(57)【要約】  本発明は、より免疫原性の高い感染症予防用ワクチンを、より短期間に、大量に提供でき、さらにはアナフィラキシーショック、アレルギー反応等の副作用が低減されたワクチンを製造するために用いられるウイルス様粒子、及びその製造方法、並びにそのようなワクチンを提供することを課題とする。本発明は、組換えウイルス膜タンパク質、及びボンビュクス・モリ由来の脂質を含むウイルス様粒子である。上記ウイルス様粒子は、上記脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面に、上記組換えウイルス膜タンパク質のスパイクが密に配置されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルス膜タンパク質、及びボンビュクス・モリ由来の脂質を含むウイルス様粒子。
【請求項２】
上記脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面に、上記組換えウイルス膜タンパク質のスパイクが密に配置されている、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
上記球状外殻の直径が、３０ｎｍ〜３００ｎｍである、請求項１又は２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
上記スパイクの長さが、５ｎｍ〜３０ｎｍである、請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
上記組換えウイルス膜タンパク質と上記脂質との含有重量比が、１：１〜１：１０である、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
上記組換えウイルス膜タンパク質が、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の核酸がコードするアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
上記組換えウイルス膜タンパク質が、組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質である、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
上記組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質におけるインフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、請求項７に記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
上記Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５型又はＨ７型である、請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
上記組換えウイルス膜タンパク質が、組換え日本脳炎ウイルスタンパク質である、請求項１〜６のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
上記アミノ酸配列が、配列番号３、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、及び３２からなる群から選択される、請求項６に記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
上記コドン最適化されたＤＮＡ配列が、配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、及び３３からなる群から選択される、請求項６〜１０のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
ワクチン用である、請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載のウイルス様粒子を含有する、ワクチン。
【請求項１５】
経口ワクチンである、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の組換えウイルス膜タンパク質遺伝子をバキュロウイルスに導入して組換え体バキュロウイルスを取得する工程、
上記組換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリの蛹に接種する工程、
上記蛹を２０℃〜３０℃で２日間〜６日間飼育する工程、
上記飼育後の蛹を破砕乳化して乳化液を製造する工程、及び
上記乳化液からウイルス様粒子を含む分画を取得する工程
を含むウイルス様粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス様粒子及びその製造方法、並びにウイルス様粒子を含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染症の効果的な予防策としてワクチンが広く用いられている。特にインフルエンザは、毎年世界各地で大流行するウイルス感染症であるため、ワクチンの需要が大きい。このインフルエンザの原因ウイルスには、その粒子の表面に膜タンパクであるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）が存在しており、これらの膜タンパクのサブタイプの組み合わせによってウイルスの分類が行われている。流行するインフルエンザウイルスの抗原亜型はある程度決まっているものの、その年によって実際に流行する型は異なるため、毎年の流行予測に合わせたワクチン生産を行う必要がある。中でもＨＡのサブタイプがＨ５又はＨ７であるウイルスの中には強病原性のものが多く、これまで世界各地で多くの感染者を出し、死亡例もあることから、有効なワクチンが必要とされている。このようなワクチンには、優れた予防効果を得るために、より高い免疫原性が求められる。また、世界各地での大流行に備えるため、大量生産が可能であること、低コストで製造できること、流行の時期に間に合うように短期間での生産が可能であること、ワクチン投与による副作用が低減されていること等も求められる。【０００３】
しかし、インフルエンザワクチンの生産には、伝統的に１０〜１１日齢の発育鶏卵が広く使用されている。この発育鶏卵によるワクチンの生産には種ウイルスを扱うことが必須であるためＰ３施設などの高度安全施設を必要とすること、大量の卵が必要であること、そのため高コストであること、免疫原性が十分でないこと、卵アレルギーの原因となること、製造に長期間必要であること、鶏卵で増やすためには抗原性に変化を与えてしまう場合があること、有効成分だけのコンポーネントワクチンの製造が困難であること等の種々の不都合がある。【０００４】
また、今日の科学技術の進歩により、培養細胞のＭＤＣＫ又はＶＥＲＯでもインフルエンザワクチンの生産が可能になってきた。特に注目されるのは、様々なベクターを用いた遺伝子操作技術で、目的とするインフルエンザワクチン用ＨＡタンパク質を、酵母やカイコ（ボンビュクス・モリ）の個体、あるいはそれらの培養細胞で生産できるようになってきたことである（特許文献１及び非特許文献１参照）。しかし、これらの方法によって、卵アレルギーの副作用の問題が解決されると共にインフルエンザワクチン用タンパク質の発現効率が向上したものの、その生産効率はまだ十分とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００７／０４６４３９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｅｄａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８５）  ３１５，  ５９２−５９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、これまでの発育鶏卵、培養細胞等を使用するワクチン生産には、コストが高いこと、大量生産が難しいこと、製造に長期間を要すること、得られるワクチンの免疫原性が不十分であること等の不都合がある。また、それにより得られるワクチンには、アレルギーに加え、オイル等のアジュバントの使用による大きな副作用の問題もある。これらを解決するためには、ワクチン用のウイルス膜タンパク質の新たな量産技術、及びそれを用いて製造される免疫原性の高いワクチンが必要である。つまり、近未来のワクチンに期待されることは、第一にワクチンにとって不可欠成分のウイルスタンパク質のコンポーネントワクチンであること、第二に大量生産が可能であること、第三にアジュバントを必要としないこと、第四に副作用が無いか又は最小限に抑えられていることである。【０００８】
そこで、本発明は、より免疫原性が高く、アナフィラキシーショック、アレルギー反応等の副作用が低減されたウイルス感染症予防用ワクチンを、より短期間に、大量に製造するために用いられるウイルス様粒子、及びその製造方法、並びにそのようなワクチンを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために行った発明は、以下の通りである。
［１］組換えウイルス膜タンパク質、及びボンビュクス・モリ由来の脂質を含むウイルス様粒子。
［２］上記脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面に、上記組換えウイルス膜タンパク質のスパイクが密に配置されている、［１］に記載のウイルス様粒子。
［３］上記球状外殻の直径が、３０ｎｍ〜３００ｎｍである、［１］又は［２］に記載のウイルス様粒子。
［４］上記スパイクの長さが、５ｎｍ〜３０ｎｍである、［１］〜［３］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［５］上記組換えウイルス膜タンパク質と上記脂質との含有重量比が、１：１〜１０：１である、［１］〜［４］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［６］上記組換えウイルス膜タンパク質が、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の核酸がコードするアミノ酸配列を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［７］上記組換えウイルス膜タンパク質が、組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質である、［１］〜［６］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［８］上記組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質におけるインフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、［７］に記載のウイルス様粒子。
［９］上記Ａ型インフルエンザウイルスが、Ｈ５型又はＨ７型である、［８］に記載のウイルス様粒子。
［１０］上記組換えウイルス膜タンパク質が、組換え日本脳炎ウイルスタンパク質である、［１］〜［６］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［１１］上記アミノ酸配列が、配列番号３、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、及び３２からなる群から選択される、［６］に記載のウイルス様粒子。
［１２］上記コドン最適化されたＤＮＡ配列が、配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、及び３３からなる群から選択される、［６］〜［１０］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［１３］ワクチン用である、［１］〜［１２］のいずれかに記載のウイルス様粒子。
［１４］［１］〜［１３］に記載のウイルス様粒子を含有する、ワクチン。
［１５］経口ワクチンである、請求項１４に記載のワクチン。
［１６］ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の組換えウイルス膜タンパク質遺伝子をバキュロウイルスに導入して組換え体バキュロウイルスを取得する工程、
上記組換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリの蛹に接種する工程、
上記蛹を２０℃〜３０℃で２日間〜６日間飼育する工程、
上記飼育後の蛹を破砕乳化して乳化液を製造する工程、及び
上記乳化液からウイルス様粒子を含む分画を取得する工程
を含むウイルス様粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、免疫原性が高く、かつ副作用が低減されたウイルス感染症予防用高度免疫機能ワクチンを、より短期間に、低コストで大量に提供することが可能となった。本発明のウイルス様粒子は、ウイルス粒子に酷似し、脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面には組換えウイルス膜タンパクのみが密に結合した構造であることで、従来のワクチンと比較して著しく高い免疫原性（免疫原性）を有する。さらに、本発明のウイルス様粒子は、経口接種によっても高い免疫原性を示すため、経口ワクチンとして好適に使用できる。また、このように免疫原性が高いことで、接種の際にアジュバントを用いる必要がないため、アナフィラキシーショック、アレルギー等の副作用を低減することもでき、安全性にも優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ボンビュクス・モリ（学名：Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）におけるコドン使用頻度を示す。ボンビュクス・モリの１１８０のコーディング領域（ＣＤＳ）中の４５００４３コドン中の使用頻度を調べた表である。それぞれのコドンの１０００個当たりの出現頻度を示す。括弧内の数字は、出現総数を示す。太字で示したところが、各アミノ酸に対するもっとも使用頻度の高い遺伝子コドンであることを示す。
【図２】図１で示した最も使用頻度の高い遺伝子コドンを元にした最適化したコドン対応表を示す。セリン（Ｓ）はＵＣＡであり、その相補鎖はＴＧＡであり、終止コドンである。そのため、セリンの相補鎖は終止コドンとなり、相補鎖に大きなフレームが出現することはない。
【図３−１】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−２】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−３】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−４】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図４】合成したワクチン用ＨＡタンパク質をコードする遺伝子のコーディングフレームの解析の結果である。下からＮ１＞−、Ｎ２＞−、Ｎ３＞−は、それぞれプラス鎖の３つのコーディングフレームを解析した結果である。上にあるバーは、開始コドンであるＡＴＧの位置を示し、下につきだしたバーは、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の場所を示す。Ｎ１＞−のみが１つの大きなコーディングフレームとなるが、他のフレームでは、下につきだしたバーが多く、仮に発現したとしても大きなタンパク質を作ることは出来ない。下から４番目から一番上までのＮ１＜−、Ｎ２＜−、Ｎ３＜−は、相補鎖のコーディングフレームを解析した結果である。いずれのフレームも、仮に、発現したとしても大きなタンパク質を作ることは出来ない。
【図５−１】コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子ｃＤＮＡ配列とのアラインメントを示す。Ｑｕｅｒｙはコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列（ＦＬＡＧ ＴＡＧを除くコーディング領域の配列）、ＳｂｊｃｔはトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）（ＨＡのコーディング領域配列）を示す。配列が同じ部分は＊で示し、−はギャップを示している。相同性は７７％と非常に低くなっているが、強毒性配列を改変し、削除した以外は、同じアミノ酸配列を発現するように設計されている。
【図５−２】コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  ウイルスのＨＡ遺伝子ｃＤＮＡ配列とのアラインメントを示す。Ｑｕｅｒｙはコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列（ＦＬＡＧ ＴＡＧを除くコーディング領域の配列）、ＳｂｊｃｔはトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）（ＨＡのコーディング領域配列）を示す。配列が同じ部分は＊で示し、−はギャップを示している。相同性は７７％と非常に低くなっているが、強毒性配列を改変し、削除した以外は、同じアミノ酸配列を発現するように設計されている。
【図６】ボンビュクス・モリを用いて生産したＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。矢印は、特異的バンドを示す。
【図７】ｐＢｍ−８ＨＡを用いて作成したＨＡ溶液によるニワトリにおけるＨＩ抗体の種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性を示す。天然のウイルスと幅広く反応した。
【図８】ショ糖密度勾配の各分画のＨＡ活性を示す。天然のウイルスの沈降位置よりも低密度の位置にＨＡ活性が分布していた。
【図９−１】ショ糖密度勾配分画中の電子顕微鏡像を示す。直径３０〜３００ｎｍのウイルス様粒子が多数観察された。矢印は、ウイルス様粒子の表面に密に存在するＨＡタンパクスパイクを示す。
【図９−２】ショ糖密度勾配分画中の電子顕微鏡像を示す。直径３０〜３００ｎｍのウイルス様粒子が多数観察された。矢印は、ウイルス様粒子の表面に密に存在するＨＡタンパクスパイクを示す。
【図９−３】ショ糖密度勾配分画中の電子顕微鏡像を示す。直径３０〜３００ｎｍのウイルス様粒子が多数観察された。矢印は、ウイルス様粒子の表面に密に存在するＨＡタンパクスパイクの三角形状のヘッド部分を示す。
【図１０−１】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−２】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−３】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−４】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位、ＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１１】ボンビュクス・モリを用いて生産したＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。矢印は、特異的バンドを示す。
【図１２−１】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−２】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−３】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−４】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−５】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１３】ボンビュクス・モリを用いて生産したＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。
【図１４−１】トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−２】トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−３】トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−４】トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１５−１】日本脳炎ウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１５−２】日本脳炎ウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１５−３】日本脳炎ウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１５−４】日本脳炎ウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１６−１】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１６−２】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１６−３】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１６−４】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１７−１】西ナイルウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１７−２】西ナイルウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１７−３】西ナイルウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−１】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−２】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−３】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−４】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−５】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−６】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−１】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−２】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−３】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−４】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−５】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−１】Ｂｍ−Ｎ細胞に発現させた組換え日本脳炎ウイルスタンパク質（ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質）のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。矢印は、特異的バンドを示す。
【図２０−２】組換え日本脳炎ウイルスタンパク質（ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質）を発現させたＢｍ−Ｎ細胞である（ｂ、ｃ、ｄ）。（ａ）は無処理のＢｍ−Ｎ細胞である。（ｄ）は、蛍光標識した日本脳炎ウイルスＥタンパク質に対するモノクローナル抗体で染色した、組換え日本脳炎ウイルスタンパク質（ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質）を発現させたＢｍ−Ｎ細胞である。
【図２１】ショ糖密度勾配分画中の日本脳炎ウイルスタンパク質（ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質）の電子顕微鏡像を示す。
【図２２−１】Ｂｍ−Ｎ細胞に発現させた組換えＨ７型トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７））ＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。矢印は、特異的バンドを示す。
【図２２−２】組換えＨ７型トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７））ＨＡタンパク質を発現させたＢｍ−Ｎ細胞である（ｂ、ｃ、ｄ）。（ａ）は無処理のＢｍ−Ｎ細胞である。（ｄ）は、ＨＡタンパク質に対する蛍光標識モルモット抗血清で染色した、組換えＨ７型トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７））ＨＡタンパク質を発現させたＢｍ−Ｎ細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
＜ウイルス様粒子＞
本発明のウイルス様粒子は、感染症の原因となるウイルスの膜タンパク質の組換え体、及びボンビュクス・モリ由来の脂質を含む。このように本発明のウイルス様粒子は、感染症の原因となるウイルス粒子と類似した構成であることで、より高い免疫原性を備えることができる。そのため、通常のワクチンで必要とされるアジュバントを使用しなくても、十分な感染予防効果を奏することが可能となる。
【００１４】
本発明のウイルス様粒子の構造としては、上記脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面に、上記組換えウイルス膜タンパク質のスパイクが密に配置されていることが好ましい。このように、本発明のウイルス様粒子は、感染症の原因となるウイルス粒子と酷似した構造を有することで、さらに高い免疫原性を備えることができる。以下に、本発明のウイルス様粒子が含む、組換えウイルス膜タンパク質、及びボンビュクス・モリ由来の脂質について説明する。
【００１５】
［組換えウイルス膜タンパク質］
本発明のウイルス様粒子が含む組換えウイルス膜タンパク質は、ウイルス感染症の原因ウイルスの膜タンパク質の組換え体である。上記ウイルス感染症の原因ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、口蹄疫ウイルス等が挙げられる。
【００１６】
インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスが挙げられる。これらのうち、本発明のウイルス様粒子を用いたワクチンの有効性、及びワクチンの需要の観点から、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスが好ましく、Ａ型インフルエンザウイルスがより好ましい。中でも、Ｈ５型及びＨ７型がさらに好ましく、トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）が特に好ましい。同様の理由から、Ｃ型肝炎ウイルスにおいては、ジェノタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、及び３ａが好ましい。
【００１７】
上記ウイルスの膜タンパク質としては、ワクチンとして効果を奏するタンパク質であれば特に限定されない。例えば、インフルエンザウイルスの場合は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質が挙げられるが、ワクチンとしての有効性の観点から、ＨＡタンパク質が好ましい。Ｃ型肝炎ウイルスの場合は、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質が挙げられる。日本脳炎ウイルスの場合は、Ｅタンパク質が挙げられる。狂犬病ウイルスの場合は、Ｇタンパク質が挙げられる。西ナイルウイルスの場合は、Ｅタンパク質が挙げられる。ＭＥＲＳコロナウイルスの場合は、スパイクＧタンパク質が挙げられる。口蹄疫ウイルスの場合は、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質等が挙げられる。
【００１８】
上記ウイルスの膜タンパク質は、一つのウイルス様粒子に複数種類含まれていても良い。例えば、ウイルスの膜タンパク質は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質、狂犬病ウイルスのＧタンパク質、西ナイルウイルスのＥタンパク質、ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質、ならびに口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、および３Ｃタンパク質からなる群より一つ以上選択された組み合わせであっても良い。
【００１９】
上記ウイルスの膜タンパク質がＨＡタンパク質である場合、本発明のウイルス様粒子は、好ましくは、インフルエンザウイルスの他の構成タンパク質、例えばＭ１およびＭ２タンパク質を含まない。
【００２０】
上記組換えウイルス膜タンパク質は、上記のウイルス膜タンパク質の組換え体であって、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の核酸がコードするアミノ酸配列を有することが好ましい。上記コドン最適化は、具体的には、ボンビュクス・モリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ（図１）をもとに作成したアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表(図２)を用い、対象となる核酸配列を置換することにより行われる。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで予期せぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Ｓｅｒの配列は、ＵＣＡ（最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い）を用い、相補鎖に多くのＵＧＡ（終止コドン）が生じるように設計されている。
【００２１】
また、上記組換えウイルス膜タンパク質をコードする核酸は、弱毒化遺伝子改変を有していても良い。弱毒化は、当業者に公知の任意の改変によって行い得る。例えばインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の場合、病原性を支配するＨＡ１とＨＡ２分子を接合する開裂部位の配列を改変する。具体的には、ＨＡタンパク質において配列番号７で示されるアミノ酸配列を配列番号８で示されるアミノ酸配列に置換する。
【００２２】
上記組換えウイルス膜タンパク質をコードする核酸は、好ましくは配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、若しくは３３の配列を含む、又はこれらそれぞれの配列からなる核酸である。
【００２３】
本発明のウイルス様粒子が含む組換えウイルス膜タンパク質は、ボンビュクス・モリ由来の脂質を含む成分からなる中空の球状外殻の表面に、スパイクとして密に配置されていることが好ましい。
【００２４】
上記スパイクの長さは、５ｎｍ〜３０ｎｍであることが好ましく、８ｎｍ〜２５ｎｍであることがより好ましく、１０ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましく、１２ｎｍ〜１８ｎｍであることが特に好ましい。上記組換えウイルス膜タンパク質スパイクが、上記範囲の長さであることで、本発明のウイルス様粒子は、よりウイルス粒子に似た構造となり、ワクチンに用いた場合に免疫原性を向上させることができる。
【００２５】
上記スパイクの形状は、ヘッド部分が三角形の楔形形状であり、末端部分はボンビュクス・モリ由来の脂質を含む成分からなる球状外殻に結合できるようになっている。
【００２６】
［ボンビュクス・モリ由来の脂質］
本発明のウイルス様粒子が含むボンビュクス・モリ由来の脂質は、ボンビュクス・モリが有する脂質であれば特に限定されず、ボンビュクス・モリ由来の細胞、ボンビュクス・モリの幼虫、蛹等が有する脂質が挙げられる。
【００２７】
上記脂質としては、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール、リン脂質等が挙げられる。
【００２８】
グリセロ糖脂質としては、例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。
【００２９】
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。
【００３０】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
【００３１】
上記の脂質から加水分解等によって誘導される脂肪酸等を含んでもよい。上記脂肪酸としては、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明のウイルス様粒子において、これらのボンビュクス・モリ由来の脂質を含む成分は、中空の球状外殻を形成していることが好ましい。即ち、上記球状外殻は、ウイルスのエンベロープ様の構造であり、上記脂質等から構成される脂質二重膜であることがより好ましい。
【００３３】
上記球状外殻の直径は、３０ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましく、５０ｎｍ〜２００ｎｍであることがより好ましく、７０ｎｍ〜１５０ｎｍであることがさらに好ましく、８０ｎｍ〜１２０ｎｍであることが特に好ましい。
【００３４】
上記組換えウイルス膜タンパク質と上記脂質との含有重量比は、１：１〜１０：１である。
【００３５】
本発明のウイルス様粒子は、上記脂質を含む成分からなる球状外殻の表面が、上記組換えウイルス膜タンパク質のスパイクで密に覆われている構造をしている。本発明のウイルス様粒子を含有するワクチンは、このように、免疫原性を備える組換えウイルス膜タンパク質のスパイクを密に備える構造をしていることにより、アジュバントを用いなくとも、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能となる。アジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシーショック等の副作用も低減することができる。また、当然のことながら、本発明のウイルス様粒子の上記球状外殻の中空内にはウイルス由来の核酸は存在しないため、非病原性である。なお、上記球状外殻の中空内には、生理食塩水、リン酸緩衝液等が含まれていてもよい。
【００３６】
本発明のウイルス様粒子は、脂質以外のボンビュクス・モリ由来の成分、例えばボンビュクス・モリ由来のタンパク質や糖等を含んでいても良い。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、脂質以外のボンビュクス・モリ由来の成分を実質的に含んでいない。
【００３７】
［ウイルス様粒子の製造方法］
本発明のウイルス様粒子は、以下の方法により製造することができる。即ち、
ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された配列の組換えウイルス膜タンパク質遺伝子をバキュロウイルスに導入して組換え体バキュロウイルスを取得する工程、
上記組換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリの蛹に接種する工程、
上記蛹を２０℃〜３０℃で２日間〜６日間飼育する工程、
上記飼育後の蛹を破砕乳化して乳化液を製造する工程、及び
上記乳化液からウイルス様粒子を含む分画を取得する工程
を含むウイルス様粒子の製造方法である。
【００３８】
ボンビュクス・モリへの組換えウイルス膜タンパク質遺伝子の導入は、組換えウイルス膜タンパク質遺伝子を導入した組換え体バキュロウイルスを用いて行う。組換えウイルス膜タンパク質遺伝子のバキュロウイルスベクターへの導入は、当業者に周知の任意の方法により行うことができる。組換え体バキュロウイルスのボンビュクス・モリのへの導入（接種）時期は蚕蛹期であれば特に限定されないが、蚕蛹期のうちの早期であることが好ましく、具体的には、蛹になった当日（脱皮１日目）〜４日目（脱皮５日目）が好ましく、翌日（脱皮２日目）〜翌々日（脱皮３日目）がより好ましい。
【００３９】
上記組換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリの蛹に接種後、これらの蛹を所定の期間飼育するが、その際の温度条件は、２０℃〜３０℃が好ましく、２２℃〜２８℃がより好ましく、２４℃〜２７℃がさらに好ましく、２６℃が特に好ましい。上記飼育の期間は、上記接種後から蛹が成虫（蛾）に変態する前までの時期であれば特に限定されないが、上記接種後２日間〜６日間が好ましく、２日間〜４日間がより好ましく、３日間がさらに好ましい。
【００４０】
ボンビュクス・モリからの組換えウイルス膜タンパク質の回収は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を用いることができる。例えば、インフルエンザウイルスの組換えＨＡタンパク質を発現させた場合であれば、ボンビュクス・モリの蛹を等張緩衝溶液中にてホモゲナイズ後、固定化赤血球あるいはシアル酸カラム（フェツインカラム）を用いて回収することができる。また、ショ糖密度勾配遠心法等の分画方法を用いて組換えウイルス膜タンパク質をウイルス様粒子の形状で含む分画を得ることもできる。
【００４１】
［ワクチン］
本発明のワクチンは、上記本発明のウイルス様粒子を含有する。本発明のウイルス様粒子は高い免疫原性を備えるため、アジュバントを用いなくとも、従来にはない高い免疫原性を示すことが可能である。アジュバントを用いないため、アレルギーやアナフィラキシーショック等の副作用も低減することができる。また、当然のことながら、本発明のウイルス様粒子の上記球状外殻の中空の内部にはウイルス由来の核酸は存在しないため、非病原性である。本発明のワクチンはヒトを含む動物のウイルス感染を、効果的に防ぐことができる。また、本発明のワクチンは、従来の鶏卵を用いた製造方法等に比較して、製造に必要な期間を著しく短縮することができる。そのため、インフルエンザ等のウイルス感染症の流行の際に、短期間でワクチンの調達をすることができ、人々を感染症から守り健康を維持させることに多大な貢献を果たすことができる。さらに、従来の鶏卵を用いるワクチンの製造においては、ワクチンに用いる種ウイルスを扱うため、Ｐ３施設等の大規模な施設を必要とすること、ワクチンの免疫原性が低いため大量のワクチンを製造する必要があること等の理由により莫大な製造コストが必要であるのに対し、本発明の製造方法によると製造コストを著しく低減することができる。
【００４２】
ワクチンの有効量は、ウイルスに対する十分な体液性免疫または細胞性免疫を誘発するなどの生物学的効果を達成するのに十分な量をいう。また、投与方法は、吸入、鼻腔内、経口、非経口（例えば皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下投与）の投与が含まれる。有効量及び投与方法は、投与されるヒトの年齢、性別、状態、体重に依存してよい。例えばインフルエンザワクチンの場合、一般には、１ｍｌ中に１５μg以上のＨＡタンパク質を含むワクチンを、６ヶ月以上３歳未満の者には０．２５ｍｌを皮下に、３歳以上１３歳未満の者には０．５ｍｌを皮下に、およそ２〜４週間の間隔をおいて２回注射する。１３歳以上の者については、０．５ｍｌを皮下に、１回、又は、およそ１〜４週間の間隔をおいて２回注射する。
【実施例】
【００４３】
以下に、具体的な実験例をあげて本発明をさらに詳しく説明する。【００４４】
［実施例１］ウイルス様粒子の製造（インフルエンザワクチン）
（１）コドン最適化ＨＡ遺伝子の核酸配列設計
２０１１年に野生のカモで発見された高病原性トリインフルエンザウイルス  Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパクの遺伝子情報を次のように設計変更した。【００４５】
まず、トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＵＲＬ：  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）にＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＫ２４０７８で登録されている遺伝子配列（配列番号１）より予測した。【００４６】
次に、予測したアミノ酸配列中の、高病原性に関連すると推定されるＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列（配列番号７）をＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ配列（配列番号８）に置換し、さらにＣ末端にＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＬｙｓからなるＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、弱毒化ＨＡタンパク質アミノ酸配列（配列番号３）を設計した。【００４７】
ボンビュクス・モリを用いたタンパク質発現の向上を目的として、コドン最適化を行った。かずさＤＮＡ研究所が提供するＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから得られるボンビュクス・モリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  （ＵＲＬ：  http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=7091）（図１）をもとに、作成されたアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表(図２)を作成した。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで思わぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Ｓｅｒの配列は、ＵＣＡ（最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い）を用い、相補鎖に多くのＵＧＡ（終止コドン）が生じるように設計した。設計後の遺伝子配列（配列番号４）と対応するアミノ酸配列を、図３に示す。発現したいタンパク質以外には、大きなコーディングフレームが出来ないことを確認した（図４）。コドン最適化ＨＡと、オリジナルのＨＡとのホモロジーは、核酸配列で７７．５％であった。【００４８】
（２）コドン最適化ＨＡ遺伝子の合成及びベクターの構築
上記設計したコドン最適化ＨＡ遺伝子の配列情報を基に、ＤＮＡの全合成をタカラバイオ株式会社に依頼した。合成したコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡをトランスファーベクターであるｐＢｍ−８（バキュロテクノロジー社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（クロンテック社）を用いて挿入し、ｐＢｍ−８Ｈ５ＨＡを作製した。【００４９】
（３）コドン最適化ＨＡ遺伝子導入バキュロウイルスのボンビュクス・モリへの感染及び乳化液の作製
ｐＢｍ−８Ｈ５ＨＡとバキュロウイルスより抽出したＤＮＡとをボンビュクス・モリ細胞（Ｂｍ−Ｎ細胞）に同時に導入することにより、細胞上清中にワクチン生産用の組換え体バキュロウイルスを得た。この組換え体バキュロウイルス（Ｈ５ＨＡ−ＢｍＮＰＶ）を、ボンビュクス・モリの蛹に接種した。すなわち、ウイルス免疫原性１×１０８ｐｆｕ／ml以上のウイルス原液を昆虫細胞用培地 ＴＣ−１００で１０倍に希釈した。この希釈液５０μlを脱皮２日目のカイコの蛹腹部に注射により接種し、その後、蛹を２６℃のインキュベーターで飼育した。９６時間後、氷上で蛹をハサミにより半分に切り開き中腸をピンセットで取り除いた後、ポッター型ホモジナイザーを用い、フェニールチオ尿酸含有ＰＢＳ中で破砕乳化した。乳化液にＰＢＳを４４ｍｌになるように加え、さらに最終０．０１％になるようホルマリンを５μl加えてボンビュクス・モリの蛹乳化液を得た。【００５０】
（４）ＨＡタンパク質の回収
得られたボンビュクス・モリの蛹乳化液をソニケーター（ＵＲ−２０Ｐ、トミー精工製）で５分間超音波処理した。【００５１】
（５）ＨＡ活性の評価
インフルエンザウイルスは様々な動物の赤血球と混和すると凝集する性質があり、これは赤血球凝集反応と呼ばれ、ウイルス表面のヘマグルチニン(Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ)が赤血球の糖鎖と結合し、複数の赤血球同士を架橋させて大きな凝集体を作ることによる。この性質を利用して、ウイルスを階段希釈したときにどこまで凝集するかを調べることで、原液に含まれるウイルス濃度（ＨＡ活性）を算出できるため、インフルエンザウイルスの定量に用いられる。具体的には、９６穴のマイクロプレートを用いて、被検体５０μlをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０μlで階段希釈した後に、０.５％に調整したニワトリ赤血球を等量加えてよく混和し、３０分〜６０分間室温に静置する。被検体にＨＡ活性があれば赤血球と凝集塊を形成するが、ウイルスが存在しない場合は、凝集塊ができず、プレートの底に日の丸のように沈んでしまう。この日の丸が形成される前の希釈点の倍率を以て、ＨＡ凝集活性としてのＨＡ価を表現する。【００５２】
得られたＨＡタンパク質溶液を上記条件で評価した。その結果、ＨＡ活性は２，０９７，１５２のＨＡ活性を示した。その結果、２２０頭のボンビュクス・モリ蛹で産生された総ＨＡ活性は、２，０９７，１５２×４４ｍｌ＝９２，２７４，６８８となり、蛹１頭当たりのＨＡ活性量は４１９，４３０となった。組換え体のボンビュクス・モリ１頭のＨＡ活性量のこの値は、１個の発育鶏卵から産生されるＨＡ活性１，０２４〜２，０４８の、およそ２０５倍〜４１０倍という驚異的なＨＡ活性量の増大を実現することができた。【００５３】
（５）ＨＡタンパク質溶液によるニワトリの免疫
（ｉ）静脈注射及び筋肉注射による投与
上記のＨＡタンパク質溶液のワクチンとしての効果を確認するために、上記ＨＡタンパク質溶液でニワトリを免疫した。ＨＡ活性を８，１９２〜１６，３８４の間に調整した０．５mlのＨＡタンパク質溶液を、１ヶ月齢の雌のニワトリに静脈内投与し、１６日目及び３３日目に、ニワトリに同量を脚部筋肉接種した。初回接種当日、初回接種から１６日後、３３日後及び４０日後にニワトリから採血した。
（ｉｉ）経口投与
上記のＨＡタンパク質溶液のワクチンとしての効果を確認するために、上記ＨＡタンパク質溶液でマウスを免疫した。ＨＡ活性を８，１９２〜１６，３８４の間に調整した０．５mlのＨＡタンパク質溶液を、４週齢のマウス５匹（ｄｄＹ，♀）に、２回投与及び３回投与した。２回投与の場合は、初回接種当日、初回投与から１４日後に経口投与し、初回投与から２８日後にマウスから採血した。３回投与の場合は、初回接種当日、初回投与から１４日後、２１日後に経口投与し、初回投与から２８日後にマウスから採血した。【００５４】
（６）免疫したニワトリにより産生された抗体のＨＩ活性評価
（ｉ）静脈注射及び筋肉注射による投与
上記採血したニワトリの血液をそれぞれ、室温で放置し、その後室温で遠心分離することにより、ニワトリ血清を得た。各々のニワトリ血清の赤血球凝集抑制活性（ＨＩ活性）を、以下の方法で検討した。まず、９６ウェルプレートを用い、各ウェル２５μｌを含む、血清の１/２段階希釈列を作製した。次に、各ウェルに２５μｌの上記ＨＡタンパク質（ＰＢＳで８ＨＡに調製したもの）を加えた。プレートを室温で３０分間静置後、０．５％／ＰＢＳのニワトリ赤血球５０μｌを各ウェルに加えた。１時間後に、赤血球凝集パターンを観察し、赤血球の凝集がみられる最大の希釈倍率を、ＨＩ活性値とした。初回接種後２０日後の血清は、１２８のＨＩ活性を示し、３３日後の血清は、８，１９２のＨＩ活性を示した。
（ｉｉ）経口投与
上記採血したマウスの血液をそれぞれ、室温で放置し、その後室温で遠心分離することにより、マウス血清を得た。各々のマウス血清の赤血球凝集抑制活性（ＨＩ活性）を、上記ニワトリ血清の場合と同様の方法にて測定した。３回投与２１日後の血清は、１２８〜１６２４のＨＩ活性を示し、有意な抗体産生上昇を確認できた。本発明のＨＡタンパク質（ウイルス様粒子）は、経口ワクチンとしても十分機能することが明らかとなった。即ち、本発明のＨＡタンパク（ウイルス様粒子）は、胃液の条件下にさらされても免疫原性を保持することができ、３回経口接種後のマウス血清は、最終的に高いＨＩ活性を示した。ＨＡタンパク質（ウイルス様粒子）を３回経口投与した後のマウス血清の抗体価（ＨＩ活性）を下記表１に記載した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
（７）種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性の評価
初回接種４０日後のニワトリ血清を用いて、種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性の有無を検討した。Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−Ｑ／Ｆ１１９−３／１９９７（Ｈ５Ｎ３）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｌｅｇｏｋ／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｗｅｓｔ  Ｊａｖａ／２００９（Ｈ５Ｎ１）、Ｓｉｌｋｗｏｒｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ（本実施例において蛹で作成したＨＡタンパク）を用いて、上記と同様の条件でＨＩ活性を測定した。結果を図７に示す。ニワトリ血清は、全てのウイルスに対して、ＨＩ活性を示した。【００５７】
（８）ショ糖密度勾配によるＨＡタンパク質溶液の分画（ウイルス様粒子の分画）
ＨＡタンパク質溶液を、ショ糖密度勾配法により分画した。各分画液のＨＡ活性を、上記と同様の方法で検討した。その結果を図８に示す。天然のウイルスの１．１８ｇ／ｌの浮遊密度である分画はＨＡ活性を示さなかった。一方、分画２０〜３１において、ＨＡ活性が認められた。【００５８】
（９）電子顕微鏡によるＨＡタンパク質溶液分画の観察（ウイルス様粒子の観察）
上記のショ糖密度勾配の分画２０〜３１をプールしたサンプルを、電子顕微鏡で観察した。その結果を図９に示す。表面に長さ約１４ｎｍ（平均値）のＨＡタンパクのスパイクを密に有する球形で、粒子径が３０ｎｍ〜３００ｎｍであるウイルス粒子様構造が認められた。本実施例のＨＡタンパクのスパイクの密度は、インフルエンザウイルス粒子上のスパイク密度よりも高いものであった。また、図９に示す通り、ＨＡタンパクのスパイクはヘッド部分の形状が三角形の楔型であり、実際のウイルス上に存在するＨＡと同様に三量体を形成していることが示唆された。この形態学特徴が、従来のワクチンには見られなかった上記の強い免疫力に反映されていると考えられる。【００５９】
（１０）ウエスタンブロッティング解析によるＨＡタンパク質の確認
上記のショ糖密度勾配の分画２５のサンプルについて、ウェスタンブロッティング（１次抗体：抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体、２次抗体：抗マウスＩｇＧウサギポリクローナル抗体）を行い、分子量７３．１ＫＤのＨＡタンパク質を確認した（図６）。【００６０】
（１１）ＨＡタンパク質溶液分画の成分分析（ウイルス様粒子の成分分析）
上記ショ糖密度勾配により所得したＨＡタンパク質溶液分画について、タンパク量及び脂質量の測定を常法に従って行った。その結果、タンパク濃度が０．７５ｍｇ／ｍｌ、脂質濃度が０．２８ｍｇ／ｍｌであった。【００６１】
このように、トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１のＨＡタンパク質の活性量がボンビュクス・モリの蛹で高くなったのは、遺伝情報を背景にしたＤＮＡの設計変更と、これに基づく合成ＤＮＡの遺伝子操作が有益に働いた為ではないかと考えられる。更に、ボンビュクス・モリの蛹期を用いて目的遺伝子が高発現したために、得られたワクチンがウイルス粒子様構造を示したと考えられる。このように、遺伝情報を背景にして、ＤＮＡの設計変更と合成を利用した新しいワクチンの製造法は、今後、多領域で利用されていくものと考えられる。【００６２】
［実施例２］インフルエンザワクチン
インドネシアで２００８年に分離されたトリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子配列（配列番号９）より予測されたアミノ酸配列情報（配列番号１０）に基づき、実施例１と同様にインフルエンザウイルス用ワクチン開発用ＤＮＡを設計した（配列番号１２）。対応するアミノ酸配列（配列番号１１）を、図１０に示す。実施例１と同様に、上記開発用ＤＮＡを含む組換え体バキュロウイルスを、ボンビュクス・モリの蛹に摂取してＨＡタンパク質（ウイルス様粒子）を合成・回収し、ウェスタンブロットにより発現を確認した（図１１）。ＨＡ活性を評価したところ、蛹１頭当たりのＨＡ活性量は４１９,４３０となった。また、実施例１と同様にＨＡタンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００６３】
［実施例３］Ｃ型肝炎ウイルスワクチン
ボンビュクス・モリで産生するのに適したＣ型肝炎ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計を以下のように行った。即ち、Ｃ型肝炎ウイルスワクチンを開発するために、Ｃ型肝炎ウイルスの核（Ｃｏｒｅ）タンパク質−Ｅ１タンパク質−Ｅ２タンパク質の融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計した。ここで融合タンパク質を設計したのは、同時に発現させることによりウイルス粒子様タンパク質が合成できることを期待したからであった。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＣＫ２８１８５で登録されているＨＣＶ遺伝子のアミノ酸配列中の、Ｃｏｒｅタンパク質から、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質までのアミノ酸配列（配列番号１３）に、ＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号１４）。この融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号１５）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１２に示す。【００６４】
設計したコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２を作成した。【００６５】
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２を用いて組換え体バキュロウイルスを得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳化液を得た。得られたボンビュクス・モリの蛹乳化液をソニケーター（ＵＲ−２０Ｐ、トミー精工製）で５分間超音波処理後、ショ糖密度勾配遠心法（ショ糖濃度１０−５０％、１００,０００Ｇ、２４時間）により、Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を精製した。精製したＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質をウェスタンブロッティングによって確認した。図１３に示す様に、６０ｋＤａ付近にバンドが確認された。なお、タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定することが可能である。【００６６】
Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質が連結して発現したとすると８３ｋダルトン以上の分子量を示すことが予想され、従って６０ｋダルトンの分子サイズは  Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２が細胞内でプロテアーゼによるプロセッシングを受け成熟したＥ２が合成されたことが示唆された。この事実は、紛れもなく設計したワクチン用タンパク質が産生されたことを示すもので、タンパクのバンドの濃さから、Ｃ型肝炎用ワクチンが効率よく合成されたことがわかる。また、実施例１と同様にＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００６７】
［実施例４］トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のワクチン開発用ＤＮＡの設計及びワクチンの製造【００６８】
ＧｅｎＢａｎｋ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＪＮ２４４２４５で登録されている韓国で2010年に分離されたトリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡ遺伝子配列のアミノ酸配列情報（配列番号１６）に基づき実施例１と同様にインフルエンザウイルス用ワクチン開発用ＤＮＡを設計した（配列番号１８）。対応するアミノ酸配列（配列番号１７）を、図１４に示す。実施例１と同様にして、インフルエンザウイルス用ワクチン開発用ＤＮＡを組込んだバキュロウイルス組換え体を得、これをカイコのＢｍ−Ｎ細胞に感染させた。Ｂｍ−Ｎ細胞での組換えＨ７型トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７））ＨＡタンパク質の発現を確認するために、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図２２−１に示す。特異的バンドを矢印で示す。また、感染させたＢｍ−Ｎ細胞を、Ｈ７型トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）ＨＡに対するモルモット抗血清で染色したところ、鮮明に染色され、細胞に前記組換えＨＡタンパク質が発現していることが確認された（図２２−２、ｄ）。また、実施例１と同様に、上記開発用ＤＮＡを含む組換え体バキュロウイルスを、ボンビュクス・モリの蛹に摂取してＨＡタンパク質を合成・回収しウイルス様粒子を得た。このウイルス様粒子のそのＨＩ活性を評価し、上記のＨＡタンパク質のワクチンとしての効果を確認した。具体的には、上記ＨＡタンパク質溶液（ウイルス様粒子）をマウスに免疫した。即ち、ＨＡ活性を４，０９２〜８，１９２の間に調整した０．５mlのＨＡタンパク質溶液（ウイルス様粒子）を、４週齢（ｄｄＹ，♀）のマウス５匹に、２週間間隔で合計２回経口投与した。初回投与から２８日後のマウスから採血した。【００６９】
上記採血したマウスの血液をそれぞれ、室温で放置し、その後室温で遠心分離することにより、マウス血清を得た。各々のマウス血清の赤血球凝集抑制活性（ＨＩ活性）を、上記ニワトリ血清の場合と同様の方法にて測定した。２回投与１４日後の血清は、６４〜２５６のＨＩ活性を示し、有意な抗体価を確認できた。本発明のＨＡタンパク質（ウイルス様粒子）は、経口ワクチンとしても十分機能することが明らかとなった。即ち、本発明のＨＡタンパク（ウイルス様粒子）は、胃液の条件下にさらされても免疫原性を保持することができ、経口接種２回後のマウス血清は最終的に高いＨＩ活性を示した。結果を上記表１に合わせて記載した。
また、実施例１と同様にＨＡタンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができ、実施例１と同様の結果が得られた。【００７０】
［実施例５］日本脳炎ウイルスのワクチン開発用ＤＮＡの設計及びワクチンの製造
日本脳炎ウイルスは、主としてコガタアカイエカによって媒介される脳炎ウイルスで、現在は東南アジアやインド、中国地域で流行している。それを予防するため、ワクチンは同ウイルスに感染させたマウス脳が使用されてきたが、最近では培養細胞でのワクチン用ウイルスが培養されている。しかし、ワクチンの免疫力強化、副作用の削減、生産コストの低下を求めて新しいワクチン開発が求められ、品質の向上に大きな期待が寄せられている。【００７１】
そこで、本発明者らは、日本脳炎ウイルスワクチンを開発するために、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質発現のための遺伝子情報を設計した。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＢＱ５２６９１で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号１９）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる日本脳炎ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２０）。この日本脳炎ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２１）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１５に示す。設計した日本脳炎コドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ＪｅｖＥを作成した。実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ＪｅｖＥを用いてバキュロウイルス組換え体を得、これをカイコのＢｍ−Ｎ細胞に感染させた。Ｂｍ−Ｎ細胞でのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の発現を確認するために、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図２０−１に示す。７０ｋＤ付近に、ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅタンパク質のバンドが確認された。また、感染させたＢｍ−Ｎ細胞をＪＥＶのＥタンパク質に対する、蛍光標識したモノクローナル抗体で染色したところ、鮮明に染色され、細胞にＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質が発現していることが確認された（図２０−２、ｄ）。【００７２】
上記バキュロウイルス組換え体をボンビュクス・モリの蛹に接種した。接種後4日目にボンビュクス・モリ蛹乳化液を得た。得られたボンビュクス・モリの蛹乳化液をソニケーター（ＵＲ−２０Ｐ、トミー精工製）で５分間超音波処理後、ショ糖密度勾配遠心法（ショ糖濃度１０−５０％（ｗ／ｗ）、１００,０００Ｇ、２時間）により、ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質を精製した。精製したＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質をウェスタンブロッティングによって確認した。また、得られたＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の分画を電子顕微鏡で観察したところ、図２１に示す通りウイルス様粒子構造物が多数観察された。【００７３】
［参考例１］狂犬病ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計
狂犬病ウイルスは地球規模に分布し、多くの死亡危害が発生し、有効で安全な、そして安価なワクチン開発が国際的に求められているが、遅々として進んでいないのが現状である。そこで、もし、免疫力が強く、安全で、安価なワクチンが開発されれば、そのニーズは地球規模であると考える。現在使用されているワクチンは、ウサギやヤギ、マウスの脳由来のもので、それに加え、ヒト二倍体細胞、ニワトリ胚細胞が使用されている。今後のワクチン開発は、供給量とコストの面で安価で使用できるコンポーネントワクチンの開発が望まれ、カイコの利用によるコンポーネントワクチンの開発が成功すれば、その利用は世界的な規模になると考えられる。【００７４】
狂犬病ウイルスワクチンを開発するために、狂犬病ウイルスのＧタンパク質発現のための遺伝子情報を設計した。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＢＸ４６６５７で登録されているアミノ酸配列（配列番号２２）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる狂犬病ウイルスＧタンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２３）。この狂犬病ウイルスＧタンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２４）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１６に示す。設計した狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｒｖＧを作成する。実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｒｖＧを用いてバキュロウイルス組換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例と同様に超音波処理し生成する。精製した狂犬病ウイルスＧタンパク質を実施例１と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認する。タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定することができる。また、実施例１と同様に狂犬病ウイルスのＧタンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００７５】
［参考例２］西ナイルウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計
西ナイルウイルスは、アメリカ、東欧やヨーロッパに広がり、近い将来、日本への伝播も危惧されている。カ−トリ−カの生態系に加え、このサイクルからヒトへ、あるいはウマにも伝播していく。未だ利用できるワクチンは無いが、このワクチン開発は世界的に急がれている。ワクチンの研究開発は、アメリカやヨーロッパでも盛んに行われているが、未だ成功していない。そこで、西ナイル熱ワクチンを、安価で大量に生産できれば、世界的に利用できる。【００７６】
西ナイルウイルスワクチンを開発するために、西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＡＴ９５３９０で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号２５）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２６）。この西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２７）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１７に示す。設計した西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｗｎｖｐＭＭＥを作成する。実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｗｎｖｐＭＭＥを用いてバキュロウイルス組換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例と同様に超音波処理し生成した。精製した西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質を実施例と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認することができる。タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定することができる。また、実施例１と同様に西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００７７】
［参考例３］ＭＥＲＳコロナウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計
ＭＥＲＳコロナウイルスワクチンを開発するために、ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＧＮ５２９３６で登録されているアミノ酸配列（配列番号２８）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる西ナイルウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２９）。このＭＥＲＳコロナウイルススパイクＧタンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質の核酸配列を設計した（配列番号３０）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１８に示す。設計したＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｍｃｖｓＧを作成する。実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｍｃｖｓＧを用いてバキュロウイルス組換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例と同様に超音波処理し生成した。精製したＭＥＲＳコロナウイルススパイクＧタンパク質を実施例と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認することができる。タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定することができる。また、実施例１と同様にＭＥＲＳコロナウイルススパイクＧタンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００７８】
［参考例４］口蹄疫ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計
本発明者らは、口蹄疫ウイルスワクチンを開発するために、口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＨＶ９４００３０で登録されている核酸配列から予想される、アミノ酸配列中のＶＰ４、Ｖｐ２、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質のアミノ酸配列をＮ末端側からＣ末端側にむけて結合したアミノ酸配列（配列番号３１）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる口蹄疫ウイルスのアミノ酸配列を得た（配列番号３２）。この口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号３３）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１９に示す。設計した口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｆｍｄｖＰを作成する。実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｆｍｄｖＰを用いてバキュロウイルス組換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例と同様に超音波処理し生成した。精製した口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質を実施例と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認し、タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定することができる。また、実施例１と同様に口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質を分画し、ウイルス様粒子の成分分析、及び電子顕微鏡によるウイルス様粒子の確認を行うことができる。【００７９】
本発明は、以下の特徴及び顕著な効果を奏する：
（１）ボンビュクス・モリ細胞に最適化したＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅを用いて遺伝子配列を設計し、ベクターに組み込んでいるため、組換えウイルス膜タンパク質のボンビュクス・モリ細胞での発現量が、ウイルス遺伝子由来の配列を用いたものより顕著に高くなる。（２）得られる組換えウイルス膜タンパク質は、ボンビュクス・モリ由来の脂質を含む成分からなる球状外殻の表面にスパイクとして密に突き刺さった構造のウイルス様粒子を構成する。また、その粒径は３０ｎｍ〜３００ｎｍであり実際のウイルスと同様のサイズである。そのため、本発明のウイルス様粒子をワクチンとして用いた場合の免疫原性（免疫原性）著しく高く、元のウイルスと同程度とすることができる。
（３）ボンビュクス・モリ細胞を用いているため、糖鎖構造は複雑でなく、糖鎖による抗原性のマスキング作用は非常に弱い。そのため、ワクチンとしての免疫原性（抗体価上昇）は、鶏卵で増殖させたウイルス由来の精製ＨＡタンパク質の２０５〜４１０倍と、著しく高い。
（４）本発明のウイルス様粒子は、人工合成ハイブリッドＤＮＡを用いて作成された組換えウイルス膜タンパク質と、ボンビュクス・モリ由来の脂質のみを実質的に含み、他のウイルス構成タンパク質を含まない。免疫原性の高い組換えウイルス膜タンパク質の比率が高いため、本発明のウイルス粒子は、ワクチンとして用いた場合に、著しく高い免疫原性を実現することができる。このように組換えウイルス膜タンパクのみを表面に有するウイルス様粒子（人工粒子）は世界でも他に例がない。
（５）本発明のウイルス様粒子を含むワクチンは、注射による接種だけでなく、経口接種でも十分に高い抗体価を誘導できる。 
（６）人工合成したＤＮＡを用いることで、危険なウイルスを取り扱うことなく、安全に、危険なウイルスに対するワクチンを製造することができる。危険なウイルスを取り扱わないため、Ｐ４、Ｐ３施設等を必要としない。
（７）ワクチンとして用いるウイルスタンパクについて、バイオインフォマティクスに基づき、病原性の低いアミノ酸配列を設計できる。それにより、安全性の高いワクチンを製造することができる。
（８）アミノ酸配列より遺伝子配列を求めており、アミノ酸配列では、例えばＨＡタンパク質においては、強毒部位とＦＬＡＧタグを除いては、元のアミノ酸配列と全く同じであるが、遺伝子配列にすると、そのホモロジーは７７％に過ぎない（例えば図５参照）ため、ウイルス遺伝子とは容易に区別が可能である。なお、ＦＬＡＧタグを用いることで、発現の確認や精製が容易となる。
（９）組換えウイルス膜タンパク質は、Ｃ末にＦＬＡＧタグ配列をつけているため、万一、ウイルスが細胞に感染したとしても、ウイルスのＲＮＰあるいはＭ１タンパクと相互作用することはないので安全性にも優れる。
（１０）ワクチンの製造を鶏卵で行う場合には、大量の鶏卵が必要となるのに対して、ボンビュクス・モリを用いることで上記のような高免疫原性のワクチンが得られるため、必要なボンビュクス・モリの頭数を抑えることができ、低コスト（鶏卵を用いる方法の１／１０程度）とすることができる。
（１１）ワクチンの製造を発育鶏卵で行う場合と比較して、ボンビュクス・モリを用いる場合には生産に必要な期間を大幅に短縮することができる。
（１２）本発明のウイルス様粒子は免疫原性が高いため、ワクチンとして用いる際にアジュバントを添加する必要はなく、アナフィラキシーショック、アレルギー等の副作用を低減で、安全性にも優れる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によると、ウイルス感染症を予防するための高免疫原性のワクチンを、より短期間に低コストで大量生産することができる。また、ボンビュクス・モリを用いることで、卵アレルギーの副作用の問題も解決することができ、安全性にも優れる。さらに、本発明のウイルス様粒子は、経口接種によっても十分高い免疫原性を示すものである。そのため、本発明のウイルス様粒子及びその製造方法、並びにそれを含むワクチンは、ウイルス感染症の予防のためのワクチン生産に好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  トリインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  トリインフルエンザウイルスのＨＡアミノ酸配列
配列番号３：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスの改変ＨＡアミノ酸配列
配列番号４：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号５：ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号６：ＦＬＡＧタグＤＮＡ配列
配列番号７：高病原性アミノ酸配列
配列番号８：低病原性アミノ酸配列
配列番号９：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１０：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのＨＡアミノ酸配列
配列番号１１：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスの改変ＨＡアミノ酸配列
配列番号１２：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１３：Ｃ型肝炎ウイルスのＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号１４：Ｃ型肝炎ウイルスのＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質アミノ酸配列（ＦＬＡＧタグ付き）配列
配列番号１５：Ｃ型肝炎ウイルスのコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１６：トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のＨＡアミノ酸配列
配列番号１７：トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）の改変ＨＡアミノ酸配
配列番号１８：トリインフルエンザウイルスＡ／ｄｕｃｋ／Ｋｏｒｅａ／Ａ７６／２０１０（Ｈ７Ｎ７）のコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１９：日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号２０：日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２１：日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２２：狂犬病ウイルスのＧタンパク質アミノ酸配列
配列番号２３：狂犬病ウイルスのＧタンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２４：狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２５：西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号２６：西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２７：西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２８：ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質アミノ酸配列
配列番号２９：ＭＥＲＳコロナウイルスのスパイクＧタンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号３０：ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイクＧタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号３１：口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号３２：口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号３３：口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１１】
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【図１３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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