(57)【要約】  従来よりも簡便な方法で、４’−ＧＬの純度が高く、各種分析用の標準品として用いることができるような組成物を得る。  以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。（Ａ）４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いる工程（Ｂ）工程（Ａ）で最終的に溶出された画分に、有機溶媒を添加し、４’−ＧＬを結晶化する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする４'−ガラクトシルラクトース（４’−ＧＬ）高純度組成物の調製法。
（Ａ）４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いる工程
（Ｂ）工程（Ａ）で最終的に溶出された画分に有機溶媒を添加し、４’−ＧＬを結晶化する工程
【請求項２】
工程（Ａ）で用いる有機溶媒水溶液中の有機溶媒の濃度が１０〜３０質量％である請求項１に記載の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。
【請求項３】
工程（Ａ）の段階溶出を、有機溶媒の濃度が１０〜２０質量％の有機溶媒水溶液、１５〜３０質量％の有機溶媒水溶液の順で行うものである請求項１または２に記載の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。
【請求項４】
工程（Ａ）で用いる有機溶媒が、メタノールである請求項１〜３のいずれか１項に記載の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。
【請求項５】
工程（Ｂ）で用いる有機溶媒が、メタノール、アセトンおよびエタノールから選ばれる１種以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。
【請求項６】
工程（Ａ）で用いる４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖が、スポロボロマイセス・シンギュラリスおよびサッカロマイセス・セレビシエを用いて生成されたものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製法により得られる４’−ＧＬ高純度組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４’−ＧＬ（４'−ガラクトシルラクトース：Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を含むガラクトオリゴ糖から４’−ＧＬを高純度で含む組成物を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４’−ＧＬは、腸内のビフィズス菌の増殖を促進させることができるガラクトオリゴ糖の主成分として知られている。また、この４’−ＧＬはガラクトオリゴ糖の分析をする際の指標に用いられている。【０００３】
この４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖は、工業的には乳糖を原料として、β−ガラクトシダーゼによる転移反応を利用して生産されているが、精製工程等を行わない場合は、一般にガラクトオリゴ糖自体の純度は低いものである。【０００４】
これまでオリゴ糖を精製して純度を高める技術としては、例えば、水酸基を有する高分子に、カルボキシルメチル基を導入した高分子をクロマト充填剤として用いることを特徴とするグルコサミノオリゴ糖の精製法が報告されているが（特許文献１）、ガラクトオリゴ糖を精製して、ガラクトオリゴ糖の成分の中でも、４’−ＧＬの純度を高める方法は報告されておらず、４’−ＧＬの標準品とされているものでさえ、あまり純度が高いものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−５５７６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、４’−ＧＬの純度が高く、各種分析用の標準品として用いることができるような組成物を簡便・安価に得る方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究をした結果、有機溶媒を用いた段階溶出と結晶化を組み合わせることにより、４’−ＧＬの純度が高い組成物が得られることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする４’−ＧＬ高純度組成物の調製法である。
（Ａ）４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いる工程
（Ｂ）工程（Ａ）で最終的に溶出された画分に有機溶媒を添加し、４’−ＧＬを結晶化する工程【０００９】
また、本発明は、上記調製法により得られる４’−ＧＬ高純度組成物である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法は、有機溶媒を用いた段階溶出と結晶化を組み合わせることにより、４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖から４’−ＧＬを高純度で含む組成物を簡便な方法で安価に調製することができる。【００１１】
また、本発明の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法により得られる４’−ＧＬ高純度組成物は、各種分析用の標準品として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法（以下、「本発明調製法」という）の工程（Ａ）は、４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒水溶液を用いて段階溶出し、当該段階溶出において、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いる工程である。
【００１３】
上記４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖は、ガラクトオリゴ糖中に４’−ＧＬが含まれているものであれば特に限定されず、例えば、β−ガラクトシダーゼによる転移反応を利用して生産されたガラクトオリゴ糖等が挙げられる。
【００１４】
具体的に、４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖をβ−ガラクトシダーゼによる転移反応を利用して生産するには、乳糖にβ−ガラクトシダーゼや、β−ガラクトシダーゼを産生する微生物を作用させればよく、好ましくはガラクトオリゴ糖中の３糖の割合を高めるために、β−ガラクトシダーゼと、糖資化性の微生物を組み合わせて作用させればよい。
【００１５】
β−ガラクトシダーゼを産生する微生物としては、例えば、クリベロマイセス・ラクチス等のクリベロマイセス属の微生物、スポロボロマイセス・シンギュラリス等のスポロボロマイセス属の微生物等が挙げられる。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ストレプトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ライヒマニー、ラクトバチルス・ヘルベティカス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンチィス等も挙げることができる。これらの微生物の中でもスポロボロマイセス属の微生物が好ましく、スポロボロマイセス・シンギュラリスがより好ましく、特に本出願人らが報告しているスポロボロマイセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６が好ましい。なお、スポロボロマイセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６は、本出願人が既に２００２年４月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（なお、前記特許生物寄託センターは平成２５年４月１日より新名称  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、新住所〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８  １２０号室に移転している。））にＦＥＲＭ Ｐ−１８８１７として寄託している。また、スポロボロマイセス・シンギュラリスとしては、上記スポロボロマイセス・シンギュラリスＩＳＫ−♯♯２Ｂ６の親株であるスポロボロマイセス・ シンギュラリスＪＣＭ５３５６も好適に用いることができ、この菌株は理化学研究所バイオリソースセンター（〒３０５−００７４日本国茨城県つくば市高野台 ３−１−１）から有償で入手することが可能である。これらの微生物は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
上記糖資化性の微生物としては、例えば、一般的にパン酵母として市販されているサッカロマイセス・セレビシエやサッカロマイセス・ユニスポラス等が挙げられる。これらの微生物は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、糖資化性の微生物が資化する糖は、特に限定されるものではないが、ガラクトオリゴ糖中の３糖の割合を高めるために、グルコースを資化する微生物であることが好ましい。
【００１７】
上記微生物を用いて４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を生成する条件としては、特に限定されず、例えば、乳糖を溶解させた水を４０℃程度に加温したものに、β−ガラクトシダーゼを産生する微生物および必要により糖資化性の微生物を添加し、撹拌しながら１日程度培養する条件等が挙げられる。β−ガラクトシダーゼを産生する微生物の添加量は、特に限定されるものではないが、例えば、乳糖１ｋｇに対して、β−ガラクトシダーゼ活性が１００〜６００Ｕとなるように添加すればよい。また、糖資化性の微生物の添加量も特に限定されるものではないが、例えば、乳糖１ｋｇに対して、当該微生物の乾燥粉体として、０．０００１〜１０質量％（１×１０７〜１×１０１２ｃｆｕ）となるように添加すればよい。β−ガラクトシダーゼ活性の測定法は後述の製造例と同様である。なお、このガラクトオリゴ糖の生成反応は、例えば、８５℃程度に加温し、これを１０分程度維持することにより終了させることができる。また、反応終了後は、遠心分離やろ過で菌体を除去することが好ましい。
【００１８】
活性炭カラムクロマトグラフィーは、活性炭を充填したカラムに、４’−ＧＬを含むガラクトオリゴ糖を負荷させ、それを有機溶媒水溶液を用いて段階溶出すればよい。
【００１９】
上記カラムに充填される活性炭の種類は特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、破砕状態のものである。また、カラムに活性炭を充填する方法は特に限定されず、例えば、活性炭に水を添加してスラリーとしたものをカラムに充填し、静置すればよい。更に、カラムに充填される活性炭の量は特に限定されず、例えば、使用するカラムの内容量の１／３から１／４量である。使用するカラムの材質は特に限定されるものではなく、例えばガラス製、プラスチック製等のカラムを用いることができ、その直径と高さも特に限定されるものではなく、例えば、直径が２〜１５ｃｍ、高さが３０〜１００ｃｍのカラムを用いることができる。
【００２０】
有機溶媒を用いた段階溶出は、溶出回数を重ねるごとに、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を用いることにより行われる。具体的には、まず、水を活性炭カラムに通液し、洗浄する。次に、有機溶媒水溶液を通液し、その後、直前の溶出時よりも有機溶媒の濃度が高い有機溶媒水溶液を通液する。この有機溶媒水溶液を活性炭カラムに通液する操作を、濃度の異なる有機溶媒水溶液で２回以上行うことを段階溶出といい、好ましい通液回数は、２回である。また、１回の溶出（通液操作）に用いられる有機溶媒水溶液の量は特に限定されないが、例えば、使用した活性炭体積の２〜６倍量である。更に、段階溶出の速度も特に限定されないが、例えば、溶出液の液面が２〜６ｃｍ／ｍｉｎで移動する速度である。
【００２１】
上記工程（Ａ）で用いる有機溶媒の種類は特に限定されるものではないが、極性を有する有機溶媒であることが好ましく、炭素数１〜３のアルコールであることがより好ましく、特に好ましくはメタノールである。この有機溶媒の濃度としては５〜４０質量％（以下、単に「％」という）が好ましく、１０〜３０％が特に好ましい。
【００２２】
具体的に、有機溶媒水溶液を用いた段階溶出は、有機溶媒の濃度が５〜２５％の有機溶媒水溶液、１０〜４０％の有機溶媒水溶液の順で行うことが好ましく、有機溶媒の濃度が１０〜２０％の有機溶媒水溶液、１５〜３０％の有機溶媒水溶液の順で行うことがより好ましく、有機溶媒の濃度が１５〜２０％の有機溶媒水溶液、２０〜３０％の有機溶媒水溶液の順で行うことが特に好ましい。
【００２３】
上記各操作の間には、ろ過、遠心分離、減圧等による濃縮や希釈を行ってもよい。また、この工程（Ａ）で最終的に溶出された画分については、そのままでもよいが、濃縮し、固形分を乾固させておくことが好ましい。
【００２４】
以上説明した工程（Ａ）により、ガラクトオリゴ糖に含まれる３糖が特異的に溶出される。なお、ガラクトオリゴ糖中の３糖の割合は、後述する製造例に記載の方法で測定することができる。
【００２５】
本発明調製法の工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で最終的に溶出された画分に、有機溶媒を添加し、４’−ＧＬを結晶化する工程である。
【００２６】
上記工程（Ｂ）で用いる有機溶媒の種類は特に限定されるものではないが、好ましくは水と混和可能な有機溶媒である。水と混和可能な有機溶媒としては、好ましくはメタノール、アセトンおよびエタノールから選ばれる１種以上であり、特に好ましくはメタノールである。この有機溶媒の添加量は特に限定されず、例えば、結晶化に用いる画分の水分量（体積）の１０〜３０倍量である。添加する有機溶媒の濃度は特に限定されないが、濃度が約１００％のものを用いるのが好ましい。
【００２７】
４’−ＧＬの結晶化は、工程（Ａ）で最終的に溶出された画分に、有機溶媒を添加し、静置等することにより行う。なお、この結晶化の際には、静置前に超音波等で結晶を析出させやすくしてもよい。
【００２８】
以上説明した工程（Ｂ）においては、３糖以外の糖（単糖、２糖および４糖等）は結晶化せず、３糖のみが結晶化する。ガラクトオリゴ糖中の３糖には、４’−ＧＬやＧａｌβ１−４Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ等の異性体が存在し、工程（Ｂ）では、３糖異性体の中でも４’−ＧＬが結晶化する割合が高いため、３糖異性体中の４’−ＧＬの割合（純度）を高めることができる。なお、３糖異性体中の４’−ＧＬの割合は、後述する実施例に記載の方法で測定することができる。
【００２９】
この工程（Ｂ）の後には、結晶化した４’−ＧＬ高純度組成物を、結晶化で用いた有機溶媒で洗浄、乾燥等を行ってもよい。
【００３０】
上記本発明調製法により得られた組成物は、４’−ＧＬを高純度、好ましくは、組成物中に含まれる３糖異性体中の４’−ＧＬの含有量として、９０％以上含む組成物であり、好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上含むものである。本発明調製法により得られた４’−ＧＬ高純度組成物は、固形分が９５％以上であり、結晶化工程では３糖異性体以外の糖（単糖、２糖および４糖等）は結晶化しない。したがって、当該組成物中の固形分は全てが３糖異性体であるため、組成物中の４’−ＧＬの含有量は「組成物の固形分×３糖異性体中の４’−ＧＬの割合」で求めることができる。また、当該組成物は、４’−ＧＬを組成物中の含有量として、８８％以上含むものであり、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上含むものである。
【００３１】
斯くして得られる４’−ＧＬ高純度組成物は、例えば、各種分析用の標準品として用いることができる他、飲食品、医薬品等の原料とすることもできる。
【実施例】
【００３２】
以下、製造例、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００３３】
製  造  例  １
糖液の調製：
乳糖２ｋｇを８０℃の熱水２.７ｋｇで溶解後、４０℃まで冷却し、恒温槽でその温度を保った。これにスポロボロマイセス・シンギュラリス  ＹＩＴ１００４７（ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１７）の菌体液（β−ガラクトシダーゼ活性：４０００Ｕ／ｋｇ）１５７ｇとサッカロマイセス・セレビシエ（オリエンタル酵母（株）製：レギュラーイースト）６３ｇ（６．３×１０１１ｃｆｕ）を添加し、撹拌しながら２２時間、４０℃に保って反応を行った。反応停止は８５℃まで昇温後、その温度を１０分間保って行った。反応終了後、反応液に対して遠心分離（１２,０００×ｇ、３０ｍｉｎ）を行い、反応に用いた菌体を除去して糖液を得た。得られた糖液（製造品）について、以下の条件のサイズ排除ＨＰＬＣにより分析し、面積百分率から糖鎖長別組成解析を行った。その結果を表１に示した。【００３４】
＜スポロボロマイセス・シンギュラリスの菌体液のβ−ガラクトシダーゼ活性測定法＞
スポロボロマイセス・シンギュラリス  ＹＩＴ１００４７（ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８１７）の菌体液のβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｕ）は、国際公開第２０１２／１４１２４４号公報に記載の測定方法と同様の方法で測定した。【００３５】
＜ＨＰＬＣ条件＞
装置：島津ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ
カラム：ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２（８.０φ×３００ｍｍ）（昭和電工（株）製）
カラム温度：８０℃
注入量：１０μＬ
移動相：精製水
分析時間：３０ｍｉｎ
流速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：示差屈折率【００３６】
【表１】
2015166903.tif 000002
＊１：ヤクルト薬品工業（株）製のガラクトオリゴ糖。乳糖にスポロボロマイセス・シンギュラリスの菌体液とクリベロマイセス・ラクチス由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させて製造。【００３７】
以上の結果より、スポロボロマイセス・シンギュラリスと、糖資化性のサッカロマイセス・セレビシエを組み合わせた場合、スポロボロマイセス・シンギュラリスと、クリベロマイセス・ラクチス由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させて得られた市販品のガラクトオリゴ糖よりも、３糖の含量が高くなることがわかった。【００３８】
実  施  例  １
溶出条件の検討（１）：
製造例１で調製した糖液を、エバポレーターを用いて濃縮し、Ｂｘが７２.３の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液の１.３ｇを分取し、２５ｍＬとなるように水で希釈を行った。活性炭（和光純薬工業（株）製、クロマトグラフ用）２５ｍＬを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー（カラムの直径：２ｃｍ、高さ：３０ｃｍ）を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、以下の表２に記載の通り、精製水でカラムを洗浄した後、単回溶出または段階溶出で糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は１００ｍＬである。洗浄、溶出に要した時間は、各段階で１０分程度である。また、洗浄、溶出は精製水、溶出液の液面が５ｃｍ／ｍｉｎで下がっていく速度で行った。【００３９】
表２の単回溶出の溶出１回目で得られた溶出液と段階溶出１の溶出２回目で得られた溶出液を回収し、エバポレーターで減圧下濃縮を行った。得られた溶出液を適切な濃度に調整し、０.４５μｍのフィルターに通し、ろ液を製造例１と同じ条件のサイズ排除ＨＰＬＣにより分析し、面積百分率から各溶出液の糖鎖長別組成解析を行った。前記糖鎖長別組成解析の結果から全糖中の３糖の割合を求めた。その結果を表２に示した。【００４０】
【表２】
2015166903.tif 000003
【００４１】
以上の結果から、段階溶出により、３糖が特異的に溶出されることがわかった。【００４２】
実  施  例  ２
溶出条件の検討（２）：
実施例１の段階溶出１において、メタノール水溶液の濃度を以下の表３に記載の通りに変更する以外は同様にして糖類の溶出を行った。また、実施例１と同様にして全糖中の３糖の割合を求めた。その結果を表３にあわせて示した。【００４３】
【表３】
2015166903.tif 000004
【００４４】
以上の結果より、溶出１回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が５〜２５％であり、溶出２回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が１０〜４０％である場合、溶出２回目の溶出液中の３糖の割合が８０％以上であることがわかった。特に、溶出１回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が１０〜２０％であり、溶出２回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が１５〜３０％である場合、溶出２回目の溶出液中の３糖の割合が９０％以上であることがわかった。さらに、溶出１回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が１５〜２０％であり、溶出２回目のメタノール水溶液のメタノール濃度が２０〜３０％である場合、溶出２回目の溶出液中の３糖の割合が高く、９５％以上であることがわかった。【００４５】
実  施  例  ３
結晶化条件の検討（１）：
製造例１と同様にして調製した糖液を、エバポレーターで減圧下濃縮し、Ｂｘが７２.３の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液２２.１ｇを分取し、４００ｍＬとなるように精製水で希釈を行った。活性炭（和光純薬工業（株）製、クロマトグラフ用）４００ｍＬを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー（カラムの直径：６ｃｍ、高さ：４０ｃｍ）を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、精製水で洗浄した後、１５％メタノール水溶液、２０％メタノール水溶液の順で実施例１の段階溶出１と同様にして糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は１６００ｍＬである。更に、この溶出で得られた溶出液を、エバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーター内で減圧乾固させ、濃縮物２.３ｇ（固形分２.３ｇ）を得た。【００４６】
上記濃縮物を、２.５ｍＬの精製水に溶解した。この溶液にメタノール５０ｍＬを撹拌しながら、メタノールの終濃度が９５.２％（ｖ／ｖ）になるまで少しずつ添加し、これに超音波をかけ、結晶の形成を促進した後、一晩室温で静置した。生成した結晶をフィルター付漏斗でろ過し、結晶をメタノールで洗浄した後、デシケーター内で乾燥させた。結晶化による３糖異性体中の４’−ＧＬ濃度の変化を確認するため、以下の方法で４’−ＧＬを含む３糖の異性体を定量し、３糖異性体中の４’−ＧＬの割合を求めた。また、４’−ＧＬ以外の３糖の異性体の割合も求めた。なお、結晶化前の濃縮物の３糖異性体中の４’−ＧＬの割合および４’−ＧＬ以外の３糖の異性体の割合も同様の方法で求めた。その結果を表４に示した。【００４７】
＜４’−ＧＬの定量法＞
試料約５ｍｇをねじ口試験管に取り、エバポレーターで減圧下濃縮し、濃縮後、デシケーター内で減圧乾固させた。乾固させた試料に対して約５０当量の２−アミノピリジンを含む２００μＬ酢酸溶液を添加し、９０℃、１時間加熱反応させた。反応液に１９５ｍｇ／ｍＬ（酢酸）に調製したボラン−ジメチルアミン試薬を２５０μＬ添加し、８０℃、５０分間還元し、ＰＡ化誘導体を得た。ＰＡ化誘導体を５０ｍＬファルコンチューブに移し、精製水で約２５ｍＬに希釈した。この希釈液に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを弱酸性〜中性に調整した。マイクロアシライザーＳ１（旭化成（株）製）を用いて透析処理した。条件は透析膜をＡＣ−１２０−１０（（株）アストム製）、電極液を０.５％硝酸ナトリウム水溶液および終了設定を０Ａとした。本処理液をエバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーターで減圧乾固した。サンプルを精製水に溶解し、０.４５μｍフィルターに通したろ液をＨＰＬＣで分析した。ＰＡ化試薬の残渣が観察されるため、分析開始から２２分以降に検出されたピーク面積の百分率から、３糖異性体中の４’−ＧＬの割合を求めた。また、４’−ＧＬ以外の３糖異性体の割合も求めた。４’−ＧＬのピークは分析開始から２６.８分後に出現し、Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃのピークは分析開始から４１.２分後に出現した。【００４８】
＜ＨＰＬＣ条件＞
装置：島津ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＦＬＣ
カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ  ＳＰ３００（４.６ｍｍφ×２５０ｍｍ
）（（株）センシュー科学製）
カラム温度：２５℃
注入量：１０μＬ
移動相：０.２Ｍ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.７）
分析時間：７０ｍｉｎ
流速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（３１０ｎｍ）【００４９】
【表４】
2015166903.tif 000005
【００５０】
以上の結果より、メタノールを用いた結晶化によって、３糖異性体中の４’−ＧＬの純度を高めることができることがわかった。また、得られた結晶は９５％以上が固形分であり、結晶化工程では３糖異性体以外の糖は結晶化しなかった。したがって、当該結晶中の固形分の全てが３糖異性体であるため、組成物中の４’−ＧＬの割合は、（９５％×９５.８％＝）９１％以上となる。【００５１】
実  施  例  ４
結晶化条件の検討（２）：
製造例１と同様にして調製した糖液を、エバポレーターで減圧下濃縮し、Ｂｘが７２.３の濃縮糖液を得た。この濃縮糖液１２０ｇを分取し、２０００ｍＬとなるように精製水で希釈を行った。活性炭（和光純薬工業（株）製、クロマトグラフ用）２０００ｍＬを常法に従って充填したオープンカラムクロマトグラフィー（カラムの直径：９ｃｍ、高さ：８０ｃｍ）を準備し、希釈糖液を負荷した。この希釈糖液を負荷したカラムについて、精製水で洗浄し、１５％メタノール水溶液、２０％メタノール水溶液の順で実施例１の段階溶出１と同様にして糖類の溶出を行った。なお、各溶出に用いた溶媒は８０００ｍＬである。更に、この溶出で得られた溶出液を、エバポレーターで減圧下濃縮した後、デシケーター内で減圧乾固させ、濃縮物１２.５ｇ（固形分１２.５ｇ）を得た。【００５２】
上記濃縮物を、１２.５ｍＬの精製水に溶解し、２.５ｍＬずつに分けた。撹拌しながら、これに水と混和可能な溶媒である、アセトンまたはエタノールをそれぞれ５０ｍＬ、終濃度が９５.２％（ｖ／ｖ）になるまで少しずつ添加した。その後、これに超音波をかけ、結晶の形成を促進し、一晩室温で静置した。生成した結晶をフィルター付漏斗でろ過し、結晶を、それぞれ結晶化の際に使用した有機溶媒で洗浄した後、デシケーター内で乾燥させた。結晶化による３糖異性体中の４’−ＧＬ濃度の変化を確認するため、実施例３と同様にして４’−ＧＬを含む３糖の異性体を定量し、３糖異性体中の４’−ＧＬの割合を求めた。その結果を表５に示した。また、実施例３で示した、メタノールを用いて結晶化した際の３糖異性体中の４’−ＧＬの割合も表５に再度示した。【００５３】
【表５】
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【００５４】
以上の結果より、アセトン、エタノールを用いると、メタノールと同様に結晶化によって３糖異性体中の４’−ＧＬの純度が高くなることがわかった。しかし、結晶化後の３糖異性体中の４’−ＧＬの割合は、メタノールを用いた場合が最も高かった。アセトン、エタノールを用いた場合も、得られた結晶は９５％以上が固形分であり、結晶化工程では３糖異性体以外の糖は結晶化しなかった。したがって、当該結晶中の固形分の全てが３糖異性体であるため、組成物中の４’−ＧＬの割合は、（９５％×９４.４％＝）８９.６％以上となる。【００５５】
実  施  例  ５
別菌株での検討
スポロボロマイセス・シンギュラリス  ＹＩＴ１００４７（ＩＳＫ−＃＃２Ｂ６）の菌体液に代えて、β−ガラクトシダーゼ活性が、製造例１で用いたスポロボロマイセス・シンギュラリス  ＹＩＴ１００４７の菌体液と同等となる量のスポロボロマイセス・シンギュラリスＪＣＭ５３５６の菌体液を用いた以外は、製造例１と同様に糖液を調製し、実施例１の段階溶出１と同様の条件で段階溶出し、実施例３と同様の条件で４’−ＧＬを結晶化した。その結果、３糖中の４’−ＧＬの割合が９５％以上である結晶を得ることができた。また、得られた結晶は９５％以上が固形分であり、結晶化工程では３糖異性体以外の糖は結晶化しなかった。したがって、当該結晶中の固形分の全てが３糖異性体であるため、組成物中の４’−ＧＬの割合は、（９５％×９５％＝）９０.３％以上となる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の４’−ＧＬ高純度組成物の調製法を用いると、４’−ＧＬ高純度組成物を簡便な方法で得ることができる。そして、この調製法で得られる４’−ＧＬ高純度組成物は、各種分析用の標準品として用いることができる他、飲食品、医薬品等の原料とすることもできる。
以    上
【国際調査報告】
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