(57)【要約】【課題】心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び組換えベクターを提供する。【解決手段】Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を、該リプログラミング因子をコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター１つ以上を用いて線維芽細胞内に導入することを特徴とする心筋様細胞の作製方法、及び、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上がウイルスゲノム上に保持されているセンダイウイルスベクターを含む心筋様細胞の作製用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を、該リプログラミング因子をコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター１つ以上を用いて線維芽細胞内に導入することを特徴とする心筋様細胞の作製方法。
【請求項２】
前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の３つであることを特徴とする、請求項１に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項３】
前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄの５つであることを特徴とする、請求項１に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項４】
さらにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を前記線維芽細胞内に導入することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項５】
前記リプログラミング因子の２つ以上が、前記センダイウイルスベクターに直列に挿入されていることを特徴とする、請求項２又は３に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項６】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５が、上流側から下流側に向けて、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、の順に隣接することを特徴とする、請求項５に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項７】
Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄが、上流側から下流側に向けて、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、の順に隣接することを特徴とする、請求項３に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項８】
前記線維芽細胞がヒト由来であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の心筋様細胞の作製方法。
【請求項９】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上がウイルスゲノム上に保持されているセンダイウイルスベクターを含む心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１０】
前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の３つであることを特徴とする、請求項９に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１１】
前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄの５つであることを特徴とする、請求項９に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１２】
さらにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むことを特徴とする、請求項９〜１１いずれか一項に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１３】
前記リプログラミング因子の２つ以上が、前記センダイウイルスベクターに直列に挿入されていることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１４】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５が、上流側から下流側に向けて、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、の順に隣接することを特徴とする、請求項１３に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【請求項１５】
Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄが、上流側から下流側に向けて、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、の順に隣接することを特徴とする、請求項１１に記載の心筋様細胞の作製用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及びそれに用いる心筋様細胞の作製用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
主に３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を線維芽細胞に遺伝子導入することにより、ｉＰＳ細胞を介することなく直接心筋様細胞へと分化誘導し、心筋様細胞を作製する方法が提案されている（特許文献１及び非特許文献１〜２参照）。これらの技術はいずれも、目的遺伝子の導入に際して、レトロウイルス由来あるいはレンチウイルス由来のＲＮＡベクター等が使用されている。【０００３】
一方で、組換え発現ベクターとしてセンダイウイルスベクターを用いて遺伝子導入する方法が報告されている（例えば非特許文献３）。センダイウイルスベクターは、単核球においてゲノムを複製できるが、感染性ウイルス粒子を形成できないため、安全性が高いとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１３−５２４８３７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ．Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａ  ｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｃｅｌｌ，１４２（３），３７５−３８６，２０１０．
【非特許文献２】Ｒ．Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ‐ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１１０（３１），１２６６７−１２６７２，２０１３．
【非特許文献３】Ｓｅｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１及び非特許文献１〜２では、主に３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）をレトロウイルスベクターにより遺伝子導入した線維芽細胞から心筋様細胞へと分化誘導する技術が開示されているが、十分な作製効率を実現できていないという問題があった。さらに、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入は、導入遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれるため、がん化の可能性が指摘されていた。【０００７】
以上のような背景から、従来以上に拍動する心筋誘導の作製効率が良く、さらにがん化等のリスクを低減させた安全性の高い心筋様細胞作製方法の実現が望まれていた。【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、安全性の高い心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及びそれに用いる心筋様細胞の作製用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（１）本発明の心筋様細胞の作製方法は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を、該リプログラミング因子をコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター１つ以上を用いて線維芽細胞内に導入することを特徴とする。
（２）（１）において、前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の３つであるように構成できる。
（３）あるいは、（１）において、前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄの５つであるように構成できる。
（４）さらに、（１）〜（３）のいずれかにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を前記線維芽細胞内に導入するように構成できる。
（５）（２）又は（３）において、前記リプログラミング因子の２つ以上が、前記センダイウイルスベクターに直列に挿入されているように構成できる。
（６）（５）において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５が、上流側から下流側に向けて、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、の順に隣接するように構成できる。
（７）（３）において、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄが、上流側から下流側に向けて、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、の順に隣接するように構成できる。
（８）（１）〜（７）において、前記線維芽細胞がヒト由来であるように構成できる。
（９）本発明の心筋様細胞の作製用組成物は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上がウイルスゲノム上に保持されているセンダイウイルスベクターを含むことを特徴とする。
（１０）（９）において、前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の３つであるように構成できる。
（１１）或いは（９）において、前記リプログラミング因子が、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄの５つであるように構成できる。
（１２）さらに（９）〜（１１）において、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むように構成できる。
（１３）（１０）又は（１１）において、前記リプログラミング因子の２つ以上が、前記センダイウイルスベクターに直列に挿入されているように構成できる。
（１４）（１３）において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５が、上流側から下流側に向けて、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、の順に隣接するように構成できる。
（１５）（１１）において、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄが、上流側から下流側に向けて、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、の順に隣接するように構成できる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安全性の高い心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び組み換えベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現に関するＦＡＣＳ分析である。
【図２】マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に遺伝子導入してから４週間後の蛍光顕微鏡画像である。
【図３】リプログラミング因子導入の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図４】マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に遺伝子導入してから１週間後の蛍光顕微鏡画像である。
【図５】ＳｅＶ−ＧＭＴ、ＳｅＶ-Ｇ／Ｍ／Ｔ、レトロウイルスベクターによるＧＭＴ遺伝子導入を行った場合の、拍動心筋様細胞数を示す比較図である。
【図６】ヒト皮膚線維芽細胞から誘導した結果における心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現に関するＦＡＣＳ分析である。
【図７】ヒト皮膚線維芽細胞にＳｅＶ−ＧＭＴによるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びｍｉＲ１３３を導入した細胞を４週間培養した時点における蛍光顕微鏡画像である。
【図８】本発明の変形例を示す図である。
【図９】本発明の変形例を示す図である。
【図１０】本発明の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係る心筋様細胞の作製方法、及び組み換えベクターについて、図面を参照しつつ説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実験例に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１３】
なお、本明細書においては「心筋様細胞」とは本発明方法を用いて線維芽細胞から直接発生させた心筋細胞を意味し、「誘導心筋細胞」とも称する。本発明において「心筋様細胞」とは、少なくとも心筋トロポニン（ｃＴｎＴ）またはαＭＨＣを発現している細胞を意味する。
【００１４】
また本明細書においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドの１つ以上を「リプログラミング因子」と称する。本発明において、リプログラミング因子１つ以上を導入する線維芽細胞は、幹細胞となることなく、分化した心筋細胞に直接リプログラミングされる。
【００１５】
［心筋様細胞の作製方法］
本実施形態の心筋様細胞の作製方法は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を、該リプログラミング因子ポリペプチドをコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター１つ以上で線維芽細胞内に導入することを特徴とする。
【００１６】
（本実施形態のセンダイウイルスベクター）
線維芽細胞への因子の遺伝子導入、すなわち、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの導入は、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクター等のウイルスベクターを用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法により行うことができる。
【００１７】
本実施形態においては、リプログラミング因子は、該リプログラミング因子ポリペプチドをコードする核酸をゲノムに有する組換えセンダイウイルスベクター１つ以上で線維芽細胞内に導入されることが好ましい。
【００１８】
本実施形態においてベクターは、好ましくはウイルスベクターである。また本実施形態においてウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。センダイウイルスベクターは、染色体非組み込み型ウイルスベクターであって、ベクターは細胞質中で発現されるので、導入遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれる危険性がない。従って安全性が高く、また目的達成後に導入細胞からベクターを除去することが可能である。本実施形態においてセンダイウイルスベクターには、感染性ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばセンダイウイルスにおいて、センダイウイルスゲノムとそれに結合するセンダイウイルス蛋白質（ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質）からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分）は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができる（国際公開公報ＷＯ００／７００５５に開示）。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行えばよい。このようなリボヌクレオ蛋白質（ＲＮＰ）も本実施形態においてセンダイウイルスベクターに含まれる。
【００１９】
センダイウイルスは、モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスの１つでパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）に属し、一本のマイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のＲＮＡをゲノムとして含んでいる。マイナス鎖ＲＮＡはネガティブ鎖ＲＮＡとも呼ばれる。
【００２０】
モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）には、パラミクソウイルス（パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルス）の他に、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる（ウイルス  第５７巻  第１号、ｐｐ２９−３６、２００７；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１２３−１６２，１９９８；Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，１３０５−１３４０，２００１；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，６１３−６２４，１９９９；Ｆｉｅｌｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｐｐ１２０５−１２４１  １９９６）。センダイウイルス以外のパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型、オルトミクソウイルス科  （Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が挙げられ、さらに具体的に例示すれば、例えば  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（��ＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、および  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
【００２１】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子については  Ｍ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子については  Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子については  Ｄ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子については  Ｄ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子については  Ｄ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子については  Ｄ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照することにより特定することができる。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、ＮＰ遺伝子（Ｎ遺伝子とも言う）については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−ｌ，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，  ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢＯ１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，  ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ  Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子については  ＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；および  ＳＶ−５，Ｓ７６８７６  が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本実施形態のベクターとして有用である。例えば本実施形態のセンダイウイルスベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列と、９０％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本実施形態のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列と、９０％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。また、本実施形態のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列において、１０個以内、好ましくは９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または１個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
【００２２】
なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。
【００２３】
なお、本実施形態において用いられるセンダイウイルスベクターは誘導体であってもよく、誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。
【００２４】
またセンダイウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばＺ株が挙げられる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，Ｍａｒｃｈ  １９５５  ｐ１−１５に開示）。つまり、当該ウイルスは、目的とする機能を達成できる限り、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８:８４１３−８４１７，１９９４に開示）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝搬能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、Fおよび/またはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないウイルスベクターを用いることができる  （国際公開公報ＷＯ００／７００５５、国際公開公報ＷＯ００／７００７０、Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００）に開示）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えばＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質）をゲノムＲＮＡにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（国際公開公報ＷＯ００／７００５５、国際公開公報ＷＯ００／７００７０、Ｌｉ，  Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００）に開示）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（ＶＬＰ）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（国際公開公報ＷＯ００／７００７０に開示）。また、ウイルスベクターをＲＮＰ（例えばＮ、Ｌ、Ｐ蛋白質、およびゲノムＲＮＡからなるＲＮＰ）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２５】
本実施形態で好適なセンダイウイルスベクターを例示すれば、例えばＭ蛋白質にＧ６９Ｅ,Ｔ１１６Ａ，及びＡ１８３Ｓの変異を、ＨＮ蛋白質にＡ２６２Ｔ，Ｇ２６４，及びＫ４６１Ｇの変異を、Ｐ蛋白質にＬ５１１Ｆ変異を、そしてＬ蛋白質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を持つＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばＺ  ｓｔｒａｉｎ）であってよく、このベクターにさらにＴＳ  ７、ＴＳ  １２、ＴＳ  １３、ＴＳ  １４、またはＴＳ  １５の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦ（ＷＯ２０１０／００８０５４、ＷＯ２００３／０２５５７０）やＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦ、および、これらにさらにＴＳ  ７、ＴＳ  １２、ＴＳ  １３、ＴＳ  １４、またはＴＳ  １５の変異を導入したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
なお「ＴＳΔＦ」は、Ｍ蛋白質にＧ６９Ｅ，Ｔ１１６Ａ，及びＡ１８３Ｓの変異を、ＨＮ蛋白質にＡ２６２Ｔ，Ｇ２６４，及びＫ４６１Ｇの変異を、Ｐ蛋白質にＬ５１１Ｆ変異を、そしてＬ蛋白質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を持ち、Ｆ遺伝子を欠失することを言う。
【００２７】
本実施形態において、リプログラミング因子を持つ組換えセンダイウイルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行うことができる。
具体的には、（ａ）センダイウイルスゲノムＲＮＡ（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするｃＤＮＡを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（Ｎ、Ｐ、およびＬ）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムＲＮＡから発現されてもよいし、ゲノムＲＮＡ以外からトランスに供給されてもよい。例えば、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムＲＮＡにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やＲＮＡゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムＲＮＡは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。
【００２８】
また、センダイウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができる（国際公開公報ＷＯ９７／１６５３９；国際公開公報ＷＯ９７／１６５３８；国際公開公報ＷＯ００／７００５５；国際公開公報ＷＯ００／７００７０；国際公開公報ＷＯ０１／１８２２３；国際公開公報ＷＯ０３／０２５５７０；国際公開公報ＷＯ２００５／０７１０９２；国際公開公報ＷＯ２００６／１３７５１７；国際公開公報ＷＯ２００７／０８３６４４；国際公開公報ＷＯ２００８／００７５８１；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８:  ２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６:  ５７８−５８７  及び  Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，  Ｓ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：  ５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４；Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２００２：８６；３３−３８、Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００：７４；  ６５６４−６５６９）。
【００２９】
センダイウイルスのゲノムは、３’端から５’端に向けて順に、ＮＰ（ヌクレオキャプシド）遺伝子、Ｐ（ホスホ）遺伝子、Ｍ（マトリックス）遺伝子、Ｆ（フュージョン）遺伝子、ＨＮ（赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ）遺伝子、及びＬ（ラージ）遺伝子が含まれている。このうち、センダイウイルスは、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、およびＬ遺伝子があればベクターとして十分機能でき、細胞中でゲノムを複製し、搭載されている遺伝子（本実施形態においては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄ）を発現させることができる。なおセンダイウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡをゲノムに持つことから、通常とは逆で、ゲノムの３’側が上流にあたり、５’側が下流にあたる。
【００３０】
本実施形態において、センダイウイルスベクターに搭載される遺伝子は、上記遺伝子のいずれの間でも挿入することができ、例えば、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間に挿入することができる。他の場所に挿入した場合であっても、全体の発現量が変化するのみで、心筋様細胞の誘導効率に差が生じる可能性はあるが、目的の細胞誘導そのものは同様にできる。
【００３１】
本実施形態において使用される組換えセンダイウイルスベクターにおいては、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄのうちの１つ以上が組み込まれる。すなわち、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄのうちのいずれか１つのみがＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に挿入されていても良いし、２つ以上が挿入されていても良い。２つ以上の遺伝子は、他の遺伝子を介して互いに離れた位置に挿入されていても良いし、隣接して挿入されていても良い。好ましくは、本実施形態においては、Ｇａｔａ４遺伝子、Ｍｅｆ２ｃ遺伝子、およびＴｂｘ５遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのＰ遺伝子の直後、すなわちＰ遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖ＲＮＡゲノムのすぐ５’側）に隣接して組み込まれる。この場合、Ｐ遺伝子とＧａｔａ４遺伝子の間には、他の転写単位（例えば蛋白質をコードする遺伝子をコードする転写単位）は含まれない。センダイウイルスのゲノム上でＧａｔａ４遺伝子、Ｍｅｆ２ｃ遺伝子、およびＴｂｘ５遺伝子がこの順番で並ぶとき、Ｇａｔａ４遺伝子が３つの遺伝子の中では最も３’側に配置され、Ｔｂｘ５遺伝子が最も５’側に配置される。
【００３２】
本実施形態においては、５つの遺伝子、すなわち、Ｇａｔａ４遺伝子、Ｍｅｆ２ｃ遺伝子、Ｔｂｘ５遺伝子、Ｍｅｓｐ１遺伝子、及びＭｙｏｃｄ遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのＰ遺伝子の直後、すなわちＰ遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖ＲＮＡゲノムのすぐ５’側）に隣接して組み込まれていても良い。
【００３３】
また、２つの遺伝子、すなわち、Ｍｅｓｐ１遺伝子とＭｙｏｃｄ遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのＰ遺伝子の直後、すなわちＰ遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖ＲＮＡゲノムのすぐ５’側）に隣接して組み込まれていても良い。
【００３４】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄのうちの１つ以上を含む上記センダイウイルスベクターは、それだけを用いて本実施形態の心筋様細胞の作製における遺伝子導入に使用することができるが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をさらに導入するリプログラミングにおいて使用することも可能である。該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）としては、ｍｉＲ１３３を使用した場合、線維芽細胞の細胞運命制御因子であるＳｎａｉｌ１の発現を抑制して線維芽細胞の特性を抑えて心筋誘導を促進するため好ましいが（Ｍｕｒａｏｋａ  Ｎ，  Ｙａｍａｋａｗａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｉｅｄａ  Ｍ．  ＭｉＲ−１３３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｓｎａｉ１  ａｎｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３３（１４）：１５６５−８１．２０１４．）、これに限られるものではない。
【００３５】
該マイクロＲＮＡは上記のＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５遺伝子を含むセンダイウイルスベクター、あるいは、Ｍｅｓｐ１とＭｙｏｃｄ遺伝子を含むセンダイウイルスベクターの中に挿入することもできるが、別のベクターに挿入して使用してもよい。該マイクロＲＮＡを別のベクターに挿入する場合、ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばリポソーム）など所望のベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、該マイクロＲＮＡは、リポソームに挿入され、リポフェクション法により繊維芽細胞に導入される。
【００３６】
なお、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ１３３）の導入については以下に示される（Ｍｕｒａｏｋａ  Ｎ，  Ｙａｍａｋａｗａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｉｅｄａ  Ｍ．  ＭｉＲ−１３３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｓｎａｉ１  ａｎｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３３（１４）：１５６５−８１．２０１４．）。
【００３７】
本実施形態において、各因子の遺伝子及び／又はポリペプチドが導入される線維芽細胞は、ヒト、又はマウス、ラット、ブタ等のヒト以外の脊椎動物から単離されたものであっても、その継代培養細胞であってもよい。線維芽細胞としては、例えば、胎児線維芽細胞、尾先端部由来線維芽細胞、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等を用いることができる。
【００３８】
（線維芽細胞の培養）
本実施形態の心筋様細胞の作製方法は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上をコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター１つ以上を線維芽細胞に接触し培養することにより、線維芽細胞内に該リプログラミング因子を導入する行程を有する。
【００３９】
線維芽細胞の培養は、適した条件であれば特に制限されるものではなく、通常、２５℃〜３７℃の範囲内の温度で、かつ、５％ＣＯ２条件下で行われる。
【００４０】
本実施形態におけるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を導入した線維芽細胞の培養は、遺伝子導入（ウイルス感染）から１週間から４週間、あるいはそれ以上かけて行うことが好ましい。この期間、後述するような無血清培地で培養することにより、心筋様細胞への分化誘導が効率よく行われ、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる。
【００４１】
該無血清培地には、後述するようなサイトカイン等が添加されることが好ましい。
【００４２】
なお、遺伝子導入してから１〜２週間は、血清を含む培地で培養しても良い。血清としては、特に制限されるものではないが、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、仔牛血清（ＮＣＳ）、ウマ血清等を用いることができる。
【００４３】
また、血清を添加する培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地、等を用いることができるが、これらに制限されるものではない。
【００４４】
（培地）
本実施形態の心筋様細胞の作製方法において使用される培地は、血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。無血清培地としては、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ３４無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いることができるが、これらに制限されるものではない。
【００４５】
該無血清培地には、少なくともサイトカイン又は小分子化合物のいずれかが含まれることが好ましい。具体的には、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子−１０）、ＪＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＪＡＫ阻害剤）、及びＩＷＰ４（Ｗｎｔ阻害剤）から選択される１又は２種の物質をさらに含むものが好ましいが、これに制限されるものではない。なお、本実施形態の心筋様細胞の作製方法に好適な培地については、本発明者の先の日本特許出願（特願２０１４−０９６７２９号明細書）に記載されており、本実施形態にも適用が可能である。
【００４６】
（心筋様細胞の確認方法）
心筋様細胞の確認は、例えば、顕微鏡により拍動するか否かを確認したり、ＦＡＣＳ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法、マイクロアレイアッセイ法等の公知の方法により心筋特異的マーカー遺伝子が発現しているか否かを確認したりすることにより行うことができるが、これらの方法に制限されるものではない。
【００４７】
心筋特異的マーカー遺伝子としては、例えば、Ｍｙｈ６、ｃＴｎＴ、ＲｙＲ２、ＨＣＮ４、Ａｃｔｃ１、Ｇｊａ１、Ｃｏｌ１ａ２等を挙げることができるが、これらに制限され
るものではない。
【００４８】
［心筋様細胞の作製用組成物］
本実施形態の心筋様細胞の作製用組成物は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上をコードする核酸をゲノムに有するセンダイウイルスベクター、あるいは、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１、及びＭｙｏｃｄポリペプチドから選択されるリプログラミング因子１つ以上を導入した線維芽細胞を含む。本実施形態の組成物にはさらに、塩、緩衝剤、安定化剤、細胞膜及び／又は細胞壁保存化合物、栄養培地、殺生物剤、脱イオン水等の媒体、等を包含しても良い。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例等によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。【００５０】
［実験１］
（マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の単離）
生後７週〜１０週のメスＩＣＲマウス（日本クレア社）とαＭＨＣ−ＧＦＰトランスジェニックマウス（オス）を交配させた。受精を確認した日を妊娠０日として、妊娠確認後１２日目に妊娠したＩＣＲマウスから胎児を摘出した。【００５１】
胎児から心臓を摘出し、倒立顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７１）にて心臓を蛍光にて投影し、ＧＦＰ蛍光が発せられる胎児を選択した。選択した胎児から、四肢および、頭部１／２〜２／３、肺、肝臓、腎臓、腸管などの実質臓器を摘出した。【００５２】
残った体幹部の組織をＰＢＳ（−）（ＷＡＫＯ社製、０４５−２９７９５）にて洗浄し、血球成分を十分に取り除き、滅菌した手術用ハサミにて組織をできるだけ細かく剪断した。【００５３】
その後、剪断した組織片に０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製、２５２００−０７２）とＰＢＳ（−）（ＷＡＫＯ社製、０４５−２９７９５）を１：１に混合した溶液を加えた（１５ｍＬ／６〜７匹胎児）。そして、３７℃、１５  分間、ウォーターバスで震盪しながらインキュベートした。【００５４】
インキュベート後、ＦＢＳ原液（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を１５ｍＬ添加し、十分縣濁させ、懸濁液を４℃で（１５００ｒｐｍ、５分）遠心分離し、上清を除去した。細胞沈殿物および浮遊物を表１に示す。【００５５】
表１に示すＭＥＦ用培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／ＰＳＡ）３０ｍＬに再懸濁し、１０ｃｍ組織培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１７２９５８）に播種した。（胎児２〜３匹分で１０ｃｍディッシュ１枚分）
その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で細胞沈殿物を培養した。翌日、新しいＭＥＦ用培地に交換し、以後、３〜４日ごとに培地交換を行った。【００５６】
【表１】
2016056438.tif 000003
【００５７】
遊走した細胞を０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製、２５２００−０７２）にて採取し、４０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ社製、ＲＥＦ３５２３４０）を用いて濾過することによりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。【００５８】
［実験２（比較例）］
（レトロウイルスによる心臓特異的転写因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）の遺伝子導入法）
ゼラチンコーティングした１０ｃｍ組織培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１７２９５８）に、Ｐｌａｔ−Ｅパッケージング細胞を  ３．６×１０６  ｃｅｌｌの濃度で播種し、表２に示すＰｌａｔ−Ｅ用培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩の間、静置しながら培養した。【００５９】
【表２】
2016056438.tif 000004
【００６０】
一方、３００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社、３１９８５−０７０）に２７μＬ  ＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｅ２６９１）を混合して５分間静置した。この混合液にｐＭｘ−Ｇａｔａ４、ｐＭｘ−Ｍｅｆ２ｃ、ｐＭｘ−Ｔｂｘ５、およびｐＭｘ−ＧＦＰのレトロウイルスプラスミドを９０００ｎｇ分それぞれ混合し、強くタッピングし、その後１５分間室温で静置した。【００６１】
その後、上記一晩培養したＰｌａｔ−Ｅ細胞全体に、前記の各種レトロウイルスプラスミド混合溶液を滴下し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で静置した（トランスフェクション）。【００６２】
トランスフェクションしてから２４時間後に、表２に示すＰｌａｔ−Ｅ用培地の培地交換を行い、更に３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間静置した。【００６３】
その後上清を、０．４５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  Ｍｉｎｉｓａｒｔ  フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１７５９８）で濾過し、５０ｍＬ  チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、４３０８２９）に回収した。【００６４】
回収した上清１０ｍＬに対し、  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、＃ＴＲ−１００３−Ｇ）を４μＬ注入し、各遺伝子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）のレトロウイルス溶液をそれぞれ調整した。【００６５】
実験１で単離したＭＥＦを、１２ウェル細胞培養用マルチウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５３０４３）に播種し（０．５×１０５個／ウェル）、一晩静置した。その後、ウェル中の培地を吸引除去して、各遺伝子レトロウイルス溶液（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）を同量ずつ混ぜ合わせたレトロウイルス混合溶液にて培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、一晩の間静置し培養して、ウイルスを感染させた（インフェクション）。【００６６】
結果物を「Ｒｅｔｒｏ−ＧＭＴ−ＭＥＦ」と称す。【００６７】
［実験３］
（ＳｅＶ１８＋Ｇａｔａ４／ＴＳΔＦの構築）
ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（ｐＭＸ−Ｇａｔａ４）に搭載されたＧａｔａ４遺伝子を鋳型にして、Ｇａｔａ４−Ｎ（5'-attGCGGCCGCGACGCGATGTACCAAAGCCTGGCCATGG-3'（配列番号：１））及びＧａｔａ４＿ＥＩＳ＿Ｎｏｔ１＿Ｃ（5'-taaGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCGGTGATTATGTCCCCATGACTGTCAG-3'（配列番号：２））のプライマーを用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。精製したフラグメントをＮｏｔ  Ｉで消化後にアガロースゲル電気泳動にて分離後、約１．４ｋｂｐのバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。一方、ＮＰ遺伝子の上流に導入遺伝子挿入部位（ＮｏｔＩ部位）を有するｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドをＮｏｔ  Ｉで消化してＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した後、アルカリフォスファターゼ処理し、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。次に、精製したＧａｔａ４フラグメントをｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドのＮｏｔ  Ｉサイトにライゲーションし、大腸菌にトランスフォーメーション後にクローニングを行い、シークエンスにより塩基配列の正しいクローンを選択して、ｐＳｅＶ１８＋Ｇａｔａ４／ＴＳΔＦプラスミドを得た。ｐＳｅＶ１８＋Ｇａｔａ４／ＴＳΔＦプラスミドの転写産物から作製したセンダイウイルスをＳｅＶ１８＋Ｇａｔａ４／ＴＳΔＦと称す（以下、ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｇａｔａ４  ｖｅｃｔｏｒ、ＳｅＶ−Ｇとも称す）。【００６８】
得られたセンダイウイルス液は液体窒素にて急速凍結後、−８０℃にて保存した。【００６９】
［実験４］
（ＳｅＶ１８＋Ｍｅｆ２ｃ／ＴＳΔＦの構築）
ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（ｐＭＸ−Ｍｅｆ２ｃ）に搭載されたＭｅｆ２ｃ遺伝子を鋳型にして、Ｍｅｆ２ｃ遺伝子の連続するアデニン（Ａ）のうち、ＲＣＲを用いたＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により１２番目及び３４８番目のアデニン（Ａ）をグアニン（Ｇ）に変換した。１２番目の変異導入のプライマーとしてＭｅｆ２ｃ＿Ａ１２Ｇ＿Ｎ（5’-CTATGGGGAGAAAGAAGATTCAGATTACG-3’（配列番号：３））及びＭｅｆ２ｃ＿Ａ１２Ｇ＿Ｃ（5’-CGTAATCTGAATCTTCTTTCTCCCCATAG-3’（配列番号：４））、また、３４８番目の変異導入のプライマーとしてＭｅｆ２ｃ＿Ａ３４８Ｇ＿Ｎ（5’-GAAGAAAAATACAAGAAAATTAATGAAG-3’（配列番号：５））及びＭｅｆ２ｃ＿Ａ３４８Ｇ＿Ｃ（5’-CTTCATTAATTTTCTTGTATTTTTCTTC-3’（配列番号：６））を用いた。【００７０】
更に、上記のように２カ所に変異を導入したＭｅｆ２ｃｍｕｔ遺伝子を鋳型にして、Ｍｅｆ２ｃ−Ｎ（5’-attGCGGCCGCGACGACACTATGGGGAGAAAAAAGATTC-3’（配列番号：７））及びＭｅｆ２ｃ−Ｃ（5’-attGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCATGTTGCCCATCCTTCAGAGAGTCGCATGCGCTTGACTG-3’（配列番号：８））をプライマーとし、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用して、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。精製したフラグメントをＮｏｔ  Ｉで消化後にアガロースゲル電気泳動にて分離後、約１．４ｋｂｐのバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。一方、NP遺伝子の上流に導入遺伝子挿入部位（ＮｏｔＩ部位）を有するｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドをＮｏｔ  Ｉで消化してＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した後、アルカリフォスファターゼ処理して、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。次に、精製したＭｅｆ２ｃフラグメントをｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドのＮｏｔ  Ｉ部位にライゲーションし、大腸菌にトランスフォーメーション後にクローニングを行い、シークエンスにより塩基配列の正しいクローンを選択して、ｐＳｅＶ１８＋Ｍｅｆ２ｃ／ＴＳΔＦプラスミドを得た。ｐＳｅＶ１８＋Ｍｅｆ２ｃ／ＴＳΔＦプラスミドの転写産物から作製したセンダイウイルスをＳｅＶ１８＋Ｍｅｆ２ｃ／ＴＳΔＦと称す（以下、ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｍｅｆ２ｃ  ｖｅｃｔｏｒ、ＳｅＶ−Ｍとも称す）。
得られたセンダイウイルス液は液体窒素にて急速凍結後、−８０℃にて保存した。【００７１】
［実験５］
（ＳｅＶ１８＋Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦの構築）
ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（ｐＭＸ−Ｔｂｘ５）に搭載されたＴｂｘ５遺伝子を鋳型にして、Ｔｂｘ５−Ｎ（5'-attGCGGCCGCGACGACACCATGGCCGATACAGATGAGG-3'（配列番号：９））及びＴｂｘ５−Ｃ（5'-attGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAGCTATTCTCACTCCACTCTGGCACCATGCCGACGCCG-3'（配列番号：１０））をプライマーとして用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用して、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。精製したフラグメントをＮｏｔ  Ｉで消化後にアガロースゲル電気泳動にて分離後、約１．６ｋｂｐのバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。一方、ＮＰ遺伝子の上流に導入遺伝子挿入部位（ＮｏｔＩ部位）を有するｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドをＮｏｔ  Ｉで消化してＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した後、アルカリフォスファターゼ処理して、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。次に、精製したＴｂｘ５フラグメントをｐＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦプラスミドのＮｏｔ  Ｉサイトにライゲーションし、大腸菌にトランスフォーメーション後にクローニングを行い、シークエンスにより塩基配列の正しいクローンを選択して、ｐＳｅＶ１８＋Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦプラスミドを得た。ｐＳｅＶ１８＋Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦプラスミドの転写産物から作製したセンダイウイルスをＳｅＶ１８＋Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦと称す（以下、ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｔｂｘ５  ｖｅｃｔｏｒ、ＳｅＶ−Ｔとも称す）。
得られたセンダイウイルス液は液体窒素にて急速凍結後、−８０℃にて保存した。【００７２】
［実験６］
（ＳｅＶ（ＰＭ）Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦの構築）
Ｇａｔａ４遺伝子フラグメントの作製は、ｐＳｅＶ１８＋Ｇａｔａ４／ＴＳΔＦ  ＤＮＡに搭載されたＧａｔａ４遺伝子を鋳型にしたＰＣＲによって行った。ＳｅＶＦ６（5'-ACAAGAGAAAAAACATGTATGG-3'（配列番号：１１））及びＧａｔａ４＿Ｍｅｆ２ｃ＿Ｃ（5’-  CTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCGGTGATTATGTCCCC  -3’（配列番号：１２））をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅したＧａｔａ４遺伝子フラグメント（約１．５ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。Ｍｅｆ２ｃ遺伝子フラグメントの作製は、ｐＳｅＶ１８＋Ｍｅｆ２ｃ／ＴＳΔＦ  プラスミドに搭載されたＭｅｆ２ｃ遺伝子を鋳型にしたＰＣＲによって行った。Ｇａｔａ４＿Ｍｅｆ２ｃ＿Ｎ（5’-  GAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACGTACACTTGTAATGGGGAGAAAGAAGATTCAG  -3'（配列番号：１３））及びＭｅｆ２ｃ＿Ｔｂｘ５＿Ｃ（5’-CTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCATGTTGCCCATCCTTC  -3’（配列番号：１４））をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅したＭｅｆ２ｃ遺伝子フラグメント（約１．４ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。また、Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントの作製は、ｐＳｅＶ１８＋  Ｔｂｘ５  ／ＴＳΔＦ  ＤＮＡに搭載されたＴｂｘ５遺伝子を鋳型にしたＰＣＲによって行った。【００７３】
Ｍｅｆ２ｃ＿Ｔｂｘ５＿Ｎ（5’-GAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCATCCACGTACACTTGTAATGGCCGATACAGATGAGGG  -3’（配列番号：１５））及びＳｅＶＲ１９９（5’-GATAACAGCACCTCCTCCCGACT-3’（配列番号：１６））をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ２分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃∞の条件でＰＣＲを行い、増幅したＴｂｘ５遺伝子フラグメント（約１．７ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。【００７４】
次にＧａｔａ4−Ｍｅｆ2ｃ遺伝子フラグメントの作製は、前述のＰＣＲによって作製したＧａｔａ４遺伝子フラグメント及びＭｅｆ２ｃ遺伝子フラグメントを鋳型にしたＰＣＲによって行った。ＳｅＶＦ６及びＭｅｆ２ｃ＿Ａ３４８Ｇ＿Ｃ（5’-CTTCATTAATTTTCTTGTATTTTTCTTC-3’（配列番号：１７））をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ２分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたＧａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ遺伝子フラグメント（約１．９ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。また、Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントの作製は、Ｍｅｆ２ｃ遺伝子フラグメント及びＴｂｘ５遺伝子フラグメントを鋳型にしたＰＣＲによって行った。Ｍｅｆ２ｃ＿Ａ３４８Ｇ＿Ｎ（5’-GAAGAAAAATACAAGAAAATTAATGAAG-3’（配列番号：１８））及びＳｅＶＲ１９９をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ３分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたＭｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメント（約２．７ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。更に、Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントを作製するために、Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ遺伝子フラグメント及びＭｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＳｅＶＦ１５（5’-AAAACATGTATGGGATATGT-3’（配列番号：１９））及びＳｅＶＲ１５０（5’-AATGTATCGAAGGTGCTCAA  -3’（配列番号：２０））をプライマーとして用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を使用し、９４℃  ２分、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ４．５分）のサイクルを３０サイクル、６８℃  ５分、４℃  ∞の条件でＰＣＲを行い、増幅されたＧａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメント（約４．５ｋｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。【００７５】
最後に、この精製したフラグメントをＮｏｔ  Ｉで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後にＧａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。一方、Ｐ遺伝子およびＭ遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位（ＮｏｔＩ部位）を有するｐＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦプラスミドをＮｏｔ  Ｉで消化してＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した後、アルカリフォスファターゼ処理して、再度、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。次に、精製したＧａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５遺伝子フラグメントをｐＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦプラスミドのＮｏｔ  Ｉサイトにライゲーションし、大腸菌にトランスフォーメーションした後にクローニングを行い、シークエンスにより塩基配列の正しいクローンを選択して、ｐＳｅＶ（ＰＭ）Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦ  プラスミドを得た。ｐＳｅＶ（ＰＭ）Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦプラスミドの転写産物から作製したセンダイウイルスをＳｅＶ（ＰＭ）Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５／ＴＳΔＦと称す（以下、ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５  ｖｅｃｔｏｒ、ＳｅＶ−ＧＭＴとも称す）。【００７６】
得られたセンダイウイルス液は液体窒素にて急速凍結後、−８０℃にて保存した。【００７７】
［実験７］
（センダイウイルスによる心臓特異的転写因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）の遺伝子導入法）
−８０℃保存下のＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｇａｔａ４  ｖｅｃｔｏｒ、ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｍｅｆ２ｃ  ｖｅｃｔｏｒ、及びＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｔｂｘ５  ｖｅｃｔｏｒの混合物（以下、「ＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｇａｔａ４／Ｍｅｆ２ｃ／Ｔｂｘ５  ｖｅｃｔｏｒ」又は「ＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔ」と称す）、あるいはＳｅｎｄａｉｖｉｒｕｓΔＦ  Ｇａｔａ４−Ｍｅｆ２ｃ−Ｔｂｘ５  ｖｅｃｔｏｒ（ＳｅＶ−ＧＭＴ）を37℃にて急速融解させ、ＭＯＩ  ２０〜５０相当のセンダイウイルス液をＤＭＥＭ培養液に加えた。【００７８】
実験１で単離したＭＥＦを、１２ウェル細胞培養用マルチウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５３０４３）に播種し（０．５×１０５個／ウェル）、一晩静置した。その後、ウェル中の培地を吸引除去して、ＤＭＥＭ／センダイウイルス混合液で培地交換した。
３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩静置培養して、ウイルスを感染させた（インフェクション）。結果物をそれぞれ、「ＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔ−ＭＥＦ」、及び、「ＳｅＶ−ＧＭＴ−ＭＥＦ」と称する。【００７９】
［実験８］
（心筋様細胞への分化誘導）
実験２により作製したＲｅｔｒｏ−ＧＭＴ−ＭＥＦ、実験４により作製したＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔ−ＭＥＦ、及び、ＳｅＶ−ＧＭＴ−ＭＥＦは、遺伝子導入翌日、表３又は表４に示す各培地に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。なお、培養は、３〜４日ごとに培地を交換して行った。【００８０】
【表３】
2016056438.tif 000005
【００８１】
【表４】
2016056438.tif 000006
【００８２】
［評価１］
（ＦＡＣＳ解析方法）
マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を、ＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔ、ＳｅＶ−ＧＭＴの各センダイウイルス溶液、及び、レトロウイルス溶液（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の混合）で培養し、１週間後、それぞれの培地を吸引した。その後、ＰＢＳ（−）で洗浄を行い、各ウェルに対して、０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡを０．５ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間静置した。【００８３】
細胞が培養液に浮き上がることを確認した後、表１に示すＭＥＦ用培地（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／ＰＳＡ）１ｍＬで中和し、１５ｍＬチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、４３０７９１）に細胞を回収した。【００８４】
回収した細胞を、４℃で遠心分離した（１５００ｒｐｍ、５分間）。上清を吸引後、表５に示すＦＡＣＳ施行用溶液（５％ＦＢＳ／ＰＢＳ）３５０μＬを加え、十分に混ぜ合わせた。この懸濁液を、セルストレーナー・キャップ付き５ｍＬポリスチレンラウンドチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社、ＲＥＦ  ３５３３３５）にてフィルターをかけ、ＦＡＣＳ用試料とした。【００８５】
フローサイトメトリー（日本ベクトン・ディッキンソン、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）を使用し、上記の試料におけるＧＦＰ陽性細胞およびｃＴｎＴ陽性細胞の測定を行った。【００８６】
【表５】
2016056438.tif 000007
【００８７】
［評価２］
（拍動細胞数の確認）
感染させてから２８日後に、ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ９０００）を用いて明視野４倍で各ウェルの全体を撮影した。また、同顕微鏡を用いて位相差２０倍で拍動する心筋様細胞の数を計測し、１２ウェルの合計を算出した。【００８８】
［結果］
図１は心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現に関するＦＡＣＳ分析である。（ａ）は対照実験の結果を示す図である。（ｂ）はマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔ（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の混合）のセンダイウイルス溶液で培養した結果である。（ｃ）はマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液で培養した結果である。（ｄ）は比較のためマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をレトロウイルス溶液（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の混合）で培養した結果である。（ｂ）に比べて（ｃ）ではｃＴｎＴ陽性細胞の数及びｃＴｎＴ強度が増大している。【００８９】
図２（ａ）は対照実験の結果を示す図である。（ｂ）はマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液でウイルス感染させてから４週間後の蛍光顕微鏡画像である。（ｃ）は比較のためマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をレトロウイルス溶液（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の混合）でウイルス感染させてから４週間後の蛍光顕微鏡画像である。【００９０】
発明者はレトロウイルスベクターによるＧＭＴ３遺伝子導入で心筋様細胞を誘導可能であることを開示しているが（ＷＯ２０１１／１３９６８８）、センダイウイルスベクター（ＳｅＶ−ＧＭＴ）によっても心筋蛋白陽性（ｃＴｎＴ、α−Ａｃｔｉｎｉｎ）、独特の横紋構造が出現し、心筋様細胞の誘導が確認できた。【００９１】
図３はリプログラミング因子導入の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。Ｇａｔａ４発現細胞（緑）、Ｍｅｆ２ｃ発現細胞（赤）がそれぞれ示される。ＤＡＰＩ（青）はすべての細胞の核を示す。ｍｅｒｇｅ画像は各画像の重ね合わせを示す。
（ａ）は比較のため、レトロウイルスベクターによりＧＭＴの各因子の細胞への導入を示す蛍光顕微鏡画像である。
（ｂ）はＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔのセンダイウイルス溶液によりＧ、Ｍ、Ｔの各因子の細胞への導入を示す蛍光顕微鏡画像である。
（ｃ）、（ｄ）はＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液によるＧ、Ｍ、Ｔの各因子の細胞への導入を示す蛍光顕微鏡画像である。
（ｂ）と比較して（ｃ）、（ｄ）はより多くの細胞へのＧ、Ｍ、Ｔの各因子の導入が確認できる。また、（ｂ）のｍｅｒｇｅ画像と（ｃ）及び（ｄ）のｍｅｒｇｅ画像を比較した場合、ＳｅＶ−Ｇ／Ｍ／Ｔにより遺伝子導入するよりはＳｅＶ−ＧＭＴにより遺伝子導入を行う方が、Ｇａｔａ４発現細胞とＭｅｆ２ｃ発現細胞が一致しており、遺伝子導入効率が向上することが確認できる。（ｃ）と（ｄ）を比較した場合、細胞密度と継代数を変化させることにより細胞への因子導入効率が向上することが確認できる。【００９２】
図４はマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）をＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液でウイルス感染させてから１週間後の蛍光顕微鏡画像である。図２（ｂ）と比較しても、ＧＭＴ３遺伝子導入からわずか１週間で既に心筋蛋白陽性（ｃＴｎＴ、α−Ａｃｔｉｎｉｎ）、独特の横紋構造が出現し、心筋様細胞が誘導されていること確認できた。【００９３】
センダイウイルスベクターでＧＭＴ３遺伝子の導入を行った場合、レトロウイルスにより導入した場合と比較して早期に心筋様細胞が誘導される理由については明らかではないが、センダイウイルスベクターが染色体非組み込み型ウイルスベクターであって、ベクターが細胞質中で発現され、導入遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれる工程を経ないため、心筋誘導に要する時間も短期間であることが予想される。【００９４】
図５（ａ）は経時による拍動心筋様細胞の数の変化を示す図である。従来のレトロウイルスベクターによるＧＭＴ遺伝子導入を行った心筋様細胞では拍動開始まで約３週間であったが、本発明におけるセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ−ＧＭＴ）によって誘導した心筋様細胞は、約１０日と早期に拍動を開始することが確認できる。【００９５】
（ｂ）は感染させてから１９日時点での拍動する心筋様細胞の数を示すグラフである。従来のレトロウイルスベクターによるＧＭＴ遺伝子導入を行った心筋様細胞と比較し、本発明におけるセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ−ＧＭＴ）によって誘導した心筋様細胞は、拍動細胞数が４０〜８０倍に増加することが確認できる。【００９６】
図６はヒト皮膚線維芽細胞からインビトロで誘導した結果における心トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の発現に関するＦＡＣＳ分析である。（ａ）は対照実験の結果を示す図である。（ｂ）はＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液によりＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５を導入した細胞を培養した結果である。（ｃ）はＳｅＶ−ＧＭＴによるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の導入に加え、さらにｍｉＲ１３３を導入した細胞を培養した結果である。（ｄ）はＳｅＶ−ＧＭＴによるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の導入に加え、さらにＭｅｓｐ１及びＭｙｏｃｄを導入した細胞を培養した結果である。（ｅ）は、（ｄ）に加えさらにｍｉＲ１３３を導入した細胞を培養した結果である。（ａ）〜（ｅ）に示されるように、ヒト皮膚線維芽細胞から誘導した場合は、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５に加えＭｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びｍｉＲ１３３を導入することによりｃＴｎＴ陽性細胞の数及びｃＴｎＴ強度が増大することが確認できる。【００９７】
図７はヒト皮膚線維芽細胞にインビトロでＳｅＶ−ＧＭＴによるＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５の導入に加え、さらにＭｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ、及びｍｉＲ１３３を導入した細胞を４週間培養した時点における蛍光顕微鏡画像である。心筋蛋白陽性（α−Ａｃｔｉｎｉｎ）、独特の横紋構造が出現し、心筋様細胞の誘導が確認できた。【００９８】
図８は本発明の変形例を示す図である。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液でＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の遺伝子導入を行って心筋誘導する際に、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及び播種密度を変化させて培養した場合における、心拍心筋様細胞の数の変化である。拍動細胞数は、線維芽細胞の播種密度、及びウイルス感染濃度に依存して増加することが確認できるので、線維芽細胞の播種密度、またはＭＯＩを変化させながら上記の細胞を培養しても良い。【００９９】
図９は本発明の変形例を示す図である。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液でＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の遺伝子導入を行う際に、細胞密度及び継代数を変化させて培養した場合における、心拍心筋様細胞の数の変化である。細胞密度及び継代数の変化により拍動細胞数が増加することが確認できるので、細胞密度、または継代数を変化させながら上記の細胞を培養しても良い。【０１００】
図１０は本発明の変形例を示す図である。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＳｅＶ−ＧＭＴのセンダイウイルス溶液でＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５の遺伝子導入を行って心筋誘導する際に、無血清培地と血清培地を使用した場合の、拍動する心筋様細胞の数を示す比較図である。（ａ）は表４に示すＦＦＶ培地（無血清培地）を使用した場合であり、（ｂ）はダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加して使用した場合（血清培地）を示す。本発明の心筋様細胞の作製においては、無血清培地を使用すると、血清培地を使用した場合に比べ拍動する心筋様細胞の数が格段に増加したことが確認できる。本発明の心筋様細胞の作製は、従来の血清培地を使用して行っても良いが、無血清培地を使用して行っても良い。
【図１】
2016056438.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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