(57)【要約】  植物から高濃度の糖を含む滲出物を産生する。  AtSWEET8タンパク質をコードする核酸又は当該核酸の相同核酸を導入する及び/又は当該核酸又は当該相同核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化する。
2015099045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
AtSWEET8タンパク質をコードする核酸又は当該核酸の相同核酸を導入する及び/又は当該核酸又は当該相同核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２】
上記AtSWEET8タンパク質をコードする核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項３】
上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項４】
上記相同核酸は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項５】
上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項６】
上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項７】
上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項８】
以下のアミノ酸配列：(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)Pを含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項９】
上記共通配列は、MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RVを含むことを特徴とする請求項８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１０】
上記糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質は、AtSWEET8タンパク質又はAtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸がコードするタンパク質であることを特徴とする請求項８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１１】
上記AtSWEET8タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１２】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１３】
上記相同核酸が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１４】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１５】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１６】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１７】
顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする請求項１又は８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１８】
上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１９】
上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２０】
上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項１９記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２１】
上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする請求項２０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２２】
上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２３】
上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項２２記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２４】
上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする請求項２３記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２５】
請求項１乃至２４いずれか一項記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
【請求項２６】
上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養する条件を相対湿度８０％ＲＨ以上とすることを特徴とする請求項２５記載の滲出物の製造方法。
【請求項２７】
上記滲出物が排水液であることを特徴とする請求項２５記載の滲出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の遺伝子を導入することで優れた特性を獲得した形質転換植物及び当該形質転換植物を用いた糖含有滲出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料やバイオプラスチックの安定的生産には、原料糖の安価且つ安定的供給が望まれる。最も代表的な原料糖は、サトウキビが蓄積する糖である。サトウキビより糖を取り出すには、一般に、所定の収穫時期にサトウキビを伐採し、破砕加工、圧搾、濃縮、精製といった処理が必要となる。また、収穫後の畑地では、新たな栽培のための畑地整備、植え付け、除草剤や防虫剤の散布等の管理作業が必要となる。このように、従来、サトウキビといった植物を用いた原料糖の製造には、製造工程のコストや栽培コストといった多大なコストを要していた。【０００３】
特許文献１には、異種遺伝子を発現可能に導入した植物を使用して当該異種遺伝子によりコードされる異種タンパク質を回収する方法が開示されている。特許文献１に開示された方法では、異種遺伝子を発現可能に導入した植物から滲出物を採取し、採取された滲出物から異種タンパク質を回収する。特許文献１において滲出物としては、根茎の滲出物及び葉の排水組織（hydathode）を介した滲出物として植物から滲出している溢液（guttation）が例示されている。【０００４】
一方、特許文献２及び非特許文献１には、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)やイネ（Oryza sativa）について、植物体内の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質が開示されている。特許文献２及び非特許文献１に開示されたトランスポータータンパク質は、GLUEタンパク質又はSWEETタンパク質として知られている。特許文献２及び非特許文献１に開示するトランスポータータンパク質をコードする核酸を植物に導入することで、根に対する糖輸送量が向上するとある。【０００５】
また、非特許文献２には、細胞膜小分子トランスポーターを人工的に小胞体（endoplasmic reticulum; ER）に局在させ、ERでの小分子トランスポーター活性を測定することで細胞膜トランスポーターの機能の確認をしている。特にグルコーストランスポーターGLUTs、SGLTsについて、ERに局在させFRET（Forster resonance energy transferまたはfluorescence resonance energy transfer）法を用いてそれらのもともとの機能を類推している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５０１７５５号公報
【特許文献２】特表２０１２−５２５８４５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nature (2010) 468, 527-534
【非特許文献２】FASEB J. (2010) 24, 2849-2858
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、植物を用いて糖を製造するにはコストの増大が非常に大きな問題としてあるが、植物由来の滲出物に糖を高濃度で含ませることができれば、滲出物を採取することで上述の問題を解決できる。特許文献１には異種タンパク質を滲出物から回収することが開示されるものの、滲出物から糖を回収する技術を開示するものではない。特許文献２及び非特許文献１には、糖輸送に関与するSWEETと名付けられたトランスポータータンパク質及びそれらをコードする核酸が開示されるものの、これらトランスポータータンパク質やそれらをコードする核酸と滲出物における糖含量との関係を開示するものではない。【０００９】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、高濃度の糖を含む滲出物を産生する形質転換植物及び当該形質転換植物を用いた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成するために本発明者らが鋭意検討した結果、植物体内の糖輸送に関与する所定のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入し、当該核酸の発現を強化した形質転換植物においては、滲出物の糖含量が非常に高いことを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１１】
（１）AtSWEET8タンパク質をコードする核酸又は当該核酸の相同核酸を導入する及び/又は当該核酸又は当該相同核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２）上記AtSWEET8タンパク質をコードする核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（３）上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（４）上記相同核酸は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（５）上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（６）上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（７）上記相同核酸は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（８）以下のアミノ酸配列：(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)Pを含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（９）上記共通配列は、MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RVを含むことを特徴とする（８）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（１０）上記糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質は、AtSWEET8タンパク質又はAtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸がコードするタンパク質であることを特徴とする（８）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（１１）上記AtSWEET8タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１２）上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１３）上記相同核酸が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１４）上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１５）上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１６）上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（１０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（１７）顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする（１）又は（８）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（１８）上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする（１７）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（１９）上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする（１８）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２０）上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする（１９）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２１）上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする（２０）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２２）上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする（１８）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２３）上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする（２２）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２４）上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする（２３）記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（２５）上記（１）乃至（２４）いずれか記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
（２６）上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養する条件を相対湿度８０％ＲＨ以上とすることを特徴とする（２５）記載の滲出物の製造方法。
（２７）上記滲出物が排水液であることを特徴とする（２５）記載の滲出物の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-273130号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、植物由来の滲出物における糖含量を大幅に向上させることができる。すなわち、本発明に係る形質転換植物は、特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するか及び／又は当該タンパク質の発現を強化することで、高糖含量といった特徴を有する滲出物を産生することができる。また、本発明に係る滲出物の製造方法は、特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するか及び／又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物を利用することで、高糖含量の滲出物を製造することができる。さらに、上記形質転換植物から採取した滲出物は高糖含量であるため、アルコール、有機酸、アルカン及びテルペノイド等を製造する際の原料として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】AtSWEET8タンパク質のアミノ酸配列に基づいて作成した系統樹の概略図である。
【図１−２】図１−１に示した系統樹の部分領域を拡大して示す図である。
【図１−３】図１−１に示した系統樹の部分領域を拡大して示す図である。
【図２−１】XP_002870717、EOA19049、XP004230255、EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753及びXP_001759812について、配列番号２のアミノ酸配列とともにマルチプルアライメント解析した結果を示す図である。
【図２−２】XP_002870717、EOA19049、XP004230255、EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753及びXP_001759812について、配列番号２のアミノ酸配列とともにマルチプルアライメント解析した結果であり、図２−１の下に続く図である。
【図３】XP_002870717及びEOA19049について、配列番号２のアミノ酸配列とともにマルチプルアライメント解析した結果を示す図である。
【図４】実施例で作製した核酸AtSWEET/pRI201ANの物理地図を模式的に示す構成図である。
【図５】シロイヌナズナにおいて、実施例に記載した条件で排水液を産生している部分を撮像した写真である。
【図６】実施例で作製した核酸pZH2B_GWOx_ AtSWEET8、pZH2B_GWOx_ AtSWEET11及びpZH2B_GWOx_ AtSWEET12の物理地図を模式的に示す構成図である。
【図７】イネにおいて、実施例に記載した条件で排水液を産生している部分を撮像した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を細胞内へ導入するか及び／又は当該タンパク質の発現を強化する。これにより当該核酸を細胞内へ導入した及び／又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物からは、高糖濃度の滲出物を採取することができる。ここで、滲出物とは、植物の組織から外部へとしみだす液体を意味し、例えば、根滲出液や、種子滲出液、排水組織からしみだす排水液を含む意味である。なお、排水組織（hydathode）から液体がしみだす現象は、溢液現象（guttation）とも称される。よって、排水液と溢液とは同義である。特に、特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を細胞内へ導入するか及び／又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物は、高糖濃度の排水液を産生することができる。
【００１５】
なお、本明細書において核酸とは、DNA及びRNAといった天然に存在する核酸、PNA（ペプチド核酸）や塩基・糖・リン酸ジエステル部に化学修飾を加えた核酸分子などの人工核酸を含む意味である。また、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸としては、ゲノムに存在する遺伝子及び当該遺伝子の転写産物の両者を含む意味である。
【００１６】
また、本明細書において糖とはCn(H2O)mの化学式であらわされる物質で、多価アルコールのアルデヒド、ケトン誘導体、それらに近縁の誘導体や縮合体を含め、多糖・オリゴ糖（少糖）・二糖・単糖も含む意味である。糖の還元基にアルコール、フェノール、サポニン、色素などのアグリコンが結合した配糖体でも良い。単糖は炭素数に基づきトリオース、テトロース、ヘキソースやペントースなどと分類されることもあり、分子内の官能基に基づきアルデヒド基を有するアルドースやケトン基を有するケトースなどと分類されることがある。糖は、アルデヒド基やケトン基から最も離れた不斉炭素の立体配置によりＤ系列とＬ系列と区別されることもある。単糖の具体的な例としては、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、ガラクトース、マンノース、キシロース、キシルロース、リボース、エリトロース、トレオース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンなどが挙げられ、二糖の具体的な例としては、スクロース（サッカロース・蔗糖）、ラクトース（乳糖）、マルトース（麦芽糖）、トレハロース、セロビオースなどが挙げられる。
【００１７】
本発明が適用される植物は、特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を細胞内へ導入するか及び／又は当該タンパク質の発現を強化することで排水液等の滲出物に含まれる糖量が、野生型と比較して有意に向上している。上記タンパク質は、植物組織の細胞全体に亘って発現させたものであっても良いが、植物組織の少なくとも一部の細胞に対して発現させたものであっても良い。ここで植物組織とは、葉、茎、種子、根及び花等の植物器官を含む意味である。本発明において核酸を導入するとは、トランスポータータンパク質をコードする核酸の細胞あたりの分子数を野生型における分子数と比較して有意に大とすることと同義である。また、本発明において、トランスポータータンパク質の発現を強化するとは、トランスポータータンパク質をコードする核酸の発現制御領域を改変すること及び／又は当該核酸そのものを細胞内に注入することで、転写産物や翻訳産物の発現量を向上させることを意味する。
【００１８】
糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸
上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」とは、シロイヌナズナのAtSWEET8タンパク質をコードする核酸、及び、シロイヌナズナ以外の植物におけるAtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸である。なお、Nature (2010) 468, 527-534のSupplementary Figure 8には、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質SWEETに関してアミノ酸配列に基づいた系統樹が開示されている。本文献では、シロイヌナズナ由来SWEETタンパク質、イネ由来SWEETタンパク質、ウマゴヤシ由来SWEETタンパク質、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)由来SWEETタンパク質、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）由来SWEETタンパク質、ペチュニア（Petunia hybrida）由来SWEETタンパク質、センチュウ（Caenorhabditis elegans）由来SWEETタンパク質、哺乳類由来SWEETタンパク質について開示している。この系統樹によれば、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質であるSWEETは、アミノ酸配列の類似性に基づいてクレードI〜Vの５つに分類されることが理解できる。上述したシロイヌナズナにおいてAtSWEET8タンパク質は、クレードIIに分類されている。
【００１９】
本文献に開示された糖輸送に関与するトランスポータータンパク質SWEETのうち、シロイヌナズナ由来SWEETタンパク質、イネ由来SWEETタンパク質、及び上ウマゴヤシSWEETタンパク質とペチュニアSWEETタンパク質について、GenBank ID番号、ゲノムデータから算出されているタンパク質コード領域のIndex（Index in the Genome）、遺伝子名、タンパク質名、タンパク質略号、SWEETタンパク質クレード番号及び由来生物種の対応を下記表１に示す。
【００２０】
【表１】
2015099045.tif 000003
【００２１】
なお、本明細書中でAtSWEETと記載する場合は表1中のAtSWEET1、AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET9、AtSWEET10、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET14、AtSWEET15、AtSWEET16及びAtSWEETT17を指し、OsSWEETと記載する場合は表１中のOsSWEET1a、OsSWEET1ｂ、OsSWEET2a、OsSWEET2b、OsSWEET3a、OsSWEET3b、OsSWEET4、OsSWEET5、OsSWEET6a、OsSWEET6b、OsSWEET7a、OsSWEET7b、OsSWEET7c、OsSWEET11、OsSWEET12、OsSWEET13、OsSWEET14、OsSWEET15及びOsSWEET16を指す。
【００２２】
AtSWEET8タンパク質をコードする核酸のコーディング領域の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。ただし、本発明における「特定の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸」としては、上述したような配列番号１及び２に示した塩基配列及びアミノ酸配列にて規定される遺伝子に限定されるものではない。
【００２３】
例えば、本発明において、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」には、AtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸が含まれる。この相同核酸とは、共通の祖先遺伝子から進化分岐した遺伝子と、進化分岐した遺伝子とは異なり、単に類似した塩基配列を有する遺伝子との両者を含む意味である。共通の祖先遺伝子から進化分岐した遺伝子としては、２種類の種の相同遺伝子（オルソログ（ortholog)）及び同一種内で重複により生じた相同遺伝子（パラログ(paralog)）が含まれる。なお、上述したAtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸は、AtSWEET8タンパク質をコードする核酸のコーディング領域に関する配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列に基づいて、GenBank等の公知のデータベースから容易に検索・同定することができる。
【００２４】
例えば、GenBankデータベースに格納されたデータを用いてClustalWにて作成した系統樹（図１−１〜１−３）から、AtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸としては、図１−１において枠で囲ったように、シロイヌナズナ（Arabidopsis lyrata）由来SWEETタンパク質(XP_002870717）、ルベラナズナ（Capsella rubella）由来SWEETタンパク質(EOA19049)、トマト(Solanum lycopersicum)由来SWEETタンパク質(XP004230255)、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)由来SWEETタンパク質4種(EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753及びXP_001759812)をコードする、７種類を同定できる。シロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）のアミノ酸配列を配列番号３に示し、ルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)のアミノ酸配列を配列番号４に示し、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)のアミノ酸配列を配列番号５に示し、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ53581)のアミノ酸配列を配列番号６に示し、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)のアミノ酸配列を配列番号７に示し、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ72753)のアミノ酸配列を配列番号８に示し及びヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(XP_001759812)のアミノ酸配列を配列番号９に示した。
【００２５】
また、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)のアミノ酸配列（配列番号５）をコードする核酸の例として、配列番号４０の塩基配列及び配列番号４１の塩基配列を挙げることができる。ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)のアミノ酸配列（配列番号７）をコードする核酸の例として、配列番号４２の塩基配列及び配列番号４３の塩基配列を挙げることができる。
【００２６】
なお、図１−１〜１−３に示す系統樹は、AtSWEET8タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を用いて検索した結果に、OsSWEET4タンパク質、OsSWEET5タンパク質、AtSWEET4タンパク質、AtSWEET5タンパク質、AtSWEET6タンパク質及びAtSWEET7タンパク質の各アミノ酸配列を追加したものである。
【００２７】
以上のように、「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２〜９に示したアミノ酸配列をコードする核酸、配列番号１及び４０〜４３に示した塩基配列を含む核酸を挙げることができる。しかし、本発明において、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」は、これら具体的なアミノ酸配列及び塩基配列に限定されるものではない。
【００２８】
例えば、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２〜９に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
【００２９】
ここで糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸とは、当該核酸がコードするタンパク質が糖輸送に関与するトランスポーター活性を有することを意味する。糖輸送に関与するトランスポーター活性とは、例えば非特許文献１及び２のMethodsに記載されているような、小胞体（endoplasmic reticulum; ER）内外への糖輸送を細胞質局在またはER局在のFRET(Forster resonance energy transfer又はfluorescence resonance energy transfer)糖センサーで測定される活性である。
【００３０】
また、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２〜９に示したアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)又は同一性（identity）が例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、類似度及び同一性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００３１】
さらにまた、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号１及び４０〜４３に示した塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００３２】
図１−１〜１−３に示したシロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）、ルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質4種(EDQ53581、EDQ64580、EDQ72753及びXP_001759812)について、配列番号２のアミノ酸配列とともにマルチプルアライメント解析した結果を図２−１〜２−２に示す。図２−１〜２−２に示すように、系統樹から同定できた７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質及びAtSWEET8タンパク質は、互いに非常に高い一致度を有していることから、植物体においてAtSWEET8タンパク質と同様の機能（糖輸送に関与するトランスポーター活性）を有する蓋然性が高いと言える。
【００３３】
ここで、シロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は８９％であり、ルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は８８％であり、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は４４％であり、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ53581)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は３６％であり、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は３３％であり、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ72753)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は３８％であり、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(XP_001759812)とAtSWEET8タンパク質とのアミノ酸配列における一致度は３４％である。このように、上述した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質とAtSWEET8タンパク質との間には３３％以上の一致度がある。
【００３４】
また、同様に、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255、配列番号５)及びヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580、配列番号７)について、AtSWEET8タンパク質並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質との間のアミノ酸配列における一致度をまとめた結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2015099045.tif 000004
【００３６】
表２に示すように、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)は、AtSWEET8タンパク質並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質との間に２９％以上の一致度がある。また、表２に示すように、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)は、AtSWEET8タンパク質並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質との間に３０％以上の一致度がある。
【００３７】
表２に示した結果から、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列、配列番号５に示したアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号７に示したアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列であって、かつ糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。
【００３８】
ところで、AtSWEET8タンパク質及び上述した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質は、C末端側に膜貫通ドメインを有している。AtSWEET8タンパク質については、配列番号２に示したアミノ酸配列において２１４番目からC末端までが膜貫通ドメインである。トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)については、配列番号５に示したアミノ酸配列において２０６番目からC末端までが膜貫通ドメインである。ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)については、配列番号７に示したアミノ酸配列において１９６番目からC末端までが膜貫通ドメインである。
【００３９】
AtSWEET8タンパク質、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)及びヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)における膜貫通ドメインを除いた領域について、AtSWEET8タンパク質並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質との間のアミノ酸配列における一致度をまとめた結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
2015099045.tif 000005
【００４１】
表３に示すように、AtSWEET8タンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域は、上述した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域との間に３５％以上の一致度がある。また、表３に示すように、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)の膜貫通ドメインを除いた領域は、AtSWEET8タンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域との間に３９％以上の一致度がある。さらに、表３に示すように、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)の膜貫通ドメインを除いた領域は、AtSWEET8タンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域との間に３７％以上の一致度がある。
【００４２】
表３に示した結果から、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２に示したアミノ酸配列におけるN末端から２１３番目までのアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列、配列番号５に示したアミノ酸配列におけるN末端から２０５番目までのアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号７に示したアミノ酸配列におけるN末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、かつ糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。
【００４３】
ところで、AtSWEET8タンパク質及び上述した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質は、N末端側に相同性の低い領域を有している。AtSWEET8タンパク質については、配列番号２に示したアミノ酸配列においてN末端から３２番目までが相同性の低い領域である。トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)については、配列番号５に示したアミノ酸配列においてN末端から２９番目までが相同性の低い領域である。ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)については、配列番号７に示したアミノ酸配列においてN末端から１７番目までが相同性の低い領域である。
【００４４】
AtSWEET8タンパク質、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)及びヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)における相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域について、AtSWEET8タンパク質並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質との間のアミノ酸配列における一致度をまとめた結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
2015099045.tif 000006
【００４６】
表４に示すように、AtSWEET8タンパク質の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域は、上述した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の膜貫通ドメインを除いた領域との間に３７％以上の一致度がある。また、表４に示すように、トマト由来SWEETタンパク質(XP004230255)の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域は、AtSWEET8タンパク質の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域との間に４０％以上の一致度がある。さらに、表４に示すように、ヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580)の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域は、AtSWEET8タンパク質の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域並びに他の６種類の相同核酸によりコードされるタンパク質の相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除いた領域との間に３９％以上の一致度がある。
【００４７】
表４に示した結果から、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、配列番号２に示したアミノ酸配列における３３〜２１３番目までのアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列、配列番号５に示したアミノ酸配列における３０〜２０５番目までのアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列、若しくは配列番号７に示したアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、かつ糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。
【００４８】
なお、図２−１〜２−２に示したマルチプルアライメント解析の結果から、以下のアミノ酸配列が７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質及びAtSWEET8タンパク質の共通配列１として導き出される。すなわち、N末端からC末端にかけて、以下のアミノ酸配列：(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)Pが共通配列１となる。
【００４９】
上記アミノ酸配列において、xは任意のアミノ酸残基を示している。当該アミノ酸配列において、-で連結した２つの数値とaaからなる表記は、その位置が任意のアミノ酸からなる配列であり、その配列が当該２つの数値で挟まれる範囲のアミノ酸残基数からなることを示している。当該アミノ酸配列において、括弧内で複数のアミノ酸を/で区切って示した表記は、その位置が当該複数のアミノ酸のうちいずれかのアミノ酸であることを示している。なお、本明細書に記載するアミノ酸配列については、この表記方法を採用する。
【００５０】
また、上記共通配列１については、N末端からC末端にかけて、配列番号４４のアミノ酸配列、1〜3個の任意のアミノ酸残基、配列番号４５のアミノ酸配列、0〜2個の任意のアミノ酸残基、配列番号４６のアミノ酸配列、2〜4個の任意のアミノ酸残基、配列番号４７のアミノ酸配列、1〜2個の任意のアミノ酸残基、配列番号４８のアミノ酸配列、2〜3個の任意のアミノ酸残基、配列番号４９のアミノ酸配列、2〜3個の任意のアミノ酸残基、配列番号５０のアミノ酸配列がこの順で連結したアミノ酸配列であると言い換えることができる。
【００５１】
この共通配列１は、図２−１〜２−２に示した７種類の相同核酸によりコードされるタンパク質及びtSWEET8タンパク質からなる群を特徴付ける配列であって、他の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質との明確な区別基準となる配列である。
【００５２】
すなわち、本発明において、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、共通配列１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。
【００５３】
また、これらのうちシロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）及びルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)は、図１―１〜１−３に示すように、AtSWEET8タンパク質のアミノ酸配列に対してより一致度の高いアミノ酸配列を有していることが判る。これらシロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）及びルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)並びにAtSWEET8タンパク質のアミノ酸配列について、マルチプルアライメント解析した結果を図３に示す。図３に示すように、シロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）及びルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)は、植物体においてAtSWEET8タンパク質と同様の機能（糖輸送に関与するトランスポーター活性）を有する蓋然性が非常に高いと言える。
【００５４】
なお、図３に示したマルチプルアライメント解析の結果から、以下のアミノ酸配列がシロイヌナズナ由来SWEETタンパク質(XP_002870717）とルベラナズナ由来SWEETタンパク質(EOA19049)とAtSWEET8タンパク質との共通配列２として導き出される。すなわち、N末端からC末端にかけて、以下のアミノ酸配列：MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RVが共通配列２となる。
【００５５】
また、上記共通配列２については、N末端からC末端にかけて、配列番号５１のアミノ酸配列、0〜1個の任意のアミノ酸残基、配列番号５２のアミノ酸配列がこの順で連結したアミノ酸配列であると言い換えることができる。
【００５６】
この共通配列２は、図３に示した２種類の相同核酸によりコードされるタンパク質及びAtSWEET8タンパク質からなる群を特徴付ける配列であって、他の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質との明確な区別基準となる配列である。
【００５７】
すなわち、本発明において、上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」としては、共通配列２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。
【００５８】
ここで、上記共通配列１において、所定の位置で取りうるアミノ酸残基のバリエーションは以下の理由によるものである。参考文献(1)（「マッキー生化学」第3版  5章アミノ酸・ペプチド・タンパク質  5.1アミノ酸、監修：市川厚、監訳：福岡伸一、発行者：曽根良介、発行所：(株)化学同人、ISBN4-7598-0944 -9）でも記載されているように、アミノ酸は同様の性質（化学的性質や物理的大きさ）を持つ側鎖に従って分類される事がよく知られる。また、タンパク質の活性を保持したまま、所定のグループに分類されるアミノ酸残基間における分子進化上の置換が頻度高く起こることがよく知られる。この考えを基に、参考文献(2)： Henikoff S., Henikoff J.G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919 (1992)中の、Fig.2でアミノ酸残基の置換変異のスコアマトリックス（BLOSUM）が提唱され、広く使用されている。参考文献(2)では、側鎖の化学的性質が似たもの同士のアミノ酸置換は、タンパク質全体に与える構造や機能変化が少なくなると言う知見に基づくものである。上記参考文献(1)及び(2)によれば、マルチプルアラインメントで考慮するアミノ酸の側鎖のグループは、化学的性質や物理的大きさなどの指標を基にして考えることができる。これは、参考文献(2)に開示されたスコアマトリックス（BLOSUM）において、スコアの0以上の値を持つアミノ酸、好ましくは1以上の値を持つアミノ酸のグループとして示される。代表的なグループとしては、下記の８つが上げられる。その他の細かいグループ分けは、当該スコアの値の0以上同士のアミノ酸グループ、好ましくは1以上同士のアミノ酸グループ、さらに好ましくは2以上のアミノ酸グループであれば良い。
【００５９】
１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）
このグループは、上記参考文献(1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪属性の疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり、V(Val、バリン)、L(Leu、ロイシン)、I(Ile、イソロイシン)及びM(Met、メチオニン)から構成される。参考文献(1)による中性非極性アミノ酸と分類されるもののうちFGACWPは以下理由で、この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。G(Gly、グリシン)やA(Ala、アラニン)はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。C(Cys、システイン)はS-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子と水素結合を形成する特性があるからである。F(Phe、フェニルアラニン)やW(Trp、トリプトファン)は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強いからである。P(Pro、プロリン)はイミノ酸効果が強く、ポリペプチドの主鎖の角度を固定してしまうからである。
【００６０】
２）ヒドロキシメチレン基をもつグループ（STグループ）
このグループは、中性極性アミノ酸のうちヒドロキシメチレン基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、S(Ser、セリン)とT(Thr、スレオニン)から構成される。SとTの側鎖に存在する水酸基は、糖の結合部位であるため、あるポリペプチド（タンパク質）が特定の活性を持つために重要な部位である場合が多い。
【００６１】
３）酸性アミノ酸（DEグループ）
このグループは、酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、D(Asp、アスパラギン酸)とE(Glu、グルタミン酸)から構成される。
【００６２】
４）塩基性アミノ酸（KRグループ）
このグループは、塩基性アミノ酸のグループであり、K(Lys、リジン)とR(Arg、アルギニン)から構成される。これらKとRは、pHの広い範囲で正に帯電し塩基性の性質をもつ。一方、塩基性アミノ酸に分類されるＨ(His、ヒスチジン)はpH7においてほとんどイオン化されないので、このグループには分類されない。
【００６３】
５）メチレン基＝極性基（DHNグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持ち、N(Asn、アスパラギン、極性基はアミド基)、D(Asp、アスパラギン酸、極性基はカルボキシル基)とH(His、ヒスチジン、極性基はイミダゾール基)から成る。 
【００６４】
６）ジメチレン基＝極性基（EKQRグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるジメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。E(Glu、グルタミン酸、極性基はカルボキシル基)、K(Lys、リジン、極性基はアミノ基)、Q(Gln、グルタミン、極性基はアミド基)、R(Arg、アルギニン、極性基はイミノ基とアミノ基)から成る。
【００６５】
７）芳香族（FYWグループ）
このグループには、側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、芳香族特有の化学的性質を特徴とする。F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、W(Trp、トリプトファン)から成る。
【００６６】
８）環状＆極性（HYグループ）
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、H(H、ヒスチジン、環状構造と極性基は共にイミダゾール基)、Y(Tyr、チロシン、環状構造はベンゼン核で極性基は水酸基)から成る。
【００６７】
上記のアミノ酸グループに基づき、ある機能を有するタンパク質のアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基を同一のグループに属するアミノ酸残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。たとえば上記「１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）」に基づき、ある機能を有するタンパク質のアミノ酸配列中のイソロイシン残基をロイシン残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。ある機能を有するタンパク質が複数ある場合には、コンセンサス配列としてアミノ酸配列を記載する場合もあるが、この場合でもあるアミノ酸残基を同一のグループに属するアミノ酸残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。たとえば、ある機能を有するタンパク質が複数あり、そこから算出されたコンセンサス配列中のアミノ酸残基がイソロイシンまたはロイシン（Ｌ／Ｉ）の時、上記「１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）」に基づき、イソロイシンまたはロイシン残基をメチオニンまたはバリン残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。
【００６８】
本発明を適用した植物は、上述したように定義された「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質」をコードする核酸を細胞内へ導入するか、当該核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化することによって、高糖濃度の滲出物（例えば排水液）を産生することができる。この糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を細胞内へ導入する手法としては、例えば、糖輸送に関与するトランスポーターをコードするDNAを発現可能なように配置した発現ベクターを細胞内へ導入する手法を挙げることができる。また、糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸の発現を強化する手法としては、対象とする植物体における糖輸送に関与するトランスポーターをコードするDNAの近傍に位置する転写プロモーターを改変する手法を挙げることができる。特に、恒常的発現を可能とするプロモーターの制御下に上述した糖輸送に関与するトランスポーターをコードするDNAを発現可能なように配置した発現ベクターを対象の植物の細胞に導入する手法が好ましい。
【００６９】
発現ベクター
発現ベクターは、恒常的な発現を可能とするプロモーター塩基配列を有する核酸と、上述した糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物細胞へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００７０】
プロモーターは、植物体内で糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の核酸を強く発現させることが可能となる。
【００７１】
また、プロモーターとしては、植物における部位特異的に核酸を発現させる機能を有するものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、従来公知の如何なるプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターを使用して、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を部位特異的に導入することによって、当該核酸を導入した細胞から成る植物器官や植物組織から産生される滲出物に含まれる糖含量を向上させることができる。
【００７２】
なお、発現ベクターは、プロモーター及び上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸に加えて、さらに他のセグメント配列を有する核酸を含んでいてもよい。当該他のセグメント配列を有する核酸は特に限定されるものではないが、ターミネーター塩基配列を有する核酸、形質転換体選別マーカー塩基配列を有する核酸、エンハンサー塩基配列を有する核酸、翻訳効率を高めるための塩基配列を有する核酸等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクター中の塩基配列を有する核酸を植物細胞に導入する場合に核酸導入の効率を高めることができる。
【００７３】
ターミネーター塩基配列を有する核酸は転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記組換えベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成するといった現象の発生を防止することができる。
【００７４】
形質転換体選別マーカー塩基配列を有する核酸としては、例えば薬剤耐性遺伝子を含む核酸を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を含む核酸を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００７５】
翻訳効率を高めるための塩基配列を有する核酸としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を有する核酸を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列を有する核酸をタンパク質コード領域上流の非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸の発現効率を高めることができる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメント配列を有する核酸を含ませることができる。
【００７６】
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター塩基配列を有する核酸、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸及び必要に応じて上記他のＤＮＡセグメント配列を有する核酸を所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸とプロモーター塩基配列を有する核酸と（必要に応じてターミネーター塩基配列を有する核酸等）とを連結し、これをベクターに導入すればよい。
【００７７】
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００７８】
形質転換
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物細胞に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta  Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。
【００７９】
発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００８０】
また、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を直接植物細胞に導入する方法を採るなら、対象とするトランスポーターをコードする核酸の発現に必要な転写ユニット、例えばプロモーター塩基配列を有する核酸や転写ターミネーター塩基配列を有する核酸と、対象とするトランスポーターをコードする核酸を含んだ核酸であれば十分であり、ベクター機能が必須ではない。さらに、転写ユニットを有さない上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸のタンパク質コード領域のみを含む核酸であっても、宿主ゲノム中の転写ユニット内にインテグレートし、対象となる遺伝子を発現することができればよい。また、宿主ゲノム中にインテグレートされない場合でも、上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸が細胞内で転写且つ／または翻訳されれば十分である。
【００８１】
上記発現ベクターや、発現ベクターを含まず対象となる糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸が導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。
【００８２】
発現ベクターの導入対象となる細胞から成る植物としては、特に限定されない。すなわち、上述した糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を導入することによって、あらゆる植物体について排水液等の滲出物に含まれる糖濃度を向上させることができる。対象となる植物としては、例えば、顕花植物であることが好ましく、顕花植物のなかでも被子植物であることがより好ましい。対象となる被子植物としては、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００８３】
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ミヤマハタザオ（Arabiopsis lyrata）、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）、ルベラナズナ（Capsella rubella）など。
アカザ科：テンサイ（Beta vulgaris）
カエデ科：サトウカエデ（Acer saccharum）
トウダイグサ科：トウゴマ（Ricinus communis）
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Solanum lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia hybrida）など。
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）、ウマゴヤシ（Medicago truncatula）、ヒヨコマメ（Cicer arietinum）など。
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria vesca）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）、モモ（Prunus persica）など。
ブドウ科：ブドウ（Vitis vinifera）
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、ウラルツコムギ（Triticum urartu）、タルホコムギ（Aegilops tauschii）、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ススキ（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum bicolor）スイッチグラス（Panicum）など。
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。
【００８４】
なかでも、サトウキビやトウモロコシ、イネ、ソルガム、コムギ、テンサイ、サトウカエデといった滲出物を比較的に多く産生し、且つ糖やデンプンの産生能の高い植物を対象とすることが好ましい。詳細を後述するように、これら植物から採取した滲出物をバイオ燃料やバイオプラスチックの原料に使用できるからである。
【００８５】
また、上述したように、本発明で使用可能な糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸は、種々の植物から単離して使用することができるが、対象の植物の種類に応じて、適宜選択して用いることができる。すなわち、対象の植物細胞が単子葉植物由来である場合には、糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸として単子葉植物から単離したものを導入することができる。また、対象の植物細胞が双子葉植物由来である場合には、糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸として双子葉植物から単離したものを導入することができる。対象の植物細胞が単子葉植物由来であったとしても、双子葉植物由来の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を導入しても良い。双子葉植物であるシロイヌナズナ由来の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸であるAtSWEET8タンパク質をコードする核酸は、対象の植物がイネ等の単子葉植物であっても滲出物に含まれる糖量を著しく向上させることができる。
【００８６】
その他の工程、その他の方法
上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体から滲出物を採取し、採取した滲出物に含まれる糖分を測定し、野生型と比較して糖濃度が有意に向上しているものを選抜してもよい。また、採取した滲出物に含まれる糖分測定は定量的でなく定性的に測定する方法でも良く、例えば糖に反応し呈色する試験紙を用いた呈色法で測定しても良い。
【００８７】
また、形質転換処理で得られた形質転換植物から定法に従って後代植物を得ることができる。上記糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸の発現量が野生型と比較して有意に向上するといった形質を保持した後代植物を、その滲出物に含まれる糖量を基準として選抜することによって、上記形質を有することで滲出物に含まれる糖量が増加した安定的な植物系統を作出することができる。なお、形質転換植物やその子孫から、植物細胞や種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に上記形質を有することで滲出物に含まれる糖量が増加した安定的な植物系統を量産することも可能である。
【００８８】
以上説明したように、本発明によれば、上述した特定の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を細胞へ導入するか、当該核酸の発現を強化することで、野生型の植物体と比較して、滲出物に含まれる糖濃度を有意に向上させることができる。ここで、滲出物に含まれる糖成分としては、グルコース（ブドウ糖）、ガラクトース、マンノース及びフルクトースといった単糖類、スクロース、ラクトース及びマルトースといった二糖類を含む意味である。すなわち、上述した特定の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を細胞へ導入するか、内在する当該遺伝子の発現を強化することで、滲出物に含まれるグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、ラクトース及びマルトース等の糖成分のうちいずれか１種以上の濃度を向上させることができる。特に、本発明によれば、滲出物中のグルコース、フルクトース及びスクロースの濃度を大幅に向上させることができる。
【００８９】
特に、滲出物として排水組織から産生される排水液を採取する際には、上述した特定の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸を細胞へ導入するか、当該核酸の発現を強化した植物を、産生された排水液の蒸散を防止するような条件下で栽培することが好ましい。さらに、当該植物を、排水液の産生量が増大するような条件下にて培養することがより好ましい。例えば、当該植物を栽培する際の栽培条件を湿度80%RH以上、より好ましくは90%RH以上の密閉空間とすることで、排水液の蒸散を防止し、且つ排水液の産生量を増大することができる。
【００９０】
例えば、野生型シロイヌナズナの排水液に含まれる糖濃度が約２．０μＭ（平均値、単糖当量）であるのに対して、AtSWEET8タンパク質をコードする核酸を導入した場合では、糖濃度が約２４００μＭまで増加する。また、野生型イネの排水液に含まれる糖濃度が約１．３μＭ（平均値、単糖当量）であるのに対して、AtSWEET8タンパク質をコードする核酸を導入した形質転換イネにおいては、排水液中の糖濃度を大幅に向上させることができる。
【００９１】
以上のように、本発明によれば高糖濃度の滲出物を採取することができる。採取した滲出物は、アルコール及び/又は有機酸の発酵生産に使用することができる。すなわち、滲出物に高濃度に含まれる糖成分を、アルコール発酵や有機酸発酵の基質として利用することができる。このとき、例えば滲出物として排水液を利用する場合、上述した特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質遺伝子を導入するか、内在する当該遺伝子の発現を強化した植物から採取した排水液をそのままアルコール発酵や有機酸発酵の反応系に利用することができる。或いは、当該植物から採取した排水液を濃縮処理や、他の炭素源や窒素源等を添加する処理を行った後、アルコール発酵や有機酸発酵の反応系に利用することができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００９３】
1.  シロイヌナズナ形質転換用DNAコンストラクトの作製
1.1   PCRによるAtSWEETタンパク質をコードするDNAの取得
1.1.1  AtSWEETタンパク質をコードするDNAの増幅
シロイヌナズナから調製したcDNAを鋳型にし、PCRによる評価用のAtSWEET1、AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET9、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET15及びAtSWEET17タンパク質をコードするDNAの増幅を行った。評価用DNAをpRI201ANベクター（タカラバイオ社製、#3264）に挿入するため、5’末端にSal I制限酵素認識配列を付加したフォワードプライマーを、また3’末端にSac IまたはPst I制限酵素認識配列を付加したリバースプライマーを設計した（表５）。【００９４】
【表５】
2015099045.tif 000007
【００９５】
そして、これらプライマーと、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼ(TaKaRa、#R050A) を使用してPCR増幅を行った。反応液組成を表６に示し、反応条件を表７に示した。【００９６】
【表６】
2015099045.tif 000008
【００９７】
【表７】
2015099045.tif 000009
【００９８】
次に、上記PCR増幅で得られたDNA断片をpCR2.1-TOPOベクターDNA (Invitrogen、#K4500-01) へ挿入するため、以下の処理をし、5’末端と3’末端にAdenineを付加した。反応液組成を表８に示した。表８に示した反応液を70℃で15分間反応させた。【００９９】
【表８】
2015099045.tif 000010
【０１００】
1.1.2  増幅DNA断片の切り出しおよび精製
PCRで増幅した各DNA断片をアガロースゲル電気泳動後、MagExtractor-PCR & Gel Clean up キット (TOYOBO、#NPK-601) を用いて、切り出し精製を行った。なお、切り出し精製は、キット添付のマニュアルに従って行った。【０１０１】
1.1.3  増幅DNA断片の形質転換
精製した増幅DNA断片を、TOPO TA Cloning (Invitrogen、#K4500-01) を用いてpCR2.1-TOPOベクターに導入した。反応液組成を表９に示した。表９に示した反応液を室温で5分間反応させた。【０１０２】
【表９】
2015099045.tif 000011
【０１０３】
次に、この反応液2μlをEscherichia coli DH5αコンピテントセル (TOYOBO、#DNA-903) に添加し、形質転換を行った。氷浴上で30分間放置した後、42℃で30秒間熱処理を行った。その後、氷浴上で急冷し、500μlのSOC培地 (Invitrogen、#15544-034) を添加し、37℃、180 rpmで1時間振とう培養した。終濃度50μg/mlのカナマイシンを添加したLB寒天プレートにDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）に溶かした40 mg/ml X-gal 40μl、100 mM IPTG 40μlを塗布した後、さらに培養液100-200μlを塗布し、37℃で一晩培養し、翌朝コロニーを得た。【０１０４】
1.1.4  コロニーPCRによる形質転換のチェックとポジティブクローンの選抜
形質転換の結果、多数のコロニーが得られた。各コロニーについて挿入DNAの有無を確認するため、M13-F : 5’-GTA AAA CGA CCA GTC TTA AG-3’（配列番号３６）及びM13-R : 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’（配列番号３７）を用いてコロニーPCRを行った。コロニーPCRの反応液組成を表１０に示し、PCR条件を表１１に示した。【０１０５】
【表１０】
2015099045.tif 000012
【０１０６】
【表１１】
2015099045.tif 000013
【０１０７】
1.1.5  ポジティブクローンからのプラスミドDNA精製
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。【０１０８】
1.1.6  ポジティブクローンの塩基配列決定
1.1.5で得たプラスミドDNAを鋳型にし、M13-F及びM13-Rプライマーを用いてPCR増幅し、ダイデオキシ法（サンガー法）によるDNA断片の塩基配列の決定を行った。【０１０９】
1.2  化学合成によるAtSWEETタンパク質をコードするDNAの取得
AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET14、AtSWEET16タンパク質をコードするDNAついては、5’末端にPst I制限酵素認識配列、3’末端にSal I制限酵素認識配列を付加するよう塩基配列を設計し、化学的に全合成した。その結果、pEX-Aベクター（オペロンバイオテクノロジー）に挿入されたAtSWEET8及びAtSWEET14タンパク質をコードするDNA、pCR2.1-TOPOベクターに挿入されたAtSWEET10及びAtSWEET16タンパク質をコードするDNAを得ることができた。【０１１０】
1.3  制限酵素反応によるAtSWEETタンパク質をコードするDNAの切り出しおよび精製
1.1.5と1.2で得られたプラスミドDNAからAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片を取り出す為、二度の制限酵素処理を行った。各DNAに対する制限酵素の組み合わせを表１２に記す。【０１１１】
【表１２】
2015099045.tif 000014
【０１１２】
1.3.1  増幅DNA断片のSac I、Nde I又はSal I制限酵素反応（一回目）
Sac I(TaKaRa、#1078A)、Nde I(TaKaRa、#1161A)又はSal I(TaKaRa、#1080A)を用いて以下の反応液を作製し、37℃で一晩反応させ、1.1.5または1.2で得られたプラスミドを切断した。Sac Iの反応液組成を表１３に、Nde Iの反応液組成を表１４に、Sal Iの反応液組成を表１５に示した。【０１１３】
【表１３】
2015099045.tif 000015
【０１１４】
【表１４】
2015099045.tif 000016
【０１１５】
【表１５】
2015099045.tif 000017
【０１１６】
1.3.2  制限酵素反応により切断したDNA断片の精製
次に、DNAを精製するため、PCI (フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール＝24:24:1)抽出とエタノール沈殿を行った。反応液に等量のPCIを加えて攪拌し、5分間、15000 rpmで遠心して回収した上層に等量のクロロホルムを加え、同様に遠心し上層を回収した。回収した上層に二倍量のエタノールを加え、Pellet Paint NF Co-Precipitant (メルクバイオインサイト、#70748) を用いてエタノール沈殿を行った。乾燥後、得られたDNAは滅菌水44μlに溶解した。【０１１７】
1.3.3  増幅DNA断片のSal I 、Xba I及びSac I制限酵素反応（二回目）
次に、Sal I(TaKaRa、#1080A)、Xba I(TaKaRa、#1093A)又はSac I(TaKaRa、#1078A)を用いて以下の反応液を作製し、37℃で一晩反応させ、1.3.2で得られたプラスミドを切断した。Sal Iの反応液組成を表１６に、Xba Iの反応液組成を表１７に、Sac Iの反応液組成を表１８に示した。【０１１８】
【表１６】
2015099045.tif 000018
【０１１９】
【表１７】
2015099045.tif 000019
【０１２０】
【表１８】
2015099045.tif 000020
【０１２１】
1.3.4  制限酵素反応により切断したDNA断片の精製
1.3.3で得られた反応液は1.1.2の手順と同様にアガロースゲル電気泳動後、MagExtractor-PCR & Gel Clean up キットを用いて切り出し精製を行った。【０１２２】
1.4  制限酵素反応によるpRI201ANベクターの切り出しおよび精製
1.3で得られたAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片とライゲーションを行うため、pRI201ANベクターを1.3と同様の手順で制限酵素処理を行った。【０１２３】
1.5  ライゲーション
1.5.1  ライゲーション反応
1.3で得たAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片を1.4で得たpRI201ANベクターへ挿入するため、ライゲーション反応を行った。反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1 (タカラバイオ、#6022) を用い、16℃で一晩反応させた。【０１２４】
1.5.2  ライゲーション反応産物の形質転換
上記ライゲーション反応の終了後、反応液2μlを用いて1.1.3と同様の方法で形質転換を行った。【０１２５】
1.5.3  コロニーPCRによるライゲーション反応のチェック
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。【０１２６】
1.5.4 ライゲーション反応により得られたDNAコンストラクトの調製
挿入DNAが確認できたコロニーからプラスミドDNAの精製を行い、目的のDNA断片を挿入したクローンを得た。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。得られたDNAコンストラクト (AtSWEET / pRI201AN) の物理地図を図４に示す。図４において、LBはleft borderを、RBはright borderを、TNOSはAgrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子NOSの転写ターミネーターを、NPTIIはEscherichia coli由来neomycin phosphotransferaseII遺伝子を、PnosはAgrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子NOSの転写プロモーターを、THSPはArabidopsis thaliana由来のheat shock protein遺伝子HSPの転写ターミネーターを、AtSWEETはArabidopsis thaliana由来SWEETタンパク質をコードするDNAを、P35Sはカリフラワーモザイクウイルス35S転写プロモーターを、AtADH 5’-UTRはArabidopsis thaliana由来のalcohol dehydrogenase遺伝子ADHの翻訳エンハンサーを、ColE1 oriはEscherichia coliの複製起点を、Ri oriはAgrobacterium rhizogenesの複製起点をそれぞれ表す。【０１２７】
1.6.1  化学合成によるOsSWEETタンパク質をコードするDNAの取得とコンストラクトの作製
シロイヌナズナのコドン頻度を参考にしてアミノ酸配列が変わらないように新たに配列設計しなおしたOsSWEET5、OsSWEET11、OsSWEET12、OsSWEET13、OsSWEET14及びOsSWEET15タンパク質をコードするDNAの開始コドン側にNde I制限酵素認識配列、終止コドン側にSac I制限酵素認識配列を付加するよう設計した。そして、設計したDNAを化学的に全合成し、pRI201ANベクターに挿入することで各DNAコンストラクトを得た。なお、5’末端に付加したNde I制限酵素認識配列(5’CATATG3’)に含まれるATGがSWEETタンパク質をコードするDNAの開始コドンと一致するようにした。【０１２８】
1.6.2  化学合成によるSlSWEET8とPpSWEET8をコードするDNAの取得とコンストラクトの作製
配列番号５に示したトマト由来SWEETタンパク質(XP004230255、以下、SlSWEET8と称す)のアミノ酸配列をコードする塩基配列として配列番号４０、配列番号７に示したヒメツリガネゴケ由来SWEETタンパク質(EDQ64580、以下、PpSWEET8と称す)をコードする塩基配列として配列番号４２を設計した。そして、これら配列番号４０及び４２における、開始コドン側にNde I制限酵素認識配列、終止コドン側にSac I制限酵素認識配列を付加するよう設計した。そして、設計したDNAを化学的に全合成し、pRI201ANベクターに挿入することで2種のDNAコンストラクトを得た。なお、5’末端に付加したNde I制限酵素認識配列(5’CATATG3’)に含まれるATGが配列番号４０及び４２の開始コドンと一致するようにした。【０１２９】
1.7  シロイヌナズナへの形質転換
1.5及び1.6.1並びに1.6.2で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton and A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、Agrobacterium tumefaciens C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたAgrobacterium tumefaciensを、Cloughらにより記載された浸潤法（Steven J. Clough and Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、T1(形質転換(transformant)第一世代)種子を回収した。回収したT1種子は、カナマイシン（50 mg/L）、カルベニシリン（100 mg/L）及びベンレート水和剤（10 mg/L：住友化学社製）を含むMS寒天培地(寒天濃度は０．８％）)に無菌播種し、約２週間培養し形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体は、新しい上記MS寒天培地に植え換え、さらに約１週間栽培後、バーミキュライトとソイルミックス（サカタのタネ）を体積比で1:1に混合した土をいれた鉢に植え替えT2（形質転換第二世代）種子を得た。【０１３０】
1.8  シロイヌナズナ排水液の取得
AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8、及びPpSWEET8タンパク質をコードするDNAによって形質転換されたシロイヌナズナのT1又はT2植物体の栽培を、18L/6D（18時間明条件の後6時間暗条件にする24時間光サイクル条件）、22℃で行った。馴化後、１〜２週間経過した植物体に1/1000ハイポネックスを与え、ラップフィルム（旭化成製、サランラップ）で湿度80%以上好ましくは90％以上になるように植物を包み込み、排水液を排出させた（図５）。おもに葉裏に付着した排水液を回収し、排水液中の糖濃度を分析した。なお、野生型シロイヌナズナにアグロバクテリウムを感染・栽培して収穫される種子をT1種子、T1種子を薬剤選抜するかPCRなどの方法により、細胞中へのDNA導入を確認した植物体をT1植物、T1植物を栽培して収穫される種子をT2種子と定義する。【０１３１】
2.  イネ形質転換用DNAコンストラクトの作製
2.1 AtSWEETタンパク質をコードするDNAの増幅
上記1.5.4で調製したシロイヌナズナ形質転換用DNAコンストラクト（AtSWEET8タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET11タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET12タンパク質をコードするDNA）を鋳型とし、PCRによりAtSWEET8タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET11タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET12タンパク質をコードするDNAをそれぞれ増幅した。なお、増幅産物をpENTR/D-TOPOベクターに導入するために、5’端にはCACC配列を付加している。【０１３２】
2.2  増幅DNA断片を用いた形質転換
得られた反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、予定したサイズの増幅産物があることを確認したのち、pENTER Directional TOPO Cloningキット（インビトロジェン）を用いてpENTR/D-TOPOベクターに導入した。【０１３３】
次に、反応液全量をEscherichia coli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ)に添加し、形質転換を行った。氷浴上で30分間放置した後、42℃で45秒間の熱処理を行った。その後、氷浴で急冷し、300μlのSOC培地(タカラバイオ)を添加し、37℃、180 rpmで1時間振とう培養した。この培養液を終濃度50μg/mlのカナマイシンを添加したLB寒天プレートに塗布し、37℃で終夜培養し、翌朝コロニーを得た。【０１３４】
2.3  コロニーPCRによる形質転換のチェックとポジティブクローンの選抜
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。【０１３５】
2.4  ポジティブクローンからのプラスミドDNA精製
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。【０１３６】
2.5  ポジティブクローンの塩基配列決定
2.4で精製したプラスミドDNAを鋳型にし、M13-F及びM13-Rプライマーを用いて、DNAシーケンサ（ベックマンコールター CEQ8000）によりDNA断片の塩基配列の決定を行った。【０１３７】
2.6  LR反応と形質転換
2.4で得たAtSWEET8タンパク質をコードするDNA、AtSWEET11タンパク質をコードするDNA、AtSWEET12タンパク質をコードするDNAが挿入されたpENTR/D-TOPOプラスミドDNAとイネ形質転換用ベクター（pZH2B_GWOx）とを用いてGateway LR反応を行い、図６に示すように、イネ植物体内で過剰発現するためのコンストラクトを構築した。【０１３８】
次に、反応液全量をEscherichia coli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ)に添加し、形質転換を行った。氷浴上で30分間放置した後、42℃で45秒間の熱処理を行った。その後、氷浴で急冷し、300μlのSOC培地(タカラバイオ)を添加し、37℃、180 rpmで1時間振とう培養した。この培養液を終濃度50μg/mlのスペクチノマイシンを添加したLB寒天プレートに塗布し、37℃で終夜培養し、翌朝コロニーを得た。【０１３９】
2.7  コロニーPCRによる形質転換のチェックとポジティブクローンの選抜
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。【０１４０】
2.8  ポジティブクローンからのプラスミドDNA精製
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。【０１４１】
2.9  ポジティブクローンの塩基配列決定
2.8で精製したプラスミドDNAを鋳型にし、以下のプライマーを用いて、DNAシーケンサ（ベックマンコールター CEQ8000）によりDNA断片の塩基配列の決定を行った。
Ubi3’F : 5’-TGC TGT ACT TGC TTG GTA TTG-3’（配列番号３８）
UbiTseq3 : 5’-GGA CCA GAC CAG ACA ACC-3’ （配列番号３９）【０１４２】
2.10.1  化学合成によるOsSWEETタンパク質をコードするDNAの取得
OsSWEET13、OsSWEET14或いはOsSWEET15タンパク質をコードするDNAに、pENTR/D-TOPOベクターに導入するため5’端にCACC配列を付加するよう設計した。設計したDNAを化学的に全合成し、pENTR/D-TOPOベクターに挿入した。【０１４３】
2.10.2  化学合成によるSlSWEET8とPpSWEET8をコードするDNAの取得
ここでは、SlSWEET8をコードする塩基配列として配列番号４１、PpSWEET8をコードする塩基配列として配列番号４３を設計した。そして、これら配列番号４１及び４３に対して、pENTR/D-TOPOベクターに導入するため5’端にCACC配列を付加するよう設計した。設計したDNAを化学的に全合成し、pENTR/D-TOPOベクターに挿入した。【０１４４】
2.11  OsSWEET、SlSWEET8又はPpSWEET8タンパク質をコードするDNAのコンストラクトの作製
2.10.1及び2.10.2で合成したDNAを用い、上記2.6〜2.9と同様にイネ形質転換用ベクターを構築した。【０１４５】
2.12  イネへの形質転換
上記2.9及び2.11で作製した植物発現用ベクターを用いて、The Plant Journal (2006) 47, 969-976に記載の方法に従い、AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8、及びPpSWEET8タンパク質をコードするDNAをイネ（日本晴）に導入した。【０１４６】
2.13  イネ排水液の取得
AtSWEET、OsSWEET、SlSWEET8、及びPpSWEET8タンパク質をコードするDNAを導入したイネの形質転換第一世代を、直径6ｃｍポットに8割程度バーミキュライトを入れたものに移し替えて馴化した。なおイネの栽培は、18L(30℃)/6D(25℃)（18時間30℃明条件の後6時間25℃暗条件にする24時間光サイクル条件）で行った。馴化後、１〜２週間経過した植物体に1/1000ハイポネックスを十分に与え、ラップフィルム（旭化成社製、サランラップ）で湿度80%以上好ましくは90％以上になるように植物を包み込み、イネの排水組織から排水液を排出させた（図７）。葉に付着した排水液を回収し、糖濃度を分析した。【０１４７】
3.  排水液中の糖濃度分析
3.1  排水液サンプルの希釈
1.8で得られたシロイヌナズナの排水液、2.13で得られたイネの排水液の体積をピペッターを用いて測定し、純水を加えて0.35mlに定容した。次に、10000xG、10分間の遠心分離を行ったのち、上清0.3mLをオートサンプラーバイアルに移してHPLC分析に用いた。【０１４８】
3.2  HPLCによる糖濃度の分析
糖濃度の分析は以下の条件でHPLCを用いて行った。このとき標準物質としてグルコース、フルクトース、スクロースを各50μMになるよう混合した標準液を用いた。
分析カラム：CarboPac PA1（ダイオネクス）
溶離液：100mM NaOH
流量：1ml/min
注入量：25μl
検出器：パルスドアンペロメトリ検出器（ダイオネクス ED40）【０１４９】
4.  分析結果
1.8で得られたシロイヌナズナの排水液、2.13で得られたイネの排水液について糖濃度を測定した結果を表１９及び２０に示す。【０１５０】
【表１９】
2015099045.tif 000021
【表２０】
2015099045.tif 000022
【０１５１】
表１９及び２０から判るように、AtSWEET8タンパク質をコードするDNAを強発現するように形質転換したシロイヌナズナは排水液中の糖濃度が大幅に向上していることが判った。特に、表１９及び２０から判るように、SWEETタンパク質をコードするDNAのうちクレードIIIに分類されるAtSWEET9、AtSWEET10、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET14、AtSWEET15タンパク質をコードするDNAを導入した植物体では排水液中の糖濃度が大幅に向上しているが、クレードIIに分類されるタンパク質のうちAtSWEET8タンパク質やその相同タンパク質をコードするDNAだけは、クレードIIIに分類されるものではないにも拘わらず、排水液中の糖濃度をより大幅に向上できることが判った。【０１５２】
野生型植物においても、個体によってはまれに排出液中５０μＭ程度の糖が検出されることがある。しかし本実施例に示すように、AtSWEET8タンパク質タンパク質をコードする核酸を導入する効果は、野生型植物で検出される最大濃度よりはるかに高いことが明らかとなった。
【図１−１】
2015099045.tif 000023
【図１−２】
2015099045.tif 000024
【図１−３】
2015099045.tif 000025
【図２−１】
2015099045.tif 000026
【図２−２】
2015099045.tif 000027
【図３】
2015099045.tif 000028
【図４】
2015099045.tif 000029
【図５】
2015099045.tif 000030
【図６】
2015099045.tif 000031
【図７】
2015099045.tif 000032
【配列表】
2015099045000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月29日(2016.2.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸を導入する及び／又は当該核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１８】
上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１９】
上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２０】
上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項１９記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２１】
上記イネ科植物がＯｒｙｚａ属植物であることを特徴とする請求項２０記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２２】
上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２３】
上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項２２記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２４】
上記アブラナ科植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属植物であることを特徴とする請求項２３記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｅ）いずれかのタンパク質をコードする核酸を導入する及び／又は当該核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２、５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号１、４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２６】
上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養する条件を相対湿度８０％ＲＨ以上とすることを特徴とする請求項２５記載の滲出物の製造方法。
【請求項２７】
上記滲出物が排水液であることを特徴とする請求項２５記載の滲出物の製造方法。
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
（削除）
【請求項３１】
（削除）
【請求項３２】
（削除）
【請求項３３】
（削除）
【請求項３４】
以下のアミノ酸配列：
（Ｎ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）ｘｘｘｘｘＦｘ（Ｓ／Ａ）（１−３ａａ）ＴＦｘｘＩ（Ｖ／Ｆ／Ｍ）Ｋｘ（Ｋ／Ｒ）（Ｓ／Ｋ／Ｔ）（Ｖ／Ｔ）ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ｆ／Ｙ）（Ｓ／Ｋ）ｘ（Ｉ／Ｖ／Ｍ）ＰＹ（Ｖ／Ｉ／Ｌ）ｘ（Ｔ／Ａ）ｘ（Ｌ／Ｍ）（Ｎ／Ｓ）ｘｘＬＷ（Ｖ／Ｔ）（Ｖ／Ｆ／Ｌ）ＹＧＬ（０−２ａａ）（Ｖ／Ｉ／Ｆ／Ｌ）ｘｘｘｘｘＬＶｘ（Ｔ／Ｓ）（Ｉ／Ｖ）Ｎ（Ａ／Ｇ）ｘＧｘｘ（Ｉ／Ｌ）（Ｅ／Ｈ）（Ｌ／Ｆ／Ｍ／Ｉ）ｘＹ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｙ／Ｆ）Ｌｘｘ（Ａ／Ｓ／Ｃ）（２−４ａａ）（Ｓ／Ｋ／Ｎ）ｘ（Ｒ／Ｑ）（１−２ａａ）（Ｖ／Ｉ／Ｍ）ｘｘｘｘｘｘｘ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）ｘｘ（Ｆ／Ｖ／Ｌ）ｘｘ（Ｖ／Ｉ／Ｍ）ｘｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｖ／Ｔ）（Ｌ／Ｆ）ｘｘ（Ｖ／Ｉ）（Ｈ／Ｄ／Ｋ）（Ｄ／Ｓ／Ｎ／Ｇ）（２−３ａａ）（Ｒ／Ｋ）ｘｘ（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｆ）（Ｉ／Ｖ／Ｌ）Ｇｘ（Ｌ／Ｍ／Ｉ）ｘｘｘ（Ｆ／Ｌ）ｘｘｘＭＹｘ（Ｓ／Ａ）Ｐｘｘ（Ｖ／Ａ）ｘｘｘＶ（Ｉ／Ｖ）ｘｘ（Ｒ／Ｋ）Ｓ（Ｖ／Ｔ）（Ｅ／Ｋ）（Ｙ／Ｆ）ＭＰＦ（Ｌ／Ｆ）ＬＳ（Ｌ／Ｆ）（Ｆ／Ｖ）ｘＦ（Ｉ／Ｌ／Ｖ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｓ）ｘｘＷｘｘＹ（Ａ／Ｓ）ｘ（Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｌ）（２−３ａａ）Ｄｘ（Ｆ／Ｙ）（Ｉ／Ｖ）ｘｘ（Ｐ／Ｓ）Ｎｘ（Ｌ／Ｉ）Ｇｘ（Ｌ／Ｆ／Ｉ）ｘ（Ｇ／Ａ）ｘ（Ａ／Ｔ／Ｓ）ＱＬｘ（Ｌ／Ｖ）Ｙｘｘ（Ｙ／Ｆ）ｘｘ（Ａ／Ｓ）（Ｔ／Ｓ）Ｐを含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する及び／又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
【請求項３５】
上記共通配列は、
ＭＶＤＡＫＱＶＲＦＩＩＧＶＩＧＮＶＩＳＦＧＬＦＡＡＰＡＫＴＦＷＲＩＦＫＫＫＳＶＥＥＦＳＹＶＰＹＶＡＴ（Ｖ／Ｉ）ＭＮＣＭＬＷＶＦＹＧＬＰＶＶＨＫＤＳｘＬＶＳＴＩＮＧＶＧＬＶＩＥ（Ｌ／Ｉ）ＦＹＶ（Ｇ／Ａ）（Ｖ／Ｌ）ＹＬｘＹＣＧＨＫ（Ｑ／Ｋ）ＮｘＲ（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｎ）ＩＬｘ（Ｙ／Ｆ）ＬｘｘＥＶ（Ｖ／Ｉ）ｘＶ（Ａ／Ｖ）ｘＩ（Ｖ／Ｉ）Ｌ（Ｖ／Ｉ）ＴＬＦ（Ｖ／Ａ）（Ｉ／Ｌ）Ｋ（Ｎ／Ｇ）ＤＦｘＫＱＴＦＶＧ（Ｖ／Ｉ）ＩＣＤ（Ｖ／Ｉ）ＦＮＩＡＭＹ（Ａ／Ｇ）（Ｓ／Ａ）ＰＳＬＡＩ（Ｉ／Ｆ）（Ｔ／Ｋ）ＶＶ（Ｋ／Ｒ）ＴＫＳ（Ｖ／Ｔ）ＥＹＭＰＦＬＬＳＬＶＣＦＶＮＡ（Ａ／Ｇ）ＩＷＴ（Ｓ／Ｔ）ＹＳＬＩＦＫＩＤｘＹＶＬＡＳＮＧＩＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＬＡＬＳＱＬＩＶＹＦＭＹＹＫＳＴＰＫ（０−１ａａ）（Ｅ／Ｄ）ＫＴＶＫＰＳＥＶＥＩ（Ｐ／Ｓ）（Ａ／Ｇ）Ｔ（Ｎ／Ｅ／Ｄ）ＲＶを含むことを特徴とする請求項３４記載の滲出物の製造方法。
【請求項３６】
上記糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質は、ＡｔＳＷＥＥＴ８タンパク質又はＡｔＳＷＥＥＴ８タンパク質をコードする核酸の相同核酸がコードするタンパク質であることを特徴とする請求項３４記載の滲出物の製造方法。
【請求項３７】
上記ＡｔＳＷＥＥＴ８タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項３８】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項３９】
上記相同核酸が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項４０】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項４１】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項４２】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３６記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項４３】
顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする請求項２５又は３４記載の滲出物の製造方法。
【請求項４４】
上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項４３記載の滲出物の製造方法。
【請求項４５】
上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項４４記載の滲出物の製造方法。
【請求項４６】
上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項４５記載の滲出物の製造方法。
【請求項４７】
上記イネ科植物がＯｒｙｚａ属植物であることを特徴とする請求項４６記載の滲出物の製造方法。
【請求項４８】
上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項４４記載の滲出物の製造方法。
【請求項４９】
上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項４８記載の滲出物の製造方法。
【請求項５０】
上記アブラナ科植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属植物であることを特徴とする請求項４９記載の滲出物の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月21日(2016.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２】
顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする請求項１記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項３】
上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項２記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項４】
上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項３記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項５】
上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項４記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項６】
上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする請求項５記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項７】
上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項３記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項８】
上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項７記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項９】
上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする請求項８記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）いずれかのタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該核酸によりコードされるタンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２、５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号１、４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１１】
上記形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養する条件を相対湿度８０％ＲＨ以上とすることを特徴とする請求項１０記載の滲出物の製造方法。
【請求項１２】
上記滲出物が排水液であることを特徴とする請求項１０記載の滲出物の製造方法。
【請求項１３】
以下のアミノ酸配列：(N/S)(V/I)xxxxxFx(S/A)(1-3aa)TFxxI(V/F/M)Kx(K/R)(S/K/T)(V/T)x(D/E)(F/Y)(S/K)x(I/V/M)PY(V/I/L)x(T/A)x(L/M)(N/S)xxLW(V/T)(V/F/L)YGL(0-2aa)(V/I/F/L)xxxxxLVx(T/S)(I/V)N(A/G)xGxx(I/L)(E/H)(L/F/M/I)xY(L/I/V)x(L/I/V)(Y/F)Lxx(A/S/C)(2-4aa)(S/K/N)x(R/Q)(1-2aa)(V/I/M)xxxxxxx(L/V/I)xx(F/V/L)xx(V/I/M)xx(L/I/V)(V/T)(L/F)xx(V/I)(H/D/K)(D/S/N/G)(2-3aa)(R/K)xx(I/V/L/F)(I/V/L)Gx(L/M/I)xxx(F/L)xxxMYx(S/A)Pxx(V/A)xxxV(I/V)xx(R/K)S(V/T)(E/K)(Y/F)MPF(L/F)LS(L/F)(F/V)xF(I/L/V)N(G/A/S)xxWxxY(A/S)x(F/I/V/L)(2-3aa)Dx(F/Y)(I/V)xx(P/S)Nx(L/I)Gx(L/F/I)x(G/A)x(A/T/S)QLx(L/V)Yxx(Y/F)xx(A/S)(T/S)Pを含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞を栽培又は培養し、当該形質転換植物又は形質転換植物細胞から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
【請求項１４】
上記共通配列は、MVDAKQVRFIIGVIGNVISFGLFAAPAKTFWRIFKKKSVEEFSYVPYVAT(V/I)MNCMLWVFYGLPVVHKDSxLVSTINGVGLVIE(L/I)FYV(G/A)(V/L)YLxYCGHK(Q/K)NxR(K/R)(K/N)ILx(Y/F)LxxEV(V/I)xV(A/V)xI(V/I)L(V/I)TLF(V/A)(I/L)K(N/G)DFxKQTFVG(V/I)ICD(V/I)FNIAMY(A/G)(S/A)PSLAI(I/F)(T/K)VV(K/R)TKS(V/T)EYMPFLLSLVCFVNA(A/G)IWT(S/T)YSLIFKIDxYVLASNGIGT(F/L)LALSQLIVYFMYYKSTPK(0-1aa)(E/D)KTVKPSEVEI(P/S)(A/G)T(N/E/D)RVを含むことを特徴とする請求項１３記載の滲出物の製造方法。
【請求項１５】
上記糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質は、AtSWEET8タンパク質又はAtSWEET8タンパク質をコードする核酸の相同核酸がコードするタンパク質であることを特徴とする請求項１３記載の滲出物の製造方法。
【請求項１６】
上記AtSWEET8タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１７】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号５又は７のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５又は７のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４０〜４３いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１８】
上記相同核酸が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３、４、６、８及び９いずれかのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項１９】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列に対して３３％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２１３番目のアミノ酸配列に対して３５％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列における３３〜２１３番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２０】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列に対して２９％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から２０５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５記載のアミノ酸配列における３０〜２０５番目のアミノ酸配列に対して４０％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２１】
上記相同核酸が、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項１５記載の滲出物の製造方法。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列に対して３０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列におけるＮ末端から１９５番目のアミノ酸配列に対して３７％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列における１８〜１９５番目のアミノ酸配列に対して３９％以上の一致度を有するアミノ酸配列を、相同性の低い領域及び膜貫通ドメインを除く領域として含み、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
【請求項２２】
顕花植物又は顕花植物由来であることを特徴とする請求項１０又は１３記載の滲出物の製造方法。
【請求項２３】
上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項２２記載の滲出物の製造方法。
【請求項２４】
上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項２３記載の滲出物の製造方法。
【請求項２５】
上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項２４記載の滲出物の製造方法。
【請求項２６】
上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする請求項２５記載の滲出物の製造方法。
【請求項２７】
上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項２３記載の滲出物の製造方法。
【請求項２８】
上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項２７記載の滲出物の製造方法。
【請求項２９】
上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする請求項２８記載の滲出物の製造方法。
【国際調査報告】
2015099045.tif 000033
2015099045.tif 000034
2015099045.tif 000035
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