(57)【要約】  本発明は、in vivoでのNrf2活性化を反映する代謝関連バイオマーカーとして、FGF21を提供する。本発明は、Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法であって、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤の投与に対する陽性の応答を示す、前記方法などを提供する。本発明により、in vivoでのNrf2活性化を反映する代謝関連バイオマーカーが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤の投与に対する陽性の応答を示す、前記方法。
【請求項２】
Nrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に対する陽性の応答を示す、前記方法。
【請求項３】
対象におけるNrf2活性化剤による治療に対する臨床応答を予測する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に感受性および／または反応性が高いことを示す、前記方法。
【請求項４】
Nrf2活性化剤による治療が有効な対象を選択する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象であることを示す、前記方法。
【請求項５】
対象におけるNrf2活性化剤による治療においてNrf2活性化剤の最適な投与量を選択する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加を指標にNrf2活性化剤の最適な投与量を決定する、前記方法。
【請求項６】
前記対象が、Nrf2活性化剤の投与が継続的に行われていた対象である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が健常な対象である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患に罹患している対象である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
FGF21レベルの増加が、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記FGF21レベルが、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記FGF21レベルが、FGF21タンパク質量である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定を免疫測定法により行う、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が体液である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記体液が、全血、血清および血漿からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
Nrf2活性化活性を指標として、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
1）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、および
2）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、
を含み、
Nrf2活性として、FGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
Nrf2活性として、肝細胞におけるFGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
Nrf2活性化活性を指標として、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
1）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
2）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
3）前記2）の工程で選択された試験化合物について、FGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記1）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記3）の工程において、肝細胞におけるFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患である、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Nrf2活性化の代謝関連バイオマーカーおよびその使用方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病、脂質異常症および肥満などの代謝性疾患に対する新規メカニズムに基づく、より効率的な治療法への要求が高まっている。【０００３】
最近、FGF21（fibroblast growth factor 21）が、代謝性疾患のための新しい治療薬の開発標的として注目されている。FGF21は、FGFファミリー分子の一つとして発見された（特許文献1、非特許文献1）。その後、グルコースおよび脂質代謝を調節する機能を有することが見出され、FGF21を投与することを含む糖尿病および肥満を治療する方法が報告されている（特許文献2）。FGF21の投与は、糖尿病モデル動物において、高血糖、インスリン抵抗性、脂質異常症を改善し、体重増加を弱めることが報告されており、現在、糖尿病等の代謝性疾患の治療薬としてFGF21関連物質の開発が進められている。【０００４】
血中FGF21レベルを増加させる方法としては、直接的なFGF21タンパク質の注射やFGF21遺伝子の導入が報告されており、開発が進められている物質もFGF21タンパク質の誘導体や修飾体が中心である。間接的にFGF21産生を促進するメカニズムとしては、PPARα活性化やPPARγ活性化が報告されている。非特許文献2および3には、PPARα活性化、PPARβ活性化等により、FGF21の産生が促進されることが記載されている。特許文献3には、FGF21の産生促進作用を有する化合物としてPPARα活性化剤が記載されている。【０００５】
また、FGF21は肝臓、白色脂肪組織、膵臓において発現され、血漿中に分泌される。特許文献4には、FGF21をサーチュインバイオマーカーとして利用することが記載されている。【０００６】
Nrf2（nuclear factor E2-related factor 2）は、Cap’n’collar（CNC）ファミリーに属する塩基性領域−ロイシンジッパー型転写因子である。Nrf2は酸化的ストレスからの防御において重要な役割を果たし、細胞保護遺伝子を協調的に誘導する。Nrf2は、非ストレス条件下において、Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）によって、ユビキチン化およびプロテアソーム媒介性分解を介して負に調節される。Keap1が酸化的刺激および求電子的刺激に曝露された場合、Nrf2はプロテアソーム媒介性分解から回避される。その後、Nrf2は核に移行し、蓄積し、小Mafタンパク質（sMaf）とのヘテロ二量体を形成し、抗酸化遺伝子および解毒遺伝子中の抗酸化応答エレメント（ARE）に結合し、それによってそれらの発現を誘導する。このストレス応答遺伝子調節系は、「Keap1−Nrf2系」と呼ばれる。【０００７】
重要なことに、Keap1−Nrf2系は、抗酸化機能および解毒機能に加えて代謝恒常性の調節にも関与している。Nrf2ノックアウト（Nrf2−／−）マウスは、高脂肪食（HFD）誘導性肥満モデルにおける体重増加に耐性を有し、インスリン抵抗性改善を示すと報告（非特許文献4）がある一方で、ストレプトゾトシン（STZ）誘導性糖尿病モデルマウスおよびob／ob肥満モデルマウスにおいて耐糖能を弱め、高血糖症を悪化させたと報告がある（非特許文献5および6）。Nrf2はまた、癌細胞におけるグルコースおよびグルタミン代謝にも関与する。
代謝性疾患に対するNrf2活性化剤の効果も報告されている。Nrf2活性化能をもつとされている化合物sulforaphaneは、STZ誘発１型糖尿病マウスのβ細胞障害を保護したとの報告がある（非特許文献7）。Nrf2活性化能をもつとされている化合物lithospermic acid B(LAB)は、2型糖尿病モデルラットのβ細胞障害を保護したとの報告がある（非特許文献8）。抗がん剤として臨床試験が行われている住血吸虫駆除薬oltiprazもNrf2活性化能を有し、HFD誘導性インスリン抵抗性および肥満を弱めると報告されている（非特許文献9）。米国において糖尿病性腎症の治療薬として臨床試験が行われていたCDDO-Me（2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid methyl ester）は、Nrf2活性化能を有するとされており（非特許文献10）、HFD誘導性肥満モデルおよび糖尿病db/dbモデルマウスにおいて血中グルコースレベルおよび血漿脂質レベルを低下させたとの報告がある（非特許文献11）。さらにCDDO−Me誘導体であるCDDO−Im（1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oyl]imidazole）の連続投与は、エネルギー消費を増加させることによって高脂肪食（HFD）誘導性肥満を防止すると報告がある（非特許文献12）。【０００８】
これらの研究は、解毒および細胞保護に加えて代謝恒常性の調節因子としてのNrf2の重要性を示し、Nrf2が糖尿病などの代謝性疾患を改善するための薬理学的標的の新規候補であると提唱している。【０００９】
また、Nrf2とFGF21の関連に関して、Nrf2ノックアウトマウスやKeap1ノックダウンマウスを用いることによって、Nrf2がFGF21発現を負に調節していることが報告されている（非特許文献13〜16）が、Nrf2がFGF21発現を正に調節することの報告はない。【００１０】
このように、Nrf2による代謝調節の正確な機構は未だ完全には解明されておらず、代謝関連のNrf2標的遺伝子も同定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO01/036640
【特許文献２】WO03/011213
【特許文献３】WO2011/037223
【特許文献４】WO2008/115518
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophyisica Acta, 1492, 203-206
【非特許文献２】Galman et al. (2008) Cell Metabolism, 8, 169-174
【非特許文献３】Muise et al. (2008) Molecular Pharmacology, 74, 403-412
【非特許文献４】Meher et al. (2012) Free Radical Biology and Medicine, 52, 1708-1715
【非特許文献５】Aleksunes et al. (2010) The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 333, 140-151
【非特許文献６】Xue et al. (2013) Diabetes, 62, 845-854
【非特許文献７】Song et al. (2009) Toxicology and Applied Pharmacology, 235, 57-67
【非特許文献８】Lee et al. (2011) Toxicology and Applied Pharmacology, 252, 47-54
【非特許文献９】Yu et al. (2011) Diabetologia, 54, 922-934
【非特許文献１０】Pergola et al. (2011) The New England Journal of Medicine, 365, 327-336
【非特許文献１１】Saha et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285, 40581-40592
【非特許文献１２】Shin et al. (2009) European Journal of Pharmacology, 620, 138-144
【非特許文献１３】Chartoumpekis et al. (2011) Diabetes, 60, 2465-2473
【非特許文献１４】Zhang et al. (2010) Toxicology and Applied Pharmacology, 245, 326-334
【非特許文献１５】Lu et al. (2011) Toxicology and Applied Pharmacology, 256, 122-135
【非特許文献１６】Zhang et al. (2012) Toxicology and Applied Pharmacology, 264, 305-314
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
薬物開発プロセスにおいて、薬物の新規候補の有効性および安全性を予測するためには、バイオマーカーが必要である。Nrf2活性化においては、代謝関連の標的遺伝子が同定されておらず、代謝性疾患の改善に直接関連し、血液または尿試料中で低侵襲的に簡便に測定される代謝関連マーカーはこれまでは知られていない。このような状況の下、Nrf2活性化剤の開発において、in vivoでのNrf2活性化を反映する代謝関連バイオマーカーが求められる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、糖尿病モデルマウスにおけるNrf2活性化の役割を示し、FGF21調節におけるその関与を特徴付けた。Keap1の遺伝子ノックダウンによるNrf2活性化は、糖尿病db／dbマウスおよび高カロリー誘導性肥満モデルマウスにおいて血漿FGF21発現レベルおよび肝臓Fgf21遺伝子発現レベルを上昇させた。Nrf2活性化剤であるCDDO−Imの投与もまた、db／dbマウスにおいて血漿FGF21発現レベルおよび肝臓Fgf21遺伝子発現レベルを上昇させたが、Nrf2遺伝子ノックアウトdb／dbマウスにおいては上昇させなかった。【００１５】
本発明者らは、Nrf2が糖尿病マウスにおいてFGF21を正に調節し、FGF21が、Keap1−Nrf2系による代謝調節を媒介しているバイオマーカーであることを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち、本発明は、以下に示す、Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法、Nrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視する方法、Nrf2活性化剤による治療に対する応答を予測する方法、Nrf2活性化剤の最適な投与量を選択する方法、糖尿病の予防または治療剤のスクリーニング方法などを提供する。【００１７】
［1］  Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤の投与に対する陽性の応答を示す、前記方法。
［2］  Nrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に対する陽性の応答を示す、前記方法。
［3］  対象におけるNrf2活性化剤による治療に対する臨床応答を予測する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に感受性および／または反応性が高いことを示す、前記方法。
［4］  Nrf2活性化剤による治療が有効な対象を選択する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象であることを示す、前記方法。
［5］  対象におけるNrf2活性化剤による治療においてNrf2活性化剤の最適な投与量を選択する方法であって、
Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含み、
FGF21レベルの増加を指標にNrf2活性化剤の最適な投与量を決定する、前記方法。
［6］  前記対象が、Nrf2活性化剤の投与が継続的に行われていた対象である、上記［1］または［2］に記載の方法。
［7］  前記対象が健常な対象である、上記［1］に記載の方法。
［8］  前記対象が、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患に罹患している対象である、上記［1］〜［6］のいずれか1項に記載の方法。
［9］  FGF21レベルの増加が、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加である、上記［1］〜［8］のいずれか1項に記載の方法。
［10］  前記FGF21レベルが、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である、上記［1］〜［9］のいずれか1項に記載の方法。
［11］  前記FGF21レベルが、FGF21タンパク質量である、上記［10］に記載の方法。
［12］  前記測定を免疫測定法により行う、上記［10］または［11］に記載の方法。
［13］  前記生体試料が体液である、上記［1］〜［12］のいずれか1項に記載の方法。
［14］  前記体液が、全血、血清および血漿からなる群から選択される、上記［13］に記載の方法。
［15］  Nrf2活性化活性を指標として、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
1）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、および
2）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、
を含み、
Nrf2活性として、FGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする方法。
［16］  Nrf2活性として、肝細胞におけるFGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定することを特徴とする、上記［15］に記載の方法。
［17］  Nrf2活性化活性を指標として、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法であって、
1）(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii) 試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
2）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および
3）前記2）の工程で選択された試験化合物について、FGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［18］  前記1）の工程において、Nrf2活性をNrf2安定化を指標として測定することを特徴とする、上記［17］に記載の方法。
［19］  前記3）の工程において、肝細胞におけるFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することを特徴とする、上記［17］または［18］に記載の方法。
［20］  前記疾患が、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患である、上記［15］〜［19］のいずれか1項に記載の方法。
［21］  前記FGF21の発現レベルを、FGF21の転写促進活性を指標に測定する、上記［15］〜［20］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、in vivoでのNrf2活性化による代謝調節を媒介しているバイオマーカーとしてFGF21が提供される。
本発明のいくつかの態様によれば、前記バイオマーカーの使用方法が提供される。具体的には、前記バイオマーカーを用いることにより、Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視すること；Nrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視すること；対象におけるNrf2活性化剤による治療に対する臨床応答を予測すること；Nrf2活性化剤による治療が有効な対象を選択すること；および対象におけるNrf2活性化剤による治療においてNrf2活性化剤の最適な投与量を選択すること；などが可能になる。
本発明の別のいくつかの態様によれば、Nrf2活性をFGF21の発現レベルの上昇を指標に測定することで、あるいは、Nrf2活性化活性を有することが見出された化合物についてFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することで、新たな作用機序をもつNrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Nrf2活性化がdb／dbマウスにおいてFGF21を増加させることを示す図である。Keap1遺伝子ノックダウン（Keap1flox／−）変異マウスおよび同腹子対照（Keap1flox／＋）マウスにおける血漿FGF21濃度（a）。n＝11〜17匹のオスおよびメス。Keap1遺伝子ノックダウン（Keap1flox／−）変異マウスの肝臓におけるFgf21  mRNA発現レベル（b）。n＝3〜17匹のオスおよびメス。ビヒクルまたはNrf2活性化剤CDDO−Imの投与後の血漿FGF21濃度（c）。n＝6〜7匹のオス。ビヒクルまたはCDDO−Im処置マウスの肝臓におけるFgf21  mRNA発現レベル（d）。n＝3〜7匹のオス。＊P＜0．05、＊＊P＜0．01、＊＊＊P＜0．001対Nrf2＋／＋：：Keap1flox／＋マウス。
【図２】CDDO−Imの投与がFGF21を誘導したことを示す図である。db／dbマウスにおけるCDDO−Imの単回投与後の肝臓Nqo1発現レベル（a）および血漿FGF21レベル（b）。n＝3〜5匹のオス。
【図３】Nrf2が食餌誘導性肥満モデルマウスにおいてFGF21を増加させることを示す図である。Keap1flox／−変異マウスにおける血漿FGF21レベル（aおよびb）ならびに肝臓Fgf21  mRNA発現レベル（cおよびd）。マウスに8週間にわたって高カロリー食（HCD）または標準食（SD）を給餌した。n＝4〜6匹のオス。＊P＜0．05対Nrf2＋／＋：：Keap1flox／＋マウス。
【図４】Nrf2が血漿トリアシルグリセロールレベルおよび非エステル化脂肪酸レベルを低下させたことを示す図である。Keap1flox／−変異マウスおよび同腹子Keap1flox／＋マウスにおける血漿トリアシルグリセロール（a）および非エステル化脂肪酸（b）濃度、ならびに血糖値(c)。n＝11〜13匹のオスおよびメス。＊P＜0．05、＊＊＊P＜0．001対Keap1flox／＋マウス。
【図５】CDDO−Imの投与およびNrf2の過剰発現がFGF21プロモーターを活性化したことを示す図である。Fgf21レポーターおよびmock、またはFgf21レポーターおよびNrf2を導入したHepa1細胞における、vehicleまたはCDDO-Iｍの添加後のレポーター活性レベル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
1. Nrf2活性化剤
「Nrf2」は、nuclear factor erythroid 2-related factor 2といい、CNC (Cap’n’collar)転写因子ファミリーに属する転写因子である。Nrf2は、非ストレス条件下では、Keap1により細胞質でユビキチン化され、プロテアソーム分解を受けて不活化されている。一方、ストレス条件下では、Keap1が修飾を受けることによりNrf2はプロテアソーム分解を免れ、これによりNrf2は細胞質から核内に移行してMafタンパク質とヘテロ二量体を形成することでARE(Antioxidant response element)配列あるいはEpRE(Electrophil response element)配列に結合し、標的遺伝子を活性化する。Nrf2の標的遺伝子は、例えば、抗酸化遺伝子（Hmox1、Gcl、Txrnd1など）や解毒代謝遺伝子（Nqo1、Gsts、Ugt1a6など）を含む細胞保護作用を有する遺伝子群の遺伝子である。
【００２１】
本発明者らは、in vivoでのNrf2活性化を反映する代謝関連バイオマーカーとしてFGF21を見出した。FGF21は、グルコースおよび脂質代謝の鍵となるメディエーターである。Nrf2活性化により肝臓等でのFGF21の発現が上昇する。肝臓等で発現されたFGF21は、血漿中に分泌される。
【００２２】
本発明において、Nrf2は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどが挙げられる。ヒトNrf2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_006164 (gene)（配列番号:1）およびAccession No. NP_006155 (protein) （配列番号:2）としてGenBankに登録されている。マウスNrf2の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_010902 (gene)（配列番号:3）およびAccession No. NP_035032 (protein)（配列番号:4）としてGenBankに登録されている。
【００２３】
本明細書中では、Nrf2は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Nrf2のアミノ酸配列中の1〜複数個(例えば、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個(1〜数個)、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
【００２４】
実質的に同質の活性としては、例えば、Nrf2標的遺伝子（具体的には、Cpt1b、PGC1α、Nr4a2、FGF21等）の転写制御（促進または抑制）活性、ARE結合活性等が挙げられる。Nrf2標的遺伝子の転写制御活性として標的遺伝子の発現レベル変動（具体的には、タンパク質量の変動、mRNA量の変動等）を指標とする活性も含まれ、Nrf2活性として挙げられる。例えば、Nrf2標的遺伝子の発現レベル変動として、Cpt1bの発現レベル上昇、PGC1αの発現レベル上昇、Nr4a2の発現レベルの低下、FGF21の発現レベルの上昇等が挙げられる。Nrf2標的遺伝子の転写制御または発現レベルの変動は直接的な作用でも間接的な作用でもよい。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、ARE結合活性、Nrf2標的遺伝子の転写制御活性等が同等（例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００２５】
なお、本明細書中、「Nrf2」は一般的にNrf2タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、Nrf2遺伝子のことを意味する場合もある。
【００２６】
本発明で用いられる「Nrf2活性化剤」は、Nrf2活性を活性化する物質をいう。「Nrf2活性」は、例えば、上記したNrf2標的遺伝子の転写制御活性、Nrf2のARE結合活性等が挙げられる。かかる物質としては、低分子化合物もしくは高分子化合物のほか、siRNA、shRNA、アンチセンスポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、酵素などを用いることができる。
【００２７】
ここで、「低分子化合物」とは、分子量10,000以下(好ましくは分子量5,000以下、より好ましくは分子量2,000以下、特に好ましくは分子量700以下)の有機または無機物質を意味する。「高分子化合物」とは、分子量10,000超(好ましくは分子量50,000以上、より好ましくは分子量100,000以上)の有機物質を意味する。
【００２８】
「Nrf2活性化剤」は、Nrf2活性の少なくとも1つを活性化する活性を有する物質をいう。Nrf2活性の「活性化」は、Nrf2活性を上方調節することを意味し、例えば、(1)Nrf2の発現を促進すること、(2)Nrf2の細胞質から核への移行を促進すること、(3)Nrf2のAREへの結合を促進すること、(4) Nrf2の核から細胞質への移行を阻害することなどによりもたらすことができる。
【００２９】
「Nrf2の発現を促進する」とは、Nrf2遺伝子の発現を促進することであり、Nrf2遺伝子からタンパク質が生成されるまでの一連の事象（例えば、転写(mRNAの生成)、翻訳(タンパク質の生成)を含む）のうちのいずれかの事象を促進することによって、当該タンパク質の生成を促進することを意味する。
【００３０】
「Nrf2の細胞質から核への移行を促進する」とは、Nrf2の分解を調節することで核への移行を促進すること、Nrf2のリン酸化状態を変化させることで核への移行を促進すること、などによりもたらすことができる。生体内ではNrf2活性は、主に分解により調節されている。従って、Nrf2の分解を阻害し、Nrf2を安定化することは最も好適なNrf2活性化の方法である。Nrf2の分解を阻害し、Nrf2の細胞質から核への移行を促進する方法としては、Keap1のS-アルキル化が知られている。Keap1のCys残基がS-アルキル化されると、Keap1の立体構造が変化し、Keap1に結合したNrf2が分解されることなく留まり続けることでKeap1がNrf2により飽和される（"Hinge and Latch"モデル）。これにより新たなNrf2がKeap1に捕捉・分解されることなく蓄積し核内に移行できるようになる。Keap1のCys151のS-アルキル化によるNrf2活性化剤の例としてbardoxolone誘導体（CDDO誘導体）などが知られている。リン酸化状態を変化させる方法としては、Nrf2をリン酸化するGSK-3β、Fynなどのキナーゼの活性を調節することがNrf2の核内への移行を促進する、ということが知られている。たとえば、GSK-3β阻害剤（SB216763）はKeap1非依存的にNrf2の核内移行を促進する化合物として知られている。
【００３１】
「Nrf2のAREへの結合を促進する」とは、核内に移行したNrf2がMafとヘテロ二量体を形成するのを促進して該Nrf2がARE配列に結合するのを促進すること、などを意味する。
【００３２】
「Nrf2の核から細胞質への移行を阻害する」とは、核内に移行したNrf2が細胞質へ戻ることを阻害することで、Nrf2が核内で転写制御活性を発揮し続けることを促進すること、などを意味する。
【００３３】
Nrf2活性は、公知の方法、あるいはそれに準ずる方法にて測定することができる。
【００３４】
例えば、Nrf2活性のうち転写制御（促進または抑制）活性は、Nrf2標的遺伝子の発現レベルの変動（上昇または低下）を見ることにより、測定することができる。また、Nrf2の標的遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色遺伝子）を連結し、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することもできる(例えば、Mol. Cancer Cell Vol.6(1) pp.154-162 (2007)など)。あるいは、Nrf2活性をNrf2タンパク質の安定化（Nrf2の分解の抑制）を指標として捉える事も可能であり、例えば、Nrf2とレポーター遺伝子の融合タンパク質を発現させ、そのレポーター遺伝子の活性を見ることにより、測定することができる(例えば、Genes Cells. Vol.16(4) pp.406-415 (2011)など)。
【００３５】
あるいは、Nrf2活性のうちNrf2のARE結合活性は、ChIPアッセイなどによりNrf2のAREへの結合を見ることにより測定することができる。ChIPアッセイによる測定は、公知の方法またはそれに準ずる方法により行うことができる（例えば、Cell Vol.103 pp843-852 (2000)など）。また、BiacoreまたはELISAなどによりNrf2-Mafヘテロ二量体のAREへの結合を評価するアッセイ系により、測定することができる。あるいは、等温滴定型熱量測定（ITC）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（SPA）、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）、蛍光偏光（FP）または酵素断片コンプリメンテーション（EFC）等を用いた結合アッセイによって、Nrf2のARE結合活性を測定することができる。または、Nrf2-Mafヘテロ二量体形成能をNrf2のARE結合活性の指標として測定することができ、上記のARE結合評価方法と同様な方法で測定することができる。
【００３６】
Nrf2活性化剤の例として、CDD0誘導体が挙げられる。CDD0誘導体は、例えば、WO99／65478、WO2004／064723、米国特許第6，326，507号公報、米国特許第6，974，801号公報、日本特許4541548号公報に記載の化合物が挙げられる。本発明のいくつかの態様では、CDD0誘導体は、WO99／65478に記載の下記式(I)：
【化１】
2014192793.tif 000002
（式中、
AまたはBは二重結合であって、Aが二重結合である場合には、C11 は有機あるいは無機の置換部分＝Xを有し、またBが二重結合である場合には、C12 は有機あるいは無機の置換部分＝Xを有し、
R1は1から10により表される6員環のいずれかの位置で置換されている有機あるいは無機の部分であり、
R2（R2基は式（I）で表される構造のいずれかの位置で置換されている）及びR3 は水素または有機あるいは無機部分であり、また
nは0から100の数である）の構造を有するものである。「有機部分」及び「無機部分」は、WO99／65478の5頁15行〜7頁13行に記載の通りである。より具体的には、「有機部分」は、アルキル、アルキルアミノ、アルコキシ、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アルキルチオ、及びアルキルカルボキシル等の炭素をベースとする官能基を含む。また、「無機部分」は、水素、ハロ、アミノ、ニトロ、チオール、及びヒドロキシル等の非炭素をベースとする基または要素を含む。R1は、例えば、電子吸引基である。「電子吸引基」は、本技術分野で公知であり、水素よりも電子吸引性が大きい基を指す。種々の電子吸引基が公知であり、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード基）、ニトロ、シアノ、−NR3+、−SR2+、−NH3+、−SO2R、−SO2Ar、−COOH、−OAr、−COOR、−OR、−COR、−SH、−SR、−OH、−Ar及び−CH＝CR2を含む（式中、Arはアリールであり、Rは任意の適当な有機あるいは無機部分を表す）。式（I）の好ましい実施の形態としては、Bは二重結合であり、XはOである。
【００３７】
本発明のさらに好ましい態様のCDD0誘導体は、下記式：
【化２】
2014192793.tif 000003
（式中、
R1は、−CN、−COOHまたは−COOR（ここで、Rは、アルキルである。）であり、
R2は、メチルであり、及び
R3は、−OH、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノまたは−NRaRb（ここで、Raは、水素またはアルキルであり、Rbは、アルキルまたはフェニルである。）である。）で表される化合物である。ここで、「アルキル」、「アルコキシ」、「アミノ」等は、WO99／65478の5頁29行〜7頁13行に記載の通りである。より好ましいCDD0誘導体は、上記式において、R1は−CNであり、R2はメチルであり、及びR3は、−OHである化合物である。別のより好ましいCDD0誘導体は、上記式において、R1は−CNであり、R2はメチルであり、及びR3は−OCH3である化合物である。
【００３８】
本発明の別のさらに好ましい態様のCDD0誘導体は、WO2004／064723に記載の下記式：
【化３】
2014192793.tif 000004
（式中、
Rは、置換または未置換のカルボニルイミダゾール、CN、CO−D−Glu（OAc）4、CONH2、CONHNH2、
【化４】
2014192793.tif 000005
である。）の構造を有するものである。
【００３９】
代表的な化合物としては、CDD0-Me（2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid methyl ester）、CDD0-Im（1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oyl]imidazole）である。
【００４０】
これらのCDD0誘導体は、例えば、WO99／65478の15頁1行〜16頁15行に記載の方法、WO2004／064723の22頁15行〜24頁10行に記載の方法、文献(T.Hondaら、Bioorganic & medical Chemistry Letters、Vol.12、pp.1027-1030 (2002))の1027頁右カラム19行〜1028頁右カラム29行に記載の方法、またはそれらに準ずる方法により合成することができる。
【００４１】
本発明に用いるNrf2活性化剤は、FGF21レベルを増加させる活性を有するものであることがより好ましい。例えば、肝臓または肝細胞においてFGF21の発現レベル(mRNA量)を増加させる活性を有するNrf2活性化剤、および／または体液中のFGF21タンパク質量を増加させる活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。FGF21レベルを増加させる活性は、後述する実施例1-2または実施例5-2に記載の方法等で確認することができる。
また、本発明に用いるNrf2活性化剤は、FGF21の転写促進活性を有するものであることが好ましい。例えば、肝細胞を用いたin vitroプロモーターアッセイにおいてFGF21の転写促進活性を有するNrf2活性化剤が挙げられる。FGF21の転写促進活性は、後述する実施例6に記載の方法のような、FGF21プロモーター領域を用いたレポーターアッセイ等で確認することができる。
【００４２】
これらのNrf2活性化剤は、後述のスクリーニング方法により得たものでもよい。
【００４３】
2. バイオマーカーおよびその使用方法
本発明では、以下に説明するように、FGF21を、in vivoでのNrf2活性化による代謝調節を媒介しているバイオマーカーとして利用する。
ここで、「バイオマーカー」は、例えば、治療介入に反応可能な患者の正常及び／又は病的状態の指示体を意味する。バイオマーカーの例には、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質-ベースの分子マーカーが含まれ、生体試料中の発現又は存在性は、標準的な方法(又はここに開示の方法)により検出可能であり、例えば、Nrf2活性化剤での治療に対する糖尿病患者の応答性を予測することができる。本発明により考慮されるこのようなバイオマーカーには、限定されるものではないが、FGF21が含まれる。いくつかの実施態様において、バイオマーカーは検査用試料には対照又は参照試料とは異なる特定の量又はレベルで存在する。他の実施態様において、このようなバイオマーカーの発現性は、対照試料で観察されるよりも、より高く測定される可能性がある。用語「マーカー」又は「バイオマーカー」は、ここでは交換可能に使用される。ここで使用される場合、用語「予測」は、予測する方法を意味する趣意において、Nrf2活性化剤での治療に対して、反応していると思われる患者を選択する方法を実施可能にするためにある。
【００４４】
「薬力学的バイオマーカー」は、必要とする対象にNrf2活性化剤を投与する前、投与中、および／または投与後に検出可能なバイオマーカーを意味する。薬力学的バイオマーカーは、投与及びレジメンを決定し、対象のサブグループ、又は治療剤に対する応答性である表現型を同定し、又は主要なNrf2活性化剤を選択及び開発する助けとなる、臨床治験又は非臨床治験アッセイの基本を提供することができる。さらに、薬理学的バイオマーカーは、Nrf2活性化剤を用いた治療をモニターするのに使用することができる。
【００４５】
2.1. Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法、およびNrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視する方法
本発明のいくつかの態様は、Nrf2活性化剤を投与された対象の応答を監視する方法、またはその監視を補助する方法（以下、「本発明の投与対象の応答監視方法」という）を提供する。本発明の投与対象の応答監視方法は、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含む。そして、FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤の投与に対する陽性の応答を示す。
【００４６】
本発明の別のいくつかの態様は、Nrf2活性化剤で治療された対象の応答を監視する方法、またはその監視を補助する方法（以下、「本発明の治療対象の応答監視方法」という）を提供する。本発明の治療対象の応答監視方法は、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含む。そして、FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に対する陽性の応答を示す。
【００４７】
ここで、「治療」には、Nrf2および／またはFGF21関連疾患を治したり癒したりすることに加えて、Nrf2および／またはFGF21関連疾患を予防すること、または、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の進行を防止することも含まれる。また、「応答」、または「臨床応答」とは、Nrf2活性化剤の投与または治療に対する対象の状態の変化、例えば、FGF21等の発現レベルの変化（具体的には、FGF21タンパク質量の変化、FGF21 mRNA量の変化等）、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の症候、またはその症候の根源である病因の緩和または悪化である。
【００４８】
本発明において、FGF21は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどを用いることができる。ヒトFGF21の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_019113(gene)（配列番号:5）およびAccession No. NP_061986(protein)（配列番号:6）としてGenBankに登録されている。マウスFGF21の遺伝子およびアミノ酸配列は、それぞれ、Accession No. NM_020013(gene)（配列番号:7）およびAccession No. NP_064397(protein)（配列番号:8）としてGenBankに登録されている。
【００４９】
本明細書中では、FGF21は、それらと実質的に同質の活性を有する限り、その変異体をも包含する意味で用いられる。該変異体としては、例えば、上記Nrf2のアミノ酸配列中の1〜複数個(例えば、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個(1〜数個)、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、または1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
【００５０】
実質的に同質の活性としては、例えば、FGF21受容体結合活性、β-Klotho結合活性等が挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同等であることを示す。したがって、FGF21受容体結合活性、β-Klotho結合活性等が同等（例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。FGF21受容体結合活性、β-Klotho結合活性等は、文献（Yie J et al. (2009) FEBS letters, 583, 19-24）や文献（Yie J et al. (2012) Chem Biol Drug Des, 79, 398-410）に記載の方法に従って測定することができる。
【００５１】
なお、本明細書中、「FGF21」は一般的にFGF21タンパク質のことを意味するが、その文脈に応じて、FGF21遺伝子のことを意味する場合もある。
【００５２】
Nrf2活性化剤の「投与」は、Nrf2活性化剤を任意の経路で対象に与えることを意味し、具体的には、経口投与であってもよく、あるいは、非経口投与であってもよい。投与経路は、Nrf2活性化剤の種類、投与量、投与対象などに応じて適宜選択することができる。
【００５３】
経口投与のためのNrf2活性化剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。
【００５４】
非経口投与のためのNrf2活性化剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００５５】
Nrf2活性化剤の投与は、医療現場で行われている一般的な方法で、他の薬物もしくは薬剤との併用投与であってもよい。併用投与に用いる他の薬物もしくは薬剤とは、特にNrf2および／またはFGF21関連疾患の予防・進行遅延・治療における使用、中でも糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害、糖尿病性腎症もしくはこれらに起因ないし関連する各種疾患からなる群から選択される少なくとも１つの疾患において使用するものである。
【００５６】
例えば、インスリン抵抗性改善薬・糖尿病薬としては、１）ＰＰＡＲγ作動薬（具体的には、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン等）、２）ビグアナイド剤（具体的には、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等）、３）スルホニル尿素剤（具体的には、トルブタミド、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピジド、グリメピリド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド等）、４）速効型インスリン分泌促進剤（具体的には、ナテグリニド、ミチグリニド、レパグリニド等）５）αグルコシダーゼ阻害剤（具体的には、アカルボース、ボグリボース、ミグリトール、カミグリボース、アジポシン、エミグリテート、プラジミシン−Ｑ、サルボスタチン等）、６）インスリンまたはインスリン誘導体（具体的には、インスリン亜鉛懸濁液、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、レギュラーインスリン、ＮＰＨインスリン、インスリングラルギン、インスリンデテミル、混合型インスリン等）、７）ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１作動薬（具体的には、エキセナチド、リラグルチド、リクシセナチド、タスポグルチド等）、８）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（具体的には、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、テネリグリプチン、ＮＶＰ−ＤＰＰ−７２８等）、９）α２拮抗薬（具体的には、ミダグリゾール、イサグリドール、デリグリドール、イダゾキサン、エファロキサン等）、１０）ＳＧＬＴ２阻害剤等が挙げられる。また、上記の二成分以上を含む配合薬（具体的には、ピオグリタゾン／メトホルミン、ピオグリタゾン／グリメピリド等）も挙げられる。
【００５７】
その他、脂質低下薬・脂質異常症治療剤が挙げられる。例えば、１）ω３脂肪酸類（具体的には、イコサペント酸エチル（ＥＰＡ−Ｅ製剤）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等）、２）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（具体的には、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、イタバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、ロスバスタチン等）３）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、４）コレステロール吸収阻害剤（具体的には、エゼチミブ）、５）アシル−ＣｏＡ・コレステロールアシル転移酵素（ＡＣＡＴ）阻害剤、６）ＣＥＴＰ阻害剤、７）スクアレン合成酵素阻害剤、８）抗酸化剤（具体的には、プロブコール等）、９）ＰＰＡＲα作動薬（具体的には、クロフィブラート、エトフィブラート、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、ＫＲＰ−１０１等）、１０）ＰＰＡＲδ作動薬、１１）ＬＸＲ作動薬、１２）ＦＸＲ作動薬（具体的には、ＩＮＴ−７４７等）、１３）ＭＴＴＰ阻害剤、１４）スクアレンエポシダーゼ阻害剤、１５）胆汁酸吸収阻害剤（具体的には、コレスチラミン、コレスチポール等）等が挙げられる。
【００５８】
その他、抗肥満薬が挙げられる。具体的には、１）ＣＢ−１受容体拮抗薬（具体的には、リモナバン、ＳＲ−１４７７７８、ＢＡＹ−６５−２５２０等）２）モノアミン再取り込み阻害剤（具体的には、シブトラミン、マジンドール等）、３）セロトニン再取り込み阻害剤（具体的には、フルオキセチン、パロキセチン等）４）リパーゼ阻害剤（具体的には、オルリスタット、セチリスタット等）５）ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体拮抗薬（具体的には、Ｓ−２３６７等）６）ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）受容体拮抗薬、７）アドレナリンβ３受容体作動薬（具体的には、ＫＲＰ−２０４、ＴＲＫ−３８０／ＴＡＣ−３０１等）等が挙げられる。
【００５９】
Nrf2活性化剤と他の薬物もしくは薬剤を併用投与する場合は、別々の製剤であっても、合剤であってもよい。また、別々の製剤においては、両者を同時に服用することも、時間をずらして投与することも可能である。
【００６０】
Nrf2活性化剤の「投与中または投与後の時点」とは、Nrf2活性化剤の投与を対象に継続的（連続的または断続的）に行っている間のある時点、あるいは、Nrf2活性化剤を対象に最後に投与した後のある時点である。「投与後の時点」は、Nrf2活性化剤を対象に最後に投与した後の、例えば、1分〜168時間（7日）の時点、好ましくは、1時間〜72時間（3日）の時点、より好ましくは、3時間〜24時間（1日）の時点、さらに好ましくは、8時間〜12時間の時点である。
【００６１】
「対象」は、Nrf2活性化剤の投与を受ける動物のことであり、例えば、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどが挙げられる。対象は、好ましくは、ヒトである。
【００６２】
好ましい態様では、「対象」は、健常な対象、例えば、健常人である。別の好ましい態様では、「対象」は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患に罹患している対象である。「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」は、Nrf2およびFGF21の変調、具体的には、下方調節によりもたらされる疾患を意味する。「対象」は、より好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つのNrf2および／またはFGF21関連疾患に罹患している対象（例えば、ヒト）である。最も好ましくは、対象は、糖尿病に罹患している対象（例えば、ヒト）である。
【００６３】
いくつかの態様では、対象は、Nrf2活性化剤の投与またはNrf2活性化剤による治療が継続的に行われていた対象である。「継続的に投与が行われていた」とは、本発明の投与対象の応答監視方法または本発明の治療対象の応答監視方法におけるNrf2活性化剤の投与または治療の以前から、対象に対するNrf2活性化剤の投与または治療が行われていたことを意味する。
【００６４】
「生体試料」は、対象から採取した試料のことを意味し、例えば、対象に由来する、体液、体組織、細胞、組織、細胞培養物などである。より具体的には、生体試料は、リンパ液、全血、血清、血漿、尿、唾液、精液、滑液、髄液、肝臓由来の細胞もしくは組織などである。いくつかの態様では、生体試料は、脂肪組織（褐色脂肪組織および白色脂肪組織）、および膵臓由来の細胞または組織のいずれも除くものである。好ましい態様では、生体試料は、体液であり、より好ましくは、全血、血清および血漿からなる群から選択されるいずれかである。別の好ましい態様では、生体試料は、肝臓由来の細胞もしくは組織である。
【００６５】
FGF21レベルを測定するための生体試料の採取および／または調製は、常法に従い行うことができる。
【００６６】
「FGF21レベル」は、生体試料中のFGF21タンパク質量またはFGF21遺伝子発現量のことを意味し、例えば、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である。FGF21レベルとして、FGF21タンパク質量を測定する場合、免疫測定法にて測定するのが好ましい。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)）などが挙げられる。免疫測定法は、好ましくは、ELISAである。FGF21レベルとして、FGF21 mRNA量を測定する場合、PCR法などの公知の手法にて測定することができる。
【００６７】
FGF21レベルの増加は、例えば、基準レベルと比較したときのFGF21レベルの増加である。いくつかの態様では、FGF21レベルの増加は、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の時点（第1の時点）の前の時点（第2の時点）における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加である。
【００６８】
ここで、「参照集団」は、Nrf2活性化剤の投与前の対象の集団；プラセボ投与中の対象の集団；プラセボ投与後の対象の集団；Nrf2活性化剤の投与中にFGF21レベルの増加が見られなかった対象の集団；Nrf2活性化剤の投与後にFGF21レベルの増加が見られなかった対象の集団などである。参照集団を決定するために、Nrf2活性化剤の投与前、投与中および／または投与後の対象におけるFGF21レベルを測定し、解析する必要がある。集団における対象の数が増えれば増えるほど、FGF21レベルの信頼性がより増す。「Nrf2活性化剤の投与前」とは、Nrf2活性化剤を対象に最初に投与する前の、例えば、1分〜168時間（7日）の時点、好ましくは、1時間〜72時間（3日）の時点、より好ましくは、3時間〜24時間（1日）の時点、さらに好ましくは、12時間〜16時間の時点である。「プラセボ投与中」とは、プラセボ投与を対象に継続的（連続的または断続的）に行っている間のある時点を意味する。「プラセボ投与後」とは、プラセボを対象に最後に投与した後の、例えば、1分〜168時間（7日）の時点、好ましくは、1時間〜72時間（3日）の時点、より好ましくは、3時間〜24時間（1日）の時点、さらに好ましくは、8時間〜12時間の時点である。なお、FGF21レベルは日内変動を有するとの報告があり、参照集団のFGF21レベルを測定する時点を設定する際に考慮することが好ましい。例えば、日内変動の少ない時間に測定する、ある一定の時間に測定すること等が挙げられ、具体的には、「Nrf2活性化剤の投与後」の時点として投与8時間後を用いる際には「Nrf2活性化剤の投与前」の時点として投与16時間前を用いる、等が挙げられる。
【００６９】
「所定のFGF21レベル」は、Nrf2活性化剤および／またはプラセボの投与前、投与中および／または投与後の対象の集団のFGF21レベルを測定し、測定結果を解析することにより得られる。具体的には、測定結果を統計解析することにより、対象が陽性の応答を示すと判断できるFGF21レベルの下限値を所定のFGF21レベルとして求める。統計解析としては、例えば、Receiver−Operating−Characteristics（ROC）曲線を用いた解析等が挙げられる。集団における対象の数が増えれば増えるほど、より信頼できる所定FGF21レベルを求めることができる。生体試料が血清である場合のFGF21タンパク質量は、複数の報告（Galman et al. (2008) Cell Metabolism, 8, 169-174、Xiao et al. (2012) J Clin Endocrinol Metab, 97, E54-E58、Dushay et al. (2010) Gastroenterology, 139, 456-463、Li et al. (2010) Journal of Hepatology, 53, 934-940、Fisher et al. (2010) Diabetes, 59, 2781-2789等 ）があり、所定FGF21タンパク質量は、それらの値を参考に設定することもできる。
【００７０】
好ましい態様では、上記(a)〜(d)の場合のFGF21レベル（以下、「コントロール」という）と比較して、FGF21レベルが、例えば、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、10倍以上、30倍以上または100倍以上高いときに、Nrf2活性化剤の投与または治療に対する陽性の応答を示すと判断することができる。
【００７１】
本発明の投与対象の監視方法における「投与に対する陽性の応答」には、例えば、FGF21が正に調節されること；およびFGF21関連の糖脂質代謝が改善されることからなる群から選択される少なくも1つが含まれる。「FGF21が正に調節される」とは、FGF21レベルが増加することであり、すなわちFGF21タンパク質量またはFGF21遺伝子発現量が増加することである。
【００７２】
本発明の治療対象の監視方法における「治療に対する陽性の応答」には、例えば、FGF21が正に調節されること；FGF21関連の糖脂質代謝が改善されること； Nrf2および／またはFGF21関連疾患を罹患している対象に臨床的または治療的利益がもたらされることからなる群から選択される少なくとも1つが含まれる。「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」は、前記の通りである。「臨床的または治療的利益」には、例えば、細胞または生物学的反応；完全寛解；部分的反応；疾患の安定（進行または再発がない）；再発の遅延化からなる群から選択される少なくとも1つが含まれる。
【００７３】
2.2. Nrf2活性化剤で治療された対象の応答（感受性及び／又は反応性）を予測する方法
本発明のさらに別のいくつかの態様は、Nrf2活性化剤で治療された対象の臨床応答（感受性及び／又は反応性）を予測する方法、またはその予測を補助する方法（以下、「本発明の治療対象の応答予測方法」という）を提供する。本発明の治療対象の応答予測方法は、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含む。そして、FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療に感受性及び／又は反応性が高いことを示す。
【００７４】
Nrf2活性化剤の投与は、経口投与であってもよく、あるいは、非経口投与であってもよい。投与経路は、Nrf2活性化剤の種類、投与量、投与対象などに応じて適宜選択することができる。投与についての説明、経口投与または非経口投与のためのNrf2活性化剤の説明などは、前記の通りである。
Nrf2活性化剤の投与は、他の薬物もしくは薬剤との併用投与であってもよい。併用投与の説明は前記の通りである。
【００７５】
「対象」は、前記の通りであり、例えば、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどが挙げられる。対象は、好ましくは、ヒトである。
好ましい態様では、対象は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患に罹患している対象である。「対象」は、より好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患に罹患している対象（例えば、ヒト）である。最も好ましくは、対象は、糖尿病に罹患している対象（例えば、ヒト）である。
【００７６】
「生体試料」は、前記の通りであり、具体的には、対象に由来する、体液、体組織、細胞、組織、細胞培養物などである。より具体的には、生体試料は、リンパ液、全血、血清、血漿、尿、唾液、精液、滑液、髄液、肝臓由来の細胞もしくは組織などである。いくつかの態様では、生体試料は、脂肪組織（褐色脂肪組織および白色脂肪組織）、および膵臓由来の細胞または組織のいずれも除くものである。好ましい態様では、生体試料は、体液であり、より好ましくは、全血、血清および血漿からなる群から選択されるいずれかである。別の好ましい態様では、生体試料は、肝臓由来の細胞もしくは組織である。
【００７７】
FGF21レベルを測定するための生体試料の採取および／または調製は、常法に従い行うことができる。
【００７８】
「FGF21レベル」は、前記の通りであり、例えば、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である。FGF21レベルとして、FGF21タンパク質量を測定する場合、免疫測定法にて測定するのが好ましい。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)）などが挙げられる。免疫測定法は、好ましくは、ELISAである。FGF21レベルとして、FGF21 mRNA量を測定する場合、PCR法などの公知の手法にて測定することができる。
【００７９】
FGF21レベルの増加は、例えば、基準レベルと比較したときのFGF21レベルの増加である。いくつかの態様では、FGF21レベルの増加が、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加である。
【００８０】
「参照集団」および「所定のFGF21レベル」の説明は、前記の通りである。
【００８１】
好ましい態様では、上記(a)〜(d)の場合のFGF21レベル（以下、「コントロール」という）と比較して、FGF21レベルが、例えば、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、10倍以上、30倍以上または100倍以上高いときに、Nrf2活性化剤による治療に感受性及び／又は反応性が高いと判断することができる。
【００８２】
本発明の治療対象の応答予測方法における「治療に感受性及び／又は反応性が高い」ことには、例えば、FGF21が正に調節されること；FGF21関連の糖脂質代謝が改善されること； Nrf2および／またはFGF21関連疾患を罹患している対象に臨床的または治療的利益がもたらされることからなる群から選択される少なくとも1つが含まれる。「FGF21が正に調節される」「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」および「臨床的または治療的利益」の説明は、前記の通りである。
【００８３】
2.3. Nrf2活性化剤による治療が有効な対象を選択する方法
本発明のさらに別のいくつかの態様は、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象を選択する方法、またはその選択を補助する方法（以下、「本発明の対象選択方法」）を提供する。本発明の対象選択方法は、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含む。そして、FGF21レベルの増加が、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象であることを示す。
【００８４】
Nrf2活性化剤の投与は、経口投与であってもよく、あるいは、非経口投与であってもよい。投与経路は、Nrf2活性化剤の種類、投与量、投与対象などに応じて適宜選択することができる。投与についての説明、経口投与または非経口投与のためのNrf2活性化剤の説明などは、前記の通りである。
Nrf2活性化剤の投与は、他の薬物もしくは薬剤との併用投与であってもよい。併用投与の説明は前記の通りである。
【００８５】
「対象」は、前記の通りであり、例えば、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどが挙げられる。対象は、好ましくは、ヒトである。好ましい態様では、対象は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患に罹患している対象である。「対象」は、より好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患に罹患している対象（例えば、ヒト）である。最も好ましくは、対象は、糖尿病に罹患している対象（例えば、ヒト）である。
【００８６】
「生体試料」は、前記の通りであり、具体的には、対象に由来する、体液、体組織、細胞、組織、細胞培養物などである。より具体的には、生体試料は、リンパ液、全血、血清、血漿、尿、唾液、精液、滑液、髄液、肝臓由来の細胞もしくは組織などである。いくつかの態様では、生体試料は、脂肪組織（褐色脂肪組織および白色脂肪組織）、および膵臓由来の細胞または組織のいずれも除くものである。好ましい態様では、生体試料は、体液であり、より好ましくは、全血、血清および血漿からなる群から選択されるいずれかである。別の好ましい態様では、生体試料は、肝臓由来の細胞もしくは組織である。
【００８７】
FGF21レベルを測定するための生体試料の採取および／または調製は、常法に従い行うことができる。
【００８８】
「FGF21レベル」は、前記の通りであり、例えば、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である。FGF21レベルとして、FGF21タンパク質量を測定する場合、免疫測定法にて測定するのが好ましい。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)）などが挙げられる。免疫測定法は、好ましくは、ELISAである。FGF21レベルとして、FGF21 mRNA量を測定する場合、PCR法などの公知の手法にて測定することができる。
【００８９】
FGF21レベルの増加は、例えば、基準レベルと比較したときのFGF21レベルの増加である。いくつかの態様では、FGF21レベルの増加が、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加である。
【００９０】
「参照集団」および「所定のFGF21レベル」の説明は、前記の通りである。
【００９１】
好ましい態様では、上記(a)〜(d)の場合のFGF21レベル（以下、「コントロール」という）と比較して、FGF21レベルが、例えば、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、10倍以上、30倍以上または100倍以上高いときに、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象であると判断することができる。
【００９２】
Nrf2活性化剤を投与した際により高いFGF21レベルの増加を示す対象を選ぶことで、Nrf2活性化剤による治療が有効な対象、すなわちNrf2活性化剤の薬効が得られやすい対象を選別することができる。生体試料が血清である場合は、Nrf2活性化剤の投与を受ける対象はFGF21タンパク質量が10000pg/mL以下、好ましくは3000pg/mL以下、より好ましくは1000pg/mL以下、さらに好ましくは300pg/mL以下であることが望ましい。これらの対象において、Nrf2活性化剤投与前またはプラセボ投与群と比べ例えば、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、10倍以上、30倍以上または100倍以上のFGF21レベルの増加が見られる対象を、よりNrf2活性化剤による治療が有効な対象として選別することができる。もしくは、Nrf2活性化剤投与後の血清FGF21タンパク質濃度が300pg/mL以上、好ましくは1000pg/mL以上、より好ましくは3000pg/mL以上、さらに好ましくは10000pg/mL以上となる対象を、よりNrf2活性化剤による治療が有効な対象として選別することができる。
【００９３】
本発明の対象選択方法における「Nrf2活性化剤による治療が有効な対象である」ことには、例えば、Nrf2活性化剤による治療によりNrf2および／またはFGF21関連疾患を罹患している対象に臨床的または治療的利益がもたらされることが含まれる。「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」および「臨床的または治療的利益」の説明は、前記の通りである。
【００９４】
2.4. Nrf2活性化剤の最適な投与量を選択する方法
本発明のさらに別のいくつかの態様は、対象におけるNrf2活性化剤による治療においてNrf2活性化剤の最適な投与量を選択する方法、またはその選択を補助する（以下、「本発明の投与量選択方法」）を提供する。本発明の投与量選択方法は、Nrf2活性化剤の投与中または投与後の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベルを測定する工程を含む。そして、FGF21レベルの増加または減少を指標にNrf2活性化剤の最適な投与量を決定する。
【００９５】
Nrf2活性化剤の投与は、経口投与であってもよく、あるいは、非経口投与であってもよい。投与経路は、Nrf2活性化剤の種類、投与量、投与対象などに応じて適宜選択することができる。投与についての説明、経口投与または非経口投与のためのNrf2活性化剤の説明などは、前記の通りである。
【００９６】
Nrf2活性化剤の投与は、他の薬物もしくは薬剤との併用投与であってもよい。併用投与の説明は前記の通りである。
【００９７】
「対象」は、前記の通りであり、例えば、哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなどが挙げられる。対象は、好ましくは、ヒトである。好ましい態様では、対象は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患に罹患している対象である。「対象」は、より好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患に罹患している対象（例えば、ヒト）である。最も好ましくは、対象は、糖尿病に罹患している対象（例えば、ヒト）である。
【００９８】
「生体試料」は、前記の通りであり、具体的には、対象に由来する、体液、体組織、細胞、組織、細胞培養物などである。より具体的には、生体試料は、リンパ液、全血、血清、血漿、尿、唾液、精液、滑液、髄液、肝臓由来の細胞もしくは組織などである。いくつかの態様では、生体試料は、脂肪組織（褐色脂肪組織および白色脂肪組織）、および膵臓由来の細胞または組織のいずれも除くものである。好ましい態様では、生体試料は、体液であり、より好ましくは、全血、血清および血漿からなる群から選択されるいずれかである。別の好ましい態様では、生体試料は、肝臓由来の細胞もしくは組織である。
【００９９】
FGF21レベルを測定するための生体試料の採取および／または調製は、常法に従い行うことができる。
【０１００】
「FGF21レベル」は、前記の通りであり、例えば、FGF21タンパク質量またはFGF21 mRNA量である。FGF21レベルとして、FGF21タンパク質量を測定する場合、免疫測定法にて測定するのが好ましい。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)）などが挙げられる。免疫測定法は、好ましくは、ELISAである。FGF21レベルとして、FGF21 mRNA量を測定する場合、PCR法などの公知の手法にて測定することができる。
【０１０１】
FGF21レベルの増加または減少は、例えば、基準レベルと比較したときのFGF21レベルの増加または減少である。いくつかの態様では、FGF21レベルの増加または減少が、以下の(a)〜(d)：
(a)  Nrf2活性化剤投与前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(b)  参照集団に由来する生体試料中のFGF21レベル；
(c)  所定のFGF21レベル；および
(d)  前記FGF21レベル測定の前の時点における前記対象に由来する生体試料中のFGF21レベル、
からなる群から選択されるFGF21レベルと比較したときの、FGF21レベルの増加または減少である。
【０１０２】
「参照集団」および「所定のFGF21レベル」の説明は、前記の通りである。
【０１０３】
具体的には、FGF21レベルの増加または減少を指標として、次のようにして最適な投与量を決定する。生体試料が血清である場合は、Nrf2活性化剤の投与を受ける対象はFGF21タンパク質量が10000pg/mL以下、好ましくは3000pg/mL以下、より好ましくは1000pg/mL以下、さらに好ましくは300pg/mL以下であることが望ましい。これらの対象において、Nrf2活性化剤投与前またはプラセボ投与群と比べ例えば、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、10倍以上、30倍以上または100倍以上のFGF21レベルの増加が見られる投与量を、最適な投与量として決定する。もしくは、Nrf2活性化剤投与後の血清FGF21タンパク質濃度が300pg/mL以上、好ましくは1000pg/mL以上、より好ましくは3000pg/mL以上、さらに好ましくは10000pg/mL以上となる投与量を、最適な投与量として決定する。
【０１０４】
最適な投与量を決定するにあたり、「FGF21レベルの増加または減少」に加えて、医療従事者に知られている他の因子、例えば、治療を受けている対象の年齢、体重および性別；対象の臨床症状；ならびにNrf2活性化剤の送達部位、種類、投与方法および投与スケジュールからなる群から選択される少なくとも1つの因子を考慮するようにしてもよい。
【０１０５】
このようにして決定した最適な投与量は、対象に臨床的または治療的利益がもたらすのに必要な最小投与量である。最適な投与量は、好ましくは対象に大きな副作用をもたらす量よりも少ない。
【０１０６】
3.Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法
本発明は、Nrf2活性化活性を指標として、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法は、試験化合物のNrf2活性化活性を評価し、Nrf2活性化活性を有する化合物を選択することを含む方法である。本発明のスクリーニング方法により選択されたNrf2活性化活性を有する化合物はNrf2および／またはFGF21関連疾患、好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患の予防または治療剤のための候補化合物となる。
【０１０８】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2，6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N，N'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【０１０９】
より具体的には、例えば、(i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii)試験化合物をNrf2を発現する細胞に接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行うことを特徴とする、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１１０】
本方法においては、まず、Nrf2を発現する細胞に、試験化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、特に制限されないが、例えば、ヒト、マウスなど由来の細胞であり、好ましくは、ヒト由来の細胞である。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Nrf2を発現する細胞」は、例えば、肝細胞、mouse embryonic fibroblast (MEF)、HEK293細胞、293T細胞などである。本発明のスクリーニング方法で用いられる「Nrf2を発現する細胞」は、一般的な遺伝子工学技術によって作製することもできる。
【０１１１】
次に、Nrf2活性を測定する。具体的には、例えば、上記（i）と（ii）の場合において、上記細胞を培養し、それぞれの場合のNrf2活性を測定する。Nrf2活性は、FGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定する。好ましくは、Nrf2活性は、肝細胞におけるFGF21の発現レベルの上昇を指標にNrf2の活性を測定する。FGF21の発現レベルは、PCR法、イムノブロット法などの公知の手法を用いて測定できる。
【０１１２】
FGF21の発現レベルは、FGF21の転写促進活性を指標に測定してもよい。好ましくは、Nrf2活性は、肝細胞におけるFGF21の転写促進活性を指標にNrf2の活性を測定する。FGF21の転写促進活性は、FGF21プロモーター領域を用いたレポーターアッセイなどの公知の手法を用いて測定できる。
【０１１３】
次いで、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Nrf2活性を活性化する化合物を選択する。例えば、上記(i)の場合におけるNrf2活性が、上記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物、特には、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、あるいは50％以上高くなる試験化合物を、Nrf2活性化活性を有する化合物として選択することができる。また、Nrf2-/-のマウス由来のMEFと、Nrf2+/+のマウス由来のMEFとを用いて、両者を比較することで、Nrf2特異的な作用であるかどうかを確認することができる。
【０１１４】
このようにして選択された化合物は、FGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤であり、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療薬の候補化合物となる。
【０１１５】
「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」は、前記の通りであり、好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患である。Nrf2および／またはFGF21関連疾患は、より好ましくは、糖尿病である。
【０１１６】
本発明のスクリーニング方法の好ましい別の態様は、以下の工程を含むことを特徴とする方法である。
1）（i)試験化合物をNrf2を発現する細胞と接触させた場合と、(ii)試験化合物をNrf2を発現する細胞に接触させない場合の、該細胞におけるNrf2活性の比較を行う工程、
2）前記(i)の場合におけるNrf2活性が、前記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物を選択する工程、および、
3）前記2）の工程で選択された試験化合物について、FGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認する工程。
【０１１７】
上記1)および2)の工程により、Nrf2活性化剤をスクリーニングすることができる。Nrf2活性の測定方法は、前述の通りである。
【０１１８】
上記1）の工程としては、Nrf2活性を、Nrf2安定化を指標として測定することが好ましい。
【０１１９】
上記2)の工程では、好ましくは、試験化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、Nrf2活性を活性化する化合物を選択する。例えば、上記(i)の場合におけるNrf2活性が、上記(ii)の場合のNrf2活性より高くなる試験化合物、特には、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、あるいは50％以上高くなる試験化合物を、Nrf2活性化活性を有する化合物として選択することができる。
【０１２０】
好ましくは、上記3）の工程は、肝細胞におけるFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することを確認することが挙げられる。
【０１２１】
Nrf2またはFGF21に特異的なプライマーやプローブは、Nrf2またはFGF21の塩基配列を元に、配列上特異性の高い領域を選択して適宜設計することができる。プライマーやプローブは通常、10〜40個、好ましくは15〜30個の塩基から構成される。
レポーターアッセイに用いるFGF21プロモーター領域の配列は、ARE配列を含み、本来のFGF21のプロモーター活性を有すれば特に限定されないが、例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のものなどを用いることができる。FGF21のプロモーター領域の遺伝子配列は、UCSG Genome Browserのようなデータベースから得ることができ、プロモーター活性を有する領域を適宜選択することができる。選択したプロモーター領域の取得は、後述する実施例6に記載の方法のような、公知の手法を用いて行うことができる（例えば、Cell Metabolism Vol.5 pp415-425 (2007)など）。
【０１２２】
上記3）の工程において、選択された試験化合物がFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することの確認は、例えば、前述の方法により、FGF21の発現レベルを測定し、比較することにより行うことができる。
本発明のいくつかの態様では、上記3）の工程において、選択された試験化合物がFGF21の発現レベルを上昇させる活性を有することの確認として、選択された試験化合物によるFGF21の転写促進活性を指標にすることができ、例えば、前述の方法により、FGF21の転写促進活性を測定し、比較することにより行うことができる。
このようにして選択された化合物は、FGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤であり、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療薬の候補化合物となる。
【０１２３】
さらに、選択された候補化合物を実験動物(例、マウス、ラットなど)に投与して、選択された候補化合物によるNrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療効果を確認する。予防または治療効果を確認するための試験法としては、公知の方法が挙げられる。Nrf2および／またはFGF21関連疾患は、好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患であり、より好ましくは、糖尿病である。
【０１２４】
4.Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療用医薬組成物
本発明は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤として、FGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤を提供する。本発明においては、FGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤を含有してなる医薬組成物を、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤として用いる。また、本発明においては、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療剤の製造においてFGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤を使用する。さらに、本発明は、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療を必要とする対象に、治療的有効量のFGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤を投与することを含む、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【０１２５】
FGF21レベルを増加させる活性を有するNrf2活性化剤（以下、「本発明のNrf2活性化剤」）は、前述のスクリーニング方法により入手することができる。
【０１２６】
「Nrf2および／またはFGF21関連疾患」は、前記の通りであり、好ましくは、糖尿病、肥満症、高トリグリセリド血症、虚血性脳血管障害、虚血性心血管障害および糖尿病性腎症からなる群から選択される少なくとも1つの疾患であり、より好ましくは、糖尿病である。
【０１２７】
本発明においては、本発明のNrf2活性化剤を常套手段に従って、製剤化し、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療のための医薬組成物として用いることができる。あるいは、本発明においては、本発明のNrf2活性化剤を常套手段に従って、製剤化し、Nrf2および／またはFGF21関連疾患の予防または治療方法のために用いることができる。
【０１２８】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【０１２９】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記活性成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【０１３０】
なお前記した各組成物は、上記活性成分との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例えば、他の糖尿病薬など）を含有してもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は、本発明のNrf2活性化剤のみを有効成分として含有する。本発明の医薬組成物は、他の医薬組成物（例えば、他の糖尿病薬など）と併用してもよい。
【０１３１】
活性成分(本発明のNrf2活性化剤)の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該活性成分の投与量は、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、注射剤の形で投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該活性成分を、約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。人以外の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【０１３２】
本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１３３】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１３４】
実施例の結果は、特に記載しない限り、以下の統計分析を行った。
結果を平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として表した。統計分析はStudent’s T-testまたはBonferroni post hoc testによる分散分析（ＡＮＯＶＡ）にて行った。【０１３５】
（実施例１）糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)でのNrf2活性化によるFGF21の誘導
（１−１）Nrf2を特異的に活性化したマウスの作成
Keap1 knockout、knockdown対立遺伝子(Taguchiら、Mol. Cell. Biol. 30:3016-3026.(2010))およびNrf2 knockout対立遺伝子（Itohら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:313-322.(1997)）は、公知のものを用いた。ICRマウスは日本SLC (Shizuoka, Japan)から、C57BL/KsJ::db/mマウスは日本クレア(Tokyo, Japan)から購入した。Keap1flox/+およびKeap1flox/-マウスは、ICRにbackcrossしたKeap1flox/floxマウスとKeap1+/-マウスの交配により得た。db/db::Keap1flox/+マウスおよびdb/db::Keap1flox/-マウスは、ICRにbackcrossしたdb/+::Keap1flox/floxマウスとdb/+::Keap1+/-マウスの交配により得た。マウスには水および齧歯動物用飼料を自由に摂取させ、特定病原体不在の条件下で維持した。全てのマウスは、東北大学の実験動物の人道的な飼育および使用のための基準ならびに日本の文部科学省の動物実験の適正な実施に向けたガイドラインの規程に従って扱った。【０１３６】
（１−２）Keap1 knockdownによるFGF21誘導
糖尿病を自然発症するdb/dbマウスにおいて、Nrf2を活性化したマウス（db/db::Keap1flox/-）とコントロールマウス（db/db::Keap1flox/+）の血漿中FGF21濃度および肝臓でのFgf21遺伝子発現レベルを比較した。
FGF21の血漿濃度は、マウス／ラットFGF21  Quantikine  ELISAキット（R＆D  Systems、Minneapolis、MN、USA）により測定した。
肝臓組織からの総RNAの抽出は、Isogen  RNA抽出キット（ニッポンジーン）を用いて行い、SuperScript  III（Invitrogen）を用いてcDNAに逆転写した。ABI7300システム（Applied  Biosystems）を用いて、TaqManプローブを用いて定量的リアルタイムPCR（qPCR）を実施した。遺伝子の相対的発現をHprt（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase）  mRNAに対して正規化した。プライマーおよびプローブは以下の通りである；
Fgf21（フォワード5’−AGATGGAGCTCTCTATGGATCG−3’（配列番号：9）、リバース5’−GGGCTTCAGACTGGTACACAT−3’（配列番号：10）、プローブ5’−FAM−TCAGAGAACTGCTGCTGGAGGAC−TAMRA−3’（配列番号：11））、
Hprt（フォワード5’−CTGGTGAAAAGGACCTCTCG−3’（配列番号：12）、リバース5’−TGAAGTACTCATTATAGTCAAGGG−3’（配列番号：13）、プローブ5’−ATCCAACAAAGTCTGGCCTGTATCCAAC−3’（配列番号：14））。【０１３７】
血漿中FGF21濃度は、db／db::Keap1flox／＋コントロールマウスと比較してdb／db::Keap1flox／−マウスにおいて有意に上昇した（図1(a)）。血漿中FGF21濃度の増加は、Nrf2遺伝子ノックアウトによって消失した（図1(a)）。また肝臓におけるFGF21 mRNAの発現レベルについても、db／db::Keap1flox／＋コントロールマウスと比較してdb／db::Keap1flox／−マウスにおいて有意に増加したが、db／db::Keap1flox／＋::Nrf2−／−マウスとdb／db::Keap1flox／−::Nrf2−／−マウスの間では変わらなかった（図1(b)）。
これらの結果は、遺伝子的なNrf2活性化がdb／dbマウスにおいて肝臓FGF21遺伝子発現および循環FGF21発現レベルを正に調節することを示唆している。【０１３８】
（１−３）Nrf2活性化剤投与によるFGF21誘導
糖尿病を自然発症するdb/dbマウスにおいて、Nrf2活性化剤を投与した場合の血漿中FGF21濃度および肝臓でのFgf21遺伝子発現レベルを比較した。Nrf2活性化剤としてはCDDO-Imを用い、10 mg/kgを1週間にわたって1日1回、経口投与した。投与して一定時間後にイソフルラン麻酔下で採血および組織採取を行い、前記（１−２）の方法と同様に血漿中のFGF21濃度や肝臓におけるFgf21 mRNAの発現レベルを測定した。
db／dbマウスへのCDDO−Imの経口投与は、血漿中FGF21濃度および肝臓FGF21遺伝子発現レベルの両方を有意に増加させ、これらの誘導はNrf2遺伝子ノックアウトによって無効化された（図1(c)および1(d)）。これらの結果を照らし合わせると、Keap1 knockdownマウスの場合と同様、薬理学的Nrf2活性化もまた、糖尿病db／dbマウスにおいて肝臓FGF21遺伝子発現レベルおよび血漿中FGF21濃度を増加させた。【０１３９】
（実施例２）Nrf2活性化剤投与後のNrf2活性化マーカーの経時変化
本実施例では、Nrf2活性化剤投与後の肝臓Nqo1遺伝子発現および血漿中FGF21濃度の経時変化を確認した。
Nrf2活性化剤としてはCDDO-Imを用い、30 μmol/kgをdb/dbマウスに経口投与した。投与して一定時間後にイソフルラン麻酔下で採血および組織採取を行い、前記実施例（１−２）の方法と同様に肝臓におけるNrf2標的遺伝子であるNqo1遺伝子の発現や血漿中のFGF21濃度を測定した。用いたプライマーおよびプローブは以下の通りである；
Nqo1（フォワード5’−AGCTGGAAGCTGCAGACCTG−3’（配列番号：15）、リバース5’−CCTTTCAGAATGGCTGGCA−3’（配列番号：16）、プローブ5’−ATTTCAGTTCCCATTGCAGTGGTTTGGG−3’（配列番号：17））。
CDDO−Imの単回投与は肝臓におけるNAD（P）Hデヒドロゲナーゼキノン1（Nqo1）遺伝子発現を増加させ、それは投与の48時間後でも持続した（図2(a)）。Nqo1遺伝子発現の時間経過と同様、血漿中FGF21濃度もCDDO−Imの単回投与後に増加し、投与後48hまで維持された（図2(b)）。これらの結果は、血漿中FGF21濃度の増加がNrf2の活性化を密接に反映することを示唆している。【０１４０】
（実施例３）高カロリー食摂取肥満モデルマウスでのNrf2活性化によるFGF21の誘導
本実施例では、肥満モデルマウスでのKeap1 knockdownによるFGF21誘導を確認した。
高カロリー食（HCD）給餌実験において、標準食（SD）群には標準食（MF、3．59kcal／g、オリエンタル酵母工業）を給餌し、HCD群には高脂肪食（HFD−60、5．06kcal／g、62．2％脂肪のカロリー、オリエンタル酵母工業）を3週間給餌した後、さらに飲用水中で20％スクロースを加え5週間給餌した。
SD給餌群において、血漿中FGF21濃度および肝臓のFgf21遺伝子発現レベルはKeap1flox／＋コントロールマウスに比べKeap1flox／−マウスにおいて増加傾向であった（図3(a)および3(c)）。HCD給餌群においては、Keap1flox／＋コントロールマウスと比較してKeap1flox／−マウスにおいて、血漿中FGF21濃度および肝臓のFgf21遺伝子発現レベルの両方が顕著に増加し、またこれらの増加はNrf2欠損によって消失した（図3(b)および3(d)）。
これらの結果は、Nrf2が代謝ストレス条件下においてFGF21をより強く誘導することを示している。【０１４１】
（実施例４）FGF21誘導を介した抗糖尿病作用
本実施例では、db/dbマウスでの糖代謝および脂質代謝改善作用を確認した。
血漿トリアシルグリセロール（TAG）レベルおよび非エステル化脂肪酸レベルは、DRI−CHEM7000（富士フイルム）および遊離脂肪酸定量キット（BioVision、San  Francisco、CA、USA）により測定した。血糖値は、One touch ultra view blood glucose analyzer (LifeScan, Milpitas, CA, USA)を用いて測定した。
FGF21は糖代謝および脂質代謝を改善することが公知である(Kharitonenkovら、J. Clin. Invest. 115:1627-1635.(2005))。血漿トリアシルグリセロール（TAG）レベルおよび非エステル化脂肪酸（NEFA）レベルならびに血糖値は、同腹子db／db::Keap1flox／＋対照マウスと比較してdb／db::Keap1flox／−マウスにおいて有意に低下した（図4(a)〜4(c)）。
これらの結果から、Nrf2活性化が血漿脂質レベルの顕著な低下を引き起こし、FGF21が糖尿病マウスにおけるNrf2の脂質低下効果を媒介し得ることが示唆される。【０１４２】
（実施例５）Nrf2活性化剤の活性の確認
（５−１）Nrf2活性化活性の確認
Nrf2の分解を阻害することにより、Nrf2を安定化させる、Nrf2活性化剤は以下の方法により確認することができる。N0T-MEF（Nrf2のDNA結合ドメインをLacZに変えた機能ノックアウトマウスより作製した細胞；Hirotsuら、Genes to Cell、Vol.16、pp.406-415（2011））を96 well plateに播種し、一晩インキュベーション (35℃、5% CO2)する。被検物質を添加し、３時間インキュベーション(35℃、5% CO2)する。Beta-Glo Assay Reagent（Promega）を添加し、室温、遮光下で１時間放置した後の発光強度を測定しNrf2活性化能（Nrf2安定化能）を求める。【０１４３】
（５−２）FGF21の発現レベルを上昇させる活性の確認
Nrf2活性化剤を暴露させた培養細胞または組織より、全RNAをISOGEN RNA抽出キット(Nippon Gene)を用いて抽出し、Super−script III(Invitrogen)を用いてcDNAに逆転写する。FGF21特異的なプライマーを用いて、qPCRを実施することにより、FGF21の発現量を確認する。特異的なプライマーの例は、前記（実施例１）に記載のものを用いることができる。遺伝子発現量はHprt等により標準化する。Nrf2活性化剤を暴露させていない培養細胞または組織でのFGF21の発現量と比較して、FGF21の発現レベルを上昇させる活性を有するNrf2活性化剤を選択する。【０１４４】
（実施例６）Nrf2活性化によるFGF21プロモーター活性化の誘導
本実施例では、FGF21プロモーターアッセイを用いた、Nrf2活性化剤およびNrf2過剰発現によるFGF21転写促進活性を確認した。
マウスFGF21プロモーター領域のクローニングは、公知の手法を用いて行った。このマウスFgf21 cDNA配列を鋳型に以下のプライマー1.1および1.2により増幅された配列（約2.1kbp）を、pGL4.15 vector (Promega)にクローニングすることで、マウスFgf21レポーターベクターを作製した。
プライマー1.1：5’-GACGGCCTCGAGGACTGAAGGCTCAGAGACCGG-3’ (配列番号：18)
プライマー1.2：5’-GACGGCAGATCTAGGCAGCTGGAATTGTGTTCTG-3’ (配列番号：19)
また、マウスNrf2 cDNA配列をpcDNA3.1/V5-His B vector（Invitrogen）にクローニングすることで、マウスNrf2発現ベクターを作製した。
マウス肝癌細胞系Hepa1c1c7(Hepa1)を、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)を補ったダルベッコ変法イーグル培地(Wako)内で培養した。マウスFgf21レポーターベクターおよびマウスNrf2発現ベクター、またはマウスFgf21レポーターベクターおよび空ベクター（mock）を、Lipofectamine2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いHepa1細胞内にトランスフェクトした。これらの細胞を6時間培養した後、培地を除去し、100nMのNrf2活性化剤CDDO-Im (2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid imidazol) またはvehicleとして0.1% Dimethylsulfoxide (Wako) を含む培地を添加し、さらに48時間培養した。その後、ルミノメーター(Berthold)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
vehicle添加時と比較して、CDDO-Imの添加によりルシフェラーゼ活性の2倍程度の増強が見られた(図5)。また、空ベクター (mock)をトランスフェクトした場合と比べ、マウスNrf2発現ベクターをトランスフェクトすることで、ルシフェラーゼ活性が2倍程度増強した。マウスNrf2発現ベクターをトランスフェクトし、CDDO-Imを添加することで、ルシフェラーゼ活性はさらに上昇した。
Nrf2は、酸化ストレスや求電子ストレスに応答し、抗酸化や異物代謝に関与する遺伝子のプロモーターにあるAREに結合し、その転写活性化を行う転写因子である。今回Fgf21遺伝子上流の配列を用いたレポーターアッセイを実施した結果、Nrf2活性化剤CDDO-Imの添加やマウスNrf2遺伝子の過剰発現により、Fgf21レポーター活性の上昇が観察された。マウスFgf21遺伝子の上流配列には、2つのARE配列が存在しており、今回の結果から、Nrf2シグナルの活性化は、Fgf21プロモーター領域のARE配列を介して、FGF21の転写促進化及び発現上昇を引き起こすことが示唆される。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
[配列番号：1] ヒトNrf2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_006164)。
[配列番号：2] ヒトNrf2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_006155)。
[配列番号：3] マウスNrf2をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_010902)。
[配列番号：4] マウスNrf2のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_035032)。
［配列番号：5］ヒトFGF21をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_019113)。
［配列番号：6］ヒトFGF21のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_061986)。
［配列番号：7］マウスFGF21をコードするcDNAの塩基配列を示す(Accession No. NM_020013)。
［配列番号：8］マウスFGF21のアミノ酸配列を示す(Accession No. NP_064397)。
［配列番号：9〜配列番号：19］実施例で用いたプライマーまたはプローブである。
【図１】
2014192793.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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