(57)【要約】  ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、及びロイコ型色原体を含有する液状試薬を提供する。  ロイコ型色原体含有水溶液に、アスコルビン酸誘導体を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法；ロイコ型色原体を、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法；ロイコ型色原体と、アスコルビン酸誘導体とを含有する液状試薬。  本発明の保存方法、安定化方法及び液状試薬は、糖尿病の診断に用いられる糖化ヘモグロビンの測定等に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコ型色原体含有水溶液に、アスコルビン酸誘導体を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
【請求項２】
アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）
【化５】
2014088056.tif 000008
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である請求項１記載の保存方法。
【請求項３】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１又は２記載の保存方法。
【請求項４】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項３記載の保存方法。
【請求項５】
ロイコ型色原体を、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
【請求項６】
アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）
【化６】
2014088056.tif 000009
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である請求項５記載の安定化方法。
【請求項７】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項５又は６記載の安定化方法。
【請求項８】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項７記載の安定化方法。
【請求項９】
ロイコ型色原体と、アスコルビン酸誘導体とを含有する液状試薬。
【請求項１０】
アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）
【化７】
2014088056.tif 000010
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である請求項９記載の液状試薬。
【請求項１１】
ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項９又は１０記載の液状試薬。
【請求項１２】
フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１１記載の液状試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、色素を生成する色原体の１種であり、カップリング型色原体とは異なり、それ単独で色素を生成する色原体であり、フェノチアジン系のロイコ型色原体、トリフェニルメタン系のロイコ型色原体、ジフェニルアミン系のロイコ型色原体等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。【０００３】
ロイコ型色原体は、カップリング型色原体と同様、血清等の試料中に存在するコレステロールや糖化ヘモグロビン等の定量すべき成分の定量にしばしば使用される。すなわち、試料中の定量すべき成分を過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、ロイコ型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から、試料中の定量すべき成分を定量することが、臨床検査において、しばしば行われている。特に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中に微量しか存在しない定量すべき成分の定量に好適に用いられる（例えば、非特許文献１参照）。【０００４】
この様に、ロイコ型色原体は、高感度色原体として、試料中の微量の定量すべき成分の定量に使用されるが、一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では室内照明などの光照射により、自然発色してしまうという欠点を有している。このロイコ型色原体の有する安定性不良という課題に対して、これまで、ロイコ型色原体の溶液中での安定化方法が検討され、報告されている（例えば、特許文献４、５参照）。しかしながら、これらのロイコ型色原体の安定化方法は厳しい条件下で行わなければならない等、必ずしも、満足の行く安定化方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５７−０２９２９７号公報
【特許文献２】特開平３−２０６８９６号公報
【特許文献３】特開昭６２−０９３２６１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０８８３０５パンフレット
【特許文献５】ＷＯ２００７／０８３７０３パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】臨床検査，1997年，Vol.41，No.9，p.1014-1019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、及び、ロイコ型色原体を安定に保持する液状試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ロイコ型色原体含有水溶液に、アスコルビン酸誘導体を添加して混合することにより、ロイコ型色原体含有水溶液中でロイコ型色原体が安定に保持される、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１２］に関する。
［１］  ロイコ型色原体含有水溶液に、アスコルビン酸誘導体を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
［２］  アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）【０００９】
【化１】
2014088056.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である［１］記載の保存方法。
［３］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１］又は［２］記載の保存方法。
［４］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［３］記載の保存方法。【００１１】
［５］  ロイコ型色原体を、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
［６］  アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）【００１２】
【化２】
2014088056.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である［５］記載の安定化方法。
［７］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［５］又は［６］記載の安定化方法。
［８］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［７］記載の安定化方法。【００１４】
［９］  ロイコ型色原体と、アスコルビン酸誘導体とを含有する液状試薬。
［１０］  アスコルビン酸誘導体が、一般式（Ｉ）【００１５】
【化３】
2014088056.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩である［９］記載の液状試薬。
［１１］  ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［９］又は［１０］記載の液状試薬。
［１２］  フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１１］記載の液状試薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法、ロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１）ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法とロイコ型色原体の安定化方法
本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存される。本発明において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であるか、又は、光に対して安定であることをいい、ロイコ型色原体が水溶液中で熱及び光に対して安定であることが好ましい。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、アスコルビン酸誘導体がロイコ型色原体含有水溶液に添加された後、添加されたアスコルビン酸誘導体がロイコ型色原体含有水溶液と混合され、アスコルビン酸誘導体存在下でロイコ型色原体含有水溶液が保存される。
【００１９】
本発明におけるアスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸の骨格を有する化合物若しくはその塩であれば特に制限はなく、例えば以下の一般式（Ｉ）
【００２０】
【化４】
2014088056.tif 000005
【００２１】
（式中、Ｘは、単結合又はＣ＝Ｏを表し、Ｒ１は、Ｘが単結合の場合には水素原子を表し、ＸがＣ＝Ｏの場合には、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｒ２は、置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される化合物若しくは塩［以下、化合物（Ｉ）と記す］等が挙げられる。また、本発明においては、アスコルビン酸誘導体とは、Ｌ−アスコルビン酸誘導体、Ｄ−アスコルビン酸誘導体のいずれであってもよい。
【００２２】
化合物（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２のアルキルとしては、同一又は異なって、例えば炭素数３〜２３のアルキル等が挙げられる。炭素数３〜２３のアルキルとしては、例えばプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、へプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル等が挙げられる。
【００２３】
化合物（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２の置換アルキルにおける置換基としては、例えば水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
化合物（Ｉ）の具体例としては、例えば６−Ｏ−ステアロイル−Ｌ−アスコルビン酸（東京化成工業社製）、６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬社製）、２，６−ジ−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸（東京化成工業社製）、２，６−ジ−Ｏ−ブチロイル−Ｌ−アスコルビン酸（東京化成工業社製）等が挙げられる。
【００２４】
本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法におけるアスコルビン酸誘導体の濃度としては、通常1〜1000μmol/Lであり、5〜500μmol/Lが好ましい。
尚、本発明において、ロイコ型色原体含有水溶液にアスコルビン酸誘導体を添加する際に、アスコルビン酸誘導体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたアスコルビン酸誘導体をロイコ型色原体含有水溶液に添加することにより、アスコルビン酸誘導体をロイコ型色原体含有水溶液に溶解させることができる。有機溶媒としては、アスコルビン酸誘導体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【００２５】
本発明のロイコ型色原体の保存方法において、ロイコ型色原体の保存安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【００２６】
本発明におけるロイコ型色原体含有水溶液とは、ロイコ型色原体が水性媒体中に溶解された水溶液であり、ロイコ型色原体を水性媒体に添加して溶解させることにより調製することができる。ロイコ型色原体が溶解される水性媒体は、ロイコ型色原体が溶解されれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。また、ロイコ型色原体含有水溶液の調製に際して、ロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたロイコ型色原体を水性媒体に添加し、ロイコ型色原体を水性媒体に溶解させ、ロイコ型色原体含有水溶液を調製することもできる。有機溶媒としては、ロイコ型色原体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【００２７】
水性媒体のpHは、ロイコ型色原体が溶解されるpHであれば特に制限はなく、例えばpH4〜10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００２８】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸(ACES)、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸(BES)、３−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(CHES)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
【００２９】
緩衝液の濃度は、ロイコ型色原体が溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。
【００３０】
本発明におけるロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ−フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(CCAP)、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン(MCDP)、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０−Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
【００３１】
さらに、本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。本発明におけるロイコ型色原体の安定化とは、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体が、熱に対して安定化されるか、又は、光に対して安定されることをいい、ロイコ型色原体が熱及び光に対して安定化されることが好ましい。ここで、ロイコ型色原体の安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
【００３２】
本発明のロイコ型色原体の安定化方法においては、ロイコ型色原体をアスコルビン酸誘導体を含む水溶液中で共存させる。本発明のロイコ型色原体の安定化方法に用いられるアスコルビン酸誘導体としては、前述のアスコルビン酸誘導体等が挙げられる。
【００３３】
本発明の安定化方法において用いられるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液としては、前述のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法におけるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液が挙げられる。本発明においてロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の濃度は、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常0.0001〜2.0 mmol/Lであり、0.0005〜1.0 mmol/Lが好ましい。
【００３４】
本発明において水溶液中にロイコ型色原体と共存させるアスコルビン酸誘導体の濃度としては、通常1〜1000μmol/Lであり、5〜500μmol/Lが好ましい。
【００３５】
本発明におけるロイコ型色原体の熱による安定性を測定する方法は、熱に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができる方法であれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液を、25℃で保存した後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００３６】
本発明におけるロイコ型色原体の光による安定性を測定する方法は、光に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができる方法であれば特に制限はないが、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液に4時間光を照射し、照射後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
【００３７】
（２）液状試薬
本発明の液状試薬は、ロイコ型色原体と、アスコルビン酸誘導体とを含有する液状試薬である。
【００３８】
本発明の液状試薬においては、ロイコ型色原体は、水性媒体中で、アスコルビン酸誘導体と共存する。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体としては、例えば前述のロイコ型色原体等が挙げられる。本発明の液状試薬における水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。本発明の液状試薬におけるアスコルビン酸誘導体としては、例えば前述のアスコルビン酸誘導体等が挙げられる。
【００３９】
本発明の液状試薬におけるアスコルビン酸誘導体の濃度としては、通常1〜1000μmol/Lであり、5〜500μmol/Lが好ましい。本発明の液状試薬におけるロイコ型色原体の濃度としては、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はなく、通常0.0001〜2.0 mmol/Lであり、0.0005〜1.0 mmol/Lが好ましい。ロイコ型色原体の水性媒体への溶解に際しては、前述の有機溶媒を溶解補助剤として用いることもできる。また、アスコルビン酸誘導体の水性媒体への溶解に際しては、前述の有機溶媒を溶解補助剤として用いることもできる。
【００４０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４１】
尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬を使用した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ；プロメライン社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、６−Ｏ−ステアロイル−Ｌ−アスコルビン酸［化合物（Ｉ）；東京化成工業社製］、６−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸［化合物（Ｉ）；和光純薬社製］、２，６−ジ−Ｏ−パルミトイル−Ｌ−アスコルビン酸［化合物（Ｉ）；東京化成工業社製］、２，６−ジ−Ｏ−ブチロイル−Ｌ−アスコルビン酸［化合物（Ｉ）；東京化成工業社製］、ＤＭＦ（関東化学社製）。
【実施例１】
【００４２】
（１）ＤＡ−６７含有水溶液、及び、ＤＡ−６７の熱安定性測定用試料の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７含有水溶液を調製した。
＜ＤＡ−６７含有水溶液＞
ＭＥＳ（ｐＨ７．０）              ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＡ−６７                        ２０μｍｏｌ／Ｌ
ＤＭＦ                            １０．３ｍＬ／Ｌ
化合物（Ｉ）                      １００μｍｏｌ／Ｌ
上記組成のＤＡ−６７含有水溶液を25℃で48時間保存したものをＤＡ−６７の熱安定性測定用試料として用いた。【００４３】
（２）ＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬＞
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                            ０．００５％【００４４】
（３）ＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７の熱安定性の評価
調製直後のＤＡ−６７含有水溶液30μLに（２）で調製したＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬120μLを添加し、37℃で5分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長660 nm、副波長800 nmで日立７１７０Ｓにて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【００４５】
同様に、25℃で48時間保存したＤＡ−６７含有水溶液を試料として用いて同様の測定を行い、25℃で48時間保存したＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（ΔＥ25℃）を測定した。【００４６】
測定したΔＥ25℃から△Ｅ直後を差し引いた値を△Ｅ１とし、ＤＡ−６７の熱安定性を評価するための指標とした。その結果を第１表に記す。△Ｅ１が０に近い程、水溶液中での着色が抑制され、ＤＡ−６７が安定化されることを示している。【００４７】
【表１】
2014088056.tif 000006
【００４８】
第１表に示される通り、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中では、アスコルビン酸誘導体を含有しない場合と比較して、25℃で48時間保存した後でも、着色が顕著に抑制されていた。このことから、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中のＤＡ−６７が熱に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液がアスコルビン酸誘導体により安定に保存され、ＤＡ−６７がアスコルビン酸誘導体により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
【実施例２】
【００４９】
（１）ＤＡ−６７の光安定性評価用試料の調製
実施例１で調製したＤＡ−６７含有水溶液に対して、1,300ルクスの光を4時間照射し、光によるＤＡ−６７の安定性を評価した。光照射後のＤＡ−６７含有水溶液をＤＡ−６７の光安定性評価用試料として用いた。【００５０】
（２）ＤＡ−６７の光安定性測定用試薬の調製
以下の組成からなるＤＡ−６７の熱安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ−６７の光安定性測定用試薬＞
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                            ０．００５％【００５１】
（３）ＤＡ−６７含有水溶液中のＤＡ−６７の光安定性の評価
実施例１で調製した直後のＤＡ−６７含有水溶液30μLに（２）のＤＡ−６７の光安定性測定用試薬120μLを添加し、37℃で5分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長660 nm、副波長800 nmで日立７１７０Ｓにて測定した。調製直後のＤＡ−６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ−６７の光安定性測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。【００５２】
同様に、（１）で調製した光照射後のＤＡ−６７含有水溶液（ＤＡ−６７の光安定性評価用試料）を試料として用いて測定を行い、光照射後のＤＡ−６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ光）を測定した。【００５３】
測定した△Ｅ光から△Ｅ直後を差し引いた値を、△Ｅ２とし、ＤＡ−６７の光に対する安定性の指標とした。その結果を第２表に示す。△Ｅ２の値が０に近い程、光照射によるＤＡ−６７の着色が抑制されることを示している。【００５４】
【表２】
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【００５５】
第２表に示される通り、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中では、アスコルビン酸誘導体を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、アスコルビン酸誘導体を含む水溶液中のＤＡ−６７が光に対して安定であり、ＤＡ−６７含有水溶液がアスコルビン酸誘導体により安定に保存され、ＤＡ−６７がアスコルビン酸誘導体により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法及びロイコ型色原体を含有する液状試薬が提供される。本発明の保存方法、安定化方法及び液状試薬は、糖尿病の診断に用いられる糖化ヘモグロビンの測定等に有用である。
【国際調査報告】
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