(57)【要約】  ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、該遺伝子は、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、該免疫原性ポリペプチドが、所定の基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含み、該少なくとも１つの抗原ペプチドは、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。本発明のビフィズス菌表層発現遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことができる。
2014129412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
該遺伝子が、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含むＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
該基盤ドメインが、
（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
（４）配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群より選択される１つ以上を含み、
該抗原ペプチドが、配列番号４〜１５のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号４〜１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つであり、
該少なくとも１つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される、
ビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
（１）前記基盤ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（２）前記基盤ドメインが、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（３）前記基盤ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；または
（４）前記基盤ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、Ｃ末端側に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する、
ビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項３】
ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、該ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質の３’末端側に位置している、請求項１または２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを保持し、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
【請求項６】
ゲノム中に、請求項３に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、Ｃ型肝炎ワクチン組成物。
【請求項８】
経口ワクチンである、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドを設計する方法であって、  立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを選択する工程；ならびに
該少なくとも１つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記基盤ドメインが、少なくとも１つのＣＤ４エピトープもしくはＣＤ８エピトープまたはその両方を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞の表層で特異的に発現するポリペプチドを、細胞表層で発現する形質転換ビフィズス菌。
【請求項１２】
ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１１の形質転換ビフィズス菌。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌、より詳細には、例えば、Ｃ型肝炎ワクチン組成物を製造することができる免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のキャリアは世界中で１億７０００万人以上おり、約７０％が慢性肝炎に移行し、肝硬変や肝癌のリスクに曝されている。日本にも約２００万人のキャリアが存在し、そのうち約８０％が１ｂ型に感染している。【０００３】
Ｃ型肝炎の治療として、主にインターフェロン治療が行なわれている。しかし、ペグ化インターフェロンαと抗ウイルス薬のリバビリンとを組み合わせた併用療法では、１型ウイルス排除率が５０％以下であること、および治療期間が長い上に副作用が重いことから、より有効な治療薬の開発および治療法の確立が必要である。【０００４】
ＨＣＶは、フラビウイルス科に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、４種の構造タンパク質領域（Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−Ｐ７）および６種の非構造タンパク質領域（ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ）から構成される。このうち、ＮＳ３タンパク質は、Ｎ末端側の３分の１にセリンプロテアーゼ活性を有し、Ｃ末端側の３分の２がＲＮＡヘリカーゼ活性を有している。このようなプロテアーゼ−ヘリカーゼの２つの活性を有するＮＳ３タンパク質について、立体構造の解明のためにＸ線結晶解析によりその立体構造が調べられている（非特許文献１）。【０００５】
ＨＣＶ感染が治癒した患者において、ＮＳ３特異的な強い免疫応答がみられた（非特許文献２）。また、ＮＳ３タンパク質は遺伝学的に保存性が高く、多数の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープが同定されている（非特許文献３）。【０００６】
Ｃ型肝炎の予防または治療のためのＮＳ３タンパク質由来ポリペプチドの利用が報告されている。例えば、特許文献１には、ＨＣＶのＮＳ３領域のアミノ酸１１８８〜１４６３位に由来する少なくとも８アミノ酸連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつＴ細胞刺激性エピトープを含むポリペプチドが記載されている。特許文献２には、ＨＣＶコア配列の少なくとも一部分に連結されたＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの少なくとも一部を含むＨＣＶ融合タンパク質を発現する酵母細胞を、ワクチンのベースとすることが記載されている。特許文献３には、ＮＳ３などの全長タンパク質または免疫原性タンパク質を発現し、分泌する弱毒化リステリア・モノサイトゲネスなどの細菌をワクチンプラットフォームとすることが記載されている。【０００７】
他方、遺伝子組換えによる形質転換微生物を経口ワクチンとして用いる方法が着目されている。ビフィドバクテリウム属微生物（本明細書においては、「ビフィズス菌」ともいう）の細胞膜に存在するＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（本明細書においては、「ＧＬＢＰ」ともいう）を用いてサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）由来のフラジェリンを表層発現させた形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）をマウスに経口投与することにより、血中にフラジェリン特異的抗体が産出され、腸管粘膜免疫を介して全身性免疫が誘導され、そしてネズミチフス菌の経口感染によるマウスの致死作用が効果的に抑制されることが報告されている（非特許文献４および特許文献４）。また、サルモネラ菌、コレラ菌（Vibrio cholerae）、または赤痢菌（Shigella dysenteriae）由来のフラジェリンを細胞内または分泌発現する形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムを含有する耐酸性カプセル製剤からなる経口ワクチンも報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５０４５３４号公報
【特許文献２】特表２００８−５１６６１０号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２９０７７号公報
【特許文献４】国際公開第２０１１／０３４１８１号
【特許文献５】国際公開第２００８／１１４８８９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Structure, 7巻、1353-1363頁、1999年
【非特許文献２】J. Gene. Med., 10巻、177-186頁、2008年
【非特許文献３】J. Clin. Invest., 95巻、521-530頁、1995年
【非特許文献４】Vaccine, 28巻、6684-6691頁、2010年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＨＣＶ感染の治療のために、より有効な治療薬を提供することを目的とする。本発明はさらに、経口投与によりＨＣＶ感染による疾患の治療に有効な治療薬を提供することも目的とする。本発明はまた、ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するための方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＨＣＶ複製に関する領域である非構造タンパク質３（non-structural protein 3：ＮＳ３）の免疫原性に着目し、ＮＳ３タンパク質由来のＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープを含む合成ポリペプチドを設計することにより、ＨＣＶ抗原ポリペプチドを表層に発現および提示するビフィズス菌を作製すること、ならびにこのＨＣＶ抗原ポリペプチド表層発現ビフィズス菌を経口投与した動物において、ＮＳ３特異的な免疫応答を誘導（すなわち、ＮＳ３特異的な腸管粘膜免疫と全身性液性免疫、ならびに細胞性免疫の誘導）することに成功した。さらに、このような合成ポリペプチドの設計を応用することにより、免疫原性ポリペプチドに対して広範に利用可能なビフィズス菌表層発現遺伝子を提供することができることを見出した。【００１２】
本発明は、ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子を提供し、
該遺伝子は、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを含むＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
該基盤ドメインが、
（１）配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３）配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
（４）配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群より選択される１つ以上を含み、
該抗原ペプチドが、配列番号４〜１５のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号４〜１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも１つであり、
該少なくとも１つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。【００１３】
１つの実施態様では、
（１）前記基盤ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（２）前記基盤ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；
（３）前記基盤ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、Ｃ末端側に、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか；または
（４）前記基盤ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドドを含み、Ｃ末端側に、配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）もしくは該アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する。【００１４】
１つの実施態様では、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、該ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質の３’末端側に位置している。【００１５】
本発明はまた、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミドを提供する。【００１６】
本発明はさらに、上記のプラスミドを保持し、上記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。【００１７】
本発明はさらに、ゲノム中に、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、上記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。【００１８】
本発明はまた、上記Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを細胞表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、Ｃ型肝炎ワクチン組成物を提供する。【００１９】
１つの実施態様では、上記ワクチン組成物は、経口ワクチンである。【００２０】
本発明はさらに、ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドを設計する方法を提供し、該方法は、
立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも１つの抗原ペプチドを選択する工程；ならびに
該少なくとも１つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
を含む。【００２１】
１つの実施態様では、上記基盤ドメインは、少なくとも１つのＣＤ４エピトープもしくはＣＤ８エピトープまたはその両方を含む。【００２２】
本発明はまた、癌細胞の表層で特異的に発現するポリペプチドを、細胞表層で発現する形質転換ビフィズス菌を提供する。【００２３】
１つの実施態様では、上記形質転換ビフィズス菌は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。【００２４】
本発明はまた、上記形質転換ビフィズス菌を含む癌ワクチンを提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に免疫原性ポリペプチドを発現および提示することができる。さらに、本発明によれば、例えば、ビフィズス菌の表層に免疫原性のＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを提示するビフィズス菌を経口投与した動物において、Ｃ型肝炎ウイルス抗原に特異的な免疫を誘導することができ、よってワクチン組成物（例えば、経口ワクチン）として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＨＣＶ−１ｂ型のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０８１２０．１）のＮＳ３タンパク質全長領域を含むアミノ酸配列を示す。
【図２】ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のリンカー部位およびＮ末端側のβ−α−βドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの例となるアミノ酸配列１および２を示す。
【図３】野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５における合成ＮＳ３タンパク質の発現に関するウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図４】ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５（１、４）、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４（２、５）、およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５（３、６）の明視野顕微鏡写真（１〜３）および蛍光顕微鏡写真（４〜６）を示す。
【図５】ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体の経日変化を示すグラフである。
【図６】ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス血清に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体の経日変化を示すグラフである。
【図７】ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群を含む各種投与群のマウス脾臓細胞における、ＮＳ３抗原を刺激の有無によるIFN-γ量の比較を示すグラフである。
【図８】ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のα−ヘリカルドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。
【図９】ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３のＣ末端側β−α−β−ドメインに基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。
【図１０】ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ４Ａ領域の一部をＮ末端に連結したＮＳ３のβ−バレルドメインに基づく基盤ドメインのＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結した合成ＮＳ３ポリペプチドの一例であるアミノ酸配列を示す。
【図１１】プラスミドｐＢＡｐｏ−ＣＭＶＮｅｏ／ＮＳ３／４Ａの構築を示す。
【図１２】ＲＴ−ＰＣＲによるＮＳ３／４Ａ断片の検出を示す。
【図１３】ウェスタン・ブロッティングによるＮＳ３／４Ａの検出を示す。
【図１４】ＮＳ３／４Ａを発現するＥＬ４細胞の増殖抑制に関するＮＳ３発現ビフィズス菌ワクチンの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（ビフィズス菌）
本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・パーブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム（B. pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナル（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・セクラル（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカードビ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B. thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム（B. thermophilum）が挙げられる。また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。
【００２８】
これらの菌株は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B．longum）JCM1217（ATCC15707）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）ATCC11863、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61巻、1211-1212頁、1997年）などが挙げられる。
【００２９】
（ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質）
ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（ＧＬＢＰ）は、ビフィズス菌が有するラクト−Ｎ−ビオース（すなわち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｄ−グルコサミン）およびガラクト−Ｎ−ビオース（すなわち、Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｄ−ガラクトサミン）を輸送するＡＢＣタンパク質（ATP Binding Cassette protein）ファミリーに属する膜タンパク質である。ＡＢＣタンパク質とは、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のＡＢＣタンパク質が存在している。そのため、ＡＢＣタンパク質であるＧＬＢＰは、ＧＬＢＰ表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217（ATCC15707）株由来のＧＬＢＰは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する（対応する塩基配列は配列番号１に示す）。
【００３０】
ＧＬＢＰの構造は天然に存在するＧＬＢＰに限定されず、ビフィズス菌の細胞表層に発現する能力を有していれば、該ＧＬＢＰを構成するアミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。
【００３１】
（免疫原性ポリペプチド）
本発明においては、ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドは、立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインと、少なくとも１つの抗原ペプチドとで構成される。該少なくとも１つの抗原ペプチドは、該基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側のいずれかに連結される。
【００３２】
「免疫原性」とは、抗原が抗原特有のＴ細胞応答（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）を誘導することができることを意味する。
【００３３】
基盤ドメインとしては、立体構造を保持し（例えば、結晶構造上で二次構造（例えば、β−シートまたはα−ヘリックス）を形成する）、かつ細胞分泌能を有する（例えば、連続した塩基性アミノ酸残基を含まない、または含まないように改変された）領域を用いることができる。立体構造を保持するドメインとしては、α−β−αドメイン、β−バレルドメイン、α−ヘリックスドメインなどが挙げられる。タンパク質の立体構造は、例えば、当業者が通常用いるＸ線結晶構造解析によって決定することができ、基盤ドメインは、公知または推定のＸ線構造解析情報に基づいて選択することができる（例えば、Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；Bioinformatics, 22巻, 195-201頁, 2006年；およびProtein Science, 2巻, 305-314頁, 1993年）。基盤ドメインは、好ましくは、ドメイン内に少なくとも１つのＣＤ４エピトープおよび／またはＣＤ８エピトープを含む。
【００３４】
「細胞分泌能」とは、ポリペプチド（タンパク質）が、ビフィズス菌の細胞膜上の輸送装置によって細胞外に分泌される能力を有することを意味する。細胞分泌能を有するには、領域が塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）を２アミノ酸以上連続して含まない（すなわち、領域中の塩基性アミノ酸の前および後のアミノ酸が、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸である）ことが望ましい。領域中に２アミノ酸以上連続する塩基性アミノ酸が含まれる場合、以下に説明するように、別のアミノ酸と置換することによって、当該領域を改変することもできる。
【００３５】
「抗原ペプチド」とは、抗原性を発揮する任意のペプチドを意味する。抗原性を発揮するペプチドは、ＣＤ４エピトープ（ヘルパーＴ細胞認識エピトープ）およびＣＤ８エピトープ（細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ）を包含する。このようなペプチドは、例えば、当業者が通常用いるエピトープマッピングによって決定し、入手することができる。
【００３６】
抗原ペプチドは、所望の特性（特に抗原性）を発揮する能力を有する限り、エピトープを構成するアミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。例えば、抗原ペプチドは、エピトープが由来する（すなわち、本来存在する）タンパク質内の該エピトープのＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１〜５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該エピトープのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該エピトープのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３７】
基盤ドメインが由来する本来のタンパク質の対応する立体構造領域のアミノ酸配列内に同種または異種の塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）が２アミノ酸以上連続する場合、望ましい作用（基盤ドメインの立体構造および分泌能）を奏するように別のアミノ酸に置換され得る。２アミノ酸以上連続する塩基性アミノ酸は全て置換される必要はなく、その中の１つの塩基性アミノ酸を除いて残りが置換されればよい。置換後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸以外であればよく、例えば、アラニン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、好ましくは、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、より好ましくは、グルタミンとロイシンとの順に配列されるように置換され得る。基盤ドメインは、そのドメインの立体構造を保持することができ、かつ細胞分泌能を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。また、複数種の基盤ドメインを用いてもよい。基盤ドメインが由来する（すなわち、本来存在する）タンパク質内の基盤ドメインのＮ末端および／またはＣ末端の領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１〜５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該基盤ドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該基盤ドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００３８】
上記１以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を有する変異体は、好ましくは、保存的に改変された変異体である。「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一アミノ酸配列をコードする核酸、および１つ以上の同類置換を有するアミノ酸配列を包含する。同類置換の例は、以下のグループのうちの１つにおけるアミノ酸と同グループの別のアミノ酸の交換である：
（１）疎水性：イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、トリプトファン、グリシン；
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン；および
（７）小さなアミノ酸：グリシン、アラニン、セリン。
【００３９】
そのような変異体のアミノ酸配列は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有する。「配列同一性パーセント」および「配列同一性％」という用語は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列の比較もしくはアライメントによって見つけられる配列同一性の割合を意味する。同一性パーセントは、配列を並べ、２つの整列配列間の一致の正確な数を計算し、短配列の長さで割り、その結果に１００をかけることによって２つの分子間の配列情報の直接比較によって決定され得る。同一性パーセントの計算のためのアルゴリズムは、スミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムである（例えば、Proteins, 48巻、367-376頁、2002年；Bioinformatics, 17巻、327-337頁、2001年）。
【００４０】
抗原ペプチドは、基盤ドメインと組み合わせてビフィズス菌細胞表層に発現および提示されることにより、免疫原性を発揮できる。少なくとも１つの抗原ペプチドは、基盤ドメインのＮ末端側およびＣ末端側の一方または両側に付加され得る。例えば、付加される抗原ペプチドが１つより多い場合、基盤ドメインは、各抗原ペプチドをその片側または両側に付加し得る。基盤ドメインがエピトープ領域を有する場合、例えば、連結される抗原ペプチドは、該抗原ペプチドによるエピトープと該基盤ドメイン内のエピトープとによって免疫原性を発揮できるように選択され得る。
【００４１】
以下、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドの例を挙げて説明する。
【００４２】
図１は、ＨＣＶ−１ｂ型のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０８１２０．１）のＮＳ３タンパク質全長領域を含むアミノ酸配列（配列番号３）を示す。図１中の１０２７位〜１６５７位のアミノ酸配列がＮＳ３の全長である（本明細書中において、アミノ酸の位置番号について特に記載しない限り、ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチド全長における位置に基づく）。ＮＳ３タンパク質は、β−バレルドメイン（１０２７位〜１１９５位）、リンカー部位（１１９６位〜１２１５位）、２つのβ−α−β−ドメイン（Ｎ末端側ドメイン１２１６位〜１３５０位とＣ末端側ドメイン１３５１位〜１５０９位）、およびα−ヘリカルドメイン（１５１０位〜１６５７位）から形成されている（非特許文献１）。
【００４３】
図１は、ＮＳ３タンパク質領域におけるＣＤ８エピトープ（図１中、下線で示す）およびＣＤ４エピトープ（図１中、二重下線で示す）の分布もまた示す。図１中、ＣＤ８エピトープは、
１０６７位〜１０８６位：ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、
１１６９位〜１１７７位：ＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）、
１２９１位〜１２９８位：ＩＴＹＳＴＹＧＫ（ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、
１３７２位〜１３８０位：ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、
１３９１位〜１３９９位：ＬＩＦＣＨＳＫＫＫ（ＣＤ８エピトープ５：配列番号８）、
１４０６位〜１４１４位：ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、
１４３５位〜１４５４位：ＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）、および
１６２９位〜１６３７位：ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）であり、ＣＤ４エピトープは、
１１３０位〜１１４９位：ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧＤＳＲ（ＣＤ４エピトープ１：配列番号１２）、
１２０２位〜１２２０位：ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、
１３０３位〜１３３０位：ＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）、および
１５３１位〜１５４７位：ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）である。
【００４４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドの基盤ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる：
（１）ＨＣＶ−１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のリンカー部位（１１９６位〜１２１５位）およびＮ末端側β−α−βドメイン（１２１６位〜１３５０位）に基づく基盤ドメイン（図２）
ＶＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹＭＳＫＡＨＧＶＤＰＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴＴＧＡＰＩＴＹＳＴＹＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬＡＴＡＴ（配列番号１６）；
（２）ＨＣＶ−１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のα−ヘリカルドメイン（１５１０位〜１６５７位）に基づく基盤ドメイン（図８）
ＧＭＦＤＳＳＶＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴＫＱＡＧＤＮＦＰＹＬＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲＡＫＡＰＰＰＳＷＤＱＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨＰＩＴＫＦＩＭＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶＴ（配列番号１７）；
（３）ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３タンパク質のＣ末端側β−α−β−ドメイン（１５１０位〜１６５７位）に基づく基盤ドメイン（但し、１３５１位〜１３５３位の３アミノ酸が欠失し、そしてＮＳ３の下流側β−α−β−ドメインの１３９８〜１３９９位の２つのＫ（リジン）をＱ（グルタミン：１３９８位）、Ｌ（ロイシン：１３９９位）に置換したもの）（図９）
ＳＶＴＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹＧＫＡＩＰＬＥＡＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＱＬＣＤＥＬＡＡＫＬＳＡＬＧＶＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＩＩＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴＶＰＱＤＡＶＳＲＳＱＭＱＧＲＴＧＲＧＲＧＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥＲＰＳ（配列番号１８）；および
（４）ＮＳ４Ａ領域の一部（例えば、１６７７位〜１６９０位）をＮ末端に連結したＮＳ３タンパク質のβ−バレルドメイン（１０２７位〜１１９５位）に基づく基盤ドメイン（但し、１０２７〜１０２８位の２アミノ酸および１１９５位のアミノ酸が欠失し、そして１１４４〜１１４５位の２つのＲ（アルギニン）をＱ（グルタミン：１１４４位）、Ｌ（ロイシン：１１４５位）に置換したもの）（図１０）
ＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭＴＰＣＴＣＧＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧＧＰＬＬＣＰＳＧＨＶＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴＲＧＶＡＫＡＶＤ（配列番号１９：図１０中のＴＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧ（配列番号２０）はＮＳ４Ａ領域に由来する）。
【００４５】
ビフィズス菌表層発現されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）免疫原性ポリペプチドは、上記基盤ドメイン（１）〜（４）の１つ以上を基盤ドメインとして含むことができる。例えば、基盤ドメイン（１）〜（４）は、単独または他の１つ以上の基盤ドメインと組み合わせて用いられ得る。
【００４６】
基盤ドメイン（１）は、例えば、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位〜１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位〜１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位〜１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む。
【００４７】
基盤ドメイン（２）は、例えば、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位〜１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）、およびＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（１６２９位〜１６３７位、ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）を含む。
【００４８】
基盤ドメイン（３）は、例えば、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＬＩＦＣＨＳＫＱＬ（１３９１位〜１３９９位、ＣＤ８エピトープ５のＫＫをＱＬに置換したもの：配列番号２１）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を含む。
【００４９】
基盤ドメイン（４）は、例えば、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲ（１１３０位〜１１４９位、ＣＤ４エピトープ１中のＲＲをＱＬに置換したもの：配列番号２２）、およびＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（１１６９位〜１１７７位、ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）を含む。
【００５０】
基盤ドメインのＮ末端側および／またはＣ末端側に、ＨＣＶ抗原ペプチドの少なくとも１つが連結される。該抗原ペプチドは、例えば、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む：
ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（配列番号４）、
ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧＤＳＲ（配列番号１２）、
ＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（配列番号５）、
ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（配列番号１３）、
ＩＴＹＳＴＹＧＫ（配列番号６）、
ＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（配列番号１４）、
ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（配列番号７）、
ＬＩＦＣＨＳＫＫＫ（配列番号８）、
ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（配列番号９）、
ＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（配列番号１０）、
ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（配列番号１５）、および
ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号１１）。
【００５１】
上記ペプチドは、ＨＣＶ−１ｂ型抗原ポリペプチドのＮＳ３タンパク質に由来するＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープである。ＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープは図１に示すように配置されているが、基盤ドメインに連結される抗原ペプチドのエピトープの種類および個数、基盤ドメインに対する連結させる位置（Ｎ末端側かＣ末端側か）および末端に複数連結させる場合の連結の順序は特に問わない。抗原ペプチドとして、上記基盤ドメイン（１）〜（４）のようなエピトープを含む領域を用いることもできる。抗原ペプチドは、基盤ドメインに配置されているエピトープと重複してもよい。例えば、連結される抗原ペプチドは、該抗原ペプチドによるエピトープと基盤ドメイン内のエピトープとによって免疫原性を発揮できるように選択され得る。
【００５２】
抗原ペプチド内の上記ＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープは、それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。例えば、抗原ペプチドは、上記エピトープが由来する（すなわち、本来存在する）ＮＳ３タンパク質内の該エピトープのＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１〜５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該エピトープのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該エピトープのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ抗原ポリペプチドに用いられる抗原ペプチドは、それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、上記ＣＤ４エピトープまたはＣＤ８エピトープのペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５３】
基盤ドメインとして選択する本来のＮＳ３タンパク質の対応する領域内に塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）が２アミノ酸以上連続する場合、望ましい作用（基盤ドメインの立体構造および細胞分泌能）を奏するように別のアミノ酸に置換され得る。置換後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸以外であればよく、例えば、アラニン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、好ましくは、グルタミン酸、グルタミンおよびロイシンであり、より好ましくは、グルタミンとロイシンとの順に配列されるように置換され得る。
【００５４】
基盤ドメインは、そのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、アミノ酸に１以上（例えば、１または数個）の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。基盤ドメインは、基盤ドメインが由来する（すなわち、本来存在する）ＮＳ３タンパク質内の該基盤ドメインが対応する領域のＮ末端および／またはＣ末端に延びる領域に由来する１以上のアミノ酸（好ましくは、１〜５アミノ酸）からなるアミノ酸配列をさらに付加する、該基盤ドメインのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかの末端から１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を欠失する、または該基盤ドメインのアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸（好ましくは、３アミノ酸以内）を置換する、あるいはこれらの組み合わせを含んでもよい。ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ抗原ポリペプチドに用いられる基盤ドメインは、そのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、上記基盤ドメイン（１）〜（４）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００５５】
基盤ドメイン（１）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側には、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得、そしてＣ末端側には、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれか１つを順不同で含む領域、より好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）を含む領域、あるいは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（１）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図２のアミノ酸配列１および２に示すとおりである（図２中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す）。
【００５６】
基盤ドメイン（２）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得る。Ｃ末端側には、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれか１つを順不同で含む領域、より好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（２）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図８のアミノ酸配列に示すとおりである（図８中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す）。
【００５７】
基盤ドメイン（３）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側に、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し得る。Ｃ末端側には、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位〜１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）を含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（３）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図９のアミノ酸配列に示すとおりである（図９中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す；太字の「ＱＬ」は置換後アミノ酸を示す）。
【００５８】
基盤ドメイン（４）の場合、好ましくは、基盤ドメインのＮ末端側には抗原ペプチドを連結せず、Ｃ末端側に、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位〜１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位〜１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位〜１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む基盤ドメイン（１）（またはそのドメインの立体構造が保持でき、かつ表層発現のための細胞分泌能を有する限り、上記基盤ドメイン（１）のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有する）を含む領域を連結し、さらにＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）の少なくともいずれかを順不同で含む領域、好ましくは、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を（好ましくは、この順で）含む領域を連結し得る（それらが抗原性を発揮する能力を有する限り、明示する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％。さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性％を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含んでもよい）。基盤ドメイン（４）の場合の合成タンパク質の例は、例えば、図１０のアミノ酸配列に示すとおりである（図１０中、基盤ドメインの配列を大文字で表し、抗原ペプチド領域の配列を小文字で表し、そしてＣＤ８エピトープおよびＣＤ４エピトープのそれぞれを下線、二重下線で示す；太字の「ＱＬ」は置換後アミノ酸を示す）。
【００５９】
（ビフィズス菌表層提示融合タンパク質）
本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示される免疫原性ポリペプチドは、ＧＬＢＰとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、Ｎ末端からＧＬＢＰおよび目的の免疫原性ポリペプチドの順に連結されている。
【００６０】
この融合タンパク質を発現するための遺伝子は、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子およびＧＬＢＰをコードする遺伝子を含む（免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子とも称する）。
【００６１】
目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に位置している。免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子は、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子がＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に連結されている融合遺伝子であってもよく、またはＧＬＢＰをコードする遺伝子と目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子が配置されていてもよい。
【００６２】
（形質転換ビフィズス菌の調製）
以下、目的の免疫原性ポリペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順の一例について、説明する。
【００６３】
１．遺伝子の取得
ＧＬＢＰをコードする遺伝子および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該ビフィズス菌のＧＬＢＰの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００６４】
例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）のＧＬＢＰをコードする遺伝子は、Acta Crystallographica Section F.，F63巻、751頁、2007年に記載されたビフィドバクテリウム・ロンガムのＧＬＢＰの構造遺伝子配列から入手可能である。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、入手することができる。
【００６５】
目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、設計したアミノ酸配列から、公知のまたは推定の遺伝子配列情報に基づき、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子配列を決定し、さらに必要に応じて宿主のコドン頻度を考慮して最適化した遺伝子配列を得ることができる。
【００６６】
例えば、基盤ドメイン（１）に基づく合成タンパク質の例である図２のアミノ酸配列１および２のそれぞれをコードする遺伝子配列１および２は、ビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された塩基配列からなる。遺伝子配列１および２の塩基配列はそれぞれ配列番号２５および２７に示されるとおりである（その対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２８に示す）。
【００６７】
基盤ドメイン（２）に基づく合成タンパク質の例である図８のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３３に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号３４に示す）。
【００６８】
基盤ドメイン（３）に基づく合成タンパク質の例である図９のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３５に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号３６に示す）。
【００６９】
基盤ドメイン（４）に基づく合成タンパク質の例である図１０のアミノ酸配列をコードし、かつビフィズス菌のコドン頻度に基づいて最適化された遺伝子の塩基配列は、配列番号３９に示されるとおりである（対応するアミノ酸配列を配列番号４０に示す）。
【００７０】
このようにして得た遺伝子配列に基づいて、コードする遺伝子は、例えば、公知の化学合成によって得ることができる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機により化学合成する方法が挙げられる。また、取得すべき塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に基づいてプライマーを調製し、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。またさらに、公知塩基配列情報に基づき、その全長または一部を化学合成したＤＮＡまたはポリヌクレオチドをプローブとして、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。
【００７１】
また、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、公知のアミノ配列情報からも容易に得ることができる。公知のアミノ配列情報から上記の各タンパク質をコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、公知のアミノ配列をコードする遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって上記ｃＤＮＡライブラリーなどから目的とする遺伝子を増幅する方法、または適切なベクターに組込んだ遺伝子と、上記各タンパク質をコードする遺伝子の一部あるいは全域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などが挙げられる。
【００７２】
上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、上記のようにして取得した遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡが挙げられる。上記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には、上記公知塩基配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００７３】
２．免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子およびビフィズス菌形質転換用ベクターの調製
上記のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子から、免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子または該免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを調製する。免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子は、上述したように、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に位置するように調製される。本発明において、組換え体ＤＮＡは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター（例えば、相同組換え型ベクター）であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、ｐＴＢ６、ｐＢＬ６７、ｐＢＬ７８、ｐＮＡＬ８Ｈ、ｐＮＡＬ８Ｍ、ｐＮＡＣ１、ｐＢＣ１、ｐＭＢ１、ｐＧＢＬ８ｂなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＫＫＴ４２７、ｐＲＭ２などが挙げられる。
【００７４】
発現の安定性および形質転換株の調製のためのＤＮＡの調製の容易さという観点から、上記プラスミドの中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミドと大腸菌のプラスミドとから合成された複合プラスミドが好ましい。
【００７５】
発現ベクターは、形質転換株を選択する観点から、抗生物質耐性、アミノ酸要求性などの選択マーカーを有することが好ましい。
【００７６】
発現ベクターは、ＧＬＢＰと目的の免疫原性ポリペプチドとの融合タンパク質の発現のために、または発現に有利となるように、調節配列を付加したものが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが挙げられる。これらの調節配列は、ビフィズス菌で発現するものであれば、その由来は特に制限はない。
【００７７】
プロモーター配列としては、ビフィズス菌で発現するものであれば特に制限はない。発現効率の観点からは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのヒストン様タンパク（ＨＵ）のプロモーター配列、ＬＤＨプロモーターなどが好ましく用いられる。
【００７８】
また、発現効率を高める観点からは、ターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列としては、上記ＨＵ遺伝子のターミネーター配列が好ましく用いられる。
【００７９】
その他、必要に応じて、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列などを配置することができる。また、ＧＬＢＰをコードする遺伝子と目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子を配置してもよい。
【００８０】
このように、上記のプラスミドに、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列などの調節配列、および選択マーカー遺伝子を導入して、クローニングベクターが調製される。選択マーカーとしては、スペクチノマイシン（ＳＰｒ）、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン（ＴＥＴｒ）、カナマイシン（ＫＭｒ）、ストレプトマイシン（ＳＴｒ）、ネオマイシン（ＮＥＯｒ）などの抗生物質耐性マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＥＰ）などの蛍光マーカー；ＬａｃＺなどの酵素などが挙げられる。
【００８１】
クローニングベクターのプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトを有するリンカーなどを備えていることが好ましい。このようなリンカーを用いることにより、上記融合タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）がプロモーターの下流に、かつ、インフレームで融合タンパク質を発現することができるように、組み込まれる。クローニングベクター用のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＢＬＥＭ１００などが挙げられる（特許第３６４２７５５号公報）。
【００８２】
例えば、このプラスミドｐＢＬＥＳ１００に上記取得したＨＵプロモーター配列、ＧＬＢＰをコードする遺伝子、および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことにより、融合タンパク質をビフィズス菌の表層に発現するベクターが得られる。このような方法で得られる発現ベクターは、ビフィズス菌の形質転換に用いられる。
【００８３】
ビフィズス菌表層発現用ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＪＴ１０１（特許文献４および非特許文献４）、および大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターのｐＪＷ２４１（特許文献４および非特許文献４）もまた挙げられる。プラスミドｐＪＴ１０１は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＣＭ１２１７（ＡＴＣＣ１５７０７）由来ＧＬＢＰ遺伝子（配列番号１および２：特許文献４および非特許文献４）を含み、当該ＧＬＢＰ遺伝子の下流に目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことができる。さらに、ｐＪＴ１０１に組み込んだＧＬＢＰ遺伝子および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子の連結物（免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子）を切り出し、大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターｐＪＷ２４１に組み込むこともできる。
【００８４】
３．融合タンパク質を発現する形質転換ビフィズス菌の調製
組換え体ＤＮＡ、例えば、上記のように調製された発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入し、形質転換ビフィズス菌を調製することができる。
【００８５】
形質転換ビフィズス菌の調製には、ビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドを利用する遺伝子相同組換え法を用いることもできる。遺伝子相同組換え法によれば、免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子（例えば、ＧＬＢＰをコードする遺伝子の３’末端側に目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を連結した融合遺伝子）をビフィズス菌染色体に挿入することが可能である。例えば、ビフィズス菌染色体遺伝子と相同部位を有する温度感受性プラスミド（高温（例えば、４２℃以上）で複製しないプラスミド）が用いられ得る（例えば、Appl. Microbiol. Biotechnol., 95巻、499-509頁、2012年）。より具体的には、ビフィズス菌染色体遺伝子と相同部位を有する温度感受性プラスミドの相同部位間に免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子を挿入し、このプラスミドをビフィズス菌に導入し、高温で培養することにより、遺伝子相同組換えによって当該目的遺伝子が染色体に組み込まれたビフィズス菌を選択的に培養することができる。
【００８６】
形質転換のための発現ベクターまたはビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドの導入は、公知の方法であればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、０．５〜２０ｋＶ／ｃｍ、０．５μｓｅｃ〜１０ｍｓｅｃの条件で行うことが可能である。例えば、２〜１０ｋＶ／ｃｍ、５０μｓｅｃ〜５ｍｓｅｃで行われる。
【００８７】
形質転換株は、融合タンパク質発現ベクターが有する選択マーカー、ビフィズス菌内にて複製可能なプラスミドの性質（例えば、温度感受性）などを利用して選択される。形質転換株を培養する培地としては、宿主微生物それぞれに適した培地、例えば、ブドウ糖血液肝臓（ＢＬ）寒天培地、デ・マン−ロゴサ−シャープ（ＭＲＳ）寒天培地、岐阜大学嫌気性（ＧＡＭ）寒天培地、改良ＧＡＭ（ＴＧＡＭ）寒天培地、ブリッグス（Ｂｒｉｇｇｓ）寒天培地、および酵母エキスブドウ糖ペプトン（ＹＧＰ）寒天培地が挙げられる。これらの培地に選択マーカーに応じて抗生物質を添加し、あるいはアミノ酸を欠失または添加し、選択圧とする。
【００８８】
なお、培養条件は、ビフィズス菌が培養可能な嫌気培養で行うことが好ましい。嫌気性条件下で培養することにより、好気性菌の増殖を防ぐことができる。嫌気性条件下とは、ビフィズス菌が増殖可能な程度の嫌気度を保てる密閉容器中であり、例えば、嫌気チャンバーまたは嫌気ボックスなどにおいて可能な条件が挙げられる。培養温度は、ビフィズス菌を培養可能な温度であればよく、通常、４℃〜４５℃、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２４℃〜３７℃である。
【００８９】
なお、ＧＬＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を表層提示させるためのベクターだけでなく、ＧＬＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質との融合タンパク質を表層提示させるためのベクターも同時に導入した形質転換ビフィズス菌を調製してもよい。
【００９０】
融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を、形質転換ビフィズス菌からプラスミドを抽出して、制限酵素処理後に電気泳動で確認してもよく、制限酵素処理断片の配列を直接シーケンスしてもよい。
【００９１】
得られた形質転換ビフィズス菌の融合タンパク質の発現の確認は、例えば、ウエスタンブロッティング法で行うことができる。まず、形質転換ビフィズス菌を、例えば、非イオン性界面活性剤を用いて、溶菌する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）などが挙げられる。次いで、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液などを用いて希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、トリス−グリシン−ポリアクリルアミドゲルなどを用いて電気泳動を行う。次いで、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＦ）膜などに転写し、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））と反応させ、さらに蛍光標識を有する２次抗体で反応させることにより、融合タンパク質の発現を確認することができる。
【００９２】
特に、目的の免疫原性ポリペプチドがビフィズス菌表層に提示されていることは、形質転換ビフィズス菌に対して、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって容易に確認し得る。免疫原性ポリペプチドが表層発現するビフィズス菌の免疫原性は、糞便に含まれる抗原特異的ＩｇＡ抗体（局所的な粘膜免疫の誘導）、血清に含まれる抗原特異的ＩｇＧ抗体（全身性免疫の誘導）、ならびに抗原刺激による細胞内サイトカイン（例えば、インターフェロンγ（IFN-γ））産生の誘導などによって決定することができる。
【００９３】
目的の免疫原性ポリペプチドの表層提示が確認された形質転換ビフィズス菌は、当業者が通常用いる方法により培養し、回収して、そのまま製剤の製造に用いてもよい。あるいは、乾燥して用いてもよい。乾燥は、凍結乾燥、低温乾燥などの低温処理を行い、腸内環境あるいは培地などの生育条件下に曝したときに生育可能となるような処理方法により行われる。
【００９４】
形質転換ビフィズス菌は、公知の方法で後処理を行ってもよい。例えば、遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または乳酸配合リンゲル液などの当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。
【００９５】
（形質転換ビフィズス菌含有ワクチン組成物）
本発明のワクチン組成物は、上記形質転換ビフィズス菌を有効成分として含有する。例えば、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドを表層発現する形質転換ビフィズス菌の場合、本発明のワクチン組成物は、ＨＣＶ感染に対する適切な免疫応答を十分に誘導する量で、患者に投与され得る。
【００９６】
ワクチンのために、形質転換ビフィズス菌は、その生菌の冷凍、凍結乾燥、懸濁液、または細胞ペーストとして、あるいは固型媒またはゲルもしくは液状媒と組み合わせて保存され得る。投与製剤の剤型としては、限定されないが、粉末、該凍結乾燥粉末を懸濁した液剤、または該凍結乾燥粉末を封入するカプセル剤などが好ましい。カプセル剤として、例えば、特許文献５に記載の耐酸性カプセルが好適に用いられ得る。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与が挙げられる。経口投与または経鼻投与が好ましく、経口投与がより好ましい。
【００９７】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などが挙げられる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などが挙げられる。
【００９８】
経口投与用の液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。
【００９９】
非経口投与用の製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えば、カカオ脂、水添油脂または水添脂肪酸などの担体を用いて調製することができる。
【０１００】
非経口投与用の製剤のうち噴霧剤は、ヒトの口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である形質転換ビフィズス菌を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。形質転換ビフィズス菌および用いる担体の性質により、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。非経口投与用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。
【０１０１】
本発明のワクチン組成物内の形質転換ビフィズス菌の含有量は、製剤の種類または剤形、投与対象の年齢、性別、体重または疾患状態、投与または摂取の方法、時期または時間などに応じて適宜設定され得る。
【０１０２】
本発明の形質転換ビフィズス菌は、例えば、免疫原性ポリペプチドがＨＣＶ抗原ポリペプチド（例えば、ＮＳ３由来抗原ポリペプチド）である場合、ＨＣＶの感染に対して有効な経口ワクチンとなる。本発明の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチド表層発現形質転換ビフィズス菌を含むワクチン組成物は、ＨＣＶ感染症の予防または治療のいずれにも用いられ得る。さらに、本ワクチン組成物は、既存のインターフェロン療法等と併用することもできる。
【０１０３】
本発明の形質転換ビフィズス菌は、ＮＳ３／４Ａを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制した（実施例９、図１４）。このことは、本発明の形質転換ビフィズス菌がワクチンとして機能し、ＮＳ３に対する細胞性免疫を活性化したことを意味すると考えられる。すなわち、本発明のビフィズス菌を経口投与することで、ＮＳ３タンパク特異的な細胞障害性T細胞（cytotoxic T lymphocyte; CTL）が誘導され、そのCTLがＮＳ３／４Ａを発現する腫瘍細胞ＥＬ４を攻撃し、腫瘍の増殖を抑制したと考えられる。このことから、本発明のビフィズス菌を含む経口ワクチンにより、抗原ペプチド特異的な細胞性免疫が誘導されていることが確認された。
【０１０４】
本発明の形質転換ビフィズス菌は、腫瘍細胞の増殖を抑制する用途にも使用しうる。実施例９に示すように、ＮＳ３タンパク質を発現するB. longum 2165を投与することにより、ＮＳ３タンパク質を発現する腫瘍の増殖が抑制された。これは、B. longum 2165の表層で発現するＮＳ３が抗原として機能し、ＮＳ３特異的なCTLの誘導を引き起こし、そのCTLがＮＳ３を発現する腫瘍の増殖を抑制したためと考えられる。
【０１０５】
このことから、細胞表層で腫瘍特異的に発現し、正常細胞で全く発現しないポリペプチドを、ビフィズス菌の表層で発現させ、投与することにより、腫瘍特異的な細胞性免疫が惹起され、腫瘍細胞の増殖が抑制されると考えられる。
【０１０６】
細胞表層で腫瘍特異的に発現し、正常細胞で全く発現しない抗原（癌抗原）は、これまでに多数報告されており、例えば、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるMAGE、MART-1、乳癌などにおけるHER2/neu、大腸癌におけるCEA、各種白血病や各種癌におけるWT1、NY-ESO-1、PSMAなどがよく知られているがこれらに限られない。また、前記癌抗原は、in silicoでも、wetな実験によっても同定することができる。In silicoで細胞表層で発現すると推定される遺伝子を同定し、マイクロアレイを作成して発現パターンを調べることにより、癌抗原か否かの１次スクリーニングをすることが可能である。癌抗原の遺伝子発現の有無は、mRNAを調製し、RTーPCRを行うことにより確認することができ、また、抗体を作成してウェスタン・ブロットやELISA等当業者に周知な方法でタンパク質の発現を確認することができる。あるいは、マイクロアレイを用いて癌特異的に発現する遺伝子を網羅的にスクリーニングし、その中から細胞表層で発現するものを同定することもできる。
【０１０７】
これらの癌抗原タンパク質（またはポリペプチド）を、ビフィズス菌の細胞表層で発現させ、その菌を経口投与することにより、癌ワクチンとして、癌の予防、治療に使用できると考えられる。
【０１０８】
癌抗原は、アミノ酸配列がわかれば、ヒトゲノム中の対応する遺伝子を同定し、プライマーをデザインしてPCR法により増幅して該癌抗原ポリペプチドをコードする遺伝子断片をクローニングすることは当業者にとって周知の技術である。クローニングした増幅断片をビフィズス菌の細胞表層発現ベクターに組み込み発現させることも技術的には容易である。それにより、各種癌抗原に応じた癌ワクチンが製造できる。このような癌ワクチンを投与することにより、癌の予防、治療が可能になると考えられる。本発明の癌ワクチンに含まれる形質転換ビフィズス菌は生菌であっても、殺菌した死菌であってもよい。
【実施例】
【０１０９】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。【０１１０】
（実施例１：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計）
ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３リンカー部位（１１９６位〜１２１５位）および上流側のβ−α−βドメイン（１２１６位〜１３５０位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図２に示す２つのアミノ酸配列を設計した。【０１１１】
アミノ酸配列１（図２の＞１：配列番号２３）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。【０１１２】
アミノ酸配列２（図２の＞２：配列番号２４）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）を含む領域を連結している。【０１１３】
上記基盤ドメインは、ＨＣＶ−１ｂ型抗原ポリペプチドの１１９６位〜１３５０位に対応する領域であり、基盤ドメイン自体は、ＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位〜１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位〜１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位〜１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む。【０１１４】
（実施例２：ＮＳ３タンパク質表層発現形質転換ビフィズス菌の調製）
実施例１で設計したアミノ酸配列１および２（それぞれ配列番号２３および２４）を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列１および２（それぞれ配列番号２５および２７；それぞれ対応するアミノ酸配列を配列番号２６および２８に示す）を設計し、これらの遺伝子配列情報に基づき、それぞれの遺伝子断片を全合成した（前者を「長型」、後者を「短型」ともいう）。遺伝子断片の全合成はGenScript社に委託した。得られた遺伝子断片をＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて処理し、同様にＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて処理した組換えプラスミドｐＪＴ１０１（特許文献４および非特許文献４）に挿入した。プラスミドｐＪＴ１０１は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＣＭ１２１７（ＡＴＣＣ１５７０７）由来ＧＬＢＰ遺伝子（配列番号１および２：特許文献４および非特許文献４）を含む。上記挿入によりＧＬＢＰ遺伝子の下流に「長型」または「短型」の遺伝子断片を連結させた。【０１１５】
ＧＬＢＰ遺伝子の下流に「長型」遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、フォワードプライマー（5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：配列番号２９）およびリバースプライマー（5’-TTTCATCTGTGCATAGTCGACTTCAGGTGTTGCAGTCGA-3’：配列番号３０）のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。他方、ＧＬＢＰ遺伝子の下流に「短型」遺伝子の融合遺伝子を含むプラスミドを鋳型にして、フォワードプライマー（5’-GGAAAACTGTCCATAGATGGCGAGGCGAACGCCACGGT-3’：配列番号２９）およびリバースプライマー（5’-TTTCATCTGTGCATATTCACAGCGGGATGGCCTTGCCGTAGA-3’：配列番号３１）のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターのｐＪＷ２４１（特許文献４および非特許文献４）をＮｄｅＩで切断し、この部位に、得られたＰＣＲ増幅断片をIn-fusion法（クローンテック・ラボラトリーズ社:Clontech Laboratories, Inc.）を用いて連結した。これにより得られた「長型」の融合遺伝子を含む表層発現ベクターをｐＪＷ２１６５、および「短型」の融合遺伝子を含む表層発現ベクターをｐＪＷ２１６４と命名した。【０１１６】
得られた表層発現ベクターであるｐＪＷ２１６５またはｐＪＷ２１６４をエレクトロポレーション法にて、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株（Biosci. Biotechnol. Biochem., 61巻、1211-1212頁、1997年）に導入し、形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムを得た。ここで、ｐＪＷ２１６５を導入した形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５、ｐＪＷ２１６４を導入した形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４と命名した。さらにＧＬＢＰのみを発現するビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２）を作製した。【０１１７】
（実施例３：形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムのＮＳ３タンパク質表層発現）
上記の方法で作製したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５がＧＬＢＰ−ＮＳ３融合タンパク質を正しい分子量で発現しているか、ウエスタンブロット法により確認を行った。ＧＡＭ培地（「ニッスイ」：日水製薬株式会社）で一晩嫌気培養したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５を洗浄後、１％TritonX/ＰＢＳで希釈し、菌液をポリアクリルアミド電気泳動で分離した。ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）/０．１％Tween20/生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて４℃で一晩ブロッキングを行った。1000倍希釈rabbit anti-NS3 IgG（オペロン社：operon）、1000倍希釈goat anti-rabbit IgG HRP Conjugated（サンタクルーズ社：Santa Cruz）の順にそれぞれ室温で１時間振盪反応させ、化学発光法によりＧＬＢＰ−ＮＳ３融合タンパク質の検出を行った。【０１１８】
ウエスタンブロッティング法の結果を図３に示す。図３において、各レーンは以下の通りである：Ｍ．分子量マーカー；１．野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５；２．ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４；および３．ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５。ＧＬＢＰ−ＮＳ３融合タンパク質の分子量は、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４で６６ｋＤａ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５で６９ｋＤａであり、図３中のそれぞれのバンドの位置を矢印で示す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５は、いずれも目的の位置にバンドを確認することができ（それぞれレーン２および３）、設計通りの分子量のタンパク質を発現していることが分かった。【０１１９】
さらに、ＮＳ３タンパク質がビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５の表層に発現しているかを確認するため、菌体の免疫染色を行った。ＧＡＭ培地で一晩嫌気培養したビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５を洗浄後、ＰＢＳで希釈し、１％−ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて37℃で30分ブロッキングを行った。50倍希釈rabbit anti-NS3 IgG（operon）、1000倍希釈Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)（インビトロジェン社:invitrogen)の順にそれぞれ37℃で１時間反応させ、蛍光顕微鏡で菌体の蛍光発色を観察した。【０１２０】
免疫染色法の結果を図４に示す。各写真は以下の通りである：１、４：ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５；２、５：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４；３、６：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５；１〜３：明視野（400倍）；４〜６：蛍光顕微鏡下（400倍）。野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５と比較して、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５は強い蛍光を確認することができ、ビフィズス菌表層に目的のＮＳ３タンパク質が発現していることが分かった。【０１２１】
（実施例４：形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムのマウスへの経口投与）
形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをGAM培地で一晩嫌気培養し、5×108CFU/mlとなるようＰＢＳで希釈した。この菌液を100μlずつ８週齢のメスBALB/Cマウスに胃内経口投与を行った。投与は週３回、４週間行った。コントロールとしてＰＢＳ投与群、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群、およびＧＬＢＰのみ発現するビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群を用い、同じ条件で投与を行った。投与開始日を１日目とし、０、１４、２８日目に尾静脈採血を行うとともに糞便を回収した。２９日目にはマウスに麻酔処置をした後、頸椎脱臼により安楽死させ、解剖し脾臓を摘出した。【０１２２】
（４−１：ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ−ＮＳ３抗原特異的抗体の検出）
糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体を酵素結合イムノソルベント（ELISA）法により検出した。糞便を５％スキムミルク/0.1mg/ml大豆トリプシン阻害剤/2mMフッ化フェニルメチルスルホニル/ＰＢＳに溶解させ、糞便溶解液を作製した。９６穴イムノプレート（NUNC）にＧＳＴ−ＮＳ３抗原ペプチドをコーティングし、５％スキムミルク/ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロッキングを行った。適当な濃度に希釈した糞便溶解液、1000倍希釈goat anti-mouse IgA HRP（Santa Cruz）の順にそれぞれ３７℃で1.5時間反応させた。最後にＴＭＢ発色試薬（ベクトン・ディッキンソン社：BD）を添加し２０分間発色させ、波長450nmで吸光度を測定した（OD 450）。また、同様に尾静脈採血で得た血液の血清中に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体を1000倍希釈goat anti-mouse IgG HRP（R&Dシステムズ社：R＆D）を用いてELISA法により検出した。【０１２３】
糞便に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＡ抗体を調べたELISA法の結果を図５に示す。図５中の記号は以下の通りである：黒四角：ＰＢＳ投与群；黒三角：ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群；黒丸：ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群；白三角：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群；および白丸：ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群。＊はｐ＜０．０５にて有意差があることを表す。２８日目に採取した糞便について、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群はＰＢＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群と比較して有意に高い吸光度（OD 450）を示した（ｐ＜０．０５）。一方、有意差は認められなかったものの、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４もわずかに高い値を示した。【０１２４】
血清に含まれるＮＳ３抗原特異的ＩｇＧ抗体を調べたELISA法の結果を図６に示す。図６中の記号は図５と同様である。＊＊はｐ＜０．０１にて有意差があることを表す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５ともに経日的にＩｇＧ抗体量が上昇し、１４、２８日目においてＰＢＳ、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群と比較し有意に高い値を示した（ｐ＜０．０１）。【０１２５】
ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５ともに、経口投与による局所的な粘膜免疫の誘導および全身性の免疫応答の誘導を確認することができた。【０１２６】
（４−２：抗原刺激による脾臓細胞のサイトカイン産生）
脾臓を70μlセルストレイナー（BD）を用いて細分化し、0.83% NH4Cl/PBSで溶血させた後、洗浄した。細胞を4×105細胞／穴となるよう１０％FBS/RPMI培地で懸濁し、ＧＳＴ−ＮＳ３抗原ペプチド2μgで刺激しながら96穴マイクロプレートで３日間培養した。Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit（R&D）を用いて、脾臓細胞の培養上清中のインターフェロンγ（IFN-γ）量を測定した。【０１２７】
結果を図７に示す。図７の縦軸は、脾臓細胞の培養上清中のIFN-γ量（pg/ml）である。左から順に、ビフィドバクテリウム・ロンガム２４５投与群、ビフィドバクテリウム・ロンガム２０１２投与群、ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群、およびビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群であり、黒棒グラフはＮＳ３抗原刺激なし（対照群）、そして白棒グラフはＮＳ３抗原刺激ありを表す。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６５投与群は、抗原刺激によりIFN-γ産生量が増加し、同じ条件で培養した非刺激対照群と比較して有意な差が認められた（ｐ＜０．０１）。ビフィドバクテリウム・ロンガム２１６４投与群においては、有意な差は見られなかったが、抗原刺激によりIFN-γ産生量は増加した。【０１２８】
（実施例５：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計２）
ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３  α−ヘリカルドメイン（１５１０位〜１６５７位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図８に示すアミノ酸配列を設計した。【０１２９】
図８のアミノ酸配列（配列番号３２）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。基盤ドメインは、ＨＣＶ−１ｂ型抗原ポリペプチドの１５１０位〜１６５７位に対応する領域であり、基盤ドメイン自体は、ＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位〜１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）、およびＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（１６２９位〜１６３７位、ＣＤ８エピトープ８：配列番号１１）を含む。【０１３０】
図８のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３３；対応するアミノ酸配列を配列番号３４に示す）を設計した。【０１３１】
（実施例６：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計３）
ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ３  下流側β−α−β−ドメイン（１３５１位〜１５０９位）に基づく基盤ドメインのＮ末端およびＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図９に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、１３５１位〜１３５３位の３アミノ酸を欠失させ、１３９８〜１３９９位の２つのＫ（リジン）をＱ（グルタミン：１３９８位）およびＬ（ロイシン：１３９９位）に置換した。【０１３２】
図９のアミノ酸配列（配列番号３５）は、基盤ドメインのＮ末端側にＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）を含む領域を連結し、そしてＣ末端側にＴＰＡＥＴＳＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰＧ（１５３１位〜１５４７位、ＣＤ４エピトープ４：配列番号１５）を含む領域を連結している。基盤ドメイン自体は、ＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＬＩＦＣＨＳＫＱＬ（１３９１位〜１３９９位、ＣＤ８エピトープ５のＫＫをＱＬに置換したもの：配列番号２１）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）を含む。【０１３３】
図９のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３６；対応するアミノ酸配列を配列番号３７に示す）を設計した。【０１３４】
（実施例７：ビフィズス菌表層発現用ＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチド遺伝子の設計４）
ＨＣＶ−１ｂ型ポリペプチドのＮＳ４Ａ領域の一部（１６７７位〜１６９０位）をＮ末端に連結したＮＳ３のβ−バレルドメイン（１０２７位〜１１９５位）に基づく基盤ドメインのＣ末端にＮＳ３由来抗原ペプチドを連結するように、図１０に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、１０２７〜１０２８位の２アミノ酸および１１９５位のアミノ酸を欠失させ、そして１１４４〜１１４５位の２つのＲ（アルギニン）をＱ（グルタミン：１１４４位）およびＬ（ロイシン：１１４５位）に置換した。【０１３５】
図１０のアミノ酸配列（配列番号３８）は、上記基盤ドメインのＣ末端側にＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＴＰＰＡＶＰ（１２０２位〜１２２０位、ＣＤ４エピトープ２：配列番号１３）、ＩＴＹＳＴＹＧＫ（１２９１位〜１２９８位、ＣＤ８エピトープ３：配列番号６）、およびＧＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＳＴＳＩＬＧＩＧ（１３０３位〜１３３０位、ＣＤ４エピトープ３：配列番号１４）を含む基盤ドメイン（１）の領域、ならびにＥＩＰＦＹＧＫＡＩ（１３７２位〜１３８０位、ＣＤ８エピトープ４：配列番号７）、ＫＬＳＡＬＧＶＮＡ（１４０６位〜１４１４位、ＣＤ８エピトープ６：配列番号９）、およびＶＡＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤＣ（１４３５位〜１４５４位、ＣＤ８エピトープ７：配列番号１０）をこの順に含む領域を連結している。上記ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ３のβ−バレルドメインに基づく基盤ドメイン自体は、ＱＳＦＬＡＴＣＩＮＧＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ（１０６７位〜１０８６位、ＣＤ８エピトープ１：配列番号４）、ＬＹＬＶＴＲＨＡＤＶＩＰＶＲＱＬＧＤＳＲ（１１３０位〜１１４９位、ＣＤ４エピトープ１中のＲＲをＱＬに置換したもの：配列番号２２）、およびＬＬＣＰＳＧＨＶＶ（１１６９位〜１１７７位、ＣＤ８エピトープ２：配列番号５）を含む。【０１３６】
図１０のアミノ酸配列を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/）にあわせた遺伝子配列（配列番号３９；対応するアミノ酸配列を配列番号４０に示す）を設計した。【０１３７】
（実施例８：皮下腫瘍用形質転換EL4細胞の作成）
マウスにHCVが感染しないことから、マウスに皮下腫瘍を作成し、その増殖抑制効果により本発明のワクチンの効果を評価するために以下の実験を行った。【０１３８】
プラスミドpSG5/NS3/4Aより、NS3/4Aをコードする断片をBamHIで切り出し、プラスミドpBApo-CMV Neo（TAKARA）のBamHIサイトに挿入することにより、プラスミドpBApo-CMV Neo/NS3/4Aを得た（図１１）。このプラスミドpBApo-CMV Neo/NS3/4Aを調製し、TransIT-293 Transfection Reagent（タカラバイオ株式会社製）を用いてEL4細胞（マウスリンパ腫細胞）に導入した。G418を８００μグラム／ｍｌ含む培地で形質転換EL４細胞を選択し、限界希釈法により形質転換EL４細胞（NS3/4A-EL4細胞）のクローン株を得た。【０１３９】
形質転換細胞であることを確認するために、RT-PCRおよびウエスタン・ブロッティングを行った。RT―PCRは常法により、全RNAからｃDNAを調製し、プライマー（配列番号４１：CGGCCCTCAGGCATGTTCGATTCTTC、配列番号４２：CCGGACAAGATGATCCTGCCCACAATG）を用いて、９４℃にて、１２０秒保温後、９８℃、１０秒、６４℃、３０秒、６８℃、４０秒を３０サイクル行い、NS3／４AをコードするDNA断片を増幅させ、アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウムにより染色し、UV下で増幅したDNA断片を確認した（図１２）。図１２において、１はプラスミドpSG5/NS3/4A、２は形質転換EL4細胞、３はMock感染EL4細胞であり、１および２において目的のバンドが確認された。【０１４０】
ウェスタン・ブロッティングは、細胞抽出液をSDS―PAGEにより分画し、ナイロン膜に転写してブロッキング後、抗体によりNS3／４Aタンパク質を検出することにより行った（図１３）。図１３では、形質転換EL4細胞において７３ｋDaのNS3/4Aタンパク質のバンドが検出された（レーン２）。また、コントロールのレーン３にはNS3/4Aタンパク質のバンドは検出されなかった。これにより、NS3/4A-EL4細胞のクローン株であることが確認された。【０１４１】
（実施例９：B. longum 2165経口投与による抗腫瘍効果の検討）
皮下接種前日に体重を測定し（Day0）、形質転換体であることが確認されたNS3/4A-EL4細胞をC57BL/6Nマウスの皮下に移植した。移植は、1×106 個の細胞を200μl のRPMI1640＆マトリゲルに包埋して皮下接種した。皮下接種日をDay１として、NS3/4Aタンパク質を表層発現するビフィズス菌の経口投与実験を開始した。【０１４２】
経口投与群は、各実験区毎に個体数６匹を用いて、PBS、B. longum 2012 (GLBP遺伝子発現株)、B. longum 2165 (GLBP-NS3遺伝子発現株)、不活化B. longum 2165（5×108 CFU/ml 菌液 250μl を65℃、5分間加熱）をそれぞれの実験区に週３回、５×１０７CFUを100μlのPBSに溶解して投与した（計1３回）。その後、腫瘍長径および短径を２日毎に計測した。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、PBS、GLBP投与区では、腫瘍体積が顕著に増大したが、2165（GLBP-NS3）および不活化2165（GLBP-NS3）を投与した区においては、有意に腫瘍体積の増加が抑制されていた。このことは、GLBP-NS3遺伝子発現ビフィズス菌がNS3/4Aタンパク質を細胞表層で発現する腫瘍細胞の増殖の抑制に効果があることを示している。また、この効果は、生菌のみならず、不活化した菌においても観察された。よって、ビフィズス菌の生死と関係なく抗原としての効果を有すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に、免疫原性を有するポリペプチドを発現および提示することができる。さらに、本発明によれば、ビフィズス菌の表層に例えばＣ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドを提示するビフィズス菌を経口投与した動物において、ＮＳ３特異的な免疫を誘導することができ、よってワクチン組成物（例えば、経口ワクチン）として利用できる。このようなワクチン組成物は、既存のインターフェロン療法等と併用して、ＨＣＶ慢性感染の治癒率を高めることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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