(57)【要約】  本発明は、（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、  該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法に関する。［化１］2016072364.tif 000016［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
2016072364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程
を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、
該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法。
【化１】
2016072364.tif 000013
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【請求項２】
上記疾患がメタボリックシンドロームである請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
上記式（１）で表される構造は、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
上記式（１）で表される構造は、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２４の炭化水素基である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造である請求項１又は請求項２に記載の検出方法。
【化２】
2016072364.tif 000014
［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
【請求項６】
（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
を更に含む、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーは、オートタキシン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン−アミノトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質コレステロール、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質、及び、平均内膜中膜肥厚よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６又は請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
上記ガングリオシドＧＭ３の測定を、上記ガングリオシドＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は、液体クロマトグラフィー／質量分析法によって行う、請求項１ないし請求項８の何れかの請求項に記載の検出方法。
【請求項１０】
標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、
該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出キット。
【化３】
2016072364.tif 000015
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びそれらの検出キットに関し、更に詳しくは、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、特定の疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びそれらの検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病及び循環器病（ＣＶＤ；ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）は肥満、高血圧及び身体活動の低下を含む多くの危険因子が重複し、互いに関連性がある。ＣＶＤの１つであるアテローム性動脈硬化症は、コレステロール及び脂肪が血管の内腔に蓄積することによって、プラークが形成された状態をいう。このプラークが破裂すると、血栓ができ、脳卒中、心臓発作等を引き起こす危険性がある（非特許文献１）。【０００３】
これまでにメタボリック及び行動リスク因子がアテローム性動脈硬化症を引き起こす原因となっていることが報告されている。行動リスク因子には、運動不足、過剰なカロリー、塩及び脂肪摂取等の不健康な食事、タバコ、及びアルコールの乱用等が含まれる。従来のメタボリックリスク因子には、高血圧、血中におけるコレステロール等の脂質濃度の増加、及び高血糖等が含まれる。また、頸動脈内膜中膜肥厚（ＣＩＭＴ）がＣＶＤ危険因子と関連があることが報告されている。【０００４】
一方、糖尿病には、１型糖尿病と２型糖尿病がある。２型糖尿病は、過剰なカロリー摂取、運動不足、肥満及び血中における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度増加等と関連があり、生活習慣病と言われている。２型糖尿病では、インスリン抵抗性及び／又はインスリン分泌不全となり、高血糖状態となっている（非特許文献２）。内臓脂肪の過剰蓄積に伴う脂肪細胞の機能異常によるアディポサイトカインの分泌バランスの破綻が、インスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病や動脈硬化性疾患の要因として重要な役割を果たしていることが明らかにされている。【０００５】
内臓脂肪組織中には常時、骨髄性細胞であるマクロファージが潜在しているが、肥大化に伴いインスリン抵抗性を獲得しつつある内臓脂肪細胞からはＭＣＰ−１というアディポサイトカインが分泌され、更にマクロファージが周辺血管より動員される。また、肥大化した脂肪組織から分泌される多量の遊離脂肪酸もＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒを介してマクロファージを活性化し、ＴＮＦαやＩＬ−６等の炎症性サイトカインを分泌する。これらの炎症性サイトカインが脂肪細胞に作用し、脂肪細胞のインスリン抵抗性を増悪する。その結果、アディポサイトカインの分泌異常が亢進する。この脂肪細胞の慢性炎症状態が、全身性のインスリン抵抗性を惹起することが見出され、脂肪組織の病態生理が注目されている（非特許文献３）。【０００６】
現在２型糖尿病の血液診断は、一般的に血糖値、ＨｂＡ１ｃ、グリコアルブミン値等を指標に診断されているが、２型糖尿病の病状を正解に把握するためには、１つの指標だけではなく、複数の指標を測定し、評価しなければならない。【０００７】
これまでに、発明者らは、血液中の、ガングリオシドの１つであるガングリオシドＧＭ３（α−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２−３）β−Ｇａｌ−（１−４）−β−Ｇｌｃ−（１−１）−セラミド）を定量することによって、２型糖尿病、高脂血症、高血圧及び肥満からなる群から選択されるインスリン抵抗性病態を示す疾患を検出することができることを見出した（特許文献１、非特許文献４）。ガングリオシドはシアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称であり、スフィンゴ糖脂質は、セラミドにグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸等の糖や硫酸の段階的な酵素付加によって生合成された糖脂質であり、細胞膜脂質二重層の外側に発現している。
また、これまでの研究により、総ＧＭ３量は、リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）と相関関係があることがわかっている（非特許文献４）。【０００８】
また、血液中のガングリオシドＧＭ３には、セラミド部分の炭化水素基の炭素数や二重結合の数、置換基の種類や数等により、多くの分子種が存在している。分子種によって、生物物理学的特性や生理学的機能が異なると言われ、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することが、メタボリックシンドローム等の生活習慣病の検出に更に有効であると考えられるが、これまでのところ、当該検出により有効であるガングリオシドＧＭ３の構造については報告がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３９２２４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kwon，G．P．et al.，Circulation， 117（2008）2919-2927
【非特許文献２】Chen，L．et al.，Nat rev Endocrinol.， 8（2012）228-236
【非特許文献３】Katada，H．et al.，Chem Bio Chem.， 10（2009）1279
【非特許文献４】Sato，T．et al.，Obe Res Clin Pract., 2（2008）Ｉ-II
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、メタボリックシンドローム等の生活習慣病（特定疾患）に関与する多くの分子と相関性がある、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、疾患を検出する又は該疾患の発症リスクを検出する方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、セラミド部分がヒドロキシル化されたガングリオシドＧＭ３を測定することにより、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出できることを見出した。【００１３】
また、該特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーと相関関係があることを見出して本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の方法である。
［１］
（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程
を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、
該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出方法である。
【化１】
2016072364.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］【００１５】
［２］
上記疾患がメタボリックシンドロームである［１］に記載の検出方法。【００１６】
［３］
上記式（１）で表される構造は、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基である［１］又は［２］に記載の検出方法。【００１７】
［４］
上記式（１）で表される構造は、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２４の炭化水素基である［１］又は［２］に記載の検出方法。【００１８】
［５］
上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造である［１］又は［２］に記載の検出方法。
【化２】
2016072364.tif 000004
［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］【００１９】
［６］
（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
を更に含む、［５］に記載の検出方法。【００２０】
［７］
上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーは、オートタキシン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニン−アミノトランスフェラーゼ、低密度リポタンパク質コレステロール、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つである、［６］に記載の検出方法。【００２１】
［８］
上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質、及び、平均内膜中膜肥厚よりなる群から選択される少なくとも１つである、［６］又は［７］に記載の検出方法。【００２２】
［９］
上記ガングリオシドＧＭ３の測定を、上記ガングリオシドＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は液体クロマトグラフィー／質量分析法によって行う、［１］ないし［８］の何れかの請求項に記載の検出方法。【００２３】
［１０］
標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、
該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする検出キット。
【化３】
2016072364.tif 000005
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【発明の効果】
【００２４】
本発明の検出方法によれば、前記問題点を解消し前記課題を解決し、血液試料中の特定構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することにより、従来の検出方法と比べて、被験者の状態を、より基本的見地から、より正確に、より簡便に把握することができる。
式（１）で表される特定のガングリオシドＧＭ３を測定することにより、一般的ガングリオシドＧＭ３の測定（ガングリオシドＧＭ３全体の測定）に比べて、更に的確に、特定疾患の検出ができたり、特定疾患の発症リスクの検出ができたりする。
また、従来の生活習慣病の検出方法と比べて、被験者の生活習慣病に関連する状態をより正確に把握することができる。【００２５】
具体的には、本発明の検出方法により、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定することで、従来法に比べ、より基本的見地から、より正確に、より簡便に、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患」を検出することができる。
本明細書では、上記「    」内（合併された疾患も含む）を、「特定疾患」と略記することがある。【００２６】
また、従来法に比べ、上記特定疾患の発症リスクを、より基本的見地から、より正確に、より簡便に、より早期に予測することができて、該特定疾患に罹患しないよう早めに対策を講じること等ができる。【００２７】
また、本発明の検出方法により、総ＧＭ３量を測定することでは特定疾患を検出することができない場合であっても、特定疾患を検出したり、特定疾患の発症リスクを検出したりすることができる。
特に、本発明の検出方法により、被験者がメタボリックシンドロームに罹患しているか否かを検出したり、該発症リスクを判断したりすることができる。【００２８】
また、特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症のマーカーと相関性があり、該特定の構造を有するガングリオシドＧＭ３を測定するという簡便な操作により、上記特定疾患に罹患しているかを検出する又は上記特定疾患を発症するリスクがあるかを予測することができる。【００２９】
本発明によれば、前記特定疾患、メタボリックシンドローム、生活習慣病等の疾患を検出すること又は該疾患の発症リスクを検出することによって、それらによって引き起こされる、糖尿病；心筋梗塞、狭心症等の心臓血管障害；脳梗塞等の脳血管障害；腎機能障害；四肢動脈閉塞等の血管障害；等の循環器系疾患の検出・予防が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の総ＧＭ３量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】血清中の総ＧＭ３量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ  ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ−ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【図３Ａ】健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の、１２個のＧＭ３分子種の量を測定した結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】健常人及び各疾患に罹患している患者の血清中の、１１個のＧＭ３分子種の量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】血清中の特定の構造を有するＧＭ３（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、及び（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ  ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ−ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【図５】ＧＭ３、スフィンゴミエリン、セラミドに存在する［ｈＣ２４：１］量を測定したグラフである。縦軸は、［Ｃ２４：１］量を１００としたときの割合（％）である。
【図６】健常人及び各疾患に罹患している患者の、（Ａ）血清中のヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量、（Ｂ）血清中の非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量を測定した結果を示すグラフである。
【図７】血清中のヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ  ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ−ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【図８】血清中の非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量と、（Ａ）総コレステロール量、（Ｂ）ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）量、（Ｃ）オートタキシン量、（Ｄ）平均内膜中膜肥厚（Ｍｅａｎ  ＩＭＴ）、（Ｅ）空腹時血糖値、（Ｆ）インスリン、（Ｇ）ＨＯＭＡ−ＩＲ量、及び（Ｈ）ＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
【００３２】
本発明の検出方法は、（ａ）被験者由来の血液試料中のガングリオシドＧＭ３を測定する工程を含む、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法であって、該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される構造であることを特徴とする。
【化４】
2016072364.tif 000006
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【００３３】
本明細書中において、各疾患を以下のように定義する。
＜１＞被験者のへその位置でのウエストサイズが男性の場合は８５ｃｍ以上、女性の場合は９０ｃｍ以上のときに、内臓脂肪型肥満症（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｆａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ、以下「ＶＦＡ」と略記する場合がある）であると判断する。
＜２＞被験者の空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上であるときに、高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）であると判断する。
【００３４】
＜３＞次の（１）から（３）の条件のうち、少なくとも１つの条件に当てはまるときに、脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）であると判断する。
（１）被験者のトリグリセライド（中性脂肪）値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上。
（２）被験者の低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）値が１４０ｍｇ／ｄＬ以上。
（３）被験者の高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）値が４０ｍｇ／ｄＬ未満。
【００３５】
＜４＞被験者の収縮期血圧（最高血圧）が１４０ｍｍＨｇ以上、及び／又は、拡張期血圧（最低血圧）が９０ｍｍＨｇ以上であるときに、高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ）であると判断する。
＜５＞アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）とは、粥状動脈硬化とも言われ、血管の内膜に脂肪やコレステロールが蓄積することにより、プラーク（粥種）が該血管の内膜に形成されている状態をいう。
【００３６】
＜６＞腎症（Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）は、腎機能が低下する病気である。高血糖症等により血糖値が高い状態が続いたことにより、腎臓の毛細血管に障害が起きて発生する腎症がある。
＜７＞また、上記ＶＦＡ、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、アテローム性動脈硬化症等、生活習慣に起因すると考えられる疾患を「生活習慣病」と略記する場合がある。
【００３７】
本発明の検出方法は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出する方法である。
「２つ以上が合併された疾患を検出する」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患を被験者が発症しているか否かを検出する」ということである。
また、「２つ以上が合併された疾患の発症リスクを検出する」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患の発症リスクを被験者が有しているか否かを検出する」ということである。
【００３８】
本発明の検出方法は、特定疾患の検出方法、特定疾患の発症リスクの検出方法であるが、また、本発明の検出方法は、生活習慣病を検出する、又は、該生活習慣病の発症リスクを検出する方法でもある。
【００３９】
また、本発明の検出方法は、メタボリックシンドロームを検出する、又は、該メタボリックシンドロームの発症リスクを検出する方法でもある。
本明細書において、「メタボリックシンドローム」とは、内臓脂肪型肥満症であると共に、「高血糖症、脂質異常症及び高血圧症」のうち少なくとも２つの疾患を発症している状態を言う。従って、「メタボリックシンドローム」の状態は、特定疾患を発症している状態に含まれる。
【００４０】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）においては、被験者由来の血液試料中の、下記式（１）で表される構造を有する特定のガングリオシドＧＭ３を測定する。該「測定」とは、特定のガングリオシドＧＭ３の存在を血液中に確認したり、血液中の特定のガングリオシドＧＭ３を定量したりすることを含む概念である。該「測定」は、必要に応じて、更にその他の工程を含んでいてもよい。
【００４１】
一般に「ガングリオシド（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）」とは、糖鎖上に１つ以上のシアル酸が結合しているスフィンゴ糖脂質を言う。
「ガングリオシドＧＭ３」とは、スフィンゴ糖脂質の糖鎖が、下記「    」内であるものを言う。
「α−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２−３）β−Ｇａｌ−（１−４）−β−Ｇｌｃ−（１−１）−セラミド」
ここで、「α−Ｎｅｕ５Ａｃ」は、Ｎ-アセチル−α−ノイラミン酸、「β−Ｇａｌ」は、β−ガラクトース、「β−Ｇｌｃ」は、β−グルコースを示す。
【００４２】
本発明で測定するガングリオシドＧＭ３（以下、単に「ＧＭ３」と略記する場合がある）は、ＧＭ３の中でも特に下記式（１）で表される構造を有するものである。
【化５】
2016072364.tif 000007
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【００４３】
ここで、「ガングリオシドＧＭ３」の定義から、式（１）中の「ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖であるＲ１」とは、「α−Ｎｅｕ５Ａｃ」、「β−Ｇａｌ」及び「β−Ｇｌｃ」が、前記「ガングリオシドＧＭ３」の定義のように結合したものである。
【００４４】
以下、「上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３」を、単に「ヒドロキシル化ＧＭ３」と略記する場合がある。
【００４５】
上記式（１）で表される構造については、上記式（１）中の「Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−」が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数２２又は２４の炭化水素基であることが、ＧＭ３総量の定量等のＧＭ３全体の測定に比べ、より的確に特定疾患の検出ができ、より的確に該特定疾患の発症リスクを検出できる点から好ましい。
【００４６】
また、Ｒ２が、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有する炭素数２３の炭化水素基であることが、上記点からより好ましい。
【００４７】
更に、上記式（１）で表される構造が下記式（２）で表される構造であることが、上記点から特に好ましい。
【化６】
2016072364.tif 000008
［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］
【００４８】
以下、「上記（２）で表される構造を有するＧＭ３」を、「［ｈＣ２４：１］ＧＭ３」と略記する場合がある。「［ｈＣ２４：１］ＧＭ３」は、ＧＭ３の脂肪酸が、置換基としてＯＨ基を有する、炭素数２４の脂肪酸（脂肪酸のカルボキシル基の酸素が二重結合で結合した炭素も１つと数える。）であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを意味する。
【００４９】
本発明における「被験者」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル等の哺乳動物を示すが、ヒトが好ましい。
【００５０】
本発明において用いられる「被験者由来の血液試料」は、全血液、血清、血漿等が挙げられる。「被験者由来の血清又は血漿」を用いることが、高精度な測定が可能となる点で好ましい。
【００５１】
例えば、被験者から採取した全血液を抗凝固剤が添加された採血管に採取し、転倒混和後、遠心分離することによって、血漿を回収することができる。また、被験者から採取した全血液を凝固させた後、遠心分離することによって、血清を回収することができる。
【００５２】
血液試料中の「式（１）で表される特定の構造を有するＧＭ３」の抽出方法は、公知の方法を用いることができる。より具体的には、後述する実施例に記載の方法等によって、血液試料中からＧＭ３を抽出することができる。
【００５３】
また、本発明の検出方法は、
（ｂ）上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する工程と、
（ｃ）上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する工程
を更に含む検出方法であることが好ましい。
【００５４】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）においては、上記（ａ）工程で測定した上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を比較する。
【００５５】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）においては、上記（ｂ）工程で有意な差があった場合に、上記被験者の、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患に関するマーカーの値が、上記健常人と比較して異常であると判定する。
「有意な差」とは、被験者由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量と、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定、２標本ｔ検定等を用いて統計解析を行った結果、Ｐ値が０．０５以下であることを言う。
【００５６】
被験者由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量を、健常人由来の血液試料中の上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３の量で割った値（倍）の下限が、１．２倍以上〜２．５倍以上の範囲のときに特定疾患のマーカー値が異常であると判断することが好ましく、１．４倍以上〜２．３倍以上の範囲のときに異常であると判断することがより好ましく、１．６倍以上〜２倍以上の範囲のときに異常であると判断することが特に好ましい。該割った値の下限の下限が低過ぎると、健常人を異常と判定してしまう場合があり、一方、該割った値の下限の上限が高過ぎると、異常な場合でも異常と判定しないことになってしまう場合がある。
【００５７】
「２つ以上が合併された疾患に関するマーカー」とは、「内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも２つ以上の疾患に関するマーカー」ということである。
【００５８】
上記工程（ｃ）は、上記式（１）で表される構造であるＧＭ３が、特に上記式（２）で表される構造であるガングリオシドＧＭ３（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）であるときに、特定疾患に関するマーカー（バイオマーカー）と相関関係があったことを見出したことに基づいている。
すなわち、例えば、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３という１つの分子を測定等することにより、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３と相関性がある「特定疾患のマーカーの値」についても予測することができ、該マーカーの値が健常人と比較して異常か否かを推測・判定することができ、そのような判定を基に、特定疾患を検出したり、特定疾患の発症リスクを検出したりする方法が特に好ましい。
【００５９】
上記内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、及び、高血圧症に関するマーカーとは、オートタキシン、ＨＯＭＡ−ＩＲ（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、ＨｂＡ１ｃ（Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ１ｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）、空腹時血糖、及び、血圧よりなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであることが好ましい。
【００６０】
上記アテローム性動脈硬化症に関するマーカーは、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、Ｃ反応性タンパク質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び、平均内膜中膜肥厚（ＩＭＴ）よりなる群から選択される少なくとも１つのマーカーであることが好ましい。
【００６１】
上記特定のガングリオシドＧＭ３の測定方法は、特に限定はないが、上記ＧＭ３に対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法、質量分析法、又は、液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いることが好ましい。これらの方法を組み合わせて使用してもよい。
【００６２】
上記ＧＭ３に対して抗体を作用させる方法としては、特に限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
【００６３】
上記高速液体クロマトグラフィー法（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する場合がある）としては、特に限定されないが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を使用することができる。
【００６４】
質量分析法としては、特に限定されないが、例えば、イオン化法として、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、及びＡＰＣＩ法等を使用することができる。また、分離部として、飛行時間型（ＴＯＦ型）、二重収束型、四重極収束型、イオントラップ型等を使用することができる。特定の構造を有するＧＭ３の測定（検出、定量）においては、イオン化法として、ＥＳＩ法又はＡＰＣＩ法、分離部として四重極収束型を使用することが好ましい。
【００６５】
「液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）」とは、上記の高速液体クロマトグラフィー法及び上記質量分析法を組み合わせた分析法である。
【００６６】
＜検出キット＞
本発明は、更に、標準物質としてガングリオシドＧＭ３を含有する、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出するキットであり、該ガングリオシドＧＭ３は、下記式（１）で表される特定の構造であることを特徴とする検出キットを提供することができる。
【化７】
2016072364.tif 000009
［式（１）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−は、置換基としてＯＨ基を有する、二重結合を有していてもよい炭素数１６以上２４以下の脂肪酸残基を示す。］
【００６７】
本発明の上記検出キットを用いれば、前記した効果をより好適に発揮することができる。すなわち、本発明の検出キットを用いれば、上記本発明の検出方法を用いて、容易に高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出する、又は、該疾患の発症リスクを検出することが可能である。
また、本発明の検出キットを用いれば、被験者が生活習慣病等の特定疾患に罹患しているか、又は、生活習慣病等の特定疾患を発症するリスクを有しているか検出することが可能であり、被験者の状態をより正確に把握することができる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。【００６９】
＜被験者＞
合計１２５人の日本人を被験者とした。その１２５人のうち、２６人は健常人であり、３９人は内臓脂肪型肥満症（ＶＦＡ）のみを有し、１５人はＶＦＡ及び高血糖症を併発し、２８人はＶＦＡ及び脂質異常症を併発していた。そして、残りの１７人は、ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発、すなわち、メタボリックシンドロームを発症していた。
なお、被験者全員にインフォームドコンセントを行い同意が得られた。【００７０】
＜脂質の抽出＞
５０μＬの血清に、１００ｎｇの１３Ｃで標識したＧＭ３（以下、「ｄ１８：１−［１３Ｃ］１６：０」と略記する）を内部標準として加え、凍結乾燥後、クロロホルム及びメタノールを１：１で混合した溶液５ｍＬに溶解した。得られた混合物を超音波処理し、４０℃で１時間保温後、４℃で３０分間遠心分離した（１５，０００×ｇ）。遠心分離後、上清を回収し、ペレットは上記と同じ抽出工程に供した。得られた上清を混合後、蒸発させて、血清から脂質を抽出した。【００７１】
＜質量分析＞
各ＧＭ３種の測定は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（イオン化法：エレクトロスプレー法、陰イオンモード、多重反応モニタリング）を用いた。ＬＣはＡｃｃｅｌａ  １２５０  Ｐｕｍｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、質量分析装置はＶａｎｔａｇｅ  ＡＭ（四重極型、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。牛乳から抽出したＧＭ３種の混合物を用いて、質量分析装置のキャリブレーションを行った。【００７２】
上記５０μＬの血清から抽出した脂質を５０μＬのメタノールに溶解後、６μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。該６μＬ中、内部標準であるｄ１８：１−［１３Ｃ］１６：０は１２ｎｇ含まれていた。【００７３】
ＬＣの設定条件を以下に示す。
（１）カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−１（長さ５０ｍｍ、野村化学）
（２）流速：５０μＬ／ｍｉｎ
（３）移動相：（ｉ）０．１％酢酸及び０．１％アンモニアを含む、Ｈ２Ｏ（２０％）／２−プロパノール（５０％）／メタノール（３０％）混合溶液（以下、「溶媒Ａ」とする）。（ｉｉ）０．１％酢酸及び０．１％アンモニアを含む、Ｈ２Ｏ（２％）／２−プロパノール（５０％）／メタノール（４８％）混合溶液（以下、「溶媒Ｂ」とする）。
（４）溶出条件：溶媒Ａの濃度を０分（分析開始時）から５分間１００％で送液し、その後３０分間で０％（溶媒Ｂの濃度を１００％）まで直線的に低下させた。その後４分間０％（溶媒Ｂの濃度を１００％）で送液し、１分後に１００％まで上昇させ、その後１０分間溶媒Ａの濃度を１００％で送液した。【００７４】
質量分析装置の設定条件を以下に示す。
（１）ニードル電圧：−２５００Ｖ
（２）キャピラリー温度：２０４℃
（３）ペーパライザー温度：３７３℃
（４）シースガス圧（窒素ガス）：５０（任意単位）
（５）イオンスイーブガス圧：０（任意単位）
（６）補助ガス圧（窒素ガス）：１５（任意単位）
（７）ＳレンズＲＦ振幅：２７６
（８）イオン源解離 （ＣＩＤ） 衝突エネルギー：０
（９）衝突圧力：１．０ｍＴｏｒｒ
（１０）衝突エネルギー：５３ｅＶ
（１１）スキャン時間：０．０１秒【００７５】
各ＧＭ３種の量は、内部標準（ｄ１８：１−［１３Ｃ］１６：０）を基に定量した。総ＧＭ３量は、検出された２３種のＧＭ３の合計量から計算した。【００７６】
＜統計解析＞
定量解析の結果は、平均標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で表した。すべての統計解析において、Ｐ≦０．０５の場合、統計的に有意差があると判断した。統計解析には、マン・ホイットニーのＵ検定又は２標本ｔ検定を用い、スピアマンの順位相関係数を求めた。
また、実施例５において、全てのＧＭ３種について、多変量解析を行った。説明変数として、肥満度指数（ＢＭＩ；Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）、腹囲、踵骨骨密度、弛緩期血圧、収縮期血圧、ブリンクマン指数、駆出率、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、血小板、ＡＳＴ（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ））、ＡＬＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスフェラーゼ（ＧＰＴ））、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、トリグリセライド、クレアチニン、尿酸、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）、Ｃ反応性タンパク質、ＬＤＬ−ｃ、遊離脂肪酸、総アディポネクチン、オートタキシン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、及び、ＩＭＴを調べた。多変量解析ではＸＬＳＴＡＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１４．４．０２、Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ社）を用い、それ以外の統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いた。【００７７】
実施例１
＜マーカー及び各疾患との相関性＞
（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、メタボリックシンドローム等の特定疾患と関連があるマーカー（指標）を測定した。結果を、表１に示す。表１中の（１）〜（５）は、（１）健常人、（２）内臓脂肪型肥満症のみ発症している患者、（３）内臓脂肪型肥満症及び高血糖症を併発している患者、（４）内臓脂肪型肥満症及び脂質異常症を併発している患者、及び（５）内臓脂肪型肥満症、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者である。【００７８】
また、表中、「ｎｓ」は、Ｐ＞０．０５、「＊」は、Ｐ≦０．０５、「＊＊」は、Ｐ≦０．０１、「＊＊＊」は、Ｐ≦０．００１、「＊＊＊＊」は、Ｐ≦０．０００１であることを示す。表中の数字は、何れも平均±標準偏差である。【００７９】
【表１】
2016072364.tif 000010
【００８０】
実施例２
＜各疾患における総ＧＭ３量の比較＞
（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、総ＧＭ３量を測定した。結果を、図１に示す。図１中の縦軸は、血清サンプル中に含まれる内部標準（「ｄ１８：１−［１３Ｃ］１６：０」）の量を１００％としたときの、総ＧＭ３量（％）である。また、図中の「＊」は、Ｐ≦０．０５を表す。【００８１】
図１の結果より、総ＧＭ３量は、（２）ＶＦＡのみを発症している場合、健常人と比べて有意な差があったが、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している場合、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している場合、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合は、健常人と比べて有意な差はなかった。【００８２】
実施例３
＜総ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
総ＧＭ３及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン、平均ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を、図２に示す。【００８３】
図２の結果、総ＧＭ３量は、総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、平均ＩＭＴ、空腹時血糖、及びＨｂＡ１ｃとは相関性があったが、オートタキシン、インスリン、及びＨＯＭＡ−ＩＲとは相関性がなかった。【００８４】
＜実施例２及び３の結果＞
実施例２及び３の結果より、総ＧＭ３量を測定・比較により、患者がメタボリックシンドローム等の特定疾患である又はメタボリックシンドローム等の特定疾患になる可能性があるか否かを正確には判断できないことが示唆された。【００８５】
実施例４
＜各ＧＭ３種及び生活習慣病との関連性＞
ＧＭ３には、ＧＭ３中のセラミド部分の炭化水素基の炭素数、二重結合の数、置換基の有無や種類等により、多くの分子種が存在している。実施例２及び３の結果を受け、総ＧＭ３量を測定するのではなく、特定のＧＭ３分子種を測定することにより、生活習慣病や特定疾患に関する、より正確な被験者の情報を取得することができるのでないかと考え、各ＧＭ３種及び各疾患との相関性を調べた。
実施例１と同様に、（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、各ＧＭ３種の量を測定した。結果を、図３Ａ及びＢに示す。【００８６】
図３Ａの横軸は、血清中のＧＭ３に最も多く含まれているＧＭ３種である、「ｄ１８：１−２４：０」から、含有量が多い順に並べた。図３Ｂの横軸は、血清中のＧＭ３に１３番目に多く含まれているＧＭ３種である、「ｄ１８：１−１６：１」から、含有量が多い順に並べた。
各ＧＭ３種の構造について、例えば「ｄ１８：１−２４：０」の場合、「ｄ１８：１」は、ＧＭ３のスフィンゴミエリン部分が、炭素数１８の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを意味する。「２４：０」は、ＧＭ３の脂肪酸が、炭素数２４の炭化水素基であり、該炭化水素基中に二重結合が存在しないことを意味する。例えば、「ｄ１８：１−２４：０」が、脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有する場合は、「ｄ１８：１−ｈ２４：０」と表記する。【００８７】
図３中の縦軸は、血清サンプル中に含まれる内部標準（「ｄ１８：１−［１３Ｃ］１６：０」）の量を１００％としたときの、各ＧＭ３種の量（％）である。また、図中の「＊」は、Ｐ≦０．０５、「＊＊」は、Ｐ≦０．０１、「＊＊＊」は、Ｐ≦０．００１、「＊＊＊＊」は、Ｐ≦０．０００１であることを示す。表中の数字は、何れも平均±標準偏差である。マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。【００８８】
図３の結果、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有する、多くのＧＭ３種（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」、「ｄ１８：１−ｈ２０：０」、「ｄ１８：１−ｈ２１：０」、「ｄ１８：１−ｈ１８：１」）において、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて有意な差があった。また、「ｄ１８：１−２０：０」及び「ｄ１８：１−２１：１」においても、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて有意な差があった。
特に「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」において、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合に、健常人と比べて、有意に１．７倍以上増加していた。
以上の結果から、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有するＧＭ３（ヒドロキシル化ＧＭ３）が、メタボリックシンドローム等の特定疾患や生活習慣病の検出に有効であることが示唆された。【００８９】
実施例５
＜各ＧＭ３種及び疾患のマーカーとの相関性＞
血清中のＧＭ３に多く含まれていたＧＭ３種（図３Ａの横軸に記載された１２種）及び疾患のマーカーとの相関関係を、多変量解析を用いて解析した。結果を表２に示す。
上記疾患マーカーは以下の通りである。
（１）肥満のマーカー：ＢＭＩ
（２）メタボリックシンドロームのマーカー：ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン（表２中、「ＡＴＸ」と略記する）、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＨｂＡ１ｃ
（３）アテローム性動脈硬化症のマーカー：リゾホスファチジルコリン（表２中、「ＬＰＣ」と略記する）、スフィンゴミエリン（表２中、「ＳＭ」と略記する）、駆出率（表２中、「ＥＦ」と略記する）、Ｃ反応性タンパク質（表２中、「ＣＲＰ」と略記する）、血小板、トリグリセライド
（４）高血圧症のマーカー：血圧
（５）腎症のマーカー：クレアチニン
（６）その他のマーカー：年齢【００９０】
【表２】
2016072364.tif 000011
【００９１】
表２中の「Ｃ２４：０」は、図３Ａの「ｄ１８：１−２４：０」に該当する。図３Ａと同様に、血清中のＧＭ３に含まれる量が多い順に並べた。【００９２】
表２より、ヒドロキシル化ＧＭ３（ｈＣ２４：０、ｈＣ２４：１、ｈＣ２２：０）が、ヒドロキシル化されていないＧＭ３と比べて、より多くの特定疾患に関連があるマーカーと相関性があることがわかった。特に、下記式（２）の構造を有する「ｈＣ２４：１」（［ｈＣ２４：１］ＧＭ３）は、年齢、オートタキシン、スフィンゴミエリン、血圧、ＨＯＭＡ−ＩＲ、リゾホスファチジルコリン、ＨｂＡ１ｃ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、Ｃ反応性タンパク質という多くのマーカーと相関性があり、特定疾患の検出・診断に用いることが有効であると示唆された。
また、表２の結果より、すべてのＧＭ３種が特定疾患に関与する分子と相関性があるわけではないこともわかった。特定疾患とあまり関連性がない分子種の増加に伴い、総ＧＭ３量は増加する場合も考えられるので、総ＧＭ３量を、特定疾患の検出・診断のマーカーとして用いることは、偽陽性又は誤った検出・診断を導くおそれがあることが示唆される。
【化８】
2016072364.tif 000012
［式（２）中、Ｒ１は、ガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示す。］【００９３】
実施例６
＜［ｈＣ２４：１］ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
実施例５の結果より、メタボリックシンドローム等の特定疾患のマーカーとして、また生活習慣病や特定疾患のマーカーとして、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３を用いることが有効であることが示唆された。次に、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を図４に示す。【００９４】
図４の結果、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３量は、総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃと相関性があった。【００９５】
実施例７
＜［ｈＣ２４：１］の含有量の測定＞
血清中のＧＭ３全体、スフィンゴミエリン全体、セラミド全体に含まれる、［Ｃ２４：１］に対する［ｈＣ２４：１］量を測定した。結果を図５に示す。
図５の縦軸は、「脂肪酸の炭素数が２４であり、該脂肪酸中に二重結合が１つ存在するもの」（［Ｃ２４：１］と略記する）の量に対する、「脂肪酸の炭素数が２４であり、水酸基を有し、該脂肪酸中に二重結合が１つ存在するもの」（［ｈＣ２４：１］と略記する）の割合を示している。【００９６】
図５の結果、ＧＭ３に含まれる［Ｃ２４：１］の２８．３１％が、［ｈＣ２４：１］であった。
一方、スフィンゴミエリンに含まれる［Ｃ２４：１］の０．６７％が、［ｈＣ２４：１］であり、セラミドに含まれる［Ｃ２４：１］の０．４５％が［ｈＣ２４：１］であった。【００９７】
これより、ＧＭ３が特定疾患の患者で多いことを前提にすると、「置換基としてＯＨ基を有し、かつ二重結合を１つ有している炭素数２４の脂肪酸」が、特にＧＭ３の中に集中して結合していた（存在していた）ことから、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３が、特に特定疾患に関するマーカーとして好適であることの立証が得られた。
図５の結果より、［ｈＣ２４：１］ＧＭ３等の式（１）で表されるＧＭ３が、特定疾患の検出方法、特定疾患の発症リスクの検出方法として好適である理由・機序が明らかになった。【００９８】
実施例８
＜各疾患におけるヒドロキシル化ＧＭ３量の比較＞
（１）健常人（２６人）、（２）ＶＦＡのみ発症している患者（３９人）、（３）ＶＦＡ及び高血糖症を併発している患者（１５人）、（４）ＶＦＡ及び脂質異常症を併発している患者（２８人）、及び（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している患者（すなわち、メタボリックシンドロームを発症している患者）（１７人）における、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）と非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の量をそれぞれ測定した。結果を、図６に示す。図中の「＊」は、Ｐ≦０．０１を表す。
図６Ａの縦軸は、３つのヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）、図６Ｂの縦軸は、３つの非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）を示す。【００９９】
図６Ａの結果より、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量は、（５）ＶＦＡ、高血糖症及び脂質異常症を併発している場合、健常人と比べて有意な差があった。
一方、図６Ｂの結果より、非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量は、上記（２）〜（５）何れの場合でも、健常人と比べて有意な差はなかった。【０１００】
実施例９
＜ヒドロキシル化ＧＭ３及び各疾患のマーカーとの相関性＞
ヒドロキシル化ＧＭ３又は非ヒドロキシル化ＧＭ３、及び各疾患のマーカー（総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃ）との相関関係を、スピアマンの順位相関を用いて解析した。結果を図７及び８に示す。
図７は３つのヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）と各疾患のマーカーとの相関関係を示し、図８は３つの非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量（ｎｇ／μＬ）と各疾患のマーカーとの相関関係を示す。【０１０１】
図７の結果、ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−ｈ２４：０」、「ｄ１８：１−ｈ２４：１」、「ｄ１８：１−ｈ２２：０」）の合計量は、総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、オートタキシン、ＩＭＴ、空腹時血糖、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃと相関性があった。
一方、図８の結果、非ヒドロキシル化ＧＭ３（「ｄ１８：１−２４：０」、「ｄ１８：１−２４：１」、「ｄ１８：１−２２：０」）の合計量は、総コレステロール、ＬＤＬ−ｃ、空腹時血糖とは相関性があったが、オートタキシン、ＩＭＴ、インスリン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨｂＡ１ｃとは相関性がなかった。【０１０２】
＜実施例８及び９の結果＞
実施例８及び９の結果から、ＧＭ３の脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有するＧＭ３（ヒドロキシル化ＧＭ３）が、メタボリックシンドローム等の特定疾患や生活習慣病の検出に有効であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明の検出方法は、内臓脂肪型肥満症、高血糖症、脂質異常症、高血圧症、及び、アテローム性動脈硬化症よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患若しくは２つ以上が合併された疾患を検出、又は、該疾患の発症リスクを検出することができ、被験者の状態をより正確に把握することができる。従って、本発明は、診断薬、研究用試薬、及び臨床検査の分野等で利用が可能である。【０１０４】
本願は、２０１１年１１月５日に出願した日本の特許出願である特願２０１４−２２４８１１に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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