(57)【要約】本発明は、癌の検出用又は診断用試薬を提供することを目的とする。  本発明は、ＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬。
【請求項２】
前記抗体又はその断片がロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）の細胞外領域に結合するものである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記細胞外領域が配列番号７、８、９又は１０で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の試薬。
【請求項５】
癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌及び白血病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の試薬。
【請求項６】
癌が大腸癌又は乳癌である、請求項１に記載の試薬。
【請求項７】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の検出方法。
【請求項８】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
【請求項９】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１０】
癌の検出又は診断において使用するためのロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＬＧＲ６抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の死因の上位は、癌である。特に大腸癌は、欧米において癌死亡率の上位を占めている。大腸癌の患者数は近年急激に増加しており、日本では年間約６万人が大腸癌に罹患し、臓器別の死亡数でも、胃癌、肺癌に続く３番目の多さとなっている。また、乳癌は、英国、米国および日本において、最も一般的にみられる女性の癌である。現在日本の乳癌罹患者数は４万人を超えており、その数はいまだに増加傾向にある。
大腸癌や乳癌は、病期が進行していなければ手術によって治癒可能であり、他方、切除不能な進行・再発性の癌においても、薬物療法の進歩により治療成績が大幅に改善している。しかしながら、進行再発大腸癌の平均的な生存期間は約２年であり、乳癌の場合は約１年半である。
癌を診断する場合には、組織染色を行う前に体液成分を利用した検出が有用である。大腸癌の場合、便潜血反応を用いた診断法が普及している。この手法では、ヒトヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸癌の発生を予測する。
便潜血反応は、簡単に受けられる検査であるため広く利用されているが、検査の有用性について課題もある。例えば、ヘモカルトＩＩ（アステラス製薬）を利用した試験で陽性判定になるには、大腸内で１日あたり２０ｍｇの出血が必要だが、実際の大腸癌患者の出血は１０ｍｇ以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は２６％程度で、実際の大腸癌患者のおよそ１／４しか発見できず、３／４を見逃しているとの報告がある（非特許文献１：Ｊａｍａ，Ｖｏｌ．２６９，１２６２−７，１９９３）。さらに、陽性判定がなされた被験者の中で、実際に大腸癌であったのは８．３％に過ぎず、多くの偽陽性を含む検査方法であり、課題が残されている。
乳癌の場合は、乳房Ｘ線検査（マンモグラフィー）や超音波による診断が行われている。マンモグラフィー検診を継続的に受けたグループでは、受けないグループに比べて乳癌死亡率は１５〜２０％減少すると報告されている。一方で、近年の報告では、乳癌の罹患者数が増える４０歳代女性において、マンモグラフィーは死亡率減少に効果が認められないという報告がある（非特許文献２：Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１３７，３０５−３１２，２００２）。これは、乳腺密度の高さが原因で乳癌を発見できないことが理由であり、特に年齢の若い日本人女性がマンモグラフィーによる検査に不向きであることも報告されている。このため、新たな診断方法の開発が求められている。
癌診断においては、身体検診、尿検査、血液生化学検査、血球算定、胸部Ｘ線や便潜血検査によって癌が疑われる場合、しこりのある組織の一部を採取した生検サンプルを用いた組織学的検査及び免疫組織化学検査が行われ、染色像について形態的な診断が行われる。一般的には、得られた組織から薄切切片を作製し、固定した後にヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）が行われる。
組織の所見においては、組織を構成する基底細胞の消失等が、癌であると判断するための重要な要素になっているが、基底細胞は良性病変でも変化することがあり、ＨＥ染色のみによる判断は困難なことが多く、異型病変における基底細胞の判定は免疫組織化学染色が主体として行われている。免疫組織化学染色において、大腸癌では上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、乳癌では上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｅｒｂＢ２）を検出することにより、癌を評価する方法が利用されている（特許文献１：２００６−５１９３７６号公報）。
しかしながら、免疫組織化学染色による発現頻度は、大腸癌でＥＧＦＲを検出した場合、２５〜７７％であり、報告者によって幅がみられる（非特許文献３：モダンメディア５５巻７号２００９年）。また、乳癌においては、Ｈｅｒ２を検出した場合１５〜２５％であり、陽性を示す患者の割合が限られている（非特許文献４：Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．９，ｐ．７５−８５，２００２）。また、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２ともに、正常な組織でも染色の方法によっては染色される場合があり、陽性判定は厳密に標準化された方法が必要となる。
このような状況から、癌患者における発現割合が高く、抗体医薬品の効果予測ができるような新たな標的分子の開発と、新たな標的分子を検出するためのモノクローナル抗体の開発が求められている。
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６（ＬＧＲ６））は、９６７アミノ酸からなる膜タンパク質であり、７回膜貫通型の領域とＮ末端の長い細胞外領域からなる構造を有している。
ＬＧＲ６遺伝子は、正常組織と比較して胃癌患者において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている（非特許文献５：Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，Ｖｏｌ．４６１，ｐ．３５５−３６５，２０１２）。また、ＬＧＲ６を認識するウサギ由来の抗ＬＧＲ６ポリクローナル抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ社）を用いた組織アレイにより、４８１症例の胃癌症例を解析し、１５３症例（３２％）でＬＧＲ６陽性であるという結果が公開されている（同文献）。
他方、ＬＧＲ６と相同性を示すＬＧＲファミリータンパク質としては、ＬＧＲ４及びＬＧＲ５が知られているが、ＬＧＲ６とこれらの分子とは相違点が多く、以下の通り検出の標的分子としては異なるタンパク質であるといえる。
まず、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲｓ）の繰り返し回数は、ＬＧＲ４及びＬＧＲ６では１５回であるのに対し、ＬＧＲ５では１６回であり、タンパク質の構造が相違する（図１）。
また、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、２、３及び４と結合し、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを増強させるが（非特許文献６：ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．７，ｅ３７１３７，２０１２）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、２、３及び４のそれぞれに対する親和性は、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６の各分子によって異なっている。例えば、ＬＧＲ６は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２と最も親和性が高く、次いで、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、１、４の順に親和性が高いことが報告されている。すなわち、各ＬＧＲ分子は、親和性の高いＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの違いによって、その効果も相違することが想定される（非特許文献６：ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．７，ｅ３７１３７，２０１２）。
また、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６の胃癌における発現プロファイルを解析した結果、ＬＧＲ４及びＬＧＲ６の陽性率はそれぞれ４３％及び３２％であることが示されている（非特許文献５：Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，Ｖｏｌ．４６１，ｐ．３５５−３６５，２０１２）。これに対し、ＬＧＲ５は胃の正常幹細胞において陽性を示し、胃癌のマーカーとして使用できないことが示されている。他方、ＬＧＲ５は、大腸癌の癌幹細胞のマーカーとして使用できる可能性が示唆されている（非特許文献７：Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３３７，ｐ．７３０−７３５，２０１２）。また、ＬＧＲ５は胃癌においても幹細胞と考えられる部分に発現するが、それ以外の癌の部分では強い発現が見られないことが示されている。これに対し、ＬＧＲ４やＬＧＲ６は、胃癌において、幹細胞を含む癌全体で発現することが示されている。
さらに、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６は、ヒト癌細胞の株の種類によって細胞内ｍＲＮＡ量が大幅に異なることも報告されている（非特許文献６：ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．７，ｅ３７１３７，２０１２）。
すなわち、ＬＧＲ６は、ＬＧＲ４及びＬＧＲ５とは癌における発現パターンが異なっている。
また、全長アミノ酸配列における相同性（同一性）は、ＬＧＲ６とＬＧＲ４との間で５５％、ＬＧＲ６とＬＧＲ５との間で４９％である。また、ヒンジ領域を含むＥＣＤ２における相同性は、ＬＧＲ６とＬＧＲ４との間で４２％、ＬＧＲ６とＬＧＲ５との間で５１％である。すなわち、ＬＧＲ６とＬＧＲ４及びＬＧＲ５との相同性は高いとはいえない。
従って、ＬＧＲ６とＬＧＲ４及びＬＧＲ５とは、標的分子として全く異なるタンパク質である。
特表２０１０−５３２１６９号公報（特許文献２）には、ヒトＬＧＲタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体が記載されている。また、同文献には、当該抗体が、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、２、３及び４タンパク質のＬＧＲタンパク質への結合を乱し、かつ／又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎによるＬＧＲシグナル伝達の活性化を乱すことが記載されている。さらに、同文献には、ＬＧＲタンパク質として、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６が記載されている。
しかしながら、同文献において解析結果が記載されているのはＬＧＲ５及びこれに対する抗体であり、ＬＧＲ６については何ら解析結果が記載されておらず、ＬＧＲ６に対する抗体を取得したことも記載されていない。上記の通り、ＬＧＲ６とＬＧＲ４及びＬＧＲ５とは、標的分子として全く異なるタンパク質であるため、同文献の記載からＬＧＲ６に対する抗体の構造、性質、機能等は明らかではない。
また、同文献で評価されているのは一部の癌に対する評価であり、ヒト腫瘍より単離した腫瘍形成性（ＴＧ）結腸癌細胞を用いた解析と、３症例の結腸腫瘍に対する発現解析のみである。すなわち、同文献には、ＬＧＲ６が他の癌、例えば大腸癌や乳癌において発現が亢進していることは記載されていない。
ＬＧＲ６に対する抗体としては、複数のメーカーからポリクローナル抗体が供給されている。例えば、ＬＧＲ６のＮ末端部分を抗原として作製された、ＬＳ−Ａ６２１（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＡＢＩＮ１２２２０７（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＮＢＰ１−４９６９６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）等が公知である。その他、ＬＧＲ６の４４５−５０４アミノ酸残基を抗原としたＨ０００５９３５２−Ａ０１（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、４５６−５４８を抗原とした抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｈ社）、５１６−５２８アミノ酸残基を抗原としたＬ４１６９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）が公知である。
ＬＧＲ６に結合するモノクローナル抗体としては、ウサギモノクローナル抗体としてＥＰＲ６８７４（ＧｅｎＴａｘ社）が公知であるが、細胞内ドメインを抗原として作製されたものであため、この抗体を用いて生きた癌細胞を検出することは困難である。また、免疫染色を行う場合、細胞の固定化と細胞膜の透過処理により、ＬＧＲ６タンパク質が変性するため、抗体の検出感度が低下する。
抗体を目的タンパク質の検出や疾患の診断ツールとして利用するには、継続的かつ均質な生産と供給が重要であるため、モノクローナル抗体であることが望まれる。一般的に、ＬＧＲ６のような膜タンパク質、特に複数回膜貫通型タンパク質は、可溶化することが難しいこと、哺乳動物の間でアミノ酸配列の相同性が高いため力価の高い抗体を誘導することが難しいこと等の理由から、高感度に膜タンパク質を検出できる抗体を作製することが困難である。免疫した動物の末梢血等からポリクローナル抗体を得られたとしても、抗体産生細胞を単離できる確率は非常に少ないのが現状である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、高感度に癌を検出することができる抗体、及び当該抗体を含む癌の検出用又は診断用試薬を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＬＧＲ６、特にＬＧＲ６の細胞外領域に結合する抗体を用いることにより、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用又は診断用試薬。
（２）前記抗体又はその断片がロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）の細胞外領域に結合するものである、上記（１）に記載の試薬。
（３）前記細胞外領域が配列番号７、８、９又は１０で示されるアミノ酸配列を含むものである、上記（２）に記載の試薬。
（４）癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）に記載の試薬。
（５）癌が、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌及び白血病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）に記載の試薬。
（６）癌が大腸癌又は乳癌である、上記（１）に記載の試薬。
（７）ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の検出方法。
（８）ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出用キット。
（９）ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の診断方法。
（１０）癌の検出又は診断において使用するためのロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片。
本発明により、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６の構造の比較及び一部の領域のアライメントを示す図である。
図２は、免疫した抗原（ＥＣＤ２）に対して反応する抗体を、ＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す図である。
図３は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す図である。
図４は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体をウエスタンブロットにより評価した結果を示す図である。
図５は、樹立したハイブリドーマが産生した抗体でＨＴ２９細胞を免疫細胞染色した結果を示す図である。
図６は、ＥＣＤ２に反応する抗体を含む培養上清を用いてフローサイトメーターで評価した結果を示す図である。
図７は、Ｍｕ２Ｃ１５抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ精製し、フローサイトメーターでＨＴ２９細胞との反応性を解析した結果を示す図である。
図８Ａは、クローン番号Ｍｕ２Ｃ１５のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト大腸癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図８Ｂは、免疫組織染色における染色度合を、強陽性（Ｓｔｒｏｎｇ）、陽性（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、弱陽性（Ｗｅａｋ）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）で分類し、統計解析した結果を示すグラフである。
図９は、クローン番号Ｍｕ２Ｃ１５のハイブリドーマ細胞が産生する抗体を用いて、ヒト乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図１０Ａは、クローン番号Ｍｕ２Ｃ１５とＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ＩＩとを用いて、病期（ステージ）の異なる乳癌組織を免疫染色した結果を示す図である。
図１０Ｂは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ＩＩを用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「３＋」、「２＋」、「１＋」、「０」と示した。
図１０Ｃは、クローン番号Ｍｕ２Ｃ１５を用いた免疫組織染色における染色度合を統計解析した結果を示すグラフである。陽性の判定結果をシグナルの強いものから順番に「３＋」、「２＋」、「１＋」、「０」と示した。
図１１は、ＬＧＲ６の細胞外ドメインと結合する公知のモノクローナル抗体（クローン番号２Ａ３）とクローン番号Ｍｕ２Ｃ１５の親和性を比較した図である。
図１２は、抗原であるＥＣＤ２をサンドイッチＥＬＩＳＡで検出できる抗体の組み合わせを解析した結果を示す図である。「−」は吸光度０．２〜０．３、「＋」は０．３〜０．４５、「＋＋」は０．４５〜０．８、「＋＋＋」は０．８以上であることを示している。
図１３は、Ｍｕ２Ｃ１５を固相化抗体とし、Ｍｕ２Ｃ２１を検出用抗体とした場合に、ＥＣＤ２を検出した場合の標準曲線を示す図である。
図１４Ａは、Ｍｕ２Ｃ１５抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の位置を示す図である。
図１４Ｂは、Ｍｕ２Ｃ１５抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の塩基配列及びアミノ酸配列、並びにシグナル配列、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の位置を示す図である。
図１５は、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６の部分ペプチドに対するＭｕ２Ｃ１５抗体の反応性を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１３年５月３０日に出願された日本国特許出願（特願２０１３−１１４１５０号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
本発明は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体−６（ＬＧＲ６）に対するモノクローナル抗体又はその断片を含む、癌の検出又は診断用試薬に関する。
本発明者は、膜貫通型タンパク質であるＬＧＲ６に着目し、鋭意検討を行った結果、ＬＧＲ６が癌、特に大腸癌及び乳癌において発現が亢進していることを見出した。また、本発明者は、従来知られている抗体と比較して、極めて高感度かつ高精度に癌を検出することができるＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体の作製に成功した。本発明の抗体は、癌の病期の初期段階においても高感度に癌を検出でき、またＬＧＲ６の細胞外領域に結合することができるため、生きた癌細胞を検出することができる。これにより、例えば、血液試料中に存在する癌細胞を検出することも可能である。すなわち、本発明の抗体を用いることにより、従来の方法では検出することができなかった癌を、簡便、高感度かつ高精度に検出することができるため、本発明の抗体は癌の検出又は診断に極めて有用である。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
２．ＬＧＲ６に対する抗体（抗ＬＧＲ６抗体）
（１）抗原の調製
本発明におけるＬＧＲ６は、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
本発明において、マウス、ラット及びヒトのＬＧＲ６のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４及び６で示される。また、マウス、ラット及びヒトのＬＧＲ６をコードするＤＮＡの塩基配列（ヌクレオチド配列）は、それぞれ、配列番号１、３、及び５で示される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）により登録されている。
マウスＬＧＲ６のアミノ酸配列：ＮＰ＿００１０２８５８１．１（配列番号２）
ラットＬＧＲ６のアミノ酸配列：ＸＰ＿００１０６２５３８．１（配列番号４）
ヒトＬＧＲ６のアミノ酸配列：ＮＰ＿００１０１７４０３．１（配列番号６）
マウスＬＧＲ６をコードするＤＮＡの塩基配列：ＮＭ＿００１０３３４０９．３（配列番号１）
ラットＬＧＲ６をコードするＤＮＡの塩基配列：ＸＭ＿００１０６２５３８．３（配列番号３）
ヒトＬＧＲ６をコードするＤＮＡの塩基配列：ＮＭ＿００１０１７４０３．１（配列番号５）
抗原としては、ＬＧＲ６のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができ、好ましくは、ＬＧＲ６の細胞外領域のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むペプチドを使用することができる。
ＬＧＲ６の細胞外領域は、ロイシンリッチリピート（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＬＲＲｓ）、及びＬＲＲｓと膜貫通ドメインとを繋ぐヒンジ領域を含む領域をいう。ロイシンリッチリピートは、ロイシンに富んだ２５アミノ酸残基程度からなる領域が繰り返して存在する構造をいい、ＬＧＲ６の場合、その繰り返し回数は１５回である。
ＬＧＲ６の細胞外領域は、例えば、ヒトＬＧＲ６の場合、配列番号６で示されるアミノ酸配列のうちの第２５番目〜第５６７番目からなる領域（配列番号７）であり、ＬＲＲｓは配列番号６で示されるアミノ酸配列のうちの第９１番目〜第４４３番目からなる領域（配列番号８）であり、ヒンジ領域は、配列番号６で示されるアミノ酸配列のうちの第４４４番目〜第５６７番目からなる領域（配列番号１０）である（図１）。他の動物由来のＬＧＲ６については、これらの領域に相当する領域である。
抗原として用いるペプチドとしては、ＬＧＲ６の少なくとも一部であればよく限定はされないが、ＬＧＲ６の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号６で示されるＬＧＲ６のアミノ酸配列のうち、第２５番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号７）、第９１番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号８）、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号９）、第４４４番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１０）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域、第４４４番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。本発明においては、配列番号６で示されるＬＧＲ６のアミノ酸配列のうち、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなるタンパク質を「ＥＣＤ２」とも称する。
また、ＬＧＲ６には、同じｍＲＮＡに由来する翻訳開始点の異なる変異体が存在する。例えば、ヒトＬＧＲ６の場合、Ｎ末端から第４３番目までのアミノ酸が欠如し、第４４番目から第７１番目のアミノ酸が野生型（配列番号６）とは異なるペプチド（配列番号１１）や、Ｎ末端から第５２番目までのアミノ酸が欠如し、第５３番目から第７０番目のアミノ酸が野生型（配列番号６）とは異なるペプチド（配列番号１２）などが存在する。
本発明におけるＬＧＲ６には、これらの変異体も含まれる。
ＬＧＲ６は、マウス、ラット、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のＬＧＲ６でもよいし、遺伝子工学的に生産されたＬＧＲ６でもよい。例えば、ＬＧＲ６が認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりＬＧＲ６を得ることができる。
また、抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ＬＧＲ６遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
上記のようにして得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また、本発明において、抗原としては、（ａ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのほか、（ｂ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、が挙げられる。
本発明において、「配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」には、配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが含まれる。
また、「配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
（ｉ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
また、本発明におけるＬＧＲ６には、配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列のほか、配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列に対して、約７０％以上、７５％以上、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むもの（配列番号２、４、６、７、８、９、１０、１１又は１２で示されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等の相同性検索を利用できる。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うこともできる。
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、ＬＧＲ６若しくはその部分断片又はこれらの変異型のペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列を含むものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又はその部分配列を含む遺伝子を使用することも可能である。
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、本発明に用いられるＬＧＲ６をコードする遺伝子には、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列に対して６０％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子も含まれる。このような遺伝子としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１、３若しくは５で示される塩基配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の相同性を有する遺伝子を挙げることができる。
上記ＬＧＲ６をコードする遺伝子又はその変異体は、例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースなどに記載された塩基配列に基づいて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））などに記載されている公知の遺伝子工学的手法を利用して得ることができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したＬＧＲ６又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは１μｇ〜１０ｍｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１〜２週間間隔で、２〜２０回、好ましくは５〜１５回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。３〜４回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、ＬＧＲ６以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、ＬＧＲ６に対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
（３）モノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、ＬＧＲ６又は部分ペプチド（例えばＥＣＤ２）をそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非哺乳動物に投与することにより免疫する。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から１〜３０日後、好ましくは２〜５日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳＯ／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０８〜５×１０８個の抗体産生細胞と２×１０７〜１０×１０７個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比１０：１〜１：１）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば１０〜２０％のウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上０．３個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウェルにＨＡＴ培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、９６ウエルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清、スキムミルク等でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に３７℃で１時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧを３７℃で１時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、ＬＧＲ６に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）としては、例えば、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｍｕ２Ｃ１５」（以下「Ｍｕ２Ｃ１５」という）、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｍｕ２Ｃ２１」（以下「Ｍｕ２Ｃ２１」という）、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｍｕ２Ｃ２２」（以下「Ｍｕ２Ｃ２２」という）が挙げられる。ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内にハイブリドーマを約５×１０６〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗ＬＧＲ６抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２７、２９、及び３１で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。また別の態様において、本発明の抗ＬＧＲ６抗体としては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が、配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が、配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
（ｖ）抗ＬＧＲ６抗体のエピトープ
本発明の抗ＬＧＲ６抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるＬＧＲ６の少なくとも一部であればよく限定はされないが、ＬＧＲ６の細胞外領域の少なくとも一部が好ましく、例えば、配列番号６で示されるＬＧＲ６のアミノ酸配列のうち、第２５番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号７）、第９１番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号８）、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号９）、第４４４番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域（配列番号１０）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域、第４４４番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部がより好ましく、特に好ましくは、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部である。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗ＬＧＲ６抗体は、例えば、生体試料中のＬＧＲ６の検出感度が高く、後述する癌の検出及び診断の用途に極めて有用なものである。
また、上述した通り、ＬＧＲには二種類の欠損変異体が存在する。具体的には、ヒトＬＧＲ６の場合、Ｎ末端から第４３番目までのアミノ酸が欠如し、第４４番目から第７１番目のアミノ酸が野生型（配列番号６）とは異なるペプチド（配列番号１１）や、Ｎ末端から第５２番目までのアミノ酸が欠如し、第５３番目から第７０番目のアミノ酸が野生型（配列番号６）とは異なるペプチド（配列番号１２）などが存在する。
これらのペプチドは、配列番号６で示されるＬＧＲ６のアミノ酸配列のうち、第９１番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域、第３１９番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域、第４４４番目〜第５６７番目のアミノ酸からなる領域において、野生型ＬＧＲ６と共通する。従って、本発明の抗体はこれらの欠損変異体も検出することができる。
また、本発明の抗ＬＧＲ６抗体のエピトープ（抗原決定基）には、他の動物由来のＬＧＲ６における上記領域に相当する領域の少なくとも一部が含まれる。
本発明のＬＧＲ６に対する抗体には、当該抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
（４）遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域が、例えば配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが好ましい。
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植）と呼ばれる手法を採用することができる。ＣＤＲグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特許第２８２８３４０号公報等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗ＬＧＲ６抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲのアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、例えば、重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号２７、２９及び３１で示されるアミノ酸配列が好ましく、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３として、それぞれ配列番号３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列が好ましい。
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（Ｖ領域）の抗原結合部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
（５）抗体断片の作製
本発明で使用されるＬＧＲ６に対する抗体の断片は、ＬＧＲ６に特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Ｆａｂは、抗体分子をパパインで処理することにより、Ｆ（ａｂ′）２は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Ｆａｂ′は、上記Ｆ（ａｂ′）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
ｓｃＦｖの場合は、抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖの場合は、抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｄｓＦｖを製造することができる。
本発明において、重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２２で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２４で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられる。
また、本発明の抗体断片の具体例としては、限定されるものではないが、例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号２７、２９及び３１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬ  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号３３、３５及び３７で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。さらに、ＶＨとして配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ／又はＶＬとして配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、抗体断片が挙げられる。
ＣＤＲを含む抗体断片（ペプチド）は、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含む抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
ＶＨのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号２６、２８及び２９で示される塩基配列が好ましく、ＶＬのＣＤＲ１〜３をコードする塩基配列としては、例えば、それぞれ配列番号３２、３４及び３６で示される塩基配列が好ましい。
（６）結合親和性
結合親和性は、結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋ）はＫＡ／ＫＤの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合親和性は、少なくとも１×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）を有しており、この解離定数に対し、例えば２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍又は１０００〜１０，０００倍高い親和性を有する。具体的には、本発明の抗体は、ＬＧＲ６の結合親和性に関する解離定数（ＫＤ）が、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１×１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１×１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１×１０−１５Ｍであり、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−１３Ｍであることがより好ましい。あるいはこれらのＫＤよりも低い値であり高親和性であってもよい。
ここで、親和性の測定対象となる抗体の解離定数（ＫＤ）が、本発明の抗体のＫＤの約１〜１００倍以内であるときは、当該抗体は、本発明の抗体と実質的に同一であるとして本発明に含まれる。
結合定数（ＫＡ）及び解離定数（ＫＤ）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）など）。
３．癌の検出用又は診断用試薬（癌の検出剤又は診断剤）
本発明の癌の検出用又は診断用試薬は、上記「２．ＬＧＲ６に対する抗体（抗ＬＧＲ６抗体）」に記載した抗体又はその断片を含有するものである。本発明の抗体は、癌に発現しているＬＧＲ６に対して特異的に結合することができるため、当該抗体を含む本発明の試薬は癌の検出又は診断のために使用することができる。
本発明における検出又は診断の対象となる癌としては、例えば大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、小腸の癌、十二指腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、好ましくは、正常細胞又は組織と比較してＬＧＲ６が有意に高く発現している癌が好ましい。そのような癌としては、例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌などが挙げられ、好ましくは大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは大腸癌、乳癌である。
本発明の試薬は、本発明の抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、本発明の試薬に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、又は着香料などを指す。
また別の態様において、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬の製造のためのＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。また、本発明は、癌の検出又は診断において使用するためのＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、癌の検出用又は診断用試薬として使用するためのＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片を提供する。ＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片の説明については上記「２．ＬＧＲ６に対する抗体（抗ＬＧＲ６抗体）」に記載した通りである。
４．癌の検出又は診断方法
本発明の癌の検出又は診断方法は、上記「２．ＬＧＲ６に対する抗体（抗ＬＧＲ６抗体）」に記載した抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料（以下、単に「生体試料」ともいう）とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む方法である。この場合、ＬＧＲ６の検出結果と癌の可能性とを関連づけることが好ましい。
本発明において、「被験者」としては、例えばヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
また、生体試料としては、例えば、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、体液、排泄物そのもの又はこれらを含む試料を意味し、特に限定されるものではない。また、生体試料には、哺乳動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物、及び体液、排泄物に対し、任意の処理、例えば希釈、分離、核酸又はタンパク質の抽出、タンパク質の変性等を行うことにより得られた試料も含まれる。生体試料は、大腸癌又は胃癌を検査する場合は、体液、排泄物が好ましく、特に糞便であることが好ましい。膀胱癌、腎臓癌を検査する場合は組織、尿を使用することができ、乳癌、子宮癌を検査する場合は母乳や生理用品などを使用することができる。いずれの生体試料も適切な前処理を行うことによって適用可能である。
糞便を試料とする場合、特開２００５−４６０６５号公報に記載される方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便から癌細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を１０μｍ以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社）を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法など当業者が通常用いる細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
大腸癌や乳癌をはじめとする様々な癌において、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはいまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだ癌であっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、癌が進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのＬＧＲ６を発現する微量な細胞を検出および／または測定することができる。
「被験者」がヒトの場合、被験者には癌患者、例えば早期癌の患者、進行癌の患者、及び健常者が含まれる。ここで、早期癌は、例えば大腸癌、胃癌などの場合は癌細胞が粘膜層又は粘膜下層までに留まっていること、進行癌は癌細胞が固有筋層又はそれより深い層に達していることを基準に患者を区別して本発明の検出を行うことも可能である。また、血液試料としては末梢血が好ましく、末梢血由来の血清がより好ましい。さらに、組織には、癌組織及び癌が生じる可能性のある正常組織が含まれる。
本発明において、「接触」とは、本発明の抗体と被験者から採取された生体試料とを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、反応用ウェルにおいて本発明の抗体と生体試料とを混合すること、当該生体試料に本発明の抗体を添加すること、本発明の抗体又は生体試料のいずれか一方を固定した担体に他方を添加すること等が含まれる。
本発明において、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法などを利用できる。
このような検出等に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出、測定及び／又は評価し、その検出、測定又は評価結果と癌の可能性等とを関連づけることができる。
本発明においては、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価結果に基づいて、被験者が癌に罹患している可能性の有無を診断することができる。
本発明の検出又は診断方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収した癌細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウェルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウェルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、癌に罹患している可能性を判定又は診断することができる。
本発明において、ＬＧＲ６の検出、発現量の測定又は評価を免疫染色を用いて行う場合には、例えば、免疫組織染色における染色度合（ＬＧＲ６の検出結果）を、強陽性（Ｓｔｒｏｎｇ）、陽性（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、弱陽性（Ｗｅａｋ）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）などに分類し、染色度合と癌の可能性とを関連付けることにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性（癌に罹患している可能性）の有無を診断することができる。
また、ＬＧＲ６の細胞外領域は、血液中に放出される場合が想定されるため、血液試料中のＬＧＲ６の発現量を測定することにより、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することも可能である。この場合、ＬＧＲ６の発現量の測定結果と癌の可能性とを関連づけて癌を検出するためには、生体試料中のＬＧＲ６の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）を定めることが望ましい。
ＬＧＲ６の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値は、例えば、次のようにして求めることができる。まず、癌患者由来の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量を測定する。このとき対象となる患者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。また、２例以上の健常者由来の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量も測定しておくことが好ましく、対象となる健常者の例数は２例以上であり、例えば、５例以上、１０例以上、５０例以上、１００例以上である。そして、癌患者由来の生体試料群と健常者由来の生体試料群の両方を含む全体から、ＬＧＲ６の発現量のｃｕｔ−ｏｆｆ値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔｔｉｎｇ法を用いて、標準曲線を作成する。ＬＧＲ６を含まないサンプルのシグナル値を基準として、その数値の２倍をｃｕｔ−ｏｆｆ値と定めること等ができる。統計解析を行うための症例は、癌の種類（例えば、大腸癌、乳癌、子宮癌、胃癌、甲状腺癌、膵癌、白血病等）、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類することもできる。さらに、統計処理は、健常者のＬＧＲ６の発現量の測定値と、癌患者において癌の種類、病期、再発の有無、転移の有無、手術前後等により分類したときのＬＧＲ６の発現量の測定値とを適宜組み合わせて行うこともできる。
本発明において、血液試料中のＬＧＲ６（細胞外領域）の発現量の臨界値（ｃｕｔ−ｏｆｆ値）は、血清中濃度で、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌであるが、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌである。
上記条件下でＬＧＲ６の発現量を測定した場合において、測定したＬＧＲ６の発現量が上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であるときに、癌が検出されたと判定でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断することができる。本発明においては、前記判定又は診断のための血清中濃度の値に上限値を設けてもよく、例えば、上記各ｃｕｔ−ｏｆｆ値以上であって、かつ所定上限値以下（例えば、２００ｎｇ／ｍｌ以下、１９０ｎｇ／ｍｌ以下、１８０ｎｇ／ｍｌ以下、１７０ｎｇ／ｍｌ以下、１６０ｎｇ／ｍｌ以下、１５０ｎｇ／ｍｌ以下、１４５ｎｇ／ｍｌ以下、１４０ｎｇ／ｍｌ以下、１３５ｎｇ／ｍｌ以下、１３０ｎｇ／ｍｌ以下）であるときに、癌を検出又は被験者の癌の可能性の有無を診断することができる。
本発明において、癌を検出したときの当該検出結果の確からしさ（確率）は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９９％以上である。
さらに、本発明の別の態様において、一人の被験者（患者）のサンプルから測定されたＬＧＲ６の発現量を上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値と比較することで癌との関連性を検出又は診断するほかに、複数の患者由来の生体試料を用いてＬＧＲ６の発現量を測定する場合がある。従って、上記ｃｕｔ−ｏｆｆ値を決定する手法と同様にして、所定数の健常人及び患者を含む集団（１次母集団）においてＬＧＲ６の発現量を測定して統計解析処理し、これらの集団に属する被験者において癌が検出された群と検出されない群に分けることも可能である。さらに、このようにして得られた測定値を基本データとして、この基本データと他の集団（２次母集団）における検出又は診断の対象となる個々の被験者由来の試料におけるＬＧＲ６の発現量とを比較することができる。
あるいは、それぞれの患者のデータを前記母集団の値に組み込んでＬＧＲ６の発現量を再度データ処理し、対象となる患者（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ＬＧＲ６の発現量の臨界値の精度を高め、これにより１人又は複数人の被験者における検出又は診断精度を高めることができる。
本発明においては、（ｉ）被験者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量と、（ｉｉ）健常者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量との比較を行うことも可能である。
そして、前記（ｉ）の場合のＬＧＲ６の発現量が、前記（ｉｉ）の場合のＬＧＲ６の発現量と比較して高い場合、例えば、健常者の生体試料におけるＬＧＲ６の発現量の約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上高い場合に、癌が検出されたと判断でき、又は被験者が癌に罹患している可能性があると診断できる。
上記検出結果は、例えば、癌の検査又は治療効果の確定診断を行う場合の主要資料又は補助資料とすることができる。
ＬＧＲ６の発現量は各種癌患者において発現するため、健康診断等においてＬＧＲ６の発現量が検出されてもどの癌であるのか特定することができない場合がある。そこで、集団で行う健康検診等の場では「癌が疑われる」という評価を行い、後に癌種の特定や進行度を決定する（精密検査を行う）ための補助資料として使用することができる。また、癌種がある程度疑われた患者由来の試料を用いてＬＧＲ６が検出されたときは、癌種の主要資料（確定診断等）に利用することができる。なお、癌種の特定には、他の腫瘍マーカー、画像診断、病理診断等を使用することができる。
すなわち、本発明は、ＬＧＲ６に対するモノクローナル抗体又はその断片と、被験者から採取された生体試料とを接触させ、前記試料におけるＬＧＲ６を検出する工程を含む、癌の検出又は診断を補助する方法も提供する。
５．癌の検出用又は診断用キット
本発明の抗ＬＧＲ６抗体は、癌の検出用又は診断用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素及び基質（発色性基質等）、基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，Ｇｏａｔ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
本発明のキットは、上記本発明の検出方法を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。本発明のキットを利用することにより、検診等における癌患者の高精度スクリーニング、癌の早期発見、癌の進行度の特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、癌による死亡率を低下させることができる。
抗ＬＧＲ抗体、癌の種類、検出方法等については上記と同様である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
実施例１．抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体の作製
（１）細胞培養
マウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ  受託番号  ＣＲＬ−１５８０）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  受託番号  ＨＴＢ３８）、ヒト胎児腎細胞２９３Ｔを、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）で８０％コンフルエントを越えないように３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。
（２）ＬＧＲ６遺伝子のクローニング
２９３Ｔ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、ＬＧＲ６のアミノ酸第３１９番目から第５６７番目をコードする塩基配列（配列番号１３）を含むＤＮＡを増幅した。
プライマー配列
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ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ）で切断し、ｐＥＴ３２ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＬＧＲ６の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
（３）ＬＧＲ６部分タンパク質の作製
上記（２）で作製したベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地［１％（ｗ／ｖ）トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社）］で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＬＧＲ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応液を１ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ  酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製したＬＧＲ６のヒンジ領域を含む部分タンパク質を得た。このタンパク質を以後、ＥＣＤ２と称する。ＥＣＤ２のアミノ酸配列は配列番号９で示される。
（４）免疫
上記で作製したＥＣＤ２をフロイント完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に１００μｌ（約４０μｇ／マウス）投与した。約３週間後、同じくＥＣＤ２をフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を７回〜１２回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてＥＣＤ２約４０μｇを静脈内に投与し、その３日後に脾臓を摘出した。
（５）細胞融合
マウスの脾臓由来のリンパ球をマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８と電気的に融合させた。細胞融合に際しては、１×１０８個の脾臓細胞と０．２５×１０８個の骨髄腫株とを混合し、ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．３Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に細胞密度が０．２５×１０８個／ｍＬとなるよう懸濁し、電気融合装置ＬＦ２０１（ネッパジーン社製）で融合を行った。融合条件はメーカー推奨の手法に従った。
融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう３０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり５〜１２個のコロニーが形成された。
（６）ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマが増殖してきたウエルの培養上清を回収し、ＥＣＤ２に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。ＥＣＤ２をＰＢＳ（−）で希釈し、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウエル当たり１μｇとなるよう分注して、４℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳ−Ｔと記載する）３５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔを３００μＬずつ各ウエルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をＥＣＤ２結合ＥＬＩＳＡプレートに分注し、１時間、室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍希釈したものを各ウエル１００μＬ分注し、１時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、１ｍｇ／ｍＬ  ＰＯＤとなるよう調製したＰＯＤ基質を加え、室温、５分間発色させた。１．５Ｎの硫酸で反応を停止した後、４９０ｎｍの吸収を、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。
（７）モノクローナル抗体の取得
上記（５）で形成されたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の中から、上記（６）の方法でＥＣＤ２に反応する抗体を選別した。また、ＥＣＤ２を作製する際に付加したＴｒｘ−、Ｓ−、Ｈｉｓ−Ｔａｇに反応する抗体を除くために、ｐＥＴ３２ｂベクターのみを大腸菌に導入し、上記（３）記載の方法で発現させ、精製したタンパク質をネガティブコントロールとして用いた。以降では、このネガティブコントロールに利用したタンパク質をＴａｇと称する。
ＥＣＤ２に反応し、Ｔａｇに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した結果、３７クローンが取得された。それぞれの抗体に関して、ＥＬＩＳＡの結果を図２に示した。これらのハイブリドーマ細胞の中から、ＥＣＤ２に強く反応し、Ｔａｇに反応しない抗体を産生する細胞を選択し、限界希釈により単クローニングを行った結果、６クローンのハイブリドーマ細胞を樹立した。これらのハイブリドーマから産生される抗体の反応性をＥＬＩＳＡで測定した結果を図３に示した。以降では、６クローンの抗体をそれぞれ、「Ｍｕ２Ｃ１」、「Ｍｕ２Ｃ１５」、「Ｍｕ２Ｃ２１」、「Ｍｕ２Ｃ２２」、「Ｍｕ２Ｃ２４」、「Ｍｕ２Ｃ２６」とも称する。
これらのハイブリドーマ細胞を、それぞれ１０ｃｍディッシュ１０枚に９０％コンフルエントとなるよう培養し、ＨＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とＥＸ  ＣＥＬＬ  Ｓｐ２／Ｏ（ニチレイバイオサイエンス社製）とを１：１で混合した培地で１０日間培養を行った。培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムを用いて精製した。培養上清１００ｍＬに対し、０．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラムに対し、培養液を１〜３ｍｌ／ｍｉｎの流速で通過させた後、６ｍＬの洗浄バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ）で洗浄した。次に１ｍＬの溶出バッファー（０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．５））で抗体タンパク質を溶出させ、３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いてｐＨ７．０〜７．４の間になるよう中和した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをＰＢＳに置換した。
実施例２．抗ＬＧＲ６モノクローナル抗体の解析
（１）ウエスタンブロッティング
実施例１．（７）で得られた６種類のハイブリドーマ細胞「Ｍｕ２Ｃ１」、「Ｍｕ２Ｃ１５」、「Ｍｕ２Ｃ２１」、「Ｍｕ２Ｃ２２」、「Ｍｕ２Ｃ２４」、「Ｍｕ２Ｃ２６」が産生する抗体に関して、ウエスタンブロッティングによる解析を行った。まず、抗原であるＥＣＤ２との反応性を解析した。実施例１．（３）で作製したＥＣＤ２のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定後、１μｇ／ｍＬとなるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄を行った。実施例１．（７）で作製した６種類のモノクローナル抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１万倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。実験結果を図４に示した。この結果から、６種類の抗体は変性させたＥＣＤ２とも反応することが示された。
（２）免疫細胞染色
実施例１．（７）で得られた６種類の抗体と、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）との反応性を解析した。以下では、ハイブリドーマ細胞が産生する抗体をそれぞれのクローン番号で記載することがある。
ＨＴ−２９を８０％コンフルエントとなるよう培養し、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ａ（新田ゼラチン社）でコートしたカバーガラス上へ播種した。２日間培養後、１０％中性緩衝ホルマリン（ＷＡＫＯ社）を用いて細胞を固定した。０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、５％（ｗ／ｖ）Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋを含むＴＢＳＴで処理した後、上記（７）で精製した抗体を１０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体として抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識あるいは抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識で室温３０分間反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄ社）で封入した。図５には、同一条件で蛍光強度を解析した結果を示す。Ｍｕ２Ｃ１５のみ強いシグナルが観察され、細胞膜及び細胞質が染色されていると考えられた。すなわち、Ｍｕ２Ｃ１５は細胞表面上のＬＧＲ６を認識することが確認された。さらに、ＬＧＲ６は７回膜貫通型の膜タンパク質であることから、細胞質にみられるシグナルは、細胞膜上のＬＧＲ６がＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎにより細胞内部に取り込まれた結果を示していると考えられる。ＬＧＲ６がＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを起こすという現象は、これまでに報告がなく、初めての報告である。
（３）ＦＡＣＳ
ヒト大腸癌細胞であるＨＴ−２９細胞を９０％コンフルエントとなるよう培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でプレートより非酵素的に剥離し、１．５ｍＬチューブに回収した。実施例１．（７）で得られたハイブリドーマ細胞のうち、Ｍｕ２Ｃ１、７、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２１、２２、２３、２５、２８、３０、３１の１６種類に関し、それぞれの培養上清を回収して１００μＬずつ添加し、６０分間反応させた。比較対象として、抗体を含まない培地のみを準備し、反応させた。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識されたＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで１／１０００希釈して添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳ＋２％ＰＢＳで２回洗浄後、Ｇｕａｖａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で解析を行った。結果を図６に示す。Ｍｕ２Ｃ１５及びＭｕ２Ｃ３０以外の抗体ではネガティブコントロールと同様のシグナルを示し、ｎａｔｉｖｅな構造のＬＧＲ６とは反応しなかったが、Ｍｕ２Ｃ１５及びＭｕ２Ｃ３０でわずかなシグナルの変化が見られた。さらに、Ｍｕ２Ｃ１５に関して、抗体を精製し、抗体濃度を１００μｇ／ｍＬに上昇させてＳＷ４８０細胞と反応させた結果を図７に示す。この場合、ネガティブコントロールと比べてシグナルの明確なシフトが観察された。すなわち、抗体が生きた細胞（生存癌細胞）と反応していることが示された。
この結果から、本発明の抗体は、生体試料、例えば血液試料中に存在する生存癌細胞の検出に有用であることが示された。
（４）抗体の可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
実施例１．（７）で得られたハイブリドーマ細胞を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５００ｎｇから、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を４２℃で１．５時間行ってｃＤＮＡを合成し、７０℃、１０分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用い、ＫＯＤ  ＰＬＵＳ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲ反応を行なうことで、目的の遺伝子を増幅した。実施例１．（７）で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例として、ハイブリドーマ細胞「Ｍｕ２Ｃ１５」が産生する抗体（「Ｍｕ２Ｃ１５」又は「Ｍｕ２Ｃ１５抗体」とも称する）の可変領域のアミノ酸配列を下記方法を用いて決定した。
抗体のＨ鎖可変領域断片を増幅するために、下記プライマー（配列番号１６、１７及び１８）を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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抗体のＬ鎖リーダー配列及び可変領域断片を増幅するために、上記プライマー（Ｌｏｎｇ及びＳｈｏｒｔ）並びに下記プライマー（配列番号１９）を用いてＰＣＲ反応（９４℃、２分間のデナチュレーションを行ない、続いて、５６℃、１５秒間のアニーリング、６８℃、４５秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル）により断片を得た。
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精製したＰＣＲ増幅断片を１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（インビトロジェン社）及び２×ＧｏＴａｑ  Ｍａｘｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と混合し、７０℃、１５分間反応後、４℃、２分間氷冷することで、３’末端へｄＡを付加した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、いわゆるＴＡクローニング法によりＨ鎖断片及びＬ鎖断片をクローニングした。その後、下記プライマー（配列番号２０および配列番号２１）を用いて、シークエンス反応を行い、Ｈ鎖とＬ鎖の可変領域の配列を決定した。
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Ｍｕ２Ｃ１５抗体のＨ鎖可変領域（以下「ＶＨ」とも称する）のアミノ酸配列を配列番号２３で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号２２で示す。また、Ｍｕ２Ｃ１５抗体のＬ鎖可変領域（以下「ＶＬ」とも称する）のアミノ酸配列を配列番号２５で示し、この領域をコードする塩基配列を配列番号２４で示す。
また、Ｍｕ２Ｃ１５抗体の可変領域のアミノ酸配列のうち、既存の抗ＬＧＲ６抗体の可変領域のアミノ酸配列と比較して特に変化が大きい（相同性が低い）領域を、当該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）として同定した。
同定したＭｕ２Ｃ１５抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を下記に示す。
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また、上記ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号２６、２８及び３０で示し、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号３２、３４及び３６で示す。Ｍｕ２Ｃ１５抗体のＶＨ及びＶＬにおける各ＣＤＲの位置を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
（５）他のＬＧＲファミリータンパク質との結合性の検討
（５−１）ＬＧＲファミリータンパク質の相同性解析
実施例１（７）で得られたハイブリドーマ細胞から産生される抗体の代表例としてＭｕ２Ｃ１５抗体を用いて、ＬＧＲファミリーに属するＬＧＲ６以外の分子との結合性について解析を行った。ヒトＬＧＲ６の細胞外ドメインと相同性を示すタンパク質としては、ヒトＬＧＲ４及びヒトＬＧＲ５が挙げられる。実施例１（３）及び（４）記載のＥＣＤ２と相同性を示すヒトＬＧＲ４のアミノ酸配列を配列番号３９、ヒトＬＧＲ５のアミノ酸配列を配列番号４１で示した。
ヒトＬＧＲ４の第３１１番目から第５７７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列：（配列番号３９）
ヒトＬＧＲ５の第３１９番目から第５６３番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列：（配列番号４１）
これらのアミノ酸配列とヒトＬＧＲ６のＥＣＤ２のアミノ酸配列との相同性を解析した結果、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）はＬＧＲ６とＬＧＲ４との間で７８％、ＬＧＲ６とＬＧＲ５との間で８３％であり、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はＬＧＲ６とＬＧＲ４との間で４２％、ＬＧＲ６とＬＧＲ５との間で５１％であった（図１）。
ヒトＬＧＲ４の第３１１番目から第５７７番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列：（配列番号３９）
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ヒトＬＧＲ５の第３１９番目から第５６３番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列：（配列番号４１）
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（５−２）ＬＧＲファミリータンパク質の部分タンパク質遺伝子のクローニング
ＨＴ−２９細胞を培養し、実施例１（２）記載の方法でＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成後、下記プライマーを用いてＬＧＲ４のアミノ酸第３１１番目から第５７７番目をコードする塩基配列（配列番号３８）を含むＤＮＡを増幅した。
プライマー配列
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ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および５８℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、プライマー上に配置した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で切断し、ｐＥＴ３２ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＬＧＲ４の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
ＬＧＲ５のアミノ酸第３１９番目から第５６３番目をコードする塩基配列（配列番号４０）は、化学合成（株式会社医学生物学研究所）によって作製した後、この塩基配列の外側に設計した制限酵素サイトにおいて、制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）で切断し、ｐＥＴ３２ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。これにより、Ｎ末端側にＴｒｘ−、Ｓ−及びＨｉｓ−Ｔａｇを持ち、Ｃ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを持つＬＧＲ５の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡを得た。
（５−３）ＬＧＲ４及びＬＧＲ５部分タンパク質との結合性の検討
実施例１．（２）記載のＬＧＲ６の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクター、及び上記（５−２）で作製したＬＧＲ４及びＬＧＲ５の部分タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターそれぞれでＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。また、ｐＥＴ３２ｂベクターでＢＬ２１（ＤＥ）を同様に形質転換した。実施例１．（３）記載の方法により発現誘導を行った後、細胞培養液２０μｌに対して５μｌとなるよう、５  ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０％ＳＤＳ、１０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｒｉｔｏｌ、２０％Ｇｌｙｃｏｒｏｌ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．０５％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）を添加し、９５℃で５分間加熱した後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図１５ａ）。
泳動後、ＰＶＤＦメンブレンにタンパク質を転写し、ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄を行った。実施例１．（７）で作製したモノクローナル抗体の中から、Ｍｕ２Ｃ１５をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識をＴＢＳ−Ｔで１０万倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００でシグナルを検出した（図１５ｂ）
この結果から、Ｍｕ２Ｃ１５抗体はＬＧＲ６の部分タンパク質には反応するが、ＬＧＲ４及びＬＧＲ５の部分タンパク質とは反応しないことが示された。
実施例３．臨床組織サンプルの解析
（１）大腸癌組織を用いた免疫組織染色
Ｍｕ２Ｃ１５と大腸癌組織との反応性を解析することで、ＬＧＲ６の大腸癌における発現割合を解析した。今回、ヒト大腸癌組織アレイスライド（ＣＤＡ３；ＳｕｐｅｒＢｉｏｃｈｉｐｓ社）を用いて解析した。
大腸癌組織アレイスライドをキシレンに５分間浸す操作を３回繰り返して脱パラフィンを行った後、１００％エタノールに５分浸すことを２回繰り返し、９０％エタノール、８０％エタノールにそれぞれ５分浸した後、流水下で２分間浸すことでサンプルの水和を行った。スライドを１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸し、６００Ｗのマイクロウエーブで５分間処理する操作を３回繰り返すことで、抗原の賦活化を行った。メタノールで希釈した３％過酸化水溶液で１０分間処理することで、内在性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。この後の検出に関しては、ヒストファイン（Ｍ）キット（ニチレイ社）を用い、添付のプロトコールに従って、ブロッキング、二次抗体反応、洗浄、検出反応を行った。一次抗体反応は、Ｍｕ２Ｃ１５を５あるいは１０μｇ／ｍＬとなるようＴＢＳ−Ｔに希釈して室温で１時間反応させた。発色は、ＩｍｐａｃｔＤＡＢ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、室温で５分間反応させることにより行った。反応後のスライドを流水洗浄後、ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて対比染色した後、封入した。組織染色の結果を図８Ａに示した。
免疫組織染色における染色度合を、強陽性（Ｓｔｒｏｎｇ）、陽性（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）、弱陽性（Ｗｅａｋ）、陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）で分類し、Ｍｕ２Ｃ１５の免疫組織染色結果を統計解析した結果を図８Ｂに示した。
正常の大腸粘膜では、測定に用いた組織サンプルのうち約半数がほとんど染色されず、また残りに関しても弱い染色のみ見られた。これに対し、大腸癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージＩから見られ、ステージＩＩのサンプルでは、測定に用いたサンプルの９０％以上が強陽性を示すことが明らかになった。このことから、ＬＧＲ６は、大腸癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた大腸癌組織サンプルの９０％以上で陽性又は強陽性を示すこと、及びＭｕ２Ｃ１５抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
（２）乳癌組織を用いた免疫組織染色
Ｍｕ２Ｃ１５と乳癌組織との反応性を解析することで、ＬＧＲ６の乳癌における発現割合を解析した。解析には、ヒト乳癌組織アレイスライド（ＦＤＡ８０８ｂ；ＵＳＢｉｏｍａｘ社、ＢＣ０８１１２０；ＵＳＢｉｏｍａｘ社、及びＣＢＡ４；ＳｕｐｅｒＢｉｏｃｈｉｐｓ社）を用いた。
免疫染色は上記実施例３．（１）記載の方法と同様に行った。実験の結果を図９に示した。
正常組織では全く染色されないか、腺細胞が陽性になる場合があった。これに対し、乳癌組織においては、強陽性に染色される組織が進行ステージＩから見られ、測定に用いたサンプルの８０％以上が強陽性又は陽性を示すことが明らかになった。このことから、ＬＧＲ６は乳癌の初期のステージから発現しており、測定に用いた乳癌組織サンプルの９０％以上で陽性及び強陽性を示すこと、及びＭｕ２Ｃ１５抗体を用いてその発現を高感度に検出できることが示された。
これらの結果から、ＬＧＲ６は、少なくとも大腸癌及び乳癌の両方で、癌の診断に利用することができるマーカーであることが示された。また、本発明の抗体は、少なくとも大腸癌及び乳癌の検出及び診断に有用であることが示された。
（３）ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔＩＩとの対比
Ｈｅｒ２の発現は、既存の分子標的薬であるハーセプチンの治療を行うかどうかを判断する指標になっている。Ｈｅｒ２陽性患者は、乳癌患者全体の１５−２０％に過ぎないとされている。Ｈｅｒ２検査は、浸潤性のある乳癌の場合に行われる。Ｈｅｒ２の発現を同定する方法としては、複数のメーカーから体外診断薬が販売されている。そこで、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ＩＩ（ＤＡＫＯ社）を用いて、上記実施例３．（２）と同じ組織アレイスライドを用い、Ｈｅｒ２陽性率を解析し、ＬＧＲ６陽性率と比較した。
ステージの異なる乳癌組織を免疫染色した結果を図１０Ａに示す。また、Ｈｅｒ２陽性率及びＬＧＲ６陽性率を解析した結果を、それぞれ図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。
ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ＩＩでは、測定に用いたサンプルのうち、強陽性（３＋）及び陽性（２＋）で検出される割合が１３％であったのに対し（図１０Ｂ、下のグラフ）、抗ＬＧＲ６抗体を用いた検出では７８％であった（図１０Ｃ、下のグラフ）。さらに、ステージ毎の発現を解析したところ、ステージＩの症例では、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ＩＩでは７．１％しか検出できなかったのに対し（図１０Ｂ、上のグラフ）、抗ＬＧＲ６抗体を用いた場合は９０％以上を検出することができた（図１０Ｃ、上のグラフ）。
これらの結果から、本発明の抗体を用いることにより、ステージＩの段階で乳癌を高感度に検出することができることが示され、当該抗体を含む本発明の試薬は、早期の乳癌の検出に極めて有効であることが示された。
また、本発明の抗体を用いることにより、乳癌の悪性度を評価できることが示された。
ＬＧＲ６の細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体としては、クローン番号２Ａ３（Ａｂｃａｍ）で示される抗体が公知である。Ｍｕ２Ｃ１５と２Ａ３との力価を、大腸癌組織を用いて比較した。
免疫染色は上記実施例３．（１）記載の方法と同様に行い、抗体濃度を５μｇ／ｍＬとなるよう調製して行った。実験の結果を図１１に示した。
２症例の大腸癌組織において、Ｍｕ２Ｃ１５を用いた場合には明確な染色が見られたのに対し、２Ａ３を用いた場合には全く染色が見られなかった。
この結果より、本発明の抗体は、既存のＬＧＲ６細胞外ドメインと結合するモノクローナル抗体よりも親和性が高く、高感度に癌を検出できることが示された。
実施例４．ＬＧＲ６検出系の構築
ＥＧＦＲなど、膜タンパク質の一部は、細胞外ドメインが血液中に放出されることが知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．９，１６６，２０１０）。同様に、ＬＧＲ６についても、血液中のＬＧＲ６細胞外ドメイン部分を検出することで、癌診断が可能であると予測される。さらに、便からＬＧＲ６タンパク質を変性させた状態で抽出し、検出することも想定される。そこで、実施例１．（７）で得られた６種類のハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を利用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＬＧＲ６の細胞外ドメインを高感度に検出する方法の構築を行った。
まず、モノクローナル抗体をＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学社）を用い、添付の手法に従ってビオチン標識した。次に、標識を行っていないモノクローナル抗体を９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウエル当たり５００ｎｇとなるよう分注し、４℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳ−Ｔと記載する）３５０μＬで３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔを３００μＬずつ各ウエルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＥＣＤ２が５０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、１時間、室温で反応させた。３５０μＬで３回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう調製したビオチン化抗体を添加し、１時間、室温で反応させた。３５０μＬで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）をＴＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したものを１００μＬ添加し、１時間、室温で反応させた。その後の検出は、実施例１．（６）と同様の方法で行った。実験結果を図１２に示した。
実験の結果、Ｍｕ２Ｃ１５を固相化し、Ｍｕ２Ｃ２１又はＭｕ２Ｃ２２をビオチン標識した抗体で検出することで、バックグラウンドが低く、かつＥＣＤ２を高感度に検出できることが示された。
さらに、これらの組み合わせを用いて、ＥＣＤ２の検出限界（臨界値）を解析した。
その実験結果を図１３に示した。この結果、およそ２０ｎｇ／ｍＬを越える濃度であれば検出可能であることが示された。
この結果から、本発明の抗体を用いることにより、生体試料、例えば血液試料、糞便等から癌を高精度かつ高感度で検出することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、従来の抗体に比べて癌を高感度で検出することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号７−１２：合成ペプチド
配列番号１３−２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ペプチド
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ペプチド
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ペプチド
配列番号２８：合成ＤＮＡ
配列番号２９：合成ペプチド
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ペプチド
配列番号３４：合成ＤＮＡ
配列番号３５：合成ペプチド
配列番号３６：合成ＤＮＡ
配列番号３７：合成ペプチド
配列番号３８：合成ＤＮＡ
配列番号３９：合成ペプチド
配列番号４０：合成ＤＮＡ
配列番号４１：合成ペプチド
配列番号４２及び４３：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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