(57)【要約】  本発明は、KLRG1のメモリーインバリアントNKT細胞に特異的なマーカーとしての使用を提供する。KLRG1を特異的に認識する抗体を用いることにより、容易に、メモリーインバリアントNKT細胞を検出または単離することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インバリアントNKT細胞におけるKLRG1の発現を検出することを含む、メモリーインバリアントNKT細胞の検出方法。
【請求項２】
KLRG1の発現の検出が、KLRG1を特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を予測するための方法であって、
（1）インバリアントNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与による、対象患者由来生体試料における、KLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化を測定すること；及び
（2）（1）において測定したKLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化と、インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性とを相関付けることを含む、方法。
【請求項４】
KLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化の測定が、KLRG1を特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項3記載の方法。
【請求項５】
リンパ球含有試料から、KLRG1陽性且つインバリアントNKT細胞受容体陽性の細胞画分を単離することを含む、メモリーインバリアントNKT細胞の単離方法。
【請求項６】
KLRG1陽性、且つインバリアントNKT細胞受容体陽性の細胞の単離が、KLRG1を特異的に認識する抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを用いて行われる、請求項5記載の方法。
【請求項７】
KLRG1を特異的に認識する抗体を含む、メモリーインバリアントNKT細胞検出用試薬。
【請求項８】
更にインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、請求項7記載の試薬。
【請求項９】
KLRG1を特異的に認識する抗体を含む、インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性を予測するための診断試薬。
【請求項１０】
更にインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、請求項9記載の試薬。
【請求項１１】
KLRG1を特異的に認識する抗体、及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、メモリーインバリアントNKT細胞単離用試薬。
【請求項１２】
インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性の予測において使用するための、KLRG1を特異的に認識する抗体、又は該抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む組み合わせ。
【請求項１３】
インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性を予測するための診断試薬を製造するための、KLRG1を特異的に認識する抗体、又は該抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メモリーインバリアントNKT細胞に特異的なマーカーを用いて、メモリーインバリアントNKT細胞を検出、単離等する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
NK細胞、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞及びγδT細胞等の自然免疫系のリンパ球は、速やかなエフェクター応答を開始するので、自然免疫系の重要なセンチネルであり、最近までは短命であると考えられてきた。メモリー型のNK細胞がいくつかの系で同定され、強力に研究されている（非特許文献1-4）。マウスサイトメガロウイルス（MCMV）感染において、Ly49H+ NK細胞が長期間生存し、延長された抗ウイルス特異的NK細胞応答を形作る役割を有し、過去に出会った病原体の「記憶（メモリー）」をも有することが見出された。免疫学的ゲノムプロジェクトにおける世界的な転写解析の結果、共通するメモリー転写、及びいくつかのNK細胞及びCD8+ T細胞のマーカーを有することが示され、このことは、いくつかの活性化メカニズムが、NK細胞系譜とCD8+T細胞系譜との間で保存されていることを示唆している（非特許文献5）。また、腸管組織においてIFN-γ及びIL-17を同時に産生することができるメモリーγδT細胞が、近年同定されている（非特許文献6）。【０００３】
iNKT細胞は、アミノ酸レベルでインバリアントなCDR3αを有し、Vα14（ヒトにおいてはVα24）遺伝子セグメントとJα18遺伝子セグメントとの間の古典的再構成の産物である、インバリアントT細胞抗原受容体（TCR）α鎖を発現する。これらのiNKT細胞は、それらのTCRの抗原を提示するMHC様分子であるCD1dと糖脂質との複合体を認識し、TCRとの会合に引き続き、抗原特異的な様式でサイトカインを分泌する（非特許文献7-10）。合成されたiNKT細胞リガンド（iNKTリガンド、CD1dリガンドともよぶ）であるα‐ガラクトシルセラミド（α-GalCer）は、樹状細胞（DC）の他に、CD1dをトランスフェクトした腫瘍細胞及び線維芽細胞等のCD1d発現細胞に負荷する（「ロード」または「パルス」とも呼ぶ）ことができる（非特許文献11-13）。α-GalCerをロードしたCD1d陽性細胞（CD1d+細胞）によって、iNKT細胞は活性化され、大量のインターフェロン-γ（IFN-γ）を産生することができる（非特許文献11-13）。
これまで、iNKT細胞の活性化を利用した免疫療法（iNKT細胞活性化療法）が開発されている。一つには、患者体内のiNKT細胞の機能回復を目的に、患者より採取されたiNKT細胞をin vitroで増殖させて体内に戻す方法がある。別の方法としては、患者末梢血から採取した樹状細胞（DC）にα‐GalCerをロードしたもの（DC/Gal）を、再び患者体内に戻すことでiNKT細胞を活性化させる方法が開発され、樹状細胞療法とも呼ばれる。当該方法は、臨床試験により安全性及び効果が立証されている（非特許文献14-17）。
また、iNKT細胞の活性化とDC成熟化を引き起こす、CD1d陽性細胞を用いた新たな免疫誘導用細胞製剤が開発されている（特許文献1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO2007/097370
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】O'Leary, J. G., Goodarzi, M., Drayton, D. L. & von Andrian, U. H. T cell- and B cell-independent adaptive immunity mediated by natural killer cells. Nat Immunol 7, 507-516 (2006).
【非特許文献２】Sun, J. C., Beilke, J. N. & Lanier, L. L. Adaptive immune features of natural killer cells. Nature 457, 557-561 (2009).
【非特許文献３】Min-Oo, G., Kamimura, Y., Hendricks, D. W., Nabekura, T. & Lanier, L. L. Natural killer cells: walking three paths down memory lane. Trends Immunol 34, 251-258 (2013).
【非特許文献４】Cooper, M. A. et al. Cytokine-induced memory-like natural killer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 1915-1919 (2009).
【非特許文献５】Bezman, N. A. et al. Molecular definition of the identity and activation of natural killer cells. Nat Immunol 13, 1000-1009, (2012).
【非特許文献６】Sheridan, B. S. et al. γδT Cells Exhibit Multifunctional and Protective Memory in Intestinal Tissues. Immunity 39, 184-195 (2013).
【非特許文献７】Cerundolo, V., Silk, J. D., Masri, S. H. & Salio, M. Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies. Nat Rev Immunol 9, 28-38 (2009).
【非特許文献８】Godfrey, D. I., Stankovic, S. & Baxter, A. G. Raising the NKT cell family. Nat Immunol 11, 197-206 (2010).
【非特許文献９】Fujii, S. et al. Adjuvant activity mediated by iNKT cells. Semin Immunol 22, 97-102 (2010).
【非特許文献１０】Berzins, S. P., Smyth, M. J. & Baxter, A. G. Presumed guilty: natural killer T cell defects and human disease. Nat Rev Immunol 11, 131-142 (2011).
【非特許文献１１】Fujii, S., Shimizu, K., Kronenberg, M. & Steinman, R. M. Prolonged interferon-γδ producing NKT response induced with α-galactosylceramideloaded dendritic cells. Nat. Immunol. 3, 867-874 (2002).
【非特許文献１２】Shimizu, K., Goto, A., Fukui, M., Taniguchi, M. & Fujii, S. Tumor cells loaded with α-galactosylceramide Induce innate NKT and NK cell-dependent resistance to tumor implantation in mice. J. Immunol. 178, 2853-2861 (2007).
【非特許文献１３】Fujii, S., Goto, A. & Shimizu, K. Antigen mRNA-transfected, allogeneic fibroblasts loaded with NKT-cell ligand confer antitumor immunity. Blood 113, 4262-4272 (2009).
【非特許文献１４】Nieda, M. et al. Therapeutic activation of Vα24+Vβ11+ NKT cells in human subjects results in highly coordinated secondary activation of acquired and innate immunity. Blood 103, 383-389 (2004).
【非特許文献１５】Chang, D. H. et al. Sustained expansion of NKT cells and antigen-specific T cells after injection of α-galactosyl-ceramide loaded mature dendritic cells in cancer patients. J. Exp. Med. 201, 1503-1517 (2005).
【非特許文献１６】Motohashi, S. & Nakayama, T. Natural killer T cell-mediated immunotherapy for malignant diseases. Front Biosci (Schol Ed) 1, 108-116 (2009).
【非特許文献１７】Motohashi, S. et al. A phase I-II study of α-galactosylceramide-pulsed IL-2/GM-CSF-cultured peripheral blood mononuclear cells in patients with advanced and recurrent non-small cell lung cancer. J Immunol 182, 2492-2501 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
各種のiNKT細胞活性化療法では、免疫誘導の作用機序が異なるものの、投与された細胞によって免疫誘導が起こるため、投与された細胞に対する患者の応答性が治療効果の指標となり得る。例えば、DC／Galを用いたiNKT細胞活性化療法では、投与されたDC／Galに対する患者の応答性は、DC／Gal投与後の患者におけるiNKT細胞の細胞数、又はiNKT細胞の誘導されたIFN-γ産生能に基づき評価されている。しかしながら、iNKT細胞の細胞数は、患者の応答性との相関が必ずしも明らかではなかった。また、iNKT細胞のIFN-γ産生能の評価は、投与対象からiNKT細胞を回収してインビトロでの培養を要するため、煩雑な操作を伴う。そこで、iNKT細胞活性化療法における、患者の応答性を容易に評価する方法を樹立することが重要である。【０００７】
本発明は、iNKT細胞の活性化が誘導された後に、IFN-γを優勢に産生する長期持続性の機能的iNKT細胞を特異的に検出、分離する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、iNKTリガンドを負荷した（パルスした）CD1d+細胞を投与した後の肺において、長期間維持される機能的なiNKT細胞が存在し、このiNKT細胞がメモリー細胞の特徴を有することを見出した。増殖及びそれに引き続く退縮期の後、KLRG1発現iNKT細胞が、メモリー細胞として特異的に数か月に亘り維持され、長期間、防御的な免疫活性を示した。このKLRG1発現iNKT細胞は、抗原特異的により強い二次的応答を示し、大量のIFN-γを産生した。【０００９】
発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：【００１０】
［1］インバリアントNKT細胞におけるKLRG1の発現を検出することを含む、メモリーインバリアントNKT細胞の検出方法。
［2］KLRG1の発現の検出が、KLRG1を特異的に認識する抗体を用いて行われる、［1］の方法。
［3］iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を予測するための方法であって、
（1）インバリアントNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与による、対象患者由来生体試料における、KLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化を測定すること；及び
（2）（1）において測定したKLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化と、インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性とを相関付けることを含む、方法。
［4］KLRG1陽性インバリアントNKT細胞数の変化の測定が、KLRG1を特異的に認識する抗体を用いて行われる、［3］の方法。
［5］リンパ球含有試料から、KLRG1陽性且つインバリアントNKT細胞受容体陽性の細胞画分を単離することを含む、メモリーインバリアントNKT細胞の単離方法。
［6］KLRG1陽性、且つインバリアントNKT細胞受容体陽性の細胞の単離が、KLRG1を特異的に認識する抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを用いて行われる、［5］の方法。
［7］KLRG1を特異的に認識する抗体を含む、メモリーインバリアントNKT細胞検出用試薬。
［8］更にインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、［7］の試薬。
［9］KLRG1を特異的に認識する抗体を含む、インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性を予測するための診断試薬。
［10］更にインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、［9］記載の試薬。
［11］KLRG1を特異的に認識する抗体、及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む、メモリーインバリアントNKT細胞単離用試薬。
［12］インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性の予測において使用するための、KLRG1を特異的に認識する抗体、又は該抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む組み合わせ。
［13］インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした抗原提示細胞による抗腫瘍療法に対する患者の応答性を予測するための診断試薬を製造するための、KLRG1を特異的に認識する抗体、又は該抗体及びインバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを含む組み合わせの使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、KLRG1発現iNKT細胞を検出することで、患者のiNKT細胞の活性化の状態、長期間に渡るiNKT細胞による免疫防御の有無、およびiNKT細胞活性化療法における患者の応答性を容易に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−ａ】脾臓及び肺におけるiNKT細胞の頻度を示す。B16メラノーマ細胞（2x105個/マウス）をC57BL/6 マウスへ静脈内投与した。7日目にB16担持又はナイーブマウスを1x106 DC/Galで免疫した（図1-a〜図1-e）。14日目に、4群のマウスについてiNKT細胞の頻度を評価した。
【図１−ｂ】肺におけるiNKT細胞の数を示す。14日目に、4群のマウスについてiNKT細胞の数を評価した。*P<0.05  ナイーブ又はB16 v.s. DC/Gal又はB16-DC/Gal、3つの独立した試験（平均値±SEM）。
【図１−ｃ】α-GalCer再刺激による肺iNKT細胞によるIFN-γ産生を示す。14日目に、4群のマウスについて、α-GalCer (100 ng/ml)での16時間の再刺激に応答した肺iNKT細胞によるIFN-γ産生を評価した。
【図１−ｄ】肺MNCsのB16メラノーマに対する細胞傷害性を示す。DC/Galによる処置の1週間後に、B16メラノーマに対する細胞傷害性を評価した。標的である腫瘍細胞を、ナイーブ又はDC/Galを注入したマウスからのプールした肺MNCsと共に、様々なE:T比で16時間混合した。左からE/T=10、E/T=30、E/T=100。*P<0.05  ナイーブ v.s. DC/Gal又はB16-DC/Gal。
【図１−ｅ】脾臓iNKT細胞のマイクロアレイ解析を示す。脾臓iNKT細胞のマイクロアレイ解析をナイーブ(n=3)及びDCG免疫したマウス(n=4)について行った。データは、同様の結果を有する2つの独立した試験の代表である（平均値±SEM；1群あたりn≧4）。
【図２−ａ】iNKT細胞表面におけるKLRG1の発現を示す。C57BL/6マウスをDC/Galで免疫するか（下）、又は処理しなかった（上及び左下）。7日後、CD19- CD1d-dimer/Gal+細胞にゲートすることにより、iNKT細胞によるKLRG1の発現を解析した。
【図２−ｂ】ナイーブ又はDC/Galで免疫したマウスの肺のKLRG1+ 及びKLRG1- iNKT細胞の表面形質のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２−ｃ】KLRG1+iNKT細胞の頻度を示す。DC/Galで免疫後2〜12週にKLRG1+ iNKT細胞の頻度を解析した。
【図２−ｄ】DC/Galで免疫後5日目から90日目にかけての、各臓器における、全iNKT細胞の絶対数の変化を示す。データは、2つの独立した試験（1群あたりn≧4）の代表的なものである。
【図２−ｅ】DC/Galで免疫後5日目から90日目にかけての、各臓器における、KLRG1+ iNKT細胞の百分率の変化を示す。データは、2つの独立した試験（1群あたりn≧4）の代表的なものである。
【図３−ａ】KLRG1+iNKT細胞及びKLRG1-iNKT細胞における、遺伝子発現解析。C57BL/6マウスをDC/Galで免疫するか、未処置とした。1カ月後、肺におけるKLRG1+ 又はKLRG1- iNKT細胞をFACSにより精製した。サイトカイン、ケモカイン、granzyme A (gzma)及びFasリガンド(fasL)の遺伝子発現の定量的解析を行った。精製したiNKT細胞における各mRNAの発現を定量的リアルタイムPCRで測定し、1コピーのハウスキーピング遺伝子HPRTに対する転写物の数で表した。データは、1群あたり4匹のマウスを有するトリプリケイトの2つの独立した試験（平均値±SEM）の代表的なものを示す。
【図３−ｂ】KLRG1+又はKLRG1-iNKT細胞におけるgranzyme A発現を示す。DC/Galにより免疫した、又は免疫しないマウスの肺におけるKLRG1+ 又はKLRG1- iNKT細胞におけるgranzyme Aの発現を、IFN-γの細胞内染色のためのbrefeldin Aの存在下で、プレートに結合した抗CD3抗体及び可溶性抗CD28抗体により2時間刺激した後、解析した。解析ゲートは、CD19- CD1d-dimer/Gal+細胞にセットした。データは、4匹のマウスを用いた2つの独立した試験の代表的なものを示す。
【図３−ｃ】KLRG1+又はKLRG1-iNKT細胞におけるIFN-γ発現を示す。DC/Galにより免疫した、又は免疫しないマウスの肺におけるKLRG1+又はKLRG1- iNKT細胞におけるIFN-γの発現を、IFN-γの細胞内染色のためのbrefeldin Aの存在下で、プレートに結合した抗CD3抗体及び可溶性抗CD28抗体により2時間刺激した後、解析した。解析ゲートは、CD19- CD1d-dimer/Gal+細胞にセットした。データは、4匹のマウスを用いた2つの独立した試験の代表的なものを示す。
【図３−ｄ】KLRG1+又はKLRG1-iNKT細胞のIFN-γ、ccl3及びccl4産生を示す。条件は図3-cと同一であり、プレートに結合した抗CD3抗体及び可溶性抗CD28抗体と共に24時間培養した培養物の上清について、ELISAによりIFN-γの、LuminexによりCCL3及びCCL4のタンパク質レベルを解析した。データは、1群あたり4匹のマウスを有するトリプリケイトの2つの独立した試験（平均値±SEM）の代表的なものを示す。*p<0.05 ナイーブKLRG1-又はDC/Gal KLRG1- iNKT v.s. DC/Gal KLRG1+ iNKT。
【図３−ｅ】KLRG1+またはKLRG1-iNKT細胞における転写因子発現を示す。1ヶ月前にDC／Gを投与したマウスの肺からのKLRG1+ またはKLRG1- iNKT細胞による転写因子Eomes, Runx3, Tbx21, Gata3 及びRorcの発現をリアルタイムPCRにより解析した。データは、1群あたり4匹のマウスを有するトリプリケイトの2つの独立した試験（平均値±SEM）の代表的なものを示す。
【図３−ｆ】KLRG1+又はKLRG1-iNKT細胞におけるIFN-γ発現を示す。DC/Galで免疫したマウスを、4か月後にB16メラノーマでチャレンジした。B16反応性iNKT細胞について、IFN-γ分泌アッセイをDC/Galによるワクチン接種して、又はワクチン接種せずに12時間後に実施した。
【図３−ｇ】B16メラノーマでチャレンジした、DC/Gal免疫又は非免疫マウスにおける肺における転移の数を示す。条件は図3-fと同一である。抗腫瘍効果を肺における転移の数をカウントすることにより、2週間後に評価した。何匹かのマウスについては、B16によるチャレンジの直前に抗NK1.1抗体で処理した。データは1群あたり4〜6匹のマウスを有する独立した2つの試験から得た平均値である。
【図４−ａ】KLRG1+iNKT細胞によるBrdU取り込みのプロファイルを示す。ナイーブ又はDC/Gal免疫B6動物の群に対して、BrdUを0日目（静注）に投与し、7日目までBrdUを含む飲水を与え、1カ月後に、CD19-CD1d-dimer/Gal+細胞にゲートして解析した。データは、2つの独立した試験（1群あたりn＝3）の代表である。
【図４−ｂ】KLRG1+iNKT細胞を養子的に移入したJα18-KOマウスの肝臓及び肺におけるKLRG1+iNKT細胞の数を示す。1ヶ月前にDC/Galで免疫したVα14+iNKTクローンマウスから、KLRG1+ iNKT細胞をソートした。KLRG1+iNKT細胞（1x105 /匹）をJα18-KOマウスへ移入した。4週間後にマウスをDC/Galにより処理するか、処理しなかった。1週間後に、KLRG1+ iNKT細胞細胞の頻度を解析した。データは独立した2つの試験（1群あたりn=4）の代表である。
【図４−ｃ】Vα14+iNKTクローンマウスからのナイーブiNKT細胞を養子的に移入したB6マウスの肝臓及び肺におけるVα14+venus+クローン化 iNKT細胞の数を示す。Vα14+iNKTクローンマウスからのナイーブiNKT細胞（KLRG1- iNKT細胞）を、C57BL/6マウスへ移入し、同日にDC/Galで免疫した。3か月後にマウスを再びDC/Galで処理するか、処理しなかった。1週間後に、3つ全ての群について、肝臓及び肺におけるVα14+venus+クローン化 iNKT細胞の数を評価した。
【図４−ｄ】Vα14+iNKTクローンマウスからのナイーブiNKT細胞を養子的に移入したB6マウスの肝臓及び肺におけるKLRG1+ iNKT細胞の頻度を示す。試験条件は図4-cと同じである。1週間後に、KLRG1+iNKT細胞の頻度を解析した。
【図４−ｅ】Vα14+iNKTクローンマウスからのナイーブiNKT細胞を養子的に移入したB6マウスの肝臓及び肺におけるKLRG1+ iNKT細胞の数を示す。試験条件は図4-cと同じである。1週間後に、KLRG1+iNKT細胞の数を解析した。
【図５−ａ】種々のNKTリガンドでパルスしたDCにより免疫したマウスの肺におけるKLRG1+ iNKT細胞の数を示す。C57BL/6マウスに、DC；10 ng/ml 又は100 ng/ml α-GalCerパルスしたDC（DC/Gal (10), DC/Gal (100)）；及び10 μg/ml iGB3 又はGSLパルスしたDC（DC/iGB3 及び DC/GSL）を投与した。DC/Gal (100)で免疫した一部のマウスを、2か月後に、DC/Gal (10) 、DC/Gal (100)、DC/iGB3 又はDC/GSLで再度チャレンジした。CD19-細胞にゲートした後、CD1d-dimer/Gal-APC及びKLRG1-PE/cy7を用いて、肺におけるKLRG1+ iNKT細胞の数を、フローサイトメトリーにより測定した。データは、独立した2つの試験の代表である（平均値±SEM）（1群あたりn=4-6）。
【図５−ｂ】iNKT細胞におけるVβ使用の解析結果を示す。試験条件はパネルAと同じである。免疫したマウスを、CD1d-dimer/Gal-APC 及びKLRG1-PE/cy7を用いて、iNKT細胞Vβ使用について解析した。
【図５−ｃ】各Vβレパトワ中のクラスターサイズを示すヒートマップを示す。5〜6匹のナイーブ又はDC/Gal-免疫マウスからプールしたiNKT細胞から、TCR RNA配列解析のためのナイーブiNKT細胞及びKLRG1+ iNKT細胞を調製した。ナイーブ、DC/Gal注入マウス（d7, d2）又はDC/Gal-DC/Galブーストしたマウス（各段階、n=2）において、Vβの相補性決定領域3(CDR3β)を、GS Junior system (Roche)により評価した。ブーストしたマウスにおける各Vβレパトワ中のCDR3の高頻度クラスター（上位50）を選択し、ナイーブマウス、DC/Gal注入マウス(d7, d2)又はDC/Gal-DC/Galブーストマウスにおいて、これらをクラスター化した。
【図５−ｄ】それぞれのマウスの各VβレパトワにおけるCDR3βクラスターのサイズ分布を示す。左側のバーは、全てのリードの1％未満のサイズのクラスターの数を、右側のバーは、全てのリードの1％以上のサイズのクラスターの数を、それぞれ示す。
【図５−ｅ】CDR3の全クラスターについての、主成分解析を示す。2つの群のCDR3クラスターが同定された(i)。グループ（1）及び（2）におけるKLRG1+iNKT細胞のクラスターサイズ分布を、それぞれ棒グラフで示した（ii及びiii）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、メモリーインバリアントナチュラルキラーT細胞（長期持続性機能的iNKT細胞、メモリーiNTK細胞とも称する）の検出方法を提供する。
【００１４】
NKT細胞は、T細胞受容体（TCR）とNK受容体の2つの抗原レセプターを発現しているリンパ球の一つである。通常のT細胞とは異なり、NKT細胞上のT細胞受容体のレパートリーは非常に限られている。例えばマウスNKT細胞（Vα14 NKT細胞という場合がある）上のT細胞受容体のα鎖は、インバリアントなVα14及びJα18遺伝子セグメントによりコードされており（Proc Natl Acad Sci USA, 83, p.8708-8712, 1986; Proc Natl Acad Sci USA, 88, p.7518-7522, 1991; J Exp Med, 180, p.1097-1106, 1994）、ヒトNKT細胞上のT細胞受容体のα鎖は、マウスのVα14と相同性の高いインバリアントなVα24及びJα18遺伝子セグメントによりコードされている。このようなインバリアントなVα鎖（例、マウス：Vα14、ヒト：Vα24）を有するNKT細胞を、特にiNKT細胞という。iNKT細胞は、当該細胞上のT細胞受容体（これを、iNKT細胞受容体と称する。）が、CD1d分子上に提示された下記の「iNKT細胞リガンド」を認識する。このような性質を、特にCD1d拘束性という。
【００１５】
「メモリーインバリアントNKT細胞（長期持続性機能的iNKT細胞）」とは、CD1d分子上に提示されたiNKT細胞リガンドによる刺激を受けた経験を有し、該刺激によるクローン増殖、及びそれに引き続く退縮期を経た後に、生体内で維持されるiNKT細胞をいう。これに対して、CD1d分子上に提示されたiNKT細胞リガンドによる刺激を受けた経験を有していないiNKT細胞を「ナイーブインバリアントNKT細胞」という。メモリーiNKT細胞の、CD1d分子上に提示されたiNKT細胞リガンドによる刺激に対する応答は、ナイーブiNKT細胞と比較して増強されており、CD1d分子上に提示されたiNKT細胞リガンドによる刺激に応答して大量のIFN-γを産生する。一態様において、メモリーiNKT細胞は、ナイーブiNKT細胞と比較してグランザイム Aをより高いレベルで発現しており、高い抗腫瘍活性を有する。
【００１６】
本発明において検出されるメモリーiNKT細胞は、哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。
【００１７】
本発明の検出方法は、iNKT細胞におけるKLRG1等の識別マーカーの発現を検出することを含む。本発明は、メモリーiNKT細胞において、KLRG1等の特定の遺伝子が特異的に発現しているのに対してナイーブiNKT細胞はKLRG1等の特定の遺伝子を発現しておらず、KLRG1等の特定の遺伝子がメモリーiNKT細胞をナイーブiNKT細胞から識別することのできる特異的なマーカーとして有用であることを見出したことに基づく。
メモリーiNKT細胞はKLRG1、ccl3、ccl4およびグランザイムAを特異的に発現しているため、iNKT細胞におけるKLRG1、ccl3、ccl4および／またはグランザイムAの発現を確認することでナイーブiNKT細胞と識別することができる。
以上より、メモリーiNKT細胞の識別マーカーは、KLRG1、ccl3、ccl4および／またはグランザイムAであり、好ましくはKLRG1である。
一態様において、メモリーiNKT細胞は、ナイーブiNKT細胞と比較して高い発現量のCD43、CD49d、Ly6C、NKG2D、FasLおよび／またはIFN-γが確認され、ナイーブiNKT細胞と比較して低い発現量のCD69、CD127および／またはCD27が確認される。さらに、メモリーiNKT細胞の特徴として、NK細胞とは異なりLPAM-1、Ly49Dおよび／またはLy49Hの発現が検出されないか、顕著に低い発現量である。
従って、上記のメモリーiNKT細胞の識別マーカーに加えて、CD43、CD49d、Ly6C、NKG2D、CD69、CD127、CD27、 LPAM-1、Ly49Dおよび／またはLy49Hの発現レベルを検出する方法を、メモリーiNKT細胞の識別の判断に利用できる。
【００１８】
本発明の検出方法に供する試料は、メモリーiNKT細胞が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されない。好適には、末梢血、骨髄、胸腺、リンパ節、肺、肝臓、腫瘍組織等の組織や、これから単離された単核球画分等が用いられる。
【００１９】
メモリーiNKT細胞の識別マーカーは、メモリーiNKT細胞以外の細胞にも発現する可能性がある。従って、精製されたiNKT細胞やiNKT細胞から樹立された細胞株を試料として用いるような場合以外は、通常は、iNKT細胞を、試料中の他の細胞から識別する必要がある。
iNKT細胞を、試料中の他の細胞から識別する方法としては、iNKT細胞の細胞表面マーカーであるNKT ligand-CD1d dimer又はtetramer complex陽性（ヒトであればVa24+Vb11+, 6B11陽性）を指標として、フローサイトメトリーを行う方法など、当業者であれば適宜公知の方より選択できる。
また、iNKT細胞の識別する方法として、iNKT細胞リガンドを利用した方法も挙げられる。iNKT細胞は、iNKT細胞受容体を介して、CD1d分子上に提示されたiNKT細胞リガンドを特異的に認識するので、例えばiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを用いて、細胞表面上のiNKT細胞受容体の発現を検出することにより、iNKT細胞を、試料中の他の細胞から識別することができる。iNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dは、iNKT細胞に特異的に結合する。従って、iNKT細胞は、「インバリアントNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1d」陽性の細胞として、試料中の他の細胞から識別される。
また、別の態様では、採取した試料とiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d発現細胞と共培養し、iNKT細胞を増殖させて試料中のiNKT細胞の占める割合を増強させた後に、上述のフローサイトメトリー法、可溶性CD1dを用いた方法などによって他の細胞と識別することができる。
【００２０】
インバリアントNKT細胞リガンド（iNKT細胞リガンド、CD1dリガンドとも称する）とは、CD1d分子上に提示されたときに、iNKT細胞上のT細胞受容体（iNKT細胞受容体）により特異的に認識され、iNKT細胞を特異的に活性化させ得る化合物をいう。本発明において使用される「インバリアントNKT細胞リガンド」としては、例えば、α-グリコシルセラミド、イソグロボトリヘキソシルセラミド (iGB3)（Science, 306, p.1786-1789, 2004）、OCH（Nature 413:531, 2001）、Sphingobium yanoikuyaeのGSL等を挙げることができる。α-グリコシルセラミドは、ガラクトース、グルコースなどの糖類とセラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、WO93／05055、WO94／02168、WO94／09020、WO94／24142、およびWO98／44928、Science, 278, p.1626-1629, 1997 等に開示されているものを挙げることができる。中でも、（2S，3S，4R）-1-O-（α-D-ガラクトピラノシル）-2-ヘキサコサノイルアミノ-1，3，4-オクタデカントリオール（本明細書中、α-ガラクトシルセラミド又はα-GalCerと称する）又はα‐ガラクトシルセラミド類縁体が好ましい。α‐ガラクトシルセラミド類縁体としては、例えば国際公開ＷＯ２００７／０９９９９９号（米国特許８１６３７０５号）、国際公開ＷＯ２００９／１１９６９２号（米国特許８５５１９５９号）、国際公開ＷＯ２００８／１０２８８８号（米国特許８２９９２２３号）、国際公開ＷＯ２０１０／０３００１２号（米国特許８５８０７５１号）、国際公開ＷＯ２０１１／０９６５３６号（米国特許８８５３１７３号）、国際公開ＷＯ２０１３／１６２０１６号（米国公開番号２０１５−０１５２１２８）に記載された化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
可溶性CD1dとは、iNKT細胞リガンド提示能を有する、CD1dの細胞外ドメインをいう。iNKT細胞へのアフィニティを増強するために、可溶性CD1dの多量体を用いることが好ましい（J Exp Med, 192, p.741-754, 2000; J Exp Med, 191, p.1895-1903, 2000）。多量体としては、例えば、二〜八量体、好ましくは、四量体又は二量体が好ましい。
【００２２】
「可溶性CD1dへのインバリアントNKT細胞リガンドのパルス」とは、iNKT細胞リガンドを可溶性CD1d上に、該リガンドがiNKT細胞へ提示され得るように、配置することをいう。可溶性CD1dへのiNKT細胞リガンドのパルスは、iNKT細胞リガンドを可溶性CD1dへ接触させることにより達成することが出来る。例えばiNKT細胞リガンドを含有する生理的な水溶液中で可溶性CD1dをインキュベートする。この場合、水溶液中のiNKT細胞リガンドの濃度は、iNKT細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば、1〜10000ng／ml好ましくは10〜1000ng／mlである。更に、インキュベート後に、ゲル濾過等でフリーのiNKT細胞リガンドを除去することにより、iNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dが単離される。
【００２３】
iNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dは、フローサイトメトリー解析において容易に検出できるように、FITC、PE等の適切な蛍光色素や、ビオチン等により標識されていてもよい。
【００２４】
好ましい態様において、iNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dは、α-GalCerをパルスした可溶性CD1d四量体又は二量体である。
【００２５】
KLRG1（Killer cell lectin-like receptor subfamily G, member 1）は公知のII型膜貫通糖タンパク質であり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いることが出来るKLRG1は、上述の哺乳動物のKLRG1である。ヒトKLRG1の代表的なアミノ酸配列としては、NCBI統合データベースAccession No. NP_005801, version NP_005801.3（2014年1月26日更新）が知られている。また、マウスKLRG1の代表的なアミノ酸配列としては、NCBI統合データベースAccession No. NP_058666, version NP_058666.1（2014年2月26日更新）が知られている。ヒトKLRG1の代表的なmRNA (cDNA)配列としては、NCBI統合データベースAccession No. NM_005810, version NM_005810.3（2015年3月15日更新）が知られている。マウスKLRG1の代表的なmRNA (cDNA)配列としては、NCBI統合データベースAccession No. NM_016970, version NM_016970.1（2015年2月15日更新）が知られている。
【００２６】
iNKT細胞におけるメモリーiNKT細胞の識別マーカーの検出は、通常生体外で行われる。
【００２７】
メモリーiNKT細胞の識別マーカーの発現レベルを確認する方法として、KLRG1を例にして説明する。KLRG1以外の識別マーカーについても、KLRG1と同様に発現レベルを確認し、本発明を実施することが可能である。KLRG1（ポリペプチド）の発現レベルは、KLRG1を特異的に認識する抗体を用いて、免疫化学的手法により測定することができる。免疫化学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。KLRG1はII型膜貫通タンパク質であり、細胞表面上に発現するので、フローサイトメトリー解析等により、iNKT細胞の細胞表面上におけるKLRG1の発現を検出するのが簡便である。
【００２８】
KLRG1を特異的に認識する抗体は、KLRG1ポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本発明においては、好適には、KLRG1の細胞外ドメインを特異的に認識する抗体が用いられる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
【００２９】
KLRG1を特異的に認識する抗体は、フローサイトメトリー解析において容易に検出できるように、FITC、PE等の適切な蛍光色素や、ビオチン等により標識されていてもよい。
【００３０】
抗体による抗原Xへの「特異的認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Xに対する結合親和性が、非特異的な抗原（例、牛血清アルブミン（BSA））に対する結合親和性よりも高いことを意味する。
【００３１】
KLRG1の発現レベルとして、KLRG1 mRNA発現レベルを測定してもよい。KLRG1 mRNA発現レベルは、KLRG1 mRNA又はcDNAを特異的に検出する核酸プライマー又は核酸プローブを用いて、PCR（RT-PCR、リアルタイムPCR等）、ノザンブロッティング、核酸アレイ、in situハイブリダイゼーション等の周知の分子生物学的手法により測定することができる。
【００３２】
KLRG1 mRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、KLRG1 mRNA又はcDNAのヌクレオチド配列に含まれる、約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、いっそう好ましくは約18〜約50塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００３３】
KLRG1 mRNA又はcDNAを特異的に検出し得る核酸プライマーは、KLRG1 mRNA又はcDNAの一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、KLRG1 mRNA又はcDNAのヌクレオチド配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より3’側の上記ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
核酸プローブ及び核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
【００３５】
また、核酸プローブ及び核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125I、131I、3H、14C、32P、33P、35S等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、ビオチンなどで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００３６】
核酸プローブ及び核酸プライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA／RNAハイブリッドのいずれであってもよい。
【００３７】
上記核酸プローブ及び核酸プライマーは、例えば、公知の遺伝子配列データベースにおいて提供されているKLRG1 mRNA又はcDNAヌクレオチド配列情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００３８】
本発明の検出方法においては、iNKT細胞においてKLRG1等の識別マーカーの発現が検出された場合（即ちKLRG1等の識別マーカー陽性の場合）、該細胞がメモリーiNKT細胞として同定される。
【００３９】
一態様において、本発明の検出方法は、評価対象試料中に含まれる細胞の細胞表面上におけるiNKT細胞受容体及びメモリーiNKT細胞の識別マーカーの発現を検出することを含む。該態様においては、iNKT細胞受容体陽性、且つメモリーiNKT細胞の識別マーカーが陽性（好ましくはKLRG1陽性）の細胞が、メモリーiNKT細胞として同定される。
【００４０】
本発明の検出方法を用いれば、容易にメモリーiNKT細胞を検出することができるので、これを応用して、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を予測することができる。即ち、本発明は、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を予測するための方法であって、下記工程、
（1）インバリアントNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与による、対象患者由来生体試料における、KLRG1等の識別マーカー陽性インバリアントNKT細胞数の変化を測定すること；及び
（2）上記（1）において測定したKLRG1等の識別マーカー陽性インバリアントNKT細胞数の変化と、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性とを相関付けること、を含む方法を提供する。
【００４１】
本発明において「iNKT細胞活性化療法」とは、iNKT細胞の活性化を利用した免疫療法を指し、代表的には1）患者体内のiNKT細胞の機能回復を目的に、患者より採取されたiNKT細胞をin vitroで増殖させて体内に戻す方法、2）患者末梢血から採取した抗原提示細胞にiNKT細胞リガンドをロードし、再び患者体内に戻すことでiNKT細胞を活性化させる方法、3）人工的に作製したCD1d陽性細胞であって、iNKT細胞リガンドをロードした細胞を対象に投与して自然免疫の活性化と獲得免疫を誘導する方法、を指す。
【００４２】
抗原提示細胞とは、抗原をリンパ球に提示してリンパ球の活性化を促す細胞をいう。通常、抗原提示細胞は、T細胞やNKT細胞に抗原を提示し得る樹状細胞又はマクロファージである。特に、樹状細胞は、強力な抗原提示能力を有しており、細胞表面上に発現されたMHC ClassI、MHC ClassI様分子（CD1d等）、MHC ClassII等を介して抗原を提示し、T細胞又はNKT細胞を活性化させ得るので、好ましい。抗原提示細胞は、iNKT細胞リガンドをiNKT細胞に確実に提示し得るように、CD1d発現細胞であることが好ましい。
【００４３】
抗原提示細胞としては、任意の哺乳動物由来のものを使用することができる。哺乳動物としては、上述のものを挙げることができる。好適には、対象患者と同一種の哺乳動物の抗原提示細胞が用いられる。例えば、患者がヒトである場合、ヒト抗原提示細胞が用いられる。
【００４４】
生体内の抗原提示細胞は公知の方法によって、上述の哺乳動物の組織（例えばリンパ節、脾臓、末梢血等）から単離することが可能である。例えば抗原提示細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等により樹状細胞を単離することができる。抗原提示細胞として樹状細胞を単離する場合には、樹状細胞上に特異的に発現する細胞表面マーカーとして、例えば、CD11c、MHC ClassI、MHC ClassI様分子（CD1d等）、MHC ClassII、CD8α、CD85k、CD86、FDL-M1、DEC-205等を挙げることが出来る。
【００４５】
また、抗原提示細胞は、上述の哺乳動物の骨髄細胞や単核球等を適切な抗原提示細胞分化条件で培養することにより製造することもできる。例えば、骨髄細胞をGM-CSF（場合によっては更にIL-4）の存在下で約6日間程度培養することにより、樹状細胞（骨髄由来樹状細胞：BMDC）へと分化する（Nature, 408, p.740-745, 2000）。また、末梢血液中の単核球（特に単球、マクロファージ等）をGM-CSF（場合によっては更にIL-2及び／又はIL-4）の存在下で培養することにより、樹状細胞を得ることが出来る。
【００４６】
人工的に作製したCD1d陽性細胞は、任意の哺乳動物細胞または哺乳動物の培養細胞に対して抗原とCD1dの遺伝子を導入して人工的に発現させたトランスフェクタントである。当該細胞は、投与対象にとって同種同系、同種異系または異種細胞のいずれであって良い。iNKT細胞リガンドをロードしたCD1d陽性細胞は、NKT細胞の活性化及びT細胞免疫応答を同時に誘導し、抗原に対して非常に強力な免疫能を誘導する方法である（国際公開WO2007/097370）。
【００４７】
以下、人工的に作製したCD1d陽性細胞、抗原提示細胞の双方を含めて「CD1d陽性細胞」として説明する。
「CD1d陽性細胞へのインバリアントNKT細胞リガンドのパルス」とは、iNKT細胞リガンドを細胞表面上のCD1d分子に、該リガンドがiNKT細胞へ提示され得るように、配置することをいう。CD1d陽性細胞へのiNKT細胞リガンドのパルスは、iNKT細胞リガンドをCD1d陽性細胞へ接触させることにより達成することが出来る。例えばiNKT細胞リガンドを含有する生理的な培養液中でCD1d陽性細胞を培養する。この場合、培養液中のiNKT細胞リガンドの濃度は、iNKT細胞リガンドの種類により適宜設定することが可能であるが、例えば、1〜10000ng／ml好ましくは10〜1000ng／mlである。更に、培養後にCD1d陽性細胞を、iNKT細胞リガンドを含まない培養液や生理的な水溶液で洗浄し、フリーのiNKT細胞リガンドを除去することにより、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞が単離される。
【００４８】
iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞による治療の対象となる疾患には、腫瘍、感染症が含まれる。
腫瘍の種類としては、iNKT細胞リガンドが治療的に有効な腫瘍であれば特に限定されない。腫瘍としては、例えば、肺癌（小および／または非小細胞）、脳腫瘍、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、皮膚癌、骨肉腫、結腸直腸癌、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ACTH生成腫瘍、副腎皮質癌、皮膚T細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、メラノーマ、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣（胚細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽腫、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、甲状腺癌、栄養膜新生物、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍等を挙げることが出来る。
感染症は、病原体の感染によって引き起こされる疾患を指し、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、肝炎ウイルス（例、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウィルス、脳炎ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス（例、HTLV−I）などのウイルスの病原体によって引き起こされるウイルス感染症；マラリア、トリパノソーマ、トキソプラズマなどの原虫により引き起こされる原虫感染症；肺炎球菌、チフス菌、赤痢菌などの細菌によって引き起こされる細菌感染症などが挙げられる。
【００４９】
iNKT細胞活性化療法の対象患者は、通常、上述の哺乳動物、好ましくは、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）であり、より好ましくはヒトである。
【００５０】
iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性とは、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与に応答して、IFN-γ産生能を有するiNKT細胞が誘導される程度又は有無をいう。上述のように、iNKT細胞活性化療法による抗腫瘍治療においては、誘導されるIFN-γを産生することができるiNKT細胞の数が、長期間の抗腫瘍効果と正の相関があるので、患者の応答性（誘導されるIFN-γを産生することができるiNKT細胞の数）が高い程、より高い治療効果が期待できる。本発明者らにより、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与により誘導されるIFN-γ産生能を有するiNKT細胞が、メモリーiNKT細胞であることが示されたので、上記本発明の検出方法により、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞をメモリー細胞として検出し、この数の変化をモニターすることにより、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を評価することができる。
【００５１】
本発明の予測方法においては、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与による、対象患者由来生体試料における、KLRG1陽性iNKT細胞数の変化を測定する。具体的には、上記本発明の検出方法に従って、対象患者由来生体試料に含まれるiNKT細胞におけるKLRG1等の識別マーカーの発現を検出することにより、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞（即ち、メモリーiNKT細胞）の細胞数の変化を測定する。一態様において、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体又はKLRG1等の識別マーカーのmRNA又はcDNAを特異的に検出する核酸プライマー又は核酸プローブを用いて、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数の変化を測定する。好ましい態様において、対象患者由来生体試料に含まれる細胞の細胞表面上におけるiNKT細胞受容体及びKLRG1等の識別マーカーの発現を検出する。該態様においては、好ましくは、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体及びiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを用いて、細胞の細胞表面上におけるiNKT細胞受容体及びKLRG1等の識別マーカーの発現が検出される。そして、iNKT細胞受容体陽性且つKLRG1等の識別マーカー陽性の細胞を、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞（即ち、メモリーiNKT細胞）として同定し、この細胞数の変化を測定する。
【００５２】
KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数の変化は、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞を投与する前におけるKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数と、当該投与後におけるKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数とを比較することにより決定することが出来る。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００５３】
iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞の投与後とは、該CD1d陽性細胞を投与してから、メモリーiNKT細胞が誘導されるのに十分な期間が経過した時点を意味する。通常は、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞を投与してから、通常、5日目以降、好ましくは14日目以降に、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数が再度測定される。誘導されたメモリーiNKT細胞は、長期間生存することが可能なので、理論的には、該CD1d陽性細胞を投与してからKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数を再測定するときまでの期間の上限値はないが、時間があきすぎるとiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞の投与との因果関係が不明確になる恐れがあることから、通常は、3ヶ月以内、好ましくは1ヶ月以内にKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数が測定される。
【００５４】
次に、工程（1）において決定したKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数の変化と、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性とを相関付ける。
【００５５】
iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞によるiNKT細胞活性化療法に対する応答が良好な患者においては、該CD1d陽性細胞投与後に、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞が誘導され、該細胞数が増加する。応答がより良好な程、該細胞数はより増加する。即ち、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与によるKLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数の増加と、当該治療法に対する応答性との間の正の相関に基づき、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞によるiNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性が予測される。
【００５６】
例えば、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞投与により、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数が増加した場合には、対象患者はiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞によるiNKT細胞活性化療法に対して応答が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定することが出来る。逆に、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞を投与しても、KLRG1等の識別マーカー陽性iNKT細胞数の増加が認められない場合には、対象患者はiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞によるiNKT細胞活性化療法に対する応答が弱く、当該治療が無効である可能性が高いと判定することが出来る。
【００５７】
iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞によるiNKT細胞活性化療法に対して応答性が良好であり、当該治療が有効である可能性が高いと判定された患者に対して、治療的有効量のiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞を更に投与することにより、該患者における疾患を治療することができる。本発明は、このようなiNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞による疾患の治療方法をも提供する。応答性が良好と判断された患者に対して、iNKT細胞リガンドをパルスしたCD1d陽性細胞を更に投与すると、該患者においてメモリーiNKT細胞が更に誘導され、メモリーiNKT細胞から産生されるIFN-γ等のサイトカインや、メモリーiNKT細胞の直接的な細胞傷害活性により治療効果が亢進し、疾患を治療し得る。
【００５８】
また、本発明は、リンパ球含有試料から、KLRG1等の識別マーカー陽性且つiNKT細胞受容体陽性の細胞画分を単離することを含む、メモリーiNKT細胞の単離方法（本発明の単離方法）をも提供する。
【００５９】
試料としては、リンパ球（好ましくは、メモリーiNKT細胞）が含まれる可能性のある生体試料であれば特に限定されない。好適には、末梢血、骨髄、胸腺、リンパ節、肺、肝臓、腫瘍組織等の組織や、これから単離された単核球画分等が用いられる。
【００６０】
KLRG1等の識別マーカー陽性且つiNKT細胞受容体陽性の細胞の単離は、好適には、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体及びiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを用いて、実施することができる。リンパ球含有試料を、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体及びiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dとともにインキュベートし、セルソーター、パニング、抗体磁気ビーズ法等によりKLRG1等の識別マーカー陽性且つiNKT細胞受容体陽性の細胞を単離することにより、単離されたメモリーiNKT細胞を得ることができる。
【００６１】
「単離」とは、目的とする細胞や成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたメモリーインバリアントNKT細胞」の純度（総細胞数に占めるメモリーiNKT細胞数の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
【００６２】
単離されたメモリーiNKT細胞を生体外で増殖させた後で、生体内へ再び戻すことにより、メモリーiNKT細胞を、iNKT細胞を投与するiNKT細胞活性化療法に用いることができる。メモリーiNKT細胞は、高いIFN-γ産生能及び直接的抗腫瘍活性を有するので、高い抗腫瘍効果が期待できる。
【００６３】
更に、本発明は、上述のKLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体或いはKLRG1等の識別マーカーのmRNA又はcDNAを特異的に検出する核酸プライマー又は核酸プローブを含む、試薬を提供する。本発明の試薬を用いることにより、上記本発明の検出方法、予測方法、及び単離方法を簡便に実施することができる。従って、本発明の試薬は、メモリーiNKT細胞検出用試薬として、iNKT細胞活性化療法に対する患者の応答性を予測するための診断用試薬として、或いはメモリーiNKT細胞単離用試薬として有用である。
【００６４】
本発明の試薬は、上述のiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを更に含むことが好ましい。即ち、好ましい態様において、本発明の試薬は、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体或いはKLRG1等の識別マーカーのmRNA又はcDNAを特異的に検出する核酸プライマー又は核酸プローブ；及びiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dを組み合わせて含む。該態様において、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体とiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dとを組み合わせる場合、それぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素により標識されていることが好ましい。
【００６５】
本発明の試薬は、KLRG1等の識別マーカーを特異的に認識する抗体或いはKLRG1等の識別マーカーのmRNA又はcDNAを特異的に検出する核酸プライマー又は核酸プローブ；及びiNKT細胞リガンドをパルスした可溶性CD1dに加えて、上記本発明の検出方法、予測方法、及び単離方法を行う際に使用する可能性がある、その他の抗体や試薬を含んでいても良い。これらの抗体又は試薬等は、あらかじめ上記抗体或いは核酸プライマー又は核酸プローブと一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。抗体又は試薬などとしては、二次抗体、基質剤、標識物質（例、蛍光色素、酵素）、固相、反応容器の他に、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。
【００６６】
本発明の試薬に含まれる各要素は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。あるいは、各要素を、別々の分離した容器に入れた上で、一緒に梱包して、キットとして提供することもできる。
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６７】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００６８】
［材料及び方法］
試薬
以下のモノクローナル抗体（mAbs）をBD Biosciences、e-Bioscience、R&D Systems又はBiolegendから購入した：抗マウスCD1d (1B1)、-CD3 (145-2C11)、-CD4 (GK1.5)、-CD11c (HL3)、-CD19 (6D5)、-CD25 (PC61)、-CD27(LG.3A10)、-CD28(37.51)、CD43(S7)、-CD44 (IM7)、-CD62L (MEL-14)、-CD69(H1.2F3)、-CD107a (1D4B)、-CD122 (TM-b1)、-CD127 (A7R34)、-IL15Ra、-Ly49H(3D10)、-NK1.1 (PK136)、-Ly49D(4E5)、-NKG2D(CX5)、-Ly6C(AL-21)、-Klrg1(2F1)、-PD1 (29F-1A12)、-IFN-γ (XMG1.2)、-T-bet(eBio4B10)、-Eomes(Dan11mag)、CD1d-dimerix、TCR Vb screening panel はBDから購入した。解析においては、FACS CaliburTM又はCanto II装置、及びCELLQuestTM、 Diva (BD Biosciences)、又はFlowJo (Tree Star)ソフトウェアを使用した。α‐GalCerは、RIKENのY. Ishiiにより合成され提供された。iGB3はAlexis Biochemicalsから購入した。Sphingobium yanoikuyaeのGSLはKawaharaらの報告（Kawahata et al., 2006．Microbiol Immunol 50, 67-71）に従って精製された。【００６９】
マウス及び細胞株
病原体フリーの6〜8週齢のC57BL/6マウスをCLEA Japanから購入した。B6マウス、Jα18-/-マウス及びiNKTクローンマウスを、特定病原体除去条件下で維持し、施設のガイドラインに従って処置した。B16メラノーマ及びNIH3T3細胞株をAmerican Type Culture Collectionから購入した。高レベルのCD1dを発現するB16 (CD1d-B16)、NIH3T3 (CD1d-NIH3T3) 及びHEK293 (CD1d-293)細胞をレトロウイルス形質導入により作成した。【００７０】
細胞調製
骨髄由来DCsをGM-CSFの存在下で作成し、6日目に100 ng/ml α-GalCerで48時間パルスし、LPSで成熟化した。いくつかの試験においては、他のNKTリガンドである、10 μg/ml iGB3又はGSLを、α-GalCerの代わりに、パルスに用いた。脾臓、肺及び肝臓からの単核球（MNCs）を単離した。簡潔に言うと、脾臓を押して70 μmセルストレイナーを通すことにより、脾細胞を得て、ACK lysing buffer (GIBCO)により赤血球を溶血し、RPMIで2回洗浄した。肺及び肝臓のMNCsの単離のため、組織をcollagenase D (Roche)で消化し、次にpercoll gradients (40/60 %) (Amersham PharmaciaBiotec)に積層し、900 gで20分遠心分離した。【００７１】
エリスポットアッセイ
100 ng/ml α-GalCer 存在下又は非存在下で16時間培養することにより、IFN-γ分泌細胞についてのエリスポットアッセイを行った。リガンド依存的IFN-γスポットの数を顕微鏡でカウントした。【００７２】
サイトカイン分泌アッセイ及び細胞内染色
製造者の指示書(Miltenyi Biotec Inc.)に従い、iNKT細胞からのIFN-γ遊離を、サイトカイン分泌検出キットを用いて決定した。簡潔に言うと、IFN-γ捕捉試薬とともに細胞を氷上で5分間インキュベートし、次に5％FCSを含む温めたRPMIで希釈し、引き続き37℃にて45分間インキュベートした。2回洗浄後、細胞を冷たいMACS緩衝液に再懸濁し、PE-結合IFN-γ検出試薬とともに4℃にて10分間インキュベートし、引き続き他の細胞表面マーカーで染色した。フローサイトメトリーによる解析のためのiNKT細胞の細胞内サイトカイン染色のため、単離された肺MNCsを、Golgi Plug (BD Bioscience)の存在下、10 μg/ml固相化抗CD3抗体及び2 μg/ml可溶性抗CD28抗体により2時間刺激し、抗CD16/32抗体でプレインキュベートすることにより抗体のFcγRへの非特異的結合をブロックし、洗浄し、着目する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体とともにインキュベートした。次に、Cytofix-Cytoperm Plus (BD Bioscience)中で細胞を透過処理し、抗IFN-γ mAbで染色した。【００７３】
細胞傷害性アッセイ
製造者の指示書(Takara Bio Company)に従い、LDHアッセイキットを用いて、肺MNCsのB16メラノーマ細胞に対する細胞傷害活性を解析した。簡潔に言うと、1x104個のB16メラノーマ細胞を、ナイーブ又はDC/Galで免疫したマウスからのプールした肺MNCとともに、種々のエフェクター／ターゲット（E/T）比で16時間培養した。培養上清をテトラゾリウム塩を含有する、新たに調製したReaction Mixtureとともにインキュベートし、490 nmにおける吸光度を測定した。データは、3回の独立した試験のトリプリケイトウェルの平均値±s.d.である。バックグラウンドのコントロール値を引いた後、細胞傷害値（％）を以下のように算出した。
細胞傷害性（％）＝{(エッフェクター：ターゲット細胞混合-エフェクター細胞コントロール)-スポンテニアス標的細胞コントロール}/(最大値 標的コントロール-スポンテニアス標的細胞コントロール)x100【００７４】
マイクロアレイ
単離したiNKT細胞の試料から抽出した全RNAを、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrayによるマイクロアレイ解析に用いた；全ての手順は、製造者の指示書(Affymetrix)に従って行った。データはGeneSpring software (Agilent Technologies)を用いて解析した。【００７５】
TCR Vβレパトワアッセイ
各iNKT細胞サブセットを高純度に単離した。全RNAを抽出し、SMARTer RACE cDNA amplification kit (Clontech)を用いて逆転写を行いファーストストランドcDNAを合成した。ユニバーサル・ミックスプライマー及びTCRβ定常領域配列に特異的なプライマーの両方をセカンドストランド増幅のために用い、高純度のTCRβ PCR産物を得て、これを次に、Roche 454-GS Junior systemを用いた長リードのハイスループットDNA配列解析に供した。TCRβレパトワ配列の全てのリードをUSEARCHアルゴリズム(http://drive5.com/usearch/)に基づくPerl scriptsを用いて解析した。各クラスターにおけるV領域コンセンサス配列をIMGTサイト(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/ )上で検索した。【００７６】
インビボ腫瘍試験
マウスを1x106のDC/Galにより、又はそれなしで免疫した。4か月後、マウスに2x105 B16 メラノーマ細胞を静脈内に注入した。14日後、マウスを屠殺し、肺転移の数を解析した。いくつかの試験において、マウスを300 μg/マウスの抗NK1.1抗体で、B16細胞の摂取の2日前から1週間に2回処置した。【００７７】
定量的PCRアッセイ
iNKT細胞による遺伝子発現を評価するため、FACSソートしたiNKT細胞を、遺伝子特異的なプライマーをプールした混合物(各0.2 μM)と共に、CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen)を用いて、RNAを精製することなく、直接cDNA合成及び前増幅に供した。前増幅の18サイクル（各サイクル：95℃ 30秒間, 60℃ 4分間）の後、アリコットを、FastStart Universal Probe Master (Roche)、遺伝子特異的フォワード及びリバースプライマー、及び対応するFAM標識加水分解プローブ(Universal Probe Library Set, Roche)を用いた定量的PCRに用いた。定量的PCRは、ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems)上で行った。遺伝子発現を、HPRT1を内部標準として用いたΔΔCT法により測定した。【００７８】
Luminex及びELISA
1x105のソートしたKLRG1+又はKLRG1- iNKT細胞を10 μg/mlの固相化CD3抗体＋10 μg/ml可溶性CD28抗体で24時間刺激した。培養上清を、IFN-γ産生についてELISA(BD)により、CCL3及びCCL4産生についてLuminex (Bio-Rad)により、解析した。【００７９】
パルス追跡試験
インビボiNKT細胞のターンオーバーを評価するため、1 μgのBrdUを、DC/Galによる免疫の直前にマウスの腹腔内へ投与した；次に、7日間、0.8 mg/mlのBrdUを含有する飲水を自由摂取で与えた。iNKT細胞を適切なmAbで標識し、次にBrdUによる標識を、固定した細胞について、BrdU Flow Kit (Becton Dickinson)を用いて評価した。後者について、細胞を、氷上で、100 μlのCytofix-Cytoperm緩衝液中で20分間固定し、perm-wash緩衝液で洗浄し、氷上で、100 μlのCytoperm Plus Buffer中で10分間インキュベートした。細胞を、氷上で、Cytofix-Cytoperm bufferにより5分間再固定し、300μg/mlのDNaseで37℃にて1時間処理し、フローサイトメトリー解析のため、抗BrdU抗体により室温にて20分間染色した。【００８０】
統計学的解析
Mann-Whitney U-testを用いて差異を解析した。P<0.05を統計学的有意とした。【００８１】
［結果］
実施例1：肺におけるKLRG1陽性iNKT細胞の長期間の持続
本発明者らは、以前、DC/Galが、マウス脾臓において2〜4日間にわたり、IFN-γ産生iNKT細胞の集団の増大を誘導するが、1週間後には細胞数が初期値のレベルに戻ることを報告している（Fujii et al., 2002. Nature Immunology 3, 867）。本試験において、本発明者らは、野生型又は担腫瘍マウスの肺において、IFN-γ産生iNKT細胞の増加した数が、DC/Galによる処理後に長期間に亘り持続することを見出した（図1a-c）。同様に、これらの免疫したマウスにおける肺単核球（MNCs）は、腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を示した（図1d）。
定常状態におけるCD4- iNKTは、抗腫瘍性iNKT細胞サブセットであることが報告されているが（Crowe, N. Y. et al., 2005. J. Exp. Med. 202, 1279）、ナイーブiNKT細胞と比較してDC/Gal注入マウスの肺におけるiNKT細胞のCD4-又はCD4+サブセットの割合やIFN-γ産生能に違いは見いだせず、iNKT細胞上のCD4マーカーは、長期間生存した抗腫瘍性のiNKT細胞の単純なマーカーとしては有用ではなかった。
従って、これらの有効なiNKT細胞の特異的なマーカーを探索するため、1ヶ月前にDC/Galで免疫したマウスのiNKT細胞を遺伝子アレイで解析した（図1e）。その結果、DC/Gal処理マウスからのiNKT細胞ではKLRG1 の発現が特異的に検出された。【００８２】
実施例2：iNKT細胞メモリー期の同定
C57BL/6マウスに対して、樹状細胞、CD1d導入NIH3T3細胞、α-GalCerをロードした樹状細胞（DC/Gal）、α-GalCerをロードしたCD1d導入B16メラノーマ細胞（CD1d-B16/Gal）、又はα-GalCerをロードしたCD1d導入NIH3T3細胞(CD1d-NIH3T3/Gal)を投与後に、KLRG1陽性iNKT細胞の増殖を検出した。細胞を投与しなかったナイーブマウス、樹状細胞またはCD1d導入NIH3T3細胞を投与したマウスではKLRG1陽性iNKT細胞を検出することが出来なかった。一方、DC/Gal、CD1d-B16/Gal、又はCD1d-NIH3T3/Galを投与したマウスではKLRG1陽性iNKT細胞の増殖が確認された（図2a）。
フローサイトメトリーによって、KLRG1陽性iNKT細胞に発現されているKLRG1以外の表面分子の発現を調べたところ、ナイーブ細胞よりもCD43、CD49d、Ly6C 及びNKG2Dをより強く発現し、CD69、CD127及びCD27をより弱く発現していたことが示された（図2b）。CD4発現に関して調べたところ、KLRG1陽性iNKT細胞群では同等の割合でCD4+細胞及びCD4-細胞が含まれていたが、ナイーブiNKT細胞はCD4+細胞をより多く有していた。また、KLRG1陽性iNKT細胞は、LPAM-1、Ly49D 及びLy49HといったNK細胞活性化／メモリーマーカーは発現していなかった。続いて、iNKT細胞の増殖のキネティクスを検討するため、DC/Galで免疫した後の2日から12週までの間、KLRG1陽性iNKT細胞の頻度を解析した。その結果、増殖は、DC/Gal投与の2日後から始まっており（図2c）、全iNKT細胞の絶対数は強力に増殖し、その後定常レベルにまで減少した（図2d）。興味深いことに、KLRG1陽性iNKT細胞は増殖してDC/Gal投与の30日後まで減少し、退縮期の後は肺及び肝臓において維持されるが、脾臓では維持されなかった（図2e）。【００８３】
実施例3：KLRG1+ iNKT細胞の特徴づけ
DC/Galによる免疫後に長期間維持されたKLRG1陽性iNKT細胞について、サイトカイン、ケモカイン及び細胞傷害性分子の定量的リアルタイムPCRを行って評価した。KLRG1陽性iNKT細胞ではccl3、ccl4 及びgranzyme Aの発現が確認され、ナイーブiNKT細胞又はKLRG1陰性iNKT細胞よりも高いレベルのIFN-γ及びfasL転写物を発現した（図3a）。続いて、DC/Galを投与したマウスからのKLRG1陽性iNKT細胞はgranzyme Aを高レベルで発現するが、ナイーブマウスのiNKT細胞では発現しないことをタンパク質レベルで確認した（図3b）。抗CD3+抗CD28 mAbsによるインビトロ刺激後のLAMP-1 (CD107a)発現で評価したところ、KLRG1陽性iNKT細胞の脱顆粒も亢進していた。
DC/Galを投与したマウス又はナイーブマウスからのiNKT細胞におけるIFN-γ産生を刺激して2時間後に評価すると、KLRG1陽性iNKT細胞のIFN-γ MFIはナイーブiNKT細胞のそれよりも圧倒的に高かった（図3c）。同様にKLRG1陽性iNKT細胞により産生されたIFN-γ、CCL3及びCCL4の量を比較しても高かった（図3d）。一方、KLRG1陽性iNKT細胞はIL-4、IL-10及びIL-17を産生しなかった。
以上より、KLRG1陽性iNKT細胞はナイーブiNKT細胞に比べて低い活性化の閾値を持ち、産生するサイトカインの種類も定常状態のiNKT細胞とは全く異なり、メモリーiNKT細胞として別個の機能を有することが示された。
次に、転写因子について調べた結果、KLRG1陽性iNKT細胞ではeomes、tbx21及びrunx3の発現が、ナイーブiNKT細胞よりも高いことを見出した(図3e)。一方、KLRG1陽性iNKT細胞におけるGATA3及びRORγの発現は、ナイーブiNKT細胞よりも低かった（図3e）。KLRG1陽性iNKT細胞のIFN-γ産生による効果を検証するため、DC/Galを投与したマウスの4か月後に、B16メラノーマ静注にして腫瘍細胞の転移について検討した。まず、インビボにおいてIFN-γ産生KLRG1陽性iNKT細胞の頻度が増加したことを確認し（図3f）、B16メラノーマ投与の2週間後に長期生存耐性の基準として、肺における腫瘍転移の数をカウントした。DC/Galを投与したマウスにおいては、転移発生が抑えられ、NK1.1抗体によって処理されたマウスでは転移が見られた（図3g）。この結果より、KLRG1陽性iNKT細胞による高い抗腫瘍効果が示された。【００８４】
実施例4：iNKTリコール応答
DC/Galを投与したマウスにおいてiNKTがメモリー段階でより長く生存することができるかを検証するため、パルス及び追跡試験を行った。KLRG1陽性iNKT細胞は、DC/Gal処理の後7日間BrdUを取り込みを行ったが、投与1ヶ月後のマウスにおいても依然としてBrdUが陽性であったことから、KLRG1陽性iNKT細胞が維持されていたことが示された（図4a）。
メモリーiNKT細胞生存を直接的に立証するため、本発明者らはKLRG1陽性iNKT細胞を別のJα18KOマウスに養子的に移入した。このケースにおいては、Vα14+iNKTクローンマウスからのiNKT細胞を用いた。該マウスはVα14NTマウスとして以前に樹立したものであり、CD1d dimer陽性venus陽性として移入した細胞を追跡することが可能になる（参照；Watarai, H. et al., 2010. Blood 115, 230-237）。DC/Galを投与したVα14+iNKTクローンマウスからのKLRG1陽性iNKT細胞は、DC/Galを投与した野生型マウスからのiNKT細胞と同様の特徴を示した。Jα18-/- マウスへ移入したKLRG1陽性Vα14陽性venus陽性iNKT細胞は、DC/Galに再び遭遇すると、二次応答において増殖した（図4b）。この結果は、KLRG1陽性iNKT細胞が抗原に対して再応答が可能であることを示唆する。次に、生理的条件をよりよく反映するため、少数のナイーブVα14陽性venus陽性iNKT細胞（即ち、KLRG1陰性 iNKT細胞）をC57BL/6マウスへ移入した。Vα14陽性iNKT クローンマウスからのVα14陽性iNKT細胞のC57BL/6マウスへの養子的移入により、抗原に晒されたことのあるiNKT細胞と胸腺から新たに発生したiNKT細胞との識別が可能となった。3ヶ月前にナイーブVα14陽性venus陽性iNKT細胞を移入したC57BL/6マウスにおいては、Vα14陽性venus陽性iNKT細胞は、ほとんど検出されなかったが、該細胞を移入し、その後DC/Galで免疫したマウスにおいては、3か月後にKLRG1陽性 Vα14陽性venus陽性iNKT細胞を検出することができた（図4c）。増殖したVα14陽性venus陽性iNKT細胞では、KLRG1の発現が継続して認められた（図4d）。
以上の結果より、メモリーiNKT細胞は、メモリーNK細胞と同様に、末梢で長期間生存することができ、リコール抗原応答に関与することが示唆された。【００８５】
次に、本発明者らは、iNKT細胞の養子的移入を受けていない、DC/Galで免疫した野生型マウスにおいて、抗原特異的二次応答が生じることを確認した。メモリーiNKT細胞は、DC/Galでブースとすると、2か月後において、一次応答よりも増殖し、活性はメモリーNK細胞において見られるそれと同様であった。低い容量（10 ng/ml）のα-GalCerでパルスしたDCによりブーストしたKLRG1+ iNKT細胞は強力に増殖し、低い容量のα-GalCerでパルスしたDCに対する一次応答後のそれの5倍以上であった。しかしDC単独、即ち、抗原なしではメモリーiNKT細胞は増殖しなかった（図5a）。iNKT細胞は外因性及び内因性の多様なリガンドに対して応答することができると考えられている。興味深いことに、DC/Galで免疫したマウスをDC/iGB3又はDC/GSLでブーストすると、肺（図5a）及び肝臓においてKLRG1+ iNKT細胞の増殖が検出されたが、これは一次応答とほとんど同じレベルのものだった。
従って、KLRG1陽性iNKT細胞は同じ抗原を特異的に認識し、これに応答することができる。即ち、メモリーT細胞と同様に、メモリーiNKT細胞は、自己再生し、長期間生存し、肺及び肝臓においては10〜70倍を超える増殖能を伴って、二次応答を開始することができる。【００８６】
実施例5：メモリーiNKT細胞のTCRレパートリー解析
iNKT細胞TCRのα鎖がインバリアント（不変）であることがよく知られているが、β鎖においてはより可変性があるものの、それは主にはVβ7、Vβ8及びVβ2に限定されている。そこで、メモリーiNKT細胞の抗原選択の証拠を探すため、フローサイトメトリーを用いて、ナイーブマウス、α-GalCerをロードしたDCを投与したマウス及びDC/GalでブーストしたマウスにおいてiNKT細胞のTCRVβレパートリーを評価した（図5b）。ナイーブiNKT細胞と比較して、DC/Galを投与したマウス、又はDC/Galを注入しDC/Galでブーストしたマウスにおいて特定のVβレパートリーの集積は見出されなかった。一方、DC/GSL又はDC/Gal-DC/GSLでブーストしたマウスにおいて、他のTCRVβ陽性iNKT細胞の減少を伴った、TCRVβ8.1+/8.2+iNKTの増加が認められ、DC/iGB3を注入した、又はDC/Gal- DC/iGB3でブーストしたマウスにおいては、TCRVβ7+iNKT細胞の増加が認められた(図5b)。
次に、プールしたiNKT細胞の群から大規模RNA配列解析を用いて、Vβ相補性決定領域（CDR1β、CDR2β及びCDR3β）を解析した。初期の配列解析において、ナイーブマウス、DC/Galを投与してDC/GalでブーストしたマウスによるTCR Vβ使用の主なパターン、即ち、Vβ2、Vβ7及びVβ8遺伝子、がFACS解析により見出されたパターンと類似することを見出した(図5b)。CDR1及びCDR2のクラスタリング後、更に詳細にRNA配列を解析した結果、KLRG1陽性 iNKT細胞のCDR1β及びCDR2βが、ナイーブiNKT細胞のそれとほとんど完全に一致することを見出した。【００８７】
メモリーiNKT細胞レパトワを形成するための可能性のあるメカニズムがもう一つある。TCRα鎖とは異なり、Vβ鎖のCDR3組成及び異なるJβセグメントとの関連性の両方、即ち、CDR3βの接合部の多様性が、ナイーブマウスにおいて極めて不均一であった。従って、本発明者らは、iNKT細胞において、TCR Vβレパートリーが、エフェクター又はメモリー段階においてより集中する、即ちCDR3領域のパターンが場合によってはクローナルであると仮説を立てた。共通するCDR1及びCDR2のクラスタリングの後でさえ、メモリーiNKT細胞のCDR3βは依然として不均一であったが、CDR3β配列は、ナイーブiNKT細胞のそれと異なっていた（図5c）。更に、ブースト後、そのようなクローンはクラスターに集積し、より顕著になった（図5c）。興味深いことに、CDR3リードのクラスターの更なる解析により、ナイーブiNKT細胞が多くの異なる小さなリードクラスター、即ち、大きなリードクラスターのごくわずか、からなるが、活性化iNKT細胞、メモリーiNKT細胞及びブーストされたメモリーiNKT細胞は、全てのVβファミリーにおいて特定の大きなクラスターを作るように選択された（図5d）。【００８８】
更に、iNKT細胞をメモリーT細胞と比較するため、本発明者らは全CDR3クラスターの主成分解析を行い、メモリーiNKT細胞及び／又は典型的なメモリーT細胞の特異的特性を有するCDR3クラスターを同定し、成功裏にそのようなCDR3クラスターを同定した（図5e(i)）：グループ（1）は、CDR3βにおけるあらゆるリードがエフェクター及びブースト段階において検出できたCDR3クラスターを含有する（図5e(ii)）；グループ（2）は、CDR3βにおけるあらゆるリードがエフェクターにおいて検出できたが、メモリー及びブースト段階においてより多く検出できたCDR3クラスターから構成される（図5e(iii))。本発明者らは、グループ（1）及びグループ（2）におけるTCRクローンリードが、それぞれVβ8.2 及びVβ8.3；並びにVβ7及びVβ8.3が豊富であることを見出した。これらの結果から、iNKT細胞は、活性化誘導細胞死によりネガティブ選択され、それらの一部がCDR3β依存的な様式でメモリー機能をともなって生き残る可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によれば、KLRG1に対する抗体を用いることにより、メモリーiNKT細胞を容易に検出、単離することができる。本発明により、iNKT細胞活性化療法における、患者の応答性を容易に評価することが可能となる。【００９０】
本出願は日本で出願された特願2014-152394（出願日：2014年7月25日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
2016013672.tif 000003
【図１−ｃ】
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【図１−ｄ】
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【図１−ｅ】
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【図２−ａ】
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【図２−ｂ】
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【図２−ｃ】
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【図２−ｄ】
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【図２−ｅ】
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【図３−ａ】
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【図３−ｂ】
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【図３−ｃ】
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【図３−ｄ】
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【図３−ｅ】
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【図３−ｆ】
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【図３−ｇ】
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【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
2016013672.tif 000020
【図４−ｃ】
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【図４−ｄ】
2016013672.tif 000022
【図４−ｅ】
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【図５−ａ】
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【図５−ｂ】
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【図５−ｃ】
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【図５−ｄ】
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【図５−ｅ】
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【国際調査報告】
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2016013672.tif 000030
2016013672.tif 000031
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