(57)【要約】  本発明の課題は、薬剤研究開発におけるＱＴ間隔延長作用及び催不整脈性を検出する評価系に用いる、評価細胞とその樹立方法、及びそれを用いた被検物質のスクリーニング方法を提供することにある。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来し、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、導入されたＫＣＮＪ２遺伝子によりＫｉｒ２．１チャネルを発現し、電気刺激を与えたときの最大拡張期電位が−８５〜−６５ｍＶであり、自発的な周期的収縮活性を有さないことを特徴とする細胞を作製する。
2014192312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来し、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、導入されたＫＣＮＪ２遺伝子によりＫｉｒ２．１チャネルを発現する心筋モデル細胞。
【請求項２】
自発的な周期的収縮活性を有さないことを特徴とする請求項１に記載の心筋モデル細胞。
【請求項３】
生理的細胞内外液を使用した条件において、電気刺激を与えたときの最大拡張期電位が、−８５〜−６５ｍＶであることを特徴とする請求項１又は２に記載の心筋モデル細胞。
【請求項４】
Ｋｉｒ２．１チャネルの発現が、ウイルスベクターに導入されたＫＣＮＪ２遺伝子の発現であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の心筋モデル細胞。
【請求項５】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）がヒト由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の心筋モデル細胞。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする心筋モデル細胞の作製方法。
１）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋細胞又は心筋前駆細胞に分化させる工程（ａ）；
２）工程（ａ）により得られた心筋細胞又は心筋前駆細胞を含む胚様体若しくはコロニーを、単一細胞に分離する工程（ｂ）；
３）ＫＣＮＪ２遺伝子を組み込み、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現可能なベクターを調製する工程（ｃ）；
４）工程（ｂ）により分離した細胞を、分離直後から１時間以内に、工程（ｃ）で調製したウイルスベクターに感染させる工程（ｄ）；
５）心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現する細胞を選択する工程（ｅ）
【請求項７】
前記ベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
前記ベクターがエピソーマル型ベクターであることを特徴とする請求項６に記載の作製方法。
【請求項９】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を備えたことを特徴とする心筋細胞に対して毒性作用及び／又は変調作用を有する物質のスクリーニング方法。
１）請求項１〜５のいずれかに記載の心筋モデル細胞と被検物質とを接触させる工程（Ａ）；
２）電気生理学的試験手法を用いて、被検物質に起因する心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用を検出する工程（Ｂ）；
３）工程（Ｂ）の検出結果に基づき、被検物質の心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用の有無を判定する工程（Ｃ）； 
【請求項１０】
工程（Ｂ）における毒性作用及び／又は変調作用が、ｈＥＲＧ電流阻害活性であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常な内向きのカリウム電流特性を有するｉＰＳ細胞由来の心筋モデル細胞、その作製方法、及びそれを用いた心筋細胞に対して毒性作用や変調作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動悸、失神及び不整脈として現れる、医薬品副作用のトルサード・ド・ポアント（ＴｄＰ）は、心電図ＱＴ間隔延長を伴う心室性頻脈であり、致死的な予後不良の不整脈症状として知られる［非特許文献１］。ＴｄＰは、抗不整脈薬をはじめ抗腫瘍剤、抗生物質、抗精神病薬など、あらゆる医薬品投与時に起こり得る重篤な副作用であるため、創薬の過程において、ＱＴ間隔延長作用及び催不整脈性をもつ医薬品候補物質を、厳密に選別する必要がある。【０００３】
ＴｄＰは、ＱＴ間隔、つまり心室の興奮から再分極までの時間の延長を伴う。ＱＴ間隔延長は、心筋細胞膜にあるイオンチャネルの障害による、イオン電流の変化と密接に関係しており、中でもカリウムイオン（Ｋ＋）チャネル異常の関与が大きいと考えられている。心筋細胞に存在するＫ＋チャネルには大きく分けて２種類あり、ひとつは電位依存性Ｋ＋チャネル（Ｋｖ）と呼ばれ、心臓活動電位の第１相に関与する一過性外向き電流と、第３相に関与する遅延整流Ｋ＋電流（ＩＫ）を制御する［図１］。もうひとつは内向き整流Ｋ＋チャネル（Ｋｉｒ：inwardly rectifying K channel）と呼ばれ［図１］、ＩＫ１を含む３種類の内向き整流Ｋ＋電流を制御する。ＩＫ１電流のチャネルはＫｉｒ２．１とＫｉｒ２．２のヘテロ４量体で構成され、静止膜電位の維持、及び活動電位最終局面での静止膜電位への再分極化といった機能を司る［図１］。【０００４】
ＱＴ間隔延長を誘発する薬物の作用機序としては、心筋細胞における、薬物による遅延整流Ｋ＋電流（ＩＫ）の速い成分（ＩＫｒ）の抑制が知られている。ＩＫｒを形成するＫ＋チャネルのサブユニット分子であるｈＥＲＧ（HumanEther-a-go-go Related Gene）で構成されるｈＥＲＧチャネルは、薬物との結合や細胞外のカリウムイオンレベルの低下に対して敏感であり、どちらの場合も結果としてＱＴ間隔延長を引き起こす。ＩＫｒの抑制、すなわち、ｈＥＲＧチャネルの阻害が、ＱＴ間隔延長を引き起こすという知見により、日米欧各国の医療行政当局は、日米欧医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）による、前臨床開発での心疾患安全性確立に対する勧告（ＩＣＨ Ｓ７Ｂ：心室再分極遅延／ＱＴ間隔延長の薬学的臨床前評価ガイドライン）に基づき、新薬開発においてｈＥＲＧチャネルに対する安全性試験の実施を義務付けている［非特許文献２］。【０００５】
ｈＥＲＧチャネルに対する安全性試験に用いるモデル細胞の選択には、細胞のもつ電気生理学的特性に注意を要するが、入手可能性などの理由から、ヒト以外の生物種の心筋細胞、もしくは、ヒトイオンチャネル遺伝子を心筋細胞以外のヒト細胞株へ異所性に発現させた細胞が、従来用いられてきた。これら従来型モデル細胞は、前者ではヒトとは異なるイオンチャネルの分布が問題であり、また後者の場合は、心筋細胞と異なる環境下による、細胞内Ｃａ２+ハンドリングの関与や、心筋細胞内に豊富なミトコンドリアの影響を無視した条件である点などが、ヒト心筋のモデル細胞として扱う際に問題となる［非特許文献３］。【０００６】
全ての組織に分化し得るヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）から分化誘導された心筋細胞は、ヒトの心臓から単離した心筋細胞に近い電気生理学的性質を有すると考えられ、新たなヒト心筋モデル細胞として脚光を浴びている。ｈｉＰＳ細胞の創薬応用により、正確なin vitroスクリーニングが可能となれば、開発の後期段階でＱＴ間隔延長作用の発覚により対象から外される多くの医薬品候補物質を、早期の段階でふるい分けることが可能となり、大幅な開発費用削減が見込まれる。【０００７】
しかしながら、ｈｉＰＳ由来心筋細胞の特性を精査すると、以下のような性質を示すことから、ヒト心筋モデル細胞としての使用には理想的とは言い難い。すなわち、ｈｉＰＳ細胞から胚様体（ＥＢ：Embryoid body）を形成させ［図２］、得られたｈｉＰＳ由来心筋細胞には、結節型、心房筋型、心室筋型の活動電位特性を示す細胞が混在し［図３］、活動電位の幅に大きなばらつきが認められ［図４Ａ］、内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）が微弱であり［図４Ｃ］、静止膜電位にほとんど影響せず［図４Ｂ］、臨床濃度のｈＥＲＧチャネル阻害薬Ｅ４０３１により自律拍動が停止する［図５］ため、スクリーニングに用いた場合、正確な判定に支障をきたす恐れがある。【０００８】
また、ｈｉＰＳ由来心筋細胞は、自律拍動性が特徴のひとつであるが［図３，４］、哺乳類発生の過程における胎生初期の心筋細胞では、一つひとつの細胞が自律的に活動電位を形成するものの、胎生後期においては自律性が消滅することから、成人ヒト心筋細胞は、刺激伝導系から電気刺激を受け取り活動電位を形成する、受動的な細胞であるはずと考えられる。従って、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞は、［図３，４］に示すような自律的な活動電位を発している点で、非常に幼若な、胎生初期の心筋細胞に近い性質を持つことを意味し、この様な細胞を成人の心筋モデル細胞として使用するには適さない。【０００９】
ＱＴ間隔延長作用を有する、ｈＥＲＧチャネル阻害薬のＥ４０３１を用いて、心室筋型ｈｉＰＳ由来心筋細胞の、活動電位に対するＥ４０３１作用を測定すると、低濃度（１０，３０ｎＭ）の曝露の場合は、［図５ Ａ］に示すような自動的活動電位の発生頻度の低下を呈するが、Ｅ４０３１濃度を徐々に高めながら曝露濃度を１００ｎＭまで上げると、静止膜電位が浅くなり、すなわち、静止膜電位値が０に近づき、ｈｉＰＳ由来心筋細胞は、脱分極の不能により活動電位の停止に陥る［図５ Ｂ］。Ｅ４０３１洗浄により活動電位が復活するので、これは測定ダメージによる活動電位発生力の消失ではなく、１００ｎＭのＥ４０３１で活動電位が停止したことを示す［図５ Ｂ］。生体への使用では、同濃度のＥ４０３１投与により心停止を引き起こさないことが、臨床的に確認されていることから、in vitro電気生理試験における、ｈｉＰＳ由来心筋細胞に対するＥ４０３１の作用濃度が、ヒト生体内心筋細胞に対する実際の作用濃度と異なることを意味している。また、Ｅ４０３１が本来持つ、ＱＴ間隔延長作用の検出も困難である［図５ Ｂ］。【００１０】
従って、成人の心筋細胞とｈｉＰＳ由来心筋細胞との間では、i）成人の心室心筋細胞では、洞房結節（ペースメーカー）からの刺激無しでは拍動しないのに対して、ｈｉＰＳ由来心筋細胞は自律拍動する点、ii）最大拡張期電位（ＭＤＰ）が成人の心室心筋細胞では約−８０ｍＶであるのに対して、ｈｉＰＳ由来心筋細胞では−４０〜−５０ｍＶである点、iii）ｈＥＲＧ／Ｋ＋チャネルブロックにより、成人の心室心筋細胞は活動電位の再分極相が延長、すなわち心室筋活動電位持続時間（ＡＰＤ：ＱＴ間隔）が延長するのに対して、ｈｉＰＳ由来心筋細胞では、脱分極の不能により活動電位の停止を引き起こす点、において大きく異なっている［図６］。【００１１】
既報では、心毒性スクリーニング用モデル細胞として、ｈＥＲＧチャネルを遺伝子導入した例が挙げられるが［特許文献１，２］、ｈＥＲＧ遺伝子を発現させる対象が、非ヒト哺乳動物由来のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である点で、上述した従来のモデル細胞に共通する問題点を有する。また、ヒト胚幹細胞由来機能性心筋細胞も、心毒性スクリーニング用モデル細胞として発表されているが［特許文献３］、イオンチャネルに関する遺伝子改変はなく、物理的に収縮している細胞を対象としている点で、本発明とは異なる。【００１２】
また、受託試験サービスとして商業的に提供されている「ヒトｉＰＳ由来心筋による心筋毒性試験」（ＱＴｅｍｐｏ；登録商標，株式会社リプロセル）［非特許文献４］では、i）ヒトｉＰＳ由来心筋細胞塊（胚様体）そのものを試験に使用している、ii）心筋細胞が自律拍動しており幼若である、iii）試験に使用されるヒトｉＰＳ由来心筋細胞は、結節、心房、心室の全ての型が混在していることから、本発明の細胞と異なり、心毒性を予想する上で、本発明に比べ外挿性に劣ると予想される。【００１３】
最新の報告によると、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来心筋細胞は、Ｋｉｒ２．１チャネル遺伝子の導入により、強いＢａ２＋感受性ＩＫ１電流が発生し、自律拍動性を失い静止状態に変化することが示されている［非特許文献５］。しかしながら、ヒトｉＰＳ由来心筋細胞とヒトＥＳ由来心筋細胞では、５０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ５０）に、約１．３７倍の開きがあることから（ｉＰＳ由来：３８２+/-３８ｍｓ，ｎ＝３６、ＥＳ由来：２７８+/-２８ｍｓ，ｎ＝６４）［Lopez-Redondo F, Kurokawa J, et al., Human ES- and iPS-derived cardiomyocytes. A comparative electrophysiological study. 57th Biophysical Society Annual Meeting, Philadelphia, Biophys J, 104, 298a. (Feb 3-6, 2013)］、両者における電気生理学的性質の差が示唆されており、かつ、ｉＰＳ由来心筋細胞において、Ｋｉｒ２．１チャネルを強発現させる系が検討されたという報告は未だ例がない。【００１４】
臨床で経験される、ｈＥＲＧチャネル阻害による心電図ＱＴ延長とは、すなわち心室心筋の活動電位持続時間（ＡＰＤ）が延長することに他ならない。従来技術には、ｈＥＲＧチャネル阻害によるＱＴ延長作用の検出に用いるモデル細胞として、単純にｈＥＲＧチャネルを発現させた非ヒト由来細胞株の作出例のみ存在した［特許文献１，２］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０４７５００
【特許文献２】特開２００７−１６７０６８号公報
【特許文献３】特表２００５−５３３５１８号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Yap YG, et al., Heart. 2003 Nov;89(11):1363-72.
【非特許文献２】橋本宗弘「ＩＣＨ−Ｓ７Ｂドラフトガイドライン」（2003）日薬理誌,(121):377-383.
【非特許文献３】古川哲史ほか,「ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の電気生理学」（2011）JPN. J. ELECTROCARDIOLOGY Vol. 31 No. 3, 325-328.
【非特許文献４】淺井康行「ヒト多能性幹細胞由来拍動心筋細胞を用いた創薬試験系」（2011）心臓  Vol.43, No.1:p14-p19
【非特許文献５】Lieu DK, et al., Circ Arrhythm Electrophysiol. 2013 Feb;6(1):191-201. Epub 2013 Feb 7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、薬剤研究開発におけるＱＴ間隔延長作用及び催不整脈性を検出する評価系に用いる評価細胞とその樹立方法、及びそれを用いた被検物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行う過程において、内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）に対するＫ＋チャネルＫｉｒ２．１をコードする遺伝子の、ＫＣＮＪ２に着目した。アデノウイルスを用いてｈｉＰＳ由来心筋細胞にＫｉｒ２．１チャネルを発現させることで、強い内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）が発生し、ｈｉＰＳ由来心筋細胞がもつ自律拍動の特性が失われ、電気刺激依存的に活動電位が発生するという知見を得た。またエピソーマル型ベクターを用いて遺伝子導入することもできる。また、最大拡張期電位（ＭＤＰ）が、ＫＣＮＪ２遺伝子発現により約−５０ｍＶから−７０ｍＶへシフトし、成熟したヒト心室筋型心筋細胞の性質に近い、電気生理学的特性を示すことを見出した。更に、ｈｉＰＳ由来心筋細胞では、ｈＥＲＧ阻害によりＭＤＰが浅くなり短縮することがあった活動電位持続時間が、ＫＣＮＪ２発現細胞ではｈＥＲＧ阻害による活動電位持続時間の延長を呈し、すなわち、ｈＥＲＧ阻害によるＱＴ間隔延長のin vitroでの再現に成功した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。【００１９】
すなわち、本発明は、
〔１〕人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来し、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、導入されたＫＣＮＪ２遺伝子によりＫｉｒ２．１チャネルを発現する心筋モデル細胞に関する。【００２０】
また本発明は、
〔２〕自発的な周期的収縮活性を有さないことを特徴とする上記〔１〕に記載の心筋モデル細胞、
〔３〕生理的細胞内外液を使用した条件において、電気刺激を与えたときの最大拡張期電位が、−８５〜−６５ｍＶであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の心筋モデル細胞、
〔４〕Ｋｉｒ２．１チャネルの発現が、ウイルスベクターに導入されたＫＣＮＪ２遺伝子の発現であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の心筋モデル細胞、
〔５〕人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）がヒト由来であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の心筋モデル細胞に関する。【００２１】
さらに本発明は、
〔６〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする心筋モデル細胞の作製方法であって、
１）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋細胞又は心筋前駆細胞に分化させる工程（ａ）；
２）工程（ａ）により得られた心筋細胞又は心筋前駆細胞を含む胚様体若しくはコロニーを、単一細胞に分離する工程（ｂ）；
３）ＫＣＮＪ２遺伝子を組み込み、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現可能なベクターを調製する工程（ｃ）；
４）工程（ｂ）により分離した細胞を、分離直後から１時間以内に、工程（ｃ）で調製したウイルスベクターに感染させる工程（ｄ）；
５）心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現する細胞を選択する工程（ｅ）を含む方法、
〔７〕ベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする上記〔６〕に記載の方法、
〔８〕ベクターがエピソーマル型ベクターであることを特徴とする上記〔６〕に記載の方法、
〔９〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を備えたことを特徴とする心筋細胞に対して毒性作用及び／又は変調作用を有する物質のスクリーニング方法であって、
１）上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の心筋モデル細胞と被検物質とを接触させる工程（Ａ）；
２）電気生理学的試験手法を用いて、被検物質に起因する心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用を検出する工程（Ｂ）；
３）工程（Ｂ）の検出結果に基づき、被検物質の心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用の有無を判定する工程（Ｃ）；を含む方法、
〔１０〕工程（Ｂ）における毒性作用及び／又は変調作用が、ｈＥＲＧ電流阻害活性であることを特徴とする上記〔９〕に記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ｈｉＰＳ由来心筋細胞の問題点であった、自律拍動性すなわち未成熟さが解消され、成人ヒト心室心筋レベルに最大拡張期電位が深く、かつ、成人ヒト心室心筋細胞と同様のｈＥＲＧ阻害薬に対するＱＴ間隔延長作用を示す、心筋モデル細胞が提供される。すなわち、心毒性のある薬剤の選別、及び、臨床試験に用いる用量の設定といった、創薬に必須のin vitroスクリーニングにおいて、本発明のモデル細胞を用いることで、外挿性の高いスクリーニング結果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒト心臓の活動電位と各Ｋ＋チャネルを示す図である。
【図２】胚様体に分化した２０１Ｂ７株ｈｉＰＳ細胞の形態及び表現型を示す図である。心筋細胞に分化したｈｉＰＳ細胞の、光学顕微鏡像。胚様体形成法による心筋への分化誘導を、ｈｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）を用いて実施した。Ａ：胚様体形成。典型的なｈｉＰＳ細胞コロニーから、ｈｉＰＳ細胞が胚様体へ分化する様子を示す。スケールバー；３００μｍ  Ｂ：心臓系マーカー(ＡＡＮ；α−ａｃｔｉｎｉｎ，ＴｎＴ；ｔｏｒｏｐｏｎｉｎＴ)を発現する、分化したｈｉＰＳ細胞の免疫染色像。スケールバー；２０μｍ  Ｃ：心臓系マーカー(α−ａｃｔｉｎｉｎ，Ｃｘ４３；Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３)を発現する、分化したｈｉＰＳ細胞の免疫染色像。
【図３】胚様体形成法によるｈｉＰＳ由来心筋細胞が示す、活動電位の多様性を示す図である。結節型：静止膜電位が浅く、著明な拡張期脱分極がみられる。心房筋型：静止膜電位が深く、拡張期脱分極がわずかで、活動電位幅の短い活動電位。心室筋型：静止膜電位が深く、拡張期脱分極がわずかで、活動電位幅の長い活動電位を示す。
【図４】心筋細胞に分化したｈｉＰＳ細胞の、電気生理学的特徴を示す図である。Ａ：自律拍動するｈｉＰＳ由来心筋細胞（ｎ＝２６）の５０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ５０）と周期長（Cycle Length）をプロットした図を示す。（破線：線形近似値）  Ｂ：０．２ｍＭのＢａＣｌ２（ＩＫ１内向き整流Ｋ＋電流を阻害）及び１４０ｍＭのＫＣｌ（高カリウム；ポジティブコントロール）下での、ｈｉＰＳ由来心筋細胞の最大拡張期電位（ＭＤＰ）を、パッチクランプ法により求めた（ｎ＝６）。高カリウム下では最大拡張期電位を減少させるが、ＢａＣｌ２下では変化しない。＊Ｐ＜０．０５（コントロール値との間に有意差あり。）  Ｃ：パッチクランプ法によって記録された、ＩＫ１内向き整流Ｋ＋チャネル電流の電流電圧曲線（左：ｎ＝６）と、代表的電流密度トレース（右）。  右：０．２ｍＭのＢａＣｌ２が、内向き電流を阻害している。  グレー；コントロール  黒；ＢａＣｌ２  Ｖｈ（保持電位）＝−８０ｍＶ
【図５】ｈｉＰＳ由来心筋細胞の活動電位に対する、抗ｈＥＲＧ阻害剤（Ｅ４０３１）の効果を示す図である。Ａ：低濃度のＥ４０３１曝露では、自動的活動電位の発生頻度の低下を呈す。Ｂ：Ｅ４０３１濃度を徐々に高めながら曝露濃度を１００ｎＭまで上げると、静止膜電位は浅くなり、脱分極の不能により活動電位の停止に陥る。
【図６】心室筋型ヒト心筋細胞とｈｉＰＳ由来心筋細胞の特徴の違いを示す図である。
【図７】エピソーマル型ベクターを使用した遺伝子導入による成熟化心筋の作成の概略図である。
【図８】KCNJ2を過剰発現したiCell-CMシートから計測したFPDの頻度依存性を示す図である。
【図９】KCNJ2を過剰発現したiCell-CMシートから高頻度刺激により計測したFP波形に対するQT延長薬の影響を示す図である。
【図１０】アデノウイルスを介したｈｉＰＳ由来心筋細胞への、ＫＣＮＪ２遺伝子導入の概要を示す図である。
【図１１】アデノウイルスを使った、ｈｉＰＳ細胞への遺伝子導入法の検討結果１を示す図である。胚様体へ分化する３日前から２４時間、ｈｉＰＳ細胞に５０００ＭＯＩのGreen Fluorescent Protein（ＧＦＰ）をコードするアデノウイルスベクター（ｐＡｄ−ＧＦＰ）を感染させ、遺伝子導入の成否をＧＦＰの発現により確認した。図は、胚様体形成１日前の、感染細胞コロニーの微分干渉顕微鏡像（上）と蛍光顕微鏡像（下）である。一部の細胞にしかＧＦＰの発現が確認できず、遺伝子導入効率は大変低い結果となった。
【図１２】アデノウイルスを使った、ｈｉＰＳ細胞への遺伝子導入法の検討結果２を示す図である。ｈｉＰＳ細胞が胚様体へ分化した直後に、トリプシン処理により細胞を単一細胞化したのち８日目の細胞に、ウイルスを２４時間感染させた。遺伝子導入の成否をＧＦＰの発現により確認した。図は、胚様体形成から１０日目の、感染したｈｉＰＳ細胞の微分干渉顕微鏡像（上）と蛍光顕微鏡像（下）である。
【図１３】ＫＣＮＪ２の発現は、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞の自律収縮を停止させる結果を示す図である。Ａ：ｈｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ２５３Ｇ１）に、ＧＦＰタンパク発現遺伝子のみを導入した、ネガティブコントロール細胞クラスターの共焦点レーザー顕微鏡像を示す。ＧＦＰを発現する細胞クラスターが、不明瞭な横紋構造を形成しており（破線部）、これは、心筋への分化が未成熟であることを示す。（ＡＡＮ：α−アクチニン）  Ｂ：ｈｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ２５３Ｇ１）に、ＧＦＰ融合ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したクラスター（右）の共焦点レーザー顕微鏡像を示す。ＧＦＰ及びＫＣＮＪ２遺伝子導入の成否は、細胞基質及び細胞膜上のＧＦＰシグナル（緑）により判定される。過剰発現するＫＣＮＪ２（緑）が、α−アクチニン（赤，ＫＣＮＪ２；右下図中の白線内）の発現を促進している。ＫＣＮＪ２を発現する細胞は、明瞭な横紋を形成しており、すなわち成熟した筋節構造が構築されていることを意味する。スケールバー；２０μｍ  Ｃ：各幹細胞由来の心筋細胞が示す自律収縮能。（２０１Ｂ７，２５３Ｇ１；ｈｉＰＳ細胞株由来心筋細胞、ｉＣｅｌｌ−ＣＭｓ；市販ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞株、ｈＥＳ−ＣＭｓ；ＥＳ細胞由来心筋細胞）ＫＣＮＪ２を発現させた各幹細胞由来の心筋細胞は、全て自律収縮能を失うが、ＢａＣｌ２への曝露により自律収縮能を回復する。  Ｄ：ＧＦＰのみ（左）及びＫＣＮJ２（右）を導入した、ｉＣｅｌｌ心筋細胞シートのＧＦＰ蛍光シグナル（各上段）と、それぞれの微分干渉顕微鏡像（各下段）。スケールバー；１００μｍ
【図１４】ＫＣＮＪ２発現及び非発現ｉＣｅｌｌ心筋細胞の細胞外電位記録を示す図である。Ａ：ＧＦＰのみ（上段）及びＫＣＮJ２（中段）を導入したｉＣｅｌｌ心筋細胞シートの、非電気刺激における細胞外電位記録を示す。ＫＣＮＪ２を発現していないｉＣｅｌｌ心筋細胞が、周期的な自律性の電気発火を示すのに対し（上段）、ＫＣＮJ２を発現させると静止状態を呈する（中段）。細胞外液中へのＢａＣｌ２（０．５ｍＭ）投与により内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）を阻害すると、細胞外電場電位における自律性の興奮状態が惹起され、自律性の電気発火が開始する（下段）。破線：０シグナルレベルを示す。スケールバー；縦軸１ｍＶ  横軸１秒  Ｂ，Ｃ：ＫＣＮJ２を導入したｉＣｅｌｌ心筋細胞シートの、異なる周波数（０．５、１、２Ｈｚ）に応じた細胞外電位記録（Ｂ）と運動ベクトル（Ｃ）。スケールバー；縦軸１ｍＶ  横軸１秒  Ｄ：異なる周波数における運動ベクトルの波形。収縮の立ち上がりを揃えて重ね書きしたところ、収縮―弛緩時間が周波数依存的に変化した（０．５Ｈｚ＞１Ｈｚ＞２Ｈｚ）（左図）。収縮―弛緩時間の周波数依存性。それぞれの標本ごと（点線）と平均値（灰色・実線）のフィッティング直線。周波数が上がるほど収縮−弛緩時間が短縮した（右図）。この実験から、ＩＫｓチャネルの寄与を調べることができる。
【図１５】ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞上に過剰発現させたＫＣＮＪ２遺伝子によるＫｉｒ２．１チャネル（ＩＫ１電流）の機能性を示す図である。Ａ：ＧＦＰのみ（上段）及びＫＣＮJ２（下段）を導入したｉＣｅｌｌ心筋細胞における、パッチクランプ法電位固定モード（ボルテージクランプモード）により記録された、代表的なＩＫ１電流トレースを示す。細胞に挿入された細い針状電極により、０．５秒間のコマンドパルスを、保持電位−８０ｍＶ、−４０ｍＶから−１５０ｍＶまで、１０ｍＶ刻みで与えてイオン電流を誘発させ、その電流密度（ｐＡ／ｐＦ）トレースを重ねて表示した。総ＩＫ１電流は、細胞外液にＢａＣｌ２（０．２ｍＭ）を投入した記録から（中央）、Ｂａ２＋無しの記録（左）を差し引いた、Ｂａ２＋イオン感受性の電流（右）として示される。スケールバー；縦軸２０ｐＡ／ｐＦ  横軸２００ミリ秒  Ｂ：ＧＦＰのみ（白抜き）及びＫＣＮJ２導入細胞（黒）（各ｎ＝９）のＩＫ１電流における瞬時電流電圧相関曲線を示す。  Ｃ：Ｂ枠線内の拡大図。ＩＫ１電流の外向き電流成分を示す。
【図１６】ＫＣＮＪ２遺伝子を過剰発現するヒトｉＰＳ由来心筋細胞の性質を示す図である。Ａ，Ｂ：ＧＦＰのみ（Ａ）、及びＫＣＮJ２遺伝子（Ｂ）を発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞における、パッチクランプ法電流固定モードによる代表的活動電位トレース記録。ＫＣＮＪ２遺伝子導入ｉＣｅｌｌ心筋細胞においては、活動電位を発生させるために、細胞内通電（Ｂ；灰色楔形）を要した。スケールバー；縦軸５０ｍＶ  横軸１秒  Ｃ〜Ｆ：活動電位の各パラメータ解析結果。＊Ｐ＜０．０５（ＧＦＰ群との比較）  Ｃ：最大拡張期電位（ＭＤＰ）白抜き；ＧＦＰ群（ｎ＝３０）  灰色；ＫＣＮＪ２群（ｎ＝３６）  Ｄ：ＡＰＤ５０（５０％再分極時の活動電位持続時間）白抜き；ＧＦＰ群（ｎ＝２９）  灰色；ＫＣＮＪ２群（ｎ＝４３）  Ｅ：ｄＶ／ｄｔｍａｘ：０相の最大立ち上がり速度（立ち上がり速度；大きいほど心室筋型に近い）白抜き；ＧＦＰ群（ｎ＝２６）  灰色；ＫＣＮＪ２群（ｎ＝９）  Ｆ：プラトー相を反映する値、ＡＰＤ４０-３０／ＡＰＤ８０-７０率（≦１．５では心房筋様、＞１．５では心室筋様の活動電位とみなされる）  白抜き；ＧＦＰ群（ｎ＝８４）  灰色；ＫＣＮＪ２群（ｎ＝５２）
【図１７】ＫＣＮＪ２発現ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の活動電位に対するＢａＣｌ２の影響を示す図である。Ａ：ＫＣＮJ２遺伝子発現ｉＣｅｌｌ心筋細胞における、パッチクランプ法電流固定モードの記録による、代表的な活動電位トレースを３例示す。コントロール細胞外液（灰色）  ０．２ｍＭＢａＣｌ２加細胞外液（黒）  ＩＫ１内向き整流Ｋ＋電流を阻害するＢａ２＋イオンの投入により、通電無しで、自発的な活動電位が誘発された。  Ｂ：最大拡張期電位（ＭＤＰ）灰色；コントロール（ｎ＝９）  濃灰色；０．２ｍＭＢａＣｌ２加（ｎ＝９）  Ｃ：ＡＰＤ５０（５０％再分極時の活動電位持続時間）灰色；コントロール（ｎ＝９）  濃灰色；０．２ｍＭＢａＣｌ２加（ｎ＝９）  Ｄ：ｄＶ／ｄｔｍａｘ：０相の最大立ち上がり速度（立ち上がり速度；大きいほど心室筋型に近い）灰色；コントロール（ｎ＝９）  濃灰色；０．２ｍＭＢａＣｌ２加（ｎ＝９）  Ｅ：プラトー期ＡＰＤ４０-３０／ＡＰＤ８０-７０率（≦１．５では心房筋様、＞１．５では心室筋様の活動電位とみなされる）灰色；コントロール（ｎ＝９）  濃灰色；０．２ｍＭＢａＣｌ２加（ｎ＝９）
【図１８】ＫＣＮＪ２発現ｈｉＰＳ由来心筋細胞に対するｈＥＲＧ阻害剤（Ｅ４０３１）の効果を示す図である。Ａ〜Ｃ：ＧＦＰのみ（Ａ，Ｂ）を発現、またはＫＣＮJ２遺伝子（Ｃ）を発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞におけるＥ４０３１の影響を示した、パッチクランプ法電流固定モードによる、代表的活動電位トレース記録。ＡはＥ４０３１によって自発的な活動電位持続時間が短縮した典型例を示し、ＢはＥ４０３１によって自発的な活動電位持続時間が延長後に停止した典型例を示す。Ｃは０．２Ｈｚの細胞内通電により発生した活動電位を示す。Ａ〜Ｃ全て、Ｅ４０３１曝露の時間軸にあわせて圧縮されたトレースにて示される。図中に挿入された、一活動電位波長の重ね合わせトレースは、ａ〜ｄの時点（薬物投与前とそれぞれの濃度のＥ４０３１投与３分後）におけるトレースを抜き出したものである。  Ｄ，Ｅ：Ｅ４０３１（１０，３０，１００ｎＭ）投与による活動電位変化の概要。ＧＦＰのみを発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞の記録（ｎ＝６）。ＫＣＮJ２遺伝子を発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞の記録（ｎ＝３）。洗浄によりＥ４０３１の影響を除くと、Ｄ，Ｅ共に、ある程度の数値の回復が見られた。
【図１９】ＫＣＮＪ２の発現により、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児由来腎臓細胞）が、内向き整流性Ｋ＋イオン電流を発生することを示す、パッチクランプの記録を示す図である。Ａ：アデノウイルス発現クローンを示す図である。上：コントロール（ＧＦＰのみを発現） 下：ＫＣＮＪ２発現クローン（ＧＦＰとの連結蛋白を発現させている。）  Ｂ：パッチクランプ法によって記録された、ＩＫ１内向き整流Ｋ＋チャネル電流の電流電圧曲線（ｎ＝５）。保持電位−８０ｍＶから、０．５秒間のコマンドパルスを、−４０ｍＶから−１５０ｍＶまで１０ｍＶ刻みで１２回与えた場合の、電流密度（ｐＡ／ｐＦ）トレースの、電位依存的変化を示した図である。  Ｃ：Ｂの電流密度トレースを、重ねて表示した図である。内向き整流Ｋ＋チャネル遺伝子のＫＣＮＪ２を発現させたＨＥＫ細胞においては、Ｂａ2＋感受性の内向き整流性を示す電流が発生した。
【図２０】ｉＰＳ由来心筋細胞におけるＩ（ｆ）チャネルの機能的発現を示す図である。Ａ：ｉＰＳ由来心筋細胞（２０１Ｂ７）における、Ｉ（ｆ）チャネル電流トレースの代表例を示す。コマンドパルスを−１４０ｍＶから−４０ｍＶまで、２０ｍＶ刻みで６回与えた場合の、電流密度（ｐＡ／ｐＦ）トレースの電位依存的変化を示した図である。電流密度トレースを重ねて表示した図（左）、及び、塩化セシウムへの曝露の有無によるトレースの変化（右）を示す。スケール：２ｐＡ／ｐＦ，１ｓ。  Ｂ：上記トレースにおける、電流電圧曲線図（ｎ＝１３）  Ｃ：等時活性化曲線（ｎ＝９）Ｖ１／２＝−２ｍＶ  ｋ＝１０．７を示す。  Ｄ：５ｍＭの塩化セシウムによる、自律拍動頻度への影響を示す。（ｎ＝６）各群間において、有意差は認められなかった。
【図２１】エピソーマル型ベクターによるKCNJ2遺伝子導入をGFP蛍光シグナルとして評価した結果を示す図である。
【図２２】エピソーマル型ベクターによりKCNJ2遺伝子を導入した場合のヒトiPS心筋の機能変化を示す図である。
【図２３】ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したｈｉＰＳ由来心筋細胞による、ＱＴ間隔延長薬の評価法イメージを示す図である。
【図２４】ＫＣＮＪ２遺伝子を導入されたｉＰＳ由来心筋細胞がもつ、ハイスループットスクリーニング応用への利点を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、薬剤研究開発における被検物質の心筋細胞への影響を試験する際に有利に使用することができる心筋モデル細胞やその作製法に関し、本発明の心筋モデル細胞は、最大拡張期電位の深さ、ｈＥＲＧチャネル阻害による活動電位持続時間の延長傾向、及び自律拍動しない点において、成人心筋細胞が持つ電気生理学的特性と共通し、創薬スクリーニングに用いた場合、結果として得られる情報の質の向上が期待できる。
【００２５】
本発明の心筋モデル細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来し、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、導入されたＫＣＮＪ２遺伝子によりＫｉｒ２．１チャネルを発現する細胞であれば特に制限されないが、自発的な周期的収縮活性を有さない細胞や、生理的細胞内外液を使用した条件において、電気刺激を与えたときの最大拡張期電位が、−８５〜−６５ｍＶである細胞や、Ｋｉｒ２．１チャネルの発現が、ウイルスベクターに導入されたＫＣＮＪ２遺伝子の発現である細胞や、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）がヒト由来である細胞が好ましい。
【００２６】
また、本発明の心筋モデル細胞の作製方法としては、ｉＰＳ細胞から心筋細胞又は心筋前駆細胞に分化させる工程（ａ）；工程（ａ）により得られた心筋細胞又は心筋前駆細胞を含む胚様体若しくはコロニーを、単一細胞に分離する工程（ｂ）；ＫＣＮＪ２遺伝子を組み込み、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現可能なウイルスベクターを調製する工程（ｃ）；工程（ｂ）により分離した細胞を、分離直後から１時間以内に、工程（ｃ）で調製したウイルスベクターに感染させる工程（ｄ）；心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、又はα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）のうち少なくとも１つの細胞内因性遺伝子を発現し、かつ、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現する細胞を選択する工程（ｅ）の各工程を備えた方法であれば特に制限されないが、上記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであることが好ましい。かかる本発明の作製方法により、上記本発明の心筋モデル細胞を得ることができる。
【００２７】
本発明の心筋モデル細胞は、内因性遺伝子から心筋細胞及び心筋前駆細胞の特異的マーカーである心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、及びα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）の内、少なくとも１つ、より好ましくは２つ、特に好ましくは３つ以上の細胞内因性遺伝子を発現するが、これらに加えて心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、Ｎ−カドヘリン、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＦ）、ミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ＧＡＴＡ−４（心筋転写因子）、ＮＫＸ２．５（心筋転写因子）、及びＭＥＦ−２ファミリー（心筋転写因子）から選ばれる１又は２種以上の特異的マーカーを発現する細胞が好ましい。
【００２８】
本発明の心筋モデル細胞は、形態学的に明瞭な心筋細胞の特徴を有する。すなわち、免疫染色によって検出可能な、筋節構造に特有の横紋を有し［図１３ Ｂ］、紡錘形、円形、三角形、多角形などの形態を示し得る。
【００２９】
上記ｉＰＳ細胞としては、山中ら［Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72.］によって記載される方法で作製されたヒト人工多能性幹細胞の他、京都大学から提供されているｈｉＰＳ細胞株の２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、並びに、Cellular Dynamics International,Inc.（ＣＤＩ）社から販売されている分化心筋細胞ｉＣｅｌｌの様に、樹立された細胞系統の形態でも提供される細胞を例示することができる。かかるｉＰＳ細胞として、初代コロニーから直接得られる細胞や、もしくは分化のためにすぐに使用可能な他の方法で作製されたｉＰＳ細胞も用いることができる。また、ｉＰＳ細胞の由来としては、ヒトの他、アカゲザル、カニクイザルなどの非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌなどの実験動物、家畜、ペットを好適に挙げることができる。
【００３０】
本発明におけるＫｉｒ２．１チャネルとしては、ＫＣＮＪ２遺伝子にコードされた、心筋細胞における内向き整流Ｋ＋チャネルの構成タンパク質の一つであって、配列番号１（UniProtKB Accession No.：P63252）で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はこれら配列と９５％以上の同一性を有する同効物を好適に挙げることができる。ここで同効物とは、細胞に発現させた場合、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質のＫｉｒ２．１活性を有するポリペプチドいい、上記Ｋｉｒ２．１活性とは、カリウムイオンチャネルとして機能し、内向き整流性Ｋ＋イオン電流を発生させる活性を意味する。また、上記実質的に同質の活性とは、その活性が性質的に、例えば電気生理学的あるいは薬理学的に、同質であることを示す。
【００３１】
かかるＫｉｒ２．１チャネルのアミノ酸配列情報は、UniProt（http://www.uniprot.org/）等のデータベース検索により、適宜入手することができ、IRK2_HUMAN（UniProtKB Accession No.：P63252）として登録されたものを、具体的に例示することができる。また、Ｋｉｒ２．１チャネルの塩基配列情報は、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベース検索により、適宜入手することができ、GenBank Accession No.：NM_000891.2  GI：22095339として登録されたものを、具体的に例示することができる。
【００３２】
本発明においてＫＣＮＪ２遺伝子とは、Ｋｉｒ２．１チャネルをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドをいう。本発明のＫＣＮＪ２遺伝子は、配列番号２（GenBank Accession No.：NM_000891.2  GI：22095339）で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はこれら配列と９５％以上の同一性を有する同効物を好適に挙げることができる。ここで同効物とは、配列番号２で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチドと実質的に同質のＫｉｒ２．１活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドをいう。
【００３３】
本発明の心筋モデル細胞の作製方法において用いられる、ＫＣＮＪ２遺伝子を含むウイルスベクターとしては、上記ＫＣＮＪ２遺伝子を宿主細胞内に保持し、該ＫＣＮＪ２遺伝子にコードされるＫｉｒ２．１チャネルを発現することができるウイルスベクターであれば特に制限されず、かかるウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスなどをベースにしたレトロウイルス、ヒト免疫不全1型ウイルス（ＨＩＶ−１）などをベースにしたレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などを由来とするウイルスベクターが挙げられ、特に、サイトメガロウイルスプロモーターを含有するｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴアデノウイルスベクターなどを好適に挙げることができる。
【００３４】
例えば、アデノウイルスベクターにＫＣＮＪ２遺伝子を導入すると、導入遺伝子を好ましくは１ヶ月以上、より好ましくは２ヶ月以上、持続的かつ長期的にｉＰＳ由来心筋細胞上で発現させることができる。一般的に、アデノウイルスベクターは、導入遺伝子が染色体外でエピゾーマルに存在し自律複製することはないため、一過性の遺伝子発現を示し、よって細胞が分裂するごとに導入遺伝子の発現は弱まる。しかし、ヒト心筋細胞は、生後約1カ月で分裂能を喪失するという性質のため、アデノウイルスベクターによる導入遺伝子の長期発現が期待でき、本発明において遺伝子導入されたｉＰＳ由来心筋細胞においても、約２ヶ月のＫＣＮＪ２遺伝子発現を確認している。より長期的なＫＣＮＪ２遺伝子の発現には、非分裂細胞への感染力があり、かつ、導入遺伝子の一部で染色体への組み込みを期待できる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を有利に使用することができる。
【００３５】
ＫＣＮＪ２遺伝子導入アデノウイルスベクターは、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）の様な非心筋細胞に対しても、Ｂａ2＋感受性の内向き整流Ｋ＋電流を発生させることができ[図１９]、ＨＥＫ細胞の他に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞、アフリカツメガエル卵母細胞などもＢａ2＋感受性の内向き整流Ｋ＋電流を発生させることができる。
【００３６】
上記ウイルスベクターは、選択可能なマーカーを含んでもよく、選択可能なマーカーとして、具体的にはアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤に対する耐性遺伝子のほか、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）などの蛍光タンパク質などを例示することができる。
【００３７】
ＫＣＮＪ２遺伝子導入アデノウイルスベクターの構築に用いることができる、組換えクローニング技術としては、ＴＡクローニングや制限酵素を用いるクローニングのほかに、大腸菌におけるラムダファージの部位特異的組換えを利用した、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標；Life Technologies,Carlsbad,CA USA）クローニングなどを好適に例示することができる。
【００３８】
ＫＣＮＪ２遺伝子の発現は、ウイルスベクターに組み込まれたＧＦＰ発現マーカーを蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などで検鏡し、視覚的に確認することができる。他にも、市販又は定法により作製した抗ＫＣＮJ２抗体を用いたウェスタンブロット法、フローサイトメトリー法、免疫組織化学染色法、免疫蛍光染色法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などにより定性・定量的に、ＫＣＮＪ２遺伝子発現を測定することができる。
【００３９】
本発明における細胞内への遺伝子導入方法としては、ＫＣＮＪ２遺伝子を細胞内に導入する限り特に制限されず、ＫＣＮＪ２遺伝子を細胞内に導入する方法としては、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Lipofectin Reagent（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）2000 Reagent（Invitrogen社製）や、SuperFect（登録商標）Transfection Reagent（キアゲン社製）、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、FuGENE（登録商標）6 Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販のトランスフェクション試薬を用いる当技術分野で広く用いられている手法を挙げることができる。
【００４０】
本発明におけるウイルスベクターに感染させる工程としては、ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞及び心筋前駆細胞を含む胚様体若しくはコロニーを単一細胞に分離し、分離から１２時間以内、より好ましくは６時間以内、特に好ましくは３時間以内、最も好ましくは１時間以内にウイルスベクターへの感染を開始させ、感染のインキュベーション時間としては、９６時間、より好ましくは７２時間、特に好ましくは４８時間、最も好ましくは２４時間のインキュベーション時間を例示することができる。
【００４１】
また、ウイルスベクターの感染に際しては、５０００ＭＯＩ、より好ましくは１０００ＭＯＩ、特に好ましくは５００ＭＯＩ、最も好ましくは１００ＭＯＩの濃度で使用する。
【００４２】
本発明における自発的な周期的収縮活性とは、細胞の周期的な電気的活動により、細胞が自発的かつ規則正しく収縮と弛緩を繰り返す現象をいい、Ｋｉｒ２．１チャネルを発現していないｉＰＳ細胞由来の心筋細胞は、この自発的な周期的収縮活性を有している。これに対して、本発明の心筋モデル細胞は自発的な周期的収縮活性を有しておらず、自発的ではなく（電気刺激を受けた場合に）細胞が規則正しく収縮と弛緩を繰り返す。細胞の自発的な周期的収縮活性は、目視観察によって判定することができ、ビデオカメラ又は顕微鏡などを用いて計数した、１視野あたりの自律拍動細胞数を、１視野あたりの細胞総数で標準化した、自律拍動細胞数率を用いて評価することができる。
【００４３】
本発明における活動電位とは、ナトリウムイオン及びカリウムイオンを主体とする電荷をもつイオンが、細胞内外の濃度差に従い、イオンチャネルを通じて受動的に拡散を起こすことにより生じる、一過性の電位変化をいう。また、本発明における膜電位とは、上記イオンの濃度差により、細胞の内外で生じている電位の差をいい、静止膜電位とは、細胞内外を移動するイオンの流出入電荷量が等しい状態における、安定した膜電位をいい、陰性の電位である。
【００４４】
本発明における最大拡張期電位とは、陰性の静止膜電位が、刺激により陽性電位へと入れ替わる脱分極を経て、もとの静止膜電位へ戻る再分極の過程における陰性頂点にあたる電位をいう。本発明の心筋モデル細胞の最大拡張期電位は、ヒト心室筋型心筋細胞に代表される細胞における最大拡張期電位と同程度の−８５〜−６５ｍＶであることが好ましい。
【００４５】
本発明において、正常な内向きのカリウム電流における内向きのカリウム電流とは、静止膜電位の維持、及び、活動電位最終局面での静止膜電位への再分極化を司るＩＫ１電流をいい、正常な内向きのカリウム電流特性とは、ヒト心筋細胞に代表される細胞が発生するＩＫ１電流強度に比して、同程度のＩＫ１電流強度を有する性質をいう。
【００４６】
本発明における活動電位測定の実施には、本発明の心筋モデル細胞の作製方法における工程（ｄ）のウイルス感染後３日以降、より好ましくは３日以降３０日以内、最も好ましくは１４日以降３０日以内の期間、培養した細胞を使用し、測定用の細胞外液・細胞内液バッファーとしては、ｐＨ６〜８のリン酸バッファー、トリス塩酸バッファーなどの、ＩＫ１電流に影響を与えないバッファーであれば特に制限されず、１３２ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４．８ｍＭ ＫＣｌ，１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ Glucoseの組成により調製されたバッファーを、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調製した細胞外液や、１１０ｍＭ K-Aspartate，５ｍＭ ＡＴＰ−Ｋ２，１１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２の組成により調製されたバッファーを、ＫＯＨによりｐＨ７．３に調製した細胞内液を、好ましく挙げることができる。
【００４７】
本発明における活動電位、静止膜電位、最大拡張期電位測定を記録するには、パッチクランプ法又は全自動ハイスループットパッチクランプシステムを用いることができる。静止状態にある、本発明のＫｉｒ２．１チャネル発現細胞における活動電位は、種々の保持電位及び脱分極刺激（コマンドパルス）を細胞に与えることにより誘発することができる。これらの条件については、当業者であれば容易に設定することができ、一例としては、０．５秒間のコマンドパルスを０．１Ｈｚの周波数内で、−４０ｍＶから−１５０ｍＶまで１０ｍＶ刻みで細胞に与えることにより、誘発することができる。ＩＫ１電流成分の特定には、０．２ｍＭのＢａＣｌ２を添加した細胞外液下で観察されるトレースを、ＢａＣｌ２添加前のトレースから差し引かれた差分により同定される、Ｂａ２＋差分電流の値を用いることができる。
【００４８】
本発明の心筋細胞に対して毒性作用及び／又は変調作用を有する物質のスクリーニング方法としては、上記本発明の心筋モデル細胞と被検物質とを接触させる工程（Ａ）；電気生理学的試験手法を用いて、被検物質に起因する心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用を検出する工程（Ｂ）；工程（Ｂ）の検出結果に基づき、被検物質の心筋細胞に対する毒性作用及び／又は変調作用の有無を判定する工程（Ｃ）；の各工程を備えた方法であれば特に制限されず、上記工程（Ｂ）における毒性作用及び／又は変調作用が、ｈＥＲＧ電流阻害活性であることが好ましい。
【００４９】
例えば、電気生理学的試験手法を用いて、被検物質に起因する心筋細胞に対する毒性作用や変調作用を検出する方法としては、全自動ハイスループットパッチクランプシステムを含むパッチクランプ法、アイソトープ及び原始吸光分析によるイオンフラックス法、膜電位感受性色素法、イオン感受性蛍光色素法、多点平面電極システムを利用した細胞外電位測定法、ＭＥＡ（Multielectrode Array）システムによる多電極記録法、ＦＲＥＴ等の分子プローブを含む膜電位感受性色素を用いた活動電位測定法、膜電位イメージング法、イオン流束（Ion flux）解析法、放射性リガンド結合試験法などを好適に挙げることができる。
【００５０】
上記毒性作用や変調作用は、ｈＥＲＧ電流阻害活性、細胞機能への影響、マーカーの発現、受容体結合、電気刺激による収縮活性、電気生理学的特性変化等を検出することにより明らかにすることができる。上記ｈＥＲＧ電流阻害活性を検出するには、本発明の心筋モデル細胞のＱＴ間隔延長作用を評価すればよく、かかるＱＴ間隔延長作用評価法としては、被検物質との接触により、活動電位持続時間（ＡＰＤ）や、ＭＥＡシステムにおけるフィールドポテンシャル持続時間（ＦＰＤ）の延長を測定する方法を挙げることができる。ＦＰＤの測定によると、Ｎａチャネルでのイオン流入による、脱分極の大きなピークを始点とし、カリウムチャネルによる再分極のピーク（２ｎｄピーク）を終点として計測される値をもとに、被検物質によるＱＴ延長作用を評価することができる。
【００５１】
上記本発明のスクリーニング方法は、創薬のスクリーニングに有用である。かかる創薬スクリーニングによると、被検物質の細胞機能への影響、マーカーの発現、受容体結合、電気刺激による収縮活性、電気生理学的特性変化の解析などにより、副作用のない薬剤としての有効性を評価することができる。影響が観察される場合、被検物質の濃度を力価測定し、致死量及び半有効量を決定することができる。
【００５２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
１．ｈｉＰＳ細胞の培養
ｈｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７，２５３Ｇ１）は、Basic fibroblast growth factor（１０ｎｇ／ｍｌ）(ｂＦＧＦ；R&D Systems)を加えた霊長類ＥＳ細胞培養液（ReproCell）中で、１ｍｇ／ｍｌのmitomycin C solution（Nacalai Tesque）で処理されたＳＮＬ７６／７（European Collection of Cell Culture）の支持細胞層上に播種し、培養を行った。継代時は、ｈｉＰＳ細胞コロニーを酵素処理により単一細胞化し、支持細胞でコーティングされた培養ディッシュに撒き、継代培養を行った。
２．心筋細胞への分化誘導
心筋細胞への分化誘導は過去の報告（PLoS ONE 6(8):e23657,2011）を、若干改変した手法で行った。共培養した支持細胞を除くために、ｉＰＳ細胞はｍＴｅＳＲ１培養液（Stem cell technologies）中のmatrigel（Invitrogen）基底膜マトリックス上で数世代継代し、分化誘導の前日に、１：６０希釈にしたmatrigelで細胞を覆った。心筋細胞への分化誘導するため、ｍＴｅＳＲ１培養液を１００ｎｇ／ｍｌのActivin A（R&D Systems）を加えたＢ２７加RPMI1640培養液（ＲＰＭＩ／Ｂ２７）に換えて２４時間培養し、続いてbonemorphogenetic protein 4（１０ｎｇ／ｍｌ, R&D Systems）とｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えて４日間培養した。５日目に、培養液をRPMI/B27/Dkk1（１００ｎｇ／ｍｌ，R&D Systems）に換えた後、７日目にはＲＰＭＩ／Ｂ２７に換え、２−３日ごとに培養液の交換を行った。９日目には自律拍動する細胞が観察された。
３．分化済み心筋細胞の前培養
分化済みのｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞として市販されている、iCell-cardiomyocytes（ｉＣｅｌｌ−ＣＭｓ）（Cellular Dynamics International；ＣＤＩ，Madison，ＷＩ，ＵＳＡ）を、iPS Academia Japan Inc.社（Kyoto，Japan）より購入した。ｉＣｅｌｌ−ＣＭｓについて、製造元（ＣＤＩ）より提供されている方法に従い解凍し、アデノウイルスに感染させるまでの４日間、前培養を行った。ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の胚様体は、Cellectis社（Sweden）より購入し、酵素処理により単一細胞化した後、製造元（Cellectis）より提供されている方法に従いアデノウイルスに感染させるまでの４日間、前培養を行った。
４．ＫＣＮＪ２発現プラスミドベクターの作製
ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰ融合タンパク質の遺伝子をコードする、プラスミドのｐＥＮＴＲ−ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰについて、cagcttgccgtctctcatgg (ＫＣＮＪ２ reverse)［配列番号３］、gtccccaacactcccctttg (ＫＣＮＪ２ forward) ［配列番号４］、cgtctccgtccagctcgaccag (ＥＧＦＰ reverse)［配列番号５］、gaccacatgaagcagcacgac (ＥＧＦＰ forward)［配列番号６］、の４プライマーにより全長の翻訳領域の配列を決定した。全長翻訳領域配列は、制限酵素のＳａｌＩとＮｏｔＩで切断され、T4 DNA ligase（Takara）のライゲーションにより、pENTR1Aベクター（Invitrogen）へ配列を挿入した。LR Clonase II Enzyme Mix（Invitrogen）のＬＲ反応により、エントリークローンであるｐＥＮＴＲ１Ａ−ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰを介した、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Invitrogen）へのターゲット遺伝子組み換えを行った。得られた発現クローンのｐＡｄ−ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰを増幅させ、純正プラスミドＤＮＡを精製した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞へ形質導入する前に、左右両端の逆方向反復配列（ＩＴＲ又はパリンドローム配列）を、Lipofectamine（登録商標）2000 Reagent （Invitrogen）に曝露させた。アデノウイルス発現クローンを増幅するＨＥＫ２９３Ａ細胞は、定常的にＥ１タンパクを発現しており、ＨＥＫ細胞及びｉＣｅｌｌ−ＣＭｓへの遺伝子導入用に回収して用いた。
５．心筋細胞へのアデノウイルスを介した遺伝子導入
前培養した幹細胞由来心筋細胞を、分散・分離溶液のアキュターゼを用いた酵素処理により単一細胞化し、lamimin/poly-D/L-lysineコーティングされたガラスボトムディッシュに撒いた。心筋細胞をアデノウイルスに感染させるために、１００ＭＯＩの濃度のｐＡｄ−ＥＧＦＰ又はｐＡｄ−ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰに、２４時間曝露させた。感染開始から４８時間後の感染率（心筋細胞におけるＧＦＰシグナル陽性率）は、６０〜１００％（平均約８０％）であった。アデノウイルス感染心筋細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ GlutaMAX（Invitrogen）、０．１ｍＭ non essential amino acid（Sigma）、０．１ｍＭ 2-mercapto ethanol（Sigma）加Knockout DMEM（Invitrogen）下にて培養を行った。培養細胞は、アデノウイルスによる遺伝子導入完了後３０日の間は、培養により維持が可能であり、以下の解析には全て導入から３０日までの感染細胞を用いて実施した。膜電流及び活動電位測定は、全てＧＦＰ陽性細胞を用いて行った。同様に、ＨＥＫ２９３細胞への遺伝子導入用として、ＨＥＫ２９３細胞をDulbecco's Modified Eagle Medium（Gibco）で培養し、１００ＭＯＩ（Multiplicity Of Infection）の濃度のｐＡｄ−ＥＧＦＰ又はｐＡｄ−ＫＣＮＪ２−ＥＧＦＰに感染させた。ＫＣＮＪ２遺伝子の発現から４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞における膜電流を測定した。
６．免疫細胞染色及び画像解析
解析に用いた細胞は、全てlamimin/poly-D/L-lysineコーティングされたガラスボトムディッシュ又はチャンバー上に培養し、免疫細胞染色には、氷冷した１００％エタノールに５〜１５分置いて固定・浸透化させた。また、ＧＦＰ画像解析には、４％パラホルムアルデヒドの後、０．１％ Triton-Xに浸透化させて用いた。引き続いて、phosphate-buffered saline（ＰＢＳ）にて洗浄し、免疫細胞染色には、５％ fetal bovine serum/PBSにて３０分間ブロッキングを行い、１次抗体との反応を４℃にて一晩行った後、Alexa 488又はAlexa 647にて標識された２次抗体イムノグロブリンＧとの反応を、室温にて２時間行った。１次抗体はAlexa 488又はAlexa 647標識２次抗体でラベルされ、余分な抗体はＰＢＳにて洗浄した。画像解析に用いた全細胞は、ＰＢＳを取り除いた後、ガラスボトムディッシュ又はスライドガラス上で、VECTASHIELD mounting medium（Vector，Burlingame，ＵＳＡ）にて封入を行った。細胞の観察には、Zeiss LSM510共焦点レーザー倒立型顕微鏡を使用し、励起光と蛍光の波長をそれぞれＥｘ； ４８８ｎｍ，Ｅｍ；５０５〜５２０ｎｍとＥｘ；６３５ｎｍ，Ｅｍ；６５０〜６７０ｎｍに設定した１００倍油浸対物レンズを用いるか、又は、Olympus IX-71倒立型蛍光顕微鏡を使用し、キセノンランプを（励起光：４９２±９ｎｍ、吸収フィルタ：５３０±１８ｎｍ）に設定した、４０倍油浸対物レンズを用いて行った。共焦点顕微鏡画像は、リニアレンジの蛍光強度／ピクセルを用いた光電子増倍管ゲインの自動調整により最適化され、１６回の取り込み画像を平均化したものを採用した。
７．心筋細胞の収縮性解析
分化誘導された心筋細胞とそのクラスターの収縮活性の観察には、ビデオカメラ（Hitachi）又は顕微鏡(IX-71)を使用した。収縮率は、１０−ｓビデオカメライメージ若しくは、１分間の目視観察により、収縮回数を計数して算出した。クラスターについては、ＧＦＰ陽性細胞を３以上含むものを、収縮性解析に使用した。ｈｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導率を割り出すために、自律拍動する細胞数は、顕微鏡の１視野あたりの細胞総数で標準化した。ＩＫ１内向き整流Ｋ＋電流を阻害するために、０．２ｍＭのＢａ２＋をバスへ投与した。静止状態のＫＣＮＪ２−ＧＦＰ細胞クラスターには、電気刺激装置(8EN-7203，NIHON KOHDEN，Tokyo，Japan）を用いた１０ｍｓ、５０Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚの均一な電場による、長期的電位刺激を与えた。
８．電場電位解析
ｉＰＳ細胞由来及びＥＳ細胞由来の心筋細胞における、自発的並びに誘発的な電場電位を計測するために、MED64 multi-electrode array system （Alpha MED Science，Osaka，Japan）を使用した。細胞は、ＭＥＤプローブに直接入れて培養し、非侵襲性平面微小電極を用いて自発的又は電気刺激誘発性の電場電位を調べた。電気刺激は、ＭＥＤプローブ上の、２つの隣接する電極から誘起させた。
９．運動ベクトル解析
自律拍動する心筋細胞の運動ベクトルは、［Ghanbari, M. The cross-search algorithm for motion estimation. IEEE Transactions on communications 38, 950-953 (1990)］及び［Hayakawa, T. et al. Noninvasive evaluation of contractile behavior of cardiomyocyte monolayers based on motion vector analysis. Tissue engineering. Part C, Methods 18, 21-32 (2012)］に記載の、ブロックマッチング・アルゴリズムを用いた解析により算出した。
１０．パッチクランプ
活動電位と膜電流は、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器（Molecular Devices，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた穿孔パッチ立体構成のパッチクランプ法により記録した。電信情報は、５ｋＨｚのローパスフィルター設定を用いて２〜５ｋＨｚで検出した。pCLAMP software（version10.02，Axon）は、voltage-pulseプロトコール作成や、データの取得及び解析に使用した。阻害剤などは、バス溶液へ迅速灌流システムを用いて投与した。ｈｉＰＳ由来心筋細胞又はｉＣｅｌｌ心筋細胞（幹細胞由来心筋細胞）を用いた全ての解析は、３６±１℃の環境下で実施した。また、同様にＨＥＫ２９３細胞においても、ホールセル・パッチクランプ技術によるＩＫ１電流の測定を実施した。細胞外液は、１３２ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，４．８ｍＭ ＫＣｌ，１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ Glucose（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調製）、細胞内液は、１１０ｍＭ K-Aspartate，５ｍＭ ATP-K2，１１ｍＭ ＥＧＴＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＫＯＨでｐＨ７．３に調製）の組成で調製した。ＩＫ１電流と電流電圧曲線は、ｈｉＰＳ由来心筋細胞・ＨＥＫ２９３細胞共に同一の電圧プロトコールで測定した。−１００ｍＶの電気刺激により誘発されたＩＫ１電流は、全細胞破裂パッチクランプ（Whole-cell ruptured patch-clamp）法により、直列抵抗が３〜５ＭΩの状態で細胞膜が破裂した後から測定を開始し、ＩＫ１電流の振幅が安定するまで（〜２−３分間）測定を続けた。その後、電流電圧曲線の解析を行った。
１１．パッチクランプ法による解析
幹細胞由来心筋細胞の解析には、細胞をlaminin/poly-D/L-lysineコーティングされたディッシュに撒いたものを、倒立型顕微鏡（IX-71，Olympus）のステージに設置し、培養液をTyrode’s solution（１３５ｍＭ ＮａＣｌ／０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／５．４ｍＭ ＫＣｌ／１．８ｍＭ ＣａＣｌ２／０．５３ｍＭ ＭｇＣｌ２／５．５ｍＭ Glucose／５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に置き換えた。組成が１１０ｍＭ aspartic acid，３０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，５ｍＭ adenosine-5’-triphosphate magnesium salt，５ｍＭ creatine phosphate disodium salt，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ（ｐＨ７．２５）の細胞内液で満たされた場合の、微小電極の尖端抵抗は１．５〜４ＭΩであった。パッチ穿孔（１０〜２０ＭΩ、直列抵抗）を得るために、amphotericin B（０．３−０．６μｇ／ｍｌ；Nacalai）を細胞内液に投与した。パッチピペット内の前面を細胞内液に浸して満たし、背面をamphotericin Bを添加した細胞内液で満たした。ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞（２０１Ｂ７）、ｉＣｅｌｌ心筋細胞及びヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の細胞膜静電容量はそれぞれ、４９．８±８．１ ｐＦ（ｎ＝１９）、４６．２±２．７ｐＦ（ｎ＝７４）、４３．７±４．８ｐＦ（ｎ＝１３）であった。
１２．パッチクランプ法の測定条件
幹細胞由来心筋細胞の活動電位及び静止膜電位は、電流固定法を用いて記録した。パッチクランプに使用した細胞の評価基準は、結果の項目に記す。自律拍動性心筋細胞の活動電位は、電気刺激無しに記録した。特に別途記載のない限り、静止状態の心筋細胞については、持続時間が０．２〜３．１ｍｓの脱分極電流刺激で、かつ、電流強度が閾上であり（活動電位を誘発する最低値の１２０％）、周波数が１Ｈｚの電流を流すことで、活動電位を誘発させた。ＩＫ１（Ｋｉｒ２．１）電流の電流電圧曲線を得るために、０．５秒間のコマンドパルスを０．１Ｈｚの周波数内で、−４０ｍＶから−１５０ｍＶまで１０ｍＶ刻みで刺激した。ＩＫ１電流成分は、０．２ｍＭのＢａＣｌ２を添加した細胞外液下で差し引かれたトレースにより同定される、Ｂａ２＋差分電流として示される。電流電圧の相関曲線は、コマンドパルスの電圧に対するＢａ２＋差分電流のピーク振幅を求めることで得られる。
１３．薬剤・化合物
選択的Ｉｋｒ阻害薬のＥ４０３１は、エーザイ株式会社（Japan）から提供されたものを使用した。他の全ての化合物は、医薬品グレードのものを使用し、一般的な流通経路により入手した。２００ｍＭ ＢａＣｌ２（水溶液）、１Ｍ ＣｓＣｌ（水溶液）、１０ｍＭ Ｅ４０３１（水溶液）のストック溶液は、パッチクランプの細胞外液中に用時、最終濃度に調製して使用した。Ｅ４０３１のストック溶液については、使用する日と同日に調製した。
１４．ＲＮＡ抽出及び、定量的real-time PCR
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）又はｉＣｅｌl心筋細胞からの全ＲＮＡ抽出には、RNeasy kit（Qiagen）を使用した。相補的ＤＮＡは、プライマーとしてランダムヘキサマー（Applied Biosystems）を用いた逆転写により作製した。定量的real-time PCRは、ABI7300 cyclerを用いて実施した。ＫＣＮＪ２プライマー（sense primer; 5’-TGTCACGGATGAATGCCCAA-3’配列番号７, antisense primer; 5’-CAAACACAGCTTGCCGTCTC-3’配列番号８）によるＫＣＮＪ２発現の解析には、SYBR greenを使用した。これらの解析は、製造者によって推奨されるプロトコールに沿って実施した。SYBR greenを使用した場合、ＰＣＲ産物は、常時、解離曲線解析ソフトウェア（Applied Biosystems）により確認作業を行った。転写量は、ΔΔＣＴ法を用いて比較を行った。ハウスキーピング遺伝子のコントロールとして、ＧＡＰＤＨを用い、プライマーは（sense primer; 5’-GAGCCACATCGCTCAGACAC-3’ 配列番号９, antisense primer; 5’-CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3’ 配列番号１０）を使用した。
１５．データ解析・統計処理
全ての数値は、平均値±標準誤差で示す。pCLAMP software ver.9.2and10.3（Molecular Dynamics）は、パッチクランプでのデータ取得及び解析に使用した。活動電位パラメータの解析には、Peak Analysis Module搭載のLabchart ver.7.2（ADInstruments）を使用した。図表作成及び統計処理には、OriginPro9.0J（Microcal）、Illustrator CS6.0（Adobe）、Instat program（GraphPad）を使用した。特に記載の無い場合、２群比較ではステューデントｔ検定を、多重比較では分散分析とBonferroni検定を行い、統計的有意差を求めた。Ｐ値＜０．０５を統計的有意差有りとした。
１６．エピソーマル型ベクターを使用した遺伝子導入
続いて、エピソーマル型ベクターを使用した遺伝子導入による成熟化心筋の作成を試みた。【００５４】
pIRES2-EGFP-KCNJ2（Hosaka et al. JMCC 2003 35:409-15）からSalI/NotIもしくはSalI/BamHIで切りだしたヒトKCNJ2を含むインサートをそれぞれの制限酵素のセットでカットしたpEBMulti-Neoベクター（和光純薬）にサブクローニングした。図７に示すように、SalI/NotIで切りだしたインサートには、マーカーとしてEGFP蛋白が発現し、SalI/BamHIで切りだしたインサートはhKCNJ2クローンのみが含まれる。遺伝子導入の効果を調べる際には、EGFPを標識して行った。【００５５】
iCell-CM（CDI社)は、CDI社のプロトコルとNakamura et al. J Pharmacol Sci 124:494-501 (2014)に従い、凍結バイアルから解凍し、35 mmもしくは60 mmプラスチックディッシュ上で前培養を行った。培地を始め試薬類は全て細胞に同封されるキットのものを使用した。初回解凍後は、バイアル当たり6 cmディッシュ３枚の底面積を基準にして単層培養を行い、２−７日後の植え換えの際に測定系に応じた処理を施した。【００５６】
遺伝子をトランスフェクションする場合の細胞単離法について次に示す。【００５７】
細胞単離法（再播種）；実験プロトコルは下記に示すものであった。
・37℃に温めたPBS(-)で3回洗う。
・37℃に温めた0.5 mL accutase (innovative cell technologies)を与え、CO2インキュベーターで 37 ℃ 30分静置する。
・30-50 %の細胞が丸くなりディッシュの底から浮いていることを確認し、ディッシュをそっと傾けて混ぜると、9割の細胞を底から浮かせる。
・37℃に温めた0.5 mL PBS(-)を加える。（accutaseには酵素反応停止は必要ないとされており、細胞を洗う意味でPBSを添加する。）
・遠心  200Xg  ５分間(RT)（ラボのエッペン卓上遠心機では1500rpmぐらい）後、上清を捨てる。遺伝子導入処理をせずに再播種したものをVehicleとした。【００５８】
Neon(登録商標) Transfection system kit (Invitrogen)を利用したエレクトロポレーションによる手法は下記に示すものであった。
・iPS細胞由来分化心筋細胞を準備する。ここでは、iCell-CM (CDI社）を用いた。
・解凍してラミニンコートしたガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ 3971-035）に前培養したiCell-CM (CDI社）を前述の方法で単離する。
・アクターゼで単離したiPS心筋細胞をPBSでwash後、遠心（200Xg, 5分間）
・プラスミド溶液を作成
Neon Transfection system kit 100μL(Invitrogen #MPK10025)
Buffer R:100μL  Plasmid:1μg
・Neon チューブにBuffer Eを3 mL入れてピペットステーションにセットする。
・細胞の遠心終了後、細胞の上清を100μL程度残してブルーチップで吸い取る。
・イエローチップでしっかりと上清を取り除く。
・プラスミド溶液に細胞を懸濁して、1.5 mLエッペンチューブ（蛋白非吸着タイプ）に移す。
・Neon 100μL tipで細胞懸濁液を吸い上げ、泡を立てずに機器にセットする。
・エレクトロポレーションを行う。 【００５９】
Voltage：1650 V、Width：10 ms、Pulse Number：3 （京大プロトコル）
・温めておいたガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ 3971-035）にすばやく撒き、CO2インキュベーターへ入れて、実験実施まで培養（2日後写真ビデオ撮影）。 ＊細胞のプラスミド溶液への懸濁から播種までは1サンプルずつ行う。【００６０】
Lipofectamin2000 (Invitrogen)を利用した手法は下記に示すものであった。即ち、ガラスボトムディッシュに再播種したiCell-CM(１枚ごとの細胞数100-1000個)が定着したのを確認し（２日以上後）、リポフェクタミン2000 (Invitrogen)のプロトコルに従い、以下の順に遺伝子導入を行った。
・50μL Opti-mediumにcDNA 1μg を加え、５分間静置。
・50μL Opti-mediumにLipofectamine2000 2μLを加え、５分間静置。
・上述のそれらの溶液を混合し、２０分間静置(室温)。
・準備したiCell-CMに加え、CO2インキュベーターで 37 ℃で培養。
・２４時間後に培地交換、さらに24時間後撮影(実験実施)。【００６１】
蛍光倒立顕微鏡（Olympus IX-71,X40 油浸対物レンズ）にて、GFP蛍光を観察した（キセノンランプ、Ex; 492 ± 9 nm, Em; 530 ± 18 nm）。イメージ撮影と動画撮影は、冷却CCDカメラ（CoolSNAP HQ, Photometrics）で行い、MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices 社）でデータ処理および解析を行った。同条件（解像度，シャッター時間等）で取得したGFP画像は全て同条件（カラースケール，閾値等）の処理を施した。【００６２】
平均動き量は、ビデオ動画からブロックマッチングアルゴリズム（前の画像から動いたベクトル値をブロックごとに計算する古典的手法）を応用したHayakawa T et al., Tissue Eng Part C Methods 18:21-32:2012 の方法に基づいて算出し、動画撮影中（3秒間）の変化を解析した。
１７．KCNJ2を過剰発現したiPS心筋シートにおける頻度依存性
iCell-CM（CDI社)は、CDI社のプロトコルとNakamura et al. J Pharmacol Sci 124:494-501 (2014)に従い、凍結バイアルから解凍し、35 mmもしくは60 mmプラスチックディッシュ上で前培養を行った。培地を始め試薬類は全て細胞に同封されるキットのものを使用した。初回解凍後は、バイアル当たり6 cmディッシュ３枚の底面積を基準にして単層培養を行い（前培養）、４日後にMEA用のチャンバー（マルチチャンネルシステム社）に細胞を撒き換えた。【００６３】
マルチチャンネルシステム社のMEAシステムを用いて細胞外電位の記録を行った。【００６４】
MEAマルチ電極アレーディッシュの中央にラミニン/poly-D-lysineをコートして、前培養してあったiCell-CMを撒き直す。MEAの電極上に心筋シートを作成するには工夫が必要であり、バイオリサーチセンター社では、電極アレイを中心としてプラスチックの筒を付属することが出来る。その筒に単離した細胞を注入して心筋シートを作成する事が出来た。KCNJ2を遺伝子導入するためのアデノウイルスは、MEAディッシュに撒き直す際に添加した。【００６５】
多電極シート(電極のレイアウト：8 X 8)からの信号は、MEA1060 アンプで増幅し、フィールドポテンシャル(FP)の波形を得た。図８Ｂの波形に示すように、FPの立ち上がりから基線に戻るまでの時間をフィールドポテンシャル持続時間(FPD)として、FPDの値を評価した。測定温度は全て37℃で行った。測定時の細胞外液はiCell-CM Maintenance medium(CDI社)のままで行い、倒立顕微鏡に取り付けた卓上CO2インキュベーター内にディッシュを静置した。【００６６】
刺激入力のための電極は、任意の隣り合う２チャンネルを選択した。それ以外の電極からはFPを計測し、再分極のピークが最も顕著に見られる波形を選択してFPDの値を算出した。FPD値の算出に使用したチャネル（一電極に相当）以外に少なくとも3つのチャネルで同じコントロールのFPD値が得られることも確認した。【００６７】
データ取得・データ解析は全てマルチチャンネルシステム社のMEAシステムを使用した。CSVファイルからマイクロソフトのExcel上でデータを解析し、統計はGraphpad社のInstatプログラムを用いて、ANOVAもしくはnon-paired t-testで評価した。
１８．結果：ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞の特徴
ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞を得るために、ｉＰＳ細胞クローンの２０１Ｂ７を胚様体へ分化させた［図２ Ａ］。心筋細胞への分化を証明するため、心筋のマーカーであるα−アクチニン（α−ａｃｔｉｎｉｎ）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、心臓トロポニンＴ（ＴｎＴ）の免疫細胞染色を行い、発現を確認した［図２ Ｂ,Ｃ］。電気生理学的な特徴として、パッチクランプ法による、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞の活動電位記録から、多様な波形を示すことが明らかとなった。いくつかの活動電位波形は、結節型、心房筋型、心室筋型に類似した波形を示した［図３］。５０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ５０）と周期長（Cycle Length）をプロットした図では、これまでの報告通り周期長が延びるに従い、ＡＰＤ５０が増大する傾向が見られたとともに、ＡＰＤ５０値のばらつきも示された［図４］。また、自発的な活動電位を発生していることから、ｈｉＰＳ細胞の分化段階は、幼若であることを示している。この様な、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞の、成人心室筋細胞と明らかに異なる電気生理学的特徴は、薬剤の毒性を予測する実験系に使用した場合に問題となり得る。最大拡張期電位（ＭＤＰ）は、成人心室心筋細胞では約−８０ｍＶであるのに対して、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞では約−５５ｍＶと陽性方向にシフトしている［図４ Ｂ］。最大拡張期電位の大部分はＫ＋イオン濃度に制御されており、すなわち本来ならばＫ＋電流が深く関係しているが、内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）を阻害するＢａ２＋イオンへの曝露が最大拡張期電位に対して影響を及ぼさないことから［図４ Ｂ］、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞においては、内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）の関与が小さいことを示している。実際、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞で記録された−１５０ｍＶにおけるＩＫ１電流密度（ｐＡ／ｐＦ）は、非常に小さい（−１．５±０．５ｐＡ／ｐＦ；［図４Ｃ］）。また、ＱＴ間隔延長を引き起こす、ｈＥＲＧチャネル阻害剤Ｅ４０３１の、ｈｉＰＳ由来心筋細胞活動電位における作用を確認すると、低濃度（１０，３０ｎＭ）の曝露の場合は、心室筋活動電位持続時間が延長し、Ｅ４０３１の除去により回復する［図５ Ａ］。一方、段階的にＥ４０３１濃度を上げ、１００ｎＭまで上昇させた長時間曝露では、除去の後に脱分極不能となり、活動電位が停止する［図５ Ｂ］。臨床において１００ｎＭ／Ｅ４０３１はＱＴ延長が見られる濃度域であり、拍動が止まるという報告はない。これは、本結果のＥ４０３１作用濃度が、臨床における作用濃度と異なることを示し、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞を安全性薬理試験に用いた場合、生体内での作用濃度を読み誤る恐れがある。以上、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞と、心室筋型ヒト心筋細胞の特徴の違いを図６にまとめる。これらの結果が、Ｋ＋チャネルＫｉｒ２．１をコードするヒトＫＣＮＪ２遺伝子を、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞へ導入する動機づけとなった。
１９．結果：ＫＣＮＪ２遺伝子の導入法の検討
ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞へ、アデノウイルスを介したＫＣＮＪ２遺伝子の導入を検討した［図１０］。まず初めに、胚様体形成前のｈｉＰＳ細胞にアデノウイルスを感染させたところ、感染ウイルス量が５０００ＭＯＩ濃度で、ごく一部の細胞にのみ、感染を示すＧＦＰの発現を認めた［図１１］。次に、１〜１０００ＭＯＩまでの感染アデノウイルス量において濃度検討を行い、感染させるタイミングを、分化した胚様体の単一細胞化から８日後に設定して、導入効率を検討したところ、導入効率の向上が見られた［図１２］。更なる感染条件検討の結果、遺伝子導入のプロトコールとして、胚様体からｉＰＳ細胞を単一細胞化した直後に、１００ＭＯＩの濃度でアデノウイルス感染を開始し、２４時間後にウイルスを除き、感染開始から３日目以降の細胞を実験に使用した。発現効率（ＧＦＰ陽性率）は、約８０％であった。
２０．結果：ＫＣＮＪ２の発現は、ｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞の自律収縮を停止させる
ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞クラスターについて、免疫細胞染色により心筋細胞マーカーのα−アクチニン、及び遺伝子導入細胞を意味するＧＦＰの発現を確認した［図１３ Ａ，Ｂ］。ＧＦＰタンパク発現遺伝子のみを導入した、ネガティブコントロール細胞クラスターでは、横紋構造の不明瞭さから、心筋への分化の未成熟さが示されたが［図１３ Ａ；右下図中の破線内］、ＧＦＰ融合ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したクラスターでは、過剰発現するＫＣＮＪ２（緑）が、α−アクチニン（赤：ＡＡＮ）の発現を促進し、明瞭な横紋、すなわち成熟した筋節構造の構築が確認できた［図１３ Ｂ；右下図中の白線内］。ＫＣＮＪ２遺伝子の導入は、ＧＦＰの蛍光シグナルにより確認された［図１３ Ｄ］。また、２０１Ｂ７細胞株及び２５３Ｇ１細胞株由来の心筋細胞、並びに、ｉＣｅｌｌ心筋細胞、ヒトＥＳ細胞由来心筋細胞の全てにおいて、ＫＣＮＪ２遺伝子の導入により、心筋細胞クラスターの自律拍動性が消失するが、ＢａＣｌ２への曝露により自律収縮能を回復した［図１３ Ｃ］。
２１．結果：ＫＣＮＪ２発現及び非発現ｉＣｅｌｌ心筋細胞の細胞外電位記録
ｉＣｅｌｌ心筋細胞シートの、非電気刺激における細胞外電位記録及び、ハイスピードビデオカメラが捉えた収縮する細胞の挙動について検討を行った［図１４］。細胞外電場電位の記録には、高純度に精製されたｉＣｅｌｌ心筋細胞を用い、シート状心筋細胞の電気生理学的特徴を捉える手段として一般的な、ＭＥＡシステムを使用した。ＧＦＰのみ遺伝子導入された、アデノウイルス感染ｉＣｅｌｌ心筋細胞シート（陰性コントロール）は、細胞外電場電位記録上で周期的な自律性の電気発火を呈した（０．９５±０．２１Ｈｚ，ｎ＝５）［図１４ Ａ上段］。一方、ＫＣＮＪ２遺伝子を発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞シートは、完全に静止状態を示した［図１４ Ａ中段］。細胞外液中へのＢａＣｌ２（０．５ｍＭ）投与により内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）を阻害すると、細胞外電場電位における自律性の興奮状態が惹起され、自律性の電気発火が開始する［図１４ Ａ下段］。従って、自律拍動の抑制には、静止状態のｉＣｅｌｌ心筋細胞上に過剰発現するＫＣＮＪ２遺伝子、つまり、Ｋｉｒ２．１チャネル（ＩＫ１電流）の寄与が示唆された。また、ＫＣＮＪ２を導入した静止状態のｉＣｅｌｌ心筋細胞シートは、周波数の変換による、電気刺激頻度の増減に依存した拍動性を示した［図１４ Ｂ，Ｃ］。この電気刺激／周波数依存性の拍動は、運動ベクトル解析（Motion vector analysis）により解析を行った。周波数を上げるにつれ、収縮−弛緩持続時間は短縮していったことから、遅延性の整流性Ｋ＋電流の寄与が示唆された［図１４ Ｄ］。
２２．結果：ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞上に過剰発現させたＫＣＮＪ２遺伝子によるＫｉｒ２．１チャネル（ＩＫ１電流）の機能性
Ｋｉｒ２．１チャネルは、ＫＣＮＪ２遺伝子導入により機能的に過剰発現しており［図１５］、ＧＦＰの発現は、ＫＣＮＪ２タンパク発現の有無を確認するための指標として扱われる。Ｋｉｒ２．１チャネルの機能的発現を、パッチクランプ法による電流測定により確認した典型例のトレースを［図１５ Ａ］に示す。０．５秒間の電位パルス刺激（コマンドパルス）を、保持電位−８０ｍＶ、−１５０ｍＶから−４０ｍＶまで、１０ｍＶ刻みで与えた条件で得られたトレースを、重ね合わせた図を解析した結果、コントロールのｉＣｅｌｌ心筋細胞では、Ｋｉｒ２．１チャネル選択的阻害剤であるＢａＣｌ２（０．２ｍＭ）により抑制される電流成分を差し引いた成分（Ｂａ２＋−subtracted電流）がほとんど発生しないのに対し、ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したｉＣｅｌｌ心筋細胞では、Ｂａ２＋−subtracted電流、つまりＩＫ１電流の発生が確認できた。刺激電位ごとの最大値をＢａ２＋−subtractedトレースから得てプロットした、ＩＫ１電流成分を［図１５ Ｂ］に示す。（ＧＦＰのみ；Ｎ＝９，ＫＣＮＪ２；ｎ＝９）。Ｂの一（−８０から−４０ｍＶ）の拡大図を［図１５ Ｃ］に示す。
２３．結果：ＫＣＮＪ２遺伝子を過剰発現するヒトｉＰＳ由来心筋細胞の性質
ＫＣＮＪ２遺伝子が導入されたｉＣｅｌｌ心筋の単細胞を用いて、パッチクランプ法により活動電位を記録した。ＫＣＮＪ２の遺伝子導入が、活動電位波形の形態的特徴を劇的に変化させることが示された［図１６ Ａ，Ｂ］。［図１５］の結果から予測されたように、ＫＣＮＪ２遺伝子を発現するｉＣｅｌｌ心筋の単細胞は、静止状態であった［図１６ Ｂ］。また、ＫＣＮＪ２遺伝子を発現するｉＣｅｌｌ心筋の単細胞に対し、細胞内通電を行うと、細胞膜電位の細胞内外の極性が入替わるオーバーシュートを引き起こし、心室筋型の活動電位を誘発する［図１６ Ｂ］。ＫＣＮＪ２遺伝子導入により、最大拡張期電位（ＭＤＰ）、ｄＶ／ｄｔｍａｘ：０相の最大立ち上がり速度（立ち上がり速度；大きいほど心室筋型に近い）及びＡＰＤ４０-３０／ＡＰＤ８０-７０率（≦１．５では心房筋様、＞１．５では心室筋様の活動電位とみなされる）は、心室筋様に変化することが確認できた［図１６ Ｃ〜Ｆ］。また、パッチクランプ法電流固定モードの記録により、ＫＣＮJ２遺伝子発現ｉＣｅｌｌ心筋細胞における、代表的な活動電位トレースを解析すると、ＩＫ１内向き整流Ｋ＋電流を阻害するＢａ２＋イオンの投入により、初回電気刺激以降の通電無しで、自発的な活動電位が誘発され［図１７ Ａ上段及び中段］、拡張期第４相に脱分極させる活動電位を自律的に発火させることが示された。ＫＣＮＪ２遺伝子導入された心筋細胞において、内向き整流Ｋ＋電流（ＩＫ１）を阻害するＢａ２＋イオンへの曝露の有無による電気生理学的性質の変化をまとめたところ、Ｂａ２＋イオンへの曝露によりＭＤＰは浅くなり［図１７ Ｂ］、また一方で、５０％再分極時の活動電位持続時間（ＡＰＤ５０）は延長を呈した［図１７ Ａ下段，Ｃ］。
２４．結果：ＫＣＮＪ２発現ｈｉＰＳ由来心筋細胞に対するｈＥＲＧ阻害剤（Ｅ４０３１）の効果
選択的ＩＫｒ阻害剤のＥ４０３１は、ＫＣＮＪ２遺伝子発現の無いｈｉＰＳ細胞由来心筋細胞において、拡張期電位を顕著に脱分極へと導いた［図１８ Ａ，Ｂ］。ＧＦＰのみを発現するコントロール細胞では、低濃度Ｅ４０３１曝露により活動電位持続時間（ＡＰＤ）が短縮（Ａ）する細胞と、延長（Ｂ）する細胞の両ケースが確認された。ＫＣＮＪ２発現細胞の最大拡張期電位（ＭＤＰ）は、累積的なＥ４０３１の投与に対して変化を示さず［図１８ Ｃ，Ｄ］、一方で、ＧＦＰのみを発現するコントロールの細胞においては、Ｅ４０３１濃度上昇にしたがって、ＭＤＰが浅く推移した。また、活動電位持続時間（ＡＰＤ）については、ＫＣＮＪ２発現細胞では、濃度依存的な延長を示した［図１８ Ｃ，Ｅ］のに対し、コントロール細胞においては、平均の値では濃度依存的な短縮を呈した（ｎ＝６）［図１８ Ｅ］。従って、ＧＦＰのみを発現するコントロールの細胞の、Ｅ４０３１による活動電位持続時間延長（ＡＰＤ）を立証することは困難であるが［図１８ Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ］、ＫＣＮＪ２遺伝子導入した静止状態の心筋細胞を用いた場合は、Ｅ４０３１濃度依存的な、活動電位持続時間の延長を記録することが可能であることが示された［図１８ Ｃ，Ｄ，Ｅ］。
２５．結果：ＫＣＮＪ２遺伝子発現により、ＨＥＫ細胞は内向き整流性Ｋ＋イオン電流を発生する
心筋細胞の代わりにＨＥＫ細胞を用いて、ＫＣＮＪ２遺伝子の導入を行い、内向き整流Ｋ＋チャネル電流ＩＫ１の電流電圧曲線（Ｂ）及び、重ね合わせた電流密度トレース（Ｃ）を精査したところ、コントロールベクターによりＧＦＰのみを発現するＨＥＫ細胞では、内向き整流Ｋ＋チャネル電流が発生しないのに対し、ＫＣＮＪ２遺伝子を導入したＨＥＫ細胞では、Ｂａ2＋感受性の強い内向き整流Ｋ＋チャネル電流が発生した［図１９ Ｂ，Ｃ］。
２６．結果：ｉＰＳ由来心筋細胞におけるＩ（ｆ）チャネルの機能的発現
心臓の洞房結節はペースメーカー電位を発生し、心臓における心拍リズムを決定している。洞房結節のペースメーカー細胞においては、特徴的な緩徐脱分極相が心拍数の調節に大きく寄与しており、この相を形成するペースメーカーチャネルとしてＩ（ｆ）チャネルが知られている。Ｉ（ｆ）チャネルは、主に洞房結節、房室結節とプルキンエ束の伝導系に局在しており、過分極電位で活性化することで、主としてＮａ+が細胞内に流入する。ｉＰＳ由来心筋細胞において、Ｉ（ｆ）チャネル電流の発生、及び、塩化セシウムによるＩ（ｆ）チャネル電流の選択的抑制が観察された［図２０Ａ〜Ｃ］。Ｉ（ｆ）チャネルは
、自律神経ホルモンによる心拍数調節に重要な役割を果たすことが知られるが、ｉＰＳ由来心筋細胞にも発現していることが明らかとなった。しかしながら、選択的Ｉ（ｆ）チャネル阻害剤である塩化セシウムによる自律拍動への影響には、各群に有意差は認められなかった［図２０Ｄ］。よって，ｉＰＳ由来心筋細胞にはＩ（ｆ）チャネルが機能的に発現しているものの，自律拍動への影響は小さいことが示された．
２７．結果：エピソーマル型ベクター遺伝子導入
エピソーマル型ベクターによるKCNJ2遺伝子の導入に成功した。図２１は、遺伝子導入をGFP蛍光シグナルとして評価した結果をまとめた図である。まず、Neonシステムによる遺伝子導入についてであるが、図中のGFP蛍光画像において、vehicleはspot的な自家蛍光のみを示したのに対し(図の上段)、Neonシステムによる処理を施した細胞ではタンパク発現を示す細胞全体の蛍光シグナルを観察することが出来た（図の中段；生存した細胞のほぼ９０％）。この処理により、半分以上の細胞が死滅した（浮かんだ）ことから、細胞障害は中程度以上であった。【００６８】
次に、Lipofectamine2000を用いた遺伝子導入についてであるが、図の最下段に示すように細胞クラスターの一部の細胞で強い蛍光シグナルを観察することが出来た。図の最下段のGFP蛍光画像では、上部の細胞には遺伝子導入されているが、下部の細胞は自家蛍光のみであり、遺伝子が導入されなかったことを示している。全体としては，10%以下の導入効率であったが、細胞障害は弱く、死滅した細胞もクラスターの縁に少し観察されるのみであった。【００６９】
アデノウイルスベクターを用いてKCNJ2を遺伝子導入したときと同様に、KCNJ2遺伝子導入により、拍動心筋の動きが停止した。【００７０】
図２２は、図２１のうち、vehicle（上段）とLipofectamine2000(下段)のビデオ画像（3秒間）から算出した平均動きベクトル量の時間変化を示している。図に示すように、KCNJ2-EGFPの遺伝子導入により、細胞の動きが完全に停止した。一方で、vehicle細胞は拍動しており、動きベクトルの活発な変化が見られた。以上の実験結果は、エピソーマル型ベクターによるKCNJ2-EGFP遺伝子導入によっても、本発明の機能変化をもたらすことが可能であることを示した。
２８．結果：KCNJ2を過剰発現したiPS心筋シートから計測したFPDの頻度依存性の検討
図８にKCNJ2を過剰発現したiCell-CMシートから計測したFPD（フィールドポテンシャル持続時間）の頻度依存性を示す。刺激頻度は0.5 Hzから2 Hzである。図８Ａには、FP波形の典型例を示す。図８Ｂ上段には、異なる頻度（0.5, 1, 2 Hz）によるFP波形を重ね合わせた図を示している（一つの心筋シート標本から得られたデータ）。図８Ｂ下段には、7例から得られたFPD値の頻度依存性の結果をまとめている。黒いシンボルは個々のシートの値であり、異なる頻度の値を点線で結び、頻度依存性を示している。白抜きシンボルで平均値を示しており、頻度(Hz)の値が増えるほどFPDが減るという逆相関が見られた。この結果は、QT間隔や活動電位持続時間に見られる頻度依存性（逆頻度依存とも言う）を良く反映する結果であり、当該発明による処理を行う事ではじめて観察することに成功した。【００７１】
心電図のQT間隔、ランゲンドルフ心臓標本のQT間隔もしくはMAP、心筋細胞標本の活動電位幅(APD)には頻度依存性があることがよく知られており、その性質は不整脈発生において重要であることが知られている（Viswanathan PC et al., Circulation 99:2466-2474:1999）。自律拍動をする未処理のiPS心筋（平均拍動能  約1 Hz）には低頻度刺激(0.5 Hzなど)を入力することは不可能であるため、刺激頻度依存性を評価することは出来ないので、当該発明による処理をiPS心筋に施したところ、刺激頻度0.5 Hzから5 Hzまでの刺激印加に追随して心筋シートを拍動させることに成功した。2Hz以上に刺激頻度を上げていくとビートごとのFPDが安定しない現象が見られ、5Hzまでの刺激印加に対してはおおむね追随するという結果が得られた。【００７２】
代表的QT延長薬剤であるE4031存在下で同様の実験を行ったところ、2 HzではビートごとのFPDの不安定性が上がり、5Hz刺激には全く追随せず、スパイラルリエントリーを示唆するFP波形が観察された。よって、10 nM E4031において、催不整脈性を示す2つのパラメーター；ビートごとのFPD値のばらつきおよび高頻度における刺激不追随性、が顕著に上がることが示された。【００７３】
即ち、図９は、KCNJ2を過剰発現したiCell-CMシートから高頻度刺激により計測したFP波形に対するQT延長薬E4031の影響を示す図である。刺激頻度2 Hz(上段)および5 Hz(下段)の結果を示す。左側にはコントロール(薬物投与前)、右側にはE4031（10 nM  5分間添加）存在下のFP波形を示す。【００７４】
まず2 Hzの結果であるが、コントロールでは刺激後の再分極ピークまでのFPD値は150-200 msの範囲内でのばらつきであったが、E4031添加後には150-350 msとFPD値ばらつきの程度が広がった。5Hzの結果では、コントロールの時には図中の矢印は刺激から、大体180 ms後に再分極が見られることが多かった(7回中5回)。一方で、E4031添加後には刺激後一定の時間に再分極することはなく、ランダムに再分極のピークが見られたことから（下段右：矢印参照）リエントリーが発生している特徴を示すFP波形が得られた．
２９．まとめ：図２３に示すように、ｈｉＰＳ由来心筋細胞は、自律拍動する幼若な細胞であり、Ｅ４０３１によるｈＥＲＧチャネル阻害が、最大拡張期電位（ＭＤＰ）を低下させるため、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長を安定的に計測することができない。一方、ＫＣＮＪ２遺伝子を導入することで成熟化したｈｉＰＳ由来心筋細胞は、活動電位の発火が電気刺激依存的になり、かつ、Ｅ４０３１によるｈＥＲＧチャネル阻害が、活動電位持続時間（ＱＴ間隔）を延長させており、より臨床への外挿性に優れた心筋モデル細胞であると言える。一般にＱＴ延長薬の薬物評価の解析では、フィールドポテンシャル持続時間（ＦＰＤ）という指標が良く用いられているが、ＦＰＤの始点は、Ｎａチャネルでのイオン流入による、脱分極の大きなピークとして同定される一方で、ＦＰＤの終点は、ピークもピークの終わりもはっきりしないばかりか、研究者により測り方の見解が異なるため、データ解析を困難にしている。図２４に示すように、ＭＥＡシステム（Microelectrode Array／マルチ電極アレイ）による細胞外電位の測定結果では、ＧＦＰのみを発現するコントロール細胞では、ＦＰＤのピーク及びピークの終点が明瞭では無いが（Ａ上段）、ＫＣＮＪ２遺伝子を導入された細胞では、カルシウムチャネルによる再分極が急峻になるため、顕著な２ｎｄピークが出現し（Ａ下段）、はじめのピークと２ｎｄピーク間をＦＰＤとすれば、解析誤差を回避することができる。現行では、Ａ上段に示す様なＦＰＤ１やＦＰＤ２を測定に用いており、従って、ひとつの測定結果に対して異なる結論が導かれる［ＦＰＤ１の方法で計測している例：Tanaka T, et al. BBRC 2009;385:497-502.  ＦＰＤ２の方法で計測している例：Matsa E et al., Eur Heart J 2011;32:952-962］。また、ＧＦＰのみを発現するコントロール細胞では、１０ｎＭのＥ４０３１作用に対して、心拍が落ち、ＦＰＤ１、ＦＰＤ２共に延長を呈するものの、ピーク及びピークが基線に戻るポイントの決定が困難であるのに対し（Ｂ）、ＫＣＮＪ２遺伝子導入細胞では、同濃度のＥ４０３１作用下でも、ＦＰＤの２ｎｄピークが顕著である（Ｃ）。（Ｂ）の様な、現行で用いられている細胞では、ＦＰＤ延長の程度が各々の拍によって異なり、正確な判定に影響を及ぼすが、ＫＣＮＪ２遺伝子を導入した細胞を用いれば、薬物による再分極の影響を正確に読み取ることができる。更に、ＫＣＮＪ２導入細胞の顕著な２ｎｄピークの特徴を生かせば、比較的単純なプログラムでピーク検出ができるため、ハイスループットスクリーニングといった高精度高効率解析システムが、現実的に開発可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によると、in vitroにおいて評価の困難であった、被検物質に起因する活動電位持続時間の延長作用を、高い精度で検出することが可能となり、外挿性の高い解析結果が期待できることから、スクリーニング用モデル細胞として、創薬技術への応用に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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