(57)【要約】  本発明の課題は、肝細胞がんを検出するマーカーであって、肝臓の状態変化に依存せず、がんの出現により初めて肝臓に存在するようになる糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカーを提供することである。  本発明は、NPAレクチン結合性糖鎖エピトープであって、かつ下記（１）〜（５）の少なくとも１つの特性を有する糖鎖エピトープを含有するNPAレクチン結合性糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカーを提供する。  （１）糖鎖エピトープがコアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まない、  （２）糖鎖エピトープがマンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖を含有する、  （３）糖鎖エピトープがマンノース5以上の高マンノース型糖鎖を含まない、  （４）糖鎖エピトープがLCAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる、  （５）糖鎖エピトープがConAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる。  被検試料中の本発明の肝細胞がんマーカーを検出することで、肝細胞がんの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NPAレクチン結合性糖鎖エピトープであって、かつ下記（１）〜（５）の少なくとも１つの特性を有する糖鎖エピトープを含有するNPAレクチン結合性糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカー；
（１）糖鎖エピトープがコアフコース（フコースα１→６糖鎖）を含まない、
（２）糖鎖エピトープがマンノースの数４以下の複合型糖鎖を含有する、
（３）糖鎖エピトープがマンノースの数５以上の高マンノース型糖鎖を含まない、
（４）糖鎖エピトープがLCAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる、
（５）糖鎖エピトープがConAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる。
【請求項２】
前記糖タンパク質が、肝組織のがん細胞表面に存在するか，又はその細胞近傍の間質に存在する糖タンパク質である請求項１に記載の肝細胞がんマーカー。
【請求項３】
前記糖タンパク質が、Complement factor H（CFH）、Fibrillin 1（FBN1）、Fibronectin（FN）、Oxygen regulated protein (HYOU1)、Epidermal growth factor receptor（EGFR）、Prosaponin （PSAP）、Cathepsin D（CTSD）、及びLysosomal associated membrane protein 2（LAMP-2）から選択されるいずれかの糖タンパク質である、請求項１又は２に記載の肝細胞がんマーカー。
【請求項４】
NPAレクチンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝細胞がんマーカーの検出用試薬。
【請求項５】
さらに、LCAレクチン又はConAレクチンを含むことを特徴とする、請求項４に記載の検出用試薬。
【請求項６】
Complement factor H（CFH）、Fibrillin 1（FBN1）、Fibronectin（FN）、Oxygen regulated protein (HYOU1)、Epidermal growth factor receptor（EGFR）、Prosaponin （PSAP）、Cathepsin D（CTSD）、及びLysosomal associated membrane protein 2（LAMP-2）から選択される少なくとも一種のNPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝細胞がんマーカーの検出用試薬。
【請求項７】
被検試料における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝細胞がんマーカーをインビトロで検出することによって、肝細胞がんを検出することを特徴とする、肝細胞がんの検出方法。
【請求項８】
前記肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を、標識化したNPAレクチンを用いた被検細胞もしくは組織のNPA染色により行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を、NPAレクチンを含むレクチンアレイを用いるレクチンアレイ解析法又はNPAレクチンを含むレクチン−抗体ELISA法により行うことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記レクチンアレイ解析法が、NPAレクチンと共に少なくともLCAレクチン又はConAレクチンを含むレクチンアレイを用いることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レクチン−抗体ELISA法が、NPAレクチン及びNPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を用いたサンドイッチ法により肝細胞がんマーカーを検出する方法であって、NPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を支持体上に固相化し、標識化したNPAレクチンにより肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質をサンドイッチしたレクチンオーバーレイにより行うか、又は標識化した前記抗体により肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質をサンドイッチした抗体オーバーレイにより行うことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記NPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体が、CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被検試料として、血清成分を含む血液試料を用いて肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を行う際に、あらかじめ被検試料に対し支持体上に固相化したα2,6シアル酸結合性レクチンとの吸着工程、及びα2,6シアル酸結合性レクチン非吸着画分を取得する工程を設けることを特徴とする、請求項７、９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
α2,6シアル酸結合性レクチンが、SNA, SSA, TJAI及びPSLlaレクチンから選択された少なくとも一種のレクチンである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検肝組織由来の被検試料に対して、NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。
【請求項１６】
前記測定方法において、
（１）あらかじめ前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法において、複数の肝細胞がん組織及び正常組織のNPAレクチンを含むレクチンに対する反応性を測定し、肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式又は検量線を用意する工程、及び
（２）前記被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性の測定値を、前記判別式又は検量線にあてはめて、肝細胞がんの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程、
を設けることを特徴とする、請求項１５に記載の測定方法。
【請求項１７】
被検試料として血清含有試料を用いて、肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検血清含有試料に対して、
（１）支持体上に固相化したα2,6シアル酸結合性レクチンと吸着させる工程、
（２）α2,6シアル酸結合性レクチン非吸着画分を取得する工程、
（３）NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。
【請求項１８】
肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検肝組織由来の被検試料に対して、NPAレクチンを含むレクチンと、CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体とのサンドイッチELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。
【請求項１９】
NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する方法であって、
（１）あらかじめ前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法において、複数の肝細胞がん組織及び正常組織のNPAレクチンを含むレクチンに対する反応性を測定し、肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式又は検量線を用意する工程、
（２）被検肝組織由来の被検試料を、前記レクチンアレイ又はELISAに供し、被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
（３）工程（２）で得られた、被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性の測定値を、工程（１）で得られた判別式又は検量線にあてはめて、肝細胞がんの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程。
【請求項２０】
前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法が、NPAレクチンと共にさらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンを含んでおり、あらかじめ用意する判別式又は検量線が、さらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンに対する判別式又は検量線も含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組織染色による肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する方法であって、下記工程（１）〜（４）を含む方法；
（１）被検肝組織由来の被検試料の組織切片を作製する工程、
（２）蛍光標識したNPAレクチンによる組織染色を行う工程、
（３）細胞表面及び／またはその近傍の間質における蛍光の有無及び強度を観察する工程、
（４）工程（３）で一定レベル以上の蛍光を観察した場合に肝細胞がんに罹患していると判定し、その強度に従って、がんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程。
【請求項２２】
蛍光標識したNPAレクチンを含むことを特徴とする、肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための組織染色用キット。
【請求項２３】
肝細胞がんマーカー検出用キットであって、下記（１）及び（２）のいずれかが支持体に固相化され、他方が標識化されていることを特徴とするキット；
（１）NPAレクチンを含むレクチン、
（２）CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体。
【請求項２４】
肝細胞がんマーカー検出用キットであって、少なくともNPAレクチンと共にさらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンを用いることを特徴とする、キット。
【請求項２５】
前記キットが被検試料として、血清含有試料に適用するためのキットであって、さらにα2,6シアル酸結合性レクチンを含むことを特徴とする、請求項２３又は２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞がんを正確かつ簡便に診断するための新規肝細胞がんマーカー及び当該マーカーを用いた肝細胞がんの検査方法に関する。より詳しくは、肝細胞がんの早期発見やがんを患う患者の予後を予測するための検査方法に関し、さらには検査のための検査用試薬キットに関する。具体的には、肝組織中のうち非がん部領域には発現していないが、がん部領域中の肝細胞がん又はがん細胞周辺間質部位（TME）に特異的に発現する糖タンパク質を同定し、当該糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカーを提供する。また、当該糖タンパク質と結合するレクチンを用いた肝細胞がんの検出方法、及びそのためのキットを提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国において、がん（悪性新生物）は主な死亡原因として増加を続け、昭和56年以降死因の第1位で、平成23年度は、心疾患、肺炎、脳疾患等の他の疾患による死亡者数を大きく引き離して全死亡者数に占める割合が28.5％となっている。つまり全死亡者数のおよそ3.5人に一人はがんで死亡したことになる。
肝がんは、全がんの死亡者数のうち、肺がん、胃がん、大腸がんに次いで第４位となっている。肝がんは、肝臓に原発する原発性肝がんと、肝外臓器で発生したがん種が肝内に転移してきた転移性肝がんに分類することができる。肝臓に発生する主な原発性肝がんには、肝細胞に由来する肝細胞がん（Hepatocellular carcinoma：HCC）と、胆管上皮細胞に由来する肝内胆管がん（または胆管細胞がん）が存在し、両者の混合型とみるべきものも存在する。肝細胞に由来する肝細胞がんは、原発性肝がんの90％以上を占めており、肝細胞がんの多くはウイルス性肝炎（HCV,HBV）から発生している。我が国を含む東アジアでは元々HCV罹患率が高く、このことが欧米よりも肝細胞がんの発生率が高い原因と考えられている。【０００３】
肝細胞がんは、化学療法や放射線治療に抵抗性を示し、手術が唯一の完全寛解療法とされており、効果的な治療を行うためには、早期発見によって治療可能な時期に処置することが何よりも重要である。
肝細胞がんの早期検出のために、従来より、腫瘍マーカーを用いた検出手段の開発が進められている。肝細胞がんについては、現在までに、多くのがん検出用のマーカーが開発されており、α1フェトプロテイン（AFP）及びPIVKA-II（protein induced by vitamin K absence or antagonist-II)は、肝細胞がんの腫瘍マーカーとして臨床的に用いられている。その他にも、肝がんの腫瘍マーカーとしては、例えば、CEA、CA19-9、KMO-1、DuPAN-2、SPan-1、CA50、SLX、塩基性フェトプロテイン（BFP）、NCC-ST-439、アルカリフォスファターゼアイソザイム、γ-GTPアイソザイム、IAP、TPA、β2-ミクログロブリン、フェリチン、POA及びトリプシンインヒビター等が知られている（特許文献１）。
例えば、臨床においては、血清中のAFPやPIVKA-IIを測定し、その発現量で肝細胞がんへの罹患の可能性の程度を判定することになるが、PIVKA-II単独陽性は26%でAFP単独陽性の9%より多く、肝細胞がん患者の61％はいずれかが陽性となるものの、両者が陰性である患者が39％存在する。したがって現行の腫瘍マーカーは肝細胞がんの診断に十分とはいえず、あらたな腫瘍マーカーの開発が必要とされている。
そのため、現在肝細胞がん早期発見のための検診は、肝細胞がんマーカー単独ではなく、超音波検査、コンピューター断層撮影（CT）、核磁気共鳴画像法（MRI）など画像検査によりおこなわれている。【０００４】
近年、肝細胞がんで発現する遺伝子や、ポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーとして多くのものが開示されている。例えば、Gla不全血液凝固第VII因子（特許文献２）、アルドラーゼβ遺伝子、カルバモイルフォスフェートシンセターゼI遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、EST51549、アルブミン遺伝子、チトクロームP450サブファミリー2E1遺伝子、レチノール結合タンパク遺伝子、又はオーガニックアニオントランスポーターC遺伝子（特許文献３）、ジンクフィンガードメイン並びにSETドメインを有するヒト遺伝子ZNFN3A1（特許文献４）、ヘパラン硫酸プロテオグリカンであるグリピカン-3（GPC3）（特許文献５）、染色体バンド1p36.13の領域に位置し、アクチン細胞骨格の再編成を調節する発生・分化促進因子1（DDEFL1）（特許文献６）、等の遺伝子或いはポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーが開示されている。【０００５】
さらに、染色体領域の8p12、16p13.2-p13.3、16q23.1-q24.3、又は19p13.2-p13.3の領域における欠損の有無（特許文献７）、分泌システインリッチタンパク質のファミリーをコードするWnt-1（特許文献８）、カルバモイル−ホスフェートシンセターゼL鎖MGC47816、及びヘリックスループ−ヘリックスドメイン及びオレンジドメインを含むタンパク質HES6の遺伝子（特許文献９）、SEMA5A（セマフォリン5A）、SLC2A2（溶質キャリアーファミリーメンバー）、ABCC2（ATP結合カセットサブファミリーCメンバー2）、又は、HAL（ヒスチジンアンモニアリアーゼ）からなる細胞関連性の肝細胞がん（HCC）タンパク質（特許文献１０）、又は、ヒトα2,6シアル酸転移酵素（特許文献１１）、等の遺伝子或いはポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーが開示されている。
しかしながら、肝がんで発現する遺伝子や、ポリペプチドからなる肝がんの腫瘍マーカーにより肝がんの発生を検出する方法では、血清、胆汁などを被検試料とする場合には適用することが難しく、遺伝子の発現の検出のための複雑な操作や、がん種の鑑別診断或いはがん検出の感度、精度の点で、医療現場で、正確にかつ簡便に用いる肝がんの早期検出・診断のための検出手段としては多くの制約があり、必ずしも満足のできるものではなかった。【０００６】
前述のように、肝細胞がんの多くはウイルス性肝炎（HCV,HBV）から発生している。特にHCV（C型肝炎ウイルス）の場合は、罹患後、急性ウイルス性肝炎から、慢性ウイルス性肝炎へと進行し、長期間経過後（約20年程度たって）、肝硬変に至り、その後高い頻度でがん化するケースが多い。肝硬変では、炎症と再生を繰り返すことにより、正常な肝組織が減少し、線維組織から構成される臓器へと変化する。HCV及びHBV患者の場合、慢性肝炎からの発がん率は、慢性肝炎軽度（F1）又は慢性肝炎中度（F2）では年率0.8〜0.9%程度であるが、慢性肝炎重度（F3）になると年率3.5%になり、肝硬変（F4）からがんとなる確率は、年率7%にまで上昇する。そして、肝疾患の病態の進行に伴い、慢性肝炎で肝組織での機能低下がはじまり、線維化が進み、肝硬変が完成していく中で肝細胞がんが出現する。つまり、肝細胞がんの背景肝は、線維化が高度に進行した状態であるために、肝臓の機能低下や線維化に影響されるマーカーはがん特異性に欠け、肝がんの早期発見にはつながらない。【０００７】
近年の一連の研究から、肝細胞がん患者の血清中や肝臓細胞前駆細胞で、ある特定の糖鎖構造を合成する糖転移酵素の活性が上昇ないし減少していることや、正常成熟肝細胞では見られない糖鎖構造が発現しているという報告がなされている。
そういった中で肝細胞がんマーカーのAFP（α1フェトプロテイン）については、α1→6フコシル化糖鎖を持つ糖鎖異性体が、LCAレクチンへの反応性からAFP-L3画分とよばれる糖鎖マーカーとして知られている。AFP-L3画分は、がんの出現をより反映して数値が上昇するため、血中のAFPにおけるL3画分の割合を測定することで、肝細胞がんの診断精度（特異度）を上げることができることが知られている。しかし、肝細胞がん患者のうち、高い割合で存在するAFP非増加例ではL3画分も増加しないため、肝細胞がんマーカーとしての十分な効果は認められず、まだメディカルニーズを十分に満たすには至っていない。一方で、肝線維化に伴う肝臓の状態変化においても肝細胞がんの出現でフコシル化が亢進することが判っており、例えば肝線維化マーカーとして知られるAGP（α1酸性糖タンパク質）でのフコシル化など多く報告されている。しかし、AGPのフコシル化の亢進は、一般にがん患者においても広く観察されており、肝細胞がんへの特異性が低く、カットオフ値の設定などが難しい。【０００８】
血清中糖タンパク質の構成糖鎖群に注目した肝細胞がんマーカーも開示されている（特許文献１２）。肝細胞がんの発症に伴って消失若しくは減少するトリシアリル糖鎖を標識化して肝細胞がんマーカーとして肝細胞がんの検出に用いること、検体から調製した肝細胞がんマーカーの量を、陰イオン交換カラムによる分取、ODSシリカカラムを使用した高速液体クロマトグラフィーによる溶出パターンによる分析によって算出することにより行うことが示されている。【０００９】
最近、肝細胞がんマーカーを含め、がんマーカーの探索において、グライコプロテオミクス技術、レクチンマイクロアレイ又は抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイなど複数の先端技術を駆使し、マーカー候補分子を網羅的に検索、検証する戦略が提案された（非特許文献１、特許文献１３）。被検血清中の指標糖鎖マーカー量を測定し、検量線に従って肝硬変と肝細胞がんとを識別できることが示され、これまで複数の成果事例がある。
しかしながら、肝細胞がんマーカー開発のほとんどがフコース含有糖タンパク質に限局しており、肝組織の線維化進展度に従って糖鎖の発現量が増大するという、血清中での存在量の差異を識別している点では従来の肝細胞がんマーカーと基本的に同じである。肝疾患における病態又は線維化進展度の優れた血清中の指標となるとしても、AFP-L3を超えて肝細胞がんを肝硬変から精度よく鑑別診断をすることができる指標とはいえなかった。【００１０】
ところで、これら従来の糖鎖または糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカーの糖鎖部分をみると、ほとんどフコース、特に「フコースα1→6糖鎖」ないし「フコースα1→3糖鎖」であり、これら「フコース含有糖タンパク質」が主な肝細胞がんの指標として採用されている（非特許文献４〜８など多数）。上述の通り現在臨床的に用いられている肝細胞がんマーカーとしても、αフェトプロテイン（AFP）のうちα1→6フコース修飾を受けた糖鎖を持つ糖鎖異性体（AFP-L3画分という）が最も高い精度で肝細胞がんを検出している。【００１１】
本発明者らが、以前行った健常者血清中タンパク質と肝細胞がん細胞株との大規模な比較糖鎖解析によって、フコースが肝疾患を特徴づける糖鎖修飾であることが解明され、多数のフコース含有糖タンパク質の一群が肝疾患病態指標マーカーとして同定された（非特許文献６，特許文献１４）。
これらの肝疾患病態指標マーカーは、いずれも肝臓の健康な状態から、ウイルス感染、慢性肝炎、肝硬変という病状に従って進行する肝組織の線維化を規定しうるタンパク質群であり、その大部分は、肝の線維化、肝硬変を調べるための優れたマーカーとして利用できる（非特許文献７，８）。しかしながら、肝細胞がんと肝硬変とを明確に区別できる肝細胞がんマーカーとしての利用は難しい（非特許文献８）。
これはα1→6フコースを修飾する酵素であるα1→6フコース転移酵素（FUT8）は慢性肝炎や肝硬変においても肝組織中で発現が亢進していることが報告されていることに一致する（非特許文献２）。酵素のドナー基質であるGDP-フコース量はヒト肝がん組織のがん部で増加していることは確認されたものの（非特許文献３）、その増加量は2倍程度しかすぎず血中マーカーとしての利用は難しい。【００１２】
一方で、AFP-L3は実際の血中濃度ががんで顕著に上昇していることは事実としてあるが、上述の合成機構のみでは説明できなかった。その後の研究からAFP-L3画分のみならず多くのある特定のフコース含有糖タンパク質群は肝細胞がん自身が発現して血中濃度を高めているのではなく、肝細胞のがん化に伴い、肝細胞内でフコシル化タンパク質が胆管側（胆汁）に（極性）輸送・分泌されていたものが血管側（血中）に輸送・放出されるようになったため、血中濃度が高まっている（分泌経路の変化）という仮説が提唱された（非特許文献４，５）。とすればフコシル化タンパク質の血中での発現量の増加を観察しても、細胞のがん化の進行程度を直接的に反映しているわけではないことから、フコシル化タンパク質は治療標的とはならないことがうかがえる。【００１３】
以上のように、AFP-L3画分に追随するがごとく、一時期「フコース含有糖タンパク質」特に「フコースα1→6糖鎖」ないし「フコースα1→3糖鎖」をターゲットとする肝細胞がんマーカーの探索及び研究開発は、きわめて活発化した時期があった。その結果、多数の肝細胞がんマーカーが同定され、肝疾患の病態解析などの分野で一定の成果は上げたものの、肝細胞がんマーカーとして正確性、簡便性などの点で現在の臨床で用いられているAFP（特にAFP-L3画分）を超える優れたマーカーの提供には至らず、現在暗礁に乗り上げた状態にある。
このような背景から、肝硬変と肝細胞がんを精度良く確実に区別し、肝細胞がんを特異的に検出できる方法の提供が強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００２−３２３４９９号公報
【特許文献２】特開平８−１８４５９４号公報
【特許文献３】特開２００４−１０５０１３号公報
【特許文献４】特表２００５−５１１０２３号公報
【特許文献５】特表２００５−５２６９７９号公報
【特許文献６】特表２００５−５０３１７６号公報
【特許文献７】特開２００６−９４７２６号公報
【特許文献８】特開２００７−１３９７４２号公報
【特許文献９】特表２００７−５０６４２５号公報
【特許文献１０】特表２００７−５３４７７２号公報
【特許文献１１】特開２００７−３２２３７３号公報
【特許文献１２】特開２００７−２７８８０３号公報
【特許文献１３】ＷＯ２０１１／００７７９７
【特許文献１４】ＷＯ２０１１／００７７６４
【特許文献１５】ＷＯ２０１０／０５５９５０
【特許文献１６】ＷＯ２０１０／０１０６７４
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Narimatsu H et al, FEBS J, 2010 Jan;277(1):95-105
【非特許文献２】Noda K et al, Hepatology, 1998 Oct;28(4):944-52
【非特許文献３】Noda K et al, Cancer Res, 2003 Oct 1;63(19):6282-89
【非特許文献４】Nakagawa T et al, J Biol Chem, 2006 Oct 6;281(40):29797-806
【非特許文献５】Nakagawa T et al, J Proteome Res, 2012 May 4;11(5):2798-806
【非特許文献６】Kaji H et al, J Proteome Res, 2013 Jun 7;12(6)2630-40
【非特許文献７】Kuno et al, Clin Chem, 2011 Jan;57(1):48-56
【非特許文献８】Ocho et al, J Proteome Res, 2014 Mar 7; 13(3):1428-37
【非特許文献９】Hirabayashi J et al, Chem Soc Rev, 2013 May 21; 42(10):4443-58
【非特許文献１０】Matsuda A et al, Biochem Biophys Res Commun 2008 May 30;370(2):259-63
【非特許文献１１】Matsuda A et al, Hepatology, 2010 July;52(1):174-82
【非特許文献１２】Quail DF et al, Nat Med, 2013 Nov.;19(11):1423-1437
【非特許文献１３】Hirabayashi J et al Electrophoresis 2011 May;32(10)1118-28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
真の肝細胞がんマーカーを開発するには、線維化に伴う構造変化ではなく、肝がん細胞又はその近傍でのみ特異的に存在するマーカーを捉える必要があり、そのためにはそのマーカー分子が実際がん部（がん細胞自身ないしその近傍間質領域に特異的に存在する細胞）から発現していることを可視化する必要がある。
現状では糖タンパク質上の糖鎖変化が肝がん細胞ないしその近傍間質領域に限局する細胞に特異的に生じたというものを観察した例は皆無である。【００１７】
本発明は、肝細胞がんを検出するマーカーであって、肝臓の状態変化に依存せず、がんの出現により初めて肝臓に存在するようになる肝細胞がんマーカーを提供する。より具体的には肝細胞がん部とその周辺の非がん部を比較して明らかにがん部にのみ存在が認められる糖鎖を持つ糖タンパク質のみを特異的に認識できるレクチンを見いだし、真の肝細胞がんマーカーとしての糖タンパク質を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
以上のことから、本発明者らは、肝がんを検出するマーカーを開発するには、肝線維化や機能低下に影響されない、よりがんに特異性の高いがん組織中に出現するマーカーを探索、発見しなければならないという結論に至った。より具体的には、原発性肝がんである肝細胞がんとその周辺の非がん部を比較して明らかにがん部にのみ存在が認められる糖鎖を持つ糖タンパク質が真の肝がんマーカーとなると考えた。【００１９】
以前から、肝細胞がんにおいても、がん細胞表面に特異的に発現している糖タンパク質を同定するために、正常細胞で発現せずにがん細胞で特異的に発現する遺伝子の探索や、がん細胞表面の膜画分に特異的に発現する糖タンパク質の探索は行われていたが、十分な成果が上がっていなかった。本発明者らは、今回、肝細胞がん細胞自身が発現している糖タンパク質のみならず、がん組織を構成する種々の細胞を含んだがんの微小環境（tumor microenvironment：TME）も含め、がん細胞ないし、がん組織を構成する細胞が分泌し、がん組織に限局している糖タンパク質をターゲットとすることを考え、がん組織の糖鎖解析を目指すことにした。そのために、本発明者らの開発したレクチンアレイを用いて、レーザーマイクロダイセクション（LMD）により肝細胞がん患者組織標本中の分化度の異なるがん組織および非がん部組織を明確に分画し、それらの中に存在する糖タンパク質を抽出後に比較糖鎖解析することを試みた。【００２０】
レクチンアレイは世界で最も高感度な糖鎖解析技術である（非特許文献９）が、これは少数の細胞や組織の中に存在する糖タンパク質上の糖鎖を解析することを得意とする解析法である。現時点では培養細胞を扱う場合は、細胞の表層や内部の成分を分画して分析する方法が確立されているが、LMD等で取得した超微量の組織断片からタンパク質を抽出する際には明確な分画方法は確立されていない。つまり分析対象となる組織抽出タンパク質液は、組織中細胞の表面に存在するタンパク質だけでなく、細胞内のタンパク質も混在することになる。ましてやがん細胞周辺の間質部位を含めた解析を目指した実験に着眼した例は皆無である。したがって、従来のがん組織断片を用いた解析により、ある糖鎖ががん組織と正常組織間でのレクチンシグナルの違いで差が見出されたとしても、当該糖鎖が必ずしもがん細胞や組織表面上やがん細胞近傍間質領域に存在しているとは限らない。それを検証するためには、何らかの手段が必要であるが、本発明者らは、松田らが以前に報告した標識レクチンによるがん細胞又は組織表面のレクチン染色による検証法（非特許文献１０，１１）を採用することとした。しかも、この染色法を用いることで、本発明者らがターゲットとしている肝細胞がん細胞近傍の間質領域（TME）も含めた、肝細胞がん及びその周辺領域に存在する糖タンパク質の糖鎖をすべて対象として視覚化することができる。【００２１】
本発明者らは、レクチンアレイにより非がん領域には存在せず、がん部領域に特異的に高い蛍光が観察されたレクチンを複数個見出すことができたため、松田らの方法（非特許文献８，９）に従って、各レクチンを標識して肝細胞がん組織に対するレクチン染色を行い検証しようとした。その際の標識として、まず病理解析に頻用されている西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）を用いたDAB染色を行ったが、いずれもレクチンアレイで数値的有意差が得られたような明確な染色強度の差を示す画像を得ることができず、むしろがん部よりも非がん部での染色性が高く見えるという、レクチンアレイとは正反対の結果が得られるものとなった。次いで、標識としては条件を整えるのが非常に難しい蛍光染色を試みたが、開始当初はやはりがん部と非がん部で有意に染色が異なる結果を得ることができなかった。それでもあきらめずに、染色条件の検討を行った結果、複数のレクチンのうち、NPAレクチンのみが、がん部非がん部ともに染色するが、その染色パターン（分布や染色強度など）が顕著に異なることを確認できた。レクチンアレイの結果とレクチン染色の結果をあわせてNPAレクチンが原発性肝細胞がんのがん部細胞膜および近傍間質の一部領域特異的に存在する糖鎖と反応するレクチンであることが初めて立証された。【００２２】
レクチン染色の結果の画像をみると、NPAレクチンが反応しているのは、非がん部の場合は肝細胞の内部であり、がん部の場合は、がん細胞表面だけでなく、がん組織中のがん細胞周辺間質部位（TME）に存在する特定（免疫）細胞とも反応しているように見える。すなわち、NPAレクチンが反応する当該糖タンパク質は、正常な肝細胞では細胞内に存在しており、肝細胞がんを発症するとがん細胞表面及び／又はがん細胞周辺のTME内の細胞表面で発現もしくは分泌されている可能性と共に、もともと細胞表面に存在していた糖タンパク質の糖鎖構造が肝細胞がんの発症に伴い、NPAレクチン反応性糖鎖に変化した可能性もある。また、肝細胞がん表面で分泌されている糖タンパク質とは別に、TMEに特異的に存在している免疫細胞などからも同一もしくは異なる糖タンパク質が細胞表面に分泌されてきたか、又は糖鎖構造のみが変化した可能性もある。いずれにしても、原発性の肝細胞がんの発症によって、がん細胞表面及び／又はがん細胞周辺のTMEにNPAレクチン反応性糖鎖を有する糖タンパク質が存在するようになったことが窺える。【００２３】
ところで、このようながん細胞の近傍の微小環境であるTMEは、最近、がん細胞の維持、湿潤、転移などに重要な役割を果たすことがわかってきており（非特許文献１２）、特に膵がん、肺がんなどの周辺間質が大きいがんの場合は、がん治療の対象としても注目されてきている（特許文献１５）。
本発明においてNPAレクチンが反応する糖タンパクは、肝細胞がんの細胞膜表面およびＴＭＥにおいて特異的に存在する（免疫）細胞の糖タンパク質である可能性が高く、肝細胞がんの診断用マーカーとなるのはもちろんのこと、今後の肝細胞がんの治療ターゲットにもなると期待できる。【００２４】
以上のように、本発明においては、検証試験の工程として、単にがん部と非がん部でのレクチン染色における染色性の有無に着目するのではなく、染色強度やパターンを取るという工夫により、NPAレクチンに結合性を示す糖タンパク質が目的に合致した分子群であることをはじめて発見した。
NPAレクチンは、N結合型糖鎖の母核構造であるαマンノシル残基と反応性があるほか、「フコースα1→6糖鎖」に対する反応性も高いレクチンであることは周知である（特許文献１６など）。しかしながら、同じ「フコースα1→6糖鎖」認識性レクチンであるLCAレクチン（Lentil Lectin）の場合は、レクチンアレイによるがん部および非がん部組織領域中に存在する糖タンパク質の比較糖鎖解析の結果では、非がん部に対しがん部のシグナルが低下しているという正反対の結果が得られている。NPAレクチンの場合と同様の条件下での組織染色においても、LCAレクチンがまったく異なる染色像を示すことからも、肝細胞がん特異的な糖鎖としてNPAレクチンが認識している糖鎖は、少なくとも「フコースα1→6糖鎖」ではない。また、「フコースα1→6糖鎖」とは反応せず、高マンノース型のうちでも長鎖でマンノースリッチな糖鎖との反応性が高いConA（Concanavalin A）の場合も、非がん部よりもがん部で有意に低値になるレクチンであったことからみて、以下のことが言える。
(1)  非特許文献１３など多くの文献によると、NPAは高マンノース結合レクチンとして分類されているが、詳細な特異性解析（LfDB「http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch」を参照）によると、いわゆるマンノースの数が5を超えるような高マンノース型糖鎖への親和性はさほど強くなく、親和性の高い糖鎖のマンノース数は主として3個であり、特にマンノ3糖にGlcNAc及び／又はGalが１つ以上結合している糖鎖への親和性が高い。また、特許文献１６などにもある通り、コアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含む複合糖鎖への結合が強いので、コアフコース認識レクチンに分類されている場合もある。
(2)  LCAは基本的にはコアフコース含有糖鎖へ強く結合するが、それ以外にも高マンノース型糖鎖にも弱く結合する。その場合、マンノースの数が5を超えるものに強く結合する。
(3)  ConAは高マンノース型糖鎖に強く結合するレクチンの代表である。
マンノースの数で親和性は大きく変わり、7を超えるマンノース数の場合に顕著な結合を示す特徴がある。【００２５】
以上より、今回NPAレクチン結合性として見出されたリガンド糖鎖の特徴はコアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まず、マンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖であると推察される。
すなわち、本発明で見いだされた原発性の肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質は、「NPAレクチン結合性糖タンパク質」のうちでも「コアフコースを含まないNPAレクチン結合性糖タンパク質」である、ということができる。
または、NPAレクチンとLCAレクチン、ConAとの結合性は独立した因子であることから、「LCAレクチンの結合性に依存しないNPAレクチン結合性糖タンパク質」または「LCAレクチン及びConAの結合性に依存しない、NPAレクチン結合性糖タンパク質」と表現することもできる。【００２６】
以上の結果は、肝組織の線維化と連動して血清中で増大することが実証されている「コアフコース」が、原発性肝細胞がんの発生とは、直接的な関連性がないことを示す結果となっている。すなわち、肝硬変から肝細胞がんへの変換は，連続的ではなく何らかのブレークスルーがあることを示唆する結果でもある。
また、NPAレクチンが認識している肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質は、がん細胞内部ではなく明らかにがん細胞表面及びその周辺間質部（TME）に局在していることから、分泌性の糖タンパク質である可能性が高い。このことは、血液や他の体液中にも分泌される可能性が高く、しかもIgGなどの血中に高濃度で存在する糖タンパク質のそれとは異なりLCAレクチンなどのフコース認識レクチンとの結合性に依存しない糖タンパク質であることから、より低侵襲的な体液診断でも線維化状態に関わらない肝硬変との差別化が期待できる。
つまり、従来肝細胞がん判定の際に、「フコース含有糖鎖」に着目していたために、LCAレクチンとの反応性が低い場合を陰性、反応性が高い場合を陽性と判定していたが、むしろLCAレクチンとの反応性が低い場合にこそ原発性肝細胞がんが陽性である可能性があることを実証するものであり、原発性肝細胞がん判定におけるNPAレクチンとの反応性を確認することの重要性が示唆される。
さらに、当該「LCAレクチンの結合性に依存しないNPAレクチン結合性糖タンパク質」からなる原発性肝細胞がんマーカーは、がん細胞表面やその周辺を覆うTME中に限局している糖タンパク質であるといえるから、がん治療のための治療標的となりうる。
以上の知見を得たことで、本発明を完成するに至った。【００２７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕  NPAレクチン結合性糖鎖エピトープであって、かつ下記（１）〜（５）の少なくとも１つの特性を有する糖鎖エピトープを含有するNPAレクチン結合性糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカー；
（１）糖鎖エピトープがコアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まない、
（２）糖鎖エピトープがマンノースの数3の（4以下の）複合型糖鎖を含有する、
（３）糖鎖エピトープがマンノースの数5以上の高マンノース型糖鎖を含まない、
（４）糖鎖エピトープがLCAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる、
（５）糖鎖エピトープがConAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる。
〔２〕  前記糖タンパク質が、肝組織のがん細胞表面に存在するか，又はその細胞近傍の間質に存在する糖タンパク質である前記〔１〕に記載の肝細胞がんマーカー。
〔２’〕  肝細胞がんを検出する方法における使用のための、前記〔１〕又は〔２〕に記載の肝細胞がんマーカーであって、当該方法は被験者から生体サンプルを採取する工程を含むものである、肝細胞がんマーカー。
〔３〕  前記糖タンパク質が、Complement factor H（CFH）、Fibrillin 1（FBN1）、Fibronectin（FN）、Oxygen regulated protein (HYOU1)、Epidermal growth factor receptor（EGFR）、Prosaponin （PSAP）、Cathepsin D（CTSD）、及びLysosomal associated membrane protein 2（LAMP-2）から選択されるいずれかの糖タンパク質である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の肝細胞がんマーカー。
〔４〕  NPAレクチンを含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の肝細胞がんマーカーの検出用試薬。
〔５〕  さらに、LCAレクチン又はConAレクチンを含むことを特徴とする、前記〔４〕に記載の検出用試薬。
〔６〕  Complement factor H（CFH）、Fibrillin 1（FBN1）、Fibronectin（FN）、Oxygen regulated protein (HYOU1)、Epidermal growth factor receptor（EGFR）、Prosaponin （PSAP）、Cathepsin D（CTSD）、及びLysosomal associated membrane protein 2（LAMP-2）から選択される少なくとも一種のNPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の肝細胞がんマーカーの検出用試薬。【００２８】
〔７〕  被検試料における、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の肝細胞がんマーカーをインビトロで検出することによって、肝細胞がんを検出することを特徴とする、肝細胞がんの検出方法。
〔８〕  前記肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を、標識化したNPAレクチンを用いた被検細胞もしくは組織のNPA染色により行うことを特徴とする、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕  前記肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を、NPAレクチンを含むレクチンアレイを用いるレクチンアレイ解析法又はNPAレクチンを含むレクチン−抗体ELISA法により行うことを特徴とする、前記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕  前記レクチンアレイ解析法が、NPAレクチンと共に少なくともLCAレクチン又はConAレクチンを含むレクチンアレイを用いることを特徴とする、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  前記レクチン−抗体ELISA法が、NPAレクチン及びNPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を用いたサンドイッチ法により肝細胞がんマーカーを検出する方法であって、NPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体を支持体上に固相化し、標識化したNPAレクチンにより肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質をサンドイッチしたレクチンオーバーレイにより行うか、又は標識化した前記抗体により肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質をサンドイッチした抗体オーバーレイにより行うことを特徴とする、前記〔９〕に記載の方法。
〔１２〕  前記NPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗体が、CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体であることを特徴とする、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  被検試料として、血清成分を含む血液試料を用いて肝細胞がんマーカーのインビトロでの検出を行う際に、あらかじめ被検試料に対し支持体上に固相化したα2,6シアル酸結合性レクチンとの吸着工程、及びα2,6シアル酸結合性レクチン非吸着画分を取得する工程を設けることを特徴とする、前記〔７〕、〔９〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕  α2,6シアル酸結合性レクチンが、SNA, SSA, TJAI及びPSLlaレクチンから選択された少なくとも一種のレクチンである前記〔１３〕に記載の方法。【００２９】
〔１５〕  肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検肝組織由来の被検試料に対して、NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。
〔１６〕  前記測定方法において、
（１）あらかじめ前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法において、複数の肝細胞がん組織及び正常組織のNPAレクチンを含むレクチンに対する反応性を測定し、肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式又は検量線を用意する工程、及び
（２）前記被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性の測定値を、前記判別式又は検量線にあてはめて、肝細胞がんの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程、
を設けることを特徴とする、前記〔１５〕に記載の測定方法。
〔１７〕  被検試料として血清含有試料を用いて、肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検血清含有試料に対して、
（１）支持体上に固相化したα2,6シアル酸結合性レクチンと吸着させる工程、
（２）α2,6シアル酸結合性レクチン非吸着画分を取得する工程、
（３）NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。
〔１８〕  肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための測定方法であって、
被検肝組織由来の被検試料に対して、NPAレクチンを含むレクチンと、CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体とのサンドイッチELISA法を用いて被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
を包含することを特徴とする、測定方法。【００３０】
〔１９〕  NPAレクチンを含むレクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法を用いて肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する方法であって、
（１）あらかじめ前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法において、複数の肝細胞がん組織及び正常組織のNPAレクチンを含むレクチンに対する反応性を測定し、肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式又は検量線を用意する工程、
（２）被検肝組織由来の被検試料を、前記レクチンアレイ又はELISAに供し、被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性を測定する工程、
（３）工程（２）で得られた、被検試料のNPAレクチンを含むレクチンとの反応性の測定値を、工程（１）で得られた判別式又は検量線にあてはめて、肝細胞がんの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程。
〔２０〕  前記レクチンアレイ解析法又はレクチン−抗体ELISA法が、NPAレクチンと共にさらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンを含んでおり、あらかじめ用意する判別式又は検量線が、さらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンに対する判別式又は検量線も含むことを特徴とする、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕  組織染色による肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定する方法であって、下記工程（１）〜（４）を含む方法；
（１）被検肝組織由来の被検試料の組織切片を作製する工程、
（２）蛍光標識したNPAレクチンによる組織染色を行う工程、
（３）細胞表面及び／またはその近傍の間質における蛍光の有無及び強度を観察する工程、
（４）工程（３）で一定レベル以上の蛍光を観察した場合に肝細胞がんに罹患していると判定し、その強度に従って、がんの進行もしくは悪性の程度を判定する工程。【００３１】
〔２１〕  蛍光標識したNPAレクチンを含むことを特徴とする、肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための組織染色用キット。
〔２２〕  肝細胞がんマーカー検出用キットであって、下記（１）及び（２）のいずれかが支持体に固相化され、他方が標識化されていることを特徴とするキット；
（１）NPAレクチンを含むレクチン、
（２）CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体。
〔２２’〕  肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための肝細胞がんマーカー検出用キットであって、下記（１）及び（２）のいずれかが支持体に固相化され、他方が標識化されていることを特徴とするキット；
（１）NPAレクチンを含むレクチン、
（２）CFH、FBN1、FN、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2から選択される少なくとも一種の糖タンパク質と結合する抗体。
〔２３〕  肝細胞がんマーカー検出用キットであって、少なくともNPAレクチンと共にさらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンを用いることを特徴とする、キット。
〔２３’〕  肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するための肝細胞がんマーカー検出用キットであって、少なくともNPAレクチンと共にさらにLCAレクチン及び／又はConAレクチンを用いることを特徴とする、キット。
〔２４〕  前記キットが被検試料として、血清含有試料に適用するためのキットであって、さらにα2,6シアル酸結合性レクチンを含むことを特徴とする、前記〔２２〕又は〔２３〕に記載のキット。【００３２】
〔２５〕  肝細胞がんマーカー検出用キットの製造における、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の肝細胞がんマーカーの使用。
〔２６〕  肝細胞がんへの罹患の有無又はがんの進行もしくは悪性の程度を判定するためのキットの製造における、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の肝細胞がんマーカーの使用。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、肝線維化や機能低下に依存せず、肝細胞がんの出現により初めて肝臓に存在する「LCAレクチンの結合性に依存しないNPAレクチン結合性糖タンパク質」からなる真の肝細胞がんマーカーを提供することができ、同時にNPAレクチンを含むキットによる当該肝細胞がんマーカーの検出法を提供することができた。また、当該肝細胞がんマーカーを検出することで、肝線維化の進展や機能低下に関わらない肝硬変との差別化も可能となり、さらにがん細胞表面やその周辺を覆うTMEに局在する当該肝細胞がんマーカーを標的とすることで、肝細胞がん治療のための薬剤開発、治療法開発の道を開くことになった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】肝細胞がん患者から外科的に摘出された肝組織連続薄切標本（ヘマトキシリン−エオシン染色：上段）とLMD後標本（ヘマトキシリン染色：下段）
【図２】HCV感染肝細胞がん患者の肝組織標本のレクチンアレイによる比較糖鎖解析結果
【図３】非HCV、非HBV感染肝細胞がん患者の肝組織標本の比較糖鎖解析結果
【図４】各レクチンの結合するN型糖鎖上位10傑
【図５】モデル細胞株を用いたレクチンアレイとサンドイッチELISAの性能比較
【図６】肝細胞がん患者組織由来タンパク質溶液を用いたレクチンアレイとサンドイッチELISAの性能比較
【図７】肝細胞がん患者から外科的に摘出された肝組織標本のヘマトキシリン−エオシン染色（左）とNPAレクチン染色（右）
【図８】肝組織標本のレクチン染色の狭視野像（×60油浸レンズ）：同一組織中の非がん部領域（上段）、中分化型がん部（下段）を示す。
【図９】肝細胞がん患者（7症例）組織由来がん部及び非がん部からの組織ライセートを用いたレクチンアレイとサンドイッチELISA（図中、■はがん部由来、□は非がん部由来）
【図１０】肝細胞がん培養細胞株のAFP産生株と非産生株における培養上清のレクチンシグナル比較
【図１１】肝細胞がん培養細胞株のAFP産生株と非産生株における培養上清中のNPA結合糖タンパク質のα2,6シアル酸認識レクチン反応性
【図１２】多段階レクチン利用法を適用した非HBV、非HCV患者由来血清のSSA非吸着−NPA吸着画分のレクチン解析
【図１３】Huh7、HAK 1A又はHLF細胞株からの細胞抽出物におけるNPAレクチン溶出画分中のHYOU1、EGFR、 PSAP、 CTSD及び LAMP-2糖タンパク質の存在を示すウェスタンブロッティング図。
【図１４】Huh7、HAK 1A、HAK 1B、KYN-1又はHLF細胞株の無血清培養の培養上清におけるNPAレクチン溶出画分中の、CFH、 FN、 PSAP、 CTSD及びLAMP-2糖タンパク質の存在を示すウェスタンブロッティング図。
【図１５】HuH-7、HAK 1B又は KYN-1細胞株の無血清培養の培養上清におけるNPAレクチン溶出画分中の、FBN1及び FN糖タンパク質の存在を示す抗体-レクチンサンドイッチELISA、並びにHAK 1A細胞株の無血清培養の培養上清におけるNPAレクチン溶出画分中の、CTSD、 PSAP及び LAMP-2糖タンパク質の存在を示す抗体-レクチンサンドイッチELISAの図。抗FBN1抗体及びFN抗体をプレート固相化し、ビオチン化標識NPAレクチンによるサンドイッチELISA測定系での検出を行った。
【図１６】HAK 1A細胞株の無血清培養の培養上清における抗 CD9抗体又は抗 CD81抗体による免疫沈降溶出画分中の、CTSD糖タンパク質の存在を示すウェスタンブロッティング図。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．本発明における肝細胞がんマーカーについて
（１−１）本発明の肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質
本発明の肝細胞がんマーカーは、「NPAレクチン結合性糖タンパク質」のうちの「コアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まないNPAレクチン結合性糖タンパク質」であると表現することができる。より具体的には、「コアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まず、マンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖を有する糖タンパク質」であるといえる。または、「コアフコース（フコースα1→6糖鎖）及び5以上のマンノースを含む糖鎖をエピトープに含まないNPAレクチン結合性糖タンパク質」ということもできる。他の糖鎖の特徴は、下記（１−３）に示すとおりである。
また、当該糖タンパク質は、NPAレクチンとは明確に反応するが、コアフコース（フコースα1→6糖鎖）への結合性では同様な挙動を示すLCAレクチンの結合性には依存しないことから、本発明の肝細胞がんマーカーは、「LCAレクチンの結合性に依存しないNPAレクチン結合性糖タンパク質」と表現することもできる。そして、同じ高マンノース型レクチンに分類されることが多いConAレクチンとの結合性にも依存しないことから、「LCAレクチン及びConAの結合性に依存しない、NPAレクチン結合性糖タンパク質」と表現することもできる。
【００３６】
以上をまとめて、本発明の肝細胞がんマーカーを正確に表現すると、
「NPAレクチン結合性糖鎖エピトープであって、かつ下記（１）〜（５）の少なくとも１つの特性を有する糖鎖エピトープを含有する糖タンパク質からなる肝細胞がんマーカー；
（１）糖鎖エピトープがコアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まない、
（２）糖鎖エピトープがマンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖を含有する、
（３）糖鎖エピトープがマンノース5以上の高マンノース型糖鎖を含まない、
（４）糖鎖エピトープがLCAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる、
（５）糖鎖エピトープがConAレクチンの結合性に依存しない複合型糖鎖からなる。」
であるということができる。
典型的な表現として、以下、本発明の肝細胞がんマーカーを「コアフコースを含まないNPAレクチン結合性糖鎖エピトープを含有する糖タンパク質」、または単に「コアフコースを含まないNPAレクチン結合性糖タンパク質」、「NPAレクチン結合性糖タンパク質」ということもある。
【００３７】
さらに、本発明の肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質は、組織染色などの結果からみて、肝細胞がんの細胞膜表面及びがん細胞周辺近傍領域（TME）の免疫細胞に限局している糖タンパク質であり、しかも、当該糖タンパク質は、正常細胞の時期には細胞内のオルガネラ等に存在していたのに肝細胞がんの発症に伴って細胞外に分泌された糖タンパク質である可能性もある。他に、プロテアーゼによる切断を受けて細胞外へ分泌された場合、又はエクソソームのような分泌小胞の表面に提示されているか、もしくは内包されている場合の可能性もある。
すなわち、本発明の肝細胞がんマーカーは、その存在位置に着目して、「肝細胞がんの細胞膜表面及び／又はTME中の免疫細胞に特異的に存在するNPAレクチン結合性糖タンパク質」と表現することもできる。
【００３８】
（１−２）本発明で用いるレクチンについて
（ａ）本発明の肝細胞がんマーカー由来糖鎖を直接検出するためのレクチン：
本発明において、肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質（NPA結合性タンパク質）由来糖鎖の糖鎖エピトープを直接的に認識するレクチンは、NPAレクチンである。
＜NPAレクチン＞
NPAレクチンは、ラッパスイセン（Narcissus pseudonarcissus）に由来し、「Monocot Mannose-binding Lectin 」（単子葉植物マンノース結合レクチン）ファミリーに属するレクチンを指す。NPLレクチンとも呼ばれることがある。ここで、「レクチン」とは、「糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質」と定義されるものである。
NPAレクチンは、ラッパ水仙から抽出し単離精製することもできるが、すでに市販されており、EY Labortories, Inc.から入手できる。ビオチン化NPLがVector Laboratories, Inc.から入手できる。
NPAレクチンの単糖特異性はManである。NPAレクチンは、詳細な特異性解析(LfDBを参照)によると、図４でその上位10傑にも示したように、いわゆるマンノースの数が5を超えるような高マンノース型糖鎖への親和性はさほど強くなく、親和性の高い糖鎖のマンノース数は主として3個であり、特にマンノ3糖にGlcNAc及び／又はGalが1つ以上結合している糖鎖への親和性が高い。
またコアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含む複合糖鎖への結合が強く、LCAレクチンなどの「コアフコース認識レクチン」として、同列に扱われる場合（特許文献１６）もある。
【００３９】
（ｂ）本発明における肝細胞がんマーカーの糖タンパク質（NPA結合性タンパク質）由来の糖鎖でないことを確認するためのレクチン：
本発明における肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質由来糖鎖の糖鎖エピトープは、コアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まないこと、及びマンノース数5以上の高マンノース型糖鎖を含まないこと、を特徴としている。
したがって、「フコースα1→6糖鎖」への親和性が高く、かつ3マンノース含有糖鎖への親和性を有さないレクチン、又は「マンノース数5以上の高マンノース型糖鎖への高親和性を有するレクチンは、NPAレクチンが結合した糖タンパク質が肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質ではないことを示す，いわば「負のマーカー」となる。そのような典型的なレクチンとしては、前者が「LCA又はPSA, AOL, AALレクチン」、特に「LCAレクチン」であり、後者が「ConAレクチン」である。
【００４０】
＜LCAレクチン＞
LCAレクチンは、レンズ豆（Lens culinaris）に由来し、「Legume Lectin」ファミリーに属するレクチンであり、単糖特異性はMan及びGlcである。LCAレクチンは、図４でその上位10傑にも示したように、基本的にはコアフコース含有糖鎖へ強く結合する。それ以外にも高マンノース型糖鎖にも弱く結合し、高マンノース型糖鎖では、マンノースの数が5を超えるものに強く結合する。
LCAレクチンは、典型的なコアフコース（フコースα1→6糖鎖）含有糖タンパク質への親和性の高いレクチンとして汎用され、標準物質となっており（特許文献１６など）、LCAレクチンを結合させたレクチンカラムは市販され、糖タンパク質分離，精製用のレクチンアフィニティクロマトグラフィーのキットとして用いられている（Science Tools from Amersham Biotech 3,3(1998)p.5-6）。
【００４１】
＜ConAレクチン＞
ConA（Concanavalin A）は豆科のCanavalia ensiformisに由来し、「Legume Lectin」ファミリーに属するレクチンであり、単糖特異性はMan及びGlcである。ConAは、高マンノース型糖鎖に強く結合するレクチンの代表であり、ConAを結合させたレクチンカラムは市販され、LCAレクチンカラムと共に、糖タンパク質分離，精製用のレクチンアフィニティクロマトグラフィーのキットとして用いられている（Science Tools from Amersham Biotech 3,3(1998)p.5-6）。
ConAの親和性はマンノースの数で大きく変わり、7を超えるマンノース数の場合に顕著な結合を示す特徴がある。
【００４２】
（ｃ）NPAレクチンと組み合わせて使用することで肝細胞がんマーカー検出精度を高める可能性のあるレクチンについて：
＜DSAレクチン＞
DSAレクチンは、Datura stramonium由来のGalβ1→4GlucNAc特異的な親和性を有するレクチンであり、HCV感染肝細胞がん患者の肝組織標本からのがん部及び非がん部のレクチンアレイ解析（図２）によると、NPAレクチンと同程度にがん部で有意（p<0.001）に高い反応性を有している。つまり、DSAレクチンが認識する非還元末端にGalβ1→4GlcNAcを3以上有する複合糖鎖含有糖タンパク質も肝細胞がんマーカー候補であるといえる。しかし、DSAレクチンの場合は、非がん部での値も高かったことからみて、肝細胞がん発症によってはじめて発現もしくは生合成された糖タンパク質ではなく、発がんによって存在量が増大したにすぎないから、真の意味での肝細胞がんマーカー候補とはならない。したがって、本発明においては直接の対象としない。しかし、本発明のNPAレクチンと組み合わせて用いることで、検出精度を高めることができる可能性がある。
【００４３】
また、図３で非HCV，非HBV感染肝細胞がん患者の肝組織標本からのがん部及び非がん部のレクチンアレイ解析（図３）で，NPAレクチンと同様に、有意差をもってがん部で高値、非がん部で低値であったHPAレクチンについても、非がん部での値も高かったことから、本発明においては直接の対象としない。しかし、DSAレクチンの場合と同様に、本発明のNPAレクチンと、またはさらにDSAレクチンとも組み合わせて用いることで、検出精度を高めることができる可能性がある。
【００４４】
（ｄ）血清中のNPA結合性タンパク質エンリッチのためのレクチン
また、本発明における肝細胞がんマーカー検出を、血清など血液試料を用いて行う場合、あらかじめ血清中に多く存在するα2,6シアル酸（Neu5Acα2-6Gal又はNeu5Gcα2-6Gal）を有する糖タンパク質を除くことでNPA結合性タンパク質を濃縮でき、肝細胞がんマーカーの検出効率を高めることができる。
α2,6シアル酸は、各種の悪性度の高いがん細胞表面での発現増加が観察されており、N結合型糖タンパク質中でのα2,6シアル酸の発現増加が、がんの進行、転移、予後不良と関係があるという報告もある（Cancer Res.,2013 Apr 1;73(7)2368-78）。しかし、肝細胞がんの場合は、α2,6シアル酸の発現増加は系統だってはみられず、本発明の肝細胞がんマーカー糖タンパク質（NPA結合糖タンパク質）は、必ずしもα2,6シアル酸の増減がマーカー指標となるわけではなく、NPA自体はα2,6シアル酸含有糖鎖への結合性を示さないため、むしろα2,6シアル酸含まない糖タンパク質が血清マーカーとなりうることも考えられる。
一方、血清中の糖タンパク質の中には、正常人由来の血清であっても、もともとNPAに結合する糖タンパク質が多く存在する。しかし、そのような正常細胞由来糖タンパク質は、同時にα2,6シアル酸も有している場合が多いことが本発明により明らかとなった。
以上のことから、血清含有試料を用いて本発明の肝細胞がんマーカー糖タンパク質（NPA結合糖タンパク質）を検出、測定しようとする際には、あらかじめ血清含有試料を、α2,6シアル酸を特異的に認識するレクチン（SNA, SSA, TJAI又はPSLlaレクチン）と反応させ、α2,6シアル酸含有糖タンパク質を除く工程を設けることがバックグラウンドを大幅に下げる効果があり有利である。例えば、被検血清試料を、これらα2,6シアル酸認識レクチンを固定化したアフィニティカラム、磁気ビーズカラムなどで処理する。血清中の大部分のタンパク質はカラムにトラップされるのに対し、本発明の肝細胞がんマーカー（NPA結合糖タンパク質）は素通りし、結果的にエンリッチされる。
その際のレクチンとして、SNA, SSA, TJAI又はPSLlaレクチンが挙げられるが、これらレクチンに代えて既知の抗α2,6シアル酸抗体（Cancer Res.,2013 Apr 1;73(7)2368-78）を用いることもできる。これらレクチンもしくは抗体は単独で用いても良いが、複数組み合わせても良い。
【００４５】
＜TJAIレクチン＞
TJAIレクチン（Trichosanthes japonica lectin-I）は、キカラスウリから抽出することができるが、生化学工業株式会社などから市販されている。
＜SSAレクチン＞
SSAレクチン（Sambucus sieboldiana lectin）は、ニホンニワトコから抽出することができるが、生化学工業株式会社などから市販されている。
＜SNAレクチン＞
SNAレクチン（Sambucus nigra lectin）は、ニワトコから抽出することができるが、VECTOR Laboratories社により市販されている。
＜PSL1aレクチン＞
PSL1aレクチン（Polyporus squamosus lectin）は、アミヒラタケから抽出することもできるが、α2,6シアル酸特異性を保持したリコンビナント体のrPSL1aレクチンが和光純薬工業により市販されている。
【００４６】
（ｅ）その他のレクチン情報について：
レクチンについての情報は、レクチンフロンティアデータベース（LfDB）、或いは産業技術総合研究所・創薬基盤研究部門のホームページ等から入手可能である。
【００４７】
（１−３）本発明の肝細胞がんマーカーにおける糖鎖の特徴
本発明の肝細胞がんマーカーにおける糖鎖の最も大きな特徴は、コアフコース（フコースα1→6糖鎖）への親和性がきわめて高いLCAレクチンとの結合に依存していない糖鎖であることであるため、コアフコース（フコースα1→6糖鎖）を含まない糖鎖である可能性が高い。少なくとも、本発明のマーカーとなる糖タンパク質の糖鎖エピトープ中にはコアフコース（フコースα1→6糖鎖）が含まれないということができる。
また、本発明の肝細胞がんマーカーにおける糖鎖の特徴は、マンノース5以上の高マンノース型糖鎖への親和性が極めて高いConAとの結合に依存していない糖鎖であること、具体的にはマンノース数５以上の高マンノース型糖鎖ではないこと、もしくはマンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖であることにある。または、マンノース5以上の高マンノース型糖鎖は，本発明マーカーのエピトープにはならないということもできる。
すなわち、本発明で見いだされた原発性の肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質は、「NPAレクチン結合性糖タンパク質」のうちでも「コアフコースを含まないNPAレクチン結合性糖鎖を含有する糖タンパク質」であり、又は「マンノース5以上の高マンノース型糖鎖を含まないNPAレクチン結合性糖鎖を含有する糖タンパク質」であるということができる。「コアフコースを含まず、マンノースの数3の（4を超えない）複合型糖鎖を含有し、かつNPAレクチン結合性の糖鎖を含有する糖タンパク質」ということもできる。「コアフコース又はマンノース5以上の高マンノース型糖鎖を持たない糖鎖エピトープを含有するNPAレクチン結合性の糖タンパク質」ということもできる。
【００４８】
２．本発明の肝細胞がんマーカーとなる糖タンパク質とその特異的抗体
（２−１）肝細胞がんマーカーとなるNPAレクチン結合性糖タンパク質
本発明のNPAレクチン結合性糖タンパク質は、肝細胞がんに罹患している肝臓のがん部において、がん細胞及びその近傍の間質部（TME）で特異的に存在している糖タンパク質であるといえるから、肝細胞がん患者から摘出された肝細胞がん組織中には相当量存在していることは明らかである。したがって、このような廃棄処理される肝細胞がん組織を大量に集めることができるので、当該がん組織から既知の方法でタンパク質画分を取得し、NPAレクチンを固定化したレクチンクロマトグラフィーなどにより、簡単に大量に取得可能であるから、必要に応じて得られた糖タンパク質のアミノ酸配列及び糖鎖構造を決定することができる。
本発明では、そのような候補糖タンパク質を効率よく複数種類同定可能な方法として、本発明者らが以前に開発したLec-IGOT-LC/MS法（特許第4220257号、Kaji H,ほかNature Protocols 1, 3019-3027 (2006)）を利用して、8種類の肝細胞がんマーカーを同定した。
これら糖タンパク質は、被検血清試料、又は被検細胞切片を用いた肝細胞がん診断の際の糖鎖ターゲットであり、かつ肝細胞がん治療の際の糖鎖ターゲットともなる。
【００４９】
具体的には、表１に記載のComplement factor H  (CFH)、Fibrillin 1 (FBN1)、Fibronectin (FN)、Oxygen regulated protein (ORP-150, Hypoxia Up-Regulated 1: HYOU1)、Epidermal growth factor receptor (EGFR)、Prosaponin (PSAP)、Cathepsin D (CTSD)、及びLysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2)である。これらの表１記載のマーカー分子は、NPAレクチンと特異的に結合することを特徴とするN結合型糖鎖を複数有するNPA結合性糖タンパク質であり、肝細胞がんを検出・判定可能な肝細胞がんマーカーとなる。
表１に示す糖付加位置のアスパラギン残基に糖鎖が付加された表１に記載の肝細胞がんマーカー糖タンパク質又は糖鎖が付加された、表１に示す糖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも一つ含む糖タンパク質断片であれば、いずれの肝細胞がんマーカーも用いることができる。これらの肝細胞がんマーカーは、単独で用いてもよいし、二以上を組合せて用いてもよい。例えば、二以上の異なる肝細胞がんマーカー糖タンパク質を用いてもよい。
これら、肝細胞がんマーカーの有無を検出することで、被検試料における肝細胞がんの罹患の有無及び／またはがんの進行もしくは悪性の程度を判定することができる。
【００５０】
【表１】
2016013597.tif 000002
【００５１】
＜Epidermal growth factor receptor（EGFR）＞
上皮成長因子受容体（Epidermal growth factor receptor、略称：EGFR、ERBB、ERBB1）は、上皮系、間葉系等各種細胞膜表面で発現しているチロシンキナーゼ型受容体であり、細胞増殖や成長を制御する上皮成長因子（EGF）のシグナル伝達に関わる糖タンパク質である。腎がん、様々な悪性腫瘍で過剰発現がみられ、癌の予後不良因子としても知られる。
【００５２】
＜Fibronectin1 （FN1）＞
フィブロネクチン（Fibronectin、略称：FN、FN1、CIG、FINC、GFND2、LETS、MSF）は、血清中では可溶性の二量体糖タンパク質として存在し、細胞表面や細胞外マトリックスでは、二量体又は多量体で存在する。がん化関連因子としても注目されている。
【００５３】
＜Fibrillin 1 (FBN1)＞
フィブリリン（Fibrillin 1 、略称：FBN1、FBN、MASS、）MFS1、OCTD、SGS、WMS）は、フィブリリンファミリーに属し、ミクロフィブリルの10-12nmのCa結合部位構成タンパク質を担う細胞外マトリックスの巨大糖タンパク質である。
【００５４】
＜Oxygen regulated protein (ORP-150, Hypoxia Up-Regulated 1: HYOU1)＞
低酸素制御因子（Oxygen regulated protein、略称：HYOU1,Grp170，HSP12A、ORP150）は、ヒートショック・プロテイン70ファミリーに属し、小胞体（ER）内で、タンパク質のフォールディング、分泌に関わるタンパク質であり、アポトーシスの抑制や低酸素誘導による攪乱からの細胞防御作用もある。乳がんなどで高発現が確認されている。
【００５５】
＜Complement factor H(CFH)＞
補体H因子（Complement factor H、略称：CFH、ARMD4、ARMS1、FHL1,HF,HF1,HF2,HUS）は、補体活性化制御（RCA）の一員として、血液中に分泌され、細菌感染への自然防御機構に関わる糖タンパク質である。
【００５６】
＜Cathepsin D (CTSD)＞
カテプシンD（Cathepsin D 、略称：CTSD、CLN10、CPSD）は、リソソームのAspプロテアーゼの一種であり、遺伝子変異により乳がん、アルツハイマー症など種々の疾病の原因となる。
【００５７】
＜Lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2)＞
リリソーム膜タンパク質２（Lysosomal associated membrane protein 2 、略称：LAMP-2、CD107b）は、細胞膜糖タンパク質ファミリーに属し、糖リガンドをセレクチンに提供する役割を持ち、がんの転移に関連する。
【００５８】
＜Prosaponin (PSAP)＞
神経栄養因子（Prosaponin、略称：PSAP、GLBA、SAP1）は、サポシン前駆体としてサポシンA,B,C及びDに切断される。サポシンA-Dはリソソーム区画に局在するが、この前駆体は、分泌性タンパク質として、又は複合的膜タンパク質として神経栄養活性を有する。
【００５９】
（２−２）肝細胞がんマーカーを検出するための抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体
そして、当該糖タンパク質のアミノ酸配列情報をもとにタンパク質部分に特異的な抗体を作製することができる。また、当該糖タンパク質の糖鎖構造に基づいて、NPAレクチンにより認識される糖鎖エピトープの糖鎖構造を正確に決定することができるから、当該糖鎖エピトープを免疫原として既知の抗体作製手法により簡単に当該糖鎖エピトープを認識する抗体を得ることができる。また、当該糖鎖エピトープ以外の糖鎖構造を認識する他のレクチンまたは抗体を取得することも可能である。
さらに、当該糖タンパク質の糖鎖エピトープを含む糖鎖と、タンパク質部分とを同時に認識する肝細胞がん特異的抗体も、CasMab法（CasMab：Kato Y et al., Sci Rep. 2014 Aug 1; 4: 5924. doi: 10.1038/srep05924）などを用いて作製することができるから、肝細胞がんを治療ターゲットとする治療用抗体医薬を提供できる。
【００６０】
本発明の肝細胞がんマーカーの検出方法、肝細胞がんの判定方法においては特にNPAレクチン結合性糖タンパク質のタンパク質部分に特異的に結合する抗体が有効であり、単独で用いることもできるが、NPAレクチンと併用することが好ましい。これらの抗体はポリクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体が好ましく、その抗原活性が損なわれない限り、Fabなどの抗体フラグメントであっても良い。これら抗体及びそのフラグメントをあわせて、抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体と呼ぶ。
また、「抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体」としては、糖鎖部分とタンパク質部分とを同時に認識する抗体（肝細胞がん特異的抗体）である場合も含まれる。当該肝細胞がん特異的抗体は、単独でも肝細胞がんマーカーの検出、及び肝細胞がん診断に極めて有効に用いることができるが、NPAレクチン又はタンパク質部分に特異的に結合する抗体などと併用することでさらに精度を上げることができる。
【００６１】
本発明で肝細胞がんマーカーの検出、肝細胞がんの判定などに用いることができる抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体として、具体的な抗体を、下記表２として示す。
【００６２】
【表２】
2016013597.tif 000003
【００６３】
（２−３）Lec-IGOT-LC/MS法について
以下、本発明で用いた「Lec-IGOT-LC/MS法」の具体的な手順について、簡単に説明する。
(1)  18O標識ペプチドの調製
2種類の肝細胞がん培養株（HLF株、HAK1A株）培養上清、並びに肝細胞がん患者病理組織由来のがん部及び非がん部のそれぞれから調製したタンパク質試料を、NPAレクチンを結合させたカラムを通し、NPA結合性糖タンパク質群を捕集し、トリプシン処理によりペプチドに断片化後、再度NPAレクチンカラムを通してNPAレクチン結合性糖ペプチド群を再捕集した。得られた候補糖ペプチドをペプチド-N-グリカナーゼ（グリコペプチダーゼF、PNGase）で処理し、Ｎ結合型糖鎖を外す代わりに糖鎖が結合していたAsnに18Oが導入されることでペプチドを安定同位体標識した。（これによりペプチド上に糖鎖が結合していたかを実験的に確証が取れ、かつペプチド配列上のどのAsnに糖鎖が結合していたかがわかる。）
(2)  標識ペプチドのアミノ酸配列及び糖鎖結合位置の同定
IGOT法で標識された候補糖ペプチドを液体カラムクロマトグラフィー（LC）で分離し、質量分析（MS）に導入し、タンデム質量分析法（MS/MSイオンサーチ法）により、そのアミノ酸配列を網羅的に決定し、検索ソフトMascotを用いて糖鎖結合位置を同定した。
(3)  肝細胞がん組織がん部での高発現糖タンパク質の同定
得られたNPAレクチン結合性ペプチド群のそれぞれをデータベース内の糖タンパク質と関連づけ、対応する各糖タンパク質の市販抗体を用いて、肝細胞がん培養株（HLF株、HAK1A株）、並びに肝細胞がん患者病理組織のいずれかで非がん部と比較してがん部で高発現している糖タンパク質を複数種類候補糖タンパク質として同定した。
(4)  肝細胞がんマーカー糖タンパク質の決定
得られた複数種類の肝細胞がんマーカー候補となる糖タンパク質のうち、実際にNPA捕集後に得られるNPA結合タンパク質画分の抗マーカー候補タンパク質抗体によるウェスタンブロットでの妥当な移動度へのバンドシグナル出現の有無によりNPA結合性を検証し、シグナル出現したものを本発明の肝細胞がんマーカー糖タンパク質として選定した。ウエスタン用の抗体が得られないなど、場合によってはNPAレクチンと抗マーカー候補タンパク質抗体とを用いたレクチン−抗体サンドイッチELISAを行った結果、バックグラウンドシグナルに対し有意にシグナル（S/N比が2以上）が生じたものも、本発明の肝細胞がんマーカー糖タンパク質として選定した。
【００６４】
３．本発明の肝細胞がんマーカーの検出方法
（３−１）レクチンアレイまたはサンドイッチELISA法による検出と定量
発明の肝細胞がんマーカーとなる「NPAレクチン結合性糖タンパク質」は、糖鎖部分のみに着目しても、NPAレクチンを用いたレクチンアレイまたはサンドイッチELISA法により、簡便かつ正確に検出することができ、しかも肝細胞がんマーカーの定量も可能である。ここで、NPAレクチンと共に、フコースα1→6糖鎖結合性レクチンであるLCAレクチンなど、5マンノ糖以上の高マンノース糖鎖結合性レクチンであるConAレクチンなど、及びα2,6シアル酸結合性レクチンであるSNA, SSA, TJAI, PSLlaレクチンなどから選択される少なくとも1種のレクチンと併用することで検出精度が高まる。
また、さらにNPAレクチン結合性糖タンパク質のタンパク質部分を認識する抗体（例えば抗LAMP2抗体、抗CTSD抗体、抗CFH抗体、抗FBN1抗体）、又は糖鎖とタンパク質部分とを同時に認識する抗体を用いることでも肝細胞がんマーカーの検出及び定量ができる。このような抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体は、単独で用いても良いが、NPAレクチンを含むレクチン類と併用したサンドイッチELISA法が特に好ましい。
【００６５】
本発明の肝細胞がんマーカーの検出及び定量方法は、被験者より採取された試料から、肝細胞がんマーカーを検出することによって、該被験者が肝細胞がんに罹患しているか否かを判定するために用いることができる。
また、肝細胞がん治療薬を投与した後に採取された血清（体液）中の上記肝細胞がんマーカーの含有量を測定することによって、肝細胞がん治療効果の評価を行うこともできる。例えば、上記肝細胞がんマーカーの含有量またはそれから算出される値を、治療薬投与前と投与後数日〜数ヵ月の時点において比較し、後者における肝細胞がんマーカーの含有量またはそれから算出される値が低下していれば予防または治療効果があったと判断することができる。肝細胞がん治療薬としては、例えば、ソラフェニブ（一般名）などが挙げられる。
【００６６】
本明細書において「被験者」とは、検査に供される者、すなわち被検試料を提供する者を指す。被験者は、何らかの疾患を有する患者又は健常者のいずれであってもよい。好ましくは、肝細胞がんに罹患している可能性がある者又は肝細胞がん患者である。
【００６７】
ここで、被検試料としては、被験者から生検などで採取された肝組織の一部の組織断片、肝炎もしくは肝硬変患者から切除された肝組織の病変部由来の組織断片を対象とすることができ、被験者は特に限定されず、肝細胞がんであるか否かの判定は必要な者に対して広く適用できる。
また、被験者の血液、リンパ液、髄液、または胆汁などの体液を用いることができ、好ましくは被験者より採取された血液を分離して得られる血清を被検試料とすることが被験者の負担も少なく検査時間も短縮化も図れるため最も好ましい。
被検体液は、採取後直ちに利用してもよいし、冷凍又は冷蔵により一定期間保存した後、必要に応じて解凍等の処理を行ない利用することもできる。本実施形態において、血清を用いる場合には、10μL〜100μL、20μL〜80μL、30μL〜70μL、40μL〜60μL又は45μL〜55μLの容量を用いれば、十分量の肝細胞がんマーカーを検出することができる。
被検試料から、マンノース含有糖鎖結合性NPAレクチン単独で又は好ましくは肝細胞がんマーカー検出用抗体と組合せて、後述のいずれかの方法により肝細胞がんマーカーが検出された場合には、その被験者は肝細胞がんに罹患しているか、その可能性が非常に高いと判定することができる。
【００６８】
（３−２）組織断片のレクチンアレイ解析法
被験者の肝組織由来の組織断片を被検試料とする場合に、例えば以下の手順でレクチンアレイ解析を行うことができる。
なお、本実施例では、基本的なプロトコルとして松田ら（非特許文献１０）の手法に従っており、以下の説明も主にその手法を説明するがこれには限られない。
＜被検試料の調製＞
組織断片を緩衝液中で破砕し、膜タンパク質の可溶化を行い、遠心による上清として組織抽出タンパク質を得、全ての組織抽出タンパク質を標識する。
また、別法として、肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を蛍光標識化した標識化抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を用いることができるが、その場合は組織抽出タンパク質の標識化工程は不要である。
【００６９】
＜標識化＞
標識物質の例としては、蛍光物質（例、FITC、ローダミン、Cy3、Cy5）、放射性物質（例、14C、3H）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ）、などが挙げられる。また、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用することもできる。検出剤をビオチン標識し、（ストレプト）アビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用して検出することもできる。なお、ここで例示した標識化方法は、本発明で用いるレクチン一般に対する標識化に用いることができ、さらに、NPAレクチン結合性糖タンパク質と結合する抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体など、本発明で用いる抗体の標識化においても用いることができる。
レクチンアレイ解析としては、ストレプトアビジンでコートした固相にビオチン化したNPAレクチンを結合させ、Cy3などで標識した組織抽出タンパク質との結合を観察することが好ましい。
標識物質として酵素を用いることもでき、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはo-フェニレンジアミン（OPD）、テトラメチルベンジジン（TMB）などが使用され、アルカリホスファターゼを使用する場合には、p-ニトロフェニルホスフェート（PNPP）などが使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。
その他、糖鎖の標識であれば2-アミノピリジンで蛍光標識する方法（PA化法）や、トリチウムラベルで放射線標識する方法等を用いることもできる。
【００７０】
＜レクチンアレイの調製＞
レクチンアレイとしては、NPAレクチンが含まれてさえいればどのようなレクチンアレイを用いても良い。例えば、本発明者らの開発した特異性の異なる45種の植物レクチンが同一基板上に固定化されているレクチンアレイ（Kuno et al., Nature Methods 2, 851-856, 2005）やLecChipTM Ver.1.0（グライコテクニカ社製）を用いることができるが、適宜公知の方法に従って調製することができる。
レクチンアレイには、NPAレクチン単独でも良いが、複数の他のレクチンを支持体上に固相化することが好ましい。その際の他のレクチンとしてはLCAレクチン、ConAレクチン、HPAレクチン、DSAレクチン、PHAＬレクチン、SNAレクチン、SSAレクチン、TJAIレクチン、PSLlaレクチン、UDAレクチン、MAHレクチン、GNAレクチン、PWNレクチン、UEAIレクチン、MALレクチン、Calsepaレクチン、ADLレクチン、ACGレクチン、PSAレクチン、AALレクチンなどが挙げられる。とりわけ、LCAレクチン、ConAレクチン、HPAレクチン、DSAレクチン、SNAレクチン、SSAレクチンを含むことが好ましく、LCAレクチン及びConAレクチンが特に好ましい。
NPAレクチンを直接支持体上に固相化してもよい（直接法）が、NPAレクチンをビオチン化NPAとし、該NPAレクチンをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することにより（間接法）、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。
レクチンアレイの支持体としては、エバネッセント波が透過可能な透明な物質であることが好ましく、ステンドグラス、ポリカーボネートなどの合成樹脂などが一般に用いられる。
【００７１】
＜レクチンアレイへの添加及び洗浄＞
Cy-3などで標識した組織抽出タンパク質を緩衝液で希釈しまたは希釈せずにレクチンアレイ反応槽に添加して相互作用させた後、非特異的結合をしている夾雑物をレクチンアレイ用緩衝液（市販されている）で洗浄する。
【００７２】
＜検出方法＞
糖鎖とレクチンとの結合は抗体との結合と比較して一般的に弱く、抗原抗体反応の結合定数が106〜109M-1程度であるのに対して、レクチンと糖鎖間の結合定数は104〜107M-1とされている。本発明で用いるNPAレクチンの場合も、肝細胞がんマーカーとの結合性が強いといっても、通常のレクチンと同程度であるから、シグナルの検出にはエバネッセント波励起型蛍光検出法を用いて行なうことが好ましい。エバネッセント波励起型蛍光検出法とは、スライドガラスの端面（側面）に全反射が起こるような条件で光を入射させると、ガラス（固相）と水（液相）などの屈折率の異なる二相間の場合、界面から数百nm程度の近接場にだけエバネッセント波と呼ばれるきわめて射程距離の短い光（近接場光と呼ばれる）が滲み出ることを利用する方法である。この方法により、蛍光物質の励起光を端面から入射して近接場に存在する蛍光物質のみを励起し、蛍光観察を行なう。エバネッセント波励起型蛍光検出法は、Kuno et al.,Nature Methods,2,851-856(2005)などに記載されている。この検出には、GlycoStationTMReader 1200（グライコテクニカ社）等を使用することができる。
また、別法である、標識化抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を作用させた場合も同様の検出方法が適用できる。
【００７３】
＜評価方法＞
レクチンアレイによる評価は、同一レクチンアレイ基板上に固定されている病変に応じてシグナルが変動しないレクチンを内部標準レクチンとして用い、NPAシグナルを相対値化してのちに、あるカットオフ値を超えるないし超えないという判断で行う。このようにあるレクチンの値を基準にして目的レクチンのシグナルを相対値化し判別に用いる方法は本発明人が既に論文発表している公知の事実であるのでそれを参照されたい（Kuno A et al Clin Chem 2011 Jan; 57(1):48-56）。カットオフ値の設定は、標本化された複数の肝細胞がん患者の肝組織標本を用いて事前に行うことができる。すなわち、あらかじめ複数の肝細胞がん患者から摘出された肝組織の肝細胞がん部及び非がん部を対象としたレクチンアレイ解析から得られた上述の相対値をもとに判別式を作成する。より好ましくは肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式を複数作成し、被検試料の肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度を判定し、被験者が肝細胞がんに罹患しているか否か、また、肝細胞がんのステージがどの程度であるかを判定する。
【００７４】
（３−３）レクチン−抗体サンドイッチELISA法
被験者の肝組織由来の組織断片を被検試料とする場合に、例えば以下の手順でサンドイッチELISA解析を行うことができる。
標識化を含め、被検試料の調製方法は、（２−１）のレクチンアレイ解析法と同様である。次いで、例えばストレプトアビジンでコートした支持体にビオチン化したNPAレクチンを結合させ、Cy3標識化した組織抽出タンパク質を添加し、相互作用させる。次いで、緩衝液で洗浄するか、または洗浄せずに未反応のNPAレクチンをブロッキングしてCy3標識を認識する抗体（抗Cy3／Cy5抗体）を反応させる。
被検組織抽出タンパク質試料を標識化せずに、肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパク質のタンパク質部分（又は糖鎖とタンパク質部分）を認識し、結合できる抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を標識化した標識化抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を用いたサンドイッチ法を適用することもできる。
また、レクチンアレイにおいて、NPAレクチン以外のLCAレクチン、ConAレクチン、HPAレクチン、DSAレクチンなど他のレクチンを併用することが好ましいのは、レクチンアレイ解析の場合と同様である。
さらに、レクチンアレイに代えて、抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を支持体上に固相化した抗体アレイを作製することができる。その場合、被検組織抽出タンパク質試料をオーバーレイした後に、標識化したNPAレクチンにより検出することができる。その際、被検組織抽出タンパク質試料をアビジン化し、ビオチン化したNPAレクチンで検出することも可能である。
【００７５】
これら、レクチン−抗体サンドイッチELISA法の結果は、自動免疫検出装置を用いた自動化にも適用可能である。唯一考慮しなければならない点は、サンドイッチに用いる抗体とレクチン間の反応である。抗体は、少なくとも2本のN結合型糖鎖を有する。したがって、使用するレクチンが抗体上の糖鎖を認識する場合は、サンドイッチ検出時にその結合反応に起因するバックグランドノイズを生じてしまう。このノイズシグナルの発生を抑制するのに抗体上の糖鎖部分に修飾を導入する方法や、糖鎖部分を含まないFabのみを用いる方法が考えられるが、これらは公知の手法を用いればよい。糖鎖部分への修飾方法としては、例えばChen SらNat Methods. 4, 437-44 (2007)やComunale MAらJ Proteome Res. 8, 595-602 (2009)等があり、Fabを用いる方法としては例えばMatsumoto HらClin Chem Lab Med 48, 505-512 (2010)等がある。
【００７６】
＜肝細胞がんマーカーの検出及び判別法＞
ELISA法は周知の手法であり、通常の手順に従って実施すればよく標識ごとに最適な測定装置が適用できる。
本法による肝細胞がんマーカーの定量的な検出は、NPAに結合するタンパク質を標準物質として用い、検量線を作成し、標準物質の相当量として換算することができる。たとえば実施例２（２−５）にある通り、NPA陽性CHO変異細胞である、Lec1細胞の培養上清や細胞ライセートを標準物質として用いることができる。NPA陽性細胞に1つのタンパク質の遺伝子を形質導入、発現させ、大量に調製すると、より安定な標準物質として利用することができる。また標準物質を用いずに評価する方法としては、上述のレクチンアレイ法に倣い、病変に応じてシグナルが変動しないレクチンを内部標準レクチンとして用い、NPAシグナルを相対値化してのちに、あるカットオフ値を超えるないし超えないという判断で行うことができる。なお、内部標準レクチンの選択、およびカットオフ値の設定は、標本化された複数の肝細胞がん患者の肝組織標本を用いて事前に行うことができる。すなわち、あらかじめ複数の肝細胞がん患者から摘出された肝組織の肝細胞がん部及び非がん部を対象としたレクチンアレイ解析から統計学的に事前に内部標準を設定することができる。またあらかじめ複数の肝細胞がん患者から摘出された肝組織の肝細胞がん部及び非がん部を対象としたELISA測定により得られた上述の相対値をもとに判別式を作成する。より好ましくは肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度に対応させた判別式を複数作成し、被検試料の肝細胞がんの進行もしくは悪性の程度を判定し、被験者が肝細胞がんに罹患しているか否か、また、肝細胞がんのステージがどの程度であるかを判定する。
【００７７】
（３−４）組織染色による検出法
そして、本発明の肝細胞がんマーカーとなるNPAレクチン結合性糖タンパク質は、組織染色などの結果からみて、肝細胞がんの細胞膜表面及びがん細胞周辺近傍領域（TME）の免疫細胞膜に限局している糖タンパク質であるため、組織染色法も好ましく用いられる。
すなわち、生検などで被験者から採取された肝組織の一部を切片化して、標識化したNPAレクチンによるNPA染色を行う。または、肝細胞がんマーカーを認識する抗体もしくは他のレクチンを併用することができ、これら抗体またはレクチンをオーバーレイするサンドイッチ法を用いることができる。
【００７８】
（３−５）被検血清試料における肝細胞がんマーカーの検出方法
本発明の肝細胞がんの検出方法を用いて、肝細胞がんの早期検出を行なうに際しては、肝細胞がんを検出するための被検試料として、被験者の血清など体液を被検試料とすることができる。特に血清の場合は、被験者の負担も少なく検査時間も短縮化も図れるため最も好ましい。本発明の検出方法により被検試料における肝細胞がんマーカーを検出し、肝臓に原発する肝細胞がんを早期に検出し、判別することができる。
被検試料が、血清など体液の場合であっても、組織試料の場合と同様に、レクチンアレイ解析法及びELISA解析法を適用することができる。特に、以下に記載するサンドイッチ法を適用することが好ましい。
サンドイッチ法においては、NPAレクチンと共にNPAレクチン結合性糖タンパク質のタンパク質部分に特異的に結合する物質を用いるのが好ましく、そのようなタンパク質部分に結合する物質としては、上記抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を用いることが好ましい。
【００７９】
具体的な方法としては、当該抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体を支持体上に固相化し、肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパクをサンドイッチした形態で準備し、被検試料をオーバーレイした後に、標識化したNPAレクチンにより検出することができる。
他の方法として、抗体を支持体上に固相化する代わりに、NPAレクチンを含む複数のレクチンを支持体上に固相化した反応場上で肝細胞がんマーカーであるNPAレクチン結合性糖タンパクを提示し、オーバーレイした被検試料に対して標識した該抗体を作用させることで検出することができる。
【００８０】
NPAレクチンを含む複数のレクチンを支持体上に固相化し、NPAレクチン結合性糖タンパクを提示し、標識した該抗体を用いて検出する方法においては、NPAレクチンを直接支持体上に固相化して行うことができるが（直接法）、該方法の改良法として、NPAレクチンをビオチン化NPAとし、該NPAレクチンをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することにより（間接法）、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。
【００８１】
本発明のNPAレクチン結合性糖タンパク質の測定にサンドイッチ法を使用する場合、その測定には、ELISA、イムノクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA法）、化学発光イムノアッセイ、エバネッセント波分析法などを利用することができる。これらの方法は当業者に公知であり、いずれの方法を選択してもよい。また、これらの方法は通常の手順に従って実施すればよく、実際の反応条件の設定等は、当業者が通常行い得る技術範囲内のものである。これらのうち、タンパク質結合物質及び糖鎖結合物質として、それぞれ抗体及びレクチンを用いたレクチン・抗体サンドイッチELISAを使用することが特に好ましい。レクチン−抗体サンドイッチELISAの具体的手順については、上記（３−３）で述べたと同様である。
また、レクチンと抗体の組み合わせによるサンドイッチELISA測定系の感度を上げるため、化学発光を用いた検出系（化学発光酵素免疫測定法、Chemiluminescent Enzyme Immunoassay；CLEIA法）の適用することもできる。
【００８２】
被検血清（体液）試料中のNPAレクチン結合性糖タンパク質は、捕捉剤として用いた支持体上のNPAレクチン又は抗NPAレクチン結合性糖タンパク質抗体と複合体を形成する。この複合体に検出剤の標識化NPAレクチン又は標識化抗体を適用して生じたシグナルを測定することにより、被検試料中のNPAレクチン結合性糖タンパク質を検出・定量する。シグナルの測定は、使用した標識物質に応じて適切な測定装置を用いて行なえばよい。
【００８３】
（３−６）多段階レクチン利用法
（３−５）で述べたように、本発明の肝細胞がんマーカーを利用して被験者の肝細胞がん罹患の有無などを調べるための被検試料としては、血清試料が最も好ましい。
しかし、血清中には、通常でも多種多様な糖タンパク質が大量に存在しており、がん細胞から分泌した血液中のNPA結合タンパク質は他の血中タンパク質に比べ圧倒的に少ないことが予想される。また元来血中にはNPAに結合するタンパク質が多く存在することが実験的に証明されている。
そこで、本発明では、さらに血清試料から肝細胞がんマーカーとなるNPA結合タンパク質を効率的に検出するための手法として、NPAへの結合性以外のレクチン反応性，すなわちα2,6シアル酸への非結合性を利用する多段階レクチン利用法（Tanら、Molecular BioSystems 2014）を検討した。
その結果、血清中多く存在するNPAに結合する糖タンパク質のほとんどが、同時にα2,6シアル酸も有している場合が多いことが判明した。つまり、あらかじめα2,6シアル酸結合性レクチン（SNA, SSA, TJAI又はPSLla）により血清中のα2,6シアル酸を有する大量の糖タンパク質を除くことで、NPA結合性タンパク質を効果的に濃縮でき、肝細胞がんマーカーの検出効率を高めることができる。
例えば、血清試料中のタンパク質を網羅的にCy3標識化し、予めストレプトアビジンコート磁気ビーズに結合させたα2,6シアル酸結合性レクチンのビオチン化物と反応させ、結合しなかった残渣溶液を取得してレクチンアレイにアプライすればよい。
【実施例】
【００８４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【００８５】
（実施例１）組織のレクチンアレイ解析
本研究に使用しているレクチンマイクロアレイは特異性の異なる45種の植物レクチンが同一基板上に固定化されており、分析対象となる糖タンパク質上の糖鎖との相互作用（結合性）を一斉に解析するシステムである（Kuno et al., Nature Methods 2, 851-856, 2005）。これを用い、肝細胞がん組織を対象とした定量的測定系で有意にシグナルが高値になる、ないし組織染色において特異的にがん部を染色できる最適なレクチンを絞り込むことを試みた。本実験には、ホルマリン固定パラフィン包埋肝細胞がん患者肝組織を用いた。それぞれがん部および非腫瘍性肝実質（非がん部）の一定領域をレーザーマイクロダイセクション（LMD）により組織断片として回収し、その後のタンパク質抽出、蛍光標識後にレクチンアレイ解析をおこなった。その基本的なプロトコルは松田ら（Biochem. Biophys. Res. Commun. 370, 259-263, 2008）に従った。詳細の方法は下記のとおりである。【００８６】
（１−１）組織切片からタンパク質の回収
組織切片からの組織断片の回収は、LMDシステム, 6000DM (ライカマイクロシステムズ) を用いた。LMD用ホルマリン固定組織標本は、LMD用スライドガラスであるフィルムコートガラス (PEN-membrane, ライカマイクロシステムズ) に5μmの厚さで薄切したものをマウントし作製した。なお、本実験では肝細胞がん患者の組織標本を用いているが、標本はすべての実施施設で倫理委員会の承認を得ている。実施施設の定法に従い、組織切片をヘマトキシリンにて核染色し可視化した。顕微鏡により確認した各サンプルのがん領域（およそ1×1mm相当、図１参照）を切り抜き、その組織フラグメントを0.6mLチューブに回収した。得られた組織断片はまず、ホルマリンによる分子内および分子間架橋を解離するため、10mM クエン酸緩衝液(pH6.0)を 200μL加え、遠心（20,000g、1min、4℃）して組織切片がバッファー中にある事を確認したのちに、95℃で60分間処理した。熱処理後、20,000 ×g、1分、4℃で遠心分離し、上清を除いたのちに、50%スラリーのAVICEL懸濁溶液（シグマ社製のAVICELをMilliQ水で懸濁し、所定濃度に調製したもの）を4μL加え、軽くタッピングした。遠心（20,000×g、1min、4℃）後、上清190uLを除去してから、残りの組織フラグメント含有ペレットにPBS(-)緩衝液190μLを加えた（バッファー交換工程）。更に、20,000×g、1分、4℃で遠心後、上清を除き、ペレットに1.0％ NP40-PBS緩衝液10μLを加えた（NP40の終濃度は0.5%になる）。ペレットを超音波破砕により細粒化した後に、氷上で60分反応し、膜タンパク質を可溶化した。反応後、20,000×g、1分、4℃で遠心し、上清を組織抽出タンパク質として回収した。【００８７】
（１−２）タンパク質の蛍光標識
回収したすべての組織抽出タンパク質溶液は、予め10μgずつPCRチューブに小分けしたCy3-SE（GEヘルスケア社製)に添加した。室温、暗所で1時間反応を行った後、余剰Cy3-SEの活性基を不活性化するためにグリシン含有緩衝液80μL添加し、室温、暗所で2時間反応した。得られた溶液を蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液とした。【００８８】
（１−３）レクチンアレイ解析
蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液はレクチンアレイ用緩衝液により2倍ないし4倍へ希釈され、それぞれ60μLをレクチンアレイの各反応槽へ添加した。レクチンアレイとしてはLecChipTM Ver.1.0(グライコテクニカ社製)をもちいた。1晩20℃にて相互作用反応させた後、各反応槽をレクチンアレイ用緩衝液で3回洗浄し、定法に従いスキャニングした。なお、以上の分析ではシグナルが得られない場合は、上述の蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液を希釈せずにレクチンアレイへ添加し分析した。得られたスキャンデータは定法に従いシグナルをNet Intensityとして数値化し、以後の統計解析のために久野ら（J Proteom Bioinform 1, 68-72 (2008)）の手法に従い規格化された。【００８９】
（１−４）統計解析
規格化されたすべてのデータは、がん部（中分化）と非がん部の2群比較検定に用いた。各データはレクチンごとに対応有の2群比較検定であるWilcoxonの符号付順位検定を用いて有意差検定し、がん部で有意なシグナル上昇を示すレクチンを選定するのに用いた。【００９０】
（１−５）HCV感染肝細胞がん患者の肝組織標本の比較解析結果
C型肝炎患者の肝細胞がん発症例から外科的に摘出された肝組織のブロックのうち、HE染色組織の組織学的所見から異なる複数の分化型のがんを含むタイプ（結節内結節型という）に限定し、中分化型肝細胞がんをかならず含む23例を実験に用いた。LMDでは中分化型肝細胞がんと分類された領域、それ以外の分化型（高分化ないし低分化型）のがん部、および非がん部を総面積が1mm2になるように切り出した（図１）。レクチンアレイ解析により69のデータが取得され、そのうち中分化型肝がん部位と非がん部それぞれ23のデータを用いて、2群比較検定を行った。その結果、図２に示すように8種のレクチンで統計学的有意差（P<0.05）を示した。特にNPA, DSAに関しては、非がん部と比較してがん部において顕著なシグナルの増加が認められた（P=0.0002）。非常に興味深いことにフコース認識レクチンとして分類される4つのレクチン（LCA, PSA, AOL, AAL）においては、すべてにおいてがん部で有意に低値を示した。【００９１】
（１−６）非HCV、非HBV感染肝細胞がん患者の肝組織標本の比較糖鎖解析結果
上述の結果が、肝の線維化進展や機能低下によってではなく、がん発生によるものであることを証明するため、HBVとHCVのいずれにも感染履歴がない肝細胞がん患者8例分の肝組織標本を用いて同様の実験を行った。症例数が少なく、各症例１か所ずつを分析に用いるだけでは統計学的有意差を示すのが困難であるため、各標本の複数のがん部及び非がん部領域（がん部19か所、非がん部20か所）から1mm2ずつ切り出し、以後の実験に用いた。したがって、統計解析には対応なしのノンパラメトリック検定であるMann-Whitney U-testを用いた。その結果、図３に示すとおりP<0.05の有意差を示すレクチンは14種で、うちNPAが顕著にがん部で高値を示し（P=0.0002）、ConAが低値を示した（P=0.0002）。【００９２】
（１−７）NPA結合性糖鎖エピトープ
以上のとおり、NPAのみが２つの実験で共通してがん部で有意に高い値を示した。このレクチンの糖結合特異性について議論する。図４にはレクチンの親和性を系統的に閲覧できるデータベースLfDB（http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch）を利用して、データベースに登録されている糖鎖のうちNPAに結合する上位10傑の糖鎖について表記した。なお、ConAの糖結合特異性解析はLfDBに掲載されていなかったため明確に記されている文献（Ohyama Y et al J Biol Chem 1985 Jun 10;260(11):6882-7）より引用した。
併せて文献的にNPAの特異性の一部であるコアフコース結合性を示すレクチンの代表であるLCAに結合する上位10傑の糖鎖についても表記した。今回の結果では、NPAとLCAのがん部及び非がん部間のシグナル差は正と負で全く異なるものであった。したがって、NPAががん部で高値だったのは、コアフコースとの結合によるものでないと示唆された。さらに非B、非C症例の実験結果からNPAはConAとも逆相関を示していたので、マンノースユニット数が５を超える高マンノース型糖鎖との結合によるものでないことも示唆された。【００９３】
（実施例２）サンドイッチELISA法による肝細胞がん培養細胞および肝がん患者組織のNPAレクチン反応性検討
予めレクチンアレイによりNPAへの反応性が確認されている肝細胞がん培養細胞株7種 (HuH-7, HepG2, KYN-1, KYN-2, HAK-1A, HAK-1B, HLF)および肝がん患者組織を用い、図５ｂに示すサンドイッチELISA系が構築できるかを検討した。なお、培養細胞からのタンパク質抽出、蛍光標識までの基本的なプロトコルは舘野らあるいは豊田らの方法（Methods Enzymol 478,181-195, 2010, Genes Cells 16, 1-11,2011）に従った。なお、組織標本からのサンプル調製は実施例１に従った。【００９４】
（２−１）培養細胞からのタンパク質抽出
肝がん培養細胞株をそれぞれ1.5mLチューブ１本当たり2×106個になるように調製した。ペレット形成後は、余剰な培地成分・血清成分をPBS(-)1mLで3回洗浄し、除去した。本実験では、組織切片からのタンパク質抽出法と合わせるため、ペレットに10mMクエン酸緩衝液（pH6.0）を200μL加え95℃で90分処理した。熱処理後、20,000×g、5分、4℃で遠心分離し、上清を除いた。残りの細胞ペレットにPBS(-)200μLを加えた（バッファー交換工程）。更に、20,000×g、5分、4℃で遠心後、上清を除き、ペレットに0.5％NP40-PBSを40μL加えた。ペレットを超音波破砕により細粒化した後に、氷上で60分反応し、膜タンパク質を可溶化した。反応後、20,000×g、5分、4℃で遠心し、上清を組織抽出タンパク質として回収した。【００９５】
（２−２）タンパク質の蛍光標識
調製した細胞抽出タンパク質溶液について、はじめに各培養細胞タンパク質抽出溶液を BCA法にてタンパク質濃度を測定した。BCA測定はMicroBCA kit(Thermo社製)を使用し、添付マニュアルに従い測定した。タンパク質量決定後、予め10μgずつＰＣＲチューブに小分けしたCy3-SE（GEヘルスケア社製）に各細胞株抽出タンパク質200ng添加した。室温、暗所で１時間化学反応を行った後、反応を完全に止めるためグリシン含有バッファー180μL添加し、室温、暗所で2時間反応した。得られた溶液を蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液とした。【００９６】
（２−３）NPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISA
マイクロタイタープレート(ストレプトアビジンコート 96穴プレート（NUNC イモビライザー）を予め洗浄液（0.1% Tween20 含有 PBS）で２回洗浄し、そこへPBS緩衝液に溶解したビオチン化NPL（Vector Laboratories社製、5μg/mL）を各ウェルに50μLずつ加え、4℃で一晩保温し、支持体へNPLを固相化した。未結合WFAを洗浄液で2回ずつ洗浄し、NPL固相化ウェルプレートを完成させた。次いで、Cy3 ラベル化したタンパク質溶液を洗浄液にて 50μLに調整し、NPL固定化ウェルへ添加した後、37℃で１時間結合反応した。反応後、各ウェルにブロッキング剤（0.5 mg/mLに調整したアシアロフェチュイン溶液）を4μL加え、37℃で15分間反応することで、未反応のNPLレクチンをブロッキングした。洗浄液で5回洗浄し、未結合タンパク質を除去したのちに、あらかじめ0.125μg/mLへ洗浄液で調整した検出剤（抗Cy3/Cy5抗体、シグマアルドリッチ社）を１ウェルあたり50μLずつ加え、37℃で30分間抗原抗体反応した。未結合抗体を除去するために洗浄液で5回洗浄後、洗浄液で10,000倍希釈した抗マウスIgG抗体-HRP溶液（Vector Laboratories社製）を、1ウェルあたり50μLずつ加え、37℃で20分間保温した。各ウェルを洗浄液で5回洗浄後、発色試薬である1-StepTM ULTRA TMB-ELISA Substrate Solution（Thermo社製）を各ウェルに100μLずつ加え、室温で30分間発色反応した。1MのH2SO4溶液を1ウェルあたり100μL加え反応を停止し、プレートリーダー（SpectraMax M5, Molecular Devices社）により450nmで吸光度測定した。なお、プレートの洗浄はプレートウォッシャー（ImmunoWashTM 1575マイクロプレートウォッシャー, Bio-Rad Laboratories社）にて洗浄液を各ウェルあたり300μL加えて実施している。【００９７】
（２−４）細胞を用いたサンドイッチELISA
肝細胞がん培養細胞株7種（HuH-7, HepG2, KYN-1, KYN-2, HAK-1A, HAK-1B, HLF）からそれぞれ調製した細胞ライセートのうち、タンパク質量として200ngをCy-3ラベルし、そのうち500pg相当を50マイクロリットルの希釈液で希釈しウェルへ添加した。なお、ELISAでは汎用性を高めるため、蛍光ではなく発色での検出を行った。その結果、図５ｂに示す数値がそれぞれの細胞株で得られた。レクチンアレイ解析におけるNPAシグナルと本実験の結果との間に相関があるかを調べるため、残存Cy３標識タンパク質溶液を用いレクチンアレイ解析した。その結果を図５ａに示す。NPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISAの測定値とレクチンアレイにおけるNPAシグナルの強度と比較すると、細胞間の相対的な強度差は傾向が類似していることがわかる。以上により、実施例１のように肝細胞がん患者の肝組織ライセートのがん部・非がん部をレクチンアレイによる比較解析で有意差が認められたNPAシグナルの傾向は、より簡易であるNPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISA測定により再現できることが示唆された。次にその実証実験として、実施例１のレクチンアレイ解析で用いた組織ライセートを使って本実験を行うことにした。【００９８】
（２−５）組織を用いたサンドイッチELISA
実施例１ですでにCy3標識している組織ライセート23症例分のうち、余剰液量がNPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISAの測定に十分耐えられるだけ存在する症例からランダムに9例を選択し、がん部及び非がん部由来ライセートのCy3ラベルサンプル（計１８サンプル）を用いNPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISAを行った。Cy3 ラベル化した組織ライセート10μLを洗浄液にて50μLに調整し、各ウェルに添加した。なお、NPA陽性細胞であるCHO細胞変異株（Lec1）の細胞抽出液を標準糖タンパク質溶液として用い、サンプルと同じタイミングで2倍希釈系列をNPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISAし、それにより検量線を作成した。各サンプルの測定値はこの検量線から標準タンパク質量としての換算値として求められ、比較解析された。その結果を図６に示す。NPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISAにおいてもがん部が有意に高値を示した（P=0.0091）。なお、P値は、Wilcoxonの符号付順位検定により求めた。【００９９】
（実施例３）組織染色によるNPA染色性の検討
（３−１）組織染色方法
実施例１から、NPAによる組織染色で、組織切片中肝細胞がんを検出できる可能性が見出された。レクチンアレイの結果として得られたシグナル強度の差を組織染色により検証するため、実施例１を行う際にあらかじめ肝細胞がん患者の肝組織から連続的に薄切していた標本を用いて、以下の通り検討した。NPA染色に用いた組織標本は、九州大学大学院 消化器・総合外科にて収集された背景肝疾患を含む肝がん病変のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックより作製した。5μmの厚さに連続薄切した組織切片を脱パラフィンした後、REAL Retrieval Solution pH6.0（Dako社）で110℃、10分間処理し、組織切片の賦活化を行った。次いで、Carbo-Free Blocking Solution（ベクター社）を用いて20℃で30分間ブロッキング処理し、PBS中で3回洗浄した後、10mM HEPESで5μg/mLに希釈したビオチン標識NPL（ベクター社）を組織切片に添加して、4℃にて一晩反応させた。反応後、PBS中で3回洗浄し、PBSで20μg/mLに希釈したAlexa 488標識ストレプトアビジン（ライフテクノロジー社）と20℃で60分間反応させた。反応後、PBS中で3回洗浄し、hoechst33342（ライフテクノロジー社）と20℃で20分間反応させ、核を染色した。NPAの特異的なシグナルは、蛍光顕微鏡（KEYENCE社）を用いて検出した。【０１００】
（３−２）染色結果
染色例の1つを低倍率（広視野）で観察した像を図７に示す。NPAレクチンを用いた蛍光染色像では、一見するとがん部及び非がん部が一様に染色されているように見える。この傾向はDAB染色による別の実験でも観察されており、さらにDAB染色においてはむしろ非がん部の方が相対的にがん部よりも強い染色性を示す結果に至っていた。
同様の蛍光染色標本を高倍率（狭視野）で観察した像を図８に示す。なお、観察した位置はレクチンアレイ解析の際、LMDで切り出された部位に相当する。がん部・非がん部ともに蛍光を発する部位が存在することには変わりないが、興味深いことにその染色パターンおよび強度ががん部と非がん部では大きく異なることが判明した。すなわち、非がん部では肝実質細胞が一様に弱い染色性を示し、かつ顆粒状の染色物が細胞中に内包されていた。それに対し、がん部ではむしろ細胞の膜に相当する部分と細胞の周辺に存在する間質に位置する部分に粒状の染色を示し、かつその染色強度は相対的に強かった。それに対し、LCAレクチンによる染色像は、NPA染色によるそれとは大きくパターンが異なり、非がん部のがん周辺領域が強い染色性を示した。これは、レクチンアレイの結果を再現するものであった。【０１０１】
（実施例４）肝細胞がん患者由来組織を用いた追試実験
先の実施例で行った実験の妥当性を示すために、実施例１〜３とは別の肝細胞がん患者由来組織を用いて追試実験を行った。九州大学大学院 消化器・総合外科から倫理委員会の承認済の肝細胞がん患者由来ホルマリン固定パラフィン包埋肝細胞がん組織標本の7症例分を簿切し、レーザーマイクロダイセクション（LMD）用スライドグラスに貼り付けた。がん部および非がん部それぞれ1ミリ四方の領域について49箇所ずつ切り出し(合計98サンプル分)、実施例１（１−１）と同様の方法で組織ライセートを作製し、実施例１（１−３）のレクチンアレイ解析及び実施例２（２−５）のNPAレクチン−抗Cy3抗体サンドイッチELISA解析とそれぞれ同様の手法を適用した（図９）。
その結果、レクチンアレイ解析、サンドイッチELISA解析のいずれにおいても、非がん部と比べがん部で有意に高値を示した（p＜0.01）。【０１０２】
(実施例５)肝細胞がん由来NPA結合タンパク質に特徴的な他のレクチン反応性の検討
がん細胞から分泌した血液中には大量の各種血中タンパク質が含まれているため、肝細胞がん患者由来血清であってもNPA結合タンパク質の存在量は他の血中タンパク質に比べ圧倒的に少ないことが予想される。また元来血中にはもともとNPAに結合するタンパク質が存在していることが実験的に証明されている。これらは、血清試料を本発明の肝細胞がんマーカーの検出用試料とする場合の大きなノイズの原因となることが予想されるため、肝細胞がんとの関連性のないNPA結合性タンパク質をできるだけ取り除いておく必要がある。
そこで、本実施例では、肝細胞がん患者由来血清中に分泌された血中タンパク質の特徴を、NPAレクチンへの結合性以外のレクチンとの反応性で説明できないかを検討するために、Tanら（Molecular BioSystems 2014）の手法を参考に考案した、レクチンアレイを応用した多段階レクチン利用法を実施した。
具体的には、実施例２で用いた7種の肝がん培養細胞株の培養上清から調製したCy3標識分泌タンパク質、及び実施例２（２−５）で取得したCy3標識組織タンパク質溶液のそれぞれを、予めストレプトアビジンコート磁気ビーズ（ベリタス社製）に結合させたNPA（選択されたレクチン）のビオチン化物（Vector社製）と反応させた。NPA結合性組織タンパク質は磁石により回収され、残渣溶液をレクチンアレイにアプライした。対照としてレクチンを含まない磁気ビーズを用いても同様の実験を行った。スキャン後、数値解析によりNPA結合タンパク質の特徴を抽出した。
実施例２で用いた7種の培養細胞株はAFP（αフェトプロテイン）の生産性の違いからAFP生産株とAFP非生産株に大別できる。それぞれのレクチンアレイ解析から、AFP産生株と非産生株とではシアル酸への反応性に顕著な違いがあり、AFP生産株では相対的にα2,6シアル酸認識レクチンへの反応性が高いことが判明した（図１０）。一方、実施例２の実験結果と同様に、NPAはすべての細胞株で強い反応性を示した。
次に、多段階レクチン利用法により、NPA結合性糖タンパク質群をビーズに吸着し、非吸着画分である上清（Through画分）をレクチンアレイにアプライし、データ取得後に、元データ（Input）との差分からNPA結合糖タンパク質群のレクチンアレイプロファイル（Input - Through）を取得した。上述の通り、AFP生産株では相対的にα2,6シアル酸認識レクチン群のシグナルの割合が高かったが、NPA結合糖タンパク質群におけるα2,6シアル酸認識レクチン群のシグナルの割合を調べたところ（図１１の中のInput - Through）、割合が大幅に低下し、AFP非生産株と同程度になった。すわなち、すべての肝細胞がん由来細胞に共通した特徴としては、α2,6シアル酸認識レクチンへの結合性を示さないNPA結合糖タンパク質が存在することが明らかになった。この傾向はCy3標識組織タンパク質溶液を用いた実験でも一致した。
このα2,6シアル酸認識レクチンへの非結合性という特徴は、血中に存在する肝細胞がん由来NPA結合糖タンパク質のエンリッチに有効であることを示している。すなわち、上述の通り元来血液中にはNPAに結合する糖タンパク質が多く存在し、健常人とがん患者には有意差がほとんどない。またその大部分がα2,6シアル酸認識レクチンに結合性を示すことが実験的にわかっている。一方で今回の実験結果より、肝細胞がん由来細胞は共通してα2,6シアル酸に認識されないNPA結合糖タンパク質を分泌している。としたならば、まず被検血清をα2,6シアル酸認識レクチンカラムにアプライし、α2,6シアル酸認識レクチン結合タンパク質を吸着除去して、非吸着画分を対象にNPA結合糖タンパク質を解析することで、肝細胞がん由来のNPA結合タンパク質を容易にとらえることができると推測される。【０１０３】
（実施例６）  多段階レクチン利用法による非B、非C原発性肝がん患者血清中NPA結合タンパク質のエンリッチ
実施例５に記した通り、健常者血清中にはNPAに結合する糖タンパク質が多く存在する。しかしながらそのほとんどはα2,6シアル酸認識レクチンにも結合することが判っている。そこで多段階レクチン利用法に則り、血清中からα2,6シアル酸含有糖タンパク質を吸着排除した後に、NPAにより回収したタンパク質群において、健常者とがん患者間で有意な質的差が生じるかを検討することにした。肝がんの多くはウイルス感染者であるが、その場合、背景肝に線維化が生じており、その影響による糖鎖変化を有してしまうため、健常者との比較において差が生じたとしてもがんに由来するものか、背景肝の違い（線維化の進展度の違い）によるものなのかが判断がつかなくなる恐れがあるため、HBV及びHCVの病歴のない（非B、非C）原発性肝がん患者血清を用いて実験することにした。
α2,6シアル酸認識レクチンとしてSSAレクチン（J-オイルミルズ社製）を用い、SSA 固定化ビーズを作製しSSA結合反応を行った。まず1.5mlマイクロチューブに洗浄済みSAビーズ10ulを分注し、そこへ10ulずつレクチン溶液（α2,6シアル酸認識レクチンであるSSAのビオチン化物1ug含有）を加えたのちに、4℃で30分間混和反応した。磁石へビーズを吸着後、上清を除き（この上清をThrough 1とする）、残存ビーズを1%Triton X-100含有PBS (PBSTx)により3回洗浄した。そこへCy3標識済み血清タンパク質溶液10 μl（血清として0.001μl相当）を加え、4℃で一晩、混和反応した。磁石へビーズを吸着後、上清をSSA非吸着画分として新しいチューブに回収し（これをThrough 2とする）、以後のNPA結合反応に用いた。なお、残存ビーズはPBSTxにより3回洗浄したのちに、 0.2% SDS含有PBSを10ul加え、混和したのちに、 95℃で5分間加熱処理し、冷却後、磁石へビーズを吸着し、上清をSSA吸着画分として回収した（この上清をElution 1とした）。
NPA結合反応を行うために、まず 1.5mlマイクロチューブに10μlずつ洗浄済みのSAビーズを分注し、そこへ10μlずつレクチン溶液（ビオチン化NPA 1ug含有）を加え、4℃で30分間混和反応した。磁石へビーズを吸着し、上清を除き（この上清をThrough 3とする）、残存ビーズをPBSTxにより3回洗浄した。そこへSSA非吸着画分（Through 2）を加え、4℃で一晩混和反応した。反応後、上清をSSA-NPA非吸着画分として新しいチューブに回収した（これをThrough 4とする）。残存ビーズをPBSTxにより3回洗浄したのちに、 0.2% SDS含有PBSを10μl加え、混和したのちに、 95℃で5分間加熱処理した。冷却後、磁石へビーズを吸着し、上清を回収した（この上清をElution 2とした）。そこへ洗浄済みのSAビーズ10μlを加え、4℃で30分間混和反応した。反応後、上清をSSA-NPA非吸着画分として新しいチューブに回収した（これをElution 3とする）。
以上の実験を健常者血清と非B、非C原発性肝がん患者血清を用いて行い、それぞれの画分をレクチンアレイ解析した。分画前血清とSSA非吸着-NPA吸着画分のスキャンデータを図１２に示す。
その結果、分画前の血清ではがん患者と健常者の血清間でプロファイルに大きな差はなく、NPAのシグナルも有意差がなかった。これはがん由来の糖タンパク質が血中に微量にしか存在しないことを裏付けている。一方で、SSA非吸着-NPA吸着画分においては、NPAを含む複数のレクチンにおいてがん患者血清でのシグナルが有意に高くなっていることが判明した。これはこの画分に原発がんに由来する分泌糖タンパク質が存在することを意味している。【０１０４】
（実施例７）グライコプロテオミクス（IGOT-LC/MS法）による肝細胞がんマーカー候補糖タンパク質の同定
この実施例では、本発明者らが以前に開発したLec-IGOT-LC/MS法（特許第4220257号など）による糖鎖ペプチド同定方法を、肝細胞がん培養株培養上清及び肝細胞がん患者病理組織由来の糖タンパク質試料に対して適用し、肝細胞がんマーカー候補となる糖タンパク質を同定する。
（７−１）ヒト肝細胞がん培養株由来試料からのIGOT法による標識ペプチドの調製
実施例２で用いた肝細胞がん培養株のうち、HLF株、HAK1A株の2種類を、それぞれ10%FBS含有培地を用いて培養後、培養液吸引して廃棄し、あらたに無血清培地を加え、で4回洗浄後、当該無血清培地を添加して、48時間培養した。培養上清を集め、3100rpm×30分遠心の後、上清を回収した。残細胞ペレットも解析に用いるため、保存した。上清は分子量3Kカットの限外ろ過膜を用いて30倍に濃縮し、0.45μmフィルターろ過後、アセトン沈殿法により、タンパク質を沈殿させた。沈殿物の回収後、短時間減圧し、アセトンを除去して、培地タンパク質濃縮物（沈殿）を得た。【０１０５】
得られた培地タンパク質濃縮物（沈殿）、および細胞を定法によりグアニジン溶液で可溶化し、高速遠心分離により、上清（抽出液）を回収した。窒素ガスにより溶存酸素を除いた後、タンパク質重量と等量のジチオスレイトール（DTT）を粉末又は少量の可溶化緩衝液に溶かして加えた。
窒素ガス存在下で、ジスルフィド結合を還元させるため室温で1〜2時間反応させた。次いで、S-アルキル化のため、タンパク質重量の2.5倍のヨード酢酸アミドを加え、遮光下、室温で1〜2時間反応させた。反応後、50〜100倍量の緩衝液で透析し、変性剤（グアニジン塩酸）や過剰の試薬を除いた。タンパク質定量後、タンパク質量の1/100〜1/50重量のトリプシンと1/100〜1/200重量のリジルエンドペプチダーゼを加え、37℃、終夜（約16時間）消化した。終濃度5mM のフッ化フェニルメタンスルフォニル（PMSF）を加え、反応を停止した。この消化物をAmide80カラムを用いた親水性相互作用クロマトグラフィーに供し、糖ペプチド画分を捕集した。
緩衝液（50mMトリス塩酸緩衝液、pH7.5）で希釈後、同緩衝液で平衡化したNPA-アガロースカラムに添加し、洗浄後、0.2Mメチルマンノシドを含む同緩衝液で溶出した。糖ペプチド画分は、ODSカラムに供し、溶出糖と塩を除去した。70%アセトニトリル（0.1% TFA）で溶出した画分を試料糖ペプチドとした（NPA(+)）。これを乾燥後、安定同位体酸素-18で標識した水（H218O）、とペプチド-N-グリカナーゼFを加え、糖鎖を切除、糖鎖付加部位を標識して、培養株由来の標識ペプチド試料を調製した。【０１０６】
（７−２）ヒト肝細胞がん患者由来組織試料からの標識ペプチドの調製
実施例４で用いた肝細胞がん患者由来のホルマリン固定パラフィン包埋肝細胞がん組織の1つを厚さ5μmに簿切し、レーザーマイクロダイセクション（LMD）用スライドグラスに貼り付け、顕微鏡下で、がん部、非がん部を約1.8mm2ずつ複数箇所LMDで切り出した。
がん部3枚分をPTS緩衝液（0.1Mトリス塩酸緩衝液、pH9.0、12mMデオキシコール酸と12mM N-ラウロイルサルコシンナトリウムを含む）中で膨潤させ、超音波処理後、100℃、1時間加熱した。これを窒素雰囲気下、ジチオスレイトール（DTT）で還元後、ヨード酢酸アミドでアルキル化した。50mM重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.6、で希釈後、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼで37℃、終夜（18時間）消化した。これに1m MPMSFを加え、反応を停止させた。これに等容の酢酸エチルを加え、界面活性剤を有機相に抽出、除去し、下層のペプチドを回収した。これをAmide80カラム（TOSOH）を用いた親水性相互作用クロマトグラフィーに供し、糖ペプチドを捕集した。これを緩衝液（50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.5）で希釈し、これにNPA-固定化アガロースゲルを加え、室温で30分反応させた。遠心で上清を回収後、ビーズを同緩衝液で洗浄し、未反応物を除去した。ビーズを乾燥後、安定同位体酸素-18で標識した水（H218O）、とペプチド-N-グリカナーゼFを加え、糖鎖を切除、糖鎖付加部位を標識し、患者組織由来の標識ペプチド試料を調製した。
（７−３）標識ペプチドのLC/MSショットガン分析
（７−１）及び（７−２）で得られた培養株由来及び患者組織由来の標識ペプチド試料を0.1%ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析を行った。インジェクトした候補糖ペプチドは脱塩用トラップカラム（逆相C18シリカゲル系の担体）上に一旦捕集し、洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップの形状をしたフリットレス微小カラム（内径150μm×50-100mm）を用い、アセトニトリルの濃度グラジェント法により分離した。溶出液は、エレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化し、直接質量分析器に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大10のイオンを選択しながら、衝突誘起解離（CID）によるタンデム質量分析を行った。【０１０７】
（７−４）MS/MS-イオンサーチ法による候補糖ペプチドの検索及び同定
得られた数千のMS/MSスペクトルデータファイルをProteome Discoverer （Thermo Scientific社のソフトウェア）でMascot-generic file （mgf）に変換した。このデータを元にタンパク質アミノ酸配列データベースを用いてMS/MSイオンサーチ法を用いて、候補糖ペプチドを同定した。
同定されたペプチドにN結合型糖鎖付加のコンセンサス配列があり、その数以下のAsn修飾（Aspへの変換、及び18Oの取り込み）があることなどを指標に同定確認処理を行い、肝細胞がん鑑別マーカー糖ペプチド候補を得た。【０１０８】
（７−５）
これらの肝細胞がん鑑別マーカー糖ペプチド候補の「ペプチド配列」に基づいてアミノ酸配列データベースNCBI-Refseqより、全長の糖タンパク質のアミノ酸配列に対応させた。これら糖タンパク質のうち、以前より肝細胞がん細胞で発現量が高いことを確認していた8種類の糖タンパク質（EGFR、FN1、FBN1、HYOU1、CFH、PSAP、CTSD及びLAMP-2）について、さらに肝細胞がんマーカー候補となるか否かを検討することとした。【０１０９】
（実施例８）肝細胞がんマーカー候補となる糖タンパク質の検証（培養細胞株の細胞抽出物中のNPA結合画分でのウェスタンブロット解析）
本実施例は、（実施例７）で選定した肝細胞がんマーカー候補糖タンパク質分子群について有意性をさらに検証するものであり、肝細胞がん細胞株の細胞抽出物を用い、肝細胞がん細胞株で、NPA結合性糖タンパク質として発現していることを確認するものである。
（８−１）レクチンアフィニティーによる被検試料の分画
実施例２で用いた肝細胞がん細胞株のうちHuh7,HAK 1A及びHLF細胞株から実施例２に記載の方法に従って細胞抽出物を得、ビオチン化 NPA（Vector 社製）1μgを1%TritonX-100 含有 PBS（PBSTx）に懸濁されたストレプトアビジン固定磁気ビーズ （Invitrogen 社製） 10μLに加え, 4℃で30 分間混和反応し、磁気ビーズへビオチン化 NPAを固相化した。磁石へビーズを吸着後、上清を除き、ビーズを PBSTx 200μL で3 回洗浄した。洗浄後、タンパク質総量として10 μgの各サンプルをPBSTxで100 μLに調整し、そこへ上述のビーズに加え、4℃で一晩混和反応した。磁石へビーズを吸着後、上清を除き、ビーズに 0.2%SDS含有PBS を 10 μL 加え、95℃で10 分間熱処理することにより吸着物を溶出した。1 min 氷冷後、上清 10μL を新たなチューブに移し、ストレプトアビジンビーズ 20μL 相当を加え、PBSTx にて 20 μL になるよう調整し、4℃で１時間の混和反応により、余剰なビオチン化 NPA を除去した。反応後上清 (20 μL) を回収し、NPA 結合タンパク質溶出画分とした。【０１１０】
（８−２）肝細胞がん由来細胞株ウェスタンブロット法による肝細胞がんマーカー分子の検出
得られたNPA 結合タンパク質溶出画分）をSDS-PAGE還元条件下で10％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、PVDF膜に転写した。5％スキムミルク含有PBSでブロッキング後、抗HYOU1抗体（R&D社製）、抗EGFR抗体（Cell Sibnaling社製）、抗PSAP抗体（Proteintech group社製）、抗CTSD抗体（Life Span社製）及び抗LAMP-2抗体（Santa Cruz抗体）を使用して、HYOU1、EGFR、PSAP、CTSD及びLAMP-2糖タンパク質分子のウェスタンブロット法による検出を行った。ウェスタンブロット法は一般的な方法に従って、上記各一次抗体と室温にて1時間反応させた。PVDF膜の洗浄後、anti-Goat IgG-HRP,（Jackson ImmunoResearch社製）など市販の二次抗体（0.5μg/mL）と室温で1時間反応させた。これらのPVDF膜を洗浄後ウェスタンブロッティング検出試薬（Perkin Elmer社）により化学発光にて検出した。【０１１１】
（結果）
結果を図１３に示す。それぞれのマーカー分子が、いずれの肝細胞がん由来細胞株のNPA結合画分から検出された。これらにより本発明のHYOU1、EGFR、PSAP、CTSD、及びLAMP-2糖タンパク質のいずれも、肝細胞がんで発現していることが検証され、かつNPA結合性糖鎖を有する分子であることが示された。【０１１２】
（実施例９）肝細胞がんマーカー候補となる糖タンパク質の検証（培養細胞株の培養上清のNPA結合画分でのウェスタンブロット解析）
本実施例は、（実施例７）で選定した肝細胞がんマーカー候補糖タンパク質分子群のうち、CFH、FN、PSAP、CTSD及びLAMP-2糖タンパク質について有意性をさらに検証するものであり、肝細胞がん細胞株の培養上清を用い、肝細胞がん細胞株で、NPA結合性糖タンパク質として発現していることを確認するものである。
実施例２で用いた肝細胞がん細胞株のうちHuh7,HAK 1A、HAK及びHLF細胞株の無血清培養上清に対して、（８−１）と同様の方法によりNPAレクチン分画した。抗CFH抗体（Santa Cruz社製）、抗FN抗体（Santa Cruz社製）、抗PSAP抗体（Proteintech group社製）抗CTSD抗体（Life Span社製）及び抗LAMP-2抗体（Santa Cruz抗体）を使用して、CFH、FN、PSAP、CTSD及びLAMP-2糖タンパク質分子のウェスタンブロット法による検出を行った。
このNPA結合画分（NPAレクチン溶出画分）をSDS-PAGE還元条件下で10％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、PVDF膜に転写した。5％スキムミルク含有PBSでブロッキング後、前述の一次抗体（CFH抗体ならびにFN抗体）と室温にて1時間反応させた。PVDF膜の洗浄後、二次抗体（0.5μg/mL）と室温で1時間反応させた。これらのPVDF膜を洗浄後ウェスタンブロッティング検出試薬（Perkin Elmer社）により化学発光にて検出した。【０１１３】
（結果）
結果を図１４に示す。それぞれのマーカー分子が、いずれも肝細胞がん細胞の培養上清のNPA結合画分から検出された。これらにより本発明のCFH、FN、PSAP、CTSD及びLAMP-2糖タンパク質のいずれも、NPA結合性糖鎖を有する分泌糖タンパク質であることが示された。【０１１４】
（実施例１０）肝細胞がんマーカー候補となる糖タンパク質の検証（培養細胞株の培養上清中のNPAレクチン-抗体サンドイッチELISA測定系によるマーカー分子の検出）
本実施例は、（実施例７）で選定した肝細胞がんマーカー候補糖タンパク質分子群のうち、FBN1 、FN及びLAMP-2糖タンパク質分子について有意性をさらに検証するものであり、肝細胞がん細胞株の細胞抽出物を用い、肝細胞がん細胞株で、NPA結合性糖タンパク質として発現していることを確認するものである。
（１０−１）NPAレクチン-抗体サンドイッチELISA測定系によるマーカー分子の検出−１
（方法）
実施例２で用いた肝細胞がん細胞株のうち、HuH-7, HAK 1B及びKYN-1細胞株の無血清培養の培養上清に対して、（８−１）と同様の方法によりNPAレクチン分画した。抗FBN1抗体（Abnova社製）及び抗FN抗体（Santa Cruz社製）を使用して、FBN1 及びFN糖タンパク質分子のNPAレクチン-抗体サンドイッチELISA測定系による検出を行った。抗FBN1抗体及び抗FN抗体をそれぞれELISAプレート固相(化)側に用いサンドイッチELISA測定系の検討を行った。
まず、抗FBN1抗体及びFN抗体をPBSで4μg/mLとなるように希釈し、ELISA用マイクロプレート（Thermo Scientific社製Nunc 436013、イモビライザー［アミノ］プレート）に100μL/ウェルずつ添加した。4℃で一晩各抗体をプレートに吸着させた後、溶液を廃棄して、ウェルをPBS-T (PBS, 0.05% Tween-20)洗浄した。次に、TBS (50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0, 0.1% NaN3)をブロッキング液として300μL/ウェルで加えて、ブロッキングをした。前記ブロッキング液を廃棄し、洗浄した後、サンプル（肝臓がん細胞株、HuH-7, HAK 1B, KYN-1の無血清培養の培養上清）の溶液100μLを各ウェルに添加した。室温で2時間反応させた後、ウェル中の溶液を廃棄し、PBS-Tにて洗浄した後、ビオチン標識化したNPAレクチンをそれぞれ2μg/mLに調製して、室温で1.5時間反応させた．その後、溶液を廃棄して洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ストレプトアビジン（Jackson社）溶液を1ウェルに100μL加えて1時間室温にて反応させた。反応液を廃棄、洗浄した後、1StepUltra TMB基質液（Thermo Scientific社）による発色を450nmの吸光度で測定した。【０１１５】
上記実施例で検討したFBN1及び FN糖タンパクは、NPA-抗体サンドイッチELISA系による反応性が濃度依存的に確認された。（なお、バッファーのみの陰性コントロールでは反応性が見られないことは確認されている）。結果を図１５に示す。これらにより本発明のFBN1及び FN糖タンパク質のいずれも、NPA結合糖鎖を有する分泌糖タンパク質であり、肝細胞がん細胞より分泌されていることが示された。【０１１６】
（１０−２）NPAレクチン-抗体サンドイッチELISA測定系によるマーカー分子の検出−２
（１０−１）と同様に、肝細胞がん細胞株HAK-1A株の無血清培養の培養上清からのNPAレクチン分画を用い、抗CTSD抗体（Life Span社製）、抗PSAP抗体（Proteintech group社製）及び抗LAMP-2抗体（Santa Cruz抗体）をELISAプレートに固定化し、NPAレクチンとのサンドイッチELISA解析を行った。
その結果、肝がん細胞のうちHAK-1A株の場合は、CTSD及びPSAP糖タンパク質の分泌は検出限界以下であったが、少なくともLAMP-2糖タンパク質は、NPA結合糖鎖を有する分泌糖タンパク質として、有意に分泌されていることが確認できた（図１５）。【０１１７】
（実施例１１）エクソソーム画分中の肝臓がんマーカー分子の検出
本実施例は、本発明のNPA結合性糖タンパク質で特に本来膜画分やリソソームに存在する糖タンパク質が肝細胞がん細胞近傍のTMEで特異的に存在が確認されている理由の１つの可能性として、肝細胞がん細胞がエクソソーム（exosome）内の糖タンパク質として分泌している可能性を検証するものである。エクソソームは、近年、がん細胞が分泌する顆粒で、がんの転移において重要な役割を担っていることを明らかにする報告が相次いでいる（Nat Med.2012 Jun;18(6):883-91.doi:10.1038/nm.2753など）。【０１１８】
（方法）
肝細胞がん細胞株 HAK 1Aの無血清培養上清からエクソソームマーカーであるCD9及びCD81の抗体である抗CD9抗体（コスモバイオ社製）及びCD81抗体（コスモバイオ社製）を用い、免疫沈降法にてエクソソームを濃縮した。
具体的には、ビオチン化抗CD9抗体及びCD81抗体それぞれ500 ngを（実施例８）で用いたストレプトアビジンコートマグネティックビーズ 10μLと 4℃、1時間反応させることによってビオチン化抗体固相化ビーズを作成した。ビーズを0.1%Tween20含有PBS (PBSt)200 μLで3回洗浄後、HAK 1A培養上清 20μgをPBStにて20μLに希釈しビーズに加え、4℃、over night にて抗原-抗体反応を実施した。上清を除き、ビーズを PBSt 200μLにて3回洗浄後、ビーズに0.2%SDS-PBSを 10μL加え、95℃、10分熱処理することで結合糖タンパク質の溶出を実施した。1分氷冷後、上清に2倍濃縮したストレプトアビジンビーズを 10μL加え、4℃、1時間反応させることにより、余剰に溶出されたビオチン化抗体の除去を実施し、得られた上清を CD9、CD81結合画分とした。当画分について、抗 CTSD 抗体（Life Span社製）を用いて、当該分子のウエスタンブロッティングを実施した。10%-20%SDS-ポリアクリルアミドゲルをにて電気泳動し、PVDF 膜に転写した。Blocking solution (Block ase, DSファーマバイオメディカル社製) にて4℃, オーバーナイトにてblocking を実施した。膜を0.1%Tween20 含有TBS (TBS-t) にて洗浄し、1次抗体反応として、Goat anti-Cathepsin D モノクローナル抗体 (R&D 社) を抗体希釈液 (Can Get signal, TOYOBO 社製) にて 1 μg/mL になるように調整し、2時間、室温にて膜をインキュベートした。反応後、膜をTBS-t で5分、3回洗浄し、2次抗体反応として、Anti-Goat IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch 社製) 10,000 倍希釈になるよう TBS-t にて調整し、1h, 室温にてインキュベートした。反応後膜を TBS-t にて、15 min, 5 min, 洗浄し, TBS で 5 min 洗浄した後、HRP 反応基質として Immunostar LD (Wako 社製) を添加し、C-DiGiT ブロットスキャナー (M&S テクノシステムズ社製) にて検出を実施した。【０１１９】
（結果）
結果を図１６に示す。当該マーカー分子が、肝細胞がん細胞 HAK 1AのCD81結合画分から検出された。これらにより本発明のCathepsin D (CTSD)糖タンパク質は、細胞質内のリソソームAspプロテアーゼの一種であるが、肝細胞がんのうち少なくともHAK1A細胞の場合にはCD81陽性エクソソームに内包ないし、表面に提示された糖タンパク質として存在することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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