(57)【要約】  高精度かつ安定した試料観察が可能な電子顕微鏡を提供する。  試料ステージと、試料（１１１）上で電子線を走査する電子光学系と、前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器（１０９）と、前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器（１１３，１１６）と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置（１１７）と、を有する電子顕微鏡であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段（１２２，１２３）を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップ（１２０）と、前記真空系の真空度を計測する真空計（１２１）と、を備える。
2016056096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、  前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、  前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、  当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、  当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、  前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、  前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、  前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、  前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項２】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項３】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項４】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項５】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項６】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、  前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、  前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、  当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、  当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、  前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、  前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、  前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、  前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする電子顕微鏡。
【請求項７】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項６に記載の電子顕微鏡。
【請求項８】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項６に記載の電子顕微鏡。
【請求項９】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１０】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１１】
冷却された試料の二次電子像および透過電子像を取得し、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料を観察する試料の観察方法であって、  当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の表面状態および内部状態の変化を観察することを特徴とする試料の観察方法。
【請求項１２】
前記透過電子像は、明視野像であることを特徴とする請求項１１に記載の試料の観察方法。
【請求項１３】
前記透過電子像は、暗視野像であることを特徴とする請求項１１に記載の試料の観察方法。
【請求項１４】
前記取得した取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定し、  前記試料の冷却状態が良好であると判断される場合、前記二次電子像および透過電子像の取得を継続し、  前記試料の冷却状態が良好であると判断されない場合、二次電子像および透過電子像の取得条件を変更することを特徴とする請求項１１から１３のいずれかに記載の試料の観察方法。
【請求項１５】
前記取得した明視野像の階調に基づき、前記試料の状態を判定することを特徴とする請求項１２に記載の試料の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、観察試料の良好な凍結状態を維持するのに好適な荷電粒子線装置および電子顕微鏡、試料の観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、微細な組織構造を持つ試料の観察や分析に、走査形電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：以下、ＳＥＭと称することがある）や透過形電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：以下、ＴＥＭと称することがある)、あるいは透過形走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ−Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：以下、ＳＴＥＭと称することがある）等の電子顕微鏡が利用されている。【０００３】  現在、電子顕微鏡を用いた生物試料の観察には、前処理によって固定した試料を用いている。試料の固定には、グルタールアルデヒドなどの還元剤を固定液に用いる化学固定法と、急速凍結により瞬時に動きを停止させ、その時の構造を保持する物理固定法がある。【０００４】  化学固定法では、組織を重金属で染色するため、構造を明瞭なコントラストで観察することができるが、試料中に含まれる蛋白質が破壊されることもあり、生物組織本来の構造を捉えられないこともある。物理固定法は、特別な凍結装置が必要であるが、染色剤等によるアーティファクト形成はなく、生物組織本来の構造を保持することができる。【０００５】  氷包埋法は、試料を急速凍結し、化学試薬による固定や染色を行わずに、極低温で電子顕微鏡による観察を行う手法である。液体窒素で冷却した液化エタンに、組織内に水を含んだ生物や食品、高分子などの薄膜試料を投入し、１０４℃／ｓｅｃ以上の冷却速度で急速凍結し、非晶質氷に包埋して観察する。【０００６】  特許文献１には、食品など液状試料の本来の組織構造を正確に観察するため、急速凍結後、ＴＥＭ観察する技術が開示されている。また、非特許文献１には、氷包埋法を用いた試料のＴＥＭ観察について記載されている。これらの文献に記載されているＴＥＭやＳＴＥＭは加速電圧が８０ｋＶ〜３００ｋＶの高加速電圧を使用している。その一方、最近では３０ｋＶの加速電圧を最高加速電圧とするＳＥＭにＳＴＥＭ検出器を取り付け、３０ｋＶでの透過像観察も可能になってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−８８３２８号公報
【特許文献２】特開２０１４−１０９６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】豊島近、Ｉｃｅ−Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ法、実験医学、Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．５、４９（４３３）−５７（４４１）、１９９０
【非特許文献２】木村利昭、走査電子顕微鏡（４）、日本調理科学会誌、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．１、８６−９３、（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  近年、凍結試料の観察には高精度化がますます求められている。電子顕微鏡観察によって正確な試料の情報を得るためには、前処理により氷包埋された試料が観察に適しているものであるかどうかを評価する必要がある。前処理が適切に行われていない場合には、試料内の構造物が露出してしまい電子線によるダメージを受けてしまうことや、氷表面上に霜が発生することで、取得される画像に影響を及ぼすことがある。【００１０】  しかしながら、上記の特許文献１や非特許文献１に記載された手法においては、前処理後の試料自体の評価については一切考慮がなされていない。そのため、従来の技術では、霜の付着や構造物の露出有無の明確な判断ができない状態で評価が行われていた。【００１１】  本発明の目的は、高精度かつ安定した試料観察が可能な荷電粒子線装置、電子顕微鏡、試料の観察方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  上記課題を解決するための一態様として、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。【００１３】  また、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。【００１４】  また、本発明は、冷却された試料の二次電子像および透過電子像を取得し、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料を観察する試料の観察方法であって、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づいて、前記試料の表面状態および内部状態の変化を観察することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】  本発明の一態様によれば、前処理後の試料が電子顕微鏡観察に適したものであるか否かを判断することができ、高精度かつ安定した電子顕微鏡観察を行うことが可能となる。【００１６】  また、本発明の一態様によれば、試料の状態に応じて観察条件を調整することにより、良好な凍結状態を維持したまま電子顕微鏡観察を行うことができる。【００１７】  上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る荷電粒子線装置の基本構成を示す図である。
【図２Ａ】氷包埋法によって作製された試料の模式図である。
【図２Ｂ】氷包埋法によって作製された試料の模式図である。
【図２Ｃ】氷包埋法によって作製された試料の模式図である。
【図２Ｄ】氷包埋法によって作製された試料の模式図である。
【図２Ｅ】氷包埋法によって作製された試料の模式図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る画像処理コントロール部を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係るディスプレイ表示を示す図である。
【図５Ａ】本発明の一実施形態に係る試料の観察方法を示すフローチャートである。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態に係る試料の観察方法を示すフローチャートである。
【図６】本発明の一実施形態に係る試料の観察方法を示すフローチャートである。
【図７Ａ】本発明の一実施形態に係る霜判定例を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施形態に係る霜判定例を示す図である。
【図８Ａ】本発明の一実施形態に係る二次電子像（ＳＥＭ像）と透過電子像（ＳＴＥＭ像）のマッチング例を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態に係る二次電子像（ＳＥＭ像）と透過電子像（ＳＴＥＭ像）のマッチング例を示す図である。
【図８Ｃ】本発明の一実施形態に係る二次電子像（ＳＥＭ像）と透過電子像（ＳＴＥＭ像）のマッチング例を示す図である。
【図８Ｄ】本発明の一実施形態に係る二次電子像（ＳＥＭ像）と透過電子像（ＳＴＥＭ像）のマッチング例を示す図である。
【図９Ａ】本発明の一実施形態に係る試料の品質判定例を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態に係る試料の品質判定例を示す図である。
【図９Ｃ】本発明の一実施形態に係る試料の品質判定例を示す図である。
【図９Ｄ】本発明の一実施形態に係る試料の品質判定例を示す図である。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態に係る荷電粒子線装置の一部断面を示す図である。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態に係る荷電粒子線装置の一部断面を示す図である。
【図１０Ｃ】本発明の一実施形態に係る荷電粒子線装置の一部断面を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】  以下、本実施の形態について図面を用いて説明する。
【実施例１】
【００２０】  背景技術にて示した文献に記載されているＴＥＭやＳＴＥＭは加速電圧が８０ｋＶ〜３００ｋＶの高加速電圧を使用している。その一方、最近では３０ｋＶの加速電圧を最高加速電圧とするＳＥＭにＳＴＥＭ検出器を取り付け、３０ｋＶでの透過像観察も可能になってきた。【００２１】  本実施例では、本発明の基本的な実施形態について説明する。図１は、本実施例に係る荷電粒子線装置の基本構成を示す図である。図１では、荷電粒子線装置の一例として、ＳＴＥＭ検出器を有し、ＳＴＥＭ像の観察が可能なＳＥＭの構成について説明する。但し、本実施の形態はこれに限られず、例えば、ＳＥＭ検出器を有し、ＳＥＭ像の観察が可能なＴＥＭやＳＴＥＭに適用することもできる。【００２２】  図１に示すＳＥＭは、主として、ＳＥＭ鏡筒１００、およびこれを制御する制御系から構成される。ＳＥＭ鏡筒１００において、電圧が印加された引き出し電極１０３が形成する電界により、電子銃１０１から放出された電子線１０２は、陽極１０４により加速されたのち、第一の集束レンズ１０５によって集束され、対物レンズ絞り１０６で不要な領域が除去される。対物レンズ絞り１０６を通過した電子線１０２は、第二の集束レンズ１０７と対物レンズ１１０によって細く絞られる。偏向コイル１０８は、細く絞られた電子線１０２を試料１１１上で二次元的に走査する。【００２３】  電子線１０２の持つエネルギーに対し、試料が十分に薄い場合、電子線１０２は試料１１１を透過する。電子線１０２のうち、試料１１１を透過する電子は、試料１１１内において非散乱もしくは非弾性散乱した明視野信号電子１１４と、弾性散乱した暗視野信号電子１１２とに分けられる。【００２４】  明視野信号電子１１４は、明視野絞り１１５により散乱角を制限されたのち、明視野絞り１１５を透過したもののみが明視野信号検出器１１６で検出される。一方、暗視野信号電子１１２は試料１１１内で散乱されるため、ある角度を持って試料１１１を透過し、対物レンズ１１０の下方に配置された暗視野信号検出器１１３によって検出される。【００２５】  暗視野信号検出器１１３の配置構成は、試料１１１と明視野絞り１１５の間で、上下方向で、適切なコントラストが得られる配置構成となるように動作する。例えば、装置使用者がコンピュータ１１８のディスプレイ１１８ａ上で暗視野像を確認しながら、適切なコントラストが得られるように、暗視野信号検出器１１３の配置場所を設定すると、制御装置１１７に位置制御信号が伝達され、暗視野信号検出器１１３が移動する。【００２６】  また、試料１１１を電子線１０２が走査する際、入射した電子の非弾性散乱によって、試料１１１内に存在する電子が励起され、真空中に放出されることで二次電子が発生する。二次電子検出器１０９は発生した二次電子を検出する。【００２７】  本実施例に係るＳＥＭは、制御系として、主として装置使用者が使用するコンピュータ１１８、コンピュータ１１８と接続され通信を行い、真空排気系や電子光学系などの制御を行う制御装置１１７を備える。コンピュータ１１８は、装置の操作画面（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ−Ｕｓｅｒ−Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ＧＵＩ）が表示されるディスプレイ１１８ａと、キーボー��やマウス等の操作画面への入力手段１１８ｂを備える。コンピュータ１１８、制御装置１１７および各構成部、または制御装置１１７から送信される命令に従って各構成部を制御する下位の制御装置（例えば、コールドトラップ位置制御部１１９、温度制御部１２４、試料移動傾斜制御部１２６、真空計制御部１２７、電子光学系制御部１２８）は、各々通信線により接続されている。【００２８】  なお、図１において、制御装置１１７は二次電子検出器１０９、暗視野信号検出器１１３、明視野信号検出器１１６、コールドトラップ位置制御部１１９、試料移動傾斜制御部１２６、真空計制御部１２７、電子光学系制御部１２８と接続されている構成について示しているが、本構成は一例に過ぎず、通信用の配線などの種々の変形例が含まれるものとする。【００２９】  制御装置１１７は、二次電子検出器１０９、明視野信号検出器１１６、暗視野検出器１１３によってそれぞれ検出された信号を受信し、画像処理コントロール部１２５にて画像処理したのちに、画像処理後のデータをコンピュータ１１８へ送信してディスプレイ１１８ａに表示する。【００３０】  また、真空の試料室には、コールドトラップ１２０と、コールドトラップ１２０の先端位置を移動させるためのコールドトラップ位置制御部１１９が配置され、真空度や凍結試料に付着した霜の状態に応じて、コールドトラップ１２０の先端位置を移動する。【００３１】  試料室には真空度を計測するための真空計１２１が備わっており、測定した真空度は真空計制御部１２７を介して制御装置１１７が備える画像処理コントロール部１２５へ送られる。【００３２】  試料冷却ホルダー１２２は、液体ヘリウムや液体窒素、スラッシュ窒素など極低温の冷却源を保存する冷却源容器１２３を備え、熱伝導によって先端に固定された試料１１１を凍結させた状態を保持できる。温度制御部１２４は、冷却源容器１２３に保存された冷却源によって、凍結した試料１１１を一定の温度に保持したり、さらに冷却することができる。または、図示しないヒーターによって、試料冷却ホルダー１２２の温度を任意の温度に設定し、試料１１１の表面に付着した霜を昇華させることもできる。試料冷却ホルダー１２２の温度は制御装置１１７が備える画像処理コントロール部１２５へ送られる。【００３３】  送られた測定結果は、コンピュータ１１８のディスプレイ１１８ａに表示される。試料冷却ホルダー１２２は、試料１１１の位置、傾斜角度を制御する試料移動傾斜制御部１２６を備えている。試料１１１の位置、傾斜角度は、試料１１１の画像をコンピュータ１１８のディスプレイ１１８ａ上に表示し、装置使用者が入力手段１１８ｂにより設定することができる。ここで設定した条件に従って、図３に示した試料ステージ位置傾斜設定部（ステージ位置調整部）３０４から試料移動傾斜制御部１２６へ命令が送信され、試料の移動、傾斜が行われる。
【実施例２】
【００３４】  図２Ａ乃至図２Ｅに氷包埋法で作製した試料の観察例を示す。【００３５】  図２Ａは正常な氷包埋試料の模式図と、その観察結果の模式図である。氷包埋法で作製された試料２０１では、非晶質氷２０２に構造物２０３が本来の構造を保ったまま内包されている。電子線２０４が試料２０１を走査すると、二次電子像（以下、ＳＥと称することがある）２０５は非晶質氷２０２の表面を示し、コントラスト変化として表される凹凸情報は得られない。一方、透過電子信号である明視野像（以下、ＢＦと称することがある）２０６や暗視野像（以下、ＤＦと称することがある）２０７では構造物２０３をコントラストの違いで確認できる。【００３６】  図２Ｂは、非晶質氷に試料が内包されているが、表面に霜２０８が付着した場合の観察例である。明視野像２０６や暗視野像２０７の観察では、表面の霜２０８はコントラストが変化して示されるため、明視野像および暗視野像の観察だけでは、霜が付着しているのか、試料中に本来存在する構造であるのかの判断が難しい。しかし、二次電子像２０５による表面観察を行うことで、霜の存在が確認できる。【００３７】  図２Ｃは、非晶質氷に試料が内包されているが、ビーム入射面に対して裏面側の表面に霜２０８が付着している場合の観察例である。明視野像２０６や暗視野像２０７の観察では、霜２０８はコントラストが変化して示されるが、二次電子像２０５では非晶質氷の表面を示し、コントラスト変化として表される凹凸情報は得られない。このような場合は、霜が付着しているのか、試料中に本来存在する構造であるのかの判断が難しい。よって、試料を傾斜し、試料の裏面の二次電子像、明視野像および暗視野像を観察することで、霜かどうかの判断ができる。【００３８】  図２Ｄは、氷包埋試料作製を誤ったり、氷包埋試料に熱ダメージが加わり、非晶質氷が昇華や溶融し、内包されるはずの構造物が表面に露出している場合の観察例である。この場合、二次電子像２０５では露出した構造物により凹凸情報が検出され、コントラストの違いとして表れる。また、明視野像２０６や暗視野像２０７の観察では、構造物２０３をコントラストの違いで確認できる。しかし、このような試料では露出した構造物に電子線が直接入射され、電子線ダメージが生じるため、観察には適さない。【００３９】  図２Ｅは、観察面は非晶質氷に試料が内包されているが、ビーム入射面に対して裏面側の表面は構造物２０３が露出している場合の観察例である。この場合、明視野像２０６や暗視野像２０７の観察では、構造物２０３はコントラストが変化して示されるが、二次電子像２０５では非晶質氷の表面を示し、コントラスト変化として表される凹凸情報は得られない。このような場合は、試料が氷に内包されているかの判断が難しい。よって、試料を傾斜し、試料の裏面の二次電子像、明視野像および暗視野像を観察することで、試料が非晶質氷に内包しているかどうかの判断ができる。
【実施例３】
【００４０】  図３は、図１の画像処理コントロール部１２５の機能および処理について説明した図である。画像処理コントロール部１２５では、凍結した試料１１１が適正な凍結状態にあるかを判断し、安定して観察するために真空雰囲気をコントロールする。【００４１】  氷包埋試料などの凍結した試料１１１が試料冷却ホルダー１２２に固定され、例えば、−９０℃から−１７０℃の間で凍結状態を維持できる温度でＳＥＭ鏡筒１００内に導入される。試料冷却ホルダー１２２を導入したのち、試料冷却ホルダー１２２の温度と真空度、およびコールドトラップ１２０の先端の現在位置が測定され、その結果が画像処理コントロール部１２５へ入力される。【００４２】  例えば、冷却試料ホルダー１２２の温度、真空度、コールドトラップ１２０の位置はそれぞれホルダー温度調節部３０１、真空度測定部３０２、コールドトラップ位置調節部３０３に測定結果が入力され、測定結果を元に最適条件演算部３０５で計算される。最適条件演算部３０５では、適正な真空度と試料温度を維持するための冷却試料ホルダー１２２の設定温度、真空度、及びコールドトラップ１２０の位置の条件を求める。【００４３】  例えば、非特許文献２の図１に示す水の飽和蒸気圧曲線に沿い、試料温度が−１００℃の時は、真空度は１×１０−５Ｔｏｒｒに設定される。最適条件演算部３０５で得られた演算結果は、再びホルダー温度調節部３０１、真空度測定部３０２、コールドトラップ位置調節部３０３に入力される。【００４４】  演算結果が入力されたホルダー温度調節部３０１から、ホルダーの温度制御部１２４へ新たな設定温度が伝達され、試料冷却ホルダー温度が適切な温度に再設定される。同様に、演算結果が入力されたコールドトラップ位置調節部３０３から、コールドトラップ位置制御部１１９へ新たな設定位置が伝達され、コールドトラップ１２０の先端が適切な位置に再設定される。【００４５】  試料ステージ位置傾斜設定部（ステージ位置調整部）３０４ではコールドトラップ１２０の位置と試料１１１とが干渉しないよう、ステージ位置を計測し、干渉する場合は、ディスプレイ表示設定部３１３を経て、ディスプレイ１１８ａに警告表示される。また、試料１１１の裏面観察が必要となった場合に、ディスプレイ１１８ａにより裏面観察の実行を選択し、試料１１１が搭載されたステージを傾斜し、裏面を観察面にする。なお、試料傾斜は、試料ホルダー１２２を直接回転させても良い。【００４６】  また、少なくとも３つの検出信号から形成される画像の観察から、種々の処理を行うための基準となる判定も画像処理コントロール部１２５で行う。【００４７】  例えば、二次電子画像演算部３０６では、二次電子検出器１０９で得られた信号が入力され、明視野画像演算部３０７には、明視野信号検出器１１６で得られた信号が入力される。同様に暗視野画像演算部３０８では、暗視野信号検出器１１３で得られた信号が入力される。これらの画像は画像取得切替部３０９により、１種類の信号のみを選択して検出したり、もしくは二次電子信号、明視野信号および暗視野信号など複数の信号を同時に取得する切り替えが可能である。【００４８】  画像処理コントロール部１２５には、得られたそれ���れの画像から、凍結試料が正常に凍結されているかを判断するための画像処理を行う、取得画像演算部３１０を備えている。取得画像演算部３１０は、同時に得た二次電子像や透過電子像から画像処理と比較を行う。例えば、両画像にエッジ検出処理を行い、凹凸情報を抽出し、抽出した位置が両画像で一致する量を計算し、その大小により試料が非晶質氷から露出しているかどうかを判断する。他には、正規化相関法や位相限定相関法など、テンプレートマッチングの技術を使用し、両画像の類似度を評価し、試料の適否判断に適用することができる。【００４９】  荷電粒子線照射量演算部３１１では、ステージ移動を行った後に、観察倍率の変化無く同一視野を観察し続けた間の電子線照射量を測定する。例えば、同一視野の観察を続け、ある時点で、試料状態が非晶質氷の昇華や融解により適正ではなくなった時の電子線照射量を記憶し、観察可能な時間を算出することができる。観察可能時間はディスプレイ表示設定部３１３を経て、ディスプレイ１１８ａへ表示される。【００５０】  画像取得切替部３０９によって、２種以上の信号を同時に取得する場合は、同時取得をしたことが認識できるよう、画像上、あるいはディスプレイ上に表示されるか、記録部３１４に記録、あるいは証明書等のデータとして発行される。ここで、異なる種類の信号を同時に取得したことを示す証明書は、証明書発行設定部３１２によって、図示しない出力手段を介して発行される。この証明書は、取得した画像が記録部３１４に保存されるのと同時に保存される。【００５１】  取得した二次電子信号や透過電子信号は、ディスプレイ表示設定部３１３により、ディスプレイ１１８ａに同時表示される。取得信号以外に、真空度や、試料冷却ホルダー温度、コールドトラップ温度、試料が正常かどうかの判定結果をディスプレイ表示設定部３１３によりディスプレイ１１８ａに表示可能となる。【００５２】  記録部３１４には、同時取得画像や証明書、画像取得時のコールドトラップ及びステージ位置、計測した真空度と試料冷却ホルダー温度が記録される。
【実施例４】
【００５３】  図４は、３種の信号を取得する際のディスプレイ表示の一例を示した図である。ディスプレイ１１８ａのスクリーン４０１には、二次電子像４０２、明視野像４０３および暗視野像４０４を同時に表示する領域がある。【００５４】  条件表示部４０５には、図１の試料冷却ホルダー１２２の冷却温度とコールドトラップ１２０の先端位置、真空計１２１で検知した真空度の値が表示される。設定部４０６では、試料冷却ホルダー温度を任意の温度に設定した値が設定温度ボタン４０７に表示される。コールドトラップ位置も任意の位置に設定した場合は、その入力値位置設定ボタン４０８に表示される。【００５５】  操作指示部４０９には、試料凍結状態を判断する試料凍結状態判断指示部４１０と、霜付着を判断する霜付着判断指示部４１１が表示される。試料凍結状態判断指示部４１０を選択すると、図５Ａ或いは図５Ｂに示すフローチャートが実施できる。図５Ａ或いは図５Ｂのフローチャート実施後、試料凍結状態が適正でなかった場合、警告表示に切り替わる。【００５６】  霜付着判断指示部４１１を選択すると、図６に示すフローチャートが実施され、霜は付着していると判断された場合は、霜付着が改善するまで霜付着ボタンが警告表示に切り替わる。【００５７】  試料位置ボタン４１２は、霜付着ボタン４１１を選択し、判定の結果、コールドトラップ先端位置が試料に近づいた際、試料とコールドトラップ先端が干渉するという結果が得られた場合、警告表示に切り替わる。【００５８】  画像取得指示部４１３を選択すると、３種類の信号を同時に取り込んだり、１種のみ、もしくは４種類の画像を任意に取り込むことができる。画像取得指示部４１３で選んだ信号の指示は画像取得切替部３０９に伝達され実行される。４種類の信号を取り込む場合は、条件表示部４０５や設定部４０６、操作指示部４０９の画面領域が画像表示に切り替わり、４種同時表示が可能となる。【００５９】  裏面観察ボタン４１６は、裏面確認が必要な場合に選択すると、試料が傾斜する。【００６０】  氷包埋試料合否判定設定画面４１７は、試料全体の品質判定時のしきい値の設定や、構造物の露出を判断する際の抽出領域サイズの設定を行う。【００６１】  終了ボタン４１４は、一連のクライオ観察を終了する場合に選択する。
【実施例５】
【００６２】  図５Ａおよび図５Ｂに、凍結試料を電子顕微鏡に導入後の品質判定手順のフローチャートを示す。図５Ａは、二次電子像（ＳＥ）、明視野像（ＢＦ）および暗視野像（ＤＦ）の評価を、観察者がディスプレイ１１８ａに表示された各像を目視で確認して判断する例を示している。一方、図５Ｂは図５Ａの変形例であり、二次電子像（ＳＥ）、明視野像（ＢＦ）および暗視野像（ＤＦ）の評価を、画像処理により自動判定する例を示している。【００６３】  つまり、図５Ａのステップ５０３、ステップ５０８、ステップ５１３では、観察者が目視で判断を行い、それに対応する図５Ｂのステップ５０３、ステップ５０８、ステップ５１３では、画像処理により自動判定を行う。【００６４】  図５Ａおよび図５Ｂの他のステップは同じであるため、図５Ａおよび図５Ｂのフローチャートについて、以下に纏めて説明する。【００６５】  凍結試料は試料冷却ホルダーによって例えば、−９０℃から−１７０℃の間で凍結状態を維持できる温度に固定され、電子顕微鏡に導入される。その後、任意の試料位置に視野を動かすため、ステージ移動を行う（ステップ５０１）。【００６６】  次に、実施例１で説明した荷電粒子線装置および方法により、二次電子像と明視野像、暗視野像を同時に取得する（ステップ５０２）。得られた３種類の信号は、図１の画像処理コントロール部１２５に送られ、ディスプレイ１１８ａに表示される。【００６７】  ここで、図５Ａの例では、観察者はディスプレイ１１８ａに表示された二次電子像（ＳＥＭ像）を目視にて確認（評価）を行い（ステップ５０３）、構造物の露出の有無の判断（ステップ５０４）、試料表面の霜の有無の判断（ステップ５０６）を行う。【００６８】  一方、図５Ｂの例では、画像処理により二次電子像（ＳＥＭ像）の自動判定を行い（ステップ５０３）、構造物の露出の有無の判断（ステップ５０４）、試料表面の霜の有無の判断（ステップ５０６）を行う。【００６９】  観察者が構造物の露出有りと判断した場合、或いは、画像処理による自動判定で構造物の露出有りと判定された場合は、観察に適していないことを観察者へ通知する（ステップ５０５）。【００７０】  構造物の露出は無く、試料表面に霜があると判断された場合は、後述の実施例６に示す昇華処理を行う（ステップ５０７）。【００７１】  観察者による二次電子像（ＳＥＭ像）の目視での確認（評価）、或いは、二次電子像（ＳＥＭ像）の画像処理による自動判定から、構造物の露出および試料表面の霜は無いと判断（判定）した場合、明視野像（ＢＦ像）と暗視野像（ＤＦ像）の各画像の確認（評価）（図５Ａのステップ５０８）、或いは、明視野像（ＢＦ像）と暗視野像（ＤＦ像）の画像処理による自動判定（図５Ｂのステップ５０８）を行う。【００７２】  霜の付着が無いと判断（判定）された場合は、裏面観察のために試料を傾斜する（ステップ５１０）。【００７３】  この時、試料の傾斜によって観察視野は傾斜前観察視野から大きくずれる場合がある。この場合は、ステップ５０２で取得した明視野像（ＢＦ像）と暗視野像（ＤＦ像）およびステージ座標から、画像処理によって傾斜前に観察していた視野にステージが移動する。つまり、二次電子像（ＳＥＭ像）および透過電子像（ＳＴＥＭ像）のマッチング（位置決め）を行う（ステップ５１１）。【００７４】  次に、二次電子像（ＳＥＭ像）と明視野像（ＢＦ像）、暗視野像（ＤＦ像）を同時に取得する（ステップ５１２）。【００７５】  ここで、図５Ａの例では、観察者はディスプレイ１１８ａに表示された二次電子像（ＳＥＭ像）を目視にて確認（評価）を行い（ステップ５１３）、構造物の露出の有無の判断（ステップ５１４）を行う。【００７６】  一方、図５Ｂの例では、画像処理により二次電子像（ＳＥＭ像）の自動判定を行い（ステップ５１３）、構造物の露出の有無の判断（ステップ５１４）を行う。【００７７】  観察者が構造物の露出有りと判断した場合、或いは、画像処理による自動判定で構造物の露出有りと判定された場合は、観察に適していないことを観察者へ通知する（ステップ５０５）。【００７８】  観察者が構造物の露出は無いと判断した場合、或いは、画像処理による自動判定で構造物の露出は無いと判定された場合は、試料傾斜を戻すか、すなわち、観察面を元に戻すかを選択する（ステップ５１５）。【００７９】  観察面を元に戻すと判断した場合、試料傾斜を戻す（ステップ５１６）。また、観察面を戻さないと判断した場合は、試料傾斜の状態をそのまま維持する。【００８０】  その後、二次電子像（ＳＥＭ像）、明視野像（ＢＦ像）、暗視野像（ＤＦ像）の各像について観察用の撮影を行う（ステップ５１７）。【００８１】  撮影終了後、観察者が撮影を続行する場合は、ステージ移動（ステップ５０１）を再度行い、別な視野で観察を続けてもよい。撮影を続行しない場合はそのまま終了となり、試料冷却ホルダー１２２の取り外しなどを行う。
【実施例６】
【００８２】  図６は試料表面に付着した霜２０８の昇華処理の手順を示したフローチャートである。【００８３】  試料表面に霜の付着がある場合、水の蒸気圧曲線に従い、測定した真空度で霜が昇華する温度まで、試料冷却ホルダー１２２の温度を上昇させる（ステップ６０１）。【００８４】  水の蒸気圧曲線の一例としては、非特許文献２等において説明されており、本実例では、制御装置１１７に当該曲線が記憶され、自動的に設定温度を求めるように構成することもできる。或いは、装置使用者が当該曲線に基づいて設定温度を入力することもできる。【００８５】  例えば、試料室の真空度が１×１０−５Ｔｏｒｒで試料冷却ホルダー１２２が−１７０℃に冷却されていたとき、試料表面に付着していた霜は、試料冷却ホルダー温度を約−９０℃に上昇させることにより昇華させることができる。その結果、試料室内の真空度は低下するため、この値を検知する（ステップ６０２）。【００８６】  次に、コールドトラップ１２０の先端位置を移動させる（ステップ６０３）。コールドトラップ１２０は試料室内雰囲気中に残留する水蒸気や、昇華により試料から発生する水蒸気を、冷却した金属に吸着してトラップするものである。先端位置をより試料に近づけることで、試料から昇華した水分を効率よく吸着させることができる。【００８７】  その後、真空度を再び検知し（ステップ６０４）、試料温度上昇（ステップ６０１）前の真空度に戻っていれば、観察に適した試料温度になるよう、試料冷却ホルダー１２２の温度を低下させる（ステップ６０５）。【００８８】  二次電子像（ＳＥＭ像）、明視野像（ＢＦ像）、暗視野像（ＤＦ像）の各像について、試料表面確認用の画像を取得する（ステップ６０６）。【００８９】  その後、観察者による各画像の目視での確認（評価）、或いは、各画像の画像処理（ステップ６０７）による自動判定により、構造物の露出の有無の判断（判定）（ステップ６０８）を行い、構造物の露出が有ると判断（判定）された場合は、観察に適していないことを観察者へ通知する（ステップ６０９）。【００９０】  構造物の露出が無いと判断（判定）された場合は、試料表面の霜の付着の有無を判断（判定）する（ステップ６１０）。【００９１】  試料表面に霜が付着していると判断（判定）された場合、上記のステップ６０１から６０７の工程を繰り返し実施する。【００９２】  構造物の露出がなく、霜も除去されていれば、二次電子像（ＳＥＭ像）、明視野像（ＢＦ像）、暗視野像（ＤＦ像）の各像について、観察用の撮影を行う（ステップ６１１）。【００９３】  その後、観察者が撮影を続行する場合は、ステージ移動を行い、別な視野で観察を続けてもよい。撮影を続行しない場合はそのまま終了となり、試料冷却ホルダー１２２の取り外しなどを行う。
【実施例７】
【００９４】  図５Ａ乃至図６における二次電子像（ＳＥＭ像）から構造物の露出を判断する方法（ステップ５０４、５１３、６０８）の一例を説明する。【００９５】  表面確認撮影（ステップ５０２、５１２、６０６）で取得した明視野像（ＢＦ像）と暗視野像（ＤＦ像）、またはそのどちらかの画像の輝度情報を、図３の取得画像演算部３１０によって抽出し、構造物のコントラストがある（隣接する数値差が大きい）領域を抽出する。【００９６】  抽出する領域は、観察者がそのサイズを任意で決めることも可能であり、領域サイズの入力は図４の氷包埋試料合否判定設定画面４１７で行う。領域の抽出は、観察者がディスプレイ１１８ａに表示された画像から、任意で比較領域を一箇所または複数個所選択しても良い。【００９７】  二次電子像、明視野像、暗視野像は同じ電子ビーム走査によって得られているため、それぞれの画像の試料位置関係は同じとなる。したがって、それぞれの画像の同一領域を比較することで、同一視野の比較が可能である。よって、二次電子像内の明視野像や暗視野像の抽出領域と同じ場所の凹凸情報のコントラストを輝度値から検出する。コントラストが検出されない場合は構造物が氷に包埋されていると判断し、コントラストが検出された場合は構造物が露出していると判断する。
【実施例８】
【００９８】  図５Ａ乃至図６における二次電子像から霜の付着の有無を判断する方法（ステップ５０６、６１０）の一例について図７Ａおよび図７Ｂを用いて説明する。図７Ａは、試料表面に霜の付着が無い場合の二次電子像７０１および二次電子信号強度７０３を示している。一方、図７Ｂは、試料表面に霜７０５が付着している場合の二次電子像７０４および二次電子信号強度７０７を示している。【００９９】  表面確認撮影（ステップ５０２、５１２、６０６）で取得した明視野像と暗視野像、またはそのどちらかの画像の輝度情報を、図３の取得画像演算部３１０によって抽出する。【０１００】  霜の付着判断は、観察対象では無い構造物の情報を利用する。実施例７で選択された領域以外の領域を自動で選択するか、観察者がディスプレイ１１８ａに表示された画像から、任意で比較領域を一箇所または複数個所選択する。選択した領域と同一箇所の二次電子像の輝度値を抽出する。【０１０１】  図７Ａに示すように、霜の付着がない氷包埋試料の表面形状は平坦なため、例えば、二次電子像７０１のライン７０２の二次電子信号強度７０３は、ほぼ平坦なプロファイルとなる。【０１０２】  一方、図７Ｂに示すように、霜の付着がある氷包埋試料の表面形状は、表面に霜７０５が形成されるため、二次電子像７０４では凹凸形状としてコントラストが得られる。よって二次電子像７０４のライン７０６の二次電子信号強度７０７は凹凸のエッジ部にピークを持つ。このピークを図３の取得画像演算部３１０で検出し霜の判断を行う。
【実施例９】
【０１０３】  図５Ａおよび図５Ｂにおける表面観察位置と裏面観察位置のマッチング（ステップ５１１）について図８Ａ乃至図８Ｄを用いて詳しく説明する。【０１０４】  まず、試料冷却ホルダー１２２を傾斜したときの観察位置のずれ量を計算し、図３の試料ステージ位置傾斜設定部（ステージ位置調整部）３０４にて、傾斜前後で同じ観察位置になるように調節する。【０１０５】  しかし、観察倍率が１万倍以上になると、試料ステージ位置傾斜設定部（ステージ位置調整部）３０４の調整で表面確認観察位置と同一視野に移動しない場合がある。その場合は、画像処理を用いて詳細な位置合わせを行う。表面確認撮影（ステップ５０２）を行ったときよりも倍率を低倍にして観察する（図８Ａの８０１）。【０１０６】  ここで、表面確認撮影（ステップ５０２）で取得した明視野像か暗視野像（図８Ｂの８０２）を図３の取得画像演算部３１０によって、傾斜方向と同じ方向に反転させ、この画像を被探索画像とする（図８Ｂの８０３）。【０１０７】  テンプレートマッチング法などの画像処理によって、観察している低倍像の中から、被探索画像のパターンを検出する（図８Ｃの８０４）。【０１０８】  ステージを検出位置が画面中心になるように移動させ（図８Ｄの８０５）、表面観察と同一条件で二次電子像、明視野像、暗視野像を取得する。
【実施例１０】
【０１０９】  凍結された試料１１１の厚みによっては、そもそも電子顕微鏡観察に適していない場合がある。このような場合、より早い段階にて試料１１１を作製し直す、或いは、新しいものに交換する等により対応することが望ましい。【０１１０】  図９Ａ乃至図９Ｄに、試料１１１の観察可否の判別例を示す。本判別は、実施例５で説明した図５Ａおよび図５Ｂのステップ５０１とステップ５０２の間に実行することができる。判別の結果、観察不可と判断された場合には、ステップ５０２における表面確認撮影（ＳＥＭ，ＢＦ，ＤＦ）を行う前の段階で、試料１１１の交換等により対応することができる。【０１１１】  まず、図９Ａに示すように、試料全体の確認のため、事前に氷包埋をしていない試料搭載メッシュの明視野像を取得する（９０１）。このとき、メッシュ基材９０２に入射した多くの電子は試料内部で吸収されるか、大きく散乱して角度を持って試料を透過するため、図１の明視野信号検出器１１６で検出される信号は少なくなり、暗い画像となる。【０１１２】  一方、支持膜など試料搭載部９０３では、多くの入射電子は非散乱もしくは非弾性散乱するため、明視野信号検出器１１６で検出される信号は多くなり、明るい画像となる。これらの画像の観察条件と、試料搭載位置の階調を記憶する。【０１１３】  次に、明視野像の階調を基準値とし、観察可能な場合の階調（しきい値）を設定する。さらに、観察視野全体の面積に対し、何割が閾値以上であれば観察試料として合格かを設定する。これらの２つの設定は図１のディスプレイ１１８ａ上の氷包埋試料合否判定設定画面４１７から観察者が任意に設定できる。【０１１４】  次に、上記の観察条件を用いて、氷包埋試料の二次電子像と明視野像を観察する。明視野像は、包埋した氷が厚い場合などは、図９Ｂに示すように、全体に暗い画像となる（９０４）。一方、包埋した氷が薄ければ薄いほど、明るい画像が得られる（９０５、９０６）。【０１１５】  明視野像の画像処理によって、試料が観察に適している厚みかを判別する。ここで、二次電子の画像を取得しておくことで、氷の昇華処理後に画像の改善が見られない場合、氷以外の要因を推定することができる。
【実施例１１】
【０１１６】  本実施例では、裏面観察時の試料傾斜方法の一例を説明する。冷却した試料ホルダーは、特許文献２に示すようなホルダーを用いることにより、冷却源容器の姿勢を一定方向に保持しながら試料を傾斜することができる。これにより、試料傾斜によって冷却源容器内の冷却源（例えば液体窒素）の液面位置が変化し沸騰（バブリング）することによる試料部の振動や、冷却源がこぼれるといった不具合を防げる。【０１１７】  図１０Ａは、試料冷却ホルダー１００１を荷電粒子線装置のホルダー受け部１００２に取り付けた状態を表している。試料冷却ホルダー１００１は、Ｏ−リング１００３を通じ、ホルダー受け部１００２に対してスライド、或いは、回転可能に取り付けられている。また、試料移動傾斜制御部１００４は接着冶具１００５により試料冷却ホルダー１００１と固定されている。【０１１８】  観察者が裏面観察実行を選択すると、試料移動傾斜制御部１００４は、例えば、モータ駆動で回転し、接触している試料冷却ホルダー１００１も同様に回転し、裏面が観察面となる。この時、冷却源容器１００６は、姿勢を保持した状態であるため、冷却源容器内の冷却源はこぼれない。【０１１９】  図１０Ｂ、図１０Ｃは、表面・裏面観察時の試料冷却ホルダー１００１とホルダー受け部１００２と、試料移動傾斜制御部１００４の位置関係と試料搭載部１００７の拡大図である。【０１２０】  ホルダー受け部１００２には、傾斜度数表示１００８があり、試料移動傾斜制御部１００４には試料表面位置を示す試料表面位置メモリ１００９がある。これらによって、現在の試料傾斜角度を把握することができる。【０１２１】  試料ホルダーによっては、試料観察部のみを傾斜できるものがある。この場合は、試料ホルダーの傾斜機構を用いても良い。【０１２２】  上記で説明した各実施例において、透過電子像として明視野像および暗視野像を用いる例を説明しているが、明視野像或いは暗視野像のいずれか一方を用いても良い。試料観察の精度を向上するためには、明視野像および暗視野像の両方を用いるのがより望ましい。【０１２３】  なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【０１２４】  １００…ＳＥＭ鏡筒，１０１…電子銃，１０２，２０４…電子線，１０３…引き出し電極，１０４…陽極，１０５，１０７…集束レンズ，１０６…対物レンズ絞り，１０８…偏向コイル，１０９…二次電子検出器，１１０…対物レンズ，１１１，２０１…試料，１１２…暗視野信号電子，１１３…暗視野信号検出器，１１４…明視野信号電子，１１５…明視野絞り，１１６…明視野信号検出器，１１７…制御装置，１１８…コンピュータ，１１８ａ…ディスプレイ，１１８ｂ…入力手段，１１９…コールドトラップ位置制御部，１２０…コールドトラップ，１２１…真空計，１２２，１００１…試料冷却ホルダー，１２３，１００６…冷却源容器，１２４…温度制御部，１２５…画像処理コントロール部，１２６，１００４…試料移動傾斜制御部，１２７…真空計制御部，１２８…電子光学系制御部，２０２…非晶質氷，２０３…構造物，２０５，４０２，７０１，７０４…二次電子像，２０６，４０３，８０１，８０２，８０３，８０５，９０１，９０４，９０５，９０６…明視野像，２０７，４０４…暗視野像，２０８，７０５…霜，３０１…ホルダー温度調節部，３０２…真空度測定部，３０３…コールドトラップ位置調整部，３０４…試料ステージ位置傾斜設定部（ステージ位置調整部），３０５…最適条件演算部，３０６…二次電子画像演算部，３０７…明視野画像演算部，３０８…暗視野画像演算部，３０９…画像取得切替部，３１０…取得画像演算部，３１１…荷電粒子線照射量演算部，３１２…証明書発行設定部，３１３…ディスプレイ表示設定部，３１４…記録部，４０１…スクリーン，４０５…条件表示部，４０６…設定部，４０７…設定温度ボタン，４０８…入力値位置設定ボタン，４０９…操作指示部，４１０…試料凍結状態判断指示部，４１１…霜付着判断指示部，４１２…試料位置ボタン，４１３…画像取得指示部，４１４…終了ボタン，４１５…暗視野信号検出器制御ボタン，４１６…裏面観察ボタン，４１７…氷包埋試料合否判定設定画面，７０３，７０７…二次電子信号強度，９０２…メッシュ基材，９０３…試料搭載部，１００２…ホルダー受け部，１００３…Ｏ−リング，１００５…接着冶具，１００７…試料搭載部，１００８…傾斜度数表示，１００９…試料表面位置メモリ
【図１】
2016056096.tif 000003
【図２Ａ】
2016056096.tif 000004
【図２Ｂ】
2016056096.tif 000005
【図２Ｃ】
2016056096.tif 000006
【図２Ｄ】
2016056096.tif 000007
【図２Ｅ】
2016056096.tif 000008
【図３】
2016056096.tif 000009
【図４】
2016056096.tif 000010
【図５Ａ】
2016056096.tif 000011
【図５Ｂ】
2016056096.tif 000012
【図６】
2016056096.tif 000013
【図７Ａ】
2016056096.tif 000014
【図７Ｂ】
2016056096.tif 000015
【図８Ａ】
2016056096.tif 000016
【図８Ｂ】
2016056096.tif 000017
【図８Ｃ】
2016056096.tif 000018
【図８Ｄ】
2016056096.tif 000019
【図９Ａ】
2016056096.tif 000020
【図９Ｂ】
2016056096.tif 000021
【図９Ｃ】
2016056096.tif 000022
【図９Ｄ】
2016056096.tif 000023
【図１０Ａ】
2016056096.tif 000024
【図１０Ｂ】
2016056096.tif 000025
【図１０Ｃ】
2016056096.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月9日(2015.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、
前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、
前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、
当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、
当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、
前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、
前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段と、
前記試料に対する荷電粒子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段と、を備え、
前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、
前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項２】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項３】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項４】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項５】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項６】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、
前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、
前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、
当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、
当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、
前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、
前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段と、
前記試料に対する電子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段と、を備え、
前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、
前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする電子顕微鏡。
【請求項７】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項６に記載の電子顕微鏡。
【請求項８】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項６に記載の電子顕微鏡。
【請求項９】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１０】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１１】
冷却された試料の二次電子像および透過電子像を取得し、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料を観察する試料の観察方法であって、
当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の表面状態および内部状態の変化を観察することを特徴とする試料の観察方法。
【請求項１２】
前記透過電子像は、明視野像であることを特徴とする請求項１１に記載の試料の観察方法。
【請求項１３】
前記透過電子像は、暗視野像であることを特徴とする請求項１１に記載の試料の観察方法。
【請求項１４】
前記取得した取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定し、
前記試料の冷却状態が良好であると判断される場合、前記二次電子像および透過電子像の取得を継続し、
前記試料の冷却状態が良好であると判断されない場合、二次電子像および透過電子像の取得条件を変更することを特徴とする請求項１１から１３のいずれかに記載の試料の観察方法。
【請求項１５】
前記取得した明視野像の階調に基づき、前記試料の状態を判定することを特徴とする請求項１２に記載の試料の観察方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ない状態で評価が行われていた。
［００１１］
本発明の目的は、高精度かつ安定した試料観察が可能な荷電粒子線装置、電子顕微鏡、試料の観察方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
［００１２］
上記課題を解決するための一態様として、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段と、前記試料に対する荷電粒子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段と、を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。
［００１３］
また、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段と、前記試料に対する電子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段と、を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。
［００１４］
また、本発明は、冷却された試料の二次電子像および透過電子像を取得し
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月30日(2017.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、
前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、
前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、
当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、
当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、
前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、
前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、
前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、
前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項２】
前記試料ステージは、更に、前記試料に対する荷電粒子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段を備える、請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項３】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項４】
前記透過電子検出器は、前記荷電粒子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項１に記載の荷電粒子線装置。
【請求項５】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項６】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の荷電粒子線装置。
【請求項７】
観察対象となる試料を支持する試料ステージと、
前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、
前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、
当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、
当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、
前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、
前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、
前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、
前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする電子顕微鏡。
【請求項８】
前記試料ステージは、更に、前記試料に対する荷電粒子線の照射面を変更可能な試料傾斜手段を備える、請求項７に記載の電子顕微鏡。
【請求項９】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非散乱電子および非弾性散乱電子を検出する明視野信号検出器であることを特徴とする請求項７に記載の電子顕微鏡。
【請求項１０】
前記透過電子検出器は、前記電子線が前記試料内において散乱することにより発生する透過電子のうち、非弾性散乱電子を検出する暗視野信号検出器であることを特徴とする請求項７に記載の電子顕微鏡。
【請求項１１】
前記制御装置は、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定する判定手段を備えることを特徴とする請求項７から１０のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１２】
前記コールドトラップは、その先端位置を前記試料近傍の任意の位置に移動できるよう移動機構を備えることを特徴とする請求項７から１０のいずれかに記載の電子顕微鏡。
【請求項１３】
冷却された試料の二次電子像および透過電子像を取得し、当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料を観察する試料の観察方法であって、
当該取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の表面状態および内部状態の変化を観察することを特徴とする試料の観察方法。
【請求項１４】
前記透過電子像は、明視野像であることを特徴とする請求項１３に記載の試料の観察方法。
【請求項１５】
前記透過電子像は、暗視野像であることを特徴とする請求項１３に記載の試料の観察方法。
【請求項１６】
前記取得した二次電子像および透過電子像に基づき、前記試料の冷却状態を判定し、
前記試料の冷却状態が良好であると判断される場合、前記二次電子像および透過電子像の取得を継続し、
前記試料の冷却状態が良好であると判断されない場合、二次電子像および透過電子像の取得条件を変更することを特徴とする請求項１３から１５のいずれかに記載の試料の観察方法。
【請求項１７】
前記取得した明視野像の階調に基づき、前記試料の状態を判定することを特徴とする請求項１４に記載の試料の観察方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
上記課題を解決するための一態様として、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に荷電粒子線を照射し、前記試料上で前記荷電粒子線を走査する光学系と、前記試料ステージおよび前記光学系を真空に保持する真空系と、当該荷電粒子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該荷電粒子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する荷電粒子線装置であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、本発明は、観察対象となる試料を支持する試料ステージと、前記試料に電子線を照射し、前記試料上で前記電子線を走査する電子光学系と、前記試料ステージおよび前記電子光学系を真空に保持する真空系と、当該電子線の照射により前記試料から放出される二次電子を検出する二次電子検出器と、当該電子線の照射により前記試料を透過する透過電子を検出する透過電子検出器と、前記二次電子検出器および前記透過電子検出器により検出した二次電子および透過電子に基づき、二次電子像および透過電子像を取得し、前記二次電子像および前記透過電子像を記憶する制御装置と、を有する電子顕微鏡であって、前記試料ステージは、前記試料を冷却する冷却手段を備え、前記真空系は、前記試料近傍の水分を吸着するコールドトラップと、前記真空系の真空度を計測する真空計と、を備えることを特徴とする。
【国際調査報告】
2016056096.tif 000027
2016056096.tif 000028