(57)【要約】【課題】  生理活性ペプチドをローディングした安定な生体注入用組成物の提供【解決手段】  式（Ｉ）で表されるトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドを含んでなる組成物：    ＣＮＲ−ＰＥＧ−ＣＮＲ      （Ｉ）  式中、  ＣＮＲは、独立して、少なくとも１つのアミノ基を含有する連結基を介してポリマー主鎖に結合する環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントであり、  ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントである。
2014199982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表されるトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドを含んでなる組成物：
ＣＮＲ−ＰＥＧ−ＣＮＲ      （Ｉ）
式中、
ＣＮＲは、独立して、少なくとも１つのアミノ基（−ＮＨ−）を含有する連結基を介してポリマー主鎖に結合する環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントであり、該ＣＮＲの未結合末端は独立して、水素原子、アリールチオカルボニルチオ、アルキルチオカルボニルチオ、アルコキシチオカルボニルチオおよびスルファニル基からなる群より選ばれる原子または基を末端基とすることができ、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントである。
【請求項２】
環状ニトロキシドラジカルが、ｏ−またはｐ−フェニレン−（Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ）ｐ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−で表される連結基であって、ｐは１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である連結基を介してポリマー主鎖に結合しており、かつ、環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれ、
ここで、ポリマー主鎖が重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖にフェニレンの未結合末端が結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式（ＩＩ）で表されるトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドを含んでなる組成物：
【化１】
2014199982.tif 000012
式中、
各Ｌ１は、同一または異なる連結基を表し、
各Ｌ２は、独立して、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
各Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
各末端のＨは場合によって、独立してアリールチオカルボニルチオ、アルキルチオカルボニルチオ、アルコキシチオカルボニルチオおよびスルファニル基から選ばれる基によって置換されていてもよく、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、そして
各ｎは、独立して、３〜１，０００の整数である。
【請求項４】
各Ｌ１が独立して、単結合、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃＣＯ−、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、ｍ−またはｐ−フェニレン、ｍ−またはｐ−キシリレン、アルキレンからなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、これらの連結基が方向によって等価でない場合、記載されている方向の逆向きであることができ、
Ｒが、次式
【化２】
2014199982.tif 000013
式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基から選ばれ、Ｒの総数ｎの少なくとも８０％を前記式で表される基が占める、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ポリアニオン性ポリマーがポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質からなる群より選ばれる１種またはそれ以上である、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項６】
生理活性ペプチドが酵素タンパク質、抗原タンパク質、抗体、サイトカイン、ペプチドホルモンおよび抗菌ペプチドからなる群より選ばれる、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドからのカチオン性総電荷対アニオン性総電荷の比が水性溶液中で１０：１〜１：１０となる、請求項１または３に記載の組成物。
【請求項８】
水性溶液中で動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定すると平均粒径が１０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内にあるポリイオンコンプレックスミセルとして存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
水性溶液中のイオン強度および／または温度変化に応じてゲルを形成する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の組成物から形成されたポリイオンコンプレックスと生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むゲル形成性医療用組成物。
【請求項１１】
式（ＩＩ）
【化３】
2014199982.tif 000014
式中、
各Ｌ１は、同一または異なる連結基を表し、
各Ｌ２は、独立して、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
各Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
各末端のＨは、アリールチオカルボニルチオ、アルキルチオカルボニルチオ、アルコキシチオカルボニルチオおよびスルファニル基から選ばれる基によって置換されており、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、そして
各ｎは、独立して、３〜１，０００の整数である、
で表されるトリブロックコポリマー。
【請求項１２】
各Ｌ１がｍ−もしくはｐ−フェニレン、ｍ−もしくはｐ−キシリレンまたはアルキレンである、請求項１１に記載のトリブロックコポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリカチオン性トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドを含む組成物に関する。より具体的には、トリブロックコポリマーがアミノ基を介して結合した環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として有する２つのポリマーブロックと該ブロックを両端に共有結合したポリ（エチレングリコール）のブロックから構成されていることにより、本発明の組成物は生理活性ペプチド等のローディングされたポリイオンコンプレックスとして提供できる。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、活性酸素種等のラジカルスカベンジャーとして機能する４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル等を包含する環状ニトロキシドラジカル化合物を、その機能に悪影響を及ぼすことなく、ジブロックポリマー化することに成功し、該ジブロックポリマーそれ自体およびそれの一定の技術分野での使用に向けた発明について特許出願した（特許文献１参照）。さらに、本発明者等はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（Ｂ）の両端にカチオン荷電性の環状ニトロキシドラジカルをペンダント基として有するブロック（Ａ）２つが共有結合した、所謂、Ａ−Ｂ−Ａ型のトリブロックコポリマーを作製した。当該トリブロックコポリマーは水性媒体中でポリアニオン性ポリマーとのイオンコンプレックス形成を駆動力とする、所謂、フラワーミセルを形成し、また、こうして形成されたミセルは生体内環境に応答してゲル化し、こうして形成されたゲルは局所部位への高い滞留性を有し、それ自体炎症モデルに対して高い炎症抑制効果を示すことが確認できたので報告した（それらの講演予稿である、例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、等を参照）。【０００３】
他方、例えば、酵素、タンパク質等を包含するペプチド又はポリペプチドはその特異的反応性または特定の機能もしくは活性を利用した薬物、特に医療用薬物として利用されてきた。しかしながら、生体中ではプロテアーゼなどの酵素による分解をうけ、バイオアベイラビリティーが極めて低いだけでなく、抗原性や毒性を示すこと等から様々な問題があった。近年、このような物質のポリエチレングリコール化によりこれらの問題を解決しつつあるものの、活性の低下や反応の煩雑性など問題が多い。酵素のチャージを利用し、反対荷電の高分子によるコンプレックス化などによる安定化も試みられているものの（非特許文献５、非特許文献６）、生体中の高いイオン強度によりコンプレックスが容易に崩壊するため実用化が妨げられてきた。さらにはマトリックス自体に高分子等を利用するため，そのマトリックス自身が炎症を起こす原因となり、問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ２００９／１３３６４７
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】２０１２．３．２  ＰＢ−１３  Ｍｉｎ  Ｌｅｙ  Ｐｕａ，Ｐｅｎｎａｐａ  Ｃｈｏｎｐａｔｈｏｍｐｉｕｎｌｅｒｔ，Ｔｏｒｕ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｙｕｋｉｏ  Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｄｏｘ  ｆｌｏｗｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｅｍｅｎｔｓ，ＭＡＮＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ２０１２，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ
【非特許文献２】２０１２．６．７  プア  ミン  リー、ションパントンピクンラット  ペナパー、吉冨徹、長崎幸夫、  慢性炎症治療を目指した新規ニトロキシドラジカル含有インジェクタブルハイドロゲルの開発、第６５回  日本酸化ストレス学会、徳島、ｐ３９
【非特許文献３】２０１２．１１．２２  Ｐｕａ  Ｍｉｎ  Ｌｅｙ，Ｔｏｒｕ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｐｅｎｎａｐａ  Ｃｈｏｎｐａｔｈｏｍｐｉｕｎｌｅｒｔ，Ａｋｉ  Ｈｉｒａｙａｍａ，ａｎｄ  Ｙｕｋｉｏ  Ｎａｇａｓａｋｉ，“Ｒｅｄｏｘ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｇｅｌ（ＲＩＧ）ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−Ｃａｔｔａｇｅｅｎａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ−”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｓｏｆｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｙｏｕｎｇ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ（ＳＩＳ  ＹＳ  ２０１２）．Ｔｓｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ
【非特許文献４】２０１３．３．１９−２２  Ｐｕａ  Ｍｉｎ  Ｌｅｙ，Ｔｏｒｕ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，Ｐｅｎｎａｐａ  Ｃｈｏｎｐａｔｈｏｍｐｉｕｎｌｅｒｔ，Ａｋｉ  Ｈｉｒａｙａｍａ，ａｎｄ  Ｙｕｋｉｏ  Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｒｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｇｅｌ（ＲＩＧ）ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｔｓｕｋｕｂａ（ＩＣＢＳ２０１３），Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ，Ｐ１５５
【非特許文献５】Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｈａｒａｄａ  ａｎｄ  Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｋａｔａｏｋａ（１９９８）“Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ  Ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｅ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｒｒｏｗｌｙ−Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−Ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９８，３１，２８８−２９４
【非特許文献６】Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉ  Ｓａｗａｄａ，Ｋａｚｕｎａｒｉ  Ａｋｉｙｏｓｈｉ（２０１０）“Ｎａｎｏ−Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐａｓｅ  ｂｙ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｎａｎｏｇｅｌｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０，１０，３５３−３５８
【発明の概要】
【０００６】
今ここに、一般的に、両性電解質であるタンパク質をはじめとする生理活性ペプチドが、水性媒体中で上記のトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーに由来するポリイオンコンプレックスのチャージバランス保持しながら、当該ポリイオンコンプレックスの形成するミセル中にローディングでき、また、かようなミセルは水性媒体中でゲル化し得ることも見出した。さらに、こうして形成されるゲルは、ローディングされた生理活性ペプチドを生体内環境下で安定に保持し、一方で、必要に応じてゲルから該ペプチドを生体内環境に放出することもできる。
【０００７】
したがって、本発明は、式（Ｉ）で表されるトリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチド等を含んでなる組成物を提供する。
ＣＮＲ−ＰＥＧ−ＣＮＲ      （Ｉ）
式中、
各ＣＮＲは、独立して、少なくとも１つのアミノ基（−ＮＨ−）を含有する連結基を介してポリマー主鎖に結合する環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含有する反復単位を含むポリマーセグメントであり、該ＣＮＲの未結合末端は、水素原子、アリールチオカルボニルチオ、アルキルチオカルボニルチオ、アルコキシチオカルボニルチオ、スルファニル基などを末端基とすることができ、
ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントである。
前記トリブロックコポリマーの好ましい態様は、次式（ＩＩ）で表されるものである。
【０００８】
【化１】
2014199982.tif 000003
式中、
各Ｌ１は、同一または異なる連結基を表し、
各Ｌ２は、独立して、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−であり、ここでｑは０または１であり、そして
各Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
各末端のＨは独立して、場合によっては、アリールチオカルボニルチオ、アルキルチオカルボニルチオ、アルコキシチオカルボニルチオ、スルファニル基などで置換されていてもよく、
ｍは、２０〜５，０００の整数であり、そして
各ｎは、独立して、３〜１，０００の整数である。
【０００９】
当該組成物は、トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチドからのカチオン性総電荷対アニオン性総電荷の比が水性溶液中で１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、より好ましくは１：１．２〜１．２〜１、特に好ましくは１：１となるように配合量が選ばれる。
【００１０】
こうして、当該組成物は水性媒体中で流動性のあるポリイオンコンプレックスミセルとして存在することができ、また、当該ミセルは、イオン強度および／または温度の変化に応じて生理活性ペプチドのローディングされた、例えば生体内環境下で安定なゲルを形成することもできる。当該ゲルは、生体内の所望の局所におかれたとき、長期にわたり安定性を示す一方で、上記の両総電荷のバランスを適度にとることにより、その場でローディングされた生理活性ペプチドを制御された様式で放出できる。したがって、本発明の組成物は、例えば、医療分野で、ローディングされたペプチドの生理活性に応じて、該活性を利用して予防または治療することのできる疾患を処置するために使用できる。
【００１１】
＜発明の記述＞
本願発明にいう、トリブロックコポリマーにおける、ペンダント基は、当該技術分野で一般に認識されているとおりの、ある官能基を持った側鎖を意味する。具体的には、ペンダント基は、ｏ−もしくはｐ−フェニレン−（Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ）ｐ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−（ここで、ｐは１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である）の連結基に、その記載されている右末端において環状ニトロキシドラジカル残基が共有結合している基である。より具体的には、上記一般式（ＩＩ）の−フェニレン−（Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ）ｐ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−Ｒで表される側鎖を参照すれば、本発明にいうペンダント基をより明瞭に理解できるであろう。このようなペンダント基が結合する主鎖としては、本発明の目的に沿うものであれば限定されるものではない。本発明において、残基とは、それぞれ対応する化合物から水素原子またはその他の化合物の分子を構成する原子が１個除去された状態にある基を意味し、例えば、典型的な環状ニトロキシドラジカルにあっては、一般式（ＩＩ）のＲについて定義する基を参照できる。
【００１２】
こうして、ペンダント基の好ましい態様のものとしては、前記環状ニトロキシドラジカルが、ｏ−もしくはｐ−フェニレン−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−（ここで、ｑは０または１である）の連結基を介してポリマー主鎖に結合しており、かつ、環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる。
【００１３】
当該主鎖にフェニレンの未結合末端（アミノ基（−ＮＨ−）を介して環状ニトロキシドラジカルを担持する末端の逆の末端）が結合していることを特徴とするトリブロックコポリマーまたはそのポリカチオンにおいて、「フェニレンの未結合末端」とは、ｏ−もしくはｐ−フェニレンのＣ１−６アルキレンが結合している位置と反対側の末端を意味する。また、本願明細書において、結合という場合、他に特記しない限り、共有結合を意味する。
【００１４】
上述のとおり、ポリマー主鎖は本発明の目的に沿う限り限定されないが、好ましくは、重合性不飽和二重結合を有する、例えば、置換エチレンのような不飽和二重結合を有する重合性モノマーのラジカル重合により形成される主鎖を意味する。このような主鎖の具体的なものとしては、上記特許文献１に記載のものを挙げることができる。
さらに好ましいトリブロックコポリマーは、上記に好ましい態様ものとして挙げた、式（ＩＩ）で表されるものである。
【００１５】
式（ＩＩ）において、各Ｌ１について定義する連結基は、好ましくは、それぞれ独立して、単結合、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃＣＯ−、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、ｍ−またはｐ−フェニレン、ｍ−またはｐ−キシリレン、アルキレンなどからなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であることができ、これらの連結基が方向によって等価でない場合、記載されている方向の逆向きであることができ、
各Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは約１００％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２０〜５，０００、好ましくは、２０〜１０００、より好ましくは５０〜２００の整数であり、そして
各ｎは、独立して、３〜１，０００、好ましくは、３〜１００、より好ましくは３〜５０の整数である、
で表される。
【００１６】
Ｃ１−６アルキレンは、限定されるものではないが、具体的には、メチレン、１，２−プロパンジイル、１，３−プロパンジイル、１，４−ブタンジイル、等の対応するアルキルのジイル基を挙げることができる。
Ｒ基の環状ニトロキシドラジカルは、好ましくは、次式
【化２】
2014199982.tif 000004
上式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基を挙げることができる。上記の各基の中、最初の式で表される残基が、以下で、ＴＥＭＰＯと略称されることのある基である。
【００１７】
このようなトリブロックコポリマーは、主鎖または主鎖とペンダント基の一部を有するトリブロックコポリマーの前駆体を準備し、次いで、当該前駆体に環状二トロキシドラジカル残基を導入することにより都合よく製造することができる。また、別法では、各ブロックをそれぞれ独立に準備し、次いで、それらを目的のトリブロックコポリマーを形成するように共有結合させてもよい。典型的な製造方法は、後述する実施例に示すが、両末端を反応可能に修飾したポリ（エチレングリコール）の末端にＣＮＲの前駆体となり得るポリマーセグメントを結合させ、または当該両末端から成長させた後、少なくとも１つアミノ基を有する連結基を介して結合されている環状ニトロキドラジカルを導入することにより実施できる。特定の例は上記の非特許文献２や４に記載を参照できるが、より具体的には、本発明者等の国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０５１３９５に記載の方法を参照できる。この出願の内容は、ここに引用することにより、本明細書の内容となる。
【００１８】
本発明で用いる、ポリアニオン性ポリマーは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類（例、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、またはこれらの短鎖分解断片等）、アニオン性タンパク質（例、アルブミン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸）等を挙げることができ、これらの分子量は、ポリマーの種類によって最適値が異なり、限定されるものでないが、例えば、ポリアクリル酸の場合、Ｍｎが、１０００〜１００００００、好ましくは、１０００〜１０００００、より好ましくは、１０００〜１００００である。これらは市販のものをそのまま、また必要に応じて精製して使用すればよい。
【００１９】
本発明にいう、生理活性ペプチド等は、本発明の組成物から形成されるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセル、または該組成物または該ミセルから形成されるゲルにローディング乃至内包でき、またはそうすることに技術的に意義のある、例えば、水性媒体、水性溶液、または水性環境下で安定化できるものであればいかなる化合物または物質であってもよい。本発明にいう「ペプチド」または「ペプチド等」の語は、低分子ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドを包含する概念として用いており、ポリペプチドには各種タンパク質も包含される。かようなタンパク質には、糖または脂質により修飾された糖タンパク質またはリポタンパク質を包含することができる。したがって、該生理活性ペプチドには、限定されるものでないが、オキシダーゼ（例、アミノ酸酸化酵素）、リパーゼ、ウロキナーゼ、リゾチーム、トリプシン等の酵素タンパク質、ＭＡＧＥ−Ａ４等の医療用ワクチンの原料として使用される抗原タンパク質、４型葉酸受容体等の抗癌活性を有する抗体（抗体フラグメントおよび一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む）、ＨＥＲ２標的ＩｇＧ１κ、ＥＧＦＲ標的ＩｇＧ２κ等の抗体、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−１１等）、増殖分化因子（ＧＤＦ−１１等）等のサイトカインまたは増殖因子、インスリン、カルシトニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（例、サイロリベリン）、黄体化ホルモン放出ホルモン（例、ソマトスタチン）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、性腺刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、アンギオテンシン、ガストリン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−エンドルフィン、エリスロポイエチン、ウロガストリン、成長ホルモン分泌抑制ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチド等のペプチドホルモン、ラクトフェリシン、バクテリオシン、ナイシン等の抗菌ペプチドを挙げることができる。これらのペプチドは天然由来のものであっても、遺伝子組換え技術を用いて生産されたものであっても、また、かようなペプチド合成技術を用いて作製されるペプチド（またはポリペプチド）の翻訳後修飾などによりグリコシル化を伴うものであってもよい。
【００２０】
本発明の組成物は、上述したとおり、トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーと生理活性ペプチド等からのカチオン性総電荷対アニオン性総電荷の比が水性溶液中で１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、より好ましくは１：１．２〜１．２〜１、特に好ましくは１：１となるように配合量が選ばれる。かような配合量を決定する際に、両性電解質であるタンパク質をはじめとする生理活性ペプチドの配合量は、それらの等電点ｐＩの値を参照して、トリブロックコポリマーまたはポリアニオン性ポリマーいずれかの配合量を調節することにより、一定のｐＨ下で組成物全体のチャージバランスがとれるように決定する。本発明にいう、水性媒体、水性溶液、水性環境下は、水、脱イオン水、滅菌水、それら自体であってもよいが、無毒性の緩衝剤を含むものであってもよく、さらには、温血動物、好ましくはヒトの体液、体液を含む器官、組織であることができる。
【００２１】
本発明の組成物は、上記３成分を単に混合したものを含むが、上述したように組成物全体のチャージバランスがとれるように配合されたものが好ましい。そうすることにより、組成物は、それらの分子が水性溶液中で会合してミセルを形成することにより、あたかも溶解したかのごとく透明なＰＩＣミセルとして存在し得る。かようなＰＩＣミセルは、動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定される平均粒子径が数十ｎｍ〜数百ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜３００ｎｍ、より好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍ、最も好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲内にある。したがって、例えば、医薬として用いる場合には、例えば、注射投与が容易に可能であり、かつゲルの生成した際の物理的炎症をトリブロックコポリマーに結合したニトロキシラジカルにより抑え、更にはゲルが分解した後にはニトロキシラジカルが結合したトリブロックコポリマーは細胞に取り込まれないため、細胞内の電子伝達系を阻害することなく副作用を抑えることができる点で有利に使用できる。
【００２２】
このようなミセル溶液は、水性溶液中のイオン強度および／または温度変化に応じて安定なゲルを形成する。通常、イオン強度は、水性溶液中でイオン化可能な物質により調整できる。室温においてミセル溶液に添加するイオン化可能物質のミセル溶液中での最終イオン濃度を０（ゼロ）〜５０（好ましくは、0ｍＭ）ｍＭからイオン濃度１５０ｍＭ以上までに変化することにより、ミセル溶液をゲル化させることができる。温度に関して、本発明の組成物は、通常室温の水性溶液中で前記ミセルが形成されるが、該温度を３７℃程度以上に上昇させることにより前記ミセル溶液はゲル化を生じる。かようなゲル化はイオン濃度および温度を同時に変化させることによっても生じさせることができる。イオン化可能な物質は、無機塩、限定されるものでないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムである。
【００２３】
また、本発明の組成物から形成されたＰＩＣは、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むゲル形成用組成物として提供することもできる。かような希釈剤は、滅菌水、鉱酸を含む酸性水溶液、生理食塩水、生理的に許容される緩衝剤を含む弱酸性または弱アルカリ性の溶液等であることができる。賦形剤は、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。
【００２４】
さらに、生理活性ペプチド等の使用を必要とし、さらに炎症を抑制することが望まれる患者に当該組成物を投与（ミセル溶液の場合、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、等の経路による）し、また、病巣に直接注入し、ゲル化を起こすことにより、注入局所に長期滞留させるとともに、必要に応じ、生理活性ペプチド等を徐放させることにより、該生理活性ペプチドで処置することを必要とする疾患または障害を処置することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】製造例１で得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ  ＮＭＲスペクトル測定の結果を表す図である。
【図２】製造例２で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図３】製造例４で調製したポリイオンコンプレックスミセルのゲル化様子を表す図に代わる写真である。
【図４】試験１の結果を示す、Ｄアミノ酸酸化酵素内包ポリイオンコンプレックスの過酸化水素産出能を示す図である。
【図５】製造例５〜７で得られるタンパク質内包ＰＩＣミセルおよび参考例1で得られるＰＩＣミセルの粒子径の測定結果を示す図である。図中、◇はＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉｎ内包ＰＩＣミセルに関し、□はＦＩＴＣ-ＢＳＡ内包ＰＩＣミセルに関し、▲はＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＰＩＣミセルに関する測定データをプロットしたものである。●はタンパク質不含ＰＩＣミセルに関するものである。
【図６】タンパク質濃度を同一濃度にした場合のＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉn内包ＰＩＣミセル溶液およびＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉn溶液中のＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉn水溶液の蛍光強度の測定結果を表す。
【図７】タンパク質濃度を同一濃度にした場合のＦＩＴＣ-ＢＳＡ内包ＰＩＣミセル溶液およびＦＩＴＣ-ＢＳＡ溶液中のＦＩＴＣ-ＢＳＡ水溶液の蛍光強度の測定結果を表す。
【図８】タンパク質濃度を同一濃度にした場合のＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＰＩＣミセル溶液およびＦＩＴＣ−ＧＯＤ溶液中のＦＩＴＣ−ＧＯＤ水溶液の蛍光強度の測定結果を表す。
【図９】試験例２によるＲＩＧからのタンパク質リリースの測定結果を表す。●はＦＩＴＣ−Ｉｎｓｕｌｉｎ内包ＲＩＧ、■はＦＩＴＣ−ＢＳＡ内包ＲＩＧおよび△はＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＲＩＧからのリリースの結果を表す。
【図１０】試験例３によるＲＩＧからのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏリリース評価試験の結果を表す写真である。
【図１１】試験例３によるＲＩＧのｉｎ  ｖｉｖｏ滞留性評価試験の結果を表す写真である。
【図１２】試験例４によるタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ滞留性評価試験の結果を表す写真である。
【図１３】試験例５によるＰＩＣミセル（ＤＡＯ含有）溶液の温度およびイオン強度の変化に基づくゲル化挙動を表す。
【図１４】試験例５によるＰＩＣミセル（ＤＡＯ不含）溶液の温度およびイオン強度の変化に基づくゲル化挙動を表す。
【図１５】製造例１４で得られたＢｒ−ＰＥＧ−ＢｒのＳＥＣ測定１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図１６】製造例１５で得られたＣＴＡ-ＰＥＧ−ＣＴＡのＳＥＣ測定１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図１７】製造例１６で得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図１８】製造例１７で得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマーのＳＥＣ測定１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果を表す図である。
【図１９】製造例１８で得られるポリイオンコンプレックスミセルの粒子径の測定結果を示す図である。
【実施例】
【００２６】
以下に、具体例を挙げ、さらに本発明を具体的に説明するが、これらの具体例に本発明を限定することを意図するものではない。【００２７】
＜製造例１＞  ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム１に従い合成した：
【化３】
2014199982.tif 000005
【００２８】
両末端にチオール基を有しているポリエチレングリコール（ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：１００００；０．１６４ｍｍｏｌ，１．６４グラム）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器にアゾビスイソブチロニトリル／トルエン（０．１６４ｍｍｏｌ／１６ｍｌ）溶液とクロロメチルスチレン（１２．３ｍｍｏｌ，１．７４ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、２．０７ｍｇであり、収率は９６．５％であった。得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの結果を図１に示す。【００２９】
＜製造例２＞  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックポリマー（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の合成
反応容器に、ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：１３０５２；１．８ｇ，０．１３８ｍｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（２．３６ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で２４時間攪拌を行った。反応終了後、反応溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｓｉｚｅ  ３，５００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）中に加え、２Ｌのメタノールに対して透析を行った。メタノールは２時間ごとに８回交換し、エバポレーションを行い、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、６５．６％であった。【００３０】
１Ｈ  ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが認められた（図２参照）。【００３１】
＜製造例３＞  ポリイオンコンプレックスミセルの設計
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｎ：５０００）をそれぞれリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ６．２８）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたポリカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。また、Ｄアミノ酸酸化酵素をリン酸緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ６．２８）に溶解し、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌに調製した。ＰＡＡ水溶液にＤアミノ酸酸化酵素を撹拌しながら加えた。さらに、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液をＰＡＡ、Ｄアミノ酸化酵素の混合溶液に撹拌しながら滴下し、ＰＩＣミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１：１となるように、ＰＩＣミセルを調製し、ＤＡＯの量を０ｍｌ、０．２ｍｌ、０．４ｍｌ、０．６ｍｌと条件を変えて調整した。（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたＰＩＣミセルのゼータ電位を測定した。結果を下記表１に示す。得られたＰＩＣミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が５９〜６７ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された。【００３２】
【表１】
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【００３３】
＜製造例４＞  インジェクタブルゲルの設計
製造例３で調製した各ＰＩＣミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。実験の結果（ゲル化の様子）を示す図面に代わる写真を図３に示す。この図から、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲルが形成したことが確認される。【００３４】
＜試験例１＞  Ｄアミノ酸酸化酵素による過酸化水素産出能評価
Ｄアミノ酸酸化酵素を０．４ｍｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ）加えたＰＩＣミセル（表１、図３の（３））をペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）／ｏ−ジアニシディン（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）評価法により過酸化水素産出能を評価した。Ｄアミノ酸酸化酵素濃度を５μｇ/ｍｌになるまで遠心エバポレーターにより濃縮し、遊離のＤＡＯとＤアミノ酸酸化酵素が０ｍｌのコントロールＰＩＣミセルと比較し評価を行った。結果を図４に示す。【００３５】
遊離のＤアミノ酸酸化酵素とＤアミノ酸酸化酵素内包ＰＩＣミセルは異なる挙動の過酸化水素産出能を示す。このことから、Ｄアミノ酸酸化酵素がＰＩＣミセルに静電相互作用により組み込まれていると考えることができる。また、Ｄアミノ酸酸化酵素内包またはローディングしたＰＩＣミセルは過酸化水素徐放能を示したため、薬物の初期バーストを防ぐことができる材料であることが理解できる。【００３６】
＜製造例５〜７＞  フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル化タンパク質内包ＰＩＣミセルの調製
ＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を0.1Ｍ ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。
次に、プロトン化したＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ； Ｍｎ：５０００）をそれぞれリン酸緩衝液（５０ｍＭ, ｐＨ６．２）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたポリカチオンＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴ水溶液とポリアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。
上記で調製したＰＡＡ水溶液１．６２１ｍＬに、それぞれ
ｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた１４９２μｇ／ｍＬのフルオレセインイソチオシアネートラベル化インスリン（ＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉｎ）水溶液７０μＬ、
ｉｉ）リン酸緩衝液（５０ｍＭ,ｐＨ６．２）に溶解させた２０３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣラベル化ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ-ＢＳＡ）水溶液５１μＬ，および
ｉｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた１６５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣラベル化グルコースオキシダーゼ（ＦＩＴＣ−ＧＯＤ）水溶液６３μＬ
を撹拌しながら加えた。その後、氷冷下で、ＰＡＡと各ＦＩＴＣ-タンパク質の混合溶液にＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液１０ｍＬを撹拌しながら滴下し、それぞれ、リン酸緩衝液（５０ｍＭ, ｐＨ６．２）３０９μＬ、３２８μＬおよび３１６μＬを添加し、ＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＦＩＴＣ-ＢＳＡおよびＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＰＩＣミセルを調製した。
ここで、ＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１／１となるように、ＰＩＣミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ-ｂ-ＰＥＧ-ｂ-ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。
それぞれ、得られたＦＩＴＣ-タンパク質内包ＰＩＣミセルの粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した結果を図５および表２に示す。【００３７】
【表２】
2014199982.tif 000007
【００３８】
得られた各ＦＩＴＣ-Ｉｎｓｕｌｉn内包ＰＩＣミセル溶液、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ内包ＰＩＣミセル溶液およびＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＰＩＣミセル溶液の蛍光強度を測定した結果を図６、７および８に示す。また、各ＦＩＴＣ-タンパク質内包ＰＩＣミセル溶液中のＦＩＴＣ-タンパク質濃度と同濃度の各ＦＩＴＣ-タンパク質水溶液の蛍光強度も、それぞれ図６、７および８に示す。各ＦＩＴＣ-タンパク質内包ＰＩＣミセル溶液では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による消光(クエンチ)が確認され、それぞれインスリン、ウシ血清アルブミンおよびグルコースオキシダーゼがＰＩＣミセルに内包されていることが示唆された。【００３９】
＜参考例1＞  タンパク質を内包していないＰＩＣミセルの調製
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。
次に、プロトン化したＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ； Ｍｎ：５０００）をそれぞれリン酸緩衝液（５０ｍＭ, ｐＨ６．２）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたポリカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とポリアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。
上記で調製したＰＡＡ水溶液１．６２１ｍＬに、氷冷下で、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液１０ｍＬを撹拌しながら滴下し、ＰＩＣミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１／１となるようにＰＩＣミセルを調製した（モル比ｒは、上記定義のとおりである）。得られたＰＩＣミセルの粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した結果を図５及び表２に示す。【００４０】
＜製造例８〜１０＞  ＦＩＴＣ-タンパク質内包レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）の調製
製造例５〜７で、それぞれ得られたＦＩＴＣ−タンパク質内包ＰＩＣミセル溶液１１ｍＬを遠心エバポレーションにより１ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液３００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、３７℃の恒温槽で加温することで、それぞれＦＩＴＣ−Ｉｎｓｕｌｉｎ内包ＲＩＧ、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ内包ＲＩＧおよびＦＩＴＣ−ＧＯＤ内包ＲＩＧを調製した。【００４１】
＜試験例２＞  レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）からのタンパク質のリリース評価
製造例８〜１０で得られたタンパク質内包ＲＩＧが入ったマイクロチューブにＰＢＳを１５０μＬ添加し、振とう機を使用して３７℃、１００ｒｐｍの条件下でインキュベートした。サンプリングポイントで、１００μＬの上澄みを分取し、新しいＰＢＳを１００μＬ添加した。分取した上澄みの蛍光強度をプレートリーダーで測定し、その蛍光強度よりタンパク質のリリース量を算出した。その結果を図９に示す。【００４２】
＜製造例１１＞  インドシアニングリーン（ＩＣＧ）ラベル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内包ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ラベル化ＰＩＣミセルの調製
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。
次に、プロトン化したＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｎ：５０００）をそれぞれリン酸緩衝液（５０ｍＭ,ｐＨ６．２）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたポリカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とポリアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。
上記で調製したＰＡＡ水溶液２．７６ｍＬに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた１０００μｇ／ｍＬのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）ラベル化ウシ血清アルブミン（ＩＣＧ−ＢＳＡ）水溶液２０５μＬを撹拌しながら加えた。その後、氷冷下で、ＰＡＡとＩＣＧ−ＢＳＡの混合溶液にＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液１０ｍＬとリン酸緩衝液（５０ｍＭ,ｐＨ６．２）に溶解されている１．６７ｍｇ／ｍＬ  ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ ６４７ラベル化ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液０．３ｍＬの混合溶液を撹拌しながら滴下し、リン酸緩衝液（５０ｍＭ,ｐＨ６．２）を３３５μＬ添加し、ＩＣＧ−ＢＳＡ内包ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−ＰＩＣミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１／１となるようにＰＩＣミセルを調製した（モル比ｒは、上記定義のとおりである）。【００４３】
＜試験例３＞  レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）からのタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏリリース評価及びＲＩＧのｉｎ  ｖｉｖｏ滞留性評価
製造例１１で得られたＩＣＧ−ＢＳＡ内包ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−ＰＩＣミセル溶液２２ｍＬを遠心エバポレーションにより２ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液２００μＬをＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスに皮下注射した。ＲＩＧからのＢＳＡのリリース挙動およびRIGの滞留性を、各々にラベル化した蛍光色素をＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてイメージングすることで評価した。ＩＣＧ−ＢＳＡをイメージングする場合は、励起波長７４５ｎｍ、蛍光波長８００ｎｍの蛍光フィルターを用い、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−ＲＩＧをイメージングする場合は励起波長６４０ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍの蛍光フィルターを用いた。結果を図１０、図１１に示す。ＲＩＧに内包されたBSAは14日間に渡って投与部位に滞留し、徐放されることが確認された。またＲＩＧは1ヵ月以上投与部位に滞留することが確認された。【００４４】
＜試験例４＞  タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ滞留性評価
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた１００μｇ／ｍＬのＩＣＧ−ＢＳＡ水溶液２００μＬをＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスに皮下注射した。ＢＳＡの滞留性をラベル化した蛍光色素（ＩＣＧ）をＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてイメージングすることで評価した。励起波長７４５ｎｍ、蛍光波長８００ｎｍの蛍光フィルターを用いてイメージングを実施した。結果を図13１２に示す。ＢＳＡを単独で投与した場合は１日後には投与部位から消失してしまっていることが確認された。【００４５】
＜製造例１２＞  Ｄアミノ酸酸化酵素（ＤＡＯ）内包ＰＩＣミセルの調製
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。
次に、プロトン化したＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーとポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｎ：５０００）をそれぞれリン酸緩衝液（１００ｍＭ,、ｐＨ６．２）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたポリカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ水溶液とポリアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。
上記で調製したＰＡＡ水溶液２．７６ｍＬに、リン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ６．２）に溶解させた１ｍｇ／ｍＬのＤアミノ酸酸化酵素水溶液（ＤＡＯ）を３４７μＬ撹拌しながら加えた。その後、氷冷下で、ＰＡＡとＤアミノ酸酸化酵素水溶液（ＤＡＯ）の混合溶液にＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマー水溶液２０ｍＬを撹拌しながら滴下し、Ｄアミノ酸酸化酵素（ＤＡＯ）内包ＰＩＣミセルを調製した。ここで、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴとＰＡＡのモル比ｒ＝１／１となるように、ＰＩＣミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。【００４６】
＜製造例１３＞  Ｄアミノ酸酸化酵素（ＤＡＯ）内包レドックスインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）の調製
製造例１２で得られた内包ＰＩＣミセル溶液１０ｍＬを遠心エバポレーションにより１．５ｍＬまで濃縮した。濃縮した溶液３００μｌをそれぞれ濃度が異なるＮａＣｌ水溶液を加えて５０２．５μｌに希釈し、ＮａＣｌ濃度が０ｍＭ，１５０ｍＭ，３００ｍＭ，５００ｍＭ，１０００ｍＭであり、ＰＩＣ濃度が２０ｍｇ／ｍｌのＤＡＯ（Ｄアミノ酸酸化酵素)内包ＰＩＣミセル溶液を作製した。【００４７】
＜試験例５＞  イオン強度変化によるゲル化挙動
製造例１３で作られたＤアミノ酸酸化酵素水溶液（ＤＡＯ）内包ＲＩＧを３００μｌセルに入れ、ＵＶ−ＶＩＳ装置を用いて６００ｎｍにおける透過率を測定し、徐々に昇温させることによりゲル化の確認をした。結果を図１３に示す。イオン強度が増大するにつれてゲル化が促進されることが確認された。また、ＤＡＯ不含のＰＩＣミセル溶液について、製造例１２に記載のように調製したＰＩＣミセルおよび該調製例に準ずるが、Ｄアミノ酸酸化酵素（ＤＡＯ）不含のＰＩＣミセル（製造例１２のＤアミノ酸酸化酵素を加えない系に相当する）を調製し、製造例１３の方法に従い該ミセル溶液のイオン強度変化によるゲル化挙動を評価した。温度と塩濃度を変化させて透過率を測定した結果を図１４に示す。【００４８】
＜製造例１４＞  Ｂｒ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−Ｂｒの合成
Ｂｒ−ＰＥＧ−Ｂｒは、次の合成スキーム２に従い合成した：
【化４】
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両末端にヒドロキシル基を有しているポリエチレングリコール（ＯＨ−ＰＥＧ−ＯＨ）（Ｍｎ：１００００：５０ｇ）を１１０℃で１２時間減圧乾燥し脱水した。次にＴＨＦ２００ｍｌ加え、そこへブチルリチウム１０ｍｌ（１６ｍｍｏｌ）とジブロモキシレン２５ｇを加えて５０℃、２４時間反応させることにより両末端がブロモ化したＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒを得た。得られたポリマーは2-プロパノールに沈殿し、真空乾燥することで精製し。得られたＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図１５に示す。【００４９】
＜製造例１５＞  ＣＴＡ（連鎖移動剤（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ））―ＰＥＧ−ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）の合成(ジチオフェニルエステル両末端ＰＥＧの合成)
ＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡは、次の合成スキーム３に従い合成した：
【化５】
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ＴＨＦ５０ｍｌに二硫化炭素を２．４ｍｌ加える。次いで、ベンジルマグネシウムブロミドを６．７ｍｌ（２０ｍｍｏｌ）を氷冷化で徐々に加えて反応させ、マグネシウムベンゾチオブロマイドを得た。製造例１４で合成したＢｒ−ＰＥＧ−Ｂｒ  ５０ｇをＴＨＦ２００ｍＬに溶かし作製したマグネシウムベンゾチオブロマイドを全て加え、６０℃、２４時間反応させることで、目的物質であるＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）―ＰＥＧ−ＣＴＡ（Ｃｈａｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｇｅｎｔ）を得た。得られたＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡは2-プロパノールで沈殿し,真空乾燥で精製した。得られたポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図１６に示す。【００５０】
＜製造例１６＞  ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）トリブロックコポリマーの合成
ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳは、次の合成スキーム４に従い合成した：
【化６】
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製造例１５で合成したＣＴＡ−ＰＥＧ−ＣＴＡ  １０ｇとアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）６０ｍｇを窒素雰囲気下でトルエンを２００ｍＬ加えて、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）を１５ｍＬ加え、６０℃、２４時間攪拌することで、目的物質であるＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳを得た。得られたポリマーは２―プロパノールで沈殿し、減圧乾燥にて精製した。得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図１７に示す。【００５１】
＜製造例１７＞  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル（ＴＥＭＰＯ）を有するトリブロックコポリマー（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の合成
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴは、次の合成スキーム5に従い合成した：
【化７】
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製造例１６で合成したＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ  ５ｇと4-アミノ  ＴＥＭＰＯ  ７．７ｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、５０℃で撹拌し、反応させることで目的物質であるＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴｂ−ＰＭＮＴを得た。得られたＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ―ｂ−ＰＭＮＴは２―プロパノールに沈殿し、減圧乾燥にて精製した。ポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と１Ｈ―ＮＭＲスペクトルの結果を図１８に示す。【００５２】
＜製造例１８＞  ポリイオンコンプレックスミセルの作製
製造例１７で作製したＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックコポリマー  １００ｍｇをメタノールに溶解し、そこへ水に溶解したＰＡＡｃ（ポリアクリル酸）１７．２ｍｇを加えた。次いで、この溶液を水に対して透析することによって、ポリイオンコンプレックスミセルを作製した。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、平均粒径が３１ｎｍの単峰性の粒子であることが確認された。（図１９参照）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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