(57)【要約】  インフルエンザウイルス作出に好適に使用し得るＭＤＣＫ細胞に関する。特に、他種細胞と共培養することなく、インフルエンザウイルス作出効率に優れたインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞に関する。さらに、当該ＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とするインフルエンザウイルスの作出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＣＫ細胞ではない他の細胞と共培養することなく、インフルエンザウイルスを作出可能な細胞である、インフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。
【請求項２】
インフルエンザウイルスの作出効率が２０％以上の性質を有することを特徴とする、請求項１に記載のインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。
【請求項３】
シングルクローン化された、請求項１又は２に記載のインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。
【請求項４】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１４及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１５で特定される、ＭＤＣＫ細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とする、インフルエンザウイルス作出方法。
【請求項６】
インフルエンザウイルスの作出方法が、リバースジェネティクス法である、請求項５に記載のインフルエンザウイルス作出方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、請求項５又は６に記載のインフルエンザウイルス作出方法：１）インフルエンザウイルスＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルス構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドが導入された、請求項１〜４のいずれかに記載のＭＤＣＫ細胞を、ＭＤＣＫ細胞ではない他の細胞と共培養することなく培養し、インフルエンザウイルスを作出する工程。２）作出したインフルエンザウイルスを単離する工程。
【請求項８】
エレクトロポレーション法を用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルス構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項５〜７のいずれかに記載のインフルエンザウイルス作出方法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のインフルエンザウイルス作出方法により作出されたインフルエンザウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、インフルエンザウイルス作出に好適に使用し得るＭＤＣＫ細胞に関する。特に、ＭＤＣＫ細胞ではない他の細胞と共培養することなく、インフルエンザウイルスを作出し得るＭＤＣＫ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】  インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、脂質二重膜構造をもつエンベロープを有する。Ａ型、Ｂ型及びＣ型の３属に分類され、各々インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルスという。一般にインフルエンザウイルスは、特にＡ型又はＢ型をいう場合が多い。Ａ型、Ｂ型及びＣ型の違いは、ウイルス粒子を構成するタンパク質のうち、Ｍ１タンパクとＮＰタンパクの抗原性の違いに基づく。また、同じＡ型やＢ型であっても、エンベロープの表面上の分子である赤血球凝集素（ヘマグルチニン、以下、単に「ＨＡ」ともいう。）やノイラミニダーゼ（以下、単に「ＮＡ」ともいう）の抗原性の違いから、それぞれ複数の亜型と株に分類される。【０００３】  インフルエンザウイルスは、いわゆる表面タンパク質であるＮＡタンパク及びＨＡタンパクが突起物として存在している。インフルエンザウイルスは抗原変化を高い確率で受け、新型のインフルエンザウイルス株を生み出す。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらのＨＡ分子及びＮＡ分子の抗原性に基づいて亜型（すなわち１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型）に分類される。ヒトＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも３種のＨＡ（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）亜型は特に重要な病原体である。Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１亜型及びＨ３Ｎ２亜型は季節的に広まり、ヒト感染を引き起こしている。２００３年には、致死性が高いトリ由来のインフルエンザウイルスＨ５亜型がヒト病原体として発生した。２００９年４月には、新型のインフルエンザウイルスとしてＨ１Ｎ１亜型ウイルスが発生し、ヒト集団において急速に蔓延している。インフルエンザウイルスの大流行は稀ではあるが、インフルエンザは毎年世界中で流行する感染症であり、インフルエンザワクチンの量的な確保が求められている。【０００４】  インフルエンザワクチンの製造には、発育鶏卵を利用してインフルエンザウイルスを増殖させる方法が用いられている。発育鶏卵を利用した製造方法は原料調達や品質管理に懸念があるため、培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させて製造する方法が実用化されつつある。インフルエンザウイルスの増殖時に鶏卵又は培養細胞を利用する場合、インフルエンザウイルスの亜型や株によっては宿主におけるウイルスの増殖性が低下することが問題となっている。そこで、遺伝子組換え技術によって、宿主における増殖性が向上したインフルエンザウイルスを作出する試みがなされている。近年、インフルエンザウイルスを動物細胞培養系で作出する方法が確立されている。例えば、ヘルパーウイルスを動物細胞に感染させて、ウイルス粒子を作出することが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。【０００５】  またインフルエンザウイルスの作出について、ヘルパーウイルスを必要としない動物細胞培養系も確立されている。インフルエンザウイルスに係る遺伝子を、遺伝子組換え法で組み込んだ動物細胞を用いて、インフルエンザウイルスを作出する方法も開発されており、この場合にはリバースジェネティクスの手法によりインフルエンザウイルスを作出することが報告されている（非特許文献３）。インフ���エンザウイルスのゲノムは８本のＲＮＡ分節からなる。リバースジェネティクス法によりインフルエンザウイルスを作出するために種々のプラスミド設計が検討されているが、その一つとして、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を供給するための８種類のプラスミド（ＰｏｌＩプラスミド）と、ウイルス粒子を形成するために必要な構造タンパク質をコードする４種類の発現プラスミド（ＰｏｌＩＩプラスミド）の合計１２種類のプラスミドを同時に細胞に導入する手法が挙げられる。しかしながら、リバースジェネティクス法は、複数のプラスミドを同時に細胞に導入するため、宿主細胞にとって負担が大きい。【０００６】  マディン−ダービーイヌ腎臓由来細胞（以下、「ＭＤＣＫ細胞」という。）は伝統的にインフルエンザウイルスの増殖に用いられている。ＭＤＣＫ細胞は１９５８年に正常な雄のコッカースパニエルの腎臓から樹立された細胞であり、インフルエンザウイルスに対する感受性は、１９６８年にＧａｕｓｈらによって明らかにされた。ＭＤＣＫ細胞の培養液にトリプシン、グルコース、ビタミンなどを添加することにより、ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルスに対する感受性を高めることができ、各種インフルエンザウイルスの分離に利用されてきた。ＭＤＣＫ細胞を用いてインフルエンザウイルスを増殖させる方法は多く報告されている（特許文献１〜３等）。しかしながら、ＭＤＣＫ細胞はインフルエンザウイルスに対する感受性は高いものの、遺伝子組換え等により人工的にインフルエンザウイルス作出する際の作出効率が低いという問題がある。【０００７】  性質の異なる２種類以上の細胞を共に培養することは共培養と呼ばれており、各々の細胞の性質の相乗効果が期待されるため、種々の目的で利用されている（非特許文献４）。共培養は、遺伝子組換え法によりインフルエンザウイルスを作出する目的でも利用されている。ＭＤＣＫ細胞を用いて遺伝子組換え技術によりインフルエンザウイルスを作出する場合には、ＭＤＣＫ細胞と、ＭＤＣＫ細胞以外の遺伝子導入に適した他種の細胞（以下、「他種細胞」という）を共培養することが多い。他種細胞としては、例えばヒト胎児由来腎臓上皮由来２９３Ｔ細胞（以下、「２９３Ｔ細胞」という。）やアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞（以下、「ＣＯＳ−７細胞」という）などを利用することが多い（非特許文献５）。特に、遺伝子導入効率の高いエレクトロポレーション（電気穿孔）法を用いた場合、細胞へ与える負担が大きく、他種細胞と共培養せずにＭＤＣＫ細胞のみを用いてインフルエンザウイルスを効果的に作出することは困難である。【０００８】  優れた安全性を有するワクチンを提供するために、製造における外来性ウイルスの混入リスクを低減する試みがなされている。細胞株由来のバイオテクノロジー応用医薬品のウイルス感染を防ぐためのアプローチ法が「ヒトまたは動物細胞株を用いて製造されるバイオテクノロジー応用医薬品のウイルス安全性評価について」（医薬審第３２９号、平成１２年２月２２日）に開示されている。ワクチン製造工程における外来性ウイルスの混入を防ぐために、感染性ウイルスの不活化や否定試験等が実施されており、原材料の選択についても有用な手段とされている。し���しながら、遺伝子組換え法によりインフルエンザウイルスを作出するためには、宿主細胞を他種細胞と共培養する必要性があり、原材料が多様化することから外来性ウイルス混入のリスクが懸念されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／１２４３２７
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／１３３９６４
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８／１０５９３１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５９，１１０７−１１１３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２２，１９８９
【非特許文献２】Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ４：１，９−１４；Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１３
【非特許文献３】Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．１０２，ｐ．１６８２５−１６８２９（１９９９）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１，Ｍａｙ  １，２００７，１８８−１９９
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  本発明は、インフルエンザウイルスを安全かつ効率的に作出することを課題とする。より詳しくは、他種細胞と共培養することなく、ＭＤＣＫ細胞のみでインフルエンザウイルスを作出すること及び当該ＭＤＣＫ細胞を提供することを課題とする。また、遺伝子組換え技術を用いてインフルエンザウイルスを作出可能なインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞を提供することを課題とする。さらには、当該ＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とするインフルエンザウイルスの作出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、安全かつ効率的にインフルエンザウイルスを作出するために、他種細胞と共培養することなくインフルエンザウイルスを作出可能なＭＤＣＫ細胞を利用し得ることを見出した。さらに、既存のＭＤＣＫ細胞株を限界希釈培養し、シングルセルクローニングを行い、適切なクローン細胞を選択した結果、他種細胞と共培養することなくインフルエンザウイルスを作出可能なＭＤＣＫ細胞を得ることができ、本発明を完成した。【００１３】  本発明は、すなわち以下よりなる。１．ＭＤＣＫ細胞ではない他の細胞と共培養することなく、インフルエンザウイルスを作出可能な細胞である、インフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。２．インフルエンザウイルスの作出効率が２０％以上の性質を有することを特徴とする、前項１に記載のインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。３．シングルクローン化された、前項１又は２に記載のインフルエンザウイルス作出用ＭＤＣＫ細胞。４．受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１４及び／又は受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１５で特定される、ＭＤＣＫ細胞。５．前項１〜４のいずれかに記載のＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とする、インフルエンザウイルス作出方法。６．インフルエンザウイルスの作出方法が、リバースジェネティクス法である、前項５に記載のインフルエンザウイルス作出方法。７．以下の工程を含む、前項５又は６に記載のインフルエンザウイルス作出方法：１）インフルエンザウイルスＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルス構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドが導入された、前項１〜４のいずれかに記載のＭＤＣＫ細胞を、ＭＤＣＫ細胞ではない他の細胞と共培養することなく培養し、インフルエンザウイルスを作出する工程。２）作出したインフルエンザウイルスを単離する工程。８．エレクトロポレーション法を用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルス構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドを導入することを含む、前項５〜７のいずれかに記載のインフルエンザウイルス作出方法。９．前項５〜８のいずれかに記載のインフルエンザウイルス作出方法により作出されたインフルエンザウイルス。
【発明の効果】
【００１４】  本発明の細胞を用いることで、他種細胞と共培養することなく、インフルエンザウイルスを作出することができる。本発明の細胞は、ウイルス感受性のみならず、遺伝子組換え技術を用いた組換えインフルエンザウイルスの作出に適した性質も有する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】  宿主細胞からインフルエンザウイルスを作出するために、プラスミドから人工的にインフルエンザウイルスを作り出す系、即ちリバースジェネティクス法による方法が行われている。リバースジェネティクス法によるインフルエンザウイルスの作出方法は、非特許文献３に開示されている。
【００１６】  インフルエンザウイルスは、脂質二重膜構造のエンベロープを有する。エンベロープの内層は主としてマトリックスタンパク質及びＲＮＡとタンパク質の複合体であるＲＮＰから成る。外層にはいわゆる表面タンパク質であるインフルエンザＮＡタンパク及びインフルエンザＨＡタンパクが突起物として存在する。インフルエンザウイルスのゲノムは、８本のＲＮＡ分節を有する。リバースジェネティクス法によりインフルエンザウイルスを作出するために種々のプラスミド設計が検討されているが、その一つとして、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を供給するための８種類のプラスミド（ＰｏｌＩプラスミド）と、ウイルス粒子を形成するのに必要な構造タンパク質をコードする４種類の発現プラスミド（ＰｏｌＩＩプラスミド）の合計１２種類のプラスミドを同時に細胞に導入することによって、インフルエンザウイルスを作出することができる。
【００１７】  リバースジェネティクス法により、例えばＨＡ遺伝子を弱毒性に変異させたインフルエンザウイルス等、所望の組換えインフルエンザウイルスを設計し、作出することが可能である。しかしながら、上述のごとく合計１２種類のプラスミドを同時に細胞に導入することは、宿主細胞にとって負担が大きく、特に遺伝子導入効率のよいエレクトロポレーション法でも、宿主細胞へ与える負担が大きい。そこで従来では、宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞と共に他種細胞を利用して組換えインフルエンザウイルスを作出することが多い。一方、他種細胞を用いることにより原材料が多様化し、外来性ウイルス混入の危険性がある。例えば他種細胞としてヒト由来細胞を利用した場合、ヒト細胞に感染し得る外来性ウイルス混入の危険性がある。
【００１８】  上記に鑑み、本願発明者らは外来性ウイルス混入の危険性を排除するために、ＭＤＣＫ細胞を他種細胞と共培養することなくインフルエンザウイルスを作出可能な細胞を見出した。本発明ではＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来）を基にして、限界希釈法によりシングルセルクローニングを行った後、細胞増殖性が優れ、インフルエンザウイルス感受性を示し、形態が均一な細胞株を２株選出した。培地はＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い、クローニングは次の方法により行った。９６ウェルプレートの各ウェルに５細胞／ｍＬの細胞密度で１００μＬずつ細胞を播種し、１個の細胞のみが播種されたウェルに目印を付けて培養を行った。目印を付けたウェルの細胞がコンフルエントになったらトリプシンで剥離し、２４ウェルプレートへ継代した。同様にして６ウェルプレート、７５ｃｍ２フラスコと継代を重ね、十分な細胞量が得られた時点で細胞の保存を行い、クローン細胞株の性質を評価した。
【００１９】  上記によりクローニングして得られた細胞は、ＭＤＣＫ細胞である。さらに具体的には、国際寄託の受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１４及びＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１５で特定されるＭＤＣＫ細胞である。これらの細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）にて、平成２７年３月４日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０１４及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２０１５として国内受託された後、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにて、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求されたものであり、それぞれ受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１４及びＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１５により受領されたものである。
【００２０】  本発明のクローニングして得られた細胞を用いることで、インフルエンザウイルスを作出することができる。インフルエンザウイルスの作出とは、人工的にインフルエンザウイルスのウイルス粒子を構築して作製することを意味する。また作製されたインフルエンザウイルスは、感染性を有するものである。インフルエンザウイルスは、例えば非特許文献３に開示する方法を利用して作出することができる。また、後述する実施例に記載の方法により作出することもできる。本発明は、上記細胞を用いることを特徴とするインフルエンザウイルス作出方法、及び当該作出方法により得られたインフルエンザウイルスにも及ぶ。
【００２１】  本明細書において、インフルエンザウイルスの作出のしやすさを、作出効率で示す。作出効率とは、細胞に遺伝子を導入した後、インフルエンザウイルスが作出される割合を示したものである。作出効率は、細胞に遺伝子を導入する実験を行った回数に対する、インフルエンザウイルスの作出が確認された回数の割合を示す。細胞に遺伝子を導入する実験は、後述する実施例１の「１．インフルエンザウイルスの作出」に記載の条件により行うことできる。実験におけるインフルエンザウイルスの作出の確認は、実施例１の「２．インフルエンザウイルスの作出確認」に記載の方法で行うことができる。実施例１ではマルチウェルプレートが用いられており、ウェルの個数が実験の回数に該当することから、ウェルの個数を用いて作出効率を算出することができる。本発明のＭＤＣＫ細胞は、他種細胞と共培養をせずにインフルエンザウイルスを作出した場合の作出効率が、０％より大きい値であることが好ましい。より好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３３％以上、より好ましくは５０％以上である。
【００２２】  作出されたインフルエンザウイルスは、例えばインフルエンザワクチン製造の際のシードウイルスとなり得る。インフルエンザウイルスは毎年世界中に流行をもたらすため、流行前に必要量のインフルエンザワクチンを供給できる体制が要求される。迅速な大量生産が要求される中、シードウイルスを早期かつ安全に調製することは重要である。ウイルスを作出する際には、マルチウェルプレートが多く利用される。マルチウェルプレートの種類として、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル等が存在するが、ウイルス作出用としては６ウェル〜９６ウェルが用いられることが多い。早期かつ安全なシードウイルスの調製のためには、他種細胞と共培養することなくＭＤＣＫ細胞のみで、１枚のマルチウェルプレートを用いた操作でウイルスが作出されることが望ましい。
【００２３】  本発明において作出可能なインフルエンザウイルスは、現在知られているすべての亜型、及び将来単離、同定される亜型をも含む。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、それらのＨＡ分子及びＮＡ分子の抗原性に基づいて亜型（すなわち１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）亜型及び９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型）に分類され、ＨＡの亜型とＮＡの亜型との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。Ｂ型インフルエンザウイルスの場合、ビクトリア系統と山形系統との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。
【００２４】  Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型は、ＲＮＡゲノムの変異性が高いため、新しい株が頻繁に生じている。２００９年４月にメキシコでの流行が認知された後、世界的に流行したとされるインフルエンザは、新型インフルエンザ、ブタインフルエンザ、パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ｓｗｉｎｅ  ｆｌｕ、Ａ／Ｈ１Ｎ１  ｐｄｍなどと呼ばれている。ブタの間で流行していたウイルスが、農場などでブタからヒトに直接感染し、その後ヒトの間で広まったとされる新型インフルエンザは、従前より存在していた季節性のＡソ連型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ１Ｎ１亜型）や、Ａ香港型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ３Ｎ２亜型）とは、区別される。またＲＮＡゲノムの変異性が高いことから、インフルエンザＡ型ウイルスの同じ亜型の中でも、単離された時期や場所によって、ウイルス株が区別されている。
【００２５】  Ｂ型インフルエンザウイルスは、非可逆的な抗原変異が続いているが、Ａ型インフルエンザウイルスにおける変異よりも比較的遅く、流行の周期は２年程度である。Ｂ型インフルエンザウイルスは１９４０年ニューヨークにおける中程度の規模のインフルエンザ流行中初めて分離されて以来、たびたび流行を繰り返し、それによる死亡率の上昇も記録されている。ヒトの間でのみ感染が確認されているが、亜型は存在せず、山形系統とビクトリア系統という２つの系統のみが存在する。
【００２６】  本発明において作出可能なインフルエンザウイルスは、上記に示したインフルエンザウイルスの他、インフルエンザワクチンに適用可能なように、弱毒化、鶏卵増殖適合化、細胞培養増殖適合化、温度感受性表現形質化、粘膜投与適合化等の改変を加えたものであってもよい。また、改変を加えるための手段として、インフルエンザウイルスの抗原部位やポリメラーゼ部位等の８本のＲＮＡ分節に変異を導入する方法やリバースジェネティクス法により増殖力の高い株のＲＮＡ分節と目的の抗原性を示すＲＮＡ分節を組み換える方法、低温継代によって弱毒ウイルスを作成する方法、ウイルス培養系への変異誘発剤を添加することによる方法等の様々な方法が挙げられる。
【００２７】  本発明におけるインフルエンザウイルス作出方法は、好ましくは、１）インフルエンザウイルスのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を発現し得るポリヌクレオチド及びインフルエンザウイルスの構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドが導入されたインフルエンザウイルス作出用細胞を培養してインフルエンザウイルスを作出する工程、及び、２）インフルエンザウイルス作出用細胞にて作出したインフルエンザウイルスを単離する工程を含む。ポリヌクレオチドは好ましくはＤＮＡである。またポリヌクレオチドは遺伝子と称することもできる。
【００２８】  インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ及び構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドは、インフルエンザウイルスの同じ亜型から由来するものであってもよいし、２種以上の異なる亜型から由来するものであってもよい。また各ポリヌクレオチドには、任意の変異が導入されていてもよい。インフルエンザウイルス作出用細胞には、ｖＲＮＡを発現し得るポリヌクレオチド及び構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドが導入されていればよい。導入されるポリヌクレオチドは、プロモーター等と連結されていてもよい。また２種以上のポリヌクレオチドが導入される場合は、各々別個の発現ベクターに含まれても一つの発現ベクターに含まれてもよい。発現ベクターは特に限定されないが、プラスミドであることが好ましい。例えば、リバースジェネティクス法によりインフルエンザウイルスを作出する場合の一例として、ｖＲＮＡ（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳ分節の８本のＲＮＡ分節）を供給するための発現ベクター、構造タンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）を供給するための発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法が挙げられる。ＨＡおよびＮＡのＲＮＡ分節を供給するためのポリヌクレオチドを抗原遺伝子、それ以外のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳ分節の６本のＲＮＡ分節を供給するためのポリヌクレオチドをバックボーン遺伝子と称する（非特許文献３）。抗原遺伝子とバックボーン遺伝子とは、異なる亜型のインフルエンザウイルス由来のものを用いることもできるし、同じ亜型でも異なるインフルエンザウイルス株から由来したものを用いることもできる。
【００２９】  インフルエンザウイルス作出用細胞を培養する工程においては、他種細胞の不存在下で培養を行うことができる。他種細胞としては、２９３Ｔ細胞等のヒト由来細胞や、ＣＯＳ−７細胞等のサル由来細胞等が例示される。インフルエンザウイルス作出用細胞を培養する際の、培地、温度、湿度、培養時間等の培養条件は、公知のＭＤＣＫ細胞の培養条件又は今後開発されるＭＤＣＫ細胞の培養条件であればよい。好ましくは、インフルエンザウイルス作出用細胞は、血清を含まない無血清培地中で培養する。無血清培地には、必要に応じて、抗生物質やアミノ酸等の添加剤が含まれていてもよい。培養中、細胞内で合成されたｖＲＮＡと構造タンパク質によりウイルス粒子が形成される。ウイルス粒子は培養液中に放出され、インフルエンザウイルスとして単離することができる。インフルエンザウイルスの単離は、公知の手法又は今後開発される手法を用いて行うことができる。
【００３０】  本発明のインフルエンザウイルス作出方法は、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ又は構造タンパク質を発現し得るポリヌクレオチドを、インフルエンザウイルス作出用細胞に導入する遺伝子導入工程を含んでもよい。２種以上のポリヌクレオチドを導入する場合は、同時に導入することが好ましい。インフルエンザウイルス作出用細胞への遺伝子導入技術は、エレクトロポレーション法やリン酸カリウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法等の様々な方法が挙げられる。いずれの方法も細胞に少なからずダメージを与えるため従来のＭＤＣＫ細胞では困難であったが、本発明のインフルエンザウイルス作出用細胞を用いることにより、効率的にウイルスを作出することが可能である。
【実施例】
【００３１】  本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。【００３２】（実施例１）  本実施例では、Ａ型Ｈ１Ｎ１亜型、Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型及びＢ型インフルエンザウイルスの各細胞における作出効率を確認した。【００３３】１．インフルエンザウイルスの作出  細胞培養用フラスコでコンフルエントな状態まで培養したＭＤＣＫ細胞をトリプシンで剥離し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で３．５×１０７細胞／ｍＬの密度に懸濁した。細胞懸濁液１００μＬ、ＤＮＡ溶液９８μＬ（４９μｇのＤＮＡを含む）及びイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）１００μＬを混合して約３００μＬの混合液を作製し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を使用してＡ−０２４のプログラムでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の混合液は１ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）中に懸濁して細胞培養用２４ウェルプレートの１ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養を開始した。エレクトロポレーションの翌日には培地をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）入りのイーグルＭＥＭ培地５００μＬに交換し、３４℃、５％ＣＯ２の条件で培養を続けた。細胞は、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１４（以下、選出株２）及びＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０１５（以下、選出株１）で特定されるＭＤＣＫ細胞を用いた。対照の細胞として、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４由来の無血清馴化ＭＤＣＫ細胞（以下、未クローン化ＭＤＣＫ細胞）を用いた。【００３４】  上記において、各種インフルエンザウイルス作出のためのＤＮＡは、以下を用いた。インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ発現ベクターとして、イヌＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター配列とインフルエンザウイルスのｖＲＮＡが機能的に連結され、直後にＤ型肝炎ウイルスリボザイム及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続くものを作製して用いた。インフルエンザウイルスの構造タンパク質発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））を用いた。エレクトロポレーションには、インフルエンザウイルスＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳ分節のｖＲＮＡ発現ベクターを各３μｇ、インフルエンザウイルスＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡポリペプチドのタンパク質発現ベクターを各５μｇ、さらにＮＰポリペプチドのタンパク質発現ベクターを１０μｇの、計１２プラスミド、４９μｇのＤＮＡを用いた。Ａ型Ｈ１Ｎ１亜型のインフルエンザウイルスとしてＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９株の再構成を、Ａ型Ｈ３Ｎ２亜型のインフルエンザウイルスとしてＡ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）株の再構成を、Ｂ型のインフルエンザウイルスとしてＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０株の再構成をそれぞれ試みた。【００３５】２．インフルエンザウイルスの作出確認  エレクトロポレーションから６〜７日で培養上清を回収し、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集試験により、赤血球凝集反応の有無を確認した。赤血球凝集試験の方法は、国立感染症研究所著「インフルエンザ診断マニュアル（第３版）」に開示される通りである。赤血球凝集像が観察されたウェルについては、インフルエンザウイルスの作出に成功したと判定した。その結果を、表１に示した。各々の実験において遺伝子導入を行ったウェルの全個数は表１に示す分母の数に該当し、そのうちインフルエンザウイルスの作出に成功したと判定されたウェルの個数は表１の分子の数に該当する。その結果、未クローン化ＭＤＣＫ細胞では、他種細胞と共培養しなかった場合は、インフルエンザウイルスを作出することができなかった。本発明の細胞を用いた場合には、他種細胞と共培養しなくとも２０％以上の作出効率でインフルエンザウイルスを作出できた。【００３６】
【表１】
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【００３７】（実施例２）  本実施例では、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡ発現ベクターにおいて、バックボーン遺伝子（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ及びＮＳ分節）と抗原遺伝子（ＨＡ及びＮＡ分節）が異なるウイルス株由来のものを用いて、組換えインフルエンザウイルスを作出した。なお、インフルエンザウイルスのタンパク質発現ベクター（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）は、バックボーン遺伝子と同じウイルス株由来のものを用いた。【００３８】１．組換えインフルエンザウイルスの作出  選出株１を用い、実施例１の「１．インフルエンザウイルスの作出」と同様の方法で、組換えインフルエンザウイルスの作出を試みた。具体的には、バックボーン遺伝子はＨ３Ｎ２亜型に由来し、抗原遺伝子はそれぞれＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）株、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５（Ｈ３Ｎ２）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／２００３（Ｈ３Ｎ２）株、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）株又はＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４（Ｈ３Ｎ２）株に由来する組換えインフルエンザウイルスの作出を試みた。また、それぞれの組換えインフルエンザウイルスの作出について、２回の作出を試みた。【００３９】２．組換えインフルエンザウイルスの作出確認  実施例１の「２．インフルエンザウイルスの作出確認」と同様の方法で、組換えインフルエンザウイルスの作出を確認した。その結果を以下の表２に示した。表２中、赤血球凝集陽性と示すものは、赤血球凝集像が観察された実験であり、インフルエンザウイルスの作出に成功したと判定することができる。表２の結果から、本発明の細胞を用いることにより、組換えインフルエンザウイルスを作出可能であることが確認された。【００４０】
【表２】
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【００４１】（まとめ）  本発明のインフルエンザウイルス作出用細胞を用いて、インフルエンザウイルスをリバースジェネティクス法により作出すると、他種細胞と共培養しなくともインフルエンザウイルスを作出可能であることが確認された。一方、従来セルバンクとして使用していた未クローン化ＭＤＣＫ細胞では、他種細胞と共培養しなかった場合は、インフルエンザウイルスを作出することができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】  本発明の細胞を用いることで、他種細胞と共培養することなく、効率よくインフルエンザウイルスを作出することができる。他種細胞と共培養しなくてもよいことから、外来性ウイルス混入の危険性を排除することができる。また、複数種の細胞を用いなくてもよいことから、経済的にも優れる。本発明の細胞は、エレクトロポレーション法などの遺伝子導入技術を利用して遺伝子組換えを行うことで、各型のインフルエンザウイルスや、例えば弱毒化したインフルエンザウイルス等を作出することができる。本発明の細胞を用いることで、インフルエンザウイルスを効率的に作出することができ、ワクチンの作製も容易となる。
【国際調査報告】
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