷害されやすくなる。この性質を利用して、がん及びウイルス感染症に対する新規な免疫療法が可能になる。【００１９】
本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を末梢血単核球に作用させると、液相エンドサイトーシス能の高いモノサイトに選択的に取り込まれる。フッ素含有型ビスホスホン酸はそのまま、そして、フッ素含有型ビスホスホン酸誘導体はエステルが加水分解され、ビスホスホン酸に形成されて、ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害する。この阻害作用により、酵素の直上流に位置する代謝産物であるイソペンテニル二リン酸が細胞内に蓄積する。イソペンテニル二リン酸は、細胞膜に存在するブチロフィリン３Ａ１分子の細胞内領域と結合し、その細胞外領域のコンフォメーションを変化させるか、その重合度を変化させる。この変化をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞が認識し、増殖刺激が入る。ここに、ＩＬ−２やＩＬ−１５などの細胞増殖因子が作用するとγδ型Ｔ細胞が著しく増殖する。この増殖したγδ型Ｔ細胞は、高い腫瘍細胞障害性、ウイルス感染細胞障害性を呈する。【００２０】
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に、本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を作用させると、これらの薬剤は細胞内に取り込まれ、モノサイト内での変化と同様の現象がおこる。すなわち、フッ素含有型ビスホスホン酸はそのまま、そして、フッ素含有型ビスホスホン酸エステル誘導体はエステルが加水分解され、ビスホスホン酸に形成されて、ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害する。この阻害作用により、酵素の直上流に位置する代謝産物であるイソペンテニル二リン酸が細胞内に蓄積する。イソペンテニル二リン酸は、細胞膜に存在するブチロフィリン３Ａ１分子の細胞内領域と結合し、その細胞外領域のコンフォメーションを変化させるか、その重合度を変化させる。この変化をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞が認識し、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を効率的に傷害する。【００２１】
本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体が有するこれらの作用を利用して、がんおよびウイルス感染に対する新規免疫療法の確立が可能になる。この療法には大きく分けて２つの手法がある。一方は養子免疫療法であり、他方は直接投与法である。【００２２】
養子免疫療法の場合には、がん患者あるいはウイルス感染患者の末梢血から単核球を精製し、本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を添加する、さらに、ＩＬ−２を添加し、１１日間培養すると全培養細胞の９０％以上がＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞になり、増殖率は１０００倍以上になる。この細胞標品をＰＢＳで洗浄し、患者に静脈内投与する。この際、細胞投与前に本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を投与すると、がん細胞あるいはウイルス感染細胞が感作されγδ型Ｔ細胞に対する感受性が上がる。【００２３】
直接投与法の場合には、がん患者あるいはウイルス感染患者に、本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を静脈内投与する。この際、一部の化合物は、モノサイトに液相エンドサイトーシスで取り込まれ、フッ素含有型ビスホスホン酸はそのまま、そして、フッ素含有型ビスホスホン酸誘導体はエステルが加水分解され、ビスホスホン酸に形成されて、ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害する。この阻害作用により、酵素の直上流に位置する代謝産物であるイソペンテニル二リン酸が細胞内に蓄積し、細胞膜に存在するブチロフィリン３Ａ１分子の細胞内領域と結合し、その細胞外領域のコンフォメーションを変化させるか、その重合度を変化させる。この変化をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞が認識し、増殖刺激が入る。一方、残りの化合物は、腫瘍細胞あるいはウイルス感染細胞内に取り込まれ、モノサイト内と同様の作用を引き起こし、γδ型Ｔ細胞に対する感受性が亢進する。このようにして、増殖したγδ型Ｔ細胞は、腫瘍細胞あるいは、ウイルス感染細胞を効率的に傷害し、抗腫瘍活性及び／又は抗ウイルス活性が誘導される。【００２４】
以上のように、本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、免疫細胞の一種であるγδ型Ｔ細胞を増殖誘導し、腫瘍細胞及び／又はウイルス感染細胞のγδ型Ｔ細胞に対する感受性を亢進することにより、抗腫瘍免疫細胞療法及び抗ウイルス感染症免疫療法のための低分子薬剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体の具体例を示した図である。構造式にカッコ書きで付された数字は化合物番号を示している。（１）パミドロン酸の２つのリン原子が置換したメチレン炭素原子に結合する水酸基をフッ素原子に置換した化合物（ＰＡＭＦ）、（２）イバンドロン酸の２つのリン原子が置換したメチレン炭素原子に結合する水酸基をフッ素原子に置換した化合物（ＩＢＡＦ）、（３）アレンドロン酸の２つのリン原子が置換したメチレン炭素原子に結合する水酸基をフッ素原子に置換した化合物（ＡＬＥＦ）、（４）ゾレドロン酸の２つのリン原子が置換したメチレン炭素原子に結合する水酸基をフッ素原子に置換した化合物（ＺＯＬＦ）、（５）ゾレドロン酸の２つのリン原子が置換したメチレン炭素原子に結合する水酸基をフッ素原子に置換し、リン原子に結合した４つのＯＨをＰＯＭ基に置換した化合物（ＺＯＬＦ−ＰＯＭ）。
【図２】成人Ｔ細胞白血病患者（１）の末梢血単核球をフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３抗体及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（左図）。成人Ｔ細胞白血病患者（１）の末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養した後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（右図）。
【図３】成人Ｔ細胞白血病患者（２）の末梢血単核球をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（左図）。成人Ｔ細胞白血病患者（２）の末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養した後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（右図）。
【図４】成人Ｔ細胞白血病患者（３）の末梢血単核球をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（左図）。成人Ｔ細胞白血病患者（３）の末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養した後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（右図）。
【図５】肺がん患者（１）の末梢血単核球をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（左図）。肺がん患者（１）の末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養した後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（右図）。
【図６】肺がん患者（２）の末梢血単核球をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（左図）。肺がん患者（２）の末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養した後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＣＤ３抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色し、ＦＡＣＳ解析した結果（右図）。
【図７】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＰＡＭＦ、ＡＬＥＦ、ＺＯＬＦ及びＺＯＬＦ−ＰＯＭを１００〜１０６ｎＭで作用させ、そこに健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。これをＰＥ標識抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２抗体で染色後、ＦＡＣＳ解析し、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞中のＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合をもとめた。この割合は細胞障害性を示し、その化合物濃度依存性を図に纏めた。
【図８】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＺＯＬＦ−ＰＯＭを０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、あるいは、５μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図９】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＺＯＬＦを０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、あるいは、１０００μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１０】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＡＬＥＦを０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、あるいは、３０００μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１１】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＰＡＭＦを０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、あるいは、３０００μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１２】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＩＢＡＦを０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、あるいは、３０００μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１３】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７にＺＯＬＦを０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、あるいは、１０００μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（２）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１４】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７に、培地（上段）、ＺＯＬＦ５００μＭ（中段）、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ（下段）をそれぞれ作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（３）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１５】ヒト組織球系腫瘍細胞であるＵ９３７に、培地（上段）、ＺＯＬＦ５００μＭ（中段）、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ（下段）をそれぞれ作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＵ９３７細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１６】ヒトモノサイト系腫瘍細胞Ｐ３１／ＦＵＪに、培地（上段）、ＺＯＬＦ５００μＭ（中段）、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ（下段）をそれぞれ作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（３）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＰ３１／ＦＵＪ細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１７】成人Ｔ細胞白血病細胞株ＨＣＴ−５に、培地（上段）、ＺＯＬＦ１ｍＭ（中段）、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭ（下段）をそれぞれ作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、成人Ｔ細胞白血病患者（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＨＣＴ−５細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１８】成人Ｔ細胞白血病細胞株ＨＣＴ−４に、培地（上段）、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭ（中段）、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１０μＭをそれぞれ作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、成人Ｔ細胞白血病患者（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＨＣＴ−４細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図１９】ヒト肺がん細胞株であるＰＣ９にＺＯＬＦ−ＰＯＭを０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、あるいは、５μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、肺がん患者（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＰＣ９細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【図２０】ヒト膀胱がん細胞株であるＥＪ−１にＺＯＬＦ−ＰＯＭを０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、あるいは、５μＭで作用させ、そこにキレート剤を添加し、細胞を洗浄後、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を添加した。その際、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞により障害を受けたＥＪ−１細胞の割合を比細胞障害率とし、エフェクター細胞／標的細胞比（Ｅ／Ｔ比）依存性を図に纏めた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明において用いられるフッ素含有型ビスホスホン酸及びフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体の一実施態様は、下記一般式（Ｉ）により表される。
【００２７】
【化３】
2016125757.tif 000005
【００２８】
（式中、Ｃｙはフェニル基又は複素環基であり、Ｙは水素原子、アルキル基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、水酸基、ハロゲン原子若しくはアルコキシ基で置換されてもよいアリール基、又は、アラルキルオキシ基であり、Ｆはフッ素原子であり、Ｐはリン原子を表し、Ｒは水素原子又はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は、同一又は互いに異なって、水素原子又はアルキルカルボニルオキシアルキル基であり、ｊは０又は１の数を表し、ｍは０又は１の数を表し、ｎは１〜６の整数を表す。ただし、Ｃｙが３−ピリジル基であり、ｍが１であり、ｎが１であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子である場合を除く）
【００２９】
Ｃｙはフェニル基又は複素環基であり、少なくともＹが結合している。複素環基は、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜４個含有する４〜１５員環の単環式複素環基又は縮合多環式複素環基である。複素環基の例としては、フリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、キノキサリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾール、インドリル、インダゾリル、ピロロピラジニル、イミダゾピリジニル、イミダゾピラジニル、ピラゾロピリジニル、ピアゾロチエニル、ピラゾロトリアジニル、オキセタニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ヘキサメチレンイミニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、チアゾリニル、イミダゾリニル、ジオキソラニル、ジヒドロオキサジアゾリル、ピラニル、テトラヒドロピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフリル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、テトラヒドロピリミジニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾジオキシニル、ジヒドロベンゾジオキセピニル、テトラヒドロベンゾフラニル、クロメニル、ジヒドロキノリニル、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロイソキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ジヒドロフタラジニル、７−アザインドリル等が挙げられる。
【００３０】
好ましくは、上記複素環基は窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれるヘテロ原子を１〜３個含有する５〜１０員環の複素環基であり、より好ましくは窒素原子及び硫黄原子から選ばれるヘテロ原子を１又は２個含有する５又は６員環の複素環基である。かかる複素環基は、具体的にはイミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジル、又は、７−アザインドリルが好ましく、イミダゾリル又はピリミジルがより好ましく、特にイミダゾリル基が好ましい。
【００３１】
上記複素環基は、置換可能な位置にＹが結合している。Ｙは水素原子、アルキル基（例、メチル、エチル、ヘキシル、オクチル等のＣ１−１０アルキル基）、ハロゲン原子（例、塩素原子、フッ素原子、臭素原子）、ハロゲン化アルキル基（例、１〜３個のハロゲン原子（前述と同義）によって置換されたＣ１−３アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル）、水酸基、アリール基、又は、アラルキルオキシ基である。ここで、前記アリール基はハロゲン原子（前述と同義）若しくはアルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等のＣ１−３アルコキシ基）で置換されていてもよい。好ましくは、Ｙは水素原子、Ｃ１−３アルキル基（前述と同義）、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、無置換のアリール基であり、より好ましくは、水素原子、メチル基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又はフェニル基であり、最も好ましくは、水素原子又は臭素原子である。
【００３２】
アリール基は、単環式アリール基及び縮合多環式アリール基を包含し、具体的にはフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル及びアセナフチレニルが挙げられる。好ましくはＣ６−１８アリール基であり、より好ましくはＣ６−８アリール基であり、特にフェニル基が好ましい。
【００３３】
アラルキルオキシ基は、好ましくはＣ７−１８アラルキルオキシ基であり、具体的にはベンジルオキシ、フェネチルオキシ等が挙げられるが、ベンジルオキシが好ましい。
【００３４】
Ｒ１及びＲ２は、同一又は互いに異なって、水素原子又はアルキルカルボニルオキシアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはアルキルカルボニルオキシアルキル基である。好ましくはＲ１及びＲ２のいずれもがアルキルカルボニルオキシアルキル基である。アルキルカルボニルオキシアルキル基としては、例えば、Ｃ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基、好ましくは、Ｃ３−４アルキルカルボニルオキシ−メチル、特にピバロイルオキシメチル及びｎ−ブタノイルオキシメチルが好ましい。
【００３５】
ｊは０又は１を表す。ｍは０又は１、好ましくは１を表す。Ｃｙがピロリル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、ヘキサメチレンイミニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリニジル等の二級アミンの場合にはｍは０を表し、当該窒素原子で−（ＣＨ２）ｎ−基と結合する。ｎは１〜６の整数を表し、好ましくは１〜３、特に好ましくは１を表す。
【００３６】
本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、例えばビスホスホン酸（又はその誘導体）にフッ素原子を導入する場合であれば、３段階の合成ステップで効率的に製造することができる。まず、（ａ）出発材料となるビスホスホン酸のアミノ基等の反応性基を保護し、（ｂ）フッ素化剤によりフッ素原子を導入し、そして（ｃ）工程ａで導入した保護基を脱保護する。工程ｂで用いるフッ素化剤としては、Ｎ−フルオロフェニルスルホンイミド、Ｎ−フルオロトルエンスルホンイミド、Ｎ−フルオロメタンスルホンイミド、Ｎ−フルオロトリフルオロメタンスルホンイミド等のＮ−フルオロスルホンイミド類、Ｎ−フルオロ−２，４，６−トリメチルピリジニウムトリフルオロメタンスルホナト、Ｎ−フルオロ−２，４，６−トリメチルピリジニウムテトラフルオロボラート等のＮ−フルオロピリジニウム塩類、ジフルオロキセノン、フッ素ガス等が挙げられるが、入手容易さや、取り扱いやすさ、収率等から、Ｎ−フルオロスルホンイミド類が好ましい。
【００３７】
あるいは、フッ素原子が導入されたビスホスホン酸（又はその誘導体）が入手できる場合には、当該化合物を出発材料として、所望の置換基を導入することによっても本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を製造することができる。使用する試薬や反応条件などは、出発原料及び導入される置換基の種類に応じて、公知の手法あるいは当該手法を適宜修飾乃至改変することによって選択、決定することができる。
【００３８】
本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、具体的には、後述の実施例の合成手順に従って合成することができる。
【００３９】
本発明におけるフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。また本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体において、異性体（例えば光学異性体、幾何異性体及び互換異性体）などが存在する場合は、本発明はそれらの異性体を包含し、また溶媒和物、水和物及び種々の形状の結晶を包含するものである。
【００４０】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩が挙げられる。そのような塩として、具体的には以下が例示される。
塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；例えばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００４１】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩等を挙げることができる。
【００４２】
本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、ファーネシル二リン酸合成酵素阻害能を有する。その結果、コレステロール、脂溶性ビタミン、リポタンパク等、細胞の生存に必須なイソプレノイド代謝産物の産生を抑制し、優れた直接的腫瘍障害効果及びウイルス感染細胞障害効果を発揮する。従って、本発明は当該フッ素含有型ビスホスホン酸および／又はフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を有効成分として含む直接的及び間接的抗腫瘍剤および抗ウイルス剤を提供する。
【００４３】
本発明の抗腫瘍および抗ウイルス剤は、生体に投与して用いることができ、好ましくは哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）に投与される。
【００４４】
本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、末梢血のような生体の血液中、又はリンパ液中に存在するＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を特異的に刺激し、増殖及び／又は誘導するとともに、これらの細胞の抗腫瘍作用を誘導・増強することができる。従って、本発明は当該フッ素含有型ビスホスホン酸および／あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を有効成分として含むリンパ球処理剤を提供する。
【００４５】
γδ型Ｔ細胞の抗腫瘍作用としては、γδ型Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体を介して、がん細胞に発現している分子、例えばＭＩＣＡ／ＢやＩＰＰ（イソペンテニルピロリン酸）を認識して細胞を傷害することが挙げられる。さらに、γδ型Ｔ細胞が産生するＴＮＦ−αやＩＮＦ−γ等のサイトカインが作用して抗腫瘍活性を増強していることが挙げられる。
【００４６】
本発明のリンパ球処理剤は、体内及び体外においてγδ型Ｔ細胞を増殖及び／又は誘導する作用を有するものである。よって本発明のリンパ球処理剤は、生体から採取されたγδ型Ｔ細胞を含む検体を処理したり、又は生体に直接投与したりして用いることができる。ここで生体とは哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）を意味し、特にヒトが好ましい。
【００４７】
本発明は、本発明のリンパ球処理剤を、生体から採取したγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることによりγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導させる工程、及び、当該γδ型Ｔ細胞を生体に戻す工程を含む、腫瘍細胞の増殖抑制方法にも及ぶ。
【００４８】
生体から採取されたγδ型Ｔ細胞を含む検体としては、末梢血のような血液、リンパ液が例示される。本発明のリンパ球処理剤の対象としては、末梢血が好ましく、末梢血から比重遠心法により単核球画分を分離して用いることがさらに好ましい。
【００４９】
本発明のリンパ球処理剤と検体とを常法に従って共に培養することにより、当該リンパ球処理剤により検体中のγδ型Ｔ細胞を刺激することが可能である。γδ型Ｔ細胞の誘導及び／又は増殖は、１００ｐＭ〜１００μＭ、好ましくは１００ｐＭ〜２０μＭ、さらに好ましくは１００ｐＭ〜５μＭといった微量の範囲のフッ素含有型ビスホスホン酸および／又はフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体存在下で培養することにより可能である。
【００５０】
本発明のリンパ球処理剤の有効成分であるフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、ビスホスホン酸骨格を有するので、従来のピロリン酸系リンパ球処理剤に比べてアルカリホスファターゼに対して耐性を示す（Biology Trace Element Research, 104, 131-140 (2005)）。このため、γδ型Ｔ細胞を誘導及び／又は増殖するためのγδ型Ｔ細胞培養培地には、血清を含むものを使用することができ、例えば、ヒトＡＢ血清あるいは牛胎児血清等を用いることができる。血清を含む培地を使用可能であるため、簡便かつ短時間で、がん治療に用いるのに十分な量のγδ型Ｔ細胞を提供することが可能であるという利点がある。
【００５１】
本発明のリンパ球処理剤を生体外において、γδ型Ｔ細胞を増殖及び／又は誘導する目的で使用する場合の構成態様としては、有効成分であるフッ素含有型ビスホスホン酸及び／又はフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体自体のみとすることができるが、エタノール、ＤＭＳＯ等の溶液として製造することもできる。さらに必要に応じて、同時に他の添加物を加えることもできる。また、リンパ球処理剤を検体に作用させる際、補助因子としてインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）等を０．１〜１５０ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ＩＵ／ｍＬあるいは０．１１〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えてもよい。これらを添加することにより、γδ型Ｔ細胞の特異的誘導及び／又は増殖が顕著になる。
【００５２】
リンパ球処理剤による特異的γδ型Ｔ細胞の誘導及び／又は増殖は、培養後、培養上清中に産生されたＩＦＮ−γ量及び／又はＴＮＦ−α量を測定することにより評価することができる。例えば、ＴＮＦ−α産生量が、培養開始時と比較して多ければ、γδ型Ｔ細胞が誘導されたと判断できる。ＩＦＮ−γ量及び／又はＴＮＦ−α量の確認は、抗ＩＦＮ−γ抗体や抗ＴＮＦ−α抗体等を用いて従来公知の方法により行うことができる。
【００５３】
上記のようにして本発明のリンパ球処理剤によって処理されたγδ型Ｔ細胞は、医薬として患者に投与して使用することができる。例えば腫瘍を有する患者由来の単核球画分を本発明のリンパ球処理剤により処理し、γδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導が認められた単核球画分を当該患者に末梢血などとして投与することにより、抗腫瘍活性を発揮させることができる。投与方法としては、局所への注射、静脈注射、経皮吸収などの方法をとることができる。
【００５４】
本発明の抗腫瘍剤、抗ウイルス剤及びリンパ球処理剤を医薬品として用いる場合、通常それ自体公知の製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他添加剤、具体的には、水、植物油、アルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール等）、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、でんぷん等）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリン、ワセリン等と混合して、常法により錠剤、丸剤、散剤、顆粒、座剤、注射剤、点眼剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エアゾール剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などの形態とすることにより、全身的或いは局所的に、経口若しくは非経口で投与することができる。
【００５５】
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当たり、有効成分の量で１回に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが１日１回から数回、経口或いは静脈注射等の注射剤の形態で投与される。
【００５６】
本発明は直接的及び間接的抗腫瘍剤および抗ウイルス剤を包含するものであり、良性及び悪性腫瘍、ウイルス感染細胞に対する治療効果を有する。また、本発明のリンパ球処理剤は、腫瘍の予防及び／又は治療において有用である。対象となる腫瘍としては、脳腫瘍（悪性星細胞腫、乏突起膠腫成分を有する神経膠腫等）、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん等）、膀胱がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん、原発性及び転移性扁平上皮がん等）、腎臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、皮膚がん、神経芽細胞腫、肉腫、骨・軟部腫瘍、骨腫瘍、骨肉腫、精巣腫瘍、性腺外腫瘍、睾丸腫瘍、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がん等）、頭頸部腫瘍（上顎がん、喉頭がん、咽頭がん、舌がん、口腔がん等）、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫（最網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、真性多血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病等）、甲状腺がん、腎盂がん、尿管腫瘍、膀胱腫瘍、胆のうがん、胆管がん、絨毛がん、悪性黒色腫、小児腫瘍（ユーイング肉腫ファミリー、ウイルムス腫瘍、横紋筋肉腫、血管肉腫、睾丸胎児性がん、神経芽腫、網膜芽腫、肝芽腫、腎芽腫等）等の悪性腫瘍等が挙げられる。対象となるウイルス感染症としては、ＨＴＬＶ−１感染症、ＨＩＶ感染症、インフルエンザ症、ヘルペス症等のウイルス感染症等が挙げられる。本発明において、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、乳がん、白血病などの血液系の腫瘍や、ＨＴＬＶ−１感染症への適応が好ましい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体の製造方法を具体的に説明し、以下に示す。なお、本発明の化合物の製造方法は、以下に具体的に説明されたものに限定されるものではない。
すべての反応は別に記載されない限り空気雰囲気下で行った。別に指定しない限り、各種試薬は市販品を用いた。【００５８】
（測定方法及び標記）
1H NMR、13C NMR及び19F NMRスペクトルは、JNM-AL-400スペクトロメーター(1H NMR at 400 MHz, 13C NMR at 100 MHz)及びVarian-500PSスペクトロメーター(1H NMR at 500 MHz, 13C NMR at 125 MHz, 19F NMR at 470 MHz)(JEOL Ltd., Akishima, Tokyo, Japan)を用いてCDCl3溶液あるいはD2O溶液で測定した。1H NMR化学シフトはテトラメチルシラン(TMS)(0.00ppm)を、13C NMR化学シフトはCDCl3(77.0ppm)を、19F NMR化学シフトはCFCl3を、それぞれ参照した。化学シフトは100万分の1（ppm）で表した。
ピークの多重性は以下のように略記する。
s, singlet; d, doublet; dt, doublet of triplets; ddd, doublet of doublet of doublets; dtt, doublet of triplet of triplets; t, triplet; tt, triplet of triplets; q, quartet; m, multiplet; br, broad; pent, pentet
マススペクトル及び高分解能マススペクトルはJEOL JMS-T100TD (JEOL Ltd.)で測定した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、プレコートされたプレート(0.25 mm, silica gel plate 60F245, Merck Millipore, MA)上で行った。
カラムクロマトグラフィーはシリカゲルプレート(Kanto Chemical Co., Inc.)上で行った。
（略語一覧）
Ｍｅ：メチル、
Ｅｔ：エチル、
ｉＰｒ：イソプロピル、
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル、
Ｂｏｃ２Ｏ：二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、
Ｅｔ３Ｎ：トリエチルアミン、
ＣＨ２Ｃｌ２：ジクロロメタン、
ｑｕａｎｔ．：定量的に得られた、
ＮＦＳＩ：Ｎ−フルオロベンゼンスルホンイミド、
ｎ−ＢｕＬｉ：ｎ−ブチルリチウム、
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、
ＨＣｌ：塩酸、
ＮａＨ：水素化ナトリウム、
１５−ｃｒｏｗｎ−５−ｅｔｈｅｒ：１５−クラウン−５−エーテル、
ＭｅＯＨ：メタノール、
Ｍｓ：メタンスルホニル、
ＭｓＣｌ：塩化メタンスルホニル、
Ｋ２ＣＯ３：炭酸カリウム、
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ＫＨ：水素化カリウム、
１８−ｃｒｏｗｎ−６−ｅｔｈｅｒ：１８−クラウン−６−エーテル、
セレクトフルオル：１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン  ビス（テトラフルオロホウ酸）【００５９】
実施例１
３−アミノ−１−フルオロ−プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＰＡＭＦ）の合成）【００６０】
【化４】
2016125757.tif 000006
【００６１】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）プロピル）カルバメート【００６２】
【化５】
2016125757.tif 000007
【００６３】
ジクロロメタン(20 mL)に溶解したテトラエチル−３−アミノプロピリデン−１，１−ビスホスホネート［１］(460 mg, 1.5 mmol)にＢｏｃ２Ｏ(334 μL, 1.5 mmol)およびトリエチルアミン(205 μL, 1.5 mmol)を室温で作用させた。反応混液を９時間攪拌後、減圧下で溶媒を除去し、濃縮した。その結果、無色オイル状のｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）プロピル）カルバメート(575 mg, 収率99%)が得られた。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.35 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.53 (s, 9H), 2.06-2.15 (m, 2H), 2.40 (tt, J = 6.4, 23.9 Hz, 2H), 3.30-3.37 (m, 2H), 4.17-4.22 (m, 8H), 5.06 (br. s, NH);
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 16.3-16.3 (m), 27.3, 28.3, 62.6-62.7 (m), 85.1, 146.6;
HRMS (ESI) m/z Calcd for C16H35NNaO8P2[M]+454.1736, found 454.1696.
[1] K. Ogawa, T. Mukai, Y. Arano, H. Hanaoka, K. Hashimot, H. Nishimura, H. Saji, J. Label. Compd Radiopharm. 2004, 47, 753-761.【００６４】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）−３−フルオロプロピル）カルバメート【００６５】
【化６】
2016125757.tif 000008
【００６６】
ＴＨＦ(2.0 mL)に溶解したｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）プロピル）カルバメート(50 mg, 0.13 mmol)にｎ−ＢｕＬｉ(90 μL, 1.6 M ヘキサン溶液， 0.14 mmol)を−７８℃アルゴン雰囲気下で滴下した。１０分間攪拌後、Ｎ−フルオロフェニルスルホンイミド(45 mg, 0.14 mmol)をカルバニオン溶液に加えた。そして、その反応混液を１時間かけて室温にした。７時間攪拌後、反応を飽和塩化アンモニウム(10 mL)で停止させた。水相から反応物を酢酸エチル(2 × 10 mL)で抽出し、得られた有機相を混合した。これを硫酸マグネシウムで脱水し、減圧下で濃縮した。反応物をアセトン／ｎ−ヘキサン＝１／１の溶媒系によりシリカゲルカラムにかけたが、目的物を高純度で得られなかったため、主成分をｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）−３−フルオロプロピル）カルバメートとする２８ｍｇの粗生成物をさらなる精製は行わず、次の反応に供した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.36 (t, J = 8.8 Hz, 12H), 1.42 (s, 9H), 2.33-2.43 (m, 2H), 3.45-3.48 (m, 2H), 4.22-4.31 (m, 8H), 5.18 (br. s, NH).
HRMS (ESI) m/z Calcd for C16H34FNNaO8P2[M]+ 472.1641, found 472.1646.【００６７】
（３）３−アミノ−１−フルオロ−プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸【００６８】
【化７】
2016125757.tif 000009
【００６９】
ｔｅｒｔ−ブチル（３，３−ビス（ジエトキシホスホリル）−３−フルオロプロピル）カルバメート(28 mg, 0.06 mmol)を１ｍＬの６Ｎ塩酸に溶解し、加熱還流を７時間行った。反応混液を減圧下で溶媒を除去し、濃縮した。残渣を水／メタノールで再結晶し、黄色の固体を得た(14 mg, 収率45%)。
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 2.38-2.51 (m, 2H), 3.28-3.34 (m, 2H);
19F NMR (470 MHz, D2O) δ -183.4 (tt, J = 23.1, 69.2 Hz);
HRMS (ESI) m/z Calcd for C3H9FNO6P2 [M]- 235.9889, found 235.9852.【００７０】
実施例２
１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＩＢＡＦ）の合成【００７１】
【化８】
2016125757.tif 000010
【００７２】
（１）テトライソプロピルモノフルオロメチレン二リン酸［２］【００７３】
【化９】
2016125757.tif 000011
【００７４】
２０ｍＬのＤＭＦに溶解したテトライソプロピルメチレン二リン酸(2.5 g, 7.3 mmol)を氷上で０℃にした。別のフラスコに２０ｍＬのＤＭＦに溶解したＮａＨ(386 mg, 60% in mineral oil, 16.6 mmol)をいれ、５分間０℃で冷却した。このＮａＨ溶液をテトライソプロピルメチレン二リン酸に滴下した。反応混液を０℃で１０分間攪拌し、室温に戻した。１時間室温で攪拌後、ＤＭＦに溶解したセレクトフルオル(5.7 g, 16.6 mmol)を添加し、反応混液を、６時間室温で攪拌した。これを５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、５０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液を添加し反応を停止させた。水相からジクロロメタン(2 × 50 mL)で抽出し、得られた有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後ろ液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラム（展開溶媒：酢酸エチル／ｎ−ヘキサン＝１／２から酢酸エチル１００％の勾配）で精製し、モノフルオロビスホスホン酸(746 mg, 収率22%)とジフルオロビスホスホン酸(615 mg, 収率28%)を得た。
［２］V. Jo Davisson, Darrell R. Davis, Vyas M. Dixit, C. Dale Poulter, J. Org. Chem.1987, 52,1794-1801. 【００７５】
（２）テトライソプロピル−１−フルオロ−３−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸【００７６】
【化１０】
2016125757.tif 000012
【００７７】
アルゴン雰囲気下で調製したＮａＨ(96 mg, 60%, 2.4 mmol)のＴＨＦ(15 mL)懸濁液に、５ｍＬのＴＨＦに溶解したテトライソプロピルモノフルオロメチレン二リン酸(724 mg, 2.0 mmol)を０℃で添加した。３０分攪拌した後、２ｍＬのＴＨＦに溶解した２−（２−ヨウ化エトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン(615 mg, 2.4 mmol)と１５−クラウン−５−エーテル(88 mg, 0.4 mmol)を添加した。反応混液を室温で２４時間攪拌し、飽和塩化アンモニウム溶液により反応停止した。水相から化合物を酢酸エチル(2 × 50 mL)により抽出し、得られた有機相を混合し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過後ろ液を減圧下で濃縮した。テトライソプロピル−１−フルオロ−３−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸の粗生成物を２ｍＬの１Ｎ塩化水素メタノール溶液で処理し、１０分間攪拌後、反応混液を減圧下で濃縮した。これをシリカゲルカラム（溶出液：アセトン／ｎ−ヘキサン＝１／１）で精製し、無色オイル状のテトライソプロピル−１−フルオロ−３−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸を得た(198 mg, 収率24%)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.37-1.38 (m, 24 H), 2.42 (dtt, J = 5.4, 15.2, 27.5 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 4.11 (br. s, OH), 4.89-4.90 (m, 4H); 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 23.7-23.8 (m), 24.2-24.3 (m), 36.8 (d, J = 19.2 Hz), 73.1 (t, J = 3.7 Hz), 73.2 (t, J = 3.5 Hz); 
19F NMR (470 MHz, CDCl3) δ -193.8 (tt, J = 22.7, 78.0 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C15H33FN2NaO7P2 [M]+ 429.1583, found 429.1543【００７８】
（３）２，２−ビス（ジイソプロピオキシホスホリル）２−フルオロエチルメタンスルホン酸【００７９】
【化１１】
2016125757.tif 000013
【００８０】
５ｍＬのジクロロメタンに溶解したテトライソプロピル−１−フルオロ−３−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸(190 mg, 0.47 mmol)にトリエチルアミン(78 μL, 0.56 mmol)と塩化メタンスルホニル(43μL, 0.56 mmol)を室温で添加した。反応混液を７時間攪拌後、酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出し、得られた有機相を水で洗浄した。次に、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過後ろ液を減圧下で濃縮した。それをシリカゲルカラムで精製（溶媒：アセトン／ｎ−ヘキサン＝１／１）し、黄色オイル状の２，２−ビス（ジイソプロピオキシホスホリル）２−フルオロエチルメタンスルホン酸(209 mg, 収率92%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.36-1.38 (m, 24H), 2.53-2.66 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 4.54 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 4.82-4.91 (m, 4H); 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 23.7 (dt, J = 2.8, 12.9 Hz), 24.2 (d, J = 28.6 Hz), 32.9 (d, J = 20.1 Hz), 37.3, 65.3 (q, J = 6.9 Hz), 73.2 (t, J = 3.7 Hz), 73.5 (t, J = 3.7 Hz);
19F NMR (470 MHz, CDCl3) δ -195.0 (tt, J = 23.1, 75.1 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C16H35FNaO9P2S[M]+ 507.1359, found 507.1353【００８１】
（４）テトライソプロピル−１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸【００８２】
【化１２】
2016125757.tif 000014
【００８３】
２．５ｍＬのＤＭＦに溶解した２，２−ビス（ジイソプロピオキシホスホリル）２−フルオロエチルメタンスルホン酸(150 mg, 0.31 mmol)に炭酸カリウム(129 mg, 0.93 mmol)とＮ−ヘキシルメチルアミン(63 mg, 0.62 mmol)溶液を添加した。反応混液を８０℃で１９時間攪拌後、水を添加し反応を停止させた。水相から化合物を酢酸エチル(2 × 50 mL)で抽出し、得られた有機相を塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムを添加し脱水し、濾過後ろ液を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：アセトン／ｎ−ヘキサン＝１／１）により精製した結果、無色のオイル状物質として、テトライソプロピル−１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸が得られた(31 mg, 収率21%)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.90 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 1.27-1.39 (m, 28H), 1.44-1.52 (m, 2H), 2.23-2.40 (m, 7 H), 2.72-2.78 (m, 2H), 4.83-4.94 (m, 4H); 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.0, 22.6, 23.7 (dt, J = 3.0, 18.0 Hz), 24.3, (dt, J = 1.4, 32.6 Hz), 27.0, 29.7, 30.3 (d, J = 19.1 Hz), 42.0, 50.9 (q, J = 6.2 Hz), 57.3, 72.6 (t, J = 3.5 Hz), 72.9 (t, J = 3.7 Hz); 
19F NMR (470 MHz, CDCl3) δ -193.6 (tt, J = 23.4, 76.2 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C21H46FNNaO6P2 [M]+ 512.2682, found 512.2686.【００８４】
（５）１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸【００８５】
【化１３】
2016125757.tif 000015
【００８６】
テトライソプロピル−１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸(30 mg, 0.06 mmol)を１ｍＬの６Ｎ塩酸に溶解し、７時間加熱還流した。反応混液を減圧下で濃縮し、粘性あるオイルとして１−フルオロ−３−（メチル（ペンチル）アミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸(20 mg, 収率99%)が得られた。
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 0.79 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.21-1.29 (m, 4H), 1.57-1.72 (m, 2H), 2.42-2.53 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.99-3.04 (m, 1H), 3.11-3.17 (m, 1H), 3.26-3.33 (m, 1H), 3.46 (m, 1H); 
13C NMR (125 MHz, D2O) δ 12.9, 21.4, 23.1, 27.3 (d, J = 19.9 Hz), 27.7, 39.4, 51.5-51.7 (m), 56.3;
19F NMR (470 MHz, D2O) δ -189.5 (tt, J = 21.6, 69.9 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C9H21FNNaO6P2 [M]- 320.0828, found 320.0843.【００８７】
実施例３
４−アミノ−１−フルオロ−ブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＡＬＥＦ）の合成【００８８】
【化１４】
2016125757.tif 000016
【００８９】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）ブチル）カルバメート【００９０】
【化１５】
2016125757.tif 000017
【００９１】
１０ｍＬのジクロロメタンに溶解したテトラエチル−４−アミノブチリデン−１，１−ビスホスホン酸(345 mg, 1.0 mmol)にＢｏｃ２Ｏ(218 μL, 1.0 mmol)とＥｔ３Ｎ(139 μL, 1.0 mmol)を室温で添加した。反応混液を２０時間攪拌後、減圧下で溶媒を除去し、濃縮した。アセトンを溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、粗生成物を精製し、無色オイル状のｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）ブチル）カルバメート(267 mg, 収率60%)を得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 12 H), 1.38 (s, 9H), 1.71 (pent, J = 7.1 Hz, 2H), 1.85-1.96 (m, 2H), 2.24 (tt, J = 5.9, 23.9 Hz, 2H), 3.02-3.13 (m, 2H), 4.08-4.16 (m, 8H), 4.76 (br. s, NH); 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 16.2 (d, J = 2.8 Hz), 16.9 (d, J = 2.5 Hz), 22.6 (t, J = 5.1 Hz), 28.3, 28.9 (m), 30.1 (t, J = 132.6 Hz), 39.7, 62.4 (d, J = 6.5 Hz), 62.5 (d, J = 6.7 Hz), 78.8, 155.8; 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C17H37NNaO8P2 [M]+ 468.1892, found 468.1868.【００９２】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）−４−フルオロブチル）カルバメート【００９３】
【化１６】
2016125757.tif 000018
【００９４】
１２ｍＬのＴＨＦに溶解したｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）ブチル）カルバメート(220 mg, 0.49 mmol)に−７８℃アルゴン雰囲気下でｎ−ＢｕＬｉ(338 μL, 1.6 Mヘキサン溶液, 0.54 mmol)を滴下した。１０分攪拌した後、Ｎ−フルオロフェニルスルホンイミドをカルバニオン溶液に添加し、１時間かけて室温に戻した。１２時間攪拌後、１０ｍＬの塩化アンモニウム溶液を加え、反応を停止させた。水相から化合物を酢酸エチル(2 × 10 mL)で抽出し、有機相を混和した後硫酸マグネシウムで脱水し、濾過後ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：アセトン／酢酸エチル＝１／１）により粗精製した。主成分をｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）−４−フルオロブチル）カルバメートとする粗生成物をそのまま次の合成反応に供した(184 mg, 収率<82% )。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 12H), 1.43 (s, 9H), 1.82-1.88 (m, 2H), 2.12-2.26 (m, 2H), 3.09-3.20 (m, 2H), 4.20-4.33 (m, 8H), 4.62 (br. s, NH); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C17H36FNNaO8P2 [M]+ 486.1798, found 486.1811.【００９５】
（３）４−アミノ−１−フルオロ−ブチリデン−１，１−ビスホスホン酸【００９６】
【化１７】
2016125757.tif 000019
【００９７】
ｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ビス（ジエトキシホスホリル）−４−フルオロブチル）カルバメート(100 mg, 0.22 mmol)を２ｍＬの６Ｎ塩酸に溶解し、１５時間加熱還流した。反応混液は、減圧下で濃縮し、溶媒を除去した。残渣を水／メタノールで再結晶し、白色固体状の４−アミノ−１−フルオロ−ブチリデン−１，１−ビスホスホン酸を得た(15 mg, 収率74%)。
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 1.93-2.04 (m, 2H), 2.08-2.23 (m, 2H), 2.95-3.05 (m, 2H); 
13C NMR (125 MHz, D2O) δ 21.7 (q, J = 6.0 Hz), 29.3 (d, J = 19.6 Hz), 39.5; 
19F NMR (470 MHz, D2O ) δ -189.5 (tt, J =23.8, 72.5 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C9H19FNO8P2 [M]- 250.0046, found 250.0069.【００９８】
実施例４
１−フルオロ−（２−イミダゾイル−１−エチリデン）−１，１−ビスホスホン酸（ＺＯＬＦ）の合成【００９９】
【化１８】
2016125757.tif 000020
【０１００】
テトラキスイソプロピル−１−フルオロ−（２−イミダゾイル−１−エチリデン）−１，１−ビスホスホン酸(58 mg, 0.15 mmol)を１ｍＬの６Ｎ塩酸に溶解し、１２時間加熱還流した。反応混液は、減圧下で濃縮し、溶媒を除去した。残渣を水／メタノールで再結晶し、白色固体状の１−フルオロ−（２−イミダゾイル−１−エチリデン）−１，１−ビスホスホン酸を得た(42 mg, 収率 99%)。
1H NMR (500 MHz, D2O) δ 4.72-4.81 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 8.62 (s, 1H); 
13C NMR (125 MHz, D2O) δ 51.2 (br. d, J = 18.5 Hz), 118.7, 123.6, 135.9; 
19F NMR (470 MHz, D2O) δ -189.8 (tt, J = 25.7, 67.9 Hz, 1F); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C5H8FN2O6P2 [M]- 272.9842, found 272.9807.【０１０１】
実施例５
テトラキスピバロイルオキシメチル−１−フルオロ−２−（１Ｈ−イミダゾイル−１−エチリデン）−１，１−ビスホスホン酸（ＺＯＬＦ−ＰＯＭ）の合成【０１０２】
【化１９】
2016125757.tif 000021
【０１０３】
２ｍＬのＴＨＦに懸濁した水素化カリウム(21 mg, 30%, 0.16 mmol)に０℃アルゴン雰囲気下でイミダゾ−ル(11 mg, 0.16 mmol)を添加した。０℃で１時間攪拌後、室温で３０分間攪拌した。これを０℃に冷却し、そこに、１．５ｍＬのテトラキスピバロイルオキシメチルビニリデン−１，１−ビスホスホン酸(100 mg, 0.16 mmol)ＴＨＦ溶液を添加した。これを３０分間攪拌し、１．５ｍＬの１８−クラウン−６−エーテル(8.2 mg, 0.03 mmol)ＴＨＦ溶液を添加した。この反応混液を１５分間攪拌し、セレクトフルオル(82 mg, 0.23 mmol)を添加した。反応混液を１７時間攪拌し、５ｍＬの塩化アンモニウム水溶液で反応停止した。水相から化合物を酢酸エチル(2 × 10 mL)で抽出し、有機相を混合し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過後ろ液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：アセトン／ｎ−ヘキサン＝１／１からアセトン／メタノール＝１０／１）で精製した。その結果、テトラキスピバロイルオキシメチル−１−フルオロ−２−（１Ｈ−イミダゾイル−１−エチリデン）−１，１−ビスホスホン酸が得られた(30 mg, 収率26%)。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.23 (s, 36H), 4.67 (ddd, J = 9.1, 10.3, 25.9 Hz, 2H), 5.60-5.71 (m, 8H), 6.96 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 7.51 (s, 1H); 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 26.8, 26.8, 38.7, 28.7, 48.1 (m), 82.8 (dt, J = 3.2, 70.2 Hz), 120.7 (d, J = 1.6 Hz), 129.2, 138.5 (d, J = 1.2 Hz), 176.5, 176.6; 
19F NMR (470 MHz, CDCl3) δ -191.6 (tt, J = 26.0, 71.8 Hz); 
HRMS (ESI) m/z Calcd for C29H49FN2NaO14P2 [M]+ 753.2541, found 753.2502.【０１０４】
本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体をリンパ球処理剤として用いる方法を試験例１〜５に具体的に説明する。なお、本発明の化合物を用いるリンパ球処理方法は、以下に具体的に説明されたものに限定されるものではない。
本試験例で用いた各患者由来の末梢血は、長崎大学病院入院患者より入手されたものであり、長崎大学病院臨床研究倫理委員会により承認されている。
試験例１（図２）
成人Ｔ細胞白血病患者（１）から末梢血を１０ｍＬヘパリン採血し、１０ｍＬのＰＢＳで希釈した。これを２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、６００×ｇ、３０分間室温で濃度勾配遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの直上層を回収しＰＢＳで３回洗浄し、末梢血単核球を得た。これを７ｍＬのＹｓｓｅｌ培地に懸濁し、そのうちの１ｍＬをＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。その結果図２左側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの０．７５％であった。また、Ｙｓｓｅｌ培地に懸濁した末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した。その結果図２右側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの９１．４８％であった。これは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭを用いて、成人Ｔ細胞白血病患者の末梢血単核球から、１１日間で、精製度の高いＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を容易にかつ大量に調製することが出きることを示している。【０１０５】
試験例２（図３）
成人Ｔ細胞白血病患者（２）から末梢血を１０ｍＬヘパリン採血し、１０ｍＬのＰＢＳで希釈した。これを２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、６００×ｇ、３０分間室温で濃度勾配遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの直上層を回収しＰＢＳで３回洗浄し、末梢血単核球を得た。これを７ｍＬのＹｓｓｅｌ培地に懸濁し、そのうちの１ｍＬをＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。その結果図３左側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの１．５８％であった。また、Ｙｓｓｅｌ培地に懸濁した末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した。その結果図３右側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの９６．８３％であった。これは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭを用いて、成人Ｔ細胞白血病患者の末梢血単核球から、１１日間で、精製度の高いＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を容易にかつ大量に調製することが出きることを示している。【０１０６】
試験例３（図４）
成人Ｔ細胞白血病患者（３）から末梢血を１０ｍＬヘパリン採血し、１０ｍＬのＰＢＳで希釈した。これを２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、６００×ｇ、３０分間室温で濃度勾配遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの直上層を回収しＰＢＳで３回洗浄し、末梢血単核球を得た。これを７ｍＬのＹｓｓｅｌ培地に懸濁し、そのうちの１ｍＬをＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。その結果図４左側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの０．４９％であった。また、Ｙｓｓｅｌ培地に懸濁した末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した。その結果図４右側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの９８．２９％であった。これは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭを用いて、成人Ｔ細胞白血病患者の末梢血単核球から、１１日間で、精製度の高いＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を容易にかつ大量に調製することが出きることを示している。【０１０７】
試験例４（図５）
肺がん患者（１）から末梢血を１０ｍＬヘパリン採血し、１０ｍＬのＰＢＳで希釈した。これを２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、６００×ｇ、３０分間室温で濃度勾配遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの直上層を回収しＰＢＳで３回洗浄し、末梢血単核球を得た。これを７ｍＬのＹｓｓｅｌ培地に懸濁し、そのうちの１ｍＬをＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。その結果図５左側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの４．１４％であった。また、Ｙｓｓｅｌ培地に懸濁した末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した。その結果図５右側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの９８．５９％であった。これは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭを用いて、肺がん患者の末梢血単核球から、１１日間で、精製度の高いＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を容易にかつ大量に調製することが出きることを示している。【０１０８】
試験例５（図６）
肺がん患者（２）から末梢血を１０ｍＬヘパリン採血し、１０ｍＬのＰＢＳで希釈した。これを２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅに重層し、６００×ｇ、３０分間室温で濃度勾配遠心した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの直上層を回収しＰＢＳで３回洗浄し、末梢血単核球を得た。これを７ｍＬのＹｓｓｅｌ培地に懸濁し、そのうちの１ｍＬをＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。その結果図６左側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの１．９５％であった。また、Ｙｓｓｅｌ培地に懸濁した末梢血単核球にＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭを作用させ、ＩＬ−２とともに１１日間培養し、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体で染色後、フローサイトメーターで解析した。その結果図６右側のパネルにあるように、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞はリンパ球ゲートの９５．７２％であった。これは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭを用いて、肺がん患者の末梢血単核球から、１１日間で、精製度の高いＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を容易にかつ大量に調製することが出きることを示している。【０１０９】
本発明のフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を抗腫瘍免疫賦活化剤として用いる方法を試験例６〜１９に具体的に説明する。なお、本発明の化合物を用いる抗腫瘍免疫賦活化方法は、以下に具体的に説明されたものに限定されるものではない。
本試験例では以下の腫瘍細胞株をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞の腫瘍細胞障害性検定の標的として用いた。細胞名の後の数字は入手先を示す。
［入手先］
（１）Health Science Research Resources Bank
（２）長崎大学  中村龍文博士より供与
（３）長崎大学  中村洋一博士より供与
モノサイト系腫瘍由来のＵ９３７細胞（Ｕ９３７）（１）
モノサイト系腫瘍由来のＰ３１／ＦＵＪ細胞（Ｐ３１／ＦＵＪ）（１）
ＨＴＬＶ−１感染患者由来のＨＣＴ−４細胞（ＨＣＴ−４）（２）
ＨＴＬＶ−１感染患者由来のＨＣＴ−５細胞（ＨＣＴ−５）（２）
肺がん由来のＰＣ９細胞（ＰＣ９）（３）
膀胱がん由来のＥＪ−１細胞（ＥＪ−１）（１）【０１１０】
試験例６（図７）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を２×１０５／２００μＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴丸底プレートに２００μＬずつ播種した。６００×ｇ２分間遠心し、上清を除去した。ここで、ＰＡＭＦ、ＡＬＥＦ、ＺＯＬＦに関して、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭの希釈系列を作成し、ＺＯＬＦ−ＰＯＭに関して、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに２００μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。この細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、２×１０５／５０μＬの細胞濃度にした健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞を５０μＬ添加した。さらにＰＥ標識抗ヒトＣＤ１０７ａモノクローナル抗体を５μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ここにＦＩＴＣ標識抗ヒトＶδ２モノクローナル抗体を２μＬ添加し、氷上で２０分間インキュベートした。これを２％ＦＣＳ加ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬの２％ＦＣＳ加ＰＢＳに懸濁した。これをフローサイトメーターで解析し、Ｖδ２陽性細胞中のＣＤ１０７ａ陽性画分の割合を計算し、その化合物濃度依存性を図７のグラフに纏めた。その結果、ＰＡＭＦ、ＡＬＥＦ、ＺＯＬＦに関しては、最大ＣＤ１０７ａ発現を惹起する化合物濃度は数百μＭであったが、ＺＯＬＦ−ＰＯＭでは、１００ｎＭ程度であった。以上のことより、フッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体をヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１１】
試験例７（図８）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＺＯＬＦ−ＰＯＭに関して、０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図８にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも１．２５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１２】
試験例８（図９）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＺＯＬＦに関して、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図９にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも３００μＭのＺＯＬＦをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１３】
試験例９（図１０）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＡＬＥＦに関して、０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、３０００μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１０にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも３００μＭのＡＬＥＦをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１４】
試験例１０（図１１）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＰＡＭＦに関して、０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、３０００μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１１にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも３００μＭのＰＡＭＦをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１５】
試験例１１（図１２）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＩＢＡＦに関して、０μＭ、３００μＭ、１０００μＭ、３０００μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１２にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも３００μＭのＩＢＡＦをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１６】
試験例１２（図１３）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＺＯＬＦに関して、０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（２）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１３にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも３００μＭのＺＯＬＦをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１７】
試験例１３（図１４）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。培地、ＺＯＬＦ５００μＭ溶液、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（３）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０．６２５：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１４にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも５００μＭのＺＯＬＦあるいは５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１８】
試験例１４（図１５）
ヒト組織球系腫瘍細胞株であるＵ９３７細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。培地、ＺＯＬＦ５００μＭ溶液、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０．６２５：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１５にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも５００μＭのＺＯＬＦあるいは５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒト組織球系腫瘍細胞株Ｕ９３７に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１１９】
試験例１５（図１６）
ヒトモノサイト系腫瘍細胞株であるＰ３１／ＦＵＪ細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。培地、ＺＯＬＦ５００μＭ溶液、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ５μＭ溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（３）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０．６２５：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１６にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも５００μＭのＺＯＬＦあるいは５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒトモノサイト系腫瘍細胞株Ｐ３１／ＦＵＪに作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１２０】
試験例１６（図１７）
成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＣＴ−５細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。培地、ＺＯＬＦ１ｍＭ溶液、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭ溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、成人Ｔ細胞白血病患者（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１、８０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１７にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも１ｍＭのＺＯＬＦあるいは１μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭを成人Ｔ細胞白血病細胞株ＨＣＴ−５に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１２１】
試験例１７（図１８）
成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＣＴ−４細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。培地、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１μＭ溶液、あるいは、ＺＯＬＦ−ＰＯＭ１０μＭ溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、成人Ｔ細胞白血病患者（４）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１、８０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１８にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも１μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭを成人Ｔ細胞白血病細胞株ＨＣＴ−４に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１２２】
試験例１８（図１９）
ヒト肺がん細胞株であるＰＣ９細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＺＯＬＦ−ＰＯＭに関して、０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、肺がん患者（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図１９にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも１．２５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒト肺がん細胞株ＰＣ９に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。【０１２３】
試験例１９（図２０）
ヒト膀胱がん細胞株であるＥＪ−１細胞を１×１０６／ｍＬの細胞濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに１ｍＬずつ分注した。これを６００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。ＺＯＬＦ−ＰＯＭに関して、０μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの希釈系列を作成した。この希釈系列の化合物溶液を、上清を除去した細胞ペレットに１ｍＬずつ添加し、３７℃で１時間４５分インキュベートした。ここに１０ｍＭのランタノイド系金属用キレート剤を２．５μＬずつ添加し、さらに１５分間インキュベートした。これらのコニカルチューブを６００×ｇで５分間遠心し、この細胞ペレットを３回ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に、この細胞ペレットを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、そのうちの２ｍＬを別のコニカルチューブに移し、さらに６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。この細胞懸濁液を１００μＬずつ９６穴丸底プレートに播種した。ここで、健常成人（１）由来のＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞をエフェクター細胞／標的細胞比０：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１になるように作用させ、４０分間３７℃でインキュベートした。プレートを６００×ｇで２分間遠心し、２５μＬの培養上清を取り、２００μＬのユーロピウム加酢酸緩衝液で希釈した。この混合液を２００μＬ取り、時間分解蛍光を測定した。各サンプルの値から比細胞障害率を求め、そのエフェクター細胞／標的細胞比依存性を図２０にあるようにグラフ化した。この結果より、少なくとも１．２５μＭのＺＯＬＦ−ＰＯＭをヒト膀胱がん細胞株ＥＪ−１に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の細胞障害活性に対して感受性が亢進することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体は、末梢血に作用させると、優れたＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞活性化剤となる。また、腫瘍細胞やウイルス感染細胞に作用させると、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞の有する細胞障害作用に対する感受性を亢進させ、抗腫瘍および抗ウイルス剤として機能する。これらの知見から、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸および／あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を用いた抗腫瘍免疫治療法および抗ウイルス感染症治療法の確立が可能となる。具体的には、がん患者あるいはウイルス感染患者の末梢血単核球を調製し、これを本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体とＩＬ−２の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏ培養し、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞を増殖誘導する。これを患者に静脈内投与あるいは局所投与することにより、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞を利用したがんおよびウイルス感染症免疫治療法が可能となる。また、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸およびフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を直接がん患者あるいはウイルス感染症患者に投与することにより、Ｖδ２陽性γδ型Ｔ細胞を利用したがんおよびウイルス感染症免疫治療法が可能となる。この場合には、まず、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体がモノサイト系の細胞に取り込まれ、フッ素含有型ビスホスホン酸はそのまま、そして、フッ素含有型ビスホスホン酸誘導体はエステルが加水分解され、フッ素含有型ビスホスホン酸に形成されて、ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害する。この阻害作用により、酵素の直上流に位置する代謝産物であるイソペンテニル二リン酸が細胞内に蓄積する。イソペンテニル二リン酸は、細胞膜に存在するブチロフィリン３Ａ１分子の細胞内領域と結合し、その細胞外領域のコンフォメーションを変化させるか、その重合度を変化させる。この変化をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞が認識し、増殖刺激が入る。この増殖したγδ型Ｔ細胞は、高い腫瘍細胞障害性、ウイルス感染細胞障害性を呈する。一方、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体が腫瘍細胞内やウイルス感染細胞内に取り込まれるが、この際、モノサイト内での変化と同様の現象がおこる。すなわち、フッ素含有型ビスホスホン酸はそのまま、そして、フッ素含有型ビスホスホン酸誘導体はエステルが加水分解され、酸の形になり、ファーネシル二リン酸合成酵素を阻害する。この阻害作用により、酵素の直上流に位置する代謝産物であるイソペンテニル二リン酸が細胞内に蓄積する。イソペンテニル二リン酸は、細胞膜に存在するブチロフィリン３Ａ１分子の細胞内領域と結合し、その細胞外領域のコンフォメーションを変化させるか、その重合度を変化させる。この変化をＶδ２陽性γδ型Ｔ細胞が認識し、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を効率的に傷害する。このようにして、本発明の新規なフッ素含有型ビスホスホン酸あるいはフッ素含有型ビスホスホン酸誘導体を用いた抗腫瘍免疫療法および抗感染症免疫治療法が可能になる。
また、オイル状の本発明化合物は、溶解性に優れ、薬剤として投与するのに好適である。【０１２５】
本出願は、日本で出願された特願２０１５−０１８２６０（出願日２０１５年２月２日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2016125757.tif 000025
【図２】
2016125757.tif 000026
【図３】
2016125757.tif 000027
【図４】
2016125757.tif 000028
【図５】
2016125757.tif 000029
【図６】
2016125757.tif 000030
【図７】
2016125757.tif 000031
【図８】
2016125757.tif 000032
【図９】
2016125757.tif 000033
【図１０】
2016125757.tif 000034
【図１１】
2016125757.tif 000035
【図１２】
2016125757.tif 000036
【図１３】
2016125757.tif 000037
【図１４】
2016125757.tif 000038
【図１５】
2016125757.tif 000039
【図１６】
2016125757.tif 000040
【図１７】
2016125757.tif 000041
【図１８】
2016125757.tif 000042
【図１９】
2016125757.tif 000043
【図２０】
2016125757.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月22日(2016.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2016125757.tif 000045
（式中、Ｃｙはイミダゾリル基であり、Ｙは水素原子であり、Ｆはフッ素原子であり、Ｐはリン原子を表し、Ｒ１及びＲ２は、同一又は互いに異なって、アルキルカルボニルオキシアルキル基であり、ｊは１の数を表し、ｍは０の数を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が同一又は互いに異なって、Ｃ２−７アルキルカルボニルオキシ−Ｃ１−３アルキル基である、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２がピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）基である、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
下記式で表される化合物又はその薬学的に許容される塩：
【化２】
2016125757.tif 000046
【請求項１３】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１４】
抗腫瘍細胞剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
抗ウイルス感染細胞剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
リンパ球処理剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする体内におけるリンパ球の処理方法。
【請求項１８】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
【請求項１９】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とする腫瘍細胞及びウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
【請求項２０】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩の有効量を生体に投与することを特徴とするがんおよびウイルス感染症の治療方法。
【請求項２１】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体外においてγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることを特徴とするγδ型Ｔ細胞の増殖及び／又は誘導方法。
【請求項２２】
請求項１、６、１１及び１２のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を、生体から採取したγδ型Ｔ細胞を含む検体に作用させることにより、γδ型Ｔ細胞を増殖及び／又は誘導させる工程、及び、当該γδ型Ｔ細胞を生体に戻す工程を含む腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の増殖抑制方法。
【国際調査報告】
2016125757.tif 000047
2016125757.tif 000048
2016125757.tif 000049
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