(57)【要約】【課題】生理活性物質の水溶性を向上させることができ、また、光や酵素的切断に依らずに特定の条件下で生理活性物質をより速く放出可能な担体リンカーを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、担体として糖鎖を付加した、新規糖鎖付加リンカーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのカルボキシ基を有する生理活性物質との結合用の、糖鎖付加リンカーであって、
前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記糖鎖付加リンカーは、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質のカルボキシ基と結合することができる、
糖鎖付加リンカー。
【請求項２】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされる、糖鎖付加リンカー。
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、または−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドである。］
【請求項３】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされる、糖鎖付加リンカー。
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、または−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、または置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリールであり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドである。］
【請求項４】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」において、糖鎖は、アミノ酸またはポリペプチドにおける、ＡｓｎまたはＣｙｓに結合している、
糖鎖付加リンカー。
【請求項５】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖は、４個以上の糖残基からなる、
糖鎖付加リンカー。
【請求項６】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記Ｒ２またはＲ６における「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖は、２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖である、
糖鎖付加リンカー。
【請求項７】
請求項６に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される２本鎖複合型糖鎖である、
糖鎖付加リンカー。
【請求項８】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖が、下記式：
【化１】
2014084110.tif 000062
［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、同一または異なって、
【化２】
2014084110.tif 000063
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、
糖鎖付加リンカー。
【請求項９】
請求項１に記載の糖鎖付加リンカーであって、
前記「糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチド」において、糖鎖は、アミノ酸またはポリペプチドと、リンカーを介することなく結合している、
糖鎖付加リンカー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖鎖付加リンカーに由来する糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩であって、
前記生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記糖鎖付加リンカー部分は、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質部分のカルボキシ基とエステル結合またはチオエステル結合を形成し、前記生理活性物質部分と結合している、
化合物またはその塩。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物またはその塩であって、
前記生理活性物質は、低分子生理活性物質または生体高分子である、
化合物またはその塩。
【請求項１２】
請求項１０に記載の化合物またはその塩であって、
前記生体高分子は、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸からなる群より選択される、
化合物またはその塩。
【請求項１３】
請求項１０に記載の化合物またはその塩であって、
無修飾の生理活性物質と比較して、向上した水溶性を有する、
化合物またはその塩。
【請求項１４】
請求項１０に記載の化合物またはその塩であって、
前記向上した水溶性が、モル濃度において、前記「無修飾の生理活性物質」と比較して、１０〜１，０００，０００倍である、
化合物またはその塩。
【請求項１５】
請求項１０に記載の化合物またはその塩であって、
前記糖鎖付加リンカー部分における前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）と前記生理活性物質部分におけるカルボキシ基との間に形成されたエステル結合またはチオエステル結合が、ｐＨおよび／または温度に依存して切断される、
化合物またはその塩。
【請求項１６】
請求項１０に記載の化合物またはその塩を含む組成物であって、
前記化合物又はその塩における糖鎖は、実質的に均一である、
組成物。
【請求項１７】
医薬組成物であって、
（Ｉ）請求項１０に記載の化合物またはその塩、および
（ＩＩ）薬理学的に許容される担体
を含む、
医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の医薬組成物であって、
前記生理活性物質は、対象に投与後に、活性を発揮する、
医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の医薬組成物であって、
ワクチン接種に用いられる、
医薬組成物。
【請求項２０】
糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法であって、
ここで、糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記方法は、以下のステップ、
（ａ）前記糖鎖付加リンカーにおける脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）と、前記生理活性物質のカルボキシ基との間で、エステル結合またはチオエステル結合が形成されるように縮合反応を行うステップを含む、
製造方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の化合物またはその塩の製造方法であって、
前記縮合反応のステップは、前記糖鎖付加リンカーが固相合成用の樹脂に結合した状態で行われる（ただし、前記糖鎖付加リンカーが、糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドを有するときに限る）、
製造方法。
【請求項２２】
糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法であって、
ここで、前記生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記方法は、以下のステップ、
（ａ）樹脂に、下記式（Ｂ）で表わされるリンカーを結合するステップであって、
前記リンカーは、下記式（Ｂ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ｂ）
［式（Ｂ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、アミノ酸、もしくはポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、アミノ酸、またはポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記リンカーにおけるＲ２のアミノ酸またはポリペプチドのカルボキシ基と前記樹脂とを結合するステップと、
（ｂ）前記樹脂に結合した前記リンカーと前記生理活性物質とを結合するステップであって、前記リンカーは、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質のカルボキシ基とエステル結合またはチオエステル結合を形成し、前記生理活性物質と結合するステップと、
（ｃ）前記リンカーにおけるＲ２のアミノ酸またはポリペプチドの側鎖に、糖鎖を付加するステップと
を含む、製造方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の製造方法により得られうる、化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖付加リンカー、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とを含む化合物またはその塩、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質を用いた、様々なワクチンの開発が行われている。しかしながら、これらの生理活性物質の中には、水溶性が低いために、例えば、（十分な）フィルター滅菌を行うことができないものが存在している。また、水溶液または水溶液から調製するエマルションに、生理活性物質を溶解させて、人体などの生体に投与することが困難なものが存在している。【０００３】
生理活性物質などの薬物の水溶性を向上させるために、様々な方法が試みられている。例えば、水溶性の高い担体（キャリアー）を薬物に人工的に直接付加した、担体‐薬物のコンジュゲート（いわゆる、薬物誘導体）が知られている。担体としては、親水性アミノ酸配列またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが知られている。【０００４】
しかしながら、担体を薬物に直接結合させた薬物誘導体の場合、その立体構造は、元の薬物の立体構造と異なってしまう。その結果、薬物誘導体は、元の薬物分子と比較して、異なる薬物動態学的、免疫原性的、毒物学的または薬理学的特性を示す。特に、例えば、薬物誘導体をワクチンとして用いた場合、元の薬物分子と比較して、その薬物誘導体の抗原性は、通常、低下することがよく知られている。【０００５】
また、担体としてＰＥＧを付加した（ＰＥＧ化）薬物は、生分解抵抗性を有する。したがって、ＰＥＧ化薬物を生体内に投与し続けると、それが生体内に蓄積して、生体に薬害を与える危険性があり、生体適合性が十分に確立されているとは言い難い（特許文献１）。さらに、ＰＥＧは分子量分布（多分散系の性質（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｔｕｒｅ））を有する。薬物をＰＥＧ化すると、付加されるＰＥＧの結合位置または分子量が異なるため、多くの単量体アイソフォーム（ｍａｎｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ：構造は異なるが同じ機能をもつタンパク質）が生成する。生成したこれらのアイソフォームは、薬物の受容体分子への結合に関して、互いに競合する可能性がある（非特許文献１）。【０００６】
薬物と担体とを、リンカー部分を介して結合させた、担体リンカー−薬物のコンジュゲートも開発されている。これらは、標的場所（血中など）で作用する際に、担体リンカー部分と薬物との間の結合が切断されて、薬物自身が放出されるように設計することができる。このような担体リンカー−薬物のコンジュゲートを利用する場合、担体リンカー部分と薬物との間の結合の切断には、光や酵素的切断がトリガーとして使用されてきた。しかしながら、光を用いる場合、標的部位への光照射が難しく、生体へのダメージも懸念される。また、酵素的切断の場合、酵素量は、個体間のみならず投与部位で大きく異なることが知られている。したがって、患者間で薬物治療の効果のばらつきが生じることが問題となる。【０００７】
このような問題に対し、担体リンカー−薬物のコンジュゲートとして、担体リンカー部分がアミド基を介して生理活性物質部分に結合したものが報告されている（特許文献２）。特許文献２に開示される技術は、担体リンカー部分と薬物との間の結合の切断を制御できるように、担体リンカー部分における分子内触媒作用による自動加水分解（ａｕｔｏｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を利用するものである。担体リンカー部分と生理活性物質部分との間の結合の切断のメカニズムは、アミド結合の切断のための、環状イミド形成による環化−活性化に基づく。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００７‐５３０５６９号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０９５４７９号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂａｒｒｙ  Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  （２００７），  Ｖｏｌ．１２，  ３１９−３２６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような課題に鑑みて、本発明は、生理活性物質の水溶性を向上させることができ、また、特定の条件下で生理活性物質をより速く放出可能な担体リンカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特許文献２は、多数の、様々な構造を有する担体リンカー−薬物のコンジュゲートがアミド結合の切断により薬物自身を放出させることを確認したに過ぎない。担体としてＰＥＧを用いた多数の実施例があることから、特許文献１は、担体の生分解性について着目していない。さらに、担体として水に溶けにくい高級脂肪酸を用いた多数の実施例があることから、特許文献１は、担体リンカー−薬物のコンジュゲート、または担体リンカーそれ自身の溶解性についても言及していない。【００１２】
本発明者らは、鋭意検討の結果、生理活性物質の水溶性を向上させるとともに、光や酵素的切断に依らずに特定の条件下、生理活性物質を放出可能な担体リンカーを見出した。
すなわち、本発明は、その一態様において、少なくとも１つのカルボキシ基を有する生理活性物質との結合用の、糖鎖付加リンカーであって、
前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記糖鎖付加リンカーは、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質のカルボキシ基と結合することができることを特徴とする。【００１３】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施態様において、前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされる、糖鎖付加リンカー
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、または−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドである。］
であることを特徴とする。【００１４】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされる、糖鎖付加リンカー
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、または−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、または置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリールであり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドである。］
であることを特徴とする。【００１５】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」において、糖鎖は、アミノ酸またはポリペプチドにおける、ＡｓｎまたはＣｙｓに結合していることを特徴とする。【００１６】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖は、４個以上の糖残基からなることを特徴とする。【００１７】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記Ｒ２またはＲ６における「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖は、２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。【００１８】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される２本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。【００１９】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記Ｒ２またはＲ６の「糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチド」における糖鎖が、下記式：
【化１】
2014084110.tif 000002
［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、同一または異なって、
【化２】
2014084110.tif 000003
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖であることを特徴とする。【００２０】
また、本発明の糖鎖付加リンカーの一実施形態において、前記糖鎖付加リンカーは、前記「糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチド」において、糖鎖は、アミノ酸またはポリペプチドと、リンカーを介することなく結合していることを特徴とする。【００２１】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の糖鎖付加リンカーであることはいうまでもない。【００２２】
また、本発明の別の態様によれば、前記糖鎖付加リンカーに由来する糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩であって、
前記生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記糖鎖付加リンカー部分は、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質部分のカルボキシ基とエステル結合またはチオエステル結合を形成し、前記生理活性物質部分と結合している、
化合物またはその塩を提供する。【００２３】
また、本発明の化合物またはその塩の一実施形態において、前記化合物またはその塩は、前記生理活性物質は、低分子生理活性物質または生体高分子であることを特徴とする。【００２４】
また、本発明の化合物またはその塩の一実施形態において、前記化合物またはその塩は、前記生体高分子は、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸からなる群より選択されることを特徴とする。【００２５】
また、本発明の化合物またはその塩の一実施形態において、前記化合物またはその塩は、無修飾の生理活性物質と比較して、向上した水溶性を有することを特徴とする。【００２６】
また、本発明の化合物またはその塩の一実施形態において、前記化合物またはその塩は、前記向上した水溶性が、モル濃度において、前記「無修飾の生理活性物質」と比較して、１０〜１，０００，０００倍であることを特徴とする。【００２７】
また、本発明の化合物またはその塩の一実施形態において、前記化合物またはその塩は、前記糖鎖付加リンカー部分における前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）と前記生理活性物質部分におけるカルボキシ基との間に形成されたエステル結合またはチオエステル結合が、ｐＨおよび／または温度に依存して切断されることを特徴とする。【００２８】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩であることはいうまでもない。【００２９】
また、本発明の別の態様によれば、前記化合物またはその塩を含む組成物であって、前記化合物又はその塩における糖鎖は、実質的に均一である組成物を提供する。【００３０】
また、本発明の別の態様によれば、医薬組成物であって、
（Ｉ）請求項１０に記載の化合物またはその塩、および
（ＩＩ）薬理学的に許容される担体
を含む、医薬組成物を提供する。【００３１】
また、本発明の医薬組成物の一実施形態において、前記医薬組成物は、前記生理活性物質は、対象に投与後に、活性を発揮することを特徴とする。【００３２】
また、本発明の医薬組成物の一実施形態において、前記医薬組成物は、ワクチン接種に用いられることを特徴とする。【００３３】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の医薬組成物であることはいうまでもない。【００３４】
また、本発明の別の態様によれば、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法であって、
ここで、糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記方法は、以下のステップ、
（ａ）前記糖鎖付加リンカーにおける脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）と、前記生理活性物質のカルボキシ基との間で、エステル結合またはチオエステル結合が形成されるように縮合反応を行うステップを含む、
製造方法を提供する。【００３５】
また、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法の一実施形態において、前記製造方法は、前記縮合反応のステップが、前記糖鎖付加リンカーが固相合成用の樹脂に結合した状態で行われる（ただし、前記糖鎖付加リンカーが、糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドを有するときに限る）ことを特徴とする。【００３６】
また、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法の一実施形態において、前記製造方法は、ステップ（ａ）の前に、（ａ’）下記式（Ａ）で表わされる糖鎖付加リンカーを調製するステップ
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
［式（Ａ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
をさらに含むことを特徴とする。【００３７】
また、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法の一実施形態において、前記製造方法は、
前記ステップ（ａ’）および／または前記ステップ（ａ）が、樹脂上で行われることを特徴とする。【００３８】
また、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法の一実施形態において、前記製造方法は、
前記生理活性物質が、少なくとも１つのカルボキシ基を有しており、
前記方法は、以下のステップ、
（ａ）樹脂に、下記式（Ｂ）で表わされるリンカーを結合するステップであって、
前記リンカーは、下記式（Ｂ）で表わされ、
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ｂ）
［式（Ｂ）中、
Ｘは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
Ｙは、存在していても存在していなくてもよく、Ｙが存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、ＣがＲ１と結合し、ＮがＲ２と結合する）を意味し、
Ｒ２は、アミノ酸、もしくはポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、アミノ酸、またはポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである。］
前記リンカーにおけるＲ２のアミノ酸またはポリペプチドのカルボキシ基と前記樹脂とを結合するステップと、
（ｂ）前記樹脂に結合した前記リンカーと前記生理活性物質とを結合するステップであって、前記リンカーは、前記酸素原子（Ｏ）または硫黄原子（Ｓ）における脱離基が脱離することにより、前記生理活性物質のカルボキシ基とエステル結合またはチオエステル結合を形成し、前記生理活性物質と結合するステップと、
（ｃ）前記リンカーにおけるＲ２のアミノ酸またはポリペプチドの側鎖に、糖鎖を付加するステップと
を含む、製造方法であることを特徴とする。【００３９】
また、本発明の別の態様によれば、上述の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩の製造方法により得られうる、化合物またはその塩を提供する。【００４０】
以上述べた本発明の一又は複数の特徴を、任意に組み合わせたものも、本発明の化合物またはその塩の製造方法であることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００４１】
本発明に係る、糖鎖付加リンカーは、水酸基が多く極性が高い糖鎖構造部分を有するため、生理活性物質と結合することにより当該生理活性物質の水溶性を向上させることができる。
また、本発明に係る、糖鎖付加リンカーは、光や酵素的切断に依らずに、特定の条件下（例えば、生体内）において当該糖鎖付加リンカーと結合した生理活性物質を放出することができる。【００４２】
また、本発明に係る、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩は、水溶性である。【００４３】
さらに、本発明に係る、糖鎖付加リンカー部分における糖鎖は生分解性の性質を有するので有利である。【００４４】
また、本発明に係る、糖鎖付加リンカー部分における糖鎖は生理活性物質の抗原性を低下させるのに有利である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一実施態様であるチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の加水分解試験の結果を示すグラフである。このグラフは、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたものである。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、本発明の一実施態様であるチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２）の加水分解試験の結果を示すグラフである。このグラフは、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたものである。
【図３】図３は、チオエステル結合を有するチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）と、チオエステル結合を有するチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２）と、エステル結合を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物６）とを加水分解試験した際の結果を示すグラフである。このグラフは、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたものである。
【図４】図４は、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物８）を加水分解試験した際の結果を示すグラフである。このグラフは、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書において、「糖鎖付加リンカー」とは、少なくとも１のカルボキシ基を有する生理活性物質と結合することにより、当該生理活性物質の水溶性を向上させることができる糖鎖を担体として有するリンカーをいう。また、当該生理活性物質に結合した糖鎖付加リンカーは、特定の条件下、例えば生体内において、所望の速度で加水分解されることを特徴とする。この加水分解により糖鎖付加リンカーは当該生理活性物質から脱離し、当該生理活性物質を放出可能とする。放出された当該生理活性物質は、糖鎖付加リンカーが付加する前の状態へと戻る。
【００４７】
本発明の一実施の態様において、糖鎖付加リンカーは、下記式（Ａ）で表わされる。
Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２       （Ａ）
【００４８】
ここで、上記式（Ａ）におけるＸは、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味する。
本明細書において、「脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）」とは、式（Ａ）：Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２で表わされる糖鎖付加リンカーのＸの位置存在する原子であって、当該原子に結合する脱離基が脱離することにより生理活性物質と結合可能な原子をいう。当該原子と生理活性物質との結合は、生理活性物質中のカルボキシ基を介して行われる。
ここで、脱離基としては、生理活性物質のカルボキシ基と脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）とが結合する際に脱離するものであれば限定されず、例えば、水素原子や、一価の陽イオンとなるリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム、銀等である。
【００４９】
なお、本発明の糖鎖付加リンカーは、上記式（Ａ）におけるＸが脱離基を有する酸素原子（Ｏ）である場合には、生理活性物質とエステル結合を形成することにより結合する。また、上記式（Ａ）におけるＸが、脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）である場合には、生理活性物質とチオエステルを形成することにより結合する。
【００５０】
また、上記式（Ａ）におけるＲ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味する。ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルを意味する。また、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）を意味する。
【００５１】
本明細書において、「置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル」は、直鎖状または分岐鎖状のアルキルを含む。「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」の例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を挙げることができる。これらの「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」は、１つまたは複数の「置換基」で、それぞれ独立に置換されることができる。「置換基」の例としては、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、アミノ基 、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、ニトロ基、メシル基、トシル基、またはハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）等を挙げることができる。
【００５２】
本発明において、「置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール」としては、以下に限定されないが、例えば、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラニル、フェナントリル、アントリル、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、キシリル、エチルフェニルまたはベンジル等を挙げることができる。
また、「置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール」は、上記に限定されず、「Ｃ５〜Ｃ１６アリール」における１つまたは複数の水素原子は、それぞれ独立に「置換基」により置換されたものも含む。「置換基」の例としては、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、ニトロ基、メシル基、トシル基、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、Ｃ１〜Ｃ４ハロゲン化アルキル基（例えば塩化メチル基）、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、キシリル基、エチルフェニル基またはベンジル基等を挙げることができる。
【００５３】
また、本発明において、「置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール」としては、以下に限定されないが、環構造を形成する炭素原子が窒素原子や酸素原子で置換されたものを挙げることができ、より具体的には、インドール、キノリン、クロメン等を挙げることができる。
また、「置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール」は、上記に限定されず、「Ｃ５〜Ｃ１６ヘテロアリール」の環構造を形成する炭素原子に結合する１つまたは複数の水素原子が、それぞれ独立に「置換基」により置換されたものを含む。「置換基」の例としては、アルキル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、メシル基、ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ハロゲン化アルキル基（例えば塩化メチル基）等を挙げることができる。
【００５４】
また、本明細書において、「置換または非置換のＣ２〜Ｃ５のアルケニル」とは、直鎖状または分岐鎖状のアルケニルを含む。「置換または非置換のＣ２〜Ｃ５のアルケニル」の例としては、エテニル、ペロペニル、ブテニル等を挙げることができる。また、「置換または非置換のＣ２〜Ｃ５のアルケニル」は、上記に限定されず、「Ｃ２〜Ｃ５アルケニル」が、１つまたは複数の「置換基」で、それぞれ独立に置換されたものも含む。「置換基」の例としては、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、アミノ基 、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、ニトロ基、メシル基、トシル基、またはハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）等を挙げることができる。
【００５５】
また、本明細書において、「置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニル」とは、直鎖状または分岐鎖状のアルキニルを含む。「置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５のアルキニル」の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル等を挙げることができる。また、「置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニル」は、上記に限定されず、「Ｃ２〜Ｃ５アルキニル」が、１つまたは複数の「置換基」で、それぞれ独立に置換されたものも含む。「置換基」の例としては、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ等）、アミノ基 、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、ニトロ基、メシル基、トシル基、またはハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）等を挙げることができる。
【００５６】
また、上記式（Ａ）におけるＹは、式（Ａ）中に存在していても、存在していなくてもよい。Ｙが式（Ａ）中に存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、Ｃが式（Ａ）中のＲ１と結合し、Ｎが式（Ａ）中のＲ２と結合する）を意味する。
【００５７】
また、上記式（Ａ）におけるＲ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味する。ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドを意味する。また、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧを意味する。
【００５８】
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００５９】
また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシ基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシ基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
本発明において、好ましい糖鎖は、糖鎖付加リンカーとして生理活性物質に付加された場合に、当該生理活性物質の水溶性を向上させる糖鎖である。
また、本発明において、好ましい糖鎖は、糖鎖付加リンカーとして生理活性物質に付加された場合に、当該生理活性物質の抗原性を低減する糖鎖である。
このような、本発明の糖鎖付加リンカーにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
【００６１】
生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加リンカーが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
【００６２】
本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
【化３】
2014084110.tif 000004
［式中、Ｒ10およびＲ11は、同一または異なって、
【化４】
2014084110.tif 000005
を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
【００６３】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加リンカーにおける糖鎖は、複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
【化５】
2014084110.tif 000006
また、本発明において、複合型糖鎖には、２本鎖複合型糖鎖を含む。２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０〜３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
【化６】
2014084110.tif 000007
モノシアロ糖鎖、
【化７】
2014084110.tif 000008
【化８】
2014084110.tif 000009
アシアロ糖鎖、
【化９】
2014084110.tif 000010
ジグルクナック糖鎖、
【化１０】
2014084110.tif 000011
ジマンノース糖鎖、
【化１１】
2014084110.tif 000012
等が好ましい。２本鎖複合型糖鎖としては、ジシアロ糖鎖またはアシアロ糖鎖がより好ましく、最も好ましくは、ジシアロ糖鎖である。
【００６４】
また、本発明の複合型糖鎖には、上記の２本鎖複合型糖鎖（２分岐型複合型糖鎖）の他、３本鎖の複合型糖鎖（３分岐型複合型糖鎖）、４本鎖の複合型糖鎖（４分岐型複合糖鎖）も含む。例えば、３本鎖、４本鎖の複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされる、トリシアロ糖鎖
【化１２】
2014084110.tif 000013
【化１３】
2014084110.tif 000014
下記構造式で表わされるテトラシアロ糖鎖
【化１４】
2014084110.tif 000015
を挙げることができる。また、３本鎖複合型糖鎖および４本鎖複合型糖鎖としては、これらのトリシアロ糖鎖およびテトラシアロ糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖残基を失った糖鎖も挙げることができる。
さらに、本発明の複合型糖鎖には、フコースが付いたものも含む。フコースが付いた複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされるフコース含有複合型糖鎖
【化１５】
2014084110.tif 000016
【化１６】
2014084110.tif 000017
【化１７】
2014084110.tif 000018
【化１８】
2014084110.tif 000019
【化１９】
2014084110.tif 000020
を挙げることができる。また、これらのフコース含有複合型糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
また、本明細書中において「２本鎖複合型糖鎖」、「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」、「３本鎖複合型糖鎖」、「４本鎖複合型糖鎖」、「フコース含有複合型糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖またはモノシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
【００６５】
また、本発明の複合型糖鎖には、下記式で表わされるポリラクトサミン構造またはシアリルポリラクトサミン構造を有する糖鎖も含む。
【化２０】
2014084110.tif 000021
（式中、ｎは２〜３の整数である。）
【化２１】
2014084110.tif 000022
（式中、ｎは２〜３の整数である。）
【００６６】
また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５〜９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース−５（Ｍ−５）
【化２２】
2014084110.tif 000023
ハイマンノース−９（Ｍ−９）
【化２３】
2014084110.tif 000024
等を挙げることができる。
【００６７】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。具体的には、下記に列挙される糖鎖を挙げることができる。
【００６８】
【化２４】
2014084110.tif 000025
【００６９】
【化２５】
2014084110.tif 000026
【００７０】
【化２６】
2014084110.tif 000027
【００７１】
【化２７】
2014084110.tif 000028
【００７２】
また、本発明の一態様において、好ましい糖鎖は、直鎖構造を有する糖鎖である。かかる糖鎖としては、例えば、オリゴヒアルロン酸が挙げられる。本明細書において、オリゴヒアルロン酸とは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に２〜３２糖、好ましくは２〜１６糖、より好ましくは４〜８糖、直鎖上に結合した糖鎖をいう。
本発明に用いられるオリゴヒアルロン酸のうち、特に好ましいものとして、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とからなる単位を１単位とした場合、２単位（４糖）以上８単位（１６糖）以下の糖鎖が挙げられ、さらに好ましくは、２単位（４糖）〜４単位（８糖）、最も好ましくは２単位（４糖）である。
本発明に好ましく用いられるヒアルロン酸としては、例えば、
４糖のオリゴヒアルロン酸、
【化２８】
2014084110.tif 000029
８糖のオリゴヒアルロン酸
【化２９】
2014084110.tif 000030
等が挙げられる。
【００７３】
また、上記に具体的に挙げられる糖鎖は、それを構成する各糖残基のヒドロキシ基および／またはカルボキシ基が、保護基により保護されていてもよい。保護基としては、例えば、糖残基のヒドロキシ基および／またはカルボキシ基を化学反応より保護する目的で導入される当業者に公知の保護基である。より具体的には、以下に限定されないが、例えば、アルキル基（メチル基、エチル基等）、ベンジル基、アシル基（アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基等）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、、フェナシル基、アリル基等を挙げることができる。
【００７４】
本明細書において、「糖鎖付加アミノ酸」は、糖鎖が結合したアミノ酸である。なお、本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）があげられる。
【００７５】
本明細書における「糖鎖付加アミノ酸」は、糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、Ｄ−アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖タンパク質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒ及び糖鎖付加Ｔｈｒが好ましい。
【００７６】
また、糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介さずに結合していてもよく、あるいは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシ基を持つアミノ酸；リシン、アルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸；セリン、スレオニン、チロシン等の分子内にヒドロキシ基を持つアミノ酸；システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸；アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸が好ましい。特に、反応性の観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましく、システインまたはアスパラギンがさらに好ましい。
【００７７】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができる。例えば、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−ＣＨ２−
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）；
Ｃ１−１０ポリメチレン；
−ＣＨ２−Ｒ−；
（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である。）
−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−
（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）
等を挙げることができる。
【００７８】
本発明における糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介さずに結合している一態様として、例えば、アスパラギンの側鎖のアミノ基上の水素原子が、糖鎖の還元末端部分で置換されてもよい。この場合、糖鎖の還元末端に存在する脱離基は、限定されないが、例えば、塩素、臭素またはフッ素等であってよい。
【００７９】
本発明における糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している一態様として、例えば、システインの側鎖のチオール基上の水素原子が、リンカーを介して糖鎖の還元末端に結合しているものが挙げられる（例えば、リンカーが−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−の場合、糖鎖の還元末端は当該リンカー中の窒素原子に結合している）。この場合、糖鎖の還元末端に結合したリンカーの脱離基は、限定されないが、例えば、塩素、臭素またはフッ素等であってよい。
【００８０】
本明細書において、「糖鎖付加ポリペプチド」は、タンパク質（またはポリペプチドまたはペプチド）に少なくとも１つの糖鎖が付加された化合物であれば特に限定されない。糖鎖付加ポリペプチドは、本明細書において、「糖タンパク質」または「糖ペプチド」と互換的に用いてよい。糖鎖付加ポリペプチドは、前述の糖鎖付加アミノ酸を含むポリペプチドであってよい。糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖とアミノ酸との結合態様及びポリペプチドを構成するアミノ酸の種類等は、本発明における糖鎖付加アミノ酸と同様に規定されてよい。糖鎖に結合する、ポリペプチドにおけるアミノ酸（残基）は、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端に限定されず、適切な場合には、ポリペプチドを構成するアミノ酸（残基）のどれであってもよい。本発明における糖鎖付加ポリペプチドにおけるアミノ酸残基は好ましくは２〜１００アミノ酸残基、さらに好ましくは２〜１０アミノ酸残基であってよい。また、本発明における糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖とポリペプチドが結合する部分のアミノ酸以外のアミノ酸は、比較的自由に選択してよい。一態様として、糖鎖とポリペプチドが結合する部分のアミノ酸が、例えばアスパラギン、システイン、リシン、グルタミンである一方で、糖鎖とポリペプチドが結合する部分のアミノ酸以外のアミノ酸(例えば、（糖鎖付加）リンカー部分と結合するアミノ酸)は特に制限されないことを当業者は理解する。
【００８１】
本発明の化合物またはその塩を生体内に投与する観点からは、本発明における糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドを構成するアミノ酸は、生体内に存在するアミノ酸からなることが好ましい。
【００８２】
本発明の糖鎖付加リンカーは、一実施の形態において、チオアルキル型の糖鎖付加リンカーとすることができる。
本明細書において、チオアルキル型の糖鎖付加リンカーとは、生理活性物質とチオエステル結合を介して結合可能な糖鎖付加リンカーであって、その構造内にアルキルの構造を有する糖鎖付加リンカーをいう。
また、本明細書において、チオアルキル型の糖鎖付加リンカーには、生理活性物質とチオエステル結合を介して結合可能な糖鎖付加リンカーであって、その構造内にアルキニル、またはアルケニルの構造を有する糖鎖付加リンカーも含まれる。
より具体的には、チオアルキル型の糖鎖付加リンカーは、
上記式（Ａ）におけるＸが脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）であり、
上記式（Ａ）におけるＲ１が、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、もしくは、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルキニルであるか、または、Ｒ１は、−Ｒ３−Ｒ４−、−Ｒ４−Ｒ５−、もしくは−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、ここで、Ｒ３およびＲ５は、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ５アルケニル、または、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキニルであり、Ｒ４は、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、または硫黄原子（Ｓ）であり、
上記式（Ａ）におけるＹは、式（Ａ）中に存在していても、存在していなくてもよく、Ｙが式（Ａ）中に存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、Ｃが式（Ａ）中のＲ１と結合し、Ｎが式（Ａ）中のＲ２と結合する）であり、
上記式（Ａ）におけるＲ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである、
糖鎖付加リンカーである。
【００８３】
本発明の糖鎖付加リンカーは、一実施の形態において、チオアリール型の糖鎖付加リンカーとすることができる。
本明細書において、チオアリール型の糖鎖付加リンカーとは、生理活性物質とチオエステル結合を介して結合可能な糖鎖付加リンカーであって、その構造内にアリールの構造を有する糖鎖付加リンカーをいう。
より具体的には、チオアルキル型の糖鎖付加リンカーは、
上記式（Ａ）におけるＸが脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）であり、
上記式（Ａ）におけるＲ１が、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アリール、または置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリールであり、
上記式（Ａ）におけるＹは、式（Ａ）中に存在していても、存在していなくてもよく、Ｙが式（Ａ）中に存在する場合には、Ｙは、−ＣＯ−、または−ＣＯＮＨ−（ただし、Ｃが式（Ａ）中のＲ１と結合し、Ｎが式（Ａ）中のＲ２と結合する）であり、
上記式（Ａ）におけるＲ２は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、もしくは糖鎖付加ポリペプチドであるか、または、Ｒ２は、−Ｒ６−Ｒ７を意味し、ここで、Ｒ６は、糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、または糖鎖付加ポリペプチドであり、Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、−ＮＨ２、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ５アルキル、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６アリール、置換もしくは非置換のＣ５〜Ｃ１６ヘテロアリール、核酸、またはＰＥＧである、
糖鎖付加リンカーである。
【００８４】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩に含まれる糖鎖は、均一であることが好ましい。本明細書において、糖鎖が均一とは、糖鎖付加リンカー部分間において糖鎖を比較した場合に、糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が糖鎖付加リンカー部分間で同一であることをいう。また、糖鎖付加リンカー部分中に複数の同一の糖鎖を付加する意図で作製した場合には、糖鎖が均一とは、糖鎖付加リンカー部分内において付加された複数の糖鎖の構造を比較した場合に、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が同一であることもいう。具体的には、糖鎖付加リンカー部分間または糖鎖付加リンカー部分内において糖鎖を比較した場合に、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上で糖鎖の構造が均一であることを言う。
均一な糖鎖の割合や均一な糖鎖付加リンカーの割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
【００８５】
本発明に用いられる、アミノ酸配列及び／または糖鎖が実質的に均一な、糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドは、固相合成、液相合成、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等、当業者に公知のペプチド製造方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。そのような糖鎖付加ポリペプチドの製造方法に関しては、例えば、国際公開第２０１０／０２１１２６号パンフレット、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット等を参照してよい。
また、糖鎖付加工程で用いる糖鎖の製造方法に関しては、例えば、国際公開第０３／００８４３１号パンフレット、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット、国際公開第２００４／００８４３１号パンフレット、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレット等を参照してよい。
【００８６】
限定はされないが、一態様において、本発明に用いられる糖鎖付加ポリペプチドには、アミノ酸の結合していない糖鎖を、アミノ酸、またはポリペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合した糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドにおいて、付加した糖鎖に糖又は糖鎖をさらに付加することで、すでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加アミノ酸の、例えば、アミノ基及び／又はカルボキシ基に、１又は複数（例えば、２個〜３０個、好ましくは２個〜１０個）のアミノ酸を結合させ、さらにこれをアミノ酸又はポリペプチドと連結させた糖鎖付加ポリペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ポリペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合させた糖鎖付加ポリペプチド、なども含まれてよい。
【００８７】
また、本発明における糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドに、糖転移酵素によって種々の糖（例えば、フコース等）を転移することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドを効率的に得てもよい。例えば、糖転移酵素（フコース転移酵素）によってフコースを転移することにより、フコースを含む所望の糖鎖構造を有する糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、使用する糖転移酵素に依存して、結合様式の異なった所望の糖鎖構造を有する糖鎖付加アミノ酸または糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
【００８８】
フコースとしては、一般に市販されているフコースまたは化学合成したものを使用することができる。
【００８９】
フコース転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるフコースの種類により適宜選択することができる。具体的には、糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移させる酵素であるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、血漿由来、血清由来、乳汁由来、肝臓由来）等を挙げることができる。また、フコース加水分解酵素を用い、ｐＨ調整等によって平衡をずらすことにより、フコースを転移させてもよい。
【００９０】
本明細書において「核酸」とは、塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）、糖残基、およびリン酸からなるヌクレオチドがリン酸エステル結合により結合したＤＮＡまたはＲＮＡをいい、２〜２０００ヌクレオチド残基を有する。
また、本明細書において「ＰＥＧ」とは、エチレングリコールの重合体であり、例えば、「（‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｏ‐）ｎ」（ｎは、２〜１００００の整数）で表わすことができる。
【００９１】
本発明の一実施の態様において、好ましい糖鎖付加リンカーは、
式（Ａ）：Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２で表わされる糖鎖付加リンカーにおいて、
Ｘが、脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）を意味し、
Ｒ１が、ベンジル、またはトリル等で表わされるアリールであるか、またはＲ１が、−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−を意味し、Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ４が硫黄原子（Ｓ）であり、Ｒ５が−ＣＨ２−であり（すなわち、Ｒ１が、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−で表わされるチオエーテルであり）、
Ｙが、−ＣＯ−を意味し、
Ｒ２が、ＮＨ−糖鎖、糖鎖付加Ａｓｎ、糖鎖付加Ｃｙｓ、または糖鎖付加Ａｓｎもしくは糖鎖付加ＣｙｓのＣ末端にアミノ酸が１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ）付加したものを意味する、糖鎖付加リンカーである。
【００９２】
本発明の糖鎖付加リンカーは、固相合成、液相合成等により製造することができる。
例えば、固相合成により式（Ａ）：Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２で表わされる糖鎖付加リンカーを製造する場合には、樹脂上に、Ｒ２、Ｙ（存在する場合のみ）、Ｒ１、Ｘの順で、適当な化合物を樹脂上に結合させていく。このとき、Ｒ２、Ｙ、Ｒ１、Ｘは、各構成ごとに順に樹脂上に結合させてもよいし、連続する複数の構成に相当する化合物を樹脂上に結合させることもできる。連続する複数の構成に相当する化合物を樹脂上に結合させる例としては、例えば、まず、樹脂上に、脱離基を有するＲ２を結合させる。次に、Ｙの末端に脱離基を有するＸ−Ｒ１−Ｙの１つの化合物を、樹脂上のＲ２と縮合させることにより、Ｒ２およびＹの脱離基が脱離し、樹脂上に、式（Ａ）：Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２で表わされる糖鎖付加リンカーを作製することができる。なお、連続する複数の構成に相当する化合物は、Ｘ−Ｒ１−Ｙに限らず、Ｘ、Ｒ１、Ｙ、Ｒ２の４つの構成から２つ以上が選択されるその他の組み合わせも含む。
【００９３】
下記に、より具体的な固相合成法による製造例を示す。
すなわち、固相合成法による製造方法は、
樹脂上に、脱離基を有するＲ２の化合物（糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、糖鎖付加ポリペプチド等）を結合させる工程と、
樹脂上のＲ２に対して、少なくとも２つの脱離基を有するＹを結合させる工程であって、Ｒ２とＹとの脱離基が脱離することにより、Ｒ２とＹとが結合する工程と、
樹脂上のＹ−Ｒ２に対して、少なくとも２つの脱離基を有するＲ１の部分に相当する化合物を結合させる工程であって、ＹとＲ１との脱離基が脱離することにより、ＹとＲ１とが結合する工程と、
樹脂上のＲ１−Ｙ−Ｒ２に対して、少なくとも２つの脱離基を有するＸの部分に相当する化合物を結合させる工程であって、Ｒ１とＸとの脱離基が脱離することにより、Ｒ１とＸとが結合する工程と、
樹脂上に合成されたＸ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２を樹脂から切り離す工程と
を含む。
【００９４】
また、例えば、固相合成法による糖鎖付加リンカーの製造方法において、Ｘ−Ｒ１−Ｙの部分に相当する一つの化合物を利用し樹脂上へ結合させる製造例においては、
樹脂上に、脱離基を有するＲ２の化合物（糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、糖鎖付加ポリペプチド等）を結合させる工程と
樹脂上のＲ２に対して、Ｙの末端に脱離基を有するＸ−Ｒ１−Ｙの化合物を結合させる工程であって、Ｒ２とＹとの脱離基が脱離することにより、Ｒ２とＹとが縮合し樹脂上にＸ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２を形成させる工程と、
樹脂上に合成されたＸ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２を樹脂から切り離す工程と
を含む製造方法により、糖鎖付加リンカーを作製することができる。
なお、固相合成法における糖鎖付加リンカーの製造方法において、樹脂上に形成された糖鎖付加リンカーを樹脂より切断することなく、さらにアミノ酸を連結させることができる（より具体的には、Ｘで表わされる脱離基を有する酸素原子または脱離基を有する硫黄原子へさらにアミノ酸を連結させることができる）。これにより、樹脂より糖鎖付加リンカーを切り離す必要なく、樹脂上で生理活性物質部分と糖鎖付加リンカー部分とを含む化合物を製造することができる。
【００９５】
固相合成に用いられる樹脂としては、樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、塩素で官能化された２−クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｄｅレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｉｔｙｌ  ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（メルク社製）等も用いることができる。
また、固相合成により製造された糖鎖付加リンカー内に存在するアミノ酸またはペプチドのＣ末端をアミド化する場合には、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることができる。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、糖鎖付加リンカーにおけるアミノ酸またはペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
なお、２−クロロトリチルクロリド樹脂は、固相合成においてペプチド鎖を伸長する際、末端にあるＣｙｓのラセミ化を防止することができる点において、好ましい。
【００９６】
樹脂上に、Ｒ２の部分に相当する化合物（糖鎖、糖鎖付加アミノ酸、糖鎖付加ポリペプチド等）を結合させる工程において、樹脂上に糖鎖付加アミノ酸を結合させる場合には、脂溶性保護基でアミノ酸が保護された糖鎖付加アミノ酸を結合させる。また、樹脂上に糖ポリペプチドを結合させる場合には、所望のアミノ酸および糖鎖付加アミノ酸を順次、樹脂上へ結合させることで、樹脂上に糖鎖付加ポリペプチドを合成することができる。
【００９７】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
【００９８】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを挙げることができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ｄｉ−Ｚ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨを挙げることができる。
【００９９】
脂溶性保護基でアミノ酸が保護された糖鎖付加アミノ酸としては、Ｆｍｏｃ−糖鎖付加Ａｓｎ、Ｂｏｃ−糖鎖付加Ａｓｎ等を挙げることができる。
なお、これらの糖鎖付加アミノ酸は、上述した糖鎖であって、同一の糖鎖構造を有する糖鎖が付加されたアミノ酸を用いる。このような糖鎖としては、任意の公知の方法により得ることができる。具体的な手法としては、限定されることなく、例えば、糖鎖を化学合成すること（例えば、Ｊ．Ｓｅｉｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．  ２０００，  ３９，  ｐ５３１−５３４参照）や、天然または人工の糖鎖給源から分離したものや市販されているものを利用することができる。当該手法において、同一の構造を有する糖鎖付加アミノ酸としては、限定されることなく、例えば、天然または人工の糖鎖給源からの同一構造の糖鎖の分離は、例えば、ＷＯ２００４／０５８７８９に記載の方法により行うことができる。具体的には、鶏卵などの天然の糖鎖給源から、Ｓｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９７；１３３５（１−２）：２３−３２などに記載の方法で糖鎖アスパラギンを含む混合物（シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ））を単離し、該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基（例えば、Ｆｍｏｃ）を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得、これをクロマトグラフィーに供することにより、該混合物に含まれる種々の構造の糖鎖を、その構造に応じて分離することができる。また、種々の保護基を有するまたは有しない特定の構造の糖鎖アスパラギンは、例えば、株式会社糖鎖工学研究所より入手可能である。
【０１００】
樹脂とアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸を結合させる反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。樹脂とアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸との結合反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
その際、縮合剤として、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、３−ジエトキシホスホリルオキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−５−アザベンゾ−１，２，３−トリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−Ｃｈｌｏｒｏ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）等を用いることができる。アミノ酸または糖鎖付加アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【０１０１】
なお、非還元末端にシアル酸を有する糖鎖を使用する際には、樹脂から切断工程における酸処理により、シアル酸がはずれてしまうことがある。よって、酸を用いる切断工程の前にシアル酸を有する糖鎖をリンカー部分へ導入する際には、導入する糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、保護基により保護されている糖鎖を用いることが好ましい。シアル酸のカルボキシル基の保護基としては、ベンジル（Ｂｎ）基等を含むアリール基、エチル基（Ｅｔ）やメチル基（Ｍｅ）等を含むアルキル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基、アルコキシ基、又はニトロ基等により環構造を形成する炭素に結合する水素原子が置換されたフェナシル基等が挙げられる。より具体的には、例えば、シアル酸のカルボキシ基を、−ＣＯＯＢｎ、―ＣＯＯＥｔ、−ＣＯＯＭｅ、−ＣＯＯＣＨ（Ｐh）２、−ＣＯＯＣＨ２ＣＯＰｈ、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＯＭｅ）２、―ＣＯＯＣＨ２ＰｈＮＯ２、または、―ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ（ＮＯ２）２で表わされるように保護する保護基が好ましい。このように、シアル酸のカルボキシ基をベンジル基等で保護することにより、酸に不安定なシアル酸の脱離を防ぐことが可能である。
【０１０２】
糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基の保護反応は、当業者に周知の方法により行うことができる。例えばベンジル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基により保護されたシアル酸のカルボキシ基の保護基の脱保護も、当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、脱保護の反応は、以下に限定されないが、塩基性条件下で加水分解することによって行うことができる。脱保護の反応は、通常０〜５０℃、好ましくは、０〜４０℃、更に好ましくは０〜３０℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜５時間程度である。反応終了後は、リン酸や酢酸などの弱酸によって中和した後、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
【０１０３】
また、Ｒ２が、核酸、ＰＥＧである場合にも、当業者は周知の方法により、適宜、樹脂へ相当する化合物を結合させることができる。
【０１０４】
また、Ｒ２が糖鎖である場合には、糖鎖が付加されていないリンカーの構造を樹脂上に合成し、樹脂から切断・単離後のリンカー末端に糖鎖を付加することにより製造することができる。糖鎖を付加する予定のリンカーの末端には、例えば、チオール基を有するように設計する。これにより、樹脂より単離後のリンカーの末端に存在するチオール基とハロアセチル化複合型糖鎖誘導体（またはハロアセトアミド化複合型糖鎖誘導体）とを結合させ、リンカー末端に糖鎖を導入することができる。
【０１０５】
また、Ｒ２が核酸やＰＥＧである場合にも、核酸またはＰＥＧが付加されていないリンカーの構造を樹脂上に合成し、樹脂から切断・単離後のリンカー末端に核酸またはＰＥＧを付加することにより製造することができる。核酸またはＰＥＧを付加する予定のリンカーの末端には、例えば、チオール基を有するように設計する。これにより、樹脂より単離後のリンカーの末端に存在するチオール基と、ハロアセチル化体（またはハロアセトアミド化体）等にした核酸またはＰＥＧとを結合させ、核酸またはＰＥＧを導入することができる。
【０１０６】
また、Ｒ２が糖鎖付加アミノ酸や糖鎖付加ポリペプチドであっても、糖鎖が付加されていないリンカーの構造のみを先に樹脂上に合成後、後からＲ２の箇所へ糖鎖を結合させることもできる。糖鎖をＲ２へ結合させる反応は、固相合成と連続して樹脂上で行ってもよいし、または樹脂から切り離した後で行ってもよい。固相合成と連続して樹脂上で糖鎖を結合させる場合には、生理活性物質部分まで合成した後に糖鎖付加工程を行ってもよいし、生理活性物質部分の合成前に糖鎖付加工程を行っても良い。
【０１０７】
リンカーまたはリンカー部分と生理活性物質部分とを有する化合物を合成した後に糖鎖を付加する際には、上述の通り、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体（またはハロアセトアミド化複合型糖鎖誘導体）を当該リンカー（無保護のＣｙｓを含む）または当該リンカー部分と生理活性物質部分とを有する化合物（無保護のＣｙｓを含む）と反応させることにより、糖鎖を無保護のＣｙｓのチオール基と反応させ、ペプチドに結合させることができる。上記反応は、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、またはこれらの混合溶液中において、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、通常１０分〜２４時間、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
【０１０８】
ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体（またはハロアセトアミド化複合型糖鎖誘導体）は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の還元末端の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。
【０１０９】
より具体的なハロアセチル化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとの反応例としては、リン酸緩衝液中、室温で反応させることができる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒と、上記の緩衝液との混合溶液中で反応を行うこともできる。このとき、有機溶媒の比率は、０〜９９％（ｖ／ｖ）の範囲で、上記緩衝液に添加することができる。緩衝液への溶解性が低い無保護のＣｙｓを含むペプチドは、このような有機溶媒を添加することにより反応溶液への溶解性を向上させることができ、好ましい。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒や、それらの混合溶液中で反応を行うこともできる。その際、塩基の存在下で行うのが好ましい。塩基としては、例えばＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等を挙げることができる。
また、グアニジン塩酸塩や尿素を緩衝溶液に加えた混合溶液中においても反応を行うことができる。なお、グアニジン塩酸塩や尿素は、最終濃度が１Ｍ〜８Ｍとなるように上記緩衝液に加えることができる。グアニジン塩酸塩や尿素の添加によっても、緩衝液への溶解性の低いペプチドの溶解性を向上させることができ、好ましい。
また、ハロアセチル化体（またはハロアセトアミド化体）等にした核酸またはＰＥＧとＣｙｓ含有ペプチドとの反応についても、当業者は公知の方法により適宜実施することができる。
【０１１０】
樹脂上のＲ２に対して、Ｙの部分に相当する化合物を結合させる工程、樹脂上のＹ−Ｒ２に対して、Ｒ１の部分に相当する化合物を結合させる工程、樹脂上のＲ１−Ｙ−Ｒ２に対して、Ｘの部分に相当する化合物を結合させる工程においては、当業者は、適宜、各構成に相当する化合物を設計・選択し、樹脂上のＲ２に縮合させることができる。
また、当業者は、連続する複数の構成に相当する化合物を樹脂上へ結合する場合も、適宜、化合物および反応条件を設計・選択することができる。
なお、糖鎖付加リンカーのＸに相当する部分（脱離基を有する酸素原子または脱離基を有する硫黄原子）は合成上保護基を必要とする場合がある。酸素原子の保護基としては、トリチル基、メトキシトリチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基等を挙げることができ、硫黄原子の保護基としては、トリチル基、メトキシトリチル基、ｔ−ブチル基、ｔ−ブチルチオ基、Ａｃｍ基等を挙げる事ができる。保護基の導入は、従来周知の方法により行うことができる。
【０１１１】
樹脂上に合成された糖鎖付加リンカー（式（Ａ）：Ｘ−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２）を樹脂から切り離す工程は、酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とトリイソプロピルシランとエタンジチオールと水との混合溶液（９０：５：２．５：２．５）、酢酸とトリフルオロエタノールとの混合溶液(５０：５０)、ＨＣｌ等を挙げることができる。
また、樹脂上に、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とが結合した化合物を合成した際にも、樹脂から当該化合物を切り離す工程は、酸で処理するのが好ましい。用いる酸や反応条件は、糖鎖付加リンカーを樹脂から切り離す条件と同様に行うことができる。
【０１１２】
このように製造された糖鎖付加リンカーは、脱離基を有する酸素原子または脱離基を有する硫黄原子において、生理活性物質と結合する。このように、糖鎖付加リンカーは、生理活性物質と結合することにより、当該生理活性物質の水溶性を高めることができる。また、糖鎖付加リンカーは、好ましくは、当該生理活性物質の抗原性を低下させることができる。
また、生理活性物質と結合した糖鎖付加リンカーは、その構造に依存して、特定の温度およびｐＨの条件下、当該生理活性物質を一定の時間内に遊離させることができる。なお、この遊離した生理活性物質は、本来の機能を有しており、例えば、生体内で糖鎖付加リンカーから遊離した生理活性物質は、本来の機能を発揮する。
また、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分との結合が、エステル結合よりもチオエステル結合である方が、加水分解速度を速くすることが可能である。また、チオエステル結合のうち、チオアルキル構造を有する糖鎖付加リンカーよりもチオアリール構造を有する糖鎖付加リンカーの方がより速く加水分解される。
当業者は、糖鎖付加リンカー部分の構造を適宜変更することで所望の生理活性物質放出時間を有する糖鎖付加リンカーを設計することができる。
【０１１３】
本発明において、生理活性物質は、その構造の一部が変化することにより（修飾されることにより）、糖鎖付加リンカー部分と結合できる。しかしながら、ひとたび糖鎖付加リンカー部分が切断されると、生理活性物質が遊離する。当該遊離した生理活性物質の構造は、糖鎖付加リンカー部分に結合する前（修飾される前）の化合物構造と同じであることが好ましい。本明細書では、糖鎖付加リンカーに結合していない生理活性物質を「無修飾の生理活性物質」と称する。無修飾の生理活性物質は、生理活性物質そのものが本来有する薬物動態学的、免疫原性的、毒物学的または薬理学的特性を有することが好ましいが、その特性が改変、修飾等されていてもよい。本発明の「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」は、所定の条件下で、糖鎖付加リンカー部分が切断されることにより、無修飾の生理活性物質を放出することが好ましい。
【０１１４】
本発明の糖鎖付加リンカーは、結合するパートナーとなる生理活性物質が有する薬物動態学的、免疫原性的、毒物学的または薬理学的特性等に悪影響を与えないことが好ましい。
【０１１５】
本明細書において、「生理活性物質」は、限定はされないが、生体の生理活動に直接的または間接的に、何らかの作用・影響をもたらす物質を意味する。生理活性物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を意図してよい。当該生理活性物質は、それ自身が生体内で機能を発揮しないものであってもよい。当該生理活性物質は、ある態様において、薬物と同義に用いられてよい。当該生理活性物質には、ワクチンまたは医薬品として有用なもののみならず、生体の生理活動に直接的に作用・影響をもたらさない物質、例えば診断薬が含まれてよい。また、当該生理活性物質には、天然由来のもののみならず、その一部を欠失、修飾または置換させたもの（誘導体ともいう）も含まれてよい。さらに、人工的に合成した物質（例えば、組み換えＤＮＡテクノロジー等の生物学的アプローチ、またはペプチド固相合成法等の化学的合成アプローチにより製造した物質）、または天然由来の物質の一部と人工的に合成した物質の一部を融合したものも含まれてよい。したがって、本発明における生理活性物質には、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等のレポータータンパク質またはフルオレセイン等の蛍光色素が融合した物質も含まれる。
【０１１６】
本発明における生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有する。本発明における生理活性物質は、生理活性物質が有する少なくとも１つのカルボキシ基において、糖鎖付加リンカーと結合する。また、本発明における生理活性物質は、少なくとも１つのカルボキシ基を有する、低分子生理活性物質または生体高分子であることが好ましい。
【０１１７】
本明細書において、「生体高分子」は、生理活性物質のうち、高分子の有機化合物であることを意味してよい。一方、「低分子生理活性物質」は、生理活性物質のうち、低分子の有機化合物であることを意味してよい。生体高分子は、例えば、タンパク質、核酸または多糖類等の高分子化合物またはその一部であってもよいが、人工的に合成したものでもよい。また、低分子生理活性物質は、例えば、生体内で、生体高分子と相互作用できるものであってよく、人工的に合成したものでもよい。しかしながら、本明細書では、生体高分子と低分子生理活性物質は、場合により、同じものを指してもよい。
【０１１８】
本発明における生体高分子は、一態様において、少なくとも１つのカルボキシ基を有する、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸であるか、あるいは、その構造の一部に、前記「タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはペプチド核酸」を含むのが好ましい。本明細書において、タンパク質またはポリペプチドに由来する部分を「ペプチド部分」ともいう。
【０１１９】
本明細書において、「タンパク質」は、複数のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されず、既知タンパク質、新規タンパク質、またはそれらの改変体を含む。本明細書において、「改変体」とは、タンパク質を天然又は人工的に部分的に改変した化合物である。そのような改変として、例えば、タンパク質の１つ又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化（例えば、タンパク質のＣ末端のアミド化）、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ヒドロキシ化、脱水縮合または標識成分の結合等が挙げられる。あるいは、当該改変体は、既知タンパク質または新規タンパク質の構造の一部を欠失、置換または融合させたもの等が挙げられる。生理活性物質としての生体高分子がタンパク質である場合、タンパク質は、限定はされないが、例えば、固相合成、液相合成、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等、当業者に公知の方法を用いて合成してよい。
【０１２０】
本明細書において、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、原則として、タンパク質と同義で用いられる。ただし、ポリペプチド及びペプチドは、タンパク質の構造の一部である場合や、高次構造をとらない比較的短いアミノ酸鎖を指すために用いられてもよい（タンパク質の断片）。本発明におけるポリペプチドまたはペプチドには、例えば、アミノ酸が２個結合したジペプチド、アミノ酸が３個結合したトリペプチド、アミノ酸が４個結合したテトラペプチド、アミノ酸が通常１０個以下の数で結合したオリゴペプチドも含まれてよい。
【０１２１】
本明細書における「ポリヌクレオチド」には、限定はされないが、２〜２０００ヌクレオチド残基を有する、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ；１本鎖または２本鎖のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）アプタマー；または、それらが化学的に修飾された化合物が含まれる。そのような修飾には、限定はされないが、当該ポリヌクレオチドの全体または一部に対して、電荷、分極性（ｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）、水素結合、静電相互作用、または流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）をさらに与える、他の化学基による修飾が挙げられる。ポリヌクレオチドは、２０塩基対またはそれ未満のサイズを有するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１２２】
本明細書において、「ペプチド核酸」は、限定はされないが、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の糖リン酸骨格を、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に変換した修飾核酸を意味する。当該ペプチド核酸は、当業者に公知の方法でさらに修飾されてよい。
【０１２３】
本発明における生体高分子には、以下に限定はされないが、一態様において、例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、オキシトシン、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼ、α１アンチトリプシン、α１プロテアーゼインヒビター、アルテプラーゼ、アミリン、シムリン、アニストレプラーゼ、アンクロッドセリンプロテアーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチトリプシン、アプロチニン、アスパラギナーゼ、アトシバン、ビファリン（Ｂｉｐｈａｌｉｎ）、ビバリルジン、骨形成タンパク質、膵臓トリプシンインヒビター、カドヘリン断片、カルシトニン（例えばサケ由来）、コラゲナーゼ、補体Ｃ１エステラーゼインヒビター、コノトキシン、サイトカイン受容体断片、ＤＮアーゼ、ダイノルフィンＡ、エンドルフィン、エンフビルチド、エンケファリン、エリスロポエチン、エキセンディン（エキセンディン−３またはエキセンディン−４等）、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、フィブリノリジン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン放出ペプチド２（ＧＨＲＰ−２）、卵胞刺激ホルモン、グラミシジン、グレリン、デスアシル型グレリン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ガラクトシダーゼ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（エクセナチド、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２など）、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、絨毛性性腺刺激ホルモン、ヘモグロビン、ヒルジン、ヒトセリンプロテアーゼインヒビター、ヒアルロニダーゼ、イズロニダーゼ、免疫グロブリン（ＩｇＧ  Ｆｃ領域等）、インターロイキン（１α、１β、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８または２１等）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インスリン、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、インターフェロン（α（α２ａ、α２ｂ、α２ｃ等）、β（β１ａ、β１ｂ）、γ（γ１ａ、γ１ｂ）、λ、ω、ε、κ等）、細胞内接着分子、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、トランスフォーミン増殖因子、ラクターゼ、レプチン、ロイプロリド、黄体形成ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、ＢＮＰまたはＣＮＰまたはそれらの断片）、ニューロペプチドＹ、パンクレリパーゼ、膵臓ポリペプチド、パパイン、副甲状腺ホルモン（パラトルモン等）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ペプシン、ペプチドＹＹ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロラクチン、プロテインＡ、プロテインＣ、チモシンα１、オクトレオチド、セクレチン、セルモレリン、可溶性腫瘍壊死因子受容体、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ソマトロピン（成長ホルモン）、ソマトプリム、ソマトスタチン、ストレプトキナーゼ、スクラーゼ、テルリプレシン、破傷風毒素Ｃフラグメント、チラクターゼ、トロンビン、チモシン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、甲状腺ホル��ン（カルシトニン等）、ウロジラチン、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ハプテン、抗原等を用いたワクチン（癌ワクチン、ＨＩＶ抗原、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢｓ抗原等）、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン等）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケメリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ））、ＨＥＲ２タンパク質（ヒト上皮増殖因子受容体）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管作動性腸管ペプチド、バソプレッシン、ジコノチド、レクチン、コリンエステラーゼ、アミラーゼ、またはペプシン、またはそれらの改変体もしくはそれらの断片が含まれる。
【０１２４】
本発明における低分子生理活性物質には、一実施態様において、例えば、少なくとも１つのカルボキシ基を有する、中枢神経系活性剤、抗感染剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、抗肥満剤、抗凝血剤、抗糖尿病剤、抗がん剤、抗新生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、避妊薬、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、血管収縮剤または心血管作動薬が挙げられる。
【０１２５】
本発明における低分子生理活性物質には、以下に限定はされないが、一態様として、例えば、アカルボース、アラプロクラート、アレンドロナート、アマンタジン、アミカシン、アミネプチン、アミノグルテチミド、アミスルプリド、アムロジピン、アモトサレン、アモキサピン、アモキシシリン、アンフェタミン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アンプレナビル、アムリノン、アニレリジン、アプラクロニジン、アプラマイシン、アルチカイン、アテノロール、アトモキセチン、アビザホン、バクロフェン、ベナゼプリル、ベンセラジド、ベンゾカイン、ベタキソロール、ブレオマイシン、ブロムフェナク、ブロファロミン、カルベジロール、カシン、カチノン、カルブタミド、セファレキシン、クリナフロキサシン、シプロフロキサシン、デフェロキサミン、デラビルジン、デシプラミン、ダウノルビシン、デクスメチルフェニデート、デクスメチルフェニデート、ジアフェニルスルホン、ジゾシルピン、ドーパミン、ドブタミン、ドルゾラミド、ドキソルビシン、デュロキセチン、エフロールニチン、エナラプリル、エピネフリン、エピルビシン、エルゴリン、エルタペネム、エスモロール、エノキサシン、エタンブトール、フェンフルラミン、フェノルドパム、フェノテロール、フィンゴリモド、フレカイニド、フルボキサミン、ホスアンプレナビル、フロバトリプタン、フロセミド、フルオエキセチン、ガバペンチン、ガチフロキサシン、ゲミフロカシン、ゲンタマイシン、グレパフロキサシン、ヘキシルカイン、ヒドララジン、ヒドロクロロチアジド、イコフンギペン、イダルビシン、イミキモド、イソプロテレノール、イスラジピン、カナマイシンＡ、ケタミン、ラベタロール、ラミブジン、レボブノロール、レボドパ、レボチロキシン、リシノプリル、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マプロチリン、メフロキン、メルファラン、メマンチン、メロペネム、メサラジン、メスカリン、メチルドパ、メチレンジオキシメタンフェタミン、メトプロロール、ミルナシプラン、ミトキサントロン、モキシフロキサシン、ノルエピネフリン、ノルフロキサシン、ノルトリプチリン、ネオマイシンＢ、ニスタチン、オセルタミビル、パミドロン酸、パロキセチン、パズフロキサシン、ペメトレキセド、ペリンドプリル、フェンメトラジン、フェネルジン、プレガバリン、プロカイン、プソイドエフェドリン、プロトリプチリン、レボキセチン、リトドリン、サバルビシン、サルブタモール、セロトニン、セルトラリン、シタグリプチン、ソタロール、スペクチノマイシン、スルファジアジン、スルファメラジン、セルトラリン、スプレクチノマイシン、スルファレン、スルファメトキサゾール、タクリン、タムスロシン、テルブタリン、チモロール、チロフィバン、トブラマイシン、トカイニド、トスフロキサシン、トランドラプリル、トラネキサム酸、トラニルシプロミン、トリメトレキサート、トロバフロキサシン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、バンコマイシン、バイオマイシン、ビロキサジン、ザルシタビン、ペニシリン、セファロスポリン、ストレプトマイシン、デストマイシン、カスガマイシン、タイロシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、スピラマイシン、リンコマイシン、コリスチン、バシトラシン、サリノマイシン、モネンシン、ラサロシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、バージニアマイシン、スルファジメトキシン、オキソリン酸、ピロミド酸、ジフラゾン、ゼアラレノン、デオキシニバレノール、パツリン、フモニシン、オクラトキシン、テトロドトキシン、オカダ酸、サキシトシンまたはゴニオトキシン等が含まれる。
【０１２６】
本発明の糖鎖付加リンカーと生理活性物質とが結合した化合物の製造は、上記方法により合成・単離した糖鎖付加リンカーを、生理活性物質へ結合させることで行うことができる。
糖鎖付加リンカーと生理活性物質との結合は、糖鎖付加リンカーの脱離基を有する酸素原子（Ｏ）または脱離基を有する硫黄原子（Ｓ）と生理活性物質の少なくとも１つのカルボキシ基とが縮合反応し、エステル結合またはチオエステル結合を介して結合する。
この縮合反応の条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、縮合反応の縮合剤には、ＰｙＢＯＰ、ＤＭＡＰ、ＨＣＴＵ等を使用することができる。また、縮合反応の溶媒として、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジクロロメタン等を使用することができる。縮合反応の反応は、例えば、アミノ酸側鎖が保護されたペプチドとチオール基を有する糖鎖付加リンカーをＤＭＦに溶解させ、ＰｙＢＯＰおよびＤＩＰＥＡを添加することで行うことができる。このとき、生理活性物質がペプチドである場合、ペプチドのＣ末端アミノ酸の異性化を抑制できることから、低温（−１５℃〜−３０℃）で反応を行うことが好ましい。
また、生理活性物質がペプチドである場合には、当該ペプチドの側鎖は保護基により保護されていることが好ましい。ペプチドの側鎖を保護している保護基は、糖鎖付加リンカーと当該ペプチドとの結合後に脱保護することができる。ペプチドの側鎖を保護する保護基は、当業者に周知の保護基を使用することができ、例えば、上述した固相合成に用いるアミノ酸の保護基を使用することができる。また、ペプチドへの保護基の導入や脱保護も、当業者は適宜実施することができる。
【０１２７】
また、生理活性物質が、ポリペプチド等である場合には、固相合成中の樹脂上に結合している糖鎖付加リンカーへ、生理活性物質を構成するアミノ酸等を順次、直接結合させることにより、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物を製造することができる。樹脂上で固相合成法により生理活性物質部分を合成する反応条件は、当業者が適宜設定することができる。
【０１２８】
一実施態様において、本発明は、上述のいずれかの製造方法により得られうる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）、化合物またはその塩を提供することが好ましい。得られうる化合物またはその塩とは、上述のいずれかの製造方法によって製造されるものには限定されず、他の製造方法によって製造されるものも対象となる。
【０１２９】
別の実施態様において、本発明は、上述のいずれかの製造方法により得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）、化合物またはその塩を提供することが好ましい。
【０１３０】
好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加リンカーを利用することで、生理活性物質が難溶性であるか否かに関わらず、「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」として、生理活性物質を水溶液、または、水溶液から調製したエマルション中に容易に溶解することができる。当該溶解後、当該糖鎖付加リンカー部分が切断されることにより、無修飾の生理活性物質が放出可能である。
【０１３１】
本発明における糖鎖付加リンカー部分は、「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」から、加水分解反応により切断される。また、好ましい一態様において、当該糖鎖付加リンカー部分は、その分子内触媒作用によって、当該「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」から自己加水分解により切断可能である。しかしながら、当該切断は、例えば、生体内に存在する酵素による切断（例えば、エステル結合を切断する酵素であるエステラーゼが挙げられる。）等の生物学的切断を排除することを意図していない。
【０１３２】
好ましい一実施態様において、本発明の化合物またはその塩は、水溶液またはエマルション中に溶解後、ｐＨおよび／または温度に依存して、糖鎖付加リンカー部分の切断が速くなる特徴を有している（ｐＨおよび／または温度依存的切断）。本発明の化合物またはその塩及び糖鎖付加リンカーは、例えば、低温（例えば−８０℃〜４℃）、低ｐＨ（例えばｐＨ１〜ｐＨ４）で保存してもよい。また、糖鎖付加リンカー部分に生理活性物質を結合させて「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」を調製する工程は、例えば、低温（例えば０℃〜２５℃）、低ｐＨ（例えばｐＨ１〜ｐＨ７）で行ってよい。糖鎖付加アミノ酸のＮ末端のアミノ基をＣ１〜Ｃ１６アシル基、Ｆｍｏｃ基またはＡｌｌｏｃ基等で保護することにより、「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」及び糖鎖付加リンカーを安定化させてもよい。
【０１３３】
好ましくは、本発明の化合物またはその塩は、生理的条件に近い温度およびｐＨ（例えば、哺乳動物の生体内の生理的環境またはそれに近い環境、例えば３５℃〜４３℃、ｐＨ６．８〜７．８等）で使用してよい。
【０１３４】
好ましい一実施態様において、本発明の化合物またはその塩を用いることにより、生理活性物質を、水溶液、または水溶液から調製するエマルションに効率的に溶解させることができる。したがって、好ましい一態様において、本発明の化合物またはその塩を用いることにより、水溶性の低い（難溶性の）生理活性物質でさえも、フィルター滅菌を行うことができる。さらに、好ましい別の態様において、本発明の化合物またはその塩を用いることにより、水溶性の低い生理活性物質でさえも、生体に投与することが可能である。
【０１３５】
好ましい別の実施態様において、本発明の化合物またはその塩を用いることにより、水溶性の高い生理活性物質でさえも、いっそう高効率で水溶液、または水溶液から調製するエマルションに溶解できる。したがって、本発明は、有利には、高価な生理活性物質を含む製剤調製または製剤投与過程における、物質の不溶性等から生じ得る「損失」を低下させる。
【０１３６】
また、好ましい他の一実施態様において、溶媒中の半減期があらかじめわかっている本発明の糖鎖付加リンカーを適宜選択することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境またはｉｎ  ｖｉｖｏ環境中に放出される無修飾の生理活性物質の放出時間、タイミングを制御することが可能となる。例えば、生体内に投与後に、所望の部位で、迅速に効果を発揮させたい生理活性物質の送達にも有利である。
【０１３７】
特に好ましい一実施態様において、本発明の「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」は、無修飾の生理活性物質と比較して、向上した水溶性を提供できる。前記向上した水溶性は、モル濃度で、２倍〜１，０００，０００倍であることが好ましく、１０倍〜１，０００，０００倍であることがより好ましく、１００倍〜１，０００，０００倍であることがさらに好ましく、５００倍〜１，０００，０００倍またはそれ以上であることがいっそうさらに好ましい。当業者は、生理活性物質の用途と目的に応じて、必要な水溶性を有する「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」または糖鎖付加リンカーを適宜選択することができる。
【０１３８】
本発明の「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」または無修飾の生理活性物質の溶解度を決定するために必要なモル吸光係数（比吸光度）は、当業者に公知の方法、例えば、アミノ酸組成分析又は窒素定量法等の方法により測定した既知のタンパク質濃度の溶液を試料として、紫外可視分光光度法（例えば、２８０ｎｍ等の紫外可視領域での波長）により決定してよい。
【０１３９】
また、本発明の一実施の形態として、糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩を含む組成物を提供する。
本発明の「組成物」は、１種以上の本発明の化合物またはその塩に加えて、任意の１種以上の他の成分（活性成分または不活性成分）を含む。本発明の組成物の使用は、特に限定されないが、例えば、アッセイ系（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系等）に用いてよい。
【０１４０】
上記のように、本発明の一実施の態様において、糖鎖付加リンカー部分の糖鎖の構造を均一とすることができる。この場合に、当該糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを有する化合物またはその塩を含む組成物に含まれる糖鎖付加リンカー部分は、糖鎖構造に限らず、糖鎖付加リンカー部分全体の構造も均一であることが好ましい。糖鎖付加リンカー部分の構造が均一であるとは、当該組成物中に含まれる糖鎖付加リンカー部分同士において、糖鎖およびリンカー部分を比較した場合に、糖鎖付加リンカー部分中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、糖鎖の結合順序、糖間の結合様式、リンカー部分を構成する構造が同一であることをいう。具体的には、組成物中に含まれる糖鎖付加リンカー部分間において、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上で糖鎖の構造およびリンカー部分が均一であることを言う。
特に、糖鎖が均一である糖鎖付加リンカー部分を含む組成物等は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合や均一な糖鎖付加リンカーの割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
【０１４１】
また、本発明の「医薬組成物」は、医薬用途に適した組成物であり、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤または賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤化したものである。このような医薬組成物としては、例えば、限定はされないが、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。医薬組成物が対象とする医薬用途は、生理活性物質部分として組成物中に含有される生理活性物質が関与する疾患、疾病を対象とするものであってよい。例えば、生理活性物質がＧＬＰ‐１またはその誘導体である場合、対象とする医薬用途は、糖尿病等であってよい。他の医薬用途についても、各生理活性物質が関与する疾患、疾病の種類を併せて考慮することで、当業者は同様に理解できる。
【０１４２】
本明細書において、「薬理学的に許容される担体」とは、特に制限されない。薬理学的に許容される担体を配合することにより、本発明の「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」の吸収性や血中濃度に影響を及ぼし、体内動態の変化をもたらしてよい。
【０１４３】
特に好ましくは、生理活性物質として抗原を用いた場合、本発明の化合物またはその塩及びそれを含む本発明の医薬組成物は、ワクチンとしても利用可能である。好ましい一態様において、例えば難溶性の抗原であっても、本発明の化合物またはその塩として水溶液またはエマルション中に溶解させることが可能であり、また、生体内で、糖鎖付加リンカー部分の切断後に、無修飾の抗原を放出させることが可能である。好ましくは、本発明の化合物またはその塩及び糖鎖付加リンカーは、ペプチドワクチン等の様々なワクチンの開発に利用できる。
【０１４４】
本明細書において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）は、動物に接種した際に、免疫応答を生じ得る物質を意味する。ワクチンは抗原を含んでいるか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。本発明の医薬組成物は、ワクチンとして用いた場合、ウイルス感染、細菌感染（敗血症等）、伝染病の予防または治療のみならず、免疫応答に関連し得る任意の疾患、例えば癌、自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ等）の治療等にも用いることが可能である。
【０１４５】
「抗原」とは、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子であり、宿主の免疫系を刺激して抗原特異的な免疫応答を誘導し得るものであればどのようなものでもよい。免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であってよい。３個〜数個（例えば５個、６個）程度のアミノ酸でも１つのエピトープとなり得るが、通常、タンパク質中の１つのエピトープは、７〜１５アミノ酸、例えば８、９、１０、１２、または１４アミノ酸を含んでいる。抗原は、一態様において、ペプチドまたはエピトープであるのが好ましい。抗原を癌の治療に用いる場合、かかるペプチドは、がんペプチドとも称される。
【０１４６】
また、本発明の医薬組成物（ワクチンとして用いる場合を含む）を生体に投与してもよい。その投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。特に、本発明の医薬組成物は、ワクチンとして用いた場合、皮下注射、筋肉内注射、経口、スタンプ式、皮内注射等であってよい。
【０１４７】
本発明の医薬組成物（ワクチンとして用いる場合を含む）の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよい。投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月等）も選択しうる。本発明の医薬組成物は、糖鎖リンカー部分の切断が徐々に生じることにより、生理活性物質に徐放性を提供してもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、糖鎖リンカー部分の切断が迅速に生じることにより、生理活性物に速効性を提供してもよい。
【０１４８】
また、ある一態様において、本発明は、糖鎖付加リンカー、または、「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」の、生理活性物質が対象とする疾患、疾病の治療または予防用医薬の製造のための使用にも関する。あるいは、別の一態様において、本発明は、糖鎖付加リンカー、または、「糖鎖付加リンカー部分と生理活性物質部分とを含む化合物またはその塩」の、生理活性物質が対象とする疾患、疾病の治療または予防等のための使用にも関する。例えば、生理活性物質がＨＥＲ２またはその誘導体である場合、対象とする疾病は、癌（例えば、乳がん）等であってよい。他の各生理活性物質が対象とする疾患、疾病の種類についても、当業者は同様に理解できる。
【０１４９】
本発明の糖鎖付加リンカーは、生分解性の性質を有する糖鎖を付加する構成を採用したことにより、ＰＥＧを付加する構成に比べて、生体への悪影響が軽減される。その結果、医薬組成物として生体へ投与する際に、長期間の投与が期待される。
【０１５０】
本明細書における水溶液は、溶媒である水に物質（例えば、酢酸）が溶解した液体であればいずれのものでもよく、当業者に公知または新規のあらゆる水溶液を対象とする。
【０１５１】
本明細書におけるエマルションは、限定されるわけではないが、水溶液から調製したものであればいずれのものでもよい。エマルションとしては、限定されるわけではないが、水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルションまたは油中水滴（Ｗ／Ｏ型）エマルションであってよい。水溶液中に分散乳化させる方法は当業者に公知の方法を用いてよい。
【０１５２】
本発明の化合物またはその塩、または本発明の医薬組成物を投与（適用）する「対象」とは、限定はされないが、動物（ヒト、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）または非哺乳動物（例えば、魚類、爬虫類、両生類または鳥類））、植物、昆虫、細菌、またはそれら由来の細胞（培養細胞を含む）、組織または器官等を含む。あるいは、当該「対象」は、人工的な環境（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応系等）であってもよい。好ましくは、本発明における「対象」はヒトである。
【０１５３】
本明細書において用いられる用語「態様」、「実施態様」（例えば、「一態様」、「一実施態様」、「別の態様」）は、本発明の好ましい一側面を表すものであり、本発明の範囲は、所定の態様に限定されるものとして解釈されることを意図していない。また、技術的に矛盾が生じない限り、本発明の上述の態様および実施態様のあらゆる組み合わせが可能であることを当業者は当然に理解する。例えば、技術的に矛盾が生じない限り、置換基のあらゆる組み合わせの態様が開示されているものとして当業者は理解する。
【０１５４】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【０１５５】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【０１５６】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１５７】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１５８】
本実施例において用いられる略語の一部を以下に説明する：
Ａｃ：アセチル（基）
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｓｎ：アスパラギン
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基
ＢｒＡｃ：ブロモアセトアミド
Ｃｙｓ：システイン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量分析
Ｆｍｏｃ（基）：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（基）
ＨＣＬ：塩酸
ＨＣＴＵ：Ｏ−（６−Ｃｈｌｏｒｏ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＨＭＰＢ：４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸
ＨＭＢＡ：４−ヒドロキシメチル安息香酸
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｈ２Ｏ：水
ＭＳＮＴ：１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（１−（Ｍｅｓｉｔｙｌｅｎｅ−２−ｓｕｌｆｏｎｙｌ）−３−ｎｉｔｒｏ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＳＰＰＳ：ペプチド固相合成
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル基
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ：トリチル基【０１５９】
また、下記の実施例において、糖鎖付加リンカーと生理活性物質とが結合した化合物をコンジュゲートと記載する。例えば、リンカー中のシステインにアシアロ糖鎖を有する糖鎖付加リンカーと、生理活性物質であるＨＥＲ２の一部（ＨＥＲのアミノ酸配列中の８−１６番目のアミノ酸を含む部分）とが結合したコンジュゲートは、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲートと表記する。
なお、ＨＥＲ２（８−１６）は、ＨＥＲ（ヒト上皮増殖因子受容体：Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーの１つであるＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列のうち、８〜１６アミノ酸残基に相当するペプチドである。このＨＥＲ２（８−１６）は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原分子：Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）の一つであるＨＬＡ−Ａ２４に結合能を有し、ＨＬＡを介した抗原提示により細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能を示す、腫瘍ワクチン候補ペプチドとして同定されたペプチドフラグメントである（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（１），９４−９９，２００１）。【０１６０】
（実施例１−１：糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の合成）
【化３０】
2014084110.tif 000031
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化３１】
2014084110.tif 000032
【０１６１】
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄した。洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２３４ｍｇ、０．３９９ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）、および２、４、６−トリメチルピリジン（７９．６μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１０分間振盪した。１０分後、ＤＭＦで洗浄した後、この縮合操作をもう１回繰り返した。２回目の縮合操作終了後、樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄した。洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去し、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が結合した樹脂２を得た。樹脂２をＤＭＦで洗浄後、４−ヒドロキシメチル安息香酸（６１．１ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７．８ｍｇ、０．３８１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で振盪した。１時間後、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄し、樹脂上にＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が結合した化合物３を得た。【０１６２】
固相合成用カラムに、化合物３（１００μｍｏｌ）が結合した樹脂の一部を取り、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１７６．７ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（１４８．２ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルイミダゾール（２７．９μＬ、０．３５０ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（５．０ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間振盪した。１時間振盪後、ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄した。洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去することで、樹脂上に、Ｌｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）４を得た。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、樹脂上に化合物５：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（配列番号１）を合成した。固相合成法における縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵ、塩基としてＮ−メチルモルホリンを使用してＤＭＦ中で行った。
化合物５上のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール：水（＝９０：５：２．５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したエーテルを加え、粗ペプチド６：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（配列番号２）を沈殿として得た。
得られた粗ペプチド６（１５．５ｍｇ）を５０ｍＭ  ＤＴＴを含むＤＭＳＯ−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）混合溶液（９／１、ｖ／ｖ、２４０μＬ）に溶解し、３０ｍＭアシアロ−ＢｒＡｃ７が溶解したＤＭＳＯ−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）混合溶液（９／１、ｖ／ｖ、９４６μＬ）を添加し、室温で２時間振盪した。【０１６３】
【化３２】
2014084110.tif 000033
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６０：４０→４０：６０（２０分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ））（配列番号３）を含む画分を得た。
この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水  Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０（３０分）直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）（１７．２ｍｇ、５．７９μｍｏｌ）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２７Ｈ２０４Ｎ２０Ｏ５８Ｓ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １４８５．７、［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ９９０．８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ７４３．３、ｆｏｕｎｄ  １４８５．７、９９０．８、７４３．３。【０１６４】
（実施例１−２：糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の合成）
【化３３Ａ】
2014084110.tif 000034
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化３３Ｂ】
2014084110.tif 000035
【０１６５】
実施例１−１において得られた粗ペプチド６（１５．５ｍｇ）を５０ｍＭ  ＤＴＴを含むＤＭＳＯ−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）混合溶液（９／１、ｖ／ｖ、２４０μＬ）に溶解した。この混合溶液に対して、７．５ｍＭジシアロ−ＢｒＡｃ９を含むＤＭＳＯ−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）混合溶液（９／１、ｖ／ｖ、３．８ｍＬ）を添加し、室温で５時間振盪した。
【化３４】
2014084110.tif 000036
【０１６６】
反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６２：３８→５２：４８（３０分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ））（配列番号４）を含む画分を得た。
この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水  Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝７０：３０→５０：５０（３０分）直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）（２１．８ｍｇ、６．１３μｍｏｌ）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１４９Ｈ２３８Ｎ２２Ｏ７４Ｓ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １７７６．８、［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １１８４．８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ８８８．９、ｆｏｕｎｄ  １７７６．８、１１８４．８、８８８．９。【０１６７】
（実施例１−３：溶解度測定）
上記の実施例１−１および実施例１−２で得られた糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）と、糖鎖付加リンカーを有さない無修飾のＨＥＲ２−（８−１６）ペプチド（化合物１０）（Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）（配列番号５）とについて、水溶液への溶解度を測定した。
【化３５】
2014084110.tif 000037
【０１６８】
より具体的には、対象とする糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）、または無修飾のＨＥＲ２（８−１６）ペプチド（化合物１０）をマイクロチューブに４．５ｍｇ程度ずつ取り、水を３０μＬ添加した。２５℃で１５分間振盪した後、２５℃、１６１００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、マイクロチューブの上清部分について、２８０ｎｍの吸光度を測定し、得られた値から濃度を算出し、溶解度を求めた。糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数は、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）または糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）中のペプチド鎖部分の２８０ｎｍの吸光度を、アミノ酸分析で求めた濃度で割ることで求めた。無修飾のペプチドの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数ε２８０は、当業者に公知の以下の式を用いて算出した。
【数１】
2014084110.tif 000038
なお、ｎＴｒｐはトリプトファン残基の数、ｎＴｙｒはチロシン残基の数、ｎＳＳはジスルフィド結合の数を表す。
（参考文献：Ｃ．  Ｎ．  Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．，  １９９５，  ４，  ２４１１−２４２３）。【０１６９】
その結果、糖鎖付加リンカーが結合していないＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの、水への溶解度は、０．２２ｍｇ／ｍＬ（２．１×１０２μＭ））であった。この時、マイクロチューブ中、ＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの沈殿を目視で確認することができた。一方、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の、水への溶解度は、１４４ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、１４４ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の沈殿は確認できなかった。また、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の、水への溶解度は、１２１ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、１２１ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の沈殿は確認できなかった。これらの結果より、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の水溶液への溶解度は、無修飾のＨＥＲ２（８−１６）ペプチド（化合物１０）と比較して、モル濃度にしていずれも１９０倍以上溶解度が向上することが分かった（表１Ａ）。
【表１Ａ】
2014084110.tif 000039
【０１７０】
また、上記の水溶液への溶解度測定と同様の方法により、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）と、糖鎖付加リンカーを有さない無修飾のＨＥＲ２−（８−１６）ペプチド（化合物３）とについて、０．１％酢酸（ＡｃＯＨ）水溶液への溶解度を測定した。【０１７１】
その結果、糖鎖付加リンカーが結合していないＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの、酢酸水溶液への溶解度は、０．５２ｍｇ／ｍＬ（４．９×１０２μＭ））であった。この時、マイクロチューブ中、ＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの沈殿を目視で確認することができた。一方、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の、酢酸水溶液への溶解度は、１１０ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、１１０ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の沈殿は確認できなかった。また、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の、酢酸水溶液への溶解度は、１０４ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、１０４ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の沈殿は確認できなかった。これらの結果より、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の水溶液への溶解度は、無修飾のＨＥＲ２（８−１６）ペプチド（化合物１０）と比較して、モル濃度にしていずれも６９倍以上溶解度が向上することが分かった（表１Ｂ）。
【表１Ｂ】
2014084110.tif 000040
【０１７２】
（実施例１−４：水溶液中での加水分解挙動の追跡）
実施例１−１および実施例１−２で得られた糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の加水分解時の挙動を追跡した。凍結乾燥した糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）に対し、あらかじめ反応温度（２５℃または３７℃）にした緩衝溶液（酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）またはＰＢＳ（ｐＨ７．４））を加えることで、加水分解反応を開始した。また、反応中の温度は、ブロックインキュベーターを用いて一定の温度（２５℃または３７℃）となるように維持した。適当な時間間隔で、一定の量の溶液をＨＰＬＣにインジェクトすることで加水分解反応を追跡した。出発物質に相当するＨＰＬＣのピーク面積から相対出発物質濃度をもとめた。インキュベーション時間に対して、出発物質の相対濃度をプロットした。その結果、直線状のプロットが得られたことから、加水分解反応が一次反応であることが示された。また、出発物質の消失半減期ｔ１／２を、式ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋ（ｋは直線プロットの傾き）から算出した。各条件下における糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の半減期を、表２及び表３に示す。【０１７３】
【表２】
2014084110.tif 000041
【表３】
2014084110.tif 000042
【０１７４】
糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）のいずれも、徐々に加水分解され、無修飾のＨＥＲ２（８−１６）ペプチド（化合物１０）を生成することが確認された。また、表２および表３に示すように、ｐＨが高い程、加水分解速度が速いことが確認された（Ｅｎｔｒｙ（エントリー）  １と３との比較（２５℃）、Ｅｎｔｒｙ  ２と４との比較（３７℃））。また、ｐＨ７．４の条件下においては、温度が高い程、加水分解が速いことが確認された（Ｅｎｔｒｙ  ３と４との比較）。なお、ｐＨ４．０、３７℃の条件下においては、化合物１および化合物８のいずれも非常に安定であり、４８時間の追跡後に生成した加水分解物１０は出発物質の１％以下と、ほとんど加水分解されないことがわかった。また、ｐＨ７．４、２５℃の条件下においては、アシアロ糖鎖付加リンカーを有するペプチドよりも、ジシアロ糖鎖付加リンカーを有するペプチドの方が、加水分解速度が速かった。一方で、ｐＨ７．４、３７℃の条件においては、アシアロ糖鎖付加リンカーを有するペプチドよりも、ジシアロ糖鎖付加リンカーを有するペプチドの方が、加水分解速度が遅い結果となった。このように、付加する糖鎖の種類を選択することによっても、特定の条件下における好ましい加水分解速度を調整することができる。【０１７５】
（実施例２：固相上での糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）の合成）
【化３６Ａ】
2014084110.tif 000043
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化３６Ｂ】
2014084110.tif 000044
【０１７６】
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄した。洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕｔｈｉｏ）−ＯＨ（１７３．４ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）、および２、４、６−トリメチルピリジン（７９．６μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１０分間振盪した。１０分後、樹脂をＤＭＦで洗浄した。洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去し、樹脂上にＣｙｓ（ＳｔＢｕ（ｔＢｕｔｈｉｏ））が結合した化合物１１を得た。樹脂上の化合物１１をＤＭＦで洗浄後、４−ヒドロキシメチル安息香酸（６０．８ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で振盪した。１０分後、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄し、樹脂上にＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）が結合した化合物１２を得た。樹脂上の化合物１２にＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１７６．３ｍｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（１４９．０ｍｇ、０．５０３ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルイミダゾール（２７．９μＬ、０．３５０ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（５．０ｍＬ）溶液を加え、室温で３時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去することで、樹脂上にＬｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）が結合した化合物１３を得た。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドが結合した樹脂上にアミノ酸側鎖が保護された化合物１４：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）（配列番号６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵ、塩基としてＮ−メチルモルホリンを使用してＤＭＦ中で行った。【０１７７】
化合物１４が結合した樹脂の一部（１０μｍｏｌ）に、０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液（５００μＬ）および０．１Ｍ  ＤＴＴが溶解したＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を添加し、室温で振盪した。６時間後、ＤＭＦで洗浄することで、樹脂上に化合物１５：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（配列番号７）を得た。化合物１５に、アシアロ−ＢｒＡｃ７（５２．８ｍｇ、３０．０μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１０．５μＬ、６０．３μｍｏｌ）が溶解したＤＭＳＯ−ＤＭＦ混合溶液（１／１、ｖ／ｖ、５００μＬ）を添加し、室温で１２時間振盪することで、樹脂上に化合物１６：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ））（配列番号８）を得た。ＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール：水（＝９０：５：２．５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したエーテルを加え、粗ペプチド１を沈殿として得た。得られた粗ペプチド１（１５．５ｍｇ）をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６５：３５→５３．４：４６．６（２４分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ））（５．０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）を得た。【０１７８】
（実施例３−１：チオアルキル構造を有する、糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の合成）
<チオール基を有する糖鎖付加リンカー（化合物１７）の合成>
【化３７】
2014084110.tif 000045
リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．７２、４．０ｍＬ）に溶解したアシアロ−ＢｒＡｃ７（１３１．７ｍｇ、７５μｍｏｌ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．７２、４．０ｍＬ）に溶解したエタンジチオール（６３μＬ、７５０μｍｏｌ、１０ｅｑ）にゆっくり滴下して加え、室温で４０分反応させた。ＨＰＬＣにより反応の終了を確認した後、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝９９：１（０−１分）→８０：２０（３０分）］を用いて精製し、チオール基を有する糖鎖付加リンカーである目的の化合物１７（１１８．３ｍｇ、収率８９％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６６Ｈ１１１Ｎ５Ｏ４６Ｓ２：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ８８８．３６、ｆｏｕｎｄ  ８８８．３４。【０１７９】
<チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の合成>
【化３８Ａ】
2014084110.tif 000046
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化３８Ｂ】
2014084110.tif 000047
【０１８０】
Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機にて樹脂上に合成したアミノ酸側鎖が保護されたペプチドを、ＡｃＯＨ−ＴＦＥ（１／１、ｖ／ｖ）溶液で処理することで樹脂から切り出した。ろ液を減圧下で濃縮乾固することでアミノ酸側鎖が保護されたペプチド（化合物１８）：Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号９）を得た。
得られたペプチド（化合物１８）（６３．５ｍｇ、４１．８μｍｏｌ）、チオール基を有する糖鎖付加リンカー（化合物１７）（４１．５ｍｇ、２３．４μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１２１．８ｍｇ、２３４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、窒素雰囲気下、−１５℃に冷却した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（４０．０μＬ、４０．７μｍｏｌ）を加え−１５℃で撹拌した。３時間後、ＴＦＡ（１００μＬ）を加え、減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣に、ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（９５／５、ｖ／ｖ）溶液（１ｍＬ）を加え、３時間撹拌した。溶液にエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。得られた粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６５：３５→３５：５５（３０分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＳＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＯＮＨ（ａｓｉａｌｏ））（配列番号１０）（６．９ｍｇ、収率１０．５％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１８Ｈ１９６Ｎ１８Ｏ５５Ｓ２：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １４０６．５２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ９３８．０１、ｆｏｕｎｄ  １４０６．１０、９３７．７３。【０１８１】
（実施例３−２：チオアリール構造を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の合成）
【化３９Ａ】
2014084110.tif 000048
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化３９Ｂ】
2014084110.tif 000049
【０１８２】
ジクロロメタン中、４−メルカプトフェニル酢酸（化合物２２）（１．０ｇ，６．１ｍｍｏｌ）に塩化トリチル（２．０ｇ，７．１ｍｍｏｌ）を作用させることで、化合物２３（２．８ｇ）を得た。Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡ樹脂上に、２残基のアミノ酸からなる糖ペプチド（Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏ）−Ｇｌｙ）が結合した化合物２４（６２μｍｏｌ）に対して、化合物２３（３２０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（５０．７ｍｇ、３７５μｍｏｌ）、およびＤＩＣ（５４μＬ，５２２μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液を添加し、室温で１時間振盪させることで、樹脂上に化合物２５を得た。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：５：２．５）溶液を加え、室温で３時間振盪後、ろ液を減圧下濃縮することで糖鎖付加リンカーである化合物２６（１９．６ｍｇ、１０μｍｏｌ、収率１６％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ７６Ｈ１２０Ｎ８Ｏ４９Ｓ：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ９８１．３４、ｆｏｕｎｄ  ９８１．３７。【０１８３】
糖鎖付加リンカーである化合物２６（８．６ｍｇ、４．４μｍｏｌ）、アミノ酸側鎖が保護されたペプチド（化合物１８）（３５．０ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、およびＰｙＢＯＰ（２２．８ｍｇ、４３．８μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させ、窒素雰囲気下、−１５℃に冷却した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（７．５μＬ、７６．４μｍｏｌ）を加え、−５℃〜−１０℃で撹拌した。２．５時間後、ＴＦＡ（５０μＬ）を加え、減圧下で濃縮乾固した。得られた残渣に、ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ（９５／５、ｖ／ｖ）溶液（１ｍＬ）を加え、３時間撹拌した。溶液にエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。
得られた粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＴＦＡ水  Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝６５：３５→３５：５５（３０分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）：Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：４−ｔｈｉｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ−Ａｓｎ（ａｓｉａｌｏ）−Ｇｌｙ）（配列番号１１）（２．３ｍｇ、収率１７．５％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２８Ｈ２０５Ｎ２１Ｏ５８Ｓ１：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １５００．０９、［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １０００．３９、ｆｏｕｎｄ  １４９９．６７、１０００．０８。【０１８４】
（実施例３−３：溶解度測定）
糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物7）の代わりに、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）およびチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）を用いた以外は、実施例１−３と同様にして、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）およびチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の水への溶解度を測定した。なお、比較として、無修飾のＨＥＲ２−（８−１６）ペプチド（化合物１０）の溶解度を測定した。その結果、糖鎖付加リンカーが結合していないＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの、水への溶解度は、０．２２ｍｇ／ｍＬ（２．１×１０２μＭ））であった。この時、マイクロチューブ中、ＨＥＲ２（８−１６）ペプチドの沈殿を目視で確認することができた。一方、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の、水への溶解度は、７７．４ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、７７．４ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の沈殿は確認できなかった。また、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の、水への溶解度は、７６．７ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認した。驚くべきことに、７６．７ｍｇ／ｍＬの濃度でさえも、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の沈殿は確認できなかった。これらの結果より、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）およびチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の水溶液への溶解度は、無修飾のＨＥＲ２−（８−１６）ペプチド（化合物１０）と比較して、モル濃度にしていずれも１００倍以上溶解度が向上することが分かった。
【表４】
2014084110.tif 000050
【０１８５】
（実施例３−４：水溶液中での加水分解挙動の追跡）
実施例３−１および実施例３−２で得られたチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）およびチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の加水分解時の挙動を追跡した。具体的には、凍結乾燥した糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の代わりに、凍結乾燥したチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）およびチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）を用い、反応温度を４℃、２５℃、または３７℃とした以外は、実施例１−４と同様にして、加水分解の挙動を追跡した。【０１８６】
なお、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）について加水分解試験を行い、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、無修飾のＨＥＲ２（８−１６）ペプチド（化合物１０）が生成したことを確認した。下記化学式は、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の加水分解反応を示し、化合物２７は化合物２０の加水分解反応によって生じる、糖鎖付加リンカーを示す。
【化４０Ａ】
2014084110.tif 000051
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化４０Ｂ】
2014084110.tif 000052
【０１８７】
実施例１−４と同様にして、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）に関して、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたグラフを図１Ａおよび図１Ｂに示す。また、各条件下におけるチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）の半減期を、表５に示す。
【表５】
2014084110.tif 000053
【０１８８】
表５に示す通り、ＰＢＳ中（ｐＨ７．４）における加水分解半減期は、２５℃では５日であったのに対し、３７℃では３２時間であった。この結果より、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）は、温度が高いほど加水分解速度が向上することが分かった（Ｅｎｔｒｙ（エントリー）  １と２との比較（ｐＨ  ４．０）、Ｅｎｔｒｙ  ３、４および５の比較（ｐＨ  ７．４））。また、３７℃におけるｐＨの影響を観察したところ、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中での加水分解半減期は２４日であることから、ｐＨが高い程加水分解が促進することが確認された（Ｅｎｔｒｙ  ２と５との比較）。このように、エステル結合を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１、８）と同様に、チオエステル結合を有するチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）も温度および/またはｐＨが高い程、加水分解速度が速いことが確認された。【０１８９】
また、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）を加水分解し、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、チオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）と同様に、無修飾のＨＥＲ２−（８−１６）ペプチド（化合物１０）が生成したことを確認した。下記化学式は、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の加水分解反応を示し、化合物２８は化合物２１の加水分解反応によって生じる糖鎖付加リンカーを示す。
【化４１Ａ】
2014084110.tif 000054
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化４１Ｂ】
2014084110.tif 000055
【０１９０】
また、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）についても、インキュベーション時間に対して、出発物質の相対濃度をプロットしたグラフを図２Ａおよび図２Ｂに示す。また、各条件下におけるチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）の半減期を、表６に示す。
【表６】
2014084110.tif 000056
【０１９１】
また、表６に示す通り、ＰＢＳ中（ｐＨ７．４）における加水分解半減期は、４℃では６６時間、２５℃では２５時間であったのに対し、３７℃では４．０時間であった。この結果より、チオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）は、温度が高いほど加水分解速度が向上することが分かった（Ｅｎｔｒｙ（エントリー）  １と２との比較（ｐＨ  ４．０）、Ｅｎｔｒｙ  ３、４および５の比較（ｐＨ  ７．４））。また、３７℃におけるｐＨの影響を観察したところ、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）中での加水分解半減期は１０日であることから、ｐＨが高い程加水分解が促進することが確認された（Ｅｎｔｒｙ  ２と５との比較）。このように、エステル結合を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２−（８−１６）コンジュゲート同様、チオエステル結合を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２−（８−１６）コンジュゲートも温度および/またはｐＨが高い程、加水分解速度が速いことが確認された。【０１９２】
なお、アシアロ糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲートである化合物２０、２１、および１の３７ｏＣ、ＰＢＳ中（ｐＨ７．４）における加水分解速度は、チオエステル結合を有するチオアリール型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２１）（４．０時間）>チオエステル結合を有するチオアルキル型糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物２０）（３２時間）>エステル結合を有する糖鎖付加リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）（７８時間）の順であった（図３）。この結果から、エステル型よりチオエステル型の方が、加水分解速度が速いことが示された。また、チオエステル型の中でも、チオアルキル型よりチオアリール型の方が速く加水分解することがわかった。【０１９３】
（実施例４−１．糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）の合成）
このケメリン９は、Ｇタンパク質共役型レセプターであるＣｈｅｍＲ２３アゴニスト活性を有することから、免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病の治療及び／又は予防剤としての可能性を有している。しかしながら、ケメリン９は、生体内においてタンパク分解酵素による分解を受け、非常に不安定であることが知られている（特許文献ＪＰ２０１０−２２９０９３）。そこで、このケメリン９に、本発明の一実施の態様である糖鎖付加リンカーを導入し、製造されたコンジュゲートの加水分解半減期の評価を行った。まず、エステル結合を介して、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカーとケメリン９（配列番号１２：ＹＦＰＧＱＦＡＦＳ、特許文献ＵＳ２００３０９６２９９に開示される、配列番号３１−３６のアミノ酸配列に相当）が結合したコンジュゲートを合成した。
【化４２】
2014084110.tif 000057
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化４３】
2014084110.tif 000058
【０１９４】
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡ樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄した。洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２３４ｍｇ、０．３９９ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７ｍｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）、および２、４、６−トリメチルピリジン（７９．６μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１０分間振盪した。１０分後、ＤＭＦで洗浄した後、この縮合操作をもう１回繰り返した。２回目の縮合操作終了後、樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄した。洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去し、樹脂上にＣｙｓ（Ｔｒｔ）が結合した化合物２を得た。樹脂上の化合物２をＤＭＦで洗浄後、４−ヒドロキシメチル安息香酸（６１．１ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ）、ＨＣＴＵ（１５７．８ｍｇ、０．３８１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、０．６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で振盪した。１時間後、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄し、樹脂上に、ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が結合した化合物３を得た。
得られた化合物３が結合している樹脂の一部（５０μｍｏｌ）に、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（９６．９ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ）、ＭＳＮＴ（７４．１ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルイミダゾール（１４．０μＬ、０．１７７ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（２．５ｍＬ）溶液を加え、室温で１時間振盪した。１時間振盪後、ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄した。洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去することで、樹脂上にＳｅｒ（ｔＢｕ）−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）が結合した化合物３０を得た。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて樹脂上にアミノ酸側鎖が保護されたペプチドが結合した化合物３１：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）（配列番号１３）を合成した。固相合成法における縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵ、塩基としてＮ−メチルモルホリンを使用してＤＭＦ中で行った。
化合物３１上のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール：水（＝９０：５：２．５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したエーテルを加え、粗ペプチド３２：Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（配列番号１４）を沈殿として得た。
得られた粗ペプチド３２（１４．２ｍｇ）、ジシアロ−ＢｒＡｃ９（４１．６ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）、およびＴＣＥＰ（１６．０ｍｇ、５５．８μｍｏｌ）を７Ｍグアニジン塩酸塩を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８、１．１５ｍＬ）に溶解し、室温で反応させた。３時間後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、溶離液  Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水  Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント  Ａ：Ｂ＝７０：３０→５５：４５（１０分）直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）：Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−（ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎ  ａｄｄｅｄ−ｌｉｎｋｅｒ：ＨＭＢＡ−Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ））（配列番号１５）（１９．０ｍｇ、５．３３μｍｏｌ）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５１Ｈ２１７Ｎ１９Ｏ７７Ｓ  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  １１８７．８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋  ８９１．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋  ７１３．１、ｆｏｕｎｄ  １１８７．８、８９１．１、７１３．１。
（実施例４−２：水溶液中での加水分解挙動の追跡）
実施例４−１で得られた糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）の加水分解時の挙動を追跡した。具体的には、凍結乾燥した糖鎖付加（Ｃｙｓ（ａｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物１）および糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ＨＥＲ２（８−１６）コンジュゲート（化合物８）の代わりに、凍結乾燥した糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）を用い、緩衝溶液として酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた以外は、実施例１−４と同様にして、加水分解の挙動を追跡した。
糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）を加水分解し、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、ケメリン９のアミノ酸配列を有する無修飾のケメリン９のぺプチド：Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（化合物３３）が生成したことを確認した。下記化学式は、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）の加水分解反応を示す。
【化４４Ａ】
2014084110.tif 000059
式中、Ｒは以下の化学式を表わす。
【化４４Ｂ】
2014084110.tif 000060
【０１９５】
実施例１−４と同様にして、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）について、インキュベーション時間に対する出発物質の相対濃度をプロットしたグラフを図４に示す。また、各条件下における糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）の半減期を、表７に示す。
【表７】
2014084110.tif 000061
【０１９６】
表７に示す通り、酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）中、３７℃の条件下では、４９時間の追跡後に生成した加水分解物（化合物３３）は出発物質（化合物２９）の１％以下と、ほとんど加水分解されないことがわかった（なお、糖鎖構造中の非還元末端に存在するシアル酸の脱離が観察された。脱シアル酸体の含量は、加水分解の挙動試験の開始前後において、４．７％から８．７％に増加した）。一方で、ＰＢＳ中（ｐＨ７．４）およびホウ酸緩衝液中（ｐＨ９．０）では加水分解反応が進行し、ケメリン９のアミノ酸配列を有する無修飾のペプチド（化合物３３）が得られることがわかった。得られた曲線から求められた半減期は、ＰＢＳ中、３７℃で４５．０時間（１．９日）であった。また、ホウ酸緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０）中３７℃にて加水分解挙動を追跡した結果、半減期は０．８３時間（５０分）であった。
また、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液に糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）を溶解させたところ、２分で完全に消失し、ケメリン９のアミノ酸配列を有する無修飾のペプチド（化合物３３）が生成した。文献での報告の通り、塩基性条件においては、加水分解が非常に速やかであることが確認された。
また、糖鎖付加（Ｃｙｓ（ｄｉｓｉａｌｏ）型）リンカー−ケメリン９コンジュゲート（化合物２９）は他の化合物と同様に、ｐＨをあげることで加水分解速度が向上することが確認された（Ｅｎｔｒｙ１、２、および３）。また、同じｐＨの場合、温度が高いほど加水分解が促進することが確認された（Ｅｎｔｒｙ３および４）。
加水分解の挙動試験後、反応液のＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０（５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、流速：０．７ｍＬ／分、溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水  溶離液Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５０：５０（２０分）  直線濃度勾配溶出］分析を行った。その結果、保持時間１０．２分で糖鎖付加リンカー部分（化合物３４）のピークが確認された。
化合物３４のＥＳＩ−ＭＳ：（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ９７Ｈ１５３Ｎ９Ｏ６５Ｓ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  １２５８．９３、［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ８３９．６２、ｆｏｕｎｄ  １２５８．９８、８３９．６５。【０１９７】
これらの結果より、本発明の糖鎖付加リンカーが結合したコンジュゲートは、投与前は室温にて低ｐＨの溶液で調製することで化合物の加水分解は起こらず、投与後は生体条件下で加水分解され、ペプチド本来の活性が発揮されると期待できる。
【図１Ａ】
2014084110.tif 000064
【図１Ｂ】
2014084110.tif 000065
【図２Ａ】
2014084110.tif 000066
【図２Ｂ】
2014084110.tif 000067
【図３】
2014084110.tif 000068
【図４】
2014084110.tif 000069
【配列表】
2014084110000001.app
【国際調査報告】
2014084110.tif 000070
2014084110.tif 000071
2014084110.tif 000072
2014084110.tif 000073
2014084110.tif 000074
2014084110.tif 000075