(57)【要約】【課題】  揮発して野生動物や害獣の副嗅球に作用させることができるため、フェロモンなどのように野生動物や害獣に対して本能的に作用して忌避させることが可能であり、かつその濃度に依らない優れた忌避効果が期待できるとともに、ヒトの成人が副嗅球を有していないことから従来の野生動物や害獣の忌避剤と比較して極めて取り扱いがしやすい、野生動物や害獣、家畜動物などのための哺乳動物忌避剤を提供する。【解決手段】  ピラジン化合物を有効成分とする副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤。
2014133156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化５４】
2014133156.tif 000057
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜８の炭化水素基、または炭素原子数１〜８のアルコキシ基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも一つは炭素原子数１〜８の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物および／またはその塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤。
【請求項２】
前記ピラジン化合物が下記式（Ｉ）：
【化５５】
2014133156.tif 000058
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子または炭素原子数１〜４の炭化水素基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも二つは炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物である、請求項１に記載の忌避剤。
【請求項３】
前記ピラジン化合物が下記（１）〜（３）で表されるピラジン化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１または請求項２に記載の忌避剤；
（１）下記式（ＩＩ）：
【化５６】
2014133156.tif 000059
［上記式（ＩＩ）中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（２）下記式（ＩＩＩ）：
【化５７】
2014133156.tif 000060
［上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（３）下記式（ＩＶ）：
【化５８】
2014133156.tif 000061
［上記式（ＩＶ）中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物。
【請求項４】
前記ピラジン化合物が下記（４）〜（１１）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（４）下記式（ＶＩＩ）：
【化５９】
2014133156.tif 000062
で表される化合物；
（５）下記式（ＶＩＩＩ）：
【化６０】
2014133156.tif 000063
で表される化合物；
（６）下記式（ＩＸ）：
【化６１】
2014133156.tif 000064
で表される化合物；
（７）下記式（Ｘ）：
【化６２】
2014133156.tif 000065
で表される化合物；
（８）下記式（ＸＩ）：
【化６３】
2014133156.tif 000066
で表される化合物；
（９）下記式（ＸＩＩ）：
【化６４】
2014133156.tif 000067
で表される化合物；
（１０）下記式（ＸＩＩＩ）：
【化６５】
2014133156.tif 000068
で表される化合物；
（１１）下記式（ＸＶＩ）：
【化６６】
2014133156.tif 000069
で表される化合物。
【請求項５】
前記ピラジン化合物が下記（１２）〜（１４）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（１２）下記式（ＶＩＩ）：
【化６７】
2014133156.tif 000070
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化６８】
2014133156.tif 000071
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化６９】
2014133156.tif 000072
で表される化合物；
（１３）下記式（Ｘ）：
【化７０】
2014133156.tif 000073
で表される化合物、
下記式（ＸＩ）：
【化７１】
2014133156.tif 000074
で表される化合物
および下記式（ＸＩＩ）：
【化７２】
2014133156.tif 000075
で表される化合物；
（１４）下記式（ＩＸ）：
【化７３】
2014133156.tif 000076
で表される化合物、
下記式（ＸＩＩＩ）：
【化７４】
2014133156.tif 000077
で表される化合物
および下記式（ＸＩＶ）：
【化７５】
2014133156.tif 000078
で表される化合物。
【請求項６】
前記ピラジン化合物が下記（１５）または（１６）で表される化合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（１５）下記式（ＸＩ）：
【化７６】
2014133156.tif 000079
で表される化合物；
（１６）下記式（ＶＩＩ）：
【化７７】
2014133156.tif 000080
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化７８】
2014133156.tif 000081
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化７９】
2014133156.tif 000082
で表される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物忌避剤に関し、より詳細には、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、害獣と呼ばれる哺乳動物から受ける人間の被害には様々なものがある。例えば、クマやイヌなどにより直接人間が肉体的被害を受ける場合、シカやサル、イノシシ、カモシカ、ハクビシン、ウサギ、ネズミなどにより田畑などが荒らされて農作物が被害を受ける場合、タヌキやキツネ、イタチなどにより家畜や養殖魚などが被害を受ける場合、モグラなどにより芝生が荒らされるなどの景観が被害を受ける場合、コウモリやネコなどの糞尿による汚染の被害を受ける場合、ペストに代表されるようにネズミなどを媒介とした疾病蔓延の場合などが挙げられる。特に農作物への被害は深刻であり、鳥類を除く獣類による農作物への被害総額は１８４億円、被害面積は８５，０００ｈａにものぼっている（非特許文献１）。【０００３】
このような状況下、昨今では様々な野生動物や害獣用の忌避剤が開発されている。例えば、動物の忌避する臭気を有するとともに化学的に安定化できて忌避剤の持続性を高めることを目的として、主鎖に硫黄結合を有し末端または分岐鎖端がチオール基である液状高分子化合物を主成分として用いた忌避剤（特許文献１）や、人体から発せられる臭気成分であるということで、炭素数６〜１０の不飽和アルデヒドや炭素数５〜９の飽和カルボン酸を有効成分として用いた忌避剤（特許文献２）、悪臭や激臭、刺激臭を与え得る目的として、特定悪臭物質に指定されているジメチルジスルフィド（二硫化メチル）や悪臭防止法の規制対象となっているペンタン酸（吉草酸）、ワサビやカラシの辛み成分であるアリルイソチオシアネートを有効成分として用いた忌避剤（特許文献３）など、悪臭や激臭、異臭、刺激臭を与える化学物質を用いた忌避剤が開示されている。【０００４】
一方、大型動物や天敵となる動物の糞尿を用いて、野生動物や害獣などを忌避させることが行われている。野生動物などはしばしば本来の生息地域から離れ人里に迷い込むことがあるが、それら糞尿にはイソペンテニルメチルスルファイドとその誘導体などの強烈な悪臭を放つ含硫化合物が含まれていて、それら野生動物などを殺傷することなく人里から遠ざける機能を持つことが経験的に知られているからである。そのような忌避剤として、例えば、トラやライオン、豹、熊、象などの大型動物や天敵となる動物の糞や尿の臭気成分を用いた忌避剤（特許文献４）や前記糞の抽出分や分離分を用いた徐放性防獣鳥物質（特許文献５）が開示されている。また、オオカミの尿も、悪臭、激臭物質である含硫化合物を多く含んでおり（非特許文献２）、それら含硫化合物が有効成分として働いて野生動物や害獣を忌避させることが知られている（非特許文献３）。オオカミの尿を用いた忌避剤は、「ウルフピー（登録商標）」という商品名で流通している。【０００５】
ところで、含硫化合物などが有する悪臭や激臭、異臭といった臭気は、いわゆる嗅覚系（主嗅球系）で受容される。すなわち嗅覚は、嗅覚器の嗅細胞から始まり、一般のにおい物質を感じ取る器官、嗅覚を司る器官である主嗅球を経て、梨状葉、扁桃体など大脳辺縁系に広く投射し、最終的にその情報は大脳皮質に到達することで感じ取られる。これに対し、フェロモンなどは、鋤鼻系（副嗅球系）で受容される。より詳細には、鋤鼻器の鋤鼻細胞から副嗅球を経て扁桃体内側部に至り、最後は視床下部に到達する神経路で受容される。すなわち、主嗅球と副嗅球とはそれぞれ異なる器官であるが、従来、ヒトの成人は副嗅球を有していないことが知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３５４５０８
【特許文献２】特開２０１１−１７３８１１
【特許文献３】特開２０１２−１５３６７２
【特許文献４】特開２００４−１８９６８４
【特許文献５】特開２００６−１０４１９０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】農林水産省、「全国の野生鳥獣による農作物被害状況について（平成２３年度）」、平成２５年２月１日（ｏｎｌｉｎｅ、平成２５年２月２１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.maff.go.jp/j/press/seisan/saigai/130201.html＞
【非特許文献２】Ｊ．Ｒａｙｍｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、第４０巻、第７号、７０７−７０９頁、１９８４
【非特許文献３】Ｄｉｅｔｌａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚｅ著、Ｈａｎｄｓ−ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｓｉｍｐｌｅ Ｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｘｅｒｃｉｓｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ、２００９年
【非特許文献４】Ｅ．Ｍｅｉｓａｍｉら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８５５巻、第７０８−７１５頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１〜５に開示されている忌避剤やウルフピー（登録商標）は、いずれも野生動物や害獣に対して悪臭や激臭、刺激臭を与えること、すなわち野生動物や害獣の嗅覚すなわち主嗅球に訴え、人体から発せられる臭気や悪臭、激臭、刺激臭と捉えさせることにより忌避させることを目的としているが、それら忌避剤は、同時に、主嗅球を有する人間に対しても悪臭や激臭、刺激臭を与えてしまうため、濃度の高いものを散布することができず、取り扱いが困難なものであった。従って、ある限度の濃度に抑えて使用せざるを得ないが、その場合の忌避効果は限定的となっていた。【０００９】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、野生動物や害獣の副嗅球に作用させるといった、従来の野生動物・害獣用の忌避剤とは異なる神経経路を通じて忌避を誘起させることができるため、フェロモンなどが与えるような野生動物や害獣に対する本能的な作用、すなわちより効果的な忌避効果を奏することが可能であり、さらにはその忌避効果について慣れを生じさせず、かつその濃度に依らない優れた忌避効果が期待できるとともに、ヒトの成人が副嗅球を有していないことから従来の野生動物や害獣の忌避剤と比較して極めて取り扱いがしやすい、野生動物や害獣、家畜動物などのための哺乳動物忌避剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、悪臭や激臭、異臭、刺激臭など、主嗅球に訴えることにより野生動物や害獣に対する忌避効果を奏する灰色オオカミの尿を、その常識に反して希釈し、その希釈した尿から、従来灰色オオカミの尿に含有されているとの報告がなく、かつ揮発させることが可能なピラジン化合物を抽出し、これらピラジン化合物およびその塩が、野生動物や害獣の副嗅球に作用して本能的に忌避させることが可能であること、その忌避効果について慣れを生じさせないこと、およびヒトの成人が副嗅球を有していないことから従来の野生動物や害獣の忌避剤と比較して極めて取り扱いがしやすいことなどを見出し、さらには灰色オオカミの尿には含有されていないピラジン化合物であって、揮発させることができて野生動物や害獣の副嗅球に作用して本能的に忌避させることができ、かつその忌避効果について慣れを生じさせないピラジン化合物を見出し、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）下記式（Ｉ）：
【化１】
2014133156.tif 000003
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜８の炭化水素基、または炭素原子数１〜８のアルコキシ基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも一つは炭素原子数１〜８の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物および／またはその塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤。【００１２】
（２）前記ピラジン化合物が下記式（Ｉ）：
【化２】
2014133156.tif 000004
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子または炭素原子数１〜４の炭化水素基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも二つは炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物である、（１）に記載の忌避剤。【００１３】
（３）前記ピラジン化合物が下記（ｉ）〜（ｉｖ）で表されるピラジン化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、（１）または（２）に記載の忌避剤；
（ｉ）下記式（ＩＩ）：
【化３】
2014133156.tif 000005
［上記式（ＩＩ）中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（ｉｉ）下記式（ＩＩＩ）：
【化４】
2014133156.tif 000006
［上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（ｉｉｉ）下記式（ＩＶ）：
【化５】
2014133156.tif 000007
［上記式（ＩＶ）中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（ｉｖ）下記式（Ｖ）：
【化６】
2014133156.tif 000008
［上記式（Ｖ）中、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物。【００１４】
（４）前記ピラジン化合物が下記（ｖ）〜（ｉｘ）で表される化合物である、（１）または（２）に記載の忌避剤；
（ｖ）下記式（ＩＩ）：
【化７】
2014133156.tif 000009
［上記式（ＩＩ）中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物
および下記式（ＶＩＩ）：
【化８】
2014133156.tif 000010
で表される化合物；
（ｖｉ）下記式（ＩＩＩ）：
【化９】
2014133156.tif 000011
［上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物
および下記式（ＶＩＩ）：
【化１０】
2014133156.tif 000012
で表される化合物；
（ｖｉｉ）下記式（ＩＶ）：
【化１１】
2014133156.tif 000013
［上記式（ＩＶ）中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物
および下記式（ＶＩＩ）：
【化１２】
2014133156.tif 000014
で表される化合物；
（ｖｉｉｉ）下記式（Ｖ）：
【化１３】
2014133156.tif 000015
［上記式（Ｖ）中、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物
および下記式（ＶＩＩ）：
【化１４】
2014133156.tif 000016
で表される化合物；
（ｉｘ）下記式（ＶＩ）：
【化１５】
2014133156.tif 000017
で表される化合物
および下記式（ＶＩＩ）：
【化１６】
2014133156.tif 000018
で表される化合物。【００１５】
（５）前記ピラジン化合物が下記（ｘ）〜（ｘｖｉｉ）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の忌避剤；
（ｘ）下記式（ＶＩＩ）：
【化１７】
2014133156.tif 000019
で表される化合物；
（ｘｉ）下記式（ＶＩＩＩ）：
【化１８】
2014133156.tif 000020
で表される化合物；
（ｘｉｉ）下記式（ＩＸ）：
【化１９】
2014133156.tif 000021
で表される化合物；
（ｘｉｉｉ）下記式（Ｘ）：
【化２０】
2014133156.tif 000022
で表される化合物；
（ｘｉｖ）下記式（ＸＩ）：
【化２１】
2014133156.tif 000023
で表される化合物；
（ｘｖ）下記式（ＸＩＩ）：
【化２２】
2014133156.tif 000024
で表される化合物；
（ｘｖｉ）下記式（ＸＩＩＩ）：
【化２３】
2014133156.tif 000025
で表される化合物；
（ｘｖｉｉ）下記式（ＸＩＶ）：
【化２４】
2014133156.tif 000026
で表される化合物。【００１６】
（６）前記ピラジン化合物が下記（ｘｖｉｉｉ）〜（ｘｘ）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の忌避剤；
（ｘｖｉｉｉ）下記式（ＶＩＩ）：
【化２５】
2014133156.tif 000027
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化２６】
2014133156.tif 000028
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化２７】
2014133156.tif 000029
で表される化合物；
（ｘｉｘ）下記式（Ｘ）：
【化２８】
2014133156.tif 000030
で表される化合物、
下記式（ＸＩ）：
【化２９】
2014133156.tif 000031
で表される化合物
および下記式（ＸＩＩ）：
【化３０】
2014133156.tif 000032
で表される化合物；
（ｘｘ）下記式（ＩＸ）：
【化３１】
2014133156.tif 000033
で表される化合物、
下記式（ＸＩＩＩ）：
【化３２】
2014133156.tif 000034
で表される化合物
および下記式（ＸＩＶ）：
【化３３】
2014133156.tif 000035
で表される化合物。【００１７】
（７）前記ピラジン化合物が下記（ｘｘｉ）または（ｘｘｉｉ）で表される化合物である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の忌避剤；
（ｘｘｉ）下記式（ＸＩ）：
【化３４】
2014133156.tif 000036
で表される化合物；
（ｘｘｉｉ）下記式（ＶＩＩ）：
【化３５】
2014133156.tif 000037
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化３６】
2014133156.tif 000038
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化３７】
2014133156.tif 000039
で表される化合物。【００１８】
（８）所望のピラジン化合物を揮発させて哺乳動物の副嗅球に作用させる工程を有する、副嗅球を有する哺乳動物に忌避させる方法。
（９）副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤としての所望のピラジン化合物および／またはその塩の使用。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る哺乳動物忌避剤によれば、揮発させて野生動物や害獣の副嗅球に作用させるといった、従来の野生動物・害獣用の忌避剤とは異なる神経経路を通じて忌避を誘起させることができるため、フェロモンなどが与えるような野生動物や害獣に対する本能的な作用、すなわちより効果的な忌避効果を奏することの他、その忌避効果について慣れを生じさせないという効果が期待できるとともに、濃度にかかわらず優れた忌避効果が期待できる。また、ヒトの成人が副嗅球を有していないことから従来の野生動物や害獣の忌避剤と比較して害獣や野生動物への特異性が高いことが期待され、極めて簡便に取り扱うことができる。さらに、一般名称として２−エチルピラジン、２−イソブチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、２−エチル−３−メチルピラジン、ジエチルメチルピラジン、イソプロピルメチルピラジン、２−イソブチル−３−メチルピラジン、２−イソプロピル−３−メトキシピラジン、２−イソプロピル−５−メトキシピラジン、２−イソブチル−３−メトキシピラジン、２−イソブチル−５−メトキシピラジン、２−ｓｅｃ−ブチル−３−メトキシピラジン、２，３−ジメチル−５−エチルピラジン、２，５−ジメチル−３−エチルピラジン、２，３−ジエチル−５−メチルピラジン、２，５−ジエチル−３−メチルピラジン、５−メチル−（５Ｈ）−シクロペンタ［ｂ］ピラジン、２，３，５−トリメチルピラジン、アセチルピラジンと呼ばれるピラジン化合物など、有効成分とするピラジン化合物によっては食品添加物として既に指定され、香料として活用されているものも少なくなく、毒性と悪臭の懸念が少なく有用性の高い、産業上利用可能性に富んだ哺乳動物忌避剤を市場に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】コントロール群（蒸留水）、オオカミの尿サンプルＡ、Ａ／５およびＡ／１５の群、Ｂ、Ｂ／５およびＢ／１５の群、ならびにＣ、Ｃ／５およびＣ／１５の群についての、マウスにおける回避率を示すグラフである。
【図２】コントロール群（蒸留水）、オオカミの尿サンプルＡ群、Ｂ群およびＣ群（（ａ）図）、ならびにコントロール群、オオカミの尿サンプルＡ／５群、Ｂ／５群およびＣ／５群（（ｂ）図）についての、マウスにおける不動時間（恐怖誘発効果）を示すグラフである。
【図３】雌マウスの尿を雌マウスに曝露した場合（ａ）およびオオカミの尿サンプルＣ／５を雌マウスに曝露した場合（ｂ）の、副嗅球におけるＦｏｓ陽性細胞の発現の様子を表す図である。
【図４】オオカミの尿サンプルＣ、Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５を曝露した場合の、副嗅球の前部僧帽細胞、前部顆粒細胞、後部僧帽細胞および後部顆粒細胞におけるＦｏｓ陽性細胞の密度を示すグラフである。
【図５】オオカミの尿サンプルＡ、ＢおよびＣについて、ガスクロマトグラフ質量分析をして得られたクロマトグラムである。
【図６】コントロール群（蒸留水）、１％（ｖ／ｖ）合成２，６−ジメチルピラジン（２，６ＤＭＰ）群、１％（ｖ／ｖ）合成３−エチル−２，５−ジメチルピラジン（２，５ＤＭ３ＥＰ）群、１％（ｖ／ｖ）合成トリメチルピラジン（ＴＭＰ）群、トータル１％（ｖ／ｖ）ピラジン化合物カクテル群、１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴ群および１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴ群について、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合の、マウスにおける不動時間（恐怖誘発効果）を示すグラフである。
【図７】コントロール群（蒸留水）およびトータル１％（ｖ／ｖ）ピラジン化合物カクテル群の、副嗅球の前部僧帽細胞、前部顆粒細胞、後部僧帽細胞および後部顆粒細胞におけるＦｏｓ陽性細胞の密度を示すグラフである。
【図８】コントロール群（蒸留水）、合成トリメチルピラジン（ＴＭＰ）群、合成３−エチル−２，５−ジメチルピラジン（２，５ＤＭ３ＥＰ）群、合成２，３−ジエチルピラジン（２，３ＤＥＰ）群、合成２，３−ジメチル−５−エチルピラジン（２，３ＤＭ５ＥＰ）群、合成２−エチル−３メチルピラジン（２Ｅ３ＭＰ）群および合成２−イソブチル−３−メチルピラジン（２ｉＢ３ＭＰ）群について、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合の、マウスにおける不動時間（恐怖誘発効果）を示すグラフである。
【図９】新たなオオカミの尿サンプルについて、ガスクロマトグラフ質量分析をして得られたクロマトグラムである。
【図１０】ＯＰｍｉｘ群、ＮｅｗＰｍｉｘ１群、ＮｅｗＰｍｉｘ２群およびＮｅｗＰｍｉｘ３群について、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合の、マウスにおける不動時間（恐怖誘発効果）を示すグラフである。
【図１１】嗅上皮を硫酸亜鉛で処理して除去し、主嗅覚系を完全に阻害した実施例１（１）のマウス（Ｐ−ｍｉｘまたはＴＭＴ）と前記処理をしていないマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）における、各種ピラジン化合物カクテルとＴＭＴの忌避誘発性を示す図である。
【図１２】同じマウスに対して各種ピラジン化合物カクテルを一日おきに１回当たり計５回呈示し、呈示後２５〜３５分間における体温の低下を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】各種ピラジン化合物カクテルの設置領域とＣｏｎｔｒｏｌである蒸留水の設置領域においてラットが過ごす様子を示した図である。
【図１４】各種ピラジン化合物カクテルの設置領域とＣｏｎｔｒｏｌである蒸留水の設置領域においてラットが過ごす時間を示すグラフ、およびその際の尾部における体温を測定した結果を示す図である。
【図１５】各種ピラジン化合物カクテルを曝露した場合および無刺激（何も施さない）の場合の、ラットの副嗅球の前部僧帽細胞、前部顆粒細胞、後部僧帽細胞および後部顆粒細胞におけるＦｏｓ陽性細胞の密度を示すグラフである。
【図１６】エゾシカ牧場にて各種ピラジン化合物カクテルを呈示する様子を示した図である。
【図１７】各種ピラジン化合物カクテルを呈示した場合と、呈示しない場合の、ビニールシートに近づいたエゾシカの頭数を時間の経過とともに示した図である。
【図１８】１ヶ月間隔を空けた２回の試験において、ピラジン化合物カクテル（Ｐ−ｍｉｘ）を呈示したビニールシートと何も呈示しないビニールシートに近づく頻度を雌雄別にカウントした結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係る哺乳動物忌避剤について詳細に説明する。
【００２２】
本発明に係る哺乳動物忌避剤は、下記式（Ｉ）で表されるピラジン化合物および／またはその塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤である。
【００２３】
下記式（Ｉ）：
【化３８】
2014133156.tif 000040
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、炭素原子数１〜８の炭化水素基、または炭素原子数１〜８のアルコキシ基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも一つは炭素原子数１〜８の炭化水素基である］
【００２４】
本発明に係る哺乳動物忌避剤は、好ましくは、下記式（Ｉ）で表されるピラジン化合物および／またはその塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤である。
【００２５】
下記式（Ｉ）：
【化３９】
2014133156.tif 000041
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子または炭素原子数１〜４の炭化水素基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも二つは炭素原子数１〜４の炭化水素基である］
【００２６】
本発明に係る哺乳動物忌避剤は、より好ましくは、下記（１）〜（４）で表されるピラジン化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物および／またはその（それらの）塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤である。
【００２７】
（１）下記式（ＩＩ）：
【化４０】
2014133156.tif 000042
［上記式（ＩＩ）中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物、
【００２８】
（２）下記式（ＩＩＩ）：
【化４１】
2014133156.tif 000043
［上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物、
【００２９】
（３）下記式（ＩＶ）：
【化４２】
2014133156.tif 000044
［上記式（ＩＶ）中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物、
【００３０】
（４）下記式（Ｖ）：
【化４３】
2014133156.tif 000045
［上記式（Ｖ）中、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物。
【００３１】
上記式（Ｉ）〜（Ｖ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３の炭化水素基は直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよく、置換基を有していてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４において、アルコキシ基は直鎖状および分岐鎖状のいずれであってもよい。
【００３２】
炭素原子数１〜８の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基で例示されるアルキル基；シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基で例示されるシクロアルキル基；ベンジル基、α，α−ジメチルベンジル基で例示されるアラルキル基；ビニル基、プロペニル基、ブテニル基で例示されるアルケニル基；フェニル基、２−トリル基、４−トリル基で例示されるアリール基などを挙げることができ、好ましくはアルキル基を挙げることができる。
【００３３】
炭素原子数１〜４の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、で例示されるアルキル基；シクロプロピル基で例示されるシクロアルキル基；ビニル基、プロペニル基、ブテニル基で例示されるアルケニル基などを挙げることができ、好ましくはアルキル基を挙げることができる。
【００３４】
炭素原子数１〜８のアルコキシ基としては、例えば、メチルオキシ、クロロメチルオキシ、トリフルオロメチルオキシ、シアノメチルオキシ、エチルオキシ、ジクロロエチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、第二ブチルオキシ、第三ブチルオキシ、イソブチルオキシ、アミルオキシ、イソアミルオキシ、第三アミルオキシ、ヘキシルオキシ、シクロヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、イソヘプチルオキシ、第三ヘプチルオキシ、ｎ−オクチルオキシ、イソオクチルオキシ、第三オクチルオキシまたは２−エチルヘキシルオキシなどを挙げることができる。
【００３５】
本発明において、ピラジン化合物は揮発性を有しているか、または揮発性溶媒などに溶解して揮発させることができるものである。従って、そのようなピラジン化合物の分子量は８００程度までのものが好ましい（食品機能性の科学編集委員会編集；食品機能性の科学）。また、揮発性を有するか、または揮発性溶媒などに溶解して揮発させることができるピラジン化合物は食品添加物として認定されているものも多く、その有用性は極めて高いと考えられる。そのようなピラジン化合物は、上記式（Ｉ）［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子または炭素原子数１〜４の炭化水素基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも一つは炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物を挙げることができ、特に、上記式（ＩＩ）〜（Ｖ）［上記式（ＩＩ）〜（Ｖ）中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立して炭素原子数１〜４の炭化水素基を示す］で表されるピラジン化合物を挙げることができる。
【００３６】
また、そのようなピラジン化合物として、下記式（ＶＩＩ）：
【化４４】
2014133156.tif 000046
で表される化合物と上記式（ＩＩ）〜（Ｖ）［上記式（ＩＩ）〜（Ｖ）中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれ独立して炭素原子数１〜４の炭化水素基を示す］で表されるいずれかのピラジン化合物との混合物、または上記式（ＶＩＩ）で表される化合物と下記式（ＶＩ）：
【化４５】
2014133156.tif 000047
で表される化合物との混合物を挙げることができる。
【００３７】
さらに、下記式（ＶＩＩ）〜（ＸＩＶ）で表されるいずれかのピラジン化合物を挙げることができる。なお、下記式（ＸＩ）で表される化合物および下記式（ＸＩＩ）で表される化合物は、オオカミ尿に含まれない物質であることが明らかとなっている。
【００３８】
【化４６】
2014133156.tif 000048
【００３９】
【化４７】
2014133156.tif 000049
【００４０】
【化４８】
2014133156.tif 000050
【００４１】
【化４９】
2014133156.tif 000051
【００４２】
【化５０】
2014133156.tif 000052
【００４３】
【化５１】
2014133156.tif 000053
【００４４】
【化５２】
2014133156.tif 000054
【００４５】
【化５３】
2014133156.tif 000055
【００４６】
なお、本明細書において、上記化合物（ＶＩＩ）のことを２，３−ジエチル−５−メチルピラジン（または２，３ＤＥ５ＭＰ）、上記化合物（ＶＩＩＩ）のことを２，６−ジメチルピラジン（または２，６ＤＭＰ）、上記化合物（ＩＸ）のことをトリメチルピラジン（またはＴＭＰ）、上記化合物（Ｘ）のことを３−エチル−２，５−ジメチルピラジン（または２，５ＤＭ３ＥＰ）、上記化合物（ＸＩ）のことを２，３−ジエチルピラジン（または２，３ＤＥＰ）、上記化合物（ＸＩＩ）のことを２，３−ジメチル−５−エチルピラジン（または２，３ＤＭ５ＥＰ）、上記化合物（ＸＩＩＩ）のことを２−エチル−３メチルピラジン（または２Ｅ３ＭＰ）、上記化合物（ＸＩＶ）のことを２−イソブチル−３−メチルピラジン（または２ｉＢ３ＭＰ）という場合があるが、上記化合物（ＶＩＩ）〜（ＸＩＶ）の名称は、それら名称に限定されない。
【００４７】
また、本発明において、ピラジン化合物は公知の方法により無機塩または有機塩としてもよい。本発明に適用可能な塩に限定はないが、無機塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができ、有機塩としては、酢酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。
【００４８】
前記ピラジン化合物及び／またはその塩は、種々の製品へ配合してその優れた忌避作用を、副嗅球を有する哺乳動物へ付与し、忌避剤とすることができる。本発明に係るピラジン化合物及び／またはその塩はその効果を発揮し得る範囲で配合することが可能であるが、通常、各製品中に０．００１〜３０質量％配合することが好ましく、０．０１〜２０質量％の配合がより好ましく、０．０１〜１０質量％の配合がさらに好ましい。
【００４９】
副嗅球とは、鋤鼻器官の神経が収束して集まる部位であり、嗅球の背側後部に存在している。前述の通り、悪臭や激臭、異臭といった臭気、すなわち匂い物質は嗅覚器、主嗅球、大脳辺縁系を経て、大脳皮質へ至る経路で受容されるが、フェロモンなどの物質は、鋤鼻器、副嗅球、扁桃体内側部を経て、視床下部へ至る経路で受容される。副嗅球に作用する本発明の哺乳動物忌避剤の場合、悪臭や激臭、異臭といった臭気を有して主嗅球に作用し、その臭気で忌避させる従来の野生動物や害獣の忌避剤とは異なり、本能に訴えるような効果が期待できる。また、従来の野生動物や害獣の忌避剤の場合、希釈しての使用あるいは少量での使用ではその忌避効果が損なわれ得るところ、副嗅球に作用する本発明の哺乳動物忌避剤の場合、少量でも忌避効果を奏することができる。
【００５０】
副嗅球を有する哺乳動物としては、例えば、ニホンザル、カニクイザルなどのマカク属に属するサル；クマ、シカ、イノシシ、タヌキ、キツネ；マウスやラットなどのネズミ、ウサギ、リスなどの齧歯類；など、従来、忌避剤の対象となっている野生動物や害獣の他、ウシやブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜を挙げることができる。家畜への使用としては、例えば、柵の周辺に散布して家畜を柵の外へ逃がさないなどの使用を挙げることができる。
【００５１】
本発明に係る哺乳動物忌避剤は、その使用目的や態様に応じて、適宜、液剤、噴霧剤、エアゾール剤、懸濁剤、乳化剤、固形剤、含浸固形製剤、錠剤、顆粒剤、粉剤などの形態に製剤化し、使用することができる。また、これらの製剤は、当業者が通常用いることができる添加剤などにより製剤化することができ、またそれは当業者が通常用いることができる方法により調製することができる。さらに、製剤の形態は、忌避対象、使用期間、使用場所の環境（温度、湿度、風量など）、所望の忌避効果などを考慮のうえ、適宜選択することができる。
【００５２】
また、本発明に係る副嗅球を有する哺乳動物に忌避させる方法は、所望のピラジン化合物を揮発させて哺乳動物の副嗅球に作用させる工程を有している。そのような工程としては、例えば、揮発性を有するピラジン化合物を、副嗅球を有する哺乳動物に対して直接噴霧する工程や、揮発性を有するピラジン化合物を含有する液剤や固形剤を忌避させたいエリアや建物などの周辺に散布しておき、それら液剤や固形剤から徐放させる態様で行う工程などを挙げることができる。
【００５３】
本発明における「所望のピラジン化合物」としては、上述した本発明に係る哺乳動物忌避剤におけるピラジン化合物を挙げることができる。
【００５４】
ピラジン化合物を含有する液剤を製造するための溶媒としては、本発明におけるピラジン化合物を揮発させて哺乳動物の副嗅球に作用させることができれば特に限定はされないが、例えば、水、ホルムアルデヒド、ｄ−リモネン、トルエン、アセトン、エタノール、２−プロパノール、ヘキサナール、トリアセチンなどを用いることができる。
【００５５】
また、本発明に係る所望のピラジン化合物および／またはその塩の使用は、副嗅球を有する哺乳動物の忌避剤としての使用である。本発明における「所望のピラジン化合物」としては、上述した本発明に係る哺乳動物忌避剤におけるピラジン化合物を挙げることができる。
【００５６】
以下、本発明に係る哺乳動物忌避剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞オオカミの尿に対するマウスの忌避誘発性の確認試験
採取時期の異なるオオカミの尿を用いてマウスの忌避誘発性試験を行った。【００５８】
（１）使用したマウス
事前に北海道医療大学の動物実験倫理委員会の許可を得た後、ＮＩＨの「実験動物の使用と管理に関するガイドライン」に従い、北海道医療大学にて維持繁殖させ、使用した。ポリカーボネートケージ中に２〜５ヵ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２〜３匹ずつ収容し、２２℃で１２時間ずつの明暗サイクルの条件下で飼育した。市販のマウス・ラット用餌（オリエンタル酵母社）と水道水とを自由摂取させた。【００５９】
（２）使用したオオカミの尿サンプル
環境温度が上昇するとオオカミの摂水量が増加し尿の濃度が低下する可能性があることから、夏季にサンプリングされた尿の購入を避け、２００９年１１月頃、２０１０年１月頃および２０１０年３月頃に雌雄オオカミの一群（ｎ＞１０）より採取された３種類の尿サンプル（Ｐｒｅｄａｔｏｒ Ｐｅｅ社）を購入し、無菌チューブ内において−２０℃で保存したものを原液のまま、あるいはＭｉｌｌｉ−Ｑ水で５倍または１５倍希釈して使用した。以下、２００９年１１月頃に雌雄オオカミの一群（ｎ＞１０）より採取された尿サンプルの原液を「オオカミの尿サンプルＡ」、「尿サンプルＡ」または単に「Ａ」と、尿サンプルＡを５倍希釈したものを「オオカミの尿サンプルＡ／５」、「尿サンプルＡ／５」または単に「Ａ／５」と、尿サンプルＡを１５倍希釈したものを「オオカミの尿サンプルＡ／１５」、「尿サンプルＡ／１５」または単に「Ａ／１５」といい、２０１０年１月頃および２０１０年３月頃に雌雄オオカミの一群（ｎ＞１０）より採取された２種類の尿サンプルＢおよびＣについても同様である。【００６０】
（３）忌避誘発性の確認試験
本実施例（１）のマウス２４匹を、本実施例（２）で準備した尿サンプルＡ、ＢおよびＣ群、ならびにコントロール群（蒸留水）の各群に６匹ずつ割り当てて試験を行った。試験は１日に１回ずつ、１２：００（午後）〜１７：００の時間帯で行った。尿サンプルＡ、ＢおよびＣ群についての試験から一週間後に、Ａ、ＢおよびＣ群に割り当てたマウスを使用して、尿サンプルＡ、ＢおよびＣの５倍希釈物であるＡ／５、Ｂ／５およびＣ／５について試験を行い、さらに一週間後に、同じマウスを使用して尿サンプルＡ、ＢおよびＣの１５倍希釈物であるＡ／１５、Ｂ／１５およびＣ／１５について試験を行った。試験内容は以下の通りである。【００６１】
長さ４５０ｍｍ×幅１００ｍｍの長腕１本と、長さが４００ｍｍ×幅１００ｍｍの短腕を左右に２本を有する、厚さ１ｃｍのアクリル樹脂製のＹ字型迷路を作製し、実験の開始の前日に３分間収容することでマウスを慣化させた。１５ｇの紙製の敷きわらにオオカミ尿１０ｍＬを混ぜ合わせたものを調製し、縦７ｃｍ×横７ｃｍのプラスチック・ディッシュに乗せて、左右の短腕のいずれか１本の先端にある匂いボックスに挿入し、同様に１５ｇの紙製の敷きわらに蒸留水１０ｍＬを混ぜ合わせたものを調製して、他方の短腕の先端にある匂いボックスに挿入した。このとき、２本の短腕はそれぞれの匂い箱に直接接続している状態にある。【００６２】
前記Ｙ字型迷路の左右の短腕内にマウスを３分間滞在させ、回避時間を測定した。なお、残存する臭気物質の影響を排除するために、Ｙ字型迷路の底部のベンチコートをそれぞれの試験ごとに交換した。また、すべての実験は、ブラインド・テストとして行った。【００６３】
オオカミの尿サンプルによるマウスにおける忌避作用は、以下のように正味の回避時間を算出して回避率を算出することにより評価した。すなわち、正味の回避時間は、蒸留水の匂いのする短腕側の滞在時間を、オオカミ尿の匂いのする短腕側の滞在時間と蒸留水の匂いのする短腕側の滞在時間を加えた時間で割ったものに１００をかけて表した。コントロール群においては、蒸留水の匂いのする一方の短腕側の滞在時間を蒸留水の匂いのする両方の短腕側の滞在時間の和で除し、１００をかけて表した。また、それぞれの尿サンプルあるいは蒸留水による回避率の違いに対する統計的有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによって評価し、データを平均値±標準誤差として示した。その結果を図１に示す。【００６４】
（４）試験結果
図１に示すように、コントロール群における回避率（±ＳＤ）が４８．９±４．９であったのに対し、尿サンプルＡの群では原液で６２．４±９．７（Ｐ＜０．０１）、Ａ／５で５５．３±９．８、Ａ／１５では５０．７±１６．３、尿サンプルＢの群では原液で６３．９±３．０（Ｐ＜０．０１）、Ｂ／５で５８．９±５．２、Ｂ／１５では４８．０±２５．２、尿サンプルＣの群では原液で６９．９±９．１（Ｐ＜０．００１）、Ｃ／５で６０．１±２．５、Ｃ／１５では６３．９±１０．７であり、オオカミの尿サンプル原液ではいずれもマウスに対する忌避作用は有意であることが示された（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔにより補足されたＯｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。尿サンプルＡ、ＢおよびＣに関するデータ全体としてはＲｅｐｅａｔｅｄ−ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡに従い、忌避作用において有意であった（Ｆ（３，２０）＝７．４７８，Ｐ＜０．０１）。また、尿サンプルＣ、Ｃ／５およびＣ／１５の群における回避率は、尿サンプルＡ、Ａ／５およびＡ／１５の群での回避率、尿サンプルＢ、Ｂ／５およびＢ／１５の群での回避率と比較して有意に高い値であった（いずれもＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．０５）。さらに、尿サンプルＡ、Ａ／５およびＡ／１５の群、ならびに尿サンプルＢ、Ｂ／５およびＢ／１５の群では、希釈するに従い回避率が低下する傾向を示したが、尿サンプルＣでは回避率がＣ／１５の群でも維持される傾向が見られた。【００６５】
以上の結果から、オオカミの尿を哺乳動物の忌避剤として使用する場合、従来の技術常識の通り、希釈せずに原液のまま使用することが最も忌避効果を奏するといえるが、一部の希釈物（尿サンプルＣ／５およびＣ／１５）については、従来の技術常識に反し、高い忌避効果を奏することが明らかとなった。【００６６】
＜実施例２＞オオカミの尿に対するマウスの恐怖誘発行動の測定試験
続いて、採取時期の異なるオオカミの尿を用いてマウスの恐怖誘発行動の測定試験を行った。【００６７】
（１）恐怖誘発行動の測定試験
Ｂ６マウスを、実施例１（２）で準備した尿サンプルＡ、Ｂ、Ｃおよびコントロール（蒸留水）の各群に１０〜１２匹ずつ、Ａ／５、Ｂ／５、Ｃ／５およびコントロール群（蒸留水）の各群に１０〜１２匹ずつ割り当てて、それぞれ試験を行った。【００６８】
縦２７ｃｍ×横１７ｃｍ×高さ１４ｃｍの、長方形のオープンボトム型ポリカーボネートチャンバーにマウスを収容し、不動時間を測定することにより行った。チャンバーの上部から排気口までポリエチレン・メッシュを装着した、直径１１ｃｍのアルミニウム排気ダクトを設置し、２日連続で５分間、マウスをチャンバー内に収容することにより汎化させた。１５ｇの紙製の敷きわらにオオカミ尿１０ｍＬを混ぜ合わせたものと１５ｇの紙製の敷きわらに蒸留水１０ｍＬを混ぜ合わせたものとを調製し、縦７ｃｍ×横７ｃｍのプラスチック・ディッシュに収納して、３日目にチャンバー内に挿入した。試験は前記チャンバーにマウスを３分間滞在させ、不動時間を測定し、平均値を算出することにより行った。マウスに学習させる際、データが混乱することを防止するため、マウスは１回のみ使用した。それぞれのサンプルによって引き出される不動時間の違いに対する統計的有意性は、分散分析（以下、「ＡＮＯＶＡ」という。）およびＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによって評価し、データを平均値±標準誤差として示した。その結果を図２に示す。【００６９】
（２）試験結果
図２の（ａ）に示すように、使用した尿サンプルはＯｖｅｒａｌｌ ＡＮＯＶＡにより、原液ではいずれも恐怖誘発行動を惹起させた（尿サンプルＡ、ＢおよびＣの群；Ｆ（３，４４）＝４．００６，Ｐ＜０．０５、尿サンプルＡ／５、Ｂ／５およびＣ／５の群；Ｆ（３，４１）＝３．４００，Ｐ＜０．０５）。また、コントロール群での不動時間が４．９秒であったのに対し、尿サンプルＡ、ＢおよびＣの群ではいずれも、不動時間が１５．３秒（Ｐ＜０．０５）、２１．７秒（Ｐ＜０．０１）および２０．４秒（Ｐ＜０．０１）と、コントロール群と比較して有意に長時間であった。一方、図２の（ｂ）に示すように、コントロール群での不動時間が３．７秒であったのに対し、尿サンプルＡ／５およびＢ／５の群では不動時間がそれぞれ４．９秒、５．３秒と、コントロール群と比較して有意な差はなかったが、尿サンプルＣ／５の群での不動時間は１２．０秒（Ｐ＜０．０１）と、コントロール群の場合と比較して有意に長時間であった（いずれもＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによる）。【００７０】
以上の結果から、オオカミの尿を哺乳動物の忌避剤として使用する場合、実施例１の結果と同様に、従来の技術常識の通り、希釈せずに原液のまま使用することが最も恐怖誘発効果を奏するといえるが、一部の希釈物（尿サンプルＣ／５）については、従来の技術常識に反し、高い恐怖誘発効果を奏することが明らかとなった。【００７１】
＜実施例３＞オオカミの尿に曝露された副嗅球におけるＦｏｓ免疫活性の確認試験
オオカミの尿に含まれる匂い物質に対する嗅覚応答経路を明らかにするために、神経興奮の指標となるＦｏｓタンパク質の発現を主嗅球と副嗅球において免疫組織化学的に解析した。【００７２】
（１）試験用スライスの調製
スプレーを用いて雌マウスの尿５ｍＬを紙製床敷き（日本エスエルシー社）に噴霧し、実施例１（１）と同様の手法で維持繁殖させた６ヶ月齢以上の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対してその匂いを曝露した。９０分後にそのマウスを３５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで７５分間、深く麻酔し、心臓から還流したリン酸緩衝液で血液を除去した後、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液を還流して脳を固定した。主嗅球と副嗅球が付随した形で脳を採取し、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液で一晩処理することによりさらに固定した後、バイブラトームを用いて１００μｍのスライスを作成した。また、オオカミの尿サンプルＣ、Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５についても同様にして、６ヶ月齢以上の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対してその匂いを曝露し、同様の手法によりスライスを作成した。【００７３】
作成したスライスそれぞれを０．３％過酸化水素水で１５分間処理し、０．４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝液で２回洗浄した後、３％ヤギ血清を含むリン酸緩衝液で１時間処理した。これを８０００倍希釈した抗Ｆｏｓ抗体（Ａｂ−５；メルクミリポア社）で１晩処理した後、０．４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝液でそれぞれのスライスを２回洗浄し、２００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧで１時間処理した。さらに、０．４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝液でそれぞれのスライスを２回洗浄した後、ＡＢＣ液（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で１時間処理し、ＤＡＢ／過酸化水素（０．０５％ＤＡＢ／０．００３％過酸化水素／０．０５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で１２分間処理して試験用スライスをそれぞれ調製した。調製したスライスは蒸留水で洗浄し乾燥させた後、顕微鏡にマウントした。【００７４】
（２）免疫組織の解析
雌マウスの尿およびオオカミの尿サンプルＣ／５を用いた場合の脳スライスにおける嗅球全体を観察したところ、副嗅球では顕著に発現していたため、それぞれ副嗅球で発現したＦｏｓ陽性細胞のみ、顕微鏡を用いてブラインド条件下でカウントした。マウスの尿を雌マウスに曝露した場合およびオオカミの尿サンプルＣ／５を雌マウスに曝露した場合の、副嗅球におけるＦｏｓ陽性細胞の発現の結果を図３に示す。また、オオカミの尿サンプルＣ、Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５を曝露した場合について、同様に顕微鏡を用いて、副嗅球で発現したＦｏｓ陽性細胞をブラインド条件下でカウントした後、僧帽細胞層（ａ ｍｉｔｒａｌ ｃｅｌｌ；以下、「ＭＴＣ」という。）および顆粒細胞層（ａ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌ；以下、「ＧＣ」という。）の写真を撮影した後、Ｓｉｇｍａ Ｓｃａｎ（登録商標）Ｐｒｏソフト（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて前部僧帽細胞層（ａｎｔｅｒｉｏｒ ＭＴＣ；以下、「ＡＭＴ」という）、前部顆粒細胞層（ａｎｔｅｒｉｏｒ ＧＣ；以下、「ＡＧＣ」という。）、後部僧帽細胞層（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ＭＴＣ；以下、「ＰＭＴ」という。）および後部顆粒細胞層（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ＧＣ；以下、「ＰＧＣ」という。）の面積を算出するとともに、大きな面積を有する３枚のスライスを用いて、副嗅球における連続矢状断面のＦｏｓ陽性細胞密度を算出した。Ｆｏｓ陽性細胞密度の違いは、ＡＮＯＶＡおよびＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔにより評価し、データは平均値±標準誤差で表した。その結果を図４に示す。【００７５】
（３）試験結果
図３の（ａ）に示すように、雌のマウスの尿を雌の性フェロモン感知器官である副嗅球に曝露することにより、Ｆｏｓ陽性細胞の発現が顕著に観察された。これに対し、図３の（ｂ）に示すように、オオカミの尿サンプルＣ／５を副嗅球に曝露することにより、雌マウスの尿を雌の副嗅球に曝露した場合と同様ないしそれ以上にＦｏｓ陽性細胞の発現が観察され、特に、ＧＣにおいて顕著な発現が観察された。【００７６】
また、図４に示すように、それぞれの群のデータについて、独立因子としての尿サンプルと副嗅球の部位（ＡＭＴ、ＡＧＣ、ＰＭＴ、ＰＧＣ）に基づき、Ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ（Ｔｗｏ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡにより評価しており、副嗅球全体におけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、それぞれのオオカミの尿サンプルを曝露した場合において有意であった（Ｆ（３，３２）＝４．８７７，Ｐ＜０．０１）。一方、オオカミの尿サンプルＣ、Ａ／５、Ｂ／５およびＣ／５を曝露した場合のＡＭＴおよびＰＭＴにおけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、いずれの場合も低値を示したが、ＡＧＣおよびＰＧＣにおけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、オオカミの尿サンプルＡ／５およびＢ／５を曝露した場合では比較的低値を示したものの、オオカミの尿サンプルＣ、およびＣ／５を曝露した場合では高値を示し、有意な差を示した（いずれもＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔにより、Ａ／５およびＢ／５を曝露した場合に対しＣ／５を曝露した場合；それぞれＰ＜０．０５，Ｐ＜０．００５、Ｂ／５を曝露した場合に対しＣを曝露した場合；Ｐ＜０．０１）。【００７７】
以上の結果から、オオカミの尿を哺乳動物に曝露した場合、一部の尿（尿サンプルＣ）について、フェロモン感知器官である副嗅球に作用する物質が含まれていることが明らかとなり、特に、その物質は主にＡＧＣおよびＰＧＣに作用することが明らかとなった。【００７８】
＜実施例４＞ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）による化学分析
オオカミの尿サンプルＡ、ＢおよびＣの揮発性成分を四重極ガスクロマトグラフ質量分析計（以下、ガスクロマトグラフ質量分析（計）を「ＧＣ−ＭＳ」という。）により分析した。【００７９】
（１）ヘッドスペース固相マイクロ抽出法（ＨＳ−ＳＰＭＥ）によるＧＣ−ＭＳ分析用サンプルの調製
ヘッドスペース固相マイクロ抽出法（ＨＳ−ＳＰＭＥ）を用いてサンプルを調製し、ＧＣ−ＭＳ分析の準備を行った。各々の尿サンプルの揮発性物質を固相微量抽出（ＳＰＭＥ）線維である５０／３０μｍジビニルベンゼン（ＤＶＢ）／ｃａｒｂｏｘｅｎ／ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ＳｔａｂｌｅＦｌｅｘ繊維（Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に吸着させた。一方、ポリテトラフルオロエチレン製のキャップを持つ４ｍＬの遮光バイアル瓶（Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にオオカミの尿１５０μＬを入れ、そのヘッドスペースへ３０分間挿入した。この時、尿サンプルはＮａＣｌで飽和させて撹拌し、３７−４０℃に加熱した。【００８０】
（２）ＧＣ−ＭＳによる化学分析
臭気物質の識別は、四重極ＧＣ−ＭＳ ＰＡＲＶＵＭ ２システム（島津製作所社）を用いて行った。３０ｍ×０．３２μｍ×０．５μｍのＲｅｓｔｅｋ Ｓｔａｂｉｌｗａｘ（登録商標）カラム（Ｒｅｓｔｅｋ社）をガスクロマトグラフとして装着し、ヘリウムをキャリアガスとして用い、カラム流量を２．４ｍＬ／分とした。オーブン温度を５分間４０℃に維持した後、１０℃／秒の速度で２００℃まで上昇させた後、５℃／秒の速度で２４０℃まで上昇させた。また、注入部温度は２３０℃とした。その結果を図５に示す。【００８１】
（３）試験結果
図５に示すように、ＡおよびＢのピークと比較して、実施例３において副嗅球に作用した尿サンプルＣでは、尿サンプルＡおよびＢではほとんど表れていないピーク１４、１６、１７が特徴的に表れていることが示された。【００８２】
そこで、尿サンプルＡ、ＢおよびＣのそれぞれに存在する３４の代表的な合成物のピーク面積の占める割合を百分率法で示し、比較するとともに、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａｌ ０８ライブラリ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＩＳＴ））を用いて各物質の構造解析を行った。また、オオカミの尿サンプルＡおよびＢと、尿サンプルＣについて、化学成分に関する違いの統計的有意性はＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔおよびＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔによって評価した。その結果を下記の表１に示す。【００８３】
［表１］
2014133156.tif 000056
【００８４】
なお、表１のデータに基づくピークの高さは、６回の質量分析の平均値であり、表中の＊印が付された化学物質は、オオカミの尿中の同定された化学物質に対して四重極ＧＣ−ＭＳと溶出時間の比較を行い、正確に同定された化学物質を示す。また、無印の化学物質は四重極ＧＣ−ＭＳにより暫定的に同定された化学物質を示し、十字の印および＃の印は、尿サンプルＡまたはＢとの比較で尿サンプルＣにおいて、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔおよびＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔによる評価で、それぞれ顕著に高いピーク、顕著に低いピークであったことを示している。【００８５】
表１に示すように、特に尿サンプルＡおよびＢでは複数かつ多量の含硫化合物が同定されており、それらが悪臭や激臭、刺激臭の原因となることから、従来、オオカミの尿が「主嗅球に作用する」忌避剤として使用されていることが示された。一方、実施例３において副嗅球に作用した尿サンプルＣにおいて同定され、尿サンプルＡおよびＢではほとんど同定されていないＩＤ Ｎｏ．１４、１６、１７は、いずれもピラジン化合物であること、および大型動物や天敵となる動物の糞尿からはこれまで同定されたという報告が見当たらないことが明らかとなった。さらに、それらＩＤ Ｎｏ．１４、１６、１７のピラジン化合物については、標準物質（高砂香料工業社）を用いて溶出時間および四重極ＧＣ−ＭＳの比較を行った結果、それぞれ、２，６−ジメチルピラジン（以下、「２，６ＤＭＰ」という。）、トリメチルピラジン（以下、「ＴＭＰ」という。）および３−エチル−２，５−ジメチルピラジン（以下、「２，５ＤＭ３ＥＰ」という。）と正確に構造決定されている。【００８６】
＜実施例５＞ピラジン化合物に対するマウスの恐怖誘発行動の測定試験
実施例４（３）で同定された、哺乳動物の副嗅球に作用するピラジン化合物を用いてマウスの恐怖誘発行動の測定試験を行った。【００８７】
（１）恐怖誘発行動の測定試験
実施例４（３）で同定した三種類のピラジン化合物である２，６ＤＭＰ、ＴＭＰ、２，５ＤＭ３ＥＰおよびそれら三種類のピラジン化合物を混合して得られるピラジン化合物カクテル、ならびにキツネ糞便中に含まれている恐怖誘発性物質として知られているトリメチルチアゾリン（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ；以下、「ＴＭＴ」という。）およびコントロール（蒸留水）の各群に、実施例１（１）のマウス１３２匹を２２匹ずつ割り当てて、それぞれ試験を行った。【００８８】
試験は、それぞれ１％（ｖ／ｖ）の合成された２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰ、ならびにそれぞれ０．３３％（ｖ／ｖ）の合成された２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰを混合して得られるピラジン化合物カクテル（トータルで１％（ｖ／ｖ））、１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴおよび１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴを、それぞれ２ｃｍ×２ｃｍの大きさの濾紙に５０μＬずつ滴下し、これらをペトリ皿に入れ、チャンバー内に挿入したこと、およびチャンバーにマウスを５分間または１０分間滞在させて不動時間を測定したことの他は、実施例２（１）と同様の手法により行った。その結果を図６に示す。【００８９】
（２）試験結果
図６に示すように、それぞれ１％（ｖ／ｖ）の合成２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰ、ならびにそれぞれ０．３３％（ｖ／ｖ）の合成２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰを混合して得られるピラジン化合物カクテル（トータルで１％（ｖ／ｖ））、１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴおよび１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴの各群全体としてはＯｖｅｒａｌｌ ＡＮＯＶＡに従い、恐怖誘発行動を有意に発現した（５分間測定の場合；Ｆ（６，３８）＝３．６８８，Ｐ＜０．０１、１０分間測定の場合；Ｆ（６，３８）＝６．０９６，Ｐ＜０．００１）。また、５分間測定の場合、コントロール群での不動時間が約１２秒であったのに対し、合成２，６ＤＭＰ群および合成ＴＭＰ群ではいずれも不動時間が約３０秒であり、有意に長時間であった（いずれもＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．０５）。合成２，５ＤＭ３ＥＰ群の不動時間についてはコントロール群と比較して有意な差はなかったものの、合成２，６ＤＭＰ群および合成ＴＭＰ群と同様に約３０秒であった。さらに合成２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰを混合して得られるピラジン化合物カクテルの群では不動時間が約５０秒であり、コントロール群と比較して有意に長時間であった（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．００１）。一方、１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴ群では不動時間が約１５秒であり、コントロール群と比較して有意な差はなかった。また、１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴでは不動時間が約３５秒であり、コントロール群と比較して有意に長時間であった（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．０５）。【００９０】
１０分間測定の場合、コントロール群での不動時間が約３０秒であったのに対し、合成２，６ＤＭＰ群および合成ＴＭＰ群ではいずれも不動時間が６０秒前後であり、５分間測定の場合と同様、有意に長時間であった（いずれもＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．０５）。合成２，５ＤＭ３ＥＰ群の不動時間については、５分間測定の場合と同様、コントロール群と比較して有意な差はなかったものの、約５４秒と長時間であった。さらに２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰを混合して得られるピラジン化合物カクテルの群では不動時間が約１０５秒と極めて長く、コントロール群と比較して非常に有意に長時間であった（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．００１）。一方、１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴ群では不動時間が約４５秒であり、コントロール群と比較して有意な差はなかった。また、１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴでは不動時間が約８０秒であり、コントロール群と比較して有意に長時間であった（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによりＰ＜０．０１）。【００９１】
以上の結果から、それぞれ１％（ｖ／ｖ）の２，６ＤＭＰ、ＴＭＰ、２，５ＤＭ３ＥＰおよびそれぞれ０．３３％（ｖ／ｖ）の２，６ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰを混合して得られるピラジン化合物カクテル（トータルで１％（ｖ／ｖ））は、従来、臭気物質、すなわち主嗅球を刺激する物質として知られ、野生動物や害獣の忌避剤として使用されているＴＭＴの同濃度のもの（１％（ｖ／ｖ）ＴＭＴ）と比較して、高い恐怖誘発効果を奏すること、および臭気が極めて強い１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴと比較しても、５分間測定の場合だとほとんど変わらないほど、高い恐怖誘発効果を奏することが明らかとなった。特に、前記ピラジン化合物カクテルは、同量のＴＭＴと比較して極めて高い恐怖誘発効果を奏することが明らかとなり、その効果は、臭気が極めて強い１０％（ｖ／ｖ）ＴＭＴの効果をしのぐことが明らかとなった。【００９２】
＜実施例６＞ピラジン化合物カクテルに曝露された副嗅球におけるＦｏｓ免疫活性の確認試験
（１）Ｆｏｓ免疫活性の確認試験
蒸留水をコントロール群として、実施例５（１）のピラジン化合物カクテルの副嗅球におけるＦｏｓタンパク質の発現を、スプレーを用いて実施例５（１）のピラジン化合物カクテル５ｍＬを紙製床敷き（日本エスエルシー社）に噴霧し、実施例１（１）と同様の手法で維持繁殖させた６ヶ月齢以上の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対してその匂いを曝露したことの他は、実施例３と同様の手法により、免疫組織化学的に解析した。その結果を図７に示す。【００９３】
（２）試験結果
図７に示すように、それぞれの群のデータについて、独立因子としてのサンプル（実施例５（１）のピラジン化合物カクテル）と副嗅球の部位（ＡＭＴ、ＡＧＣ、ＰＭＴ、ＰＧＣ）に基づき、Ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ（Ｔｗｏ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡにより評価しており、副嗅球全体におけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、実施例５（１）のピラジン化合物カクテルを曝露した場合、コントロール群と比較して有意な差を示した（Ｆ（２，６８）＝２５．３０２，Ｐ＜０．００１）。また、副嗅球全体としてみた場合、実施例５（１）のピラジン化合物カクテル群におけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、コントロール群と比較して極めて有意な差を示した（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔにより、Ｐ＜０．００１）。【００９４】
以上の結果から、実施例５（１）のピラジン化合物カクテルを哺乳動物に曝露した場合、フェロモン感知器官である副嗅球に対して、極めて効果的に作用することが明らかとなった。【００９５】
＜実施例７＞新たなピラジン化合物によるマウスの恐怖誘発行動の測定試験
（１）市販のピラジン化合物を用いたマウスの恐怖誘発行動の測定試験
市販の合成された２，３−ジエチルピラジン（２，３ＤＥＰ）、２，３−ジメチル−５−エチルピラジン（２，３ＤＭ５ＥＰ）、２−エチル−３メチルピラジン（２Ｅ３ＭＰ）、２−イソブチル−３−メチルピラジン（２ｉＢ３ＭＰ）を入手して候補ピラジン化合物とし、実施例５において極めて高い恐怖誘発効果が既に確認されているＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰと比較する形でマウスの恐怖誘発行動の測定試験を行った。【００９６】
試験は、合成ＴＭＰ、合成２，５ＤＭ３ＥＰ、合成２，３ＤＥＰ、合成２，３ＤＭ５ＥＰ、合成２Ｅ３ＭＰおよび合成２ｉＢ３ＭＰを、それぞれ薄めないまま２ｃｍ×２ｃｍの大きさの濾紙に１μｍずつ滴下し、これらをシャーレに入れ、チャンバー内に挿入したこと、使用したマウスを、北海道医療大学の動物実験倫理委員会の許可を事前に得た後にＮＩＨの「実験動物の使用と管理に関するガイドライン」に従って北海道医療大学にて維持繁殖させた２〜４ヵ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとしたこと、およびそれぞれのサンプルによって引き出される不動時間の違いに対する統計的有意性をｔ検定によって評価したことの他は、実施例５（１）と同様の手法により行った。その結果を図８に示す。【００９７】
図８に示すように、合成ＴＭＰ群、合成２，５ＤＭ３ＥＰ群、合成２，３ＤＥＰ群、合成２，３ＤＭ５ＥＰ群、合成２Ｅ３ＭＰ群および合成２ｉＢ３ＭＰ群について、コントロール群（蒸留水）と比較して、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合のいずれも有意に長時間であり、マウスを５分間曝露した場合は、合成２，３ＤＥＰ群、合成２，５ＤＭ３ＥＰ群、合成ＴＭＰ群、合成２，３ＤＭ５ＥＰ群、合成２Ｅ３ＭＰ群、合成２ｉＢ３ＭＰ群の順に長時間であり、マウスを１０分間曝露した場合は、合成２，３ＤＥＰ群、合成２，５ＤＭ３ＥＰ群、合成２，３ＤＭ５ＥＰ群、合成ＴＭＰ群、合成２Ｅ３ＭＰ群、合成２ｉＢ３ＭＰ群の順に長時間であった（図８中、＊印はＰ＜０．０５、＊＊印はＰ＜０．０１を示す）。【００９８】
以上の結果から、合成２，３ＤＥＰ、合成２，３ＤＭ５ＥＰ、合成２Ｅ３ＭＰおよび合成２ｉＢ３ＭＰのいずれも、合成ＴＭＰと比較して、高い恐怖誘発効果を有するか、あるいはこれらに劣らない恐怖誘発効果を有することが明らかとなった。また、合成２，３ＤＥＰおよび合成２，３ＤＭ５ＥＰは、オオカミ尿に含まれない物質であり、従来の哺乳動物忌避剤とはまったく異にする哺乳動物忌避剤の提供が可能となることが明らかとなった。【００９９】
（２）ＧＣ−ＭＳ分析によりスクリーニングしたピラジン化合物を用いたマウスの恐怖誘発行動の測定試験
実施例４と同様の手法で新たにＧＣ−ＭＳ分析用サンプルを調製し、リテンションタイムを延長してＧＣ−ＭＳ分析をしたところ、図９に示すように、実施例４で分析したオオカミ尿のサンプルＡ、ＢおよびＣでは構造決定に至らなかったピークを新たに確認することができ、２，３−ジエチル−５−メチルピラジン（２，３ＤＥ５ＭＰ）と同定した。この同定した２，３ＤＥ５ＭＰの他、実施例４で同定した２，６−ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰ、ならびに本実施例７（１）の試験に用いた合成２，３ＤＥＰ、合成２，３ＤＭ５ＥＰ、合成２Ｅ３ＭＰおよび合成２ｉＢ３ＭＰを用いて、実施例４（１）と同様の手法により下記（Ａ）〜（Ｄ）のピラジン化合物カクテルを調製し、本実施例７（１）と同様の手法でマウスの恐怖誘発行動の測定試験を行った。その結果を図１０に示す。【０１００】
（Ａ）ＯＰｍｉｘ（実施例４（１）で調製したピラジン化合物カクテル）
２，６−ＤＭＰ、ＴＭＰおよび２，５ＤＭ３ＥＰのピラジン化合物カクテル
（Ｂ）ＮｅｗＰｍｉｘ１
２，５ＤＭ３ＥＰ、２，３ＤＭ５ＥＰおよび２，３ＤＥＰのピラジン化合物カクテル
（Ｃ）ＮｅｗＰｍｉｘ２
ＴＭＰ、２Ｅ３ＭＰおよび２ｉＢ３ＭＰのピラジン化合物カクテル
（Ｄ）ＮｅｗＰｍｉｘ３
２，３ＤＥ５ＭＰ、２，６−ＤＭＰおよびＴＭＰのピラジン化合物カクテル【０１０１】
図１０に示すように、ＯＰｍｉｘ群、ＮｅｗＰｍｉｘ１群、ＮｅｗＰｍｉｘ２群およびＮｅｗＰｍｉｘ３群について、コントロール群（蒸留水）と比較して、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合のいずれも有意に長時間であり、マウスを５分間曝した場合と１０分間曝した場合のいずれも、ＮｅｗＰｍｉｘ３群、ＮｅｗＰｍｉｘ２群、ＯＰｍｉｘ群、ＮｅｗＰｍｉｘ１群の順に長時間であった（図１０中、＊印はＰ＜０．０５、＊＊印はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す）。【０１０２】
以上の結果から、ＮｅｗＰｍｉｘ１群、ＮｅｗＰｍｉｘ２群およびＮｅｗＰｍｉｘ３群のいずれも、ＯＰｍｉｘ群と比較して、高い恐怖誘発効果を有するか、あるいはこれらに劣らない恐怖誘発効果を有することが明らかとなった。また、ＯＰｍｉｘを構成する２，５ＤＭ３ＥＰを２，５ＤＭ３ＥＰ置換することで、極めて高い恐怖誘発効果を奏したことから、２，５ＤＭ３ＥＰは他のピラジン化合物と混合することで、より効果の高い哺乳動物忌避剤の提供が可能となることが明らかとなった。【０１０３】
＜実施例８＞ピラジン化合物の受容器官や忌避誘発性効果の持続についての確認試験
（１）ピラジン化合物の受容器官についての確認試験
マウスを用いて上記各種ピラジン化合物の受容器官についての確認試験を行った。嗅上皮を硫酸亜鉛で処理して除去し、主嗅覚系を完全に阻害した実施例１（１）のマウス（Ｐ−ｍｉｘまたはＴＭＴ）と前記処理をしていないマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）について、実施例１（３）と同様の手法により忌避誘発性の確認試験を行った。ただし、試験には３０％（ｖ／ｖ）の各種ピラジン化合物カクテル１０μＬを用い、対象として ３０％（ｖ／ｖ）のＴＭＴ１０μＬを用い、忌避の誘起が認められたマウスの割合を忌避率（Ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｒａｔｉｏ）で表した。その結果を図１１に示す。【０１０４】
図１１に示すように、嗅上皮を硫酸亜鉛で処理して主嗅覚系が完全に阻害されたマウスは、ＴＭＴに対する忌避か消失するのに対し、ピラジン化合物カクテルに対する忌避は有意に消失しなかった（図１１中、＊印はＰ＜０．０５を示す）。【０１０５】
以上の結果から、ピラジン化合物カクテルは、主嗅覚系以外の嗅覚系、すなわち副嗅球系（鋤鼻系）で受容されることが明らかとなった。【０１０６】
（２）ピラジン化合物の忌避誘発効果持続性の確認試験
マウスを用いて上記各種ピラジン化合物（Ｐｍｉｘ）の忌避誘発効果持続性についての確認試験を行った。試験は、ストレス反応の一種である体温の低下を指標とすることとした。実施例１（１）のマウスを用いて、２００μＬの各種ピラジン化合物カクテルを同じマウスに対して一日おきに計５回呈示し、呈示後２５〜３５分間における体温の低下について赤外線カメラを用いて測定した。また、一日おきに各種ピラジン化合物カクテルを呈示する前のマウスの平均体温、一日おきに各種ピラジン化合物カクテルを呈示して体温の測定を終えた後のマウスの平均体温、一日おきに蒸留水を呈示した後のマウスの平均体温も測定した。その結果を図１２に示す。【０１０７】
図１２中、「Ａｌｌ Ｂｅｆｏｒｅ」は一日おきに各種ピラジン化合物カクテルを呈示する前のマウスの平均体温、「Ａｌｌ Ａｆｔｅｒ ＤＷ」は一日おきに蒸留水を呈示した後のマウスの平均体温をそれぞれ示し、「１ｓｔ」、「２ｎｄ」、「３ｒｄ」、「４ｔｈ」、「５ｔｈ」はそれぞれ各種ピラジン化合物カクテルの呈示後２５〜３５分間におけるマウスの平均体温を示す。図１２に示すように、各種ピラジン化合物カクテルの呈示後２５〜３５分間において、マウスの体温の低下が観察され、その後体温の回復、各種ピラジン化合物カクテルの呈示後における体温の低下を繰り返した。【０１０８】
以上の結果から、ピラジン化合物の忌避誘発効果は、慣れを生じさせず持続性を有することが明らかとなった。【０１０９】
＜実施例９＞ラットにおけるピラジン化合物の忌避誘発性や効果の持続性についての確認試験
ラットにおけるピラジン化合物の忌避誘発性や効果の持続性についての確認試験を行った。試験に用いたラットは、事前に旭川医科大学の動物実験倫理委員会の許可を得た１２週齢の雌ラットであった。実施例５（１）で用いたチャンバーの４隅のうちの２隅に穴あきシャーレを設置し、その穴あきシャーレに上記各種ピラジン化合物カクテル（Ｐ−ｍｉｘ）を１００μＬ滴下した２ｃｍ×２ｃｍの濾紙を収容して、穴あきシャーレ設置領域にてラットが過ごす時間と、その際の尾部における体温を測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌを無刺激（何も施さない）として同様の試験を行った。ラットの様子を図１３に示し、試験の結果を図１４に示す。【０１１０】
図１３に示すように、ラットは各種ピラジン化合物カクテルを忌避していることが目視によっても認められ、また、図１４に示すように、各種ピラジン化合物カクテルの設置領域においてラットが過ごす時間は、ピラジン化合物カクテルを設置しない無刺激の領域においてラットが過ごす時間と比較して極端に短いことが分かった。さらに、図１４に示すように、各種ピラジン化合物カクテルの設置領域におけるラットの体温は、ピラジン化合物カクテルを設置しない無刺激の領域におけるラットの体温と比較して低温であった。【０１１１】
以上の結果から、ピラジン化合物の忌避誘発効果は、副嗅球系（鋤鼻系）を有するラットにおいても確認できることが明らかとなった。【０１１２】
＜実施例１０＞ピラジン化合物に曝露されたラットの副嗅球におけるＦｏｓ免疫活性の確認試験
ラットのピラジン化合物に対する嗅覚応答経路を明らかにするために、事前に旭川医科大学の動物実験倫理委員会の許可を得た１２週齢の雌ラットを用いたこと、各種ピラジン化合物カクテル（Ｐ−ｍｉｘ）を用いたこと、Ｃｏｎｔｒｏｌを無刺激（何も施さない）としたことの他は、実施例３と同様の手法により試験用スライスの調製と免疫組織の解析を行い、神経興奮の指標となるＦｏｓタンパク質の発現をラットの副嗅球において免疫組織化学的に解析した。その結果を図１５に示す。【０１１３】
図１５に示すように、各種ピラジン化合物カクテルを曝露した場合のラットＡＭＴ、ＡＧＣ、ＰＭＴ、ＰＧＣにおけるＦｏｓ陽性細胞の密度は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較していずれも高値を示し、有意な差を示した。【０１１４】
以上の結果から、ピラジン化合物はラットの副嗅球に作用し、忌避誘発効果を奏することが明らかとなった。【０１１５】
＜実施例１１＞エゾシカにおけるピラジン化合物の忌避誘発性や効果の持続性についての確認試験
２０１３年８月と９月に西興部村のエゾシカ牧場にて、エゾシカのピラジン化合物に対する忌避誘発性やその効果の持続性についての確認試験を行った。その様子を図１６に示す。図１６に示すように、４枚のビニールシートを設置し、それらの中央に乾燥トウモロコシをのせた。また、上記各種ピラジン化合物カクテル（Ｐｙｒａｚｉｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅ：Ｐ−ｍｉｘ）の呈示は、図１６に示すように、穴を開けた金属製水道管に２ｍＬの各種ピラジン化合物カクテルをしみこませた脱脂綿を収容し、これを両端のビニールシートの四隅に設置することにより行った。さらに、中央の２つのビニールシートの四隅には何も入れていない水道管を設置し、これをＣｏｎｔｒｏｌとした。そして、ビニールシートに近づいた（ビニールシート上に首を突っ込んできた）エゾシカの頭数を時間の経過とともにカウントした。その結果を図１７に示す。【０１１６】
図１７に示すように、カウント開始から５分前後経過するまでは、ピラジン化合物カクテル（Ｐｙｒａｚｉｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）を呈示したビニールシートと何も呈示しないビニールシートとでは、ピラジン化合物カクテルを呈示したビニールシートの方が、近づいたエゾシカの頭数は少なかった。なお、カウント開始から５分前後経過した後にＣｏｎｔｒｏｌの数値が減少するのは、餌によりエゾシカの空腹が満たされ、餌に強い興味を示さなくなったためである。【０１１７】
また、エゾシカはピラジン化合物カクテルを呈示したビニールシートに近づいても餌を食べずに逃げた様子や、ピラジン化合物カクテルを嗅ぐと飛び跳ねる様子が見られ、これらの行動はメスに特徴的に見られた。さらに、ピラジン化合物カクテルを呈示したビニールシートに近づいたエゾシカは、雌雄関係なく、一種の恐怖行動である尾を立てる確率が高くなった。【０１１８】
さらに、２０１３年８月と９月の２回の試験において、ピラジン化合物カクテル（Ｐ−ｍｉｘ）を呈示したビニールシートと何も呈示しないビニールシートに近づく頻度を雌雄別にカウントし、統計的有意性をＡＮＯＶＡによって評価した。その結果を図１８に示す。【０１１９】
図１８に示すように、雌雄のいずれもピラジン化合物カクテルの存在により、ビニールシートへ近寄る回数が減り、その傾向は試験実施の１ヶ月後に再度行った場合も同様であった（図１８中、＊＊印はＰ＜０．０５を示す）。なお、カウント開始から５分前後経過した後にＣｏｎｔｒｏｌの数値が減少するのは上述の理由と同様である。【０１２０】
以上の結果から、ピラジン化合物の忌避誘発効果は、副嗅球系（鋤鼻系）を有するエゾシカにおいても確認でき、その効果は慣れを生じさせず持続性を有することが明らかとなった。【０１２１】
＜実施例１２＞哺乳動物忌避剤としての使用
（１）獣道での使用
２，６ＤＭＰ、ＴＭＰ、２，５ＤＭ３ＥＰおよびそれら三種類のピラジン化合物を混合して得られるピラジン化合物カクテルをそれぞれ紙製床敷き（日本エスエルシー社）に噴霧したものを用意し、クマやシカが頻繁に出没する獣道に敷設して、１ヶ月間、クマやシカを含む野生動物の足跡や糞の有無を確認する。また、２，６ＤＭＰ、ＴＭＰ、２，５ＤＭ３ＥＰおよびそれら三種類のピラジン化合物を用意し、クマやシカが頻繁に出没する獣道に散布して、同様に１ヶ月間、クマやシカを含む野生動物の足跡や糞の有無を確認する。その結果、野生動物の足跡や糞の痕跡は相当期間確認されず、持続的な効果を確認することができる。【０１２２】
（２）動物園や牧場などでの効果の確認
２，６ＤＭＰ、ＴＭＰ、２，５ＤＭ３ＥＰおよびそれら三種類のピラジン化合物を混合して得られるピラジン化合物カクテルをそれぞれ紙製床敷き（日本エスエルシー社）に噴霧したものを用意し、動物園や牧場などにおいて敷設する。その結果、飼育動物は紙製床敷きに近寄ることなく、かつ持続的な効果を確認することができる。
【図１】
2014133156.tif 000083
【図２】
2014133156.tif 000084
【図３】
2014133156.tif 000085
【図４】
2014133156.tif 000086
【図５】
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【図６】
2014133156.tif 000088
【図７】
2014133156.tif 000089
【図８】
2014133156.tif 000090
【図９】
2014133156.tif 000091
【図１０】
2014133156.tif 000092
【図１１】
2014133156.tif 000093
【図１２】
2014133156.tif 000094
【図１３】
2014133156.tif 000095
【図１４】
2014133156.tif 000096
【図１５】
2014133156.tif 000097
【図１６】
2014133156.tif 000098
【図１７】
2014133156.tif 000099
【図１８】
2014133156.tif 000100
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月4日(2014.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化５４】
2014133156.tif 000101
［上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子または炭素原子数１〜４の炭化水素基を示し、この際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも二つは炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物および／またはその塩を有効成分として含有する、副嗅球を有する哺乳動物（イヌ属に属する哺乳動物を除く。）の忌避剤。
【請求項２】
前記副嗅球を有する哺乳動物（イヌ属に属する哺乳動物を除く。）がマカク属に属するサル、クマ、シカ、イノシシ、タヌキ、キツネ、齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウマである、請求項１に記載の忌避剤。
【請求項３】
前記ピラジン化合物が下記（１）〜（３）で表されるピラジン化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１または請求項２に記載の忌避剤；
（１）下記式（ＩＩ）：
【化５５】
2014133156.tif 000102
［上記式（ＩＩ）中、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（２）下記式（ＩＩＩ）：
【化５６】
2014133156.tif 000103
［上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物；
（３）下記式（ＩＶ）：
【化５７】
2014133156.tif 000104
［上記式（ＩＶ）中、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立した炭素原子数１〜４の炭化水素基である］で表されるピラジン化合物。
【請求項４】
前記ピラジン化合物が下記（４）〜（１１）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（４）下記式（ＶＩＩ）：
【化５８】
2014133156.tif 000105
で表される化合物；
（５）下記式（ＶＩＩＩ）：
【化５９】
2014133156.tif 000106
で表される化合物；
（６）下記式（ＩＸ）：
【化６０】
2014133156.tif 000107
で表される化合物；
（７）下記式（Ｘ）：
【化６１】
2014133156.tif 000108
で表される化合物；
（８）下記式（ＸＩ）：
【化６２】
2014133156.tif 000109
で表される化合物；
（９）下記式（ＸＩＩ）：
【化６３】
2014133156.tif 000110
で表される化合物；
（１０）下記式（ＸＩＩＩ）：
【化６４】
2014133156.tif 000111
で表される化合物；
（１１）下記式（ＸＩＶ）：
【化６５】
2014133156.tif 000112
で表される化合物。
【請求項５】
前記ピラジン化合物が下記（１２）〜（１４）で表されるピラジン化合物の混合物からなる群から選択される１または２以上のピラジン化合物の混合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（１２）下記式（ＶＩＩ）：
【化６６】
2014133156.tif 000113
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化６７】
2014133156.tif 000114
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化６８】
2014133156.tif 000115
で表される化合物；
（１３）下記式（Ｘ）：
【化６９】
2014133156.tif 000116
で表される化合物、
下記式（ＸＩ）：
【化７０】
2014133156.tif 000117
で表される化合物
および下記式（ＸＩＩ）：
【化７１】
2014133156.tif 000118
で表される化合物；
（１４）下記式（ＩＸ）：
【化７２】
2014133156.tif 000119
で表される化合物、
下記式（ＸＩＩＩ）：
【化７３】
2014133156.tif 000120
で表される化合物
および下記式（ＸＩＶ）：
【化７４】
2014133156.tif 000121
で表される化合物。
【請求項６】
前記ピラジン化合物が下記（１５）で表される化合物または（１６）で表されるピラジン化合物の混合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（１５）下記式（ＸＩ）：
【化７５】
2014133156.tif 000122
で表される化合物；
（１６）下記式（ＶＩＩ）：
【化７６】
2014133156.tif 000123
で表される化合物、
下記式（ＶＩＩＩ）：
【化７７】
2014133156.tif 000124
で表される化合物
および下記式（ＩＸ）：
【化７８】
2014133156.tif 000125
で表される化合物。
【請求項７】
前記ピラジン化合物が下記（１７）〜（２１）で表される化合物からなる群から選択される１または２以上の化合物である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の忌避剤；
（１７）下記式（ＶＩＩ）：
【化７９】
2014133156.tif 000126
で表される化合物；
（１８）下記式（ＸＩ）：
【化８０】
2014133156.tif 000127
で表される化合物；
（１９）下記式（ＸＩＩ）：
【化８１】
2014133156.tif 000128
で表される化合物；
（２０）下記式（ＸＩＩＩ）：
【化８２】
2014133156.tif 000129
で表される化合物；
（２１）下記式（ＸＩＶ）：
【化８３】
2014133156.tif 000130
で表される化合物。
【国際調査報告】
2014133156.tif 000131
2014133156.tif 000132
2014133156.tif 000133
2014133156.tif 000134