(57)【要約】  本発明は、植物油を基本原料として、３−ヒドロキシヘキサン酸分率の高いポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］を生産する方法を提供することを目的とする。本発明によれば、［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］生産能を付した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを破壊等させることによって、該遺伝子の発現を抑制することによって、植物油を基本原料として、３−ＨＨｘ酸分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造する方法を提供する。
2014133088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法であって、該方法は、
（ａ）ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を用意し；
（ｂ）上記株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、該遺伝子の発現を抑制し；及び
（ｃ）炭素源として植物油を含有する培地で、該株を増殖させる
ことを含み、ここで、３−ヒドロキシヘキサン酸の分率が１〜２０モル％であり、及び株内蓄積率が５０〜９０重量％であるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法。
【請求項２】
前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｆａｄＢ１（配列番号１）、ｆａｄＢ２（配列番号２）、及びｆａｄＢ’（配列番号３）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現の抑制が遺伝子の破壊であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
３−ヒドロキシヘキサン酸分率を向上させたポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を生成する組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を用意し；
（ｂ）上記株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させるためのベクターを構築し；及び
（ｃ）上記（ａ）の株に上記（ｂ）で構築したベクターを導入し、相同性組換えによって上記遺伝子を破壊又は改変し、該遺伝子の機能を抑制する
ことを含む方法。
【請求項６】
前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｆａｄＢ１（配列番号１）、ｆａｄＢ２（配列番号２）、及びｆａｄＢ’（配列番号３）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現の抑制が遺伝子の破壊であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物油を基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリエステルの１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を微生物により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会における必須材料である石油合成プラスチックは安価で加工しやすい反面、難分解性のため廃棄された際の処理が問題になっている。そこで、多くの微生物がエネルギー源として細胞内に蓄積するポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は石油ではなく、バイオマスを原料とし、かつ生分解性を有する環境低負荷型のプラスチック素材として期待されている。ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）は多くの微生物が生合成する代表的なＰＨＡであるが、Ｐ（３ＨＢ）は固くて脆いという物性のため実用化が困難である。【０００３】
一方、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）などによって植物油から合成されるポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸）共重合体［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］は柔軟性に富む優れた物性を示す。さらに、本共重合体は、３ＨＨｘ組成に応じて硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を示すため、多様の用途に向けた応用が期待できる（非特許文献１）。【０００４】
これまで、アエロモナス・キャビエは、植物油を原料として、３ＨＨｘ（ヒドロキシヘキサン酸）の分率が１０〜２０ｍｏｌ％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成することが知られている。しかしながら、その菌体内蓄積率は約１５重量％と低く、実生産に適用することは困難であった（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。微生物ポリエステレの実用化のためには、多様な物性を実現する多様な組成の共重合体を効率よく生産する技術が必要である。これまでにも高３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を蓄積し、かつ増殖能の高い組換え株の作製方法が探索され、効率的Ｐ（３ＨＢ）生産菌である水素細菌クプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）染色体へのアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡシンターゼ変異酵素遺伝子の染色体への導入、３ＨＢモノマーの供給酵素であるβ−ケトチオラーゼ遺伝子又はアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素の不活性化、脂肪酸β−酸化経路中の中間体である２−エノイル−ＣｏＡをＲ−３ＨＡ−ＣｏＡに変換するＲ−ヒドラターゼ遺伝子の導入による改変が開示されている（特許文献３、特許文献４、非特許文献２）。【０００５】
一方、クプリアヴィダス・ネカトールの脂肪酸β−酸化経路についてはほとんど報告がないが、近年、ＭＩＴ大学（米国）の研究グループにより、クプリアヴィダス・ネカトール染色体１上のＨ１６ Ａ０４５９−Ａ０４６４及びＨ１６ Ａ１５２６−Ａ１５３１の２つの領域を欠失させた株が植物油での増殖が著しく低下することが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、この知見を基にしたＰＨＡ共重合体の生産や組成制御への展開を図った報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献２】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献３】特許第３０６２４５９号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１１／１０５３７９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｃｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９：３３３−３３６（１９９８）
【非特許文献３】Ｂｒｉｇｈａｍ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９２：５４５４５４６４（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）」）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株において、脂肪酸β−酸化経路における２−エノイル−ＣｏＡの水和反応と、続く（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの脱水素反応を触媒する二機能酵素であるＦａｄＢの遺伝子を破壊することによって、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生産する微生物を製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明によれば、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を破壊することにより、植物油、及び／または脂肪酸を原料として高３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を高い蓄積率で製造する方法が提供される。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法であって、該方法は、
（ａ）ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を用意し；
（ｂ）上記株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、該遺伝子の発現を抑制し；及び
（ｃ）炭素源として植物油を含有する培地で、該株を増殖させる
ことを含み、ここで、３−ヒドロキシヘキサン酸の分率が１〜２０モル％であり、及び株内蓄積率が５０〜９０重量％であるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法。
［２］前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株であることを特徴とする、上記［１］に記載の方法。
［３］前記２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｆａｄＢ１（配列番号１）、ｆａｄＢ２（配列番号２）、及びｆａｄＢ’（配列番号３）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、上記［１］及び［２］に記載の方法。
［４］前記遺伝子発現の抑制が遺伝子の破壊であることを特徴とする、上記［１］〜［３］に記載の方法。
［５］３−ヒドロキシヘキサン酸分率を向上させたポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を生成する組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株を用意し；
（ｂ）上記株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させるためのベクターを構築し；及び
（ｃ）上記（ａ）の株に上記（ｂ）で構築したベクターを導入し、相同性組換えによって上記遺伝子を破壊又は改変し、該遺伝子の機能を抑制する
ことを含む方法。
［６］前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株であることを特徴とする、上記［５］に記載の方法。
［７］前記２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ｆａｄＢ１（配列番号１）、ｆａｄＢ２（配列番号２）、及びｆａｄＢ’（配列番号３）、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、上記［５］及び［６］に記載の方法。
［８］前記遺伝子発現の抑制が遺伝子の破壊であることを特徴とする、上記［５］〜［７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］生産微生物の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、高い増殖能と高いＰＨＡ生産能を維持しつつ、３ＨＨｘ分率の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生産する株を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】微生物におけるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）の生合成の経路を示す。
【図２】クプリアヴィダス・ネカトール株に見出されたＦａｄＢホモログを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法であって、該方法は、
（ａ）ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を用意し；
（ｂ）上記株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、該遺伝子の発現を抑制し；及び
（ｃ）炭素源として植物油を含有する培地で、該株を増殖させる
ことを含み、ここで、３−ヒドロキシヘキサン酸の分率が１〜２０モル％であり、及び株内蓄積率が５０〜９０重量％であるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法を提供する。
【００１４】
（１）組換えクプリアヴィダス・ネカトール株
本発明の製造方法に使用される微生物としては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が好ましい。ここで、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株」とは、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生合成させることを目的として、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているＰＨＡシンターゼを変異あるいは遺伝子破壊などにより欠損した株に、炭素数６の３ＨＨｘ−ＣｏＡを基質とすることができる広基質特異性ＰＨＡシンターゼ（例えばアエロモナス・キャビエ株由来ＰＨＡシンターゼ又はその変異酵素の遺伝子）を導入された株、あるいは、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているＰＨＡシンターゼ遺伝子が広基質特異性ＰＨＡシンターゼやその変異酵素の遺伝子に染色体上で置換された株を意味し、該株は、広基質特異性ＰＨＡシンターゼの作用によってクプリアヴィダス・ネカトール野生株が生合成できないＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成する能力を有することを特徴とする。上記のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株には、上記特徴を有する株であれば特に限定されないが、例えば、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、及びＭＦ０３−Ｊ１株が挙げられる。ここで、「ＮＳＤＧ株」とは、水素細菌クプリアヴィダス・ネカトールの一種であるＨ１６株の染色体にＰＨＡシンターゼ変異酵素の遺伝子であるｐｈａＣNSDGが導入された形質転換体をいう（詳細には、特許文献４を参照されたい）。「ＮＳＤＧΔＡ株」とは、前記のＮＳＤＧ株において、β−ケトチオラーゼ遺伝子であるｐｈａＡCnを欠失させた形質転換体をいう。一方、「ＭＦ０１株」とは、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡCnを広基質特異性β−ケトチオラーゼ遺伝子ｂｋｔＢCnに置換した形質転換体をいう。「ＭＦ０３株」とは、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡCnをアエロモナス・キャビエ由来の（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｒ−ヒドラターゼ）遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）に置換した形質転換体をいう。また、「ＭＦ０３−Ｊ１株」とは、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡ（β−ケトチオラーゼ遺伝子）をクプリアヴィダス・ネカトール由来のＲ−ヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ１Cn）に置換した形質転換体をいう（詳細には、上記特許文献４を参照されたい）。上記５種のＨ１６変異株は、クプリアヴィダス・ネカトールのＰＨＡシンターゼ酵素をコードする遺伝子の配列情報を基にして、一般的な遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００１５】
（２）２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子
本発明の製造方法に使用される「２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ」とは、脂肪酸β−酸化経路中の中間体である２−エノイル−ＣｏＡから（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの水和反応を触媒する酵素を指す。一方、本発明の製造方法に使用される「３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」とは、脂肪酸β−酸化経路中の中間体である上記の（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡから３−ケトアシル−ＣｏＡへの脱水素反応を触媒する酵素を指す。これらの酵素をコードする遺伝子は、クプリアヴィダス・ネカトール株において複数存在することが知られている。また、本発明によれば、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株における脂肪酸β−酸化経路中の２−エノイル−ＣｏＡから（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの生成（２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼによる）、続く３−ケトアシル−ＣｏＡの生成（３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによる）経路を遮断して、（Ｒ）−ヒドラターゼ（ＰｈａＪ）による該２−エノイル−ＣｏＡから（Ｒ）−３ＨＨｘ−ＣｏＡ（Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）のモノマー）の生成を促進することができる（図１参照）。よって、本発明によれば、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株において、該株の染色体上の上記２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は上記３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊（以下、単に「破壊等」と称する場合がある）させることによって、該遺伝子の発現を抑制することにより、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能をさらに高めた組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を作製することができる。したがって、上記の２つの遺伝子のうちのいずれか１つの遺伝子を破壊等することによって、所望のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を高めた株が得られれば、いずれの遺伝子を破壊等の対象としてもよい。本発明によれば、上記２つの遺伝子の両方を完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、より好ましくは破壊させることによって目的とする株を作製することができる。なお、本発明の製造方法に使用される上記酵素をコードする核酸（遺伝子）は、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記酵素をコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明によれば、上記２つの遺伝子に関して、限定されないが、例えば、２−エノイル−ＣｏＡの水和反応と、続く（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの脱水素反応を触媒する二機能酵素であるＦａｄＢをコードする遺伝子の両方を完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって、所望のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を高めた株を得ることができる。ここで、ＦａｄＢの遺伝子は、クプリアヴィダス・ネカトール株の染色体において、Ｈ１６ Ａ１５２６（染色体１（ＮＣ ００８３１３）の４８５７５３−４８８１７６：配列番号１）（本明細書中、「ｆａｄＢ１」とも称する）、Ｈ１６ Ｂ０７２４（染色体２（ＮＣ ００８３１４）の８１７２２３−８１９３０１：配列番号２）（本明細書中、「ｆａｄＢ２」とも称する）、及びＨ１６ Ａ０４６１（染色体１（ＮＣ ００８３１３）の４８５７５３−４８８１７６：配列番号３）（本明細書中、「ｆａｄＢ’」とも称する）として同定されている（図２参照）。
【００１７】
（３）ベクターの構築及び組換え微生物の作製
本発明の製造方法に使用される組換え微生物は、上記した通り、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体上の２−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子の少なくとも１つ、又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つを完全に若しくは部分的に欠失させ、又は改変若しくは破壊させることによって得られる。ここで、本明細書において遺伝子の「欠失」とは、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列から１以上の塩基を除くことを意味し、これにより該酵素の活性の一部、好ましくは全部が失われることを意味する。なお、本発明における製造方法においては、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列を全て欠失されてもよい。また、本明細書において遺伝子の「改変」とは、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列において、塩基の欠損、置換又は不可を生じさせ、該酵素の活性を抑制するか、又は該酵素を不活性化することを意味する。一方、本明細書において遺伝子の「破壊」とは、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列内に、例えば、外来遺伝子を挿入させることによって該酵素をコードする遺伝子の機能を失わせることを意味する。ここで、本明細書において、対象とする酵素を機能させなくするという目的において使用する場合、「欠失」、「改変」及び「破壊」という用語は、厳密に区別することなく、同義的に用いられてもよい。
【００１８】
細胞の染色体上にある対象とする遺伝子の機能を失わせる方法としては、細胞内にベクターを導入する方法を用いることが一般的である。例えば、上記酵素をコードする遺伝子の破壊は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを内因性相同配列とともにベクターに配置し、染色体上の該遺伝子と該ベクターが相同組換えによって置換された場合に起こすことができる。一形態において、このような破壊は、完全な破壊であり、上記酵素の有意な発現はないことが好ましい。本発明によれば、微生物の染色体上の上記酵素をコードする遺伝子を欠失、改変又は破壊するために使用される構築されるベクターとしては、対象酵素をコードする遺伝子を相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、トーヨーボー社製等）を用いることもできる。
【００１９】
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。遺伝子発現の破壊を目的としてベクターを使用する場合、所望の遺伝子の他に、染色体上に同時に組み込まれる選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を導入しておくことが好ましい。本発明のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）の製造方法に用いられるベクターとしては、微生物の染色体上の対象酵素をコードする遺伝子を外来の遺伝子（例えば、対象酵素をコードする遺伝子＋抗生物質耐性遺伝子）によって置換することを目的として、限定されないが、相同性組換え用ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＪＱ２００（Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．及びＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｐ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｌｌｏｗ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｅｎｅ（１９９３）１２７：１５−２１を使用することができる。さらに、上記ｐＫ１８ｍｏｂａｓｃＢが導入された株は、該ベクター上にｓａｃＢにコードされるレヴァンスクラーゼによって、スクロースを基質にして細胞内に毒性多糖が蓄積されるため、該株をスクロース添加培地中で培養することにより、対象酵素をコードする遺伝子が脱落した株を選択的に得ることができる。
【００２０】
当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同性組換えが起るように機能する領域（必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー等）が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。
【００２１】
一般的に、組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。本発明の製造方法に使用される宿主細胞としては、上述した通り、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が好ましい。より好ましくは、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株である。なお、後述する実施例６及び７では、作製した遺伝子置換ベクター（ｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ１、ｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ２、又はｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ’）を上記の株に接合伝達法により導入し、ベクターが相同領域で単交差相同性組換えにより染色体に挿入された組換え株をカナマイシン耐性を指標に単離した。また、外来遺伝子が染色体上に導入される位置は、例えば対象酵素の遺伝子発現の破壊を目的とする場合、導入されたベクターによって外来遺伝子が対象酵素の遺伝子と相同性組換えによって置換されるような位置であれば特に限定されない。
【００２２】
（４）共重合ポリエステルの合成
ポリエステル合成は、上述したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株（例えば、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、又はＭＦ０３−Ｊ１株）を植物油を含む所定の培地で培養し、培養細胞（例えば、菌体）内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
【００２３】
組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得る植物油を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。
【００２４】
本発明の製造方法で使用される形質転換体の親株であるクプリアヴィダス・ネカトールは、植物油を炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、使用可能な植物油としては、一般的には、市販されている植物油を使用することができ、その供給源は特に限定されない。好ましくは、大豆油、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂である。それらから得られる脂肪酸でもよい。また、本発明によれば、本発明の形質転換体は、親株のクプリアヴィダス・ネカトールと同様の培養条件で培養することができ、培地中の植物油の濃度は、０．１〜５％が好ましいが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００２５】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化 アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム 等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ トリウム等が挙げられる。
【００２６】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、必要であれば、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００２７】
（５）共重合ポリエステルの精製と構造解析
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
【００２８】
得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの３ＨＨｘ分率は、好ましくは１〜２０モル％、より好ましくは１〜１５モル％、さらにより好ましくは５〜１２モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。また、３ＨＨｘ分率は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）中の３ＨＢのモノマーユニット数及び３ＨＨｘのモノマーユニット数をそれぞれ「ａ」及び「ｂ」とした場合、ｂ×１００／（ａ＋ｂ）により算出することができる。後述する実施例７で示すように、本発明よって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量あたり５０〜９０重量％、好ましくは７０〜９０重量％の割合で菌体に蓄積され、さらに、従来法によって製造された共重合ポリエステルと比較して、３ＨＨｘ分率が約１ｍｏｌ％増加した。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３０】
実施例１  使用した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株
以下の実施例では、遺伝子組換え用の宿主として、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株であるＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株、ＭＦ０３株、及びＭＦ０３−Ｊ１株を用いた。「ＮＳＤＧ株」は、水素細菌クプリアヴィダス・ネカトールの一種であるＨ１６株の染色体にＰＨＡシンターゼ変異酵素の遺伝子であるｐｈａＣNSDGが導入された形質転換体であり、「ＮＳＤＧΔＡ株」は、前記のＮＳＤＧ株において、β−ケトチオラーゼ遺伝子であるｐｈａＡCnを欠失させた形質転換体である。一方、「ＭＦ０１株」は、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡCnを広基質特異性β−ケトチオラーゼ遺伝子ｂｋｔＢCnに置換した形質転換体であり、「ＭＦ０３株」は、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡCnをアロエモナス・キャビエ由来のＲ−ヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪＡｃ）に置換した形質転換体であり、及び「ＭＦ０３−Ｊ１株」は、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡをクプリアヴィダス・ネカトール由来のＲ−ヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ１Ｃｎ）に置換した形質転換体である。いずれの株についても、特許文献４を参照し、一般的な遺伝子工学的手法を用いて作製した。【００３１】
実施例２  クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株におけるＦａｄＢ遺伝子
２−エノイル−ＣｏＡの水和反応及び（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの脱水素反応を触媒する二機能酵素であるＦａｄＢをコードする遺伝子を破壊の対象とした。ＦａｄＢの遺伝子は、クプリアヴィダス・ネカトール株の染色体において、Ｈ１６ Ａ１５２６（染色体１（ＮＣ ００８３１３）の４８５７５３−４８８１７６：配列番号１）（本明細書中、「ｆａｄＢ１」とも称する）、Ｈ１６ Ｂ０７２４（染色体２（ＮＣ ００８３１４）の８１７２２３−８１９３０１：配列番号２）（本明細書中、「ｆａｄＢ２」とも称する）、及びＨ１６ Ａ０４６１（染色体１（ＮＣ ００８３１３）の４８５７５３−４８８１７６：配列番号３）（本明細書中、「ｆａｄＢ’」とも称する）として同定されている（図２参照）。【００３２】
実施例３  ｆａｄＢ１破壊用ベクターの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡ（ＮＣ ００８３１３）を鋳型に、下記の配列１及び配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によって、ＦａｄＢをコードする遺伝子ｆａｄＢ１（配列番号１）とその上下流約１ｋｂｐを含む領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キット（プロメガ社製）にて精製した。
配列１：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＣＧＡＡＣＣＡＧＴＡＣＴＣＧＧＣ（配列番号４）（下線はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）
配列２：ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＴＴＧＡＣＧ（配列番号５）（下線はＸｂａＩ制限酵素サイト）【００３３】
その後、Ｔ４キナーゼ（トーヨーボー社製）により５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ切断及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）により連結した。作製したプラスミドを鋳型に下記の配列３及び配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースＰＣＲ法によって、ｆａｄＢ１の上流約１ｋｂｐ、ｐＵＣ１１８ベクター領域、ｆａｄＢ１の下流約１ｋｂｐを含む断片を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。
配列３：ＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＴＣＴＣＧ（配列番号６）
配列４：ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴ（配列番号７）【００３４】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより自己連結した。得られたベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断し、ｆａｄＢ１の上流領域と下流領域が連結された断片を単離した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断したｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢと連結することにより、ｆａｄＢ１破壊ベクターｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ１を得た。【００３５】
実施例４  ｆａｄＢ２破壊用ベクターの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡ（ＮＣ ００８３１４）を鋳型に、下記の配列５及び配列６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によって、ＦａｄＢをコードする遺伝子ｆａｄＢ２（配列番号２）とその上下流約１ｋｂｐを含む領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。
配列５：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号８）（下線はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）
配列６：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＣＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＣＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴ（配列番号９）（下線はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）【００３６】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ切断及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。作製したプラスミドを鋳型に下記の配列７及び配列８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースＰＣＲ法によって、ｆａｄＢ２の上流約１ｋｂｐ、ｐＵＣ１１８ベクター領域、ｆａｄＢ２の下流約１ｋｂｐを含む断片を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。
配列７：ＧＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡＴＣＧＧＴＧＴＧ（配列番号１０）
配列８：ＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＣＣＡＴ（配列番号１１）【００３７】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより自己連結した。得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、ｆａｄＢ２の上流領域と下流領域が連結された断片を単離した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、アルカリホスファターゼ（トーヨーボー社製）で５’−末端を脱リン酸化したｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢと連結することにより、ｆａｄＢ２破壊ベクターｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ２を得た。【００３８】
実施例５  ｆａｄＢ’破壊用ベクターの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡ（ＮＣ ００８３１３）を鋳型に、下記の配列９及び配列１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によって、ＦａｄＢをコードする遺伝子ｆａｄＢ’（配列番号３）とその上下流約１ｋｂｐを含む領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。
配列９：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＴＴＧＴＣＧ（配列番号１２）（下線はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）
配列１０：ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣ（配列番号１３）（下線はＸｂａＩ制限酵素サイト）【００３９】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。作製したプラスミドを鋳型に下記の配列１１及び配列１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたインバースＰＣＲ法によって、ｆａｄＢ’の上流約１ｋｂｐ、ｐＵＣ１１８ベクター領域、ｆａｄＢ’の下流約１ｋｂｐを含む断片を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。
配列１１：ＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＴＧＴＣＴＣＧ（配列番号１４）
配列１２：ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴ（配列番号１５）【００４０】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより自己連結した。得られたベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断し、ｆａｄＢ１の上流領域と下流領域が連結された断片を単離した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断したｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢと連結することにより、ｆａｄＢ’破壊ベクターｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ’を得た。【００４１】
実施例６  相同性組換え株の作製
実施例２で得られたそれぞれのベクターを用いて、実施例１に記載の組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、各ベクターを大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％トリプトン、１％塩化ナトリウム、０．５％イーストエキス、ｐＨ７．２）３．０ｍｌ中で３７℃終夜培養した。これと並行して、組換えクプリアヴィダス・ネカトール株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％イーストエキス）３．０ｍｌ中で３０℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液０．２ｍｌに対して、組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の培養液０．１ｍｌを混合し、３０℃で６時間培養した。この菌体混合液を０．２ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で３日間培養した。組換え大腸菌のベクターが、クプリアヴィダス・ネカトールに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からｐＫ１８ｍｓΔｆａｄＢ１が染色体に取り込まれたクプリアヴィダス・ネカトール形質転換体（ポップイン株）である。さらに、ポップイン株をＮＲ培地で３０℃終夜培養した後、１０％スクロースを添加したＮＲ培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ上のｓａｃＢにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、１０％スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株（ポップアウト株）のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上からｆａｄＢ１、ｆａｄＢ２、又はｆａｄＢ’が欠失したクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これらをそれぞれクプリアヴィダス・ネカトール「ＮＳＤＧ−ΔｆａｄＢ１株」、「ＮＳＤＧ−ΔｆａｄＢ２株」、及び「ＮＳＤＧ−ΔｆａｄＢ’株」と命名した。また、上記と同様の方法を用いて、ｆａｄＢ１及びｆａｄＢ２、並びにｆａｄＢ１及びｆａｄＢ’を二重破壊した株を作製し、それぞれ「ＮＳＤＧ−ΔΔｆａｄＢ１ｆａｄＢ２株」及び「ＮＳＤＧ−ΔΔｆａｄＢ１ｆａｄＢ’株」と命名した。【００４２】
実施例７  組換えクプリアヴィダス・ネカトール株による共重合ポリエステル合成
ＮＲ培地（前述）で前培養した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を１００ｍｌのＭＢ培地（０．９％リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、１％微量金属溶液）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２時間振とう培養した。炭素源として１％大豆油を用いた。破壊ベクターを保持する組換え株においては、培地中に０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加した。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、付着した油分を除くために７０％エタノールで洗浄したのち、蒸留水で洗浄した。得られた菌体は凍結乾燥し、乾燥菌体重量（ＤＣＭ）を測定した。【００４３】
乾燥菌体１０〜３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく攪拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層０．５ｍｌをキャピラリーガラスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を下記の表１及び２に示す。【００４４】
【表１】
2014133088.tif 000003
【００４５】
表１の結果に記載されるように、ｆａｄＢ１破壊株においては、大豆油から生合成されＰＨＡ生産量がわずかに低下したが、３ＨＨｘ分率が２．０ｍｏｌ％から２．６ｍｏｌ％に増加した。一方、ｆａｄＢ’遺伝子破壊株においては、３ＨＨｘ分率は３．２ｍｏｌ％に増加したが、ＰＨＡ生産量が減少していた。ｆａｄＢ１−ｆａｄＢ’二重破壊株では菌体生育及びＰＨＡ生産量が減少していた。また、ｆａｄＢ１遺伝子破壊においては、ＰＨＡ生産量が大きく減少することなく、共重合体中の３ＨＨｘ分率を増加させる傾向が見られたことから、これまでに本発明者らによって作製した各種のクプリアヴィダス・ネカトール株（ＭＦ０２株、ＭＦ０３株、及びＭＦ０３−Ｊ１株；特許文献４参照）について、実施例６と同様にｆａｄＢ１破壊を導入し、大豆油を炭素源としたＰＨＡ生産を検討した。その結果、いずれの株においてもＰＨＡ生産量の大きな減少なしに３ＨＨｘ分率が約１ｍｏｌ％増加することを見出した（表２）。さらに、ポリマー中に取り込まれたモノマーユニットの量を計算したところ（表１及び２の最右段）、ｆａｄＢ１の破壊により確かに３ＨＨｘユニットの取り込み量が増加していることが示された。これは該遺伝子破壊による共重合組成変化は３ＨＢユニットの減少による相対的なもののみではないことを示している。【００４６】
【表２】
2014133088.tif 000004
【００４７】
本実施例で得られた３ＨＨｘ分率の向上は約１ｍｏｌ％であるが、本発明で用いた組換えクプリアヴィダス・ネカトール株のＰＨＡ生産率（乾燥菌体あたり）は８０重量％以上と非常に高く、これほど高い蓄積率及び生産性を維持しつつ、３ＨＨｘ分率を増加させることは通常、極めて困難である。従来では、種々の遺伝子操作により３ＨＨｘ分率が増加する場合であっても、それは炭素数４の３ＨＢユニットの分率低下による相対的な３ＨＨｘ分率の増加であり、結果的にＰＨＡ生産量の減少を伴っている。本発明では高いレベルのＰＨＡ生産量を維持しつつ、３ＨＨ分率の増加に成功しており、工業化の観点からは非常に意義がある。
【図１】
2014133088.tif 000005
【図２】
2014133088.tif 000006
【配列表】
2014133088000001.app
【国際調査報告】
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