(57)【要約】  コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された形質転換体は、糖類などを原料として効率よく4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を製造することができる。好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する場合は、特に効率よく4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を製造することができる。
2015156271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
【請求項２】
コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア（Pantoea）属、プロビデンシア（Providencia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）属、クロノバクター（Cronobacter）属、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モルガネラ（Morganella ）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、シェワネラ（Shewanella）属、又はカプリアビダス（Cupriavidus）属由来の遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）、プロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）、プロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア  フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、シュードアルテロモナス ピシシダ（Pseudoalteromonas piscicida）、シュードアルテロモナス ハロプランクティス （Pseudoalteromonas haloplanktis）、クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）、シトロバクター ヤンガエ （Citrobacter youngae）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae, シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida, モルガネラ モルガニ（Morganella morganii）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、シェワネラ プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）、又はカプリアビダス タイワネンシス （Cupriavidus taiwanensis）由来の遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項４】
コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、下記の(a)または(b)のDNAである請求項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号１〜２１の何れかの塩基配列からなるDNA
(b)  (a)のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするか、又は(a)のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項５】
宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項６】
宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主のコリネバクテリウム  グルタミカムが、コリネバクテリウムR (FERM BP-18976)、ATCC13032、またはATCC13869である請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
コリネバクテリウム  グルタミカム HBA-2(受託番号：NITE BP-01838)形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含む反応液中で培養する工程と、反応液中の4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を回収する工程とを含む4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法。
【請求項１０】
好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩（以下、「4-HBA」と略称することがある）の生産能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的な4-HBAの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化、および化石資源の枯渇問題を背景に、再生可能な資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料と並んで新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現に向けた重要な方策であることが認識され、注目されている。【０００３】
4-ヒドロキシ安息香酸は、抗菌剤であるパラベンの合成原料として使用される他、液晶のポリマー原料として利用されている有用な化学物質である。
現在、4-HBAは、原油を原料として化学的に生産されている。化学的な4-HBA製造方法としては、例えばフェノールと水酸化カリウムと二酸化炭素とを用いて高圧条件下で反応させる方法などがある。
このような方法は、出発物質であるフェノールが化石原料に依存しているだけでなく、反応プロセス中で高温高圧条件を必要とする、典型的な化学工業の高エネルギー消費型製造プロセスである。そこで、省エネルギー型で、再生可能資源から製造可能な、低廃棄物排出の環境調和型プロセスの開発、即ちバイオ法による4-HBA製造技術の確立が望まれている。【０００４】
しかし、従来の、再生可能資源を原料としたバイオ法による4-HBAの生産は、バイオ法による乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖からの代謝反応段数が非常に多いために生産性が低い。また、生産物である4-HBAによる菌の増殖阻害や、細胞毒性等の難点がある。このため、工業的生産は実現していない。【０００５】
4-HBAは、芳香族アミノ酸などの合成に関わるシキミ酸経路の中間体であるコリスミ酸からubiCによってコードされるコリスメート−ピルベート  リアーゼによって合成されることが大腸菌を用いて明らかにされている（非特許文献1、2、特許文献1、2）。【０００６】
これまでに、大腸菌由来のコリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子(ubiC)を他種微生物であるKlebsiella pneumoniaeに導入して4-HBAを生成する試みが報告されている（非特許文献3）。またシキミ酸経路を増強した大腸菌での4-HBAの発酵生産が報告されている（非特許文献4）。さらに、4-HBAによる増殖阻害や毒性回避を試みるため、4-HBA耐性株の選抜や、イオン交換樹脂添加培養が報告されているものの、4-HBAの生産性は実用上十分ではない。一方、本発明者らは、コリネ型細菌にコリスメート−ピルベート  リアーゼを導入してグルコースからフェノールを生成したことを報告しているが、中間物質である4-HBAの生成に関する記載や、コリスメート−ピルベート  リアーゼの酵素活性に関する記述はない（特許文献3）。【０００７】
また、大腸菌以外のubiCについては、Rhodobacter sphaeroides由来のものが報告されているが、大腸菌を宿主として該遺伝子を高発現させた形質転換体、及びRhodobacter sphaeroidesを宿主として該遺伝子を高発現させた形質転換体の何れも、4-HBAを低濃度でしか生産できず、実用上満足できるものではない（特許文献4）。【０００８】
大腸菌由来のUbiC酵素は、酵素学的な解析が詳細になされており、生成物である4-HBAによって強く阻害されることが知られている。したがって、工業的に使用できる4-HBA高生産株の構築のためには、高活性なUbiCの取得、4-HBAによる生成物阻害に耐性なUbiCの取得、及び4-HBAに耐性な宿主の選択が極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許6030819
【特許文献２】米国特許6114157
【特許文献３】国際公開2012/063862
【特許文献４】特開2013-183048
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Bacteriol., 174, 5309-5316 (1992)
【非特許文献２】Microbiology, 140, 897-904 (1994)
【非特許文献３】Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 985-988 (1995)
【非特許文献４】Biotechnol. Bioeng., 76, 376-390 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、糖類、代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、又はコリスミ酸を原料として、効率よく4-HBAを製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良く4-HBAを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、コリネ型細菌に、コリスミ酸から4-HBAの生成反応を触媒するコリスメート−ピルベート  リアーゼ（chorismate pyruvate-lyase）遺伝子を導入した形質転換体は、グルコース等から効率よく4-HBAを生成することを見出した。
また、この形質転換体は、好気的、かつ実質的に増殖しない条件下で反応させる場合に、特に4-HBAの生産効率が高いことを見出した。
また、これまでに4-HBAの生産が報告されている幾つかの形質転換体の宿主について、それらの増殖に及ぼす4-HBAの影響を比較したところ、大腸菌、Rhodobacter sphaeroides、Corynebacterium glutamicum、及び溶媒耐性菌として報告されているPseudomonas putidaの中では、Corynebacterium glutamicum が最も4-HBA耐性が高いことを見出した。【００１３】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体、及び、4-HBAの製造方法を提供する。
項１．  コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の生産能を有する形質転換体。
項２．  コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア（Pantoea）属、プロビデンシア（Providencia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）属、クロノバクター（Cronobacter）属、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モルガネラ（Morganella）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、シェワネラ（Shewanella）属、又はカプリアビダス（Cupriavidus）属由来の遺伝子である、項１に記載の形質転換体。
項３．  コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）、プロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）、プロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア  ファグソニ（Escherichia fergusonii）、シュードアルテロモナス ピシシダ（Pseudoalteromonas piscicida）、シュードアルテロモナス ハロプランクティス （Pseudoalteromonas haloplanktis）、クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）、シトロバクター ヤンガエ （Citrobacter youngae）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae, シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida, モルガネラ モルガニ（Morganella morganii）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、シェワネラ プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）、又はカプリアビダス タイワネンシス （Cupriavidus taiwanensis）由来の遺伝子である、項１に記載の形質転換体。
項４．  コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、下記の(a)または(b)のDNAである項１に記載の形質転換体。
(a)  配列番号１〜２１の何れかの塩基配列からなるDNA
(b)  (a)のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするか、又は(a)のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項５．  宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
項６．  宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項５に記載の形質転換体。
項７．  宿主のコリネバクテリウム  グルタミカムが、コリネバクテリウムR (FERM BP-18976)、ATCC13032、またはATCC13869である項６に記載の形質転換体。
項８．  コリネバクテリウム  グルタミカム HBA-2(受託番号：NITE BP-01838)形質転換体。
項９．  項１〜８のいずれかに記載の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含む反応液中で培養する工程と、反応液中の4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を回収する工程とを含む4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法。
項１０．  好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する項９に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の形質転換体を用いることにより、グルコースなどの糖類や、コリスミ酸、キナ酸、シキミ酸などから4-HBAを高効率で製造することができる。
一般に微生物は4-HBAのような芳香族化合物の細胞毒性により、増殖が阻害されるため、微生物を用いて4-HBAを製造することは困難であった。また、微生物が有するコリスメート−ピルベート  リアーゼの活性は一般に弱く、また、コリスメート−ピルベート  リアーゼは4-HBAによる強い生成物阻害を受けるため、十分な4-HBAの生産が困難であった。しかし、本発明によれば、4-HBA耐性に優れた微生物を用いて、実用上十分に効率よく4-HBAを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】4-ヒドロキシベンゾエートが4種の微生物（Corynebacterium glutamicum R、Escherichia coli JM109、Pseudomonas putida S12 ATCC700801、及びRhodobacter sphaeroides NBRC12203）の増殖に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）4-HBA生産能を有する形質転換体
本発明の4-HBA生産能を有する形質転換体は、コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、形質転換体である。
【００１７】
宿主
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００１８】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
中でも、安全でかつ4-HBA生産性が高い点で、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
中でも、R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００１９】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００２０】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００２１】
また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM BP-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
【００２２】
図1に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、4-HBAに対する耐性が極めて高いことを見出した。この点で、コリネ型細菌は本発明方法による4-HBA製造に好適である。
【００２３】
コリスメート−ピルベート  リアーゼ酵素遺伝子
コリスメート−ピルベート  リアーゼは、コリスミ酸から4-HBAと、ピルビン酸を生じる反応を触媒する酵素である。
コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の由来は、特に限定されず、パントエア（Pantoea）属、プロビデンシア（Providencia）属、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）属、クロノバクター（Cronobacter）属、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モルガネラ（Morganella）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、シェワネラ（Shewanella）属、又はカプリアビダス（Cupriavidus）属微生物由来の遺伝子が挙げられる。
酵素比活性が高い点では、パントエア属、プロビデンシア属、エシェリヒア属、シュードアルテロモナス属、クロノバクター属、シトロバクター属、又はエンテロバクター属微生物由来の遺伝子が好ましく、4-HBAによる生成物阻害を受け難い点では、プロビデンシア属、エンテロバクター属、シェワネラ属、又はカプリアビダス属微生物由来の遺伝子が好ましく、形質転換体による4-HBA生産性が良い点では、パントエア属、プロビデンシア属、エシェリヒア属、又はクロノバクター属微生物由来の遺伝子が好ましい。総合的に見ると、プロビデンシア属、又はクロノバクター属由来の遺伝子がより好ましい。
【００２４】
具体的には、パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）、プロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）、プロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）、シュードアルテロモナス ピシシダ（Pseudoalteromonas piscicida）、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス （Pseudoalteromonas haloplanktis）、クロノバクキー サカザキ（Cronobacter sakazakii）、シトロバクター ヤンガエ （Citrobacter youngae）、シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）、エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae, シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）、モルガネラ モルガニイ（Morganella morganii）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、シェワネラ プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）、カプリアビダス タイワネンシス （Cupriavidus taiwanensis）由来の遺伝子が挙げられる。
【００２５】
パントエア アナナティス由来の遺伝子としては配列番号1の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、プロビデンシア ラスティジアニイ由来の遺伝子としては配列番号2の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、プロビデンシア スチュアルティイ由来の遺伝子としては配列番号3の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、プロビデンシア スニービア由来の遺伝子としては配列番号4の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、プロビデンシア  レットゲリ由来の遺伝子としては配列番号5の塩基配列からなる遺伝子が挙げられプロビデンシア アルカリファシエンス由来の遺伝子としては配列番号６の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、プロビデンシア バーホドグラナリエア由来の遺伝子としては配列番号７の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、エシェリヒア コリ由来の遺伝子としては配列番号8の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、エシェリヒア フェルグソニー由来の遺伝子としては配列番号9の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シュードアルテロモナス ピシシア由来の遺伝子としては配列番号10の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シュードアルテロモナス ハロプランクティス由来の遺伝子としては配列番号11の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、クロノバクター  サカザキ由来の遺伝子としては配列番号12の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シトロバクター ヤンガエ由来の遺伝子としては配列番号13の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シトロバクター コセリ由来の遺伝子としては配列番号14の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、エンテロバクター アエロゲネス由来の遺伝子としては配列番号15の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、エンテロバクター クロアカエ由来の遺伝子としては配列番号16の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シュードモナス プチダ由来の遺伝子としては配列番号17の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、モルガネラ モルガニイ由来の遺伝子としては配列番号の塩基配列18からなる遺伝子が挙げられ、アゾトバクター ビネランディ由来の遺伝子としては配列番号19の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、シェワネラ プトレファシエンス由来の遺伝子としては配列番号20の塩基配列からなる遺伝子が挙げられ、カプリアビダス タイワネンシス由来の遺伝子としては配列番号の塩基配列21からなる遺伝子が挙げられる。
【００２６】
また、塩基配列1〜21のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（類縁体）も使用できる。
本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
【００２７】
また、塩基配列1〜21のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（類縁体）も使用できる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００２８】
コリスメート-ピルベート リアーゼ活性は、「Microbiology,140, 897-904(1994)」に記載の方法を改変して測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、50mM トリス-HCl (pH 7.5)、0.5 mM chorismate Ba salt、0.2 mM NADH、0.2 M NaCl、5 Unitラクテートデヒドロゲナーゼを含ませ、33℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度の減少を追跡することにより反応初速度を測定する。chorismate Ba saltを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差をコリスメート-ピルベート リアーゼ活性とし、酵素及び基質添加に依存したNADH由来の340 nmの経時的、直線的な吸光度減少が認められた場合に、コリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を有すると判定する。酵素活性の1 unitは、1分間あたり1マイクロモルの4-HBAを産生せしめる酵素量と定義し、酵素反応の初速度から算出した。
【００２９】
塩基配列1〜21のいずれかの塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができ、これにより高確率でコリスメート-ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが得られる。
【００３０】
また、本発明の形質転換体は、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子が導入されていないことが好ましい。4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼは、4-HBAをフェノールに変換する酵素である。コリネ型細菌は内在性4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を有していないため、外来性の4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子を導入しない場合、コリネ型細菌は4-HBAからフェノールへの変換を行わない。一方、コリスメート-ピルベート リアーゼ遺伝子に加えて4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子も導入すると、形質転換体はグルコースなどの糖類から4-HBAを経由してフェノールを生産するようになる。
【００３１】
しかし、一般にフェノールは4-HBAより酵素に対する阻害力が格段に強いため、糖類から多段階の反応を経てフェノールを製造しようとすると、フェノールが多数の酵素を阻害するため、フェノール製造効率が悪くなる。一方、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子が導入されておらず、かつコリスメート-ピルベート リアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を用いて糖類から毒性が比較的低い4-HBAを一旦製造し、別途、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子が導入された形質転換体又は4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素自体を用いて4-HBAからフェノールを製造する場合は、フェノールの影響を受ける酵素が、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼだけであるため、フェノール製造効率が比較的良くなる。
【００３２】
また、一般にフェノールは4-HBAより細胞毒性も格段に強い。微生物を用いて糖類からフェノールを製造する場合、多段階の反応を経るため、フェノール製造に時間がかかる。そのため、微生物は生成したフェノールに長時間曝されて毒性の影響を受け、フェノール製造効率が悪くなる。一方、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子が導入されておらず、かつコリスメート-ピルベート リアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を用いて、糖類から細胞毒性が比較的低い4-HBAを生成すれば、多段階の反応を経ることで長時間を要しても形質転換体が受けるダメージは少ない。さらに、別途、4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ遺伝子が導入された形質転換体又は4-ヒドロキシベンゾエート デカルボキシラーゼ酵素自体を用いて4-HBAからフェノールを製造することにより、効率良く糖類からフェノールを製造することができる。
【００３３】
形質転換体のためのベクターの構築
PCRで増幅したコリスメート-ピルベート リアーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58−67699号公報〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及び〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム  グルタミカム  ATCC3058由来のpHM1519  〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム  グルタミカム  T250由来のpCG4〔特開昭57−183799号公報〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕等が挙げられる。
好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム  グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3−フォスフェートデヒドロゲナーゼＡ遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhA等が挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーター等が挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
【００３４】
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などがあげられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる（Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)）。
【００３５】
形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、粗ルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、1種を単独で使用でき、または2種以上を今後してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。
【００３６】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウ化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、10（w/v %）とすればよい。
【００３７】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、または炭酸カルシウム等があげられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.1〜1（w/v %）とすればよい。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が得られるが、通常、約0.1〜10（w/v %）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００３８】
好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
培養温度は約15〜45℃とすればよく、培養時間は約1〜7日とすればよい。
【００３９】
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ遺伝子が、破壊され、又は欠失していることが好ましい。4-ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼを破壊することにより生成した4-HBAの代謝が抑えられて、4-HBAの生産性が向上すると共に副生成物が少なくなる。
遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００４０】
（２）4-HBAの製造方法
上記説明した本発明の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中の4-HBAを回収する工程とを含む方法により4-HBAを製造することができる。
原料化合物は形質転換体が細胞内に取り込める化合物であることが必要であり、また、植物に多く含まれる等、工業的に利用し易いものであることが望ましい。
糖類としては、グルコースが好適であるが、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれる。このような糖類としては、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。
また、代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物としては、キナ酸、シキミ酸などが挙げられる。
また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙などを糖化酵素などで糖化した、グルコースなどの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。中でも、原料化合物としては、グルコース、コリスミ酸、キナ酸、シキミ酸が好ましい。
【００４１】
微生物の増殖
反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25〜38℃で、約12〜48時間培養して増殖させることが好ましい。
【００４２】
培養用培地
反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
【００４３】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ−アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【００４４】
栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
培地のpHは約6〜8が好ましい。
【００４５】
具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００４６】
反応液
反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
炭素源としては、上記説明した原料化合物又はそれを含む糖蜜や糖化液などを用いればよい。また、炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
反応液中の原料化合物の濃度は、約1〜20（w/v ％）が好ましく、約2〜10（w/v ％）がより好ましく、約2〜5（w/v ％）がさらにより好ましい。
また、原料化合物を含む全炭素源の濃度は、約2〜5（w/v ％）とすればよい。
【００４７】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1〜10（w/v ％）とすればよい。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01〜1（w/v ％）とすればよい。
【００４８】
さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
反応液のｐＨは約6〜8が好ましい。
【００４９】
具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
【００５０】
反応条件
反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約20〜50℃が好ましく、約25〜47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く4-HBAを製造できる。
また、反応時間は、約1〜7日間が好ましく、約1〜3日間がより好ましい。
培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。本発明の形質転換体自体の4-HBA生産能力は、好気的条件下の方が高い。しかし、好気的条件下では形質転換体が増殖するため、原料化合物が増殖のために消費され、その分、4-HBA製造効率が低下する。
従って、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で反応を行うのが好ましい。本発明で増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避または抑制できる。
【００５１】
また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため、原料化合物が増殖のために消費されない分、4-HBA製造効率が高くなる。
還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約−200 mV〜−500 mVが好ましく、約−150 mV〜−500 mVがより好ましい。
反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY  JAMES社製、ORP  Electrodes）を用いて測定できる。
【００５２】
還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate−reducing  bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and  Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書  第三巻、京都大学農学部  農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1〜60分程度、好ましくは約5〜40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
【００５３】
還元条件下で反応させる場合は、反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
【００５４】
4-HBAの回収
上記のようにして培養することにより、反応液中に4-HBAが生産される。反応液を回収することにより4-HBAを回収できるが、さらに、公知の方法で4-HBAを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、イオン交換樹脂法、濃縮法、晶析法、膜分離法、有機溶媒抽出法、各種吸着法等が挙げられる。
【実施例１】
【００５５】
4-ヒドロキシベンゾエート生産遺伝子（コリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子）のクローニングと発現
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）LMG 20103からの染色体DNA抽出は、LMG Bacteria Culture Medium No.1 培地 [Beef extract 1 g, Yeast extract 2 g, Peptone 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.4に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで28℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５６】
プロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）JCM 3953からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５７】
プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）ATCC 25827からの染色体DNA抽出は、ATCC Medium No.3培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを6.8に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５８】
プロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）JCM 16941からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.27培地 [Peptone 15 g, Soya peptone 5 g, Sodium Chloride 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで28℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００５９】
プロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）JCM 1675からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６０】
プロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）JCM 1673からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６１】
プロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）JCM 16940からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.27培地 [Peptone 15 g, Soya peptone 5 g, Sodium Chloride 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで28℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６２】
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）K12 MG1655からの染色体DNA抽出は、LB培地 [Tryptone  10 g、Yeast extract  5 g、NaCl  5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６３】
エシェリヒア フェルグソニー（Escherichia fergusonii）NBRC 102419からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地 [Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６４】
シュードアルテロモナス ピシシダ（Pseudoalteromonas piscicida）JCM 20779からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.118培地 [MARINE BROTH-2216（ベクトン・ディッキンソン社製）37.4 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６５】
シュードアルテロモナス ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）NBRC 102225からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.304培地 [MARINE BROTH-2216（ベクトン・ディッキンソン社製）37.4 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６６】
クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）JCM 1233からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６７】
シトロバクター ヤンガエ（Citrobacter youngae）ATCC 29220からの染色体DNA抽出は、ATCC Medium No.3培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを6.8に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６８】
シトロバクター コセリ（Citrobacter koseri）ATCC BAA-895からの染色体DNA抽出は、ATCC Medium No.18培地[Peptone 15 g, Soya peptone 5 g, Sodium Chloride 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００６９】
エンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）NBRC 13534からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地  [Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７０】
エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）NBRC 13535からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地  [Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７１】
シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 47054からの染色体DNA抽出は、ATCC Medium No.1065培地  [Tryptone  10 g、Yeast extract  5 g、NaCl  5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７２】
モルガネラ モルガニイ（Morganella morganii）NBRC 3848からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.802培地  [Polypepton 10 g, Yeast extract 2 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで30℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７３】
アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）ATCC 9104からの染色体DNA抽出は、NBRC Medium No.805培地  [Yeast extract 1 g, Mannitol 5 g, K2HPO4 0.7 g, KH2PO4 0.1 g, MgSO4・7H2O 1 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0-7.2に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで26℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７４】
シュワネラ プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）JCM 20190からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.22培地  [Peptone 10 g, Beef extract 10 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0-7.2に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７５】
カプリアビダス タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）LMG 19424からの染色体DNA抽出は、JC Medium No.27培地 [Peptone 15 g, Soya peptone 5 g, Sodium Chloride 5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで25℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。【００７６】
(2) 4-ヒドロキシベンゾエート生産遺伝子（コリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子）のクローニング
4-ヒドロキシベンゾエート生産遺伝子（コリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子）をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべくubiC遺伝子を含む遺伝子配列、配列番号1（Pantoea ananatis ubiC遺伝子）、配列番号2（Providencia rustigianii ubiC遺伝子）、配列番号3（Providencia stuartii ubiC遺伝子）、配列番号4（Providencia sneebia ubiC遺伝子）、配列番号5（Providencia rettgeri ubiC遺伝子）、配列番号6（Providencia alcalifaciens ubiC遺伝子）、配列番号7（Providencia burhodogranariea ubiC遺伝子）、配列番号8（Escherichia coli ubiC遺伝子）、配列番号9（Escherichia fergusonii ubiC遺伝子）、配列番号10（Pseudoalteromonas piscicida ubiC遺伝子）、配列番号11（Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC遺伝子）、配列番号12（Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子）、配列番号13（Citrobacter youngae ubiC遺伝子）、配列番号14（Citrobacter koseri ubiC遺伝子）、配列番号15（Enterobacter aerogenes ubiC遺伝子）、配列番号16（Enterobacter cloacae ubiC遺伝子）、配列番号17（Pseudomonas putida ubiC遺伝子）、配列番号18（Morganella morganii ubiC遺伝子）、配列番号19（Azotobacter vinelandii ubiC遺伝子）、配列番号20（Shewanella putrefaciens ubiC遺伝子）、配列番号21（Cupriavidus taiwanensis ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。【００７７】
Pantoea ananatis ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-1）；  5’- CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT -3’         （配列番号22）
（b-1）；  5’- CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG -3’（配列番号23）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００７８】
Providencia rustigianii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-2）；  5’- CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC -3’
（配列番号24）
（b-2）；  5’- CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG -3’
（配列番号25）
尚、プライマー（a-2）及び（b-2）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００７９】
Providencia stuartii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-3）；  5’- CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC -3’（配列番号26）
（b-3）；  5’- CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC -3’    （配列番号27）
尚、プライマー（a-3）及び（b-3）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８０】
Providencia sneebia ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-4）；  5’- CTCTCATATGGATGATACGCTTTTTACCTCTC -3’（配列番号28）
（b-4）；  5’- CTCTCATATGCTTCCCTTCACTTGTCATGC -3’  （配列番号29）
尚、プライマー（a-4）及び（b-4）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８１】
Providencia rettgeri ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-5）；  5’- CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACTTCTCAG -3’（配列番号30）
（b-5）；  5’- CTCTCATATGTTAACGATATGCAGGTGATTCAGG -3’（配列番号31）
尚、プライマー（a-5）及び（b-5）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８２】
Providencia alcalifaciens ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-6）；  5’- CTCTCATATGCATGAAACGATTTTTACCTCTCATC -3’
（配列番号32）
（b-6）；  5’- CTCTCATATGGTTATCTATATGCAGGTGATTCAGG -3’
（配列番号33）
尚、プライマー（a-6）及び（b-6）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８３】
Providencia burhodogranariea ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-7）；  5’- CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTACCTCTC -3’（配列番号34）
（b-7）；  5’- CTCTCATATGATACTTCCCTCCACTTGTCG -3’  （配列番号35）
尚、プライマー（a-7）及び（b-7）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８４】
Escherichia coli ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-8）；  5’- CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA -3’   （配列番号36）
（b-8）；  5’- CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC -3’（配列番号37）
尚、プライマー（a-8）及び（b-8）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８５】
Escherichia fergusonii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-9）；  5’- CTCTCATATGCTGATTTTGCAACAACTGGTG -3’（配列番号38）
（b-9）；  5’- CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGATGCAGG -3’（配列番号39）
尚、プライマー（a-9）及び（b-9）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８６】
Pseudoalteromonas piscicida ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-10）；  5’- CTCTCATATGCCTTTGCAATTACCCTTAGAG -3’（配列番号40）
（b-10）；  5’- CTCTCATATGAAGCCTGCCATTTCTGGTGG -3’ （配列番号41）
尚、プライマー（a-410）及び（b-10）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８７】
Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-11）；  5’- CTCTCATATGATTACTTTCCCTGTTTCATTATCTGC -3’
（配列番号42）
（b-11）；  5’- CTCTCATATGTCATGAGTACAAATACGCTCCTG -3’
（配列番号43）
尚、プライマー（a-11）及び（b-11）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８８】
Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-12）；  5’- CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG -3’   （配列番号44）
（b-12）；  5’- CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC -3’（配列番号45）
尚、プライマー（a-12）及び（b-12）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００８９】
Citrobacter youngae ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-13）；  5’- CTCTCATATGCCACACCCTGCGTTAA -3’   （配列番号46）
（b-13）；  5’- CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGCA -3’（配列番号47）
尚、プライマー（a-13）及び（b-13）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９０】
Citrobacter koseri ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-14）；  5’- CTCTCATATGTCACACCCTGCGTTAAC -3’    （配列番号48）
（b-14）；  5’- CTCTCATATGTTAATACAACGGTGATGCGGG -3’（配列番号49）
尚、プライマー（a-14）及び（b-14）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９１】
Enterobacter aerogenes,ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-15）；  5’- CTCTCATATGCCACATCCTGCGCTTAC -3’     （配列番号50）
（b-15）；  5’- CTCTCATATGTTAATACAATGGCGATGCAGGC -3’（配列番号51）
尚、プライマー（a-15）及び（b-15）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９２】
Enterobacter cloacae ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-16）；  5’- CTCTCATATGTCACACCCTGCGCTAA -3’  （配列番号52）
（b-16）；  5’- CTCTCATATGTCAGTACAACGGCGATGC -3’（配列番号53）
尚、プライマー（a-16）及び（b-16）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９３】
Pseudomonas putida ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-17）；  5’- CTCTCATATGTCGTACGAATCCCCG -3’    （配列番号54）
（b-17）；  5’- CTCTCATATGTCAGCGGTTTTCCTCCTTG -3’（配列番号55）
尚、プライマー（a-17）及び（b-17）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９４】
Morganella morganii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-18）；  5’- CTCTCATATGACACAAACAGTGATAACACCC -3’（配列番号56）
（b-18）；  5’- CTCTCATATGCCACGTTATTCTTCTCCGAG -3’ （配列番号57）
尚、プライマー（a-18）及び（b-18）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９５】
Azotobacter vinelandii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-19）；  5’- CTCTCATATGACCGCTGCTCCCG -3’   （配列番号58）
（b-19）；  5’- CTCTCATATGTTATAGGGTGTCCGGGTC -3（配列番号59）
尚、プライマー（a-19）及び（b-19）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９６】
Shewanella putrefaciens, ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-20）；  5’- CTCTCATATGAATGTGACTAGCTTAAGCTTCC -3’（配列番号60）
（b-20）；  5’- CTCTCATATGTCACTGGCAAATTGCTCGC -3’   （配列番号61）
尚、プライマー（a-20）及び（b-20）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９７】
Cupriavidus taiwanensis ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-21）；  5’- CTCTCATATGAGCGCGCAGTCCGTG -3’     （配列番号62）
（b-21）；  5’- CTCTCATATGCAGTTTCATCTCGTGGTCTC -3’（配列番号63）
尚、プライマー（a-21）及び（b-21）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。【００９８】
鋳型DNAは、Pantoea ananatis LMG 20103、 Providencia rustigianii JCM 3953、 Providencia stuartii ATCC 25827、 Providencia sneebia JCM 16941、 Providencia rettgeri JCM 1675、 Providencia alcalifaciens JCM 1673、 Providencia burhodogranariea JCM 16940、 Escherichia coli MG1655、 Escherichia fergusonii NBRC 102419、 Pseudoalteromonas piscicida JCM 20779、 Pseudoalteromonas haloplanktis NBRC 102225、 Cronobacter sakazakii JCM 1233、 Citrobacter youngae ATCC 29220、 Citrobacter koseri ATCC BAA-895、 Enterobacter aerogenes NBRC 13534、 Enterobacter cloacae NBRC 13535、 Pseudomonas putida ATCC 47054、 Morganella morganii NBRC 3848、 Azotobacter vinelandii ATCC 9104、 Shewanella putrefaciens JCM 20190 及びCupriavidus taiwanensis LMG 1942から抽出した染色体DNAを用いた。【００９９】
*) 菌株購入機関の略称は以下の通り。
＜機関略称＞
ATCC : American Type Culture Collection
JCM : Japan Collection of Microorganisms
LMG : Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms / Laboratory for Microbiology of the Faculty of Sciences of Ghent University (BCCM/LMG)
NBRC: NITE Biological Resource Center【０１００】
実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus)       10μl
dNTP Mixture (2.5mM each)                 4μl
鋳型DNA                                   1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*)                各々1μl（最終濃度  0.2μM）
滅菌蒸留水                                32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。【０１０１】
*)  Pantoea ananatis ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-1) と (b-1) の組み合わせ、Providencia rustigianii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-2) と (b-2) の組み合わせ、Providencia stuartii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-3) と (b-3) の組み合わせ、Providencia sneebia ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-4) と (b-4) の組み合わせ、Providencia rettgeri ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-5) と (b-5) の組み合わせ、Providencia alcalifaciens ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-6) と (b-6) の組み合わせ、Providencia burhodogranariea ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-7) と (b-7) の組み合わせ、Escherichia coli ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-8) と (b-8) の組み合わせ、Escherichia fergusonii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-9) と (b-9) の組み合わせ、Pseudoalteromonas piscicida ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-10) と (b-10) の組み合わせ、Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-11) と (b-11) の組み合わせ、Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-12) と (b-12) の組み合わせ、Citrobacter youngae ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-13) と (b-13) の組み合わせ、Citrobacter koseri ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-14) と (b-14) の組み合わせ、Enterobacter aerogenes ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-15) と (b-15) の組み合わせ、Enterobacter cloacae ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-16) と (b-16) の組み合わせ、Pseudomonas putida ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-17) と (b-17) の組み合わせ、Morganella morganii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-18) と (b-18) の組み合わせ、Azotobacter vinelandii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-19) と (b-19) の組み合わせ、Shewanella putrefaciens ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-20) と (b-20) の組み合わせ、Cupriavidus taiwanensis ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-21) と (b-21) の組み合わせで行った。【０１０２】
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃                10秒
アニーリング過程      ：50℃                5秒
エクステンション過程  ：68℃
Pantoea ananatis ubiC遺伝子                 31秒
Providencia rustigianii ubiC遺伝子          31秒
Providencia stuartii ubiC遺伝子             32秒
Providencia sneebia ubiC遺伝子              32秒
Providencia rettgeri ubiC遺伝子             30秒
Providencia alcalifaciens ubiC遺伝子        30秒
Providencia burhodogranariea ubiC遺伝子     33秒
Escherichia coli ubiC遺伝子                 30秒
Escherichia fergusonii ubiC遺伝子           40秒
Pseudoalteromonas piscicida ubiC遺伝子      33秒
Pseudoalteromonas haloplanktis ubiC遺伝子   33秒
Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子            32秒
Citrobacter youngae ubiC遺伝子              30秒
Citrobacter koseri ubiC遺伝子               30秒
Enterobacter aerogenes ubiC遺伝子           30秒
Enterobacter cloacae ubiC遺伝子             30秒
Pseudomonas putida ubiC遺伝子               33秒
Morganella morganii ubiC遺伝子              32秒
Azotobacter vinelandii ubiC遺伝子           33秒
Shewanella putrefaciens ubiC遺伝子          34秒
Cupriavidus taiwanensis ubiC遺伝子          40秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。【０１０３】
上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia sneebia株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia rettgeri株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia alcalifaciens株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Providencia burhodogranariea株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Escherichia coli株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Escherichia fergusonii株由来ubiC遺伝子の場合約0.7-kb、Pseudoalteromonas piscicida株由来ubiC遺伝子の場合約0.6-kb、Pseudoalteromonas haloplanktis株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子の場合約0.6-kb、Citrobacter youngae株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Citrobacter koseri株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Enterobacter aerogenes株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Enterobacter cloacae株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Pseudomonas putida株由来ubiC遺伝子の場合約0.6-kb、Morganella morganii株由来ubiC遺伝子の場合約0.5-kb、Azotobacter vinelandii株由来ubiC遺伝子の場合約0.6-kb、Shewanella putrefaciens株由来ubiC遺伝子の場合約0.6-kb、Cupriavidus taiwanensis株由来ubiC遺伝子の場合約0.7-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した【０１０４】
(3) 4-ヒドロキシベンゾエート生産遺伝子（コリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子）発現プラスミドの構築
上記項(2)に示したPCRにより増幅したPantoea ananatis株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia sneebia株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia rettgeri株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia alcalifaciens株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Providencia burhodogranariea株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Escherichia coli株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Escherichia fergusonii株由来ubiC遺伝子を含む約0.7-kb DNA断片、Pseudoalteromonas piscicida株由来ubiC遺伝子を含む約0.6-kb DNA断片、Pseudoalteromonas haloplanktis株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子を含む約0.6-kb DNA断片、Citrobacter youngae株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Citrobacter koseri株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Enterobacter aerogenes株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Enterobacter cloacae株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Pseudomonas putida株由来ubiC遺伝子を含む約0.6-kb DNA断片、Morganella morganii株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片、Azotobacter vinelandii株由来ubiC遺伝子を含む約0.6-kb DNA断片、Shewanella putrefaciens株由来ubiC遺伝子を含む約0.6-kb DNA断片、Cupriavidus taiwanensis株由来ubiC遺伝子を含む約0.7-kb DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209 [国際公開 WO2012/033112]  2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液  1μl 、T4 DNAリガーゼ  （タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。これをライゲーションA液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液及びU液とした。【０１０５】
得られた21種のライゲーションA液、B液、C液、D液、E液、F液、G液、H液、I液、J液、K液、L液、M液、N液、O液、P液、Q液、R液、S液、T液及びU液それぞれを、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子（ライゲーションA液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションB液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションC液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia sneebia株由来ubiC遺伝子（ライゲーションD液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia rettgeri株由来ubiC遺伝子（ライゲーションE液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia alcalifaciens株由来ubiC遺伝子（ライゲーションF液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia burhodogranariea株由来ubiC遺伝子（ライゲーションG液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Escherichia coli株由来ubiC遺伝子（ライゲーションH液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Escherichia fergusonii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションI液）の場合、長さ約0.7-kb の挿入断片が、Pseudoalteromonas piscicida株由来ubiC遺伝子（ライゲーションJ液）の場合、長さ約0.6-kb の挿入断片が、Pseudoalteromonas haloplanktis株由来ubiC遺伝子（ライゲーションK液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションL液）の場合、長さ約0.6-kb の挿入断片が、Citrobacter youngae株由来ubiC遺伝子（ライゲーションM液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Citrobacter koseri株由来ubiC遺伝子（ライゲーションN液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Enterobacter aerogenes株由来ubiC遺伝子（ライゲーションO液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Enterobacter cloacae株由来ubiC遺伝子（ライゲーションP液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Pseudomonas putida株由来ubiC遺伝子（ライゲーションQ液）の場合、長さ約0.6-kb の挿入断片が、Morganella morganii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションR液）の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Azotobacter vinelandii株由来ubiC遺伝子（ライゲーションS液）の場合、長さ約0.6-kb の挿入断片が、Shewanella putrefaciens株由来ubiC遺伝子（ライゲーションT液）の場合、長さ約0.6-kb の挿入断片が、Cupriavidus taiwanensis株由来ubiC遺伝子（ライゲーションU液）の場合、長さ約0.7-kb の挿入断片が認められた。【０１０６】
Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA1、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA2、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA3、Providencia sneebia株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA4、Providencia rettgeri株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA5、Providencia alcalifaciens株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA6、Providencia burhodogranariea株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA7、Escherichia coli株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA8、Escherichia fergusonii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA9、Pseudoalteromonas piscicida株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA10、Pseudoalteromonas haloplanktis株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA11、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA12、Citrobacter youngae株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA13、Citrobacter koseri株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA14、Enterobacter aerogenes株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA15、Enterobacter cloacae株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA16、Pseudomonas putida株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA17、Morganella morganii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA18、Azotobacter vinelandii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA19、Shewanella putrefaciens株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA20、Cupriavidus taiwanensis株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA21とそれぞれ命名した（表1）。【０１０７】
【表１】
2015156271.tif 000003
【０１０８】
(4) 4-ヒドロキシベンゾエート生産遺伝子（コリスメート−ピルベート  リアーゼ遺伝子）導入株の構築
上述のプラスミドpHBA1〜pHBA21を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpHBA1〜pHBA21の導入が認められた。
得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-1〜HBA-21と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表2にまとめて示した。【０１０９】
コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-2 は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託した（国内寄託の受託日：2014年3月27日、ブダペスト条約に基づく国際寄託の受託日：2015年2月23日、受託番号：NITE BP-01838）。この株は、37 CFR1.808に規定される条件の下で公に利用可能である。【０１１０】
【表２】
2015156271.tif 000004
【実施例２】
【０１１１】
コリネバクテリウム  グルタミカム  4-ヒドロキシベンゾエート生成遺伝子導入株由来のコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性比較
実施例1において作製したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株（表1）参照を、カナマイシン50 μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。【０１１２】
上記のプレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて15時間、好気的に振とう培養を行った。【０１１３】
このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体を、遠心分離（4℃、8,000 rpm, 10分）により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離（4℃、15,000 rpm, 20分）によって得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性を測定した。
粗酵素液、50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 mM chorismate Ba salt, 0.2 mM NADH, 0.2 M NaCl, 5 Unit lactate dehydrogenaseを混合し、33℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク濃度から比活性を算出した（1分間あたり、1マイクロモルの4-HBAを産生せしめる酵素量を1 unitと定義した）。（なお、反応液をフィルター濾過後、生じた4-HBAはHPLCによって4-HBAのピークを直接検出し（Cosmosil C18 ARII（ナカライテスク）、移動相20%メタノール、0.07% 過塩素酸）、両アッセイ法による定量性に違いがないことを別途確認した。）【０１１４】
この結果、HBA1〜HBA21株について、表3のように目的とするコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性が検出された。特に高い活性を示したのは、Pantoea ananatis由来ubiC遺伝子と、Cronobacter sakazakii由来ubiC遺伝子であった。
その他、Providencia rustigianii, Providencia stuartii, Providencia sneebia, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia burhodogranariea, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Pseudoalteromonas piscicida, Pseudoalteromonas haloplanktis, Cronobacter sakazakii, Citrobacter youngae, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida, Morganella morganii, Azotobacter vinelandii, Shewanella putrefaciens, Cupriavidus taiwanensis由来の4-ヒドロキシベンゾエート生成遺伝子についてもコリスメート−ピルベート  リアーゼ活性が検出された。ここで、同様の実験をCorynebacterium glutamicum野生株（空ベクターのみを有する）に対して行ったところ、4-HBA生成は認められなかった。【０１１５】
【表３】
2015156271.tif 000005
【実施例３】
【０１１６】
コリネバクテリウム  グルタミカム  4-HBA生成遺伝子導入株由来のコリスメート‐ピルベート  リアーゼ活性に対する生成物阻害のIC50による比較
実施例2において調製した、HBA-1〜HBA-21株由来の細胞破砕上清を用いて、生成物である4-HBAによる阻害を検討した。
その結果、Providencia属に属する、Providencia rustigianii, Providencia stuartii,Providencia sneebia, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia burhodogranariea由来のコリスメート‐ピルベート  リアーゼが、他属由来のものと比較して、特に4-HBAに対して低阻害性であった（表4）。【０１１７】
【表４】
2015156271.tif 000006
【実施例４】
【０１１８】
コリネバクテリウム  グルタミカム  4-ヒドロキシベンゾエート生成遺伝子導
入株のグルコースからの4-ヒドロキシベンゾエート生成実験
実施例１において作製したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株（表1）参照を、カナマイシン50 μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。【０１１９】
上記のプレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlに更に2%炭酸カルシウムの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて24時間、好気的に振とう培養を行った。【０１２０】
上記条件で増殖して得られた培養液を遠心分離（4℃、15,000 rpm, 10分）し、得られた上清液を用いて4-HBAをHPLCによって定量した。
この結果、Corynebacterium glutamicum HBA-1, HBA-2, HBA-3, HBA-8、及びHBA-12株は、表5に示すように目的とする4-HBAを生成した。中でも、Providencia rustigianii、Providencia stuartii、又はCronobacter sakazakii由来の4-HBA生成酵素遺伝子導入株による4-HBA生成能は、E. coli, 又はPantoea ananatis由来の4-HBA生成酵素遺伝子導入株よりも高く、優れていた。最も4-HBA生成能に優れていたのは、Providencia rustigianii由来の4-HBA生成酵素遺伝子導入株であった。また、同様の実験をCorynebacterium glutamicum野生株（空ベクターのみを有するコントロール）に対して行った際、4-HBA生成は認められなかった。【０１２１】
【表５】
2015156271.tif 000007
【実施例５】
【０１２２】
4-HBA生産宿主としての適性試験（4-HBAによる好気増殖への影響）
Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Pseudomonas putida, 及び、Rhodobacter sphaeroidesについて、好気培養における4-HBAの増殖阻害実験を行った。なお、本試験に用いたPseudomonas putida S12は、溶媒耐性菌として報告されており、これまでにチロシン経由での4-HBAの生成が報告されている。【０１２３】
Corynebacterium glutamicum をA寒天培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4.7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
上記のプレート上で増殖したコリネバクテリウム グルタミカム  R株をA液体培地[(NH2)2CO 2g、(NH4)2SO4 7g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2 SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて15時間、好気的に振とう培養を行った。【０１２４】
上記条件で増殖したコリネバクテリウム グルタミカム  R株を、A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610＝0.05となるように植菌し、同時に4-HBAが終濃度0, 100, 200, 250, 300 mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610の吸光度を測定することにより行った。【０１２５】
Escherichia coli JM109をLB寒天培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、及び1.5％寒天]に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで増殖したEscherichia coli JM109をLB液体培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5% 塩化ナトリウム]に塗布し、37℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖したEscherichia coli JM109をLB液体培地100 mlに初期菌体濃度OD=0.05となるように植菌し、同時に4-HBA濃度が終濃度0, 100, 200 mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610の吸光度を測定することにより行った。【０１２６】
Pseudomonas putida S12をLB寒天培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、及び1.5％寒天]に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。
上記プレートで増殖したPseudomonas putida S12をLB液体培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5% 塩化ナトリウム]に塗布し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖したPseudomonas putida S12をLB液体培地100 mlに初期菌体濃度OD610=0.05となるように植菌し、同時に4-HBA濃度が終濃度0, 100, 200, 300 mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610の吸光度を測定することにより行った。【０１２７】
Rhodobacter sphaeroidesをLB寒天培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、及び1.5％寒天]に塗布し、30℃、20時間暗所に静置した。
上記プレートで増殖したRhodobacter sphaeroidesをLB液体培地[1% ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5% 塩化ナトリウム]に塗布し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。
上記条件で増殖したRhodobacter sphaeroidesをLB液体培地100 mlに初期菌体濃度OD=0.1となるように植菌し、同時に4-HBA濃度が終濃度0, 100, 200 mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610の吸光度を測定することにより行った。【０１２８】
培地中への4-HBA添加による好気増殖への影響の解析結果を図1に示す。
Escherichia coliは、100 mM 4-HBA存在下で著しく増殖阻害を受け、200 mM  4-HBAでは完全に増殖が阻害された。
Pseudomonas putida S12（溶媒耐性として報告されていた株）は、200 mM 4-HBAでは完全に増殖が阻害された。
Rhodobacter sphaeroidesは、100 mM 4-HBAでは完全に増殖が阻害された。
これに対して、Corynebacterium glutamicumは、Escherichia coli、Pseudomonas putida S12、及びRhodobacter sphaeroidesの増殖が完全に阻害された200 mMの4-HBA存在下でも増殖可能であった。更に、Corynebacterium glutamicum は250 mMの4-HBA存在下でも増殖可能であり、ここには示さないが培養開始後28時間には200 mMの4-HBA存在下における増殖と同等（野生株OD610の約65％）まで増殖した。
このように、Corynebacterium glutamicumは、Escherichia coli、Pseudomonas putida S12、及びRhodobacter sphaeroidesと比較して、4-HBAに対して高い耐性を有し、4-HBA生産の宿主として高い適性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でグルコース等から4-HBAを製造することができる。
【図１】
2015156271.tif 000008
【配列表】
2015156271000001.app
【国際調査報告】
2015156271.tif 000009
2015156271.tif 000010
2015156271.tif 000011
2015156271.tif 000012