(57)【要約】  本発明の目的は、再生医療への応用において安全性が高い多能性細胞、およびその製造方法を提供することである。本発明の目的はまた、特には細胞の癌化の問題や、細胞内での菌の存在という、安全性に対する懸念がより少ない多能性細胞、およびその製造方法を提供することである。  本発明により体細胞から多能性細胞を製造する方法が提供される。該方法は、体細胞に、発酵能を有する細菌から得ることができる、細胞を再プログラミング誘導することができる糖タンパク質含有成分を接触させる工程を含む。
2014167943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された哺乳類動物の体細胞から誘導された多能性細胞であって、以下の工程、
（ａ）前記体細胞に、発酵能を有する細菌のホモジネートから得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つを有するタンパク質含有成分を接触させて培養または維持する工程、および
（ｂ）形成された細胞塊を回収する工程、
含む製造工程により生産される多能性細胞。
【請求項２】
前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、請求項１に記載の多能性細胞。
【請求項３】
前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａの分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、請求項１または２に記載の多能性細胞。
【請求項４】
前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である請求項１〜３のいずれか一つに記載の多能性細胞。
【請求項５】
前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である請求項４に記載の多能性細胞。
【請求項６】
前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の多能性細胞。
【請求項７】
前記体細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞である請求項１〜６のいずれか一つに記載の多能性細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の多能性細胞を分化誘導培地で培養することにより分化誘導された細胞。
【請求項９】
前記細胞が、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、または血球細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
単離された哺乳類動物の体細胞から多能性細胞を製造するための方法であって、
前記体細胞に、発酵能を有する細菌のホモジネートから得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つを有するタンパク質含有成分を接触させることを含む体細胞から多能性細胞を製造する方法。
【請求項１１】
前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａの分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、請求項１０〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
前記体細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞である請求項１０〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
発酵能を有する細菌のホモジネートから得られる細胞を多能性細胞に再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つを有する糖タンパク質含有成分を含有する細胞再プログラミング誘導組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａの分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である請求項１７〜１９のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２１】
前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、請求項１７〜２１のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞である請求項１７〜２２のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１７〜２３のいずれか一つに記載の組成物を含む抗がん剤。
【請求項２５】
乳酸菌または納豆菌からのホモジネートまたは粗精製物を含む、単離された哺乳類動物体細胞の再プログラミング培地。
【請求項２６】
前記ホモジネートまたは粗精製物が、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つを有するタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の培地。
【請求項２７】
前記成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａの分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、請求項２６に記載の培地。
【請求項２８】
前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である請求項２５〜２７のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２９】
前記培地が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最少必須（ＥＭＥ）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、アルファ−最少必須培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｈａｍ−Ｆ−１２、ＭＣＤＢおよびそれらの改変培地からなる群より選ばれる、請求項２５〜２８のいずれか一つに記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の再プログラミングを誘導するタンパク質含有成分に関する。本発明はまた、そのようなタンパク質含有成分を用いて多能性細胞を製造する方法に関する。本発明はさらには、そのようなタンパク質含有成分を含む培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ES細胞は、胚性幹細胞と呼ばれ、1981年にはマウスの胚から、1998年にはヒ卜の胚から発見された。ES細胞は胎盤を構成する細胞以外のさまざまな種類の細胞に変化する能力(多能性)を持つ細胞として、それを用いた組織や器官を構築する研究が主に行われてきた。しかしながら、ES細胞は順調に成長すれば生命になる受精卵を利用しているため、倫理的に大きな問題を抱えている。もうひとつの大きな問題として、拒絶の問題がある。ES細胞を元に作製した分化細胞や臓器を患者に移植しても、免疫系はこれらを非自己と認識し攻撃する可能性がある。【０００３】
これらES細胞の問題を解決するために、京都大学の山中伸弥教授のグループは、通常は他の機能を持つ細胞に分化しない皮膚細胞からさまざまな種類の細胞に変化する能力を持つ細胞を開発し、iPS細胞と名付けた。山中ファクターと呼ばれる4つの因子(Qct 3/4， Sox2， KLf4，c-Myc) をマウスやヒ卜の皮膚細胞にレ卜口ウイルスベクターを使って導入すると、細胞の初期化がおこり、ES細胞と同じく多能性を持つ細胞が作り出せることを示した［非特許文献１ ;及び非特許文献２］。この時に用いる細胞は、患者自身の分化した皮膚などの体細胞に由来するため、iPS細胞から分化させた細胞を患者に移植しても免疫系はその臓器を自己と認識し移植が拒絶されることはない。iPS細胞の発見によりES細胞が抱えていた「生命倫理」という問題もクリアされた。【０００４】
上記の通り、iPS細胞は再生医療の切り札として世界的に注目されているが、細胞が癌化してしまうという技術的な問題が残されている。癌化の原因のひとつは、細胞に導入したc-Myc遺伝子によるものだが、最近では、c-Myc遺伝子を除く3つの因子でもiPS細胞が作製された。また、遺伝子の細胞への導入もレ卜口ウイルスを使うのではなく、アデノウイルスやプラスミドを用いてiPS細胞を作製することで、より安全で実用化に近いiPS細胞の作製に一歩近づいた。しかし、人工的にいくつかの遺伝子を、細胞分化を終えた細胞に強制発現させる手法をとることから、将来、これらの細胞が癌化する可能性は否定できない。【０００５】
また、特許文献１において、マィコバクテリウム・レプラエ菌またはその成分を用いて、再ブログラミングされた胚幹細胞(ES) 様細胞を産生する方法が提案されている。特許文献１には、マイコバクテリウム・レプラエ菌そのものを、成人の分化細胞に接触・感染させることによる、再プログラミングされたES様細胞を産生する方法、この方法によって産生された細胞が記載されている。接触・感染させた菌は、産生されたＥＳ様細胞中に存在することが記載されている。しかしながら、マイコバクテリウム・レプラエ菌はらい菌であり、再生医療への応用には安全性の懸念がある。【０００６】
また、本発明者により、発酵能を有する細菌である乳酸菌や納豆菌を、体細胞に感染させて、体細胞から多能性細胞を製造する方法が報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takahashi and Yamanaka，C ell 126，663-676，2006
【非特許文献２】Takahashi et al，Cell 131，861-872，2007
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開ＵＳ２００６／０２２２６３６Ａ１号明細書
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１３／００８８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞の再プログラミングを誘導する新規な物質および該物質を含む組成物を提供することである。本発明の目的はまた、再生医療への応用において安全性が高い多能性細胞、およびその製造方法を提供することであり、特には細胞の癌化の問題や、細胞内での菌の存在という、安全性に対する懸念がより少ない多能性細胞、およびその製造方法を提供することである。本発明の目的はまた、その製造方法に用いることができる培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、以前より乳酸菌や納豆菌などの発酵能を有する細菌に着目し、発酵能を有する細菌と細胞との関係を調べた結果、細胞分化を終えたヒ卜皮膚細胞に乳酸菌または納豆菌をそれぞれ感染させると、ES細胞やiPS細胞のように細胞塊を形成し、アルカリホスファターゼ染色法で染色されることを見出した。
本発明者は、生きた乳酸菌そのものではなく乳酸菌から由来するタンパク質含有成分であっても、細胞分化を終えたヒ卜皮膚細胞を再プログラミングし、ES細胞やiPS細胞のように細胞塊を形成させることを見出し、本発明を完成した。また、これらの細胞塊を種々の細胞へと分化誘導させたところ、分化が確認された。【００１１】
即ち、以下の発明が提供される。
（１）単離された哺乳類動物（例えば、ヒトまたはマウス）の体細胞から誘導された多能性細胞であって、以下の工程、
（ａ）前記体細胞に、発酵能を有する細菌のホモジネートから得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有するタンパク質含有成分を接触させて培養または維持する工程、および
（ｂ）形成された細胞塊を回収する工程、
含む製造工程により生産される多能性細胞。
（２）前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、前記（１）に記載の多能性細胞。
（３）前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、前記（１）または（２）に記載の多能性細胞。
（４）前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（５）前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である前記（４）に記載の多能性細胞。
（６）前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液（例えば、緩衝液）を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、（好ましくはさらに、（c）該透過しない画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した溶出画分から得る工程、）を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（７）前記体細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞である前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（８）前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の多能性細胞を分化誘導培地で培養することにより、分化誘導された細胞。
（９）前記細胞が、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、または血球細胞である、前記（８）に記載の細胞。【００１２】
（１０）（単離されたまたは生体内の）哺乳類動物（例えば、ヒトまたはマウス）の体細胞から多能性細胞を製造するための方法であって、
前記体細胞に、発酵能を有する細菌のホモジネートから得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有するタンパク質含有成分を接触させることを含む体細胞から多能性細胞を製造する方法。
（１１）前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、前記（１０）に記載の方法。
（１２）前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、前記（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である前記（１０）〜（１２）のいずれか一つに記載の方法。
（１４）前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である前記（１３）に記載の方法。
（１５）前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液（例えば、緩衝液）を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、（好ましくはさらに、（c）該透過しない画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した溶出画分から得る工程、）を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、前記（１０）〜（１４）のいずれか一つに記載の方法。
（１６）前記体細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞である前記（１０）〜（１５）のいずれか一つに記載の方法。【００１３】
（１７）発酵能を有する細菌のホモジネートから得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有するタンパク質含有成分を含有する細胞再プログラミング誘導組成物。
（１８）前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、前記（１７）に記載の組成物。
（１９）前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、前記（１７）または（１８）に記載の組成物。
（２０）前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である前記（１７）〜（１９）のいずれか一つに記載の組成物。
（２１）前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である前記（２０）に記載の組成物。
（２２）前記タンパク質含有成分が、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネートを硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液（例えば、緩衝液）を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、（好ましくはさらに（c）該透過しない画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した溶出画分から得る工程、）を含む工程により得られるタンパク質含有成分である、前記（１７）〜（２１）のいずれか一つに記載の組成物。
（２３）前記体細胞が、ヒト由来の、正常体細胞またはがん細胞であるである前記（１７）〜（２２）のいずれか一つに記載の組成物。
（２４）前記（１７）〜（２３）のいずれか一つに記載の組成物を含む抗がん剤。【００１４】
（２５）乳酸菌または納豆菌からのホモジネートまたは粗精製物を含む、哺乳類動物（例えば、ヒトまたはマウス）体細胞の再プログラミング培地。
（２６）前記ホモジネートまたは粗精製物が、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有する成分を含むことを特徴とする、前記（２５）に記載の培地。
（２７）前記成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、前記（２６）に記載の培地。
（２８）前記乳酸菌が、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌である前記（２５）〜（２７）のいずれか一つに記載の培地。
（２９）前記培地が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最少必須（ＥＭＥ）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、アルファ−最少必須培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｈａｍ−Ｆ−１２、ＭＣＤＢおよびそれらの改変培地からなる群より選ばれる、前記（２５）〜（２８）のいずれか一つに記載の培地。【００１５】
（３０）（単離されたまたは生体内の）哺乳類動物（例えば、ヒトまたはマウス）の体細胞を多能性細胞に誘導するための、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導するタンパク質含有成分であって、以下の性質：
（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、
（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および
（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない
の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有するタンパク質含有成分の使用。
（３１）前記タンパク質含有成分が、細菌のホモジネートを硫安沈殿法を用い濃縮することにより得られた、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である、前記（３０）に記載の使用。
（３２）前記タンパク質含有成分が、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む、前記（３０）または（３１）に記載の使用。
（３３）前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である前記（３０）〜（３２）のいずれか一つに記載の使用。
（３４）（単離されたまたは生体内の）哺乳類動物の体細胞を多能性細胞に誘導するための、発酵能を有する細菌の抽出液からの精製画分の使用、ここで、該精製画分は、（a）発酵能を有する細菌を破砕することにより得られるホモジネート溶液を硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿させて硫安沈殿硫安沈殿として得る工程、および（b）該硫安沈殿を溶解した溶液（例えば、緩衝液）を１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過させ、透過しない画分を得る工程、（好ましくはさらに（c）該透過しない画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した溶出画分から得る工程、）を含む工程により得られる画分である。
（３５）前記発酵能を有する細菌が乳酸菌または納豆菌である前記（３４）の使用。
【発明の効果】
【００１６】
本発明においては、体細胞への遺伝子の導入および強制発現、または細菌そのものの導入を用いることなく、体細胞から多能性幹細胞を製造することができる。本発明では、人体に存在して細胞と共存している乳酸菌などの発酵能を有する細菌から得られる成分（タンパク質含有成分）を含む組成物を用いて多能性幹細胞を製造することができる。本発明による多能性細胞の製造方法は、医療分野(創薬研究、並びに医薬品の安全性、有効性及び副作用の試験)、疾患研究(難病の原因解明、治療法や予防法の開発)、再生医療(神経、血管、臓器の機能修復)、並びに食品分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】乳酸菌成分と一緒に培養したHDF細胞（培養３日後）を示す。
【図２】乳酸菌成分で処理したHDF細胞を、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞へ分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Oil Red O染色（脂肪）、Alizarin Red S染色（骨）、およびAlcian Blue染色（軟骨）した結果を示す。
【図３】乳酸菌成分と一緒に培養したA549細胞（培養１４日後）を示す。
【図４】乳酸菌成分で処理したA549細胞を、脂肪細胞、および骨細胞へ分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Oil Red O染色（脂肪）、およびAlizarin Red S染色（骨）した結果を示す。
【図５】乳酸菌成分と一緒に培養したHepG2細胞（培養１４日後）を示す。
【図６】乳酸菌成分で処理したHepG2細胞を、脂肪細胞、および骨細胞へ分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Oil Red O染色（脂肪）、およびAlizarin Red S染色（骨）した結果を示す。
【図７】乳酸菌成分と一緒に培養したMCF7細胞（培養１４日後）を示す。
【図８】乳酸菌成分で処理したMCF7細胞を、脂肪細胞、および骨細胞へ分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Oil Red O染色（脂肪）、およびAlizarin Red S染色（骨）した結果を示す。
【図９】乳酸菌成分で処理したHepG2細胞を、分化誘導培地で培養した後、それぞれ細胞を、抗α-fetoprotein抗体（内胚葉マーカー）、および抗NeuroFilament抗体（外胚葉、神経細胞マーカー）で染色した結果を示す。
【図１０】乳酸菌成分で処理したA549細胞における、多能性マーカーの発現をRT-PCR法を用いて確認した結果である。矢印は、Nanogの発現を示す。
【図１１】実施例１で得た乳酸菌成分を、陰イオン交換クロマトグラフィーで分離した溶出パターンを示す。
【図１２】大腸菌成分と一緒に培養したHDF細胞（培養３日後）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明において、「細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分」または「細胞再プログラミング誘導タンパク質含有成分」とは、単離された哺乳類動物の体細胞（正常な体細胞、体細胞由来のがん細胞のいずれも含む意味である）、例えば、上皮細胞と接触させることにより、体細胞を、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同様の、種々の細胞に分化する能力を有する多能性細胞へと形質を変換させることができるタンパク質含有成分をいう。ここで接触とは、体細胞に誘導タンパク質含有成分が接触できる限り特に制限されないが、好ましくは、体細胞が生存する環境（例えば、培地）中に該成分を存在させることにより、該成分が体細胞に作用できる状態におくことを言う。
ここでいう誘導タンパク質含有成分とは、以下の性質：（i）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、（ii）コンカナバリンＡに結合しない、および（iii）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない、の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは全て、を有するタンパク質含有成分である。本発明のタンパク質含有成分は、好ましくは、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない大きさの成分である。本発明のタンパク質含有成分は、さらに好ましくは、SDS-PAGEにおいて約５５〜約６５ＫＤａ（より好ましくは約６０ＫＤａ）の分子量を示すタンパク質をメインバンドとして含む。該成分中においてタンパク質は、単独の状態で存在しても、また他の物質が共有結合または非共有結合で結合した状態、例えば、他の物質と複合体を形成した状態でもよい。また、誘導タンパク質含有成分は、ある程度精製された状態であっても粗精製の状態であってもよい。例えば、本発明に示されるように、誘導タンパク質含有成分が乳酸菌中に存在するので、乳酸菌のホモジネートまたは粗精製物として体細胞と接触させても良い。粗精製物としては、これに限定されないが、例えば、硫安沈殿、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはこれらを組み合わせて得られる画分から得られるものをあげることができる。本明細書において「組成物」または「細胞再プログラミング誘導組成物」とは、誘導タンパク質含有成分をその一部に含む形態であれば特に制限されず、特に明細書中で区別して用いられない限り、あるいは文脈の意味から限定されない限り、ある程度精製されたまたは粗精製された誘導タンパク質含有成分を任意の成分と混合したもの、ある程度の精製または粗精製誘導タンパク質含有成分を添加した培地、さらには、前記の粗精製画分そのものを含む意味で用いられる。
【００１９】
本発明による体細胞から多能性細胞を製造する方法は、体細胞に、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分またはそれを含む組成物を接触させる工程を含むことを特徴とする。このようなタンパク質含有成分は、例えば、発酵能を有する細菌の細胞抽出液を、硫安沈殿法により濃縮することにより得ることができる。例えば、硫安濃度、１０〜８０％飽和、好ましくは２０〜７０％飽和、より好ましくは２０〜６０％飽和で沈殿させた硫安沈殿画分として得ることができる。さらに好ましくは、このようにして得た硫安沈殿画分であって、１００ＫＤａの限外ろ過フィルターを透過しない画分から得ることができる。さらには、このようなタンパク質含有成分は、例えば、前記画分を、陰イオンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いてさらに精製することにより、より純度が高いタンパク質含有成分として得ることができる。
本発明で用いるタンパク質含有成分に含まれるタンパク質の例は、好ましくは、糖タンパク質であり、さらに好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約５５〜６５ＫＤａの分子量を示す糖タンパク質、より好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約６０ＫＤａの分子量を示す糖タンパク質である。また、本発明で用いることができるタンパク質含有成分に含まれる糖タンパク質の例は、好ましくは、（１）ｍ−アミノフェニルボロン酸に結合する、（２）コンカナバリンＡに結合しない、または（３）小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）に結合しない、の一つまたは複数の性質を有する糖タンパク質であり、最も好ましくは、これら全ての性質を有する糖タンパク質である。
【００２０】
本発明で初期化のために用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞のうち生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。例えば、これに制限されないが、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、腸細胞、肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、毛細胞、筋肉細胞、脳細胞、肺細胞、脂肪細胞、胃粘膜細胞、およびリンパ球等の分化した細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の体性幹細胞、組織前駆細胞をあげることができる。体細胞の由来は、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはマウスなどのげっ歯類、またはヒ卜などの霊長類であり、特に好ましくはヒ卜またはマウスである。また、ヒ卜の体細胞を用いる場合、胎児、新生児または成人の何れの体細胞を用いてもよい。本発明の方法で製造される多能性細胞を再生医療など疾患の治療に用いる場合には、該疾患を患う患者自身から分離した体細胞を用いることが好ましい。また、本発明では体細胞としてがん細胞を用いることができる。がん細胞に、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分、例えば、前記した性質を有するタンパク質を含む成分（発酵能を有する細菌の細胞抽出液からの粗精製画分を含む）を接触させることによって、がん細胞から非がん細胞を製造することができる。本発明において、体細胞(がん細胞である場合を含む)に、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分を接触させる工程は、インビトロでもまた生体内でも行うことができる。
【００２１】
本発明で言う多能性細胞とは、所定の培養条件下において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において多種の細胞(外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、または内胚葉系の細胞など)への多分化能を有する細胞(このような細胞のことは、幹細胞とも称する)のことを言う。
【００２２】
本発明で用いる再プログラミング誘導タンパク質含有成分を得ることができる発酵能を有する細菌の種類は特に限定されず、乳酸菌、納豆菌などの好気性細菌でもよいし、ビフィズス菌などの嫌気性細菌でもよいが、乳酸菌が特に好ましい。また、本発明で用いる乳酸菌の種類は、発酵能を有する限り特に限定されない。乳酸菌とは、発酵によって糖類から乳酸を産生する能力を有する菌の総称である。代表的な乳酸菌としては、ラク卜バシラス属(Lactobacillus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、エンテ口コッ力ス属(Enterococcus)、ラク卜コッ力ス属(Lactococcus) 、ペディオコッ力ス属(Pediococcus)、リューコノストック属(Leuconostoc) 、ス卜レプトコッ力ス属(Streptococcus) などに属する乳酸菌が挙げられ、本発明で用いる誘導タンパク質含有成分を得るために、これらの乳酸菌を使用することができる。好ましくは、Lactococcus属、Streptococcus属、またはLactobacillus属の乳酸菌を使用することができる。乳酸菌としては、特に好ましくは、Lactococcus Lactis subsp. Lactis、Streptococcus salivarius subsp. thermophilus、Lactobacillus sp.、またはLactobacillus acidophilusを使用することができる。
【００２３】
本発明においては、細胞培養用の通常の培地を用いて、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分の存在下において体細胞の培養を行うことにより、本発明の多能性細胞または非がん細胞（がん細胞を再プログラミングして非がん化した細胞）を分離及び培養することができる。本発明の多能性細胞を製造および培養するための培地は、特に制限されず、多能性細胞の培養に用いることができる任意の培地を用いることができ、例えば、これに制限されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最少必須（ＥＭＥ）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、アルファ−最少必須培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｈａｍ−Ｆ−１２、ＭＣＤＢ、およびそれらの改変培地をあげることができる。培地は、製造した多能性細胞のその後の使用や誘導効率の観点より、無血清培地が好ましく、さらには、必要に応じて、各種の成長因子、サイト力イン、ホルモンなど(例えば、FGF-2、TGFβ-1、アクチビンA、ノギン(Nanoggin) 、BDNF、NGF、NT-1、NT-2、NT-3等のヒ卜ES細胞の増殖・維持に関与する成分)を添加してもよい。このような培地も本発明の一部である。また、分離された多能性細胞の分化能及び増殖能は、ES細胞について知られている確認手段を利用することにより確認することができる。
【００２４】
本発明の方法で製造される多能性細胞及び非がん細胞の用途は特に限定されず、各種の試験・研究や疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた多能性細胞をレチノイン酸、EGFなどの増殖因子、またはグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞(例えば神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、血球細胞など)を誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。
【００２５】
本発明の多能性細胞を用いて治療を行うことができる中枢神経系の疾患としてはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷などが挙げられる。パーキンソン病の治療のためには、多能性細胞をドーパミン作動性ニュー口ンへと分化しパーキンソン病患者の線条体に移植することができる。ドーパミン作動性ニュー口ンへの分化はマウスのストローマ細胞株であるPA6細胞と本発明の多能性細胞を無血清条件で共培養することで進めることができる。アルツイハイマー病、脳梗塞、脊髄損傷の治療においては本発明の多能性細胞を神経幹細胞に分化誘導した後に、傷害部位に移植することができる。
【００２６】
また、本発明の多能性細胞は肝炎、肝硬変、肝不全などの肝疾患の治療に用いることができる。これら疾患を治療するには、本発明の多能性細胞を肝細胞あるいは肝幹細胞に分化し移植することができる。本発明の多能性細胞をアクチビンA存在下で5日間培養し、その後肝細胞増殖因子(HGF) で1週間程度培養することで肝細胞あるいは肝幹細胞を取得することができる。
【００２７】
さらに本発明の多能性細胞はＩ型糖尿病などの膵臓疾患の治療に用いることができる。I型糖尿病の場合には、本発明の多能性細胞を膵臓β細胞に分化させ、膵臓に移植することができる。本発明の多能性細胞を膵臓β細胞に分化させる方法は、ES細胞を膵臓β細胞に分化させる方法に準じて行うことができる。
【００２８】
さらに本発明の多能性細胞は虚血性心疾患に伴う心不全の治療に用いることができる。心不全の治療には、本発明の多能性細胞を心筋細胞に分化させた後に傷害部位に移植することが好ましい。本発明の多能性細胞は胚様体を形成させる3日前よりノギンを添加し培地中に添加することで、胚様体形成後2週間程度で、心筋細胞を得ることができる。
【００２９】
また、本発明によれば、がん細胞に、発酵能を有する細菌から得ることができる細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分を接触させることによって、がん細胞から非がん細胞を製造することができる。従って、本発明で用いられる細胞再プログラミング誘導タンパク質含有成分またはそれを含む組成物は、抗がん剤として有用である。
さらに本発明により提供される細胞を再プログラミング誘導することができるタンパク質含有成分は、分化した細胞やがん細胞などの異常分化を起こした細胞を初期化できるので、医薬品や化粧品への添加物として用いることができる。また、本発明の再プログラミング誘導タンパク質含有成分は、乳酸菌等に由来する物質であるので安全である。
【００３０】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：乳酸菌成分の調製
乳酸菌は、理化学研究所バイオリソースセンター  微生物材料開発室から購入した。MRS 培地を高圧蒸気殺菌後、乳酸菌（Lactobacillus acidophilus; JCM1021）をMRS培地20mlに植菌し、37℃で2〜3日間振盪培養した。次に、滅菌済みの前記培地1Lを含んだ3L振盪フラスコに植菌し、37℃で3〜4日間、振盪培養した。得られた培養液1Lから遠心分離10,000 rpm、10 minにより菌体を集めた。PBSに懸濁、遠心分離を3回繰り返して菌体を洗浄後、PBS (pH7.0) 30 mlに懸濁した。菌体懸濁液をBranson soniccator 250D 超音波破砕装置（株式会社Branson）でOUTPUT 3 Duty 50% 氷上で30分間破砕した。得られた細胞抽出液（ホモジネート）に3.42gの硫酸アンモニウム（硫安）を添加し（硫安濃度20%）、4℃で2時間冷却後、遠心分離8,000rpm、10min、4℃により菌体残渣を除いた。上清を回収後、硫酸アンモニウム8.28g追加し、一晩冷蔵庫で冷却した。サンプルを遠心分離10,000rpm、20min、4℃により硫安濃度20〜60%飽和で沈殿するタンパク質画分（またはタンパク質複合物）を沈殿させた。沈殿を0.02 M Triethanolamine (TEA) 緩衝液（pH 7.5） 5 mlに溶解し（全量で7.5 ml前後になる）、透析膜（Thermo slide A dialyzer pore size 20,000 MW）に入れ、一晩4℃で0.02 M Triethanolamine (TEA) 緩衝液(pH 7.5)に対して透析を行い、低分子の物質を取り除いた。次いで、透析したサンプルを回収し、100 KDaの限外ろ過フィルター(Millipore)でろ過し、膜を透過しなかった濃縮サンプルを回収した。タンパク質画分（またはタンパク質複合物）を、Protein Assay Kit（Bio Rad社）を用いて定量し、「乳酸菌成分」として以下の実験に用いた。タンパク濃度は、５mg/mlであった。【００３２】
実施例２：乳酸菌成分存在下でのHDF細胞の培養
10cmシャーレでHDF細胞（Human Dermal Fibroblasts, CELL APPLICATIONS, INC. Cat No.106-05a）をFibroblast Growth Medium（CELL  APLICATION INC.）で培養した。10mlのCMF（Ca2+ Mg2+フリーバッファー）で細胞を洗浄し、0.25%トリプシン溶液（1mM EDTA含）を1ml加えて全体にいきわたらせた。細胞を、CO2インキュベーター（37℃）に5分間入れた後、トリプシン阻害溶液（CELL  APLICATION INC.）3mlを加え懸濁し、細胞数をカウントした。あらかじめ6 well plate に1 wellあたり実施例１で得られたLactobacillus acidophilus (JCM1021)由来の乳酸菌成分（50μl）を入れておき、5 x 105のHDF細胞を加えた。乳酸菌は理化学研究所バイオリソースセンター  微生物材料開発室から購入した。細胞をそのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。
その結果、数日後には細胞塊が観察できた。図１の写真は、培養してから3日後の細胞の状態を示している。【００３３】
実施例３：細胞（乳酸菌成分処理HDF細胞）の分化誘導
実施例２で作製したHDF細胞塊(A)を、乳酸菌成分存在下で２週間培養し、脂肪細胞（B）、骨細胞（C）、軟骨細胞（D）に分化誘導をうながす培養液（GIBCO; A10070-01, A10072-01, A10071-01）に交換し、さらに2〜3週間培養した。
結果を図２に示す。図２に示されるように、乳酸菌成分を作用させたHDF細胞塊は、分化誘導培地で培養後、(B)Oil Red O染色（脂肪）、(C)Alizarin Red S染色（骨）、(D)Alcian Blue染色（軟骨）により染色され、それぞれの細胞への細胞の分化が確認できた。【００３４】
実施例４：乳酸菌成分存在下での肺がん細胞株（A549）の培養
理化学研究所  バイオリソースセンターから肺がん細胞株（A549; RBRC-RCB0098）を入手した。実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の肺がん細胞（A549）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。
その結果、数日後には細胞塊が観察できた。図３の写真は、培養してから14日後の細胞の状態を示している。【００３５】
実施例５：細胞（乳酸菌成分処理A549細胞）の分化誘導
理化学研究所  バイオリソースセンターから肺がん細胞株（A549; RBRC-RCB0098）を入手した。実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の肺がん細胞（A549）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。形成された細胞塊を、乳酸菌成分存在下で２週間培養し、脂肪細胞（B）、骨細胞（C）に分化誘導をうながす培養液（GIBCO; A10070-01, A10072-01）に交換し、さらに2〜3週間培養した。
結果を図４に示す。写真(A)は培養してから14日後のものである。乳酸菌成分を作用させた肺がん細胞株（A549）由来の細胞塊は、分化誘導培地で培養後、(B) Oil Red O染色（脂肪）、(C) Alizarin Red S染色（骨）により染色され、細胞の分化が確認できた。なお、写真(D)は、写真（C）の四角の部分の拡大である。【００３６】
実施例６：乳酸菌成分存在下での肝がん細胞株（HepG2）の培養
理化学研究所  バイオリソースセンターから肝がん細胞株（HepG2; RBRC-RCB1648）を入手した。実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の肝がん細胞（HepG2）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。
その結果、数日後には細胞塊が観察できた。図５の写真は、培養してから14日後の細胞の状態を示している。【００３７】
実施例７：細胞（乳酸菌成分処理HepG2細胞）の分化誘導
実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の肝がん細胞（HepG2）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。形成された細胞塊を、乳酸菌成分存在下で２週間培養し、脂肪細胞（B）、骨細胞（C）に分化誘導をうながす培養液（GIBCO; A10070-01, A10072-01）に交換し、さらに2〜3週間培養した。
結果を図６に示す。写真(A)は培養してから14日後のものである。乳酸菌成分を作用させた肝がん細胞株（HepG2）由来の細胞塊は、分化誘導培地で培養後、(B) Oil Red O染色（脂肪）、(C) Alizarin Red S染色（骨）により染色され、細胞の分化が確認できた。【００３８】
実施例８：乳酸菌成分存在下での乳がん細胞株（MCF７）の培養
理化学研究所  バイオリソースセンターから乳がん細胞株（MCF7; RBRC-RCB1904）を入手した。実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の乳がん細胞（MCF7）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。
その結果、数日後には細胞塊が観察できた。図７の写真は、培養してから14日後の細胞の状態を示している。【００３９】
実施例９：細胞（乳酸菌成分処理MCF7細胞）の分化誘導
実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の乳がん細胞（MCF7）を加えた。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。形成された細胞塊を、乳酸菌成分存在下で２週間培養し、脂肪細胞（B）、骨細胞（C）に分化誘導をうながす培養液（GIBCO; A10070-01, A10072-01）に交換し、さらに2〜3週間培養した。
結果を図８に示す。写真(A)は培養してから14日後のものである。乳酸菌成分を作用させた乳がん細胞株（MCF7）由来の細胞塊は、分化誘導培地で培養後、(B) Oil Red O染色（脂肪）、(C) Alizarin Red S染色（骨）により染色され、細胞の分化が確認できた。【００４０】
実施例１０：細胞（乳酸菌成分処理HepG2細胞）の分化誘導
実施例２と同様に、あらかじめ6 well plate に1 wellあたり50μlの乳酸菌成分を入れておき、5 x 105の肝がん細胞（HepG2）を加える。そのまま34℃、5% CO2インキュベータで培養した。細胞塊を、乳酸菌成分存在下で２週間培養した後、ポリLリジンとラミニンでコートしたカバーグラス上に移し7日間培養後、抗α-fetoprotein抗体（内胚葉マーカー）、抗NeuroFilament抗体（外胚葉、神経細胞マーカー）で染色した。
結果を図９に示す。図９に示されるように分化誘導させた後の細胞は、各々の抗体で認識された。【００４１】
実施例１１：乳酸菌成分存在下で培養した肺がん細胞株（A549）の多能性マーカー
実施例４と同様の実験を、肺がん細胞株（A549）を用いて乳酸菌成分の存在下または非存在下で実験を行った。培養から14日目に細胞を回収し、様々な多能性マーカー(Oct3/4, Sox2, Nanog, GDF-3, Rex1, ECAT, FGF4)や初期の老化マーカー(p15, p16, ARF)を用いてRT-PCR法を行った。
結果を図１０に示す。興味深いことに、A549細胞と乳酸菌成分を作用させると、多能性のマスター遺伝子と言われているNanogの発現が強く誘導された（矢印）。【００４２】
実施例１２：再プログラミング因子の同定
乳酸菌由来の再プログラミング因子を同定するために、実施例1で得られた濃縮乳酸菌成分（50μl、タンパク量0.25 mg）をさらに陰イオン交換クロマトグラフィーで分離した（QEF カラム）。0.02 M TEA緩衝液（pH 7.5）で平衡化したHiPrep 16/10-Q-FF（GE health care社製）カラム（16 ml）にチャージし、0〜1Mの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、活性画分(0.1M〜0.4M)を回収した。HDF細胞を用いて、実施例２と同様にして、活性画分の効果を確認した。
結果を図１１に示す。フラクション12から18に細胞塊形成活性が存在することが明らかになった。【００４３】
比較例１：大腸菌成分による比較
実施例１２と同様の実験を大腸菌（XLI-blue：Stratagene社）を用いて行い、画分(0.1M〜0.4M NaCl画分)を回収した。この画分をHDF細胞に作用させ、実施例２と同様の実験を行い、細胞塊形成活性を確認した。
結果を図１２に示す。その結果、大腸菌由来のフラクションには、細胞塊形成活性が存在しないことが明らかになった。【００４４】
実施例１３：乳酸菌成分の精製
実施例１で得られた乳酸菌成分を、さらに以下の工程（１）〜（３）を用いて精製した。
（１）イオン交換クロマトグラフィー（HiPrep Q FF 16/10、GEヘルスケア）
（２）疎水性相互作用クロマトグラフィー（HiTrap Phenyl FF (low sub) 5ml、GEヘルスケア）
（３）ゲルろ過クロマトグラフィー（HiLoad Superdex 200 prep grade、GEヘルスケア）
次いで、再プログラミン活性を有するゲルろ過クロマトグラフィー後のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、ＣＢＢで染色される３本のバンドが検出された。メインのバンドの分子量は、約６０ＫＤａであった。【００４５】
実施例１４：細胞再プログラミング誘導タンパク質の物理化学的性質の検討
実施例１３で得られた精製品を、糖タンパク質と結合するｍ−アミノフェニルボロン酸−アガロース（Glycoprotein Enrichment Resin、Takara社）を用いて精製した。その結果、ｍ−アミノフェニルボロン酸との結合が確認できた。また、実施例１３で得られた精製品を用いて、糖タンパク質と結合することが一般に知られているレクチンである、コンカナバリンＡおよび小麦胚芽レクチン（Wheat germ lectin）を用いて、結合性を確認したところ、これらのレクチンには結合しなかった。
さらに、実施例１３で得られた精製品をProteinase Kで処理したところ、再プログラミング誘導活性が失われた。【００４６】
実施例１５：乳酸菌成分存在下での腸細胞の培養
実施例２と同様にして、腸細胞を用いて実験を行った。その結果、HDF細胞と同様に、数日後に細胞塊が観察された。【００４７】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、体細胞から多能性細胞を生産する方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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