(57)【要約】  大腸がんの転移又は再発のリスクを、高い精度で、客観的かつ迅速に予測する手法の提供。  大腸がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の大腸がんの転移又は再発リスクを評価する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の大腸がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜４４３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜４４３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜２５３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜２５３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、大腸がんの再発リスクを評価する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、配列番号２５４〜２８８で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２５４〜２８８で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、大腸がんの肝転移を評価する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡが、配列番号２８９〜４４３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２８９〜４４３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、大腸がんのリンパ節転移を評価する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜２３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜２３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ２であって術後化学療法を行っていない女性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、配列番号２４〜３７で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２４〜３７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ２であって術後化学療法を行っていない男性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、配列番号３８〜６３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号３８〜６３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない女性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡが、配列番号６４〜１７９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号６４〜１７９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない男性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡが、配列番号１８０〜２１７で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１８０〜２１７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った女性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、配列番号２１８〜２５３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２１８〜２５３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、進行度ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った男性大腸がん患者における大腸がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが、配列番号２５４〜２６２で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２５４〜２６２で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、女性大腸がん患者における大腸がんの肝転移を評価する、請求項４記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが、配列番号２６３〜２８８で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２６３〜２８８で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、男性大腸がん患者における大腸がんの肝転移を評価する、請求項４記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡが、配列番号２８９〜２９９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号２８９〜２９９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、女性大腸がん患者における大腸がんのリンパ節転移を評価する、請求項５記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡが、配列番号３００〜４４３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号３００〜４４３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、男性大腸がん患者における大腸がんのリンパ節転移を評価する、請求項５記載の方法。
【請求項１６】
配列番号３８〜６３で示される塩基配列が、配列番号６０、配列番号６１、配列番号５７及び配列番号５６で示される塩基配列である、請求項８記載の方法。
【請求項１７】
配列番号６４〜１７９で示される塩基配列が、配列番号１３４、配列番号１１１、配列番号６５、配列番号９４、配列番号１３７及び配列番号１７７で示される塩基配列である、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２５４〜２６２で示される塩基配列が、配列番号２６１、配列番号２５８、配列番号２６２及び配列番号２６０で示される塩基配列である、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２６３〜２８８で示される塩基配列が、配列番号２８３、配列番号２８４又は配列番号２７８で示される塩基配列である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
配列番号３００〜４４３で示される塩基配列が、配列番号３３０、配列番号３４８、配列番号４２２、配列番号４０６、配列番号３５３、配列番号３６５、配列番号３３９、配列番号３９５、配列番号３７２、配列番号３１１、配列番号３６８、配列番号３８９、配列番号３５０、配列番号３５６、配列番号３８３、配列番号３４９、配列番号３６３、配列番号３４４、配列番号４３３、配列番号４０８、配列番号３７１、配列番号３０７、配列番号３５７、配列番号３７０、配列番号３２７、配列番号４１８、配列番号４３４、配列番号３８５、配列番号３４０、配列番号３９０、配列番号４４０、配列番号４３０、配列番号３２５、配列番号３２８、配列番号３７５、配列番号４２３、配列番号４０７、配列番号３０５、配列番号３３３、配列番号４１１、配列番号３６２、配列番号３９３、配列番号３６４、配列番号３９９、配列番号４２４、配列番号３５４、配列番号４４１、配列番号３８２、配列番号３７９、配列番号３６１、配列番号３２３、配列番号３０４、配列番号４３１、配列番号４０４、配列番号４２６、配列番号４１５、配列番号３７７、配列番号３６０、配列番号４３５、配列番号４１９、配列番号３３７、配列番号３６７、配列番号４００、配列番号４０５、配列番号３９１、配列番号３７８、配列番号３３５、配列番号３８８、配列番号３１３、配列番号４０２、配列番号３８６、配列番号３１９、配列番号３１８、配列番号４０９、配列番号４２９、配列番号３２１、配列番号３０８、配列番号３７３、配列番号３１２、配列番号３４２、配列番号３８１、配列番号３９６、配列番号４１６、配列番号３４３、配列番号３５１、配列番号４２１、配列番号４１３、配列番号３６６、配列番号３２４、配列番号３９４、配列番号４０１、配列番号４３７、配列番号３８０、配列番号４３９、配列番号４１２、配列番号３９８、配列番号３１０、配列番号４３８、配列番号４２８、配列番号３３６、配列番号４２５、配列番号３９７、配列番号３２９及び配列番号４１７で示される塩基配列である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
配列番号３８〜６３で示される塩基配列が、下記１）〜２）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項８記載の方法。
【表１】
2015115544.tif 000037
【請求項２２】
配列番号６４〜１７９で示される塩基配列が、下記１）〜１４）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項９記載の方法。
【表２】
2015115544.tif 000038
【請求項２３】
配列番号２６３〜２８８で示される塩基配列が、下記１）〜１０）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項１３記載の方法。
【表３】
2015115544.tif 000039
【請求項２４】
配列番号２８９〜２９９で示される塩基配列が、下記１）〜３）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項１４記載の方法。
【表４】
2015115544.tif 000040
【請求項２５】
配列番号３００〜４４３で示される塩基配列が、下記１）〜５３）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項１５記載の方法。
【表５】
2015115544.tif 000041
【請求項２６】
さらに前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを対照レベルと比較する工程を含む請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
さらに前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを閾値レベルと比較する工程を含む請求項１〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
発現産物の発現レベルの測定が、転写産物の量又は翻訳産物の量を測定することによって行われる、請求項１〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ又はＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する請求項１〜２８のいずれか１項記載の方法に用いる大腸がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キット。
【請求項３０】
転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、大腸がんの転移又は再発のリスクを評価するためのマーカーとしての使用。
【請求項３１】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜４４３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜４４３で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、請求項３０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び参照による援用）
本出願は、２０１４年１月３１日に出願した日本国特願２０１４−０１７９４５の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書において参照として援用される。
また、本明細書に引用される全ての文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを認めるものと解釈されてはならない。【０００２】
本発明は、大腸がんの転移又は再発のリスクを分子レベルで評価する手法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸がんは大腸（盲腸、結腸、直腸）に発生するがん腫であり、部位別にそれぞれ盲腸がん、結腸がん、直腸がんと称されている。大腸がんは肝臓や周囲のリンパ節に転移することも多く、転移の有無は、生命予後に重要な影響を及ぼすとともに抗がん剤や外科手術などの治療選択に大きな影響を及ぼす。そのため、大腸がんは、腫瘍の大きさと周辺組織への浸潤度およびリンパ節と他臓器への転移による分類法（ＴＮＭ分類）により細かく分類され、また、ＴＮＭ分類の結果を基に進行度をステージ０〜ステージ４に分類している。【０００４】
手術が必要な大腸がんの手術後の治療については、例えば、ステージ２の大腸がんの治療では再発リスクが小さいとして化学療法を追加しない場合もあった。しかしながら、その後に一部の症例は再発する。また、周囲リンパ節に転移を認めるステージ３の大腸がんの再発リスクは、がん細胞が転移したリンパ節の部位と数で評価され、それを指標とした分類に基づく治療がなされている。そしてその治療においては、術後の化学療法が推奨され、同じステージ３であってもＴＮＭ分類の違いで異なる化学療法を行う試みがなされているが、化学療法を受けなくても再発せず予後良好の場合があるため術後に化学療法を希望しない患者もいる。しかしながら、その一部は再発するなど、治療方法の選択にばらつきがあった。また、同じグループに分類され同じ治療を受けた患者でも再発の有無がある。【０００５】
また、大腸がんの治療では手術後の再発に速やかに対応するため、一定の間隔で診察・検査（フォローアップ）を行うが、再発の有無を予測するよい基準がないため、取りこぼしを少なくしようとするとフォローアップの回数が多くなり、患者、医療機関、国費で賄う保険制度ともに負担となっているのが現状である。【０００６】
また、肝転移もリンパ節転移も病理組織診断で最終診断がされる現在の画像診断技術では、微小な肝転移やリンパ節転移を特定することは困難であった。そのため、手術中もしくは手術後の病理組織診断でなければ、リンパ節転移の程度は判明しない。【０００７】
一方、近年、遺伝子の発現状態の比較によって、ある状態にある細胞で発現している遺伝子を網羅的に解析し、その種類や発現レベルを細胞間で比較する、遺伝子の発現解析(expression analysis)ための手法が開発されている。例えば、転写開始部位の遺伝子の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析するＲＮＡ−ｓｅｑ（非特許文献１）やＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression：非特許文献２）等が知られている。このうち、ＣＡＧＥ法は、ｍＲＮＡ等の長いキャップ付ＲＮＡを選択し、その５’末端を無作為かつ大量に配列決定することで転写開始点の活性を網羅的に定量化できるという特徴を有する。【０００８】
しかしながら、ヒトゲノムにおける転写開始領域の発現レベルと特定の疾患との関係についてはこれまでに全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63
【非特許文献２】Genome Res. 2011 Jul;21(7):1150-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、大腸がんの転移又は再発のリスクを、高い精度で、客観的かつ迅速に予測する手法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、手術によって得られる大腸がん組織のうち、再発があるものとないもの、肝転移があるものとないもの、及びリンパ節転移があるものとないものからＲＮＡを抽出し、ＣＡＧＥ解析法を用いて転写開始領域（Transcript Start Site；ＴＳＳ）付近の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の転写開始領域を含むＤＮＡの発現レベルが当該２群間で有意に異なり、これを指標として、「再発あり」と「再発なし」、「肝転移あり」と「肝転移なし」、又は「リンパ節転移あり」と「リンパ節転移なし」とを判別できることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）大腸がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の大腸がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
２）前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する１）の方法に用いる大腸がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キット。
３）転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、大腸がんの転移又は再発のリスクを評価するためのマーカーとしての使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、例えば、リンパ節転移の無い患者でも再発リスクの有無が迅速かつ的確に判断できるようになる。また、転移や再発の有無の予測を行うことができるので、転移や再発が予想される（再発リスクの高い）患者に対するきめ細かいフォローアップやフォローアップ回数の最適化と、必要に応じた適切な治療法（化学療法等）を実施することで予後の改善が見込まれる。また、本発明の方法を用いることにより、治療効果のばらつきが小さい最適な治療法を選択できる新たな分類法が確立できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）腸癌取扱規約第8版による進行度分類、（Ｂ）UICC 7th editionによる進行度分類
【図２】大腸癌取扱規約第8版とＴＮＭ分類の対照表
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、大腸がんとは、大腸（盲腸、結腸、直腸）に発生するがん腫を意味する。
【００１６】
本発明において、転移とは、大腸がんがリンパ節や他の臓器において増殖することを意味し、転移の評価とは、転移の有無又は転移能（大腸がんが多臓器へ転移して増殖する能力）の有無を評価又は測定することを意味する。好適には、肝転移又はリンパ節転移を評価又は測定することが挙げられる。
【００１７】
本発明において、「再発リスク」とは再発のしやすさを意味する。「再発」とは、生体から腫瘍を摘出して一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合、及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能等に左右される。
【００１８】
本発明における再発リスクの評価は、特に、ステージ２、ステージ３の患者の再発リスクを評価することに適し、より好ましくは、ステージ２であって術後化学療法を行っていない患者の再発リスク、ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った又は行わない患者の再発リスクを評価することに適する。
【００１９】
本明細書において示す進行度ステージは、大腸癌取扱規約第8版（大腸癌研究会（ＪＳＣＣＲ））の進行度分類によるステージ又はこれに相当するステージを意味するものとし、これに相当するステージとしては、例えば国際対がん連合（ＵＩＣＣ）によるＴＮＭ分類による進行度分類（UICC 7th edition）における同等のステージが挙げられる。参考までに、大腸癌取扱規約第8版による進行度分類と、UICC 7th editionによる進行度分類を図１に、大腸癌取扱規約第8版とTNM分類の対照表を図２に示す。
【００２０】
大腸癌取扱規約第8版による、ステージ２とは、がんが大腸の固有筋層を超えて漿膜下層や大腸壁の外にまで浸潤しているがリンパ節転移，遠隔転移が見られない状態を指し、ステージ３は、がんが大腸だけでなくリンパ節へと転移している状態で、さらにステージ３はａとｂに分けられる。ステージ３ａは、がんが大腸だけでなく傍直腸リンパ節あるいは中間リンパ節へと転移しているが、転移陽性のリンパ節が３つ以内のもので、ステージ３ｂはこれが４つ以上のもの、又は主リンパ節へ転移を認めるものを指す。
【００２１】
本発明において用いられる生体試料は、評価対象となる大腸がん患者から分離された大腸がん組織である。当該生体試料は、測定に供するために適宜調製・処理される。例えば試料を核酸レベルでの測定に供する場合はＲＮＡ抽出液が調製され、試料をタンパク質レベルでの測定に供する場合はタンパク質抽出液が調製される。
【００２２】
生体試料からＲＮＡを抽出する方法は、公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、ライフテクノロジーズ社製Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅキット、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ、同社製ＲＮｅａｓｙが例示できるが、これらのうちキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙキットが好適に用いられる。
【００２３】
本明細書において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。また、「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。従って、ＤＮＡには、２本鎖のゲノムＤＮＡ、１本鎖のｃＤＮＡや該ＤＮＡと相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ等が包含される。また、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００２４】
本発明において、配列番号１〜４４３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（転写開始領域とその下流に連続する１００塩基からなるヒトゲノムＤＮＡ）の転写産物は、実施例で示すとおり、１）ステージ２であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男・女）において、再発があった検体と再発がない検体、２）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男・女）において、再発があった検体と再発がない検体、３）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った大腸がん患者（男・女）において、再発があった検体と再発がない検体、４）大腸がん患者（男・女）において、肝転移がない検体と肝転移がある検体、５）大腸がん患者（男・女）において、リンパ節転移がない検体とリンパ節転移がある検体について、ＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression）解析法を用いて、ゲノム上の転写開始領域を含む下流１００ベース以上のＤＮＡの発現状態を網羅的に解析した結果、夫々の２群間でその発現レベル（転写活性）に有意な差異が認められたものである。具体的には、１）〜５）の検体のＲＮＡの転写活性について、「再発あり」又は「転移あり」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「再発なし」又は「転移なし」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用い、閾値としてＦＤＲ（false discovery rate）５％を設定し、抽出されたものである。
【００２５】
したがって、配列番号１〜４４３で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡ（以下、「配列番号１〜４４３における転写開始点を含むＤＮＡ」と称する）の（又はそれによってコードされる）発現産物（「本発明の発現産物」と云う）は、大腸がんの転移又は再発リスクを評価するためのバイオマーカーとなり得る。
より詳細には以下のとおりである。
【００２６】
１ｆ）配列番号１〜２３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ２であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）において、再発リスクを評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
１ｍ）配列番号２４〜３７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ２であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）において、再発リスクを評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現差物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
２ｆ）配列番号３８〜６３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）において、再発リスク評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号３８〜６２における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号６３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は再発リスクが高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
２ｍ）配列番号６４〜１７９における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）において、再発リスク評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
３ｆ）配列番号１８０〜２１７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った大腸がん患者（女性）において、再発リスク評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
３ｍ）配列番号２１８〜２５３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った大腸がん患者（男性）において、再発リスク評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
４ｆ）配列番号２５４〜２６２における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
大腸がん患者（女性）において、肝転移を評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも肝転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
４ｍ）配列番号２６３〜２８８における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
大腸がん患者（男性）において、肝転移を評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号２６３〜２８７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、肝転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号２８８における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は肝転移の可能性が高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
５ｆ）配列番号２８９〜２９９における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
大腸がん患者（女性）において、リンパ節転移を評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れもリンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
５ｍ）配列番号３００〜４４３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
大腸がん患者（男性）において、リンパ節転移を評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号３００〜４４２における転写開始点を含むＤＮＡは、リンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号４４３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物はリンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
【００２７】
本発明において、「転写開始領域」は、転写開始点を含む領域をいう。特定のプロモーターからの転写開始点は単一の塩基に限定されず、ゲノム上のプロモーターの下流の複数の位置に存在する塩基であり得る。これらの複数の転写開始点を含む領域を本明細書において転写開始領域と称する。より詳細には、転写開始領域は、複数の転写開始点のうち最も５’側に位置する転写開始点と最も３’側に位置する転写開始点との間の領域である。配列番号１〜４４３で示される塩基配列の各々において、転写開始領域は１位（５’末端）の塩基と３’末端から１０１番目の塩基とによって両端が規定される領域に相当する５’末端を形成する塩基領域である。換言すると、配列番号１〜４４３で示される塩基配列の各々には、転写開始領域と、転写開始領域中の最も３’側に位置する転写開始点に続く１００個の塩基が示されている。本明細書においては、斯かる転写開始領域を「配列番号１〜４４３において示される転写開始領域」とも称する。
【００２８】
配列番号１〜４４３において示される転写開始領域のゲノム上の位置、及びそれに関連する遺伝子情報等は後記表１〜２、表３−１〜３−２、表４−１〜４−２、表５、表６−１〜６−７、表７〜９及び表１０−１〜１０−６に示すとおりである。
【００２９】
本発明において、発現産物の発現レベルが測定されるＤＮＡは、配列番号１〜４４３で示される塩基配列における、転写開始領域中の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に続く１塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡである。
【００３０】
ここで、下流に続く塩基配列の塩基数は、発現産物を特定できる数であればよい。当該塩基数としては、例えば１塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上が挙げられる。また、当該塩基数としては、例えば１０塩基以下、１５塩基以下、２０塩基以下、２５塩基以下、３０塩基以下、４０塩基以下、５０塩基以下、１００塩基以下が挙げられる。
【００３１】
下流側の塩基は、ＣＡＧＥ法による測定の場合には特に必要ないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによる測定の際にはその精度を担保するために下流１００塩基程度までの何れかの部分を対象とすることができ、転写開始領域とその下流１００塩基からなるＤＮＡのうち、少なくとも２０塩基以上の長さのものであればゲノム全体を対象にした実験系であっても特定できる確率が高い。
【００３２】
また、当該ＤＮＡには、その発現産物が大腸がんの転移又は再発リスクを評価するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該ＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡも包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３の条件にて検索をした場合、配列番号１〜４４３に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましく９８％以上の同一性があることを意味する。
【００３３】
斯かる本発明の発現産物は、1種又は２種以上を適宜組み合わせてその発現レベルを把握することにより、大腸がんの転移又は再発リスクを評価することが可能である。
このうち、後記表１１〜１５に示す閾値を設定した場合に、特異度１００％・感度１００％で分類できるもの、すなわち、一つの発現レベルのみを以って確実な判別が可能なＤＮＡとして、以下のものが挙げられる。
【００３４】
前記、２ｆ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価における、配列番号６０、配列番号６１、配列番号５７又は配列番号５６における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、２ｍ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価における、配列番号１３４、配列番号１１１、配列番号６５、配列番号９４、配列番号１３７又は配列番号１７７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、４ｆ）大腸がん患者（女性）の肝転移の評価における、配列番号２６１、配列番号２５８、配列番号２６２又は配列番号２６０における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、４ｍ）大腸がん患者（男性）の肝転移の評価における、配列番号２８３、配列番号２８４又は配列番号２７８における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、５ｍ）大腸がん患者（男性）のリンパ節転移の評価における、
配列番号３３０、配列番号３４８、配列番号４２２、配列番号４０６、配列番号３５３、配列番号３６５、配列番号３３９、配列番号３９５、配列番号３７２、配列番号３１１、配列番号３６８、配列番号３８９、配列番号３５０、配列番号３５６、配列番号３８３、配列番号３４９、配列番号３６３、配列番号３４４、配列番号４３３、配列番号４０８、配列番号３７１、配列番号３０７、配列番号３５７、配列番号３７０、配列番号３２７、配列番号４１８、配列番号４３４、配列番号３８５、配列番号３４０、配列番号３９０、配列番号４４０、配列番号４３０、配列番号３２５、配列番号３２８、配列番号３７５、配列番号４２３、配列番号４０７、配列番号３０５、配列番号３３３、配列番号４１１、配列番号３６２、配列番号３９３、配列番号３６４、配列番号３９９、配列番号４２４、配列番号３５４、配列番号４４１、配列番号３８２、配列番号３７９、配列番号３６１、配列番号３２３、配列番号３０４、配列番号４３１、配列番号４０４、配列番号４２６、配列番号４１５、配列番号３７７、配列番号３６０、配列番号４３５、配列番号４１９、配列番号３３７、配列番号３６７、配列番号４００、配列番号４０５、配列番号３９１、配列番号３７８、配列番号３３５、配列番号３８８、配列番号３１３、配列番号４０２、配列番号３８６、配列番号３１９、配列番号３１８、配列番号４０９、配列番号４２９、配列番号３２１、配列番号３０８、配列番号３７３、配列番号３１２、配列番号３４２、配列番号３８１、配列番号３９６、配列番号４１６、配列番号３４３、配列番号３５１、配列番号４２１、配列番号４１３、配列番号３６６、配列番号３２４、配列番号３９４、配列番号４０１、配列番号４３７、配列番号３８０、配列番号４３９、配列番号４１２、配列番号３９８、配列番号３１０、配列番号４３８、配列番号４２８、配列番号３３６、配列番号４２５、配列番号３９７、配列番号３２９又は配列番号４１７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
【００３５】
また、少なくとも２つのＤＮＡの発現産物を用いる場合の好適な組み合わせ、すなわち上記転写開始領域から選択した２個のすべての組み合わせについて、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関する再発又は転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものとして、後記表１６〜２０に示すＤＮＡの発現産物が其々挙げられる。
【００３６】
尚、更なる精度向上を目的として、これらを適宜２セット若しくは３セット以上を組み合わせて用いることができる。また、斯かる２つのＤＮＡの組み合わせに加えて、配列番号１〜４４３における転写開始点を含むＤＮＡのうち、当該組み合わせとして示された以外のＤＮＡの発現産物と組み合わせてもよく、更には本発明の評価に寄与し得る範囲でそれ以外の任意の塩基配列からなるＤＮＡの発現産物を組み合わせてもよい。
【００３７】
本発明の発現産物としては、当該ＤＮＡから発現される転写産物及び翻訳産物が挙げられる。転写産物としては、具体的には、当該ＤＮＡから転写されて生じるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。また、翻訳産物としては、具体的には、当該ＲＮＡによってコードされるタンパク質が挙げられる。
【００３８】
発現産物の測定又は検出の対象には、そのＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等も包含される。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。
【００３９】
また、発現レベルとは、当該発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
【００４０】
発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロッ、トハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【００４１】
ここで、測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、配列番号１〜４４３で示される塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ−ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが生成される如く、上記検出物又は生成物が当該転写産物又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
【００４２】
具体的には、配列番号１〜４４３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
【００４３】
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、配列番号１〜４４３で示される塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
【００４４】
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
【００４５】
例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用する場合は、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出、測定する方法を用いることができる。
【００４６】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の本発明の発現産物（この場合、転写産物）が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【００４７】
また、ＤＮＡマイクロアレイを用いて検体中のｍＲＮＡの発現量を測定する場合、支持体に本発明の発現産物（この場合、転写産物）由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡ発現量を測定することができる。
【００４８】
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の発現産物（転写産物）の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５〜２５塩基からなる核酸が挙げられる。
【００４９】
ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)などに記載されている。
【００５０】
また、塩基配列を決定する方法としては、ＣＡＧＥ法、ＴＳＳ−ｓｅｑ法、ＲＮＡ−ｓｅｑ法、ＤＧＥ法、ＳＡＧＥ法等が挙げられるが、ＣＡＧＥ法が好適である。
【００５１】
ＣＡＧＥ法を用いて、発現レベルを測定する場合、後記実施例に記載した方法に準じて実施することができる。
【００５２】
また、配列番号１〜４４３における転写開始点を含むＤＮＡからコードされるタンパク質（すなわち、翻訳産物）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、１−ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２−ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
【００５３】
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物（この場合、翻訳産物）に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチドを検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
【００５４】
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
【００５５】
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。
【００５６】
斯くして、大腸がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中の本発明の発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて、大腸がんの転移又は再発リスクが評価される。具体的には、検出された本発明の発現産物の発現レベルを対照レベルと比較することによって評価される。
【００５７】
ここで、「対照レベル」とは、例えば、転移又は再発がない大腸がん患者から分離されたがん組織若しくは大腸がん患者から分離された正常組織における当該発現産物の発現レベル、又は大腸がんを発症していない健常人群における当該発現産物の発現レベルが挙げられる。
【００５８】
例えば、対象患者のがん組織の当該発現産物の発現レベルが、転移又は再発がない大腸がん患者から分離されたがん組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い（又は低い）場合には、当該患者の大腸がんは転移がない若しくは転移能が低い、又は再発リスクが低いと評価できる。
【００５９】
また、本発明における大腸がんの転移又は再発リスクの評価は、本発明の発現産物の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、対照レベルとして、例えば正常組織、転移又は再発がない大腸がん患者から分離されたがん組織或いは健常人の組織由来の当該発現産物の発現レベルに基いて標準値（閾値レベル）を設定し、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルを標準値と比較する（例えば±２Ｓ．Ｄ．の範囲を許容範囲とする）ことにより行うことができる。例えば、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルが閾値レベルより高い（又は低い）場合に、当該患者の大腸がんは転移がない若しくは転移能が低い、又は再発リスクが低いと評価できる。
【００６０】
本発明の方法に従い、必要に応じて他の方法（CT,MRIやPET-CTなど）との組み合わせで、提供された情報に基づいて、大腸がんの転移又は再発リスクが評価される。転移又は再発の可能性があると判断された場合には、例えば化学療法を行うことができる。一方、転移又は再発の可能性が低いと判断された場合には、これらの処置を行う必要はないと考えられる。
【００６１】
本発明の大腸がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の発現産物（転写産物）等と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の発現産物（翻訳産物）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
【００６２】
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００６３】
実施例１  大腸がんにおける「再発あり」と「再発なし」、「肝転移あり」と「肝転移なし」、又は「リンパ節転移あり」と「リンパ節転移なし」とを判別するための転写開始領域の抽出と検証
（１）検体試料の入手
大腸がんを含む大腸を外科的に切除した後，がん組織の一部を切り取ってすぐさまマイクロチューブに入れ液体窒素中で凍結後，-80度Ｃの超低温庫で保管し，適宜，解析に使用した。使用したサンプルは、以下のとおりである。
＜１ｆ：進行度ステージ２の女性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出・評価用サンプル２１検体（再発なし：１９検体、再発あり：２検体）
＜１ｍ：進行度ステージ２の男性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出・評価用サンプル４０検体（再発なし：３３検体、再発あり：７検体）
＜２ｆ：進行度ステージ３ａ又は３ｂの女性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル６検体（再発なし：４検体、再発あり：２検体）
・検証用サンプル３検体（再発なし：２検体、再発あり：１検体）
＜２ｍ：進行度ステージ３ａ又は３ｂの男性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル８検体（再発なし：７検体、再発あり：１検体）
・検証用サンプル３検体（再発なし：２検体、再発あり：１検体）
＜３ｆ：進行度ステージ３ａ又は３ｂの女性であって術後化学療法を行った大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出・評価用サンプル２５検体（再発なし：１７検体、再発あり：８検体）
＜３ｍ：進行度ステージ３ａ又は３ｂの男性であって術後化学療法を行った大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出・評価用サンプル３８検体（再発なし：３０検体、再発あり：８検体）
＜４ｆ：肝転移あり又は肝転移なしの女性の大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル８検体（肝転移あり：３検体、肝転移なし：５検体）
・検証用サンプル３検体（肝転移あり：１検体、肝転移なし：２検体）
＜４ｍ：肝転移あり又は肝転移なしの男性の大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル９検体（肝転移あり：３検体、肝転移なし：６検体）
・検証用サンプル３検体（肝転移あり：１検体、肝転移なし：２検体）
＜５ｆ：リンパ節転移あり又はリンパ節転移なしの女性の大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル６検体（リンパ節転移あり：２検体、リンパ節転移なし：４検体）
・検証用サンプル３検体（リンパ節転移あり：１検体、リンパ節転移なし：２検体）
＜５ｍ：リンパ節転移あり又はリンパ節転移なしの男性の大腸がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル８検体（リンパ節転移あり：３検体、リンパ節転移なし：５検体）
・検証用サンプル３検体（リンパ節転移あり：１検体、リンパ節転移なし：２検体）【００６４】
（２）試料の保存・調製
摘出された組織片は、適宜冷凍処理されて−８０℃で保存した。保存組織片は、２ｍＬマイクロチューブに組織片を５０ｍｇ以下になるように入れてキアゲン社製ＱＩＡｚｏｌを添加して、ジルコニアビーズを１個入れて密閉し、キアゲン社製ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて浸透処理により破砕した。【００６５】
（３）ＲＮＡの調製
破砕・抽出処理を行った試料は、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔにより、添付されたプロトコルに従ってＲＮＡ調製を行った。調製後のＲＮＡは、分光高度計による紫外吸収（２３０、２６０、２８０ｎｍ）を測定して、２６０／２３０、２６０／２８０比を算出し、そのＲＮＡの質を検定した。また、アジレント社製ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ｎａｎｏ  ｃｈｉｐにより電気泳動を行い、ＲＮＡ分解度を示すＲＩＮ値を算出して、ＲＮＡの分解度合いを検定した。【００６６】
（４）ＣＡＧＥライブラリー調製
精製ＲＮＡを５μｇ用意し、非増幅非タグ化ＣＡＧＥ法（細胞工学別冊  次世代シークエンサー目的別アドバンストメソッド」、菅野純夫、鈴木穣監修、学研メディカル秀潤社、2012年09月19日発行」内、第３章３“網羅的プロモーター解析（イルミナシーケンサーを用いた非増幅ＣＡＧＥ法）”参照）により、ＣＡＧＥライブラリーを調製した。具体的には、精製ＲＮＡを逆転写反応に供して精製後、過ヨウ素酸ナトリウムによりリボースのジオールを参加してアルデヒド化し、ビオチンヒドラジドを添加してアルデヒド基にビオチンを付加した。ＲＮａｓｅＩにより一本鎖ＲＮＡ部分を消化・精製後、アビジン磁気ビーズによりビオチン化されたＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖のみをビーズ表面に結合させ、ＲＮａｓｅＨ消化及び熱処理によりｃＤＮＡを遊離させて回収した。回収したｃＤＮＡの両端にシーケンスに必要なアダプターを連結させた後、イルミナ社製ＨｉＳｅｑ２５００によりシーケンスを行った。なお、本工程において精製・緩衝液置換等に用いるＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター社製）の標準的な条件では、二本鎖の場合で１００塩基以上の長さの核酸が回収される条件であり、これを採用した本工程により生産されるＣＡＧＥライブラリーは１００塩基以上の鎖長をもつ二本鎖ＤＮＡからなる。【００６７】
（５）ＲＮＡ発現解析
ｉ）リファレンス転写開始領域の準備
ヒトの初代培養細胞や細胞株、さらに組織等を含め合計約１０００ものヒトサンプルについて転写開始点の活性がゲノムワイドに測定されたプロファイルするプロジェクトである「ＦＡＮＴＯＭ５」（論文投稿中）において同定された転写開始領域のうち、ヒトリファレンスゲノムｈｇ１９上に定義された約１８万の転写開始領域をリファレンス転写開始領域とした。【００６８】
ｉｉ）転写活性の定量
シーケンシングにより得られたリードとヒトのリファレンスゲノム(hg19)のアラインメントをbwa(Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60)を用いて行った。マッピングクオリティが20以上、かつアラインメントの開始位置が、リファレンス転写開始領域内に位置するようなアラインメントだけを選択し、各転写開始領域ごとのリード数を数え上げた。各ライブラリーの総リード数と、RLE(Genome Biol. 2010;11(10):R106)法により推定されたライブラリサイズを用いて、カウントを100万あたりのリード数(counts per million)に変換する。【００６９】
（６）結果
（６−１）
１ｆ：ステージ２であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価
１ｍ：ステージ２であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価
３ｆ：ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価
３ｍ：ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行った大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価【００７０】
（Ａ）活性の異なる転写開始領域の抽出
上記で定量された、転写開始領域抽出・評価用検体での転写活性について、「再発なし」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「再発あり」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用いて行った。すなわち、二群間で発現量の平均が異なるかどうか（発現量の平均が等しいことを帰無仮説とし、この帰無仮説が真であることを仮定した場合、測定結果が偶然に起きる確率を計算する）を統計的に検定するものである。閾値としてＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）５％を設定したところ、これよりも小さな転写開始領域を含むＤＮＡを夫々同定した（表１〜２、表３−１〜３−２及び表４−１〜４−２）。この基準は、該当する閾値により抽出される候補のうち９５％は真に発現差があると統計的に推定されたものであり、通常広く使われるＰ値（発現差が無いことを仮定した場合に偶然起きる確率）を５％とする場合よりも厳しい基準である。【００７１】
【表１】
2015115544.tif 000002
【００７２】
【表２】
2015115544.tif 000003
【００７３】
【表３−１】
2015115544.tif 000004
【００７４】
【表３−２】
2015115544.tif 000005
【００７５】
【表４−１】
2015115544.tif 000006
【００７６】
【表４−２】
2015115544.tif 000007
【００７７】
（Ｂ）表１〜２、表３−１〜３−２及び表４−１〜４−２で示される転写開始領域を用いた再発有無の分類
転写開始領域抽出・評価用検体を三分割（検体群ａ，ｂ，ｃ）し、２／３の検体（検体群ｂ，ｃ）における表１〜２、表３−１〜３−２及び表４−１〜４−２の各発現量を説明変数、その再発有無を被説明変数として一般化線形モデルの一種であるロジスティック回帰モデルを構成する。残り１／３（検体群ａ）の検体における表１〜２、表３−１〜３−２及び表４−１〜４−２の各発現量を、構成したモデルに当てはめることで再発有無の予測を行う。同様の予測を検体群ｂ，検体群ｃについて行うことで、すべての検体に関する予測を、それを含まない検体群から行った。
その結果を再発有無と比較したところ、夫々以下の正答率を得ることができた。
（1f）進行度ステージ２の女性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者の再発リスクの評価：正答率：約90％
（1m）進行度ステージ２の男性であって術後化学療法を行っていない大腸がん患者の再発リスクの評価：正答率：約85％
（3f）進行度ステージ３ａまたは３ｂの女性であって術後化学療法を行った大腸がん患者の再発リスクの評価：正答率：約72％
（3m）進行度ステージ３ａまたは３ｂの男性であって術後化学療法を行った大腸がん患者の再発リスクの評価：正答率：約90％【００７８】
（６−２）
２ｆ：ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価
２ｍ：ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価
４ｆ：大腸がん患者（女性）の肝転移の評価
４ｍ：大腸がん患者（男性）の肝転移の評価
５ｆ：大腸がん患者（女性）のリンパ節転移の評価
５ｍ：大腸がん患者（男性）のリンパ節転移の評価【００７９】
（Ａ）活性の異なる転写開始領域の抽出
上記で定量された、転写開始領域抽出・評価用各サンプルでの転写活性について、「再発あり」及び「再発なし」、「肝転移あり」及び「肝転移なし」、又は「リンパ節転移あり」及び「リンパ節転移なし」の夫々から得られた各臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用いて行った。すなわち、二群間で発現量の平均が異なるかどうか（発現量の平均が等しいことを帰無仮説とし、この帰無仮説が真であることを仮定した場合、測定結果が偶然に起きる確率を計算する）を統計的に検定するものである。閾値としてＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）５％を設定したところ、これよりも小さな転写開始領域を含むＤＮＡを夫々同定した（表５、表６−１〜６−７、表７〜９及び表１０−１〜１０−６）。この基準は、該当する閾値により抽出される候補のうち95%は真に発現差があると統計的に推定されたものであり、通常広く使われるP値(発現差が無いことを仮定した場合に偶然起きる確率)を５%とする場合よりも厳しい基準である。【００８０】
【表５】
2015115544.tif 000008
【００８１】
【表６−１】
2015115544.tif 000009
【００８２】
【表６−２】
2015115544.tif 000010
【００８３】
【表６−３】
2015115544.tif 000011
【００８４】
【表６−４】
2015115544.tif 000012
【００８５】
【表６−５】
2015115544.tif 000013
【００８６】
【表６−６】
2015115544.tif 000014
【００８７】
【表６−７】
2015115544.tif 000015
【００８８】
【表７】
2015115544.tif 000016
【００８９】
【表８】
2015115544.tif 000017
【００９０】
【表９】
2015115544.tif 000018
【００９１】
【表１０−１】
2015115544.tif 000019
【００９２】
【表１０−２】
2015115544.tif 000020
【００９３】
【表１０−３】
2015115544.tif 000021
【００９４】
【表１０−４】
2015115544.tif 000022
【００９５】
【表１０−５】
2015115544.tif 000023
【００９６】
【表１０−６】
2015115544.tif 000024
【００９７】
（Ｂ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（１）
上記（Ａ）で同定された転写開始領域のうち、一つの発現レベルのみを用いて転移の有無、又は再発の有無を分類できるかどうかを考える。それぞれについて、何らかの閾値を設定することで、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できることを確認した。以下に、その閾値の例を示す（ある群における最大値の方が、その他の群における最小値よりも小さい場合、これらの平均を表１１〜１５に示している）。２ｆ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【００９８】
【表１１】
2015115544.tif 000025
【００９９】
２ｍ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【０１００】
【表１２】
2015115544.tif 000026
【０１０１】
４ｆ）大腸がん患者（女性）の肝転移の評価のためのＤＮＡ【０１０２】
【表１３】
2015115544.tif 000027
【０１０３】
４ｍ）大腸がん患者（男性）の肝転移の評価のためのＤＮＡ【０１０４】
【表１４】
2015115544.tif 000028
【０１０５】
５ｍ）大腸がん患者（男性）のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【０１０６】
【表１５】
2015115544.tif 000029
【０１０７】
（Ｃ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（２）
上記で同定された転写開始領域の発現レベルのうち、複数を用いて転移の有無、又は再発の有無を分類できるかどうかを考える。例としてここでは、一般化線形モデルの一種であるロジスティック回帰モデルを構成することを考える。これは、再発又はリンパ節転移の有無を示す従属変数（Ｙ）を、転写開始領域の発現レベルである説明変数（Ｘｉ、上記ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎの対数をとったもの）で確率的に予測することを考える場合、最もシンプルなモデルの一つである。【０１０８】
上記の転写開始領域から選択した二個のすべての組み合わせについて、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関する再発又はリンパ節転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものを選択した（表１６〜２０）。【０１０９】
ここでは、機械学習器の中でも最も単純なものの一つであるロジスティック回帰モデルを採用しているが、当該転写開始領域の発現を測定する方法や、他の遺伝子等の発現レベルや遺伝子型との組み合わせ等によって、他の数理モデルを適切に利用することで、より頑健な予測が可能になる。２ｆ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（女性）の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【０１１０】
【表１６】
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【０１１１】
２ｍ）ステージ３ａ又は３ｂであって術後化学療法を行っていない大腸がん患者（男性）の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【０１１２】
【表１７】
2015115544.tif 000031
【０１１３】
４ｍ）大腸がん患者（男性）の肝転移の評価のためのＤＮＡ【０１１４】
【表１８】
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【０１１５】
５ｆ）大腸がん患者（女性）のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ
【表１９】
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【０１１６】
５ｍ）大腸がん患者（男性）のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【０１１７】
【表２０】
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【０１１８】
実施例２
実施例１で用いた検体とは別の手術摘出検体、女性５５検体（リンパ節転移あり２６検体、リンパ節転移なし２９検体）、男性９１検体（リンパ節転移あり３８検体、リンパ節転移なし５３検体）それぞれを用いて、実施例１と同様に、ＣＡＧＥライブラリーを調製してリンパ節転移ありの群とリンパ節転移なしの群で活性の異なる転写開始領域を抽出した。その結果、女性について配列番号２９０で示される転写開始領域の転写活性レベルが、男性について配列番号３０４、３０９、３１１、３１７、３２０、３４３、３４７、３５１、３６９、３７２、３９６、４００、４０５、４２６及び４４１で示される転写開始領域の転写活性レベルが、それぞれ転移あり／なしの群の間で優位に異なることが確認された（表２１、表２２）。【０１１９】
【表２１】
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【０１２０】
【表２２】
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【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明によれば、術前又は術中に採取した大腸がんの原発巣を調べることで、大腸がんの転移又は再発リスクの判断や予測を、客観的に行うことができる。これにより、医療分野や臨床検査分野へ貢献が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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