(57)【要約】ポリイソプレノイド生合成経路において、イソプレンモノマー生合成の律速酵素であるＨＭＧＲの特定アミノ酸残基を変異した変異タンパク質を提供する。本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換した変異タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換した変異タンパク質。
【請求項２】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位、５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号１０で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける７０位、２１４位、２４６位、２７６位、４００位、４５９位、４９８位、５６３位のアミノ酸残基である請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける４１１位、４７０位、５０９位、５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７０で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける３５位、９４位、１３３位、１９８位のアミノ酸残基である請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７１で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける８１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、５７４位のアミノ酸残基である請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項５】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７２で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける２４３位、２７５位、３０５位、３５７位、４２９位、４８８位、５２７位、５９２位のアミノ酸残基である請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項６】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７３で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける７３位、２４３位、３０５位、３５７位、４２９位、４８８位のアミノ酸残基である請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項７】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換した請求項１〜６のいずれかに記載の変異タンパク質。
【請求項８】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換した請求項１〜６のいずれかに記載の変異タンパク質。
【請求項９】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換した請求項１〜６のいずれかに記載の変異タンパク質。
【請求項１０】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換した請求項１〜６のいずれかに記載の変異タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の変異タンパク質を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の変異タンパク質を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の変異タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
請求項１３記載の遺伝子を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法。
【請求項１５】
請求項１３記載の遺伝子を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法。
【請求項１６】
請求項１３記載の遺伝子を保有する組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１３記載の遺伝子を保有する植物。
【請求項１８】
請求項１７記載の植物を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の植物を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法。
【請求項２０】
請求項１３記載の遺伝子を保有するイソプレノイド産生植物。
【請求項２１】
請求項２０記載のイソプレノイド産生植物を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法。
【請求項２２】
請求項２０記載のイソプレノイド産生植物を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法。
【請求項２３】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法。
【請求項２４】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換する請求項２３記載の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法。
【請求項２５】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換する請求項２３記載の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法。
【請求項２６】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換する請求項２３記載の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法。
【請求項２７】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換する請求項２３記載の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法。
【請求項２８】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換する工程を含む変異タンパク質の製造方法。
【請求項２９】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換する請求項２８記載の変異タンパク質の製造方法。
【請求項３０】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換する請求項２８記載の変異タンパク質の製造方法。
【請求項３１】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換する請求項２８記載の変異タンパク質の製造方法。
【請求項３２】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換する請求項２８記載の変異タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異タンパク質、該変異タンパク質の製造方法、該変異タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を保有する組換えベクター及び植物、メバロン酸産生量及びイソプレノイド産生量を制御する方法、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリイソプレノイド生合成経路において、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（以下、ＨＭＧＲ又はＨＭＧ−ＣｏＡ  レダクターゼとも称する）は、イソプレンモノマー（イソペンテニル二リン酸）生合成における律速酵素である。ＨＭＧＲは、翻訳後の可逆的リン酸化によって酵素活性が制御されていることが知られており、具体的には、動物において、ＨＭＧＲの翻訳後の調節機構として、Ｃ末端側にあるセリンのリン酸化による酵素活性の不活性化がよく知られている。このことは、植物においても確認されており、具体的には、非特許文献１において、シロイヌナズナにおけるＣ末端側にあるセリンに相当する５７７番目のセリン残基のリン酸化によって酵素活性が低下することが確かめられている。【０００３】
また、コレステロール生合成阻害剤を用いてポリイソプレノイドの産生量を増やす方法など、遺伝子組換えを用いずにポリイソプレノイド産生量を増加する方法も挙げられるが、未だポリイソプレノイドの産生量を増加させる等の方法には改良の余地があり、更なる技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄａｌｅ  Ｓ、他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３３（２）、５０６−５１３（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記課題を解決し、ポリイソプレノイド生合成経路において、イソプレンモノマー生合成の律速酵素であるＨＭＧＲの特定アミノ酸残基を変異した変異タンパク質を提供することを目的とする。また、該変異タンパク質の製造方法、該変異タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を保有する組換えベクター及び植物を提供し、更に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法を提供することを目的とする。ひいては、メバロン酸産生量及びイソプレノイド産生量を制御する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換した変異タンパク質に関する。【０００７】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号１０で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける７０位、２１４位、２４６位、２７６位、４００位、４５９位、４９８位及び５６３位のアミノ酸残基であることが好ましい。【０００８】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７０で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける３５位、９４位、１３３位及び１９８位のアミノ酸残基であることが好ましい。【０００９】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７１で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける８１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基であることが好ましい。【００１０】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７２で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける２４３位、２７５位、３０５位、３５７位、４２９位、４８８位、５２７位及び５９２位のアミノ酸残基であることが好ましい。【００１１】
前記シロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２８７位、３３９位、４１１位及び４７０位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、配列番号７３で示されるパラゴムノキの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける７３位、２４３位、３０５位、３５７位、４２９位及び４８８位のアミノ酸残基であることが好ましい。【００１２】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。【００１３】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換することが好ましい。【００１４】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換することが好ましい。【００１５】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。【００１６】
本発明はまた、前記変異タンパク質を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法に関する。
また、前記変異タンパク質を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法に関する。【００１７】
本発明は、前記変異タンパク質をコードする遺伝子に関する。
また、前記遺伝子を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法に関する。
また、前記遺伝子を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法に関する。
また、前記遺伝子を保有する組換えベクターに関する。【００１８】
本発明は、前記遺伝子を保有する植物に関する。
また、前記植物を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法に関する。
また、前記植物を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法に関する。【００１９】
本発明はまた、前記遺伝子を保有するイソプレノイド産生植物に関する。
また、前記イソプレノイド産生植物を用いて、イソプレノイド産生量を制御する方法に関する。
また、前記イソプレノイド産生植物を用いて、メバロン酸産生量を制御する方法に関する。【００２０】
本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性の制御方法に関する。【００２１】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。【００２２】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換することが好ましい。【００２３】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換することが好ましい。【００２４】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。【００２５】
本発明は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換する工程を含む変異タンパク質の製造方法に関する。【００２６】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。【００２７】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換することが好ましい。【００２８】
前記配列番号１の９１位及び３３９位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換することが好ましい。【００２９】
前記配列番号１の２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の変異タンパク質は、ポリイソプレノイド生合成経路において、イソプレンモノマー生合成の律速酵素であるＨＭＧＲの特定アミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換した変異タンパク質である。従って、該変異タンパク質又は、該変異タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を作製することにより、ＨＭＧＲの酵素活性を制御、ひいてはメバロン酸及びイソプレノイド産生量を制御することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明者らは、ポリイソプレノイドの生合成経路において、ポリイソプレノイドの生合成量を増加させるために、種々の検討を行った。ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を図１に示す。図１に示すように、ポリイソプレノイドの生合成経路には様々な酵素が関与しているが、そのなかでも、ポリイソプレノイドの基本骨格となるイソプレンモノマーを生合成する際に律速となる３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）について着目した。
【００３３】
ＨＭＧＲは、Ｃ末端側に存在するセリン、例えば、シロイヌナズナ由来のＨＭＧＲでは、５７７番目のセリンが活性の制御に関与していることが広く知られている。具体的には、Ｃ末端側に存在するセリンがリン酸化されることでＨＭＧＲの活性が失われる。そのため、セリンのリン酸化を防止するために該セリンをアラニンに置換した変異体（例えば、非特許文献１）が広く知られている。そして、該変異体は、もはやリン酸化によって活性が制御されることはないものと広く信じられていた。このように、本願出願時には、Ｃ末端側に存在するセリンをアラニンに置換することにより、もはやＨＭＧＲはリン酸化により活性の制御を受けないものと一般的に考えられていた。
【００３４】
このような技術常識が存在していたものの、本発明者らは、ＨＭＧＲのアミノ酸残基のリン酸化について、更なる検討を進めた結果、既知のセリン残基以外に新たなアミノ酸残基が酵素活性の制御に関与していることを見出すことに成功した。
【００３５】
具体的には、非特許文献１で知られているＨＭＧＲのＣ末端側のセリンをアラニンに置換し、当該セリンのリン酸化に伴うＨＭＧＲの酵素活性の不活性化が起きないように処置した変異ＨＭＧＲを発現するシロイヌナズナ形質転換植物体において、更にホスファターゼ処理を行ったところ、当該変異ＨＭＧＲの酵素活性が上昇することを見出した。このことから、ＨＭＧＲの酵素活性の制御に関与するリン酸化サイトとして、既知のセリン残基以外のアミノ酸残基が存在することが示唆された。これは、上述の技術常識を打ち破る非常に大きな発見であり、当業者であっても予測することができないものである。なお、シロイヌナズナの生体内では、リン酸化はリン酸化酵素（カイネース）により必要に応じて行われている。
【００３６】
次に、本発明者らは、上記示唆に基づいて、ＨＭＧＲの酵素活性を制御する新たなリン酸化サイトの探索を行った。具体的には、ＨＭＧＲの酵素活性の制御に関与する既知のセリン残基（上記５７７番目のセリンに相当）以外のアミノ酸残基の選抜を行い、種々のＨＭＧＲにおいて、保存性の高い配列、すなわち保存領域中に含まれるアミノ酸残基のなかから、ＨＭＧＲの活性を制御することが可能な９個のアミノ酸残基を特定した。そして、特定した９個それぞれの特定アミノ酸残基を欠失、又は置換した変異タンパク質を作製することで、ＨＭＧＲの酵素活性を上昇、低下及び維持できること、すなわちＨＭＧＲの酵素活性を制御できることを明らかにした。
なお、リン酸化サイトとなり得るアミノ酸残基としては、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、リジンが挙げられる。
【００３７】
このことにより、上記本発明で作製した変異タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を作製することで、該形質転換体のＨＭＧＲの酵素活性を制御する、ひいてはメバロン酸及びイソプレノイド産生量を制御することが可能である。
【００３８】
具体的には、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位に相当するスレオニン残基、及び３３９位に相当するセリン残基を、他のアミノ酸残基に、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより作成された変異ＨＭＧＲは、酵素活性が増強する。
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける２２５位に相当するチロシン残基、２５７位に相当するチロシン残基、２８７位に相当するセリン残基、４１１位に相当するセリン残基、４７０位に相当するスレオニン残基、５０９位に相当するスレオニン残基、及び５７４位に相当するチロシン残基を、他のアミノ酸残基に、好ましくはアラニン、フェニルアラニン又はシステインに置換することにより作成された変異ＨＭＧＲは、酵素活性が増強する。
よって、これらの変異ＨＭＧＲをコードする遺伝子が導入された植物においては、酵素活性が増強され、下流の代謝産物量を増強させることができる。よって、例えば、これらの変異ＨＭＧＲをコードする遺伝子をパラゴムノキに導入することにより、パラゴムノキにおいて酵素活性を増強でき、下流の代謝物である天然ゴムの生合成量を増大させることができる。
【００３９】
一方、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位に相当するスレオニン残基、ならびに３３９位に相当するセリン残基を、他のアミノ酸残基に、好ましくはアラニン又はフェニルアラニンに置換することにより作成された変異ＨＭＧＲは、酵素活性が減少する。
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける２２５位に相当するチロシン残基、２５７位に相当するチロシン残基、２８７位に相当するセリン残基、４１１位に相当するセリン残基、４７０位に相当するスレオニン残基、５０９位に相当するスレオニン残基、及び５７４位に相当するチロシン残基を、他のアミノ酸残基に、好ましくはアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することにより作成された変異ＨＭＧＲは、酵素活性が減少する。
よって、これらの変異ＨＭＧＲをコードする遺伝子が導入された植物においては、酵素活性が減少され、下流の代謝産物量を減少させることができる。よって、例えば、これらの変異ＨＭＧＲをコードする遺伝子をジャガイモ（ソラニン）、トマト（トマチン）、レタス（ラクチュシン）、ダイズ（グループAソヤサポニン）等の有害物質や苦み物質を可食部に蓄積する植物に導入することにより、可食部においてＨＭＧＲの酵素活性を減少でき、下流の代謝物で、有害成分であるステロイドアルカロイドやセスキテルペノイドを減少させることができる。
【００４０】
植物において、従来から行われているＨＭＧＲの機能増大法は、もっぱら遺伝子を過剰発現させる方法であったが、該酵素の複数のアミノ酸が活性に寄与することは全く想定されていなかった。遺伝子の過剰発現は、遺伝子組換えが前提となるが、本発明によればアミノ酸置換で活性制御が可能である。そのため非組換えによる改変が可能であり、遺伝子組換え体よりも扱いが極めて容易で、より産業応用が期待される。
【００４１】
なお、本明細書において、ＨＭＧＲは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）をメバロン酸（ＭＶＡ）にする還元反応を触媒する酵素であり、ＨＭＧＲの酵素活性とは該還元反応の活性を意味し、様々な生物種が保有する酵素である。更に、１種の生物の中でも複数種類のＨＭＧＲを保有することもある。
また、リン酸化は、生物が保有するカイネースによって生体内で適宜行われている反応で、生体内の酵素等の機能を有するタンパク質において、リン酸化や脱リン酸化を行うことで、その機能の有無、強弱等を制御している。
【００４２】
（変異タンパク質）
本発明の変異タンパク質は、ＨＭＧＲにおいて、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失又は他のアミノ酸残基に置換することで得られる。
【００４３】
なお、上記配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらのアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基はそれぞれ、ＨＭＧＲの種類に関係なく、ＨＭＧＲにおいて保存性の高い配列中のアミノ酸残基、すなわちＨＭＧＲにおける保存領域中に含まれるアミノ酸残基である。保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、タンパク質において、同様の機能を有する部位であると推察される。配列番号１で示されるシロイヌナズナ由来のＨＭＧＲと種類の異なるＨＭＧＲが共通する保存領域を保有する場合、上記配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位又は５７４位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基も同時に保有することが推察でき、保存領域における当該アミノ酸残基は、配列番号１に示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応するアミノ酸残基と同様の役割を担っていることも推察できる。また、本発明において、ＨＭＧＲの保存領域はあらかじめ、マルチプルシーケンスアライメントにより選定したもので、上記位置のアミノ酸残基は、保存性が高いと判定されたものの中から選抜した位置のものである。
なお、本明細書において、マルチプルシーケンスアライメントは、後述の実施例の方法により実施できる。
【００４４】
配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位又は５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域としては、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位又は５７４位の各アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む保存領域であれば特に限定されないが、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける各保存領域の配列に対する配列同一性がそれぞれ、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは７５％以上、より更に好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、より特に好ましくは８８％以上、最も好ましくは９０％以上、より最も好ましくは９２％以上、更により最も好ましくは９５％以上、特に最も好ましくは９８％以上であり、上限は限定されない。
【００４５】
なお、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける上記各特定アミノ酸残基を含む保存領域はそれぞれ、４８位のアミノ酸残基を含む保存領域が４８〜５８番目のアミノ酸配列で表される配列番号２、９１位のアミノ酸残基を含む保存領域が８５〜９１番目のアミノ酸配列で表される配列番号３、２２５位のアミノ酸残基を含む保存領域が２２２〜２３５番目のアミノ酸配列で表される配列番号４、２５７位のアミノ酸残基を含む保存領域が２５６〜２６９番目のアミノ酸配列で表される配列番号５、２８７位のアミノ酸残基を含む保存領域が２８２〜２９９番目のアミノ酸配列で表される配列番号９１、３３９位のアミノ酸残基を含む保存領域が３３１〜３３９番目のアミノ酸配列で表される配列番号６、４１１位のアミノ酸残基を含む保存領域が４０１〜４１６番目のアミノ酸配列で表される配列番号７、４７０位のアミノ酸残基を含む保存領域が４６８〜４８１番目のアミノ酸配列で表される配列番号８、５０９位のアミノ酸残基を含む保存領域が４９７〜５２１番目のアミノ酸配列で表される配列番号９、５７４位のアミノ酸残基を含む保存領域が５７０〜５７８番目のアミノ酸配列で表される配列番号９２で表される配列を意味し、上記配列同一性はこれらの保存領域の配列に対する配列同一性を意味する。
【００４６】
配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける各保存領域の配列に対する配列同一性は、上述の通りであるが、より好ましくは以下の通りである。
９１位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する９１位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号３）に対する配列同一性は、好ましくは７１％以上、より好ましくは８５％以上、特に好ましくは１００％である。
２２５位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する２２５位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号４）に対する配列同一性は、好ましくは６４％以上、より好ましくは７１％以上、更に好ましくは７８％以上、特に好ましくは８５％以上、最も好ましくは９２％以上、より最も好ましくは１００％である。
２５７位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する２５７位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号５）に対する配列同一性は、好ましくは６４％以上、より好ましくは７１％以上、更に好ましくは７８％以上、特に好ましくは８５％以上、最も好ましくは９２％以上、より最も好ましくは１００％である。
２８７位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する２８７位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号９１）に対する配列同一性は、好ましくは６０％以上、より好ましくは７１％以上、更に好ましくは７８％以上、特に好ましくは８２％以上、最も好ましくは８７％以上、より最も好ましくは１００％である。
３３９位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する３３９位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号６）に対する配列同一性は、好ましくは６６％以上、より好ましくは７７％以上、更に好ましくは８８％以上、特に好ましくは１００％である。
４１１位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する４１１位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号７）に対する配列同一性は、好ましくは６２％以上、より好ましくは６８％以上、更に好ましくは７５％以上、特に好ましくは８１％以上、より特に好ましくは８７％以上、最も好ましくは９３％以上、より最も好ましくは１００％である。
４７０位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する４７０位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号８）に対する配列同一性は、好ましくは６４％以上、より好ましくは７１％以上、更に好ましくは７８％以上、特に好ましくは８５％以上、最も好ましくは９２％以上、より最も好ましくは１００％である。
５０９位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する５０９位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号９）に対する配列同一性は、好ましくは６８％以上、より好ましくは７２％以上、更に好ましくは７６％以上、特に好ましくは８４％以上、最も好ましくは９６％以上、より最も好ましくは１００％である。
５７４位のアミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基を含む保存領域において、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの対応する５７４位のアミノ酸残基を含む保存領域（配列番号９２）に対する配列同一性は、好ましくは７１％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは１００％である。
【００４７】
上記９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位の各アミノ酸残基、並びにそれらに相当する位置の各アミノ酸残基としては、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、リジンであることが好ましく、セリン、スレオニン、チロシンであることがより好ましい。上記アミノ酸残基は、生体内でリン酸化を受けやすいアミノ酸であるため、ＨＭＧＲの酵素活性の制御に大きく関与するものと推察できる。
【００４８】
具体的には、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおいては、９１位のスレオニン、２２５位のチロシン、２５７位のチロシン、２８７位のセリン、３３９位のセリン、４１１位のセリン、４７０位のスレオニン、５０９位のスレオニン、５７４位のチロシンである。
【００４９】
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位の各アミノ酸残基に相当する位置のアミノ酸残基としては、例えば、配列番号１０で示されるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧＲ（ＨＭＧ１）ではそれぞれ、９１位のスレオニンが７０位のスレオニン、２２５位のチロシンが２１４位のチロシン、２５７位のチロシンが２４６位のチロシン、２８７位のセリンが２７６位のセリン、４１１位のセリンが４００位のセリン、４７０位のスレオニンが４５９位のスレオニン、５０９位のスレオニンが４９８位のスレオニン、５７４位のチロシンが５６３位のチロシンに相当し、３３９位のセリンを含む保存領域に対応する保存領域を保有しないため、３３９位のセリンに相当するアミノ酸残基は保有しない。
また、配列番号１１で示されるＴａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｓ由来のＨＭＧＲではそれぞれ、９１位のスレオニンが８１位のスレオニン、２２５位のチロシンが２２３位のチロシン、２８７位のセリンが２８５位のセリン、４１１位のセリンが４０９位のセリン、４７０位のスレオニンが４６８位のスレオニン、５０９位のスレオニンが５０７位のスレオニン、５７４位のチロシンが５７２位のチロシンに相当し、２５７位のチロシン、３３９位のセリンを含む各保存領域に対応する各保存領域を保有しないため、２５７位のチロシン、３３９位のセリンに相当する各アミノ酸残基は保有しない。
また、配列番号７０で示されるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧＲ（ＨＭＧ２）ではそれぞれ、４１１位のセリンが３５位のセリン、４７０位のスレオニンが９４位のスレオニン、５０９位のスレオニンが１３３位のスレオニン、５７４位のチロシンが１９８位のチロシンに相当し、９１位、２２５位、２５７位、３３９位それぞれのアミノ酸残基を含む各保存領域に対応する各保存領域を保有しないため、９１位、２２５位、２５７位、３３９位それぞれに相当する各アミノ酸残基は保有しない。
また、配列番号７１で示されるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧＲ（ＨＭＧ３）ではそれぞれ、９１位のスレオニンが８１位のスレオニン、２２５位のチロシンが２２５位のチロシン、２５７位のチロシンが２５７位のチロシン、２８７位のセリンが２８７位のセリン、３３９位のセリンが３３９位のセリン、４１１位のセリンが４１１位のセリン、４７０位のスレオニンが４７０位のスレオニン、５０９位のスレオニンが５０９位のスレオニン、５７４位のチロシンが５７４位のチロシンに相当する。
また、配列番号７２で示されるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧＲ（ＨＭＧ４）ではそれぞれ、２２５位のチロシンが２４３位のチロシン、２５７位のチロシンが２７５位のチロシン、２８７位のセリンが３０５位のセリン、３３９位のセリンが３５７位のセリン、４１１位のセリンが４２９位のセリン、４７０位のスレオニンが４８８位のスレオニン、５０９位のスレオニンが５２７位のスレオニン、５７４位のチロシンが５９２位のチロシンに相当し、９１位のスレオニンを含む保存領域に対応する保存領域を保有しないため、９１位のスレオニンに相当するアミノ酸残基は保有しない。
また、配列番号７３で示されるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧＲ（ＨＭＧ５）ではそれぞれ、９１位のスレオニンが７３位のスレオニン、２２５位のチロシンが２４３位のチロシン、２８７位のセリンが３０５位のセリン、３３９位のセリンが３５７位のセリン、４１１位のセリンが４２９位のセリン、４７０位のスレオニンが４８８位のスレオニンに相当し、２５７位のチロシン、５０９位のスレオニンを含む各保存領域に対応する各保存領域を保有しないため、２５７位のチロシン、５０９位のスレオニンに相当する各アミノ酸残基は保有しない。
これらを含む具体例を後述の表１に示した。
【００５０】
本発明の変異タンパク質は、上記９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失させる、又は他のアミノ酸残基に置換させるというアミノ酸残基の改変により得られる。上記改変により、生体内で必要に応じて起きる上記特定アミノ酸残基の可逆的なリン酸化を人工的にコントロールすることで、ＨＭＧＲの酵素活性を制御することができ、ひいてはメバロン酸産生量を制御することも可能である。また、ＨＭＧＲはポリイソプレノイド生合成経路の律速酵素であるため、イソプレノイド産生量を制御することも可能となる。
【００５１】
置換する他のアミノ酸残基としては、置換前のアミノ酸以外であれば特に限定されないが、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸である。特にアラニン、フェニルアラニン又はシステインに置換するとリン酸化が起きにくくなり、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換すると擬似的にリン酸化を起こし、恒常的にリン酸化した状態にすることができる。欠失又は置換する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよく、例えば、欠失又は置換部位の塩基配列をオーバーラップするプライマーにおいて、欠失又は置換部位のアミノ酸残基をコードする３塩基をすべて欠失したもの、又は置換する他のアミノ酸残基をコードする塩基に置換したもの（１〜３塩基置換）を用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、特定アミノ酸残基を欠失又は置換させることができる。
【００５２】
ＨＭＧＲにおいて、上記９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換すると、擬似的にリン酸化が起きたような状態、すなわち、恒常的にリン酸化を起こした状態にでき、これにより、ＨＭＧＲの酵素活性を制御できる。
【００５３】
また、ＨＭＧＲにおいて、上記９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失する又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換することが好ましい。欠失、又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換すると、リン酸化を起こさないようにする、すなわち、リン酸化サイトを潰すことができ、これにより、ＨＭＧＲの酵素活性を制御できる。
なお、リン酸化サイトを潰す点で、欠失する、又はアラニンに置換する、フェニルアラニンに置換する、若しくはシステインに置換することは同様であるが、元のアミノ酸残基が与えていたタンパク質への影響を考慮すると、元のアミノ酸残基と構造（立体的な大きさ、専有面積等）が類似したものに置換することが好ましい。具体的には、元のアミノ酸残基がチロシンの場合、フェニルアラニンに置換することが好ましく、セリン又はスレオニンの場合、アラニン又はシステインに置換することが好ましい。
【００５４】
特に、上記９１位及び３３９位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましく、９１位及び３３９位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することがより好ましい。上記置換により、ＨＭＧＲの酵素活性を向上することができる。
【００５５】
特に、上記９１位及び３３９位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失する、又はアラニン若しくはフェニルアラニンに置換することが好ましい。上記置換により、ＨＭＧＲの酵素活性を抑制、維持でき、更にはリン酸化を抑制できるためにリン酸化による酵素活性の向上をも抑制することができる。
【００５６】
特に、上記２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換することが好ましい。上記置換により、ＨＭＧＲの酵素活性を低下、又は失活させることができる。
【００５７】
特に、上記２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基、並びにこれらに相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失する、又はアラニン、フェニルアラニン若しくはシステインに置換することが好ましい。上記置換により、ＨＭＧＲの酵素活性を維持でき、更にはリン酸化を抑制できるためにリン酸化による酵素活性の低下をも抑制することができる。
【００５８】
ＨＭＧＲとしては、前述のように保存領域中のアミノ酸残基は異なるＨＭＧＲであっても、同様の機能を持っていることから、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲにおける９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位及び５７４位のアミノ酸残基を含む保存領域からなる群より選択される少なくとも１つの保存領域に対応する保存領域を有するＨＭＧＲであれば特に限定されず、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲのアミノ酸配列との配列同一性の下限は特に限定されないが、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７５％以上、特に好ましくは７８％以上、最も好ましくは８０％以上である。５０％未満であると、前記各保存領域に対する配列同一性が前述の範囲を満たさないおそれがある。
【００５９】
配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲ以外のＨＭＧＲとしては、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ（ゴム産生タンポポの一種）、グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｉｄｅｓ）、トウダイグサ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｉａ  Ｌ．）由来のＨＭＧＲなどが挙げられる。なかでも、パラゴムノキ、レタス、ロシアンタンポポ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ、グアユール、ノゲシ、キャッサバ、シロイヌナズナ、トチュウ、トウダイグサからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来のＨＭＧＲであることが好ましく、パラゴムノキのＨＭＧＲが特に好ましい。
【００６０】
本発明におけるＨＭＧＲとは、１種の生物に複数種存在する場合のＨＭＧＲも含まれ、例えば、シロイヌナズナ由来のＨＭＧＲとして、配列番号１で表されるＨＭＧ１（Ｓ）、配列番号６９で表されるＨＭＧ２等、パラゴムノキ由来のＨＭＧＲとして、配列番号１０で表されるＨＭＧ１、配列番号７０で表されるＨＭＧ２、配列番号７１で表されるＨＭＧ３、配列番号７２で表されるＨＭＧ４、配列番号７３で表されるＨＭＧ５等が挙げられる。その他の例としては、表１に示す。
【００６１】
本発明の変異タンパク質の製造方法は、従来公知の方法を用いることができ、後述する組換えベクターを作製し、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物、昆虫、植物など、目的タンパク質を発現できるものを用いて、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を作製、目的タンパク質を発現させる。また、本発明の変異タンパク質の精製方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、Ｈｉｓタグ等を目的タンパク質に融合した形で発現させることで、特定のカラムを用い、簡単に精製できる。
【００６２】
本発明の変異タンパク質において、上記酵素活性の確認方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的タンパク質を発現させ、目的タンパク質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定する方法が挙げられる。
【００６３】
（遺伝子）
本発明の遺伝子は、上記変異タンパク質をコードする遺伝子である。上記変異タンパク質をコードする遺伝子であるため、当該遺伝子により発現した変異タンパク質を用いることで、ＨＭＧＲの酵素活性を制御することができ、ひいてはメバロン酸産生量を制御することも可能である。また、ＨＭＧＲはポリイソプレノイド生合成経路の律速酵素であるため、イソプレノイド産生量を制御することも可能となる。
【００６４】
本発明の遺伝子としては、例えば、配列番号１２で示される塩基番号１−１７７６の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、また、配列番号１２で示される塩基番号１−１７７６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＭＧＲ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、更には、配列番号１２で示される塩基番号１−１７７６の塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつＨＭＧＲ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００６５】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【００６６】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００６７】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【００６８】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００６９】
上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定のタンパク質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、シークエンサー等による塩基配列の確認が挙げられる。
【００７０】
（組換えベクター）
本発明の遺伝子をプラスミドに導入することにより、上記ＨＭＧＲをコードする遺伝子を保有する組換えベクターが得られる。当該組換えベクターにより、大腸菌等によって目的タンパク質を発現させたり、更なる形質転換体作製のベクターとして用いることができる。導入するプラスミドとしては、特に限定されない。
【００７１】
上記組換えベクターを用いて目的タンパク質を発現する場合、宿主としては、特に限定されず真核生物が好ましいが、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物、昆虫、植物など目的タンパク質を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【００７２】
（形質転換体）
本発明の遺伝子を宿主に導入することにより、上記ＨＭＧＲをコードする遺伝子を保有する形質転換体が得られる。そして、当該形質転換体では、目的タンパク質が発現することにより、導入した生体内で上記ＨＭＧＲによる酵素活性が得られるため、該ＨＭＧＲが触媒し、生合成するメバロン酸の産生量を向上又は減少させる等の制御が可能となる。ひいては、イソプレノイド産生植物の形質転換体であれば、導入した生体内のイソプレノイド生合成経路中の律速酵素とされるＨＭＧＲの活性が制御されることから、イソプレノイドの産生量を制御できることも推察できる。
【００７３】
上記形質転換体に用いられる宿主としては、ＨＭＧＲを保有する生物であれば特に限定されないが、なかでも、メバロン酸ひいてはイソプレノイド産生量が制御できる点で、イソプレノイド産生植物が好ましい。イソプレノイド産生植物としては、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ（ゴム産生タンポポの一種）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；トウダイグサ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｉａ  Ｌ．）、タカトウダイ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｌａｓｉｏｃａｕｌａ  Ｂｏｉｓｓ）等のトウダイグサ属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属）；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ）等のＬａｃｔｕｃａ属、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）等のＭａｎｉｈｏｔ属、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等のＥｕｃｏｍｍｉａ属、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）等のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ属、Ｌａｃｔｕｃａ属、Ｍａｎｉｈｏｔ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｅｕｃｏｍｍｉａ属、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、レタス、ロシアンタンポポ、Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ、グアユール、ノゲシ、キャッサバ、シロイヌナズナ、トチュウ、トウダイグサからなる群より選択される少なくとも１種の植物であることがより好ましく、パラゴムノキ、レタス、ロシアンタンポポが更に好ましい。
【００７４】
発現ベクターとしては、前述の組換えベクターを用いることができ、上記宿主の宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能であるものを使用できる。
【００７５】
発現ベクターとして、例えば、ｐＥＴ１６０系、ｐＢＩ系、ｐＵＣ系ベクター、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等、公知のものを用いればよい。
【００７６】
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
【００７７】
以上の方法等により、上記形質転換体（形質転換植物細胞）が得られる。
【００７８】
（点突然変異育種）
また、改変された上記ＨＭＧＲを有する植物を、該当箇所の塩基配列を育種マーカーとした突然変異育種技術を利用することで作出することもできる。突然変異育種技術としては、一般的な突然変異植物体の作出方法と、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）法を含む一般的な突然変異の選抜方法を用いることができる。当該突然変異体（突然変異植物細胞）では、点突然変異により本発明の遺伝子を保有するため、野生型のＨＭＧＲの替わりに改変された上記ＨＭＧＲが発現することにより、上記ＨＭＧＲによる酵素活性が得られるため、該ＨＭＧＲが触媒し、生合成するメバロン酸の産生量を向上又は減少させる等の制御が可能となる。ひいては、イソプレノイド産生植物の突然変異体であれば、当該突然変異体内のイソプレノイド生合成経路中の律速酵素とされるＨＭＧＲの活性が制御されることから、イソプレノイドの産生量を制御できることも推察できる。
【００７９】
本発明はまた、本発明の遺伝子を保有するイソプレノイド産生植物を提供するものである。該イソプレノイド産生植物は、形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞を有するイソプレノイド産生植物であれば特に限定されず、例えば、上述の方法で得られた形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞又は点突然変異により改変された上記ＨＭＧＲを発現する突然変異植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞若しくは突然変異植物細胞やそれらの子孫又はクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該イソプレノイド産生植物を量産することも可能である。
【００８０】
形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞から植物体を再生する方法は、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９），  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９），  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞から植物体を再生できる。
【００８１】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的のタンパク質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的のタンパク質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【００８２】
上記形質転換植物体又は突然変異植物体から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物体又は突然変異植物体を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物体又は突然変異植物体由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【００８３】
本発明では、本発明の遺伝子を保有するイソプレノイド産生植物を使用してメバロン酸、イソプレノイド、ポリイソプレノイドの製造を行うことにより、メバロン酸、イソプレノイド、ポリイソプレノイドの産生量を制御できる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞、形質転換植物細胞又は突然変異植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再生された形質転換植物体又は突然変異植物細胞から再生された突然変異植物体、該形質転換植物体又は突然変異植物体から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、メバロン酸、イソプレノイド、ポリイソプレノイドを製造することができる。本発明の形質転換体又は突然変異体は、改変されたタンパク質によりメバロン酸、イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生合成経路の律速酵素の酵素活性が制御されるので、該タンパク質（酵素）が触媒し、生合成するメバロン酸の産生量を制御させることができ、ひいてはイソプレノイドの産生量、更にはポリイソプレノイドの産生量も制御できる。
【００８４】
ここで、本明細書において、ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。
【００８５】
本発明では、上記９個のアミノ酸残基のうち少なくとも１種のアミノ酸残基を改変することにより、メバロン酸、イソプレノイド、ポリイソプレノイドの産生量を制御できるが、９個のアミノ酸残基のうち２種以上のアミノ酸残基を改変することにより、本発明の効果が顕著に発揮される。
【実施例】
【００８６】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。【００８７】
＜新たなリン酸化サイトの存在の示唆＞
シロイヌナズナ由来のＨＭＧＲ1において、リン酸化が起こることで酵素活性が低下することが既知となっている５７７番目のセリンをアラニンに置換した変異ＨＭＧＲ1（以下、Ｓ５７７Ａ−ＨＭＧＲ１と記載する）を内生のＨＭＧＲ１を欠損したシロイヌナズナ変異体に導入し、Ｓ５７７Ａ−ＨＭＧＲ１を発現するシロイヌナズナ形質転換体を作成した。このＳ５７７Ａ−ＨＭＧＲ１発現形質転換植物体からＥＲ画分（ＨＭＧＲはＥＲ局在の膜蛋白質）を得た。得られたＳ５７７Ａ−ＨＭＧＲ１を含むＥＲ画分を、ホスファターゼ処理したところ、野生型ＨＭＧＲ１を発現するシロイヌナズナから得られた野生型ＨＭＧＲを含むＥＲ画分をホスファターゼ処理した場合と同様、酵素活性が上昇することが判明した。なお、Ｓ５７７Ａ−ＨＭＧＲ１発現形質転換植物体と野生型ＨＭＧＲ１発現形質転換植物体のＨＭＧＲの蓄積量が同程度なことはウェスタンで確認した。このことから、既知のリン酸化サイト（５７７番目のセリン）以外に、ＨＭＧＲの酵素活性の制御に関与する新たなリン酸化サイト（アミノ酸残基）が存在することが示唆された。【００８８】
＜ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏによるＨＭＧＲのリン酸化サイトの推定＞
表１で示される植物において、マルチプルシーケンスアライメントを行い、保存性の高い配列部分（保存領域）を検索した。一方、全長配列からリン酸化が起きる可能性のあるアミノ酸残基を選抜し、このうち保存領域に含まれるリン酸化予想部位を選別した。結果は表１に示す。
なお、マルチプルシーケンスアライメントにはｉｄｅｎｔｉｔｙＸ、リン酸化が起きる可能性のあるアミノ酸残基（リン酸化サイト）の選抜にはＰｈｏｓＰｈＡｔと呼ばれるソフトを用いて行った。【００８９】
＜ＨＭＧＲ発現ベクターの構築＞
配列番号１で示されるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＨＭＧＲのＳ型（以下、ＨＭＧ１Ｓとも称する）のＤＮＡ配列である配列番号１２で示される配列を下記に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を大腸菌を用いてヒートショック法によりｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングし、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ＨＭＧ１Ｓを得た。エントリーベクターの作製には、ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ、大腸菌にはＤＨ５αを用いた。
（プライマー１：配列番号１３）
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＴＣ−３’
（プライマー２：配列番号１４）
５’−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧ−３’【００９０】
＜発現ベクター（組換えベクター）の作製＞
上記で得られたｐＥＮＴＲ／ＨＭＧ１Ｓを用いて、ｐＥＴ１６０−ＤＥＳＴに目的タンパク質の遺伝子配列部分を組換え、導入し、発現ベクターｐＤＥＳＴ／ＨＭＧ１Ｓを得た。上記組換え反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＧａｔｅｗａｙシステムのＬＲ反応を用いた。【００９１】
＜変異ＨＭＧＲ発現ベクターの作製＞
上記で得られたｐＤＥＳＴ／ＨＭＧ１ＳをテンプレートとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  （ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液１サンプル（２５μｌ）あたりの組成は、プラスミド１〜５ｎｇ、変異ごとに下記に示す各ｆｏｒｗａｒｄ及びｒｅｖｅｒｓｅプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ）０．７５μｌ、５×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍｅｓｔａｒ（Ｍｇ２＋）５μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ  ２μｌ、ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  ＨＳ  ０．２５μｌ、ｍｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒ  １５．７５μｌとした。所定の反応サイクルでＰＣＲを行った（反応サイクル：ステップ１：９８℃２分、ステップ２：９８℃１０秒、ステップ３：６０℃１５秒、ステップ４：６８℃８分、ステップ２〜４を１７回繰り返し）。ＰＣＲ産物の一部（７μｌ）を電気泳動し、増幅が見られたものについて、ＰＣＲ産物の残りにＤｐｎＩ  ０．２μｌを添加して、３７℃３時間反応させた。反応液２μｌを大腸菌（ＤＨ５α）の自作ケミカルコンピテントセル２０μｌに添加し、ヒートショック法によって形質転換を行った。菌液全量をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養後、得られたコロニーをコロニーＰＣＲによって選別した。ＱｕｉａｇｅｎのＰｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてプラスミド抽出を行い、変異が挿入されているかどうかシークエンスを確認し、目的の変異ＨＭＧ１Ｓ発現ベクターを得た。上記方法により、合計３４種類の変異ＨＭＧ１Ｓ発現ベクターを作製した。なお、ポジティブコントロールとしての５７７位のセリン変異ＨＭＧ１Ｓも含む。シークエンスの確認には、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＢｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｙ  Ｖ３．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット、シークエンサーＡＢＩ３１３０ＸＩを用いた。【００９２】
各変異ＨＭＧ１Ｓを作製するために用いた各プライマーを以下に示す。【００９３】
＜ＨＭＧ１Ｓの２２５位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２２５Ｆに用いたプライマー）
（プライマー３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１５）
５’−ｔｔｇａｔＴＴＴｇａａｔｃｇａｔｔｔｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃ−３’
（プライマー４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１６）
５’−ｔｔｇａｔＴＴＴｇａａｔｃｇａｔｔｔｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２２５Ｄに用いたプライマー）
（プライマー５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１７）
５’−ｔｔａｃｃｇｔｔｇｇａｔｇｇａｔｔｔｇａｔＧＡＴｇａａｔｃｇａｔｔｔｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃ−３’
（プライマー６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１８）
５’−ｇｃａｔｔｇｃｃｃｃａａａａｔｃｇａｔｔｃＧＧＣａｔｃａａａｔｃｃａｔｃｃａａｃｇｇｔａａ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２２５Ｅに用いたプライマー）
（プライマー７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１９）
５’−ｔｔａｃｃｇｔｔｇｇａｔｇｇａｔｔｔｇａｔＧＡＧｇａａｔｃｇａｔｔｔｔｇｇｇｇｃａａｔｇｃ−３’
（プライマー８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号２０）
５’−ｇｃａｔｔｇｃｃｃｃａａａａｔｃｇａｔｔｃＣＴＣａｔｃａａａｔｃｃａｔｃｃａａｃｇｇｔａａ−３’【００９４】
＜ＨＭＧ１Ｓの２５７位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２５７Ｆに用いたプライマー）
（プライマー９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号２１）
５’−ａｔｇａｇＴＴＣｔｃｔｇｔｔｃｃｔａｔｇｇｃｔａｃａａｃｃ−３’
（プライマー１０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号２２）
５’−ａｃａｇａＧＡＡｃｔｃａｔａａｃｃａｔｃａａｇｃａａｃａａ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２５７Ｄに用いたプライマー）
（プライマー１１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号２３）
５’−ｔｔｇｔｔｇｃｔｔｇａｔｇｇｔｔａｔｇａｇＧＡＣｔｃｔｇｔｔｃｃｔａｔｇｇｃｔａｃａａｃｃ−３’
（プライマー１２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号２４）
５’−ｇｇｔｔｇｔａｇｃｃａｔａｇｇａａｃａｇａＧＴＣｃｔｃａｔａａｃｃａｔｃａａｇｃａａｃａａ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ２５７Ｅに用いたプライマー）
（プライマー１３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号２５）
５’−ｔｔｇｔｔｇｃｔｔｇａｔｇｇｔｔａｔｇａｇＧＡＡｔｃｔｇｔｔｃｃｔａｔｇｇｃｔａｃａａｃｃ−３’
（プライマー１４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号２６）
５’−ｇｇｔｔｇｔａｇｃｃａｔａｇｇａａｃａｇａＴＴＣｃｔｃａｔａａｃｃａｔｃａａｇｃａａｃａａ−３’【００９５】
＜ＨＭＧ１Ｓの４１１位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４１１Ａに用いたプライマー）
（プライマー１５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号２７）
５’−ｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｃｇｔｇｇｔａａａＧＣＡｇｔｔｇｔｔｔｇｃｇａｇｇｃｔｇｔａａｔｃ−３’
（プライマー１６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号２８）
５’−ｇａｔｔａｃａｇｃｃｔｃｇｃａａａｃａａｃＴＧＣｔｔｔａｃｃａｃｇｔｃｃｃｔｃａａｔｃｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４１１Ｄに用いたプライマー）
（プライマー１７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号２９）
５’−ｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｃｇｔｇｇｔａａａＧＡＴｇｔｔｇｔｔｔｇｃｇａｇｇｃｔｇｔａａｔｃ−３’
（プライマー１８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３０）
５’−ｇａｔｔａｃａｇｃｃｔｃｇｃａａａｃａａｃＡＴＣｔｔｔａｃｃａｃｇｔｃｃｃｔｃａａｔｃｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４１１Ｅに用いたプライマー）
（プライマー１９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３１）
５’−ｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｃｇｔｇｇｔａａａＧＡＡｇｔｔｇｔｔｔｇｃｇａｇｇｃｔｇｔａａｔｃ−３’
（プライマー２０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３２）
５’−ｇａｔｔａｃａｇｃｃｔｃｇｃａａａｃａａｃＴＴＣｔｔｔａｃｃａｃｇｔｃｃｃｔｃａａｔｃｃ−３’【００９６】
＜ＨＭＧ１Ｓの４７０位のスレオニンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ４７０Ａに用いたプライマー）
（プライマー２１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３３）
５’−ｇｃｔＧＣＡｇｇｃｃａａｇａｔｃｃａｇｃｔｃａａａａｃｇｔｇ−３’
（プライマー２２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３４）
５’−ｇｇｃｃＴＧＣａｇｃｔａｔｇａａｔａｃａｇｃａｇａｃａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ４７０Ｄに用いたプライマー）
（プライマー２３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３５）
５’−ｇｃｔＧＡＴｇｇｃｃａａｇａｔｃｃａｇｃｔｃａａａａｃｇｔｇ−３’
（プライマー２４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３６）
５’−ｇｇｃｃＡＴＣａｇｃｔａｔｇａａｔａｃａｇｃａｇａｃａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ４７０Ｅに用いたプライマー）
（プライマー２５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３７）
５’−ｇｃｔＧＡＡｇｇｃｃａａｇａｔｃｃａｇｃｔｃａａａａｃｇｔｇ−３’
（プライマー２６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号３８）
５’−ｇｇｃｃＴＴＣａｇｃｔａｔｇａａｔａｃａｇｃａｇａｃａｃ−３’【００９７】
＜ＨＭＧ１Ｓの５０９位のスレオニンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ５０９Ａに用いたプライマー）
（プライマー２７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号３９）
５’−ｃｃａｔｃｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇｇｇＧＣＡｇｔｇｇｇａｇｇａｇｇａａｃａｃａｇｃｔｔｇｃ−３’
（プライマー２８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４０）
５’−ｇｃａａｇｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｃａｃＴＧＣｃｃｃｃａｃｃｔｃｇａｔａｇａｔｇｇ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ５０９Ｄに用いたプライマー）
（プライマー２９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号４１）
５’−ｃｃａｔｃｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇｇｇＧＡＴｇｔｇｇｇａｇｇａｇｇａａｃａｃａｇｃｔｔｇｃ−３’
（プライマー３０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４２）
５’−ｇｃａａｇｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｃａｃＡＴＣｃｃｃｃａｃｃｔｃｇａｔａｇａｔｇｇ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ５０９Ｅに用いたプライマー）
（プライマー３１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号４３）
５’−ｃｃａｔｃｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇｇｇＧＡＡｇｔｇｇｇａｇｇａｇｇａａｃａｃａｇｃｔｔｇｃ−３’
（プライマー３２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４４）
５’−ｇｃａａｇｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｃａｃＴＴＣｃｃｃｃａｃｃｔｃｇａｔａｇａｔｇｇ−３’【００９８】
＜ＨＭＧ１Ｓの４８位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４８Ａに用いたプライマー）
（プライマー３３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号４５）
５’−ａｔｔｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｇａａａｇｃａＧＣＣｇａｃｇｃｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｇｔｔａ−３’
（プライマー３４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４６）
５’−ｔａａｃｇｇａａｇａｇｇａａｇｃｇｃｇｔｃＧＧＣｔｇｃｔｔｔｃｇｇｔｇｇａｇｇａｇｃａａｔ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４８Ｄに用いたプライマー）
（プライマー３５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号４７）
５’−ａｔｔｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｇａａａｇｃａＧＡＣｇａｃｇｃｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｇｔｔａ−３’
（プライマー３６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４８）
５’−ｔａａｃｇｇａａｇａｇｇａａｇｃｇｃｇｔｃＧＴＣｔｇｃｔｔｔｃｇｇｔｇｇａｇｇａｇｃａａｔ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ４８Ｅに用いたプライマー）
（プライマー３７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号４９）
５’−ａｔｔｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｇａａａｇｃａＧＡＡｇａｃｇｃｇｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｇｔｔａ−３’
（プライマー３８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５０）
５’−ｔａａｃｇｇａａｇａｇｇａａｇｃｇｃｇｔｃＴＴＣｔｇｃｔｔｔｃｇｇｔｇｇａｇｇａｇｃａａｔ−３’【００９９】
＜ＨＭＧ１Ｓの９１位のスレオニンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ９１Ａに用いたプライマー）
（プライマー３９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５１）
５’−ａａｔａｃｇｃｃｔｃｔｔｃａｃｇｔｃｇｔｃＧＣＡａｔｃａｃａｇａａｃｔｃｇｇｃｇｃｃａｔｔ−３’
（プライマー４０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５２）
５’−ａａｔｇｇｃｇｃｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇａｔＴＧＣｇａｃｇａｃｇｔｇａａｇａｇｇｃｇｔａｔｔ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ９１Ｄに用いたプライマー）
（プライマー４１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５３）
５’−ａａｔａｃｇｃｃｔｃｔｔｃａｃｇｔｃｇｔｃＧＡＴａｔｃａｃａｇａａｃｔｃｇｇｃｇｃｃａｔｔ−３’
（プライマー４２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５４）
５’−ａａｔｇｇｃｇｃｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇａｔＡＴＣｇａｃｇａｃｇｔｇａａｇａｇｇｃｇｔａｔｔ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｔ９１Ｅに用いたプライマー）
（プライマー４３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５５）
５’−ａａｔａｃｇｃｃｔｃｔｔｃａｃｇｔｃｇｔｃＧＡＡａｔｃａｃａｇａａｃｔｃｇｇｃｇｃｃａｔｔ−３’
（プライマー４４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５６）
５’−ａａｔｇｇｃｇｃｃｇａｇｔｔｃｔｇｔｇａｔＴＴＣｇａｃｇａｃｇｔｇａａｇａｇｇｃｇｔａｔｔ−３’【０１００】
＜ＨＭＧ１Ｓの３３９位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ３３９Ａに用いたプライマー）
（プライマー４５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５７）
５’−ｃｇａｇｔａｇａｔｔｔｇｃａａｇａｃｔｇｃａａＧＣＣｇｔｔａａａｔｇｃａｃａａｔｃｇｃ  −３’
（プライマー４６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５８）
５’−ｇｃｇａｔｔｇｔｇｃａｔｔｔａａｃＧＧＣｔｔｇｃａｇｔｃｔｔｇｃａａａｔｃｔａｃｔｃｇ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ３３９Ｄに用いたプライマー）
（プライマー４７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５９）
５’−ｃｇａｇｔａｇａｔｔｔｇｃａａｇａｃｔｇｃａａＧＡＴｇｔｔａａａｔｇｃａｃａａｔｃｇｃ−３’
（プライマー４８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号６０）
５’−ｇｃｇａｔｔｇｔｇｃａｔｔｔａａｃＡＴＣｔｔｇｃａｇｔｃｔｔｇｃａａａｔｃｔａｃｔｃｇ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ３３９Ｅに用いたプライマー）
（プライマー４９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号６１）
５’−ｃｇａｇｔａｇａｔｔｔｇｃａａｇａｃｔｇｃａａＧＡＡｇｔｔａａａｔｇｃａｃａａｔｃｇｃ−３’
（プライマー５０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号６２）
５’−ｇｃｇａｔｔｇｔｇｃａｔｔｔａａｃＴＴＣｔｔｇｃａｇｔｃｔｔｇｃａａａｔｃｔａｃｔｃｇ−３’【０１０１】
＜ＨＭＧ１Ｓの２８７位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ２８７Ａに用いたプライマー）
（プライマー５７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号９３）
５’−ｃｔｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｃＧＣＣｇｔｃｔｔｇｔｔｇａａｇｇａｔｇｇｃａｔｇａｃ−３’
（プライマー５８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号９４）
５’−ｇｔｃａｔｇｃｃａｔｃｃｔｔｃａａｃａａｇａｃＧＧＣｇｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｇａｃａａｇ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ２８７Ｄに用いたプライマー）
（プライマー５９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号９５）
５’−ｇｃｔａｔｇｔｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｔｇｇｃｇｃｃａｃｃＧＡＴａｃｃｇｔｔｃｔｔａａｇｇａ−３’
（プライマー６０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号９６）
５’−ｔｃｃｔｔａａｇａａｃｇｇｔＡＴＣｇｇｔｇｇｃｇｃｃａｃｃａｇａｇａｔａａａｃａｔａｇｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ２８７Ｅに用いたプライマー）
（プライマー６１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号９７）
５’−ｃｔｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｃＧＡＡｇｔｃｔｔｇｔｔｇａａｇｇａｔｇｇｃａｔｇａｃ−３’
（プライマー６２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号９８）
５’−ｇｔｃａｔｇｃｃａｔｃｃｔｔｃａａｃａａｇａｃＴＴＣｇｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｇａｃａａｇ−３’【０１０２】
＜ＨＭＧ１Ｓの５７４位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ５７４Ａに用いたプライマー）
（プライマー１１３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１５０）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＧＣＣａａｃａｇａｔｃｃａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔ−３’
（プライマー１１４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１５１）
５’−ａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＧＧＣｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ５７４Ｆに用いたプライマー）
（プライマー６３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号９９）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＴＴＣａａｃａｇａｔｃｃａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔ−３’
（プライマー６４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１００）
５’−ａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＧＡＡｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ５７４Ｄに用いたプライマー）
（プライマー６５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１０１）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＧＡＣａａｃａｇａｔｃｃａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔ−３’
（プライマー６６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１０２）
５’−ａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＧＴＣｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｙ５７４Ｅに用いたプライマー）
（プライマー６７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１０３）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＧＡＡａａｃａｇａｔｃｃａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔ−３’
（プライマー６８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１０４）
５’−ａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＴＴＣｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’【０１０３】
＜ＨＭＧ１Ｓの５７７位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ５７７Ａに用いたプライマー）
（プライマー５１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号６３）
５’−ｃａａｔａｇａＧＣＣａｇｃｃｇａｇａｃａｔｃｔｃｔｇｇａｇｃａａｃｇ−３’
（プライマー５２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号６４）
５’−ｃｇｇｃｔＧＧＣｔｃｔａｔｔｇｔａｔｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｔｃｔｃａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ５７７Ｄに用いたプライマー）
（プライマー５３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号６５）
５’−ｇｔｃａｃａｔｇａａａｔａｃａａｔａｇａＧＡＣａｇｃｃｇａｇａｃａｔｃｔｃｔｇｇａｇｃ−３’
（プライマー５４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号６６）
５’−ｇｃｔｃｃａｇａｇａｔｇｔｃｔｃｇｇｃｔＧＴＣｔｃｔａｔｔｇｔａｔｔｔｃａｔｇｔｇａｃ−３’
（ｐＨＭＧ１Ｓ／Ｓ５７７Ｅに用いたプライマー）
（プライマー５５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号６７）
５’−ｇｔｃａｃａｔｇａａａｔａｃａａｔａｇａＧＡＡａｇｃｃｇａｇａｃａｔｃｔｃｔｇｇａｇｃ−３’
（プライマー５６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号６８）
５’−ｇｃｔｃｃａｇａｇａｔｇｔｃｔｃｇｇｃｔＴＴＣｔｃｔａｔｔｇｔａｔｔｔｃａｔｇｔｇａｃ−３’【０１０４】
＜変異ＨＭＧＲを発現する形質転換体の作製＞
上記で得られた各変異ＨＭＧ１Ｓ発現ベクターを用いて、ヒートショック法により、大腸菌を形質転換した。これにより、各変異ＨＭＧ１Ｓを発現する形質転換体を得た。大腸菌には、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を用いた。【０１０５】
＜変異ＨＭＧＲの発現＞
上記で得られた各変異ＨＭＧ１Ｓを発現する形質転換大腸菌を、それぞれ２ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、培養後の菌液を５０ｍｌＬＢ液体培地に移し、さらに２時間３７℃で震盪培養した後ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、２０℃で６時間培養した。ＬＢ液体培地にはすべて、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように添加した。全培養工程終了後の菌液をそれぞれ全量４℃  ５０００ｇ  ５分間遠心して集菌し、ペレットを−２０℃で保存した。【０１０６】
＜変異ＨＭＧＲの回収及び精製＞
上記で得られた各菌体を１００μＭ  ＡＥＢＳＦ、１０μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ｌｙｓｏｚｙｍｅを添加した結合バッファー（４０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．８ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶解した。ソニケーターＳＯＮＩＦＩＥＲ４５０（ＢＲＡＳＯＮ）を用いて氷中で冷却しながら菌細胞を破砕（破砕条件はＤｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：５０％、Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ：２．５で１分×３回）した。４℃１５，０００ｒｐｍで１５分遠心し、あらかじめ結合バッファーで３回洗浄しておいた１００μｌの  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を上清に添加した。４℃で１時間回転震盪した後、４℃８０００ｒｐｍで５分間遠心した。レジンをＥｍｐｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に移動し、洗浄バッファー（２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ以外の組成は結合バッファーと同様）で３回洗浄した。レジンに１５μｌの１００μＭ  ＡＥＢＳＦ、１０μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０ｍＭ  ＤＴＴを添加した溶出バッファー（４３０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ以外の組成は結合バッファーと同様）を添加し、４℃１５，０００ｒｐｍで１分遠心して溶出した。さらにレジンに２０μｌの溶出バッファーを加え、４℃１５，０００ｒｐｍで１分間遠心して溶出した。合計３５μｌのＨｉｓタグ精製変異ＨＭＧ１Ｓタンパク質溶液が得られた。
なお、得られた各タンパク質の定量および精製度はポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した。定量のためにＢＳＡ標準液（１００ｎｇ、３００ｎｇ、１μｇ）を同時に泳動し、ＣＢＢ染色した後のゲルから、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋とＩｍａｇｅ  Ｌａｂを用いてバンド強度の検出・測定を行った。【０１０７】
＜変異ＨＭＧＲの酵素活性測定＞
上記精製によって得られた各変異ＨＭＧ１Ｓ  １．６５ｎｇを加えた反応液（１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、４０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ）を３７℃５分間プレインキュベートした後、１４Ｃでラベルされた２０μＭ  ＨＭＧ−ＣｏＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）を加えて（最終反応液容量は２６μｌ）、３７℃１５分反応させた。１ｍｇ／ｍｌ  メバロン酸ラクトン５μｌと６Ｎ塩酸５μｌを加えて室温で１５分置いた後、ｐＨ６．０の飽和カリウムリン酸バッファー１２５μｌを加えて中和した。酢酸エチル３００μｌを加えて激しく混合し、２０℃１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清の酢酸エチル層を用いて液体シンチュレーションカウンターで放射活性を測定した。各変異ＨＭＧ１Ｓの酵素活性結果を表２に示す。なお、野生型のＨＭＧ１Ｓの酵素活性を１とする比活性で示した。【０１０８】
【表１】
2015178493.tif 000002
【０１０９】
表１中、括弧内の数値は、基準となるシロイヌナズナ由来ＨＭＧＲ（Ｓ型）における各保存領域に対する配列同一性の割合を示す（単位は％）。また、「−」は、対応する保存領域又は特定アミノ酸残基を保有しないことを示す。【０１１０】
表１の結果から、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲ（ＨＭＧ１Ｓ）における９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位又は５７４位の各アミノ酸残基を含む各保存領域に対応する保存領域を保有する他のＨＭＧＲにおいて、前記各アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を保有することがわかる。【０１１１】
【表２】
2015178493.tif 000003
【０１１２】
表２中、「−」は酵素活性が失活していることを意味し、「１」以上であれば、野生型よりも酵素活性が高いことを意味する。【０１１３】
表２の結果から、まず、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位、及び５７４位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換すると、酵素活性が低下又は失活することが明らかとなった。【０１１４】
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの２２５位、２５７位、２８７位、４１１位、４７０位、５０９位、及び５７４位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアラニン又はフェニルアラニンに置換すると、酵素活性が野生型に比べ、低下するものの、比較的活性を維持することが明らかとなった。このことから、生体内においてリン酸化が起きないようにできるため、結果として当該部位のリン酸化による酵素活性抑制を防ぐことができ、結果的に安定的な酵素活性を保持できると推察できる。【０１１５】
次に、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位及び３３９位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換すると、酵素活性が向上することが明らかとなった。【０１１６】
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位及び／又は３３９位のアミノ酸残基をアラニンに置換すると、野生型のＨＭＧＲに比べて酵素活性が向上するものの、擬似リン酸化した変異体に比べると活性が低いことが明らかとなった。このことから、生体内では、野生型では必要に応じて当該アミノ酸残基がリン酸化されるため、リン酸化による酵素活性の向上が予想できるので、リン酸化を抑制できるアラニンに置換した変異体では酵素活性を維持若しくは抑制することが裏付けられた。【０１１７】
なお、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの４８位のアミノ酸残基をアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換しても、酵素活性は野生型から変化がなく、ＨＭＧＲの酵素活性を制御できないことが分かった。【０１１８】
以上の結果から、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、及び５７４位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失、又は他のアミノ酸残基に置換することで、ＨＭＧＲの酵素活性を制御できることが明らかとなった。【０１１９】
更に、表１、２の結果から、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、及び５７４位に相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失、又は他のアミノ酸残基に置換することで、ＨＭＧＲの酵素活性を制御できることも裏付けられた。【０１２０】
また、配列番号１で示されるシロイヌナズナのＨＭＧＲの９１位、２２５位、２５７位、２８７位、３３９位、４１１位、４７０位、５０９位、及び５７４位に相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、欠失、又は他のアミノ酸残基に置換した変異タンパク質を発現する形質転換体中のメバロン酸の産生量を制御すること、ひいてはイソプレノイド及びポリイソプレノイドの産生量を制御することも裏付けられた。【０１２１】
＜ＨｂＨＭＧＲ発現ベクターの構築＞
配列番号１０で示されるパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のＨＭＧ１（以下、ＨｂＨＭＧ１とも称する）のＤＮＡ配列である配列番号１０５で示される配列を下記に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅した。得られたＰＣＲ産物を大腸菌を用いてヒートショック法によりｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングし、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／ＨｂＨＭＧ１を得た。エントリーベクターの作製には、ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ、大腸菌にはＤＨ５αを用いた。
（プライマー６９：配列番号１０６）
５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’
（プライマー７０：配列番号１０７）
５’−ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＡＣＡＴ−３’【０１２２】
＜発現ベクター（組換えベクター）の作製＞
上記で得られたｐＥＮＴＲ／ＨｂＨＭＧ１を用いて、ｐＥＴ１６０−ＤＥＳＴに目的タンパク質の遺伝子配列部分を組換え、導入し、発現ベクターｐＤＥＳＴ／ＨｂＨＭＧ１を得た。上記組換え反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＧａｔｅｗａｙシステムのＬＲ反応を用いた。【０１２３】
＜変異ＨｂＨＭＧＲ発現ベクターの作製＞
上記で得られたｐＤＥＳＴ／ＨｂＨＭＧ１をテンプレートとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  （ＴａＫａＲａ）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液１サンプル（２５μｌ）あたりの組成は、プラスミド１〜５ｎｇ、変異ごとに下記に示す各ｆｏｒｗａｒｄ及びｒｅｖｅｒｓｅプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ）０．７５μｌ、５×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍｅｓｔａｒ（Ｍｇ２＋）５μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ  ２μｌ、ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  ＨＳ  ０．２５μｌ、ｍｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒ  １５．７５μｌとした。所定の反応サイクルでＰＣＲを行った（反応サイクル：ステップ１：９８℃２分、ステップ２：９８℃１０秒、ステップ３：６０℃１５秒、ステップ４：６８℃８分、ステップ２〜４を１７回繰り返し）。ＰＣＲ産物の一部（７μｌ）を電気泳動し、増幅が見られたものについて、ＰＣＲ産物の残りにＤｐｎＩ  ０．２μｌを添加して、３７℃３時間反応させた。反応液２μｌを大腸菌（ＤＨ５α）の自作ケミカルコンピテントセル２０μｌに添加し、ヒートショック法によって形質転換を行った。菌液全量をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養後、得られたコロニーをコロニーＰＣＲによって選別した。ＱｕｉａｇｅｎのＰｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてプラスミド抽出を行い、変異が挿入されているかどうかシークエンスを確認し、目的の変異ＨｂＨＭＧ１発現ベクターを得た。上記方法により、合計２１種類の変異ＨｂＨＭＧ１発現ベクターを作製した。なお、ポジティブコントロールとしての５６６位のセリン（シロイヌナズナ由来のＨＭＧ１Ｓにおける５７７位のセリンに相当）変異ＨｂＨＭＧ１も含む。シークエンスの確認には、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＢｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｙ  Ｖ３．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット、シークエンサーＡＢＩ３１３０ＸＩを用いた。【０１２４】
各変異ＨｂＨＭＧ１を作製するために用いた各プライマーを以下に示す。【０１２５】
＜ＨｂＨＭＧ１の２１４位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ２１４Ｆに用いたプライマー）
（プライマー７１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１０８）
５’−ｇｔａｇａａｇｇｇｔｔｃｇａｔＴＴＣｇａｇｔｃｇａｔｔｔｔａｇｇａｃ−３’
（プライマー７２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１０９）
５’−ｇｔｃｃｔａａａａｔｃｇａｃｔｃＧＡＡａｔｃｇａａｃｃｃｔｔｃｔａｃ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ２１４Ｅに用いたプライマー）
（プライマー７３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１１０）
５’−ｇｔａｇａａｇｇｇｔｔｃｇａｔＧＡＡｇａｇｔｃｇａｔｔｔｔａｇｇａｃａ−３’
（プライマー７４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１１１）
５’−ｔｇｔｃｃｔａａａａｔｃｇａｃｔｃＴＴＣａｔｃｇａａｃｃｃｔｔｃｔａｃ−３’【０１２６】
＜ＨｂＨＭＧ１の２４６位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ２４６Ｆに用いたプライマー）
（プライマー７５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１１２）
５’−ｇｃｔｇａａｃｇｇｇｃｇｇｇａｇＴＴＣｔｃｔｇｔｔｃｃａａｔｇｇｃ−３’
（プライマー７６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１１３）
５’−ｇｃｃａｔｔｇｇａａｃａｇａＧＡＡｃｔｃｃｃｇｃｃｃｇｔｔｃａｇｃ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ２４６Ｅに用いたプライマー）
（プライマー７７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１１４）
５’−ｇｃｔｇａａｃｇｇｇｃｇｇｇａｇＧＡＡｔｃｔｇｔｔｃｃａａｔｇｇｃ−３’
（プライマー７８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１１５）
５’−ｇｃｃａｔｔｇｇａａｃａｇａＴＴＣｃｔｃｃｃｇｃｃｃｇｔｔｃａｇｃ−３’【０１２７】
＜ＨｂＨＭＧ１の４００位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ４００Ａに用いたプライマー）
（プライマー７９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１１６）
５’−ｇａａｇｇａｃｇｔｇｇｃａａａＧＣＣｇｔｔｇｔｔｔｇｔｇａｇ−３’
（プライマー８０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１１７）
５’−ｃｔｃａｃａａａｃａａｃＧＧＣｔｔｔｇｃｃａｃｇｔｃｃｔｔｃ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ４００Ｄに用いたプライマー）
（プライマー８１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１１８）
５’−ｔｇａａｇｇａｃｇｔｇｇｃａａａＧＡＣｇｔｔｇｔｔｔｇｔｇａｇｇｃａａｔｔａｔｃａａｇ−３’
（プライマー８２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１１９）
５’−ｃｔｔｇａｔａａｔｔｇｃｃｔｃａｃａａａｃａａｃＧＴＣｔｔｔｇｃｃａｃｇｔｃｃｔｔｃａ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ４００Ｅに用いたプライマー）
（プライマー８３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１２０）
５’−ｔｇａａｇｇａｃｇｔｇｇｃａａａＧＡＡｇｔｔｇｔｔｔｇｔｇａｇｇｃａａｔｔａｔｃａａｇ−３’
（プライマー８４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１２１）
５’−ｃｔｔｇａｔａａｔｔｇｃｃｔｃａｃａａａｃａａｃＴＴＣｔｔｔｇｃｃａｃｇｔｃｃｔｔｃａ−３’【０１２８】
＜ＨｂＨＭＧ１の４５９位のスレオニンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４５９Ｃに用いたプライマー）
（プライマー８５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１２２）
５’−ｃｔｇｃａａｔｃｔｔｔａｔｔｇｃｃＴＧＴｇｇｃｃａｇｇａｔｃｃａｇｃ−３’
（プライマー８６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１２３）
５’−ｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｇｃｃＡＣＡｇｇｃａａｔａａａｇａｔｔｇｃａｇ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４５９Ｄに用いたプライマー）
（プライマー８７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１２４）
５’−ｔｃｇｔａｔｃｔｇｃａａｔｃｔｔｔａｔｔｇｃｃＧＡＴｇｇｃｃａｇｇａｔｃｃａｇｃａｃａｇａ−３’
（プライマー８８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１２５）
５’−ｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｇｃｃＡＴＣｇｇｃａａｔａａａｇａｔｔｇｃａｇａｔａｃｇａ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４５９Ｅに用いたプライマー）
（プライマー８９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１２６）
５’−ｔｃｇｔａｔｃｔｇｃａａｔｃｔｔｔａｔｔｇｃｃＧＡＡｇｇｃｃａｇｇａｔｃｃａｇｃａｃａｇａ−３’
（プライマー９０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１２７）
５’−ｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｇｇｃｃＴＴＣｇｇｃａａｔａａａｇａｔｔｇｃａｇａｔａｃｇａ−３’【０１２９】
＜ＨｂＨＭＧ１の４９８位のスレオニンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４９８Ｃに用いたプライマー）
（プライマー９１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１２８）
５’−ｃｔｃｃａｔｔｇａｇｇｔｇｇｇｔＴＧＴｇｔｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｃｔｃ−３’
（プライマー９２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１２９）
５’−ｇａｇｔｔｃｃａｃｃｔｃｃｇａｃＡＣＡａｃｃｃａｃｃｔｃａａｔｇｇａｇ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４９８Ｄに用いたプライマー）
（プライマー９３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１３０）
５’−ａｃｃａｔｇｃｃｃｔｃｃａｔｔｇａｇｇｔｇｇｇｔＧＡＣｇｔｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｃｔｃａａｃ−３’
（プライマー９４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１３１）
５’−ｇｔｔｇａｇｔｔｃｃａｃｃｔｃｃｇａｃＧＴＣａｃｃｃａｃｃｔｃａａｔｇｇａｇｇｇｃａｔｇｇｔ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｔ４９８Ｅに用いたプライマー）
（プライマー９５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１３２）
５’−ａｃｃａｔｇｃｃｃｔｃｃａｔｔｇａｇｇｔｇｇｇｔＧＡＡｇｔｃｇｇａｇｇｔｇｇａａｃｔｃａａｃ−３’
（プライマー９６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１３３）
５’−ｇｔｔｇａｇｔｔｃｃａｃｃｔｃｃｇａｃＴＴＣａｃｃｃａｃｃｔｃａａｔｇｇａｇｇｇｃａｔｇｇｔ−３’【０１３０】
＜ＨｂＨＭＧ１の５６６位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ５６６Ａに用いたプライマー）
（プライマー９７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１３４）
５’−ｇｔｃａｃａｔｇａａｇｔａｃａａｃａｇａＧＣＣａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔａａａｇｃｔ−３’
（プライマー９８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１３５）
５’−ａｇｃｔｔｔａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔＧＧＣｔｃｔｇｔｔｇｔａｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ５６６Ｄに用いたプライマー）
（プライマー９９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１３６）
５’−ｇｔｃａｃａｔｇａａｇｔａｃａａｃａｇａＧＡＣａｇｃａａａｇａｔａｔｇｔｃｔａａａｇｃｔ−３’
（プライマー１００（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１３７）
５’−ａｇｃｔｔｔａｇａｃａｔａｔｃｔｔｔｇｃｔＧＴＣｔｃｔｇｔｔｇｔａｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔ−３’【０１３１】
＜ＨｂＨＭＧ１の２７６位のセリンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ２７６Ａに用いたプライマー）
（プライマー１０１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１３８）
５’−ｃｔｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｃＧＣＣｇｔｃｔｔｇｔｔｇａａｇｇａｔｇｇｃａｔｇａｃ−３’
（プライマー１０２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１３９）
５’−ｇｔｃａｔｇｃｃａｔｃｃｔｔｃａａｃａａｇａｃＧＧＣｇｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｇａｃａａｇ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ２７６Ｄに用いたプライマー）
（プライマー１０３（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１４０）
５’−ｃａｇｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｃＧＡＣｇｔｃｔｔｇｔｔｇａａｇｇ−３’
（プライマー１０４（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１４１）
５’−ｃｃｔｔｃａａｃａａｇａｃＧＴＣｇｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｇ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｓ２７６Ｅに用いたプライマー）
（プライマー１０５（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１４２）
５’−ｃｔｔｇｔｃａｇｇｔｇｇｇｇｃｃａｃｃＧＡＡｇｔｃｔｔｇｔｔｇａａｇｇａｔｇｇｃａｔｇａｃ−３’
（プライマー１０６（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１４３）
５’−ｇｔｃａｔｇｃｃａｔｃｃｔｔｃａａｃａａｇａｃＴＴＣｇｇｔｇｇｃｃｃｃａｃｃｔｇａｃａａｇ−３’【０１３２】
＜ＨｂＨＭＧ１の５６３位のチロシンの変異に用いた各プライマー＞
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ５６３Ｆに用いたプライマー）
（プライマー１０７（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１４４）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＴＴＣａａｃａｇａｔｃｃａｇｃ−３’
（プライマー１０８（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１４５）
５’−ｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＧＡＡｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ５６３Ｄに用いたプライマー）
（プライマー１０９（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１４６）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＧＡＣａａｃａｇａｔｃｃａｇｃ−３’
（プライマー１１０（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１４７）
５’−ｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＧＴＣｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’
（ｐＨｂＨＭＧ１／Ｙ５６３Ｅに用いたプライマー）
（プライマー１１１（ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号１４８）
５’−ｇｔｃａａｇａｇｔｃａｃａｔｇａａｇＧＡＡａａｃａｇａｔｃｃａｇｃ−３’
（プライマー１１２（ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号１４９）
５’−ｇｃｔｇｇａｔｃｔｇｔｔＴＴＣｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｔｔｇａｃ−３’【０１３３】
＜変異ＨｂＨＭＧＲを発現する形質転換体の作製＞
上記で得られた各変異ＨｂＨＭＧ１発現ベクターを用いて、ヒートショック法により、大腸菌を形質転換した。これにより、各変異ＨｂＨＭＧ１を発現する形質転換体を得た。大腸菌には、ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を用いた。【０１３４】
＜変異ＨｂＨＭＧＲの発現＞
上記で得られた各変異ＨｂＨＭＧ１を発現する形質転換大腸菌を、それぞれ２ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、培養後の菌液を５０ｍｌＬＢ液体培地に移し、さらに２時間３７℃で震盪培養した後ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、２０℃で６時間培養した。ＬＢ液体培地にはすべて、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように添加した。全培養工程終了後の菌液をそれぞれ全量４℃  ５０００ｇ  ５分間遠心して集菌し、ペレットを−２０℃で保存した。【０１３５】
＜変異ＨｂＨＭＧＲの回収及び精製＞
上記で得られた各菌体を１００μＭ  ＡＥＢＳＦ、１０μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ｌｙｓｏｚｙｍｅを添加した結合バッファー（４０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．８ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶解した。ソニケーターＳＯＮＩＦＩＥＲ４５０（ＢＲＡＳＯＮ）を用いて氷中で冷却しながら菌細胞を破砕（破砕条件はＤｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ：５０％、Ｏｕｔ  ｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ：２．５で１分×３回）した。４℃１５，０００ｒｐｍで１５分遠心し、あらかじめ結合バッファーで３回洗浄しておいた１００μｌの  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を上清に添加した。４℃で１時間回転震盪した後、４℃８０００ｒｐｍで５分間遠心した。レジンをＥｍｐｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に移動し、洗浄バッファー（２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ以外の組成は結合バッファーと同様）で３回洗浄した。レジンに１５μｌの１００μＭ  ＡＥＢＳＦ、１０μＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０ｍＭ  ＤＴＴを添加した溶出バッファー（４３０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ以外の組成は結合バッファーと同様）を添加し、４℃１５，０００ｒｐｍで１分遠心して溶出した。さらにレジンに２０μｌの溶出バッファーを加え、４℃１５，０００ｒｐｍで１分間遠心して溶出した。合計３５μｌのＨｉｓタグ精製変異ＨｂＨＭＧ１タンパク質溶液が得られた。
なお、得られた各タンパク質の定量および精製度はポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した。定量のためにＢＳＡ標準液（１００ｎｇ、３００ｎｇ、１μｇ）を同時に泳動し、ＣＢＢ染色した後のゲルから、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋とＩｍａｇｅ  Ｌａｂを用いてバンド強度の検出・測定を行った。【０１３６】
＜変異ＨｂＨＭＧＲの酵素活性測定＞
上記精製によって得られた各変異ＨｂＨＭＧ１  １．６５ｎｇを加えた反応液（１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、４０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ）を３７℃５分間プレインキュベートした後、１４Ｃでラベルされた２０μＭ  ＨＭＧ−ＣｏＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）を加えて（最終反応液容量は２６μｌ）、３７℃１５分反応させた。１ｍｇ／ｍｌ  メバロン酸ラクトン５μｌと６Ｎ塩酸５μｌを加えて室温で１５分置いた後、ｐＨ６．０の飽和カリウムリン酸バッファー１２５μｌを加えて中和した。酢酸エチル３００μｌを加えて激しく混合し、２０℃１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清の酢酸エチル層を用いて液体シンチュレーションカウンターで放射活性を測定した。各変異ＨｂＨＭＧ１の酵素活性結果を表３に示す。なお、野生型のＨｂＨＭＧ１の酵素活性を１とする比活性で示した。【０１３７】
【表３】
2015178493.tif 000004
【０１３８】
表３中、「−」は酵素活性が失活していることを意味し、「１」以上であれば、野生型よりも酵素活性が高いことを意味する。【０１３９】
表３の結果から、まず、配列番号１０で示されるパラゴムノキのＨＭＧ１の２１４位、２４６位、２７６位、４００位、４５９位、４９８位、及び５６３位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換すると、酵素活性が低下又は失活することが明らかとなった。【０１４０】
また、配列番号１０で示されるパラゴムノキのＨＭＧ１の２１４位、２４６位、２７６位、４００位、４５９位、４９８位、及び５６３位のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をアラニン、フェニルアラニン又はシステインに置換すると、酵素活性が野生型に比べ、同程度又は低下するものの、比較的活性を維持することが明らかとなった。このことから、生体内においてリン酸化が起きないようにできるため、結果として当該部位のリン酸化による酵素活性抑制を防ぐことができ、結果的に安定的な酵素活性を保持できると推察できる。【０１４１】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：シロイヌナズナ由来のＨＭＧＲ（Ｓ型）のアミノ酸配列
配列番号２：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける４８位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号３：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける９１位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号４：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける２２５位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号５：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける２５７位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号６：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける３３９位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号７：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける４１１位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号８：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける４７０位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号９：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける５０９位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ１のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｓ由来のＨＭＧＲのアミノ酸配列
配列番号１２：シロイヌナズナ由来のＨＭＧＲ（Ｓ型）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１３：プライマー１
配列番号１４：プライマー２
配列番号１５：プライマー３
配列番号１６：プライマー４
配列番号１７：プライマー５
配列番号１８：プライマー６
配列番号１９：プライマー７
配列番号２０：プライマー８
配列番号２１：プライマー９
配列番号２２：プライマー１０
配列番号２３：プライマー１１
配列番号２４：プライマー１２
配列番号２５：プライマー１３
配列番号２６：プライマー１４
配列番号２７：プライマー１５
配列番号２８：プライマー１６
配列番号２９：プライマー１７
配列番号３０：プライマー１８
配列番号３１：プライマー１９
配列番号３２：プライマー２０
配列番号３３：プライマー２１
配列番号３４：プライマー２２
配列番号３５：プライマー２３
配列番号３６：プライマー２４
配列番号３７：プライマー２５
配列番号３８：プライマー２６
配列番号３９：プライマー２７
配列番号４０：プライマー２８
配列番号４１：プライマー２９
配列番号４２：プライマー３０
配列番号４３：プライマー３１
配列番号４４：プライマー３２
配列番号４５：プライマー３３
配列番号４６：プライマー３４
配列番号４７：プライマー３５
配列番号４８：プライマー３６
配列番号４９：プライマー３７
配列番号５０：プライマー３８
配列番号５１：プライマー３９
配列番号５２：プライマー４０
配列番号５３：プライマー４１
配列番号５４：プライマー４２
配列番号５５：プライマー４３
配列番号５６：プライマー４４
配列番号５７：プライマー４５
配列番号５８：プライマー４６
配列番号５９：プライマー４７
配列番号６０：プライマー４８
配列番号６１：プライマー４９
配列番号６２：プライマー５０
配列番号６３：プライマー５１
配列番号６４：プライマー５２
配列番号６５：プライマー５３
配列番号６６：プライマー５４
配列番号６７：プライマー５５
配列番号６８：プライマー５６
配列番号６９：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＨＭＧ２のアミノ酸配列
配列番号７０：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ２のアミノ酸配列
配列番号７１：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ３のアミノ酸配列
配列番号７２：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ４のアミノ酸配列
配列番号７３：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ５のアミノ酸配列
配列番号７４：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ１８０１９）のアミノ酸配列
配列番号７５：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ２３８５８）のアミノ酸配列
配列番号７６：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ１９５０９）のアミノ酸配列
配列番号７７：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ２２０４６）のアミノ酸配列
配列番号７８：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ２２２２８）のアミノ酸配列
配列番号７９：Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌｅｔｔｕｃｅ由来のＨＭＧＲ（ＴＣ２３３４８）のアミノ酸配列
配列番号８０：Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ由来のＨＭＧＲ（００３９８２ｍ）のアミノ酸配列
配列番号８１：Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ由来のＨＭＧＲ（００４２０９ｍ）のアミノ酸配列
配列番号８２：Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｎｄｅｓ由来のＨＭＧＲのアミノ酸配列
配列番号８３：Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｉａ  Ｌ．由来のＨＭＧＲのアミノ酸配列
配列番号８４：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＨＭＧ１のアミノ酸配列
配列番号８５：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．由来のＨＭＧ１のアミノ酸配列
配列番号８６：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．由来のＨＭＧ２のアミノ酸配列
配列番号８７：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．由来のＨＭＧ３のアミノ酸配列
配列番号８８：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来のＨＭＧ２のアミノ酸配列
配列番号８９：Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＨＭＧ４のアミノ酸配列
配列番号９０：Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＨＭＧ５のアミノ酸配列
配列番号９１：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける２８７位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号９２：配列番号１で示されるシロイヌナズナにおける５７４位のアミノ酸残基を含む保存領域のアミノ酸配列
配列番号９３：プライマー５７
配列番号９４：プライマー５８
配列番号９５：プライマー５９
配列番号９６：プライマー６０
配列番号９７：プライマー６１
配列番号９８：プライマー６２
配列番号９９：プライマー６３
配列番号１００：プライマー６４
配列番号１０１：プライマー６５
配列番号１０２：プライマー６６
配列番号１０３：プライマー６７
配列番号１０４：プライマー６８
配列番号１０５：Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ由来のＨＭＧ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１０６：プライマー６９
配列番号１０７：プライマー７０
配列番号１０８：プライマー７１
配列番号１０９：プライマー７２
配列番号１１０：プライマー７３
配列番号１１１：プライマー７４
配列番号１１２：プライマー７５
配列番号１１３：プライマー７６
配列番号１１４：プライマー７７
配列番号１１５：プライマー７８
配列番号１１６：プライマー７９
配列番号１１７：プライマー８０
配列番号１１８：プライマー８１
配列番号１１９：プライマー８２
配列番号１２０：プライマー８３
配列番号１２１：プライマー８４
配列番号１２２：プライマー８５
配列番号１２３：プライマー８６
配列番号１２４：プライマー８７
配列番号１２５：プライマー８８
配列番号１２６：プライマー８９
配列番号１２７：プライマー９０
配列番号１２８：プライマー９１
配列番号１２９：プライマー９２
配列番号１３０：プライマー９３
配列番号１３１：プライマー９４
配列番号１３２：プライマー９５
配列番号１３３：プライマー９６
配列番号１３４：プライマー９７
配列番号１３５：プライマー９８
配列番号１３６：プライマー９９
配列番号１３７：プライマー１００
配列番号１３８：プライマー１０１
配列番号１３９：プライマー１０２
配列番号１４０：プライマー１０３
配列番号１４１：プライマー１０４
配列番号１４２：プライマー１０５
配列番号１４３：プライマー１０６
配列番号１４４：プライマー１０７
配列番号１４５：プライマー１０８
配列番号１４６：プライマー１０９
配列番号１４７：プライマー１１０
配列番号１４８：プライマー１１１
配列番号１４９：プライマー１１２
配列番号１５０：プライマー１１３
配列番号１５１：プライマー１１４
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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