(57)【要約】  植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子であって、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が前記外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ２ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する。
2014129560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子であって、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が前記外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ２ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子。
【請求項２】
前記キュウリモザイクウイルスＲＮＡ２ゲノムに相当する配列と前記アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）との間に、前記植物内で機能するターミネーター配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
Ｔ−ＤＮＡベクターの形態である、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記植物が、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム、ならびにキュウリモザイクウイルスの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現している植物である、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
植物において外来遺伝子を発現させるための方法であって、植物においてキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム、並びにキュウリモザイクウイルスの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸分子を前記植物に導入する工程、及び、前記核酸分子が導入された植物を栽培して前記核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程を含む方法。
【請求項６】
キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノムの発現が、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子、並びに、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子を、それぞれ植物に導入することによって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸分子の植物への導入が、核酸分子を含む溶液の植物への浸透又は注入により行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物において目的遺伝子を１〜２週間程度で発現させることが可能な一過性発現法は、植物を利用した物質生産法として有力な手段である。【０００３】
従来の植物における一過性発現法は、（１）アグロインフィルトレーション法、（２）植物ウイルスベクター法、（３）ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、及び（４）パーティクル・ガン法に大別される。【０００４】
（１）アグロインフィルトレーション法は、目的遺伝子を挿入したＴ−ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性発現させる手法である（非特許文献１：Grimsley N., Hohn B., Hohn T., and Walden R., (1986), "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid an alternative route for viral infection of plants by using the Ti Plasmid., Proc Natl Acad Sci USA, 83(10):3282-6）。この手法によれば、感染能の強いアグロバクテリウムを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で普く移行させて感染させ、植物の全組織で一様に目的遺伝子を発現させることができる。しかし、その各細胞における発現量は、アグロバクテリウムの感染能力及び導入した遺伝子の発現調節配列（プロモーター及びターミネーター）の能力により制限されてしまい、植物体全体としての発現レベルを向上させることは困難であった。【０００５】
（２）植物ウイルスベクター法は、目的遺伝子を挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡを試験管内転写し、得られたＲＮＡをベクターとして植物に接種して感染させ、ウイルス自身の増殖能及び全身移行能を利用して、目的遺伝子を植物に発現させる手法である。斯かる植物ウイルスベクターの例としては、本発明者等の開発したキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクター（特許文献１：特許第４００９６６３号公報）や、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベクター（非特許文献２：Takamatsu N, Ishikawa M, Meshi T, and Okada Y., (1987), Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV-RNA, EMBO J., 6(2):307-11）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）ベクター（非特許文献３：Baulcombe, D.C., Chapman, S., and Santa Cruz, S., (1995), Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infectious, Plant J., 7:1045-1053）等が挙げられる。この手法は、ウイルスの自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、特に増殖能の高いＣＭＶやＴＭＶに基づくベクターを使用すれば、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。しかし、植物体の各組織細胞への移行性はウイルスの移行能力に依存するため、植物体全体の細胞にウイルスベクターを感染させ、目的遺伝子を発現させることは極めて困難である。その結果、ベクター導入後の植物体は、ウイルスが移行し、目的遺伝子を発現する細胞と、ウイルスが移行せず、目的遺伝子を発現しない細胞とのキメラ（モザイク）状態になってしまう。よって、植物体全体としての発現レベルを向上させることはやはり困難であった。【０００６】
（３）ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムは、目的遺伝子を挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ−ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ−ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入又は減圧による浸透）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性発現させる手法である（特許文献２：特開２００７−５１０４２３号公報；特許文献３：特開２００８−５３５４７３号公報；特許文献４：特開２０１１−０２４５９１号公報）。すなわち、ベクターを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で行き渡らせて感染させ、植物の全組織で目的遺伝子を発現させることができる。また、ウイルス（ＴＭＶ又はＰＶＸ）の自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。このように、本手法は、上述の（１）アグロインフィルトレーション法及び（２）植物ウイルスベクター法の利点を兼ね備えた手法である。しかし、ベースとなる植物ウイルスは、増殖能の高い単独一本鎖ＲＮＡをゲノムとするＴＭＶ又はＰＶＸに限られるため、感染可能な宿主植物が非常に制限されてしまうという課題があった。また、発現対象の目的遺伝子に加えて、ウイルス（ＴＭＶ又はＰＶＸ）の複製に必要な全ての遺伝子が一本鎖ＲＮＡ上に配置されるために、導入可能な目的遺伝子のサイズが制限されてしまうという課題があった。【０００７】
（４）パーティクル・ガン（パーティクル・ボンバードメント）法は、核酸で被覆した金属微粒子を高速で射出することにより、目的遺伝子を細胞内に導入する手法である（非特許文献４：Christou P, (1995), Particle bombardment, Methods Cell Biol., 50:375-82）。種々の生物種や組織に簡便に使用できるが、実施に斯かる費用が比較的高価である上に、目的遺伝子が導入時に分断されたり、植物細胞中に導入される細胞比率が極端に低いため、実用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４００９６６３号公報
【特許文献２】特開２００７−５１０４２３号公報
【特許文献３】特開２００８−５３５４７３号公報
【特許文献４】特開２０１１−０２４５９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Grimsley N., Hohn B., Hohn T., and Walden R., (1986), "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid an alternative route for viral infection of plants by using the Ti Plasmid., Proc Natl Acad Sci USA, 83(10):3282-6
【非特許文献２】Takamatsu N, Ishikawa M, Meshi T, and Okada Y., (1987), Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV-RNA, EMBO J., 6(2):307-11
【非特許文献３】Baulcombe, D.C., Chapman, S., and Santa Cruz, S., (1995), Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infectious, Plant J., 7:1045-1053
【非特許文献４】Christou P, (1995), Particle bombardment, Methods Cell Biol., 50:375-82
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上の背景から、植物体の全身移行能に優れると共に、用いた植物体のほとんどの細胞で目的遺伝子を高レベルで発現させることができ、更には宿主植物の種類や導入可能な目的遺伝子サイズの自由度も高い、優れた一過性発現法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討した結果、２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＲＮＡ２ゲノムに相当する配列を、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列と機能的に組み合わせた核酸分子を、別途ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム並びにタンパク質２ｂを機能的に発現する宿主植物に導入し、当該植物を栽培して外来遺伝子を発現させることにより、植物体の全身の細胞に外来遺伝子を普く移行させて発現させることができるとともに、各細胞での外来遺伝子の発現効率を高め、植物体全体として高発現を達成することができることを見出した。また、本手法によれば、ＴＭＶやＰＶＸを用いた上述のｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムと比べて、宿主植物の種類や導入可能な外来遺伝子サイズの自由度が遥かに高まることを見出し、本発明に到達した。【００１２】
即ち、本発明の主旨は、以下に存する。
（１）植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子であって、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が前記外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ２ゲノムに相当する配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子。
（２）前記キュウリモザイクウイルスＲＮＡ２ゲノムに相当する配列と前記アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ配列）との間に、前記植物内で機能するターミネーター配列を有する、（１）の核酸分子。
（３）Ｔ−ＤＮＡベクターの形態である、（１）又は（２）の核酸分子。
（４）前記植物が、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム、ならびにキュウリモザイクウイルスの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現している植物である、（１）〜（３）の核酸分子。
（５）植物において外来遺伝子を発現させるための方法であって、植物においてキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム、並びにキュウリモザイクウイルスの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程、（１）〜（３）の核酸分子を前記植物に導入する工程、及び、前記核酸分子が導入された植物を栽培して前記核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程を含む方法。
（６）キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノムの発現が、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列、前記植物内で機能するターミネーター配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子、並びに、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）、前記植物内で機能する発現プロモーター配列、キュウリモザイクウイルスのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列、前記植物内で機能するターミネーター配列、及びアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）をこの順序で有する核酸分子を、それぞれ植物に導入することによって行われる、（５）の方法。
（７）核酸分子の植物への導入が、核酸分子を含む溶液の植物への浸透又は注入により行われる、（５）又は（６）の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、植物体の全身の細胞に外来遺伝子を普く移行させて発現させることができるとともに、各細胞での外来遺伝子の発現効率を高め、植物体全体として高発現を達成することができる。また、種々の宿主植物や種々のサイズの外来遺伝子を対象として一過性発現を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＣＭＶ−２ｂ遺伝子植物発現ベクター（ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−２ｂ：核酸分子Ｂ）の構成を模式的に示す図である。図中「ＨＰＴ」はハイグロマイシン耐性遺伝子を、「Ｔｎｏｓ」はＮｏｓターミネーターを、「Ｐｎｏｓ」はＮｏｓプロモーターを、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒ」はストロベリーベインバンディングウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター由来内部断片配列＋タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の５’上流領域（Ω領域）を、「２ｂ」はＣＭＶ−２ｂタンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ示す。
【図２】図２は、２ｂ形質転換ニコチアナベンタミアーナタバコの２ｂタンパク質発現を確認したウエスタンブロットの解析結果を示す写真である。
【図３】図３（ａ）〜（ｄ）は、植物発現用バイナリーベクターの構成を模式的に示す図である。図３（ａ）は、ＣＭＶゲノム１を含むベクター（核酸分子Ａ）、図３（ｂ）は、ＣＭＶゲノム２を含むベクター、図３（ｃ）は、ＣＭＶゲノム２を含むベクターの２ｂ遺伝子領域を目的遺伝子たる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に置換したベクター（本発明の核酸分子）、図３（ｄ）は、ＣＭＶゲノム３を含むベクター（核酸分子Ｃ）を示す。「Ｐｎｏｓ」はＮｏｓプロモーター、「ｎｐｔＩＩ」はカナマイシン耐性遺伝子、「Ｔｎｏｓ」はＮｏｓターミネーター、「Ｐ３５Ｓ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来プロモーター配列、「ＦＷ−２ａ−Ｓａｌ」及び矢印、並びに、「ＲＶ ＣＳ−ｐＢＩ」及び矢印は、目的遺伝子たる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をベクターに挿入する際に使用したＰＣＲプライマーサイトを示す。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）は、接種植物体における葉の蛍光顕微鏡像の写真である。図４（Ａ）は、野生型植物体及び２ｂ形質転換植物体にアグロインフィルトレーション後（接種後５日目）の葉におけるＧＦＰ検出時の蛍光顕微鏡写真である。葉の自家蛍光波長をフィルターによりカットした。明部（原写真では緑色）はＧＦＰ発現部位を示す。黒色部分はＧＦＰの発光が無い葉の領域を示す。図４（Ｂ）は、未接種植物体における葉（ネガティブコントロール）の蛍光顕微鏡写真である。左写真の明部（赤色）は、葉の自家蛍光による。右写真は、左写真と同一画像で葉の自家蛍光波長をフィルターによりカットしたものである。ＧＦＰの緑色は検出されない。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、ＣＭＶゲノムの一部を有する形質転換体への接種後の葉の蛍光顕微鏡像の写真である。図５（Ａ）は、ＣＭＶゲノムＲＮＡ１形質転換タバコ（ＣＲ１−Ｔｇ）へのアグロインフィルトレーション後（接種後７日目）の葉におけるＧＦＰ検出時の顕微鏡像の写真である。図５（Ｂ）は、ＣＭＶゲノムＲＮＡ３形質転換タバコ（ＣＲ３−Ｔｇ）へのアグロインフィルトレーション後（接種後５日目）の葉におけるＧＦＰ検出時の顕微鏡像の写真である。明部（原写真では緑色）はＧＦＰ発現部位、黒色部分はＧＦＰの発光が無い葉の領域を表す。
【図６】２ｂ遺伝子及びＣＭＶゲノムの一部を有する形質転換体への接種後の葉の蛍光顕微鏡像の写真である。左図：２ｂ遺伝子及びＣＭＶゲノムＲＮＡ１形質転換タバコ（ＣＲ１＋２ｂＴｇ）へのアグロインフィルトレーション後（接種後７日目）の葉におけるＧＦＰ検出時の顕微鏡像の写真である。右図：２ｂ遺伝子及びＣＭＶゲノムＲＮＡ３形質転換タバコ（ＣＲ３＋２ｂＴｇ）へのアグロインフィルトレーション後（接種後５日目）の葉におけるＧＦＰ検出時の顕微鏡像の写真である。明部（原写真では緑色）はＧＦＰ発現部位、黒色部分はＧＦＰの発光が無い葉の領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、具体的な実施態様に即して本発明を詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施態様に束縛されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
【００１６】
［１．諸言］
まず、本発明の前提となるアグロバクテリウム及びキュウリモザイクウイルスについて説明する。
【００１７】
［１−１．アグロバクテリウム］
アグロバクテリウム（Agrobacterium）は、グラム陰性菌に属する土壌細菌であるリゾビウム属（Rhizobium)のうち、植物に対する病原性を有するものの総称である。アグロバクテリウムの例としては、根頭癌腫病に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacients）が挙げられる。
【００１８】
アグロバクテリウムは、Ｔｉプラスミドという巨大プラスミドを有する。Ｔｉプラスミドは「Ｔ−ＤＮＡ」（transfer DNA）配列と呼ばれる領域を有し、当該領域に相当するＤＮＡ断片が植物細胞に移動し、ランダム導入によって植物ゲノムに組み込まれるという性質を有する。斯かる性質を利用して、Ｔｉプラスミドは、植物に形質転換により外来遺伝子を導入して発現させる、等の目的に利用される。
【００１９】
Ｔ−ＤＮＡ配列は、ゲノムへの組み込みに必要な右境界配列（right border sequence：以降適宜「ＲＢ配列」、或いは単に「ＲＢ」と表記する。）と左境界配列（left border sequence：以降適宜「ＬＢ配列」、或いは単に「ＬＢ」と表記する。）を両端に有し、ＲＢ配列とＬＢ配列との間に、植物ホルモン生合成遺伝子及びオパイン生合成遺伝子を有する。
【００２０】
Ｔｉプラスミドは、上記の植物ホルモン生合成遺伝子及びオパイン生合成遺伝子を初め、植物の形質転換には不要な配列を含むため、巨大であり、操作性が悪い。よって現在では、Ｔｉプラスミドを改変した２種のプラスミド、即ち、バイナリープラスミドとヘルパープラスミドとを組み合わせたＴ−ＤＮＡバイナリー系によって、植物の形質転換による外来遺伝子の導入を行うことが主流である。
【００２１】
バイナリープラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ領域から植物の形質転換に不要な領域（例えば上記の植物ホルモン生合成遺伝子やオパイン生合成遺伝子等の領域）を除去した配列と、アグロバクテリウム及び他の微生物（例えば大腸菌等）の双方で機能し得る複製開始点と、選択可能な遺伝子マーカーとを組み込むことにより、アグロバクテリウムと他の微生物との双方で複製可能としたシャトルベクターである。バイナリープラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ配列の全体ではなく、通常はＴ−ＤＮＡ配列由来のＲＢ配列及びＬＢ配列（並びにその近傍領域）を有し、更に任意選択として、除去された植物ホルモン生合成遺伝子及びオパイン生合成遺伝子等の遺伝子の発現を調節していたｎｏｓプロモーター及びｎｏｓターミネーターを、ＲＢ配列とＬＢ配列との間に有する。植物に導入すべき外来遺伝子は、ＲＢ配列とＬＢ配列との間に、且つ、任意選択として前記のｎｏｓプロモーター及びｎｏｓターミネーターの制御下に配置される。一般に「Ｔ−ＤＮＡベクター」とは、通常はこのバイナリープラスミドを指す。
【００２２】
ヘルパープラスミドとは、Ｔｉプラスミドについて、Ｔ−ＤＮＡ配列のゲノムへのランダム組み込みを生じさせる遺伝子群であるｖｉｒ領域を残しつつ、Ｔ−ＤＮＡ配列や、その他のＴ−ＤＮＡ配列の宿主組換等に不要な領域を除去することにより、小型化した改変プラスミドをいう。Ｔ−ＤＮＡ領域のゲノムへの組み込みを生じさせるｖｉｒ領域の機能は、トランスに働くことが知られている。よって、上記のＴ−ＤＮＡベクターがｖｉｒ領域を有していなくとも、ｖｉｒ領域を有するこのヘルパープラスミドをＴ−ＤＮＡベクターと共にアグロバクテリウム内に共存させることで、Ｔ−ＤＮＡベクター内のＴ−ＤＮＡ領域にゲノムへの組み込みを生じさせ、惹いては、ＲＢ配列とＬＢ配列との間に配置された外来遺伝子を植物のゲノム内に組み込んで発現させることが可能となる。
【００２３】
なお、このようなｖｉｒ領域を有するヘルパープラスミドを使用せず、上述のＴ−ＤＮＡベクターに更にｖｉｒ領域を組み込んでおき、単独のベクターとして機能させることも可能である。
【００２４】
斯かるアグロバクテリウム由来のベクター（上記Ｔ−ＤＮＡベクター等）を利用して植物に外来遺伝子を一過性発現させる場合、通常はベクターを物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させる（上記非特許文献１：Grimsley N. et al.参照）。アグロバクテリウム由来のベクターはＴ−ＤＮＡ領域の作用により強い感染能を有するため、植物体の全身に物理的手法（注入や浸透等）で普く移行させて感染させれば、植物の全組織でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。しかし、上述のように、各細胞における外来遺伝子の発現量は、アグロバクテリウムの調節配列（ｎｏｓプロモーター及びｎｏｓターミネーター等）の能力により制限されてしまうため、植物体全体としての発現レベルを向上させることは困難であった。
【００２５】
［１−２．キュウリモザイクウイルス］
キュウリモザイクウイルス（cucumber mosaic virus：以降適宜「ＣＭＶ」と表記する。）は、ブロモウイルス科に属する植物病原性ウイルスであって、３つの１本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３）からなるゲノムを有する。ＲＮＡ１、２、３はそれぞれｐＣＹ１、ｐＣＹ２、ｐＣＹ３としてプラスミド化されている（Suzuki, M., et al., Virology, (1991), 183:106-113）。
【００２６】
ＲＮＡ１（ｐＣＹ１）は、１ａタンパク質（レプリカーゼ）をコードする遺伝子を含む。ＲＮＡ２（ｐＣＹ２）は、２ａタンパク質（ＲＮＡポリメラーゼ）をコードする遺伝子と、２ｂタンパク質をコードする遺伝子とを含む。ＲＮＡ３（ｐＣＹ３）は、３ａタンパク質（細胞間移行関連タンパク質）をコードする遺伝子と、膜タンパク質をコードする遺伝子とを含む。
【００２７】
なお、ｐＣＹ２の２ｂタンパク質をコードする遺伝子内に、マルチクローニングサイトを導入することにより、外来遺伝子を組み換え可能としたプラスミドベクター（Ｃ２−Ｈ１）が開発されている（Matsuo, K., et al., Planta, (2007), 225:277-286）。このプラスミドベクターを用いれば、外来遺伝子を植物細胞内で一過性発現させることが可能である。
【００２８】
斯かるＣＭＶ由来のベクターを用いた手法によれば、ＣＭＶの高い自己複製能を利用して外来遺伝子を発現させるため、植物細胞当たりの外来遺伝子の発現量を高めることができる。しかし、植物体の各組織細胞への移行性はウイルスの移行能力に依存するため、植物体全体の細胞にベクターを感染させ、外来遺伝子を発現させることは極めて困難である。その結果、ベクター導入後の植物体は、ウイルスが移行し、外来遺伝子を発現する細胞と、ウイルスが移行せず、外来遺伝子を発現しない細胞とのキメラ（モザイク）状態になってしまう。よって、植物体全体としての発現レベルを向上させることはやはり困難であった。
【００２９】
［２．植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子］
本発明の第一の観点によれば、植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子が提供される（なお、この核酸分子を、以降適宜「本発明の核酸分子」と表記する。また、本発明の核酸分子を用いて外来遺伝子を発現させる対象となる植物を、以降適宜「対象植物」と表記する。）。
【００３０】
本発明の核酸分子は、下記の配列（ａ）〜（ｅ）を、この順序で有する。但し、配列（ｄ）は任意選択である。
（ａ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）。
（ｂ）対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
（ｃ）ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムに相当する配列であって、その２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が、対象植物に発現させる外来遺伝子に置換された配列（以降適宜「外来遺伝子含有ＣＭＶ ＲＮＡ２相当配列」と表記する。）。
（ｄ）対象植物内で機能するターミネーター配列。
（ｅ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）。
【００３１】
上記（ａ）及び（ｅ）、即ち、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）は、上述したように、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列のゲノムへのランダム組み込みに関与する配列である。
【００３２】
上記（ｂ）発現プロモーター配列は、対象植物のゲノム内で機能し、外来遺伝子のコーディング配列の転写を開始させることが可能な配列であれば、その種類は制限されない。但し、対象植物内で外来遺伝子を高効率に発現させる観点からは、アグロバクテリウム由来のｎｏｓプロモーターよりも強力な活性を有するプロモーターを用いることが好ましい。斯かるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Odell et al., (1985), Nature, 313:810-812）、キャッサバモザイクウイルスプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、バドナウイルス（Badnavirus）プロモーター、ストロベリーベインバインディングウイルス（ＳＶＢＶ）のプロモーター、ミラビリス（Mirabilis）モザイクウイルスプロモーター（ＭＭＶ）、ルビスコ（Rubisco）プロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。中でも、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡ由来のプロモーター等が好ましい。
【００３３】
上記（ｃ）外来遺伝子含有ＣＭＶ ＲＮＡ２相当配列において、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムに相当する配列としては、通常はＲＮＡ２ゲノムのｃＤＮＡ配列が用いられる。上述のように、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムには、２ａタンパク質をコードする遺伝子と、２ｂタンパク質をコードする遺伝子とが含まれる。本発明ではＲＮＡ２ゲノムのｃＤＮＡ配列のうち、２ｂタンパク質をコードする遺伝子に相当する配列の一部又は全部を、外来遺伝子と置換する。
【００３４】
置換の態様は任意であるが、外来遺伝子の転写効率を向上させる観点からは、外来遺伝子のコーディング配列の開始コドンを、ＲＮＡ２ｂを発現させるためのサブゲノミックプロモーターの下流から置換することが好ましい。また、外来遺伝子長は、２ｂタンパク質をコードする遺伝子における置換される配列の長さと一致させ、置換前後の配列長が同一となるように置換することが好ましいが、ＲＮＡ２ゲノムのＣＭＶ粒子への組み込みが阻害されない限りにおいて、外来遺伝子長は、置換される配列の長さよりも長短いずれでもよく、置換前後で長さを一致させる必要はない。
【００３５】
また、本配列には、ウイルスでの転写・翻訳効率を向上させる等の目的で、種々の改変を加えてもよい。好ましい改変の例としては、開始コドン（ＡＵＧ）周辺への特定配列の導入（例えば“Ａ／ＴＸＸＡＵＧＸＣ”：ここでＸは任意の塩基を表す。）、リボソーム内部進入部位（internal ribosomal entry site：ＩＲＥＳ）配列の導入、リボザイムによる切断可能な配列の導入等が挙げられる。
【００３６】
上記（ｄ）ターミネーター配列は、上述の通り任意選択要素である。但し、外来遺伝子のコーディング配列の転写を確実に停止させ、所望の機能的なタンパク質を発現させる観点からは、本発明の核酸分子はターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列は、外来遺伝子のコーディング配列の転写を停止させることが可能な配列であれば、その種類は制限されない。例としては、アグロバクテリウム由来のｎｏｓターミネーターや、ヒートショックプロテイン（ｈｓｐ）ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ ＲＮＡターミネーター等が挙げられる。
【００３７】
また、上記（ｂ）発現プロモーター配列及び（ｃ）外来遺伝子含有ＣＭＶ ＲＮＡ２相当配列（並びに任意配列である（ｄ）ターミネーター配列）は、（ｃ）に含まれる機能的な遺伝子（即ち、２ａタンパク質をコードする遺伝子及び外来遺伝子）を発現させることが可能となるように、作動式に連結される。即ち、上記の（ｂ）及び（ｃ）（並びに任意により（ｄ））は、植物ゲノム内で自律的に発現可能な発現カセットを構成する（なお、この発現カセットを以降適宜「本発明の発現カセット」と表記する。）。言い換えれば、この本発明の発現カセットは、（ａ）右境界配列（ＲＢ）及び（ｅ）左境界配列（ＬＢ）のランダム組み込みによって植物ゲノム内に導入され、２ａタンパク質及び外来遺伝子を自律的に発現することになる。
【００３８】
本発明の核酸分子は、その機能を実質的に妨げない限りにおいて、更に他の配列を有していてもよい。他の配列の例としては、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド由来の他の任意の配列（例えばｖｉｒ領域等）や、選択マーカー遺伝子等が挙げられる。選択マーカー遺伝子は、本発明の核酸分子の導入を確認する目的で用いられる。その種類は制限されないが、通常は各種の抗生物質耐性遺伝子や薬剤耐性遺伝子、例えばアンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、アクチノニン（ＰＤＦ１遺伝子）、ビアラホス除草剤、グリホサート除草剤、スルホンアミド、マンノース等に対する耐性をもたらす遺伝子等が挙げられる。また、選択マーカー遺伝子は、通常は固有のプロモーター等の調節配列と作動式に連結され、植物ゲノム内で自律的に発現する発現カセットとして構成される（これを以降適宜「選択マーカー発現カセット」と表記する。）とともに、上記の（ａ）右境界配列（ＲＢ）と（ｅ）左境界配列（ＬＢ）との間（本発明の発現カセットの３’側又は５’側）に配置される。これにより、右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）のゲノムへのランダム組み込みによって、選択マーカー発現カセットが（本発明の発現カセットと共に）植物ゲノム内に導入され、自律的に発現することになる。
【００３９】
本発明の核酸分子は、直鎖状の形態であっても環状の形態であってもよい。但し、環状の形態、例えばプラスミドの形態であることが好ましく、特に、アグロバクテリウム内で複製能を有するＴ−ＤＮＡベクターの形態であることが好ましい。
【００４０】
上述した構成を有する本発明の核酸分子は、当業者に周知の各種の遺伝子組み換え技術を適宜組み合わせて用いることにより、容易に作製することが可能である。
【００４１】
本発明の核酸分子は、対象植物において外来遺伝子を発現させるために用いることができる。斯かる方法については次章で詳細に説明する。
【００４２】
［３．植物において外来遺伝子を発現させるための方法］
本発明の第二の観点によれば、上述の本発明の核酸分子を用いて、植物において外来遺伝子を発現させるための方法が提供される（なお、この方法を、以降適宜「本発明の方法」と表記する。）。
【００４３】
本発明の方法は、少なくとも下記の工程（ｉ）〜（iii）を含む。
（ｉ）対象植物において、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム並びにＣＭＶの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現させる工程。
（ii）本発明の核酸分子を対象植物に導入する工程。
（iii）本発明の核酸分子が導入された対象植物を栽培して、本発明の核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる工程。
【００４４】
本発明の方法に使用される対象植物には特に制限はなく、任意の種の植物を用いることが可能である。また、植物体のみならず、その一部の組織や細胞等の培養物を用いることもできる。
【００４５】
本発明を適用可能な植物の例としては、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、堅果植物等が挙げられる。
好ましい植物としては、イネ科、キク科、ナス科、バラ科の植物が挙げられる。
【００４６】
更に好ましい植物としては、以下の属に由来する植物が挙げられる。シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ウリミバエ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシ等。
【００４７】
本発明の方法に使用される外来遺伝子にも特に制限はなく、任意の遺伝子を用いることが可能である。例としては、各種の天然又は合成の遺伝子、並びにその断片、変異体、改変体等が挙げられる。
【００４８】
外来遺伝子の具体例としては、各種のサイトカイン、免疫原性物質、抗体、酵素、血液由来成分、アジュバント作用物質、ウイルス由来成分、病原微生物由来成分等が挙げられる。
【００４９】
工程（ｉ）では、対象植物において、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム、並びにＣＭＶの２ｂタンパク質を、それぞれ機能的に発現させる。
【００５０】
本工程は、例えば、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂタンパク質をコードする遺伝子に相当する配列、及び、ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列を対象植物に導入し、植物ゲノム内に組み込んで機能的に発現させることにより達成される。これらの配列を対象植物に導入する時機や順序についても制限はない。即ち、これらの配列を同時に導入してもよく、任意の順序で別個に導入してもよい。
なお、工程（ｉ）では、これらの配列の一部又は全部を既に有する組み換え植物等の既存の植物を用い、必要に応じて更に残る配列を導入した上で、その後の工程（ii）に使用してもよい。また、工程（ｉ）におけるこれらの配列の一部又は全部の対象植物への導入を、工程（ii）の本発明の核酸分子の対象植物への導入と同時に行ってもよい。
【００５１】
工程（ｉ）において、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂタンパク質をコードする遺伝子に相当する配列、及び、ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列を対象植物に導入する手法としては、通常、植物発現ベクターを用いた形質転換による導入法が用いられる。
【００５２】
植物発現ベクターとしては任意のものを用いることが可能である。例としては、各種のウイルスベクター、ファージベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。ウイルスベクターの好ましい具体例としては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）ポテトエックスウイルス（ＰＶＸ）、クローバーイエローベインウイルス（ＣＬＹＶＶ）等の各種の一本鎖ＲＮＡウイルス由来のベクター等が挙げられる。中でもキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のベクターが挙げられる。これらの植物発現ベクターを用いて対象植物細胞を形質転換する手法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、プロトプラストＰＥＧ介在形質転換法、パーティクル・ガン法等が挙げられる。植物発現ベクターや形質転換の詳細な条件については、対象植物や導入配列等に応じて公知の条件の中から適宜選択すればよい。
【００５３】
また、ＣＭＶのＲＮＡ１、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂタンパク質、及びＲＮＡ３ゲノムについて、上述の本発明の核酸分子と同様の構成を有する以下の核酸分子Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ用い、これらを対象植物に導入して発現させることも可能である。
【００５４】
核酸分子Ａは、下記の配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ’）、（ｄ）及び（ｅ）を、この順序で有する。但し、配列（ｄ）は任意選択である。
（ａ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）。
（ｂ）対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
（ｃ’）ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列。
（ｄ）対象植物内で機能するターミネーター配列。
（ｅ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）。
【００５５】
配列（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）については、本発明の核酸分子について説明したとおりである。
【００５６】
配列（ｃ’）、即ち、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列としては、通常はＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムのｃＤＮＡ配列が用いられる。本配列には、ウイルスでの転写・翻訳効率を向上させる等の目的で、種々の改変を加えてもよい。好ましい改変の例としては、本発明の核酸分子の配列（ｃ）について上述した各種の改変が挙げられる。
【００５７】
核酸分子Ａにおいても、上記（ｂ）発現プロモーター配列及び（ｃ’）ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノムに相当する配列（並びに任意配列である（ｄ）ターミネーター配列）は、（ｃ’）のＲＮＡ１ゲノムを発現させることが可能となるように作動式に連結され、植物ゲノム内で自律的に発現可能な発現カセットを構成する（なお、この発現カセットを以降適宜「発現カセットＡ」と表記する。）。この発現カセットＡは、（ａ）右境界配列（ＲＢ）及び（ｅ）左境界配列（ＬＢ）のランダム組み込みによって植物ゲノム内に導入され、ＲＮＡ１ゲノムを自律的に発現することになる。
【００５８】
核酸分子Ｂは、下記の配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ”）、（ｄ）及び（ｅ）を、この順序で有する。但し、配列（ｄ）は任意選択である。
（ａ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）。
（ｂ）対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
（ｃ”）ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂ領域（２ｂタンパク質をコードする遺伝子）に相当する配列。
（ｄ）対象植物内で機能するターミネーター配列。
（ｅ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）。
【００５９】
配列（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）については、本発明の核酸分子について説明したとおりである。
【００６０】
配列（ｃ”）、即ち、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂ領域（２ｂタンパク質をコードする遺伝子）に相当する配列としては、通常はＣＭＶのＲＮＡ２ｂのｃＤＮＡ配列が用いられる。本配列にも、ウイルスでの転写・翻訳効率を向上させる等の目的で、種々の改変を加えてもよい。好ましい改変の例としては、本発明の核酸分子の配列（ｃ）について上述した各種の改変が挙げられる。
【００６１】
核酸分子Ｂにおいても、上記（ｂ）発現プロモーター配列及び（ｃ”）ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列（並びに任意配列である（ｄ）ターミネーター配列）は、（ｃ”）のＲＮＡ２ゲノムの２ｂ領域を発現させることが可能となるように、作動式に連結され、植物ゲノム内で自律的に発現可能な発現カセットを構成する（なお、この発現カセットを以降適宜「発現カセットＢ」と表記する。）。この発現カセットＢは、（ａ）右境界配列（ＲＢ）及び（ｅ）左境界配列（ＬＢ）のランダム組み込みによって植物ゲノム内に導入され、ＲＮＡ３ゲノムを自律的に発現することになる。
【００６２】
核酸分子Ｃは、下記の配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ'''）、（ｄ）及び（ｅ）を、この順序で有する。但し、配列（ｄ）は任意選択である。
（ａ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）。
（ｂ）対象植物内で機能する発現プロモーター配列。
（ｃ'''）ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列。
（ｄ）対象植物内で機能するターミネーター配列。
（ｅ）アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の左境界配列（ＬＢ）。
【００６３】
配列（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）については、本発明の核酸分子について説明したとおりである。
【００６４】
配列（ｃ'''）、即ち、ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列としては、通常はＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムのｃＤＮＡ配列が用いられる。本配列にも、ウイルスでの転写・翻訳効率を向上させる等の目的で、種々の改変を加えてもよい。好ましい改変の例としては、本発明の核酸分子の配列（ｃ）について上述した各種の改変が挙げられる。
【００６５】
核酸分子Ｃにおいても、上記（ｂ）発現プロモーター配列及び（ｃ'''）ＣＭＶのＲＮＡ３ゲノムに相当する配列（並びに任意配列である（ｄ）ターミネーター配列）は、（ｃ'''）のＲＮＡ３ゲノムを発現させることが可能となるように、作動式に連結され、植物ゲノム内で自律的に発現可能な発現カセットを構成する（なお、この発現カセットを以降適宜「発現カセットＣ」と表記する。）。この発現カセットＣは、（ａ）右境界配列（ＲＢ）及び（ｅ）左境界配列（ＬＢ）のランダム組み込みによって植物ゲノム内に導入され、ＲＮＡ３ゲノムを自律的に発現することになる。
【００６６】
核酸分子Ａ、Ｂ及びＣは、その機能を実質的に妨げない限りにおいて、更に他の配列を有していてもよい。他の配列の例としては、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド由来の他の任意の配列（例えばｖｉｒ領域等）や、選択マーカー遺伝子等が挙げられる。選択マーカー遺伝子については上述した通りである。
【００６７】
核酸分子Ａ、Ｂ及びＣは、直鎖状の形態であっても環状の形態であってもよい。但し、環状の形態、例えばプラスミドの形態であることが好ましく、特に、アグロバクテリウム内で複製能を有するＴ−ＤＮＡベクターの形態であることが好ましい。
【００６８】
核酸分子Ａ及びＢは、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）の作用により、植物細胞に対して強い感染能を有する。即ち、高い効率で植物細胞のゲノムへのランダム組み込みを生じ、右境界配列（ＲＢ）と左境界配列（ＬＢ）との間に介在する配列（即ちＲＮＡ１ゲノム又はＲＮＡ３ゲノム等）が植物ゲノム内に導入され、植物内で発現することになる。よって、植物体の全身に物理的手法（注入や浸透等）で普く移行させて感染させれば、植物の全組織の細胞内でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。
【００６９】
核酸分子Ａ及び／又はＢ及び／又はＣを用いて、ＣＭＶのＲＮＡ１及び／又はＲＮＡ２ゲノムの２ｂ領域及び／又はＲＮＡ３ゲノムを対象植物に導入する場合、その導入の手法は限定されないが、これらの核酸分子を含む溶液を調製し、当該溶液を各種の物理的手法、例えば注入や浸透等の手法で、植物組織内に導入することが好ましい。斯かる手法の詳細な条件としては、後述する工程（ii）において、本発明の核酸分子を対象植物に導入する手法と同様の条件を使用することが可能である。
【００７０】
なお、上述した核酸分子Ａ、Ｂ及びＣや、その他の各種のベクターは、当業者に周知の各種の遺伝子組み換え技術を適宜組み合わせて用いることにより、容易に作製することが可能である。
【００７１】
工程（ii）では、本発明の核酸分子を対象植物に導入する。
導入の手法は限定されないが、例えば、本発明の核酸分子を含む溶液を調製し、当該溶液を各種の物理的手法、例えば注入や浸透等の手法で、植物組織内に導入することが好ましい。
【００７２】
本発明の核酸分子を含む溶液の調製は、例えば、本発明の核酸分子を産生するアグロバクテリウム等の微生物を培養し、得られた培養物（例えば一晩培養物等）を用いることができる。通常、一晩培養は波長６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）が３〜３．５単位に達する。これを、アグロ浸潤の前に３〜５回希釈され、一般に５〜９×１０9コロニー形成単位を生ずる（Turpen et al., (1993), J. Virol. Methods, 42:227-240）。このような培養物を、例えば、ＭＥＳバッファー等のバッファーを用いて、１０2倍、好ましくは１０3倍、より好ましくは１０4倍に希釈し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８になるように懸濁する。これらの菌体溶液を各々単独で使用する場合は、ＯＤ６００＝０．２〜０．６値の懸濁液に調製する。複数の菌体溶液を混合して使用する場合には、各々の菌体を等量ずつ混合して、最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．３〜１．２値に調製する。
【００７３】
本発明の核酸分子を含む溶液を注入により対象植物に導入する場合、例えばシリンジ等を用いて、当該溶液を対象植物に強制的に注射することにより行う。本発明の核酸分子を含む溶液を浸透により対象植物に導入する場合は、本発明の核酸分子を含む溶液を対象植物と接触させた上で、例えば真空デシケーター等を用いて減圧条件とし、当該溶液を対象植物に強制的に浸透させることにより行う。
以上の手法を用いて、本発明の核酸分子を、対象植物の全組織に一様に行き渡らせることが好ましい。
【００７４】
なお、本発明の核酸分子によって、Ｔ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）と、植物ゲノムへのランダム組み込みを生じさせるには、上述のようにＴｉプラスミド由来のｖｉｒ領域が必要となる。よって、本発明の核酸分子が当該ｖｉｒ領域を有しない場合には、本発明の核酸分子と共に、当該ｖｉｒ領域を有するヘルパープラスミドを導入する。一方、本発明の核酸分子が当該ｖｉｒ領域を有する場合は、ヘルパープラスミドは不要である。
【００７５】
また、工程（ｉ）におけるＣＭＶのＲＮＡ１及び／又はＲＮＡ３ゲノムの対象植物への導入を、上述の核酸分子Ａ及び／又はＢを用いて行う場合、工程（ii）における本発明の核酸分子の対象植物への導入と同時に行ってもよい。この場合、本発明の核酸分子と、核酸分子Ａ及び／又はＢとを含む溶液を調製し、当該溶液を単一の注入や浸透等の操作により、同時に植物組織内に導入することが好ましい。ここで、本発明の核酸分子と、核酸分子Ａ及び／又はＢとからなる核酸分子のセット、例えばＴｉベクターセットも、本発明の対象となる。
【００７６】
工程（iii）では、本発明の核酸分子が導入された対象植物を栽培して、本発明の核酸分子に組み込まれた外来遺伝子を発現させる。対象植物を栽培する手法は、対象植物の種類や外来遺伝子を発現させる目的等に応じて、適宜選択すればよい。
【００７７】
［４．小括］
以上説明した本発明の核酸分子は、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ配列由来の右境界配列（ＲＢ）及び左境界配列（ＬＢ）の作用により、植物細胞に対して強い感染能を有する。即ち、高い効率で植物細胞のゲノムへのランダム組み込みを生じ、右境界配列（ＲＢ）と左境界配列（ＬＢ）との間に介在する配列（即ち上記の本発明の発現カセット等）が、植物ゲノム内に導入され、植物内で発現することになる。よって、本発明によれば、植物体の全身に物理的手法（注入や浸透等）で普く移行させて感染させれば、植物の全組織の細胞内でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。
【００７８】
また、本発明の核酸分子は、ＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムの２ｂタンパク質をコードする遺伝子内に外来遺伝子を有し、且つ、独自の発現プロモーター配列の制御下で外来遺伝子をＣＭＶの２ａタンパク質と共に自律的に発現するように構成されている。よって、本発明の核酸分子を、ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム並びにＣＭＶの２ｂタンパク質をそれぞれ機能的に発現している植物に感染させることで、ＣＭＶのゲノム発現産物をトランスに補償し、ＣＭＶの高い自己複製能を利用して外来遺伝子を発現させることができる。惹いては、植物細胞当たりの外来遺伝子の発現量も高めることができ、更には対象となる宿主植物の種類についても、自由度を高めることができる。
【００７９】
更に、本発明の核酸分子は、従来のｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムのベクターと比べて、外来遺伝子以外の配列を最小限に抑えることができるため、従来よりも大型の外来遺伝子を導入できるという利点がある。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。【００８１】
なお、以下の記載において、ＧＦＰ蛍光の検出は、ＧＦＰ落射蛍光装置ＳＺＸ−ＲＦＬ２（SZX fluorescence illumination system：オリンパス株式会社）を使用して蛍光顕微鏡写真を取得することにより行った。【００８２】
［実験１］
ＣＭＶ２ｂタンパク質の植物発現ベクターの構築
ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有する植物発現用バイナリーベクター（ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ）に挿入済みのウイルス由来プロモーター内部配列の下流に、ＣＭＶ２ｂ遺伝子を挿入した。２ｂ遺伝子の両末端に設計したＣＭＶ−２ｂ−Ｆ１（配列番号１：５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＡＧＧＴＧＣＡＡＴＧ−３’）及びＣＭＶ−２ｂ−Ｒ１（配列番号２：５’−ＴＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＣ−３’）プライマーを用いてＣＭＶのＲＮＡ２ゲノムを鋳型にＰＣＲを行い、３３３ｂｐ長の増幅産物を得た。ＴＡクローニングを行って制限酵素配列を付与したＸｂａＩ−２ｂ遺伝子−ＳａｃＩ断片を得た。植物発現用ベクターｐＧＰＴＶ−ＨＰＴベクターを制限酵素ＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断して線状化し、ＸｂａＩ−２ｂ遺伝子−ＳａｃＩ断片をライゲーションして、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−２ｂ（核酸分子Ｂ）を構築した。このｃＤＮＡクローンの配列に対して、制限酵素部位の確認及びABI PRISM Big Dye Terminator（Applied Niosystems, USA）を用いたシーケンシングを行い、ミスが無いことを確認した。ＣＭＶ２ｂ遺伝子の植物発現ベクターの構造を図１に模式的に示す。【００８３】
［実験２］
植物発現用ベクターのアグロバクテリウムへの形質転換方法
アグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）への植物バイナリーベクターの形質転換には、液体窒素による凍結融解（Freeze thaw）法（Holsters M. et. al, (1978), Mol. Gen. Genet., 163(2):181-7）を使用した。得られた形質転換アグロバクテリウム菌体（ＬＢＡ４４０４）を、１００ｍｇ／ｌリファンピシン、３００ｍｇ／ｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加したＬＢ培地中で、２８℃で一晩振盪培養することにより、菌体液を得た。【００８４】
［実験３］
２ｂ形質転換植物体の作出
タバコ（Nicotiana benthamiana）への形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacients）を用い、リーフディスク法（Horsch RB. et al., (1984), Science, 223:496-498）により実施した。タバコの葉から直径約１ｃｍのリーフディスクを切り出し、ｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−２ｂを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacients）ＬＢＡ４４０４株の菌液に浸して、２日間ＭＳ（Murashige-Skoog）寒天培地上で共存培養を行った。共存培養したリーフディスクは、３日後に付着アグロバクテリウムを洗浄し、１５ｍｇ／ｌハイグロマイシン及び５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを添加した再分化用ＭＳ培地上で培養（２３℃、１６時間明期、８時間暗期）し、二週間毎に継代を行った。再分化して得られたシュートは、１５ｍｇ／ｌハイグロマイシン及び５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを添加した発根用ＭＳ培地で発根を誘導した後、培養個体を組換温室内で馴化して土耕栽培による育成を行い、次世代種子（Ｔ１個体）を得た。【００８５】
［実験４］
２ｂ形質転換体の２ｂタンパク質発現解析
再分化した培養個体（Ｔ０個体）から、葉を採取して液体窒素を用いて粉砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用バッファーを加えて磨砕した。磨砕液は遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分）を行い、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。トランスファーには、ＰＶＤＦ膜を用い、抗２ｂ抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。再分化した個体の中から２ｂタンパク質を発現している形質転換タバコを選抜し、後述の［実験６］の接種試験に使用した。ウエスタンブロットの解析結果を示す写真を図２に示す。【００８６】
［実験５］
ＣＭＶの分節ゲノムを挿入した目的遺伝子発現用バイナリーベクターの構築
鈴木匡の博士論文（「キュウリモザイクウイルス遺伝子の機能に関する研究」、１９９７年、東京大学博士論文、国会図書館、書誌ＩＤ：００００００３４３７０７）に記載された方法に従い、ＣＭＶの分節ゲノムの全長ｃＤＮＡを植物発現用バイナリーベクターｐＢＩ１２１に挿入したプラスミドｐＢＩ−ＣＲ１，２，３を構築した。具体的には、ＣＭＶの有する分節ゲノム：ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＲＮＡ３（ウイルスゲノム）を各々鋳型としてｃＤＮＡを増幅し、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（タカラバイオ株式会社）を用いてＣＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｐ３５Ｓ）とノパリンシンターゼのターミネーター（Ｔｎｏｓ）と間に各々組み込み、ｐＢＩ１２１に挿入して、ｐＢＩ−ＣＲ１，２，３を得た。さらに、目的遺伝子の挿入可能なベクターを構築するため、マーカー遺伝子としても利用されるオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein：ＧＦＰ）遺伝子を、ｐＢＩ−ＣＲ２の２ｂ遺伝子領域と置換したｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰの作出を行った。まずＣＭＶベクターの一部であるｐＵＣ１１８をバックボーンとするｐＣＹ２−Ｈ１の制限酵素サイトＳｔｕＩ及びＳｐｅＩ間にＧＦＰ遺伝子を挿入したｐＣＹ２−Ｈ１−ＧＦＰを鋳型として、このベクターの２ａ遺伝子内の制限酵素サイトＳａｌＩからＲＮＡ２ウイルスゲノム３’末端のＳａｃＩまでの領域を増幅するプライマーＦＷ２ａ−Ｓａｌ（配列番号３：５’−ＴＡＧＴＴＡＣＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＣＣＣ−３’）及びＲＶＣＳ−ｐＢＩ（配列番号４：５’−ＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧ−３’）を用いたＰＣＲにより増幅した。これにより約３２９０ｂｐのｃＤＮＡを得た。一方、先に構築したベクターｐＢＩ−ＣＲ２を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩで消化して線状化した。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎキット（ＴａＫａＲａ）を用いて線状化したベクターとＰＣＲで増幅した約３２９０ｂｐのインサートとのライゲーションを行った後、コンピテントセル（ＨＢ１０１）に形質転換してｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰのクローンを得た。このｃＤＮＡクローンの配列は、制限酵素サイトの確認と、シーケンシングによりミスが無いことを確認した。以上の手順により、ＣＭＶゲノム１を含むベクター（核酸分子Ａ）、ＣＭＶゲノム２を含むと共に２ｂ遺伝子領域を目的遺伝子たるＧＦＰに置換したベクター（本発明の核酸分子）、及び、ＣＭＶゲノム３を含むベクター（核酸分子Ｃ）を作製した。本発明では、ＣＭＶの３本の分節ゲノムを基として利用しているため、植物体内でＲＮＡ１、ＲＮＡ２（目的遺伝子挿入済み）、ＲＮＡ３という３本のウイルスゲノムを同時かつ同一空間に発現させる必要がある。このため、これら３分子種のベクターを１セットとして利用する。これらの植物発現用バイナリーベクターの構成を図３（ａ）〜（ｄ）に模式的に示す。図３（ａ）は、ＣＭＶゲノム１を含むベクター（核酸分子Ａ）、図３（ｂ）は、ＣＭＶゲノム２を含むベクター、図３（ｃ）は、ＣＭＶゲノム２を含むベクターの２ｂ遺伝子領域を目的遺伝子たるＧＦＰに置換したベクター（本発明の核酸分子）、図３（ｄ）は、ＣＭＶゲノム３を含むベクター（核酸分子Ｃ）を示す。【００８７】
［実験６］
アグロインフィルトレーション法
アグロインフィルトレーション法は、Grimsley N. et. al, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3282-3286を改変して使用した。ＣＭＶの分節ゲノム及びＧＦＰ遺伝子を挿入したバイナリーベクターｐＢＩ−ＣＲ１、ｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰ及びｐＢＩ−ＣＲ３をそれぞれ保有するアグロバクテリウムを、［実験２］の方法で形質転換を行い、組換アグロバクテリウム菌体液を得た。それぞれ遠心分離（２０℃、４８００ｒｐｍ、１５分）を行い、得られた菌体ペレットをＭＥＳバッファー（最終濃度１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０μＭ アセトシリンゴン、ｐＨ５．７）にＯＤ６００＝０．２〜０．８になるように懸濁した。これらの菌体溶液を各々単独で使用する場合には、ＯＤ６００＝０．２〜０．６値の懸濁液に調製し、複数の菌体溶液を混合して使用する場合には、各々の菌体を等量ずつ混合して、最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．３〜１．２値に調製した。菌体溶液のニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。この操作には、［実験１］及び［実験２］の方法で得た、２ｂ遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌体も混合して使用した。これらの接種ベクターの組み合わせを表１に示す。【００８８】
【表１】
2014129560.tif 000003
【００８９】
［実験７］
菌体接種植物体の育成及び目的タンパク質の検出
アグロインフィルトレーション法により、形質転換アグロバクテリウムを接種したニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）又は組換植物体（形質転換植物体）を、人工気象器もしくは照明付植物育成用インキュベーター中で２３℃、１６時間明期、８時間暗期で栽培した。接種後の植物体で、目的遺伝子（ＧＦＰ）が発現していることを確かめるため、ＧＦＰを可視化可能な波長域の青色光を照射し、３〜１４日栽培した植物体でＧＦＰの蛍光を確認した。［実験６］の方法で、表１に記載した接種植物体及び接種アグロバクテリウム菌体（保有ベクター）の組み合わせで、アグロインフィルトレーションを実施した結果、２ｂタンパク質もしくは２ｂ遺伝子が植物体に存在しない場合には、ＧＦＰは殆どが葉脈に局在する。一方、植物体から２ｂタンパク質を供給した場合、又は、２ｂ遺伝子を有するアグロバクテリウム菌体からアグロインフィルトレーションにより２ｂタンパク質を一過的に供給した場合では、何れにおいても２ｂタンパク質の存在下で、ＧＦＰが葉全体（葉脈＋葉肉組織）で発現していることが確認できた。【００９０】
接種植物体における葉のＧＦＰ検出結果を表す蛍光顕微鏡写真を図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。図４（Ａ）は、野生型植物体及び２ｂ形質転換植物体にアグロインフィルトレーション後（接種後５日目）の葉の蛍光顕微鏡写真である。図４（Ｂ）は、未接種植物体における葉（ネガティブコントロール）の蛍光顕微鏡写真である。図４（Ａ）、（Ｂ）では、ＧＦＰ落射蛍光装置ＳＺＸ−ＲＦＬ２（SZX fluorescence illumination system：オリンパス株式会社）を使用してＧＦＰ蛍光写真を取得した。図４（Ａ）、（Ｂ）は、接種植物体における葉の蛍光顕微鏡像の写真である。【００９１】
［実験８］
ＣＭＶの分節ゲノムＲＮＡ１又はＲＮＡ３を有する形質転換植物体の作出
ＣＭＶのタンパク質の一部又は（２ａを除く）全部を植物体に発現させるため、まずＣＭＶの分節ゲノムＲＮＡ１又はＲＮＡ３を有する形質転換植物体の作出を行った。［実験５］で構築したｐＢＩ−ＣＲ１又はｐＢＩ−ＣＲ３を、それぞれ保有するアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株を［実験２］の方法で形質転換を行って組換アグロバクテリウム菌体液を得た。その後、抗生物質をハイグロマイシンからカナマイシンに変更した他は［実験３］と同様の手順で、リーフディスク法（Horsch RB. et al., Science, (1984), 223:496-498）によるニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）への形質転換を実施した。タバコの葉から直径約１ｃｍのリーフディスクを切り出し、ｐＢＩ−ＣＲ１又はｐＢＩ−ＣＲ３を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacients）ＬＢＡ４４０４株の菌液に浸して、ＭＳ（Murashige-Skoog）寒天培地上で２日間共存培養を行った。共存培養したリーフディスクは、３日後に付着アグロバクテリウムを洗浄し、５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを添加した再分化用ＭＳ培地上で培養（２３℃、１６時間明期、８時間暗期）し、二週間毎に継代を行った。再分化して得られたシュートは、５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５００ｍｇ／ｌカルベニシリンを添加した発根用ＭＳ培地で発根を誘導した後、培養個体を組換温室内で馴化して土耕栽培による育成を行い、次世代種子（Ｔ１個体）を得た。【００９２】
［実験９］
ＣＭＶゲノムＲＮＡ１又はＲＮＡ３形質転換体の接種用植物体としての機能解析
ＣＭＶゲノムＲＮＡ１又はＲＮＡ３形質転換体の次世代種子（Ｔ１個体）を、１２５ｍｇ／ｌカナマイシンを添加した培地に無菌播種し、カナマイシン耐性が付与されたＴ１個体を選抜した。この芽生えを土耕栽培して温室内で育成を行った。播種後、約２ヶ月栽培した植物体に、［実験６］の方法で、アグロインフィルトレーションを実施した。ＣＭＶゲノムＲＮＡ１形質転換体のＴ１個体には、ｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰとｐＢＩ−ＣＲ３を有する２種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．６値に調製した。また、ＣＭＶゲノムＲＮＡ３形質転換体のＴ１個体には、ｐＢＩ−ＣＲ１とｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰを有する２種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１に等量混合した懸濁液の菌体量を最終濃度ＯＤ６００＝０．６値に調製した。いずれも、組換植物体への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。さらに本発明において必須である、２ｂ遺伝子をこれらの形質転換植物体に供給するため、アグロインフィルトレーション法による一過性発現を実施した。ＣＭＶゲノムＲＮＡ１形質転換体（ＣＲ１−Ｔｇ）のＴ１個体には、ｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰとｐＢ−ＣＲ３及びｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−２ｂを有する３種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１：１に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．９値に調製した。また、ＣＭＶゲノムＲＮＡ３形質転換体（ＣＲ−３Ｔｇ）のＴ１個体には、ｐＢＩ−ＣＲ１とｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰ及びｐＧＰＴＶ−ＨＰＴ−２ｂを有する３種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１：１に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．９値に調製し、植物体への強制注入を行った。アグロインフィルトレーションによる接種後、［実験７］の方法で、５〜７日間栽培を行った。【００９３】
続いて、以下の表２に記載した接種植物体及び接種アグロバクテリウム菌体（保有ベクター）の組み合わせで、アグロインフィルトレーションを実施した。
【表２】
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【００９４】
２ｂタンパク質もしくは２ｂ遺伝子が植物体に存在しない場合には、ＧＦＰは葉脈にほとんどが局在する。一方、２ｂ遺伝子を有するアグロバクテリウム菌体から２ｂを一過的に供給した場合では、いずれにおいても２ｂの存在下で、ＧＦＰが葉全体（葉脈＋葉肉組織）で発現していることが確認できた。接種植物体におけるＧＦＰ検出結果を図５に示す。【００９５】
［実験１０］
ＣＭＶゲノムＲＮＡ１＋２ｂ遺伝子又はＲＮＡ３+２ｂ遺伝子を有する形質転換体の接種用植物体の作出
ＣＭＶの２ｂタンパク質の存在下で、目的遺伝子のＧＦＰが葉全体（葉脈＋葉肉組織）で発現していることが［実験７］で確認できたことから、この２ｂタンパク質をコードする遺伝子と共にＣＭＶのゲノムＲＮＡ１又はＲＮＡ３を発現する形質転換体（Nicotiana benthamiana）を作出するため、［実験８］の方法で作出した形質転換体のＴ１個体を温室出育成し、受粉前の花の雌しべに、［実験３］の方法で作出した２ｂ形質転換体の花粉を人工授粉させた。得られた種子は、１２５ｍｇ／ｌカナマイシン及び１５ｍｇ／ｌハイグロマイシンを添加したＭＳ培地に無菌播種を行い、カナマイシン及びハイグロマイシンの両方に耐性が付与された植物体を選抜した後、芽生えを移植して温室内で土耕栽培による育成を行った。これらの個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出して、ゲノミックＰＣＲ解析を実施し、ＣＲ１＋２ｂ形質転換体は、ｐＢＩ−ＣＲ１と２ｂ遺伝子の両方を有する形質転換植物体であること、ＣＲ３＋２ｂ形質転換体は、ｐＢＩ−ＣＲ３と２ｂ遺伝子の両方を有する形質転換植物体であることも確認済みである。【００９６】
［実験１１］
ＣＭＶゲノムＲＮＡ１＋２ｂ遺伝子又はＲＮＡ３+２ｂ遺伝子を有する形質転換体の接種用植物体としての機能解析
１２５ｍｇ／ｌカナマイシン及び１５ｍｇ／ｌハイグロマイシンを添加したＭＳ培地に無菌播種を行い、カナマイシン及びハイグロマイシンの両方に耐性が付与された植物体を選抜した後、芽生えを土耕栽培して温室内で育成を行った。播種後、約２ヶ月栽培した植物体に、［実験６］の方法で、アグロインフィルトレーションを実施した。ＣＲ１＋２ｂ形質転換体には、ｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰとｐＢＩ−ＣＲ３を有する２種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１に等量混合して最終の懸濁液の菌体量をＯＤ６００＝０．６値に調整した。また、ＣＲ３＋２ｂ形質転換体のＴ１個体には、ｐＢＩ−ＣＲ１とｐＢＩ−ＣＲ２Δ２ｂ−ＧＦＰを有する２種類のアグロバクテリウム菌体溶液を１：１に等量混合した懸濁液の菌体量を最終濃度ＯＤ６００＝０．６値に調整した。いずれも、組換植物体への接種には、針なしシリンジ又は真空デシケーターを用いて強制注入を行った。アグロインフィルトレーションによる接種後、［実験７］の方法で、５〜７日間栽培を行った。その結果を以下の表３に示す。【００９７】
【表３】
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【００９８】
接種植物体における葉のＧＦＰ検出結果を表す蛍光顕微鏡写真を図６に示す。図６は、ＣＲ１＋２ｂ形質転換体（左図）及びＣＲ３＋２ｂ形質転換体（右図）にそれぞれアグロインフィルトレーションした後（接種後５日目）の葉の蛍光顕微鏡写真である。何れもＧＦＰ落射蛍光装置ＳＺＸ−ＲＦＬ２（SZX fluorescence illumination system：オリンパス株式会社）を使用してＧＦＰ蛍光写真を取得した。葉肉及び葉脈の何れでも、ＧＦＰ蛍光の発現が生じていることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
上述のように、本発明の遺伝子発現ベクター及び遺伝子改変植物を用いた方法によれば、植物体全体の細胞にベクターを移行・感染させて、目的遺伝子を高レベル発現させることが可能となる。また、種々の宿主植物や種々のサイズの目的遺伝子を対象として一過性発現を行うことが可能となる。従って、本発明は農学、農業生産工学、資源生産科学、生物生産工学等の産業分野において、高い利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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