(57)【要約】  本発明は、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造した人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で、コロニーを形成させる工程、および（ｂ）被検物質の存在下でのコロニー数が、被検物質の非存在下でのコロニー数と比較して、増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、を含む、方法等を提供する。
2014189144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造した人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で、コロニーを形成させる工程、および
（ｂ）被検物質の存在下でのコロニー数が、被検物質の非存在下でのコロニー数と比較して、増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３】
急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下、および非存在下で、血球系細胞へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より血球系細胞数が増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
【請求項４】
前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、赤血球である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、好中球である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、巨核球である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が次の工程を含む、請求項５に記載の方法：
（ｉ）造血前駆細胞をVEGF、IL-6、IL-3、IL-11、SCF、FLT3L、erythropoietin（EPO）およびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞をIL-3、SCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞をSCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程。
【請求項９】
前記工程（ｂ）が造血前駆細胞をGM-CSFおよび／またはG-CSFを含有する培地中で培養する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）が造血前駆細胞をTPOおよびSCFを含有する培地中で培養する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ａ）が次の工程から成る、請求項３から１０のいずれか１項に記載の方法：
（１）BMP-4を含有する培地中でiPS細胞から胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
【請求項１２】
前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、請求項３から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
骨髄異形成症候群患者のT細胞から製造したiPS細胞を分化誘導して作製した造血前駆細胞を含む、骨髄異形成症候群の治療剤。
【請求項１５】
前記iPS細胞から造血前駆細胞への分化誘導が次の工程から成る、請求項１４に記載の剤：
（１）BMP-4を含有する培地中でiPS細胞から胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
【請求項１６】
前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、請求項１４に記載の剤。
【請求項１７】
前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、請求項１６に記載の剤。
【請求項１８】
急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造した人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された造血前駆細胞（非T細胞由来の造血前駆細胞）および対照iPS細胞から誘導された造血前駆細胞（対照造血前駆細胞）を被検物質と接触させる工程、および
（ｂ）当該被検物質接触後の非T細胞由来の造血前駆細胞数が、当該被検物質接触後の対照造血前駆細胞数と比較して、減少した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記対照造血前駆細胞が、非T細胞と同一患者から単離した血液単核球中のT細胞から製造したiPS細胞から誘導された造血前駆細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記造血前駆細胞が以下の工程を含む方法によりiPS細胞から誘導された造血前駆細胞である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法：
（１）iPS細胞をBMP-4を含有する培地中で培養し、胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
【請求項２２】
前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性骨髄性白血病またはその類縁疾患である骨髄異形成症候群（MDS）の治療および/または予防薬をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、正常iPS細胞から誘導された造血前駆細胞を含有してなる、骨髄異形成症候群（MDS）の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（MDS）はクローナルな後天性造血障害で、慢性に経過する治療抵抗性の貧血、血球減少（不応性貧血）と急性骨髄性白血病へ移行しやすい前白血病状態を併せもつ予後不良の骨髄疾患である。比較的高齢者に多く、また悪性腫瘍に対する化学療法や放射線療法後に発症（二次性MDS）する確率が数倍〜数十倍に増加するのが特徴で、近年の社会の高齢化や積極的化学療法の拡がりと相まって、MDS症例は増加の一途をたどっている。現行の治療法は有効なものが少なく、根治の可能性がある治療法は同種造血幹細胞移植のみであるが、その適応は若年者に限られ、大多数の高齢患者では輸血などの対症療法が主体となり、数年内に感染症や白血病化によって大半が死の転帰をとる。MDSでは、モデルマウスが殆どなく、免疫不全マウスにもMDS細胞は生着しないので、MDSの病態が再現・解析でき、将来の治療法の開発を可能にするツールの開発、及び新規治療薬・診断薬の開発が切望されている。【０００３】
一方、再生医療の分野等では、生体材料として利便性のある細胞から所望の細胞型へ転換する技術が望まれており、最近においては、マウスおよびヒトの人工多能性幹細胞（iPS細胞）が相次いで樹立された。Yamanakaらは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した（特許文献１および非特許文献１）。このようにして得られるiPS細胞は、治療対象となる患者由来の細胞を用いて作製された後、各組織の細胞へと分化させることができるため、in vitroで病態を再現することが可能と考えられている。しかしながら、現在までのところ、MDS患者由来の体細胞を用いてiPS細胞の作製に成功した例については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2007/069666号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi, K, et al., Cell. 131:861-872 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、急性骨髄性白血病またはその類縁疾患である骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防薬をスクリーニングする方法を提供することにある。本発明の課題はまた、骨髄異形成症候群（MDS）の治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、骨髄異形成症候群（MDS）患者の体細胞由来のiPS細胞から分化誘導された細胞において骨髄異形成症候群（MDS）の病態を再現することに成功した。すなわち、MDS患者の血液単核球中の非T細胞由来のiPS細胞から分化誘導された造血前駆細胞では、コロニー形成能が低く、特に、好中球・赤血球・巨核球への分化能が乏しいという所見が見出された。その一方で、同一患者の血液単核球であっても、T細胞由来のiPS細胞から分化誘導された造血前駆細胞では、驚くべきことに、MDSに特有の染色体異常は認められず、コロニー形成能、血球細胞への分化能とも正常であることも明らかにした。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。【０００８】
すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
[１] 急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造した人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で、コロニーを形成させる工程、および
（ｂ）被検物質の存在下でのコロニー数が、被検物質の非存在下でのコロニー数と比較して、増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
[２] 前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、[１]または[２]に記載の方法。
[３] 急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下、および非存在下で、血球系細胞へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より血球系細胞数が増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
[４]前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、[３]に記載の方法。
[５]前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、赤血球である、[３]または[４]に記載の方法。
[６]前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、好中球である、[３]または[４]に記載の方法。
[７]前記工程（ｂ）で誘導する血球系細胞が、巨核球である、[３]または[４]に記載の方法。
[８] 前記工程（ｂ）が次の工程を含む、[５]に記載の方法：
（ｉ）造血前駆細胞をVEGF、IL-6、IL-3、IL-11、SCF、FLT3L、erythropoietin（EPO）およびthrombopoietin （TPO）を含有する培地中で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞をIL-3、SCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞をSCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程。
[９]前記工程（ｂ）が造血前駆細胞をGM-CSFおよび／またはG-CSFを含有する培地中で培養する工程を含む、[６]に記載の方法。
[１０]前記工程（ｂ）が造血前駆細胞をTPOおよびSCFを含有する培地中で培養する工程を含む、[７]に記載の方法。
[１１] 前記工程（ａ）が次の工程から成る、[３]から[１０]のいずれかに記載の方法：
（１）BMP-4を含有する培地中でiPS細胞から胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
[１２] 前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、[３]から[１０]のいずれかに記載の方法。
[１３] 前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、[１２]に記載の方法。
[１４] 骨髄異形成症候群患者のT細胞から製造したiPS細胞を分化誘導して作製した造血前駆細胞を含む、骨髄異形成症候群の治療剤。
[１５] 前記iPS細胞から造血前駆細胞への分化誘導が次の工程から成る、[１４]に記載の剤：
（１）BMP-4を含有する培地中でiPS細胞から胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
[１６] 前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、[１４]に記載の剤。
[１７] 前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、[１６]に記載の剤。
[１８] 急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造した人工多能性幹（iPS）細胞から誘導された造血前駆細胞（非T細胞由来の造血前駆細胞）および対照iPS細胞から誘導された造血前駆細胞（対照造血前駆細胞）を被検物質と接触させる工程、および
（ｂ）当該被検物質接触後の非T細胞由来の造血前駆細胞数が、当該被検物質接触後の対照造血前駆細胞数と比較して、減少した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程、
を含む、方法。
[１９] 前記対照造血前駆細胞が、非T細胞と同一患者から単離した血液単核球中のT細胞から製造したiPS細胞から誘導された造血前駆細胞である、[１８]に記載の方法。
[２０] 前記骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞が、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常を有している、[１８]または[１９]に記載の方法。
［２１] 前記造血前駆細胞が以下の工程を含む方法によりiPS細胞から誘導された造血前駆細胞である、[１８]から[２０]のいずれかに記載の方法：
（１）iPS細胞をBMP-4を含有する培地中で培養し、胚様体を形成させる工程、
（２）前記胚様体をbFGFおよびBMP-4を含有する培地中で培養する工程、および
（３）工程（２）で得られた細胞をbFGF、VEGF、IL-6、IL-3、IL-11、stem cell factor (SCF)およびFLT3Lを含有する培地中で培養する工程。
[２２]前記造血前駆細胞が、iPS細胞をフィーダー細胞と共培養する工程を含む方法により誘導された造血前駆細胞である、[１８]から[２０]のいずれかに記載の方法。
[２３] 前記フィーダー細胞がOP9細胞株である、[２２]に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規のツールを用いた急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療および/または予防薬のスクリーニングが可能となる。特に、同一患者の、しかも同じ血液単核細胞由来の細胞を対照として用いることができるため、病態の有無以外の細胞の条件を揃えることができ、より高確度なスクリーニング系となり得る。また、本発明により、骨髄異形成症候群患者の体細胞由来の造血前駆細胞を用いた骨髄異形成症候群（MDS）の治療剤を提供することが可能となる。したがって、本発明は、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、iPS細胞の樹立をしたMDS患者における血液の染色像を示す。（A）は、KM3（MDS患者）における芽球、骨髄細胞および巨大血小板を示し、（B）は、KM5（MDS患者）の芽球、骨髄細胞、赤芽球細胞、巨核球を示す。
【図２】図２は、KM3の血液（non-T細胞およびT細胞）由来のiPS細胞における染色体18p11.3の遺伝子（USP14、NDC810およびMYL12A）のコピー数の測定結果を示す。
【図３】図３は、MDS-iPS細胞の核型およびCGH解析の結果を示す。（A）は、KM3-A4 iPS細胞株の核型およびCGH解析の結果を示し、（B）は、KM5由来のiPS細胞株の核型の１例および各iPS細胞株のCGH解析の結果を示す。
【図４】図４は、KM5由来のiPS細胞を間期核FISHにより解析した結果を示す。染色体20qにおける欠損が確認された（MDS-iPSCs）。
【図５】図５は、各細胞株における多能性細胞マーカーについてのRT-PCR解析の結果を示す。MDS患者からの変異iPS細胞（MDS-iPS）は、多能性細胞マーカーについてES細胞等と同等の発現が確認された。
【図６】図６は、各iPS細胞株（KM3-A4およびKM5-B3）の多能性マーカータンパク質（Tra-1-60およびSSEA4）に対する免疫染色後の蛍光像を示す。
【図７】図７は、KM3-A4から生成したテラトーマの写真およびその切片の染色像を示す。
【図８】図８は、グローバルな遺伝子発現データに基づく、教師なし階層クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）のデンドログラムを示す。
【図９】図９は、KM5由来iPS細胞からの造血前駆細胞への分化誘導結果を示す。（A）は、KM5由来のT細胞から樹立した正常iPS細胞（T-iPS細胞）から誘導した造血前駆細胞への分化を示し、（B）は、KM5由来の変異iPS細胞（MDS-iPS細胞）を造血前駆細胞へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。T-iPS細胞またはMDS-iPS細胞をOP9上で培養することにより造血前駆細胞へ分化させた。
【図１０】図１０は、KM5由来の異常MDS-iPS細胞（(A)においてはNonT-iPS、(B)においてはMDS-iPSC）および正常MDS-iPS細胞（(A)においてはT-iPS、(B)においては Normal iPSC）から分化誘導された造血前駆細胞（HPC）のコロニー形成単位（CFU）アッセイの結果を示す。（A）は、単位細胞あたりのコロニー数およびコロニー内の構成成分（BFU-E：赤血球、GEMM：混合、GM：顆粒球・マクロファージ、G：顆粒球、M：マクロファージ）の割合を示し、（B）は、15日目におけるコロニーの染色像を示す。（A）の5M-B1は、正常な核型を示すiPS細胞株である。
【図１１】図１１は、KM3由来の変異iPS細胞（KM3-A4）および正常iPS細胞（KM3-G1）を造血前駆細胞へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。KM3-A4またはKM3-G1をEB法で培養することにより造血前駆細胞へ分化させた。
【図１２】図１２は、KM3およびKM5由来のMDS-iPSCおよびNormal iPSC (T-iPS) を赤血球へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。図中、横軸は、赤血球（CD235a+）の割合を示す。
【図１３】図１３は、KM3およびKM5由来の異常MDS-iPSC (NonT-iPS)およびNormal iPSC(T-iPS)を好中球へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。図中、縦軸は、CD11b+骨髄細胞中の好中球（CD66b+）の割合を示す。5M-B1は、正常な核型を示すiPS細胞株である。
【図１４】図１４は、MDS-iPS細胞の核型およびCGH解析の結果を示す。（A）は、KM15由来の iPS細胞株の核型およびCGH解析の結果を示し、（B）は、KM16由来のiPS細胞株の核型およびCGH解析の結果を示す。
【図１５】図１５は、KM5、KM15およびKM16由来の異常MDS-iPSC (MDS又はMD)およびNormal iPSC(Normal又はN)から分化誘導された造血前駆細胞（HPC）のコロニー形成単位（CFU）アッセイの結果を示す。右端に記載の略記はそれぞれ下記の意味を示す：BFU-E：赤血球、GEMM：混合、GM：顆粒球・マクロファージ、G：顆粒球、M：マクロファージ。
【図１６】図１６は、KM3、KM5、KM15およびKM16由来の異常MDS-iPSC (MDS又はMD)およびNormal iPSC (Normal又はN) を赤血球へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。図中、縦軸は、赤血球（CD235a+）の割合を示す。5M-B1は、正常な核型を示すiPS細胞株である。
【図１７】図１７は、KM3、KM5、KM15およびKM16由来の異常MDS-iPSC (MDS又はMD)およびNormal iPSC(Normal又はN)を好中球へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。図中、縦軸は、CD11b+骨髄細胞中の好中球（CD66b+）の割合を示す。5M-B1は、正常な核型を示すiPS細胞株である。
【図１８】図１８は、KM3由来の変異iPS細胞（KM3-A4）および正常iPS細胞（KM3-A3）を巨核球へ分化した際のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１９】図１９は、KM5およびKM16由来のMDS-iPSCおよびNormal iPSCにおける、p38阻害剤の適用によるコロニー形成能の改善効果を観察した結果を示す。右端に記載の略記はそれぞれ下記の意味を示す：BFU-E：赤血球、GEMM：混合、GM：顆粒球・マクロファージ、G：顆粒球、M：マクロファージ。p38阻害剤であるSB203580の適用により、コロニー形成能の改善効果が見られた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において使用される「変異MDS-iPS細胞」、「変異MDS-iPSCs」、「MDS-iPSC」もしくはこれに準ずる用語は、骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞であって、該iPS細胞から誘導される造血前駆細胞の低コロニー形成能と、該iPS細胞から血球系細胞（例、赤血球、好中球、巨核球）への低分化能とで特徴づけられるiPS細胞を意味する。好ましくは、骨髄異形成症候群に特有の細胞内病態、例えば染色体異常を有するiPS細胞である。本明細書において使用される「変異MDS-iPS細胞」、「変異MDS-iPSCs」および「MDS-iPSC」なる用語は、下記の「正常MDS-iPS細胞」、「正常MDS-iPSCs」および「Normal iPSC」との対比で、「異常MDS-iPS細胞」と読み替えることもできる。
【００１２】
一方、本明細書において使用される「正常MDS-iPS細胞」、「正常MDS-iPSCs」、「Normal iPSC」もしくはこれに準ずる用語は、骨髄異形成症候群患者の体細胞から製造したiPS細胞のうち、骨髄異形成症候群に特有の細胞内病態を有さないiPS細胞を意味する。骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中のT細胞から製造したiPS細胞は、骨髄異形成症候群に特有の染色体異常等の細胞内病態を含まず、かつ該iPS細胞から誘導された造血前駆細胞は正常なコロニー形成能と血球系細胞へ分化能を有することから、好ましくは、T細胞から製造したiPS細胞である。
【００１３】
iPS細胞の製造方法
本発明において、iPS細胞は、ある特定の核初期化物質を、タンパク質またはそれをコードする核酸の形態で体細胞に導入すること、または薬剤によって内在性の当該核初期化物質のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、WO 2007/069666およびWO 2010/068955）。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Esrrb, EsrrgまたはGlis1が例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
【００１４】
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照すること、またL-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、EsrrgおよびGlis1のマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名    マウス          ヒト      
L-Myc       NM_008506      NM_001033081
Lin28       NM_145833      NM_024674
Lin28b      NM_001031772   NM_001004317
Esrrb       NM_011934      NM_004452
Esrrg       NM_011935      NM_001438
Glis1       NM_147221      NM_147193
【００１５】
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775、Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770、WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、BKウイルスおよび牛乳頭腫（Bovine papillomavirus）の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriPもしくはLarge TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させ��発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄疫ウイルス（FMDV）2Aコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/092042、WO 2009/152529）。
【００１６】
核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤[例えば、バルプロ酸(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling activator（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤（例えば、SB431542）（Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)）、mitogen-activated protein kinase signalling阻害剤、glycogen synthase kinase-3阻害剤（PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009))、等を使用することができる。
【００１７】
薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現を上昇させる方法における薬剤としては、6-bromoindirubin-3'-oxime、indirubin-5-nitro-3'-oxime、valproic acid、2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine、1-(4-methylphenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone HBr(pifithrin-alpha)、prostaglandin J2および prostaglandin E2等が例示される（WO 2010/068955）。
【００１８】
iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば(1) 10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地（これらの培地にはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、(2) bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地(例えばTX-WES培地、トロンボＸ社)または霊長類ES細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ES細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、mTeSR-1）、などが含まれる。
【００１９】
培養法の例としては、例えば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培地中で体細胞と核初期化物質 (DNAまたはタンパク質) を接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
【００２０】
あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞 (たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等) 上で10％FBS含有DMEM培地（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。
【００２１】
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００２２】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
【００２３】
本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。本発明において、骨髄異形成症候群に特有の細胞内病態を有するiPS細胞を製造するためには、血液単核球中の非T細胞を用いることが望ましい。ここで、非T細胞とは、血液中の単核球のうちT細胞以外の細胞を意味し、例えば、CD3、CD4、CD8およびCD9のすべてのマーカーが陰性であることによって特徴づけられる。また、非T細胞とは、血液中の単核球をIL-3、IL-6、G-CSFおよびGM-CSFを含有する培養液中で培養することで濃縮される細胞群であっても良い。本発明において、骨髄異形成症候群患者から骨髄異形成症候群に特有の細胞内病態を有さないiPS細胞を製造するためには、体細胞として血液中のT細胞を用いることが望ましい。ここで、T細胞とは、例えば、CD3、CD4、CD8およびCD9から選択されるマーカーのうち少なくとも一つが陽性であることによって特徴づけられる。また、T細胞とは、血液中の単核球をIL-2、CD3抗体およびCD28抗体を含有する培養液中で培養することで濃縮される細胞群であっても良い。
【００２４】
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００２５】
iPS細胞から分化誘導した造血前駆細胞を骨髄異形成症候群の治療および/または予防薬をスクリーニングする方法に用いる場合、当該iPS細胞は、骨髄異形成症候群の罹患が既知である患者から体細胞を採取して作製されることが望ましい。この場合において、iPS細胞は、骨髄異形成症候群に特有の染色体異常を有していることが望ましい。骨髄異形成症候群の染色体異常には、染色体の部分的な異常および染色体の数的な異常が含まれる。染色体の部分的な異常は、重複、欠失、転座などが挙げられるが、これらに限定されない。染色体の数的な異常は、例えば、1本になる「モノソミー」、3本になる「トリソミー」、4本になる「テトラソミー」、5本になる「ペンタソミー」が挙げられる。骨髄異形成症候群の染色体異常として、例えば、第4染色体長腕（4q）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第5染色体長腕（5q）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第7染色体長腕（7q）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第9染色体短腕（9p）の一部または全部の重複（すなわち、コピー数の増加）、第11染色体長腕（11q）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第17染色体短腕（17p）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の増減少）、第18染色体短腕（18p）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第20染色体長腕（20q）の一部または全部の欠損（すなわち、コピー数の減少）、第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明において、骨髄異形成症候群の治療および/または予防薬をスクリーニングする方法に使用されるiPS細胞は、例えば、骨髄異形成症候群の罹患が既知である患者から採取された非T細胞から製造されたiPS細胞が挙げられる。興味深いことに、骨髄異形成症候群患者から採取された非T細胞より製造されたiPS細胞は、前記の染色体異常を有していない場合であっても、そこから分化誘導された造血前駆細胞が骨髄異形成症候群の病態を発現する場合があり得る。
【００２７】
本スクリーニング方法に要する対照としてのiPS細胞から分化誘導した造血前駆細胞は、骨髄異形成症候群の罹患が既知である患者から採取される正常な体細胞から誘導されたものであってもよく、あるいは正常な個体由来の体細胞から誘導されたものであってもよい。他の条件をそろえるといった観点から、骨髄異形成症候群に特有の染色体異常を有しているiPS細胞の製造に用いた骨髄異形成症候群の患者から採取される正常な体細胞から作製されたiPS細胞を対照のiPS細胞として用いることが望ましい。より好ましくは、骨髄異形成症候群の患者のT細胞から製造されたiPS細胞を対照として造血前駆細胞の製造に用いることである。
【００２８】
造血前駆細胞への分化誘導法
多能性幹細胞から造血前駆細胞を分化誘導する方法としては、例えば、胚様体の形成とサイトカインの添加による方法（Chadwick et al. Blood 2003, 102:906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4:248-62およびSaeki et al. Stem Cells 2009, 27:59-67）、異種由来のストローマ細胞との共培養法（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）、無血清培地を用いる方法（WO2011/115308）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
本発明において「造血前駆細胞」は、造血幹細胞より分化が進み、細胞の分化の方向が決定した細胞を意味する。これらの細胞は、KDR、CD34、CD90およびCD117のようなマーカーの発現により検出され得るが、マーカーはこれらに限定されない。好ましくは、CD43陽性、CD34陽性、およびCD38陰性の細胞である。一方、「造血幹細胞」は、T細胞、B細胞、赤血球、血小板、好酸球、単球、好中球、好塩基球などの成熟血液細胞を作り出す能力を有し、かつ自己複製能を有する細胞を意味する。本明細書における「造血前駆細胞」は、特に断りがない限り、「造血幹細胞」を含むものとする。
【００３０】
本発明において分化誘導された造血前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。
【００３１】
本発明の造血前駆細胞の誘導において、ES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養により誘導してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により誘導してもよい。ここで、ヒト多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(TM)およびAccumax(TM)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Accutase(TM)）を用いてヒト多能性幹細胞を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。ここで、使用されるヒト多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーであることが好ましい。一方、マウス多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、0.25% trypsin/EDTAを用いた分離方法が挙げられる。
【００３２】
ここで、浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することで胚様体を形成させることであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）をした培養皿を使用して行うことができる。
【００３３】
本発明において、接着培養を用いる場合、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて任意の培地中で培養してもよい。ここで、フィーダー細胞とは、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものであり、例えば、哺乳類胎仔のAGM領域から得られた細胞（例えば、AGM-S3細胞株：特開2001-37471）、マウス間葉系細胞（例えば、C3H10T1/2細胞株：理研BioResource Centerより入手可能）、または骨髄に由来する間質細胞(ストローマ細胞)（例えば、OP9細胞株）が用
いられ得る。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
本発明において、造血前駆細胞を誘導する培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro34（invitrogen）、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００３５】
本発明において、接着培養を用いる場合、造血前駆細胞への分化における培地は、好ましくは、vascular endothelial growth factor (VEGF)を含んでいる。培地におけるVEGFの濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1μg/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、20ng/mlである。
【００３６】
本発明において、接着培養を用いる場合、さらに好ましい培地は、10%FBS、VEGF、トランスフェリン、L-グルタミン、α-monothioglycerol(MTG)およびアスコルビン酸を含有するαMEM培地（HPC分化培地ともいう）であり得る。
【００３７】
本発明において、接着培養を用いる場合、培養日数は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは、12日以上14日以下、特に好ましくは、13日である。
【００３８】
本発明において、接着培養を用いる場合、フィーダー細胞を除去して造血前駆細胞を濃縮・精製する工程を含むことができる。当該工程は、造血前駆細胞をフィーダー細胞と共に培養皿から引き剥がした後にフィーダー細胞のみを回収および除去することにより達成され得る。培養皿から引き剥がす方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、collagenase Type IVおよび／またはTrypsin/EDTAを用いた方法が使用される。造血前駆細胞の分離方法として、好ましくは、0.05%trypsin/EDTAが用いられる。
【００３９】
本発明において、浮遊培養を用いる場合、造血前駆細胞への分化誘導は、例えば、下記の工程により行われてもよい。
(i) EBを形成する工程
(ii) 原条(primitive streak)／中胚葉を形成する工程
(iii) 造血前駆細胞へ特化させる工程
【００４０】
上記各工程において、目的の細胞を誘導するため、あるいは各工程における目的を達成するために基本培地へ必要な任意の物質を添加した培地を用いることができる。例えば、各工程において下記の物質を添加した培地が用いられる。
(i) BMP-4
(ii) bFGF
(iii) VEGF、bFGF、IL-6、IL-3、IL-11、SCFおよびFLT3L
【００４１】
前記工程(i)から(iii)において用いられる基礎培地は、好ましくは、L-グルタミン酸、チオグリセロールおよびアスコルビン酸を補充したStemPro-34である。
【００４２】
前記工程(i)の培地におけるBMP-4の濃度は、EBを形成できる濃度であればいくらでもよいが、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであり、好ましくは、10ng/mlである。
【００４３】
前記工程(ii)の培地におけるbFGFの濃度は、例えば、100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、750pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、1ng/mlである。
【００４４】
前記工程(iii)の培地におけるVEGFの濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10ng/mlである。
【００４５】
前記工程(iii)の培地におけるIL-6の濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10ng/mlである。
【００４６】
前記工程(iii)の培地におけるIL-3の濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、40ng/mlである。
【００４７】
前記工程(iii)の培地におけるIL-11の濃度は、例えば、500pg/ml、750pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、5ng/mlである。
【００４８】
前記工程(iii)の培地におけるSCFの濃度は、例えば、1ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００４９】
前記工程(iii)の培地におけるFLT3Lの濃度は、例えば、1ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００５０】
前記工程(i)の培養時間は、例えば5日以下の培養であり、好ましくは、1〜3日であり、特に好ましくは1日である。
【００５１】
前記工程(ii) の培養時間は、例えば10日以下の培養であり、好ましくは、1〜5日であり、特に好ましくは3日である。
【００５２】
前記工程(iii) の培養時間は、例えば10日以下の培養であり、好ましくは、2〜6日であり、特に好ましくは4日である。
【００５３】
上記製造工程(ii)の終了後において中胚葉の細胞群を純化・精製する工程を含むことができる。中胚葉の細胞群の純化・精製は、中胚葉の細胞群を含む細胞の集団から中胚葉の細胞群を高い純度で分離できる方法であれば何を用いてもよく、例えば、FACSによる純化・精製が挙げられる。本発明においては、純化・精製された中胚葉の集団に未分化な細胞が含まれないよう、さらにSSEA-1陰性（すなわち、SSEA-1−）であることを指標として細胞を選択し得る。Flk1陽性（すなわち、Flk1+）およびSSEA-1−の細胞を選択する工程は同時に行われてもよく、別々の工程として行われてもよい。例えば、Flk1+/SSEA-1−である細胞の選択は、FACSを用いて同時に行うことができる。
【００５４】
本工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００５５】
本工程において、培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。特に、本工程がヒト多能性幹細胞を単一細胞へ分散させる工程を含む場合には、培地にROCK阻害剤が含まれていることが好ましい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００５６】
赤血球への分化誘導法
多能性幹細胞から血球系細胞、特に赤血球を分化誘導する方法としては、例えば、胚様体の形成とサイトカインの添加による方法（Chadwick et al. Blood 2003, 102:906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4:248-62およびSaeki et al. Stem Cells 2009, 27:59-67）、異種由来のストローマ細胞との共培養法（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77）、無血清培地を用いる方法（WO 2011/115308）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
本発明において「赤血球」は、ヘモグロビンに富んだ細胞を意味する。本発明において「赤血球」は、ヘモグロビンのα-グロビン、ε-グロビン、γ-グロビン、β-グロビンおよびCD235aのようなマーカーの発現により検出され得るが、マーカーはこれらに限定されない。成熟した赤血球において好ましいマーカーは、α-グロビンおよびβ-グロビンであり得る。またFACSにより赤血球を分離する場合において好ましいマーカーは、CD235aであり得る。
【００５８】
本発明において分化誘導された赤血球は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。
【００５９】
本工程では、上述した造血前駆細胞を任意の方法で分離し、浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは浮遊培養が採用される。本工程では、造血前駆細胞を分離して用いても良く、上述の方法で得られた状態をそのまま用いても良い。
【００６０】
浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）をした培養皿を使用して行うことができる。
【００６１】
また、接着培養においては、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて任意の培地中で培養する。フィーダー細胞は、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものである。本工程におけるフィーダー細胞は、例えば、骨髄に由来する間質細胞（ストローマ細胞）などであり、好ましくは、OP9細胞が用いられ得る。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６２】
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemPro-34培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、StemPro-34培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、EasyDiffTM Erythroid Supplement（Lonza）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００６３】
本工程における培地はさらに、ROCK阻害剤を含んでいてもよい。特に、本工程がヒト多能性幹細胞を単一細胞へ分散させる工程を含む場合には、培地にROCK阻害剤が含まれていることが好ましい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において使用され得る。
【００６４】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。
【００６５】
赤血球への分化誘導因子としては、例えば、ステムセルファクター(Stem Cell Factor（SCF）)、コロニー刺激因子（Coloney-Stimulating Factor (CSF)）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte- (G-)CSF）、エリスロポエチン（Erythropoietin (EPO)）、インターロイキン類、トロンボポエチン（Thrombopoietin（TPO））およびFlt3リガンドなどがある。ここで、インターロイキン類は、白血球から分泌されるタンパク質で、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、およびIL-9などを含む30種以上がある。
【００６６】
本発明において、造血前駆細胞から赤血球への分化誘導は、例えば、下記の工程により行われてもよい：
(i) 造血前駆細胞をVEGF、IL-6、IL-3、IL-11、SCF、FLT3L、EPOおよびTPOを含有する培地中で培養する工程、
(ii) 工程(i)で得られた細胞をIL-3、SCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程、および
(iii) 工程(ii)で得られた細胞をSCFおよびEPOを含有する培地中で培養する工程。
【００６７】
培地における赤血球への分化誘導因子の濃度は、目的の細胞を誘導できる濃度であればいくらでもよい。
【００６８】
培地におけるVEGFの濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10ng/mlである。
【００６９】
培地におけるIL-6の濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、10ng/mlである。
【００７０】
培地におけるIL-3の濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、40ng/mlである。
【００７１】
培地におけるIL-11の濃度は、例えば、500pg/ml、750pg/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、5ng/mlである。
【００７２】
培地におけるSCFの濃度は、例えば、1ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００７３】
培地におけるFLT3Lの濃度は、例えば、1ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００７４】
培地におけるEPOの濃度は、例えば、1U/ml、2U/ml、3U/ml、4U/ml、5U/ml、6U/ml、7U/ml、8U/ml、9U/ml、10U/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、4U/mlである。
【００７５】
培地におけるTPOの濃度は、例えば、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、50ng/mlである。
【００７６】
前記工程(i)の培養時間は、例えば10日以下の培養であり、好ましくは、2〜6日であり、特に好ましくは4日である。
【００７７】
前記工程(ii)の培養時間は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは、5〜15日であり、特に好ましくは10日である。
【００７８】
前記工程(iii)の培養時間は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは、12〜16日であり、特に好ましくは14日である。
【００７９】
前記工程(iii)においては、培養の途中でSCFおよびEPOを含む培地に交換することも可能である。その場合における培養時間は、培地交換前が、例えば12日以下の培養であり、好ましくは、7〜9日であり、特に好ましくは8日であり、培地交換後が、例えば8日以下の培養であり、好ましくは、5〜7日であり、特に好ましくは6日である。
【００８０】
好中球への分化誘導法
多能性幹細胞から好中球を分化誘導する方法としては、例えば、Saeki et al., Stem Cells 27: 59-67やMorishima et al., J Cell Physiol. 2011 May;226(5):1283-91などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
本発明において「好中球」は、白血球の一種であり、細菌感染などにおける免疫反応を司る細胞を意味する。本発明において「好中球」は、Ly6g、CD11bおよびCD66bのようなマーカーの発現により検出され得るが、マーカーはこれらに限定されない。好中球において好ましいマーカーは、CD66bであり得る。
【００８２】
本発明において分化誘導された好中球は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。
【００８３】
本工程では、前記造血前駆細胞を浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは接着培養が採用される。
【００８４】
浮遊培養においては、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養し、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）をした培養皿を使用して行うことができる。
【００８５】
接着培養においては、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて任意の培地中で培養する。フィーダー細胞は、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものである。本工程におけるフィーダー細胞は、例えば、骨髄に由来する間質細胞(ストローマ細胞)などであり、好ましくは、OP9細胞が用いられ得る。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８６】
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αMEM培地またはIMDM培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、EasyDiffTM Myeloid Supplement（Lonza）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【００８７】
好中球への分化における培地は、好ましくは、GM-CSFおよび／またはG-CSFを含んでいる。培地におけるGM-CSFの濃度は、例えば、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng /ml、1μg/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、200ng/mlである。培地におけるG-CSFの濃度は、例えば、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1μg/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【００８８】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養日数は、例えば30日以下の培養であり、好ましくは、18-25日、特に好ましくは、23日である。
【００８９】
本発明において、造血前駆細胞から好中球への分化誘導は、例えば、下記の工程により行われる。
(i) 造血前駆細胞から骨髄系前駆細胞を誘導する工程
(ii) 骨髄系前駆細胞から好中球を誘導する工程
【００９０】
上記各工程において、目的の細胞を誘導するため、あるいは各工程における目的を達成するために必要な任意の物質を添加した培地を用いることができる。例えば、各工程において下記の物質を添加した培地が用いられる。
(i) GM-CSF
(ii) G-CSF
【００９１】
工程(i)において好ましい培地は、例えば、10% FBS, 5.5 mg/ml human transferrin, 2 mM L-glutamine, 0.5 mM α-monothioglycerol, 50μg/ml ascorbic acid, および200ng/ml GM-CSFを含有するα-MEM培地（多能性骨髄系前駆細胞増殖用培地ともいう）であり得る。
【００９２】
工程(ii)において好ましい培地は、例えば、20% FBSおよび100ng/ml G-CSFを含有するIMDM培地（好中球分化培地ともいう）であり得る。
【００９３】
(i)の培養時間は、例えば5日以下の培養であり、好ましくは、1〜3日であり、特に好ましくは、2日である。(ii) の培養時間は、例えば15日以下の培養であり、好ましくは、5〜12日であり、特に好ましくは、9日もしくは10日である。
【００９４】
巨核球への分化誘導法
多能性幹細胞から巨核球を分化誘導する方法としては、例えば、WO2008/041370、WO2009/122747、Takayama et al.,Blood,111：5298-5306 2008などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９５】
本発明において「巨核球」は、造血系細胞の一種であり、血小板産生能を有する細胞を意味する。本発明における「巨核球」は、多核化した細胞であってもよく、例えば、CD41a陽性、CD42a陽性およびCD42b陽性として特徴付けられる細胞を含む。多核化した巨核球とは、造血前駆細胞と比較して核の数が相対的に増大した細胞又は細胞群のことをいう。例えば、巨核球の元となる造血前駆細胞の核が2Nの場合には、4N以上の細胞を多核化した細胞という。
【００９６】
本発明において分化誘導された巨核球は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、あるいは純化された集団であってもよい。
【００９７】
本工程では、前記造血前駆細胞を浮遊培養により培養してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。本発明における培養方法として、好ましくは接着培養が採用される。
【００９８】
浮遊培養においては、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養し、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていない培養皿、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）をした培養皿を使用して行うことができる。
【００９９】
接着培養においては、フィーダー細胞上で、またはコーティング処理された培養皿にて任意の培地中で培養する。フィーダー細胞は、目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助的役割を果たす他の細胞を意味するものである。本工程におけるフィーダー細胞は、巨核球を誘導することができる細胞であれば特に限定されないが、例えば、C3H10T1/2（Katagiri T, et al., Biochem Biophys Res Commun. 172, 295-299 (1990)）や骨髄に由来する間質細胞(ストローマ細胞)などが挙げられ、好ましくは、OP9細胞が用いられ得る。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１００】
本工程における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、αMEM培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、EasyDiffTM Megakaryocyte Supplement（Lonza）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール（2ME）、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
【０１０１】
巨核球への分化における培地は、好ましくは、TPOおよび／またはSCFを含んでいる。培地におけるTPOの濃度は、例えば、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1μg/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。培地におけるSCFの濃度は、例えば、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1μg/mlであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mlである。
【０１０２】
本発明において好ましい培地は、例えば、10% FBS, 5.5 mg/ml human transferrin, 2mM L-glutamine, 0.5 mM α-monothioglycerol, 50μg/ml ascorbic acidおよび200ng/ml GM-CSFを含有するα-MEM培地（巨核球分化培地ともいう）であり得る。
【０１０３】
培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。CO2濃度は、約2〜5％、好ましくは5％である。培養日数は、例えば20日以下の培養であり、好ましくは、5-15日、特に好ましくは、10日である。培養期間中に適宜培地を追加で加えたり、培地の一部または全部を交換することも可能である。
【０１０４】
急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療および/または予防薬のスクリーニング方法
本発明は、前述のように得られたiPS細胞由来の造血前駆細胞と被検物質とを接触させ、各指標を用いて、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療および/または予防薬の被検物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０５】
本発明の一つの態様として、造血前駆細胞数を指標として用いる場合、次の工程を含む方法によって急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防薬をスクリーニングすることができる：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞から誘導された造血前駆細胞（非T細胞由来の造血前駆細胞）および対照iPS細胞から誘導された造血前駆細胞（対照造血前駆細胞）を被検物質と接触させる工程、および
（ｂ）当該被検物質接触後の非T細胞由来の造血前駆細胞数が、当該被検物質接触後の対照造血前駆細胞数と比較して、減少した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１０６】
ここで使用される骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造されたiPS細胞は、好ましくは、染色体異常を有している骨髄異形成症候群患者の体細胞由来の細胞である。ここで、染色体異常とは、前述の骨髄異形成症候群の染色体異常であり、好ましくは、第9染色体短腕（9p）のコピー数の増加、第18染色体短腕（18p）のコピー数の減少、第20染色体長腕（20q）のコピー数の減少、第5染色体長腕（5q）のコピー数の減少、第7染色体長腕（7q）のコピー数の減少、第11染色体長腕（11q）のコピー数の減少、および第3染色体長腕と第21染色体長腕との転座から成る群より選択される少なくとも一つの染色体異常であり得る。
【０１０７】
ここで使用される、非T細胞由来の造血前駆細胞は、コロニー形成アッセイを行った場合、骨髄異形成症候群患者の体細胞から製造した正常MDS-iPS細胞を分化誘導して作製した造血前駆細胞と比較して、低いコロニー形成能を示す。低いコロニー形成能を示すコロニーは、例えば、顆粒球・マクロファージコロニー（GM）、マクロファージコロニー（G）および顆粒球コロニー（M）であるが、これらに限定されない。
【０１０８】
ここで使用される対照iPS細胞は、他の条件をそろえるといった観点から、骨髄異形成症候群に特有の染色体異常を有しているiPS細胞の製造に用いた骨髄異形成症候群の患者から採取される正常な体細胞から作製されたiPS細胞を用いることが望ましい。より好ましくは、骨髄異形成症候群の患者のT細胞から製造されたiPS細胞を用いることである。
本スクリーニング法において、より好ましくは、被検物質との接触前後での対照造血前駆細胞数の変化を測定し、対照造血前駆細胞数の減少が抑制された、望ましくは実質的に対照造血細胞数を減少させないことをさらなる指標として、被検物質を選択することができる。このようにして選出された薬剤を、後述の、骨髄異形成症候群患者のT細胞由来iPS細胞から分化誘導された造血前駆細胞を有効成分とする治療剤と併用すれば、異常な造血細胞の増幅を抑制しつつ、正常な造血細胞の増幅を実質的に妨げないので、より有効な治療が可能となる。
【０１０９】
本発明の急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法の一つの態様として、以下の工程を含む方法が例示される：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞から誘導された造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で、コロニーを形成させる工程、および
（ｂ）被検物質の存在下でのコロニー数が、被検物質の非存在下でのコロニー数と比較して、増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１１０】
本発明において、「コロニーを形成させる」とは、造血前駆細胞を分離し、サイトカイン存在下にメチルセルロース、軟寒天等の半固形培地中で培養し、細胞集団（すなわち、コロニー）を形成させることを意味する。コロニーの形成において用いるサイトカインは、SCF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6およびEPOから成る群より選択される一つ以上が例示される。コロニーを形成は、市販のキットを用いて行うことができ、例えば、セルバイオラボ社のCytoSelectなどが例示される。
【０１１１】
本発明において、コロニー数は、目視によって計数されても良く、インセルアナライザーを用い機械的に計数しても良い。この他にも、得られたコロニーを溶解し、セルバイオラボ社のCyquant GR Dyeを用いて計数しても良い。
【０１１２】
本発明の急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬をスクリーニングする方法の一つの態様として、以下の工程を含む方法が例示される：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下、および非存在下で、血球系細胞へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より血球系細胞数が増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１１３】
本発明において、血球系細胞とは、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球および巨核球から成る群より選択される。
【０１１４】
本発明において、血球系細胞が赤血球である場合、次の工程を含む方法によって急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防薬をスクリーニングすることができる：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で赤血球へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より赤血球数が増加した場合、当該被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１１５】
本発明において、血球系細胞が好中球である場合、
次の工程を含む方法によって急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防薬をスクリーニングすることができる：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で好中球へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より好中球数が増加した場合、前記被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１１６】
本発明において、血球系細胞が巨核球である場合、次の工程を含む方法によって急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）の治療または予防薬をスクリーニングすることができる：
（ａ）骨髄異形成症候群患者から単離した血液単核球中の非T細胞から製造したiPS細胞を造血前駆細胞へ誘導する工程、
（ｂ）前記造血前駆細胞を被検物質の存在下および非存在下で巨核球へ誘導する工程、および
（ｃ）被検物質の存在下において、非存在下より巨核球数が増加した場合、前記被検物質を急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬の候補として選出する工程。
【０１１７】
本発明のスクリーニング方法においては、任意の被検物質を用いることができ、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物等が挙げられる。本発明において、被検物質はまた、（1）生物学的ライブラリー法、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願公開第2002/103360号）として作製され得る。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法において選出される薬剤の対象疾患は、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）のみに限定されず、例えば、赤血球数の減少を伴う疾患、好中球数の減少を伴う疾患、造血前駆細胞の減少および／または造血機能低下を伴う疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、本発明のスクリーニング方法において選出される薬剤の対象疾患は、先天性貧血、再生不良性貧血、自己免疫性貧血、骨髄異形成症候群（MDS）、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、各種の癌または腫瘍に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、癌化学療法もしくは放射線療法に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、急性放射性症候群、骨髄・臍帯血・末梢血移植後の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の回復遅延、輸血に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、白血病（急性骨髄性白血病 (AML)、急性リンパ性白血病 (ALL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)を含む）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、遺伝性血液疾患などを含む。本発明のスクリーニング方法において選出される薬剤の、より適した対象疾患は、前記のとおり、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群であり得る。
【０１１９】
骨髄異形成症候群（MDS）の治療剤
本発明は、骨髄異形成症候群患者の体細胞から製造したiPS細胞を分化誘導して作製した造血前駆細胞を含む、骨髄異形成症候群の治療剤を提供する。本発明において使用される骨髄異形成症候群患者の体細胞は、患者由来の細胞であり、かつ、染色体異常を有していないことが好ましい。本発明において使用される骨髄異形成症候群患者の体細胞は、例えばT細胞であるが、これに限定されない。
【０１２０】
本発明における骨髄異形成症候群の治療剤に含まれる造血前駆細胞は、当該治療の対象となる患者本人に由来するものであってもよいし、他の骨髄異形成症候群の患者に由来するものであってもよい。好ましくは、当該治療の対象となる患者本人に由来するものである。造血前駆細胞が他の骨髄異形成症候群患者に由来するものである場合、拒絶反応が起こらないという観点から、HLAの型が同一である他人から体細胞を採取することが好ましい。
【０１２１】
本発明における薬剤は、誘導した造血前駆細胞を単独で含んでいてもよく、または造血前駆細胞と共に緩衝液や抗生物質、その他の医薬添加物等を含んでいてもよい。
【０１２２】
本発明における薬剤は、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群（MDS）のみに限定されず、例えば、赤血球数の減少を伴う疾患、好中球数の減少を伴う疾患、造血前駆細胞の減少および／または造血機能低下を伴う疾患の治療剤としても有効である。具体的には、本発明における治療剤の対象疾患として、先天性貧血、再生不良性貧血、自己免疫性貧血、骨髄異形成症候群（MDS）、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、各種の癌または腫瘍に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、癌化学療法もしくは放射線療法に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、急性放射性症候群、骨髄・臍帯血・末梢血移植後の造血幹細胞および／または造血前駆細胞の回復遅延、輸血に伴う造血幹細胞および／または造血前駆細胞の減少症、白血病（急性骨髄性白血病 (AML)、急性リンパ性白血病 (ALL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)を含む）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、遺伝性血液疾患などが挙げられる。本発明の治療剤の適用に関して好ましい疾患は、前記のとおり、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群であり得る。
【０１２３】
本発明において造血前駆細胞を含む薬剤の患者への投与経路は、特に限定されない。例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、脳内への投与形態が例示できる。好ましい投与経路は、静脈内または骨髄内であり得る。
【０１２４】
本発明の造血前駆細胞は、移植治療において用いることも可能であり、その場合には、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様の方法で行うことができる。
【０１２５】
本発明の薬剤の患者への投与量は、治療すべき病態の種類、症状および疾患の重篤度、患者年齢、性別もしくは体重、投与法などにより異なるので一義的には言えないが、医師が前記状況を考慮して判断することにより、適宜適当な投与量を決定することができる。
【０１２６】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
【実施例１】
【０１２７】
MDS患者由来iPSCsの樹立
芽球の出現、骨髄・末梢血における血球異形成像が確認された4名の骨髄異形成症候群（MDS）患者（KM3、KM5、KM15およびKM16; KM3およびKM5由来の血液の染色像を図１に示す）の末梢血から、Okita. K, et al., Stem Cells. 2012 Nov 29.に記載の方法を用いてiPS細胞を作製した。詳細は次の通りである。京都大学病院においてこれらのMDS患者から同意を得た後採血し、採取した血液から、Ficoll-paque Plus (GE Healthcare)またはBD Vacutainer CPT (BD)を用いた密度勾配遠心法にて、末梢血単核球（PMNC）を回収した。Nucleofector 2b Device（Lonza）およびAmaxa(R) Human T Cell Nucleofector(R) Kitを用いて、3 μgの発現プラスミド混合物を3から5×106個のPMNCに導入した。この時、発現プラスミドは、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL、およびpCXWB-EBNA1の組み合わせを用いた。発現プラスミドを導入した3 × 104から1 ×106個の細胞を、あらかじめMEFフィーダー細胞（マイトマイシンC処理済）を播種しておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件下で培養した。この時T細胞由来のiPS細胞を樹立するためには、30 U/ml IL-2 (PeproTech)および 5 μl/well Dynabeads Human T-activator CD3/CD28を添加したX-vivo10培地(Lonza)を用いた。一方、T細胞以外の血球（non-T細胞）由来のiPS細胞を樹立するためには10% FCS, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6, 10 ng/ml G-CSFおよび10 ng/ml GM-CSFを添加したαMEM培地の培地を用いた。プラスミド導入2日目に、bFGFおよび10 μM Y27632を添加した等量の霊長類ES細胞用培地（リプロセル）を各ウェルに加えた。次いで、プラスミド導入4日目に、培養培地を、bFGFおよび10 μM Y27632を添加した霊長類ES細胞用培地（リプロセル）に交換した。プラスミド導入20〜25日目 にES様コロニー（iPS細胞コロニー）をピックアップした。このようにしてT細胞由来iPS細胞とnon-T細胞由来iPS細胞を作製した。
続いて、MDS患者（KM3）由来の血液より作製した各iPS細胞株のUSP14、NDC80およびMYL12Aのコピー数を測定したところ、A4株（KM3-A4：non-T細胞由来iPS細胞）においてコピー数が半数以下であることが確認された（図２）。さらに、同KM3-A4株においてCGH(Comparative genomic hybridization)アレイ解析を行ったところ、第9染色体短腕（9p）のコピー数が増加していること、および第18染色体短腕（18p）のコピー数が減少していることが確認された（図３A右図）。この時のGバンド法による核型解析においても同様の変異が確認された（図３A左図）。一方、同じMDS患者（KM3）のT細胞から作製したiPS細胞株（G1、H1、H3、H4、H5、H7、I1、J1）はいずれも染色体異常は認められなかった（図２）。
以上より、MDS患者（KM3）のnon-T細胞から樹立されたKM3-A4株は染色体変異を持った細胞由来のiPS細胞であり、T細胞由来のiPS細胞はMDS患者由来であってもすべて正常の染色体を有するiPS細胞であることが確認された。このことは、同一患者のT細胞由来のiPS細胞は、正常対照として用いることができることを意味する。
同様に、MDS患者（KM5）由来の血液細胞から樹立した9株のiPS細胞についてSNP-CGHアレイ解析を行ったところ、A1、A2、A3、B1、B2、B3およびB4株（それぞれ、KM5-A1、KM5-A2、KM5-A3、KM5-B1、KM5-B2、KM5-B3およびKM5-B4）において第20染色体長腕（20q）のコピー数が減少していることが確認された（図３B右図）。この時のGバンド法による核型解析においても同様の変異が確認された（図３B左図）。KM5においても同一の患者から正常対照となるiPS細胞が得られることが確認された（図３B右図、KM5-D2、KM5-E1）。さらに、FISH法により20q部の数を確認したところ、変異iPS細胞では、20q12-13は1対しか確認できなかった（図４）。
同様に、MDS患者（KM15）由来の血液細胞から樹立したiPS細胞についてSNP-CGHアレイ解析を行ったところ、I7株（KM15-I7）において第5染色体長腕（5q）および第11染色体長腕（11q）のコピー数が減少していることが確認された（図１４A）。この時のGバンド法による核型解析においても同様の変異が確認された（図１４A左図）。KM15においても同一の患者から正常対照となるiPS細胞が得られることが確認された（図１４A右図、KM15-I2）。
同様に、MDS患者（KM16）由来の血液細胞から樹立したiPS細胞についてSNP-CGHアレイ解析を行ったところ、C1株（KM16-C1）において第7染色体長腕（7q）のコピー数が減少し、第3染色体長腕と第21染色体長腕とが転座していることが確認された（図１４B）。この時のGバンド法による核型解析においても同様の変異が確認された（図１４B左図）。KM16においても同一の患者から正常対照となるiPS細胞が得られることが確認された（図１４B右図、KM16-D1）。
得られたKM3およびKM5由来のiPS細胞について多能性マーカーをRT-PCRにて確認したところ、既存のES細胞（KhES3またはH1）やiPS細胞（692D2または585A1）と同様に多能性マーカーが発現していることが確認された（図５）。また、多能性の表面マーカーも同様に発現していることが確認された（図６）。さらに、奇形腫形成能をもつことを確認した（図７）。以上より、変異iPS細胞（MDS-iPSCs）と正常iPS細胞（Normal iPSCsまたはT-iPSCs）は、多能性の機能において違いが見られないことが確認された。
一方、マイクロアレイ法によりES細胞、既存のiPS細胞およびMDS患者由来のiPS細胞における遺伝子発現を解析し、階層クラスタリングしたところ、同一人由来のiPS細胞であっても変異iPS細胞が正常iPS細胞と異なる遺伝子発現プロファイルを有する傾向があることが確認された（図８）。
【実施例２】
【０１２８】
造血前駆細胞への分化誘導
iPS細胞（MDS-iPSCsおよびNormal iPSCs）を造血前駆細胞 (HPCs) に分化させるために、OP9ストローマ細胞共培養系およびEB法のそれぞれを用いてiPS細胞を培養した。
OP9ストローマ細胞共培養系においては、10mlのHPC分化培地 (10% FBS, 5.5 mg/ml human transferrin, 2 mM L-glutamine, 0.5 mM α-monothioglycerol, 50μg/mL ascorbic acid, および20ng/ml vascular endothelial growth factor (VEGF)を補充したα-MEM) を用いて、前もってゼラチンで被覆しOP9をオーバーコンフルエントに培養した10cmディッシュへiPS細胞の小塊(<100細胞) を播種した。翌日、20 mlの新鮮なHPC分化培地に培地交換し、その後、3日ごとにHPC分化培地で培地交換した。12-14日目に、コロニーを5 mlのcollagenase Type IV (１mg/ml) で30分間処理し、0.05% Trypsin-EDTAを用いて37℃で20分間解離させた。ストローマ細胞を除去するために、解離させた細胞に5倍のOP9培地を加えて再懸濁し、37℃で45分間培養容器上で培養した後、浮遊細胞を回収した。さらにストローマ細胞および凝集細胞を除去するために、回収した細胞を100 μmフィルターに通過させて、分化誘導した細胞をFACSにより評価した。
一方、EB法においては、下記の手順により造血前駆細胞へ分化誘導させた。
（day0-day1）6ウェル低接着プレートを用いて、37℃、5% CO2、5% O2および90% N2の環境で、10 ng/mL human bone morphogenetic protein-4 (BMP-4)、2mM glutamine、penicillin/streptomycin、0.4mM α-monothioglycerolおよび50 μg/mL ascorbic acidを補充したStemPro-34からなる凝集培地中、フィーダー細胞を含まないiPS細胞の小塊 (10-20細胞) を24時間培養することにより、胚様体(EBs)を作製した。
（day1-day4）得られたEBsを回収、洗浄し、5 ng/mL bFGF、 10 ng/mL BMP-4、2mM glutamine、penicillin/streptomycin、0.4mM α-monothioglycerolおよび50 μg/mL ascorbic acidを補充したStemPro-34中でさらに3日間培養して、原条(primitive streak)/中胚葉形成を誘導した。
（day4-day8）4日目に、EBsを再び回収し、vascular endothelial growth factor (VEGF; 10 ng/mL)、bFGF (1 ng/mL)、interleukin-6 (IL-6; 10 ng/mL)、IL-3 (40 ng/mL)、IL-11 (5 ng/mL)、stem cell factor (SCF; 100 ng/mL)およびhuman FLT3 ligand (FLT3L; 100ng/ml)を補充したStemPro-34中で、造血前駆細胞への特化および発生のために4日間再培養した。
（day8-day15）8日目に、EBsを5% CO2/air環境に移し、VEGF (10 ng/mL)、erythropoietin (EPO; 4 U/mL)、thrombopoietin (TPO; 50 ng/mL)、SCF、FLT3L、IL-6、IL-11およびIL-3を補充したStemPro-34中に移し、造血前駆細胞成熟（赤芽球および巨核芽球系前駆細胞への成熟）および増殖のためさらに7日間培養した。0.25% Trypsin-EDTAを用いて37℃で5-10分間のインキュベーション後、1000 μlピペットにより細胞を単一細胞懸濁液にまで解離させ、次いで、解離させた細胞を70μmフィルターに通過させて、分化誘導した細胞をFACSにより評価した。
以上の結果、OP9ストローマ細胞共培養系、EB法のいずれの方法を用いた場合においても、MDS-iPSCsの造血前駆細胞への分化能は、Normal iPSCsと同程度であった（図９および図１１）。
【実施例３】
【０１２９】
MDS-iPSCsおよびNormal iPSCs由来の造血前駆細胞におけるコロニー形成アッセイ
35 mm培養皿を用いて、SCF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6およびEPO (MethoCult H4435)を含む2 mlのメチルセルロース培地中に、実施例２の方法によりiPS細胞（異常MDS-iPSCs (NonT-iPS)およびNormal iPSCs (T-iPS)）から分化誘導し、フローサイトメーターにより抽出したCD43+CD34+CD38-画分の細胞を2500個播種した。15日後、顕微鏡下でコロニーの数を計測した。さらに、サイトスピン後、ライト染色し、顕微鏡観察により、コロニー型の確認を行った。
その結果、MDS-iPSCs由来の造血前駆細胞はNormal iPSCsと比較して、有意にコロニー形成能が低いことが確認された（図１０および１５）。また、コロニーアッセイday15の有核細胞中に占める好中球（分葉核球及び桿状核球）の割合は、Normal iPSC由来造血前駆細胞では40%であったのに対し、MDS-iPSC由来造血前駆細胞では2%と低値であった。ここで、5M-B1は、核型に変異のないMDS-iPSCsであることから、nonT細胞由来のiPS細胞は核型の変異に依拠しないMDSの特徴を有していると考えられる。
【実施例４】
【０１３０】
MDS-iPSCsおよびNormal iPSCsの赤血球への分化誘導
分化誘導前に、線維芽細胞成長因子(bFGF)を補充したマウス胚性線維芽細胞条件培地中、Matrigelで被覆したプレート上で72〜96時間培養することで、iPS細胞（MDS-iPSCs (MDS-iPS) およびNormal iPSCs (T-iPS)）からフィーダー細胞の混入を除去した。
（day0-day1）6ウェル低接着プレートを用いて、37℃、5% CO2、 5% O2および90% N2の環境で、10 ng/mL BMP-4、2mM glutamine、penicillin/streptomycin、 0.4mM α-monothioglycerol および50 μg/mL ascorbic acidを補充したStemPro-34からなる凝集培地中、フィーダー細胞を含まないiPS細胞の小塊 (10-20細胞) を24時間培養することにより、胚様体(EBs)を作製した。
（day1-day4）得られたEBsを回収、洗浄し、5 ng/mL bFGF、10 ng/mL BMP-4、2mM glutamine、penicillin/streptomycin、0.4 mM α-monothioglycerolおよび50 μg/mL ascorbic acidを補充したStemPro-34でさらに3日間培養して、原条(primitive streak)/中胚葉形成を誘導した。
（day4-day8）4日目に、EBsを再び回収し、VEGF (10 ng/mL)、bFGF (1 ng/mL)、IL-6（10 ng/mL)、IL-3 (40 ng/mL)、IL-11 (5 ng/mL)SCF（100 ng/mL) およびFLT3L（100 ng/ml)を補充したStemPro-34中で、造血前駆細胞への特化および発生のために4日間再培養した。
（day8-day18）8日目に、EBsを5% CO2/air環境に移し、VEGF (10 ng/mL) 、EPO（4 U/mL) 、TPO（50 ng/mL)、SCF、FLT3L(100 ng/ml)、IL-6(10 ng/mL)、IL-11(5 ng/mL)およびIL-3(40 ng/mL)を補充したStemPro-34中に移し、造血前駆細胞成熟（赤芽球および巨核芽球系前駆細胞への成熟）および増殖のためにさらに10日間培養した。0.25% Trypsin-EDTAを用いて37℃で5-10分間のインキュベーション後、1000 μlピペットにより細胞を単一細胞懸濁液にまで解離させ、造血前駆細胞を得た。
（day18〜day26）上記の造血前駆細胞を106細胞/mLの密度で播種し、SCF (100 ng/ml)、IL-3 (5 ng/ml)およびEPO (4 U/mL)を補充したStemPro-34中で8日間培養した。
（day26〜day33）得られた細胞を、SCFおよびEPOを補充した新鮮なStemPro-34中で培養し、30〜33日目に、フローサイトメトリーによりCD235a陽性細胞の割合を決定した。
その結果、MDS-iPSCsは、Normal iPSCsと比較して、赤血球への低い分化誘導能を示した（図１２および１６）。
【実施例５】
【０１３１】
MDS-iPSCsおよびNormal iPSCsの好中球への分化誘導
iPS細胞（異常MDS-iPSCs (NonT-iPS)およびNormal iPSCs (T-iPS)）を造血前駆細胞 (HPCs) に分化させるために、OP9ストローマ細胞共培養系を用いてiPS細胞を培養した。簡潔には、10mlのHPC分化培地を用いて、前もってゼラチンで被覆しOP9をオーバーコンフルエントに培養した10cmディッシュへiPS細胞の小塊(<100細胞)を播種した。翌日、20 mlの新鮮なHPC分化培地と培地交換し、その後、3日ごとにHPC分化培地を交換した。11-12日目に、コロニーを5mlのcollagenase Type IV (１mg/ml) で30分間処理し、0.05% Trypsin-EDTAを用いて37℃で20分間解離させた。解離させた細胞に多能性骨髄系前駆細胞増殖用培地 (10% FBS, 5.5 mg/ml human transferrin, 2 mM L-glutamine, 0.5 mM α-monothioglycerol, 50 μg/ml ascorbic acid, および20 ng/ml GM-CSFを補充したα-MEM) を加えて再懸濁した。2日後に骨髄系培養物を回収し、凝集細胞を除去するために、細胞を70 μmフィルターに通過させた。フローサイトメトリーによりLin-CD34+CD43+CD45+前駆体細胞を抽出し、2.5 mlの好中球分化培地 (20% FBSおよび100 ng/ml G-CSFを補充したIMDM) 中、OP9をセミコンフルエントに培養した6ウェルプレート上に播種した。3日目に、2.5 mlの好中球分化培地を加えて、6日目に、好中球分化培地の半分を交換した。9-10日後に、フローサイトメトリーにより、CD11b陽性骨髄細胞中のCD66b陽性好中球細胞の割合を決定した。
その結果、MDS-iPSCsは、Normal iPSCsと比較して、好中球への低い分化誘導能を示した（図１３および１７）。
【実施例６】
【０１３２】
MDS-iPSCsおよびNormal iPSCsの巨核球への分化誘導
iPS細胞（MDS-iPSCsおよびNormal iPSCs）を造血前駆細胞 (HPCs) に分化させるために、実施例5に記載のOP9ストローマ細胞共培養系を用いてiPS細胞を培養した。12-14日目に、コロニーを5 mlのcollagenase Type IV (1mg/ml) で30分間処理し、0.05% Trypsin-EDTAを用いて37℃で20分間解離させた。骨髄間質細胞を除去するために、5倍のOP9培地を加えて解離させた細胞を再懸濁して、培養容器上に播種し、37℃で45分間インキュベートした後、浮遊細胞を回収した。さらに、骨髄間質細胞および凝集細胞を除去するために、細胞を100 μmフィルターに通過させて、2 mlの巨核球分化培地 (10% FBS, 5.5 mg/ml human transferrin, 2 mM L-glutamine, 0.5 mM α-monothioglycerol, 50 μg/ml ascorbic acid, 100 ng/ml TPOおよび100 ng/ml SCFを補充したα-MEM)を補充したOP9セミコンフルエント6ウェルプレートに播種した。2日後に浮遊細胞を回収し、2 mlの巨核球分化培地を補充した新しいOP9セミコンフルエント6ウェルプレートに播種した。4日目に、2 mlの巨核球分化培地を加えた。6日目および8日目に、培地の半分を交換した。10日目に、フローサイトメトリーにより、CD45陽性細胞中、CD41a/CD42b二重陽性細胞の割合を決定した。
その結果、MDS-iPSCsは、Normal iPSCsと比較して、巨核球への低い分化誘導能を示した（図１８）。
【実施例７】
【０１３３】
p38阻害剤によるコロニー形成能の改善効果
MDS-iPS細胞から誘導された造血前駆細胞における低下したコロニー形成能が、p38阻害剤の効果により回復するかを検討するために、p38阻害剤を加えることを除いては実施例３と同様の方法によりコロニー形成アッセイを行った。簡潔には、35 mm培養皿を用いて、SCF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6、EPOおよび10 μM SB203580（p38阻害剤）を含む1.1 mlのメチルセルロース培地中に、実施例２の方法によりiPS細胞（MDS-iPSCs (NonT-iPS))およびNormal iPSCs (T-iPS)）から分化誘導し、フローサイトメーターにより抽出したCD43+CD34+CD38-画分の細胞を2500個播種した。14または15日後、顕微鏡下でコロニーの数を計測した。さらに、サイトスピン後ライト染色し、顕微鏡観察により、コロニー型の確認を行った。【０１３４】
その結果、p38阻害剤を適用することにより、コロニー形成能の改善効果が見られた（図１９）。このことは、MDS患者由来のiPS細胞由来の分化細胞がMDSやそれから移行した急性骨髄性白血病の治療薬のスクリーニングにおいて有用であることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明は、骨髄異形成症候群患者の体細胞から製造したiPS細胞を分化誘導して作製した造血系細胞、特に、造血前駆細胞、赤血球および／または好中球において、骨髄異形成症候群の病態を再現できたことに基づくものである。したがって、当該細胞を用いて急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群の治療または予防薬のスクリーニングを行うことが可能である。【０１３６】
本出願は、2013年5月23日付で日本国に出願された特願2013-109385を基礎としており、ここで言及することによって、その内容はすべて本明細書中に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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