(57)【要約】分化細胞の初期化を誘導する合成ペプチド、該合成ペプチドを含む初期化誘導のための薬学的組成物、ならびに該合成ペプチドを用いて分化細胞から未分化細胞を生産する方法を提供する。本発明によって提供されるペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列若しくはその改変アミノ酸配列からなる初期化誘導ペプチド配列を有する合成ペプチドである。また、本発明によって提供される未分化細胞の生産方法は、上記合成ペプチドを供給した対象細胞を含む細胞培養物を培養し、対象細胞の初期化を誘導することを含む。
2015199041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
ＣＫＳＫＳＲＲＳＣ（配列番号１）；
若しくは、前記アミノ酸配列において、１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導する改変アミノ酸配列のいずれかからなる初期化誘導ペプチド配列を有する、合成ペプチド。
【請求項２】
ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導するために用いられる組成物であって、
請求項１または２に記載の合成ペプチドと、
薬学的に許容可能な少なくとも１種以上の担体と、
を含む、組成物。
【請求項４】
少なくとも一種の分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法であって、
対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、
前記細胞培養物中に、請求項１または２に記載の合成ペプチドを供給すること、および、
該ペプチドを供給した前記細胞培養物を培養して対象細胞の初期化を誘導すること、
を含む、未分化細胞の生産方法。
【請求項５】
前記分化細胞が、ヒトの線維芽細胞である、請求項４に記載の生産方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の生産方法によって生産された未分化細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の合成ペプチドとその利用に関する。詳しくは、分化した細胞（分化細胞）の初期化を誘導し得るペプチドと該ペプチドを有効成分とする組成物、ならびにそれらの利用に関する。
なお、本出願は２０１４年６月２３日に出願された日本国特許出願２０１４−１２８４３６号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞（pluripotent stem cell）とは、一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化することが可能な能力（多分化能）を有する未分化細胞である。また、多能性幹細胞は、多分化能を維持した状態（典型的には未分化状態）で自己複製可能な能力（自己複製能）を有するため、長期間に渡って多分化能を維持した状態（典型的には未分化状態）で培養（維持）することができる。このような多分化能と自己修復能（増殖能）から、多能性幹細胞は細胞移植療法等の再生医療に用いる細胞資源として大きな期待が寄せられている。かかる多能性幹細胞の具体例としては、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；以下「ｉＰＳ細胞」ともいう）、胚性幹細胞（embryonic stem cell；以下「ＥＳ細胞」ともいう）、ミューズ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell；Ｍｕｓｅ細胞）等が挙げられる。
特にｉＰＳ細胞は、分化した細胞（典型液には体細胞、例えば皮膚の線維芽細胞等）を人為的に初期化（リプログラミング）することで多分化能と自己複製能を獲得させた細胞である。即ち、患者自身の体細胞（分化細胞）を利用してｉＰＳ細胞を作製可能である。このため、ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的課題がない若しくは少ないことから、再生医療用細胞資源として好適な細胞として期待され、臨床応用に向けた研究が急速に進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０６９６６６号
【特許文献２】国際公開第２００９／０９３６９２号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】セル（Cell）、１２６巻、２００６年、ｐｐ．６６３−６７６
【非特許文献２】セル・ステム・セル（Cell Stem Cell）、４巻、２００９年、ｐｐ．４７２−４７６
【非特許文献３】セル・ステム・セル（Cell Stem Cell）、７巻、２０１０年、ｐｐ．６１８−６３０
【非特許文献４】カレント・バイオロジー（Current Biology）、１２巻、２００２年、ｐｐ．１２８７−１２９２
【発明の概要】
【０００５】
ところで、ｉＰＳ細胞は、分化細胞（典型的には体細胞）内に複数の初期化因子を導入することで、該分化細胞を初期化して作製される。上記初期化因子としては、数種の遺伝子の組み合わせ（例えばOct3/4、klf4、c-MycおよびSox2の4種の遺伝子等）が典型的に用いられる（特許文献１および非特許文献１）。遺伝子導入により分化細胞を初期化する技術には、導入遺伝子がゲノムへ組み込まれる可能性（遺伝子挿入の可能性）、初期化効率、操作の煩雑性等の課題が存在する。これらの課題の解決（特に遺伝子挿入の可能性の回避）を目的として、遺伝子の導入方法の改善や、上記初期化因子として用いられる遺伝子の遺伝子産物（例えばＲＮＡやタンパク質）を導入することで分化細胞を初期化する技術の確立等が試みられている（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００６】
本発明は、分化細胞を人為的に初期化させ得る新規の技術の開発を課題として創出されたものであり、具体的には、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドであって、対象の分化細胞（例えば体細胞）の初期化を誘導する新規の人工ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを含み、分化細胞の初期化を誘導する目的に資する組成物（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して、分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法および該方法により生産される未分化細胞の提供を他の目的とする。
【０００７】
本発明者らは、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドに関する研究を鋭意推進したところ、驚くべきことに、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むように合成したペプチドを分化細胞に供給して特定の培養条件下で培養することで、該分化細胞を初期化し得ることを新たに見出し、本発明を完成するに至った。なお、かかる配列番号１に示すアミノ酸配列は、従前から初期化因子としての使用が試みられてきたタンパク質（例えば初期化因子として用いられる遺伝子（Oct3/4、klf4、c-MycおよびSox2等）の遺伝子産物）とは関係のない配列である。
【０００８】
本発明によると、上記目的を実現すべく、分化細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加された際）に、該細胞の初期化を誘導する能力（以下、「初期化誘導活性」ともいう）を有することで特徴付けられる人為的に合成されたペプチド（以下、「初期化誘導ペプチド」ともいう）が提供される。
即ち、ここで開示される合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）は、少なくとも１種の分化細胞の初期化を誘導する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
ＣＫＳＫＳＲＲＳＣ（配列番号１）；
若しくは、該アミノ酸配列において、１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加された改変アミノ酸配列であって、少なくとも１種の分化細胞の初期化を誘導する改変アミノ酸配列のいずれかからなる初期化誘導ペプチド配列を有する合成ペプチドである。
【０００９】
ここで開示される合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）は、ペプチド鎖中に初期化誘導ペプチド配列を有することを特徴とする。このことにより、対象の分化細胞（典型的には当該細胞を培養する培地中）に該初期化誘導ペプチドを供給して培養するという簡易な方法によって、対象の分化細胞の初期化を誘導することができる。
また、ここで開示される初期化誘導ペプチドを使用することで、従来のｉＰＳ細胞の作製方法で用いられる初期化因子（典型的には遺伝子、ＤＮＡ）を使用することなく分化細胞の初期化を誘導することが可能である。換言すると、合成ペプチドの供給によって対象の分化細胞の初期化を誘導し得るため、遺伝子導入に起因するゲノムへの外来遺伝子の挿入の心配がない。
また、ここで開示される合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）は、単純な構造（典型的には直鎖状のペプチド鎖）であり、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。さらに、ここで開示される初期化誘導ペプチドを使用することで、分化抑制因子（例えばｂＦＧＦやＬＩＦ等）に代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく対象細胞の初期化を誘導することができるため、対象の分化細胞の初期化を低コストで実現することができる。このため、ここで開示される合成ペプチドは、分化細胞の初期化を誘導する用途に用いられる組成物の成分として好ましい。また、分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法に利用することができる。
【００１０】
ここで開示される好ましい一態様の合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）は、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が３０以下であることを特徴とする。
このような短いペプチド鎖からなるペプチドは構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が高く、取扱い性や保存性に優れる。さらに、このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、比較的安価な製造コストで製造（入手）可能であるため好ましい。
【００１１】
また、本発明は、他の側面として、少なくとも一種の分化細胞の初期化を誘導するために用いられる組成物（以下、「初期化誘導剤」ともいう）であって、ここで開示されるいずれかの態様の合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）と、薬学的に許容可能な少なくとも１種以上の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体等）とを含む、組成物（薬学的組成物）を提供する。
かかる構成の組成物は、上述した初期化誘導ペプチドを含むため、該組成物を対象とする分化細胞（典型的には該細胞を培養する培地中）に供給することにより、該分化細胞の初期化を誘導することができる。このような組成物（初期化誘導剤）は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来の分化細胞（例えば線維芽細胞）の初期化を誘導する目的に好適に使用し得る。
【００１２】
また、本発明は、他の側面として、少なくとも一種の分化細胞を初期化して未分化細胞を生産する方法であって、対象の細胞を含む細胞培養物を準備すること、該細胞培養物中に、ここで開示されるいずれかの態様の合成ペプチド（初期化誘導ペプチド）を供給すること、および、該ペプチドを供給した該細胞培養物を培養して対象細胞の初期化を誘導すること、を含む、生産方法である。
かかる未分化細胞の生産方法によると、遺伝子導入等の煩雑な処理を行うことなくインビトロ（in vitro）培養系において未分化細胞を効率よく生産することができる。また、かかる未分化細胞の生産方法によると、上述のとおり単純な構成の合成ペプチド（あるいは該合成ペプチドを含む組成物）を細胞培養物中（典型的には当該細胞を培養する培地中）に供給して培養するという簡易な手法によって、目的の分化細胞（および該細胞からなる組織体）を初期化して未分化細胞を生産することができる。また、かかる未分化細胞の生産方法は、遺伝子導入を必要としないため、未分化細胞のゲノム中に導入遺伝子が挿入される心配がない。また、かかる未分化細胞の生産方法では、煩雑な操作や特別な装置を必要とすることなく、高い再現性をもって分化細胞の初期化を誘導し得るため、未分化細胞の生産方法として好ましい。
さらに、かかる未分化細胞の生産方法によると、分化抑制因子（例えばｂＦＧＦやＬＩＦ等）に代表される高価な液性因子等を大量に使用することなく（典型的には該液性因子を用いることなく）分化細胞から未分化細胞を作製し、該未分化細胞を未分化状態に長期間維持することができる。このため、未分化細胞の作製および作製した未分化細胞の維持を低コストで実現することができる。
【００１３】
ここで開示される未分化細胞の生産方法の好適な一態様では、上記対象とする分化細胞がヒトの線維芽細胞であることを特徴とする。本発明の未分化細胞生産方法は、ヒトの線維芽細胞（例えば上皮組織由来の線維芽細胞）から未分化細胞を生産する目的に好適に実施することができる。
ヒト由来の細胞から生産された未分化細胞は、医療分野（再生医療分野、新薬開発分野、基礎医学分野等）での利用価値が極めて高い。また、線維芽細胞は増殖能が高く、インビトロ培養系での培養（維持）が容易（典型的には単独培養が可能）な細胞であるため、該細胞を対象の分化細胞とすることで、未分化細胞を効率よく生産することができる。
【００１４】
また、本発明によると、他の側面として、ここで開示される未分化細胞の生産方法のいずれかによって生産された未分化細胞が提供される。かかる未分化細胞は、典型的には、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」ともいう）の群から選択される１つ以上（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上）の内在性の遺伝子を発現していることを特徴とする、未分化細胞が提供される。
かかる未分化細胞は、その生産工程において外来遺伝子の導入を必要としないため、ゲノム中への外来遺伝子の挿入に起因する腫瘍化の心配が少ない細胞である。
また、内在性のＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰは、多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）で特異的に発現する遺伝子であり、分化が進むにつれて該遺伝子の発現が減少（典型的には消滅）することが知られている。このため、これらの遺伝子の発現（即ち該遺伝子から転写、翻訳されたタンパク質の存在）は、細胞が未分化状態であることを示す指標（マーカー）、即ち未分化マーカーとして広く利用されている。また、これらの遺伝子の発現は、細胞が多能性を有することを示す指標（マーカー）、即ち多能性マーカーとしても使用される。したがって、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰの群から選択される１つ以上（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上）の内在性の遺伝子を発現する未分化細胞は、再生医療用細胞資源として好適に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、一実施例にかかる初期化誘導ペプチド（サンプル１）の添加条件および細胞を培養する温度条件を変えて培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。それぞれ、培養開始後１日目、２日目、３日目に観察した画像を示す。
【図２】図２は、一実施例にかかる初期化誘導ペプチド（サンプル１）の存在下或いは初期化誘導ペプチド無添加で培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。それぞれ、培養開始後３日目、６日目、７日目、９日目、１３日目、２１日目、２７日目、３４日目に観察した画像を示す。
【図３】図３は、一実施例にかかる初期化誘導ペプチド（サンプル１）の存在下で３日間培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。即ち、ここで開示する分化細胞を初期化する方法の一実施態様により得られる細胞の形態を示す顕微鏡写真（画像）である。
【図４】図４は、一実施例にかかる初期化誘導ペプチド（サンプル１）の存在下で３４日間培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。即ち、ここで開示する分化細胞を初期化する方法の一実施態様により得られる細胞の形態を示す顕微鏡写真（画像）である。
【図５】図５は、初期化誘導ペプチドを添加せずに２１日間培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。
【図６】図６は、一実施例により得られた細胞の形態と未分化マーカー遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３、ＡＬＰ）の発現状態（典型的には該遺伝子の遺伝子産物である各タンパク質の存在）を示す顕微鏡写真（画像）である。左側の列（ＤＩＣの列）に示す写真（画像）は、ＤＩＣ観察により細胞の形態を調べた顕微鏡写真（ＤＩＣ画像）である。中央の列（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｍａｒｋｅｒの列）に示す写真（画像）は、各未分化マーカー遺伝子の発現状態を蛍光観察により調べた蛍光顕微鏡写真（ＦＬ画像）である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、中央の列に示すＦＬ画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図７】図７は、一実施例に係る初期化ペプチド（サンプル１）の添加条件および細胞を培養する温度条件を変えて培養した線維芽細胞の形態を示す光学顕微鏡写真（画像）である。それぞれ、培養開始後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目に観察した画像を示す。なお、１３℃あるいは２２℃の温度条件であって、一実施例に係る初期化ペプチド（サンプル１）を添加して培養開始後６日目に観察した画像中には、矢印の元に円で囲んだ部分を矢印の先に拡大して示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００１７】
本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって生産され、所定の組成物中（例えば生理食塩水等の担体中）で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、特に好ましくは５０以下、例えば３０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００１８】
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記初期化誘導ペプチドが有する初期化誘導活性、後述する膜透過性ペプチド配列が有する膜透過性能）を損なうことなく、１個から数個のアミノ酸残基、例えば、１個、２個、または３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個、２個、または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個、２個、または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示される初期化誘導ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個、２個、または３個のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様に初期化誘導活性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
【００１９】
本明細書において、「分化細胞」とは、未分化細胞から分化した全ての細胞を意味する。典型的には体細胞と同義である。即ち、最終的に分化した細胞のみではなく、種々の体性幹細胞や前駆細胞も含む。例えば、内胚葉細胞、中胚葉細胞、外胚葉細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、等の多能性を有しない幹細胞（前駆体を含む）や、白血球、赤血球、神経細胞（ニューロン）、筋細胞、肝細胞、膵細胞等の最終的に分化した細胞が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「初期化」とは、分化細胞を未分化状態の細胞にすることをいう。ここで、細胞が未分化状態であることは、未分化細胞である多能性幹細胞（ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）に特異的に発現することが知られている未分化マーカー遺伝子が発現していること（典型的には該遺伝子の遺伝子産物である各タンパク質が存在すること）で評価することができる。未分化マーカー遺伝子としては、例えば、内在性のＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ１−６０、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等が挙げられる。即ち、本明細書において、「未分化細胞」とは、従来公知の未分化マーカー遺伝子のうちの１つ以上の未分化マーカー遺伝子を発現している（該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を発現している）細胞をいうこととする。典型的には、内在性のＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ１−６０、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の群から選択される１つ以上（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）の遺伝子を発現している細胞をいう。例えば、少なくともＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇとを発現している細胞であり得る。
【００２１】
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、所定の分化細胞（典型的には、ヒトもしくはヒト以外の哺乳類、鳥類、あるいはその他の動物由来の細胞）の培養細胞に供給された際（典型的には該細胞を培養している培地中に添加される）に該細胞を初期化し得る能力、即ち初期化誘導活性を有することが、本発明者らによって初めて見出された合成ペプチド（即ち初期化誘導ペプチド）である。また、ここで開示される初期化誘導剤は、対象の分化細胞の初期化を誘導するために用いられる組成物（薬学的組成物）であり、上記初期化誘導ペプチドの少なくとも1種を有効成分（即ち対象の分化細胞の初期化に関与する物質）として含むことで特徴付けられる。
【００２２】
上述のとおり、ここで開示される初期化誘導ペプチドは、初期化誘導ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＣＫＳＫＳＲＲＳＣ（配列番号１）
若しくはその改変アミノ酸配列を含む合成ペプチドである。配列番号１に示される具体的なアミノ酸配列は、本発明者がヒト由来のセントリン２のｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ配列を独自に翻訳して得た、合計９アミノ酸残基の人為的なアミノ酸配列であることに加え、分化細胞の初期化を誘導し得ることが本発明者によって新たに見出されたアミノ酸配列である。
ここで、セントリンとは、真核細胞の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである（非特許文献４参照）。
【００２３】
或いはまた、ここで開示される初期化誘導ペプチドは、上述した初期化誘導ペプチド配列から成るペプチドであってもよいが、初期化誘導ペプチド配列を細胞内へ効率よく導入するために、当該初期化誘導ペプチド配列のＮ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有してもよい。当該膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、特にＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（又はその改変アミノ酸配列）が初期化誘導ペプチドの膜透過性ペプチドペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。配列番号２〜６に、上記ＮｏＬＳに関連する膜透過性ペプチド配列および他の膜透過性ペプチド配列の好適例を挙げる。具体的には以下のとおりである。
【００２４】
即ち、配列番号２のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であるヒト内皮細胞に存在するＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号３のアミノ酸配列は、ＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれる合計８アミノ酸残基から成るＮｏＬＳに対応する。
配列番号４のアミノ酸配列は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号５のアミノ酸配列は、上記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）の合計１１アミノ酸残基から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
配列番号６のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ由来の合計１６アミノ酸配列から成る膜透過性ペプチド配列に対応する。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００２５】
特に、特許文献２にも記載されている配列番号２に示すアミノ酸配列（又はその改変アミノ酸配列）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号２に示すアミノ酸配列と上述の初期化誘導ペプチド配列（配列番号１）とを組み合わせることにより、高い初期化誘導活性を示す合成ペプチドを得ることができる。
【００２６】
ここで開示される初期化誘導ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したような初期化誘導ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されたものであり得る。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
【００２７】
また、ここで開示される初期化誘導ペプチドは、その初期化誘導活性を失わない限りにおいて、初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分アミノ酸配列としては初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。
初期化誘導ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）で初期化誘導活性を発揮し得る限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。また初期化ペプチドのペプチド鎖を構成するアミノ酸の残基数は特に限定されないが、化学合成が容易であり、安価に初期化誘導ペプチドを提供することができる観点から、鎖長の短いペプチドが好ましい。このような短鎖ペプチドは、典型的に構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が高く、取扱い性や保存性に優れる。かかる観点から、初期化誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には５０以下、好ましくは３０以下のアミノ酸残基数、例えば２５以下のアミノ酸残基数）のものが好適である。例えばアミノ酸残基数が１０以下の合成ペプチドであってもよい。配列番号１のアミノ酸配列のみから成る短鎖ペプチドは好適な一例である。
【００２８】
全体のアミノ酸配列（ペプチド鎖）に対する初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチドの占める割合、即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占める初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％は、初期化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。初期化誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％であるか或いは１〜数個のリンカーを含む場合は該リンカー以外を占める）ペプチドは好適な一形態である。
或いはまた、ペプチド鎖中に膜透過性ペプチド配列を有しない場合は、全体のアミノ酸配列に対する初期化誘導ペプチド配列の占める割合は、概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。初期化誘導ペプチド配列から成る（即ち、初期化誘導ペプチド配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一例である。
なお、本発明の初期化誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、初期化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００２９】
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【００３０】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて初期化誘導ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する初期化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の初期化誘導ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００３１】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の初期化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した初期化誘導ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示される初期化誘導ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち初期化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
【００３２】
ここで開示される初期化誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、初期化誘導ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、初期化誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
【００３３】
ここで開示される初期化誘導ペプチドは、上記初期化誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記初期化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
【００３４】
ここで開示される初期化誘導剤は、有効成分である初期化誘導ペプチドをその初期化誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。初期化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、初期化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
初期化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、初期化誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００３５】
初期化誘導ペプチド（初期化誘導剤）を適用する分化細胞は特に制限されず、該初期化誘導ペプチド（初期化誘導剤）を使用することで種々の分化細胞を初期化することが可能である。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には脊椎動物、特に哺乳動物）由来の細胞が挙げられる。特にヒト由来の細胞は、医学分野への利用価値が高いため、対象細胞として好ましい。例えば、皮膚、血液、歯、粘膜等の組織由来の細胞は、生体に大きなダメージを与えることなく低侵襲での採取が可能であるため好ましい。インビトロ培養系での培養（維持）の容易性の観点からは、増殖能が高く、典型的に単独培養が可能な線維芽細胞は、対象細胞として好ましい。線維芽細胞は主に結合組織に存在する細胞であり、全身のあらゆる組織から採取可能な細胞である。例えば皮膚（真皮）、消化管、血管、骨、歯、軟骨、脳、眼球、肺等の組織由来の線維芽細胞を使用することができる。これら好適な対象細胞のなかでも、生体からの採取の容易性（侵襲性の低さ）およびインビトロ培養系での培養（維持）の容易性の観点から、特にヒトの皮膚由来の線維芽細胞あるいはヒトの血液細胞が適用対象として好ましい。
【００３６】
ここで開示される初期化誘導ペプチド（あるいは該ペプチドを含む初期化誘導剤）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、生体外（インビトロ）で培養（継代）している分化細胞を初期化する場合は、ここで開示される初期化誘導ペプチド（あるいは該ペプチドを含む初期化誘導剤）の適当量を、初期化を行う対象の分化細胞（細胞培養物）に対し、培養過程のいずれかの段階（好ましくは培養開始と同時、若しくは培養開始後の早い段階）で培地に少なくとも１回供給するとよい。供給量及び供給回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。哺乳動物由来の分化細胞（典型的にはヒト由来の分化細胞）を初期化する場合であれば、培地中の初期化誘導ペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜５０μＭ（例えば１μＭ〜２０μＭ）の範囲内となるように、培養細胞（細胞培養物）に対して１〜複数回供給する（例えば培養開始時ならびに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加供給する）ことが好ましい。
【００３７】
初期化誘導ペプチド（初期化誘導剤）は、それ以外の初期化因子（例えばOct3/4、klf4、c-MycおよびSox2等の遺伝子およびその遺伝子産物）を必要とすることなく分化細胞の初期化を誘導することができる。しかし、例えば、細胞培養物中における初期化効率の向上等の目的で、初期化誘導ペプチド（初期化誘導剤）と、従来公知の初期化因子とを併用してもよい。なお、分化抑制因子（未分化維持因子ともいう。例えば、白血病阻止因子（ＬＩＦ）や塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等）や初期化促進因子（例えば、プロテインキナーゼＣ阻害剤（ＰＫＣ阻害剤）、ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤等）の使用や、フィダー細胞（例えばＭＥＦ細胞、ＳＮＬ細胞等）の使用、培養容器のコート処理（例えばマトリゲルコート処理）等、初期化因子以外のｉＰＳ作製のための種々の手段は、特に制限なく本発明の実施の際に適用可能である。
【００３８】
ここで開示される未分化細胞の生産方法（換言すれば、対象とする分化細胞を初期化する方法）は、対象の分化細胞を含む細胞培養物を準備することと、該細胞培養物中に、初期化誘導ペプチド（或いは該ペプチドを含む初期化誘導剤）を供給することと、該初期化誘導ペプチドを供給した細胞培養物を培養して対象細胞の初期化を誘導することとを含む方法である。
【００３９】
上記対象の分化細胞を含む細胞培養物を準備する方法は特に限定されず、例えば初代培養細胞の培養方法や細胞株の培養方法等、従来公知の方法を適宜採用すればよい。かかる細胞培養物を準備する方法自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００４０】
上記初期化誘導ペプチドを供給した細胞培養物を培養する培養条件は、対象の分化細胞を通常培養する場合と同様の条件を採用することができる。例えば培養温度については、哺乳動物由来の分化細胞を初期化して未分化細胞を作製する場合であれば、通常の哺乳動物由来の分化細胞の培養温度を適用可能である。最適な温度条件は対象の分化細胞の種類およびコンディション等により異り得るが、典型的には哺乳動物由来の細胞であれば、例えば２５℃以上３７℃未満（好ましくは２５℃以上３５℃以下、より好ましくは３０℃以上３５℃以下）の温度範囲の中で適宜設定することができる。培養に用いる培地は、対象の分化細胞を通常培養する場合と同様の組成の培地、或いはｉＰＳ細胞を作製する際に通常用いられるものと同様の組成の培地を特に制限はなく使用することができる。また、インキュベータ内の湿度、ＣＯ２濃度についても、対象の分化細胞を通常培養する場合と同様の条件（例えば、５％ＣＯ２、相対湿度９５％以上）を特に制限なく適用することができる。
上記初期化誘導ペプチドを供給した細胞培養物を培養する時間は、対象細胞の初期化を誘導することが可能な時間であれば、特に制限されない。例えば１日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは７日以上の培養を行うとよい。通常３５日以内（好ましくは２８日以内、より好ましくは２１日以内、例えば１４日以内）には対象の分化細胞の初期化を誘導し得る。
【００４１】
また、ここで開示される未分化細胞の生産方法は、初期化誘導ペプチドを供給して培養した細胞培養物中から、未分化細胞を選別（分離）することをさらに含んでもよい。これにより、全細胞数に占める未分化細胞数の割合（純度）が高い未分化細胞集団（該細胞集団を含む細胞培養物）を作製することができる。
未分化細胞を含む細胞培養物中から未分化細胞を選別（分離）する方法としては、例えばｉＰＳ細胞を含む細胞培養物中から未分化なｉＰＳ細胞を選別（分離）する方法を特に制限なく適用することができる。例えば、かかる選別方法としては、適当な選択培地を用いること、顕微鏡下でクラスターを構成する細胞を採取（ピックアップ）すること、未分化マーカー遺伝子の発現状態（典型的には、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の存在）を基準にした細胞選別（セルソーティング、例えばＦＡＣＳを用いたセルソーティング）を行うこと等により選別することができる。
【００４２】
本方法の実施において分化細胞の初期化が誘導されたこと、即ち本方法の実施により生産された細胞が未分化状態の細胞であることは、多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）の未分化マーカー遺伝子として利用される遺伝子（内在性の遺伝子）のうちの１つ以上（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）が発現していること（典型的には、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質が発現していること）を確認することで、評価することができる。未分化マーカー遺伝子としては、従来公知のものを特に制限なく利用可能であり、例えば、内在性のＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ１−６０、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等が挙げられる。
評価の正確性の向上の観点からは、複数の未分化マーカー遺伝子の発現を確認することが好ましい。好ましくは、少なくともＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇが発現していること、より好ましくは、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの他に、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰから選択される１つ以上の未分化マーカー遺伝子が発現していること、さらに好ましくはＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰが発現していること、を確認する。
なお、未分化マーカー遺伝子の発現は、例えば、酵素反応を利用した手法や抗原抗体反応を利用した免疫学的手法等の一般的な分子生物学的手法、具体的には、ｑＰＣＲ（定量ポリメラーゼ連鎖反応；Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）、ウエスタンブロッティング、細胞免疫染色等の手法により該遺伝子の遺伝子産物であるｍＲＮＡやタンパク質の存在を検出することで、確認することができる。
或いはまた、初期化された細胞は、典型的に多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）が形成するクラスター（細胞の集合体、コロニー）に類似した形態のクラスター、即ち多能性幹細胞様クラスター（ＥＳ細胞様クラスター、或いはｉＰＳ細胞様クラスター）を形成するため、顕微鏡（位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡等）を用いて細胞の形態を観察することで確認してもよい。
【００４３】
以下、ここで開示される初期化誘導ペプチドにより作製される未分化細胞を、短鎖ペプチド誘導性初期化未分化細胞（Short peptide-induced Reprograming, Undifferentiated Stage細胞；ＳＩＲＩＵＳ細胞）という。本発明者らは、ここで開示される未分化細胞の生産方法で生産した未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）に対して分化誘導を行うことで、該ＳＩＲＩＵＳ細胞を所望の分化細胞（細胞塊、組織、器官等を含む）に分化させる得ること、即ちＳＩＲＩＵＳ細胞が多能性を有することを確認した。なお、ＳＩＲＩＵＳ細胞を分化させる方法としては、従来公知の分化誘導方法を特に制限なく適応することができる。かかるＳＩＲＩＵＳ細胞の分化誘導方法自体は本発明を特徴付けるものではないため詳細な説明は省略する。
【００４４】
ＳＩＲＩＵＳ細胞は、再生医療用資材（典型的には移植用細胞の産生に用いる細胞資源）として好適に利用可能である。例えば、生体外（インビトロ）でＳＩＲＩＵＳ細胞を分化誘導して作製（生産）した分化細胞（細胞塊、組織、器官等を含む）および該細胞由来の生合成物を、修復や再生が必要とされる患部に（即ち患者の生体内）に戻すことにより、当該修復や再生を効果的に行うことができる。即ち、組織体の再生が有力な治療法となる種々の疾患を効率的に治療することが可能となる。ここで、上記ＳＩＲＩＵＳ細胞から分化誘導して作製した分化細胞由来の生合成物としては、分泌タンパク質やホルモン等の生理活性物質（例えばインスリン等）が例示される。
【００４５】
或いはまた、ＳＩＲＩＵＳ細胞を分化誘導して作製した分化細胞は、医薬品、化合物、天然抽出物、毒物等の毒性及び有効性（例えば薬効）の評価に好適に利用可能である。これにより、例えば従来の実験動物は初代培養細胞等を用いた評価方法と比較して、低コストで安定した評価が可能となる。
また、ヒト由来のＳＩＲＩＵＳ細胞（例えば患者由来のＳＩＲＩＵＳ細胞、特に遺伝的要因による疾患を有する患者由来のＳＩＲＩＵＳ細胞）は、疾患の病態解明や治療薬の研究開発等に好適に利用可能であり、これら研究分野における研究対象細胞としての利用価値が高い。
【００４６】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００４７】
＜実施例１：ペプチド合成＞
初期化誘導ペプチドとして、ＣＫＳＫＳＲＲＳＣ（配列番号１）の初期化誘導ペプチド配列からなるペプチドを市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。以下、かかる合計９アミノ酸残基からなる直鎖状の合成ペプチドを「サンプル１」と呼称する。
なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。合成したサンプル１は、ＰＢＳ（−）に溶かし、ペプチドストック液を調製した。
【００４８】
＜実施例２：ＳＩＲＩＵＳ細胞の作製＞
上記実施例１で得られたサンプル１を用いて、ＳＩＲＩＵＳ細胞を作製した。供試細胞として、ヒトの皮膚組織由来の線維芽細胞の培養細胞株である、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ-２０９７）を用いた。試験の詳細は以下のとおりである。
【００４９】
凍結保存しておいたＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を、６枚の直径６０ｍｍの培養皿（６０ｍｍディッシュ）中に３×１０５個／ウェルの細胞密度となるように播種した。具体的には、まず解凍したＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を一般的なＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地中に懸濁して細胞密度が１．５×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液２ｍＬを６０ｍｍディッシュ中に播種した。ここで、上記ＤＭＥＭ培地としては、一般的なＤＭＥＭ（和光純薬社製、Cat No. 043-30085）に１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有させたものを用いた。
そして、上記６０ｍｍディッシュ中に播種したＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を、５％ＣＯ２、３７℃の条件下のインキュベータ内で数時間（凡そ６時間）前培養（プレ培養）した。
上記数時間のプレ培養後のＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を、表１に示す例１〜例６にかかる培養条件のうちのいずれかで、本培養を行った。具体的な培養条件は、以下のとおりである。
例１にかかる培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、培地中のペプチド濃度が２０μＭとなる量のサンプル１の上記ストック液を添加し、３０℃の温度条件下で培養するものである。
例２にかかる培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、培地中のペプチド濃度が２０μＭとなる量のサンプル１の上記ストック液を添加し、３７℃の温度条件下で培養するものである。
例３にかかる培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、上記サンプル１添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（−）を添加し、３０℃の温度条件下で培養するものである。
例４にかかる培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、上記サンプル１添加区に添加したペプチドストック液と同容量のＰＢＳ（−）を添加し、３７℃の温度条件下で培養するものである。
例５に係る培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、培地中のペプチド濃度が２０μＭとなる量のサンプル１の上記ストック液を添加し、１３℃の温度条件下で培養するものである。
例６に係る培養条件は、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養しているＤＭＥＭ培地中（６０ｍｍディッシュ中）に、培地中のペプチド濃度が２０μＭとなる量のサンプル１の上記ストック液を添加し、２２℃の温度条件下で培養するものである。
なお、ペプチドの添加の有無および培養温度以外の培養条件は、例１〜６のいずれも同様の条件とした。即ち、例１〜６のいずれにおいても、同じ組成のＤＭＥＭ培地（上記プレ培養に用いたものと同様）を用い、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を行った。また、例１〜６のいずれにおいても、本培養を開始してから２日毎に培地交換とペプチド添加（ペプチド無添加区ではＰＢＳ（−）添加）を行った。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
上記本培養（ペプチド存在下での細胞培養）を開始後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、９日目、１３日目、２１日目、２７日目および３４日目に、各例における細胞の形態を位相差顕微鏡を用いて観察した。かかる顕微鏡観察により得られた顕微鏡写真（画像）を図１〜５および図７に示す。なお、図２に示す画像のうち、例３として示す顕微鏡写真は、例３と同じ条件の試験を相互に独立して複数回繰り返したときに、稀に確認された細胞集合体（クラスター）を示した顕微鏡写真（画像）である。
【００５２】
図１に示すように、例１の培養物中には、かかる条件での本培養を開始してから３日以内（典型的には本培養開始後１日目（凡そ２４時間後））に、細胞が集合した集合体（クラスター）が形成されることを確認した。かかるクラスターの形態は、多能性幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞、特にＥＳ細胞）のクラスター（コロニー）の形態に非常に類似した形態であることを確認した。
例１と同じ条件での試験を相互に独立して複数回繰り返したところ、ペプチド存在下での培養開始後３日目以内に、９５％以上の確率（２７回の試験のうちの２６回）で６０ｍｍディッシュ内に１個以上のクラスターが形成されることを確認した。このとき、６０ｍｍディッシュ１枚あたりに形成されるクラスターの個数（頻度）は、平均３個であった。
一方、図１に示すように、例２〜４の培養物中には、本培養開始後３日以内に細胞の集合体（クラスター）が形成されない若しくはその形成頻度が極めて低かった。なお、例２〜４と同じ条件での試験を相互に独立して複数回繰り返したときに稀に確認された細胞の集合体（クラスター）の形態を詳細に観察すると、例１で観察されるクラスターと比較して細胞の集合具合が緩く、クラスターの辺縁が曖昧であった。
なお、例５および例６の培養物中の細胞は、培養容器に接着することなく浮遊していた。図７に、例４〜６に係る試験区の細胞について、上記本培養を開始後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目に各例における細胞の形態を位相差顕微鏡を用いて観察した結果を示す。図７に示すように、例５および例６の培養物中の細胞の形態は、対象細胞にペプチドを添加することなく３７℃の温度条件で培養した例４に係る細胞と比べて細胞の形態が明らかに異なっていた。具体的には、例５および例６の培養物中の細胞は細胞の形態が丸く、光学顕微鏡下の観察で白く光って見えた。即ち、例５および例６の培養物中の細胞の形態は、死細胞の形態に極めて近かった。このことは、培養温度が低すぎるために、対象細胞（ここではＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞）を初期化する（ＳＩＲＩＵＳ細胞の作製）どころか、細胞の生存（増殖）に適さなかったと考える。
即ち、サンプル１存在下でＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞を培養することで、該細胞培養物中に、多能性幹細胞のクラスターに類似した形態のクラスターを、短期間（典型的には３日以内）且つ高効率に形成し得ることを確認した。また、ＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞の初期化を誘導する場合の温度条件は２５℃以上３７℃未満（例えば２５℃以上３５℃以下、典型的には３０℃）が好ましいことを確認した。
これらの結果は、ここで開示する初期化誘導ペプチド（即ち、該ペプチドを含有する初期化誘導剤）が初期化誘導活性を有することを示している。換言すると、分化細胞を培養する培養物中（典型的には培地中）にここで開示する初期化誘導ペプチドを供給（添加）し、該ペプチドを供給した細胞培養物を培養することで、分化細胞の初期化を誘導し得る、即ち、未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）を作製し得ることを示している。
【００５３】
図２に示すように、例１の培養物中には、かかる条件での本培養を開始してから少なくとも３４日目まで、クラスター（コロニー）が維持されることを確認した。かかるクラスターの形態は多能性幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞、特にＥＳ細胞）のクラスター（コロニー）の形態に非常に類似した形態であり、例１の培養条件で培養開始後３日目から少なくとも３４日目までは同じ形態が維持されることを確認した。例１で観察されるクラスターの形態を典型的に示す写真として、例１の培養条件での培養開始後３日目と３４日目のクラスターを高倍率で観察した顕微鏡画像を、図３および図４に示す。
これに対して、図２に示すように、例３の培養物中で稀に観察されるクラスターは、培養期間を延長するにつれて細胞どうしの凝集が緩くなり、３４日目頃までにはクラスターが消滅した。また、例２および４において稀に観察されたクラスターについても、例３と同様に、本培養開始後３４日目までに該クラスターは消滅することを確認した。例２〜４で観察されるクラスターの形態を示す写真として、例３の培養条件での培養開始後２１日目のクラスターを高倍率で観察した顕微鏡画像を図５に示す。ここで、図５に示す写真は、例２〜４で観察されたクラスターのなかで、例１で観察されるクラスターの形態と最も類似していたものである。
これらの観察結果より、例１の培養条件（本実施例に係る分化細胞初期化方法）によって形成されたクラスターは、サンプル１を含む培地中で培養することで、長期間にわたって多能性幹細胞と類似したクラスターの形態を維持し得ることを確認した。このことは、未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）は、初期化誘導ペプチドを含む培地中で培養することで、長期間に渡り未分化状態を維持し得ることを示している。換言すると、ここで開示する初期化誘導ペプチドが、未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）を未分化状態に維持する能力を有することを示している。
【００５４】
＜実施例３：ＳＩＲＩＵＳ細胞の未分化状態の評価＞
上記実施例１で得られたサンプル１を用いて作製したＳＩＲＩＵＳ細胞（クラスターを形成する細胞）の分化状態を、未分化マーカー遺伝子（内在性のＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰ）の発現状態、即ち該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質（以下、該タンパク質を「未分化マーカータンパク質」ともいう）の発現状態を細胞免疫染色（蛍光免疫染色）することで評価した。評価試験の詳細は、以下のとおりである。
【００５５】
本実施例にかかるＳＩＲＩＵＳ細胞は、培養容器として、スライド１枚当たりのウェル数が１個（培養面積は１９ｍｍ×４４ｍｍ）の細胞培養チャンバー（チャンバースライド、Ｓｌｉｄｅ  Ｃｈａｍｂｅｒ、ともいう）を用い、１ウェルあたりの細胞数を１．５×１０５個／ウェルとし、１ウェルあたりの培地量を１ｍＬとした以外は上記実施例２の例１に示す培養条件と同様の条件で培養することにより作製した。そして、本培養（ペプチド存在下での培養）を開始後３日目のＳＩＲＩＵＳ細胞の分化状態を、以下の細胞免疫染色により評価した。
【００５６】
まず、各試験区の細胞の固定、透過処理およびブロッキング処理を行った。具体的には、上記３日間のペプチド存在下での培養が終わった各試験区の培養容器（チャンバースライド）の中から培地を除去し、各チャンバースライド内の細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。次いで、４体積％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（４％パラホルムアルデヒド溶液）をチャンバースライド内に添加し、氷上に１５分間静置して細胞を固定した。所定時間が経過後、４％パラホルムアルデヒド溶液を除去し、冷ＰＢＳで各チャンバースライド内の細胞を洗浄した。
次いで、０．２５体積％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００溶液）を各チャンバースライド内に添加し、氷上で１５分間静置して細胞膜の透過処理を行った。所定時間が経過後、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００溶液を除去し、冷ＰＢＳで各チャンバースライド内の細胞を洗浄した。
そして、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を各チャンバースライド内に添加して室温で１時間のブロッキング処理を行った。所定時間が経過後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを除去し、冷ＰＢＳで各チャンバースライド内の細胞を洗浄した。
【００５７】
次に、各未分化マーカータンパク質を認識する一次抗体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて所定の倍率（表２に示す希釈倍率）で希釈した一次抗体（一次抗体希釈液）を上記スライドチャンバー内にそれぞれ添加し、４℃で一晩（約１６〜１８時間）静置した。そして、所定時間経過後、上記一次抗体希釈液を除去し、冷ＰＢＳで洗浄した。
表２に、本実施例にて発現状態を評価した未分化マーカーと、各未分化マーカータンパク質の認識に用いた一次抗体の詳細（製品名、製品番号、免疫動物、抗体のクラス）と、該一次抗体の希釈倍率とを示す。なお、表２に示す一次抗体のうち、抗Ｏｃｔ３／４抗体はSanta Cruz Biotechnology 社製のものを用い、抗Ｎａｎｏｇ抗体、抗Ｓｏｘ２抗体、抗ＴＲＡ１−８１抗体、抗ＥＥＳＡ−３抗体および抗ＡＬＰ抗体はAbcam 社製のものを用いた。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
次に、各一次抗体を検出する二次抗体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１０００倍希釈した二次抗体（二次抗体希釈液）を上記スライドチャンバー内に添加し、室温で２時間、暗所に静置した。そして、所定時間経過後、上記二次抗体希釈液を除去し、冷ＰＢＳで洗浄した。
ここで、抗Ｏｃｔ３／４抗体の検出には蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標） 555）で標識された蛍光標識二次抗体を使用し、抗Ｎａｎｏｇ抗体、抗Ｓｏｘ２抗体、抗ＴＲＡ１−８１抗体、抗ＳＳＥＡ−３抗体、抗ＡＬＰ抗体の検出には、蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標） 488）で標識された蛍光標識二次抗体を使用した。表３に、目的の未分化マーカーと、各未分化マーカータンパク質を認識する一次抗体の検出に用いた二次抗体の詳細（製品名、製品番号、免疫動物）とを示す。なお、表３に示す二次抗体はいずれもLife Technologies社製のものを用いた。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
そして、上記細胞免疫染色を行った各試験区の細胞をＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）含有封入液であるSlow Fade（Life Technologies社製、Cat. No. 36936）とカバーガラスを用いて封入した。
【００６２】
上述のとおり細胞免疫染色を行った各試料（各スライド）について、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察および微分干渉（ＤＩＣ：differential interference contrast）観察を行った。結果を図６に示す。これらの図面は、サンプル１存在下且つ３０℃の温度条件下で３日間培養した後のＣＣＤ１０７９ＳＫ細胞の形態（例えば集合状態）および未分化マーカー遺伝子の発現状態（即ち、該遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の存在）を調べた顕微鏡写真（画像）である。具体的には、左側の列（ＤＩＣの列）に示す写真（画像）は、ＤＩＣ観察により細胞の形態を調べた顕微鏡写真（ＤＩＣ画像）である。中央の列（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｍａｒｋｅｒの列）に示す写真（画像）は、上記免疫染色により認識した各未分化マーカータンパク質を蛍光観察により観察することで、各未分化マーカー遺伝子の発現状態を調べた結果を調べた蛍光顕微鏡写真（ＦＬ画像）である。また、右側の列（Ｍｅｒｇｅの列）に示す写真（画像）は、中央の列に示す各未分化マーカー遺伝子の発現状態を調べた結果を調べたＦＬ画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。
【００６３】
上記評価試験の結果、図６に示すように、サンプル１の存在下での培養により形成されたクラスターを構成する細胞は、未分化マーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰを強く発現していることを確認した。このことは、上記クラスターを構成する細胞が未分化状態の細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）であることを示している。即ち、ここで開示する未分化細胞の生産方法により作製した未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）は、未分化マーカー遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ１−８１、ＳＳＥＡ−３およびＡＬＰを強く発現していることを確認した。
これらの結果は、ここで開示する初期化誘導ペプチド（即ち、該ぺプチドを含有する初期化誘導剤）が初期化誘導活性を有することを示している。換言すると、分化細胞を培養する培養物中（典型的には培地中）にここで開示する初期化誘導ペプチドを供給（添加）し、該ペプチドを供給した細胞培養物を培養することで、分化細胞の初期化を誘導し得る、即ち、未分化細胞（ＳＩＲＩＵＳ細胞）を作製し得ることを示している。
【００６４】
＜実施例４：顆粒剤の調製＞
上記サンプル１を５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、初期化誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
上述のように、ここで開示される初期化誘導ペプチド（および該ペプチドを含む初期化誘導剤）は、分化細胞の初期化を誘導する初期化誘導活性を有している。このため、分化細胞を初期化する目的または未分化細胞を生産する目的に好適に使用し得る。また、ここで開示される未分化細胞の生産方法により、分化細胞を初期化して未分化細胞を生産することができる。かかる方法により生産した未分化細胞は、再生医療用途の細胞資源として好適に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１〜６    合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2015199041.tif 000013
2015199041.tif 000014