(57)【要約】膜状基材と、膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備える陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、共重合体がモノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含み、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を有する、陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
2016013609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜状基材と、前記膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備える陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、前記共重合体がモノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含み、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を有する、陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
前記共重合体において、前記カチオン交換基を有するモノマー単位以外のモノマー単位が荷電を持たない中性モノマーであり、前記中性モノマーが、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位である、請求項１に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項３】
前記共重合体が、モノマー単位として少なくとも１種類の疎水性モノマー単位を含む、請求項１又は２に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
前記疎水性モノマー単位が、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基を有する、請求項２又は３に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
前記弱カチオン交換基が、アクリル酸モノマー、メタクリル酸モノマー、アクリル酸化合物モノマー、及びメタクリル酸化合物モノマーのいずれかの由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
前記弱カチオン交換基がメタクリル酸モノマー由来である、請求項１〜５のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
前記共重合体において、前記疎水性モノマー単位及び／又は前記親水性モノマー単位の質量割合が、前記カチオン交換基モノマー単位の質量割合よりも高い、請求項２〜６のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
前記１又は複数種類のカチオン交換基が、弱カチオン交換基のみからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項９】
前記１又は複数種類のカチオン交換基が、弱カチオン交換基と強カチオン交換基の混合である、請求項１〜７いずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１０】
前記強カチオン交換基がスルホン酸基である、請求項９に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１１】
前記共重合体が、共有結合により前記膜状基材の表面に固定されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１２】
前記共重合体が、親水性モノマー単位として、前記（メタ）アクリルアミド類化合物を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１３】
前記共重合体が、親水性モノマー単位として、イソプロピルアクリルアミドを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１４】
前記共重合体が、親水性モノマー単位として、前記（メタ）アクリレート類化合物を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１５】
前記共重合体が、親水性モノマー単位として、２−ヒドロキシエチルメタクリレートを含む、請求項１〜１１、１４のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１６】
前記膜状基材がポリエチレンを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１７】
前記膜状基材にグラフト重合された前記共重合体のグラフト率が２０〜２００％である、請求項１６に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１８】
前記膜状基材がポリフッ化ビニリデンである、請求項１〜１５のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１９】
前記膜状基材にグラフト重合された前記共重合体のグラフト率が５〜１００％である、請求項１８に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２０】
前記共重合体が、実質的に架橋構造を有しない、請求項１〜１９のいずれかに記載の陽イオン交換クロマオグラフィー担体。
【請求項２１】
前記共重合体が、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２２】
前記重合性官能基が(メタ)アクリルアミド、又は（メタ）アクリレート由来である、請求項２１に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の、生体分子精製用の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２４】
前記生体分子が抗体である、請求項２３に記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２５】
担体１ｍＬに対し、単量体と凝集体を含む抗体１００ｍｇをフロースルー精製した時に、凝集体割合を５０％以上低減させる、請求項１ないし２４のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２６】
不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、前記生理活性物質を精製する精製方法であって、請求項１〜２５のいずれかに記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体に対し、前記混合溶液を接触させ、純度の向上した生理活性物質を得る精製方法。
【請求項２７】
精製方法がフロースルーである、請求項２６に記載の精製方法。
【請求項２８】
生理活性物質の回収率が８０％以上である、請求項２６又は２７に記載の精製方法。
【請求項２９】
前記生理活性物質が抗体タンパク質の単量体である、請求項２６〜２８のいずれかに記載の精製方法。
【請求項３０】
前記不純物が、前記抗体タンパク質の２量体以上の凝集体を含む、請求項２９に記載の精製方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれかに記載の前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前、又は後に陰イオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製を行う精製方法。
【請求項３２】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体が膜状である、請求項３１に記載の精製方法。
【請求項３３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体が、基材上にグラフト重合体を有する構造である、請求項３１又は３２に記載の精製方法。
【請求項３４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製が、フロースルーである、請求項３１〜３３に記載の精製方法。
【請求項３５】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間にバッファー交換をしない、請求項３１〜３４のいずれかに記載の精製方法。
【請求項３６】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程が連続である、請求項３１〜３５のいずれかに記載の精製方法。
【請求項３７】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、酸又は塩基を加えることにより、バッファーの水素イオン指数を変化させる、請求項３１〜３６のいずれかに記載の精製方法。
【請求項３８】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、電気伝導度を０．０１ｍＳ／ｃｍ以上変化させる工程を有する、請求項３２〜３７のいずれかに記載の精製方法。
【請求項３９】
前記陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製工程を有する、請求項２６〜３８のいずれかに記載の精製方法。
【請求項４０】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程における前記生理活性物質の溶出後、バッファー交換をしない、請求項３９に記載の精製方法。
【請求項４１】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程における前記生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーの主成分が１価酸である、請求項３９又は４０に記載の精製方法。
【請求項４２】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程における前記生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーが酢酸バッファーである、請求項３９〜４１のいずれかに記載の精製方法。
【請求項４３】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程における前記生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーの電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項３９〜４２のいずれかに記載の精製方法。
【請求項４４】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程の後に、酸性処理によりウィルス不活化を行う、請求項３９〜４３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項４５】
前記アフィニティークロマトグラフィー工程の後に、塩基を加えることにより前記生理活性物質を含む溶出液の水素イオン指数の調整を行う、請求項３９〜４４のいずれかに記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱カチオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー担体、及びそれを用いた生体分子の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。【０００３】
液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。【０００４】
イオン交換クロマトグラフィーは、吸着剤表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着剤の形状としては、ビーズや、平膜、及び中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着剤として市販されている。【０００５】
カチオン交換基を有する吸着剤では、低塩濃度の抗体溶液を吸着材に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた生理活性物質を溶出させる精製が一般的に行われている。更に、より良好な方法として、以下に説明するフロースルー様式による目的物質の精製も提案されている。【０００６】
フロースルー様式とは、目的物質よりも不純物を選択的に吸着剤に吸着させる精製方法の様式である。そのため、従来の吸着、溶出を利用した方法に比べ、緩衝液の節約や工程の簡略化につながる。また、高流速で抗体溶液を処理することが出来れば、更にフロースルー精製の利点が活きると考えられる。【０００７】
また、カチオン交換工程においては、抗体単量体と抗体２量体等の凝集体を分離することがしばしば目的とされている。しかし、抗体単量体と抗体凝集体の等電点はほぼ等しいため、フロースルー精製において、抗体単量体と抗体２量体の分離は特に難しく、カチオン交換基の密度をはじめとする、カチオン交換体の緻密な設計が必要となる。また、抗体はそれぞれ性質が異なるため、綿密な設計をしても全ての抗体に対して、同じ設計が最適であるわけではなく、それぞれの抗体に適したカチオン交換基密度が存在すると考えられる。【０００８】
特許文献１では、樹脂上に芳香族と弱カチオン交換基を有する低分子化合物を結合させたフロースルー精製に用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が開示されている。【０００９】
特許文献２では、シリカビーズに弱カチオン交換基を有する共重合体を結合させたクロマトグラフィー担体が開示されている。【００１０】
特許文献３では、強カチオン交換基を有するモノマーと非荷電（中性）モノマーを担体にグラフト重合を施したフロースルーに適したクロマトグラフィー担体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第４７７６６１５号公報
【特許文献２】特許第５２３４７２７号公報
【特許文献３】特開２０１３−１８９４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１に開示されているマルチモーダルクロマトグラフィー担体は、ビーズ状であるため、高流速での処理が出来ず、フロースルー精製の利点が生かされていないことを、本発明者らは見出した。【００１３】
特許文献２に開示されているシリカビーズに共重合体を結合させたクロマトグラフィー担体も、高流速での処理が出来ないことを、本発明者らは見出した。【００１４】
また、特許文献３に開示されているカチオン交換膜は、固体担体上の低密度（１ないし３０ｍｍｏｌ／Ｌ）の陽イオン交換基の使用を特徴としており、カチオン交換基密度に制限がある。【００１５】
このように、抗体の性質に対応して電荷密度の調節が可能であり、高流速処理が可能なカチオン交換体は開示されていない。そこで、本発明は、フロースルー精製において、高流速処理を可能とし、電荷密度の調整が可能なカチオン交換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、弱カチオン交換基を有する重合体を結合させた担体を用いると、高流速処理及び電荷密度の調節が可能となり、タンパク質のフロースルー精製に適していることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１７】
本発明の態様によれば、膜状基材と、膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備える陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、共重合体がモノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含み、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を有する、陽イオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。【００１８】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位以外のモノマー単位が荷電を持たない中性モノマーであり、中性モノマーが、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位であってもよい。【００１９】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の共重合体が、モノマー単位として少なくとも１種類の疎水性モノマー単位を含んでいてもよい。【００２０】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、疎水性モノマー単位が、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基を有していてもよい。【００２１】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、弱カチオン交換基が、アクリル酸モノマー、メタクリル酸モノマー、アクリル酸化合物モノマー、及びメタクリル酸化合物モノマーのいずれかの由来であってもよい。【００２２】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、弱カチオン交換基がメタクリル酸モノマー由来であってもよい。【００２３】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の共重合体において、疎水性モノマー単位及び／又は親水性モノマー単位の質量割合が、カチオン交換基モノマー単位の質量割合よりも高くてもよい。【００２４】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、１又は複数種類のカチオン交換基が、弱カチオン交換基のみからなっていてもよい。【００２５】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、１又は複数種類のカチオン交換基が、弱カチオン交換基と強カチオン交換基の混合であってもよい。【００２６】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、強カチオン交換基がスルホン酸基であってもよい。【００２７】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、共有結合により膜状基材の表面に固定されていてもよい。【００２８】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、親水性モノマー単位として、（メタ）アクリルアミド類化合物を含んでいてもよい。【００２９】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、親水性モノマー単位として、イソプロピルアクリルアミドを含んでいてもよい。【００３０】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、親水性モノマー単位として、（メタ）アクリレート類化合物を含んでいてもよい。【００３１】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、親水性モノマー単位として、２−ヒドロキシエチルメタクリレートを含んでいてもよい。【００３２】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、膜状基材がポリエチレンを含んでいてもよい。【００３３】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、膜状基材にグラフト重合された共重合体のグラフト率が２０〜２００％であってもよい。【００３４】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、膜状基材がポリフッ化ビニリデンであってもよい。【００３５】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、膜状基材にグラフト重合された共重合体のグラフト率が５〜１００％であってもよい。【００３６】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、実質的に架橋構造を有していなくともよい。【００３７】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体が、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含んでいてもよい。【００３８】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、重合性官能基が(メタ)アクリルアミド、又は（メタ）アクリレート由来であってもよい。【００３９】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体が、生体分子精製用の陽イオン交換クロマトグラフィー担体であってもよい。生体分子が抗体であってもよい。【００４０】
上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体が、担体１ｍＬに対し、単量体と凝集体を含む抗体１００ｍｇをフロースルー精製した時に、凝集体割合を５０％以上低減させてもよい。【００４１】
また、本発明の態様によれば、不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、生理活性物質を精製する精製方法であって、上記の陽イオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させ、純度の向上した生理活性物質を得る精製方法が提供される。【００４２】
上記の精製方法がフロースルーであってもよい。【００４３】
上記の精製方法において、生理活性物質の回収率が８０％以上であってもよい。【００４４】
上記の精製方法において、生理活性物質が抗体タンパク質の単量体であってもよい。【００４５】
上記の精製方法において、不純物が、抗体タンパク質の２量体以上の凝集体を含んでいてもよい。【００４６】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前、又は後に陰イオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製を行ってもよい。【００４７】
上記の精製方法において、陰イオン交換クロマトグラフィー担体が膜状であってもよい。【００４８】
上記の精製方法において、陰イオン交換クロマトグラフィー担体が、基材上にグラフト重合体を有する構造であってもよい。【００４９】
上記の精製方法において、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製が、フロースルーであってもよい。【００５０】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間にバッファー交換をしなくともよい。【００５１】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程が連続であってもよい。【００５２】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、酸又は塩基を加えることにより、バッファーの水素イオン指数を変化させてもよい。【００５３】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、電気伝導度を０．０１ｍＳ／ｃｍ以上変化させる工程を有してもよい。【００５４】
上記の精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前に、アフィニティークロマトグラフィーによる精製工程を有してもよい。【００５５】
上記の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー工程における生理活性物質の溶出後、バッファー交換をしなくともよい。【００５６】
上記の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー工程における生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーの主成分が１価酸であってもよい。【００５７】
上記の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー工程における生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーが酢酸バッファーであってもよい。【００５８】
上記の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー工程における生理活性物質の溶出に用いられる溶出バッファーの電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。【００５９】
上記の精製方法において、アフィニティークロマトグラフィー工程の後に、酸性処理によりウィルス不活化を行ってもよい。
【発明の効果】
【００６０】
本発明に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いれば、高流速で処理が可能であり、更にタンパク質の性質に対応した電荷密度でのタンパク質精製が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１に係る抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図２】図１のグラフの拡大図である。
【図３】実施例１ないし２９及び比較例１ないし３の結果を示す表である。
【図４】実施例３０ないし３２の結果を示す表である。
【図５】実施例３３ないし４０の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００６３】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、膜状基材と、膜状基材の表面に固定された共重合体と、を備え、共重合体が、モノマー単位として（メタ）アクリルアミド類化合物及び／又は（メタ）アクリレート類化合物を含み、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度、好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度、より好ましくは４５ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度で、少なくとも弱カチオン交換基を含む１又は複数種類のカチオン交換基を有する。
【００６４】
「（メタ）アクリルアミド類化合物」とは、アクリルアミドを基本骨格に持つモノマーないしはモノマー単位であり、基本骨格以外の構造により、親水性にも疎水性にもなり得る。また、「（メタ）アクリレート類化合物」とは、アクリレートを基本骨格に持つモノマーないしはモノマー単位であり、基本骨格以外の構造により、親水性にも疎水性にもなり得る。
【００６５】
「密度」とは、陽イオン交換クロマトグラフィー担体１リットル当たりのカチオン交換基のモル数の濃度として一般的に表される、陽イオン交換クロマトグラフィー担体におけるカチオン交換基の濃度を意味する。「カチオン」は陽イオンとも表現され、「アニオン」は陰イオンとも表現される。また、「担体」は、交換体、吸着剤、固定相とも表現される。
【００６６】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、例えば、生理活性物質の精製に用いられる。生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質の単量体成分である。不純物とは、例えば抗体タンパク質の２量体以上の凝集体である。
【００６７】
生理活性物質の一例である抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体で精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
【００６８】
抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
【００６９】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体の精製対象の一例である抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【００７０】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質の何れであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
【００７１】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が備える膜状基材の形状は、特に限定されないが、形状としては、中空糸状、平膜状、不織布状、モノリス、キャピラリー、焼結体、円板または円筒状等が挙げられる。また、材料も特に限定を受けないが、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、セルロース等から構成されていることが好ましい。
【００７２】
ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。また、ポリアミドとしては特に限定を受けないが、ナイロン６（ε−カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ−フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、ｍ−フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。ポリエステルとしては、特に限定を受けないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
【００７３】
膜状基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、基材が中空糸状の場合は、例えば５〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは１００ｎｍ以上、特に好ましくは１５０ｎｍ以上、あるいは４００ｎｍ以上である。また、基材膜表面積の観点から、好ましくは９００ｎｍ以下、より好ましくは８００ｎｍ以下、さらに好ましくは７００ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以下である。細孔径が５ｎｍ以下であると、分離できる抗体タンパク質の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上であると、当該膜状基材の表面積が少なくなり、不純物の結合容量が小さくなる傾向にある。
【００７４】
また、後述のグラフト率が高い場合や、共重合体中の親水性モノマーが占める割合が高い場合、中空糸膜の細孔が塞がりやすい傾向にあり、このような場合は、４００〜６５０ｎｍ程度の孔径が特に好ましい。
【００７５】
また、基材が平膜状や不織布状の場合、基材を膜として用いる際に、支持体を用いることが可能であることや、積層しての使用が可能であるため、細孔径の好適範囲が広くなる。好ましい範囲としては、１０ｎｍから１ｍｍであり、好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、更に好ましくは３００ｎｍ以上である。また表面積の観点から、好ましくは５００ｕｍ以下、より好ましくは３００ｕｍ以下、更に好ましくは１００ｕｍ以下である。
【００７６】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、弱カチオン交換基を少なくとも有し、かつ、当該担体の体積あたり３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高い密度で１又は複数種類のカチオン交換基を有する。
【００７７】
弱カチオン交換基とはカルボン酸基、ホスホン酸基、及びリン酸基等が挙げられる。弱カチオン交換基は、移動相のｐＨにより、荷電量を変化させることが可能である。そのため、移動相のｐＨを変化させることにより、陽イオン交換クロマトグラフィー担体の電荷密度の調整が可能となる。
【００７８】
弱カチオン交換基の導入方法として、弱カチオン交換基を有するモノマーを共重合させる方法がある。そのようなモノマーとして、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸化合物、及びメタクリル酸化合物等が挙げられる。アクリル酸化合物としては、２−アクリロキシエチルコハク酸、２−アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２−アクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。メタクリル酸化合物としては、２−メタクリロキシエチルコハク酸、２−メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、及び２−メタクリロイロキシエチルフタル酸等が挙げられる。
【００７９】
また、弱カチオン交換基に変換可能なモノマーを共重合させ、その後官能基変換により、弱カチオン交換基を導入してもよい。このような官能基としてエステル類等があり、ｔ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、アリルアクリレート、及びアリルメタクリレート等のモノマーが挙げられる。これらをモノマーとして共重合に用いた後、酸性条件により脱保護し、カルボン酸基へと変換できる。
【００８０】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を有していれば、強カチオン交換基を有していてもよく、あるいは強カチオン交換基を有していなくとも、弱カチオン交換基のみを有していればよく、カチオン交換基の合計で当該担体の体積あたりの密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高ければよい。
【００８１】
強カチオン交換基を導入することによって、ｐＨに対する荷電量変化を鈍感にさせ、再現性を向上させることが可能となる。ほぼ全ての強カチオン交換基は、抗体精製における実用的な抗体溶液のｐＨ領域で荷電しているため、荷電量が一定である。したがって、陽イオン交換クロマトグラフィー担体に強カチオン交換基が存在することで、常に一定以上の荷電量が保証される。さらに、ｐＨを変化させることにより、弱カチオン交換基の荷電量を調整し、陽イオン交換クロマトグラフィー担体全体の荷電量を微調整することが出来る。陽イオン交換クロマトグラフィー担体に強カチオン交換基が存在することで、ｐＨの微変化によって陽イオン交換クロマトグラフィー担体の性能が大きく左右されることを抑制することが可能である。強カチオン交換基としては、スルホン酸基等が挙げられる。
【００８２】
３０ｍｍｏｌ／Ｌよりもカチオン交換基の合計密度が低ければ、荷電させることが可能なカチオン交換基量が少なくなり、吸着容量が低く、処理できる抗体量が低くなる傾向にある。特許文献３では、強カチオン交換基を用い、カチオン交換基の密度を３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、フロースルー精製における、抗体の単量体と凝集体の選択性を発現しているが、低密度であるため、吸着容量が小さくなり、処理できる抗体量が少ない。また、カチオン交換基の密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であると、荷電可能量範囲が狭くなり、適用できる抗体種が狭くなる傾向にある。
【００８３】
なお、カチオン交換基の合計で当該担体の体積あたりの密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高ければよいが、このうち、弱カチオン交換基の密度が、５ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１０ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であれば、電荷密度の調整が可能となる。
【００８４】
実施の形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体が備える共重合体は、膜状基材に固定されており、例えば共有結合により膜状基材に固定されている。当該担体は、少なくとも弱カチオン交換基を有し、かつ、最終的に３０ｍｍｏｌ／Ｌよりも高い密度になるように１又は複数種類のカチオン交換基を有しておればよい。
【００８５】
膜状基材に共重合体を固定する方法として、グラフト重合がある。グラフト重合法としては、放射線グラフト重合法や、表面リビングラジカル重合法が挙げられる。
【００８６】
放射線グラフト重合法で膜状基材表面に共重合体を固定する場合、膜状基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、膜状基材に電離性放射線を照射すると、膜状基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００８７】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、膜状基材の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
【００８８】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に膜状基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、膜状基材を反応性化合物と接触させた状態で膜状基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
【００８９】
実施の形態において共重合体の重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、メタノールやエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００９０】
共重合体は、その組成に、カチオン交換基を有するモノマー単位に加え、アクリルアミド類、メタアクリルアミド類、アクリレート類、メタアクリレート類の化合物をモノマー単位として１又は複数種類含む。共重合体は、アクリルアミド類、メタアクリルアミド類、アクリレート類、メタアクリレート類の組み合わせのみから成っていてもよいし、メタアクリレート類のみからなっていてもよい。さらに、共重合体は、その組成に、荷電を持たない中性モノマーである、親水性及び／又は疎水性の化合物をモノマー単位として１又は複数種類含んでいてもよい。これらのモノマー単位は、陽イオン交換クロマトグラフィーを洗浄する際の現実的な酸や塩基条件に対して安定であり、洗浄による性能低下が起こり難く、更に膜の強度を下げにくい傾向にある。これらの親水性及び／又は疎水性モノマーを、カチオン交換基を有するモノマーと共重合させることにより、カチオン交換基同士の距離を離し、より選択的に抗体凝集体を吸着しやすくなると考えられる。この他のモノマー単位の例として、例えば、アクリルニトリルがあるが、アクリルニトリルは、アルカリにより加水分解されやすいため、アクリルニトリルをモノマー単位として用いると、アルカリ洗浄により性能が損なわれる傾向にあるため好ましくない。また、スチレン類等の芳香族を含むモノマー単位は膜を堅くし、脆くなる傾向にあるため好ましくない。さらに、抗体単量体と抗体凝集体の吸着力の差別化の観点から、共重合体において、中性モノマーである、親水性モノマー単位及び／又は疎水性モノマー単位の質量割合が、カチオン交換を有するモノマー単位の質量割合よりも高いことが好ましく、より好ましくは、２倍以上であり、更に好ましくは３倍以上である。
【００９１】
実施の形態において、共重合体は、カチオン交換基を有するモノマー及び中性モノマーのみから成り立っているため、カチオン交換基を有するモノマーの質量、及び中性モノマーの質量は、以下のように求めることが出来る。
（カチオン交換基モノマー質量）＝
（カチオン交換基密度×担体体積×カチオン交換基モノマー分子量）
（中性モノマーの質量）＝
（カチオン交換担体質量―基材担体質量―カチオン交換基モノマー質量）
これらの質量比により、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合、及び中性のモノマー単位の質量割合を求めることができる。
【００９２】
また、抗体は疎水性相互作用の性質を有するため、膜状基材の疎水性が強いと、疎水性相互作用により、抗体が膜状基材に吸着され、目的の抗体の回収率が低下することがある。この現象に対し、共重合体の重合時に親水性モノマーを導入することにより、抗体が膜状基材へ吸着することを防ぐことが出来る。そのような親水性モノマーとして、アクリルアミド、メタアクリルアミド、並びにジメチルアクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、ジエチルメタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物が挙げられる。あるいは、上記のような親水性モノマーとして、アクリレート、メタアクリレート、並びに２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート等の（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。
【００９３】
あるいは、共重合体の重合時に疎水性モノマーを導入し、疎水性相互作用を活かすことにより抗体単量体と抗体凝集体の吸着選択性を上げることもできる。一般に抗体凝集体は、抗体単量体よりも強い疎水性相互作用を示す。適した疎水性モノマーを選択することにより、抗体単量体と抗体凝集体の疎水性相互作用の差を顕著にし、高い選択性を実現し得る。そのような疎水性モノマーとして、スチレン類、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類等があるが、力学的強度の観点から、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類が望ましい。アルキル基に関しては、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基であれば、抗体に対し、実質的に疎水性相互作用を発現しうる。  
【００９４】
また、共重合体は、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含まず、架橋構造を持たなくてもよい。あるいは、共重合体は、モノマー単位中に重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含み、架橋構造を有していてもよい。しかし、共重合体は、実質的に非架橋構造であることが好ましい。実質的に非架橋であるとは、架橋構造を有していても実質的に抗体凝集体の吸着性能に影響を及ぼさない程度に架橋度の低いことをいう。共重合体が実質的に非架橋である場合、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位の質量割合は、例えば、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．１％以下であり、低いほど好ましい。  
【００９５】
モノマー中に重合性官能基を２つ以上含むモノマーは、特に限定されないが、重合性官能基としてはオレフィンが挙げられる。そのようなモノマーとして、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリレート系モノマー、又はそれらの官能基が混合したモノマーが挙げられる。（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスメタクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスメタクリルアミド等が挙げられる。
【００９６】
（メタ）アクリレート系モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，５−ペンタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，９−ノナンジオールジアクリレート、１，１０−デカンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ジプロピレングリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオールジアクリレート、４、４’−チオジベンゼンチオールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、１，３−ブタンジオールジメタクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，５−ペンタンジオールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、１，９−ノナンジオールジメタクリレート、１，１０−デカンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタクリレート、トリプロピレングリコールジメタクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオールジメタクリレート、４、４’−チオジベンゼンチオールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、及びペンタエリトリトールテトラメタクリレート等が挙げられる。
【００９７】
グラフト重合によるグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、基材膜の密度により、最適値が異なりうる。基材膜がポリエチレンの時は、吸着容量の観点から２０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、更に好ましくは３０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、更に好ましくは１００％以下である。グラフト率は以下の式によって表わされる。
ｄｇ（％）＝（ｗ１−ｗ０）／ｗ０  ×  １００
ここで、ｗ０は反応前の多孔質中空糸の重量、ｗ１はグラフト鎖が導入された多孔質中空糸の重量である。
【００９８】
基材膜がポリフッ化ビニリデンの時は、ポリフッ化ビニリデンはポリエチレンに比べ、密度が高いため、適したグラフト率がポリエチレンの時と異なる。基材膜がポリフッ化ビニリデンの時は、吸着容量の観点から５％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは１５％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは１００％以下、より好ましくは８０％以下、更に好ましくは７０％以下である。
【００９９】
また、カチオン交換基を有する共重合体が膜状基材に固定されていることにより、膜状基材表面上にカチオン交換基が分布している場合に比べ、立体的に吸着することが可能となる。そのため、抗体単量体に比べ、抗体凝集体はより強固に基材に吸着され、抗体単量体を高い純度で得ることが可能となる。したがって、共重合体が、少なくとも弱カチオン交換基を有し、１又は複数種類のカチオン交換基を有していることが好ましい。また、共重合体が架橋構造であると、共重合体の立ち上がりを抑えることにより、通液圧を抑制するといったメリットがあるが、抗体凝集体が基材に立体的に吸着することが妨げられるため、抗体単量体に比べて抗体凝集体をより強固に吸着し抗体単量体を高い純度で得ることを可能とする観点からは、共重合体は実質的に非架橋構造であることが望ましい。
【０１００】
また、共重合体において親水性モノマーが少ないと、共重合体が伸縮して抗体凝集体の立体的な吸着が不可能となるため、抗体凝集体の立体的な吸着をするには、ある程度以上の含有量が必要である。そのような共重合体中の親水性モノマーの質量割合として、３０％以上が好ましく、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。また、疎水性モノマーの質量割合に比べ、親水性モノマーの割が高いことが望ましい。好ましくは１．３倍以上、より好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは１．７倍以上、特に好ましくは１．９倍以上である。親水性モノマーおよび疎水性モノマーの質量割合は最終生成物から熱分解ＧＣ／ＭＳによって検出され得る。または、合成時の仕込み組成比と一致するとして算出することもできる。グラフト重合であれば、仕込み時の全モノマーの中の親水性モノマーの重量割合である。
【０１０１】
全カチオン交換基密度を求める方法として、強酸などを用いてカチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩基を用いて中和し、逆滴定により測定する方法がある。また、カチオン交換基のカウンターカチオンをリチウムイオンに置換した後に、強酸で処理し、溶出するリチウムの量を測定する方法もある。これらの方法により、全カチオン交換基密度が測定できる。
【０１０２】
また、強カチオン交換基密度を測定する方法として、例えば、強酸などを用いて強カチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩化ナトリウム水溶液を加え、溶出してくる塩化水素を滴定することにより測定することが可能である。
【０１０３】
弱カチオン交換基密度は、全カチオン交換基密度から、強カチオン交換基密度を差し引くことにより求めることが出来る。
【０１０４】
実施の形態による純度の向上した生理活性物質を得る精製方法は、不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、生理活性物質を精製する精製方法であって、上述した陽イオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させることを含む。実施の形態に係る精製方法による生理活性物質の回収率は、例えば８０％以上である。回収率は、下記式に基づいて算出される。
回収率＝（抗体回収量×処理後単量体成分純度）／（抗体処理量×処理前単量体成分純度）
【０１０５】
フロースルーとは、目的の生理活性物質が材料をフロースルーすることを意図する精製方法をいう。例えば、抗体タンパク質の単量体が目的物で、抗体タンパク質の凝集体が不純物である場合、抗体タンパク質単量体は吸着剤を流れ、抗体タンパク質の凝集体が吸着剤に結合する。この時、抗体タンパク質の単量体は吸着剤に吸着されてもよいが、抗体タンパク質の凝集体がより選択的に吸着剤に吸着されることにより、抗体タンパク質の単量体が精製される。
【０１０６】
陽イオン交換担体を用いたフロースルー精製の実施の形態に係るクロマトグラフィーの移動相としては、強酸、強アルカリ以外の緩衝液（バッファー）を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その塩類の濃度は０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、バッファー濃度は１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２〜７０ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。ここで、バッファー濃度とは、バッファーの有効成分の濃度のことをいう。例えば、酢酸バッファーであれば、通常酢酸と酢酸ナトリウムから調整されるが、その時の、酢酸と酢酸ナトリウムの合計の濃度である。また、トリスバッファーでは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの濃度のことをいう。また、酢酸−トリスバッファー等のように表記されるバッファーについては、前者の濃度のことであり、酢酸−トリスでは酢酸、トリス−酢酸であればトリスの濃度のことである。また、本実施形態では、緩衝能をほとんど持たないｐＨの溶液（例えば、ｐＨ３．４の酢酸緩衝液）も、クロマトグラフィーに用いることができる。
【０１０７】
緩衝溶液における無機塩類の濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌより高いと、イオン交換基の乖離度が低くなり、凝集体等の不純物を保持することが困難となる傾向にある。
【０１０８】
塩類の濃度を電気伝導度という尺度で表すと、好ましくは０．５〜２０ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは、０．５〜１５ｍＳ／ｃｍ、さらに好ましくは０．５〜１０ｍＳ／ｃｍ、特に好ましくは、０．８〜５．０ｍＳ／ｃｍである。
【０１０９】
緩衝液の水素イオン濃度は、処理する抗体タンパク質の等電点や、大きさなどにより異なり、適宜最適条件を検討する必要があるが、例えばｐＨ４．０〜１０．０であり、好ましくは５．０〜９．５であり、さらに好ましくは６．０〜９．０、特に好ましくは６．５〜８．０である。抗体タンパク質の等電点付近になると、抗体タンパク質同士の静電反発が小さくなり、凝集しやすい傾向にある。また、ｐＨが４．０より低くなると、抗体タンパク質の変性が起こり、活性の低下や、凝集体の精製等、品質低下が引き起こされる傾向にある。
【０１１０】
陽イオン交換クロマトグラフィー工程における抗体ロード量は、不純物を除去できれば特に限定を受けないが、担体１ｍＬあたり１００ｍｇ以上であり、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり３００ｍｇ以上が好ましく、より好ましくは５００ｍｇ以上、更に好ましくは７００ｍｇ以上、また更に好ましくは０．８ｇ以上、特に好ましくは１ｇ以上である。
【０１１１】
本実施形態において実施される陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、担体１ｍＬに対し、単量体と凝集体を含む抗体１００ｍｇ以上をフロースルー精製した時に、抗体中における抗体凝集体の割合は５０％以上低減され、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上低減される。なお、抗体凝集体の割合の低減率とは、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率から、処理後の凝集体成分（１）、（２）の含有率の差をとり、当該差を、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率で割った値の百分率表示である。凝集体成分（１）、（２）のそれぞれの含有率は、クロマトチャートのピークの面積から算出される。
【０１１２】
また、本実施形態において実施される陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程に加え、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と組み合わせることにより、精製物の純度をさらに向上しうる。
【０１１３】
従来の一般的な陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程では、目的物質を一旦、担体に吸着させ、溶出することにより精製をするため、目的物質のｐＩよりも高いｐＩを持つ不純物、及び低いｐＩを持つ不純物共に除去することが可能である。一方、本実施形態のフロースルー精製では、目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物を除去することが困難な場合がある。しかし、目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物は陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製により除去できる。そのため、本実施形態に係る陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程を組み合わせることにより、従来の不純物除去性を保持したまま、効率の良い精製が達成できる。
【０１１４】
目的物質よりも低いｐＩを持つ不純物とは、特に限定を受けないが、例えば、宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、及びアフィニティークロマトグラフィー工程由来の不純物であるプロテインＡ等がある。
【０１１５】
陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程は、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前であってもよいし、後であってもよい。
【０１１６】
陰イオン交換クロマトグラフィー担体は、特に限定を受けないが、膜状であれば、高流速が可能であり、より効率の良い精製工程の構築が可能である。また、陰イオン交換クロマトグラフィー担体は、基材上にグラフト重合鎖を有する構造であってもよい。
【０１１７】
陰イオン交換クロマトグラフィー担体の構造は、特に限定を受けないが、基材上にグラフト重合体を有する構造であれば、不純物に立体的に吸着することが出来るため、より高い不純物除去性が期待できる。
【０１１８】
陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製方法については、特に限定を受けないが、フロースルー精製であればより効率的に精製することが可能である。
【０１１９】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程における抗体ロード量は、不純物を除去できれば特に限定を受けないが、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり０．２ｇ以上が好ましく、より好ましくは０．５ｇ以上、更に好ましくは１．０ｇ以上、更に更に好ましくは２．０ｇ以上、特に好ましくは４ｇ以上である。
【０１２０】
陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、バッファー交換をしてもよいし、しなくてもよい。バッファー交換をしない場合、より効率的な精製が出来る。
【０１２１】
陽イオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程と、陰イオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程は、連続で行ってもよいし、先の工程終了後、一旦タンクに貯蔵し、次の工程を行ってもよい。
【０１２２】
陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間にｐＨの調整を行ってもよい。ｐＨを調整することにより、より前者の処理ｐＨ付近のｐＩを持つ不純物の除去性が高くなる。具体的には、先に陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製を行う場合には、陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に、塩基を加え、ｐＨを上げることにより、より不純物が除去できるようになる。逆に、先に陰イオン交換クロマトグラフフィー担体を行う場合には、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に酸を加え、ｐＨを低くすることにより、より不純物が除去できるようになる。変化させるｐＨの値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることが出来る。ｐＨの変化量の値としては、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０等があげられ、示した単位でもよいし、それぞれの間の値でもよい。
【０１２３】
不純物を除去出来れば特に限定は受けないが、好ましくは、ｐＨを０．１以上変化させれば不純物除去性が特に向上する。
【０１２４】
また、ｐＨと同様に、陽イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に電気伝導度の調整を行ってもよい。変化させる電気伝導度の値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることが出来る。電気伝導度の変化量の値として、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０等が挙げられ、示した値でもよいし、それぞれの間の値でもよい。
【０１２５】
また、一般に、抗体精製において、アフィニティークロマトグラフィーによる精製がなされた後に、イオン交換クロマトグラフィー工程による精製が行われるが、本実施形態において実施される陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前に、アフィニティークロマトグラフィー工程を行ってもよい。アフィニティークロマトグラフィー工程後に、上記陽イオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行うことにより、より純度の高い目的物を得ることが可能となる。
【０１２６】
本実施形態によれば、アフィニティークロマトグラフィー工程後の抗体を含む溶出液のバッファー交換を行わずに、陽イオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製及び陰イオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製を行うことで、効率的な精製が可能である。そのような溶出液として、１価酸を主成分として含むバッファーがある。
【０１２７】
一般的に陰イオン交換クロマトグラフィー工程では、多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いると、吸着量が低下し、不純物除去性能が低下する傾向にあるため、アフィニティークロマトグラフィー工程で多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いた場合、陰イオン交換クロマトグラフィーまでにバッファーを交換しておくことが望ましい。しかし、１価酸を主成分とする溶出バッファーを用いてアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出を行えば、バッファー交換の必要なく、陽イオン交換クロマトグラフィー工程及び陰イオン交換クロマトグラフィー工程による精製が可能となる。
【０１２８】
１価酸を主成分とする溶出バッファーについては、アフィニティークロマトグラフィー工程において溶出が可能であり、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程において、不純物が除去できれば特に限定を受けないが、酢酸が望ましい。
【０１２９】
また、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出に使用する溶出バッファーは、以下に限定されないが、その後の陽イオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製の不純物除去性の観点から、電気伝導度が１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが望ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下，特に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下である。
【０１３０】
また、溶出プールの電気伝導度を低く保つために、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出の直前に、電気伝導度の低い緩衝液で担体を洗浄することが望ましい。緩衝液としては、抗体を溶出させることがないようｐＨが十分に高く、電気伝導度が十分低ければよい。
【０１３１】
そのようなｐＨとして、５．０以上が好ましく、より好ましくは６．０以上、更に好ましくは７．０以上であり、電気伝導度としては、１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下である。
【０１３２】
また、アフィニティークロマトグラフィー工程での溶出後に、溶出液に含まれうるウィルスを酸性（低ｐＨ）条件に一定時間曝すことにより、ウィルスの不活化を行ってもよい。ウィルスを不活化するためには、ｐＨは４．０以下が望ましく、好ましくは３．８以下、より好ましくは３．６以下、更に好ましくは３．５以下、特に好ましくは３．４以下である。
【０１３３】
アフィニティークロマトグラフィー工程、またはそれに続くウィルス不活化の後に、塩基を溶出液に加えることにより、溶出液のｐＨの調整を行ってもよい。調整後のｐＨの値は、続くイオン交換クロマトグラフィー工程において不純物除去が可能であれば特に限定を受けないが、４．０以上が好ましく、より好ましくは５．０以上、更に好ましくは６．０以上である。
【実施例】
【０１３４】
以下に、実施の形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。【０１３５】
（実施例１）
実施例１では、放射線グラフト重合法によって、カルボン酸基を有する中空糸状のカチオン交換膜を合成した。【０１３６】
１）放射線グラフト重合
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。【０１３７】
得られた中空糸１本の体積を測定したところ、１．０５ｍＬであった。この中空糸をエタノールにより親水化し、水に置換した。水を除去した後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加えた。１時間放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を取り出し、純水１０ｍＬを加えた。更に１時間放置した後、純水を回収することにより、膜内に残った水酸化ナトリウムを回収した。回収した水酸化ナトリウム溶液を統合し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸により滴定をおこなったところ、中和に７．９８ｍＬ要した。ブランクが９．７７ｍＬであったことから、水酸化ナトリウムと反応した、膜が有する弱カチオン交換基は１７９ｕｍｏｌであることが分かった。これを測定した体積で除すると弱カチオン交換基密度を求めることが出来、カチオン交換基密度は１７０ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１に係るカチオン交換膜１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１００及び０．９００であった。【０１３８】
２）細胞培養液の調整
抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１１５ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。【０１３９】
３）プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅを充填したもの）に、ろ過した抗体溶液を２Ｌ添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））２０ｍＬを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を２４０ｍＬ通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。【０１４０】
４）凝集体調整
得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ３に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の凝集体を含む抗体溶液を調整した。【０１４１】
５）凝集体を含む抗体溶液調整
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／トリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調整した。【０１４２】
６）凝集体量の測定
得られた抗体溶液を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。  カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ  ＹＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ１．７ｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３０℃
システム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ  ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）−アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）【０１４３】
その結果、図１のクロマトチャートが得られ、それを拡大したものが図２である。図２の（１）及び（２）のピークで現れるものは抗体の凝集体であり、（３）で現れるピークは単量体である。クロマトチャートのピークの面積から算出される凝集体（１）の割合は１．５４％であり、凝集体（２）の割合は２．２０％、単量体の割合は９６．２５％であった。以下の実施例及び比較例においても、最初に現れる凝集体のピークを凝集体（１）、２番目に現れる凝集体のピークを凝集体（２）という。【０１４４】
７）凝集体の除去
カチオン交換膜１に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。なお、図３において、「凝集体割合低減率」とは、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率から、処理後の凝集体成分（１）、（２）の含有率の差をとり、当該差を、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率で割った値の百分率表示である。【０１４５】
（実施例２）
実施例２では以下に説明するカチオン交換膜２を用いた。カチオン交換膜２は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．０３ｇ、メタクリル酸１．０３ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３２ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は３９０ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例２に係るカチオン交換膜２とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．２１７及び０．７８３であった。【０１４６】
実施例２で用いた抗体溶液の凝集体（１）の割合は１．５９％であり、凝集体（２）の割合は１．６７％、単量体の割合は９６．７４％であった。【０１４７】
カチオン交換膜２に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．２９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１４８】
（実施例３）
実施例３では以下に説明するカチオン交換膜３を用いた。カチオン交換膜３は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．７７ｇ、メタクリル酸０．２８ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１７ｇ、グラフト率７２％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は５９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例３に係るカチオン交換膜３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０３５及び０．９６５であった。【０１４９】
実施例３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）であり、凝集体（１）の割合は１．３１％であり、凝集体（２）の割合は２．０４％、単量体の割合は９６．６６％であった。【０１５０】
カチオン交換膜３に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．３７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬでカチオン交換膜３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１５１】
（実施例４）
実施例４では、カチオン交換膜３と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例４で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４９％であり、凝集体（２）の割合は３．１９％、単量体の割合は９４．３２％であった。【０１５２】
カチオン交換膜３に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．３１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）１０ｍＬでカチオン交換膜３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１５３】
（実施例５）
実施例５では以下に説明するカチオン交換膜４を用いた。カチオン交換膜４は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．８３ｇ、ブチルメタクリレート１．９２ｇ、メタクリル酸０．６４ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３２ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例５に係るカチオン交換膜４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０２及び０．８９８であった。【０１５４】
実施例５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．２５％であり、凝集体（２）の割合は２．０７％、単量体の割合は９４．６８％であった。【０１５５】
カチオン交換膜４に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．７６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１５６】
（実施例６）
実施例６では以下に説明するカチオン交換膜５を用いた。カチオン交換膜５は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．４９ｇ、ブチルメタクリレート０．７２ｇ、メタクリル酸０．３６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．３５ｇ、グラフト率４５％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１５５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例６に係るカチオン交換膜５とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１４８及び０．８５２であった。【０１５７】
実施例６で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３５％であり、凝集体（２）の割合は１．８２％、単量体の割合は９５．８３％であった。【０１５８】
カチオン交換膜５に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．７３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜５を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１５９】
（実施例７）
実施例７では以下に説明するカチオン交換膜６を用いた。カチオン交換膜６は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．０６ｇ、ブチルメタクリレート１．０３ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．７２ｇ、グラフト率５７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例７に係るカチオン交換膜６とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１３４及び０．８６６であった。【０１６０】
実施例７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．１２％であり、凝集体（２）の割合は１．５６％、単量体の割合は９６．３２％であった。【０１６１】
カチオン交換膜６に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．１７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜６を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１６２】
（実施例８）
実施例８では以下に説明するカチオン交換膜７を用いた。カチオン交換膜７は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．２８ｇ、グラフト率７６％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例８に係るカチオン交換膜７とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１００及び０．９００であった。【０１６３】
実施例８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．３７％であり、凝集体（２）の割合は１．９４％、単量体の割合は９４．６９％であった。【０１６４】
カチオン交換膜７に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（５．４９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１６５】
（実施例９）
実施例９では以下に説明するカチオン交換膜８を用いた。カチオン交換膜８は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．９７ｇ、グラフト率６６％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７４ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例９に係るカチオン交換膜８とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１４及び０．８８６であった。【０１６６】
実施例９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４５％であり、凝集体（２）の割合は２．３９％、単量体の割合は９５．１７％であった。【０１６７】
カチオン交換膜８に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２５ｍＬ（６．０２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜８を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１６８】
（実施例１０）
実施例１０では以下に説明するカチオン交換膜９を用いた。カチオン交換膜９は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．４０ｇ、ブチルメタクリレート１．２０ｇ、メタクリル酸０．７７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、４．８２ｇ、グラフト率６１％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２４９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１０に係るカチオン交換膜９とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１７７及び０．８２３であった。【０１６９】
実施例１０で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は０．７２％であり、凝集体（２）の割合は１．１４％、単量体の割合は９８．１４％であった。【０１７０】
カチオン交換膜９に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜９を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１７１】
（実施例１１）
実施例１１では以下に説明するカチオン交換膜１０を用いた。カチオン交換膜１０は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１１に係るカチオン交換膜１０とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０３及び０．８９７であった。【０１７２】
実施例１１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は１．５７％であり、凝集体（２）の割合は１．５５％、単量体の割合は９６．８８％であった。【０１７３】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は４０ｍＬ（５．９１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１７４】
（実施例１２）
実施例１２では、以下に説明するカチオン交換膜１１を用いた。カチオン交換膜１１は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．９３ｇ、ブチルメタクリレート１．９３ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．０６ｇ、グラフト率６９％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１２に係るカチオン交換膜１１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１及び０．８９であった。【０１７５】
実施例１２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．７１％であり、凝集体（２）の割合は２．６９％、単量体の割合は９４．６０％であった。【０１７６】
カチオン交換膜１１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は３０ｍＬ（５．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜Ｙを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。
（実施例１３）【０１７７】
実施例１３ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１３で用いた抗体溶液は１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４７％であり、凝集体（２）の割合は１．５９％、単量体の割合は９５．９４％であった。【０１７８】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１７９】
（実施例１４）
実施例１４では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１４で用いた抗体溶液は３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３２％であり、凝集体（２）の割合は２．２１％、単量体の割合は９５．４７％であった。【０１８０】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．６６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１８１】
（実施例１５）
実施例１５ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）であり、凝集体（１）の割合は１．３２％であり、凝集体（２）の割合は２．００％、単量体の割合は９６．６８％であった。  【０１８２】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１８３】
（実施例１６）
実施例１６では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１６で用いた抗体溶液は１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）であり、凝集体（１）の割合は１．５９％であり、凝集体（２）の割合は２．２０％、単量体の割合は９６．２１％であった。【０１８４】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．６３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１８５】
（実施例１７）
実施例１７ではカチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）であり、凝集体（１）の割合は１．４１％であり、凝集体（２）の割合は１．８１％、単量体の割合は９６．７８％であった。【０１８６】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１８７】
（実施例１８）
実施例１８では、カチオン交換膜１０と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例１８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．３０％であり、凝集体（２）の割合は２．０８％、単量体の割合は９５．６２％であった。【０１８８】
カチオン交換膜１０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．７２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。
（実施例１９）
実施例１９では以下に説明するカチオン交換膜１２を用いた。カチオン交換膜１２は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．５７ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１．２９ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１１ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１９に係るカチオン交換膜１２とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０９及び０．８９１であった。【０１８９】
実施例１９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．９９％であり、凝集体（２）の割合は２．３１％、単量体の割合は９４．７０％であった。【０１９０】
カチオン交換膜１２に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２２ｍＬ（５．３３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１９１】
（実施例２０）
実施例２０では以下に説明するカチオン交換膜１３を用いた。カチオン交換膜１３は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．６９ｇ、エチレングリコールジメタクリレート１．１７ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例２０に係るカチオン交換膜１３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。【０１９２】
実施例２０で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４８％であり、凝集体（２）の割合は２．２４％、単量体の割合は９５．２９％であった。【０１９３】
カチオン交換膜１３に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２２ｍＬ（５．７０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１９４】
（実施例２１）
実施例２１では以下に説明するカチオン交換膜１４を用いた。カチオン交換膜１４は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート１．３６ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例２１に係るカチオン交換膜１４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。【０１９５】
実施例２１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．７３％であり、凝集体（２）の割合は２．１０％、単量体の割合は９５．１６％であった。【０１９６】
カチオン交換膜１４に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は４０ｍＬ（５．５２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１９７】
（実施例２２）
実施例２２では以下に説明するカチオン交換膜１５を用いた。カチオン交換膜１５は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．３６ｇ、グラフト率４６％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２２７ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２２に係るカチオン交換膜１５とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１５及び０．８８５であった。【０１９８】
実施例２２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は３．１４％であり、凝集体（２）の割合は２．０３％、単量体の割合は９４．８２％であった。【０１９９】
カチオン交換膜１５に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１０ｍＬ（５．５３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１５を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２００】
（実施例２３）
実施例２３では以下に説明するカチオン交換膜１５を用いた。カチオン交換膜１６は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２６ｇ、グラフト率４４％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１９８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２３に係るカチオン交換膜１６とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０４及び０．８９６であった。【０２０１】
実施例２３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は４．４１％であり、凝集体（２）の割合は２．１６％、単量体の割合は９３．４３％であった。【０２０２】
カチオン交換膜１６に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．５３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１６を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２０３】
（実施例２４）
実施例２４では以下に説明するカチオン交換膜１７を用いた。カチオン交換膜１７は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート４．６２ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、７．９９ｇ、グラフト率３９％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２１４ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２４に係るカチオン交換膜１７とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１２６及び０．８７４であった。【０２０４】
実施例２４で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．４２％であり、凝集体（２）の割合は１．７７％、単量体の割合は９５．８１％であった。【０２０５】
カチオン交換膜１７に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６４ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．２ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．２ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２０６】
（実施例２５）
実施例２５では以下に説明するカチオン交換膜１７を用いた。カチオン交換膜１８は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２９ｇ、グラフト率４３％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２０９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２５に係るカチオン交換膜１８とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０８及び０．８９２であった。【０２０７】
実施例２５で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．９６％であり、凝集体（２）の割合は２．０１％、単量体の割合は９５．０３％であった。【０２０８】
カチオン交換膜１８に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１８を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２０９】
（実施例２６）
実施例２６では以下に説明するカチオン交換膜１９を用いた。カチオン交換膜１９は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート４．６２ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．１７ｇ、グラフト率４１％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２２３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２６に係るカチオン交換膜１９とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１２７及び０．８７３であった。【０２１０】
実施例２６で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．８３％であり、凝集体（２）の割合は１．９６％、単量体の割合は９５．２１％であった。【０２１１】
カチオン交換膜１９に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．６９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜１９を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２１２】
（実施例２７）
実施例２７では以下に説明するカチオン交換膜２０を用いた。カチオン交換膜２０は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．９９ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート１．６３ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．４２ｇ、グラフト率４５％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２４１ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２７に係るカチオン交換膜２０とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１１９及び０．８８１であった。【０２１３】
実施例２７で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．５４％であり、凝集体（２）の割合は１．９３％、単量体の割合は９５．５３％であった。【０２１４】
カチオン交換膜２０に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は１８ｍＬ（５．５１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は０．７ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速０．７ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬでカチオン交換膜２０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で２３ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２１５】
（実施例２８）
実施例２８では以下に説明するカチオン交換膜２０を用いた。カチオン交換膜２１は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、グリシジルメタクリレート０．５１ｇ、ｔ−ブチルメタクリレート０．２６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１２ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜前駆体を得た。【０２１６】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。更に、１４０ｍＬのクロロホルム中で、４ｍＬのメタンスルホン酸と反応させ、ｔ−ブチル基を脱保護し、カルボンキシル基に変換した。【０２１７】
実施例１と同様の方法で、膜体積、及び全カチオン交換基密度を測定したところ、１．０ｍＬ、４９ｍｍｏｌ／Ｌであった。【０２１８】
スルホン酸基密度は以下の方法により求めた。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸に１時間浸漬し、スルホン酸を全て水素化した。純水で洗浄し、塩酸を除去した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、塩化水素を溶出させた。１時間放置した後、塩化水素を含む塩化ナトリウム水溶液を回収した。更に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、１時間放置し、回収することにより、膜内に残った塩化水素を回収した。回収物を統合し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて滴定したところ、中和に２．０９ｍＬ要した。ブランクが０．２９ｍＬであったことから、膜が有するスルホン酸基は１８ｕｍｏｌであることが分かった。これを膜体積で除すると１８ｍｍｏｌ／Ｌであった。カルボキシル基は全カチオン交換基密度からスルホン酸基密度を差し引くことで求めることが出来、３１ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例２８に係るカチオン交換膜２１とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０４７及び０．９５３であった。【０２１９】
実施例２８で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）であり、凝集体（１）の割合は２．８０％であり、凝集体（２）の割合は３．２１％、単量体の割合は９３．９９％であった。【０２２０】
カチオン交換膜２１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．９９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２２１】
（実施例２９）
実施例２９ではカチオン交換膜２１と以下に説明する抗体溶液を用いた。実施例２９で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は１．７７％であり、凝集体（２）の割合は１．７８％、単量体の割合は９６．４４％であった。  【０２２２】
カチオン交換膜２１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（４．７４ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０２２３】
（比較例１）
比較例１では以下に説明するカチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ未満のカチオン交換膜２２を用いた。カチオン交換膜２２は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．８６ｇ、メタクリル酸０．２ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．２２ｇ、グラフト率７４％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２７ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度であった。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０１７及び０．９８３であった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例１に係るカチオン交換膜２２とした。【０２２４】
比較例１で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．２７％であり、凝集体（２）の割合は１．８６％、単量体の割合は９５．８７％であった。【０２２５】
カチオン交換膜２２に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、実施例１と比較して多かった。結果を図３に示す。【０２２６】
（比較例２）
比較例２では以下に説明するカチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の強カチオン交換基のみを有するカチオン交換膜２３を用いた。カチオン交換膜２３は次のように合成した。カチオン交換膜２３は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．６ｇ、ブチルメタクリレート１．８ｇ、グリシジルメタクリレート０．６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２８０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１１ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜前駆体を得た。【０２２７】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低い密度であった。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．０３及び０．９７であった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例２に係るカチオン交換膜２３とした。【０２２８】
比較例２で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）であり、凝集体（１）の割合は２．０３％であり、凝集体（２）の割合は２．０６％、単量体の割合は９５．９１％であった。【０２２９】
カチオン交換膜２３に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．８０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、実施例と比較して多く、処理容量が多い時に凝集体除去性能が不純分である。結果を図３に示す【０２３０】
（比較例３）
比較例３では以下に説明する、単独重合体が膜状基材の表面に固定されたカチオン交換膜２４を用いた。カチオン交換膜２４は次のように合成した。メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸３．０ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、３．２８ｇ、グラフト率９％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８３ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例３に係るカチオン交換膜２４とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、１．０及び０である。【０２３１】
比較例３で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は２．１２％であり、凝集体（２）の割合は２．３１％、単量体の割合は９５．５７％であった。【０２３２】
カチオン交換膜２４に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は２０ｍＬ（５．１５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、他の実施例と比較して多かった。結果を図３に示す。【０２３３】
（実施例３０）
実施例３０は、カチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルー精製後に、アニオン交換クロマトグラフィー担体によりフロースルー精製することにより、不純物を低減させた例を示す。【０２３４】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３０のカチオン交換工程では、カチオン交換膜１０を用いた。実施例３０で用いた抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は１．０５％であり、凝集体（２）の割合は１．１３％、単量体の割合は９７．８２％であった。また、ＨＣＰの含有量は３５０ｐｐｍであり、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２３５】
ＨＣＰはＣＹＧＮＵＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のＣＨＩＮＥＳＥ  ＨＡＭＳＴＥＲ  ＯＶＡＲＹ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用い、プロテインＡはＴＨＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用い、ＵＶ測定により定量した。【０２３６】
カチオン交換膜１０に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）及びＨＣＰ、プロテインＡを含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．４５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２３７】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３０のアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加え、ｐＨ７．８にし、Ｃａｐｔｏ  Ｑに接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．０１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．０ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）５ｍＬでＣａｐｔｏ  Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５５ｍＬの抗体溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２３８】
（実施例３１）
実施例３１は、アニオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルー精製後に、カチオン交換クロマトグラフィー担体によりフロースルー精製することにより、不純物を低減させた例を示す。【０２３９】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３１のアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用いた。抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）であり、凝集体（１）の割合は０．４２％であり、凝集体（２）の割合は１．１４％、単量体の割合は９８．４４％であった。また、ＨＣＰの含有量は３０６ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２４０】
体積１ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｑに、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）及びＨＣＰ、プロテインＡを含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（６．２８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．０ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）５ｍＬでＣａｐｔｏ  Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２４１】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３１のカチオン交換工程ではカチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加え、ｐＨ７にし、カチオン交換膜１０に接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．６５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの抗体溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２４２】
（実施例３２）
実施例３２は、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製後に、アニオン交換クロマトグラフィー担体にフロースルー精製することにより、不純物を低減させた例を示す。【０２４３】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３２のカチオン交換工程では、カチオン交換膜１０を用いた。抗体溶液は１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）であり、凝集体（１）の割合は０．９１％であり、凝集体（２）の割合は１．３２％、単量体の割合は９７．７７％であった。また、ＨＣＰの含有量は３９０ｐｐｍであり、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２４４】
カチオン交換膜１０に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）及びＨＣＰ、プロテインＡを含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。同様の操作をさらに５回繰り返し、回収した溶液を、サイズクロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  ＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２４５】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３２のアニオン交換工程では、０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加え、ｐＨ７．８にし、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。加えた量は３１０ｍＬ（３．８０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬで流れる１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）１０ｍＬでＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で３２０ｍＬの抗体溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ｐＨＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図４に示す。【０２４６】
（実施例３３）
実施例３３では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。【０２４７】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３３に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７２％であり、凝集体（２）の割合は１．０４％、単量体の割合は９８．２４％であった。また、ＨＣＰの含有量は２９８ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２４８】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３３に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。カチオン交換膜１０に加えた抗体溶液の量は８２ｍＬ（３．６７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で９２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２４９】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３３に係るアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加えてｐＨ７．８にしたところ電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をＣａｐｔｏ  Ｑに接触させた。Ｃａｐｔｏ  Ｑに加えた抗体溶液の量は８２ｍＬ（２．９６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。Ｃａｐｔｏ  Ｑに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．０ｍＬ／分で５ｍＬ通液し、Ｃａｐｔｏ  Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計８７ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２５０】
（実施例３４）
実施例３４では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。【０２５１】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３４に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．８３％であり、凝集体（２）の割合は１．１２％、単量体の割合は９８．０５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３１７ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２５２】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３４に係るアニオン交換工程では体積１ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｑ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を用い、抗体溶液を精製した。Ｃａｐｔｏ  Ｑに加えた抗体溶液の量は８１ｍＬ（３．７２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．０ｍＬ／分、温度は２５℃であった。Ｃａｐｔｏ  Ｑに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．０ｍＬ／分で５ｍＬ通液し、Ｃａｐｔｏ  Ｑを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計８６ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２５３】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３４に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に酢酸を加え、ｐＨ７．０に調整したところ、電気伝導度は１．９ｍＳ／ｃｍであった。その後、カチオン交換膜１０に接触させた。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．３３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２５４】
（実施例３５）
実施例３５では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。【０２５５】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３５に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７９％であり、凝集体（２）の割合は１．１６％、単量体の割合は９８．０５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３９０ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２５６】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３５に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。加えた抗体溶液の量は８２ｍＬ（３．７１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２５７】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３５に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加えてｐＨ７．８にしたところ電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は８２ｍＬ（２．９９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２５８】
（実施例３６）
実施例３６では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、及びカチオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。【０２５９】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３６に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７８％であり、凝集体（２）の割合は１．２１％、単量体の割合は９８．０１％であった。また、ＨＣＰの含有量は３６５ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。【０２６０】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３６に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．６９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２６１】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３６に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。アニオン交換工程で回収した抗体溶液に酢酸を加え、ｐＨ７．０に調整したところ、電気伝導度は１．９ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をカチオン交換膜１０に接触させた。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２６２】
（実施例３７）
実施例３７では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。アニオン交換クロマトグラフィー工程においては、担体体積あたり４ｇ以上の抗体をロードした。【０２６３】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３７に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。同じ操作を全部で２回行い、それぞれの溶出液を統合した。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．５６％であり、凝集体（２）の割合は１．７９％、単量体の割合は９７．６５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３４９ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は４ｐｐｍであった。【０２６４】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３７に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。加えた抗体溶液の量は１００ｍＬ（２．６０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１１０ｍＬの溶液を回収した。同じ操作を全部で５回行い、回収した溶液を統合し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２６５】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３７に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加えてｐＨ７．８にしたところ電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は５００ｍＬ（２．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計５１０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２６６】
（実施例３８）
実施例３８では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。また、カチオン交換工程とアニオン交換工程の間にｐＨ調整の操作を行わなかった。【０２６７】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３８に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。同じ操作を全部で２回行い、それぞれの溶出液を統合した。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．９９％であり、凝集体（２）の割合は０．９８％、単量体の割合は９８．０３％であった。また、ＨＣＰの含有量は３０６ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は２ｐｐｍであった。【０２６８】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３８に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。加えた抗体溶液の量は１２０ｍＬ（２．４０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１３０ｍＬの溶液を回収した。同じ操作を全部で５回行い、回収した溶液を統合し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２６９】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３８に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は４８０ｍＬ（１．９５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計４９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。
（実施例３９）
実施例３９では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。また、カチオン交換工程とアニオン交換工程の間にｐＨ調整の操作を行わなかった。【０２７０】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３９に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させた。溶出液の一部に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．５に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は２．２ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．５０％であり、凝集体（２）の割合は０．９１％、単量体の割合は９８．５９％であった。また、ＨＣＰの含有量は４４３ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は１ｐｐｍであった。【０２７１】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３９に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。加えた抗体溶液の量は１３０ｍＬ（２．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．５）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１４０ｍＬの溶液を回収した。得られた抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２７２】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例３９に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は１２５ｍＬ（１．７９ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．５）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２７３】
（実施例４０）
実施例４０では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６３ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用い、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーの一連の精製工程をバッファーの交換をせずに行った。また、カチオン交換工程とアニオン交換工程の間にｐＨ調整の操作を行わなかった。【０２７４】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例４０では、実施例３９のアフィニティークロマトグラフィー工程で得た溶出液の一部に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを８．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は２．３ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．６４％であり、凝集体（２）の割合は１．０８％、単量体の割合は９８．２８％であった。また、ＨＣＰの含有量は５８８ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は２ｐｐｍであった。【０２７５】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例４０に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１０を用いた。加えた抗体溶液の量は１３０ｍＬ（２．０５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１０に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ８．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、カチオン交換膜１０を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１４０ｍＬの溶液を回収した。得られた抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。【０２７６】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例４０に係るアニオン交換工程では体積０．２５ｍＬのＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換工程で回収した抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は１２５ｍＬ（１．７５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ８．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図５に示す。
【図１】
2016013609.tif 000003
【図２】
2016013609.tif 000004
【図３】
2016013609.tif 000005
【図４】
2016013609.tif 000006
【図５】
2016013609.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月20日(2017.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３４】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー担体による精製が、フロースルーである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の精製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
カチオン交換基を有する吸着剤では、低塩濃度の抗体溶液を吸着剤に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた生理活性物質を溶出させる精製が一般的に行われている。更に、より良好な方法として、以下に説明するフロースルー様式による目的物質の精製も提案されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
陽イオン交換担体を用いたフロースルー精製の実施の形態に係るクロマトグラフィーの移動相としては、強酸、強アルカリ以外の緩衝液（バッファー）を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その塩類の濃度は０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、バッファー濃度は１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２〜７０ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである。ここで、バッファー濃度とは、バッファーの有効成分の濃度のことをいう。例えば、酢酸バッファーであれば、通常酢酸と酢酸ナトリウムから調製されるが、その時の、酢酸と酢酸ナトリウムの合計の濃度である。また、トリスバッファーでは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの濃度のことをいう。また、酢酸−トリスバッファー等のように表記されるバッファーについては、前者の濃度のことであり、酢酸−トリスでは酢酸、トリス−酢酸であればトリスの濃度のことである。また、本実施形態では、緩衝能をほとんど持たないｐＨの溶液（例えば、ｐＨ３．４の酢酸緩衝液）も、クロマトグラフィーに用いることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
５）凝集体を含む抗体溶液調整
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調整した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
カチオン交換膜１１に抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は３０ｍＬ（５．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。
（実施例１３）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
（実施例２３）
実施例２３では以下に説明するカチオン交換膜１６を用いた。カチオン交換膜１６は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２６ｇ、グラフト率４４％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１９８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２３に係るカチオン交換膜１６とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０４及び０．８９６であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
（実施例２５）
実施例２５では以下に説明するカチオン交換膜１８を用いた。カチオン交換膜１８は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．６５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２９ｇ、グラフト率４３％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２０９ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例２５に係るカチオン交換膜１８とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０８及び０．８９２であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
（実施例２８）
実施例２８では以下に説明するカチオン交換膜２１を用いた。カチオン交換膜２１は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、グリシジルメタクリレート０．５１ｇ、ｔ−ブチルメタクリレート０．２６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１２ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜前駆体を得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
（比較例２）
比較例２では以下に説明するカチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の強カチオン交換基のみを有するカチオン交換膜２３を用いた。カチオン交換膜２３は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．６ｇ、ブチルメタクリレート１．８ｇ、グリシジルメタクリレート０．６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２８０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１１ｇ、グラフト率７０％のカチオン交換膜前駆体を得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
カチオン交換膜２３に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（４．８０ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有量は減少していたものの、実施例と比較して多く、処理容量が多い時に凝集体除去性能が不十分である。結果を図３に示す
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３３に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７２％であり、凝集体（２）の割合は１．０４％、単量体の割合は９８．２４％であった。また、ＨＣＰの含有量は２９８ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３４に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．８３％であり、凝集体（２）の割合は１．１２％、単量体の割合は９８．０５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３１７ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５５】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３５に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７９％であり、凝集体（２）の割合は１．１６％、単量体の割合は９８．０５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３９０ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３６に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速４ｍＬ／分（３００ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ１６ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み２．５Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））８０ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））４８ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）８０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．８に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液の電気伝導度は１．８ｍＳ／ｃｍであった。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するアニオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．７８％であり、凝集体（２）の割合は１．２１％、単量体の割合は９８．０１％であった。また、ＨＣＰの含有量は３６５ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３７に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。同じ操作を全部で２回行い、それぞれの溶出液を統合した。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．５６％であり、凝集体（２）の割合は１．７９％、単量体の割合は９７．６５％であった。また、ＨＣＰの含有量は３４９ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は４ｐｐｍであった。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３８に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。同じ操作を全部で２回行い、それぞれの溶出液を統合した。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．９９％であり、凝集体（２）の割合は０．９８％、単量体の割合は９８．０３％であった。また、ＨＣＰの含有量は３０６ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は２ｐｐｍであった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例３９に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分（２３０ｃｍ／時間）で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬで平衡化し、抗体を含む培養上澄み７Ｌ添加し、抗体を吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３６０ｍＬを通液してカラムから抗体を溶出させた。溶出液の一部に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを７．５に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は２．２ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は０．５０％であり、凝集体（２）の割合は０．９１％、単量体の割合は９８．５９％であった。また、ＨＣＰの含有量は４４３ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は１ｐｐｍであった。
【国際調査報告】
2016013609.tif 000008
2016013609.tif 000009