(57)【要約】線虫を、被検者由来の生体関連物質又はその処理物の存在下で飼育し、線虫の嗅覚による化学走性を指標として癌を検出することを特徴とする癌の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として癌を検出することを特徴とする癌の検出方法。
【請求項２】
線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫が正の応答を示したときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫の嗅覚神経の応答が大きいときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生体関連物質又はその処理物が、体液、細胞、組織、又は細胞若しくは組織の培養物若しくは保存液である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
体液が尿である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
保存液が生理食塩水である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂いの受容体の同定方法。
【請求項１０】
前記受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害された線虫における匂いに対する反応を検査するものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
受容体遺伝子の発現又は機能阻害がＲＮＡｉによるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
匂いが癌種の匂いである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
同定される受容体の種類が、癌種により、又は匂い物質の濃度に依存して異なるものである請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として癌種を同定することを特徴とする癌種の同定方法。
【請求項１６】
以下の工程を含む、請求項１５に記載の方法：
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により癌を検出し、
（ｂ）前記工程（ａ）において癌であることが検出された試料について、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法により同定された受容体を改変した改変体線虫を用いて、匂いに対する反応を検査し、
（ｃ）前記改変体線虫と、前記工程（ａ）で使用した線虫との間で匂いに対する反応が異なるときは、同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
【請求項１７】
受容体の改変が、受容体の欠失、受容体の発現又は機能の阻害、及び受容体の高発現又は高機能化からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
線虫を含む、癌の検出又は同定用キット。
【請求項１９】
線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項２１】
線虫と、
生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部と、
前記収容部の線虫の匂いに対する反応を探知する探知部と、
を備える癌の検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫の嗅覚を用いた癌検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を含む悪性新生物は、１９８１年より日本人の死因トップを占めている。世界保健機構によれば、２００５年における世界の悪性新生物による死亡率は１３％（７６０万人）を占め、今後も増加し続けると予測されている。
癌は、早期であればある程、診療にかかる精神的・身体的・経済的・社会的負担が軽く、根治の可能性も高い。進行すればする程、根治の可能性は低下し、切除不能の進行再発癌に至っては、多大の負担と損失のうえ、延命治療となる現実がある。癌は細胞の遺伝子の異常が原因となり発生するため、ほとんどの癌において人口１０万対各年齢における発生頻度は４−６乗に比例して増加する（Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎａｄａ，１９８２）。このため、いずれの年齢や社会においても、癌を早期発見・早期治療できれば、様々な場面において負担と損失が小さくできることは明白である。【０００３】
しかし、早期癌では症状が無い事が一般的であり、受診者は癌検診を受けるためのモチベーションに欠けるのが現実である。実際、日本の癌検診受診率はすべてにおいて１０−３５％程度であり、２０１７年までに癌検診受診率５０％以上を目指す日本のがん対策基本計画の目標を大きく下回っている。内視鏡や手術技術など、早期癌に対する治療技術で世界トップにある日本において、苦痛が少なく、簡単で安価、多くの人を対象として施行可能で高精度な癌検診法が新たに開発・応用されれば、世界の癌診療に革命をもたらすと言っても過言ではない。【０００４】
本発明者らを含めいくつかのチームでは、訓練された犬（がん探知犬）を用いて、癌には特有のニオイがあり、早期癌を含む検体に対して感度・特異度ともに９０％を超える高い精度で検出可能である事を報告してきた（非特許文献１：Ｓｏｎｏｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｏｄｏｕｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｓｃｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｇｕｔ，６０，８１４−８１９，２０１１）。
この事から、癌特有のニオイを検出すれば高精度の癌探知システムの構築が可能と考えられる。【０００５】
しかし、がん探知犬の能力には個体差があり、気温の上昇する夏には集中力が低下する。また、探知犬の訓練方法に関しても一定の方法論が存在しない。さらに、がん探知犬の調子が整った状況でも１日に５回のテストが限界である。何よりも、正解が全く不明の検診目的のサンプルにおいてテストを続ける行為は、がん探知犬が間違った行動をとっても探知犬に「ボールで遊ぶ」という報酬を提供してしまうため、精度を落とす結果となる。従って、探知犬を用いた癌検診を業務として行う事はできない。【０００６】
また、ＧＣ／ＭＳ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）分析などの分析装置を用いて揮発性物質を特定し、癌の診断を行う方法が報告されている（非特許文献２：Ｙ．Ｈａｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｒｉｎａｒｙ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６，６７９−８４，２０１２）（非特許文献３：Ｋｈａｌｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ａ  ＧＣ−ｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｕｒｉｎｅ  ｈｅａｄｓｐａｃｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，８，ｅ６９６０２，２０１３）。しかし、日常的に存在する揮発性物質がノイズとなる可能性が高く、検出するための機器の開発と作製に多額の資金と分析技術が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｏｎｏｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｏｄｏｕｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｓｃｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｇｕｔ，６０，８１４−８１９，２０１１
【非特許文献２】Ｙ．Ｈａｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｒｉｎａｒｙ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６，６７９−８４，２０１２
【非特許文献３】Ｋｈａｌｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ａ  ＧＣ−ｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｕｒｉｎｅ  ｈｅａｄｓｐａｃｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，８，ｅ６９６０２，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、線虫の嗅覚を利用した癌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、線虫の嗅覚に基づく化学走性又は嗅覚神経の応答により、癌を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１０】
（１）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として癌を検出することを特徴とする癌の検出方法。
（２）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である（１）に記載の方法。
（３）線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫が正の応答を示したときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。【００１１】
（５）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対して、線虫の嗅覚神経の応答が大きいときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）生体関連物質又はその処理物が、体液、細胞、組織、又は細胞若しくは組織の培養物若しくは保存液である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）体液が尿である（６）に記載の方法。
（８）保存液が生理食塩水である（６）に記載の方法。
（９）
線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂いの受容体の同定方法。
（１０）前記受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害された線虫における匂いに対する反応を検査するものである（９）に記載の方法。【００１２】
（１１）受容体遺伝子の発現又は機能阻害がＲＮＡｉによるものである（１０）に記載の方法。
（１２）匂いが癌種の匂いである（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）同定される受容体の種類が、癌種により、又は匂い物質の濃度に依存して異なるものである（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として癌種を同定することを特徴とする癌種の同定方法。【００１３】
（１６）以下の工程を含む、（１５）に記載の方法：
（ａ）前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により癌を検出し、
（ｂ）前記工程（ａ）において癌であることが検出された試料について、前記（９）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法により同定された受容体を改変した改変体線虫を用いて、匂いに対する反応を検査し、
（ｃ）前記改変体線虫と、前記工程（ａ）で使用した線虫との間で匂いに対する反応が異なるときは、同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
（１７）受容体の改変が、受容体の欠失、受容体の発現又は機能の阻害、及び受容体の高発現又は高機能化からなる群から選ばれる少なくとも１つである（１６）に記載の方法。
（１８）線虫を含む、癌の検出又は同定用キット。
（１９）線虫がシノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）である（１７）に記載のキット。
（２０）線虫が、野生型線虫、変異型線虫又はトランスジェニック線虫である（１８）又は（１９）に記載のキット。
（２１）線虫と、
生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部と、
前記収容部の線虫の匂いに対する反応を探知する探知部と、
を備える癌の検出システム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、線虫を用いた癌の検出方法が提供される。本発明の方法によれば、癌を高感度かつ低コストで検出することができる。さらに、本発明の方法は、サンプルの採取及び解析が容易であり、費用も安価である。さらに、本発明の方法は早期癌を検出することができる。従って、本発明の方法は、癌の臨床検査などに極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図１は、健常者及び癌患者の尿に対する線虫の反応試験結果を示す図である。
図２は、
本発明の方法に使用するシャーレのフォーマットを示す図である。
図３は、インディケーター遺伝子としてＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ遺伝子を用いたときの測定原理を示す図である。
図４は、インディケーター遺伝子としてＧＣａＭＰ遺伝子を用いたときの測定原理を示す図である。
図５は、線虫を配置するためのマイクロ流路を有するチップを示す図である。【００１６】
図６は、マイクロ流路を有するチップ内での流路の切り替えを示す図である。
図７は、癌患者由来の尿に対し、線虫のＡＷＣ嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。
図８は、癌患者由来の尿に対し、線虫のＡＷＣ嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。
図９は、沈殿物及び固形物を除去した尿サンプルを用いて線虫の化学走性を試験した結果を示す図である。
図１０は、癌患者由来の尿に対し、線虫のＡＷＡ嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。【００１７】
図１１は、癌患者由来の尿に対し、線虫のＡＷＡ嗅覚神経の反応を試験した結果を示す図である。
図１２は、アッセイプレートを示す図である。
図１３は、癌細胞の培養培地に対する線虫の誘引行動を示す図である。
図１４は、本発明の方法の中規模試験結果を示す図である。
図１５は、本発明の方法と他の腫瘍マーカーを用いて中規模試験を行い、感度を比較した結果を示す図である。【００１８】
図１６Ａは、本発明のシステムのブロック図である。
図１６Ｂは、本発明のシステムの処理部の構成図である。
図１７は、種々の濃度の繊維芽細胞培養培地に対する線虫の走性を示す図である。
図１８は、種々の濃度の癌細胞培養培地に対する線虫の走性を示す図である。
ｃｏｌｏ２０５＝大腸癌、ＭＫＮ１＝胃癌
図１９は、Ｓ状結腸癌患者の癌組織及び健常組織に対する線虫の走性を示す図である。
図２０は、ヒトの癌組織切片を生理食塩水に入れて保存した後の当該生理食塩水の希釈液に対する線虫の走性を示す図である。【００１９】
図２１は、尿の濃度を変えて線虫の走性を試験した結果を示す図である。
図２２は、特定の匂い物質に対する応答に関与した嗅覚受容体についてのＲＮＡｉスクリーニングを示す図である。
（Ａ）ＲＮＡｉスクリーニング戦略が効果的であったことの確認。ジアセチルの１０−３希釈又はピラジンの１０−３希釈に対する走化性応答におけるｅｒｉ−１変異体でのｏｄｒ−１０を標的とするＲＮＡｉの効果を示す。対照との有意な差を示す（Ｐ＜０．００１、ステューデントｔ検定）。（Ｂ）匂い物質に対する走化性と関連付けられた、第三次スクリーニング後に得られた嗅覚受容体候補遺伝子の数。（Ｃ）ｓｒｘ−４７又はｓｒａ−１７プロモーターによって発現誘導された蛍光リポーターの発現パターン。緑色は、これらの遺伝子のプロモーターによって誘導される蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの発現を示す。マジェンタ色は、ＡＷＡ、ＡＷＢ、及びＡＷＣ嗅覚ニューロンにおけるｍＣｈｅｒｒｙの発現を示す。ｓｒｘ−４７の発現は、ＡＷＡ及びＡＳＨニューロンにおいて観察された。ｓｒａ−１７の発現は、ＡＷＡニューロンにおいて検出された。スケールバー、１０μｍ。
図２３は、嗅覚受容体候補遺伝子の発現パターンを示す図である。
（左）緑色は、嗅覚受容体候補遺伝子のプロモーターによって発現誘導されたＶｅｎｕｓの発現を示す。（中央）マジェンタ色は、ＡＷＡ、ＡＷＢ及びＡＷＣニューロンにおけるｍＣｈｅｒｒｙの発現（Ａ）又は色素（ｄｙｅ）染色された感覚ニューロン（ＡＳＨ、ＡＳＪ、ＡＷＢ、ＡＳＫ、ＡＤＬ、ＡＳＩ、ＰＨＡ及びＰＨＢニューロン）（Ｂ−Ｍ）を示す。（右）重ね合わせた図。すべての画像は、尾部領域（Ｃ、下部）を除いて、線虫の頭部領域の左側面画像のものである。矢印及び矢じりは、受容体候補遺伝子が発現するニューロンの細胞体を示す。スケールバー＝１０μｍ。【００２０】
図２４は、ＳＲＩ−１４はＡＳＨニューロンにおいて高濃度のジアセチルに対する応答に機能することを示す図である。
（Ａ）野生型（ＷＴ）、ｏｄｒ−１０、及びｓｒｉ−１４変異体における低濃度及び高濃度のジアセチルに対する化学走性。ジアセチル濃度を下部に示す（ｎ＝５）。（Ｂ）高濃度のジアセチル（５μｌ未希釈）に対する忌避応答におけるｓｒｉ−１４を標的とするＲＮＡｉの効果（ｎ＝８）。（Ｃ）高濃度のジアセチル（５μｌ未希釈、Ｄａ）、イソアミルアルコール（５μｌ未希釈、Ｉａａ）、及びベンズアルデヒド（１μｌ未希釈、Ｂｚ）、並びに忌避物質オクタノール（１μｌ未希釈、Ｏｃｔ）及びノナノン（１μｌ未希釈、Ｎｏｎａ）に対するｓｒｉ−１４変異体の化学走性（ｎ＝６）。（Ｄ）ｓｒｉ−１４プロモーターによって発現誘導される蛍光リポーター（緑色）の発現パターン。矢じりは、それぞれｍＣｈｅｒｒｙ又は蛍光色素によって同定されたＡＷＣ又はＡＳＨの細胞体を示す（マジェンタ）。（Ｅ）高濃度のジアセチル（５μｌ未希釈）に対する化学走性において、野生型線虫でｓｒｉ−１４をＡＳＨ又はＡＷＣ特異的にＲＮＡｉしたときの効果（ｎ＝５）。（Ｆ）高濃度のジアセチル（５μｌ未希釈）へのｓｒｉ−１４変異体の応答の欠陥についてｓｒｉ−１４ｃＤＮＡのニューロン特異的発現の効果（ｎ＝５）。（Ｇ）ＡＳＨの感覚繊毛におけるＳＲＩ−１４：：ＧＦＰの局在。スケールバー、１０μｍ（Ｄ及びＧ）。エラーバーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ステューデントｔ検定（Ｂ及びＣ）又はダネット検定（Ａ、Ｅ、及びＦ）。【００２１】
図２５は、ＲＮＡｉ処理された線虫の高濃度ジアセチル濃度に対する化学走性を繰り返しアッセイした結果を示す図である。
ｓｒｉ−１４に加えて、第三スクリーニング後に得られた高濃度ジアセチル（５μｌの未希釈）に対する応答に関する受容体候補遺伝子のうち、ｓｒｈ−２５、ｓｒｈ−７９、ｓｒｈ−２１６、又はｓｒｈ−２８１のＲＮＡｉは、ジアセチルからの忌避行動に有意で再現性のある欠陥を引き起こした。誤差バーはＳＥＭを表す。対照と比較した有意差を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ボンフェローニ補正を含むステューデントｔ検定）。
図２６は、ｓｒｉ−１４の構造を示す図である。
ｓｒｉ−１４は７回膜貫通型タンパク質をコードする。（Ａ）ｓｒｉ−１４の構造。ｏｋ２６８５株の欠失領域を示す。（Ｂ）ＳＲＩ−１４の予測されたアミノ酸配列。隠れマルコフモデルによって予測された７回膜貫通型ドメインを示す。（Ｃ）ＳＲＩ−１４の疎水性プロット。プロットは、Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅによって定義されたハイドロパシーパラメータに由来する。（Ｄ）ｓｒｉ−１４変異体は、高い浸透圧刺激（４Ｍ  ＮａＣｌ）に対して正常な忌避行動を示した。誤差バーはＳＥＭを表す。対照と比較した有意差を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、ダネット検定）。【００２２】
図２７は、高濃度ジアセチルに対する応答に関与するニューロンを示す図である。（Ａ）感覚ニューロンが特異的に破壊された野生型線虫における高濃度ジアセチル（５μｌ未希釈）に対する化学走性（ｎ≧８）。（Ｂ）ＡＷＡを除去された線虫における１０−３希釈のジアセチルに対する化学走性。（Ｃ）ＡＷＡ、ＡＳＨ感覚ニューロンと４つの第一層介在ニューロンの間の神経配線の模式図。（Ｄ）介在ニューロンが特異的に阻害された野生型線虫における高濃度ジアセチル（５μｌ未希釈）に対する化学走性（ｎ≧５）。（Ｅ）介在ニューロンが特異的に阻害された野生型線虫における１０−３希釈のジアセチルに対する化学走性（ｎ≧５）。誤差バーはＳＥＭを表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ダネット検定；†††Ｐ＜０．００１；ステューデントｔ検定。（Ａ）において、アステリスクは、いずれのニューロンも除去、阻害されていない野生型対照株と比較した、統計学的な有意差を示す。【００２３】
図２８は、種々のジアセチル濃度に対するＡＷＡニューロンの応答を示す図である。（Ａ）指示された遺伝子型の線虫における低濃度のジアセチル（１０−５希釈）による刺激後のＡＷＡニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はＳＥＭを表す（すべての遺伝子型についてｎ≧８）。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（Ｂ）低濃度のジアセチル（１０−５希釈）を添加してから１０秒後の平均蛍光変化。誤差バーはＳＥＭを表す。＊＊Ｐ＜０．０１、ダネット検定（それぞれの遺伝子型についてｎ≧８）。黒色はＷＴであり、赤色はｓｒｉ−１４変異体であり、青色はｏｄｒ−１０変異体である。（Ｃ）指示された遺伝子型の線虫における高濃度のジアセチル（１０−３希釈）による刺激後のＡＷＡニューロンのカルシウム応答。データは（Ａ）と同じく示される（すべての遺伝子型についてｎ≧８）。（Ｄ）高濃度のジアセチル（１０−３希釈）の添加から１０秒後の平均蛍光変化。誤差バーはＳＥＭを表す（すべての遺伝子型についてｎ≧８）。【００２４】
図２９は、種々のジアセチル濃度に対するＡＳＨニューロンの応答を示す図である。（Ａ）野生型線虫における低濃度（１０−５希釈）及び高濃度（１０−３希釈）のジアセチル刺激後のＡＳＨニューロンのカルシウム応答（ｎ≧１１）。（Ｂ）ｓｒｉ−１４変異体（ｎ＝２６）、ｏｄｒ−１０変異体（ｎ＝２８）、ｓｒｉ−１４ｃＤＮＡのＡＳＨ特異的発現を伴うｓｒｉ−１４変異体（ｓｒｉ−１４レスキュー、ｎ＝９）、及びｓｒｉ−１４をＡＳＨ特異的にＲＮＡｉした野生型線虫（ｎ＝２０）におけるＡＳＨニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はＳＥＭを表す。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（Ｃ）高濃度ジアセチル（１０−３希釈）を添加してから１０秒後の平均蛍光変化。誤差バーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５、ダネット検定（ｎ≧１１）。
図３０は、ｕｎｃ−１３変異体及びＡＷＡを破壊された線虫におけるＡＳＨニューロンのカルシウムイメージングの図である。野生型（Ａ，Ｎ＝１４）、ｕｎｃ−１３変異体（Ｂ，Ｎ＝１４）及びＡＷＡを破壊された線虫（Ｃ，Ｎ＝１１）における高濃度のジアセチル（１０−３希釈）刺激後のＡＳＨニューロンのカルシウム応答。ｕｎｃ−１３変異体及びＡＷＡを破壊された線虫では、野生型線虫ニューロンと比較して、大きく長時間持続するカルシウム応答が観察された。曲線の周囲の陰影領域はＳＥＭを表す。黒色バーは、ジアセチル刺激が存在したことを示す。（Ｄ）高濃度ジアセチルを添加してから１０秒後の平均蛍光変化。誤差バーはＳＥＭを表す。対照からの有意差は、（＊Ｐ＜０．０５、ダネット検定）によって示される。【００２５】
図３１は、ＡＷＣニューロンが高濃度ジアセチルの除去に応答することを示す図である。野生型における高濃度ジアセチル（１０−３希釈）の除去後のＡＷＣニューロンのカルシウム応答（Ｎ＝１０）。曲線の周囲の陰影領域はＳＥＭを表す。黒色バーは、ジアセチルが存在したことを示す。
図３２は、高濃度又は低濃度のジアセチルの除去に対するＡＷＢニューロンの応答を示す図である。（Ａ）野生型線虫（茶色、ｎ＝１０）又はＡＷＢニューロンにおいてｓｒｉ−１４を異所性に発現させた線虫（橙色、ｎ＝１１）における、低濃度（１０−５希釈、左）又は高濃度（１０−３希釈、右）のジアセチルの除去後のＡＷＢニューロンのカルシウム応答。曲線の周囲の陰影領域はＳＥＭを表す。黒色バーは、ジアセチルが存在したことを示す。（Ｂ）ジアセチルを除去してから１０秒後の平均蛍光変化。白色バー、野生型；橙色バー、ＡＷＢにおいてｓｒｉ−１４を異所性に発現させた株。誤差バーはＳＥＭを表示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ステューデントｔ検定（ｎ≧１０）。【００２６】
図３３は、匂いの濃度に依存した嗅覚受容体のスイッチのモデル図である。低濃度ジアセチルに対しては、ＡＳＨニューロンにおけるＳＲＩ−１４ではなく、ＡＷＡニューロンにおけるＯＤＲ−１０が、ジアセチル受容体として機能し、ＡＷＡの活性化及び誘引行動をもたらす。対照的に、高濃度ジアセチルは、ＡＳＨニューロンにおけるＳＲＩ−１４によって感知されるが、ＡＷＡニューロンにおけるＯＤＲ−１０によって感知されない。ＡＳＨニューロンは、高濃度ジアセチルによってだけ活性化され、忌避行動を誘導する。ＡＷＡも高濃度ジアセチルに応答するが、これは、ＯＤＲ−１０以外の嗅覚受容体がＡＷＡニューロンにおいて応答することを示す。
図３４は、Ｎ２株及び遺伝子変異株における各種癌患者の尿に対する走性を示す図である。
図３５は、Ｎ２株及び遺伝子変異株における各種化学物質に対する走性を示す図である。【００２７】
図３６は、嗅覚受容体ノックダウン株における乳癌患者の尿に対する走性を示す図である。
図３７は、線虫の走性テストにより癌種を特定する方法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
（１）癌の検出
本発明は、線虫を、被検者由来の生体関連物質又はその処理物の存在下で飼育し、例えば線虫の嗅覚による化学走性などを指標として癌を検出することを特徴とする癌の検出方法である。
本発明者は、被検者が癌であるか否かを検査するに際し、一態様として被検者由来のサンプルに対する線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの嗅覚による化学走性に注目した。
線虫であるセノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、以下「Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ」ともいう）は生物研究のモデル生物として、世界中の研究室で広く飼育、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易で、嗅覚が優れている特徴がある。
【００２９】
線虫は匂い物質に対して、寄る、逃げるといった化学走性を示すことから、本発明においては、この行動を指標として癌の匂いに対する線虫の反応を調べる。
健常者、及び癌患者の尿に対する線虫の反応を調べたところ、健常者の尿に対しては忌避行動を、癌患者の尿に対しては誘引行動を示し、３０検体を調べその精度は１００％であった（図１）。
また、早期癌を含む、胃癌、結腸・直腸癌、膵臓癌の全てに反応したことから、がん探知犬の行動と同じく、様々な癌に共通した、癌特有の匂いに反応している事が示された。
【００３０】
従って、本発明においては、胃癌、結腸・直腸癌、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、胆管癌、乳癌、悪性リンパ腫、消化管間葉性腫瘍、盲腸癌、肺癌などの癌種を検出の対象とすることができる。
この線虫を用いた癌診断システムは、以下の通り、従来の問題点の多くを解決できる。
【００３１】
（ｉ）早期癌を検出することが可能である。
ステージ０、１の早期癌についても、高精度で検出可能である。尿を採取した時点（２０１１年）で既存の腫瘍マーカーで陰性と判断された検体について、このテストでは陽性を示した。この患者は、経過観察中の２年間に癌を発症した。すなわち、既存の腫瘍マーカーでは検出できない癌を、本発明により検出することが可能である。
（ｉｉ）多種類の癌の存在を単一の検査で診断することができる。すなわち、一度の検診で多くの種類の癌について診断することができる。これまでのところ、胃癌、結腸・直腸癌、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、胆管癌、乳癌、悪性リンパ腫、消化管間葉性腫瘍、盲腸癌、肺癌について検出可能であることを確認している。
（ｉｉｉ）高感度である。
３０検体のテストでは１００％の感度・特異度で検出が可能であった。さらに、中規模テスト（２４２検体）を行っても、癌患者について１００％の感度・９５％の特異度で検出が可能であった。
【００３２】
（ｉｖ）サンプルの採取が容易である。
尿サンプルの採取には、食事制限などの特別な条件を定めておらず、通常の定期検診で採取した尿サンプルを用いて解析できる。このため、被検者は苦痛を伴わず、他の尿検査と同時にサンプル採取が可能である。必要な尿の量は数μｌで済む。
【００３３】
（ｖ）解析が安価で容易にできる。
（ｖ−１）早い
短時間で解析可能。線虫の化学走性の解析は、１時間半程度で行うことができる。トランスジェニック線虫を用いた嗅覚神経の応答の解析は、３０分程度で行うことができる。
（ｖ−２）安価
例えば、１検体あたり、線虫飼育用シャーレ２枚（１枚約１０円）、走性解析用シャーレ３〜５枚（１枚約１０円）。寒天はそれぞれのシャーレ１枚あたり、２．５円、１０円。その他試薬を合わせても、１検体あたり１００円程度。人件費を合わせても、非常に安価に解析できる。
（ｖ−３）解析が容易であり、専門的な技術は必要としない。
線虫の走性解析は非常に容易であり、誰でも行うことができる。線虫の飼育も容易である。線虫に対する特別な訓練は必要とせず、通常飼育した線虫を用いて解析することができる。
（ｖ−４）多検体の解析が可能
実験者１人当たり１日に１５０回程度の回数で走性解析を行うことができる。１検体あたり３回の走性を解析する場合、１日に５０検体を解析できる。この作業を自動化することも可能である。
【００３４】
（ｖｉ）実用化が容易、全世界で導入可能
（ｖｉ−１）システム全体が安価で導入しやすい
線虫の飼育に特別な部屋は必要ない。必要とする機器は、２０℃インキュベーターと実体顕微鏡のみであり、安価かつ短時間でシステムの構築ができる。
（ｖｉ−２）全世界に導入可能
高価な測定機器を必要としないことから、先進国だけでなく、全ての国に導入可能である。
【００３５】
（ｖｉｉ）癌治療後の再発診断に応用可能
全ての部位の癌を検出できることから、術後再発の可能性判断に応用できる。
以上より、本発明は、被検者の苦痛が少なく、操作を簡単かつ安価に行うことができ、多くの人を対象として実施可能であり高精度な新たな癌検診法として有用である。
【００３６】
（２）嗅覚受容体の同定
匂いは嗅覚神経上の嗅覚受容体によって受け取られる。ヒトには約３５０種の嗅覚受容体が存在し、約１万種の匂いを識別できると言われている。匂いの種類に対して圧倒的に少ない受容体において、どのようにして膨大な種類の匂いを識別できるのかは不明であることから、それを明らかにするため、匂いと受容体との対応関係を明らかにする必要がある。しかし、そのような試みは部分的にしか行われておらず、特に生体内における対応関係はほとんどわかっていなかった。
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは生体内での解析に優れ、嗅覚神経がわずか１０個程度（ヒトでは約５００万個）しかないことや、神経回路が全て同定されていること、さらには匂いを感じる仕組みが哺乳類とほぼ同じであることから、嗅覚研究のモデル生物であると考えられている。線虫の嗅覚受容体は哺乳類と同じ７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型であり、ゲノム上に１２００個以上あると予想されている。しかし、匂いとの対応関係が判明している受容体はわずか１個（ジアセチル受容体のＯＤＲ−１０）であり、匂いシグナルをどのようにして受容しているのかが不明であった。
【００３７】
そこで本発明者は、ＲＮＡｉにより線虫体内で嗅覚受容体遺伝子の機能を阻害し、その個体が１１種の匂いに対してどのような反応を示すかを調べる、網羅的スクリーニングを行った。匂いに対する反応に変化をもたらした遺伝子をピックアップし、解析を繰り返した。その結果、調べた匂い全てについて候補遺伝子を得ることに成功した（図２２Ｂ）。
【００３８】
次に、得られた候補遺伝子は本当に生体内で嗅覚受容体として機能しているのかどうかを明らかにするために、本発明者は同一の匂いでも濃度によって嗜好性（好き嫌い）が変化する現象に注目して、解析を進めることにした。ヒトでは、匂いの濃度によって嗜好性が変化することが経験的に知られており、例えばインドールは低濃度ではジャスミンの香り、高濃度では糞尿臭がする。線虫でも同様の現象が観察され、匂いの濃度によって活性化する嗅覚神経の種類が変化し、それによって嗜好性が変化することを、本発明者は先行研究により明らかにしている（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３，７３９（２０１２））。では、同一の匂いでも濃度によって反応する受容体が変化するのだろうか。この興味深い疑問について解析するために、本発明者は高濃度ジアセチルの受容に関わるものとして得られたｓｒｉ−１４遺伝子に着目した。ｓｒｉ−１４機能低下型変異体は、低濃度ジアセチルへの反応は正常であり、高濃度ジアセチルへの反応にのみ異常を示した。一方、既知のジアセチル受容体ＯＤＲ−１０の変異体は、低濃度のジアセチルへの反応のみ低下した（図２４Ａ）。ＯＤＲ−１０は好きな匂いを受容するＡＷＡ嗅覚神経で機能していることが既に報告されていたが（Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｅｌｌ  ８４，８９９−９０９（１９９６））、ｓｒｉ−１４の発現解析や表現型回復実験、神経特異的遺伝子発現阻害実験により、ＳＲＩ−１４は嫌いな匂いを受容するＡＳＨ感覚神経で機能していることがわかった（図２４）。またＳＲＩ−１４は嗅覚受容体が存在する感覚繊毛に局在が観察された（図２４Ｇ）。
【００３９】
ここで、遺伝子発現阻害実験は、例えばＲＮＡｉを利用した阻害、アンチセンス核酸を利用した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害などが挙げられるが、ＲＮＡｉを利用した阻害が好ましい。
【００４０】
次に、カルシウムイメージングを用いてＡＷＡ、ＡＳＨ感覚神経のジアセチルに対する応答を観察した。ＡＷＡ神経は低濃度、高濃度どちらのジアセチルにも応答したが、ｏｄｒ−１０変異体では低濃度ジアセチルへの応答が見られなかった（図２８）。ｓｒｉ−１４変異体では正常であった。一方、ＡＳＨ感覚神経は高濃度ジアセチルにのみ応答を示し、その応答はｓｒｉ−１４変異体で有意に低下した。ｏｄｒ−１０変異体では正常であった（図２９）。さらに、ｓｒｉ−１４をジアセチルに応答しない別の感覚神経ＡＷＢに異所的に発現させると、ＡＷＢが高濃度ジアセチルに強く応答するようになったことから（図３２）、ＳＲＩ−１４がジアセチル受容体として生体内で機能していることが強く示唆された。以上の結果から、同一の匂いでも濃度によって受容体が使い分けられており、低濃度ジアセチルはＡＷＡ神経にあるＯＤＲ−１０で受容して好きと感じ、高濃度ジアセチルはＡＳＨ神経にあるＳＲＩ−１４が受容して嫌いと感じることがわかった（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ７，ｒａ３９（２０１４））（図３３）。
【００４１】
線虫は、犬とほぼ同数の嗅覚受容体を持つ嗅覚の優れた生物であることから、麻薬探知犬のように有害な物質、有益な物質の匂いを感度良く認識している可能性がある。その場合、本研究の成果から、それらの匂いの受容体を同定することができる。匂いと受容体の対応関係がわかれば、その結合をモデルとした人工匂いセンサの開発が可能であると予想され、将来的に線虫を用いた嗅覚解析は広く社会に貢献するものとして有用である。
【００４２】
２．検出方法
（１）線虫
本発明の方法に用いる線虫は土壌自活線虫の一種であり、生物研究のモデル生物として広く研究に用いられている。本発明の方法に用いる線虫は、雌雄を問わないが、自家受精により増殖することができる点で雌雄同体のものが好ましい。また、本発明において使用する線虫は、シャーレの中で大腸菌を餌として飼育すればよく、飼育は容易である。親をシャーレに移しておけば、４日後には子供が産まれて成虫にまで成長し、５０〜１００倍に個体数が増える。その間、インキュベーターに入れて放置しておけばよく、特別な操作は必要ない。雌雄同体を使用する場合は、かけ合わせなどの操作も必要ない。飼育するのに必要な設備は２０℃インキュベーター及び実体顕微鏡であり、システムの立ち上げは短時間に、安価に行える。
【００４３】
本発明において使用される線虫としては、例えば野生型線虫の場合は、セノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）が挙げられ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｂｒｉｏｓｔｏｌ  Ｎ２株の雌雄同体を用いることが好ましいが、各種遺伝子を欠損した遺伝子変異株を用いることもできる。これらの線虫は、例えばＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＣ）より入手することができる。
本発明においては、上記線虫（野生型線虫）のほかに、変異型線虫やトランスジェニック線虫を用いることができる。トランスジェニック線虫には、線虫の嗅覚神経ＡＷＣ、ＡＷＡに、インディケーター遺伝子を導入した線虫、癌の匂いの受容に関わる遺伝子（受容体遺伝子）の発現または機能を阻害した線虫、癌の匂いの受容に関わる遺伝子（受容体遺伝子）を高発現または高機能化した線虫、線虫の行動解析を容易にするために各細胞に蛍光タンパク質を発現させた線虫などが例としてあげられるが、これらに限定されるものではなく、外来遺伝子を導入した全てのトランスジェニック株を対象とする。
【００４４】
本発明では、線虫の所定のプロモーターの直下に目的遺伝子を連結したＤＮＡを構築し、これを線虫の野生株や遺伝子変異株（例えば生殖腺）に微量注射する。これにより、外来遺伝子を安定的に継代できるトランスジェニック線虫を作製することができる。カルシウム濃度が上昇することは、神経が活性化したことを表すことから、例えば神経内カルシウム濃度を測定できるインディケーター遺伝子を用い、カルシウム濃度の変化を指標として癌を検出することができる。
【００４５】
ＡＷＣに発現させるために使用するプロモーターとしては、例えばｏｄｒ−１プロモーター（Ｙｕ，Ｓ．，Ａｖｅｒｙ，Ｌ．，Ｂａｕｄｅ，Ｅ．＆  Ｇａｒｂｅｒｓ，Ｄ．Ｌ．Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ：ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，３３８４−３３８７（１９９７）．）などが挙げられる。ｏｄｒ−１はＡＷＣとＡＷＢ（ＡＷＣとは別の嗅覚神経）に発現誘導する。
また、ＡＷＡに発現させるために使用するプロモーターとしては、例えばｏｄｒ−１０プロモーター（Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｐ．，Ｃｈｏｕ，Ｊ．Ｈ．＆  Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｉ．ｏｄｒ−１０ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｄｉａｃｅｔｙｌ．Ｃｅｌｌ  ８４，８９９−９０９（１９９６）．）が挙げられる。ｏｄｒ−１０はＡＷＡのみに発現誘導することが知られている。
【００４６】
これらのプロモーターの塩基配列情報は、例えばアクセッション番号Ｚ６８１１８、ＦＯ０８０９３１により得ることができる。また、プロモーターは線虫ゲノムＤＮＡを精製し、それを鋳型としてＰＣＲにより増幅して入手することも可能である。
カルシウムインディケーター遺伝子としては、Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ（ＹＣ）遺伝子（Ｎａｇａｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．＆  Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ（２＋）ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１０５５４−１０５５９（２００４）．）、ＧＣａＭＰ遺伝子（Ｎａｋａｉ，Ｊ．，Ｏｈｋｕｒａ，Ｍ．＆  Ｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ａ  ｈｉｇｈ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  Ｃａ２＋  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１３７−１４１（２００１）．）などが挙げられ、これらの遺伝子は、例えばアクセッション番号ＡＢ１７８７１２、ＨＭ１４３８４７により塩基配列情報を得ることができる。また、これらの遺伝子は、ａｄｄｇｅｎｅにより入手することも可能である。
【００４７】
プロモーター直下にインディケーター遺伝子を連結する方法やマイクロインジェクション法などは当分野において周知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））等を参照すればよい。あるいは、線虫の生殖腺にＤＮＡ溶液を注入するには公知手法により行うことができる（Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｄ．＆  Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １０，３９５９−３９７０（１９９１）．）。
変異型線虫は、例えば野生型線虫のゲノムに多型が生じた線虫、癌種それぞれの匂いに対する嗅覚受容体をを欠失した変異体などを意味する（後述の実施例において説明する）。
【００４８】
（２）被検者由来の生体関連物質又はその処理物
本発明において使用される試料は被検者（健常人、癌患者、癌が疑われる患者等、動物）由来の生体関連物質である。「生体関連物質」とは、被検者から採取された生体試料であり、例えば体液（尿、汗、唾液、便汁）、細胞（生検細胞等）、癌組織（生検組織、組織切片等）血液、呼気などが挙げられる。本発明においては、これらの生体試料そのものを使用することができるが、生体関連物質の処理物を使用することが好ましい。「処理物」とは、生体関連物質を物理的及び／又は化学的に処理したサンプルを意味する。
【００４９】
尿などの体液サンプルには固形物や沈殿物が含まれている。例えば尿は、採取されたものをそのまま用いることもできるが、細い管を通して線虫に与える必要があるので、フィルター除去処理を行うことが好ましい（例えばｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ０．２２μｍ，ＭｉｌｌｅｘＧＰ，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。このようなフィルターにより固形物の除去処理を施した尿サンプルは、上記「処理物」に含まれる。なお、本発明者は、予備実験により、フィルター処理によって線虫の反応（尿に対する誘引行動）が変化しないことを確認した（図９）。
上記と同様に、生体関連物質として細胞（例えば生検による癌細胞）を使用する場合は、細胞培養後の培養物から遠心分離やフィルタリング等により細胞破砕物などの固形物を除去し、固形物除去後の培養上清液を処理物として得る。
また、本発明においては、上記試料のほか癌細胞又は癌組織（生検組織、組織切片等）の保存液を使用することもできる。保存液としては、例えば生理食塩水、緩衝液、ホルマリン、ＤＭＳＯなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。保存液には凍結保存に一般に使用される凍結保存用保存液が含まれ、凍結保存後は、融解して使用することができる。
【００５０】
（３）線虫の嗅覚を利用した検出
まず、検出に必要な線虫を得るために増殖させる。
線虫（成虫）をシャーレ（大腸菌をまいたＮＧＭ培地）に数匹置いて、３〜６日、好ましくは４日間、１５〜２５℃、好ましくは２０℃で飼育する。これにより次の世代の線虫が３００〜５００匹程度、成虫まで育つ。
次に、実際に検査を行うためのシャーレを作製する。シャーレに図２のようなフォーマットを作成し、４点にアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を置く（添加する）。アジ化ナトリウムは線虫を麻酔して動かなくするためのものであり、添加量は１Ｍ濃度では０．２〜３μｌ、好ましくは０．５μｌである。
シャーレにまいた大腸菌を洗浄バッファーにより除き、シャーレに生体関連物質又はその処理物のサンプルを置く（添加する）。サンプルとして尿を使用する場合、尿サンプルは原液を使用することもできるが、採取された尿を例えば滅菌水、緩衝液等により１．５〜１０００倍に希釈してもよい。希釈倍率は１０倍であることが好ましい。シャーレに添加する尿サンプルは０．５〜１０μｌ、好ましくは１μｌである。
【００５１】
このようにして準備されたシャーレの中心に線虫を置く。
所定時間（１時間程度）線虫を飼育する（泳がせる）。室温は２３℃±１℃。
所定時間経過後、＋側の個体数、−側の個体数を数え、ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ（下記式）を計算する。＋側の個体数をＮ（＋）、−側の個体数をＮ（−）とすると、
ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ＝Ｎ（＋）−Ｎ（−）／全個体数
となる。
その後、正の応答又は負の応答を指標として、癌を検出する。
「正の応答」とは、線虫がサンプルに対して「好き」であること又は「興味ある」ことを意味し、「負の応答」とは、線虫がサンプルに対して「嫌い」であること又は「興味ない」ことを意味する。
化学走性を指標とする場合は、正の値（＋）は正の応答（正の化学走性、好き）、負の値（−）は負の応答（負の化学走性、嫌い）を表す。
【００５２】
ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘは＋１〜−１の値を取り、誘引された場合プラスの値を、忌避した場合マイナスの値を取る。
１検体あたり１回の解析でもよいが、複数回の解析を行い、ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘの値の平均値を計算することにより値の精度を高めることができる。解析により得られた値（複数回行ったときはその平均値）が正の値の場合、癌である又は癌のリスク（可能性）があると予備的に又は確定的に判断できる。「癌である」との判断は、例えば癌の確定診断又は予備的診断の補助資料として使用することができ、「癌のリスクがある」との判断は、例えば健康診断や癌の初診等において癌を疑うための補助資料として使用することができる。
【００５３】
線虫の匂いに対する反応は、化学走性以外の行動や生体反応を指標として検出することもできる。例えば、線虫が匂いの濃度が高くなる方向へ向きを変える風見鶏行動（Ｉｉｎｏ  ＆  Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００９）や、匂いの濃度が低くなると起こすターン行動（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９）、体の屈曲度（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００８）、神経の応答などが挙げられる。
風見鶏行動において、「正の応答」とは、線虫がサンプルの方向に向きを変えることを意味する。また、ターン行動においては、サンプルが高い濃度から低い濃度に変わったときにターンすると、線虫は「負の応答」をしたといえる。体の屈曲度の場合は、頭部と尾部の間の距離が長いと、「正の応答」をとったといえる。
【００５４】
（４）遺伝子組み換え線虫を利用した検出
（ｉ）遺伝子組み換え線虫を利用した検出についても、上記の通り行うことができるが、線虫の嗅覚神経ＡＷＣ、ＡＷＡに、神経内カルシウム濃度を測定できるインディケーター遺伝子を発現させたトランスジェニック線虫を用い、カルシウム濃度の変化（神経の応答）を指標として検出する。この方法は線虫数個体で解析することができるため、線虫の培養にかかるコストが低く、短時間で行うことができる利点がある。
インディケーター遺伝子としてＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ遺伝子を用いた時の測定原理を図３に示す。
測定に使用するインディケータータンパク質は、カルシウム結合タンパク質ＣａＭと、ＣａＭが結合するターゲットのＭ１３とをつなぎ、その両端にＣＦＰ、ＹＦＰをつないだ融合タンパクである（遺伝子にコードされており、遺伝学的に生体内で発現させることができる）。カルシウム濃度が低いときは、ＣａＭとＭ１３が離れており、ＣＦＰとＹＦＰも離れた位置にある（左図）。そのため、ＣＦＰを励起させる光を与えると、ＣＦＰから青い光が発せられる。一方、カルシウム濃度が高くなってＣａＭとＭ１３が結合すると、ＣＦＰとＹＦＰが近付き、両者の間で蛍光共鳴エネルギー移動（又はフェルスター共鳴エネルギー移動）（ＦＲＥＴ）が生じる。すると、ＣＦＰを励起する光を与えても、ＹＦＰから黄色い光が発せられるようになる（右図）。そこで、青い光、黄色い光を同時に計測し、その比を計算すれば、カルシウム濃度変化がわかる。
【００５５】
インディケーター遺伝子としてＧＣａＭＰ遺伝子を用いた時の測定原理を図４に示す。
インディケータータンパク質は、ＣａＭとＭ１３とをＧＦＰにつないだ構造をしている融合タンパク質である。このタンパク質も、遺伝子によりコードされており、遺伝学的に生体内で発現させることができる。カルシウム濃度が高くなってＣａＭと結合すると、ＧＦＰの蛍光強度が上昇する。そこで、ＧＦＰの蛍光を測定すれば、カルシウム濃度の変化がわかる。
本発明においては、被検者由来の生体関連物質又はその処理物に対して、線虫の嗅覚神経の応答が大きいとき、すなわちカルシウム濃度変化が大きいときは、被検者は癌である、又は癌のリスクがあると判定する。ここで、「嗅覚神経の応答が大きいとき」及び「カルシウム濃度変化が大きいとき」における「大きいとき」とは、対照（健常人由来の生体関連物質又はその処理物）と比較して、被検者由来の生体関連物質又はその処理物を刺激として与えた時の、蛍光強度比（ｒａｔｉｏ＝ＹＦＰ／ＣＦＰ）の変化、あるいはＧＦＰの蛍光強度変化が有意に大きいことを意味する。
【００５６】
（ｉｉ）嗅覚神経にカルシウムインディケーターを発現させた線虫個体を、樹脂製（例えばジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）樹脂製）のチップに入れる（図５）。図５では、ＰＤＭＳ樹脂製のチップに、線虫を挟み込む部分と、４つの流路が形成されている。
潅流装置（ＷＰＩ社。Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＰＳ−２等）で１〜４の流路を切り替えることにより（図６）、尿刺激のＯＮ、ＯＦＦを行う（Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ａ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，６３−７０（２００７）；Ｃｈｒｏｎｉｓ，Ｎ．，Ｚｉｍｍｅｒ，Ｍ．＆  Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｉ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４，７２７−７３１（２００７）．）。
【００５７】
図６は、チップ内での流路の切り替えを示す図である。流路１、２及び４にバッファー、流路３に尿を入れておく。流路２及び３は常にＯＮにしておく。流路１がＯＮで、流路４がＯＦＦの時は、線虫に尿刺激は当たらない。流路１をＯＦＦ、流路４をＯＮにすると、線虫に尿刺激が与えられる。
ＡＷＣ嗅覚神経は「匂いあり」→「なし」で反応する神経であるため（嗅覚−ＯＦＦ反応）、尿がある状態からない状態に変化させた時の反応を見る。ＡＷＡ神経はその反対に、「匂いなし」→「あり」に反応する神経であるため（嗅覚−ＯＮ反応）、尿がない状態からある状態に変化させた時の反応を見る。
ところで、健常者の尿でも線虫の嗅覚神経は弱く反応するため、コントロールの尿（健常者の尿）を用意し、同じ線虫個体にコントロール尿、検体尿を順番に与えて、その反応の強さの違いにより、癌の検出を行うことが好ましい。
【００５８】
（ｉｉｉ）蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ３０００Ｂ等）を用いて、対物レンズ（４０倍）で蛍光画像を取得する。画像の取得は、例えば２００ｍｓごとに行うが、顕微鏡、レンズなどにより適宜変更することができる。Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎの場合は、２波長の画像を分けて取得する必要があるので、カメラは、同時に２波長の画像を取得できるカメラ、例えばＯＲＣＡ−Ｄ２  ｄｉｇｉｔａｌ  ｃａｍｅｒａ（浜松ホトニクス）であることが好ましい（他にも同様の機能を持つカメラが販売されている）。ＧＣａＭＰの場合１波長の画像を取得できればよいので、ＧＦＰ画像を取得できる一般的な顕微鏡用カメラがあればよい。
【００５９】
（ｉｖ）取得画像について、嗅覚神経の細胞体（最も変化が見えやすい部位）をＲＯＩ（注目領域）として囲み、各ピクセルごとの蛍光強度をソフトウェア（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して全ての計算と映像作成を行う。なお、各社から販売されている他のソフトも使用可能である。Ｙｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎの場合、各ピクセルごとのＹＦＰ／ＣＦＰ  ｒａｔｉｏを計算し、ＲＯＩ内での平均値を計算する。また、ＧＣａＭＰの場合、ＲＯＩ内での蛍光強度の平均値を計算する。
【００６０】
３．受容体の同定
本発明においては、線虫を用いて匂いの受容体の同定を行うことを特徴とする、線虫における匂いの受容体の同定方法を提供する。
本発明の同定方法は、受容体をコードする遺伝子の発現又は機能を阻害し、当該阻害された線虫における匂いに対する反応を検査する工程を含む。
嗅覚受容体遺伝子の発現又は機能阻害は、前記の通りＲＮＡｉを利用した阻害、アンチセンス核酸を利用した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害などが挙げられるが、ＲＮＡｉを利用した阻害が好ましい。
【００６１】
受容体遺伝子の発現を阻害した線虫を用いて、各種癌由来の試料の匂いに対する反応を検査する。ある癌種によって匂いに対する反応がない場合は、受容体は当該癌種の匂いに対する受容体であると判断することができる。
また、同定される受容体の種類は、又は匂い物質の濃度に依存して異なる。従って、どの濃度の試料に対して反応するかを検査し、高濃度の試料に対する受容体、及び低濃度の試料に対する受容体を同定することができる。
【００６２】
嗅覚系は、様々な匂い物質を感知し、応答する。嗅覚受容体は、大部分の生物において、Ｇタンパク質（ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質）結合型受容体であり、揮発性又は可溶性匂い物質に直接結合する。哺乳動物のゲノムと比較して、線虫シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノムは、より多くの推定上の嗅覚受容体遺伝子を含み、これは、線虫において、受容体−匂いの関係に対して、組み合わせ的な複雑さが存在し得ることを示唆している。本発明者は、特定の匂い物質に対する応答に必要とされる線虫の嗅覚受容体を同定するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）スクリーニングを用いた。このスクリーニングにより、１１個の匂い物質に関連付けられた１９４個の候補嗅覚受容体遺伝子を同定した。さらに、本発明者は、高濃度のジアセチルの感知に関与するものとしてＳＲＩ−１４を同定した。レスキュー及びニューロン特異的なＲＮＡｉ実験により、ＳＲＩ−１４が、特定の化学感覚ニューロンであるＡＳＨニューロン（嫌いな匂いや化学物質を受容する線虫の感覚神経）において機能し、忌避応答をもたらすことを実証した。カルシウムイメージングにより、ＡＳＨニューロンは高濃度ジアセチルに対してのみ応答し、一方、別の種類の化学感覚ニューロンであるＡＷＡニューロン（主に好きな匂いを受容する線虫の嗅覚感覚神経）は、低い濃度と高い濃度の両方に反応することを示した。ＳＲＩ−１４の機能の喪失は、高濃度ジアセチルに対するＡＳＨの応答を妨げ、一方、ＯＤＲ−１０の機能の喪失は、低濃度ジアセチルに対するＡＷＡの応答を減少させた。ＳＰＩ−１４を異所的に発現している化学感覚ニューロンは、高濃度のジアセチルに対して応答した。したがって、線虫は、嗅覚受容体レベルと感覚ニューロンレベルで分別される、濃度依存的な匂い感受性機構を有する。
【００６３】
一般に動物は、それらの嗅覚系を通じて様々な匂い物質を感知し、応答する。匂い物質は、その大部分は揮発性化合物であり、嗅覚受容体ニューロン（ＯＲＮ）によって感知される。ＯＲＮにおいて、匂い分子は、嗅覚受容体に直接結合し、次に、細胞内シグナル伝達経路を介して情報を伝達する（１）。哺乳動物において、嗅覚受容体は、７回膜貫通型Ｇタンパク質（ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質）結合型受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーの一員であり（２）、ただ１つの嗅覚受容体型が任意の個々のＯＲＮに存在する（３）。しかしながら、匂いと受容体の対応関係の同定を目的とした各種研究にもかかわらず、個々の匂いと受容体の関係は、ほとんどが未知のままである（４，５）。味（味覚（ｇｅｓｔａｔｉｏｎ））は類似したプロセスであるが、可溶性化学物質の検出に関与する。
【００６４】
線虫シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）は、匂い（ｓｍｅｌｌ）及び味に関連した化学感覚プロセスの分析（嗅覚、揮発性シグナルの検出、及び味覚、可溶性シグナルの検出）に用いられるモデル生物であり、化学物質に応答することが知られている、約１３個の感覚ニューロンを通じて、多数の化学刺激（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｕｅ）を感知し、応答する（６，７）。便宜上、本発明者は、嗅覚としてこの化学感覚プロセス、及び匂い物質として化学物質に言及する。線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムは、ＧＰＣＲをコードする１２００を超える推定上の嗅覚受容体遺伝子を含むことが予測され、ＧＰＣＲは化学感覚ニューロンのうち１１個において発現が見られる（８）。これらの所見は、嗅覚とは異なるが（３）、哺乳動物おける味認識（１０）に類似した、それぞれのＯＲＮにおいて複数タイプの嗅覚受容体（９）が発現している可能性があることを示している。しかしながら、受容体と匂い物質又は他の化学物質の関係が、ジアセチルに特異的な受容体であるＯＤＲ−１０（１１）及びフェロモン受容体（ＧＰＣＲでもある（１２〜１４））についてのみ同定されているだけであり、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＯＲＮにおける受容体のこれらの組合せによってどのようにして匂い物質が感知されるかは知られていない。
【００６５】
多くの動物と同様に、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）もまた、特定の匂い物質に嗜好性を示し、それらをＡＷＡ又はＡＷＣ嗅覚ニューロンによって感知したとき、匂い物質に対する誘引行動（ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示し、ＡＷＢ、ＡＳＨ、又はＡＤＬ感覚ニューロンによって物質を感知したとき、忌避行動を示す（６，１５，１６）。しかしながら、いくつかのニューロンは、忌避行動と誘引行動の両方に関与しており、例えば、ＡＷＢニューロンが該当する（１６）。本発明者らは、これまでに、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における、同一の匂い物質に対する誘引応答又は忌避応答が、匂い物質の濃度に依存することを示した（１７）。これは、同一の匂い物質でも濃度によって異なる嗅覚受容体が機能するという可能性をもたらす。
【００６６】
ここでは、本発明者は、ジアセチルの異なる濃度を異なる嗅覚受容体が媒介し、それによって嗜好性が変化することを示した。匂い−受容体対をスクリーニングすることによって、本発明者は、１１個の匂い物質に対して、１９４個の候補嗅覚受容体遺伝子を同定した。これらのうち、本発明者は、高濃度のジアセチルに特異的に応答するものとしてＳＲＩ−１４を同定した。本発明者の結果は、ジアセチルの受容について、ＡＷＡニューロンにおけるＯＤＲ−１０は低濃度に対して誘引応答を媒介し、ＡＳＨニューロンにおけるＳＲＩ−１４は高濃度に対して忌避応答を媒介することを示した。
【００６７】
４．癌種の特定
本発明においては、線虫走性テストにより癌種を特定することが可能となる。従って、本発明においては、被検者由来の生体関連物質又はその処理物の匂いに対する線虫の反応を指標として癌種を同定することを特徴とする癌種の同定方法を提供する。
【００６８】
癌探知犬の研究から、癌種によって匂いが異なると予想されている。そこで、線虫において、癌種それぞれの匂いに対する嗅覚受容体を同定し、その受容体を改変した改変体を作製する。改変体には、受容体遺伝子が欠失した株（欠失変異体）、受容体遺伝子の発現または機能を阻害した株、受容体遺伝子を高発現または高機能化した株などが挙げられる。
欠失変異体の作製法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｖｉａ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３）などが挙げられる。また、受容体遺伝子の発現または機能を阻害した株、受容体遺伝子を高発現または高機能化した改変線虫を作製する。発現又は機能を阻害するには、ＲＮＡｉを利用した阻害、アンチセンス核酸を利用した阻害、ドミナントネガティブ型変異遺伝子の発現による阻害などが挙げられる。受容体遺伝子を高発現または高機能化するには、受容体遺伝子のプロモーターをタンデムに連結する方法、エンハンサーを導入する方法、受容体遺伝子を多コピー導入する方法、受容体の匂いやＧタンパク質との結合部位に改変を加える方法、受容体の活性化や局在、匂いとの親和性を制御する部位に改変を加える方法などがある。
【００６９】
本発明の同定方法は、例えば以下の工程を含む。
（ａ）まずＳＴＥＰ１として、前記本発明の検出方法により癌を検出する。例えば、Ｎ２株を用いて、癌種の有無を検査する。
（ｂ）次に、ＳＴＥＰ２として、各癌種の受容体の変異体や受容体遺伝子の発現、機能を変化させた株を用いて、癌種を特定する。
前記工程（ａ）において癌であることが検出された試料について、前記同定された嗅覚受容体を欠失させた変異体線虫や受容体遺伝子の発現、機能を変化させた株を用いて、匂いに対する反応を検査する。
（ｃ）前記改変体線虫と、前記工程（ａ）で使用した線虫との間で匂いに対する反応が異なるときは、同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
例えば、前記変異体線虫や受容体遺伝子の発現または機能を阻害した線虫のうち匂いに対する反応を示さなかった線虫において同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。あるいは、受容体遺伝子を高発現または高機能化した線虫のうち匂いに対する反応が亢進した線虫において同定された受容体に対応する癌種を、同定の対象癌種であると判定する。
例えば、大腸癌の匂いの受容体変異体が誘引行動を示さない場合、大腸癌であると判断（診断）できる（図３７）。
【００７０】
５．キット及びシステム
本発明は、線虫を含む癌の検出用キットを提供する。本発明のキットには線虫が含まれるが、本発明の検出方法を実施するために必要な１種以上の成分を含めることができる。このような成分としては、例えば緩衝液、培養液、アジ化ナトリウム、大腸菌、シャーレ、寒天などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。また、本発明のキットには、検出法又は同定法を説明した使用説明書を含めることができる。
また、本発明は、線虫と、生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部と、前記収容部の線虫の行動を探知する探知部とを備える癌の検出システムを提供する。
【００７１】
図１６Ａは、本発明のシステムのブロック図である。図１６Ａにおいて、本発明のシステムは生体関連物質又はその処理物及び前記線虫を収容する収容部３０と、前記収容部３０の線虫の匂いに対する反応を探知する探知部１０と、探知された情報を処理する処理部２０とを有する。さらに、本発明のシステムは、前記処理部２０で処理されたデータを保存する保存部４０を備えることができる。保存部４０には、癌検出のためのプログラムやデータベースが備えられている。
収容部３０は、シャーレ、培養皿、マイクロ流路を有するチップなどが例示されるが、線虫及び試料を収容できる限り限定されるものではない。
本発明のシステムは、線虫の少なくとも１匹の動画像をリアルタイムで撮影することができる少なくとも１つの探知部１０を含む。探知部１０は線虫の画像、個体数、動きの軌跡等のデータを取得するデバイスであり、顕微鏡又はカメラ、例えば蛍光顕微鏡、デジタル顕微鏡、デジタルビデオカメラなどを備える。顕微鏡及びカメラには、線虫の動きを追随できる自動追尾（追跡）システムを備えることができ、線虫１匹ごとに又は複数匹を同時に追跡する。そして、その軌跡から線虫の移動距離を測定する。あるいは、所定のエリアに集合している線虫を撮影し、個体数を数える。また、顕微鏡及びカメラには、蛍光強度を検出できるセンサーを備えることもできる。
本発明のシステムでは、リアルタイムの画像により線虫の動きを測定することも、静止画像（写真）を用いて線虫の動きを測定することもできる。リアルタイムで線虫の画像を撮影すると、線虫の位置を動的に探し求めることが可能である。
【００７２】
図１６Ｂは、本発明のシステムの処理部２０の構成図である。処理部２０は、計算手段１１０とデータベース１２０から構成され、計算手段１１０は、（ｉ）検査条件設定手段１１１、（ｉｉ）線虫の反応検査手段１１２、（ｉｉｉ）癌の判定手段１１３、及び（ｉｖ）検査結果表示手段１１４を備える。
【００７３】
（ｉ）検査条件設定手段１１１
検査条件設定手段１１１は、ＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）により、計算に必要な条件を、マウスやキーボードから入力するための手段であり、入力された情報は、グラフにより確認することができる。
検査条件設定手段により、本発明のシステムに、検査目的に応じて所定の条件を記憶させておくことができる。条件として、例えば、線虫の個体数、線虫の特徴、ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘの採否、測定時間などがある。
線虫の特徴は、欠失変異体であること、遺伝子発現等を阻害した株であること、測定のために蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子等）が導入されたことなどが含まれる。但し、条件はこれらに限定されるものではなく、検査目的に応じて適宜設定することができる。
【００７４】
（ｉｉ）線虫の反応検査手段１１２
線虫の反応検査手段１１２は、検査条件設定手段１１１又はデータベース１２０から癌を検出又は同定するための計算式（例えばｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ）を選択するとともに、それぞれの計算式に基づいて、線虫の反応を計算する手段である。この手段では、所定エリア内の線虫の個体数の測定、１匹の線虫が動いた総距離の測定、１匹の線虫が発する蛍光強度の検出などを行い、被検サンプルに反応した線虫の行動を記録する。例えば、１匹の線虫に着目してサンプルに誘引されて移動したときの距離を測定し、各線虫の移動距離を合算して総和を求める。あるいは、線虫に蛍光タンパク質遺伝子を導入したときは、サンプルに反応した線虫の蛍光強度を測定する。これも１匹の線虫あたりの蛍光強度を測定して線虫の総和を求めてもよく、一定のエリアに集まった線虫全体から発する蛍光強度を、エリア単位で測定することもできる。
【００７５】
（ｉｉｉ）癌の判定手段１１３
癌の判定手段１１３は、線虫の匂いに対する反応をもとに癌の有無を検出し、又は癌の種類を同定する手段である。
検査条件として個体数を採用した場合、対照のエリアに移動した線虫の個体数に対し、検査対象エリアに移動した線虫の個体の比又は差などを求める。検査条件として移動距離を採用した場合、対照の線虫の移動距離と比較して何％多ければ反応したか、その差又は比を求めることができる。予めこの差又は比の一定値を境界値として設定しておけば、この境界値は癌の判定の判断基準として使用される。また、検査条件として蛍光強度を採用した場合は、対照の線虫の蛍光強度と比較して何％多ければ反応したといえるか等、上記移動距離と同様に境界値を設定することができる。
測定されたデータと、境界値と、サンプル情報（癌種の情報等）とを対比して、所定の癌であるかどうかを判定する。
【００７６】
（ｉｖ）判定結果出力手段１１４
判定結果出力手段１１４は、検出又は同定された癌種又は癌の有無に基づいてその情報を出力する手段であり、癌種及びその確率（リスク）を表示する。表示はグラフでも表でもよい。上記（ｉｉ）により計算された線虫の行動のアニメーションを表示することもできる。
【００７７】
（ｖ）データ蓄積手段
入力された検査条件と検査結果は、関連付けられてデータ蓄積手段としてデータベース１２０に保存される。
保存された検査条件と計算結果は、再度データベース１２０から、あるいは検査条件設定手段１１１と判定結果表示手段１１４から読み込むことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７８】
癌の検出
（ｉ）線虫の飼育
野生型線虫Ｎ２の成虫を６ｃｍシャーレ（大腸菌をまいたＮＧＭ培地）に５〜６匹置き、４日間、２０℃で培養した。次の世代の線虫を３００〜５００匹程度、成虫まで育てた。
（ｉｉ）走性解析
９ｃｍシャーレに図２に示すフォーマットを作成し、４点にアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）を０．５μｌずつ置いた。
線虫飼育プレートにｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍｌをかけ、浮いてきた線虫をｂｕｆｆｅｒごとチューブに回収した。しばらく置いておくと線虫が下に沈むので、沈んだところで上清を廃棄した。さらにチューブにｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍｌを入れ、線虫が下に沈んだところで上清を廃棄した。この洗浄を３回繰り返し、大腸菌を除去した。【００７９】
９ｃｍシャーレの「＋」のところに、滅菌水により１０倍に薄めた尿サンプルを１μｌずつ置いた。
次に、シャーレの中心に線虫を１００匹程度置き、１時間線虫を飼育した（泳がせた）。室温は２３℃±１℃で行った。
１時間後、＋側の個体数、−側の個体数を数え、ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘを計算した。
１検体あたり、５回解析を行い、５回分のｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘの値の平均値を計算した。【００８０】
（ｉｉｉ）結果
結果を図１に示す。図１より、健常者由来の対照の尿（ｃ１〜ｃ１０）はすべて負（−）のｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ（忌避反応）を示したのに対し、癌患者由来の尿（ｐ１〜ｐ２０）はすべて正（＋）のｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎｄｅｘ（誘引）を示し、１００％の精度で癌を検出することができた。
なお、図１においてエラーバーはＳＥＭを表す。
【実施例２】
【００８１】
カルシウムイメージング
マイクロ流路を用いたイメージング実験においては、尿サンプルは薄いチューブ中に流す必要があることから、尿中の沈殿物及び固形物を遠心及びろ過により除去した（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ０．２２μｍ，ＭｉｌｌｅｘＧＰ，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＡＷＣ及びＡＷＡニューロンをモニターするため、それぞれｏｄｒ−１及びｏｄｒ−１０プロモーターによりＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ遺伝子（ＹＣ３．６０）を神経細胞に発現させた。カルシウムイメージングは、公知方法で行った（Ｕｏｚｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｑｕｉｃｋ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２，５００（２０１２）；Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｃｈｏｉｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｎｆｌｉｃｔｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ，ＧＣＹ−２８，ａｎｄ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＳＣＤ−２，ｉｎ  ＡＩＡ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３１，３００７−３０１５（２０１１））。【００８２】
線虫の頭部をマイクロチャンネルの外に出すことができるように、線虫をマイクロチャンネルに固定した（図５）。対照の尿及び癌患者由来の尿のそれぞれについて、同一の線虫を用いて反応を試験した。
ＹＣ３．６０の蛍光画像は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ３０００Ｂ顕微鏡（４０倍対物レンズ）及びＯＲＣＡ−Ｄ２デジタルカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて取得した。すべての画像は、露光時間２００ｍｓで取得した。ＡＷＣ又はＡＷＡ神経のＣＦＰ及びＹＦＰの蛍光強度を取得し、ＣＦＰの蛍光強度に対するＹＦＰの蛍光強度の比について、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）により解析した。この蛍光強度比は、ＹＦＰ強度／ＣＦＰ強度（＝Ｒ）として計算し、１０−ｓウインドウの比の平均（−１０−０ｓ）をＲ０としてセットした。【００８３】
癌患者由来の尿に対し、線虫のＡＷＣ及びＡＷＡ嗅覚神経の反応を試験した結果を図７、８に示す。
図７において、左２つのパネルは対照尿、右２つのパネルは胃癌患者由来の尿を用いて試験した結果である。図７はＡＷＣ嗅覚神経の尿刺激（尿あり→なし）に対するカルシウム濃度変化（Ｙｅｌｌｏｗ  ＣａｍｅｌｅｏｎのＹＦＰ／ＣＦＰ  ｒａｔｉｏ変化）を示す図である。健常者の尿（対照）と比較して、癌患者の尿に対して有意に強く反応した。図８は平均の蛍光強度比（ＹＦＰ／ＣＦＰ  ｒａｔｉｏ）の変化量を表す。＊＊＊はｐ＜０．００１で有意であることを示す。
なお、本実施例において尿中の沈殿物及び固形物は遠心分離及びろ過により除去したが、この処理によって線虫の化学走性には影響しなかった（図９）。
ＡＷＡ嗅覚神経についても、尿の添加により応答が観察された（図１０、１１）。【００８４】
これらの結果は、対照の尿と癌患者由来の尿とを識別するために線虫の嗅覚神経が重要な役割を果たしていることを示すものであり、図７〜１１より、線虫の嗅覚神経を利用して癌を検出できることを示すものである。なお、図８、９及び１１において、エラーバーはＳＥＭを表す。
【実施例３】
【００８５】
本実施例では、被検者由来の生体関連物質のモデルとして、樹立された癌細胞株、及び培養培地又は保存液を用い、癌の検出実験を行った。
（１）癌細胞株を用いた癌の検出
ヒト癌細胞の培養上清を用いた癌の検出を行うため、大腸癌（結腸直腸癌）細胞としてＳＷ４８０、ＣＯＬＯ２０１及びＣＯＬＯ２０５、乳癌細胞としてＭＣＦ７、胃癌細胞としてＮＵＧＣ４、ＭＫＮ１及びＭＫＮ７を用いた。
ＳＷ４８０，ＣＯＬＯ２０１及びＣＯＬＯ２０５は独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢセルバンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｏｋｙｏ，ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏ．ｇｏ．ｊｐ））から入手し、それ以外の細胞は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｅｎｄａｉ，Ｊａｐａｎ））から入手した。すべての細胞株は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２エアレーション下でコンフルエントではない状態で維持した。培地上部の清澄な層の培養液を試験に用いた。細胞を培養した後の培地は、アッセイプレート（図１２）の「＋」の位置にスポットした。培地自体の匂いによる影響を無くすために、細胞を培養した培地のスポット位置とは反対側の位置に、同じ濃度で希釈した対照の培養液をスポットした（図１２）。【００８６】
実施例１と同様にアッセイプレート上で線虫の化学走性を試験した結果、野生型線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、癌細胞の培養培地（１／１０６〜１／１０７に希釈）に対して誘引行動を示した（図１３）。
図１３中、各細胞における左側のバーは１／１０６希釈、右側のバーは１／１０７希釈の癌細胞培養培地を用いた結果である。また、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１で有意であることを表す（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）。また、図１３中、エラーバーはＳＥＭを表す。【００８７】
線維芽細胞（ガン化されていない細胞）の培養液又は保存液についても上記と同様に試験した結果、線虫は誘引行動を示さない（弱い忌避）ことが示された（図１３）。このことは、「人間の細胞の分泌物」に線虫は誘引行動を示しているわけではなく、「癌細胞の分泌物」に誘引行動を示すことを意味する。
ＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩは培地のみ。ＫＭＳＴ−６、ＣＣＤ−１１２ＣｏＮは線維芽細胞（入手先はそれぞれＲＢＣ、ＡＴＣＣ）。【００８８】
（２）線維芽細胞培養培地及び癌細胞培養培地に対する走性
また、様々な濃度の線維芽細胞培養培地及び癌細胞培養培地に対する走性、並びに人間の癌組織に対する線虫の走性を検討した。手法は以下の通り。
線維芽細胞培養培地及び癌細胞培養培地を水で各種濃度（原液〜１０−９）に薄め、それに対する野生型線虫の化学走性を観察した。人間の癌組織、健常組織についてはインフォームドコンセプトを得た上で癌患者から切除し、それを直径０．１〜０．８ｍｍに細分して使用した。
その結果、繊維芽細胞についてはいずれの濃度でも誘引行動は示さないのに対し、癌細胞については１０−６、１０−７の濃度で有意な誘引行動が観察された（図１７、１８）。【００８９】
人間の癌組織に対する線虫の走性については、癌組織片に対して誘引行動を示すのに対し、同じ患者の健常組織（癌組織から最も離れた組織）に対しては忌避行動を示した（図１９）。片側に癌組織、反対側に健常組織を置くと、癌組織の方に線虫が寄ることも分かった。【００９０】
（３）癌組織切片の生理食塩水保存液に対する走性
人間の癌組織片を生理食塩水に入れて−２０℃で保存した（保存期間：３か月）。その生理食塩水の希釈液に対する線虫の走性を検討した。
癌患者からインフォームドコンセプトを得た上で癌組織を直径０．５ｃｍ切除し、２０ｍｌの生理食塩水に入れた。その生理食塩水を水で１０−２〜１０−４の濃度に薄め、それに対する野生型線虫の化学走性を観察した。
その結果、癌組織を入れた生理食塩水に対しては誘引行動を示すのに対し、健常組織を入れた生理食塩水に対しては忌避行動を示した（図２０）。
ｏｄｒ−３変異体は癌組織の食塩水に誘引行動を示さないことから、線虫は匂いを感じていると言える。
【実施例４】
【００９１】
中規模試験
本発明の方法が高精度であることを確認するため、２４２個の尿サンプル（２１８の対照サンプル、２４の癌患者由来のサンプル）を用いて試験を行った（表１）。表１は被検者の背景を示す。
【表１】
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【００９２】
すべての尿サンプルは１０倍に希釈し、線虫を用いた化学走性試験は、各サンプルについて３回実施した。【００９３】
その結果、線虫は癌患者由来のすべての尿（２４／２４）に対して誘引反応を示し、検出感度は１００％であった（図１４）。他方、線虫は、ほとんどの対照尿サンプル（２０７／２１８）に対して忌避行動を示した（図１４）。図１４において、オレンジのバー（１，２，４１，４４，５４，５６，９０，１５７，１９６，２０２，２０８，２１３，２２０，２２６，２３２−２３９及び２４１−２４２番）は癌患者由来のサンプル、青いバー（上記以外の番号）は対照サンプルを示す。また、図１４中、エラーバーはＳＥＭを表す。
本発明者はまた、同じ被検者について、他の腫瘍マーカーについても解析した。
解析対象となる腫瘍マーカーとして、血清ＣＥＡ、血清抗ｐ５３抗体（Ａｎｔｉ−ｐ５３Ａｂ）及び尿Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミン（ＤｉＡｃＳｐｍ）を用いた。これらの腫瘍マーカーと比較して、本発明の方法（ＮＳＤＴ）による感度は極めて高かった（図１５、表２）。なお、感度（％）は、癌患者由来のサンプルに対する陽性の割合である。
【表２】
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表２には、ステージ０及び１の癌患者が含まれている。このことは、本発明の方法は、早期癌の検出にも有用であることを意味している。
【実施例５】
【００９４】
尿の最適濃度の検討
方法：
健常者の尿サンプル３検体（ｃ１、ｃ２、ｃ３）、癌患者の尿サンプル５検体（ｐ２、ｐ５、ｐ８、ｐ１７、ｐ１８）について水で各種濃度（原液〜１０−５）に薄め、それらに対する野生型線虫の化学走性を調べた。【００９５】
結果：
図２１より、１０倍希釈が好ましいことが示された。図２１において、各濃度に記載の棒グラフは、左側３本のグラフが健常者由来の尿、右側５本のグラフが癌患者由来の尿を用いたときの結果を示す。
【実施例６】
【００９６】
受容体の同定
（１）材料及び方法
線虫培養及び線虫株
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＯＰ５０とともに培養したｅｒｉ−１変異体を除いて、食物源として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＡ２２を含む線虫増殖培地（ＮＧＭ）プレート（３６）上で、標準的な条件下で２０℃にて培養した。使用した野生型線虫は、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｎ２株であった。他の線虫株として、ＧＲ１３７３：ｅｒｉ−１（ｍｇ３６６）、ＶＣ２１２３：ｓｒｉ−１４（ｏｋ２８６５）、ＣＸ３４１０：ｏｄｒ−１０（ｋｙ２２５）、及びＭＴ７９２９：ｕｎｃ−１３（ｅ５１）を用いた。【００９７】
ＲＮＡ干渉及び化学走性アッセイ
ＲＮＡｉアッセイは、Ａｈｒｉｎｇｅｒライブラリー（３７）を用いて、ｅｒｉ−１（ｍｇ３６６）（１９）に対して、餌によるＲＮＡｉ法（ｆｅｅｄｉｎｇ  ＲＮＡｉ法）によって行った。
９個体のｅｒｉ−１変異体の成虫を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（０．１９ｇ／Ｌ）、アンピシリン（６０ｍｇ／Ｌ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むＮＧＭプレート上に置き、４日間培養した。次に、成虫を化学走性アッセイに使用した。化学走性アッセイは、以前に報告されているように行った（６，１７）。化学走性アッセイについて、本発明者は、それぞれ１μｌの１０−３若しくは１０−４希釈された匂い物質（低濃度）、又はそれぞれ１及び５μｌの未希釈の匂い物質（高濃度）を使用したそれぞれの実験において、３０〜５０個体を用いた。
ＲＮＡｉスクリーニング結果の統計分析は以下のように行った。
すべての日（表３）又は毎日の、２ＳＤからのそれぞれの単一試験のｚスコアと対照値を計算した。大きな差としての閾値としてｚスコア（−１．９６及び１．９６、Ｐ＜０．０５）を用いた。しかしながら、１つの受容体の阻害が顕著な効果を引き起こさないようであった。したがって、本発明者は、より弱い閾値としてｚスコア±１（−０．９６及び０．９６、Ｐ＜０．３３）を用いた。【００９８】
浸透圧忌避
本発明者は、浸透圧刺激のために４Ｍ  ＮａＣｌを用い、浸透圧忌避行動について以前に報告されているようにアッセイした（３８）。【００９９】
ｓｒｉ−１４の機能の細胞特異的ノックダウン
特異的ニューロンにおけるｓｒｉ−１４の機能をノックダウンするための導入遺伝子の構築は、以前に報告されているように行った（２４）。ｓｒｉ−１４の標的領域（１．６ｋｂのゲノム配列）を以下の２つのプライマーを用いて増幅した。
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遺伝子発現は、ＡＳＨについてはｓｒａ−６（２０）プロモーターによって、及びＡＷＣについてはｃｅｈ−３６（３９）とｓｒｄ−１７プロモーターによって行った。【０１００】
ニューロンの遺伝的除去及び阻害
本発明者は、ＡＷＡ、ＡＷＢ、ＡＷＣ、及びＡＳＨニューロンの除去のためにマウスのカスパーゼ−１（ｍＣａｓｐ１）を用いた。これらは、それぞれ、ｏｄｒ−１０（１１）、ｓｔｒ−１（１５）、ｃｅｈ−３６（３９）、及びｓｒａ−６（２０）プロモーターによって発現させた。また、介在ニューロンの阻害のためにｕｎｃ−１０３（ｇｆ）を用いた。ｕｎｃ−１０３（ｇｆ）のＡＩＡ−、ＡＩＢ−、ＡＩＹ−、又はＡＩＺ−特異的発現は、それぞれ、ｇｃｙ−２８．ｄ（２９）、ｎｐｒ−９（４０）、ｔｔｘ−３（４１，４２）、又はｌｉｎ−１１（４３，４４）プロモーターによって行った。【０１０１】
ｓｒｉ−１４ｃＤＮＡの調製及び増幅
ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡミニキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて単離された全量ＲＮＡは、製造業者の指示書に従って、ｇＤＮＡＲｅｍｏｖｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いたＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲマスターミックスによってｃＤＮＡに変換した。ｓｒｉ−１４ｃＤＮＡを下記の２つのプライマーを用いて増幅し、ＮｈｅＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＰＤ−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
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【０１０２】
カルシウムイメージング
ＡＷＡ、ＡＷＢ、ＡＷＣ、及びＡＳＨニューロンの応答をモニターするために、本発明者は、それぞれ、ｏｄｒ−１０、ｓｔｒ−１、ｏｄｒ−３、及びｓｒａ−６プロモーター（１１，１５，２０，４５）を用いて、ＹＣ３．６０を発現する株を作製した。カルシウムイメージングは、以前に報告されているように（３３，４６，４７）、マイクロ流体デバイスを用いて行われた。マイクロ流体デバイスを用いた実験について、線虫の鼻が、ジアセチル［１０−５希釈（低濃度）と１０−３希釈（高濃度）］又は匂いのない溶液を含む流水に曝露されるように、マイクロチャネルに線虫を捕捉することによって、それぞれの線虫を固定した。室温は２０℃から２３℃に設定した。ＹＣ３．６０の蛍光画像は、４０×対物レンズと３ＣＣＤデジタルカメラ（Ｃ７７８０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２を用いて得た。すべての画像は、露光時間を２００ｍｓにして回収した。ＡＷＡ、ＡＷＢ、ＡＷＣ、及びＡＳＨ細胞体のタイムスタックを捕捉し、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウエア（ｖｅｒ．２．６、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）とシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）の発光比について分析した。この比は、ＹＥＰ強度／ＣＦＰ強度（Ｒ）として計算され、１０秒ウィンドウ（−１０〜０秒）における平均比は、Ｒ０として設定した。【０１０３】
（２）結果
匂い−受容体対のＲＮＡ干渉スクリーニング
特定の匂い物質に対する応答に必要とされる嗅覚受容体を網羅的に同定するために、本発明者は、システマティックＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）スクリーニングを行った。線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるニューロンのＲＮＡｉは、ＲＮＡｉに対する線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ニューロンの低感受性のため（１８）、野生型線虫においては有効でないことから、ＲＮＡｉ増強型線虫株ｅｒｉ−１（ｍｇ３６６）（１９）を用いた。【０１０４】
本発明者は、ｅｒｉ−１変異体におけるＲＮＡｉによってｏｄｒ−１０のノックダウンが、低濃度（１０−３希釈）のジアセチルに対する応答に特定の欠陥を引き起こすことを示し、この線虫株が、嗅覚受容体遺伝子のＲＮＡｉスクリーニングに効果的に使用され得ることを確認した（図２２）。ＳＲＨファミリーを含む、８２２個の推定上の嗅覚受容体をコードする遺伝子（全ての遺伝子がＧＰＣＲをコードする）をスクリーニングした。そして、１１個の匂い物質に対する、ＲＮＡｉ処理された線虫の応答を試験した。線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、匂い物質の濃度に依存して嗜好性が変化し得るため（１７）、さらに、高濃度（未希釈の匂い物質のそれぞれ１μｌと５μｌ）の匂い物質（低濃度では誘引行動を引き起こす）に対する応答も試験した。匂い物質は、低濃度の６つの誘引物質（６）、高濃度で忌避を誘導する３つの高濃度誘引物質（１７）、及び高濃度の２つの忌避物質（６，２０）を含むものとした（図２２）。【０１０５】
匂い物質に対する化学感覚誘導性の運動応答に異常を示したＲＮＡｉ処理線虫株については繰り返し試験した（材料及び方法を参照）（表３）。第三次スクリーニングの結果、１９４個の推定上の嗅覚受容体をコードする遺伝子を標的とするＲＮＡｉは、１つ又は複数の匂い物質に対して、対照よりも弱い応答を引き起したことから、嗅覚受容体候補をコードするものと考えられた（図２２及び表４）。
感覚ニューロンに発現する遺伝子は嗅覚受容体として働く可能性があることから、これらの遺伝子の発現パターンを調べた。
本発明者は、個々の嗅覚受容体をコードする遺伝子のプロモーターに連結された蛍光リポーターを用いて、ノックダウンしたときに化学感覚誘導性の運動において重大な欠陥を示した、１６個の推定上の嗅覚受容体をコードする遺伝子の発現パターンを分析した（図２２Ｃ及び図２３、Ａ〜Ｌ）。さらに、１９個の嗅覚受容体遺伝子の発現パターンは、ＷｏｒｍＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｍｂａｓｅ．ｏｒｇ）に記載されている情報を用いた。これらの３５個の遺伝子のうち、３０個はニューロンにおいて発現した。リポーター発現によって分析した１６個の遺伝子のうち１５個は、匂い感覚に関与する感覚ニューロンにおいて発現した（表５）。【０１０６】
高濃度のジアセチルに応答する嗅覚受容体ＳＲＩ−１４の同定
ＯＤＲ−１０はジアセチル受容体であり、ｏｄｒ−１０変異体は、低いジアセチル濃度に対する化学走性に欠陥がある（１１）。従来報告されているように（１１）、本発明者は、ｏｄｒ−１０変異体が高濃度ジアセチルに対して、正常な化学走性を示すことを確認した（図２４Ａ）。これは、ジアセチルに対して他の受容体が存在し、ＯＤＲ−１０が低濃度に特異的である可能性がある（２１）ことを示唆している。ＲＮＡｉスクリーニングによって、５つの嗅覚受容体候補遺伝子（ｓｒｈ−２５、ｓｒｈ−７９、ｓｒｈ−２１６、ｓｒｈ−２８１、及びｓｒｉ−１４）が高濃度ジアセチルに関与するものとして得られた（表３及び図２５）。そこで本発明者は、上流のプロモーターを用いて発現解析を行ったところ、ｓｒｈ−７９及びｓｒｈ−２１６の発現は検出できず、ｓｒｈ−２５及びｓｒｈ−２８１の発現は、高濃度のジアセチルに対する忌避行動に関与していないＡＤＬ感覚ニューロンにおいて観察された（表５）。したがって、様々な受容体が、どのようにして単一の匂い物質に対して濃度依存の反応を生じさせているのかを理解するために、本発明者はｓｒｉ−１４に注目することにした。これは、この遺伝子を標的とするＲＮＡｉが、高濃度ジアセチルからの忌避において有意に大きな欠陥を引き起こしたためである（図２４Ｂ）。【０１０７】
ＳＲＩ−１４は、７つのエキソンを有する遺伝子によってコードされ、ＷｏｒｍＢａｓｅによれば、ｏｋ２６８５は、機能欠損であることが予測される欠失変異体である（図２６Ａ）。ＳＲＩ−１４の予想アミノ酸配列（配列番号５）によると、タンパク質が推定上の７回膜貫通型ドメインを有することがわかった（図２６、Ｂ及びＣ）。高浸透圧条件下でのｓｒｉ−１４（ｏｋ２８６５）変異体の行動分析は、線虫が正常な高浸透圧忌避行動を示すことを示した。しかしながら、ｓｒｉ−１４変異体は、ｓｒｉ−１４  ＲＮＡｉ処理された線虫と同じく、高濃度のジアセチルに対して忌避応答の欠陥を示した（図２４Ａ）。さらに、ｏｄｒ−１０変異体と比較して、ｓｒｉ−１４変異体は、高濃度ジアセチルに特異的な化学走性の欠陥を示した（図２４Ａ）。ｓｒｉ−１４変異体は、他の忌避物質及び高濃度の他の誘引物質に対して正常な応答を示した（図２４Ｃ）。これは、調べた匂い物質のうち、ＳＲＩ−１４は高濃度ジアセチルの感知にのみ関与することを示している。【０１０８】
リポーター発現解析により、ｓｒｉ−１４がＡＷＣ及びＡＳＨ化学感覚ニューロンにおいて発現していることがわかった（図２４Ｄ）。ＡＷＣニューロンは、１０倍希釈したジアセチルを含む多数の誘引物質の感知に必要とされ（２２，２３）、ＡＳＨニューロンは、忌避物質（９）及び高濃度のイソアミルアルコール（１７）の忌避に関与する。ＳＲＩ−１４が、高濃度のジアセチルに応答してＡＷＣ又はＡＳＨニューロンにおいて機能するかを明らかにするために、本発明者は、ＡＷＣ及びＡＳＨニューロンにおいて、ｓｒｉ−１４のニューロン特異的ノックダウンを行った（２４）。ｓｒｉ−１４のＡＳＨ特異的ノックダウンは、ジアセチルからの忌避において欠陥を引き起したが、ＡＷＣ特異的ノックダウンでは異常が現れなかった（図２４Ｅ）。【０１０９】
さらに、高濃度ジアセチルからの忌避におけるｓｒｉ−１４変異体の欠陥は、ｓｒｉ−１４ｃＤＮＡのＡＳＨ特異的発現によってレスキューされたが、ＡＷＡ、ＡＷＢ、又はＡＷＣ嗅覚ニューロンにおける特異的発現によって、部分的にレスキューあるいはレスキューされなかった（図２４Ｆ）。これらの結果は、ＡＳＨ感覚ニューロンにおけるＳＲＩ−１４の機能が、高濃度ジアセチルからの忌避を媒介するために必要かつ十分であることを示している。高浸透圧条件に対する忌避応答は、ＡＳＨニューロンによって媒介され（２５，２６）、この応答は、ｓｒｉ−１４変異体において正常であり（図２６Ｄ）、ＡＳＨニューロンが他の忌避刺激の感知と応答は正常であったことを示している。加えて、ＳＲＩ−１４−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質は、ＡＳＨニューロンの感覚繊毛に局在した（図２４Ｇ）。これは、ＳＲＩ−１４が、ＡＳＨにおける感覚繊毛における嗅覚シグナリングの因子として機能することを示している。【０１１０】
匂い物質の濃度に依存した嗜好性変化に関与する感覚ニューロン及び介在ニューロンの同定
低濃度のジアセチル（１０−４希釈溶液）はＡＷＡニューロンによって感知され（６）、中間濃度（１０−１希釈溶液）はＡＷＣニューロンによって感知される（２２，２３）。これらはともに誘引を媒介する。しかしながら、どの感覚ニューロンが、高濃度のジアセチル（未希釈）を感知し、忌避応答に関与するかは知られていない。以前の研究において、ＡＳＨ及びＡＷＢ感覚ニューロンは、高濃度イソアミルアルコール（１７）を検出し、忌避を媒介することが示されている。さらに、ＡＷＣ及びＡＷＢニューロンは、誘引と忌避の両方に関与する（１７，２７）。【０１１１】
そこで本発明者は、高濃度ジアセチルに対する忌避応答におけるＡＳＨ、ＡＷＢ、及びＡＷＣ感覚ニューロンの関与を調べた。ＡＷＢ又はＡＷＣが遺伝的に除かれた線虫は、高濃度ジアセチルに応答した化学走性の欠陥を示さなかった（図２７Ａ）。しかしながら、ＡＳＨニューロンを除去すると、この忌避行動が阻害された（図２７Ａ）。これらの結果は、主にＡＳＨニューロンが、高濃度ジアセチル濃度を感知したことを示し、これは、ＳＲＩ−１４がＡＳＨニューロンにおいて機能することを示す結果と一致している。【０１１２】
ＡＷＡニューロンがジアセチルの忌避及びジアセチルに対する誘引を媒介するのかどうかを調べるために、本発明者は、ＡＷＡニューロンが特異的に除かれた線虫の行動応答を分析した。ＡＷＡを除かれた線虫は、高濃度ジアセチルからの忌避の低下（図２４Ａ）、および低濃度に対する誘引の低下を示した（図２７Ｂ）。これは、誘引と忌避の両方に機能するＡＷＣとＡＷＢニューロンの能力に類似している（１７，２７）。ＡＷＡとＡＳＨの両方の二重除去は、単一の除去よりも重大な欠陥を引き起し、これは、ＡＷＡとＡＳＨが高濃度ジアセチルに対する応答について、並行して働いていることを示している（図２７Ａ）。【０１１３】
匂いの濃度に依存した嗜好性変化への介在ニューロンの貢献を明らかにするために、本発明者は、ＡＷＡ若しくはＡＳＨ感覚ニューロン又は両方の感覚ニューロンに直接のシナプス結合又はギャップ結合を有するＡＩＡ、ＡＩＢ、ＡＩＹ、及びＡＩＺ介在ニューロンの関与を調べた（図２７Ｃ）。これらの介在ニューロンを、過分極をもたらすｕｎｃ−１０３（ｇｆ）のニューロン特異的発現によって個別に阻害した（２８，２９）。ＡＩＡ、ＡＩＹ、又はＡＩＺ介在ニューロンの機能的阻害は、高濃度ジアセチルに曝露された線虫において忌避から誘引へと応答を変化させ（図２７Ｄ）、ＡＩＢの阻害は、忌避応答を弱めた。この結果は、これらの介在ニューロンが、匂いの濃度依存的な嗜好性変化において重要な役割を果たすことを示しており、ＡＩＢ、ＡＩＹ、及びＡＩＺが高濃度及び低濃度のイソアミルアルコールに対する異なった行動応答に重要であるという以前の報告と一致している（１７）。対照的に、低濃度のジアセチルに対する誘引は、ＡＩＹを除くこれらの介在ニューロンの阻害によって影響されなかった（図２７Ｅ）。これは、低濃度ジアセチルに対する誘引を媒介する神経回路が、高濃度ジアセチルからの忌避を媒介する神経回路と異なることを示唆している。【０１１４】
匂い濃度に依存した嗅覚受容体の使い分け
本発明者による線虫の行動実験の結果と従来の研究結果（１１）は、ジアセチルに対する濃度依存的な嗜好性変化が、２つのタイプの受容体、ＡＷＡニューロンにおけるＯＤＲ−１０とＡＳＨニューロンにおけるＳＲＩ−１４によって媒介されることを示唆している。そこで本発明者は、野生型株、ｏｄｒ−１０変異体、及びｓｒｉ−１４変異体において、遺伝的にコードしたカルシウム指示薬であるＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ（ＹＣ）３．６０（３０）を用いたカルシウムイメージングによって、様々な濃度のジアセチルに対するＡＷＡ及びＡＳＨニューロンの応答をモニターした。【０１１５】
野生型線虫又はｓｒｉ−１４変異体におけるＡＷＡニューロンは、細胞内カルシウムが低濃度のジアセチルに曝露後に増加した（２９）（図２８、Ａ及びＢ）。しかしながら、ｏｄｒ−１０変異体は低濃度ジアセチルに応答を示さなかった（図２８、Ａ及びＢ）。これは、ＯＤＲ−１０がＡＷＡニューロンにおいて低濃度ジアセチルに特異的な受容体として機能するという所見と一致している（２１）。対照的に、ｏｄｒ−１０変異体及び野生型線虫において、ＡＷＡニューロンが、高濃度のジアセチルに対して正常に応答した（図２８、Ｃ及びＤ）。これらの結果は、ｏｄｒ−１０変異体が高濃度ジアセチルに対して正常な化学走性を示した所見と一致している（図２４Ａ）。これらのニューロンの除去が誘引と忌避応答の両方を減少させたため（図２７、Ａ及びＢ）、これらの結果と合わせると、ＯＤＲ−１０以外の受容体がＡＷＡニューロンに存在し、高濃度ジアセチルを感知することが示唆される。【０１１６】
本発明者は、ＡＳＨニューロンにおける一過性Ｃａ２＋応答をモニターした。野生型線虫のＡＳＨニューロンにおいては、高濃度のジアセチルにのみＣａ２＋応答が検出された（図２９Ａ）。高濃度ジアセチルに対するＡＳＨの応答が他のニューロンによって影響を受けるかどうかを明らかにするために、本発明者は、シナプス小胞のエキソサイトーシスに欠損を有する、ｕｎｃ−１３（ｅ５１）変異体のＡＳＨにおけるＣａ２＋応答を解析した（３１）。ｕｎｃ−１３変異体のＡＳＨニューロンにおける高濃度のジアセチルに対するカルシウム応答は、野生型線虫のＡＳＨニューロンよりも有意に大きく、長続きした（図３０、Ａ，Ｂ，及びＤ）。これは、他のニューロンからのシグナルがジアセチルに対するＡＳＨの活性を阻害していることを示している。【０１１７】
ＡＷＡ除去線虫では、ジアセチルに対する応答が変化することが観察されたため（図２７、Ａ及びＢ）、さらに本発明者は、ＡＳＨニューロンにおける高濃度のジアセチルに対するカルシウム応答におけるＡＷＡ除去の効果を試験し、ＡＷＡニューロンの除去がＡＳＨニューロンのカルシウム応答を増強させることを見出した（図３０、Ａ，Ｃ，及びＤ）。これは、ＡＷＡがＡＳＨの応答の抑制性回路に関与することを示すものである。
次に、本発明者は、変異線虫のＡＳＨニューロンにおける高濃度ジアセチルに対するＣａ２＋応答をモニターした。Ｃａ２＋応答は、ｏｄｒ−１０変異体のＡＳＨニューロンでは正常に引き起こされたが、ｓｒｉ−１４変異体のＡＳＨニューロンにおいては応答が有意に減少した（図２９、Ｂ及びＣ）。ｓｒｉ−１４変異体のＡＳＨにおける高濃度ジアセチルに対する応答の欠陥は、野生型ｓｒｉ−１４遺伝子のＡＳＨ特異的発現によってレスキューされた（図２９、Ｂ及びＣ）。さらに、野生型線虫においてＡＳＨ特異的にｓｒｉ−１４をノックダウンすると、高濃度のジアセチルに対するＡＳＨのＣａ２＋応答が減少した（図２９、Ｂ及びＣ）。これらの結果は、ＳＲＩ−１４が、ＡＳＨニューロンにおいて高濃度ジアセチルの受容のための主要なコンポーネントとして機能することを示している。【０１１８】
ｓｒｉ−１４の発現がＡＷＣニューロン並びにＡＳＨニューロンにおいて観察されたため（図２４Ｄ）、本発明者は、高濃度のジアセチルに対するＡＷＣ応答をモニターした。ＡＷＣにおけるＣａ２＋濃度の増加は、匂い除去により生じる（３２）。したがって、本発明者は、高濃度のジアセチルの除去後にＡＷＣニューロンの応答を試験し、ＡＷＣニューロンにおいてＣａ２＋応答が起こることを見出した（図３１）。この結果は、ジアセチルがＡＷＣ及びＡＷＡによって感知されるという以前の報告と一致している（２２，２３）。しかしながら、ＡＷＣの除去は、高濃度ジアセチルからの忌避に影響を及ぼさなかった（図２７Ａ）。これは、ＡＷＣニューロンの応答がジアセチルの忌避に重要でないことを示している。高濃度のジアセチルに対する行動応答はｓｒｉ−１４のＡＷＣ特異的発現又はｓｒｉ−１４のＡＷＣ特異的ノックダウンのいずれによっても影響がなかったため（図２４、Ｅ及びＦ）、高濃度ジアセチルに対するＡＷＣの応答を媒介するＳＲＩ−１４以外の受容体が存在していると考えられる。【０１１９】
ＡＷＢニューロンは、一般的に、忌避行動と関連付けられる（１５）。以前の研究では、ＡＷＢニューロンにおけるＣａ２＋応答がノナノン又は高いイソアミルアルコール濃度の除去後に生じることが報告されたため（１７、３３）、本発明者は、ＡＷＢニューロンにおいてｓｒｉ−１４ｃＤＮＡの異所性発現を行い、様々な濃度のジアセチルに対するＣａ２＋応答をモニターした。
野生型ＡＷＢニューロンにおいて、本発明者は、低濃度又は高濃度のジアセチルのいずれにおいても匂いの除去後僅かなＣａ２＋応答を観察した。野生型ＡＷＢニューロンにおけるこの弱い応答と比較して、高濃度ジアセチルの除去に対するＡＷＢニューロンにおけるＣａ２＋応答は、ＳＲＩ−１４の異所性発現によって有意に増強した。ＳＲＩ−１４異所性発現は、低濃度のジアセチルの除去に対する応答は変化させなかった（図３２、Ａ及びＢ）。この結果は、ＳＲＩ−１４が、高濃度のジアセチルの感知に寄与するという我々の結論を支持している。合わせて、これらの所見は、ＡＷＡニューロンにおけるＯＤＲ−１０及びＡＳＨニューロンにおけるＳＲＩ−１４が、それぞれ低濃度及び高濃度ジアセチルに応答して、誘引及び忌避行動を媒介する受容体として機能することを示唆している（図３３）。【０１２０】
（３）考察
本発明者は、特定の匂い物質について嗅覚受容体を網羅的に同定するためにＲＮＡｉスクリーニングを用いた。線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、嗅覚受容体及び嗅覚シグナリングが哺乳動物のものと類似しているため（２３，３４）、嗅覚解析のためのモデル生物と考えられている。さらに、嗅覚シグナルが神経回路において伝達される経路を辿ることができる全神経ネットワークが記述されている（３５）。しかしながら、大部分の匂い物質は、特定の受容体又は受容体オリゴマーとの対応関係がわかっておらず、匂い物質と嗅覚受容体の間の相互作用の機構は知られていない。結論として、どのようにして匂いシグナルがインプットされるか、どのようにして嗅覚シグナルが神経回路上を伝達されるか、どのようにして線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における少数のＯＲＮが非常に多くの匂い物質を識別し得るのかについて理解されていない。ＲＮＡｉスクリーニングによって得た受容体候補のさらなる解析は、特定の匂い物質に関する嗅覚受容体を同定し、これらの機構の理解を与えるために役立つ。【０１２１】
本発明者は、異なる感覚ニューロンが匂い濃度に依存して機能することを以前に報告した（１７）。この研究において、本発明者は、ジアセチルの受容について、ＯＤＲ−１０及びＳＲＩ−１４が、特定のＯＲＮ内の低濃度又は高濃度に特異的な受容体としてそれぞれ機能することを見出した（図３３）。ＳＲＩ−１４が、ＯＤＲ−１０よりもジアセチルに対して低い親和性を有する可能性が推測される。しかしながら、これらの受容体は、匂い物質認識部位内に相同配列性を有しておらず、異なる濃度の同じ化学物質を区別するこれらの受容体の能力の基盤となる機構は未知のままである。【０１２２】
カルシウムイメージング実験は、ＡＷＡ感覚ニューロンが低濃度及び高濃度のジアセチルの両方に応答することを示した。ＡＷＡニューロンの遺伝的除去は、高濃度ジアセチルからの忌避および低濃度ジアセチルに対する誘引の両方で欠陥を引き起こした。これらの結果は、ＡＷＡニューロンが広範囲の濃度に対してジアセチルを検出し、異なる濃度に対して反対の行動を引き起こすのに寄与することを示唆している。これらの所見、並びにＡＷＢニューロン（１６）及びＡＷＣニューロン（２６）に関して以前に報告された所見は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のこれらのＯＲＮが誘引行動と忌避行動の両方を媒介し得ることを示している。ＯＤＲ−１０がＡＷＡニューロンに存在し（１１）、ｏｄｒ−１０変異体は低濃度のジアセチルに対する誘引が低下したが、高濃度のジアセチルに対する忌避は正常であったことから、ＡＷＡニューロンが、特に、高いジアセチル濃度に対して、複数のジアセチル受容体を有することが示唆される。【０１２３】
本発明者がＲＮＡｉスクリーニングにおいて得た、ＳＲＩ−１４以外の高濃度ジアセチルに対する受容体候補が存在する。これらの他の候補の解析は、他のジアセチル受容体の同定、匂いの濃度に応じて異なる受容体が働く戦略の追加をもたらす可能性がある。
【表３】
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【０１２４】
表３．ｓｒｈ嗅覚受容体ファミリー遺伝子のＲＮＡｉスクリーニングの生データ。第一次（Ａ）、第二次（Ｂ）、及び第三次（Ｃ）のスクリーニングにおけるｓｒｈファミリー遺伝子についてＲＮＡｉ処理した線虫の１１個の匂い物質に対する化学走性インデックス。１１個の匂い物質は、低濃度の６つの誘引物質［イソアミルアルコール（Ｉａａ）、ベンズアルデヒド（Ｂｚ）、ブタノン（Ｂｕ）、ペンタンジオン（Ｐｄ）、ピラジン（Ｐｚ）、及びトリメチルチアゾール（Ｔｍｔ）］、２つの忌避物質［ノナノン（Ｎｏｎａ）及びオクタノール（Ｏｃｔ）］、並びに高濃度の３つの誘引物質［イソアミルアルコール（高Ｉａａ）、ベンズアルデヒド（高Ｂｚ）、及びジアセチル（高Ｄａ）］を含んでいる。青色、橙色、及び緑色の陰影は、それぞれ、同日の対照値、すべての日の対照値の平均、及びこれらの両方と比較した統計差を示す（材料及び方法を参照）。
【表４】
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【０１２５】
表４．１９４個の候補嗅覚受容体遺伝子のＲＮＡｉスクリーニングの生のデータ。第三次スクリーニング後に全１９４個の嗅覚受容体候補遺伝子が得られた。この表は、第一次、第二次、及び第三次スクリーニングにおけるこれらの遺伝子についてＲＮＡｉ処理した線虫の化学走性インデックスを示す。いくつかの遺伝子は、複数の匂い物質の感知に関与することが示された。
【表５】
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【０１２６】
表５．３５個の受容体候補遺伝子の発現パターン及び関連した匂い物質。感覚ニューロンだけを名称によって列挙している。他のニューロンは、一群のいくつかのニューロンとして列挙している。解析遺伝子の発現写真については図２３を参照されたい。ボールド体の遺伝子は、除いた場合、ジアセチルに対する化学感覚応答性をもたらしたニューロンにおいて（リポーター遺伝子発現に基づいて）発現が見られたもの。Ｂｕ、ブタノン；Ｂｚ、ベンズアルデヒド；Ｄａ、ジアセチル；Ｉａａ、イソアミルアルコール；Ｎｏｎａ、ノナノン；Ｏｃｔ、オクタノール；Ｐｄ、ペンタンジオン；Ｐｚ、ピラジン；Ｔｍｔ、トリメチルチアゾール。
【実施例７】
【０１２７】
本発明者は、各地で採取したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ株において上記実施例を行ったところ、各種癌患者由来の尿に誘引行動を示さない株が見出された。この株のゲノム配列を調べたところ、ゲノム上に多くの１塩基置換を有することが判明した。
そこで本実施例においては、野生株とともに上記遺伝子変異株を用いて、癌検出の精度を検討した。【０１２８】
方法：
乳癌、食道癌、胆管癌、直腸癌、盲腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、消化管間葉性腫瘍の癌患者の尿サンプル、健常者の尿サンプル、中規模実験で偽陽性を示した健常者の尿サンプルについて、野生株、遺伝子変異株の化学走性を調べた。【０１２９】
結果：
遺伝子変異株は、ほとんどすべての癌種の尿に誘引行動を示さなかった（図３４）。
遺伝子変異株は、他の匂いに対しては正常な走性を示すことから、基本的な嗅覚は働いていると言える。従って、遺伝子変異株には癌種の匂いを受容する受容体に欠損があると予想される（図３５）。
また、遺伝子変異株は偽陽性サンプルには正常に誘引行動を示す。従って、野生株（Ｎ２株）で陽性を示したサンプルについて遺伝子変異株で解析し、遺伝子変異株で陰性となったときは癌と診断し、遺伝子変異株で陽性となったときは偽陽性と診断することができる。従って、遺伝子変異株を用いると、癌検出の精度を高めることができる（図３５）。
【実施例８】
【０１３０】
各癌種の匂いの受容に関わる受容体候補の同定
次世代シークエンサー（イルミナ社）を用いて、実施例７で得られた遺伝子変異株の全ゲノムを解読し、Ｎ２のゲノム配列と比較し、変異のある受容体遺伝子を探索した。【０１３１】
その結果、受容体遺伝子に強い変異が入っていた（表６）。
【表６】
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【０１３２】
これらの遺伝子について、嗅覚神経ＡＷＣ特異的ＲＮＡｉ（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｇｅｎｅ  ３９５，１７０−１７６，２００７）によりノックダウンし、各癌種の尿に対する走性を測定した。
その結果、癌種により、反応する受容体が異なることが分かった。
これにより、線虫走性テストにより癌種を特定することが可能となる。
受容体ノックダウン株における乳癌患者の尿に対する走性を調べた結果を図３６に示す。【０１３３】
癌探知犬の研究から、癌種によって匂いが異なると予想されている。そこで、線虫において、癌種それぞれの匂いに対する嗅覚受容体を同定し、その受容体を欠失した変異体を作製する。変異体の作製法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｖｉａ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３）などが挙げられる。
まず、ＳＴＥＰ１として、Ｎ２株を用いて、癌種の有無を検査する。
次に、ＳＴＥＰ２として、各癌種の受容体の変異体を用いて、癌種を特定する。例えば、大腸癌の匂いの受容体変異体が誘引行動を示さない場合、大腸癌と診断できる（図３７）。【０１３４】
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２６．Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５５，５２９−５３８（１９９０）．
２７．Ｍ．Ｔｓｕｎｏｚａｋｉ，Ｓ．Ｈ．Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ａ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｓｗｉｔｃｈ：ｃＧＭＰ  ａｎｄ  ＰＫＣ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｏｄｏｒ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５９，９５９−９７１（２００８）．
２８．Ｄ．Ｊ．Ｒｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｗｅｉｎｓｈｅｎｋｅｒ，Ｈ．Ｔｉａｎ，Ｊ．Ｈ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｊ．Ｍｉｗａ，Ｔ．Ｇｒｕｎｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｌｅｂｏｅｕｆ，Ｌ．Ｒ．Ｇａｒｃｉａ，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｕｎｃ−１０３−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｅｒｇ−ｌｉｋｅ  Ｋ（＋）ｃｈａｎｎｅｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ．２０，４１−６６（２００６）．
２９．Ｙ．Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．Ｔａｂａｔａ，Ｔ．Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｔ．Ｈｉｒｏｔｓｕ，Ｄ．Ｄ．Ｉｋｅｄａ，Ｍ．Ｔｓｕｎｏｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｎｏ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｉ．Ｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｃｈｏｉｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｎｆｌｉｃｔｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ，ＧＣＹ−２８，ａｎｄ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ＳＣＤ−２，ｉｎ  ＡＩＡ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３１，３００７−３０１５（２０１１）．
３０．Ｔ．Ｎａｇａｉ，Ｓ．Ｙａｍａｄａ，Ｔ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｍ．Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ（２＋）ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，１０５５４−１０５５９（２００４）．
３１．Ｊ．Ｅ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｗ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｍ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，ＵＮＣ−１３  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２，９５９−９６４（１９９９）．
３２．Ｓ．Ｈ．Ｃｈａｌａｓａｎｉ，Ｎ．Ｃｈｒｏｎｉｓ，Ｍ．Ｔｓｕｎｏｚａｋｉ，Ｊ．Ｍ．Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｒａｍｏｔ，Ｍ．Ｂ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ａ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，６３−７０（２００７）．
３３．Ｈ．Ｉ．Ｈａ，Ｍ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ｙ．Ｓｈｅｎ，Ｃ．Ｖ．Ｇａｂｅｌ，Ｃ．Ｆａｎｇ−Ｙｅｎ，Ｙ．Ｑｉｎ，Ｄ．Ｃｏｌｏｎ−Ｒａｍｏｓ，Ｋ．Ｓｈｅｎ，Ａ．Ｄ．Ｓａｍｕｅｌ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ａｖｅｒｓｉｖｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６８，１１７３−１１８６（２０１０）．
３４．Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，２９５−３０１（２００６）．
３５．Ｊ．Ｇ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ，Ｊ．Ｎ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３１４，１−３４０（１９８６）．
３６．Ｓ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７，７１−９４（１９７４）．
３７．Ａ．Ｇ．Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．Ｓ．Ｋａｍａｔｈ，Ｐ．Ｚｉｐｐｅｒｌｅｎ，Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｍｐｏｓ，Ｍ．Ｓｏｈｒｍａｎｎ，Ｊ．Ａｈｒｉｎｇｅｒ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，３２５−３３０（２０００）．
３８．Ａ．Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｓ．Ｂａｎｄｈａｋａｖｉ，Ｓ．Ｊａｂｂａｒ，Ｒ．Ｓｈａｈ，Ｇ．Ｊ．Ｂｅｉｔｅｌ，Ｒ．Ｉ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＯＳＲ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６７，１６１−１７０（２００４）．
３９．Ａ．Ｌａｎｊｕｉｎ，Ｍ．Ｋ．ＶａｎＨｏｖｅｎ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｊ．Ｋ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｐ．Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｏｔｘ／ｏｔｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ５，６２１−６３３（２００３）．
４０．Ｗ．Ｇ．Ｂｅｎｄｅｎａ，Ｊ．Ｒ．Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｔ．Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｍ．Ｍａｌｔｂｙ，Ｓ．Ｓ．Ｔｏｂｅ，Ｉ．Ｄ．Ｃｈｉｎ−Ｓａｎｇ，Ａ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ／ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＰＲ−９  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｌｏｃａｌ  ｓｅａｒｃｈ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｃｕｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，１３３９−１３４２（２００８）．
４１．Ｏ．Ｈｏｂｅｒｔ，Ｉ．Ｍｏｒｉ，Ｙ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｈｏｎｄａ，Ｙ．Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｇ．Ｒｕｖｋｕｎ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｔｘ−３  ＬＩＭ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ．Ｎｅｕｒｏｎ  １９，３４５−３５７（１９９７）．
４２．Ｅ．Ｌ．Ｔｓａｌｉｋ，Ｔ．Ｎｉａｃａｒｉｓ，Ａ．Ｓ．Ｗｅｎｉｃｋ，Ｋ．Ｐａｕ，Ｌ．Ａｖｅｒｙ，Ｏ．Ｈｏｂｅｒｔ，ＬＩＭ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６３，８１−１０２（２００３）．
４３．Ｏ．Ｈｏｂｅｒｔ，Ｔ．Ｄ’Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｙ．Ｌｉｕ，Ｇ．Ｒｕｖｋｕｎ，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬＩＭ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅ  ｌｉｎ−１１．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，２０８４−２０９６（１９９８）．
４４．Ｚ．Ａｌｔｕｎ−Ｇｕｌｔｅｋｉｎ，Ｙ．Ａｎｄａｃｈｉ，Ｅ．Ｌ．Ｔｓａｌｉｋ，Ｄ．Ｐｉｌｇｒｉｍ，Ｙ．Ｋｏｈａｒａ，Ｏ．Ｈｏｂｅｒｔ，Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｓｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ，ｃｅｈ−１０，ｔｔｘ−３  ａｎｄ  ｃｅｈ−２３，ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  ｃｌａｓｓ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，１９５１−１９６９（２００１）．
４５．Ｋ．Ｒｏａｙａｉｅ，Ｊ．Ｇ．Ｃｒｕｍｐ，Ａ．Ｓａｇａｓｔｉ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｔｈｅ  Ｇ  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＯＤＲ−３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃｉｌｉｕｍ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２０，５５−６７（１９９８）．
４６．Ｎ．Ｃｈｒｏｎｉｓ，Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒ，Ｃ．Ｉ．Ｂａｒｇｍａｎｎ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４，７２７−７３１（２００７）．
４７．Ｔ．Ｕｏｚｕｍｉ，Ｔ．Ｈｉｒｏｔｓｕ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．Ｙａｍａｄａ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｇ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｉｉｎｏ，Ｔ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｑｕｉｃｋ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２，５００（２０１２）．
【符号の説明】
【０１３５】
１０：探知部、２０：処理部、３０：収容部、４０：保存部
１１０：計算手段、１２０：データベース
【配列表フリーテキスト】
【０１３６】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１３−２５５１４５号（２０１３年１２月１０日出願）及びＵＳ６１／９８２，３４１号（２０１４年４月２２日出願）の明細書の内容を包含する。
［配列表］
2015088039.tif 000017
2015088039.tif 000018
2015088039.tif 000019
2015088039.tif 000020
2015088039.tif 000021
【図１２】
2015088039.tif 000022
【図１６Ａ】
2015088039.tif 000023
【図１６Ｂ】
2015088039.tif 000024
【図２５】
2015088039.tif 000025
【図２６】
2015088039.tif 000026
【図３１】
2015088039.tif 000027
【図３３】
2015088039.tif 000028
【図１】
2015088039.tif 000029
【図２】
2015088039.tif 000030
【図３】
2015088039.tif 000031
【図４】
2015088039.tif 000032
【図５】
2015088039.tif 000033
【図６】
2015088039.tif 000034
【図７】
2015088039.tif 000035
【図８】
2015088039.tif 000036
【図９】
2015088039.tif 000037
【図１０】
2015088039.tif 000038
【図１１】
2015088039.tif 000039
【図１３】
2015088039.tif 000040
【図１４】
2015088039.tif 000041
【図１５】
2015088039.tif 000042
【図１７】
2015088039.tif 000043
【図１８】
2015088039.tif 000044
【図１９】
2015088039.tif 000045
【図２０】
2015088039.tif 000046
【図２１】
2015088039.tif 000047
【図２２】
2015088039.tif 000048
【図２３】
2015088039.tif 000049
【図２４】
2015088039.tif 000050
【図２７】
2015088039.tif 000051
【図２８】
2015088039.tif 000052
【図２９】
2015088039.tif 000053
【図３０】
2015088039.tif 000054
【図３２】
2015088039.tif 000055
【図３４】
2015088039.tif 000056
【図３５】
2015088039.tif 000057
【図３６】
2015088039.tif 000058
【図３７】
2015088039.tif 000059
【国際調査報告】
2015088039.tif 000060
2015088039.tif 000061
2015088039.tif 000062
2015088039.tif 000063
2015088039.tif 000064
2015088039.tif 000065