(57)【要約】  本発明は、簡便な方法で、感度良く、かつ、確実に関節リウマチの疾患活動性を評価する方法及びそのためのキットを提供することにある。さらに、類似したリウマチ性疾患であるリウマチ性多発筋痛症及び再発性多発軟骨炎の正確な診断法と関節リウマチとの鑑別法並びにそのためのキットを提供する。  本発明は、負の関節リウマチ診断用マーカーとして、Jacalin結合性O-結合型糖鎖エピトープを提供するものであり、血液中のMMP-3とJacalinとの結合量の逆数に、血液中のMMP-3量又は血液中のMMP-3とABA、ACAもしくはACGとの結合量を乗じた値の変化量により、関節リウマチの疾患活動性をより客観的に判定することで、より正確な病状把握を可能とした。  また、血液中のMMP-3上のLEL又はSTL反応性糖鎖が、リウマチ性多発筋痛症及び再発性多発軟骨炎診断用糖鎖マーカーとなることを見いだし、リウマチ性多発筋痛症及び再発性多発軟骨炎の正確な診断法を提供した。さらに、血液中のMMP-3上のLEL又はSTL結合量と、MMP-3上のJacalin又はACGなどとの結合量の比を測定することによる、類似したリウマチ性疾患との鑑別可能な関節リウマチの正確な診断法を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体液試料におけるMMP-3上のO-結合型糖鎖の糖鎖構造の変化を測定する工程を含む、関節リウマチの疾患活動性の判定のためのデータを提供する方法。
【請求項２】
前記糖鎖構造の変化の測定が、被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルに、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルの逆数を乗じた、もしくは前記糖鎖構造の変化の測定が、被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルの逆数に、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルを乗じた、下記の糖鎖修飾判別指数X又はYを算出することで行われる、請求項１に記載の方法；
X＝被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナル／同MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル、
Y＝被検体液試料中のMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル／同MMP-3全量を示す測定シグナル。
【請求項３】
糖鎖修飾判別指数Xの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が高いと判定する、又は糖鎖修飾判別指数Yの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が低いと判定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルが、Jacalinレクチンを用いて測定される値である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記MMP-3全量を示す測定シグナルが、体液試料中のMMP-3存在量の測定値、又は体液試料中のMMP-3存在量に応じて増減する測定シグナルである、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記MMP-3存在量に応じて増減する測定シグナルが、MMP-3のポリペプチド鎖を特異的に認識する抗MMP-3抗体を用いて測定されるシグナル値、又は体液試料中のMMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンとの結合量を示す測定シグナル値である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
関節リウマチの疾患活動性を判定する方法であって下記の（１）〜（５）を含む方法；
（１）被検体液試料におけるMMP-3とJacalinとの結合量を示すシグナルを測定する工程、
（２）同被検体液試料におけるMMP-3存在量、又は同MMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンとの結合量もしくは抗MMP-3抗体との結合量を示すシグナルを測定する工程、
（３）工程（１）で得られた測定値の逆数に、工程（２）で得られた測定値を乗じた糖鎖修飾判別指数Xまたは、または工程（１）で得られた測定値に、工程（２）で得られた測定値の逆数を乗じた糖鎖修飾判別指数Yを算出する工程、
（４）工程（３）で算出された値（X）または（Y）を基準値（X0）または（Y0）と比較する工程、
（５）工程（４）においてＸが基準値X0よりも高い場合（X＞X0）に関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する工程、又は
工程（４）においてYが基準値Y0よりも低い場合（Y＜Y0）を関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する工程。
【請求項８】
前記基準値X0またはY0が、健常者からの体液試料に対して工程（１）〜（３）を経て算出された値である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被験者の関節リウマチの疾患活動性の経時的な病状変化を判定する方法であって、下記の（１）〜（５）を含む方法；
（１）被検体液試料におけるMMP-3とJacalinとの結合量を示すシグナルを測定する工程、
（２）同被検体液試料におけるMMP-3存在量、又は同MMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンもしくは抗MMP-3抗体との結合量を示すシグナルを測定する工程、
（３）工程（１）で得られた測定値の逆数に、工程(２)で得られた測定値を乗じた糖鎖修飾判別指数X’、又は工程（１）で得られた測定値に、工程(２)で得られた測定値の逆数を乗じた糖鎖修飾判別指数Y’を算出する工程、
（４）工程（３）で算出された値（X’）又は（Y’）を、同一被験者の被検日以前の体液試料に対して工程（１）〜（３）を経て算出された値（X’0）又は（Y’0）と比較する工程、
（５）工程（４）の比較工程において、Ｘ’については被検日以前より高い数値が出た場合（X’＞X’0）に、Y’については被検日以前より低い数値が出た場合（Y’＜Y’0）被験者の関節リウマチの疾患活動性が悪化したと判定し、低い数値が出た場合（X’＜X’0）または高い数値が出た場合（Y’＞Y’0）に、疾患活動性が改善したと判定する工程。
【請求項１０】
前記被検体液試料が、関節リウマチ治療後の被験者由来の体液試料であり、前記被検日以前の体液試料が、治療前の同一被験者由来の体液試料であって、
工程（４）の比較工程において、X’については治療前より低い場合（X’＜X’0）に、またはY’については治療前より高い場合（Y’＞Y’0）に被験者に施された関節リウマチ治療による治療効果があったと判定し、治療前より高い又は変化がない場合（X’≧X’0）、もしくは治療前より低い又は変化がない場合（Y’≦Y’0）に、治療効果がないと判定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、Jacalin非結合性であることを特徴とする、関節リウマチ活動性判定用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
【請求項１２】
MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されていることを特徴とする、関節リウマチ活動性判定用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の糖鎖エピトープからなる関節リウマチ活動性判定用マーカー。
【請求項１４】
MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖の関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用。
【請求項１５】
関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用のためのMMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖。
【請求項１６】
請求項１１もしくは１２に記載の糖鎖エピトープ、又は当該糖鎖エピトープを複数含有するMMP-3を特異的に認識する物質を含む、被検体液試料に適用可能な関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
【請求項１７】
前記糖鎖エピトープを特異的に認識する物質が、糖鎖認識抗体、レクチン、糖鎖認識ペプチド及び糖鎖認識アプタマーから選択された物質である、請求項１６に記載の関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
【請求項１８】
MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質を含む、被検体液試料に適用可能な関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
【請求項１９】
前記MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質がJacalinである、請求項１８に記載の関節リウマチの疾患活動性判定用試薬。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の関節リウマチ疾患活動性判定用試薬と共に、さらに血液試料中のMMP-3に対して、MMP-3存在量依存的にMMP-3と特異的に結合する物質を含む、関節リウマチ疾患活動性判定用キット。
【請求項２１】
前記体液試料中のMMP-3に対して、MMP-3存在量依存的にMMP-3と特異的に結合する物質が、ABA、ACA及びACGから選択されるレクチン、又は抗MMP-3抗体である、請求項２０に記載の関節リウマチ疾患活動性判定用キット。
【請求項２２】
被検体液試料中のMMP-3上の糖鎖であって、ポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を有する糖鎖を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
【請求項２３】
ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである請求項２２に記載の糖鎖エピトープ。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の糖鎖エピトープからなるリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用マーカー。
【請求項２５】
請求項２２もしくは２３に記載の糖鎖エピトープ、又は当該糖鎖エピトープを含有するMMP-3を特異的に認識する物質を含む、被検血液試料に適用可能なリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用試薬。
【請求項２６】
被検体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断のためのデータを提供する方法。
【請求項２７】
ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記測定工程が、抗MMP-3抗体と、ポリラクトサミン構造を認識するレクチンとのサンドイッチアッセイ法による測定工程である，請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）への罹患の有無を疑う被験者に由来する体液試料に対し、下記の（１）〜（３）の工程により判定することを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）への罹患の判定方法；
（１）被験者由来の体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）健常人及び／又は関節リウマチ患者由来の体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（３）（１）で得られた糖鎖の存在量を示す数値が（２）で得られた糖鎖の存在量を示す数値を有意に上回っていた場合、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）に罹患していると判定する工程。
【請求項３０】
前記（１）及び（２）の測定工程が、抗MMP-3抗体と、LELレクチン又はSTLレクチンとのサンドイッチアッセイ法である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
被検体液試料に対して少なくとも下記の（１）及び（２）の測定工程が適用されることを特徴とする、関節リウマチ（RA）診断のためのデータを提供する方法；
（１）抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）抗MMP-3抗体への結合活性と共に、Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖認識レクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程。
【請求項３２】
前記（１）及び（２）測定工程が、前記抗MMP-3抗体と、ポリラクトサミン構造を認識するレクチン及び前記O-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイを用いたサンドイッチアッセイにより同時に行われることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
関節リウマチへの罹患の有無を疑う被験者に由来する体液試料に対し、下記の（１）〜（４）の工程により判定することを特徴とする、関節リウマチへの罹患の判定方法；
（１）抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）抗MMP-3抗体への結合活性と共に、Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖認識レクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程。
（３）（１）で得られた糖鎖の存在量に対する（２）で得られた糖鎖の存在量の比を算出する工程、
（４）あらかじめ又は同時に、健常人由来体液試料に対して（１）〜（３）の工程を適用し、算出された糖鎖の存在量の比の数値と比較して、（３）で得られた数値が有意に高い場合、被験者が関節リウマチに罹患していると判定する方法。
【請求項３４】
前記（１）及び（２）の測定工程が、前記抗MMP-3抗体と、前記ポリラクトサミン構造を認識するレクチン及び前記O-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイを用いたサンドイッチアッセイにより同時に行われることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
下記の（１）及び（２）を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用キット；
（１）抗MMP-3抗体
（２）ポリラクトサミン構造を認識するレクチン。
【請求項３６】
ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
下記の（１）〜（３）を含むことを特徴とする関節リウマチ診断用キット；
（１）抗MMP-3抗体、
（２）ポリラクトサミン構造を認識するレクチン、
（３）Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖を認識するレクチン。
【請求項３８】
（２）及び（３）のレクチンが同一のレクチンアレイ上に存在する請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの簡便かつ正確な疾患活動性評価方法及び評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（RA）は、人口の1％近く罹患する頻度の高い疾患であって、関節の滑膜増殖に伴い関節破壊を生じる進行性、かつ難治性の炎症性疾患である。全身の関節で滑膜炎が発生し、増殖した滑膜組織からIL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインや各種プロテアーゼが分泌され、次第に関節軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。炎症性サイトカインにより活性化された軟骨細胞や滑膜細胞から分泌された細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases：MMPs）が軟骨破壊に強く関与しており、その中でもMMP-3（matrix metalloproteinases-3）は関節リウマチの滑膜細胞で大量に産生され、軟骨破壊の進行に強く関わっていることが知られている（非特許文献１〜３）。また、それらの炎症性サイトカインは破骨細胞の活性化、骨芽細胞の抑制を介して骨破壊も引き起こし、関節破壊から機能障害を引き起こすことで患者のADL（activities of daily living、日常生活動作）を著しく低下させることが知られる（非特許文献４）。【０００３】
関節リウマチ患者に対しては、副腎皮質ステロイド薬の他、非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）、抗リウマチ薬剤（DMARD）及び生物学的薬剤（抗TNFレセプター拮抗剤、抗IL-1β拮抗剤、抗IL-6受容体拮抗剤）などの薬物治療が行われるが、いずれの薬剤も効果に個人差が大きく、また複数の薬剤を使用しても寛解に至らない症例が存在する。
このような難治性の関節リウマチの治療においては、早期発見及び早期治療により、病勢を少なくとも低疾患活動性以下に抑え込むことで、関節破壊の進展を抑制することが重要であるとされる（非特許文献５）。
しかしながら関節リウマチの臨床所見は個人差が大きく、いまだ特異的な検査もなく、他の関節炎との鑑別も難しいため、早期診断には専門的な知識が必要とされ、その治療効果の判定もまた同様で、継続的な専門医の診察が必要と考えられている（非特許文献６）。
関節リウマチ疾患活動性を定量化して評価するために、従来からいろいろな評価方法が編み出されてきたが、正確に定量化することは難しい。その中で、関節リウマチの疾患活動性を正確に定量的に評価する手法として開発されたDAS（Disease Activity Score）は、圧痛関節数と腫脹関節数を調べ、かつ患者の体調の自己評価も加味し、特別な計算式に当てはめて判定する方法であり、臨床研究における疾患活動性の評価法として主流となっている。
しかし、28関節についての熟練した医師の診察が欠かせない上に、平方根、対数を用いる複雑な計算が必要なため、日常の診療では時間がかかり、また足関節や足指関節の症状が反映されないなどの問題点が指摘されていた（非特許文献７）。「DAS28」で「寛解」と評価されても関節破壊が進行するケースもあるため、臨床的な寛解基準としては別途Booleanの基準やSDAIなどの基準に当てはめる必要があるとされている（非特許文献８）。【０００４】
したがって、簡便で、かつ関節破壊という重大な疾患活動性を見逃すことなく正確に評価できる関節リウマチマーカーの探索やそれを用いた新たな評価法の開発が望まれており、活発な研究開発がなされている。
例えば、ミエリン塩基性タンパク質自己抗体及びミエリン塩基性タンパク質遺伝子多型の検出（特許文献１、２）、新規ポリペプチドのタリンのF1ドメイン又はF3ドメインの検出（特許文献３）、ロイシンリッチα2グリコプロテイン（LRG）の検出（特許文献４）、滑膜細胞で高発現し、滑膜細胞の異常増殖に関連する新規タンパク質シノビオリン(Synoviolin)、その遺伝子及びその自己抗体の検出（特許文献５〜８）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ-GTP）及びその遺伝子の検出（特許文献９）、セレノシステイン含有タンパク質の含量の測定（特許文献１０）、抗アルドラーゼＡ抗体の検出（特許文献１１）、IX型コラーゲンα-1鎖の切断タンパク質断片の切断位置を検出する抗体によるIX型コラーゲン破壊の診断（特許文献１２）、イノシトール1,4,5-三リン酸レセプター（IP3R）による自己抗体の検出（特許文献１３）、RA抗原であるcloneAポリペプチド及びフォリスタチン関連タンパク質（FRP）による慢性関節リウマチ患者特異的抗体の検出（特許文献１４）などの他、RA滑膜細胞特異的に発現が増減するmiRNA（miR124a）の検出（特許文献１５）も提案されている。また、関節液中のテネイシンCの選択的スプライシング位置及び量を検出する抗体により変形性関節症と関節リウマチとを鑑別する方法（特許文献１６）も提案されている。しかし、未だ実用された活動性評価系マーカーは存在しない。【０００５】
これらの関節リウマチマーカーのうち、現在、血清MMP-3値が最も信頼性の高い関節破壊の予後予測因子として注目されており（非特許文献９）、臨床的にも早期関節リウマチの診断や、治療方針の決定などに用いられている。従来から関節リウマチ診断用の炎症マーカーとして用いられてきた血清CRPやESRは、全身の炎症を反映しているのに対し、血清MMP-3は、関節局所の病態を反映しているといわれ、早期RAとの鑑別が難しい変形性関節症、痛風、外傷性関節症などとの鑑別に威力を発揮している。その一方で、同様に早期RAとの鑑別が難しいリウマチ性疾患であるリウマチ性多発筋痛症（PMR）でも高い値を示し、さらに各種膠原病、腎疾患などでも高い値となってしまうなど特異性が高いとはいえない。そのため、関節リウマチの正確な診断のためには、血清CRPなどの炎症マーカーなどと組み合わせて用いざるを得なかった（非特許文献１０）。【０００６】
血清中の糖タンパク質の糖鎖組成の変化に着目した研究も活発である。従来から免疫グロブリンG糖鎖など血清中の糖タンパク質を加熱変性後、糖鎖を切り出して標識、精製し、ODS−シリカカラムによる高速液化クロマトグラフィーを用いた糖鎖分析を行い、健常人試料からの糖鎖組成の変化に基づき関節リウマチ診断を行う方法（特許文献１７）があるが、分析用試料の調製が煩雑で、感度も低い問題があった。近年、血清中に分泌されるN-結合型糖鎖に着目し、MS/MSスペクトルを用いた解析に基づく診断法が提案されており、関節リウマチ患者で有意な発現量の増加が観察される複数のN-結合型糖鎖、特に、(Hex)3(HexNAc)3(Deoxyhexose)1(NeuAc)3＋(Man)3(GlcNAc)2の糖組成を有する糖鎖の存在量及び当該糖鎖のフコース(Deoxyhexose)の結合位置が異なる構造異性体の存在比率を、関節リウマチの診断用マーカーとするものである（特許文献１８）。しかしながら、これらのN-結合型糖鎖のほとんどは健常者においても血中に存在するものであり、特徴的な(Hex)3(HexNAc)3(Deoxyhexose)1(NeuAc)3＋(Man)3(GlcNAc)2の増加はウイルス性肝炎患者の病態悪化においても観察されている（例えば、Nakagawa T et al. Journal of Biological Chemistry 281 (40) 29797-29806 (2006)など多数）ことから、関節リウマチ診断用マーカーとしての臨床的な実用性には問題がある。【０００７】
複数の関節リウマチマーカーを組み合わせ、特別の計算式に当てはめてスコア化することで、正確に関節リウマチ診断及び予後予測を行うための評価法も多数提案されている。
例えば、第１マーカー（SLC16A4）遺伝子発現量情報、及び第２マーカー（SLCO2B1、PTPRM、SHB又はATP9A）遺伝子発現量情報に基づく関節リウマチの存在を評価する方法（特許文献１９）が提案されている。
最近、米国Crescendo社が、血清中のIL-6、EGF、VEGFA、LEP、SAA1、VCAM1、CRP、MMP-1、MMP-3、TNFRSF1A、RETN、及びCHI3L1からなる12個のバイオマーカーを測定し、特別な計算式でスコア化した疾患活動性指標（DAI）により、関節リウマチの診断、モニタリングをする手法（特許文献２０、非特許文献１１）を開発した。当該手法は、「DAS28」との相関性も高く、熟練した医師による詳細な診断を必要とせずに、より正確な関節リウマチの診断を可能とするものであるといえる。しかしながら、12個ものバイオマーカーの測定には多額の資金が必要であり、複雑な計算式による計算も必要となることから、臨床の現場においてはあまり実用的な手法とはいえない。
このような背景から、複雑な計算式もいらず、できるだけ少ないバイオマーカーによる簡便な測定により、正確に関節リウマチの疾患活動性の評価が可能な新規関節リウマチマーカーの提供が強く望まれていた。【０００８】
また、関節リウマチは、特に発症初期では、同じリウマチ性疾患の一種である、リウマチ性多発筋痛症（PMR）と似た症状を呈することがあり（非特許文献１２）、両者の鑑別が難しい症例が散見する。そのため、関節リウマチとリウマチ性多発筋痛症とを正確に鑑別するための手法が求められていた。
一方、リウマチ性疾患のうち、再発性多発軟骨炎（RP）は極めてまれな疾患であり、その症状が特徴的ではあるが、症状が出たり消えたりする活動期と非活動期があることが知られている。また、特異的な血液検査法として抗コラーゲン抗体を用いる方法があるが、陽性率もそれほど高くなく、関節リウマチでも陽性になってしまうという問題もある（非特許文献１３）。そのため、活動期、非活動期ににかかわらず正確に測定できる優れたマーカー及び検査方法の提供が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１４４５１２
【特許文献２】特開２０１４−１７００１２号公報
【特許文献３】特開２０１１−１５７３０１号公報
【特許文献４】特開２０１０−２８６２７９号公報
【特許文献５】特開２００７−３２５５９５号公報
【特許文献６】特開２００７-８２５４５号公報
【特許文献７】特開２００７−７５１０６号公報
【特許文献８】ＷＯ０２／０５２００７
【特許文献９】特開２００３−２４０９９号公報
【特許文献１０】特開２００３−２６５９８号公報
【特許文献１１】特開平１１−９４８３６号公報
【特許文献１２】ＷＯ２００８／１０８７２３
【特許文献１３】ＷＯ２００８／００１９４４
【特許文献１４】ＷＯ９７／１７４４１
【特許文献１５】ＷＯ２０１０／００１６３２
【特許文献１６】特開２００４−１３８４８９号公報
【特許文献１７】特開平８−２２８７９５号公報
【特許文献１８】ＷＯ２００９／０９６４０３
【特許文献１９】特開２０１２−１５２１９８号公報
【特許文献２０】ＷＯ２０１１／０４７３５８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Lab Invest. 1992 Jun; 66(6): 680-690
【非特許文献２】J.Biol.Chem. 1986 Oct 25; 261(30): 14245-14255
【非特許文献３】Inflammation and Regeneration 2004 May; 24(3): 154-160
【非特許文献４】J Immunol Res. 2014; 2014: 263625
【非特許文献５】Ann Rheum Dis. 2010 Apr; 69(4): 631-637
【非特許文献６】Ann Rheum Dis. 2014 Mar; 73(3): 492-509
【非特許文献７】Arthritis Rheum. 2012 May; 64(5): 1316-1322
【非特許文献８】Arthritis Rheum. 2011 Mar; 63(3): 573-586
【非特許文献９】J Rheumatol. 2000 Dec; 27(12): 2761-2768
【非特許文献１０】Ann Rheum Dis. 2002 Feb; 61(2): 161-166
【非特許文献１１】Arthritis Care Res. 2012; 64: 1794-1803
【非特許文献１２】J Autoimmun. 2014; Feb-Mar; 48-49: 76-8.
【非特許文献１３】Arthritis Rheum. 1990 Oct 33(19):1493-1500
【非特許文献１４】Molecular & Cellular Proteomics 2009; 8 (1): 99-108
【非特許文献１５】Biochemistry 1990 Nov 6; 29(44): 10261-10270
【非特許文献１６】Nature Methods 2005; 2: 851-856
【非特許文献１７】Clin Chem 2011 Jan; 57(1): 48-56
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、簡便な方法で、感度良く、かつ、確実に関節リウマチの疾患活動性を評価する方法及びそのためのキットを提供すること、具体的には、新規な関節リウマチマーカーを用いて、医療現場で適用可能な簡便な手法により、適用性、感度、精度の点で臨床上許容される性能で、関節リウマチ疾患活動性を評価する方法、及び関節リウマチ治療効果を判定する方法、関節リウマチ寛解を判定する方法、並びにそのためのキットを提供することにある。【００１２】
また、関節リウマチと類似したリウマチ性疾患であるリウマチ性多発筋痛症（PMR)とを正確に鑑別するための判定方法、及びそのためのキットを提供すること、さらにリウマチ性疾患のうちの再発性多発軟骨炎（RP）の正確な判定方法及びそのためのキットを提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく、臨床現場で適用可能な関節リウマチ疾患活動性の評価方法のための関節リウマチマーカーについて鋭意検討する中で、既知の各種マーカーの中で最も関節局所の病態を反映していると考えられる血清中のMMP-3について着目し、さらに詳細な検討を加えた。すると、血清中のMMP-3は関節リウマチに罹患するとその分泌量が増大する傾向があるが、それと共に、その糖鎖の組成においても大きく変化することが見いだされた。
本発明者らは、以前から種々の疾病に罹患すると、病態に応じて血清中の特定の糖タンパク質の糖鎖組成に変化をもたらす場合があることを経験していたため、関節リウマチの疾患活動性に応じて血清中のMMP-3の糖鎖組成に変化が現れる可能性に思い至った。しかし、血清中のMMP-3タンパク質は、関節リウマチの罹患により増加するといってもたかだか100ng/mlから1000μg/ml程度と極めて微量であり、血中糖タンパク質総量に対する存在比は100〜1,000,000分の1以下と極めて少ない。したがって、MMP-3の上に存在する糖鎖の糖鎖変化を、血清に含まれるすべての糖タンパク質の糖鎖から特異的に検出することは、S/N比が低くなり、感度が低いため正確な測定が難しい。そこで、本発明者らは、抗MMP-3抗体を用いた抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法を利用して、血清中の微量のMMP-3上の糖鎖構造情報を得る方法を構築した。当該手法を市販のリコンビナントMMP-3タンパク質に対して適用すると、100pgから1ng程度のMMP-3タンパク質量であっても最低限の糖鎖構造情報を得ることが可能であった。これは健常者の血中に含まれる微量のMMP-3（40ng/ml程度）においても鋭敏な感度での分析が可能であり、病状に応じた糖鎖変化を検討できることを示すものである。【００１４】
次いで、関節リウマチに罹患した患者等の血清を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法による解析を適用し、患者血清中のMMP-3上の糖鎖に特異的な糖鎖を認識するレクチンを選び出し、関節リウマチマーカーとなる糖鎖の同定を試みた。
その結果、関節リウマチ患者血清中のMMP-3においては、レクチンのACG、Jacalin、ABA、ACAで有意に高いシグナルを観察した。ここで、ACG以外のJacalin、ABA、ACAレクチンは明らかにO-結合型糖鎖（O-glycan）認識レクチンであることから、この結果は、関節リウマチの罹患により血清中のMMP-3上の糖鎖として、O-結合型糖鎖、少なくともJacalin、ABA及びACAレクチンのいずれかが認識するO-結合型糖鎖が存在していることを意味する。従来、血清中の糖タンパク質の糖鎖組成変化としては、主にN-結合型糖鎖が注目されており（特許文献１８など）、MMP-3上の糖鎖に至っては、O-結合型糖鎖の存在すら報告がなかったことから、関節リウマチ特異的な糖鎖エピトープの糖鎖構造としては新規な糖鎖構造であると考えられる。【００１５】
しかし、単に発現量の多い糖鎖というだけでは、関節リウマチの罹患の如何に関わらずMMP-3が本来有している糖鎖が、血清中へのMMP-3分泌量の増大に伴って、シグナルの増大が観察されている可能性もある。そこで、各レクチンシグナル量について、血清中のMMP-3量との相関を見たところ、ACG、ABA、ACAはいずれもMMP-3発現量との相関が高かったが、Jacalinレクチンの場合のみ相関が弱く、特にMMP-3発現量の高い群で顕著にJacalinシグナルの低い例が見られた。MMP-3との相関の高いABA及びACAと、Jacalinとの相関をとると、ABA及びACA間の相関が高いのに対して、いずれのレクチンもJacalinとの間の相関は低かった。
これらの結果は、JacalinとABA、ACAそれぞれの間の糖鎖認識の違いが反映されている可能性がある。本発明者らは、これまでの知見からO-結合型糖鎖のペプチドに結合しているN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）の6位への糖鎖修飾の違いが結果に反映されていると考えた。特にJacalinは、O-結合型糖鎖のGalNAcの6位への修飾を許容できず、それにより反応性を消失することが判っている（非特許文献１４）。この位置への代表的な修飾としてはシアル酸修飾がある。そこで、前述の患者血清のうちいくつかの血清試料を用いて、シアル酸分解酵素であるシアリアーゼ処理を施した。シアリアーゼ処理前後のサンプルを対象にレクチンアレイ解析を行った結果、処理後のサンプルではJacalinのシグナルもABA、ACAと同様にMMP-3の量に相関を示した。
以上の結果から、MMP-3はリウマチを罹患すると血中濃度が上昇するが、その上に存在するO-結合型糖鎖のペプチドに直接結合しているGalNAcへのシアル酸修飾は、患者によって異なることが明らかになった。しかも、関節リウマチの疾患活動性が悪化している患者群において、Jacalinシグナルが弱くなるという顕著な傾向が見られることから、疾患活動性の悪化と当該シアル酸修飾に逆相関がある可能性が高まった。【００１６】
そこで次に、この違いの臨床的有用性を調べることにし、MMP-3上のO-結合型糖鎖の「質的変化」を捉える指標として、ABA／Jacalin値を検討することにした。この値と臨床パラメータ―との相関を統計学的に検証した結果、従来から関節リウマチ疾患活動性を表す数値とされる、DAS28-CRP、DAS28-ESR、CDAI、SDAI、及び医師VASの値と全て有意な相関があり、特に、DAS28とは、p≦0.0001という高い相関を示した。
このことは、レクチンアレイやレクチン―抗体サンドイッチELISA法に代表されるようなレクチンを用いての特定タンパク質上の糖鎖解析手法により、血清中のMMP-3のJacalinへの反応性と共にABA、ACAもしくはACGへの反応性を測定して両者の比を求めるだけで、熟練した医師の診断や複雑な計算式による煩雑な計算をすることなく関節リウマチの疾患活動性を客観的に把握することができ、DAS28と同程度の関節リウマチの診断精度が提供できることを意味する。
また、Jacalinが認識する糖鎖はO-結合型糖鎖であり、ペプチド鎖のSer/Thrに結合しているO-結合型糖鎖のコア構造−１（Core1：Gal(β1,3)GalNAc）ないしTn抗原（GalNAc）である。そして、それらに存在するGalNAcの6位にシアル酸が導入された場合、Jacalinはその修飾により反応性が阻害される。一方、ABA及びACAもJacalinと同じO-結合型糖鎖認識レクチンであるが、当該位置のシアル酸修飾は、それを認識するか、又は許容できる（Kuno A et al Molecular& Cellular Proteomics 8 (1) 99-108 (2009)）。すなわち、上記結果は、関節リウマチに罹患することで、血清中のMMP-3が有するO-結合型糖鎖のコア構造−１でのGalNAcの6位に対するシアル酸修飾が増加していくことを強く示唆する結果である。【００１７】
この点を検証するために、実際の関節リウマチ患者の病変関節から採取した滑液試料を用いてMMP-3量に応じたJacalinシグナルをプロットすると、きれいな逆相関を示すプロファイルを示した。一方、初期の関節リウマチと鑑別の難しい変形関節症患者から得られた滑液試料は、健常者と同様のプロファイルを示した。
この結果は、関節リウマチに罹患すると、その病態の悪化に伴って、滑膜組織内での滑膜細胞で産生されるMMP-3上のJacalin結合性糖鎖エピトープが減少すること、すなわち、同MMP-3上のO-結合型糖鎖のコア構造−１でのGalNAcの6位に対するシアル酸修飾が増加していくことを実証するものである。そして同時に、関節リウマチ罹患患者血清試料中で観察された、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖エピトープの減少という現象が、滑膜組織由来MMP-3上での糖鎖構造変化を正確に反映していることに他ならない。このことは、被験者にとってより侵襲性の低い血清試料で、正確な関節リウマチ診断が可能であることが実証されたことでもある。
以上の知見を得たことで、本発明を完成するに至った。【００１８】
すなわち、本発明により、血清中のMMP-3上のレクチンJacalin結合性O-結合型糖鎖エピトープからなる関節リウマチの逆相関の（負の）糖鎖バイオマーカーが提供されたということができる。具体的には、血液（例えば血清）中のJacalinシグナルの逆数をMMP-3値もしくはABA、ACAもしくはACGシグナル値で補正した値を測定することで、関節リウマチの疾患活動性を評価することができる。または、血液（血清）中のMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖のコア構造−１である「Gal(β1,3)GalNAc」のGalNAcの6位を修飾するシアル酸（NeuNAc）の修飾の程度（シアル酸修飾が増加すると、Jacalinの反応性は低下する）を観察することでも、関節リウマチの疾患活動性が評価できる。
本発明の関節リウマチの疾患活動性評価法は、関節リウマチを、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で検出及び判別することを可能とする。しかも、簡便な手法により、医療現場で適用可能な方法で、関節リウマチの疾患活動性を評価することを可能とする。【００１９】
本発明において、被検試料における関節リウマチ糖鎖マーカーの減少は、標識化したJacalin及びさらに標識化したABA、ACA及びACGの染色により、或いは、標識化したMMP-3もしくは標識抗MMP-3抗体とのサンドイッチ法により行うことができる。該サンドイッチ法において用いられる、抗MMP-3抗体としては市販されている（商品名）を用いることができる。なお、抗MMP-3抗体として市販の抗体を用いない場合は、既知のMMP-3の配列情報に基づいて、自体公知の方法により特異的な抗体を作製することができる。本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。【００２０】
本発明の負の関節リウマチ糖鎖マーカーであるMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖の糖鎖構造を解析するための技術としては、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（FAC）、レクチンマイクロアレイ、MS又はMSn（質量分析やタンデム質量分析法）などによる糖鎖プロファイリングが挙げられる。当該糖鎖構造が決定されれば、その情報に基づいて正の関節リウマチ糖鎖マーカーを選択することができる。レクチンについての情報は、レクチンフロンティアデータベース（LfDB）、或いは産業技術総合研究所・糖鎖医工学研究センターのホームページ等から入手可能である。また、上記糖鎖構造を認識する抗体を用いることもできる。【００２１】
本発明の関節リウマチの疾患活動性評価方法を用いて、関節リウマチを疑う被験者の血液試料（血清又は血漿）を用い、医療現場での簡便かつ精度の高い関節リウマチの疾患活動性の評価が可能となった。また、最も侵襲性の低い試料として血液試料が好ましいが、関節液（滑液）でも同様の結果が得られ、その他、胸水、腹水、リンパ液、唾液、髄液などの被験者由来の体液であっても同様に診断可能であるのは当然である。なお、以下の説明では、典型的な血液試料について主として述べるが、本発明が血液試料のみに限定されるわけではない。【００２２】
本発明は、本発明の関節リウマチの疾患活動性評価方法を実施するために用いられる、レクチン又は抗体のどちらかが標識された、Jacalin並びにABA、ACA、及びACGから選択されたいずれかのレクチンと共に抗MMP-3抗体を装備した関節リウマチの疾患活動性評価用キットを包含する。
当該キットにおいてはJacalin及びABA、ACA、ACGから選択されたいずれかのレクチンを含む複数のレクチンを支持体上に固相化した、レクチンアレイが好ましく用いられるが、各レクチンをビオチン化レクチンとし、ストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することもできる。【００２３】
さらに、関節リウマチと同様にリウマチ性疾患であるリウマチ性多発筋痛症（PMR)及び再発性多発軟骨炎（RP）それぞれの罹患の有無を正確に判定し、関節リウマチとの正確な鑑別を行えるためのマーカーを調べるために、レクチンアレイプロファイリングの結果を見直し、統計学的に有意差があるLEL及びSTLといういずれもポリラクトサミン構造を認識するレクチンを選択し、新たに調製した関節リウマチ（RA）、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び再発性多発軟骨炎（RP）の患者血清を用いて、MMP-3濃縮画分のLEL及びSTLレクチンとの反応性を検討した。
その結果、いずれのレクチンに対しても再発性多発軟骨炎（RP）患者由来試料の反応性が極めて高く、次いでリウマチ性多発筋痛症（PMR）患者由来試料が高く、関節リウマチ（RA）患者及び健常者（HC）由来試料は、ほとんど反応性が無いという有意な結果が得られた。
このことは、MMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖が、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の罹患判定用の優れた糖鎖マーカーとなることを示すものである。
また、LELレクチンシグナルとJacalin又はACGシグナルとの比をとることで、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、再発性多発軟骨炎（RP）患者及び健常人（HC）由来血清と比較して、関節リウマチ（RA）患者由来血清のみが高い数値を示すことを確認した。【００２４】
これらの結果から見て、被検血清試料中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖との反応性を、例えば抗MMP-3抗体とLEL又はSTLレクチンとのサンドイッチアッセイ法などで測定することで、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）を、関節リウマチ（RA）と識別して正確に罹患の有無を診断することができる。
また、被検血清試料中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖との反応性シグナルと、Jacalin、ACGなどMMP-3上の前記O-結合型糖鎖との反応性シグナルとの比を測定することで、類似したリウマチ性疾患と鑑別して関節リウマチ（RA）に罹患していることを、正確に診断することができる。
以上の知見を得たことで、本発明の他の課題も解決することができた。【００２５】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕被検体液試料におけるMMP-3上のO-結合型糖鎖の糖鎖構造の変化を測定する工程を含む、関節リウマチの疾患活動性の判定方法。
本発明は、以下の様に表現することもできる。
〔１’〕被検体液試料におけるMMP-3上のO-結合型糖鎖の糖鎖構造の変化を測定する工程を含む、関節リウマチの疾患活動性の判定のためのデータを提供する方法。
〔２〕前記糖鎖構造の変化の測定が、被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルに、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルの逆数を乗じた、もしくは前記糖鎖構造の変化の測定が、被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルの逆数に、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルを乗じた、下記の糖鎖修飾判別指数Ｘ又はＹを算出することで行われる、前記〔１〕に記載の判定方法；
X＝被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナル／同MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル、
Y＝被検体液試料中のMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル／同MMP-3全量を示す測定シグナル。
〔３〕糖鎖修飾判別指数Xの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が高いと判定する、又は糖鎖修飾判別指数Yの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が低いと判定する、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルが、Jacalinレクチンを用いて測定される値である、前記〔２〕又は〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記MMP-3全量を示す測定シグナルが、体液試料中のMMP-3存在量の測定値、又は体液試料中のMMP-3存在量に応じて増減する測定シグナルである、前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記MMP-3存在量に応じて増減する測定シグナルが、MMP-3のポリペプチド鎖を特異的に認識する抗MMP-3抗体を用いて測定されるシグナル値、又は体液試料中のMMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンとの結合量を示す測定シグナル値である、前記〔５〕に記載の方法。【００２６】
〔７〕関節リウマチの疾患活動性を判定する方法であって下記の（１）〜（５）を含む方法；
（１）被検体液試料におけるMMP-3とJacalinとの結合量を示すシグナルを測定する工程、
（２）同被検体液試料におけるMMP-3存在量、又は同MMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンとの結合量もしくは抗MMP-3抗体との結合量を示すシグナルを測定する工程、
（３）工程（１）で得られた測定値の逆数に、工程（２）で得られた測定値を乗じた糖鎖修飾判別指数Ｘまたは、工程（１）で得られた測定値に、工程（２）で得られた測定値の逆数を乗じた糖鎖修飾判別指数Yを算出する工程、
（４）工程（３）で算出された値（X）または（Y）を基準値（X0）または（Y0）と比較する工程、
（５）工程（４）においてXが基準値X0よりも高い場合（X＞X0）に関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する工程、又は
工程（４）においてYが基準値Y0よりも低い場合（Y＜Y0）を関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する工程。
〔８〕前記基準値X0またはY0が、健常者からの体液試料に対して工程（１）〜（３）を経て算出された値である、前記〔７〕に記載の方法。【００２７】
〔９〕被験者の関節リウマチの疾患活動性の経時的な病状変化を判定する方法であって、下記の（１）〜（５）を含む方法；
（１）被検体液試料におけるMMP-3とJacalinとの結合量を示すシグナルを測定する工程、
（２）同被検体液試料におけるMMP-3存在量、又は同MMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンもしくは抗MMP-3抗体との結合量を示すシグナルを測定する工程、
（３）工程（１）で得られた測定値の逆数に、工程（２）で得られた測定値を乗じた糖鎖修飾判別指数X’、又は工程（１）で得られた測定値に、工程（２）で得られた測定値の逆数を乗じた糖鎖修飾判別指数Y’を算出する工程、
（４）工程（３）で算出された値（X’）又は（Y’）を、同一被験者の被検日以前の体液試料に対して工程（１）〜（３）を経て算出された値（X’0）又は（Y’0）と比較する工程、
（５）工程（４）の比較工程において、X’については被検日以前より高い数値が出た場合（X’＞X’0）に、Y’については被検日以前より低い数値が出た場合（Y’＜Y’0）被験者の関節リウマチの疾患活動性が悪化したと判定し、低い数値が出た場合（X’＜X’0）または高い数値が出た場合（Y’＞Y’0）に、疾患活動性が改善したと判定する工程。
〔１０〕前記被検体液試料が、関節リウマチ治療後の被験者由来の体液試料であり、前記被検日以前の体液試料が、治療前の同一被験者由来の体液試料であって、
工程（４）の比較工程において、X’については治療前より低い場合（X’＜X’0）に、またはY’については治療前より高い場合（Y’＞Y’0）に被験者に施された関節リウマチ治療による治療効果があったと判定し、治療前より高い又は変化がない場合（X’≧X’0）、もしくは治療前より低い又は変化がない場合（Y’≦Y’0）に、治療効果がないと判定する、前記〔９〕に記載の方法。【００２８】
〔１１〕MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、Jacalin非結合性であることを特徴とする、関節リウマチ活動性判定用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
〔１２〕MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されていることを特徴とする、関節リウマチ活動性判定用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
〔１３〕前記〔１１〕又は〔１２〕に記載の糖鎖エピトープからなる関節リウマチ活動性判定用マーカー。
〔１４〕関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用のためのMMP-3であって、ペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖を複数有している、MMP-3。
〔１５〕関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用のためのMMP-3であって、被検体液試料から分取され、かつJacalin非結合性のO-結合型糖鎖を複数有している、MMP-3。【００２９】
〔１６〕MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖の関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用。
〔１７〕関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用のためのMMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖。【００３０】
〔１８〕前記〔１１〕もしくは〔１２〕に記載の糖鎖エピトープ、又は前記〔１４〕もしくは〔１５〕に記載のMMP-3を特異的に認識する物質を含む、被検体液試料に適用可能な関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
〔１９〕前記糖鎖エピトープを特異的に認識する物質が、糖鎖認識抗体、レクチン、糖鎖認識ペプチド及び糖鎖認識アプタマーから選択された物質である、前記〔１８〕に記載の関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
〔２０〕MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質を含む、被検体液試料に適用可能な関節リウマチ疾患活動性判定用試薬。
〔２１〕前記MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質がJacalinである、前記〔２０〕に記載の関節リウマチの疾患活動性判定用試薬。
〔２２〕前記〔１８〕〜〔２１〕のいずれかに記載の関節リウマチ疾患活動性判定用試薬と共に、さらに体液試料中のMMP-3に対して、MMP-3存在量依存的にMMP-3と特異的に結合する物質を含む、関節リウマチ疾患活動性判定用キット。
〔２３〕前記体液試料中のMMP-3に対して、MMP-3存在量依存的にMMP-3と特異的に結合する物質が、ABA、ACA及びACGから選択されるレクチン、又は抗MMP-3抗体である、前記〔２２〕に記載の関節リウマチ疾患活動性判定用キット。
〔２４〕Jacalinの関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用。
〔２５〕関節リウマチの疾患活動性の判定方法における使用のためのJacalin。
〔２６〕関節リウマチの疾患活動性判定用試薬の製造におけるJacalinの使用。【００３１】
〔２７〕被検体液試料中のMMP-3上の糖鎖であって、ポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を有する糖鎖を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用マーカーとなる糖鎖エピトープ。
〔２８〕ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである前記〔２７〕に記載の糖鎖エピトープ。
〔２９〕前記〔２７〕又は〔２８〕に記載の糖鎖エピトープからなるリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用マーカー。
〔３０〕前記〔２７〕もしくは〔２８〕に記載の糖鎖エピトープ、又は当該糖鎖エピトープを含有するMMP-3を特異的に認識する物質を含む、被検血液試料に適用可能なリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用試薬。【００３２】
〔３１〕被検体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断方法。
本発明は以下の様に表現することもできる。
〔３１’〕被検体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断のためのデータを提供する方法。
〔３２〕ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである前記〔３１〕に記載の方法。
また、本発明は、以下の様にも表現できる。
〔３２’〕LELレクチン又はSTLレクチンのリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断方法における使用。
〔３２’’〕リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断方法における使用のためのLELレクチン又はSTLレクチン。
〔３２’’’〕リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の診断用試薬における使用のためのLELレクチン又はSTLレクチン。
〔３３〕前記測定工程が、抗MMP-3抗体と、ポリラクトサミン構造を認識するレクチンとのサンドイッチアッセイ法による測定工程である，前記〔３１〕又は〔３２〕に記載の方法。【００３３】
〔３４〕リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）への罹患の有無を疑う被験者に由来する体液試料に対し、下記の（１）〜（３）の工程により判定することを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）への罹患の判定方法；
（１）被験者由来の体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）健常人及び／又は関節リウマチ患者由来の体液試料に対し、抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（３）（１）で得られた糖鎖の存在量を示す数値が（２）で得られた糖鎖の存在量を示す数値を有意に上回っていた場合、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）に罹患していると判定する工程。
なお、ここで典型的なポリラクトサミン構造を認識するレクチンは、LELレクチン又はSTLレクチンである。
〔３５〕前記（１）及び（２）の測定工程が、抗MMP-3抗体と、LELレクチン又はSTLレクチンとのサンドイッチアッセイ法である前記〔３４〕に記載の方法。【００３４】
〔３６〕被検体液試料に対して少なくとも下記の（１）及び（２）の測定工程が適用されることを特徴とする、関節リウマチ（RA）の診断方法；
（１）抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）抗MMP-3抗体への結合活性と共に、Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖認識レクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程。
なお、ここで典型的なポリラクトサミン構造を認識するレクチンは、LELレクチン又はSTLレクチンである。
そして、本発明は、以下の様にも表現することができる。
〔３６’〕被検体液試料に対して少なくとも下記の（１）及び（２）の測定工程が適用されることを特徴とする、関節リウマチ（RA）診断のためのデータを提供する方法；
（１）抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）抗MMP-3抗体への結合活性と共に、Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖認識レクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程。
〔３７〕前記（１）及び（２）測定工程が、前記抗MMP-3抗体と、ポリラクトサミン構造を認識するレクチン及び前記O-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイを用いたサンドイッチアッセイにより同時に行われることを特徴とする前記〔３６〕に記載の方法。【００３５】
〔３８〕関節リウマチへの罹患の有無を疑う被験者に由来する体液試料に対し、下記の（１）〜（４）の工程により判定することを特徴とする、関節リウマチへの罹患の判定方法；
（１）抗MMP-3抗体への結合活性と共にポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程、
（２）抗MMP-3抗体への結合活性と共に、Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖認識レクチンとの結合活性を示す糖鎖の存在量を測定する工程。
（３）（１）で得られた糖鎖の存在量に対する（２）で得られた糖鎖の存在量の比を算出する工程、
（４）あらかじめ又は同時に、健常人由来体液試料に対して（１）〜（３）の工程を適用し、算出された糖鎖の存在量の比の数値と比較して、（３）で得られた数値が有意に高い場合、被験者が関節リウマチに罹患していると判定する方法。
なお、ここで典型的なポリラクトサミン構造を認識するレクチンは、LELレクチン又はSTLレクチンである。
〔３９〕前記（１）及び（２）の測定工程が、前記抗MMP-3抗体と、前記ポリラクトサミン構造を認識するレクチン及び前記O-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイを用いたサンドイッチアッセイにより同時に行われることを特徴とする前記〔３８〕に記載の方法。【００３６】
〔４０〕下記の（１）及び（２）を含むことを特徴とする、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）診断用キット；
（１）抗MMP-3抗体
（２）ポリラクトサミン構造を認識するレクチン。
〔４１〕ポリラクトサミン構造を認識するレクチンがLELレクチン又はSTLレクチンである前記〔４０〕に記載のキット。
〔４２〕下記の（１）〜（３）を含むことを特徴とする関節リウマチ診断用キット；
（１）抗MMP-3抗体、
（２）ポリラクトサミン構造を認識するレクチン、
（３）Jacalin、ABA、ACA及びACGから選択された少なくとも一種のO-結合型糖鎖を認識するレクチン。
〔４３〕（２）及び（３）のレクチンが同一のレクチンアレイ上に存在する前記〔４２〕に記載のキット。
【発明の効果】
【００３７】
本発明のMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖の減少を観察する関節リウマチ疾患活動性評価方法は、関節リウマチの疾患活動性を客観的に判定することができ、より正確な病状把握を可能とする。そして、血清中のJacalin及びABA、ACA、ACGから選択されたいずれかのレクチンもしくは抗MMP-3抗体との結合性シグナルを測定するだけの簡単な操作で、熟練した医師による詳細な診断及び煩雑な計算式による解析が必要であった「DAS28」と匹敵する正確な判定が可能となったことから、医療現場への恩恵は計り知れない。しかも、本発明において、血液試料（血清試料）又は関節液（滑液）試料など体液試料中で観察されるMMP-3上のO-結合型糖鎖の質的変化が、滑膜組織で産生されるMMP-3上でのO-結合型糖鎖の質的変化を正確に反映していることも実証された。本発明により、医療現場で容易に適用できる、簡便さと精度を備えた臨床適用上優れた関節リウマチ疾患活動性判定用のキットが提供できた。当該キットによって、従来難しかった初期の関節リウマチを、変形性関節症などの他の関節炎症性疾患と鑑別できる可能性も期待される。【００３８】
さらに、本発明により、被検体液試料中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖が、関節リウマチと同様にリウマチ性疾患であるリウマチ性多発筋痛症（PMR）及び再発性多発軟骨炎（RP）それぞれの罹患の有無を正確に判定するための糖鎖マーカーとなることが判明し、抗MMP-3抗体と共に、LEL及び／又はSTLレクチンを用いることで、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び再発性多発軟骨炎（RP）の正確な診断法、及び関節リウマチとの鑑別法を提供した。
さらに、被検体液試料中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖との反応性シグナルと、Jacalin、ACG、ABA、ACA及びACGから選択されたMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンとの反応性シグナルとの比を測定する工程を含む、関節リウマチ（RA）の正確な診断法、及び類似したリウマチ性疾患との鑑別法を提供した。
また、本発明により、抗MMP-3抗体及びLELもしくはSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの組み合わせ、又はさらにJacalin、ACG、ABA、ACA及びACGから選択されたMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンを組み合わせることで、類似したリウマチ性疾患と有意に識別可能な、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、再発性多発軟骨炎（RP）、及び関節リウマチ（RA）用の診断用キットを提供できた。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、溶出画分（MMP-3-IP）のウエスタンブロットを示す。なお、各血清試料は、リコンビナントMMP-3量として換算できるように、あらかじめプレ実験で試料内のMMP-3量が、スタンダードrMMP-3の範囲（50〜400pg）に入るように調整してからゲルにロードした。図中の括弧内はサンプルのアプライ量を示す（未表示：0.1μL（血清0.2μL相当）、×1/4 ： 0.025μL（血清0.05μL相当）、×1/2 ： 0.05μL（血清0.1μL相当）、×2 ： 0.2μL（血清0.4μL相当）、×4 ： 0.4μL（血清0.8μL相当））。
【図２】図２は、WBのバンド強度から見積もられたMMP-3量と通常測定MMP-3量との相関図を示す。
【図３】図３は、患者血清由来MMP-3のレクチンアレイ解析結果を示す。測定した36症例のうち典型的なプロファイルを示した2例についてのグラフである。α2,3シアル酸認識レクチンであるACGとO-結合型糖鎖認識レクチンであるABA及びACAとではシグナルパターンが酷似しているのに対して、同じくO-結合型糖鎖認識レクチンであるJacalinとは相対的強度が相違しているのが見て取れる。各症例のうち、Jacalin値が低いケースを「パターン（１）」とよび、高いケースを「パターン（２）」とよぶ。
【図４】図４は、レクチンアレイ解析より想定されるMMP-3の主要O-結合型糖鎖構造を示す。図中、下線を引いた糖鎖構造が、MMP-3の主要O-結合型糖鎖構造として想定される。なお、□はGalNAcを、○はGalを、◆はNeuNAcを表す。
【図５】図５は、MMP-3の血清中濃度とABA、ACA、ACG及びJacalinそれぞれのシグナル強度との相関図を示す。ABA、ACA、及びACGシグナルは、いずれもMMP-3濃度と相関があるのに対し、JacalinシグナルはMMP-3濃度との相関が認められなかった。
【図６】図６は、ABA、ACA及びJacalinレクチンシグナル間の相関図を示す。ABA、ACA間には強い相関が認められたが、Jacalinはどのレクチンとも相関が認められず、Jacalinのみが、MMP-3量とは異なる傾向を示すことが明確になった。
【図７】図７は、ABA／Jacalin値と関節リウマチ疾患活動性との相関図を示す。MMP-3量と強い相関のあるレクチンの１つであるＡＢＡのシグナルとJacalinシグナルから、糖鎖修飾判別指数のX＝ABA／Jacalin値を横軸とし、関節リウマチ疾患活動性を示すといわれる各種パラメータの値を縦軸にプロットし、両者間の相関を調べた。その結果、患者VAS値以外の全てのパラメータとある程度の相関が認められた。
【図８】図８は、ABA／Jacalin値と疾患活動性カテゴリとの相関図を示す。36症例の血清試料を、DAS28-ESR、SDAI及びCDAIそれぞれの基準に則り4つのカテゴリ（寛解、低疾患活動性、中疾患活動性、及び抗疾患活動性）に分類し、ABA／Jacalin値をプロットし、それぞれの分布を調べたところ、ABA／Jacalin値は、活動性が高くなるに従って数値が上昇する。一方、MMP-3値と疾患活動性との相関は見られなかった。P値はスピアマンの順位相関係数から求められた。
【図９】図９は、血清由来MMP-3の糖鎖プロファイルヘシアリダーゼ消化が与える影響を示す。12症例分の血清試料についてMMP-3をシアリダーゼ消化し、未処理のものも含めレクチンアレイ解析を行ったところ、消化前はJacalinシグナルに有意差があった（図３参照）が、消化後はその差が解消していた。この結果から想定されるシアリダーゼ消化前後の糖鎖構造変化を示す。なお、□はGalNAcを、○はGalを、◆はNeuNAcを表す。
【図１０】図１０は、滑液中のMMP-3のウエスタンブロットを示す。関節リウマチ（RA）及び変形性関節症（OA）に罹患した3症例ずつの患者から採取した滑液中のMMP-3量を測定し、あらかじめ1μg/mLに濃度調整したそれぞれの滑液希釈試料から、抗MMP-3抗体によりIPし、取得した溶出液（MMP-3-IP）を等量ゲルにロードしウエスタンブロットした。どの試料においてもほぼ同程度のMMP-3値が測定された。
【図１１】図１１は、滑液由来MMP-3の比較糖鎖解析を示す。関節リウマチ（RA）及び変形性関節症（OA）に罹患した3症例ずつの患者から採取した滑液中のMMP-3をレクチンアレイにより比較糖鎖解析した。上段が関節リウマチ患者3症例由来滑液試料、下段が変形性関節症患者3症例由来滑液試料の糖鎖プロファイルを示す。本実験では、MMP-3量をあわせて行っているので、シグナルの差はMMP-3の糖鎖の質的な差を意味している。関節リウマチ患者由来滑液試料におけるMMP-3糖鎖プロファイルは、関節リウマチ患者のうち特に疾患活動性の高い患者の血清試料から得られたMMP-3の糖鎖プロファイルと類似しており、滑液試料においてもJacalin値が相対的に低い特徴を有している。このことは、滑膜組織内で産生したMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖エピトープの糖鎖構造が、血清中に分泌されても同じ糖鎖構造のまま保持されていることを意味するから、より患者への負担の少ない血液試料（血清試料）で、滑液試料とほぼ同程度の精度での糖鎖エピトープ解析が可能であることが示された。
【図１２】図１２は、滑液中の4つのレクチンシグナルの比較データを示す。図１１の糖鎖プロファイルのうち、関節リウマチ患者血清試料で有意なシグナル強度が認められたACG、ABA、ACA及びJacalinについて、関節リウマチ（RA）及び変形性関節症（OA）の滑液試料間での数値をグラフ化した。4つのレクチン共に、RA及びOA間で有意差が認められたが、特にJacalinにおいて両者間に有意な差が認められ、RAでは、Jacalin値が低い傾向が見られた。すなわち、血清試料でのMMP-3上の糖鎖エピトープ解析が、滑液中のMMP-3上の糖鎖エピトープの状態を正確に反映していることが実証された。
【図１３】図１３は、他の症例（関節リウマチ：RA、リウマチ性多発筋痛症：PMR、再発性多発軟骨炎：RP）患者群計29名の血清を用い、MMP-3の血清中濃度とABA、ACA、ACG及びJacalinそれぞれのシグナル強度との相関図を示す。（図５）と同様に、ABA、ACA、及びACGシグナルは、いずれもMMP-3濃度と相関があるのに対し、JacalinシグナルはMMP-3濃度との相関が認められなかった。
【図１４】図１４は、RA、PMR、RP及び健常人（HC）ごとに、Jacalin値とMMP-3値とをプロットしたグラフである。RAではMMP-3値とJacalin値との間に相関がみられず、図５の乖離例と同様にMMP-3値が高くなるほどJacalin値が低下する様にも見て取れるが、非RAではそのような傾向は見られず、JacalinとMMP-3値との相関は高かった。
【図１５】図１５は、RA、PMR、RP及びHCごとに、ACG/Jacalin値とMMP-3値とをプロットしたグラフである。関節リウマチ（RA）のみで、RAの活動性の高い群において、ACG/Jacalin値が高いことがわかる。
【図１６】図１６は、RA、PMR、RP及びHCごとのSTL及びLELレクチンシグナルを測定し、Wilcoxson検定及びROC解析を行ったグラフである。リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び再発性多発軟骨炎（RP）では、AUC=1.0でありいずれの疾患でも特異的に鑑別可能であることが示された。
【図１７】図１７は、RA、PMR、RP及びHCごとのJacalin/LEL値及びACG/LEL値を測定し、Wilcoxson検定及びROC解析を行ったグラフである。関節リウマチ（RA）では、Jacalin/LEL値の場合はAUC=0.983、ACG/LEL値の場合はAUC=0.956であり、いずれの値も特異的に鑑別可能であることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
１．本発明における関節リウマチ糖鎖マーカー
本発明において、関節リウマチ診断に逆相関の（負の）糖鎖バイオマーカーとして利用する糖鎖は、血清中で観察可能な滑膜組織由来のMMP-3（matrix metalloproteinases-3）上の糖鎖であり、かつ関節リウマチ疾患活動性の増大に伴って徐々に失われていくとみられるJacalin結合性糖鎖である。
Jacalin結合性糖鎖量を、血清中のMMP-3存在量又はMMP-3上で一定に存在する糖鎖量ないし、MMP-3存在量に相関がある反応性を示すレクチンを代表とする糖鎖認識プローブの結合量で補正した値が、本発明の糖鎖バイオマーカー量ということになる。
【００４１】
（１−１）MMP-3について
MMP-3は関節リウマチの滑膜細胞で大量に産生され、軟骨破壊の進行に強く関わっていることが知られている（非特許文献１〜３）。
従来から関節リウマチ診断用の炎症マーカーとして用いられてきた血清CRPやESRが、全身の炎症を反映しているのに対し、血清中のMMP-3値は、関節局所の病態を反映しているといわれており、現在、最も信頼性の高い関節破壊の予後予測因子として注目されている。また、初期の関節リウマチは、変形性関節症などの他の関節性疾患との鑑別が難しいが、軟骨破壊の程度を反映する血清中のMMP-3値によれば、関節リウマチを初期段階で診断することができる。
しかし、関節リウマチ疾患活動性の指標となる「DAS28」との相関性はさほど高くないことから、単独での関節リウマチの病態の指標となる診断用マーカーとして用いることには無理があり、臨床的には「DAS28」などと組み合わせて早期関節リウマチの診断や、治療方針の決定などに用いられている。
【００４２】
MMP-3は、軟骨細胞や滑膜細胞から分泌型（分子量57,000又は59,000）として分泌され、シグナルペプチドなどが除去されて活性型（分子量45,000、28,000）となり、基底膜や軟骨を構成する軟骨プロテオグリカン、III,IV,V,VII,IX型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びゼラチンを分解するメタロプロテアーゼである（非特許文献２、１５）。
MMP-3は、シグナル配列及びプロ配列が除かれ、MMP-3成熟体となって活性化される。MMP-3は、他のMMPファミリーメンバーと同様に、Znと結合する酵素活性ドメイン（結合ドメイン）と、基質の認識に関与するヘモペキシン様ドメインとが75アミノ酸残基以下のヒンジ領域（リンカードメイン）で繋がれたドメイン構造をとっていると考えられる。MMP-3上の糖鎖構造および付加位置情報は乏しく、N-結合型糖鎖に関しては酵素活性ドメインに存在することが知られている。しかしながらO-結合型糖鎖に関する知見は全くない。他のMMPsの知見をもとに予測すると、関節リウマチに罹患後に、滑膜組織及び血清中で糖鎖構造の変化が観察されたMMP-3上のJacalin、ABA、ACAレクチンと結合するO-結合型糖鎖は、MMP-3のヒンジ領域上に複数本存在すると考えられるが、他の領域にも存在する可能性はある。
【００４３】
（１−２）本発明における関節リウマチ糖鎖マーカー結合性のレクチン
本発明において、負の糖鎖バイオマーカーとして、関節リウマチの疾患活動性を特異的に判定できる関節リウマチマーカーは、「滑膜組織由来のMMP-3上のレクチンJacalin結合性O-結合型糖鎖」である。なお、「レクチン」とは、「糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質」と定義されるものであり、本発明で用いられるJacalin、ABA、ACA及びACGは、いずれもレクチンの一種である。
本発明の糖鎖マーカーを認識するレクチンである「Jacalin」とは、ジャックフルーツ（学名:Artocarpas integliforia）の種から単離されるレクチンであり、Jacalin-related Lectinファミリーに属する。Galに単糖特異性があることが知られている（レクチンフロンティアデータベース（LfDB）より）。
Jacalinは、ジャックフルーツの種子を破砕後、抽出し、精製することもでき、既知の塩基配列を用いて遺伝子組換え技術により大腸菌宿主などから大量生産可能である。本発明の実施例では、Vector社製Uncongugated Jacalin （商品番号L-1150）およびBiotinylated Jacalin（商品番号B-1155）、又は、Jacalinを含むレクチンアレイ（商品名「LecChipTM（GlycoTechnica社製）」）を用いた。
【００４４】
また、関節リウマチ診断のための関節リウマチ疾患活動性解析に用いる他のレクチンのうち、ABAは、マッシュルーム（学名：Agaricus bisporus）から単離されるレクチンであり、Gal及びGlcNAcに特異性を有するレクチンであり、ACAは、ヒユ科のアマランサス（学名:Amaranthus）の種から単離されるレクチンであり、GalNAcに特異性のあるレクチンであり、ACGは、ヤナギマツタケ（学名:Agrocybe cylindracea）から単離されるガレクチンファミリーに属するレクチンである（レクチンフロンティアデータベース（LfDB）より）。
ABA、ACA及びACGは、いずれもその由来植物またはきのこから抽出することもでき、また各塩基配列情報（各データベースの番号）から遺伝子組換え技術を利用して合成することができるが、ABAはWAKO社(組換え体)及びMBL社(天然由来)などから、ACAはVector社(天然由来)などから、また組換えACGはWAKO社などからそれぞれ市販されており、これらABA、ACA及びACGが配置されたレクチンアレイも商品名「LecChipTM」としてGlycoTechnica社から市販されている。本発明の実施例では、「LecChipTM」を用いている。
【００４５】
（１−３）本発明の糖鎖バイオマーカーとなる糖鎖エピトープについて
本発明の関節リウマチ診断用の負の糖鎖バイオマーカーとなる糖鎖エピトープは、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖である。そして、当該O-結合型糖鎖は、MMP-3の酵素活性ドメイン（結合ドメイン）と、ヘモペキシン様ドメインとを繋ぐヒンジ領域（リンカードメイン）上に複数本存在すると考えられ、このO-結合型糖鎖が複数本存在することが、レクチン間での大きな反応性の違いを生じさせると考えられる。
また、Jacalinは、ペプチド鎖のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合しているO-結合型糖鎖のコア構造−１（Core1）である「Gal(β1,3)GalNAc」ないしTn抗原（GalNAc）をリガンドとするが、それらのGalNAcの6位へシアル酸（NeuNAc）の修飾が導入されることで認識がキャンセルされることが知られている。すなわち、Jacalinシグナル量の減少は、上述の糖鎖骨格の「GalNAｃ」の6位へのシアル酸の修飾率が増加した状態に対応すると考えられる。なお、JacalinはGalNAcへのα2,6シアル酸修飾により結合性が低下する代表例であり、同様の特徴を有するレクチンおよび糖鎖認識抗体、ないし糖鎖認識ペプチド、糖鎖認識アプタマーであれば代用することが可能である。
【００４６】
さらに、Core1の「Gal」及び「GalNAc」いずれを修飾するシアル酸も認識ないし許容できるABA及びACAのシグナルはMMP-3値の挙動と一致していることを考え合わせると、健常人のMMP-3のリンカードメイン上のO-結合型糖鎖は、発明者によるレクチンアレイ解析データに従うと、Core1を母骨格とし、「Gal」及び「GalNAc」のGalのみないしいずれもシアル酸（NeuNAc）による修飾がなされており、関節リウマチに罹患すると、関節リウマチ疾患活動性の高まりに応じて徐々にシアル酸（NeuNAc）の導入率が増え、6位への修飾がない「GalNAc」の量が失われていくと考えられる。
MMP-3に対するシアリダーゼによるシアル酸切断実験の結果（図９）によれば、MMP-3が有する主要なO-結合型糖鎖の構造はコア１構造（Gal(β1,3)GalNAc）であり、Galへのα2,3シアル酸の修飾がほぼなされていると解される。そして、GalNAcへのα2,6シアル酸修飾の程度は、健常人では低い頻度であるが、関節リウマチの疾患活動性が高まるにつれその修飾程度が増大していくと結論付けられた。
このことから、コア１構造中のGalNAcへのα2,6シアル酸修飾程度が関節リウマチ疾患活動性のマーカーとなること、及びJacalin由来シグナルは負の活動性マーカーとなることと共に、ABA及びACA由来シグナルと共に、ACG由来シグナルもまた、血清中のMMP-3量と同様の挙動を示すことが実証された。
【００４７】
すなわち、本発明の関節リウマチ活動性の判定用マーカーとなる糖鎖エピトープは、以下の様に表現できる。
「MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、Jacalin非結合性であることを特徴とする、糖鎖エピトープ。」又は
「MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されていることを特徴とする、糖鎖エピトープ。」
そして、このことは、Jacalinに限らず、MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質であれば、関節リウマチ疾患活動性判定用試薬として用いることができることを示している。
具体的には、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcに対するα2,6シアル酸の修飾を認識、結合するレクチン、糖鎖認識抗体、糖鎖認識ペプチド、糖鎖認識アプタマーなどを用いることができる。反対に、MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質、すなわちSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない糖鎖認識抗体、結合性レクチン、糖鎖認識ペプチド及び糖鎖認識アプタマーから選択された物質もまた、関節リウマチ疾患活動性判定用試薬として用いることができる。後者の典型例が、本実施例で用いたJacalinである。
【００４８】
２．本発明の関節リウマチの疾患活動性の判定方法
（２−１）本発明の関節リウマチの疾患活動性を判定するためのマーカー
本発明は、関節リウマチの疾患活動性を判定するために、被検血液試料におけるMMP-3上のO-結合型糖鎖の糖鎖構造の変化を測定することを特徴としている。
そのための関節リウマチ活動性の判定用マーカーとなる正の糖鎖エピトープは、以下の様に表現できる。
「MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、Jacalin非結合性であることを特徴とする、糖鎖エピトープ。」又は
「MMP-3上のO-結合型糖鎖であって、MMP-3のペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されていることを特徴とする、糖鎖エピトープ。」
【００４９】
そして、当該糖鎖エピトープを検出及び定量することにより、関節リウマチへの罹患の有無及び関節リウマチの疾患活動性の程度を判定することができる。
当該糖鎖エピトープを特異的に認識する物質、すなわちSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖を特異的に認識する糖鎖認識抗体、結合性レクチン、糖鎖認識ペプチド及び糖鎖認識アプタマーから選択された物質は、当該糖鎖エピトープを検出及び定量するための関節リウマチ疾患活動性判定用試薬となる。
反対に、MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質、すなわちSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない糖鎖認識抗体、結合性レクチン、糖鎖認識ペプチド及び糖鎖認識アプタマーから選択された物質もまた、関節リウマチ疾患活動性判定用試薬として用いることができる。後者の典型例が、本実施例で用いたJacalinである。以下の解析方法においては、主としてJacalinを用いて説明するが、Jacalinに限られるわけではない。
【００５０】
また、被検血液試料など被検体液試料から分取されるMMP-3であって、かつJacalin非結合性のO-結合型糖鎖を複数有している、MMP-3自身、すなわちペプチド鎖中のSer/Thrに結合しているGalNAcがα2,6シアル酸で修飾されているO-結合型糖鎖を複数有しているMMP-3自身が関節リウマチ活動性の判定用マーカーとなる。
そのようなMMP-3を検出又は定量するためには、上記糖鎖エピトープと同様の解析方法が適用される。
【００５１】
そして、被検血液試料など被検体液試料における関節リウマチの疾患活動性を判定するために、糖鎖構造の変化を測定するにあたり、被検血液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルに、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルの逆数を乗じた、もしくは前記糖鎖構造の変化の測定が、被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナルの逆数に、MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナルを乗じた、下記の糖鎖修飾判別指数X又はYを算出することで行うことができる。
なお、糖鎖修飾判別指数（X又はY）は、「類似した特異性を有する複数のレクチン群があり、特にある母骨格糖鎖構造（例えば本発明ではコア1構造）に対する修飾の組成（例えばシアル酸とかフコースなど）、様式（どの糖鎖にどの位置に）、割合が異なる場合に、各レクチンの結合の強さが異なるとする。この結合の強さを定量可能なシグナルとして変換できる場合、それらを組み合わせ数式化することで、母骨格に対する修飾の状態を比較評価できるようにするための指数。」と定義できる。
X＝被検体液試料中のMMP-3全量を示す測定シグナル／同MMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル、
Y＝被検体液試料中のMMP-3上のJacalin結合性O-結合型糖鎖全量を示す測定シグナル／同MMP-3全量を示す測定シグナル。
その際、糖鎖修飾判別指数Ｘの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が高いと判定することができ、反対に、糖鎖修飾判別指数Yの値が高いほど、関節リウマチの疾患活動性が低いと判定することができる。
【００５２】
被験者が、関節リウマチに罹患しているか否か、または特定の時期の関節リウマチの疾患活動性を判定するためには、健常者における基準値（X0）または（Y0）を設定し、被験者由来の体液試料で測定、算出されたＸ及びＹを比較する工程を設けることが好ましい。
Xが基準値X0よりも高い場合（X＞X0）に関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する工程、又はYが基準値Y0よりも低い場合（Y＜Y0）を関節リウマチの疾患活動性が高い、又は関節リウマチに罹患していると判定する。
【００５３】
被験者を経時的に観察して、被験者の関節リウマチの疾患活動性の経時的な病状変化を判定することもできる。
その場合は、被験者由来の体液試料で測定、算出されたX’及びY’を同一被験者の被検日以前の体液試料に対して算出された値（X’0）又は（Y’0）と比較する工程を設けることが好ましい。X’については被検日以前より高い数値が出た場合（X’＞X’0）に、Y’については被検日以前より低い数値が出た場合（Y’＜Y’0）被験者の関節リウマチの疾患活動性が悪化したと判定し、低い数値が出た場合（X’＜X’0）または高い数値が出た場合（Y’＞Y’0）に、疾患活動性が改善したと判定する。
関節リウマチ治療後の被験者由来の体液試料を治療前の体液試料と比較することで、治療効果を判定できる。
【００５４】
ここで、被検体液試料中の「MMP-3全量を示す測定シグナル」としては、体液試料中のMMP-3存在量の測定値、又は体液試料中のMMP-3存在量に応じて増減する測定シグナルを用いることができる。
体液試料中のMMP-3存在量の測定値とは、被検体液試料中に含まれるMMP-3存在量の絶対値の測定値であり、当業者にとって、試料中のMMP-3存在量の測定方法は既知である。具体的には、MMP-3に対するモノクローナル抗体をラテックス粒子にコートして用いた、ラテックス凝集法などを用いることができる。
また、被検体液試料中の「MMP-3存在量に応じて増減する測定シグナル」としては、抗MMP-3抗体（MMP-3のポリペプチド鎖を特異的に認識する抗体）を用いて測定されるシグナル値の他、MMP-3値と同じ挙動を示すABA、ACAもしくはACG由来シグナル量、すなわち、体液試料中のMMP-3と、ABA、ACA又はACGとの結合量を示す測定シグナル値が好ましく用いられる。なお、ABA、ACA、ACGに限らず、MMP-3量と相関の認められるレクチンであれば代用することが可能である。
本発明の最も好ましいX及びYは、以下の通りである。
X＝被検体液試料中のABA由来測定シグナル／同Jacalin由来測定シグナル、
Y＝被検体液試料中のJacalin由来測定シグナル／同ABA由来測定シグナル。
【００５５】
（２−２）レクチンアレイまたはサンドイッチELISA法による検出と定量
本発明においては、被検試料をレクチンアレイまたはサンドイッチELISA法を用いてJacalinシグナル値を測定し、その逆数を同時に測定したABA、ACAもしくはACGシグナル値で補正することにより関節リウマチの罹患の有無又は関節リウマチ疾患活動性を判定することができる。ABA、ACAもしくはACGシグナル値は、MMP-3値で代替することができる。
レクチンアレイはMMP-3を蛍光標識しレクチンアレイへアプライし、結合反応後、シグナルを検出する直接法、または未標識のMMP-3をレクチンアレイへアプライ後、抗体オーバーレイ法により結合シグナルを検出する間接法のどちらでも解析することができる。
ここで、被検試料としては、被験者より採取された血液から得られる血清や血漿のみならず、関節液（滑液）、胸水、腹水、滑膜液、リンパ液など他の体液試料を対象とすることができ、被験者は特に限定されず、関節リウマチであるか否か、又は関節リウマチ疾患活動性の判定が必要な者に対して広く適用できる。
なお、被験者の血液（血清、血漿など）を被検試料とすることが被験者の負担も少なく検査時間の短縮化も図れるため最も好ましい。
本発明の検出方法により被検試料における関節リウマチ糖鎖マーカーの減少を検出し、関節リウマチの疾患活動性を的確に評価することができる。また、関節リウマチ治療の効果を的確に判定し、寛解程度を決定することができる。
【００５６】
（２−３）レクチンアレイ解析法
＜MMP-3含有画分の濃縮＞
本発明の逆相関の（負の）関節リウマチ糖鎖マーカーとなるJacalin結合性糖鎖は、MMP-3上の糖鎖であるため、被験者の血液試料など被検試料が微量の場合などは、抗MMP-3抗体を用いたアフィニティカラムなどによるMMP-3濃縮画分を用いることで、より正確な関節リウマチ疾患活動性の判定が可能となる。
また、WO2011/007797に記載のストレプトアビジンコート磁気ビーズを用いる精製方法に倣い、抗MMP-3抗体をビオチン化して、ストレプトアビジンコート磁気ビーズにコンジュゲーションした磁気ビーズを用いることでも効率よく濃縮することができる。本発明の実施例では、当該磁気ビーズを用いてMMP-3濃縮画分を得ている。
【００５７】
＜標識化＞
標識物質の例としては、蛍光物質（例、FITC、ローダミン、Cy-3、Cy-5）、放射性物質（例、14C、3H）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、などが挙げられる。また、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用することもできる。検出剤をビオチン標識し、（ストレプト）アビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用して検出することもできる。
標識物質として酵素を用いる場合は、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはo-フェニレンジアミン（OPD）、テトラメチルベンジジン（TMB）などが使用され、アルカリホスファターゼを使用する場合には、p-ニトロフェニルホスフェート（PNPP）などが使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００５８】
＜レクチンアレイの調製＞
レクチンアレイとしては、Jacalinレクチンと共に、ABA、ACA及びACGのいずれかのレクチンが含まれてさえいればどのようなレクチンアレイを用いても良い。例えば、本発明者らの開発した特異性の異なる45種の植物レクチンが同一基板上に固定化されているレクチンアレイ（非特許文献１６）やLecChipTM Ver.1.0（グライコテクニカ社製）を用いることができるが、適宜公知の方法に従って調製することができる。
レクチンアレイには、Jacalinレクチンと共に、ABA、ACA及びACGのいずれかのレクチンのみでも良いが、ABA、ACA及びACGレクチンすべてを含むことが好ましく、さらに複数の他のレクチンを支持体上に固相化することが好ましい。その際の他のレクチンとしてはMAHレクチン、MALレクチン、WGAレクチンなどが挙げられる。
Jacalin及び他のレクチンを直接支持体上に固相化してもよい（直接法）が、Jacalinなどをビオチン化Jacalinなどとし、ストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することにより（間接法）、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。
レクチンアレイの支持体としては、エバネッセント波が透過可能な透明な物質であればよく、スライドガラス、ポリカーボネートなどの合成樹脂などが一般に用いられる。
【００５９】
＜レクチンアレイへの添加及び洗浄＞
Cy-3などで標識した被検試料を緩衝液で希釈しまたは希釈せずにレクチンアレイ反応槽に添加して相互作用させた後、非特異的結合をしている夾雑物をレクチンアレイ用緩衝液（市販されている）で洗浄する。なお、エバネッセント波で検出する場合は洗浄工程を省くこともできる。
【００６０】
＜検出方法＞
一般に、レクチンの糖鎖への結合は抗原抗体反応の結合と比較して一般的に弱く、抗原抗体反応の結合定数が106〜109M-1程度であるのに対して、レクチンと糖鎖間の結合定数は104〜107M-1とされているため、レクチンの糖鎖結合シグナルの検出には、通常エバネッセント波励起型蛍光検出法を用いて行なうことが好ましく、本発明においてもエバネッセント波励起型蛍光検出法が好ましく用いられる。エバネッセント波励起型蛍光検出法とは、スライドガラスの端面（側面）に全反射が起こるような条件で光を入射させると、ガラス（固相）と水（液相）などの屈折率の異なる二相間の場合、界面から数百nm程度の近接場にだけエバネッセント波と呼ばれるきわめて射程距離の短い光（近接場光と呼ばれる）が滲み出ることを利用する方法である。この方法により、蛍光物質の励起光を端面から入射して近接場に存在する蛍光物質のみを励起し、蛍光観察を行なう。エバネッセント波励起型蛍光検出法は、非特許文献１６などに記載されている。この検出には、GlycoStationTMReader 1200（モリテックス：グライコテクニカ社）等を使用することができる。
【００６１】
しかし、本発明で検出対象となるJacalinなどレクチンとMMP-3上のO-結合型糖鎖エピトープとの結合性は、実施例での解析結果によると、非常に高い結合定数が見積られる結果を示している。これはMMP-3のヒンジ領域に存在していると思われるO-結合型糖鎖が複数本存在していることによるクラスター効果であると考えられる。基板上に固定されている高密度のレクチンと糖鎖との相互作用は、クラスター効果により結合定数で2ケタ以上の効果があるといわれている。また、このクラスター効果は、特に解離速度を著しく遅くする効果があるとされているため、洗浄工程を必要する検出系でも検出が可能であると考えられる。したがって、洗浄工程を含む間接法である抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法や、後述するように、サンドイッチELISA法などの抗原抗体反応の検出系で用いられるような一般的検出法を適用することができる。
【００６２】
＜評価方法＞
レクチンアレイによる評価は、体液、例えば血清由来MMP-3中にほぼ一定割合で存在する糖鎖を認識する、ないしMMP-3量と結合シグナル値に相関があるレクチンであるABAレクチンなどを内部標準レクチンとして選択して同一レクチンアレイ基板上に固定し、Jacalinシグナルなど目的レクチンシグナルを相対値化してのちに、あるカットオフ値を超えるないし超えないという判断で行う。このようにあるレクチンの値を基準にして目的レクチンのシグナルを相対値化し判別に用いる方法は本発明者らが以前発表した論文（非特許文献１７）に従って行うことができる。カットオフ値の設定は、標本化された複数の関節リウマチ患者の体液、例えば血清を用いて事前に行うことができる。すなわち、あらかじめ複数の関節リウマチ患者由来の血清及び健常人血清を対象としたレクチンアレイ解析から得られた上述の相対値をもとに、後述する糖鎖修飾判別指数（X又はY）を算出する。より好ましくはあらかじめ関節リウマチの疾患活動性の程度に対応させた糖鎖修飾判別指数を複数作成し、被検血液試料由来の糖鎖修飾判別指数と比較して、被験者の関節リウマチの疾患活動性の程度を判定し、被験者が関節リウマチに罹患しているか否か、また、関節リウマチ疾患活動性がどの程度であるかを判定する。
【００６３】
（２−４）サンドイッチ法
サンドイッチ法では、抗MMP-3抗体及びJacalinなどのレクチンのいずれかを固相に結合させる。以下、固相化した結合物質を「捕捉剤」と呼び、他方を「検出剤」と呼ぶ。捕捉剤を固相化する支持体（固相）としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、マイクロアレイ基板（例、マイクロアレイ用スライドガラス）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、Sepharose（商標））、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、PVDF膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）などが例示される。その中でもプレート、ビーズおよびメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。捕捉剤は、十分な結合強度が得られる限りいずれの方法で固相化してもよく、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着などによって固相化する。或いは、予め捕捉剤を固相化した支持体を用いてもよい。
【００６４】
検出剤は、間接的または直接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質の例としては、蛍光物質（例、FITC、ローダミン、Cy-3、Cy-5）、放射性物質（例、13C、3H）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、などが挙げられる。また、検出剤をビオチン標識し、（ストレプト）アビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用してもよい。
【００６５】
標識物質として酵素を用いる場合、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはo-フェニレンジアミン（OPD）、テトラメチルベンジジン（TMB）などが使用され、アルカリホスファターゼを使用する場合には、p-ニトロフェニルホスフェート（PNPP）などが使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００６６】
捕捉剤は、血液試料中のMMP-3と、又はMMP-3上のJacalin、ABA、ACA及びACGレクチン結合性糖鎖と複合体を形成する。この複合体に検出剤を適用して生じたシグナルを測定することにより、血清中のMMP-3上のJacalin、ABA、ACA及びACGレクチン結合性糖鎖を検出・定量する。シグナルの測定は、使用した標識物質に応じて適切な測定装置を用いて行なえばよい。
【００６７】
本発明のJacalin結合性糖鎖エピトープを測定するためのサンドイッチ法としては、具体的にはJacalinを含む複数のレクチンを支持体上に固相化し被検試料を添加し、反応することで、反応場上に当該レクチンへ結合するMMP-3を提示し、それに対して標識した該MMP-3結合物質を作用させることで検出することができる。使用する複数のレクチンは、同一支持体上に整列（アレイ化）することもできるし、それぞれ異なる支持体上に固定して、並列測定することもできる。その際、Jacalinなどのレクチンを直接支持体上に固相化して行う方法（直接法）に代えて、Jacalinなどレクチンをそれぞれビオチン化し、該ビオチン化レクチンをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製する方法（間接法）により、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。
他の方法として、MMP-3結合物質を支持体上に固相化し、被検試料を添加し反応することで、MMP-3を結合物質上にMMP-3をオーバーレイした形態で準備したのちに、標識化したJacalinレクチン及び他の標識レクチンにより当該レクチンへ反応性を示すMMP-3を検出することができる。
【００６８】
本発明のJacalin結合性糖鎖含量の測定には、ELISA、イムノクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA法）、化学発光イムノアッセイ、エバネッセント波分析法などを利用することができる。これらの方法は当業者に公知であり、いずれの方法を選択してもよい。また、これらの方法は通常の手順に従って実施すればよく、実際の反応条件の設定等は、当業者が通常行い得る技術範囲内のものである。これらのうち、MMP-3結合物質として抗MMP-3抗体を用いたレクチン・抗体サンドイッチELISAを使用することが特に好ましい。
被検血液試料など被検体液試料中のJacalin結合性糖鎖を有するMMP-3は、捕捉剤として用いた支持体上のJacalinなどのレクチン又は抗MMP-3抗体と複合体を形成する。この複合体に検出剤の標識化レクチン又は標識化抗MMP-3抗体を適用して生じたシグナルを測定することにより、被検試料中のJacalin結合性糖鎖を検出・定量する。シグナルの測定は、使用した標識物質に応じて適切な測定装置を用いて行なえばよい。
【００６９】
被験者の血液試料を被検試料とする場合に、例えば以下の手順でサンドイッチELISA解析を行うことができる。
標識化を含め、被検試料の調製方法は、（２−２）のレクチンアレイ解析法と同様である。
次いで、例えばストレプトアビジンでコートしたELISAプレートの各ウェルにビオチン化したJacalinを結合させ、被検血液試料またはそのMMP-3画分を添加し、試料中のMMP-3と相互作用させる。次いで、緩衝液で洗浄するか、または洗浄せずに未反応のJacalinをブロッキング剤でブロッキングして、標識MMP-3抗体を反応させる。
また、サンドイッチELISAにおいて、Jacalin以外のABA、ACA、又はACGレクチンなど他のレクチンを併用することが好ましいのは、レクチンアレイ解析の場合と同様である。
さらに、レクチンコートELISAプレートに代えて、抗MMP-3抗体を支持体上に固相化した抗体コートELISAプレートを用いることができる。その場合、被検血液試料を添加し抗原抗体反応した後に、標識化したJacalin及び他の標識化レクチン（ABA、ACA、又はACG）を反応させ、それぞれのシグナル値を測定することができる。
【００７０】
＜関節リウマチ活動性マーカーの検出及び判別法＞
ELISA法は周知の手法であり、通常の手順に従って実施すればよく、標識ごとに最適な測定装置が適用できる。
本法による関節リウマチマーカーの定量的な検出は、血清などから調製し、タンパク質量が公知であるJacalin結合性MMP-3を標準物質として用い、検量線を作成し、標準物質の相当量として換算することができる。標準物質にはJacalinへの結合性が認められるのであればリコンビナントMMP-3でもよい。たとえば実施例１にある通り、マウスミエローマ細胞（N0細胞）で大量発現し精製した、市販リコンビナントMMP-3（R＆D社製、製品番号513-MP-010）を標準物質として用いることができる。また標準物質を用いずに評価する方法としては、上述のレクチンアレイ法に倣い、病変に応じてシグナルが変動しないレクチンを内部標準レクチンとして用い、Jacalinシグナルを相対値化してのちに、あるカットオフ値を超えるないし超えないという判断で行うことができる。なお、内部標準レクチンの選択、およびカットオフ値の設定は、多数の疾患活動性が判明している関節リウマチ患者の血液試料を用いて事前に行うことができる。すなわち、あらかじめ多数の疾患活動性の異なる患者から採取された血液試料を対象としたレクチンアレイ解析から統計学的に事前に内部標準を設定することができる。またあらかじめ多数の疾患活動性の異なる患者から採取された血液試料を対象としたELISA測定により得られた上述の相対値をもとに判別式を作成する。より好ましくは関節リウマチの進行もしくは疾患活動性悪化の程度に対応させた判別式を複数作成し、被検血液試料の関節リウマチの進行もしくは疾患活動性悪化の程度を判定し、被験者が関節リウマチに罹患しているか否か、また、関節リウマチ疾患活動性のステージがどの程度であるかを判定する。
【００７１】
例えば、内部標準レクチンとしてABAを用いた場合には、40μLずつの血液試料をMMP-3−ABA、MMP-3−Jacalinでサンドイッチして測定した数値を用いてMMP-3−ABA／MMP-3−Jacalin比が2未満だと寛解、2以上3未満だと低疾患活動性、3以上8未満だと中疾患活動性、8以上だと高疾患活動性と判定する。
なお、ELISA測定をマイクロアレイやSPRなどの異なる相互作用解析原理に基づく測定法に置き換えることもできる。その場合、これらは周知の手法であるため、通常の手順に従って実施すればよく、手法ごとに最適な測定装置が適用できる。
【００７２】
３．関節リウマチの疾患活動性の判定用キット
MMP-3上のSer/Thrに結合しているαGalNAcを含む糖鎖を認識し、かつ当該αGalNAcにα2,6シアル酸が結合した糖鎖を認識しない物質、好ましくはJacalinを関節リウマチの疾患活動性判定用試薬の有効成分として用いることができる。
さらに血液試料中のMMP-3に対して、MMP-3存在量依存的にMMP-3と特異的に結合する物質、具体的にはABA、ACA及びACGから選択されるレクチン、又は抗MMP-3抗体を組み合わせて、関節リウマチ疾患活動性判定用キットとして用いることができる。
本発明の活動性判定用キットは、例えば下記の組み合わせが可能である。
（１）（ａ）Jacalinを必須のレクチンとして含み、さらに好ましくはABA、ACA、又はACGの少なくとも１つを含む複数のレクチンが、直接又はビオチン−アビジンを介して間接的に結合された支持体；及び
（ｂ）被検血液試料中のMMP-3を標識可能な標識物質。
（２）（ａ）Jacalinを必須のレクチンとして含み、さらに好ましくは内部標準レクチンとなるABA、ACA、又はACGの少なくとも１つを含む複数のレクチンが、直接又はビオチン−アビジンを介して間接的に結合された支持体；及び
（ｂ）標識化された抗MMP-3抗体。
（３）（ａ）抗MMP-3抗体が、直接又はビオチン−アビジンを介して間接的に結合された支持体；及び
（ｂ）標識化されたJacalinを含み、さらに好ましくはABA、ACA、又はACGの少なくとも１つを含む複数の標識化されたレクチン。
その際、支持体は１つで複数のレクチンを固定してもよいが、各レクチンごとに異なる支持体に固定して用いても良い。
【００７３】
本発明の診断用試薬又は診断用キットは、関節リウマチに罹患しているか否かを知りたい被験者、特に変形性関節症などと似た症状を示す初期の関節リウマチに罹患しているか否かを判定するために用いられる。その際、あらかじめ健常者及び／又は関節リウマチ患者に適用して得られた測定値を基準値とすることができる。
また、関節リウマチ患者における、経時的な疾患活動性の病態変化を正確に把握するために用いられる。
そして、関節リウマチ治療を受けている患者における当該治療の効果を客観的に判定するために用いられる。特に、寛解したかどうか、すなわち治療を続ける必要がなくなったかどうかを判定するために用いる。
【００７４】
４．類似したリウマチ性疾患の正確な診断方法及びそのための診断用キット
本発明により、被検体液試料（血清試料など）中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチン反応性糖鎖が、リウマチ性疾患のうちでも特に再発性多発軟骨炎（RP）患者体液試料との反応性が有意差をもって極めて高く、次いでリウマチ性多発筋痛症（PMR）患者体液試料との反応性が、関節リウマチ（RA）患者及び健常人（HC）体液試料と際だった有意性をもって高いことが示された。
すなわち、抗MMP-3抗体と共に、LEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンとを組み合わせたキットは、再発性多発軟骨炎（RP）診断用キット及び／又はリウマチ性多発筋痛症（PMR）診断用キットとなる。
ここで、LELレクチンは、Lycipersicon esculentum由来のGlcNAc反応性レクチンとして、STLレクチンは、Solanum tuberosum由来のGlcNAc反応性レクチンとして従来から知られており、両レクチンは、ポリラクトサミン構造のGlcNAcを認識すると考えられる。なお、LELレクチンについての他の情報は、本発明者らの文献（Methods in Enzymology, vol.479, 2010, p.185-204）に、またSTLレクチンについての他の情報は、同（Methods in Enzymology, vol.478, 2010, p.181-195）に詳細に記載されている。
また、他のポリラクトサミン構造を認識するレクチンとしては、Galectin-3などが知られている。
【００７５】
具体的な被検体液試料（血清試料など）中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖などの測定方法としては、前記（２−３）に記載のレクチンアレイ法を適用し、被検血清試料など被検体液試料を、MMP-3濃縮画分をLEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンを含むレクチンアレイで測定する方法が適用できる。
また、前記（２−４）に記載のサンドイッチ法を適用し、被検血清試料など被検体液試料を、抗MMP-3抗体と、LEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンとを用いたサンドイッチ法、例えば標識抗MMP-3抗体と、LEL及び／又はSTLレクチンを含むレクチンアレイとの組み合わせによるサンドイッチELISA法などである。
当該測定法を用いることで、再発性多発軟骨炎（RP）及び／又はリウマチ性多発筋痛症（PMR）を、特異的に診断することができる。
【００７６】
上記の抗MMP-3抗体と共に、LEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンとを組み合わせたキットに、さらにJacalin、ACGなどMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンを組み合わせることで、類似したリウマチ性疾患それぞれと有意に識別可能な、リウマチ性多発筋痛症（PMR）、再発性多発軟骨炎（RP）、及び関節リウマチ（RA）用の診断用キットを提供できる。ここで、「MMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチン」というとき、前記（１−２）で記載された関節リウマチ（RA）血清中のMMP-3濃縮画分での結合性が確認されたJacalin、ABA、ACA及びACGを指す。なお、他には例えばシアリルコア1構造を見るMAHレクチンなども用いることができる。
被検体液試料（血清試料など）中のMMP-3上のLEL又はSTLレクチン反応性糖鎖との反応性シグナルと、Jacalin、ACGなどMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンとの反応性シグナルとの比を算出する工程を含む、関節リウマチ（RA）の正確な診断法、及び類似したリウマチ性疾患との鑑別法となる。
具体的には、前記（２−３）に記載のレクチンアレイ法を適用し、被検血清試料など被検体液試料を、MMP-3濃縮画分をLEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンと共に、Jacalin、ACGなどのMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイで測定する方法が適用できる。
また、前記（２−４）に記載のサンドイッチ法を適用し、被検血清試料など被検体液試料を、抗MMP-3抗体と、LEL及び／又はSTLレクチンなどのポリラクトサミン構造を認識するレクチンとさらにJacalin、ACGなどMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンを用いたサンドイッチ法、例えば標識抗MMP-3抗体と、LEL及び／又はSTLレクチンと共にJacalin、ACGなどのMMP-3上のO-結合型糖鎖認識レクチンを含むレクチンアレイとの組み合わせによるサンドイッチELISA法などである。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
また、各実施例中で使用しているすべての体液（血清及び滑液）は、採取先の臨床機関でインフォームド・コンセント受けた患者に由来するものであり、かつ発明者らの所属する機関それぞれで倫理審査を受け、承認されたものである。【００７８】
（実施例１）被検血清試料中のMMP-3存在量の測定
本実施例では、関節リウマチ患者32症例およびその他の関節炎4症例の血清を収集し、そのうち30症例を対象に行った。
血清中MMP-3の簡易分画・濃縮（エンリッチ）は、本発明者らが以前開発した手法（非特許文献１４）をベースに、これまで発明者が分析してきたタンパク質に比べ、血中濃度が非常に低いMMP-3タンパク質のために条件を最適化して以下の通り行われた。
（１−１）プレクリア工程：
血清中に含まれるタンパク質のうち、抗原抗体反応場に利用する磁気ビーズへ非特異的に結合するものを事前に除去する作業（プレクリア）を行った。すなわち、1.5 mL容チューブ取り分けた血清 40μLに対し、予め反応バッファー（1％Triton X-100入りTris-buffered saline (TBSTx)）で3回洗浄したストレプトアビジン固定化磁気ビーズ（SAビーズ）溶液(多摩川精機社製、10mg/mL）10μLと反応バッファー36μLを加えて溶液調整し、4℃で30分間振盪反応した。反応後、磁石により磁気ビーズを1カ所にトラップし、得られた上清を別の1.5mL容チューブに回収した。【００７９】
（１−２）免疫沈降工程：
回収した上清に、ビオチン化MMP-3抗体（R&D社製）（50μg/mL）を4μL加え、4℃で一晩振盪しながら抗原抗体反応を行った。反応後、反応バッファーで洗浄済のSAビーズ溶液（10mg/mL）10μLを加えて、4℃で30分間振盪反応した。抗原−抗体複合体と結合した磁気ビーズを磁石で回収し、得られた上清を除去後、ビーズを反応バッファー200μLで3回洗浄した。ビーズを磁石で回収する際、ビーズとビーズの間に挟まって非特異的に回収されている夾雑タンパク質を完全に除去するための洗浄は、磁気ビーズへ反応バッファーを加えてから、超音波分散装置（多摩川精機社製）や多目的スピンダウンミキサーであるバグクラッシャー（タイテック社製）等を用いて、ビーズを完全に分散することで達成された。【００８０】
（１−３）溶出工程：
ビーズに抗体を介し間接的にトラップされたMMP-3を溶出するために、洗浄したビーズに0.2％SDSを含むTBS 10μLを加え、95℃で5分加熱し、抗体を不活性化することでMMP-3を遊離した。磁気ビーズを磁石で1カ所にトラップし、得られた上清を回収した。【００８１】
（１−４）ビオチン化抗体除去工程：
得られた上清には、MMP-3だけでなく不活性化した抗MMP-3抗体も共存している。この抗体はビオチン化されているため、SAビーズにより容易にトラップできる。そこで、1.5mL容チューブに溶出液と、予め反応バッファーで3回洗浄済のSAビーズ（20mg/mL）10μLを加え、4℃で30分間ビオチン−アビジン反応を行い、反応後速やかに磁石にて磁気ビーズを1カ所にトラップした。得られた上清を回収してMMP-3-IP産物（20μL）とした。【００８２】
（１−５）結果：
各サンプルの回収量を見積もるため、上述のビオチン化抗体を用いてウエスタンブロット（WB）を行った。事前に市販組換え型ヒトMMP-3（rMMP-3, R&D Systems社製）を用い、WBによる当該タンパク質の検出下限を算出したところ、50pgであった。そこで、rMMP-3の50,100, 200, 400pgを標準物質としてサンプルと一緒にゲルにロードし、WBすることで、各サンプル中MMP-3量の半定量的解析を行った。なお、サンプルはそれぞれ0.1μLゲルへロードした。
その結果、いくつかのサンプルでrMMP-3を400pgロードした時のバンド強度を超えたため、それぞれ適宜希釈して、再度WBした。その結果を図１に記す。【００８３】
各サンプルのバンドシグナルは標準物質のシグナル範囲に収まっていたため、標準物質のシグナルから検量線を作成し、各サンプルの血中濃度をrMMP-3換算として算出した。それぞれの換算濃度を図２に示す。
エンリッチの妥当性を検証するため、臨床現場で測定されたMMP-3値との比較をしたところ、強い相関を示した（図２右）。これはエンリッチにより得られたMMP-3量は、血中に存在しているときの濃度に依存していることを示唆している。
なお、今回算出した数値は臨床現場で通常測定している値と比較すると、大きなずれがあるが、これは本実施例で使用した標準物質と、臨床現場で用いられている測定系に使用される標準物質は異なるものであり、それにより抗体との反応性が異なるためと考えられた。
さらに、今回は市販健常者血清（コージンバイオ社製）に由来するMMP-3についても同様の実験を行っているが、文献的に報じられている健常者のMMP-3濃度範囲で回収ができていた。【００８４】
（実施例２）抗体オーバーレイ・レクチンアレイによる糖鎖プロファイリング
本実施例では、実施例１でMMP-3の簡易分画・濃縮（エンリッチ）がなされた被検血清試料MMP-3-IP中のMMP-3に対して、レクチンアレイによる比較糖鎖プロファイリングを適用し、リウマチに伴うMMP-3上の糖鎖変化を調べた。
実施例（１−４）で得られた各被検MMP-3-IP 試料を2μLとり、レクチンアレイ反応バッファーである1％TritonX-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)により、60μLに調整した。この溶液をレクチンマイクロアレイ（LecChipTM(グライコテクニカ社製)）の各反応槽（ガラス１枚当たり７つの反応槽が形成されている）へ添加し、20℃で10時間以上相互作用反応した。これにより試料中のMMP-3上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている45種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。その後、未反応の基盤上レクチンへ検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズシグナルが生じることを避けるため、ヒト血清由来IgG溶液（シグマ社製）を2μL（20μg相当）加え、30分反応させた。このブロッキング反応を行った後に、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、PBSTx 溶液 58μLに 再度ヒト血清由来IgG溶液を2μL加え、若干攪拌した後に、検出用の抗MMP-3抗体（ビオチン化物）を100ng相当加え、20℃で1時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄し、次いでCy-3標識ストレプトアビジン（GEヘルスケア社製）200ng相当が含有しているPBSTx溶液を加え、さらに30分、20℃で反応した。反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、アレイスキャナーGlycoStationTM（グライコテクニカ社製）によりアレイスキャンを行った。【００８５】
その結果、MMP-3の糖鎖構造情報を取得することができた。当該MMP-3の糖鎖構造情報はこれまで報告はない。取得シグナルは血中MMP-3濃度に応じて増減した。図３には測定した30症例のデータの典型例を示す。全症例において有意なシグナル強度を示すレクチンは、ACG、ABA、Jacalin、ACAの４種のみであった。なお、ACGはα2,3シアル酸を認識するレクチンであり、ABA、Jacalin、ACAは詳細な特異性は異なるものの基本的にはコア１構造やTn構造を骨格とするO-結合型糖鎖を認識するレクチンである。
以上より、MMP-3上の糖鎖構造は、図４に示す通り、コア１構造ないしTn構造を骨格とするO-結合型糖鎖であり、シアル酸の修飾の程度が異なる構造群であることが想定される。【００８６】
次に各レクチンシグナルと血中MMP-3量との相関を検証した。図５に示す通り、ACG、ABA及びACAは比較的強い相関を示したが、Jacalinは相関を示さなかった。このJacalinの乖離はO-結合型糖鎖認識レクチン間での相関を調べた場合も観察された（図６）。この3つのO-結合型糖鎖認識レクチンはそれぞれ特異性に違いがあり、特にコア１構造のGalNAcにα2,6シアル酸（NeuNAc）の修飾が導入される場合にその許容性が異なり、Jacalinの反応性が最も低下することが、他の糖タンパク質の解析で明らかになっている（非特許文献１４）。具体的には、Jacalinは、O-結合型糖鎖のコア１構造のGalNAcにα2,6シアル酸（NeuNAc）の修飾が導入されることが許容されないが、ABAとACAの場合は許容されるか、又は無関係である。【００８７】
以上より、関節リウマチ罹患に伴い血中濃度が上昇するMMP-3上のO-結合型糖鎖は、健常者血清中にも存在するMMP-3のそれに比べ、コア１構造へのシアル酸、特にα2,6シアル酸修飾に富んだものになっていることが示唆された。
この現象はMMP-3量とは相関しないことは興味深いことであり、以後臨床パラメータとの相関性について検証することにした。【００８８】
（実施例３）取得データと臨床パラメータとの比較解析
（実施例２）で得られたMMP-3にユニークなレクチンシグナルと臨床パラメータとの相関性を調べた。なお、検証にあたり、タンパク質上のO-結合型糖鎖の質的変化を反映させた糖鎖修飾判別指数Ｘのうち、X＝ABA／Jacalinの場合の値を用いた。検証したパラメータのうち関節リウマチの活動性を示すパラメータとの比較を図７に示す。患者VAS以外のパラメータ（DAS28-CRP, DAS28-ESR, CDAI, SDAI, 医師VAS）とある程度の相関を示した。これまでMMP-3量は疾患の活動性とは相関が弱いと報じられていたため、そのタンパク質上の糖鎖の質的変化を反映したABA／Jacalin値が、それに反し活動性と相関があることは非常に興味深い。【００８９】
次に、各患者を、関節リウマチの活動性をあらわす3つの評価法（DAS28-ESR, SDAI, CDAI）で4段階（寛解、低疾患活動性、中等度疾患活動性、および高疾患活動性）にカテゴライズし、活動性とABA／Jacalin値との相関をグラフ化した（図８）。
その結果、糖鎖修飾判別指数であるABA／Jacalin値は疾患活動性指標とよく相関していた（スピアマンの順位相関係数より求めたP値はP＜0.001）。一方、MMP-3量についてもグラフ化したが、いずれの評価法に対しても相関を示さなかった。【００９０】
以上の結果から、MMP-3上のO-結合型糖鎖の質的変化を糖鎖修飾判別指数として定量的に計測することが関節リウマチの活動性を評価するのに適用できる可能性が初めて見いだされた。
このような糖鎖の質的変化がシアル酸の修飾の様式の相違や割合の変化によるものであるかを検証するために、シアリダーゼ消化前後のMMP-3についてレクチンアレイで比較解析することにした。【００９１】
（実施例４）シアリダーゼ消化の糖鎖プロファイルへの影響
（実施例３）の結果から、血清中MMP-3の各レクチンに対する反応性の変化は、MMP-3上のO-結合型糖鎖へのシアル酸修飾の様式の相違、割合の変化によって生じている可能性が高いと考えられる。そこで、本実施例では、（実施例１）及び（実施例２）の解析で利用した被検血清試料のうちの糖鎖修飾判別指数（ABA/Jacalin値）低値群及び高値群それぞれ６例ずつ合計１２症例を選び、各血清試料についてMMP-3上のシアル酸残基を切断除去した場合に、糖鎖プロファイルへ与える影響を調べた。
（４−１）血清中MMP-3のエンリッチ
（実施例１）の方法にしたがい、前記選定した12の症例の血清試料について再度血清中のMMP-3をエンリッチし、12種類の被検MMP-3-IP試料を得た。糖鎖修飾判別指数（ABA/Jacalin値）低値群のサンプル名はRA07,20,31,33,34,35、及び高値群のサンプル名はRA10,13,14,17,21,24である。【００９２】
（４−２）シアリダーゼ消化
得られたMMP-3IP溶液 20μLのうち2μLをシアリダーゼ消化に使用した。溶液2μLに専用 5×reaction buffer B を2μLとSialidase A（いずれも Prozyme 社製）を0.5μL（final: 0.125 U/mL）加え、超純水により10μLに調製した。37℃にて1時間反応し、MMP-3からシアル酸（α2,3シアル酸とα2,6シアル酸の両方）を切断除去した。コントロールとして、上述組成のうちシアリダーゼを含まない反応溶液も調製し、併せて反応した。反応溶液はすべて反応終了後にしばらく氷上静置した。これにより得られたものをシアリダーゼ消化産物とした。【００９３】
（４−３）抗体オーバーレイ・レクチンアレイによる糖鎖プロファイリング
抗体オーバーレイ・レクチンアレイは実施例１と同様の方法により行った。なお、シアリダーゼ反応溶液は、予めPBSTxで総容量60μLになるように調製したのちにレクチンアレイ解析に使用した。
その結果を図９に示す。シアル酸を切断したのちにO-結合型糖鎖上のシアル酸を認識するレクチン（ACG、MAH）でシグナルがほぼ0になった。それに伴い、シアル酸修飾を一切許容しないコア1構造認識レクチンであるPNAのシグナルがすべてのサンプルで出現した。一方で、Tn構造を認識するレクチンであるHPA, VVA, やGALIはシアル酸消化後もシグナルが得られなかった。
以上により、MMP-3が有する主要なO-結合型糖鎖の構造はコア１構造（Gal(β1,3)GalNAc）であり、Galへのα2,3シアル酸の修飾がほぼなされていると解される。そして、GalNAcへのα2,6シアル酸修飾の程度は、低い頻度でなされていて、その割合が病態に伴い変動すると結論付けられた。このことから、コア１構造中のGalNAcへのα2,6シアル酸修飾程度が関節リウマチ疾患活動性のマーカーとなり、及びJacalin由来シグナルは負の活動性マーカーとなることと共に、ABA及びACA由来シグナルと共に、ACG由来シグナルもまた、血清中のMMP-3量と同様の挙動を示すことが実証された。つまり、糖鎖修飾判別指数X又はYの算出に用いる「被検血清試料中のMMP-3全量を示す測定シグナル」としては、MMP-3存在量の測定値と共に、抗MMP-3抗体を用いて測定されるシグナル値、血清試料中のMMP-3とABA、ACA及びACGから選ばれるいずれかのレクチンとの結合量を示す測定シグナル値を用いることができる。
また、シアル酸消化後のABA規格化糖鎖プロファイルはほぼ一致したことから、サンプルごとに生じていた反応性の違いはシアル酸の修飾の様式、度合い（図９中の右に示した想定される反応前後の構造変化を参照）に起因していることが示唆された。【００９４】
（実施例５）滑液中MMP-3の糖鎖プロファイリング
病変部位となる滑膜組織から生産されたMMP-3は滑液中に放出され、骨破壊に関与することになる。その一部が血中に移動し、血清中のMMP-3量が滑膜組織での生産量に相関があることを前提として、従来から血清中のMMP-3量がマーカーとして利用されてきたと考えられる。しかしながら、（実施例２）においてレクチンアレイ解析により関節リウマチ活動性との相関が見出された血清中のMMP-3上のO-結合型糖鎖でのシアル酸の修飾の様式、度合いの変化が、滑膜組織で生産されたMMP-3上での糖鎖構造の変化を正確に反映したものであるかどうかは推測の域を超えない。
そこで、本実施例では、滑液中に放出されたMMP-3がどのような糖鎖プロファイルをしているかを調べることで、血中MMP-3の糖鎖変化の関節リウマチ活動性との関連の妥当性を検証することにした。【００９５】
（５−１）滑液中MMP-3のエンリッチ
実施例１の方法にしたがい、関節リウマチ（RA）３症例、変形性関節症（OA）3症例について滑液からMMP-3をエンリッチした。なお、RAとOAで滑液中のMMP-3量が大きく異なるため、予め滑液中のMMP-3量を測定し、同一MMP-3量を利用してエンリッチを行った。その結果、図１０に示す通り、取得MMP-3量はほぼ同じになった。【００９６】
（５−２）抗体オーバーレイ・レクチンアレイによる糖鎖プロファイリング
抗体オーバーレイ・レクチンアレイは実施例２と同様の方法により行った。その結果を図１１に示す。
大変興味深いことにRAとOAのMMP-3は糖鎖プロファイルが大きく異なっていた。そしてその相違は血清中MMP-3と同様に4つのレクチンで説明ができた。RA患者由来のMMP-3は相対的にJacalinシグナルが弱く、ACGは強い傾向にあった（図１２）。このJacalinシグナルの傾向は関節リウマチ患者血清で得られた疾患活動性に伴うJacalinシグナルの減弱に一致するものである。
以上により、滑膜細胞は活性化に伴いMMP-3の放出量を増加させるが、活性化による細胞の糖鎖合成マシナリに変化が生じ、その結果としてタンパク質上のO-結合型糖鎖のシアル酸修飾、特にα2,6シアル酸の修飾に変化が生じ、高度になることが示唆された。また、実施例２及び３の被検血清試料において得られた知見は、滑膜組織から産生されたMMP-3での糖鎖構造の変化を正確に反映したものであることが実証された。【００９７】
（実施例６）MMP-3陽性となる疾患の鑑別能
（６−１）他のリウマチ性疾患患者由来血清を用いたMMP-3上のJacalinなどのO-結合型糖鎖との反応性比較
本実施例では、関節リウマチ患者（RA）14例、リウマチ性多発筋痛症患者（PMR）8例、再発性多発軟骨炎患者（RP）7例、健常人（HC）5例の血清を対象に、実施例１及び２の検証を行った。RA、PMR、RPはどれも血清MMP-3が高値になりやすい疾患である。臨床診断をする上でRAとPMRは鑑別に苦慮することも多く、RPは臨床症状が比較的特徴的であるものの、感度の高い検査方法が存在しない。具体的には、上記の各対象疾患の患者血清から、実施例１と同様の方法でMMP-3を濃縮し、実施例２と同様の方法で各疾患由来のMMP-3の糖鎖プロファイリングを行った。
その結果、各疾患における糖鎖構造情報を取得することができた。得られた全患者のデータから、まずACG、ABA、ACA、及びJacalin値を比較検討したところ、図１３に示す通り、実施例１（１−１）で対象としたリウマチ患者血清での結果（図５）と同様に、ACG、ABA、ACAではMMP-3値と相関し、Jacalinは相関しないという結果が得られた。【００９８】
JacalinのMMP-3値との乖離がどの疾患で生じているかを見るために、疾患ごとに分けたグラフを作成した（図１４）。その結果、興味深いことに、RAと非RAでは傾向が異なり、RAではMMP-3値が高くなるほどJacalin値との乖離傾向が高まり、むしろ低下している様に見えるのに対し、非RAではそのような傾向は見られず、JacalinとMMP-3値との相関は高かった。
そこで全てのリウマチ疾患でMMP-3値と高い相関を示す典型的なレクチンであるACGとJacalinとの比をとり、ACG/Jacalin値を算出してグラフ化した（図１５）ところ、この値が高値を示すのはRAの活動性の高い群だけであった。
ところで、実施例４で実証したように、Jacalin値の低下はMMP-3含有O-結合型糖鎖のGalNAcにおけるα2,6シアル酸修飾を反映していると解される。そして、このようなGalNAcのα2,6シアル酸修飾を反映したJacalin値の低下現象は、リウマチ疾患のうちでもRAに特有であり、かつRAの活動性の高い症例に特徴的なものであることが本実施例においてもあらためて実証できた。【００９９】
（６−２）ポリラクトサミン構造を認識するレクチンとの反応性比較
（６−１）のように、JacalinのシグナルはRAの活動性を示すものとしてあらためて証明できたが、RAと非RAの鑑別にも用いられることが示唆されるので、他のレクチンのシグナルの差も再度比較検討をした（図１６）。
他のレクチンとしては、（６−１）のレクチンアレイプロファイリングの結果、統計学的に有意差があるLEL （Lycipersicon esculentum由来）及びSTL （Solanum tuberosum由来）というポリラクトサミン構造を認識するレクチンが選択された。両レクチンは、ポリラクトサミン構造のGlcNAcを認識すると考えられる。
LEL及びSTLレクチン反応性糖鎖のシグナルを測定し、Steel-Dwass検定により判定したところ、HC、RAと比較してPMR、RPでは有意に高値であるという結果を得、疾患ごとに大きな違いがあることが判明した（図１６上段）。
同様のSteel-Dwass検定を血清MMP-3濃度で各疾患について行ったが、このような差は血清MMP-3濃度のみでは見ることができない（図１６下段左）。
これらのシグナルを使用し、HC・RAとPMR、HC・RA・PMRとRPを鑑別できるかを、縦軸に真の陽性率、横軸に擬陽性率をとりプロットしたROC曲線（受信者動作特性曲線）により解析した。3群の中で最もRAとの鑑別の難しいPMRについてのROC解析を行ったところ、ROC=1.0でかつAUC（ROC曲線下面積）=1.0という非常に高い鑑別能力を持つことが判明した（図１６下段右）。STL、LELの両シグナルとも、PMRとRA/HCもしくは、RPとPMR/RA/HCをAUC=1.0という非常に高い鑑別能力を持つことが判明した（図１６下段右と同じグラフ）。
すなわち、被検血清試料中でのMMP-3上のLEL及び／又はSTLレクチン反応性糖鎖が、リウマチ性多発筋痛症（PMR）及び再発性多発軟骨炎（RP）それぞれの優れた糖鎖マーカーとなることを示す結果となった。
このことは、被検血清試料のMMP-3濃縮画分におけるLELもしくはSTLレクチンとの反応性を測定するか、又は抗MMP-3抗体とLELもしくはSTLレクチンとのサンドイッチアッセイ法での測定値により、リウマチ性多発筋痛症（PMR）の罹患の有無、及び／又は再発性多発軟骨炎（RP）の罹患の有無を判定できることを意味する。さらに、従来鑑別が難しかった関節リウマチとリウマチ性多発筋痛症とを正確に鑑別できることを示す結果でもある。
鑑別が難しい症例があるリウマチ性多発筋痛症（PMR）と関節リウマチ（RA）とを正確に識別できたことと共に、正確な診断方法が確立していなかった再発性多発軟骨炎（RP）の正確な診断方法が提供できたことは画期的である。【０１００】
MMP-3の糖鎖プロファイリングデータを利用した上記実験データを詳細に解析し、MMP-3が高値となりやすい疾患の中でRAのみを特異的に検出する方法を探索した。
RAではLEL又はSTLシグナルといったポリラクトサミンを認識するレクチンのシグナルがPMR、RPと比較して低いため、PMR及びRPとは鑑別できるが、HCでもLEL又はSTLシグナルは低いため、HCとの鑑別はできない。そこで、RAについては、HCとの違いを際立たせるために、MMP-3上のACG、JacalinなどのO-結合型糖鎖のシグナルとの比をとることで、RAのみで高値になる指標（例えばJacalin/LELやACG/LEL）を作成することができた（図１７上段）。これらのシグナル値を元に疾患の中でRAのみを検出する能力をROC解析で検討したところ、AOC=0.95〜0.98という高い鑑別能力がある事が示された（図１７下段）。
すなわち、類似したリウマチ性疾患のうちで、関節リウマチであることを正確に鑑別するためには、被検血清試料のMMP-3反応性画分におけるLELもしくはSTLレクチンと、Jacalin、 ACGなどO-結合型糖鎖との反応性の比を測定すれば良いことが示されたことになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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