(57)【要約】  本願発明者らは、鋭意研究の結果、セマフォリン3A遺伝子の発現調節を担う転写因子を同定した。これらの転写因子を阻害又は促進することにより、セマフォリン3Aの発現を調節（抑制又は増強）することができる。また、これら転写因子の阻害活性又は促進活性を指標として化合物をスクリーニングすることにより、セマフォリン3Aの発現を調節する化合物を得ることができる。Sema3Aの発現を調節する化合物は、皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症、及び神経損傷の治療に、とりわけそう痒の治療に有用である。
2014178427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を調節する少なくとも１種の物質を有効成分として含有する、セマフォリン3Aの発現調節剤。
【請求項２】
セマフォリン3Aの発現調節がセマフォリン3Aの発現増強であり、前記有効成分が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を阻害する物質と、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質とからなる群より選択される少なくとも１種の物質である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
セマフォリン3Aの発現の増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤である請求項２記載の剤。
【請求項４】
前記疾患又は状態が、皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、又は骨粗鬆症である請求項３記載の剤。
【請求項５】
前記疾患又は状態が、皮膚疾患におけるそう痒である請求項４記載の剤。
【請求項６】
RORαを促進する少なくとも１種の物質を有効成分として含有する、皮膚疾患におけるそう痒の治療又は予防剤である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
RORαを促進する少なくとも１種の物質が、SR1078及びコレステロール硫酸から選択される少なくとも１種である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
セマフォリン3Aの発現調節がセマフォリン3Aの発現抑制であり、前記有効成分が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質と、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を抑制する物質とからなる群より選択される少なくとも１種の物質である、請求項１記載の剤。
【請求項９】
セマフォリン3Aの発現の抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤である請求項８記載の剤。
【請求項１０】
神経再生促進剤である請求項９記載の剤。
【請求項１１】
NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択される少なくとも１種の転写因子の調節を指標として化合物をスクリーニングすることを含む、セマフォリン3Aの発現を調節する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
セマフォリン3Aの発現調節がセマフォリン3Aの発現増強であり、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択される少なくとも１種の転写因子の阻害、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択される少なくとも１種の転写因子の促進を指標とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
セマフォリン3Aの発現の増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤のスクリーニング方法である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患又は状態が、皮膚疾患におけるそう痒である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
セマフォリン3Aの発現調節がセマフォリン3Aの発現抑制であり、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択される少なくとも１種の転写因子の促進、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択される少なくとも１種の転写因子の阻害を指標とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
セマフォリン3Aの発現の抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤のスクリーニング方法である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
神経再生促進剤のスクリーニング方法である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
セマフォリン3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む細胞と、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を調節する物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定することを含む、前記物質によるセマフォリン3Aの発現調節作用の評価方法。
【請求項１９】
セマフォリン3Aプロモーター領域が下記(1)〜(3)のいずれかの塩基配列を含む、請求項１８記載の方法。
(1)  配列番号１に示す塩基配列。
(2)  配列番号２に示す塩基配列。
(3)  (1)又は(2)と９０％以上の同一性を有する塩基配列。
【請求項２０】
前記物質が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を阻害する物質、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質であり、該物質によるセマフォリン3Aの発現増強作用が評価される、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
前記物質が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を阻害する物質であり、該物質によるセマフォリン3Aの発現抑制作用が評価される、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２２】
培養細胞と、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択される転写因子を調節する物質を接触させ、前記細胞におけるセマフォリン3Aの発現量を測定することを含む、前記物質によるセマフォリン3Aの発現調節作用の評価方法。
【請求項２３】
前記物質が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を阻害する物質、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質であり、該物質によるセマフォリン3Aの発現増強作用が評価される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記物質が、NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、及びFra1から選択されるいずれかの転写因子を促進する物質、又はRORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を阻害する物質であり、該物質によるセマフォリン3Aの発現抑制作用が評価される、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子を利用したセマフォリン3Aの発現を増強又は抑制する剤、及び特定の転写因子の阻害又は促進を指標とした、セマフォリン3Aの発現を増強又は抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セマフォリン(Semaphorin: Sema) は神経軸索の伸長などの細胞移動を制御するガイダンス因子として同定され、免疫応答や器官形成、骨代謝制御、がんの進展などの様々な生体機能や病態に関与する分子群であることが知られている。Semaファミリータンパク質はドメイン構造の違いからSema1〜Sema7のクラスに分類され、さらにサブクラスに分類される（非特許文献１）。【０００３】
その中のひとつであるセマフォリン３Ａ（Sema3A）は神経軸索の伸長方向を決定する神経ガイダンス因子の代表的な分子として知られ、Sema3Aが存在すると神経軸索の伸長が阻害される。このことは両面的な薬理作用につながると考えられる。すなわち、Sema3Aを阻害することによって神経再生を促進させることと、Sema3Aを増強して神経伸長を抑制することである。実際、前者については、神経再生促進剤としての技術が開示され（特許文献１）、後者については、特に皮膚組織で痒み知覚の軽減に利用する可能性が報告されている（非特許文献２）。【０００４】
皮膚バリア機能の破綻を伴うアトピー性皮膚炎や乾皮症患者では、正常皮膚に内在するSema3A発現の低下に伴って表皮内神経線維が緻密化し、抗ヒスタミン薬が奏功しない難治性の痒みを発症しやすくすることが明らかにされ（非特許文献３）、組換えSema3Aタンパク質を含む軟膏をアトピー性皮膚炎モデルNC/Ngaマウスに外用することで痒みや炎症を有意に抑制するという試み（非特許文献４）やSema3Aタンパク質そのものをアトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患治療薬とする技術が開発されている（特許文献２）。【０００５】
このような、Sema3Aを補充して皮膚内の神経軸索の誘導を抑え、結果として痒みを抑えるというアプローチは、痒み治療の有望な手法となる可能性があるものの、実用化には、Sema3Aタンパク質の調製と安定的な製剤開発が鍵となる。Sema3Aは、セマフォリンの分泌型タンパク質メンバーで、500アミノ酸残基のセマフォリン（Sema）ドメイン、Ｃ−２型免疫グロブリン（Ig）ドメイン、及び塩基性末端ドメインの３つの構造ドメインを有し、Sema3Aが生理活性を示すにはホモ二量体化が必須であることが示されている（非特許文献４）。Sema3Aを医薬品として製剤化する場合、500アミノ酸残基からなるSemaドメインのホモ二量体で分子量10万を超える高分子量タンパク質が有効成分となるが、高分子量二量体タンパク質を安定的に生産し、治療薬として妥当なコストと安定的品質を確保し得る製剤を開発することは決して容易ではない。【０００６】
こうした製剤上の課題を解決する技術のひとつとして、生体内のSema3Aを発現増強する物質で治療効果を誘導するアプローチが考えられる。この手法の１例としては、ヒノキ科植物であるアスナロ（Thujopsisdolabrata）の抽出液にその作用があることが見出され、その技術が開示されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４９７５２３１号公報
【特許文献２】特開２００８−２９７２４３号公報
【特許文献３】特開２０１１−１１１４１６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】熊ノ郷淳、実験医学、2013、vol.31,No.4, pp.482-487.
【非特許文献２】五嶋良郎、相原道子、実験医学、2013、vol.31,No.4, pp.488-494.
【非特許文献３】Tominaga et al., Exp Rev Dermatol, 2010, 5: 197-212.
【非特許文献４】Negi et al, J DermatolSci, 2012, 66: 37-43.
【非特許文献５】松永幸子、高木淳一、実験医学、2013、vol.31,No.4, pp.523-530.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Sema3A発現を内在性に抑制できれば神経再生促進作用を、他方、増強できれば神経軸索伸長阻害作用を、それぞれ誘導することができる。しかしながら、Sema3Aの発現を制御する物質を簡便に探索あるいは検査する方法は十分に開発されていない。特に、皮膚そう痒性疾患では表皮内のSema3Aの低下が知られており、それが痒み発症につながっていることが示されていることから、内在性のSema3Aを増強する物質を探索するための簡便なSema3A発現調節物質検索方法を提供できれば、難治性のそう痒症治療薬の開発に非常に有用である。【００１０】
本発明は、Sema3Aの発現を調節する物質のスクリーニングや、発現調節作用の評価に有用な新規な手段を提供すること、およびそう痒の治療や神経損傷の治療等に有用な新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、ヒトSema3A遺伝子プロモーターの単離を行い、その特性を決定してプロモーター領域の転写因子群を同定した。これら転写因子群について、鋭意検討を行ない、Sema3Aの発現増強に関わる転写因子群および発現抑制に関わる転写因子群を同定することに成功し、さらに、これら転写因子の阻害等によりSema3A遺伝子の発現を調節できることを確認し、本願発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を調節する少なくとも１種の物質を有効成分として含有する、セマフォリン3Aの発現調節剤を提供する。また、本発明は、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択される少なくとも１種の転写因子の調節を指標として化合物をスクリーニングすることを含む、セマフォリン3Aの発現を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は、セマフォリン3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む細胞と、転写因子を調節する物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定することを含む、前記物質によるセマフォリン3Aの発現調節作用の評価方法を提供する。さらに、本発明は、培養細胞と、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択される転写因子を調節する物質を接触させ、前記細胞におけるセマフォリン3Aの発現量を測定することを含む、前記物質によるセマフォリン3Aの発現調節作用の評価方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、Sema3Aの遺伝子発現を調節する転写因子を利用した、Sema3Aの発現調節剤が提供される。Sema3Aの発現を増強する剤は、アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患におけるそう痒の治療及び予防等に有用である。Sema3Aの発現を抑制する剤は、神経損傷部位における神経再生の促進等に有用である。また、本発明により、Sema3Aの発現を調節する化合物をスクリーニングする方法、及びSema3Aの発現増強作用又は発現抑制作用の強さを評価するための方法も提供される。本発明のスクリーニング方法及び評価方法によれば、Sema3Aの発現調節により優れた治療効果を奏する新規な医薬を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトSema3Aをコードする遺伝子の5’-フランキング領域を示す模式図である。本願発明者らが新規にクローニングしたSema3A上流遺伝子の塩基配列を元に、推定転写因子結合部位はP-Match-1.0 Publicプログラム（BIOBASE）による検索で明らかにした。
【図２】ヒトSema3Aをコードする遺伝子の5’-フランキング領域の塩基配列（配列番号１）である。推定転写因子結合配列を配列の下に示した。
【図３】正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）を用いたSema3A上流遺伝子のルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。より厳密にプロモーター領域を決定するために、5’末端欠失変異体による分析を、増殖期のNHEK並びに分化誘導後のNHEKを用いて行った。
【図４−１】Sema3Aの最小プロモーター（-240/-1）付近のヌクレオチド配列を示す。推定転写因子結合配列に下線を付し、最小プロモーター配列（-134/-25）を点線で囲った。
【図４−２】Sema3A遺伝子の上流の転写抑制領域（-1444/-975）のヌクレオチド配列を示す。推定転写因子結合配列に下線を付した。
【図５】Sema3Aプロモーターの推定転写因子結合配列に対する転写因子の結合を示す。実験は培養NHEKからの核タンパク質抽出物、及び推定転写因子結合配列を含むビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）で行った。レーン1は核抽出物とビオチン標識プローブの結合プロファイル、レーン2は400倍過剰量の未標識プローブと競合させた後のビオチン標識プローブの結合プロファイルを示す。
【図６】Sema3Aの推定転写因子結合配列部位に部位特異的変異を導入した構築体を用いたルシフェラーゼアッセイの結果である。***はp＜0.001で有意差あり。
【図７】転写因子RORα, Jun, Fos, Sox4, NF-κB1がSema3A発現に関与していることを確認するための低分子干渉RNA（siRNA）を使用した各転写因子及びSema3AのリアルタイムPCRによる遺伝子発現測定結果である。NHEKをRORα, Jun, Fos, Sox4, NF-κB1のsiRNA (40 nM)でトランスフェクションし、48時間培養後にtotal RNA単離を行った。Aは各転写因子の発現抑制効率を示している。B、Cは各転写因子ノックダウン後のSema3A発現解析結果である。
【図８】転写因子GABPα, Sox9, Rel (c-Rel), CREB, Pbx1, ER, JunB, JunD, Fra1, Fra2がSema3A発現に関与していることを確認するためのsiRNAを使用した各転写因子及びSema3AのリアルタイムPCRによる遺伝子発現測定結果である。NHEKを各転写因子のsiRNA（40 nM）でトランスフェクションし、48時間培養後にtotal RNA単離を行った。Aは各転写因子の発現抑制効率を示している。Bは各転写因子ノックダウン後のSema3A発現解析結果である。それぞれコントロールに対して*はp＜0.05、***はp＜0.001で有意差あり。
【図９】NHEKにおけるSema3A発現に対するRORα作動薬及び拮抗薬の作用を調べた結果である。NHEKを各薬剤で一定時間処理した後、total RNAを回収し、定量リアルタイムPCRでSema3A発現量を解析した。AはRORα作動薬SR1078の結果、BはRORα作動薬のコレステロール硫酸の結果、CはRORα拮抗薬SR1001の結果である。それぞれ非処理群に対して**はp＜0.01、***はp＜0.001で有意差あり。
【図１０】アトピー性皮膚炎（AD）モデルNC/Ngaマウスの病変部にRORα作動薬のコレステロール硫酸を外用する実験の結果である。基剤又はコレステロール硫酸溶液を病変部に９日間連続で塗布した後、皮膚を摘出して皮膚組織中のSema3A発現量を定量リアルタイムPCRにより測定した。**は基剤のみのコントロールに対しp＜0.01で有意差あり。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
「転写因子」とは、ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の一群で、ＤＮＡ上のプロモーターやエンハンサーといった、遺伝子の転写領域の5'上流に存在する転写を制御する領域に結合し、ＤＮＡの遺伝情報をメッセンジャーＲＮＡに転写する過程を促進、あるいは逆に抑制する役割をもつタンパク質である。転写因子は、１つのタンパク質分子が単独で、または複数のタンパク質分子と複合体を形成することによって転写調節（促進又は抑制）機能を発揮する。本発明における「転写因子」との語には、単独のタンパク質分子からなるもののほか、同一又は異なる複数のタンパク質が複合した多量体ないしは複合体の形態のものが包含され、さらにはそのような多量体ないしは複合体を構成する個々のタンパク質分子も包含される。ヒトのゲノム上には、転写因子をコードする遺伝子がおよそ1,800前後存在するとの推定がなされているが、標的タンパク質に対する転写因子はまちまちである。
【００１６】
本発明において、「転写因子の調節」とは、転写因子の阻害又は促進をいう。
【００１７】
「転写因子の阻害」とは、転写因子をコードする遺伝子からのmRNAの転写に始まり、生産された転写因子がSema3A遺伝子のプロモーター領域に結合してSema3Aの発現を調節するに至る過程のいずれかのステップを阻害することをいう。転写因子に対するアンチセンスRNA、マイクロRNA、siRNA等の利用は、転写因子の阻害の一例である。
【００１８】
「転写因子の促進」とは、転写因子をコードする遺伝子からのmRNAの転写に始まり、生産された転写因子がSema3A遺伝子のプロモーター領域に結合してSema3Aの発現を調節するに至る過程のいずれかのステップを促進することをいう。患部に転写因子タンパク質そのものを適用すること、あるいは患部において転写因子遺伝子の発現を増強することは、転写因子の促進の一例である。
【００１９】
図２に示した推定転写因子結合部位は、本願発明者らが新規にクローニングしたSema3A遺伝子上流のプロモーター領域の塩基配列（配列番号１）を元に、Match-1.0 Publicプログラム及びP-Match-1.0 Publicプログラム（BIOBASE）による検索を行なって同定されたものである。本プログラムは転写因子や実験的に証明されている転写因子結合配列に関する情報を網羅的に収載したデータベースで、新規の転写因子結合配列を予測できるソフトである。データベース解析を行うことで、Sema3A遺伝子上流に存在する未知の転写因子結合配列を推定し、Sema3Aの発現に関わる転写因子を予測できた。
【００２０】
転写因子結合配列の予測結果、プロモーター領域の5'末端欠失変異体のレポーターアッセイ、及びsiRNAによる転写因子ノックダウン実験の結果に基づき、Sema3A遺伝子の発現調節を担う転写因子として以下の転写因子が同定された。これらの転写因子の調節によってSema3Aの発現を調節することができる。
NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2（Nrf2ともいう）、Fra1（Fosl1ともいう）、RORα、ER（Esr1ともいう）、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB（Atf2ともいう）、JunB、JunD、Fra2
【００２１】
上記の転写因子は、以下の群に分類することができる。
(A)  Sema3Aの発現を抑制する転写因子群
NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、Fra1
(B)  Sema3Aの発現を促進する転写因子群
RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、Fra2
【００２２】
(A)の転写因子群は、好ましくはNF-κBであり得る。なお、NF-κBの調節は、そのサブユニットであるNF-κB1の調節により行なってよい。
【００２３】
(B)の転写因子群は、好ましくはRORα、AP-1、Sox-4、Jun、Fos、STATx（特にSTAT3）、GABPα、Sox-9、CREB、JunB、JunD、及びFra2からなる転写因子群、より好ましくはRORα、AP-1、Sox-4、Jun、Fos、CREB、及びJunBからなる転写因子群、さらに好ましくはRORα、AP-1、Jun、Fos、及びCREBからなる転写因子群、あるいはRORα、AP-1、Jun、及びFosからなる転写因子群であり得る。なかでも、RORαは、Sema3Aの発現調節のための標的として特に好ましい転写因子である。なお、Jun及びFosはAP-1を構成するタンパク質であり、これらも本発明における「転写因子」に包含される。
【００２４】
(A)の転写因子を阻害することで、Sema3A遺伝子の発現が増強する。従って、(A)の転写因子のいずれかを阻害する物質は、Sema3Aの発現増強剤として用いることができる。そのような剤は、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤として有用である。そのような疾患又は状態の具体例としては、アトピー性皮膚炎、乾皮症等の皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症を挙げることができる。アトピー性皮膚炎等のそう痒性皮膚疾患においては、正常皮膚に内在するSema3Aの発現が低下していることが知られており、Sema3Aタンパク質自体を患部に補うことでそう痒を抑制できることが知られている（非特許文献３、４及び特許文献２等）。アレルギー性鼻炎においても、鼻粘膜上皮でSema3Aの発現が低下し、上皮層内の末梢神経線維及び鼻甲介の粘膜固有層が増加していること、Sema3Aタンパク質を鼻腔内投与することで鼻炎の症状を軽減できることが知られている（Sawaki et al., J PharmacolSci 117, 34-44 (2011)）。また、Sema3Aが骨量を増加させる因子であり、骨粗鬆症の治療にも有用であることが知られている（林ら、実験医学、Vol. 31, No. 4, 2013年）。従って、Sema3A遺伝子の発現を抑制する転写因子の阻害によりSema3Aの発現を増強することで、皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症等を治療及び予防することができる。すなわち、(A)の転写因子のいずれかを阻害する物質は、皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症等の治療又は予防剤として、とりわけ皮膚疾患におけるそう痒又はアレルギー性鼻炎の治療又は予防剤として、特には皮膚疾患におけるそう痒の治療又は予防剤として好ましく用いることができる。もっとも、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態は上記の具体例に限定されない。
【００２５】
Sema3Aの発現増強はまた、(B)の転写因子を促進することによっても可能である。従って、(B)の転写因子のいずれかを促進する物質は、(A)の転写因子の阻害剤と同様に、Sema3Aの発現増強剤として用いることができ、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤として有用である。Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態の好ましい具体例は上記の通りである。とりわけ、RORαを促進する物質は、Sema3Aの発現増強のために使用可能な物質の特に好ましい例である。
【００２６】
Sema3Aの発現増強剤は、(A)の転写因子を阻害する物質を１種又は２種以上含んでいてもよいし、(B)の転写因子を促進する物質を１種又は２種以上含んでいてもよく、あるいは、(A)の転写因子を阻害する物質の１種以上及び(B)の転写因子を促進する物質の１種以上の両者を含んでいてもよい。
【００２７】
一方、(B)の転写因子を阻害することで、Sema3A遺伝子の発現が抑制される。従って、(B)の転写因子のいずれかを阻害する物質は、Sema3Aの発現抑制剤として用いることができる。そのような剤は、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤として有用である。そのような疾患又は状態の具体例としては、外傷性神経傷害、嗅覚異常症、脳梗塞性神経障害、顔面神経麻痺、糖尿病性神経症、緑内障、網膜色素変性症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋発育不全性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳梗塞、外傷性神経変性疾患等における、脊髄神経又は末梢神経の損傷等を挙げることができる。Sema3Aを阻害することによって神経再生を促進できることが知られており、これを利用した神経再生促進剤が知られている（特許文献１）。従って、Sema3A遺伝子の発現を促進する転写因子の阻害によりSema3Aの発現を抑制することで、神経損傷部における神経再生を促進することができる。すなわち、(B)の転写因子のいずれかを阻害する物質は、神経再生促進剤として好ましく用いることができる。もっとも、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態は上記の具体例に限定されない。
【００２８】
Sema3Aの発現抑制はまた、(A)の転写因子を促進することによっても可能である。従って、(A)の転写因子のいずれかを促進する物質は、(B)の転写因子の阻害剤と同様に、Sema3Aの発現抑制剤として用いることができ、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤、例えば神経再生促進剤として有用である。
【００２９】
Sema3Aの発現抑制剤は、(A)の転写因子を促進する物質を１種又は２種以上含んでいてもよいし、(B)の転写因子を阻害する物質を１種又は２種以上含んでいてもよく、あるいは、(A)の転写因子を促進する物質の１種以上及び(B)の転写因子を阻害する物質の１種以上の両者を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明が提供する医薬（皮膚疾患におけるそう痒、アレルギー性鼻炎、又は骨粗鬆症の治療又は予防剤等の、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤、および神経再生促進剤等の、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤）は、主として局所投与で用いられる。例えば、神経再生が望まれる患部への注射等による投与、痒みを抑制すべき患部への塗布による投与、鼻炎症状の抑制のための鼻腔内投与等が挙げられる。骨粗鬆症の治療又は予防剤の投与方法としては、例えば、骨組織内で特異的に発現するプロモーターを利用した核酸医薬（例えば、(A)の転写因子に対するsiRNA又は(B)の転写因子自体を骨組織内特異的プロモーター制御下で発現するベクター等）の形態での全身投与を挙げることができ、これにより骨組織局所的にSema3Aの発現を増強させることができる。具体的な投与経路に応じて、注射剤、軟膏等の適当な剤形に製剤することができる。投与量は、患部の大きさ、症状の強さ等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、有効成分量として、１回の投与当たり0.01μg〜1g程度、例えば0.01mg〜10mg程度であり得る。
【００３１】
Sema3Aの発現増強剤として用いる、(A)の転写因子のいずれかを阻害する物質としては、例えば上記で定義した通り、各転写因子の発現を阻害するアンチセンスRNA、マイクロRNA、siRNA等を用いることができる。この場合、対象となる転写因子に対するそのようなRNA分子を生産可能な発現ベクターを公知の手法により作製し、該ベクターを有効成分としてSema3A発現増強剤を製剤することができる。各種の転写因子のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子配列は公知であり、またsiRNAやmiRNAを生体細胞内で生産させるためのベクターも公知で市販品も存在するので、当業者であればアンチセンスRNA、マイクロRNA、siRNA等を利用したSema3A発現増強剤を調製することができる。あるいは、各転写因子の阻害剤として既に知られている物質であってもよい。(A)の転写因子の阻害剤としては、IMD-0354(Tanaka et al,Blood, 105:2324-31, 2005)、DHMEQ(Ariga et al, J BiolChem, 277:24625-30, 2002)(いずれもNF-κBを阻害)等が知られている。あるいはまた、(A)の転写因子のいずれかを阻害することを指標として、化合物群をスクリーニングし、Sema3Aの発現増強剤として提供することもできる。
【００３２】
(A)の転写因子のいずれかを阻害することを指標とした化合物のスクリーニングは、例えば次のようにして実施することができる。
【００３３】
工程１：転写因子と化合物を接触させ、結合の有無を調べる。アッセイロボットを用いてマイクロプレート内で結合の有無を調べることで、ハイスループットのスクリーニングが可能である。
【００３４】
工程２：結合が確認された化合物について、Sema3A遺伝子の発現量を上昇させる作用があるか否かを調べる。この工程は、例えば、Sema3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物でトランスフェクトした細胞を用いたレポーターアッセイにより実施できる。該核酸構築物を含む細胞と、工程１で結合が確認された化合物を、マイクロプレートのウェル内等で接触させ、レポーター遺伝子の発現量を調べればよい。レポーターアッセイ自体は周知の常法であり、市販のキット等を用いて容易に行なうことができる。Sema3Aプロモーター領域の配列は、配列番号１に示したものを好ましく用いることができる。(A)の転写因子が結合する領域は配列番号１中の1位〜471位である。このようなスクリーニングにより、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態（好ましい具体例は上記した通り）の治療又は予防剤として有用な、Sema3Aの発現を増強する化合物を新たに同定することができる。
【００３５】
Sema3Aの発現増強剤として用いる、(B)の転写因子のいずれかを促進する物質は、例えば上記で定義した通り、各転写因子タンパク質そのものであってもよい。具体的には、例えば医薬として用いる場合には、Sema3Aの発現を増強したい患部に転写因子タンパク質そのものを、又は転写因子タンパク質を発現可能なベクターを適用することができる。あるいは、各転写因子の促進剤として既に知られている物質であってもよい。(B)の転写因子の促進剤としては、SR1078(Wang et al, ACS Chem Biol. 5:1029-34, 2010), コレステロール硫酸（Bitsch et al, Anal Biochem. 323:139-49, 2003）（いずれもRORαを促進）等が知られている。RORα活性化作用を有するRORαアゴニストは、(B)の転写因子の促進剤として特に有望である。あるいはまた、(B)の転写因子のいずれかを促進することを指標として、化合物群をスクリーニングし、Sema3Aの発現増強剤として提供することもできる。上記した通り、Sema3A発現増強剤は、そう痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症等の治療又は予防、とりわけそう痒の治療又は予防剤として有用である。特に注目されるRORαアゴニストの医薬用途として、例えばWO2011/115892にはSR1078等を中枢神経疾患、代謝病、がん等の治療に用いることが記載されているが（ただしWO2011/115892にはRORの逆作動薬を中枢神経疾患、代謝病、がん等の治療に用いることも記載されており、RORの阻害と促進のどちらがこれらの疾患の治療に有用であるかは具体的に開示されていない）、皮膚疾患であるそう痒の治療用途に関する報告はなく、本発明で初めて提案する新しい用途である。
【００３６】
(B)の転写因子のいずれかを促進することを指標とした化合物のスクリーニングは、例えば、Sema3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物でトランスフェクトした細胞を用いたレポーターアッセイにより、レポーター遺伝子の発現量を増大させる化合物をスクリーニングすることで実施することができる。マイクロプレートのウェル内等で、Sema3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む細胞と化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を調べればよい。この場合、Sema3Aプロモーター領域としては、配列番号１に示した塩基配列を用いることもできるし、あるいは、(B)の転写因子が結合する領域が存在する、Sema3A遺伝子の-134位〜-24位の領域（配列番号１中の1311位〜1421位、この領域の配列を取り出して配列番号２に示す）のみを用いることもできる。このようなスクリーニングにより、Sema3Aの発現増強が望まれる疾患又は状態（好ましい具体例は上記した通り）の治療又は予防剤として有用な、Sema3Aの発現を増強する化合物を新たに同定することができる。
【００３７】
Sema3Aの発現抑制剤として用いる、(A)の転写因子のいずれかを促進する物質については、上記した(B)の転写因子のいずれかを促進する物質と同様のことがいえる。各転写因子タンパク質そのものであってもよいし、各転写因子の促進剤として既に知られている物質であってもよく、あるいは、(A)の転写因子のいずれかを促進することを指標として化合物群をスクリーニングし、Sema3Aの発現抑制剤として提供することもできる。(A)の転写因子の促進剤としては、イソフムロン類（WO 2006/043671）やスルフォラファン（Thimmulappa et al, Cancer Res,62:5196-203,2002）（いずれもNF-E2を活性化）等が知られている。化合物のスクリーニングは、例えば、Sema3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物でトランスフェクトした細胞を用いたレポーターアッセイにより、レポーター遺伝子の発現量を増大させる化合物をスクリーニングすることで実施することができる。(A)の転写因子が結合する領域は配列番号１中の1位〜471位であり、配列番号１に示した塩基配列をSema3Aプロモーター領域として用いることができる。このようなスクリーニングにより、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤、好ましくは神経再生促進剤として有用な、Sema3Aの発現を抑制する化合物を新たに同定することができる。
【００３８】
Sema3Aの発現抑制剤として用いる、(B)の転写因子のいずれかを阻害する物質については、上記した(A)の転写因子のいずれかを阻害する物質と同様のことがいえる。各転写因子に対するアンチセンスRNA、マイクロRNA、siRNA等を用いることができるし、各転写因子の阻害剤として既に知られている物質であってもよく、あるいは、(B)の転写因子のいずれかを阻害することを指標として化合物をスクリーニングして得ることもできる。(B)の転写因子の阻害剤としては、T-5224（Uchihashi et al, Drug Metab Dispos.39:803-13, 2011.AP-1を阻害）、SR1001（Crumbley et al, PLoS One. 7:e33804, 2012. RORαの逆作動薬）、SR3335（Solt and Burris, Trends in Endocrinology and Metabolism. 23:619-627, 2012. 及びKumar et al., ACS Chem Biol. 18:218-22, 2011. RORαの逆作動薬）等が知られている。化合物のスクリーニングは、(A)の転写因子を阻害する物質のスクリーニングと同様に、上記工程１及び工程２に準じた工程を行えばよい。核酸構築物に含まれるSema3Aプロモーター領域としては、配列番号１に示した塩基配列を用いることもできるし、あるいは、(B)の転写因子が結合する領域が存在する、配列番号１中の1311位〜1421位の領域（この領域の配列を取り出して配列番号２に示す）のみを用いることもできる。このようなスクリーニングにより、Sema3Aの発現抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤、好ましくは神経再生促進剤として有用な、Sema3Aの発現を抑制する化合物を新たに同定することができる。
【００３９】
なお、配列番号１に示した塩基配列は、本願発明者らが同定したSema3A遺伝子のプロモーター領域の配列であるが、配列番号１中の少数の塩基、特にSema3A遺伝子調節のシスエレメントである-1444位〜-974位（配列番号１中の1位〜471位）及び-134位〜-24位（配列番号１中の1311位〜1421位）以外の部位の塩基であれば、配列番号１に示した塩基配列と多少の相違があっても、スクリーニング方法においてSema3Aプロモーター領域として使用可能である。従って、Sema3Aの発現を増強又は抑制する化合物のスクリーニングにおいては、配列番号１に示す塩基配列又は配列番号２に示す塩基配列と同一の塩基配列のほか、配列番号１又は配列番号２と高い同一性（９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性）を有する塩基配列も、Sema3Aプロモーター領域として使用することができる。
【００４０】
ここで、塩基配列の「同一性」とは、比較すべき２つの塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した塩基数を、全塩基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。ただし、比較すべき配列が他の任意の配列と連結された状態にある場合には（例えば、発現ベクターに組み込まれた状態、発現させたい所望の遺伝子と連結させた状態など）、プロモーターに相当する領域のみを取り出して配列を対比し、同一性を算出する。
【００４１】
また、上記した通り、各種の転写因子について、阻害剤及び促進剤が公知である。このような公知の阻害剤及び促進剤の中から、Sema3Aの発現を調節（抑制又は増強）する活性が特に強い化合物を見出す目的で、上記のスクリーニング方法の説明において記載した、Sema3Aプロモーター領域−レポーター遺伝子構築物を含む細胞を用いたレポーターアッセイを実施することができる。すなわち、本発明は、セマフォリン3Aプロモーター領域及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む細胞と、NF-κB、c-Rel、CREB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、JunB、JunD、Fra1、及びFra2から選択されるいずれかの転写因子を調節する物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定することを含む、前記物質によるセマフォリン3Aの発現調節作用の評価方法も提供する。
【００４２】
レポーターアッセイやSema3Aプロモーター領域については、スクリーニング方法に関する上記の説明と同様であり、Sema3Aプロモーター領域としては、下記(1)〜(3)のいずれかの塩基配列を含むものを用いることができる。
(1)  配列番号１に示す塩基配列
(2)  配列番号２に示す塩基配列
(3)  (1)又は(2)と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列
【００４３】
上記(A)の転写因子のいずれかの阻害剤、及び上記(B)の転写因子のいずれかの促進剤について、上記の評価方法を適用した場合には、該阻害剤ないしは該促進剤によるSema3Aの発現増強作用が評価される。一方、上記(A)の転写因子のいずれかの促進剤、及び上記(B)の転写因子のいずれかの阻害剤について、上記の評価方法を適用した場合には、該促進剤ないしは該阻害剤によるSema3Aの発現抑制作用が評価される。配列番号２又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を利用したプロモーター領域は、(B)の転写因子の阻害剤又は促進剤を評価する場合に使用可能である。
【００４４】
あるいは、レポーターアッセイによらず、培養細胞中でのSema3Aの発現量を指標として、上記の転写因子を調節（阻害又は促進）する物質によるSema3Aの発現調節作用を評価することも可能である。この場合は、培養細胞と、上記(A)の転写因子（NF-κB、Nkx2.5、Brn-2、Elk-1、HNF-4α1、XBP-1、HLF、NF-E2、Fra1）及び上記(B)の転写因子（RORα、ER、AP-1、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Pbx1b、Jun、Fos、GABP、STATx、AREB6、GABPα、c-Rel、CREB、JunB、JunD、Fra2）から選択される転写因子を調節（阻害又は促進）する物質を接触させ、細胞内でのSema3Aの発現量を測定する。
【００４５】
上記(A)の転写因子のいずれかの阻害剤及び上記(B)の転写因子のいずれかの促進剤について当該評価方法を適用した場合には、該阻害剤ないしは該促進剤によるSema3Aの発現増強作用が評価される。一方、上記(A)の転写因子のいずれかの促進剤及び上記(B)の転写因子のいずれかの阻害剤について当該評価方法を適用した場合には、該促進剤ないしは該阻害剤によるSema3Aの発現抑制作用が評価される。
【００４６】
(A)の転写因子の阻害剤の評価と(B)の転写因子の促進剤の評価を組み合わせて実施し、Sema3Aの発現を増強する作用が非常に高い薬剤の組み合わせを同定することができる。そのような薬剤の組み合わせは、そう痒の治療又は予防剤等の、Sema3Aの発現の増強が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤として特に好ましく用いることができる。
【００４７】
また、(A)の転写因子の促進剤の評価と(B)の転写因子の阻害剤の評価を組み合わせて実施し、Sema3Aの発現を抑制する作用が非常に高い薬剤の組み合わせを同定することができる。そのような薬剤の組み合わせは、神経再生促進剤等の、Sema3Aの発現の抑制が望まれる疾患又は状態の治療又は予防剤として特に好ましく用いることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００４９】
１．ヒトSema3A遺伝子プロモーターの単離
ヒトSema3A遺伝子のコード領域の既知のヌクレオチド配列に基づいて、5'-フランキング領域を、遺伝子特異的プライマー1（GSP1: 5’-TCTGATAGTTTGCTCTTGCTGTAAG-3’、配列番号３）と遺伝子特異的プライマー2（GSP2: 5’-AAGACAGACAATCCTAGTTAACCAG-3’、配列番号４)を使用して、製造業者の取扱説明書に従い、Genome Walker Kit（Clontech, Mountain View, CA）を用いて増幅した。簡単に言えば、Ex Taqpolymelaseを用いる、製造業者によって推奨されるツーステップPCRプロトコール：94℃にて25秒間、そして72℃にて4分間を7サイクル、それに続いて94℃にて25秒間、そして67℃にて4分間を32サイクル、そして最後の伸長反応は67℃にて4分間、を使用して、GSP1とアダプタープライマー（AP）1を用いた一次PCRを実施した。次いで、一次PCR混合物を希釈し、そしてGSP2とAP2を用いた二次PCR増幅の鋳型として使用した。7サイクルの代わりに5サイクルの初回サイクルと、それに続く32サイクルの代わりに22サイクルの使用を除き、二次PCRは一次PCRと同一であった。Sema3Aの5'-フランキング領域の連続的な5'-欠失体突然変異株を、表１に列挙したプライマーを使用したPCRによって産出した。増幅後に、全てのPCR産物をpGEM-T-Easyベクター（Promega Co., Madison, WI, USA）内にクローン化し、そして、ABI Prism 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて配列決定した。【００５０】
レポータープラスミドpGL3-1444/-1を構築するために、PCRを以下の条件下、最初の変性94℃にて5分間、94℃にて1分間、60℃にて1分間、72℃にて1分間を30サイクル、そして最後に伸長72℃にて5分間、鋳型であるpGEM-T-Sema3A-1444/-1ならびにKpnIまたはHindIIIのための制限酵素部位を含む1組の特異的なSema3Aプライマー（Sema3A-1444 KpnIおよびSema3A+1 HindIII）を使用して実施した。得られたPCR産物はKpnI及びHindIIIで消化し、そしてpGL3-Basicベクター（Promega）内にクローニングした。なお、pGL3-Basicベクターは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。構築物の全てを、QIAGEN Plasmid Maxi Ki（QIAGEN, Duesseldolf, Germany）を使用することで調製した。【００５１】
さらに、Quikchange site-directed mutagenesis kitを用いて、Sema3Aの推定転写因子結合配列部位に部位特異的変異導入を行ない、RORα結合領域、Sox-5/9結合領域及びGABP結合領域が欠失したレポータープラスミド構築物を作製した。部位特異的変異導入のために使用したプライマーを表２に示す。【００５２】
【表１】
2014178427.tif 000003
【００５３】
【表２】
2014178427.tif 000004
【００５４】
２．ヒトSema3A遺伝子プロモーターの特性決定
（１）NHEKを用いたSema3Aプロモーターのルシフェラーゼアッセイ
正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）はLonza社のプロトコールに従い、培養した。NHEKを12ウェル組織培養プレート内で培養し、X-treme GENE HD DNAトランスフェクション試薬（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）を使用して、それぞれの構築物1μgを用いて、トランスフェクションした。トランスフェクション効率を補正するために、すべての細胞にHSV-TKプロモーターの制御下にあるウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子を含むpRK-TKベクター（Promega）を同時にトランスフェクションした。トランスフェクション後、増殖期（80%コンフルエント）もしくは、分化後（コンフルエント後、1.4mMカルシウムを添加し、さらに4日間培養を継続したもの）のNHEKに、Passive Lysis Buffer 250μlを加え、細胞を溶解させた。測定にはDual-luciferase reporter assay system（Promega Co., Madison, WI, USA）を用いた。所定の96ウェルプレートにLuciferase Assay ReagentII100μlを加え、そこにサンプル20μlを加えて、Wallac 1420 ARVOsxMultilabel counter （Perkin Elmer）を用いて測定した。その後、さらにStop&Glo reagent 100μlを加えて、同様に測定を行った。【００５５】
（２）siRNAによる転写因子の発現抑制
培養NHEKを製造業者の取り扱い説明書に従って、転写因子RORα, Jun, Fos, Sox4, STAT3, NF-κB1, GABPα, Sox9, Rel (c-Rel), CREB, Pbx1, ER, JunB, JunD, Fra1, Fra2に対するsiRNA（Thermo Scientific）40nMをそれぞれLipofectamineRNAi Max（Invitrogen, Carisbad, CA）を使用してトランスフェクションした。その細胞を、抗生物質不含培地中で48時間培養し、その後、全RNAを抽出し、リアルタイムPCRで解析した。使用した各siRNAの配列（それぞれ、4種類のsiRNAの混合物を使用）を下記表３に示す。【００５６】
【表３−１】
2014178427.tif 000005
【００５７】
【表３−２】
2014178427.tif 000006
【００５８】
転写因子の転写レベルを、定量リアルタイムPCRによって分析した。全RNAを、製造業者の取扱説明書に従って、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて培養細胞から抽出し、PrimeScript RT reagent kit（Takara, Shiga, Japan）を用いて、cDNAに逆転写した。定量リアルタイムPCRは製造業者の取扱説明書に従って、SYBR Premix Ex Taq（Takara）を使用して、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR system （Applied Biosystems）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表４に示す。リボソームタンパク質S18（RPS18）を基準遺伝子として使用した。mRNAの量を、RPS18のmRNA量に対して標準化し、そして最終的に未処理対照のmRNAに対する比として示した。【００５９】
【表４】
2014178427.tif 000007
【００６０】
（３）電気泳動移動度シフト分析（EMSA）
一本鎖ビオチン化オリゴヌクレオチドと、これに相補的な一本鎖非標識オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを調製した。プローブに用いた配列（センス鎖の配列）を表５に示す。核タンパク質の抽出とEMSAを、NE-PER Nuclear Cytoplasmic Extraction Reagents及びLightShiftChemiluminescent EMSA kit（Thermo Scientific）を使用することで実施した。核タンパク質抽出物（5μg）を、1×結合バッファー及び50ng/μlのポリ（dI・dC）、50mM KCl, 5 mM EDTA、2.5%グリセロール、0.05% NP-40、並びにSema3Aプロモーター領域の-122/-93、-77/-46、-47/-18の領域に対応するビオチン化プローブ（50 pmol/μl）と共に、室温で20分間インキュベートした。競合アッセイのために、400倍過剰の未標識プローブを、ビオチン化プローブの添加前に結合反応に加えた。これらのインキュベーション混合物を、次に0.5×TBEバッファーと共に6%ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてBiodyne Bナイロン膜（Pall, Port Washington, NY）に転写した。EMSAキットの中の化学発光検出試薬を使用することで、バンドを可視化した。【００６１】
【表５】
2014178427.tif 000008
【００６２】
（４）転写因子の結合部位の推定
P-Match1.0 Publicプログラムによる検索で、ヒトSema3Aの5'-フランキング領域内の多数の推定転写因子結合部位が明らかになった（図１、図２）。特に転写開始部位の位置に近い-134/-1の領域の中に、RORα/ER/AP-1, Sox-4/5/9, GABPによって認識されるコンセンサス配列によく合致した配列が存在したので、これらの転写因子がSema3Aプロモーター活性の調節に関わっていることが示唆された。より厳密にSema3Aのプロモーター領域を決定するために、欠失体による分析を実施した（図３）。【００６３】
最高レベルのルシフェラーゼ活性はpGL3-134（Sema3Aプロモーター領域内の-134/-1領域を含む）でトランスフェクションした分化型NHEKにおいて検出した。しかしながら、欠失プラスミドの相対ルシフェラーゼ活性は、欠失がpGL3-24に進むまで残存していた。構築体の中で、pGL3-1444/-1, -1244/-1, -1044/-1断片を含むプラスミドは、NHEKにおいて有意に低い活性を示し、-1444/-844領域における上流サプレッサー活性の存在が示唆された。これらの結果は、-134/-24領域がSema3A遺伝子転写のための最小プロモーターを含んでいることを実証したので、そのヌクレオチド配列を図４−１に示す。この領域にはいくつかの転写因子結合部位、たとえばRORα/ER/AP-1, Sox-4/5/9, GABPなどがこのコアプロモーター領域に存在していた。また、上流サプレッサー活性の存在が示唆された転写抑制領域（-1444/-975）の配列及び転写因子結合部位を図４−２に示す。【００６４】
（５）Sema3A遺伝子調節に関与するcisエレメントの同定
次に、これらの転写因子が推定結合部位のそれぞれに実際に結合できるかどうかを解析した。このために、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を培養NHEKの核タンパク質抽出物、及びSema3Aプロモーター領域の-122/-93、-77/-46、-47/-18の領域に対応するビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いて実施した。図５に示されているように、RORα/ER/AP-1結合部位を含む-122/-93、Sox 5/9結合部位を含む-77/-46、GABP結合部位を含む-47/-18の各プローブの標的配列には転写因子が結合し、シフトしたバンドが検出された。これらの結果は-122/-18 bp領域のこれらの結合部位が、Sema3A転写のためのシスエレメントとして不可欠であることを示している。【００６５】
Sema3A発現に重要な転写因子結合配列を同定するために、各転写因子結合配列を部位特異的に欠失後、増殖期のNHEKを用いてプロモーターアッセイを行った。正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）における各変異体のルシフェラーゼアッセイの結果を図６に示す。RORα結合配列が存在する-108/-98領域を欠失した変異体でルシフェラーゼ活性の著しい抑制が認められ、この領域にSema3A発現を上方制御する転写因子が結合することが明らかとなった。【００６６】
さらに、RORα, Jun, Fos, Sox4, STAT3, NF-κB, GABPα, Sox9, Rel (c-Rel), CREB, Pbx1, ER, JunB, JunD, Fra1, Fra2がSema3A発現に関与していることを確認するために、低分子干渉RNA（siRNA）を使用して転写因子の発現を抑制し、リアルタイムPCRを用いて、各転写因子及びSema3Aの遺伝子発現を解析した。【００６７】
RORα, Jun, Fos, Sox4, STAT3, NF-κB1のノックダウンについての結果を図７に示す。RORα、Jun、Fos，Sox4、STAT3の各転写因子に対するsiRNAでトランスフェクションしたNHEKでは、Sema3A発現は有意に抑制された。一方、NF-κB1のsiRNAでトランスフェクションしたNHEKでは、Sema3A発現は有意に増強した（約8倍）。これらの結果は、RORα, Jun, Fos, Sox4, STAT3がSema3A発現に不可欠であり、NF-κB1がSema3Aの発現抑制因子であることを強く示唆している。【００６８】
GABPα, Sox9, Rel, CREB, Pbx1, ER, JunB, JunD, Fra1, Fra2のノックダウンについての結果を図８に示す。GABPα, Sox9, CREB, JunB, JunD, Fra2の発現抑制により、Sema3A発現は有意に（*, p＜0.05; ***, p＜0.001）抑制された。特に、CREBとJunBの発現を抑制した際のSema3A発現の抑制が顕著であった。【００６９】
（６）NHEKにおけるSema3A発現に対するRORα作動薬及び拮抗薬の作用
siRNA及び部位特異的変異導入構築体のプロモーターアッセイの結果より、レチノイド関連オーファン受容体α（RORα）がSema3A発現の上方制御に重要な転写因子の一つであることが判明した。そこで、NHEKにRORα作動薬または拮抗薬を添加後、一定時間経過後（SR1078とSR1001は48時間後、コレステロール硫酸は96時間後）にtotal RNAを回収し、定量リアルタイムPCRでSema3A発現量を解析した。【００７０】
結果を図９に示す。AがRORα作動薬SR1078、BがRORα作動薬のコレステロール硫酸、CがRORα拮抗薬SR1001の結果である。RORα作動薬のSR1078及びコレステロール硫酸を添加したNHEKでSema3A発現は濃度依存的に有意に促進された。一方、RORα拮抗薬のSR1001を添加した時にSema3A発現が濃度依存的に有意に抑制された。いずれの化合物も分子量は表皮角層に浸透しやすい500Da以下であることから、外用薬として応用できる可能性がある。【００７１】
（７）アトピー性皮膚炎モデルNC/Ngaマウスの病変部に対するRORα作動薬の作用
アトピー性皮膚炎（AD）モデルNC/Ngaマウスの病変部にRORα作動薬のコレステロール硫酸を外用する実験を行った。AD素因を有するNC/Ngaマウスの剃毛した背部にダニ抗原を配合したビオスタAD軟膏を週2回3週間外用し、ADを発症させた。皮膚炎を発症したマウスを抽出し、(i)基剤のジメチルスルホキシドのみ、(ii)1mMコレステロール硫酸の２群（各4匹）に分類後、マウスの病変部に基剤又はコレステロール硫酸溶液を9日間連続で塗布した。外用終了後に皮膚を摘出し、0.02％トリプシン/EDTA溶液に一晩浸漬後、表皮を剥離して、RNAを抽出した。定量リアルタイムPCRによる表皮のSema3A発現量を図１０に示す。基剤を外用した群と比較し、1mMコレステロール硫酸を外用した群でSema3A発現は有意に（**, p＜0.01）促進された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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