(57)【要約】  安定的な供給が可能で、長鎖脂肪酸の蓄積量の多い生物由来の長鎖脂肪酸原料を開発し、それを用いて、特定の長鎖脂肪酸を容易に、また安価でかつ大量に生産する方法を提供することである。  システイン等の栄養ストレス付与培地で培養することで、長鎖脂肪酸を細胞内に多量に蓄積するクロレラ科藻類のシステイン要求性変異株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン非存在下で長鎖脂肪酸の生産を増加するクロレラ科（Chlorellaceae）藻類のシステイン要求性変異株。
【請求項２】
クロレラ科藻類がクロレラ属（Chlorella）藻類又はパラクロレラ属（Parachlorella）藻類である、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
パラクロレラ属藻類が国際受託番号FERM BP-22268及びFERM BP-22288で示されるP. kessleriである、請求項２に記載の変異株。
【請求項４】
クロレラ科藻類を変異原で処理する突然変異誘発工程、
突然変異誘発工程後のクロレラ科藻類をシステイン添加培地のプレートに塗布し、コロニー形成するまで培養するコロニー形成工程、
プレート状に形成された単一コロニー由来のクロレラ科藻類をシステイン添加培地のプレートとシステイン非添加培地のプレート上でそれぞれ培養するシステインストレス培養工程、
システイン添加培地のプレートで増殖し、システイン非添加培地のプレートでは増殖しない株を候補株として選択する候補株選択工程、
前記候補株をシステイン添加培地のプレートとシステイン非添加培地のプレート上で再度培養する確認培養工程、及び
システイン非添加培地のプレートで増殖しない候補株をシステイン要求性変異株として選択するシステイン要求性変異株選択工程
を含む長鎖脂肪酸生産性クロレラ科藻類の作出方法。
【請求項５】
変異原がアルキル化剤又は放射線である、請求項４に記載の作出方法。
【請求項６】
放射線が重イオンビームである、請求項５に記載の作出方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステイン要求性変異株をシステイン添加培地で対数増殖期〜静止期まで培養する前培養工程、及び
前培養工程で得られた細胞を栄養ストレス付与培地で10日〜30日間培養するストレス付与工程
を含む長鎖脂肪酸生産方法。
【請求項８】
ストレス付与工程後の細胞から長鎖脂肪酸を物理的方法及び／又は化学的方法により抽出する抽出工程をさらに含む、請求項７に記載の生産方法。
【請求項９】
栄養ストレス付与培地がシステイン非添加培地である、請求項７又は８に記載の生産方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の国際受託番号FERM BP-22268で示されるP. kessleriの変異株を用いてエルカ酸を生産する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の生産方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の国際受託番号FERM BP-22288で示されるP. kessleriの変異株を用いてオレイン酸及びネルボン酸を生産する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地組成によって長鎖脂肪酸の細胞内含有量を制御可能なクロレラ科藻類及びそれを用いた長鎖脂肪酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物由来の油脂を加水分解して得られる長鎖脂肪酸は、工業上重要な原料であり、食品、又は化粧品若しくは染料等の化成品、あるいはバイオディーゼルのようなバイオ燃料等、様々な用途に利用されている。【０００３】
長鎖脂肪酸は、一般に炭素数と飽和度によって化学的性質が異なる。例えば、炭素数22の不飽和脂肪酸であるエルカ酸は、摂取に伴う人体への影響から食用への制限はあるが、付加価値の高い様々な誘導体の出発原料として利用されており、需要度が高い長鎖脂肪酸である（非特許文献１〜４）。例えば、界面活性剤、潤滑剤として利用される他、重合剤として油彩絵具に添加されている。また、水素付加によってベヘン酸に変換可能で、ショートニングとして食品の原材料にも利用されている。さらに、エルカ酸の誘導体であるドコサノールは、ヘルペスウイルスによって生じる口内炎を抑制する作用が報告されており（非特許文献５及び６）、米国食品医薬品局（FDA）に認可されている。その他、エルカ酸オクチロドデシルは、化粧品や整髪料に添加されている。エルカ酸は、ナタネ種子に多く含まれており、工業的にはナタネ油から精製されている。ところが、近年は低エルカ酸含有ナタネ品種であるキャノーラ種がナタネの作付面積の大半を占めるようになり、エルカ酸の原料供給量が低下している。【０００４】
そこで、ナタネに代わるエルカ酸の原料開発が急務となっている。しかし、植物種子等に由来する油脂には、通常、エルカ酸以外の長鎖脂肪酸が多量に含まれており、工業利用に際しては、エルカ酸以外の脂肪酸を分離しなければならない。したがって、エルカ酸を効率的に、また大量に生産するためには、原料の段階で脂肪酸組成が均質で、かつエルカ酸収量が高い植物種や品種が必要となる。ところが、そのような性質を有する植物種や品種は、非常に限定的であり、ナタネと同程度以下の労力とコストで同等以上の収量を得ることは難しい。さらに、エルカ酸蓄積量が多い新たな品種の開発にも、多大な時間と労力を要する。加えて、ナタネをはじめとする原料植物は、栽培可能な環境や耕作地が限定されている。一方で耕作地の拡大は、栽培管理の負担増大や環境破壊という問題を伴う。【０００５】
上記問題を解決するために、近年、炭化水素産生藻類が注目されている。炭化水素産生藻類とは、栄養源を資化する過程で長鎖脂肪族炭化水素を生合成する能力を有する微細藻類である。炭化水素産生藻類の多くは、特段の施肥や温度管理を要することなく培養池等で大量培養が可能である。また、生産される長鎖脂肪酸は、光合成によって固定化された大気中の二酸化炭素に由来することから、温室効果ガスの削減や地球温暖化の防止にも繋がり得るという利点を有する。さらに食用植物油脂と競合することがないため、安定的な原料供給が可能である。【０００６】
しかし、炭化水素産生藻類は、一般に長鎖脂肪酸の細胞内蓄積量が少なく、収量が低いという問題がある。また、Botryococcus braunii（ボツリオコッカス・ブラウニー）のようにテルペン系炭化水素を細胞内に大量に蓄積する藻類は、増殖に時間を要し、バイオマス生産効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Koletzko B. et al., 2005, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 41(5):584-99.
【非特許文献２】Sonntag N.O.V., 1991, Informatics 5:449-463.
【非特許文献３】Leonard C., 1994, Lipid Tech 4:79-83.
【非特許文献４】Pizza G.J., and Foglia T.A., 2001, Eur J Lipid Sci Technol, 103:405-454.
【非特許文献５】Leung D.T. and Sacks S.L., 2004, Expert Opin Pharmacother 5(12):2567-2571.
【非特許文献６】Katz D., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(23): 10825-10829.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、特定の長鎖脂肪酸の含有量が高く、かつバイオマス生産効率が高い生物由来の原料を開発し、提供することである。また、その原料生物を用いて、特定の長鎖脂肪酸を容易に、安定的に、かつ大量に生産する方法を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、炭化水素産生藻類の一群であるクロレラ科藻類に着目した。クロレラ科藻類は、培養が容易で、増殖速度も速いことからバイオマス生産効率が高い。さらに、硫黄源欠乏条件下で培養すると、中性脂質を蓄積するという性質を有する（Mizuno, Y., et al., 2013, Bioresour. Technol., 129: 150-155. doi:10.1016/j.biortech. 2012.11.030）。この蓄積機構の詳細については明らかにされていないが、本発明者らは、硫酸イオン（SO42-）の代謝との関連性を仮定した。つまり、硫酸イオンの代謝経路を欠損することによって、その代謝産物であるシステインを生合成できなくなった変異株（システイン要求性変異株）は、システインを含まない通常の生育培地では常時、硫黄源欠乏状態と同じ状態となり、硫黄源欠乏条件にすることなく細胞内に脂質を蓄積するのではないかと予測した。そこで、Parachlorella kessleri（パラクロレラ・ケスレリ）を用いて、重イオンビームを変異原として突然変異誘発処理を行い、システイン要求性変異株を作出した。その結果、システイン要求性変異株であるPk 3A7株（又はSrp1株；以下本明細書では3A7株と表記する）及びPk YY7株（又はSrp2株；以下本明細書ではYY7株と表記する）は、予測通りシステイン非添加条件下で細胞内に脂質を蓄積した。特に3A7株はエルカ酸を総脂質量の60％以上も、またYY7株はオレイン酸を総脂質量の60％以上、及びネルボン酸を最大で約16％も蓄積することが明らかとなった。一方、システインを添加した培地では、両株共に野生型と同様に増殖し、細胞内にデンプンを蓄積した。これらの結果から、クロレラ科藻類のシステイン変異株は、システイン添加培地では増殖とデンプン蓄積を行い、システイン非添加の通常生育培地では構成的に長鎖脂肪酸を細胞内に蓄積する、という新たな知見を得た。これは、培地交換によって細胞増殖と長鎖脂肪酸の細胞内蓄積を容易にスイッチできることを意味する。本発明は、当該知見に基づくもので、以下を提供する。
（１）システイン非存在下で長鎖脂肪酸の生産を増加するクロレラ科（Chlorellaceae）藻類のシステイン要求性変異株。
（２）クロレラ科藻類がクロレラ属（Chlorella）藻類又はパラクロレラ属（Parachlorella）藻類である、（１）に記載の変異株。
（３）パラクロレラ属藻類が国際受託番号FERM BP-22268及びFERM BP-22288で示されるP. kessleriである、（２）に記載の変異株。
（４）クロレラ科藻類を変異原で処理する突然変異誘発工程、突然変異誘発工程後のクロレラ科藻類をシステイン添加培地のプレートに塗布し、コロニー形成するまで培養するコロニー形成工程、プレート状に形成された単一コロニー由来のクロレラ科藻類をシステイン添加培地のプレートとシステイン非添加培地のプレート上でそれぞれ培養するシステインストレス培養工程、システイン添加培地のプレートで増殖し、システイン非添加培地のプレートでは増殖しない株を候補株として選択する候補株選択工程、前記候補株をシステイン添加培地のプレートとシステイン非添加培地のプレート上で再度培養する確認培養工程、及びシステイン非添加培地のプレートで増殖しない候補株をシステイン要求性変異株として選択するシステイン要求性変異株選択工程を含む長鎖脂肪酸生産性クロレラ科藻類の作出方法。
（５）変異原がアルキル化剤又は放射線である、（４）に記載の作出方法。
（６）放射線が重イオンビームである、（５）に記載の作出方法。
（７）（１）〜（３）のいずれかに記載のシステイン要求性変異株をシステイン添加培地で15〜35℃にて対数増殖期〜静止期まで培養する前培養工程、及び前培養工程で得られた細胞を栄養ストレス付与培地で10日〜30日間培養するストレス付与工程を含む長鎖脂肪酸生産方法。
（８）ストレス付与工程後の細胞から長鎖脂肪酸を物理的方法及び／又は化学的方法により抽出する抽出工程をさらに含む、（７）に記載の生産方法。
（９）栄養ストレス付与培地がシステイン非添加培地である、（７）又は（８）に記載の生産方法。
（１０）（３）に記載の国際受託番号FERM BP-22268で示されるP. kessleriの変異株を用いてエルカ酸を生産する、（７）〜（９）のいずれかに記載の生産方法。
（１１）（３）に記載の国際受託番号FERM BP-22288で示されるP. kessleriの変異株を用いてオレイン酸及びネルボン酸を生産する、（７）〜（９）のいずれかに記載の生産方法。【００１０】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-152376号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のクロレラ科藻類のシステイン要求性変異株は、培地中のシステインの有無により増殖及びデンプンの細胞内蓄積と、長鎖脂肪酸の細胞内蓄積をスイッチできる。この性質を利用して、当該変異株を用いて長鎖脂肪酸を効率的に生産することができる。【００１２】
本発明の長鎖脂肪酸生産方法によれば、システインに関して異なる組成の培地に交換することで、クロレラ科藻類のシステイン要求性変異株における増殖と長鎖脂肪酸の細胞内蓄積を制御し、目的の長鎖脂肪酸を少ない工程で容易かつ効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】P. kessleriの野生株（WT）と3A7株のCys培地（硫黄(S)低濃度システイン(cys)添加培地）での成長曲線を示す。培養条件は、明:暗＝12hr:12hr、光強度（光量子束密度）が150μmol・m-2・s-1である。
【図１Ｂ】P. kessleriの野生株（WT）と3A7株のTAP培地（S含有cys非添加培地）での成長曲線を示す。培養条件は、明:暗＝12hr:12hr、光強度が150μmol・m-2・s-1である。
【図２】P. kessleriの野生株（WT）と3A7株をTAP培地、及びSTAP培地（S欠乏cys非添加培地）で培養したときの培養時間と細胞の乾燥重量の関係を示す。
【図３】P. kessleriの野生株（WT）及び3A7株をTAP培地、STAP培地、TAP＋cys培地（S含有cys添加培地）及びCys培地（S低濃度cys添加培地）で10日間培養したときの細胞あたりの総脂質量を示す。
【図４】P. kessleriの野生株（WT）と3A7株の細胞内に蓄積された脂質（長鎖脂肪酸）の組成比を示す。図の横軸に示した培地で本培養を8日間行った。脂肪酸の同定は、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）を用いて行った。
【図５】P. kessleriの野生株（WT）と3A7株の細胞内に蓄積された脂質（長鎖脂肪酸）の組成比を示す。図の横軸に示した培地で本培養を10日間行った。脂肪酸の同定は、GC-MSを用いて行った。
【図６】P. kessleriの野生株（ａ、ｂ）、3A7株（ｃ、ｄ）及びYY7株（ｅ、ｆ）をCys培地（S低濃度cys添加培地）で前培養した後、TAP培地に移して本培養したときの細胞内に蓄積された脂質（長鎖脂肪酸）の組成比（％）（ａ、ｃ、ｅ）及び細胞あたりの各脂質量を示す。横軸は、本培養を開始後の経過日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．クロレラ科藻類システイン要求性変異株
１−１．概要
本発明の第１の態様は、クロレラ科藻類のシステイン要求性変異株である。本発明の変異株は、システイン非存在下で培養することで細胞内の長鎖脂肪酸蓄積量を増加する。それ故、本発明の変異株を用いて、長鎖脂肪酸を容易かつ効率的に生産することができる。
１−２．構成
本発明のクロレラ科藻類システイン要求性変異株は、クロレラ科藻類のシステイン代謝系に異常を有する栄養要求性変異株で構成される。
【００１５】
「クロレラ科（Chlorellaceae）藻類」とは、トレボウキシア藻綱（Trebouxiophyceae）クロレラ目（Chlorellales）に属する緑藻植物である。不動性の単細胞生物（群体を含む）であり、多くの種は、水中で浮遊生活を送っている。クロレラ科藻類には、例えば、クロレラ属（Chlorella）藻類、及びパラクロレラ属（Parachlorella）藻類等が含まれる。クロレラ属藻類の具体例としては、C. pyrenoidosa（C.ピレノイドーサ）、C. sorokiniana（C.ソロキニアナ）、C. lobophora（C.ロボフォラ）、C. vulgaris（C.ブルガリス）が挙げられる。また、パラクロレラ属藻類の具体例としては、P. kessleriが挙げられる。
【００１６】
クロレラ科藻類は、炭化水素産生藻類で、光合成により生合成されたデンプンを資化する経路において、長鎖脂肪酸を生合成することができる。また、硫酸イオン（SO42-)欠乏条件下で細胞内に長鎖脂肪酸を蓄積する性質を有する。
【００１７】
本発明のクロレラ科藻類システイン要求性変異株として好ましいクロレラ科藻類は、上記性質を有する種であれば、特に限定はしないが、培養が容易で、倍加時間が短く、大量培養が可能で、またバイオマス生産効率の高い種が好ましい。好ましい例として、P. kessleriが挙げられる。
【００１８】
「システイン要求性変異株」とは、上述のようにシステイン代謝系に異常を有する栄養要求性変異株である。光合成独立栄養生物であるクロレラ科藻類の野生株は、硫酸イオン代謝経路を介してL-システイン（2-Amino-3-mercaptopropanoic acid）（本明細書では、「システイン」と表記する）を生合成できる。本発明のシステイン要求性変異株は、硫酸イオンからシステインに至る代謝経路での欠損によりシステインの生合成能を欠失した変異株が該当する。システイン非添加培地で生育できない変異株であればよく、前記代謝経路のいずれの経路に異常を生じているかは問わない。
【００１９】
本明細書において「クロレラ科藻類システイン要求性変異株」（本明細書では、しばしば「cys変異株」と表記する）とは、クロレラ科藻類のシステイン要求性変異株をいう。cys変異株は、システイン非添加培地では生育できないが、システインを含む培地では、生育可能であることを特徴とする。cys変異株の具体例として、P. kessleriのシステイン要求性変異株であり、国際受託番号FERM BP-22268で示される3A7株、又は国際受託番号FERM BP-22288で示されるYY7株が挙げられる。国際受託番号FERM BP-22268のP. kessleri 3A7株は、2014年4月8日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国内寄託された株を2015年7月14日付で、国際寄託機関である同センターに寄託されている。また、国際受託番号FERM BP-22288のP. kessleri YY7株は、2015年7月14日付で、国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託されている。
【００２０】
「長鎖脂肪酸」（長鎖脂肪族炭化水素、又は高級脂肪酸）とは、通常、一般式R-COOHで示される脂溶性の脂肪酸をいう。本明細書における長鎖脂肪酸は、特に前記一般式においてRが9≦C≦29のアルキル基を示す炭素数10〜30の脂肪酸を意味する。好ましくは19≦C≦29のアルキル基を示す炭素数20〜30の脂肪酸である。本明細書において、長鎖脂肪酸の炭素鎖の形状は問わない。直鎖状であっても、分枝鎖状であってもよい。また、本明細書において長鎖脂肪酸は、炭素鎖に二重結合のない飽和脂肪酸、及び二重結合を1つ以上含む不飽和脂肪酸のいずれも包含する。本発明の対象となる長鎖脂肪酸の具体例としては、飽和脂肪酸であればC10:0（炭素数10；二重結合数0、以下同様）のカプリン酸（デカン酸）、C12:0（炭素数12；二重結合数0、以下同様）のラウリン酸（ドデカン酸）、C14:0のミリスチン酸（テトラデカン酸）、C15:0のペンタデシル酸（ペンタデカン酸）、C16:0のパルミチン酸（ヘキサデカン酸）、C17:0のヘプタデカン酸（マルガリン酸）、C18:0のステアリン酸（オクタデカン酸）、C20:0のアラキジン酸（イコサン酸）、C22:0のベヘン酸（ドコサン酸）、C24:0のリグノセリン酸（テトラコサン酸）、C26:0のセロチン酸（ヘキサコサン酸）、C28:0のモンタン酸（オクタコ酸）、C30:0のメリッシン酸（トリアコンタン酸）が挙げられる。また、不飽和脂肪酸であれば、C16:1のパルミトレイン酸（ヘキサデセン酸）、C18:1のオレイン酸（オクタデセン酸）、C18:2のリノール酸（オクタデカジエン酸）、C18:3のリノレン酸（オクタデカトリエン酸）、C20:1のガドレイン酸（イコサエン酸）、C20:4のアラキドン酸（イコサテトラエン酸）、C20:5のエイコサペンタエン酸（EPA)、C22:1のエルカ酸（ドコサエン酸）、C22:5のドコサペンタエン酸（DPA)、C22:6のドコサヘキサエン酸（DHA)、C24:1のネルボン酸（テトラコサエン酸）等が挙げられる。
【００２１】
本発明のcys変異株は、栄養ストレス条件下で培養することにより、前記長鎖脂肪酸を生合成し、細胞内に多量に蓄積する性質を有する。本明細書において「栄養ストレス」とは、硫黄ストレス又はシステインストレスをいう。具体的には、硫黄源欠乏ストレス、低濃度硫黄ストレス、低濃度システインストレス、及びシステイン欠乏ストレスが該当する。例えば、前記P. kessleri 3A7株であれば、システイン欠乏ストレスを付与するシステイン非添加培地、好ましくは後述するTAP培地のように硫黄含有システイン非添加培地、で培養することにより、長鎖脂肪酸としてC22:1のエルカ酸を細胞内における総脂質量の60％以上の含有率で蓄積することができる。また、前記P. kessleri YY7株であれば、システイン欠乏ストレスを付与するシステイン非添加培地、好ましくは後述するTAP培地のように硫黄含有システイン非添加培地、で培養することにより、細胞内総脂質量における含有率60％以上でC18:1のオレイン酸を、また最大約16％でC24:1のネルボン酸を蓄積することができる。
１−３．クロレラ科藻類システイン要求性変異株の作出
本発明のクロレラ科藻類システイン要求性変異株は、自然突然変異によりシステイン要求性となったクロレラ科藻類変異株を自然界から単離してもよいが、クロレラ科藻類に突然誘発処理を施した後、システイン添加及び非添加培地での培養により人為的に作出することもできる。
【００２２】
システイン要求性変異株を人為的に作出する場合、突然誘発処理を施すクロレラ科藻類の種類は、特に限定はしないが、培養が容易で、倍加時間が短く、バイオマス生産効率の高い種が好ましい。例えば、1日当たりの1L中の細胞増加重量（g/L/day)が0.1g以上、好ましくは1g以上の種である。このような種として、例えば、C. pyrenoidosa（2.90〜3.64 g/L/day）、C. sorokiniana（0.23〜1.47 g/L/day）、P. kessleri（1.29 g/L/day）等が挙げられる。また、長鎖脂肪酸の生産量が高い種ほど好ましい。例えば、1日当たりの1L中の長鎖脂肪酸生産量（g/L/day)が0.05g以上、好ましくは0.1g以上の種である。このような種としては、例えば、C. vulgaris（0.3 g/L/day）、P. kessleri（0.48〜0.59 g/L/day）等が挙げられる。したがって、P. kessleriは、本発明のシステイン要求性変異株作出用クロレラ科藻類として特に好ましい種である。突然誘発処理に用いるクロレラ科藻類は、対数増殖期に培地から回収した細胞を用いるのが好ましい。クロレラ科藻類の培養は、原則として淡水性クロレラ属（又は淡水性微細藻類）の一般的な培養方法（参照：微生物の保存法, 1977, 根井外喜男編, 東京大学出版会）に準じて行えばよい。
【００２３】
突然誘発処理の変異原には、公知の変異原を用いればよい。例えば、突然変異誘発剤や放射線が挙げられる。
【００２４】
突然変異誘発剤による突然誘発は、クロレラ科藻類を突然変異誘発剤の溶液に所定の時間接触することで達成できる。突然変異誘発剤には、メタンスルホン酸エチル（EMS)、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG)等のアルキル化剤を用いることができる。突然変異誘発剤の濃度や接触時間は、突然変異誘発剤の種類、クロレラ科藻類の種類、生存率等を勘案して適宜定めればよい。具体的な方法については、例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参照すればよい。
【００２５】
放射線による突然誘発は、クロレラ科藻類を放射線で所定の時間照射することで達成できる。放射線には、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、X線、紫外線の他、重イオンビーム（例えば、12C、14N、20Ne、40Ar、56Fe）等が挙げられる。一般に放射線は、LET（Linear Energy Transfer；線エネルギー付与）が大きいほど変異率が高い。LETとは、放射線が物質中を通過する際、飛程に沿って単位長さあたりに平均して失う（対象に与える）エネルギー（keV/mm）をいう。LETは、線質によって異なる。例えば、ガンマ線やX線のLETは、低く0.2〜2 keV/mmであり、重イオンビームのLETは高く、23〜4000である。適当な変異率を得るためには、低LETの線質ほど多くの吸収線量を必要とするが、反面、吸収線量が高くなると生存率は低下する。したがって、放射線による突然誘発は、放射線の線質に応じて吸収線量を適宜定めればよい。ガンマ線やX線の場合、半致死線量でDNA一本鎖切断や点突然変異等を誘発することができる。また、重イオンビームの場合、稔性、及び生存率への影響がない、又は極めて低い線量域で好適な突然変異を誘発することができる（Ota et al., 2013, Bioresour. Technol. 149: 432-438）。
【００２６】
突然誘発処理後の細胞は、洗浄後、システイン添加培地のプレートに塗布し、適当な生育条件下（例えば、後述する第２態様の長鎖脂肪酸生産方法における前培養工程に記載の条件と同様の条件下）でコロニーを形成させる。コロニーは、直径2mm〜5mmのサイズまで形成させればよい。その後、TAP培地等のシステイン非添加培地のプレートに前記コロニーをセルロースフィルターや滅菌布を用いて転写してレプリカを取るか、又はスパチュラ又は白金耳等で同一コロニー由来の細胞からピックアップしてシステイン添加及び非添加培地のプレート上の同位置区画に移植する。再度適当な生育条件下で培養後、システイン添加プレート上では増殖してコロニーを再形成するが、システイン非添加プレート上では増殖せず、コロニーを形成できない株を候補株として選択する。
【００２７】
候補株を、増殖した前記ステイン含有培地のプレートから採取し、システイン添加及び非添加培地のプレート上の同位置区画に再度移植する。その後、システイン非添加培地のプレート上でのみ生育しないことを再確認する。上記方法で得られたクロレラ科藻類を本発明のクロレラ科藻類システイン要求性変異株とする。cys変異株が生合成し、蓄積する長鎖脂肪酸の同定が必要であれば、cys変異株をTAP培地等の栄養ストレス条件下で培養後、公知方法で細胞内の長鎖脂肪酸を同定すればよい。長鎖脂肪酸を同定及び定量する方法は、特に限定はしない。例えば、質量分析法又はNMR法を利用することができる。質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）を含む。これらの分析方法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962、Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(27) 10205-10210、Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163、又はShimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931を参照にすればよい。栄養ストレス条件下で、各cys変異株がいずれの長鎖脂肪酸を生合成し、細胞内に蓄積するかを予め調べておき、データ化しておくことで、第２態様の長鎖脂肪酸生産方法において、脂肪酸組成が均質で目的の長鎖脂肪酸の含有量が高いcys変異株を必要とする場合、データベース内のcys変異株群の中から直ちに選択することが可能となる。例えば、P. kessleri 3A7株はエルカ酸の含有量が高いcys変異株として、またP. kessleri YY7株はオレイン酸やネルボン酸の含有量が高いcys変異株として、利用することができる。
１−４．効果
本発明のcys変異株は、培養が容易で、また栄養ストレス条件下では多量の長鎖脂肪酸を生合成し、細胞内に蓄積する。それ故、本発明のcys変異株を用いることで、長鎖脂肪酸の容易かつ安価な生産が可能となる。
【００２８】
本発明のcys変異株の作出方法によれば、システインの栄養要求性を指標として、多大な試行錯誤を必要とすることなく、比較的容易に目的のcys変異株を作出することができる。
２．長鎖脂肪酸生産方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、長鎖脂肪酸生産方法である。本発明の生産方法は、前記第１態様に記載のクロレラ科藻類システイン要求性変異株を用いて長鎖脂肪酸を生産する。本発明の生産方法によれば、容易かつ安価に、また安定的に長鎖脂肪酸を提供することができる。
２−２．生産方法の構成
本発明の長鎖脂肪酸生産方法は、前培養工程及びストレス付与工程を必須工程として、また抽出工程を選択工程として含む。以下、各工程について、具体的に説明をする。
（１）前培養工程
「前培養工程」は、第１態様に記載のクロレラ科藻類システイン要求性変異株をシステイン添加培地で培養する、本生産方法において必須の工程である。前培養工程は、cys変異株の増殖及び細胞内のデンプンの蓄積を目的とする。これは、次のストレス付与工程で使用する栄養ストレス付与培地ではcys変異株がほとんど増殖できないため、また長鎖脂肪酸は細胞内に蓄積されたデンプンを変換して合成され、その量はデンプン量と反比例関係にあるためである。
【００２９】
本明細書において「システイン添加培地」とは、システインを含むクロレラ科藻類の生育培地をいう。このような生育培地には、低濃度硫黄培地にシステインを添加したシステイン培地（本明細書では、しばしば「Cys培地」と表記する）や基礎生育培地にシステインを添加した培地が挙げられる。
【００３０】
前記Cys培地の組成例として、NH4Cl 40mg, CaCl2・2H2O 5.1mg, MgCl2・6H2O 25.3mg, K2HPO4 11.9mg, KH2PO46.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL（pH6.5〜6.8）（ここで、Hutner's trace elements：Na2EDTA・2H2O 5g, ZnSO4・7H2O 2.2g, H3BO3 1.14g, MnCl2・4H2O 506mg,FeSO4・7H2O 499mg, CoCl2・6H2O 161mg, CuSO4・5H2O 157mg, (NH4)6Mo7O24・4H2O 110mg, Distilled water 100mL）で示される低濃度硫黄培地に再終濃度1μg/mLでシステインを添加したものが挙げられる。また、基礎生育培地の組成は、野生型クロレラ科藻類が生育可能な培地であれば、特に限定はしない。例えば、硫酸（S)のみを硫黄源として含むTAP培地（NH4Cl 40mg, CaCl2・2H2O 5.1mg, MgSO4・7H2O 10mg, K2HPO4 11.9mg, KH2PO46.03mg, Hutner's trace elements(前述) 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL）（pH6.5〜6.8）が挙げられる。システインの添加量は、500ng/mL〜100μg/mLであればよい。好ましくは、1μg/mLである。
【００３１】
培養温度は、cys変異株が増殖可能な温度であればよい。通常は、野生型クロレラ科藻類と同じ15〜35℃、好ましくは18〜30℃、より好ましくは20〜28℃の範囲内である。
【００３２】
クロレラ科藻類は光合成を行うため、培養は曝光下で行う。曝光時の光量子束密度は、5〜150μmol・m-2・s-1、好ましくは25〜100μmol・m-2・s-1の範囲にあればよい。なお、光量子束密度は、1秒間、光が照射された面に含まれる全光子数を受光面積で除した値である。曝光は、連続照射であっても、明暗期を有する間断照射であってもよい。間断照射の場合、明暗期間は特に限定はしないが、例えば、明期8時間：暗期16時間（「8hr:16 hr」と表記する。以下同様とする。）〜16hr:8hr時間の範囲でよい。10hr:14hr〜14hr:10hrの範囲が好ましい。通常は12hr:12hrで行えばよい。クロレラ科藻類の光合成には、600〜750 nmの光と400〜500 nmの光が有効である。したがって、光源は、光合成に寄与するこれらの波長スペクトル光を放射可能であれば、特に制限しない。太陽光以外にも、蛍光灯、水銀灯、メタルハライドライト等が挙げられる。また、LED（Light Emitting Diode：発光ダイオード）のように、特定の波長にスペクトルピークを有する単色光を放射する光源であれば、前記波長スペクトルの範囲にスペクトルピークを有する複数種のLEDを組み合わせて本工程の光源として使用してもよい。
【００３３】
本工程の培養期間は、システイン添加培地に接種したcys変異株が対数増殖期〜静止期に達するまで行う。対数増殖期は、細胞の高い増殖率が維持されながら、かつ多数の細胞を回収可能な後期対数増殖期が好ましい。また静止期は、増殖率が極めて緩やかな増加から0に達するまでの期間で、死細胞や衰弱した細胞の出現率が比較的低い前期静止期が好ましい。具体的な培養期間は、cys変異株、培地、培養温度等によって変動するが、例えば、P. kessleri 3A7株の場合、Cys培地で18〜25℃の条件下であれば、2〜14日、好ましくは6〜12日である。
【００３４】
本工程では、前培養期間を通して、又は定期的若しくは不定期に、必要に応じて培地を撹拌してもよい。撹拌手段は問わない。例えば、撹拌棒等の撹拌装置を用いてもよいし、培養槽を反転、回転、振動することで培地を撹拌してもよい。
【００３５】
また、必要に応じて、二酸化炭素を培地に添加してもよい。
（２）ストレス付与工程
「ストレス付与工程」は前培養工程で得られたcys変異体の細胞を栄養ストレス付与培地で培養する、本生産方法において必須の工程である。本工程は、前培養工程で増殖させ、また細胞内にデンプンを蓄積させたcys変異株を栄養ストレス条件下に移すことによって、細胞内で長鎖脂肪酸を生合成させ、その後蓄積させることを目的とする。
【００３６】
栄養ストレスとは、前述のように、硫黄源欠乏ストレス、低濃度システインストレス、及びシステイン欠乏ストレスが該当する。硫黄源欠乏ストレスは、硫酸イオン（SO42-)のような硫黄源（S）の欠乏下でcys変異体を培養することで付与できる。また、低濃度システインストレスは、cys変異株の生育及び／又は増殖に必要なシステイン濃度未満の培地でcys変異体を培養することで付与できる。そして、システイン欠乏ストレスは、システイン非存在下でcys変異体を培養することで付与できる。本工程において、好ましい栄養ストレスは低濃度システインストレス又はシステイン欠乏ストレスであり、より好ましい栄養ストレスはシステイン欠乏ストレスである。
【００３７】
「栄養ストレス付与培地」とは、cys変異体に栄養ストレスを付与する培地をいう。例えば、栄養ストレスが硫黄源欠乏ストレスであれば、硫黄源欠乏培地（S欠培地）が該当する。具体的には、例えば、TAP培地におけるHutner's trace elementsのZnSO4及びFeSO4をそれぞれZnCl2及びFeCl2に置換して、培地から硫酸イオンを完全に除いたSTAP培地（Takeshita et al., 2014, Bioresour Technol. 158:127-34.）が挙げられる。また、栄養ストレスが低濃度システインストレスであれば、低濃度システイン培地（低Cys培地）が該当する。具体的には、システイン濃度が0.001〜0.01μg/mL以下のCys培地が該当する。そして、栄養ストレスがシステイン欠乏ストレスであれば、システイン非添加培地、例えば前述の硫酸イオンのみを硫黄源として含むTAP培地が該当する。
【００３８】
本工程では、前培養工程後の培養液からcys変異株の細胞を回収した後、栄養ストレス付与培地に細胞を植え継げばよい。細胞の回収は、前記培養液を常法により遠心又は濾過して、培地を除去することで達成できる。例えば、培養液を遠心機により適当な時間遠心した後、細胞スラリーを回収する方法や培養液を細胞サイズよりも小さい孔径を有する適当なフィルターを用いて培養液を除去する方法が挙げられる。回収した細胞は、必要に応じて水又は培地と同程度の浸透圧を有するバッファ若しくは生理食塩水で1回以上洗浄してもよい。
【００３９】
本工程での培養条件は、培養温度、明暗期等については、前培養工程に準じて行えばよい。培地の撹拌や二酸化炭素添加を行うこともできる。ただし、培養期間は、10日〜30日間、好ましくは5〜15日である。P. kessleri 3A7株及びYY7株の場合、TAP培地で20〜28℃の条件下であれば、14〜28日である。3A7株では、この工程により、細胞内でエルカ酸が、またYY7株では、オレイン酸やネルボン酸が生合成され、多量に蓄積される。
（３）抽出工程
「抽出工程」は、ストレス付与工程後のcys変異株の細胞から長鎖脂肪酸を抽出する抽出工程である。本工程は、選択工程であって、必要に応じて行えばよい。本工程の目的は、ストレス付与工程でcys変異株が生合成し、細胞内に蓄積した長鎖脂肪酸を抽出し、回収することを目的とする。
【００４０】
本工程では、まずストレス付与工程後の培養液からcys変異株の細胞を回収する。回収方法は、前記ストレス付与工程に記載の方法と同様でよい。その後、必要に応じて細胞を水又は培地と同程度の浸透圧を有するバッファ若しくは生理食塩水で1回以上洗浄してもよい。
【００４１】
本工程で使用する長鎖脂肪酸の抽出方法は、クロレラ科藻類等の炭化水素産生藻類から炭化水素を抽出するための当該分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。クロレラ科藻類は、通常、強固な細胞壁を有している。したがって、細胞から長鎖脂肪酸を効率的に抽出するには、回収したcys変異株を物理的方法及び／又は化学的方法で処理することが好ましい。
【００４２】
物理的方法としては、例えば、圧潰法、超音波法、又はその組み合わせによる抽出方法が挙げられる。
【００４３】
「圧潰法」とは、細胞に物理的圧力を付与して細胞壁を圧潰破砕し、細胞内の長鎖脂肪酸を抽出する方法である。圧潰法は、例えば、まず、回収した細胞をビーズミル又はグラインドミル等を用いて物理的にすり潰して破砕液を得る。具体的な条件や方法は、ミルの使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液をそのまま又は有機溶媒等を加えて遠心した後、長鎖脂肪酸を含む油相（有機溶媒相）を回収する方法である。使用する有機溶媒は、低極性又は非極性の水非混和性媒体であればよく、n-ヘキサン若しくはn-ヘプタンのような炭素数6〜10の脂肪族若しくは脂環式炭化水素又はベンゼンのような炭素数6〜10の芳香族炭化水素が好ましく、ヘキサン又はn-ヘプタンがより好ましい。
【００４４】
「超音波法」とは、超音波によって細胞壁を破砕し、細胞内の長鎖脂肪酸を抽出する方法である。超音波法は、例えば、まず、回収した細胞を水又はバッファ等の適当な溶液に懸濁した後、超音波破砕装置（ソニケーター）を用いて適当な発振周波数と出力で細胞を破砕する。具体的な条件や方法は、超音波破砕装置の使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液から前記圧潰による抽出方法と同様に長鎖脂肪酸を回収する方法が挙げられる。
【００４５】
化学的方法としては、例えば、酵素法が挙げられる。
【００４６】
「酵素法」とは、酵素によって細胞壁を溶解し、細胞内の長鎖脂肪酸を抽出する方法である。酵素方法では、例えば、Cellulase R-10、Hemicellulase、Lysozyme、α-Mannosidase、及びβ-Mannosidaseのカクテルを使用すればよい。酵素処理をする場合、まず、細胞を使用する酵素の至適条件下で処理する。その後、必要に応じて酵素処理溶液中のタンパク質を変性除去し、残った溶液から前記圧潰による抽出方法と同様に長鎖脂肪酸を回収する方法である。
（４）分離工程
有機溶媒に溶解した長鎖脂肪酸の回収方法又は精製方法は当該分野で公知の方法を用いればよく、特に限定はしない。例えば、エステル化やアルカリ等によって鹸化し、分溜する方法が挙げられる。また、特開平8-9981に開示の発明を利用することもできる。
２−３．効果
本発明の長鎖脂肪酸生産方法によれば、従来法で行われていた植物油脂の加水分解工程を必要とせず、細胞の培地を変えるだけで生産することができる。長鎖脂肪酸を、少ない工程で効率的に生産することができるため、生産コストの低減が可能となり、長鎖脂肪酸を安価で提供することができる。
【００４７】
また、細胞中のデンプン蓄積量と長鎖脂肪酸蓄積量は、トレードオフの関係にあることから、それぞれを蓄積する培地での培養期間を調節することによって、細胞内に蓄積される長鎖脂肪酸量を制御することができる。
【００４８】
さらに、本発明の長鎖脂肪酸生産方法は、クロレラ科藻類を原料とすることから、油脂用植物の作付量や生産量に左右されず、また食用としての植物油と競合問題も発生しないことから原料を安定的確保できる。
【実施例】
【００４９】
＜実施例１：クロレラ科藻類のシステイン要求性変異株の分離＞
（目的）
クロレラ科藻類に突然変異誘発処理を施し、システイン要求性変異株を分離する。
（方法）
Ａ.クロレラ科藻類の培養
P. kessleriは、直径5〜10μmのほぼ球形をした淡水性単細胞緑藻類で、クロレラ科藻類としてはやや大形な部類に属する。野生株は、TAP培地で容易に増殖し、培養は極めて易しい。また、含油量が他のクロレラ科藻類よりも比較的高く、増殖速度も速いことからバイオマス生産効率も高い。そこで、システイン要求性変異株の分離用クロレラ科藻類には、P. kessleriの野生株（WT）を用いた。国立環境研究所（つくば；日本）から入手したP. kessleri 野生株（N-2152株）を40mLのTAP培地に接種し、光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で1〜2週間静置培養した。この培養液を100mLのTAP培地に播種して同条件で5日間再度培養した。
Ｂ．突然変異誘発処理
培養液を8連チューブ（Rikaken）に200mLずつ分配し、RIBF(RI-Beam Factory)（理化学研究所;和光；日本）で培養液に重イオンビーム照射を行い、P. kessleriに突然変異誘導処理を行った。照射ビームには56Feイオン（LET=645keV/μm）を用いた。重イオン照射後の株を500枚のCys-1.5％寒天培地（Cysプレート）に塗布し、12hr:12hrの明暗期を与えて23℃で、コロニーが形成されるまで、14日間程培養した。
Ｃ．システイン要求性変異株の選抜
プレートから滅菌爪楊枝で単一コロニーを掻き取り、Cys培地とTAP培地を入れた寒天プレート（それぞれCysプレートとTAPプレート）に接種した。この時用いた2つのプレートは、192方眼のマス目で区画され、各区画にアドレスが付与されている。総数約3,500の単一コロニーを2つの寒天プレートの同じアドレスの区画に重複して（duplicateで）接種した。光強度を50μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で約10日間静置培養した。【００５０】
藻類の成長を目視で確認し、Cysプレートでは増殖するがTAPプレートでは増殖していない株をシステイン要求性変異株の候補株として選択した。Cysプレートの対応するアドレスから滅菌爪楊枝を使って、予めCys液体培地を入れた24wellタイタープレート（Iwaki）に前記候補株を接種し、2週間静置培養して細胞数を増やした。滅菌爪楊枝の柄の先を使ってCys培地とTAP培地を入れた24ウェルの寒天平板プレートに培養液を再接種した。再び、12hr:12hrの明暗期を与えて23℃で10日間静置培養した。その後、再度、Cysプレートでは増殖するがTAPプレートでは増殖しない株を本発明のシステイン要求性変異株として単離した。
（結果）
P. kessleriのシステイン要求性変異株として、3A7株及びYY7株を得た。なお、前述のようにP. kessleri 3A7株は国際受託番号FERM BP-22268として、またYY7株は国際受託番号FERM BP-22288として2015年7月14日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託されている。
＜実施例２：P. kessleriのシステイン要求性変異株3A7株の基本性質の検証＞
（目的）
実施例１で得られたP. kessleriのシステイン要求性変異株である3A7株について、成長曲線、細胞の乾燥重量及び総脂質量等の基本性質について検証する。
（方法）
Ａ．成長曲線
P. kessleri 3A7株を100mLのTAP培地及びCys培地にそれぞれ接種し、光強度を150μmol・m-2・s-1として12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した。その間、毎日培養液を一部採取し、粒度分布測定装置（CDA-1000, シスメックス）を用いて細胞濃度を算出した。陽性対照としてP. kessleri 野生株（WT:N-2152株）を同条件で用いた。
Ｂ．乾燥重量及び総脂質量
P. kessleriの3A7株をTAP培地（硫黄含有システイン非添加培地）及びSTAP培地（硫黄欠乏システイン非添加培地）の2種の培地で培養し、それぞれの培地における培養期間と、乾燥重量の変化について調べた。また、TAP培地、STAP培地、TAP＋cys培地（硫黄含有システイン添加培地）及びCys培地（低濃度硫黄システイン添加培地）の4種の培地で培養し、それぞれの培地における培養期間と総脂質量の変化について調べた。培養は、光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した。乾燥重量の変化の検証では、培養2日後、4日後、7日後及び10日後に、また総脂質量の変化の検証では、培養3日後、5日後、7日後及び10日後に培養液の一部を採取した。【００５１】
乾燥重量は、次のように測定した。細胞懸濁液4mLを分取し、遠心分離によって上清を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを1mLのエタノールに再懸濁し、予め計量したアルミシャーレに入れて、105℃で3時間乾燥させた。乾燥前後の重量差を求めて乾燥重量とした。陽性対照としてP. kessleri 野生株（WT:N-2152株）を同条件で用いた。【００５２】
総脂質量は、次のように測定した。細胞懸濁液10mLを分取し、遠心分離によって上清を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを1.5mLメタノール、及び5mL MTBEの順で懸濁し、超音波により60秒間細胞を破砕した。破砕後、振盪機（DOUBLE SHAKER NR-30：タイテック）により150rpmで2時間振盪し、1.5mLの水を加えて水層と油層に分離した。上層の油層を予め計量したアルミシャーレに分取し、ドラフト内で一晩乾燥させた。乾燥前後の重量差を求め乾燥重量とした。陽性対照としてP. kessleri 野生株（WT:N-2152株）を同条件で用いた。【００５３】
また、培養10日後に各培地から細胞懸濁液1mLを分取し、遠心分離によって上清を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに1mM NileRed染色液（in DMSO）を加え、4分間ボルテックスにより良く撹拌した。染色後の細胞を蛍光顕微鏡（オリンパスBX52）を用いて観察した。細胞あたりの総脂質量は、測定した総脂質量を細胞数で割って算出した。総脂質量の測定方法は前項に記載の方法から、また細胞数は「Ａ．成長曲線」の項と同じ方法から求めた。
（結果）
Ａ．図１に結果を示す。3A7株は、システインを包含するCys培地では、野生株と同程度に増殖した(図１Ａ）。一方、硫黄を包含するがシステインを包含しないTAP培地では、野生株は正常に増殖したが、3A7株はほとんど増殖できず、システイン要求性変異株であることが確認された（図１Ｂ）。
Ｂ．P. kessleriの培養時間と乾燥重量の結果を図２に、また各培地で培養したP. kessleriの細胞あたりの脂質蓄積量を図３に示す。【００５４】
図２から野生株及び3A7株は、いずれも硫黄欠乏システイン非添加ストレス下のSTAP培地では乾燥重量、すなわちバイオマスが著しく低下することが明らかとなった。この結果は、硫黄欠乏によってP. kessleriの増殖が抑制されるため、バイオマスが低下することを示唆している。【００５５】
図３から3A7株の場合、TAP培地やSTAP培地のようなシステイン非添加培地で培養した場合には、細胞あたりの脂質蓄積量が著しく高くなることが明らかとなった。それに対して、システインを添加した完全培地（TAP+cys培地及びCys培地）では、細胞あたりの脂質蓄積量は低かった。一方、野生株の場合は、硫黄を欠乏しているSTAP培地で培養したときにのみ細胞あたりの脂質蓄積量が高かった。【００５６】
STAP培地のような硫黄欠乏システイン非添加培地は、細胞あたりの脂質蓄積量の点では好適であるが、バイオマスが著しく低下するため総脂質量は伸びない。したがって、本発明のシステイン要求性変異株であるP. kessleriの3A7株を、TAP培地のようなシステイン非添加培地での培養した場合に、細胞あたりの脂質蓄積量とバイオマスや総脂質量を高い値で維持できることから、脂質の生産効率が最も良いことが判明した。
＜実施例３：P. kessleri 3A7株における細胞内脂質の組成比＞
（目的）
P. kessleriの3A7株が細胞内に蓄積する脂質を同定し、培地による組成比の変化を同定する。
（方法）
P. kessleriの3A7株を100mLのCys培地で、光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した（前培養工程）。培養後、700gで10分間遠心（LOW SPEED CENTRIFUGE LC-121：TOMY）してスラリーを回収した。滅菌水で1回洗浄後、スラリーを100mLのTAP培地、STAP培地、TAP+cys培地、及びCys培地にそれぞれ移植し、これらを本培養とした。再度光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した（ストレス付与工程）。【００５７】
培養8日目及び10日目に、本培養の各培養液を30mL採取し、培養液中の脂肪酸を同定した。脂肪酸の同定にはGCMS-QP2010 Plus（島津製作所）を用いた。使用カラムは、SP-2380（シグマアルドリッチ社）で、標準試料Supelco 37 Component FAME Mix 10 mg/mL in methylene chloride (varied), analytical standard （シグマアルドリッチ社）により定性分析を行い、MS装置に内蔵されているライブラリによりMSで定性も行った。脂肪酸の割合は得られたピークの面積から検査する面積百分率法により求めた。
（結果）
図４に培養8日後の、また図５に培養10日後の、各培養液におけるP. kessleriの3A7株の細胞内脂質の組成比を示す。8日目、10日目ともに3A7株は、TAP培地で本培養を行ったときにC22:1のエルカ酸を最も多く細胞内に蓄積することが明らかとなった。その量は、培養10日目で63％にも達していた。P. kessleriの野生型は、硫黄源を欠乏したSTAP培地では、培養10日目で40％ほどのエルカ酸を含有していたが、TAP培地では10％程度しか含有していなかった。硫黄源は、培地中に様々な形態で含まれており、硫黄源欠乏培地によってエルカ酸の含有量を制御することは容易ではない。一方、クロレラ科藻類の野生型は、システインを生合成できることから、通常の生育培地にはシステインが添加されていない。それ故に、3A7株は、通常の生育培地にシステインを添加するか、しないかによって、細胞増殖及びエルカ酸の細胞内蓄積を容易に制御できる。
＜実施例４：P. kessleri YY7株における細胞内脂質の組成比＞
（目的）
P. kessleriのYY7株が細胞内に蓄積する脂質を同定し、野生株や他の変異株との脂質組成比の違いを検証する。
（方法）
基本的な操作は、実施例３に準ずる。まず、P. kessleriの野生株、3A7株、及びYY7株をそれぞれ100mLのCys培地で、光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した（前培養工程）。培養後、700gで10分間遠心（LOW SPEED CENTRIFUGE LC-121：TOMY）してスラリーを回収した。滅菌水で1回洗浄後、各株のスラリーを100mLのTAP培地に移植して、これを本培養とした。再度光強度を150μmol・m-2・s-1として、12hr:12hrの明暗期を与え、23℃で10日間静置培養した（ストレス付与工程）。【００５８】
本培養0、2、4、7及び10日目に、培養液を30mL採取し、培養液中の脂肪酸を同定した。脂肪酸の同定にはGCMS-QP2010 Plus（島津製作所）を用いた。使用カラムは、SP-2380（シグマアルドリッチ社）で、標準試料Supelco 37 Component FAME Mix 10 mg/mL in methylene chloride (varied), analytical standard （シグマアルドリッチ社）により定性分析を行い、MS装置に内蔵されているライブラリによりMSで定性も行った。脂肪酸の割合は得られたピークの面積から検査する面積百分率法により求めた。
（結果）
図５に結果を示す。ａ（野生株）、ｃ（3A7株）、及びｅ（YY7株）は、本培養開始後における細胞内脂質組成比の経時変化を示す。また、ｂ（野生株）、ｄ（3A7株）、及びｆ（YY7株）は、細胞内に蓄積した各脂質量の経時変化を示す。【００５９】
YY7株では、本培養期間中、C18:1のオレイン酸とC24:1のネルボン酸を安定的に得ることができた。本培養7日目でオレイン酸の蓄積量は細胞内全脂質量の約65％、またネルボン酸の蓄積量は約16％にも達することが判明した。また、3A7株とYY7株は、いずれもP. kessleriであり、共に本培養下で細胞内にオレイン酸を蓄積するが、3A7株はネルボン酸を全く蓄積せず、またYY7株はエルカ酸を全く蓄積しないことが明らかとなった。この結果は、本発明のシステイン要求性変異株が同じ種由来であっても、株種によって異なる長鎖脂肪酸を生産し得ることを示唆している。【００６０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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