(57)【要約】本発明はコンドロイチン硫酸Ｅに対して高い特異性をもって反応し、特定の硫酸化多糖の検出や単離等に用いることができる抗体を提供する。本発明はコンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない、新規な抗コンドロイチン硫酸Ｅ抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない抗体。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸Ｃ、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｃ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び６−Ｏ−脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅのいずれにも反応しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫することによって得られる請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８又はＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫した動物由来の抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合により作製される請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、請求項８に記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８又はＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９であるハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Ｅの検出キット。
【請求項１３】
脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない抗体の製造方法。
【請求項１４】
脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない、新規な抗コンドロイチン硫酸Ｅ抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
ＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳＢ：コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳＤ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳＥ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＤＳ：デルマタン硫酸
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＰＮ：ヘパロサン
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ｄｅＳ−ＣＳＣ：完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｃ
ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ：６−Ｏ−脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅ
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＧａｌＮＡｃ： Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＰＥ：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
Ｃ−ＡＢＣ：コンドロイチナーゼＡＢＣ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＣＳＥ−ＰＥ：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸Ｅ【０００３】
ＣＳはＧＡＧの一種で、ＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの二糖の繰り返し構造からなる直鎖状高分子多糖である。二糖単位に結合した硫酸基の数とその結合位置の違い及びウロン酸異性体の存在が、ＣＳの構造を多様化させる。ＣＳの異性体としてＣＳＡ、ＣＳＢ（ＤＳとも称される）、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ＣＳＥ等が存在する。【０００４】
ＣＳＥは、ＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの４位と６位が硫酸化修飾を受けた基本二糖単位［ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ、６Ｓ）］の繰り返し構造を有する硫酸化多糖である。【０００５】
ＣＳＥに対する抗体として、ＣＳＥ及び基本二糖単位［ＩｄｏＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）］の繰り返し構造を有するＣＳＢに反応することが報告されているＣｈ−１抗体やＣｈ−３抗体（特許文献１）、ＣＳＤの基本二糖単位であるＤ構造［ＧｌｃＡ（２Ｓ）β１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）］を主に認識するが、ＣＳＥにも反応することが報告されているＭＯ−２２５抗体（非特許文献１、２、３）、ＣＳＥ、サメ皮膚由来ＤＳ、及びＣＳＡに反応することが報告されているＧＤ３Ｇ７抗体（非特許文献４）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１２９７０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】山形方人著、「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、  262巻、9号、1987年3月25日、p. 4146−4152
【非特許文献２】Ito Yumi著、「グライコバイオロジー（Glycobiology）」、15巻、6号、2005年、p. 593-603
【非特許文献３】福井成行著、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」、20号、2002年、p. 1011-1017
【非特許文献４】Gerdy B. ten Dam著、「アメリカンジャーナルオブパソロジー(The American Journal of Pathology)」、171巻、4号、2007年10月、p. 1324−1333
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はＣＳＥに高い特異性をもって反応し、特定の硫酸化多糖の検出や単離等に用いることができる抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題の解決を目指し、脂質とＣＳＥとを結合させた物質を抗原として新規抗ＣＳＥ抗体の作製を試みた。
本発明者は鋭意検討の結果、得られた抗体がＣＳＥに反応し、ＣＳＡ、ＣＳＢ及びＣＳＤに反応しないことを見出し、ＣＳＥと特異的に反応する抗ＣＳＥ抗体を発明するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）コンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない抗体。
（２）コンドロイチン硫酸Ｃ、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｃ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び６−Ｏ−脱硫酸化コンドロイチン硫酸Ｅのいずれにも反応しない、（１）に記載の抗体。
（３）硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂに反応しない、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫することによって得られる（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、（４）に記載の抗体。
（６）モノクローナル抗体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体。
（７）受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８又はＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（８）（６）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（９）脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫した動物由来の抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合により形成される（８）に記載のハイブリドーマ。
（１０）脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、（９）に記載のハイブリドーマ。
（１１）受領番号がＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８又はＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９であるハイブリドーマ。
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Ｅの検出方法。
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Ｅの検出キット。
（１４）  脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸Ｅに反応し、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ及びコンドロイチン硫酸Ｄに反応しない抗体の製造方法。
（１５）  脂質がジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミンである、（１４）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明抗体は、ＣＳＥに特異的に反応するため、ＣＳＥの検出に好適に用いることができる。また、本発明ハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を効率的に産生させることができる。また、本発明ＣＳＥ検出方法により、ＣＳＥを高精度に検出することができる。また、本発明ＣＳＥ検出キットを用いることにより、本発明ＣＳＥ検出方法によるＣＳＥの検出をより効率的且つ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各種ＧＡＧへのＥ−１２Ｃ抗体およびＥ−１８Ｈ抗体の反応性を示す図である。
【図２】硫酸化ＣＳＡや硫酸化ＣＳＢ等の各種ＧＡＧへのＥ−１２Ｃ抗体およびＥ−１８Ｈ抗体の反応性を示す図である。
【図３】Ｅ−１２Ｃ抗体およびＥ−１８Ｈ抗体を用いた凍結切片組織染色の図（写真）である。
【図４】Ｅ−１２Ｃ抗体およびＥ−１８Ｈ抗体を用いたパラフィン切片組織染色の図（写真）である。
【図５】Ｃ−ＡＢＣで処理した組織に対するＥ−１２Ｃ抗体の染色性を示した図（写真）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明はＣＳＥに反応し、ＣＳＡ、ＣＳＢ及びＣＳＤに反応しない抗体を提供する。
【００１４】
ＣＳＥは、ＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの４位と６位が硫酸化修飾を受けた基本二糖単位［ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ、６Ｓ）］の繰り返し構造を有する硫酸化多糖である。本発明抗体が反応するＣＳＥは、このような硫酸化多糖であれば、天然のものであっても、化学的に合成されたものであってもよい。天然のものとしては、例えばイカ由来のものが挙げられる。化学的に合成されたものとしては、例えば、後述する実施例６（１）に記載の方法によりＣＳＡから化学的に合成されたもの（以下、硫酸化ＣＳＡともいう）が挙げられる。このようなＣＳＥにおける当該基本二糖単位の存在比は、１５％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、４０％以上であることがさらに好ましく、５０％以上であることが極めて好ましく、６０％以上であることが特に好ましく、７０％以上であることが最も好ましい。基本二糖単位の存在比は後述する実施例に記載の方法により求めることができる。
【００１５】
本発明において、特に断らない限り抗体の「反応」とは免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、抗原との結合により評価することができる。抗体と抗原との結合は、常法であるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等によって調べることができる。ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、後述する実施例３（２）に記載の方法を挙げることができる。例えば、抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、当該抗体は当該抗原に反応するということができる。
【００１６】
また、抗原に対する本発明抗体の反応性は、例えば、後述する実施例３（２）に記載の方法により測定される本発明抗体のＣＳＥに対する反応性を基準とした、相対的な反応性とすることができる。
【００１７】
本願明細書において、「反応しない」とは、抗原と抗体の反応性が、陰性対照又はブランクと同程度であることを意味する。例えば、上記反応性を測定する方法において、ＣＳＥに対する反応性を１００％とした場合に、抗原と抗体の反応性と陰性対照又はブランクとの差が、１０％未満であるとき、好ましくは５％未満、より好ましくは４％未満、さらに好ましくは３％未満、極めて好ましくは２％未満、特に好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であるときは、「反応しない」と判断することができる。
【００１８】
本発明の抗体は、ＣＳＥに反応し、ＣＳＡ、ＣＳＢ及びＣＳＤ に反応しない抗体であれば特に限定されないが、ＣＳＣ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥにも反応しない抗体であることが好ましく、硫酸化ＣＳＢにも反応しない抗体であることがより好ましい。
ここで、硫酸化ＣＳＢとは、後述する実施例６（１）に記載の方法により得られたものを指す。
【００１９】
本発明の抗体のクラスは、特に制限されないが、ＩｇＭであることが好ましく、ＩｇＭ、κ鎖であることがより好ましい。
【００２０】
本発明の抗体の種類は、特に限定されず、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ'、Ｆｖ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理することにより得られうる。
【００２１】
本発明の抗体を得るための方法について、下記の項目に分けて説明する。ただし、本発明の抗体を得る方法は、以下のものには限定されない。
１．抗原の調製
２．免疫方法
３．ポリクローナル抗体の取得
４．モノクローナル抗体の取得
５．ハイブリドーマの作製
６．ハイブリドーマの選択とクローニング
【００２２】
＜１．抗原の調製＞
本発明の抗体は、例えば、ＣＳＥの抗原性を高めるために、脂質とＣＳＥとが結合してなる物質を抗原として抗体を産生しうる動物を免疫することにより得ることができる。ＣＳＥは特に限定されないが、イカ由来であるものが好ましい。脂質は、ＣＳＥと結合するものであれば特に限定されないが、リン脂質が好ましく、ＰＥであることがさらに好ましい。脂質とＣＳＥとの結合は特に限定されないが、化学的な結合であることが好ましく、共有結合であることがより好ましく、アミノアルキル結合であることがさらに好ましい。ＣＳＥとＰＥの結合に用いることができるＧＡＧとＰＥの結合方法は、特開平４−８０２０１に記載の還元末端をラクトン化する方法、特開平４−８０２０２に記載の還元末端の限定酸化方法、特開２００３−３３５８０１に記載のＧＡＧ−テトラブチルアンモニウム（ＧＡＧ−Ｂｕｔ4Ｎ+）塩の中間体を経た調製方法等が挙げられる。
【００２３】
＜２．免疫方法＞
免疫される動物は、ＣＳＥに反応する抗体を産生しうる動物であれば特に限定されないが、ブタ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス等の動物であることが好ましく、マウスであることが好ましい。
免疫のアジュバントは、特に使用しなくてもよいが、使用する場合は、ミョウバン、グラム陽性菌、グラム陰性菌、核酸等、アジュバント効果が期待されるものが好ましく、サルモネラ菌体膜がより好ましい。
免疫は、例えば、抗原とアジュバントを動物に静脈注射することで行うことができる。注射方法は、これに限らず、皮下注射、腹腔内注射でもよい。通常、投与は数回に分けて実施する。
【００２４】
＜３．ポリクローナル抗体の取得＞
ポリクローナル抗体は、免疫した動物より、血液を採取することで取得することができる。採取した血液中にポリクローナル抗体が存在するか否かは、抗体反応を指標に評価することができる。抗体反応の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。ポリクローナル抗体は採取された血液そのものでもよく、遠心分離によって得られる血清でもよく、精製されたものでもよい。抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
【００２５】
＜４．モノクローナル抗体の取得＞
モノクローナル抗体を取得する方法としては、得られたハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで培養する方法が挙げられ、目的に応じて選択できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合、ハイブリドーマを培養した際の細胞培養液を回収することで得られ、ｉｎ ｖｉｖｏの場合、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から得ることができる。
モノクローナル抗体は、細胞培養液や腹水をそのまま使用してもよく、遠心分離し細胞等を除いたものを使用してもよく、精製したものを使用してもよい。
抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
【００２６】
ＣＳＥに反応するモノクローナル抗体としては、Ｅ−１２ＣおよびＥ−１８Ｈと名付けられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体 （以下、Ｅ−１２Ｃ抗体、Ｅ−１８Ｈ抗体という）を挙げることができる。
Ｅ−１２Ｃ抗体およびＥ−１８Ｈ抗体は、ＣＳＥに反応し、他の各種ＧＡＧ（ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ、硫酸化ＣＳＢ）には反応しない特徴を有する。
【００２７】
＜５．ハイブリドーマの作製＞
ハイブリドーマは免疫した動物から、リンパ節又は脾臓を摘出することで得られる抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合することにより作製される。抗体産生細胞はリンパ球が好ましい。腫瘍細胞はミエローマ細胞が好ましく、由来は哺乳動物由来が好ましく、マウス由来がより好ましい。
【００２８】
＜６．ハイブリドーマの選択とクローニング＞
ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマの増殖速度と抗体反応を指標に行うことができる。抗体反応の測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
【００２９】
上記方法によりＣＳＥに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマについてクローニングを実施する。クローニングの方法としては、限界希釈法等が挙げられる。限界希釈法では、９６ウェルプレートに１ウェルあたりの細胞数を１個／ウェル（５．０ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）又は０．５個／ウェル（２．５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）となるように播種するのが好ましい。クローニング操作は２回以上繰り返すことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。
【００３０】
具体的なハイブリドーマとしては、Ｅ−１２ＣおよびＥ−１８Ｈと名付けられたハイブリドーマを挙げることができる。
【００３１】
上記ハイブリドーマは２０１４年２月２６日 （寄託日）、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８−１２２号室）に寄託し、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０８が付与された。また、平成２７年２月１７日付で、国際寄託に移管されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８）。
【００３２】
本発明のＣＳＥ検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程が含まれている限り、特に限定されない。
上記の「試料」とは、ＣＳＥを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば、尿、血液、血漿、血清、関節液、髄液等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物等が例示される。
【００３３】
本発明のＣＳＥ検出方法において、試料中に存在するＣＳＥの検出における具体的方法としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
【００３４】
本発明のＣＳＥ検出方法における検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在するＣＳＥ濃度は、例えば、予め既知濃度のＣＳＥ標準溶液を用いてＣＳＥ濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、ＣＳＥ濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。
【００３５】
本発明ＣＳＥ検出キットは、本発明抗体を少なくとも含んでいれば、特に限定されない。本発明ＣＳＥ検出キットによれば、本発明ＣＳＥ検出方法をより簡便に行うことができる。上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」は、例えば本発明抗体そのもの（例えば、溶液に溶解した本発明抗体等も含む）を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が挙げられる。また本発明ＣＳＥ検出キットの構成成分には、本発明抗体に加えて、例えば２次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、ＣＳＥ標準液などを含むものであってもよい。
【００３６】
本発明抗体の製造方法は、脂質とコンドロイチン硫酸Ｅとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含んでいれば、特に限定されない。抗体の具体的な製造方法は、上記１．〜６．に記載した方法や後述する実施例に記載の方法を用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を参考例、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、本発明は本参考例、実施例に限定されるものではない。【００３８】
（参考例１）ＣＳＥの調製
ＣＳＥは、イカ軟骨よりプロテアーゼ処理、アルコール沈殿を経て抽出され（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，３１７−３２１（１９６６））、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６，９８３−９８７  （１９６１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，４５７０−４５７６（１９７７））。【００３９】
上記工程を経て、重量平均分子量１４．６ｋＤａ、硫黄含量１０．０％、Ｅ構造含有率７０％以上のＣＳＥを得た（ＣＳＥの分析方法は以下の通りである）。当該ＣＳＥを抗原ＣＳＥとした。【００４０】
（参考例２）ＣＳＥの分子量および二糖組成の解析
（１）分子量解析
抗原ＣＳＥの分子量は、ＣＳＥの０．２％溶液５０μｌをＨＰＬＣ (ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ, 東ソー)によるゲルろ過で分析した。ゲルろ過カラムは、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷＸＬＧ４０００（０００８０２０, ７．８ｍｍ Ｉ.Ｄ.×３０ｃｍ, 東ソー）、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷＸＬＧ３０００（０００８０２１, ７．８ｍｍ Ｉ.Ｄ.×３０ｃｍ, 東ソー）、ＴＳＫｇｅｌ ＰＷＸＬＧ ２５００（０００８０２２, ７．８ｍｍ Ｉ.Ｄ.×３０ｃｍ, 東ソー）を連結させて用いた。移動相に０．２Ｍ ＮａＣｌを使用して、カラム温度 ４０℃、流速 ０．６ ｍｌ／ｍｉｎの条件で展開した。ＣＳＥの検出には示唆屈折計を用いた。平均分子量はＣＳの分子量標準品を対照にして求めた。尚、標準ＣＳの分子量は光散乱法により測定した。当該標準品を対照として、算出されたＣＳＥの重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）はそれぞれ、１４．６ｋＤａと７．７ｋＤａで、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ)は１．８であった。【００４１】
（２）二糖組成解析
抗原ＣＳＥにおける硫酸基の置換位置を確認する二糖分析は、Ｃ−ＡＢＣにより分解された二糖画分を、ポストカラム微量蛍光二糖分析ＨＰＬＣシステム（Ｔｏｙｐｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５，２２６９−２２７５）を用い定量した。【００４２】
二糖組成はＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分析した。逆相カラム（Ｓｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＤＯＣＯＳＩＬ ＳＰ１００，ＤＣ−Ａ１５１−ＳＰ，１ ｍｍ ＩＤ×１５ ｃｍ，センシュー科学）を使用し、励起波長 ３４６ｎｍ、測定波長 ４１０ｎｍでの蛍光波長を測定した。溶離液は、Ａ）ＤＷ（グラジェント），Ｂ）０．２Ｍ ＮａＣｌ（グラジェント），Ｃ）１０ ｍＭ Ｔｅｔｒａ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆａｔｅ １２％（常時），Ｄ）５０％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ １７％（常時）を流速１．１ ｍｌ/ｍｉｎ（Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５）で流し、０．５％ ２−シアノアセトアミド及び０．２５Ｍ 水酸化ナトリウムを０．７ ｍｌ/ｍｉｎ（６００Ｅ）で流した。カラム温度が５５℃の条件で展開した。【００４３】
二糖組成の解析は酵素消化による二糖分析で得られた特定が可能な不飽和二糖の量（ΔＤｉ-０Ｓ、ΔＤｉ-４Ｓ、ΔＤｉ-６Ｓ、ΔＤｉ-２Ｓ、ΔＤｉ-（４，６）Ｓ、ΔＤｉ-（２，４）Ｓ、ΔＤｉ-（２，６）Ｓ、ΔＤｉ-（２,４,６）Ｓのモル％の合計)を１００％として、特定の構造を持つ二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前の硫酸化多糖の硫酸化を反映するものである。標準物質は、ＣＳＡ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ＤＳ及びＨＡの酵素分解物を分離、精製した不飽和二糖を用いた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４，１５４３−１５５０  （１９６８）、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. １４６，３２７−３３５  （１９８５）。
上記手法により算出された二糖組成を次の表１に示す。【００４４】
【表１】
2015152280.tif 000002
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔＤｉ-０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-４Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-（４,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ １-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４）Ｓ：ΔＨｅｘＡ （２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-（２,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-（２，４，６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
上記のΔＨｅｘＡは不飽和ウロン酸、ＨｅｘＮＡｃはＮ-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。【００４５】
（参考例３）６−Ｏ−脱硫酸化ＣＳＥ（ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ）の調製
上記により得られたＣＳＥの６位硫酸基を選択的に脱硫酸化し、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥを調製した。以下に工程を記す。プロトンフォームとしたＣＳＥを無水ピリジンで中和し、ＣＳＥピリジニウム塩を得た。５０ｍｇのＣＳＥピリジニウム塩と［ビス（トリエチルシリル）アセトアミド］（ＢＴＳＡ）を無水ピリジン中で６０℃、２時間反応させた。反応液に蒸留水を加え反応を停止させてから、透析により塩を除去した。透析後、溶液を３０分間煮沸し、室温に戻してから０．５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを９．５に調整した。再び透析した溶液を凍結乾燥させ、粉体として、４０ｍｇ回収した。【００４６】
当該粉体を上記の（１）分子量解析および（２）二糖組成解析に従って分析した。重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）はそれぞれ、１２．７ ｋＤａと６．５ ｋＤａで、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．９であった。二糖組成は、ΔＤｉ-０Ｓ １８．０％、ΔＤｉ-４Ｓ ８２．０％、ΔＤｉ-６Ｓ ０％、ΔＤｉ-２Ｓ ０％、ΔＤｉ-（４,６）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，４）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２,６）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，４，６）Ｓ ０％であり、選択的に６位硫酸基が脱硫酸化されたことを確認した。【００４７】
（参考例４）完全脱硫酸化ＣＳＣ（ｄｅＳ−ＣＳＣ）の調製
ＣＳＣをメタノール／塩化アセチル中で反応させ、脱硫酸化させる方法 （Ｔｈｏｍａｓ Ｇ. Ｋａｎｔｏｒ, Ｍａｘｗｅｌｌ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ.（１９５７）Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ７９，１５２−１５３）に従いｄｅＳ−ＣＳＣを調製した。【００４８】
ＣＳＣ粉体を上記の（１）分子量解析及び（２）二糖組成解析に従って分析した。脱硫酸化前のＣＳＣの二糖組成は、ΔＤｉ-０Ｓ １．９％、ΔＤｉ-４Ｓ １７．８％、ΔＤｉ-６Ｓ ６８．２％、ΔＤｉ-２Ｓ ０％、ΔＤｉ-（４，６）Ｓ １．３％、ΔＤｉ-（２，４）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，６）Ｓ １０．８％、ΔＤｉ-（２，４，６）Ｓ ０％であった。上記調製工程を経て、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）はそれぞれ５．９ｋＤａと３．９ｋＤａ、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．５となった。二糖組成は、ΔＤｉ-０Ｓ ９１．２％、ΔＤｉ-４Ｓ ０％、ΔＤｉ-６Ｓ ８．７％、ΔＤｉ-２Ｓ ０％、ΔＤｉ-（４，６）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，４）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，６）Ｓ ０％、ΔＤｉ-（２，４，６）Ｓ ０％となり、脱硫酸化されていることを確認した。【００４９】
（参考例５）ビオチン標識化ＧＡＧの調製
各種ＧＡＧ（ＣＳＥ、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ）５ ｍｇを２Ｍ ＮＨ4Ｃｌ溶液 １ ｍｌに溶解した。その溶液にＮａＣＮＢＨ3 ５０ ｍｇを添加し、７０℃で４８時間反応させた。更に、ＮａＣＮＢＨ3 ２５ ｍｇ加え、７０ ℃で４８時間反応させた。反応溶液の塩を除去するため、透析膜（ＭＷＣＯ １２０００〜１４０００）で一晩透析した。透析後の溶液を凍結乾燥し、粉体として回収した。【００５０】
凍結乾燥させた粉体をＰＢＳ ４５０μｌに溶解させ、ビオチン溶液（Ｂｉｏｔｉｎ １０ ｍｇ／２２２ μｌ ｉｎ ＤＭＦ）を５０ μｌ添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、透析膜（ＭＷＣＯ １２０００〜１４０００）で一晩透析し、その溶液を凍結乾燥し、ビオチン標識化ＧＡＧ（ＣＳＥ、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ）の粉体として回収した。【００５１】
（実施例１）
ＣＳＥ抗原の調製
（１）ＣＳＥテトラブチルアンモニウム塩（以下「ＣＳＥ-Ｂｕｔ4Ｎ+塩」）の調製
参考例１で調製したＣＳＥ１．０ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ-Ｘ８ Ｈ+ ｆｏｒｍ（２１７５１４-５００ｇ，ＳＩＧＭＡ）カラム（２．５ ｃｍφ × ６．５ ｃｍ）にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったＣＳＥを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアンモニウム（１０％ ｉｎ Ｗａｔｅｒ）（Ｔ０９５５，東京化成工業）を添加し、ｐＨを酸性から中性に調整した（ｐＨ ７．１５）。溶液を室温で３日間凍結乾燥して、ＣＳＥ-Ｂｕｔ4Ｎ+塩を乾燥粉末として１．８５ｇ回収した。【００５２】
（２）ＣＳＥ−ＰＥの調製
ＣＳＥ-Ｂｕｔ4Ｎ+乾燥粉末１．８５ ｇ を脱水メタノール２５ ｍｌに溶解し、ＰＥ（１６３−１６１１９３, Ｗａｋｏ）１０４ ｍｇ（１５０μｍｏｌ）を添加した。アルゴンガス雰囲気下、５０℃で１時間撹拌した後、トリメチルアミンボラン（Ｔ１１８１，東京化成工業）を３６ｍｇ加え、継続して２４時間、５０℃で攪拌した。更に、トリメチルアミンボラン ３６ｍｇを２４時間おきに２回に分けて添加し、５０℃で反応させ、ＣＳＥ−ＰＥ反応溶液を得た。【００５３】
（３）ＣＳＥ−ＰＥの精製
上記（２）記載の反応溶液を減圧濃縮後、メタノールを加え減圧濃縮を繰り返し、トリメチルアミンボランをメタノールとの共沸で除去した。その残渣に０．２Ｍ 酢酸ナトリウム４０ ｍｌを加え、室温で２時間撹拌した後、遠心分離（６０００ ｒｐｍ、３０分間）により不溶物を除去した。その上清に酢酸ナトリウム飽和エタノールを３倍量（１２０ｍｌ）加えて目的物を沈殿させた。生成した沈殿を蒸留水に溶解し凍結乾燥により、０．８３ｇの粉体を回収した。【００５４】
０．８ｇの粉体のうち０．７ｇを水２５ ｍｌおよびメタノール２５ ｍｌに溶解させ、セルファインブチル（１９９０５，ＪＮＣ）ゲルを２０ｇ添加し、懸濁液を撹拌しながら、１ Ｍ ＮａＣｌ １０ ｍｌを滴下し、４℃で２時間撹拌した。そして、懸濁液をカラム（２．５ ｃｍφ × ２５ ｃｍ）に充填した。【００５５】
カラムの溶液を抜き、０．２ Ｍ ＮａＣｌ ２００ ｍｌで洗浄した後、蒸留水５０ ｍｌ及び３０％（ｖ/ｖ） メタノール−蒸留水混液２００ ｍｌで溶出した（メタノール溶出画分）。メタノール溶出画分を減圧濃縮で乾固し蒸留水で再溶解した後、ＭＷＣＯ １２０００〜１４０００の透析膜で流水透析後に凍結乾燥により粉体を回収した。回収したＣＳＥ−ＰＥの粉体の重量は、５０ｍｇであった。【００５６】
（実施例２）
ＣＳＥに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得
（１）免疫用抗原の調製
実施例１で調製したＣＳＥ−ＰＥを最終濃度２ ｍｇ/ｍｌとなるようＰＢＳに溶解させ、超音波処理後、最終濃度０．１ ｍｇ/ｍｌとして、３７℃に加温した。これに酸処理したSalmonella minnesota菌体膜をＰＢＳで予め１ ｍｇ/ｍｌに懸濁した溶液を１１３６μｌ加え、３７℃、１０分間静置させた。この混合溶液を２００μｌ に分注し、−２０℃に保存した。【００５７】
（２）マウス免疫
上記（１）で作製した分注液を０、４、７、１１、２１、２５日目にＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス３匹（６週齢）に２００μｌずつ尾静注より注入した。また、抗体価をＥＬＩＳＡにより確認するため、２９日目に眼底採血をし、これを４℃、一晩静置後、５０００ ｒｐｍ、１０分間遠心した後、血清を回収し、−８０℃で保存した。【００５８】
（３）ＥＬＩＳＡ法による抗体反応測定
実施例１で調製したＣＳＥ−ＰＥを７０％ ＥｔＯＨで２．５μｇ／５０ μｌに溶解し、Ｆ底９６穴マイクロタイタープレート（３３５５，サーモフィッシャーサイエンティフィック）に該溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。【００５９】
減圧乾燥下で溶液を蒸発させ固相化後、ブロッキング溶液として１％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ−ＰＢＳ を２００ μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で１時間放置した。ブロッキング溶液を除去後、ＰＢＳ ２００ μｌ／ｗｅｌｌで１回洗浄した。【００６０】
ＰＢＳで希釈した、上記（１）で作製したマウス血清を５０ μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温にて１時間反応させた。血清を除去し、ＰＢＳ ２００ μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。２次抗体として、１％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したＨｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 標識ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭを５０ μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で１時間反応させた。２次抗体溶液を除去後、ＰＢＳ ２００ μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。【００６１】
発色及び測定は、発色溶液［８０ ｍＭ クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．６）５ ｍｌにｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ２ｍｇを溶解させた後、３０％ 過酸化水素水２ μｌを加えて調製した溶液］を１００ μｌ／ｗｅｌｌ添加した。遮光放置して発色が見られたところで１ Ｎ ＨＣｌ 溶液１００ μｌ／ｗｅｌｌで発色を停止させた。測定波長λ1=４９２ ｎｍ、対照波長λ2=６３０ ｎｍに設定したマイクロプレートリーダー（ＳＫ６０３）で吸光度を測定した。【００６２】
３匹のマウスの血清が、濃度依存的にＣＳＥ−ＰＥに反応したため、抗原により免疫されたことを確認した。【００６３】
（４）マウス骨髄腫細胞由来ＰＡＩ細胞の培養
ＰＡＩ細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク，ＪＣＲＢ０１１３）を１０％  ＦＢＳ−ＲＰＭＩ ［培地終濃度１０％ ＦＢＳ，１％ ＰＳＧ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ含有］で３７℃、５％ＣＯ2存在下において培養した。【００６４】
（５）マウス脾臓細胞の調製
免疫開始後３２日目（最終免疫７日後）のマウスから脾臓を無菌的に取り出し、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地を入れたシャーレ上で脾臓をほぐした。これを１３００ ｒｐｍ、５分間遠心後、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地で再懸濁し、懸濁液中の組織をセレストレーナーで取り除いた。１３００ ｒｐｍ、５分間遠心した沈殿を１０％  ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地２０ ｍｌで再懸濁し、脾臓細胞を回収した。【００６５】
（６）ハイブリドーマの作製
上記で調製したＰＡＩ細胞と脾臓細胞をＰＡＩ細胞：脾臓細胞＝１：５ cell／cellの比率で混合し、ポリエチレングリコール＃４０００にて融合させた。細胞融合の培養にはＨＡＴサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を１００倍希釈で加えた１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ培地を使用した。ＨＡＴ耐性コロニーの出現が観察できるまで、マウス１匹あたり２枚の９６ウェルプレートで１０〜１４日間培養した。【００６６】
培養上清が陽性であり、増殖が速いコロニーは、ウェル面積を変更し、６ウェルプレートで培養させた。６ウェルプレートまでに、４回のスクリーニング試験を実施して、抗体価を測定した。【００６７】
（７）クローニング
前述（６）で培養上清が陽性であった細胞を限界希釈法によりクローニング操作した。クローニング操作では、クローニングメディウムＣＭ−Ｂ（４１００２２５１７，エーディア）を使用した。細胞数をそれぞれ１個／ｗｅｌｌ（５．０ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、０．５個／ｗｅｌｌ（２．５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）となるように希釈し、９６穴マイクロプレートに播種し、１クローンあたり２枚の９６穴プレートで１０〜１４日間培養した。前述（５）と同様に、４回のスクリーニング試験を経て陽性であったクローンを選択した。【００６８】
続いて、一次クローニングで得られたクローンを用い、２回目のクローニング操作を実施した。上述と同様の操作で、陽性であったクローンを選択した。【００６９】
（８）ハイブリドーマの選択
前述（７）で選択したクローンのＣＳＥに対する特異性を評価し、２つのクローンを得た。この２つのクローン名をそれぞれＥ−１２Ｃ、Ｅ−１８Ｈとした。上記のハイブリドーマクローンは、２０１４年２月２６日（寄託日）、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０９、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０８が付与された。また、平成２７年２月１７日付で、国際寄託に移管されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０９、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０１８０８）。【００７０】
（実施例３）
モノクローナル抗体の特徴
（１）モノクローナル抗体の生産
目的のＣＳＥに反応するモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを培養し、その培養液から遠心分離により細胞を除去し取得した（培養上清）。ハイブリドーマＥ−１２ＣよりＥ−１２Ｃ抗体、ハイブリドーマＥ−１８ＨよりＥ−１８Ｈ抗体をそれぞれ取得した。【００７１】
（２）各種ＧＡＧによるＥＬＩＳＡ試験
Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体について、各種ＧＡＧ（ＣＳＥ、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ）に対する反応性をビオチン標識化ＧＡＧ固相化プレートによるＥＬＩＳＡ法で検討した。ＣＳＥはイカ由来、ＣＳＡはクジラ由来、ＣＳＢはブタ由来、ＣＳＣはサメ由来、ＣＳＤはサメ由来、Ｈｅｐはウシ由来、ＨＳはブタ由来、ＨＰＮはＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ５株由来、ＫＳはサメ由来、ＨＡは鶏由来のものを使用した。以下の表２に使用した各種ＧＡＧの分子量、分散値及び硫黄含量を示す。
【表２】
2015152280.tif 000003
【００７２】
ストレプトアビジンコートプレートであるＢｉｏＢｉｎｄ ストリップアセンブリ （９５０２９ ２９３，サーモフィッシャーサイエンティフィック）にＰＢＳで希釈した各種ビオチン標識化ＧＡＧ １ μｇ／ｍｌを加え、室温で１時間放置することで固相化した。同様に、同濃度のＢｉｏｔｉｎ溶液とＰＢＳを各々５０ μｌ／ｗｅｌｌとなるようにプレートに加え、陰性対照及びブランクとした。【００７３】
固相化に用いた溶液を除去後、ブロッキング溶液として１％ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ−ＰＢＳを２００ μｌ／ｗｅｌｌとなるように加え、室温で１時間放置した。ブロッキング溶液を除去後、ＰＢＳ ２００ μｌ／ｗｅｌｌで１回洗浄し、培養上清を５０ μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温にて１時間反応させた。以降の二次抗体からの工程は実施例２（３）に記載の ＥＬＩＳＡ法による抗体反応測定と同様の方法で吸光度を測定した（図１）。得られた吸光度の値から、抗体のＣＳＥに対する反応性（吸光度の値）を１００％とし、抗体と各固相化物質との相対的な反応性（％）を算出した。結果を次の表３に示す。【００７４】
【表３】
2015152280.tif 000004
【００７５】
ＣＳＥと、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体との反応性から陰性対照を差し引いた値はいずれも９８％以上であり、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体がいずれも強力にＣＳＥと反応することが示された。【００７６】
ＣＳＥ以外のＧＡＧ（ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＣＳＣ、ＣＳＤ、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＨＰＮ、ＫＳ、ＨＡ、ｄｅＳ−ＣＳＣ、ｄｅ６Ｓ−ＣＳＥ）に対する吸光度はＰＢＳやＢｉｏｔｉｎを固相化したブランク及び陰性対照の吸光度と同程度であった（図１）。ＣＳＥ以外のＧＡＧと抗体の反応性から、陰性対照を差し引くと、いずれも０．５％未満であった。これにより、Ｅ−１２Ｃ抗体とＥ−１８Ｈ抗体は、共にＣＳＥ以外のＧＡＧとは反応せず、ＣＳＥと特異的に反応することが示された。【００７７】
（実施例４）
抗体のサブタイプの測定
ＩｓｏＱｕｉｃｋ（ＴＭ）マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット（ＩＳＯＱ５，シグマ）およびＩｓｏＱｕｉｃｋ（ＴＭ）マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定用ストリップ（ｉ９４１０−２５ＥＡ，シグマ）を用い、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体のサブタイプを判定した。【００７８】
実施例３（１）より得られるＥ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体（培養上清）にＩｓｏＱｕｉｃｋ ｋｉｔの先端を５分間浸し、バンドが確認できたところで終了した。出現したバンドの位置から抗体が属するタイプを判定した。その結果、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体は共にＩｇＭの単一バンドであり、Ｌ鎖はκ鎖であった。【００７９】
（実施例５）
ＣＳＥ検出キットの作製
以下の構成からなるＣＳＥ検出キットを作製した。
１．実施例３（１）より得られるモノクローナル抗体
２．２次抗体（Ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 標識ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ）
３．用時調製 発色溶液セット（８０ ｍＭ クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．６）、ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ 、３０％ 過酸化水素水）
４．反応停止液（１ Ｎ ＨＣｌ）【００８０】
（実施例６）
硫酸化ＣＳＡ及び硫酸化ＣＳＢに対するＥ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体の反応性
（１）硫酸化ＣＳＡ及び硫酸化ＣＳＢの調製
ＣＳＡ１００ｍｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、陽イオン交換樹脂ダイヤイオン（ＰＫ２２０、三菱化学）（２．５ ｃｍφ × ６．５ ｃｍ）にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったＣＳＡを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアミン（ＴＢＡ）を添加し、ｐＨを酸性から中性に調整した。溶液を室温で凍結乾燥して、ＣＳＡ−ＴＢＡ塩を得た。
当該ＣＳＡ−ＴＢＡ塩をホルムアミド/ジメチルホルムアミドを１：４で混合させた溶媒に溶解させ、硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを添加した。硫酸化剤の添加量は、二糖ユニット当たり８当量となるよう添加した。硫酸化反応後の溶液に、蒸留水を添加し反応を停止させ、水酸化ナトリウムで中和させた。この溶液をＭＷＣＯ１２０００から１４０００の透析膜で一晩透析させた後に、凍結乾燥により１６０ｍｇの硫酸化ＣＳＡを得た。このようにしてＣＳＡのＧａｌＮＡｃの６位に硫酸基を導入することで硫酸化ＣＳＡを調製することが可能である（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１５８，１８３−１９０（１９８６））。ＣＳＢも同様に硫酸化させ、１６０ｍｇの硫酸化ＣＳＢを得た。【００８１】
（２）硫酸化ＣＳＡ及び硫酸化ＣＳＢの分子量および二糖組成の解析
解析は「（参考例２）の（１）分子量解析、（２）二糖組成解析」に記載の方法で実施した。結果を表４に示す。表中では、硫酸化剤を８当量添加した硫酸化ＣＳＡをＣＳＡ−８Ｓ、同様に硫酸化剤を８当量添加した硫酸化ＣＳＢをＣＳＢ−８Ｓとしている。【００８２】
【表４】
2015152280.tif 000005
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔＤｉ-０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-４Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-（４,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ １-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４）Ｓ：ΔＨｅｘＡ （２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-（２,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
上記のΔＨｅｘＡは不飽和ウロン酸、ＨｅｘＮＡｃはＮ-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。【００８３】
基本二糖単位が［ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）］であるＣＳＡの６位が硫酸化されたＣＳＡ−８ＳのΔＤｉ-（４,６）Ｓ構造の含有率は５９．４％であった。これにより、ＣＳＥの基本二糖単位［ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）］（以下、Ｅ構造ともいう）を主に含有する硫酸化ＣＳＡが調製されたことを確認した。また、基本二糖単位が［ＩｄｏＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）］であるＣＳＢの６位が硫酸化されたＣＳＢ−８ＳのΔＤｉ-（４,６）Ｓ構造の含有率は６６．０％であった。これにより、基本二糖単位［ＩｄｏＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）］を主に含有する硫酸化ＣＳＢが調製されたことを確認した。【００８４】
上記で調製した硫酸化ＣＳＡ及び硫酸化ＣＳＢを「参考例５のビオチン標識化ＧＡＧの調製」に記載の方法によりビオチン化し、ビオチン化硫酸化ＣＳＡ及びビオチン化硫酸化ＣＳＢを調製した。【００８５】
Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体の硫酸化ＣＳＡと硫酸化ＣＳＢに対する反応性をＥＬＩＳＡにより評価するため、「実施例３のモノクローナル抗体の特徴」に記載の方法に従い試験した。結果を表５及び図２に示す。【００８６】
【表５】
2015152280.tif 000006
【００８７】
硫酸化ＣＳＡと、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体との反応性から陰性対照を差し引いた値はいずれも９６％以上であり、その反応性はＣＳＥとほぼ同等であった。Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体はいずれも強力に硫酸化ＣＳＡと反応した。【００８８】
Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体は、イカ由来のＣＳＥのみではなく、ＣＳＡより化学的に合成されたＣＳＥ（硫酸化ＣＳＡ）にも反応することが確認された。【００８９】
ＣＳＡ、ＣＳＢ、硫酸化ＣＳＢの吸光度はブランク及び陰性対照の吸光度と同程度であった。これにより、Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体は、ＣＳＡ、ＣＳＢ、硫酸化ＣＳＢには反応しないことが確認された。【００９０】
（実施例７）
表面プラズモン共鳴法による相互作用解析
（１）アミンカップリング法によるリガンドＧＡＧの固定化
センサーチップＣＭ５表面にコーティングされている直鎖デキストランには負に帯電したカルボキシル基が導入されている。カルボキシル基をＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）により活性化し、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解させた５０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを固定化した。固定化後に残った活性ＮＨＳ基をエタノールアミンによりブロッキングした。ブロッキング後、５０ＲＵ（レゾナンスユニット）以上の固定化量が得られるようリガンドとなるビオチン化ＧＡＧを添加した。リファレンスセルも同様にビオチンを固定化させネガティブコントロールセルとした。ランニング緩衝液としてＰＢＳを流速１０μｌ／ｍｉｎで流し、温度２５℃の条件で実施した。【００９１】
（２）相互作用測定
０．２２μｍフィルターで透過させたＥ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体の培養上清をアナライトとして、相互作用解析した。抗体培養上清はＰＢＳにより希釈して、ＩｇＭ濃度として２ｎＭとなるように調製した。流速２０μｌ／ｍｉｎで注入し、リガンドと相互作用させた。リファレンスセルのレスポンスを差し引いたセンサーグラムを表示させ、レスポンスがない場合は検出されないもの（ＮＤ）とした。解析可能なレスポンスが得られた場合は、１：１ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌにより、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）の値から解離定数（ＫＤ）値を算出した。ＫＤ値は、ｋｄ／ｋａにより求めることができる。【００９２】
（３）分子量の異なるＣＳＥの調製
分子量の異なるＣＳＥは、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６，９８３−９８７  （１９６１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，４５７０−４５７６（１９７７））。当該文献を参考に分子量が異なる５種類のＣＳＥを調製した。【００９３】
調製した５種類の分子量が異なるＣＳＥについて解析した。解析は「参考例２（１）分子量解析、（２）二糖組成解析」に記載の方法で実施した。結果を表６に示す。【００９４】
【表６】
2015152280.tif 000007
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔＤｉ-０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-４Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-（４,６）：ΔＨｅｘＡ １-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４）：ΔＨｅｘＡ （２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-（２,６）：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
上記のΔＨｅｘＡは不飽和ウロン酸、ＨｅｘＮＡｃはＮ-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。【００９５】
重量平均分子量（Ｍｗ）が６８.０ｋＤａ、Ｅ構造含有率が６１．４％のＣＳＥをＣＳＥ−６８Ｋとした。重量平均分子量（Ｍｗ）が５６.７ｋＤａ、Ｅ構造含有率が６１．０％のＣＳＥをＣＳＥ−５６Ｋとした。重量平均分子量（Ｍｗ）が２４.１ｋＤａ、Ｅ構造含有率が６３．０％のＣＳＥをＣＳＥ−２４Ｋとした。重量平均分子量（Ｍｗ）が１４．６ｋＤａ、Ｅ構造含有率が７０.４％のＣＳＥをＣＳＥ−１４Ｋとした。このＣＳＥ−１４Ｋは抗体作製の免疫抗原に使用したものと同一である。重量平均分子量（Ｍｗ）が８.７ｋＤａ、Ｅ構造含有率が６６．７％のＣＳＥをＣＳＥ−８Ｋとした。これら上記５種類のＣＳＥを使用した。【００９６】
（４）分子量の異なるＣＳＥに対する相互作用解析
上記表６に記載の５種類のＣＳＥとｄｅ６Ｓ−ＣＳＥをセンサーチップに固定化させて相互作用解析した。試験は、「実施例７の（１）アミンカップリング法によるリガンドの固定化、（２）相互作用測定」に記載の方法で実施した。結果を表７に示す。【００９７】
【表７】
2015152280.tif 000008
【００９８】
ＣＳＥ−１４ＫとＥ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体とのＫＤ値はそれぞれ３．６×１０-10（Ｍ）、２．５×１０-10（Ｍ）となり、抗原抗体反応として強い相互作用を示した。Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体と抗原ＣＳＥの６位を選択的に脱硫酸化したｄｅ６Ｓ−ＣＳＥとの反応性は検出されなかった（ＮＤ）。【００９９】
Ｅ−１２Ｃ抗体とＣＳＥ−６８ＫとのＫＤ値は１．７×１０-11（Ｍ）、ＣＳＥ−５６Ｋでは３．４×１０-11（Ｍ）、ＣＳＥ−２４Ｋでは２．３×１０-10（Ｍ）、ＣＳＥ−１４Ｋでは３．６×１０-10（Ｍ）、ＣＳＥ−８Ｋでは３．７×１０-10（Ｍ）となった。Ｅ−１８Ｈ抗体とＣＳＥ−６８ＫとのＫＤ値は１．５×１０-11（Ｍ）、ＣＳＥ−５６Ｋでは２．５×１０-11（Ｍ）、ＣＳＥ−２４Ｋでは１．２×１０-10（Ｍ）、ＣＳＥ−１４Ｋでは２．６×１０-10（Ｍ）、ＣＳＥ−８Ｋでは２．９×１０-10（Ｍ）となった。いずれのＫＤ値も１×１０-9（Ｍ）以下であり、強力な相互作用を示すことが確認された。【０１００】
（５）Ｅ構造含有率の異なる硫酸化ＣＳＡに対する相互作用解析
ＣＳＡ−ＴＢＡ塩に対して硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを２、４、６当量添加して反応させた。以降の工程は実施例６（１）硫酸化ＣＳＡ及びＣＳＢの調製に記載の方法に従い調製した。調製された硫酸化ＣＳＡの分子量および二糖組成解析を参考例２（１）分子量解析、（２）二糖組成解析に記載の方法で実施した。結果を表８に示す。【０１０１】
【表８】
2015152280.tif 000009
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔＤｉ-０Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-４Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-６Ｓ：ΔＨｅｘＡ１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ
ΔＤｉ-（４,６）：ΔＨｅｘＡ １-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４）：ΔＨｅｘＡ （２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ-（２,６）：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ-（２,４,６）Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）１-３ＨｅｘＮＡｃ（４Ｓ, ６Ｓ）
上記のΔＨｅｘＡは不飽和ウロン酸、ＨｅｘＮＡｃはＮ-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。【０１０２】
硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを２当量添加して調製した生成物をＣＳＡ−２Ｓ、４当量添加して調製した生成物をＣＳＡ−４Ｓ、６当量添加して調製した生成物をＣＳＡ−６Ｓと表記した。ＣＳＡ−２ＳのＥ構造含有率は１４．１％、ＣＳＡ−４ＳのＥ構造含有率は３２．７％、ＣＳＡ−６ＳのＥ構造含有率は４５．９％となり、添加した硫酸化剤の当量に応じて、Ｅ構造が生成された。「実施例６の表４」に記載したＣＳＡ、ＣＳＡ−８Ｓ、ＣＳＢ、ＣＳＢ−８Ｓの結果を合わせて、表９に表記した。【０１０３】
【表９】
2015152280.tif 000010
【０１０４】
Ｅ−１２Ｃ抗体とＣＳＡ及びＣＳＡ−２Ｓとの反応性は検出されなかった。Ｅ−１２Ｃ抗体とＣＳＡ−４ＳとのＫＤ値は１．０×１０-8（Ｍ）、ＣＳＡ−６Ｓでは３．５×１０-9（Ｍ）、ＣＳＡ−８Ｓでは７．８×１０-10（Ｍ）となった。Ｅ−１８Ｈ抗体とＣＳＡ及びＣＳＡ−２Ｓとの反応性は検出されなかった。Ｅ−１８Ｈ抗体とＣＳＡ−４ＳとのＫＤ値は９．４×１０-9（Ｍ）、ＣＳＡ−６Ｓでは１．８×１０-9（Ｍ）、ＣＳＡ−８Ｓでは４．３×１０-10（Ｍ）となった。【０１０５】
Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体のＣＳＢ、硫酸化ＣＳＢに対する反応性は検出されなかった。【０１０６】
（実施例８）
抗ＣＳＥ抗体の組織染色性を以下の通り検討した。
（１）凍結切片における免疫組織染色
イカ軟骨を小片化し、ティシュー・テックＯ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に組織片を埋め、液体窒素で凍らせて凍結切片を作製した。【０１０７】
作製した切片を、１０％中性緩衝ホルマリン液により室温で１０分間固定後、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液で２回洗浄した。【０１０８】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．３％過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温で１０分間行った。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１％カゼイン溶液（和光純薬工業株式会社）でブロッキングを室温で６０分間行った。【０１０９】
０．１％カゼイン溶液で１２μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＳＥ抗体（Ｅ−１２Ｃ又はＥ−１８Ｈ）を３７℃で６０分間反応させた。この際、陰性対照として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（シグマ）を使用した。【０１１０】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体(ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて１０分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて５分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に５分間浸漬した後、５分間ＤＡＢ（同仁化学研究所）で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。【０１１１】
得られた染色像を図３に示す。Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体いずれでも染色が見られた。陰性対照として用いたｍｏｕｓｅ ＩｇＭでは染色は見られなかった。【０１１２】
（２）パラフィン切片における免疫組織染色
イカ軟骨を小片化し、１０％中性緩衝ホルマリン液に固定後、パラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。【０１１３】
作製した切片を、脱パラフィン処理(キシレン) 、親水化処理 (アルコール下降系列：９９．９％、９５％、８０％、７０％エタノール)した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液で２回洗浄した。【０１１４】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．３％過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温で１０分間行った。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、アビジン溶液（ヒストファイン  内因性アビジン・ビオチンブロッキングキット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)でブロッキングを室温で１０分間行った。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ビオチン溶液（ヒストファイン  内因性アビジン・ビオチンブロッキングキット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)でブロッキングを室温で１０分間行った。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１％カゼイン溶液（和光純薬工業株式会社）でブロッキングを室温で６０分間行った。【０１１５】
０．１％カゼイン溶液で１２μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＳＥ抗体（Ｅ−１２Ｃ又はＥ−１８Ｈ）を３７℃で６０分間反応させた。この際、陰性対照として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（シグマ）を使用した。【０１１６】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体を室温にて１０分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを室温にて５分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に５分間浸漬した後、５分間ＤＡＢ（同仁化学研究所）で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。【０１１７】
得られた染色像を図４に示す。Ｅ−１２Ｃ抗体及びＥ−１８Ｈ抗体のいずれでも染色が見られた。陰性対照として用いたｍｏｕｓｅ ＩｇＭでは染色は見られなかった。【０１１８】
（３）Ｃ−ＡＢＣ処理した凍結切片の免疫組織染色
Ｃ−ＡＢＣ処理し、ＣＳＥ等のコンドロイチン硫酸が除去された組織の染色性を検討した。【０１１９】
イカ軟骨を小片化し、ティシュー・テックＯ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に組織片を埋め、液体窒素で凍らせて凍結切片を作成した。【０１２０】
作製した切片を、１０％中性緩衝ホルマリン液により室温で１０分間固定後 、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液で２回洗浄し、その後５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液で２５０ｍＵ／ｍｌに希釈したＣ−ＡＢＣで３７℃にて１２０〜１８０分間消化した。Ｃ−ＡＢＣ未処理の対照切片は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液で３７℃にて１２０〜１８０分間浸漬させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．３％過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温にて１０分間行った。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１％カゼイン溶液（和光純薬工業株式会社）でブロッキングを室温にて６０分間行った。【０１２１】
０．１％カゼイン溶液で１２μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＳＥ抗体（Ｅ−１２Ｃ）を３７℃で６０分間反応させた。この際、陰性対照として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ（シグマ）を使用した。【０１２２】
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ抗体（ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス）を室温にて１０分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ヒストファイン  ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて５分間反応させた。０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄後し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液に５分間浸漬した後、５分間ＤＡＢ（同仁化学研究所）で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。【０１２３】
得られた染色像を図５に示す。Ｃ−ＡＢＣ未処理の切片は染色が見られたが、Ｃ−ＡＢＣ処理した切片では、染色性は完全に消失した。なお、Ｅ−１８Ｈ抗体についても同様の結果が得られた。【０１２４】
日本特許出願２０１４−０７２４３１号（出願日：２０１４年３月３１日）及び日本特許出願２０１４−１６２９６８号（出願日；２０１４年８月８日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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