(57)【要約】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及びブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。2015156329.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。
【化１】
2015156329.tif 000009
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項２】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、請求項１に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。
【請求項３】
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。
【化２】
2015156329.tif 000010
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項４】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、請求項３に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。
【請求項５】
免疫測定用固相上での、免疫反応による、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法であって、
前記免疫測定用固相及び熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料を、反応溶液中０．１〜１０重量％のブロッキング剤でブロッキングする工程、及び、
前記抗体検査材料を、熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【化３】
2015156329.tif 000011
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項６】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、請求項５に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項７】
前記免疫測定用固相は、親水化処理された固相である、請求項５又は６に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項８】
前記免疫測定用固相は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン又は環状ポリオレフィンを樹脂成分とする固相である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項９】
前記免疫測定用固相は、Ｕ底マイクロタイタープレート又はＶ底マイクロタイタープレートである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検査薬又は診断薬に関する。より詳しくは、ヒトおよび他の動物の血液試料中の熱帯熱マラリア原虫の抗体価を測定することができる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質を含む抗体検査材料、及びそれを用いた熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは地球上に於いて最も重大な原虫感染症の一つである。熱帯地域と亜熱帯地域の流行地域を中心に、毎年3億人の感染者と200万人以上の死亡者が報告されている。また近年は、地球規模での経済活動の拡大により人や物資の移動が盛んになってきている。これに伴い、日本人渡航者が流行地で感染する例や、流行地から日本への入国者が国内で発症する輸入マラリアの症例が、1980年代より急激に増えている。このためマラリア対策は、流行地のみならず日本に於いても緊急の課題となっている。【０００３】
ヒトにマラリアを引き起こすPlasmodium属の寄生原虫は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、および一部のサルマラリア（Plasmodium knowlesiなど）の５種類である。原虫を媒介する蚊の刺咬により体内に入ったマラリア原虫は血中から速やかに肝細胞に侵入し（一次肝臓内ステージ）、肝細胞内で分裂・増殖してから血中に放出され、赤血球内に侵入して分裂増殖を繰り返し（赤血球内サイクル）、増殖した原虫は他の蚊によってさらに伝搬されてゆく。マラリアによる発熱の症状は赤血球内サイクルによって引き起こされる。特に熱帯熱マラリアは他の４種に比較して治療が遅れると重症化と死亡の危険をもたらす。【０００４】
またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。流行地に於ける近年の感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告（1996 & 1998）によると地球温暖化の場合２℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。そのため、第二次大戦後にDDT散布と衛生対策によって根絶したはずの日本を含む温帯地域においても、マラリア再流行が懸念されている。
したがって、マラリア感染を検出したりマラリアワクチンの効果を確かめたりするための血清抗体価を簡便に測定できる試薬の開発が求められている。【０００５】
血液中の抗マラリア原虫抗体を検出する方法として、マラリア原虫破砕物を抗原として吸着させた微粒子を用いる方法がある。
従来のヒト血清中やヒト血漿中の抗体検出を行うための免疫検査には、病原微生物の破砕溶液（粗抗原）を感作した微粒子が用いられてきた。例えば検査用微粒子の作製には、Poplanichら（非特許文献１）の報告にあるようにsoap-free polymerizationによって作製されたpoly(styrene-co-acrylic acid)微粒子の疎水性表面に粗抗原をpHコントロールで物理吸着させる方法が多く用いられてきた。
そして、この方法を利用した抗体検出キットの市販例としては、栄研化学のトキソプラズマ感染検査キット（非特許文献２〜４）やPENTAX（HOYA社に合併後、製造中止）のデング熱感染検査キット（非特許文献５，６）が知られている。【０００６】
一般にマラリア患者血清／血漿中のマラリア原虫抗原への抗体価の検出はELISA法で測定されることが多い。しかしELISA法による市販検査キットもあるが非常に高価なため（米国DRG International社、１検体50ドル）、市販品が普及しているとは言い難い。従ってマラリア流行地の病院であっても、非流行地のトラベルクリニックであっても、精密な測定機器や試薬を必要とせずに、安価（１検体１ドル）で簡便に抗体価測定が可能な技術開発は広く望まれている。【０００７】
従来の免疫検査を指向して抗原を物理吸着させた微粒子の欠点は４つの点で問題があった。すなわち、擬陽性が起きやすいこと、微粒子と抗原の結合に物理吸着を用いているためpHの最適化を必要とすること、そのためpH変化や温度変化に弱く安定性が悪いこと、ソープフリー重合で作製したポリスチレンラテックスのため実際にはpoly(styrene-co-acrylic acid)と官能基が有りながら、不安定な物理吸着のみ用いて化学結合を行っていないこと、リン酸カルシウム微粒子の場合はリン酸カルシウムの溶解しにくいpHや溶液組成においてのみ抗原を物理吸着することが可能であること。特に熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を用いた場合では顕微鏡観察では比較的特異性が高いものの（非特許文献１）、目視観察と多検体処理を長所とするマイクロタイター法では擬陽性を示しやすいことが問題（群馬大名誉教授 佐藤久美子博士・鈴木守博士らが1990-2000年にかけて行った研究結果）であった。【０００８】
他方、物理吸着ではなく化学結合による、ペプチドや酵素の結合した微粒子の作製法が報告されている。一つはSafranjら（非特許文献７）の報告にあるように抗原モノマー（抗原ペプチドのN端をmethacryloyl化）と微粒子形成モノマー（例えばDiethylene Glycol Dimethacrylate, 新中村化学工業株式会社, 2G）を直接共重合する方法がある。【０００９】
従来の化学結合によってペプチドや酵素を結合させた微粒子は、抗原モノマーが重合反応時の溶媒（ethyl propionateやethyl acetateなど疎水性有機溶媒が最適）に溶解できない場合は均質な球状微粒子が得られない、実際の免疫反応も患者と正常血清の判別する凝集像が得られないという問題があった。すなわち抗原ペプチドに一般的な、水溶性の高い側鎖を有するアミノ酸残基が多く含まれるペプチド配列を用いて直接抗原微粒子を重合させるのは困難であった。【００１０】
これまでに、本発明者らは、活性エステル基を介して微粒子表面に熱帯熱マラリア原虫の酵素であり抗原である組み替えエノラーゼ（分子量４７ｋＤ）を化学結合させた検査材料を作製した。次にウサギ抗エノラーゼ血清およびウサギプレ血清を実際に判別する凝集試験を行った。しかし何れも陽性と考えられる凝集像が得られなかった。【００１１】
次に、本発明者らは、タンパク質ではなくペプチドを抗原として用いることで、ウサギ抗エノラーゼ血清およびウサギプレ血清を判別する凝集試験を行ったところ、抗血清とプレ血清を明瞭に区別する陽性凝集像と陰性凝集像を得ることに成功した。さらには患者と非患者の血清を区別することに成功し、特許出願を行った（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2012-240940
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2007, 79, 4690-4695
【非特許文献２】坪田宣之と小澤光 寄生虫学雑誌 1977, 26, 276-285
【非特許文献３】坪田宣之ら 寄生虫学雑誌 1977, 26, 286-290
【非特許文献４】小林昭夫ら 寄生虫学雑誌 1977, 26, 175-180
【非特許文献５】山本ら J. Clin. Virol. 2000, 19, 195-204
【非特許文献６】山本ら J. Virol. Methods 2002, 104, 195-201
【非特許文献７】Safranjら Radiat. Phys. Chem. 1995, Vol. 46, No. 2, pp. 203-206
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、さらに改良されたマラリア抗体価の測定技術が求められていた。
本発明は、より検出感度や特異性に優れた、熱帯熱マラリア原虫の検査薬又は診断薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる抗体検査材料、及びブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬を用いることにより、熱帯熱マラリア原虫の抗体価を効率よく測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
すなわち、本発明は以下を提供する。
＜１＞  熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。【００１７】
【化１】
2015156329.tif 000003
【００１８】
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
＜２＞  前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、＜１＞に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。【００１９】
＜３＞  熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。【００２０】
【化２】
2015156329.tif 000004
【００２１】
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
＜４＞  前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、＜３＞に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。【００２２】
＜５＞  免疫測定用固相上での、免疫反応による、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法であって、
前記免疫測定用固相及び熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料を、反応溶液中０．１〜１０重量％のブロッキング剤でブロッキングする工程、及び、
前記抗体検査材料を、熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。【００２３】
【化３】
2015156329.tif 000005
【００２４】
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
＜６＞  前記ブロッキング剤は、スキムミルクである、＜５＞に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。【００２５】
＜７＞  前記免疫測定用固相は、親水化処理された固相である、＜５＞又は＜６＞に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
＜８＞  前記免疫測定用固相は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン又は環状ポリオレフィンを樹脂成分とする固相である、＜５＞〜＜７＞のいずれかに記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
＜９＞  前記免疫測定用固相は、Ｕ底マイクロタイタープレート又はＶ底マイクロタイタープレートである、＜５＞〜＜８＞のいずれかに記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬を用いることにより、熱帯熱マラリア原虫の抗体価を効率よく測定することができる。
本発明の検査薬又は診断薬は、検出感度・特異性に優れ、例えば、クリニックを訪れた発熱患者への感染の有無を確かめる迅速診断キットとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】熱帯熱マラリア原虫の組み換えエノラーゼを固定化した微粒子による、ウサギ抗エノラーゼ血清及びウサギプレ血清を測定した凝集試験の結果を示す図（写真）である。（Ａ）はウサギ抗エノラーゼ血清の測定結果、（Ｂ）はウサギプレ血清の測定結果を示す。
【図２】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子による、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清を測定した凝集試験の結果（スキムミルク0%）を示す図（写真）である。（Ａ）は熱帯熱マラリアの患者血清の測定結果、（Ｂ）は健康なボランティアの血清の測定結果を示す。
【図３】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子による、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清を測定した凝集試験の結果（スキムミルク0.05%）を示す図（写真）である。（Ａ）は熱帯熱マラリアの患者血清の測定結果、（Ｂ）は健康なボランティアの血清の測定結果を示す。
【図４】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子による、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清を測定した凝集試験の結果（スキムミルク0.25%）を示す図（写真）である。（Ａ）は熱帯熱マラリアの患者血清の測定結果、（Ｂ）は健康なボランティアの血清の測定結果を示す。
【図５】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子を用いた、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清の抗体価をプロットした散布図である。
【図６】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子を用いた凝集試験及び蛍光ELISA法による、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清の抗体価をプロットした散布図である。
【図７】熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化した微粒子による、熱帯熱マラリアの患者血清及び日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清を測定した凝集試験の結果（スキムミルク0.25%）について、吸光度測定を行った結果を示す図である。
【図８】熱帯熱マラリアの患者血清（1:128希釈）と反応させた微粒子、健康なボランティアの血清（1:128希釈）と反応させた微粒子、及びPBS-tween20に懸濁した微粒子の微粒子表面をIFA法により検出した結果を示す図（写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について、説明する。
【００２９】
［１］熱帯熱マラリア原虫に対する抗体検査材料及び検査薬又は診断薬
本発明は、熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬に関する。
また、さらなる本発明は、熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料であって、ブロッキング剤によりブロッキングされた抗体検査材料に関する。
【００３０】
【化４】
2015156329.tif 000006
【００３１】
Xはハロゲンまたは-OYを示し、ここでYはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【００３２】
本発明者らは、前記の従来技術や本発明者らの先の発明の改良すべき点に対して解決方法をさらに考えた。すなわち、ペプチド抗原を担体として上記重合体に導入した抗原固定化微粒子は良い検査材料になったが、蛋白抗原（エノラーゼ）を上記重合体に導入した抗原固定化微粒子では目的とする結果が得られなかったため、改良を検討し、本発明を達成した。
【００３３】
すなわち、本発明の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬は、微粒子に、活性エステル基とエチレングリコールユニットを有する親水性分子である上記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体から形成される微粒子を用いること；微粒子表面に固定化する抗原として、熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を利用すること；スキムミルク溶液等のブロッキング剤を用いることを特徴とするものである。
本発明で用いる抗体検査材料は、熱帯熱マラリア患者の血清抗体の測定において、検出感度及び特異性に優れる。したがって、熱帯熱マラリア感染を検査又は診断するための検査薬又は診断薬及び検査キット又は診断キットとして有用である。
【００３４】
本発明の検査薬又は診断薬には、本発明で用いる抗体検査材料及びブロッキング剤以外に、バッファー（緩衝液）等、当業者に公知の検査薬又は診断薬に用いられている各要素によって構成することができる。
【００３５】
本発明を適用できると考えられる製品として、以下のものを挙げることができる。
（１）マラリア疑いでクリニックを訪れた発熱患者への感染の有無を確かめる診断キット。
抗体検出検査IFA法の代替用。IFA法は手間がかかるため疫学調査以外にあまり使われなくなり、現在は抗原検出キットである金微粒子標識抗体とイムノクロマト法が多用されている。本発明を実用化すると、イムノクロマト法では得られない抗体価の情報から免疫状態や過去の感染履歴を診断することができる。
【００３６】
（２）熱帯熱マラリアの感染履歴を検出する、診断キット。
例えば、流行地から帰国した際の健康診断、流行地住民へのマラリア対策。過去１年以内の感染の有無を診断する。
WHOによって標準化された抗体価測定法IFA法は熟練者による一日の操作と顕微鏡観察が必要なため実施機関が少ない。蛍光顕微鏡や蛍光標識抗体を用いるため、設備や試薬の維持も簡単ではない。また近年の蛍光顕微鏡の検出感度向上によって擬陽性が出やすい。そのため日本国内でもあまり使われなくなった。
【００３７】
（３）輸血用血液によるマラリア二次感染の防止に用いる、診断キット。
日本では実施されないが、輸血用血液の検査にマラリア感染履歴を診断する抗体価測定が行われている。
【００３８】
（４）マラリア診断が確定後、ベッドサイドにおいて投薬量を決めるための診断キット。
【００３９】
（５）流行地の疫学調査用抗体価測定キット。
本発明は、多検体処理に優れている。また、陰性であることをはっきり診断できる点でも優れている。例えばマラリア対策の進んでいる流行地には患者数がとても少ない。フィリピンにおいても年間６０００名の患者と大きく減少している。しかし根絶のためには多くの流行地住民から血清採取と測定を数十年の長期にわたって行う必要がある。ほとんどの検体が陰性であるため、数少ない陽性反応と簡単に区別できることが重要になっている。例えば、顕微鏡によるIFA法やギムザ染色したスライドグラス上の血液塗抹標本赤を観察する方法は、陽性の診断よりも陰性の診断に時間がかかってしまう大きな欠点がある。
【００４０】
（粗抗原）
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原は、公知の方法（例えば、『マラリア学ラボマニュアル』（田辺和裄・脇誠治・小島莊明・北潔 編、菜根出版 発行、東京2000年）を参照することができる）にしたがって調製することができる。
具体的には、例えば、ヒト赤血球を用いて培養、単離した熱帯熱マラリア原虫を氷冷下、界面活性剤によって破壊し、遠心後の上清を粗抗原タンパク質抽出液とすることができる。
担体に固定化されるタンパク質のサイズは、通常、１０〜３０００ｋＤ程度であり得る。
【００４１】
（重合体）
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原を固定化する担体は、下記化合物（I）と化合物（II）の重合反応により得られる重合体からなる微粒子である。
【００４２】
【化５】
2015156329.tif 000007
【００４３】
Xはハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）または-OYを示し、ここでYは、アルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲン（塩素、フッ素、臭素等）で置換されていてもよい。
【００４４】
前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基及びｓｅｃ−ブチル基などの基が挙げられ；前記芳香族基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基及び２−ナフチル基などの基が挙げられ；前記ピリジル基としては、例えば、２−ピリジル基、３−ピリジル基及び４−ピリジル基などの基が挙げられ；前記キノリル基としては、例えば、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基及び８−キノリル基などの基が挙げられ；前記ベンゾオキサゾール基としては、例えば、２−ベンゾオキサゾール基などが挙げられ；前記ベンゾチアゾール基としては、例えば、２−ベンゾチアゾール基などが挙げられ；前記ベンゾトリアゾール基としては、例えば、１−ベンゾトリアゾール基などが挙げられる。これらのうち、フェニル基、３−ピリジル基、８−キノリル基、スクシンイミド基（OSu基）、２−ベンゾチアゾール基、及び１−ベンゾトリアゾール基（OBt基）が、活性エステルの活性がより高いという点で好ましい。
【００４５】
重合方法は、通常のラジカル重合によって行うことができ、放射線（γ線）や重合開始剤を用いる方法が例示される。
重合開始剤としては、公知のラジカル重合開始剤を使用することができ、例えば、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、1,1'-アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)（ABCN）などを使用することができる。
重合体の反応収率は、通常９０％以上でありうる。そのため、重合体における化合物（I）と化合物（II）との組成比は仕込み比によって決めることができる。本発明で用いる際の重量割合は、通常７０：２０〜９９：１程度が好ましく、さらには８０：２０程度が好ましい。
【００４６】
溶媒は、各化合物を溶解し、重合反応を進行させうる溶媒であればよいが、例えば、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、酢酸、プロピオン酸、アセトン、メチルエチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、およびこれらの混合溶媒などが例示される。
【００４７】
重合体が形成する微粒子の粒径は０．１〜１０μｍが好ましい。なお、化合物（I）、化合物（II）はそれぞれ複数種類重合に使用してもよい。
【００４８】
微粒子表面への抗原の固定化は微粒子の活性エステル基の-OYと抗原のアミノ基の反応により行うことができる。抗原のアミノ基は末端のアミノ基でもよいし、側鎖のアミノ基でもよい。
微粒子への抗原の導入割合は好ましくは重量比として０．０１〜２％である。
微粒子への抗原の固定化は、例えば、粗抗原溶液と微粒子を炭酸バッファー等のバッファー中で２〜４０℃、８〜４８時間反応することで行うことができる。
【００４９】
［２］診断及び検査キット
本発明は、本発明で用いる抗体検査材料及びブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キットに関する。
【００５０】
（ブロッキング剤）
本発明の検査キット又は診断キットは、スキムミルク溶液等のブロッキング剤を用いることを特徴とするものである。
本発明の検査キット又は診断キットにおいて使用するブロッキング剤には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、スキムミルク、血清（ウシ胎児血清、ウマ血清等）、ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  Ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）の少なくとも１種が含まれる。中でも、スキムミルクが好ましい。これらを、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０など、非イオン界面活性剤が好ましい）と組み合わせて使用することができる。組み合わせる界面活性剤は、ブロッキング反応時の反応溶液中において、０．０５〜０．３重量％の範囲内にあることが望ましい。中でも、スキムミルクと非イオン界面活性剤の組み合わせが好ましい。
スキムミルクの場合、ブロッキング剤は、ブロッキング反応時の反応溶液中において、全体で０．１〜１０重量％の範囲内にあることが望ましい。好ましくは０．２〜５重量％、より好ましくは０．２５〜２重量％、さらに好ましくは１〜２重量％の範囲内である。０．１重量％を下回ると、凝集像が明確にならない傾向がある。１０重量％を上回ると、観察される抗体価が低下する傾向にある。
スキムミルク以外の場合の好ましい濃度は、以下のように例示される。
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
０．３〜３％溶液として使用。
ゼラチン
２％溶液として使用。
血清（ウシ胎仔血清、ウマ血清）
１０％溶液として使用。
ブロッキング剤を２種以上混合し、混合ブロッキング剤として用いることもできる。混合ブロッキング剤は、以下のように例示される。
スキムミルク＋ＢＳＡ
フィッシュゼラチン＋スキムミルク
ＰＶＰ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  Ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）＋ＢＳＡ
これらは何れも、界面活性剤を組み合わせて使用することができる。例えば、０．０５〜０．３％濃度Ｔｗｅｅｎ  ２０を５％スキムミルクと組合せて使用できる。
【００５１】
ブロッキングは、例えば、抗体検査材料にブロッキング剤を添加し、２〜４０℃、１〜２４時間反応することにより、行うことができる。また、ブロッキングを免疫測定用固相上で行うことにより、免疫測定用固相及び抗体検査材料を、同時にブロッキングすることができ、好ましい。
【００５２】
本発明の検査キット又は診断キットには、本発明で用いる抗体検査材料及びブロッキング剤以外に、バッファー（緩衝液）等、当業者に公知の検査キット又は診断キットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００５３】
［３］診断及び検査方法
本発明で用いる抗体検査材料により、試料中の熱帯熱マラリア原虫に対する抗体を検出することができる。
すなわち、本発明の検査方法又は診断方法は、免疫測定用固相上での、免疫反応による、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法であって、
前記免疫測定用固相及び本発明で用いる抗体検査材料を、反応溶液中０．１〜１０重量％のブロッキング剤でブロッキングする工程、及び、
抗体検査材料を、熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法に関する。
また、さらなる本発明は、免疫反応による、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法であって、
本発明で用いる抗体検査材料を、反応溶液中０．１〜１０重量％のブロッキング剤でブロッキングする工程、及び、
抗体検査材料を、熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法に関する。
【００５４】
本発明で用いる抗体検査材料により、例えば、被験者の血液試料中のマラリア原虫由来タンパク質に対する抗体を検出でき、マラリアの診断・感染履歴の調査やワクチン投与後の抗体価維持の確認を検査する材料として利用することができる。
試料は、被験者の血液、血清、血漿等を使用することができる。
免疫測定反応は、例えば、本発明で用いる抗体検査材料と熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料とを混合し、１５〜４０℃、４〜２４時間反応することにより、行うことができる。
免疫測定用固相の形状は、実施すべき免疫検定の種類に応じて、シャーレ、マイクロタイタープレート、キュベット、フィルム、ビーズ、多孔性フィルター、細径チューブ、棒、針等であり得る。マイクロタイタープレートとしては、Ｕ底マイクロタイタープレート又はＶ底マイクロタイタープレートを好ましく例示することができる。
本発明で用いる抗体検査材料を使用する場合、固相がプラズマ処理、化学処理等により親水化処理されていることが、安定な陽性の凝集像が得られるため好ましい。
また、材質としては、通常免疫検定に用いられる材料による固相、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン又は環状ポリオレフィン等を樹脂成分とする固相を用いることができる。中でも、ポリスチレン製の固相を用いると、安定な陽性の凝集像が得られ、好感度で高い特異性が得られるため好ましい。
【００５５】
検出方法は結合反応を検出する方法である限り特に制限されないが、ELISA法、凝集反応によるアッセイ、蛍光検出法、発光検出法、可視紫外吸光検出法、電気化学的検出法などが挙げられる。この中では、本発明の抗原を固定化した高分子微粒子を用いた凝集反応によるアッセイが好ましい。
抗原が抗体と反応することにより微粒子が凝集し、目視により抗体の検出が可能である。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。【００５７】
はじめに熱帯熱マラリア原虫の粗抗原をジエチレングリコールジメタクリレートポリマー微粒子へ化学修飾した微粒子を作製した。
＜粗抗原の調製＞
粗抗原の調製法は標準的な方法によって行った。具体的には、『マラリア学ラボマニュアル』（田辺和裄・脇誠治・小島莊明・北潔 編、菜根出版 発行、東京2000年）の41-59ページおよび124ページの記載を参考にして行った。すなわちヒト赤血球を用いて培養、単離したPlasmodium falciparum原虫を氷冷下、界面活性剤によって原虫を破壊した。遠心後の上清を粗抗原抽出液とした（ブラッドフォード法によって測定されたタンパク質濃度1.9mg/mL）。【００５８】
抗原を固定化する重合体の調製は、特開２０１２−２４０９４０に記載の方法に基づいて行った。具体的には、以下のように調製した。
＜ポリマーの重合＞
下記化合物（i）（市販品、中村化学製）０．４ｇと化合物（ii）（メタクリル酸クロリドとHOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）の反応生成物を使用）を０．１ｇを溶媒プロピオン酸エチル１０ｍＬ中、室温２５℃で３時間γ線照射下（３０ｋＧｙ）で反応させ、重合反応を行った。【００５９】
【化６】
2015156329.tif 000008
【００６０】
＜粗抗原固定化微粒子の調製＞
粗抗原溶液（タンパク質量0.4mg）と微粒子80mgをpH8.6炭酸バッファー8.0mL中で24℃12時間反応した。
すなわち、微粒子（粒径1000nm）表面の活性エステル基とタンパク質のアミノ基が反応することでアミド基を生成、タンパクを微粒子表面に固定する（製造例１）。【００６１】
＜抗原タンパク質固定化微粒子の調製＞
組み換えエノラーゼを用いた以外は上記と同様にして、活性エステル基を介して100mgの微粒子表面に熱帯熱マラリア原虫の酵素であり抗原である組み替えエノラーゼ（大腸菌で作製、単離精製のために6-HisタグをＮ端に結合している）0.6mg（Hisタグのため天然型より少し大きな分子量、約５０ｋＤ付近に観察される）を化学結合させた検査材料を作製した（製造例２）。【００６２】
＜比較例１＞
（凝集試験）
上記製造例２の検査用微粒子を用いた抗体価検査には96穴U字型マイクロプレートを使用した。ウサギ抗エノラーゼ血清およびウサギプレ血清を判別する凝集試験を行った。各ウェルに2倍希釈系列（1/16-1/2048）で血清をPBS-tween20で希釈し、血清25μLに抗原固定化微粒子0.1 mg/mL, 25μLを滴下した。12時間後に反応像を観察、凝集反応のみられる最大の希釈倍率をもって抗体価とした。
しかし何れも陽性と考えられる凝集像が得られなかった（図１；（Ａ）はウサギ抗エノラーゼ血清、（Ｂ）はウサギプレ血清の結果を示す）。【００６３】
＜比較例２＞
（凝集試験）
上記製造例１の検査用微粒子を用いた抗体価検査には96穴U字型マイクロプレートを使用した。各ウェルに2倍希釈系列（1/32-1/65536）で血清をPBS-tween20で希釈し、血清50μLに抗原固定化微粒子0.1 mg/mL, 50μLを滴下した。４〜６時間後に反応像を観察、凝集反応のみられる最大の希釈倍率をもって抗体価とした。
検査用の血清には、１９８５年に群馬大学医学部の鈴木守教授らの疫学調査によって採取されたブラジル流行地における熱帯熱マラリアの患者血清、および日本国内に住んでいるマラリア既往のない健康なボランティアの血清各１０検体を用いた。
反応の結果、すべての検体で陽性または擬陽性の凝集像を示すことがわかった（図２；（Ａ）が熱帯熱マラリアの患者血清、（Ｂ）が健康なボランティアの血清の結果である）。【００６４】
＜比較例３及び実施例１〜５＞
（凝集試験）
次に、免疫反応においては、用いる容器や材料にブロッキング剤による表面処理が行われていることに着目した。ウェルに血清を加えた後、0.05%濃度となるようにスキムミルクを添加し、25℃で12時間反応した。それ以外は、上記比較例２と同様に試験した。しかし今度は抗体価を読み取るのが難しい凝集像を示した（図３：（Ａ）が熱帯熱マラリアの患者血清、（Ｂ）が健康なボランティアの血清の結果である）（比較例３）。【００６５】
少しずつスキムミルク濃度を上げていった結果、0.25%スキムミルク濃度においてマラリア患者と日本人ボランティアについて全く異なる凝集像をしめすことがわかった（図４：（Ａ）が熱帯熱マラリアの患者血清、（Ｂ）が健康なボランティアの血清の結果である）（実施例１）。抗体価としてプロットするとマラリア患者と日本人ボランティアを非常にはっきり区別できることを明らかにした（図５）（実施例２）。【００６６】
また、スキムミルク濃度を上げすぎると、観察される抗体価が少しずつ低下することがわかった。さらに、マイクロタイター法に用いる９６穴マイクロプレートの材質を塩化ビニルのプレートを用いると低めの抗体価を示すことがわかった。また親水化処理（プラズマ処理、化学処理）をしていないプレートを用いると、陽性の凝集像が崩れやすいこと（目視では陰性のように見える）がわかった。すなわち、９６穴マイクロプレートは親水化処理したポリスチレンプレートが最も安定な陽性凝集像、すなわち高感度で高い特異性を示した。【００６７】
この検出方法を従来法の一つであり最も高感度な蛍光ELISA法と比較した。
ELISA法は標準的な方法によって行った。具体的には、『マラリア学ラボマニュアル』（田辺和裄・脇誠治・小島莊明・北潔 編、菜根出版 発行、東京2000年）の124-126ページの記載を参考にして行った。ただしHRP標識抗ヒトIgGの代わりにalkaline phosphatase標識抗ヒトIgGを、酵素基質にABTSの代わりに4-methyl umbelliferyl-phosphateを、蛍光測定用プレートリーダーにDYNATECH LABORATORIES製のMicro FLUOR Readerを用いた。
プロット作成においては、ELISAデータのうち、1:256希釈時に測定された蛍光強度値をプロットした。その結果、すべての検体において直線的で良好な相関を示すことがわかった（図６；●が熱帯熱マラリアの患者血清、○が健康なボランティアの血清の結果である）（実施例３）。【００６８】
凝集像を定量化するために、見かけの吸光度（655nm）をマイクロプレートリーダーによって測定した（図７；各サンプルにおいて、左から希釈率（1/32-1/65536）が低いものの数値を示す。）（実施例４）。その結果、陽性像においては655nmの赤色光の透過度が大きく（見かけの吸光度が低く）なるとわかった。
さらに本発明により得られる陽性凝集像が、血清中の特異抗体によることを確認するために、微粒子表面をIFA法によって測定した。熱帯熱マラリアの患者血清（1:128希釈）と反応した微粒子、健康なボランティアの血清（1:128希釈）と反応した微粒子、及びPBS-tween20に懸濁した微粒子を試料として用いた。二次抗体はFITCラベルanti-human IgG（1:200希釈）を用いた（図８）（実施例５）。その結果、患者血清と微粒子の反応においてのみ、微粒子表面上にヒトIgG抗体（熱帯熱マラリア原虫への特異抗体）を検出した。患者ではないボランティア血清や血清希釈液（PBS-tween20）のみを反応させた場合は、微粒子表面上にヒトIgG抗体を検出しなかった。【００６９】
本発明で作製した微粒子は、イムノクロマト法による迅速診断キットへ応用出来ることも優れた点である。すなわち、多孔質フィルターペーパーに滴下吸着する（埋め込む）ことで、Dip-stickタイプの簡易検査キットを作成できる。Dip-Stickは精密な抗体価測定に不適であるが、短時間（〜１０分）で検出可能な点が優れている。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬は、医療、診断、研究などの分野で有用である。より具体的には、これまでに市販例の無かった熱帯熱マラリア感染の感染や既往歴の診断に適した微粒子検査材料及び熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬を提供することができる。
【図５】
2015156329.tif 000013
【図６】
2015156329.tif 000014
【図１】
2015156329.tif 000015
【図２】
2015156329.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
2015156329.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月26日(2016.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング反応時の反応溶液中において、０．２５〜１０重量％で使用される、スキムミルクを含むブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。
【化１】
2015156329.tif 000021
Ｘはハロゲンまたは−ＯＹを示し、ここでＹはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項２】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクからなる、請求項１に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査薬又は診断薬。
【請求項３】
熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料、及び
ブロッキング反応時の反応溶液中において、０．２５〜１０重量％で使用される、スキムミルクを含むブロッキング剤を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。
【化２】
2015156329.tif 000022
Ｘはハロゲンまたは−ＯＹを示し、ここでＹはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項４】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクからなる、請求項３に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査キット又は診断キット。
【請求項５】
免疫測定用固相上での、免疫反応による、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法であって、
前記免疫測定用固相及び熱帯熱マラリア原虫の粗抗原と、下記化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の重合反応により得られる重合体とを反応させて得られる、熱帯熱マラリア原虫由来の抗原タンパク質が該重合体に固定化されている抗体検査材料を、反応溶液中０．２５〜１０重量％のスキムミルクを含むブロッキング剤でブロッキングする工程、及び、
前記抗体検査材料を、熱帯熱マラリア原虫感染症の被験者の試料と反応させる工程を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【化３】
2015156329.tif 000023
Ｘはハロゲンまたは−ＯＹを示し、ここでＹはアルキル基、芳香族基、ピリジル基、キノリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、ベンゾオキサゾール基、ベンゾチアゾール基、又はベンゾトリアゾール基を示し、これらの基における水素原子は、ハロゲンで置換されていてもよい。
【請求項６】
前記ブロッキング剤は、スキムミルクからなる、請求項５に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項７】
前記免疫測定用固相は、親水化処理された固相である、請求項５又は６に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項８】
前記免疫測定用固相は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン又は環状ポリオレフィンを樹脂成分とする固相である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【請求項９】
前記免疫測定用固相は、Ｕ底マイクロタイタープレート又はＶ底マイクロタイタープレートである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の熱帯熱マラリア原虫感染症の検査方法又は診断方法。
【国際調査報告】
2015156329.tif 000024
2015156329.tif 000025
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2015156329.tif 000027
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