(57)【要約】ヒト間葉系幹細胞から子宮内膜症の性質を持つ細胞（以下、「子宮内膜症様細胞」という。）の作製方法を提供する。さらに、当該細胞を動物に移植してヒト子宮内膜症を呈するモデル動物の作製方法および子宮内膜症モデル動物を提供する。ヒト間葉系幹細胞に分化誘導促進剤を作用させて分化誘導した細胞を、細胞外マトリックスでコートされた培養容器内で、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液を用いて培養する工程を含む、子宮内膜症様細胞の作製方法による。
2015041019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト間葉系幹細胞に分化誘導促進剤を作用させて分化誘導した細胞を、細胞外マトリックスでコートされた培養容器内で、分化誘導剤を含まない低炭素源培養液を用いて培養する工程を含む、子宮内膜症様細胞の作製方法。
【請求項２】
子宮内膜症様細胞の作製方法であって、以下の工程（１）〜（３）：
（１）ヒト間葉系幹細胞を、低炭素源培養液で培養し、増殖させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含む低炭素源培養液で培養し、分化誘導する工程；および
（３）工程（２）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液でさらに培養する工程；
を含み、工程（１）〜（３）の培養は、細胞外マトリックスでコートされた培養容器を用いて行う、方法。
【請求項３】
前記低炭素源増殖培養液に含まれる炭素源が、約500〜3000mg/lのグルコースである、請求項１または２に記載の子宮内膜症様細胞の作製方法。
【請求項４】
分化誘導促進剤が、サイクリックAMPアナログである、請求項１〜３のいずれかに記載の子宮内膜症様細胞の作製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法で得られた子宮内膜症様細胞。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法で得られた子宮内膜症様細胞を、免疫不全動物に移植することによる、子宮内膜症モデル動物の作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で作製された子宮内膜症モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症の性質を持つ細胞に関し、さらにヒト子宮内膜症を呈するモデル動物の作製方法および子宮内膜症モデル動物に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１３−１９２５９６号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
子宮内膜症は「子宮内膜と同じあるいは類似の形態と機能をもった組織が異所性に発育し、症候をもたらす疾患（日本産科婦人科学会、1993年）」と定義されており、その発症機序を含めて不明な点が多く残されている疾患である。子宮内膜症はヒトを含めた霊長類にのみ発症する疾患であり、マウス等汎用される実験動物を用いての子宮内膜症疾患モデルの構築が難しい。また、子宮内膜症患者より摘出した組織や細胞を用いてのin vitro実験は材料を定期的に入手できず個体差も大きいという問題がある。さらに、子宮内膜症に特有の性質を有した細胞株が存在していないことから、従来、病態解明の基礎研究や薬物スクリーニングを継続的に行うことが困難であった。【０００４】
正常子宮内膜および子宮内膜症の細胞や組織は、プロラクチン（PRL）、インスリン様成長因子結合タンパク質１（IGFBP-1）、ステロイドホルモン受容体[エストロゲン受容体１（ESR1）、エストロゲン受容体２（ESR2）、プロゲステロン受容体（PGR）等]などの特有の分化マーカーを発現していることが報告されている（Aghajanova et al., Endocrinology 151, 1341-1355, 2010; Tabanelli et al., The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 42, 337-344, 1992; Tabibzadeh, Endocrine Reviews 12, 272-290 1991）。また、子宮内膜症の細胞や組織は、インターロイキン-１受容体タイプ１（IL-1Rt1）、IL-6、IL-8、TNF受容体I（TNFR I）、TNF受容体II（TNFR II）、COX2およびMCP-1などの炎症性因子を発現または細胞外に分泌することが報告されている（Bulun, New England Journal of Medicine 360, 268-279, 2009; Giudice and Kao, The Lancet 364, 1789-1799, 2004）。子宮内膜症組織からこのような性質を持った細胞株を樹立しようとする試みはこれまでいくつか行われてきている（非特許文献１：Bono et al., British Journal of Cancer 106, 1205-1213, 2012）が、エストロゲン受容体の発現能が損なわれているなど子宮内膜症の状態を忠実に再現しているとはいえない。【０００５】
子宮内膜症の発症機序は未だに不明であるが、発症母地として考えられている子宮内膜は発生学的には中間中胚葉由来の器官であること、同様に中胚葉由来である骨髄内の間葉系幹細胞が正常子宮内膜および子宮内膜症病巣組織に分化しうる可能性が示唆されている（Du and Taylor, Stem cells 25, 2082-2086, 2007; Taylor, JAMA : The Journal of the American Medical Association 292, 81-85, 2004）。一方、正常子宮内膜組織にも間葉系幹細胞類似の細胞集団が存在することが報告されている（Gargett et al., Biology of Reproduction 80, 1136-1145, 2009）。また、子宮内膜症の細胞や組織は、副腎由来アンドロゲン（Dehydoepiandorosterone：DHEA、およびAndrostendione：A-dione）からエストロゲン（Estradiol：E2）を合成できるが、副腎や性腺のようにコレステロールからDe NovoでE2を合成することはできないことが報告されている（Bulun et al., Endocrine-Related cancer 6, 293-301,1999）。【０００６】
従来、間葉系幹細胞から子宮内膜細胞への分化誘導を目指した研究報告がある（非特許文献２：Aghajanova et al., Biology of Reproduction 82, 1076-1087, 2010）。しかしながら、この報告は病的な子宮内膜症細胞の分化誘導ではなく、正常な子宮内膜細胞への分化誘導を目指した研究であり、子宮内膜症細胞への分化誘導を示唆するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】British Journal of Cancer 106, 1205-1213, 2012
【非特許文献２】Biology of Reproduction 82, 1076-1087, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト間葉系幹細胞から子宮内膜症の性質を持つ細胞（以下、「子宮内膜症様細胞」という。）の作製方法、当該細胞を動物に移植してヒト子宮内膜症を呈するモデル動物の作製方法および子宮内膜症モデル動物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、患者由来組織からの樹立ではなく間葉系幹細胞からの分化誘導による方法に着目した。子宮内膜症の細胞や組織は、子宮内膜症の分化マーカーや炎症性因子を発現し、また、副腎由来アンドロゲンからエストロゲンを合成できるが、副腎や性腺のようにコレステロールからDe NovoでE2を合成することはできないことが報告されている。このような性質を保持し、さらに免疫不全マウス等に移植することによって子宮内膜症に類似の組織を構築できるような子宮内膜症様細胞の開発を目指した。【００１０】
本発明者の検討によれば、非特許文献２（Aghajanovaら）の方法で誘導した細胞は、炎症性因子の発現は弱く、また副腎由来アンドロゲンからのエストロゲン合成能の性質を有していないことを確認した。そこで、本発明者は鋭意検討を重ねた結果、子宮内膜症の性質を有する細胞の分化誘導に着目して研究を進め、低濃度の炭素源を含有する培地を使用すること、培養を細胞外マトリックスでコートされた培養容器内で行うこと、分化誘導後さらに分化誘導促進剤不存在下に培養することにより、所期の目的を達成することができることを見いだし、本発明を完成した。【００１１】
本発明は、即ち以下よりなる。
１．ヒト間葉系幹細胞に分化誘導促進剤を作用させて分化誘導した細胞を、細胞外マトリックスでコートされた培養容器内で、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液を用いて培養する工程を含む、子宮内膜症様細胞の作製方法。
２．子宮内膜症様細胞の作製方法であって、以下の工程（１）〜（３）：
（１）ヒト間葉系幹細胞を、低炭素源培養液で培養し、増殖させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含む低炭素源培養液で培養し、分化誘導する工程；および
（３）工程（２）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液でさらに培養する工程；
を含み、工程（１）〜（３）の培養は、細胞外マトリックスでコートされた培養容器を用いて行う、方法。
３．前記低炭素源増殖培養液に含まれる炭素源が、約500〜3000mg/l のグルコースである、前項１または２に記載の子宮内膜症様細胞の作製方法。
４．分化誘導促進剤が、サイクリックAMPアナログである、前項１〜３のいずれかに記載の子宮内膜症様細胞の作製方法。
５．前項１〜４のいずれかに記載の作製方法で得られた子宮内膜症様細胞。
６．前項１〜４のいずれかに記載の作製方法で得られた子宮内膜症様細胞を、免疫不全動物に移植することによる、子宮内膜症モデル動物の作製方法。
７．前項６に記載の方法で作製された子宮内膜症モデル動物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法で作製した子宮内膜症様細胞は、各種子宮内膜分化マーカーを発現し、さらに子宮内膜症組織での発現上昇が認められている炎症性因子の発現も確認できた。また、本発明の子宮内膜症様細胞は、副腎由来アンドロゲンからのエストロゲン（E2）産生能も有している。さらに本発明の子宮内膜症様細胞をメス免疫不全マウスの腹腔内に注入したところ、子宮内膜症様の腫瘤が確認された動物モデルを構築することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞を、細胞外マトリックスでコートした培養容器を用いて、分化誘導促進剤（8-Br-cAMP）を添加した低炭素源培養液で培養し、分化誘導した後の細胞の形態（培養像）を示す写真図である。（実施例１、実験例１−１）
【図２】分化誘導した細胞について、各種子宮内膜分化マーカーの発現量を確認した結果図である。（実施例１、実験例１−１）
【図３】分化誘導した細胞について、子宮内膜症組織での発現上昇が認められている炎症性因子の発現量を確認した結果図である。（実施例１、実験例１−１）
【図４】分化誘導した細胞について、細胞培養上清中に分泌されている炎症性因子のタンパク質量を確認した結果図である。（実施例１、実験例１−１）
【図５】分化誘導後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源培養液に交換して培養した後の細胞の形態（培養像）を示す写真図である。（実施例１、実験例１−２）
【図６】分化誘導後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源培養液に交換して培養した後の、子宮内膜分化マーカーおよび炎症性因子の発現を確認した結果を示す図である。（実施例１、実験例１−２）
【図７】分化誘導後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源培養液に交換して培養した細胞について、子宮内膜症組織で高発現することが知られているステロイド合成酵素遺伝子であるCYP19、HSD3B2、HSD17B7およびSTSの発現を確認した結果を示す図である。（実施例１、実験例１−２）
【図８】分化誘導後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源培養液に交換して培養した細胞について、副腎や性腺でのステロイドのDe novo合成に必要であることが知られているStAR、CYP11AおよびCYP17の発現を確認した結果を示す図である。（実施例１、実験例１−２）
【図９】分化誘導後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源培養液に交換して培養した細胞のエストロゲン（E2）産生能を、培養上清中のE2濃度で確認した結果を示す図である。（実施例１、実験例１−３）
【図１０】本発明の子宮内膜症様細胞をメス免疫不全マウスの腹腔内に注入して作製した動物モデルにおいて、注入１週間後（ａ）および注入２カ月後（ｂおよびｃ）の腹腔内（腹膜表面）に形成された子宮内膜症様の腫瘤を示す写真図である。（実施例２、実験例２−１）
【図１１】確認された腫瘤から作製した組織切片をヘマトキシリン-エオジンで染色し、光学顕微鏡で観察した結果を示す写真図である。（実施例２、実験例２−１）
【図１２】確認された腫瘤から作製した組織切片を、子宮内膜マーカーおよび子宮内膜症組織でもみられる炎症性マーカーで染色した結果を示す図である。（実施例２、実験例２−２）
【図１３】ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞の代わりにヒト不死化間葉系幹細胞UE6E7T-11を用いて、実施例１と同様にして細胞を培養したときの子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子）の発現を確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図１４】ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞の代わりにヒト不死化間葉系幹細胞UE6E7T-11を用いて、実施例１と同様にして細胞を培養したときのE2産生能を解析した結果を示す図である。（実施例３）
【図１５】ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞を細胞外マトリックスでコートしていない培養容器を用い、4000mg/lのグルコースを含む培養液で培養して得られた細胞の、子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子）およびE2産生酵素遺伝子の発現を解析した結果を示す図である。（比較例１）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、子宮内膜症の性質を持つ細胞、すなわち子宮内膜症様細胞に関し、さらにヒト子宮内膜症を呈するモデル動物の作製方法および子宮内膜症モデル動物に関する。本発明の子宮内膜症様細胞は、ヒト間葉系幹細胞に分化誘導促進剤を作用させて分化誘導した細胞を、細胞外マトリックスでコートされた培養容器内で、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液を用いて培養する工程を含む方法により作製される。
【００１５】
より具体的には、本発明の子宮内膜症様細胞を作製する方法は、以下の工程（１）〜（３）：
（１）ヒト間葉系幹細胞を、低炭素源培養液で培養し、増殖させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含む低炭素源培養液で培養し、分化誘導する工程；および
（３）工程（２）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液でさらに培養する工程；
を含み、工程（１）〜（３）の培養は、細胞外マトリックスでコートされた培養容器を用いて行う。
【００１６】
本発明において「ヒト間葉系幹細胞」は、ヒト間葉系組織に由来する体性幹細胞であり、いずれのヒト間葉系組織由来の体性幹細胞も使用できる。例えば、骨髄由来、臍帯血由来、脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞などが挙げられ、これらは、市販のもの（例えば、ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞（Lonza社））を使用してもよく、あるいは当該分野で公知の方法を用いてヒト組織から単離したヒト間葉系幹細胞を使用してもよい。また、株化されたヒト間葉系幹細胞も使用できる。例えば、ヒト骨髄由来不死化間葉系幹細胞株、具体的には、UE6E7T-11、UE6E7T-12、UE7T-13（Takeda et al., The Journal of Gene Medicine 6, 833-845, 2004）、およびヒト臍帯血由来不死化間葉系幹細胞株、具体的には、UCB-TERT-21、UCB408E6E7TERT-33（Terai et al., Molecular and Cellular Biology 16, 1491-1499, 2005）（これらは理化学研究所バイオリソースセンターから入手可能）などが挙げられる。１つの実施形態において、本発明で使用されるヒト間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞である。
【００１７】
本発明においては、ヒト間葉系幹細胞を「細胞外マトリックス」でコートされた培養容器で培養する。本発明の方法において、「細胞外マトリックス」としては、組織や細胞の足場となり得るいずれの培養用細胞外マトリックスも使用することができる。例えば、細胞外に分泌され細胞接着を増進する成分、ヒトを含む生体から得られたコラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、およびこれらのタンパクや多糖体（分解物、断片化産物を含む）の人工合成物、ヒトを含む生体から得られた血清や血漿、およびこれらから分離または精製された産物等が挙げられる。または市販の細胞外マトリックス成分（マトリゲル(R)マトリックス（Becton, Dickinson and Company製等）であってもよい。より好適には、Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンなどが挙げられる。前記例示された細胞外マトリックスによる培養容器のコーティングは、自体公知の方法により行なうことができる。例えばI型コラーゲンであれば直径100mmのシャーレ表面に50mg/ml溶液を4ml加えてコートすることができる。培養容器としては、細胞の培養に通常用いられる容器であればよい。
【００１８】
本発明においては、ヒト間葉系幹細胞を「低炭素源培養液」を用いて培養する。本発明の方法において、「低炭素源培養液」とは、低濃度の炭素源を含有する培養液をいい、使用する炭素源およびその濃度は当業者に適宜選択され得る。低炭素源培養液に含まれる炭素源およびその濃度としては、例えば、約500〜3000mg/l、好ましくは、約500〜2000mg/l、より好ましくは、約500〜1000mg/lのグルコースが挙げられる。低炭素源培養液の基本培地としては、例えば、市販の低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Vogt et al., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 49, 171-179, 1963）（ナカライテスク）、αMEM培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地などの、動物細胞の培養に使用される当該分野で公知の培地を使用することができる。培地には、5〜15(v/v)％、好ましくは8〜12(v/v)％の血清（例えば、牛胎児血清（FBS：Foetal Bovine Serum））が含まれていてもよい。血清を使用する場合、予め、自体公知の方法、例えば、デキストラン被覆活性炭等で処理し、ステロイドホルモンなどの低分子化合物を除去しておくのが好ましい。また、必要に応じて、アミノ酸、L-グルタミン、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンB）、pHを安定させるために、例えば、Goods'緩衝剤（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES))等を含んでもよい。
【００１９】
本発明において、「分化誘導促進剤」とは、ヒト間葉系幹細胞を、任意の子宮内膜マーカー（例えば、ESR1、ESR2、PGR、PRL、IGFBP1）と子宮内膜症に関連する炎症性因子（例えば、IL-1RtI、IL-1ra、IL-6、IL-8、TNFR I、TNFR II、COX2、MCP-1）を発現する細胞へ分化誘導しうる物質であればよい。そのような物質としては、例えば、サイクリックAMP（cAMP）アナログが挙げられ、より具体的には、8-ブロモアデノシン-3'-5'-サイクリックモノホスフェート（8-Br-cAMP）、ジブチリル-cAMP、8-CPT-2-Me-cAMPナトリウム塩(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt)から選択されるいずれかのcAMPアナログを使用することができる。本発明の方法で用いる分化誘導促進剤の濃度は、使用する分化誘導促進剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、分化誘導促進剤として8-Br-cAMPを用いる場合、約0.05mM〜5mM、好ましくは、約0.1mM〜2mMである。
【００２０】
本発明の方法の培養工程において、培養温度、CO2濃度、培養時間は、当業者に適宜選択されるが、培養温度は、約30〜40℃、好ましくは、約36〜38℃であり、CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは、約5％であり、培養時間は、約2日〜8日である。以下に、本発明の方法の上記工程（１）〜（３）の具体的な態様を例示する。
【００２１】
工程（１）
低炭素源培養液にヒト間葉系幹細胞を加え、細胞外マトリックスでコートされた培養容器に播種する。播種するヒト間葉系幹細胞の細胞数は、適宜選択され得るが、例えば、2,500〜5,000個/cm2で培養容器に播種する。好ましくは、本工程で使用する培養液は、血清（例えば、FBS）を含む。１つの実施形態として、本工程では、ヒト間葉系幹細胞を、5％CO2存在下、36〜38℃の条件で、6〜8日間培養する。培養液は2〜3日毎に交換するのが好適である。本工程によって、ヒト間葉系幹細胞を、好ましくは、70%以上、より好ましくは、70〜80％コンフルエントとなるまで増殖させる。
【００２２】
工程（２）
工程（１）で培養されたヒト間葉系幹細胞を、分化誘導促進剤を含む低炭素源培養液で培養し分化誘導する。使用する分化誘導促進剤およびその濃度は、上述のとおりであるが、cAMPアナログを培養液に最終濃度0.1〜2mMとなるように添加するのが好適である。１つの実施形態として、本工程では、分化誘導のため、5％CO2存在下、36〜38℃の条件で、4〜8日間培養する。培養液は2〜3日毎に交換するのが好適である。好ましくは、本工程で使用する培養液は、工程（１）で使用する培養液とほぼ同濃度の血清を含む。
【００２３】
工程（３）
上記分化誘導した後、工程（２）で使用した培養液を除去し、工程（２）で得られた細胞を、分化誘導促進剤を含まない低炭素源培養液でさらに培養する。１つの実施形態において、本工程では、5％CO2存在下、36〜38℃の条件、2〜4日間培養する。好ましくは、本工程で使用する培養液は、工程（１）で使用する培養液とほぼ同濃度の血清を含む。
【００２４】
本発明の方法で作製される子宮内膜症様細胞は、１）ESR1、ESR2、PGR、PRL、IGFBP-1などの１つ以上の子宮内膜に特有の分化マーカーを発現し、２）IL-1Rt1、IL-1ra、IL-6、IL-8、TNFR I、TNFR II、COX2、MCP-1などの１つ以上の炎症性因子を発現し、３）子宮内膜症組織で高発現することが知られているCYP19、HSD3B2、HSD17B2、STSなどの１つ以上のステロイド合成酵素遺伝子を発現し、かつ、副腎や性腺でのステロイドのDe novo合成に必要であることが知られているStAR、CYP11A、CYP17を発現せず、４）副腎由来アンドロゲンからエストロゲン（E2）を産生する。本発明は、上記の方法で作製された「子宮内膜症様細胞」にも及び、本発明の「子宮内膜症様細胞」は、前記１）〜４）の性質を有する。子宮内膜症様細胞における各種マーカー遺伝子およびタンパク質の発現は、当該分野で公知の方法を用いて確認することができる。例えば、遺伝子の発現を確認する方法としては、RT-PCRやハイブリダイゼーション法などの遺伝子解析法、タンパク質の発現を確認する方法としては、Bio-Plex法、蛍光免疫測定法などの免疫学的測定法が挙げられる。
【００２５】
本発明によって得られた子宮内膜症様細胞を、免疫不全動物に移植し、飼育することで、子宮内膜症様病変を発症した子宮内膜症動物モデルを作製することができる。使用される免疫不全動物としては、例えば、免疫不全マウス（NOD/Scid-IL-2R gamma null、CB17/Icｒ-Prkdcscid/CrICrIj、BALB/c Slc-nu/nuなど）が挙げられる。例えば、免疫不全マウスを用いた子宮内膜症動物モデルの作製方法として、約0.1〜0.2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁した本発明の子宮内膜症様細胞（約5×105〜2×106個/ml）をマウスの腹腔内に移植し、1〜8週間飼育することにより、腹腔内各部に子宮内膜症様病変を発症した子宮内膜症動物モデルを作製することができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。【００２７】
（実施例１）子宮内膜症様細胞の作製
本実施例では間葉系幹細胞から子宮内膜症様細胞を作製したので、その手順について詳述する。【００２８】
工程（１）間葉系幹細胞の培養
本工程では、2×105個のヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞(Lonza社、Cat.No. PT-2501)を、10mlの低炭素源増殖培養液（以下に示す）に加え、コラーゲンタイプ I（ラット尾由来、BD Biosciences社、Cat.No. 354236)で表面をコートした直径100mmの培養容器に播種し、5％CO2存在下、37℃で70〜80％コンフルエントとなるまで6日間培養した。培養液は2〜3日毎に交換した。【００２９】
本実施例および以降の実験例、ならびに以降の実施例では、「低炭素源増殖培養液」とは、低グルコースダルベッコ改変イーグル培地(1000mg/lのグルコース含有、フェノールレッド不含、ナカライテスク社 Cat.No. 08490-05)を基本培地とし、最終濃度2mMのL-グルタミン、10(v/v)％の牛胎児血清（FBS）、最終濃度100単位/mlのペニシリン、最終濃度100mg/mlのストレプトマイシン、最終濃度0.25 mg/mlのアンフォテリシンBおよび最終濃度10mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を添加した培養液をいうこととする。FBSは、予めデキストラン被覆活性炭(Sigma社、Cat.No. C6241)で処理し、ステロイドホルモンなどの低分子化合物を除去したものを使用した。【００３０】
本工程において、コントロール群では、細胞外マトリックスでコートしていない培養容器を用いることを除いて上記と同じ条件で培養した。【００３１】
工程（２）間葉系幹細胞の分化誘導
本工程では、工程（１）で70〜80％コンフルエントとなるまでヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞を培養した後、分化誘導した。分化誘導用培養液として、8-Br-cAMP（ナカライテクス社、Cat.No.05450-86）を最終濃度1 mMとなるように添加した低炭素源増殖培養液（「8-Br-cAMP(+)低炭素源増殖培養液」とも称する）を調製した。工程（１）で得られた細胞（約7〜8×105個）をそのままの培養容器上で、培地のみ9mlの8-Br-cAMP(+)低炭素源増殖培養液に交換して、5％CO2存在下、37℃にて6日間培養した。2〜3日毎に8-Br-cAMP(+)低炭素源増殖培養液を交換した。【００３２】
本工程において、コントロール群では、工程（１）のコントロール条件下で得られた細胞を、細胞外マトリックスでコートしていない培養容器を用いて8-Br-cAMPを含まない低炭素源増殖培養液を用いることを除いて、同じ条件で培養した。【００３３】
工程（３）子宮内膜症様細胞の作製
本工程では、工程（２）で分化誘導した後、8-Br-cAMPを含まない低炭素源増殖培養液に培地交換し、さらに培養した。工程（２）で得られた細胞（約7〜8×105個）をそのままの培養容器上で、培地のみ9mlの低炭素源増殖培養液に交換して、5％CO2存在下、37℃にて2日間培養した。本工程において、コントロール群では、工程（２）のコントロール条件下で得られた細胞を、細胞外マトリックスでコートしていない培養容器を用いることを除いて、同じ条件で培養した。【００３４】
（実験例１−１）工程（２）で分化誘導した細胞の解析
本実験例では、工程（２）で分化誘導した細胞について、細胞の形態、子宮内膜分化マーカーの発現、子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子およびタンパク質）の発現を確認し、解析した。【００３５】
(i)細胞の形態
工程（２）で分化誘導開始後6日目の細胞の形態を光学顕微鏡（倍率10倍）で観察した。その結果、図１（ｂ）に示すように、8-Br-cAMPを添加して分化誘導した細胞は、図１（ａ）に示すコントロールに比べて細胞が盛り上がって丸味を帯び、in vitroで脱落膜化させた正常子宮内膜と類似の形態をとっていることが観察された。【００３６】
(ii)子宮内膜分化マーカーの発現
工程（２）で分化誘導開始後6日目の細胞について、エストロゲン受容体(ESR1およびESR2)、プロゲステロン受容体(PGR)、プロラクチン(PRL)およびインスリン様成長因子結合タンパク質１(IGFBP1)等の各種子宮内膜分化マーカーの発現量を確認した。分化誘導開始後6日目の細胞（2×105個）から、ReliaPrep RNA Cell Miniprep System（Promega社、Cat. No.Z6012）を使用して全RNAを抽出した後、PrimeScript RT Master Mix（タカラバイオ社、Cat. No. RR036B）を使用して、そのマニュアルに従って逆転写反応を行い、cDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、Go Taq Green Master Mix(Promega社、Cat. No. M7123)を用いてPCR反応を行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動することにより、各子宮内膜分化マーカーの発現量を測定した。その際、β-アクチン(ACTB)を内部標準とした。その結果を図２に示した（レーンa：コントロール群、レーンb：cAMP刺激群）。これよりESR1、ESR2、PGR、PRLおよびIGFBP1の発現が上昇していることが確認された。【００３７】
(iii)子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子）の発現
上記(ii)と同様にして、子宮内膜症組織での発現上昇が認められている炎症性因子の発現を測定した。その結果、図３に示すとおり8-Br-cAMPによる分化誘導によって子宮内膜症病巣局所で高発現していることが知られているインターロイキン-１受容体タイプI(IL-1RtI)、IL-6、IL-8、TNFR II、COX2およびMCP-1の発現が上昇していることが確認された。本実施例では、TNFR Iの発現はあまり上昇していなかった。【００３８】
(iv)子宮内膜症関連炎症性因子（タンパク質）の発現
工程（２）で分化誘導開始後2日目の細胞培養上清中に分泌されている炎症性因子のタンパク質レベルでの発現をBio-Plex法により測定した。すなわち、上清50μlをHuman Cytokine Assays  27-plex（Bio-Rad社、Cat.No.M50-0KCAF0Y）の各ウェルに導入し、当該マニュアルに従い上清に含まれるサイトカインを測定した。その結果、図４に示すように、炎症性因子IL-1ra（IL1レセプターアンタゴニスト）、IL-6およびMCP-1の培養液中への分泌量が有意に増大していることが確認された。【００３９】
（実験例１−２）工程（３）で作製された子宮内膜症様細胞の解析
本実験例では、工程（３）で作製された細胞、即ち、工程（２）の分化誘導後に8-Br-cAMPを含まない低炭素源増殖培養液に再度培地交換して2日間培養（全培養日数14日）した後の細胞について、解析を行った。【００４０】
(i)細胞の形態
上記実験例１−１の(i)と同様に、細胞の形態を光学顕微鏡（倍率10倍）で観察した。図５（ａ）にコントロール群（即ち、ヒト間葉系幹細胞を細胞外マトリックスでコートしていない培養容器上で8-Br-cAMPを含まない低炭素源増殖培養液で14日間培養した後の細胞）、図５（ｂ）に分化誘導群の形態を示す。その結果、図５（ｂ）に示すように、8-Br-cAMPを除去して培養することによって、細胞の形態は図５（ａ）に示すコントロールと同じような元の線維芽細胞様に戻ったことが確認された。【００４１】
(ii)子宮内膜分化マーカーおよび炎症性因子の発現
上記実験例１−１の(ii)および(iii)と同手法により、子宮内膜分化マーカーおよび炎症性因子の発現を確認した。その結果、図６に示すように、8-Br-cAMPを除去して培養することによって、子宮内膜分化マーカーであるPGRの発現が低下した。一方、IL-8、IL-6およびTNFR II等の炎症性因子の発現は高いままであることが確認された。【００４２】
(iii)ステロイド合成酵素の発現
子宮内膜症組織で高発現することが知られているステロイド合成酵素遺伝子であるCYP19、HSD3B2、HSD17B7およびSTSの発現を、上記実験例１−１の(ii)および(iii)と同手法により確認した。さらに、副腎や性腺でステロイドDe Novo合成に必要であることが知られているStAR、CYP11AおよびCYP17の発現も同様に確認した。その結果、図７に示すようにCYP19、HSD3B2、HSD17B7およびSTSの発現は上昇していた。一方、図８に示すように、StAR、CYP11AおよびCYP17の発現の上昇は認められなかった（レーンｂ）。【００４３】
（実験例１−３）子宮内膜症様細胞のエストロゲン（E2）産生能
本実験例では、工程（３）で作製した細胞について、エストロゲンであるエストラジオール（E2）の産生能を確認した。工程（３）で作製した細胞（1×105個）を、FBSの代わりに0.1％v/vのウシ血清アルブミン（BSA）を添加した低炭素源増殖培養液１mlに加え、コラーゲンタイプ I（ラット尾由来、BD Biosciences社、Cat.No. 354236)で表面をコートした１２ウェルプレートに播種し、5％CO2存在下、37℃で24時間培養した。【００４４】
その後、培養液に最終濃度1 mMとなるように副腎由来アンドロゲンであるA-dione（東京化成工業；アンドロステンジオン）、DHEA（東京化成工業）またはDHEA-sulfate（東京化成工業；DHEA-S、不活化副腎アンドロゲン）を添加して、さらに48時間培養した。対照(Vehicle)として、アンドロゲンの代わりに溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）を添加したほかは同様にして培養した。【００４５】
培養上清中のE2濃度は、Estradiol EIA kit(Cayman Chemical社、Cat.No. 582251)を使用して当該キットのマニュアルに従って測定した。その結果、図９に示すように、工程（３）で作製した細胞は、A-dioneおよびDHEAからE2を産生するが、不活化副腎アンドロゲン(DHEA-S)からはE2は産生しないことが分かった。【００４６】
上記実施例および各実験例の結果から、ヒト間葉系幹細胞を分化誘導した後、8-Br-cAMPを含まない培養液に交換してさらに培養することにより、子宮内膜分化マーカーであるPGRの発現は低下するが、子宮内膜症に関連する炎症性因子（IL-8、IL-6およびTNFR II）の発現は高いままであることが確認された。またCYP19、HSD3B2、HSD17B7およびSTSといった、子宮内膜症組織で高発現が報告されているステロイド合成酵素遺伝子の発現が上昇しており、副腎由来アンドロゲン(A-dioneおよびDHEA)からのE2産生能力が確認されたことから、子宮内膜症様細胞が作製されたことが分かる。一方、ステロイドDe Novo合成に必須であるStAR、CYP11AおよびCYP17の発現の上昇は認められなかったことから、ここで作製された細胞は、副腎や性腺系列の細胞に分化したものでないことが確認された。【００４７】
（実施例２）子宮内膜症モデルマウスの作製
実施例１の工程（３）で作製した子宮内膜症様細胞（1×105個）のPBS(pH7.4)懸濁液100μlを、無処置の8〜14週齢メス免疫不全マウス（米国ジャクソン研究所、NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl /SzJ、略称:NSG）の腹腔内に注入した。本実施例では、コントロールとして、実施例１で使用したヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞(Lonza社、Cat.No. PT-2501)を実施例１の工程（１）〜（３）のコントロール条件下で順に培養して得た細胞をマウスの腹腔内に注入した。【００４８】
（実験例２−１）子宮内膜症様の腫瘤の確認
細胞をマウスに注入した１週間後に、麻酔下開腹したところ、腹腔内（腹膜表面）に子宮内膜症様の腫瘤が数個確認された。細胞注入後1〜2ヶ月経過すると腫瘤の数、大きさともに増大した。図１０に形成された腫瘤を肉眼および実体顕微鏡下(2倍)で観察した図を示した。一方、コントロール群ではこのような腫瘤は認められなかった。【００４９】
この腫瘤を切除し、Tissue Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetechnical社)中に包埋して凍結した後、クライオスタットで5μm厚に薄切して組織切片を作製し、定法通りにヘマトキシリン-エオジン染色を行って光学顕微鏡で観察した。その結果を図１１に示すように、子宮内膜症に特有の、間質細胞に囲まれた上皮様細胞からなる腺管構造が確認された（図１１矢印）。【００５０】
（実験例２−２）子宮内膜マーカーおよび炎症性マーカーの確認
実験例２−１と同様に作製した組織切片について、子宮内膜マーカーであるESR1、ESR2、およびPGR、ならびに子宮内膜症組織でもみられる炎症性マーカーの一つであるCOX2の発現について確認した。上記組織切片を、一次抗体としてウサギ抗ESR1抗体(Santa Cruz Biotechnology社、Cat. No. sc-543)、マウス抗ESR2抗体(abcam社、Cat. No. ab288)、マウス抗PGR抗体(Dako社、Cat. No. PgR636)、ヤギ抗COX2抗体(Santa Cruz Biotechnology社、Cat. No. sc-1746)の各種で反応させた後、二次抗体としてAlexa Fluor 488 標識ロバ抗ウサギIgG抗体(Molecular Probe社、Cat. No. A21206)、Alexa Fluor 488標識ロバ抗マウスIgG抗体(Molecular Probe社、Cat. No. A21202)、Alexa Fluor 647標識ロバ抗ヤギIgG抗体(Molecular Probe社、Cat. No. A21447)の各種と反応させた。最後に、Cy3標識マウス抗Vimentin抗体(Sigma社、Cat. No. C9080)と反応させ、核染色剤として4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)を含む封入剤ProLong Gold antifade reagent with DAPI(Molecular Probe社、Cat. No. P36935)で封入し、蛍光免疫染色切片を作製した。この切片を、Zeiss社共焦点レーザー顕微鏡LSM710を用いて20倍で観察した。その結果を図１２に示した。【００５１】
本実験例２−２で用いたVimentin抗体はマウス抗原には反応しない抗体であり、したがって、Vimentin抗体により染色されている赤い部分は注入したヒト子宮内膜症様細胞由来の間質組織であることが確認された。この周囲間質組織に囲まれるように腺管構造を持った上皮様細胞が存在しており、間質および腺上皮様組織中には子宮内膜マーカーであるESR1、ESR2、PGRそれぞれに陽性の細胞が存在する他、子宮内膜症組織でもみられる炎症性マーカーの一つであるCOX2陽性の細胞も存在している。以上のことから、マウス体内に移植された細胞から構築された組織は、ヒト子宮内膜症病巣に近い性質を持つ組織であることが確認され、細胞を移植したマウスは子宮内膜症モデルマウスとして利用できることが示唆された。【００５２】
（実施例３）
実施例１の工程（１）において、ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞(Lonza社、Cat.No. PT-2501)の代わりにヒト不死化間葉系幹細胞UE6E7T-11（理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を使用するほかは、実施例１の工程（１）、（２）および（３）と同様にして細胞を培養した。かかる方法で作製した細胞について、実施例１の実験例１において確認したのと同手法により子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子）の発現およびE2産生能を解析した。その結果を図１３および図１４に示した。図に示すとおり、UE6E7T-11より誘導した細胞も、炎症性マーカーを高く発現し、副腎由来アンドロゲンからのE2産生能を有していた。
これらの結果から、ヒト不死化間葉系幹細胞であるUE6E7T-11より作製された細胞も子宮内膜症様細胞であることが確認された。【００５３】
（比較例１）
本比較例では、ヒト間葉系幹細胞を既報（非特許文献２）の方法で分化誘導した細胞を、実施例１の方法で分化誘導した細胞と比較した。本比較例では、全工程において実施例１で使用した細胞外マトリックスでコートした培養容器の代わりに、細胞外マトリックスでコートしていない培養容器を用いた。また、本比較例の各培養には、実施例１で使用した低炭素源増殖培養液において、グルコース濃度を1000mg/lの代わりに4000mg/lとした培養液を使用した。さらに既報の条件に合わせて、当該培養液中にはフェノールレッドを添加し、FBSも活性炭処理を行なっていないものを使用した。また、当該培養液中のL-グルタミン 濃度は4mMとし、HEPESを添加していない点も既報の条件に合わせた。【００５４】
まず、上記のように培養条件を変更した以外は、実施例１の工程（１）と同様にして、ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞(Lonza社、Cat.No. PT-2501)を増殖培養した。【００５５】
次いで、培養した細胞を、上記培養液からFBSを除いた培養液を用いて5％CO2存在下、37℃にて24時間培養した。その後、細胞を、上記培養液のFBS濃度を10(v/v)％の代わりに2(v/v)％とし、8-Br-cAMPを最終濃度1mMとなるように添加した培養液を使用して、実施例１の工程（２）と同様にして培養し、分化誘導した。【００５６】
かかる方法で作製した細胞について、実施例１の実験例１において確認したのと同手法により子宮内膜症関連炎症性因子（遺伝子）およびE2産生酵素遺伝子の発現を解析した。その結果を図１５に示した。比較例においては、炎症性因子については弱い発現が見られたにすぎず、E2産生酵素遺伝子の発現は見られなかった。このことから、細胞外マトリックスでコーティングしていない培養容器や通常の炭素源濃度の培養液を用いた培養では、子宮内膜症様細胞は作製されないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上詳述したように、本発明の方法で作製した子宮内膜症様細胞は、各種子宮内膜分化マーカーを発現し、さらに子宮内膜症組織での発現上昇が認められている炎症関連因子の発現も確認できた。また、本発明の子宮内膜症様細胞はエストロゲン（E2）産生能も有している。さらに本発明の子宮内膜症様細胞をメス免疫不全マウスの腹腔内に注入したところ、子宮内膜症様の腫瘤が確認された動物モデルを構築することができた。【００５８】
子宮内膜症の発症機序は未だに不明である。また、間葉系幹細胞から子宮内膜細胞への分化誘導を目指した報告はあるが、病的な子宮内膜症細胞の分化誘導ではなく、正常な子宮内膜細胞への分化誘導を目指した研究であり、子宮内膜症細胞への分化誘導を示唆するものではなかった。【００５９】
従って、本発明の子宮内膜症様細胞を構築でき、かかる細胞を移植した子宮内膜症動物モデルを構築したことで、従来不明であった子宮内膜症の発症機序の解明に貢献し、予防薬、治療薬の開発にも貢献し、ひいては子宮内膜症の予防方法、治療方法に貢献しうるものである。
【図４】
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【図９】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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