(57)【要約】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体を含む、肺癌のバイオマーカー。  （ａ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子  （ｂ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体  （ｃ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
2015099197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体を含む、肺癌のバイオマーカー。
（ａ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子
（ｂ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
（ｃ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
【請求項２】
ＤＤＲ２タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である請求項１に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＤＤＲ２活性を有するタンパク質
【請求項３】
ＤＤＲ２遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものである請求項１に記載のマーカー。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
ＤＤＲ２タンパク質の変異体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である請求項１に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質
【請求項５】
第６８１番目のアミノ酸残基の変異が、スレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ６８１Ｉ）である請求項４に記載のバイオマーカー。
【請求項６】
ＤＤＲ２遺伝子の変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示すものである請求項１に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドが変異したＤＮＡ
【請求項７】
第２番目のヌクレオチドの変異が、当該ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第１４８４００番目の塩基の変異である、請求項６に記載のバイオマーカー。
【請求項８】
第２番目のヌクレオチドの変異が、ヌクレオチドＣからヌクレオチドＴへの変異である請求項６に記載のバイオマーカー。
【請求項９】
被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現レベルを測定し、発現レベルが対照と比較して過剰発現しているときは、当該測定結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあることの指標とする、肺癌の検査方法。
【請求項１０】
被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子の変異の有無を解析し、当該ＤＤＲ２タンパク質の所定のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の所定の塩基配列に変異が存在したときは、当該解析結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあることの指標とする、肺癌の検査方法。
【請求項１１】
前記被検試料が、外科切除検体、気管支鏡検体及び気管支洗浄液検体からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９又は１１に記載の方法により、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体の発現レベルが過剰発現した結果が得られたときは、被検者は肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定する癌の検査方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の方法により、ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列に変異が存在したときは、被検者は肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定する癌の検査方法。
【請求項１４】
肺癌の検査は、肺癌の検出又は肺癌の性質の推定である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＤＲ２タンパク質の変異体が、ＤＤＲ２のアミノ酸配列のうち、第６８１番目のアミノ酸残基が変異したものである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１６】
第６８１番目のアミノ酸残基の変異が、スレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ６８１Ｉ）である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第６８１番目のアミノ酸残基の変異の有無の解析は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドの変異の有無の解析である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
第２番目のヌクレオチドの変異が、ヌクレオチドＣからヌクレオチドＴへの変異である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＤＲ２遺伝子の変異が、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち、第１４８４００番目の塩基の変異である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子変異がＴ／Ｃのヘテロ接合のときは肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
肺癌が肺扁平上皮癌である請求項９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち、第１４８４００番目の塩基を含む少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
１０〜２５６５塩基の長さを有する請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載のオリゴヌクレオチドに標識が施されたプローブ。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが連続する１０〜３０塩基の長さを有するものである請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
請求項２２及び２３に記載のオリゴヌクレオチド並びに請求項２４及び２５に記載のプローブからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、肺癌の検査用キット。
【請求項２７】
請求項１２又は１３に記載の方法により肺癌であると判定された被検者に対し、抗がん剤を投与することを特徴とする肺癌の治療方法。
【請求項２８】
ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を阻害する物質を肺癌患者に投与することを特徴とする、肺癌の治療方法。
【請求項２９】
発現を阻害する物質が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される物質である請求項２８に記載の方法。
（ａ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはその変異体に対する抗体
（ｂ）ＤＤＲ２遺伝子若しくはその変異体に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ
【請求項３０】
ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を阻害する物質を含む、肺癌治療用医薬組成物。
【請求項３１】
発現を抑制する物質が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される物質である請求項３０に記載の医薬組成物。
（ａ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはその変異体に対する抗体
（ｂ）ＤＤＲ２遺伝子若しくはその変異体に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異を指標とした肺癌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性肺癌は、依然日本において部位別死亡数第１位の、予後不良の疾患である。原発性肺癌の約４０％を占める腺癌に関しては、近年治療標的となる遺伝子の解明が進み予後が改善されつつあるが、約３５％を占める扁平上皮癌についてはこれまで治療標的となる遺伝子がほとんど解明されていなかった。
近年、Ｐｅｔｅｒ  Ｓ  Ｈａｍｍｅｒｍａｎらによって、肺扁平上皮癌の約３．８％にｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２（ＤＤＲ２）の変異があり、慢性骨髄性白血病の治療薬であるダサチニブの効果に関連することが報告された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１１；１（１）：７８−８９、非特許文献１）。
ＤＤＲ２はリガンドであるコラーゲンと結合し、細胞接着、細胞増殖、細胞外再構築などの役割を担う受容体型チロシンキナーゼである。肺扁平上皮癌以外でも肺大細胞癌、腎淡明細胞癌などで１７部位、１８種類のアミノ酸変化を伴う変異が報告されているが、癌細胞におけるその役割については十分には理解されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１１；１（１）：７８−８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸変異及びＤＤＲ２遺伝子の変異を指標とした肺癌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＤＤＲ２タンパク質及びＤＤＲ２遺伝子の過剰発現、並びにＤＤＲ２タンパク質の所定のアミノ酸残基の変異及びＤＤＲ２遺伝子の所定の塩基の変異が肺癌、特に肺扁平上皮癌と関連することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体を含む、肺癌のバイオマーカー。
（ａ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子
（ｂ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
（ｃ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
（２）ＤＤＲ２タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である（１）に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ＤＤＲ２活性を有するタンパク質
（３）ＤＤＲ２遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものである（１）に記載のマーカー。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）ＤＤＲ２タンパク質の変異体が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である（１）に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質
（５）第６８１番目のアミノ酸残基の変異が、スレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ６８１Ｉ）である（４）に記載のバイオマーカー。
（６）ＤＤＲ２遺伝子の変異体が、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示すものである（１）に記載のバイオマーカー。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドが変異したＤＮＡ
（７）第２番目のヌクレオチドの変異が、当該ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第１４８４００番目の塩基の変異である、（６）に記載のバイオマーカー。
（８）第２番目のヌクレオチドの変異が、ヌクレオチドＣからヌクレオチドＴへの変異である（６）に記載のバイオマーカー。
（９）被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現レベルを測定し、発現レベルが対照と比較して過剰発現しているときは、当該測定結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあることの指標とする、肺癌の検査方法。
（１０）被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子の変異の有無を解析し、当該ＤＤＲ２タンパク質の所定のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の所定の塩基配列に変異が存在したときは、当該解析結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあることの指標とする、肺癌の検査方法。
（１１）前記被検試料が、外科切除検体、気管支鏡検体及び気管支洗浄液検体からなる群から選ばれる少なくとも１つである（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）前記（９）又は（１１）に記載の方法により、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体の発現レベルが過剰発現した結果が得られたときは、被検者は肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定する癌の検査方法。
（１３）前記（１０）又は（１１）に記載の方法により、ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列に変異が存在したときは、被検者は肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定する癌の検査方法。
（１４）肺癌の検査は、肺癌の検出又は肺癌の性質の推定である、（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）ＤＤＲ２タンパク質の変異体が、ＤＤＲ２のアミノ酸配列のうち、第６８１番目のアミノ酸残基が変異したものである、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１６）第６８１番目のアミノ酸残基の変異が、スレオニンからイソロイシンへの変異（Ｔ６８１Ｉ）である（１５）に記載の方法。
（１７）第６８１番目のアミノ酸残基の変異の有無の解析は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドの変異の有無の解析である、（１５）に記載の方法。
（１８）第２番目のヌクレオチドの変異が、ヌクレオチドＣからヌクレオチドＴへの変異である（１７）に記載の方法。
（１９）ＤＤＲ２遺伝子の変異が、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち、第１４８４００番目の塩基の変異である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（２０）前記遺伝子変異がＴ／Ｃのヘテロ接合のときは肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定するものである、（１９）に記載の方法。
（２１）肺癌が肺扁平上皮癌である（９）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち、第１４８４００番目の塩基を含む少なくとも１０塩基の配列又はこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２３）１０〜２５６５塩基の長さを有する（２２）に記載のオリゴヌクレオチド。
（２４）前記（２２）又は（２３）に記載のオリゴヌクレオチドに標識が施されたプローブ。
（２５）オリゴヌクレオチドが連続する１０〜３０塩基の長さを有するものである（２４）に記載のプローブ。
（２６）前記（２２）及び（２３）に記載のオリゴヌクレオチド並びに（２４）及び（２５）に記載のプローブからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、肺癌の検査用キット。
（２７）前記（１２）又は（１３）に記載の方法により肺癌であると判定された被検者に対し、抗がん剤を投与することを特徴とする肺癌の治療方法。
（２８）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を阻害する物質を肺癌患者に投与することを特徴とする、肺癌の治療方法。
（２９）発現を阻害する物質が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される物質である（２８）に記載の方法。
（ａ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはその変異体に対する抗体
（ｂ）ＤＤＲ２遺伝子若しくはその変異体に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ
（３０）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を阻害する物質を含む、肺癌治療用医薬組成物。
（３１）発現を抑制する物質が、以下の（ａ）又は（ｂ）に示される物質である（３０）に記載の医薬組成物。
（ａ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはその変異体に対する抗体
（ｂ）ＤＤＲ２遺伝子若しくはその変異体に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、肺癌の検査方法及びキットが提供される。本発明の方法を用いることにより、肺癌の患者を、簡便かつ確実に検出又は診断することができる。従って、本発明の方法は、肺癌の検出、病態理解、診断及び分子標的療法の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、肺癌組織及び肺癌細胞株における遺伝子の変異を示す図である。
図２は、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す図である。
図３は、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す図である。
図４は、ＴＧＦβ１の発現量をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
図５は、ＴＧＦβ１の発現量をＥＬＩＳＡにより解析した結果を示す図である。
図６は、転移マウスモデルによる細胞移植実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献及び特許公報等の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１３−２６７５６８号（２０１３年１２月２５日出願）の明細書の内容を包含する。
【００１０】
本発明者は、被検者から採取されたＤＤＲ２（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２）タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列中の所定の変異が、肺癌と関連することを見出した。また、本発明者は、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現レベルを測定したところ、過剰発現が肺癌と関連することを見出した。すなわち、被検者から採取されたＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列に所定の変異が存在するときは、当該変異は、被検者が肺癌又はそのリスクがあることの指標とすることができ、また、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体が対照と比較して過剰発現しているときは、その過剰発現は、被検者が肺癌又はそのリスクがあることの指標となり得ることを見出した。
【００１１】
従って、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子又はこれらの変異体を含む、肺癌のバイオマーカーを提供する。
（ａ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子
（ｂ）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
（ｃ）ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子の変異体
【００１２】
また本発明は、被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現レベルを測定し、発現レベルが対照と比較して過剰発現しているときは、当該測定結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあると判定する、肺癌の検査方法を提供する。さらに、本発明は、被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子の変異の有無を解析し、当該ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列に変異が存在したときは、当該解析結果を、肺癌である又は肺癌のリスクがあると判定する、肺癌の検査方法を提供する。
【００１３】
本発明の一態様において、肺癌の検査方法は、被験者から採取されたＤＤＲ２（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２）のアミノ酸配列のうち、第６８１番目のアミノ酸残基の変異の有無を解析し、当該解析結果に基づいて前記被験者の肺癌を検査することを特徴とする。
本発明者は、外科切除検体あるいは気管支鏡検体計８１検体、および肺癌細胞株２６株を用いてＤＤＲ２の全エクソン領域のシークエンスを行なった。臨床検体８１検体中１検体と細胞株２６株中１株において第６８１番目のアミノ酸残基がスレオニンからイソロイシンへ変化した変異（Ｔ６８１Ｉ）を認めた。これはキナーゼドメイン上の変異であり、本変異はこれまで報告されていない新規変異である。本発明は、この新規変異を、肺癌の新規マーカーとして着目することにより完成されたものである。従って、本発明では、ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基の変異の有無、又はＤＤＲ２遺伝子のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードする遺伝子の変異を解析し、当該解析結果と被験者の肺癌とを関連づけることで、肺癌を検査する方法を提供する。
【００１４】
本発明において、肺癌の「検査」とは、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現レベルを指標として、あるいはＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子に変異が存在することを指標として、肺癌を検出すること、及び／又は肺癌の性質を推定することを意味する。
【００１５】
具体的には、ＤＤＲ２のアミノ酸配列（例えば配列番号３）のうち、第６８１番目のアミノ酸残基の変異を指標として、あるいは、ＤＤＲ２をコードする遺伝子の塩基配列において、例えば配列番号１に示す塩基配列のうち１４８４００番目の塩基の変異、又は配列番号２に示す塩基配列の第２０４２番目の塩基の変異を指標として、肺癌を検出すること、及び／又は肺癌の性質を推定することを意味する。「検査」には、分析する態様又は変異解析する態様も含まれる。
ここで、上記「第６８１番目」、「１４８４００番目」は、解析の対象となるアミノ酸残基及び塩基の位置を、それぞれＤＤＲ２タンパク質及びＤＤＲ２遺伝子の全長配列における番号により示している。従って、実際の解析に使用するＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子が、例えば部分断片であって全長より短くても、対象の位置は「第６８１番目」、「第１４８４００番目」を意図するものである。なお、配列番号２及び４においては、第２０４２番目の塩基が上記「第１４８４００番目」に対応している。
【００１６】
また「肺癌を検出すること」には、被験者が肺癌を患っていることを判定、診断又は予備的に診断することが含まれるが、被験者が実際に肺癌を患っていなくても将来的に肺癌を患うリスクがあると判定、判定、診断又は予備的に診断することも含まれる。「予備的に診断する」には、医師が最終診断を行うための補助、すなわち肺癌を補助的に診断することも含まれる。
さらに、「肺癌の性質を推定する」とは、被験者から検出された肺癌の種類、原発性などを推定することを意味する。例えば、ＤＤＲ２タンパク質のＴ６８１Ｉ変異は、肺扁平上皮癌に見られるため、同変異が確認された肺癌は、例えば肺扁平上皮癌であると推定することができる。上記推定には、医師が最終診断を行うための補助、すなわち肺癌を補助的に推定することも含まれる。
【００１７】
１．ＤＤＲ２タンパク質
本発明において検査の対象となるタンパク質は、ＤＤＲ２タンパク質の野生型又は変異型タンパク質である。野生型ＤＤＲ２タンパク質は、過剰発現を指標として検査を行う場合に検査対象となる。変異型タンパク質は、過剰発現及び変異のいずれかを指標として検査を行う場合に検査対象となる。
本発明において、ＤＤＲ２の野生型タンパク質は、具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において前記置換部位（第６８１番目）のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質
本明細書においては、この（ｂ）のタンパク質を「野生型改変タンパク質」という。
【００１８】
変異型タンパク質は、ＤＤＲ２のアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基がスレオニンからスレオニン以外（例えばイソロイシン）に変異した変異型ＤＤＲ２タンパク質（以下、「変異型ＤＤＲ２タンパク質」ともいう）であり、アミノ酸配列を配列番号５に示す。配列番号５に示すアミノ酸配列において、第６８１番目のアミノ酸残基の変異は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列（配列番号１又は２）のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドの変異に基づくものである。第６８１番目のアミノ酸残基が例えばスレオニンからイソロイシンへの変異の場合は、配列番号１に示す塩基配列では第１４８３９９〜１４８４０１番目のＡＣＴからＡＴＴへの変異、配列番号２に示す塩基配列では第２０４１〜２０４３番目のＡＣＴからＡＴＴへの変異となる。本発明は、このような変異型ＤＤＲ２タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子の両者を提供する。
【００１９】
本発明の変異型ＤＤＲ２タンパク質は、具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（配列番号３に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸がスレオニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質）
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち第６８１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質
本明細書においては、この（ｂ）のタンパク質を「変異型改変タンパク質」という。
【００２０】
前記スレオニン以外のアミノ酸は、スレオニン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、好ましくは疎水性アミノ酸（トリプトファン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）であり、より好ましくはイソロイシンである。
【００２１】
２．ＤＤＲ２遺伝子及びその変異体
本発明において、検査の対象となる遺伝子は、ＤＤＲ２遺伝子（野生型）又はその変異型遺伝子である。野生型ＤＤＲ２遺伝子は、過剰発現を指標として検査を行う場合に検査対象となる。変異型ＤＤＲ２遺伝子は、過剰発現及び変異のいずれかを指標として検査を行う場合に検査対象となる。
野生型ＤＤＲ２遺伝子としては、例えば以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものが挙げられる。
（ａ）配列番号１又は２に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
但し、上記（ｂ）のＤＮＡにおいて、配列番号１に示す塩基配列のうち第１４８３９９〜１４８４０１番目の塩基（配列番号２では第２０４１〜２０４３番目の塩基）は（ａ）のＤＮＡと同一である。
本明細書においては、この（ｂ）のＤＮＡを「野生型改変ＤＮＡ」という。
【００２２】
また、本発明は、変異型ＤＤＲ２タンパク質をコードする遺伝子（以下、「変異型ＤＤＲ２遺伝子」ともいう）を提供する。
本発明の変異型ＤＤＲ２遺伝子は、具体的には以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を有するＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列において第１４８３９９番目〜第１４８４０１番目の塩基がスレオニン以外のアミノ酸のコドンに置換された塩基配列
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって（但し第１４８３９９番目〜第１４８４０１番目の塩基は上記（ａ）と同一である）、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列（配列番号２に示される塩基配列において第２０４１番目〜第２０４３番目の塩基がスレオニン以外のアミノ酸のコドンに置換された塩基配列）
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって（但し第２０４１番目〜第２０４３番目の塩基は上記（ｃ）と同一である）、かつＤＤＲ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本明細書においては、この（ｂ）及び（ｄ）のＤＮＡを「変異型改変ＤＮＡ」という。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、（４）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、又は（５）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃などの条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２４】
前記スレオニン以外のアミノ酸は、スレオニン以外のアミノ酸であれば特に限定されないが、好ましくは疎水性アミノ酸（トリプトファン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）であり、より好ましくはイソロイシンである。イソロイシンのコドンはＡＴＡ、ＡＴＣ又はＡＴＴであるが、好ましくはＡＴＴである。
本発明者は、肺癌患者由来のＤＤＲ２遺伝子（配列番号１）の第１４８４００番目の塩基において、遺伝子型がＴ／Ｃヘテロ接合であることを見出した。
【００２５】
従って、本発明は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基置換（アミノ酸配列ではＴ６８１Ｉ）を指標として、個体の肺癌を検査する方法に関するものであり、具体的には、被験者から採取されたＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち、第１４８３９９〜１４８４０１番目の塩基、好ましくは第１４８４００番目の塩基の遺伝子変異、又は配列番号２に示す塩基配列の第２０４１番目〜第２０４３番目、好ましくは第２０４２番目の塩基の変異を解析し、当該解析結果に基づいて前記被検者の肺癌を検査することを特徴とする、肺癌の検査方法を提供する。
本発明の好ましい態様では、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列のうち第６８１番目のアミノ酸残基をコードするコドンの第２番目のヌクレオチドの変異、すなわち、ＤＤＲ２をコードする遺伝子（ＤＤＲ２遺伝子ともいう）の塩基配列（例えば配列番号１）において、第１４８４００番目の塩基の変異は、ヌクレオチドの塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に変異したもの（ＡＣＴからＡＴＴへの変異）である。配列番号２に示す塩基配列では、第２０４２番目の塩基がＣからＴに変異したものである。
上記ＤＤＲ２遺伝子に基づく検査方法において、遺伝子変異がＴ／Ｃのヘテロ接合のときは、被験者は肺癌である、又は肺癌のリスクがあるものと判定される。
また、遺伝子変異がＴ／Ｃのヘテロ接合のときは、被験者は肺扁平上皮癌である、又は肺扁平上皮癌のリスクがあるものと判定することができ、この判定結果は、肺癌の性質を推定するために有用である。
【００２６】
肺癌患者におけるＤＤＲ２遺伝子の変異箇所は特定の部位に限定されておらずどのドメインにも変異が報告されており、肺癌の中では肺扁平上皮癌に高頻度に認める（実施例）。このことから、上記変異は肺癌の診断や治療に応用するための基本情報となる。本発明においては、被験者の検体（組織）のＤＮＡから、この変異を特異的に検出し得ることを確認した。
【００２７】
本発明において、検出のために使用される遺伝子及びタンパク質はＤＤＲ２遺伝子及びその変異型遺伝子、並びにＤＤＲ２タンパク質及びその変異型タンパク質（それぞれの改変タンパク質及び改変ＤＮＡを含む）である。ＤＤＲ２遺伝子は、ヒト第１染色体のｑ２３，３領域に位置し、受容体型チロシンキナーゼに属するタンパク質であるＤＤＲ２をコードする遺伝子である。ヒトＤＤＲ２遺伝子は、１５５０２８ｂｐの塩基配列（配列番号１）を有するものであり、ＤＤＲ２タンパク質は配列番号３に示される８５５個のアミノ酸配列からなる（配列番号２に示す塩基配列によりコードされる）。ヒトＤＤＲ２遺伝子の塩基配列情報及びＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列情報は、例えばアクセッション番号ＮＧ−０１６２９０により得ることができる。
【００２８】
３．バイオマーカー
本発明においてバイオマーカーとなる遺伝子及びタンパク質は、ＤＤＲ２遺伝子及びその変異型遺伝子、並びにＤＤＲ２タンパク質及びその変異型タンパク質である。そして、ＤＤＲ２遺伝子変異の情報は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列の第１４８４００番目の塩基の変異であり、例えばＡＣＴがＡＴＴに変異する。ＡＴＴはイソロイシンのコドンであるから、この変異により、ＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列の第６８１位（配列番号３に示すアミノ酸配列の第６８１番目のアミノ酸残基）においてスレオニンからイソロイシンへの置換（Ｔ６８１Ｉ）が起こる。
【００２９】
本発明において、遺伝子変異は、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）のうち第１４８３９９〜１４８４０１番目の塩基、好ましくは第１４８４００番目の塩基、又は配列番号２に示す塩基配列の第２０４１番目〜第２０４３番目の塩基、好ましくは第２０４２番目の塩基において主に一塩基の変異を含む。
本発明の好ましい態様において、ＤＤＲ２遺伝子又はＤＤＲ２タンパク質の上記変異は、被験者の肺癌を評価するためのマーカーとして利用することができるまた、ＤＤＲ２遺伝子若しくはＤＤＲ２タンパク質又はこれらの変異体の過剰発現も被験者の肺癌を評価するためのマーカーとして利用することができる。。
【００３０】
本発明において、主な検出の対象となる肺癌は、扁平上皮癌又は腺扁平上皮癌である。
この変異又は過剰発現を解析することによって、肺癌、特に扁平上皮癌であるか否かを評価することができる。
本発明において見出されたＴ６８１Ｉ変異は、肺癌組織で検出され、変異と表現型との関連は、解析したＤＤＲ２遺伝子の第１４８４００番目の塩基の遺伝子変異がＴ／Ｃのヘテロ接合のときは肺癌である、又は肺癌のリスクがあると判定することができる。本発明者による１０７名の症例を用いた統計解析によると、肺癌症例では１．９％で検出された。
【００３１】
本発明において見出されたＴ６８１Ｉ変異の検出率は高くないが、変異の部位より推測すると分子標的薬の新規標的分子になることが予想される。この変異を持つ細胞を用いて新規分子標的薬のスクリーニングの系を確立することが可能になる。
【００３２】
４．検出法
（１）変異型ＤＤＲ２タンパク質（変異型改変タンパク質を含む。以下同様。）の変異検出
本発明においては、被検者の外科切除検体、気管支鏡検体又は気管支洗浄液検体等のサンプル（癌組織、正常肺組織などを含む）から得られたＤＤＲ２タンパク質について、例えばアミノ酸配列のダイレクトシークエンス法によって第６８１番目のアミノ酸配列を解析し、スレオニンであるかそれ以外のアミノ酸（イソロイシン）であるかを検出する。また、使用する試料は、上記検体に限定されるものではなく、喀痰、血液、尿、唾液などを用いることもできる。
なお、上記サンプルからＤＤＲ２タンパク質を得るには、例えば当分野において周知の手法、例えば界面活性剤によるタンパク質の可溶化、透析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００３３】
（２）変異型ＤＤＲ２遺伝子（変異型改変ＤＮＡを含む。以下同様。）の変異検出
また本発明においては、被験者から採取された上記サンプルから得られたＤＮＡについて、塩基配列の変異を解析する。
上記変異を解析するための被験者からのゲノムサンプルは、外科切除検体、気管支鏡検体又は気管支洗浄液検体等（癌組織、正常肺組織などを含む）から抽出することができる。ゲノムＤＮＡの抽出及び精製法は周知である。例えば、ヒトから採取した外科切除検体、気管支鏡下肺生検検体及び気管支洗浄液検体から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）などのキットを用いて抽出することができる。本発明の場合、変異がＤＤＲ２タンパク質のコード領域（オープンリーディングフレーム）に存在するため、ゲノムＤＮＡの代わりにｍＲＮＡやｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出してもよい。ｍＲＮＡやｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するには市販のキット、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ロシュ社製ＲＮＡ精製キット（ＨｉｇｈＰｕｒｅシリーズのキット）などを用いることができ、抽出手法も周知である。
【００３４】
以下、上記の被験サンプルの遺伝子変異検出法の一例を示す。
（２−１）ＰＣＲ法を用いた検出
ＰＣＲにより被験サンプルを増幅するには、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤｉｓｃｏｖｅｒａｓｅＴＭ  ＤＨＰＬＣ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。用いるプライマーは、被験サンプル中の対象変異部分が増幅されるように、プライマーの任意の位置に遺伝子変異が含まれるように設計し合成する。
【００３５】
増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、変異の有無を判定する。例えばＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法である。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブという）は、前記遺伝子変異情報に基づいて設計することができる。あるいは、アレル特異的プライマーを用いて増幅する際に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を用いて増幅産物に蛍光標識した塩基を取り込むことで、変異遺伝子の定量を行うことができる。
【００３６】
（２−２）塩基配列決定法による検出
本発明においては、ダイレクトシークエンシングにより変異を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＡＢＩシリーズ（ライフテクノロジーズ）等を用いる。
【００３７】
（２−３）ＤＮＡマイクロアレイによる検出
ＤＮＡマイクロアレイは、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。まず、被験サンプルのポリヌクレオチドを単離し、ＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化ＤＮＡ／ｍＲＮＡ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００３８】
（２−４）その他
上記方法以外にも、ＭＢＰ−ＱＰ法により遺伝子変異を検出することができる。ＭＢＰ−ＱＰ法は、ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｉａｓｅｄ  ＰＣＲにより遺伝子増幅を行い、ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｐｒｏｂｅ法で遺伝子変異を検出する方法である。ＭＢＰ−ＱＰ法は、本発明者らにより他の遺伝子変異の検出を目的として確立された方法であり、この方法により容易に遺伝子変異を検出することが可能である。
【００３９】
（３）過剰発現したＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の検出
過剰発現したタンパク質（野生型改変タンパク質を含む。以下同様。）は、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング等により検出することができる。
また、過剰発現した遺伝子（野生型改変ＤＮＡを含む。以下同様。）は、例えば定量ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等により検出することができる。
変異体タンパク質及び変異体遺伝子（変異型改変タンパク質及び変異型改変ＤＮＡを含む。以下同様。）についても、上記手法を適用することができる。
【００４０】
（４）検査結果の判定
被検者から採取された被検試料中のＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体（総称して「ＤＤＲ２類」という）の発現レベルが、対照と比較して過剰発現しているときは、当該発現レベルの値は、被検者が肺癌である又は肺癌のリスクがあることの指標となる。そして、当該発現レベルの値が対照と比較して高いときは、被検者は肺癌である又は肺癌のリスクがあると判定される。
ここで、「対照」とは、健常者由来のＤＤＲ２類の発現値若しくはレベル、又は健常者由来のＤＤＲ２類のデータをもとに標準化された正常値若しくはレベルを意味する。
また、被検者から採取された被検試料のＤＤＲ２タンパク質のアミノ酸配列又はＤＤＲ２遺伝子の塩基配列に、前記変異を有するときは、被検者は肺癌である又は肺癌のリスクがあると判定される。
【００４１】
（５）検査結果の取り扱い
ところで、本発明の方法では、複数の被験者由来の試料を用いて変異の有無を解析している。従って、被験者個人の肺癌を検出する場合、例えばアレル特異的ＰＣＲ法により、ゲノムＤＮＡにおける遺伝子変異の統計解析を行い、その結果当該個人が全体のどの位置に存在又は属するかを調べることによって、各被験者個人の肺癌の可能性を知ることができる。また、予め規定された数の被験者（１次母集団）においてＴ６８１Ｉ変異と表現型（肺癌又はその種類）との間の分析を行い、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験者由来の変異とを比較し、表現型である肺癌と関連付けすることもできる。野生型遺伝子及びタンパク質の過剰発現レベルの解析結果についても、上記変異の有無の解析と同様に行うことができる。
上記測定された被験者由来のデータを前記母集団の値に組み込んで、変異又は発現レベルと肺癌とのリスクレベルを再度データ処理しておくと、対象となる被験者（母集団）の例数を増やすことにより、解析の精度を高めることができる。
【００４２】
５．肺癌検出用プローブ又はＰＣＲプライマー
以下に、肺癌検出用プローブ又はＰＣＲプライマーについて説明する。被験対象者からのゲノムＤＮＡサンプルの取得法は前記のとおりである。
本発明においてプライマー及び／又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１）のうち、第１４８４００番目の塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むように設計された少なくとも１０塩基の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）である。
【００４３】
変異箇所周辺の塩基配列（一部）を表１に示す。
【表１】
2015099197.tif 000003
【００４４】
表１において、「ｃ／ｔ」は「Ｃ」が「Ｔ」に変異したことを意味する。本発明においては、上記ＤＤＲ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）の変異部位（ｃ／ｔ）を含む１０〜５０塩基を有するオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、肺癌検出用プローブ又はＰＣＲプライマーとして使用することができる。肺癌の検出は、前記変異を指標として行われる。
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは連続する少なくとも１０塩基であれば特に限定されるものではなく、好ましくは１０〜２５６５塩基長であり、より好ましくは１０〜１００塩基長、さらに好ましくは１０〜５０塩基長、またさらに好ましくは１０〜３０塩基長である。１０〜２５６５塩基長のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列においてＤＤＲ２のコード領域（配列番号２又は４）から設計及び合成することが好ましい。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載の塩基配列に基づいて、通常の化学合成により得ることができる。本発明においてはこれらの配列の相補鎖（相補配列）も含まれる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは上記配列番号４に示す塩基配列情報に基づいて設計及び合成することができる。この場合、変異部位が塩基配列の５’端又は３’端に存在するように設計することもできるが、これに限定されず、５’又は３’端よりも内側に存在するように設計してもよい。
また、本発明のプローブは、本発明のオリゴヌクレオチドに結合した標識部分を含んでいてもよい。標識として、蛍光標識、ラジオアイソトープ標識、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識などを施すことができるが、好ましくは蛍光標識である。
【００４６】
作製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、当該プローブが被験ＤＮＡにハイブリダイズしたかどうか、その有無を利用して変異を決定又は検出することができる。
【００４７】
前記蛍光色素は特に制限されるものではない。例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）等が挙げられる。あるいは、本発明のプローブは、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして使用することができる。
【００４８】
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４４５〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５２０〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００４９】
本発明のプローブは、配列番号１に示す塩基配列のうち、第１４８４００番目の塩基（配列番号２又は４では当該１４８０００番目に対応する塩基）を含み、かつ、第１４８４００番目の塩基よりも上流側の塩基及び下流側の塩基を含むように設計することが好ましい。第１４８４００番目の塩基が「Ｃ」（正常配列）のアリルを「アリルＣ」とし、「Ｔ」（第１４８４００番目の塩基に変異が生じている配列）のアリルを「アリルＴ」とすると、上記プローブが、アリルＣの配列にはハイブリダイズするがアリルＴの配列にはハイブリダイズしない条件でハイブリダイゼーションを行う。プローブは、アリルＴの配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするため、バンドの有無によってアリルがＣであるかＴであるかを判断（検出）することができる。
【００５０】
アリルＴを検出するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを設計するときは、第１４８４００番目の塩基よりも上流側から設計するとともに、第１４８４００番目の塩基よりも下流側から設計する。これにより、ＰＣＲにより増幅された断片は、変異の有無により検出される断片の大きさが異なるため、断片の大きさの相違により変異を検出することができる。プライマーの長さは、少なくとも１５塩基、好ましくは１５〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２４塩基の長さを有するように設計する。もちろん、プライマーの設計は、前記第１４８４００番目の塩基の上流及び下流の５０塩基以内の領域に限定されるものではなく、ゲノムＤＮＡの配列をベースにして、増幅断片が１０００ｂｐ以下、好ましくは５００ｂｐ以下、さらに好ましくは２００ｂｐ以下（例えば５０〜１００ｂｐ）となるように鋳型ＤＮＡの領域から適宜選択することもできる。
【００５１】
以上のように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。なお、プローブには、予め適当な蛍光標識（例えばＦＡＭ、ＶＩＣ等）を付加して作業の自動化を図ることも可能である。
【００５２】
６．キット
本発明は、肺癌を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、具体的には、本発明のヌクレオチドおよび本発明のプローブからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む。例えば、本発明のキットは、上記成分に加え、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬、固相支持体、説明書などを含んでいてもよい。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
【００５３】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
本発明のキットは、ＤＤＲ２遺伝子の変異を含むＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００５４】
本発明のキットにより遺伝子変異又は過剰発現を判定する場合、例えば、疾患の診断、治療時にヒトから採取した外科切除検体、気管支鏡下肺生検検体及び気管支洗浄液検体およびそれらから作製された固定標本などから上記ＤＤＲ２遺伝子を含むＤＮＡを単離し、この単離したＤＮＡをキット中のオリゴヌクレオチドと反応させて遺伝子型又は過剰発現のレベルを判定する。
判定した遺伝子型、遺伝子変異又は過剰発現レベルから、肺癌（特に扁平上皮癌）であるか否か、又は肺癌のリスクを判定する。
【００５５】
７．ＤＤＲ２の発現を阻害する物質
「発現を阻害する」とは、ＤＤＲ２の遺伝子発現を抑制すること、ＤＤＲ２の機能（腫瘍細胞の増殖、遊走、浸潤、転移）を抑制することを意味する。
従って、当該ＤＤＲ２タンパク質又はＤＤＲ２遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、「物質」に限定はない。例えば、ＤＤＲ２タンパク質の発現を阻害する物質として、ＤＤＲ２に対する抗体、ＤＤＲ２をコードする遺伝子に対する阻害性核酸、例えばアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
（１）ＤＤＲ２又はその変異体に対する抗体
本発明の医薬組成物に含まれる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、その作製手法は周知である。
【００５６】
（１−１）ポリクローナル抗体の作製
上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として精製したＤＤＲ２、精製したＤＤＲ２変異体を用いる。
次に、得られた精製タンパク質を、緩衝液に溶解させて抗原溶液を調製し、必要に応じて、公知のアジュバントを添加する。免疫は、上記精製ＤＤＲ２又は変異体を含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に投与することにより行う。
免疫した動物のそれぞれから採取した抗血清の中から、目的の抗血清をスクリーニングする。スクリーニング方法は、公知の免疫検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を、その常法に従い行うことができる。抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を採用すればよい。
【００５７】
（１−２）モノクローナル抗体の作製
抗原及びその溶液の調製、免疫方法、並びに上記抗原の投与量、投与間隔及び投与回数などは、当分野において周知である。
抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。
採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得ることができる。
ミエローマ細胞、細胞融合法、抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合比、ＨＡＴ選択培地による培養、目的のハイブリドーマのスクリーニング、ハイブリドーマのクローニング手法などは、当分野において周知である。
【００５８】
また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。
ヒト型抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域の枠組領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域の枠組領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域である抗体である。ヒト型抗体は、当該分野で周知の方法により作製することができる。
【００５９】
ヒト抗体とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。ヒト抗体は、当該分野で周知の方法により、ヒト抗体を産生するトランスジェニック動物を作製し、当該トランスジェニック動物を抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
【００６０】
抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分又は当該領域から誘導された部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ  Ｆｖ）等が挙げられる。
【００６１】
（２）遺伝子の阻害性核酸
ＤＤＲ２遺伝子又はその変異型の阻害性核酸は、その遺伝子機能又は遺伝子発現を抑制する核酸を意味し、例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、デコイ核酸、マイクロＲＮＡなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。
【００６２】
（２−１）アンチセンス核酸
アンチセンス核酸は、ＤＤＲ２遺伝子のｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡ）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも約１７ヌクレオチドであり、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。
アンチセンス核酸は、例えば、各種ＤＮＡトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法により、あるいはウイルスベクターを用いることにより、細胞に導入される。
【００６３】
（２−２）デコイ核酸
本発明において、デコイ核酸は、ＤＤＲ２遺伝子の転写因子に結合し、プロモーター活性を抑制するおとり核酸を意味し、この核酸を細胞内に導入し、転写因子がこの核酸に結合することにより、転写因子の本来のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、その転写因子の発現が抑制される。具体的には、デコイ核酸は、標的結合配列に結合しうる核酸又はその類似体である。
【００６４】
本発明の好ましいデコイ核酸の例は、例えばＤＤＲ２遺伝子のプロモーターに結合する転写因子と結合し得る核酸（ＤＮＡでもＲＮＡ）などが挙げられる。デコイ核酸は、上記遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖、又はその相補鎖を含む２本鎖として設計することができる。長さは特に限定されるものではない。
【００６５】
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、これらの方法により得られた核酸を、制限酵素等を用いて切断し、ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよい。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。デコイ核酸の変異体の作製方法は、当業界で公知の方法を用いて、たとえば、部位特異的突然変異誘発法等によって合成することもできる。部位特異的突然変異誘発法は当分野において周知であり、市販のキット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）等を使用することができる。
デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロッティング法、ＦＡＣＳ解析法、ＲＴ−ＰＣＲ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばｐｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
【００６６】
（２−３）ＲＮＡ干渉
本発明においては、細胞においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を調節しうる合成小核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ分子を使用することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子を用いる場合は、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とすることができる。そのようなＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、標的遺伝子の選択的スプライシングにより得られるバリアント、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ等が挙げられる。選択的スプライシングによって適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合、ｓｉＲＮＡ分子を用いてエクソン部分又は保存配列の発現を阻害することができる。
【００６７】
ｓｉＲＮＡ分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。
ｓｉＲＮＡは、二本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンＲＮＡ分子として生成することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、通常の化学合成により得ることができる。または、ｓｉＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて生物学的に生成することも可能である。
【００６８】
さらに、本発明は、マイクロＲＮＡを用いて上記遺伝子の発現を抑制することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく阻害性核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。
【００６９】
８．治療方法及び医薬組成物
本発明は、前記方法により肺癌であると判定された被検者に対し、抗がん剤を投与することを特徴とする肺癌の治療方法を提供する。
また本発明は、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を抑制する物質を肺癌患者に投与することを特徴とする、肺癌の治療方法を提供する。
さらに、本発明は、ＤＤＲ２タンパク質若しくはＤＤＲ２遺伝子、又はこれらの変異体の発現を抑制する物質を含む、肺癌治療用医薬組成物を提供する。
抗がん剤又は本発明の医薬組成物の体内への投与は、例えば、非経口または経口等の公知の用法で行うことができ、限定はされないが、好ましくは非経口投与である。
【００７０】
これら各種用法に用いる製剤（非経口剤や経口剤等）は、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。
抗がん剤又は本発明の医薬組成物の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（ＤＤＲ２若しくはその変異体に対する抗体、又はＤＤＲ２遺伝子若しくはその変異体に対する阻害性核酸）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病期の種類・進行度、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
【００７１】
抗がん剤又は本発明の医薬組成物を非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。
各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態、あるいは使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。当該非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等を含有させることができる。
【００７２】
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形材や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填材（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、および湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００７３】
経口剤は、連続的に、あるいは１日１回から数回に分けて投与される。投与経路は、非経口投与（例えば静注）であることが好ましい。
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを投与する場合は、その有効量は、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
方法
肺扁平上皮癌９株を含む、肺癌細胞株２６株および患者検体８０例において解析を行なった。患者検体は２００４年５月より２０１２年２月までに佐賀大学医学部附属病院にて加療を行なった８０例の腺癌を除く原発性肺癌症例の外科切除検体および気管支鏡検体であり、うち５４例が扁平上皮癌の診断であった。全ての患者においてインフォームドコンセントの下同意を得た。各々の検体においてＤＮＡダイレクトシークエンス法を用いた、ＤＤＲ２の全エクソンシークエンスを行なった。
ＤＮＡは外科切除検体、気管支下肺生検検体および気管支洗浄液よりＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。変異の検出は１〜１９までの全エクソンにおいてダイレクトシークエンス法にて解析した。ＰＣＲの増幅はＤｉｓｃｏｖｅｒａｓｅＴＭ  ＤＨＰＬＣ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて行なった。その後Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．ＭＡ）を用いて精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によりサイクルシークエンス法を用いてダイレクトシークエンスを行なった。【００７６】
結果
患者検体８０例の解析では、アミノ酸変異を伴わない３種の遺伝子多型（Ｈ１３６Ｈ；１１％、Ｌ４２０Ｌ；１７．５％、Ｈ５２０Ｈ；７．５％）とアミノ酸変異を有する１種の遺伝子変異（Ｔ６８１Ｉ；１．３％）を認めた（図１）。また肺癌細胞株のうち肺扁平上皮癌細胞株であるＥＢＣ−１においてもＴ６８１Ｉ変異を認め、変異頻度としては全体の２．２％、扁平上皮癌のうちの３．２％という結果であった（図１）。上記の結果から、肺癌診断のためにＤＤＲ２遺伝子変異（Ｔ６８１Ｉ）を検出する方法を確立することができた。
【実施例２】
【００７７】
細胞株を用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ
ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔマトリゲルインベージョンチャンバー３５４４８０を用いて、細胞株を用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行った。
使用した細胞：
Ｈ２２６Ｂ−ＷＴ（Ｄ＃６８）
Ｈ２２６Ｂ−ｍｕｔａｎｔ（Ｍ＃７３）
Ｈ２２６Ｂ−ｅｍｐｔｙ（Ｅ＃４）
細胞数：５×１０５／ｗｅｌｌ
浸潤時間：２２時間【００７８】
インベージョンチャンバーを２時間水和した後、インサートに細胞を添加し、２２時間インキュベーションを行った。
上面の細胞を取り除き、浸潤した細胞をディフクイックにて固定・染色し、封入した。【００７９】
結果を図２及び図３に示す。
図２及び３より、肺がん細胞株Ｈ２２６ＢにＤＤＲ２野生型、Ｔ６８１Ｉ変異を強制発現させると、がん細胞浸潤能が有意に増加することが示された。
【実施例３】
【００８０】
ＴＧＦｂ１のｍＲＮＡ発現レベルの解析
（１）リアルタイムＰＣＲによる発現解析
方法：
Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ００９９８１３３＿ｍ１）  のプライマープローブを使用し、以下の条件でＰＣＲを行った。
サイクル条件；初期変性９５℃  ６０秒→ＰＣＲ  ９５℃  １５秒  ６０℃  ３０秒を４０サイクル
ＰＣＲ試薬；ＴＯＹＯＢＯのＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＱＰＳ−１０１）
Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＧＡＰＤＨ及び１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いた。【００８１】
結果を図４に示す。
リアルタイムＰＣＲにて得られたＴＧＦβ１のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＤＲ２（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）高発現株ではｅｍｐｔｙに比べてＴＧＦβ１の発現量は増し、また、ｍｕｔａｎｔ（Ｔ６８１Ｉ）高発現クローンではＷｉｌｄ  ｔｙｐｅに比べて、更に有意に発現量が増加していた。これらの結果は、ＤＤＲ２又はその変異体の過剰発現体は、癌の浸潤、転移能を促進することを示すものである。【００８２】
（２）ＥＬＩＳＡによる発現解析
方法：
Ｈ２２６Ｂ−ＷＴ（Ｄ＃６８）、Ｈ２２６Ｂ−ｍｕｔａｎｔ（Ｍ＃７３）、Ｈ２２６Ｂ−ｅｍｐｔｙ（Ｅ＃４）各細胞の細胞上清を、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β１Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＤＢ１００Ｂ）を使用し測定した。
結果を図５に示す。
図５より、ＴＧＦβ１のタンパク発現レベルは、ＤＤＲ２（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）高発現株ではｅｍｐｔｙに比べて有意差はないもののＴＧＦβ１の発現量は増し、ｍｕｔａｎｔ（Ｔ６８１Ｉ）高発現クローンではＷｉｌｄ  ｔｙｐｅに比べて、更に有意に発現量が増加していた。従って、変異体（Ｔ６８１Ｉ）が癌の浸潤、転移能を促進することが示された。
【実施例４】
【００８３】
転移マウスモデルによる移植実験
方法：
マウス：
ＮＯＪ／ＳＣＩＤマウス  オス  ８週齢
細胞：
Ｈ２２６Ｂ−ｅｍｐｔｙ  Ｅ＃４
Ｈ２２６Ｂ−ｗｉｌｄ  Ｄ＃６８
Ｈ２２６Ｂ−Ｔ６８１Ｉ  Ｍ＃７３【００８４】
上記細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、細胞を、５×１０５／ｔｏｔａｌ／１００μｌの用量で各群５匹ずつマウス腹側皮下に移植した。移植後、体重及び腫瘍量を週１回測定した。腫瘍量は、以下の式により算出した。
腫瘍量＝（短径）２×（長径）／２
図６は、肺転移の肉眼所見とＨＥ染色の結果を示す図である。図６より、ＤＤＲ２（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）高発現株、ｍｕｔａｎｔ（Ｔ６８１Ｉ）高発現株において肺転移の総和が大きいことが分かる。
従って、ＤＤＲ２の高発現および、ＤＤＲ２の変異体（Ｔ６８１Ｉ）は、癌の浸潤、転移能を促進することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号４：ｎはａ，ｇ，ｃ又はｔを表す（存在位置：２０４１．．２０４３）。
配列番号５：Ｘａａは、Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｃｙｓ，又はＰｈｅを表す（存在位置：６８１）。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の方法及びキットは、肺癌の検査に有用である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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