(57)【要約】  バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染する。当該バクテリオファージは、ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂであってもよい。当該バクテリオファージは、ゲノム構成がＤＮＡ複製モジュール、構造タンパク質モジュール、会合・分泌モジュールおよび制御領域を含むものであってもよい。
2015194540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染する、
バクテリオファージ。
【請求項２】
ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂである、
請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
ゲノム構成がＤＮＡ複製モジュール、構造タンパク質モジュール、会合・分泌モジュールおよび制御領域を含む、
請求項１または２に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
ゲノムの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列からなる、
請求項１から３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉである、
請求項１から４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のバクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項８】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０株に前記バクテリオファージを感染させた菌株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関のあて名：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、寄託日：２０１４年６月１６日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８７５）である、
請求項７に記載のカンキツかいよう病予防剤。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載のカンキツかいよう病予防剤を、植物または植物成長媒体に投与する工程、を含む、
カンキツかいよう病の予防方法。
【請求項１０】
前記植物は、カンキツ類である、
請求項９に記載のカンキツかいよう病の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージ、カンキツかいよう病予防剤およびカンキツかいよう病の予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンキツ類に病害を及ぼすカンキツかいよう病の対策に使用される主な農薬は、銅剤である。例えば、引用文献１には、銅剤とアミン化合物を含有する植物処理組成物が開示されている。他の農薬としては、有効成分としてシグナーマイシンを含む植物病害防除剤が引用文献２に開示されている。さらに引用文献３には、カンキツかいよう病の対策に使用できる生物農薬として、非病原性のキサントモナス属細菌を用いた植物病害防除剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１３−５３６２３７号公報
【特許文献２】特開２０１０−２２２２９２号公報
【特許文献３】特開２０１３−２１５１８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１に開示された植物処理組成物に含まれる銅剤は劇物であるため、食用作物に使用した際、残留農薬の健康への影響が懸念される。また、使用された銅剤の一部は、雨によって川、地下水または海に流されるため、環境汚染のリスクもある。さらに、銅剤に耐性を示すカンキツかいよう病菌の増加が問題となっている。【０００５】
上記特許文献２に開示されたシグナーマイシンを有効成分として含む防除剤に関しても、化学農薬である以上、耐性を示すカンキツかいよう病菌の出現による有効散布量の増大が予想される。【０００６】
上記特許文献３に開示された非病原性のキサントモナス属細菌を用いた防除剤は、拮抗する細菌等に特異性がなく、他の有用な微生物に影響を及ぼす可能性がある。【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、カンキツかいよう病菌に特異性が高く、より安全にカンキツかいよう病を予防できるバクテリオファージ、カンキツかいよう病予防剤およびカンキツかいよう病の予防方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の観点に係るバクテリオファージは、
ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染する。【０００９】
この場合、ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂである、
こととしてもよい。【００１０】
また、ゲノム構成がＤＮＡ複製モジュール、構造タンパク質モジュール、会合・分泌モジュールおよび制御領域を含む、
こととしてもよい。【００１１】
また、ゲノムの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列からなる、
こととしてもよい。【００１２】
また、前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉである、
こととしてもよい。【００１３】
本発明の第２の観点に係るカンキツかいよう病予防剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージを含む。【００１４】
本発明の第３の観点に係るカンキツかいよう病予防剤は、
上記本発明の第１の観点に係るバクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を含む。【００１５】
この場合、前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０株に前記バクテリオファージを感染させた菌株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関のあて名：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、寄託日：２０１４年６月１６日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８７５）である、
こととしてもよい。【００１６】
本発明の第４の観点に係るカンキツかいよう病の予防方法は、
上記本発明の第２の観点に係るカンキツかいよう病予防剤または上記本発明の第３の観点に係るカンキツかいよう病予防剤を、植物または植物成長媒体に投与する工程、を含む。【００１７】
この場合、前記植物は、カンキツ類である、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、カンキツかいよう病菌に特異性が高く、より安全にカンキツかいよう病を予防できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係るバクテリオファージの形状の一例を示す図である。
【図２】本発明に係るバクテリオファージの増殖の経時変化を示す図である。
【図３】本発明に係るバクテリオファージのゲノムの構成を示す図である。
【図４】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株のＳｗｉｍｍｉｎｇ運動性を示す図である。（Ａ）は未感染の宿主菌株のコロニーを示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株のコロニーを示す図である。（Ｃ）は未感染の宿主菌株およびバクテリオファージが感染した菌株の運動性距離の経時変化を示す図である。
【図５】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株のＳｗａｒｍｉｎｇ運動性を示す図である。（Ａ）は未感染の宿主菌株のコロニーを示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株のコロニーを示す図である。（Ｃ）は未感染の宿主菌株およびバクテリオファージが感染した菌株の運動性距離の経時変化を示す図である。
【図６】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株のＴｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性を示す図である。（Ａ）は未感染の宿主菌株のコロニーを示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株のコロニーを示す図である。
【図７】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株および未感染宿主菌株をそれぞれ液体培養後、遠心分離により菌体を沈殿させた状態を示す図である。
【図８】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株を針刺し法で接種した葉の経時変化を示す図である。（Ａ）はバクテリオファージに未感染の宿主菌株を接種した葉の経時変化を示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株を接種した葉の経時変化を示す図である。
【図９】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株を針刺し法で接種した葉における病変の大きさを示す図である。
【図１０】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株を浸透法で接種した葉の経時変化を示す図である。
【図１１】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株を吹き付けた葉の経時変化を示す図である。（Ａ）はバクテリオファージに未感染の宿主菌株を吹き付けた葉の経時変化を示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株を吹き付けた葉の経時変化を示す図である。
【図１２】本発明に係るバクテリオファージが感染した菌株によるカンキツかいよう病予防効果を示す図である。（Ａ）はバクテリオファージが感染した菌株を噴霧せずにカンキツかいよう病菌を接種した葉の経時変化を示す図である。（Ｂ）はバクテリオファージが感染した菌株を噴霧してからカンキツかいよう病菌を接種した葉の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００２１】
（実施の形態１）
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を含む。当該バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染する。当該バクテリオファージは、ファージ粒子の構造が線状であるため、Ｉｎｏｖｉｒｕｓ、またはＦｆ型ファージであるともいえる。ファージ粒子の構造が線状であるとは、ファージ粒子の構造が、例えば図１に示すような構造である。ファージ粒子の構造は、ファージ粒子をリンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色し、電子顕微鏡で観察することができる。
【００２２】
ファージ粒子の大きさは、ゲノムサイズに依存する。ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂの場合、ファージ粒子の長さは、およそ８０００〜１５００ｎｍである。図１に示すファージ粒子の場合、ファージ粒子の長さは、１０００ｎｍであって、その径は７ｎｍである。
【００２３】
図１に示すバクテリオファージのゲノムサイズは、７３２５ｂであるが、バクテリオファージのゲノムサイズはこれに限定されない。バクテリオファージのゲノムサイズは、７０００〜８０００ｂ、または７０００〜７６００ｂであってもよく、好ましくは、７１００〜７５００ｂ、より好ましくは、７２００〜７４００ｂである。
【００２４】
図１に示すバクテリオファージのゲノムの塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列からなる。当該バクテリオファージのゲノム構成は、Ｉｎｏｖｉｒｕｓ（Ｆｆ型ファージ）の代表格である大腸菌Ｍ１３と共通するモジュールとしてＤＮＡ複製モジュール、構造タンパク質モジュールおよび会合・分泌モジュールを含む。さらに、当該バクテリオファージのゲノム構成には、会合・分泌モジュールの下流に制御領域が含まれる。
【００２５】
バクテリオファージのゲノムの塩基配列は、バクテリオファージからフェノール抽出などによってＤＮＡを単離し、ショットガンシークエンス法などの公知の方法で決定できる。決定したゲノムの塩基配列を配列解析プログラムおよび配列データベースを用いて解析することで、ＯＲＦおよび遺伝子の機能を推定できる。
【００２６】
バクテリオファージは、そのゲノムの塩基配列が配列番号１に示す塩基配列に限られず、ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染するバクテリオファージであれば、配列番号１に示される塩基配列と８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％または９５％〜１００％の配列相同性を示すものであってもよい。
【００２７】
上記バクテリオファージが感染するカンキツかいよう病菌は、カンキツ類の果実、葉、枝などに病害を及ぼす病原菌である。カンキツかいよう病菌は、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉである。カンキツかいよう病菌は、例えば、独立行政法人農業生物資源研究所から入手可能なＭＡＦＦ株である。より具体的には、バクテリオファージが感染するカンキツかいよう病菌は、ＭＡＦＦ３０１０８０、ＭＡＦＦ３０２１０２、ＭＡＦＦ６７３００１、ＭＡＦＦ６７３０１０、ＭＡＦＦ６７３０１３、ＭＡＦＦ６７３０２１などである。
【００２８】
上記バクテリオファージは、例えば、土壌などを含む試料を、洗浄して遠心分離し、膜フィルターで上清を濾過することで得られる。さらに、宿主として適切な上記カンキツかいよう病菌を用いることで、目的とするバクテリオファージを単離することができる。バクテリオファージの単離および力価の測定には、寒天培地に検定菌とファージ試料混合液を加えた軟寒天培地（０．７５％寒天）を重層してプラークを形成させる方法が好適である。
【００２９】
バクテリオファージのカンキツかいよう病菌への感染方法は、当該技術分野で公知である任意の方法を用いることができる。一例としては、ＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）培地で培養したカンキツかいよう病菌を含む培養液にバクテリオファージを加え、培養することでバクテリオファージをカンキツかいよう病菌に感染させることができる。
【００３０】
バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌は、溶菌せずに当該バクテリオファージを生産、分泌しながら増殖する。バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌が溶菌せずに増殖していることを確かめるには、菌濃度の指標となる６００ｎｍの波長光の吸光度を測定すればよい。
【００３１】
カンキツかいよう病菌の重要な病原因子の１つとして、キサンタンなどの菌体外多糖（「ＥＰＳ」ともいう）が知られている。下記実施例５に示すように、バクテリオファージが感染することでカンキツかいよう病菌からの菌体外多糖、特にキサンタンの生成が大幅に低下する。このため、バクテリオファージは、下記実施例６に示すように、病原性のあるカンキツかいよう病菌に感染することで、当該カンキツかいよう病菌の病原性を顕著に低下させ、かいよう形成能を消失させる。
【００３２】
また、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌は、Ｓｗｉｍｍｉｎｇ運動性、Ｓｗａｒｍｉｎｇ運動性およびＴｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性の少なくとも１つが未感染のカンキツかいよう病菌と比べて低下する（下記実施例４参照）。上述の菌体外多糖の生成の大幅な低下に加え、この運動性の低下は、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌の病原性の顕著な低下、およびかいよう形成能の消失の一因である。
【００３３】
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤に含まれるカンキツかいよう病菌として、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０株に上記バクテリオファージを感染させた菌株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関のあて名：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、寄託日：２０１４年６月１６日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８７５）が挙げられる。
【００３４】
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、植物、または土壌、マット、固形培地などの構造体、養液栽培における養液、および水栽培における水などの植物成長媒体に投与すればよい。こうすることで、カンキツかいよう病予防剤に含まれるカンキツかいよう病菌が分泌するバクテリオファージを、潜在的な病原性のカンキツかいよう病菌に感染させることができる。この結果、カンキツかいよう病を予防できる。ここで、「予防」とは、カンキツかいよう病菌の植物への感染の予防、カンキツかいよう病菌による植物の病害の予防、カンキツかいよう病菌による植物の病害の拡大防止および病原性のカンキツかいよう病菌の駆除を含む。なお、植物成長媒体は、植物が成長する媒体であれば任意のものでよい。
【００３５】
上記カンキツかいよう病予防剤の投与対象となる植物は、カンキツかいよう病菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよく、特には、カンキツ類である。当該カンキツかいよう病予防剤を、噴霧などにより植物成長媒体に投与することで、植物成長媒体で生育する植物に、カンキツかいよう病菌が感染すること、あるいはカンキツかいよう病菌による病害が及ぶことを防止できる。また、当該カンキツかいよう病予防剤を、噴霧などにより植物に投与することで、病原性のカンキツかいよう病菌に未感染の植物であれば、該植物へのカンキツかいよう病菌の感染、あるいはカンキツかいよう病菌の病害が該植物に及ぶことを防止できる。病原性のカンキツかいよう病菌に感染後の植物であれば、当該カンキツかいよう病予防剤を投与することで病害の拡大を阻止できる。
【００３６】
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、所望の効果が得られる限り、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を任意の濃度で含む。例えば、滅菌水に懸濁した状態で、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌は、１０３〜１０１４コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ、１０４〜１０１２ｃｆｕ／ｍＬまたは１０３〜１０８ｃｆｕ／ｍＬであってもよい。この濃度で植物に投与する場合、カンキツかいよう病予防剤は、植物個体あたり１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。植物に投与する場合、当該カンキツかいよう病予防剤を注射筒に入れ、圧迫接種してもよいし、注射針を介して接種してもよい。当該カンキツかいよう病予防剤を含む懸濁液を植物成長媒体に投与する場合、例えば、植物成長媒体の表面積１ｍ２あたり、１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを散布することで投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。
【００３７】
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、植物または植物成長媒体に単回で投与されてもよいし、任意の時間間隔で植物または植物成長媒体に複数回投与されてもよい。実施例６に示すように、当該カンキツかいよう病予防剤は、植物に投与後４週間にわたって、病原性の顕著な低下、およびかいよう形成能の消失を維持した。このため、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、１週間に１回または複数回、あるいは２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回などの間隔で植物などに投与すればよい。投与間隔は、投与対象の植物または植物成長媒体に応じて、適宜決定することができる。
【００３８】
本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、有効成分であるバクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌以外にも、一般に薬学的または植物学的に許容される他の物質、組成物等を含んでもよい。
【００３９】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、カンキツかいよう病菌の病原性を顕著に低下させ、かいよう形成能を消失させることができる。このため、カンキツかいよう病菌の植物への感染、または植物におけるカンキツかいよう病の発症もしくは病害拡大を予防できる。また、当該カンキツかいよう病予防剤は、カンキツかいよう病菌の防除にも使用できる。
【００４０】
なお、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤に含まれるカンキツかいよう病菌が分泌するバクテリオファージは、カンキツかいよう病菌に特異的に感染する性質を有するため、特異性が高く、他の有用な微生物に影響を与えない。これにより、当該カンキツかいよう病予防剤は、環境への影響を極力小さくすることができる。したがって、当該カンキツかいよう病予防剤は、化学農薬よりも安全性が高く、環境汚染、残留農薬などの問題を回避できる。
【００４１】
また、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、バクテリオファージがカンキツかいよう病菌内にあるため、バクテリオファージに対する紫外線、乾燥、温度変化などの環境因子の影響を低減することができる。すなわち、バクテリオファージの安定性および持続性を高めることができる。このため、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、長期にわたってカンキツかいよう病を予防できる。また、当該カンキツかいよう病予防剤に含まれるカンキツかいよう病菌は、増殖しながら、バクテリオファージを生産し、生産したバクテリオファージを分泌するので、潜在的な病原性カンキツかいよう病菌にさらにバクテリオファージを感染させることができる。これにより、少量の投与でカンキツかいよう病の予防が可能であるうえ、非病原性拮抗菌としても利用できる。したがって、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防剤は、植物の生産者の利便性を高め、低コストでの安全な農作物の提供に寄与する。
【００４２】
なお、上記バクテリオファージも、カンキツかいよう病予防剤として利用できる。例えば、適切な溶媒に懸濁させたバクテリオファージを有効成分とするカンキツかいよう病予防剤は、植物、または植物成長媒体に投与することで、潜在的な病原性のカンキツかいよう病菌に該バクテリオファージを感染させ、カンキツかいよう病を予防できる。
【００４３】
上記バクテリオファージを有効成分とするカンキツかいよう病予防剤の投与量は、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積などに応じて、適宜决定することができる。カンキツかいよう病予防剤に含まれるバクテリオファージの用量は、例えば感染単位で測定され、感染単位は細菌培養用平板上に透明領域又はプラークを形成する能力であるプラーク形成単位（ｐｆｕ）として定義される。例えば、好適な用量は、植物個体あたり１０２〜１０１０ｐｆｕ、好ましくは１０４〜１０８ｐｆｕである。カンキツかいよう病予防剤は、上記用量のバクテリオファージを好適な担体又は希釈剤中に含み、投与対象の植物の種類あるいは植物成長媒体の容積などに応じて、例えば１００μＬ〜１００ｍＬまたは１〜１０ｍＬである。
【００４４】
上記バクテリオファージを有効成分とするカンキツかいよう病予防剤によれば、バクテリオファージがカンキツかいよう病菌に感染して自己増殖するため、少量の投与でカンキツかいよう病の予防が可能である。
【００４５】
なお、上記バクテリオファージの他の実施の形態として、カンキツかいよう病菌の菌体外多糖の生成抑制剤が挙げられる。菌体外多糖の生成抑制剤は、有効成分として上記バクテリオファージを含む。病原性のカンキツかいよう病菌を、菌体外多糖の生成抑制剤に任意の方法で暴露することで、上記バクテリオファージがカンキツかいよう病菌に感染し、該カンキツかいよう病菌による菌体外多糖の生成を抑制できる。こうすることで、カンキツかいよう病菌の病原性を顕著に低下させ、かいよう形成能を消失させることができる。
【００４６】
さらに、別の実施の形態として、カンキツかいよう病菌の菌体外多糖の生成抑制方法が挙げられる。当該菌体外多糖の生成抑制方法は、上記バクテリオファージを、カンキツかいよう病菌に感染させる工程を含む。
【００４７】
（実施の形態２）
続いて、実施の形態２について説明する。本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防方法は、上記実施の形態１に係るカンキツかいよう病予防剤を、植物または植物成長媒体に投与する工程を含む。植物は、カンキツかいよう病菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよいが、好ましくはカンキツ類である。さらに好適には当該植物は、レモン、ネーブルオレンジ等の高級カンキツ類である。
【００４８】
カンキツかいよう病予防剤を投与する方法は、植物または植物成長媒体を、カンキツかいよう病予防剤に暴露することができる方法であれば任意である。カンキツかいよう病予防剤を投与する方法は、例えば、カンキツかいよう病予防剤を噴霧、注射すること、あるいはカンキツかいよう病予防剤を植物または植物成長媒体に浸透させることなどである。
【００４９】
カンキツかいよう病予防剤の投与量は任意であるが、バクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を任意の濃度で含むカンキツかいよう病予防剤を、植物個体あたり１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬ投与すればよい。あるいは、当該カンキツかいよう病予防剤を、植物成長媒体の表面積１ｍ２あたり、１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを散布することで投与してもよい。
【００５０】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るカンキツかいよう病予防方法は、カンキツかいよう病菌の病原性を顕著に低下させるバクテリオファージを植物または植物成長媒体に効率よく作用させることができる。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００５２】
（実施例１：バクテリオファージの単離および精製）
試験に用いたカンキツかいよう病菌であるＭＡＦＦ株は独立行政法人農業生物資源研究所から分譲された。ＭＡＦＦ株は、栄養寒天培地（ＮＡ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ（商標）、ＢＢＬ  ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー製、米国メリーランド州コッキーズヒル）を用いて２８℃で培養した。液体培養が必要な場合は、ＮＢ培地（ＢＢＬ  ベクトン  ディッキンソン  アンド  カンパニー製）で、２８℃、２４時間振盪培養した（２２０ｒｐｍ）。ＭＡＦＦ株は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む０．８％のＮＢ培地中で、−８０℃で保管した。【００５３】
日本の農地から採取した土壌試料から線状のバクテリオファージ（以下、単に「ファージ」ともいう）を、次のように検出した。およそ１０ｇの土壌試料を、滅菌した５０ｍＬの円錐状の遠心分離チューブに入れ、当該チューブを水道水で満たし、２０分毎に反転させた。次に、チューブを、２０分間、１５００×ｇで遠心分離し、膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルター（ミリポア社製、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて、上清を濾過した。【００５４】
次に、土壌濾液１００μＬを、宿主としてＭＡＦＦ株を用いて軟寒天培地（０．７５％寒天）と混合し、１．５％（ｗ／ｖ）寒天を含むＮＢプレートに重層してプラークを形成させた。ファージは、単一のプラークで増殖したものを精製した。１ｍＬのＮＢ培地で一晩培養した細菌の培養液を、５００ｍＬフラスコ内の１００ｍＬの新たなＮＢ培地で１００倍に希釈した。十分な量のファージ粒子を得るために、全体で２Ｌの培養液で細菌培養を行った。ＯＤ６００ｎｍが０．２になったときに、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．００１〜１．０になるようにファージを加えた。さらに１２〜２４時間の培養後、遠心分離機（日立Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２１Ｅ）による遠心分離（Ｒ１２Ａ２ローターを使用して、８０００×ｇ、４℃で１５分間）で細胞を除去した。【００５５】
膜孔の径が０．４５μｍの膜フィルターで上清を濾過し、０．５ＭのＮａＣｌおよび５％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００（関東化学工業社製）存在下でファージ粒子を沈降させた。遠心分離機（日立Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２１Ｅ）による遠心分離（ＲＰＲ２０−２ローターを使用して、１５０００×ｇ、４℃で３０分間）でペレットを回収し、ペレットを、ＳＭバッファ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ））に溶解した。ファージを保管する場合、４℃の遮光環境に静置した。【００５６】
ファージの力価は、系列希釈およびプラーク形成試験で決定した。精製されたファージ（１０１３ｐｆｕ／ｍＬ）を、カーボン支持膜を張ったメッシュに５μＬ滴下後、２％リンタングステン酸ナトリウム５μＬでネガティブ染色し、電子顕微鏡（日立Ｈ６００Ａ）で観察した。【００５７】
（結果）
図１は、得られたファージ（以下、「ＸａｃＦ１ファージ」とする）粒子の電子顕微鏡像を示す。粒子は、長さ１０００ｎｍ、径７ｎｍの線状構造を有していた。【００５８】
表１は、ＸａｃＦ１ファージの宿主を示す。ＸａｃＦ１ファージは、異なるカンキツ品種に感染するカンキツかいよう病菌の少なくとも６株に感染することを確認した。【００５９】
【表１】
2015194540.tif 000003
【００６０】
（実施例２：増殖試験）
ＸａｃＦ１ファージが感染したＭＡＦＦ株の増殖を調べるために、ＸａｃＦ１ファージが感染したＭＡＦＦ株（以下、単に「ＸａｃＦ１感染菌株」ともいう）および未感染のＭＡＦＦ株を５ｍＬのＮＢ培地で一晩培養した。続いて、３０ｍＬのＮＢ培地を含む１００ｍＬフラスコに、０．５ｍＬのＭＡＦＦ株懸濁液（１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を入れた。フラスコを２００ｒｐｍで撹拌しながら２８℃で培養し、分光光度計を用いて４８時間にわたって３時間毎に、ＯＤ６００ｎｍを測定した。【００６１】
（結果）
図２は、ＯＤ６００ｎｍの経時変化を示す。ＸａｃＦ１ファージが感染したＭＡＦＦ株（以下、単に「ＸａｃＦ１感染菌株」ともいう）は、ＯＤ６００ｎｍが上昇しているため、溶菌せずにＸａｃＦ１ファージを産生しながら増殖することが示された。ＸａｃＦ１感染菌株は、未感染のＭＡＦＦ株（以下、単に「未感染宿主菌株」ともいう）と比較して、増殖速度および増殖量が約２／３に低下した。【００６２】
（実施例３：ＤＮＡの単離）
ＤＮＡの単離、制限酵素および他のヌクレアーゼによる切断、ならびに組み換えＤＮＡの構築は、以下のように標準の分子生物学的手法を用いて行った。【００６３】
ＸａｃＦ１ファージのＤＮＡは、精製されたＸａｃＦ１ファージ粒子から、フェノール抽出によって単離した。場合によっては、アルカリＳＤＳ液による少量調製法によって、ＸａｃＦ１ファージが感染した細菌から染色体外のＤＮＡを単離した。ＸａｃＦ１ファージに感染した宿主細菌から配列解析のための複製型（ＲＦ）ＤＮＡを単離し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、Ｒｏｃｈｅ  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ショットガンシークエンス法を行った。【００６４】
次に、ＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  ｖ２．６を用いて、得られた配列のアセンブリを行った。解析された配列は、ＸａｃＦ１ファージの最終ゲノムサイズ（７３２５ｂ）の１５６倍に相当した。ＤＮＡＳＩＳ  ｖ３．６（日立ソフトウェア・エンジニアリング社製）を用いて、ヌクレオチド配列データをコンピュータで解析した。８０ｂよりも長いＯＲＦ候補がＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）を用いて同定された。配列アライメントはＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて行った。ＯＲＦに可能性のある機能を割り当てるために、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索した。【００６５】
（結果）
ＸａｃＦ１ファージのゲノムは、７３２５ｂからなる環状１本鎖ＤＮＡであった。図３は、Ｉｎｏｖｉｒｏｕｓ（Ｆｆファージ）の代表格である大腸菌Ｍ１３と比較したＸａｃＦ１ファージの遺伝子地図を示す。ＸａｃＦ１ファージのＤＮＡ複製モジュール（Ｒ）、構造タンパク質モジュール（Ｓ）および会合・分泌モジュール（Ａ−Ｓ）は、Ｍ１３と共通するモジュールである。ＸａｃＦ１ファージのゲノムは、Ｍ１３と異なり、会合・分泌モジュールの下流に制御領域を有していた。ＸａｃＦ１ファージの予測されたＯＲＦの詳細を表２に示す。【００６６】
【表２】
2015194540.tif 000004
【００６７】
（実施例４：ＸａｃＦ１ファージ感染菌の運動性の評価）
Ｓｗｉｍｍｉｎｇ運動性とＳｗａｒｍｉｎｇ運動性の評価は、それぞれ０．３％（ｗ／ｖ）および０．７％（ｗ／ｖ）の栄養寒天培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ；Ｄｉｆｃｏ（商標）、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）において行なった。終夜培養した培養液を、４℃で２分間遠心分離し（８０００×ｇ）、菌体を滅菌水で洗浄後、ＯＤ６００ｎｍ＝１．０となるように滅菌水に懸濁した。２０ｍＬの栄養寒天培地を含む直径９０ｍｍのシャーレの培地上に、細菌懸濁液２μＬをスポットし、２８℃に保温しながら細菌移動範囲を測定した。【００６８】
Ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性は次のように評価した。上記と同様に２μＬの細菌懸濁液を最少栄養培地（ＭＭ；０．１２５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１７５％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２５％  ＭｇＳＯ４、０．０１５％  クエン酸ナトリウム、１．５％寒天（ｗ／ｖ））にスポットした。２８℃で培養しながらコロニーの周縁部分を顕微鏡観察した（１００倍）。【００６９】
（結果）
Ｓｗｉｍｍｉｎｇ運動性の結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図４（Ａ）に示す未感染宿主菌株と比較して、図４（Ｂ）に示すＸａｃＦ１ファージ感染菌株は、培地上にコロニーが拡がらないことが観察された。運動性距離を定量したところ、図４（Ｃ）に示すように、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株は未感染宿主菌株よりもＳｗｉｍｍｉｎｇ運動性が低下することが示された。【００７０】
図５（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｓｗａｒｍｉｎｇ運動性の結果を示す。Ｓｗｉｍｍｉｎｇ運動性と同様に、図５（Ａ）に示す未感染宿主菌株と比較して、図５（Ｂ）に示すＸａｃＦ１ファージ感染菌株は、培地上にコロニーが拡がらないことが観察された。運動性距離を定量したところ、図５（Ｃ）に示すように、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株は未感染宿主菌株よりもＳｗａｒｍｉｎｇ運動性が低下することが示された。【００７１】
図６（Ａ）および（Ｂ）は、Ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性の結果を示す。図６（Ａ）に示す未感染宿主菌株では、コロニー周辺にＴｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性に由来する不規則構造が観察された。一方、図６（Ｂ）に示すＸａｃＦ１ファージ感染菌株のコロニー周辺の形状は、未感染宿主菌株のコロニー周辺よりも滑らかであった。つまり、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株は未感染宿主菌株よりもＴｗｉｔｃｈｉｎｇ運動性が低下することが示された。【００７２】
（実施例５：菌体外多糖（キサンタン）の生産評価）
ＸａｃＦ１ファージ感染菌株および未感染宿主菌株の培養上清に含まれる菌体外多糖を、次の方法で定量した。２％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコースを追加したＮＢ培地で、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株または未感染宿主菌株を、２４時間、２８℃で振盪培養した（２００ｒｐｍ）。１０ｍＬの培養液を遠心分離し（５０００×ｇで２０分間）、細胞を除去した。培養上清を３倍量の９９％エタノールと混合し、４℃で３０分間冷却後、遠心分離により沈殿として菌体外多糖を回収した。回収した菌体外多糖は、５５℃で終夜乾燥させ定量した。【００７３】
（結果）
ＸａｃＦ１ファージ感染菌株では、１０ｍＬの培養液から０．６ｍｇの菌体外多糖が回収された。一方、未感染宿主菌株では、１０ｍＬの培養液から６．７ｍｇの菌体外多糖が回収された。ＸａｃＦ１ファージ感染菌株は、未感染宿主菌株と比較して、菌体外多糖の生産が１／１０ほどになり、ほとんど菌体外多糖、特に図７に示すように黄色に観察されるキサンタンを生産しないことが示された。カンキツかいよう病菌が生産する菌体外多糖は、カンキツかいよう病の病原因子である。このため、ＸａｃＦ１ファージ感染菌は、病原性が大幅に低下していることが示された。【００７４】
（実施例６：ＸａｃＦ１ファージ感染菌株の病原性の評価）
ＸａｃＦ１ファージ感染菌株の病原性を次の方法で評価した。レモンの葉を水道水で丁寧に洗浄した後、葉を完全に広げ、次亜塩素酸ナトリウムに２分間浸すことで殺菌し、滅菌水で洗浄した。背軸表面を上に向けて濾紙表面上に葉を置いた。ＸａｃＦ１ファージ感染菌株および未感染宿主菌株の各懸濁液を、針刺し法および浸透法で葉に接種した（滅菌水で１０８ｃｆｕ／ｍＬ）。針刺し法では、葉を針で刺し、刺した箇所に各懸濁液１０μＬを滴下した。浸透法では、葉の表側を指で支えて、裏側に各懸濁液を含む注射筒を圧迫接種した。観察のために、接種後、処置した領域に直接印をつけておいた。【００７５】
上記針刺し法および浸透法では、感染を促進するため、接種した葉をビニール袋で４８時間覆った。１２時間の明期と１２時間の暗期の光周期で、４週間、葉を２８℃の栽培箱内に置いた。【００７６】
（結果）
図８は、針刺し法の結果を示す。未感染宿主菌株では、１週間後に病斑が顕著になり、時間経過とともに病斑が拡大、隆起し、２週間後には典型的なかいよう病徴を示した。その後、かいようがさらに拡大した。一方、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株では、４週間後も明確な病変がほとんど見られなかった。それぞれ２０枚の葉における病変領域を定量した結果を図９に示す。ＸａｃＦ１ファージ感染菌株による病変は、ほとんど現れず、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株には、病原性がないことが示された。【００７７】
図１０は、浸透法の結果を示す。上段は、葉の裏側を示し、左側の２箇所に未感染宿主菌株を接種し、右側の１箇所にＸａｃＦ１ファージ感染菌株を接種している。下段は、上段の葉の表側を示す。未感染宿主菌株では、１週間後、接種箇所が脱色し、明らかな病徴が見られた。２週間後には、接種箇所が褐変し、組織の崩壊が始まった。４週間後には、かいよう化がさらに進展した。一方、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株では、３週間後でも特に目立った変化は見られず、４週間後に、接種箇所周辺に少し黄変境界が出現した。ＸａｃＦ１ファージ感染菌株を接種した葉では、かいよう病の病徴は見られなかった。この結果からも、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株には、病原性がないことが示された。【００７８】
（実施例７：ＸａｃＦ１ファージのカンキツかいよう病予防効果）
ＸａｃＦ１ファージ感染菌株のカンキツかいよう病予防効果を次の方法で評価した。レモンの葉を水道水で丁寧に洗浄した後、葉を完全に広げ次亜塩素酸ナトリウム液に２分浸すことで殺菌し、滅菌水で洗浄した。背軸表面を上に向けて濾紙表面上に葉を置いた。ＸａｃＦ１感染菌株（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０）の滅菌水懸濁液(１０８細胞／ｍＬ)を葉の表面に霧吹き器で吹き付けた(１ｍＬ／葉)。対照として未感染宿主菌株（ＭＡＦＦ３０１０８０）を同じ条件で葉の表面に吹き付けた。吹き付け後、湿度調整したシャーレ内で葉を、１２時間明期、１２時間暗期の光周期で２８℃、４週間保存し観察した。【００７９】
（結果）
図１１（Ａ）に示すように、未感染宿主菌株を吹き付けたレモンの葉では、３週間後、菌の感染が明瞭となり、４週間後では葉面広領域に感染が拡大した。一方、図１１（Ｂ）に示すように、ＸａｃＦ１感染菌株を吹き付けたレモンの葉では、４週間後でも葉面において変化は全く見られなかった。なお、各実験５枚のレモンの葉を用いて、すべての葉において同じ結果が得られた。【００８０】
（実施例８：ＸａｃＦ１ファージ感染菌株のカンキツかいよう病予防効果）
ＸａｃＦ１ファージ感染菌株の噴霧処理を行なったレモンの葉について、噴霧２日後、針でレモンの葉を刺し、ＭＡＦＦ３０１０８０野生株の滅菌水懸濁液（１０８細胞／ｍＬ）を、刺した個所に滴下した（１箇所あたり１０μＬ）。対照として噴霧処理を行なわないレモンの葉に対して、上記滅菌水懸濁液を同様に接種した。接種後、上記実施例７と同様にレモンの葉を保存し観察した。【００８１】
（結果）
噴霧処理をしない場合は、明らかな病徴が２週間後から発生した。図１２（Ａ）に示すように、３週間後には褐変と組織の崩壊が顕著となった。さらに４週間後には、病徴の進展が見られた。一方、噴霧処理をしたレモンの葉では、図１２（Ｂ）に示すように、３週間後、接種部分に傷が若干見られるが、病徴は見られない。４週間後でも変化はなく、病徴と認められるものは皆無であった。なお、各実験５枚のレモンの葉を用いて、すべての葉において同じ結果が得られた。【００８２】
実施例８に示すように、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株を接種したレモンの葉では、病原性を有するカンキツかいよう病菌の野生株に暴露されても、カンキツかいよう病の兆候が現れなかった。したがって、ＸａｃＦ１ファージ感染菌株は、カンキツかいよう病予防剤として有用である。【００８３】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態および変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【００８４】
本出願は、２０１４年６月２０日に出願された、日本国特許出願特願２０１４−１２６７８２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願２０１４−１２６７８２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、果樹、主にカンキツ類に対するかいよう病の予防、拡大防止またはカンキツかいよう病菌の防除に好適である。特に、かいよう病に感受性のあるレモン、ネーブルオレンジなどの高級カンキツ類におけるかいよう病の予防および拡大防止に好適である。
【図２】
2015194540.tif 000005
【図９】
2015194540.tif 000006
【図１】
2015194540.tif 000007
【図３】
2015194540.tif 000008
【図４】
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【図５】
2015194540.tif 000010
【図６】
2015194540.tif 000011
【図７】
2015194540.tif 000012
【図８】
2015194540.tif 000013
【図１０】
2015194540.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月22日(2015.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染し、
ゲノム構成がＤＮＡ複製モジュール、５個のＯＲＦを有する構造タンパク質モジュール、会合・分泌モジュールおよび制御領域を含む、
バクテリオファージ。
【請求項２】
ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂである、
請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
ゲノムの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列からなる、
請求項１または２に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉである、
請求項１、２、４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項７】
請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載のバクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項８】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０株に前記バクテリオファージを感染させた菌株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関のあて名：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室、寄託日：２０１４年６月１６日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１８７５）である、
請求項７に記載のカンキツかいよう病予防剤。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載のカンキツかいよう病予防剤を、植物または植物成長媒体に投与する工程、を含む、
カンキツかいよう病の予防方法。
【請求項１０】
前記植物は、カンキツ類である、
請求項９に記載のカンキツかいよう病の予防方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月2日(2016.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファージ粒子の構造が線状で、カンキツかいよう病菌に感染し、
ゲノムの構造タンパク質モジュールに、カンキツ類に感染するカンキツかいよう病菌を特異的に認識する構造タンパク質をコードするＯＲＦを含む、
バクテリオファージ。
【請求項２】
ゲノムサイズが７０００〜８０００ｂである、
請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
ゲノムの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列からなる、
請求項１または２に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃｉｔｒｉである、
請求項１、２、４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項７】
請求項１、２、４、５のいずれか一項に記載のバクテリオファージが感染したカンキツかいよう病菌を含むカンキツかいよう病予防剤。
【請求項８】
前記カンキツかいよう病菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ  ＭＡＦＦ３０１０８０株に前記バクテリオファージを感染させた菌株（寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、寄託機関のあて名：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２２号室、寄託日：２０１４年６月１６日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１８７５）である、
請求項７に記載のカンキツかいよう病予防剤。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載のカンキツかいよう病予防剤を、植物または植物成長媒体に投与する工程、を含む、
カンキツかいよう病の予防方法。
【請求項１０】
前記植物は、カンキツ類である、
請求項９に記載のカンキツかいよう病の予防方法。
【国際調査報告】
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2015194540.tif 000018
2015194540.tif 000019
2015194540.tif 000020