(57)【要約】  たばこ原料の緑色が維持されているとともに、たばこ葉に含まれていた褐変関与酵素が失活したたばこ原料の製造方法を提供する。具体的には、Ｌ*ａ*ｂ*法で表現したａ＊値が１．０以下であり、水分含有量が８重量％以下のたばこ葉材料を、前記ａ＊値が１．０以下、褐変関与酵素が０．１Ｕ／ｇ以下となるように、７５℃以上の温度で、かつ調湿された環境下で加熱する工程を含む、たばこ原料の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ*ａ*ｂ*法で表現したａ＊値が１．０以下であり、水分含有量が８重量％以下のたばこ葉材料を、前記ａ＊値が１．０以下、褐変関与酵素が０．１Ｕ／ｇ以下となるように、７５℃以上の温度で、かつ調湿された環境下で加熱する工程を含む、たばこ原料の製造方法。
【請求項２】
前記調湿された環境が、３％ＲＨ〜６０％ＲＨの環境である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記調湿された環境が、３％ＲＨ〜６０％ＲＨの間の相対湿度が略一定に保たれている環境である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記加熱する工程の温度が、９９℃以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法により得られたたばこ原料を用いたオーラルたばこ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、たばこ原料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  スヌースのようなオーラルたばこ製品は、不織布のような材料により形成された包装材にたばこ原料が収納されてなるものであり、使用者はこれを口腔内に入れて使用する。  オーラルたばこ製品は、その使用態様から、たばこ原料から使用者の口腔内にたばこ原料に含まれる望ましくない成分が染み出ることがある。このことについて、例えば、特許文献１には、たばこ原料に含まれるニトロソアミンをオーラルたばこ製品の製造時に低減するための技術が記載されている。【０００３】  特許文献１では、空気乾燥させて黄変したたばこ葉を自然乾燥工程と制御乾燥工程により乾燥させ、たばこ原料中の亜硝酸態窒素やニトロソアミンを減少させることを開示している。  また、特許文献２には、黄色種たばこの乾燥に用いられる乾燥室の表示機構に関する発明が記載されている。特許文献２には、黄色種たばこの乾燥について、初期３８℃から最終的に６８℃まで昇温し、黄変期は約９５−７５％ＲＨ、中骨の乾燥期は約５０−２０％ＲＨに設定することが記載されている。  上記のような技術とは別に、特許文献３には、無煙たばこ組成物に関する技術が記載されており、当該組成物に含有させるものとして着色料を挙げている。  たばこ葉の公知の乾燥方法としては、主に葉巻の材料として用いられるグリーン・ラッパーの火力乾燥法が知られている（非特許文献１）。当該文献には、葉たばこが黄色く変色する（黄変）する前のたばこ葉の乾燥についての標準温湿度操作図が記載されている（発酵期：乾球３５℃、湿球２９度、１０〜１４時間、色沢固定期：乾球４５〜５０℃、湿球３２〜３４℃、２０〜２６時間、中骨乾燥期：乾球５５〜７０℃、湿球３７℃、３０〜３６時間）。当該乾燥方法により得られたもののうち、グリーン・ラッパー適品は収量の３３．５％であったことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３９２２９８５号公報
【特許文献２】特開２００７−２６７７１２号公報
【特許文献３】特表２００９−５０８５２３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】盛岡たばこ試験場報告  第１４号  １７−３０  １９８０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  非特許文献１に記載の方法は、緑色が維持された状態でたばこ葉を乾燥させるものであるが、その方法により得られるたばこ原料を水で抽出した場合には、その抽出液の色が褐色になることがわかった。このような濃い色の抽出液が生じるような場合、そのたばこ原料を用いたたばこ製品は使用者に好ましくない印象を与える可能性がある。  特許文献１に記載の方法では、たばこ葉の色が黄変してから、乾燥処理（マイクロ波や制御乾燥）を実施するというものである。つまり、特許文献１に記載の方法では、収穫したたばこ葉を処理するタイミングは、少なくとも緑色である状態ではなくなってからということを開示している。  また、上記特許文献２に記載の方法では、その乾燥処理は黄変期を経ているので、処理後のたばこ葉の色は黄変していると考えられる。  これらのことから、特許文献１や２に記載の方法を用いて得られるたばこ原料は、いずれも緑色が維持されていないと考えられる。また、特許文献１に記載の方法のように、黄色に変色したたばこ葉を乾燥処理したたばこ原料や、特許文献２に記載の方法を経たたばこ原料のように、乾燥後に黄変しているたばこ原料をオーラルたばこ製品に使用した場合には、口腔内に出る抽出液の色が濃くなることが想定される。  一方、特許文献３では、上記のように無煙たばこ組成物に含ませる材料として着色料を挙げている。このような技術によれば、無煙たばこ組成物を着色することはできるものの、その作用は含有されている着色剤が寄与するものである。【０００７】  このようなことから、本発明では、着色剤を用いることなく、たばこ原料の緑色が維持されているとともに、水を溶媒として抽出を行った場合に抽出液の色を淡くするために、たばこ原料中の褐変関与酵素が失活したたばこ原料の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者が鋭意検討した結果、特定のたばこ葉材料に特定の加熱処理を加えることで、得られるたばこ原料が緑色を呈し、かつ、たばこ葉に含まれていた褐変関与酵素が失活することで緑色が保たれ、そのたばこ原料を水で抽出して得られる抽出液の色は淡くなり、上記課題を解決できることがわかり、本発明に到達した。【０００９】  すなわち、本発明は、以下のとおりである。［１］  Ｌ*ａ*ｂ*法で表現したａ＊値が１．０以下であり、水分含有量が８重量％以下のたばこ葉材料を、前記ａ＊値が１．０以下、褐変関与酵素が０．１Ｕ／ｇ以下となるように、７５℃以上の温度で、かつ調湿された環境下で加熱する工程を含む、たばこ原料の製造方法。［２］  前記調湿された環境が、３％ＲＨ〜６０％ＲＨの環境である、［１］に記載の製造方法。［３］  前記調湿された環境が、３％ＲＨ〜６０％ＲＨの間の相対湿度が略一定に保たれている環境である、［１］または［２］に記載の製造方法。［４］  前記加熱する工程の温度が、９９℃以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。［５］  ［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法により得られたたばこ原料を用いたオーラルたばこ製品。
【発明の効果】
【００１０】  本発明によれば、得られるたばこ原料をオーラルたばこ製品として使用した際に、使用者の口腔内に出る抽出液の色が濃くならない。また、本発明のたばこ原料は、その色が緑色に維持されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例２で得られたたばこ原料について、各加熱時間の経過時の緑色度（ａ＊値）を相対湿度ごとに示す図である。（加熱温度（ａ）：７８℃、（ｂ）：８５℃）
【図２】実施例２で得られたたばこ原料について、各加熱時間の経過時のＡＢＳ４２０ｎｍを相対湿度ごとに示す図である。（加熱温度（ａ）：７８℃、（ｂ）：８５℃）
【図３】実施例２で得られたたばこ原料について、各加熱時間の経過時のＰＰＯ活性を相対湿度ごとに示す図である。（加熱温度（ａ）：７８℃、（ｂ）：８５℃）
【図４】処理前のたばこ葉（たばこ葉材料）の測色（ａ＊値）に選択する点（星印）の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  以下、本発明について実施形態及び例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態及び例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。
【００１３】＜たばこ葉材料＞  本発明のオーラルたばこ製品に用いられるたばこ原料となるたばこ種は、特に限定されるものではなく、例えばニコチアナ属であり、ニコチアナタバカムの黄色種・バーレー種、ニコチアナルスチカのブラジリア種などを挙げることができる。  本発明の製造方法において、たばこ原料として用いられるたばこ葉材料は、Ｌ*ａ*ｂ*法で表現したａ＊値が１．０以下であり、水分含有量が８重量％以下のたばこ葉材料である。  このようなたばこ葉材料は公知の方法を用いることで得ることができ、例えば上述した非特許文献１に記載の方法、具体的には、非特許文献１に記載された標準温湿度操作図に記載の条件を用いることができる。  他の態様としては、まず、２０〜４０℃、相対湿度（「乾球温度」と「湿球温度」の差異で表現することもある）４０〜８０％ＲＨ（以下、相対湿度の単位として「％ＲＨ」を用いる）で３〜２４時間乾燥させ（発酵期）、その後、４０〜５５℃、相対湿度４０〜７０％ＲＨで２４〜７２時間乾燥させ（色沢固定期：葉は乾燥）、その後、６０〜７０℃、相対湿度５〜３０％ＲＨで０〜１２０時間乾燥させる（中骨乾燥期：中骨まで乾燥）態様を挙げることができる。この方法を用いる場合、それぞれの工程を別々に行ってもよく、連続的に処理してもよい。たばこ葉材料の緑色を保つという観点からは、連続的に処理を行うことが好ましい。  また、上記の中骨乾燥期の乾燥については省いてもよく、その場合には、色沢固定期の乾燥時間を長くして、得られるたばこ葉材料の水分含有量を少なくとも８重量％以下になるまで十分に低減させる。  本発明の製造方法に用いるたばこ葉材料に含まれる水分含量が８重量％を超えると、後の加熱工程においてたばこ葉材料の緑色の低下が著しくなる。  なお、本発明において、「たばこ葉材料」とは、本発明の製造方法に供されるものであって、後述する特定の加熱工程を経ていないものを意味し、「たばこ原料」とは、後述する特定の加熱工程を経て得られるものを意味する。
【００１４】  Ｌ＊ａ＊ｂ＊法で表現したａ＊値が１．０以下のたばこ葉材料としては、収穫後、黄変する前のたばこ葉を用いる態様を挙げることができる。  ここで、「黄変する」とは、Ｌ＊ａ＊ｂ＊法で表現したａ＊値について、収穫葉の面積の大部分、例えば６０％以上、例えば９０％以上が１．０より大きい値になるまで変色したものをいう。たばこ葉はその収穫後に、たばこ葉に存在する（緑色）色素が減少することにより、黄変していく。なお、たばこ葉の収穫後のａ＊値は、通常−９〜−１．５程度である。
【００１５】  本発明の製造方法で用いられるたばこ葉材料は、上記を満たす限り特に限定されるものでなく、非特許文献１で例示される方法の他に、収穫後、たばこ葉から中骨を取り除いたものを処理工程に供したり、また、収穫後、たばこ葉を圧搾等により水分を除去してから処理工程に供してもよい。また、収穫後、たばこ葉を冷蔵もしくは冷凍保存した後に処理工程に供してもよい。  Ｌ＊ａ＊ｂ＊法におけるａ＊値は、その値が小さいほど緑色が強くなる。緑色は、通常のシガレットに用いられる際の収穫時期よりも早期に収穫することによって強くすることが出来る。この範囲の下限としては、−２０以上であることが、たばこ原料として緑色であることを担保する観点から適当である。たばこ原料の緑色を強くしたい場合には、緑色度（ａ＊値）は−２以下であることが適当である。
【００１６】  処理前のたばこ葉のａ＊値の測定は、以下のようにして行われる。  たばこ葉の表面の２０カ所を分光測色計（KONICA MINOLTA/CM3500d, Konica Minolta Holdings, Inc）を用いて色を測定する。なお、色の定義は、上記のように国際照明委員会（Commission International de l’Eclairage: CIE）およびJISにて採用されているＬ＊ａ＊ｂ＊表色系にて表現するものである。  たばこ葉表面の２０カ所とは、例えば図４の★に示すようにたばこ葉の中央部と外周部について均等に選択する。  測色操作は、標準光（測色用標準イルミナントＤ６５、ＣＩＥ、ＩＳＯの基準光）を当て、反射光を測定（反射色測定／正反射光除去方式（SCE））にて行って数値化する。上記条件でたばこ葉を測定した時のa*値が小さいほど緑色であると言える。
【００１７】＜加熱する工程＞  本発明の製造方法は、上記のたばこ葉材料を、ａ＊値が１．０以下、褐変関与酵素（ＰＰＯ）の活性が０．１Ｕ／ｇ以下となるように、７５℃以上の温度で、かつ調湿された環境下で加熱する工程を含む。  このような加熱を行うことで、得られるたばこ原料に含まれていたＰＰＯ（ポリフェノールオキシダーゼ）が失活し、たばこ原料のａ＊値が１以下である状態、つまり緑色が保たれるようになる。  加熱の態様としては、７５℃以上であり、別の態様として８０℃以上を挙げることができ、さらに別の態様として８５℃以上を挙げることができる。一方で、加熱温度の上限としては９９℃以下を挙げることができ、別の形態として９０℃以下を挙げることができる。加熱温度は、加熱する工程において、上記範囲内の温度で略一定に保たれている態様を挙げることができる。  また、加熱の際の相対湿度としては３％ＲＨ〜６０％ＲＨである態様を挙げることができる。  また、加熱の際の相対湿度が、前記の相対湿度の範囲間の相対湿度で略一定に保たれている態様を挙げることができる。  ここで、略一定に保たれているとは、変動幅が±１０％程度で継続して相対湿度が保たれている状態をいう。  また、加熱の時間については、１時間〜３日程度の態様を挙げることができる。  同一の加熱温度条件においては、ＰＰＯ活性を確実に失活させる観点から相対湿度を低くする場合（例えば２０％以下の場合）は加熱の時間を長くし、ａ＊値を低く保つ観点から相対湿度を高くする場合（例えば３０％を超える場合）には加熱の時間を短くする態様を挙げることができる。
【００１８】  具体的な加熱温度、相対湿度、加熱時間の態様としては、以下を例示することができる。  加熱温度を７５℃以上８０℃未満に設定し、相対湿度として３％ＲＨ以上２０％ＲＨ以下に設定する場合は、加熱時間として４８時間以上を挙げることができる。一方、この場合の加熱時間の上限としては、９６時間以下をあげることができる。  加熱温度を８０〜８５℃程度に設定し、相対湿度として３％ＲＨ以上１０％ＲＨ未満に設定する場合は、加熱時間として２４時間以上を挙げることができる。一方、この場合の加熱時間の上限としては、９６時間以下をあげることができる。  加熱温度を８０〜８５℃程度に設定し、相対湿度として１０％ＲＨ以上４０％ＲＨ未満に設定する場合は、加熱時間として４〜１８時間程度を挙げることができる。  加熱温度を８０〜８５℃程度に設定し、相対湿度として４０％ＲＨ以上６０％ＲＨ以下に設定する場合は、加熱時間として１〜２時間程度を挙げることができる。  上記以外の態様でも、得られるたばこ原料のａ＊値が１．０以下で、かつ、ＰＰＯ活性が０．１Ｕ／ｇ以下になる態様であれば、限定なく用いることができる。
【００１９】  得られるたばこ原料のａ＊値が１．０以下で、かつ、ＰＰＯ活性が０．１Ｕ／ｇ以下になるように加熱を行う際に用いることができる装置としては、恒温恒湿器を挙げることができる。具体的には、エスペック社（ＥＳＰＥＣ）の恒温恒湿器（ＰＲ−３ＫＰＨ）を挙げることができる。  本発明の製造方法を経て得られたたばこ原料のａ＊値の測定は、水分３〜５重量％まで乾燥したたばこ原料を、粉砕機を用いて１−２ｍｍメッシュの大きさに粉砕し、分光測色計を用いて粉砕したサンプルの色を測定することで行うことができる。色の定義は、上記のたばこ葉の測色と同じく、L*a*b*表色系にて表現する。  測色操作は、サンプル粉体をガラス容器に層厚１ｃｍで投入し、容器底部から標準光（測色用標準イルミナントD65, CIE, ISOの基準光）を当て、反射光を測定（反射色測定／正反射光除去方式（SCE））することで数値化できる。
【００２０】  本発明の製造方法により得られるたばこ原料として、水を抽出溶媒として用いた場合の抽出液の色について、４２０ｎｍ波長の吸光度（「ＡＢＳ４２０ｎｍ」とも表記する）が１．０以下のものが得られる。  また、上記吸光度は、たばこ原料について本発明の製造方法に含まれるステップが行われない場合、通常、０．２以上になる。  水による抽出は、以下のような手順で行って得られるものである。  水分を５重量％以下にまで低減させ、粉砕したたばこ原料１重量部を秤量し、２２℃の水２５重量部に加えて１０分程度振盪抽出を行う。その後同温度で２０分程度静置し、抽出液を０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過する。ろ過後の溶液を水で二倍希釈し、分光吸光光度計を用い、４２０ｎｍ波長の吸光度を測定する。なお、本発明において、吸光度は光路長１ｃｍで測定を行う。  なお、本発明において、上記条件の吸光度の数値を「褐変度」ともいい、この数値が大きいほど抽出液の褐色度が高いと定義する。また、本発明において褐色と茶色は同義である。  この褐変度については、前述したたばこ原料の製造方法において、ＰＰＯ活性を低下させるための加熱処理の温度と時間を変更することで調整することができる。  具体的には、褐変度の増加を抑制するには、ＰＰＯ活性を低下させるために加熱処理の温度を高くしたり、その時間を長くしたりすることが有効である。ただし、たばこ原料の緑色度を保つ観点から、相対湿度に応じて加熱処理の温度と時間を調整する。
【００２１】  たばこ原料の酵素活性値は、分光吸光光度計のセルに、試料から酵素タンパク質を抽出した溶液と、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて混合し、これに基質として１０ｍＭピロカテコール溶液を加え、４０℃におけるリファレンスに対する４２０ｎｍ波長の吸光度の増加を測定することで得ることができる。リファレンスとしては、酵素タンパク質液のかわりにリン酸カリウム緩衝液を混合した液を挙げることができる。抽出条件としては、後述する実施例と同じ方法を用いる。  リファレンスの吸光度増加分を差し引き、試料の吸光度（ΔＡＢＳ）を一分間に０．０１上昇させる酵素量を１Ｕと定義する。
【００２２】  本発明のたばこ原料の製造方法では、上記のように特定のたばこ葉材料を特定条件下で加熱する工程を経て得られるものである。このことについて、乾燥後のたばこ原料の緑色度（a*値）を上昇させるだけであれば、凍結乾燥のみを行うだけでも十分であるが、凍結乾燥のみを行って得られたたばこ原料は乾燥後の品質劣化が著しく、乾燥後の吸湿とともに褐変する。  また、凍結乾燥のみを行ったたばこ原料の抽出液は著しく褐変する。この場合、本発明の効果である、緑色のたばこ原料で、かつその抽出液の褐変度が小さいという要件を満たさない。
【００２３】＜オーラルたばこ製品＞  本発明の製造方法により得られるたばこ原料は、例えばオーラルたばこ製品として用いることができる。オーラルたばこ製品は、例えばスヌース、ガム、かみたばこ、かぎたばこ、圧縮たばこ（タブレット、スティック等）、可食フィルム等でありうる。  本発明のオーラルたばこ製品を例えばスヌースとする場合は、上述したたばこ原料を例えば不織布のような原料を用いた包装材に公知の方法を用いて充填することで得られる。例えばたばこ原料の量を調整して充填し、ヒートシールなどの手段によりシールしてスヌースを得る。  包装材としては特段の限定なく用いることができるが、セルロース系の不織布などが好ましく用いられる。  本発明の原料をオーラルたばこ製品とする場合、より具体的にはガムとする場合は、本発明で用いられる上記たばこ原料を公知のガムベースと公知の方法を用いて混合することで得られる。かみたばこやかぎたばこ、圧縮たばこについても、本発明で用いられる上記たばこ原料を用いること以外は、公知の方法を用いて得ることができる。また、可食フィルムについても本発明で用いられる上記たばこ原料を用いること以外は、公知の材料や方法を用いて得ることができる。
【００２４】  本発明のたばこ原料をオーラルたばこ製品として用いる場合には、本発明の製造方法を経て得られるたばこ原料の割合は適宜調整可能であるが、できるだけ多い方が好ましく、たばこ原料全量に対して、４０重量％以上であることが好ましく、６０重量％以上であることがより好ましく、８０重量％以上がより好ましく、９８重量％以上であることがより好ましく、１００重量％であることが特に好ましい。  本発明のたばこ原料を用いたオーラルたばこ製品において、上記の特定のたばこ原料以外のものを含有する場合には、本発明の効果を損なわないものを用いる。
【００２５】  本発明のたばこ原料は、その抽出液の褐変度が小さいことから、それを用いた製品を梱包する包装材への褐色の染み出しが抑制されることが期待できる。また、たばこ原料の色が緑色に保持されている。
【実施例】
【００２６】  本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例の記載に限定されるものではない。【００２７】＜参考例１＞  日本国内で生産されたバーレー品種の葉たばこの下位葉を収穫し、収穫した葉を機械乾燥室に設置し制御された雰囲気下で乾燥した。制御された雰囲気について、以下説明する。  まず、収穫した葉を乾球温度３６℃、湿球温度２９℃（７５％ＲＨ）で１２時間保管し、次いで乾球温度４５℃、湿球温度３２℃（相対湿度４２％）で２４時間かけて葉肉部を乾燥し、最後に乾球温度６８℃、湿球温度４０℃（２０％ＲＨ）の雰囲気下で３６時間かけて中骨を含むたばこ葉全体を乾燥してたばこ葉材料を得た。当該乾燥工程は、非特許文献１に記載の乾燥方法に準じるものである。  このたばこ葉材料の水抽出物のＡＢＳ４２０ｎｍは、１．８２であり、たばこ葉材料のＰＰＯ活性は０．４３Ｕ／ｇであった。【００２８】＜実施例１＞  参考例に対し、本発明の製造方法にかかる実施例１では、まず上記の非特許文献１に記載された方法に準じて、乾球温度３６℃、湿球温度２９℃（７５％ＲＨ）で１２時間保管し、次いで乾球温度４５℃、湿球温度３２℃（相対湿度４２％）で２４時間かけて葉肉部を乾燥し、葉脈部を乾球温度６８℃、湿球温度４０℃（２０％ＲＨ）の雰囲気下で３６時間かけて乾燥してたばこ葉材料を得た。その際のａ＊値は−５．９６６、水分含有量は６．３６％重量％であった。その乾燥後、たばこ葉材料を乾球温度８５℃、湿球温度６９℃（５０％ＲＨ）の調湿雰囲気下で６０分かけて乾燥葉を加熱して、たばこ原料を得た。得られたたばこ原料のａ＊値は−２．５であり、ＰＰＯ活性は０．０１６Ｕ／ｇであった。また、水による抽出液のＡＢＳ４２０ｎｍは０．６７であった。【００２９】  参考例１と実施例１を経て得られたたばこ葉材料あるいはたばこ原料は共に緑色であり、分光測色計を用いた測色値（ａ＊値）は両方ともに１．０以下であった。  しかし、参考例１で得られたたばこ葉材料の水による抽出液のＡＢＳ４２０ｎｍは１．８２であり、褐色を呈していた。  このことから、緑色のたばこ葉材料を得るだけであれば、非特許文献１に記載されているような従来技術で達成しうるが、水に含浸させたときの抽出物の色は激しく褐色化するものであることが分かった。【００３０】（酵素活性測定法）  上記たばこ葉材料やたばこ原料のＰＰＯ活性の測定は以下のように行った。たばこ葉材料等を粉砕した試料１ｇを１００ｍＬバイアルに量り取り、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５０ｍＬを加え、氷冷環境下で２分間ホモジナイズし、さらに氷冷環境下で３０分間超音波処理を行った。  その後、０．２μmメンブレンフィルター（膜素材：セルロースアセテート）を用いて抽出物を濾過した。このろ液を酵素活性測定用の粗酵素溶液とした。ＰＰＯ活性測定は、以上に述べた酵素溶液と反応緩衝液と基質溶液を用いて実施した。活性測定の手順を以下に示す。  １００μＬの粗酵素溶液に９００μＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を混合し、４０℃に調温した。混合液に対し、１０ｍＭピロカテコール溶液１０００μＬを混合し、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度の増加��度を測定した。この時、対照として酵素溶液を混合しない１０００μＬの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。この時、粗酵素溶液によって吸光度（ΔＡＢＳ）が一分間に０．０１上昇させる酵素量を１Ｕと定義した。【００３１】（ａ＊値の測定）  上記たばこ葉材料やたばこ原料の外観の色彩については、以下の手順により測定した。  水分３〜５％まで乾燥したたばこ葉材料やたばこ原料を、粉砕機（MiniBlender, Melitta Japan Ltd., Tokyo, Japan)を用いて１−２ｍｍメッシュの大きさに粉砕し、分光測色計（KONICA MINOLTA/CM3500d, Konica Minolta Holdings, Inc）を用いて粉砕したサンプルの色を測定した。色の定義は、国際照明委員会（Commission International de l'Eclairage: CIE）およびJISにて採用されているL*a*b*表色系にて表現した。  測色操作は、サンプル粉体をガラス容器に層厚１ｃｍで投入し、容器底部から標準光（測色用標準イルミナントD65, CIE, ISOの基準光）を当て、反射光を測定（反射色測定／正反射光除去方式（ＳＣＥ）） にて行って数値化した。  なお、一般的なたばこ葉であるバーレー種、黄色種、ニコチアナ・ルスチカの収穫後、乾燥前のたばこ葉（冷凍品）の緑色度(ａ＊値)は、それぞれバーレー種:−２．１±０．３、黄色種:−２．５±０．６、ニコチアナ・ルスチカ:−４．６±０．５である。【００３２】（ＡＢＳ４２０ｎｍの測定）  上記たばこ葉材料やたばこ原料の抽出液の褐変度は、以下の方法にて測定した。水分５％以下まで乾燥した材料等（たばこ葉）を０．４ｇ秤量し、水１０ｍＬを加えて１０分間２２℃で振盪抽出する。振盪後、２２℃で２０分間静置し、抽出液を０．２０μｍ孔径メンブレンフィルター（Whatman PVDF membrane, GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire, UK)でろ過した。この溶液を水で二倍希釈し、分光吸光光度計を用いて４２０ｎｍ波長の吸光度を測定した。【００３３】  ＜実施例２＞  参考例１と同様の方法により乾燥処理を行って得られたたばこ葉材料を用い、加熱温度として７８℃または８５℃の環境下で、相対湿度を特定の値に調湿した上で加熱時間の経過に伴うたばこ葉材料（たばこ原料）の物性（ａ＊値、ＡＢＳ４２０ｎｍ、ＰＰＯ活性）の変化を測定した。  具体的には、相対湿度を５％ＲＨ、２０％ＲＨ、３０％ＲＨ、４０％ＲＨまたは５０％ＲＨに調湿し、加熱時間として１時間、２時間、４時間、８時間、（２４時間）の経過時に各物性の測定を行った。  結果を図１（ａ＊値）、図２（ＡＢＳ４２０ｎｍ）及び図３（ＰＰＯ活性）に示す。図１の縦軸（a*）は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊法で表現した分光測色計のデータであり、ａ＊値が小さいほど緑色である。また、図２において吸光度が高いほど（Ｙ軸の値が大きいほど）褐色である。さらに、図３において、ＰＰＯ活性が高いほど（Ｙ軸の値が大きいほど）、たばこ原料の緑色の安定度が低くなる。【００３４】  図１〜３の結果から、たばこ葉材料の緑色度を大きく低下させることなく、ＰＰＯ活性を低下させるために、加熱温度、相対湿度及び加熱時間が重要であり、７５℃以上で、かつ、制御された相対湿度の条件下で所定の加熱時間を経過させることが必要であることが明らかとなった。  この時、相対湿度が高いほど、ＰＰＯ活性の低下が速やかになることが分かった。一方で、相対湿度が低い条件でも加熱時間を長くすればＰＰＯ活性が十分に低下することが分かった。【００３５】＜参考例２＞  収穫したたばこ葉の黄変について  葉表面の大部分が黄色に変色するまで保存してあった黄色種（FCV）たばこ葉について測色計にて測定した。その結果、葉表面の大部分を占める黄色に変色した部分の緑色度（ａ＊値）は２．０±０．７であった。また、このたばこ葉をマイクロ波乾燥し、黄色のたばこ原料とした場合のａ＊値は５．３±０．１、また吸光度（ＡＢＳ４２０ｎｍ）は１．５７であった。  すなわちたばこ葉表面の大部分（面積の６０％以上）の緑色度（ａ＊値）が１．０より大きい値まで変化した場合“黄色に変色した葉”と言える。  また、本発明の加熱処理を行っていないたばこ葉の酵素活性値は、４．６４Ｕ／ｇ（凍結乾燥葉、バーレー種（みちのく））、６．４２Ｕ／ｇ（凍結乾燥葉バーレー種（Burley21））であった。【００３６】  本発明の製造方法では、ａ＊値と水分含有量が所定値以下に調整されたたばこ葉材料をさらに特定条件で加熱することにより、仕上った緑色が安定して固定化されたたばこ原料を得ることができる。そのメカニズムは、たばこ葉に含まれる褐変関与酵素（ポリフェノールオキシダーゼ：PPO）が失活することによるものである。
【産業上の利用可能性】
【００３７】  本発明の製造方法により得られるたばこ原料は、たばこ葉の緑色が保持されるとともに、褐変関与酵素の活性が失活していることから、そのたばこ原料を水で抽出して得られる抽出液が淡い色を呈し、これを用いたオーラルたばこ製品を使用者が使用した場合には、使用者の口腔内がオーラルたばこ製品の色の染み出しに起因して着色することを防ぐことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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