(57)【要約】  スタチン系化合物の純度を、効率よく向上させることができる精製方法を提供すること。下記一般式（１）：2016056658.tif 000084（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、または水素である。）で表される化合物を含む、スタチン系化合物の精製方法であって、（Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：2016056658.tif 000085（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）で表される化合物に変換する工程を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法。
2016056658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
2016056658.tif 000070
（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物を含むスタチン系化合物の精製方法であって、
（Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：
【化２】
2016056658.tif 000071
（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
で表される化合物に変換する工程
を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法。
【請求項２】
前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、請求項１に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項３】
前記工程（Ａ）を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、請求項１又は２に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項４】
前記工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物が、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項５】
前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項６】
前記スタチン系化合物が、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、かつ、前記一般式（１）及び（２）におけるＲ１が、
【化３】
2016056658.tif 000072
であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項７】
前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式（３）：
【化４】
2016056658.tif 000073
（式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスタチン系化合物の精製方法。
【請求項８】
下記一般式（２）：
【化５】
2016056658.tif 000074
（式中、Ｒ１は、
【化６】
2016056658.tif 000075
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム。
【請求項９】
下記一般式（２）：
【化７】
2016056658.tif 000076
（式中、Ｒ１は、
【化８】
2016056658.tif 000077
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ピタバスタチンカルシウム。
【請求項１０】
下記一般式（２）：
【化９】
2016056658.tif 000078
（式中、Ｒ１は、
【化１０】
2016056658.tif 000079
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、フルバスタチンナトリウム。
【請求項１１】
下記一般式（２）：
【化１１】
2016056658.tif 000080
（式中、Ｒ１は、
【化１２】
2016056658.tif 000081
である。）で表される化合物。
【請求項１２】
スタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式（２）：
【化１３】
2016056658.tif 000082
（式中、Ｒ１は、
【化１４】
2016056658.tif 000083
である。）で表される化合物の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、スタチン系化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチン系化合物の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン等のスタチン系化合物は、生体内において、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼ（以下、「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ」と称する場合がある。）の阻害剤として働き、例えば、高脂血症の治療に有用な化合物である。
例えば、ロスバスタチンは、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸の一般名であり、そのカルシウム塩は以下の化学式で表される。【０００３】
【化１】
2016056658.tif 000003
【０００４】
治療において、ロスバスタチンは、そのカルシウム塩であるロスバスタチンカルシウムとして投与される。ロスバスタチンカルシウムは、ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）として販売されている。
例えば、特許文献１に、ロスバスタチン、そのナトリウム塩とカルシウム塩、及びこれらの製造方法が開示されている。特許文献１によれば、ロスバスタチン及びその塩は、（３Ｒ）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−５−オキソ−６−トリフェニルホスホラニリデンヘキサン酸メチルと、４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メタンスルホニルアミノ）−５−ピリミジンカルボキシアルデヒドとを縮合させて不斉中心を一個有する側鎖を導入し、次いで３−ヒドロキシ基の脱保護、５−オキソ基の不斉還元、及び加水分解を行なうことによって得られる。
スタチン系化合物は、純度の向上が望まれており、本発明の発明者らは、従来よりも高純度のロスバスタチンカルシウムが得られる方法として、（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（以下、「ＤＯＸＰ」と称する場合がある。）に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素等を作用させて（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（以下、「ＤＯＬＰ」と称する場合がある。）を得る工程を有するロスバスタチンカルシウムの製造方法について発明し、既に特許出願を行なっている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６４８８９７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／１１９２６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の発明者らは、スタチン系化合物の不純物には、製造工程において副生するものだけではなく、製造後、保管中に生成又は増加する不純物もあるということに着目して検討を行なったところ、製造後、保管中に生成又は増加する不純物の一つとして、下記一般式（１）で表される化合物の存在を特定した。本発明の発明者らは、スタチン系化合物を回収し、かつ、その純度を上げるためには、該一般式（１）で表される化合物の除去が重要であると考えた。【０００７】
【化２】
2016056658.tif 000004
【０００８】
しかしながら、スタチン系化合物から、前記一般式（１）で表される化合物を除去するにあたっては、スタチン系化合物が有機溶媒や水に溶解し難い性質を有するため、再結晶等の通常用いる精製方法では除去することは難しい。
本発明は、スタチン系化合物に含まれる前記一般式（１）で表される化合物を効率よく除去し、高純度のスタチン系化合物を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、前記一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）で表される新規化合物に変換するとスタチン系化合物からの除去が容易になることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
【化３】
2016056658.tif 000005
【００１１】
即ち、本発明は、以下に関する。
［１］下記一般式（１）：【００１２】
【化４】
2016056658.tif 000006
【００１３】
（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物を含むスタチン系化合物の精製方法であって、
（Ａ）該一般式（１）で表される化合物を、下記一般式（２）：【００１４】
【化５】
2016056658.tif 000007
【００１５】
（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
で表される化合物に変換する工程
を有することを特徴とする、スタチン系化合物の精製方法；
［２］前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することを特徴とする、［１］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
［３］前記工程（Ａ）を、溶媒の存在下、加熱することにより行なうことを特徴とする、［１］又は［２］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
［４］前記工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物が、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上含有することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［５］前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することを特徴とする、［２］〜［４］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［６］前記スタチン系化合物が、ロスバスタチン、ピタバスタチン、フルバスタチン、及びその塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、かつ、前記一般式（１）及び（２）におけるＲ１が、【００１６】
【化６】
2016056658.tif 000008
【００１７】
であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［７］前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はその塩であり、かつ、下記一般式（３）：【００１８】
【化７】
2016056658.tif 000009
【００１９】
（式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
で表される化合物をさらに含むことを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
［８］下記一般式（２）：【００２０】
【化８】
2016056658.tif 000010
【００２１】
（式中、Ｒ１は、【００２２】
【化９】
2016056658.tif 000011
【００２３】
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム；
［９］下記一般式（２）：【００２４】
【化１０】
2016056658.tif 000012
【００２５】
（式中、Ｒ１は、【００２６】
【化１１】
2016056658.tif 000013
【００２７】
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ピタバスタチンカルシウム；
［１０］下記一般式（２）：【００２８】
【化１２】
2016056658.tif 000014
【００２９】
（式中、Ｒ１は、【００３０】
【化１３】
2016056658.tif 000015
【００３１】
である。）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、フルバスタチンナトリウム；
［１１］下記一般式（２）：【００３２】
【化１４】
2016056658.tif 000016
【００３３】
（式中、Ｒ１は、【００３４】
【化１５】
2016056658.tif 000017
【００３５】
である。）で表される化合物；
［１２］スタチン系化合物の製造方法であって、該スタチン系化合物に含まれる下記一般式（２）：【００３６】
【化１６】
2016056658.tif 000018
【００３７】
（式中、Ｒ１は、【００３８】
【化１７】
2016056658.tif 000019
【００３９】
である。）で表される化合物の存在量を測定する工程を有することを特徴とする、スタチン系化合物の製造方法。
さらに、本発明は、以下に関する。
・前記工程（Ａ）を、３０℃以上１００℃以下の条件下で行なうことを特徴とする、［３］に記載のスタチン系化合物の精製方法；
・前記工程（Ｂ）において、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式（２）で表される化合物を除去することを特徴とする、［２］〜［４］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法；
・前記工程（Ａ）に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有することを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一つに記載のスタチン系化合物の精製方法。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の方法によれば、スタチン系化合物の純度を効率よく向上させることができ、高純度のスタチン系化合物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】合成例１で得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）を、室温又は冷蔵（４℃）で保存し、保存開始から３日目、１９日目、８１日目での、（（３Ｒ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３−ヒドロキシ−５−オキソ−６−ヘプテン酸カルシウム（３−ＭＯＬＡ−Ｃａ）の含有量及びロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の含有量をＨＰＬＣで分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本明細書において用いられる用語について詳しく説明する。
本明細書において、「炭素数１〜８の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ-オクチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数１〜４の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜６の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、１−エチルプロピル基、１−エチルブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜４の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜８の分岐状アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基を意味する。
本明細書において、「炭素数１〜４のアルキル基」とは、上記「炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基」のうち、炭素数が１〜４のものを意味する。
本明細書において、「窒素含有複素環を含む基」とは、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン等のスタチン系化合物に含まれる母骨格に相当する基である。
本明細書において、「アルカリ金属元素」とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムを意味する。好ましくは、アルカリ金属元素は、ナトリウム又はカリウムである。
本明細書において、「アルカリ土類金属元素」とは、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウムを意味する。好ましくは、アルカリ土類金属元素は、カルシウム又はバリウムである。
本明細書において、「カルシウム化合物」とは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等の、カルボン酸をカルボン酸のカルシウム塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、カルシウム化合物は塩化カルシウムである。
本明細書において、「アミン化合物」とは、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等の、カルボン酸をカルボン酸のアミン塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、アミン化合物はｎ−プロピルアミン又はジメチルアミンである。
なお、本発明に係る化合物には、化合物の塩、無水物、水和物、溶媒和物等も包含される。
【００４３】
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素」とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を有する酵素を意味する。
「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコールに変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、一般式（１Ａ）で表される化合物に、測定の対象とする酵素を作用させ、一般式（１Ａ）で表される化合物から変換された一般式（２Ａ）で表される化合物の量を直接的に測定することにより、その酵素活性を確認することができる。また、本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、通常の固定化技術を用いて固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
【００４４】
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」（以下、「本発明の微生物若しくは細胞」と称することがある。）とは、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有していれば特に制限はなく、内在的に前記活性を有する生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記活性を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により前記活性を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理等、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とする遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現を低減する等の方法を用いることができる。
なお、「微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。また、本明細書において、「前記活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。
また、本発明の微生物若しくは細胞は、国際公開第２００３／０７８６３４号に記載の方法で作製することができる。
【００４５】
本明細書において、「宿主生物」とする生物の種類は特に限定されず、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは、大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
【００４６】
本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物又は細胞を意味する。
【００４７】
本明細書において、「微生物若しくは細胞の処理物」とは、微生物若しくは細胞を培養し、当該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体等に固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。
【００４８】
次に、本発明の精製方法について詳しく説明する。
［スタチン系化合物］
本発明の精製方法では、下記一般式（１）で表される化合物（以下、「３−ＭＯＬＡ」と称することがある。）を含むスタチン系化合物の精製を行なうことができる。本発明において、スタチン系化合物とは、化合物自体であってもよく、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等の塩の形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。
【００４９】
【化１８】
2016056658.tif 000020
【００５０】
（式中、Ｒ１は、窒素含有複素環を含む基であり、Ｒ２は、炭素数１〜４のアルキル基、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
前記一般式（１）において、Ｒ１は、
【００５１】
【化１９】
2016056658.tif 000021
【００５２】
であることが好ましい。
本発明の精製方法の対象となるスタチン系化合物は、ロスバスタチン、ピタバスタチンフルバスタチン、及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、ロスバスタチンピタバスタチン、又はこれらの塩であることがより好ましく、ロスバスタチン又はこれらの塩であることが特に好ましい。
また、ここで、本発明の精製方法は、前記一般式（１）で表される化合物を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で測定して０．０１面積％以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることが好ましく、０．０５面積％以上含有するスタチン系化合物を、精製の対象とすることができる。また、上限値としては、本発明の効果が得られる限り、特に制限はないが、通常９９面積％以下、好ましくは５０面積％以下、より好ましくは２５面積％以下、特に好ましくは５面積％以下、もっとも好ましくは１面積％以下である。本発明の好ましい実施態様では、スタチン系化合物は、前記一般式（１）で表される化合物を０．０１面積％以上５面積％以下含有する。
【００５３】
［本発明の精製方法］
本発明の精製方法は、（Ａ）前記一般式（１）で表される化合物を下記一般式（２）：
【００５４】
【化２０】
2016056658.tif 000022
【００５５】
（式中、Ｒ１は、前記と同義である。）
で表される化合物（以下、「ＫＴＮＥ」と称することがある。）に変換する工程を有することを特徴とする。
前記工程（Ａ）の後、（Ｂ）前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程を有することが好ましい。
また、さらに、前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することが好ましい。
以下、本発明の精製方法が有する工程（Ａ）〜（Ｃ）について、工程ごとに説明する。
【００５６】
工程（Ａ）：
工程（Ａ）は、前記一般式（１）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する工程である。
前記一般式（１）で表される化合物は、通常、前記スタチン系化合物に含まれているが、工程（Ａ）を開始するにあたって、前記一般式（１）で表される化合物を添加してもよい。
工程（Ａ）では、前記一般式（１）で表される化合物は、脱炭酸化され、前記一般式（２）で表される化合物に変換される。
一方で、工程（Ａ）において、前記スタチン系化合物は、カルボン酸、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩のいずれの形態であってもよく、これらの混合物であってもよい。前記一般式（１）で表される化合物の脱炭酸化に伴い、前記スタチン系化合物は、その形態が変化しても、変化しなくてもよい。具体的には、後述するように工程（Ａ）を酸性又は塩基性条件下で行なう場合は、用いる酸又は塩基の種類に応じて、用いる酸又は塩基に由来する塩の形態に変換されることがある。例えば、スタチン系化合物がロスバスタチンであり、かつ、水酸化ナトリウムの存在下で工程（Ａ）を行なう場合、通常、上記の反応と共に、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸（以下、「ＤＯＬＡ」と称する場合がある。）が、ロスバスタチンナトリウム（以下、「ＲＳＶ−Ｎａ」と称する場合がある。）に変換される。
【００５７】
工程（Ａ）の反応条件等は、前記一般式（１）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換することができれば、特に制限はない。工程（Ａ）における反応条件の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ａ）は、溶媒の存在下で行なうことが好ましい。ここで、溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」と称する場合がある。）、シクロペンチルメチルエーテル等）、酢酸エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等）、アミド類（例、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等）、炭化水素（例、トルエン、シクロヘキサン等）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノール等）、水等が挙げられ、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、トルエン、水が好ましい。
反応温度としては、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上であり、また、通常１３０℃以下、好ましくは１００℃以下である。反応を効率的に進めるため、必要に応じて加熱することが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、工程（Ａ）は、３０℃以上１００℃以下の条件下で行われる。
工程（Ａ）におけるｐＨに特に制限はないが、反応を促進するために、酸性条件下又は塩基性条件下とすることが好ましい。
酸性条件下で行なう場合、好ましくはｐＨ０以上ｐＨ３以下、より好ましくはｐＨ２以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、塩酸、硫酸が好ましい。
塩基性条件下で行なう場合、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
また、反応時間は、その他の条件にもよるが、通常１時間以上、好ましくは２時間以上であり、また、通常４８時間以下、好ましくは２４時間以下である。
上記の反応時間を短縮するためにも、必要に応じて、工程（Ａ）においては、反応溶液を必要に応じて撹拌することが好ましい。
【００５８】
工程（Ｂ）：
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた混合物（工程（Ａ）に先立ち、前記スタチン系化合物を溶媒に溶解する工程を有する場合、溶液）から、前記一般式（２）で表される化合物を除去する工程である。なお、ここで、除去するとは、必ずしも完全に除去されている必要はなく、その大部分が除去されて、得られる化合物の純度が向上すればよい。また、本工程で、前記一般式（２）で表される化合物が除去されると、前記スタチン系化合物、又はその塩が残る。
前記一般式（２）で表される化合物を除去することができれば、その手段や反応条件に特に制限はない。工程（Ｂ）の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ｂ）は、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記一般式（２）で表される化合物を除去することが好ましい。
ここで、用いることのできる有機溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（以下、「ＣＰＭＥ」と称する場合がある。）等）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類等が挙げられ、中でも、上述のエーテル類、エステル類が好ましく、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチルが好ましい。
また、塩基性の条件下とは、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下の範囲の条件が好ましく、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲の条件で行なうことがより好ましい。
【００５９】
工程（Ｃ）：
工程（Ｃ）は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物、即ち、前記スタチン系化合物又はその塩とカルシウム化合物とを反応させる工程であり、前記工程（Ｂ）で得られた化合物をカルシウム塩に変換する場合に行なう工程である。具体的には、前記スタチン系化合物がロスバスタチン又はピタバスタチンである場合に、ロスバスタチンカルシウム又はピタバスタチンカルシウムを得るために行なう。
工程（Ｃ）では、例えばスタチン系化合物がロスバスタチンである場合、通常、前記工程（Ｂ）で得られた化合物（例えば、ＲＳＶ−Ｎａ）が、ロスバスタチンカルシウム（以下、「ＲＳＶ−Ｃａ」と称する場合がある。）に変換される。
【００６０】
工程（Ｃ）における反応条件等は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させ、カルシウム塩を得ることができれば特に制限はないが、工程（Ｃ）における反応条件等の好ましい例を以下に記載する。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、前記工程（Ｂ）で得られた化合物に対して、通常０．５当量〜３当量、好ましくは、０．６当量〜２．８当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（以下、「ＭＴＢＥ」と称する場合がある。）、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル系溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒や、これら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜２００時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
【００６１】
なお、前記スタチン系化合物がロスバスタチンである場合、前記一般式（１）で表される化合物に加えて、下記一般式（３）で表される化合物（（５Ｓ、６Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メタンスルホニル（メチル）アミノ］−ピリミジン−５−イル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸又はその塩；以下「５−ＭＯＬＡ」と称する場合がある。）を含有していてもよい。
【００６２】
【化２１】
2016056658.tif 000023
【００６３】
（式中、Ｒ３は、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素又は水素である。）
前記一般式（３）において、Ｒ３は、アルカリ金属元素又は水素であることが好ましい。ここで、アルカリ金属元素としてはリチウム、ナトリウム又はカリウムが好ましく、ナトリウム又はカリウムであることが特に好ましい。
【００６４】
この場合、工程（Ａ）の反応温度は、通常３０℃以上、好ましくは４０℃以上であり、また、通常１４０℃以下、好ましくは１３０℃以下である。
上記のように反応温度を高めにすることにより、前記一般式（１）で表される化合物が前記一般式（２）で表される化合物に変換され、さらに、５−ＭＯＬＡが、（３Ｅ，５Ｅ）−４−［（４−フルオロフェニル）−２−［メタンスルホニル（メチル）アミノ］−６−イソプロピルピリミジン−５−イル）］−２−オキソ−３，５−ヘキサジエン（以下、「ＤＥＮＫ」と称する場合がある。）に変換される。
【００６５】
【化２２】
2016056658.tif 000024
【００６６】
ここで生成したＤＥＮＫは、工程（Ｂ）において、４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−１−ブテニル）］−ピリミジン（一般式（２）において、Ｒ１が、
【００６７】
【化２３】
2016056658.tif 000025
【００６８】
の化合物；以下「ＫＴＮＥ」と称する場合がある。）と共に除去することができる。
【００６９】
［ロスバスタチンカルシウムの製造方法］
前記スタチン系化合物がロスバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるロスバスタチンカルシウムの製造方法に特に制限はないが、以下の方法で製造されたものであることが好ましい。
なお、以下において、ｗ／ｖは重量／容量を意味する。
本発明の製造方法には、以下に示すように、一般式（１Ａ）で表される化合物を一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する工程（ｉ）、及び一般式（２Ａ）で表される化合物を式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムに変換する工程（iiiａ）、（iiiｂ）（（iiiｂ−１）〜（iiiｂ−３））又は（iiiｃ）（（iiiｃ−１）〜（iiiｃ−２））が含まれる。
【００７０】
【化２４】
2016056658.tif 000026
【００７１】
式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４の１級アルキル基又は炭素数３〜４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基又はｎ−ブチル基が好ましい。中でも、効率よく工程（ｉ）を行うことができる観点から、Ｒとしては、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ−プロピル基が特に好ましい。
−Ｘ１及び−Ｘ２はそれぞれ独立して、−ＯＨ又は＝Ｏを表し、−Ｘ１又は−Ｘ２の少なくとも一方が＝Ｏである。
Ｒ３Ａ及びＲ４Ａはそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜８のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基である。
【００７２】
本発明の製造方法には、以下に示すように、工程（ｉ）で使用する一般式（１Ａ）で表される化合物の製造方法として、式（３Ａ）で表される化合物及び一般式（４）で表される化合物から一般式（１Ａ）で表される化合物に変換する工程（ii）が含まれる。
さらに、工程（ii）の好ましい態様として、式（３Ａ）で表される化合物及び一般式（４ａ）で表される化合物から一般式（５）で表される化合物に変換する工程（iiａ）、及び一般式（５）で表される化合物を一般式（１Ａ）で表される化合物に変換する工程（iiｂ）が含まれる。
【００７３】
さらに、工程（ｉ）の別の態様として、一般式（１ａ）で表される化合物を一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に変換する工程（ｉａ）、及び一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物を一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する工程（ｉｂ）も本発明の製造方法に含まれる。
【００７４】
【化２５】
2016056658.tif 000027
【００７５】
式中、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
Ｒ１Ａは炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基を表す。
Ｒ２Ａは炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、上記Ｒとは異なる基である。Ｒ２Ａは好ましくは、イソプロピル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基又はｔｅｒｔ−アミル基であり、特に好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
【００７６】
以下に、本発明の製造方法の各工程について詳述する。
【００７７】
工程（ｉ）：
工程（ｉ）は、一般式（１Ａ）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（本発明の生物若しくは細胞）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「本発明の酵素等」と称することがある。）を作用させて還元して、一般式（２Ａ）で表される化合物を得る工程である。
【００７８】
【化２６】
2016056658.tif 000028
【００７９】
式中、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
【００８０】
工程（ｉ）で用いる酵素としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの（以下「ＯＣＲ１」と称する場合がある）又は該アミノ酸配列のホモログを用いることができる。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すポリペプチドのいずれかを含む酵素、又はこれらのホモログが挙げられる。
（Ａ）特許第４２７０９１８号に記載のＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、一般式（１Ａ）で表される化合物を、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一般式（１Ａ）で表される化合物を、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
【００８１】
上記（Ｂ）のホモログは、配列番号２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
また、上記（Ｃ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで、「１又は数個のアミノ酸」とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸である。
上記酵素をコードする遺伝子は、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列、又はこれらのホモログを含むＤＮＡである。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、一般式（１Ａ）で表される化合物に作用して、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ一般式（１Ａ）で表される化合物に作用して、一般式（２Ａ）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
ここで、上記（Ｅ）の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９．等に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、上記（Ｆ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列に１又は数個の塩基が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。「１又は数個の塩基」とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下の塩基である。
【００８２】
工程（ｉ）において、反応基質となる一般式（１Ａ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
工程（ｉ）においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
上記補酵素を添加する場合には、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、１）本発明の生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、
３）本発明の生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは細胞に導入する方法等が挙げられる。
上記１）の方法においては、反応系にグルコース、エタノール、２−プロパノール又はギ酸等を添加することが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍〜１００倍、好ましくは０．５倍〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノール又はイソプロパノール等の添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である一般式（１Ａ）で表される化合物に対して、通常０．１当量〜２０当量、好ましくは１当量〜５当量である。
また、上記３）の方法においては、工程（ｉ）に用いられる酵素をコードするＤＮＡと共に、上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に、宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法等を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーター等発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００８３】
工程（ｉ）は、一般式（１Ａ）で表される化合物、及び上記酵素、該酵素を生産する能力を有する生物若しくは細胞、該生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びに、必要に応じて各種補酵素（その再生システム、即ち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。）を含有する、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。なお、一般式（１Ａ）で表される化合物は、後述する方法により製造することができる。
水性媒体としては、水又は緩衝液（リン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液等）が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール等、一般式（１Ａ）で表される化合物の溶解度が高いものを使用することができる。
工程（ｉ）は、通常４℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ４〜８で行われる。反応時間は、通常０．５時間〜４８時間、好ましくは０．５時間〜２４時間である。また、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
工程（ｉ）で得られる一般式（２Ａ）で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーション等により菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００８４】
また、工程（ｉ）は、以下のように、工程（ｉａ）及び工程（ｉｂ）の２段階に分けて行うこともできる。
【００８５】
工程（ｉａ）：
工程（ｉａ）は、一般式（１Ａ）において、−Ｘ１及び−Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ａ）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（１Ａ）において、−Ｘ１が−ＯＨで−Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は−Ｘ１が＝Ｏで−Ｘ２が−ＯＨである一般式（１ｃ）で表される化合物を得る工程である。
一般式（１ａ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
【００８６】
【化２７】
2016056658.tif 000029
【００８７】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
【００８８】
工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）及び／又は（１ｃ）で表される化合物は、次の工程（ｉｂ）に供する前に、例えば結晶化により精製されてもよい。
【００８９】
工程（ｉｂ）：
工程（ｉｂ）は、工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に、上記カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（２Ａ）で表される化合物を得る工程である。
一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
【００９０】
【化２８】
2016056658.tif 000030
【００９１】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
【００９２】
また、工程（ｉ）、又は、工程（ｉａ）及び（ｉｂ）で得られる、一般式（２Ａ）で表される化合物、中でも一般式（２Ａ）においてＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
一般式（２Ａ）においてＲがｎ−プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【００９３】
【表１】
2016056658.tif 000031
【００９４】
すなわち、一般式（２Ａ）においてＲがｎ−プロピル基である化合物の結晶は、２θ＝８．７°、１６．３°、１９．７°、２１．２°、２１．３°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝８．７°、１２．９°、１６．３°、１７．１°、１９．７°、２１．２°、２１．３°、２２．４°、２２．７°、２４．９°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
【００９５】
工程（ii）：
工程（ii）は、工程（ｉ）で使用する一般式（１Ａ）で表される化合物を製造する工程である。具体的には、式（３Ａ）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程である。
【００９６】
【化２９】
2016056658.tif 000032
【００９７】
式中、Ｒ１Ａ、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドが好ましい。塩基の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物に対して、通常１当量〜６当量、好ましくは、１．５当量〜６当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り、特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜２００℃、好ましくは、−５℃〜４０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜２００時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【００９８】
式（３Ａ）で表される化合物は、特許第２６４８８９７号公報に記載の方法により製造することができ、また、市販のものを用いることもできる。一般式（４）で表される化合物は、市販のものを用いることができる。
【００９９】
なお、Ｒ１ＡがＲとは異なる基である場合は、上記縮合で得られた化合物と、Ｒ−ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１Ａ）で表される化合物を得る。本工程は、工程（iiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１００】
工程（ii）においては、特に以下の（iiａ）及び（iiｂ）の工程を有することが好ましい。
【０１０１】
工程（iiａ）：
工程（iiａ）は、式（３Ａ）で表される化合物と一般式（４）においてＲ１ＡがＲ２Ａである一般式（４ａ）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させて、一般式（５）で表される化合物を得る工程である。
【０１０２】
【化３０】
2016056658.tif 000033
【０１０３】
式中、Ｒ２Ａは前記定義と同義である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルコキシドを用いることができ、特に、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、水素化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物に対して、通常１当量〜６当量、好ましくは、１．５当量〜６当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素系の非極性溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（３Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜２００時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【０１０４】
一般式（５）で表される化合物は、結晶性が高いため、クロマトグラフィー等の煩雑な精製を行うことなく高純度で得ることができる。
【０１０５】
工程（iiｂ）：
一般式（５）で表される化合物と、Ｒ−ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１ａ）で表される化合物を得る。
ここで、Ｒは、炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４の１級アルキル基又は炭素数３〜４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基又はｎ−ブチル基が好ましく、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ−プロピル基が特に好ましい。
【０１０６】
【化３１】
2016056658.tif 000034
【０１０７】
式中、Ｒ２Ａ、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
【０１０８】
一般式（１Ａ）で表される化合物の中でも、特に、下記式（１ａ）で表される化合物が好ましい。
【０１０９】
【化３２】
2016056658.tif 000035
【０１１０】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
反応は、溶媒を用いて行うこともできる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。また、Ｒ−ＯＨで表されるアルコール自体を溶媒として用いてもよい。溶媒の使用量は、式（５）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、１ｍＬ〜１０ｍＬである。
反応温度は、通常３０℃〜１５０℃、好ましくは、４０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
【０１１１】
上記のようにして得られる一般式（１Ａ）で表される化合物、特に一般式（１ａ）で表される化合物、中でも一般式（１ａ）においてＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
一般式（１ａ）においてＲがｎ−プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【０１１２】
【表２】
2016056658.tif 000036
【０１１３】
すなわち、２θ＝１６．７°、２０．８°、２１．３°、２２．１°、２５．１°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１６．７°、１７．６°、１９．２°、２０．８°、２１．３°、２２．１°、２４．１°、２４．３°、２５．１°、２６．４°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
【０１１４】
工程（iiiａ）：
工程（iiiａ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させ、得られた生成物を単離することにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
【０１１５】
【化３３】
2016056658.tif 000037
【０１１６】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．９当量〜２当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．４当量〜１．５当量、好ましくは、０．５当量〜１．２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
【０１１７】
工程（iiiｂ）：
工程（iiiｂ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を、塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた式（８）で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた一般式（９）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
具体的には、一般式（２Ａ）で表される化合物を、塩基により加水分解して、一般式（７）で表される化合物とする。
【０１１８】
【化３４】
2016056658.tif 000038
【０１１９】
式中、Ｒは前記定義と同義である。Ｘはナトリウム又はカリウム等を表す。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．９当量〜２当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物に対して、通常０．４当量〜１．５当量、好ましくは、０．５当量〜１．２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、一般式（２Ａ）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
【０１２０】
次いで、一般式（７）で表される化合物を酸で処理して式（８）で表される化合物とする。
【０１２１】
【化３５】
2016056658.tif 000039
【０１２２】
式中、Ｘは前記定義と同義である。
酸としては、塩酸、硫酸等を用いることができ、特に、塩酸が好ましい。酸の使用量は、酸性化できる量であれば特に限定されないが、加水分解時に使用した塩基に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、通常０．５時間〜５時間である。
【０１２３】
さらに、式（８）で表される化合物にアミン化合物を添加して、式（９）で表されるアミン塩とする。結晶性が高いアミン塩とすることにより、目的物であるロスバスタチンカルシウムの純度を向上させることが可能である。
【０１２４】
【化３６】
2016056658.tif 000040
【０１２５】
式中、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは前記定義と同義である。
アミン化合物としては、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等を用いることができ、特に、ｎ−プロピルアミン、ジメチルアミンが好ましい。アミン化合物の使用量は、式（８）で表される化合物に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、０．５時間〜５時間である。
【０１２６】
特に、一般式（９）で表される化合物がｎ−プロピルアミン塩やジメチルアミン塩である場合は、結晶性が高いため、高純度で得ることができるので好ましい。
【０１２７】
（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸のｎ−プロピルアミン塩は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【０１２８】
【表３】
2016056658.tif 000041
【０１２９】
すなわち、２θ＝２６．８°、２９．１°、３０．３°、３８．９°、４５．７°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１９．８°、２２．９°、２６．８°、２９．１°、３０．３°、３４．２°、３６．５°、３８．９°、４５．７°、４６．８°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
【０１３０】
また、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸のジメチルアミン塩は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【０１３１】
【表４】
2016056658.tif 000042
【０１３２】
すなわち、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°、１８．９°、１９．４°、１９．６°、２０．５°、２１．２°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。
【０１３３】
次いで、一般式（９）で表されるアミン塩を塩基により塩交換して、一般式（７）で表される化合物とする。
【０１３４】
【化３７】
2016056658.tif 000043
【０１３５】
式中、Ｒ３Ａ、Ｒ４Ａ及びＸは前記定義と同義である。
【０１３６】
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（９）で表される化合物に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、通常０．５時間〜１０時間である。
【０１３７】
さらに、一般式（７）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る。
【０１３８】
【化３８】
2016056658.tif 000044
【０１３９】
式中、Ｘは前記定義と同義である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（７）で表される化合物に対して、通常０．５当量〜３当量、好ましくは、０．６当量〜２．８当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（トルエン、シクロヘキサン、メシチレン等）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜２００時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
【０１４０】
工程（iiiｃ）：
工程（iiiｃ）は、一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物とし、次いで一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
【０１４１】
【化３９】
2016056658.tif 000045
【０１４２】
式中、Ｒ及びＸは前記定義と同義である。
一般式（２Ａ）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物を得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１４３】
一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、式（１０）で表される化合物を得る工程において、酸触媒としては、ｐ−トルエンスルホン酸、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート、硫酸、塩酸等を用いることができ、特に、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。酸触媒の使用量は、式（７）で表される化合物に対して、通常０．００１当量〜０．５当量、好ましくは、０．０１当量〜０．１当量である。
前記分子内脱水縮合は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒との混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（７）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜５０ｍＬである。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常１時間〜７２時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【０１４４】
式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１４５】
なお、本発明において、粉末Ｘ線回折スペクトルは、公知の方法にしたがって測定することができる。例えば、サンプルをガラス試料板上に充填し、４５ｋＶ及び４０ｍＡにて操作されるセラミックスＸ線管球Ｃｕから発生する１．５４０６オングストロームの波長のＸ線をサンプルに照射して測定することができる。粉末Ｘ線回折スペクトルの２θの値は、測定機器やサンプルによって、例えば±０．２°の誤差範囲内で変わることがあるため、本発明における２θの値は絶対的な値と解釈すべきではない。
【０１４６】
［ピタバスタチンカルシウム及びフルバスタチンナトリウムの製造方法］
前記スタチン系化合物がピタバスタチン又はフルバスタチンである場合、本発明の精製方法に用いられるピタバスタチンカルシウム及びフルバスタチンナトリウムの製造方法に特に制限はないが、ピタバスタチンについては、例えば、特開平１−２７９８６６号公報、特開２００２−３００８９７号公報（ＵＳ２００４／００３０１３９Ａ１）等に記載の方法で、フルバスタチンについては、例えば、特開平３−４７１６７号公報等に記載の方法で製造することができる。
【０１４７】
［本発明のスタチン系化合物等］
本発明によれば、下記一般式（２）：
【０１４８】
【化４０】
2016056658.tif 000046
【０１４９】
（式中、Ｒ１は、
【０１５０】
【化４１】
2016056658.tif 000047
【０１５１】
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するロスバスタチンカルシウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するロスバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
【０１５２】
また、本発明によれば、下記一般式（２）：
【０１５３】
【化４２】
2016056658.tif 000048
【０１５４】
（式中、Ｒ１は、
【０１５５】
【化４３】
2016056658.tif 000049
【０１５６】
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するピタバスタチンカルシウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するピタバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
【０１５７】
また、本発明によれば、下記一般式（２）：
【０１５８】
【化４４】
2016056658.tif 000050
【０１５９】
（式中、Ｒ１は、
【０１６０】
【化４５】
2016056658.tif 000051
【０１６１】
である。）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有するフルバスタチンナトリウムを得ることができる。なお、上記一般式（２）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
上記一般式（２）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するフルバスタチンナトリウムは、安定して保存することができる。
【０１６２】
さらに、本発明によれば、下記一般式（２）：
【０１６３】
【化４６】
2016056658.tif 000052
【０１６４】
（式中、Ｒ１は、
【０１６５】
【化４７】
2016056658.tif 000053
【０１６６】
である。）で表される新規化合物を提供することができる。これらの化合物の存在量を測定すると、スタチン系化合物の品質評価を行なうことができる。本発明によれば、これらの化合物の存在量を測定する工程を有するスタチン系化合物の製造方法も提供することができる。
【実施例】
【０１６７】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。【０１６８】
本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。【０１６９】
＜ＲＳＶ−Ｃａの化学純度＞
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＤＯＸＰの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（ｍＬ／ｍＬ／ｇ）Ｂ：ＴＨＦ
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：３８％（０分）→３８％（１７分）→８０％（２７分）
流速：１ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
＜ＤＯＬＰの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧＩＩＩ−Ｈ（２．０ｍｍ×１００ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／エタノール＝３／２（ｍＬ／ｍＬ）Ｂ：０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム／エタノール＝１／４（ｍＬ／ｍＬ）
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：０％（０分）→０％（１０分）→１００％（２５分）→１００％（３０分）
流速：０．３ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＰＴＶ−Ｃａの化学純度＞
カラム：インタクト社製  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：アセトニトリル
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：２５％（０分）→３５％（２０分）→９０％（３０分）→９０％（３５分）
流速：１．０ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ３３１ｎｍ
＜ＲＳＶ−Ｃａ中のＤＥＮＫ分析＞
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出器：ＭＳ  （極性：ポジティブ  モード：ＳＩＭ  フラグメンター：２００  ドライガス流量：５Ｌ／ｍｉｎ  ネブライザー：４０ｐｓｉ  ドライガス温度：２５０℃  ベポライザー温度：１５０℃）【０１７０】
［参考例１］
（ＤＨＡＢの合成）
［工程１］【０１７１】
【化４８】
2016056658.tif 000054
【０１７２】
窒素雰囲気下、１０Ｌのフラスコにメルドラム酸（Meldrum's acid）９００．１ｇ（６．２４ｍｏｌ）とクロロベンゼン４５３２．１ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２０℃に調整した。混合液にトリエチルアミン６３１．９ｇ（６．２４ｍｏｌ）を２５分かけて滴下した。３０分間撹拌した後、混合液にジケテン（ＤＫ）５５７．８ｇ（６．８６ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。内温２２℃で１．５時間撹拌した後、反応混合物に、３５％塩酸６５１．４ｇと水１７９９．９ｇとの混合液を１時間２０分かけて滴下した。有機層を分離後、有機層を水で洗浄した。得られた有機層を乾燥したＳＫ１Ｂ（Ｈ型イオン交換樹脂、三菱化学社製）で乾燥させた。
乾燥終了後、有機層をろ過して次の工程にて使用した。
［工程２］【０１７３】
【化４９】
2016056658.tif 000055
【０１７４】
窒素雰囲気下、前工程で得られた有機層を１０Ｌのフラスコに仕込んだ後、ｔｅｒｔ−ブタノール５５５．４ｇ（７．４８ｍｏｌ）を添加した。混合物を内温６０℃まで昇温した。７時間撹拌した後、反応液を室温まで冷却した。反応液に７％炭酸水素ナトリウム水溶液１３２５．８ｇを添加した後、反応混合物をろ過した。その後、有機層を分離し、得られた有機層を水で洗浄した。有機層は６０℃において有機溶媒が留出しなくなるまで濃縮を行った。
残渣を薄膜蒸留装置（圧力：５０Ｐａ〜８０Ｐａ、熱媒温度：１１０℃）で精製した。得られた３，５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（以下、「ＤＨＡＢ」と称する場合がある。）は８９３ｇ（収率：６９％）で、ＨＰＬＣ純度は９２．１面積％であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，互変異性体の混合物）δ１．４３−１．４９（９Ｈ，ｍ），２．０７（２．５Ｈ，ｓ），２．２５（０．５Ｈ，ｓ），３．２４（１．７Ｈ，ｓ），３．４６（０．３Ｈ，ｓ），３．７３（０．３Ｈ，ｓ），５．６１（０．７Ｈ，ｓ）【０１７５】
［合成例１］
（ＤＯＸＰの製造）【０１７６】
【化５０】
2016056658.tif 000056
【０１７７】
反応釜に、窒素雰囲気下、参考例１に記載の方法で合成したＤＨＡＢ２０．５ｋｇ（１０３ｍｏｌ）にテトラヒドロフラン７５Ｌを加えた溶液を調製した。得られた溶液を、５時間かけて水素化ナトリウムのテトラヒドロフラン溶液に滴下し、０℃〜５℃で１時間撹拌した（以下、「反応液Ａ」とする）。
別の反応釜に、窒素雰囲気下で、水素化ナトリウム８．２８ｋｇ（純度６１．９％，２１４ｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン７５Ｌを仕込み、内温が０℃〜５℃になるまで冷却した。そこに、４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（以下、「ＡＬＤ」と称する場合がある。）１４．９ｋｇ（４２．４ｍｏｌ）とメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１５０Ｌを仕込み、０℃〜５℃まで冷却した。得られたスラリーに、上述の方法で得られた反応液Ａを、内温０℃〜５℃となるように制御しながら滴下した。滴下終了後、２時間かけて内温２０℃〜２５℃まで昇温し、２０℃〜２５℃で２時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＡＬＤからＤＯＸＢ（（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｔ−ブチルエステル）への転化率は９９．３％であった。
反応終了後、内温が２０℃以下になるまで冷却し、２０℃以下を維持したまま水１５０Ｌを滴下した。滴下終了後、分液により水層を抜き出した。続いて２％水酸化ナトリウム水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＯＨ  １．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）、１０％クエン酸水溶液７５．０ｋｇ（クエン酸７．５ｋｇ，水６７．５ｋｇ）、２％ＮａＣｌ水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＣｌ  １．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）の順で有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、収率８３％でＡＬＤからＤＯＸＢが得られていることがわかった。
得られた有機層を、外温３５℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた残渣にｎ−プロパノール７５Ｌを添加し、外温４０℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。
その後、得られた残渣にｎ−プロパノール３８Ｌを加え、内温９７℃で８時間反応させた。得られた溶液を、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＢからＤＯＸＰへの転化率は９９％であった。
得られた溶液を、内温６０℃で減圧濃縮を行ない、溶液量を４５Ｌまで濃縮した。その後、内温４５℃まで冷却し、同温度でＤＯＸＰの種晶を投入した。４時間かけて０℃〜５℃まで冷却し、固液分離によりＤＯＸＰの結晶を回収した。得られた結晶のＨＰＬＣ純度は９８．１面積％であった。
１２０Ｌ反応器に、得られた結晶及びメタノール５０Ｌを仕込み、昇温して均一な溶液とした。結晶が全て溶解したことを確認した後、４５℃に内温を調整し、ＤＯＸＰの種晶を投入した。その後、４時間かけて０℃〜５℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥してＤＯＸＰを得た。得られたＤＯＸＰのＨＰＬＣ純度は９９．０面積％であり、回収量は１４．０ｋｇ（収率６３％）であった。【０１７８】
（菌体の調製）
［カルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの調製例］【０１７９】
（１） 遺伝子のクローニング
オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ（旧ＩＦＯ）１４７３由来のＯＣＲ１（特許第４２７０９１８号、配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｏｃｒ１）を元に、ｏｃｒ１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｏｃｒ１＿Ｆ（配列番号３）とｏｃｒ１＿Ｒ（配列番号４）を設計、合成した。続いて、オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
次に、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＬ００９１２６．３）がコードするグルコース−１−デヒドロゲナーゼにおいて９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したＧＤＨ（配列番号６）をコードする遺伝子配列（以下、ｇｄｈ（配列番号５））に対し、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ１（配列番号７）とｇｄｈ＿Ｒ１（配列番号８）を設計、合成した。続いて、常法に従ってＰＣＲを行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。【０１８０】
（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたｏｃｒ１のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化した特開２００５−３４０２５号公報に記載のプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１を得た。
次に、上記（１）で得られたｇｄｈのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＧＤＨを得た。
さらに、ｐＫＶ３２ＧＤＨを鋳型として、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを付加したプライマーｇｄｈ＿Ｆ２（配列番号９）とｇｄｈ＿Ｒ２（配列番号１０）でＰＣＲを行い、得られたフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１の下流に挿入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。得られたプラスミドにおけるｇｄｈ遺伝子の向きはＰＣＲにより確認した。【０１８１】
（３）発現株の調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。【０１８２】
（ＤＯＬＰの合成）【０１８３】
【化５１】
2016056658.tif 000057
【０１８４】
（１）バイオ反応
１ｍ３の反応槽に、イオン交換水２００Ｌ、含水グルコース１１０.９４ｋｇ、リン酸水素二カリウム２．１３ｋｇ及びリン酸二水素カリウム４．２５ｋｇを仕込み、溶解させた。次に、上記で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体５２．７ｋｇと、イオン交換水３Ｌに溶解させたＮＡＤＰ+０．１４４ｋｇを仕込み、懸濁させた。そこに、ＤＭＳＯ  ９６．０ｋｇに溶解させたＤＯＸＰ  １０．０ｋｇ（１９．２ｍｏｌ）を添加し、内温４５℃〜５２℃で、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨを６．０に保持しながら、６時間撹拌した。反応終了後、９８％硫酸を用いてｐＨ５．０に調整し、内温６５℃で１時間撹拌した。得られたＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９２．６０面積％であった。
得られた反応液を遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。得られた沈殿物を２０％メタノール水溶液５０２Ｌに懸濁させ、遠心分離した。【０１８５】
（２）ＤＯＬＰ抽出
上記で得られた沈殿物を５％硫酸ナトリウム水溶液１０５．３ｋｇに懸濁した後、酢酸エチルによる抽出を３回繰り返し、得られた抽出液を混合して減圧濃縮した。得られた濃縮液を、４％硫酸ナトリウム水溶液１０４ｋｇで洗浄後、分液した。得られた有機層を濾過後、再度、減圧濃縮した。得られたＤＯＬＰ／酢酸エチル溶液は１３２．８ｋｇであり、ＤＯＬＰの含有量は７．０ｋｇ（回収率７０％、ＨＰＬＣ純度は９４．１３面積％）であった。【０１８６】
（３）ＤＯＬＰ晶析
上記の方法で得られたＤＯＬＰの酢酸エチル溶液（ＤＯＬＰ  ６．７ｋｇ含有）を減圧濃縮した。得られた残渣に１−プロパノール５１．５ｋｇを添加後、再度、減圧濃縮した。その後、水２５．６ｋｇを添加し、温度を１０℃まで冷却した。ＤＯＬＰ種晶を添加して結晶を析出させた後、水１２．８ｋｇを追加し、析出した結晶を固液分離により回収した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８０面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン４８．１ｋｇを添加した。得られた混合物を４５℃まで昇温した後、分液して水層を除去した。分液後、減圧濃縮を実施した。温度を４０℃に調整した後、ＤＯＬＰ種晶を添加するとＤＯＬＰが析出した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．４ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８７面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記で得られた湿結晶に、窒素雰囲気下でトルエン３１．７ｋｇを添加した。得られた混合物を６２℃まで昇温し、ＤＯＬＰを溶解させた。溶液を４０℃まで冷却したのち、ＤＯＬＰ種晶５．２ｇを添加し結晶化させた。その後、トルエン９ｋｇを追加した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．２ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９９．５８面積％であり、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記の方法を２回繰り返し、得られた結晶を減圧乾燥して回収した。乾燥後のＤＯＬＰの重量は３．４１ｋｇ（通算回収率４８％）であり、純度は９９．８６面積％であった。【０１８７】
（ＲＳＶ−Ｃａの合成）【０１８８】
【化５２】
2016056658.tif 000058
【０１８９】
窒素雰囲気下、上記で得られた（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（ＤＯＬＰ）２．９９ｋｇ（５．７１ｍｏｌ）とメチルｔ−ブチルエーテル１１．１ｋｇを反応容器に仕込み、脱塩水２９．０ｋｇを添加した。得られたスラリーに２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液３．４７ｋｇ（６．４２ｍｏｌ）を内温２５℃〜２８℃で１０分間かけて滴下した。３．５時間撹拌した後、分液して得られた水層にメチルｔ−ブチルエーテル１１．１ｋｇを添加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、再度、有機層を分離して除去し、水層を液量２４Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた溶液を内温２５℃〜２８℃に調整し、１０％塩化カルシウム水溶液６．９２ｋｇ（６．２２ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。得られたスラリーを、内温２５℃〜２８℃で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、同温で１４０分間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度４０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は２．１４ｋｇ（収率７５％）で、水分を２．９％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。
得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），１．２３（１Ｈ，ｍ），１．４５（１Ｈ，ｍ），１．９３（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｍ），３．３７−３．３０（４Ｈ，ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），３．７０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．１３（１Ｈ，ｂｒ ｓ），４．９９（１Ｈ，ｂｒ ｓ），５．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１６．０Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｍ），７．６３（２Ｈ，ｍ）【０１９０】
（ＲＳＶ−Ｃａの精製）【０１９１】
【化５３】
2016056658.tif 000059
【０１９２】
窒素雰囲気下、得られたＲＳＶ−Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）、精製水３０．０ｇ、メチルｔ−ブチルエーテル３７．３ｇを反応容器に仕込み、撹拌開始後、内温を０℃〜５℃に調製した。得られたスラリーに１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２２．０ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下し、次いで、１時間撹拌し、得られたＤＯＬＡを有機層に抽出した。その後、分液して得られた有機層に精製水２０．０ｇを加え、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。次いで、５分間撹拌した後、分液して有機層を除去した。得られた水層のｐＨを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて８．７に調整し、減圧濃縮した後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整した。内温を２３℃〜２８℃に調整した後、そこに、０．１７ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液２３．２ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を１．５時間かけて滴下した。得られたスラリーを２３〜２８℃で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、０℃〜５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶の重量は８．９３ｇ（収率８９％）であり、水分を５．６％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％であった。【０１９３】
［合成例２］
（ＲＳＶ−Ｃａの空気酸化）【０１９４】
【化５４】
2016056658.tif 000060
【０１９５】
合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａ１５．０ｇ（２９．９ｍｍｏｌ）を反応容器に仕込み、空気存在下、外温８０℃で加熱し、２４時間撹拌した。室温まで冷却した後、ＲＳＶ−Ｃａ１４．７ｇを回収した。
ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．４７面積％であり、３−ＭＯＬＡの含量は０．２９面積％であった。【０１９６】
［合成例３］
（ＤＯＬＰの酸化）【０１９７】
【化５５】
2016056658.tif 000061
【０１９８】
合成例１と同様の方法で合成した（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（ＤＯＬＰ）７．３０ｇ（１３．９ｍｍｏｌ）と塩化メチレン４６．４ｇを反応容器に仕込み、二酸化マンガン２２．０ｇを加えて内温３５℃で３．５時間撹拌した。次いで、二酸化マンガン７．０ｇを追加して２時間撹拌し、さらに、二酸化マンガン２．９ｇを追加して２時間撹拌した。その後、内温２５℃まで冷却してセライトろ過にて固形分を除去した。得られたろ液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル）によって精製した。目的物を含むフラクションを減圧濃縮することにより、（（３Ｒ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３−ヒドロキシ−５−オキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（３−ＭＯＬＰ）を含むシロップ５．１４ｇ（３−ＭＯＬＰ含量４．７６ｇ，収率６６％）を得た。
得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．６４（２Ｈ，ｔｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，７．６Ｈｚ），２．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．７５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），４．０８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．４９（１Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．１４（２Ｈ，ｍ），７．５９（２Ｈ，ｍ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ）【０１９９】
［合成例４］
（３−ＭＯＬＡの分解）【０２００】
【化５６】
2016056658.tif 000062
【０２０１】
窒素雰囲気下、合成例３で得られた（（３Ｒ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３−ヒドロキシ−５−オキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（３−ＭＯＬＰ）０．１２ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）とエタノール２．５１ｇを反応容器に仕込み、そこへ脱塩水１．０４ｇを添加した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１２ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、外温２５℃にて３時間撹拌した後、外温を５０℃まで昇温してさらに２７時間撹拌した。そこに、さらに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１２ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を追加し、１時間撹拌した後、精製水１．０６ｇと、メチルｔ−ブチルエーテル２．０５ｇを仕込み、分液した。得られた水層にメチルｔ−ブチルエーテル２．０５ｇを加え、再度分液した後、得られた２つの有機層を合わせて濃縮することにより、４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−１−ブテニル）］−ピリミジン（ＫＴＮＥ）０．０６ｇ（ＨＰＬＣで分析した化学純度９１．３面積％）を得た。
得られた化合物を分析した結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８），２．２５（３Ｈ，ｓ），３．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），６．１６（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．１４（２Ｈ，ｍ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．６０（２Ｈ，ｍ）【０２０２】
［合成例５］
（ＫＴＮＥの合成）【０２０３】
【化５７】
2016056658.tif 000063
【０２０４】
窒素雰囲気下、４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ（市販品））３．０１ｇ（８．５４ｍｍｏｌ）とアセトン３０．０ｇを反応容器に仕込み、撹拌を開始した後、外温を５℃まで冷却した。１０％水酸化ナトリウム水溶液０．８０ｇ（２．０４ｍｍｏｌ）を４回に分けて添加した後、さらに、テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）０．２９ｇ（０．８９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を外温１０℃まで昇温し、２０時間撹拌した後、酢酸０．１７ｇ（２．８０ｍｍｏｌ）で中和した。そこに、メチルｔ−ブチルエーテル１７６ｇ、精製水１００ｇを加えて生成物を有機層へと抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機層を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン＝１：２）によって精製し、目的のフラクションを減圧濃縮して、ＫＴＮＥ  １．６５ｇ（収率４９％）を得た。
本合成例により、合成例４で得られた化合物が、ＫＴＮＥであることを確認できた。【０２０５】
［比較例１］
合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａを保管後、後述の実施例１に用いる直前にＨＰＬＣで分析した結果、化学純度９９．８６面積％、３−ＭＯＬＡの含有量０．０４面積％であった。【０２０６】
［実施例１］
（ＲＳＶ−Ｃａの精製）【０２０７】
【化５８】
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【０２０８】
合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）、及び精製水４０．０ｇ、メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを反応容器に仕込み、撹拌開始後、内温を５℃〜１０℃に調製した。得られた混合液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、４時間撹拌した。分液して得られた有機層に精製水４０ｇを加え、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を１５分間かけて滴下した。内温を４５℃〜５０℃まで昇温して２．５時間撹拌し、室温で分液した。得られた水層にメチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを添加し、３０分間撹拌した後、分液した。得られた水層を、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液を用いてｐＨ８．３に調整した。得られた溶液を濃縮後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整し、内温２５℃にて０．１７ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液２３．２ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。得られたスラリーを内温２５℃で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、同温で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は８．６６ｇ（収率８７％）であった。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．９２面積％、ＲＳＶ−Ｃａ中の３−ＭＯＬＡの含有量は検出限界以下であった。【０２０９】
［比較例２］
合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａを保管後、後述の実施例２に用いる直前にＨＰＬＣ分析した結果、化学純度は９９．７３面積％、３−ＭＯＬＡの含有量は０．１４面積％であった。【０２１０】
［実施例２］
（ＲＳＶ−Ｃａの精製）【０２１１】
【化５９】
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【０２１２】
窒素雰囲気下、精製水４０．０ｇと、メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇとの混合液に、２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を加えて、撹拌を開始した後、そこに、合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）を４回に分けて添加した。その後、３時間撹拌してＲＳＶ−Ｃａを溶解させた後、分液して得られた有機層に精製水４０．０ｇを加えて撹拌した。そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、得られた溶液を内温５０℃まで昇温し、２．５時間撹拌した。室温まで冷却した後、分液した。得られた水層に再度メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを加えて３０分間撹拌した後、再度、有機層を除去した。得られた水層を減圧濃縮した後、精製水を用いて全量が８０ｍＬとなるように調整し、次いで、活性炭０．５ｇを添加して内温５０℃で１．５時間撹拌した。その後、活性炭をろ別し、内温を２５℃まで冷却した後、０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。その後、２５℃で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、０℃〜５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は８．４０ｇ（収率８４％）であった。
また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．９３面積％、ＲＳＶ−Ｃａ中の３−ＭＯＬＡの含有量は検出限界未満であった。【０２１３】
［実施例３］
（ＲＳＶ−Ｃａの精製）【０２１４】
【化６０】
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【０２１５】
窒素雰囲気下、反応容器に、合成例２で得られたＲＳＶ−Ｃａ１０．０ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）と、精製水４０．０ｇと、メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２５℃に調整した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸１０．８ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した後、４．５時間撹拌した。分液後、得られた有機層に精製水４０ｇを加え、そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１１．０ｇ（２０．４ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、５分間撹拌した。その後、分液して得られた水層を４９℃まで昇温して６．５時間撹拌した。得られた溶液を内温が２５℃になるまで冷却し、メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを加えて１５分間撹拌した後、有機層を分離して除去した。得られた水層に、再度、メチルｔ−ブチルエーテル４２．８ｇを加えて１５分間撹拌し、分液した。得られた水層を濃縮し、０．２ｍｏｌ／Ｌの酢酸を用いて水層のｐＨを７．５に調整した。そこに、内温２５℃にて０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下し、同温で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、０℃〜５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度５０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は８．９３ｇ（収率８９％）であった。
また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は９９．８６面積％、ＲＳＶ−Ｃａ中の３−ＭＯＬＡの含有量は検出限界以下であった。【０２１６】
【表５】
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【０２１７】
［実施例４］
（ＰＴＶ−Ｃａの精製）【０２１８】
【化６１】
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【０２１９】
窒素雰囲気下、反応容器に、ＰＴＶ−Ｃａ１．００ｇ（２．２７ｍｍｏｌ。本実施例に用いる直前にＨＰＬＣで分析した結果、化学純度９９．６６面積％、ＰＴＶ−３−ＭＯＬＡ−Ｃａの含有量０．２５面積％であった。）と、精製水４．００ｇと、メチルｔ−ブチルエーテル４．４１ｇを仕込み、撹拌開始後、外温を２５℃に調整した。得られた溶液に２ｍｏｌ／Ｌ塩酸１．２１ｇ（２．３８ｍｍｏｌ）を滴下した後、３０分間撹拌した。分液後、得られた有機層に精製水４．００ｇを加え、そこに、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１．２９ｇ（２．３８ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下し、５分間撹拌した。その後、分液して得られた水層を外温５０℃まで昇温して３時間撹拌した。得られた溶液を室温まで冷却し、メチルｔ−ブチルエーテル４．４１ｇを加えて１０分間撹拌した後、有機層を分離して除去した。得られた水層に、再度、メチルｔ−ブチルエーテル４．４１ｇを加えて１０分間撹拌し、分液した。得られた水層を濃縮し、精製水を用いて全量が１５．０ｍＬとなるように調整し、室温にて、０．１７ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム水溶液２３．０ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。その後、室温で１時間撹拌し、−１０℃／時間の速度で０℃〜５℃まで冷却した後、０℃〜５℃で１時間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を、温度４５℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は０．７７ｇ（収率７７％）であった。
また、ＨＰＬＣで分析した結果、得られたピタバスタチンカルシウム（以下、「ＰＴＶ−Ｃａ」と称する場合がある。）の結晶の化学純度は９９．８９面積％、ＰＴＶ−Ｃａ中のＰＴＶ−３−ＭＯＬＡの含有量は０．０１面積％であった。【０２２０】
［参考例２］
（ＲＳＶ−Ｃａの空気酸化）【０２２１】
【化６２】
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【０２２２】
合成例１で得られたＲＳＶ−Ｃａを、２つの褐色瓶（容積９ｍＬ）に０．１５ｇずつ量り取り、蓋をした。その後にそれぞれを室温又は冷蔵（４℃）で８１日間保存した。保存開始から３日目、１９日目、８１日目でサンプリングを行なった。
各々のサンプルに含まれる、（（３Ｒ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３−ヒドロキシ−５−オキソ−６−ヘプテン酸カルシウム（３−ＭＯＬＡ（カルシウム塩））の含有量と、ＲＳＶ−Ｃａの含有量をＨＰＬＣで分析した。
分析した結果を、図１に示す。８１日目におけるＲＳＶ−Ｃａの結晶の化学純度は、室温保存で９９．６３面積％、冷蔵保存で９９．９０面積％であり、３−ＭＯＬＡ−Ｃａの含有量は、室温保存では０．３１面積％、冷蔵保存では０．０２面積％であった。
【産業上の利用可能性】
【０２２３】
本発明の方法によれば、スタチン系化合物の純度を効率よく向上させることができ、高純度のスタチン系化合物を得ることができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１４−２０９４８１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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