(57)【要約】  測定装置は、金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの金属膜上に検体を提供して、捕捉体と被検出物質とを結合させる（第１工程）。第１工程の後、測定装置は、金属膜の温度を測定し、金属膜の温度と増強角または共鳴角との関係の情報に基づいて、入射光の入射角を増強角または共鳴角に決定する（第２工程）。第２の工程の後、測定装置は、増強角または共鳴角で金属膜に対して入射光を照射させ、入射光によって生じたシグナルを検出することで被検出物質を検出する（第３工程）。
2016098653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するための検出方法であって、
金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜上に前記検体を提供して、前記捕捉体と前記被検出物質とを結合させる第１工程と、
前記第１工程の後、前記金属膜の温度を直接的または間接的に測定し、前記金属膜の温度と入射光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射光の入射角である増強角または前記金属膜に照射された入射光の反射光の光量が最小となるときの入射光の入射角である共鳴角との関係の情報に基づいて、入射光の入射角を前記増強角または前記共鳴角に決定する第２工程と、
前記第２工程の後、前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に対して入射光を照射させ、入射光によって生じたシグナルを検出することで前記被検出物質を検出する第３工程と、を含む、
検出方法。
【請求項２】
前記第１工程では、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜の表面に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜上に前記検体および前記被検出物質を標識する蛍光物質を提供して、前記捕捉体と前記被検出物質とを結合させ、かつ前記被検出物質を前記蛍光物質で標識させ、
前記第２工程では、前記金属膜の温度と、前記プリズムを介して前記金属膜の裏面に照射された励起光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となる前記増強角との関係の情報に基づいて、励起光の前記入射角を前記増強角に決定し、
前記第３工程では、前記プリズムを介して前記金属膜の裏面に対して励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記被検出物質を検出する、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記第１工程では、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有するチップの前記回折格子に前記検体および前記被検出物質を標識する蛍光物質を提供して、前記捕捉体と前記被検出物質とを結合させ、かつ前記被検出物質を前記蛍光物質で標識させ、
前記第２工程では、前記金属膜の温度と、前記回折格子に照射された励起光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となる前記増強角との関係の情報に基づいて、励起光の前記入射角を前記増強角に決定し、
前記第３工程では、前記増強角で前記捕捉体が固定された前記回折格子に対して励起光を照射し、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで前記被検出物質を検出する、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記金属膜の温度と、照射された励起光によって生じる蛍光の強度との関係の情報に基づいて、前記第３工程で検出された蛍光の強度を補正する第４工程をさらに有する、請求項２または請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
前記第１工程では、入射面、成膜面および出射面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜上に前記検体を提供して、前記捕捉体と前記被検出物質とを結合させ、
前記第２工程では、前記金属膜の温度と、前記プリズムを介して前記金属膜に照射され、前記金属膜で反射され、かつ前記出射面から出射された励起光の反射光の光量が最小となる前記共鳴角との関係の情報に基づいて、入射光の前記入射角を前記共鳴角に決定し、
前記第３工程では、反射光を検出することで前記被検出物質を検出する、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するための検出装置であって、
表面プラズモン共鳴が生じるように、金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜に入射光を照射する光照射部と、
前記金属膜に照射された入射光によって生じたシグナルを検出する光検出部と、
前記金属膜の温度を直接的または間接的に測定する温度測定部と、
前記金属膜の温度と、入射光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射光の入射角である増強角または前記金属膜に照射された入射光の反射光の光量が最小となるときの入射光の入射角である共鳴角との関係の情報を記憶している記憶部と、
前記温度測定部で測定した前記金属膜の温度と、前記記憶部に記憶された情報とに基づいて、入射光の前記入射角を前記増強角または前記共鳴角に決定する処理部と、を有し、
前記光照射部は、前記処理部により決定された前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に対して入射光を照射し、
前記光検出部は、前記処理部により決定された前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に照射された入射光によって生じたシグナルを検出する、
検出装置。
【請求項７】
前記チップは、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有し、
前記光照射部は、前記金属膜に対して前記プリズムを介して励起光を照射し、
前記光検出部は、前記金属膜に照射された励起光によって前記被検出物質を標識した前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、
前記記憶部は、前記金属膜の温度と、照射された入射光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となる前記増強角との関係の情報を記憶し、
前記処理部は、前記温度測定部で測定した前記金属膜の温度と、前記記憶部に記憶された情報とに基づいて、励起光の前記入射角を前記増強角に決定する、
請求項６に記載の検出装置。
【請求項８】
前記チップは、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定され、蛍光物質で標識される被検出物質を捕捉するための捕捉体とを有し、
前記光照射部は、前記回折格子に対して励起光を照射し、
前記光検出部は、前記回折格子に照射された励起光によって前記被検出物質を標識した前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、
前記記憶部は、前記金属膜の温度と、照射された入射光によって前記金属膜に生じるプラズモン散乱光の強度が最大となる前記増強角との関係の情報を記憶し、
前記処理部は、前記温度測定部で測定された前記金属膜の温度と、前記記憶部に記憶された情報とに基づいて、励起光の前記入射角を前記増強角に決定する、
請求項６に記載の検出装置。
【請求項９】
前記チップは、入射面、成膜面および出射面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有し、
前記光照射部は、前記金属膜に対して前記プリズムを介して入射光を照射し、
前記光検出部は、前記金属膜で反射され、かつ前記出射面から出射された入射光の反射光を検出し、
前記記憶部は、前記金属膜の温度と、励起光の反射光の光量が最小となる前記共鳴角との関係の情報を記憶し、
前記処理部は、前記温度測定部で測定された前記金属膜の温度と、前記記憶部に記憶された情報とに基づいて、入射光の前記入射角を前記共鳴角に決定する、
請求項６に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出する検出方法および検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。【０００３】
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
特許文献１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分析法は、金属薄膜が形成されたプリズムに対して金属薄膜で全反射するように金属薄膜への入射角を変化させながら励起光を照射し、金属薄膜で励起光が全反射されることにより金属薄膜の表面に生じるプラズモン散乱光を測定する工程と、測定されたプラズモン散乱光の強度が最大となる入射角（増強角）を励起光の金属薄膜に対する入射角に決定する工程と、被検出物質に特異的に結合できる第１捕捉体（例えば１次抗体）が固定された金属薄膜上に、被検出物質および蛍光物質で標識された第２捕捉体（例えば２次抗体）を提供する反応工程と、決定した増強角で励起光を照射し、金属薄膜上の被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光の蛍光強度を測定する検出工程と、を含む。【０００５】
特許文献１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分析法では、金属薄膜上に被検出物質を提供すると、第１捕捉体に被検出物質が結合する。次いで、被検出物質が結合した金属薄膜上に第２捕捉体および蛍光物質を提供すると、被検出物質が蛍光物質で標識される。この状態で金属薄膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）により増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１５２０６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分析法で用いられる増強角は、温度により異なることが知られている。具体的には、増強角は、金属薄膜の温度変化によって当該金属薄膜の屈折率が増加または減少することや、プリズムが温度変化により膨張または収縮することなどによって変化してしまう。特に、温度を調整しない分析方法では、増強角の決定時と、被検出物質の検出時との温度が異なる場合があるため、被検出物質の検出時において、最適な増強角で被検出物質を検出できず、検出精度が低下してしまうという問題があった。【０００８】
本発明の目的は、表面プラズモン共鳴を利用する検出方法および検出装置であって、被検出物質をより高感度に検出することができる検出方法および検出装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するための検出方法であって、金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜上に前記検体を提供して、前記捕捉体と前記被検出物質とを結合させる第１工程と、前記第１工程の後、前記金属膜の温度を直接的または間接的に測定し、前記金属膜の温度と入射光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射光の入射角である増強角または前記金属膜に照射された入射光の反射光の光量が最小となるときの入射光の入射角である共鳴角との関係の情報に基づいて、入射光の入射角を前記増強角または前記共鳴角に決定する第２工程と、前記第２工程の後、前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に対して入射光を照射させ、入射光によって生じたシグナルを検出することで前記被検出物質を検出する第３工程と、を含む。【００１０】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、表面プラズモン共鳴を利用して、検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出するための検出装置であって、表面プラズモン共鳴が生じるように、金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有するチップの前記金属膜に入射光を照射する光照射部と、前記金属膜に照射された入射光によって生じたシグナルを検出する光検出部と、前記金属膜の温度を直接的または間接的に測定する温度測定部と、前記金属膜の温度と、入射光によって前記金属膜から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射光の入射角である増強角または前記金属膜に照射された入射光の反射光の光量が最小となるときの入射光の入射角である共鳴角との関係の情報を記憶している記憶部と、前記温度測定部で測定した前記金属膜の温度と、前記記憶部に記憶された情報とに基づいて、入射光の前記入射角を前記増強角または前記共鳴角に決定する処理部と、を有し、前記光照射部は、前記処理部により決定された前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に対して入射光を照射し、前記光検出部は、前記処理部により決定された前記増強角または前記共鳴角で前記金属膜に照射された入射光によって生じたシグナルを検出する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、表面プラズモン共鳴を利用する検出方法および検出装置において、被検出物質をより高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施の形態１に係る検出装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、チップの構成を示す図である。
【図３】図３は、実施の形態１に係る検出装置の動作を示すフローチャートである。
【図４】図４は、入射角の調整方法を示すフローチャートである。
【図５】図５は、金属膜の温度差と、入射角の補正角度との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、実施の形態２に係る検出装置の構成を示す模式図である。
【図７】図７Ａ、Ｂは、回折格子の斜視図である。
【図８】図８Ａ、Ｂは、チップの第２の態様を模式的に示す図である。
【図９】図９は、実施の形態２に係る検出装置の動作を示すフローチャートである。
【図１０】図１０は、実施の形態１、２に係る検出装置の他の動作を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、蛍光強度の補正方法を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、金属膜の温度差と、蛍光強度の補正係数との関係を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施の形態３に係る検出装置の構成を示す模式図である。
【図１４】図１４は、実施の形態３に係る検出装置の動作を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１４】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る検出装置１００の構成を示す模式図である。
【００１５】
図１に示されるように、検出装置１００は、チップホルダー７０と、光照射部１１０と、光検出部１２０と、温度測定部１３０と、記憶部１４１および処理部１４２を含む制御部１４０とを有する。検出装置１００は、チップホルダー７０にプリズム２０を有するチップ１０を装着した状態で使用される。実施の形態１に係る検出装置１００は、プリズム２０を利用するプリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳ装置である。そこで、プリズム２０を有するチップ１０について先に説明し、その後に検出装置１００について説明する。
【００１６】
（チップの構成）
図２は、チップの構成を示す模式図である。図２Ａは、チップ１０の斜視図であり、図２Ｂは、チップ１０の断面図であり、図２Ｃは、チップ１０’の他の形態の断面図である。
【００１７】
図２Ａ、Ｂに示されるように、チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。通常、チップ１０は、検出ごとに交換される。
【００１８】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、光照射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０の裏面で反射した励起光αの反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
【００１９】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。
【００２０】
入射面２１は、励起光αが光照射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、所定の走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２とのなす角度および成膜面２２と出射面２３とのなす角度は、いずれも約８０°である。
【００２１】
なお、チップ１０の設計により、増強角が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０に固定化された被検出物質によって増強角がシフトするが、その量は数度未満である。ここで「増強角」とは、金属膜３０に励起光αを照射したことにより、金属膜３０で生じるプラズモン散乱光の光量が最大となる励起光αの入射角である。
【００２２】
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１．４〜１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２３】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。
【００２４】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２５】
金属膜３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、金属膜３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００２６】
捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。
【００２７】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４３を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。流路４３の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口４１および排出口４２にそれぞれ接続されている。なお、後述の接触式の温度センサー１３１は、注入口４１または排出口４２から挿入され、金属膜３０の温度を測る（図２Ｂ参照）。
【００２８】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２９】
なお、図２Ｃに示されるように、チップ１０’は、流路４３に代えてウェル４４を有していてもよい。このチップ１０’では、ウェル４４の開口部（流路蓋４０’に形成された貫通孔）から検体を提供したり、温度センサー１３１によって金属膜３０の温度を測定したりする。
【００３０】
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。検出装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。
【００３１】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、検出装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、検出装置１００は、チップホルダー７０と、光照射部１１０と、光検出部１２０と、温度測定部１３０と、記憶部１４１および処理部１４２を含む制御部１４０とを有する。
【００３２】
チップホルダー７０は、チップ１０を保持する。チップホルダー７０の形状は、チップ１０を保持することができ、かつ励起光αの光路を妨げなければ特に限定されない。本実施の形態では、チップホルダー７０は、流路蓋４０を側方から把持することでチップ１０を保持するように構成されている。
【００３３】
光照射部１１０は、チップホルダー７０に保持されたチップ１０（金属膜３０の裏面）に励起光αを出射する。蛍光γの測定時には、光照射部１１０は、金属膜３０に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、励起光αを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。
【００３４】
光照射部１１０は、光源ユニット１１１、第１角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００３５】
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００３６】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３７】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射される光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３８】
第１角度調整機構１１２は、金属膜３０の裏面（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。第１角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０裏面の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップ１０（金属膜３０）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整機構１１２は、励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を回転軸として光源ユニット１１１を回動させる。このとき、入射角を変化させても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３９】
前述したように、金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの最大光量を得られる角度が増強角である。増強角の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。なお、チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４３内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４３内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。本実施の形態では、金属膜３０の法線Ｎに対する励起光αの好適な出射角は、約７０°である。
【００４０】
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１の出射光（励起光α）の出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４１】
光検出部１２０は、被検出物質の検出時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じた蛍光γと、増強角の測定時において金属膜３０の裏面への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δとを検出する。光検出部１２０は、例えば、受光ユニット１２１、位置切替機構１２２および受光センサー制御部１２３を含む。
【００４２】
受光ユニット１２１は、チップ１０の金属膜３０の表面に対する法線Ｚ方向に配置される。受光ユニット１２１は、第１レンズ１２４、光学フィルター１２５、第２レンズ１２６および受光センサー１２７を含む。
【００４３】
第１レンズ１２４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１２６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１２４で集光された光を受光センサー１２７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１２５は、両レンズの間に配置されている。
【００４４】
光学フィルター１２５は、蛍光成分のみを受光センサー１２７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１２５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターであるが、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであってもよい。
【００４５】
受光センサー１２７は、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１２７は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光γまたはプラズモン散乱光δを検出することが可能な高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４６】
位置切替機構１２２は、光学フィルター１２５の位置を、受光ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、位置切替機構１２２は、受光センサー１２７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に配置する。位置切替機構１２２は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター１２５を水平方向に移動させる公知の機構（ターンテーブルやラックアンドピニオンなど）とによって構成される。
【００４７】
受光センサー制御部１２３は、受光センサー１２７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２７の感度の変更などを制御する。受光センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４８】
温度測定部１３０は、金属膜３０の温度を直接的または間接的に測定する。温度測定部１３０は、温度センサー１３１および温度センサー調整機構１３２を有する。温度センサー１３１の種類は、金属膜３０の温度を測定することができれば、特に限定されず、接触式であってもよいし、非接触式であってもよい。接触式の温度センサー１３１の例には、サーミスタ温度計、測温抵抗体温度計、熱電対温度計などが含まれる。また、非接触式の温度センサー１３１の例には、放射温度計、二色温度計、サーモグラフィーなどが含まれる。本実施の形態では、温度センサー１３１は、接触式の温度計である。温度センサー調整機構１３２は、温度センサー１３１の位置や、検出した出力値を制御部１４０（記憶部１４１）に送る。
【００４９】
制御部１４０は、例えば、記憶部１４１、処理部１４２、演算装置、制御装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されており、第１角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切替機構１２２、温度センサー調整機構１３２および受光センサー制御部１２３を制御する。記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、最適な入射光の入射角との関係の情報を記憶している。具体的には、本実施の形態では、記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、照射された入射光によって金属膜３０から生じるプラズモン散乱光δの強度が最大となる増強角との関係の情報を記憶している。この情報は、被検出物質の検出前に作成してもよいし、外部で作成されたものであってもよい。処理部１４２は、温度測定部１３０で測定した金属膜３０の温度と、記憶部１４１に記憶された情報とに基づいて、入射光の入射角を最適な入射角（増強角）に決定する。
【００５０】
（検出装置の検出動作）
次に、検出装置１００の検出動作（実施の形態１に係る検出方法）について説明する。図３は、検出装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜３０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
【００５１】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、チップ１０を準備して、チップホルダー７０にチップ１０を設置する。また、チップ１０の金属膜３０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５２】
次いで、検体中の被検出物質と一次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。具体的には、金属膜３０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜３０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００５３】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜３０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。蛍光物質で標識した後は、金属膜３０上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。
【００５４】
なお、１次反応（工程Ｓ１２０）と２次反応（工程Ｓ１３０）との順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜３０上に提供してもよい。また、金属膜３０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００５５】
次いで、入射角を調整する（工程Ｓ１４０）。具体的には、制御部１４０は、温度測定部１３０に測定させた金属膜３０の温度と、プリズム２０を介して金属膜３０の裏面に照射された励起光αによって金属膜３０から生じるプラズモン散乱光の強度が最大となる増強角との関係の情報に基づいて、励起光αの入射角をその金属膜３０における増強角に決定する。
【００５６】
ここで、図４および図５を参照して、金属膜３０の温度と、入射角の補正角度との関係の求め方について詳細に説明する。図４は、入射角の調整方法を説明するためのフローチャートである。図５は、金属膜の温度差と、増強角の補正角度との関係を示すグラフである。図５の横軸は、金属膜の温度差（℃）であり、縦軸は入射角の補正角度（°）である。
【００５７】
増強角は、温度によりわずかに変化することが知られている。そこで、本実施の形態では、金属膜３０の温度に応じて入射角をその温度における増強角に設定し、当該入射角で励起光αを照射して、励起された蛍光物質から放出された蛍光γを検出することで、被検出物質の検出精度を向上させている。具体的には、予め記憶部１４１に金属膜３０の基準温度（例えば、２０°）と任意の金属膜３０の温度との温度差（℃）と、その温度差における入射角の補正角度（°）との関係の情報を記憶しておく。ここで、入射角の補正角度（°）とは、金属膜３０の基準温度と、検出時の金属膜３０の温度との差分値（温度差）に対して、検出時の金属膜の温度における増強角に合わせるための、基準温度における増強角からの増強角の差分値である。図４および図５に示されるように、金属膜３０の温度差と、入射角の補正角度との関係を求めるためには、まず、任意の複数の金属膜３０の温度と、当該金属膜３０の温度における増強角を測定する（工程Ｓ１４１）。金属膜３０の温度を直接的に測定する場合には、温度センサー１３１を流路蓋４０の注入口４１または排出口４２に挿入し、温度センサー１３１を金属膜３０に接触させて測定する。また、金属膜３０の温度を関節的に測定する場合には、温度センサー１３１を流路蓋４０上に移動させた状態で流路蓋４０または検体の温度を測定する。このとき、金属膜３０の温度は、流路蓋４０または検体の温度に近似している。次いで、基準温度と前記任意の金属膜３０の温度との差分値をそれぞれ求める（工程Ｓ１４２）。そして、基準温度における増強角と前記任意の金属膜３０の温度における増強角の差分値をそれぞれ求める（工程Ｓ１４３）。なお、増強角を求めるためには、第１角度調整機構１１２により励起光αの光軸の角度を走査しながら、受光センサー１２７によりプラズモン散乱光δを検出する。そして、プラズモン散乱光δの光量が最大となる励起光αの入射角を増強角とする。
【００５８】
次いで、制御部１４０は、温度測定部１３０を駆動して、金属膜３０の温度を測定する（工程Ｓ１４４）。次いで、制御部１４０は、当該金属膜３０の温度と基準温度との差分値（温度差）を求める。そして、制御部１４０は、当該差分値に対応する入射角の補正角度を求めた後、検出時の金属膜３０の温度に対応する増強角を決定する。最後に、第１角度調整機構１１２を駆動して、励起光αの入射角を増強角となるように調整する（工程Ｓ１４５）。
【００５９】
次いで、被検出物質を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１１３を駆動して励起光αを工程Ｓ１４０で決定した入射角で金属膜３０の所定の位置に照射させながら、受光センサー制御部１２３を駆動して金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を検出するように受光センサー１２７を制御する。このとき、制御部１４０は、位置切替機構１２２を操作して、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路上に配置する。このとき、光学フィルター１２５はプラズモン散乱光δを透過させないため、蛍光γのみが受光センサー１２７に検出される。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
【００６０】
なお、検出装置１００は、２次反応（工程Ｓ１３０）の前にブランク値を測定してもよい。この場合、被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１５０）では、蛍光γの検出値からブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す蛍光γの量を算出する。ブランク値の測定では、制御部１４０は、入射光の入射角を走査しながら、金属膜３０上に励起光αを照射する。そして、制御部１４０は、励起光αの照射により金属膜３０から生じたプラズモン散乱光の強度の最大値をブランク値として得る。
【００６１】
以上のように、本実施の形態に係る検出装置１００は、金属膜３０の温度に関わらず、増強角で被検出物質を検出することができるため、被検出物質をより高感度に検出することができる。
【００６２】
［実施の形態２］
実施の形態２に係る検出装置２００は、回折格子５０を利用する格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳ装置である点において、実施の形態１に係る検出装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係る検出装置１００と同様の構成については同一の符号を付してその説明を省略する。
【００６３】
図６は、実施の形態２に係る検出装置２００の構成を示す図である。
【００６４】
図６に示されるように、検出装置２００は、チップホルダー８０と、光照射部１１０と、光検出部２２０と、温度測定部１３０と、記憶部１４１および処理部１４２を含む制御部１４０とを有する。検出装置２００は、チップホルダー８０に回折格子５０を有するチップ９０を装着した状態で使用される。
【００６５】
（チップの構成）
図７Ａ、Ｂおよび図８Ａ、Ｂは、チップ９０の構成を示す模式図である。図７Ａは、１次元回折格子の斜視図であり、図７Ｂは、２次元回折格子の斜視図である。図８Ａは、チップ９０の第１の態様を模式的に示す図であり、図８Ｂは、チップ９０’の第２の態様を模式的に示す図である。
【００６６】
図６〜図８に示されるように、チップ９０は、基板６０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。金属膜３０には、回折格子５０が形成されている。回折格子５０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子５０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図６では、捕捉体および被検出物質を省略している。
【００６７】
基板６０は、金属膜３０の支持部材である。基板６０の材料は、金属膜３０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板６０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
【００６８】
金属膜３０は、基板６０上に配置されている。前述のとおり、金属膜３０には、回折格子５０が形成されている。金属膜３０に光を照射すると、金属膜３０中に生じる表面プラズモンと、回折格子５０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。本実施の形態のおける金属膜３０の材料、形成方法および厚みは、実施の形態１における金属膜３０と同じ材料、同じ形成方法および同じ厚みである。
【００６９】
回折格子５０は、金属膜３０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子５０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子５０は、図７Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図７Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図７Ａに示される１次元回折格子では、金属膜３０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図７Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜３０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子５０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。
【００７０】
回折格子５０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板６０の上に金属膜３０を形成した後、金属膜３０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板６０の上に、金属膜３０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子５０を含む金属膜３０を形成することができる。
【００７１】
図６に示されるように、励起光αは、所定の入射角で金属膜３０（回折格子５０）に照射される。照射領域では、金属膜３０で生じた表面プラズモンと、回折格子５０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光γが放出される。ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光γは特定の方向に指向性を持って出射される。なお、励起光αの反射光は、ほとんど生じない。
【００７２】
なお、チップ９０は、図８Ｂに示されるように、流路４３に変えてウェル４４を有していてもよい。この場合、チップ９０’は、ウェル４４の開口部（流路蓋４０’に形成された貫通孔）から検体を提供したり、温度センサー１３１によって金属膜３０の温度を測定したりする。
【００７３】
（検出装置の構成）
次に、検出装置２００の各構成要素について説明する。前述のとおり、検出装置２００は、チップホルダー８０と、光照射部１１０と、光検出部２２０と、温度測定部１３０と、記憶部１４１および処理部１４２を含む制御部１４０と有する回折格子５０を利用する格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳ装置である。
【００７４】
チップホルダー８０は、上面が開放された箱状に形成されている。チップホルダー８０は、その内部にチップ９０を収容する。
【００７５】
光照射部１１０は、波長および光量が一定の励起光αを、チップ９０の金属膜３０（回折格子５０）に照射する。このとき、光照射部１１０は、金属膜３０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子５０で生じるように、励起光αを金属膜３０（回折格子５０）に照射する。励起光αの光軸は、回折格子５０における周期的構造の配列方向（図７Ａ、Ｂにおけるｘ軸方向）に沿う。
【００７６】
光照射部１１０は、光源ユニット１１１、第１角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００７７】
第１角度調整機構１１２は、回折格子５０への励起光αの入射角を調整する。第１角度調整機構１１２は、励起光αの光軸と金属膜３０との交点を通り、かつ金属膜３０の表面上の直線を回転軸として励起光αの光軸とチップ１０（金属膜３０）とを相対的に回転させる。本実施の形態では、第１角度調整機構１１２は、励起光αの光軸と金属膜３０との交点を通り、かつ金属膜３０の表面上の直線を回転軸として光照射部１１０を回転させる。励起光αの入射角は、回折格子５０のピッチや励起光αの波長、金属膜３０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。
【００７８】
光検出部２２０は、光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜３０との交点を通り、かつ金属膜３０の表面に対する法線Ｎを挟むように配置されている。光検出部２２０は、金属膜３０に生じるプラズモン散乱光δまたは回折格子５０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光γを検出する。
【００７９】
光検出部２２０は、例えば、受光センサー１２７、第２角度調整機構２２１および受光センサー制御部１２３を含む。光検出部２２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。受光センサー１２７は、プラズモン散乱光δまたは蛍光γを検出する。
【００８０】
第２角度調整機構２２１は、受光センサー１２７が蛍光γを検出できるように、受光センサー１２７の光軸を調整する。第２角度調整機構２２１は、蛍光γの光軸と金属膜３０の交点を通り、かつ蛍光γの光軸に直交する軸を回転軸として受光センサー１２７を回動させる。
【００８１】
受光センサー１２７は、蛍光γを検出して、金属膜３０上の蛍光像を検出する。たとえば、受光センサー１２７は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。受光センサー１２７は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。
【００８２】
集光レンズ群（図示省略）は、チップ９０と受光センサー１２７との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜３０上の蛍光像を受光センサー１２７の受光面上に結像させる。
【００８３】
蛍光フィルター（図示省略）は、チップ９０と受光センサー１２７との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、受光センサー１２７に到達する光から蛍光γ以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、受光センサー１２７に到達する光の光量を調整したりする。
【００８４】
制御部１４０は、例えば、記憶部１４１、処理部１４２、制御装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されており、第１角度調整機構１１２、光源制御部１１３、温度センサー調整機構１３２、受光センサー制御部１２３、第２角度調整機構２２１を制御する。記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、最適な入射光の入射角との関係の情報を記憶している。具体的には、本実施の形態では、記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、照射された入射光によって金属膜３０から生じるプラズモン散乱光δの強度が最大となる増強角との関係の情報を記憶している。この情報は、被検出物質の検出前に作成してもよいし、外部で作成されたものであってもよい。処理部１４２は、温度測定部１３０で測定した金属膜３０の温度と、記憶部１４１に記憶された情報とに基づいて、入射光の入射角を最適な入射角（増強角）に決定する。
【００８５】
（検出装置の検出動作）
次に、実施の形態２に係る検出装置２００の検出動作（検出方法）について説明する。なお、実施の形態１に係る検出装置１００の検出動作と同じ工程は、同じ符号を付してその説明を省略する。
【００８６】
図９は、検出装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜３０（回折格子５０）上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
【００８７】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。
【００８８】
次いで、検体中の被検出物質と一次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。
【００８９】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。
【００９０】
次いで、入射角を調整する（工程Ｓ２４０）。具体的には、制御部１４０は、温度測定部１３０に測定させた金属膜３０の温度と、金属膜３０の表面（回折格子５０）に照射された励起光αによって金属膜３０から生じるプラズモン散乱光δの強度が最大となる増強角との関係の情報に基づいて、励起光αの入射角を増強角に決定する。なお、金属膜３０の温度と、増強角との関係の求め方は、励起光αを金属膜３０の表面（回折格子５０）に照射する点以外は、実施の形態１における工程Ｓ１４０と同様であるので、その説明を省略する。
【００９１】
次いで、被検出物質を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１１３により励起光αを工程Ｓ２４０で決定した増強角で金属膜３０の所定の位置に照射させながら、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を検出するように受光センサー制御部１２３を制御する。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
【００９２】
なお、検出装置２００でも、２次反応（工程Ｓ１３０）の前にブランク値を測定してもよい。この場合、被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１５０）では、蛍光γの検出値からブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す蛍光γの量を算出する。
【００９３】
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００は、実施の形態１に係る検出装置１００と同様の効果を有する。
【００９４】
（変形例）
同じ量の蛍光物質であっても、温度の違いによって当該蛍光物質から放出される蛍光γの強度が異なる場合がある。そこで、実施の形態１の変形例に係る検出方法では、蛍光γの強度を補正している。実施の形態１、２に係る検出装置１００、２００の他の検出動作は、検出された蛍光γの強度を補正する工程Ｓ１６０をさらに有していてもよい。なお、実施の形態１、２に係る検出装置１００、２００の検出動作と同じ工程は、同じ符号を付してその説明を省略する。
【００９５】
図１０は、実施の形態１、２に係る検出装置１００、２００の動作手順の他の一例を示すフローチャートである。
【００９６】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。
【００９７】
次いで、検体中の被検出物質と一次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。
【００９８】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。
【００９９】
次いで、増強角を調整する（工程Ｓ１４０、工程Ｓ２４０）。
【０１００】
次いで、被検出物質を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１１３により励起光αを工程Ｓ１４０、または工程Ｓ２４０で決定した増強角で金属膜３０の所定の位置に照射させながら、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を検出するように受光センサー制御部１２３を制御する。
【０１０１】
次いで、検出した蛍光強度を補正する（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部１４０は、金属膜３０の温度と、照射された励起光によって生じる蛍光γの強度との関係の情報に基づいて、受光センサー１２７で検出された蛍光強度を調整する。
【０１０２】
ここで、図１１および図１２を参照して、金属膜３０の温度と、蛍光強度の補正係数との関係の求め方について詳細に説明する。図１１は、蛍光強度の補正方法を説明するためのフローチャートである。図１２は、金属膜の温度差と、蛍光強度の補正係数との関係をグラフに表したものであり、図１２の横軸は、金属膜の温度差（℃）であり、縦軸は蛍光強度の補正係数である。
【０１０３】
図１１および図１２に示されるように、記憶部１４１には、金属膜３０の基準温度（例えば、２０°）と任意の金属膜３０の温度との温度差（℃）と、その温度差における蛍光強度の補正係数との関係の情報を記憶しておく。ここで、蛍光強度の補正係数とは、金属膜３０の基準温度と、検出時の金属膜３０の温度との差分値（温度差）に対して、検出時の金属膜の温度における適切な蛍光強度に合わせるための、基準温度における蛍光強度に対する任意の温度における蛍光強度の割合である。金属膜３０の温度差と、蛍光強度の補正係数との関係は、まず、任意の複数の金属膜３０の温度と、当該金属膜３０の温度における蛍光強度を測定する（工程Ｓ１６１）。このとき、励起光αの入射角度は増強角であることが好ましい。次いで、基準温度における蛍光強度に対する任意の温度における蛍光強度の割合をそれぞれ求める（工程Ｓ１６２）。
【０１０４】
次いで、制御部１４０は、被検出物質の検出時（工程Ｓ１５０）における金属膜３０の温度と基準温度との差分値（温度差）を求める（工程Ｓ１６３）。そして、制御部１４０は、当該差分値に対応する蛍光強度の補正係数を求めた後、検出された蛍光強度に当該補正係数を用いることで適正な蛍光強度を決定する（工程Ｓ１６４）。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
【０１０５】
なお、実施の形態１、２に係る検出装置１００、２００では、あらかじめ記憶部１４１に記憶された情報に基づいて増強角を調整したが、当該情報は、検出装置１００、２００の検出動作において得るようにしてもよい。この場合、当該情報の取得は、１次反応（工程Ｓ１２０）の前に行われる。
【０１０６】
具体的には、１次反応の前に、金属膜３０を加温または冷却して、当該金属膜３０の温度と、当該金属膜３０の温度において、励起光αを金属膜３０の所定の位置に照射させながら、第１角度調整機構１１２により金属膜３０に対する励起光αの入射角度を走査させる。また、制御部１４０は、光検出部１２０、２２０が金属膜３０上からのプラズモン散乱光δを検出するように制御する。金属膜３０で反射した励起光αの反射光βは、受光センサー１２７に到達する。これにより、制御部１４０は、励起光αの入射角度とプラズモン散乱光δの光量との関係を含むデータを得る。そして、制御部１４０は、データを解析して、増強角を求める。次いで、金属膜３０の基準温度と任意の金属膜３０の温度との温度差（℃）と、その温度差における増強角の補正角度（°）との関係の情報を得てもよい。そして、得られた情報を工程Ｓ１４０、工程Ｓ２４０で使用してもよい。
【０１０７】
［実施の形態３］
実施の形態３に係る検出装置３００は、ＳＰＲ装置である点において、実施の形態１に係る検出装置１００と異なる。そこで、実施の形態１に係る検出装置１００と同様の構成については同一の符号を付してその説明を省略する。
【０１０８】
図１３は、実施の形態３に係る検出装置３００の構成を示す模式図である。
【０１０９】
図１３に示されるように、検出装置３００は、チップホルダー７０と、光照射部１１０と、光検出部３２０と、温度測定部１３０と、記憶部１４１および処理部１４２を含む制御部１４０と有する。検出装置３００は、チップホルダー７０にチップ１０を装着した状態で使用される。チップホルダー７０およびチップ１０は、同一のものを使用することができる。なお、本実施の形態におけるチップホルダー７０は、励起光αの光路および反射光βの光路も妨げない。
【０１１０】
光検出部３２０は、光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜３０との交点を通り、かつ金属膜３０の表面に対する法線Ｎを挟むように配置されている。光検出部３２０は、入射面２１から入射し、金属膜３０の裏面で反射して出射面２３から出射された励起光αの反射光βを検出する。
【０１１１】
光検出部３２０は、例えば、受光センサー１２７、第２角度調整機構３２１および受光センサー制御部１２３を含む。光検出部３２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。
【０１１２】
第２角度調整機構３２１は、受光センサー１２７が反射光βを検出できるように、受光センサー１２７の光軸を調整する。第２角度調整機構３２１は、反射光βの光軸と金属膜３０の裏面との交点を通り、かつ反射光βの光軸に直交する軸を回転軸として受光センサー１２７を回動させる。受光センサー１２７は、反射光βを検出する。たとえば、受光センサー１２７は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。
【０１１３】
制御部１４０は、例えば、記憶部１４１、処理部１４２、演算装置、制御装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されており、第１角度調整機構１１２、光源制御部１１３、第２角度調整機構３２１、受光センサー制御部１２３および温度センサー調整機構１３２を制御する。記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、最適な入射光の入射角との関係の情報を記憶する。具体的には、本実施の形態では、記憶部１４１は、金属膜３０の温度と、照射された入射光によって金属膜３０で反射し、出射面２３から出射した反射光βの光量が最小となる共鳴角との関係の情報を記憶する。この情報は、被検出物質の検出前に作成してもよいし、外部で作成されたものであってもよい。処理部１４２は、温度測定部１３０で測定した金属膜３０の温度と、記憶部１４１に記憶された情報とに基づいて、入射光の入射角を最適な共鳴角に決定する。
【０１１４】
（検出装置の検出動作）
次に、実施の形態３に係る検出装置３００の検出動作（検出方法）について説明する。なお、実施の形態１に係る検出装置１００の検出動作と同じ工程は、同じ符号を付してその説明を省略する。
【０１１５】
図１４は、実施の形態３に係る検出装置３００の動作手順の他の一例を示すフローチャートである。
【０１１６】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。
【０１１７】
次いで、検体中の被検出物質と一次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。
【０１１８】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。
【０１１９】
次いで、入射角を調整する（工程Ｓ３４０）。具体的には、制御部１４０は、金属膜３０の温度を測定させて、金属膜３０の温度と、プリズム２０を介して金属膜３０の裏面に照射された励起光αの反射光βの光量が最小となる共鳴角との関係の情報に基づいて、励起光αの入射角を共鳴角に決定する。なお、金属膜３０の温度と、増強角との関係の求め方は、増強角でなく共鳴角を求める点以外は、実施の形態１における工程Ｓ１４０と同様である。共鳴角を求めるためには、第１角度調整機構１１２により励起光αの光軸の角度を走査しながら、受光センサー１２７により反射光βを検出する。そして、反射光βの光量が最小となる励起光αの入射角を共鳴角とする。
【０１２０】
次いで、被検出物質を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１１３により励起光αを工程Ｓ３４０で決定した共鳴角で金属膜３０の所定の位置に照射させながら、励起光αの反射光βを検出するように受光センサー制御部１２３を制御する。光量は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
【０１２１】
なお、検出装置３００でも、２次反応（工程Ｓ１３０）の前にブランク値を測定してもよい。この場合、被検出物質を検出する工程（工程Ｓ１５０）では、蛍光γの検出値からブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す蛍光γの量を算出する。ブランク値の測定では、制御部１４０は、入射光の入射角を走査しながら、プリズム２０を介して金属膜３０に励起光αを照射する。そして、制御部１４０は、金属膜３０で反射した励起光αの反射光βの最小値をブランク値として得る。
【０１２２】
以上のように、本実施の形態に係る検出装置３００は、実施の形態１に係る検出装置１００と同様の効果を有する。
【０１２３】
本出願は、２０１４年１２月１５日出願の特願２０１４−２５３４０７に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
また、本発明に係る検出方法および検出装置は、被検出物質を高い信頼性で測定することもできる。よって、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
【符号の説明】
【０１２５】
１０、１０’、９０、９０’  チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０、４０’  流路蓋
４１  注入口
４２  排出口
４３  流路
５０  回折格子
６０  基板
７０、８０  チップホルダー
１００、２００、３００  検出装置
１１０  光照射部
１１１  光源ユニット
１１２  第１角度調整機構
１１３  光源制御部
１２０、２２０、３２０  光検出部
１２１  受光ユニット
１２２  位置切替機構
１２３  受光センサー制御部
１２４  第１レンズ
１２５  光学フィルター
１２６  第２レンズ
１２７  受光センサー
１３０  温度測定部
１３１  温度センサー
１３２  温度センサー調整機構
１４０  制御部
１４１  記憶部
１４２  処理部
２２１、３２１  第２角度調整機構
α  励起光
β  反射光
γ  蛍光
δ  プラズモン散乱光
【図１】
2016098653.tif 000003
【図２】
2016098653.tif 000004
【図３】
2016098653.tif 000005
【図４】
2016098653.tif 000006
【図５】
2016098653.tif 000007
【図６】
2016098653.tif 000008
【図７】
2016098653.tif 000009
【図８】
2016098653.tif 000010
【図９】
2016098653.tif 000011
【図１０】
2016098653.tif 000012
【図１１】
2016098653.tif 000013
【図１２】
2016098653.tif 000014
【図１３】
2016098653.tif 000015
【図１４】
2016098653.tif 000016
【国際調査報告】
2016098653.tif 000017
2016098653.tif 000018
2016098653.tif 000019
2016098653.tif 000020