(57)【要約】【課題】  数少ない標準品で、試料中のトリグリセライド分子種を同定・定量する。【解決手段】  試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成を測定する工程と、前記測定された脂肪酸組成から前記試料に含まれるトリグリセライド分子種の出現確率を分子種毎に算出する工程と、前記試料に含まれるトリグリセライド分子種をクロマトグラフィにより分離して実クロマトグラフィプロファイルを作成する工程と、各トリグリセライド分子種の保持ファクターと前記算出されたトリグリセライド分子種の出現確率とから予測クロマトグラフィプロファイルを作成する工程を含み、当該予測クロマトグラフィプロファイルと前記実クロマトグラフィプロファイルを照合することで、分離された各トリグリセライド分子種の分子種を特定する。
2015119137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルを分析する方法であって、
試料に含まれる脂肪酸エステルを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から求められる前記脂肪酸エステル分子種の出現確率と、各脂肪酸エステル分子種の予測保持ファクターと、前記試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種をクロマトグラフィにより分離して得られる分離パターンとから試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種を特定する方法。
【請求項２】
試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステル化合物を構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から前記試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種の出現確率を分子種毎に算出する工程と、
前記算出された脂肪酸エステル分子種の出現確率と各脂肪酸エステル分子種の予測保持ファクターとから予測クロマトグラフィプロファイルを得る工程と、
前記試料に含まれる脂肪酸エステル分子種をクロマトグラフィにより分離して実クロマトグラフィプロファイルを得る工程と、
前記予測クロマトグラフィプロファイルと前記実クロマトグラフィプロファイルを照合して、分離された脂肪酸エステル分子種の各分子種を特定する工程、
を含む試料中の脂肪酸エステルを分析する方法。
【請求項３】
前記保持ファクターは、脂肪酸エステル分子種を構成する脂肪酸の構成から設定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステル分子種の構成を決定する方法であって、
試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種を構成する全脂肪酸の脂肪酸組成を測定する工程と、
前記測定された脂肪酸組成から前記試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種の出現確率を分子種毎に算出する工程を含む方法。
【請求項５】
前記脂肪酸エステルは、トリアシルグリセライド、ジアシルグリセライド、モノクロロプロパンジオールジアシルエステルである請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルをクロマトグラフィにより分離して得られる分離パターンから前記脂肪酸エステルの分子種を特定するデータ処理装置であって、
試料に含まれる前記脂肪酸エステルを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成比から算出される前記脂肪酸エステル分子種毎の出現確率と当該各脂肪酸分子種の予測保持ファクターとから作成された予測クロマトグラフィプロファイルと前記分離パターンとから、分離された各脂肪酸エステルの各分子種を特定する照合部を備えたデータ処理装置。
【請求項７】
さらに、
試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成比からトリグリセライド分子種毎の出現確率を求める出現確率算出部と、
出現確率算出部で求められたトリグリセライド分子種の各出現確率と当該各トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとから予測クロマトグラフィプロファイルを作成する予測プロファイル作成部と、
を含む請求項６に記載のデータ処理装置。
【請求項８】
試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステル分子種をクロマトグラフィによって分離して分離パターンを得る分離手段と、
試料に含まれる前記脂肪酸エステルを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成比から算出される前記脂肪酸エステル分子種毎の出現確率と当該各脂肪酸分子種の予測保持ファクターとから作成された予測クロマトグラフィプロファイルと前記分離パターンとから、分離された各脂肪酸エステルの各分子種を特定する照合部と、
を含む脂肪酸エステル分子種の測定装置。
【請求項９】
さらに、
試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成比からトリグリセライド分子種毎の出現確率を求める出現確率算出部と、
出現確率算出部で求められたトリグリセライド分子種の各出現確率と当該各トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとから予測クロマトグラフィプロファイルを作成する予測プロファイル作成部と、
を含む請求項８に記載の測定装置。
【請求項１０】
請求項１〜５に記載の脂肪酸エステル分子種の分析方法を実現するためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析方法、具体的には脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステル、特にプロパンジオール類又はプロパントリオールの脂肪酸エステルの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリド（トリグリセロール）は中性脂肪の１種であり、動物の体内脂肪組織や血液、食品中の油脂、植物油などに多く含まれる。トリグリセリドはグリセリンの１、２及び３位に種々の脂肪酸がエステル結合した化合物である。トリグリセリドは生体内ではエネルギーの貯蔵物質として働く。そして、脂肪酸の結合位置や結合する脂肪酸の違いにより、その吸収性や生理活性が異なることが指摘されている。従って、トリグリセリドの分子種を同定し、定量を行うことは、生体における代謝や分化、さらには病態を知る上では非常に重要である。【０００３】
ところで、トリグリセリドとして結合する脂肪酸には、飽和脂肪酸や不飽和脂肪酸があり、また、脂肪酸の長さや不飽和度が異なる種々の脂肪酸が存在するので、トリグリセリドの分子種の数は極めて多い。これまで、トリグリセリドの分子種は、試料より抽出した総脂質から、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）や液液抽出や固相抽出などの方法でトリグリセリドを分画し、次いでＬＣ（液体クロマトグラフィ）やＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィ−質量分析、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィ−質量分析）で分析する方法、あるいはこれらを組み合わせた方法で分析されていた（例えば非特許文献１）。【０００４】
しかしながら、試料の前処理や分離条件の設定が難しいなどの理由により、これらの方法で分析するのには大変な労力と時間を要していた。また、質量分析においては、脂肪酸のグリセリンへの結合態様が異なっても同じマススペクトルが観察され得るので、マススペクトルのみからでは分子種の同定や定量は不可能であり、分子種の同定のためには標準物質が不可欠である。ここにおいてトリグリセライドに結合する脂肪酸分子種の個数（種類）がｎ個であると、ｎ３−１／２｛ｎ（ｎ−１）（ｎ−２）｝−ｎ（ｎ−１）個のトリグリセライド分子種があることになる。例えば、トリグリセライドを構成する脂肪酸の種類が４種であるとしても、最大４０種類のトリグリセライドが存在する可能性がある。このような多数の標準物質の全てを揃えることは困難であり、標準物質を用いて得られた指標（例えば分離時間）と照合する方法は現実的ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K. Ikeda et al., Global analysis of triacylglycerols including oxidized molecular species by reverse-phase high resolution LC/ESI-QTOF MS/MS Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2639-2647
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記の背景技術に基づきなされたものであって、多数の標準物質を用いることなく比較的簡便な方法で、試料中に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルの分子種の同定や定量を可能にする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る分析方法は、試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルを分析する方法であって、試料に含まれる脂肪酸エステルを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から求められる前記脂肪酸エステル分子種の出現確率と、各脂肪酸エステル分子種の予測保持ファクターと、前記試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種をクロマトグラフィにより分離して得られる分離パターンとから試料に含まれる前記脂肪酸エステル分子種を特定する方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、多数の標準物質を用いることなく試料中の脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルの分子種の同定又は定量ができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は本発明に係る分析方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は本発明に係る分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図３】図３は白米から分離されたトリグリセライドの液体クロマトグラフィによるクロマトグラフである。
【図４】図４はマウス肝臓から分離されたトリグリセライドの液体クロマトグラフィによるクロマトグラフである。
【図５】図５は市販のコーン油の１次元目及び２次元目クロマトグラフィによるクロマトグラフである。
【図６】図６は市販のコーン油及びライス油中のトリグリセライドの液体クロマトグラフィ（２次元目クロマトグラフィ）によるクロマトグラフである。
【図７】図７はモノクロロプロパンジオール脂肪酸エステルの構造式を示す。
【図８】図８はモノクロロプロパンジオール脂肪酸エステルの液体クロマトグラフィによるクロマトグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る分析方法は、試料に含まれる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステルの各分子種を、クロマトグラフィによって同定又は定量する方法である。
【００１１】
本発明において分析対象となる脂肪族多価アルコールに１以上の脂肪酸がエステル結合した脂肪酸エステル（以下、本明細書において当該化合物を「脂肪酸エステル」という。）は、脂肪族多価アルコールが有する水酸基に脂肪酸がエステル結合した化合物である。脂肪族多価アルコールは、グリセリンやプロパンジオールのような飽和脂肪族多価アルコールであり、プロピレングリコールやエチレングリコールのような不飽和脂肪族多価アルコールであってもよい。また、脂肪酸も飽和脂肪酸であるか不飽和脂肪酸であるかも問わず、直鎖脂肪酸であるか分枝脂肪酸の何れでもよく、炭素数も問わない。本発明においては、これらの脂肪酸エステルの中でも、プロパンジオール類又はプロパントリオール（グリセリン）の脂肪酸エステルが好ましい分析対象である。プロパンジオール類又はプロパントリオールの脂肪酸エステルは、プロパンジオール類が有する２つの水酸基又はプロパントリオール（グリセリン）が有する３つの水酸基の何れかの水酸基と脂肪酸がエステル結合した化合物である。これらの化合物の中で、プロパンジオール類が有する２つの水酸基にそれぞれ脂肪酸がエステル結合した化合物（ジエステル化合物）、プロパントリオールが有する３つの水酸基にそれぞれ脂肪酸が結合した化合物（トリグリセライド）が特に好適な対象となり得る。本発明において、プロパンジオール類とは、プロパンジオールだけでなく、モノクロロプロパンジオールのように、水酸基が結合していない炭素にクロルのようなハロゲンやアルコキシ基などの置換基が結合した化合物を意味する。また、本明細書において用語「分子種」は脂肪酸の種類及び脂肪酸の結合位置が特定された個々の化合物を意味し、「脂肪酸エステル」は化合物の総称又は包括的な意味で用いられる。つまり、脂肪酸エステル分子種を同定するとは、クロマトグラフィにより分離された脂肪酸エステルの各分子種について、それを構成する脂肪酸の種類及び脂肪酸の結合位置を特定又は推定することを言う。
【００１２】
本発明に係る分析方法は、試料中に含まれる脂肪酸エステルを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から求められる脂肪酸エステル分子種の出現確率と、各分子種の予測保持ファクターと、前記試料に含まれる脂肪酸エステルをクロマトグラフィにより分離して得られる分離パターンとから試料に含まれる脂肪酸エステルの分子種を特定又は推定する方法である。言い換えると、脂肪酸エステルを構成する脂肪酸の物理的特性から、クロマトグラフィにおける脂肪酸エステルの分離位置を予測又は推定することで、実際に分離された試料中の脂肪酸エステルの分子種を特定又は推定する方法であると言える。当該方法は、例えば、図１に示すフローチャートに従って実施される。なお、本発明にかかる方法は、試料中に含まれるあらゆる脂肪酸エステル分子種を一度の測定で分析する方法ではなく、１つの脂肪族多価アルコールを基本骨格とする脂肪族エステル群の中で、エステルを構成する脂肪酸の違いによる分子種を、標準物質を用いることなく、あるいは数少ない標準物質を用いることで分離分析する方法である。従って、試料から測定対象となる脂肪族エステル群、例えばトリグリセライド化合物やモノクロロプロパンジオール脂肪酸エステル化合物が各試料から各種の方法で分離されることが前提となる。
【００１３】
図１では、脂肪酸エステルとしてトリグリセライドを例にして説明する。当該方法は、（１）試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から、前記試料に含まれるトリグリセライド分子種の出現確率をトリグリセライド分子種毎に算出する工程と、（２）前記算出されたトリグリセライド分子種の出現確率と各トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとから予測クロマトグラフィプロファイルを得る工程と、（３）前記試料に含まれるトリグリセライド分子種をクロマトグラフィにより分離して実クロマトグラフィプロファイルを得る工程と、（４）当該予測クロマトグラフィプロファイルと前記実クロマトグラフィプロファイルを照合して、分離されたトリグリセライド分子種の各分子種を特定する工程を含む。
【００１４】
（０）トリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成を測定する工程
この工程は（１）の工程に先立って行われる工程であって、試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成を求める工程である（Ｓ１）。脂肪酸組成の分析に先立ち、試料からトリグリセライドが分離される。分離されたトリグリセライドは加水分解などによりグリセリンと脂肪酸に分解される。トリグリセライドの分離やその分解は公知の方法で行われる。脂肪酸組成の分析方法は特に限定されず、公知の方法が利用される。当該方法として、例えば、分解により生じた脂肪酸をエステル化した後、ガスクロマトグラフィ法（ＧＣ法）やガスクロマトグラフィ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ法）あるいは液体クロマトグラフ法で分析する方法が例示される。この工程において、トリグリセライドを構成する全ての脂肪酸分子種及び各脂肪酸分子種の存在量が求められる。
【００１５】
（１）トリグリセライド分子種の出現確率を算出する工程
この工程は、先だって測定された脂肪酸の分子種及び脂肪酸分子種の存在量から、存在する可能性のあるトリグリセライド分子種及びその出現確率を算出する工程である（Ｓ２）。天然に存在するトリグリセライドを構成する脂肪酸の分子種は、ミリスチン酸（Myristic acid：「Ｍ」と表示される）、パルミチン酸（Palmitic acid：「Ｐ」と表示される）、パルミトレイン酸（Palmitoleic acid：「Ｐｏ」と表示される）、ステアリン酸（Stearic acid：「Ｓ」と表示される）、オレイン酸 (Oleic acid：「Ｏ」と表示される)、リノール酸（Linoleic acid：「Ｌ」と表示される）、リノレン酸（Linolenic acid：「Ｌｎ」と表示される。）などと多岐にわたる。トリグリセライドは３分子の脂肪酸が１分子のグリセリンに結合した化合物であって、例えば、脂肪酸組成がパルミチン酸（Ｐ）とオレイン酸（Ｏ）からなる場合では、３分子のパルミチン酸が結合した分子種（「ＰＰＰ」と表示され、３つの記号はそれぞれクリセリンの水酸基に結合する脂肪酸分子種を表す。）、３分子のオレイン酸が結合した分子種（「ＯＯＯ」）、２分子のパルミチン酸と１分子のオレイン酸が結合した２つの分子種（「ＰＰＯ」と「ＰＯＰ」）、１分子のパルミチン酸と２分子のオレイン酸が結合した２つの分子種（「ＯＯＰ」と「ＯＰＯ」）の計６種類の分子種が存在する。
【００１６】
脂肪酸分析の結果から脂肪酸の分子種が決定されると、存在する可能性のあるトリグリセライド分子種が求まる。例えば、脂肪酸分析においてパルミチン酸のみが検出されると存在するトリグリセライドはＰＰＰのみである。また、パルミチン酸とオレイン酸が検出されると、ＰＰＯ、ＰＯＰ、ＰＯＯ、ＯＰＯ、ＰＰＰ、ＯＯＯの６種類のトリグリセライド分子種が存在する可能性がある。また、パルミチン酸とパルミトレイン酸とオレイン酸が求められると、上記の式から１８種類のトリグリセライド分子種が存在する可能性がある。
【００１７】
一方、脂肪酸分子種の存在比が求められているので、その存在比から想定されるトリグリセライド分子種の出現確率が求められる。測定される脂肪酸はトリグリセライド分子種を構成する脂肪酸に由来するので、グリセリンの任意の位置にある水酸基に、ある種の脂肪酸が結合する確率は当該脂肪酸分子種の存在比に比例する。従って、トリグリセライド分子種の出現割合は、脂肪酸分子種の結合確率、つまり脂肪酸分子種の存在比によって算出される。例えば、脂肪酸組成としてパルミチン酸（Ｐ）とオレイン酸（Ｏ）の存在比が５：３であったとすると、パルミチン酸（Ｐ）の存在比は5/8であるので、グリセリンの任意の水酸基にパルミチン酸（Ｐ）が結合する確率は5/8、オレイン酸（Ｏ）が結合する確率は3/8となる。従って、３つのパルミチン酸（Ｐ）が結合したトリグリセライド「ＰＰＰ」の出現確率は5/8×5/8×5/8＝125/512となり、３つのオレイン酸（Ｏ）を含むトリグリセライド「ＯＯＯ」の出現確率は3/8×3/8×3/8＝27/512、トリグリセライド「ＰＯＰ」の出現確率は5/8×3/8×5/8＝75/512、トリグリセライド「ＯＰＯ」の出現確率は3/8×5/8×3/8＝45/512となる。また、トリグリセライド「ＰＰＯ」の出現確率は5/8×5/8×3/8=75/512であるが、トリグリセライド「ＯＰＰ」は「ＰＰＯ」と同じ化学構造（「ＰＰＯ」と「ＯＰＰ」は同一分子種である）なので、その出現確率はその２倍の150/512となる。トリグリセライド「ＰＯＯ」の出現確率も、それと同様に5/8×3/8×3/8×2＝90/512（ＰＯＯとＯＯＰは同一分子種である）となり、６種類のトリグリセライド分子種ＰＰＰ、ＰＰＯ、ＰＯＰ、ＰＯＯ、ＯＰＯ、ＯＯＯの出現確率は、125/512、150/512、75/512、90/512、45/512、27/512と求められる。このような算出はコンピュータを用いて簡単に行える。なお、本発明においては後述するクロマトグラフィプロファイルが求まればよいので、トリグリセライド分子種の出現確率は各トリグリセライドの存在比として取り扱えばよい。従って、脂肪酸の存在量も各トリグリセライドの存在比として取り扱えばよい。
【００１８】
（２）予測クロマトグラフィプロファイルを作成する工程
この工程は（１）の工程で算出されたトリグリセライド分子種の出現確率から予測クロマトグラフィプロファイルを作成する工程である（Ｓ３）。この工程で作成される予測クロマトグラフィプロファイルは、（１）の工程で求められた各分子種の出現確率とトリグリセライド分子種の予測保持ファクターで定義される。ここにおいてトリグリセライド分子種の「予測保持ファクター」は、後述するトリグリセライド分子種の測定条件下において予測される溶出のしやすさを表す指標である。この予測保持ファクターは、トリグリセライド分子種を構成する脂肪酸組成やトリグリセライド分子種の分配係数ｌｏｇＰow（オクタノール／水）、トリグリセライド分子種の分子屈折率（溶媒に溶かした溶液の屈折率 ：ＭＲ）、トリグリセライド分子種の溶出順序などの各トリグリセライド分子種の物理的特性やトリグリセライド分子種を構成する脂肪酸の分配係数ｌｏｇＰowや分子屈折率ＭＲ、溶出順序などの物理的特性から設定される。トリグリセライド分子種はグリセリンに３分子の脂肪酸が結合した化合物であるので、その物理的特性は当該分子種を構成する脂肪酸組成に依存する。トリグリセライド分子種のクロマトグラフィによる分離は逆相クロマトグラフィで分析されることがほとんどであり、逆相クロマトグラフィによってトリグリセライド分子種を分離する場合における溶出のしやすさは、トリグリセライド分子種の脂肪酸構成や分配係数ｌｏｇＰow、逆相クロマトグラフィにおけるトリグリセライド標準物質の溶離時間（Ｒｔ：Retention time）や溶出順序（序数）などから予測し得る。予測保持ファクターは、こうした物理的特性を基礎として１の物理的特性から、あるいは２以上の物理的特性が組み合わされることで設定される。例えば、トリグリセライド分子種の標準物質の溶離時間からそれを構成する各脂肪酸の保持係数（溶離時間に対応する指数）を算出した後、出現が予測されたトリグリセライド分子種を構成する各脂肪酸の保持係数を合計して当該トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとすること、各脂肪酸の分配係数を合計して当該トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとすること、溶出順序（序数）を足し合わせて当該トリグリセライド分子種の予測保持ファクターとすることが例示される。設定される予測保持ファクターの数は少なくとも１つであり、主として用いられる１つの予測保持ファクターと２次的に用いられる他の予測保持ファクターの２つ以上であってもよい。予測保持ファクターは、予測クロマトグラフィプロファイル作成の際に設定される（Ｓ４）。なお、予測保持ファクターの設定のために、脂肪酸組成の分析において検出された脂肪酸分子種に対応する最小限のトリグリセライドの標準物質又は脂肪酸の標準物質に係る物理的特性が必要に応じて測定される。最小限のトリグリセライドの標準物質とは、測定された脂肪酸分子種のみを含むトリグリセライドの標準物質を意味し、最小限の脂肪酸の標準物質とは検出された脂肪酸の標準物質を意味する。例えば、パルミチン酸（Ｐ）とオレイン酸（Ｏ）が測定された場合、最小限のトリグリセライド標準物質はＰＰＰの標準物質とＯＯＯの標準物質の２種類のトリグリセライドであり、最小限の脂肪酸標準物質はパルミチン酸の標準物質とオレイン酸の標準物質である。
【００１９】
予測クロマトグラフィプロファイルでは、各分子種は設定された予測保持ファクターと当該分子種の出現確率という２つのパラメータを有する。予測クロマトグラフィプロファイルからトリグリセライド分子種の溶出しやすさが把握されればよいので、予測保持ファクターは絶対値であっても、各分子種間の相対比でもよい。また、出現確率も実クロマトグラフィプロファイルの存在量と対比できればよいので、絶対値であっても、各分子種間の相対比でもよい。予測クロマトグラフィプロファイルは標準物質を用いて求められるので、クロマトグラフィの測定条件が同じであれば理論的には同じプロファイルが得られる。
【００２０】
（３）実クロマトグラフィプロファイルを作成する工程
この工程は、試料に含まれるトリグリセライド分子種をクロマトグラフィで分離して（Ｓ５）、クロマトグラフィプロファイル（実クロマトグラフィプロファイル）を作成する工程である（Ｓ６）。この工程では、トリグリセライド分子種の特定は不要である。
【００２１】
本発明において実クロマトグラフィプロファイルとは、クロマトグラフィで分離された各分子種の保持ファクターと各分子種の存在量に比例した信号量で定義され、クロマトグラフィで得られる分離パターンに相当する。ここにおいて分子種の「保持ファクター」とは、分離に使用されるクロマトグラフィにおける溶出のしやすさを表す指標（保持指標）である。この保持ファクターは、例えば、溶出順序（序数）であり、カラムクロマトグラフィにおける溶出時間であり、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）における保持時間（Ｒｔ）であり、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）におけるＲｆ値であり得る。信号量は分離された分子種を化学的又は物理的手段により測定して得られる値であり、例えば高速液体クロマトグラフィにおけるピーク高さであり、ピーク面積であり、薄層クロマトグラフィにおける分取された分子種の質量であり得る。本発明で使用可能なクロマトグラフィはこうしたクロマトグラフィプロファイルを作成できる手段であれば特に限定されず、例えば、カラムクロマトグラフィや高速液体クロマトグラフィなどの液体クロマトグラフィ（ＬＣ）であり、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）であり、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）であり得る。本発明では、操作が簡便であることや分離能が高いこと、さらに試料から抽出された脂質からのトリグリセライドの分離に続いてトリグリセライド分子種の分離を連続して行える二次元クロマトグラフィを利用できることなどの理由で、液体クロマトグラフィ、特に高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が望ましく用いられる。また、予測クロマトグラフィプロファイルとの照合しやすさからは、予測保持ファクターと同じ手法で保持ファクターを設定するのが好ましい。
【００２２】
ここで作成されたクロマトグラフィプロファイルでは、各トリグリセライド分子種（言い換えると分離により観測された各ピーク）は保持ファクターとそれに対応したトリグリセライド分子種の存在量に比例した信号量の２つのパラメータを有する。また、クロマトグラフィプロファイルは、高速液体クロマトグラフィやガスクロマトグラフィによって得られたクロマトグラムそのものでもあり得る。
【００２３】
（４）トリグリセライド分子種を特定する工程
この工程は、（２）の工程で作成された予測クロマトグラフィプロファイルと（３）の工程で作成された実クロマトグラフィプロファイルを照合することで、分離されたトリグリセライド分子種を特定する工程である（Ｓ７〜Ｓ８）。照合には、分子種の出現確率や分子種の存在比の大きなもの（又は小さなもの）から分子種を特定する方法や予測保持ファクターと保持ファクターが一致するものから分子種を特定する方法などがある。また、保持ファクターと予測保持ファクターが近似又は一致するものを優先してグループ化し、次に各グループ内で分子種の出現確率や分子種の存在比の大きなもの（又は小さなもの）から分子種を特定する方法、主たる予測保持ファクターと保持ファクターが近似又は一致するものを優先し、次に２次的に用いられる予測保持ファクターと保持ファクターが近似するもの又は一致するものから分子種を特定する方法などがある。
【００２４】
また、分子種の特定精度を高めるために、照合に際し、少数のトリグリセライド分子種の標準物質の保持ファクター（実測により求められた値）が参酌され得る。このために、（３）の工程において実クロマトグラフィプロファイルを作成した際の測定条件において、少数のトリグリセライド分子種標準物質の保持ファクターが測定される。そして、求められた保持ファクター（例えばＲｔ）に近い保持ファクターを有するトリグリセライド分子種が、上記の照合手順に優先して当該標準物質の分子種に特定され得る。用いられる標準物質の種類や数は特に制約されるものではない。トリグリセライド標準物質は分離条件などによって適宜選択され、脂肪酸の組成分析で測定された脂肪酸を含むトリグリセライド標準物質であり、（３）の工程における測定条件において、最初に溶出される可能性の高いトリグリセライド標準物質と最後に溶出される可能性の高いトリグリセライド標準物質でもあり得る。さらに加えるならばこの間に溶出される１〜３種類程度のトリグリセライド標準物質であり得る。当該参酌により、トリグリセライド分子種の特定がさらに正確になされる。
【００２５】
以上の工程により、トリグリセライド標準物質を用いることなく、または数少ないトリグリセライド標準物品の使用で試料に含まれるトリグリセライド分子種を特定又は推定できる。
【００２６】
さらに上記の工程から特定されたトリグリセライド分子種の定量も行い得る。例えば、（３）の工程において実クロマトグラフィプロファイルを作成する際に、検出器として帯電エアロゾル検出器（Charged aerosol detector：CAD）を用いた逆相クロマトグラフィ（単一溶媒によるアイソクラティック分析）を行うことが例示される。ＣＡＤ検出器によると、トリグリセライド分子種の分子種によらず、同一の存在量であれば同一の信号量が得られる。従って、１種類のトリグリセライド標準物質を用いて感度を測定しておくと、特定された各トリグリセライド分子種の定量ができる。また、本発明に係る手法を用いると、至極簡便に試料中のトリグリセライド分子種の組成を把握できる。従って、試料中のトリグリセライドの組成変化を追跡する場合などには、ＬＣ−ＭＳのような高価な装置を用いることなく測定できるので、非常に有効な手段となり得る。
【００２７】
本発明に係る分析方法は、トリグリセライド分子種を分離する分離手段から切り離されたデータ処理装置、若しくはトリグリセライド分子種を分離する分離手段が組み込まれた測定装置上で実現される。図２は当該測定装置１の一例を示す概略構成図である。当該測定装置１は、トリグリセライド分離手段２と、出現確率算出部３と、実プロファイル作成部４と、データ処理部５と、出力部８を含む。トリグリセライド分離手段２は、試料に含まれるトリグリセライドを各分子種に分離し、分子種の保持ファクターと分子種の存在量に比例した信号量を出力する。出現確率算出部３は、予め測定された試料に含まれるトリグリセライドを構成する全脂肪酸の脂肪酸組成から試料に含まれるトリグリセライド分子種の分子種とその出現確率を算出する。実プロファイル作成部４は、前記分離手段２で測定されたトリグリセライド分子種の保持ファクターと分子種の存在量に比例した信号量とから、実クロマトグラフィプロファイルを作成する。データ処理部５は、予測プロファイル作成部６と照合部７を含む。予測プロファイル作成部６は、出現確率算出部３で求められたトリグリセライド分子種の分子種とその出現確率と、設定された各分子種の予測保持ファクターとから予測クロマトグラフィプロファイルを作成する。照合部７は、予測プロファイル作成部６で作成された予測クロマトグラフィプロファイルと実プロファイル作成部４で作成された実クロマトグラフィプロファイルとを照合し、分離されたトリグリセライド分子種の特定を行う。また、必要に応じて、ＣＡＤで測定したトリグリセライド標準品の信号量とから分離されたトリグリセライド分子種の定量を行う。出力部８は、例えば、ＣＲＴやプリンターなどの表示装置（図示せず）を含み、特定されたトリグリセライド分子種の分子種やその存在量、存在比を表示装置に出力する。
【００２８】
当該装置における実行方法はプログラムとして提供される。本発明に係る分析方法に必要となる必要な情報、すなわち予測クロマトグラフィプロファイルの作成に必要となる脂肪酸組成や分析された試料中のトリグリセライド分子種の存在量に対応した信号量、分離されたトリグリセライド分子種の保持ファクターは、それぞれ脂肪酸組成解析装置やトリグリセライド分離装置によって提供され得る。また、予測クロマトグラフィプロファイルの作成に必要なトリグリセライド分子種の予測保持ファクターも外部から提供され得る。従って、本発明の分析方法は、上記のトリグリセライド分離手段２を備えた装置上で実行されるのみならず、得られた分離パターンと外部から入力された必要な情報とからトリグリセライド分子種を特定するトリグリセライド分離手段２とから切り離されたデータ処理方法としても実施され得る。
【００２９】
以上の実施形態ではトリグリセライドを例にして説明したが、本発明の分析方法は、試料中に含まれるプロパンジオール類の脂肪酸エステルなど、炭素数の異なる脂肪酸がエステル結合する可能性のある種々の多価アルコールエステル化合物についても同様に適用できる。すなわち、プロパンジオール類の脂肪酸エステルを構成する脂肪酸組成の分析を行い、得られた脂肪酸組成から各脂肪酸エステル分子種の出現確率を算出する。このとき、脂肪酸残基は２つの水酸基に結合する可能性があるので、検出された脂肪酸分子種の存在比によって２つの水酸基に結合する確率が求まり、プロパンジオール類の脂肪酸エステル分子種の出現確率が算出される。次に、モノクロロプロパンジオール脂肪酸エステルのように、プロパンジオール類の脂肪酸エステルも逆相系のクロマトフラフィによって分析されることがほとんどであり、その溶出のしやすさは、脂肪酸エステルを構成する脂肪酸分子種の物理的特性に依存する。従って、トリグリセライドの場合と同様にして予測クロマトグラフィプロファイルが作成され得る。また、プロパンジオール類の脂肪酸エステルも高速液体クロマトグラフィなどのクロマトグラフィによって分離ができれば、実クロマトグラフィプロファイルが作成される。こうして、予測クロマトグラフィプロファイルと実クロマトグラフィプロファイルを照合することで、プロパンジオール類の脂肪酸エステルの特定又は推定が行われ、さらには試料中の定量が行われ得る。
【００３０】
次に、本発明について下記の実施例に基づいて具体的に説明する。
【実施例１】
【００３１】
〔白米中のトリグリセライド分子種の分離〕
粉砕した白米から水飽和ｎ−ブタノールで脂質を抽出した。この脂質を下記方法に従い２次元クロマトグラフィによりトリグリセライド分子種に分離した。２次元目の逆相クロマトグラフィで得られたグロマトグラムを図３に示す。また、得られたクロマトグラムから、各ピークにおけるピーク面積（信号量）と各ピークの溶出時間から求めた保持ファクターＫを求めて、実クロマトグラフィプロファイル（表１）を作成した。この保持ファクターＫは、カラムのデッドボリュームを考慮して求めた各ピークの保持指標であり、スルーピークの溶出時間に対する各ピークの実質保持時間の比を示している。スルーピークはカラムの充填剤に吸着されずに溶出されるピークであって、カラムの容積と流速によって求められる。図１に示したクロマトグラフでは、装置のデッドボリュームから計算されるスルーピークのリテンションタイムは９０.７３分であり、スルーピークの保持時間は５.７３分であった。このとき、ＰＰＰの溶出時間は１９２.１３分であるので実質保持時間は１０１.４分であり、保持ファクターＫは１０１.４０／５.７３＝１７.７と計算された。【００３２】
（分離方法）
装置：Ultimate 3000 Standard LC System（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)
・１次元目
カラム：PVA-SiL column（250 mm x 4.6 mm i.d., YMC, Kyoto, Japan）
移動相：hexane/tert-butylmethylether/methanol（グラジエント）
流量：  1.0 ml/min
検出器：UV検出器（２１０nm）
・２次元目
カラム：Cadenza CD-C18 column（500 mm x 4.6 mm i.d., Imtakt, Kyoto, Japan）
移動相：acetonitrile/acetone（30/70、v/v）（アイソクラティック）
流量：  1.0 ml/min
検出器：UV検出器（２１０nm）及びＣＡＤ
・トラップカラム
カラム：YMC-Pack ProC18RS column（50 mm x 4.6 mm i.d., YMC）
移動相：methanol/ethanol/H2O
流量：  5.0 ml/min【００３３】
【表１】
2015119137.tif 000003
【００３４】
〔脂肪酸組成の測定〕
脂質から分離したトリグリセライドの脂肪酸組成を下記方法により求めた。その組成比を表２に示した。なお、表２に示した保持ファクターは、トリグリセライド分子種の予測保持ファクターＫ´を算出するために用いた指標であって、単種類の脂肪酸が結合したトリグリセライド標準物質のクロマトグラフィから求めた指標である。具体的には、トリカプリン（ＣＣＣ）、トリラウリン（ＬａＬａＬａ）、トリミリスチン（ＭＭＭ）、トリリノレニン（ＬｎＬｎＬｎ）、トリリノレイン（ＬＬＬ）、トリオレイン（ＯＯＯ）、トリパルミチン（ＰＰＰ）、トリステアリン（ＳＳＳ）の各標準物質を用いたクロマトグラフィ（トリグリセライド分子種の分析条件と同一条件：図１参照）から、上記のようにして各標準物質の保持ファクターを求め、この保持ファクターから各脂肪酸１個あたりの保持ファクター（標準物質の保持ファクターを３で割ったもの：逆相液体クロマトグラフィにおける保持ファクターとして用いられる）を求めたものである。【００３５】
（測定方法）
前記トラップカラムによりトラップされたトリグリセライドを、Fatty Acid Methylation Kit（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を用いて分解した後メチル化した。次に、ＧＣ−ＦＩＤ装置を用いてメチル化脂肪酸の定量を行った。【００３６】
【表２】
2015119137.tif 000004
【００３７】
〔出現確率の算出〕
表２に示した脂肪酸組成から、出現が予測されるトリグリセライド分子種及びその出現確率を求めた。脂肪酸分析では、ミリスチン酸（Ｍ）、パルミチン酸（Ｐ）、ステアリン酸（Ｓ）、オレイン酸（Ｏ）、リノール酸（Ｌ）が検出された。それらの脂肪酸組成から存在する可能性のあるトリグリセライド分子種を計算した結果、７５種類の分子種の存在が理論上予測された。また、表２に示した保持ファクターから各トリグリセライド分子種の予測保持ファクターＫ´を求めた。トリグリセライド分子種の予測保持ファクターＫ´は、トリグリセライドを構成する脂肪酸の保持ファクター（表２における保持ファクター）の合計値とした。出現確率の高い上位１８種のトリグリセライド分子種の出現確率及びその予測保持ファクターＫ´から予測クロマトグラフィプロファイルを作成した（表３）。【００３８】
【表３】
2015119137.tif 000005
【００３９】
〔トリグリセライド分子種の同定〕
次に上記表３に示した予測クロマトグラフィプロフ ァイルと表１に示した実クロマトグラフィプロファイルを照合し、実クロマトグラフィプロファイルにおけるピークがどの分子種であるかを推定又は特定した。ここでは、保持ファクターＫと予測保持ファクターＫ´が一致又は近似するものを優先して特定した。この結果、表４に示すように、図３に示すピークＮｏ.２はＬＬＬ、同Ｎｏ.６はＯＬＬ及びＬＯＬ（分離されず）、同Ｎｏ.７はＬＬＰ及びＬＰＬ（分離されず）、同Ｎｏ.１１はＰＯＬ及びＯＰＬ及びＰＬＯ（分離されず）、同Ｎｏ.１２はＰＰＬ及びＰＬＰ（分離されず）であると特定できた。【００４０】
【表４】
2015119137.tif 000006
【実施例２】
【００４１】
〔マウス肝臓中のトリグリセライド分子種の分離〕
高脂肪高糖質食を給餌したマウスの肝臓からBligh and Dyer法に従って脂質を抽出した。この脂質を上記方法と同様にして２次元クロマトグラフィによりトリグリセライド分子種に分離した。なお、トリグリセライド分子種の分離には、Cadenza CL-C18 column（250 mm x 4.6 mm i.d., Imtakt, Kyoto, Japan）を用いた。２次元目の逆相クロマトグラフィで得られたグロマトグラムを図４に示す。また、得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして実クロマトグラフィプロファイルを作成した（表５）。図４に示したクロマトグラフでは、スルーピークのリテンションタイムは５８.１２分でありスルーピークの保持時間は３.１２分であった。【００４２】
【表５】
2015119137.tif 000007
【００４３】
〔脂肪酸組成の測定及び出現確率の算出〕
脂質から分離したトリグリセライドの脂肪酸組成を実施例１と同様の方法で求めた。その組成比及び各脂肪酸の保持ファクターを求めた。また、この脂肪酸組成から出現が予測されるトリグリセライド分子種及びその出現確率を求め、各トリグリセライド分子種の予測保持ファクターＫ´とから予測クロマトグラフィプロファイルを作成した。得られた脂肪酸組成を表６に、予測クロマトグラフィプロファイルを表７に示した。【００４４】
【表６】
2015119137.tif 000008
【００４５】
【表７】
2015119137.tif 000009
【００４６】
〔トリグリセライド分子種の同定〕
次に上記表７に示した予測クロマトグラフィプロファイルと表５に示した実クロマトグラフィプロファイルを照合し、実クロマトグラフィプロファイルにおけるピークがどの分子種であるかを推定又は特定した。ここでも実施例１と同様に、保持ファクターＫと予測保持ファクターＫ´が一致又は近似するものを優先して特定した。この結果、表８に示すように、図４に示すピークＮｏ.５はＰＯＬ及びＯＰＬ及びＰＬＯ（分離されず）、同Ｎｏ.８はＰＯＯ／ＯＰＯ（分離されず）であると特定できた。【００４７】
【表８】
2015119137.tif 000010
【実施例３】
【００４８】
〔ライス油及びコーン油中のトリグリセライド分子種の分離〕
市販されているコーン油（味の素社製  商品名「胚芽の恵み」）及びライス油（つの食品社製）中のトリグリセライド分子種の分析を行った。２次元目のカラム温度を２４℃に設定した以外は実施例１と同じ測定条件にて分析を行った。試料中のトリグリセライドを構成する脂肪酸組成を表９に、トリグリセライド分子種の出現確率を表１０に示した。１次元目及び２次元目のクロマトグラフィで得られたコーン油のグロマトグラムを図５に、２次元目のクロマトグラフィで得られたコーン油及びライス油のクロマトグラムを図６に示した。そして、得られたクロマトグラムから、実施例１と同様にして実クロマトグラフィプロファイルを作成し、予測クロマトグラフィプロファイルと照合を行った。コーン油の結果を表１１に、ライス油の結果を表１２に示した。予測クロマトグラフィプロファイルの予測保持ファクターＫ´や出現確率も実施例１と同様にして求めた。このようにして、コーン油及びライス油中に含まれるトリグリセライド分子種が特定された。【００４９】
【表９】
2015119137.tif 000011
【００５０】
【表１０】
2015119137.tif 000012
【００５１】
【表１１】
2015119137.tif 000013
【００５２】
【表１２】
2015119137.tif 000014
【実施例４】
【００５３】
〔モノクロロプロパンジオールジ脂肪酸エステル分子種の分離〕
図７に示す構造式を有するモノクロロプロパンジオールジ脂肪酸エステル（ＭＣＰＤ−ＦＡ）について２次元高速液体クロマトグラフィを実施した。ＭＣＰＤとして、３−モノクロロプロパンジオールジオレイン酸エステル（３ＭＣＰＤ−ＯＯ）、２−モノクロロプロパンジオレイン酸エステル（２ＭＣＰＤ−ＯＯ）、３−モノクロロプロパンジオールジリノール酸エステル（３ＭＣＰＤ−ＬＬ）を用いた。これら３種の化合物を実施例３に記載のコーン油に混合した溶液をサンプルとして、実施例１に記載された条件で分析を行った。２次元目のクロマトフラフィにおけるクロマトグラフを図８に示した。この結果、ＭＣＰＤは１次元目のクロマトグラフィにおいてトリグリセライドと同じ画分に分画され、２次元目のクロマトグラフィにおいてトリグリセライドと分離された。また、ＭＣＰＤは、３−モノクロロプロパンジオールエステルと２−モノクロロプロパンジオールエステルは同じような保持ファクターを有するが、ジオレイン酸エステルとジリノール酸エステルは良好に分離され、モノクロロプロパンジオールに結合する脂肪酸エステルの物理的特性に依存することが示された。このことからＭＣＰＤの各分子種の予測保持ファクターが算出でき、予測クロマトグラフィプロファイルが作成できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に係る方法は、膨大な数の標準試料を用いることなく、脂肪酸エステル分子種の同定や定量を可能にする。また、本発明は、食品分野は勿論のこと、化粧品や医薬品分野など種々の分野への利用ができる。
【図１】
2015119137.tif 000015
【図２】
2015119137.tif 000016
【図４】
2015119137.tif 000017
【図５】
2015119137.tif 000018
【図６】
2015119137.tif 000019
【図７】
2015119137.tif 000020
【図８】
2015119137.tif 000021
【図３】
2015119137.tif 000022
【国際調査報告】
2015119137.tif 000023
2015119137.tif 000024
2015119137.tif 000025
2015119137.tif 000026