(57)【要約】  ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた発色反応を、DAB及びその増感剤としてのイミダゾールを含む発色反応液を用い、特異染色強度を増強させるとともに、DABの凝集によるDAB含有基質溶液への沈澱、及びバックグラウンド染色等の非特異的な染色を抑制することが可能なDAB含有基質キットを提供する。本発明のキットは、ペルオキシダーゼ発色団としてのDABと水とを含む発色団含有溶液(A)、並びにEDTA・2Na、EDTA・2NH4、GEDTA及びNTAの少なくとも１種のキレート剤と、POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及び／又はPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤と、イミダゾールと、過酸化水素と、水とを含む発色試薬(B)を含み、少なくとも発色団含有溶液(A)及び発色試薬(B)が別に保管される２液タイプ以上である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ発色団としてのジアミノベンジジン（DAB）と水とを含む発色団含有溶液(A)、並びにテトラエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物、エチレンジアミン四酢酸・ジアンモニウム塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸、及びニトリロ三酢酸からなる群より選択される少なくとも１種のキレート剤と、ポリオキシエチレン(POE)アルキルエーテル系非イオン界面活性剤及びポリオキシプロピレン(POP)アルキルエーテル系非イオン界面活性剤の少なくとも１種からなる非イオン界面活性剤と、イミダゾールと、過酸化水素と、水とを含む発色試薬(B)を含有し、少なくとも発色団含有溶液(A)及び発色試薬(B)が別に保管される２液タイプ以上の、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた染色用DAB含有基質キット。
【請求項２】
発色試薬(B)が、過酸化水素及び水を含む発色化溶液(B1)、並びに前記キレート剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系非イオン界面活性剤、イミダゾール及び水を含む基質安定化溶液(B2)とが別に保管される２液タイプであり、キットを３液タイプとした請求項１記載のキット。
【請求項３】
免疫染色法又はin situハイブリダイゼーション法の染色に使用するための、請求項１又は２記載のキット。
【請求項４】
POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及びPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤が、POE（２３）ラウリルエーテル(Brij 35)、POE（２０）セチルエーテル(Brij 58)、POEステアリルエーテル、POEオレイルエーテル、POEミリスチルエーテル、POEオクチルドデシルエーテル、POPラウリルエーテル、POPセチルエーテル、POPステアリルエーテル、POPオレイルエーテル、POPミリスチルエーテル及びPOPオクチルドデシルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項５】
キレート剤がEDTA・2Naであり、且つPOEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤が、POE（２３）ラウリルエーテルである請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
発色団含有溶液(A)中のDABの含有量は、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB含有基質溶液中の濃度として、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬとなる量である請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記発色試薬(B)又は前記基質安定化溶液(B2)中の前記キレート剤の含有量は、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB含有基質溶液中の濃度として、０．１〜１０ｍＭとなる量である請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
前記発色試薬(B)又は前記基質安定化溶液(B2)中の前記POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及びPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤の少なくとも１種の非イオン界面活性剤の含有量は、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB基質溶液中の含有割合として、０．０５〜３０質量％となる量である請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
前記発色試薬(B)又は前記基質安定化溶液(B2)中のイミダゾールの含有量は、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB含有基質溶液中の濃度として、３〜３００ｍＭとなる量である請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記発色試薬(B)又は前記発色化溶液(B1)中の過酸化水素の含有量は、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB含有基質溶液中の含有割合として、０．００１〜０．３質量％となる量である請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)のｐＨを、用いる前記染色用DAB含有基質キットの各溶液を混合又は混合希釈したDAB含有基質溶液のｐＨが、５〜９となるように調整した請求項１〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
ペルオキシダーゼが、西洋わさび由来のペルオキシダーゼである請求項１〜１１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、免疫組織化学染色（IHC）法、免疫細胞化学染色(ICC)法等の免疫染色法や、in situハイブリダイゼーション（ISH）法における発色反応を、ジアミノベンジジン（DAB）及びその増感剤としてのイミダゾールを含む発色反応液を用い、DABの凝集によるDAB含有基質溶液への沈澱及び非特異的な染色による、例えば、バックグラウンド染色を抑制して、特異染色強度を増強させることが可能なDAB含有基質キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、病理や分子生物学の分野ではIHC法、ICC法又はISH法に用いる発色反応液は、発色するための標識酵素の種類に応じて試薬の使い分けが行われている。標識酵素として現在最も使用されているのはペルオキシダーゼであり、多くは植物性の西洋わさび由来のペルオキシダーゼ（HRP）（分子量40〜45kDa）が用いられることが非特許文献１に記載されている。HRPの酵素反応水素供与体としては、茶色に発色するジアミノベンジジン（DAB）及び過酸化水素を含むDAB含有基質溶液が日常的に用いられている。
DAB含有基質溶液は、2液または3液に分けられ（DABが反応しないようにDABと過酸化水素が分けられている場合が一般的である）、用事調製を行う高濃度ストック溶液、または乾燥品であるタブレット錠が市販されている。例えば、Dako社製のLiquid DAB+ Substrate Chromogen System（Code: K3468）、Thermo SCIENTIFIC社製のDAB Quanto (Code: TA-XXX-QHDX)、Life Technologies社製のStable DAB（Code:750118）、ニチレイバイオサイエンス社製のDAB基質キットが挙げられる。しかし、その組成については公開されていない場合がほとんどである。
非特許文献1には、DAB発色の増感剤としてイミダゾールを添加することが記載されている。これまでの経験上、イミダゾールはDAB反応を早める効果はあるが、同時にDABの凝集を引き起こし、一定時間経過後に反応液中への沈殿を引き起こすことがわかっていた。加えて、増感効果が高いが故に、組織上の目的物質以外のHRP存在下周辺にも非特異的な染色、例えば、バックグラウンド染色を引き起こすことがわかっていた。
ところで、特許文献１には、DAB含有基質溶液に必要により非イオン性界面活性剤を含有させうること、特許文献２及び３には、DAB含有基質溶液にEDTAを配合できることが記載されている。しかし、これら文献には、上記イミダゾールを配合した場合の課題については何等検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３５０３８９０号公報
【特許文献２】カナダ特許出願公開第２４１７６７１号明細書
【特許文献３】ドイツ特許出願公開第３８１２６０５号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】名倉宏，長村義之，堤寛：改訂四版  渡辺・中根  酵素抗体法  学際企画  2002）「酵素抗体法」（改訂四版 渡辺・中根 学際企画2002）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、免疫組織化学染色法、免疫細胞化学染色法等の免疫染色法やin situハイブリダイゼーション法等における発色反応を、DAB及びその増感剤としてのイミダゾールを含むDAB含有基質溶液を用い、特異染色強度を増強させるとともに、非特異的な染色を抑制することが可能なDAB含有基質キットを提供することにある。
本発明の他の課題は、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、免疫染色法やin situハイブリダイゼーション法における発色反応を、DAB及びその増感剤としてのイミダゾールを含む発色反応液を用い、特異染色強度を増強させるとともに、DAB含有基質溶液中におけるDABの凝集による沈澱を抑制し、非特異的な染色をも抑制することが可能なDAB含有基質キットを提供することにある。
本発明の別の課題は、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、免疫染色法やin situハイブリダイゼーション法における発色反応を、DAB及びその増感剤としてのイミダゾールを含むDAB含有基質溶液を用い、特異染色強度を増強させるとともに、バックグラウンド染色等の非特異的な染色を抑制し、且つDAB含有基質溶液中におけるDABの凝集による沈澱を長期間抑制して使用感及び保存安定性をも改善したDAB含有基質キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、従来、免疫染色法の酵素抗体法や、in situハイブリダイゼーション法に一般的に使用されている発色のためのDAB含有基質溶液組成に、増感剤として知られるイミダゾールを含有させて、特異染色強度を増加させた場合であっても、特定のキレート剤と、特定の非イオン界面活性剤とを含有させることにより、非特異的な染色を軽減しつつ、スライドガラスを用いた場合に生じる、例えばバックグラウンド染色を抑制しうることを見出した。更に、DAB含有基質溶液を調製後のDABの凝集を阻害することができ、更には、2液タイプ以上とし、その組成を調製することにより、その保存安定性も格段に良くなり、4℃遮光保存下では各液の混合後2週間まで沈殿が起こることなく、且つDAB含有基質溶液の調製直後と同等の染色性が得られることを見出し、本発明を完成した。
ここで、本発明においてDAB含有基質溶液とは、本発明のキットを混合又は混合希釈して得られる基質溶液を意味する。また、本明細書中においては、染色を、染色又は発色の意味で用いる場合がある。【０００７】
本発明によれば、ペルオキシダーゼ発色団としてのジアミノベンジジン（DAB）と水とを含む発色団含有溶液(A)、並びにテトラエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム・二水和物（EDTA・2Na）、エチレンジアミン四酢酸・ジアンモニウム塩（EDTA・2NH4）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（GEDTA）、及びニトリロ三酢酸（NTA）からなる群より選択される少なくとも１種のキレート剤と、ポリオキシエチレン(以下POEと略す)アルキルエーテル系非イオン界面活性剤及びポリオキシプロピレン(以下POPと略す)アルキルエーテル系非イオン界面活性剤の少なくとも１種からなる非イオン界面活性剤と、イミダゾールと、過酸化水素と、水とを含む発色試薬(B)を含有し、少なくとも発色団含有溶液(A)及び発色試薬(B)が別に保管される２液タイプ以上の、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、例えば、IHC法、ICC法、又はISH法の染色に使用するためのDAB含有基質キット（以下、本発明のキットと略すことがある）が提供される。
また、本発明によれば、前記発色試薬(B)が、過酸化水素及び水を含む発色化溶液(B1)、並びに前記キレート剤、POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及びPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤の少なくとも１種からなる非イオン界面活性剤、イミダゾール、及び水を含む基質安定化溶液(B2)とが別に保管される２液タイプであり、キットを３液タイプとした上記キットが提供される。
更に本発明によれば、DABを用いた組織、細胞又はこれらの一部の染色に、本発明のキットを使用する、IHC法、ICC法、又はISH法が提供される。
更にまた、本発明によれば、DABを用いた組織、細胞又はこれらの一部の染色に、本発明のキットを用いることを特徴とする染色法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のキットは、ペルオキシダーゼ発色団としてのDABと水とを含む発色団含有溶液(A)、並びに特定のキレート剤と、特定の界面活性剤と、イミダゾールと、過酸化水素と、水とを含む発色試薬(B)を含有し、少なくとも発色団含有溶液(A)及び発色試薬(B)が別に保管される２液タイプ以上のキットであるので、ペルオキシダーゼを用いた、IHC法、ICC法や、ISH法において、特異染色強度を増強させるとともに、非特異的な染色を抑制し、且つDABの凝集によるDAB含有基質溶液中での沈澱を抑制することができる。更には、上記沈澱を長期間抑制して使用感及び保存安定性をも改善することができる。このような効果を有する本発明のキットは、スライドガラスに貼付した組織検体をIHC法により染色する際、ICC法により細胞検体を染色する際、更にはISH法により組織や細胞検体を染色する際に特に有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のキットは、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、IHC法及びICC法における染色や、ISH法における発色を基盤にして、生体の正常又は腫瘍組織や細胞等に存在する、例えば、抗原、mRNA、DNA等の特定の物質を、DAB発色団を用いて染色することにより、病理診断や生物分子学実験等を行うための、２液タイプ以上のDAB含有基質キットである。
本発明において、IHC法に用いる組織検体、ICC法に用いる細胞検体や、ISH法に用いる組織や細胞検体は、組織や細胞が変性しないように固定後薄切して用いる。例えば、長期保存等を目的として、通常ホルマリンやアルコール等によって検体を固定し、続いてパラフィン等を含む包埋媒体により包埋した後、組織検体を薄切りし、スライドガラスに貼付したものを好ましく用いることができる。染色に先立つ抗原抗体反応や、DIG(Digoxigenin)標識を施したプローブを用いたハイブリダイゼーションの後の抗体反応は、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた、直接法又は間接法等の公知の方法で行うことができる。この際、ペルオキシダーゼとしては、HRPを好ましく用いることができる。
本発明のキットは、好ましくは、上記組織や細胞検体を貼付したスライドガラスを用いた間接法の酵素抗体反応に用いることができる。例えば、検体をホルマリンで固定した後にパラフィン包埋したスライドガラスを脱パラフィンし、親水化した後、必要により抗原性賦活化を行い、内因性ペルオキシダーゼ除去を行った後、一次抗体を反応させるか、あるいはDIG標識を施したプローブを反応させ、次いで、ペルオキシダーゼ、及び二次抗体又は抗DIG抗体が結合したポリマー等を反応させた後、本発明のキットの各溶液を混合して調製したDAB含有基質溶液を反応させて、ペルオキシダーゼを触媒としてその箇所を特異的に発色させる方法に用いることができる。また、発色後、更にヘマトキシリン等により核染色を行うことにより形態を見やすくすることも可能である。
前記DAB含有基質溶液の調製は、例えば、本発明のキットに含まれる各溶液を混合する方法、又は本発明のキットに含まれる各濃縮溶液を、特定量の蒸留水等の水に混合する方法により行うことができる。
【００１０】
本発明のキットを用いて、IHC法における染色や、ISH法による発色に用いることができる組織としては、例えば、大腸（正常・癌）、小腸（正常）、十二指腸（正常）、結腸（正常）、胃（正常・癌）、食道（正常）、舌（正常）、肝臓（癌）、膵臓（正常）、腎臓（正常）、脳（正常）、小脳（正常）、心臓（正常）、乳腺（正常・癌）、胎盤、前立腺（正常・癌）、肺（正常・癌）、甲状腺（正常）、扁桃（正常）、リンパ節（正常）、子宮頚部（正常）、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、胸腺過形成症例、GIST (Gastrointestinal stromal tumor)、中皮腫が挙げられる。以上の組織のうち、大腸（正常・癌）、小腸（正常）、十二指腸（正常）、結腸（正常）、胃（正常・癌）など筋組織または結合組織を含む部分にはバックグラウンド染色が特に見られる傾向があるので、本発明のキットはこれらの組織の染色に極めて有効である。
本発明のキットを用いて、ICC法における染色やISH法における発色に用いることができる細胞としては、例えば、乳癌細胞、肺癌細胞、リンパ芽球（正常）が好ましく挙げられる。
【００１１】
本発明のキットは、ペルオキシダーゼ発色団としてのDABと水とを含む発色団含有溶液(A)を含む。この溶液(A)に含まれるDABは、後述する過酸化水素が、ペルオキシダーゼと反応し、その際の酵素反応の水素供与体として作用する。そして、該DABが、重合反応することにより、ペルオキシダーゼ結合部分を特異的に茶系色に発色させることができる。
溶液(A)において、DABの含有量は、最終的にIHC法やICC法の染色又はISH法の発色に用いるDAB含有基質溶液として発色反応しうる量であれば良く、好ましくは、用いるDAB含有基質溶液中の濃度として、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬである。０．１ｍｇ／ｍＬ未満では、発色反応が十分に生じないおそれがあり、一方、１０ｍｇ／ｍＬを超えると、DAB含有基質溶液とした際にDABが凝集等して沈澱が生じるおそれがある。
【００１２】
溶液(A)において、水としては、例えば、蒸留水又は超純水を用いることができる。水の量は、溶液(A)においてDABを溶解しうる量であって、最終的にDAB含有基質溶液とした際に、各成分の含有量が適当な範囲となるように適宜選択して決定することができる。
溶液(A)には、DAB及び水の他に、DABの溶解性又は安定性を向上させるために、各種有機溶媒を含有させることもでき、その含有量は、その目的に応じて適宜選択することができる。
【００１３】
本発明のキットは、特定のキレート剤と、POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及び／又はPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤と、イミダゾールと、過酸化水素と、水とを含む発色試薬(B)を含む。
発色試薬(B)は、例えば、過酸化水素及び水を含む発色化溶液(B1)と、特定のキレート剤、POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及び／又はPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤、イミダゾール及び水を含む基質安定化溶液(B2)とに分割することができる。
本発明のキットは、DABと過酸化水素とを別に保管する２液タイプ以上のキットであれば何液タイプであっても良いが、効率性を考慮した場合、前記発色団含有溶液(A)及び前記発色試薬(B)からなる２液タイプ、又は前記発色団含有溶液(A)、前記発色化溶液(B1)及び前記基質安定化溶液(B2)からなる３液タイプにすることが好ましい。
【００１４】
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)に用いる特定のキレート剤は、EDTA・2Na、EDTA・2NH4、GEDTA、及びNTAからなる群より選択される少なくとも１種であり、特にその効果の点からEDTA・2Na又はGEDTAの使用が好ましい。これらの特定のキレート剤は、特に、DABの非特異的な結合を抑制し、特に、スライドガラスに貼付した組織検体を用いる場合に、バックグラウンド染色を抑制することができる。また、後述する特定の非イオン界面活性剤との組み合わせにより、検体組織が、筋組織や結合組織等であっても、DABの非特異的結合を有効に抑制することができる。
前記発色試薬(B)又は前記基質安定化溶液(B2)中の前記キレート剤の含有量は、用量依存的に上記作用効果が改善される傾向にあり、その作用効果を考慮して適宜選択することができる。具体的には、用いるDAB含有基質溶液中の濃度として、好ましくは０．１〜１０ｍＭとなる量、特に好ましくは０．３〜３ｍＭとなる量で含有させることができる。
【００１５】
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)に用いる特定の界面活性剤は、POE（２３）ラウリルエーテル(Brij 35)、POE（２０）セチルエーテル(Brij 58)、POEステアリルエーテル、POEオレイルエーテル、POEミリスチルエーテル、POEオクチルドデシルエーテル等のPOEアルキルエーテルや、POPラウリルエーテル、POPセチルエーテル、POPステアリルエーテル、POPオレイルエーテル、POPミリスチルエーテル、POPオクチルドデシルエーテル等のPOPアルキルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、特にBrij 35の使用が好ましい。これらの特定の非イオン界面活性剤は、特に、DABと過酸化水素を含むDAB含有基質溶液とした際に、DABの水溶液中での重合や沈澱を抑制する効果に優れ、また、DABの発色強度を増強することもできる。他の界面活性剤、例えば、Triton X-100(4−(1，1，3，3−Tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol)、NP-40(4−Nonylphenyl−polyethylene glycol）もしくはTween 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)を用いた場合、又は非プロトン性極性溶媒、例えば、DMSO(Dimethyl sulfoxide)を用いた場合には、所望の効果が得られない。
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)中の前記POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及び／又はPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤の含有量は、用量依存的に上記作用効果が改善される傾向にあり、その作用効果を考慮して適宜選択することができる。具体的には、IHC法、ICC法やISH法に用いるDAB含有基質溶液中の含有割合として、好ましくは０．０５〜３０質量％となる量、特に好ましくは０．１〜５質量％となる量で含有させることができる。
【００１６】
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)に用いるイミダゾールは、DABの発色において、発色強度を増強させる増強剤として作用する成分である。このような作用効果を示すイミダゾールは、発色強度を増強させる一方で、過酸化水素の存在下、DABの凝集を引き起こし、一定時間経過後にDAB含有基質溶液中への沈殿を引き起こし、加えて、検体組織や検体細胞上の目的物質以外の非特異的な染色、例えば、バックグラウンド染色を引き起こす原因にもなっている。そこで、本発明のキットでは、前記特定のキレート剤及び前記特定の非イオン界面活性剤を組み合わせた、発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)にイミダゾールを配合する。
発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)中のイミダゾール含有量は、用量依存的に上記DABの発色増強作用が得られるが、多いと上記問題点が発生する可能性も高くなるので、IHC法、ICC法や、ISH法に用いるDAB含有基質溶液中の濃度として、通常３〜３００ｍＭとなる量、特に５〜１００ｍＭとなる量で含有させることが好ましい。また、イミダゾールの濃度を高くする場合には、前記特定のキレート剤の濃度も上記範囲内で高く設定することが好ましい。
【００１７】
発色試薬(B)又は発色化溶液(B1)に用いる過酸化水素は、ペルオキシダーゼに作用してDABの発色反応に係る成分である。過酸化水素の含有量は、過剰量であっても良いが、多すぎると特異染色強度が低下するおそれがある。また、少なすぎると発色反応が十分進行せず、また、DAB含有基質溶液とした後の保存性が低下するおそれがある。
そこで、過酸化水素の含有量は、IHC法、ICC法や、ISH法に用いるDAB含有基質溶液中の含有割合として、好ましくは０．００１〜０．３質量％となる量、特に好ましくは０．０１〜０．０５質量％となる量で含有させることができる。
【００１８】
発色試薬(B)、発色化溶液(B1)及び基質安定化溶液(B2)に用いる水は、例えば、蒸留水又は超純水を用いることができる。水の量は、各成分の含有量が適当な範囲となるように適宜選択して決定することができる。
本発明のキットにおいて、発色試薬(B)又は基質安定化溶液(B2)のｐＨは、得られるDAB含有基質溶液のｐＨが、通常、５〜９、特に６〜８となるように調整することが、本発明の所望の効果を効率的に得るために好ましい。
ｐＨの調整は、塩酸等のｐＨ調整剤により行うことができる他、リン酸、Tris、MOPS、HEPES、ADA、CHES、MES等の緩衝剤を用いて行うこともできる。過酸化水素を含む発色試薬(B)又は得られるDAB含有基質溶液の保存安定性をより向上させる点からは塩酸等のｐＨ調整剤の使用が特に好ましい。
【００１９】
本発明のキットに用いる前記各溶液には、本発明の効果が損なわれない範囲で、また、他の効果を得るために他の成分を配合することができる。その他の成分としては、例えば、防腐剤、殺菌剤が挙げられる。
【００２０】
本発明のキットは、用手法でも自動機器を用いる方法のいずれでも使用することができる。特に、温度制御可能な自動機器及び自動免疫組織化学染色機器や、自動in situハイブリダイゼーション装置を用いた方法への使用が簡便で好ましい。
本発明のキットを用いた、IHC法、ICC法及びISH法における染色又は発色は、キットの各溶液を混合し、もしくは特定量の水にキットの各溶液を混合溶解して、DAB含有基質溶液を調製し、例えば、スライドガラスの検体組織や検体細胞を用いた酵素抗体法の場合、DAB含有基質溶液を標識した領域に、通常、室温（１５〜３０）℃で滴下し、１〜２０分間反応させることにより行うことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例、対照例及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが本発明はこれらに限定されない。
尚、以下に示す例において評価は下記のとおり行った。
評価項目(1)
特異染色強度：得られた試料の特異染色強度を光学顕微鏡により観察した。
評価は、対照例１又は２の特異染色強度を「＋」とし、これを基準にその強度が対照例１又は２の何倍であるかで評価した。
評価項目(2)
バックグラウンド染色：得られた試料のバックグラウンド染色を光学顕微鏡により観察した。
評価は、バックグラウンド染色が認められた比較例１又は８を「±」とし、バックグラウンド染色が認められない対照例１又は８を「−」として、比較例１又は８を基準に、その量より多いものを「＋」、約２倍多いものを「２＋」として評価した。
評価項目(3)
DAB含有基質溶液の色：後述する実施例及び比較例で調製したキットの各溶液を混合した後の混合溶液の色を目視で観察した。
評価項目(4)
DAB含有基質溶液中の沈殿物：後述する実施例及び比較例で調製したキットの各溶液を混合した後の混合溶液中の沈殿物の状態を目視で観察した。
評価項目(5)
保存安定性：後述する実施例及び比較例で調製したキットを、３７℃で保存した際に、調製直後のキットを混合して得られたDAB含有基質溶液を用いて評価した特異染色強度及びバックグラウンド染色と同程度の評価結果が得られる保存期間を測定した。【００２２】
ペルオキシダーゼ標識抗体を用いた免疫組織化学染色試料の作製
(Ａ)脱パラフィン工程及び親水化工程
ホルマリンで固定した後にパラフィン包埋したヒト小腸組織切片をミクロトームで３μmに薄切し、あらかじめシランコーティングされたコーティングスライドガラスに貼り付け、３７℃で１６時間乾燥させた。これを、キシレン層に３分×３回静置し、脱パラフィンを行った。その後、エタノール層に３分×４回静置し、親水化を行った。
(Ｂ)洗浄工程
最後のエタノール層静置後、ｐＨ７．６のリン酸緩衝液にて３分×３回の洗浄を行った。
(Ｃ)免疫組織化学染色工程【００２３】
用手法での免疫組織化学染色
(Ｂ)洗浄工程を行ったスライドガラスの水気を切り、３％過酸化水素／メタノール溶液に１０分間反応させ、内因性ペルオキシダーゼ除去を行い、反応終了後、ｐＨ７．６のリン酸緩衝液にて、３分×３回の洗浄を行った。
得られたスライドガラスの水気を切り、組織検体の周りをPAP ペン（大道産業社製）を用いて囲み、試薬の防波堤を作製した。
次いで、スライドガラスの水気を切り、マウス由来の一次抗体として、商品名「抗アクチン（平滑筋）モノクローナル抗体(クローン1A4)」(ニチレイバイオサイエンス社製）を、スライドガラスに１００μＬ滴下し、２５℃で６０分間反応させた。反応終了後、ｐＨ７．６のリン酸緩衝液にて３分×３回の洗浄を行った。
次に、洗浄したスライドガラスの水気を切って、アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼと、Fab'にした抗マウスIg及び抗ウサギIgを二次抗体として結合させた標識ポリマー（商品名「シンプルステインMAX-PO（MULTI）」、ニチレイバイオサイエンス社製）を100μL滴下し、２５℃で３０分間反応させた。反応終了後、ｐＨ７．６のリン酸緩衝液にて３分×３回の洗浄を行った。
該洗浄後、水気を切ったスライドガラスに、発色基質として、各実施例及び比較例で調製したキットにより得られるDAB含有基質溶液を滴下し、室温で５分間反応させた。反応終了後、５分間流水洗浄を行った。続いて、対比染色のためスライドガラスの水気を切り、マイヤーヘマトキシリンに３０秒間反応させ核染色させた後、５分間流水洗浄を行った。
次いで、スライドガラスの水気を切り、エタノール層通過×３回、エタノール層静置３分×１回、キシレン層通過１回、キシレン層静置５分×２回を行い、脱水・透徹を行った。その後、非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、封入を行って各試料を作製した。【００２４】
対照例１：イミダゾール、特定のキレート剤及び特定の界面活性剤を含まない３液タイプのDAB含有基質キット
最終に得られるDAB含有基質溶液中の濃度が１５ｍｇ／ｍＬとなる量のDABを蒸留水に溶解し、発色団含有溶液(A)を調製した。また、蒸留水に過酸化水素を０．６質量％となるように溶解した発色化溶液(B1)と、pH７．６のTris-HClの基質安定化溶液(B2')とを調製した。得られた発色団含有溶液(A)、発色化溶液(B1)及び基質安定化溶液(B2')からなるキットを用い、蒸留水１ｍＬに各溶液１滴（約４０μＬ）を混合撹拌して、DAB含有基質溶液を調製した。
得られたDAB含有基質溶液を用いて、上記方法にしたがって免疫組織化学染色試料を作製した。得られた試料について、評価項目(1)及び(2)を行った。結果を表１に示す。【００２５】
比較例１：特定の界面活性剤を含まない３液タイプのDAB含有基質キット
最終に得られるDAB含有基質溶液中の濃度が１５ｍｇ／ｍＬとなる量のDABを蒸留水に溶解し、発色団含有溶液(A)を調製した。また、蒸留水に過酸化水素量が０．６質量％となるように溶解した発色化溶液(B1)と、イミダゾール濃度０．５Ｍ、及びEDTA・2Na濃度２０ｍＭとなるように蒸留水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５に調整した基質安定化溶液(B2')とを調製した。得られた発色団含有溶液(A)、発色化溶液(B1)及び基質安定化溶液(B2')からなるキットを用い、蒸留水１ｍＬに各溶液１滴（約４０μＬ）を混合撹拌して、DAB含有基質溶液を調製した。得られた溶液中の過酸化水素の含有割合は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は０．８ｍＭであり、ｐＨは７．５であった。
得られたDAB含有基質溶液を用いて、上記方法にしたがって免疫組織化学染色試料を作製した。得られた試料について、評価項目(1)〜(4)を行った。尚、評価項目(3)及び(4)についてはDAB含有基質溶液の調製後１時間経過後に評価を行った。結果を表１及び表２に示す。【００２６】
実施例１：キレート剤としてEDTA・2Naを用いた３液タイプのDAB含有基質キット
基質安定化溶液(B2')の代わりに、イミダゾール濃度０．５Ｍ、EDTA・2Na濃度２０ｍＭ、及びPOE(23)ラウリルエーテル(Brij 35、SIGMA-ALDRICH社製)の含有割合が１質量％となるように蒸留水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５に調整した基質安定化溶液(B2)を調製した。この(B2)溶液の調製以外は、比較例１と同様に、キットを用いてDAB含有基質溶液を調製した。得られた溶液中の過酸化水素濃度は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は０．８ｍＭ、Brij 35の含有割合は０．０４質量％であり、ｐＨは７．５であった。また、各評価を比較例１と同様に行った。尚、評価項目(3)及び(4)については、DAB含有基質溶液の調製後３日経過後の評価も行った。結果を表１及び表２に示す。【００２７】
比較例２〜４：異なる界面活性剤を含む３液タイプのDAB含有基質キット
Brij 35の代わりに、表１に示すポリオキシソルビタン系非イオン界面活性剤であるTween 20、ポリオキシアルキルフェニルエーテル系非イオン界面活性剤であるTriton X-100又はショ糖脂肪酸エステルである商品名「DKエステルSS」（第一工業製薬社製）を用いた以外は、実施例１と同様に基質安定化溶液(B2')を調製した。発色団含有溶液(A)及び発色化溶液(B1)については、比較例１と同様に調製し、３液タイプのキットとした。得られたキットを用いて比較例１と同様にDAB含有基質溶液を調製し、各評価を実施例１と同様に行った。結果を表１及び表２に示す。尚、得られたDAB含有基質溶液中の各濃度は、実施例１と同様である。【００２８】
実施例２〜５：実施例１で用いたキレート剤の種類又は濃度を変更した３液タイプのDAB含有基質キット
EDTA・2Na２０ｍＭの代わりに、表１に示す濃度のEDTA・2NH4、NTA、GEDTA又はEDTA・2Naを用いた以外は、実施例１と同様に基質安定化溶液(B2)を調製した。発色団含有溶液(A)及び発色化溶液(B1)については、比較例１と同様に調製し、３液タイプのキットとした。得られたキットを用いて比較例１と同様にDAB含有基質溶液を調製し、各評価を実施例１と同様に行った。結果を表１及び表２に示す。尚、実施例５で得られたDAB含有基質溶液中の過酸化水素濃度は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は０．８ｍＭ、Brij 35の含有割合は０．０４質量％であり、ｐＨは７．５であった。【００２９】
比較例５〜７：異なるキレート剤を含む３液タイプのDAB含有基質キット
EDTA・2Naの代わりに、表１に示す濃度のクエン酸、酒石酸又は没食子酸を用いた以外は、比較例２と同様に基質安定化溶液(B2')を調製した。発色団含有溶液(A)及び発色化溶液(B1)については、比較例１と同様に調製し、３液タイプのキットとした。得られたキットを用いて比較例１と同様にDAB含有基質溶液を調製し、各評価を実施例１と同様に行った。但し、混合１時間後の溶液の色及び沈殿物の状態の評価については行わなかった。結果を表１及び表２に示す。尚、比較例５〜７で得られたDAB含有基質溶液中の過酸化水素濃度は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、クエン酸又は酒石酸濃度は０．８ｍＭ、没食子酸濃度は０．０８ｍＭ、Tween 20の含有割合は０．０４質量％であった。【００３０】
【表１】
2014133120.tif 000002
【００３１】
【表２】
2014133120.tif 000003
【００３２】
表１及び表２より、発色増強作用を有するイミダゾールを含有しない対照例１では、特異染色強度が低いが、バックグラウンド染色は生じなかった。これに対して、イミダゾールを含有する比較例１では、特定のキレート剤であるEDTA・2Naを含有しても、バックグラウンド染色が生じ、混合１時間後という短時間に溶液に沈澱が認められた。比較例３〜４は、POEアルキルエーテル系非イオン界面活性剤及び／又はPOPアルキルエーテル系非イオン界面活性剤以外の非イオン界面活性剤を配合することにより、比較例１よりも更に優れた特異染色強度を示したが、バックグラウンド染色も増強され、更に、混合３日後の溶液にも沈澱が認められた。比較例５〜６は、キレート剤をEDTA・2Naよりもキレート効果が低いものに変更した例であるが、この場合、特異染色強度がEDTA・2Naを用いた比較例２より低下し、バックグラウンド染色及び溶液の状態は比較例２とほぼ同様な結果であった。これに対して、実施例１では、特異染色強度が増強され、バックグラウンド染色も認められず、混合３日後の溶液に沈澱も認められなかった。更に、実施例２〜４より、EDTA・2Naを特定の他のキレート剤に変更した場合であっても実施例１と同様な効果が得られることがわかった。【００３３】
実施例６：イミダゾールの濃度を変更した３液タイプのDAB含有基質キット
イミダゾールの濃度０．５Ｍを、０．１Ｍ（DAB含有基質溶液中のイミダゾール濃度は４ｍＭ）、０．２Ｍ（DAB含有基質溶液中のイミダゾール濃度は８ｍＭ）、０．３Ｍ（DAB含有基質溶液中のイミダゾール濃度は１２ｍＭ）及び０．４Ｍ（DAB含有基質溶液中のイミダゾール濃度は１６ｍＭ）に変更した以外は、実施例１と同様に基質安定化溶液(B2)を調製し、実施例１と同様に３液タイプのキットとして、同様な評価を行った。その結果、特異染色強度が、＋１．５〜＋２．５の範囲で、イミダゾール濃度の用量依存的に増加することがわかった。バックグラウンド染色及び混合溶液の色並びに沈澱状態は、いずれも実施例１と同様であった。【００３４】
実施例７〜１３：界面活性剤の濃度を変更した３液タイプのDAB含有基質キット
Brij 35の濃度を表３に示す濃度に変更した以外は、実施例１と同様に基質安定化溶液(B2)を調製した。発色団含有溶液(A)及び発色化溶液(B1)については、比較例１と同様に調製し、３液タイプのキットとした。得られたキットを用いてDAB含有基質溶液を調製し、得られた混合直後の溶液を用いて免疫組織化学染色試料の作製を行った。得られた試料について、評価項目(1)及び(2)の評価を行った。結果を表３に示す。また、DAB含有基質溶液調製後、４℃遮光下にて２週間保存した後の混合溶液を用いて免疫組織化学染色試料の作製を行った。得られた試料について、評価項目(1)及び(2)の評価、並びに４℃遮光下にて２週間保存した後の混合溶液について評価項目(3)及び(4)の評価を行った。結果を表４に示す。尚、調製したDAB含有基質溶液中のBrij 35の濃度は、実施例７で０．０２質量％、実施例８で０．０６質量％、実施例９で０．０８質量％、実施例１０で０．１質量％、実施例１１で０．１２質量％、実施例１２で０．２質量％、実施例１３で０．４質量％であった。【００３５】
【表３】
2014133120.tif 000004
【００３６】
【表４】
2014133120.tif 000005
【００３７】
表４の結果より、特定の界面活性剤の濃度を高くすることで、DAB含有基質溶液を長期保存しても、該溶液に沈澱が生じず、保存安定性に優れることがわかった。
また、実施例１３については、キットを加速試験３７℃・３ヶ月および凍結融解試験マイナス２０℃保存・３日間を行った後に各溶液の混合をした後の評価も行った。その結果、染色性及び沈殿に問題はなかった。更に、加速試験及び凍結融解試験後に、混合溶液の４℃遮光下５日間保存しての評価も行ったが、特異染色強度の低下はほとんど認められず、バックグラウンド染色変化も認められなかった。しかし、７日経過後の混合溶液を用いた場合は、染色はされるが、当日調製したものと比較すると若干特異染色強度の低下が見られた。【００３８】
実施例１４：２液タイプのDAB含有基質キット
最終に得られるDAB含有基質溶液中の濃度が２０ｍｇ／ｍＬとなる量のDABを、蒸留水に溶解し、発色団含有溶液(A)を調製した。また、過酸化水素の含有割合が０．０２５質量％、イミダゾール濃度が２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度が２ｍＭ、及びBrij 35の含有割合が０．４質量％となるように蒸留水に溶解し、塩酸のみでｐＨを７．５に調整した発色試薬(B)を調製した。得られた発色団含有溶液(A)及び発色試薬(B)からなる２液タイプのキットを用い、(B)液５００μＬに対して、(A)液１滴（約２０μＬ）を混合撹拌して、DAB含有基質溶液を調製した。得られた溶液中の過酸化水素の含有割合は０．０２５質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は２ｍＭ、Brij 35の含有割合は０．４質量％であり、ｐＨは７．５であった。
得られたDAB含有基質溶液を用いて、上記方法にしたがって免疫組織化学染色試料を作製した。得られた試料について、評価項目(1)及び(2)を行い、得られたキットについて、評価項目(5)の保存安定性試験を行った。結果を表５に示す。【００３９】
実施例１５〜１８
塩酸のみでｐＨを７．５に調整せずに、表５に示す緩衝液をＨＣｌ又はＮａＯＨにて滴定し表５に示すｐＨに調整した以外は、実施例１４と同様に発色試薬(B)を調製した。その他、発色団含有溶液(A)の調製、並びに各評価は実施例１４と同様に行った。結果を表５に示す。【００４０】
【表５】
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MOPS:3-モルホリノプロパンスルホン酸、
HEPES:4-(2-ハイドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、
ADA:N-(2-アセトアミド)イミドジ酢酸、
CHES:N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸。
表５の結果より、発色試薬(B)は保存試験において、いずれも保存安定性に優れ、緩衝液を含まない実施例１４が特に優れていることがわかった。【００４１】
実施例１９
EDTA・2Naの濃度を２ｍＭから１ｍＭ、１．５ｍＭに変更した以外は、実施例１４と同様に発色試薬(B)を調製した。その他、発色団含有溶液(A)を調製し、特異染色強度、バックグラウンド染色の評価を行ったところ、いずれも実施例１４と同様であった。また、染色の色調を観察したところ、EDTA・2Na濃度が１ｍＭまでは、黄土色であったが、１．５ｍＭ以上の場合は、こげ茶色であり、より好ましい色調を示すことがわかった。【００４２】
用手法でのCISH（Chromogenic in situ Hybridization）
（Ａ）組織切片作製、脱パラフィン、親水化工程
パラフィン包埋した、あらかじめHER2陽性であることが確認されているヒト乳がん組織ホルマリン固定組織切片をミクロトームで５μmに薄切し、あらかじめシランコーティングされたスライドガラスに貼り付け、３７℃、１６時間乾燥させた。これをキシレン３分×３回静置し、脱パラフィンを行った。その後、エタノール３分×４回静置し、親水化を行った。
（Ｂ）前処理工程
最後のエタノール静置後、スライドの水気を切り、３％過酸化水素／水に入れ、内因性ペルオキシダーゼ除去を行い、２５℃、５分間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて１分×２回の洗浄を行った。
スライドの水気を切り、事前に温浴にて９８℃に温めておいた１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の中にスライドを入れ、３０分間反応させた。
反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて２分×２回の洗浄を行った。
スライドの水気を切り、プロテアーゼ（ニチレイバイオサイエンス社製）を１／５に希釈した溶液を１００μＬ滴下し、２５℃で３分間反応させ、反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて５分×３回の洗浄を行った。
脱水操作のため、７０％、９０％及び１００％エタノール（残り成分は脱イオン水）と２５℃で各１分間反応後、ドライヤーで冷風を直接スライドガラスにあて、組織を乾燥させた。【００４３】
変性及びハイブリダイゼーション
ヒト17番染色体上（17q21.1）に存在する、約２２０ｋｂの相補鎖となるような配列にリンカーを介してDIG標識を施したHER2プローブを乾燥した組織周辺に１０μＬ滴下した。
泡を避けながら、２２mm×２２mmのカバーガラス（松浪硝子工業社製）を組織上に載せ、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールした。シール後、スライドガラスを７５℃に設定されたホットプレートに置き、５分間熱変性を行った。反応後、スライドガラスを湿潤箱に移動し、３７℃で一晩反応させた。【００４４】
ポストハイブリダイゼーション及び検出
次に、注意して、ペーパーボンドをはがし、２×ＳＳＣ（クエン酸緩衝液）バッファーにて２５℃、５分間反応させた。その後、あらかじめ７２℃に温めた２×SSCバッファーにて５分間、その後リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて１分×２回の洗浄を行った。
アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab'にした抗DIG抗体を結合させた標識ポリマーを１００μＬ滴下し、２５℃で３０分間反応させ、反応終了後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）にて１分×３回の洗浄を行った。
反応前に実施例及び比較例で調製した各溶液からなるキットを用いてDAB含有基質溶液を調製した。スライドガラスの水気を切り、各１００μＬのDAB含有基質溶液を滴下し、室温で１０分間反応させた。反応終了後、５分間流水洗浄を行った。
続いて、対比染色のためスライドガラスの水気を切り、マイヤーヘマトキシリンに１５秒間反応させ核染色させた後、５分間流水洗浄を行った。
次いで、流水洗浄後、水気を切り、エタノール通過×３回、エタノール静置３分×１回、キシレン通過１回、キシレン静置５分×２回を行い、脱水・透徹を行った。その後、非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、封入を行って、各試料を作製した。【００４５】
対照例２：イミダゾール、特定のキレート剤及び特定の界面活性剤を含まない３液タイプのDAB含有基質キット
最終に得られるDAB含有基質溶液中の濃度が１５ｍｇ／ｍＬとなる量のDABを蒸留水に溶解し、発色団含有溶液(A)を調製した。また、蒸留水に過酸化水素を０．６質量％となるように溶解した発色化溶液(B1)と、pH７．６のTris-HClの基質安定化溶液(B2')とを調製した。得られた発色団含有溶液(A)、発色化溶液(B1)及び基質安定化溶液(B2')からなるキットを用い、蒸留水１ｍＬに各溶液１滴（約４０μＬ）を混合撹拌して、DAB含有基質溶液を調製した。
得られたDAB含有基質溶液を用いて、上記方法にしたがってCISH試料を作製した。得られた試料について、評価項目(1)及び(2)を行った。結果を表６に示す。【００４６】
比較例８：特定の界面活性剤を含まない３液タイプのDAB含有基質キット
最終に得られるDAB含有基質溶液中の濃度が１５ｍｇ／ｍＬとなる量のDABを蒸留水に溶解し、発色団含有溶液(A)を調製した。また、蒸留水に過酸化水素量が０．６質量％となるように溶解した発色化溶液(B1)と、イミダゾール濃度０．５Ｍ、及びEDTA・2Na濃度２０ｍＭとなるように蒸留水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５に調整した基質安定化溶液(B2')とを調製した。得られた発色団含有溶液(A)、発色化溶液(B1)及び基質安定化溶液(B2')からなるキットを用い、蒸留水１ｍＬに各溶液１滴（約４０μＬ）を混合撹拌して、DAB含有基質溶液を調製した。得られた溶液中の過酸化水素の含有割合は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は０．８ｍＭであり、ｐＨは７．５であった。
得られたDAB含有基質溶液を用いて、上記方法にしたがってCISH試料を作製した。得られた試料について、評価項目(1)〜(4)を行った。尚、評価項目(3)及び(4)についてはDAB含有基質溶液の調製後１時間経過後に評価を行った。結果を表６に示す。【００４７】
実施例２０：キレート剤としてEDTA・2Naを用いた３液タイプのDAB含有基質キット
基質安定化溶液(B2')の代わりに、イミダゾール濃度０．５Ｍ、EDTA・2Na濃度２０ｍＭ、及びBrij 35(SIGMA-ALDRICH社製)の含有割合が１０質量％となるように蒸留水に溶解し、塩酸でｐＨを７．５に調整した基質安定化溶液(B2)を調製した。この(B2)溶液の調製以外は、比較例８と同様にキットを用いてDAB含有基質溶液を調製した。得られた溶液中の過酸化水素濃度は０．０２４質量％、イミダゾール濃度は２０ｍＭ、EDTA・2Na濃度は０．８ｍＭ、Brij 35の含有割合は０．４質量％であり、ｐＨは７．５であった。また、各評価を比較例８と同様に行った。尚、評価項目(3)及び(4)については、DAB含有基質溶液の調製後３日経過後の評価も行った。結果を表６及び表７に示す。【００４８】
【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
以上の結果から本発明のキットは、CISHに使用した際でも、特異染色強度の増強、バックグラウンド染色の低減及びDAB含有基質溶液中の沈澱抑制効果があることがわかった。
【国際調査報告】
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