(57)【要約】  本発明は、主に、細胞の製造方法、造血組織の製造方法、当該製造方法により得られる細胞若しくは造血組織、細胞誘導剤、造血組織作製用キット、並びに、細胞誘導剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。  斯かる課題を解決する手段として、下記の工程を含む、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）の製造方法：下記一般式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）を培養する工程、を提供する。［化１］2016068257.tif 000030［式中、Ｒ１、Ｘは明細書中に規定するとおり。］
2016068257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）の製造方法：
下記一般式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）を培養する工程。
【化１】
2016068257.tif 000021
［式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）またはアセチル基（ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）−）を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【請求項２】
前記化合物が、下記化学式で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【化２】
2016068257.tif 000022
【請求項３】
体細胞（Ｃ）が、歯髄から取得した細胞または間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
下記の工程を含む、造血組織の製造方法：
下記化学式で表される化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程。
【化３】
2016068257.tif 000023
【請求項５】
下記の工程を含む、造血組織の製造方法：
（１）下記化学式で表される化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程、
【化４】
2016068257.tif 000024
及び
（２）前記培養した細胞を、キャリアとともに動物に移植する工程。
【請求項６】
体細胞が、歯髄から取得した細胞または間葉系幹細胞である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法により得られる、造血組織。
【請求項９】
下記化学式で表される化合物を含む、細胞誘導剤。
【化５】
2016068257.tif 000025
【請求項１０】
（１）下記化学式で表される化合物、及び
【化６】
2016068257.tif 000026
（２）キャリア
を含む、造血組織作製用キット。
【請求項１１】
下記の工程を含む、細胞誘導剤のスクリーニング方法：
（１）体細胞を被験物質の存在下で培養し、当該被験物質の細胞誘導能を評価する工程、及び
（２）前記工程で評価した被験物質の細胞誘導能と、下記化学式で表される化合物の細胞誘導能とを比較する工程。
【化７】
2016068257.tif 000027
【請求項１２】
体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）を製造するためであって、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）から細胞（Ｂ）を製造するための、下記化学式で表される化合物の使用。
【化８】
2016068257.tif 000028
【請求項１３】
造血組織を製造するための、下記化学式で表される化合物の使用。
【化９】
2016068257.tif 000029
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、2014年10月31日に出願された日本国出願第2014-223316号明細書（それらの開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、主に、細胞の製造方法、造血組織の製造方法、当該製造方法により得られる細胞若しくは造血組織、細胞誘導剤、造血組織作製用キット、並びに、細胞誘導剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、患者の欠損した又は異常な細胞、組織、器官等の機能の回復を目的とした、再生医療技術が着目されている。各種細胞、組織、器官等の誘導方法や培養方法の確立に加えて、iPS細胞技術の開発による自己の細胞を供給源とすることの可能性が提唱され、技術のさらなる進展が期待されている。【０００４】
再生医療技術において、治療の目的とする細胞、組織、器官等の誘導方法や培養方法の確立が肝要である。【０００５】
白血病に代表される造血組織（造血幹細胞及びこれに由来する血球細胞等を含む。）の異常に基づく疾患においては、骨髄等の造血組織の移植が、有効な治療方法の一つである。しかしながら、患者とは異なるドナーに由来する骨髄組織を移植する場合、HLAの型の適合する必要があること、及び、そもそも骨髄を提供できるドナーが少ないことなどが問題となり、治療を必要とする患者のすべてに骨髄移植が実施できていないのが現状である。【０００６】
そこで、HLAの型の適合の問題が生じない、自己の細胞に由来する骨髄組織などの造血組織を再生医療技術によって製造する技術が待ち望まれている。しかしながら、再生医療技術によって骨髄組織等の造血組織を作製する方法は、まだ確立されていないのが現状である。【０００７】
歯科治療において取得できる歯髄組織などに由来する細胞は、取得が容易である等の観点から、再生技術に用いる細胞の供給源として着目されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Arakaki M et. al. J Biol Chem. Mar 23, 2012; 287(13): 10590-10601.
【非特許文献２】Miura M et. al. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(10):5807-12.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の背景技術を鑑みてなされたものであり、細胞の製造方法、造血組織の製造方法、当該製造方法により得られる細胞若しくは造血組織、細胞誘導剤、造血組織作製用キット、並びに、細胞誘導剤のスクリーニング方法を提供することを、主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、斯かる課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、下記化学式で表される化合物の存在下で、体細胞を培養することで、当該体細胞とは異なる体細胞に分化しうる細胞を製造できることを見出した。本発明は、斯かる発見に基づき、さらに検討を重ねて完成したものである。【００１１】
すなわち、本発明は下記の態様を包含する。【００１２】
項１、下記の工程を含む、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）の製造方法：
下記化学式で表される化合物の存在下で、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）を培養する工程。【００１３】
【化１】
2016068257.tif 000003
【００１４】
［式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）またはアセチル基（ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）−）を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］【００１５】
項２、前記化合物が、下記化学式で表される化合物である、項１に記載の方法。【００１６】
【化２】
2016068257.tif 000004
【００１７】
項３、体細胞（Ｃ）が、歯髄から取得した細胞または間葉系幹細胞である、項１に記載の方法。【００１８】
項４、下記の工程を含む、造血組織の製造方法：
下記化学式で表される化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程。【００１９】
【化３】
2016068257.tif 000005
【００２０】
項５、下記の工程を含む、造血組織の製造方法：
（１）下記化学式で表される化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程、【００２１】
【化４】
2016068257.tif 000006
【００２２】
及び
（２）前記培養した細胞を、キャリアとともに動物に移植する工程。【００２３】
項６、体細胞が、歯髄から取得した細胞または間葉系幹細胞である、項４または５に記載の方法。【００２４】
項７、項１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られる、細胞。【００２５】
項８、項４〜６のいずれか１項に記載の方法により得られる、造血組織。【００２６】
項９、下記化学式で表される化合物を含む、細胞誘導剤。【００２７】
【化５】
2016068257.tif 000007
【００２８】
項１０、（１）下記化学式で表される化合物、及び【００２９】
【化６】
2016068257.tif 000008
【００３０】
（２）キャリア
を含む、造血組織作製用キット。【００３１】
項１１、下記の工程を含む、細胞誘導剤のスクリーニング方法：
（１）体細胞を被験物質の存在下で培養し、当該被験物質の細胞誘導能を評価する工程、及び
（２）前記工程で評価した被験物質の細胞誘導能と、下記化学式で表される化合物の細胞誘導能とを比較する工程。【００３２】
【化７】
2016068257.tif 000009
【００３３】
項１２、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）を製造するためであって、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）から細胞（Ｂ）を製造するための、下記化学式で表される化合物の使用。
【化８】
2016068257.tif 000010
【００３４】
項１３、造血組織を製造するための、下記化学式で表される化合物の使用。
【化９】
2016068257.tif 000011
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、新規な細胞の製造方法、造血組織の製造方法、当該製造方法により得られる細胞若しくは造血組織、細胞誘導剤、造血組織作製用キット、並びに、細胞誘導剤のスクリーニング方法が提供される。【００３６】
本発明の方法より、体細胞より造血組織を提供する方法が提供され、骨髄移植等の治療を必要とする患者に、新たな治療方法を提供しうる技術となることが期待される。また、本発明により見出された化合物の新たな性質は、再生医療技術のさらなる進展のためのツールとなることも期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】マウス乳歯由来歯髄細胞（mDP）の形態観察の結果を示す。（Ａ）ソートの結果を、プロット図により示す。
【図１Ｂ】マウス乳歯由来歯髄細胞（mDP）の形態観察の結果を示す。（Ｂ）蛍光顕微鏡像を示す。
【図１Ｃ】マウス乳歯由来歯髄細胞（mDP）の形態観察の結果を示す。（Ｃ）形態の定量結果（Relative length（相対長さ）、Relative breadth（相対幅）及びElliptical form factor）を示す。
【図２Ａ】歯髄幹細胞様形態を誘導する薬剤のスクリーニング結果を示す。（Ａ）GSK-3 inhibitor IX, BIOの構造を示す。
【図２Ｂ】歯髄幹細胞様形態を誘導する薬剤のスクリーニング結果を示す。（Ｂ）細胞携形態について、蛍光顕微鏡像を示す。
【図２Ｃ】歯髄幹細胞様形態を誘導する薬剤のスクリーニング結果を示す。（Ｃ）形態の定量結果（Relative eliptical form factor）を示す。
【図３】BIO処理の効果を示す。（Ａ）ウェスタンブロッティングによる、β−カテニンのリン酸化の検出を示す。（Ｂ）β−カテニンのリン酸化の定量結果を示す。（Ｃ）幹細胞マーカー（Oct3/4及びKlf-4）の発現の定量結果を示す。（Ｄ）幹細胞マーカー（Oct3/4）の発現の定量結果を示す。
【図４】BIOの存在下で培養した細胞の、骨芽細胞への分化能を示す。（Ａ）von Kossa染色の結果の一例を示す。（Ｂ）von Kossa染色の強度（Intensity of von Kossa staining）の定量結果を示す。
【図５】BIOの存在下で培養したマウス骨髄由来間葉系幹細胞の移植実験の結果を示す。（Ａ、Ｂ）マウス骨髄由来間葉系幹細胞（mBM-MSC）を処理した場合。（Ａ）操作のスキームを示す。（Ｂ）移植した部位を観察した顕微鏡像を示す。（Ｃ、Ｄ）ヒト乳歯由来歯髄幹細胞（SHED）を処理した場合。（Ｃ）操作のスキームを示す。（Ｄ）移植した部位を観察した顕微鏡像を示す。
【図６】BIOの存在下で培養したヒト乳歯由来歯髄幹細胞の移植実験の結果を示す。（Ａ）ゲーティングの結果を示す。（Ｂ）ヒト型CD11b抗原（hCD11b）の発現の検出を示す。（Ｃ）移植マウスの外的所見を示す。
【００３８】
図１Ｂ及び図２Ｂについては、白黒反転画像（Monochrome inverted image）を合わせて示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．細胞の製造方法
本発明は下記の細胞の製造方法を提供する：
下記の工程を含む、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）の製造方法：
下記一般式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）を培養する工程。
【００４０】
【化１０】
2016068257.tif 000012
【００４１】
［式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）またはアセチル基（ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）−）を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００４２】
製造方法
本発明の製造方法は、体細胞（Ｃ）を材料とする。本発明の製造方法は、材料である体細胞（Ｃ）と、得られる細胞（Ｂ）が分化しうる細胞（Ａ）とが異なることを特徴とする。ここで、「異なる」とは、細胞分化の系統樹において異なる系統に属することを意味すると理解される。例えば、神経堤を起源とする歯髄に由来する細胞や間葉を起源とする間葉系幹細胞は、中胚葉を起源とする造血系の細胞とは、異なる系統に属する。
【００４３】
「分化しうる」とは、通常の生理条件下、又は、人為的な分化誘導の条件下で、特定の細胞へと分化する能力を有すること意味する。
【００４４】
通常の生理条件下では、細胞の分化は一方向に進み、逆行することはない。すなわち、分化した体細胞は、脱分化などの特異な現象を経ることなく、他の細胞に分化しうる細胞へと性質が変化することはない。従って、本発明は、iPS細胞の作製工程などの体細胞の初期化の工程を含まない方法であると理解される。
【００４５】
iPS細胞の作成工程などで行われる体細胞の初期化は、通常、外来遺伝子の導入を伴う。これに対して、本発明の製造方法においては、外来遺伝子の導入を行うことなく、内在遺伝子の機能によって（特に、内在遺伝子の機能のみによって）体細胞（Ｃ）を材料として、細胞（Ｂ）を分化誘導する。
【００４６】
培養
本発明の細胞の製造方法は、上記化合物の存在下で、体細胞（Ｃ）を培養する工程を含む。培養は、上記化合物の存在下で行う以外は、通常の細胞の培養方法に準じて行うことができる。
【００４７】
本発明の培養工程における上記化合物の濃度は、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、0.01μＭ〜100μＭ程度、0.1〜10μＭ程度、0.2〜5μＭ程度、1μＭ程度とすることができる。
【００４８】
培養は、培地を用いて行うことで、体細胞（Ｃ）の効率的な培養を行なうことができる。用いる培地は、体細胞（Ｃ）の培養に適した培地であれば特に限定されるものではない。このような培地として、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培地、alpha Modified Eagle Minimum Essential Medium（αMEM）等が挙げられる。培地は、必要に応じて通常の体細胞の培養の際に含める添加剤を含むものであってもよい。添加剤の具体例として、牛胎児血清（fetal bovine serum）、アミノ酸（例えば、L-グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）などが挙げられる。必要な添加物を予め添加した、DMEM/F12（ライフテクノロジーズ社製）などの市販品を用いることもできる。
【００４９】
培養は、適切な容器中で行なうことができる。好適な培養を行なう手法として、約37℃程度および二酸化炭素濃度約5％程度の条件下で培養する手法が例示されるが、これに限定されるものではない。上記条件での培養は、例えば公知のCO2インキュベータを用いて行なうことができる。
【００５０】
培養を行う期間は、本発明の効果を損なわない範囲で、特に限定されるものではない。例えば、12時間から20日間程度とすることができる。
【００５１】
本発明を拘束するものではないが、上記化合物による細胞（Ｂ）の誘導の効果は、3日以下、特に2日程度で達成されると考えられる。必要に応じて、例えば十分な細胞数を得るために、これより長い期間の培養をすることができる。
【００５２】
培養において、必要において継代を行うことができる。継代を行う場合は、コンフルエント状態に到達する前に細胞を回収し、細胞を新しい培地に播種する。また、本発明の培養において、培地を適宜交換することもできる。
【００５３】
ただし、コンフルエント状態に到達するまでの培養が制限されるわけではない。例えば、前述の十分な細胞数を得ることを目的とした培養の場合は、コンフルエント状態に到達するまで培養を行ってもよい。
【００５４】
体細胞（Ｃ）
本発明の方法において材料として用いる体細胞（Ｃ）は、動物に由来する体細胞であれば特に限定されるものではない。通常、「体細胞」とは分化した細胞を指し、他の細胞へ分化する能力を有さない。
【００５５】
体細胞（Ｃ）の種類は、特に限定されるものではない。
【００５６】
体細胞（Ｃ）の由来は特に限定されるものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ等の哺乳類に由来するものであることが好ましい。得られる細胞（Ｂ）が、疾患の治療を目的とするものである場合、治療を必要としている個体に由来することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００５７】
体細胞（Ｃ）は、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）、生体から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞のいずれであってもよい。
【００５８】
本発明のある態様においては、体細胞（Ｃ）は、歯髄に由来する細胞である。歯髄に由来する細胞には、歯髄細胞、歯髄幹細胞が含まれる。歯髄に由来する細胞は、歯髄から採取した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）や歯髄から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞が包含される。株化した細胞としては、非特許文献１に記載されているものを使用することができる。
【００５９】
本発明の別の態様においては、体細胞（Ｃ）は間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞の由来は特に限定されず、骨髄由来のもの、脂肪組織由来のものなどを用いることができる。なかでも、調製が容易である骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい例である。間葉系幹細胞は、公知の手法に従い調製することができる。例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨髄穿刺により得られる骨髄液を遠心分離することで採取することができる。
【００６０】
化合物
本発明の製造方法における培養工程は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物の存在下で行うことを特徴とする。
【００６１】
【化１１】
2016068257.tif 000013
【００６２】
［式中、Ｒ１は水素原子（Ｈ）またはアセチル基（ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）−）を表す。Ｘはハロゲン原子を表す。］
【００６３】
上記化合物は、下記の一般式（Ｉ’）で表すこともできる。
【００６４】
【化１２】
2016068257.tif 000014
【００６５】
［式中、Ｒ１、Ｘは前記に同じ。］
【００６６】
ハロゲン原子とは、フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）またはヨウ素原子（Ｉ）を表す。
【００６７】
上記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｘが結合するベンゼン環上の位置は特に限定されないが、６位の位置に結合することが好ましい。すなわち、本発明の化合物の好ましい態様は、下記一般式（ＩＩ）で表される。
【００６８】
【化１３】
2016068257.tif 000015
【００６９】
［式中、Ｒ１、Ｘは前記に同じ。］
【００７０】
上記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、公知の製造方法または公知の製造方法に準じた方法により製造することができる。例えば、文献：J. Med. Chem. 2004, 47, 935-946に記載の製造方法またはこれに記載の製造方法に準じた製造方法により製造することができる。
【００７１】
本発明の化合物の好ましい態様の一つとして、下記化学式で表される化合物が例示される。
【００７２】
【化１４】
2016068257.tif 000016
【００７３】
上記化合物は、下記の化学式で表すこともできる。
【００７４】
【化１５】
2016068257.tif 000017
【００７５】
当該化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３のαアイソフォーム（GSK-3α）及びβアイソフォーム（GSK-3β）の選択的な阻害剤である。当該化合物は、(2Z, 3E)-6’-Bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3’-biindolinylidene]-2’-one、6-bromoindirubin-3'-oxime、GSK-3 Inhibitor IX、BIOなどの名称で知られている。当該化合物は、CAS番号：667463-62-9、PubChem CID：5287844が付与されている。上記の化合物を、以下「BIO」と記載する場合がある。
【００７６】
当該化合物は、公知の製造方法により製造することができる。市販品を使用することもできる。
【００７７】
上記の化合物に替えて、上記化合物以外のGSK-3（GSK-3α及びGSK-3βの両方若しくはいずれか一方。）の発現及び／又は機能を抑制する作用を有する化合物を本発明の方法において用いることもできる。例えば、GSK-3の阻害剤又はアンタゴニストとして機能する低分子化合物、GSK-3の遺伝子産物の転写及び／又は翻訳を阻害する化合物（例えば、siRNA、shRNA、miRNA等。）、GSK-3に対する特異的な抗体などが挙げられる。ただし、LiCl、LiFは好ましくない例であると理解される。
【００７８】
さらに、GSK-3のβアイソフォームは、Wnt/β−カテニン経路に属する。従って、Wnt/β−カテニン経路に対して、BIOと同様の作用を有する化合物も、本願発明において使用することができる。
【００７９】
細胞（Ｂ）の製造
かくして、本発明の製造方法により、上記体細胞（Ｃ）とは異なる体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）が得られる。
【００８０】
細胞（Ｂ）が分化しうる体細胞（Ａ）は、体細胞（Ｃ）と異なるものであれば、とくに限定されない。
【００８１】
例えば、体細胞（Ｃ）として歯髄から取得した細胞、若しくは、間葉系幹細胞を用いる場合、得られる細胞（Ｂ）は、骨芽細胞、造血系の細胞などに分化することができる。ここで、「造血系の細胞」とは、造血幹細胞及び造血幹細胞から分化できる血球細胞（具体的には、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージなど）、赤血球、血小板などを包含する。）が例示される。
【００８２】
得られた細胞（Ｂ）が、体細胞（Ａ）に分化できることは、当業者に明らかの手法で確認をすることができる。その一例を、後述の実施例に示す。また、後述の造血組織の製造方法によっても確認をすることができる。
【００８３】
本発明の好ましい態様においては、本発明の方法により得られる細胞（Ｂ）は、幹細胞である。幹細胞とは、自己複製能と別の細胞へと分化する能力（分化能）を有する。本明細書において、細胞が幹細胞であることの確認は、自己複製能と分化能を有することの確認に換えて、Oct3/4、Klf-4などの幹細胞マーカーの発現によっても確認することもできる。細胞（Ｂ）が幹細胞である場合、この点においても体細胞（Ｃ）とは異なる。
【００８４】
本発明はまた、当該細胞の製造方法による得られる細胞（Ｂ）をも包含するものである。
【００８５】
本発明の製造方法によって得られる細胞（Ｂ）は、例えば体細胞（Ａ）やこれを含む組織の製造に使用することができる。その一例である造血組織の製造方法について、以下に詳述する。
【００８６】
２．造血組織の製造方法
本発明は下記の造血組織の製造方法をも提供する：
下記一般式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程。
【００８７】
【化１６】
2016068257.tif 000018
【００８８】
［式中、Ｒ１、Ｘは前記に同じ。］
【００８９】
本発明の造血組織の製造方法の好ましい態様においては、
（１）上記化合物の存在下で、造血機能を有さない体細胞を培養する工程、及び
（２）前記培養した細胞を、キャリアとともに動物に移植する工程
を含む。
【００９０】
造血組織
本明細書において、「造血組織」とは、造血の機能、すなわち、各種の血球細胞を生成することができる機能を有する組織を主に指す。造血幹細胞又はこれに類する機能を有する幹細胞を含む組織であることが好ましい。生体内における造血組織の典型例としては骨髄が挙げられ、本発明の製造方法により得られる造血組織は、少なくとも造血の機能の点においては、骨髄と同様の機能を有することが好ましい。従って、得られる造血組織は、「骨髄」又は「骨髄様組織」と換言することができる。
【００９１】
培養
本発明の造血組織の製造方法における培養工程は、造血機能を有さない体細胞を用いる以外は、上記「１．」欄に記載の培養工程と同様に行うことができる。
【００９２】
造血機能を有さない体細胞
本発明の造血組織の製造方法における培養工程において、造血機能を有さない体細胞を培養する。
【００９３】
造血機能を有さない体細胞とは、血球細胞（具体的には、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージなど）、赤血球、血小板などを包含する）を生成する細胞を除いた体細胞であれば、特に限定されない。また、血球細胞も該当しない。
【００９４】
造血機能を有さない体細胞の由来は特に限定されるものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ等の哺乳類に由来するものであることが好ましい。得られる造血組織が、疾患の治療を目的とするものである場合、治療を必要としている個体に由来することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００９５】
造血機能を有さない体細胞は、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）、生体から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞のいずれであってもよい。
【００９６】
造血機能を有さない体細胞の種類は、特に限定されるものではない。
【００９７】
本発明のある態様においては、造血機能を有さない体細胞は、歯髄から取得した細胞である。歯髄から取得できる細胞には、歯髄細胞、歯髄幹細胞が含まれる。歯髄から取得した細胞は、歯髄から取得した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）や歯髄から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞が包含される。株化した細胞としては、非特許文献１に記載されているものを使用することができる。歯髄は、切歯、犬歯、臼歯等のいずれの歯由来であってもよい。
【００９８】
本発明の別の態様においては、造血機能を有さない体細胞は間葉系幹細胞である。なかでも、調製が容易である骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい例である。間葉系幹細胞は、公知の手法に従い調製することができる。例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨髄穿刺により得られる骨髄液を遠心分離することで採取することができる。
【００９９】
移植
本発明の造血組織の製造方法の好ましい態様は、培養した細胞を、キャリアとともに動物に移植する工程を含む。
【０１００】
移植の対象となる動物は、特に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ等の哺乳類が好ましい例として挙げられる。ただし、移植対象の選定に際しては、法令、並びに、倫理、インフォームドコンセント等に関する規定等を遵守することが望ましい。また、必要に応じて、対象とする動物を非ヒト動物とすることもできる。
【０１０１】
移植の対象となる動物は、造血機能を有さない体細胞が由来する動物と同種であっても異種であってもよい。同種である場合、移植の対象となる動物は、造血機能を有さない体細胞が由来する個体と同一であっても異なってもよい。
【０１０２】
細胞を移植する部位は、特に限定されるものではない。製造される造血組織を支持できる、体液性でない動物の部位であることが望ましい。例えば、皮下、筋中、骨の空洞などが挙げられる。移植する手法は特に限定されないが、注射による移植が簡便であるため、好ましい例として挙げられる。
【０１０３】
移植を行う前に、一般式（Ｉ）で表される化合物（例えばBIO）を洗浄などの手段により除去することが好ましい。
【０１０４】
キャリア
上記移植工程は、培養した細胞を、キャリアとともに動物に移植する。キャリアは、造血組織へと誘導される細胞を支持し、拡散若しくは周囲の細胞に吸収されることを防止するために用いられる。
【０１０５】
キャリアは、上記目的を達成できるものであれば特に制限されるものではない。キャリアの好ましい例として、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、トリリン酸カルシウム（β―ＴＣＰ）、オクタリン酸カルシウム（ＯＰＣ）などが例示される。
【０１０６】
移植をする際の、細胞とキャリアとの配合比率は、特に限定されるものではない。例えば、細胞1.0x107個に対して、キャリアを10〜200mg程度、20〜80 mg程度、40 mg程度とすることができる。
【０１０７】
移植後、移植をした動物を適切な期間管理する。非ヒト動物であれば、通常の飼育条件下で管理することが好ましい。移植後、造血組織が製造されるまでの期間は、当業者が適宜設定することができる。例えば、動物がマウスである場合、2週間〜6月程度、1月〜3月程度、2月程度とすることができる。
【０１０８】
造血組織の製造
かくして、造血組織が製造される。
【０１０９】
造血組織の製造は、血球細胞を生成する機能を有することを評価することで確認をすることができる。血球細胞の生成は、当業者に公知の手法で確認をすることができ、その一例を後述の実施例に示す。
【０１１０】
本発明はまた、当該造血組織の製造方法による得られる造血組織をも包含するものである。
【０１１１】
本発明の製造方法によって得られる造血組織は、例えば、白血病などの造血組織の異常に基づく疾患の治療に用いることができる。造血組織を、疾患を有する動物（患者など。）の体内で製造し治療をするものであっても、患者以外の動物の体内で製造し、製造された造血組織を、疾患を有する動物に移植して治療をすることもできる。
【０１１２】
３．細胞誘導剤
本発明はまた、前述の細胞の製造方法及び造血組織の製造方法に使用することができる細胞誘導剤をも提供する。本発明の細胞誘導剤は、体細胞（「１．」欄に記載の体細胞（Ｃ）が例示される）を原料として、当該原料の体細胞とは異なる体細胞に分化しうる細胞（「１．」欄に記載の細胞（Ｂ）が例示される。）を誘導するために用いられる。
【０１１３】
細胞誘導剤の有効成分としては、上記「１．」欄に記載の化合物を用いる。化合物としては、前述のBIOが好ましい例として挙げられる。従って、本発明は、当該化合物の、細胞を誘導するための使用をも提供する。
【０１１４】
細胞誘導剤は、提供される形態に応じて、上記化合物の効果を阻害しない範囲で、通常の溶媒、基材などを含むものであってもよい。
【０１１５】
４．造血組織作製用キット
本発明はまた、
（１）化合物、及び
（２）キャリア
を含む、造血組織作製用キットをも提供する。
【０１１６】
本発明のキットに含まれる化合物、キャリアとしては、上記「２．」欄に記載のものを用いる。化合物としては、前述のBIOが好ましい例として挙げられる。
【０１１７】
また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えば細胞を移植するための道具（例えば、注射器。）、ポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これに限定されない。上記造血組織の製造方法を行うための手順を書き記した書面などを含むこともできる。
【０１１８】
本発明のキットは、上記「２．」欄に記載の造血組織の製造方法に好適に用いることができる。
【０１１９】
５．細胞誘導剤のスクリーニング方法
本発明はまた、下記の工程を含む、細胞誘導剤のスクリーニング方法をも提供する：
（１）体細胞を被験物質の存在下で培養し、当該被験物質の細胞誘導能を評価する工程、及び
（２）前記工程で評価した被験物質の細胞誘導能と、下記一般式（Ｉ）で表される化合物（例えば、BIO）の細胞誘導能とを比較する工程。
【０１２０】
【化１７】
2016068257.tif 000019
【０１２１】
［式中、Ｒ１、Ｘは前記に同じ。］
【０１２２】
細胞誘導剤のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法により選別される細胞誘導剤は、体細胞（「１．」欄に記載の体細胞（Ｃ）が例示される）を原料ととして、当該原料の体細胞とは異なる体細胞に分化しうる細胞（「１．」欄に記載の細胞（Ｂ）が例示される。）を誘導することができる細胞誘導剤である。
【０１２３】
工程（１）
本発明のスクリーニング方法の第１の工程において、体細胞を被験物質の存在下で培養し、当該被験物質の細胞誘導能を評価する。
【０１２４】
培養
当該工程において、まず体細胞を被験物質の存在下で培養する。体細胞の培養は、上記「１．」欄に記載の培養工程に準じて行うことができる。
【０１２５】
体細胞
体細の種類は、特に限定されるものではない。
【０１２６】
体細胞の由来は特に限定されるものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ等の哺乳類に由来するものであることが好ましい。
【０１２７】
体細胞は、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）、生体から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞のいずれであってもよい。
【０１２８】
本発明のスクリーニング方法のある態様においては、体細胞は、歯髄に由来する細胞である。歯髄に由来する細胞には、歯髄細胞、歯髄幹細胞が含まれる。歯髄に由来する細胞は、歯髄から採取した細胞を培養した細胞（特に、初代培養細胞。）や歯髄から採取した細胞を用いて継代培養を継続して株化した細胞が包含される。株化した細胞としては、非特許文献１に記載されているものを使用することができる。
【０１２９】
本発明の別の態様においては、体細胞は間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞の由来は特に限定されず、骨髄由来のもの、脂肪組織由来のものなどを用いることができる。なかでも、調製が容易である骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい例である。間葉系幹細胞は、公知の手法に従い調製することができる。例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、骨髄穿刺により得られる骨髄液を遠心分離することで採取することができる。
【０１３０】
被験物質
被験物質は、特に限定されるものではなく、あらゆる化合物を使用することができる。好ましい態様においては、生体に対する安全性が確認された化合物であることが好ましい。
【０１３１】
細胞誘導能の評価
次いで、培養をして得られた細胞に基づき、被験物質の細胞誘導能を評価する。
【０１３２】
「細胞誘導能」とは、当該被験物質が、原料の体細胞を、当該原料の体細胞とは異なる体細胞に分化しうる細胞に誘導できる作用を意味する。従って、被験物質の細胞誘導能を評価は、斯かる作用の程度を評価する。
【０１３３】
「細胞誘導能」を評価する方法は、当業者が適宜設定することができる。
【０１３４】
一例として、体細胞が歯髄に由来する細胞である場合、後述の実施例に記載の如く、培養により得られた細胞の形態、幹細胞の性質の獲得（自己複製能と分化能の獲得；幹細胞マーカーの発現等。）などに基づいて評価をすることができる。また、分化能としては、実施例に記載に例示されるvon Kassa染色による骨芽細胞への分化能の獲得、実施例に記載に例示される造血組織への分化能の獲得を指標とすることもできる。
【０１３５】
別の例として、体細胞が間葉系幹細胞である場合、実施例に記載に例示される造血組織への分化能の獲得を指標とすることができる。
【０１３６】
工程（２）
本発明のスクリーニング方法の第２の工程において、前記工程で評価した被験物質の細胞誘導能と、上記化合物（例えば、BIO）の細胞誘導能とを比較する。
【０１３７】
化合物の細胞誘導能
上記化合物（例えば、BIO）の細胞誘導能は、工程（１）において用いた体細胞を、当該化合物（例えば、BIO）の存在下で培養した場合の細胞誘導能を意味する。当該化合物（例えば、BIO）の細胞誘導能は、適切に対比を行うために、工程（１）で行った評価と同様にして行うことが好ましい。
【０１３８】
細胞誘導剤の選別
細胞誘導剤の選別は、工程（２）の比較の結果に基づいて行う。
【０１３９】
具体的には、予め設定した基準に適合する被験物質を、細胞誘導剤として選別する。予め設定した基準は、例えば、上記化合物（例えばBIO）の細胞誘導能と同程度あるいは同程度以上とすることができる。被験物質の細胞誘導能が、当該化合物（例えば、BIO）の細胞誘導能と同程度以下である場合も、当該被験物質を細胞誘導剤として選別することは妨げられない。この場合、例えば当該被験物質が安全性、経済性などの観点で当該化合物(例えば、BIO）に比して有利な効果を有している場合は参酌できる。
【０１４０】
かくして、細胞誘導剤がスクリーニングされる。スクリーニングにより選別された細胞誘導剤は、上記「１．」欄の細胞の製造方法、「２．」欄に記載の造血組織の製造方法において、BIOに換えて好適に使用することができる。
【０１４１】
６．使用
本発明はまた、体細胞（Ａ）に分化しうる細胞（Ｂ）を製造するためであって、前記体細胞（Ａ）とは異なる体細胞（Ｃ）から細胞（Ｂ）を製造するための、前述の一般式（Ｉ）で表される化合物（例えば、BIO）の使用をも提供する。
【０１４２】
【化１８】
2016068257.tif 000020
【０１４３】
［式中、Ｒ１、Ｘは前記に同じ。］
【０１４４】
また、造血組織を製造するための、上記化合物の使用も提供される。
【０１４５】
具体的な使用態様としては、上記「１．」欄の細胞の製造方法、「２．」欄に記載の造血組織の製造方法が例示される。
【実施例】
【０１４６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１４７】
参考例１：マウス乳歯由来歯髄幹細胞の形態の観察
非特許文献１において作製したマウス乳歯由来歯髄細胞（mDP）の形態を観察した。【０１４８】
＜方法及び結果＞
非特許文献１において作製したマウス乳歯由来歯髄幹細胞（mDP）の細胞株を、常法に従い、Hoechst 33342（Hoechst Blue、青色）及びHoechst33258（Hoechst Red、赤色）の２色の色素で染色した。フローサイトメトリー法により、色素が排出されて２色の染色の程度が弱い細胞をソートして、歯髄幹細胞（mDP-SP）を選別した。なお、幹細胞は色素の排出能力が向上していると考えられている。【０１４９】
ソートの結果を図１Aに示す。歯髄の中には歯髄幹細胞が0.5〜1.0%存在することと同様に、マウス乳歯由来歯髄細胞（mDP）の細胞株中にも幹細胞の性質を有する細胞が存在することが確認できた。【０１５０】
次いで、選別した歯髄幹細胞（mDP-SP）及び歯髄細胞（mDP-MP）の形態を観察した。それぞれの細胞を、常法に従い、Phalloidin-Alexa594（アクチン染色、赤）及びDAPI（核染色、青）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した。【０１５１】
顕微鏡像を図１Bに示す。さらに、形態の定量結果（Relative length（相対長さ）、Relataive breadth（相対幅）及びElliptical form factor）を図１Ｃに示す。「Elliptical form factor」は、Relative length/Relative breadthの式で求められる値であり、注目する細胞の細長さの度合いを示す指数である。【０１５２】
歯髄幹細胞は紡錘形の形態を有する。一方、歯髄細胞は扁平形態を有する。【０１５３】
実施例１：歯髄幹細胞様形態を誘導する薬剤のスクリーニング
歯髄細胞に加えることで、歯髄幹細胞様の形態を誘導できる薬剤をスクリーニングした。【０１５４】
＜方法及び結果＞
FCS（ウシ胎児血清）を10%添加したDMEM/F12培地（ライフテクノロジーズ社製）に、FDA Approved Drug Screen-Well Libraryの各薬剤を2 μM（終濃度）添加して、mDP細胞を２日間培養した。その後、Phalloidin-Alexa594によるアクチン染色をした細胞について、顕微鏡観察により歯髄幹細胞様の形態の誘導を評価した。各薬剤は、DMSOの溶液として提供されている。【０１５５】
その結果、GSK-3 inhibitor IX, BIOが、歯髄幹細胞様の形態を誘導できる薬剤として選別された。【０１５６】
結果を図２に示す。図２Ａは、GSK-3 inhibitor IX, BIOの構造、及び、類似する活性を有さないMeBIO（対照化合物）の構造を示す。図２Ｂに、BIOの存在下で培養したmDP細胞の形態を示す。図２Cは、形態の定量結果を示す。【０１５７】
BIOの存在下で培養したmDP細胞は、その形態がmDP-SP細胞に類似するものとなっていた。このような効果は、対照のDMSOのみの存在下及びMeBIOの存在下で培養した場合には、観察されなかった。以上のとおり、BIOが、歯髄幹細胞様の形態を誘導できる薬剤として選別された。【０１５８】
実施例２：GSK-3β及びWnt-βカテニン経路の関与の検証
BIOはWnt-β−カテニン経路に属するGSK-3βの抑制剤であるため、BIOによる効果における、GSK-3β及びWnt-β−カテニン経路の関与を検証した。【０１５９】
＜方法及び結果＞
プロテインフォスファターゼ１（PP1）及びプロテインフォスファターゼ２Ａ（PP2A-C）の阻害剤であるCalyculin-Aは、その作用によってWntシグナルが活性化され、β−カテニン（β-catenin）のリン酸化が亢進することが知られている。図３A上段は、0〜20nMのCalyculin-Aの存在下で、0分、30分又は60分培養したmDP細胞におけるリン酸化β−カテニン（phospho-βcatenin）に対する抗体で検出したβ−カテニンのリン酸化の程度を示す。【０１６０】
実施例１と同様にしてBIOの存在下で培養したmDP細胞を、洗浄及び培地交換の後、20nMのCalyculin-Aの存在下で培養し、β−カテニンのリン酸化の程度を検出した。DMSOの存在下BIOの存在下で培養したmDP細胞を対照とした。【０１６１】
結果を図３A下段及び図３Bに示す。BIOの存在下で培養したmDP細胞においては、対照で観察されるβ−カテニンのリン酸化の亢進は観察されなかった。この結果は、BIOの存在下で培養の培養により、GSK-3βの機能が抑制されていることを示している。【０１６２】
実施例３：幹細胞マーカーの発現の評価
BIOの存在下で培養した細胞における、幹細胞マーカーの発現を検出した。【０１６３】
＜方法及び結果＞
実施例１と同様にしてBIOの存在下で培養したmDP細胞における幹細胞マーカーOct3/4及びKlf-4の相対遺伝子発現量（Relative gene expression）を、リアルタイムRT-PCR法により測定した。【０１６４】
また、マウスの切歯（incisor）及び第1臼歯（1st molar）の歯髄から採取した細胞の初代培養細胞を用いて、同様に、BIOの存在下で培養し、Oct3/4の相対遺伝子発現量（Relative gene expression）を測定した。【０１６５】
結果を図３Ｃ及びＤに示す。BIOの存在下で培養したmDP細胞、並びに、マウス門歯及び第１臼歯由来の細胞において、幹細胞マーカーの発現が亢進していた。このことは、BIOの存在下で培養することで、幹細胞としての性質が誘導されたことを示している。【０１６６】
実施例４：骨芽細胞への分化能の評価
BIOの存在下で培養した細胞の、骨芽細胞への分化能を評価した。【０１６７】
＜方法及び結果＞
実施例１と同様にして、mDP細胞をBIOの存在下で培養した。その後、洗浄及び培地交換を行い、引き続き骨誘導培地若しくはBMP2タンパク質100ng/mlをさらに添加した骨誘導培地で7日間培養した。【０１６８】
なお、骨誘導培地は、文献：Nakamura T, Naruse M, Chiba Y, Komori T, Sasaki K, Iwamoto M, Fukumoto S: Novel Hedgehog Agonists Promote Osteoblast Differentiation in Mesenchymal Stem Cells. J Cell Physiol. 2014 Sep 12. doi: 10.1002/jcp.24823. [Epub ahead of print]に準じて作製した。【０１６９】
次いで、von Kossa染色により、石灰化物を染色し、骨芽細胞への誘導を評価した。von Kossa染色は、非特許文献１に準じて行った。DMSOのみを添加培地に添加、又は、MeBIOを培地に添加する以外は同様とした群を、対照とした。【０１７０】
結果を図４に示す。図４Ａは、von Kossa染色の結果の一例を示す。図４Ｂは、von Kossa染色の強度（Intensity of von Kossa staining）の定量結果を示す。【０１７１】
BIOの存在下で培養した細胞において、von Kossa染色の強い染色が観察され、当該細胞は骨芽細胞への分化能を獲得していることが明らかとなった。【０１７２】
実施例５：マウス骨髄由来間葉系幹細からの骨髄様組織の製造
BIOで処理したマウス骨髄由来間葉系幹細胞（mBM-MSC）を用いて、骨髄様組織をマウスの体内で製造した。【０１７３】
＜方法及び結果＞
マウス骨髄由来間葉系幹細胞（mBM-MSC）は、文献：Yamaza T et al. PLoS One. 2008 Jul 9;3(7):e2615.に準じて調製した。得られたmBM-MSCを、実施例１と同様にして、BIOの存在下で12日間培養した。培地は、FCS（ウシ胎児血清）を10%添加したDMEM/F12培地に替えて、FCSを20%添加したαMEM培地を使用した。BIOの添加なしに培養した細胞を対照とした。【０１７４】
培養後、得られた細胞を1xPBS緩衝液で洗浄しBIOを除去し、1.0x 107細胞をヒドロキシアパタイト（HA）（40mg）と混合して、免疫不全マウス（NOD/ShiJic-scid/jclマウス）の背部へ、皮下注射により移植した。【０１７５】
移植したマウスを8週間通常に飼育した後に、移植部位を摘出して常法に従いヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を行い、観察した。【０１７６】
結果を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａは、操作のスキームを示す。図５Ｂは、移植した部位を観察した顕微鏡像を示す（ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色））。【０１７７】
対照のBIOの添加なしに培養した細胞を移植したマウス（transplant without BIO）では、HAの周囲に骨様の硬組織が確認できた。一方、BIOの存在下で培養した細胞を移植したマウス（transplant with BIO）では、HAが完全に吸収され、骨組織とともに大量の骨髄様の組織の形成が確認された。【０１７８】
実施例６：ヒト乳歯由来歯髄幹細胞からの骨髄様組織の製造
BIOで処理したヒト乳歯由来歯髄幹細胞（SHED）を用いて、骨髄様組織をマウスの体内で製造した。【０１７９】
＜方法及び結果＞
マウス骨髄由来間葉系幹細胞（mBM-MSC）に換えてヒト乳歯由来幹細胞（Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous teeth；SHED）を用いる以外は、実施例５と同様にして細胞を免疫不全マウス（NOD/ShiJic-scid/jclマウス）に移植した。【０１８０】
結果を図５Ｃ及びＤに示す。図５Ｃは、操作のスキームを示す。図５Ｄは、移植した部位を観察した顕微鏡像を示す（ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色））。【０１８１】
完全にHAは吸収されなかったものの、BIOの存在下で培養した細胞を移植したマウス（transplant with BIO）では対照群と比較して骨の形成が促進されて おり、マウス骨髄由来間葉系幹細胞を用いた場合と同様に、骨髄様の組織の形成が確認された。【０１８２】
実施例７：末梢血細胞の形成の検出
実施例６で得たマウスにおいて、ヒト由来の末梢血細胞の形成を確認した。【０１８３】
＜方法及び結果＞
実施例６の方法に従って得たマウス（transplant with BIO）において、移植後８週間後のマウスから血液を採取した。まず、フローサイトメトリー法により、血液成分からFSC/SSCプロットにおいて、単球（高FSC、低SSC；R1群）及び顆粒球（高FSC、高SSC；R2群）をゲーティングした。ゲーティングされたR1群及びR2群のそれぞれについて、ヒト型CD11b抗原（hCD11b）の発現を検出した。独立した２例について、試験をした。【０１８４】
ヒトから採取した血液（human blood cells）、移植をしなかったマウス(non-transplant）、BIOの添加なしに培養した細胞を移植したマウス（transplant without BIO）に由来する試料を対照とした。【０１８５】
結果を図６に示す。図６Ａは、フローサイトメトリー法によるゲーティングの結果の一例（ヒト血液（human blood cells）の場合。）を示す。図６Ｂは、ヒト型CD11b抗原（hCD11b）の発現の検出を示す。【０１８６】
BIOの存在下で培養した細胞を移植したマウスにおいて特異的に、ヒト型CD11b抗原（hCD11b）の陽性細胞が検出できた。このことは、移植した細胞からヒトの機能的な血球細胞が生じており、移植した細胞が造血組織を形成したことを示している。【０１８７】
実施例８：移植マウスの外的所見
実施例６で得たマウスの外的所見を観察した。【０１８８】
＜結果＞
結果を図６Ｃに示す。【０１８９】
BIOの存在下で２日間培養したヒト乳歯由来幹細胞（SHED）を移植したマウスにおいて、眼の周りや四肢に皮膚症状（炎症所見）が観察された。その後、このマウスは移植後３〜６ヶ月後頃には死に至る。【０１９０】
本発明を束縛するものではないが、この結果は、移植した細胞からヒト血球細胞が生じて、移植片対宿主病（graft versus host disease; GVHD）を引き起こしていると考えられる。すなわち、移植した細胞からヒトの機能的な血球細胞が生じており、移植した細胞が造血組織を形成したことを示している。【０１９１】
＜考察＞
本発明の造血組織の製造方法により造血組織が形成できる作用機序は、十分明らかではないものの、BIOの存在下で培養することで、（１）体細胞が造血幹細胞又はこれに類する機能を有する幹細胞に分化しうる能力が獲得され、（２）移植後に造血幹細胞又はこれに類する機能を有する幹細胞への誘導が、移植箇所の周辺からの刺激で惹起されるためと考えられる。ただし、斯かる作用機序は推定に過ぎず、本発明を束縛するものではない。
【図１Ａ】
2016068257.tif 000031
【図１Ｂ】
2016068257.tif 000032
【図１Ｃ】
2016068257.tif 000033
【図２Ａ】
2016068257.tif 000034
【図２Ｂ】
2016068257.tif 000035
【図２Ｃ】
2016068257.tif 000036
【図３】
2016068257.tif 000037
【図４】
2016068257.tif 000038
【図５】
2016068257.tif 000039
【図６】
2016068257.tif 000040
【国際調査報告】
2016068257.tif 000041
2016068257.tif 000042
2016068257.tif 000043
2016068257.tif 000044
2016068257.tif 000045
2016068257.tif 000046