(57)【要約】  被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を評価する方法であって、被験物質を投与されたヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定する定量工程と、ＣＨＲＤ遺伝子等について測定された転写産物量が、被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又はＣＰＴ１Ａ遺伝子等について測定された転写産物量が、被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定する判定工程と、を備える、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質のイン・ビボにおけるナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を評価する方法であって、
前記被験物質を投与されたヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定する定量工程と、
ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又は
ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定する判定工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記定量工程が、前記被験物質を投与されたヒト対象から投与５〜７時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、
前記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又は
ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記定量工程が、前記被験物質を投与されたヒト対象から投与２３〜２５時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、
前記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又は
ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子について測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又は
ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子について測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記定量工程が、前記被験物質を投与されたヒト対象から投与５〜７時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、
前記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又は
ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記定量工程が、前記被験物質を投与されたヒト対象から投与２３〜２５時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、
前記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又は
ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、前記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、
前記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記閾値が、前記被験物質を投与する前に前記ヒト対象から採取された血液細胞で発現している各遺伝子の転写産物量である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記定量工程において、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブからなる群から選択される少なくとも１種を使用して転写産物量を測定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質のスクリーニング方法であって、
候補物質に対して、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む、スクリーニング方法。
【請求項１１】
前記候補物質が、ＮＫＴ細胞の抗原受容体、及びＣＤ１ｄに結合する物質である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、請求項１０又は１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物質のイン・ビボにおけるナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性の検出剤であって、
配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブからなる群から選択される少なくとも１種からなる、検出剤。
【請求項１４】
前記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、請求項１３に記載の検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の中間的な性質を有する細胞である。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を有し、ＮＫ細胞のマーカー（マウスではＮＫ１．１、ヒトではＣＤ５６）を発現する。特に、Ｔ細胞抗原受容体のＶα鎖（マウスの場合、遺伝子断片Ｖα１４−Ｊα２８、ヒトではＶα２４−Ｊα１８）に多様性がほとんど無いインバリアントＴＣＲを発現するＮＫＴ細胞は、インバリアントＮＫＴ細胞と呼ばれる。１９９７年に、このインバリアントＮＫＴ細胞が、樹状細胞表面上の抗原提示分子であるＣＤ１ｄに結合した糖脂質α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）を認識することが報告された（非特許文献１）。現在では、ＣＤ１ｄに結合したα−ＧａｌＣｅｒを認識して結合し、かつインバリアントＴＣＲを発現する細胞をＮＫＴ細胞と呼ぶことが多い。【０００３】
ヒト及びマウスの実験結果によれば、ＣＤ１ｄに拘束されたＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄに結合したα−ＧａｌＣｅｒによって活性化され、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）等のサイトカインを大量に産生することが知られている（非特許文献２）。また、ＮＫＴ細胞は、数の少ない細胞集団ではあるが、上記のようなサイトカン産生を介したクロストークによって、ＮＫ細胞をはじめとする主要なリンパ球の機能に影響を与え、抗原特異的な免疫応答を調節していることが知られている（非特許文献３及び非特許文献４）。【０００４】
ＮＫＴ細胞を活性化する能力のある物質として、従来α−ＧａｌＣｅｒが知られている（例えば、非特許文献２）。また、特許文献１には、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−４産生を選択的に誘導する能力のある糖脂質が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０６４３４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８巻，ｐｐ．１６２６−１６２９．
【非特許文献２】Ｂｅｎｄｅｌａｃ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，２００７年，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５巻，ｐｐ．２９７−３３６．
【非特許文献３】Ｃａｒｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３巻，ｐｐ．４６４７．
【非特許文献４】Ｂｅｒｚｉｎｓ  ＳＰ，  ｅｔ  ａｌ．，２０１１年，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１巻，ｐｐ．１３１−１４２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の糖脂質（以下、「合成糖脂質化合物」ともいう。）は、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−４産生を選択的に誘導することができる（以下、「ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性」ともいう。）。これにより、例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスをＴｈ２が増加する方向に調節すること、ＩＬ−１７産生を低下させること、ＧＭ−ＣＳＦ産生を低下させることができる。このようなＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質は、例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスがＴｈ１に偏向した疾患又はＴｈ１細胞が病態を悪化させる疾患の治療、自己免疫疾患の治療、生体内におけるＧＭ−ＣＳＦ濃度の増加に起因する疾患の治療、及びＩＬ−１７産生Ｔ細胞の増加に起因する疾患の治療に極めて有効である。【０００８】
ところで、新薬開発を目的とし、ある物質がＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有するか否かを評価する場合、試験管内（イン・ビトロ）での評価だけでは充分ではなく、ヒトに投与したときの免疫修飾能を評価することが望ましい。しかしながら、ヒトをはじめとする哺乳動物において、ＮＫＴ細胞は末梢血中に僅かしか存在せず、ＮＫＴ細胞の活性化状態を直接検出することは、従来技術では非常に困難である。【０００９】
また、一般にヒトを対象とした臨床試験は、時間及びコストがかかるため、可能な限り早い段階で薬効を評価することのできる方法が求められる。【００１０】
そこで、本発明は、イン・ビボにおける被験物質のＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を迅速に評価することのできる評価方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を評価する方法であって、上記被験物質を投与されたヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定する定量工程と、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又はＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定する判定工程と、を備える、方法。【００１２】
（２）上記定量工程が、上記被験物質を投与されたヒト対象から投与５〜７時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、上記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又はＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、（１）に記載の方法。【００１３】
（３）上記定量工程が、上記被験物質を投与されたヒト対象から投与２３〜２５時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、上記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、又はＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子からなる群から選択される１種以上の遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、（１）又は（２）に記載の方法。【００１４】
（４）上記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子について測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又はＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子について測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。【００１５】
（５）上記定量工程が、上記被験物質を投与されたヒト対象から投与５〜７時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、上記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又はＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子について投与５〜７時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。【００１６】
（６）上記定量工程が、上記被験物質を投与されたヒト対象から投与２３〜２５時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、上記判定工程が、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも多い場合、並びに／又はＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子について投与２３〜２５時間後の血液細胞に対して測定された転写産物量が、上記被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められた閾値よりも少ない場合に、上記被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１７】
（７）上記閾値が、上記被験物質を投与する前に上記ヒト対象から採取された血液細胞で発現している各遺伝子の転写産物量である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。【００１８】
（８）上記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。【００１９】
（９）上記定量工程において、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブからなる群から選択される少なくとも１種を使用して転写産物量を測定する、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。【００２０】
（１０）イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質のスクリーニング方法であって、候補物質に対して、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法を実施することを含む、スクリーニング方法。【００２１】
（１１）上記候補物質が、ＮＫＴ細胞の抗原受容体、及びＣＤ１ｄに結合する物質である、（１０）に記載のスクリーニング方法。【００２２】
（１２）上記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、（１０）又は（１１）に記載のスクリーニング方法。【００２３】
（１３）被験物質のイン・ビボにおけるナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性の検出剤であって、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブからなる群から選択される少なくとも１種からなる、検出剤。【００２４】
（１４）上記ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性が、ＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性である、（１３）に記載の検出剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ヒト対象から採取された血液サンプルに含まれる特定の遺伝子の転写産物量の変化に基づいて、イン・ビボにおける被験物質のＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を迅速に（すなわち、投与後の早い段階で）評価することができる。したがって、ヒトを対象とした臨床試験における薬効評価用として好適である。【００２６】
また、本発明によれば、例えば、特許文献１に記載の合成糖脂質化合物のイン・ビボでの薬効評価が可能であり、更にＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する新規物質（新薬候補）のスクリーニングも可能である。【００２７】
さらに本発明の検出剤は、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブ１種以上からなるものであるため、ヒト対象から採取された血液サンプルに含まれる特定の遺伝子の転写産物量を再現性よくかつ精度よく測定することができる。これにより、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したか否かをより高い精度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１のＡコホートにおける投与６時間後のスキャッタープロットである。グラフの縦軸、横軸共にアレイ間正規化後のシグナル値の平均値を示す。
【図２】実施例１のＡコホートにおける投与２４時間後のスキャッタープロットである。グラフの縦軸、横軸共にアレイ間正規化後のシグナル値の平均値を示す。
【図３】実施例１のＣコホートにおける投与６時間後のスキャッタープロットである。グラフの縦軸、横軸共にアレイ間正規化後のシグナル値の平均値を示す。
【図４】実施例１のＣコホートにおける投与２４時間後のスキャッタープロットである。グラフの縦軸、横軸共にアレイ間正規化後のシグナル値の平均値を示す。
【図５】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図６】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図７】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図８】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図９】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１０】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１１】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１２】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１３】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１４】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１５】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１６】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１７】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１８】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【図１９】化合物３１を投与した被験者における、末梢血中の転写産物量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００３０】
（転写産物）
本明細書において、「転写産物」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に加え、タンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡも包含する。
【００３１】
〔被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性の評価方法〕
本発明に係る被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を評価する方法（以下、単に「評価方法」ともいう。）は、被験物質を投与されたヒト対象から採取された血液細胞で発現している所定の遺伝子の転写産物量を測定する定量工程（以下、単に「定量工程」ともいう。）と、測定された転写産物量と各遺伝子に対して設定された閾値との比較に基づいて、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定する判定工程（以下、単に「判定工程」ともいう。）と、を備える。また、本発明は、上記定量工程を含む、被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を評価するためのデータを収集する方法と捉えることもできる。
【００３２】
（所定の遺伝子）
本発明に係る評価方法における「所定の遺伝子」は、特許文献１に記載の合成糖脂質化合物の一つである（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトシル）−２−（Ｎ−テトラコサノイルアミノ）−１，３，４−ノナントリオール（以下、「化合物３１」ともいう。）をヒト対象（健常者対象）に投与したときに、投与前と比べて、血液サンプル（血液細胞）中で転写産物量が統計上有意に増加又は減少する遺伝子である。すなわち、「所定の遺伝子」の転写産物量の増加又は減少と、ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性とは相関しているため、本発明に係る評価方法により、被験物質の評価が可能となる。
【００３３】
第一実施形態において「所定の遺伝子」は、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子、ＬＯＣ６４５１９５遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子（以下、「遺伝子群１」ともいう。）である。各遺伝子の詳細については、表１〜表９に記載した。
【００３４】
第一実施形態では、遺伝子群１から選択される１種の遺伝子について、定量工程及び判定工程を実施してもよく、また、遺伝子群１から選択される２種以上の遺伝子について、又は遺伝子群１の全ての遺伝子について、定量工程及び判定工程を実施してもよい。複数の遺伝子について定量工程及び判定工程を実施することにより、被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性をより一層精度よく評価することができる。
【００３５】
第二実施形態において「所定の遺伝子」は、遺伝子群１の各遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子及びＦＯＳ遺伝子（以下、「遺伝子群２」ともいう。）である。各遺伝子の詳細については、表１〜表９に記載した。
【００３６】
第二実施形態では、遺伝子群２から選択される１種以上の遺伝子について、定量工程及び判定工程を実施してもよく、遺伝子群２から選択される２種以上の遺伝子について、定量工程及び判定工程を実施してもよい。また、第二実施形態では、評価の精度をより一層高める観点から、遺伝子群２の全ての遺伝子について、定量工程及び判定工程を実施することが好ましい。
【００３７】
遺伝子群１又は２に含まれる各遺伝子は、被験物質投与後の時間経過に伴う転写産物量の変化パターンに応じて、遺伝子群Ａ、遺伝子群Ｂ、遺伝子群Ｃ、遺伝子群Ｄ及び遺伝子群Ｅに分けることができる。
【００３８】
遺伝子群Ａは、投与前と比較して、投与６時間後及び投与２４時間後に転写産物量が統計上有意に増加する。遺伝子群Ａに含まれる遺伝子は、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子である。
【００３９】
遺伝子群Ｂは、投与前と比較して、投与２４時間後に転写産物量が統計上有意に増加する。投与６時間後の転写産物量と投与前の転写産物量には統計上有意差はない。遺伝子群Ｂに含まれる遺伝子は、ＯＡＳ３遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子である。
【００４０】
遺伝子群Ｃは、投与前と比較して、投与６時間後に転写産物量が統計上有意に減少する。投与２４時間後の転写産物量と投与前の転写産物量には統計上有意差はない。遺伝子群Ｃに含まれる遺伝子は、ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子及びＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子である。
【００４１】
遺伝子群Ｄは、投与前と比較して、投与６時間後及び投与２４時間後に転写産物量が統計上有意に減少する。遺伝子群Ｄに含まれる遺伝子は、ＤＲＣ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子である。
【００４２】
遺伝子群Ｅは、投与前と比較して、投与２４時間後に転写産物量が統計上有意に減少する。投与６時間後の転写産物量と投与前の転写産物量には統計上有意差はない。遺伝子群Ｅに含まれる遺伝子は、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子である。
【００４３】
したがって、本発明に係る評価方法は、定量工程が、被験物質を投与されたヒト対象から投与５〜７時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、判定工程が、遺伝子群Ａに含まれる遺伝子の転写産物量が、各遺伝子に対して設定された閾値よりも多い場合、又は遺伝子群Ｃ若しくは遺伝子群Ｄに含まれる遺伝子の転写産物量が、各遺伝子に対して設定された閾値よりも少ない場合に、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含むものであってもよい（以下、便宜上「６時間評価」ともいう。）。血液細胞の採取は、被験物質の投与５．５〜６．５時間後に行うことが好ましく、被験物質の投与５．７５〜６．２５時間後に行うことがより好ましく、被験物質の投与６時間後に行うことが更に好ましい。
【００４４】
なお、第一実施形態においては、６時間評価の場合、遺伝子群Ａに含まれる遺伝子は、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子であり、遺伝子群Ｃ又は遺伝子群Ｄに含まれる遺伝子は、ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子である。
【００４５】
第二実施形態においては、６時間評価の場合、遺伝子群Ａに含まれる遺伝子は、第一実施形態の遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子及びＯＡＳ２遺伝子であり、遺伝子群Ｃ又は遺伝子群Ｄに含まれる遺伝子は、第一実施形態の遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子及びＦＯＳ遺伝子である。
【００４６】
本発明に係る評価方法はまた、定量工程が、被験物質を投与されたヒト対象から投与２３〜２５時間後に採取された血液細胞で発現している転写産物量を測定することを含み、判定工程が、遺伝子群Ａ若しくは遺伝子群Ｂに含まれる遺伝子の転写産物量が、各遺伝子に対して設定された閾値よりも多い場合、又は遺伝子群Ｄ若しくは遺伝子群Ｅに含まれる遺伝子の転写産物量が、各遺伝子に対して設定された閾値よりも少ない場合に、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定することを含むものであってもよい（以下、便宜上「２４時間評価」ともいう。）。血液細胞の採取は、被験物質の投与２３．５〜２４．５時間後に行うことが好ましく、被験物質の投与２３．７５〜２４．２５時間後に行うことがより好ましく、被験物質の投与２４時間後に行うことが更に好ましい。
【００４７】
なお、第一実施形態においては、２４時間評価の場合、遺伝子群Ａ又は遺伝子群Ｂに含まれる遺伝子は、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子であり、遺伝子群Ｄ又は遺伝子群Ｅに含まれる遺伝子は、ＤＲＣ１遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子である。
【００４８】
第二実施形態においては、２４時間評価の場合、遺伝子群Ａ又は遺伝子群Ｂに含まれる遺伝子は、第一実施形態の遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子及びＯＡＳ３遺伝子であり、遺伝子群Ｄ又は遺伝子群Ｅに含まれる遺伝子は、第一実施形態の遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子及びＦＯＳ遺伝子である。
【００４９】
第一実施形態及び第二実施形態のいずれにおいても、６時間評価又は２４時間評価を実施する場合は、６時間評価又は２４時間評価のいずれかを実施してもよく、６時間評価及び２４時間評価を組み合わせて実施してもよい。
【００５０】
（被験物質）
被験物質としては、低分子化合物であってもよく、高分子化合物であってもよい。低分子化合物としては、例えば、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、糖脂質等から任意に選択される。高分子化合物としては、例えば、タンパク質、抗体等から任意に選択される。
【００５１】
一実施態様として、被験物質として、ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有することが確認されている特許文献１に記載の糖脂質（例えば、下記式（Ｉ）で表されるαガラクトシルセラミドの誘導体）を選択してもよい。この場合、例えば、当該糖脂質の投与量、投与方法等を変化させた場合のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性との相関を評価することができる。
【化１】
2015178288.tif 000002
［一般式（Ｉ）中、Ｒ１はアルドピラノース残基を表し、Ｒ２は水素原子又は水酸基を表し、Ｒ３は−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−、又は−ＣＨ＝ＣＨ−を表し、Ｒ４は水素原子又はＣＨ３を表し、ｘは０〜３５であり、ｙ及びｚは、ｙ＋ｚ＝０〜３を満たす整数を表す。］
【００５２】
また、被験物質として、イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有するか否か不明の物質を選択してもよい。本発明の評価方法によりイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したと判定された物質は、例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスがＴｈ１に偏向した疾患又はＴｈ１細胞が病態を悪化させる疾患の治療、自己免疫疾患の治療、生体内におけるＧＭ−ＣＳＦ濃度の増加に起因する疾患の治療、及びＩＬ−１７産生Ｔ細胞の増加に起因する疾患の治療に極めて有効である。被験物質は、非臨床試験において設定された安全性基準を達成した物質であることが好ましく、ヒト対象に投与した場合に安全性を有すると判断された物質であることがより好ましい。「ヒト対象に投与した場合に安全性を有する」とは、例えば、臨床試験のフェーズＩにおいて安全性が確認されたことを意味し、より具体的には、当該物質の有効量の１０倍又は１００倍の血中濃度においても重篤な副作用を呈さないことが挙げられる。
【００５３】
（血液細胞）
血液細胞は、被験物質を投与される前、又は被験物質を投与されたヒト対象から採取されたものである。被験物質を投与した後、血液細胞を採取するまでの時間は、例えば、投与１時間後〜投与７２時間後の間で設定することができる。血液細胞は、真空採血管により採血し、遠心分離により血液細胞を回収する方法等の公知の方法により採取することができる。ヒト対象の性別、年齢、身長、体重、健康状態等は特に制限されるものではなく、評価の目的に応じて適宜設定してよい。被験物質の投与方法は、目的に応じて設定すればよく、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。非経口投与は、全身投与（例えば、血管内注射）であってもよく、局所投与（例えば、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与、又は経直腸的投与等）であってもよい。被験物質の投与量は、被験物質の種類等、及び目的に応じて設定すればよい。
【００５４】
（定量工程）
血液細胞で発現している転写産物量を測定する方法としては、当業者に公知の任意の方法を採用してよい。定量工程は、例えば、以下の手順にしたがって実施することができる。
（１）被験物質を投与されたヒト対象から、投与１日前、投与６時間後、投与２４時間後に採取された血液サンプルを用意する。なお、投与１日前の血液サンプルは、転写産物量の基準として使用する（例えば、閾値を決定するのに使用する）。
（２）血液サンプルを遠心分離して、血液細胞を沈殿として回収する。
（３）回収した血液細胞から、常法に従い、総ＲＮＡを精製する。市販されている総ＲＮＡの抽出キット又は精製キットを使用してもよい。総ＲＮＡサンプルから転写産物を精製（又は濃縮）してもよい。
（４）精製した総ＲＮＡを鋳型とし、常法に従い、所定の遺伝子の転写産物量を測定する。総ＲＮＡを鋳型とした転写産物量の測定は、例えば、マイクロアレイ解析、（リアルタイム）定量ＰＣＲ解析、核酸デジタル計数システム（ｎｃｏｕｎｔｅｒ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ等により実施することができる。
【００５５】
定量工程では、血液サンプル（血液細胞）の量のバラつきを補正するため、所定の遺伝子に加えて、内部標準としてハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）の転写産物量も併せて測定してもよい。これにより、より正確な転写産物量の比較が可能になる。
【００５６】
（判定工程）
判定工程では、定量工程で測定された転写産物量（又は補正後の転写産物量）と、各遺伝子に対して設定された閾値との比較に基づいて、被験物質がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したか否かを判定する。
【００５７】
（閾値）
閾値は、被験物質を投与されていないヒト対象から採取された血液細胞で発現している転写産物量に基づいて定められる。閾値は、各遺伝子について、当該血液細胞で発現しているそれぞれの遺伝子の転写産物量であることが好ましい。これにより、被験物質の投与による所定の遺伝子の転写産物量の変化をより感度よく判定することが可能になる。閾値は、例えば、被験物質を投与されていない（１人又は複数人の）ヒト対象から採取された血液細胞で発現している所定の遺伝子の転写産物量を測定しておき、当該転写産物量（複数人の場合は、例えば、平均値）を閾値として予め設定してもよい。また、閾値は、被験物質の投与が予定されているヒト対象から、被験物質の投与前に採取された血液細胞で発現している所定の遺伝子の転写産物量を測定し、当該転写産物量を閾値としてもよい。これによりより一層感度よく判定することが可能になる。
【００５８】
（ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性）
本明細書において、被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性とは、ＮＫＴ細胞を活性化し、ＮＫＴ細胞によるＩＬ−４産生を選択的に誘導する活性を意味する。ＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性は、ＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γ産生を誘導せず、かつＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を誘導する活性であることがより好ましい。
【００５９】
〔イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質のスクリーニング方法〕
本発明に係る評価方法は、上述の構成を採用していることから、イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質のスクリーニング方法としても使用することができる。すなわち、１又は複数の候補物質を被験物質として、本発明に係る評価方法を実施することにより、イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する物質のスクリーニングが可能になる。
【００６０】
本発明に係るスクリーニング方法により選抜される物質は、イン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を有する。したがって、当該物質は、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスがＴｈ１に偏向した疾患又はＴｈ１細胞が病態を悪化させる疾患の治療剤又は予防剤として用いることができる。また、当該物質は、自己免疫疾患の治療剤又は予防剤としても用いることができる。更に当該物質は、生体内におけるＧＭ−ＣＳＦ濃度の増加に起因する疾患の治療剤又は予防剤としても用いることができる。更にまた、当該物質は、ＩＬ−１７産生Ｔ細胞の増加に起因する疾患の治療剤又は予防剤としても用いることができる。
【００６１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫バランスがＴｈ１に偏向した疾患とは、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患に加え、劇症肝炎、移植片拒絶、細胞内感染病原体による感染症等の主として細胞性免疫による疾患を意味する。自己免疫疾患とは、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、尋常性白斑、ベーチェット病、膠原病、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、シェーグレン症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝疾患、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症等の疾患を意味する。生体内におけるＧＭ−ＣＳＦ濃度の増加に起因する疾患とは、慢性臓器炎、関節リウマチ等の慢性炎症性疾患等の疾患を意味する。ＩＬ−１７産生Ｔ細胞の増加に起因する疾患とは、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、視神経脊髄炎、炎症性腸疾患等の疾患を意味する。
【００６２】
〔被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性の検出剤〕
本発明に係る被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性性の検出剤は、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列を含むプローブからなる群から選択される少なくとも１種からなる。各プローブは、配列番号１〜７８のいずれかに示す塩基配列からなるものであってもよい。
【００６３】
配列番号１〜７８に示す塩基配列は、表１〜表９に示すように、遺伝子群２に含まれる遺伝子のｃＲＮＡ（又は転写産物）とハイブリダイズする。したがって、上記検出剤は、所定の遺伝子のｃＲＮＡ（又は転写産物）と定量的なハイブリダイズが可能であり、これにより、例えば、血液細胞で発現している転写産物量を反映した蛍光シグナル等によるシグナルを取り出すことができ、被験物質のイン・ビボにおけるＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を検出することができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６５】
＜実施例１：遺伝子の同定＞
化合物３１をヒト対象に経口単回投与し、末梢血中の遺伝子発現の変化をマイクロアレイによって解析した。実施例１では、ヒト対象として健常成人（以下、「被験者」という。）を採用し、以下の手順にて試験を行った。【００６６】
（方法）
（１）被験者への合成糖脂質化合物の投与
インフォームドコンセントを得た被験者６名を２つのコホート（Ａ及びＣコホート）に分類し、各被験者に化合物３１、すなわち以下の式（ＩＩ）で示される、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトシル）−２−（Ｎ−テトラコサノイルアミノ）−１，３，４−ノナントリオールを経口単回投与した。Ａコホートに分類された被験者には、化合物３１を０．３ｍｇ／人の投与量で投与し、Ｃコホートに分類された被験者には、化合物３１を３ｍｇ／人の投与量で投与した。
【化２】
2015178288.tif 000003
【００６７】
（２）末梢血からの総ＲＮＡ抽出
まず、真空採血管（ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、化合物３１を投与してから６時間後及び２４時間後（１日目）に、各被験者の静脈よりそれぞれ２．５ｍＬの血液を採取した。なお、化合物３１を投与する日の前日に、各被験者の静脈より同様に２．５ｍＬの血液を採取し、対照として使用した。【００６８】
続いて、採取した血液が入った真空採血管を２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、血液細胞を沈殿させ、上清を除去した。得られた沈殿をＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅの水で洗浄し、ＢＭ１（再懸濁バッファー）に懸濁させた後、ＢＭ２（結合バッファー）とｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを添加して、５５℃、９００ｒｐｍで１０分間溶解させた。得られた溶解液を上記キットに付属のＰＡＸｇｅｎｅ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに通して破砕した後、遠心分離により不要なペレットを取り除いて、上清を得た。得られた上清に７００μＬのイソプロパノールを添加して、総ＲＮＡを析出させた。その後、キットに付属のＰＡＸｇｅｎｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して、総ＲＮＡを精製し、２０μＬ又は３０μＬのＢＭ５（溶出バッファー）にて溶出した。【００６９】
（３）マイクロアレイによる遺伝子発現解析
次に、Ａｇｉｌｅｎｔ社が推奨するプロトコル（Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ），ｖｅｒ  ６．５，Ｍａｙ  ２０１０）に記載の方法に従って遺伝子発現解析を実施した。まず、上記工程で抽出した総ＲＮＡ  １００ｎｇを鋳型として、ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡからＯｎｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｐｉｋｅ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）及びＱｕｉｃｋ−Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（１カラー用）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ラベル化ｃＲＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ラベル化ｃＲＮＡの精製を行った後、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて濃度測定を行った。この時、精製されたラベル化ｃＲＮＡの増幅効率が１５倍以上、かつラベルの取り込み効率が６ｐｍｏｌ／μｇ以上のサンプルを合格とし、以降の試験に用いた。【００７０】
続いて、６００ｎｇのラベル化ｃＲＮＡを分取し、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ラベル化ｃＲＮＡとマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイは、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥマイクロアレイ（８×６０Ｋ）  ｖｅｒ  ２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いた。サンプルをマイクロアレイ面にアプライした後、８×６０Ｋガスケットスライド（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でカバーし、ハイブリダイゼーションチャンバ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で固定した。固定したアレイをＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）内で１７時間（６５℃、１０回転）の条件下にてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  １（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて洗浄後のマイクロアレイをスキャニングした。【００７１】
得られたスキャニングデータをソフトウェアＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｖｅｒ  １０．７．１．１（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により数値化プロトコルＧＥ１＿１０７＿Ｓｅｐ０９を用いて数値化した（数値化グリッドファイル：０３９４９４＿Ｄ＿Ｆ＿２０１２６２８）。数値化されたデータは、以下の方法により解析した。
（ａ）アレイ間の正規化
一色法の際のアレイ間正規化法として、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ社奨励のグローバルノーマライゼーションを行った。数値化データ（Ｒａｗ  Ｓｉｇｎａｌ）が１．０以下のプローブを除外した後、アレイごとに測定値の７５パーセンタイル値で補正し、アレイ間のばらつきを抑えて、生物学的な変動のみを抽出した。
アレイ間正規化と同時に、数値化データ（Ｒａｗ  Ｄａｔａ）に記載された５項目のフラグ情報に基づいて、データの信頼度の指標となる３種類（Ｄｅｔｅｃｔｅｄ、Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ、Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇに変換した）。表１に数値化データ（Ｒａｗ  Ｄａｔａ）とＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇにおけるフラグ情報を示す。【００７２】
【表１】
2015178288.tif 000004
【００７３】
各プローブに付すＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇの選択基準は、以下のとおりである。いずれか一項目でも「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」と判定されたプローブには「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇを付した。また、「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」判定は全く無いものの、いずれかの項目で「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」と判定されたプローブには「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇを付した。「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」及び「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」の判定が全く無いプローブには「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇｓを付した。なお、「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇｓを付されたプローブが、最も信頼性の高いプローブであることを意味する。全てのプローブに３種いずれかのＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇを付した後、データごとにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇで分類されたプローブ数をカウントした。【００７４】
（ｂ）相関性解析
各群内の被験者間の相関性を調べるために、同一群内の２被験者間で相関解析を行った（３通り／群）。まず、同一群内の各２被験者で共通してＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｆｌａｇが「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付されたプローブを選定し、それらの正規化されたシグナル値データに基づいてスキャッタープロットを作成し、決定係数（ｒ２）を算出した。【００７５】
（ｃ）階層的クラスタリング解析
遺伝子発現プロファイルデータ間の類似性及び独立性を調査するために、被検者６名×３検体の計１８検体の全てのデータで共通して、「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」を示すプローブを選定した後、これらの正規化されたシグナル値に基づいて、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて階層的クラスタリングを行った。なお、解析条件のうち、Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｔｒｉｃを「Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｕｎｃｅｎｔｅｒｅｄ」として設定し、Ｌｉｎｋａｇｅ  ｒｕｌｅを「Ｗａｒｄ’ｓ」として設定した。その後、上記相関性解析で得られた決定係数（ｒ２）の結果と併せて、同一群内の類似性及び各群の独立性を評価し、有意差検定が実施できるか否かを判断した。【００７６】
（ｄ）発現比の算出及び変動遺伝子群の抽出
各群内で相関性が認められた正規化後のシグナル値に基づいて、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １２．０（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて０時間（投与前）群と、６時間群又は２４時間群との間で２群間の有意差検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ検定）を行い、ｐ値を算出した。【００７７】
また、各群の平均シグナル値、０時間群に対する６時間群又は２４時間群の発現比（ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ）を算出した後、全検体で「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付されたプローブについて、０時間群（ｘ軸）対する処理群（ｙ軸）のスキャッタープロットを作成した（図１〜図４）。なお、解析には、両群で「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付されたプローブを用いた。図１〜４は、それぞれ、Ａコホートにおける投与６時間後、Ａコホートにおける投与２４時間後、Ｃコホートにおける投与６時間後、及びＣコホートにおける投与２４時間後のスキャッタープロットである。グラフの縦軸、横軸共にアレイ間正規化後のシグナル値の平均値を示す。また、図１〜図４において、点線は１．５倍、破線は０．６７倍の境界を示し、白四角ドットは変動遺伝子を示す。【００７８】
次に、化合物３１の投与後に発現が変動した遺伝子群を抽出するために、以下の３つの条件のいずれかに合致するプローブを選定した。
（条件１）６時間群及び２４時間群の両群で、「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、発現比が１．５倍以上又は０．６７倍以下であり、かつ有意差検定においてｐ＜０．０５を示したプローブ
（条件２）６時間群及び２４時間群の両群で、「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、発現比が１倍より大きく１．５倍未満か又は０．６７倍より大きく１倍より小さく、かつ有意差検定においてｐ＜０．０１を示したプローブ
（条件３）
・スイッチＯＮ型：
０時間群では一被験者以上が「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグを付されたものの、処理群では全てが「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、発現比が４倍以上であり、かつ有意差検定においてｐ＜０．０１を示したプローブ
・スイッチＯＦＦ型：
処理群では一被験者以上が「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグを付されたものの、０時間群では全てで「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、発現比が０．２５倍以下であり、かつ有意差検定においてｐ＜０．０１を示したプローブ
ただし、相関性解析及び階層的クラスタリング解析で、同一処理群のばらつきが大きかった場合は、その要因となる被験体を解析から除外した。この場合、統計処理は行えないため、ｐ値による選定基準を適用せず、また被験体数減少により平均値の精度が低下するため、（条件２）も適用しない。この場合は、以下の２つの条件のいずれかに合致するプローブを選定した。
（条件１’）６時間群及び２４時間群の両群で、「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、かつ発現比が１．５倍以上又は０．６７倍以下であるプローブ
（条件３’）
・スイッチＯＮ型：
０時間群では一被験者以上が「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグを付されたものの、処理群では全てが「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、かつ発現比が４倍以上であるプローブ
・スイッチＯＦＦ型：
処理群では一被験者以上が「Ｎｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグを付されたものの、０時間群では全てが「Ｄｅｔｅｃｔｅｄ」フラグ又は「Ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ」フラグを付され、かつ発現比が０．２５倍以下であるプローブ【００７９】
（ｅ）ベン図解析
Ａコホート及びＣコホートの間で共通して転写産物量が変動したプローブ数を調べるため、６時間群及び２４時間群のそれぞれで、プローブの転写産物量の増加と減少に分けてベン図解析を行った。２つの組合せ間で重複したプローブ群及び特異的な変動を示したプローブを抽出した。【００８０】
（結果）
Ａコホート及びＣコホートに共通して、化合物３１の投与６時間後及び２４時間後に、投与前と比較して、転写産物量が有意に増加した遺伝子の転写産物量の経時変化を図５〜図７、及び図１５〜図１６に示した。図５、図６及び図１５は、投与６時間後及び２４時間後のいずれにおいても、投与前と比較して、転写産物量が有意に増加した遺伝子を示している。図７及び図１６は、投与２４時間後のみ、投与前と比較して、転写産物量が有意に増加した遺伝子を示している。【００８１】
すなわち、転写産物量の増加が見られた遺伝子として、ＣＨＲＤ遺伝子、ＧＹＬＴＬ１Ｂ遺伝子、ＭＹＯＦ遺伝子、ＥＰＳ８遺伝子、ＳＨ３ＲＦ１遺伝子、ＩＬ４Ｉ１遺伝子、ＣＤ１８０遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＲＵＦＹ４遺伝子、ＧＰＥＲ遺伝子、ＲＣＣ２遺伝子、ＯＡＳ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ４７遺伝子、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＧＳＧ１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００２７２７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００５８５１遺伝子及びＸＬＯＣ＿Ｉ２＿０１２０４６遺伝子及びＬＯＣ６４５１９５遺伝子が同定された（表２、表３及び表８も参照）。【００８２】
Ａコホート及びＣコホートに共通して、化合物３１の投与６時間後及び２４時間後に、投与前と比較して、転写産物量が有意に減少した遺伝子の転写産物量の経時変化を図８〜図１４、及び図１７〜図１９に示した。図８及び図１７は、投与６時間後のみ、投与前と比較して、転写産物量が有意に減少した遺伝子を示している。図９〜図１１、図１８は、投与６時間後及び投与２４時間後のいずれにおいても、投与前と比較して、転写産物量が有意に減少した遺伝子を示している。図１２〜図１４、図１９は、投与２４時間後のみ、投与前と比較して、転写産物量が有意に減少した遺伝子を示している。【００８３】
すなわち、転写産物量の減少が見られた遺伝子として、ＤＲＣ１遺伝子、ＦＯＳＢ遺伝子、ＰＤＫ４遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３遺伝子、ＣＰＴ１Ａ遺伝子、ＴＲＩＭ４９遺伝子、ＲＥＬＬ１遺伝子、ＣＮＴＮＡＰ３Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＢ５遺伝子、ＰＲＯＭ２遺伝子、ＭＳ４Ａ２遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、ＧＡＴＡ２遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２０遺伝子、ＰＥＲ１遺伝子、ＳＥＭＡ３Ｃ遺伝子、ＥＭＰ１遺伝子、ＴＡＧＡＰ遺伝子、Ｆ１２遺伝子、ＫＢＴＢＤ７遺伝子、ＫＬＦ６遺伝子、ＳＬＣ１Ａ７遺伝子、ＭＹＯＭ２遺伝子、ＧＮＬＹ遺伝子、ＧＺＭＢ遺伝子、ＦＧＦＢＰ２遺伝子、Ｃ１ｏｒｆ２１遺伝子、ＣＯＬＧＡＬＴ２遺伝子、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、Ｆ２Ｒ遺伝子、ＺＮＦ６８３遺伝子、ＰＲＦ１遺伝子、ＳＨ２Ｄ２Ａ遺伝子、ＤＡＡＭ２遺伝子、ＡＧＰＡＴ４−ＩＴ１遺伝子、ＭＹＢＬ１遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＫＬＦ１０遺伝子、ＸＬＯＣ＿０００３５７遺伝子、ＸＬＯＣ＿００６６８８遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１００６１遺伝子、ＬＩＮＣ００２２２遺伝子、ＬＯＣ４００６５５遺伝子、ＬＯＣ１００１３０５８１遺伝子、ＸＬＯＣ＿００７３１４遺伝子、ＸＬＯＣ＿Ｉ２＿００００９２遺伝子、ＸＬＯＣ＿０１０２４５遺伝子及びＬＯＣ２８６０８７遺伝子が同定された。さらに、発現の減少が見られた遺伝子として、ＫＩＲ２ＤＬ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ４遺伝子、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ２遺伝子、ＫＩＲ２ＤＳ４遺伝子及びＫＩＲ３ＤＬ２遺伝子等のＫＩＲファミリーに属する遺伝子が同定された（表４〜表６、表８も参照）。【００８４】
ここで、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（２００１年，Ｎａｔｕｒｅ，４１３巻，ｐｐ．５３１−５３４）によれば、化合物３１を投与することにより、ＮＫＴ細胞が活性化し、ＩＬ−４タンパク質の分泌量が一時的に亢進するものの、ＩＦＮ−γタンパク質の分泌量は大きく変化しないことが理解できる。また、ＩＬ４Ｉ１タンパク質は、ＩＬ−４の刺激によりＢ細胞やミエロイド系の細胞から分泌され、Ｔ細胞の増殖を抑制すること（Ｂｏｕｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７年，Ｂｌｏｏｄ，１１０巻，ｐｐ．２２０−２２７）、及びＴｈ１７細胞において発現しており、ＩＬ−２産生や細胞増殖の抑制に関与すること（Ｓａｎｔａｒｌａｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２年，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３６巻，ｐｐ．２０１−２１４）が報告されている。これらは、タンパク質レベルでの報告ではあるが、本実施例における、化合物３１の投与によるＩＬ４Ｉ１の転写産物量の増加は、化合物３１によるＮＫＴ細胞の活性化を反映しているものと理解できる。したがって、上記遺伝子群の転写産物量の変化は、化合物３１がイン・ビボでＮＫＴ細胞活性化に伴う選択的ＩＬ−４産生誘導活性を示したことを反映しているといえる。【００８５】
本実施例において、転写産物量の増加又は減少がみられた遺伝子を表２〜表６、表８にまとめた。表２〜表６、表８中の配列番号は、マイクロアレイ上のプローブ配列に対応している。また、表７及び表９に各プローブの配列を示した。なお、ｅｎｓｅｍｂｌ  ＩＤとは、ゲノムのデータベースであるＥｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）の識別番号である。なお、配列番号６５〜７８の遺伝子に対応する転写産物の塩基配列を、配列表の配列番号７９〜１０３に示し、その対応関係を表１０に示した。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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