(57)【要約】  微生物及び／又はその培養物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ経由で、アシルＣｏＡ還元酵素による酵素反応を利用してブタンジオール類を製造する方法であって、前記微生物は、アシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性を欠損もしくは低減されていることを特徴とする、ブタンジオール類の製造方法。
2014091991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物及び／又はその培養物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ経由で、アシルＣｏＡ還元酵素による酵素反応を利用してブタンジオール類を製造する方法であって、  前記微生物は、アシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性を欠損もしくは低減されていることを特徴とする、ブタンジオール類の製造方法。
【請求項２】
アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
【請求項３】
前記微生物は、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）をコードする遺伝子及びアシルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ番号：１．２．１．１０）をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
【請求項４】
前記微生物は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）をコードする遺伝子及び４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）をコードする遺伝子を更に含む、請求項３に記載のブタンジオール類の製造方法。
【請求項５】
前記微生物は、大腸菌、酵母、コリネ型細菌又はクロストリジウム属細菌である、請求項１に記載のブタンジオール類の製造方法。
【請求項６】
前記微生物は、アシルＣｏＡチオエステラーゼII遺伝子（ｔｅｓＢ）のＣＤＳ領域が欠損した大腸菌である、請求項５に記載のブタンジオール類の製造方法。
【請求項７】
微生物のアシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性を欠損もしくは低減させる工程を含むことを特徴とする、ブタンジオール類製造用微生物の作製方法。
【請求項８】
アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、請求項７に記載のブタンジオール類製造用微生物の作製方法。
【請求項９】
β−ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）をコードする遺伝子及びアシルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ番号：１．２．１．１０）をコードする遺伝子を含み、アシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性が欠損もしくは低減された微生物。
【請求項１０】
アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）をコードする遺伝子及び４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）をコードする遺伝子を更に含む請求項９に記載の微生物。
【請求項１２】
前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネ型細菌又はクロストリジウム属細菌である、請求項９のいずれかに記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブタンジオール類の製造方法、ブタンジオール類製造用微生物の作製方法及び微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源の枯渇や地球温暖化対策などの観点から、再生可能資源を原料とした化合物製造プロセスが注目されている。特に、バイオマスを原料として、生物化学的プロセスで種々のポリマー原料化合物や化学品原料化合物を製造する、所謂バイオリファイナリーが広く検討されている。【０００３】
バイオマスの原料転換が期待されている化合物として、ブタンジオール類が挙げられる。例えば、１，３−ブタンジオールは溶剤として、また、１，４−ブタンジオールは、精密有機化学品の合成原料、ポリエステル及びエンジニアリングプラスチックのモノマー単位などで広く使用されており、その市場規模は大きい。そのため、バイオマスなどの再生可能資源を原料とした生物化学的プロセスで、効率良くブタンジオール類を製造する方法に対する要求が大きくなっている。【０００４】
生物化学的プロセスを用いたブタンジオール類の製造方法としては、例えば、特許文献１乃至２及び非特許文献１に記載された方法が挙げられる。【０００５】
【特許文献１】特許第４３８０７０４号明細書
【特許文献２】国際公開２００８／１１５８４０号公報
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｙ  Ｙｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７，  ４４５−４５２  （２０１１）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１乃至２及び非特許文献１に記載された方法は、プロセスが複雑である。【０００８】
上記課題に対して、１，４−ブタンジオールの経済的な製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のものを含む。
［１］微生物及び／又はその培養物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ経由で、アシルＣｏＡ還元酵素による酵素反応を利用してブタンジオール類を製造する方法であって、前記微生物は、アシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性を欠損もしくは低減されていることを特徴とする、ブタンジオール類の製造方法。【００１０】
［２］アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、［１］に記載のブタンジオール類の製造方法。【００１１】
［３］前記微生物は、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）をコードする遺伝子及びアシルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ番号：１．２．１．１０）をコードする遺伝子を含む、［１］に記載のブタンジオール類の製造方法。【００１２】
［４］前記微生物は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）をコードする遺伝子及び４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）をコードする遺伝子を更に含む、［３］に記載のブタンジオール類の製造方法。【００１３】
［５］前記微生物は、大腸菌、酵母、コリネ型細菌又はクロストリジウム属細菌である、［１］に記載のブタンジオール類の製造方法。【００１４】
［６］前記微生物は、アシルＣｏＡチオエステラーゼII遺伝子（ｔｅｓＢ）のＣＤＳ領域が欠損した大腸菌である、［５］に記載のブタンジオール類の製造方法。【００１５】
［７］微生物のアシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性を欠損もしくは低減させる工程を含むことを特徴とする、ブタンジオール類製造用微生物の作製方法。【００１６】
［８］アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、［７］に記載のブタンジオール類製造用微生物の作製方法。【００１７】
［９］β−ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）をコードする遺伝子及びアシルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ番号：１．２．１．１０）をコードする遺伝子を含み、アシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）の活性が欠損もしくは低減された微生物。【００１８】
［１０］アシルＣｏＡヒドロラーゼが、ＥＣ番号：３．１．２．２又はＥＣ番号：３．１．２．２０に分類されるアシルＣｏＡヒドロラーゼである、［９］に記載の微生物。【００１９】
［１１］エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）をコードする遺伝子及び４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）をコードする遺伝子を更に含む［９］に記載の微生物。【００２０】
［１２］前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネ型細菌又はクロストリジウム属細菌である、［９］に記載の微生物。
【発明の効果】
【００２１】
ブタンジオール類の選択的、経済的な製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本実施形態のブタンジオール類の製造方法の酵素系の一例である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、「ＣｏＡ」とは、「コエンザイムＡ」を意味する。また、「％」は、特に記載のない限り、「質量％」を意味する。「ｐｐｍ」は質量基準である。【００２４】
本実施形態は、微生物を用いて、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由してアシルＣｏＡ還元酵素による還元工程を含むブタンジオール類の製造方法を含む。本発明者らは、ブタンジオール類の生産性を向上させるべく種々検討した。具体的には、宿主微生物が本来有する、ブタンジオール類の生産量に与える影響の大きい（副反応）酵素系の存在を精査した。その結果、宿主由来の酵素に起因する３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸への生成反応が、副反応酵素系の１つであることを見出した。即ち、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸への加水分解反応が、アシルＣｏＡ還元酵素による還元工程、つまり、最終的にブタンジオール類の生成に多大な影響を与えることを見出した。【００２５】
かかる知見に基づき、本発明者らは更に、当該生物化学的製造方法において用いる宿主菌が有する特定のアシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）活性を欠損もしくは低減することにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸への加水分解反応を抑制することができ、結果、ブタンジオール類の生産量を向上できることを見出した。【００２６】
以下、本実施形態で使用される、微生物の特徴、微生物の作製方法、微生物の使用方法（即ち、ブタンジオール類の製造方法）及び製造されたブタンジオール類の取得方法などについて、説明する。【００２７】
（宿主微生物）
本実施形態で用いられる宿主微生物は、アシルＣｏＡヒドロラーゼの活性を欠損もしくは低減された微生物である。このような微生物を、ブタンジオール類製造のための宿主として用いることにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由し、アシルＣｏＡ還元酵素による還元工程を含むブタンジオール類の製造方法において、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡがアシルＣｏＡヒドロラーゼにより加水分解され３−ヒドロキシブタン酸に導かれることが抑制され、結果、ブタンジオール類の生産性が向上する。【００２８】
活性を欠損もしくは低減する対象となる「アシルＣｏＡヒドロラーゼ」としては、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの分解活性を有する酵素であれば特に制限はないが、具体的にはＥＣ番号：３．１．２．２に属するアシルＣｏＡヒドロラーゼ、ＥＣ番号：３．１．２．２０に属するアシルＣｏＡヒドロラーゼ及びこれらのホモログなどが挙げられる。これらは、アシルＣｏＡチオエステラーゼ、チオエステラーゼ、チオエステラーゼＩＩ等とも通称されるが、本発明における「アシルＣｏＡヒドロラーゼ」はこれらを包含する。【００２９】
なお、本明細書において、活性の「欠損もしくは低減」とは、当該改変の対象となる親株に対し、対象となるアシルＣｏＡヒドロラーゼの活性が二分の一以下に低減されていることを意味する。このような欠損もしくは低減により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの分解が回避され、ブタンジオール類の生産量が実質的に向上する。なお、いずれの細菌株を用いる実施形態においても、「アシルＣｏＡヒドロラーゼ」活性は、大腸菌ＪＭ１０９株に比較し１／２以下に低減されていることがより好ましい。  本実施形態における「欠損もしくは低減」は、以下のようにして確認することができる。例えば、当該宿主微生物を、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する一連の酵素をコードする遺伝子により形質転換し、これら酵素反応の基質となる適当な炭素源、例えばグルコース等を含む培地により培養する。生成した３−ヒドロキシブチリルＣｏＡはアシルＣｏＡヒドロラーゼの存在により加水分解されて、３−ヒドロキシブタン酸として菌体外に排出される。この３−ヒドロキシブタン酸を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の公知の方法により定量することにより、アシルＣｏＡヒドロラーゼの「欠損もしくは低減」を評価することができる。【００３０】
本実施形態に用いられる、改変の対象となる親株の微生物の例としては、後述する種々の遺伝子を導入することができる宿主微生物であり、遺伝子組み換え技術を適用することができ、かつ、活性の欠損もしくは低減の対象となるアシルＣｏＡヒドロラーゼを発現する微生物であれば、特に限定されない。【００３１】
本実施形態で使用可能な宿主微生物の具体例としては、産業上の利用の観点から、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルキシアヌス等が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムなどが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、コリネバクテリウム・グルタミカムを使用することが、形質転換が容易であるため、好ましく、大腸菌を使用することが、より好ましい。【００３２】
大腸菌としては、例えば大腸菌Ｋ−１２株ないしはＢ株およびこれらの派生株、さらに具体的には大腸菌ＢＷ２５１１３株をはじめとするＢＷ株、ＪＭ１０９株をはじめとするＪＭ株、ＭＶ１１８４株はじめとするＭＶ株、ＤＨ５αをはじめとするＤＨ株、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ２１株等ならびにこれらの派生株が挙げられる。【００３３】
［アシルＣｏＡヒドロラーゼ活性欠失もしくは低減宿主微生物の作製］
本実施形態に用いられる、アシルＣｏＡヒドロラーゼ活性を欠損もしくは低減した宿主の作成方法には特に制限はなく、微生物が有する遺伝子の発現を欠損・低減するための既知の方法で作成することができる。具体例としては、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソ グアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等を用いた化学修飾、インターカレーション剤を用いた複製時エラーの誘発、紫外線や放射線等を用いた物理的な損傷への修復応答におけるエラー誘発等を利用したＤＮＡへのランダム変異の導入、もしくは、トランスポゾンやファージ感染等により誘発されるＤＮＡの欠失や挿入による方法などが挙げられる。また、目的とする酵素の塩基配列が既知である場合は、当該遺伝子又はその周辺領域に対し相補配列をもつＤＮＡ断片を導入することによる相同組換えを利用したＤＮＡへの欠失や挿入の導入、などの方法を採用しても良い。そのような変異の導入の確認及びその効果については、既知の種々ＤＮＡ配列解析技術が適用できるほか、当該酵素の欠失による実質的な当該酵素反応生成物の低減を分析することにより確認することができる。【００３４】
宿主微生物への遺伝子の導入は種々の知られた方法、例えば制限酵素／ライゲーションに基づく方法、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング方法などを適宜組み合わせて用いることで、上記遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより可能である。又は相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子又はその一部を挿入することにより可能である。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。本発明において遺伝子には、ＤＮＡ及びＲＮＡが包含され、好ましくはＤＮＡである。【００３５】
前記遺伝子を連結するベクターとしては、宿主で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば大腸菌において外来遺伝子導入に利用されているプラスミド、ファージ及びコスミド等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、ｐＨＳＧ３９８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＥＴ１７ｂ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１等が挙げられ、ファージとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ  ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が挙げられる。これらのいくつかは市販されており、市販品（キット）をその手順書に従いそのまま、又は適宜改変して使用することができる。【００３６】
上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続してもよい。使用する発現プロモーターは、特に制限されず、宿主に応じて当業者が適宜選択可能である。例えば大腸菌において外来遺伝子発現に利用されているＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λ−ＰＬプロモーター、又は大腸菌由来の硝酸呼吸に関与する硝酸還元遺伝子ｎａｒＧＨＪＩオペロンのＮａｒプロモーター領域や、大腸菌の硝酸還元酵素遺伝子であるＦｒｄ遺伝子のプロモーター領域を利用することもできる。【００３７】
また場合により宿主微生物の本来の遺伝子を破壊してその遺伝子を発現させないようにすることも好ましい。遺伝子破壊の方法については、大腸菌における遺伝子破壊に利用されている公知の方法を使用できる。具体的には、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の当技術分野でノックアウト細胞等を作製する際に用いられる方法を用いることが出来る。また、破壊したい遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、破壊したい遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法も利用できる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ９．４７−９．５８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い作製することができる。又、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。【００３８】
相同置換を起こす位置又はトラップベクターを挿入する位置は、破壊したい標的遺伝子の発現を消失させる変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域である。【００３９】
さらに、前記ベクターの宿主への導入方法としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌へのベクター導入に一般的に利用されている電気パルス法、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。【００４０】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、この核酸断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子を連結した核酸断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えにより導入することもできる。【００４１】
さらに目的とする遺伝子が導入された組換え微生物を選択する方法は、特に制限されないが、目的とする遺伝子が導入された組換え微生物のみを、容易に選択できる手法によるものが好ましい。【００４２】
なお、本実施形態における形質転換微生物は、微生物培養菌体そのもの又はその培養物の各種形態で使用されても良い。本実施形態における微生物の培養物は、具体的には、微生物培養菌体の培地・緩衝液等媒体による懸濁物、微生物培養菌体からの無細胞抽出液、さらにこの無細胞抽出液から当該反応を触媒する成分を濃縮・精製・抽出したもの等の処理物を含む。本実施形態における微生物の培養物は更に、前記の微生物の処理物を難溶性の担体に固定化したものを含む。このような固定化担体としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルホルムアミド、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グルコマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン等、更にこれらの共重合、架橋化物など、前述の微生物菌体もしくはその処理物を包合した水難溶性の固形分を形成するような化合物が挙げられる。これらは１種類を単独で使用しても良く、２種類以上を混合して使用しても良い。また、活性炭、多孔質セラミックス、グラスファイバー、多孔質ポリマー成形体、ニトロセルロース膜など、予め固形物として形成された物体上に微生物もしくはその抽出液・抽出成分を保持させたものも、微生物の培養物として用いることもできる。【００４３】
（ブタンジオール類の製造）
図１に、本実施形態のブタンジオール類（１，３−ブタンジオール及び１，４−ブタンジオール）の製造方法の酵素系の一例を示す。本実施形態において、ブタンジオール類は、前述した一連の遺伝子を、形質転換などにより微生物体内で発現させた培養物を用いて得ることができる。なお、遺伝子は、個別に又は一連のクラスターとして、任意のベクターに挿入して宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源として培地中で培養することで、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物がブタンジオール類を製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。【００４４】
（１，３−ブタンジオールの製造）
以下、各々の酵素反応における酵素について説明する。【００４５】
［３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給］
本実施形態の１，３−ブタンジオールの製造方法における、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給方法には特に制限はなく、既知の様々な方法が用いられる。【００４６】
一例として、先ず、解糖系などの既知の反応経路により得られるアセチルＣｏＡの供給下で、２分子のアセチルＣｏＡから１分子のＣｏＡが脱離し、アセトアセチルＣｏＡを与える、β−ケトチオラーゼ（ＥＣ番号：２．３．１．９）をコードする遺伝子又はそのホモログを用いた酵素反応を利用してアセトアセチルＣｏＡを供給する。また、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡを基質として、不可逆にアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素（ＥＣ番号：２．３．１．１９４）をコードする遺伝子又はそのホモログを使用して、アセトアセチルＣｏＡを供給しても良い。アセトアセチルＣｏＡ合成酵素の詳細については、例えばＵｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ  ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０７，  １１２６５−１１２７０  （２０１０）．などの非特許文献を参照することができる。次に、得られたアセトアセチルＣｏＡを還元して３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）又はこれらのホモログを用いた酵素反応により、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。なお、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）を使用した場合、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができ、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）を使用した場合、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。【００４７】
また、他の例として、３−ヒドロキシブタン酸に直接ＣｏＡを転移する酵素として、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ番号：２．８．３．１）が知られている。プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡの供給下で、微生物又は該微生物を含む培養物に３−ヒドロキシブタン酸を供給することにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。【００４８】
［アシルＣｏＡ還元酵素］
本実施形態で用いられるアシルＣｏＡ還元酵素は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを還元して３−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。【００４９】
上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ番号：１．２．１．１０）又はそのホモログが挙げられる。【００５０】
なお、得られた３−ヒドロキシブタナールは、後述する宿主が通常有するアルコール還元酵素により、１，３−ブタンジオールへと導かれるが、アルコール還元酵素をコードする遺伝子を追加的に発現させて、１，３−ブタンジオールを製造しても良い。【００５１】
（１，４−ブタンジオールの製造）
図１には、本実施形態の１，４−ブタンジオールの製造方法の酵素系の一例も示した。本実施形態による１，４−ブタンジオールの製造においては、前述した１，３−ブタンジオールの製造と同様にして供給される３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを、例えばクロトニルＣｏＡ、3−ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由する酵素反応を利用して、１，４−ブタンジオールへと導くことができる。以下、各々の酵素反応における酵素について説明する。【００５２】
［エノイルＣｏＡヒドラターゼ］
本実施形態で使用される、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを脱水し、クロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の具体例としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）又はそのホモログが挙げられる。上記酵素の詳細については、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｃｋ，  Ｊ．Ｍ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．  ＩＩ．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄ−（-）−β−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８  （１９６９）  ２７４８−２７５５．の非特許文献などを参照することができる。【００５３】
また、本実施形態で使用される（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の具体例としては、特に限定されないが、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．５５（３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ）又はＥＣ番号：４．２．１．１１９）などが挙げられる。上記酵素の詳細については、Ｆｕｋｕｉ，  Ｔ．，  Ｓｈｉｏｍｉ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｄｏｉ，  Ｙ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  （Ｒ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  （１９９８）  ６６７−６７３．、またはＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．  ＩＩ．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄ−（−）−ｂｅｔａ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ．，  Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ  ＧＪ，  Ｍｅｒｒｉｃｋ  ＪＭ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，  ８  ２７４８−２７５５  （１９６９）．等の非特許文献などを参照することができる。【００５４】
［ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ］
本実施形態で使用されるビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼは、クロトニルＣｏＡのオレフィンを転位してビニルアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。【００５５】
上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、限定されないが、ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）又はそのホモログなどが挙げられる。上記酵素の詳細については、例えば、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １７４（３）  １８９−１９９  （２０００）．などの非特許文献を参照することができる。【００５６】
［４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ］
本実施形態において、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒトラターゼは、ビニルアセチルＣｏＡを水和して４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。【００５７】
上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１２０）又はそのホモログなどが挙げられる。上記酵素の詳細については、例えば、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ，  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １７４（３）  １８９−１９９  （２０００）．などの非特許文献を参照することができる。なお、この非特許文献における事例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼと、前述のビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ（ＥＣ番号：５．３．３．３）との複合酵素及びこれをコードする遺伝子に関するものである。しかしながら、各々の酵素の機能を適切に提供することができれば、各々の酵素をコードする遺伝子を別個に使用しても良いし、酵素タンパク質又は触媒サブユニットをコードする遺伝子を使用しても良い。【００５８】
［アシルＣｏＡ還元酵素］
本実施形態で使用されるアシルＣｏＡ還元酵素は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを還元して４−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。【００５９】
上述した反応を触媒する酵素の具体例としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（アシル化）（ＥＣ番号：４．２．１．１０）又はそのホモログが挙げられる。【００６０】
なお、得られた４−ヒドロキシブタナールは、後述する宿主が通常有するアルコール還元酵素により、１，４−ブタンジオールへと導かれるが、アルコール還元酵素をコードする遺伝子を追加的に発現させて、１，４−ブタンジオールを製造しても良い。【００６１】
本実施形態におけるホモログは、オーソログ及びパラログを含む。オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化により生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。パラログとは、同種内において、種分化でなく遺伝子重複によって生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。ホモログとは、オーソログ、パラログに関係なく配列に同一性を有する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。【００６２】
より具体的には、上述した遺伝子のホモログ（遺伝子）は、当該遺伝子に対して９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性のある塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、その遺伝子と全く同一又はその塩基の１個若しくは数個が欠失、置換又は付加された遺伝子を指す。【００６３】
また、ホモログ遺伝子は、対象の遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を含む。具体的には、公知のデータベースに対するホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）を適用して、又は、同定遺伝子の少なくとも一部から成るプローブ（当該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）を用いたストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法に基づいて、遺伝子又はその遺伝子による形質転換で得られる酵素として取得することができる。また、当業者であれば、塩基配列を置換等することによって、自ら設計することが可能である。なお、ここで言うストリンジェントな条件としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）の非特許文献に記載されたハイブリダイズさせる条件が挙げられる。ハイブリダイズさせる条件とは、より具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムで、ｐＨ：７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート溶液及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に、プローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温保持し、ハイブリダイズさせる条件である。【００６４】
［培養方法］
本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をＬＢ培地などの栄養培地で１５℃〜４０℃、望ましくは１８℃〜３７℃の温度で２４時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば０．０１〜５０％、望ましくは０．１〜３０％のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で１時間〜２００時間程度培養し、その過程で培養液中に１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールを蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。【００６５】
微生物を培養するための培地炭素源としては、グルコースやシュークロース、フルクトース等の糖類、グリセロール等のポリオール、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物またはこれらのアルカリ金属塩、ｎ−パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、または例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％〜３０％、望ましくは０．１％〜２０％程度の濃度で用いることができる。【００６６】
微生物を培養するための培地窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉等の天然有機物を単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常０．０１％〜２０％、望ましくは０．１％〜１０％程度の濃度で用いることができる。【００６７】
さらに必要に応じて、リン酸２水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩を菌の生育、酵素活性の改善のために添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩に関しては０．０１％〜５％、マグネシウム塩においては１０ｐｐｍ〜１％、他の化合物では０．１ｐｐｍ〜１，０００ｐｐｍ程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ程度、菌の生育、酵素活性を改善のために添加することができる。【００６８】
培地のｐＨは、４．５〜９、望ましくは５〜８に調整することが望ましい。また前記のような培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応原料を含む水、生理食塩水、または培養のｐＨと同等のｐＨに調整されたリン酸、酢酸、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとこれらの塩よりなる緩衝液などに再度懸濁し、反応させることは、反応液中の夾雑物を低減し、後の生成物の分取を簡便にするために有用である。反応中のｐＨは、充分な濃度の緩衝液を用いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行により上記ｐＨを逸脱する場合においては、同様のｐＨとなるよう水酸化ナトリウム、アンモニアなどを用いて適宜調整することが望ましい。【００６９】
反応液中に１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールが蓄積することにより、反応速度が低下する場合、生成物の濃度に応じて反応液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液等を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。この操作は、遠心分離器や分離膜等を用いて連続的に、あるいは回分的にも実施することができる。【００７０】
反応液中に生成した１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールの分離回収および精製は、１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールの生成量が実質的な量に達した時点で、反応液から菌体を遠心分離により除去してから、あるいはそのままの反応液に、一般の有機化合物の分離回収および精製の手段を用いることで行うことができる。例えば、培養液から菌体その他を除去したろ液より、適当な有機溶媒を用いて抽出する。この抽出物をそのまま留去するほか、更に適当な溶媒で再抽出する、あるいはシリカゲル等のクロマトグラフィーを用いて精製する、もしくは多段蒸留等に供することにより、高純度の１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールが得られる。
【実施例】
【００７１】
（実施例及び比較例）
次に、実施例を説明することにより、本発明をより詳細に説明する。【００７２】
表１に、配列表に対応する配列番号の遺伝子と、該遺伝子がコードする酵素の関係についてまとめたものを示す。【００７３】
【表１】
2014091991.tif 000003
［参考例１］
大腸菌Ｋ−１２株の公知の全ゲノム配列情報を参照して、相同組換え法を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株のゲノム上より、アシルＣｏＡヒドロラーゼであるアシルＣｏＡチオエステラーゼＩＩ遺伝子（ｔｅｓＢ）のＣＤＳ領域が欠失したＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔＴｅｓＢ株を調製した。なお、相同組換え法による遺伝子欠損については、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ (１９７２); Ｍａｔｓｕｙａｍａ, Ｓ. ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ, Ｓ., Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ., １６２, １１９６ (１９８５)の非特許文献を参照し、常法に従って実施した。欠損したＣＤＳ領域の配列については、配列番号６に示す。【００７４】
配列番号１で示される遺伝子配列の上下流に、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩサイトの上流側ＣＡＴ、下流側ＡＴＧをそれぞれ含む上流側、下流側１５塩基対分に対応する配列をそれぞれ５'末端側、３'末端側に付加した平滑末端断片を常法により調製した。この断片と、ｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）をＮｄｅＩ処理した断片とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によりライゲーションし、プラスミドｐＥＴＢＤ１を得た。【００７５】
ｐＥＴＢＤ１と同様の方法により、配列番号２で示される遺伝子配列をｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩサイトをターゲットとして挿入した、配列２を含むプラスミドｐＥＴＢＤ２を得た。【００７６】
ｐＥＴＢＤ１の配列１の終止コドン下流に位置する、ｐＥＴ１７ｂマルチクローニングサイト由来のＥｃｏＲＩサイトを制限酵素処理により切断し、ｐＥＴＢＤ１の開環断片を調製した。次にｐＥＴＢＤ２の配列２の領域と上流のｐＥＴ１７ｂ由来Ｔ７プロモーターを含む領域の上下流に、前記ｐＥＴＢＤ１のＥｃｏＲＩサイトを含む上流側１５ｂｐ分、下流側１５ｂｐ分に対応する配列を付加した断片を、ＰＣＲにより調製した。得られた２つの断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔによりライゲーションし、配列１及び２を含むプラスミドｐＥＴＢＤ１−２を得た。【００７７】
プラスミドｐＥＴＢＤ１−２により、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔＴｅｓＢ株を常法に従って形質転換した。【００７８】
［参考例２］
形質転換宿主をＪＭ１０９（ＤＥ３）に変更した以外は、参考例１と同様の方法によりプラスミドｐＥＴＢＤ１−２による形質転換体を取得した。【００７９】
［実施例１］
参考例１で調製したｐＥＴＢＤ１−２の配列２の下流に位置する、ｐＥＴ１７ｂベクター由来ＥｃｏＲＶサイトＧＡＴＡＴＣの中央をターゲットとしたインバースＰＣＲにより、プラスミドｐＥＴＢＤ１−２の開環断片を調製した。【００８０】
ｐＥＴＢＤ１と同様の方法により、配列番号５で示される遺伝子配列をｐＥＴ１７ｂのＮｄｅＩサイトをターゲットとして挿入した、配列５を含むプラスミドｐＥＴＢＤ５を得た。【００８１】
次に、ｐＥＴＢＤ５の配列５の領域と上流のｐＥＴ１７ｂ由来Ｔ７プロモーターを含む領域の上下流に、前記ｐＥＴＢＤ１−２のＥｃｏＲＶサイト配列を含む上流側１５ｂｐ分、下流側１５ｂｐ分に対応する配列を付加した断片を、ＰＣＲにより調製した。【００８２】
得られたこれらの断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔによりライゲーションし、配列１、２、５を含むプラスミドｐＥＴＢＤ１−２−５を調製した。当該プラスミドにより、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔＴｅｓＢ株を常法に従い形質転換した。【００８３】
［比較例１］
形質転換宿主を、ＪＭ１０９（ＤＥ３）に変更した他は、実施例１と同様の方法によりプラスミドｐＥＴＢＤ１−２−５による形質転換体を取得した。【００８４】
［実施例２］
実施例１で調製したｐＥＴＢＤ１−２−５に、更に実施例１と同様の方法により、ｐＥＴＢＤ１−２−５の配列５の下流側配列をターゲットとして、配列番号３（エノイルＣｏＡヒドラターゼに対応）、配列番号４（ビニルアセチルＣｏＡデルタイソメラーゼ、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼに対応）で示される遺伝子配列をｐＥＴ１７ｂ由来Ｔ７プロモーターとともにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔの方法を用いて順次下流側に追加したプラスミドｐＥＴＢＤ１−２−５−３−４を調製した。当該プラスミドにより、ＪＭ１０９（ＤＥ３）ΔＴｅｓＢ株を常法に従って、形質転換体を得た。【００８５】
［比較例２］
形質転換宿主を、ＪＭ１０９（ＤＥ３）に変更した他は、実施例２と同様の方法により、プラスミドｐＥＴＢＤ１−２−５−３−４による形質転換体を取得した。【００８６】
各実施例、比較例及び参考例で得られた形質転換体をそれぞれ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、１２時間、好気下で培養した。培養液０．１ｍＬを、グルコース１％、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含むＬＢ培地５ｍＬに移植し、３０℃、４８時間、好気下で培養した。培養液上清を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：カラム；Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供試した。培養液中に生成した３−ヒドロキシブタン酸量、１，３−ブタンジオール量及び／又は１，４−ブタンジオール量を、表２に示す。【００８７】
【表２】
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表２より明らかであるように、本実施形態の生物化学的手法を利用したブタンジオール類の製造方法は、宿主微生物が有する特定のアシルＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ番号：３．１．２．−）活性を欠損もしくは低減することにより、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡから３−ヒドロキシブタン酸への加水分解反応が抑制される。そのため、１，３−ブタンジオール及び／又は１，４−ブタンジオールの生産性を向上することができる。【００８８】
本出願は、２０１２年１２月１２日に日本国特許庁に出願された特願２０１２−２７１５１９号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１２−２７１５１９号の全内容を本出願に援用する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014091991.tif 000007
2014091991.tif 000008
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