(57)【要約】  実用性の高い新規FAD-GDHを提供することを課題とする。（１）作用：電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；（２）基質特異性：D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；（３）pH安定性：pH5〜8で安定である；（４）アミノ酸配列：配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と83％以上同一のアミノ酸配列を含む、という特徴を備えるグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）アミノ酸配列：  配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と83％以上同一のアミノ酸配列を含む。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と90％以上同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）分子量：  約60kDa（SDS-PAGEによる）。
【請求項４】
下記の酵素化学的性質を更に有する、請求項３に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ：
（５）至適pH：  7.0；
（６）至適温度：  50℃；
（７）温度安定性：  20℃〜50℃の範囲で安定（pH5.0、1時間）。
【請求項５】
基質特異性が、D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が8％以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、請求項６に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項９】
請求項８に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項１１】
以下のステップ（１）及び（２）、或いは以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法：
（１）アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ；
（ｉ）請求項１０に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
【請求項１４】
請求項１３に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース脱水素酵素）に関する。詳しくは、アスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（E.C.1.1.99.10）及びその遺伝子等に関する。本出願は、２０１５年１１月６日に出願された日本国特許出願第２０１５−２１８８５２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者は年々増加しており、糖尿病患者、特にインスリン依存性の患者は血糖値を日常的に監視し血糖をコントロールする必要がある。近年、酵素を用いてリアルタイムで簡便にかつ正確に測定できる自己血糖測定器で糖尿病患者の血糖値をチェック出来るようになった。グルコースセンサ（例えば、自己血糖測定器に使用されるセンサ）用として、グルコースオキシダーゼ（E.C.1.1.3.4）、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（E.C.1.1.5.2）（例えば特許文献１〜３を参照）が開発されたが、酸素反応性、マルトース、ガラクトースへの反応性が問題となった。この問題を解決すべく、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「FAD-GDH」と略称する）が開発された（例えば特許文献４、５、非特許文献１〜４を参照）。【０００３】
一般に、糖尿病判定検査時には、経口グルコース負荷試験だけでなく、経口キシロース負荷試験、経静脈キシロース負荷試験が実施される。FAD-GDHは概してキシロースへ反応することが知られており、FAD-GDHを用いた場合、上記負荷試験時に血糖値へ影響することが問題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−３５０５８８号公報
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献３】特開２００１−３４６５８７号公報
【特許文献４】国際公開第２００４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７／１３９０１３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１５／０６０１５０号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967).
【非特許文献２】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967).
【非特許文献３】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967).
【非特許文献４】Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
FAD-GDHはキシロースに対する反応性の問題はあるものの、基質特異性に優れ、グルコースセンサ用の酵素として有望視されている。FAD-GDHを実用化するにあたっては、上記の通り、キシロースに対する反応性が問題となる。本発明は、このような状況に鑑み、特にグルコースセンサ用として実用性の高い新規FAD-GDH及びその用途等を提供することを課題とする。尚、キシロースに対する反応性が低いFAD-GDHも報告されているが（特許文献６）、グルコースセンサに応用した場合に特に重要となるpH安定性等の特性は明らかにされておらず、その実用的価値は不明である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく本発明者は、広範な微生物を対象として大規模なスクリーニングを実施した。その結果、キシロースに対する反応性が低い新規FAD-GDHを取得することに成功した。当該FAD-GDHの特性を調べたところ、驚くべきことに、グルコースセンサで頻用されるメディエータ（フェリシアン化カリウム）の至適pHを含む、広範囲のpH域で高い活性を示すことが判明した。この事実は、当該FAD-GDHがグルコースセンサ用途に適し且つ実用性が高いことを示す。
以下の発明は、以上の成果及び考察に基づく。
［１］以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）アミノ酸配列：  配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と83％以上同一のアミノ酸配列を含む。
［２］アミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と90％以上同一のアミノ酸配列である、［１］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［３］以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）分子量：  約60kDa（SDS-PAGEによる）。
［４］下記の酵素化学的性質を更に有する、［３］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ：
（５）至適pH：  7.0；
（６）至適温度：  50℃；
（７）温度安定性：  20℃〜50℃の範囲で安定（pH5.0、1時間）。
［５］基質特異性が、D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が8％以下である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［６］アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［７］アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、［６］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［８］以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［９］［８］に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
［１０］［９］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
［１１］以下のステップ（１）及び（２）、或いは以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法：
（１）アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ；
（ｉ）［１０］に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
［１２］［１］〜［７］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
［１３］［１］〜［７］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
［１４］［１３］に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
［１５］［１］〜［７］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
［１６］［１］〜［７］のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Aspergillus iizukae No.5453株の培養液から精製した酵素（精製酵素）SDS-PAGEによる分析の結果。Mは分子量マーカー（上から200、116、97.2、66.4KDa）を表し、レーン番号はSuperdex 200で分離した際のフラクション番号である。
【図２】精製酵素のpH安定性。所定の処理（37℃、１時間）の後、残存活性を測定した。
【図３】N末端アミノ酸配列を問い合わせ配列としたBLAST解析の結果。
【図４】内部アミノ酸配列の解析結果。HPLC分離で得られた各ピークのアミノ酸配列を示す。
【図５】目的遺伝子（グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子）周辺の制限酵素マップ。
【図６】組換え酵素のpH安定性。所定の処理（37℃、１時間）の後、残存活性を測定した。
【図７】組換え酵素の至適pH。各種pHの緩衝液で活性を測定した。
【図８】組換え酵素の至適温度。各温度で活性を測定した。
【図９】組換え酵素の温度安定性。所定の処理（各温度、１時間）の後、残存活性を測定した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．用語
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
【００１０】
単離された酵素の純度は特に限定されない。但し、純度の高いことが要求される用途への適用が予定されるのであれば、単離された酵素の純度は高いことが好ましい。
【００１１】
２．グルコースデヒドロゲナーゼ及びその生産菌
本発明の第１の局面はグルコースデヒドロゲナーゼ及びその生産菌を提供する。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「本酵素」ともいう）は以下の特性を備える。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。一方、本酵素は基質特異性に優れ、D-グルコースに対して選択的に作用する。詳しくは、本酵素はD-キシロースに対する反応性が低い。具体的にはD-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である。好ましくは当該反応性が8％以下である。更に好ましくは当該反応性が7％以下である。
【００１２】
一方、本酵素はマルトースやD-ガラクトースなどに対する反応性も極めて低い。D-グルコースに対する反応性を100％としたときのマルトースに対する反応性、D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-ガラクトースに対する反応性は、いずれも5％以下、好ましくは3％以下である。更に好ましくは当該反応性が1％以下である。更に更に好ましくは当該反応性が実質0％である（即ちマルトース及びガラクトースに対する実質的な反応性がない）。
【００１３】
以上のような優れた基質特異性を有する本酵素は、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本酵素によれば試料中にD-キシロースやマルトース或いはD-ガラクトースなどの夾雑物が存在していた場合であっても目的のグルコース量をより正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適したものであるといえ、しかも当該用途も含め様々な用途に適用可能であること、即ち汎用性が高いともいえる。尚、本酵素の反応性及び基質特異性は、後述の実施例に示す方法で測定・評価することができる。
【００１４】
本酵素の由来、即ち本酵素の生産菌はアスペルギルス・イイズカエ（Aspergillus iizukae）である。上記特性を有する本酵素を産生可能である限りにおいて生産菌は限定されない。生産菌の具体例を示せば、NBRC 8869株（実施例で使用したAspergillus iizukae No.5453株と同一株）である。当該菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NBRC）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、所定の手続きを経ることによってその分譲を受けることができる。
【００１５】
生産菌は野生株（天然からの分離株であって、遺伝子操作などの変異・改変処理が施されていないもの）であっても変異株であってもよい。尚、本酵素の遺伝子を宿主微生物に導入して得られた形質転換体を生産菌としてもよい。
【００１６】
本酵素の更なる特徴は、pH安定性に優れる点である。具体的には、本酵素はpH5.0〜8.0で安定である。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、37℃、1時間の処理後、50％以上、好ましくは60％以上、更に好ましくは70％以上の活性を維持する。好ましくは、pH5.0〜9.0、pH4.0〜9.0又はpH4.0〜10.0の範囲で当該高い活性を維持する。尚、「pH5.0〜8.0で安定である」との特徴は、少なくとも当該pH域では高い活性が維持されることを意味し、当該pH域以外（例えばpH4.5の条件）で活性が低下することを意図したものではない。
【００１７】
一態様では、本酵素を構成するポリペプチド鎖は、配列番号１に示すアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなる。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではグルコースデヒドロゲナーゼ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。従って、等価なアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。「グルコースデヒドロゲナーゼ活性」とは、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する活性を意味するが、その活性の程度は、グルコースデヒドロゲナーゼとしての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。
【００１８】
「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はグルコースデヒドロゲナーゼ活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの「複数」とは例えば全アミノ酸の約30％未満に相当する数であり、好ましくは約20％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5％未満に相当する数であり、最も好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と例えば約83％以上、好ましくは約85％以上、さらに好ましくは約90％以上、更に更に好ましくは約95％以上、より一層好ましくは約98％以上、最も好ましくは約99％以上の同一性を有する。尚、活性中心を構成すると推定される525位ヒスチジン（H）及び568位ヒスチジン（H）は欠失又は置換の対象にしないことが好ましい。
【００１９】
好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価なアミノ酸配列が得られる。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００２０】
ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
【００２１】
二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本酵素に等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
【００２２】
二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
【００２３】
本酵素の分子量は約60kDaである（後述の実施例を参照）。分子量はSDS-PAGEで測定した値である。
【００２４】
本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
【００２５】
上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００２６】
本酵素を以下の酵素学的性質（至適pH、至適温度、温度安定性）で更に特徴付けることができる。
【００２７】
至適pHは7.0である。至適pHは、例えば、pH5.0〜5.5のpH域では0.1M酢酸緩衝液中、pH5.5〜6.5のpH域では0.1M MES緩衝液中、pH6.0〜8.0のpH域では0.1Mリン酸緩衝中、pH8.0〜9.0のpH域では0.1M Tris緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
【００２８】
至適温度は50℃である。尚、至適温度は、pH7.0(例えば0.1Mリン酸緩衝液を用いる）の条件下での測定結果に基づき評価することができる。
【００２９】
温度安定性については、酢酸緩衝液(pH5.0)中、20℃〜50℃の条件で1時間処理しても80％以上の活性を維持する。
【００３０】
３．グルコースデヒドロゲナーゼをコードするDNA
本発明の第２の局面は本酵素に関連する核酸を提供する。即ち本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号２に示す塩基配列からなるDNAである。
【００３１】
本酵素をコードする遺伝子は典型的には本酵素の調製に利用される。本酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の本酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の本酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、本酵素をコードする遺伝子の用途は本酵素の調製に限られない。例えば、本酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは本酵素の変異体（改変体）をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
【００３２】
本明細書において「本酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に本酵素が得られる核酸のことをいい、本酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
【００３３】
本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成、PCR法（例えばオーバーラップPCR）或いはこれらの組合せによって、単離された状態に調製することができる。
【００３４】
本発明の他の態様では、本酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「等価核酸」ともいう。また、等価核酸を規定する塩基配列を「等価塩基配列」ともいう）が提供される。等価核酸の例として、本発明の本酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、本酵素に特徴的な酵素活性（即ちグルコースデヒドロゲナーゼ活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2〜40塩基、好ましくは2〜20塩基、より好ましくは2〜10塩基である。等価核酸は、基準となる塩基配列（配列番号２）に対して、例えば60％以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80％以上、より一層好ましくは85％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらに一層好ましくは95％以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する。
【００３５】
以上のような等価核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価核酸を得ることができる。
【００３６】
本発明の他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、99％又は99.9％同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
【００３７】
本発明の更に別の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその等価塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３８】
本発明の更に他の態様は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の本酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10〜約100塩基長、好ましくは約20〜約100塩基長、更に好ましくは約30〜約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
【００３９】
本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（本酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
【００４０】
使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
【００４１】
本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
【００４２】
本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００４３】
宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ本酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
【００４４】
本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の本酵素を生産することに利用することができる。
【００４５】
４．グルコースデヒドロゲナーゼの製造法
本発明の更なる局面はグルコースデヒドロゲナーゼの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ（ステップ（１））及び培養後の培養液及び／又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ（ステップ（２））が行われる。
【００４６】
培養法及び培養条件は目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、グルコースデヒドロゲナーゼが生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件として培地、培養温度及び培養時間を例示する。
【００４７】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3〜8、好ましくは約5〜7程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、好ましくは約25〜35℃程度で、1〜15日間、好ましくは2〜5日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００４８】
以上の条件で培養した後、培養液又は菌体よりグルコースデヒドロゲナーゼを回収する（ステップ（２））。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過（例えば珪藻土をろ過助剤としたろ過）、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、ビーズ処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、各精製工程では原則としてグルコースデヒドロゲナーゼ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。
【００４９】
本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（ｉ））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、グルコースデヒドロゲナーゼ）を回収する（ステップ（ｉｉ））。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。
【００５０】
酵素の精製度は特に限定されないが、例えば比活性が10〜1000（U/mg）、好ましくは比活性が50〜500（U/mg）の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００５１】
５．グルコースデヒドロゲナーゼの用途
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。この反応による変化が利用できる各種用途に本発明を適用可能である。
【００５２】
本発明は例えば血糖値の測定、食品（調味料や飲料など）中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品（例えば食酢）又は発酵飲料（例えばビールや酒）の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。
【００５３】
本発明はまた、本酵素を含むグルコース測定用試薬を提供する。当該試薬は上記の本発明のグルコース測定法に使用される。グルコース測定用試薬の安定化や使用時の活性化等を目的として、血清アルブミン、タンパク質、界面活性剤、糖類、糖アルコール、無機塩類等を添加してもよい。
【００５４】
グルコース測定用試薬を測定キットの構成要素にすることもできる。換言すれば、本発明は、上記グルコース測定用試薬を含むキット（グルコース測定用キット）も提供する。本発明のキットは必須の構成要素として上記グルコース測定用試薬を含む。また、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液、容器などを任意の要素として含む。尚、本発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。
【００５５】
本酵素を利用してグルコースセンサを構成することが可能である。即ち、本発明は、本酵素を含むグルコースセンサも提供する。本発明のグルコースセンサの典型的な構造では、絶縁性基板上に作用電極及び対極を備えた電極系が形成され、その上に本酵素とメディエータを含む試薬層が形成される。参照電極も備えた測定系を用いることにしてもよい。このような、いわゆる３電極系の測定系を用いれば、参照電極の電位を基準として作用電極の電位を表すことが可能となる。各電極の材料は特に限定されない。作用電極及び対極の電極材料の例を示せば、金（Ａｕ）、カーボン（Ｃ）、白金（Ｐｔ）、チタン（Ｔｉ）である。メディエータとしては、フェリシアン化合物（フェリシアン化カリウムなど）、金属錯体（ルテニウム錯体、オスミウム錯体、バナジウム錯体など）、キノン化合物（ピロロキノリンキノンなど）などが使用される。尚、グルコースセンサの構成、グルコースセンサを利用した電気化学的測定法については、例えば、バイオ電気化学の実際−バイオセンサ・バイオ電池の実用展開−（２００７年３月発行、シーエムシー出版）に詳しい。
【００５６】
本酵素を酵素剤の形態で提供することもできる。本発明の酵素剤は有効成分（本酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【実施例】
【００５７】
１．微生物からのスクリーニング
公的機関から入手した保存菌株や自然界から入手した菌株を含む13,000株を培養して得られた培養液を試料として、以下の条件、即ち、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が高いこと、マルトースに反応しないこと、キシロースへの反応性が低いこと、及びグルコースオキシダーゼ活性を示さないこと、を満たすものを以下の方法で選出した。【００５８】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
（測定試液）
100 mmol/L PIPES cont. 0.1％(w/v) Triton X-100 pH 7.0：  24mL
3 mmol/L 1-Methoxy PMS（Phenazine methanesulfate）：  2mL
6.6 mmol/L NTB（Nitrotetrazorium blue）：  1mL
1 mol/L グルコース：  3mL【００５９】
（測定手順）
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を１ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、570nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。上記測定試液のうち、グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定し、マルトース、キシロースへの反応性も確認した。【００６０】
グルコースオキシダーゼ活性の測定方法
（測定試液）
100 mmol/L PIPES cont. 0.1％(w/v) Triton X-100 pH 7.0：  23mL
5g/dL フェノール試液：  0.5mL
25u/mL PO“Amano”3（天野エンザイム株式会社）溶液：  3mL
0.5g/dL 4-アミノアンチピリン試液：  0.5mL
1 mol/L グルコース：  3mL【００６１】
（測定手順）
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を１ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、500nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。【００６２】
検討の結果、マルトースに反応せず、キシロースへの反応性が低く、しかもグルコースオキシダーゼではない、Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼが見出された。Aspergillus iizukae No.5453株について、マルトース及びキシロースへの反応性とグルコースオキシダーゼ（GO）活性を以下の表に示す。マルトース及びキシロースへの反応性は、グルコースへの反応性を100％としたときの相対値（マルトース（又はキシロース）を基質とした場合の測定値／グルコースを基質とした場合の測定値  ×  １００）で表した。また、グルコースオキシダーゼ（GO）はグルコースデヒドロゲナーゼに対する相対値（グルコースオキシダーゼ（GO）活性の測定値／グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定値  ×  １００）で表した。比較のため、グルコースオキシダーゼ（Aspergillus niger由来）、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（Acinetobacter calcoaceticus由来）、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（Aspergillus oryzae由来）の結果も示した。
【表１】
2017077924.tif 000002
【００６３】
Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼは、既存のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼと比較して優位にマルトース及びキシロースへの反応性が低いことがわかる。尚、Aspergillus iizukae No.5453株は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NBRC）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されているAspergillus iizukae Sugiyama NBRC 8869と同一株である。【００６４】
２．精製酵素の調製
以上の検討によって見出された、Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼについて、その精製酵素を取得すべく、Aspergillus iizukae No.5453株を以下の培地で30℃、5日間培養した。得られた培養液から菌体を除去し、粗酵素液とした。
（培地）
グルコース：  15.0％(w/v)
酵母エキス：  3.0％(w/v)
大豆ペプトン：  6.0％(w/v)
KH2PO4：  0.3％(w/v)
K2HPO4：  0.2％(w/v)
ヒドロキノン(pH6.0)：  4mM【００６５】
粗酵素液を精製（塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマト、ゲル濾過クロマトグラフィー）し、精製酵素を得た。精製酵素をゲル濾過（GEヘルスケア社製Superdex 200を使用）及びSDS-PAGEで分析した。SDS-PAGEの結果を図１に示す。グルコースデヒドロゲナーゼ活性が最も高いフラクション（No.34）を以降の実験に使用した。【００６６】
３．精製酵素の基質特異性確認
上記２．で得た精製酵素の基質特異性を調べた。
（活性測定方法）
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してD-グルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。FAD-GDH活性の測定は下記の反応系で行った。
【数１】
2017077924.tif 000003
尚、式中のPMSはフェナジンメタンスルフェート（Phenazine methanesulfate）を表し、NTBはニトロテトラゾリウムブルー（Nitrotetrazorium blue）を表す。反応（１）において、グルコースの酸化に伴って還元型PMSが生成し、更に反応（２）において還元型PMSによるNTBの還元により生成したDiformazanを570nmの波長で測定する。【００６７】
酵素活性は、以下の計算式によって算出される。
【数２】
2017077924.tif 000004
尚、式中のVtは総液量を、Vsはサンプル量を、20.1はDiformazanの0.5μ molあたりの吸光度係数（cm2 / 0.5μ mol）を、1.0は光路長（cm）を、dfは希釈倍数をそれぞれ表す。【００６８】
0.1％（w/v）トリトンX-100を含む100mmol/L PIPES-NaOH緩衝液pH7.0 2.4mL、1mol/L D-グルコース溶液0.3mL、3 mmol/L PMS溶液0.2mL、及び6.6 mmol/L NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、酵素液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に570nmに吸収を持つDiformazanが生成される。1分間あたりの570nmにおける吸光度の増加を測定し、FAD-GDH活性を測定した。結果を以下の表に示す。尚、グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定し、マルトース、キシロースへの反応性を確認した。比較のため、Aspergillus oryzaeの生産するグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH”Amano”8  天野エンザイム株式会社）の結果を併記した。
【表２】
2017077924.tif 000005
【００６９】
Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼは、Aspergillus oryzaeの生産するグルコースデヒドロゲナーゼと比較してキシロースへの反応性が低く、さらにマルトースには反応せず、血糖測定に適した性質を有していることが判明した。【００７０】
４．精製酵素のpH安定性確認
上記２．で得た精製酵素のpH安定性を調べた。1 U/mLになるように酵素液を各種pHの緩衝液で調製後、37℃、１時間加温処理した。その後、測定に用いる緩衝液で希釈し、上記３．と同じ方法で残存活性を測定した。【００７１】
測定結果を図２に示す。pH 4〜pH 10の範囲において高い安定性を示した（残存活性が70％以上）。血糖測定用センサでは、酵素と同時に用いるメディエータ（電子受容体）の種類に応じて反応時のpHを調整する必要があることが知られている。本酵素は広いpH域で高い安定性を示した。この性質は様々なメディエータの使用を可能にする。即ち、本酵素が血糖測定に適した性質を有することが明らかとなった。【００７２】
５．N末端アミノ酸及び内部アミノ酸配列の決定
目的の酵素の活性ピークであるフラクションNo.34をSDS-PAGEで分離して得られたバンドについて、常法に従い、PVDF膜へブロッティングした後、N末アミノ酸解析を実施したところ、約60KDaのタンパク質（図１、矢印）で「SSSYDYIVIGGGTSGLTVAN（配列番号３）」の配列情報が得られた。同配列を問い合わせ配列として、NCBIが提供するBLAST解析を実施したところ、グルコースデヒドロゲナーゼである可能性が高いことが判明した。BLAST解析結果を図３に示す。【００７３】
次に、本タンパク質の全長配列を入手すべく、内部アミノ酸解析を実施した。まず、以下の方法でトリプシン処理し（ゲル内消化）、得られたペプチド断片を高速液体クロマトグラフ（HPLC）で分離した。その後、プロテインシークエンサーPPSQ-33A（株式会社島津製作所）を用いてアミノ酸解析をした。【００７４】
（トリプシン処理）
(i)電気泳動後のゲル試料を適当な大きさに切断する。
(ii)2-メルカプトエタノール及び４−ビニルピリジンを用いて還元アルキル化処理。
(iii)緩衝液（0.1mol/L炭酸水素アンモニウム）中でプロメガ社製Sequencing Grade Modified Trypsinを用いて消化後、ゲルからペプチド断片を抽出する。【００７５】
（HPLC分離条件）
高速液体クロマトグラフ（HPLC）：  LC-20Aシステム（株式会社島津製作所）
カラム：  Cadenza CD-C18(2.0mmI.D.×150mm)（インタクト株式会社）
カラム温度：  50℃
検出波長：  214mm
注入量：  70μL
移動相流速：  0.2mL/min
移動相A：  水/トリフルオロ酢酸（1000/1）
移動相B：  アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸（800/200/1）【００７６】
HPLC分離で得られたピーク（１３個のピークを特定し、保持時間の短い方から順に番号を付した）の解析によって同定したアミノ酸配列を図４に示す。【００７７】
６．遺伝子配列の決定
上記５．で得られたN末アミノ酸解析結果とピークNo.5のアミノ酸解析結果に基づき、以下のプライマーを設計した。
プライマーGDH5453-F：TAYGAYTAYATHGTNATHGGNGGNGGNACNWSNGG（配列番号４）
プライマーGDH5453-5-1-R：NSWNGCDATRTGNACRTTNCC（配列番号５）【００７８】
Aspergillus iizukae No.5453株のゲノムDNAをテンプレートにして、設計したプライマーとPrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いてPCRを行い、増幅されたDNA断片を得た。PCR条件は以下の通りとした。
（反応液）
PrimeSTAR Max Premix（2×）  25μL
GDH5453-F  15 pmol
GDH5453-5-1-R  15 pmol
ゲノムDNA(1/1000希釈)  1μL
滅菌蒸留水で50μLに調整
（サイクル条件）
98℃で10秒、55℃で15秒、72℃で2分の条件で３５サイクル【００７９】
得られたDNA断片をMighty Cloning Reagent Set (Blunt End)（タカラバイオ株式会社）を用いてサブクローニングし、常法に従いDNA断片の塩基配列を確認した。【００８０】
得られた塩基配列（配列番号６）に基づき、以下のプライマーを設計した。
プライマーFS51R07F：AACCGTCTGTCTGAAGACCC（配列番号７）
プライマーFS51R07R：TACTTCCTTTTGCTCG（配列番号８）【００８１】
上記DNA断片をテンプレートにして、設計したプライマーとPCR DIG Probe Synthesis Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いてPCRを行い、ジゴキシゲニン標識されたDNAプローブを得た。このプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。染色体DNAを制限酵素BamHI、KpnI、PstI、SacI、SphI、XbaIで完全消化したものと、これら制限酵素と制限酵素SalIを組み合わせて完全消化したものを0.8％アガロース電気泳動で分離した。続いて、ゼータープローブメンブレン（Bio-Rad株式会社）に転写し、サザンハイブリダイゼーション用の膜を得た。サザンハイブリダイゼーションは、DIG Easy Hyb. (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用い、常法に従って行った。アルカリホスファターゼで標識したジゴキシゲニン抗体を用いて検出し、検出結果から目的遺伝子周辺の制限酵素マップ（図５）を作製した。【００８２】
目的DNA周辺の制限酵素マップより、制限酵素SphIで完全消化した約5.7Kbpの断片中に目的の遺伝子が含まれることが明らかとなったため、染色体DNAを制限酵素SphIで完全消化したものを0.8％アガロース電気泳動後、約5.7Kbp付近の断片をアガロースより回収し、pUC18(タカラバイオ株式会社)プラスミドの制限酵素SphIサイトに挿入した。当該組換えプラスミドで形質転換した大腸菌（E.coli）JM109(タカラバイオ株式会社)を1000株作製した。【００８３】
得られた形質転換体のコロニーをナイロンメンブレン(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)に転写した後、DIG Easy Hyb. (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用いてコロニーハイブリダイゼーションを常法で行ったところ、ポジティブクローンが数株得られた。当該クローンからプラスミドを回収し、常法に従い塩基配列を決定した。当該塩基配列（配列番号２）から予想されるアミノ酸配列（配列番号１）は上記５．で決定した精製酵素のN末端及び内部アミノ酸配列を含んでいた。このことから、得られた組換えプラスミドにはグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が含まれることが確認された。【００８４】
７．組換え酵素の調製及び特性の評価
Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子配列がタカアミラーゼ改変CS3プロモーターとアスペルギルス・オリゼ由来FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼのターミネーター遺伝子の間に配置された発現カセットと、アスペルギルス・オリゼ由来オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrG遺伝子)がpUC19に挿入された発現プラスミドpUCPGDH5453を構築した。構築した発現プラスミドを用いて、アスペルギルス・オリゼRIB40のpyrG遺伝子欠損株をプロトプラスト-PEG法で形質転換した。ウリジン要求性を利用して形質転換株を取得した。可溶性でんぷんをC源にタカアミラーゼ誘導条件下で形質転換株を液体培養し、組換え酵素を含む培養液を回収した。回収した培養液を各種精製（塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマトなど）し、精製酵素を取得した。精製酵素の各種特性を評価した。【００８５】
（１）pH安定性
2 U/mLの酵素液を各種pHの緩衝液で調製後、37℃、１時間加温処理した。その後、測定に用いる緩衝液で希釈し、残存活性を測定した。測定結果を図６に示す。精製酵素は、37℃、1時間処理において、pH3〜10で高い安定性を示した（残存活性が70％以上）。【００８６】
（２）至適pH
使用する緩衝液を各種pHの緩衝液に置き換えて活性を測定し、至適pHを確認した。測定結果を図７に示す。酵素反応の至適pHは7.0であった。【００８７】
（３）至適温度
各温度で活性を測定し、至適温度を確認した。測定結果を図８に示す。酵素反応の至適温度は50℃であった。【００８８】
（４）温度安定性
50mM 酢酸-NaOH（pH5.0）で2U/mLの酵素液を調製後、各温度で１時間加温処理した。処理後すぐに氷中に保存し、残存活性を測定した。測定結果を図９に示す。加温処理の温度が50℃以下であれば、高い安定性を示した（残存活性が80%以上）。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼはキシロースに対する反応性が低く、またpH安定性に優れる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは特にグルコースセンサへの利用に適したものであり、その実用性は高い。【００９０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月29日(2017.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）アミノ酸配列：  配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と83％以上同一のアミノ酸配列を含む。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と90％以上同一のアミノ酸配列である、請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、請求項１又は２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、請求項３に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項６】
請求項５に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項８】
以下のステップ（１）及び（２）、或いは以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法：
（１）アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ；
（ｉ）請求項７に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
【請求項１１】
請求項１０に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月16日(2017.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ：
（１）作用：  電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する；
（２）基質特異性：  D-グルコースに対する反応性を100％としたときのD-キシロースに対する反応性が10％以下である；
（３）pH安定性：  pH5〜8で安定である；
（４）アミノ酸配列：  配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90％以上同一のアミノ酸配列を含む。
【請求項２】
アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、請求項１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、請求項２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするDNA；
（Ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるDNA；
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列と90％以上同一の塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項５】
請求項４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えDNAを保有する微生物。
【請求項７】
以下のステップ（１）及び（２）、或いは以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法：
（１）アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ；
（ｉ）請求項６に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
（ｉｉ）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
【請求項１０】
請求項９に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
【国際調査報告】
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