(57)【要約】  下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、メラニン産生抑制剤。2016121962.tif 000023（式中、ｎは０〜２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表し、2016121962.tif 000024は一重結合又は二重結合を表す）
2016121962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、メラニン産生抑制剤。
【化１】
2016121962.tif 000021
（式中、ｎは０〜２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表し、
2016121962.tif 000022
は一重結合又は二重結合を表す）
【請求項２】
前記式中、ｎは２を表す、請求項１に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
上記化合物がモノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４，８，１２−トリエノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４−エノイル）グリセロール、又はモノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４，８，１２，１６−テトラエノイル）グリセロールである、請求項１又は２に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のメラニン産生抑制剤を有効成分として含む、メラニン産生抑制用の皮膚外用剤。
【請求項５】
上記化合物又はその塩を０．００１〜１０重量％の濃度で含む、請求項４に記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
化粧料である、請求項４又は５に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
医薬である、請求項４又は５に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
請求項４に記載の皮膚外用剤を皮膚に適用することを含む、皮膚におけるメラニン産生を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
美白化粧品の市場は年々拡大を続けている。より高い効果を持つ美白成分の開発が求められており、新規美白成分の研究・開発が様々な化粧品メーカーや研究機関で行われている。メラニンは皮膚や毛の色を決定する高分子色素であり、紫外線から皮膚を保護する重要な役割を持つ。しかし、表皮中のメラニン量の増加・蓄積は色素沈着の原因となる。【０００３】
メラニンの生成には様々な要因が関係しているが、その中でもチロシナーゼは主要な働きをすることが知られている。チロシナーゼは酸化還元酵素であり、動植物における様々な色素形成反応を触媒する。例えば、紫外線照射を受けた皮膚のメラノサイトでは、チロシンが出発物質となり、チロシナーゼの働きによってドーパ、そしてドーパキノンが生成され、これがさらに酸化反応を経て最終的にメラニン色素が生成される。このメラニン生成反応の初期段階で機能するチロシナーゼ活性を阻害することがメラニン生成の抑制につながる。メラニンの過剰蓄積がシミやそばかす等の皮膚褐変を引き起こすことから、様々なチロシナーゼ活性阻害剤がそのメラニン産生抑制作用に基づいて医薬品や化粧料に用いられている。例えば、チロシナーゼ活性阻害作用を有するリン酸アスコルビルマグネシウムやアスコルビン酸グルコシドなどのアスコルビン酸誘導体は、美白用途で多くの化粧料等に配合されている。【０００４】
一方で近年では、抗炎症作用を起点とする美白剤を配合する化粧品も販売されており、消費者の認知度も高まってきている。例えば、チロシナーゼに加えて、表皮角化細胞（ケラチノサイト）において産生される多様なメラノサイト刺激因子もメラニン産生に関与していることが知られるようになってきており、メラノサイト刺激因子として、炎症に関与するサイトカインの１つであるＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）も報告されている（非特許文献１）。非特許文献１は、ＭＩＦ活性の抑制による美白効果を報告している。ＭＩＦは通常、皮膚細胞内に存在しており、紫外線や菌感染などによってすぐに細胞から分泌されることで、皮膚炎症の初期段階に産生され、連鎖的な炎症を惹起する。この作用から、日焼けや菌感染症、アトピー性皮膚炎などへの関与が報告されていたが、ＭＩＦによる炎症惹起とメラニン産生の直接的なメカニズムも解明されつつある。また最近、ＭＩＦが表皮細胞に作用し、メラニン合成を刺激するＳＣＦ（幹細胞因子）の産生促進によりメラニン合成を増加させること、また、ＭＩＦがメラノソーム輸送に関与するＰＡＲ−２（プロテアーゼ受容体）の産生を促進することも報告されている（非特許文献２）。これらのことから、ＭＩＦはメラノサイトへの直接への刺激だけでなく、表皮細胞に作用した後にメラニン産生を促進するのではないかと推測される。このように、チロシナーゼ活性阻害以外の作用機序に基づく美白剤の開発も進められている。しかし新規な美白剤の開発はなおも求められている。【０００５】
ところで、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エノイル）グリセロール（Ｃ１７モノグリセリンエステル又はＭＧＰＡとも称される）は、低い粘度を有し、かつ水性媒体中でＩＩ型（油中水型）の非ラメラ液晶を形成できる化合物として報告されている（特許文献１）。Ｃ１７モノグリセリンエステルと水から形成される液晶を含む皮膚外用剤は、ビタミンＣ誘導体など生理活性成分の経皮浸透促進性や保湿性に優れることも明らかになっている（特許文献２）。しかしＣ１７モノグリセリンエステルの他の用途はまだ十分に知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／０７８３８３号
【特許文献２】特開２０１２−１７３１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】中間満雄「新規メラニン産生制御因子マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対する白神酵母エキスの効果」、フレグナンスジャーナル、２０１１−５
【非特許文献２】「肌蛋白「ＭＩＦ」抑制する美白メカニズムを解明」薬事日報、５面、２０１２年２月１日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なメラニン産生抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Ｃ１７モノグリセリンエステルをはじめとするある種の非ラメラ液晶化合物がメラニン産生抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む、メラニン産生抑制剤。
【化１】
2016121962.tif 000003
（式中、ｎは０〜２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表し、
2016121962.tif 000004
は一重結合又は二重結合を表す）
［２］前記式中、ｎは２を表す、上記［１］に記載のメラニン産生抑制剤。
［３］上記化合物がモノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４，８，１２−トリエノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４−エノイル）グリセロール、又はモノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４，８，１２，１６−テトラエノイル）グリセロールである、上記［１］又は［２］に記載のメラニン産生抑制剤。
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載のメラニン産生抑制剤を有効成分として含む、メラニン産生抑制用の皮膚外用剤。
［５］上記化合物又はその塩を０．００１〜１０重量％の濃度で含む、上記［４］に記載の皮膚外用剤。
［６］化粧料である、上記［４］又は［５］に記載の皮膚外用剤。
［７］医薬である、上記［４］又は［５］に記載の皮膚外用剤。
［８］上記［４］に記載の皮膚外用剤を皮膚に適用することを含む、皮膚におけるメラニン産生を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、皮膚細胞におけるメラニン産生を効果的に抑制することができる。【００１２】
本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願 特願2015-017197号の内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は被験試料処理後の黒化レベルの目視判定結果及び観察画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、非ラメラ液晶化合物を有効成分として含む、メラニン産生抑制剤に関する。本発明において非ラメラ液晶化合物とは、水性媒体（水、緩衝液など）中で非ラメラ液晶を形成可能な化合物を意味する。
【００１５】
本発明で用いる非ラメラ液晶化合物としては、下記一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化２】
2016121962.tif 000005
（式中、ｎは０〜２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表し、
2016121962.tif 000006
は一重結合又は二重結合を表す）
で表される化合物又はその塩が挙げられる。より好ましい実施形態では、前記式中、ｎは２を表す。
【００１７】
一般式（Ｉ）で表される化合物の例として、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００１８】
【化３】
2016121962.tif 000007
【００１９】
一般式（ＩＩ）中、ｎは０〜２の整数を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表す。より好ましい実施形態では、前記式中、ｎは２を表す。
【００２０】
一般式（Ｉ）で表される化合物の別の例として、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００２１】
【化４】
2016121962.tif 000008
【００２２】
一般式（ＩＩＩ）中、ｎは０〜２の整数（好ましくは、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表す。より好ましい実施形態では、前記式中、ｎは２を表す。
【００２３】
一般式（Ｉ）で表される化合物のさらに別の例として、下記一般式（ＩＶ）で表される化合物が挙げられる。
【００２４】
【化５】
2016121962.tif 000009
【００２５】
一般式（ＩＶ）中、ｎは０〜２の整数（好ましくは、１又は２）を表し、ｍは１又は２を表し、Ｒはグリセロールから１つの水酸基が除かれた親水性基を表す。より好ましい実施形態では、前記式中、ｎは２を表す。
【００２６】
なお本発明において、上記一般式中の表記：
2016121962.tif 000010
は当該化合物が幾何異性体のＥ体（シス体）若しくはＺ体（トランス体）又はそれらの混合物であることを意味する。また本明細書において化合物の名称が「モノ」を含み、上記一般式中のＲについて２以上の位置異性体が存在する場合には、その名称によって表される化合物は、それぞれの位置異性体及びその混合物を包含するものとする。例えば上記一般式で表される化合物は、グリセロールの１位又は２位エステル体、及びそれらの混合物を包含する。
【００２７】
以上の非ラメラ液晶化合物によって形成される非ラメラ液晶は、キュービック液晶又は逆ヘキサゴナル液晶でありうる。非ラメラ液晶形成能は、常法により液晶構造を解析することによって確認することができる。偏光顕微鏡を用いたペネトレイション法では、Ｉ型キュービック液晶とＩＩ型キュービック液晶を容易に判別できる。またエックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定により散乱ピークの比から、Ｉａ３ｄキュービック液晶、Ｉｍ３ｍキュービック液晶、逆ヘキサゴナル液晶を容易に判別することができ、またＳＡＸＳデータから算出したピークの値の逆数の比を求めることにより、容易に空間群と格子定数を決定することができる。
【００２８】
本発明では、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である、メラニン産生抑制作用を有する非ラメラ液晶化合物を用いる。上記一般式（Ｉ）で表され、メラニン産生抑制作用を有する非ラメラ液晶化合物の特に好ましい例として、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エノイル）グリセロール（以下、Ｃ１７モノグリセリンエステルとも称する）が挙げられる。なおＣ１７モノグリセリンエステルは上記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物の１つ（ｎ＝２、ｍ＝１）である。Ｃ１７モノグリセリンエステルは後述の実施例１に記載のようにして合成することができる。好ましい化合物の別の例としては、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４−エノイル）グリセロール、モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４，８，１２−トリエノイル）グリセロール、及びモノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４，８，１２，１６−テトラエノイル）グリセロールが挙げられる。
【００２９】
本発明のメラニン産生抑制剤は、皮膚に適用することにより、当該メラニン産生抑制剤を適用しない場合と比較して、皮膚細胞、特にメラノサイトにおけるメラニン産生を有意に抑制することができる。そこで本発明は、上記のような非ラメラ液晶化合物又はその塩を１つ（１種）又は２つ（２種）以上含むメラニン産生抑制剤を提供する。上記非ラメラ液晶化合物の塩は、任意の塩であってよく、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などの塩が挙げられる。本発明の上記非ラメラ液晶化合物の塩は、用途に応じて、化粧料又は医薬の製造上許容される塩、例えば、薬学上許容される塩であってよい。本発明のメラニン産生抑制剤は組成物であり得る。
【００３０】
本発明の非ラメラ液晶化合物は、後述の実施例の記載を参考にして合成することができる。あるいは、一般式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、国際公開ＷＯ  ２０１４／１７８２５６に記載された合成法に従って合成することができる。一般式（ＩＩＩ）で表される両親媒性化合物は、例えば、国際公開ＷＯ  ２０１１／０７８３８３に記載された合成法に従って合成することができる。さらに、一般式（ＩＶ）で表される両親媒性化合物は、例えば、国際公開ＷＯ  ２００６／０４３７０５に記載された合成法に従って合成することができる。合成された化合物については、ＮＭＲ測定等の常法により、目的の化合物が得られたことを確認しておくことが好ましい。
【００３１】
本発明は、本発明のメラニン産生抑制剤又は上記非ラメラ液晶化合物を有効成分として含む、メラニン産生抑制用の皮膚外用剤も提供する。本発明の皮膚外用剤は、メラニン産生抑制を目的として皮膚に外部から適用する任意の製剤である。本発明の皮膚外用剤は、化粧料であってもよいし、医薬であってもよい。本発明において医薬は、医薬品と医薬部外品を包含する。本発明の皮膚外用剤は、好ましくは美白用化粧料又は美白用医薬である。「美白用」とは、通常はメラニン産生による皮膚の黒化の予防（黒化防止若しくは軽減）を意味するが、黒化の改善（白色化）も含みうる。本発明のメラニン産生抑制剤は、美白剤でもありうる。本発明の皮膚外用剤及び美白剤は組成物であり得る。
【００３２】
本発明の皮膚外用剤は、本発明のメラニン産生抑制剤又はその有効成分である上記非ラメラ液晶化合物に加えて、水性媒体を含んでもよい。水性媒体としては、特に限定するものではないが、滅菌水、精製水、蒸留水、イオン交換水、超純水などの水；生理的食塩水、塩化ナトリウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化マグネシウム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液、硫酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液等の電解質水溶液；リン酸緩衝溶液やトリス塩酸緩衝溶液などの緩衝溶液；グリセリン、ブチレングリコール（例えば１，３ブチレングリコール）、エチレングリコール、エタノール等のアルコールをはじめとする水溶性有機化合物を含有する水溶液等が挙げられる。本発明の皮膚外用剤は、例えば、アルコールと水を含んでもよい。本発明の皮膚外用剤は、１種又は２種以上のアルコールを含んでもよい。
【００３３】
本発明の皮膚外用剤は、油分（例えば、揮発性油分）を含んでもよいし、含まなくてもよい。油分としては医薬品又は化粧料において使用可能な油性成分、例えば、植物油、動物油、鉱物油、エステル油（例えば、パルミチン酸エチルヘキシル）、シリコーン油、フッ素油等が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、本発明の皮膚外用剤は、上記非ラメラ液晶化合物を０．００１〜０．５重量％、例えば０．００１〜０．１重量％、０．００１〜０．０５重量％又は０．００１〜０．０１重量％の濃度で含んでもよい。別の実施形態では、本発明の皮膚外用剤は、上記非ラメラ液晶化合物を０．０００１〜１５重量％で含んでもよいし、０．００１〜１０重量％、例えば０．００５〜１．０重量％、０．０１〜０．５重量％、０．０５〜０．１重量％又は０．０５〜１０重量％の濃度で含んでもよい。なお本発明において「重量％」は、ｗ／ｗ（ｗｅｉｇｈｔ／ｗｅｉｇｈｔ）％である。
【００３５】
本発明のメラニン産生抑制剤又は皮膚外用剤は、上記非ラメラ液晶化合物又はその塩に加えて、製剤の適用性（溶解補助、ｐＨ調節、等張化、吸収促進、安定化、成形など）を高めるための薬学上許容される任意の添加剤を含有してもよい。このような添加剤の例として、溶媒（水、生理食塩水等）、乳化剤、希釈剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐剤、中和剤、緩衝剤、分散剤、ゲル化剤、滑沢剤、コーティング剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、香料、色素等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の皮膚外用剤はまた、メラノサイトに対するメラニン産生抑制効果を阻害しない限り、他の生理活性成分を含んでもよい。例えば、本発明の皮膚外用剤は、より高い美肌効果を得るため、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、セラミド、プラセンタエキス、ビタミン類、乳酸菌エキス等の美肌作用を有する成分をさらに含んでもよい。
【００３７】
本発明の皮膚外用剤は外用可能な任意の剤形であってよく、例えば、クリーム、乳液、ローション、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、ハップ剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション等の形態であってよい。
【００３８】
上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤のメラニン産生抑制効果は、皮膚モデルに適用して一定期間（例えば２週間）培養した後、皮膚モデル細胞に含まれるメラニン量を測定し、それらを適用していない無処理の皮膚モデルと比較して、メラニン量が有意に低減したことを確認することにより判定することができる。メラニン量の測定は、アルカリ可溶化法を利用してメラニンを定量することにより行ってもよい。メラニン量の測定はまた、皮膚モデルに適用して一定期間（例えば２週間）培養後の皮膚モデルの顕微鏡下観察画像について目視判定又は画像処理判定を行い、皮膚の黒化レベルの相対値を算出することにより行ってもよい。上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤はまた、細胞毒性が低いため、より安全性が高い。
【００３９】
上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤のメラニン産生抑制効果はまた、マウス由来のＢ１６メラノーマ細胞を用いて評価することもできる。Ｂ１６メラノーマ細胞は、メラニン産生能を有し、メラニン生成に対する作用を試験するために一般的に使用されている。例えば、その非ラメラ液晶化合物、メラニン産生抑制剤又は皮膚外用剤を、最終濃度５０μＭとなるようにＢ１６メラノーマ細胞に添加し、７２時間培養した後、細胞を回収し、１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を添加したＤＭＥＭ培地に懸濁する。この懸濁液を１，５００  ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を分取して波長４０５  ｎｍの吸光度を測定し、別途作成したメラニン検量線に基づいて細胞中のメラニン量を算出し、それをメラニン生成量とし、並行して試験した試料無添加群（対照）のメラニン生成量に対する比率（メラニン量比率）を決定すればよい。メラニン量比率が１００％よりも低いこと（好ましくは、統計学的に有意に低いこと）は、試験した非ラメラ液晶化合物、メラニン産生抑制剤又は皮膚外用剤がメラニン産生抑制効果を有することを示す。それらが示すメラニン量比率は、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、特に好ましくは６０％以下である。
【００４０】
なお上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤のメラニン産生抑制効果は、チロシナーゼ活性阻害作用に基づくものではない。
【００４１】
本発明はまた、上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤を用いたメラニン産生抑制方法も提供する。本発明のメラニン産生抑制方法は皮膚細胞、特にメラノサイトに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤を皮膚に適用することにより、皮膚における、より具体的には皮膚細胞、特にメラノサイトにおけるメラニン産生を抑制することができる。本発明のメラニン産生抑制方法は、異常なメラニン産生亢進やメラニン沈着増加が見られる疾患に対する治療又は予防方法に用いることができる。そのような疾患としては、例えば肝斑や皮膚色素沈着過剰症が挙げられる。皮膚色素沈着過剰症とは、家族性素因、ホルモン、太陽光への曝露、及び皮膚老化等を原因とする、メラニンの蓄積が皮膚に褐色又は有色の斑の外観となって現れる皮膚障害である。本発明のメラニン産生抑制方法はまた、美容のための肌に対する美白方法に用いてもよい。美白方法は、例えば、肌のしみ、そばかす、くすみ等の改善や予防を目的として行うことができる。本発明のメラニン産生抑制方法を適用する対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。メラニン産生抑制方法を適用する対象は、異常なメラニン産生亢進やメラニン沈着増加が見られる疾患を有するか又はその疾患を発症するリスク（遺伝的素因、又は生活習慣上若しくは環境上のリスクなど）が高い患者が挙げられる。メラニン産生抑制方法を適用する対象はまた、美容のための肌に対する美白を望むヒトが対象であってよい。さらに本発明は、上記非ラメラ液晶化合物、本発明のメラニン産生抑制剤又は本発明の皮膚外用剤を皮膚に適用することにより、メラニン産生亢進やメラニン沈着増加のリスクを低下させる方法も提供する。例えば、メラニン産生抑制のための本発明の皮膚外用剤の一日当たりの好ましい使用量は、使用する対象、剤形、使用間隔等の要因に依存して変動するが、典型的には、ヒト成人一人の一日当たりの使用量で、全顔であれば約０．１〜３ｇ／日、顔を除く全身であれば約１〜１０ｇ／日であってよい。この一日量は、一度に使用してもよく、２〜４回に分割して使用してもよい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００４３】
なお、下記実施例１、３、及び６に記載した各化合物の粘度は粘度・粘弾性測定装置（Ｇｅｍｉｎｉ  ＩＩ、マルバーン社）を使用し、温度２５℃にて測定した。【００４４】
［実施例１］  モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エノイル）グリセロール（Ｃ１７モノグリセリンエステル又はＭＧＰＡとも称する）の合成
【化６】
2016121962.tif 000011
【００４５】
グリセロール０．６５ｇ（７．１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．５９ｇ（４．３ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．５ｍＬ）溶液に、８０℃で５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４−エン酸メチル１．０ｇ（３．５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。１００℃で１８時間撹拌した後、反応液に１Ｍ塩酸を添加し、エーテルで抽出した。抽出液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン混液）で精製することにより、ＭＧＰＡを無色透明液体として得た。【００４６】
得られた化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ測定及び粘度測定を行った結果は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ：０．８０−０．９０（ｍ，９Ｈ），１．００−１．７０（ｍ，１５Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝７．８，１７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），２．２５−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），３．５０−４．００（ｍ，３Ｈ），４．１０−４．２５（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）
粘度：０．４８Ｐａ・ｓ（せん断速度９２  １／ｓ）【００４７】
［実施例２］  三次元皮膚モデルを用いたメラニン産生抑制効果評価試験
ＭＥＬ−３００皮膚モデル（アジア人ドナー；ＭａｔＴｅｋ）、及び専用のＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ維持培地を用いて、以下のとおり被験試料のメラニン産生抑制効果の評価を実施した。ＭＥＬ−３００皮膚モデルをはじめとするメラノサイト含有ヒト皮膚三次元モデルは、専用培地中のメラニン産生促進因子の作用により長期培養において黒化が進行するため、ヒト皮膚の擬似モデルとして美白成分のメラニン産生抑制効果評価用に汎用されている。【００４８】
被験試料としては、実施例１に記載のようにして合成したＣ１７モノグリセリンエステルを用いた。比較例ではオレイン酸モノグリセリド（リケマールＯＬ−１００Ｅ；理研ビタミン）を用いた。Ｃ１７モノグリセリンエステル、及びオレイン酸モノグリセリドはそれぞれ、パルミチン酸エチルヘキシル（ＩＯＰ）中に溶解し、これらを試料溶液として用いた。【００４９】
６ウェルプレートの各ウェルにＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ培地を添加した後、各ウェルに培養カップ中のＭＥＬ−３００皮膚モデルを配置し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養し、馴化した。新しい６ウェルプレートにＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ培地を添加し、馴化後のＭＥＬ３００皮膚モデルを配置した。培養カップ中のＭＥＬ３００皮膚モデルに、上記で調製した試料溶液を角層側から１００μＬ添加し（試料最終濃度：０．００１％、０．０１％、又は０．１％；いずれもｗ／ｖ（％））、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で２週間培養した。培養期間中２日毎に試料及び培地を新鮮なものに交換した。２週間培養後、分光測色計Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｄｅｒ  ＣＲ−１３  （ＭＩＮＯＬＴＡ  ＣＯ．，  ＬＴＤ，  Ｊａｐａｎ）を用いて皮膚モデルのＬ＊値（明度指標値）の測色を行うとともに、皮膚の黒化レベルについて目視判定及び観察画像の撮影を行った。目視判定では、最も高い黒化レベルを５として５段階（５（黒）〜１（白））でスコア化した。【００５０】
また２週間培養後の皮膚モデルについて、アラマーブルー法により細胞生存率を決定し、試料の細胞毒性を評価した。具体的には、アラマーブルー試薬をＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ培地にて１０倍希釈し、２４ウェルプレートに３００μＬずつ分注した。皮膚モデルをこのアラマーブルー含有培地にて２時間培養し、培地中に放出された蛍光（Ｅｘ．／Ｅｍ．＝５４４ｎｍ／５９０ｎｍ）を測定することにより細胞生存率を決定した。測定値は陰性コントロールの皮膚モデルを１００とした相対値として表した。【００５１】
さらに、アルカリ可溶化法により、２週間培養後の皮膚モデルに含まれるメラニンの定量を行った。培養完了後の培養カップから回収した皮膚モデルの全量を、生理的リン酸緩衝液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋フリー）、５％トリクロロ酢酸、及びエタノール／ジエチルエーテル（３：１）混液でそれぞれ３回ずつ順次洗浄後、ジエチルエーテルにて１回洗浄した。皮膚モデルを乾燥後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて加熱溶解した。得られたアルカリ溶解液について、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、合成メラニン試料を用いて検量線を作成し、それを用いて吸光度測定値から皮膚モデル中のメラニン量を算出した。【００５２】
なお陽性コントロールとして、０．５％コウジ酸を用いて、被験試料と同様に皮膚モデルを処理し、評価を行った。また陰性コントロール（被験試料未処理コントロール）として、ＩＯＰのみで同様に皮膚モデルを処理し、評価を行った。【００５３】
得られたＬ＊値、細胞生存率及びメラニン量について、陰性コントロールとの間でＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定による有意差検定を行った。【００５４】
図１に、被験試料処理後の黒化レベルの目視判定結果及び観察画像を示した。図１に示されるように、Ｃ１７モノグリセリンエステル及びオレイン酸モノグリセリドはいずれも、黒化スコアの減少、すなわち皮膚モデルの白色化をもたらした。【００５５】
表１に被験試料処理による皮膚の明度変化を示すＬ＊値を示した。Ｌ＊値が大きいほど明度が高く、皮膚がより白いことを意味する。Ｃ１７モノグリセリンエステル処理について、陰性コントロールと比較して、０．００１％から明度の増加が認められ、さらに０．１００％まで濃度を高めた場合には顕著な明度の増加が認められたことから、全体として濃度依存的な明度の増加傾向が示された。一方、オレイン酸モノグリセリドにも、陰性コントロールと比較して、０．００１％から明度の増加は認められたものの、０．１００％まで濃度を高めても明度の増加度は変わらず、濃度依存性は認められなかった。【００５６】
【表１】
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【００５７】
表２には、被験試料処理の皮膚細胞毒性の有無を示す細胞生存率を示した。Ｃ１７モノグリセリンエステルとオレイン酸モノグリセリドはいずれを用いた場合にも、０．００１％と０．０１０％で細胞生存率に有意な低下は認められなかったが、オレイン酸モノグリセリドについては０．１％濃度で細胞生存率の低下が認められた。Ｃ１７モノグリセリンエステルについて、オレイン酸モノグリセリドに比べて細胞毒性が低いこと、少なくとも０．１００％で細胞毒性がないことが示された。【００５８】
【表２】
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【００５９】
表３に被験試料処理によるメラニン量変化の結果を示した。Ｃ１７モノグリセリンエステルを用いた場合、濃度依存的なメラニン量の減少が認められ、陰性コントロールとの間で有意差が認められた。０．１％濃度のＣ１７モノグリセリンエステルを用いた処理では、高い美白効果が知られているコウジ酸による処理と近いレベルのメラニン量低減が認められた。一方、オレイン酸モノグリセリドを用いた場合にもメラニン産生量の減少は認められたものの、濃度依存性は得られず、高濃度処理域にてばらつきが大きくなった。表２に示したようにオレイン酸モノグリセリドは高濃度域において細胞生存率が減少傾向を示すことから、オレイン酸モノグリセリドが皮膚モデルに何らかの影響を与え、それがばらつきの原因となったものと考えられる。【００６０】
【表３】
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【００６１】
以上より、Ｃ１７モノグリセリンエステルがメラニン産生抑制作用を有し、それにより美白作用を有することが示された。【００６２】
［実施例３］  モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４，８，１２−トリエノイル）グリセロール（ファルネシル酢酸グリセリルとも称する）の合成
【化７】
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【００６３】
２００〜２５０ｍｍＨｇの減圧下、グリセロール９．２ｇ（０．１０ｍｏｌ）及び炭酸カリウム０．２８ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）溶液に、８５℃で５，９，１３−トリメチルテトラデカ−４，８，１２−トリエン酸メチル（ファルネシル酢酸メチルとも称する）１３．９ｇ（５０．０ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、同一温度で３時間撹拌した。この間、反応で生じたメタノールは留去した。得られた反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒（１：１，１５０ｍＬ）で希釈し、水、飽和重曹水、及び飽和食塩水（２回）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後濃縮することによって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００：０〜０：１００）で精製することにより、表題の化合物８．２２ｇ（収率４９％）を無色透明液体として得た。【００６４】
得られた化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ測定及び粘度測定を行った結果は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ：１．５−１．８（ｍ，１２Ｈ），１．９−２．１（ｍ，８Ｈ），２．１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．２５−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝５．６，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄｄ，Ｊ＝３．６，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．０２−５．１６（ｍ，３Ｈ）
粘度：０．２６Ｐａ・ｓ（せん断速度９２  １／ｓ）【００６５】
［実施例４］  モノＯ−（５，９，１３−トリメチルテトラデカノイル）グリセロール（飽和Ｃ１７グリセリンエステルとも称する）の合成
【化８】
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【００６６】
５，９，１３−トリメチルテトラデカン酸メチル５０．３ｇ（１７７ｍｍｏｌ）に２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール７０ｇ（０．５３ｍｏｌ）と炭酸カリウム３６．７ｇ（２６６ｍｍｏｌ）を添加し、２００〜２５０ｍｍＨｇの減圧下、８５℃で３時間撹拌した。この間、反応で生じたメタノールは留去した。得られた反応溶液を減圧濃縮（５０℃から２１０℃へ上昇、１．４ｋＰａから０．３８ｋＰａへ減圧）した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、５，９，１３−トリメチルテトラデカン酸（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル４３．０ｇ（収率６３％）を得た。【００６７】
５，９，１３−トリメチルテトラデカン酸（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル３２．７ｇ（８５．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３４０ｍＬ）溶液に、室温で３Ｍ塩酸８５ｍＬを添加し、同一温度で５時間撹拌した。この反応溶液を酢酸エチル（３００ｍＬ）、飽和重曹水（４００ｍＬ）に加えて分液した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後濃縮することによって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、表題の化合物２８．７ｇ（収率９８％）を無色透明液体として得た。【００６８】
得られた化合物について、１Ｈ−ＮＭＲを測定した結果は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ：０．７−０．９（ｍ，１２Ｈ），０．９５−１．４５（ｍ，１６Ｈ），１．４５−１．７５（ｍ，３Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝５．８，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝４．０，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｄｄ，Ｊ＝５．９，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．７Ｈｚ，１Ｈ）【００６９】
［実施例５］  モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４−エノイル）グリセロール（Ｃ２２グリセリンエステルとも称する）の合成
【化９】
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【００７０】
６０〜７０ｍｍＨｇの減圧かつ窒素気流下、グリセロール１４４ｇ（１．５６ｍｏｌ）及び炭酸カリウム１．５８ｇ（１．１５ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７００ｍＬ）溶液に、７８〜８３℃で５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４−エン酸メチル１９９ｇ（０．５６４ｍｏｌ）を徐々に滴下した。同一温度で１０時間撹拌した後、７５℃でギ酸を添加しｐＨを４に調整した。得られた溶液を減圧濃縮した後、ｔ−ブチルメチルエーテル（１．５Ｌ）で希釈し、生じた不溶物を濾別した。得られた濾液を１０％重曹水で２回洗浄した後、活性炭（８ｇ）で処理し脱色した。濾過後濃縮して得られた残渣をエタノールで溶解し、セルロースパウダーで濾過した。濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル混液）で精製することにより、表題の化合物を得た。【００７１】
得られた化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ：０．８０−０．９５（ｍ，１２Ｈ），１．００−１．７０（ｍ，２２Ｈ），１．８５−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．１５−２．５５（ｍ，４Ｈ），３．５３−３．７８（ｍ，３Ｈ），３．８０−４．００（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．２５（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）【００７２】
［実施例６］  モノＯ−（５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４，８，１２，１６−テトラエノイル）グリセロール（ゲラニルゲラニル酢酸グリセリルとも称する）の合成
【化１０】
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【００７３】
２００〜２５０ｍｍＨｇの減圧下、グリセロール７．４ｇ（８０ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム５．５ｇ（４０ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１６ｍＬ）溶液に、８５℃で５，９，１３，１７−テトラメチルオクタデカ−４，８，１２，１６−テトラエン酸メチル（ゲラニルゲラニル酢酸メチルとも称する）１３．９ｇ（４０．０ｍｍｏｌ）を徐々に滴下し、同一温度で６時間撹拌した。この間、反応で生じたメタノールは留去した。得られた反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒（１：１，２００ｍＬ）で希釈し、水、飽和重曹水、飽和食塩水（２回）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後濃縮することによって得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００：０〜０：１００）で精製することにより、表題の化合物５．４４ｇ（収率３３％）を透明液体として得た。【００７４】
得られた化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ測定及び粘度測定を行った結果は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ）δ：１．５５−１．７２（ｍ，１５Ｈ），１．９−２．２（ｍ，１３Ｈ），２．２７−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＯＨ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝５．４，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄｄ，Ｊ＝３，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．０５−５．１５（ｍ，４Ｈ）
粘度：０．３７Ｐａ・ｓ（せん断速度９２  １／ｓ）【００７５】
［実施例７］マウスＢ１６メラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制効果評価試験
実施例１及び３〜６で合成した化合物、並びにアルブチン（比較化合物）について、メラニン産生抑制作用の評価を行った。【００７６】
各化合物の試験溶液は、１，３−ブチレングリコールを溶媒として用いて、実施例１及び３〜６の化合物の最終濃度は５０μＭ、アルブチンの最終濃度が５００μＭとなるように調製した。【００７７】
試験化合物添加群では、まず、６ウェルプレートにマウスＢ１６メラノーマ細胞を０．４×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。培地を除去し、調製した試験溶液をウェルに添加し、７２時間培養した。各ウェルの培地をマイクロチューブに分取し、ＰＢＳで洗浄後、０．０２５％トリプシン／ＰＢＳを用いて細胞を回収した。５００  ｒｐｍ、１０分間の遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に再懸濁した。【００７８】
この懸濁液を１，５００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清を９６ウェルプレートに分取し、マイクロプレートリーダーで波長４０５  ｎｍの吸光度を測定した。また、合成メラニン試料を用いて検量線を作成した。得られた吸光度測定値に基づき、作成したメラニンの検量線から細胞中のメラニン量を算出して、メラニン生成量とした。【００７９】
対照として、試験溶液を添加しないこと以外は同様に試験し、メラニン生成量を算出した（無添加群）。【００８０】
各化合物について、試験化合物添加群で得られたメラニン生成量の、無添加群（対照）のメラニン生成量に対する相対比率を算出することにより、メラニン量比率（％）を決定した。メラニン量比率が低いほど、メラニン産生が抑制されていることを示す。算出結果を以下の表４に示す。
【表４】
2016121962.tif 000019
【００８１】
美白剤として知られるアルブチンは、５００μＭの濃度で、４２．６±２．４％のメラニン量比率を示した。一方、実施例１及び３〜６の化合物はいずれも、その１／１０の濃度で、メラニン量比率の低下を示した。とりわけ、実施例１と実施例４の化合物は特に顕著なメラニン産生抑制効果を示した。なお上記の結果から、アルブチンは、上記の１／１０の濃度となる５０μＭではメラニン産生抑制効果を示さないと推測された。【００８２】
［実施例８］チロシナーゼ活性阻害作用の評価
試験化合物として、実施例１で合成した化合物、及びアルブチン（比較化合物）について、チロシナーゼ活性阻害作用の評価を行った。
実施例１の化合物は最終濃度２００μＭ、５００μＭ、又は１０００μＭ、アルブチン（比較化合物）は最終濃度５００μＭとなるように、０．１  Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で各化合物を希釈した溶液（０．１％  ＤＭＳＯを含む）を調製した（試験溶液）。【００８３】
試験化合物添加群では、９６ウェルプレートに、調製した試験溶液と１００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  マッシュルームチロシナーゼ溶液を５０μＬずつ加え、３７℃で１分間インキュベートした。さらに、２ｍＭ  Ｌ−チロシン溶液５０μＬを加え、波長４７５  ｎｍでの吸光度を、３７℃で０〜１５分まで１分間隔でマイクロプレートリーダーを使用して測定した。対照として、試験溶液を添加しないこと以外は同様に試験し、メラニン生成量を決定した（無添加群）。【００８４】
下記計算式に従って、試験化合物添加群で得られたメラニン生成量の、無添加群（対照）メラニン生成量に対する相対比率を算出することにより、チロシナーゼ活性率（％）を算出した。  
チロシナーゼ活性率（％）＝［（被験試料の吸光度（１５分）−被験試料の吸光度（０分）］／［（対照試料の吸光度（１５分）−対照試料の吸光度（０分）］  ×  １００【００８５】
チロシナーゼ活性率が小さいほど、対照と比較してチロシナーゼ活性が低下していること、すなわち、試験化合物のチロシナーゼ活性阻害作用が高いことを意味する。算出されたチロシナーゼ活性率を以下の表５に示す。
【表５】
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【００８６】
チロシナーゼ活性阻害剤である比較化合物のアルブチンは非常に高いチロシナーゼ活性阻害作用を示したのに対し、実施例１の化合物はチロシナーゼ活性阻害作用を全く示さなかった。この結果から、本発明に係る化合物はチロシナーゼ活性阻害とは異なる機構により美白作用を発揮することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、美白用製品に用いることができる。本発明に係るメラニン産生抑制剤及びそれを含む皮膚外用剤等は、皮膚におけるメラニン産生を効果的に抑制し、それによりしみやくすみの抑制効果、肌を明るくする効果等をもたらすために利用することができる。        【００８８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により、本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【国際調査報告】
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2016121962.tif 000027
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