(57)【要約】  強力な磁場下で１ミクロン以下の常磁性磁気微粒子を使用する場合、磁気微粒子が磁束に沿って数珠状の凝集体を形成し、平坦な粒子の層と粒子の塊が混ざって凸凹状になることが確認された。生体分析に使用する場合、この現象が定量性の低下に影響する。  微小な磁気微粒子を含む溶液を濡れ性の高い平面基板で上下をできるだけ液の厚みが薄くなるように挟みこみ、一方の平面基板側から磁場を与え磁気微粒子を引き付ける方法を用いることで、磁気微粒子は分散状態のまま基板面に膜のように均一に固定でき、生体分子の定量性を向上できる。
2014129292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上下を２枚の親水性の高い平面基板で挟まれた溶液槽を有し、一方の平面基板側に磁力のオンオフ、あるいは磁力の強弱の切り替えが可能な磁場発生手段を備え、当該磁場発生手段によって溶液槽内の磁気微粒子を基板固定することを特徴とする生体分子分析用デバイス。
【請求項２】
前記平面基板間の幅として100μm以下であることを特徴とする請求項１記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項３】
前記磁気微粒子として粒径0.02〜1μmの常磁性磁気微粒子を用いる請求項１または請求項２記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項４】
前記平面基板の表面が蒸留水に対する接触角が30°以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項５】
上下を２枚の濡れ性の高い前記平面基板から得られる毛細管現象によって、溶液槽内に溶液を導入することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項６】
前記磁場発生装置として、
電磁石、可動式の永久磁石、可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった電磁石、可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった永久磁石のうちいずれかを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項７】
溶液槽の導入口と排出口に疎水性表面の送液管が接続されて送液手段を有し、流路構造を持つことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項８】
前記請求項１において、
前記生体分子が抗原分子であり、磁気微粒子による捕捉が抗原抗体反応によって実施されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか1項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項９】
前記請求項１において、
前記生体分子が核酸分子であり、磁気微粒子による捕捉がハイブリダイゼーションによって実施されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか1項記載の生体分子分析用デバイス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか1項記載の生体試料分析用デバイスと、蛍光色素を励起する手段と、蛍光を検出する手段とが一体化した生体分子分析装置。
【請求項１１】
検出器側の平面基板として、ガラス、あるいは親水化処理を行った光学用ポリマーを使用することを特徴とした請求項10記載の生体分子分析装置。
【請求項１２】
前記蛍光色素を励起して、蛍光を検出する手段として、落射型光学顕微鏡を用いることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載の生体分子分析装置。
【請求項１３】
前記生体分子を蛍光色素で標識して1分子ずつカウンティングすることを特徴とした請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の生体分子分析装置。
【請求項１４】
磁力がオフ、あるいは磁力が弱の状態で溶液槽内に磁気微粒子溶液を導入し、その後に磁力がオン、あるいは磁力が強にしてから蛍光色素を観察する順で行われることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の生体分子分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子分析デバイスおよび、それを用いた生体分子分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌診断の分野では、早期に癌発症の徴候を知るため様々な癌マーカーが研究され、実用化も進んでいる。癌マーカーとは癌細胞由来の分泌型の生体因子であり、癌の進行とともに増加し血中や尿中に現れる。例えば、ホルモン、サイトカイン等のタンパク質、マイクロRNA等の核酸が知られている。早期の癌ではこれらの癌マーカーの量は少なく検出が難しく、元々発現量の少ない癌マーカーが存在する場合も同様である。現在、主流である高感度の癌マーカー検出方法は抗体を用いた免疫測定法であり、ELISAやナノ微粒子アッセイといった手法が知られている。最近では、さらなる高感度な免疫測定法として、単分子で検出可能なデジタルELISAが開発されている（非特許文献１）。血液中の癌マーカーを検出する場合、患者から採取できる血液量は限られており、その中から極微量の癌マーカーを出来るだけ多く捕捉して検出することが求められる。例えば、50μｌの血漿中から検出する場合、早期の癌では癌マーカーは10-16〜10-12Mの濃度範囲であるため、50μｌ中に3000分子程度存在する標的分子を定量する検出感度が必要になる。このように低濃度の癌マーカーを検出可能な超高感度の検出装置が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Rissin DM et al， Nature Biotecnology, Jun 28（6）； p595−599 （2010）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は極微量の生体分子の定量方法および、定量用デバイスの構造と装置構成に関する。一般的に溶液中に浮遊する極微量の生体分子を効率よく捕捉するためには、目的の生体分子と捕捉する側の分子の衝突頻度を高める必要がある。そこで我々は捕捉する側の分子として1ミクロン以下の微小な磁気微粒子を用いる方法を考案した。これらの微小な磁気微粒子を用いることで、粒子数当たりの表面積を大きくでき、分子運動も向上できるため目的の生体分子との反応効率を高めることができる。さらに生体分子の検出を蛍光色素標識で行う場合、磁気微粒子のサイズが励起波長、発光波長の同等以下であれば蛍光色素の励起と発光を妨げることなく観察することができる。したがって、目的の生体分子を捕捉した磁気微粒子だけでなく捕捉していない磁気微粒子すべてを平面上に密に固定しても定量性を損なわず蛍光輝点を得ることができる。そのため、生体分子を捕捉した磁気微粒子のすべてを一定の面積の基板に展開して生体分子数を数えることができ、極微量な生体分子を定量することが可能となる。【０００５】
以上のように、本方式では磁気微粒子の粒径が小さければ小さいほど、捕捉効率を上げることができ、かつ一定面積上に固定できる微粒子数も高密度にできるため、高感度検出と高速検出にとって有利になる。しかし、一方で小さい磁気微粒子は磁化率が低く集磁しにくいため、平面基板に展開する際には強力な磁場と、より多くの集磁時間が求められる。また、こうした強力な磁場の存在下では磁気微粒子が磁束に沿って数珠状の凝集体を形成し、平坦な粒子の層と粒子の塊が混ざって凸凹状になることが確認された。この現象は特に磁気微粒子濃度が高い場合に多く見られる。大きな粒子の塊が形成されると対物レンズの焦点深度を超えて高さを持ってしまうため、部分的に焦点から外れる蛍光輝点が存在することになり定量性が損なわれる。たとえ外れた蛍光輝点をすべて拾うためにオートフォーカス機能を付けたとしても、解析が複雑になる上に撮影に時間を要することになり高速検出にとっては不利となってしまう。したがって、高濃度の微小磁気微粒子の高密度に均一に固定する手段が必要になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
微小な磁気微粒子を含む溶液を濡れ性の高い平面基板で上下をできるだけ液の厚みが薄くなるように挟みこみ、一方の平面基板側から磁場を与え磁気微粒子を引き付ける方法を用いる。あるいは同様に濡れ性の高い２枚の平面基板の間に一定の厚みの隙間を作り、その中に磁気微粒子を流し込んでから一方の平面基板側から磁場を与えて磁気微粒子を基板に固定するデバイスを用いる。
【発明の効果】
【０００７】
溶液を濡れ性の高い平面基板で上下をできるだけ液の厚みが薄くなるように挟みこむことで、磁気微粒子は分散状態のまま基板面に膜のように均一に固定できることから基板上の蛍光色素に対する焦点合わせが容易にでき、磁気微粒子が蛍光色素を抱き込んで励起光を遮蔽する効果も防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施例の一般原理を説明するための図。
【図２】本実施例のデバイス構造と原理を説明するための図。
【図３】本実施例の原理検証の方法を説明するための図。
【図４】本実施例の原理検証の結果を説明するためのグラフ。
【図５】本実施例の原理検証の結果を説明するためのグラフ。
【図６】本実施例の原理検証の結果を説明するための図。
【図７】本実施例の原理検証の結果を説明するための図。
【図８】本実施例のデバイス構造を説明するための図。
【図９】本実施例の抗原分子の捕捉方法と蛍光標識方法の一例を説明するための図。
【図１０】本実施例の核酸分子の捕捉方法と蛍光標識方法の一例を説明するための図。
【図１１】本実施例の生体分子分析装置の構成の一例を説明するための図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施例では、解析対象の生体分子を磁気微粒子に捕捉する方法と、当該微粒子を二次元に提示するための平滑な支持基板を持つデバイスの構造と、当該微粒子を支持基板上に導入、固定、観察する手順について開示する。支持基板としては磁気をよく透過する材質のものや、厚みのものであれば何でもよく、特に好ましくは石英ガラス基板やシリコン基板などである。また、支持基板上に溶液を封止するためのカバー基板材としては可視光透過性の無機ガラスや光学ポリマーを用いることができる。支持基板もカバー基板も濡れ性が高いほどよく、洗浄したガラスなどがもっとも手に入りやすい。ただし、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの疎水性ポリマーでもO2プラズマやカルボキシル基の導入によって表面を親水化処理することで利用することができる。基板の濡れ性は蒸留水の接触角10〜30°程度で十分であるが、より効果を得るためには接触角は10°未満であるほうがよい。
【００１０】
支持基板の直下に支持基板に磁気微粒子を引き付けるための磁場発生装置を設置する。磁場発生装置は磁場のオン／オフあるいは強弱を切り換える機能が付いていることが望ましい。磁場発生装置は電磁石、可動式の永久磁石、可動式の電磁石、支持基板と磁石の間に可動式の磁場遮断板が備わった永久磁石、または電磁石を用いることができる。使用する磁石の磁力は使用する磁気微粒子に応じて使い分ける。特に粒径300nm以下の磁気微粒子の固定は強い磁場が必要であり、0．１T以上の表面磁束密度で数秒間引き付ける必要がある。ただし、このとき必要とされる磁力は磁気微粒子の粒径、あるいはフェライト含有量、溶媒、磁気微粒子の表面修飾によって変動する。
【００１１】
当該支持基板上に当該カバー基板を有し、これらの基板間に溶液を封入するための一定のスペースを持ち、さらに支持基板側に磁場発生装置を備える構造体を以下、デバイスと称する。当該デバイスは支持基板全面をスキャンできるように可動ステージ上に設置して使用する。
【００１２】
観察は以下の順序で行う。はじめに目的の生体分子を捕捉した磁気微粒子を含んだ反応液を支持基板上に載せ、次に磁場発生装置をオンにして磁場を発生させ、反応液内のすべての磁気微粒子を支持基体上に引き付けて固定し、さらに支持基板上に固定した磁気微粒子とそれに結合した蛍光標識された生体分子に励起光を照射して撮影する。観察された輝点数をカウントすることで目的の生体分子濃度を求める。
【００１３】
実施例では、解析対象の生体分子が抗原性タンパク質（以下、抗原と称する）であることを開示する。解析対象の抗原を用意し、抗原に対する抗体を結合した磁気微粒子と蛍光体標識された抗体に前記解析対象の抗原と結合させ、標識された蛍光体を検出することを特徴とする免疫学的分析方法を開示する。捕獲する磁気微粒子の作製法、蛍光標識の方法は実施例で詳細に記載する。
【００１４】
また、実施例では、解析対象の生体分子を二次元的に展開して磁場で固定するデバイスと、デバイスを搭載した生体分子分析装置、前記蛍光体の蛍光を測定するための手段を備えることを特徴とする生体分子分析装置を開示する。
【００１５】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
本実施例では、本発明の原理と検証について記載する。図１のように、一般に平行に配置した2枚の平面基板101に溶液102を封入した場合、上側の平面基板101を一定の速度vでx方向に可動させると基板表面近傍における流体は追随して同程度の流速v1（≒v）を持つが、下側の固定した平面基板101表面の溶液102は基板表面101に近づくにしたがって流速０に減少することが知られている。これは封入した溶液102と平面基板101の間に摩擦力が生じるためであり、濡れ性が高い平面基板101ほど流体の動きに影響を与える。したがって、図２のように濡れ性の高い平面基板201で溶液202の上下をできるだけ液の厚みhが薄くなるように挟みこむことで、溶液202のほとんどが基板表面201近傍に存在するようになり、もっとも流速が高い中央部の流速v2も抑えることができる。この状態で溶液中に磁気微粒子203を分散させた後、磁束密度Bの磁場204で一方の基板表面側に磁気微粒子203を引き付けると磁気微粒子203の移動によって流速が生じるが、横方向への流れが制限されるため磁場204方向に向けて垂直に移動するようになる。このとき磁気微粒子203は分散状態のまま基板面に膜のように均一に固定できることから基板上の蛍光色素に対する焦点合わせが容易にでき、磁気微粒子203が蛍光色素を抱き込んで励起光を遮蔽する効果も防ぐことができる。【００１７】
これらの効果を確認するため、図３のようにスライドガラス301上に、カバーガラス302を一辺を持ち上げた状態で配置したデバイスを作製した。２枚のガラスの隙間に磁気微粒子303を含む溶液304を注入することで観察するx座標の位置を変えることによって、0〜150μmに液の厚みを変えたものを１基板で観察できる。ただし、カバーガラス302は傾いており、1視野（430μm×330μm）内で左右に約3μmずつ厚みが異なるため、視野中心の液の厚みを液厚hと定めた。今回、直径300nm、16pMの常磁性磁気微粒子303を含む溶液304を2枚のガラスの隙間に注入し、磁場305で下方のスライドガラス301側に磁気微粒子303を引き付けた時のｈ＝40、60、80、100、120、140μmにおける粒子の形状を散乱光で観察した。画像から液厚ごとに輝点数、および輝点サイズとして平均輝点ピクセル数を取得した。【００１８】
図４に画像から得た実測輝点数を、与えた磁気微粒子303数から求めた理論輝点数で割り、液厚に対してプロットした。さらに、図５に平均輝点ピクセル数と液厚に対してプロットしたグラフを示した。その結果、h=40〜80μmまでは磁気微粒子303の輝点数は変わらなかったが、h=100μmを超えると、液厚ｈが増すにつれて粒子の実測輝点数/理論輝点数比が0.8以下に減少することが確認された。一方、磁気微粒子303径（平均輝点ピクセル数）は輝点数が減少に応じて増加することが確認された。これは液厚が増加するにつれて磁気微粒子303の凝集が進んだことを示している。さらに固定の様子も異なり、図6のようにｈ=40μmの粒子は細かく、密に固定されているのに対して、図7ではh=140μmでは大きい粒子を形成して疎に固定されていることが確認された。さらに、このとき粒子の頂点の焦点がぼやけ、z軸方向に2〜3μm程度の凝集体になっていることが確認された。h=100μm以下ではこのような焦点のずれは見られず、磁気微粒子303を密に薄い層に固定できることが確認された。
【実施例２】
【００１９】
実施例1の結果をもとに液厚を100μm以下に調整したデバイスによって生体分子計測する手順の一例を、図８を用いて説明する。デバイスのうち磁気微粒子を固定する支持基板801は26mm×76mm、厚み1．2mmのスライドガラス（松浪硝子工業）を利用した。カバー材802としては8mm×8mm、厚み0．15mmのカバーグラス（松浪硝子工業）を利用した。いずれも、バッファードフッ酸（HF：NH4F＝1：200）で1分間、あるいは１N  KOHで60分間洗浄を行い、蒸留水で接触角が10°以下であることを確認した。次に厚み0.05mmのポリイミドテープ（中興化成）を1mm幅にカットしたものを用意してカバー材802と同じサイズの正方形の枠になるように支持基板801に貼り付け、その上にカバー材802を配置した。このようにして上下をガラスで挟んだ7mm×7mm、高さ50μmのチャンバーを作製した。このときチャンバーは完全には密閉せず、溶液の入口と空気の出口を設けておくとよい。そうすることで入口付近に溶液を滴下するだけで、図８-（a）、（b）のように毛細管現象によりチャンバー内に磁気微粒子を含む溶液803が吸い込まれていき均一に広がっていく。そのため高い圧力をかけて送液する必要はなく、チャンバーを厳密に密閉する必要もない。ただし、入口付近からチャンバー外に溶液803が漏れ出ないように、シリコンチューブやシリコナイズチップなど表面が疎水性を有する送液管804を入口部分に差し込み溶液803を添加する方法が望ましい。出口側も同様に空気だけが吐出されるように疎水性を有する排出管805を配置するとよい。今回は外径1.0mm、内径0.5mmのシリコンチューブを利用した。溶液量はチャンバーの体積に合わせて調整する。例えば、今回の場合、チャンバー全面に溶液を満たすために3μｌ程度の溶液量にした。例えば、正方格子で300nmの磁気微粒子を支持基板801上に正方格子状に一層に敷き詰めた場合、1．1×107個/mm2の密度になる。したがって、300pMの磁気微粒子溶液803を3ul前記チャンバーに入れることで、一層分の磁気微粒子を与えることができる。また、溶液803導入時は磁気微粒子がチャンバー内に均一に分散するまでデバイスにかかる磁場806をオフにしておく必要がある。磁場806は永久磁石や電磁石のどちらも利用できるが、もっとも安価で簡便な方法は永久磁石を着脱する方法である。磁場806のオン/オフの切り替えは電磁石を使用したものが便利だが比較的構造が大きくなる。今回、永久磁石を用いた磁気微粒子固定を実施した。永久磁石は0.5テスラ（T）の磁束密度をもつφ20mm×10mmのネオジム磁石を利用した。チャンバーの真下にネオジム磁石を固定できるホルダを配置し、手動で磁石を出し入れすることで磁場806のオン/オフの切り替えができるようにした。【００２０】
次に試料調整方法に関して、図9を用いて説明する。検出したい生体分子が抗原901である場合、事前に抗体902付き磁気微粒子903で捕捉し、さらに抗体902付き蛍光色素904でラベルする。これらの反応はすべて常温下、反応用バッファー（トリスバッファ（ｐH8．0）、50ｍＭ ＮａＣｌ、0.1%  Tween20）中で行う。抗体902付き磁気微粒子903と抗原901の反応と蛍光標識抗体902と抗原901の反応はどちらが先でもよく、同時に行ってもよい。抗原901はあらゆる種類のものが使用できるが、抗体902は抗原901に対して特異的の高いものを選択する方がよい。例えば、今回は抗原901として前立腺がんの腫瘍マーカーであるPSA（前立腺特異抗原）を選択した。PSA抗体は磁気微粒子側に結合するものと、蛍光色素標識のものが必要である。抗体902はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体ならば同じものを使用してもよい。抗体902は抗原901の種類に合わせて適切なものを選択する。望ましくは磁気微粒子側にモノクローナル抗体、蛍光色素側にポリクローナル抗体を選択し、先にモノクローナル抗体付きの磁気微粒子903と抗原901を反応させ、次にポリクローナル抗体を反応させる方法がよい。これはポリクローナルを先に反応させると抗原上の結合サイトが塞がれてしまう可能性があるためである。磁気微粒子に抗体902を結合する場合、抗体902の活性を保ったまま結合できる二次抗体905付きの磁気微粒子を用意する。これらの磁気微粒子903は市販されており、容易に入手することができる。例えば、常磁性微粒子903であるアデムテック社のAnti-mouse IgG修飾アデムビーズ（φ300nm）を利用することができる。二次抗体905修飾磁気微粒子に対して約１０倍以上のPSA抗体を混合しインキュベートする。次に磁気微粒子903を磁場907で捕捉してから溶液を除去し清浄なバッファーで懸濁する。この操作を未反応の抗体の大方が除去できるまで繰り返す。磁気微粒子903としてストレプトアビジンの修飾磁気微粒子を使用することもできる。例えば、アデムテック社のストレプトアビジン修飾アデムビーズ（φ100ｎｍ、φ200ｎｍ、φ300ｎｍ）を利用することができる。この場合は、ビオチン化した抗体902を使用して、磁気微粒子903表面に抗体902を結合させる。【００２１】
蛍光色素は様々な種類のものが市販されている。例えば、FITC、Alexa（商標登録）、CY5などがよく知られている。しかし、本検討では少なくとも一分子の抗原901の検出を可能にするため、輝度が高く、消光時間の長い蛍光色素を利用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、数百分子の蛍光色素が一つの枝状の炭素鎖に結合したデンドリマー型蛍光色素や、蛍光ポリスチレンビーズ、量子ドットを使用することができる。【００２２】
本実施例では蛍光色素904として蛍光ポリスチレンビーズを用いた抗体902の蛍光標識方法について説明する。蛍光ポリスチレンビーズは、例えば、インビトロジェン社からFluoSphere  F8771（登録商標）が発売されており、利用できる。本ビーズは周りをストレプトアビジンでコートされており、ビオチン化抗体902と結合できる。抗体902付き蛍光ポリスチレンビーズと抗体902付き磁気微粒子で抗原901を挟んで捕捉する。反応の順序ははじめに、反応容器内に抗体902と磁気微粒子を入れ、よく撹拌しておく。磁気微粒子903を磁場907で集め、未反応の抗体902を含む上清を除去し、反応バッファーで懸濁しておく。次に、この溶液に検出したい抗原901の入った溶液を入れてから、よく混合して1時間インキュベートする。このとき、反応容器を上下に回転させるか、振とうして撹拌することで抗原901と抗体902の反応が早まる。混合する比率は、抗体902付き磁気微粒子903が抗原901に比べて過剰になるように混合する。具体的には、想定される抗原901量に対して100から10000倍量の抗体902付き磁気微粒子903を入れる。次いで、この反応液に蛍光色素904付き抗体902を入れて、さらに数分間インキュベートする。蛍光色素904付き抗体902も同様に抗原901量に対して過剰になるように100から10000倍量、場合によってはそれ以上になるように投入する。それぞれを過剰量入れることによって、抗原901との衝突頻度が上がり、抗原901の捕捉率と蛍光標識率が向上する。反応終了後、未反応の蛍光標識抗体を洗浄する。反応液量の5倍程度の洗浄バッファーで反応液を希釈した後、マイクロチューブのまま集磁用マグネットホルダに差し込んで、2分間静置する。磁気微粒子が壁面に集まったのを確認したら、吸い取らないように上清をすべて取り除き、再び同量の洗浄バッファーを入れ、磁気微粒子を懸濁し集磁する。この操作を約5〜７回繰り返し実施し、未反応の蛍光色素904付き抗体902を除去する。最後の洗浄バッファー除去後、デバイスに導入したい液量に濃縮して、全量をデバイスに注入する。注入時はデバイスにかかる磁場806をオフにしておき、デバイス内に均一に液が行き渡るようにする。すべての液が入ったのを確認してから磁場806をオンにする。磁場806をオンにしたまま、磁気微粒子が膜状に形成されたことを確認した。デバイスおよび落射型顕微鏡を含む生体分析装置の好ましい構成については実施例４で詳細に述べる。デバイスを自動式ステージ上に置き、図８-（c）のように上方の対物レンズ807より励起光を照射し、約500視野分の視野をスキャンすることで磁気微粒子903の抱き込みによるロスがほとんどない状態で蛍光輝点を観察することができた。
【実施例３】
【００２３】
本実施例では検出したい生体分子が核酸断片である場合の手順を図１０に示す。はじめに検出対象の試料核酸断片1001を磁気微粒子1002で捕捉し、さらに試料核酸断片1001に対して相補的な配列1003を持つ蛍光色素1004付き核酸断片1005でラベルする。これらはハイブリダイゼーションによる特異的な反応であり、反応用バッファー（ＰＢＳバッファー（ｐH７．４）、50ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌ、0.1%  Tween20）中で行った。核酸付き磁気微粒子1002と試料核酸断片1001、蛍光色素1004付き核酸断片1005と試料核酸断片1001の反応はどちらが先でもよく、同時に行ってもよい。核酸断片は一本鎖のDNAやRNAが使用できる。具体的な解析対象としてマイクロＲＮＡを例に取り、詳細を説明する。【００２４】
マイクロＲＮＡは20mer程度の一本鎖の核酸断片である。検出方法は、はじめに試料核酸断片1001となるマイクロRNAの３‘末端側にアダプタとなる核酸配列1003を結合する。例えば20merのポリＡ配列が利用できる。次にアダプタの相補配列断片1005を蛍光色素1004に結合させる。アダプタの相補配列断片1005がついた蛍光色素1004と試料核酸断片1001を混合し室温で１時間程インキュベートした。同様に試料核酸断片1001の相補配列断片1003を付けた磁気微粒子1002を作製しておき、先ほど蛍光色素1004と反応させた試料核酸断片1001と混合して、同様に室温で１時間程インキュベートした。【００２５】
本実施例では磁気微粒子1003にアデムテック社のストレプトアビジン修飾アデムビーズ（φ100nm）を用い、蛍光色素1004に量子ドットを用いた方法について説明する。量子ドットは直径数ナノ〜数十ナノの半導体微粒子である。従来の蛍光色素に比べて高寿命、高輝度で、粒径によって異なる波長の蛍光を発する。量子ドットは複数のメーカーから市販されており、様々な官能基で修飾されているものもある。任意の抗体を結合できる量子ドットとして、例えば、インビトロジェン社のQdot655  ストレプトアビジン（登録商標）が利用でき、ビオチン化した標識核酸断片を付けることができる。【００２６】
例えば、インビトロジェン社のストレプトアビジン修飾Qdot（商標登録）が利用できる。量子ドットと核酸断片との結合は混合して30分間以上インキュベートすればよく、反応後に５０kDaカットオフのスピンカラムで未反応の核酸断片を除去する。【００２７】
以上のように作製した捕捉配列片付き磁気微粒子と蛍光色素標識核酸断片と1〜100pMの濃度の調整したマイクロRNAを混合し、よく混合して６時間インキュベートした。このとき、反応容器を上下に回転させるか、振とうして撹拌することでハイブリダイゼーション反応が早まる。混合する比率は、磁気微粒子が目的の核酸断片に比べて過剰になるように混合する。具体的には、想定される試料分子数に対して１００から１００００倍量の磁気微粒子を入れた。【００２８】
以上のように処理した反応液を支持基板1006上に載せ、磁場1007で引き付けて実施例２と同様に観察した。その結果、各試料の総輝点数は反応させたマイクロRNA濃度に比例することが確認された。さらに、φ100nmの磁気微粒子を用いたことで、実施例２と同数の磁気微粒子を用いながら、約9倍密に固定することができたため、検出時間を約9倍向上させることができた。
【実施例４】
【００２９】
本実施例では、生体分子分析装置の好ましい構成の一例について図11を参照しながら説明する。本実施例の生体分子分析装置は、磁気微粒子を磁場で支持基板1101上に引き付けて保持するためのデバイスに加えて、支持基板1101に光を照射する手段と、解析対象の生体分子溶液を供給する手段と蛍光を測定する手段、支持基板を稼働させる手段が一体となっている。【００３０】
より具体的には、可動ステージ1102を載せた光学顕微鏡を用いた。可動ステージ1102上に磁石ホルダ1103を置き、さらにその上にデバイス1104を固定した。デバイスには送液管1105と排出管1106を接続しておく。送液管1105の材料には、シリコンチューブを使用した。生体試料溶液をデバイス1104内に入れてから磁場発生装置1107から磁場を発生させ、支持基板1103表面に磁気微粒子を引き付けて固定した。励起光源1108は、用いる蛍光体の種類によって適切なものを選択する。例えば、蛍光標識用の蛍光色素として、量子ドットを用いる場合には、光源1108に水銀ランプを用いた。また、５３２nm（ＹＡＧレーザ）も使用できる。励起光源1108から発する励起フィルタ1109と励起光をレンズ1110を通し、ダイクロイックミラー1111によって対物レンズ1112に導き、支持基板1101上に照射した。支持基体1107上の蛍光標識付分子から発せられる蛍光は、励起光と同軸光路を逆に進み、対物レンズ1112で集められた後ダイクロイックミラー1111を通過し、結像レンズ1113により２次元ＣＣＤカメラ1114の感光面上に結像される。励起光の散乱光は吸収フィルタ1115によって除去される。定量性を高めるためには観察する輝点数を増やす必要がある。それには可動ステージ1103を高速に動作させ、支持基板1101全面を短時間でスキャンすることによって輝点数を増やすことができる。上記のように、20倍の対物レンズ1112、送液ポンプ1116、励起光源1108及び蛍光検出ユニット、磁場発生装置1107、可動ステージ1103で組み上げた生体分子分析装置を用いることで、約3分で100視野（16mm2）の面積をスキャンすることができた。これは3分間で一層に敷き詰めた磁気微粒子を1.8×107個観察できる速さに相当する。
【符号の説明】
【００３１】
101  平面基板
102  溶液
103  磁気微粒子
104  磁場
201  平面基板
202  溶液
203  磁気微粒子
204  磁場
301  スライドガラス
302  カバーガラス
303  磁気微粒子
304  溶液
801  支持基板
802  カバー材
803  溶液
804  送液管
805  排出管
806  磁場
901  抗原
902  抗体
903  磁気微粒子
904  蛍光色素
905  二次抗体
906  平面基板
907  磁場
1001  試料核酸断片
1002  磁気微粒子
1003  試料の相補配列断片
1004  蛍光色素
1005  アダプタの相補配列断片
1006  支持基板
1007  磁場
1101  支持基板
1102  可動ステージ
1103  磁石ホルダ
1104  デバイス
1105  送液管
1106  排出管
1107  磁場発生装置
1108  励起光源
1109  励起フィルタ
1110  レンズ
1111  ダイクロイックミラー
1112  対物レンズ
1113  結像レンズ
1114  CCDカメラ
1115  吸収フィルタ
1116  送液ポンプ
【図１】
2014129292.tif 000003
【図２】
2014129292.tif 000004
【図３】
2014129292.tif 000005
【図４】
2014129292.tif 000006
【図５】
2014129292.tif 000007
【図６】
2014129292.tif 000008
【図７】
2014129292.tif 000009
【図８】
2014129292.tif 000010
【図９】
2014129292.tif 000011
【図１０】
2014129292.tif 000012
【図１１】
2014129292.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月22日(2016.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上下を２枚の親水性の高い平面基板で挟まれた溶液槽、磁力のオンオフ、あるいは磁力の強弱の切り替える機能を有し、前記生体分子分析デバイスの一方の平面基板上に、生体分子および蛍光標識と結合した磁気微粒子を固定可能な磁場発生手段、を有する生体分子分析デバイスと、
前記生体分子分析デバイス上に固定した磁気微粒子に結合した蛍光標識が発光する画像を取得する撮像手段と、
前記撮像手段で取得された画像から輝点数をカウントする手段を備え、
前記平面基板間の幅は100μm以下であり、
前記磁気微粒子は粒径0.02〜1μmの常磁性磁気微粒子である生体分子分析装置。
【請求項２】
前記生体分子分析用デバイスの平面基板の表面が蒸留水に対する接触角が30°以下であることを特徴とする請求項１記載の生体分子分析装置。
【請求項３】
前記生体分子分析用デバイスは完全には密封されておらず、入口と出口を有しており、
前記入口に配置された液体は、２枚の濡れ性の高い前記平面基板から得られる毛細管現象によって、溶液槽内に溶液を導入されることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項記載の生体分子分析装置。
【請求項４】
前記磁場発生装置として、電磁石、可動式の永久磁石、可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった電磁石、可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった永久磁石のうちいずれかを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の生体分子分析装置。
【請求項５】
溶液槽の導入口と排出口にそれぞれ接続された疎水性表面を有する送液管を有する送液手段を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の生体分子分析装置。
【請求項６】
前記生体分子が抗原分子であり、磁気微粒子と生体分子または蛍光標識の結合が抗原抗体反応によって実施されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか1項記載の生体分子分析装置。
【請求項７】
前記生体分子が核酸分子であり、磁気微粒子徒生体分子または蛍光標識の結合がハイブリダイゼーションによって実施されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか1項記載の生体分子分析装置。
【請求項８】
前記撮像手段と一体化された蛍光色素を励起する手段を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の生体分子分析装置。
【請求項９】
検出器側の平面基板として、ガラス、あるいは親水化処理を行った光学用ポリマーを使用することを特徴とした請求項８記載の生体分子分析装置。
【請求項１０】
前記蛍光色素を励起して、蛍光を検出する手段として、落射型光学顕微鏡を用いることを特徴とする請求項８または請求項９に記載の生体分子分析装置。
【国際調査報告】
2014129292.tif 000014
2014129292.tif 000015
2014129292.tif 000016
2014129292.tif 000017