(57)【要約】  本発明の課題は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に増加させることができる新たな方法を提供することである。本発明に係るヨーグルト製造方法は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を備える。ｐＨ緩衝剤添加工程では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加されたヨーグルト原料が乳酸菌によって発酵させられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤を添加するｐＨ緩衝剤添加工程と、
前記ｐＨ緩衝剤が添加された前記ヨーグルト原料（以下「ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料」という）を乳酸菌によって発酵させる発酵工程と
を備える、ヨーグルト製造方法。
【請求項２】
前記乳酸菌は、少なくとも、菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌を含む
請求項１に記載のヨーグルト製造方法。
【請求項３】
前記菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌は、少なくとも、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌を含む
請求項２に記載のヨーグルト製造方法。
【請求項４】
前記ｐＨ緩衝剤は、リン酸塩である
請求項１から３のいずれかに記載のヨーグルト製造方法。
【請求項５】
前記リン酸塩は、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸水素二カリウムより成る群から選択される少なくとも一方のリン酸塩である
請求項４に記載のヨーグルト製造方法。
【請求項６】
前記ヨーグルト原料には、８重量％以上２０重量％以下の範囲内の無脂乳固形分が含まれている
請求項１から５のいずれか１項に記載のヨーグルト製造方法。
【請求項７】
前記発酵工程では、前記ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料が３０℃以上４０℃以下の範囲内の温度下で前記乳酸菌によって発酵させられる
請求項１から６のいずれか１項に記載のヨーグルト製造方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のヨーグルト製造方法によって得られるヨーグルト。
【請求項９】
乳酸菌と、
ｐＨ緩衝剤と
を含有するヨーグルト。
【請求項１０】
前記乳酸菌は、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌であり、
全量に対して４０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の乳酸菌体外機能性産生物をさらに含有する
請求項９に記載のヨーグルト。
【請求項１１】
乳原料にｐＨ緩衝剤を添加するｐＨ緩衝剤添加工程と、
前記ｐＨ緩衝剤が添加された前記乳原料を、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌によって発酵させる発酵工程と
を備える、乳酸菌体外機能性産生物製造方法。
【請求項１２】
ｐＨ緩衝剤を有効成分とする乳酸菌体外機能性産生物増産剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を増加させるヨーグルト製造方法、及び、そのヨーグルト製造方法によって製造されるヨーグルトに関する。また、本発明は、乳酸菌の菌体外機能性産生物の産生量を増加させる乳酸菌体外機能性産生物製造方法、並びに、その方法に使用される乳酸菌体外機能性産生物増産剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌および乳酸菌由来の機能性産生物を摂取することにより、消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用（健康の維持・疾病リスクの低減）をすることが知られている。例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（以下「ブルガリア菌」とも称する）は、ヨーグルトスターターとして発酵乳の製造に用いられている乳酸菌のひとつである。このブルガリア菌の中には、菌体外多糖体(ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ)を産生する菌株も多く存在する。そして、このＥＰＳは、発酵乳製品の物性や安定性に寄与するのみならず、プロバイオティクス効果の享受にも寄与することが知られている。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（以下「ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株」とも称する）が産生するＥＰＳには、自己免疫疾患を予防する効果があることが知られている。また、本菌株を用いて製造された発酵乳には、ＮＫ細胞の活性化、感冒罹患の減少、抗インフルエンザ等の効果があることが知られている。（例えば、特許文献１〜３等参照）。このように、ＥＰＳを産生する乳酸菌や、乳酸菌などの産生するＥＰＳを利用することにより、健康に寄与する機能性食品やサプリメントを提供することができることとなる。【０００３】
ところで、このような機能性食品やサプリメントを効率的に製造するためには、同機能性食品中のＥＰＳ産生量を高める必要がある。【０００４】
ブルガリア菌に限らず乳酸菌由来のＥＰＳを高めるために、過去に様々な方法が提案されている。例えば、特許文献４には、ペプトン、酵母エキス、及び不飽和脂肪酸もしくはそのエステルを含む培地で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等のケフィラン生産能を有する乳酸菌を培養することにより、培養液中に高濃度のＥＰＳを産生することができることが開示されている。また、特許文献５には、牛乳に乳清タンパクや大豆タンパクを加え、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスで発酵させることにより、乳酸菌由来のＥＰＳが顕著に増加することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２４７８９５号公報
【特許文献２】特開２００５−１９４２５９号公報
【特許文献３】国際公開パンフレットＷＯ２０１１／０６５３００
【特許文献４】特開２０１１−２５０７５６号公報
【特許文献５】特開２０１１−５１２６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に増加させることができる新たな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一局面に係るヨーグルト製造方法は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を備える。ｐＨ緩衝剤添加工程では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加されたヨーグルト原料（以下「ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料」という）が乳酸菌によって発酵させられる。なお、ヨーグルト原料への乳酸菌の添加はｐＨ緩衝剤の添加前であってもよいし、添加後であってもよい。【０００８】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述のヨーグルト製造方法の通り、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤を添加してからそのヨーグルト原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、ヨーグルト中の乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができることが明らかとなった。すなわち、このヨーグルト製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。【０００９】
ところで、このヨーグルト製造方法において、乳酸菌は、少なくとも、乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌を含むことが好ましい。そして、この乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌は、少なくとも、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌を含むことが好ましい。なお、かかる場合、乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌単体であってもよいし、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種と他の乳酸菌を含む乳酸菌混合物であってもよい。【００１０】
また、このヨーグルト製造方法において、ｐＨ緩衝剤はリン酸塩であることが好ましい。乳酸菌として、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌とストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の乳酸菌（以下「サーモフィルス菌」とも称する）との混合物が使用される場合、サーモフィルス菌の増殖を抑制しつつラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌の増殖を促進することができるからである。なお、このリン酸塩は、アルカリ金属塩であることが好ましい。さらに、リン酸塩は、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸水素二カリウムより成る群から選択される少なくとも一方のリン酸塩であることが好ましい。【００１１】
さらに、このヨーグルト製造方法において、ヨーグルト原料には、８重量％以上２０重量％以下の範囲内の無脂乳固形分が含まれていることが好ましい。なお、ここで、ヨーグルト原料とはｐＨ緩衝剤添加前のものを意味する。【００１２】
加えて、このヨーグルト製造方法において、発酵工程では、ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料が３０℃以上４０℃以下の範囲内の温度下で乳酸菌によって発酵させられることが好ましい。【００１３】
上述のヨーグルト製造方法によって製造されたヨーグルトには、乳酸菌およびｐＨ緩衝剤が含有される。なお、このヨーグルトでは、ｐＨ緩衝剤が均一に溶解されている。ここで、乳酸菌およびｐＨ緩衝剤は、上述の通りである。また、このヨーグルト中のｐＨ緩衝剤は、例えば、高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー技術や、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術（例えば、Szlyk E, Hrynczyszyn P, 「Phosphate additives determination in meat products by 31-phosphorus nuclear magnetic resonance using new internal reference standard: hexamethylphosphoroamide phosphatesolution」, Talanta. 2011 Mar 15;84(1):199-203. doi: 10.1016/j.talanta.2010.12.046 参照）などによって検出することができる。【００１４】
また、上述のヨーグルトは乳酸菌体外機能性産生物（例えば、乳酸菌体外多糖体など）をさらに含有することが好ましい。かかる場合、乳酸菌体外機能性産生物は、ヨーグルト全量に対して４０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量含まれていることが好ましい。【００１５】
本発明の他の局面に係る乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を備える。ｐＨ緩衝剤添加工程では、乳原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加された乳原料が、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌（以下「菌体外機能性産生物産生乳酸菌」ともいう）によって発酵させられる。なお、乳原料への乳酸菌の添加はｐＨ緩衝剤の添加前であってもよいし、添加後であってもよい。【００１６】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の乳酸菌体外機能性産生物製造方法の通り、乳原料にｐＨ緩衝剤を添加してからその乳原料を発酵させることによって、菌体外機能性産生物産生乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができることが明らかとなった。すなわち、この乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。すなわち、本局面においてｐＨ緩衝剤は、乳酸菌体外機能性産生物増産剤の有効成分として機能する。【００１７】
なお、上述の乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、別の観点から捉えると、「乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）して乳酸菌によりその乳原料を発酵させる乳酸菌体外機能性産生物の増産方法」、「乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）する乳酸菌体外機能性産生物の増産方法」、「乳酸菌体外機能性産生物を増産させるために乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）する方法」、「乳酸菌体外機能性産生物を増産させるための乳原料に対するｐＨ緩衝剤の使用（使用方法）」などとも表現することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一局面に係るヨーグルト製造方法では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤を添加してからそのヨーグルト原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、ヨーグルト中の乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができる。すなわち、このヨーグルト製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。【００１９】
また、本発明の他の局面に係る乳酸菌体外機能性産生物製造方法では、乳原料にｐＨ緩衝剤を添加してからその乳原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができる。すなわち、この乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明は、以下に述べる個々の実施の形態に限定されない。
【００２１】
−第１実施形態−
本実施形態に係るヨーグルトは、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を経て製造される。ｐＨ緩衝剤添加工程では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加されたヨーグルト原料（以下「ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料」という）が乳酸菌によって発酵させられる。
【００２２】
本実施形態において、ヨーグルトとは、乳等省令で定義される「発酵乳」および「乳酸菌飲料」を指す。乳等省令における「発酵乳」とは、「乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳などを乳酸菌または酵母で発酵させ、糊状または液状にしたもの」または「これらを凍結したもの」と定義されている。発酵乳は、「容器充填後に発酵させて固化させたハードヨーグルト（固形状発酵乳、セットタイプヨーグルト）」、「発酵後にカードを粉砕し、容器充填したソフトヨーグルト（糊状発酵乳）」、「ソフトヨーグルトを均質機でさらに細かく砕き、液状の性質を高めたドリンクヨーグルト（液状発酵乳）」に大別される。また、乳等省令における「乳酸菌飲料」とは、「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く。）」をいう。
【００２３】
ヨーグルト原料には、乳、乳製品、乳タンパクの少なくとも一種以上が含まれる。ヨーグルト原料としては、例えば、牛乳、羊、ヤギ等の獣乳や、その加工品、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、部分脱脂乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、クリーム、バター、バターミルク、ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、非たんぱく態窒素などの乳原料、砂糖、糖類、加工澱粉（デキストリンの他、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維、甘味料、有機酸（リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸など）、香料、水などを挙げることができる。なお、ヨーグルト原料は、上述のような常用の原料を混合し、加温させながら溶解させることで得られる。ヨーグルト原料には、ゼラチン、寒天、ペクチン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等のゲル化剤、増粘剤、安定剤が添加されてもよい。かかる場合、ゼラチン等の安定剤などを水などの溶媒に予め加温して溶解させておき、この安定剤水溶液を他の成分と混合することによって、ヨーグルト原料を調製する。
【００２４】
また、このヨーグルト原料の無脂乳固形分（以下「ＳＮＦ」という）は８重量％以上２０重量％以下の範囲内であることが好ましい。本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ヨーグルトの風味を良好に保ちつつ、ヨーグルト中の菌体外多糖体（以下「ＥＰＳ」という）含有量を高めることができるからである。なお、ヨーグルト原料のＳＮＦは、８．５重量％以上１８．５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、９重量％以上１５重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、９．５重量％以上１４重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００２５】
本実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、特に限定されないが、リン酸塩であることが特に好ましい。なお、本実施形態において、リン酸塩には水和物も含まれるものとする。リン酸塩としては、例えば、リン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）等が挙げられる。なお、これらのリン酸塩は、単独で用いられてもよいし併用されてもよい。また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法では、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を単独あるいは組み合わせて用いることが好ましく、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）を単独で用いることが特に好ましい。
【００２６】
また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法のｐＨ緩衝剤添加工程において、ヨーグルト原料に対して０．０５重量％以上０．５５重量％以下の範囲内の量のｐＨ緩衝剤が添加されるのが好ましい。本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ｐＨ緩衝剤の添加量がこの範囲内であれば、ヨーグルトのカード強度（カードテンション）や風味を良好に保ちつつ、ブルガリア菌の増殖を促進することができると共にブルガリア菌由来のＥＰＳの産生量を増強することができるからである。なお、ｐＨ緩衝剤添加量は、０．０８重量％以上０．４５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、０．１重量％以上０．３５重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００２７】
本実施形態において、乳酸菌は、菌体外機能性産生物、例えばＥＰＳを産生する乳酸菌（以下「菌体外機能性産生物産生乳酸菌」という）、例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の乳酸菌（以下「ブルガリア菌」ともいう）である。本実施の形態では、乳酸菌は、菌体外機能性産生物産生乳酸菌であれば菌株を問わないが、ＥＰＳを産生するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１）が好適である。なお、本実施形態では、ブルガリア菌を主体とすることが好ましいが、その他のＥＰＳを産生する乳酸菌（以下「ＥＰＳ産生乳酸菌」という）、例えば、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）や、ラクトコッカス・ラクティス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等をブルガリア菌と併用してもよい。
【００２８】
また、ＥＰＳ産生乳酸菌以外の乳酸菌、例えば、サーモフィルス菌、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ビフィズス菌、プロピオン酸菌などの発酵乳の製造に一般的に用いられるその他の乳酸菌を、ＥＰＳ産生乳酸菌と併用してもよい。また、上記乳酸菌と共に酵母を添加してもよい。なお、本実施形態に係るヨーグルト製造方法では、乳酸菌として、ＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を併用することが特に好ましい。
【００２９】
本実施形態に係るヨーグルト製造方法の発酵工程において、発酵温度を３０℃以上４０℃以下の範囲内とすることが好ましい。乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができるからである。なお、発酵温度は、３２℃以上３９℃以下の範囲内とすることがより好ましく、３４℃以上３８℃以下の範囲内とすることがさらに好ましい。
【００３０】
本実施形態にかかる菌体外機能性産生物産生乳酸菌は、全量に対して４０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが好ましい。例えば、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、上記範囲内の量のＥＰＳが産生される場合においてｐＨ緩衝剤非添加時のＥＰＳの産生量に対するｐＨ緩衝剤添加時のＥＰＳの産生量の比が高くなる、すなわちｐＨ緩衝剤の添加効果が高くなることが認められるからである。なお、菌体外機能性産生物産生乳酸菌は、全量に対して４２ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが好ましく、４４ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することがより好ましく、４８ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することがさらに好ましく、５０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが特に好ましい。
【００３１】
また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、菌体外機能性産生物の産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時の産生量の１．０５倍以上であることが好ましく、１．１倍以上であることがより好ましく、１．２倍以上であることがさらに好ましく、１．２５倍以上であることが特に好ましい。例えば、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ｐＨ緩衝剤添加時のＥＰＳ産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時のＥＰＳ産生量の１．２５倍以上となる場合がある。
【００３２】
−第２実施形態−
本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を経て製造される。ｐＨ緩衝剤添加工程では、乳原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加された乳原料が、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌によって発酵させられる。
【００３３】
なお、本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物は、ヨーグルト原料が乳原料とされること以外、第１実施形態に係るヨーグルト製造方法と同じである。また、本実施形態にいう「乳酸菌体外機能性産生物」は、第１実施形態にいう「菌体外機能性産生物」と同じものを示す。そして、ここにいう「乳原料」とは、牛乳、羊、ヤギ等の獣乳や、その加工品、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、部分脱脂乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、クリーム、バター、バターミルク、ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、非たんぱく態窒素などである。また、この乳原料の無脂乳固形分（以下「ＳＮＦ」という）は８重量％以上２０重量％以下の範囲内であることが好ましく、８．５重量％以上１８．５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、９重量％以上１５重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、９．５重量％以上１４重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００３４】
また、本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物の産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時の乳酸菌体外機能性産生物の産生量の１．０５倍以上であることが好ましく、１．１倍以上であることがより好ましく、１．２倍以上であることがさらに好ましく、１．２５倍以上であることが特に好ましい。
【００３５】
＜実施例＞
以下、本発明の好ましい実施例を説明するが、本発明は、前述した実施形態や以下の実施例に限定されることなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更することが可能である。なお、実施例に用いられているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（以下、ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株）は、２００６年１１月２９日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に、受託番号でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。また、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３０５９株は、２００６年１２月１５日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に、受託番号でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４０として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。なお、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの特許微生物寄託業務は２０１２年４月１日をもって独立行政法人製品評価技術基盤機構に承継されており、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターは２０１３年４月１日をもって日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構事業所内に移転している。
【００３６】
（製造例）
（１）ヨーグルト原料ミックスＡ（ＳＮＦ＝９．４重量％）の調製
原料乳５０ｋｇ、脱脂粉乳５．４９ｋｇ、無塩バター１．５ｋｇおよび水４３．０１ｋｇを混合し、その混合物を９５℃で５分間加熱殺菌した後に３７℃前後まで冷却して、ヨーグルト原料ミックスＡを調製した。
【００３７】
（２）ヨーグルト原料ミックスＢ（ＳＮＦ＝１０．２重量％）の調製
原料乳２５ｋｇ、脱脂濃縮乳１８．４ｋｇ、脱脂粉乳０．９６ｋｇ、無塩バター１．３１ｋｇおよび水４５．７５ｋｇを混合し、その混合物を９５℃で５分間加熱殺菌した後に３７℃前後まで冷却して、ヨーグルト原料ミックスＡよりも無脂乳固形分（ＳＮＦ）が高いヨーグルト原料ミックスＢを調製した。
【実施例１】
【００３８】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすリン酸塩添加量の影響の検証−
サーモフィルス菌ＯＬＳ３０５９株（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＯＬＳ３０５９、以下ＯＬＳ３０５９株とも称する）、及び、多糖体を産生するラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌である１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを５本の試験管に２０ｍＬずつ分注して、５つのサンプル１−１、１−２、１−３、１−４、１−５を準備した。そして、サンプル１−１には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル１−２には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．４重量％含み且つＮａＨ２ＰＯ４が全量に対して０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。サンプル１−３には、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４が全量に対してそれぞれ０．２５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。サンプル１−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４が全量に対してそれぞれ０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。なお、サンプル１−５（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。その後、上記各サンプルを４３℃の恒温水槽に浸漬して発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４〜４．５となった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、酸度、ＥＰＳ含有量、ブルガリア菌数、サーモフィラス菌数を測定した（表１参照）。【００３９】
ｐＨは、ガラス電極を用いたｐＨメーター（ＴＯＡ−ＨＭ５０Ｖ、東亜ディーケーケー社製）にて測定した。酸度は次の手順で測定した。各サンプルから９．００ｇを分取し、その分取サンプルに５００μＬのフェノールフタレインを添加した。そして、その分取サンプルを０．１Ｎの水酸化ナトリウムで滴定し、３０秒間、微紅色の消失しない時点を終点とした。【００４０】
また、ヨーグルトのＥＰＳ含有量は次の手順で測定した。まず、各サンプルを１０ｇずつ計り取ってそれぞれを５０ｍＬのチューブに入れ、そこに、１００％のトリクロロ酢酸１ｍＬを添加した。次に、その内容物を攪拌した後、その内容物を約４℃、約１０分で静置した。次いで、４℃の温度下２０分間、その内容物を１２０００×ｇの相対遠心力で遠心分離し、上清を新たな５０ｍＬのチューブに移した。そして、この上清を攪拌しながら、上清の２倍量の冷エタノールをその上清に徐々に添加して、上清と冷エタノールとを完全に混合した。続いて、その混合物を約４℃の温度下で一晩静置した後、前記と同様の条件下でその混合物を遠心分離した。その後、その混合物の上清を捨て、沈澱物に１０ｍＬの精製水を添加して、その沈殿物を精製水に完全に溶解させた。口径０．４５μｍのフィルター付きのシリンジを用いてその水溶液１５０μＬをＨＰＬＣに注入した。そして、「注入開始時点から１６分後付近においてＲＩ検出器によって検出される単一ピークのピーク面積」の「全ピーク面積」に対する割合をＥＰＳ含有量とした。ＨＰＬＣの分析操作条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣシステム：  Ａｑｕｉｔｙ  Ｈ−ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：  ＯＨｐａｋ  ８０６ＨＱ（Ｓｈｏｄｅｘ）＋ＳＢ−Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）
カラム温度：  ４０℃
溶媒：  ０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
流速：  ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２４１４（Ｗａｔｅｒｓ）、検出温度４０℃
サンプルインジェクション：  １５０μＬ
分析時間：５０ｍｉｎ【００４１】
ＥＰＳ含有量に及ぼすリン酸塩添加量の影響を表１に示す。リン酸塩を添加したサンプル１−１、１−２、１−３及び１−４では、対照サンプル１−５に比べて、発酵時間が長くなり、発酵終了時の酸度も１以上となった。リン酸塩の添加によって、ヨーグルトのＥＰＳ産生量が増加する結果となった。なお、リン酸塩としてＮａ２ＨＰＯ４のみを添加した場合（サンプル１−１）に、ＥＰＳ含有量が最も多かった。また、ブルガリア菌数はリン酸塩の添加によって増加したが、サーモフィルス菌はＮａ２ＨＰＯ４の濃度の上昇に伴って減少した。【００４２】
これらの結果から、リン酸塩の添加によって乳酸菌が増殖することができるｐＨ域での発酵時間を延長することができ、この効果によってブルガリア菌の菌数が増加したと考えられる。さらに、リン酸塩、中でもＮａ２ＨＰＯ４の添加によってサーモフィルス菌の増殖低下が観察されたことから、サーモフィルス菌の増殖低下もブルガリア菌由来のＥＰＳ増加に寄与したものと考えられる。
【表１】
2014084340.tif 000002
【実施例２】
【００４３】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすリン酸塩の種類の影響の検証−
ＯＬＳ３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように５００ｇのヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを６本の試験管に２０ｍＬずつ分注して、６つのサンプル２−１、２−２、２−３、２−４、２−５、２−６を準備した。そして、サンプル２−１には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル２−２には、Ｋ２ＨＰＯ４が全量に対して０．６１重量％含まれるようにＫ２ＨＰＯ４を添加した。なお、サンプル２−２におけるＫ２ＨＰＯ４のモル濃度は、サンプル２−１におけるＮａ２ＨＰＯ４のモル濃度と同じである。サンプル２−３には、ＮａＣｌが全量に対して０．２１重量％含まれるようにＮａＣｌを添加した。なお、サンプル２−３におけるＮａＣｌのモル濃度は、サンプル２−１におけるＮａ２ＨＰＯ４のモル濃度と同じである。サンプル２−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル２−５には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。なお、サンプル２−６（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。その後、上記各サンプルを４３℃の恒温水槽に浸漬して発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４〜４．５となった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、酸度、ＥＰＳ含有量、ブルガリア菌数、サーモフィルス菌数を測定した（表２参照）。なお、これらの物性値は実施例１と同様の方法で測定した。【００４４】
ＥＰＳ含有量に及ぼすリン酸塩の種類の影響を表２に示す。Ｎａ２ＨＰＯ４のみを添加したサンプル２−１、２−４、２−５では、Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量の増加に伴って発酵時間が長くなると共にＥＰＳ含有量が増加した。また、Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量の増加に伴ってブルガリア菌の菌数は増加し、サーモフィルス菌の菌数は減少した。ここで、サーモフィルス菌の菌数の減少に影響する要因を調べた。具体的には、サンプル２−１、サンプル２−２及びサンプル２−３について、サーモフィルス菌の菌数などを対比した。サンプル２−２のサーモフィルス菌の菌数およびＥＰＳ含有量は、サンプル２−１のサーモフィルス菌の菌数およびＥＰＳ含有量とほぼ同等であった。サンプル２−３では、サンプル２−６（対照）とほぼ同様に、ＥＰＳ含有量の増加やサーモフィルス菌の菌数の減少は見られなかった。なお、これは、添加したＮａＣｌがｐＨ緩衝作用を発揮しなかったためであると思われる。したがって、リン酸塩の添加がサーモフィルス菌の増殖を抑制している可能性が示唆された。
【表２】
2014084340.tif 000003
【実施例３】
【００４５】
−ＥＰＳ産生量およびカードテンションに及ぼすリン酸塩添加量の影響の検証−
１００ｋｇのヨーグルト原料ミックスＡを２０ｋｇずつに分け、５つのサンプル３−１、３−２、３−３、３−４、３−５を準備した。サンプル３−１（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。サンプル３−２には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−３には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−５には、Ｎａ２ＨＰＯ４が１．０重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。そして、ヨーグルトの製造に一般的に使用されるサーモフィラス菌及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターターを、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように各サンプルに接種した。その後、乳酸菌スターター入りの各サンプルをそれぞれ８５ｇ容量の容器に８５ｇ充填して４３℃の恒温室で発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。【００４６】
そして、各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、ＥＰＳ含有量、カードテンション（ＣＴ）を測定した（表３参照）。なお、各サンプル中のＥＰＳ含有量は、実施例１と同様に測定した。ＣＴは次の手順で測定した。各サンプルに１００ｇの錘をつけ、カードメーターマックス（ＭＥ−５００、飛鳥機器社製）によって各サンプルが破断に至るときの弾力性を測定した。そして、この弾性力をＣＴ指標値とした。【００４７】
各サンプルの発酵時間、ＥＰＳ含有量、ＣＴの結果を表３に示す。Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量が増加するに伴ってサンプル中のＥＰＳ含有量が増加し、ＣＴ値が減少した（すなわちサンプルが柔らかくなった）。
【表３】
2014084340.tif 000004
【実施例４】
【００４８】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすヨーグルト原料ミックスのＳＮＦ含有量の影響の検証−
ＯＬＳ−３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡ及びヨーグルト原料ミックスＢにそれぞれ接種した後、乳酸菌スターター入りの各ヨーグルト原料ミックスＡ，Ｂを８５ｇ容量の容器に８５ｇずつ分注して、２種類のサンプル４−１（ＳＮＦ＝９．４重量％）、４−２（ＳＮＦ＝１０．２重量％）を準備した。そして、これらのサンプル４−１，２を４３℃の恒温室で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。【００４９】
サンプル４−１のＥＰＳ含有量は４６．０ｍｇ／ｋｇであった。これに対し、サンプル４−２のＥＰＳ含有量は４８．６ｍｇ／ｋｇであった。すなわち、サンプル４−２のＥＰＳ含有量は、サンプル４−１の１．１倍であった。したがって、高ＳＮＦのヨーグルト原料を使用することによりヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができることが明らかとなった。
【実施例５】
【００５０】
−ＥＰＳ産生量に及ぼす発酵温度の影響の検証−
ＯＬＳ−３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを８５ｇ容量の容器に８５ｇずつ分注して、２種類のサンプル５−１、５−２を準備した。そして、サンプル５−１を４３℃で発酵させ、サンプル５−２を３７℃で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。【００５１】
サンプル５−１のＥＰＳ含有量は４３．４ｍｇ／ｋｇであった。これに対し、サンプル５−２のＥＰＳ含有量は５１．１ｍｇ／ｋｇであった。すなわち、サンプル５−２のＥＰＳ含有量は、サンプル５−１の１．２倍であった。したがって、発酵温度を低温にすることで、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができることが明らかとなった。
【実施例６】
【００５２】
先ず、サンプル６−１（対照）としてヨーグルト原料ミックスＡを準備した。また、ヨーグルト原料ミックスＢを３つに分けて、３つのサンプル６−２、６−３、６−４を準備した。そして、ヨーグルトの製造に一般的に使用されるサーモフィラス菌及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターターを、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように各サンプルに接種した。また、サンプル６−４には、さらに、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。そして、サンプル６−１および６−２を４３℃で発酵させ、サンプル６−３および６−４を３７℃で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。【００５３】
各サンプルのＳＮＦ、発酵温度、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４）添加量、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を表４に示す。サンプル６−２（高ＳＮＦ含有量）ではＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．１５倍に高められ、サンプル６−３（高ＳＮＦ含有量，低発酵温度）ではＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．１９倍にまで高められた。さらに、サンプル６−４（高ＳＮＦ含有量，低発酵温度，リン酸塩添加）では、ヨーグルトのＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．３７倍にまで高められた。
【表４】
2014084340.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に係るヨーグルトの製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の含有量を効率的に増加させることができるため、乳酸菌由来の機能性産生物（多糖体など）が有する健康増進作用を高めたヨーグルトや、有効量の乳酸菌由来の機能性産生物を十分含有した小容量のヨーグルトを効率よく製造することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月28日(2015.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を増加させるヨーグルト製造方法、及び、そのヨーグルト製造方法によって製造されるヨーグルトに関する。また、本発明は、乳酸菌の菌体外機能性産生物の産生量を増加させる乳酸菌体外機能性産生物製造方法、並びに、その方法に使用される乳酸菌体外機能性産生物増産剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌および乳酸菌由来の機能性産生物を摂取することにより、消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用（健康の維持・疾病リスクの低減）をすることが知られている。例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（以下「ブルガリア菌」とも称する）は、ヨーグルトスターターとして発酵乳の製造に用いられている乳酸菌のひとつである。このブルガリア菌の中には、菌体外多糖体(ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＥＰＳ)を産生する菌株も多く存在する。そして、このＥＰＳは、発酵乳製品の物性や安定性に寄与するのみならず、プロバイオティクス効果の享受にも寄与することが知られている。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（以下「ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株」とも称する）が産生するＥＰＳには、自己免疫疾患を予防する効果があることが知られている。また、本菌株を用いて製造された発酵乳には、ＮＫ細胞の活性化、感冒罹患の減少、抗インフルエンザ等の効果があることが知られている。（例えば、特許文献１〜３等参照）。このように、ＥＰＳを産生する乳酸菌や、乳酸菌などの産生するＥＰＳを利用することにより、健康に寄与する機能性食品やサプリメントを提供することができることとなる。
【０００３】
ところで、このような機能性食品やサプリメントを効率的に製造するためには、同機能性食品中のＥＰＳ産生量を高める必要がある。
【０００４】
ブルガリア菌に限らず乳酸菌由来のＥＰＳを高めるために、過去に様々な方法が提案されている。例えば、特許文献４には、ペプトン、酵母エキス、及び不飽和脂肪酸もしくはそのエステルを含む培地で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等のケフィラン生産能を有する乳酸菌を培養することにより、培養液中に高濃度のＥＰＳを産生することができることが開示されている。また、特許文献５には、牛乳に乳清タンパクや大豆タンパクを加え、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスで発酵させることにより、乳酸菌由来のＥＰＳが顕著に増加することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２４７８９５号公報
【特許文献２】特開２００５−１９４２５９号公報
【特許文献３】国際公開パンフレットＷＯ２０１１／０６５３００
【特許文献４】特開２０１１−２５０７５６号公報
【特許文献５】特開２０１１−５１２６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に増加させることができる新たな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一局面に係るヨーグルト製造方法は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を備える。ｐＨ緩衝剤添加工程では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加されたヨーグルト原料（以下「ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料」という）が乳酸菌によって発酵させられる。なお、ヨーグルト原料への乳酸菌の添加はｐＨ緩衝剤の添加前であってもよいし、添加後であってもよい。
【０００８】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述のヨーグルト製造方法の通り、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤を添加してからそのヨーグルト原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、ヨーグルト中の乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができることが明らかとなった。すなわち、このヨーグルト製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。
【０００９】
ところで、このヨーグルト製造方法において、乳酸菌は、少なくとも、乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌を含むことが好ましい。そして、この乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌は、少なくとも、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌を含むことが好ましい。なお、かかる場合、乳酸菌体外多糖体産生能力を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌単体であってもよいし、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種と他の乳酸菌を含む乳酸菌混合物であってもよい。
【００１０】
また、このヨーグルト製造方法において、ｐＨ緩衝剤はリン酸塩であることが好ましい。乳酸菌として、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌とストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の乳酸菌（以下「サーモフィルス菌」とも称する）との混合物が使用される場合、サーモフィルス菌の増殖を抑制しつつラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌の増殖を促進することができるからである。なお、このリン酸塩は、アルカリ金属塩であることが好ましい。さらに、リン酸塩は、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸水素二カリウムより成る群から選択される少なくとも一方のリン酸塩であることが好ましい。
【００１１】
さらに、このヨーグルト製造方法において、ヨーグルト原料には、８重量％以上２０重量％以下の範囲内の無脂乳固形分が含まれていることが好ましい。なお、ここで、ヨーグルト原料とはｐＨ緩衝剤添加前のものを意味する。
【００１２】
加えて、このヨーグルト製造方法において、発酵工程では、ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料が３０℃以上４０℃以下の範囲内の温度下で乳酸菌によって発酵させられることが好ましい。
【００１３】
上述のヨーグルト製造方法によって製造されたヨーグルトには、乳酸菌およびｐＨ緩衝剤が含有される。なお、このヨーグルトでは、ｐＨ緩衝剤が均一に溶解されている。ここで、乳酸菌およびｐＨ緩衝剤は、上述の通りである。また、このヨーグルト中のｐＨ緩衝剤は、例えば、高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー技術や、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術（例えば、Szlyk E, Hrynczyszyn P，「Phosphate additives determination in meat products by 31-phosphorus nuclear magnetic resonance using new internal reference standard:hexamethylphosphoroamide phosphatesolution」, Talanta. 2011 Mar 15;84(1):199-203. doi: 10.1016/j.talanta.2010.12.046 参照）などによって検出することができる。
【００１４】
また、上述のヨーグルトは乳酸菌体外機能性産生物（例えば、乳酸菌体外多糖体など）をさらに含有することが好ましい。かかる場合、乳酸菌体外機能性産生物は、ヨーグルト全量に対して４０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量含まれていることが好ましい。
【００１５】
本発明の他の局面に係る乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を備える。ｐＨ緩衝剤添加工程では、乳原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加された乳原料が、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌（以下「菌体外機能性産生物産生乳酸菌」ともいう）によって発酵させられる。なお、乳原料への乳酸菌の添加はｐＨ緩衝剤の添加前であってもよいし、添加後であってもよい。
【００１６】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の乳酸菌体外機能性産生物製造方法の通り、乳原料にｐＨ緩衝剤を添加してからその乳原料を発酵させることによって、菌体外機能性産生物産生乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができることが明らかとなった。すなわち、この乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。すなわち、本局面においてｐＨ緩衝剤は、乳酸菌体外機能性産生物増産剤の有効成分として機能する。
【００１７】
なお、上述の乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、別の観点から捉えると、「乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）して乳酸菌によりその乳原料を発酵させる乳酸菌体外機能性産生物の増産方法」、「乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）する乳酸菌体外機能性産生物の増産方法」、「乳酸菌体外機能性産生物を増産させるために乳原料にｐＨ緩衝剤を配合（添加）する方法」、「乳酸菌体外機能性産生物を増産させるための乳原料に対するｐＨ緩衝剤の使用（使用方法）」などとも表現することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一局面に係るヨーグルト製造方法では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤を添加してからそのヨーグルト原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、ヨーグルト中の乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができる。すなわち、このヨーグルト製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。
【００１９】
また、本発明の他の局面に係る乳酸菌体外機能性産生物製造方法では、乳原料にｐＨ緩衝剤を添加してからその乳原料を発酵させることによって、乳酸菌が増殖できるｐＨ領域の時間を延長することができ、その結果、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を高めることができる。すなわち、この乳酸菌体外機能性産生物製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の産生量を効率的に高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明は、以下に述べる個々の実施の形態に限定されない。
【００２１】
−第１実施形態−
本実施形態に係るヨーグルトは、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を経て製造される。ｐＨ緩衝剤添加工程では、ヨーグルト原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加されたヨーグルト原料（以下「ｐＨ緩衝剤添加ヨーグルト原料」という）が乳酸菌によって発酵させられる。
【００２２】
本実施形態において、ヨーグルトとは、乳等省令で定義される「発酵乳」および「乳酸菌飲料」を指す。乳等省令における「発酵乳」とは、「乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳などを乳酸菌または酵母で発酵させ、糊状または液状にしたもの」または「これらを凍結したもの」と定義されている。発酵乳は、「容器充填後に発酵させて固化させたハードヨーグルト（固形状発酵乳、セットタイプヨーグルト）」、「発酵後にカードを粉砕し、容器充填したソフトヨーグルト（糊状発酵乳）」、「ソフトヨーグルトを均質機でさらに細かく砕き、液状の性質を高めたドリンクヨーグルト（液状発酵乳）」に大別される。また、乳等省令における「乳酸菌飲料」とは、「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く。）」をいう。
【００２３】
ヨーグルト原料には、乳、乳製品、乳タンパクの少なくとも一種以上が含まれる。ヨーグルト原料としては、例えば、牛乳、羊、ヤギ等の獣乳や、その加工品、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、部分脱脂乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、クリーム、バター、バターミルク、ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、非たんぱく態窒素などの乳原料、砂糖、糖類、加工澱粉（デキストリンの他、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維、甘味料、有機酸（リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸など）、香料、水などを挙げることができる。なお、ヨーグルト原料は、上述のような常用の原料を混合し、加温させながら溶解させることで得られる。ヨーグルト原料には、ゼラチン、寒天、ペクチン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等のゲル化剤、増粘剤、安定剤が添加されてもよい。かかる場合、ゼラチン等の安定剤などを水などの溶媒に予め加温して溶解させておき、この安定剤水溶液を他の成分と混合することによって、ヨーグルト原料を調製する。
【００２４】
また、このヨーグルト原料の無脂乳固形分（以下「ＳＮＦ」という）は８重量％以上２０重量％以下の範囲内であることが好ましい。本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ヨーグルトの風味を良好に保ちつつ、ヨーグルト中の菌体外多糖体（以下「ＥＰＳ」という）含有量を高めることができるからである。なお、ヨーグルト原料のＳＮＦは、８．５重量％以上１８．５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、９重量％以上１５重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、９．５重量％以上１４重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００２５】
本実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、特に限定されないが、リン酸塩であることが特に好ましい。なお、本実施形態において、リン酸塩には水和物も含まれるものとする。リン酸塩としては、例えば、リン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）等が挙げられる。なお、これらのリン酸塩は、単独で用いられてもよいし併用されてもよい。また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法では、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）を単独あるいは組み合わせて用いることが好ましく、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）を単独で用いることが特に好ましい。
【００２６】
また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法のｐＨ緩衝剤添加工程において、ヨーグルト原料に対して０．０５重量％以上０．５５重量％以下の範囲内の量のｐＨ緩衝剤が添加されるのが好ましい。本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ｐＨ緩衝剤の添加量がこの範囲内であれば、ヨーグルトのカード強度（カードテンション）や風味を良好に保ちつつ、ブルガリア菌の増殖を促進することができると共にブルガリア菌由来のＥＰＳの産生量を増強することができるからである。なお、ｐＨ緩衝剤添加量は、０．０８重量％以上０．４５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、０．１重量％以上０．３５重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００２７】
本実施形態において、乳酸菌は、菌体外機能性産生物、例えばＥＰＳを産生する乳酸菌（以下「菌体外機能性産生物産生乳酸菌」という）、例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の乳酸菌（以下「ブルガリア菌」ともいう）である。本実施の形態では、乳酸菌は、菌体外機能性産生物産生乳酸菌であれば菌株を問わないが、ＥＰＳを産生するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１）が好適である。なお、本実施形態では、ブルガリア菌を主体とすることが好ましいが、その他のＥＰＳを産生する乳酸菌（以下「ＥＰＳ産生乳酸菌」という）、例えば、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）や、ラクトコッカス・ラクティス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）等をブルガリア菌と併用してもよい。
【００２８】
また、ＥＰＳ産生乳酸菌以外の乳酸菌、例えば、サーモフィルス菌、ラクトバチルス・ガッセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ビフィズス菌、プロピオン酸菌などの発酵乳の製造に一般的に用いられるその他の乳酸菌を、ＥＰＳ産生乳酸菌と併用してもよい。また、上記乳酸菌と共に酵母を添加してもよい。なお、本実施形態に係るヨーグルト製造方法では、乳酸菌として、ＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を併用することが特に好ましい。
【００２９】
本実施形態に係るヨーグルト製造方法の発酵工程において、発酵温度を３０℃以上４０℃以下の範囲内とすることが好ましい。乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができるからである。なお、発酵温度は、３２℃以上３９℃以下の範囲内とすることがより好ましく、３４℃以上３８℃以下の範囲内とすることがさらに好ましい。
【００３０】
本実施形態にかかる菌体外機能性産生物産生乳酸菌は、全量に対して４０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが好ましい。例えば、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、上記範囲内の量のＥＰＳが産生される場合においてｐＨ緩衝剤非添加時のＥＰＳの産生量に対するｐＨ緩衝剤添加時のＥＰＳの産生量の比が高くなる、すなわちｐＨ緩衝剤の添加効果が高くなることが認められるからである。なお、菌体外機能性産生物産生乳酸菌は、全量に対して４２ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが好ましく、４４ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することがより好ましく、４８ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することがさらに好ましく、５０ｍｇ／ｋｇ以上１００ｍｇ／ｋｇ以下の範囲内の量の菌体外機能性産生物を産生することが特に好ましい。
【００３１】
また、本実施形態に係るヨーグルト製造方法において、菌体外機能性産生物の産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時の産生量の１．０５倍以上であることが好ましく、１．１倍以上であることがより好ましく、１．２倍以上であることがさらに好ましく、１．２５倍以上であることが特に好ましい。例えば、乳酸菌としてＥＰＳを産生するブルガリア菌とサーモフィルス菌を採用し、ｐＨ緩衝剤としてリン酸塩を採用した場合、ｐＨ緩衝剤添加時のＥＰＳ産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時のＥＰＳ産生量の１．２５倍以上となる場合がある。
【００３２】
−第２実施形態−
本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物は、ｐＨ緩衝剤添加工程および発酵工程を経て製造される。ｐＨ緩衝剤添加工程では、乳原料にｐＨ緩衝剤が添加される。発酵工程では、ｐＨ緩衝剤が添加された乳原料が、乳酸菌体外機能性産生物を産生する乳酸菌によって発酵させられる。
【００３３】
なお、本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物の製造方法は、ヨーグルト原料が乳原料とされること以外、第１実施形態に係るヨーグルト製造方法と同じである。また、本実施形態にいう「乳酸菌体外機能性産生物」は、第１実施形態にいう「菌体外機能性産生物」と同じものを示す。そして、ここにいう「乳原料」とは、牛乳、羊、ヤギ等の獣乳や、その加工品、殺菌乳、脱脂乳、全脂粉乳、部分脱脂乳、脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、クリーム、バター、バターミルク、ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、非たんぱく態窒素などである。また、この乳原料の無脂乳固形分（以下「ＳＮＦ」という）は８重量％以上２０重量％以下の範囲内であることが好ましく、８．５重量％以上１８．５重量％以下の範囲内であることがより好ましく、９重量％以上１５重量％以下の範囲内であることがさらに好ましく、９．５重量％以上１４重量％以下の範囲内であることが特に好ましい。
【００３４】
また、本実施形態に係る乳酸菌体外機能性産生物の産生量は、ｐＨ緩衝剤無添加時の乳酸菌体外機能性産生物の産生量の１．０５倍以上であることが好ましく、１．１倍以上であることがより好ましく、１．２倍以上であることがさらに好ましく、１．２５倍以上であることが特に好ましい。
【００３５】
＜実施例＞
以下、本発明の好ましい実施例を説明するが、本発明は、前述した実施形態や以下の実施例に限定されることなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更することが可能である。なお、実施例に用いられているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（以下、ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株）は、２００６年１１月２９日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に、受託番号でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４１としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。また、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＯＬＳ３０５９株は、２００６年１２月１５日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター  中央第６）に、受託番号でＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４０として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。なお、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターの特許微生物寄託業務は２０１２年４月１日をもって独立行政法人製品評価技術基盤機構に承継されており、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターは２０１３年４月１日をもって日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構事業所内に移転している。
【００３６】
（製造例）
（１）ヨーグルト原料ミックスＡ（ＳＮＦ＝９．４重量％）の調製
原料乳５０ｋｇ、脱脂粉乳５．４９ｋｇ、無塩バター１．５ｋｇおよび水４３．０１ｋｇを混合し、その混合物を９５℃で５分間加熱殺菌した後に３７℃前後まで冷却して、ヨーグルト原料ミックスＡを調製した。
【００３７】
（２）ヨーグルト原料ミックスＢ（ＳＮＦ＝１０．２重量％）の調製
原料乳２５ｋｇ、脱脂濃縮乳１８．４ｋｇ、脱脂粉乳０．９６ｋｇ、無塩バター１．３１ｋｇおよび水４５．７５ｋｇを混合し、その混合物を９５℃で５分間加熱殺菌した後に３７℃前後まで冷却して、ヨーグルト原料ミックスＡよりも無脂乳固形分（ＳＮＦ）が高いヨーグルト原料ミックスＢを調製した。
【実施例１】
【００３８】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすリン酸塩添加量の影響の検証−
サーモフィルス菌ＯＬＳ３０５９株（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＯＬＳ３０５９、以下ＯＬＳ３０５９株とも称する）、及び、多糖体を産生するラクトバチルス・デルブルエッキー・サブスピーシス・ブルガリクス種の乳酸菌である１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを５本の試験管に２０ｍＬずつ分注して、５つのサンプル１−１、１−２、１−３、１−４、１−５を準備した。そして、サンプル１−１には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル１−２には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．４重量％含み且つＮａＨ２ＰＯ４が全量に対して０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。サンプル１−３には、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４が全量に対してそれぞれ０．２５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。サンプル１−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４が全量に対してそれぞれ０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を添加した。なお、サンプル１−５（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。その後、上記各サンプルを４３℃の恒温水槽に浸漬して発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４〜４．５となった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、酸度、ＥＰＳ含有量、ブルガリア菌数、サーモフィラス菌数を測定した（表１参照）。
【００３９】
ｐＨは、ガラス電極を用いたｐＨメーター（ＴＯＡ−ＨＭ５０Ｖ、東亜ディーケーケー社製）にて測定した。酸度は次の手順で測定した。各サンプルから９．００ｇを分取し、その分取サンプルに５００μＬのフェノールフタレインを添加した。そして、その分取サンプルを０．１Ｎの水酸化ナトリウムで滴定し、３０秒間、微紅色の消失しない時点を終点とした。
【００４０】
また、ヨーグルトのＥＰＳ含有量は次の手順で測定した。まず、各サンプルを１０ｇずつ計り取ってそれぞれを５０ｍＬのチューブに入れ、そこに、１００％のトリクロロ酢酸１ｍＬを添加した。次に、その内容物を攪拌した後、その内容物を約４℃、約１０分で静置した。次いで、４℃の温度下２０分間、その内容物を１２０００×ｇの相対遠心力で遠心分離し、上清を新たな５０ｍＬのチューブに移した。そして、この上清を攪拌しながら、上清の２倍量の冷エタノールをその上清に徐々に添加して、上清と冷エタノールとを完全に混合した。続いて、その混合物を約４℃の温度下で一晩静置した後、前記と同様の条件下でその混合物を遠心分離した。その後、その混合物の上清を捨て、沈澱物に１０ｍＬの精製水を添加して、その沈殿物を精製水に完全に溶解させた。口径０．４５μｍのフィルター付きのシリンジを用いてその水溶液１５０μＬをＨＰＬＣに注入した。そして、「注入開始時点から１６分後付近においてＲＩ検出器によって検出される単一ピークのピーク面積」の「全ピーク面積」に対する割合をＥＰＳ含有量とした。ＨＰＬＣの分析操作条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣシステム：  Ａｑｕｉｔｙ  Ｈ−ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：  ＯＨｐａｋ  ８０６ＨＱ（Ｓｈｏｄｅｘ）＋ＳＢ−Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）
カラム温度：  ４０℃
溶媒：  ０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
流速：  ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＲＩ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２４１４（Ｗａｔｅｒｓ）、検出温度４０℃
サンプルインジェクション：  １５０μＬ
分析時間：５０ｍｉｎ
【００４１】
ＥＰＳ含有量に及ぼすリン酸塩添加量の影響を表１に示す。リン酸塩を添加したサンプル１−１、１−２、１−３及び１−４では、対照サンプル１−５に比べて、発酵時間が長くなり、発酵終了時の酸度も１以上となった。リン酸塩の添加によって、ヨーグルトのＥＰＳ産生量が増加する結果となった。なお、リン酸塩としてＮａ２ＨＰＯ４のみを添加した場合（サンプル１−１）に、ＥＰＳ含有量が最も多かった。また、ブルガリア菌数はリン酸塩の添加によって増加したが、サーモフィルス菌はＮａ２ＨＰＯ４の濃度の上昇に伴って減少した。
【００４２】
これらの結果から、リン酸塩の添加によって乳酸菌が増殖することができるｐＨ域での発酵時間を延長することができ、この効果によってブルガリア菌の菌数が増加したと考えられる。さらに、リン酸塩、中でもＮａ２ＨＰＯ４の添加によってサーモフィルス菌の増殖低下が観察されたことから、サーモフィルス菌の増殖低下もブルガリア菌由来のＥＰＳ増加に寄与したものと考えられる。
【表１】
2014084340.tif 000006
【実施例２】
【００４３】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすリン酸塩の種類の影響の検証−
ＯＬＳ３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように５００ｇのヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを６本の試験管に２０ｍＬずつ分注して、６つのサンプル２−１、２−２、２−３、２−４、２−５、２−６を準備した。そして、サンプル２−１には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル２−２には、Ｋ２ＨＰＯ４が全量に対して０．６１重量％含まれるようにＫ２ＨＰＯ４を添加した。なお、サンプル２−２におけるＫ２ＨＰＯ４のモル濃度は、サンプル２−１におけるＮａ２ＨＰＯ４のモル濃度と同じである。サンプル２−３には、ＮａＣｌが全量に対して０．２１重量％含まれるようにＮａＣｌを添加した。なお、サンプル２−３におけるＮａＣｌのモル濃度は、サンプル２−１におけるＮａ２ＨＰＯ４のモル濃度と同じである。サンプル２−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル２−５には、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。なお、サンプル２−６（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。その後、上記各サンプルを４３℃の恒温水槽に浸漬して発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４〜４．５となった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、酸度、ＥＰＳ含有量、ブルガリア菌数、サーモフィルス菌数を測定した（表２参照）。なお、これらの物性値は実施例１と同様の方法で測定した。
【００４４】
ＥＰＳ含有量に及ぼすリン酸塩の種類の影響を表２に示す。Ｎａ２ＨＰＯ４のみを添加したサンプル２−１、２−４、２−５では、Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量の増加に伴って発酵時間が長くなると共にＥＰＳ含有量が増加した。また、Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量の増加に伴ってブルガリア菌の菌数は増加し、サーモフィルス菌の菌数は減少した。ここで、サーモフィルス菌の菌数の減少に影響する要因を調べた。具体的には、サンプル２−１、サンプル２−２及びサンプル２−３について、サーモフィルス菌の菌数などを対比した。サンプル２−２のサーモフィルス菌の菌数およびＥＰＳ含有量は、サンプル２−１のサーモフィルス菌の菌数およびＥＰＳ含有量とほぼ同等であった。サンプル２−３では、サンプル２−６（対照）とほぼ同様に、ＥＰＳ含有量の増加やサーモフィルス菌の菌数の減少は見られなかった。なお、これは、添加したＮａＣｌがｐＨ緩衝作用を発揮しなかったためであると思われる。したがって、リン酸塩の添加がサーモフィルス菌の増殖を抑制している可能性が示唆された。
【表２】
2014084340.tif 000007
【実施例３】
【００４５】
−ＥＰＳ産生量およびカードテンションに及ぼすリン酸塩添加量の影響の検証−
１００ｋｇのヨーグルト原料ミックスＡを２０ｋｇずつに分け、５つのサンプル３−１、３−２、３−３、３−４、３−５を準備した。サンプル３−１（対照）には、リン酸塩を添加しなかった。サンプル３−２には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．１重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−３には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−４には、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．５重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。サンプル３−５には、Ｎａ２ＨＰＯ４が１．０重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。そして、ヨーグルトの製造に一般的に使用されるサーモフィラス菌及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターターを、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように各サンプルに接種した。その後、乳酸菌スターター入りの各サンプルをそれぞれ８５ｇ容量の容器に８５ｇ充填して４３℃の恒温室で発酵させた。各サンプルのｐＨが４．４になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。
【００４６】
そして、各サンプルについて、発酵停止までの時間（発酵時間）、ＥＰＳ含有量、カードテンション（ＣＴ）を測定した（表３参照）。なお、各サンプル中のＥＰＳ含有量は、実施例１と同様に測定した。ＣＴは次の手順で測定した。各サンプルに１００ｇの錘をつけ、カードメーターマックス（ＭＥ−５００、飛鳥機器社製）によって各サンプルが破断に至るときの弾力性を測定した。そして、この弾性力をＣＴ指標値とした。
【００４７】
各サンプルの発酵時間、ＥＰＳ含有量、ＣＴの結果を表３に示す。Ｎａ２ＨＰＯ４の添加量が増加するに伴ってサンプル中のＥＰＳ含有量が増加し、ＣＴ値が減少した（すなわちサンプルが柔らかくなった）。
【表３】
2014084340.tif 000008
【実施例４】
【００４８】
−ＥＰＳ産生量に及ぼすヨーグルト原料ミックスのＳＮＦ含有量の影響の検証−
ＯＬＳ−３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡ及びヨーグルト原料ミックスＢにそれぞれ接種した後、乳酸菌スターター入りの各ヨーグルト原料ミックスＡ，Ｂを８５ｇ容量の容器に８５ｇずつ分注して、２種類のサンプル４−１（ＳＮＦ＝９．４重量％）、４−２（ＳＮＦ＝１０．２重量％）を準備した。そして、これらのサンプル４−１，２を４３℃の恒温室で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。
【００４９】
サンプル４−１のＥＰＳ含有量は４６．０ｍｇ／ｋｇであった。これに対し、サンプル４−２のＥＰＳ含有量は４８．６ｍｇ／ｋｇであった。すなわち、サンプル４−２のＥＰＳ含有量は、サンプル４−１の１．１倍であった。したがって、高ＳＮＦのヨーグルト原料を使用することによりヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができることが明らかとなった。
【実施例５】
【００５０】
−ＥＰＳ産生量に及ぼす発酵温度の影響の検証−
ＯＬＳ−３０５９株及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターター（ヨーグルトスターター）を、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるようにヨーグルト原料ミックスＡに接種した後、その乳酸菌スターター入りヨーグルト原料ミックスＡを８５ｇ容量の容器に８５ｇずつ分注して、２種類のサンプル５−１、５−２を準備した。そして、サンプル５−１を４３℃で発酵させ、サンプル５−２を３７℃で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。
【００５１】
サンプル５−１のＥＰＳ含有量は４３．４ｍｇ／ｋｇであった。これに対し、サンプル５−２のＥＰＳ含有量は５１．１ｍｇ／ｋｇであった。すなわち、サンプル５−２のＥＰＳ含有量は、サンプル５−１の１．２倍であった。したがって、発酵温度を低温にすることで、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を高めることができることが明らかとなった。
【実施例６】
【００５２】
先ず、サンプル６−１（対照）としてヨーグルト原料ミックスＡを準備した。また、ヨーグルト原料ミックスＢを３つに分けて、３つのサンプル６−２、６−３、６−４を準備した。そして、ヨーグルトの製造に一般的に使用されるサーモフィラス菌及び１０７３Ｒ−１株の混合培養物である乳酸菌スターターを、乳酸菌スターターが全量に対して２重量％含まれるように各サンプルに接種した。また、サンプル６−４には、さらに、Ｎａ２ＨＰＯ４が全量に対して０．３重量％含まれるようにＮａ２ＨＰＯ４を添加した。そして、サンプル６−１および６−２を４３℃で発酵させ、サンプル６−３および６−４を３７℃で発酵させた。各サンプルの酸度が０．８になった時点でサンプルを１０℃以下まで冷却し、そのサンプルの発酵を停止させた。各サンプル中のＥＰＳ含有量を測定した。なお、ＥＰＳ含有量は実施例１と同様の方法で測定した。
【００５３】
各サンプルのＳＮＦ、発酵温度、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４）添加量、ヨーグルト中のＥＰＳ含有量を表４に示す。サンプル６−２（高ＳＮＦ含有量）ではＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．１５倍に高められ、サンプル６−３（高ＳＮＦ含有量，低発酵温度）ではＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．１９倍にまで高められた。さらに、サンプル６−４（高ＳＮＦ含有量，低発酵温度，リン酸塩添加）では、ヨーグルトのＥＰＳ含有量が対照サンプル６−１の１．３７倍にまで高められた。
【表４】
2014084340.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に係るヨーグルトの製造方法は、乳酸菌由来の機能性産生物の含有量を効率的に増加させることができるため、乳酸菌由来の機能性産生物（多糖体など）が有する健康増進作用を高めたヨーグルトや、有効量の乳酸菌由来の機能性産生物を十分含有した小容量のヨーグルトを効率よく製造することができる。
【国際調査報告】
2014084340.tif 000010
2014084340.tif 000011
2014084340.tif 000012
2014084340.tif 000013