(57)【要約】  本発明の課題は、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節でき、数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法を提供することである。本発明によれば、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下であり、リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下であり、
リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物。
【請求項２】
リポソームが、シングルラメラである請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
血漿中におけるリポソーム組成物からの薬物のリリース速度が、リポソーム組成物での初期の内包量に対して１０ｗｔ％／２４ｈｒ以上である請求項１又は２に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
リポソームを構成する脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含む請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
リポソームの平均粒子径が、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物。
【請求項７】
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
内包されなかった薬物水溶液を低張の液で置換することで内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して高張に調整する浸透圧調整工程
を有するリポソーム組成物の製造方法であって、
脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程において、リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下となるよう調整し、
浸透圧調整工程において、リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整するリポソーム組成物の製造方法。
【請求項８】
乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる請求項７に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【請求項９】
薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う請求項７又は８に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリポソーム組成物及びその製造方法に関する。本発明は、好適に医薬品用途として用いることのできるリポソーム組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソーム（以下、脂質小胞体ともいう）は、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。
リポソームは、バリア能、化合物保持能、生体適合性、粒径設定の自由度、易分解性、表面修飾性等の特徴を生かして、免疫センサー、人工赤血球、薬物送達システムのキャリヤーなど多様な応用が検討されてきた。キャリヤーの用途において、リポソームは、水溶性化合物、脂溶性低分子、高分子と幅広い物質を内包することができる。【０００３】
リポソームを特に薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、生体膜での透過の観点から、粒子サイズを２００ｎｍ程度以下にする必要がある。また、薬物送達システムのキャリヤーでは、哺乳類の体温である３７℃程度の温度条件下で分散性が良好な粒子を形成しているリポソームにする必要もある。特に、ナノサイズの微粒子については、凝集、沈降や薬物の漏出など様々な観点から、保存安定性を付与することが好ましい。【０００４】
薬物送達システムのキャリヤーとして、静脈内注射により薬剤（薬物を含むリポソームを含む溶液等）を投与する場合、静脈注射剤には高い安全性が求められる。クロロホルムなどの塩素系溶剤又は使用が認められていない分散助剤などの添加剤は好ましくない。また、医薬品としての安定性の付与も必要であり、保管後の薬物の漏出、脂質の分解抑制などが求められる。さらに、無菌性を保証するために、無菌ろ過に対する適性も求められる。リポソームを医薬品として工業的規模で製造方法するには、上記のような観点を考慮に入れる必要がある。【０００５】
特許文献１には、少なくとも一つの水溶性カンプトセシン及び少なくとも一つのフルオロピリミジンと安定に会合したリポソームを含む組成物であって、カンプトセシン／フルオロピリミジンのモル比が、細胞又は癌細胞ホモジネートに対して所望の細胞障害性、細胞分裂停止性、又は、生物学的効果を有する組成物が記載されている。また、リポソームがコレステロールを含み、それが２０モル％より少なく存在することが記載されている。しかし、リポソームの外水相及び内水相における浸透圧に関して記載はない。【０００６】
特許文献２には、リポソームがイリノテカン又はイリノテカン塩酸塩、中性リン脂質及びコレステロールを含有し、コレステロールと中性リン脂質との重量比が１：３〜５であるリポソームが開示されている。また、リポソームが、イリノテカン塩酸塩１、水素添加大豆ホスファチジルコリン３．４〜３．８、ポリエチレングリコール２０００−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン０．３４〜０．３８、コレステロール０．８〜０．９５の成分重量比であることが記載されている。しかし、リポソームの外水相及び内水相における浸透圧に関して明確な記載はない。リポソームの内部水相と外部水相との間に緩衝液によって形成されるイオン勾配を有しているが、薬物をローディングしているため外水相に対して高張になっている可能性はある。しかし、ローディング時にイオンが一定量漏出するため、イオン勾配差は大きくないと推定できる。さらにリポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、この成分重量比を換算すると、コレステロールの含有率が２９ｍｏｌ％以上３６ｍｏｌ％以下に相当することなる。この換算は、水素添加ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール２０００−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールの分子量を、それぞれ７８５、２７３０、３８７として計算した。なお、換算した値は上記の各成分重量比範囲において取り得るコレステロールの最小・最大比率である。【０００７】
上記のいずれの文献において、実用上必要な長期の保存安定性を有し、かつ、適切なリリース（放出）速度をもつリポソーム組成物及びその製造方法は十分確立されておらず、改良が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００６−５２２０２６号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１２２６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
リポソームの脂質膜に薬物を吸着させて保持するような方式では、疎水性相互作用、静電相互作用などの強固な相互作用により、リポソーム外に薬物が放出されにくくなる。そのため、製造後のリポソーム組成物の構成が維持でき、長期の保管安定性を担保しやすい。
この場合、相互作用が強すぎるため、患部に薬物を放出させることが困難になる。そこで、薬物をリポソームの内水相に溶解状態で内包することが理想的であり、さらにリポソーム組成物を高張の条件にすることで、リポソーム組成物からの薬物の放出を促進し、より適したドラッグデリバリーが実現できる。ただし、高張の条件にすることで、リポソーム組成物から薬物が漏出し易くなり、長期の保管安定性を担保することが困難であった。【００１０】
また、効果的に患部に薬剤を送達させる場合、リポソームの平均粒子サイズが１００ｎｍ以下の微粒子であることが好ましい。しかし、微粒子化することで、リポソームの膜の湾曲（曲率）が大きくなり、薬物を内包させることが困難であった。【００１１】
別の側面において、リポソームに含まれる薬物が抗がん剤である場合、がん細胞への攻撃が薬物の曝露時間に大きく影響されるものがある。例えば、ＤＮＡ合成を阻害する代謝拮抗剤のような薬物は、ＤＮＡ合成期にある一部の細胞だけを攻撃するため、曝露時間が短いと効果的な殺細胞性が得られない。そのような薬物において、投与後の体内代謝が速いと、腫瘍での充分な曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多い。
また、曝露時間を充分に得るために、希薄濃度の抗がん剤を点滴によって長時間曝露させる投与方法もあるが、患者が点滴時間中拘束されるなどＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ；生活の質）の観点において好ましくない。【００１２】
本発明は、上記に鑑みて、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節できるリポソーム組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、リポソーム組成物における脂質のコレステロール類の量を１０〜３５ｍｏｌ％の最適な範囲に設定することにより、内水相が高張であっても、薬物の放出性を適度に調節できるリポソーム組成物、及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下であり、
リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物である。【００１４】
本発明のリポソーム組成物において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、リポソームがシングルラメラである。
好ましくは、哺乳動物の血漿中におけるリポソーム組成物からの薬物のリリース速度が、リポソーム組成物での初期の内包量に対して２０ｗｔ％／２４ｈｒ以上である。
好ましくは、リポソームを構成する脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含む。
好ましくは、リポソームの平均粒子径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。【００１５】
本発明は、上記に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物である。【００１６】
本発明は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び内包されなかった薬物水溶液を低張の液で置換することで内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して高張に調整する浸透圧調整工程
を有するリポソーム組成物の製造方法であって、
脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程において、リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下となるよう調整し、
浸透圧調整工程において、リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整するリポソーム組成物の製造方法である。【００１７】
本発明のリポソーム組成物の製造方法において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる。
好ましくは、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリポソーム組成物によれば、実用上必要な長期の保存安定性を有し、リポソーム組成物における脂質のコレステロール類の量を１０〜３５ｍｏｌ％の最適な範囲に設定することにより、内水相が高張であっても、薬物の放出性を適度に調節できる（好ましくは数十時間のオーダーでの薬物のリリース制御ができる）リポソーム組成物、及びその製造方法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はコレステロール量と外水相率との関係をプロットしたものである。
【図２】図２はコレステロール量と外水相率との関係をプロットしたものである。
【図３】図３は時間とリリース速度との関係をプロットしたものである。
【図４】図４はインキュベーション時間と外水相率との関係をプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００２１】
「封入率」とは、リポソームの構成成分と薬物とを混入して、封入した薬物担体を形成するとき、混入した薬物（仕込み量）に対するリポソームに封入された薬物の比率（質量比またはｍｏｌ比）をいう。
「放出」とは、リポソームに封入された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出ることを意味する。
「放出率」とは、リポソームの構成成分と薬物とを封入したリポソームから外部へ出る薬物と、リポソームに封入された薬物との比率（重量比またはｍｏｌ比）をいう。
「リリース（放出）速度が遅い」とは、単位時間あたりにリポソームの外部へ出る薬物量が少ないことを意味する。
「血中滞留性」とは、リポソーム組成物（又はリポソーム組成物を含有する医薬組成物）を投与した対象（「被検体」又は「個体」であり、好ましくはヒト（患者）、マウス、サル、家畜などの哺乳動物）において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質（状態）を意味する。
「腫瘍」（本発明では、「がん（癌）」と同義で用いる）とは、具体的には食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、喉頭癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、カポジ肉腫などの固形腫瘍、また白血病などの液性腫瘍が挙げられる。腫瘍が発生する部位は、腫瘍の細胞、組織、器官または臓器及びそれらの内部などである。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
リポソーム組成物の脂質成分の合計量に対して、コレステロール類の含有率が１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％以下であり、
リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるリポソーム組成物である。
【００２４】
（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
【００２５】
リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相及び膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態などが挙げられ、これらの組合せでもよい。
【００２６】
リポソームの大きさ（平均粒子径）は特に限定されないが、２〜２００ｎｍであり、好ましくは５〜１５０ｎｍ、より好ましくは５〜１２０ｎｍであり、さらに好ましくは５〜１００ｎｍである。なお、本発明において、「平均粒子径」とは、光散乱法により測定されるリポソームの直径の平均値を意味する。
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
【００２７】
リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質として、具体的には、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種又は複数種の成分から構成されてよい。
【００２８】
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、又はこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。これらのなかでも、水素添加大豆ホスファチジルコリンなどの水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましく、水素添加大豆ホスファチジルコリンがより好ましい。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。
【００２９】
リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、特に限定されないがリン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。
【００３０】
リン脂質以外の脂質が塩基性官能基を含む場合、例えば、脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。
【００３１】
コレステロール類としては、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロール及びその誘導体を挙げることができる。具体例としては、特に限定されないがコレステロールが挙げられる。平均粒子サイズが１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。しかし、漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロールなどを添加することが有効である。
【００３２】
リポソーム組成物において、コレステロール類の添加は、リポソームの膜のすきまを埋めるなどして、リポソームの膜の流動性を下げる作用をすると期待される。一般には、リポソームにおいて、コレステロール類の量は、脂質成分の合計（総脂質）ｍｏｌ中、通常５０ｍｏｌ％程度までの量で含むことが望ましいとされている。高い浸透圧をもつリポソーム組成物において、リポソーム組成物の高い浸透圧条件と、コレステロール類の量との関係はこれまで不明であった。しかし、本発明では、リポソーム組成物の高い浸透圧条件において、コレステロール類の量を最適な範囲に制御することにより、哺乳動物における薬物放出率を調節できるという予想外の効果を見出した。本発明では、リポソーム組成物の脂質成分の合計（リポソーム組成物に含まれる総脂質）ｍｏｌ中、コレステロール類の含有率は１０〜３５ｍｏｌ％であり、好ましくは１５〜２５ｍｏｌ％、より好ましくは１７〜２１ｍｏｌ％である。
【００３３】
リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸、ジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤などの添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
【００３４】
本発明のリポソームには、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体として、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類を親水性高分子で修飾することが含有することが好ましい。
【００３５】
親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は最も汎用であり、血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。
【００３６】
ＰＥＧの分子量は、特に限定されない。ＰＥＧの分子量は５００〜１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００〜７，０００ダルトン、より好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンである。
【００３７】
本発明のリポソームでは、リポソームに含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ＰＥＧ修飾脂質）を用いることが好ましい。ＰＥＧ修飾脂質としては、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）及びジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。これらのＰＥＧ修飾脂質は、全脂質量に対して０．３〜５０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％含有するように添加すればよい。
【００３８】
本発明のリポソームでは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（リポソームに含まれる主たる脂質）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（主たる脂質と併用する脂質）、及びコレステロールの脂質の組合せが好ましい。
【００３９】
本発明のリポソーム組成物では、アニオンポリマー（ポリアニオン）を含まないことが好ましい。本発明では、内水相の浸透圧でリリース性をコントロールできるため、汎用性に優れ、リポソームに使用できる薬物が限定されることがないという利点を有する。
【００４０】
（薬物）
本発明のリポソームは、薬物として水溶性薬物の少なくとも一つを含むことができる。
水溶性薬物の場合、リポソームの内水相に保持する形態が有利となるが、脂質二分子膜は薄く、やわらかいために薬物が漏出しやすくなることがある。しかし、本発明のリポソームの製造方法によれば、粒子径を１００ｎｍ程度以下にしても、安全性及び安定性を有するリポソームが製造できる。
【００４１】
薬物に含まれる薬物は、リポソームに内包することのできる水溶性の薬物であればよく、具体的には、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、低分子化合物、糖類（オリゴ糖及び多糖）、高分子化合物、抗腫瘍剤、抗菌剤、造影剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、育毛剤等の生理活性又は薬理学的活性を有する水溶性の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームを薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、安定性の観点から、水溶性薬物は低分子化合物であることが好ましい。
【００４２】
水溶性薬物としては、具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンなどのアントラサイクリン系、シスプラチン、オキサリプラチンなどのシスプラチン系、パクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン系、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系、ブレオマイシンなどのブレオマイシン系、シロリムスなどのシロリムス系の抗がん剤、メトトレキセート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビン、ペメトレキセドなどの代謝拮抗剤等が挙げられる。これらのなかでも、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ペメトレキセド等の水溶性薬物が好ましい。
【００４３】
（溶解状態で内包した水溶性薬物）
本発明のリポソームに内包した水溶性薬物は、リポソームの内水相に溶解状態で存在している。ここで、溶解状態とは、リポソームの体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで薬物結晶が観察されない、ＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合は、脂質膜が作る物理化学的な環境による溶解促進や、一部薬物が脂質膜に取り込まれるなどして大部分が溶解していることを示し、溶解状態で内包されたものとみなす。また、リポソーム内部で固体物を形成させて、薬物を封入させるローディング方法により内包したものは、水溶性の高い薬物であっても、本発明でいう溶解状態ではない。
【００４４】
溶解状態で内包させる水溶性薬物としては、水に対して１ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものがより好ましい。
【００４５】
（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソームの製造方法は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する薬物トローディング工程
を有するリポソーム組成物の製造方法である。リポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程等、他の工程を含んでよい。
【００４６】
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化することでリポソームを形成する乳化工程では、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶剤を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
【００４７】
（乳化工程）
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化する。脂質が有機溶媒に溶解している油相及び水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相及び水相がＯ／Ｗ型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。又は、油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
【００４８】
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波又は機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理又はマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、薬物をローディングしない状態のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。
【００４９】
本発明では、撹拌の速度及び時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性及び安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ以上３５ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ以上３０ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることがより好ましい。
【００５０】
（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又はシクロヘキサンといった有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤をまったく用いないことがより好ましい。
【００５１】
水溶性有機溶媒は、特に限定されないが、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒は、具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類などが挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノール、及びｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
【００５２】
エステル系有機溶媒は、特に限定されないが、有機酸及びアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒は、具体的には、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチルがより好ましく、酢酸エチルがさらに好ましい。
【００５３】
水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合比率は、特に限定されないが質量比で、９０：１０〜３０：７０、好ましくは８０：２０〜４０：６０、より好ましくは８０：２０〜７０：３０であればよい。水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水又は緩衝液など下記に述べる水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば１〜３０質量％の範囲で加えられていてもよい。混合溶媒のｐＨは、特に限定されないが、３〜１０程度の範囲が好ましく、４〜９程度であることがより好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬剤などの生理活性物質などを含んでいてもよい。
【００５４】
水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、特に限定されないが質量比で、８０：２０〜７０：３０であることが好ましい。
【００５５】
脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、４０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであればよい。
【００５６】
（水相）
水相とは、外水相及び内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドバッファーなどがあげられる。水相のｐＨは特に限定されないが、５〜９、好ましくは７〜８であればよい。例えば、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳともいう）及びトリス緩衝生理食塩水などが挙げられる。
【００５７】
（蒸発工程）
本発明では、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、及び油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。
【００５８】
蒸発工程における有機溶剤を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、及び真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
【００５９】
本発明では、有機溶剤を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶剤を蒸発させる工程の開始後から３０分以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。
【００６０】
本発明の製造方法を実施する際の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃以上７０℃以下とすることが好ましい。
【００６１】
乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、又は濃度や浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過、凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。
【００６２】
得られたリポソームは、透析法、濾過法、エクストリュージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。本発明のリポソーム組成物の製造方法では、薬物をローディングしない状態の空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに調製することが好ましい。また、リポソーム内に内包された薬物と内包されない薬物とを分離するには、遠心分離法、透析法、ゲル濾過法等が利用できる。
【００６３】
（エクストリュージョン処理）
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液及びフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
【００６４】
（薬物ローディング工程）
本発明の薬物ローディング工程では、リポソームに水溶性薬物を封入させる場合、水和・膨潤させる水性媒体に薬物を溶解し、相転移温度以上の加熱、超音波処理又はエクストルージョン等の方法により薬物をリポソームの内水相に内包させることができる。また、脂質乳化時の水相に薬物を溶解させ内水相に内包させることもできる。
【００６５】
（浸透圧調整工程）
本発明では、浸透圧調整工程によって、リポソームの内水相を高張にすること（圧力差）によって、薬物が放出しやすくなる。浸透圧を設定することにより、リリース速度が制御できる。浸透圧調整工程として、特に限定されないが、薬物ローディング工程の後に透析などの方法が採用できる。これにより浸透圧を調整することができる。また、本発明では、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程（好ましくは内水相の浸透圧調整）を同時に行うことが、生産効率の観点から好ましい。
【００６６】
本発明では、放出（リリース）の制御をすることにより、例えば、ドラッグデリバリーシステムとして本発明のリポソームを用いた場合、ターゲットとする患部において、必要とする薬物を必要な量を放出することができる。ただし、高張のリポソームは、薬物を放出し易いという反面、保管時にも漏出し易くなるという、保管安定性との両立が困難である。本発明のリポソームの組成物によれば、乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームに対して、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるように設定することで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるという予想外の効果を有する。
【００６７】
一般に、内水相を高張にする方法としては、例えば、薬物が内包されていないリポソームの内水相と外水相とを高い浸透圧にして、その後、透析などで、外水相の浸透圧を低下させる方法がある。その場合、その後に行われる薬物ローディング工程において、内水相に含まれる薬物が漏出し、かつ内水相の浸透圧が低下することがある。
【００６８】
したがって、本発明では、薬物のローディングとともに、高い浸透圧の溶液で内水相を置換し、その後、透析により外水相の薬物の除去と外水相浸透圧の低下を同時に行うことで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。
【００６９】
本発明のリポソームでは、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、好ましくは２．５倍〜６倍であり、より好ましくは３倍〜５倍である。２倍以上にすることによって、リポソームの脂質二重膜は、二重膜構造又は指組み構造などの構造を示すことが一般的に知られている。内水相の浸透圧が外水相に対して２倍以上になると、リポソームは二重膜構造から指組み構造になり始める。この二重膜の構造は、各脂質の種類や配合比率で調整することができるが、本発明は、好適な脂質構造をとるために、コレステロール比率を１０ｍｏｌ％以上３５ｍｏｌ％にすることで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。
【００７０】
最終的な薬物ローディング工程後に得られた液は、外水相と内水相の溶質が均一化されており、そのときの浸透圧を、完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧と定義できる。ただし、その後の外水相の透析による置換・浸透圧調整工程において、加熱操作は脂質の相転移以下に抑えるなどにより内水相の溶質が充分に保持されている場合に限る。また外水相の浸透圧は、最終的な透析工程に用いる透析液の浸透圧で定義できる。ただし、透析液にて充分に置換できた場合に限る。また、リポソーム組成物の完成液について、遠心分離や限外ろ過を利用し、外水相の溶質の組成濃度と内水相の溶質の組成濃度を定量し、その組成液の浸透圧を計測することでも、内水相及び外水相の浸透圧を得ることができる。
【００７１】
浸透圧の計測は第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定法にしたがえばよい。具体的には水の凝固点（氷点）降下度測定により、オスモル濃度を求めることができる。また、水の凝固点降下度は溶質モル濃度で定義されるものであり、溶質モル濃度からもオスモル濃度を求めることができる。
【００７２】
本発明における外水相の持つ浸透圧は、投与に際して重要な影響を生体に及ぼす。体液の浸透圧から大きく離れる場合は、各組織での水分の移動を原因とした溶血や痛みが発生する。したがって、本発明における外水相の浸透圧は、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、もっとも好ましくは体液と等張である。
【００７３】
（無菌ろ過）
本発明のリポソーム組成物の製造方法によって得られた、リポソームを含む水溶液を医薬組成物とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。通常、ろ過工程において、ろ過滅菌フィルターへのリポソームが吸着又は凝集が発生することがある。しかし、本発明では、特定の平均粒子径及び均一な粒子径分布を有するリポソームが得られるため、ろ過を行う時に圧損などの影響が少ないという予想外の効果を有する。
【００７４】
リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程及び後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。
【００７５】
（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソームを含む水溶液は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
【００７６】
本発明によって得られるリポソームを含む水溶液に、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えてリポソーム組成物を含有する医薬組成物とすることができる。医薬組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、及びｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。
【００７７】
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００７８】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。
【００７９】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ等が挙げられる。安定化剤及び酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
【００８０】
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウムなどが挙げられる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
【００８２】
特に、本発明では、医薬組成物に、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウム、塩酸などを含有することが好ましい。
【００８３】
医薬組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
【００８４】
医薬組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部及び薬液中のガスを窒素などの不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。
【００８５】
医薬組成物の投与方法は、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射、髄腔内注射を選択することができる。リポソーム組成物の具体的な投与方法としては、シリンジ、点滴による投与が挙げられる。
【００８６】
医薬組成物に含まれる薬物の投与量は、通常、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかし、本発明のリポソーム組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００８７】
（リリース速度）
リリース速度とは、単位時間あたりにリポソームの外部へ出る薬物量を意味する。本発明において、リリース速度は１０質量％／２４ｈｒ以上７０質量％／２４ｈｒ以下が好ましく、２０質量％／２４ｈｒ以上６０質量％／２４ｈｒ以下がより好ましくは２０質量％／２４ｈｒ以上５０質量％／２４ｈｒ以下がさらに好ましい。
【００８８】
リリース速度は、温度に依存するため、定温条件で測定することが好ましい。例えば、ヒトの場合、温度は特に限定されることはないが、体温（３５℃以上３８℃以下）の範囲内で測定することが好ましい。
【００８９】
リポソームに含まれる薬物が抗がん剤である場合、リリース速度が１５質量％／２４ｈｒ未満であると、抗がん剤として充分な体内での曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多く、また、場合によっては抗がん剤を含むリポソームが不要に長い時間体内に残留することで、皮膚などの本来分布しにくい組織に集積することで予想外の毒性が発現する場合がある。また７０質量％／２４ｈｒより大きいと、単位時間あたりの曝露する薬物量が多くなるため、最高血中濃度が高くなることで毒性が大きくなり、また、漏出した薬剤が腫瘍部以外の組織に分布あるいは速やかな代謝を受け血中滞留性が低下するために好ましくない。
【００９０】
リリース速度の測定方法は、特に限定されないが、対象となる哺乳動物、モデル系等に投与した後、哺乳動物又はモデル系から、血液又は血漿等を単位時間毎に採取して、必要に応じて前処理などを行う。そして、目的の薬物を液体高速クロマトグラフ、マススペクトルなどの方法によって測定することができる。
また、薬物のリリース速度を測定する際、薬物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤では、例えば、ヒト（患者；体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好ましい。他の動物の場合も、上記の体重６０ｋｇ当たりの投与量に対して、体重及び表面積に応じて換算した量を投与することができる。
【００９１】
（腫瘍体積）
本発明では、腫瘍体積を測定するために、モデルとなる動物（好ましくはマウス）に対して腫瘍を移植できる。本発明のリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、腫瘍の体積の増殖抑制という効果が観測できる。腫瘍の体積の増殖抑制は、使用される薬物、リポソームを構成する脂質等の組合せ、及び有効量に依存する。腫瘍体積の増殖抑制とは、腫瘍成長を抑制し得るか、腫瘍静止を達成し得るか、及び実質的若しくは完全な腫瘍退縮の少なくとも一つを意味する。
【００９２】
本発明のリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、モデル動物に対して、処置グループ及びコントロールグループに分配して、腫瘍細胞が定着するよう、腫瘍細胞移植の例えば、腫瘍細胞が１００〜１０００ｍｍ2に成長した後に開始できる。投薬量は、治療開始時の体重に基づいて０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与できる。例えば、モデル動物がマウスの場合、本発明のリポソーム組成物の評価として、各グループのマウスを最低体重に達するまで毎日全体として体重を測定した。次いで、実験の終了まで、各グループの体重を測定した。サンプリング時のための最終屠殺まで、腫瘍が２０００ｍｍ3に達するまで又は動物が死亡するまでノギス等で腫瘍を測定できる
【００９３】
哺乳動物の対象の中の腫瘍体積は、任意の当分野で認められている方法を用いて測定され得る。例えば、ノギスの測定を用いて、式：（ａ×ｂ2）×０．５（式中、“ａ”は最大直径であって、“ｂ”は短径の長さである）を用いて腫瘍体積を評価できる。また、ヒトでは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）走査、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）走査のような画像診断などの手法により腫瘍体積を測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のリポソーム組成物及びその製造方法では、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節できるリポソーム組成物を得ることができる。本発明のリポソーム組成物は、医薬品、化粧品、食品など適用可能であり、特に医薬用途に有用である。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
溶剤組成における混合比は容量比を意味する。例えば、「エタノール／酢酸エチル＝９０／１０」は、容量比で９０％エタノール／１０％酢酸エチルを意味する。【００９６】
（実施例１）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びコレステロールを表１に示すモル比で計６．３８ｍｍｏｌとなるように混合し、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝１／１）１５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【００９７】
【表１】
2015166986.tif 000003
【００９８】
ｂ）水相の調製
ゲムシタビン塩酸塩を注射用水と１０×ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、８ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その際、注射用水と１０×ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の比率により浸透圧を８４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌになるよう調整した。【００９９】
ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成と同時に実施した薬物内包工程
ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）で３０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに６０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに１２０００ｒｐｍにて１０分間混合した。その後、水素添加大豆ホスファチジルコリン及びコレステロールの和と、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）とのモル比が９５／５となるように０．３４ｍｍｏｌのＤＳＰＥ−ＰＥＧを水溶液として添加した。つづいて、７０℃加温を維持し攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸散させ、蒸発した分量の水を追加した。つづいて、密封して７０℃で７０分維持した後、室温まで冷却した。この時点における各製剤の浸透圧は８４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、このときの浸透圧が完成する薬物内包リポソームの内水相浸透圧となる。つづいて、７０〜８０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、０．２μｍフィルター及び０．０５μｍフィルターを順次通過させることで整粒し、薬物内包リポソーム液を作製した。【０１００】
ｄ）透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として１０倍容量に希釈した１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）を調整した。この液の浸透圧は３０７ｍＯｓｍ／Ｌであった。この浸透圧が完成する薬物内包リポソームの外水相浸透圧となる。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物内包リポソーム液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。【０１０１】
平均粒子径の測定
試料を１×ＰＢＳ（ニッポンジーン社製）で１０００倍重量に希釈し、ナノトラックＵＰＡ−ＵＴ（日機装社製）を用い動的光散乱法で体積平均粒子径を測定した。結果を表２に示す。【０１０２】
【表２】
2015166986.tif 000004
【０１０３】
薬剤の保管安定性の測定
実施例１−１〜１−５のリポソーム組成物を５℃及び２５℃で一週間保管し、薬物の内水相での保持性能を、外水相に存在する薬物量を定量することで測定した。保管開始から１週間後にサンプリングした試料１００μＬを水で１０倍希釈（体積）し、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ、メルクミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、外水相に存在する薬剤の存在率（外水相率）を次の式により算出した。
式：外水相率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×１０）÷製剤中薬物濃度×１００
結果を図１に示す。【０１０４】
図１において、コレステロールを１０〜３８ｍｏｌ％含む処方は安定に内包薬物を保持し、さらに驚くべきことにコレステロール含率１９ｍｏｌ％の実施例１−４において顕著に保持性能が向上することが分かった。【０１０５】
（実施例２）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びコレステロールを表３に示すモル比で計２．８５ｍｍｏｌとなるように混合し、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝１／１）１５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【０１０６】
【表３】
2015166986.tif 000005
【０１０７】
ｂ）水相の調製
ゲムシタビン塩酸塩を注射用水と１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）を用い、８ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その際、注射用水と１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）の比率により浸透圧を５００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌになるよう調製した。【０１０８】
ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成と同時に実施した薬物内包工程
ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）で３０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに６０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに１２０００ｒｐｍにて１０分間混合した。その後、水素添加大豆ホスファチジルコリン及びコレステロールの和と、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとのモル比が９５／５となるように０．１５ｍｍｏｌのＤＳＰＥ−ＰＥＧを水溶液として添加した。つづいて、７０℃加温を維持し攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸散させ、浸透圧が１０９０〜１２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌになった時点で加温と攪拌を止め、蒸散を停止した。このときの浸透圧が完成する薬物内包リポソームの内水相浸透圧となる。つづいて、７０〜８０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、０．２μｍフィルター及び０．０５μｍフィルターを順次通過させることで整粒した。【０１０９】
ｄ）透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この浸透圧が完成する薬物内包リポソームの外水相浸透圧となる。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。【０１１０】
平均粒子径の測定
試料を１×ＰＢＳ（ニッポンジーン社製）で１００倍重量に希釈し、ＦＰＡＲ１０００ＡＳ（大塚電子社製）を用い動的光散乱法でキュムラント平均粒子径を測定した。結果を表４に示す。【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
薬剤の保管安定性の測定
実施例２−１〜２−６のリポソーム組成物を５℃及び２５℃で一週間保管し、実施例１と同様に、外水相率を測定した。結果を図２に示す。【０１１３】
図２より、保持性能についてはコレステロール含率１９ｍｏｌ％が最適であることが分かった。脂質二重膜はコレステロール含率が２０ｍｏｌ％を超えるところから膜の相状態が変化し、流動性が増すと言われている。一般には２０ｍｏｌ％近傍の相状態の境界域において、膜構造が不安定になり内包薬物を保持しにくいと考えられ、この結果は予想外のものである。【０１１４】
血漿中のリリース速度の測定
実施例２−１〜２−６のリポソーム組成物の各５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、０、１、４、９、２４時間の時点で１００μＬ採取した。つづいて、限外ろ過フィルター（メルクミリポア製アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ）を用い７４００×ｇ、３０分、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、外水相率を次の式により算出した。
式：外水相率（％）＝（各インキュベーション時点のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物の内水相に含まれる薬量×１００
血漿中のリリース速度を示す時間変化の結果を図３に示す。図３において各実施例番号及びコレステロール含率を示す。【０１１５】
図３では、コレステロール含率２５ｍｏｌ％で血漿中での薬物リリースが速くなることが分かる。また、コレステロール含率は、図２に示される２５℃、一週間の保管安定性においては大きな影響を及ぼし、特にコレステロール含率１９ｍｏｌ％で安定であったが、血漿中での安定性には大きな影響を及ぼすものではなかった。これは、血漿中での薬物放出性を変えることなく、保管時の保持性を向上させることが出来ることを示し、実用上非常に有益な制御方法になることを示す。【０１１６】
（実施例３）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロールを７６／１９のモル比となるようにそれぞれ１．７９ｇ、０．２２ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝１／１）１５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。【０１１７】
ｂ）水相の調製
ゲムシタビン塩酸塩を注射用水と１０×ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、８ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その際、注射用水と１０×ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の比率を変更することで、表５の浸透圧になるよう調整した。【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成と同時に実施した薬物内包工程
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに６０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに１２０００ｒｐｍにて１０分間混合した。その後、水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧとのモル比が７６／１９／５となるように０．４１ｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧを水溶液として添加した。つづいて、７０℃での加温を維持し攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸散させ、下表に示す浸透圧となった時点で加温と攪拌を止め、蒸散を停止した。このときの浸透圧が完成する薬物内包リポソームの内水相浸透圧となる。つづいて、７０〜８０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、０．２μｍフィルター及び０．０５μｍフィルターを順次通過させることで整粒した。【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
ｄ）透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として水で１０倍容量に希釈した１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）を調製した。この液の溶質モル濃度から求めた浸透圧は３０７ｍＯｓｍ／Ｌであった。この浸透圧が完成する薬物内包リポソームの外水相浸透圧となる。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。【０１２２】
血漿中のリリース速度の測定
実施例１のリポソーム組成物５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、０、１、４、９、２４時間の時点で１００μＬ採取した。つづいて、限外ろ過フィルター（メルクミリポア社製アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、外水相率を次の式により算出した。
式：外水相率（％）＝（各インキュベーション時点のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物の内水相に含まれる薬量×１００
血漿中のリリース速度を示す時間変化の結果を図４に示す。【０１２３】
図４の結果より、本発明のコレステロール比率において、外水相に対する内水相の浸透圧を調整することにより、血漿中におけるリリース速度を任意にコントロールできることが分かった。【０１２４】
上記に示す結果から、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下という条件であっても、溶解状態の水溶性薬物を内包し、かつ保存安定性に優れるリポソーム組成物が提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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