(57)【要約】  MMP-7の会合体を単量体化する方法を提供する。MMP-7の会合体を、低濃度の１価陽イオン塩化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム等）を含む緩衝液、または１価陽イオン塩化物を含有しない同緩衝液で処理することからなるMMP-7の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及び前記緩衝液に溶解したMMP-7含有（医薬）組成物。低濃度のMMP-7含有（医薬）組成物を調製する場合は、糖アルコールや糖類を添加した上記緩衝液が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液でマトリックスメタロプロテアーゼ−７（MMP-7）の会合体を処理することを含む、MMP-7会合体の単量体化方法。
【請求項２】
130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液でMMP-7の会合体を処理する、請求項１に記載の単量体化方法。
【請求項３】
１価陽イオン化合物を含有しない溶液でMMP-7の会合体を処理する、請求項１に記載の単量体化方法。
【請求項４】
前記１価陽イオン化合物の濃度が、100mM以下である、請求項１又は２に記載の単量体化方法。
【請求項５】
前記１価陽イオン化合物の濃度が、80mM以下である、請求項１、２又は４に記載の単量体化方法。
【請求項６】
前記１価陽イオン化合物の濃度が、40mM以下である、請求項１、２、４又は５に記載の単量体化方法。
【請求項７】
前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、請求項１、２、４、５又は６に記載の単量体化方法。
【請求項８】
前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、請求項１、２、４、５又は６に記載の単量体化方法。
【請求項９】
前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、請求項８に記載の単量体化方法。
【請求項１０】
前記溶液が、更に塩化カルシウムを含有する、請求項１から９の何れか一項に記載の単量体化方法。
【請求項１１】
前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、請求項１０に記載の単量体化方法。
【請求項１２】
前記溶液が緩衝液である、請求項１から１１の何れか一項に記載の単量体化方法。
【請求項１３】
前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、請求項１２に記載の単量体化方法。
【請求項１４】
前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、請求項１から１３の何れか一項に記載の単量体化方法。
【請求項１５】
前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25mMトリス緩衝液（pH6〜8）である、請求項１３又は１４に記載の単量体化方法。
【請求項１６】
前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、請求項１から１５の何れか一項に記載の単量体化方法。
【請求項１７】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、請求項１６に記載の単量体化方法。
【請求項１８】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、請求項１６又は１７に記載の単量体化方法。
【請求項１９】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、2〜7％である、請求項１８に記載の単量体化方法。
【請求項２０】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、請求項１７から１９の何れか一項に記載の単量体化方法。
【請求項２１】
前記マンニトールが2〜5％、前記スクロースが2〜7%である、請求項２０に記載の単量体化方法。
【請求項２２】
請求項１から２１の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程を含む、MMP-7の製造方法。
【請求項２３】
前記工程が、130ｍM以上の１価陽イオン化合物含有液を用いた処理工程後に行われる、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
下記（１）〜（５）の工程を包含する、請求項２２又は２３に記載の製造方法。
（１）proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
（２）proMMP-7封入体を溶解／リフォールディング処理する工程、
（３）proMMP-7を精製する工程、
（４）proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
（５）請求項１から２１の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
【請求項２５】
前記（５）の工程が、限外ろ過膜を用いた濃縮工程である、請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
130ｍM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にマトリックスメタロプロテアーゼ−７（MMP-7）を有効成分として含有する、MMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項２７】
130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、請求項２６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項２８】
１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、請求項２６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項２９】
前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、請求項２６又は２７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３０】
前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、請求項２６又は２７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３１】
前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、請求項３０に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３２】
更に、塩化カルシウムを含有する、請求項２６から３１の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３３】
前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、請求項３２に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３４】
前記溶液が緩衝液である、請求項２６から３３の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３５】
前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、請求項３４に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３６】
前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、請求項２６から３５の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３７】
前記MMP-7の濃度が1μg/ml〜1mg/mlである、請求項３６に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３８】
前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25mMトリス緩衝液（pH6〜8）である、請求項３５、３６又は３７に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項３９】
前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、請求項２６から３８の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４０】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、請求項３９に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４１】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、請求項３９又は４０に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４２】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、2〜7％である、請求項４１に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４３】
前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、請求項４０から４２の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４４】
前記マンニトールが2〜5％、前記スクロースが2〜7%である、請求項４３に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
【請求項４５】
溶剤に溶解し得て、その溶解時の組成物が請求項２６から４４の何れか一項に記載の組成物である、MMP-7含有（医薬）固体組成物。
【請求項４６】
請求項２６から４５の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物を含有する、椎間板ヘルニアの治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「MMP-7」と称することもある）の会合体を単量体化する方法に関する。詳細には、MMP-7の会合体を低濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液または当該化合物を含有しない同溶液中で処理することからなる、MMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及び前記溶液にさらに糖アルコール又は糖類を溶解したMMP-7含有（医薬）組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
MMP-7は、活性部位に亜鉛分子をもつ亜鉛型メタロプロテアーゼファミリーに属するマトリックスメタロプロテアーゼ（以下、「MMP」と称することもある）の一つである（例えば、非特許文献１参照）。MMPは前駆体として産生され、細胞外分泌時にシグナル配列がプロセスされ、次いでプロ配列がプロセスされて活性型になる。細胞外に分泌されたMMPは細胞外マトリックスの代謝を司るのに対して、MMP-7は主に癌細胞より分泌され、浸潤、転移に関与することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。MMP-7は他の多くのMMPが持っているヒンジ、ヘモペキシン様ドメインを持っておらず、MMPの中では最小の分子単位からなり、コラーゲンや細胞外マトリックスを構成しているコンポーネント（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アグリカン）を基質とする。【０００３】
MMP-7は、軟骨組織の主成分であるアグリカンを基質とすること、椎間板ヘルニアの手術検体由来のマクロファージがMMP-7を発現していること（例えば、非特許文献３参照）等からヘルニア塊の自然退縮に関わっていることが推測される。その後、波呂らは、MMP-7をヘルニアイヌの椎間板に投与して椎間板内髄核の容積の減少を観察し、椎間板ヘルニアの治療薬としての可能性を示した（例えば、非特許文献４参照）。MMP-7の医薬品としての開発が望まれるところであるが、MMP-7は生体中に微量にしか存在せず、生体からMMP-7を分離精製することは極めて困難であり、生体成分を用いた場合、潜在的なウイルス汚染など安全面における問題が懸念される。MMP-7は癌細胞からも取得できるが、癌細胞を製造株とするのは好ましいことではない（例えば、非特許文献５参照）。【０００４】
このような問題を解決する方法として遺伝子組み換え技術によりMMP-7を取得する試みが行われている。CHO細胞でMMP-7を発現させたBarnettらの報告（例えば、非特許文献６参照）、アルカリフォスファターゼのシグナル配列の塩基配列と大腸菌のコドン使用頻度に最適化されたプロマトリックスメタロプロテアーゼ７（以下、「proMMP-7」と称することもある）の遺伝子配列とを連結させた核酸断片を用いることにより、３４℃では可溶性のproMMP-7、４２℃では不溶性のproMMP-7として発現させた報告（例えば、特許文献１参照）及び改変型シグナルペプチドとproMMP-7の遺伝子配列とを連結させた核酸断片を用いることにより、封入体として大量に発現させた報告（例えば、特許文献２参照）等がある。【０００５】
proMMP-7から活性型MMP-7への変換は、1mM (4-aminophenyl)mercuric acetate（APMA）又は0.2μMトリプシン存在下、37℃で保温する方法やproMMP-7含有溶液を５３℃で保温する方法（例えば、非特許文献７参照）が報告されており、彼らは、活性化した低濃度（1mg/ml以下）のMMP-7（別名Matrilysin）は、−20℃で6か月間保存した場合及び室温で28日間保存した場合、その活性及び電気泳動における変化がなかったことを明らかにした。この変化に関する明確な記載はないが、電気泳動の結果からMatrilysinの分解が見られなかったことを示唆したものと考えられる。その他にも、proMMP-7やMMP-7の精製に関しては、Kihira、Onedaらの方法（例えば、特許文献１、非特許文献８参照）をはじめとして種々の報告があり、実験レベルにおいて一定のMMP-7の精製方法は確立されている。一般には、実験レベルでのMMP-7の精製方法をスケールアップして大量生産が行われる。しかしながら、MMP-7を大量に製造する方法は、決して確立されているとは言い難く、MMP-7の大量製造における問題点や解決策に関する報告は殆ど見られない。【０００６】
また、MMP-7を含有する組成物については、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス塩酸塩）、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムを含むものが報告されており（例えば、特許文献３〜５、非特許文献７，９参照）、MMP-7のようなメタロプロテアーゼは、溶液組成物の場合、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムの共存により安定化することが知られている（例えば、特許文献６参照）。特に医薬品は主に安全性の観点で通常体液の浸透圧付近とされ、塩化ナトリウムは溶液組成物の浸透圧調整剤として一般的であるところ、実際これらの文献に開示されている組成物は、塩化ナトリウムをはじめとする１価陽イオン化合物を体液と等張かそれ以上の濃度で含んでいるものが殆どである。また、これらの文献に開示されている組成物は、糖アルコール又は糖類を含んでいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第2938352号公報
【特許文献２】WO 2010／047347A1号公報
【特許文献３】特開2000-344672号公報
【特許文献４】特開2000-226329号公報
【特許文献５】特開2002-173424号公報
【特許文献６】特開2005-6509号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Soler et al., Biochem Biophys Res Commun, 1994, vol.201, p.917-923
【非特許文献２】Ii et al., Exp Biol Med (Maywood), 2006, vol.231, p.20-27
【非特許文献３】Haro et al., J Spinal Disord, 1999, vol.13, p.245-249
【非特許文献４】Haro et al., J Orthop Res, 2005, vol.23, p.412-419
【非特許文献５】Miyazaki et al., Cancer Research, 1990, vol.50, p.7758-7764
【非特許文献６】Barnett et al., Protein Exp Purif, 1994, vol.5, p.27-36
【非特許文献７】Crabbe et al., Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507
【非特許文献８】Oneda et al., J Biochem, 1999, vol.126, 905-911
【非特許文献９】Browner et al., Biochemistry, 1995, vol.34, 6602-6610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明者らは、MMP-7を含有する医薬品の開発検討の過程で、MMP-7は、従来の医薬品製剤、特には前述のメタロプロテアーゼの溶液組成物のように、塩化ナトリウム等の１価陽イオン化合物が体液と等張の150mM程度以上の場合会合体を形成すること、及び、蛋白やその製剤の製造時に通常用いられる装置中のゲル又は製剤の保存時に通常用いられるバイアル瓶等の容器にMMP-7が吸着することに気づき、MMP-7製造時における、MMP-7の製造装置への吸着が抑制されたMMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法、及びMMP-7の会合体形成及び吸着が抑制されたMMP-7含有（医薬）組成物を提供することが課題となった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記（１）〜（４）を見出し、本願発明を完成するに至った。
（１）MMP-7会合体は、低濃度の１価陽イオン塩化物（塩化ナトリウム及び塩化カリウム等）を含むトリス緩衝液（pH6〜8）等の溶液で処理することにより、解離して単量体を形成する。１価陽イオン塩化物を含有しない同溶液で処理した場合においても同様に単量体を形成する。
（２）上記の処理によるMMP-7会合体の単量体化方法（以下、単に「単量体化方法」と称することもある）をMMP-7の製造工程に組み入れることにより、MMP-7の製造効率を上げることができる。特に、単量体化方法を、自己活性化によりproMMP-7をMMP-7に変換した直後の限外ろ過膜処理工程に組み入れることにより、より大きな効果が得られる。
（３）MMP-7単量体は高い酵素活性を維持する。
（４）上記のトリス緩衝液にマンニトール、スクロース等の糖類又は糖アルコールを含有させることにより、MMP-7の会合体形成抑制だけでなく、MMP-7のゲル及びバイアル器壁への吸着が抑制される。すなわち、水溶液とした場合に体液と等張となる150mM程度より低い濃度の１価陽イオン塩化物と、糖アルコール又は糖類とを含有する組成物とすることにより、MMP-7の会合体形成及び吸着が抑制された医薬製剤となる。【００１１】
したがって、本願発明は、MMP-7会合体を単量体化する方法（単量体化方法）、単量体化方法を取り入れたMMP-7の製造方法及び上記の緩衝液を用いて調製されるMMP-7含有（医薬）組成物を包含するものであり、以下の通りである。
[１]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液でマトリックスメタロプロテアーゼ−７（MMP-7）の会合体を処理することを含む、MMP-7会合体の単量体化方法。
[２]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液でMMP-7の会合体を処理する、[１]に記載の単量体化方法。
[３]１価陽イオン化合物を含有しない溶液でMMP-7の会合体を処理する、[１]に記載の単量体化方法。
[４]前記１価陽イオン化合物の濃度が、100mM以下である、[１]又は[２]に記載の単量体化方法。
[５]前記１価陽イオン化合物の濃度が、80mM以下である、[１]、[２]又は[４]に記載の単量体化方法。
[６]前記１価陽イオン化合物の濃度が、40mM以下である、[１]、[２]、[４]又は[５]に記載の単量体化方法。
[７]前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[１]、[２]、[４]、[５]又は[６]に記載の単量体化方法。
[８]前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、[１]、[２]、[４]、[５]又は[６]に記載の単量体化方法。
[９]前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[８]に記載の単量体化方法。
[１０]前記溶液が、更に塩化カルシウムを含有する、[１]から[９]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１１]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[１０]に記載の単量体化方法。
[１２]前記溶液が、緩衝液である、[１]から[１１]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１３]前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、[１２]に記載の単量体化方法。
[１４]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[１]から[１３]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１５]前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25ｍMトリス緩衝液（pH6〜8）である、[１３]又は[１４]に記載の単量体化方法。
[１６]前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、[１]から[１５]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[１７]前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[１６]に記載の単量体化方法。
[１８]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、[１６]又は[１７]に記載の単量体化方法。
[１９]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2〜7％である、[１８]に記載の単量体化方法。
[２０]前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[１７]から[１９]の何れか一項に記載の単量体化方法。
[２１]前記マンニトールが2〜5％、前記スクロースが2〜7%である、[２０]に記載の単量体化方法。
[２２][１]から[２１]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程を含む、MMP-7の製造方法。
[２３]前記工程が、130mM以上の１価陽イオン化合物含有液を用いた処理工程後に行われる、[２２]に記載の製造方法。
[２４]下記（１）〜（５）の工程を包含する、[２２]又は[２３]に記載の製造方法。
（１）proMMP-7封入体産生細胞を破砕する工程、
（２）proMMP-7封入体を溶解／リフォールディング処理する工程、
（３）proMMP-7を精製する工程、
（４）proMMP-7を自己活性化してMMP-7とする工程、及び
（５）[１]から[２１]の何れか一項に記載の単量体化方法からなる工程
[２５]前記（５）の工程が、限外ろ過膜を用いた濃縮工程である、[２４]に記載の製造方法。
[２６]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液又は１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にマトリックスメタロプロテアーゼ−７（MMP-7）を有効成分として含有する、MMP-7含有（医薬）組成物。
[２７]130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[２６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[２８]１価陽イオン化合物を含有しない溶液中にMMP-7を有効成分として含有する、[２６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[２９]前記１価陽イオン化合物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムからなる群より選択される、[２６]又は[２７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３０]前記１価陽イオン化合物が、１価陽イオン塩化物に由来するものである、[２６]又は[２７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３１]前記１価陽イオン塩化物が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群より選択される、[３０]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３２]更に、塩化カルシウムを含有する、[２６]から[３１]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３３]前記塩化カルシウムの濃度が、30mM以下である、[３２]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３４]前記溶液が、緩衝液である、[２６]から[３３]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３５]前記緩衝液が、5〜25mMのトリス緩衝液である、[３４]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３６]前記MMP-7の濃度が、20mg/ml以下である、[２６]から[３５]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３７]前記MMP-7の濃度が1μg/ml〜1mg/mlである、[３６]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３８]前記溶液が、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含有する5〜25mMトリス緩衝液（pH6〜8）である、[３５]、[３６]又は[３７]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[３９]前記溶液が、更に糖アルコール及び／又は糖類を含有する、[２６]から[３８]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４０]前記糖アルコール及び／又は糖類が、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、及びオリゴ糖アルコールからなる群より選択される、[３９]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４１]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2%以上である、[３９]又は[４０]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４２]前記糖アルコール及び／又は糖類が、2〜7％である、[４１]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４３]前記糖アルコール及び／又は糖類が、マンニトール又はスクロースである、[４０]から[４２]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４４]前記マンニトールが2〜5％、前記スクロースが2〜7%である、[４３]に記載のMMP-7含有（医薬）組成物。
[４５]溶剤に溶解し得て、その溶解時の組成物が[２６]から[４４]の何れか一項に記載の組成物である、MMP-7含有（医薬）固体組成物。
[４６][２６]から[４５]の何れか一項に記載のMMP-7含有（医薬）組成物を含有する、椎間板ヘルニアの治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明に従えば、MMP-7の会合体を容易に単量体化する方法が提供されるので、当該方法をMMP-7の製造工程に組み入れることにより、MMP-7の生産性や回収効率を上げることができる。【００１３】
また、当該方法により単量体化されたMMP-7は、MMP-7の会合体が存在する場合に比べてMMP-7の酵素としての比活性が高く、高品質のMMP-7製剤を得るための好適な材料となり得る。【００１４】
更に、本願発明の態様の一つである、低濃度の塩化ナトリウム、及び糖アルコール又は糖類を含む緩衝液中でMMP-7を保存することにより、MMP-7は単量体としての形状を維持するだけでなく、高い酵素活性を維持し、またMMP-7の保存容器への吸着を抑制することができる。したがって、本願発明の単量体化方法に使用される緩衝液は、MMP-7製剤の保存液として有用である。そして、本願発明の、水溶液とした場合に低濃度の塩化ナトリウム、及び糖アルコール又は糖類を含むMMP-7組成物は、MMP-7の会合体形成が抑制され、さらにMMP-7の容器等への吸着が抑制された、医薬用途の溶液組成物及びその調製用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、動的光散乱法により測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、塩化ナトリウム（NaCl）及び塩化カリウム（KCl）によるMMP-7会合体の形成抑制効果を示す。
【図２】図2は、動的光散乱法により測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、MMP-7会合体の形成抑制における塩化カルシウム（CaCl2）の影響を示す。
【図３】図3は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定したMMP-7の分子量の解析結果に基づく、MMP-7の会合体形成におけるMMP-7濃度の影響を示す。
【図４】図4は、0.1mg/ml、2mg/ml、20mg/mlの各MMP-7を、150mM塩化ナトリウム（NaCl）または40mM NaClを含有するトリス緩衝液で希釈したときに、当該濃度の塩化ナトリウムがMMP-7の酵素活性に及ぼす影響を示す。
【図５】図5は、マンニトールによるMMP-7のゲルへの吸着抑制効果を示す。A：5mMトリス緩衝液(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl、B：5mMトリス緩衝液(pH7)/10mM CaCl2/40mM NaCl/3.5%マンニトール。
【図６】図6は、マンニトール及びスクロースによるMMP-7のバイアル器壁への吸着抑制効果を示す。
【図７】図7は、マンニトール及びスクロースの各濃度におけるMMP-7のバイアル器壁への吸着抑制効果を示す。
【図８】図8は、マンニトール及びスクロースの各濃度におけるMMP-7の酵素活性に及ぼす影響を示す。
【図９】図9は、MMP-7会合体の形成抑制におけるマンニトールの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願発明は、MMP-7会合体の単量体化方法、該単量体化方法を組み入れたMMP-7の製造方法及びMMP-7含有（医薬）組成物を提供するものであり、MMP-7会合体を低濃度の１価陽イオン化合物、さらには糖アルコール又は糖類を含有する溶液（以下、「単量体化用溶液」と称することもある）で処理すること、同溶液にMMP-7を保存すること及び水溶液とした場合に低濃度の１価陽イオン化合物と糖アルコール又は糖類を含有するMMP-7組成物とすることに特徴がある。
【００１７】
MMP-7会合体の検出は、動的光散乱法、サイズ排除クロマトグラフィー法、超遠心分析法等の方法を用いて、MMP-7の分子量を測定し、アミノ酸配列から求められるMMP-7単量体の分子量（約19kDa）と比較することにより行われる。本願発明においては、動的光散乱法で測定した試料中の分子量が19kDa〜38kDaの間の数値を示した場合にMMP-7は単量体として存在すると判定し、38kDa以上の数値を示した場合にMMP-7は会合体を形成していると判定した。上記の判定基準は、動的光散乱法による測定値の真度を考慮したもので、二量体以上の値を示した場合は明らかな会合体を形成しているとし、それよりも小さな値の場合は単量体とした。
【００１８】
MMP-7の単量体化は、MMP-7会合体を単量体化用溶液で処理することにより行われる。本願発明において、「MMP-7会合体を単量体化用溶液で処理する」とは、MMP-7会合体を単量体化用溶液にさらすことを意味し、その溶液で溶解することを含む。そして、MMP-7会合体が130mMを超える高濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液に溶解されている場合、単量体化用溶液を用いて限外ろ過膜や透析膜等によるバッファー交換を行うことを含む。該単量体化用溶液のpHを一定に保つための緩衝剤として、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液及び炭酸緩衝液等の使用が可能である。これらの中から単量体化処理を行う際のpHに合わせて適宜選択すれば良い。該緩衝液の濃度は、5〜25mM、好ましくは、5〜20mMの範囲である。pHは、5〜9、好ましくは、6〜8の範囲である。より好ましくは、メタロプロテアーゼの安定性の向上に効果を発揮するトリス緩衝液が選択され、該トリス緩衝液の濃度は5〜10mM、pHは6〜8の範囲である（特表2011-521906参照）。
【００１９】
本願発明において「１価陽イオン化合物」とは、１価の陽イオンと対となる陰イオンとからなる化合物を意味し、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム等を挙げることができる。また、「１価陽イオン塩化物」とは、１価の陽イオンと塩化物イオンからなる化合物を意味し、１価陽イオン塩化物の場合、例えば、本願発明に使用する１価陽イオン化合物は何れのものを使用しても良いが、１価陽イオン塩化物を使用するのが好ましい。具体的には、塩化ナトリウム及び塩化カリウムであり、最も好ましいのは塩化ナトリウムである。
【００２０】
MMP-7会合体を単量体に解離するために低濃度の１価陽イオン化合物が使用される。単量体に解離したMMP-7は、低濃度の１価陽イオン化合物を含有する単量体化用溶液において単量体として維持される。同じ効果が、１価陽イオン化合物を含有しない単量体化用溶液及び水等の液を用いた場合にも得られる。したがって、１価陽イオン化合物を含有しない単量体化用溶液（本願発明では、該単量体化用溶液に水等の液が含まれるものとする）を用いたMMP-7会合体の単量体化方法も本願発明に包含される。以下、低濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液及び１価陽イオン化合物を含有しない同溶液を、単に「単量体化用溶液」と称することもある。
【００２１】
単量体化用溶液に、多価陽イオン化合物を添加することにより、１価陽イオン化合物の処理濃度の範囲を広げることができる。好ましくは、2価陽イオン化合物であり、より好ましくは、2価カルシウムイオン化合物であり、最も好ましくは、塩化カルシウムである。なお、「多価陽イオン化合物」は、上記の１価の陽イオン化合物と同様に多価の陽イオンと対となる陰イオンとからなる化合物を意味する。
【００２２】
具体的には、単量体化用溶液として水を用いた場合は、40mM以下の１価陽イオン化合物が使用され、単量体化用溶液に塩化カルシウムを添加することにより、40mM以上の１価陽イオン化合物を含有させた単量体化用溶液での処理を可能にする。より具体的には、5mM〜10mM塩化カルシウムを含有する場合は80mM以下の１価陽イオン化合物、10mM〜30mM塩化カルシウムを含有する場合は100mM以下の１価陽イオン化合物、及び30mM塩化カルシウムを含有する場合は130mM以下の１価陽イオン化合物を含有する単量体化用溶液の使用が可能となる。この結果は、塩化カルシウムの添加により、MMP-7会合体を単量体に解離する効果及びMMP-7単量体の会合体形成を抑制する効果が増強されたことを示す。また、実施例２の結果（図2）から、本効果は塩化カルシウムの濃度に比例することを読み取ることができる。すなわち、高濃度の塩化カルシウムを使用することにより、MMP-7の単量体化及びMMP-7単量体の維持のより大きな効果を期待することができる。以上より、１価陽イオン化合物の濃度としては、水溶液にした場合130mM以下、好ましくは100mM以下、さらに好ましくは80mM以下、最も好ましくは40mM以下である。なお、１価陽イオン化合物は含有しなくても良いが、含有する方が医薬組成物としての品質の観点で好ましい。
【００２３】
本願発明においては、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含む、5〜25mMトリス緩衝液（pH6〜8）からなる単量体化用溶液、または塩化ナトリウムを除いた同単量体化用溶液を使用するのが好ましい。
【００２４】
本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法は、効率よく、高品質のMMP-7単量体を製造するために、MMP-7の製造工程に組み込むことができる。遺伝子組み換え技術により得られるMMP-7の一般的な製造方法は、菌体の培養、封入体の放出、封入体の溶解とリフォールディング、proMMP-7の精製、自己活性化によるproMMP-7のMMP-7への変換、MMP-7の精製・濃縮等の工程により行われる。
【００２５】
より具体的には、以下のMMP-7の製造工程で使用される。まず、proMMP-7産生大腸菌が作製される。一般には、常法に従って発現ベクターに挿入されたproMMP-7遺伝子を大腸菌に導入することにより作製することができる。しかしながら、proMMP-7は、大腸菌に対して強い毒性を有するために生産効率が極端に低下することがある。これを解消するためにproMMP-7のＮ末側にシグナルペプチドを付加するなどの工夫が行われるが、proMMP-7の場合、単にシグナルペプチドを付加しただけでは、proMMP-7の発現量は上昇せず、また発現したproMMP-7の一部がプロテアーゼにより分解されるという現象が認められる。このような現象は、効率的なMMP-7の製造方法の確立の妨げになる。したがって、proMMP-7の発現量の増大やプロテアーゼによるproMMP-7の分解抑制効果が増強されたproMMP-7産生大腸菌をMMP-7製造の原料に用いるのが好ましい。かかるproMMP-7産生大腸菌は、WO2010/047347に記載の方法に従って調製することができる（より具体的には、調製例を参照）。
【００２６】
こうして得られたproMMP-7産生大腸菌は、クローニングを繰り返して純化した後にワーキングセルバンクとして保存され、MMP-7製剤化のための大量培養の種菌として用いられる。ワーキングセルバンクの保存液としては、通常、組み換え大腸菌の保存に用いられる条件、例えば、7〜10％ジメチルスルフォキシドや10〜50%グリセロールを含む溶液中で、−80〜−20℃の冷凍庫や液体窒素中、あるいはアンプル内に凍結乾燥して2〜10℃の冷蔵庫で保存される。
【００２７】
proMMP-7産生大腸菌の製造スケールでの培養は、小スケールでの前培養と大スケールでの本培養の2段階で行われる。前培養には、proMMP-7産生大腸菌の増殖には組換え大腸菌の一般的なLB培地（プラスミド保持のためにアンピシリン等抗生物質を添加する場合がある）を使用しても良いが、本培養においては、副作用の原因となる物質をできる限り排除した培地を用いるのが好ましい。このような培地として、例えば、種々の微量金属（マグネシウム、カルシウム、銅、ナトリウム等）を含むグルコース培地、LB培地、M9培地等が挙げられる。培養条件としては、大腸菌の増殖に適した範囲が用いられるが、例えば、pH（pH6〜8）、温度（30〜45℃）、時間（4〜16時間）の培養条件が可能である。これらの培養条件は、培養スケールや発現誘導の処理等により適切に調節される。効率的にproMMP-7の発現を行うために発現誘導剤が使用されるが、該発現誘導剤としてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）、ラクトース等が挙げられる。
【００２８】
本培養により大量に培養・増殖したproMMP-7産生大腸菌からMMP-7を回収するには以下の方法がとられる。まず、proMMP-7産生大腸菌を培養し、増殖させた菌体を適切な方法で破砕し、proMMP-7からなる封入体を菌体外に放出させる。菌体の破砕には、化学物質（例えば、キレート剤としてEDTA）、界面活性剤（例えば、Triton X100）、酵素（例えば、リゾチーム）などで溶解させる方法またはフレンチプレスや超音波処理などの物理的処理による方法が取られるが、いずれの方法でも良い。これらの方法をいくつか組合せることにより、より効果的に菌体を破砕することができる。封入体含有破砕液の限外ろ過膜分画や遠心分離により、濃縮と洗浄を繰り返すことにより大部分の菌体成分が除去される。洗浄には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液など一般的な緩衝液が使用される。また、限外ろ過膜の孔径や遠心分離の条件は多数報告されているので、これらの条件を参考にすれば良い。大量に処理する場合は、限外ろ過膜分画により封入体を回収するのが好ましい。
【００２９】
回収した封入体は、一旦、還元剤及び変性剤を含有する溶液で溶解される。斯かる還元剤として、システイン、グルタチオン、ジチオスレイトール及び２−メルカプトエタノールなどを使用することができる。これらは幾つかを組合せて使用しても良い。還元剤の濃度は、溶解する封入体の量に依存するが、10〜200mMの範囲で使用される。変性剤としては、尿素、グアニジン塩酸塩などを用いることができる。斯かる尿素及びグアニジン塩酸塩は、それぞれ4〜8M及び2〜6Mの濃度範囲で使用される。また、緩衝液としては、封入体の回収で使用するものと同様の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液（pH7.0〜9）が使用される。溶解時の温度は、40℃以下であれば特に制限する必要はない。溶解時間は、封入体の溶解状況を見ながら設定すれば良く、通常、30分〜1時間攪拌される。
【００３０】
次に、封入体の溶解液に、界面活性剤、金属イオンを含むリフォールディングバッファーを加えることにより、proMMP-7のリフォールディング、すなわち正常な立体構造の構築が行われる。この時使用する界面活性剤としてブリッジ35、金属イオンとして酢酸亜鉛、塩化コバルトなどが、それぞれ0.5〜2％及び0.05mM〜0.2mMの濃度範囲で使用される。リフォールディングするときの緩衝液の種類及び濃度は、封入体を溶解するときと同じものを使用すればよい。リフォールディング処理は、１日以上静置することにより行われる。
【００３１】
リフォールディング溶液からproMMP-7を精製する際には、一般に、蛋白質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法を組み合わせた方法が使用される。本願発明のproMMP-7は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー及び限外ろ過膜処理からなる工程を用いることにより精製することができる。両クロマトグラフィーは、常法に従って行えば良い。得られた蛋白質やポリペプチドの量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、Protein Assay  Kit (BIO-RAD, Inc)などの蛋白測定試薬を用いて測定される。
【００３２】
次いで、proMMP-7のMMP-7への変換が行われる。変換方法としては、proMMP-7含有溶液を1mM (4-aminophenyl)mercuric acetate(APMA)又は0.2μMトリプシン存在下、３７℃で保温する方法やproMMP-7含有溶液を53℃で保温する方法（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507）が挙げられるが、いずれの方法を用いても良い。この時、30〜200mMの塩化ナトリウムを添加することがある（Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507、WO 2010/047347 A1）。保温時間は1〜5時間の範囲で行われるが、試薬及びproMMP-7の濃度や処理量等により適宜調節される。トリプシンはN-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone（TPCK）処理したものが使用される。
【００３３】
MMP-7の酵素活性を測定する方法としては、蛍光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2；配列番号7)のMMP-7による切断を蛍光測定装置により測定する方法がある(Crabbeら, Biochemistry, 1992, vol.31, 8500-8507)。実際には、斯かる原理に基づくMMP-7活性測定Kit（ANASPEC社）が市販されているので、これを用い、添付のプロトコールに従って、活性の測定が行われる。こうして変換されたMMP-7をproMMP-7から分離精製するときは、前述の蛋白精製方法が使用される。
【００３４】
変換されたMMP-7は、高塩濃度の溶液中で会合体を形成し、MMP-７の溶液中の濃度が、1mg/ml以上になるとその傾向が強い。MMP-7の会合体の存在は、MMP-7の製造・製剤化において生産性や品質の低下に繋がる。前述したように、塩化カルシウムの共存下、130mM以下の１価陽イオン化合物を含む単量体化用溶液中では、MMP-7会合体は、単量体化し、MMP-7単量体として維持されるが、130mMを超える濃度の１価陽イオン化合物を含有する溶液中では、MMP-7会合体を形成する可能性が高いことが示唆される。よって、130mM以上の１価陽イオン化合物による処理工程後に本願発明の単量体化方法が組み込まれる。より具体的には、自己活性化によるproMMP-7のMMP-7への変換直後に組み込むのが好ましい。
【００３５】
本願発明の単量体化方法による処理は、20mg/ml以下のMMP-7に対して行うのが好ましいが、20mg/ml以上のMMP-7を処理する場合は、前述したように、塩化カルシウムの濃度を調節することにより、同様のMMP-7の会合体形成抑制効果を期待することができる。
【００３６】
こうして得られたMMP-7の単量体を含む溶液は、必要に応じて、限外ろ過膜等によるMMP-7の精製と濃縮工程を経て製剤化の原料とされる。かかる工程においても本願発明の単量体化用溶液が使用される。一旦、単量体化したMMP-7は、単量体化用溶液中に保存する限り、単量体として維持され、且つ、長期にわたり酵素活性の低下も認められない。したがって、本願発明の単量体化用溶液は、製剤化前のMMP-7の保存、及びMMP-7を有効成分として含有する（医薬）組成物の製造に使用することにより、高品質のMMP-7を維持することができる。
【００３７】
本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法及び該単量体化方法を組み入れたMMP-7の製造方法において、糖アルコールや糖類は、MMP-7の製造に汎用されるゲルへの吸着抑制効果及び製剤化に使用されるバイアル等の器壁への吸着抑制効果を有する。このような糖アルコール及び糖類として、スクロース、ラクトース、マルトース、キシロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、オリゴ糖アルコールなどが挙げられる。好ましくは、マンニトール及びスクロース、特に好ましくはマンニトールである。
【００３８】
低濃度（例えば、1μg/ml〜1mg/ml）のMMP-7を製剤化する場合は、MMP-7のバイアル器壁への吸着によるロスが想定されるため、単量体化用溶液に上記の糖アルコールや糖類を含有させるのは特に有効である。MMP-7の場合、バイアル器壁への吸着阻止効果を示す2%以上、好ましくは、体内浸透圧の調節可能な範囲である2〜7%の糖アルコール又は糖類が添加される。本願発明においては、好ましくは、MMP-7の活性を維持することができる2〜5％のマンニトール又は2〜7%のスクロースを添加した単量体化用溶液が使用される。より好ましくは、2〜5％マンニトール、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含む、5〜25mMトリス緩衝液（pH6〜8）からなる単量体化用溶液が使用される。
【００３９】
当該単量体化用溶液に溶解されたMMP-7は、本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物としてそのまま使用することができ、MMP-7の会合体形成抑制、MMP-7の活性維持、MMP-7の容器等への吸着抑制、医薬水溶液組成物としての品質の確保の観点で、MMP-7含有（医薬）組成物は、2％以上の糖アルコール及び／又は糖類、及び30〜40mMの1価陽イオン化合物（塩化ナトリウム又は塩化カリウム）を含むのが好ましい。より具体的には、MMP-7の濃度が20mg/ml以下の場合、本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、2〜5％マンニトール又は2〜７%のスクロース、30〜40mM塩化ナトリウム及び5〜30mM塩化カルシウムを含むのが好ましい。本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、液状、凍結乾燥、あるいは凍結して保存することが可能である。その際に、MMP-7含有（医薬）組成物の医薬品としての安定性や等張性を維持するために、追加的に安定化剤、等張剤及び保存剤等のヒトや他の動物に対して投与することが許容される化合物が添加されうる。本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、溶剤に溶解し得てその溶解時の組成物が上述の本願発明の液体のMMP-7含有（医薬）組成物となる、固体組成物を含む。この固体組成物は、本願発明の液体のMMP-7含有（医薬）組成物を凍結乾燥等により溶剤を除去する等で得られる。溶剤とは、医薬品添加物辞典において溶剤とされているもので、水、エタノール等が挙げられる。
【００４０】
こうして得られた本願発明のMMP-7含有（医薬）組成物は、MMP-7の会合体形成や吸着が抑制された特異的なMMP-7の酵素活性を有するものであり、椎間板ヘルニアの治療薬または診断薬として使用され得るものである。
【００４１】
以下、実施例に従い、本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４２】
≪調製例≫
（１）APSPを有するproMMP-7発現ベクター（pETMMP7）の構築
腎臓のcDNAライブラリー（HumanMTC Panel I, Catalog#: K1420-1, BD社）よりプライマーP1（配列番号1）とP2（配列番号2）を用いてproMMP-7遺伝子をPCRにより増幅した。増幅されたDNAをクローニングベクター（pCRII-TOPO, Invitrogen）に挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、DNAシークエンサーを用いて行った。当該塩基配列とデーターベース（Accession Numbers: NM002423）に登録されているproMMP-7の塩基配列のホモロジー検索を行い、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pCRproMMP-7）を得た。
【００４３】
次に、pCRproMMP-7を鋳型として、制限酵素NdeI認識配列、PhoA-アルカリフォスファターゼシグナルペプチド（APSP）配列をコードする塩基配列及びproMMP-7のN末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP3（配列番号3）と制限酵素BamHI認識配列及びproMMP-7のC末端配列をコードする塩基配列からなるプライマーP4（配列番号4）を用いて、PCRを行った。上記と同様に増幅されたDNAをクローニングベクターに挿入し、得られたDNAの塩基配列を決定した。塩基配列に変異がないことを確認した後、得られたプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、予め同じ制限酵素で切断した発現ベクターpET22b（メルク社、製品コード；69744-3）に挿入し、proMMP-7遺伝子が挿入されたプラスミド（pETMMP7）を得た。
【００４４】
（２）改変型APSPを有する発現ベクターpETMMP7（L13P-A21E）の構築及び発現
GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen社）を用い、添付のプロトコールに従って、上記（１）で得たpETMMP7のAPSP配列（Met-Lys-Gln-Ser-Thr-Ile-Ala-Leu-Ala-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Phe-Thr-Pro-Val-Thr-Lys-Ala；配列番号8）のシグナルペプチダーゼ認識部位に変異を導入した（APSP配列で示されるアミノ酸配列の13番目のロイシン（Leu）をプロリン（Pro）に、21番目のアラニン（Ala）をグルタミン酸（Glu）に置換した）。APSPの改変には、5'側プライマーとしてM2（配列番号5）及び3'側プライマーとしてP6（配列番号6）の配列を用いた。得られた改変型APSPを有するpETMMP7（L13P-A21E）で大腸菌（BL21(DE3)）を形質転換し、proMMP-7を発現する組み換え大腸菌（MMP7L13P-A21E菌）を得た。
【００４５】
発現誘導は、Overnight Express Autoinduction System 1（メルク社；製品コード71300-3）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。簡単には、125ｍLの三角フラスコに50μg/mL Ampicillin（和光純薬株式会社）を含むLB培地50ｍLに各コロニーを懸濁し、Kitの試薬を添加し、37℃で16時間培養した。その菌体液のOD600nmを測定し、OD600nm＝20、１mLに相当する菌体を遠心分離により沈渣に回収した。沈渣を200μLのBugBusterにより破砕し、遠心分離により沈査を得た。沈渣をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）用のSample Bufferで可溶化し、15%アクリルアミドゲルSDS-PAGEにかけ、CBB染色を行った。その結果、proMMP-7発現量の増加と分解の抑制効果の増強が確認された。
【００４６】
本調製例においては、以下の配列からなるプライマーを使用した。
P1: ccataggtcc aagaacaatt gtctctg（配列番号1）
P2: caatccaatg aatgaatgaa tggatg（配列番号2）
P3: catatgaaac aaagcactat tgcactggca ctcttaccgt tactgtttac ccctgtgacc aaggccctgc cgctgcctca g（配列番号3）
P4: ggatccctat ttctttcttg aattac（配列番号4）
M2: ctgtttaccc ctgtgaccaa ggaactgccg ctgcc（配列番号5）
P6: cttggtcaca ggggtaaaca gtggcggtaa gag（配列番号6）
【実施例１】
【００４７】
≪１価陽イオン塩化物によるMMP-7会合体の形成抑制効果≫
（１）MMP-7の製造
調製例に記載の方法により得たproMMP-7産生大腸菌（MMP7L13P-A21E菌）を種菌としてグルコース培地で培養・増殖し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）によるproMMP-7の発現誘導を行った。培養液から菌体を回収し、フレンチプレスにより破砕した。該破砕液を遠心分離し、沈渣に封入体を回収した。次いで、封入体を0.1M Tris-HCl(pH7.5)及び0.1Mジチオスレイトールを含む6M塩酸グアニジンで溶解し、0.1mM酢酸亜鉛、10mM塩化カルシウム、0.2M塩化ナトリウム及び1.0%Brij35を含む50mMHEPES緩衝液（pH7.5）でリフォールディングした後、常法により、proMMP-7をイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーで精製した。得られたproMMP-7を47〜48℃で加熱処理して自己活性化を行い、MMP-7を得た。得られたMMP-7は、40mM NaCl、10mM CaCl2及び3.5%マンニトールを含む5mMトリス緩衝液（pH7）を用いて、限外ろ過膜による希釈と濃縮を繰り返し、−80℃で保存した。【００４８】
（２）MMP-7会合体の測定
上記（１）で得られた高濃度のMMP-7溶液を、5mM塩化カルシウム（CaCl2）を含む水に塩化ナトリウム（NaCl）または塩化カリウム（KCl）を溶解した溶液で希釈し、試料1及び試料2を調製した。
試料1：1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／各濃度NaCl（10〜160mM）
試料2：1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／各濃度KCl（10〜160mM）【００４９】
MMP-7の会合体形成における塩化ナトリウム及び塩化カリウムの影響を、上記の各試料100μlを用いて動的光散乱法（機材；Wyatt Technology DynaPro(Protein Solutions) Titan、セル；Wyatt Technology 12uL Cell 8.5mm Centre Height、測定温度；20℃）により調べた。各試料中のMMP-7の分子量を測定・解析し、MMP-7の単量体の分子量（約19kDa）に基づいて分子量38kDa以下の場合を単量体と判定した。その結果、10mM〜80mM NaCl溶液中では、MMP-7の分子量は20〜29kDaとなり、単量体として存在することが判明した。塩化カリウムを用いた場合も同様に10mM〜80mM KCl溶液中において単量体で存在するとの結果が得られた（図1）。図中の点線は、分子量38kDaを示す。
【実施例２】
【００５０】
≪MMP-7会合体の形成抑制における塩化カルシウムの影響≫
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、水に塩化カルシウム及び塩化ナトリウムを溶解した溶液で希釈し、試料3を調製した。
試料3：1mg/ml MMP-7／各濃度CaCl2(0〜30mM)／各濃度NaCl(0〜160mM)【００５１】
各濃度の塩化カルシウム存在下における、MMP-7会合体形成抑制への影響を実施例１-（２）の方法に従って調べた。【００５２】
その結果、0mM CaCl2のとき40mM以下のNaClで、5mM CaCl2のとき80mM以下のNaClで、10mM CaCl2のとき100mM以下のNaClで、20mM CaCl2のとき120mM以下のNaClで、及び30mM CaCl2のとき130mM以下のNaClでそれぞれ単量体を形成することが示された。また、単に水で希釈した場合もMMP-7単量体の形成が認められた。以上より、130mM以上のNaCl存在下でMMP-7の会合体は形成されるが、これに30mM以下（〜30mM）のCaCl2を共存させることによりMMP-7会合体の形成は抑制されることが明らかになった。すなわち、当該濃度の塩化カルシウムは、より効果的にMMP-7の単量体を維持し、且つ安定化させる効果を有する（図2）。
【実施例３】
【００５３】
≪MMP-7会合体形成におけるMMP-7濃度の影響≫
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を10mM CaCl2及び各濃度の塩化ナトリウムを含有する溶液で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料4を調製した。
試料4：各濃度MMP-7(10、15、20mg/ml)／10mM CaCl2／各濃度NaCl(50〜250mM)【００５４】
MMP-7会合体形成抑制効果に対するMMP-7の濃度の影響を、サイズ排除クロマトグラフィー法（HPLC機材；HEWLETT PACKED 1100 series、担体；TOYOPARL HW50S、処理温度；25℃、流速0.5mL/min、検出波長280nm）により調べた。カラムサイズは、直径5mm、長さ150mmのものを使用し、カラムの平衡化は、5mM Tis-HCl（pH7）、10mM CaCl2、3.5%マンニトールに40〜500mM NaClを含む溶液で行った。【００５５】
本条件では、分子量60kDa〜80kDaのタンパク質はボイド容量に出現する（クロマトグラフィー開始後、1.8分）。よって、クロマトグラフィー開始後2分近傍のピーク（またはリーディングピーク）をMMP-7の会合体とし、該ピークの面積を指標にして、MMP-7が会合体を形成する塩化ナトリウムの濃度を算出した。【００５６】
その結果、MMP-7の濃度に依存して塩化ナトリウムによるMMP-7会合体の形成抑制効果は弱くなるが、20mg/ml以下のMMP-7においては、0〜80mMのNaClによりMMP-7は単量体として存在することが判明した（図3）。実施例２の結果（図2）から、塩化カルシウムの濃度を増加することにより、MMP-7の単量体が維持される塩化ナトリウムの濃度も比例的に増加することは明白であり、本実施例において30mMCaCl2の濃度を使用した場合、100mM NaCl存在下においても20mg/mlのMMP-7は単量体として存在することが推測される。更に、20mg/ml以上のMMP-7を使用した場合、塩化カルシウムの濃度を増加することにより、MMP-7を単量体として維持されることが推測される。【００５７】
試料4を4℃で一晩放置した後に、上記と同実験を行ったが、図3と同様の結果が得られた。
【実施例４】
【００５８】
≪MMP-7の会合体形成による酵素活性への影響≫
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、40mM NaCl、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、各濃度のMMP-7を含有する試料5を調製した。
試料5：各濃度MMP-7（0.1、2、20mg/ml)／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）【００５９】
各濃度のMMP-7溶液を、150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7）または40mM NaCl、10mM CaCl2を含む10mMトリス緩衝液（pH7）で0.1mg/mlとなるように希釈した後（１次希釈）、更に、各溶液を150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7）で5ng/mlに希釈し（2次希釈）、当該希釈液について、MMP-7活性測定Kit（ANASPEC社）を用い、添付のプロトコールに従って、蛍光基質(Dnp-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2；配列番号7)に対する切断活性を測定した。【００６０】
その結果、１次希釈において150mM NaClを含むトリス緩衝液（pH7）で希釈した2mg/ml以上のMMP-7では酵素活性が低下した（図4）。この酵素活性の低下は、MMP-7会合体の形成と一致する。一方で、0.1mg/ml以下の濃度では酵素活性の低下が見られないことから、当該濃度のMMP-7においては、少なくとも150mM NaClによる会合体の形成は起こらないことが示唆される。
【実施例５】
【００６１】
≪限外ろ過膜によるMMP-7の濃縮工程における塩化ナトリウム濃度の影響≫
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2を含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試料6を調製した。
試料6：4mg/ml MMP-7／10mM CaCl2／各濃度NaCl（40mM、80mM、200mM、500mM）／5mMトリス緩衝液（pH7）【００６２】
試料6の各4mlを、限外ろ過膜（Amicon Ultra-4 10K）を用いて遠心濃縮（2500g）を行い、一定時間毎にろ液の容量と濃縮液の吸光度を測定した。【００６３】
その結果、濃度の薄い塩化ナトリウムを用いた方が、短時間でMMP-7を濃縮することができ、高塩濃度では濃縮に長時間を要した（表1）。表１の記号（−）は、濃縮終了を示す。【００６４】
【表１】
2015178414.tif 000002
【実施例６】
【００６５】
≪マンニトールによるMMP-7の吸着抑制効果≫
（１）MMP-7のゲルへの吸着抑制
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2及び40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、試料7を調製した。
試料7：5.5mg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl【００６６】
試料7の1mlを、予め10mM CaCl2及び40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で平衡化したカラム（HW40F、26x6cm、東ソー株式会社）にかけ、同トリス緩衝液で洗浄後、3.5%マンニトールを含有する同トリス緩衝液で溶出（流速5ml/min）した。【００６７】
その結果、ゲルに吸着したMMP-7がマンニトールにより溶出された（図5）。この結果は、マンニトールが、MMP-7のゲルへの吸着抑制効果を有することを示唆する。【００６８】
（２）MMP-7の器壁への吸着抑制
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、10mM CaCl2、40mM NaCl及びマンニトール、スクロースを含む5mMトリス緩衝液（pH7）で希釈し、バイアル中に試料8〜10の溶液（１ml）を調製した。各試料の浸透圧が同じになるようにこれらの濃度を調整した。マンニトール、スクロースを含まない同トリス緩衝液で希釈したもの（試料10）をコントロールとした。【００６９】
試料8：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）／3.5%マンニトール
試料9：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）／6.6%スクロース
試料10：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液（pH7）【００７０】
室温で3時間放置後、バイアル中の各溶液を2段階で希釈した。1次希釈に10mM CaCl2、40mM NaClを含む5mMトリス緩衝液（pH7）、2次希釈に1%ブロックエース(ブロックエース粉末:DSファーマバイオメディカル社)／TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)を用いた。溶液中のMMP-7をELISAにより定量した。ELISAには、MMP-7をウサギに免疫して得られたウサギ抗MMP-7抗体、該ウサギ抗MMP-7抗体をビオチン標識試薬(Biotin (Long Arm) NHS-Water Soluble:ベクター社)で標識したビオチン標識ウサギ抗MMP-7抗体、西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン(Horseradish Peroxidase Streptavidin, Concentrate；ベクター社)、及びHRP基質溶液(Peroxidase Substrate Solution B:KPL社)を用いた。ELISA反応のコントロールとして濃度の明らかなMMP-7のELISA用スタンダードを用いた。該MMP-7の濃度は、吸光度を測定することにより算出した。【００７１】
その結果、無添加(試料10)に比べて、マンニトール(試料8)、スクロース(試料9)を添加した場合、MMP-7の回収率が高く、これらの吸着抑制効果が確認された（図6）。【００７２】
次いで、MMP-7の器壁への吸着阻止に対するマンニトール及びスクロースの有効濃度及びMMP-7の酵素活性への影響を調べた。実施例１−（１）で得られたMMP-7溶液を、マンニトールまたはスクロースを含む10mM CaCl2、40mM NaCl及び5mMトリス緩衝液(pH7)で希釈し、バイアル中に試料12〜16の溶液(1 ml)を調製した。マンニトール、スクロースを含まない同トリス緩衝液で希釈したもの（試料11）を、各試料のコントロールとした。【００７３】
試料11：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
試料12：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／1% マンニトール
試料13：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／2% マンニトール
試料14：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／2% スクロース
試料15：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／5% マンニトール
試料16：50μg/ml MMP-7／10mM CaCl2／40mM NaCl／5mMトリス緩衝液(pH7)
／7% スクロース【００７４】
室温で3時間放置後、バイアル中の各溶液を2段階で希釈した。１次希釈液に0.01％ Briji35、0.01％ BSA、150mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液(pH7)で5ng/mlに希釈し、実施例４と同様に蛍光基質に対する切断活性（MMP-7の酵素活性）を測定した。本試験では、ペプチド研究所から入手した蛍光基質（MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2；(7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-leucyl-[Nβ-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl]-L-alanyl-L-arginine amide；配列番号9)を用いた。また、2次希釈に1%ブロックエース（ブロックエース粉末：DSファーマバイオメディカル社）／TBS-T(0.05% Tween20/50mM Tris/150mM NaCl)を用い、上記ELISAにより溶液中のMMP-7を定量した。【００７５】
その結果、無添加（試料11）に比べ、2〜5% マンニトール(試料13、15)、2〜7% スクロース（試料14、16）を添加した場合、MMP-7の回収率が高く、これらの器壁への吸着抑制効果が確認された（図7）。また同添加によりMMP-7の酵素活性の低下は認められなかった（図8）。
【実施例７】
【００７６】
≪MMP-7会合体の形成抑制におけるマンニトールの影響≫
実施例１-（１）で得られたMMP-7溶液を、スピンフィルターを用いて、各濃度のNaCl、5mM CaCl2、3.5％マンニトールを含む5mMトリス緩衝液（pH7）でバッファー交換した後、同トリス緩衝液で希釈し、試料17〜22を調製した。マンニトールを含まない同トリス緩衝液で同様に処理したもの（試料17）を各試料のコントロールとした。【００７７】
試料17：10mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2
試料18：10mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料19：40mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料20：80mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料21：120mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール
試料22：180mM NaCl／1mg/ml MMP-7／5mM CaCl2／3.5％マンニトール【００７８】
各試料を実施例１−（２）に記載の動的光散乱法により、MMP-7の分子量を測定した。その結果、MMP-7は、40mM以上の塩化ナトリウムにより会合体を形成することが示された（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本願発明のMMP-7会合体の単量体化方法は、MMP-7の製造及び製剤化に利用され得る。
【図１】
2015178414.tif 000003
【図２】
2015178414.tif 000004
【図３】
2015178414.tif 000005
【図４】
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【図５】
2015178414.tif 000007
【図６】
2015178414.tif 000008
【図７】
2015178414.tif 000009
【図８】
2015178414.tif 000010
【図９】
2015178414.tif 000011
【配列表】
2015178414000001.app
【国際調査報告】
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