(57)【要約】  表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、プリズムと、被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜と、を有する分析チップをチップホルダーに設置する。次いで、チップホルダーに設置された分析チップの捕捉領域および非捕捉領域に対応した金属膜の裏面に励起光を照射し、捕捉領域および非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光または励起光の反射光を検出することで、捕捉領域の端部の位置情報を得る。そして、位置情報に基づいてチップホルダーを移動させて、捕捉領域を検出位置に移動させる。最後に、金属膜の裏面に励起光を照射し、蛍光物質から放出された蛍光を検出する。
2015152198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜と、を有する分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、
前記チップホルダーに設置された前記分析チップにおける前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出し、または前記金属膜の裏面で反射して前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出されたプラズモン散乱光または反射光に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程と、
前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、
前記検出位置に配置された前記捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
を含む、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項２】
前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程では、前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出し、検出されたプラズモン散乱光の、励起光の入射角度に対する依存特性に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項３】
前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程では、所定の入射角度で前記金属膜の裏面上を励起光の照射スポットで走査するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域上から放出されたプラズモン散乱光を検出し、検出されたプラズモン散乱光の光量の変動に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項４】
前記励起光の入射角度は、検出されたプラズモン散乱光の光量が最大となる前記捕捉領域における増強角である、請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項５】
前記励起光の入射角度は、検出されたプラズモン散乱光の光量が最大となる前記非捕捉領域における増強角である、請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項６】
前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程では、前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出された反射光の、励起光の入射角度に対する依存特性に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項７】
前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程では、所定の入射角度で前記金属膜の裏面上を励起光の照射スポットで走査するとともに、前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出された反射光の光量の変動に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る、請求項６に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項８】
前記励起光の入射角度は、検出された反射光の光量が最小となる前記捕捉領域における共鳴角である、請求項７に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項９】
前記励起光の入射角度は、検出された反射光の光量が最小となる前記非捕捉領域における共鳴角である、請求項７に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項１０】
被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜と、を含む分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、
前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、
前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射する励起光照射部と、
前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出するプラズモン散乱光検出部、または前記金属膜の裏面で反射され前記出射面から出射された励起光の反射光を検出する反射光検出部と、
前記プラズモン散乱光検出部または前記反射光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域の端部の位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップの前記捕捉領域を検出位置に移動させる位置調整部と、
前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、
を有する、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項１１】
表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するときに、前記被検出物質が捕捉された捕捉領域を、前記被検出物質を検出する検出位置に位置合わせする位置合わせ方法であって、
入射面、出射面および成膜面を有するプリズムの前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜の裏面であって、前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した領域に対して前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出し、または前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面で反射して前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出された前記プラズモン散乱光または前記反射光に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程と、
前記位置情報に基づいて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、
を含む、位置合わせ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置、ならびに試料液中に含まれる被検出物質を検出するときに分析チップを位置合わせする位置合わせ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やＤＮＡなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する１つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：ＳＰＦＳ）法が知られている。【０００３】
ＳＰＦＳ法では、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光（増強された電場）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。【０００４】
ＳＰＦＳ法では、高感度かつ高精度な検出を行うためには、分析チップの位置を高い精度で合わせる必要がある。被検出物質の量（濃度）を正確に検出するためには、励起光の入射角を高精度に調整することが必要であるが、分析チップの位置がずれていると、励起光の入射角を高精度に調整することができない。また、被検出物質を高感度に検出するためには、励起光の照射スポットの形状および位置と金属膜上の反応場の形状および位置とが一致することが好ましいが、分析チップの位置がずれていると、励起光の照射スポットの形状および位置を高精度に調整することができない。一方で、ユーザーに分析チップの位置を高い精度で合わせることを要求することは、ユーザビリティ（使いやすさ）の観点から好ましくない。【０００５】
ＳＰＦＳ法ではないが、分析チップに光を照射して被検出物質を検出する方法において、分析チップの位置合わせを行う方法がいくつか提案されている。たとえば、特許文献１には、ＳＰＲ法を利用した検出において、分析チップ（フローセル）に２つの位置確認孔を形成することが開示されている。ユーザーは、この位置確認孔を利用することで分析チップの位置を調整することができる。また、特許文献２には、蛍光物質を利用した検出において、励起光とは別波長の照明光を分析チップ（バイオチップ）に照射し、照明光の反射光または透過光を検出して、分析チップの位置を特定することが開示されている。励起光とは別波長の照明光を利用することで、蛍光物質の退色を防ぎつつ分析チップの位置を特定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２８８１０３号公報
【特許文献２】特開２００７−０９３２５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の位置合わせ方法には、２つの位置確認孔を形成しなければならないため、分析チップの製造コストが増大するという問題がある。また、ユーザーが位置合わせをしなければならないため、ユーザビリティが悪いという問題もある。【０００８】
また、特許文献２に記載の位置合わせ方法には、励起光源とは異なる光源や波長制限フィルターなどを追加しなければならないため、分析装置の製造コストが増大するという問題がある。【０００９】
本発明の目的は、分析チップおよび分析装置の製造コストの増大を防ぎつつ、分析チップの位置を高い精度で合わせることができる表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および位置合わせ方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜と、を有する分析チップを、搬送ステージに固定されたチップホルダーに設置する工程と、前記チップホルダーに設置された前記分析チップにおける前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出し、または前記金属膜の裏面で反射して前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出されたプラズモン散乱光または反射光に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程と、前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、前記検出位置に配置された前記捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。【００１１】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜と、を含む分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、前記チップホルダーを移動させる搬送ステージと、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面に前記入射面を介して励起光を照射する励起光照射部と、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出するプラズモン散乱光検出部、または前記金属膜の裏面で反射され前記出射面から出射された励起光の反射光を検出する反射光検出部と、前記プラズモン散乱光検出部または前記反射光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの前記捕捉領域の端部の位置を特定するとともに、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップの前記捕捉領域を検出位置に移動させる位置調整部と、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、を有する。【００１２】
さらに、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る位置合わせ方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するときに、前記被検出物質が捕捉された捕捉領域を、前記被検出物質を検出する検出位置に位置合わせする位置合わせ方法であって、入射面、出射面および成膜面を有するプリズムの前記成膜面上に配置され、その表面に前記被検出物質を捕捉する捕捉体が固定化された捕捉領域および前記捕捉体が固定化されていない非捕捉領域を含む金属膜の裏面であって、前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した領域に対して前記入射面を介して励起光を照射するとともに、前記捕捉領域および前記非捕捉領域から放出されたプラズモン散乱光を検出し、または前記捕捉領域および前記非捕捉領域に対応した前記金属膜の裏面で反射して前記出射面から出射された励起光の反射光を検出し、検出された前記プラズモン散乱光または前記反射光に基づいて、前記捕捉領域の端部の位置情報を得る工程と、前記位置情報に基づいて、前記捕捉領域を検出位置に移動させる工程と、を含む。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ユーザーの手を煩わせることなく分析チップの高精度な位置合わせを実現することができる。したがって、本発明によれば、製造コストの増大およびユーザビリティの低下を防ぎつつ、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】図２は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の動作手順を示すフローチャートである。
【図３】図３は、図２に示される位置合わせ工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。
【図４】図４Ａ、Ｂは、分析チップにおける捕捉領域の端部の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。
【図５】図５Ａは、受光センサーによるプラズモン散乱光の検出結果の例を示すグラフであり、図５Ｂは、捕捉領域および非捕捉領域と、照射スポットと、の位置関係を示す模式図である。
【図６】図６Ａ、Ｂは、受光センサーによるプラズモン散乱光の検出結果の例を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を模式的に示す図である。
【図８】図８Ａ、Ｂは、分析チップにおける捕捉領域の端部の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図である。
【図９】図９Ａは、反射光受光センサーによる反射光の検出結果の例を示すグラフであり、図９Ｂは、捕捉領域および非捕捉領域と、照射スポットと、の位置関係を示す模式図である。
【図１０】図１０Ａ、Ｂは、反射光受光センサーによる反射光の検出結果の例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１６】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０（蛍光検出部）、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５４に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１７】
（分析チップの構成）
分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。
【００１８】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０の裏面で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。
【００１９】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。
【００２０】
入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２１】
なお、分析チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０に固定化された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２２】
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２３】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。
【００２４】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２５】
金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表の面）の少なくとも一部には、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２が配置されている（図５Ｂ参照）。捕捉領域Ａ１には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。捕捉領域Ａ１の平面視形状は、特に限定されない。捕捉領域Ａ１の平面視形状の例には、円形や多角形などが含まれる。なお、本実施の形態では、捕捉領域Ａ１の平面視形状は、円形である（図５Ｂ参照）。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。非捕捉領域Ａ２は、捕捉体が固定化されていない捕捉領域Ａ１以外の領域である。たとえば、非捕捉領域Ａ２は、金属膜３０そのものであってもよいし、金属膜３０の表面に被検出物質の吸着を防止するブロッキング層を有していてもよい。
【００２６】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０の捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉領域Ａ１の捕捉体に接触する。
【００２７】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光βおよびプラズモン散乱光γを外部に取り出す部分が蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２８】
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。
【００２９】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。
【００３０】
励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０（金属膜３０の裏面）に励起光αを出射する。蛍光βの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光αは、分析チップ１０の位置決めにも使用される。
【００３１】
励起光照射ユニット１１０は、励起光αをプリズム２０に向けて出射するための構成と、金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角度を変更するための構成とを含む。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、第１角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００３２】
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットＳ（図５Ｂ参照）の形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００３３】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３４】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットＳの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００３５】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００３６】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射される光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３７】
第１角度調整機構１１２は、金属膜３０の裏面（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。第１角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０裏面の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５４とを相対的に回転させる。
【００３８】
たとえば、第１角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を変化させても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３９】
金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの最大光量を得られる角度が増強角である。増強角またはその近傍の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。なお、分析チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの好適な出射角は、約７０°である。
【００４０】
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１の出射光（励起光α）の出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４１】
応答光検出ユニット１３０は、被検出物質の検出時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じた蛍光βと、分析チップ１０の位置決め時および増強角測定時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γとを検出する。応答光検出ユニット１３０は、例えば、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。
【００４２】
受光ユニット１３１は、分析チップ１０の金属膜３０の法線方向（図１におけるｚ軸方向）に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。
【００４３】
第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。
【００４４】
光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターであるが、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであってもよい。
【００４５】
受光センサー１３７は、蛍光βまたはプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１３７は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βまたはプラズモン散乱光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４６】
位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。位置切り替え機構１３２は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター１３５を水平方向に移動させる公知の機構（ターンテーブルやラックアンドピニオンなど）とによって構成される。
【００４７】
センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４８】
送液ユニット１４０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の流路４１内に、試料液や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。
【００４９】
薬液チップ１４１は、試料液や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。薬液チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
【００５０】
シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。
【００５１】
送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、分析チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００５２】
シリンジ１４４と分析チップ１０との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ１０内での残液量を一定に管理する観点からは、送液ユニット１４０は、シリンジ１４４の先端の位置を検出する装置をさらに有することが好ましい。
【００５３】
送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１より各種液体を吸引し、分析チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、分析チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、分析チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、分析チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。
【００５４】
流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、薬液チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の捕捉領域Ａ１に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。
【００５５】
搬送ユニット１５０は、分析チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が分析チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを応答光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が分析チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または分析チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５２およびチップホルダー１５４を含む。チップホルダー１５４は、搬送ステージ１５２に固定されており、分析チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５４の形状は、分析チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光αの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５４には、励起光αが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５２は、チップホルダー１５４を一方向（図１におけるｘ軸方向）およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５２は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００５６】
制御部１６０は、第１角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５２を制御する。また、制御部１６０は、応答光検出ユニット１３０の検出結果に基づいて、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０における捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定するとともに、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０の捕捉領域Ａ１を適切な測定位置に移動させる位置調整部としても機能する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５７】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および本発明の実施の形態１に係る位置合わせ方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３〜図５は、位置合わせ工程を説明するための図である。図３は、図２に示される位置合わせ工程（Ｓ１４０）内の工程を示すフローチャートである。
【００５８】
まず、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５４に分析チップ１０が設置される（Ｓ１００）。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（Ｓ１１０）。
【００５９】
次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（Ｓ１２０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
【００６０】
次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（Ｓ１３０）。
【００６１】
次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０および搬送ステージ１５２を操作して、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を得るとともに、得られた位置情報に基づいて捕捉領域Ａ１（分析チップ１０）の位置を調整する（Ｓ１４０）。図３に示されるように、この工程では、まず、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０における捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２の直下であって、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２と同じ形状の領域（金属膜３０の裏面の領域）に励起光αを照射するとともに、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２から放出されたプラズモン散乱光γを検出して、分析チップ１０の捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を得る（Ｓ１４１）。これにより、測定位置からの捕捉領域Ａ１の位置ずれの程度を特定することができる。次いで、得られた位置情報に基づいて、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０の捕捉領域Ａ１を適切な測定位置に配置する（Ｓ１４２）。
【００６２】
図４Ａは、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を得る工程（Ｓ１４１）を説明するための模式図であり、図４Ｂは、励起光αの入射角度と、プラズモン散乱光γの光量との関係を模式的に示したグラフである。図４Ｂの実線（Ｌ１）は、捕捉領域Ａ１における励起光αの入射角度に対するプラズモン散乱光γの光量の変動を示しており、破線（Ｌ２）は、非捕捉領域Ａ２における励起光αの入射角度に対するプラズモン散乱光γの光量の変動を示している。図５Ａは、励起光αの照射スポットＳの移動距離と、プラズモン散乱光γの光量との関係を模式的に示したグラフであり、図５Ｂは、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２と、照射スポットＳと、の位置関係を示す模式図である。なお、図５Ａの矢印で示された点ａ〜点ｆは、図５Ｂに示されたａ〜ｆに対応している。
【００６３】
ここでは、図４および図５に示されるように、励起光αの入射角度を固定した状態で、励起光αの照射スポットＳを金属膜３０の裏面を走査させて得られるプラズモン散乱光γの励起光αの、入射角度に対する依存特性を利用する。すなわち、励起光αの入射角度を固定した状態で、励起光αの照射スポットＳを金属膜３０の裏面を走査して、プラズモン散乱光γの変動により、捕捉領域Ａ１の端部の位置を検出する。具体的には、第１角度調整機構１１２により励起光αの入射角度を所定の角度となるように調整した状態で、搬送ステージ１５２を駆動させて分析チップ１０を移動することで、励起光αの照射スポットを金属膜３０の裏面上を走査させる。ここで、励起光αの入射角度は、捕捉領域Ａ１から放出されるプラズモン散乱光γの光量と、非捕捉領域Ａ２から放出されるプラズモン散乱光γの光量と、が同量でない角度（図４ＢにおけるＬ１およびＬ２が交わらない位置の入射角度）である。たとえば、励起光αの入射角度は、後述する捕捉領域Ａ１における増強角、または非捕捉領域Ａ２における増強角である。なお、図４Ｂに示されるような励起光αの入射角度に対するプラズモン散乱光γの光量の変動は、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２に対応する金属膜３０の裏面のいずれの部分に励起光αを照射しても得られる。
【００６４】
図５Ａおよび図５Ｂに示されるように、照射スポットＳを金属膜３０の裏面の一方の端部から他方の端部に向かって走査させると、受光センサー１３７で受光するプラズモン散乱光γの光量が変化し始める点（図５Ａの点ｂおよび図５Ｂのｂ）が存在する。これは、金属膜３０の裏面における励起光αの照射スポットＳの位置に対応した金属膜３０表面の状態が変化したことを意味する。ここで、前述したように、捕捉領域Ａ１に対応する金属膜３０の裏面と、非捕捉領域Ａ２に対応する金属膜３０の裏面と、に同一の入射角度で励起光αを照射した多くの場合では、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２から放出されるプラズモン散乱光γの光量が異なる（図４Ｂ参照）。この場合は、図４ＢにおけるＰ１の入射角度で励起光αを入射した場合の例である。したがって、図５Ａにおいてプラズモン散乱光γの光量が増加し始める点（点ｂ）は、図５Ｂにおいて照射スポットＳの走査方向の先端が捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２の境界に到達した点であることが分かる。
【００６５】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が徐々に増加する（図５Ａの点ｂ〜点ｃ）。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に増加するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが非捕捉領域Ａ２に対応する部分から捕捉領域Ａ１に対応する部分に移行していることが分かる。
【００６６】
さらに照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が一定となる（図５Ａの点ｃ〜点ｄ）。これは、照射スポットＳの全てが捕捉領域Ａ１に対応する部分の範囲内に位置するためである。
【００６７】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が徐々に減少する（図５Ａの点ｄ〜点ｅ）。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に減少するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが捕捉領域Ａ１に対応する部分から非捕捉領域Ａ２に対応する部分に移行していることが分かる。
【００６８】
最後に、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量の減少が停止する（図５Ａの点ｅ〜点ｆ）。これは、照射スポットＳが、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に移行したことが分かる。
【００６９】
図５Ｂにおいて、捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定するには、ｂ、ｃ、ｄ、ｅのいずれかを使用すればよい。ｂおよびｄは、照射スポットＳの走査方向の先端が捕捉領域Ａ１の端部に到達した地点を示している。したがって、励起光αの照射スポットＳ径を考慮すれば、捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定することができ、結果として捕捉領域Ａ１の中心の位置を特定することができる。
【００７０】
また、ｃおよびｅは、励起光αの照射スポットＳの走査方向の後端が捕捉領域Ａ１の端部に到達した地点を示している。したがって、励起光αの照射スポットＳ径を考慮すれば、捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定することができ、結果として捕捉領域Ａ１の中心の位置を特定することができる。
【００７１】
なお、ｂおよびｃの中点、またはｄおよびｅの中点を使用してもよい。ｂおよびｃの中点、またはｄおよびｅの中点を利用する場合は、励起光αの照射スポットＳ径を考慮することなく、捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定することができ、結果として捕捉領域Ａ１の中心の位置を特定することができる。この場合、励起光αの照射スポットＳ径の影響を抑制する観点からは、プラズモン散乱光γの光量の中間値を用いて、捕捉領域Ａ１の端部を特定することが好ましい。
【００７２】
このように、分析チップ１０の裏面に励起光αを照射するとともに、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２から放出されるプラズモン散乱光γを検出することで、分析チップ１０における捕捉領域Ａ１の位置を特定することができる。
【００７３】
ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の説明に戻る（図２参照）。次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光γを検出して、増強角を検出する（Ｓ１５０）。具体的には、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査しつつ、応答光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光γを検出する。このとき、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を操作して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。そして、制御部１６０は、プラズモン散乱光γの光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。
【００７４】
次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する（Ｓ１６０）。このとき、制御部１６０は、第１角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。
【００７５】
次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（Ｓ１７０）。
【００７６】
次いで、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、蛍光物質で標識された２次抗体を含む液体（標識液）を分析チップ１０の流路４１内に導入する（Ｓ１８０）。流路４１内では、抗原抗体反応（２次反応）によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。
【００７７】
次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０をＳ１４０で決定された適切な測定位置に移動させる（Ｓ１９０）。
【００７８】
次いで、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および応答光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光βを検出する（Ｓ２００）。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。検出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
【００７９】
以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。
【００８０】
なお、増強角の検出（Ｓ１５０）は、１次反応（Ｓ１２０）の前に行ってもよい。この場合は、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、１次反応（Ｓ１１０およびＳ１２０）の前に実施される。また、励起光αの入射角があらかじめ決まっている場合は、増強角の検出（Ｓ１５０）を省略してもよい。この場合も、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、光学ブランク値の測定（Ｓ１６０）の前に実施される。このように、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）は、光学測定（増強角の検出、光学ブランク値の測定または蛍光の検出）を初めて実施する前に実施されることが好ましい。
【００８１】
また、上記の説明では、被検出物質と捕捉体とを反応させる工程（１次反応、Ｓ１２０）の後に、被検出物質を蛍光物質で標識する工程（２次反応、Ｓ１８０）を行った（２工程方式）。しかしながら、被検出物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、分析チップ１０の流路４１内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被検出物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、分析チップ１０の流路４１内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、分析チップ１０の流路４１内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被検出物質が蛍光物質で標識されるとともに、被検出物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、分析チップ１０の流路４１内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。このように１工程方式を採用する場合は、抗原抗体反応の前に増強角の検出（Ｓ１５０）が実施され、さらにその前に、分析チップ１０の測定位置の決定（Ｓ１３０およびＳ１４０）が実施される。
【００８２】
また、位置合わせ工程（Ｓ１４０）を行うタイミングは、被検出物質を蛍光標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出する前であれば、１次反応（Ｓ１２０）の前でなくてもよい。たとえば、位置合わせ工程（Ｓ１４０）を１次反応（Ｓ１２０）の後に行ってもよいし、１次反応（Ｓ１２０）の後であって、２次反応（Ｓ１８０）の前であってもよい。
【００８３】
また、励起光αの入射角度は、検出されたプラズモン散乱光γの光量が最大となる捕捉領域Ａ１における増強角（図４ＢのＰ１参照）であってもよい。ここでいう増強角は、正確な増強角ではなく、分析チップ１０を設計したときにより決まる理論上の角度である。図６Ａに示されるように、励起光の増強角を捕捉領域Ａ１における増強角とすると、入射角度を任意の角度とした場合と比較して、プラズモン散乱光γの変動量が大きくなることが分かる（図５Ｂおよび図６Ａ参照）。よって、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を取得する工程において、捕捉領域Ａ１の端部をより正確に検出することができる。
【００８４】
また、励起光αの入射角度は、検出されたプラズモン散乱光γの光量が最大となる非捕捉領域Ａ２における増強角（図４ＢのＰ２参照）であってもよい。この場合、図６Ｂに示されるように、照射スポットＳを金属膜３０の裏面の一方の端部から他方の端部に向かって走査させると、受光センサー１３７で受光するプラズモン散乱光γの光量が低下し始める点（図６Ｂの点ｂ）が存在する。これは、金属膜３０の裏面における励起光の照射スポットＳの位置に対応した金属膜３０表面の状態が変化したことを意味する。ここで、前述したように、捕捉領域Ａ１に対応する金属膜３０の裏面と、非捕捉領域Ａ２に対応する金属膜３０の裏面と、に同一の入射角度で励起光αを照射した多くの場合では、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２から放出されるプラズモン散乱光γの光量が異なる（図４Ｂ参照）。したがって、プラズモン散乱光γの光量が増加し始める点は、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２の境界に該当することが分かる。
【００８５】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が徐々に減少する（図６Ｂの点ｂ〜点ｃ）。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に増加するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが非捕捉領域Ａ２に対応するから捕捉領域Ａ１に対応する部分に移行していることが分かる。
【００８６】
さらに照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が一定となる（図６Ｂの点ｃ〜点ｄ）。これは、照射スポットＳの全てが捕捉領域Ａ１に対応する部分の範囲内に位置するためである。
【００８７】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量が増加に増加する（図６Ｂの点ｄ〜点ｅ）。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に減少するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが捕捉領域Ａ１に対応するから非捕捉領域Ａ２に対応する部分に移行していることが分かる。
【００８８】
最後に、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、受光センサー１３７に入射するプラズモン散乱光γの光量の増加が停止する（図６Ｂの点ｅ〜点ｆ）。これは、照射スポットＳが、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に移行したことが分かる。
【００８９】
また、励起光の増強角を捕捉領域Ａ１における増強角とすると、入射角度を任意の角度とした場合と比較して、プラズモン散乱光γの変動量が大きくなることが分かる（図５Ａおよび図６Ｂ参照）。よって、この場合も捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を取得する工程において、捕捉領域Ａ１の端部をより正確に検出することができる。
【００９０】
［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、励起光αの反射光δを検出する反射光検出ユニット２７０を有する点において、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同じ構成要素については同一の符番を付し、説明を省略する。
【００９１】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
図７は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の構成を示す図である。図７に示されるように、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射ユニット１１０、応答光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０、制御部１６０に加え、反射光検出ユニット２７０を有する。
【００９２】
反射光検出ユニット２７０は、照射スポットＳを通る、金属膜３０に対する法線を挟んで、励起光照射ユニット１１０の反対側に配置されている。反射光検出ユニット２７０は、反射光検出センサー２７１および第２角度調整機構２７２を有する。
【００９３】
反射光検出センサー２７１は、励起光αの反射光δを検出する。反射光検出センサー２７１の種類は、反射光δを検出可能であれば特に限定されない。たとえば、反射光検出センサー２７１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。反射光検出センサー２７１の受光面の大きさは、反射光δのビーム径よりも大きいことが好ましい。反射光検出センサー２７１は、励起光αの反射光δが入射する位置に配置される。第２角度調整機構２７２は、第１角度調整機構１１２と同様に構成されており、反射光δの角度に応じて反射光検出センサー２７１の受光面の角度を第１角度調整機構１１２に連動して調整する。
【００９４】
次に、ＳＰＦＳ装置２００の検出動作（本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および本発明の一実施の形態に係る位置合わせ方法）について説明する。なお、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の検出動作は、位置合わせ工程を除き、実施の形態１と同じであるため、本実施の形態では位置合わせ工程のみ説明する。
【００９５】
図８は、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を得る工程を説明するための模式図である。図８Ａは、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を得る工程を説明するための模式図であり、図８Ｂは、励起光αの入射角度と、反射光δの光量との関係を模式的に示したグラフである。図８Ｂの実線（Ｌ３）は、捕捉領域Ａ１における励起光αの入射角度に対する反射光δの光量の変動を示しており、破線（Ｌ４）は、非捕捉領域Ａ２における励起光αの入射角度に対する反射光δの光量の変動を示している。図９Ａは、励起光αの照射スポットＳの移動距離と、反射光δの光量との関係を模式的に示したグラフであり、図９Ｂは、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２と、照射スポットＳと、の位置関係を示す模式図である。なお、図９Ａの矢印で示された点ａ〜点ｆは、図９Ｂに示されたａ〜ｆに対応している。
【００９６】
ここでは、図８および図９に示されるように、励起光αの入射角度を固定した状態で、励起光αの照射スポットＳを金属膜３０の裏面を走査させて得られる反射光δの入射角度の依存特性を利用する。すなわち、励起光αの入射角度を固定した状態で、励起光αの照射スポットＳを金属膜３０の裏面を走査して、反射光δの変動により、捕捉領域Ａ１の端部を検出する。具体的には、図９Ａに示されるように、第１角度調整機構１１２により励起光αの入射角度を所定の角度となるように調整した状態で、搬送ステージ１５２を駆動させて分析チップ１０を移動することで、励起光αの照射スポットＳを金属膜３０の裏面上を走査させる。ここで、励起光αの入射角度は、捕捉領域Ａ１から放出される反射光の光量と、非捕捉領域から放出される反射光の光量と、が同量でない角度（図８ＢにおけるＬ３およびＬ４が交わらない位置の入射角度）である。たとえば、励起光αの入射角度は、後述する捕捉領域Ａ１における共鳴角、または非捕捉領域Ａ２における共鳴角である。
【００９７】
このとき、照射スポットＳを金属膜３０の裏面の一方の端部から他方の端部に向かって走査させると、反射光検出センサー２７１で受光する反射光δの光量が変化し始める点が存在する。これは、金属膜３０の裏面における励起光αの照射スポットＳの位置に対応した金属膜３０表面の状態が変化したことを意味する。ここで、前述したように、捕捉領域Ａ１に対応する金属膜３０の裏面と、非捕捉領域Ａ２に対応する金属膜３０の裏面と、に同一の入射角度で励起光αを照射した多くの場合では、出射面２３から出射される反射光δの光量が異なる（図８Ｂ参照）。この場合は、図８ＢにおけるＰ３の入射角度で励起光を入射した場合の例である。したがって、反射光δの光量が減少し始める点は、捕捉領域Ａ１および非捕捉領域Ａ２の境界に該当することが分かる。
【００９８】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、反射光検出センサー２７１に入射する反射光δの光量が徐々に減少する。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に増加するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが非捕捉領域Ａ２に対応する部分から捕捉領域Ａ１に対応する部分に移行している途中であることが分かる。
【００９９】
さらに照射スポットＳを走査し続けると、反射光検出センサー２７１に入射する反射光δの光量が一定となる。これは、照射スポットＳの全てが捕捉領域Ａ１に対応する部分の範囲内に位置するためである。
【０１００】
次いで、そのまま照射スポットＳを走査し続けると、反射光検出センサー２７１に入射する反射光δの光量が徐々に増加する。これは、照射スポットＳにおいて、非捕捉領域Ａ２に対応する部分に対して、捕捉領域Ａ１に対応する部分の割合が徐々に減少するためである。すなわち、金属膜３０の裏面において、照射スポットＳが捕捉領域Ａ１に対応する部分から非捕捉領域Ａ２に対応する部分に移行していることが分かる。
【０１０１】
図９Ａのグラフおよび図９Ｂの説明図において、捕捉領域Ａ１の端部の位置を特定するには、実施の形態１と同様に、点ｂ〜点ｅ、ｂ〜ｅのいずれかを使用すればよい。
【０１０２】
このように、分析チップ１０の裏面に励起光αを照射するとともに、出射面２３から出射される反射光δを検出することで、分析チップ１０における捕捉領域Ａ１端部の位置を特定することができる。
【０１０３】
なお、励起光αの入射角度は、検出された反射光δの光量が最小となる捕捉領域Ａ１における共鳴角（図８ＢのＰ３参照）であってもよい。ここでいう共鳴角は、正確な共鳴角ではなく、分析チップ１０を設計したときにより決まる理論上の角度である。図１０Ａに示されるように、励起光の入射角度を捕捉領域Ａ１における共鳴角とすると、入射角度を任意の角度とした場合と比較して、反射光δの光量の変動が大きくなることが分かる（図９Ａおよび図１０Ａ参照）。よって、捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を取得する工程において、捕捉領域Ａ１の端部をより正確に検出することができる。
【０１０４】
また、励起光αの入射角度は、検出された反射光δの光量が最小となる非捕捉領域Ａ２における共鳴角（図８ＢのＰ４参照）であってもよい。この場合、図１０Ｂに示されるように、励起光の共鳴角を非捕捉領域Ａ２における共鳴角とすると、入射角度を任意の角度とした場合と比較して、反射光δの光量の変動が大きくなることが分かる（図９Ａおよび図１０Ｂ参照）。よって、この場合も捕捉領域Ａ１の端部の位置情報を取得する工程において、捕捉領域Ａ１の端部をより正確に検出することができる。
【０１０５】
なお、実施の形態１および実施の形態２では、図１および図７におけるＸ方向にのみ搬送ステージ１５２が移動するＳＰＦＳ装置１００、２００について説明したが、図１および図７におけるＹ方向（紙面垂直方向）にも搬送ステージが移動する構成であってもよい。この場合、搬送ステージは、チップホルダー１５４をＸ方向に移動するＸ方向移動機構およびチップホルダー１５４をＹ方向に移動するＹ方向移動機構を有する。また、平面方向に移動可能な搬送ステージ１５２を有するＳＰＦＳ装置では、照射スポットＳを複数方向に走査することができるため、捕捉領域Ａ１の端部の検出精度をさらに高めることができる。
【０１０６】
また、上記実施の形態ではＳＰＦＳ装置について説明したが、本発明に係る分析チップ１０の位置合わせ方法は、ＳＰＲ装置などのＳＰＦＳ装置以外の分析装置にも適用されうる。なお。ＳＰＲ装置に適用する場合には、反射光検出ユニット２７０が不要であるため、装置構成を変えることなく分析チップ１０の位置合わせを行うことができる。
【０１０７】
本出願は、２０１４年３月３１日出願の特願２０１４−０７２２６６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および分析チップの位置決め方法は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【０１０９】
１０  分析チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  流路
１００、２００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光照射ユニット
１１１  光源ユニット
１１２  第１角度調整機構
１１３  光源制御部
１３０  応答光検出ユニット
１３１  受光ユニット
１３２  位置切り替え機構
１３３  センサー制御部
１３４  第１レンズ
１３５  光学フィルター
１３６  第２レンズ
１３７  受光センサー
１４０  送液ユニット
１４１  薬液チップ
１４２  シリンジポンプ
１４３  送液ポンプ駆動機構
１４４  シリンジ
１４５  プランジャー
１５０  搬送ユニット
１５２  搬送ステージ
１５４  チップホルダー
１６０  制御部
２７０  反射光検出ユニット
２７１  反射光検出センサー
２７２  第２角度調整機構
α  励起光
β  蛍光
γ  プラズモン散乱光
δ  反射光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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