(57)【要約】本発明の目的は、従来技術に比べて簡便かつ短時間でありながら、エルゴチオネインを高収量で生産することができることから、工業的規模でのエルゴチオネインの製造を可能にする、エルゴチオネイン生産能を有する生物体を提供することにある。上記目的は、下記（１）の酵素をコードする遺伝子又は下記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換糸状菌により解決される。（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素
2016121285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の酵素をコードする遺伝子又は下記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換糸状菌。
（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインから下記式〔Ｉ〕
【化１】
2016121285.tif 000023
〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素
（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、上記式〔Ｉ〕に示されるヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素
【請求項２】
前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項３】
前記糸状菌がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項４】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、宿主糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項５】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項６】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、該形質転換糸状菌を宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて３０℃、３日間で培養した場合のエルゴチオネインの量が乾燥菌体質量１ｇあたり１０．０ｍｇ以上になるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項７】
前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項８】
前記（２）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（２）の酵素が配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項９】
ヒスチジン及びシステインを、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換糸状菌に作用させて、エルゴチオネインを得る工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
【請求項１０】
ヒスチジン及びシステインを含む培地を用いて、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換糸状菌を培養することにより得られた培養物から、純度が５％以上であるエルゴチオネイン含有物を得る工程を含む、高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法。
【請求項１１】
下記（１）の酵素をコードする遺伝子及び下記（２）の酵素をコードする遺伝子からなる群から得ばれる少なくとも１種の遺伝子と、異種遺伝子とを含む組換えベクター。
（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインから下記式〔Ｉ〕
【化２】
2016121285.tif 000024
〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素
（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、上記式〔Ｉ〕に示されるヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素
【請求項１２】
前記（１）の酵素をコードする遺伝子及び前記（２）の酵素をコードする遺伝子は、前記組換えベクターを挿入すべき宿主生物に由来する、又は該宿主生物に発現させるために最適化された遺伝子である、請求項１１に記載の組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年１月３０日出願の日本特願２０１５−１７３２８号及び２０１５年８月７日出願の日本特願２０１５−１５７４４４号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、エルゴチオネイン生産能が認められる菌類及び該菌類を利用したエルゴチオネインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
下記式〔ＩＩ〕
【化１】
2016121285.tif 000003
〔ＩＩ〕
で示されるエルゴチオネインは含硫アミノ酸の１種であり、ヒトを含めた動物の肝臓などの臓器や血液において存在が確認されている生体物質である。【０００４】
エルゴチオネインは抗酸化活性を有することが知られており、例えば、ヒドロキシルラジカルの捕捉作用、鉄や銅に依存した過酸化水素からのヒドロキシルラジカルの生成抑制作用、銅依存オキシヘモグロビンの酸化抑制作用、ミオグロビン及び過酸化水素によるアラキドン酸酸化抑制作用などを示すといわれている。また、エルゴチオネインは、エラスターゼ活性阻害作用、チロシナーゼ活性阻害作用、抗炎症作用、細胞エネルギー増進作用、抗ストレス作用、抗老化作用、しわ形成抑制作用、過酸化脂質生成抑制作用などを示すともいわれている。【０００５】
このような種々の生理活性を有する機能性生体物質であることや熱に強く水溶性の物質であるという特徴を活かして、エルゴチオネインを機能性食品、サプリメント、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料などへ応用することが期待されている。【０００６】
エルゴチオネインの製造方法としては、動物の臓器や血液から抽出する方法に加えて、エルゴチオネインの生産能があるキノコ類の菌糸体からエルゴチオネインを抽出する方法が知られている（例えば、下記の特許文献１及び２を参照、該文献の全記載はここに開示として援用される）。また、下記の非特許文献１及び２（該文献の全記載はここに開示として援用される）には細菌の多くはエルゴチオネインの生産能がないことや、菌類の中でもアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ；クロコウジカビ）やニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；アカパンカビ）はエルゴチオネインの生産能があるが、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；パン酵母）にはエルゴチオネインの生産能がほとんどないことなどが記載されている。【０００７】
エルゴチオネインの生産能がある菌類の中にはエルゴチオネインの生合成系が報告されているものがある。例えば、下記の非特許文献３及び４（該文献の全記載はここに開示として援用される）にはニューロスポラ・クラッサの生合成系が記載されており、下記の非特許文献５（該文献の全記載はここに開示として援用される）には分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の生合成系が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４８６５０８３号公報
【特許文献２】特許第５２３１０２５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Donald B. Melville et al, J. Biol. Chem. 1956, 223:9-17
【非特許文献２】Dorothy S. Genghof, J. Bacteriology, Aug. 1970, p.475-478
【非特許文献３】Fungal Genet Biol 49 (2012) 160-172
【非特許文献４】Org Lett. 2014 Oct 17;16(20):5382-5385
【非特許文献５】PLoS One 2014 May 14;9(5):e97774
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１及び２に記載の方法は、キノコ類の菌糸体を培養した後にエルゴチオネインを抽出する方法であるところ、キノコ類の菌糸体の培養は熟練及び長期間を要すことから、工業的規模でエルゴチオネインを生産するには不適な方法である。【００１１】
非特許文献１〜５の記載から、キノコ類以外の一部の菌類によってエルゴチオネインを生合成できることがわかる。これらのうち、非特許文献３には、ヒスチジンの−ＮＨ２基をメチル化してヘルシニンを生成し、このヘルシニン及びシステインから下記式〔Ｉ〕
【化２】
2016121285.tif 000004
〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素（ＮｃＥｇｔ−１）をコードする遺伝子（ＮＣＵ０４３４３）を欠失させるように形質転換した形質転換ニューロスポラ・クラッサが記載されている。また、非特許文献３及び４には、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する可能性がある酵素としてＮＣＵ０４６３６及びＮＣＵ１１３６５が記載されている。さらに非特許文献４には、実際にＮＣＵ１１３６５遺伝子を強発現（過剰発現）するように形質転換した形質転換大腸菌から抽出したＮＣＵ１１３６５を用いて、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）反応によりヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインが生成できたことが記載されている。【００１２】
しかし、非特許文献３及び４には、遺伝子ＮＣＵ０４３４３、ＮＣＵ０４６３６又はＮＣＵ１１３６５を過剰発現するように形質転換した形質転換体を用いて生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）反応によりエルゴチオネインを生成したという記載はない。【００１３】
一方、非特許文献５には、上記ＮｃＥｇｔ−１に相当する酵素をコードする遺伝子ＳＰＢＣ１６０４．０１を過剰発現するように形質転換した形質転換シゾサッカロミセス・ポンベを用いてエルゴチオネインをｉｎ  ｖｉｖｏ合成したことが記載されている。しかし、非特許文献５に記載の形質転換シゾサッカロミセス・ポンベを用いて得られたエルゴチオネインの量は非常に少なく、さらに上記ＮＣＵ１１３６５遺伝子に相当する遺伝子を過剰発現するように形質転換した形質転換体について記載がない。【００１４】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、特許文献１及び２に記載のキノコ類の菌糸体に比べて簡便かつ短時間でありながら、エルゴチオネインを高収量で生産することができることから、工業的規模でのエルゴチオネインの製造を可能にする、エルゴチオネイン生産能を有する生物体を提供すること、及び該生物体を利用した高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、菌類の一種であるアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ；ショウユコウジカビ）において、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子ＡｓＥｇｔＡ及びヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣを特定することに成功した。【００１６】
次に、本発明者らは、単離した各遺伝子を過剰発現するためのＤＮＡコンストラクトを作製し、アスペルギルス・ソーヤに導入して形質転換することによって、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを過剰発現する形質転換アスペルギルス・ソーヤ；ＡｓＥｇｔＡとＡｓＥｇｔＢとを過剰発現する形質転換アスペルギルス・ソーヤ；及びＡｓＥｇｔＡとＡｓＥｇｔＣとを過剰発現する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製することに成功した。【００１７】
これらの形質転換アスペルギルス・ソーヤを種々の試験に供した結果、驚くべきことに、ＡｓＥｇｔＡを過剰発現する形質転換株は野生株と比べてエルゴチオネインの生産能が向上する傾向にあるが、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを過剰発現する形質転換株はそのような傾向にないことを見出した。【００１８】
さらに驚くべきことに、このような事実がありながら、ＡｓＥｇｔＡとＡｓＥｇｔＢとを過剰発現する形質転換株及びＡｓＥｇｔＡとＡｓＥｇｔＣとを過剰発現する形質転換は、ＡｓＥｇｔＡを過剰発現する形質転換株と比べてエルゴチオネインの生産能が向上する傾向にあることを見出した。このことは、エルゴチオネイン生合成系に関与する２種の遺伝子を過剰発現する形質転換体は、相加的というよりもむしろ相乗的にエルゴチオネインの生産能を増強するものであることを示している。【００１９】
また、エルゴチオネイン生合成系に関与する上記１種又は２種の遺伝子を過剰発現する形質転換株は、常法に従って培養することができ、その増殖速度などについても野生株と格別相違がないものであった。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。【００２０】
したがって、本発明によれば、下記（１）の酵素をコードする遺伝子又は下記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換糸状菌が提供される。
（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素
（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素【００２１】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物である。【００２２】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記糸状菌がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である。【００２３】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、宿主糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である。【００２４】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記形質転換糸状菌は、前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である。【００２５】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、該形質転換糸状菌を宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて３０℃、３日間で培養した場合のエルゴチオネインの量が乾燥菌体質量１ｇあたり１０．０ｍｇ以上になるように増強された形質転換糸状菌である。【００２６】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である。【００２７】
好ましくは、本発明の形質転換糸状菌において、前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である。【００２８】
本発明の別の側面によれば、本発明の形質転換糸状菌を、宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて培養することにより得られた培養物から、純度が５％以上であるエルゴチオネイン含有物を得る工程を含む、高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法が提供される。【００２９】
本発明の別の側面によれば、前記（１）の酵素をコードする遺伝子及び前記（２）の酵素をコードする遺伝子からなる群から得ばれる少なくとも１種の遺伝子と、異種遺伝子とを含む組換えベクターが提供される。【００３０】
本発明の別の側面によれば、前記（１）の酵素をコードする遺伝子と異種遺伝子とを含む組換えベクター及び前記（２）の酵素をコードする遺伝子と異種遺伝子とを含む組換えベクターを含む組成物が提供される。【００３１】
好ましくは、本発明の組換えベクター及び組成物において、前記（１）の酵素をコードする遺伝子及び前記（２）の酵素をコードする遺伝子は、前記組換えベクターを挿入すべき宿主生物に由来する、又は該宿主生物に発現させるために最適化された遺伝子である。【００３２】
本発明の別の側面によれば、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換大腸菌が提供される。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の形質転換糸状菌や製造方法によれば、通常の糸状菌を培養する条件により、高含量かつ高純度のエルゴチオネインを製造することができる。その結果、本発明によれば、従来のエルゴチオネイン生産能があるキノコ類や該キノコ類を使用したエルゴチオネインの製造方法に比べて、簡便かつ短時間でエルゴチオネインを生産することができる。したがって、本発明によれば、工業的規模でエルゴチオネインを製造することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、実施例に記載の形質転換アスペルギルス・ソーヤ及びコントロール株のエルゴチオネインの生産量を調べた結果を示した図である。図中の「ＥＧＴ」はエルゴチオネインを表わす。
【図２】図２は、実施例に記載のコントロール株及びＡｓＥｇｔＡ形質転換株から得たエルゴチオネイン抽出液のＨＰＬＣチャートを示した図である。
【図３】図３は、実施例に記載の形質転換株及びコントロール株から抽出した総タンパク質を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真図である。レーン１はコントロール株、レーン２はＡｓＥｇｔＡ形質転換株、レーン３はＡｓＥｇｔＢ形質転換株、レーン４はＡｓＥｇｔＣ形質転換株、レーン５は（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株、レーン６は（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株の由来のものをそれぞれ示す。
【図４】図４は、菌類のエルゴチオネイン生合成系を表わした模式図である。図中の「ＳＡＭ」はＳ−アデノシルメチオニンを表わし、「ＰＬＰ」はピリドキサール  ５’−リン酸を表わす。
【図５】図５は、実施例に記載の形質転換アスペルギルス・オリゼ及びコントロール株のエルゴチオネインの生産量を調べた結果を示した図である。図中の「ＥＧＴ」はエルゴチオネインを表わす。
【図６】図６は、実施例に記載の形質転換大腸菌及びコントロール株のエルゴチオネインの生産量を調べた結果を示した図である。
【図７】図７は、実施例に記載の形質転換大腸菌の培養結果及びエルゴチオネインの生産量を調べた結果を示した図である。図中の「菌体内」はエルゴチオネイン抽出液中のエルゴチオネインの定量結果を示し、「菌体外」は培養上清中のエルゴチオネインの定量結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の詳細について説明する。
【００３６】
（本発明の形質転換糸状菌の概要）
本発明の形質転換糸状菌は、下記（１）の酵素をコードする遺伝子又は下記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する。
（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素
（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素
【００３７】
本発明の形質転換糸状菌は、外来遺伝子として挿入された上記（１）及び（２）の酵素（以下、それぞれ酵素（１）及び酵素（２）とよぶ。）をコードする遺伝子を過剰発現することにより、ヒスチジン及びシステインから最終的にエルゴチオネインを生成することができる。本発明の形質転換糸状菌は、大きく、酵素（１）をコードする遺伝子を過剰発現し、かつ、酵素（２）をコードする遺伝子を過剰発現しないもの；及び、酵素（１）をコードする遺伝子を過剰発現し、かつ、酵素（２）をコードする遺伝子を過剰発現するものの２つの態様に分けられる。なお、過剰発現する酵素（１）をコードする遺伝子及び過剰発現する酵素（２）をコードする遺伝子は、それぞれ単独に１種又は２種以上であり得る。
【００３８】
菌類の想定されるエルゴチオネインの生合成系の模式図を図４に示す。酵素（１）は図４中のｅｇｔＡに相当するものであり、酵素（２）は図４中のｅｇｔＢ又はｅｇｔＣに相当するものである。
【００３９】
（酵素（１）及び（２）の酵素学的性質）
酵素（１）は、図４に示されているとおり、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に依存して、ヒスチジンを、−ＮＨ２基がトリメチル化されたヘルシニンへ転換する反応を触媒し得る、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼ活性を有する。さらに、酵素（１）は、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヘルシニン及びシステインから、下記式〔Ｉ〕
【化３】
2016121285.tif 000005
〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒し得るスルファターゼ活性を有する。したがって、酵素（１）は、これらの活性を有することにより、結果として、Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成することができる。
【００４０】
酵素（２）は、ピリドキサール  ５’−リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒し得る、ＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼ活性を有する。
【００４１】
本発明の形質転換糸状菌は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を発現することによって、それぞれの酵素が活性化する条件において、ヒスチジン及びシステインからエルゴチオネインを生成することができる。
【００４２】
（酵素（１）及び（２）の構造的性質）
酵素（１）は、上記した酵素学的性質を有するもの、すなわち、Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインからヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒するようなＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼ活性及びスルファターゼ活性を有するものであれば、アミノ酸配列、全体的及び部分的な立体構造、分子量などの構造的性質；最適ｐＨ、最適温度、失活条件などの生化学的性質；由来生物種などによって特に限定されない。ただし、酵素（１）は、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼ活性及びスルファターゼ活性を有するものであるために、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼ及びスルファターゼによく保存されている領域（ドメイン）を含むものであることが好ましい。
【００４３】
ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域としては、例えば、ドメインＤＵＦ２２６０を含むＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼドメインが挙げられる。また、スルファターゼの保存領域としては、例えば、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）−スルファターゼドメインが挙げられる。ただし、上記ドメインは一体的に連結されているものでなくともよく、例えば、ドメイン内に非保存領域が含まれていてもよい。また、酵素（１）は、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域とスルファターゼの保存領域との間に、ＤｉｎＢ＿２ドメインを含むものであることが好ましく、鉄結合モチーフであるＨＸ３ＨＸＥを含むＤｉｎＢ＿２ドメインを含むものであることがより好ましい。
【００４４】
例えば、酵素（１）の一態様は、ＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼの保存領域、ＤｉｎＢ＿２ドメイン及びスルファターゼの保存領域を含む構造を有するものであり、酵素（１）の別の一態様は、ドメインＤＵＦ２２６０を含むＳＡＭ依存型メチルトランスフェラーゼドメイン、ＨＸ３ＨＸＥを含むＤｉｎＢ＿２ドメイン及びＦＧＥ−スルファターゼドメインを含む構造を有するものである。
【００４５】
酵素（１）の好ましい態様は、非特許文献３に記載のＮｃＥｇｔ−１（ＮＣＵ０４３４３）のアミノ酸配列との配列同一性が好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上であるアミノ酸配列を有するものである。なお、本明細書において「配列同一性」とは、２つの配列をアラインメントした場合の配列間の同一性（一致性；Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、配列間の類似性（Ｓｉｍｉｒａｌｉｔｙ）を意味するものではない。
【００４６】
酵素（１）の好ましい態様の具体例は、アクセッション番号（カッコ内の数値は配列番号４に記載のＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列をクエリーにしたＢｌａｓｔｐの結果としての配列同一性を示す）がそれぞれＸＰ＿００１７２７３０９．１（９７％）、ＸＰ＿００２３７５５５６．１（９７％）、ＸＰ＿００１２１１６１４．１（７４％）、ＧＡＡ９０４７９．１（７５％）、ＸＰ＿００１２６１０２７．１（７２％）、ＸＰ＿００１２７５８４３．１（７２％）、ＥＤＰ５５０６９．１（７２％）、ＸＰ＿７５５９００．１（７２％）、ＥＨＡ２４８１１．１（７４％）、ＸＰ＿００１３９７１１７．２（７３％）、ＥＹＥ９６６５５．１（７２％）、ＣＡＫ４２５４１．１（７１％）、ＸＰ＿６８０８８９．１（６９％）、ＥＰＳ３２７２３．１（６６％）、ＧＡＤ９１７６２．１（６３％）、ＥＫＶ０６０１８．１（６３％）、ＸＰ＿００２４８７１５９．１（６１％）、ＸＰ＿００２１４５３８７．１（６１％）、ＣＤＭ３１０９７．１（６２％）、ＸＰ＿００２６２３０４５．１（５７％）、ＥＱＬ３６０９６．１（５７％）、ＥＥＱ９１０１２．１（５７％）、ＸＰ＿００２７９４３１６．１（５７％）、ＸＰ＿００２５４０８３９．１（５７％）、ＸＰ＿００１２４６５０５．１（５７％）、ＸＰ＿００３０６６６８１．１（５６％）、ＥＦＷ１８３２９．１（５６％）、ＥＥＨ０６８２０．１（５６％）、ＸＰ＿００３１７２８０３．１（５５％）、ＥＧＥ８２２３０．１（５６％）、ＥＧＤ９５４２６．１（５４％）、ＥＺＦ３０３９１．１（５４％）、ＥＨＹ５３１４９．１（５３％）、ＸＰ＿００２８４４１４０．１（５４％）、ＸＰ＿００３２３７５５５．１（５４％）、ＥＸＪ７８７６５．１（５２％）、ＸＰ＿００１５４３９８０．１（５３％）、ＥＸＪ８４１６７．１（５３％）、ＥＸＪ７６８０４．１（５１％）、ＥＴＩ２１４２５．１（５２％）、ＥＸＪ５５８６８．１（５２％）、ＥＫＧ１３３７７．１（５１％）、ＸＰ＿００３８３６９８８．１（５１％）、ＥＯＮ６０８３１．１（５０％）、ＥＧＥ０８４４６．１（５２％）、ＥＭＤ８６１６３．１（５１％）、ＥＵＮ２１８１４．１（５１％）、ＥＭＤ６９８９５．１（５０％）、ＥＭＥ４０６６９．１（５２％）、ＥＵＣ４５４２７．１（５１％）、ＥＥＨ１８３６５．１（５２％）、ＸＰ＿００１９３９５３７．１（５１％）、ＥＵＣ２８３２７．１（５０％）、ＸＰ＿００３２９６６４５．１（５０％）、ＥＥＲ３８４８６．１（５４％）、ＸＰ＿００７５８７６３２．１（５０％）、ＥＯＡ８７１１０．１（５０％）、ＥＥＨ４７３０３．１（５４％）、ＥＭＣ９１７７２．１（５１％）、ＥＪＴ７９０６３．１（５０％）、ＸＰ＿００７２８９８７８．１（５１％）、ＥＭＦ０９３０８．１（５０％）、ＸＰ＿００７２７４１８８．１（４９％）、ＸＰ＿００３８４９５４０．１（５１％）、ＥＮＨ８３４０９．１（５０％）、ＥＱＢ４７７５４．１（４８％）、ＸＰ＿００６６９３５１０．１（５１％）、ＥＴＮ４１９１６．１（５０％）、ＸＰ＿００３７１１９３３．１（４９％）、ＥＷＧ４６２９９．１（５０％）、ＥＧＵ８７４１２．１（４９％）、ＥＳＺ９５３６５．１（４８％）、ＥＧＣ４７６３１．１（５２％）、ＥＸＭ３１３８１．１（４９％）、ＥＸＬ８３３７３．１（４９％）、ＸＰ＿３８５８２３．１（５０％）、ＥＭＴ７００５４．１（５０％）、ＥＸＫ９５３１３．１（４９％）、ＣＣＴ７１８６０．１（５０％）、ＥＸＭ０４８６７．１（４９％）、ＥＸＡ３８５３１．１（４９％）、ＥＷＺ３４５７７．１（４９％）、ＥＷＹ８７１０２．１（４９％）、ＥＮＨ７０５８５．１（４９％）、ＥＹＢ２９６６１．１（５０％）、ＥＸＫ３７２１９．１（４９％）、ＥＷＺ９５３２３．１（４９％）、ＥＧＹ２０６１３．１（４９％）、ＥＭＥ７８６７１．１（５０％）、ＥＫＪ７３６２３．１（５０％）、ＥＦＱ３０７０１．１（４８％）、ＥＰＥ０９９７７．１（４８％）、ＥＸＶ０６６２４．１（４９％）、ＥＲＳ９９８５２．１（４９％）、ＥＧＯ５９４６２．１（４９％）、ＸＰ＿００３３４８７８０．１（４８％）、ＥＦＹ９９９２７．１（４９％）、ＸＰ＿００７５９４９１５．１（４７％）、ＸＰ＿００３６６０７５２．１（４９％）、ＥＡＡ２７０８８．３（４９％）、ＥＲＦ６８２７９．１（４９％）、ＥＦＸ０４４２９．１（５０％）、ＥＴＲ９８６７６．１（４９％）、ＥＦＹ８４３４０．１（４８％）、ＸＰ＿００６９６８６２０．１（４８％）、ＸＰ＿００３０４８８８４．１（４９％）、ＥＨＫ２０８３２．１（４９％）、ＥＰＥ２４４１３．１（４９％）、ＥＪＰ６２９６２．１（４９％）、ＥＴＳ８３７４０．１（４８％）、ＥＨＫ４５９８９．１（４９％）、ＥＬＱ６４９０４．１（４７％）、ＸＰ＿００６６７２５５５．１（４８％）、ＥＬＱ４０００７．１（４６％）、ＥＸＬ８３３７５．１（５０％）、ＥＸＫ９５３１５．１（５０％）、ＣＣＥ３３５９１．１（４８％）、ＥＸＭ０４８６９．１（５１％）、ＥＸＡ３８５３３．１（５０％）、ＥＷＺ９５３２５．１（５０％）、ＥＸＫ３７２２１．１（５０％）、ＥＷＺ３４５７９．１（５０％）、ＥＷＹ８７１０４．１（５０％）、ＣＣＸ３１７５４．１（４７％）、ＸＰ＿９５６３２４．２（４６％）及びＸＰ＿９５６３２４．２（４６％）であるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。上記のうち、例えば、アクセッション番号がＸＰ＿００１７２７３０９．１（９７％）であるタンパク質は配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、アクセッション番号がＸＰ＿００１３９７１１７．２（７３％）であるタンパク質は配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。これらのことより、ＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有するメチルトランスフェラーゼ、又はメチルトランスフェラーゼと推定される（ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  ｐｕｔａｔｉｖｅ）アミノ酸配列やメチルトランスフェラーゼとみなされる理論的タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列を有するタンパク質は酵素（１）として利用し得る。
【００４７】
酵素（２）もまた、上記した酵素学的性質を有するもの、すなわち、ピリドキサール  ５’−リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として、ヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒するようなＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼ活性を有するものであれば、構造的性質、生化学的性質及び由来生物種などによって特に限定されない。ただし、酵素（２）は、ＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼ活性を有するものであるために、ＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼの保存領域（ドメイン）を含むものであることが好ましい。
【００４８】
酵素（２）としては、非特許文献３に記載のＮＣＵ０４６３６との配列同一性が７５％程度であるＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼドメインを含む構造を有するものと非特許文献４に記載のＮＣＵ１１３６５との配列同一性が４４％程度であるＰＬＰ結合型システイン・デスルフラーゼドメインを含む構造を有するものという少なくとも構造的に２種類のものであり得る。酵素（２）は、これら２種類のうちいずれか１種のものであってもよく、両方であってもよい。
【００４９】
（酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列）
酵素（１）及び（２）は、上記した酵素学的性質、好ましくは上記した酵素学的性質及び構造的性質を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。例えば、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）の一態様として配列番号４に示すアミノ酸配列があり、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（２）の一態様として配列番号５及び６に示すアミノ酸配列がある。これら配列番号４〜６に示すアミノ酸配列を有する酵素は、すべてアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質と名付けられる。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１〜３に示す塩基配列である。
【００５０】
同様に、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）の一態様として配列番号２６及び３４に示すアミノ酸配列がある。配列番号２６及び３４に示すアミノ酸配列を有する酵素は、それぞれアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｏＥｇｔＡタンパク質及びＡｎＥｇｔＡタンパク質と名付けられる。また、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号２３及び３３に示す塩基配列である。また、上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（２）の一態様として配列番号２７及び２８に示すアミノ酸配列がある。配列番号２７及び２８に示すアミノ酸配列を有する酵素は、それぞれアスペルギルス・オリゼに由来するものであり、本発明者らによりそれぞれＡｏＥｇｔＢタンパク質及びＡｏＥｇｔＣタンパク質と名付けられる。また、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号２４及び２５示す塩基配列である。
【００５１】
ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣは、アスペルギルス・ソーヤの染色体ＤＮＡ上に存在するこれらの酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。また、ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣタンパク質は、アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ上に存在する該酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。さらにＡｎＥｇｔＡタンパク質は、アスペルギルス・ニガーの染色体ＤＮＡ上に存在する該酵素をコードする遺伝子によってコードされるものである。このような由来生物の染色体ＤＮＡ上に存在する遺伝子及び該遺伝子によってコードされるタンパク質や酵素を、それぞれ「野生型遺伝子」及び「野生型タンパク質」や「野生型酵素」と本明細書ではよぶ場合がある。
【００５２】
酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列は、それぞれ上記した酵素（１）及び（２）の酵素学的性質を有するものであれば、野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００５３】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えらた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５４】
野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型酵素が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００５５】
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、上記した酵素学的性質、好ましくは上記した酵素学的性質及び構造的性質を有する酵素（１）及び（２）が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものであれば特に限定されない。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が形質転換糸状菌内で過剰発現することにより酵素（１）及び（２）が生産される。本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の触媒活性を有する態様で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質（酵素）が生産されることを意味する。
【００５６】
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由して酵素（１）及び（２）を生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずに酵素（１）及び（２）を生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。
【００５７】
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも上記した酵素学的性質を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００５８】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【００５９】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【００６０】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）  核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社）、０．１％（ｗ／ｖ）  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ  、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【００６１】
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ。これらの文献の全記載はここに開示として援用される）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【００６２】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００６３】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００６４】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ酵素活性を有するものである。
【００６５】
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【００６６】
２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【００６７】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０．１（ゼネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【００６８】
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、例えば、エルゴチオネイン生産能がある生物種や酵素（１）及び（２）の発現が見られる生物種などに由来する。酵素（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物が挙げられる。微生物の中でも糸状菌はエルゴチオネイン生産能があることが知られている菌種が多いことから好ましい。糸状菌の具体例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌が挙げられ、より具体的にはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）などが挙げられる。
【００６９】
上記アスペルギルス属糸状菌の具体例として挙げたアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用による安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。
【００７０】
上記のとおり、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換糸状菌において発現される酵素（１）及び（２）は、宿主糸状菌の生育条件によって不活化せず、又はそれぞれの活性を示す蓋然性がある。そこで、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主糸状菌や宿主糸状菌と生育条件が近似する糸状菌であることが好ましい。
【００７１】
（遺伝子工学的手法による酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のクローニング）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の取得方法や、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子配列、酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
【００７２】
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素（１）及び（２）の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００７３】
例えば、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する微生物由来の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株、アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
【００７４】
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。その例としては、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計した配列番号１７〜２２で表されるプライマーなどが挙げられる。なお、これらのプライマーを用いると、目的遺伝子全長が増幅されるので、ＲＡＣＥを省略できる。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００７５】
また、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を構築することが可能である。
【００７６】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌  ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
【００７７】
該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素（１）及び（２）のアミノ酸配列を知り得る。
【００７８】
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることがができる。
【００７９】
本発明の別の一態様として、酵素（１）をコードする遺伝子を含む組換えベクター、酵素（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクター、並びに酵素（１）をコードする遺伝子及び酵素（２）をコードする遺伝子を含む組換えベクターが挙げられる。本発明の組換えベクターは、本発明の形質転換糸状菌を作製するために使用される。
【００８０】
本発明の組換えベクターは、異種遺伝子又は異種核酸配列を含むことが好ましい。異種遺伝子は宿主生物に本来的に存在しない（ｎｏｔ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）遺伝子であれば特に限定されず、例えば、宿主生物由来の核酸配列に依拠しない合成遺伝子、酵素（１）をコードする遺伝子と由来生物が相違する生物に由来する遺伝子、宿主生物と相違する他の糸状菌や微生物、植物、動物、ウイルスなどの生物に由来する遺伝子などが挙げられる。宿主生物が糸状菌である場合の異種遺伝子の具体例としては、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
本発明の組換えベクターの具体例としては、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片と、ＰｔｅｆのＤＮＡ断片と、ＡｓＥｇｔＡ及び／又はＡｓＥｇｔＣのＤＮＡ断片と、ＴａｌｐのＤＮＡ断片と、ｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結してなる組換えベクターが挙げられるが、これに限定されない。
【００８２】
（形質転換糸状菌の作製方法）
本発明の形質転換糸状菌の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトのみ又は酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト及び酵素（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトの両方で宿主糸状菌を形質転換することにより、酵素（１）をコードする遺伝子のみ又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の両方を過剰発現する形質転換糸状菌が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００８３】
酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【００８４】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【００８５】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【００８６】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中で酵素（１）又は酵素（１）及び（２）を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【００８７】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３ （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００８８】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中で酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００８９】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【００９０】
ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００９１】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００９２】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
【００９３】
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有する酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素（１）又は（２）をコードする遺伝子の上流領域及び酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。酵素（１）若しくは（２）をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
【００９４】
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）の酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるエルゴチオネインの量が、同じ条件下で培養した宿主糸状菌の培養物におけるエルゴチオネインの量よりも大きいことを確認することにより行うことができる。
【００９５】
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
【００９６】
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００９７】
相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。 
【００９８】
（宿主糸状菌）
宿主糸状菌としては、酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト又は酵素（１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクト及び酵素（２）をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）を生産することができる糸状菌であれば特に限定されないが、例えば、エルゴチオネインの生産が認められる糸状菌や酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌が好ましい。宿主糸状菌の具体例としては、非特許文献１及び２に記載の糸状菌が挙げられ、例えば、アスペルギルス属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アカパンカビ（Ｎｅｕｓｐｏｒａ）属などに属する糸状菌が挙げられる。酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する糸状菌としては、例えば、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属などに属する糸状菌などが挙げられる。
【００９９】
糸状菌の中でも、安全性や培養の容易性を加味すれば、上記に酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来生物として挙げた、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー 、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・サイトイなどのアスペルギルス属微生物であることが好ましい。
【０１００】
（酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の具体例）
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（１）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｓＥｇｔＡが挙げられる。また、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（２）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣが挙げられる。遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜３として示す。また、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号４〜６として示す。
【０１０１】
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来の酵素（１）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｏＥｇｔＡが挙げられる。また、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来の酵素（２）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣが挙げられる。遺伝子ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２３〜２５として示す。また、ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号２６〜２８として示す。
【０１０２】
アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株由来の酵素（１）をコードする遺伝子としては、例えば、後述する実施例に記載がある遺伝子ＡｎＥｇｔＡが挙げられる。遺伝子ＡｎＥｇｔＡの塩基配列を配列表の配列番号３３として示す。また、ＡｎＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号３４として示す。
【０１０３】
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガー以外の糸状菌から酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列（配列番号１〜３）並びにＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４〜６）に基づいて、その他の糸状菌のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、糸状菌の総タンパク質を基に、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。得られた遺伝子が酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子に相当することは、得られた遺伝子により由来糸状菌を宿主糸状菌として形質転換し、宿主糸状菌に比してエルゴチオネインの生産量が増強されていることで確認できる。
【０１０４】
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーは生育条件が近似していることから、これらそれぞれが有する遺伝子を挿入することにより、相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、アスペルギルス・ソーヤから得られた酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を、宿主糸状菌としてアスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ニガーに導入して形質転換することができる。酵素（１）又は酵素（１）及び（２）が確実に所望の酵素活性を有することを鑑みれば、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の由来糸状菌と宿主糸状菌とが同一であることが好ましい。例えば、アスペルギルス・ソーヤ由来の酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子を、同じアスペルギルス・ソーヤに形質転換することが挙げられる。
【０１０５】
酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子は、アスペルギルス・ソーヤなどに由来する酵素（１）や酵素（２）をコードする遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、宿主生物に発現させるためにコドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。そのような遺伝子の具体例としては、大腸菌発現用に合成されたＥｃＥｇｔＡ（配列番号３７）及びＥｃＥｇｔＣ（配列番号３８）が挙げられる。
【０１０６】
（本発明の形質転換糸状菌の一実施態様）
本発明の一実施態様は、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＡ及び／又はＡｎＥｇｔＡをアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーその他の糸状菌に挿入して、挿入した遺伝子がコードするタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換糸状菌である。本発明の別の一実施態様は、遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＡ及び／又はＡｎＥｇｔＡと遺伝子ＡｓＥｇｔＢ、ＡｓＥｇｔＣ、ＡｏＥｇｔＢ及び／又はＡｏＥｇｔＣとをアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーその他の糸状菌に挿入して、挿入した遺伝子がコードするタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換糸状菌である。このような形質転換糸状菌は、挿入した遺伝子がコードする酵素（１）又は酵素（１）及び酵素（２）を過剰発現することにより、宿主糸状菌よりも、エルゴチオネインの生産量が大きい。また、後述する実施例に記載があるとおり、例えば、ＡｓＥｇｔＡタンパク質とＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣタンパク質とを過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ＡｓＥｇｔＡタンパク質のみを過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤよりも、エルゴチオネインの生産量が大きい。そこで、本発明の形質転換糸状菌は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、宿主糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌であることが好ましい。また、本発明の形質転換糸状菌は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、酵素（１）をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌であることがより好ましい。
【０１０７】
また、後述する実施例に記載があるとおり、例えば、ＡｓＥｇｔＡタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ又はＡｓＥｇｔＡタンパク質とＡｓＥｇｔＢ若しくはＡｓＥｇｔＣタンパク質とを過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、宿主糸状菌であるアスペルギルス・ソーヤの生育に適したＤＰＹ培地を用いて３０℃、３日間で培養することにより、乾燥菌体質量１ｇあたり２６．６〜３７．３ｍｇのエルゴチオネインが得られている。それに対して、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣタンパク質を過剰発現するように形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、同じ条件で培養することにより、乾燥菌体質量１ｇあたり０．９〜１．２ｍｇのエルゴチオネインのみしか生産しない。そこで、本発明の形質転換糸状菌の一実施態様は、酵素（１）又は酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、本発明の形質転換糸状菌を宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて３０℃、３日間で培養した場合のエルゴチオネインの量が乾燥菌体質量１ｇあたり５．０ｍｇ以上、好ましくは１０．０ｍｇ以上、より好ましくは２０．０ｍｇ以上、さらに好ましくは２５．０ｍｇ以上になるように増強された形質転換糸状菌である。また、本発明の形質転換糸状菌の別の一実施態様は、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子の発現が、本発明の形質転換糸状菌を宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて３０℃、３日間で培養した場合のエルゴチオネインの量が乾燥菌体質量１ｇあたり２７．０ｍｇ以上、好ましくは２８．０ｍｇ以上、より好ましくは２９．０ｍｇ以上、さらに好ましくは３０ｍｇ以上になるように増強された形質転換糸状菌である。
【０１０８】
本発明の形質転換糸状菌は、挿入された酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子によって生産される酵素（１）及び（２）と同時に、宿主糸状菌が本来保有している酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子により上記酵素（１）及び（２）と構造的性質が同種又は別種の野生型の酵素（１）及び（２）を生産する場合がある。
【０１０９】
本発明の別の一態様として、酵素（１）及び（２）をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換古細菌又は形質転換真性細菌が挙げられる。形質転換真性細菌の非限定的な例としては、ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＡ及びＥｃＥｇｔＣを含有するプラスミドベクターによって形質転換された形質転換大腸菌が挙げられる。
【０１１０】
（本発明のエルゴチオネインの製造方法）
本発明のエルゴチオネインの製造方法は、ヒスチジン及びシステインを、本発明の形質転換糸状菌に作用させて、エルゴチオネインを得る工程を少なくとも含む。ヒスチジン及びシステインを形質転換糸状菌に作用させる方法は、ヒスチジン及びシステインと形質転換糸状菌とが接触して、形質転換糸状菌が有する酵素によってエルゴチオネインが生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒスチジン及びシステインを含有し、かつ、形質転換糸状菌の生育に適した培地を用いて、形質転換糸状菌に適した各種培養条件下で形質転換糸状菌を培養することによって、エルゴチオネインを製造する方法が挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気条件下で行う固体培養法や液体培養法が挙げられる。
【０１１１】
培地は、糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。糸状菌がアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＤＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。ただし、培地成分には、酵素（１）の活性化に必要な鉄（ＩＩ）が含まれることが好ましい。鉄（ＩＩ）は化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。
【０１１２】
ヒスチジン及びシステインは特に限定されず、例えば、ヒスチジン及びシステインそれ自体、ヒスチジン及びシステインを構成単位として含む誘導体（例えば、シスチン）、ヒスチジン及びシステイン含有物などが挙げられる。
【０１１３】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＤＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３〜５日間の振盪培養が挙げられる。
【０１１４】
培養終了後に培養物からエルゴチオネインを抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
【０１１５】
抽出溶媒はエルゴチオネインが溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒；水、温水及び熱水などが挙げられる。溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながらエルゴチオネインを抽出する。抽出溶媒温度は室温から１００℃に設定することができる。
【０１１６】
エルゴチオネインの抽出方法の一実施態様としては、例えば、培養物から回収した菌体を水で洗浄した後に、菌体を水に加えた懸濁液を調製し、次いで得られた懸濁液を９８〜１００℃、１５分間などの加温処理に供した後に、遠心分離することにより上清を回収し、次いで回収した上清をろ過して不溶物を取り除く方法が挙げられる。また、該加熱処理した懸濁液を、遠心分離に供することなく、ろ過してもよい。
【０１１７】
また、上記加温処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
【０１１８】
得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することによりエルゴチオネインを精製することができる。
【０１１９】
エルゴチオネインの定性的又は定量的分析は特に限定されず、例えば、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。ＨＰＬＣ分離条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【０１２０】
本発明の形質転換糸状菌を用いれば、高収量のエルゴチオネインが得られる。例えば、非特許文献５のＦｉｇ．Ｓ６に記載のエルゴチオネインの収量は非常に少なく、最大でも培養液４０ｍＬあたり１０μｇ程度である。それに対して、本発明の形質転換糸状菌を用いた場合、培養液１０ｍｌあたり、３ｍｇ以上のエルゴチオネインを製造することができる。
【０１２１】
（本発明の高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法）
本発明の高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法は、本発明の形質転換糸状菌を、ヒスチジン及びシステインを含み、好ましくは宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて培養することにより得られた培養物から、純度が５％以上であるエルゴチオネイン含有物を得る工程を含む。
【０１２２】
本発明の高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法により得られるエルゴチオネイン含有物の純度は５％以上であれば特に限定されないが、好ましくは６％以上であり、より好ましくは８％以上であり、さらに好ましくは９％以上である。エルゴチオネイン含有物の純度の測定は、例えば、本発明の形質転換糸状菌を培養して得られた培養物からエルゴチオネイン抽出液を得て、次いで得られたエルゴチオネイン抽出液を凍結乾燥などして乾燥粉末を得て、次いで得られた乾燥粉末を適当な濃度になるように蒸留水に溶かして純度測定試料を得て、次いで得られた純度測定試料をＨＰＬＣなどのエルゴチオネインを定量する方法により測定し、次いで測定結果と純度測定試料とから算出することにより行うことができる。
【０１２３】
本発明の製造方法の別の態様は、形質転換体ではなく、酵素（１）又は酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有する微生物を用いる製造方法である。例えば、本発明の製造方法の別の態様は、ヒスチジン及びシステインを、酵素（１）又は酵素（１）及び酵素（２）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡ上に有するアスペルギルス属微生物といった麹菌などの糸状菌に作用させて、エルゴチオネイン又は高純度エルゴチオネイン含有物を得る工程を含む、エルゴチオネイン又は高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法である。
【０１２４】
本発明の製造方法において、生産物であるエルゴチオネインが、使用する微生物に対して増殖阻害又は生産阻害を引き起こし得る。そこで、培地中に銅イオンなどの酸化剤を添加することにより、生産したエルゴチオネインを二量体化（Ｓ−Ｓ結合の形成）して、微生物の増殖阻害又は生産阻害を回避できる可能性がある。したがって、本発明の製造方法において、ヒスチジン及びシステインを微生物に作用させる際に、銅イオンなどの酸化剤が存在していることが好ましい。
【０１２５】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【０１２６】
（エルゴチオネインの用途）
本発明の形質転換糸状菌や本発明の製造方法を利用して得られたエルゴチオネインは、種々の生理活性を有する機能性生体物質であることや熱に強く水溶性の物質であるという特徴を活かして、機能性食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料などやこれらの製品を製造するための原料として利用可能である。
【０１２７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【０１２８】
［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象遺伝子の探索
ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）においてエルゴチオネインの生合成に関与する酵素としてＮＣＵ０４３４３及びＮＣＵ１１３６５が知られている（非特許文献３及び４を参照）。また、非特許文献３では、ＮＣＵ０４６３６がエルゴチオネインの生合成に関与する可能性が示唆されている。そこで、ニューロスポラ・クラッサの上記３つの酵素をコードする遺伝子をクエリーとして、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列を基に、ＮＣＵ０４３４３、ＮＣＵ０４６３６及びＮＣＵ１１３６５のそれぞれをコードする遺伝子と比較的配列同一性の高い領域を検索した。検索にはＢＬＡＳＴプログラム（ｔｂｌａｓｔｎ）及びアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅｓ、  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ６５  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；  ＤＦ０９３５５７−ＤＦ０９３５８５、ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １８，１６５-１７６，２０１１）を用いた。【０１２９】
その結果、ＮＣＵ０４３４３と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号１に示す遺伝子が見出された。この遺伝子をアスペルギルス・ソーヤ由来のｅｇｔＡ遺伝子という意味でＡｓＥｇｔＡ遺伝子（配列番号１）と名付けた。ＮＣＵ０４６３６と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号２に示す遺伝子が見出され、この遺伝子をＡｓＥｇｔＢ遺伝子（配列番号２）と名付けた。ＮＣＵ１１３６５と比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号３に示す遺伝子が見出され、この遺伝子をＡｓＥｇｔＣ遺伝子（配列番号３）と名付けた。【０１３０】
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０．１（ゼネティックス社）によりアミノ酸レベルでの配列同一性の比較を行うと、ＡｓＥｇｔＡタンパク質（配列番号４）、ＡｓＥｇｔＢタンパク質（配列番号５）及びＡｓＥｇｔＣタンパク質（配列番号６）とＮＣＵ０４３４３、ＮＣＵ０４６３６及びＮＣＵ１１３６５との配列同一性は、それぞれ４６％、７５％及び４４％であった。また、ＡｓＥｇｔＣタンパク質とＮＣＵ１１３６５のシゾサッカロミセス・ポンベのオルソログであるＳＰＢＣ６６０．１２ｃとの配列同一性は２７％であった。以上の結果から、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣの塩基配列やアミノ酸配列に基づけば、他のアスペルギルス属微生物のｅｇｔＡ遺伝子、ｅｇｔＢ遺伝子及びｅｇｔＣ遺伝子が探索できることが示唆された。【０１３１】
（２）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出
１５０ｍｌ容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ３、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸；ｐＨ６．０）を蒸留水で３０ｍｌ調製し、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。【０１３２】
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
プラスミドｐＵＣ１９に、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号７）、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号８）、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ（上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１８３８ｂｐ、配列番号９）を連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。【０１３３】
Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧは、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。Ｐｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表１〜３に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧの各増幅断片をこの順に連結し、さらにｐＵＣ１９と連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【０１３４】
【表１】
2016121285.tif 000006
【０１３５】
【表２】
2016121285.tif 000007
【０１３６】
【表３】
2016121285.tif 000008
【０１３７】
ｐＵＣ１９は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅにて、増幅したＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧを、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。【０１３８】
得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。【０１３９】
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。【０１４０】
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆ及びＴａｌｐの間に、対象遺伝子であるＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。【０１４１】
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表４に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【０１４２】
【表４】
2016121285.tif 000009
【０１４３】
アスペルギルス・ソーヤ由来の遺伝子ＡｓＥｇｔＡ（配列番号１）、ＡｓＥｇｔＢ（配列番号２）及びＡｓＥｇｔＣ（配列番号３）を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（エッペンドルフ社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣを増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表５〜７に示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（Ｐｔｅｆ及びＴａｌｐの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【０１４４】
【表５】
2016121285.tif 000010
【０１４５】
【表６】
2016121285.tif 000011
【０１４６】
【表７】
2016121285.tif 000012
【０１４７】
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣとを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣが挿入された対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、５’末端側から３’末端側にかけて、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣのＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９のＭＣＳに、Ｐｔｅｆ−ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧの配列が順に連結された３種のＤＮＡコンストラクトが得られた。【０１４８】
得られたＤＮＡコンストラクトにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。【０１４９】
得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクト）を抽出した。【０１５０】
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。【０１５１】
［例２．形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製（１）］
（１）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株
各ＤＮＡコンストラクトをエタノール沈殿した後に、ＴＥに溶解して、所望の濃度に調製したＤＮＡ溶液を、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。【０１５２】
（２）アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。【０１５３】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。【０１５４】
［例３．形質転換アスペルギルス・ソーヤのエルゴチオネイン生産（１）］
下記表８に示すとおり、コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株；遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣのいずれか１種の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤ；並びに遺伝子ＡｓＥｇｔＡと遺伝子ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣとにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤのそれぞれのエルゴチオネイン生産能を以下のとおりに比較した。【０１５５】
【表８】
2016121285.tif 000013
【０１５６】
５０ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ｐＨ未調整）１０ｍｌに、表８に示す各菌株の分生子を接種し、３０℃で３日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス（カルバイオケム社）上で回収した。回収した菌体を４０ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体の質量を秤量し、該湿菌体の質量に対して２倍量の水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、９８℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、エルゴチオネイン抽出液を得た。【０１５７】
得られたエルゴチオネイン抽出液について、下記の条件のＨＰＬＣにより分析した。
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＨＩＬＩＣ（４．６×２５０ｍｍ）
溶離液；アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウム＝８：２
流速；１ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長；２２０ｎｍ
温度；室温
定量法；エルゴチオネイン標品（エンゾライフサイエンス社；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＭＬ−ＦＲ１１１）を用いた検量線法【０１５８】
表８に示す各菌株のうち、エルゴチオネインの量が最大であったものを選抜し、それらについてエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を比較した。比較した結果を表９及び図１に示す。ここで、上記で得たＡｓＥｇｔＡ形質転換株の湿菌体（ペーパータオルで水分を除いたもの）の一部について、水分計（ＭＸ−５０；エー・アンド・デイ社）を用いて水分含量を測定した結果、湿菌体の水分含量は７７．７％だった。そこで、表９では、乾燥菌体あたりのエルゴチオネインの生産量を算出するにあたり、水分含量を７８％として概算している。【０１５９】
また、コントロール株（コントロール）及びＡｓＥｇｔＡ形質転換株を用いたエルゴチオネイン抽出液のＨＰＬＣのチャートを図示したものを図２に示す。さらに次の手順によりエルゴチオネイン抽出液中のエルゴチオネインの純度を測定した。【０１６０】
すなわち、５００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地１００ｍｌに、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株の分生子を接種し、３０℃で３日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をミラクロス上で回収した。回収した菌体を２００ｍｌの蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体の質量を秤量し、該湿菌体の質量に対して２倍量の水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、沸騰浴中で１５分間加熱した。加熱終了後に、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、エルゴチオネイン抽出液を得た。得られたエルゴチオネイン抽出液を凍結乾燥して凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末を２５ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水に溶かして、純度測定試料とした。この純度測定試料について、エルゴチオネイン量を測定した結果、２．３ｍｇ／ｍｌだった。したがって、抽出液中のＥＧＴの純度は９．２％と算出された。【０１６１】
【表９】
2016121285.tif 000014
【０１６２】
表９及び図１に示されているとおり、３種の対象遺伝子のうち１種又は２種の遺伝子を導入することにより形質転換したＡｓＥｇｔＡ形質転換株、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株は、形質転換していないコントロール株並びにＡｓＥｇｔＢ形質転換株及びＡｓＥｇｔＣ形質転換株よりも、エルゴチオネインの生産量が多かった。また、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株はエルゴチオネインの生産量が多いものの、ＡｓＥｇｔＢ形質転換株及びＡｓＥｇｔＣ形質転換株のエルゴチオネインの生産量はコントロール株と変わらないこと、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株のエルゴチオネインの生産量は、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株のエルゴチオネインの生産量及びＡｓＥｇｔＢ形質転換株又はＡｓＥｇｔＣ形質転換株のエルゴチオネインの生産量を合計した総エルゴチオネイン量よりも多かったことを鑑みれば、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株は、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株、ＡｓＥｇｔＢ形質転換株及びＡｓＥｇｔＣ形質転換株に対して、相加的というよりもむしろ相乗的にエルゴチオネインの生産能が増強されたものであることがわかった。【０１６３】
また、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株では、通常の糸状菌を培養する際の培地及び培養条件を用いて、３日間培養を一度実施することにより３７．３ｍｇ／ｇ−乾燥菌体でエルゴチオネインを生産することができた。これに対して、例えば、特許文献１ではタモギタケの菌糸体を高濃度のアミノ酸を添加した培地を用いて、二段階の合計２８日間の培養をしてはじめて３４ｍｇ／ｇ−乾燥菌体のエルゴチオネインが得られている。したがって、本発明の形質転換糸状菌を用いれば、通常の糸状菌の培養方法を採用して、簡潔かつ短時間で高含量のエルゴチオネインを生産できることがわかった。【０１６４】
また、図２に示されているとおり、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株は、コントロール株との比較から、エルゴチオネインを効率的に高純度で生産できることがわかった。このことは、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株を用いて得られたエルゴチオネイン抽出液中のエルゴチオネイン純度測定結果により裏付けられる。同様に、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株においても、エルゴチオネインを効率的に高純度で生産できることがわかった。【０１６５】
［例４．形質転換アスペルギルス・ソーヤの確認］
試験管中のＤＰＹ液体培地１０ｍｌに、表８に示す各菌株の分生子を接種し、３０℃で３日間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体を、ビーズ式細胞破砕装置（ＭＳ−１００Ｒ；トミー精工社）を用いて冷却条件で破砕した破砕菌体末を、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液に懸濁することによりＳＤＳ懸濁液を得た。得られたＳＤＳ懸濁液にサンプルバッファー（Ｌａｎｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（５×）；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１／４容量添加して攪拌し、次いで９８℃、３分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により回収した上清について、菌体０．２ｍｇ相当をアプライすることにより、アクリルアミドゲル電気泳動に供して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。結果を図３に示す。【０１６６】
図３に示されているとおり、ＡｓＥｇｔＡタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が９５．７ｋＤａであるところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは９０ｋＤａ付近に２本のバンドとして見られた。同様に、ＡｓＥｇｔＢタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が５６．４ｋＤａであるところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは５０ｋＤａ弱のバンドとして見られた。また、ＡｓＥｇｔＣタンパク質はアミノ酸配列からの想定分子量が５１．２ｋＤａであるところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは５０ｋＤａのバンドとして見られた。【０１６７】
図３から、コントロール株はＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＥｇｔＢタンパク質及びＡｓＥｇｔＣタンパク質をほとんど発現しておらず、（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｓＥｇｔＡ＋ＡｓＥｇｔＣ）形質転換株はＡｓＥｇｔＡタンパク質とＡｓＥｇｔＢタンパク質又はＡｓＥｇｔＣタンパク質とを発現していた。また、ＡｓＥｇｔＡ形質転換株、ＡｓＥｇｔＢ形質転換株及びＡｓＥｇｔＣ形質転換株は、それぞれ対応するＡｓＥｇｔＡタンパク質、ＡｓＥｇｔＢタンパク質及びＡｓＥｇｔＣタンパク質を発現していた。【０１６８】
［例５．遺伝子ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象タンパク質の探索
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＲＩＢ４０株の総タンパク質を基に、アスペルギルス・ソーヤのＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質の各アミノ酸配列をクエリーとして配列同一性の高いタンパク質を検索した。検索にはＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ｖｉｅｗ／ＡＯ）を用いた。【０１６９】
その結果、ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質の各アミノ酸配列と比較的配列同一性が高かったタンパク質として、それぞれＡＯ０９００１２０００２６５（配列番号２６）、ＡＯ０９００２００００６１９（配列番号２７）及びＡＯ０９００２６０００２９１（配列番号２８）が見出された。なお、ＡＯ０９００１２０００２６５は、Ｓ．ｐｏｍｂｅのＥｇｔ１と類似するものとして、非特許文献５のＴａｂｌｅ  ２に記載されているものである。ＡＯ０９００１２０００２６５、ＡＯ０９００２００００６１９及びＡＯ０９００２６０００２９１は、それぞれＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ及びＡｓＥｇｔＣタンパク質と９７％、９９％及び９３％の配列同一性が認められた。ＡＯ０９００１２０００２６５、ＡＯ０９００２００００６１９及びＡＯ０９００２６０００２９１のそれぞれをコードする遺伝子をアスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡから特定し、アスペルギルス・オリゼ由来のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ及びｅｇｔＣ遺伝子という意味で、遺伝子ＡｏＥｇｔＡ（配列番号２３）、ＡｏＥｇｔＢ（配列番号２４）及びＡｏＥｇｔＣ（配列番号２５）と名付けた。【０１７０】
（２）アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡの抽出
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の分生子を用いた以外は、上記例１−（２）と同様の方法で実施した。【０１７１】
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
上記例１−（３）で作製したベクター断片を用いた。【０１７２】
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
対象遺伝子がＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣ遺伝子であること及び鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを用いた以外は、上記例１−（４）と同様の方法で実施した。なお、ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣ遺伝子を増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表１０〜１２に示す。【０１７３】
【表１０】
2016121285.tif 000015
【０１７４】
【表１１】
2016121285.tif 000016
【０１７５】
【表１２】
2016121285.tif 000017
【０１７６】
なお、上記例１−（４）と同様にして、抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。【０１７７】
［例６．形質転換アスペルギルス・オリゼの作製］
遺伝子ＡｏＥｇｔＡ、ＡｏＥｇｔＢ及びＡｏＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトを用いて特開２０１３−０３４４１６号公報に記載のアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来ｐｙｒＧ破壊株について形質転換した以外は、上記例２−（１）及び（２）と同様の方法で実施した。【０１７８】
［例７．形質転換アスペルギルス・オリゼのエルゴチオネイン生産］
下記表１３に示すとおり、コントロールであるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株；遺伝子ＡｏＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼ；並びに遺伝子ＡｏＥｇｔＡと遺伝子ＡｏＥｇｔＢ又はＡｏＥｇｔＣとにより形質転換した形質転換アスペルギルス・オリゼのそれぞれのエルゴチオネイン生産能を以下のとおりに比較した。【０１７９】
【表１３】
2016121285.tif 000018
【０１８０】
表１３に示す各菌株の分生子を接種した以外は上記例３と同様の方法により実施した。【０１８１】
表１３に示す各菌株のうち、エルゴチオネインの量が最大であったものを選抜し、それらについてエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を比較した。比較した結果を図５に示す。【０１８２】
図５に示されているとおり、形質転換アスペルギルス・ソーヤと同様に、形質転換アスペルギルス・オリゼは、形質転換していないコントロール株よりも、エルゴチオネインの生産量が多かった。また、（ＡｏＥｇｔＡ＋ＡｏＥｇｔＢ）形質転換株及び（ＡｏＥｇｔＡ＋ＡｏＥｇｔＣ）形質転換株のエルゴチオネインの生産量は、ＡｏＥｇｔＡ形質転換株のエルゴチオネインの生産量よりも多かった。これらの結果より、アスペルギルス・オリゼの形質転換株においてもエルゴチオネインを効率的に生産できることがわかった。【０１８３】
［例８．遺伝子ＡｎＥｇｔＡを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１）対象タンパク質の探索
データベースＮｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｎｒ）を基に、アスペルギルス・ソーヤのＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列をクエリーとして配列同一性の高いタンパク質を検索した。検索にはＢｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を用いた。【０１８４】
その結果、ＡｓＥｇｔＡタンパク質のアミノ酸配列と配列同一性が高かったタンパク質のうち、アスペルギルス・ニガーであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８株の相同タンパク質としてＸＰ＿００１３９７１１７．２（配列番号３４）が見出された。ＸＰ＿００１３９７１１７．２は、ＡｓＥｇｔＡタンパク質と７３％の配列同一性が認められた。ＸＰ＿００１３９７１１７．２をコードする遺伝子をアスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡから特定し、アスペルギルス・ニガー由来のｅｇｔＡ遺伝子という意味で、遺伝子ＡｎＥｇｔＡ（配列番号３３）と名付けた。【０１８５】
（２）アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の染色体ＤＮＡの抽出
アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の分生子を用いた以外は、上記例１−（２）と同様の方法で実施した。【０１８６】
（３）コンストラクト用プラスミドの作製
上記例１−（３）で作製したベクター断片を用いた。【０１８７】
（４）対象遺伝子挿入コンストラクトの作製
対象遺伝子がＡｎＥｇｔＡ遺伝子であること及び鋳型ＤＮＡとして上記で得られたアスペルギルス・ニガーＩＡＭ２５３３株の染色体ＤＮＡを用いた以外は、上記例１−（４）と同様の方法で実施した。なお、ＡｎＥｇｔＡ遺伝子を増幅するために使用したプライマー及びＰＣＲ条件を下記表１４に示す。【０１８８】
【表１４】
2016121285.tif 000019
【０１８９】
なお、上記例１−（４）と同様にして、抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、遺伝子ＡｎＥｇｔＡが挿入されたＤＮＡコンストラクトが得られたことを確認した。【０１９０】
クローニングした遺伝子ＡｎＥｇｔＡの配列を確認したところ、ゲノム情報が公開されているＡ．  ｎｉｇｅｒ  ＣＢＳ  ５１３．８８株の予測遺伝子（ＡＮＩ＿１＿７９２１３４）の配列と一致した（対応するアミノ酸配列は上記ＸＰ＿００１３９７１１７．２）。【０１９１】
［例９．形質転換アスペルギルス・ソーヤの作製（２）］
遺伝子ＡｎＥｇｔＡを挿入したＤＮＡコンストラクトを用いた以外は、上記例２−（１）及び（２）と同様の方法で実施した。【０１９２】
［例１０．形質転換アスペルギルス・ソーヤのエルゴチオネイン生産（２）］
コントロールであるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株及び遺伝子ＡｎＥｅｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤの分生子を接種した以外は上記例３と同様の方法により実施した。【０１９３】
各菌株のうちエルゴチオネインの量が最大であったものを選抜し、それらについてエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を比較した。比較した結果を表１５に示す。【０１９４】
【表１５】
2016121285.tif 000020
【０１９５】
表１５に示されているとおり、遺伝子ＡｓＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤと同様に、遺伝子ＡｎＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤは、形質転換していないコントロール株よりも、エルゴチオネインの生産量が多かった。これらの結果より、由来生物種が異なる異種遺伝子ＡｎＥｇｔＡにより形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤにおいてもエルゴチオネインを効率的に生産できることがわかった。【０１９６】
［例１１．形質転換大腸菌の作製］
ＡｓＥｇｔＡ及びＡｓＥｇｔＣのそれぞれのアミノ酸配列をもとに、コドン、二次構造、ＧＣ含量などの観点から大腸菌発現用に遺伝子配列を最適化したものに、遺伝子の上流にＥｃｏＲＶ配列（ＧＡＴＡＴＣ）を付加し、かつ、下流にＳｐｅＩ配列（ＡＣＴＡＧＴ）を付加することにより、ＥｃＥｇｔＡ（配列番号３７）及びＥｃＥｇｔＣ（配列番号３８）を得た。【０１９７】
発現用ベクターとしてｐＵＴＥ１２０Ｋ’を構築した。すなわち、特開平６−２９２５８４号公報に記載のｐＵＴＥ１００Ｋ’をＮｈｅＩ及びＨｐａＩで消化し、ｌａｃプロモーターを除去した。次いで、ｐＫＫ２２３−３（ＧＥ社）のＴａｃプロモーター領域を３’末端にＮｈｅＩサイト及び５’末端にＥｃｏＲＶサイトを付加してＰＣＲで増幅及び精製した。次いで、ＮｈｅＩ消化した後、ｐＵＴＥ１００Ｋ’の本来ｌａｃプロモーターがあった部位に挿入して、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’を作製した。【０１９８】
ｐＵＴＥ１２０Ｋ’をＥｃｏＲＶ及びＳｐｅＩを用いて制限酵素処理し、次いでＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣをライゲーションして、ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣが挿入されたプラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＡ及びｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＣを作製した。【０１９９】
上記コンストラクト用プラスミドにて形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＡ及びｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＣを精製した。次いで、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＣをＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで制限酵素処理をし、遺伝子ＥｃＥｇｔＣを含む断片を切り出し、精製した。また、ｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＡをＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩで制限酵素処理し、上記遺伝子ＥｃＥｇｔＣを含む断片を挿入して、プラスミドｐＵＴＥ１２０Ｋ’−ＥｃＥｇｔＡ−ＥｃＥｇｔＣを作製した。該プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、形質転換大腸菌を得た。【０２００】
形質転換大腸菌を、０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＴＹ培地（１％（ｗ／ｖ）バクト・トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）バクト・イースト・エクストラクト、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて、２５℃で１６時間培養することにより、培養液全体及び回収した菌体の熱水抽出液中にエルゴチオネインが検出される。【０２０１】
［例１２．形質転換大腸菌のエルゴチオネイン生産（１）］
下記表１６に示すとおり、コントロールである発現用ベクターｐＵＴＥ１２０Ｋ’を導入した大腸菌；遺伝子ＥｃＥｇｔＡ又はＥｃＥｇｔＣにより形質転換した形質転換大腸菌；及び遺伝子ＥｃＥｇｔＡと遺伝子ＥｃＥｇｔＣとにより形質転換した形質転換大腸菌のそれぞれのエルゴチオネイン生産能を以下のとおりに比較した。【０２０２】
【表１６】
2016121285.tif 000021
【０２０３】
１９ｍｌ容試験管中のＴＹ培地  ２．５ｍｌに、表１６に示す各菌株を接種し、３７℃で１６時間、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、種培養を行った。種培養した培養液０．０２ｍｌを、１９ｍｌ容試験管中のアンピシリン及び０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＴＹ培地  ２．５ｍｌに接種し、２５℃で２４時間、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、本培養を行った。なお、本培養に用いたＴＹ培地には、アミノ酸を添加していないもの（ＴＹ−）、０．００５％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、メチオニン及びシステインを添加したもの（ＴＹ＋）、並びに０．０１％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、メチオニン及びシステインを添加したもの（ＴＹ＋＋）の３系統を用意した。【０２０４】
培養後の培養物から遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）をすることにより菌体を沈殿物として回収した。１ｍｌの培養液から得られる菌体に、０．５ｍｌの水を添加し、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、９８℃、１０分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、エルゴチオネイン抽出液を得た。【０２０５】
得られたエルゴチオネイン抽出液及び本培養後の培養物から得た培養上清（０．４５μｍフィルターを用いたろ過処理済み）について、下記の条件のＬＣ−ＭＳにより分析した。
ＬＣ装置；Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（アジレント社）
質量分析装置；ＱＳＴＡＲ Ｅｌｉｔｅ  (ＡＢ  ｓｃｉｅｘ社)
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＨＩＬＩＣ（４．６×２５０ｍｍ）
溶離液；アセトニトリル＋０．１％ギ酸：水＋０．１％ギ酸 = ７５：２５（ｖ／ｖ）
流速；２５０ μｌ／ｍｌ
検出；ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；１０ μｌ
温度；室温
定量法；エルゴチオネイン標品（エンゾライフサイエンス社；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＭＬ−ＦＲ１１１）を用いた検量線法【０２０６】
表１６に示す各菌株についてエルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を比較した。なお、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株については、任意に選んだ２株を用いた。【０２０７】
比較した結果を図６に示す。図６に示されているとおり、コントロール株及びＥｃＥｇｔＣ形質転換株では、培養上清及びエルゴチオネイン抽出液にかかわらずエルゴチオネイン量が認められなかった。このことから、コントロール株及びＥｃＥｇｔＣ形質転換株は、エルゴチオネインの生産能がないこと、又はエルゴチオネインの生産能は非常に微小であることがわかった。【０２０８】
一方で、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株及び（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株では、エルゴチオネインの生産能が確認できた。また、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株によるエルゴチオネイン量は、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株によるエルゴチオネイン量よりも多く、それらの差異は培養上清において顕著であった。また、培地中へのヒスチジン、メチオニン及びシステインの添加の影響を比較したところ、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株及び（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株のいずれにおいても、培地中へヒスチジン、メチオニン及びシステインを添加することにより、エルゴチオネイン量は増加した。【０２０９】
以上の結果より、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株はエルゴチオネインの生産量が多いものの、ＥｃＥｇｔＣ形質転換株のエルゴチオネインの生産量は検出できなかったことから、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株は、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株に対して、相加的というよりもむしろ相乗的にエルゴチオネインの生産能が増強されたものであることがわかった。【０２１０】
［例１３．形質転換大腸菌のエルゴチオネイン生産（２）］
１９ｍｌ容試験管中の５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有ＴＹ培地（１％（ｗ／ｖ）バクト・トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）バクト・イースト・エクストラクト、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）  ２．５ｍｌに、表１６に示す各菌株を接種し、３７℃で一晩、１８０ｒｐｍでの振とう条件下で、種培養を行った。次いで、得られた種培養液  ０．８ｍｌを、５００ｍｌ容ヒダ付き三角フラスコ中の０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ＋５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有ＴＹ培地  １００ｍｌに接種し、２５℃で２４時間、１５０ｒｐｍでの振とう条件下で、本培養を行った。【０２１１】
培養後の培養物から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分）をすることにより菌体を沈殿物として回収した。１ｍｌの培養液から得られた菌体に０．５ｍｌの蒸留水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、９８℃、１０分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、エルゴチオネイン抽出液を得た。【０２１２】
得られたエルゴチオネイン抽出液及び本培養後の培養物から得た培養上清（０．４５μｍフィルターを用いたろ過処理済み）について、上記例１２に記載した条件のＬＣ−ＭＳにより分析した。また、４０ｍｌの培養液から得られた菌体について、６０℃のインキュベーター内で乾燥させることにより乾燥菌体重量を測定した。エルゴチオネイン（ＥＧＴ）の生産量を比較した結果を表１７に示す。【０２１３】
【表１７】
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【０２１４】
表１７に示されているとおり、上記例１２と同様に、コントロール株及びＥｃＥｇｔＣ形質転換株はエルゴチオネインの生産能がない又は該生産能は非常に微小であること；（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株によるエルゴチオネイン量は、ＥｃＥｇｔＡ形質転換株によるエルゴチオネイン量よりも多く、それらの差異は培養上清において顕著であったこと；（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換株はＥｃＥｇｔＡ形質転換株に対して相加的というよりもむしろ相乗的にエルゴチオネインの生産能が増強されたものであることがわかった。【０２１５】
［例１４．形質転換大腸菌のエルゴチオネイン生産（３）］
１９ｍｌ容試験管中の１μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有ＴＹ培地  ２．５ｍｌに、表１６に示す（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換大腸菌を接種し、３０℃で１６時間、１４０ｒｐｍでの振とう条件下で、種培養を行った。次いで、得られた種培養液の全量を、３ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）中の０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％（ｗ／ｖ）ヒスチジン、０．１％（ｗ／ｖ）メチオニン及び０．６％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウムを含有する高密度培養用培地  ２０００ｍｌに接種し、２５℃、０．０１ＭＰａ、７５０ｒｐｍに制御して本培養を行った。【０２１６】
培養後の培養物から遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、５分）をすることにより菌体を沈殿物として回収した。１ｍｌの培養液から得られた菌体に１ｍｌの蒸留水を添加して攪拌することにより、菌懸濁液を得た。得られた菌懸濁液を、１００℃、１５分の条件で加熱処理に供した。該処理後、遠心分離により上清として回収した菌体外液を、０．４５μｍフィルターでろ過することにより、エルゴチオネイン抽出液を得た。【０２１７】
得られたエルゴチオネイン抽出液及び本培養後の培養物から得た培養上清（０．４５μｍフィルターを用いたろ過処理済み）について、上記例３に記載した条件のＨＰＬＣにより分析した。また、菌体濃度は吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）により分析した。【０２１８】
培養中の吸光度（ＯＤ６００）並びにエルゴチオネイン抽出液及び培養上清におけるエルゴチオネイン量の測定結果を図７に示す。図７に示すとおり、エルゴチオネイン抽出液中（菌体内）のエルゴチオネイン量は最大で０．６４ｍｇ／ｍｌであり、培養上清中（菌体外）のエルゴチオネイン量は最大で０．０５ｍｇ／ｍｌであった。また、菌体濃度（ＯＤ６００）は最大で４７．１であった。これらの結果より、（ＥｃＥｇｔＡ＋ＥｃＥｇｔＣ）形質転換大腸菌を高密度培養することにより、培養液あたり大量のエルゴチオネインを製造することができた。【０２１９】
上記例１１〜例１４の結果より、アスペルギルス・ソーヤ由来のＡｓＥｇｔＡタンパク質及びＡｓＥｇｔＣタンパク質のそれぞれのアミノ酸配列に基づいて、コドン、二次構造、ＧＣ含量などの観点から宿主生物に発現させるために最適化した遺伝子ｅｇｔＡ又はｅｇｔＡ及びｅｇｔＣを用いて、宿主生物を形質転換することにより、宿主生物の本来のエルゴチオネイン生産能に関係なく、宿主生物にエルゴチオネインを生産させ得ることがわかった。【０２２０】
また、上記例１１〜例１４の結果より、エルゴチオネイン生産形質転換株を大量又は高密度培養することによって、エルゴチオネインを大量に製造し得ることがわかった。これらの結果より、形質転換糸状菌についても、大量又は高密度培養することにより、エルゴチオネインを工業的に製造し得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２２１】
本発明の形質転換糸状菌や製造方法は、高純度のエルゴチオネインを製造するために利用することができる。したがって、本発明は、エルゴチオネインは抗酸化能が高い含硫アミノ酸であることから、抗酸化機能が付与された化粧品やサプリメントなどの抗酸化製品を製造するための原料を工業的規模で製造するために利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月31日(2017.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の酵素をコードする遺伝子又は下記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子が挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を過剰発現する形質転換糸状菌。
（１）Ｓ−アデノシルメチオニン、鉄（ＩＩ）及び酸素の存在下で、ヒスチジン及びシステインから下記式〔Ｉ〕
【化１】
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〔Ｉ〕
に示されるヘルシニルシステインスルホキシドを生成する反応を触媒する酵素
（２）ピリドキサール  ５’−リン酸を補酵素として、上記式〔Ｉ〕に示されるヘルシニルシステインスルホキシドからエルゴチオネインを生成する反応を触媒する酵素
【請求項２】
前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項３】
前記糸状菌がアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）からなる群から選ばれるアスペルギルス属微生物である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項４】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、宿主糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項５】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、前記（１）の酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換糸状菌に比してエルゴチオネインの量が増えるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項６】
前記形質転換糸状菌は、前記（１）の酵素をコードする遺伝子又は前記（１）及び（２）の酵素をコードする遺伝子の発現が、該形質転換糸状菌を宿主糸状菌の生育に適した培地を用いて３０℃、３日間で培養した場合のエルゴチオネインの量が乾燥菌体質量１ｇあたり１０．０ｍｇ以上になるように増強された形質転換糸状菌である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項７】
前記（１）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（１）の酵素が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項８】
前記（２）の酵素をコードする遺伝子が配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を有する遺伝子及び配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を有する遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子であり、又は前記（２）の酵素が配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する酵素、配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する酵素及び配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する酵素からなる群から選ばれる酵素である、請求項１に記載の形質転換糸状菌。
【請求項９】
ヒスチジン及びシステインを、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換糸状菌に作用させて、エルゴチオネインを得る工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
【請求項１０】
ヒスチジン及びシステインを含む培地を用いて、請求項１〜８のいずれか１項に記載の形質転換糸状菌を培養することにより得られた培養物から、純度が５％以上であるエルゴチオネイン含有物を得る工程を含む、高純度エルゴチオネイン含有物の製造方法。
【国際調査報告】
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