(57)【要約】  試料のＣＡＲＳスペクトルなどのスペクトルデータを、データ量を抑えて高速に取得する。試料に集光して照射される照射光の走査中、試料から発生される光を分光する分光器の検出部の露光状態を継続し、試料内の複数の位置で発生されたスペクトルを積算したスペクトルデータを取得する。
2015181872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
試料を保持する試料保持部と、
前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された試料に集光して照射する照射光学系と、
光照射によって試料から発生された光を分光する分光部と、
前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
前記照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部と、を備え、
前記検出部は、前記照射制御部による試料への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする光学分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記検出部は前記積算したスペクトルを複数出力し、前記複数出力されたスペクトルを平均することを特徴とする光学分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記試料保持部に保持された試料の画像データを取得する画像データ取得部と、
取得した画像データを元に試料の形状を認識する形状認識部と、を備え、
前記照射制御部は、前記形状認識部によって認識した試料の形状にもとづき、試料の特定領域に前記光源からの光束を集光して照射することを特徴とする光学分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記スペクトルはＣＡＲＳスペクトルであることを特徴とする光学分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部はスキャンミラーを含み、
前記スキャンミラーの制御方向が前記検出部の分光方向とほぼ垂直な方向であることを特徴とする光学分析装置。
【請求項６】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部は前記試料を２次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部は前記試料を３次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
【請求項８】
光源と、
試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、
前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、
光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、
前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、
前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、
破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、
前記検出部は、前記照射制御部による細胞への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする生体分子解析装置。
【請求項９】
請求項８に記載の生体分子解析装置において、
前記細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することを特徴とする生体分子解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学分析装置の高性能化に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡は言うまでも無く自然科学、工学、産業分野において無くてはならない観察ツールである。特に近年は、照明光源としてレーザを用いたより高機能な顕微鏡が先端技術開発において必須となりつつある。その代表例が蛍光共焦点顕微鏡であり、蛍光試薬との組み合わせにより生体試料中の特定物質の分布を観察する手段として医学、生物学の分野において広く普及している。更に近年の高性能な短パルスレーザ光源の登場とあいまって、非線形光学効果を用いた非線形光学顕微鏡の技術発展と、医学、生物学分野におけるニーズの高まりが著しい。非線形光学顕微鏡（あるいは非線形顕微鏡）の例として、二光子蛍光顕微鏡（非特許文献１）、ＳＨＧ顕微鏡（非特許文献２）、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡（非特許文献３）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡（非特許文献４）などが知られている。例えば二光子蛍光顕微鏡は、試料に照射するレーザ光として試料の吸収が小さい波長域を選択することができ、従来の蛍光共焦点顕微鏡と比較して深部のイメージングが可能である。ＳＨＧ顕微鏡は試料からの第二高調波を観察する顕微鏡であり、コラーゲンなどの繊維構造や、細胞膜など特定の構造体を選択的に検知することができる。ＣＡＲＳ顕微鏡は励起光とストークス光の２種類のレーザ光を試料に照射し、これらの光の差周波が試料分子の固有振動に共鳴した結果生じるアンチストークス光を観測する顕微鏡である。アンチストークス光の波長、強度分布により試料中の特定物質の分布を観測することができ、蛍光顕微鏡に代わるラベルフリー、非侵襲な顕微鏡として注目されている。ＳＲＳ顕微鏡はＣＡＲＳ顕微鏡と同様に励起光、ストークス光を試料に照射し、物質の固有振動を上記２種類の光の強度変化として観測する顕微鏡であり、ＣＡＲＳ顕微鏡と同様に非侵襲な顕微鏡である。このように、非線形光学顕微鏡は従来の顕微鏡では実現不可能であった様々な高機能な観察手段を提供する。【０００３】
ここでＣＡＲＳ顕微鏡の動作原理について説明する。ＣＡＲＳは３次の分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、励起光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。一般的には、光源の数を少なくするために、プローブ光は励起光で代用される。この場合、誘起される３次の分極は
（式１）
ＰAS(3)(ωAS)＝|χr(3)(ωAS)＋χnr(3)|ＥP2(ωP)Ｅ*S(ωS)
で表される。ここに、χr(3)(ωAS)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、χnr(3)は非共鳴項である。また、励起光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表されている。非共鳴項は周波数依存性がない。式(1)のＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度は以下のように表される。【０００４】
（式２）
2015181872.tif 000003
図１３に示した分子のエネルギー準位図を用いて、ＣＡＲＳ光が発生する機構を説明する。図１３は共鳴項のプロセスを示している。１４０１は分子の振動基底状態を表し、１４０２は振動励起状態を表す。周波数ωPの励起光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は仮想準位１４０３を介して、１４０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、仮想準位１４０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はωAS＝２・ωP−ωSと表される。【０００５】
この共鳴ＣＡＲＳ光は、図１３から明らかなように、励起光とストークス光の周波数の差ωP−ωSが観測試料のある振動励起状態に一致する場合にのみ発生する。但し、ここではプランク単位系を採用しており、プランク定数は１としている。従って、ストークス光として広帯域な光源を用いた場合、発生するＣＡＲＳ光も広帯域な光となるが、振動励起状態に対応する波長において鋭いピークを持つスペクトルを有する。このスペクトルはラマンスペクトルと呼ばれ、試料中の分子の振動励起状態の分布を反映しており、分子種の同定に用いることができる。【０００６】
図１４は、式(1)の非共鳴項に関係する一つのプロセスを示す図である。ストークス光の周波数が振動励起状態ではなく、仮想準位１４０５を介したプロセスとなる。周波数ωPの励起光と周波数ω’Pのプローブ光の同時照射により電子等の関与する仮想準位１４０５が励起され、さらに周波数ω’Sのストークス光により、仮想準位１４０６を介して周波数ωASの非共鳴のＣＡＲＳ光が発生する。この非共鳴のＣＡＲＳ光は振動励起状態と無関係に発生するため、広帯域なストークス光を使用した場合は、強度の波長依存性を持たない広帯域な非共鳴ＣＡＲＳ光が発生する。これらの共鳴ＣＡＲＳ光と非共鳴ＣＡＲＳ光とは互いにコヒーレントであり、干渉することになる。実際に試料の分子種の同定に必要なのは共鳴ＣＡＲＳ光のスペクトル、すなわちラマンスペクトルであるため、取得したＣＡＲＳ光のスペクトルからラマンスペクトルを取得する信号処理が必要である。この信号処理についてはいくつかの方法が知られており（非特許文献５参照）、たとえば、強度スペクトルから位相スペクトルを回復する方法である最大エントロピー法では数学的な計算を行い、共鳴項の複素部分を求める。【０００７】
なお、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係は図１５のように図示される。所定の周波数を持った励起光と、それより小さな周波数領域にあるストークス光が試料に入射され、励起光よりも大きな周波数領域にＣＡＲＳ光が発生する。【０００８】
ＣＡＲＳ顕微鏡は、上記のようにして求められたラマンスペクトルを、励起光、ストークス光を集光する位置を変化させて複数測定を行い、結果的に分子種ごとの空間分布の画像を取得する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】W. Denk et al., “Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy”, Science, Volume 248, Issue 4951, pp. 73-76 (1990)
【非特許文献２】P. J. Campagnola et al., “Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms”, Nature Biotechnology 21, 1356-1360 (2003)
【非特許文献３】M. Okuno et al., “Quantitative CARS Molecular finger printing of living Cells”, Angewandte Chemie International Edition 49, 6773-6777(2010)
【非特許文献４】B. G. Saar et al., “Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering”, Science Vol.330 1368(2010)
【非特許文献５】J. P. R. Day, K. F. Domke, G. Rago, H. Kano, H. Hamaguchi, E. M. Vartiainen, and M. Bonn, “Quantitative Coherent Anti-Stokes Scattering (CARS) Microscopy”, J. Phys. Chem. B, Vol. 115, 7713-7725 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上に述べたＣＡＲＳ顕微鏡において細胞などの試料を分析する場合、試料内の各点にレーザ光を照射してＣＡＲＳ光のスペクトルを分光器で測定し、２次元もしくは３次元の領域にわたる異なる位置のそれぞれでＣＡＲＳ光のスペクトルデータを取得し、これらのデータから結果的に試料のスペクトル情報と空間情報（画像情報）を得る。しかしながら、この場合、分光器の検出部のデータ転送レートの制約からデータの取得に長時間を有するため、場合により現実的な時間内で試料を測定することが困難になる。特に多数の細胞を解析する用途（単一細胞解析）にＣＡＲＳ顕微鏡を用いる場合、データ取得速度が遅いことが致命的な欠点となり、現状のＣＡＲＳ顕微鏡を単一細胞解析に応用することは実質的に困難である。さらに、スペクトル情報と空間情報を取得する従来の方法では、データ量そのものが膨大となり、測定後のデータの保存が困難、データ解析が長時間になるなどの課題がある。例えば上述の最大エントロピー法などを用いて行われるデータの解析が長時間になることは、試料分析の実質的なスルーレートを低下させることになるため、分析手法としてＣＡＲＳ顕微鏡を応用する場合に大きな問題となる。これまで述べてきた問題は、試料の各点でスペクトルを取得する測定方法（ハイパースペクトルイメージング）に共通の問題であり、ＣＡＲＳ顕微鏡のほか、ラマン顕微鏡や、蛍光共焦点顕微鏡で蛍光スペクトルを取得する場合にも同様に当てはまる。【００１１】
上記の課題に鑑み、本発明の目的は、高速に試料の分析を可能とする光学分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従来のＣＡＲＳ顕微鏡などのハイパースペクトルイメージングは、試料からできるだけ多くの情報（スペクトル情報と空間情報）を取得して分析を容易にするという考え方に基づいている。しかし実際は、取得データのすべての情報が必要ではない場合が多く、例えば細胞内の一部もしくは全体のある物質の含有量などが分かれば十分な場合がある。そこで本発明では、試料の全ての空間点からスペクトルを取得するのではなく、一部もしくは全体の領域内のスペクトルの積算値を取得することで、問題の解決を行う。具体的には以下の手段を用いた。【００１３】
（１）短パルスレーザなどの光源と、試料を保持する試料保持部と、光源からの光束を試料保持部に保持された試料に集光して照射する照射光学系と、光照射によって試料から発生された光を分光する分光部と、分光部により分光された光を検出するラインセンサやエリアセンサ等の検出器アレイを含む検出部と、照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部と、を備え、検出部は、照射制御部による試料への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することとした。【００１４】
これにより、データ取得時間の短縮とデータ量の削減が可能となる。【００１５】
（２）（１）において、検出部は積算したスペクトルを複数出力し、複数出力されたスペクトルを平均することとした。【００１６】
これにより、測定される光の強度が強い場合でも分光器の飽和を回避することができ、また複数のスペクトルの和や平均を取ることでノイズを相対的に低減し、スペクトル信号のＳ／Ｎ比を高めることが可能となる。【００１７】
（３）（１）において、試料保持部に保持された試料の画像データを取得する画像データ取得部と、取得した画像データを元に試料の形状を認識する形状認識部と、を備え、照射制御部は、形状認識部によって認識した試料の形状にもとづき、試料の特定領域に光源からの光束を集光して照射することとした。【００１８】
これにより、測定時間の短縮が実現される。また、試料の別々の部分からスペクトル信号を取得することができ、より詳細な試料の解析が可能となる。【００１９】
（４）（１）において、スペクトルとしてＣＡＲＳスペクトルを検出することとした。【００２０】
これにより、無染色かつ高速な試料の解析が可能となる。【００２１】
（５）（１）において、照射制御部がスキャンミラーを含み、スキャンミラーの制御方向が検出部の分光方向と垂直な方向であることとした。【００２２】
これにより、走査がより高速となり、高速な測定が可能となる。【００２３】
（６）（１）において、照射制御部が試料を２次元的に走査することとした。【００２４】
これにより、比較的薄いサンプルに対し、高速な測定が可能となる。【００２５】
（７）（１）において、照射制御部が試料を３次元的に走査することとした。【００２６】
これにより、比較的厚いサンプルに対し、信頼性の高い測定値を取得することが可能となる。【００２７】
（８）光源と、試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、光源からの光束を試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、分光部により分光された光を検出する検出部と、照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、検出部は、照射制御部による細胞への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することとした。【００２８】
これにより、生体試料の高速な解析が可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によると、従来よりもデータ量を抑制した高速な光学分析装置の提供が可能となる。【００３０】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】光学分析装置の構成例を示す模式図。
【図２】ＣＣＤカメラの受光部の模式図。
【図３】データ取得動作のシーケンス図。
【図４】スキャンミラーを用いる場合の構成図。
【図５】ＣＡＲＳ光の後方散乱を検出する光学分析装置の構成図。
【図６】光学分析装置の構成例を示す模式図。
【図７】光学分析装置の構成例を示す模式図。
【図８】生体分子解析装置の構成例を示す模式図。
【図９】生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図。
【図１０】細孔アレイシートの上面図。
【図１１】生体分子解析装置の動作を説明するフローチャート。
【図１２】主因子分析の結果を示す図。
【図１３】共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。
【図１４】非共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。
【図１５】励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光の周波数の関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００３３】
図１は、本発明の光学分析装置の基本的な構成例を示す模式図である。以下、図１に従って本実施例の動作を説明する。【００３４】
コンピュータ１１からの指示によりドライバ１０を通して発光制御される光源すなわち短パルスレーザ光源１０１（中心波長１０６４ｎｍ、パルス幅９００ｐｓ、繰り返し周波数３０ｋＨｚ、平均出力２００ｍＷ）から出射したレーザ光は、ビームスプリッタ１０２により、励起光である透過光と反射光とに２分割される。反射光は集光レンズ１０３によりフォトニック結晶ファイバ１０４に結合され、ファイバ内部で広帯域なスーパーコンティニューム光が生成される。生成されたスーパーコンティニューム光はコリメートレンズ１０５により平行光とされた後、ロングパスフィルタ１０６に入射して短パルスレーザ光源の波長とそれより短い波長の成分が遮断される。ロングパスフィルタ１０６を通過した励起光よりも波長の長い成分であるストークス光は上記励起光とダイクロイックミラー１０８により合波される。ここでダイクロイックミラー１０８は励起光の波長とそれより短い波長域の光を反射し、励起光よりも長い波長域の光を透過する性質を有する。従って励起光は反射し、ストークス光は透過して結果的に合波される。【００３５】
この合波光束は光源からの光束を試料に集光して照射する照射光学系を構成する対物レンズ１０９（ＮＡ０．９、倍率４０倍）により試料１１０の一点に集光され、試料の集光箇所に存在する分子の共鳴振動を反映したＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光はコンデンサレンズ１１１（ＮＡ０．６５）により平行光とされ、ショートパスフィルタ１１２を通過して同軸成分である励起光とストークス光が遮断された後、分光器１１３に入射し、分光部１１４により分光され、検出部１１５により波長ごとに別々に検出されて、スペクトルが検出信号として出力される。【００３６】
ここで、分光器１１３の検出動作について説明する。分光器１１３は、入射した光を回折格子で波長ごとに異なる方向に回折させる分光部１１４と、分光部１１４により回折した光を１次元もしくは２次元の検出器アレイ（ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等）で検出する検出部１１５からなる。本実施例では検出部１１５としてＣＣＤカメラを用いており、その受光部２０１は図２に示されるように画素２０２が２次元的に配列したものになっている。分光部１１４で分光された光は横長のビーム２０３として受光部に入射し、横方向の位置により波長が異なる。ここで検出部１１５のＣＣＤカメラは外部からの制御により所定時間の間露光状態、すなわち各画素が入射した光に露光され入射光を電荷に変換して電荷を蓄積する状態となる。そして露光終了後、縦に並んだ画素列に蓄積された総電荷量がバッファ２０４に転送され（full vertical binning）、バッファ２０４の電荷が外部にシリアル信号として出力される。このため出力信号は入射光の波長ごとの強度に比例した信号、すなわち入射光のスペクトル信号となっている。【００３７】
ここで本実施例では、検出部１１５が露光状態の間、試料１１０を保持しているＸＹＺステージ１２を駆動して、試料への励起光及びストークス光の集光位置が試料を３次元的もしくは２次元的に走査する。より具体的には、予め指定した例えば直方体領域もしくは長方形領域を一定速度で走査する。従って、一度の試料測定において１種類のスペクトル信号が得られる。この１種類のスペクトルは、走査線上にある試料の各位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルに相当する。データ数はＣＣＤカメラの横方向の画素数である。以後、この取得信号をＣＡＲＳスペクトルと呼ぶ。なお、従来の方法では、励起光とストークス光の集光位置を変えるごとにＣＡＲＳスペクトルを取得するため、多数のＣＡＲＳスペクトルがデータとして取得される。【００３８】
本実施例で得られたＣＡＲＳスペクトルは、最大エントロピー法などの信号処理が施されてラマンスペクトルに変換される。ここで得られたラマンスペクトルは、試料中の様々な化学種の含有量を表している。本実施例で得られたＣＡＲＳスペクトルは、励起光・ストークス光の位置を走査して得られた信号であるため、この信号より試料全体の（走査領域内の）各化学種の総含有量を知ることができる。【００３９】
本実施例のデータ取得のシーケンスを、図３を用いて説明する。図３（ａ）は従来法のシーケンスを表し、露光、データ転送、位置移動の動作をデータ点数分だけ繰り返す。なお、データ転送と位置移動の順番は逆であっても構わないし、同時に行ってもよい。これに対し本実施例のシーケンスは図３（ｂ）のようになっており、露光、位置移動を試料の走査が終了するまで繰り返し、最後にデータ転送を行う。なお、図３（ｂ）では露光、位置移動、データ転送がシリアルに行われるが、位置移動の間に直前の露光動作が継続していてもよいし、データ転送が直前の位置移動と同時に行われてもよい。【００４０】
本実施例と従来法を、データ取得時間とデータ量について比較する。従来法のデータ取得時間は、１回のスペクトル測定の露光時間、移動時間、スペクトルデータの転送時間の和に、測定点数（試料空間上の測定を行う位置の数）を乗じたものとなる。これに対して本実施例のデータ取得時間は、およそデータ転送時間を０とみなした場合の従来法のデータ取得時間となる。従って上記露光時間がデータ転送時間と同程度かそれよりも小さい場合、データ取得時間の短縮が可能である。データ量については、従来法のデータ量は本実施例のデータ量に測定点数を乗じたものとなる。通常、イメージを取得するために測定点数は数万点から数百万点とするため、本実施例によりデータ量が数百万分の１から数万分の１程度に削減される。【００４１】
本実施例における試料位置の走査は、離散的すなわち測定点ごとに露光中の位置を固定し露光終了後に別の位置に移動する場合と、連続的すなわち所定の速度で試料位置を連続的に変化させる場合のいずれでも構わない。連続的な走査の場合は、検出部の露光時間中に試料中の光スポットを走査し続け、走査が終了した時点で検出部の露光を終了してデータ転送を行う。なお、連続的な走査の場合は、従来法における１測定点が、励起光とストークス光の試料中の集光スポットサイズの空間領域に相当するとして、離散的な場合と同等に扱うことができる。すなわち、連続的な走査は、位置移動量を集光スポットサイズとし、１測定点あたりの露光時間をピクセル滞在時間（pixel dwell time）とした場合の離散的走査とほぼ同等である。なお、ピクセル滞在時間は、（集光スポットサイズ）÷（試料の走査速度）として定義される。【００４２】
本実施例では照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部としてＸＹＺステージ１２を用い、測定点の走査のために試料位置を走査したが、照射制御部による光照射位置の制御方法はこの限りではない。例えば、照射制御部として励起光・ストークス光の試料への入射角度を外部制御により走査するガルバノミラー、ＭＥＭＳミラーなどのスキャンミラーを用いてもよいし、対物レンズ１０９の位置を走査しても構わない。あるいは上に述べた方法の組み合わせであっても構わない。【００４３】
特にガルバノミラーを用いて１軸をスキャンする場合の例について図４を用いて説明する。この場合、ダイクロイックミラー１０８と対物レンズ１０９の間にガルバノミラー１６０１を挿入し、励起光・ストークス光が反射してから対物レンズ１０９に入射する構成とする。ここで、ガルバノミラー１６０１はコンピュータ１１からの外部制御により設置角度が制御され、これにより励起光・ストークス光の光束の角度を制御することができる。ガルバノミラー１６０１により角度が変化した励起光・ストークス光は試料１１０中で角度変化前と異なる位置に集光され、ＣＣＤカメラの受光面においても発生したＣＡＲＳ光が異なる位置に入射される。ここでガルバノミラー１６０１の角度走査方向を、ＣＣＤカメラの受光面においてＣＡＲＳ光の位置が図２の垂直方向（分光される方向とほぼ垂直な方向）に変化するように設定する。この場合、ＣＡＲＳ光のビーム２０３が垂直方向に移動するが、上述のようにデータ取得時には垂直方向に積算されたデータが出力されるため、ビームの位置が変化しても出力信号には影響がない。他の軸はＸＹＺステージ１２を用いて走査する。この動作はＭＥＭＳミラーなどの他のスキャンミラーを用いても同様である。これらのスキャンミラーは通常、ＸＹＺステージなどに比べると高速に動作するため、これらを適用することにより高速な測定が可能である。【００４４】
また、本実施例で分光器は励起光・ストークス光の試料への入射側と反対側に配置されているが、同じ側に配置し、試料からの後方散乱光を対物レンズ１０９で平行光として分光器で検出してもよい。この場合、図５の模式図に示すように、励起光・ストークス光とＣＡＲＳ光が同軸となるため、ビームスプリッタ３０１などを用いてＣＡＲＳ光を励起光・ストークス光と分離する必要がある。【００４５】
本実施例では検出器としてＣＣＤカメラを想定したが、検出器はこの限りではなく、ＣＯＭＳカメラや１次元の検出器アレイであるラインセンサを用いた場合も同様の効果を得ることができる。【００４６】
本実施例のスキャンは２次元でも３次元でもよいと述べたが、比較的厚い（大雑把には試料に集光した励起光、ストークス光の焦点深度以上）試料については３次元スキャンを用いることで試料全体からの信号の積算量を精度良く取得できるため、有効である。逆に薄い（試料に集光した励起光、ストークス光の焦点深度以下）試料については２次元スキャンを行うことで短時間に精度よく信号の積算量が取得できる。
【実施例２】
【００４７】
本実施例は、試料の測定において複数回の露光動作を行う実施例である。本実施例の光学分析装置の構成例は実施例１と同じである。【００４８】
本実施例のデータ取得の時間シーケンスを図３（ｃ）に示す。基本的な方法は実施例１と同等であるが、本実施例では試料の走査全体に渡って検出部１１５の露光状態を継続するのではなく、途中で検出部１１５の露光状態を中断してデータ転送を行い、その後再び露光状態とすることを繰り返す。そしてデータ取得終了後、複数得られたスペクトルデータの平均値を最終的な取得データとして、実施例１と同様に信号処理等を行う。すなわち、本実施例では、励起光とストークス光によって試料の所望領域全体にわたって行われる走査を複数の走査に分割し、分割された各部分走査に対して分光器１１３の検出部１１５は実施例１と同様にそれぞれの部分走査の間に積算したスペクトルを出力する。こうして部分走査の数と同数の積算スペクトルを得、それを平均したものを最終的なスペクトルデータとする。【００４９】
この場合、実施例１に比べて一度の露光時間が短くなるため、受光部が飽和して正常にデータ出力ができなくなることを避けることができる。また、複数のデータの平均を取ることで、一度のスペクトルデータの出力ごとに加算されるノイズ（電荷を電圧に変換するアンプで主に発生）を平均化することにより、実施例１に比べてＳ／Ｎ比を向上させることが可能である。【００５０】
なお、本実施例の一度の検出部の露光は、言うまでもなく試料の複数位置にわたって行われる必要がある。言い換えると、検出部の露光時間をピクセル滞在時間よりも長くする必要がある。従来法は露光時間とピクセル滞在時間が等しい場合に相当する。
【実施例３】
【００５１】
本実施例は、試料の特定領域からデータを取得する実施例である。図６は、本実施例の光学分析装置の構成例を示す模式図である。本実施例の光学分析装置は、実施例１の光学分析装置の構成に加え、試料を微分干渉顕微鏡で観察できる構成を備える。【００５２】
本実施例では、まず照明４０１（ハロゲンランプ）からの照明光を、ウォラストンプリズム４０２を通過させてからダイクロイックミラー４０３で反射させてコンデンサレンズ１１１によって試料１１０に集光し、試料１１０の微分干渉像を対物レンズ１０９、ダイクロイックミラー４０４、ウォラストンプリズム４０５、ポラライザ４０６、結像レンズ４０７を用いてＣＣＤカメラ４０８等の撮像装置上に結像させて試料のイメージを取得する。この構成はよく知られた微分干渉顕微鏡のそれと同一である。なお、ダイクロイックミラー４０３，４０４は照明４０１の可視光域の波長（４００−７００ｎｍ）は反射し、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光（いずれも７００ｎｍ以上の近赤外域の波長を有する）は透過するように設計されており、ＣＡＲＳ信号の生成、検出には影響を及ぼさない。【００５３】
ここで、ＣＣＤカメラ４０８により取得されたイメージはコンピュータ１１に送られ、試料の形状や構造を認識する形状認識部で試料（細胞など）の輪郭を抽出する画像データの解析がなされた後、コンピュータ１１がステージ１２に輪郭の範囲内のみ走査するよう命令を送り、この走査時間中に分光器１１３の検出部１１５が露光状態を継続して積算されたＣＡＲＳスペクトルが取得される。このとき、光スポットの走査範囲が測定試料に限定されるため、実施例１に比べてデータ取得時間を短縮することが可能である。また、走査範囲は必ずしも試料の全体とは限らず、一部の領域、たとえば細胞の核の部分のみからＣＡＲＳスペクトルを取得することも可能である。この場合も同様に微分干渉像を取得して、核の部分の輪郭抽出をコンピュータ１１で行ってから核の部分だけの走査を行えばよい。さらに、例えば同一試料の複数個所（例えば細胞の核と核以外）から別々にＣＡＲＳスペクトルを取得してもよい。【００５４】
本実施例では試料の観察手段として微分干渉顕微鏡を用いたが、試料の輪郭抽出が可能な画像データが取得できればよいのであって、微分干渉顕微鏡を例えば通常の明視野顕微鏡（ウォラストンプリズム４０２，４０５、ポラライザ４０６を取り除いた構成に相当）、位相差顕微鏡などの画像データ取得部に置き換えてもよく、あるいはこれらの組み合わせを用いても構わない。
【実施例４】
【００５５】
本実施例は、ＣＡＲＳスペクトルの代わりに自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを取得する実施例である。【００５６】
図７は、本実施例の光学分析装置の構成例を示す模式図である。本実施例の光学分析装置は実施例１に示した光学分析装置からストークス光の生成部が省略された形となっている。すなわち、レーザ１０１から出射された励起光が直接対物レンズ１０９に入射する。また、分光器１１３でのスペクトル取得範囲はＣＡＲＳと異なり、励起光よりも長波長側に設定される。この設定は分光器１１３中の分光部１１４に設けられた回折格子の角度の設定によりなされる。【００５７】
本実施例でも動作は実施例１や実施例２と同様であり、図３（ｂ）あるいは図３（ｃ）に示したシーケンスに従って試料中の化学種あるいは蛍光ラベルの含有量を反映したスペクトルが取得される。集光したレーザから自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを取得する場合にも、試料全体の解析を行うために従来は集光箇所ごとにスペクトルデータを取得していたが、本実施例によりデータ取得速度の高速化とデータ量の削減を行うことができる。
【実施例５】
【００５８】
本実施例は、本発明の光学分析装置を単一細胞解析に適用した生体分子解析装置の実施例であり、細胞解析の一つの形態としてＣＡＲＳスペクトルを取得する実施例である。【００５９】
図８、図９は、本実施例に係る生体分子解析装置の構成例を示す模式図である。図８は本装置の光学系部分を示した概略図であり、図９は生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図である。図９には遺伝子発現解析を行うために試料である細胞のｍＲＮＡを捕捉する生体分子採取システム２が含まれている。光学系部分及び生体分子採取システムはコンピュータ１１により制御され、またデータの取得が行われる。【００６０】
（光学系部分の説明）
図８に示した装置の光学系部分は、実施例３の図６に示した構成に加え、細胞破壊用レーザ５（波長３５５ｎｍ、平均出力２Ｗ、繰り返し周波数５ｋＨｚのパルスレーザ）及びドライバ６０２、レーザ５からの出射光を励起光と同軸にするためのダイクロイックミラー６０３を備える。光学系部分には、（１）微分干渉顕微鏡像の取得、（２）ＣＡＲＳスペクトルの取得、（３）細胞の破壊、の３つの機能が含まれる。（１）及び（２）の機能については実施例３で述べたとおりである。（３）の機能は、細胞破壊用レーザ５からの出射光を対物レンズ１０９により観測対象の細胞に集光し、細胞を破壊して細胞内部のｍＲＮＡ等の生体分子を外部に放出させる機能である。放出されたｍＲＮＡは、後述するように生体分子採取システム２により捕捉・解析される。【００６１】
（生体分子採取システムの説明）
図９に示す生体分子採取システム２は、細胞から放出されたｍＲＮＡ等の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスを備える。例えば、単一細胞ごとにアレイデバイスの複数の領域にｍＲＮＡを捕捉し、アレイデバイスにおいて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。本実施例では、アレイデバイスは、多数の貫通孔が面に垂直に形成された透明な多孔質メンブレンから構築され、以下、これを細孔アレイシート３０と呼ぶ。また、細孔アレイシート３０にｃＤＮＡライブラリーが形成されたものをｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートと呼ぶ。【００６２】
本実施例においては、細孔アレイシート３０として、直径０．２μｍの貫通孔が陽極酸化によって多数形成された、厚さ８０μｍ、大きさ２ｍｍ×２ｍｍの酸化アルミニウム製多孔質メンブレンを用いている。細孔アレイシート３０には、生体分子を捕捉する領域同士を分離するため分離壁３１を形成することができる。この分離壁３１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、半導体プロセスにより形成することができ、厚さは８０μｍ程度で細孔アレイシート３０に密着させることができる。【００６３】
図１０は、細孔アレイシート３０の上面図である。細孔アレイシート３０（大きさ２ｍｍ×２ｍｍ、厚さ８０μｍ）には、多数の生体分子、例えばｍＲＮＡを捕捉するための領域３００が形成される。領域３００のサイズは、ここでは、一辺を１００μｍとし、間隔を８０μｍとしている（１８０μｍ周期で配置）。領域３００のサイズは、捕捉対象とする生体分子の量や面内での拡散しやすさ（分子の大きさ）に応じて１μｍ程度から１０ｍｍ程度まで自由に設計することが可能である。【００６４】
アレイデバイスとしては、アルミニウムを陽極酸化することによって形成した多孔質メンブレンからなる細孔アレイシート３０の他、シリコン等の材料を陽極酸化することによって多数の貫通孔を形成したものを用いても良い。さらに、半導体プロセスを用いて、シリコン酸化物やシリコン窒化物薄膜に多数の貫通孔を設けることによって、アレイデバイスを構築しても良い。【００６５】
図９に示すように、細胞から放出される生体分子を、電気泳動によって細孔アレイシート３０における特定の領域まで導く手段として、ループ状の白金電極３２をシールド線３３の先端に接合している。白金電極３２の線材の直径は３０μｍであり、線材を２つ折にして、リード線接合部分を捻って一本化した後、ループ側を直径１００μｍの円形に加工する。このような電極を２つ作製し、細孔アレイシート３０を挟むように配置し、電源３５によって直流１．５Ｖを印加する。放出されるｍＲＮＡ３６は負の電荷を持つので、上側の白金電極３２を正極とする。ただし、銀−塩化銀の参照電極３９を設けて、下側の白金電極３２に０．２Ｖを印加する。このような操作によって、生体分子を捕捉する領域３００の内部にｍＲＮＡ３６を電気泳動によって誘導することができる。また、生体分子の捕捉効率をより向上するために、横方向の電気泳動によるｍＲＮＡの濃縮を実現するため、上側の白金電極３２のループの直径を５０μｍにしても良い。この場合、線材の直径は１０μｍとする。【００６６】
（動作フローの説明）
次に、本実施例に係る生体分子解析装置の動作フローについて説明する。図１１にフローチャートの一例を示す。【００６７】
最初に接着系培養細胞２１，２２，２３からなる試料をシャーレ２０に載せる。この実施例では測定対象が培養細胞であるから、シャーレ２０を使って事前に培養し、測定対象の細胞が底面に接着するようにする。試料が凍結切片の場合には、これをシャーレ２０の上に載せる。あるいは、複数の細胞をゲル中に３次元的に配置したものを試料としても良い。次に、顕微鏡システムを用いて、対象となる細胞群の微分干渉像を取得し、生体分子を採取、測定する対象細胞をユーザーが決定する。次に、コンピュータ１１は、ユーザーから測定対象とする細胞又は細胞の部分に関する情報の入力を受ける。一般に、ユーザーは複数の細胞を測定対象とする場合が多い。その場合には、生体分子を捕捉する細胞の順序をコンピュータ１１が決定し、まず、１番最初に対象となった細胞が視野の中心に配置されるようにＸＹＺステージ１２を駆動する。ここで、実施例３に述べた方法により視野の中心に配置された細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。【００６８】
次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を用いて、ＣＡＲＳスペクトルを取得した細胞の近傍（図９の例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，１）番地の領域３００）を接近させる。本実施例では細孔アレイシート３０の下面とシャーレ２０との間の距離を３００μｍに設定しているが、この距離は、採取する生体分子の種類や、電極構造によって変化させることができる。例えば、１μｍから１０ｍｍ程度が好適である。ＸＹＺステージ３４による細孔アレイシート３０の移動は、コンピュータ１１が事前のプログラムに従って自動的に行う。移動の完了をコンピュータ１１が確認した後、電気泳動用の白金電極３２に電圧を印加すると同時に、測定対象とする細胞の細胞膜を破壊するために、細胞破壊用レーザ光源５からのレーザ光を細胞に照射する。ここで照射時間は、例えば１０秒とし、電気泳動駆動時間は６０秒とすることができる。【００６９】
一つの細胞の破壊とその細胞中の生体分子の捕捉が終了した後、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ１２を駆動して登録された２番目の対象細胞を視野の中心に位置づける。その後、２番目の細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を駆動して２番目の対象細胞の近傍（図９の構成例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，２）番地の領域３００）を接近させる。そして、コンピュータ１１に登録された２番目の細胞へ細胞破壊用レーザ５からのレーザ光を照射する。このとき、前記と同様に、同時に白金電極３２に電圧を印加する。その後、順次指定された細胞に対し、上記のＣＡＲＳスペクトル取得を行い、細胞を破壊して、その細胞中の生体分子を細孔アレイシート３０の特定の領域３００に捕捉した後、捕捉した生体分子を測定するための処理を実行する。最後に、微分干渉像における破壊された細胞に相当する部分と、細孔アレイシート３０における生体分子を捕捉した領域３００、取得したＣＡＲＳスペクトルを対応付けて、ユーザーに提示する。【００７０】
ここでは破壊する細胞を１細胞としたが、より粗い分解能のデータを取得したい場合は、アレイデバイス上の一つの領域３００に対して、複数の細胞を破壊したときに放出され、電気泳動されるｍＲＮＡを捕捉しても良い。その際の破壊は複数の細胞を同時に破壊しても良いし、アレイデバイスを動かさずに１細胞ずつ順次破壊しても良い。また、本実施例ではＣＡＲＳスペクトルの取得と生体分子の捕捉を異なる細胞に対して順次行うフローとしたが、例えば試料の微分干渉像の取得後、対象となる細胞のＣＡＲＳスペクトルを全て測定したのち、各細胞を順次破壊して生体分子を補足する、というフローであっても構わない。【００７１】
本実施例により、個々の細胞に対してＣＡＲＳスペクトルと遺伝子発現データを取得することができる。この機能を利用して、細胞の動的特性を高い精度で確認することが可能となる。このような解析を実行するために、まず、ＣＡＲＳスペクトルを取得する。取得したＣＡＲＳスペクトルと細胞の詳細な状態との対応を確認したいと考えた時点で、ユーザーが選択した細胞について細胞を破壊し、その細胞内の生体分子をアレイデバイス上に捕捉して、その量を計測する。この生体分子の定量によって詳細な細胞の状態や種類を同定し、ＣＡＲＳスペクトルとの対応をとることによって、ＣＡＲＳスペクトルと細胞の状態や種類との対応付けを高精度に行うことが可能となる。ＣＡＲＳスペクトルは、通常単一細胞の解析に用いられる蛍光共焦点顕微鏡に比べてラマンスペクトルを取得可能であるという点で測定対象の化学種に対してより多くの情報を得ることが可能であり、このような高精度な解析が可能となる。【００７２】
次に、細胞の分類をＣＡＲＳスペクトルで行うための方法について示す。ＣＡＲＳスペクトルを取得後、例えば１８０個の細胞の２０個の遺伝子発現解析を行って、主因子分析を行い、上位２つの主因子についてプロットした図を図１２に示す。図中のＰＣはprincipal componentの略であり、ＰＣ１が第一の主因子、ＰＣ２が第２の主因子を指す。個々の点は１つの細胞の遺伝子発現データに対応する。多くの場合に細胞の状態や種類に対応して複数のクラスター（この例では６個のクラスター）に分かれる。図１２において、一つ一つの点は細胞に対応するので、どの細胞がどのような種類の細胞であるかをＣＡＲＳスペクトルだけでは判定できなくても、遺伝子発現解析データに基づいて対応させることができる。この対応付けを利用して、どのようなＣＡＲＳスペクトルが得られたときにどのような細胞の状態や種類になるかを判定させるような機械学習をコンピュータシステムにさせることができ、学習が完了した後はＣＡＲＳスペクトルの取得のみで細胞の状態や種類の分類が可能となる。【００７３】
なお、この例では、細胞の遺伝子発現に基づくクラスタリングに主因子分析を用いたが、階層的クラスタリングやk-means法等様々の方法を適用することができる。また、機械学習の方法としては、サポートベクタマシン等、データマイニングに用いられる様々な方法が知られており、それらのいずれを用いても良い。【００７４】
また、本実施例では、試料から得られる分光スペクトルとしてＣＡＲＳスペクトルを用いて説明したが、ＣＡＲＳスペクトルの代わりに自発ラマンスペクトルや蛍光スペクトルを用いても同様の効果を得ることができる。【００７５】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、大量の試料から高速に情報を取得可能な分析装置を提供することが可能となり、医療や製薬分野における研究開発を加速することができる。
【符号の説明】
【００７７】
２：生体分子採取システム、５：細胞破壊用レーザ、１１：コンピュータ、２１，２２，２３：接着系培養細胞、３０：細孔アレイシート、３２：白金電極、１０１：短パルスレーザ光源、１０４：フォトニック結晶ファイバ、１０９：対物レンズ、１１０：試料、１１３：分光器、１１４：分光部、１１５：検出部、２０１：ＣＣＤカメラ受光部、４０１：照明、４０７：結像レンズ、４０８：ＣＣＤカメラ
【図１】
2015181872.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月27日(2016.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
試料を保持する試料保持部と、
前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された試料に集光して光スポットを形成する照射光学系と、
光照射によって試料から発生された光を分光する分光部と、
前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
前記照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部と、を備え、
前記検出部は、前記照射制御部による試料への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする光学分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記検出部は前記積算したスペクトルを複数出力し、前記複数出力されたスペクトルを平均することを特徴とする光学分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記試料保持部に保持された試料の画像データを取得する画像データ取得部と、
取得した画像データを元に試料の形状を認識する形状認識部と、を備え、
前記照射制御部は、前記形状認識部によって認識した試料の形状にもとづき、試料の特定領域に前記光源からの光束を集光して照射することを特徴とする光学分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記スペクトルはＣＡＲＳスペクトルであることを特徴とする光学分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部はスキャンミラーを含み、
前記スキャンミラーの制御方向が前記検出部の分光方向とほぼ垂直な方向であることを特徴とする光学分析装置。
【請求項６】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部は前記試料を２次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の光学分析装置において、
前記照射制御部は前記試料を３次元的に走査することを特徴とする光学分析装置。
【請求項８】
光源と、
試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、
前記光源からの光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して光スポットを形成する照射光学系と、
光照射によって細胞から発生された光を分光する分光部と、
前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、
前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、
破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備え、
前記検出部は、前記照射制御部による細胞への複数の光照射位置にわたって露光状態を継続し、各光照射位置から発生されたスペクトルを積算したスペクトルを出力することを特徴とする生体分子解析装置。
【請求項９】
請求項８に記載の生体分子解析装置において、
前記細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することを特徴とする生体分子解析装置。
【国際調査報告】
2015181872.tif 000019
2015181872.tif 000020
2015181872.tif 000021
2015181872.tif 000022