(57)【要約】  本発明は、よりグルタチオンを高生産するように遺伝子が改変されている酵母、及び該酵母を利用したグルタチオンの製造法を提供することを目的とする。本発明は、親株と比較してチオールオキシダーゼの活性が増大した酵母を培地中で培養することにより、グルタチオンを産生せしめた後、得られる培養液からグルタチオンを回収することを特徴とする、グルタチオンの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株と比較してチオールオキシダーゼの活性が増大した酵母を培地中で培養することにより、グルタチオンを産生せしめた後、得られる培養液からグルタチオンを回収することを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
【請求項２】
チオールオキシダーゼが、下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号３又は４に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号３又は４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号３又は４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
酵母が親株と比較してグルタチオンレダクターゼの活性が低下した酵母である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
グルタチオンレダクターゼが下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号６に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
酵母が、親株と比較してγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
γ−グルタミルシステイン合成酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号８に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
グルタチオン合成酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号９に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１０に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１０と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１０に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
酵母が、親株と比較してグルタチオン輸送酵素の発現が強化された酵母である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
グルタチオン輸送酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１２に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法で得られたグルタチオン中の酸化型グルタチオンを還元することを含む、還元型グルタチオンの製造方法。
【請求項１２】
親株と比較して、チオールオキシダーゼの発現が強化され、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化されるように人為的に改変された遺伝子を有することを特徴とする酵母。
【請求項１３】
親株と比較して、チオールオキシダーゼの発現が強化され、かつ、グルタチオン輸送酵素の発現が強化されるように人為的に改変された遺伝子を有することを特徴とする酵母。
【請求項１４】
酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、請求項１２又は１３に記載の酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、食品などに用いられるグルタチオンを高生産する酵母、及び該酵母を用いたグルタチオンの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは還元型及び酸化型の存在が知られており、還元型グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドである。また、酸化型グルタチオンは２分子の還元型グルタチオンのチオール基がジスルフィド結合した化合物である。人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、酸化型グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。【０００３】
またグルタチオンは、現在工業的には、酵母を用いた発酵法により生産されている。グルタチオンは酵母の細胞内に蓄積されるため、実際には、酵母を培養し、その菌体中からグルタチオンを抽出する方法が広く用いられている。それ故に、これまで、グルタチオン生産に使用する酵母への突然変異処理やグルタチオンの合成に関与する酵素を遺伝子組換えにより導入すること（特許文献１、２）、また、培地中にグルタチオンを構成する３種のアミノ酸であるＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン、グリシンを添加することにより、培養菌体内のグルタチオン含量を向上させることによりグルタチオン生産性を向上させる試みがなされてきた。更に、近年では酸化型グルタチオンの形で酵母菌体内に蓄積させる方法が報告されている。非特許文献１ではグルタチオンレダクターゼ遺伝子を破壊し、グルタチオン輸送酵素の発現を強化した株で酸化型グルタチオンが増加し、総グルタチオン（酸化型＋還元型グルタチオン）が約３０％増加している。また特許文献３においてはグルタチオンペルオキシダーゼの発現により酸化型グルタチオンを含めたグルタチオン総量を増加させる方法を報告している。
しかしながら、更に工業的に安価なグルタチオンの製造には、より効率的にグルタチオンを生産する酵母の取得が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６４-５１０９８号公報
【特許文献２】特開２０１２-２１３３７６号公報
【特許文献３】特開２０１４-６４４７２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，  １１９−１２５（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記技術背景の下、よりグルタチオンを高生産するように遺伝子が改変されている酵母、及び該酵母を利用したグルタチオンの製造法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討した結果、酵母においてチオールオキシダーゼの活性が増大した株で、酸化型グルタチオンを含めたグルタチオンの菌体内の含量が増加することを見出した。また、チオールオキシダーゼの活性が増大した株において、酸化型グルタチオンの還元に関与するグルタチオンレダクターゼ活性を低下させたところ、驚くべきことにグルタチオン生産に関して顕著な増加が確認され、菌体内のグルタチオン含量（酸化型グルタチオン＋還元型グルタチオン）が大幅に増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、チオールオキシダーゼの活性が増大した株のγ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）および／またはグルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）の活性を増大させることで、より相乗的にグルタチオンの生産を改善できることを確認した。
即ち、本発明は、チオールオキシダーゼの活性が増大した酵母を培養することを特徴とするグルタチオンの製造方法に関する。【０００８】
具体的には、本発明は、以下を提供する。
［１］親株と比較してチオールオキシダーゼの活性が増大した酵母を培地中で培養することにより、グルタチオンを産生せしめた後、得られた培養液からグルタチオンを回収することを特徴とする、グルタチオンの製造方法。
［２］チオールオキシダーゼが、下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号３又は４に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号３又は４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号３又は４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、上記［１］に記載の製造方法。
［３］酵母が親株と比較してグルタチオンレダクターゼの活性が低下した酵母である上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］グルタチオンレダクターゼが下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号６に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、上記［３］に記載の製造方法。
［５］酵母が、親株と比較してγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化された酵母である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］γ−グルタミルシステイン合成酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号８に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、上記［５］に記載の製造方法。
［７］グルタチオン合成酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号９に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１０に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１０と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１０に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、上記［５］に記載の製造方法。
［８］酵母が、親株と比較してグルタチオン輸送酵素の発現が強化された酵母である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］グルタチオン輸送酵素が下記（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１２に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、上記［８］に記載の製造方法。
［１０］酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法で得られたグルタチオン中の酸化型グルタチオンを還元することを含む、還元型グルタチオンの製造方法。
［１２］親株と比較して、チオールオキシダーゼの発現が強化され、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素の発現が強化されるように人為的に改変された遺伝子を有することを特徴とする酵母。
［１３］親株と比較して、チオールオキシダーゼの発現が強化され、かつ、グルタチオン輸送酵素の発現が強化されるように人為的に改変された遺伝子を有することを特徴とする酵母。
［１４］酵母が、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母である、上記［１２］又は［１３］に記載の酵母。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、グルタチオンを効率よく生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明は、細胞内のチオールオキシダーゼ活性が増大し、好ましくはさらにグルタチオンレダクターゼ活性が低下した酵母によるグルタチオンの製造方法である。
より好ましくは上記に加え、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）および／またはグルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）および／またはグルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）の活性が増大した酵母によるグルタチオンの製造方法である。
【００１１】
本発明において「酵素活性が増大する」とは、目的の酵素活性が野性株等の親株と比較して増大していることを意味する。また、「酵素活性が増大する」とは、もともと目的の酵素活性を有する菌株において目的の酵素活性を増大させることだけでなく、もともと目的の酵素活性を有さない菌株に目的の酵素活性を付与することを含む。
【００１２】
酵素活性の増大は、例えば、菌株の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより達成できる。
【００１３】
遺伝子の発現の増強は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。また、より強力なプロモーターとしては、公知の高発現プロモーター、例えば、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターを用いてもよい。なお、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。より強力なプロモーターを利用した例としては、染色体上のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のプロモーターを強転写プロモーターで置換することによりγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を増強する方法が開示されている（大竹康之ら、バイオサイエンスとインダストリー、第５０巻第１０号、第９８９〜９９４頁、１９９２年）。
【００１４】
また、遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることによっても達成できる。
【００１５】
遺伝子のコピー数の増加は、染色体上に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ＡＲＳ）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ＡＲＳを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開９５／３２２８９号パンフレットに記載されている。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。
【００１６】
また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。ベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドを好適に用いることができる。目的遺伝子は、好適なプロモーターと組み合わせてベクターに挿入し、目的遺伝子を発現させてもよい。また、遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含むベクターを用いる場合には、ベクター中のプロモーターを利用して目的遺伝子を発現させてもよい。
【００１７】
また、酵素活性が増大するような改変は、例えば、目的の酵素の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強された酵素は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来の酵素に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
目的の酵素活性が増大したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。チオールオキシダーゼ活性はFEBS Letters 477 (2000) 62-66に記載の方法によって測定することができる。また、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、Jacksonの方法（Jackson, R. C., Biochem.J., 111, 309 (1969)）によって測定することができる。グルタチオン合成酵素活性は、Gushimaらの方法（Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)）によって測定することができる。グルタチオン輸送酵素活性はTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 273, No. 50, Issue of December 11, pp. 33449-33454, 1998を参考にすることによって測定することができる。
【００１９】
目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が増大したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を親株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、親株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００２０】
目的の酵素の量が増大したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、親株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に増大しているのが好ましい。
【００２１】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、染色体の改変により酵素活性が増大している場合には、本発明の酵母は、グルタチオンを蓄積できる限り、酵素活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、酵素活性が増大するように改変された染色体のホモ型であってもよい。
【００２２】
本発明において「酵素活性が低下する」とは、目的の酵素活性が野性株等の親株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。
【００２３】
酵素活性の低下は、例えば、菌株の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、突然変異処理又は遺伝子組換え技術により達成できる。
【００２４】
突然変異処理としては、紫外線照射、または、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。
【００２５】
遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 10(8):573-578、WO 98/14600等）を利用できる。
【００２６】
酵素活性が低下するような改変は、例えば、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。
【００２７】
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部を欠失させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００２８】
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる。
【００２９】
また、酵素活性が低下するような改変は、例えば、染色体上の目的の酵素をコードする遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子やグルタチオン等のγ−グルタミル化合物の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００３０】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで酵母を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。
【００３１】
用いる組換えＤＮＡの構造によっては、相同組換えの結果として、野生型遺伝子と欠失型遺伝子とが組換えＤＮＡの他の部分（例えば、ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入される場合がある。この状態では野生型遺伝子が機能するため、当該２個の遺伝子間で再度相同組換えを起こさせ、１コピーの遺伝子を、ベクター部分及びマーカー遺伝子とともに染色体ＤＮＡから脱落させ、欠失型遺伝子が残ったものを選抜する必要がある。
【００３２】
また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡで酵母を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いればよい。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組み換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。
【００３３】
目的の酵素活性が低下したことの確認は、同酵素の活性を測定することによって行うことが出来る。グルタチオンレダクターゼの活性は、公知の手法（コスモバイオ社製Glutathione Reductase Assay Kit品番7510-100-K等）により測定することができる。
【００３４】
目的の酵素をコードする遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を親株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００３５】
目的の酵素の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。目的の酵素の量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
【００３６】
酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
【００３７】
（１）チオールオキシダーゼ
チオールオキシダーゼとは一般に、生体内において下記式（１）の反応を触媒する酵素である。
既知の文献によれば、チオールオキシダーゼは主にタンパク質のフォールディングに関与していることが知られている。例えば、チオールオキシダーゼの一種であるＥＲＶ１は、ミトコンドリア内膜においてタンパク質にジスルフィド結合を導入するＭｉａ４０に含まれる中のチオール基を酸化することで、Ｍｉａ４０を活性化している。非特許文献（The EMBO Journal (2012) 31, 3169-3182）。また、これまでチオールオキシダーゼとグルタチオン生産との関係を示す報告はなされていない。
【００３８】
【化１】
2016140349.tif 000002
【００３９】
本発明におけるチオールオキシダーゼは上記の通り、タンパク質もしくはペプチドの分子間もしくは分子内のチオール基を酸素分子により酸化し、ジスルフィド結合を生成する活性（即ち、チオールオキシダーゼ活性）を有していれば良く、特に限定されないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号３又は４に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号３又は４と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、
（ｆ）配列番号３又は４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつチオールオキシダーゼ活性を有するタンパク質、
のいずれかであることが好ましい。
【００４０】
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、チオールオキシダーゼ活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００４１】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
【００４２】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００４３】
配列番号１〜２に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、配列番号１〜２に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００４４】
チオールオキシダーゼ活性を有する限り、配列番号１〜２に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。
【００４５】
配列番号３又は４に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号３〜４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）」等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液(１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる) を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、さらに好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、最も好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００４７】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、ハイブリダイゼーション条件はこれらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号３又は４に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができる。
【００４９】
ＤＮＡの配列同一性（％）とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００５０】
ＤＮＡの配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る: ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ８，  １９９４年９月，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１；  Ｒｉｃｅ，  Ｐ．  （１９９６）  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，  Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＣＢ１０  １ＲＱ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、および、ｔｈｅ．ｅ．ｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００５１】
ここで、配列番号３又は４に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）」等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。
【００５２】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ(例えば置換) の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変(例えば、置換と挿入) を含んでいても良い。
【００５３】
上記の記載の複数個の塩基とは、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質がチオールオキシダーゼ活性を有する限り特に限定されないが、例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００５４】
本発明の代表的なチオールオキシダーゼとしては、チオールオキシダーゼ（ＥＲＶ１）、チオールオキシダーゼ（ＥＲＯ１）が挙げられる。
【００５５】
（２）グルタチオンレダクターゼ
グルタチオンレダクターゼとは、下記式（２）に示すような酸化型グルタチオンを、ＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸）を利用して還元する活性を有する酵素である。
【００５６】
【化２】
2016140349.tif 000003
【００５７】
本発明におけるグルタチオンレダクターゼはＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを利用してジスルフィド結合を還元する活性（即ち、グルタチオンレダクターゼ活性）を有していれば良く、特に限定されないが、
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号５に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号６に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号６と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質、
を挙げることができる。
【００５８】
配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、グルタチオンレダクターゼ活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００５９】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【００６０】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００６１】
配列番号５に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【００６２】
グルタチオンレダクターゼ活性を有する限り、配列番号５に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。
【００６３】
配列番号６に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号６に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【００６４】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号６に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【００６５】
ここで、配列番号６に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【００６６】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ(例えば置換) の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変(例えば、置換と挿入) を含んでいても良い。
【００６７】
上記の記載の複数個の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がグルタチオンレダクターゼ活性を有する限り特に限定されないが、例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００６８】
配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンレダクターゼ活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびに酸化型グルタチオン、ＮＡＤＰＨを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に還元型グルタチオンまたはＮＡＤＰが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
【００６９】
本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合には、本発明の酵母は、グルタチオン等のγ−グルタミル化合物を蓄積できる限り、酵素活性が低下するように改変された遺伝子と野生型遺伝子とをヘテロで有していてもよいが、通常は、酵素活性が低下するように改変された遺伝子のホモ型であるのが好ましい。
【００７０】
本発明において、グルタチオンレダクターゼ活性は、親株と比較して、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下している。また、グルタチオンレダクターゼ活性は、実質的に消失しているのが好ましい。
【００７１】
（３）γ−グルタミルシステイン合成酵素
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素としては、グルタミン酸とシステインとを縮合させγ−グルタミルシステインを合成する活性（即ち、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性）を有していればよく、特に限定されないが、
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号７に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号８に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号８と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質、
を挙げることができる。
【００７２】
配列番号７に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００７３】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【００７４】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００７５】
配列番号７に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【００７６】
γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り、配列番号７に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。
【００７７】
配列番号８に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号８に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【００７８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号８に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【００７９】
ここで、配列番号８に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【００８０】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ(例えば置換) の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変(例えば、置換と挿入) を含んでいても良い。
【００８１】
上記の記載の複数個の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００８２】
配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質がγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質、ならびにL−グルタミン酸およびL-システインを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にγ−グルタミルシステインが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
【００８３】
本発明におけるγ−グルタミルシステイン合成酵素としては、上記タンパク質のうち、配列番号７で示されるＧＳＨ１が好ましい。
【００８４】
（４）グルタチオン合成酵素
本発明におけるグルタチオン合成酵素としては、γ−グルタミルシステインとグリシンを縮合させグルタチオンを合成する活性（即ち、グルタチオン合成酵素活性）を有していればよく、特に限定されないが、
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号９に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１０に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１０と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１０に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
を挙げることができる。
【００８５】
配列番号９に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、グルタチオン合成酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００８６】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【００８７】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００８８】
配列番号９に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【００８９】
グルタチオン合成酵素活性を有する限り、配列番号９に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。
【００９０】
配列番号１０に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１０に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【００９１】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１０に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【００９２】
ここで、配列番号１０に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【００９３】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ(例えば置換) の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変(例えば、置換と挿入) を含んでいても良い。
【００９４】
上記の記載の複数個の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がグルタチオン合成酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【００９５】
配列番号９で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したいタンパク質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて該タンパク質を製造した後、該タンパク質ならびにγ−グルタミルシステインおよびグリシンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にグルタチオンが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。
【００９６】
本発明におけるグルタチオン合成酵素としては、配列番号９で示されるＧＳＨ２が好ましい。
【００９７】
（５）グルタチオン輸送酵素
本発明において、グルタチオン輸送酵素とは、細胞質のグルタチオンを液胞に輸送する機能（即ち、グルタチオン輸送酵素活性）を有するタンパク質を意味し、当該機能を有する限り特に限定されない。
より好ましくはグルタチオン輸送酵素として、
（ａ）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号１２に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号１２と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｆ）配列番号１２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および／または付加されたＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつグルタチオン輸送酵素活性を有するタンパク質、
を挙げることができる。
【００９８】
配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、上記（１）に記載の方法に準じて調製することができ、グルタチオン合成酵素活性を有する限り上記タンパクに包含される。
【００９９】
置換、挿入、欠失および／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については（１）において上述した通りである。
【０１００】
上記の記載で複数個のアミノ酸とは、例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【０１０１】
配列番号１１に示したアミノ酸配列との配列同一性は、６０％以上が好ましいが、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、８５％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の配列同一性は、（１）において上述した方法により算出できる。
【０１０２】
グルタチオン輸送酵素活性を有する限り、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。また、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。
【０１０３】
配列番号１２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ハイブリダイゼーションの条件等は（１）において上述した通りである。
【０１０４】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１２に示されるＤＮＡとの配列同一性が７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７９％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のＤＮＡをあげることができる。ＤＮＡの配列同一性（％）は（１）において上述した通りである。
【０１０５】
ここで、配列番号１２に示す塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠矢、挿入および/または付加されたＤＮＡは、（１）において上述した方法に準じて調製することができる。
【０１０６】
置換、挿入、欠失および/または付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ(例えば置換) の改変のみを含むものであっても良いし、２種類以上の改変(例えば、置換と挿入) を含んでいても良い。
【０１０７】
上記の記載の複数個の塩基とは、該ＤＮＡがコードするタンパク質がグルタチオン輸送酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、さらにより好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。
【０１０８】
本発明におけるグルタチオン輸送酵素としては、配列番号１１で示されるＹＣＦ１が好ましい。
【０１０９】
（６）本発明の酵母
本発明の酵母は、グルタチオン生産能を有する酵母であれば、特に制限はなく、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlesbergensis)、サッカロマイセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロマイセス・ルーキシー(Saccharomyces rouxii)などのサッカロマイセス属、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)などのキャンディダ属、シゾサッカロマオセス・ポンべ(Schizosaccaromyces pombe)などのシゾサッカロミセス属、トルロプシス・バーサティリス(Toluropsis versatilis)、トルロプシス・ペトロフィラム(Toluropsis petrophilum)などのトルロプシス属、ピキア（Pichia）属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、マイコトルラ(Mycotorula)属、ロードトルラ(Rhodotorula)属、ハンゼニュラ(Hansenula)属、エンドマイセス(Endomyces)属などの酵母が挙げられる。
中でも、サッカロマイセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましく、更にはサッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビシエ、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリスが好ましい。
【０１１０】
（７）本発明におけるグルタチオンの製造方法
本発明の酵母菌体の培養は通常の微生物の培養と同様に行えばよい。すなわち炭素源、窒素源、無機物その他の栄養等を適宜含有していれば、合成培地、半合成培地、天然（複合）培地のいずれも使用可能である。
【０１１１】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロース、マルトース、マンノース、マニトール、キシロース、ガラクトース、デンプン、デンプン加水分解物液、糖蜜などの種々の炭水化物原料が使用できる。またピルビン酸、酢酸、乳酸などの各種有機酸、アスパラギン酸、アラニンなどの各種アミノ酸類も使用可能である。
【０１１２】
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素その他の窒素含有化合物ならびにペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物や加水分解物などの窒素性有機物質あるいはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニンなどの各種アミノ酸が使用可能である。
【０１１３】
更に無機物としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。
【０１１４】
培養は振とう培養、通気攪拌深部培養などの好気的培養条件下で実施する。培養時ｐＨは、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは４．０〜６．０、最も好ましくは５．０に制御される。ｐＨ制御の中和剤としてはアンモニア水、水酸化ナトリウム、炭酸アンモニウムなどが使用可能である。好気的培養時の培地への空気供給量は、培地１Ｌに対し、好ましくは０．２Ｌ／分以上、より好ましくは０．５Ｌ／分以上、さらに好ましくは１Ｌ／分以上である。また、総容量２Ｌのジャーファーメンターを使用して培養する場合、好気的培養条件としては上記通気量に加え、攪拌数は好ましくは２００ｒｐｍ以上、より好ましくは３００ｒｐｍ以上、さらに好ましくは４００ｒｐｍ以上である。また、培養時の温度は、２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃、最も好ましくは２８〜３２℃である。培養期間は、通常１６時間〜７２時間、好ましくは２４時間〜４８時間である。培地中への初期細胞濃度（仕込み濃度）は酵母の種類、培地組成などにより異なるが、初発濁度（ＯＤ６００）は好ましくは０．０１〜２．０、より好ましくは０．０２〜１．０、さらに好ましくは０．１〜０．４である。グルコースなどの上記炭素源に関しては培養初期に一括に仕込んで培養する回分方式、培養期間を通じて少しずつ添加する半回分方式のいずれの方式も適用可能であるが、本発明者らの検討結果によれば、使用する微生物にもよるが、半回分方式の方が増殖速度が向上し、最終菌濃度もより高位となり、菌体内のグルタチオン合成関連酵素の活性も高まるのでより好ましい。半回分方式でグルコースなどの炭素源の流加速度を決定する指標としては培養液の濁度、酸素消費速度、二酸化炭素発生速度、ｐＨ調整用中和剤の消費量などが有効利用でき、使用する酵母に合わせて適切な指標を選び、その変化に対応させて炭素源の流加速度を変化させることにより、酵母培養の最適化が図れ、最終菌濃度およびグルタチオン合成関連酵素の活性向上、その結果グルタチオンの生産性向上が実現できる。
【０１１５】
本法により、高濃度のグルタチオンを主として菌体内に含有する酵母と培地成分からなる培養液が得られるが、その培養液中の酵母菌体を、濾過や遠心分離操作により培地成分と分離し、得られた酵母菌体から熱水抽出、アルカリ抽出法、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作などを必要に応じて適宜組み合わせてグルタチオンを抽出することができる。また、培養後の培養液に対し、直接に上記の抽出操作を実施してもよく、あるいは、酵素分解法、自己消化法、物理的な破砕操作を行って、菌体中のグルタチオンを培地中に溶出させた後に、上記抽出調査を行って、グルタチオンを抽出しても良い。このようにして得られるグルタチオン抽出液から、一般的な方法によりグルタチオンを精製することによりグルタチオンを高度に含有する分画、またはグルタチオン粉末を得ることが出来る。
【０１１６】
また、一旦上記グルタチオン抽出液、若しくはグルタチオン粉末中に含まれる酸化型グルタチオンを還元することにより、還元型の割合が高められたグルタチオンを得ることもできる。還元する方法としては特に限定しないが、好ましくはグルタチオンレダクターゼによる還元が挙げられる。
【０１１７】
以下、実施例などを挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例などにより限定されない。
【実施例】
【０１１８】
［製造例１］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強した酵母（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株）【０１１９】
非特許文献（Hara KY, Kiriyama K, Inagaki A, Nakayama H, Kondo A. (2012) Improvement of glutathione production by metabolic engineering the sulfate assimilation pathway of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 426(2):129-33.）に記載のＧＳＨ１およびＧＳＨ２を増強したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を使用した。【０１２０】
［製造例２］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、さらにＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強した酵母（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＶ１強化株、ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＯ１強化株）の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、5'-GGCCGCTAGCATGAAAGCAATAGATAAAATGACGG-3' （配列番号１３）および5'-GGCCGGATCCTTATTCGTCCCAGCCGTCCTTCC-3' (配列番号１４)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、チオールオキシダーゼ（ＥＲＶ１）遺伝子ＮｈｅＩ−ＢａｍＨI断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＮｈｅＩ−ＢａｍＨI消化部位に連結し、ＥＲＶ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＶ１を得た。得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＶ１を制限酵素ＮｃｏＩで消化した。製造例１に示したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＶ１強化株）を得た。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、5'-GGCCGCTAGCATGAGATTAAGAACCGCCATTGCCAC-3' （配列番号１５）および5'-GGCCGGATCCTTATTGTATATCTAGCTTATAGGAAATAGGC-3' (配列番号１６)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、チオールオキシダーゼ（ＥＲＯ１）遺伝子ＮｈｅＩ−ＢａｍＨI断片を得た。この断片を非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１４５：７０１−７０８）に記載のｐＧＫ４０６のＮｈｅＩ−ＢａｍＨI消化部位に連結し、ＥＲＯ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＯ１を得た。得られたプラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＯ１を制限酵素ＮｃｏＩで消化した。製造例１に示したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、形質転換体ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＯ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＯ１強化株）を得た。【０１２１】
［製造例３］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊株）の作製
非特許文献（Kiriyama K, Hara KY, Kondo A. (2013) Oxidized glutathione fermentation using Saccharomyces cerevisiae engineered for glutathione metabolism. ApplMicrobiol Biotechnol, 97(16):7399-7404.）に記載の方法で、ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊株）を得た。【０１２２】
［製造例４］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子の発現を低下し、さらにＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＶ１強化株、ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＯ１強化株）の作製
製造例２に示したＥＲＶ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＶ１およびＥＲＯ１発現プラスミドｐＧＫ４０６−ＥＲＯ１を制限酵素ＮｃｏＩで消化した。製造例３に示したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株とし、形質転換を行い、それぞれ形質転換体ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＶ１強化株）およびＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＯ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＯ１強化株）を得た。【０１２３】
［製造例５］ＥＲＶ１の発現を増強し、さらにＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＶ１強化＋ＹＣＦ１強化株）、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化株）の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとして、5'- AAAAGGATCCATGGCTGGTAATCTTGTTTCATGGGCC-3' （配列番号１７）および5'- AAAACTCGAGTTAATTTTCATTGACCAAACCAGCCTCC-3' (配列番号１８)を用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、グルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）遺伝子ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。この断片をｐ４２７ＴＥＦ（コスモバイオ社製）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化部位に連結し、ＹＣＦ１発現プラスミドｐ４２７−ＹＣＦ１を得た。製造例４に示した Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１株、および製造例３で示したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を宿主酵母株とし、ｐ４２７ＴＥＦ−ＹＣＦ１を用いて形質転換を行い、それぞれ形質転換体ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１、ＹＣＦ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＶ１強化＋ＹＣＦ１強化株）およびＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＹＣＦ１株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＹＣＦ１強化株）を得た。【０１２４】
［実施例１］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、さらにＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強した酵母（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＶ１強化株、ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化株＋ＥＲＯ１強化）によるグルタチオンの生産
製造例２で取得した、ＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を増強し、ＥＲＶ１またはＥＲＯ１の発現を増強した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１およびＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＯ１をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、培養液を１ｍｌ回収した。
遠心分離して集めた菌体を滅菌水にて２度洗い、９５℃で３分間熱処理することで、菌体内のグルタチオンを溶出した。２５℃、２００００ｘｇにて５分間遠心した上清のグルタチオン濃度をＨＰＬＣ法にて分析し、培地あたりのグルタチオン濃度を決定した。
また菌体濃度は６００ｎｍの吸光度を測定すること、若しくは培養液を８０℃で１２時間以上静置した後に重量を測定し、予め秤量した容器の重量を差し引くことで乾燥菌体重量を求め、培養液量で除することで算出した。
グルタチオン含量は上記のグルタチオン濃度を菌体濃度で除することでグルタチオンの乾燥菌体当たりにおける重量（グルタチオン含量）を算出した。
表１からわかるように、ＥＲＶ１またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強することにより、グルタチオン（還元型グルタチオン＋酸化型グルタチオン）含量が向上した。【０１２５】
［比較例１］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強した酵母によるグルタチオンの生産
酵母として、製造例１で取得したＧＳＨ１およびＧＳＨ２の発現を増強した組換え酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を使用した以外は実施例１と同様の方法で培養を行い、グルタチオンの乾燥菌体当りにおける重量を算出した。結果を表１に示す。【０１２６】
【表１】
2016140349.tif 000004
【０１２７】
［実施例２］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子の発現を低下し、さらにＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＶ１強化株、ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＧＬＲ１破壊＋ＥＲＯ１強化株）によるグルタチオンの生産
製造例４で取得したＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子の発現を低下し、さらにＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１株とＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＯ１株を０．５μｇ/Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン含量を実施例１に記載の方法で測定した。
［比較例２］ＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した酵母によるグルタチオンの生産
酵母として、製造例３で取得したＧＳＨ１遺伝子およびＧＳＨ２遺伝子の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２株を使用した以外は実施例２と同様の方法で培養を行い、グルタチオンの乾燥菌体当りにおける重量を算出した。結果を表２に示す。【０１２８】
【表２】
2016140349.tif 000005
【０１２９】
表２からわかるように、ＥＲＶ１遺伝子またはＥＲＯ１遺伝子の発現を増強するだけでなく、ＧＬＲ１遺伝子を破壊することで、菌体当りのグルタチオン含量は更に向上した。【０１３０】
［実施例３］ＥＲＶ１を増強し、さらにＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した株（ＧＳＨ１強化＋ＧＳＨ２強化＋ＥＲＶ１強化＋ＹＣＦ１強化＋ＧＬＲ１破壊株）によるグルタチオンの生産
製造例５で取得したＥＲＶ１の発現を増強し、さらにＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した組換え酵母ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＥＲＶ１、ＹＣＦ１株を０．５μｇ/Ｌ  ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ  Ａを含むＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌ  グルコース）５ｍｌで３０℃、１６〜２４時間振盪することにより種母培養を行った。
次にＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌポリペプトン（和光純薬（株）製）、２０ｇ／Ｌグルコース（ナカライテスク（株）製））２０ｍｌを含むバッフル付き三角フラスコにＯＤ６００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、攪拌１５０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行い、菌体内のグルタチオン濃度を実施例１に記載の方法で測定した。
［比較例３］ＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊した酵母によるグルタチオンの生産
酵母として、製造例５で取得したＧＳＨ１、ＧＳＨ２およびＹＣＦ１の発現を増強し、ＧＬＲ１遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９／ΔＧＬＲ１、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＹＣＦ１株を使用した以外は実施例３と同様の方法で培養を行い、グルタチオンの乾燥菌体当りにおける重量を算出した。結果を表３に示す。【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
表３からわかるように、ＥＲＶ１遺伝子とＹＣＦ１遺伝子の両方の発現を増強することで、グルタチオン含量は更に向上した。
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
配列番号１：チオールオキシダーゼ（ＥＲＶ１）のアミノ酸配列
配列番号２：チオールオキシダーゼ（ＥＲＯ１）のアミノ酸配列
配列番号３：チオールオキシダーゼ（ＥＲＶ１）をコードする核酸の塩基配列
配列番号４：チオールオキシダーゼ（ＥＲＯ１）をコードする核酸の塩基配列
配列番号５：グルタチオンレダクターゼ（ＧＬＲ１）のアミノ酸配列
配列番号６：グルタチオンレダクターゼ（ＧＬＲ１）をコードする核酸の塩基配列
配列番号７：γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）のアミノ酸配列
配列番号８：γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）をコードする核酸の塩基配列
配列番号９：グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）のアミノ酸配列
配列番号１０：グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）をコードする核酸の塩基配列
配列番号１１：グルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）のアミノ酸配列
配列番号１２：グルタチオン輸送酵素（ＹＣＦ１）をコードする核酸の塩基配列
配列番号１３：ＥＲＶ１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１４：ＥＲＶ１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１５：ＥＲＯ１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１６：ＥＲＯ１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー
配列番号１７：ＹＣＦ１遺伝子増幅用フォワードＰＣＲプライマー
配列番号１８：ＹＣＦ１遺伝子増幅用リバースＰＣＲプライマー【０１３４】
本出願は日本で出願された特願２０１５−０４２９０９（出願日：２０１５年３月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
2016140349000001.app
【国際調査報告】
2016140349.tif 000007
2016140349.tif 000008
2016140349.tif 000009
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