(57)【要約】  熱安定性の向上したエンドキシラナーゼ変異体を提供する。  糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、及び／又は位置６２に相当する位置のアミノ酸残基が、システインに置換されている、請求項１に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列の位置４４、及び／又は位置６３に相当する位置のアミノ酸残基が、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項１又は２に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列の位置１０１、及び／又は位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が、プロリン、及びアスパラギンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項５】
さらに、配列番号１のアミノ酸配列の位置６１、位置６５、及び位置６６に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が全て置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項７】
糸状菌由来のエンドキシラナーゼが、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項８】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつエンドキシラナーゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体：
（ａ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、該アミノ酸を除いて、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞により生産されたエンドキシラナーゼ変異体を得る工程を含む、エンドキシラナーゼ変異体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物。
【請求項１４】
前記酵素組成物が、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼからなる群から選択される１または２種以上の酵素をさらに含む、請求項１３に記載のバイオマス分解用酵素組成物。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４に記載のバイオマス分解用酵素組成物を、バイオマスに添加することを含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なエンドキシラナーゼ変異体およびこれを含むバイオマス分解用酵素組成物、および糖液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースの糖化には様々な手法があるが、エネルギー使用量が少なく、かつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。セルロースは、草本系植物、木本系植物中に多く含まれ、これら植物を総称してセルロース含有バイオマスと呼ぶ。セルロース含有バイオマスは、セルロースに加え、キシラン、アラビナンといったヘミセルロース、およびリグニンを含んでいる。キシランは、β−１，４結合したＤ-キシロースを主鎖として有しており、この主鎖に対して、Ｏ−アセチル、β−アラビノフラノシル、グルクロン酸、フェノール酸が部分的に修飾される場合もある（非特許文献１）。キシラナーゼは、β−１，４結合したキシロース主鎖に作用することで、セルロース含有バイオマスを分解する重要な酵素の１種である。【０００３】
キシラナーゼは、アミノ酸配列の相同性にて、ファミリー１０（ＧＨ１０）とファミリー１１（ＧＨ１１）に分類される（非特許文献２）。ＧＨ１０のキシラナーゼは、一般的に分子量が３０ｋＤａ以上である、一方、ＧＨ１１のキシラナーゼは一般的に分子量が２０ｋＤａ程度と比較的小さいと言われている（非特許文献３）。【０００４】
糸状菌は、広い種類のセルロース系バイオマスを分解する微生物として知られている。アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）が培養液中に産生するセルラーゼは、セルロース含有バイオマスの分解において、トリコデルマ・リーセイの産生するセルラーゼよりも高いグルコース収量が得られることが知られている（非特許文献４）。近年、アクレモニウム・セルロリチカスより７つのキシラナーゼがクローニングされており、その野生型酵素の機能解析が実施されている（非特許文献５）。Ｗａｔａｎａｂｅらの報告においては、７つのキシラナーゼのうち、ＸｙｌＣが、アクレモニウム・セルロリチカスでの発現量が最も少ないものの、最も高いキシラン分解活性を保有することが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｏｕｇｈｌａｎ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７，２５９−２８９（１９９３）
【非特許文献２】Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２４６，３−１２（１９９９）
【非特許文献３】Ｂｅａｕｇｒａｎｄら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３９，２５２９−２５４０（２００４）
【非特許文献４】Ｆｕｊｉｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ．２，２４（２００９）
【非特許文献５】Ｗａｔａｎａｂｅら，ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．４，２７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、熱安定性が向上した新規なエンドキシラナーゼ変異体を提供することにある。また、これを含む酵素剤および、効率的な糖液の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２から選択される１または２以上の位置に相当する位置のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することによって、当該エンドキシラナーゼの熱安定性を向上できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］  糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。
［２］  配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、及び／又は位置６２に相当する位置のアミノ酸残基が、システインに置換されている［１］のエンドキシラナーゼ変異体。
［３］  配列番号１のアミノ酸配列の位置４４、及び／又は位置６３に相当する位置のアミノ酸残基が、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、［１］又は［２］のエンドキシラナーゼ変異体。
［４］  配列番号１のアミノ酸配列の位置１０１、及び／又は位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が、プロリン、及びアスパラギンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、［１］〜［３］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
［５］  さらに、配列番号１のアミノ酸配列の位置６１、位置６５、及び位置６６に相当する位置から選択される一以上のアミノ酸残基が置換されている、［１］〜［４］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
［６］  配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が全て置換されている、［１］〜［５］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
［７］  糸状菌由来のエンドキシラナーゼが、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）に由来する、［１］〜［６］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体。
［８］  以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつエンドキシラナーゼ活性を有する、［１］〜［７］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体：
（ａ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、該アミノ酸を除いて、配列番号３，４，５，６，７，８，９，１０又は４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
［１０］  ［９］のＤＮＡを含む、発現ベクター。
［１１］  ［１０］の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
［１２］  ［１１］の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞により生産されたエンドキシラナーゼ変異体を得る工程を含む、エンドキシラナーゼ変異体の製造方法。
［１３］  ［１］〜［８］のいずれかのエンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物。
［１４］  前記酵素組成物が、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼからなる群から選択される１または２種以上の酵素をさらに含む、［１３］のバイオマス分解用酵素組成物。
［１５］  ［１３］又は［１４］のバイオマス分解用酵素組成物を、バイオマスに添加することを含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-225543号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、熱安定性が向上したエンドキシラナーゼ変異体を提供することができる。特に本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、高温条件、具体的には６５℃以上における熱安定性が向上しており、かつキシラン分解活性も向上しているという効果を有する。したがって、本発明のエンドキシラナーゼ変異体および本発明のエンドキシラナーゼ変異体を含む酵素組成物は、セルロース含有バイオマスからの糖液製造に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、野生型エンドキシラナーゼ又はいずれかのエンドキシラナーゼ変異体を発現する酵母ピキア・パストリスの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示す写真図である。図中、Ｍはマーカー、ならびに１は野生型エンドキシラナーゼ、２は位置３５及び位置６２に置換を含むエンドキシラナーゼ変異体、３は位置３５、位置４４、位置６２、位置６１、位置６５、位置６３、位置６６に置換を含むエンドキシラナーゼ変異体、４は位置３５、位置４４、位置６２、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、位置６３、位置６６に置換を含むエンドキシラナーゼ変異体を含む培養上清を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（１）エンドキシラナーゼ変異体
本発明において「エンドキシラナーゼ」とは、β−１，４結合したキシロース主鎖に作用することでヘミセルロースを加水分解する活性（エンドキシラナーゼ活性）を有する酵素であり、ＥＣ番号３．３．１．８に分類される酵素である。エンドキシラナーゼは、ファミリー１０（ＧＨ１０）とファミリー１１（ＧＨ１１）の２種に分類されるが、本発明のエンドキシラナーゼは、ファミリー１１（ＧＨ１１）に分類される酵素であり、β−ジェリーロール構造を保有する。「エンドキシラナーゼ活性」の測定は、β−１，４結合したＤ-キシロースを基質として、好ましくは、試薬として販売されているバーチウッドキシラン（Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ）を基質として使用して行うことができる。基質であるキシランが分解されたか否かは、反応後の反応液に含まれる還元糖量を測定することで確認することができる。還元糖量は、ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）を使用することで測定することができ、Ｂａｉｌｅｙら“Ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｘｙｌａｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，２５７−２７０に記載の方法が好ましく使用できる。活性を測定する条件は、前述した方法で、エンドキシラナーゼの活性を測定できれば特に限定はされない。活性測定のための、好ましい温度条件としては２０℃〜９０℃の範囲、好ましくは、４０℃〜７５℃の範囲、ｐＨは４〜９の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５〜７、反応時間は、１秒から６００分であることが好ましく、最も好ましくは１分から６０分である。また活性測定時に基質として使用するキシランは、０．１重量％〜１０重量％の範囲が好ましく、最も好ましくは０．５重量％〜２重量％の範囲である。
【００１２】
本発明においてエンドキシラナーゼは、糸状菌由来であるものを利用することができ、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）など、好ましくはアクレモニウム属由来のものを利用することができる。本発明のエンドキシラナーゼとして特に好ましくは、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）から単離されたエンドキシラナーゼを利用することができる。アクレモニウム・セルロリチカスのエンドキシラナーゼは公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋなどにＡＢ８７４９９０、ＡＢ８７４９９１、ＡＢ８７４９９２、ＡＢ８７４９９３、ＡＢ８７４９９４、ＡＢ８７４９９５、ＡＢ８７４９９５、ＡＢ８７４９９６、として登録されており、本発明においてはこれらの遺伝子情報等を利用することができる。
【００１３】
本発明において好ましくは、エンドキシラナーゼは配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【００１４】
また、本発明においてエンドキシラナーゼには、エンドキシラナーゼ活性を保持する限り、上記エンドキシラナーゼの一部が含まれる。ここで「エンドキシラナーゼの一部」とは、元のエンドキシラナーゼ活性の少なくとも４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上を保持する限り、任意の一部の領域が除去されたエンドキシラナーゼの断片からなり、例えばこのような断片としては、エンドキシラナーゼよりシグナルペプチドの領域が除去されたものが挙げられる。シグナルペプチドとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、位置１から位置３４までのアミノ酸配列で表わされる領域が挙げられる。本発明において好ましくは、エンドキシラナーゼの一部は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる。
【００１５】
本発明の「エンドキシラナーゼ変異体」は、上記の「エンドキシラナーゼ」のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される１または２以上の位置におけるアミノ酸残基が別のアミノ酸に置換されており、かつエンドキシラナーゼ活性を有するタンパク質を意味する。より好ましくは、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸置換を含む。特に好ましくは、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する６つの位置全てにおいてアミノ酸置換を含む。
【００１６】
本発明の「エンドキシラナーゼ変異体」は、上記位置にアミノ酸置換を含むことにより、当該アミノ酸置換を含まないエンドキシラナーゼと比べて、高い耐熱性を有する。
【００１７】
上記エンドキシラナーゼのアミノ酸配列における、「配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置」にて特定されるアミノ酸位置は、以下の手順１）〜３）を含む手法にて決定することができる。
【００１８】
手順１）配列番号１のアミノ酸配列において、開始メチオニンを位置１と定義する。以降のアミノ酸配列については、位置２、３、４．．．と順次番号付けをし、各位置を定義する。
【００１９】
手順２）次に、上記エンドキシラナーゼのアミノ酸配列において配列番号１で表されるアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び、位置１０２に相当するアミノ酸位置を決定する。当該相当するアミノ酸位置は、上記エンドキシラナーゼのアミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列と整列させることによって明らかにすることができる。このような操作はアミノ酸配列のアライメントと呼ばれる。アライメントツールとしては、ＣｌｕｓｔａｌＷなどの多数の良く知られたソフトウェアを用い、デフォルトのパラメータを用いておこなう。当業者は異なる長さのアミノ酸配列の間で、アライメントにより、上記エンドキシラナーゼのアミノ酸配列における、配列番号１で表されるアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び、位置１０２に相当するアミノ酸位置を明らかにすることができる。
【００２０】
手順３）上記アライメント解析で、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び、位置１０２に相当する箇所を、上記「エンドキシラナーゼ」のアミノ酸配列における、「配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置」とする。
【００２１】
なお、上記エンドキシラナーゼにおいて、上記「配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置」以外の位置にアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入などの変異を伴うとき、又は上記エンドキシラナーゼの一部である場合には、「配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置」がそれぞれ、Ｎ末端からカウントした３５番目、４４番目、６２番目、６３番目、１０１番目、及び１０２番目ではない場合がある。このような場合においても、上記方法により決定された位置を、「配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置」とする。
【００２２】
各位置おけるアミノ酸置換は、別のアミノ酸への置換であればよく、特に限定されないが、それぞれ以下のアミノ酸への置換を含むことが好ましい：
位置３５：システイン；
位置４４：ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはヒスチジン；
位置６２：システイン；
位置６３：ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはロイシン；
位置１０１：プロリン、又はアスパラギン、好ましくはプロリン；
位置１０２：プロリン、又はアスパラギン、好ましくはアスパラギン。
【００２３】
位置３５及び位置６２に相当する位置のアミノ酸が共にシステインへ置換されることによって、当該位置のシステイン側鎖でのジスルフィド結合を形成することができ、好ましい。
【００２４】
位置１０１及び位置１０２に相当する位置のアミノ酸については、真核生物を宿主としてエンドキシラナーゼ変異体を発現する場合、置換されることなく野生型のアミノ酸のままであってもよい。位置１０１及び位置１０２に相当する位置は、真核生物において糖鎖修飾を受けるアミノ酸配列に含まれる場合がある。
【００２５】
本発明の「エンドキシラナーゼ変異体」は、配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置から選択される位置におけるアミノ酸置換に加えて、配列番号１のアミノ酸配列の位置６１、位置６５、及び位置６６に相当する位置から選択される１または２以上の位置におけるアミノ酸置換を含んでもよい。これらの位置にアミノ酸置換をさらに含むことにより、耐熱性をさらに高めることができる。好ましくは、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の位置６１、位置６５、及び、位置６６に相当する位置から選択される２つ、又は３つのアミノ酸置換をさらに含む。より好ましくは、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の位置６１、位置６５、及び位置６６に相当する３つの位置のアミノ酸置換をさらに含む。
【００２６】
各位置おけるアミノ酸置換は、別のアミノ酸への置換であればよく、特に限定されないが、それぞれ以下のアミノ酸への置換を含む：
位置６１：グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはメチオニン；
位置６５：プロリン；
位置６６：グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン、好ましくはグリシン。
【００２７】
一態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び、位置１０２から選択される１又は２以上の位置におけるアミノ酸が置換されたアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むか、当該ポリペプチドからなる。「その一部」としては、上記シグナルペプチドの領域が除去されたポリペプチドが挙げられる。このようなエンドキシラナーゼ変異体として、より詳細には、以下のものが含まれる：
位置３５にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号３のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置６２にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号５のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置３５および位置６２の両方の位置にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号９のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置４４にヒスチジンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号４のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置６３にロイシンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号６のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置１０１にプロリンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号７のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号７のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
位置１０２にアスパラギンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体であり、配列番号８のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号８のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）；
特に好ましいエンドキシラナーゼ変異体は、前述した位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１及び位置１０２の６つの置換の全てを含むエンドキシラナーゼ変異体又はその一部である。
【００２８】
別の態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２から選択される位置の置換に加えて、位置６１、位置６５、及び位置６６から選択される１または２以上の位置におけるアミノ酸が置換されたアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むか、当該ポリペプチドからなる。
【００２９】
また、別の態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置６１、位置６５、及び位置６６の７つの位置におけるアミノ酸が置換されたアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むか、当該ポリペプチドからなる。このようなエンドキシラナーゼ変異体として、より詳細には、配列番号４５のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号４５のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、及び、位置６６の９つの位置におけるアミノ酸が置換されたアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むか、当該ポリペプチドからなる。このようなエンドキシラナーゼ変異体として、より詳細には、配列番号１０のアミノ酸を含むか、当該アミノ酸配列からなる（配列番号１０のアミノ酸配列には、上記シグナルペプチドの領域が含まれていない）。
【００３１】
本発明のエンドキシラナーゼ変異体には、上記エンドキシラナーゼ変異体又はその一部のアミノ酸配列において、上記のアミノ酸位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び、位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。ここで「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１０個以内、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、あるいは１個又は２個である。
【００３２】
本発明のエンドキシラナーゼ変異体にはまた、上記エンドキシラナーゼ変異体又はその一部のアミノ酸配列において、上記のアミノ酸位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び、位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、当該該アミノ酸を除いて、上記エンドキシラナーゼ変異体又はその一部のアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ（（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸列からなり、かつエンドキシラナーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる。
【００３３】
本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にさらなるペプチド又はタンパク質が付加されていてもよい。このようなペプチド又はタンパク質としては、例えば、翻訳開始点となるメチオニン、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、異種加水分解酵素、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチド又はタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチド又はタンパク質を選択して、本発明のエンドキシラナーゼ変異体に付加することができる。
（２）エンドキシラナーゼ変異体の製造方法
本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、例えば前記（１）で述べたエンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに連結し、発現ベクターを宿主に導入し、異種あるいは同種タンパク質として生産し、単離および精製することで製造することができる。アミノ酸配列をコードするコドン使用頻度は、エンドキシラナーゼが由来とする糸状菌、例えばＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（アクレモニウム・セルロリチカス）と同じものでもあってもよいし、宿主のコドン使用頻度に合わせて変更してもよい。
【００３４】
上述のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの調製方法としては、従来公知の手法を用いることが可能であり、例えば、遺伝子合成により目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを全合成する方法、あるいは、糸状菌より単離されたエンドキシラナーゼ又はその一部をコードするＤＮＡに対して、部位特異的変異導入法により、上記所定の位置のアミノ酸をコードするＤＮＡが別の所定のアミノ酸をコードするように変異を導入する方法等が挙げられる。ＤＮＡの目的部位に変異を起こす部位特異的変異導入法としては、従来の慣用的に用いられているＰＣＲ法によりおこなうことができる。
【００３５】
本発明のエンドキシラナーゼをコードするＤＮＡとして特に好ましくは、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）から単離されたエンドキシラナーゼをコードするＤＮＡを利用することができる。例えば、本発明において、エンドキシラナーゼをコードするＤＮＡは、配列番号３２で示される塩基配列を含むＤＮＡか、当該塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、配列番号３２で示される塩基配列より、シグナルペプチドをコードする領域が除去された配列番号３３で示される塩基配列を含むＤＮＡか、当該塩基配列からなるＤＮＡを利用することができる。これらのＤＮＡは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（アクレモニウム・セルロリチカス）より公知の方法に準じてＤＮＡを単離し、ＰＣＲ等の手法によってＤＮＡ増幅させることで取得することができる。
【００３６】
一態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、及び位置１０２から選択される１または２以上の位置におけるアミノ酸が置換されたアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、当該ＤＮＡからなる。このようなエンドキシラナーゼ変異体コードするＤＮＡとして、より詳細には、以下のものが含まれる：
位置３５にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３４の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置６２にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３６の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置３５および位置６２の両方の位置にシステインへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号４０の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置４４にヒスチジンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３５の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置６３にロイシンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３７の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置１０１にプロリンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３８の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）；
位置１０２にアスパラギンへの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡであり、配列番号３９の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）。
【００３７】
また別の態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列において前述した位置３５、位置４４、位置６２及び位置６３の４つの置換に加えて、位置６１にメチオニンへの置換、位置６５にアスパラギン酸への置換、及び位置６６にアスパラギンへの置換の３つの置換を含むアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、当該ＤＮＡからなる。このようなエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡとして、配列番号４９の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）。
【００３８】
また別の態様において、本発明のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１のアミノ酸配列において前述した位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１及び位置１０２の６つの置換に加えて、位置６１にメチオニンへの置換、位置６５にアスパラギン酸への置換、及び位置６６にアスパラギンへの置換の３つの置換を含むアミノ酸配列又はその一部を有し、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むか、当該ＤＮＡからなる。このようなエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡとして、配列番号４１の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなる（当該ＤＮＡは、上記シグナルペプチドの領域をコードしていない）。
【００３９】
本発明のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡには、上記のアミノ酸位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び、位置１０２における置換されたアミノ酸の変異を生じるものではなく、かつエンドキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、以下の塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるＤＮＡも含む：
上記塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列。例えば、配列番号１に表される塩基配列において、１〜１００個の塩基、好ましくは１〜５０個の塩基、より好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列；
上記塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列。塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる；
上記塩基配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１〜０．２×ＳＳＣ及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５〜６５℃にて洗浄を行う条件をいう。
【００４０】
上記のようにして調製したエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適切な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、該ＤＮＡを含む発現ベクターを製造することができる。
【００４１】
発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０の誘導体など、植物細胞用のベクターとしてのアグロバクテリウムなどが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能ある限り他のいかなるベクターも用いることができる。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどを例示することができる。また、宿主が酵母である場合、ｐＰｉｎｋ-ＨＣ、ｐＰｉｎｋ-ＬＣ、ｐＰｉｎｋα-ＨＣ、ｐＰＣＩＺ、ｐＰＣＩＺα、ｐＰＣＩ６、ｐＰＣＩ６α、ｐＦＬＤ１、ｐＦＬＤ１α、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ９、ｐＤ９１２、ｐＤ９１５などが挙げられる。
【００４２】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が、酵母である場合、ＡＯＸ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＡＤＥ２プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ−Ｌ１プロモーター、ＧＡＰプロモーターなどが挙げられる。
【００４３】
本発明において用いる宿主細胞としては、大腸菌、バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などが好ましい。酵母細胞としては、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などが挙げられる。真菌細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などが挙げられる。昆虫細胞としてはＳｆ９など、植物細胞としては双子葉植物など、動物細胞としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。本発明において用いる宿主としては、好ましくは真核微生物であり、さらに好ましくは、酵母細胞、真菌細胞である。酵母細胞、真菌細胞を宿主として用いる場合、酵素生産量が多い、酵素を細胞外に分泌生産できる、及び／又は、酵素の耐熱性を高めることができる、といった利点を有し得る。
【００４４】
形質転換または、トランスフェクションは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。本発明のエンドキシラナーゼ変異体は、上記のように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞においてプロモーターの制御下にて発現させ、産生物を回収して得ることができる。発現に際しては、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を適切な細胞密度まで増殖または成長させた後、温度シフトまたはイソプロピル−１−チオ-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）添加などの化学的誘発手段によってプロモーターを誘発させ、細胞をさらに一定期間培養する。あるいは、培地中に含まれる糖によってプロモーターを誘発させ、細胞の培養と発現を同時に行うことができる。
【００４５】
目的とするエンドキシラナーゼ変異体が細胞外に排出される場合には、培地から直接に、また細胞外に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって、細胞を破壊した後にエンドキシラナーゼ変異体を精製する。具体的には、エンドキシラナーゼ変異体は、組換え細胞の培地から、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を組み合わせて、部分的にまたは完全に精製することができる。
（３）エンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物
本発明のバイオマス酵素組成物は、少なくとも本発明のエンドキシラナーゼ変異体を、バイオマスを加水分解するための有効成分として含み、バイオマスを分解する用途に使用される酵素組成物である。ここで、バイオマスとは、生物系の植物体のことを指し、草本系植物、木質系植物、藻類、海草類、製糖作物、資源作物、穀物、などが例示される。これらのバイオマスは、いずれも、２糖以上の多糖類を含んでおり、本発明のバイオマス分解用酵素組成物による多糖類の加水分解を行うことができる。特に好ましく使用できるのは、セルロース含有バイオマスである。セルロース含有バイオマスは、セルロース成分を含む生物資源である。具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲藁、麦藁などの草本系バイオマス、あるいは樹木、廃建材などの木質系バイオマス、さらに藻類、海草、など水生環境由来のバイオマスのことを指す。こうしたセルロース系バイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース（以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。）の他に芳香族高分子であるリグニン等を含有している。
【００４６】
本発明のバイオマス分解用酵素組成物に含まれるエンドキシラナーゼ変異体は、精製されたものであっても、粗精製されたものであっても使用することができる。また、本発明のバイオマス分解用酵素組成物に含まれるエンドキシラナーゼ変異体は、固相に固定化されていても良い。固相としては例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物などが挙げられる（特にこれらに限定されない）。本発明のエンドキシラナーゼ変異体が固相に固定されることによって、連続反復使用が可能となる点において有利である。さらに、上記エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞の処理物も、粗精製されたエンドキシラナーゼ変異体として利用することができる。当該「形質転換した細胞の処理物」には、固相に固定化した形質転換細胞、ならびに形質転換細胞の死菌、破砕物、およびそれらを固相に固定化したものなどが含まれる。
【００４７】
本発明のバイオマス分解用酵素組成物は、本発明のエンドキシラナーゼ変異体のほかに、他の酵素を含んでいてもよい。好ましくは、バイオマス分解に関連する加水分解酵素を含むことが好ましい。このような他の酵素としては、例えばセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、などが挙げられる。
【００４８】
これらの他の酵素は、糸状菌等の微生物が産生する酵素であることが好ましい。糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中に酵素を産生することから、その培養液を未精製の酵素としてそのまま本発明のエンドキシラナーゼ変異体とあわせて本発明の酵素組成物としてもよいし、また培養液を精製し、製剤化したものを本発明のエンドキシラナーゼ変異体とあわせて本発明の酵素組成物としてもよい。
【００４９】
前記他の酵素を産生するための糸状菌としては、トリコデルマ属由来の糸状菌であることが好ましい。トリコデルマ属のうち、より好ましく用いることができるものは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ混合物である。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ混合物としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ-３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ-３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３-７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３-７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ-８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＣＬ-８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ ＱＭ９１２３）に由来するセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。
【００５０】
また、本発明のバイオマス分解用酵素組成物は、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤、緩衝剤、防腐剤、など、酵素以外の物質を添加したものであってもよい。
【００５１】
本発明のバイオマス分解用酵素組成物は、バイオマスに添加することで、糖液の製造方法に使用することができる。ここで言う糖液とは、少なくともバイオマスに由来する多糖がより低分子量の糖に加水分解された糖類を含む溶液のことを指す。糖液中の糖成分としては、キシロース、グルコース、セロビオース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、マンノース、アラビノース、シュクロース、フルクトースなどが例示できる。本発明のバイオマス分解用酵素組成物は、少なくともエンドキシラナーゼ変異体を含むことから、本酵素組成物を使用して得た糖液には、キシロース、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオースを含むことが多い。糖液の製造で使用するバイオマスは、前述したバイオマスであればいずれであってもよく、好ましくは、バイオマスからの糖収量を上げる目的で前処理したものが使用できる。前処理とは、予めバイオマスを、酸、アルカリ、加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを部分的に分解しておくことを指す。本発明の糖液の製造方法では、バイオマスにバイオマス分解用酵素組成物を添加し、温度４０℃〜１００℃、処理ｐＨ３〜７、バイオマス濃度０．１〜３０％の条件において、１分から２４０時間反応させることが好ましい。該範囲に設定することにより、本発明のバイオマス分解用酵素組成物の分解効率を最大限発揮することができる。
【００５２】
本発明の糖液の製造方法に使用したバイオマス分解用酵素組成物は、回収し、さらに再利用することができる。回収されたバイオマス分解用酵素組成物中に含まれるエンドキシラナーゼ変異体は、糖液の製造方法に付される前の５０％以上、６０％以上、７０％以上、又は８０％以上、好ましくは９０％以上の活性を保持し得る。バイオマス分解用酵素組成物の回収は以下の手法によって行うことができる。バイオマスにバイオマス分解用酵素組成物を添加し加水分解反応を行った後、加水分解物を固液分離する。固液分離により得られる溶液成分には、前記バイオマス分解用酵素組成物および糖成分が含まれ、バイオマス分解用酵素組成物と糖成分とは、限外濾過膜を用いた濾過によって分離する。限外濾過膜を用いたバイオマス分解用酵素組成物と糖成分の分離においては、その分画分子量は、単糖、オリゴ糖（２糖〜１０糖）を透過でき、バイオマス分解用酵素組成物を阻止できるものであれば限定されない。具体的には分画分子量２，０００〜５０，０００の範囲であればよく、酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を酵素と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。本発明のバイオマス分解用酵素組成物の回収および／または再利用において、バイオマス分解用酵素組成物に含まれるエンドキシラナーゼ変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列において位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、及び、位置６６の９つの位置におけるアミノ酸が置換された配列番号１０のアミノ酸配列を有するエンドキシラナーゼ変異体を含むことがより好ましい。
【００５３】
本発明の糖液の製造方法で得られた糖液は、グルコース、キシロースなどの単糖成分を含むため、エタノール、乳酸などの原料糖として使用することが可能である。また、本発明の糖液の製造方法で得られた糖液は、キシロオリゴ糖、キシロビオース、キシロトリオースなどを含むため、オリゴ糖として、プレバイオティクス用途に用いることが可能であり、ヒト健康食品、家畜飼料として使用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）タンパク質濃度の測定
本発明で使用したエンドキシラナーゼおよびエンドキシラナーゼ変異体のタンパク質濃度は、ＢＣＡ法にて測定した。エンドキシラナーゼ又はエンドキシラナーゼ変異体を含む溶液２５μＬを２００μＬのＢＣＡ試薬と混合し、３７℃で３０分反応させることで発色させた。タンパク質濃度は、牛血清アルブミンを標準品として、５７０ｎｍの吸光度を測定、比色定量することで決定した。
（参考例２）トリコデルマ由来セルラーゼの調製
トリコデルマ由来セルラーゼは以下の方法で調製した。
［前培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９（ＡＴＣＣより分譲）を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）。
［本培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製  ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過（ミリポア社製  ステリカップ−ＧＶ  材質：ＰＶＤＦ）した。この前述条件で調製した培養液に対し、βグルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、これをトリコデルマ由来セルラーゼとして、以下、実施例に使用した。
（比較例１）アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）から単離された野生型エンドキシラナーゼ（配列番号１のアミノ酸配列を有する）のクローニング
配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型エンドキシラナーゼをコードするＤＮＡは、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＦ株よりＲＴ−ＰＣＲで単離し、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ部位、ＢａｍＨＩ部位に、野生型エンドキシラナーゼよりシグナルペプチド領域を除去したタンパク質をコードする、配列番号３３の塩基配列を有するＤＮＡのクローニングを実施した。ｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩ部位の塩基配列ＣＡＴＡＴＧにおける、“ＡＴＧ”は、メチオニンコドンとして翻訳開始点として使用し、３’末端にはストップコドン“ＴＡＧ”を含んでいる。【００５５】
前記配列番号３３の塩基配列を含むｐＥＴ１１ａは、ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。得られた組換えＢＬ２１（ＤＥ３）株は、アンピシリンナトリウム１００ｍｇ／Ｌ含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養し、その後、イソプロピル-β-Ｄ-１-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）２００μＭを添加し、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型エンドキシラナーゼの発現誘導を行った。発現誘導は、培地を１６℃で２０時間保温して行い、その後組換えＢＬ２１（ＤＥ３）株を４℃、５，０００ｘｇにて１５分遠心分離を行うことで集菌した。集菌した菌体は、トリス緩衝液ｐＨ８（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した。菌体を含む緩衝液は、-８０℃にて１時間完全に凍結させた後、室温にて融解する操作を合計３回繰り返すことで、菌体中の可溶性タンパク質の緩衝液への抽出を行った。その後、緩衝液を１８，０００ｒｐｍにて、２０分、４℃で遠心分離を行い上清と菌体残さに分離した。前記上清はトリス緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８）で予め平衡化しておいたＱ−ＨＰカラム（ＧＥ社）に通し、目的のエンドキシラナーゼをカラムに吸着させた後、ＮａＣｌ濃度勾配により溶出を行った。エンドキシラナーゼ画分として、２００〜４００ｍＭのＮａＣｌ濃度時の溶液を回収した。その後、エンドキシラナーゼ画分は、さらにトリス緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８、２Ｍ  ＮａＣｌ）で透析した後、Ｂｕｔｙｌ  ＨＰカラム（ＧＥ社）に通じ、エンドキシラナーゼを吸着した。エンドキシラナーゼは、ＮａＣｌ濃度勾配により溶出し、１Ｍ  ＮａＣｌで溶出される画分を回収した。前記画分をさらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０ゲルろ過カラム（ＧＥ社）に通じて精製した。得られた精製エンドキシラナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる不純物の確認を行った。
（実施例１）位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２のいずれか１つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの作製と大腸菌による組換え発現
実施例として、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２のいずれか１つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの作製を以下手順にて実施した。【００５６】
野生型エンドキシラナーゼからＮ末端の３４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを除くアミノ酸配列（配列番号２）をコードする塩基配列（配列番号３３）を含むｐＥＴ１１ａを鋳型（比較例１）として、表１に記載のプライマー対（Ｆｗ：フォワードプライマー、Ｒｖ：リバースプライマー）を使用して、ＰＣＲを行うことで、所定の位置にアミノ酸置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを作製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭａｘＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いた。使用したプライマー対を表１（配列番号１４〜配列番号２５）に示す。また、得られたエンドキシラナーゼ変異体（位置３５のアミノ酸を開始点とする）コードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、に示す（表１）。またそれぞれのエンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、に示す。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは比較例１の手順に準じてｐＥＴ１１ａにクローニングした。次いで、エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ１１ａを用いて、比較例１の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、各エンドキシラナーゼ変異体を得た。【００５７】
【表１】
2016072448.tif 000002
【００５８】
（実施例２）位置３５および位置６２の２つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの作製と大腸菌による組換え発現
実施例１にて作製した、位置３５に変異を導入したエンドキシラナーゼ変異体（配列番号３）をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ１１に対して、さらに、位置６２に変異を導入するプライマー対（配列番号１８および配列番号１９）を使用して、位置３５と位置６２においてそれぞれシステインへの２つの置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡ（配列番号４０）を作製した。本変異導入に使用したプライマー対は表２に示す２種である。作製したエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは比較例１の手順に準じてｐＥＴ１１ａにクローニングした。次いで、当該エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ１１ａを用いて、比較例１の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、実施例２のエンドキシラナーゼ変異体（配列番号９）を得た。【００５９】
【表２】
2016072448.tif 000003
【００６０】
（比較例２）位置６１、位置６５、位置６６のいずれか１つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの作製と大腸菌による組換え発現
比較例として位置６１、位置６５、位置６６のいずれか１つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体を作製した。野生型エンドキシラナーゼの塩基配列（配列番号２）を含むｐＥＴ１１ａを鋳型として、表３に記載のプライマー対（Ｆｗ：フォワードプライマー、Ｒｖ：リバースプライマー）を使用して、ＰＣＲを行うことで、各エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを作製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭａｘＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いた。使用したプライマー対と得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、に示す（表３）。またそれぞれのエンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列を、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す（開始メチオニンを除く）。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは比較例１の手順に準じてｐＥＴ１１ａにクローニングした。次いで、当該エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ１１ａは、比較例１の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、比較例２の変異体を得た。【００６１】
【表３】
2016072448.tif 000004
【００６２】
（実施例３）位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、位置６６の９つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの作製と大腸菌による組換え発現
実施例２にて作製した、位置３５と位置６２においてそれぞれシステインへの２つの置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡ（配列番号４０）を含むｐＥＴ１１に対して、さらに、位置４４、位置６３、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、位置６６に変異を導入するプライマー対を使用して、各位置に置換を有するエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを作製した。本変異導入に使用したプライマー対は表４に示す９種である。作製したエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４１に示す。また当該エンドキシラナーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。得られたエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡは比較例１の手順に準じてｐＥＴ１１ａにクローニングした。次いで、エンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡを含むｐＥＴ１１ａは、比較例１の手順に準じて、タンパク質の発現および精製を行い、実施例３のエンドキシラナーゼ変異体（配列番号１０）を得た。【００６３】
【表４】
2016072448.tif 000005
【００６４】
（実施例４）実施例１〜３のエンドキシラナーゼ変異体および比較例１の野生型エンドキシラナーゼ、比較例２のエンドキシラナーゼ変異体の各温度でのエンドキシラナーゼ活性測定
エンドキシラナーゼ活性は、１％のバーチウッドキシラン（シグマアルドリッチ社）を基質として使用して、測定を行った。エンドキシラナーゼによるバーチウッドキシランが加水分解され、生成した還元糖の量は、ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ）法でキシロースを標品として使用して測定した。反応は、各種エンドキシラナーゼ変異体（実施例１、実施例２、実施例３）および野生型エンドキシラナーゼ（比較例１）、エンドキシラナーゼ変異体（比較例２）を１ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃の各温度において、１０分間保温することでバーチウッドキシランの分解を実施した。タンパク質濃度は参考例１に準じて濃度測定を行い調整した。反応後、還元糖量を測定するためＤＮＳ溶液を０．７５ｍＬ添加することで開始し、５分煮沸することで反応を停止した。反応停止後の反応液は、５４０ｎｍの吸光度を測定することで還元糖量を測定した。１ｕｎｉｔのエンドキシラナーゼ活性は、５０℃・１分間において、１μｍｏｌのキシロースをバーチウッドキシランより生成するために必要な酵素量と定義しユニット数を算出した。また、算出した各ユニット値を元に、特に野生型（比較例１）における５５℃の活性値を基準（１００％）として相対的な活性値を表５にまとめた。【００６５】
結果、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２より選択される位置に置換を含むエンドキシラナーゼ変異体は、野生型エンドキシラナーゼと比べて、高温条件下においても高い活性を保持しており、当該変異により耐熱性が高められたことが明らかとなった。特に、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２に加えて、位置６１、位置６５、位置６６にも置換を含むエンドキシラナーゼ変異体において、高い耐熱性が認められた。【００６６】
【表５】
2016072448.tif 000006
【００６７】
（実施例５）エンドキシラナーゼ変異体を用いた糖液の製造方法１
サトウキビ搾汁後の残渣であるバガスを原料にして、オリゴ糖液製造を試みた。エンドキシラナーゼとしては、比較例１の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例３のエンドキシラナーゼ変異体を使用した。前処理として、バイオマス重量が３０％（ｗ／ｗ）となるように１Ｎ苛性ソーダ水溶液中で６日間浸漬処理した。前処理物を０．５ｇずつ２ｍＬチューブに秤量し、バイオマスの終濃度が１０％（ｗ／ｗ）となるように加水後、希釈硫酸を用いてｐＨ５に調整した。ｐＨを調整した本組成物に、野生型エンドキシラナーゼもしくはエンドキシラナーゼ変異体を０．０５ｍｇ／ｇ−ＢＭ添加し、サーモブロック回転器（日伸理化製  ＳＮ−４８ＢＮ）を用いて５０℃で２４時間反応させた。反応後の上清における糖組成を表６に示す。野生型エンドキシラナーゼと比較して、エンドキシラナーゼ変異体の方がキシロオリゴ糖であるキシロビオースを多く得ることができた。【００６８】
【表６】
2016072448.tif 000007
【００６９】
（実施例６）エンドキシラナーゼ変異体を用いた糖液の製造方法２
実施例５において、酵素としてエンドキシラナーゼ変異体に加えてトリコデルマ由来セルラーゼ（参考例２）を用いて糖液の製造を試みた。実施例５と同様の方法でｐＨ調整まで行った組成物に対して、トリコデルマ由来セルラーゼをタンパク質量で１０ｍｇ／ｇ−ＢＭおよびエンドキシラナーゼ変異体（実施例３）を０．０５ｍｇ／ｇ−ＢＭ添加し、サーモブロック回転器（日伸理化製  ＳＮ−４８ＢＮ）を用いて５０℃で４８時間反応させた。比較として、トリコデルマ由来セルラーゼのみを添加して反応させた。反応後の上清における糖組成を表７に示す。トリコデルマ由来セルラーゼだけのものと比較して、エンドキシラナーゼ変異体を加えた方が糖収量を向上させることができた。【００７０】
【表７】
2016072448.tif 000008
【００７１】
（実施例７）実施例５における反応後のエンドキシラナーゼ残存活性
実施例５にて得られた反応後の上清５００μｌを、ＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（ＰＥＳ、分画分子量１０，０００）（ザルトリウス社）を用いて限外濾過し、比較例１の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例３のエンドキシラナーゼ変異体を回収した。回収した比較例１の野生型エンドキシラナーゼもしくは実施例３のエンドキシラナーゼ変異体と、キシラン分解時の濃度（２．５ｍｇ／ｌ）に希釈した比較例１の野生型エンドキシラナーゼ、実施例３のエンドキシラナーゼ変異体のエンドキシラナーゼ活性を測定した。エンドキシラナーゼ活性は、回収エンドキシラナーゼもしくは希釈エンドキシラナーゼを反応液の１／１０量添加した点、反応温度を５０℃で行った点以外は、実施例４と同様に行った。希釈した比較例１の野生型エンドキシラナーゼ、実施例３のエンドキシラナーゼ変異体の活性値をそれぞれ基準（１００％）として、回収した比較例１の野生型エンドキシラナーゼ、実施例３のエンドキシラナーゼ変異体の相対的な活性値を残存活性とした。表８に回収後の残存活性を示す。エンドキシラナーゼ変異体ではキシラン分解後も活性が高く残っており、キシラン分解に有意に再利用出来ることが確認できた。【００７２】
【表８】
2016072448.tif 000009
【００７３】
（実施例８）酵母ピキア・パストリスによる野生型エンドキシラナーゼ及びエンドキシラナーゼ変異体の発現
野生型エンドキシラナーゼからＮ末端の３４アミノ酸残基からなるシグナルペプチドを除くアミノ酸配列（配列番号２）をコードする塩基配列（配列番号３３）を含むｐＥＴ１１ａを鋳型（比較例１）として、配列番号５１と配列番号５３のプライマー対を使用してＰＣＲを行うことで、配列番号５４、配列番号４７、配列番号５５を順にコードするＤＮＡを作製した。【００７４】
また、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置１０１、位置１０２、位置６１、位置６５、位置６６の９つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体（配列番号１０）をコードするＤＮＡ（配列番号４１）を含むｐＥＴ１１ａを鋳型（実施例３）として、配列番号５２と配列番号５３のプライマー対を使用してＰＣＲを行うことで、配列番号５４、配列番号５０、配列番号５５を順にコードするＤＮＡを作製した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭａｘＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いた。【００７５】
さらに、位置３５および位置６２の２つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体（配列番号９）をコードする塩基配列（配列番号４８）の上流に配列番号５４の塩基配列、下流に配列番号５５の塩基配列を付加したＤＮＡと、位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置６１、位置６５、位置６６の７つの置換を含むエンドキシラナーゼ変異体（配列番号４５）をコードする塩基配列（配列番号４９）の上流に配列番号５４の塩基配列、下流に配列番号５５の塩基配列を付加したＤＮＡを、人工遺伝子合成した。ＤＮＡ２．０社のＥｌｅｃｔｒａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、前記ＰＣＲにて得られたＤＮＡ２種と前記人工遺伝子合成したＤＮＡ２種の計４種のＤＮＡをＳａｐＩ部位で切断し、ｐＤ９１５へのクローニングを行った。前記４種のＤＮＡは配列番号５６の塩基配列の下流にクローニングされ、これにより配列番号２、１０、９、４５のＮ末端に分泌シグナルペプチド領域（配列番号４６）が付加されたタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドが得られた。【００７６】
ピキア・パストリスＰＰＳ−９０１０株（ＤＮＡ２．０社）のコンピテントセルの調製を行った。ピキア・パストリスＰＰＳ−９０１０株のシングルコロニーを２０ｍｌのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１％（ｗ／ｖｏｌ）、ペプトン２％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ））が入った１００ｍｌフラスコへ植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで１６時間振とう培養を行った(前培養)。前記前培養液を、５０ｍｌのＹＰＤ液体培地が入った２００ｍｌバッフル付フラスコへＤ６００＝０．１５〜０．２になるように植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで振とう培養しＯＤ６００＝０．８〜１．０まで増殖させた。培養液を５０ｍｌファルコンチューブへ移し、５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行うことで集菌した。集菌した菌体に対し氷冷したＢＥＤＳ溶液（１０ｍＭビシン―水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、エチレングリコール３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１Ｍソルビトール）を９ｍｌ添加して静かに懸濁し、さらに更に１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）１ｍｌを添加し、静かに懸濁して３０℃、１００ｒｐｍで５分間振とうした。５００ｘｇにて１５分間遠心分離を行い、得られた沈殿に氷冷したＢＥＤＳ溶液を１ｍｌ添加し静かに懸濁したものを、コンピテントセルとした。コンピテントセルはそのまま形質転換に使用するか、２００μｌずつに分注して−８０℃で保存した。【００７７】
前記プラスミド各２０μｇをＡｖｒＩＩ部位で切断し、線状断片とした。前記線状断片をエタノール沈殿にて精製し、前記ピキア・パストリスのコンピテントセル５０μｌと混合後、氷冷したエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移して氷上に２分間置いた。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて電圧１．５ｋＶ、抵抗２００Ω、静電容量２５μＦでエレクトロポレーションを行った後、直ちに氷冷１Ｍソルビトール０．５ｍｌを加え、ＹＰＤ液体培地０．５ｍｌを取り分けた１４ｍｌファルコンチューブへ移した。前記ファルコンチューブを３０℃、１２０ｒｐｍで１．５時間振とう培養し、培養液１００μＬを、ゼオシン入りＹＰＤＳプレート培地（１ｍｇ／ｍｌゼオシン、酵母エキス１％（ｗ／ｖｏｌ）、ペプトン２％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、１Ｍソルビトール、寒天２％（ｗ／ｖｏｌ））にコンラージ棒を用いて塗布し，３０℃で２〜３日間培養した。プレート上に生じたコロニーのうち直径の大きいものを選抜し、ＹＰＤ液体培地０．５ｍｌを取り分けた深さ２ｍｌの９６穴プレートに滅菌爪楊枝で各コロニーをつつき植菌し、２８℃、１０００ｒｐｍで４日間培養した。培養液の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１に示す。いずれのタンパク質も分泌発現されることを確認した。また、配列番号２、９、４５を含むタンパク質については一次構造からの推定分子量よりも大きい分子量にバンドが検出されたことから、ピキアによる発現において糖鎖修飾が起きていることが確認された。【００７８】
【表９】
2016072448.tif 000010
【００７９】
（実施例９）  エンドキシラナーゼ変異体の活性比較
実施例８で得られた各種培養液の上清のエンドキシラナーゼの活性測定を行った。活性測定は、各種培養液の上清を０．２５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、５０℃、６０℃、７０℃の各温度で反応を行う以外は、実施例４と同様に行った。算出した各ユニット値を元に、特に野生型における５０℃の活性値を基準（１００％）として相対的な活性値を表１１にまとめた。キシラナーゼ変異体を含む上清は高温条件下においても高い活性を保持していた。また、酵母にて発現させた酵素は、実施例４にて大腸菌より発現された場合と比較して、高い耐熱性が認められた。【００８０】
【表１０】
2016072448.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明におけるエンドキシラナーゼ変異体は、高温条件下での高いキシラン分解活性を示すため、バイオマスの加水分解および糖液の製造、オリゴ糖の製造に使用できる。【００８２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2016072448.tif 000012
【配列表】
2016072448000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月17日(2017.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来のエンドキシラナーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６２、位置６３、位置６１、位置６５、及び位置６６に相当する位置のアミノ酸残基が全て置換されているアミノ酸配列を含み、かつ、エンドキシラナーゼ活性を有する、エンドキシラナーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が全て置換されている、請求項１に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列の位置３５、及び／又は位置６２に相当する位置のアミノ酸残基が、システインに置換されている、請求項１または２に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列の位置４４、及び／又は位置６３に相当する位置のアミノ酸残基が、ヒスチジン、グリシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列の位置１０１、及び／又は位置１０２に相当する位置のアミノ酸残基が、プロリン、及びアスパラギンから、それぞれ独立して選択されるいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項２〜４のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項６】
糸状菌由来のエンドキシラナーゼが、アクレモニウム・セルロリチカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体。
【請求項７】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつエンドキシラナーゼ活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体：
（ａ）配列番号１０又は４５で示されるアミノ酸配列； 
（ｂ）配列番号１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、１から数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）配列番号１０又は４５で示されるアミノ酸配列において、位置３５、位置４４、位置６１、位置６２、位置６３、位置６５、位置６６、位置１０１、及び位置１０２における置換されたアミノ酸は変異せず、該アミノ酸を除いて、配列番号１０又は４５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを用いた形質転換により作製された、形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞により生産されたエンドキシラナーゼ変異体を得る工程を含む、エンドキシラナーゼ変異体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のエンドキシラナーゼ変異体を含むバイオマス分解用酵素組成物。
【請求項１３】
前記酵素組成物が、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、マンナナーゼ、マンノシダ−ゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、エステラーゼ、リパーゼからなる群から選択される１または２種以上の酵素をさらに含む、請求項１２に記載のバイオマス分解用酵素組成物。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載のバイオマス分解用酵素組成物を、バイオマスに添加することを含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
【国際調査報告】
2016072448.tif 000013
2016072448.tif 000014
2016072448.tif 000015
2016072448.tif 000016
2016072448.tif 000017