(57)【要約】  本発明の課題は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することである。その解決手段としての本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ）、および／または、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。これらのタンパク質の血液中の存在量の測定は、例えばこれらのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことができる。
2015178237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ）、および／または、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断する、動脈壁肥厚の程度の検知方法。
【請求項２】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血液中の存在量の測定を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量の測定を、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体の、動脈壁肥厚の程度を検知するための使用。
【請求項５】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、動脈壁肥厚の程度を検知するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞などの脳血管疾患や心筋梗塞などの心血管疾患の原因となるアテローム血栓症（ＡＴＩＳ：Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）は、動脈壁肥厚が進行した結果、血管内部に動脈硬化性のプラーク（粥腫）が形成され、内皮の損傷やプラークの破綻などによって血小板が活性化されて血栓が形成されるに至った状態であり、近年、死亡原因となる疾患として著しく増加していることは一般にもよく知られた事実である。従って、そのイベントリスクの判定を正確に行い、リスクが高い患者に対して適切な治療を行うことは、生命の危険や重篤な機能障害の発生を回避する上で非常に重要である。現在、アテローム血栓症の診断は、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像に基づいて行われている。しかしながら、こうした画像による診断は、画像の良し悪しが撮影者の技術によって左右されるため、いずれもゴールドスタンダードになり得ない。こうした点に鑑み、アテローム血栓症の指標となるバイオマーカーの探索が精力的に行われているが（例えば特許文献１）、動脈壁肥厚の程度の指標として用いることができるバイオマーカーは見出されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５１２０９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、バイオマーカーを用いた動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ）とカルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２のそれぞれが、動脈壁肥厚の程度を検知するためのタンパク質バイオマーカーとして有用であり、これらの血液中の存在量が多いほど動脈壁肥厚の程度が強く、これらの血液中の存在量に基づいて、現在、臨床現場において頸動脈硬化の進行度の指標として用いられている頸動脈ＩＭＴ（内膜中膜複合体厚）の程度を階層化することができることを見出した。【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、請求項１記載の通り、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血液中の存在量の測定を、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量の測定を、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
また、本発明は、請求項４記載の通り、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体の、動脈壁肥厚の程度を検知するための使用である。
また、本発明は、請求項５記載の通り、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、動脈壁肥厚の程度を検知するためのキットである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度を検知する方法として、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量を指標とする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づいて、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群を区別することができることを示すグラフである。
【図２】同、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づいて、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることを示すグラフである。
【図３】実施例２における、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度に基づいて、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群を区別することができることと、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。動脈壁肥厚の程度の検知は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のいずれか一方の血液中の存在量に基づいて行ってもよいし、それぞれの血液中の存在量を併用して行ってもよい。
【００１０】
本発明において、動脈壁肥厚の程度を検知するためのバイオマーカーとして用いるＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇは、補体成分であるＣ３ａの分解産物であり、血液中でＣ３ａのＣ末端のアルギニンが切除されることで生成し、Ｃ３ａよりも安定かつ生物活性が低いことが知られている（必要であれば例えば特開２０１０−２１０４０８号公報を参照のこと）。
【００１１】
また、Ｓ１００Ａ１２は、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００タンパク質ファミリーに属し、終末糖化産物ＡＧＥの受容体であるＲＡＧＥへの新規リガンドＥＮ−ＲＡＧＥ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれ、好中球が産生することが知られている（必要であれば例えばＡ．ＫＯＳＡＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００４，８９（１１）：５４２３−５４２８を参照のこと）。
【００１２】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血液中の存在量の測定は、例えば抗原抗体反応を利用する免疫学的手法、具体的には、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法、ラテックス凝集比濁法、フローサイトメトリー法などにより、それぞれの方法の標準的なプロトコルに従って行うことができる。こうした方法に用いる抗体は、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれを特異的に認識する抗体が好適である。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体や公知の抗体であってもよいし、自家作製した抗体であってもよい。抗体は、容易かつ簡便に動脈壁肥厚の程度を検知することができるように、洗浄液などとともにキット化してもよい。
【００１３】
本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法において検知対象とする動脈は、壁肥厚が起こりうる動脈であれば体内のどの部位に存在する動脈であってもよいが、検知対象とする好適な動脈としては頸動脈が挙げられる。検知対象とする動脈が頸動脈の場合、本発明の方法は、例えば次のようにして利用することができる。健康診断などにおいて頸動脈におけるアテローム血栓症のイベントリスクの判定を行うために、頸動脈壁肥厚の程度を知ることを目的として、対象者から採取した血液中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の存在量を、頸動脈壁肥厚の程度が軽度と重度のそれぞれの場合の予め定めた標準存在量（例えば超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像による診断によって確定されたそれぞれの集団の平均存在量）と比較する。比較の結果、対象者の存在量が、壁肥厚の程度が軽度の場合の標準存在量よりも少なければ治療の必要なし、軽度の場合の標準存在量に相当すれば薬物療法を実施する、重度の場合の標準存在量に相当すれば頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）を施行するといったように、治療の必要性の有無を判断したり、治療方針を策定したりする。こうした治療の必要性の有無の判断や治療方針の策定を行う際、現在、アテローム血栓症の診断に利用されている、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像による診断の結果を参考にしてもよい。また、本発明の方法は、治療を行った対象者の治療後のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の血液中の存在量を、治療前の存在量と比較することによる、頸動脈におけるアテローム血栓症に対する治療効果の判定や、対象者のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の血液中の存在量を、以前の存在量と比較することによる、頸動脈におけるアテローム血栓症のイベントリスクの経時的変化の判定などにも利用することもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００１５】
参考例１：標準物質として用いるＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の調製
（Ａ）Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ遺伝子のクローニング
ヒト肝癌細胞株であるＨｕｈ７細胞より、全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてメーカーの推奨する方法に従って精製した。得られた核酸にＣ３ａｄ−ａｓプライマー（５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｇｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃｇｃｇｃ−３’：配列番号１）を加え、ＳｕｐｅｒＳｕｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、メーカーの推奨する条件で、４２℃で１時間逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。【００１６】
得られた反応液にＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で３０分反応させ、混在するＲＮＡを分解した。この反応液の一部を用い、Ｃ３ａ−ｓプライマー（５’−ｇａａｔｔｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｔｃｃｇｔｇｃａｇｃｔｃａｃｇｇａｇａａｇｃｇａａｔｇｇａｃ−３’：配列番号２）とＣ３ａｄ−ａｓプライマーの存在下で、Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる３０回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ遺伝子のｃＤＮＡの増幅を行った。【００１７】
増幅した断片を１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、アガロースゲルから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する方法に従って約２６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ  ｃＤＮＡ）を、メーカーの推奨する方法に従ってｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結反応させた後、得られた連結反応液を用いてＤＨ５α株を形質転換した。アンピシリン耐性で、ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを加えた寒天培地上での平板培養で白色コロニーを形成する形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）にて培養した。培養した菌体からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドを精製した。【００１８】
精製したプラスミドに組み込まれているＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ  ｃＤＮＡの配列は、ベクターに適合したプライマーを用い、ＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ・ＣＯＵＬＴＥＲ）により、メーカーの推奨する方法に従って反応を行い、ＣＥＱ２０００  ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．０、ＢＥＣＫＭＡＮ・ＣＯＵＬＴＥＲ）により解析した。得られたデータを基に、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１．２、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて配列データの解析を行い、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ  ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。【００１９】
（Ｂ）ＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原発現プラスミドの構築
クローニングされたＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇプラスミド０．５μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、約２６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製した。【００２０】
次に、発現ベクターであるｐＡＴｔｒｐＥのプラスミド０．５μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、ｐＡＴｔｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を精製した。【００２１】
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＡＴｔｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片の連結反応を、１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＡＴＰ〕５μｌとＴ４リガーゼ１μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温して行なった。ｐＡＴｔｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドを得るために、得られた連結反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリン耐性で、寒天培地上での平板培養で生育した形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた２ＹＴ培地にて培養した。【００２２】
１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）〕により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、約２６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴｔｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドを選別した。【００２３】
（Ｃ）ＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の発現および精製
ｐＡＴｔｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドをもつ大腸菌ＢＬ２１株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地に接種し、３７℃で９時間培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。得られた培養液を５Ｋｒｐｍで１０分間遠心して集菌した。【００２４】
集めた菌体に、２０ｍｌの０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）を加えて懸濁し、再び遠心して、ＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の発現している菌体を約２ｇ得た。得られた菌体をＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心し、ＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原を含む可溶性画分を得た。得られた可溶性画分に、尿素とジチオスレイトールを、それぞれ最終濃度が６Ｍと２ｍＭになるように添加した後、Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、メーカーの推奨する方法に従ってアフィニティークロマトを行い、ＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原を精製した。【００２５】
参考例２：抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体の作製
（Ａ）ハイブリドーマの作製
抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行った。免疫抗原はＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端１１アミノ酸ペプチド（ＱＨＡＲＡＳＨＬＧＬＡ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートとし、１０μｇ（ペプチド相当）をアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ）とともにＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。２〜４週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したペプチド１０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。【００２６】
最終免疫後３日目にマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４をＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄後、この細胞と脾臓細胞を１：５の細胞数比で混合した。２００×ｇで５分間遠心した後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（Ｍｅｒｃｋ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。【００２７】
得られた融合細胞を、２００×ｇで５分間遠心してＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清およびヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、９６ウエル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、免疫抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望のハイブリドーマを得、限界希釈法により単一クローン化を行い、ハイブリドーマを樹立した。【００２８】
（Ｂ）抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体の作製および解析
（Ａ）で樹立したハイブリドーマの１つ（クローン名：Ｃ３ａｄ−５）を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）を用い、３７℃にて５％炭酸ガス中において７２〜９６時間培養した。培地中に産生されたモノクローナル抗体を精製するため、その培養液を、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。【００２９】
Ｃ３ａｄ−５が産生するモノクローナル抗体について、抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ）により、サブクラスを同定した結果、ＩｇＧ２ａであることがわかった。また、Ｃ３ａｄ−５が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に反応するが、市販のヒトＣ３ａ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に反応しないことから、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体であることがわかった。【００３０】
参考例３：ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体の作製
免疫抗原としてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＮ端側１６アミノ酸ペプチド（ＫＲＭＤＫＶＧＫＹＰＫＥＬＲＫＣ：配列番号４）のＫＬＨコンジュゲートを用いること以外は参考例２と同様にして、所望のハイブリドーマを樹立した。その１つ（クローン名：Ｃ３Ｎ−６）が産生するモノクローナル抗体について、参考例２と同様にしてサブクラスを同定した結果、ＩｇＧ１であることがわかった。また、Ｃ３Ｎ−６が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ精製物および市販のヒトＣ３ａ精製物に反応することから、ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体として用いることができることがわかった。【００３１】
実施例１：Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づく頸動脈ＩＭＴの程度の階層化
頸動脈壁肥厚が認められることでアテローム血栓症およびその危険因子を持つと判断された７７名の患者（ＡＴＩＳ関連患者）と、頸動脈壁肥厚の程度が重度であることから頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）の施行が必要と判断された３９名の患者（ＣＥＡ患者）について、それぞれの患者から同意を得て、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２の血中濃度を測定した。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２の血中濃度の測定は、それぞれ後述するＥＬＩＳＡ法により行った。結果を表１に示す。【００３２】
【表１】
2015178237.tif 000003
【００３３】
ＡＴＩＳ関連患者の７７例とＣＥＡ患者の３９例の両群のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の測定結果を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較したところ、それぞれｐ＜０．０００１とｐ＝０．０１０２で両群を区分することができた（図１）。さらに、頸動脈ＩＭＴの測定を行っているＡＴＩＳ関連患者の７７例とＣＥＡ患者の３１例の合計１０８例について、左右の総頸動脈の遠位壁（ｆａｒ  ｗａｌｌ）の最大ＩＭＴ（ＩＭＴ−Ｃｍａｘ）の合計値で２群（壁肥厚が３ｍｍ未満の軽度な群と３ｍｍ以上の重度な群）に分け、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の測定結果を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較したところ、それぞれｐ＜０．０００１とｐ＝０．０２５４で両群を区分することができた（図２）。この結果は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定による検討においても確認することができた。以上の結果から、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度が高いほど頚動脈壁肥厚の程度が強く、これらの血中濃度に基づいて、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることがわかった。また、上記の２群（肥厚が３ｍｍ未満の軽度な群と３ｍｍ以上の重度な群）の区別の、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度からの予測可能性を、ロジスティック回帰モデルを用いて１０−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎで検証したところ、ＡＢＩ（足関節／上腕インデックス）を説明変数として予測したＲＯＣ曲線のＡＵＣ（曲線下面積）が０．６３６であるのに対して、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の２変数を説明変数として予測したＲＯＣ曲線のＡＵＣは０．７８７であり、前者よりも後者の方が予測精度が高いことから、頚動脈壁肥厚の程度を検知する上において、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度を併用することの有用性を確認することができた。【００３４】
（Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度の測定のためのＥＬＩＳＡ法のプロトコル）
参考例２で作製した抗ヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体（Ｃ３ａｄ−５）を、終濃度が５μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）１ウエルにつき１００μｌづつ分注した。４℃で一晩静置した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「洗浄液」）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを２回洗浄した。その後、０．５％カゼイン−Ｎａを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「ブロッキング液」）０．３５ｍｌをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で４時間静置した。ブロッキング液を除去した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン−Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）９０μｌと、測定試料（血清）または段階的に希釈した標準物質（参考例１で調製したＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原）１０μｌを、それぞれのウエルに添加して１００μｌとし、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した。その後、参考例３で作製したヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体（Ｃ３Ｎ−６）をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識して調製した標識抗体液（０．２Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン−Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した後、基質（オルトフェニレンジアミン）溶液１００μｌを添加し、室温暗所で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９０）を測定することで、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度を測定した。【００３５】
（Ｓ１００Ａ１２の血中濃度の測定のためのＥＬＩＳＡ法のプロトコル）
Ａ．ＫＯＳＡＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００４，８９（１１）：５４２３−５４２８に記載のＥＬＩＳＡ法を改変して行った。具体的には、次のようにして行った。抗ヒトＳ１００Ａ１２特異的モノクローナル抗体（ｈＣＦ１２８）を、終濃度が０．３μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ  ＮａＣｌとＢＳＡ１μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）１ウエルにつき１００μｌづつ分注した。４℃で一晩静置した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「洗浄液」）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを２回洗浄した。その後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下「ブロッキング液」）０．３５ｍｌをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で４時間静置した。ブロッキング液を除去した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと１ｍＭ  ＥＤＴＡ−３Ｎａを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μｌと、測定試料（血清）または段階的に希釈した標準物質（組換えＳ１００Ａ１２抗原）１０μｌを、それぞれのウエルに添加して１００μｌとし、室温で３０分間反応させた。反応後、洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを４回洗浄した。その後、ヒトＳ１００Ａ１２を検出するためのモノクローナル抗体（ｈＣＦ１１３）をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識して調製した標識抗体液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを４回洗浄した後、基質（オルトフェニレンジアミン）溶液１００μｌを添加し、室温暗所で２０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９０）を測定することで、Ｓ１００Ａ１２の血中濃度を測定した。【００３６】
実施例２：Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度に基づく頸動脈ＩＭＴの程度の階層化（その２）
Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度の測定のために、市販のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ測定用キット（Ｈｕｍａｎ  Ｃ３ａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いること以外は、実施例１と同様の実験を行った（但しＡＴＩＳ関連患者は３０例でＣＥＡ患者は３１例）。結果を図３に示す。図３から明らかなように、市販のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ測定用キットを用いても、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群をｐ＜０．０００１で区分することができた。また、左右の総頸動脈の遠位壁の最大ＩＭＴの合計値が３ｍｍ未満の群と３ｍｍ以上の群をｐ＜０．０００１で区分することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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