(57)【要約】本発明は、皮下に埋め込まれて、拒絶が起こらない移植空間を形成するためのデバイスであって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成される、デバイスを提供する。
2015041357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下に埋め込まれて、拒絶が起こらない移植空間を形成するためのデバイスであって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成される、デバイス。
【請求項２】
前記移植空間に移植される材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記移植空間に移植される材料がランゲルハンス氏島（膵島）である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記移植空間に移植される材料が体性幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
分化誘導された細胞がインスリン分泌細胞である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
血管誘導因子が、繊維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子及び上皮増殖因子からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記構造体が、ハイドロゲル、スポンジ及び多孔質体からなる群から選ばれる、請求項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
さらにヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
前記移植空間に移植される材料が、同種異系細胞または同種異系微小組織である、請求項２に記載のデバイス。
【請求項１０】
ヘモグロビン量に換算して、２mg/g組織〜５０mg/g組織の血管新生を誘導可能な量の前記血管誘導因子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
哺乳動物の皮下に請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出す工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を皮下に形成する方法。
【請求項１２】
哺乳動物の皮下に請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる移植材料を移植する工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で移植材料を哺乳動物に移植する方法。
【請求項１３】
前記移植材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫拒絶を生じ得る移植材料を免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させるためのデバイスの使用であって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成され、前記デバイスを皮下に埋め込んで前記デバイスの周辺に血管を形成し、その後前記デバイスを皮下から取り出して拒絶が起こらない移植空間を形成し、前記移植空間内に免疫拒絶が生じ得る移植材料を移植し、免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させることを特徴とする、使用。
【請求項１５】
前記移植空間に移植される材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
哺乳動物の皮下に請求項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる疾患治療用の移植材料を移植する工程を含む、疾患の治療方法。
【請求項１７】
疾患が糖尿病であり、移植材料が膵島である、請求項１６に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抑制剤フリーの移植のためのデバイスに関し、詳しくは、免疫抑制剤の投与を必要としない同種細胞または同種微小組織（以下移植材料）の移植を実現するデバイスに関する。
また、本発明は、免疫拒絶が抑制された空間を皮下に形成する方法に関する。
さらに本発明は、免疫抑制剤フリーの条件下で移植材料を移植する方法に関する。
さらに本発明は、通常、特段の処置を施さなければ免疫拒絶を生じ得る移植材料を、免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させるためのデバイスの使用に関する。
本明細書において、移植材料として特にインスリン産生能を有するランゲルハンス氏島移植片(islet graft)は、単に膵島と記載することがある。
【背景技術】
【０００２】
現在インスリン依存性の糖尿病を治療するためにインスリンの皮下注射が行われている。血糖値のコントロールが十分に行われないため、長期的には血管系の合併症、例えば糖尿病性網膜症により失明、糖尿病性腎症による腎不全、さらに、血液循環不全による足の切断が必要になる等、が発症している。特に糖尿病性腎症による腎不全では、透析医療へ入る患者の最大の原疾患は糖尿病であり、１兆7千億円を超える透析医療費が必要であり、健康保険体制の大きな負担になっている。短期的には、血糖値の不安定から、就寝中に低血糖に陥り死に至る患者もいる。この様な現状に鑑み死体ドナーから提供された膵臓から膵島を分離し、これを糖尿病患者に移植する研究が長年行われ、近年では世界で年２−３百人程度の臨床応用が試みられるようになってきた。膵島移植の臨床応用では、膵島は経門脈的に肝臓内に移植され、移植後は拒絶反応を防止するために免疫抑制剤の投与が行われている。肝臓内に移植する手技は手術侵襲が若干大きいこと、また、移植後移植部位に異変が起きたときには移植膵島を除去することが困難である。さらに、拒絶反応を防止するために免疫抑制剤の投与を行うが、その合併症、例えば感染しやすくなるまた癌の発生確率が高くなる等が指摘されている。また、インスリンと比較して免疫抑制剤が高価であるため、術後の患者の経済的負担が増加する。【０００３】
出来るだけ低侵襲に移植でき、また、もしもの時に容易に移植膵島を除去することが可能な場所として皮下への移植の検討が望まれてきた。また、免疫抑制剤の投与を必要としない移植法として、膵島を半透膜に包みレシピエントの免疫系から膵島を隔離してから移植するバイオ人工膵臓、膵島内の免疫反応を惹起する樹状細胞等を除くために膵島の紫外線照射や低温培養等が試みられてきたが、その技術的な困難また再現性に問題を抱えている。これらの問題のない膵島移植が強く望まれている。【０００４】
特許文献1は、皮下に膵島また他の細胞を移植するために、皮下に小口径の血管床を誘導する技術を開示しているが、特許文献1は、拒絶反応が問題にならない同種同系間の膵島移植が検討されており、同種異系間の膵島移植における拒絶反応に関する検討は全く行われていない。なお、「同種異系」は、「種が同じで、遺伝的組成が異なる」ことを意味する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2000-178180
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、免疫抑制剤を使用することなく、細胞、組織等を皮下に移植する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のデバイス、方法及び使用を提供するものである。
項１．  皮下に埋め込まれて、拒絶が起こらない移植空間を形成するためのデバイスであって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成される、デバイス。
項２．  前記移植空間に移植される材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、項１に記載のデバイス。
項３．  前記移植空間に移植される材料が膵島である、項２に記載のデバイス。
項４．  前記移植空間に移植される材料が体性幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、項２に記載のデバイス。
項５．  分化誘導された細胞がインスリン分泌細胞である、項４に記載のデバイス。
項６．  血管誘導因子が、繊維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子及び上皮増殖因子からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜５のいずれかに記載のデバイス。
項７．  前記構造体が、ハイドロゲル、スポンジ及び多孔質体からなる群から選ばれる、項１〜６のいずれかに記載のデバイス。
項８．  さらにヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む、項１〜７のいずれかに記載のデバイス。
項９．  前記移植空間に移植される材料が、同種異系細胞または同種異系微小組織である、項２に記載のデバイス。
項１０．  ヘモグロビン量に換算して、2mg/g組織〜５０mg/g組織の血管新生を誘導可能な量の前記血管誘導因子を含む、項１〜９のいずれか１項に記載のデバイス。
項１１．  哺乳動物の皮下に項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出す工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を皮下に形成する方法。
項１２．  哺乳動物の皮下に項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる移植材料を移植する工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で移植材料を哺乳動物に移植する方法。
項１３．  前記移植材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、項１２に記載の方法。
項１４．  免疫拒絶を生じ得る移植材料を免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させるためのデバイスの使用であって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成され、前記デバイスを皮下に埋め込んで前記デバイスの周辺に血管を形成し、その後前記デバイスを皮下から取り出して拒絶が起こらない移植空間を形成し、前記移植空間内に免疫拒絶が生じ得る移植材料を移植し、免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させることを特徴とする、使用。
項１５．  前記移植空間に移植される材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、項１４に記載の使用。
項１６．  哺乳動物の皮下に項１〜１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる疾患治療用の移植材料を移植する工程を含む、疾患の治療方法。
項１７．  疾患が糖尿病であり、移植材料が膵島である、項１６に記載の治療方法。
【発明の効果】
【０００８】
インスリン依存性の糖尿病を治療するために膵島の移植が臨床でも行われている。しかし、未だ移植時の侵襲が大きいこと、また、移植後に免疫抑制剤の投与を必要であることの２つの解決すべき問題を残している。本発明は皮下に膵島などの移植材料を免疫抑制剤を使用せずに移植できる空間を作製するデバイスに関する。【０００９】
棒状、平板状、シート状、筒状、ロッドなどの種々の形状の生体適合性構造体に繊維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子などの血管の新生を促進する因子(血管誘導因子)と必要に応じてヘパリンを担持させ、これを糖尿病ラットの皮下に埋め込むと、５−１５日程度後には生体適合性構造体の周囲組織に微細血管が多数誘導される。ハイドロゲルを除去したスペースに膵島を移植すると、驚いたことに膵島移植後は免疫抑制剤を投与せずとも、移植膵島は拒絶されずに長期間生着し、さらにインスリンを分泌し血糖値を長期間正常化させることが可能であった。【００１０】
膵島以外の移植材料についても同様に生体内で拒絶反応を伴うことなく生着することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】糖尿病ACIラットの背部皮下にF344ラットの膵島を移植後の血糖値の変動。同種異系の膵島移植により血糖値が低下し、膵島がインスリンを分泌できる状態で生着していることを示す。
【図２】組織像。(a)微細血管が誘導された皮下組織。(b-1)移植後９４日目の 膵島移植部位の組織切片のヘマトキシリン＆エオジン染色像、(b-2)はほぼ同じ部位のインスリンの免疫染色像、(b-3)は、(b-1)の移植膵島が存在する部分を拡大図。移植された膵島が形状を保ち、インスリンを分泌できる状態にあることを示す。
【図３】糖尿病ACIラットの肝臓にF344ラットの膵島を移植後の血糖値の変動。血糖値はいったん下がりその後すぐに上昇しているので、膵島が拒絶されたことがわかる。
【図４】糖尿病ACIラットにLeisラットの膵島を移植後の血糖値の変動。矢印の日に皮膚と共に移植膵島を取り除いた。膵島を取り除くと血糖値が速やかに上昇しており、血糖値の低下は移植した膵島から分泌されたインスリンにより生じていることがわかる。
【図５】FITC-レクチンの生体内灌流後に血管新生された皮下部位。血管系は緑色の蛍光色素-レクチン陽性血管として同定した。スケールバーは100μm。
【図６】(A)正常ACIラット(▲,n=3)及び3000個のF344膵島(■,n=3)又は3000個のLewis膵島(●,n=3)を移植されたSTZ-ACIラットの腹腔内グルコース耐性試験。全てのレシピエントにおいて,腹腔内グルコース耐性試験を移植後1〜3ヶ月にわたり行った。(B)非糖尿病ACIラット(I)、糖尿病ACIラット(II)及び3000個のLewis膵島(III)又は3000個のF344膵島(IV)が血管新生された皮下空間に移植されたSTZ-ACIラットの血漿インスリンレベル。各群における同種異系膵島の3つのレシピエントを移植後１〜3ヶ月調べた。三群の間で有意差はなかった。
【図７】血管新生された皮下部位に移植された同種異系膵島の生着及び再血管新生。血管新生された皮下空間に移植され94日後、102日後及び130日後に回収された(A)F344-ACI膵島移植片、(B)Lewis-ACI膵島移植片及び(C)F344-Wistar膵島移植片のインスリン及び核のヘマトキシリン及びエオジン(H&E)染色並びに免疫蛍光染色。スケールバー:100μm(左カラム及び右カラム)、50μm(中央カラム)。(D)同種異系移植30日後の皮下部位の膵島移植片及び(E)正常ACI膵臓の膵島における血管系の試験のためのFITC-レクチンの生体内灌流。スケールバー:50μm。直径4 mm長さ25 mmの4.5%のアガロースゲルロッドを凍結乾燥した。これに、50 μgの繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加して血管誘導に用いた。８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。STZを投与後3日後に、ACIラットの背中の両側の皮下に血管誘導用アガロースゲルを各１本ずつ移植した。膵島をコラーゲナーゼ法にてF344ラットの膵臓から分離した。この膵島は、膵島のドナーF344と糖尿病ACIラットは同種異系の関係である。アガロースロッドを埋め込み後１週間後に皮膚を切開し、アガロースゲルロッドを除去し、出来た空隙に膵島を各1500個ずつそれぞれの背部皮下の２個の空隙に移植した。アガロースロッドは組織付着なしに容易に除去された。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。図８に示すように、５匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、５匹全例が１００日以上にわたって血糖値が正常化した。血糖値が正常化したことは、同種異系の膵島がインスリンを分泌できる状態で生着していることを示し、拒絶反応が適切に抑制された移植空間が形成されていることを示す。
【図８】糖尿病ACIラットの背部皮下にF344ラットの膵島を移植後の血糖値の変動。同種異系の膵島移植により血糖値が低下し、膵島がインスリンを分泌できる状態で生着していることを示す。ヘパリンを添加していないアガロースゲルロッドを用いても、血糖値は正常化した。
【図９】生着した皮下膵島移植片の拒絶。生着した膵島は、bFGFを含むアガロースロッドを皮下に埋入後1週間で取り出し、膵島を移植して得た。全てのレシピエントは左側と右側の背部皮下にそれぞれ１５００個の膵島を移植してある。レシピエントの左側の皮下膵島(n=6)を91−109日に回収した。片側の膵島を除去しても血中グルコースレベルは正常血糖を維持した。(A)膵島を移植することで血糖値が正常化しているACIラットに3000個のF344膵島を門脈経由で肝臓に移植した後の膵島移植片を有する糖尿病ACIラットの血中グルコースレベル(n=2)。２つの矢印はF344膵島を肝臓に移植した日を示す。移植後１０日程度で２匹のいずれのラットの血糖値が上昇し、皮下また肝臓内の膵島が拒絶されたことを示している。(B) F344膵島移植片により血糖値が正常化しているACIラットに107個のF344脾細胞を腹腔内に移植後した。移植後５日程度で血糖値は上昇した (n=4)。皮下に生着していたF３４４ラットの膵島が拒絶されたことを示す。矢印はF344脾細胞移植の日を示す。(C)F344膵島の門脈内移植後１４日で回収した同種異系膵島移植片を含む皮下組織(C-1)及び肝臓(C-2)のヘマトキシリン及びエオジン(H&E)染色。膵島組織はなく白血球の集積がみられた。スケールバー:(C-1)100μm,(C-2)50μm.(D)F344脾細胞の腹腔内注射のH&E染色(D-1)及びインシュリンの免疫蛍光染色と核染色(D-2)。スケールバー:50μm。インスリン陽性細胞はわずかに存在するが、その周囲には多くの白血球が集積し、膵島が拒絶されつつある組織像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のデバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成され、皮下に埋め込んで使用する。このデバイスを皮下に埋め込むと、生体適合性構造体から徐々に放出される血管誘導因子の作用により周囲に多数の微細血管が形成される。なお、デバイスは、皮膚を切開し、デバイスを皮下に埋め込んだ後切開部を縫合し、一定期間デバイスを埋め込んだままとする。その後、小口径の血管が必要なだけ形成された後に再度皮膚を切開し、デバイスを取り出し、移植材料を小口径の血管で囲まれた移植空間に移植する。本発明のデバイスは１日以上(例えば１〜２５日)哺乳動物の皮下に埋め込むことで、同種異系細胞または同種異系微小組織を長期間、生着・機能させ得る程度に免疫拒絶が抑制された空間を作製できるので、血管誘導因子は約１２時間デバイスにとどまっていれば十分に効果を発揮する。哺乳動物としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギなどが挙げられ、ヒトが好ましい。本発明のデバイスを皮下から取り出すことで、免疫拒絶フリーの移植空間を形成することができる。この移植空間に本来拒絶反応を生じる細胞(同種異系細胞など)、微小組織(同種異系微小組織)などの移植材料を埋め込むと、驚くべきことに免疫抑制剤を使用しない状態で免疫反応が抑制され、移植材料は生着する。移植材料は同種同系でも同種異系でもよい。
【００１３】
本発明のデバイスを皮下に所定期間埋め込み周囲に小口径の血管を形成し、その後取り出した空間は、免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間になる。この空間を移植に適した空間の意味で、本明細書において「移植空間」と称することがある。
【００１４】
本発明の移植空間は、膵島などの移植材料を移植後長期間生着させることができる。皮下に生着した移植片は周辺に小口径の血管が存在するため、十分な酸素と栄養分の供給が受けられる。小口径の血管内には多数の白血球が存在するため、小口径の血管由来の白血球が移植空間内に供給されると考えられる。意外にも、白血球は移植片の周囲に無処置の組織よりは若干多く存在するものの、さほど多くはない。移植空間の周囲組織に抑制性の白血球・リンパ球が存在するために、免疫拒絶を抑制されていると考えられる。  
【００１５】
移植材料は細胞が好ましく、組織を移植する場合、微小組織が好ましい。移植材料としては、同種異系細胞、同種異系微小組織の他、同種同系細胞、同種同系微小組織が挙げられる。同種異系細胞、同種異系微小組織は通常、特段の処置を施さずに皮下に移植すると速やかに拒絶されるが、本発明の移植空間に移植することで拒絶が抑制され、それを回避できる。すなわち、本発明によれば、同種異系、同種同系のいずれにも望ましい移植用の場を提供できる。た。ここで、「微小組織」とは厚さが10〜500μm程度のものであり、面積は大きくてもよく、特に制限されない。皮下は、本来血管があまり形成されていない。本発明のデバイスを埋め込むことで微細血管が周囲に形成されるが、移植材料が大きすぎると、移植材料の内部に十分な酸素や栄養が供給されない。一方、移植材料の面積は、本発明のデバイスを埋め込む皮下の部分の面積を拡大することで対応可能である。
【００１６】
移植材料は、生理活性物質を分泌可能なものであれば特に限定されない。生理活性物質としては、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、蛋白質（酵素など）などが挙げられる。ホルモンとしては、インスリン、グルカゴン、サイロキシン（Ｔ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、コルチゾール、アルドステロン、性ステロイドホルモン、カテコールアミン、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロン、成長ホルモン、プロラクチン、バゾプレシン、オキシトシンなどが挙げられる。サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（CSF)、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、エリスロポエチン（EPO)、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、肝細胞成長因子（HGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）腫瘍壊死因子（TNF-α）、リンフォトキシン（TNF-β）、レプチン、神経成長因子（NGF）などが挙げられる。蛋白質としては、アルブミン、ヘム蛋白、エステラーゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、イソメラーゼ、シンターゼなどの酵素などが挙げられる。
【００１７】
これらの生理活性物質を分泌する移植材料としては、例えば膵島、神経系の分泌細胞、甲状腺細胞、副腎(皮質、髄質)細胞、副甲状腺細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、或いはこれらの細胞を含む微小組織が挙げられる。さらに、移植材料は、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞から誘導された任意の細胞が挙げられる。移植材料は遺伝子欠損や遺伝子変異などにより特定の遺伝子産物が産生されないか、或いは機能が低下した遺伝子産物しか得られない遺伝病の治療に有効な細胞を含む。
【００１８】
血管誘導因子としては、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β) 、胎盤増殖因子、上皮増殖因子、オステオネクチン(Osteonectin) 、アンギオポイエチン１(Ang1)やアンギオポイエチン２(Ang2)などが挙げられ、これらの因子は１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。ヘパリン又はヘパラン硫酸をさらに構造体に含ませることで、血管の誘導を促進することができる。血管誘導因子の配合量は、各因子により異なり、特に限定されないが、ヘモグロビン量に換算して２mg/g組織〜５０mg/g組織の血管新生を誘導可能な量であることが好ましく、ヘモグロビン量に換算して３mg/g組織〜４０mg/g組織の血管新生を誘導可能な量であることがより好ましく、ヘモグロビン量に換算して４mg/g組織〜３０mg/g組織の血管新生を誘導可能な量であることがいっそう好ましく、５mg/g組織〜２５mg/g組織の血管新生を誘導可能な量であることが特に好ましい。また、血管誘導因子の配合量は、各因子により異なり、特に限定されないが、ヘモグロビン量に換算して、本発明のデバイスの皮下組織への１週間の埋め込みにより、埋込前の皮下組織中のヘモグロビン量の  5倍〜150倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることが好ましく、10倍〜100倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることがより好ましく、15倍〜70倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることがいっそう好ましい。また、血管誘導因子の配合量は、各因子により異なり、特に限定されないが、ヘモグロビン量に換算して、本発明のデバイスの皮下組織への１週間の埋め込みにより、血管誘導因子を含まないデバイスを同じ条件で埋め込んだ場合のヘモグロビン量の2倍〜15倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることが好ましく、2倍〜10倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることがより好ましく、2倍〜5倍にヘモグロビン量を増加させることができる量であることがいっそう好ましい。また、例えば塩基性繊維芽細胞増殖因子の場合１つのデバイスあたり  20μg/cm3〜500μg/cm3 程度、好ましくは30μg/cm3〜300μg/cm3程度であり、より好ましくは40μg/cm3〜150μg/cm3程度である。
【００１９】
本発明の生体適合性構造体は、ハイドロゲル、スポンジ、多孔質体高分子ブロックなどから構成される。ハイドロゲルを構成する材料としては、ハイドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC-Na）、ハイドロキシエチルセルロース（HEC）などのセルロース誘導体、ゼラチン、アルギン酸、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、デンプン、アガロース、寒天、デキストラン、プルラン、ペクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、キチン、キトサン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ-2- ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ-2- ヒドロキシエチルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレートなどの合成高分子の化学架橋体や放射照射による架橋体、さらに、上記高分子を構成するモノマーの共重合体の架橋体、ポリアニオンとポリ−Ｌ−リジンなどのポリカチオンとのポリイオンコンプレックス膜などが挙げられる。これらの生体適合性構造体は、ゲル状物の凍結乾燥により製造してもよい。
【００２０】
スポンジとしては、上記高分子の多孔体、例えばセルロース、アガロース、キトサンやコラーゲンのスポンジが挙げられる。多孔質体を構成する材料としては、ゼラチン、シリコーン、アパタイトなどの有機又は無機の材料が挙げられる。好ましい生体適合性構造体はハイドロゲルであり、特にアガロースゲルが好ましい。
【００２１】
生体適合性構造体の形状としては、フィルム状、シート状、板状、棒状、筒状（円筒、楕円筒、角筒等）などが挙げられる。前記構造体は、中空状のものであってもよく、前記構造体の表面又は内部に血管誘導因子を含む。前記構造体は、表面が生体適合性であり、その体液が通過するものであればよく、細胞が内部に侵入可能なメッシュ状或いはスポンジ状などの多孔質の空隙があってもよく、さらに血管が内部に侵入可能な比較的大きな孔径の空隙があってもよい。誘導される微細血管が構造体の内部に侵入する場合には、構造体を摘出することなくその内部に移植材料を導入すればよく、誘導される微細血管が構造体の表面にとどまっている場合には、構造体を摘出後の空間に移植材料を導入すればよい。
【００２２】
本発明の構造体の内部がアルミナ、ジルコニアなどのセラミック、ステンレス鋼やチタン合金などの金属の網目や連通孔を有する多孔質体などの支持体を有し、その外表面をハイドロゲル、スポンジ、多孔質体を構成する生体適合性材料で被覆するものであってもよい。
【００２３】
前記構造体内に血管誘導因子を担持させる方法としては、構造体に単純に含浸させる方法、静電的相互作用や疎水相互作用などの物理化学的相互作用で担持させる方法、新生血管誘導物質との生物学的な特異的相互作用を有する物質を構造体に含ませそれとの相互作用を利用して担持させる方法、中空状のものであれば中空部に血管誘導因子の溶液を入れる方法などが挙げられる。構造体に単純に含浸させる場合には、血管誘導因子の放出速度をコントロールするために、構造体の分子網目密度を調節することが好ましい。静電的相互作用や疎水相互作用などの物理化学的相互作用で担持させる場合には、生体内での血管誘導因子の物理化学的状態を十分考慮して担持せる必要がある。例えば血管内皮細胞増殖因子や塩基性繊維芽細胞増殖因子は、生体内で分子全体として正に荷電しているため、アクリル酸やメタクリル酸から作製された構造体のように構造体自体が負に荷電していれば静電的相互作用で担持でき放出速度もコントロール出来る。生物学的な特異的相互作用を利用する場合には、血管誘導因子とその活性を高めることの出来る物質を前もって構造体に担持させておくのが好ましい。例えば、血管内皮細胞増殖因子や塩基性繊維芽細胞増殖因子はヘパリンやヘパラン硫酸等のムコ多糖と生物学的な特異的相互作用をするため、ヘパリンなどのムコ多糖を担持させたゲルを作製しこれに増殖因子を含浸させることで目的を達することが出来る。構造体作製に用いる材料によっては、３者を同時に混合して目的の構造体を作製する事もできる。
【００２４】
血管誘導因子を徐放する方法としては、ＤＤＳに関係する各種の技術を利用することができる。
【００２５】
本発明のデバイスは皮下に埋め込まれる。具体的には皮膚に小切開を入れ、皮膚の下にヘラ等で血管がほとんどない皮下組織に空隙を設け、この空隙部分にデバイスを埋入し、切開部縫合することによりデバイスは皮下に埋め込まれる。この状態で１〜３５日間、好ましくは２〜２８日間、より好ましくは３〜２１日間、特に４〜１４日間程度経過すると、デバイスの周辺部に血管（小口径の血管）が形成される。血管の形成は肉眼で観察することもでき、近赤外イメージング装置、血管イメージング装置等などの医療機器を用いて確認することができる。
【００２６】
本発明のデバイスを所定期間埋め込むことにより、デバイスを除去後デバイスを埋め込んでいた空間に、細胞や微小組織を移植し、長期間生着および機能させ得る程度に免疫抑制状態とすることができる。すなわち、本発明のデバイスによれば、膵島を移植した後、例えば、30日以上、60日以上、90日以上、100日以上、110日以上、120日以上、正常範囲の血糖値を維持可能な空間を形成できる。そして、そのような空間に移植材料を移植すると、移植材料は移植後すぐに機能することができ、例えば膵島を埋入すると移植直後にはインスリンを産生することができ、当日か翌日には血糖値は正常化する。移植材料は、厚すぎると十分な栄養が供給されないため適切な厚さがあるが、移植面積に関しては特に制限されず、広い面積で移植することができる。また、移植は１箇所であってもよく、複数箇所であってもよい。移植された細胞、組織は、必要に応じて一部又は全部を容易に取り出すことができる。
【００２７】
本発明のデバイスを用いて形成される前記空間は、種々の組織の移植に用いることができる。特に、その機能を発揮するのに移植の場所が制限されない組織の移植に好適である。このような組織としては、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、酵素等の生理活性物質を分泌する組織が挙げられる。具体的には、肝細胞や、膵島、副腎、上皮小体等の細胞が挙げられる。さらには体性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞等から分化誘導して作製した組織の移植にも用いることができる。
【００２８】
本発明のデバイスを用いて形成される移植部位に組織を移植することは、種々の疾患の治療に有用である。特に、インスリンを産生する能力が絶>対的に不足しており、外部から注射などによってインスリンを投与する必要があるインスリン依存性糖尿病患者においては、他の内分泌疾患に比べて移植による症状の軽減効果や生活の質の改善効果が大きい。従って、本発明の移植部位形成剤は、インスリン依存性糖尿病の治療のための膵島移植部位の形成に用いられる場合にその有用性が特に大きい。このような糖尿病の主な症例は、I型糖尿病である。しかし、II型糖尿病の治療においても有用である。すなわち、II型糖尿病が進行すると膵β細胞容積が低下し、現状治療法としてはインスリンを投与することになるが、このようなケースでも、本発明の移植部位形成剤を用いることで、治療することが可能となるのみならず、II型糖尿病については、膵臓におけるインスリン産生能よりも 体のインスリン抵抗性が大きくなることで糖尿病になっていくと考えると、インスリン投与が必要になる必須になる前の段階から予防的な意味合いでの移植も有効である。
【００２９】
さらに、本発明のデバイスによれば、他人の組織を移植した場合であっても拒絶反応が抑制される移植部位を形成することができる。このため例えば、インスリン依存性糖尿病の治療における膵島移植には他人から提供される組織を用いるため、移植後は免疫抑制剤の継続的な服用が必要となるが、本発明の移植部位形成剤を用いることで免疫抑制剤の服用を低減又は省略できる膵島移植が可能になる。インスリン依存性糖尿病の主な患者群はI型糖尿病であり、その発症の原因が自己免疫反応である。免疫反応を抑制できる移植部位を形成できることは、自己免疫反応からの保護も望め移植膵島の長期間の機能保持の観点からも本方法の有用性は高い。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。【００３１】
実施例において、（１）免疫染色、（２）FITC-レクチンの生体内灌流、（３）統計解析は、以下のように行った
（１）組織染色
膵島移植片を含む回収された組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、薄い組織切片(厚さ4μm)を次の操作のために調製した。インスリン、CD4T細胞と、CD8T細胞は、免疫染色をした。マクロファージ及び顆粒球についてのヘマトキシリン及びエオジン(H&E)染色及び免疫蛍光染色を行った(Luan N M, Iwata H. Biomaterials 2013; 34: 5019−5024.)。免疫染色のために、脾臓組織及び一次抗体のないサンプルを陽性コントロール及び陰性コントロールとして各々使用した。CD4T細胞に対する抗体(ウサギポリクローナル; Novus Biologicals, Littleton, CO)、CD8T細胞に対する抗体(マウスモノクローナル,OX-8; Novus Biologicals)、マクロファージに対する抗体(CD68)(マウスモノクローナル;ED1, Novus Biologicals)及び顆粒球に対する抗体(マウスモノクローナル;HIS48, Novus Biologicals)は購入した。薄い組織切片をBlocking One溶液(Nacalai Tesque)で1時間処理し、抗体の非特異的吸着をブロックし、次いでCD4T細胞に対する一次抗体(1:50 Blocking One溶液中)、CD8T細胞に対する一次抗体(1:50 Blocking One溶液中)、マクロファージに対する一次抗体(1:50 Blocking One溶液中)及び顆粒球に対する一次抗体(1:50 Blocking One溶液中)と4℃で終夜インキュベートした。0.05%Tween-20を含むPBSで洗浄後、切片をAlexaFluor594抗-ウサギIgG抗体又はAlexaFluor488抗-マウスIgG抗体(1:200 Blocking One溶液中;Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)により1時間室温で処理し、0.05%Tween-20を含むPBSで洗浄した。核をHoechst33258(Dojindo, Kumamoto, Japan)で対比染色した。【００３２】
（２）血管系測定のためのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-レクチンの生体内灌流
アガロースロッドの1週間の埋入により血管新生させたACIラット又は移植30日後におけるF344膵島のACIレシピエントに200μgのFITC-レクチン(Vector Labs, Burlingame, CA)及び1000 IUヘパリンを含む1mLの生理食塩水を静脈内注射した。循環の15分後、皮下組織及び膵臓を速やかに切除した。生理食塩水溶液で2回簡単に洗浄し,固定し、液体窒素で急速凍結した。薄い組織切片(厚さ4μm)を調製し、インスリンの免疫蛍光染色を常法に従い行った。
（３）統計解析
２群をStudentのt-検定で比較した。p<0.05を有意差ありとした。全ての統計的計算は、JMPver.5.1.1(http://www.jmp.com/)を用いて行った。【００３３】
実施例１
直径4 mm長さ25 mmの4.5%のアガロースゲルロッドを凍結乾燥した。これに、50 μgの繊維芽細胞増殖因子(bFGF)と25 μgのヘパリンを添加して血管誘導用デバイスとして用いた。８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。STZを投与後3日後に、ACIラットの背中の両側の皮下に血管誘導用アガロースゲルを各１本ずつ移植した。膵島をコラーゲナーゼ法にてF344ラットの膵臓から分離した。この膵島は、膵島のドナーF344と糖尿病ACIラットは同種異系の関係である。デバイスを埋め込み後１週間後に皮膚を切開し、デバイスを除去し、出来た空隙に膵島を各1500個ずつそれぞれの背部皮下の２個の空隙に移植した。デバイスは組織付着なしに容易に除去された。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。図１に示すように、１０匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、１０匹中９匹が１００日以上にわたって血糖値が正常化した。血糖値が正常化したことは、同種異系の膵島がインスリンを分泌できる状態で生着していることを示し、拒絶反応が適切に抑制された移植空間が形成されていることを示す。【００３４】
図２には組織像を示した。(a)はアガロースロッドに50 μgの繊維芽細胞増殖因子と25 μgのヘパリンを添加してラット背側の皮下に埋め込んだ７日後の移植部位の組織像である。多くの微細血管が誘導されている。(b)は血糖値が正常化しているACIラットから、移植部位を取り出してその組織像を調べたものである。(b-1)は膵島移植部位の組織切片のヘマトキシリン＆エオジン染色像である。膵島と思われる細胞集塊が多数みられ、また、その細胞集塊の中に多くの微細血管が貫通していた。このことは、デバイスが埋め込まれていた移植空間に移植されたF344ラット由来の同種異系の膵島が拒絶されず移植空間内において、微細血管から酸素及び栄養を供給されて長期間生存可能な状態で生着していることを示す。(b-2)はほぼ同じ部位のインスリンの免疫染色像である。緑色に染色されている部分がインスリンを分泌している細胞が存在する部分である。インスリンの免疫蛍光染色切片を蛍光顕微鏡で観察したところ、ヘマトキシリン−エオジン染色切片で膵島と思われる細胞集塊と重なる位置にインスリン陽性の細胞が存在していた。これにより、移植された膵島がインスリン産生機能を保持していることが明らかになった。(b-3)は、(b-1)の移植膵島が存在する部分を拡大して示した。移植膵島が存在し、炎症性の細胞は皆無であった。炎症性細胞がないことは、本発明のデバイスを皮下に埋め込むことで、免疫系が抑制された空間（移植空間）が形成されることを実証する。
次に、移植の1〜3ヶ月後のF344膵島又はLewis膵島を有する正常ACIラット及びSTZ-ACIラットについて腹腔内グルコース耐性試験を行った。結果を図6Aに示す。曲線下の面積は、正常ACTラット、3000個のF344膵島を有するSTZ-ACIラット及び3000個のLewis膵島を有するSTZ-ACIラットについて、各々19867±1897、22835±2023及び20180±1286mgmin/dLであった。さらに、血漿インスリンレベルを測定した結果を図６Bに示す。3000個のF344膵島が血管新生された皮下空間に移植されたSTZ-ACIラット(IV) 又は3000個のLewis膵島が血管新生された皮下空間に移植されたSTZ-ACIラット(III)の血漿インスリンレベルを膵島移植の40日後及び90日後に測定したところ、各々1.56±0.23（ＩＶ）及び1.73±0.140ng/mL（ＩＩＩ）であった。正常ACIラット（Ｉ）及び糖尿病ACIラット（ＩＩ）の血漿インスリンレベルは、各々1.39±0.32及び0.31±0.06ng/mLであった。レシピエントの血漿インスリンレベルは膵島移植片により十分に維持された。(図6B)【００３５】
比較例１
実施例１と同様に８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。膵島をコラーゲナーゼ法にてF344ラットの膵臓から分離した。血管誘導していないレシピエントの背部両側の皮下に同種異系の膵島を各1500個ずつ移植した。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。４匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、いずれのラットの血糖値も正常化することはなかった。これは、ラットの皮下は微小血管が極めて少なく、このため皮下の酸素濃度は低いため、移植膵島への酸素供給が十分でなく、膵島が酸素不足で死滅したと考える。【００３６】
比較例２
実施例１と同様に８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。膵島をコラーゲナーゼ法にてF344ラットの膵臓から分離した。分離した3000個の膵島を経門脈的に肝臓内に移植した。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。３匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、図３に示すように、３匹ともが血糖値は一時的に正常化するものの、１０日以内に術前の高血糖値に戻ってしまった。同種異系の膵島を経門脈的に肝臓内に移植すると、膵島は最初インスリンを産生可能な状態で存在するが、１０日以内に拒絶されてその機能を失うことが明らかになった。【００３７】
実施例２
直径4 mm長さ25 mmの4.5%のアガロースゲルを凍結乾燥した。これに、50 μgの繊維芽細胞増殖因子(bFGF)と25 μgのヘパリンを添加して血管誘導に用いた。８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。STZの投与3日後に、ACIラットの背中の両側の皮下に血管誘導用アガロースゲルを各１本ずつ移植した。膵島をコラーゲナーゼ法にてLewisラットの膵臓から分離した。デバイスを埋め込み１週間後に皮膚を切開してデバイスを除去し、出来た空隙に膵島を各1500個ずつそれぞれの背部皮下の２ヶ所の空隙(移植空間)に移植した。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。図４中矢印の日に両側の皮膚を移植膵島と共に除去した。図４に示すように、４匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、４匹全例が背部から移植膵島を除去する日まで血糖値は正常化し、膵島の除去と共に術前の高血糖値に戻ってしまった。移植した膵島がインスリンを分泌して血糖値を正常化していたことを示している。【００３８】
ラット間同種移植のまとめを以下の表１に示す。【００３９】
【表１】
2015041357.tif 000003
【００４０】
実施例３
直径4 mm長さ20 mmの4.5%のアガロースゲルを凍結乾燥した。これに、50 μgの繊維芽細胞増殖因子(bFGF)と25 μgのヘパリンを添加して血管誘導に用いた。６週令の雄のBALB/cマウスをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)200 mg/kgをBALB/cマウスの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントマウスとして用いた。STZを投与後3日後に、BALB/cマウスの背中の両側の皮下に血管誘導用アガロースゲルを各１本ずつ移植した。膵島をコラーゲナーゼ法にてC57BL/6マウスの膵臓から分離した。デバイスを埋め込み後１週間後に皮膚を切開し、デバイスを除去し、出来た空隙にランゲルハンス氏島（膵島）を各250個ずつそれぞれの背部皮下の２個の空隙に移植した。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。８匹の糖尿病BALB/cマウスを用いて検討したところ、５匹のマウスで３０日以上にわたって血糖値が正常化した。【００４１】
[実施例４〜５]
繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の添加量を表２に記載の量とした以外は実施例１と同様の条件で、実施例４〜５および比較例３〜４を実施し、皮下組織に誘導された微細血管の量および血糖値正常化効果について検討した。【００４２】
結果を下記表２に併せて示す。なお、皮下組織に誘導された微細血管の量は、組織１ｇ中に含まれるヘモグロビン量（mg/g組織）で評価した。【００４３】
bFGF(50μg) −ヘパリンを有するデバイスを１週間糖尿病ラットの背部の皮下部位に移植した実施例４のラットについてFITC-レクチンの生体内灌流を行い、図5に示すように血管新生された皮下部位の血管系を調べた。多数のレクチン-陽性血管が皮下部位に見られ、これはこの部位での密な血管分布の形成を示し、生存した膵島移植片に対する十分な栄養分及び酸素の供給を期待させる。【００４４】
血管はヘモグロビンを含むので、皮下組織のヘモグロビン含量は血管誘導を半定量的に比較するために使用された(Kawakami Y, Iwata H, Gu Y J, et al. Pancreas 2001; 23: 375−381.)。未処理皮下組織のヘモグロビン含量は0.35±0.55mg/g組織であった。組織のヘモグロビン含量は、アガロースロッドに導入したbFGF量に依存する。10μgのbFGFがロッドに添加されると、組織のヘモグロビン含量は3.30±1.35mg/gになり、これはbFGFで未処理の組織と有意な違いはない。bFGFを50μg/ロッドに増加させると組織のヘモグロビン含量は9.40±2.84mg/gに有意に増加する。bFGFの量を増やす、または、より長期に徐放させるとヘモグロビン量は増加する可能性がある。【００４５】
さらに、長期生着した膵島移植片を有する実施例５のラットの左側の皮下膵島移植片を組織学的測定のために91−130日に回収した。一方の移植片の除去後でさえ正常血糖は維持された,組織切片をH&E及びAlexa488-標識抗インスリン抗体染色した(図7A,B,C)。全ての3つのドナー−レシピエントの組合せの群において、膵島はH&E切片で明瞭に観察され、インスリン陽性細胞は免疫蛍光染色された切片で明瞭に観察された。多くの小血管が膵島移植片で観察されたが、リンパ球はほとんど浸潤していなかった。本発明者はまた、FITC-レクチンを用いた生体内灌流法により皮下膵島移植片における血管を評価した。インスリン細胞の周囲のFITC-レクチン染色された細胞により示されるように、小口径の血管は膵島移植片において明瞭に検出された（図7D）。図7Eは正常膵臓組織の染色像である。図7D,Eにおいて膵島の形態及び血管分布は互いに類似している。これらのデータは、血管新生された皮下部位で移植された同種異系膵島は宿主血管系に接続した血管のネットワークを確立したことを示す。【００４６】
【表２】
2015041357.tif 000004
【００４７】
実施例６
直径4 mm長さ25 mmの4.5%のアガロースゲルロッドを凍結乾燥した。これに、50 μgの繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加して血管誘導に用いた。８週令の雄のACIラットをレシピエントとして用いた。ストレプトゾトシン(STZ)60 mg/kgをACIラットの腹腔内に投与し糖尿病を誘導した。STZ投与後２回連続して血糖値が400 mg/dlを超えるラットを糖尿病レシピエントラットとして用いた。STZを投与後3日後に、ACIラットの背中の両側の皮下に血管誘導用アガロースゲルを各１本ずつ移植した。膵島をコラーゲナーゼ法にてF344ラットの膵臓から分離した。この膵島は、膵島のドナーF344と糖尿病ACIラットは同種異系の関係である。デバイス（アガロースロッド）を埋め込み後１週間後に皮膚を切開し、デバイスを除去し、出来た空隙に膵島を各1500個ずつそれぞれの背部皮下の２個の空隙に移植した。デバイスは組織付着なしに容易に除去された。移植後、２−３日に一度血糖値を測定した。図８に示すように、５匹の糖尿病ACIラットを用いて検討したところ、５匹全例が１００日以上にわたって血糖値が正常化した。血糖値が正常化したことは、同種異系の膵島がインスリンを分泌できる状態で生着していることを示し、拒絶反応が適切に抑制された移植空間が形成されていることを示す。【００４８】
実施例７
実施例１と同様にして得たF344膵島の移植により血糖が100日以上正常化しているSTZ-ACIレシピエントの肝臓に3000個のF344膵島を門脈を介して移植した。血中グルコースレベルは膵島注入後7〜10日で350mg/dLに増加した(n=2, 図9A)。肝臓及び皮下の膵島はともにインスリン産生機能を失った。多くのリンパ球が膵島注入の14日後に回収された肝臓及び皮下の膵島周辺に浸潤し、膵島は深刻な障害を受けた(図9C-1及びC-2)。さらに、実施例１と同様にして得たF344膵島の移植により血糖が100日以上正常化しているSTZ-ACIレシピエントに対し、F344脾細胞を腹腔内投与した。血中グルコースレベルはF344脾細胞投与後4-7日で350mg/dLを超えて増加した(n=4, 図9B)。多くのリンパ球が膵島周辺に浸潤し、インスリン陽性細胞数は脾細胞注射の4日後に回収した組織で減少した(図9D-1及びD-2)。【００４９】
実施例７の結果は、膵島ドナーと同一の系統ラットの細胞により惹起された免疫応答が、膵島移植片の生着を破綻させ致命的な影響を及ぼすこと一方では、本発明のデバイスを用いた方法により、同種異系細胞の移植・生着に適した免疫抑制部位が形成されていることを示唆する。【００５０】
また、本発明の方法により、免疫抑制剤なしで移植された膵島移植片は、長期間安定に生着し、正常血糖になるレベルまでインスリンを分泌し続けることが明らかになった。この膵島移植片は、免疫拒絶される同種異系の移植材料を移植して免疫系を劇的に活性化することで拒絶されるが、このような特殊な操作を行わない限り、移植した膵島は膵臓内と同様の状態で生着しており、糖尿病治療に非常に有効であることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
死体ドナーから得られた膵島を糖尿病患者に移植することは、インスリン依存性糖尿病の治療法としては優れた方法である。しかし、死体ドナーの提供数が限られており一般的な治療法として定着することはないと予想される。一方、近年人工多能性幹細胞(iPS細胞等)や胚性幹細胞（ES細胞）からインスリン分泌細胞さらに疑似膵島が分化誘導され、それを半透膜製のバッグに封入し拒絶反応を受けないようにした後糖尿病モデル動物に移植することで、血糖値を正常化できるとの報告がなされている。簡便に人工多能性幹細胞(iPS細胞等)や胚性幹細胞（ES細胞）からインスリン分泌細胞さらに疑似膵島が分化誘導できるようになれば、本発明の方法を用いて移植すれば、免疫抑制剤の投与また半透膜製のバッグを用いることなく細胞移植による糖尿病治療を施すことが可能になる。本発明は糖尿病の理想的な治療法を提供する極めて有力な方法である。膵島以外の移植材料についても、免疫抑制剤の投与が不要であることは大きなメリットになる。
【図１】
2015041357.tif 000005
【図２】
2015041357.tif 000006
【図３】
2015041357.tif 000007
【図４】
2015041357.tif 000008
【図５】
2015041357.tif 000009
【図６】
2015041357.tif 000010
【図７】
2015041357.tif 000011
【図８】
2015041357.tif 000012
【図９】
2015041357.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月7日(2015.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下に埋め込まれて、拒絶が起こらない移植空間を形成するためのデバイスであって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成され、前記移植空間に移植される材料として同種異系細胞または同種異系微小組織を用い、免疫抑制剤フリーの条件下で前記移植空間を形成するためのものである、デバイス。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記移植空間に移植される材料がランゲルハンス氏島（膵島）である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記移植空間に移植される材料が体性幹細胞、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から分化誘導された細胞である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
分化誘導された細胞がインスリン分泌細胞である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
血管誘導因子が、繊維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、胎盤増殖因子及び上皮増殖因子からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１または３〜５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７】
前記構造体が、ハイドロゲル、スポンジ及び多孔質体からなる群から選ばれる、請求項１または３〜６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８】
さらにヘパリンまたはヘパラン硫酸を含む、請求項１または３〜７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
ヘモグロビン量に換算して、２ｍｇ／ｇ組織〜５０ｍｇ／ｇ組織の血管新生を誘導可能な量の前記血管誘導因子を含む、請求項１または３〜８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
哺乳動物の皮下に請求項１、３〜８または１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出す工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を皮下に形成する方法。
【請求項１２】
哺乳動物の皮下に請求項１、３〜８または１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる移植材料を移植する工程を含む、免疫抑制剤フリーの条件下で移植材料を哺乳動物に移植する方法。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
免疫拒絶を生じ得る移植材料を免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させるためのデバイスの使用であって、前記デバイスは血管誘導因子を含む生体適合性構造体から構成され、前記デバイスを皮下に埋め込んで前記デバイスの周辺に血管を形成し、その後前記デバイスを皮下から取り出して拒絶が起こらない移植空間を形成し、前記移植空間内に免疫拒絶が生じ得る移植材料を移植し、免疫抑制剤フリーの条件下で皮下で生着させることを特徴とする、使用。
【請求項１５】
前記移植空間に移植される材料が同種異系細胞または同種異系微小組織である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
哺乳動物の皮下に請求項１、３〜８または１０のいずれかに記載のデバイスを埋め込み前記デバイスの周囲に小口径の血管を形成する工程、前記デバイスを取り出して免疫抑制剤フリーの条件下で免疫拒絶が抑制された空間を形成する工程、前記空間に同種異系細胞及び同種異系微小組織からなる群から選ばれる疾患治療用の移植材料を移植する工程を含む、疾患の治療方法。
【請求項１７】
疾患が糖尿病であり、移植材料が膵島である、請求項１６に記載の治療方法。
【請求項１８】
請求項１２、１６または１７のいずれかに記載の方法に用いるための、請求項１、３〜８または１０のいずれかに記載のデバイス。
【国際調査報告】
2015041357.tif 000014
2015041357.tif 000015
2015041357.tif 000016
2015041357.tif 000017
2015041357.tif 000018