(57)【要約】  本発明は、貪食細胞へ効率的に物質を送達するための低コストかつ安全な手段を提供することを目的とし、乳酸菌及び／又はその抽出物を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための担体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌及び／又はその抽出物を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための担体。
【請求項２】
前記乳酸菌がラクトバチルス（Lactobacillus）属に属することを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項３】
前記乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属することを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項４】
前記乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）であることを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項５】
前記乳酸菌が死菌体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
貪食細胞への物質の送達が、貪食細胞のスカベンジャー受容体を介することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の担体。
【請求項７】
前記スカベンジャー受容体がクラスＡのスカベンジャー受容体であることを特徴とする請求項６に記載の担体。
【請求項８】
前記物質が、貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の担体。
【請求項９】
前記貪食細胞が関与する疾患が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項８に記載の担体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の担体と、前記貪食細胞に送達する物質とを含有する組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の担体を用いることを特徴とする貪食細胞への物質の送達方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための薬物担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の貪食細胞は貪食作用による異物、老廃物の除去、又は自然免疫に中心的な役割を果たしているのに加えて、抗原処理機能により、獲得免疫の調節にも重要な役割を果たしていると考えられている。一方で、貪食細胞の活性もしくは機能の亢進が、生体にとって病的な状態をもたらすことがあることも知られている。【０００３】
貪食細胞の活性もしくは機能の亢進に起因した疾患としては、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、虚血性疾患、再狭窄、高血圧、線維性血管障害（糖尿病、全身性エリテマトーデス等）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症等）、脳損傷、脳血管事象（例えば、卒中、発作、神経傷害及び中枢神経系内部での再生等）、造血障害、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、癌（特に成人Ｔ細胞白血病を含む白血病）及び固形癌、自己免疫疾患、感染（例えば、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ等）、線維増殖障害（例えば、乾癬等）、慢性及び急性の炎症疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸症候群等）、糸球体疾患、敗血症、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、骨疾患、変形性線維増殖／炎症応答によって特徴づけられることがある心臓血管及び心臓血管以外の血管の病態、例えば酸素又はグルコース欠乏組織等の病気により損傷された部位への白血球の浸潤により特徴づけられる疾患（例えば、脳卒中及び心筋梗塞等）等が挙げられる。【０００４】
ところで、種々の生体組織中のほとんどの貪食細胞には、異物貪食に寄与するスカベンジャー受容体が広く発現している。このスカベンジャー受容体は、負電荷を帯びた様々な粒子に対して親和性を有し、酸化、アセチル化及び糖化等で変性した変性ＬＤＬ、並びに体内に侵入した細菌及びその構成因子の貪食を媒介することが知られている（非特許文献１〜３）。スカベンジャー受容体の発現量が貪食細胞内の変性ＬＤＬの量に依存して調節されるということがないため、貪食細胞は無制限に変性ＬＤＬを取り込む。そして、前記アテローム性動脈硬化症は、この変性ＬＤＬが過剰蓄積された貪食細胞が血管内膜で泡沫化することに起因する。【０００５】
上記のように、貪食細胞における変性ＬＤＬの過剰蓄積によって、アテローム性動脈硬化が引き起されるため、例えば、抗泡沫化作用を有する化合物（例えば、ｅｓｃｕｌｅｏｇｅｎｉｎ Ａ（非特許文献４）、ＰＰＡＲγアゴニスト（非特許文献５）、アディポネクチン（非特許文献６）等）、又は、貪食細胞内に蓄積した変性ＬＤＬの代謝や分解を担う酵素（非特許文献７）等を、貪食細胞に効率的に送達することで、より効果的にアテローム性動脈硬化の予防及び治療ができると考えられ、今日多くの研究がなされている。【０００６】
例えば、薬物を貪食細胞へ効率的に送達するために、従来、標的指向性リポソームを用いる等の手段が考案されてきた。しかしながら、標的指向性リポソームは、複雑な化学合成や精製プロセスが必要であり、工業化には多くの課題があった。【０００７】
そのため、貪食細胞への物質送達の効率が高く、且つ製造が容易であり、安全性が高く、比較的低コストである担体の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature. 1997 Mar 20; 386(6622):292-6.
【非特許文献２】Cell Microbiol. 2009 Aug; 11(8):1160-9.
【非特許文献３】J Biol Chem. 2011 Feb 11; 286(6):4854-70.
【非特許文献４】Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Nov; 27(11):2400-6.
【非特許文献５】Nat Med. 2001; 7(1):48-52.
【非特許文献６】Atherosclerosis. 2013; 228(1): 124-35.
【非特許文献７】日本乳酸菌学会誌 Vol.14 (2003) No.2 pp.72-79.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、貪食細胞へ効率的に物質（例えば、薬物、薬剤等）を送達するための、低コストかつ安全な担体を提供すること、並びに、貪食細胞へ物質を効率的に送達するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討の結果、驚くべきことに、乳酸菌が貪食細胞に効率的に取り込まれることを見出し、さらに研究を重ね、乳酸菌が貪食細胞のスカベンジャー受容体に対して高い親和性を有することで、貪食細胞による該乳酸菌の取り込み効率が向上するという知見を得て、さらに種々の検討を重ねて本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
（１）乳酸菌及び／又はその抽出物を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための担体。
（２）前記乳酸菌がラクトバチルス（Lactobacillus）属に属することを特徴とする前記（１）に記載の担体。
（３）前記乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属することを特徴とする前記（１）に記載の担体。
（４）前記乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）であることを特徴とする前記（１）に記載の担体。
（５）前記乳酸菌が死菌体であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の薬物担体。
（６）貪食細胞への物質の送達が、貪食細胞のスカベンジャー受容体を介することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の担体。
（７）前記スカベンジャー受容体がクラスＡのスカベンジャー受容体であることを特徴とする前記（６）に記載の担体。
（８）前記物質が、貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の担体。
（９）前記貪食細胞が関与する疾患が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする前記（８）に記載の担体。
（１０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載の担体と、前記貪食細胞に送達する物質とを含有する組成物。
（１１）前記（１）〜（９）のいずれかに記載の担体を用いることを特徴とする貪食細胞への物質の送達方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、所望の種々の物質を貪食細胞へ効率的に送達するための担体を提供することができる。また、例えば前記物質として、貪食細胞が関与する疾患についての薬物を用いれば、貪食細胞が関与する疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症等）の診断、予防又は治療に使用するための有効な担体又は該担体を含む組成物を提供することができる。
また、本発明に用いる乳酸菌は、安全性である点、大量培養及び大量取得が可能である点、遺伝子組み換え技術の適応が比較的容易である点などから、本発明によれば、安全性が高く、貪食細胞への送達効果が高い担体を、安価に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明は、貪食細胞へ物質を送達するための担体に関する。本発明の前記担体は、乳酸菌菌体又はその抽出物を含有する。本発明の好ましい態様において、前記担体が乳酸菌菌体又はその抽出物を含有することで、貪食細胞への物質送達効率が向上する。
【００１５】
本発明の担体に用いる前記乳酸菌は、特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコックス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ビフィズス属の各菌等、公知の乳酸菌を用いることができる。さらに詳しくは、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ファシウム（Enterococcus faecium）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレービ（Bifidobacterium breve）等が挙げられる。これら各種乳酸菌のうち、分子送達効果に優れることから、ラクトバチルス属の乳酸菌が好ましく、中でも、ラクトバチルス・プランタラムが特に好ましい。
【００１６】
前記ラクトバチルス・プランタラムに属する菌の本発明における好ましい代表例としては、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年１１月３０日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７，微工研菌寄第１５３１７号として寄託）、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ １１４９基準株及びびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１株（微工研菌寄第１１９１２号）等が挙げられ、特に好ましくは、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いる前記乳酸菌としては、天然培地、合成培地及び半合成培地等の培地で培養したものいずれであってもよい。本発明において、乳酸菌の培養は、公知方法、自体公知の方法又はそれらに準じる方法に従って行われてよい。
【００１８】
前記培地としては、特に限定されず、例えば、窒素源及び／又は炭素源を含有するものが好ましく用いられる。前記窒素源としては、特に限定されず、例えば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が挙げられる。前記炭素源としては、特に限定されず、例えば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、澱粉、バガス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が挙げられる。これらは１種で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
【００１９】
前記培地は、前記窒素源及び／又は炭素源に加えて、さらに、無機質を添加してもよい。前記無機質としては、特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン又は各種ビタミン類等が挙げられ、これらを１種で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２０】
前記乳酸菌の培養温度及び培養時間は、培養が効率的に実施できれば特に限定されないが、本発明のひとつの態様において、培養温度は、例えば、通常約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃としてもよい、培養時間は、例えば約１２〜４８時間としてもよい。また、本発明のひとつの態様において、乳酸菌の培養は、通気振盪により実施してもよい。また、培地のｐＨは、特に限定されないが、本発明のひとつの態様において、通常約ｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜６としてもよい。
【００２１】
本発明に用いる乳酸菌の菌体は、生菌体であってもよく、死菌体であってもよく、特に限定されないが、安定性及び取扱いの容易性等の観点から、死菌体を用いることが好ましい。
【００２２】
前記乳酸菌の死菌体を調製する方法について、具体的に説明する。
【００２３】
本発明において、前記死菌体の調製方法は、本発明の効果を失しない限り、特に限定されないが、例えば、（Ｉ）培養終了後に乳酸菌の生菌体を培養液から分離した後に、前記生菌体を殺菌処理して死菌体の状態とする方法、（ＩＩ）培養液中で乳酸菌の生菌体を殺菌処理して死菌体の状態とし、その後に前記死菌体を培養液から分離する方法等のいずれの方法によって調製してもよい。
培養液から菌体を分離する方法としては、この分野で通常用いられる種々の方法を採用してもよく、特に限定されない。本発明のひとつの態様において、具体的には、例えば、培養液に蒸留水を加えた後に遠心分離等の手段によって上清を除くことによって、培養液と菌体とを分離する方法等を採用してもよい。なお、この態様においては、培養液に蒸留水を加えて遠心分離を行った後に上清を除去した後、所望により、上清を除去した残留物にさらに蒸留水を加えて遠心分離を行う操作を何度か繰り返してもよい。本発明のひとつの態様において、分離操作として濾過工程を含んでいてもよい。
【００２４】
続いて、乳酸菌の生菌体の殺菌処理方法について具体的に説明する。前記殺菌処理方法としては、特に限定されず、例えば、加熱、紫外線照射、ホルマリン処理等が挙げられる。なお、前記殺菌処理は、採取された生菌体に対して行ってもよく、生菌体を含んだ培養液に対して行ってもよい。
【００２５】
前記加熱処理を行う場合、加熱温度は特に限定されないが、例えば、通常約６０℃〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃としてもよい。加熱手段としては、公知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、ヒーター等の手段であってもよい。加熱時間は、殺菌処理が十分に完了できれば特に限定されないが、例えば、加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分としてもよい。
【００２６】
上記の様にして得られた前記死菌体は、さらに摩砕、破砕又は凍結乾燥処理等を行い、死菌体処理物としてもよい。本発明においては、前記死菌体処理物も死菌体として好適に用いることができる。
【００２７】
また、本発明には、乳酸菌の菌体に替えて又は菌体と共に、乳酸菌菌体の抽出物を用いてもよい。前記抽出物の抽出方法は特に限定されず、公知方法、自体公知方法又はそれらに準ずる方法に従って行ってもよい。具体的には、例えば、乳酸菌の生菌体又は死菌体を、（ｉ）常圧又は加圧下で、室温又は加温した抽出溶媒中に加えて浸漬や撹拌しながら抽出する方法、（ｉｉ）抽出溶媒中で還流しながら抽出する方法等が挙げられる。抽出温度、抽出時間は、使用する抽出溶媒の種類は抽出条件によって適宜選択してよい。
【００２８】
前記抽出溶媒としては、特に限定されず、例えば、水、有機溶媒又はこれらの任意の割合での混合溶媒を用いてもよい。前記有機溶媒としては、特に限定されないが、例えば、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノール及びｎ-ブタノール等）、多価アルコール（例えば、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）等の室温で液体であるアルコール類；エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、プロピルエーテル等）；エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル等）；ケトン類（例えば、アセトン、エチルメチルケトン等）；炭化水素類（例えば、ヘキサン、キシレン、トルエン等）；クロロホルム等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上を組合せて用いてもよい。上記有機溶媒の中でも、操作性や環境に対する影響等の観点から、室温で液体であるアルコール類、例えば、炭素原子数１〜４の低級アルコールを用いるのが好ましく、残留溶媒による安全性の観点からはエタノールを用いるのがより好ましい。
【００２９】
本発明においては、前記抽出操作により得た抽出液及び残渣を含む混合物を所望により濾過又は遠心分離等に供し、残渣である固形成分を除去して得た抽出液をそのまま本発明の前記担体の調製に用いてもよいし、前記抽出液を濃縮、凍結乾燥又はスプレードライ等の方法により、乾燥、粉末化して使用してもよい。
【００３０】
本発明の前記担体は、前記菌体又は前記抽出物を含有することで、貪食細胞に高効率で取り込まれる。そのため、本発明の前記担体は、所望の物質を貪食細胞に効率的に送達させるための担体として、非常に適した担体である。
【００３１】
なお、本発明において、貪食細胞とは、特に限定されないが、好ましくは、マクロファージ、単球、多核白血球及び樹状細胞等を含有する。
【００３２】
本発明の担体により、貪食細胞に送達する物質としては、特に限定されないが、例えば機能性物質等が挙げられる。前記機能性物質としては、貪食細胞に送達されることで何らかの効果を奏する機能を有した物質であることが好ましくは、例えば、原子、分子、化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、ベクター、ウイルス、細胞等が挙げられる。上記「何らかの効果」とは、特に限定されず、好ましい又は有用な効果であってもよく、有害な作用をもたらすような作用であってもよい。前記「有害な作用」は、試験、研究に利用することもでき、また、生体に対して好ましくない作用を及ぼす貪食細胞が存在した場合に、これの機能を抑制又は消滅させることに利用することができる。すなわち、本発明の担体を用いる目的に応じて、前記機能性物質を選択してよい。
【００３３】
本発明のひとつの態様において、前記機能性物質としては、例えば、マクロファージに対して抗泡沫化作用を有する化合物（例えば、ｅｓｃｕｌｅｏｇｅｎｉｎ Ａ、ＰＰＡＲγアゴニスト、アディポネクチン等）；酸化型ＬＤＬの取り込みによってマクロファージ内に蓄積したコレステロールの代謝、分解を担う酵素（例えば、コレステロール酸化酵素ＣｈｏＡ等）；貪食細胞の活性化に寄与する炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１β等）；及び、細胞を検出及び識別するために有用な蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）等が挙げられる。
【００３４】
本発明のひとつの好ましい態様において、前記機能性物質は、貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質である。
【００３５】
前記貪食細胞が関与する疾患としては、特に限定されないが、例えば、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、虚血性疾患、再狭窄、高血圧、線維性血管障害（糖尿病、全身性エリテマトーデス等）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症等）、脳損傷、脳血管事象（例えば、卒中、発作、神経傷害及び中枢神経系内部での再生等）、造血障害、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、癌（特に成人Ｔ細胞白血病を含む白血病）及び固形癌、自己免疫疾患、感染（例えば、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳ等）、線維増殖障害（例えば、乾癬等）、慢性及び急性の炎症疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸症候群等）、糸球体疾患、敗血症、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、骨疾患、変形性線維増殖／炎症応答によって特徴づけられることがある心臓血管及び心臓血管以外の血管の病態、例えば酸素又はグルコース欠乏組織等の病気により損傷された部位への白血球の浸潤により特徴づけられる疾患（例えば、脳卒中及び心筋梗塞等）等が挙げられる。
【００３６】
本発明のひとつの態様において、前記貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質は、例えば、アテローム性動脈硬化の予防改善効果を目的とする場合、ｅｓｃｕｌｅｏｇｅｎｉｎ Ａ、ＰＰＡＲγアゴニスト、アディポネクチン及びＣｈｏＡ等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、前記貪食細胞に送達する物質は、本発明の前記担体に担持させてもよく、また、単に前記貪食細胞に送達する物質と本発明の前記担体を混合して用いてもよい。
【００３８】
前記貪食細胞に送達する物質を本発明の担体に担持させる方法について説明する。
前記担持方法は、本発明の効果を失しない限り、特に限定されないが、例えば、前記貪食細胞に送達する物質を、前記乳酸菌の菌体表面及び／又は菌体内部あるいは前記乳酸菌抽出物に結合させてもよい。前記結合方法としては、特に限定されないが、例えば、共有結合、極性共有結合、イオン結合、静電結合、配位共有結合、芳香族結合、水素結合、双極子又はファンデルワールス相互作用を含む化学結合を採用してもよい。また、遺伝子工学的に、前記菌体表面及び／又は菌体内部に発現、産生させることで、前記貪食細胞に送達する物質を菌体に担持させてもよい。
【００３９】
続いて、前記担持方法をより具体的に説明する。
【００４０】
本発明のひとつの態様において、前記乳酸菌に蛍光標識剤（例えば、ＦＩＴＣ ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ（同仁化学製））を担持させる場合、前記乳酸菌及び前記蛍光標識剤を遮光下で反応させることで、菌体表面に前記蛍光標識剤を担持させることができる。前記反応条件としては、例えば、約３０℃〜４５℃で約１０分〜１２０分としてもよい。
【００４１】
また、本発明の別のひとつの態様において、前記乳酸菌にコレステロール酸化酵素ＣｈｏＡを担持させる場合、前記乳酸菌由来のプラスミドとｃｈｏＡ遺伝子を導入した大腸菌由来プラスミドを任意に融合させて作製したプラスミドｐＷＫ７（例えば、J Biosci Bioeng. 2001; 92(5): 459-65.を参照。）等を、エレクトロポレーション法等で乳酸菌に導入し形質転換することで、前記乳酸菌にコレステロール酸化酵素ＣｈｏＡを担持させてもよい。
遺伝子工学的な技術を応用することで、例えば、アディポネクチン（例えば、Atherosclerosis. 2013; 228(1): 124-35.を参照。）やＩＬ−１β（例えば、Clin Vaccine Immunol. 2010; 17(1): 43-8.を参照。）を、乳酸菌に担持させることができる。
【００４２】
本発明の前記担体は、前記乳酸菌菌体及び／又は抽出物に加えて、乳酸菌以外の成分を含有していてもよい。該成分は、本発明の効果を失しない限り、特に限定されず、例えば、医薬、薬学及び食品等の分野で知られる任意の成分を用いることができる。本発明のひとつの態様において、前記乳酸菌以外の成分は、前記乳酸菌菌体及び／又は抽出物と親和性の高いもの、又は前記乳酸菌菌体及び／又は抽出物と結合し得るもの等であることが好ましい。このような成分としては、例えば、脂質、ステロール、植物油、鉱油、レシチン類等が挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明の前記担体は、ターゲティング剤等の貪食細胞への取り込みを促進する物質を含んでいてもよい。ここで、前記「ターゲティング剤」とは、好ましくは、特定の標的器官又は組織に対して選択性を示す化合物を指す。前記ターゲティング剤としては、通常この分野で用いられる種々の化合物を使用してよく、特に限定されないが、例えば、レチノイド等が挙げられる。
【００４４】
本発明の前記担体中、前記乳酸菌菌体及び／又は抽出物の含有量は、本発明の効果が発揮されれば、特に限定されないが、前記薬物担体１００質量％中、例えば、約１質量％〜１００質量％の範囲であってよい。また、本発明の前記担体に担持させる、又は前記担体と混合させる前記貪食細胞へ送達する物質の量は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されないが、本発明の前記担体１００質量部に対し、例えば、約１０質量部〜３００質量部であってよい。
【００４５】
本発明の別のひとつの態様は、本発明の前記担体及び前記貪食細胞に送達する物質を含有する組成物に関する。前記貪食細胞に送達する物質は、好ましくは、上記した機能性物質である。本態様における該組成物は、特に限定されないが、例えば、医薬品、飲食品、飼料、食品添加剤及び飼料添加剤等であってよく、好ましくは、医薬品等である。
また、本発明の前記担体の医薬製造への使用も本発明に包含される。
【００４６】
本発明の前記医薬品について説明する。
前記医薬品の投与経路は、特に限定されず、例えば、経口または非経口のいずれかの経路で哺乳動物に投与してもよい。
【００４７】
前記医薬品の剤形は、特に限定されず、その投与経路に応じて選択されてよい。剤形としては、例えば、経口剤、非経口剤のいずれの形態であってもよい。
前記経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。非経口剤としては、特に限定されないが、例えば、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤等）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤等）などが挙げられる。
【００４８】
本発明の前記医薬品は、この分野で通常行われている手法により製造してよい。また、前記医薬品は、本発明の前記担体、前記機能性物質の他に、例えば、薬学上許容される担体を含んでもよい。前記薬学上許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。より具体的には、前記薬学上許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられ、これらは１種で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
【００４９】
前記経口剤は、固形剤（例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）であってもよい。前記固形剤は、有効成分を賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、溶解補助剤等と混合し、常法に従って製剤化してよい。前記賦形剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等が挙げられる。前記結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等が挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。前記溶解補助剤としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられる。また、所望により、コーティング剤（例えば、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよく、被覆は２層以上であってもよい。
【００５０】
前記経口剤は、液剤（例えば、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等）であってもよい。前記液剤は、有効成分を一般的に用いられる希釈剤（例えば、精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解し、懸濁または乳化して製剤化してよい。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００５１】
本発明の医薬品が非経口剤である場合の前記注射剤は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。前記注射剤は、例えば、有効成分を溶剤に溶解、懸濁または乳化することで製剤化してよい。前記溶剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組合せて用いてもよい。さらに前記注射剤は、安定剤、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。前記注射剤は、さらに、最終工程において、滅菌又は無菌操作が含まれていてもよい。
また、無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶剤に溶解して使用してもよい。
【００５２】
本発明の前記医薬品の投与量は、特に限定されず、その目的によって適宜選択してよい。投与量は、疾患の種類、程度；投与経路；投与対象；投与対象の年齢、性別、状態等；あるいは本発明の前記担体に担持又は前記担体と混合させる前記機能性物質の種類、その他の条件に応じて設定してよい。
【００５３】
本発明の前記医薬品の投与対象としては、特に限定されないが、任意の動物、例えば哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ等）等が挙げられる。
【００５４】
続いて、本発明の前記飲食品について説明する。
本発明の前記飲食品は、一般的に飲食品に用いられる食品添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色料、漂白料、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等の一種以上が添加されてもよい。なお、本発明の前記飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、乳児用食品、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品が含まれる。
【００５５】
本発明の前記飲食品の形態は、特に限定されない。具体的には、例えば、いわゆる栄養補助食品（サプリメント）としての錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。これ以外には、例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。
【００５６】
本発明の前記飲食品の摂取量は、特に限定されず、飲食品の形態；飲食品を摂取する対象の年齢、性別、状態等；あるいは本発明の前記担体に担持又は前記担体と混合させる前記機能性物質の種類、その他の条件に応じて設定してよい。
【００５７】
次に、本発明の前記担体の貪食細胞へ物質を送達する経路について説明する。
本発明の前記担体の貪食細胞への物質の送達は、スカベンジャー受容体を介することが好ましい。該スカベンジャー受容体は、特に限定されないが、クラスＡのスカベンジャー受容体であることが好ましい。該クラスＡのスカベンジャー受容体としては、ＡＩ及びＡＩＩ（モノクローナル抗体Clone2F8によって認識されるCD204抗原受容体）等が挙げられる。
【００５８】
本発明は、また、本発明の前記担体を用いて、貪食細胞へ物質を送達する方法も含有する。貪食細胞へ送達する物質は、上記の通りであってよく、また送達は、前記スカベンジャー受容体を介するものであってよい。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形を行うことができる。【００６０】
（実施例１）
ＭＲＳ（de Man, Rogosa, Sharpe）液体培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−０８６０７）株を播種し、３２℃で２４時間培養した。培養後、培養液を４２００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、４２００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した後、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体に生理食塩水によく分散させ、上記条件にて遠心分離をする操作を３回繰り返した。その後、得られた菌体をイオン交換水に分散し、８０℃で２０分間加熱した。４２００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して沈殿を凍結乾燥することにより、加熱死菌体を得た（実施例品１）。【００６１】
（実施例２）
前記ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株の代わりにラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株を用いた以外は、実施例１と同様にして、加熱死菌体を得た（実施例品２）。【００６２】
（試料の調製）
実施例品１及び２を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）１ｍＬに５ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁した。菌体懸濁液に終濃度が５μｇ／ｍＬになるようにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ（同仁化学）を添加し、３７℃で６０分間、遮光下で反応させて、菌体をＦＩＴＣで標識した。ＦＩＴＣで標識した菌体を１９０００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、沈殿を１ｍＬのリン酸緩衝液に懸濁後、上記と同条件で遠心分離した。リン酸緩衝液への懸濁と遠心分離の操作を３回繰り返した後、遠心分離で得られた残留物を１ｍＬのリン酸緩衝液に懸濁し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で５００倍希釈した。【００６３】
（貪食細胞の調製）
貪食細胞は、マウス脾臓由来のものを用いた。
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌性、６〜１２週齢）から脾臓を摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で押しつぶした。０．０１７Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７．６５）に最終濃度０．７５％となるように塩化アンモニウムを加えて作製した溶液で、得られた細胞集団を４℃、５分間処理して赤血球を破壊後、＃２００メッシュに通して、脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液中の細胞数は自動血球計測装置（ＣＤＡ−５００、シスメックス社製）を用いて測定した。脾臓細胞の濃度が１×１０７（細胞数）／ｍＬとなるように、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に上記の脾臓細胞浮遊液を懸濁後、２４穴培養プレートに１ｍＬずつ添加し、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、９０分間培養した。その後、培養液をピペッティングし、非接着細胞を含む培養液を丁寧に除去して、貪食細胞を多く含む接着細胞集団を得た。培養液を除去後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を５００μＬ添加した。【００６４】
（試験例１）
上記（貪食細胞の調製）で得た貪食細胞を多く含む接着細胞集団５００μＬに、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製された実施例品１及び実施例品２のＦＩＴＣ標識菌体（試料１及び２）、あるいは、菌体を含まず１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地のみで調製された対照試料（試料３）５００μＬを、貪食細胞を多く含む接着細胞集団５００μＬに添加した。上記試料１〜３を５％炭酸ガス培養器内で３７℃、４時間あるいは２４時間培養し、その後、貪食細胞を回収した。回収した貪食細胞中のＦＩＴＣ標識菌体を取り込んだ貪食細胞の割合を、フローサイトメーター（ベックマンコールター）を用いて検出し、貪食細胞が菌を取り込んだ割合を算出した。結果を表１に示す。【００６５】
【表１】
2014199448.tif 000002
【００６６】
（試験例２）
上記（貪食細胞の調製）で得た貪食細胞を多く含む接着細胞集団５００μＬに、Ａタイプのスカベンジャー受容体に対するモノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ（ｃｌｏｎｅ ＲＴＫ４５３０、以下、抗スカベンジャーＡ抗体という。）を４μｇ添加した（試料４）。また、抗スカベンジャーＡ抗体に替えてアイソタイプコントロール抗体４μｇを添加した試料も調製した（試料５）。５％炭酸ガス培養器内で３７℃、１時間培養後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製された実施例品１のＦＩＴＣ標識菌体５００μＬを添加し、４時間あるいは２４時間培養した。４時間後、あるいは２４時間後に貪食細胞を回収し、回収した貪食細胞中のＦＩＴＣ標識菌体を取り込んだ貪食細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて検出し、貪食細胞が菌を取り込んだ割合を算出した。結果を表２に示す。【００６７】
【表２】
2014199448.tif 000003
【００６８】
試験例１の結果から、本発明の担体に用いる乳酸菌菌体（Ｌ−１３７株及びＪＣＭ１１４９株）は、効率よく貪食細胞に取り込まれることが示された。
また、試験例２の結果から、スカベンジャーＡ受容体を不活性化させた貪食細胞（試料４を添加した細胞）においては、乳酸菌菌体の取り込み率が顕著に低くなることが分かる。すなわち、本発明の担体は、主に貪食細胞のスカベンジャー受容体を介して取り込まれることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、所望の種々の物質を貪食細胞へ効率的に送達することができ、例えば機能性物質として、貪食細胞が関与する疾患についての薬物を用いることで、貪食細胞が関与する疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症等）の診断、予防又は治療に使用するための有効な担体又は該担体を含む組成物を提供することができる。さらに、本発明には、安全性である点、大量培養及び大量取得が可能である点、遺伝子組み換え技術の適応が比較的容易である点等から、食品及び医薬品の分野で広く利用されてきていた乳酸菌及び／又はその抽出物を用いるため、本発明によれば、安全性が高く、貪食細胞への送達効果が高い担体を、安価に製造することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月5日(2016.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である乳酸菌及び／又はその抽出物を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための担体。
【請求項２】
前記乳酸菌が死菌体であることを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項３】
貪食細胞への物質の送達が、貪食細胞のスカベンジャー受容体を介することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の担体。
【請求項４】
前記スカベンジャー受容体がクラスＡのスカベンジャー受容体であることを特徴とする請求項３に記載の担体。
【請求項５】
前記物質が、貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の担体。
【請求項６】
前記貪食細胞が関与する疾患が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項５に記載の担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の担体と、前記貪食細胞に送達する物質とを含有する組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の担体を用いることを特徴とする、生体外における貪食細胞への物質の送達方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月8日(2016.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である乳酸菌及び／又はその抽出物を含有することを特徴とする、貪食細胞へ物質を送達するための担体。
【請求項２】
前記乳酸菌が死菌体であることを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項３】
貪食細胞への物質の送達が、貪食細胞のスカベンジャー受容体を介することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の担体。
【請求項４】
前記スカベンジャー受容体がクラスＡのスカベンジャー受容体であることを特徴とする請求項３に記載の担体。
【請求項５】
前記物質が、貪食細胞が関与する疾患の診断、予防及び／又は治療に用いる物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の担体。
【請求項６】
前記貪食細胞が関与する疾患が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項５に記載の担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の担体と、前記貪食細胞に送達する物質とを含有する、貪食細胞へ物質を送達するための組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の担体を用いることを特徴とする、生体外における貪食細胞への物質の送達方法。
【国際調査報告】
2014199448.tif 000004
2014199448.tif 000005
2014199448.tif 000006
2014199448.tif 000007
2014199448.tif 000008
2014199448.tif 000009
2014199448.tif 000010