(57)【要約】  被験者に与える侵襲性が低く、かつ簡便で精度の高い膵外分泌機能異常の検出方法を提供することを目的とする。  被験者由来の体液試料中のＡＰＯＡ２タンパク質の２種バリアント、それらの変異体及び／又はそれらの断片をインビトロで測定することを含み、その量に基づいて膵外分泌機能異常の有無を検出する方法、並びに、該タンパク質に特異的に結合可能な抗体を含む膵外分泌機能異常の検出用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の体液中に存在するＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量をインビトロで測定し、その量に基づいて膵外分泌機能異常の有無を決定する膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項２】
前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項３】
前記ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項４】
被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体のそれと比較して少ないときに、被験体の膵臓が、膵液の通過障害を有していると評価する、請求項１〜３のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項５】
前記被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体の２分の１以下である、請求項４に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項６】
被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体のそれと比較して同等以上であって、かつ被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が、健常体のそれと比較して少ないときに、被験体の膵臓が、膵液の産生障害を有していると評価する、請求項１〜３のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項７】
前記被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が健常体の２分の１以下である、請求項６に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項８】
前記体液試料が血液である、請求項１〜７のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列に結合するＡＰＯＡ２非末端結合分子とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する工程、又は
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列に結合するＡＰＯＡ２非末端結合分子とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する工程
を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子及びＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子が抗体又は核酸アプタマーである、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子及びＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子がそれぞれ抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体及び抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体である、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体、及び/又はそれらの化学修飾体を含む、膵外分泌機能異常の検出用キット。
【請求項１３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合し、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５、又は９、１０及び１１、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８、又は１２、１３及び１４、で示されるアミノ酸配列からなる
抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体又はその断片、及び
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列に特異的に結合し、
重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６及び１７、又は２１、２２及び２３、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９及び２０、又は２４、２５及び２６、で示されるアミノ酸配列からなる
抗ＡＰＯＡ２非末端モノクローナル抗体又はその断片
から選択される、１種類以上のモノクローナル抗体又はその断片を含む、膵外分泌機能異常の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＰＯＡ２のアイソフォーム２種（ＡＰＯＡ２-ＡＴ又はＡＰＯＡ２-ＡＴＱ）を膵外分泌機能異常の検出用マーカーとし、その体液中の濃度を測定することにより膵外分泌機能の異常を検出する方法に関する。【０００２】
本発明はまた、膵外分泌機能異常の検出のために使用される前記タンパク質と結合可能な物質を含む膵外分泌機能異常を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
膵臓は胃の後部に存在する長さ１５cm程度の臓器であり、食物を腸管で消化するために必要な消化酵素を含む膵液を分泌する役割（外分泌機能）と、インシュリンやグルカゴンのような糖代謝に必須なホルモンを分泌する役割（内分泌機能）を持つ。【０００４】
外分泌部として、膵臓の中には、膵液を十二指腸まで輸送する複数の膵管が通っており、これらの膵管は、十二指腸側に近づくにつれて合流し、主膵管を形成する。主膵管は、十二指腸につながる前に総胆管と合流し、その後、十二指腸の壁を貫き、十二指腸乳頭と呼ばれる部分で開口する。【０００５】
膵臓が分泌する消化酵素の多くは、腺房細胞において活性を持たない前駆体として産生され、これが胃液中のペプシンや小腸上皮の刷子縁に存在するエンテロキナーゼのようなペプチダーゼの働きで分解されることで、活性型酵素となる。例えば、膵臓から分泌された前駆体酵素キモトリプシノーゲンは、トリプシンやエンテロキナーゼにより活性型酵素キモトリプシンに変換される。つまり、強力な分解酵素である膵酵素によって膵臓組織自体が消化されてしまわないように、膵酵素は膵臓の中で活性を持たない状態で存在している。しかし、膵管閉塞などによって膵液が膵管内で鬱滞すると、膵酵素は膵臓内で前駆体から活性型に変換される場合がある。このような機序により、膵酵素が膵臓内で異常に活性化してしまうと、膵臓自身が自家消化を受け、膵炎を発症する。【０００６】
膵外分泌機能検査は、慢性膵炎などの膵疾患の患者において、手術後の外分泌機能障害の有無や程度を診断する目的で行われ、有管法と無管法に大別される。【０００７】
有管法は、経口的にチューブを挿入し、十二指腸液を回収して膵酵素の活性を測定する感度、特異度が高い膵外分泌機能検査法である。しかし、検査が侵襲的で、煩雑な手技を必要とし、また特別な検査装置が必要であり、検査時間とコストがかかる欠点がある。さらに、日本国内ではヒトへの投与可能な検査用試薬の入手が困難であり、施行が難しい状況にある。【０００８】
一方、無管法は、食事や経口的に膵酵素基質を投与した後に、糞便や尿、血液、又は呼気中に存在する、膵酵素自身の活性や膵酵素の代謝産物の量を測定する検査法である。例えば、膵臓から分泌されるキモトリプシンの合成基質ＢＴ-ＰＡＢＡ（Ｎ-ｂｅｎｚｏｙｌ Ｌ-ｔｙｒｏｓｙｌ Ｐ-ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を経口投与し、キモトリプシンによる分解産物であるＰＡＢＡ（Ｐ-ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）の尿中濃度を測定するＰＦＤ試験、膵臓から分泌されるエラスターゼの合成基質ＦＤＬ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉｌａｕｒａｔｅ）を経口投与し、分解産物であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの尿中排泄率又は血中濃度を測定するＰＬＴ試験、糞便中のキモトリプシン量を測定する糞便中キモトリプシン試験、及び糞便中のエラスターゼの定量を行う糞便中エラスターゼ試験などが、現在、一般的に実施される膵機能検査法として知られている。しかし、いずれの方法も感度が低いため軽度の異常は検出できない。また食事制限などの検査前の処置が必要なため、入院が必要であり、長い検査時間を要するという欠点もある。その他の無管法には、膵臓から血中に逸脱したエラスターゼ１や膵アミラーゼ等の膵外分泌性酵素を定量する検査法がある。しかし、膵アミラーゼによる検査法は、急性膵炎等の重度な膵疾患の鑑別には有用であるものの、発症後の異常値持続期間は数日程度と短く、また感度が低いため膵外分泌機能異常のスクリーニングには有効ではない。これに対してエラスターゼ１は、膵アミラーゼに比べて血中半減期が比較的長く、異常値持続期間も２〜４週間程続くが、慢性膵炎の非代償期のように膵外分泌機能が著しく低下した膵外分泌機能不全では、健常者の基準値範囲内に留まることが知られており、膵外分泌機能の異常を網羅的に検出できるマーカーではない（非特許文献１〜３）。それゆえに、現在、被験者への費用的な負担が小さく、高精度な結果が得られる感度の高い膵外分泌機能の検査法の開発が望まれている。【０００９】
ＡＰＯＡ２（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２、又はＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ-ＩＩ）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ.ＮＰ_００１６３４．１）は、血漿リポタンパク質を構成するアポリポタンパク質ファミリーの一種である。アポリポタンパク質は、これまでに１０種以上が知られており、それらの主な機能は、リポタンパク質の構造の安定化、リポタンパク質代謝に関与する酵素の活性化、細胞表面に存在するリポタンパク質受容体に対するリガンドとしての作用等である。ＡＰＯＡ２タンパク質は、肝臓組織においてシグナルペプチドを含む１００アミノ酸からなる前駆体として合成される高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）を構成するアポリポタンパク質の一つである。血液中に存在するプロセシングされた成熟型ＡＰＯＡ２タンパク質は、７７アミノ酸からなり、アミノ末端（Ｎ末端）にはグルタミン残基（Ｑ）を、Ｎ末端から７６番目にはスレオニン残基（Ｔ）を、そして７７番目のカルボキシル末端（Ｃ末端）にはグルタミン残基（Ｑ）を有している。また、ＡＰＯＡ２タンパク質には、完全長ＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、Ｃ末端のグルタミン残基（Ｑ）を欠失したＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、Ｃ末端のスレオニン・グルタミン残基（ＴＱ）を欠失したＡＰＯＡ２タンパク質であるＡＰＯＡ２−Ａタンパク質等の質量の異なるバリアントが存在することが報告されている。【００１０】
タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ Ｂａｎｋ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）に登録されているＡＰＯＡ２タンパク質の立体構造データ（ＰＤＢ  IＤ：１Ｌ６Ｌ）に基づく解析によれば、ＡＰＯＡ２タンパク質は、Ｎ末端側に存在するシステイン残基を介したジスルフィド結合（Ｓ-Ｓ結合）により二量体を形成するとされている。したがって、ＡＰＯＡ２タンパク質は、血液中で前記３種のバリアントの組み合わせから生じる様々な分子量の二量体として存在することがわかっている。具体的には、完全長のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴＱタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴ／ＡＴタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−Ａタンパク質の二量体（ＡＰＯＡ２−ＡＴ／Ａタンパク質二量体）、ＡＰＯＡ２−Ａタンパク質からなる二量体（ＡＰＯＡ２−Ａ／Ａタンパク質二量体）等が知られている。また、この他にも、ＡＰＯＡ２タンパク質は、ジスルフィド結合によりＡＰＯＤタンパク質、ＡＰＯＥタンパク質、ＡＰＯＡ１−Ｍタンパク質といった他のタンパク質と二量体を形成することや、単量体として存在することが知られている（非特許文献４、５）。【００１１】
上記各種ＡＰＯＡ２タンパク質二量体の血中濃度は、膵臓癌患者と健常者と比較すると、有意に異なることが知られている。特にＡＰＯＡ２−ＡＴＱ／ＡＴタンパク質二量体は、質量分析の結果、分子量１７２５３±９（ｍ／ｚ）の質量値を有するタンパク質として見出され、健常者と比べて膵臓癌患者において減少することや、このタンパク質二量体を膵臓癌マーカーとして利用することで、高い精度で膵臓癌を検出できることが明らかとなっている（特許文献１及び２、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００６／０９８０８７号
【特許文献２】特開２０１０−１７５４５２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】丹藤ら、２００８年、臨床消化器内科、第２３巻、ｐ５１３−５１７
【非特許文献２】出居ら、２００８年、モダンメディア、第５４巻、ｐ１８０−１８５
【非特許文献３】医学書院、２０１３年、臨床検査データブック、ｐ１４７−１４９
【非特許文献４】Ｂｌａｎｃｏ−Ｖａｃａ Ｆ．ら、２００１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、第４２巻、ｐ．１７２７−１７３９
【非特許文献５】Ｒｏｃｃｏ ＡＧ．ら、２００６年、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、第９１巻、ｐ．３０４３−３０４９
【非特許文献６】Ｈｏｎｄａ Ｋ．ら、２０１２年、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、第７巻、ｅ４６９０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
有管法による膵外分泌機能の検査は、感度・特異度が高いが、浸襲性が高く、検診等におけるスクリーニング検査には不向きである。また、無管法である糞便や尿中の膵消化酵素の活性を測定する膵外分泌機能検査は、他の消化器疾患の影響を受けやすく、感度も低いという問題がある。さらに、アミラーゼ等の血液中に存在する膵酵素を検出する簡便な方法も存在するが、アミラーゼの濃度上昇は炎症等に伴う一過性な現象であり、感度が低いため、膵外分泌機能の異常を高い精度で評価することはできない。【００１５】
したがって、本発明の課題は、被験者の負担が少なく、侵襲性の低い血中のタンパク質の濃度を測定する簡便な検査法で、精度の高い膵外分泌機能の異常を検査する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、まずＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのうち、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の２種類について定量的に検出した。そして、膵外分泌機能の異常を有する被験体と健常体におけるそれぞれの量を比較した。その結果、健常体と膵外分泌機能異常を有する被験体間では、血中の両タンパク質量が異なることを見いだした。さらに、膵外分泌機能の異常の中で膵管内における膵液の通過障害を示す被験体では、健常体と比べてＡＰＯＡ２−ＡＴＱの血中濃度が低いこと、並びに膵外分泌機能の異常の中で膵臓組織における膵液の産生障害を示す被験体では、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱの血中濃度が健常体と同程度以上である一方、ＡＰＯＡ２−ＡＴの血中濃度は健常体と比べて低いことを見いだした。【００１７】
本発明は、上記知見に基づき、以下の発明を包含する。
（１）被験体の体液中に存在するＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量をインビトロで測定し、その量に基づいて膵外分泌機能異常の有無を決定する膵外分泌機能異常の検出方法。
（２）前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１）に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（３）前記ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１）に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（４）被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体のそれと比較して少ないときに、被験体の膵臓が、膵液の通過障害を有していると評価する、（１）〜（３）のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（５）前記被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体の２分の１以下である、（４）に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（６）被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が、健常体のそれと比較して同等以上であって、かつ被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が、健常体のそれと比較して少ないときに、被験体の膵臓が、膵液の産生障害を有していると評価する、（１）〜（３）のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（７）前記被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が健常体の２分の１以下である、（６）に記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（８）前記体液試料が血液である、（１）〜（７）のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列に結合するＡＰＯＡ２非末端結合分子とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定する工程、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列に結合するＡＰＯＡ２非末端結合分子とを用いて、試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定する工程を含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の膵外分泌機能異常の検出方法。
（１０）前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子及びＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子が抗体又は核酸アプタマーである、請求項９に記載の検出方法。
（１１）前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子及びＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子がそれぞれ抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体及び抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体である、（１０）に記載の検出方法。
（１２）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体、及び/又はそれらの化学修飾体を含む、膵外分泌機能異常の検出用キット。
（１３）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合し、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５、又は９、１０及び１１、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８、又は１２、１３及び１４、で示されるアミノ酸配列からなる抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体又はその断片と、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列に特異的に結合し、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６及び１７、又は２１、２２及び２３、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９及び２０、又は２４、２５及び２６、で示されるアミノ酸配列からなる抗ＡＰＯＡ２非末端モノクローナル抗体又はその断片から選択される、１種類以上のモノクローナル抗体又はその断片を含む、膵外分泌機能異常の検出用キット。【００１８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-040580号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、膵外分泌機能異常を容易に、かつ高い信頼度で検出することが可能になる。被験体の体液試料中に含まれるＡＰＯＡ２タンパク質の２種アイソフォームの濃度を測定するだけで、その被験体が膵外分泌機能の異常を有するか否か、また、膵外分泌機能異常を有するのであれば、その異常が膵液の通過障害であるのか又は産生障害であるのか、を容易に判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．膵外分泌機能異常検出用マーカー
（概要）
本発明は、膵外分泌機能異常において、膵液の産生障害を伴う膵疾患患者では、血中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が健常者よりも少なく、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量は健常者と同等か、または健常者よりも多いという新規知見、及び膵液の通過障害を伴う膵疾患患者では、血中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が健常者よりも少ないという新規知見に基づくものである。
【００２１】
（構成）
本明細書において「膵外分泌機能異常検出用マーカー」とは、膵外分泌機能異常を検出するための生物学的マーカー（いわゆる、バイオマーカー）であって、被験体の膵臓における外分泌機能異常の有無を示す指標となる物質をいう。被験体の血液中における膵外分泌機能異常検出用マーカーの量を測定し、その測定値が健常体の測定値より多い又は少ないことを指標に、被験体の膵外分泌機能異常を検出できる。
【００２２】
膵外分泌機能異常検出用マーカーは、ＡＰＯＡ２タンパク質の２種類のバリアント、すなわち、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、又はその断片から構成される。
【００２３】
本明細書において「膵外分泌機能」とは、膵臓の腺房細胞で生産される消化酵素を含んだ膵液が、膵臓から十二指腸に分泌される機能を指す。「膵液」は、膵臓から十二指腸に分泌されるアルカリ性消化液である。膵液は、導管部より分泌される重炭酸塩と、腺房細胞で産生され、炭水化物分解酵素やタンパク質分解酵素などの食物を消化する多種の消化酵素（アミラーゼやリパーゼ、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ等）を含む。
【００２４】
また、本明細書において「膵外分泌機能異常」とは、膵臓から十二指腸への膵液の分泌が低下した状態を指す。膵外分泌機能異常には、膵管の閉塞により膵管内に膵液が鬱滞する「膵液の通過障害」、及び腺房細胞での膵液の生産量が低下する「膵液の産生障害」が含まれる。
【００２５】
膵外分泌機能異常は、慢性膵炎、膵腫瘍、及び膵石症等の様々な膵疾患の発症により、引き起こされることが知られている。
【００２６】
例えば、慢性膵炎は、進行度により代償期、非代償期、その途中過程である移行期の3期に分けられるが、進行度に応じて異なる膵外分泌機能異常が引き起こされる。発病初期の代償期では、膵管の狭窄や膵石により膵管が閉塞し、これにより膵液の流れが阻害される。その結果、膵管の内圧が上昇し、膵消化酵素が血中へ逸脱する。この時期の膵外分泌機能異常は、腹痛や背部痛を伴う軽度な症状を示す。ただし、膵臓が依然として膵液を産生する能力をかなり保っているため、内視鏡的治療法により狭窄や膵石を除去することにより治療回復が可能である。一方、非代償期では、膵管内で鬱滞した膵酵素が活性化され、その結果、自家消化により膵実質の荒廃が進行する。そのため、膵液の産生能力は著しく障害を受け、膵外分泌機能不全を呈する。この時期の主な症状は、食物の消化不良であり、膵内分泌機能の異常から、膵性糖尿病を合併するケースもある。
【００２７】
慢性膵炎は、エコー、CT、MRI等の画像検査によって診断される。膵管内の膵石等の特徴的な画像所見、膵実質の脱落と線維化等の特徴的な組織所見があれば、慢性膵炎と確定される。特徴的な組織所見が確認できない場合、反復する上腹部痛発作、血中／尿中膵酵素値、BT-PABA検査値などを指標に診断される。
【００２８】
また、膵管上皮細胞から発生する膵管癌によっても膵外分泌機能異常は生じる。これは、膵管癌による膵管狭窄から随伴性膵炎が引き起こされるためと考えられている。
【００２９】
さらに、膵外分泌機能異常は、膵疾患患者に対する治療により促進または解消される。膵疾患患者に対する治療としては、食事療法等の生活習慣の改善、膵切除手術、放射線治療、及び化学療法等が挙げられる。例えば、軽度から中程度の慢性膵炎の一般的な治療法は、節酒、低脂肪食、及びタンパク質摂取の制限等の食事療法や精神的ストレスの改善である。場合によっては、膵石に対する対外衝撃波結石破砕療法や内視鏡治療、及び膵管狭窄や膵仮性嚢胞に対するドレナージ療法が施される。より進行した急性憎悪の慢性膵炎や急性膵炎に対しては、前記食事療法に加え、初期の十分な輸液、並びに腹痛を抑える鎮痛剤及び膵酵素の活性を抑えるタンパク質分解酵素阻害剤の投与がなされる。一方、膵管癌を含む膵腫瘍の治療に際しては、まず、膵切除による治療が検討される。特に、膵管癌については、外科的な膵切除が唯一の根治療法とされている。しかし、動脈浸潤等の影響により切除不能な膵管癌については、ゲムシタビン等を用いた化学療法や放射線療法が行われる。これらの治療の結果によっては、膵液の産生細胞が損傷受けたことにより膵液の生産障害が引き起こされたり、逆に膵管の閉塞が解消されることにより膵液の通過障害が回復するケースがある。膵疾患の治療後には、治療後の膵臓が膵液の産生障害を引き起こしているかどうかを評価し、膵消化酵素補充薬の投与の必要性や投与量が決定される。
【００３０】
本明細書において、「被験体」とは、膵外分泌機能異常の検出対象となる検体であって、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトが該当する。本明細書において、被験体がヒトの場合には、以降、特に「被験者」とする。
【００３１】
本明細書において「健常体」とは、少なくとも膵外分泌機能異常のない個体、好ましくは健康な個体をいう。健常体は、被験体と同一の生物種であることを要する。例えば、検出に供する被験体がヒト（被験者）の場合には、健常体もヒト（本明細書では、以降「健常者」とする）でなければばらない。健常体の身体的条件は、被験体と同一又は近似することが好ましい。身体的条件とは、例えば、ヒトの場合であれば、人種、性別、年齢、身長、体重等が該当する。
【００３２】
本明細書において「ＡＰＯＡ２タンパク質」とは、各生物種ＡＰＯＡ２タンパク質が該当するが、好ましくはヒト由来のＡＰＯＡ２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１６３４．１）である。具体的には、配列番号１又２で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来の野生型ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント、それらの天然変異体、及びそれらの断片が含まれる。
【００３３】
本明細書において前記「ＡＰＯＡ２タンパク質(の)バリアント」とは、ヒト又は動物の血液（血漿、血清を含む）、又は他の体液中に存在し得る、ＡＰＯＡ２タンパク質の異なる分子形態を意味する。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質においてＣ末端領域の構造が異なるＡＰＯＡ２タンパク質、又はそれらの天然変異体が該当する。具体的には、例えば、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、Ｃ末端領域のアミノ酸配列がＡＴＱで終わるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、前記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる、Ｃ末端領域のアミノ酸配列がＡＴで終わるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及びＣ末端領域のアミノ酸配列がＡで終わるＡＰＯＡ２−Ａタンパク質等のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントがこれに該当する。
【００３４】
本明細書において「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と９０％以上、９２％以上又は９４％以上、好ましくは９５％以上又は９６％以上、より好ましくは９７％以上、一層好ましくは９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するものをいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を最大の一致度となるように必要に応じてギャップを導入して整列（アラインメント）させたときに、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数（ギャップ数も含む）に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。「複数個」とは、２〜１０の整数、例えば、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３の整数をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体（スプライスバリアント）等が挙げられる。また、前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するＡＰＯＡ２タンパク質と実質的に同等な構造又は性質を有し得るからである。保存的アミノ酸とは、同じアミノ酸群に分類されるアミノ酸どうしの関係をいう。前記アミノ酸群には、非極性アミノ酸群（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）、極性アミノ酸群（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸群（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸群（アルギニン、ヒスチジン、リジン）、非荷電アミノ酸群（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐鎖アミノ酸群（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸群（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等が知られている。
【００３５】
前記「それらの断片」とは、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント、及びそれらの天然変異体のＣ末端領域を含むＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント及びその変異体の断片をいう。具体的には、ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント及びその変異体のプロテアーゼ消化物等がこれに該当する。
【００３６】
２．抗ＡＰＯＡ２抗体及びその断片
２−１．抗ＡＰＯＡ２抗体
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２抗体には、抗ＡＰＯＡ２末端抗体（抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体、及び抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体を含む）、及び抗ＡＰＯＡ２非末端抗体が含まれる。以下、各抗体について説明をする。
【００３７】
（１）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体
「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体」は、抗ＡＰＯＡ２末端抗体の一つで、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に存在するエピトープを特異的に認識し、かつ結合することができる抗体、又はその断片をいう。
【００３８】
本明細書において「Ｃ末端領域（カルボキシル末端領域）」とは、アミノ酸配列においてＣ末端のアミノ酸及びその周辺の連続する数アミノ酸を含む６〜２５アミノ酸、好ましくは８〜２０アミノ酸又は１０〜１７アミノ酸からなる領域をいう。
【００３９】
本明細書において「特異的に認識し、かつ結合する」とは、他のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとの交差反応性が無いか又は極めて弱いため、他のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに対して認識も結合もできないか、又はほとんどしないことを意味する。具体的には、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するが、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域及びＡＰＯＡ２−Ａタンパク質のＣ末端領域には結合を示さない抗体をいう。
【００４０】
（２）抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体
「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体」は、抗ＡＰＯＡ２末端抗体の一つで、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に存在するエピトープを特異的に認識し、かつ結合することができる抗体、又はその断片をいう。具体的には、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域に特異的に結合するが、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域、及びＡＰＯＡ２−Ａタンパク質のＣ末端領域には結合を示さない抗体をいう。
【００４１】
（３）抗ＡＰＯＡ２非末端抗体
「抗ＡＰＯＡ２非末端抗体」とは、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントの全長アミノ酸配列において、前記Ｃ末端領域以外の領域に存在するエピトープを認識し、結合する抗ＡＰＯＡ２抗体をいう。つまり、抗ＡＰＯＡ２非末端抗体と、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体又は抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体では、それぞれの認識するエピトープが完全に異なる。
【００４２】
なお、抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、「非末端」抗体と称するが、これは抗ＡＰＯＡ２末端抗体に対する便宜的な名称である。したがって、Ｃ末端領域以外に存在するエピトープであれば特に限定はなく、Ｎ末端に存在するエピトープを認識し、結合する抗体も抗ＡＰＯＡ２非末端抗体に含まれ得る。
【００４３】
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、ある特定のＣ末端配列を持つＡＰＯＡ２タンパク質に対する結合活性と、そのＡＰＯＡ２タンパク質とは異なるＣ末端配列を持つＡＰＯＡ２タンパク質に対する結合活性を比較した場合に、両者の結合活性がほぼ同等であり、かつ、前記抗ＡＰＯＡ２末端抗体のＣ末端領域への結合を阻害しないものが好ましい。つまり、本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、バリアント特異性がないものが好ましい。具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体」と、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する「抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体」がＡＰＯＡ２タンパク質に対して同等の結合活性を有し、またいずれの抗体も抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体や抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体のＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域への結合を阻害しないことが挙げられる。
【００４４】
２−２．抗体の種類
（１）モノクローナル抗体
抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体、及び抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体又はその断片のいずれであってもよい。大量生産を可能にするため、及び均質の効果を得るためには、モノクローナル抗体が好ましい。
【００４５】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、単一の免疫グロブリンからなる抗体、又はそのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＦＲ」とする）及び相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＣＤＲ」とする）を含み、特定の抗原（エピトープ）を特異的に認識し、かつ結合することのできる抗体をいう。
【００４６】
典型的な免疫グロブリン分子は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる２本のポリペプチド鎖一組がジスルフィド結合によって２組相互接続された四量体として構成される。重鎖は、Ｎ末端側の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＨ」とする）とＣ末端側の重鎖定常領域（Ｈ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＨ」とする）からなり、軽鎖は、Ｎ末端側の軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域：以下、「ＶＬ」とする）とＣ末端側の軽鎖定常領域（Ｌ鎖Ｃ領域：以下、「ＣＬ」とする）からなる。このうち、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で特に重要である。このＶＨ及びＶＬは、いずれも約１１０個のアミノ酸残基からなり、その内部に抗原との結合特異性に直接関与する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、可変領域の骨格構造として機能する４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を有している。ＣＤＲは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定することで知られている（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｖｏｌ．１、ｅｄｓ．５、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。定常領域のアミノ酸配列が種内抗体間ではほとんど一定なのに対して、ＣＤＲのアミノ酸配列は各抗体間において変異性が高く、それ故、超可変領域（Ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれている。可変領域において、前記ＣＤＲとＦＲは、Ｎ末端からＣ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。免疫グロブリン分子内においてＶＬ及びＶＨは、相対して二量体を形成することによって抗原結合部位を形成している。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスが知られているが、本発明で用いる抗体は、いずれのクラスであってもよい。好ましくはＩｇＧである。
【００４７】
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域には特異的に結合するが、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質には結合性を示さない。このような抗体の具体的な例としては、例えば、後述する実施例１に記載の、抗体クローン名「７Ｆ２」及び「６Ｇ２」で表される抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体クローン等が挙げられる。７Ｆ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号３で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号４で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号５で示されるアミノ酸配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号７で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる。また、６Ｇ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号９で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１０で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる。これ以外にも、同様の結合性を示す抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端ポリクロ―ナル抗体であってもよい。抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体は市販の抗体を利用することもできる。
【００４８】
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域には特異的に結合するが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質には結合性を示さない。例えば、後述する実施例で使用した抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクロ―ナル抗体や、それと同様の結合性を示す抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端モノクロ―ナル抗体が挙げられる。抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体は市販の抗体を利用することもできる。
【００４９】
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント（すなわち、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質）に対する結合活性を比較した場合、結合活性が同等であるものが好ましい。具体的な例としては、抗体クローン名「ＭＡＢ１」及び「ＭＡＢ２」で表される抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体クローン等が挙げられる。ＭＡＢ１クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１６で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号１８で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号１９で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２０で示されるアミノ酸配列からなる。また、ＭＡＢ２クローンは、重鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２２で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなり、かつ軽鎖におけるＣＤＲ１が配列番号２４で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２５で示されるアミノ酸配列、そしてＣＤＲ３が配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなる。これ以外にも、後述する実施例で使用した抗ＡＰＯＡ２非末端ポリクロ―ナル抗体が挙げられる。抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は市販の抗体を利用することもできる。
【００５０】
（２）抗体断片
前記「ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体又はその断片」における「その断片」とは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の部分断片（抗体断片）であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも１組のＶＬとＶＨを有するポリペプチド鎖、又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。Ｆａｂは、パパインによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＮ末端側で切断されることによって生じる断片であって、ＶＨ及びＣＨを構成する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）のうちＶＨに隣接するＣＨ１からなるポリペプチドと、軽鎖から構成される。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＣ末端側で切断されることによって生じるＦａｂ’の二量体である。Ｆａｂ’は、Ｆａｂよりもヒンジ部を含む分だけＨ鎖が若干長いが実質的にはＦａｂと同等の構造を有する（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ ｅｄ．、３ｄ ｅｄ．、１９９３）。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原（すなわち本明細書においてはＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアント）と特異的に結合する能力を有している。さらに、本発明の抗体断片は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３４８、５２２−５５４参照）であって、かつ抗原結合能力を有しているものが含まれる。この他、例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ Ｅｄ．、１９９８、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、も参照されたい。
【００５１】
（３）合成抗体
本発明で用いる抗体は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって、合成したものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された合成抗体が挙げられる。具体的には、限定はしないが、本発明で用いるモノクローナル抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ参照）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、ＶＬ及びＶＨは、通常別々のポリペプチド鎖（Ｌ鎖とＨ鎖）上に位置する。一本鎖Ｆｖは、これらの可変領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖にＶＬ及びＶＨを包含した構造を有する合成抗体である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノムやプラスミド等のベクターに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基礎とした構造を有する合成抗体である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８）。例えば、前記リンカーの長さが約１２アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Ｆｖ内の２つの可変部位は、立体構造上、自己集合できないことから、機能的な抗原結合部位を形成することができない。しかし、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、２つの一本鎖Ｆｖを相互作用させることにより、一方のＦｖ鎖のＶＬが他方のＦｖ鎖のＶＨと集合可能となり、全体で２つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Ｍａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ、２００５、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２６：６４９−６５８）。さらに、一本鎖ＦｖのＣ末端にシステイン残基を付加させることにより、２本のＦｖ鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる（Ａｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：２１−２７）。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していても構わない。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体構造及び四量体構造を有する。それぞれ三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
【００５２】
（４）修飾抗体
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片は、修飾することができる。ここでいう修飾は、抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片がＡＰＯＡ２タンパク質と特異的結合活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体又はその断片を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。前記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。また、前記抗体のグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を調整するために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
【００５３】
２−３．抗ＡＰＯＡ２抗体の作製
２−３−１．免疫原の調製
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２抗体を作製する場合には、まず免疫原（抗原）としてのＡＰＯＡ２タンパク質又はその断片を調製する。
【００５４】
（抗ＡＰＯＡ２末端抗体用免疫原の作製）
抗ＡＰＯＡ２末端抗体を作製する場合には、免疫原として各ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが必要である。
【００５５】
抗原用ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、配列番号１又は２のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域の連続した６アミノ酸以上のアミノ酸配列を含む限り、特に限定はしない。例えば、天然型ＡＰＯＡ２タンパク質、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質、又は合成ＡＰＯＡ２タンパク質のいずれのＡＰＯＡ２タンパク質由来のバリアントも用いることができる。ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、配列番号１又は２のアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により合成することができる。例えば、以下の方法によって調製することができる。
【００５６】
天然型ＡＰＯＡ２タンパク質は、血液（血清、及び血漿を含む）のような体液をはじめとする生物試料、又は培養細胞の培養上清から公知のタンパク質分離・精製技術、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いて回収することで入手できる。
【００５７】
組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した微生物内、昆虫細胞内、又は動物細胞内で発現させた後、当該細胞から公知のタンパク質分離・精製技術を用いて回収することで入手できる。なお、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質の具体的な調製方法については、後述する。
【００５８】
合成ＡＰＯＡ２タンパク質は、例えば、公開されたＡＰＯＡ２タンパク質のアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば、固相ペプチド合成法等により合成することで入手できる。この合成ＡＰＯＡ２タンパク質には、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のキャリアータンパク質に連結させてもよい。
【００５９】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの断片を免疫原とする場合も、天然型ＡＰＯＡ２タンパク質断片、組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質断片、又は合成ＡＰＯＡ２タンパク質断片のいずれを使用することもできる。例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質断片としては、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、Ｃ末端を含む６以上、好ましくは１０アミノ酸以上、好ましくは１８アミノ酸以上、より好ましくは３０アミノ酸以上の連続したアミノ酸残基を含むオリゴペプチド又はポリペプチドを抗原として使用することができる。例えば、配列番号２７又は２８で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが使用できる。
【００６０】
天然型ＡＰＯＡ２タンパク質の断片を免疫原として用いる場合は、精製したＡＰＯＡ２タンパク質をトリプシン等の適切なプロテアーゼで処理した後、逆相カラムでピークを分離分取する。続いて、各ピークに含まれるペプチドのアミノ酸配列を質量分析器により決定して、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域の連続した６アミノ酸以上の配列を部分配列として含んでいる場合、そのペプチドを免疫原として用いれば良い。
【００６１】
組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質の断片を免疫原として用いる場合は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質において、Ｃ末端アミノ酸残基を含む連続した６アミノ酸以上の部分配列からなるペプチド（Ｃ末端断片）をコードするＤＮＡ配列を発現用ベクターに挿入する。次に、その発現用ベクターを各種細胞に導入し、コードされたＣ末端断片を発現させる。最後に、発現後の細胞からＣ末端断片を常法に従い抽出する。得られたＣ末端断片を免疫源として用いれば良い。
【００６２】
（抗ＡＰＯＡ２非末端抗体用免疫原の作製）
抗ＡＰＯＡ２非末端抗体を作製する場合も、免疫原として各ＡＰＯＡ２タンパク質のいずれかのバリアントが必要である。基本的な調製方法は、前記抗ＡＰＯＡ２末端抗体の作製方法と同じでよい。ただし、ＡＰＯＡ２タンパク質の免疫原として使用可能な領域は、抗ＡＰＯＡ２末端抗体の作製で使用する免疫原としての領域と異なる領域を用いる。すなわち、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の領域の全部又は一部を免疫原として使用すればよい。抗ＡＰＯＡ２非末端抗体を作製する場合も、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の領域のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド又はポリペプチドを抗原として使用することができる。抗ＡＰＯＡ２非末端抗体を作製は、抗ＡＰＯＡ２末端抗体を作製する場合と同様の手順で行えばよい。
【００６３】
（組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質の調製）
以下で、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を含む組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質（組み換え型ＡＰＯＡ２タンパク質バリアント）の調製について詳述する。
【００６４】
（ａ）組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントをコードするポリヌクレオチドの調製
ＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントの発現に用いるベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ３０ａ、ｐＧＥＸ６ｐ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）が挙げられる。また、ファージとしては、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
【００６５】
上記ベクターにＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドを挿入するには、例えば、精製した該ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、それに対応する制限酵素で切断したベクター内部にＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法がある。
【００６６】
（ｂ）ＡＰＯＡ２タンパク質バリアント発現ベクターの宿主内への導入
得られたＡＰＯＡ２タンパク質バリアント発現ベクターを宿主中に導入して、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントを発現し得る形質転換体（バリアント発現形質転換体）を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌（例えば、エシェリキア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、バチルス・サブチリス：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母、昆虫細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．１６０、３３９３−３４０２））等が好適に用いられる。前記ベクターの細菌への導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ、１９８９、Ｖｏｌ．８６、６０７７；ＰＮＡＳ、１９８７、Ｖｏｌ．８４、７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３、Ｖｏｌ．５２、４５６−４６７）、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００６７】
細菌を宿主とする場合は、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするＤＮＡ配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよい。
【００６８】
酵母、動物細胞、昆虫細胞等の真核細胞を宿主とする場合にも、同様に当技術分野で公知の手法に従ってＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現形質転換体を得ることができる。真核細胞において用いられるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント発現ベクターには、プロモーター配列、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントをコードするＤＮＡ配列の他、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が連結されていてもよい。
【００６９】
（ｃ）バリアント発現形質転換体の培養及び組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントの発現
続いて、上記作製したバリアント発現形質転換体を培養する。バリアント発現形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、細菌を宿主とする場合、培地は、細菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、ＬＢ培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、バリアント発現形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養等の好気的条件の下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。バリアント発現形質転換体がＣＨＯ細胞等の動物細胞である場合には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７０】
前記ＡＰＯＡ２タンパク質バリアント発現ベクターがタンパク質発現制御システム（例えば、宿主が細菌の場合、リプレッサー遺伝子及びオペレーター等が該当する）を含むタンパク質発現誘導型ベクターである場合には、前記バリアント発現形質転換体に所定の処理を行い、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントの発現を誘導させる必要がある。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を適宜行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現制御システムは、ｌａｃリプレッサー遺伝子及びｌａｃオペレーターからなるシステムである。本システムは、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）処理により発現を誘導することが可能である。このシステムを含むＡＰＯＡ２タンパク質発現ベクターを有する形質転換体において、目的とするＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを発現させるためには、培地中に適当量（例えば、終濃度１ｍＭ）のＩＰＴＧを添加すればよい。
【００７１】
（ｄ）組換え型ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントの抽出及び／又は回収
培養後、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することにより目的のタンパク質を抽出することができる。また、ＡＰＯＡ２タンパク質バリアントが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを単離精製することができる。ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
【００７２】
２−３−２．抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体、及びそれを産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
【００７３】
（１）免疫原による哺乳動物の免疫
前記２−３−１で得られた免疫原を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
【００７４】
次に、前記調製した免疫原溶液を哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により行い、抗体価が充分な上昇を示せば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
【００７５】
（２）免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定の領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、局所リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウス等由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６２−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳＰ２／０−Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）等が挙げられる。
【００７６】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させるには、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤としては、平均分子量１，５００〜４，０００Ｄａのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ、１９７７、Ｖｏｌ．２６６、５５０−５５２）。
【００７７】
（３）目的とするハイブリドーマの選抜
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地等で適当に希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に２×１０６個／ウェル程度播種し、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
【００７８】
ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマに対して、まず、配列番号１又は２で示すアミノ酸配列を含むＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアントに対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントへの結合活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマについては、交差反応性の試験を行い、許容できるものを選択する。許容できる交差反応性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差反応性を意味する。例えば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナル強度が、バックグラウンドレベルから特異的反応によるシグナル強度の１％未満に抑えられれば、事実上交差反応しないということができる。
【００７９】
ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントへの反応特異性を確認するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。ＥＬＩＳＡ法では、抗原となるＡＰＯＡ２タンパク質の各種バリアント又はその断片を、それぞれ異なるウェルに固相化したマイクロプレートを用意し、これに前記ハイブリドーマの培養液上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウェルを洗浄し、免疫グロブリンに対する２次抗体の標識体を加えてさらに反応させる。再度ウェルを洗浄し、最終的にウェルに結合した２次抗体の標識を利用して測定すれば、培養液上清中に存在する抗体の、抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。
【００８０】
例えば、ＡＰＯＡ２タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質のいずれかのＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体を取得するには、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質自体若しくはＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのＣ末端領域を含むペプチド、及び配列番号１又は２以外のアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２タンパク質（例えば、ＡＰＯＡ２−Ａタンパク質）を用いてＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントにのみ結合する抗体をスクリーニングすればよい。
【００８１】
例えば、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合し、配列番号２示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質やＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端のアミノ酸を欠失させたＡＰＯＡ２−Ａタンパク質とは結合しないか、又はほとんどしない。したがって、それを指標にスクリーニングできる。
【００８２】
また、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端モノクローナル抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合し、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質やＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端のアミノ酸を欠失させたＡＰＯＡ２−Ａタンパク質とは結合しないか、又はほとんど結合しない。したがって、それを指標にスクリーニングできる。
【００８３】
さらに、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸を認識する抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、配列番号１又は２のいずれかで示されるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント若しくはＣ末端の異なるペプチドに対する結合活性を比較した場合に結合活性が同程度であることを指標に、抗体をスクリーニングすることで得ることができる。
【００８４】
ハイブリドーマは組換えＤＮＡ技術を用いて選抜することもできる。まず、前述の方法に従って取得したハイブリドーマ群からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当該技術分野で公知の方法を用いればよい。続いて、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーやランダムプライマーを用いて前記ｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得する。このｃＤＮＡを鋳型に、可変領域をコードする遺伝子の上流にあるシグナル配列の塩基配列と、定常領域側の塩基配列を含むプライマーセットを利用してＰＣＲを行う。得られた増幅産物を適当なクローニングベクターに挿入してクローン化し、そのハイブリドーマが生産する抗体の可変領域遺伝子のライブラリーを得ることができる。より具体的な例として、限定はしないが、Ｎｏｖａｇｅｎ社の提供するＭｏｕｓｅ Ｉｇ Ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行いて、増幅産物（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の提供するＺＥＲＯ ＢＬＵＮＴ ＰＣＲ ＴＯＰＯ ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ部位に挿入してクローン化し、得られたベクター群を可変領域アミノ酸配列をコードする遺伝子ライブラリーとすることができる。次に、前記本発明で開示された可変領域又は各ＣＤＲのアミノ酸配列を元にプローブを設計し、前記ライブラリーからポジティブクローンをスクリーニングすることで、本発明で使用されるモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを選抜することができる。
【００８５】
（４）ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体産生             
ハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することによりモノクローナル抗体生産に用いることができる。具体的には、ハイブリドーマを作製する際の融合パートナーに用いた細胞由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、モノクローナル抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、ＳＰ２／０細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後１０日間を経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に接種することにより、モノクローナル抗体を含む腹水液を回収できる。
【００８６】
また、ハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことによりモノクローナル抗体生産に用いることができる。具体的には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のハイブリドーマＳＦＭ培地中に１×１０５細胞／ｍＬとなるようにハイブリドーマを接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することによりモノクローナル抗体を含む培養液上清を得ることができるが、この限りではない。
【００８７】
（５）組換え抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体又はその断片の組換えＤＮＡ操作による作製方法
本発明で用いる抗体又はその断片は、当該抗体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列情報を利用して、組換えＤＮＡ操作によって得ることもできる。
【００８８】
抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来、例えば、上記手法で取得した抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の抗体における可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を用いて、ＶＨ及びＶＬの塩基配列を任意のＣＬ、及びＣＨをコードする塩基配列にそれぞれ連結し、それぞれのポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させることもできる。また、ＣＤＲグラフト抗体技術を用いて、上記手法で取得した抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の抗体における可変領域のアミノ酸配列のうち、各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをヒトＦＲ配列のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと所定の順序で連結し、適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させてもよい。このとき重鎖と軽鎖とが同一宿主細胞内で発現し、重鎖／軽鎖からなる二量体として産生できるようにすると便利である。具体的には、例えば、軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明で用いる抗体を得ることもできる。又は、上記可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそのまま適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、免疫グロブリン分子の断片として発現させることもできる。あるいは、上述したように、前記アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨ、又は軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適当なリンカーで連結してファージに組み込んだ一本鎖Ｆｖとして、又はダイアボディ等の合成抗体断片として発現させてもよい。その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体をファージ表面に発現させるファージディスプレイ抗体技術（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９９５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１−５０、国際公開ＷＯ９７／１３８４４号、同ＷＯ９０／０２８０９号）により、人工的に重鎖、軽鎖をコードする遺伝子をシャッフリングさせ多様化した一本鎖Ｆｖ抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。
【００８９】
組換え抗ＡＰＯＡ２抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの調製、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターの宿主導入法については、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて行えばよい。目的とする組換え抗ＡＰＯＡ２タンパク質抗体又はその断片は、形質転換細胞の培養液中又は当該細胞内から得ることができる。
【００９０】
免疫グロブリン発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、ＳＶ４０ ｖｉｒｕ ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクター）等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＶ ｂａｓｅｄベクターの１種であるＢＣＭＧＳ Ｎｅｏベクターは、ＣＯＳ７細胞等に形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」、村松正実及び岡山博人編、実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック、１９９１、羊土社、２９７−２９９）。
【００９１】
前記ベクターは、抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの他に、前記抗体又はその断片を発現する上で必要な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、スプライシング部位）、又は、必要であれば選択マーカーを含むことができる。
【００９２】
形質転換の宿主としては、上記「２−３−１．免疫原の調製」に記載した宿主の他、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）細胞（Ｅｕｒｏｐｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｐｒｅｖｉｅｗ（１９９６） Ｖｏｌ．５、５１２−５１９；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ（１９９０）Ｖｏｌ．５０、１４９５−１５０２）が好適に用いられる。
【００９３】
本明細書における抗体又はその断片を発現するベクターを含有する宿主細胞は、常法に従って培養を行うことにより、その培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。具体的には、ＣＨＯ細胞を宿主とした場合には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることができる。また、例えば、宿主細胞を大腸菌とした場合には、ＬＢ培地等大腸菌の培養に用いられる一般的な培地に接種して培養し、タンパク質の発現を誘導することにより、培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生することができる。
【００９４】
発現産物である抗体又はその断片が定常領域を含む場合には、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて培養液上清や、細胞破砕液から精製・回収することができる。一方、可変領域のみで構成され、定常領域を含まない状態で発現させた場合には、前記精製方法は適用できないので、他の適当な精製方法を応用する。例えば、そのＣ末端にヒスチジンタグ等の精製に有利なタグ配列を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが可能である。タグとの融合タンパク質ではない場合は、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったタンパク質精製の常法に従って精製することができる。
【００９５】
本発明で使用されるモノクローナル抗体又はその断片は、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアント又はその断片に対する特異性を確認するため、前述のように使用前に予め他のバリアントとの交差反応性を検証しておくことが好ましい。例えば、本発明で用いる抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体又はその断片において、交差反応性を確認すべき抗原は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−Ａタンパク質である。
【００９６】
また、前記タンパク質以外にも、部分構造がＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントと共通する他のタンパク質についても本発明で使用される抗体又はその断片の交差反応性を確認しておくことがより好ましい。交差反応の確認には、例えば、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡ法を使うことが可能である。反応特異性を試験すべき抗体、すなわち、抗ＡＰＯＡ２末端抗体、及びその断片とＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとの反応の場に、交差反応性を確認すべき他の抗原タンパク質を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差反応性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差反応性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
【００９７】
２−３−３．抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体の作製
抗ＡＰＯＡ２ポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の方法によって作製することができる。免疫原及び哺乳動物の免疫については、前記「２−３−２．抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法」に記載の方法に準じて行えばよい。以下に、抗ＡＰＯＡ２モノクローナル抗体の作製方法と異なる点を中心に抗ＡＰＯＡ２末端ポリクロ―ナル抗体の取得法を示す。
【００９８】
抗ＡＰＯＡ２末端ポリクローナル抗体を作製するためには、まず、特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアント配列上の少なくとも６アミノ酸以上の長さを持つＣ末端断片、例えば配列番号２７又は２８で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。次に、前記調製した免疫原溶液を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギ等に投与し、免疫する。免疫原溶液の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路等により適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇの免疫原を含んでいればよい。免疫原溶液の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は１５０ｍＭの塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行い、抗体価の上昇が充分見られたとき、免疫原溶液を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。免疫後は、血液からＡＰＯＡ２タンパク質を認識するポリクローナル抗体を含む抗血清が回収できる。
【００９９】
２−３−４．抗ＡＰＯＡ２抗体の精製
（１）ペプチド固定化カラムの作製
ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチド、及びＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチドのＣ末端にアミド基を付加したペプチドをそれぞれ固定化したアフィニティーカラムを作製する。詳しい方法は「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第２版（秀潤社）に記載されている。アフィニティーカラムに使用する担体は、ホルミルセルロファインやＣＮＢｒアガロースのように、担体上の官能基をペプチドのアミノ基へ結合可能なもの、若しくは担体に共有結合させたマレイミド基を介して、ペプチド配列上のシステイン残基へ結合可能なものなどが利用可能である。また、固定化するペプチドの長さは、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端を含む限り、６アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上、好ましくは１８アミノ酸以上、より好ましくは３０アミノ酸以上である。
【０１００】
（２）抗体精製
抗ＡＰＯＡ２抗体は、前記腹水液、細胞液上清、又は抗血清からペプチド固定化アフィニティーカラムを用いて精製することができる。例えば、前記抗血清を適切な緩衝液で希釈し、抗血清に含まれるＩｇＧ抗体を、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域ペプチドを固定化したアフィニティーカラムに吸着させ、この吸着画分を回収する。続いて、Ｃ末端をアミド化したＡＰＯＡ２タンパク質ペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いて、ペプチドのＣ末端領域以外への結合性を示すイムノグロブリンを吸着除去する。最終的に、この非吸着画分を特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを特異的に認識する抗ＡＰＯＡ２抗体として取得する。
【０１０１】
３．膵外分泌機能異常の検出方法
本発明の態様は、膵外分泌機能異常をインビトロで検出する方法に関する。本発明は、被験体の体液中に存在するＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定し、その量に基づいて被験者の膵外分泌機能異常の有無を決定することを特徴とする。
【０１０２】
本発明の方法は、（１）膵外分泌機能異常検出用マーカーの測定工程、及び（２）膵外分泌機能異常の決定工程を含む。以下、それぞれの工程について詳細に説明をする。
【０１０３】
３−１．膵外分泌機能異常検出用マーカーの測定工程
「膵外分泌機能異常検出用マーカーの測定工程」とは、被験体由来の体液中に存在する本発明の膵外分泌機能異常検出用マーカー、すなわち、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、又はその断片の量をインビトロで測定する工程である。
【０１０４】
本明細書において「体液」とは、膵外分泌機能異常の検出のために供される試料であって、生物学的流動体を意味する。体液は、本発明で用いる膵外分泌機能異常検出用マーカーが含まれる可能性のある生物学的流動体であればよく、特に限定はされない。例えば、血液、尿、リンパ球培養上清、髄液、消化液（例えば、膵液、大腸液、食道腺分泌液、唾液を含む）、汗、腹水、胸水、関節液、鼻水、涙、膣液、精液等が含まれる。好ましくは、血液又は尿である。本明細書中、「血液」は、血漿及び血清を含み、全血も好ましく用いることができる。全血は、静脈血、動脈血又は臍帯血等の種類を問わない。体液は、同一個体から得られる異なる二以上の組合せであってもよい。本発明の膵外分泌機能異常の検出方法は、侵襲性の低い血液や尿からも検出可能であることから、簡便な検出法として非常に有用である。
【０１０５】
「被験体由来の体液」とは、被験体から採取された体液である。被験体由来の体液は、被験体から採取されたものを直ちに本発明の方法に供してもよいし、採取後、直接、又は適当な処理を施した後に、冷蔵又は凍結したものを本発明の方法に供する前に、室温に戻して使用してもよい。冷蔵又は凍結前の適当な処理としては、例えば、体液が血液の場合であれば、採取した全血にヘパリン等を添加して抗凝固処理を施した後に血漿若しくは血清として分離すること等が含まれる。これらの処理は、当該分野で公知の技術に基づいて行なえばよい。
【０１０６】
本明細書において「ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量」とは、被験体由来の体液中に存在する前記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおけるそれぞれの分量をいう。この分量は、絶対量又は相対量のいずれであってもよい。絶対量の場合、所定の体液量中に含まれる前記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの質量又は容量が該当する。相対量の場合、例えば、標準物質を使用し、その標準物質の測定値に対する被験体由来の２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定値の相対的な値をいう。例えば、濃度、蛍光強度、吸光度等が挙げられる。
【０１０７】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量は、インビトロで公知の方法を用いて測定することができる。例えば、２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのそれぞれと特異的に結合可能な物質、すなわちＡＰＯＡ２末端結合分子を用いて測定する方法が挙げられる。ＡＰＯＡ２末端結合分子には、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱのＣ末端領域と特異的に結合可能なＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子と、ＡＰＯＡ２−ＡＴのＣ末端領域と特異的に結合可能なＡＰＯＡ２−ＡＴ末端結合分子が含まれる。
【０１０８】
本明細書において「特異的に結合可能」とは、ある物質が、本発明の標的であるＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントのみと実質的に結合し得ることを意味する。この場合、特定のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの検出に影響を与えない程度の非特異的な結合が存在してもよい。
【０１０９】
「ＡＰＯＡ２末端結合分子」には、例えば、ＡＰＯＡ２結合タンパク質やＡＰＯＡ２結合核酸が挙げられる。
「ＡＰＯＡ２結合タンパク質」には、例えば、抗ＡＰＯＡ２抗体が挙げられる。より具体的には、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを抗原とし、Ｃ末端領域の構造の違いを認識して結合する「抗ＡＰＯＡ２末端抗体」、好ましくは配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むヒトＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを抗原とした時、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのいずれか１種のみを認識して結合する「抗ヒトＡＰＯＡ２末端抗体」又はそれらの抗体断片である。あるいは、それらの化学修飾誘導体であってもよい。ここで、「化学修飾誘導体」とは、例えば、前記抗ＡＰＯＡ２末端抗体又はその抗体断片において、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントとの特異的な結合活性を獲得又は保持する上で必要な機能上の修飾、又は前記抗ＡＰＯＡ２末端抗体又はその抗体断片を検出する上で必要な標識のための修飾のいずれをも含む。
【０１１０】
ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの測定に用いる抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよい。特異的検出を可能にするため、好ましくはモノクローナル抗体である。例えば、ＡＰＯＡ２末端と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２末端ポリクローナル抗体等は、前述の方法によって作製することができる。
【０１１１】
「ＡＰＯＡ２結合核酸」には、例えば、ＡＰＯＡ２核酸アプタマーが挙げられる。「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、及び三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。具体的には、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおけるＣ末端領域の構造の違いを認識して結合する「ＡＰＯＡ２末端アプタマー」、好ましくは配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むヒトＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントを標的分子とした時、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントのいずれか１種のみを認識して結合する「ヒトＡＰＯＡ２末端アプタマー」又はそれらの抗体断片、あるいはＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントにおけるＣ末端以外の領域を認識して結合する「ＡＰＯＡ２非末端アプタマー」である。
【０１１２】
本工程で使用する核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を用いた試験管内選別法が挙げられる。ＳＥＬＥＸ法とは、例えば、ＲＮＡアプタマーを分離する場合であれば、「ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のＲＮＡ分子によって構成されるＲＮＡプールから標的分子に結合したＲＮＡ分子を選択する。回収したＲＮＡ分子をＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅した後、得られたｃＤＮＡ分子を鋳型として転写を行い、選択されたＲＮＡ分子の増幅産物を得て、それを次のラウンドのＲＮＡプールにする。」という一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いＲＮＡ分子を選択する方法である。一方、ＳＥＬＥＸ法で、ＤＮＡアプタマーを分離する場合も基本手順は同じであるが、回収したＤＮＡ分子を増幅する際にＲＴ−ＰＣＲ反応を経る必要がない。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、２０〜８０塩基、プライマー結合領域は、それぞれ１５〜４０塩基の範囲が好ましい。標的分子への特異性を高めるためには、予め標的分子に類似する分子とＲＮＡプール又はＲＮＡプールとを混合し、標的分子と結合しなかったＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子からなるプールを用いればよい。標的分子をＡＰＯＡ２タンパク質又はＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントとして、上記の方法を実行することによって最終的に得られた核酸分子をＡＰＯＡ２核酸アプタマーとして利用すればよい。なお、ＳＥＬＥＸ法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Ｐａｎら（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. １９９５, Ｕ.Ｓ.Ａ．９２: １１５０９−１１５１３）に準じて行えばよい。
【０１１３】
核酸アプタマーは、一般に、ＲＮＡアプタマーとＤＮＡアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は特に限定はしない。例えば、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせで構成されるアプタマー等を含む。一般的にはＲＮＡアプタマーが頻用されるが、安定性、化学合成における製造コスト、及びアプタマー製造における工程数の点ではＤＮＡアプタマーが優れている。
【０１１４】
本工程で使用する核酸アプタマーは、標的分子への結合能を阻害しない範囲において、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、Ｃｙａｎｉｎｅ７、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等）、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等の標識物質により標識することもできる。
【０１１５】
２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントは、ＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントにのみ結合する抗ＡＰＯＡ２抗体を用いた免疫学的方法により、又はＡＰＯＡ２タンパク質の特定のバリアントにのみ結合するＡＰＯＡ２末端アプタマーを用いた結合方法により測定可能である。
【０１１６】
免疫学的方法は、抗ＡＰＯＡ２抗体を用いる限り、どのような方法でも良いが、好ましくは、抗ＡＰＯＡ２末端抗体を固相化抗体又は標識抗体として用い、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端以外の領域と結合するもう一つの抗体（抗ＡＰＯＡ２非末端抗体）と組み合わせて行うＥＬＩＳＡ法である。例えば、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体を標識抗体として用い、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端抗体を固相化抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定できる。また、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体を固相化抗体として用い、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を標識抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定可能である。抗ＡＰＯＡ２非末端抗体は、Ａｂｃａｍ社、ＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤ社等より市販されており、それらを利用することもできる。
【０１１７】
ＡＰＯＡ２アプタマーを用いた結合方法も、基本的には免疫学的方法と同様のアプローチで測定すればよい。例えば、ＡＰＯＡ２末端アプタマーを固相化アプタマー又は標識アプタマーとして用い、ＡＰＯＡ２非末端アプタマーと組み合わせて行う方法である。
【０１１８】
３−２．膵外分泌機能異常の決定工程
「膵外分泌機能異常の決定工程」とは、前記膵外分泌機能異常の検出用マーカー測定工程で測定されたタンパク質の量に基づいてインビトロで前記膵外分泌機能異常の有無を決定又は評価する工程である。測定された膵外分泌機能異常の検出用マーカー、すなわち、被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量）を測定して、膵外分泌機能異常の有無を決定する。本決定工程によれば、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量、又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量のいずれか一方のみを用いて決定しても良いが、両者を組み合わせることにより、より精度高く膵外分泌機能異常の有無を決定できる。以下、それぞれの決定工程について詳細に説明する。
【０１１９】
膵外分泌機能異常の有無の決定は、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量に基づき行うことができる。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合するＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端結合分子と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合するＡＰＯＡ２−ＡＴＱ非末端結合分子を用いて、被験体の体液試料中におけるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定し、被験体体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱの量が健常者と比べ少ない場合に被験体の膵臓は膵外分泌機能異常を有しており、さらに膵外分泌機能異常が、通過障害であると判断できる。
【０１２０】
膵外分泌機能異常の有無の決定は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量に基づき行うことができる。具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体と、該Ｃ末端領域以外のアミノ酸配列と結合する抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ非末端抗体を用いて、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量を測定し、被験体体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴの量が、健常体と比べて少ない場合には被験体の膵臓は膵外分泌機能の異常を有すると判断できる。また、被験体体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴの量が、健常体と比べ同等以上のときは、被験体の膵臓は少なくとも膵液の産生障害の異常は有していないと判断できる。ここで、被験体が少なくとも産生障害ではないと判断できれば、膵消化酵素補充薬の投与の必要性や投与量を決定する判断材料として有用である。
【０１２１】
上記ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量のみで膵外分泌機能異常の有無を検出した後に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量を測定し、それぞれの結果を組み合わせることによって、膵外分泌機能異常が膵液の通過障害であるか、膵液の産生障害であるかを決定することができる。具体的には、被験体体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質が健常体と比べて少なく、かつ、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が健常体のそれと比較して少ない場合には、膵液の通過障害であると判断できる。一方で、被験体体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質が健常体と比べて少なく、かつ、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量が被験体と比べて同等以上のときには、膵液の産生障害であると判断できる。
【０１２２】
本発明において、被験体の体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の健常体のそれとの比較は、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の値の大小で行うことができる。
【０１２３】
健常体の母集団中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のそれぞれの量の最低値以上の場合に、健常体と「同等以上」と判断してもよく、最低値未満の場合に、「少ない」と判断してもよい。さらに上記「少ない」と判断する場合には、被験体の体液試料中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のそれぞれの量が、健常体の母集団中のそれぞれの量と比較して最低値の２分の１以下の値であることがより好ましい。
【０１２４】
上記方法の他にも、被験体のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又はＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量が、健常体のそれと比較して少ないことを判断する際に、統計学的処理を用い、健常体の値と比較して、統計学的に有意に「少ない」と解析された被験体のみを「健常体の値と比べて少ない」と判断することもできる。統計学的に有意とは、例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１又はｐ＜０．００１の場合が挙げられる。ここで、「ｐ」又は「ｐ値」とは、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「ｐ」又は「ｐ値」が小さいほど、仮定が新に近いことを意味する。「統計学的に有意に差がある」とは、被験体と健常体のそれぞれから得られた膵外分泌機能異常の検出用マーカーの量が統計学的に処理したときに両者間に有意に差があることをいう。健常体との比較において、統計学的に有意に差がある場合、その被験体は膵外分泌機能異常を呈していると評価することができる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定されない。例えば、スチューデント検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【０１２５】
健常体の体液中における膵外分泌機能異常の検出用マーカーの濃度は、被験体の体液中における膵外分泌機能異常の検出用マーカーの濃度を測定する都度、測定することもできるが、予め測定しておいた膵外分泌機能異常の検出用マーカーの濃度を利用することもできる。特に、健常体の様々な身体的条件における膵外分泌機能異常の検出用マーカーの濃度を予め測定しておき、その値をコンピューターに入力してデータベース化しておけば、被験体の身体的条件を当該コンピューターに入力することで、その被験体との比較に最適な身体的条件を有する健常体の膵外分泌機能異常の検出用マーカーの濃度を即座に利用できるので便利である。
【０１２６】
４．膵外分泌機能異常の検出用キット
本発明で用いる「膵外分泌機能異常の検出用キット」とは、膵外分泌機能の異常の有無を評価するために、直接又は間接的に利用されるものをいう。
【０１２７】
本発明のキットは、その構成物として、ＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントに特異的に結合可能なＡＰＯＡ２結合分子、例えば、抗ＡＰＯＡ２末端抗体、及び／又はＡＰＯＡ２末端アプタマーが含まれる。具体的には、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端抗体、及び/又はそれらの化学修飾体を含む抗体、及び／又はＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端アプタマー、ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端アプタマーである。
【０１２８】
抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端抗体の具体例は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質のＣ末端領域と特異的に結合し、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３、４及び５、又は９、１０及び１１、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号６、７及び８、又は１２、１３及び１４、で示されるアミノ酸配列からなる抗ＡＰＯＡ２末端モノクローナル抗体又はその断片が挙げられる。
【０１２９】
さらに、配列番号１で示されるＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又は配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質のＣ末端領域以外のアミノ酸配列を認識し、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６及び１７、又は２１、２２及び２３、で示されるアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９及び２０、又は２４、２５及び２６、で示されるアミノ酸配列からなる抗ＡＰＯＡ２非末端モノクローナル抗体又はその断片が挙げられ、これらの断片のうちから１種類以上のモノクローナル抗体又はその断片を選択して、膵外分泌機能異常の検出用キットに用いることができる。
【０１３０】
上記ＡＰＯＡ２結合分子は、固相担体に結合されていてもよく、この場合、好ましくは検査用ストリップに結合されていてもよい。その他、例えば、標識二次抗体若しくは標識プローブ、さらには標識の検出に必要な基質、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのＡＰＯＡ２タンパク質、及び使用説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１３１】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。但し、本発明は、この実施例によって制限されない。【０１３２】
＜実施例１：血中ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又は血中ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質をバイオマーカーとして利用した用いた膵外分泌機能異常の検出（１）＞
膵管癌患者から得た血清中における標記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量と、膵アミラーゼ濃度との関連性について検証を行った。【０１３３】
インフォームドコンセントを得て収集した、膵管癌患者６名の血清（検体Ａ〜Ｆ）及び健常者１０名の血清を対象に、ＡＰＯＡ２―ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、膵アミラーゼ濃度に基づく膵外分泌機能の検出方法との比較を行った。【０１３４】
（ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定）
血清中のＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定は、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴＱ末端モノクローナル抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識体と、ＡＰＯＡ２タンパク質のＣ末端領域以外の部位を認識する抗ＡＰＯＡ２非末端ポリクローナル抗体（ＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤ社）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識化はＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ  ＫＩＴ−ＳＨを用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。抗ＡＰＯＡ２非末端ポリクローナル抗体をＰＢＳ溶液で２μｇ／ｍＬに調製した後、イムノプレートマキシソープ（ＮＵＮＣ社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔ（０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）を４００μＬ添加して洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ、０.０５％ＴＷＥＥＮ２０、ＰＢＳ）溶液４００μＬを添加して１時間室温で静置した。その後、前記溶液を廃棄し、抗体固相化プレートとした。次に、希釈液を用いて希釈した血漿を、各ウェルに１００μＬずつ添加し１時間室温で反応させた。この際、血漿の希釈倍率は１００００倍とした。ウェル内の抗原溶液を廃棄後、ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を行い、希釈液で０．２μｇ／ｍＬに希釈した抗体７Ｆ２のＰＯＤ標識体１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔ（ピアス社製）による洗浄を行った後、ＴＭＢ溶液１００μＬを添加して酵素反応を行い、０．５Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた測定値に対して、組換え型ヒト由来タンパク質ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の抗原溶液を標品として、血中のタンパク質濃度を算出した。【０１３５】
（ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定）
血清中ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の量の測定は、前記と同じ血清を対象に、前記ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の量の測定と同様に、抗ＡＰＯＡ２−ＡＴ末端ポリクローナル抗体と前記抗ＡＰＯＡ２非末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。抗ＡＰＯＡ２非末端ポリクローナル抗体のＰＯＤ標識化、及びサンドイッチＥＬＩＳＡについても、前記同様に行った。得られた測定値に対して、組換え型ヒト由来タンパク質ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の抗原溶液を標品として、血中のタンパク質濃度を算出した。【０１３６】
（膵アミラーゼ量の測定）
血清中の膵アミラーゼ量の測定は、前記と同じ血清を対象に、Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ａｍｙｌａｓｅ  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ社）を用いて行った。抗体固相化９６穴プレート、洗浄液、ビオチン標識抗膵アミラーゼ抗体及びＰＯＤ-ストレプトアビジンコンジュゲート、検量線作成用膵アミラーゼ標品はすべてキットに付属のものを用いた。血清検体は、キットに付属の希釈液で２０倍に希釈の後、抗体固相化プレートのウェルに５０μＬずつ入れ、１時間反応させた。続いて、前記希釈検体を廃棄し、洗浄液による洗浄を行い、希釈液で希釈したビオチン標識抗膵アミラーゼ抗体を各ウェルに５０μＬずつ加え、また１時間反応させた。さらに、ビオチン標識抗膵アミラーゼ抗体溶液を廃棄し、洗浄液による洗浄を行った。希釈液で希釈したＰＯＤ-ストレプトアビジンコンジュゲートを各ウェルに５０μＬずつ加え、３０分反応させた。その後、ＰＯＤ-ストレプトアビジンコンジュゲート溶液を廃棄し洗浄液で洗浄の後、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を各ウェルに５０μＬずつ加えた。１５分間反応させた後、停止溶液を各ウェルに５０μＬずつ加え反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。検量線作成用膵アミラーゼ標品の測定値から検量線を作成し、各検体ごと得られた測定値から、血清中の膵アミラーゼ濃度を算出した。【０１３７】
表１に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及び膵アミラーゼに関する検体Ａ〜Ｆの各膵管癌患者における血清中の濃度と健常者１０検体の濃度範囲を示す。健常者の濃度範囲は、健常者血清１０検体を対象に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及び膵アミラーゼを測定し、その平均値±１ＳＤを健常者の範囲として示したものである。【０１３８】
膵アミラーゼの濃度は、膵外分泌機能異常の検体においては、健常者の範囲から逸脱する傾向がある。そして、健常者の範囲よりも膵アミラーゼ濃度が低い場合には、膵外分泌異常が膵液の産生障害であると判定でき、膵アミラーゼ濃度が高い場合には、膵外分泌異常が膵液の通過障害であると判定できる。【０１３９】
健常者を対象にした測定から、健常者の範囲は６５．７〜１７７．４（Ｕ／Ｌ）であった。これに対し、膵管癌の検体患者では、検体Ａ、Ｂ、Ｃにおいて健常者の範囲から低下し、検体Ｄにおいては上昇することが分かった。この結果、膵アミラーゼの濃度により、検体Ａ、Ｂ、Ｃの膵液の産生低下と、検体Ｄにおける膵液の通過障害を検出できることが分かった。しかしながら、検体ＥとＦの測定値は健常者の基準値範囲に留まり、膵アミラーゼの測定値からは膵外分泌機能異常を検出できなかった。【０１４０】
一方、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の健常者の範囲はそれぞれ、２６．８〜７６．４μｇ／ｍＬ 、２２．７〜１５８．３μｇ／ｍＬであった。【０１４１】
膵管癌検体を用いた測定では、膵管癌検体Ｄについて、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の濃度が健常者の範囲を下回っていた。これにより、本検体の被験者が膵外分泌機能異常を有しており、その原因が膵液の通過障害であると決定できた。さらに、膵管癌検体Ａ〜Ｃ、Ｅ及びＦについては、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の濃度は健常者と同等かそれ以上であるが、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の濃度が健常者の範囲を下回っていた。これにより、これら検体の被験者が膵外分泌機能異常を有しており、その原因が膵液の産生障害であると決定できた。【０１４２】
以上の結果から、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を用いることにより、膵アミラーゼを用いた方法では検出できなった検体Ｅ，Ｆの検体についても膵外分泌機能異常の可能性を示すことができた。これは、本願発明の検出方法が、膵外分泌機能異常を医学的に判別できる有管法の検査対象を容易に選別できることを示している。【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
＜実施例２：血中ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質又は血中ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質をバイオマーカーとして利用した用いた膵外分泌機能異常の検出（２）＞
膵管癌患者から得た血清中における標記２種のＡＰＯＡ２タンパク質のバリアントの量と、膵アミラーゼ濃度との関連性について検証を行った。
インフォームドコンセントを得て収集した、画像検査により慢性膵炎と診断された患者８名の血漿（検体Ｇ〜Ｎ）及び健常者６０名の血漿を対象に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質とＡＰＯＡ２―ＡＴタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、膵アミラーゼ濃度に基づく膵外分泌機能の検出方法との比較を行った。各ＡＰＯＡ２タンパク質又は酵素の量の測定については、前記実施例１と同様の方法で行った。【０１４５】
表２に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及び膵アミラーゼの検体Ｇ〜Ｎの各慢性膵炎患者における血漿中の濃度と、健常者６０検体における最大濃度及び最小濃度を示す。健常者の濃度範囲は、健常者血漿６０検体を対象に、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質、及び膵アミラーゼを測定し、その平均値±１ＳＤを健常者の範囲として示したものである。【０１４６】
膵アミラーゼの健常者の範囲は３８．７〜８５．９（Ｕ／Ｌ）であった。これに対し、慢性膵炎の検体患者では、検体Ｌにおいて健常者の範囲から低下し、また検体Ｈ、Ｊ及びＭにおいては上昇することが分かった。この結果から、本願発明の検出方法によれば、膵アミラーゼの濃度により、検体Ｌの膵液の産生低下と、検体Ｈ、Ｊ及びＭにおける膵液の通過障害を検出できることが分かった。しかしながら、検体Ｇ、Ｉ、Ｋ及びＮの測定値は健常者の基準値範囲に留まり、膵アミラーゼの測定値からは膵外分泌機能異常を検出できなかった。【０１４７】
一方、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質及びＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の健常者の範囲はそれぞれ、３２．９〜８５．８μｇ／ｍＬ、２８．９〜１５１．５μｇ／ｍＬであった。【０１４８】
慢性膵炎検体を用いた測定では、膵管癌検体Ｈ、Ｊ及びＭについて、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の濃度が健常者の範囲を下回っていた。これにより、本検体の被験者が膵外分泌機能異常を有しており、その原因が膵液の通過障害であると決定できた。さらに、膵管癌検体Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ及びＮについては、ＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質の濃度は健常者と同等かそれ以上であるが、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質の濃度が健常者の範囲を下回っていた。これにより、これら検体の被験者が膵外分泌機能異常を有しており、その原因が膵液の産生障害であると決定できた。【０１４９】
以上の結果から、ＡＰＯＡ２−ＡＴタンパク質とＡＰＯＡ２−ＡＴＱタンパク質を用いることにより、膵アミラーゼを用いた方法では検出できなった検体Ｇ、Ｉ、Ｋ及びＮの検体についても膵外分泌機能異常の可能性を示すことができた。これは、本願発明の検出方法が、膵外分泌機能異常を医学的に判別できる有管法の検査対象を容易に選別できることを示している。【０１５０】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明により、被験者の負担が少なく、かつ簡便な検査法で、効果的に膵外分泌機能異常を検出することができるため、膵外分泌機能の微弱な異常を発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、血液を用いて膵外分泌機能異常を非侵襲的に検出できるため、膵外分泌機能異常を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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