(57)【要約】  初期段階の肺がんであっても種類を問わず再発可能性を予測できる方法を提供する。肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、肺がん患者由来のサンプルにおいて、少なくとも、ｇ１０２７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ１２８１４｜ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１２３７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ２２３９２−２｜ＮＤＫＢ＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１４６３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ３５２２１｜ＣＴＮＡ１＿ＨＵＭＡＮ）及びｇ１８２１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ５１６９０｜ＡＲＳＥ＿ＨＵＭＡＮ）の４種類のタンパク質の発現量を測定する工程、を含む肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法により、初期段階の肺がんであっても種類を問わず再発可能性を予測できる。
2016121715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、
肺がん患者由来のサンプルにおいて、少なくとも、ｇ１０２７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ１２８１４｜ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１２３７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ２２３９２−２｜ＮＤＫＢ＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１４６３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ３５２２１｜ＣＴＮＡ１＿ＨＵＭＡＮ）及びｇ１８２１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ５１６９０｜ＡＲＳＥ＿ＨＵＭＡＮ）の４種類のタンパク質の発現量を測定する工程、
を含む肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも４種類のタンパク質の発現量に基づいて、肺がん患者の再発可能性を予測する工程、
を含む肺がん患者の予後予測方法。
【請求項３】
前記肺がん患者の再発可能性を予測する工程が、
前記少なくとも４種類のタンパク質を含むタンパク質群を用いてＰａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づき構築した最終予後予測モデルに、請求項１に記載の少なくとも４種類のタンパク質の発現量を当てはめリスクスコアを算出する工程、
を含む請求項２に記載の肺がん患者の予後予測方法。
【請求項４】
請求項１に記載の少なくとも４種類のタンパク質を含むタンパク質群の発現量に基づき構築した最終予後予測モデル又は閾値を格納した記憶手段、
肺がん患者のサンプルに含まれる前記少なくとも４種類のタンパク質の発現量を、前記記憶手段に記憶された最終予後予測モデルに当てはめリスクスコアを算出、又は閾値と比較することで肺がん患者の再発可能性を予測する予測手段、
を含む肺がん患者の予後予測装置。
【請求項５】
前記最終予測モデルが、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づき構築したモデルであることを特徴とする請求項４に記載の肺がん患者の予後予測装置。
【請求項６】
コンピュータを、請求項４又は５に記載の肺がん患者の予後予測装置として機能させるためのプログラム。
【請求項７】
請求項６に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項８】
請求項１に記載の少なくとも４種類のタンパク質と同じアミノ酸配列を有する合成タンパク質を含み、
前記合成タンパク質の各々が、同位体標識されたアミノ酸を含む内部標準。
【請求項９】
請求項１に記載の少なくとも４種類のタンパク質を検出するための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、肺がん患者の予後予測方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体に関する。特に、肺がん患者由来のサンプル中の特定タンパク質の発現量を測定することで肺がん患者の手術後の再発可能性を予測し、肺がん患者に最適な術後治療を実施すための肺がん患者の予後予測方法、予後予測方法に用いられる肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本を含む殆どの先進諸国において、癌による部位別死亡者数の中で、肺がんによる死亡は第１位を占めている。肺がんに対しては、様々な治療法の改良及び早期発見用の検査方法の改良が行われているが、日本においは毎年約７０，０００人の肺がん患者（以下、単に「患者」と記載することがある。）が死亡している。【０００３】
患者の手術後の主な死亡原因は転移による再発である。そのため、日本においては、画像診断や手術時の目視では発見しきれないがん細胞の転移を抑えるため、手術後にテガフール・ウラシル（ＵＦＴ（登録商標））等の副作用が比較的少ない抗がん剤を約２年程度飲み続ける術後治療が行われている。この術後治療により、手術のみで経過観察を行う治療方法より、患者の再発を抑えることができる。しかしながら、統計的には、患者の約７割は手術により治癒するといわれている。そのため、約７割の患者は、本来は不要である抗がん剤治療を術後に受けることになり、体にダメージを与えるのみでなく、経済的にも大きな負担になっている。【０００４】
一方、残りの約３割については、手術ではがん細胞を取り切れずに、再発すると言われている。この約３割の患者に対しては、手術後に、ＵＦＴより更に強い抗がん剤治療を施すことが望ましい。しかしながら、現状では手術後は一律にＵＦＴ等の抗がん剤を投与している。したがって、手術後の患者毎に再発の可能性の有無を調べ、患者に最も適した術後治療を施すことが望ましい。【０００５】
また、欧米においては、比較的症状の軽いＩ期の場合は「経過観察」が主流である。しかしながら、Ｉ期の患者の中には進行性の患者も含まれている。そのため、進行性の患者に対しては、手術や抗がん剤投与等の適切な治療を早期に実施することが望ましいが、現状では、一律に経過観察が行われている。【０００６】
患者の手術後の予後を予測する方法としては、肺腺がん患者から採取した生体由来試料における、ミオシンＩＩＡ及び／又はビメンチン発現量を測定することで、予後を予測する方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５１４７８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載されている方法は、肺がんの中でも肺腺がんに限定されており、他の肺がんである、扁平上皮、腺扁平上皮、大細胞等に応用できるのか明らかではないという問題がある。本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、患者由来のサンプルにおいて、少なくとも、ｇ１０２７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ１２８１４｜ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１２３７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ２２３９２−２｜ＮＤＫＢ＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１４６３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ３５２２１｜ＣＴＮＡ１＿ＨＵＭＡＮ）及びｇ１８２１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ５１６９０｜ＡＲＳＥ＿ＨＵＭＡＮ）の４種類のタンパク質の発現量を測定し、当該発現量に基づき肺がん患者の再発可能性を予測することで、初期段階の肺がんであっても種類を問わず再発可能性を予測できることを新たに見出した。なお、本発明のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、全てＵｎｉｐｒｏｔデータベースの番号である。【０００９】
すなわち、本発明の目的は、肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、肺がん患者の予後予測方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下に示す、肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、肺がん患者の予後予測方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体に関する。【００１１】
（１）肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、
肺がん患者由来のサンプルにおいて、少なくとも、ｇ１０２７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ１２８１４｜ＡＣＴＮ１＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１２３７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ２２３９２−２｜ＮＤＫＢ＿ＨＵＭＡＮ）、ｇ１４６３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ３５２２１｜ＣＴＮＡ１＿ＨＵＭＡＮ）及びｇ１８２１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｓｐ｜Ｐ５１６９０｜ＡＲＳＥ＿ＨＵＭＡＮ）の４種類のタンパク質の発現量を測定する工程、
を含む肺がん患者の予後を予測するための情報を提供する方法。
（２）上記（１）に記載の少なくとも４種類のタンパク質の発現量に基づいて、肺がん患者の再発可能性を予測する工程、
を含む肺がん患者の予後予測方法。
（３）前記肺がん患者の再発可能性を予測する工程が、
前記少なくとも４種類のタンパク質を含むタンパク質群を用いてＰａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づき構築した最終予後予測モデルに、上記（１）に記載の少なくとも４種類のタンパク質の発現量を当てはめリスクスコアを算出する工程、
を含む上記（２）に記載の肺がん患者の予後予測方法。
（４）上記（１）に記載の少なくとも４種類のタンパク質を含むタンパク質群の発現量に基づき構築した最終予後予測モデル又は閾値を格納した記憶手段、
肺がん患者のサンプルに含まれる前記少なくとも４種類のタンパク質の発現量を、前記記憶手段に記憶された最終予後予測モデルに当てはめリスクスコアを算出、又は閾値と比較することで肺がん患者の再発可能性を予測する予測手段、
を含む肺がん患者の予後予測装置。
（５）前記最終予測モデルが、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づき構築したモデルであることを特徴とする上記（４）に記載の肺がん患者の予後予測装置。
（６）コンピュータを、上記（４）又は（５）に記載の肺がん患者の予後予測装置として機能させるためのプログラム。
（７）上記（６）に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
（８）上記（１）に記載の少なくとも４種類のタンパク質と同じアミノ酸配列を有する合成タンパク質を含み、
前記合成タンパク質の各々が、同位体標識されたアミノ酸を含む内部標準。
（９）上記（１）に記載の少なくとも４種類のタンパク質を検出するための抗体。
【発明の効果】
【００１２】
患者由来のサンプル中の、少なくとも、ｇ１０２７、ｇ１２３７、ｇ１４６３、及びｇ１８２１タンパク質の発現量に基づき再発可能性を予測することで、初期段階の肺がんであっても種類を問わず再発可能性を予測できる。したがって、再発の可能性が低い患者に対しては不要な抗がん剤治療を回避することができ、逆に、再発の可能性が高い患者に対しては、手術後の早い段階から患者に適した抗がん剤治療を行うことができる。【００１３】
本発明の予後予測装置に、インターネット回線を用いて肺がん患者の予後を予測するための情報を入力することで、症例の少ない遠隔地等の病院の患者に対しても適切な術後治療を実施することができる。【００１４】
コンピュータを肺がん患者の予後予測装置として機能させるプログラム、当該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することで、症例の少ない遠隔地等の病院のコンピュータを予後予測装置として機能させることができるので、遠隔地の患者に対しても適切な術後治療を実施することができる。【００１５】
また、内部標準、抗体を提供することで、患者から得られたサンプルに含まれるタンパク質の発現量の絶対値を簡単に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、肺がん患者の予後予測装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、本発明の予後予測装置を用いて、患者の予後を予測するための工程を示す図である。
【図３】図３は、予後予測タンパク質を同定するための統計処理手順を示す図である。
【図４】図４は、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に用いられるタンパク質を４〜１００種類に選択した際のＣｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔにおける平均ｃ−ｉｎｄｅｘ値を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例２で作成した最終予後予測モデルにより予測した結果と、実際に観察された予後との相関を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２で構築した最終予後予測モデルを用いて、教師群１１５サンプルを低危険群（４６サンプル）と高危険群（６９サンプル）に予測したグラフ、検証群５８サンプルを低危険群（３５サンプル）と高危険群（２３サンプル）に予測したグラフを示している。
【図７】図７は、実施例３で構築した最終予後予測モデルを用いて、教師群５５サンプルを低危険群（３４サンプル）と高危険群（２１サンプル）に予測したグラフ、検証群３９サンプルを低危険群（２８サンプル）と高危険群（１１サンプル）に予測したグラフを表している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法、肺がん患者の予後予測方法、内部標準、抗体、肺がん患者の予後予測装置、予後予測装置のプログラム及び記録媒体について詳しく説明する。
【００１８】
先ず、本発明における「肺がん」の種類は、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、大細胞がん、等が挙げられる。「肺がん患者由来のサンプル」とは、タンパク質を測定することができるサンプルを意味し、例えば、手術の際に採取したがん細胞、血液、尿、肺胞洗浄液、呼気に含まれる肺がん由来タンパク質等が挙げられる。
【００１９】
本発明の、肺がん患者の予後を評価するための情報を提供する方法は、肺がん患者由来のサンプル中で発現している各種タンパク質の内、少なくとも、ｇ１０２７、ｇ１２３７、ｇ１４６３、及びｇ１８２１タンパク質の発現量を測定することを特徴としている。なお、本発明の「タンパク質の発現量を測定する」とは、目的とするタンパク質の発現量を測定できれば方法等については特に制限は無く、例えば、完全長のタンパク質を測定してもよいし、目的とするタンパク質のプロセス体（タンパク質断片）を測定することで、目的とするタンパク質の発現量を測定してもよい。
【００２０】
後述する実施例に示すとおり、前記少なくとも４種類のタンパク質は術後のがんの再発に関与している。そのため、前記少なくとも４種類のタンパク質の発現量の情報を提供することで、患者の再発可能性を予測することができる。したがって、手術後の抗がん剤の投与が不要、又はより適切な抗がん剤の投与等、患者毎の適切な術後治療のための予後予測を提供することができる。
【００２１】
本発明の、肺がん患者の予後予測方法は、上記の少なくとも４種類のタンパク質の発現量に基づいて、予後を予測することを特徴としている。予後の予測は、測定した上記少なくとも４種類のタンパク質の発現量に基づいて、予後を予測できるものであれば特に制限はない。以下に、質量分析（ＭＳ）を用いたサンプル中のタンパク質の発現量の比較定量結果から、統計的手段を用いて最終予後予測モデル（判別式）を作成し、予後を予測する手順を示す。
（１）採取・保存した患者の一定数のサンプルを教師群と検証群に分ける。
（２）教師群に割り当てられたサンプルを、複数サンプル間でタンパク質の存在量を網羅的に比較できるｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬（ＡＢＳｃｉｅｘ社）等を用いて質量分析を行うことでサンプル中のタンパク質の発現量を測定し、データベース化する。なお、データベース化の際には、測定したタンパク質の発現量とその患者の実際に観察された予後、例えば、手術した３か月間後に再発、５年後に再発、９年間無再発等の情報を関連付けて記憶しておく。
（３）上記（２）で得られたデータを、統計処理し、手術後に再発の可能性が高いタンパク質群を同定する。統計処理は、例えば、サンプルを教師群（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａｓｅｔ）と検証群（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｄａｔａｓｅｔ）に分け、教師群を更にランダムにｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａとｔｅｓｔ  ｄａｔａに分け、ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａを生存に関わる多変数の効果を調べる回帰モデルであるコックス比例ハザードモデル（Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、再発に関連する候補タンパク質を限定する。
（４）上記（３）で限定した候補タンパク質群を、複数の変数を用いて予測モデルを構築できるＰａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析を用いて、予後予測モデルの作成を行う。作成した予後予測モデルは、ｔｅｓｔ  ｄａｔａを利用してｃ−ｉｎｄｅｘ（ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｉｎｄｉｃｅｓ）に基づいた予測性能の評価を行う。
（５）候補タンパク質を１０％ずつ減らしながら、上記（４）を繰り返すことで、候補タンパク質の数（ｍ）が異なるセットを作成する。
（６）更に、（３）〜（５）をｎ回繰り返すことで、候補タンパク質の数がｍであるセットをｎ個作成することができる。作成した候補タンパク質の数が異なる判別モデルの精度をｃ−ｉｎｄｅｘを指標に評価を行い、最終予後予測モデル作成に適切な候補タンパク質数Ｍを決定する。候補タンパク質の数がＭであるセットをｎ個作成することで、Ｍ×ｎ個のタンパク質（重複を含む）が得られ、ｎ個のモデルの中で最も高い頻度で選択されたタンパク質からＭ番目までのタンパク質をＭ個選択し、当該選択したタンパク質を用いてＰａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づく最終予後予測モデル（判別式）を構築する。なお、最終予後予測モデルとは、Ｍ×ｎ個の候補タンパク質（重複を含む）の中から選択したタンパク質Ｍ個に基づいて、教師群の全症例を予測できるようにＰａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析を用いて作成したモデルを意味し、（４）の予測モデル（ｍ個を選択したモデル）とは異なる。
（７）構築した最終予後予測モデルは、作成に用いた教師群とは別の検証群のデータを用いて検証を行うことで、作成した最終予後予測モデルの信頼性の評価をすることができる。
（８）そして、予後を予測するためには、サンプル中のタンパク質の発現量を測定し、測定した発現量を最終予後予測モデルに当てはめ、リスクスコアを算出することで、再発の危険度を予測すればよい。
【００２２】
なお、上記に示す手順は、統計的手段の一例を示すもので、上記の手段に限定されるものではない。例えば、重み付け得票分類（ｗｅｉｇｈｔｅｄ−ｖｏｔｉｎｇ）、教師あり学習を用いるパターン認識モデルの一つであるサポートベクターマシン（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅｓ）等のモデルを用いて、最終予後予測モデルを作成してもよい。
【００２３】
また、上記に示す方法は、サンプル中の各種タンパク質の発現量の比較定量結果から、最終予後予測モデルを作成する手順を示しているが、測定したタンパク質の発現量の絶対値に基づき、予後を予測する最終予後予測モデルを作成してもよい。絶対値に基づく場合でも、Ｐａｒｔｉａｌ  ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析、ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｖｏｔｉｎｇ、ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅなどを応用して、最終予後予測モデルを作成することができる。また、絶対値の場合、手術後の実際に観察された予後に関する情報が分かっているサンプルについて、上記少なくとも４種類のタンパク質の発現量の絶対値を調べ、どの程度の発現量であれば再発するリスクが高いのかデータ処理して閾値を設定し、当該閾値と比較することで再発可能性を予測できるようにしてもよい。タンパク質の発現量の絶対値の測定は、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、免疫組織染色等、公知の方法を用いることができる。
【００２４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いる場合は、サンプル中の測定対象タンパク質と同様のアミノ酸配列の内部標準を同時に分析し、内部標準との測定値を比較することで測定対象タンパク質の発現量の絶対値を測定することができる。内部標準は、測定対象タンパク質の一部、例えば、末端のアミノ酸のみを、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ等の同位体標識した人工アミノ酸を用いて合成した合成タンパク質を用いればよい。後述するように、本発明では、予後を予測するタンパク質を４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２１種類選択したモデルを作成している。内部標準は、それぞれのモデルのタンパク質に対応する同位体標識した合成タンパク質で作成すればよい。内部標準は、配列を提供すれば、例えば、ＳＩＧＭＡ社等の試薬メーカーから入手することができる。
【００２５】
ＥＬＩＳＡの場合は、測定対象タンパク質のみを特異的に認識する抗体を作成し、公知の手順で測定対象タンパク質の発現量を測定すればよい。また、免疫組織染色についても、公知の手順で発現量を測定すればよい。内部標準、抗体は、発現量の測定に必要な試薬と共に、キットとしてもよい。
【００２６】
なお、後述する実施例に示すとおり、本発明では、予後を予測するタンパク質を４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２１種類選択したモデルを作成しているが、最終予後予測モデルの精度が高ければ、タンパク質の組み合わせ数及び種類を適宜変更してもよい。例えば、表２に示す２９，０００セットのタンパク質の中で選択された回数の多いタンパク質を単独、又は適宜組み合わせてタンパク質群を作成してもよい。
【００２７】
本発明では、後述する実施例に示すように、手術後の実際に観察された予後の情報を関連付けたサンプルを分析することで、予後予測の指標となるタンパク質を同定した。また、当該タンパク質の発現量に基づいて構築した最終予後予測モデルを用いることで、患者の予後を予測ができることを明らかにしている。そのため、当該最終予後予測モデルや閾値をコンピュータの記憶手段に記憶しておくことで、コンピュータを肺がん患者の予後予測装置として用いることもできる。
【００２８】
図１は、肺がん患者の予後予測装置の概略を示す図である。予後予測装置１は、入力手段２、最終予後予測モデル又は閾値を記憶する記憶手段３、予測手段４、制御部５及びプログラムメモリ６を少なくとも含んでいる。
【００２９】
入力手段２は、予後予測装置１に、患者サンプルから得られた発現量の情報を入力できれば特に制限はなく、キーボード、ＵＳＢ等が挙げられる。また、入力手段２はインターネット回線を使用しても良い。例えば、インターネット回線を用いて遠隔地の病院で取得した患者サンプルの発現量の情報を予後予測装置１に送信・入力し、インターネット回線を通じて予後予測結果を送付することで遠隔地の病院の患者に対しても適切な術後治療を実施することができる。
【００３０】
記憶手段３には、患者の予後を予測する為の最終予後予測モデル又は閾値が記憶されている。予測手段４は、入力手段２により入力された患者サンプルから得られた発現量の情報を記憶手段３に記憶されている最終予後予測モデルに当てはめリスクスコアを算出する、又は閾値と比較することで、再発の危険度を予測することができる。プログラムメモリ６には、例えば、図１に示すコンピュータを予後予測装置１として機能させるためのプログラムが格納されている。このプログラムが制御部５により読み出され実行されることで、入力手段２、記憶手段３及び予測手段４の動作制御が行われる。プログラムは、予めコンピュータに記憶しておいても良いし、記録媒体に最終予後予測モデル、閾値と共に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ６に格納されるようにしてもよい。
【００３１】
図２は、本発明の予後予測装置を用いて、患者の予後を予測するための工程を示す図である。プログラムメモリ６に格納されたプログラムが制御部５に読み出されて実行し、先ず、入力手段２により、サンプル中のタンパク質の発現量を入力する（Ｓ１００）。なお、サンプル中のタンパク質の発現量は、予後予測装置と接続している発現量の測定装置の測定結果を直接入力してもよいし、別途測定した測定値を入力してもよい。次に、入力手段２により入力された発現量の情報を、記憶手段３に記憶されている最終予後予測モデルに当てはめリスクスコアを算出する、又は閾値と比較する（Ｓ１１０）。そして、得られた予後の予測結果を表示する（Ｓ１２０）。表示方法は、コンピュータの表示手段に表示してもよいし、紙等にプリントアウトしてもよい。
【００３２】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
以下の手順により、肺がん患者の予後を予測するために必要なタンパク質の同定と予後予測モデルの構築を行った。
〔サンプル〕
肺がん患者から採取した手術摘出肺がん試料であって、手術後の実際に観察された予後に関する情報（最長は手術後９年まで経過観察）を有する１７３サンプルを準備した。【００３４】
〔タンパク質発現量の比較定量及びデータベースの作製〕
（１）上記１７３サンプルを、
・教師群：１１５サンプル（腺：７３症例、扁平上皮：２４症例、腺扁平上皮：５症例、大細胞：１３症例）
・検証群：５８サンプル（腺：３７症例、扁平上皮：１２症例、腺扁平上皮：２症例、大細胞：７症例）に割り当てを行った。
（２）教師群のサンプル中に特異的に発現しているタンパク質を探索するために、先ず、次の手順により、サンプル内タンパク質の網羅的解析を行った。
（ｉ）対照として、肺がん細胞株２０種類から抽出したタンパク質を混合した試料を準備した。
（ｉｉ）上記対照試料と手術摘出肺がん組織試料から抽出したタンパク質、或いは、正常肺から抽出したタンパク質から、酵素消化によりペプチドを作成した後、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬（ＡＢＳｃｉｅｘ社）を用い標識を行った。
（ｉｉｉ）標識したペプチド試料を全て混合し、液体クロマトグラフィーによる分画化後に、質量分析装置（ＡＢＳｃｉｅｘ社）を用いて解析を行い、試料中のタンパク質の相対比較定量結果を取得した。
（ｉｖ）分析したサンプル毎に、タンパク質の発現量及びそのサンプルの患者の無病再発期間を関連付けて分析結果をデータベース化した。検証群のサンプルについても、教師群と同様の手順で分析した。【００３５】
〔統計処理及び予後予測タンパク質の同定〕
上記〔タンパク質発現量の比較定量及びデータベースの作製〕で作製したデータベースを用い、図３に示す手順で統計処理を行った。
（１）教師群の１１５サンプルを、ランダムにｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（９２サンプル）とｔｅｓｔ  ｄａｔａ（２３サンプル）に分けた。
（２）発現量の分散値とＣｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓの結果により、候補タンパク質を１００個まで限定した。
（３）次に、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析を用いて、実際に観察された予後の情報（再発までの時間軸の情報）を考慮した予測モデルをｔｒａｉｎｉｎｇ  ｄａｔａ（９２サンプル）を用いて作成した。作成した予測モデルの予測性能は、ｔｅｓｔ  ｄａｔａを用いＣｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔを行い、ｃ−ｉｎｄｅｘに基づいて評価した。なお、ｃ−ｉｎｄｅｘは、Ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔにおける正答率を意味する。
（４）次に、候補タンパク質を１０％ずつ減らし、上記（３）の工程を繰り返した。なお、１０％減らした際に、候補タンパク質が小数点になる場合は四捨五入した整数の候補タンパク質を選定した。次に１０％を減らす際にも、同様に四捨五入し整数の候補タンパク質を選定した。具体的には、１００、９０、８１、７３・・・２１、１９、１７、１５、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５及び４種類の合計２９パターンについて、候補タンパク質を選定した。（（１）〜（４）の手順を“Ｒａｎｄｏｍ  ５−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”と記載する。）
（５）上記（１）〜（４）の手順を１０００回繰り返した。
（６）表１は、候補タンパク質を１０％ずつ減らし、１１種類まで減らした際の候補タンパク質の選択方法を示している。候補タンパク質は、１回目の“Ｒａｎｄｏｍ  ５−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”（表１では“ＣＶ１”と記載。）の際に選択された１１種類のタンパク質、２回目の“Ｒａｎｄｏｍ  ５−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”（表１では“ＣＶ２”と記載。）で選択された１１種類のタンパク質、・・・１，０００回目の“Ｒａｎｄｏｍ  ５−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”（表１では“ＣＶ１０００”と記載。）で選択された１１種類のタンパク質をリストアップし、合計１０００回の“Ｒａｎｄｏｍ  ５−ｆｏｌｄ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”で選択された回数の多い順に１１種類のタンパク質を選択した。候補タンパク質を、４、５、６、７、８、９、・・・７３、８１、９０、１００種類選択する場合も、同様の手順で行った。【００３６】
【表１】
2016121715.tif 000003
【００３７】
表２は、４、・・・１００種類（２９パターン）のタンパク質を選択した際（２９×１，０００回＝２９，０００回）に、選択回数が上位５０種類のタンパク質の合計選択回数及びそのタンパク質のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を表す。
【表２】
2016121715.tif 000004
【００３８】
表３〜１６は、それぞれ、タンパク質を４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１７、１９、２１種類選択した際の、上位タンパク質の合計選択回数（１０００回中で選択された回数）及びそのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を表す。【００３９】
【表３】
2016121715.tif 000005
【００４０】
【表４】
2016121715.tif 000006
【００４１】
【表５】
2016121715.tif 000007
【００４２】
【表６】
2016121715.tif 000008
【００４３】
【表７】
2016121715.tif 000009
【００４４】
【表８】
2016121715.tif 000010
【００４５】
【表９】
2016121715.tif 000011
【００４６】
【表１０】
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【００４７】
【表１１】
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【００４８】
【表１２】
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【００４９】
【表１３】
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【００５０】
【表１４】
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【００５１】
【表１５】
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【００５２】
【表１６】
2016121715.tif 000018
【００５３】
表２〜１６に示すように、順位は異なるものの、選択回数が上位のタンパク質には共通性が見られた。具体的には、（１）４種類までタンパク質を絞り込んだ表３のｇ１０２７、ｇ１２３７、ｇ１４６３及びｇ１８２１については、表４〜表１６においてもすべて含まれること、（２）表３〜表１６のタンパク質は、表２に示す２９，０００回でヒットした上位３４タンパク質内に全て含まれていること、を確認した。したがって、予後予測には、上記４種類のタンパク質の発現量を少なくとも調べることが重要であることが判明した。【００５４】
図４は、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析を用いて候補タンパク質を４〜１００種に選択した際のＣｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔにおける平均ｃ−ｉｎｄｅｘ値を示すグラフである。選択したタンパク質の数が４〜１００種類の何れの場合もｃ−ｉｎｄｅｘ値は０．６１〜０．６２の間で、高い正答率といえる。【００５５】
〔最終予後予測モデルの検証〕
＜実施例２＞
上記のとおり、２９種類の判別モデルにおけるｃ−ｉｎｄｅｘの平均値に基づく各モデルの診断精度の評価は何れも高い正答率であったが、その中で、最も診断精度が高かった１１タンパク質を用いた判別モデルを最終予後予測モデルとした。表１及び１０に示すように、１０００回の１１タンパク質モデル構築の際に、最も多く選出されたタンパク質から１１番目までを最終モデルを構築するための因子として、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析に基づく最終予後予測モデル（判別式）を、教師群全１１５症例を用いて、「Ｈｏｎｇｚｈｅ  Ｌｉ  ｅｔ.  ａｌ．，“Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ”，  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ，Ｖｏｌ．２０  Ｓｕｐｐｌ．１，  ２００４，ｐｉ２０８−ｉ２１５」に記載されている手順で構築した。得られた最終予後予測モデル（判別式）を以下に示す。【００５６】
ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１×（ｐｒｏｔｅｉｎ１  −  ｍｅａｎ１）＋ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ２×（ｐｒｏｔｅｉｎ２  −  ｍｅａｎ２）＋・・・ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１０×（ｐｒｏｔｅｉｎ１０  −  ｍｅａｎ１０）＋ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１１×（ｐｒｏｔｅｉｎ１１  −  ｍｅａｎ１１）【００５７】
なお、上記最終予後予測モデル（判別式）の、“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ１”及び“ｍｅａｎ１”とは、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｏｘ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ解析の際に得られた値で、下記表１７に示す選択回数の順位が１位のタンパク質の“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”の値である“−０．４４４１”、“０．０１４２”である。“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ２”及び“ｍｅａｎ２”・・・は、順位が２位・・・のタンパク質の“ｃｏｅｆｆｉｃｅｎｔ”及び“ｍｅａｎ”の値を示す。また、“ｐｒｏｔｅｉｎ１”、“ｐｒｏｔｅｉｎ２”・・・とは、１１５サンプル中の個々のサンプル中で発現している“順位１位のタンパク質の発現量”、“順位２位のタンパク質の発現量”・・・を表している。
上記の最終予後予測モデル（判別式）に１１５サンプルを当てはめることで、各々のサンプルのリスクスコアを算出した。タンパク質が１１個以外の最終予後予測モデル（判別式）の場合も、同様に計算をすることでリスクスコアを算出できる。【００５８】
【表１７】
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【００５９】
本発明のサンプルは、手術後に実際に観察された予後が明らかなサンプルを使用している。そのため、実施例２で作成した最終予後予測モデルにより予測した結果と、実際に観察された予後との相関を調べた。図５は、教師群１１５サンプルについての相関を示すグラフで、実際に観察された患者の予後を無再発生存（手術後、５年経過した段階で再発しなかった患者）及び再発（手術後、５年以内に再発）に分け、それらの患者のサンプルを最終予後予測モデルで予測したリスクスコア（危険度）に基づいてプロットしたグラフである。なお、図５では、リスクスコアが“０”の場合を、低危険群と高危険群の境界とした。図５から明らかなように、実際に観察された予後が無再発生存のサンプルの多くは低危険群に予測され、実際に観察された予後が再発のサンプルの多くは高危険群に予測されていた。したがって、実施例２で作成した最終予後予測モデルの精度が高いことが明らかとなった。【００６０】
図６は、構築した最終予後予測モデルを用いて、教師群１１５サンプルを低危険群（４６サンプル）と高危険群（６９サンプル）に予測したグラフ、検証群５８サンプルを低危険群（３５サンプル）と高危険群（２３サンプル）に予測したグラフを示している。なお、図６に示す低危険群とは、図５に示す境界により低危険群に分類されたサンプルで、高危険群とは図５に示す境界により高危険群に分類されたサンプルである。また、図６中の実線は、高危険群又は低危険群に分類された手術摘出肺がん試料１７３サンプルの手術後の実際に観察された予後に関する情報を示しており、破線は９５％信頼区間を示している。実施例２で構築した最終予後予測モデルは、教師群のサンプルを用いて作成したモデルであることから、ｐ値はｐ＝６．８×１０-9と非常に小さく、信頼性が高い。そして、作成した最終予後予測モデルを検証群に適用した際のｐ値はｐ＝１．１×１０-5であり、作成した最終予後予測モデルを適用した検証群の予測も、信頼度が高いことが明らかとなった。【００６１】
表１８は、教師群中で低危険群（ｎ＝４６）及び高危険群（ｎ＝６９）に予測されたサンプル、並びに、検証群中で低危険群（ｎ＝３５）及び高危険群（ｎ＝２３）に予測されたサンプルの肺がんの種類を表している。表１８から明らかなように、本発明の最終予後予測モデルを用いることで、肺がんの種類によらず高精度に予後を予測できることが明らかとなった。【００６２】
【表１８】
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【００６３】
＜実施例３＞
上記の１７３のサンプルから、肺がんとしては初期の段階であるＩ期の症例である９４サンプルのみを選択し、当該９４サンプルを教師群（５５サンプル）及び検証群（３９サンプル）に分けた以外は、＜実施例２＞と同様の手順で、最終予後予測モデルの検証を行った。【００６４】
図７は、実施例３で構築した最終予後予測モデルを用いて、教師群５５サンプルを低危険群（３４サンプル）と高危険群（２１サンプル）に予測したグラフ、検証群３９サンプルを低危険群（２８サンプル）と高危険群（１１サンプル）に予測したグラフを示している。実施例３で構築した最終予後予測モデルのｐ値はｐ＝２．０×１０-4であった。そして、作成した最終予後予測モデルを検証群に適用した際のｐ値はｐ＝６．２×１０-4であった。一般的に、ｐ＜０．０５であれば統計学的に有意であると言えることから、作成した最終予後予測モデルの信頼度は高いと言える。以上の結果より、本発明の最終予後予測モデルは、初期段階の肺がん患者のサンプルからでも、高い精度で予後の予測ができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明に係る肺がん患者の予後予測方法及び予後予測装置を用いることで、肺がん患者の予後を高い精度で予測することができる。そのため、患者に適した術後治療を実施することができることから、医療機関や大学医学部などの研究機関等における肺がん患者の検査及び研究に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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