(57)【要約】  高い親水性と優れた耐圧性能を両立した固相担体を提供すること。  式（１）で表される２〜４価の構造を有する樹脂を含むことを特徴とする固相担体。2015119255.tif 000066〔式（１）中、  Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、  Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（２）で表される２価の基等を示し、  ｎは２〜４の整数を示す。〕2015119255.tif 000067〔式（２）中、  Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、  Ｙ1は、チオ基、スルフィニル基、オキシ基またはイミノ基を示す。〕
2015119255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される２〜４価の構造を有する樹脂を含むことを特徴とする
固相担体。
【化１】
2015119255.tif 000053
〔式（１）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表される２価の基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
【化２】
2015119255.tif 000054
〔式（２）中、
Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｙ1は、チオ基、スルフィニル基、オキシ基またはイミノ基を示す。〕
【化３】
2015119255.tif 000055
〔式（３）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【化４】
2015119255.tif 000056
〔式（４）中、
Ｒ3は、カルボニル基または＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し（＊は、式（４）中のＹ1と結合する位置を示す）、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【化５】
2015119255.tif 000057
【請求項２】
ｎが２である請求項１に記載の固相担体。
【請求項３】
Ｘ1が、式（２）、（３）または（４）で表される２価の基であり、Ｙ1が、チオ基またはスルフィニル基である請求項１または２に記載の固相担体。
【請求項４】
更に、チオ基またはスルフィニル基と、ヒドロキシ基とを有する１価の基を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項５】
前記チオ基またはスルフィニル基と、ヒドロキシ基とを有する１価の基が、式（６−１）または（６−２）で表される、請求項４に記載の固相担体。
【化６】
2015119255.tif 000058
〔式（６−１）中、
Ｒ4は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｒ5は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｙ3は、チオ基またはスルフィニル基を示す。〕
【化７】
2015119255.tif 000059
〔式（６−２）中、
Ｒ5およびＹ3は前記と同義である。〕
【請求項６】
粒子である、請求項１〜５いずれか１項に記載の固相担体。
【請求項７】
多孔質粒子である、請求項６に記載の固相担体。
【請求項８】
更に、リガンドを固定可能な官能基を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固相担体を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の固相担体にリガンドを固定したアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１１】
前記リガンドがタンパク質である請求項１０に記載のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の充填剤がカラム容器に充填されているクロマトグラフィーカラム。
【請求項１３】
標的物質を含む組成物を用意する工程と、請求項１２に記載のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする標的物質の精製方法。
【請求項１４】
下記式（８）で表される１価の基、下記式（９）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基およびイソシアネート基から選ばれる１種以上の官能基を有する固相と、下記式（１０）で表される架橋剤とを接触させる工程を含むことを特徴とする固相担体の製造方法。
【化８】
2015119255.tif 000060
〔式（８）中、
Ｒ7は炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
【化９】
2015119255.tif 000061
【化１０】
2015119255.tif 000062
〔式（１０）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｙ2は、チオ基、オキシ基またはイミノ基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
【請求項１５】
固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、
前記固相担体を構成する高分子の末端の一部または全部が、下記式（２１）で表される架橋構造で互いに架橋されている、
アフィニティ精製用担体。
【化１１】
2015119255.tif 000063
〔式（２１）中、
Ｒ２１は、ｎ２価の有機基を示し、
Ｘ２１は、それぞれ独立して、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を示し、
ｎ２は、２以上の整数を示す。〕
【請求項１６】
前記固相担体を構成する高分子が、スチレン系モノマーに由来する構造単位、ビニルケトン系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリロニトリル系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位および（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位から選ばれる１種または２種以上を有する高分子である、請求項１５に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項１７】
前記架橋構造が、固相担体の重合前或いは重合中に下記式（３３）で表される多官能チオール化合物を添加して導入されるものである、請求項１５または１６に記載のアフィニティ精製用担体。
【化１２】
2015119255.tif 000064
〔式（３３）中、Ｒ２１およびｎ２は、前記と同義である。〕
【請求項１８】
前記固相担体が、固相担体の重合後に下記式（２２）で表される架橋剤を添加して導入される架橋構造を更に有する、請求項１７に記載のアフィニティ精製用担体。
【化１３】
2015119255.tif 000065
〔式（２２）中、
Ｒ２２は、炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｘ２２およびＸ２３は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕
【請求項１９】
Ｘ２２およびＸ２３が、チオール基である、請求項１８に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項２０】
式（２２）で表される架橋剤を添加して導入された架橋構造中のチオ基を酸化してなる、請求項１９に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項２１】
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、リガンドである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項２２】
前記リガンドが、タンパク質またはペプチドである、請求項２１に記載のアフィニティ精製用担体。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のアフィニティ精製用担体を担体とする、
クロマトグラフィーカラム用充填剤。
【請求項２４】
請求項２３に記載の充填剤がカラム容器に充填されている、
クロマトグラフィーカラム。
【請求項２５】
標的物質を含む組成物を用意する工程と、
請求項２４に記載のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、
標的物質の精製方法。
【請求項２６】
標的物質が、標的タンパク質である、請求項２５に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体、該固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、充填剤、クロマトグラフィーカラム及び精製方法に関する。特に、抗体などのタンパク質の精製に有用な、固相担体、該固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬等に代表されるバイオ医薬品の分野では、タンパク質等の標的物質の発現技術が著しく進展し、それに伴いクロマトグラフィー等による精製工程での生産性の向上が求められている。生産性を向上させる方法として、宿主細胞由来タンパク質、デオキシリボ核酸のような、医薬品原料に混在する不純物の濃度を１回の精製で可能な限り低減させ、精製回数や工程を少なくすることが挙げられ、これを実現できるクロマトグラフィーカラム用充填剤の需要が高まっている。【０００３】
そして、精製工程における不純物除去効率を向上させるためには、担体の防汚性を改善させ、不純物と充填剤との疎水性相互作用による非特異吸着を抑制し、充填剤に対する不純物の付着を抑える必要があり、斯様な付着を抑える有効な手段として、クロマトグラフィーカラム用充填剤の担体である固相担体の親水化が知られている（特許文献１）。
そのため、親水性を高めた固相担体として、水溶性ポリマーで細孔内部が固定された特定の固相担体（特許文献２）や、アクリルアミドモノマー等の親水性モノマーを逆相懸濁重合して形成した固相担体、親水性モノマーを保護基等で疎水化処理した後に重合し、脱保護して得た固相担体が開発されている（特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１０５２９号
【特許文献２】特許第５２５０９８５号
【特許文献３】特表２００３−５１１６５９号公報
【特許文献４】特表２００９−５０３２０３号公報
【特許文献５】特開２００６−１１１７１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来採用されていた技術で固相担体の親水性を高めた場合や担体の防汚性を改善させた場合には、機械強度（耐圧性能）が低下するという問題があった。固相担体の耐圧性能が不十分な場合には、スケールの大きなカラムを用いて精製を行う際に圧密化が起こり、通液しなくなる可能性がある。また、カラム圧力損失が大きくなり、高線速下で使用することが困難となるため、操作に要する時間が長時間化する。【０００６】
本発明が解決しようとする第１の課題は、高い親水性と優れた耐圧性能を両立した固相担体を提供することにある。
また、本発明が解決しようとする第２の課題は、優れた防汚性と優れた耐圧性能を両立したアフィニティ精製用担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは固相担体に架橋構造を導入することに着目し、斯かる架橋構造について鋭意検討した結果、特定の架橋構造を、固相担体に導入することによって、高い親水性と優れた耐圧性能が両立されることを見出し、本発明を完成した。
また、本発明者らは鋭意検討した結果、固相担体を構成する高分子の末端の一部または全部を、特定の架橋構造で互いに架橋させることによって、優れた防汚性と優れた耐圧性能を両立したアフィニティ精製用担体が得られることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、前記第１の課題を解決するために、以下の＜１−１＞〜＜１−５＞を提供するものである。【０００９】
＜１−１＞式（１）で表される２〜４価の構造を有する樹脂を含むことを特徴とする固相担体（以下、第１の固相担体とも称する）。【００１０】
【化１】
2015119255.tif 000003
【００１１】
〔式（１）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表される２価の基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕【００１２】
【化２】
2015119255.tif 000004
【００１３】
〔式（２）中、
Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｙ1は、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ（＝Ｏ））、オキシ基（＞Ｏ）またはイミノ基（＞ＮＨ）を示す。〕【００１４】
【化３】
2015119255.tif 000005
【００１５】
〔式（３）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕【００１６】
【化４】
2015119255.tif 000006
【００１７】
〔式（４）中、
Ｒ3は、カルボニル基または＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し（＊は、式（４）中のＹ1と結合する位置を示す）、
Ｙ1は、前記と同義である。〕【００１８】
【化５】
2015119255.tif 000007
【００１９】
＜１−２＞上記＜１−１＞の固相担体を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤（以下、第１のクロマトグラフィーカラム用充填剤とも称する）。【００２０】
＜１−３＞上記＜１−２＞の充填剤がカラム容器に充填されているクロマトグラフィーカラム（以下、第１のクロマトグラフィーカラムとも称する）。【００２１】
＜１−４＞標的物質を含む組成物を用意する工程と、上記＜１−３＞のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする標的物質の精製方法（以下、第１の精製方法とも称する）。【００２２】
＜１−５＞下記式（８）で表される１価の基、下記式（９）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基およびイソシアネート基から選ばれる１種以上の官能基を有する固相と、下記式（１０）で表される架橋剤とを接触させる工程を含むことを特徴とする固相担体の製造方法（以下、第１の固相担体の製造方法とも称する）。【００２３】
【化６】
2015119255.tif 000008
【００２４】
〔式（８）中、
Ｒ7は炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕【００２５】
【化７】
2015119255.tif 000009
【００２６】
【化８】
2015119255.tif 000010
【００２７】
〔式（１０）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｙ2は、チオ基、オキシ基またはイミノ基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕【００２８】
また、本発明は、前記第２の課題を解決するために、以下の＜２−１＞〜＜２−１２＞を提供するものである。【００２９】
＜２−１＞固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、前記固相担体を構成する高分子の末端の一部または全部が、下記式（２１）で表される架橋構造で互いに架橋されている、アフィニティ精製用担体（以下、第２のアフィニティ精製用担体とも称する）。【００３０】
【化９】
2015119255.tif 000011
【００３１】
〔式（２１）中、
Ｒ２１は、ｎ２価の有機基を示し、
Ｘ２１は、それぞれ独立して、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を示し、
ｎ２は、２以上の整数を示す。〕【００３２】
＜２−２＞前記固相担体を構成する高分子が、スチレン系モノマーに由来する構造単位、ビニルケトン系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリロニトリル系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位および（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位から選ばれる１種または２種以上を有する高分子である、前記＜２−１＞のアフィニティ精製用担体。【００３３】
＜２−３＞前記架橋構造が、固相担体の重合前或いは重合中に下記式（３３）で表される多官能チオール化合物を添加して導入されるものである、前記＜２−１＞または＜２−２＞のアフィニティ精製用担体。【００３４】
【化１０】
2015119255.tif 000012
【００３５】
〔式（３３）中、Ｒ２１およびｎ２は、前記と同義である。〕【００３６】
＜２−４＞前記固相担体が、固相担体の重合後に下記式（２２）で表される架橋剤を添加して導入される架橋構造を更に有する、前記＜２−３＞のアフィニティ精製用担体。【００３７】
【化１１】
2015119255.tif 000013
【００３８】
〔式（２２）中、
Ｒ２２は、炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｘ２２およびＸ２３は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕【００３９】
＜２−５＞Ｘ２２およびＸ２３が、チオール基である、前記＜２−４＞のアフィニティ精製用担体。【００４０】
＜２−６＞式（２２）で表される架橋剤を添加して導入された架橋構造中のチオ基を酸化してなる、前記＜２−５＞のアフィニティ精製用担体。【００４１】
＜２−７＞前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、リガンドである、前記＜２−１＞〜＜２−６＞いずれかのアフィニティ精製用担体。【００４２】
＜２−８＞前記リガンドが、タンパク質またはペプチドである、前記＜２−７＞のアフィニティ精製用担体。【００４３】
＜２−９＞前記＜２−１＞〜＜２−８＞いずれかのアフィニティ精製用担体を担体とする、クロマトグラフィーカラム用充填剤（以下、第２のクロマトグラフィーカラム用充填剤とも称する）。【００４４】
＜２−１０＞前記＜２−９＞の充填剤がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム（以下、第２のクロマトグラフィーカラムとも称する）。【００４５】
＜２−１１＞標的物質を含む組成物を用意する工程と、前記＜２−１０＞のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、標的物質の精製方法（以下、第２の精製方法とも称する）。【００４６】
＜２−１２＞標的物質が、標的タンパク質である、前記＜２−１１＞の精製方法。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の第１の固相担体は、高い親水性を有し、耐圧性能に優れるため圧密化しにくく、また、リガンドを固定した場合の標的物質に対する動的結合容量が大きい。したがって、本発明によれば、不純物除去効率が高く、耐圧性能に優れ圧密化しにくく、且つリガンドを固定した場合の標的物質に対する動的結合容量が大きいクロマトグラフィーカラム用充填剤及びクロマトグラフィーカラムを提供できる。【００４８】
本発明の第２のアフィニティ精製用担体は、優れた防汚性を有し、耐圧性能に優れるため圧密化しにくく、また、リガンドを有する場合には標的物質に対する動的結合容量が大きい。したがって、本発明によれば、不純物除去効率が高く、耐圧性能に優れ圧密化しにくく、且つリガンドを有する場合には標的物質に対する動的結合容量が大きいクロマトグラフィーカラム用充填剤およびクロマトグラフィーカラムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【図２】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【図３】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【図４】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【図５】本発明の固相担体の製造方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
＜第１の固相担体＞
本発明の第１の固相担体は、下記式（１）で表される２〜４価の構造を有する樹脂を含むことを特徴とするものであり、斯かる構造（１）を樹脂表面に有するものが好ましい。なお、式（１）中、Ｒ１に結合していない側のＸ1から伸びる−は、結合手を意味する。本明細書において、特に断りがない限り以下同様である。
【００５１】
【化１２】
2015119255.tif 000014
【００５２】
〔式（１）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表される２価の基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
【００５３】
【化１３】
2015119255.tif 000015
【００５４】
〔式（２）中、
Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｙ1は、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ（＝Ｏ））、オキシ基（＞Ｏ）またはイミノ基（＞ＮＨ）を示す。〕
【００５５】
【化１４】
2015119255.tif 000016
【００５６】
〔式（３）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【００５７】
【化１５】
2015119255.tif 000017
【００５８】
〔式（４）中、
Ｒ3は、カルボニル基または＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し（＊は、式（４）中のＹ1と結合する位置を示す）、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【００５９】
【化１６】
2015119255.tif 000018
【００６０】
以下、構造（１）について詳細に説明する。
式（１）中、Ｒ1は、ｎ価の有機基を示す。ｎは２〜４の整数であるが、２または３が好ましく、２がより好ましい。なお、ｎが２である場合の構造（１）は、下記式（１−１）で表される。
【００６１】
【化１７】
2015119255.tif 000019
【００６２】
〔式（１−１）中、
Ｒ1-2は２価の有機基を示し、
Ｘ1は前記と同義であり、それぞれ独立して、式（２）、（３）、（４）または（５）で表される２価の基を示す。〕
【００６３】
また、Ｒ1における２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられ、これらは、置換基として親水性基を有していてもよい。親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、チオ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基、シアノ基等が挙げられる。斯かる親水性基の置換位置及び個数は任意であるが、その個数は、親水性、耐圧性能の観点から、好ましくは０〜６個であり、より好ましくは０〜４個であり、更に好ましくは０〜２個である。
【００６４】
また、上記２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数は、親水性、耐圧性能の観点から、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜６であり、特に好ましくは２〜６である。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００６５】
また、上記２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、親水性、耐圧性能、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基が好ましく、−Ｒa（ＯＲb）mＯＲc−で表される基がより好ましい（Ｒa、ＲbおよびＲcは、それぞれ独立して炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｍは０〜３０の整数を示す）。
【００６６】
上記Ｒa、ＲbおよびＲcで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｍは０〜３０の整数を示すが、親水性、耐圧性能、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、０〜２５の整数が好ましく、０〜２０の整数がより好ましく、０〜１５の整数が更に好ましく、０〜１０の整数が更に好ましく、０〜５の整数が更に好ましく、０〜３の整数が特に好ましい。
なお、上記Ｒ1-2は、Ｒ1で示される２価の有機基と同じである。
【００６７】
また、式（１）中、Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（２）、（３）、（４）または（５）で表される２価の基を示すが、親水性、耐圧性能、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、式（２）、（３）または（４）で表される２価の基が好ましく、式（２）または（４）で表される２価の基がより好ましく、式（２）で表される２価の基が特に好ましい。
【００６８】
【化１８】
2015119255.tif 000020
【００６９】
〔式（２）中、
Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｙ1は、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ（＝Ｏ））、オキシ基（＞Ｏ）またはイミノ基（＞ＮＨ）を示す。〕
【００７０】
【化１９】
2015119255.tif 000021
【００７１】
〔式（３）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【００７２】
【化２０】
2015119255.tif 000022
【００７３】
〔式（４）中、
Ｒ3は、カルボニル基または＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し（＊は、式（４）中のＹ1と結合する位置を示す）、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
【００７４】
【化２１】
2015119255.tif 000023
【００７５】
上記式（２）中、Ｒ2は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては１が好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【００７６】
また、上記式（２）〜（４）中、Ｙ1は、チオ基、スルフィニル基、オキシ基またはイミノ基を示すが、親水性と耐圧性能とリガンドを固定した場合の動的結合容量とをいずれも高める観点から、チオ基、スルフィニル基が好ましく、スルフィニル基がより好ましい。
【００７７】
なお、式（２）、（３）または（４）で表される２価の基はＹ1側の結合手がＲ1と結合していてもよく、他方の結合手がＲ1と結合していてもよい。同様に、式（５）で表される２価の基は、窒素原子側の結合手がＲ1と結合していてもよく、他方の結合手がＲ1と結合していてもよい。
【００７８】
また、本発明の第１の固相担体としては、親水性、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、上記構造（１）に加えて、チオ基またはスルフィニル基とヒドロキシ基とを有する１価の基を更に有するものが好ましく、斯かる基を樹脂表面に有するものがより好ましい。
【００７９】
上記チオ基またはスルフィニル基とヒドロキシ基とを有する１価の基としては、式（６−１）または（６−２）で表されるものが好ましく、式（６−１）で表されるものがより好ましい。
【００８０】
【化２２】
2015119255.tif 000024
【００８１】
〔式（６−１）中、
Ｒ4は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｒ5は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｙ3は、チオ基またはスルフィニル基を示す。〕
【００８２】
【化２３】
2015119255.tif 000025
【００８３】
〔式（６−２）中、
Ｒ5およびＹ3は前記と同義である。〕
【００８４】
上記式（６−１）中、Ｒ4は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては１が好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【００８５】
また、式（６−１）および（６−２）中、Ｒ5は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示す。斯かる１価の有機基の炭素数としては、親水性、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００８６】
また、上記１価の有機基としては、１価の炭化水素基、該１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基、−（ＲdＯ）p−Ｈ（Ｒdは炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｐは１〜３０の整数を示す）が挙げられる。これらは直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
【００８７】
また、上記１価の炭化水素基は、１価の脂肪族炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基および１価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは１価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。斯かるアルキル基の炭素数としては、親水性、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【００８８】
また、上記親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等が挙げられるが、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、ヒドロキシ基が好ましい。
また、親水性基の置換位置および個数は任意であるが、その個数は、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜４個であり、特に好ましくは２個である。
【００８９】
また、上記−（ＲdＯ）p−Ｈにおいて、Ｒdで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｐは１〜３０の整数を示すが、耐圧性能の観点から、１〜２５の整数が好ましく、１〜２０の整数がより好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
【００９０】
斯様なＲ5の中でも、上記１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基が好ましく、好適な具体例としては、下記式（７）で表されるものが挙げられる。
【００９１】
【化２４】
2015119255.tif 000026
【００９２】
〔式（７）中、
Ｒ6は炭素数１〜１０の２価または３価の有機基を示し、
ｑは１または２を示し、
＊＊は、式（６−１）または（６−２）中のＹ3との結合位置を示す。〕
【００９３】
式（７）中、Ｒ6で示される２価または３価の有機基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００９４】
また、上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００９５】
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
【００９６】
また、上記３価の有機基としては、３価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
【００９７】
上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
【００９８】
また、式（７）中、ｑとしては、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、２が好ましい。
【００９９】
また、本発明の第１の固相担体としては、上記の構造等の他に、リガンドを固定可能な官能基を有するものが好ましく、斯かる基を表面に有するものがより好ましい。
また、上記リガンドを固定可能な官能基としては、下記式（８）で表される１価の基、下記式（９）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基が挙げられ、式（８）で表される基が好ましい。
【０１００】
【化２５】
2015119255.tif 000027
【０１０１】
〔式（８）中、
Ｒ7は炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
【０１０２】
【化２６】
2015119255.tif 000028
【０１０３】
式（８）中、Ｒ7で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１が好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０１０４】
また、上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
斯様なリガンドの中でも、精製の標的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質がより好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましく、プロテインＡが更に好ましい。
【０１０５】
また、本発明の第１の固相担体の平均粒径（体積平均粒径）は、耐圧性能の観点から、好ましくは２０〜１５０μｍであり、より好ましくは４０〜１００μｍである。なお、斯かる平均粒径はリガンド固定前の平均粒径をいう。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
また、本発明の第１の固相担体の比表面積は、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
なお、上記平均粒径および比表面積は、レーザー回折・散乱式粒径分析測定装置や水銀ポロシメータ等により測定できる。
【０１０６】
また、本発明の第１の固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、第１の固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。また、第１の固相担体が含む樹脂は、式（１）で表される２〜４価の構造を有するものであれば特に限定されるものではなく、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
【０１０７】
＜第１の固相担体の製造方法＞
本発明の第１の固相担体の製造方法は常法を適宜組み合わせて製造すればよく、特に限定されないが、下記式（８）で表される１価の基、下記式（９）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基およびイソシアネート基から選ばれる１種以上の官能基を有する固相と、下記式（１０）で表される架橋剤とを接触させる工程を含むことを特徴とする固相担体の製造方法により、簡便かつ効率よく製造することができる。
【０１０８】
【化２７】
2015119255.tif 000029
【０１０９】
〔式（８）中、
Ｒ7は炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
【０１１０】
【化２８】
2015119255.tif 000030
【０１１１】
【化２９】
2015119255.tif 000031
【０１１２】
〔式（１０）中、
Ｒ1は、ｎ価の有機基を示し、
Ｙ2は、チオ基、オキシ基またはイミノ基を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
【０１１３】
また、上記製法の具体的な方法としては、例えば、＜ＰＲ−１＞（工程１−１）原料粒子等の固相を常法に従って得て、図１〜４に例示するように、（工程１−２）得られた固相と式（１０）で表される架橋剤とを接触させる方法が挙げられる。
また、構造（１）中のＸ1が式（２）〜（４）で表される２価の基であり、Ｙ1がスルフィニル基である固相担体は、＜ＰＲ−２＞（工程２−１）上記固相を常法に従って得て、図５に例示するように、（工程２−２）得られた固相と式（１０）で表される架橋剤とを接触させ、（工程２−３）更に得られた固相担体（ｉ）に酸化剤を接触させる方法等により得られる。なお、この場合、架橋化剤として、式（１０）中のＹ2がチオ基のものを用いる。
また、上記方法＜ＰＲ−１＞および＜ＰＲ−２＞において、（工程１−２）、（工程２−２）に先立ち、（工程１−１）、（工程２−１）で得られた固相にＲ5ＳＨで表される化合物を接触させることで、式（６−１）または（６−２）で表される１価の基を固相担体に導入することもできる。なお、上記Ｒ5ＳＨで表される化合物におけるＲ5は式（６−１）中のＲ5と同義である。
以下、上記各工程について、具体的に説明する。
【０１１４】
（工程１−１および２−１）
工程１−１および２−１は、式（８）で表される１価の基、式（９）で表される１価の基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基およびイソシアネート基から選ばれる１種以上の官能基を有するモノマー（以下、官能基含有モノマーという）を（共）重合させ、上記官能基を有する固相を得る工程である。上記（共）重合の方法は、好ましくは懸濁重合である。
【０１１５】
上記官能基含有モノマーとしては、式（８）で表される１価の基を有するものが好ましく、例えば、エポキシ基含有不飽和モノマーが挙げられる。斯かるエポキシ基含有不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、スチレン系モノマー等が好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましく、下記式（１１）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがさらに好ましい。
【０１１６】
【化３０】
2015119255.tif 000032
【０１１７】
〔式（１１）中、
Ｒ8は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ9は単結合、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基または−（Ｒ10Ｏ）r−を示し（Ｒ10は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｒは１〜３０の整数を示す）、
Ｒ7は前記と同義である。〕
【０１１８】
Ｒ9で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０１１９】
また、Ｒ10で示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０１２０】
また、ｒとしては、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０１２１】
また、上記のようなＲ9の中でも、単結合が好ましい。
【０１２２】
また、上記官能基含有モノマーの好適な具体例としては、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１２３】
また、上記官能基含有モノマーの合計使用量としては、親水性、耐圧性能の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、２０〜８０質量部がより好ましく、３０〜７０質量部が特に好ましい。
【０１２４】
また、工程１−１および２−１には、官能基含有モノマーとともに他のモノマーを用いてもよい。該他のモノマーとしては、非架橋性モノマー、架橋性モノマーのいずれも使用でき、これらを併用してもよい。
【０１２５】
上記非架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリレート系非架橋性モノマー、（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマー、スチレン系非架橋性モノマー、ビニルケトン系非架橋性モノマー、（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマー、Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマーが挙げられ、これらのうち１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーが好ましい。
【０１２６】
上記（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【０１２７】
また、上記（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【０１２８】
また、上記スチレン系非架橋性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等が挙げられる。
【０１２９】
また、上記ビニルケトン系非架橋性モノマーとしては、例えば、エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン等が挙げられる。
【０１３０】
また、上記（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマーとしては、例えば、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。
【０１３１】
また、上記Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマーとしては、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロパミド等が挙げられる。
【０１３２】
また、上記非架橋性モノマーの合計使用量としては、親水性、耐圧性能の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、０〜７０質量部が好ましく、３〜５０質量部がより好ましく、５〜３０質量部が特に好ましい。
【０１３３】
また、上記架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリレート系架橋性モノマーが好ましい。また、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。
【０１３４】
また、上記（メタ）アクリレート系架橋性モノマーの具体例としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１３５】
また、架橋性モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、親水性、耐圧性能の観点から、モノマー総量を１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、５〜７０質量部がより好ましく、１０〜６０質量部が更に好ましく、２０〜５０質量部が特に好ましい。
【０１３６】
また、工程１−１および２−１の具体的な方法としては、例えば、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【０１３７】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．０１〜１０質量部程度である。
【０１３８】
上記多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、モノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や混合モノマーに可溶な線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。
【０１３９】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、テトラクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【０１４０】
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して７０〜６００質量部であり、より好ましくは７０〜４００質量部である。
【０１４１】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
【０１４２】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、燐酸カルシウム、塩化ナトリウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【０１４３】
また、工程１−１および２−１には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
【０１４４】
また、工程１−１および２−１の重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。
また、重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【０１４５】
なお、斯様にして得られた固相の式（８）または（９）で表される基に対し、Ｒ5ＳＨで表される化合物を開環付加させることで、下記式（６−１）または（６−２）で表される１価の基を固相に導入することもできる。
【０１４６】
【化３１】
2015119255.tif 000033
【０１４７】
〔式（６−１）中、各記号は前記と同義である。〕
【０１４８】
【化３２】
2015119255.tif 000034
【０１４９】
〔式（６−２）中、各記号は前記と同義である。〕
【０１５０】
上記Ｒ5ＳＨで表される化合物としては、メタンチオール、チオグリセロールが挙げられる。斯かる化合物の合計使用量は、式（８）または（９）で表される基１モルに対し、通常０．１〜１２モル当量である。
また、斯かる開環付加反応の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
【０１５１】
（工程１−２および２−２）
工程１−２および２−２は、官能基含有モノマーに由来する官能基に対し、式（１０）で表される架橋剤を開環付加させ、架橋構造を導入する工程である。
【０１５２】
工程１−２および２−２で用いる架橋剤（１０）としては、エチレンジオール、１，６−ヘキサンジオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジオール、ジエチレングリコール等のジオール類；エチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、２，２’−オキシビス（エチルアミン）、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミン等のジアミン類；エチレンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール等のジチオール類の他、２−メルカプトエタノール、グリセリン等が挙げられる。これら架橋剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
上記架橋剤（１０）の合計使用量は、官能基含有モノマーに由来する官能基１モルに対し、通常０．１〜１２モル当量であり、好ましくは０．１〜６モル当量であり、より好ましくは０．１〜３モル当量である。
【０１５３】
なお、工程１−２および２−２は、塩基性触媒存在下で行ってもよい。斯かる塩基性触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１５４】
また、工程１−２および２−２の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、好ましくは０．５〜４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
【０１５５】
（工程２−３）
工程２−３は、式（１０）中のＹ2がチオ基の架橋剤で架橋された固相担体（ｉ）に酸化剤を接触させて、固相担体（ｉ）のチオ基をスルフィニル基に酸化する工程である。
【０１５６】
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１５７】
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜５モル当量であり、さらに好ましくは０．５〜３モル等量である。
【０１５８】
なお、工程２−３は、溶媒存在下で行ってもよい。斯かる溶媒としては、水や、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１５９】
また、工程２−３の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜７０℃程度である。
【０１６０】
なお、上記各工程で得られる反応生成物を、蒸留、抽出、洗浄等の分離手段で精製してもよい。
【０１６１】
そして、上記のようにして得られる本発明の構造（１）を有する樹脂を含む第１の固相担体は、高い親水性を有し、耐圧性能（機械的強度）に優れるため圧密化しにくく、また、リガンドを固定した場合の標的物質に対する動的結合容量が大きいため、クロマトグラフィー用担体として有用である。
【０１６２】
＜第１のクロマトグラフィーカラム用充填剤＞
本発明の第１のクロマトグラフィーカラム用充填剤は、本発明の第１の固相担体を担体とするものである。
本発明の第１の固相担体はリガンドを固定した場合の標的物質（特に標的タンパク質）に対する動的結合容量が大きいため、上記充填剤はアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
斯様なアフィニティクロマトグラフィーカラム用充填剤としては、上記固相担体に上記リガンドを固定したものが挙げられる。リガンドの合計使用量は、本発明の第１の固相担体１ｇあたり、通常５０〜３００ｍｇ程度であるが、好ましくは１２０〜１８０ｍｇである。
【０１６３】
また、リガンドの固定は、上記固相担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよいが、塩を添加したバッファー下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸等が挙げられる。
また、バッファーの合計使用量は、本発明の第１の固相担体に対し、通常２０〜８０質量倍程度であるが、好ましくは３５〜４５質量倍である。
また、リガンド固定の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は通常１〜４０℃程度である。
なお、充填剤の担体である固相担体中に式（８）で表される１価の基等の官能基が残存する場合は、Ｒ5ＳＨで表される化合物（Ｒ5は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示す）を反応させて、上記官能基を開環させてもよい。
【０１６４】
＜第１のクロマトグラフィーカラム＞
本発明の第１のクロマトグラフィーカラムは、本発明の第１のクロマトグラフィーカラム用充填剤がカラム容器に充填されているものである。該カラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
【０１６５】
＜第１の精製方法＞
本発明の第１の精製方法は、標的物質を含む組成物を用意する工程と、本発明の第１のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。上記標的物質としては、標的タンパク質が挙げられる。また、精製は本発明の第１のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法に従い行えばよい。
【０１６６】
＜第２のアフィニティ精製用担体＞
本発明の第２のアフィニティ精製用担体は、固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、固相担体を構成する高分子の末端の一部または全部が、下記式（２１）で表される架橋構造で互いに架橋されているものである。
【０１６７】
【化３３】
2015119255.tif 000035
【０１６８】
〔式（２１）中、
Ｒ２１は、ｎ２価の有機基を示し、
Ｘ２１は、それぞれ独立して、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）またはスルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）を示し、
ｎ２は、２以上の整数を示す。〕
【０１６９】
（架橋構造）
以下、架橋構造（２１）について詳細に説明する。架橋構造（２１）は、結合手の数がｎ２の架橋構造である。
【０１７０】
式（２１）中、Ｒ２１は、ｎ２価の有機基を示す。ｎ２は、２以上の整数であるが、防汚性および耐圧性能等の観点から、２〜６の整数が好ましく、２〜４の整数が好ましく、２または３がより好ましく、２が特に好ましい。
【０１７１】
また、Ｒ２１で示されるｎ２価の有機基の総炭素数は、防汚性および耐圧性能等の観点から、好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜３０、更に好ましくは１〜２４、更に好ましくは２〜１８、更に好ましくは２〜１２、更に好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜８、更に好ましくは３〜７、特に好ましくは４〜６である。
【０１７２】
また、Ｒ２１で示されるｎ２価の有機基としては、ｎ２価の炭化水素基、ｎ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基（＞Ｏ）、チオ基（＞Ｓ）、スルフィニル基（＞Ｓ＝Ｏ）、スルホニル基（＞Ｓ（＝Ｏ）2）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）およびイミノ基（＞ＮＨ）から選ばれる１種以上を有する基（以下、ｎ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基等を有する基とも称する）が挙げられる。中でも、防汚性および耐圧性能等の観点から、ｎ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基等を有する基が好ましく、ｎ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基、チオ基、スルフィニル基、およびスルホニル基から選ばれる１種以上を有する基がより好ましい。
【０１７３】
Ｒ２１で示されるｎ２価の有機基がｎ２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましく、１〜１０が更に好ましく、１〜６が更に好ましく、２〜４が更に好ましく、２または３が特に好ましい。一方、Ｒ２１で示されるｎ２価の有機基がｎ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基等を有する基である場合、斯かる基におけるｎ２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜４０が好ましく、２〜３０がより好ましく、２〜２４が更に好ましく、２〜１８が更に好ましく、２〜１２が更に好ましく、２〜１０が更に好ましく、２〜８が更に好ましく、３〜７が更に好ましく、４〜６が特に好ましい。
これらＲ２１における「ｎ２価の炭化水素基」は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくはｎ２価の脂肪族炭化水素基であり、好適な具体例としては、２〜４価の脂肪族炭化水素基が挙げられる。
２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。３価の脂肪族炭化水素基としては、アルカントリイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。４価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンテトライル基が好ましく、４，４−ジプロピルヘプタン−テトライル基等が挙げられる。
【０１７４】
上記のような架橋構造（２１）の好適な具体例としては、式（２３）または（２４）で表される架橋構造が挙げられ、防汚性および耐圧性能等の観点から、式（２３）で表される架橋構造が好ましい。なお、架橋構造（２３）は、結合手の数が２の架橋構造であり、架橋構造（２４）は、結合手の数がｐ２の架橋構造である。
【０１７５】
【化３４】
2015119255.tif 000036
【０１７６】
〔式（２３）中、
Ｒ２３は、２価の炭化水素基、または２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基、チオ基、スルフィニル基およびスルホニル基から選ばれる１種以上を有する基を示し、
Ｘ２１は前記と同義であり、それぞれ独立して、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を示す。〕
【０１７７】
式（２３）中、Ｒ２３が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜２０が好ましく、１〜１０がより好ましく、１〜６が更に好ましく、２〜４が更に好ましく、２または３が特に好ましい。一方、Ｒ２３が２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基、チオ基、スルフィニル基およびスルホニル基から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜１８が好ましく、２〜１２がより好ましく、２〜１０が更に好ましく、２〜８が更に好ましく、３〜７が更に好ましく、４〜６が特に好ましい。
これらＲ２３における「２価の炭化水素基」は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基である。２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【０１７８】
また、上記の中でも、Ｒ２３としては、防汚性および耐圧性能等の観点から、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基、チオ基、スルフィニル基およびスルホニル基から選ばれる１種以上を有する基が好ましく、−Ｒｆ（ＹaＲｇ）ｔＹbＲｈ−で表される基（Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈは、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、ＹaおよびＹbは、それぞれ独立して、オキシ基、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を示し、ｔは０〜１０の整数を示す）がより好ましい。
Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。また、ｔは、０〜１０の整数を示すが、０〜５の整数が好ましく、０〜３の整数がより好ましく、０または１が特に好ましい。
【０１７９】
【化３５】
2015119255.tif 000037
【０１８０】
〔式（２４）中、
Ｒ２４は、ｐ２＋ｑ２価の有機基を示し、
Ｒ２５は、２価の炭化水素基を示し、
Ｒ２６は、炭化水素基を示し、
ｐ２は、２〜６の整数を示し、
ｑ２は、０〜８の整数を示し、
Ｘ２１は前記と同義であり、それぞれ独立して、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を示す。〕
【０１８１】
式（２４）中、ｐ２は、２〜６の整数を示すが、２〜４の整数が好ましく、３または４がより好ましく、４が特に好ましい。ｑ２は、０〜８の整数を示すが、０〜４の整数が好ましく、０〜２の整数がより好ましく、０が特に好ましい。また、ｐ２＋ｑ２は、好ましくは２〜１０の整数であり、より好ましくは２〜６の整数であり、更に好ましくは２〜４の整数であり、更に好ましくは３または４であり、特に好ましくは４である。
Ｒ２４で示されるｐ２＋ｑ２価の有機基としては、ｐ２＋ｑ２価の炭化水素基、ｐ２＋ｑ２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にオキシ基を有する基が好ましく、ｐ２＋ｑ２価の炭化水素基が好ましい。ｐ２＋ｑ２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、アルカンジイル基、アルカントリイル基、アルカンテトライル基が好ましい。
Ｒ２４で示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、特に好ましくは２〜４である。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
Ｒ２４で示されるアルカントリイル基、アルカンテトライル基の炭素数は、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜８、特に好ましくは４〜６である。アルカントリイル基、アルカンテトライル基の好適な具体例は、以下の式に示すとおりである。
【０１８２】
【化３６】
2015119255.tif 000038
【０１８３】
〔各式中、＊は結合手を示す。〕
【０１８４】
Ｒ２５で示される２価の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜６、より好ましくは２〜４である。また、当該２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、当該２価の炭化水素基としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましく、アルカンジイル基がより好ましい。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
Ｒ２６で示される炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜８である。当該炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、当該炭化水素基としては、脂肪族炭化水素基が好ましく、アルキル基がより好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【０１８５】
（リガンド等）
また、本発明の第２のアフィニティ精製用担体は、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基を有する。
上記リガンドは標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
上記リガンドの中でも、タンパク質、ペプチドが好ましく、タンパク質がより好ましく、特に、イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
リガンドの結合量は、固相担体１ｇ当たり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇである。
【０１８６】
リガンドを結合するための反応性基としては、環状エーテル基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基が挙げられ、環状エーテル基が好ましい。環状エーテル基としては、下記式（２５）で表される１価の基、下記式（２６）で表される１価の基が挙げられ、式（２５）で表される１価の基が特に好ましい。
【０１８７】
【化３７】
2015119255.tif 000039
【０１８８】
〔式（２５）中、Ｒ２７は炭素数１〜６の２価の炭化水素基を示す。〕
【０１８９】
【化３８】
2015119255.tif 000040
【０１９０】
式（２５）中、Ｒ２７で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。２価の炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０１９１】
また、固相担体を構成する高分子は、高分子鎖の末端の一部または全部が、式（２１）で表される架橋構造で互いに架橋されているものであれば特に限定されるものではなく、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
固相担体を構成する高分子としては、エチレン性不飽和モノマーに由来する構造単位を有する高分子が好ましい。例えば、スチレン系モノマーに由来する構造単位、ビニルケトン系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリロニトリル系モノマーに由来する構造単位、（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位および（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位から選ばれる１種または２種以上を有する高分子などである。
【０１９２】
また、固相担体の形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体は、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
本発明の第２のアフィニティ精製用担体を構成する固相担体が粒子である場合、その粒子径は、通常、３５〜１００μｍであり、好ましくは４０〜８５μｍである。粒子径を３５μｍ以上とすることにより、圧力特性が向上する。また、１００μｍ以下とすることによりリガンドを結合した場合の動的結合容量が大きくなる。また、粒子径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
粒子径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、上記「粒子径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径を意味する。
【０１９３】
＜第２のアフィニティ精製用担体の製造方法＞
本発明の第２のアフィニティ精製用担体の製造方法は、常法を適宜組み合わせて製造することができる。
例えば、（工程ＰＳ１）リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーと、必要に応じで当該モノマー以外のモノマー（以下、他のモノマーとも称する）を、下記式（３３）で表される多官能チオール化合物および重合開始剤の存在下で（共）重合させ、必要に応じて、（工程ＰＳ２−１）架橋剤を用いた架橋化反応や（工程ＰＳ２−２）酸化剤を用いるなどしてチオ基をスルフィニル基に酸化をするなどして製造できる。また、（工程ＰＳ３）斯様な方法で得られた固相担体にリガンドを結合させてもよい。
【０１９４】
【化３９】
2015119255.tif 000041
【０１９５】
〔式（３３）中、
Ｒ２１は、前記と同義であり、ｎ２価の有機基を示し、
ｎ２は、前記と同義であり、２以上の整数を示す。〕
【０１９６】
（工程ＰＳ１）
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマー、他のモノマーとしては、いずれも、エチレン性不飽和モノマーが挙げられる。具体的には、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、（メタ）アクリロニトリル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマーおよび（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種または２種以上のモノマーを例示することができる。
【０１９７】
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーとしては、環状エーテル基、カルボキシ基、コハク酸イミドオキシ基、ホルミル基、イソシアネート基およびアミノ基から選ばれる反応性基を有するモノマーが好ましく、環状エーテル基を有するモノマーがより好ましく、式（２５）または（２６）で表される１価の基を有するモノマーが更に好ましく、式（２５）で表される１価の基を有するモノマーが特に好ましい。式（２５）で表される１価の基を有するモノマーとしては、エポキシ基含有不飽和モノマーが挙げられる。
エポキシ基含有不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、スチレン系モノマー等が好ましく、（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましく、下記式（２７）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがさらに好ましい。
【０１９８】
【化４０】
2015119255.tif 000042
【０１９９】
〔式（２７）中、
Ｒ２８は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ２９は単結合、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基または−（Ｒ３０Ｏ）j−を示し（Ｒ３０は炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｊは１〜３０の整数を示す）、
Ｒ２７は前記と同義である。〕
【０２００】
Ｒ２９で示される２価の炭化水素基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が更に好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０２０１】
また、Ｒ３０で示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【０２０２】
また、ｊとしては、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０２０３】
また、上記のようなＲ２９の中でも、単結合が好ましい。
【０２０４】
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーの具体例としては、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２０５】
また、リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーの合計使用量としては、固定可能なリガンド量とリガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、２０〜８０質量部がより好ましく、３０〜７０質量部がさらに好ましく、４０〜６０質量部が特に好ましい。
【０２０６】
また、他のモノマーとしては、非架橋性モノマー、架橋性モノマーのいずれも使用でき、これらを併用してもよい。
また、上記非架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーが挙げられ、架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーが挙げられる。
【０２０７】
上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー等が好ましい。また、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、下記式（２８）で表される（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。
【０２０８】
【化４１】
2015119255.tif 000043
【０２０９】
〔式（２８）中、
Ｒ３１は水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ３２は炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２１０】
Ｒ３２で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、エタン−１，１，２−トリイル基等が挙げられる。
【０２１１】
ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーの具体例としては、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２１２】
また、上記ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、製造時の凝集防止の観点から、モノマー総量１００重量部に対し、１〜３０質量部が好ましく、２〜２０質量部がより好ましく、３〜１５質量部が特に好ましい。
【０２１３】
また、上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー等が好ましい。また、上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、下記式（２９）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２１４】
【化４２】
2015119255.tif 000044
【０２１５】
〔式（２９）中、
Ｒ３３は、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ３４は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
Ｒ３５は、炭素数１〜６の炭化水素基を示し、
ｋは、０〜５０の整数を示す。〕
【０２１６】
Ｒ３４で示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２または３である。また、アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、好適な具体例としてはエタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【０２１７】
Ｒ３５で示される炭化水素基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１または２がより好ましい。また、炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基および芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【０２１８】
ｋは、０〜５０の整数を示すが、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０２１９】
ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーの具体例としては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２２０】
また、上記ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーの合計使用量としては、動的結合容量の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、０〜７０質量部が好ましく、０〜３０質量部がより好ましく、０〜２０質量部が特に好ましい。
【０２２１】
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、動的結合容量と防汚性の観点から、１〜５が好ましく、１〜３がより好ましい。また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましく、下記式（３０）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２２２】
【化４３】
2015119255.tif 000045
【０２２３】
〔式（３０）中、
Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ３８は、炭素数１〜８の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２２４】
Ｒ３８で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは１〜５である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、メタン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０２２５】
ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーの具体例としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２２６】
また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜７０質量部が好ましく、１０〜５０質量部がより好ましく、１５〜４０質量部が好ましい。
【０２２７】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、２〜５官能のものが好ましく、２または３官能のものがより好ましい。また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、（メタ）アクリレート系モノマーが好ましく、下記式（３１）または（３２）で表される（メタ）アクリレート系モノマーがより好ましい。
【０２２８】
【化４４】
2015119255.tif 000046
【０２２９】
〔式（３１）中、
Ｒ３９〜Ｒ４１は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ４２は、炭素数１〜６の３価の炭化水素基を示す。〕
【０２３０】
【化４５】
2015119255.tif 000047
【０２３１】
〔式（３２）中、
Ｒ４３およびＲ４４は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
Ｒ４５は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
ｉは、１〜５０の整数を示す。〕
【０２３２】
式（３１）中、Ｒ４２で示される３価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、その炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、プロパン−１，１，１−トリイル基等が挙げられる。
【０２３３】
また、式（３２）中のＲ４５で示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
また、ｉとしては、１〜２５の整数が好ましく、１〜１５の整数がより好ましい。
【０２３４】
ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーの具体例としては、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、２以上のエチレングリコールを含むポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、２以上のエチレングリコールを含むポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０２３５】
また、上記ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーを使用する場合、その合計使用量としては、動的結合容量、防汚性の観点から、モノマー総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、５〜７０質量部がより好ましく、１０〜６０質量部が更に好ましく、２０〜５０質量部が特に好ましい。
【０２３６】
工程ＰＳ１における（共）重合反応は、下記式（３３）で表される多官能チオール化合物存在下で行われるものであるが、多官能チオール化合物の添加は、固相担体の重合前でも重合中でもよい。
【０２３７】
【化４６】
2015119255.tif 000048
【０２３８】
〔式（３３）中、
Ｒ２１は、前記と同義であり、ｎ２価の有機基を示し、
ｎ２は、前記と同義であり、２以上の整数を示す。〕
【０２３９】
上記多官能チオール化合物の添加により、ラジカル重合中の複数の生長炭素ラジカルが、多官能チオール化合物からの水素引き抜き反応を伴って容易に反応し、複数の水素末端のポリマーと複数の硫黄ラジカルを有する単一の化合物を生成する。この複数の硫黄ラジカルを有する単一の化合物からの再開始により再びポリマー鎖が形成される。このように多官能チオール化合物が連鎖移動剤として作用し、上記多官能チオール化合物由来の架橋構造（２１）が導入される。これにより、得られる担体の防汚性が改善され、充填剤に非特異的に吸着する不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ＝Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等に対する防汚性を改善することが可能となり、また、優れた耐圧性能が得られ、しかも、リガンドを結合した際の動的結合容量も大きくなる。
【０２４０】
上記多官能チオール化合物としては、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、１，２−エタンジチオール、１，３−プロパンジチオール、２，２’−チオジエタンチオール、３−メルカプトプロパン酸２−メルカプトエチル、ビス（３−メルカプトプロパン酸）エチレン、ビス［オクタン酸］２，２−ビス［（３−メルカプト−１−オキソプロポキシ）メチル］−１，３−プロパンジイル、トリス（３−メルカプトプロパン酸）［（エタン−１，１，１−トリイル）トリスメチレン］、トリメチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオナート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）、ヘキサキス（３‐メルカプトプロパン酸）［オキシビス（メチレンメタンテトライル）ヘキサキスメチレン］等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記多官能チオール化合物の使用量は、モノマー総量１００質量部に対し、０．０１〜１０質量部が好ましく、０．０５〜５質量部がより好ましい。
なお、上記のとおり多官能チオール化合物の添加は重合前でも重合中でもよいが、重合開始剤の投入と同時または重合開始剤の投入後に多官能チオール化合物を添加する場合は、重合開始剤の投入から、好ましくは０〜５時間以内、より好ましくは０〜３時間以内、さらに好ましくは０〜１時間以内に多官能チオール化合物を添加する。また、多官能チオール化合物の添加は、塩基性触媒存在下で行ってもよい。
【０２４１】
上記モノマーを重合させるための重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。
重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して、０．０１〜１０質量部程度である。
【０２４２】
また、工程ＰＳ１における（共）重合反応は、懸濁重合が好ましい。懸濁重合の具体的な手法としては、例えば、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、モノマーおよび必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【０２４３】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して４０〜４００質量部程度である。
【０２４４】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
【０２４５】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【０２４６】
また、工程ＰＳ１の重合反応には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
【０２４７】
また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、例えば、通常２〜１００℃程度であり、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。
また、重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【０２４８】
（工程ＰＳ２−１）
工程ＰＳ２−１は、リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーに由来するリガンドを結合するための反応性基の一部に、架橋剤を開環付加させ、架橋剤由来の架橋構造を固相担体に導入する架橋化反応である。これにより、リガンドを結合するための反応性基の残基を介して固相担体表面等に架橋構造が形成される。このようにして固相担体の重合後に架橋剤を添加して、架橋構造を固相担体に導入することによって、防汚性や耐圧性能が向上する。
【０２４９】
上記架橋剤としては、２〜６価の架橋剤が好ましく、２または３価の架橋剤がより好ましい。また、スチレン系架橋剤、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を反応性基とする架橋剤が好ましく、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を反応性基とする架橋剤がより好ましい。斯様な架橋剤の中でも、下記式（２２）で表される架橋剤が好ましい。
【０２５０】
【化４７】
2015119255.tif 000049
【０２５１】
〔式（２２）中、
Ｒ２２は、炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｘ２２およびＸ２３は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕
【０２５２】
Ｒ２２における２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基およびエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。
【０２５３】
また、上記２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数は、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜６であり、特に好ましくは２〜６である。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【０２５４】
また、上記２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基およびエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基が好ましく、−Ｒｉ（ＯＲｊ）uＯＲｋ−で表される基がより好ましい（Ｒｉ、ＲｊおよびＲｋは、それぞれ独立して炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｕは０〜３０の整数を示す）。
【０２５５】
上記Ｒｉ、ＲｊおよびＲｋで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｕは０〜３０の整数を示すが、０〜２５の整数が好ましく、０〜２０の整数がより好ましく、０〜１５の整数が更に好ましく、０〜１０の整数が更に好ましく、０〜５の整数が更に好ましく、０〜３の整数が特に好ましい。
【０２５６】
Ｘ２２およびＸ２３は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示すが、チオール基が好ましい。
【０２５７】
また、上記ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を反応性基とする架橋剤の種類としては、例えば、１，２−エタンジチオール、１，３−プロパンジチオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、ビス（２−メルカプトエチル）スルフィド、トリス（メルカプト酢酸）トリメチロールプロパン、ビス（メルカプト酢酸）エチレングリコール、（±）−ジチオスレイトールなどが挙げられる。
【０２５８】
また、上記スチレン系架橋剤としては、例えば、芳香族環又は芳香族複素環と２〜４個のエチレン性不飽和結合とを分子内に有する架橋剤が挙げられる。具体的には、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、フタル酸ジアリル、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン等が挙げられ、ジビニルピリジンのようなヘテロ環式架橋剤でもよい。
【０２５９】
工程ＰＳ２−１の架橋反応の反応温度は、通常２５〜２００℃であるが、好ましくは５０〜１００℃である。
工程ＰＳ２−１の架橋反応の反応時間は、通常３０分〜２４時間程度であり、好ましくは１〜１２時間程度である。
【０２６０】
（工程ＰＳ２−２）
工程ＰＳ２−２は、酸化剤を用いるなどして、工程ＰＳ１で多官能チオール化合物存在下で（共）重合反応を行うことで導入された架橋構造（２１）中のチオ基や工程ＰＳ２−１で導入された架橋構造中のチオ基を酸化する工程である。工程ＰＳ２−２により、これらチオ基は、スルフィニル基またはスルホニル基に、好ましくはスルフィニル基に酸化される。
【０２６１】
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜３モル当量である。
【０２６２】
また、上記酸化反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常１〜５０質量倍程度であるが、好ましくは５〜１５質量倍である。
【０２６３】
また、上記酸化反応の反応時間は特に限定されないが、通常１〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜９０℃程度である。
【０２６４】
なお、上記各工程で得られる固相担体は、必要に応じて多孔化剤や未反応モノマーを蒸留、抽出、洗浄等により除去することで得ることができる。
【０２６５】
（工程ＰＳ３）
リガンドの固定は、上記で得られた固相担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよいが、塩を添加したバッファー下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸等が挙げられる。バッファーの合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常２０〜８０質量倍程度であるが、好ましくは３５〜４５質量倍である。
また、反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は通常１〜４０℃程度である。
なお、リガンドが固定された担体を、チオール化合物と接触させ、未反応の反応性基を開環させてもよい。
【０２６６】
そして、本発明の第２のアフィニティ精製用担体は、優れた防汚性を有し、耐圧性能に優れるため圧密化しにくく、また、リガンドを有する場合には標的物質に対する動的結合容量が大きい。したがって、本発明の第２のアフィニティ精製用担体は、クロマトグラフィーカラム用充填剤の担体として有用である。
【０２６７】
＜第２のクロマトグラフィーカラム＞
本発明の第２のクロマトグラフィーカラムは、本発明の第２のアフィニティ精製用担体を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤がカラム容器に充填されているものである。該クロマトグラフィーカラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
【０２６８】
＜第２の精製方法＞
本発明の第２の精製方法は、標的物質を含む組成物を用意する工程と、本発明の第２のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。
精製は、本発明の第２のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法と同様であるが、例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、本発明の第２のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。
本発明の第２の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
【実施例】
【０２６９】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、平均粒径（体積平均粒径）は、ベックマン・コールター社製レーザー回析・散乱法粒径分布測定装置（ＬＳ１３  ３２０）を用いて求めた。【０２７０】
〔実施例１−１  ジチオール架橋粒子〕
（１）多孔質粒子の合成
３５８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、５５℃で４時間撹拌しポリビニルアルコールを溶解させた。これにドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３６ｇおよび亜硝酸ナトリウム０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−１）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−１）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。次いで、セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−１）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（和光純薬工業社製）０．９７ｇを添加し、８６℃で３．５時間撹拌した。
（２）親水化反応
その後、上記反応液にチオグリセロール（旭化学工業社製）２５．０３ｇを添加し、８６℃に温度を維持させたまま更に３時間撹拌した。
（３）架橋反応
次いで、上記反応液を２５℃まで冷却した後、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル（東京化成）２．４０ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して１時間撹拌した。次いで、反応液を２５℃まで冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、ジチオール架橋粒子分散液（Ｐ−１）を得た。
なお、分散液（Ｐ−１）中のジチオール架橋粒子の平均粒径は７０μｍであった。【０２７１】
〔実施例１−２  スルホキシド化粒子〕
実施例１−１の操作（３）で得られたジチオール架橋粒子分散液を氷浴で冷却し、この分散液に過酸化水素（和光純薬工業社製）１１．８５ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄し、更に、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、スルホキシド化粒子分散液（Ｐ−２）を得た。
なお、分散液（Ｐ−２）中のスルホキシド化粒子の平均粒径は７０μｍであった。【０２７２】
〔実施例１−３  スルホキシド化粒子〕
実施例１−１の操作（１）および（２）と同様の操作で反応を行った後、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール３．１６ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して１時間撹拌した。次いで、反応液を２５℃まで冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、ジチオール架橋粒子分散液を得た。
次いで、得られたジチオール架橋粒子分散液を氷浴で冷却し、この分散液に過酸化水素（和光純薬工業社製）１１．８５ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄し、更に、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、スルホキシド化粒子分散液（Ｐ−３）を得た。
なお、分散液（Ｐ−３）中のスルホキシド化粒子の平均粒径は７０μｍであった。【０２７３】
〔実施例１−４  スルホキシド化粒子〕
実施例１−１の操作（１）および（２）と同様の操作で反応を行った後、反応液を２５℃まで冷却し、１，２−エタンジチオール１．７２ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して１時間撹拌した。次いで、反応液を２５℃まで冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、ジチオール架橋粒子分散液を得た。
次いで、得られたジチオール架橋粒子分散液を氷浴で冷却し、この分散液に過酸化水素（和光純薬工業社製）１１．８５ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄し、更に、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、スルホキシド化粒子分散液（Ｐ−４）を得た。
なお、分散液（Ｐ−４）中のスルホキシド化粒子の平均粒径は６７μｍであった。【０２７４】
〔実施例１−５  ジアミン架橋粒子〕
実施例１−１の操作（１）および（２）と同様の操作で反応を行った後、反応液を２５℃まで冷却し、エチレンジアミン１．０４ｇおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３．１２ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して１時間撹拌した。次いで、反応液を２５℃まで冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、ジアミン架橋粒子分散液（Ｐ−５）を得た。
なお、分散液（Ｐ−５）中のジアミン架橋粒子の平均粒径は６９μｍであった。【０２７５】
〔実施例１−６  ジオール架橋粒子〕
実施例１−１の操作（１）および（２）と同様の操作で反応を行った後、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジオール２．６１ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して１時間撹拌した。次いで、反応液を２５℃まで冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、ジオール架橋粒子分散液（Ｐ−６）を得た。
なお、分散液（Ｐ−６）中のジオール架橋粒子の平均粒径は６８μｍであった。【０２７６】
〔比較例１−１〕
実施例１−１の操作（１）および（２）と同様の操作で反応を行った後、反応液を氷浴で冷却し、この分散液に過酸化水素（和光純薬工業社製）１１．８５ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄し、更に、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｐ−７）を得た。
なお、分散液（Ｐ−７）中の粒子の平均粒径は５７μｍであった。【０２７７】
〔比較例１−２〕
チオグリセロールの添加量を５０．１０ｇに変更した以外は、比較例１−１と同様の操作を行い、粒子分散液（Ｐ−８）を得た。
なお、分散液（Ｐ−８）中の粒子の平均粒径は７１μｍであった。【０２７８】
〔比較例１−３〕
３５８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、５５℃で４時間撹拌しポリビニルアルコールを溶解させた。これにドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３６ｇおよび亜硝酸ナトリウム１．８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−２）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．４ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．８ｇおよびグリセロール−１，３−ジメタクリレート（新中村化学工業社製）９．８ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）７．４ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．６ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−２）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−２）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。次いで、セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−２）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（和光純薬工業社製）０．９７ｇを添加し、８６℃で３．５時間撹拌した。その後、この反応液を冷却した後ろ過し、純水で洗浄し、更に、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｐ−９）を得た。
なお、分散液（Ｐ−９）中の粒子の平均粒径は４８μｍであった。【０２７９】
【表１】
2015119255.tif 000050
【０２８０】
〔試験例１−１  粒子の耐圧性評価〕
実施例１−１で得られた多孔質粒子の流通特性を測定するために、内径１６ｍｍ、長さ１００ｍｍのＨＲ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）カラムに分散液（Ｐ−１）を流し込み、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｉｌｏｔを用いて、線流速４５０ｃｍ／ｈｒで通液して、カラムに粒子を充填した。次いで、純水を通液し、段階的に線流速を上げていき、圧力損失１．９ＭＰａの時の線流速を測定した。この線流速を測定可能線流速とし、以下の基準に従い耐圧性を評価した。また、分散液（Ｐ−１）を分散液（Ｐ−２）〜（Ｐ−９）にそれぞれ変更し、実施例１−２〜実施例１−６および比較例１−１〜比較例１−３で得られた多孔質粒子についても耐圧性評価を行った。これら結果を表２に示す。【０２８１】
（耐圧力性能評価基準）
ＡＡ：測定可能線流速が２７００ｃｍ／ｈｒ以上
Ａ：測定可能線流速が２４００ｃｍ／ｈｒ以上２７００ｃｍ／ｈｒ未満
Ｂ：測定可能線流速が２４００ｃｍ／ｈｒ未満【０２８２】
〔試験例１−２  粒子の親水性評価（親水性指標値：Vuv/Vcon比）〕
１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに国際公開第２０１２／０８６６６０号に記載のプロテインＡ０．１５ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、粒子分散液（Ｐ−１）を粒子乾燥質量換算で０．９ｇ添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で２４時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を得た。
次いで、上記アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を、容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のカラムに充填し、このカラムに、濃度１ＭのＮａＣｌ溶液にアセトンを１質量％溶かした溶液１００μＬを供し、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）を溶出液として用いて溶出ピークを電導度検出器（ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ）で検出し、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるＮａＣｌとアセトンの溶出時間を測定した。
得られたＮａＣｌ溶液とアセトン溶液の溶出時間の比（アセトン溶出時間／ＮａＣｌ溶出時間＝Ｖｕｖ／Ｖｃｏｎｄ）を、親水性を表す値とし、以下の基準に従い親水性を評価した。
分散液（Ｐ−１）を分散液（Ｐ−２）〜（Ｐ−９）にそれぞれ変更し、実施例１−２〜実施例１−６および比較例１−１〜比較例１−３で得られた多孔質粒子についても親水性評価を行った。これら結果を表２に示す。【０２８３】
（親水性能評価基準）
ＡＡ  ：Vuv/Vcondが1.06未満
Ａ    ：Vuv/Vcondが1.06以上1.10未満
Ｂ  ：Vuv/Vcondが1.10以上【０２８４】
〔試験例１−３  動的結合容量測定試験〕
１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに国際公開第２０１２／０８６６６０号に記載のプロテインＡ０．１５ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、粒子分散液（Ｐ−１）を粒子乾燥質量換算で０．９ｇ添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で２４時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を得た。
次いで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤について、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速６０ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対するＤＢＣを測定した。カラムは容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で２５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。
分散液（Ｐ−１）を分散液（Ｐ−２）〜（Ｐ−９）にそれぞれ変更し、実施例１−２〜実施例１−６および比較例１−１〜比較例１−３で得られた多孔質粒子についても動的結合容量（ＤＢＣ）測定を行った。これら結果を表２に示す。【０２８５】
（動的結合容量評価基準）
ＡＡ：５５ｍｇ／ｍＬ以上
Ａ  ：５３ｍｇ／ｍＬ以上５５ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ  ：５０ｍｇ／ｍＬ以上５３ｍｇ／ｍＬ未満
Ｃ  ：４８ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ未満【０２８６】
【表２】
2015119255.tif 000051
【０２８７】
表２に示す通り、実施例１−１〜実施例１−６の粒子は、比較例１−１、比較例１−２の親水化粒子と比べて測定可能線流速が高く、親水性と動的結合容量も同等以上であった。また、比較例１−３の非親水化粒子と比べて親水性と動的結合容量が高く、圧力性能は同等以上であった。【０２８８】
〔実施例２−１〕
（１）３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、加熱撹拌しポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム（和光純薬社製）０．３６ｇおよび亜硝酸ナトリウム（和光純薬社製）０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−３）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ、およびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−３）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−３）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０２８９】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤として３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）１０．９４ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール存在下での重合反応を行った。【０２９０】
（３）次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール処理粒子分散液とする。【０２９１】
（４）上記３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール処理粒子分散液に過酸化水素（和光純薬工業社製）４．３０ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄した。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、スルホキシド化粒子分散液とする。【０２９２】
（５）改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製  ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に上記スルホキシド化粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティ精製用担体２−１を得た。【０２９３】
〔実施例２−２〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）を調製した。一方、グリシジルメタクリレート８．８７ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４８ｇ、およびグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）４．４４ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−４）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−４）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０２９４】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤として１，２−エタンジチオール（和光純薬社製）５．６５ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、１，２−エタンジチオール存在下での重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）を４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）〜（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−２を得た。【０２９５】
〔実施例２−３〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）を調製した。一方、グリシジルメタクリレート８．７９ｇ、グリセロールモノメタクリレート１．４６ｇ、およびエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）４．４０ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−５）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−５）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０２９６】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤として１，３−プロパンジチオール（和光純薬社製）４．５７ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、１，３−プロパンジチオール存在下での重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）を４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）〜（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−３を得た。【０２９７】
〔実施例２−４〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）、単量体溶液（Ｍ−３）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−３）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０２９８】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤として２，２’−チオジエタンチオール（丸善油化社製）９．２６ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、２，２’−チオジエタンチオール存在下での重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）を４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）および（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−４を得た。【０２９９】
〔実施例２−５〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）、単量体溶液（Ｍ−３）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−３）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０３００】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤としてペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）１０．９４ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）存在下での重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（丸善油化社製）を４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）および（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−５を得た。【０３０１】
〔比較例２−１〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）、単量体溶液（Ｍ−３）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−３）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０３０２】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、３時間撹拌を行うことで、重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、１，２−エタンジチオールを４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）〜（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−６を得た。【０３０３】
〔比較例２−２〕
（１）実施例２−２と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）、単量体溶液（Ｍ−４）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−４）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０３０４】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、３時間撹拌を行うことで、重合反応を行い、反応液を２５℃まで冷却した。
その後、実施例２−１の工程（３）および（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−７を得た。【０３０５】
〔比較例２−３〕
（１）実施例２−１と同様の手順で水溶液（Ｓ−３）を調製した。一方、グリシジルメタクリレート８．８６ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）０．７４ｇ、およびトリメチロールプロパントリメタクリレート５．１７ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇおよびアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液（Ｍ−６）を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−３）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液（Ｍ−６）を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０３０６】
（２）その後、８６℃に温度を維持させたまま、上記反応液に、連鎖移動剤としてチオグリセロール（旭化学工業社製）６．２６ｇを添加し、３時間撹拌を行うことで、チオグリセロール存在下での重合反応を行った。
次いで、反応液を２５℃まで冷却し、１，２−エタンジチオールを４５．５６ｇ添加して３０分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が８５℃に到達した時点から５時間撹拌することで、グリシジルメタクリレート由来のエポキシ基を一部架橋化した。
その後、実施例２−１の工程（３）〜（５）と同様の操作を行い、アフィニティ精製用担体２−８を得た。【０３０７】
〔試験例２−１  平均粒子径の測定〕
実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−３の各担体の平均粒子径を、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製  ＬＳ１３３２０）により測定した。結果を表３に示す。【０３０８】
〔試験例２−２  プロテインＡ結合量の定量〕
実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−３の各担体に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの担体をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表３に示す。【０３０９】
〔試験例２−３  動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験〕
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−３の各担体のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬにタンパク質を溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表３に示す。【０３１０】
〔試験例２−４  ＨＣＰの定量〕
カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０  ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−３の各担体を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、および２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出し、以下の基準に従い評価した。結果を表３に示す。【０３１１】
（ＨＣＰ定量評価基準）
ＡＡ：ＨＣＰ量が１５００ｐｐｍ未満
Ａ：ＨＣＰ量が１５００ｐｐｍ以上３０００ｐｐｍ未満
Ｂ：ＨＣＰ量が３０００ｐｐｍ以上【０３１２】
〔試験例２−５  担体の耐圧性能評価〕
実施例２−１〜２−５および比較例２−１〜２−３の各担体を、濃度が１０質量％となるように純水にそれぞれ分散させた。カラム充填後の担体の体積が２０ｍＬとなる量の分散液を、内径１６ｍｍ、長さ１００ｍｍのＨＲ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）カラム容器に流し込み、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｉｌｏｔを用いて、線流速４５０ｃｍ／ｈｒで通液して、カラムに担体を充填した。次いで、純水を通液し、段階的に線流速を上げていき、圧力損失１．９ＭＰａの時の線流速を測定した。この線流速を測定可能線流速とし、以下の基準に従い耐圧性能を評価した。結果を表３に示す。【０３１３】
（耐圧力性能評価基準）
ＡＡ：測定可能線流速が２７００ｃｍ／ｈｒ以上
Ａ：測定可能線流速が２４００ｃｍ／ｈｒ以上２７００ｃｍ／ｈｒ未満
Ｂ：測定可能線流速が２４００ｃｍ／ｈｒ未満【０３１４】
【表３】
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【０３１５】
表３の結果から、重合中に多官能チオール化合物を連鎖移動触媒として添加して、固相担体を構成する高分子の末端を架橋構造（２１）で互いに架橋させることによって、優れた防汚性を有し、耐圧性能に優れ、標的物質に対する動的結合容量が大きい担体が得られることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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