(57)【要約】  ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体への組み込みが生じている潜在型のレトロウイルス感染をも根治を可能とする新規な手段が開示されている。本発明では、ウイルスが感染の足場とする分子を保有する患者体内の細胞を破壊することにより、既にウイルスに感染している細胞そのものを破壊するとともに患者体内でのウイルス感染の拡大を阻止し、最終的な根治を目指す。免疫不全ウイルス感染の治療においては、高い細胞傷害活性を有する抗体等を患者に投与して、患者体内のCD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれか、好ましくはCD4分子保有細胞を破壊すればよい。
2014189138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む、免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤。
【請求項２】
CD4分子を保有する細胞を破壊する物質を有効成分として含む請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記物質が、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体、又は、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体若しくはその抗原結合性断片であって、細胞毒成分が結合された抗体若しくはその抗原結合性断片である、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記物質が、破壊対象の細胞が保有する前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体である、請求項３記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項３又は４記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
前記感染が、急性感染、慢性感染又は潜在型感染である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項８】
対象の体内に存在する、ウイルス感染の足場となる分子を保有する細胞を破壊することを含む、前記対象における前記ウイルスによる感染の治療又は予防方法。
【請求項９】
ウイルスが免疫不全ウイルスであり、対象の体内に存在する、CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊することを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
CD4分子を保有する細胞を破壊することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体、又は、前記分子に対する抗体若しくはその抗原結合性断片であって、細胞毒成分が結合された抗体若しくはその抗原結合性断片を前記生体に投与することにより、当該分子を保有する細胞を破壊することを含む、請求項８ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記分子に対する抗体であって、細胞傷害活性を有する抗体を前記生体に投与することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞傷害活性はADCC活性である、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
前記感染が急性感染、慢性感染又は潜在型感染である請求項８ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス等のウイルスによる感染の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
HIVウイルス感染は後天性免疫不全症候群（いわゆるAIDS）を発症し、経年後に死に至る感染症として恐れられてきた。しかし人々の努力により、ウイルスのライフサイクルの研究の成果として各ステップに対する阻害剤が開発され、特にいくつかのステップを同時に阻害する方法（cART）が導入され、根治はないが、AIDSの発症をコントロールできるまでには至っている。即ち、血中のRNAウイルス検出はできない状況を継続することはできる（非特許文献1,2）。しかし、実はリンパ節、腸内組織中にもウイルスが存在する事が判明している（非特許文献3,4）。ほとんどはウイルスがレトロウイルスであるために、宿主細胞中の染色体に組み込まれた状態で眠っている状態で存在しているがために根治はしないと考えられている。従って、一生涯の薬剤費用が莫大になる事、飲み忘れによる薬剤耐性の発生、更には薬剤の副作用が問題となっており、根治を目指す機運が高まっている（非特許文献5）。【０００３】
ベルリンに居住しているHIV感染患者について紹介すると、多剤処方（ART）を受けていた患者が血液癌（AML）を併発した。最初は抗HIV処方（ART）を中断し、AML治療に集中しAMLは改善されたが、ART中断したためにHIVウイルスが爆発的に増殖したので改めてART多剤処方が行われ、HIV制御もでき落ち着きを取り戻した。しかしながら再度AMLを再発したために、窮余の策としてCCR5不全の人からの骨髄移植という治療を受けた（非特許文献6）。ここで突如CCR5不全という事が出てきたが説明しておく。この分子はHIVウイルスが感染するにあたり利用する受容体分子の一つである。即ちCCR5分子はHIVが感染する際に足場となる分子の一つである。CD4分子が主たる感染の足場で、CCR5が共同して初めて感染が成立する。これまでに遺伝的に感染してもAIDSを発症しない人がいることが判明していたが、彼らはCCR5分子が遺伝的に不全という事が示されている（非特許文献7）。そこで骨髄移植にあたり、CCR5不全の人の骨髄を拝借したのである。それ以来ART・HIV多剤処方を中止しているにも係らず、骨髄移植後4年以上経っても血中にはHIVウイルスが検出できない状況が続いていて、臨床的には寛解状態に至ったとして、「ベルリンの奇跡」とされている。【０００４】
ただし、HIVウイルスによってはCCR5ではなくCXCR4という異なる受容体分子を足場にするHIVウイルスも存在するために、CCR5不全の骨髄移植だけでは問題を残してしまう。CXCR4の人での多型遺伝子状態と発症との関係については情報がほとんどない。しかも実際移植を考える際に、HLAのマッチングというハードルが存在しており、ニュースを聞いて骨髄移植を希望した患者が殺到したが、移植可能な組み合わせは世界レベルでも数例しかないことが判明した。しからばと、HIV感染者でしかもAMLを発症した患者から造血幹細胞を取り出し、遺伝子操作でCCR5分子が発現できないような操作が行われ患者に戻すという治療を受けたという報告がある。いくつかの施設で各数例ではあるが、効果があることが示された。しかしこれも非常に特殊な症例と言わざるを得ない（非特許文献8）。この遺伝子操作法ではCCR5型ウイルスでもCXCR4型ウイルスでも対策はできることになるが、あくまで非常に特殊なケースと考えるべきである。それはHIV感染者がAMLという血液癌を併発してしまった症例であるが故である。一般の感染者に対して、このような遺伝子操作を行う事は自己血採取・CD34細胞分離・遺伝子操作・培養・移入という手技になり、煩雑すぎるし非常に高価な治療法である。他人からのCD34細胞を利用する手法を考えるべきであるが、骨髄移植に伴うGVHDという重篤な副作用発症リスクが高いことを考えるとなかなか踏み切れるものではない。【０００５】
ARTにより血中にはフリーのHIVウイルスは検出できない状況を維持できるのが現状なのに何が問題かを改めて考えると、一生涯の服用による莫大な医療費、飲み忘れによる薬剤耐性化の問題で、処方できる薬剤の制限出現、更には薬剤の副作用による、更なる治療をきたすという問題である。これらは全て潜在型ウイルスがある条件下で活性化することに起因する。そこで潜在型HIVウイルスを無理やり意図的にたたき起こしてRNAウイルス粒子として飛び出させ、そこを多剤処方でたたくという「パージ&ショック療法」が試みられているが、試験管ではうまく行っても体内ではなかなかコントロールができていない（非特許文献9）。またRNAウイルス粒子を産生させても感染している細胞自体を壊すことはできていないことも判明し（非特許文献10）、根治とはかけ離れている実態が明らかになりつつあるのが現状である。【０００６】
感染拡大阻害を目指した治療法はCD4分子をターゲットとしたT-20という薬剤、CCR5をターゲット分子としたマラビロクという薬剤が既に承認を受けて治療に用いられている。しかしマラビロクはウイルスがCCR5を利用するタイプのウイルスであることを確認しないと処方できないが、その検査に一か月を要し、費用もかかるのであまり処方されていない。CXCR4型ウイルス阻害剤については未だ承認された薬剤はない。しかしこれらの薬剤に対する耐性株の出現も既に数多く報告されている。【０００７】
以上述べた通り、これまではHIVウイルス増殖を抑制する薬剤で血中のHIVウイルス量を検出感度以下に保つ治療法が確立されてきたが、ウイルス排除・根治には至っていない。AIDS発症がCD4細胞数の減少とリンクしているとの考え方で、ART処方の目安をCD4数が200個/mlから500個/mlをメドにしたレジメが推奨されている（非特許文献2）。即ち、従来の治療法では、CD4発現細胞はできるだけ温存する対象として捉えている。一生涯薬剤を飲み続けなければAIDS発症を引き起こすという事で、経済的に負担できない患者が多くいる。また薬剤を飲み忘れると直ぐに薬剤耐性になる為に、使用できる薬剤自体が制限されてしまう。或いは処方されている薬剤自体の副作用に悩む患者も多々いる。いずれもHIVからの根治とはなりえていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】A.R. Zolopa,The evolution of HIV treatment guidelines: current state-of-the-art of ART,Antiviral Res2010; 85: 241-244.
【非特許文献２】M.A. Thompson et al., Antiretroviral treatment of adult HIV infection: 2012 recommendations of the International Antiviral Society-USA panel,JAMA 2012; 308: 387-402.
【非特許文献３】M. Zeng et al., Cumulative mechanisms of lymphoid tissue fibrosis and T cell depletion in HIV-1 and SIV infections, J Clin Invest 2011; 121: 998-1008.
【非特許文献４】J. Cohen, HIV/AIDS research. Tissue says blood is misleading, confusing HIV cure efforts,Science 2011; 334: 1614.
【非特許文献５】D. Trono et al., HIV persistence and the prospect of long-term drug-free remissions for HIV-infected individuals,Science 2010; 329: 174-180.
【非特許文献６】NG. Hutter et al., Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation,New Engl J Med 2009; 360: 692-698.
【非特許文献７】M. Dean et al.,Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Hemophilia Growth and Development Study, Multicenter AIDS Cohort Study, Multicenter Hemophilia Cohort Study, San Francisco City Cohort, ALIVE Study,Science 1996; 273: 1856-1862.
【非特許文献８】D.L. DiGiusto et al.,RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma, Sci Transl Med 2010; 2: 36ra43.
【非特許文献９】S.G. Deeks, HIV: Shock and kill, Nature 2012; 487: 439-440.
【非特許文献１０】L. Shan et al., Stimulation of HIV-1-specific cytolytic T lymphocytes facilitates elimination of latent viral reservoir after virus reactivation, Immunity 2012; 36: 491-501.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体への組み込みが生じている潜在型のレトロウイルス感染をも根治を可能とする新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、上述のベルリンの奇跡の症例が、CCR5分子への感染阻害ではなく分子そのものを破壊するという概念を利用していることに注目した。HIV感染ではCD4陽性細胞が感染を受けるので、CD4分子を保有する細胞をターゲットとすれば、感染細胞だけではなく非感染細胞でもCD4分子を保有する細胞を破壊できる。逆の視点でみると、感染の足場となる分子が存在しなければ、生体内において細胞破壊でウイルスが放出されても新たな感染が成立しないことから、ウイルスは死に絶えるしかない。この状況がベルリン患者の経験と理解できる。こうした理解に基づいて鋭意研究した結果、HIVが感染の足場として利用するCD4分子等を保有する細胞をHIV感染患者の体内から一時的に除去することにより、ウイルスが染色体に組み込まれてしまった潜在型感染の患者においても体内でのHIV感染の拡大を阻止し、ウイルス感染を治療可能であることを見出し、本願発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、CD4分子を保有する細胞、CCR5分子を保有する細胞及びCXCR4分子を保有する細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む、免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤を提供する。また、本発明は、対象の体内に存在する、ウイルス感染の足場となる分子を保有する細胞を破壊することを含む、前記対象における前記ウイルスによる感染の治療又は予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、急性感染及び慢性感染のみならず、宿主染色体にウイルスが組み込まれた潜在型レトロウイルス感染症例においても、HIVの根治が期待され、一生涯抗ウイルス薬を飲み続けるという負担から患者を解放することができる。これまでは、ウイルス感染からAIDS発症に至るにはCD4細胞数が減少することが要因として理解されてきたために、誰一人積極的にCD4細胞を破壊しようとの試みはされてこなかった。本発明は、このような従来の理解とは逆の方向性でウイルスの根治を目指すものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト末梢血単核球中のCD4保有細胞に対する抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性をフローサイトメトリー解析により測定した結果である。
【図２】ヒト末梢血単核球中のCD4陽性細胞に対する抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性を市販のアッセイキットで測定した結果である。
【図３】抗CD4ヒト化抗体IT1208を40mg/kg（1週間間隔で4回静脈注射）でサルに投与し、静脈血（blood）、直腸（rectum）及びリンパ節（LN）におけるCD4保有T細胞数を測定した結果である。縦軸はCD4保有細胞の頻度（％）、横軸はIT1208の初回投与からの日数。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、ウイルスが感染の足場とする分子を保有する患者体内の細胞を破壊することにより、既にウイルスに感染している細胞そのものを破壊するとともに患者体内でのウイルス感染の拡大を阻止し、最終的なウイルスの根治を目指す。ウイルスが感染の足場を失えば、新たな感染（急性感染）が成立せず、また既に感染している患者体内でも非感染細胞へのウイルスの侵入が不可能になるため、体内でのウイルス増殖が抑制され、最終的にはウイルスが体内から排除されることになる。この手法によれば、足場分子を保有する細胞を全て破壊するため、ウイルスが感染し染色体に組み込まれた状態になっている潜在型レトロウイルス感染症例であっても、潜在型感染細胞そのものを破壊でき、かつ、細胞外に放出されたウイルスの感染先が失われてウイルスの増殖も防止され、その結果、ウイルス感染の根治が可能になる。従って、本発明は、各種ウイルスの急性感染及び慢性感染のみならず、レトロウイルスの症例に対しても有効である。
【００１５】
ヒト免疫不全ウイルス及びサル免疫不全ウイルス等の免疫不全ウイルスは、CD4分子を主たる感染の足場とし、さらにCCR5分子又はCXCR4分子を利用して細胞に侵入する。従って、患者体内のCD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれかを破壊することにより、免疫不全ウイルスの感染足場を消失させることで、ウイルス感染細胞そのものを破壊できるとともに、非感染細胞へのウイルスの感染を防止することができる。従って、本発明による免疫不全ウイルス感染の治療又は予防剤は、CD4分子保有細胞、CCR5分子保有細胞及びCXCR4分子保有細胞の少なくともいずれかを破壊する物質を有効成分として含む。そのような物質を複数含有していてもよい。患者が有するウイルスがCCR5を利用するタイプであればCCR5分子保有細胞を、CXCR4分子を利用するタイプであればCXCR4分子保有細胞を破壊することによってウイルス感染を治療できるが、ウイルスがCCR5型かCXCR4型かを確認する検査には時間と費用がかかる（もっとも、CCR5分子保有細胞を破壊する物質とCXCR4分子保有細胞を破壊する物質の両者を患者に投与すれば、いずれのタイプの免疫不全ウイルスでも対応可能ではある）。一方、CD4分子はいずれのタイプの免疫不全ウイルスでも足場として利用するため、ウイルスのタイプを調べる必要がない。従って、本発明においては患者体内のCD4分子保有細胞を枯渇させることが好ましく、本発明の治療又は予防剤としては、CD4分子保有細胞を特異的に破壊する物質を含むものが好ましい。
【００１６】
患者体内に存在する特定の分子を保有する細胞を特異的に破壊する手段としては、当該分子に対する抗体（より具体的には、当該分子の細胞外領域を認識する抗体）を好ましく用いることができる。CD4分子保有細胞の破壊には抗CD4抗体を、CCR5分子保有細胞の破壊には抗CCR5抗体を、CXCR4分子保有細胞の破壊には抗CXCR4抗体を用いればよい。抗体にはADCC（抗体依存性細胞傷害）活性、CDC（補体依存性細胞傷害）活性等の細胞傷害活性があることが知られており、本発明ではこうした活性を高めた抗体を細胞破壊の手段として好ましく用いることができる。ADCC活性とCDC活性のいずれを採用しても問題はないが、その細胞傷害活性が強いほど使用量が少量で済むために、患者の身体的負担と副作用リスクを軽減でき、経済的なメリットも高い。そのため、ADCC活性やCDC活性を強力に高めた抗体を利用することが望まれる。
【００１７】
そのような強力な細胞傷害活性を有する抗体は、例えば、公知の手法により作出したモノクローナル抗体又は既に確立されている公知の抗体から、この分野で公知の手法によりその細胞傷害活性を高めることによって作出することができる。あるいは、所望の対象分子を特異的に認識し、かつ強力な細胞傷害活性を有する抗体が公知であれば、そのような抗体を本発明の剤の有効成分として利用してもよい。例えば、WO 2010/074266には、従来の抗CD4抗体よりもADCC活性が高められた抗CD4抗体が開示されている。
【００１８】
モノクローナル抗体には、齧歯動物等の非ヒト由来の抗体の他、キメラ抗体、ヒト化抗体（非ヒト由来抗体のCDR領域をヒト抗体の相当する領域に移植したもの）、ヒト抗体（非ヒト動物又はヒト細胞株を用いて製造される、ヒトの体内で産生されるものと同じ抗体）が包含される。ヒトに投与する場合、ヒトとのキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を好ましく用いることができる。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の作製方法は、この分野で周知の方法として確立している。例えば、抗CD4ヒト抗体は、ヒト抗体を産生できるように遺伝的に改変されたマウス等の非ヒト動物にCD4タンパク質分子を免疫して調製することができる。CD4の遺伝子配列、アミノ酸配列及び立体構造等の情報は、公的データベースに登録されており、例えばNCBIのGenBankにはM12807のアクセッション番号で登録されている。免疫原として用いるCD4タンパク質ないしはその適当な断片は、このような配列情報に基づいて周知の遺伝子工学的手法により容易に調製することができる。
【００１９】
抗体の細胞傷害活性を高める手法は公知であり、いずれの手法を用いてもよい。公知の手法の一例を以下に記載する。
【００２０】
ADCC活性を増強する方法の一つとして、抗体のFc部分に存在している糖鎖に含まれるフコース（コアフコース）を除去するポテリジェント（登録商標）技術が挙げられる（Yamane-Ohnuki N, Satoh M, Production of therapeutic antibodies with controlled fucosylation, MAbs2009; 1: 230-236.）。このコアフコースを付加する酵素はFucT-8（Fut-8）と称される遺伝子にコードされているので、Fut-8をノックアウトした動物細胞内で組換え抗体をコードする遺伝子を発現させることにより、ADCC活性が増強された抗体分子を得ることができる（Yamane-Ohnuki N, et al., Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity, Biotechnol Bioeng 2004; 87: 614-622.）。この手法で得られたCCR4分子を認識する抗体（一般名モガムリズマブ）は、その細胞破壊機能が顕著に優れていることから既に臨床的に有効性が認められ、HTLV-1というウイルスの感染から発症するT細胞白血病の治療に応用すべく、日本国内においてその製造承認が与えられている。（なお、モガムリズマブは、CCR4を発現するT細胞白血病リンパ腫細胞を破壊することによりT細胞白血病を治療するものであり、HTLV-1の感染足場を破壊するのではない）。フコース基質供与を遮ってしまう手法も存在するが、コアフコースに限らず全てのフコースを除去してしまうためコアフコース特異的な手法ではなく、上記したポテリジェント（登録商標）技術がより好ましい。
【００２１】
ADCC活性を増強する他の方法として、抗体のFc部位に存在する糖鎖を変換する方法が挙げられる。当該方法では、アンテナ型分岐糖鎖部のGlcNAcをGnT-III遺伝子操作で導入することによりコアフコース付加を回避する（M. Schuster et al., Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering, Cancer Res 2005; 65: 7934-7941.）。このような手法により作出されたADCC活性が増強された抗体を用いてもよい。
【００２２】
また、CDC活性が増強する方法としては、例えば、アイソタイプIgG1の一部にアイソタイプIgG3の配列を組み合わせてCDC活性を高めるコンプリジェント（登録商標）技術が知られている（Natsume A, In M, Takamura H, et al. Engineered antibodies of IgG1/IgG3 mixed isotype with enhanced cytotoxic activities, Cancer Res. 2008;68:3863-3872.）。
【００２３】
さらに、上記したポテリジェント（登録商標）技術とコンプリジェント（登録商標）技術を組み合わせて抗体のエフェクター活性を強力に高めるアクリタマブ（登録商標）技術も知られている（Natsume A, et al., Improving effector functions of antibodies for cancer treatment: Enhancing ADCC and CDC, Drug Des Devel Ther. 2009; 3: 7-16）。このような手法でADCC活性及びCDC活性の両者を高めた抗体を用いてもよい。
【００２４】
抗体のADCC活性やCDC活性を評価する手法は公知であり、市販のキット類も存在する。抗CD4抗体のADCC活性の評価であれば、例えば下記実施例に記載されるように、ヒト末梢血単核球と抗CD4抗体を混合して37℃で数時間反応させ、フローサイトメトリー解析により反応液中のCD8+細胞に対するCD3+細胞の割合を測定し、得られた測定値をADCC活性を有しない抗CD4抗体を用いた場合の測定値と比較することにより、抗CD4抗体のADCC活性の強さを評価することができる。
【００２５】
あるいは、本発明では、患者体内に存在する特定の分子を保有する細胞を特異的に破壊する手段として、細胞毒成分が結合された、当該分子に対する抗体又はその抗原結合性断片を用いることもできる。細胞毒成分を抗体に結合したものを用いる場合、該抗体は高い細胞傷害活性を有していなくてよく、細胞毒成分によって各分子を保有する細胞が傷害される。対象とする分子との結合性を維持した抗体断片（抗原結合性断片）に細胞毒成分を結合させたものも、本発明の剤の有効成分として使用可能である。
【００２６】
本発明において、細胞毒成分とは、生細胞を破壊する活性を有する物質をいい、生物由来の毒物、化学物質、放射性物質等が包含される。
【００２７】
抗原結合性断片は、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している限り、いかなる抗体断片であってもよい。具体例としては、Fab、F(ab')2、scFv等を挙げることができるが、これらに限定されない。FabやF(ab')2は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。scFv（single chain fragment of variable region、単鎖抗体）の作製方法も周知であり、例えば、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンH鎖及びL鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンH鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、該ベクターで大腸菌を形質転換してscFvを発現させ、これを大腸菌から回収することにより、scFvを得ることができる。
【００２８】
本発明の剤の投与量は、患者体内の対象とする細胞を枯渇できる量であればよい。有効成分の細胞障害活性の強さや患者の年齢、体重等により投与量は変動し得るが、通常、1回の投与量で0.01μg/kg〜200mg/kg程度、例えば10μg/kg〜150mg/kg程度であり得る。投与経路は、経口でも非経口でもよいが、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等の非経口投与が好ましい。注射剤や点滴剤として調製して用いることができる。
【００２９】
本発明の剤の投与は、患者体内のウイルスが検出されなくなるまで数週間〜数箇月ないしはそれ以上の期間継続してよく、例えば上記の投与量で１日〜数日に１回の投与を継続することができる。投与間隔は、有効成分として使用する物質の血中代謝に応じて適宜決定することができる。例えば、抗体を用いる場合、抗体の血中代謝は通常10日〜14日程度であるため、1〜2週間程度の間隔で投与を2回ないしはそれ以上継続することができる。適宜、フローサイトメトリー解析等により患者体内の対象細胞が破壊されていることを確認しながら、処置を行なってよい。細胞枯渇処置は、患者体内にウイルスが検出されなくなるまで行なわれる。患者の血液サンプルや組織サンプルを用いたPCR法による検査（Roche Diagnostics社製HIV RNA検出キット、或いは次の文献記載方法； Palmer S, et al., New Real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma, J. Clin. Microbiol., 2003; 41: 4531-4536.）でウイルスが検出限界以下となる状態が一定期間継続して確認されるまで、細胞を枯渇させた状態を維持してよい。
【００３０】
免疫不全ウイルス感染の治療の場合、枯渇させる対象となる細胞は免疫細胞の一部であるので、患者体内のCD4保有細胞等を枯渇させる処置を行なう期間は、患者を無菌状態で管理するなど患者の健康に留意し対処すべきである。剤の投与を中止し、抗CD4抗体等の有効成分が患者体内で代謝されると、患者体内では自然に造血幹細胞由来のCD4保有細胞が発生する。剤の用量を調節すれば細胞の回復時期を自由にコントロールできる。細胞の回復についても適宜フローサイトメトリー解析等により確認することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３２】
１．ADCC活性を有する抗CD4抗体の作製
WO 2010/074266に記載された方法により、ADCC活性が増強された抗CD4ヒト化抗体IT1208（可変領域としてWO 2010/074266に記載のHV2及びLV0を含む、サブタイプはIgG1）を作製した。Biacore T100を用いて測定された抗体結合活性はKD(nM)＜0.009であり、高い結合活性を有していた。【００３３】
２．抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性の測定(1)
健常人由来PBMC 500μlとanti-CD4 mAb (IT1208、又はコントロール抗体)含有液100μlをバイアル中37℃/4時間/75 rpmという条件で反応させた後、フローサイトメトリー解析により反応液中に残存するCD4保有細胞数を検討した。コントロール抗体として、EP1951303B1に開示されているGenMab社のHuMax-CD4の配列を参考に作製したものを使用した。更なるコントロールとして、市販のanti-CD20抗体（リツキシマブ、全薬工業株式会社）を使用した。活性評価はフローサイトメーターで測定した。FITCで標識した抗CD3抗体を用いてCD3陽性細胞の検出を、またフィコエリスリンで標識した抗CD8抗体を用いてCD8陽性細胞の検出を行なった。CD8陽性細胞数に対するCD3陽性細胞数の割合（％）を算出し、CD4陽性細胞数を調べた（CD3陽性細胞数／CD8陽性細胞数の割合100％がCD4陽性細胞数ゼロを意味する）。【００３４】
その結果を図１に示す。Humax-CD4及びリツキシマブでは、抗体濃度10μg/mLでもそれぞれ204%、及び181%以下にはならなかったにもかかわらず、IT1208は0.01μg/mLで既に153%になっており、1μg/mL以上で111%以下になり、ほぼすべてのCD4陽性細胞が細胞死に至らしめられた。以上の通り、ヒト末梢血由来PBMC中NK細胞とコントロール抗体によるADCC活性比較で、IT1208のADCC活性が100倍近く増強していることが確認された。【００３５】
３．抗CD4ヒト化抗体IT1208のADCC活性の測定(2)
プロメガ社が市販している、ADCC活性測定キットのプロトコールに従い、次の条件でIT1208のADCC活性の測定を実施した。健常人由来PBMC12500個、anti-CD4mAb（IT1208）、およびプロメガキットに含まれているADCC Bioassay Effector cellの75000個を加え穏やかによく混ぜたのち、CO2インキュベーター中で37℃、6時間培養し、発光試薬Bio-Glo reagentを加え、室温で20分培養し、発光プレートリーダーで化学発光を測定した。【００３６】
その結果を図２に示す。IT1208は1nM以上でADCC活性を示し、濃度依存的に増強し50nMで最大値に達している。コントロール抗体として使用したリツキシマブ（antiCD20）は、ADCC活性がみられ始めた濃度が10nM以降で、かつ、最大に達する濃度も1μM以降であった。【００３７】
４．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(1)
HIV感染者でART処方を受けている患者（末梢血中のHIVフリーウイルスコピー数が検出限界以下：< 50 copy/ml）の末梢血球を採取し、サンプルとして用いた。フローサイトメトリー解析（蛍光色素標識抗CD4抗体を用いた直接法、又は上記２と同様の抗CD3抗体及び抗CD8抗体を用いた間接法）によりサンプル中のCD4細胞数を測定後、フィトヘマグルチニンで刺激してHIVウイルスを増加させた。ウイルスコピー数が増加したことをPCRにより確認後、サンプルにanti-CD4 mAb（IT1208、又はコントロール抗体）を添加して60分間反応させ、細胞数及びHIV RNAコピー数を計測した。【００３８】
５．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(2)
HIV感染に用いられるヒト化マウスモデルの中で、最適と考えられるマウスモデル（Rag2-/-γc-/- (RAG-hu)マウス、Traggiai, E. et al., Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice, Science, 2004; 304: 104-107.）を作成し、HIVウイルスを感染させた。更にその状態で従来使用されている抗HIV薬剤（saquinavir(中外製薬), lopinavir/ritonavir(Abbott Laboratories社) , atazanavir(Bristol-Myers-Squibb社)）を投与し、血中からHIVウイルスコピーが検出できない状態まで飼育した。PCRによる従来のHIVウイルス検出法により血中ウイルスコピー数が検出限界以下になった個体にanti-CD4 mAb（IT1208）を投与し、観察した。【００３９】
６．サルにおけるCD4保有細胞の枯渇処理の影響について
上記で調製したIT1208をサルに投与し（100mg/kgを1週間間隔で4回、静脈注射により投与）、サル体内のCD4保有細胞を枯渇させた。当該サルを半年間観察したが、異常は認められなかった。【００４０】
また、IT1208を40mg/kg（1週間間隔で4回静脈注射）でサルに投与し、静脈血、リンパ節及び直腸内のCD4保有T細胞数をフローサイトメトリー解析（蛍光色素標識抗CD4抗体を用いた直接法）により測定した。【００４１】
静脈血サンプルは、サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、鼠径部から採血して得た。  【００４２】
リンパ節サンプルは次の通りに調製した。サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、腋窩をメスで1〜2cm程度切開してリンパ節を50mlチューブに採材した。ハンクス液（HBSS）でリンパ節組織を２回洗浄後、コラゲナーゼ（終濃度1.0mg/ml）及びDNase I（終濃度20μg/ml）を添加したハンクス液（HBSS）中で30分、37℃、150rpmでインキュベートした。70μmのセルストレイナーに通した後、組織をすりつぶし、洗浄、回収してリンパ節サンプルとした。【００４３】
直腸サンプルは次の通りに調製した。サルをケタミン＋キシラジンで麻酔後、解剖台にうつ伏せにして寝かせ、肛門鏡で肛門を開き、生検鉗子で直腸組織を10ピース採材した。直腸組織を50mLチューブに入れ、適切量のMACSbuffer（0.5%BSA−2mMEDTAinPBS(-)）を添加し、10秒間ボルテックスした後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この洗浄処理をbufferが濁らなくなるまで繰り返した。洗浄後の組織をコニカルチューブに移し、25mLのpredigestion solutionを添加し、37℃で30分間、MACSmix（商品名）Tube Rotator(130-090-753)で振盪した。チューブを10秒間ボルテックス後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。適切量のMACS bufferを添加し、10秒間ボルテックス後、茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この洗浄処理をbufferが濁らなくなるまで繰り返した。EDTA/DTTを除去するため、10 mL程度のHBSS(+) with 10 mM HEPES（あるいはRPMI1640）を添加し、10秒間ボルテックスした。これを茶漉しに通して粘膜上皮層（液層）を回収し、腸管を別のチューブに回収した。この処理を繰り返した後、組織と2.5 mLのenzyme mixをgentleMACS C tubeに入れ、gentleMACSTM Dissociatorで軽く分散させた(m_brain_01)。37℃で30分間、MACSmixTM Tube Rotator(130-090-753)を用いて振盪し、gentleMACSTM Dissociatorで完全に分散させた(m_intestine_01)。細胞懸濁液（粘膜固有層由来の細胞）を回収し、適切量のMACS bufferで希釈した後、Pre-Separation Filter(70μm, 130-095-823)に通した。細胞にMACS bufferを添加して洗浄（4℃、300xg、10分間遠心）後、上清を捨てて適切量のMACS bufferに再懸濁し、フローサイトメトリー解析に付す直腸サンプルとした。【００４４】
フローサイトメトリー解析の結果を図３に示す。上記のレジメンでIT1208を投与することにより、静脈血内のCD4保有T細胞は100%枯渇させ、リンパ節のそれは70%以上、および直腸のそれも40%以上欠失させることができた。あと１〜２回程度IT1208を追加投与すればリンパ節のCD4保有T細胞を枯渇できると考えられる。SIVをART治療後、ウイルスが再発するのは主としてリンパ節からという報告がある（Horiike et al., Virology 423 (2012) 107-118）。従って、免疫不全ウイルスの根治には、体内の特にリンパ節に存在するCD4保有細胞を枯渇させることが重要と考えられる。【００４５】
７．ADCC増強型抗CD4抗体IT1208のHIV感染に対する効果(3)
上記６でIT1208を100mg/kgでの投与にてCD4保有細胞を枯渇させたサルにSIVウイルスを接種し、ウイルスの増殖を観察した。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【国際調査報告】
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