(57)【要約】  血小板の活性化抑制性能、高い血小板回収性能及び高い血漿除去性能を有する、人工保存液置換血小板溶液を製造するための新規な手段が開示されている。本発明の人工保存液置換血小板溶液の製造方法は、下記式1で表される条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップと、前記濃縮血小板溶液を人工保存液と混合して人工保存液置換血小板溶液を得る混合ステップと、を備える。1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1  A ：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）  B ：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）  γ：入口壁ずり速度（s−1）  μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式1の条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップと、
前記濃縮血小板溶液を人工保存液と混合して人工保存液置換血小板溶液を得る混合ステップと、
を備える、人工保存液置換血小板溶液の製造方法。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A ：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B ：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s-1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）
【請求項２】
下記の式1の条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップと、
人工保存液を前記分離膜に接触させ、前記濾過ステップで濃縮血小板溶液中に回収されなかった血小板を前記人工保存液中に回収し、血小板含有人工保存液を得る回収ステップと、
前記濃縮血小板溶液を前記血小板含有人工保存液と混合して人工保存液置換血小板溶液を得る混合ステップと、
を備える、人工保存液置換血小板溶液の製造方法。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s-1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）
【請求項３】
タンパク質除去率が60％以上、かつ、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率が60%以下である、請求項1又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記濾過ステップにおける膜間圧力差が5.0×103 Pa以下である、請求項１〜３のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項５】
前記分離膜の透水性能は、35〜150 mL／hr／m2／Paである、請求項１〜４のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項６】
前記分離膜は、中空糸膜である、請求項１〜５のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項７】
前記クロスフロー濾過は、内圧式クロスフロー濾過である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記中空糸膜の内径は、100〜500μmである、請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項９】
前記中空糸膜の有効長は、5〜50cmである、請求項６〜８のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項１０】
前記分離膜は、親水性ポリマーを含み、前記分離膜の血小板溶液と接する面を測定角90°でX線電子分光法により測定した際の前記親水性ポリマーの存在量が、30〜60質量％である、請求項１〜９のいずれか一項記載の製造方法。
【請求項１１】
下記の式1の条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップを備える、濃縮血小板溶液の製造方法。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s-1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工保存液置換血小板溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血や血液製剤の製造のために行われる献血は、全血献血と、成分献血とに大別される。献血により採取された血液を成分ごとに分離することで、様々な種類の血液製剤が製造されている。血小板製剤とは、濃縮された血小板が血漿（主成分がタンパク質と水分）に分散した溶液のことである。血小板製剤中の血小板の濃度は、全血よりも3倍量以上高いため、血小板同士が非常に凝集しやすい可能性がある。【０００３】
血小板製剤は、血小板減少症や血小板機能低下症における出血の予防や治療のための輸血に用いられている。現行の血小板製剤は、患者によって蕁麻疹や発熱等のアレルギー反応を引き起こすことが問題となっている。アレルギーの主原因として血小板製剤に含まれるタンパク質が挙げられており、タンパク質を含む血漿を除去し、人工保存液に置換した人工保存液置換血小板溶液が望まれている。【０００４】
上記の人工保存液置換血小板溶液の製造方法には、操作中に血小板が活性化しないことに加え、高い血小板回収率、高いタンパク質除去率が求められる。従来は、血小板製剤のタンパク質を取り除く方法として、遠心分離法が一般的であった。遠心分離法によって血小板製剤中のタンパク質を除去した場合には、血小板の活性化が起こる可能性が示唆されており、また遠心法では操作が煩雑であり、相当の時間を要すると言われている。しかし、現在のところ遠心法以外に他の方法では実用化されていないのが現状である。【０００５】
他の方法としては、膜を用いて分離する方法が考えられ、膜分離の方法としては、血球（赤血球、白血球、血小板）と血漿との分離（特許文献１〜３）等に用いられた公知技術がある。特許文献１は赤血球の溶血を防ぐために膜の膨潤性に着目しており、多孔質膜に膨潤しにくい素材を用いると共に、多孔質膜には湿潤水分を極小量とする技術を開示している。特許文献２は膜のフィブリル構造を規定したり、血液流量を速くする技術である。さらに特許文献３は目詰まりや汚れが生じにくい膜として、親水性高分子に着目し、多孔質膜中に親水性高分子を3〜30質量％含有させたポリスルホン系樹脂多孔質膜を開示している。いずれにしても、先行技術では、濾過する対象を全血としており、血小板製剤の様な凝集しやすい溶液を対象としていない。さらには、膜に関してのみ着目しており、分離の方法に関しての知見や示唆は見られない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−２９０４６９号公報
【特許文献２】特開昭５４−１５４７６号公報
【特許文献３】特開昭６１−２３８８３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、血小板の活性化抑制性能、高い血小板回収性能及び高い血漿除去性能を有する、人工保存液置換血小板溶液を製造するための新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らが鋭意検討した結果、従来の透析治療やアフェレーシス療法用途の分離膜で人工保存液置換血小板溶液を製造することは非常に困難であるとの知見を得た。その原因として、膜の構造設計が適切でないことが挙げられた。従来の血液浄化用途の膜は、赤血球、白血球、血小板、タンパク質を主成分とする全血から、尿素などの低分子量物質や一部のタンパク質を除去することを目的として作製されている。そのため、分子量が大きなタンパク質を除去することができなかった。【０００９】
また、タンパク質を多く取り除くために本来の使用条件に比べて濾過量を上げると、途中で濾過ができなくなった。これは、膜内部において、タンパク質が目詰まりし、膜表面において、血小板がタンパク質を巻き込んだ堆積層（ケーク）を形成したことで濾過が阻害されたためであった。【００１０】
目詰まりやケークが形成されたのは、膜表面の孔が小さく、分子量の大きいタンパク質が膜を抜けずに膜表面や膜内部に留まったことと、濾過の流量設計が不適切で血小板が膜表面に多く堆積したことが原因であった。また、濾過が阻害されると、タンパク質の除去量の減少、血小板ロスの増加、活性化血小板の増加が見受けられた。【００１１】
このように、本願発明者らは、血小板溶液や分離目的に合わせた構造の分離膜を用いて分離条件を設定する必要があることを見出した。しかし、血小板溶液に含まれるタンパク質を除去するための膜設計と分離条件は今まで検討されてこなかった。そこで、さらに鋭意研究を重ね、血小板を活性化することなく高い血小板回収性能と高い血漿除去性能を達成できる分離条件を見出すことに成功し、本願発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、下記式1で表される条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップと、前記濃縮血小板溶液を人工保存液と混合して人工保存液置換血小板溶液を得る混合ステップと、を備える、人工保存液置換血小板溶液の製造方法を提供する。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A ：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B ：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s−1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）【００１３】
また、本発明は、下記式1で表される条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップと、人工保存液を前記分離膜に接触させ、前記濾過ステップで濃縮血小板溶液中に回収されなかった血小板を前記人工保存液に回収し、血小板含有人工保存液を得る回収ステップと、血小板人工保存液を、前記濃縮血小板溶液と混合することにより、人工保存液置換血小板溶液を得る混合ステップと、を備える、人工保存液置換血小板溶液の製造方法を提供する。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s−1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）【００１４】
上記の製造方法よって得られる人工保存液置換血小板溶液は、タンパク質除去率（元の血小板溶液中のタンパク質濃度を100とする）が60％以上、かつ、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率が60%以下であることが好ましく、タンパク質除去率が65％以上、かつ、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は40%以下であることがより好ましい。ここで、CD62P陽性血小板比率が高いほど、血小板が活性化していることを表す。【００１５】
また、上記の濾過ステップにおける膜間圧力差が5.0×103 Pa以下であることが好ましく、上記の分離膜の透水性能は、35〜150 mL／hr／m2／Paであることが好ましい。【００１６】
さらに、上記の分離膜は、中空糸膜であることが好ましく、上記クロスフロー濾過は、内圧式クロスフロー濾過であることが好ましく、上記の中空糸膜の内径は、100〜500μmであることが好ましく、上記の中空糸膜の有効長は、5〜50cmであることが好ましく、上記の分離膜は、親水性ポリマーを含み、前記分離膜の血小板溶液と接する面を測定角90°でX線電子分光法により測定して得られる前記親水性ポリマーの存在量は、30〜60質量％であることが好ましい。【００１７】
さらに、本発明は、下記式1で表される条件下、血小板溶液と接する面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用い、25〜1500s-1の入口壁ずり速度で前記血小板溶液をクロスフロー濾過して濃縮血小板溶液を得る濾過ステップを備える、濃縮血小板溶液の製造方法を提供する。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個／(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A：血小板溶液に含まれる血小板濃度（個／mL；ただし、8.0×107〜200×107個／mL）
B：面積あたり濾過流量（mL／hr／m2）
γ：入口壁ずり速度（s−1）
μP：血小板溶液の粘度（Pa・s）
【発明の効果】
【００１８】
本発明の人工保存液置換血小板溶液の製造方法によれば、全血ではなく血小板製剤のような凝集しやすい血小板溶液であっても、血小板の活性化を抑制しつつ、高い血小板回収率及び高いタンパク質除去率を達成でき、品質のよい人工保存液置換血小板溶液を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】A) 実施例で用いた中空糸膜の内表面（血液接触面）の10000倍の走査型電子顕微鏡像の一例である。B) 実施例で用いた中空糸膜の内表面（血液接触面）の10000倍の走査型電子顕微鏡像を塗りつぶして二値化した画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、「血小板溶液」とは、血漿を含む媒質中に血小板及びタンパク質が分散した液であって、赤血球及び白血球を実質的に含まない液である。媒質は、典型的には血漿であるが、人工保存液等の緩衝液が媒質の一部として含まれていてもよい。本発明で用いる血小板溶液の血小板濃度は8.0×107〜200×107個／mLである。血小板溶液は、全血を遠心分離した後、白血球除去フィルターに通す等の方法によって赤血球及び白血球を除去することにより得ることができる。一般に血小板製剤として知られる製剤は、濃縮された血小板を血漿中に分散させた製剤であり、血小板濃度が上記の範囲内であれば、そのまま「血小板溶液」として本発明の方法に供することができる。あるいは、本発明では、血小板製剤に含まれる血漿の一部が人工保存液で置換されているものや、人工保存液をあらかじめ混合して希釈したものを血小板溶液として用いることもできる。なお、血漿とは、この分野で周知の通り、全血から赤血球、白血球、血小板が遠心分離などの手法により除去されて残った成分を指し、主成分はタンパク質と水分である。
【００２１】
本発明において、「人工保存液」とは、血小板を分散させる媒質として使用可能な人工の（非天然の）溶液である。血小板のための人工保存液は公知であり、具体例としては、ＰＡＳIII−ＭやＭ−ｓｏｌ、生理食塩水、ビカネイト（登録商標）など一般的に輸液として用いられている溶液、さらにはＡＣＤ−Ａ液などのクエン酸を含む溶液が挙げられる。もっとも、これらに限定されるものではなく、血小板の保存に適した性能を有する溶液、すなわち、血小板と接触した時に、凝集塊の発生や浸透圧などによる血小板の破壊を誘導しない溶液であれば、いかなるものでも本発明における「人工保存液」として使用可能である。
【００２２】
「人工保存液置換血小板溶液」とは、血小板溶液の媒質の大部分が人工保存液に置換されたものをいう。主として血漿である媒質が人工保存液に置換されることで、血小板溶液中のタンパク質量が大幅に低減される。上記の人工保存液置換血小板溶液の製造方法によれば、血小板の活性化を防止しつつ、タンパク質が望ましく除去された人工保存液置換血小板溶液を得ることができる。また上記の人工保存液置換血小板溶液の製造方法では、タンパク質除去率が60％以上、かつ、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率が60%以下であることが好ましく、タンパク質除去率が65％以上、かつ、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率が40%以下であることがより好ましい。ここで、CD62P陽性血小板比率が高いほど、血小板が活性化していることを表す。CD62P陽性血小板比率が60%以上では、血小板が凝集し、血小板機能が低下しやすいため、活性化しないような製造方法が重要である。また、CD62P陽性血小板比率が低すぎると血小板の凝集機能が損なわれている可能性もあるため、人工保存液置換血小板溶液中のCD62P陽性血小板比率は1%以上、さらには3%以上が好ましい。また、元の血小板溶液のCD62P陽性血小板比率を1とした場合の人工保存液置換血小板溶液のCD62P血小板比率の増加比は3.0以下、好ましくは2.0以下、さらに好ましくは1.5以下である。
【００２３】
本発明の人工保存液置換血小板溶液の製造方法では、血小板溶液と接する膜表面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の分離膜を用いて、下記式1で表される条件において、入口壁ずり速度を25〜1500s-1にして血小板溶液をクロスフロー濾過する。このような条件下で血小板溶液を濃縮することで、血小板の活性化を抑制しつつ、高い効率でのタンパク質の除去を達成できる。
1.0×1011＜(A×B)／(γ×μP)≦2.5×1013（個/(hr・m2・Pa)）  ・・・・式1
A ：血小板溶液に含まれる血小板濃度 [個/mL]
（ただし、8.0×107〜200×107個/mL）
B ：面積あたり濾過流量 [mL/hr/m2]、
γ：入口壁ずり速度 [s-1]、
μP：血小板溶液の粘度 [Pa・s]
【００２４】
血小板溶液の濾過によって血漿除去血小板溶液を作製する際の最大の問題点は、タンパク質及び血小板が膜に目詰まりすることである。膜表面の平均孔径が0.1μm以上2.0μm未満の場合、目詰まりの原因は、血小板が表面に堆積し、タンパク質も巻き込んだ堆積層を形成することにある。この堆積層をケークと呼ぶ。ケークが形成されると、血漿の除去効率が低下する。さらには、ケークに存在する血小板を完全には回収することができないので、血小板の回収率も低下してしまう。そのうえ、ケーク中の血小板は活性化因子を放出するので、回収した血小板も活性化されてしまうという問題も生じる。つまり、血小板溶液の濾過時にケーク形成を抑制することが重要である。血小板の回収率としては、80%以上が好ましく、さらには85%以上が好ましく、より好ましくは90%以上である。
【００２５】
本願発明者らは、ケーク形成を抑制する濾過方法として、クロスフロー濾過が最も適していることを見出した。クロスフロー濾過とは、血小板溶液の一部のみを濾過して、残りをそのまま流す（分離膜を透過させず、分離膜の表面に流す）ことで、膜表面に対して垂直な流れと膜表面に対して平行な流れの2つの流れを存在させる濾過方法のことである。中空糸膜を例にとると、中空糸膜の一方から血小板溶液を入れ、その一部を濾過して、濾過されずに残った血小板溶液を他方から排出する濾過方式となる。
【００２６】
膜に垂直な濾過流れは、ケークの形成を促進するのに対し、膜表面に平行な流れは、ケークの形成を抑制する。本発明では、この2つの流れに着目し、式1を満たす条件で分離膜を設定し、流量を制御しつつ濾過することで、ケーク形成の抑制が可能になることを見出した。
【００２７】
式1のうち、分子（A×B）は、ケークを形成する力に相当し、分母の（γ×μP）がケークを抑制する力に相当する。（A×B）が、（γ×μP）に比べて小さいほど、ケークが生じにくくなり、血小板の活性化をさせず、高い血小板回収率で安定してタンパク質を除去できる。上記式１の通り、ケーク形成の力と抑制の力の比（（A×B）/（γ×μP））が1.0×1011より大きくかつ2.5×1013以下となるようにすることで、分離膜上でのケーク形成を抑制しながら濾過することができる。また、（A×B）が（γ×μP）に比べて小さすぎると、タンパク質の濾過が十分に行われなくなる。したがって、ケーク形成の力と抑制の力の比は、より好ましくは1.0×1011より大きくかつ2.0×1013以下であり、さらに好ましくは1.0×1011より大きくかつ1.5×1013以下である。
【００２８】
分離膜として中空糸膜を用いる場合を例に説明すると、入口壁ずり速度γの求め方は次のとおりである。
γ（s-1）＝4×C／D  ・・・・式2
C  ：  供給液線速度（m/s）
D  ：  相当半径（m）
【００２９】
式2中のCは以下の式3で与えられる。
C＝（E／1000000）／（F×中空糸本数）  ・・・・式3
E  ：  供給される血小板溶液流量（mL/s）
F  ：  膜と接触している血小板溶液の、濾過されなかった血小板溶液が流れる方向に対して垂直方向の断面の面積（m2）
【００３０】
Fにおける「膜と接触している血小板溶液」とは、血小板溶液と接触している側の膜表面の垂直方向に連続して存在している血小板溶液を指す。中空糸膜の場合、Fとは、中空糸膜断面における内腔部分の面積である。
【００３１】
また、式2中のDは以下の式4で与えられる。
D＝2×（F／G）  ・・・・式4
G  ：  上記Fで表記した断面の外周において、壁面と接触する部分の合計長さ（m）
【００３２】
中空糸膜の場合、Gとは、断面における内腔部分の円周の長さである。
【００３３】
膜に供給する血小板溶液の流量は、定速で送液しても定圧で送液してもどちらでも良い。ポンプなどを用いて定速で血小板溶液を送液する場合、生理食塩水を1分間流したときの液量を上記式3の血小板溶液流量Eとすればよい。一方、ある一定の圧力で送液する場合の血小板溶液流量Eは、次の式で求めることができる。
E＝H×（μP／μw）  ・・・・式5
H  ：  ある一定の圧力で濾過をかけずに生理食塩水を1分間送液したときの液量（mL/min）
μP  ：  血小板溶液の粘度（Pa・s）
μw  ：  生理食塩水の粘度（Pa・s）
【００３４】
入口壁ずり速度γとは、血小板溶液が膜と最初に接触する入口地点における濾過される前の血小板溶液の流量から算出した壁ずり速度のことを指す。壁ずり速度とは、膜表面におけるずり速度のことを指す。ずり速度は、膜表面と平行な方向の線速度の速度勾配を表し、流れの中心から離れるほど大きくなり、膜表面において最大となる。ケークは膜表面において形成されるため、ケーク抑制には壁ずり速度も重要といえる。なかでも、入口壁ずり速度が特に重要であることを本願発明者らは見出した。これは、膜の入口付近で血小板やタンパク質が活性化された場合、下流において膜表面への付着が起きやすく、ケークが形成されるためと考えられる。一方で、壁ずり速度が高すぎても血小板が活性化する。以上のことから、入口壁ずり速度は25秒-1以上が好ましく、100秒-1以上がより好ましく、600秒-1以上がより好ましい。また、1500秒-1以下が好ましく、1000秒-1以下がより好ましい。
【００３５】
また、血小板溶液の粘度μPとしては、高い方がケーク形成を抑制する力が大きくなる。一方で、粘度が高いと、血小板やタンパク質の濃度が高いため、血小板の活性化を起こしやすく、ケークが形成されやすい。以上を考慮した結果、血小板溶液の粘度としては、1.0×10-3 Pa・s以上が好ましく、1.2×10-3 Pa・s以上がより好ましい。また2.5×10-3 Pa・s以下が好ましく、1.8×10-3 Pa・s以下がより好ましい。なお、任意の溶液の粘度は、市販の測定機器を用いて常法により測定することができる。
【００３６】
本発明における、面積あたり濾過流量Bは、設定濾過流量を血小板溶液が接触する膜の面積で割った値である。面積あたり濾過流量が小さいほど、ケークを形成する力が小さい。一方で、血小板溶液中の血漿の除去効率（ひいてはタンパク質の除去効率）は低下する。以上を考慮した結果、面積あたり濾過流量は、4800 mL/hr/m2〜48000 mL/hr/m2が好ましく、14400 mL/hr/m2〜32000 mL/hr/m2がさらに好ましい。
【００３７】
また、ケークが形成されると、設定した濾過流量よりも、実際の濾過流量の減少や、タンパク質除去量の低下が生じる。このような場合、膜間圧力差（以下、TMP）が大きくなる。特に、一度、ケークが形成されると、加速度的にケーク形成が進行する。このため、膜間圧力差が好ましくは5.0×103 Pa以下、より好ましくは3.0×103 Pa以下の条件で濾過することが好ましい。TMPは、次の式で求めることができる。
TMP（Pa）＝（（Pi＋Po）／2）−PF  ・・・・式6
Pi  ：  供給される血小板溶液の圧力（Pa）
Po  ：  濾過されずに排出された血小板溶液の圧力（Pa）
PF  ：  濾過されて排出された溶液の圧力（Pa）
【００３８】
上述した条件に好適な膜は、血小板溶液と接する膜表面の平均孔径が0.1μm以上2μm未満、好ましくは0.3μm以上1.0μm以下の膜である。タンパク質を可能な限り除去する必要があるため、膜表面の孔径はできる限り大きい方が良い。その一方で、膜表面の孔径は、大きさが2〜4μmである血小板よりも小さい必要がある。タンパク質と血小板の両者の大きさを考慮すると、ケークを形成させずに血小板溶液を濾過するには、上記した孔径が血小板溶液からタンパク質を取り除くのに最も適している。
【００３９】
また、膜表面の開孔率が大きいほど、同じ孔径でも膜内部への進入経路が多いため、ケーク層は形成されにくい。膜表面の開孔率は、10％以上が好ましく、12％以上がより好ましく、15％以上がさらに好ましい。分離膜表面の開孔率が10％未満の場合には、透水性能の著しい低下により膜間圧力差が上昇し、血小板の活性化及び血小板回収率の低下につながりかねない。また、開孔率が高すぎると膜の強度が不足するため、開孔率は30％以下が好ましく、20％以下がより好ましい。膜表面の孔径、開孔率の測定方法の詳細については後述するが、電子顕微鏡で1000倍に拡大した画像をMatrox Inspector2.2（Matrox Electronic Systems Ltd.）等の公知のソフトウェアで画像処理することによって得ることができる。
【００４０】
また、透水性が高い膜ほど、ケーク層は形成されにくく、膜間圧力差を低く制御できる。すなわち、透水性能が高い膜を使うことは、血小板活性化の抑制と血小板回収率の向上に繋がる。高いずり速度範囲においてなるべく多くの血漿を取り除くことを考慮すると、膜の透水性能は、35 mL/hr/m2/Pa以上が好ましく、70 mL/hr/m2/Pa以上がより好ましい。また、150 mL/hr/m2/Pa以下であることが好ましい。膜の透水性能の測定方法の詳細については後述するが、一定圧力で単位時間あたりに膜を介して流出した水の量を測定して得ることができる。
【００４１】
本発明において使用する分離膜の形状は、特に限定されない。しかし、上記記載の条件を達成するには、狭い流路で血小板溶液を流すのが最も効率的である。分離膜の形状としては中空糸が最も適しており、さらに内圧式でクロスフロー濾過することが好ましい。
【００４２】
中空糸膜を用いて外圧式で濾過しても問題は無いが、その場合、中空糸膜同士の隙間をできる限り狭くする必要がある。また、血小板ケーク形成の抑制や血小板溶液の流動性の保持の観点から、中空糸膜同士を接触させない工夫が必要となる。中空糸膜同士を接触させない方法としては、糸束にスペーサー糸を入れる、中空糸外側の断面を星形など複雑な形状にする、繊維方向の形状を波形にするなどが挙げられる。
【００４３】
本発明において、中空糸膜を内圧式クロスフローで使用する場合、膜内径が小さいほど、高いずり速度を得やすい。その一方、膜内径が小さすぎると膜内腔そのものが詰まる危険性も高くなるため、膜の内径に注意する必要がある。この点を考慮した結果、本発明においては、中空糸の膜内径は100〜500μmが好ましく、200〜350μmがさらに好ましい。詳細は後述するが、中空糸膜内径は、中空糸膜外径と膜厚を測定することで求めることができる。
【００４４】
中空糸膜を内圧クロスフロー濾過で使用する場合、膜の有効長によって膜面積あたり濾過流量Bが変わる。膜の有効長が長いほど膜面積あたり濾過流量が低くなるため、よりケーク形成を抑制することができる。しかし、血小板活性の観点から見た場合、膜の有効長が長いほど、中空糸内腔に滞留する時間、すなわち血小板と膜表面の接触時間が長くなるため、血小板が活性化しやすくなる。この点を考慮した結果、本発明においては、中空糸膜の有効長は5〜50 cmが好ましく、20〜35 cmがさらに好ましい。
【００４５】
本発明における有効長とは、分離膜として有効に機能する部分の長さのことである。したがって、膜を充填してモジュールを作成した場合、膜がポッティング剤などで埋められていて、濾過できない部分は含まれない。中空糸膜を例に取ると、中空糸膜で有効に機能する部分の糸の長さが有効長に該当する。また、平膜を例に取ると、縦と横の長さが存在するが、血小板溶液を流す方向と同一方向の長さが有効長に該当する。
【００４６】
分離膜の素材については、上記した条件を満たすものであれば制限はないが、膜と接触しても血小板を活性化させない、いわゆる血液適合性を有する素材が適している。素材の例としては、血液透析膜や血漿分離膜で使用されているセルロースアセテートを代表とする再生セルロースや、エチレンビニルアルコール共重合体及びポリスルホンなどの合成ポリマーが挙げられる。
【００４７】
上記した膜素材の中でも特に、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンといったいわゆるポリスルホン系ポリマーを主たる原料とした分離膜は、透水性能や分画性能に優れていることが知られている。本発明においても、使用する素材としてはポリスルホン系ポリマーが最も好ましい。ここで「ポリスルホン系ポリマー」とは、その主鎖に芳香環、スルフォニル基及びエーテル基を有するポリマーをいう。
【００４８】
ポリスルホン系ポリマーとしては、例えば、一般式（I）で示されるポリスルホン、一般式（II）で示されるポリスルホン、ポリエーテルスルホン及びポリアリルエーテルスルホン等が挙げられるが、これらの中でも一般式（I）で示されるポリスルホン及び一般式（II）で示されるポリスルホンが好ましく、さらにn数が50〜80であるものがより好ましい。なお、一般式（I）又は(II)で示されるポリスルホンと、他のモノマーとのブロック共重合体や、一般式（I）又は(II)で示されるポリスルホンの変性体も「ポリスルホン系ポリマー」に包含される。一般式（I）又は(II)で示されるポリスルホンと他のモノマーとのブロック共重合体における「他のモノマー」由来の構造は、ブロック共重合体全体に対して10質量％以下であることが好ましい。
【００４９】
【化１】
2014084263.tif 000002
【００５０】
【化２】
2014084263.tif 000003
【００５１】
また、膜素材のポリマーに親水性ポリマーを混練したり、膜表面へ親水性ポリマーを修飾したりすることで、血液適合性に優れた膜を作製できることが知られている。本発明においても、分離膜に親水性ポリマーが含まれていることが好ましい。「親水性ポリマー」とは、水溶性のポリマー化合物であるか、又は非水溶性であっても静電相互作用や水素結合により水分子と相互作用する高分子をいう。ここで親水性ポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドン（以下、「PVP」）が挙げられ、中でもPVPが好ましい。
【００５２】
親水性ポリマー物質として添加され得るPVPとしては、重量平均分子量が約6000（K-15相当）〜1200000（K-90相当）のものが存在する。本発明で用いる場合、PVPの重量平均分子量は、親水性を向上させるために10000以上が好ましく、40000以上がより好ましい。
【００５３】
ポリスルホン系ポリマーと親水性ポリマーを主たる原料とした分離膜を用いる場合、血小板溶液と接する側の最表層部分の親水性ポリマーの存在量は30〜60質量％が好ましく、さらに50〜60質量％が好ましい。血小板溶液の場合、分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量が30質量％以上であると、膜表面の親水性が向上し、血液適合性が良くなるため、分離膜表面の血小板凝集を好ましく防いで、分離膜の分離性能の低下を防止することができる。また、分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量が50質量％以上になれば、さらに親水性が高くなり、凝集が起こりにくくなるため、より好ましい。一方、分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量を60質量％以下に抑えることで、血小板溶液中に溶出する親水性ポリマーの量を抑えることができるため、溶出した親水性ポリマーの影響を低減することができる。
【００５４】
分離膜の最表層部分とは、測定角90°でX線電子分光法（XPS）により測定された範囲である。当該方法では、具体的には表面より深さが10 nm（100Å）程度までの親水性ポリマー存在量を測定可能である。例えば、中空糸膜の内側に血小板溶液を通液する場合、「分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量」は、中空糸膜の内表面における炭素原子や窒素原子等の元素の存在比率を調べることによって算出することができる。詳細については、後述する。
【００５５】
「膜表面に親水性ポリマーが存在する」とは、親水性ポリマーが何らかの形でポリスルホン系分離膜の血小板溶液と接触する膜表面、又は非接触側の膜表面に留まっている状態をいう。例えば、親水性ポリマーが、ポリスルホン系分離膜の血小板溶液と接触する膜表面、又は非接触側の膜表面に共有結合している態様、製膜プロセスにおいて血小板溶液との接触側に親水性ポリマー溶液を用いることで親水性ポリマー含量の高い層を形成させる態様、事後的なコーティングにより親水性ポリマーの皮膜を形成させる態様など、種々の態様が包含され、上記した血小板溶液と接する側の膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量を満足する限り、いかなる態様であってもよい。
【００５６】
膜表面に親水性ポリマーを存在させる方法の具体例として、以下の方法が挙げられる。製膜原液から湿式製膜する場合、表面には、エントロピーロスを防ぐために高分子量のポリマーが集まり、かつ、エンタルピーロスを防ぐために親水性ポリマーが集まる傾向にある。従って、例えば、ポリスルホン膜の場合、ポリスルホンと親水性ポリマーの2成分ポリマーからなる原液を作成すれば、表面に親水性ポリマー原液を濃縮させることができるため、重合することで膜表面に親水性ポリマーを局在させることができる。また、分離膜が中空糸膜の場合には、二重環状口金から吐出する際に内側に注入液を流すが、この注入液に親水性ポリマーを添加しても良い。このようにすると、中空糸膜が相分離し、膜構造が決定する前に、注入液中の親水性ポリマーが製膜原液側に拡散するため、内表面に親水性ポリマーを局在化させることができる。あるいはまた、中空糸膜を製膜後に、分離膜の機能層表面を親水性ポリマーでコーティングしてもよく、この方法は簡便で好適に用いることができる。コーティング後、放射線や熱処理等によって親水性ポリマーを分離膜に架橋させてもよく、これにより、親水性ポリマーの溶出をより好ましく抑制することができる。また、親水性ポリマーと中空糸膜を化学反応によって固定化しても良い。
【００５７】
本発明の濾過ステップでは、上記式1で表される条件下、適当な血小板溶液用分離モジュール（具体的には、上述した中空糸等の分離膜を装着したカラムが挙げられる）中に血小板溶液を流すことで、血小板溶液から媒質（主として血漿）の一部を濾過して取り除く。これにより、血小板が液中に濃縮された濃縮血小板溶液が得られる。式1の条件を満たす限り、濃縮の程度は限定されないが、通常、数分の1〜数十分の1程度まで血小板溶液の体積が減少するように媒質が除去される。
【００５８】
この濃縮ステップは、血小板の活性化を抑制しつつ高い効率でタンパク質を除去できる濃縮血小板溶液の製造方法ないしは血小板溶液の濃縮方法としても有用である。
【００５９】
濃縮ステップの後、人工保存液を加える混合ステップを行い、人工保存液置換血小板溶液が得られる。人工保存液の添加量は特に限定されず、得られた人工保存液置換血小板溶液を血小板製剤として用いる際の使用目的に応じ、適当な血小板濃度となるように適宜選択することができる。通常、もとの血小板溶液の4分の1程度〜同程度の体積となるように人工保存液が添加される。
【００６０】
混合ステップに先立ち、分離膜上に残った血小板を回収する回収ステップを行なってもよい。回収ステップを行なう場合、濾過ステップで用いた分離膜に人工保存液を接触させ、分離膜上に残った血小板を人工保存液とともに回収し、この人工保存液中に血小板を含んだ、血小板含有人工保存液を混合ステップにおける人工保存液として用いる。回収ステップの導入により、血小板溶液が流入する側の分離膜上、及び分離膜の孔内に残った血小板を回収することができ、血小板回収率を向上することができる。
【００６１】
回収ステップでは、濾過ステップで用いた分離膜に人工保存液を接触させるが、膜に接触させる方法は特に限定されない。例えば、人工保存液を分離膜に濾過させず、流し込んだ血小板溶液が接触する側の分離膜表面に人工保存液を接触させ、分離膜上に残存した血小板を人工保存液中に含ませて回収する方法、人工保存液を分離膜にて濾過し、孔内部に残存した血小板を人工保存液中に含ませて回収する方法、人工保存液を分離膜にてクロスフロー濾過することで、分離膜表面及び孔内部に残存した血漿を膜の外へ除去しながら血小板を人工保存液中に溶かし回収する方法などがあるが、いずれの方法を用いてもよく、またこれらの方法を適宜組み合わせて行なってもよい。中でも、人工保存液をクロスフロー濾過させて回収する方法が好ましく、この方法によれば特に血小板回収率を高めることができる。
【００６２】
また、回収ステップは、分離膜に流す人工保存液の流量を変えながら回収しても良い。
【００６３】
回収ステップにおけるずり速度は、式1と同様のずり速度の範囲になるよう流量を制御することが好ましい。膜面積あたり濾過流量については、濾過ステップで行った流量以下の流量に設定することが好ましい。膜面積あたり濾過流量を濾過ステップでの濾過流量と同等、または少ない流量にすることにより、血小板の活性化を促進せずに回収ステップで分離膜表面及び孔内部に残存した血小板を回収することができる。さらには、得られた人工保存液置換血小板溶液を原液として、再度、同様の操作を行ってもよい。タンパク質の除去率を上げるには、繰り返し操作を行うことは好ましい。ただし、繰り返し操作を行うと、血小板回収率は低下するので、繰り返し操作の回数としては5回まで、さらには3回までが好ましい。
【００６４】
本発明の方法に供する血小板溶液、濾過ステップで得られる濃縮血小板溶液、及び回収ステップで得られる血小板含有人工保存液のそれぞれに含まれる血小板数は、公知の全自動血球測定器（例えば日本光電工業株式会社製のCelltacα（MEC-6318）など）により測定することができる。また、血小板回収率は、以下の式により算出することができる。
血小板回収率（％）＝(I＋J)／K×100  ・・・・式7
I  ：  濃縮血小板溶液に含まれる血小板数
J  ：  血小板含有人工保存液に含まれる血小板数
K  ：  血小板溶液に含まれる血小板数
【００６５】
血小板の活性化を示す指標として、CD62P陽性血小板比率が挙げられる。血小板が外部からの刺激等で活性化されると、CD62Pが血小板の細胞膜表面に移行して発現するため、CD62Pが発現した血小板の割合によって血小板活性化の度合いを評価できる。CD62P陽性血小板比率は、詳細については後述するが、フローサイトメーターで測定できる。
【００６６】
また、本発明の方法に供する血小板溶液及び本発明の方法により得られる人工保存液置換血小板溶液の品質を簡便かつ短時間に把握できる有用な方法として、スワーリング検査が挙げられる。スワーリングとは、血小板を含む溶液の入った容器を光にかざしてゆっくりと撹拌すると、渦巻き状のパターンが見られる現象をいう。活性化されていない血小板の形態は円盤状であることから、撹拌によって円盤状血小板が光を一様に屈折させて光散乱現象が生じ、スワーリングが観察される。一方、活性化により血小板の形態が変化すると、光散乱現象は生じず、スワーリングは低下し消失する。
【００６７】
タンパク質濃度の測定においては、公知の総タンパク質濃度の測定法をそのまま利用すれば良い。総タンパク質濃度の測定方法として、紫外吸収法をはじめ各種方法があり、発色法がよく利用されている。発色法を大きく分けると、ブラッドフォード法を代表とするタンパク質と発色色素の化学結合を利用した方法と、ビシンコニン酸（BCA）法を代表とするタンパク質存在下で生じる還元銅イオンのキレート錯体を利用した方法に分けられる。タンパク質濃度の測定方法に関しては特に限定されないが、精度の観点からBCA法が最も適している。BCA法の詳細については、後述する。
【００６８】
タンパク質除去率は、以下の式により算出することができる。
タンパク質除去率（％）＝{(O×U)-(V×W)}×100／(O×U)  ・・式8
O  ：  血小板溶液のタンパク質濃度（mg/mL）
U  ：  血小板溶液液量（mL）
V  ：  人工保存液置換血小板溶液のタンパク質濃度（mg/mL）
W  ：  人工保存液置換血小板溶液の液量（mL）
【００６９】
以下、各種パラメータの測定方法について詳述する。
【００７０】
(1)  透水性能測定
「膜の透水性能」は、以下の方法により測定及び算出することができる。平膜でも中空糸膜でも、基本的には同じ下記式9で求めることができる。例えば、中空糸膜の場合、プラスチック管に中空糸膜を挿入し、中空糸膜の両端をプラスチック管両端部の内壁に接着固定して、有効長10 cmのモジュールを作製する。このモジュールに、本発明の方法の濾過ステップで用いるのと同じ濾過方向で圧力をかけて水を流し濾過させる。例えば、中空糸膜の内側から外側へ濾過する場合、内側から1.3×104 Paの水圧をかけ、中空糸膜の外側に流出してくる単位時間当たりの水の量を測定し、以下の式により「分離膜の透水性能」を算出する。
透水性能（mL／hr／Pa／m2）＝QW／(T×P×X)  ・・・・式9
QW  ：  中空糸膜の外側に流出した水の量（mL）
T   ：  水圧をかけた時間（hr）
P   ：  水圧（Pa）
X   ：  中空糸膜の内表面の面積（m2）
【００７１】
平膜など中空糸と異なる形状の膜を使用する場合も同様に、プラスチック等のケースに入口と出口を設ける。その際、膜以外を通る経路が無いように、経路を膜で塞ぐようにモジュールを作成する。膜の一方の表面から反対側の方向へ、入口側から上記記載の条件と同様に1.3×104 Paの水圧をかけ、膜の他方の表面から流出してくる単位時間当たりの水量を測定し、上記の式により「分離膜の透水性能」を算出することができる。この場合、上記式9中のXは、経路内で水と接する部分の分離膜の表面積（m2）であり、通常は経路の断面積と考えることができる。
【００７２】
(2)  中空糸膜内径測定
中空糸膜内径Riは、次の式で求めることができる。
Ri（μm）＝Ro−2×Y  ・・・・式10
Ro  ：  中空糸膜外径（μm）
Y   ：  中空糸膜厚（μm）
【００７３】
「中空糸膜外径」は、ランダムに選別した複数（例えば16本）の中空糸膜の外径をレーザー変位計（例えば、LS5040T(株式会社KEYENCE)等を使用可能）でそれぞれ測定した値の平均値である。「中空糸膜厚」は、ランダムに選別した複数（例えば16本）の中空糸膜の膜厚をマイクロウォッチャーの1000倍レンズ（例えば、VH−Z100(株式会社KEYENCE)等を使用可能）でそれぞれ測定した値の平均値である。
【００７４】
(3)  膜表面の孔径および開孔率測定
「表面に存在する孔の平均孔径」は、以下の方法により測定及び算出することができる。まず、走査型電子顕微鏡（例えば、S-800(日立製作所)等を使用可能）で分離膜の表面の10000倍画像を撮影する。このとき、画像の明るさ、コントラストは装置の自動機能を用いる。次に、公知のソフトウェア（例えば、Microsoft Paint（Microsoft Ltd.）等を使用可能）を用いて、孔の部分を黒く塗りつぶす。その後、二値化し、公知のソフトウェア（例えば、Matrox Inspector2.2（Matrox Electronic Systems Ltd.）等を使用可能）を用いて、孔の部分を白く、それ以外の部分を黒く反転させる画像処理を行い、白い孔の個数（以下、「総開孔数」）及び白い孔の部分のピクセル数の総和（以下、「総開孔面積」）を求め、以下の式11により、画像1枚当たりの平均孔径を算出する。これらの測定作業を、例えば中空糸5本につきそれぞれランダムに10箇所ずつ、計50回繰り返し、全50枚の画像についての平均値を得て、これを「内表面に存在する孔の平均孔径」とすることができる。なお、白と黒の二値化した画像と元の写真を比べて、孔がずれていないか、確認を行う。走査型電子顕微鏡像では孔の奥にも孔がしばしば認められるが（図１Ａ参照）、このような場合は最表面の孔を優先して画像処理が行なわれ（図１Ｂ参照）、「表面に存在する孔の平均孔径」が算出される。また、孔の全体が写っておらず、端が切れている場合でも、画像に写っている箇所については、算出対象とする。さらに、孔径が0.05μｍ未満の孔は、ノイズの可能性があるため、算出対象としない。
平均孔径（μm）＝総開孔面積／総開孔数  ・・・・式11
【００７５】
なお、上記の10000倍画像の撮影条件は、例えば以下のとおりとすることができる。
[撮影条件]
画像サイズ  ：  655×740ピクセル
画像解像度  ：  0.0143μm／ピクセル
画像面積    ：  93.0μm2（縦9.37μm×横9.93μm角）
【００７６】
血小板溶液を濾過するとき、透水性能の劣化が少ない方が良い。透水性能に大きな影響を与える要素の一つとして、分離膜表面の開孔率が挙げられる。膜表面の開孔率は、上記の「表面に存在する孔の平均孔径」と同一の方法により測定し、以下の式12により、画像1枚当たりの開孔率を算出する。これらの測定作業を、例えば中空糸5本につきそれぞれランダムに10箇所ずつ、計50回繰り返し、全50枚の画像についての平均値を得て、これを「表面の開孔率」とすることができる。
開孔率（％）＝総開孔面積／画像サイズ×100  ・・・・式12
【００７７】
(4)  親水性ポリマーの存在率測定
血小板溶液と接触する側の膜表面を露出させ、超純水でリンスした後、室温、0.5 Torrにて10時間乾燥させたものを測定サンプルとする。サンプルをX線光電子分光装置（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のESCALAB220i-XL等を使用可能）にセットし、X線の入射角に対する検出器の角度を調整して測定角を90°として測定を行なう。得られたC1s、N1s及びS2pのそれぞれのスペクトルの面積強度、並びに装置付属の相対感度係数から、中空糸膜の外表面から約10 nmの深さまでにおける炭素原子、窒素原子及び硫黄原子の存在比率を求める。
【００７８】
ここで、例えば、「血小板溶液と接触する側の膜表面における親水性ポリマー」がPVPである場合には、測定角を90°としてXPSで測定をして、分離膜の血小板溶液と接触する側の膜表面から約10 nmの深さまでにおける炭素原子、窒素原子及び硫黄原子の存在比率を調べ、以下の式13により、分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量を算出することができる。
分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量（質量％）
＝N×111／（N×111＋S×442）  ・・・・式13
N    ：  窒素原子の存在比率
S    ：  硫黄原子の存在比率
111  ：  PVPの繰り返し単位数
442  ：  ポリスルホン系ポリマーの繰り返し単位数
【００７９】
(5)  CD62P陽性血小板比率測定
フローサイトメーターを用いたCD62P陽性血小板比率の測定では、、人工保存液置換血小板溶液を製造後5分以内にサンプリングを行い、1%パラホルムアルデヒド／PBS溶液を用いて固定化し、固定化後12時間以上１週間以内の固定化済み血小板を測定試料に用いる。測定試料をPBSにより洗浄し、血小板数を調整した後、(i) 活性化非依存性の血小板特異マーカーに対する抗体であるCD61抗体とコントロールIgGを加えたサンプル、および(ii) CD61抗体とCD62P抗体を加えたサンプルを用意する。(i)および(ii)のサンプルは、抗体を加えた後に、20分間暗所で静置する。その後、(i)および(ii)のサンプルそれぞれに固定試薬であるベクトンディッキンソン社製CellFixを純水で10倍希釈したものを加えて、一晩静置する。その後、それぞれのサンプルにPBSを加えて2000×g、10分間の条件で遠心し、洗浄を行う。測定については、まず、(i)のサンプルを用いて、フローサイトメーターで散乱光パターンによる血小板ゲートに加えて、CD61の蛍光標識を用いて、血小板をゲートする。さらにその後、コントロールIgGの蛍光標識で、血小板の0.5%〜1.0%が陽性となるようにカットオフラインを設定する。ゲート及びカットオフラインを固定したままサンプルを(ii)に変えて同様に測定し、カットオフラインを超えた血小板数の割合をCD62P陽性血小板比率とする。
【００８０】
(6)  BCA法を用いたタンパク質濃度測定
BCA法を用いたタンパク質濃度は、各社から市販されているBCAキットを使用すれば簡便に測定できる。血小板溶液および人工保存液置換血小板溶液を5分以内にサンプリングし、サンプリングから24時間以内のものを用いる。測定サンプルについては、サンプリングした血小板溶液および人工保存液置換血小板溶液を2000×g、10分間の条件で遠心分離し、血小板を除いた上澄みを測定サンプルとする。測定サンプルは4℃に保管し、測定はサンプリングから１週間以内に行う。測定については、はじめにBCA試薬と検量線用のサンプルを調製する。キットの仕様に従い、検量線用サンプルまたは測定サンプルに対してBCA試薬を加え、室温で30秒間ミクロミキサーを用いて撹拌する。その後、37℃で30分間インキュベートし、サンプル温度を室温まで下げた後、波長562nmにおけるサンプルの吸光度を測定する。吸光度を測定する波長は、厳密に同じでなくても、その近辺の波長±20nm程度の範囲内であればよい。検量線サンプルから、タンパク質濃度と吸光度の検量線を引き、検量線の式に測定サンプルの吸光度を代入することで、測定サンプルのタンパク質濃度を求めることができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、透水性能、中空糸膜内径、膜表面の孔径および開孔率、親水性ポリマーの存在量、CD62P陽性血小板比率、ならびにタンパク質濃度の測定は、上記(1)〜(6)に記載した通りの方法で実施した。【００８２】
（中空糸膜の調製）
15部のユーデル（登録商標）ポリスルホン（P3500；ソルベイ社）、8部のPVP（K90；ISP社）、75部のジメチルアセトアミド（以下、「DMAc」）及び2部の水からなる混合物を、90℃で混合溶解した後に、50℃に保温したものを製膜原液とした。また、80部のDMAC及び20部の水からなる混合溶液に、30部のPVP（K30；ISP社）を加え混合溶解したものを芯液とした。【００８３】
外径1.0 mm／内径0.7 mmのオリフィス型二重円筒型口金を用いて、外側の筒から製膜原液を、内側の筒から芯液を、それぞれ同時に吐出し、30℃に設定した長さ80 mmの乾式部を通過させた後、90部の水及び10部のDMACからなる混合溶液を入れた90℃の凝固浴に浸漬して凝固させ、さらに80℃の温水浴で温水洗浄してからカセ枠に巻き取り、湿潤状態の中空糸膜を得た。なお、製膜速度を40 m／分としたところ、中空糸膜内径は300μm、中空糸膜の膜厚は80μmとなった。該中空糸内表面について、電界放射型走査型電子顕微鏡S-800(日立製作所)を用いて10000倍画像を撮影した。このとき、画像の明るさ、コントラストは装置の自動機能を用いた。次に、Microsoft Paint（Microsoft Ltd.）を用いて、孔の部分を黒く塗りつぶした。二値化した後、Matrox Inspector2.2（Matrox Electronic Systems Ltd.）を用いて、孔の部分を白く、それ以外の部分を黒く反転させる画像処理を行い、白い孔の個数及び白い孔の部分の総開孔面積を求め、式11により、画像1枚当たりの平均孔径を算出した。これらの測定作業を、中空糸5本につきそれぞれランダムに10箇所ずつ、計50回繰り返し、全50枚の画像についての平均値を得た。図１Ａに代表的な電子顕微鏡観察像、図１Ｂに代表的な電子顕微鏡観察像を二値化処理した画像を示した。【００８４】
得られた湿潤状態の中空糸膜を0.4 mの長さに切断して小分けし、90℃の温水浴に30分間浸漬して温水洗浄した後、100℃で10時間の乾燥処理を行い、さらに乾熱乾燥機により170℃で5時間の加熱架橋処理を行って、中空糸膜を得た。【００８５】
（実施例１）
分離膜として、ポリスルホンとPVPからなる、中空糸膜を用いた。【００８６】
中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュール（血小板溶液用分離膜モジュール）を作製した。まず、φ18×310mmの筒状のプラスチックモジュールに、上記製膜操作により得られた528本の中空糸膜の束を挿入し、これを60質量％グリセリン水溶液に浸漬した後に、50℃で一昼夜乾燥した。続いて、遠心器にセットしたプラスチックモジュールの両端にウレタン樹脂すなわちポッティング材5mLをそれぞれ注入し、60G／15分で回転させた（1度目のポッティング）。その15分後に、さらにプラスチックモジュールの両端にポッティング材10mLをそれぞれ注入し、再び60G／15分で回転させて（2度目のポッティング）、中空糸膜モジュールを作製した。【００８７】
中空糸膜内径は300μm、膜面積は0.144m2、透水性能は75mL／hr／Pa／m2、内表面に存在する開孔率は17.3％、孔の平均孔径は0.90μm、内表面に存在する親水性ポリマーの存在量は54.2％であった。【００８８】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製Salacet F（登録商標） 746.2mLに大塚製薬社製Meylon（登録商標） 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。【００８９】
血小板を2.0×1011個含む血小板溶液600mL（血小板濃度は33×107個／mL）を、血液ポンプを用いて67.2mL／minに設定し、内圧をかけてクロスフロー濾過した（濾過ステップ）。血小板溶液の粘度は、1.6mPa・sだった。また、この時の濾過速度は60.5mL／minであり、入口壁ずり速度は800秒-1、面積あたり濾過流量は60.5×60(mL／hr)÷0.144(m2)＝25208mL／hr／m2、TMPは3.0×103Paであった。【００９０】
この処理によって、血小板溶液は中空糸内側を通過して濾過され、濃縮血小板溶液60mLが得られた（濾過ステップ）。その後、M-solを中空糸内側に67.2mL／minで流して血小板の溶けた人工保存液を回収した（回収ステップ）。そして、この人工保存液と濃縮血小板溶液を混合し、200mLの人工保存液置換血小板溶液に調製した（混合ステップ）。得られた人工保存液置換血小板溶液は元々の血小板溶液から血漿蛋白質が87％除去できていた。血小板回収率は93％であり、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は10%であり、スワーリングも観察できた。【００９１】
（実施例２）
分離膜として、ポリスルホンとPVPからなる、中空糸膜を用いた。【００９２】
中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュール（血小板溶液用分離膜モジュール）を作製した。まず、φ10×220mmの筒状のプラスチックモジュールに、上記製膜操作により得られた50本の中空糸膜の束を挿入し、これを60質量％グリセリン水溶液に浸漬した後に、50℃で一昼夜乾燥した。続いて、遠心器にセットしたプラスチックモジュールの両端にウレタン樹脂すなわちポッティング材0.5mLをそれぞれ注入し、60G／15分で回転させた（1度目のポッティング）。その15分後に、さらにプラスチックモジュールの両端にポッティング材1.7mLをそれぞれ注入し、再び60G／15分で回転させて（2度目のポッティング）、中空糸膜モジュールを作製した。【００９３】
中空糸膜内径は300μm、膜面積は0.0094m2、透水性能は75mL／hr／Pa／m2、内表面に存在する開孔率は17.3％、孔の平均孔径は0.90μm、内表面に存在する親水性ポリマーの存在量は54.2％であった。【００９４】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製Salacet F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。【００９５】
血小板を1.78×1010個含む血小板溶液16.2mL（血小板濃度は110×107個/mL）を、血液ポンプを用いて3.2mL／minに設定し、内圧をかけてクロスフロー濾過した（濾過ステップ）。血小板溶液の粘度は、1.9mPa・sだった。また、この時の濾過速度は2.5mL／minであり、入口壁ずり速度は400秒-1、面積あたり濾過流量は2.5×60(mL／hr)÷0.0094(m2)＝15957mL／hr／m2、TMPは4.5×103Paであった。【００９６】
この処理によって、血小板溶液は中空糸内側を通過して濾過され、濃縮血小板溶液3.24mLが得られた。その後、M-solを中空糸内側に3.2mL／minで流して血小板の溶けた人工保存液を回収した（回収ステップ）。そして、この人工保存液と濃縮血小板溶液を混合して16.2mLの人工保存液置換血小板溶液に調製した（混合ステップ）。得られた人工保存液置換血小板溶液は元々の血小板溶液から血漿蛋白質が73％除去できていた。血小板回収率は94％であり、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は30%であり、スワーリングも観察できた。【００９７】
（実施例３）
分離膜として、実施例１と同じポリスルホンとPVPからなる、中空糸膜を用いた。また、実施例１と同様に中空糸膜モジュールを作製した。【００９８】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製Salacet F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。【００９９】
血小板を2.0×1011個含む血小板溶液200mL（血小板濃度は100×107個／mL）を、血液ポンプを用いて7.5mL／minに設定し、内圧をかけてクロスフロー濾過した（濾過ステップ）。血小板溶液の粘度は、1.9mPa・sだった。また、この時の濾過速度は6.0mL／minであり、入口壁ずり速度は100秒-1、面積あたり濾過流量は6.0×60(mL／hr)÷0.144(m2)＝2500mL／hr／m2、TMPは5.0×102Paであった。【０１００】
この処理によって、血小板溶液は中空糸内側を通過して濾過され、濃縮血小板溶液80mLが得られた（濾過ステップ）。その後、M-solを中空糸内側に7.5mL／minで流して血小板の溶けた人工保存液を回収した（回収ステップ）。そして、この人工保存液と濃縮血小板溶液を混合し、200mLの人工保存液置換血小板溶液に調製した（混合ステップ）。得られた人工保存液置換血小板溶液は元々の血小板溶液から血漿蛋白質が76％除去できていた。血小板回収率は95％であり、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は20%であり、スワーリングも観察できた。【０１０１】
（比較例１）
分離膜として、ポリスルホンとPVPからなる、中空糸膜を用いた。【０１０２】
中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュール（血小板溶液用分離膜モジュール）を作製した。まず、φ10×220mmの筒状のプラスチックモジュールに、上記製膜操作により得られた50本の中空糸膜の束を挿入し、これを60質量％グリセリン水溶液に浸漬した後に、50℃で一昼夜乾燥した。続いて、遠心器にセットしたプラスチックモジュールの両端にウレタン樹脂、すなわちポッティング材0.5mLをそれぞれ注入し、60G／15分で回転させた（1度目のポッティング）。その15分後に、さらにプラスチックモジュールの両端にポッティング材1.7mLをそれぞれ注入し、再び60G／15分で回転させて（2度目のポッティング）、中空糸膜モジュールを作製した。【０１０３】
中空糸膜内径は300μm、膜面積は0.0094m2、透水性能は75mL／hr／Pa／m2、内表面に存在する開孔率は17.3％、孔の平均孔径は0.90μm、内表面に存在する親水性ポリマーの存在量は54.2％であった。【０１０４】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製Salacet F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／mL）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。【０１０５】
血小板を1.78×1010個含む血小板溶液16.2mL（血小板濃度は110×107個/mL）を、血液ポンプを用いて15.9mL／minに設定し、内圧をかけてクロスフロー濾過した（濾過ステップ）。血小板溶液の粘度は、1.9mPa・sだった。また、この時の濾過速度は12.7mL／minであり、入口壁ずり速度は2000秒-1、面積あたり濾過流量は12.7×60(mL／hr)÷0.0094(m2)＝81063mL／hr／m2、TMPは7.0×103Paであった。【０１０６】
この処理によって、血小板溶液は中空糸内側を通過して濾過され、濃縮血小板溶液4.2mLが得られた。その後、M-solを中空糸内側に15.9mL／minで流して血小板の溶けた人工保存液を回収した（回収ステップ）。そして、この人工保存液と濃縮血小板溶液を混合して16.2mLの人工保存液置換血小板溶液に調製した（混合ステップ）。得られた血小板製剤は元々の血小板製剤から血漿蛋白質が61％除去できていた。血小板回収率は86％であり、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は65%であり、スワーリングは観察できなかった。(A×B)／(γ×μP)の値が2.5×1013を越えていないが、入口壁ずり速度が越えたため、血小板の活性が大きくなった結果、血小板が膜に多く付着し、目詰まりにより、タンパク質除去率が低くなったのではないかと考えられる。【０１０７】
（比較例２）
分離膜として、ポリスルホンとPVPからなる、中空糸膜を用いた。【０１０８】
中空糸膜から、以下のようにして中空糸膜モジュール（血小板溶液用分離膜モジュール）を作製した。まず、φ10×120mmの筒状のプラスチックモジュールに、上記製膜操作により得られた50本の中空糸膜の束を挿入し、これを60質量％グリセリン水溶液に浸漬した後に、50℃で一昼夜乾燥した。続いて、遠心器にセットしたプラスチックモジュールの両端にウレタン樹脂すなわちポッティング材0.5mLをそれぞれ注入し、60G／15分で回転させた（1度目のポッティング）。その15分後に、さらにプラスチックモジュールの両端にポッティング材1.7mLをそれぞれ注入し、再び60G／15分で回転させて（2度目のポッティング）、中空糸膜モジュールを作製した。【０１０９】
中空糸膜内径は300μm、膜面積は0.0047m2、透水性能は75mL／hr／Pa／m2、内表面に存在する開孔率は17.3％、孔の平均孔径は0.90μm、内表面に存在する親水性ポリマーの存在量は54.2％であった。【０１１０】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製Salacet F 746.2mlに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／mL）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。【０１１１】
血小板を8.9×109個含む血小板溶液8.1mL（血小板濃度は110×107個/mL）を、血液ポンプを用いて5.6mL／minに設定し、内圧をかけてクロスフロー濾過した（濾過ステップ）。血小板溶液の粘度は、1.9mPa・sだった。また、この時の濾過速度は3.9mL／minであり、入口壁ずり速度は700秒-1、面積あたり濾過流量は3.9×60(mL／hr)÷0.0047(m2)＝49787mL／hr／m2、TMPは1.0×104Paであった。【０１１２】
この処理によって、血小板溶液は中空糸内側を通過して濾過され、濃縮血小板溶液4.1mLが得られた。その後、M-solを中空糸内側に5.6mL／minで流して血小板の溶けた人工保存液を回収した（回収ステップ）。そして、この人工保存液と濃縮血小板溶液を混合して8.1mLの人工保存液置換血小板溶液に調製した（混合ステップ）。得られた血小板製剤は元々の血小板製剤から血漿蛋白質が40％除去できていた。血小板回収率は60％であり、人工保存液置換血小板溶液のCD62P陽性血小板比率は45%であり、スワーリングも観察できた。これは、入口壁ずり速度が低かったが、(A×B)／(γ×μP)の値が2.5×1013を越えているため、ケーク層が形成し、タンパク質の除去率および血小板回収率が低くなったと推測できる。さらに、ケーク層形成により、ある程度、血小板が活性化されていると推測される。【０１１３】
上記実施例及び比較例の各種数値データをまとめて表１に示す。【０１１４】
【表１】
2014084263.tif 000004
【図１】
2014084263.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月30日(2015.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
(3)  膜表面の孔径および開孔率測定
「表面に存在する孔の平均孔径」は、以下の方法により測定及び算出することができる。まず、走査型電子顕微鏡（例えば、S-800(日立製作所)等を使用可能）で分離膜の表面の10000倍画像を撮影する。このとき、画像の明るさ、コントラストは装置の自動機能を用いる。次に、公知のソフトウェア（例えば、Microsoft Paint（Microsoft Ltd.）等を使用可能）を用いて、孔の部分を黒く塗りつぶす。その後、二値化し、公知のソフトウェア（例えば、Matrox Inspector2.2（Matrox Electronic Systems Ltd.）等を使用可能）を用いて、孔の部分を白く、それ以外の部分を黒く反転させる画像処理を行い、白い孔の個数（以下、「総開孔数」）及び白い孔の部分のピクセル数の総和（以下、「総開孔面積」）を求め、以下の式11により、画像1枚当たりの平均孔径を算出する。これらの測定作業を、例えば中空糸5本につきそれぞれランダムに10箇所ずつ、計50回繰り返し、全50枚の画像についての平均値を得て、これを「内表面に存在する孔の平均孔径」とすることができる。なお、白と黒の二値化した画像と元の写真を比べて、孔がずれていないか、確認を行う。走査型電子顕微鏡像では孔の奥にも孔がしばしば認められるが（図１Ａ参照）、このような場合は最表面の孔を優先して画像処理が行なわれ（図１Ｂ参照）、「表面に存在する孔の平均孔径」が算出される。また、孔の全体が写っておらず、端が切れている場合でも、画像に写っている箇所については、算出対象とする。さらに、孔径が0.05μｍ未満の孔は、ノイズの可能性があるため、算出対象としない。
平均孔径（μm）＝2×(総開孔面積／総開孔数／π)0.5  ・・・・式11
π：円周率
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ここで、例えば、膜素材が一般式(I)で示されるポリスルホンであり、かつ、「血小板溶液と接触する側の膜表面における親水性ポリマー」がPVPである場合には、測定角を90°としてXPSで測定をして、分離膜の血小板溶液と接触する側の膜表面から約10 nmの深さまでにおける炭素原子、窒素原子及び硫黄原子の存在比率を調べ、以下の式13により、分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量を算出することができる。
分離膜最表層部分の親水性ポリマーの存在量（質量％）
＝N×111／（N×111＋S×442）×100  ・・・・式13
N    ：  窒素原子の存在比率
S    ：  硫黄原子の存在比率
111  ：  PVPの繰り返し単位の分子量
442  ：  ポリスルホン系ポリマーの繰り返し単位の分子量
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製SOLACET F（登録商標） 746.2mLに大塚製薬社製Meylon（登録商標） 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製SOLACET F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製SOLACET F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／ml）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製SOLACET F 746.2mLに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／mL）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
作製した中空糸膜モジュールを用いて、血小板溶液の濾過を行った。具体的には、まず、テルモ社製SOLACET F 746.2mlに大塚製薬社製Meylon 52.2mL、テルモ社製ACD-A液126.8mL、大塚製薬社製硫酸Mg補正液（1mEq／mL）3.2mL、大塚製薬社製蒸留水71.6mLを加え、混合し、人工保存液としてM-solを調製した。また、元の血小板溶液中の血小板数を予め測定しておいた。
【国際調査報告】
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