(57)【要約】  Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤は、新たな抗炎症剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２】
前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２遺伝子又はＨｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【化１】
2016121862.tif 000029
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化２】
2016121862.tif 000030
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項５】
前記Ｇ０Ｓ２阻害剤がＨｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、請求項４に記載の抗炎症剤。
【請求項６】
鎮痛作用を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、
前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【化３】
2016121862.tif 000031
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
【化４】
2016121862.tif 000032
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１〜５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤及びその使用に関する。より具体的には、抗炎症剤、抗炎症剤のスクリーニング方法及び新規化合物に関する。本願は、２０１５年１月２８日に日本に出願された特願２０１５−１４８２９号、及び２０１５年９月８日に日本に出願された特願２０１５−１７６７４５号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は様々な疾患に認められる症状の一つである。現在、炎症を抑制する医薬品は数多く存在するが、炎症関連疾患には、未だアンメットメディカルニーズの高い疾患が存在する。炎症関連疾患としては、例えば、癌が挙げられる。癌は炎症を伴う難治性疾患の一つである。癌は日本における死因第１位の疾患であり、世界中でも癌による死者数は年々増加し問題視されている。【０００３】
癌は多くの臓器で認められるが、中でも肝臓癌（肝細胞癌）は死亡率や再発率の高い癌種である。肝臓癌の原因はウイルス感染によるものが９０％近くを占め、ウイルス感染後から始まる肝炎、肝硬変という長期間の慢性肝炎の病態を経て発癌する（例えば、非特許文献１を参照。）。その病態の中で、慢性炎症は、細胞の遺伝子変異による癌細胞の発現を促進することが知られている。しかしながら肝臓癌発症の原因は、ウイルス自体によるものか慢性的な炎症によるものか、未だ明らかとされていない状況にある（例えば、非特許文献２、３を参照。）。また、肝臓癌に対する化学療法は、抗癌剤に抵抗性を示しやすい等の理由から、肝臓癌に対する標準的な療法が確立されていないのが現状である。そのため、慢性肝炎及び肝臓癌の画期的な診断薬や新たな治療・予防戦略の構築が求められている。【０００４】
ところで、地球上の多くの生物には、体内時計と呼ばれる生体恒常性維持に重要な機能システムが備わっている。これら体内時計は、時計遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群による転写・翻訳のフィードバックループ機構によって構成されている。様々な生体機能、睡眠覚醒、体温、ホルモン分泌、代謝等に約２４時間周期の変動（日周リズム）が認められるが、これらは体内時計機構により調節されていることが知られている。【０００５】
近年、体内時計機構の変容が、様々な疾患、例えば生活習慣病として糖尿病、高血圧、痛風等の発症に関わることが明らかにされている（例えば、非特許文献４、５を参照）。また、癌に関しても、発癌や癌細胞の性質、抗癌剤に体する感受性が、体内時計機構により影響を受けることが指摘されている（例えば、非特許文献６を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bosch FX, et al., Primary liver cancer: worldwide incidence and trends., Gastroenterology, 127, S5-S16, 2004.
【非特許文献２】Portolani N, et al., Early and late recurrence after liver resection for hepatocellular carcinoma: prognostic and therapeutic implications., Ann. Surg., 243, 229-235, 2006.
【非特許文献３】Freeman AJ, et al., Estimating progression to cirrhosis in chronic hepatitis C virus infection., Hepatology, 134, 809-816, 2001.
【非特許文献４】Filipski E, et al., Effects of light and food schedules on liver and tumor molecular clocks in mice., J. Nat. Cancer Inst., 97, 507-517, 2005.
【非特許文献５】Ohdo S, et al., Molecular basis of chronopharmaceutics., J. Pharm. Sci., 100, 3560-3576, 2011.
【非特許文献６】Innominato PF, et al., Chronotherapy and the molecular clock: Clinical implications in oncology., Adv. Drug Deliv. Rev., 62, 979-1001, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、炎症と体内時計機構との関連性には未解明な点が多い。そこで、本発明は、炎症に体内時計機構が関与しているか否かを明らかにし、新たな抗炎症剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤。
［２］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２遺伝子又はＨｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸である、［１］に記載の抗炎症剤。
［３］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、［１］に記載の抗炎症剤。
［４］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤が、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物である、［１］に記載の抗炎症剤。
【化１】
2016121862.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化２】
2016121862.tif 000003
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
［５］前記Ｇ０Ｓ２阻害剤がＨｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、［４］に記載の抗炎症剤。
［６］鎮痛作用を示す、［１］〜［５］のいずれかに記載の抗炎症剤。
［７］被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
［８］被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法。
［９］下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【化３】
2016121862.tif 000004
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
【化４】
2016121862.tif 000005
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１〜５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。
【図２】実験例２において、５００μＬ培地中に、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌ添加した細胞におけるＮＦ−κＢ応答エレメントの活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりｓｉＲＮＡ非投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図３】実験例３において、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを投与したジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）暴露マウスの肝臓における、ＮＦ−κＢ応答エレメント（ＮＲＥ）へのＮＦ−κＢの結合活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照ｓｉＲＮＡ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図４Ａ】実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。
【図４Ｃ】実験例３における、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。
【図４Ｄ】実験例３における、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。
【図５】実験例４において、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウス及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
【図６Ａ】実験例５における、化合物ライブラリーの一次スクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＧ０Ｓ２プロモーター（−２０３０→−１３７８）活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。
【図６Ｂ】実験例５における、化合物ライブラリーの二次スクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＡＴＰ活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。
【図７Ａ】実験例６における、化合物のスクリーニングの結果を示すグラフである。細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＧ０Ｓ２プロモーター（−２０３０→＋１０）活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。
【図７Ｂ】実験例６において、細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＢｍａｌ１プロモーター活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。
【図７Ｃ】実験例６において、細胞を１０μＭの各化合物に暴露した後、２４時間目のＰｅｒ２プロモーター活性（相対値）を、２を底とする対数で示す。各値は平均値を示す（ｎ＝３）。各化合物投与群とＤＭＳＯ投与群におけるＰｅｒ２プロモーター活性（相対値）に有意な差は認められなかった。
【図８Ａ】実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図８Ｂ】実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＲＡＲα遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図８Ｃ】実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＣｃｌ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図８Ｄ】実験例７において、細胞に１０μＭの化合物Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３を暴露した後２４時間目のＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡの発現量（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図８Ｅ】実験例８において、化合物Ｎｏ．１の濃度に対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図８Ｆ】実験例８において、化合物Ｎｏ．２の濃度に対するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図９Ａ】実験例９において、化合物Ｎｏ．２を投与したマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの一過性発現プロファイルを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。２ｗａｙ−ＡＮＯＶＡ解析の結果、危険率１％未満で対照群と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意な差が認められた。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図９Ｂ】実験例９において、化合物Ｎｏ．２を投与したマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の一過性発現プロファイルを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により対照群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１０Ａ】実験例１０において、化合物Ｎｏ．２（１０μＭ）及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）の暴露から１２時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＣｃｌ２  ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１０Ｂ】実験例１０において、化合物Ｎｏ．２（１０μＭ）及びＴＮＦα（２００ｎｇ／ｍＬ）の暴露から１２時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＣｃｌ２  ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１０Ｃ】実験例１０において、ＬＰＳを尾静脈投与した後６時間目のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２  ｍＲＮＡの発現に対する、化合物Ｎｏ．２（５ｍｇ／Ｋｇ、尾静脈投与）の影響を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＬＰＳ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１１Ａ】実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。「＊＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１１Ｂ】実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるｐ６５タンパク質の核内存在量の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。「＊＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１１Ｃ】実験例１１において、対照群、ＬＰＳ投与群、ＬＰＳ＋化合物Ｎｏ．２投与群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の定量結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。「＊」は、対照群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＃」は、ＬＰＳ投与群との対比において、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図１２】実験例１２において、担癌１４日目のマウスにおける化合物Ｎｏ．２（１５ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水の腹腔内投与後のＰＷＴのタイムコースを示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝６）を示す。２ｗａｙ−ＡＮＯＶＡ解析の結果、危険率１％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ−生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意な差が認められた。「＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率５％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ−生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意差があることを示す。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で対照群（０．０５％ＤＭＳＯ−生理食塩水）と化合物Ｎｏ．２投与群との間に有意差があることを示す。「ａａ」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で、０．０５％ＤＭＳＯ−生理食塩水投与前と０．０５％ＤＭＳＯ−生理食塩水投与後との間に有意差があることを示す。「ｂｂ」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定の結果、危険率１％未満で、化合物Ｎｏ．２投与前と化合物Ｎｏ．２投与後との間に有意差があることを示す。
【図１３Ａ】実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１３Ｂ】実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１３Ｃ】実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（１０μＭ）の暴露から２４時間目のＨｅｐＧ２細胞におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１３Ｄ】実験例１４において、化合物Ｎｏ．２及びその誘導体（２．５又は５μＭ）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。「＃＃」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の５μＭ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１４Ａ】実験例１５において、化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）とのＩＣ５０を比較した結果を示すグラフである。各化合物の暴露後２４時間目のＯ−４０００Ｅ細胞のＧ０Ｓ２プロモーター活性（相対値）を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図１４Ｂ】実験例１５において、０．５〜５μＭの化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１４Ｃ】実験例１５において、０．５〜５μＭの化合物Ｎｏ．２とその誘導体である実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）の暴露から４８時間目のＨｅｐａ１−６細胞におけるＣｃｌ２  ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。「＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率５％未満で有意差があることを示す。「＊＊」は、ボンフェローニ・ダン検定により化合物Ｎｏ．２の同用量投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１４Ｄ】実験例１５において、各化合物（１又は５μＭ）の暴露から２４時間目のＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率（相対値）を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜６）を示す。「＊＊」は、Ｓｃｈｅｆｆｅ検定によりＤＭＳＯ投与群の結果と比較した結果、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１５】実験例１６において、対照細胞と、Ｇ０Ｓ２ノックダウン細胞におけるＧ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照細胞の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図１６】実験例１７において、実施例２、実施例３、実施例１０の化合物を投与した肝炎モデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。「ベヒクル」はＬＰＳを投与しなかったマウスを表し、「対照」は化合物の代わりに生理食塩水を投与したマウスを表す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。シェッフェ検定によりベヒクル群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図１７】実験例１８において、実施例２の化合物の標的タンパク質を同定するプルダウンアッセイにおける、アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１８Ａ】実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８〜９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図１８Ｂ】実験例１９における、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜５）を示す。「Ｐ＝０．１４」は、スチューデントｔ検定により対照細胞の結果と比較した結果、危険率１４％未満で有意差があることを示す。
【図１８Ｃ】実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、αＳＭＡのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８〜９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図１８Ｄ】実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、コラーゲン  タイプＩ  α２（Ｃｏｌ１α２）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８〜９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図１８Ｅ】実験例１９において、対照マウス及び実施例１の化合物を投与したＮＡＳＨモデルマウスの肝臓における、コラーゲン  タイプＩ  α１（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８〜９）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「Ｐ＝０．０６７３」は危険率６．７３％未満で有意差があることを示す。
【図１９】実験例２０において、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３〜１０）を示す。「Ｐ＝０．０５２２」は、スチューデントｔ検定により対照マウスの結果と比較した結果、危険率５．２２％未満で有意差があることを示す。
【図２０】実験例２１において、実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝５）を示す。
【図２１Ａ】実験例２２において、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす実施例１０の化合物の影響を示すグラフである。ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後の結果を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝８〜１０）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。また、シェッフェ検定によりＤＥＮ投与群の結果と比較した結果、「＄」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図２１Ｂ】実験例２２において、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす実施例１０の化合物の影響を示すグラフである。ＤＥＮの飲水投与開始から１２週間後の結果を示す。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝７〜８）を示す。シェッフェ検定により対照マウスの結果と比較した結果、「＊＊」及び「＃＃」は危険率１％未満で有意差があることを示す。また、シェッフェ検定によりＤＥＮ投与群の結果と比較した結果、「＄＄」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２２Ａ】実験例２３において、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡを用いてＨｓｄ１７ｂ４遺伝子をノックダウンした結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照ｓｉＲＮＡ投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２２Ｂ】実験例２３において、化合物Ｎｏ．２の存在下又は非存在下（図中、「ＤＭＳＯ」と示す。）において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、化合物Ｎｏ．２の非存在下における結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図２３Ａ】実験例２４において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４−ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２３Ｂ】実験例２４において、細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４−ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションし、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２４】実験例２５において、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターを安定発現させた細胞を用いて、化合物Ｎｏ．２の存在下又は非存在下（図中、「ＤＭＳＯ」と示す。）でルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、化合物Ｎｏ．２の非存在下における結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２５Ａ】Ｇ０Ｓ２転写活性調節領域の構造を示す図である。
【図２５Ｂ】実験例２６において、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターと、ＳＴＡＴ５発現ベクター又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、対照）とを共発現させた細胞のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、対照と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２６】実験例２７において、培地に化合物Ｎｏ．２を添加した細胞の核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量をウエスタンブロッティングにより測定した結果を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により、対照又は２．５μＭ添加群と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図２７Ａ】実験例２８において、化合物Ｎｏ．２を経口投与したマウスの血液中の薬物濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図２７Ｂ】実験例２８において、化合物Ｎｏ．２を経口投与したマウスの肝臓中の薬物濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図２８Ａ】実験例２９における、対照群のマウスの肝臓の代表的な写真である。
【図２８Ｂ】実験例２９における、ＤＥＮ飲水群のマウスの肝臓の代表的な写真である。
【図２８Ｃ】実験例２９における、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群のマウスの肝臓の代表的な写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１は、炎症関連疾患の一例として、肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。肝臓癌の９割は肝炎、肝硬変という長期間の慢性肝炎の病態を経て発癌する。なお、図１に示す過程におけるＧ０Ｓ２及び炎症シグナルの影響は、発明者らが今回明らかにしたものであり、詳細は後述する。
【００１２】
ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を飲水に投与することにより、動物に慢性肝炎、肝硬変、肝臓癌発症に至る過程を再現することができる。この実験モデルは、ヒトにおける肝臓癌発症機構を解明する有用な実験系である。発明者らは、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルを用い、分子時計機構に着目した肝炎肝臓癌発症の機構を解析した。その結果、肝炎肝臓癌発症に細胞周期調節因子であるＧ０Ｓ２（Ｇ０／Ｇ１  ｓｗｉｔｃｈ  ｇｅｎｅ  ２）が関与していることを見出した。
【００１３】
［抗炎症剤］
１実施形態において、本発明は、Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤を有効成分として含有する抗炎症剤を提供する。Ｇ０Ｓ２阻害剤としては、例えばＧ０Ｓ２の転写を抑制する化合物、Ｇ０Ｓ２の活性を阻害する物質等が挙げられる。
【００１４】
本実施形態の抗炎症剤が治療又は予防の対象とする炎症関連疾患としては、例えば肝炎、小腸炎、大腸炎（ＩＢＤ）、肝臓癌、リウマチ、喘息、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎等が挙げられる。
【００１５】
本実施形態の抗炎症剤は、Ｇ０Ｓ２遺伝子に対する（Ｇ０Ｓ２の発現を阻害する）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸であってもよい。
【００１６】
また、実施例において後述するように、発明者らは、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現が、Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）タンパク質を介して制御されていることが明らかにした。すなわち、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現の上流でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質が作用していることを明らかにした。
【００１７】
したがって、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現を阻害する物質は、Ｇ０Ｓ２阻害剤であるということもできる。すなわち、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現を阻害する物質は、抗炎症剤として使用することができる。
【００１８】
したがって、本実施形態の抗炎症剤は、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸であってもよい。
【００１９】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１〜２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２０】
ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０〜９５℃で約１分程度変性させた後、３０〜７０℃で約１〜８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００２１】
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２２】
ｍｉＲＮＡは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基程度のＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）の一種である。近年、人工的なｍｉＲＮＡを用いて標的遺伝子のノックダウンを行うことが可能となっている。
【００２３】
人工的なｍｉＲＮＡは、哺乳動物の細胞中で発現ベクターからＰｏｌ２プロモーターにより発現させるとよい。細胞内に導入されたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｍｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。
【００２４】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。
【００２５】
アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２６】
本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
【００２７】
本実施形態の抗炎症剤は、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質であってもよい。上記の特異的結合物質は、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に特異的に結合してそれらの機能を阻害することにより、抗炎症効果を発揮する。
【００２８】
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に抗原を免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。
【００２９】
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。また、上記の抗体又は抗体断片は、例えばポリエチレングリコール等の化合物が結合したものであってもよい。ポリエチレングリコールを結合することにより、例えば血中安定性を高めること等が可能になる。
【００３０】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、Ｇ０Ｓ２タンパク質又はＨｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００３１】
特異的結合物質は、上記の他にも、例えば、対象物質に対する結合性を指標として、化合物ライブラリー等からスクリーニングしたものであってもよい。
【００３２】
実施例において後述するように、ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルのマウスに、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与することにより、肝炎及び肝臓癌の発症を抑制することができる。したがって、本実施形態の抗炎症剤は、肝炎又は肝臓癌の治療又は予防剤であるということもできる。
【００３３】
本実施形態の抗炎症剤は、下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物であってもよい。
【００３４】
【化５】
2016121862.tif 000006
【００３５】
式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化６】
2016121862.tif 000007
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００３６】
本実施形態の抗炎症剤において、上記式（１）で表される化合物は、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩であってもよく、フリー体の溶媒和物であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。
【００３７】
薬学的に許容される塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が挙げられる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ヨウ化水素酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロパン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩；アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩；グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
【００３８】
溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【００３９】
上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物は、Ｈｓｄ１７ｂ４（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｙｐｅ  ２）に対する結合能を有するものであってもよい。
【００４０】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物がＨｓｄ１７ｂ４に特異的に結合することを明らかにした。Ｈｓｄ１７ｂ４は、ペルオキシソーム等に存在することが知られるタンパク質であり、脂肪酸をβ酸化する等の活性を有する酵素である。ヒトＨｓｄ１７ｂ４のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号はＰ５１６５９であり、マウスＨｓｄ１７ｂ４のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号はＰ５１６６０である。
【００４１】
実施例において後述するように、本実施形態の抗炎症剤は、鎮痛作用を示す。したがって、本実施形態の抗炎症剤は鎮痛剤であるということもいえる。
【００４２】
［医薬組成物］
本実施形態の抗炎症剤は、それ自体を投与してもよいし、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。
【００４３】
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよく、例えば注射剤、軟膏、貼付剤等の非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。
【００４４】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００４５】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤等が挙げられる。
【００４６】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００４７】
医薬組成物が注射剤である場合、注射剤用の溶媒としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤用の溶媒は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００４８】
抗炎症剤の患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。
【００４９】
抗炎症剤の投与量は、患者の症状等により差異はあるが、経口投与の場合、１日あたり、例えば５〜２０ｍｇ／ｋｇ等が挙げられる。また、非経口的に投与する場合、その投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば皮下投与の場合には、例えば１０〜２５ｍｇ／ｋｇを１日あたり１回投与することが挙げられる。投与量が上記範囲を超えると、肝障害が生じる場合がある。また、静脈注射の場合の致死量は約２５ｍｇ／ｋｇである。
【００５０】
［抗炎症剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下で細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定する工程と、前記発現量が、前記被検物質の非存在下における前記細胞中のＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のスクリーニング方法により、抗炎症剤をスクリーニングすることができる。
【００５１】
被検物質としては、例えば化合物ライブラリー等を用いることができる。被検物質は、例えば細胞の培地中に添加すればよい。Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量の測定方法は特に制限されず、例えばリアルタイムＰＣＲにより行ってもよいし、例えばウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等によりタンパク質レベルで行ってもよい。
【００５２】
あるいは、Ｇ０Ｓ２プロモーターの下流に、例えばルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を連結した発現ベクターを作製し、この発現ベクターを遺伝子導入した細胞等を用いたレポーターアッセイにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を測定してもよい。
【００５３】
被検物質の存在下で、対照（被検物質の非存在下）と比較してＧ０Ｓ２遺伝子の発現量と比較して低下していた場合には、前記被検物質は抗炎症剤であると判定することができる。
【００５４】
１実施形態において、本発明は、被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質は抗炎症剤であると判定する工程と、を備える、抗炎症剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５５】
実施例において後述するように、発明者らは、Ｇ０Ｓ２の上流でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質が機能していることを明らかにした。したがって、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を低下させる被検物質は、Ｇ０Ｓ２の阻害剤であるということができる。すなわち、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を低下させる被検物質は、抗炎症剤であるということができる。
【００５６】
本実施形態のスクリーニング方法は、細胞レベルで行ってもよいし、精製したＨｓｄ１７ｂ４タンパク質を用いて試験管内で行ってもよい。被検物質としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００５７】
Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性としては、脂肪酸をβ酸化する活性が挙げられる。Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性は、例えば、２−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ、胆汁酸中間体、又は超長鎖脂肪酸の代謝量を測定すること等により測定することができる。なお、発明者らは、コンピューター解析結果より、Ｈｓｄ１７ｂ４の酵素活性部位にＮＳ−３−０１１等の化合物が結合する結果、Ｈｓｄ１７ｂ４の活性が低下することを明らかにした。また、Ｈｓｄ１７ｂ４にはＮＳ−３−０１１以外の化合物も結合し得る。
【００５８】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、炎症関連疾患の治療又は予防方法を提供する。
【化７】
2016121862.tif 000008
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化８】
2016121862.tif 000009
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【００５９】
１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、疼痛の治療又は予防方法を提供する。
【００６０】
１実施形態において、本発明は、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、又は上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、肝炎又は肝臓癌の治療又は予防方法を提供する。
【００６１】
１実施形態において、本発明は、炎症関連疾患の治療若しくは予防、又は疼痛の治療若しくは予防のための、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、若しくは上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物を提供する。
【００６２】
１実施形態において、本発明は、炎症関連疾患の治療剤若しくは予防剤、又は疼痛の治療剤若しくは予防剤を製造するための、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、若しくは上記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物の使用を提供する。
【００６３】
［新規化合物］
発明者らはまた、下記式（２）で表される化合物を見出した。
【００６４】
【化９】
2016121862.tif 000010
式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
【化１０】
2016121862.tif 000011
ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。Ｒ８がヘキシル基である場合、ｍは１〜５の整数であり、ｍが２以上の整数である場合、複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００６５】
上記式（２）で表される化合物は、上記式（１）で表される化合物と同様に、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩であってもよく、フリー体の溶媒和物であってもよく、薬学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。薬学的に許容される塩及び溶媒和物としては上述したものと同様である。
【００６６】
後述するように、本実施形態の化合物は、下記式（３）で表される化合物（化合物Ｎｏ．２）と比較して、顕著に高いＧ０Ｓ２の発現抑制効果を奏する。したがって、本実施形態の化合物は、例えば抗炎症剤として利用することができる。
【００６７】
【化１１】
2016121862.tif 000012
【００６８】
本実施形態の化合物は、上記式（１）で表される化合物と同様に医薬組成物として製剤化してもよい。この場合、医薬組成物の剤型、投与方法、投与量は、上述したものと同様である。
【実施例】
【００６９】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【００７０】
［実験例１］
（Ｇ０Ｓ２の同定）
ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルを対象に、体内時計機構の変容を観察した。その結果、Ｇ０Ｓ２（Ｇ０／Ｇ１  ｓｗｉｔｃｈ  ｇｅｎｅ  ２）の発現リズムに変容が認められた。マウスＧ０Ｓ２の塩基配列を配列番号１に示し、ヒトＧ０Ｓ２の塩基配列を配列番号２に示す。【００７１】
［実験例２］
（Ｇ０Ｓ２の機能解析）
培養細胞におけるＧ０Ｓ２をノックダウンし、炎症性シグナルにより活性化される転写因子であるＮＦ−κＢに対する影響を検討した。【００７２】
まず、ＮＦ−κＢ応答エレメントを用いたレポーターアッセイを行った。マウス胎仔由来線維芽細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３に、ＮＦ−κＢ応答エレメントの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞を作製した。続いて、この細胞の培地（容量５００μＬ）に、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌのＧ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを添加し、４８時間静置した。Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡとしては、市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、商品名「Ｓｔｅａｌｔｈ  ｓｉＲＮＡ」、カタログ番号「＃１３２０００１」、配列番号３にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。【００７３】
続いて各細胞を回収して破砕し、発光基質（商品名「Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ）  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ」、プロメガ社製）を反応させて発光量を計測し、ＮＦ−κＢ応答エレメントの活性を測定した。図２は、測定結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを培地に添加することにより、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＦ−κＢ応答エレメントの活性が低下することが明らかとなった。【００７４】
以上の結果から、Ｇ０Ｓ２は炎症性シグナルの転写活性の調節因子であることが明らかとなった。【００７５】
［実験例３］
（Ｇ０Ｓ２のノックダウン）
ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）によるマウス肝炎肝臓癌発症モデルのマウスを２群に分け、一方にＧ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与し（Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群）、他方に陰性対照のｓｉＲＮＡを投与した（対照ｓｉＲＮＡ投与群）。マウスへのｓｉＲＮＡの投与は、核酸導入試薬（商品名「ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（商標）ＥＸ  Ｏｌｉｇｏ＜ｉｎ  ｖｉｖｏ＞、北海道システム・サイエンス社）を用いて、１．６ｎｍｏｌ／匹を尾静脈投与することにより行った。Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡとしては、市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、商品名「Ｓｔｅａｌｔｈ  ｓｉＲＮＡ」、カタログ番号「＃１３２０００１」、配列番号３にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。対照ｓｉＲＮＡとしては市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、配列番号４にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。【００７６】
マウスへのｓｉＲＮＡの投与の１日後からＤＥＮを８０ｍｇ／Ｌの濃度で飲水に添加した。マウスへのｓｉＲＮＡの投与３日後に肝臓を採取し、ＮＦ−κＢ応答エレメント配列を含むＤＮＡ断片を用いたゲルシフトアッセイを行い、ＮＦ−κＢとＮＦ−κＢ応答エレメントとの結合量を測定した。【００７７】
図３は、測定結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを投与することにより、マウス肝炎肝臓癌発症モデルの肝臓におけるＮＦ−κＢ応答エレメント（ＮＲＥ）へのＮＦ−κＢの結合活性が低下することが明らかとなった。【００７８】
続いて、上記と同様のＧ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスを用意した。マウスへのｓｉＲＮＡの投与の１日後からＤＥＮを８０ｍｇ／Ｌの濃度で飲水に添加し、１４週間飼育した後にと殺し、解析を行った。その結果、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウスにおいては肝臓癌の発症が抑制された。これに対し、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスにおいては、肝臓癌の発症が認められた。【００７９】
図４Ａは、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真であり、図４Ｂは、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。図４Ａ中の矢印は癌細胞を示し、図４Ｂ中の矢印は発症した肝臓癌を示す。【００８０】
また、図４Ｃは、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真であり、図４Ｄは、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。【００８１】
［実験例４］
（Ｃｃｌ２の発現量の検討）
実験例３のＧ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウス及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの肝臓において、ケモカインＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量をｑＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。図５は、各群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。図中の＊印は、危険率５％未満で有意差があることを意味する。【００８２】
その結果、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスにおいては、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスと比較して、Ｃｃｌ２の発現が有意に抑制されていることが明らかとなった。【００８３】
［実験例５］
（化合物ライブラリーを用いた一次、二次スクリーニング）
Ｇ０Ｓ２遺伝子転写抑制薬を探索した。探索するにあたり、東京大学創薬オープンイノベーションセンターから９６００化合物からなる化合物ライブラリー（Ｃｏｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）の提供を受けた。この化合物ライブラリーを対象に３８４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを用いてルシフェラーゼ活性への影響を評価することにより、一次スクリーニングを行った。Ｇ０Ｓ２プロモーター（−２０３０→−１３７８）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞株を用いて、各化合物（終濃度１０μＭ）について薬効評価を３回ずつ検討し、すべての検討でルシフェラーゼ活性を１／４未満に低下させた化合物を抽出した結果、１７５個の化合物がヒットした。図６Ａに一次スクリーニングの結果を示す。【００８４】
次に、これらの化合物（終濃度１０μＭ）が、マウス線維芽細胞由来の細胞であるＯ−４０００Ｅ細胞株の生存率に与える影響を、細胞内のＡＴＰ存在量を指標に評価することにより二次スクリーニングを行った。図６Ｂに二次スクリーニングの結果を示す。その結果、細胞生存率を有意に低下させる化合物はほとんど存在しなかった。そこで、細胞生存率に影響を与えず、かつ一次スクリーニングでＯ−４０００Ｅ細胞株のルシフェラーゼ活性を１／１０未満まで下げる５０個の化合物を候補化合物とした。【００８５】
［実験例６］
（Ｇ０Ｓ２プロモーターに対する選択性によるスクリーニング）
より肝臓での環境に近づけるため、マウス肝癌由来の細胞であるＨｅｐａ１−６細胞に、Ｇ０Ｓ２プロモーター（−２０３０→＋１０）の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させた細胞を作製した。この細胞を使用して、上述した一次スクリーニング時と同様に候補化合物のルシフェラーゼ活性に対する影響を評価した。図７Ａにスクリーニングの結果を示す。【００８６】
さらに、ヒット化合物の転写抑制作用がＧ０Ｓ２プロモーターに対する選択性を有するものかどうかを検討するため、生体において多くの遺伝子発現に関与し生体の恒常性維持に関わる時計遺伝子群に着目し検討を行った。【００８７】
発明者らの研究より、時計遺伝子が、Ｇ０Ｓ２遺伝子の転写制御を行う核内受容体ＲＡＲαの発現にも関与していることが示唆されている。そこで、正常な細胞における時計遺伝子に影響を及ぼす化合物を除外するため、Ｂｍａｌ１プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させたＭＥＦ細胞株を用いた検討を行った。結果を図７Ｂに示す。【００８８】
その結果、多くの化合物で有意にＢｍａｌ１のプロモーター活性を抑制する可能性が示唆された。そこで、Ｂｍａｌ１プロモーター活性に有意な変化がなく、Ｇ０Ｓ２プロモーター（−２０３０→＋１０）の活性を１／２未満まで低下させる化合物を抽出した結果、化合物Ｎｏ．１、化合物Ｎｏ．２及び化合物Ｎｏ．３の３つの化合物が候補として残った。下記式（１２）、（３）及び（１３）に、それぞれ化合物Ｎｏ．１、化合物Ｎｏ．２（以下、「ＮＳ−３−００８」という場合がある。）及び化合物Ｎｏ．３の化学式を示す。【００８９】
【化１２】
2016121862.tif 000013
【００９０】
【化１３】
2016121862.tif 000014
【００９１】
【化１４】
2016121862.tif 000015
【００９２】
そこで更にＰｅｒ２プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現カセットを安定発現させたＭＥＦ細胞株を用いて、この３つの化合物の薬効評価を行った結果、残ったヒット化合物の３つはいずれもＰｅｒ２プロモーター活性に影響を与えなかった。結果を図７Ｃに示す。【００９３】
［実験例７］
（ヒット化合物の内因性ｍＲＮＡ発現への影響）
これまでに抽出された３つの化合物について、Ｇ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を評価した。Ｈｅｐａ１−６細胞を播種して２４時間後に、ヒット化合物を１０μＭで暴露し、２４時間後にサンプリング及び全ＲＮＡの抽出を行った。続いて、ｑＲＴ−ＰＣＲ法によりＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量変化を測定した。【００９４】
その結果、図８Ａに示すように、いずれの化合物においてもＧ０Ｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量が約半分まで低下していることが明らかとなった。さらに、図８Ｂに示すように、Ｇ０Ｓ２の転写制御に関与することが知られている核内受容体ＲＡＲαの発現量は、化合物Ｎｏ．１と化合物Ｎｏ．２では変化がなかったが、化合物Ｎｏ．３で有意な減少が認められた。また、図８Ｃ及び図８Ｄに示すように、Ｇ０Ｓ２が調節因子として寄与しているＮＦ−κＢシグナルの下流因子であるＣｃｌ２及びインターロイキン（ＩＬ）−６のｍＲＮＡ発現量は、いずれの化合物の暴露によっても有意な減少が認められた。これらの結果より、化合物Ｎｏ．３を候補から外し、化合物Ｎｏ．１及び化合物Ｎｏ．２を候補化合物とした。【００９５】
［実験例８］
（ヒット化合物のＩＣ５０の算出）
ヒット化合物である化合物Ｎｏ．１及びＮｏ．２の薬効評価のため、ＩＣ５０の算出を行った。Ｏ−４０００Ｅ細胞株を播種し、化合物Ｎｏ．１及びＮｏ．２をそれぞれ終濃度０．１５６２５μＭ〜１０μＭとなるよう８段階に段階希釈して暴露した。暴露から２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、カーブフィッティングを行ってＩＣ５０を算出した。その結果、図８Ｅに示すように化合物Ｎｏ．１のＩＣ５０は５．００μＭであり、図８Ｆに示すように化合物Ｎｏ．２のＩＣ５０は２．２５μＭと算出された。【００９６】
［実験例９］
（正常マウスに対する化合物Ｎｏ．２の薬効評価）
ＩＣ５０がより低値を示した化合物Ｎｏ．２について、正常マウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響について検討を行った。ＩＣＲ雄性マウスに対し１５ｍｇ／ｋｇで化合物Ｎｏ．２を背部皮下投与し、投与後３０分、１、２、４、６、１２、２４時間目の肝臓におけるＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果、図９Ａに示すように、投与から４時間目においてＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量が約半分にまで低下する傾向が認められ、２時間目および１２時間目で、有意に減少していることが分かった。さらに、図９Ｂに示すように、投与後２時間目から１２時間目の肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質発現量を測定したところ、投与後４時間目と６時間目の化合物Ｎｏ．２投与群で有意な低下が認められた。【００９７】
［実験例１０］
（化合物Ｎｏ．２の炎症シグナルへの拮抗作用の評価１）
次に、生体内での効果が認められた化合物Ｎｏ．２が炎症シグナルの活性化に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。Ｇ０Ｓ２タンパク質が調節因子として働くＮＦ−κＢを活性化させるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はＴＮＦαをＨｅｐａ１−６細胞に暴露すると同時に化合物Ｎｏ．２を１０μＭで暴露した。図１０Ａ、図１０Ｂに示すように、暴露から１２時間後に細胞を回収しＣｃｌ２  ｍＲＮＡ発現量を測定したところ、ＬＰＳ又はＴＮＦαの暴露によって増大したＣｃｌ２  ｍＲＮＡ発現が化合物Ｎｏ．２の暴露によって有意に抑制された。また、マウスにＬＰＳ  ２５μｇを尾静脈より投与し、肝炎モデルを作製した。ＬＰＳ投与３０分後に化合物Ｎｏ．２（５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈投与し、６時間目に肝臓をサンプリングした。その結果、図１０Ｃに示すように、肝臓のＣｃｌ２  ｍＲＮＡ発現量は、対照群（生理食塩水投与群）と比較し有意に発現量が増加したが、化合物Ｎｏ．２を投与した群ではその発現は有意に抑制された。【００９８】
［実験例１１］
（化合物Ｎｏ．２の炎症シグナルへの拮抗作用の評価２）
実験例１０とは異なる条件下で、インビボにおいて化合物Ｎｏ．２が炎症シグナルの活性化に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。【００９９】
ＩＣＲ雄性マウスにＬＰＳ（１０μｇ／匹）を尾静脈投与し、ＬＰＳ投与群とした。また、ＬＰＳの代わりに生理食塩水を投与したマウスを用意し、対照群とした。続いて、ＬＰＳ投与群を２つに分け、一方の群に、ＬＰＳの投与から１時間後に化合物Ｎｏ．２を５ｍｇ／ｋｇとなるよう背部皮下投与し、ＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群とした。続いて、化合物Ｎｏ．２の投与から５時間後に、各群のマウスをと殺し肝臓を採取した。【０１００】
続いて、得られた各群のマウスの肝臓におけるＧ０Ｓ２タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により定量した。図１１Ａは、Ｇ０Ｓ２タンパク質の定量結果を示すグラフである。【０１０１】
その結果、Ｇ０Ｓ２の発現は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、Ｇ０Ｓ２の発現は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に抑制された。【０１０２】
また、各群のマウスの肝臓について、ＮＦ−κＢの構成タンパク質の１つであるｐ６５タンパク質の核内存在量をウエスタンブロット法により定量した。図１１Ｂは、ｐ６５タンパク質の定量結果を示すグラフである。【０１０３】
その結果、ｐ６５タンパク質の核内存在量は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、ｐ６５タンパク質の核内存在量は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に低下した。【０１０４】
また、各群のマウスの肝臓について、ＮＦ−κＢの標的遺伝子であるＣｃｌ２のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した。図１１Ｃは、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の定量結果を示すグラフである。【０１０５】
その結果、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量は、対照群と比較してＬＰＳ投与群で有意に上昇した。さらに、Ｃｃｌ２のｍＲＮＡの発現量は、ＬＰＳ投与群と比較してＬＰＳ＋Ｎｏ．２投与群で有意に低下した。【０１０６】
以上の結果は、化合物Ｎｏ．２がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症シグナルに拮抗し、ＮＦ−κＢを介したケモカインの発現亢進を抑制する作用を持つことを更に支持するものである。【０１０７】
［実験例１２］
（化合物Ｎｏ．２の神経障害性疼痛への薬効評価）
炎症モデルで効果が認められた化合物Ｎｏ．２が神経障害性疼痛に拮抗する作用を持つか否かの検討を行った。癌移植による神経障害性疼痛モデルはＮＦ−κＢを活性化させる。そこで癌移植後２週間目にボンフェロニーテストを行い、疼痛強度を測定し疼痛が惹起されていることを確認したモデルマウスに、化合物Ｎｏ．２を１５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。図１２に示すように、投与後経時的に疼痛強度を測定した結果、４、６、８時間目に有意に化合物Ｎｏ．２投与群で痛みが緩和された。また、坐骨神経部分損傷モデルマウスにおいても同様な効果が認められた。【０１０８】
［実験例１３］
（化合物の合成）
下記スキームにしたがって、実施例１及び実施例２の化合物を合成した。
【化１５】
2016121862.tif 000016
【０１０９】
まず、水素化ナトリウム存在下チオ尿素（化合物１）と二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルとの反応により化合物２を得た。続いて、化合物２を化合物３に変換したのち（Yin B, et al., Tetrahedron Lett., 49, 3687, 2008. を参照。）、水溶性カルボジイミド存在下ヘキシルアミンとの縮合によって化合物４ａを（Poss MA, et al., Tetrahedron Lett., 33, 5933, 1992. を参照。）、ドデシルアミンとの縮合によって化合物４ｂをそれぞれ収率９３％及び９４％で得た。化合物４ａに対し塩化水素エーテル溶液を作用させることで、実施例１の化合物（化合物Ｎｏ．２）が収率６７％で得られた。
（化合物Ｎｏ．２）
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１０（１Ｈ，ｂｓ），７．７９（１Ｈ，ｂｓ），７．５６（２Ｈ，ｂｓ），７．４１−７．２７（５Ｈ，ｍ），４．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５１−１．４１（２Ｈ，ｍ），１．３２−１．２１（６Ｈ，ｍ），０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）。【０１１０】
また、化合物４ｂをジクロロメタン中トリフルオロ酢酸と反応させることで、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）が定量的に得られた。
（ＮＳ−３−０１１）
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９９（１Ｈ，ｂｓ），７．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５０（２Ｈ，ｂｓ），７．４２−７．３５（２Ｈ，ｍ），７．３３−６．２６（３Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．１４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５３−１．４１（３Ｈ，ｍ），１．３２−１．１６（１７Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１１】
また、下記式（４）で表される実施例３の化合物（ＮＳ−３−０５４）も合成した。
【化１６】
2016121862.tif 000017
（ＮＳ−３−０５４）
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），８．０７（１Ｈ，ｓ），８．０１（２Ｈ，ｓ），７．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．６１（２Ｈ，ｂｓ），４．６１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５０−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．２９−１．１２（６Ｈ，ｍ），０．８４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１２】
また、下記式（５）で表される実施例４の化合物（ＮＳ−３−００５）も合成した。
【化１７】
2016121862.tif 000018
（ＮＳ−３−００５）
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３８−７．２８（５Ｈ，ｍ），４．４８（２Ｈ，ｂｓ），３．１５（２Ｈ，ｂｓ），１．６２−１．４８（１１Ｈ，ｍ），１．３５−１．１６（６Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。【０１１３】
また、下記式（６）で表される実施例５の化合物（ＮＳ−３−０１０）も合成した。
【化１８】
2016121862.tif 000019
（ＮＳ−３−０１０）
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．７７（１Ｈ，ｂｓ），７．４５（２Ｈ，ｂｓ），７．４２−７．３７（３Ｈ，ｍ），７．３４−７．２８（３Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．４７−３．３７（１Ｈ，ｍ），１．８６−１．７７（２Ｈ，ｍ），１．７３−１．６５（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．５３（１Ｈ，ｍ），１．３５−１．０８（５Ｈ，ｍ）。【０１１４】
また、下記式（７）で表される実施例６の化合物（ＮＳ−３−０１３）も合成した。
【化１９】
2016121862.tif 000020
（ＮＳ−３−０１３）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．５０−７．４１（２Ｈ，ｍ），７．３７（２Ｈ，ｂｓ），７．３４−７．２９（２Ｈ，ｍ），７．２８−７．２１（３Ｈ，ｍ），３．４３−３．３５（２Ｈ，ｍ），３．０９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．４８−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．３４−１．２０（６Ｈ，ｍ），０．８８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１５】
また、下記式（８）で表される実施例７の化合物（ＮＳ−３−０１４）も合成した。
【化２０】
2016121862.tif 000021
（ＮＳ−３−０１４）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．６６（１Ｈ，ｂｓ），８．０３−７．９０（１Ｈ，ｍ），７．７１（２Ｈ，ｂｓ），７．４８−７．４１（２Ｈ，ｍ），７．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），３．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５９−１．４８（２Ｈ，ｍ），１．３９−１．２２（６Ｈ，ｍ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１６】
また、下記式（９）で表される実施例８の化合物（ＮＳ−３−０１５）も合成した。
【化２１】
2016121862.tif 000022
（ＮＳ−３−０１５）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．４１−７．３４（２Ｈ，ｍ），７．３１（２Ｈ，ｂｓ），３．１１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．９７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．７６−１．５８（５Ｈ，ｍ），１．５４−１．４１（３Ｈ，ｍ），１．３６−１．０７（９Ｈ，ｍ），０．９６−０．８２（５Ｈ，ｍ）。【０１１７】
また、下記式（１０）で表される実施例９の化合物（ＮＳ−３−０１６）も合成した。
【化２２】
2016121862.tif 000023
（ＮＳ−３−０１６）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９４−７．８４（１Ｈ，ｍ），７．４８７．３５（５Ｈ，ｍ），７．３５−７．２７（３Ｈ，ｍ），４．８７−４．７８（１Ｈ，ｍ），３．１８−３．０３（２Ｈ，ｍ），１．５０−１．３４（５Ｈ，ｍ），１．３１−１．１３（６Ｈ，ｍ），０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１８】
また、下記式（１１）で表される実施例１０の化合物（ＮＳ−３−０８６）も合成した。
【化２３】
2016121862.tif 000024
（ＮＳ−３−０８６）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０９（１Ｈ，ｂｓ），８．０７（１Ｈ，ｓ），８．００（２Ｈ，ｓ），７．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５６（２Ｈ，ｂｓ），４．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．４８−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．３２−１．１０（１８Ｈ，ｍ），０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。【０１１９】
また、下記式（１２）で表される比較例１の化合物（ＮＳ−３−０６０）も合成した。
【化２４】
2016121862.tif 000025
（ＮＳ−３−０６０）
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８３（１Ｈ，ｂｓ），７．５２（１Ｈ，ｂｓ），７．４５（２Ｈ，ｂｓ），７．４１−７．３６（２Ｈ，ｍ），７．３４７．２７（３Ｈ，ｍ），４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），４．３８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．１９−３．１０（２Ｈ，ｍ），１．７５−１．６６（１Ｈ，ｍ），１．５５−１．３７（３Ｈ，ｍ），１．３６−１．２３（２Ｈ，ｍ）。【０１２０】
［実験例１４］
（化合物Ｎｏ．２の誘導体の創製と薬効評価）
化合物Ｎｏ．２の誘導体７種（実施例２、４〜９）をＨｅｐａ１−６細胞に１０μＭで暴露し、２４時間後のＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量への影響を評価した。その結果、図１３Ａに示すように、実施例４（ＮＳ−３−００５）及び実施例６（ＮＳ−３−０１３）の化合物において、化合物Ｎｏ．２と同等程度までＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量を低下させる作用が認められた。【０１２１】
また、図１３Ｂに示すように、これらの化合物についてＡＴＰ  ａｓｓａｙにより細胞生存率に対する影響を評価したところ、実施例２（ＮＳ−３−０１１）の化合物でのみ有意な低下が認められた。【０１２２】
また、図１３Ｃに示すように、ヒトＨｅｐＧ２細胞に対する薬効をｍＲＮＡレベルで評価したところ、実施例６（ＮＳ−３−０１３）の化合物で有意な低下が認められ、実施例２（ＮＳ−３−０１１）の化合物において化合物Ｎｏ．２と同程度の効果が確認された。【０１２３】
そこで、マウス肝癌由来細胞Ｈｅｐａ１−６細胞とヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２細胞で共通して薬効が認められた実施例６（ＮＳ−３−０１３）の化合物と１０μＭでは細胞死が認められた実施例２（ＮＳ−３−０１１）の化合物について、１０μＭ未満の濃度での薬効評価を行った。【０１２４】
その結果、図１３Ｄに示すように、Ｈｅｐａ１−６細胞に対し化合物Ｎｏ．２、実施例２（ＮＳ−３−０１１）、実施例６（ＮＳ−３−０１３）の化合物を２．５及び５μＭで４８時間暴露したところ、化合物Ｎｏ．２は５μＭ、実施例２（ＮＳ−３−０１１）、実施例６（ＮＳ−３−０１３）の化合物は５μＭと２．５μＭ暴露の両方でＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量が有意に低下した。更に、実施例２（ＮＳ−３−０１１）の化合物は、いずれの濃度においても化合物Ｎｏ．２の５μＭ暴露群と比較してＧ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量の有意な低下が認められた。【０１２５】
［実験例１５］
（化合物Ｎｏ．２と実施例２の化合物の薬効比較）
これまでの検討から１０μＭ未満での薬効が認められ、化合物Ｎｏ．２以上の効果が期待される実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）について、低濃度での詳細な薬効評価を行った。まず、Ｏ−４０００Ｅ細胞を用いて、化合物Ｎｏ．２及び実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）のＧ０Ｓ２プロモーター活性に対するＩＣ５０の算出を行った。その結果、図１４Ａに示すように、化合物Ｎｏ．２ではＩＣ５０が２．３１μＭであったのに対し、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）ではＩＣ５０が０．２１μＭとなり、約１０分の１の量で同等の薬効を示すことが分かった。【０１２６】
そこで、Ｈｅｐａ１−６細胞に対し０．５〜５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２及び実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）を暴露し４８時間後の内因性Ｇ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量への影響を評価した。その結果、図１４Ｂに示すように、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）は、１〜５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２よりも有意に高い作用を示し、ＩＣ５０は約１μＭであった。【０１２７】
また、同様にＣｃｌ２  ｍＲＮＡ発現量の評価を行ったところ、図１４Ｃに示すように、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）は、１〜２．５μＭの範囲で化合物Ｎｏ．２よりも有意に高い効果を示した。また、図１４Ｄに示すように、この際の細胞生存率をＡＴＰ  ａｓｓａｙによって評価したところ、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）の５μＭ暴露時には有意に細胞生存率の低下が認められた。しかし、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）の１μＭの濃度においては細胞生存率の低下は認められず、かつ１μＭで化合物Ｎｏ．２よりも強い作用を示したことから、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）は、化合物Ｎｏ．２よりも有用な化合物であることが示唆された。【０１２８】
［実験例１６］
（ｍｉＲＮＡによるＧ０Ｓ２のノックダウン）
配列番号５及び６に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成し、ハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡ断片を形成した。続いて、形成した２本鎖ＤＮＡ断片を、ｍｉＲＮＡ用発現ベクター（商品名「ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ」、インビトロジェン社製）に連結した。続いて、作製した発現ベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に、リアルタイムＰＣＲによりＧ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量を定量した。【０１２９】
図１５は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、対照の細胞と比較して、Ｇ０Ｓ２をノックダウンした細胞では、Ｇ０Ｓ２及びＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量が低下したことが明らかとなった。【０１３０】
［実験例１７］
（化合物の薬効評価）
ＬＰＳ  １０μｇをマウスに腹腔内投与し、肝炎モデルを作製した。ＬＰＳ投与から１時間後に、実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）、実施例３の化合物（ＮＳ−３−０５４）及び実施例１０の化合物（ＮＳ−３−０８６）を背部皮下投与した。各化合物の投与から５時間後に各マウスから肝臓を採取し、リアルタイムＰＣＲによりＣｃｌ２の発現量を定量した。【０１３１】
図１６は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図中、「ベヒクル」はＬＰＳを投与しなかったマウスを表し、「対照」は化合物の代わりに生理食塩水を投与したマウスを表す。【０１３２】
その結果、対照群のマウスと比較して、化合物投与群のマウスはＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量が低下したことが明らかとなった。いずれの化合物についてもＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が認められた。【０１３３】
［実験例１８］
（実施例２の化合物の標的タンパク質の同定）
マウス肝臓細胞をホモジナイズして、細胞質及び核からそれぞれタンパク質を抽出した。その後、Ｇ０Ｓ２の発現を抑制する実施例２の化合物（ＮＳ−３−０１１）をペグビオチン化した化合物（＃１４２）、又はＧ０Ｓ２の発現を抑制しない比較例１の化合物（ＮＳ−３−０６０）をペグビオチン化した化合物（＃１５１）を、上記のタンパク質と混合し、インキュベーションした。化合物＃１４２及び＃１５１の化学式を、それぞれ下記式（１３）及び（１４）に示す。【０１３４】
【化２５】
2016121862.tif 000026
【０１３５】
【化２６】
2016121862.tif 000027
【０１３６】
その後、アビジンを標識したマグネットビーズ（以下、「アビジンビーズ」という場合がある。）でプルダウンアッセイを行い、アビジンビーズに結合した化合物及びタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のアクリルアミドゲルは、ネガティブ染色し、化合物＃１４２に特異的に結合したタンパク質のバンドを切り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によりタンパク質を同定した。【０１３７】
図１７は、アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。図中の矢印で示す約７５ｋＤａのタンパク質のバンドを解析した結果、Ｈｓｄ１７ｂ４（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｙｐｅ  ２、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５１６６０）であることが明らかとなった。【０１３８】
［実験例１９］
（非アルコール性肝炎モデルマウスを用いた実施例１の化合物の薬効評価）
非アルコール性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルの初期炎症に及ぼす化合物の影響を確認するために、ＮＡＳＨモデル作製用飼料（型式「Ａ０６０７１３０２」、リサーチダイエット社）を１週間摂食させた。摂食開始日から連日１９時に実施例１の化合物（２．５、５．０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。対照としては、通常の飼料を与え、０．５％ＤＭＳＯを添加した水を化合物と同容量経口投与したマウスを使用した。【０１３９】
摂食開始から１週間後に肝臓を採取し、Ｃｃｌ２、αＳＭＡ、コラーゲン  タイプＩ  α２、コラーゲン  タイプＩ  α１遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。なお、αＳＭＡ、コラーゲン  タイプＩ  α２、コラーゲン  タイプＩ  α１は、肝臓の線維化の指標となるマーカーである。【０１４０】
また、摂食開始から１週間後に血液を採取し、薬物投与２時間後の血中薬物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い測定した。【０１４１】
図１８ＡはＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＣｃｌ２の発現量を示すグラフである。図１８Ａに示すように、化合物の投与によりＣｃｌ２の発現量が低下することが明らかとなった。【０１４２】
図１８Ｂは実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。図１８Ｂに示すように、実施例１の化合物の平均血中濃度は、３２ｎＭであった。【０１４３】
図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅは、それぞれ、αＳＭＡ、コラーゲン  タイプＩ  α２（Ｃｏｌ１α２）、コラーゲン  タイプＩ  α１（Ｃｏｌ１α１）遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅに示すように、実施例１の化合物を５ｍｇ／ｋｇ投与した群において、αＳＭＡ、コラーゲン  タイプＩ  α２、コラーゲン  タイプＩ  α１遺伝子の発現量が有意に低下することが明らかとなった。【０１４４】
［実験例２０］
（実施例１の化合物の連日投与実験）
連日１９時にマウスに実施例１の化合物（５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。化合物の投与開始から２１日後に血液を採取し、薬物投与から２４時間後の化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い測定した。対照としては、通常の飼料を与え、０．５％ＤＭＳＯを添加した水を化合物と同容量経口投与したマウスを使用した。【０１４５】
図１９は実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。図１９に示すように、実施例１の化合物の平均血中濃度は、０．８ｎＭであった。【０１４６】
［実験例２１］
（実施例１の化合物の血中濃度の測定）
ＩＣＲマウスに実施例１の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ）を背部皮下投与した。化合物の投与から０．５、１、２、４、６、１２及び２４時間後に血液を採取し、化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。図２０は実施例１の化合物の血中薬物濃度を示すグラフである。【０１４７】
［実験例２２］
（ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの血清中ＡＬＴ活性に及ぼす化合物の影響の検討）
ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を８０ｍｇ／Ｌの濃度で水に溶解したものを飲水として、ＩＣＲマウスに飲水投与し、肝臓に慢性的な炎症を起こした。また、ＤＥＮの飲水投与開始直後より実施例１０の化合物（ＮＳ−３−０８６）を１５ｍｇ／ｋｇ飲水投与させた群を用意した。対照群としては、飲水として水道水を与えた群を使用した。【０１４８】
続いて、ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後及び１２週間後に各群のマウスから尾採血し、血清中アラニン・アミノトランスフェーラーゼ（ＡＬＴ）活性を市販のキット（型式「トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー」、和光純薬工業社製）を用いて測定した。【０１４９】
図２１Ａ及び図２１Ｂは、ＤＥＮの飲水投与開始から８週間後（図２１Ａ）及び１２週間後（図２１Ｂ）の血清中ＡＬＴ活性を示すグラフである。図２１Ａ及び図２１Ｂ中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は対照群の結果を示し、「ＤＥＮ」はＤＥＮ投与群の結果を示し、「ＤＥＮ＋実施例１０」は、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群の結果を示す。【０１５０】
その結果、対照群と比較して、ＤＥＮ飲水群はＡＬＴ活性が有意に高いことが明らかとなった。また、ＤＥＮ飲水による血清中ＡＬＴ活性の上昇は、実施例１０の化合物を同時に投与することにより抑制されたことが明らかとなった。【０１５１】
以上の結果は、ＤＥＮによる肝臓の炎症が、実施例１０の化合物の投与により抑制されたことを示す。【０１５２】
［実験例２３］
（Ｇ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量及び化合物の薬効に及ぼすＨｓｄ１７ｂ４ノックダウンの影響の検討）
マウス肝癌由来細胞であるＨｅｐａ１−６細胞を２つに分け、一方にＨｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡを、他方に対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示す。また、対照ｓｉＲＮＡとしては市販されているもの（ライフテクノロジーズ社、配列番号４にアンチセンス鎖の塩基配列を示す。）を使用した。【０１５３】
続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した。【０１５４】
図２２ＡはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現が抑制されたことが確認された。【０１５５】
続いて、化合物Ｎｏ．２の存在下（１０μＭ）又は非存在下（図２２Ｂ中、「ＤＭＳＯ」と示す。）において、Ｈｅｐａ１−６細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した。【０１５６】
図２２ＢはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、化合物Ｎｏ．２の存在下において、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量が有意に低下することが明らかとなった。更に、Ｈｓｄ１７ｂ４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、化合物Ｎｏ．２によるＧ０Ｓ２遺伝子の発現量の低下の効果が消失したことが明らかとなった。【０１５７】
以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質を介してＧ０Ｓ２遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。【０１５８】
［実験例２４］
（Ｇ０Ｓ２  ｍＲＮＡ発現量に及ぼすＨｓｄ１７ｂ４遺伝子の過剰発現の影響の検討）
マウス肝癌由来細胞であるＨｅｐａ１−６細胞に、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクター（Ｈｓｄ１７ｂ４−ｐｃＤＮＡ３．１）又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）をトランスフェクションした。【０１５９】
続いて、４８時間後に各細胞を回収し、全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。続いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子又はＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した。【０１６０】
図２３Ａ及び図２３ＢはリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図２３ＡはＨｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量を定量した結果を示し、図２３ＢはＧ０Ｓ２遺伝子の発現量を定量した結果を示す。【０１６１】
その結果、図２３Ａに示すように、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクターのトランスフェクションにより、Ｈｓｄ１７ｂ４遺伝子の発現量が有意に上昇したことが確認された。また、図２３Ｂに示すように、Ｈｓｄ１７ｂ４の発現ベクターのトランスフェクションにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量が有意に上昇したことが明らかとなった。【０１６２】
以上の結果より、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現量は、Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質を介して制御されていることが明らかとなった。【０１６３】
［実験例２５］
（Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域に及ぼす化合物の影響の検討）
図２４に示すように、各長さのＧ０Ｓ２転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターを作製した。続いて、これらの発現ベクターをマウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼの安定発現細胞を作製した。【０１６４】
続いて、各細胞の培地に、終濃度１０μＭの化合物Ｎｏ．２又はＤＭＳＯ（対照）を添加した。続いて、２４時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１６５】
図２４は、各細胞のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｇ０Ｓ２転写活性調節領域に存在するＳＴＡＴ５／６結合領域がなくなると、化合物Ｎｏ．２の添加によるルシフェラーゼの発現抑制効果が低減することが明らかとなった。【０１６６】
以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、ＳＴＡＴ５又はＳＴＡＴ６の転写を介して作用している可能性が考えられた。【０１６７】
［実験例２６］
（Ｇ０Ｓ２の転写活性に及ぼすＳＴＡＴ５の影響の検討）
Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の下流にルシフェラーゼのｃＤＮＡを連結した発現ベクターと、ＳＴＡＴ５発現ベクター又は空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、対照）とを、マウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションした。続いて、２４時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１６８】
図２５Ａは、Ｇ０Ｓ２の転写活性調節領域の構造を示す図である。また、図２５Ｂは、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、対照群と比較して、ＳＴＡＴ５発現ベクターをトランスフェクションした細胞は、有意に高いルシフェラーゼ活性を示すことが明らかとなった。【０１６９】
以上の結果より、Ｇ０Ｓ２遺伝子の転写活性は、ＳＴＡＴ５により直接制御されていることが明らかとなった。【０１７０】
［実験例２７］
（核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量に及ぼす化合物の影響の検討）
マウス線維芽細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞の培地に終濃度２．５、５、１０μＭの化合物Ｎｏ．２又はＤＭＳＯ（対照）を添加した。続いて、２４時間後に細胞を回収し、核内タンパク質を調製し、ウエスタンブロッティングによりＳＴＡＴ５タンパク質の存在量を測定した。【０１７１】
図２６は、ウエスタンブロッティングの結果を示すグラフである。その結果、対照と比較して、化合物Ｎｏ．２を添加した細胞では、化合物Ｎｏ．２の用量依存的に核内ＳＴＡＴ５タンパク質の存在量が低下した。【０１７２】
以上の結果より、化合物Ｎｏ．２は、核内ＳＴＡＴ５の存在量を調節することにより、Ｇ０Ｓ２遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。【０１７３】
［実験例２８］
（化合物Ｎｏ．２の血中及び肝臓中濃度の測定）
マウスに化合物Ｎｏ．２（１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。化合物Ｎｏ．２の投与から０分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間及び１２時間後に血液を採取し、化合物の血中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。また、化合物Ｎｏ．２の投与から０分、５分、１５分、３０分、１時間及び６時間後に肝臓を採取し、化合物の肝臓中濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。【０１７４】
図２７Ａは血液中の化合物Ｎｏ．２の濃度を示すグラフである。また、図２７Ｂは肝臓中の化合物Ｎｏ．２の濃度を示すグラフである。その結果、血液中の化合物Ｎｏ．２の濃度は投与後１５分目に最高濃度になり、肝臓中の化合物Ｎｏ．２の濃度は投与後５分目に最高濃度になることが明らかとなった。【０１７５】
［実験例２９］
（ＤＥＮによるマウス肝炎肝臓癌発症モデルの肝臓に及ぼす化合物の影響の検討）
ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）を８０ｍｇ／Ｌの濃度で水に溶解したものを飲水として、ＩＣＲマウスに飲水投与し、肝臓に慢性的な炎症及び肝癌を発症させた。また、ＤＥＮの飲水投与開始直後より実施例１０の化合物（ＮＳ−３−０８６）を１５ｍｇ／ｋｇ飲水投与させた群を用意した。対照群としては、飲水として水道水を与えた群を使用した。【０１７６】
続いて、ＤＥＮの飲水投与開始から１４週間後に各群のマウスをと殺し、肝臓を摘出して解析した。図２８Ａ、図２８Ｂ及び図２８Ｃは、ＤＥＮの飲水投与開始から１４週間後の肝臓の写真である。【０１７７】
図２８Ａは対照群（図中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真であり、図２８ＢはＤＥＮ飲水群（図中、「ＤＥＮ」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真であり、図２８ＣはＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群（図中、「ＤＥＮ＋実施例１０」と示す。）のマウスの肝臓の代表的な写真である。【０１７８】
その結果、対照群と比較して、ＤＥＮ飲水群のマウスの肝臓には、多数の腫瘍が認められ、また、肝臓の硬化が認められた。一方、ＤＥＮ及び実施例１０の化合物を投与した群のマウスの肝臓では、腫瘍の形成が抑制され、また、肝臓の硬化も抑制された。下記表１に、各群のマウスの肝臓中の腫瘍の数を示す。【０１７９】
【表１】
2016121862.tif 000028
【０１８０】
以上の結果は、ＤＥＮによる肝臓の癌化及び硬化が、実施例１０の化合物の投与により抑制されたことを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。
【図１】
2016121862.tif 000033
【図２】
2016121862.tif 000034
【図３】
2016121862.tif 000035
【図４Ａ】
2016121862.tif 000036
【図４Ｂ】
2016121862.tif 000037
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2016121862.tif 000039
【図５】
2016121862.tif 000040
【図６Ａ】
2016121862.tif 000041
【図６Ｂ】
2016121862.tif 000042
【図７Ａ】
2016121862.tif 000043
【図７Ｂ】
2016121862.tif 000044
【図７Ｃ】
2016121862.tif 000045
【図８Ａ】
2016121862.tif 000046
【図８Ｂ】
2016121862.tif 000047
【図８Ｃ】
2016121862.tif 000048
【図８Ｄ】
2016121862.tif 000049
【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
2016121862.tif 000051
【図９Ａ】
2016121862.tif 000052
【図９Ｂ】
2016121862.tif 000053
【図１０Ａ】
2016121862.tif 000054
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2016121862.tif 000056
【図１１Ａ】
2016121862.tif 000057
【図１１Ｂ】
2016121862.tif 000058
【図１１Ｃ】
2016121862.tif 000059
【図１２】
2016121862.tif 000060
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2016121862.tif 000062
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
2016121862.tif 000069
【図１６】
2016121862.tif 000070
【図１７】
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【図１８Ａ】
2016121862.tif 000072
【図１８Ｂ】
2016121862.tif 000073
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０】
2016121862.tif 000078
【図２１Ａ】
2016121862.tif 000079
【図２１Ｂ】
2016121862.tif 000080
【図２２Ａ】
2016121862.tif 000081
【図２２Ｂ】
2016121862.tif 000082
【図２３Ａ】
2016121862.tif 000083
【図２３Ｂ】
2016121862.tif 000084
【図２４】
2016121862.tif 000085
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
2016121862.tif 000088
【図２７Ａ】
2016121862.tif 000089
【図２７Ｂ】
2016121862.tif 000090
【図２８Ａ】
2016121862.tif 000091
【図２８Ｂ】
2016121862.tif 000092
【図２８Ｃ】
2016121862.tif 000093
【配列表】
2016121862000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月20日(2016.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物；
Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸；又は
Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤。
【化１】
2016121862.tif 000094
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化２】
2016121862.tif 000095
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物であり、Ｈｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、請求項１に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【請求項６】
鎮痛作用を示す、請求項１又は５に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、
前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質はＧ０Ｓ２阻害剤であると判定する工程と、を備える、Ｇ０Ｓ２阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【化３】
2016121862.tif 000096
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
【化４】
2016121862.tif 000097
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは２〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項１０】
抗炎症作用を示す、請求項１、５又は６に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００７］
しかしながら、炎症と体内時計機構との関連性には未解明な点が多い。そこで、本発明は、炎症に体内時計機構が関与しているか否かを明らかにし、新たな抗炎症剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［０００８］
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物；
Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸；又は
Ｈｓｄ１７ｂ４タンパク質に対する特異的結合物質である、Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤。
［化１］
2016121862.tif 000098
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
［化２］
2016121862.tif 000099
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
［２］前記式（１）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物であり、Ｈｓｄ１７ｂ４に対する結合能を有する、［１］に記載の
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
Ｇ０Ｓ２阻害剤。
［３］鎮痛作用を示す、［１］又は［２］に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
［４］抗炎症作用を示す、［１］〜［３］のいずれかに記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
［５］被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質はＧ０Ｓ２阻害剤であると判定する工程と、を備える、Ｇ０Ｓ２阻害剤のスクリーニング方法。
［６］下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［化３］
2016121862.tif 000100
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
［化４］
2016121862.tif 000101
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは２〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
発明の効果
［０００９］
本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。
図面の簡単な説明
［００１０］
［図１］肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。
［図２］実験例２において、５００μＬ培地中に、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌ添加した細胞におけるＮＦ−κＢ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
応答エレメントの活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。ボンフェローニ・ダン検定によりｓｉＲＮＡ非投与群の結果と比較した結果、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示す。
［図３］実験例３において、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡを投与したジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）暴露マウスの肝臓における、ＮＦ−κＢ応答エレメント（ＮＲＥ）へのＮＦ−κＢの結合活性を示すグラフである。各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。スチューデントｔ検定により対照ｓｉＲＮＡ投与群の結果と比較した結果、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。
［図４Ａ］実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「対照ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。
［図４Ｂ］実験例３における、対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。
［図４Ｃ］実験例３における、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群（図中、「Ｇ０Ｓ２ｓｉＲＮＡ」と示す。）のマウスの肝臓の病理顕微鏡写真である。
［図４Ｄ］実験例３における、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウスから摘出した肝臓の写真である。
［図５］実験例４において、Ｇ０Ｓ２  ｓｉＲＮＡ投与群のマウス及び対照ｓｉＲＮＡ投与群のマウスの肝臓におけるＣｃｌ２のｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。
［図６Ａ］実験例５における、化合物ライブラリーの一次スクリーニングの結果、
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月9日(2016.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物（但し、Ｎ−メチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン、Ｎ−プロピル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン及びＮ−ブチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジンを除く。）、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物からなる、Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤。
【化１】
2016121862.tif 000102
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
【化２】
2016121862.tif 000103
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）に対する結合能を有する、請求項１に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【請求項６】
鎮痛作用を示す、請求項１又は５に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、
前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質はＧ０Ｓ２阻害剤であると判定する工程と、を備える、Ｇ０Ｓ２阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【化３】
2016121862.tif 000104
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
【化４】
2016121862.tif 000105
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは２〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキルを表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項１０】
抗炎症作用を示す、請求項１、５又は６に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００７］
しかしながら、炎症と体内時計機構との関連性には未解明な点が多い。そこで、本発明は、炎症に体内時計機構が関与しているか否かを明らかにし、新たな抗炎症剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［０００８］
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物（但し、Ｎ−メチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン、Ｎ−エチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン、Ｎ−プロピル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジン及びＮ−ブチル−Ｎ’−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］グアニジンを除く。）、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物からなる、Ｇ０／Ｇ１  Ｓｗｉｔｃｈ  ２（Ｇ０Ｓ２）阻害剤。
［化１］
2016121862.tif 000106
［式（１）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ２は
［化２］
2016121862.tif 000107
（ここで、Ｒ５は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ３は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ４は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。ｎが２以上の整数である場合、複数存在するＲ５は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
［２］Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ（１７−β）Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）に対する結合能を有する、［１］に記載のＧ０Ｓ２
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
阻害剤。
［３］鎮痛作用を示す、［１］又は［２］に記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
［４］抗炎症作用を示す、［１］〜［３］のいずれかに記載のＧ０Ｓ２阻害剤。
［５］被検物質の存在下でＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が、前記被検物質の非存在下におけるＨｓｄ１７ｂ４タンパク質の活性と比較して低下していた場合に、前記被検物質はＧ０Ｓ２阻害剤であると判定する工程と、を備える、Ｇ０Ｓ２阻害剤のスクリーニング方法。
［６］下記式（２）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［化３］
2016121862.tif 000108
［式（２）中、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ７は
［化４］
2016121862.tif 000109
（ここで、Ｒ１０は炭素数１〜３のハロゲン化アルキル基を表し、ｍは２〜５の整数を表す。）を表し、Ｒ８は炭素数１〜１５のアルキル基を表し、Ｒ９は水素原子又はカルボン酸エステル基を表す。複数存在するＲ１０は互いに同一であっても異なっていてもよい。］
発明の効果
［０００９］
本発明によれば、新たな抗炎症剤を提供することができる。
図面の簡単な説明
［００１０］
［図１］肝臓癌が発症する過程を示す模式図である。
［図２］実験例２において、５００μＬ培地中に、Ｇ０Ｓ２に対するｓｉＲＮＡを、０、１２．５、２５及び５０ｐｍｏｌ添加、した細胞におけるＮＦ−κＢ
【国際調査報告】
2016121862.tif 000110
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2016121862.tif 000112
2016121862.tif 000113
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