(57)【要約】  乳がんにおける化学療法の薬剤効果の有無、再発リスク又は転移の可能性を高い精度で、客観的かつ迅速に評価する手法の提供。  乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の乳がんの転移又は再発リスクを評価する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の乳がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜１９９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜１９９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜１０７で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜１０７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、乳がんの再発リスクを評価する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、配列番号１０８〜１９９で示される塩基配列にける転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１０８〜１９９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、乳がんのリンパ節転移を評価する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜３２で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１〜３２で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、術前化学療法を行っていない乳がん患者における乳がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、配列番号３３〜１０７で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号３３〜１０７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない乳がん患者における乳がんの再発リスクを評価する、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、配列番号１０８〜１７７で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１０８〜１７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、病型がTNタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者における乳がんのリンパ節転移を評価する、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、配列番号１７８〜１９９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、該転写開始領域が、配列番号１７８〜１９９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、病型がHER2-positiveタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者における乳がんのリンパ節転移を評価する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
配列番号１〜３２で示される塩基配列が、配列番号２９で示される塩基配列である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１０８〜１７７で示される塩基配列が、配列番号１５０及び配列番号１４７で示される塩基配列である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１７８〜１９９で示される塩基配列が、配列番号１９４、配列番号１８７、配列番号１８６、配列番号１９２及び配列番号１９３で示される塩基配列である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜３２で示される塩基配列が、下記１）〜１０）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項５記載の方法。
【表１】
2015115545.tif 000018
【請求項１３】
配列番号３３〜１０７で示される塩基配列が、下記１）〜３４）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項６記載の方法。
【表２】
2015115545.tif 000019
【請求項１４】
配列番号１０８〜１７７で示される塩基配列が、下記１）〜２４）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項７記載の方法。
【表３】
2015115545.tif 000020
【請求項１５】
配列番号１７８〜１９９で示される塩基配列が、下記１）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項８記載の方法。
【表４】
2015115545.tif 000021
【請求項１６】
さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを対照レベルと比較する工程を含む請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを閾値レベルと比較する工程を含む請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
発現産物の発現レベルの測定が、転写産物の量又は翻訳産物の量を測定することによって行われる、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳物を認識する抗体を含有する、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法に用いる乳がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キット。
【請求項２０】
転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、乳がんの転移又は再発のリスクを評価するためのマーカーとしての使用。
【請求項２１】
前記ＤＮＡが、配列番号１〜１９９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜１９９で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
病型がTNタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者、又は病型がHER2-positiveタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、ＨＬＡ−ＤＱＡ１のＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の乳がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び参照による援用）
本出願は、２０１４年１月３１日に出願した日本国特願２０１４−０１７９４６の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書において参照として援用される。
また、本明細書に引用される全ての文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを認めるものと解釈されてはならない。【０００２】
本発明は、乳がんの転移又は再発のリスクを分子レベルで評価する手法に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳がんは生物学的な特性から、Luminal A、Luminal B、HER2-positive、Triple-negative（ＴＮ）の４病型に分類される。それぞれのタイプごとに適した治療法として標準治療があるが、タイプによって予後や化学療法の効果が異なるといわれており、例えば、同一タイプ、ステージで且つ同じ治療法を選択したグループ内でも早期に再発する患者と再発しない患者が存在する。【０００４】
これまで、乳がんで包括的な治療が行われた後に、それが再発するかを判断することはできていなかった。また、ある特定の薬剤に関する予測因子は特定されておらず、臨床応用されるまでに至ってはいない。つまり、例えば術前化学療法では、該当する病型やステージ等が大きな適応基準の要素となっているが、病型およびステージが同じであれば、通常すべて同じ薬剤（レジメン）で行われており、個々の乳がんに適合した的確な治療がなされていないのが現状である。なお、これまでＴＮタイプの乳がんにおいては化学療法の選択肢は複数あるものの、どの治療法を選択するのが良いか判断する根拠はなかった。【０００５】
また、研究用の検査として、マンマプリント（Agendia社-DNAチップ研究所）が実用化されているが（特許文献１）、これは７０遺伝子シグニチャーによって早期乳がん患者の術後再発リスクを大まかに測定するものであり、化学療法の実施有無や乳がんの病型に応じた、よりきめ細かい再発の診断や予測を行うことが求められている。【０００６】
一方、近年、遺伝子の発現状態の比較によって、ある状態にある細胞で発現している遺伝子を網羅的に解析し、その種類や発現レベルを細胞間で比較する、遺伝子の発現解析(expression analysis)のための手法が開発されている。例えば、転写開始部位の遺伝子の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析するＲＮＡ−ｓｅｑ（非特許文献１）やＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression：非特許文献２）等が知られている。このうち、ＣＡＧＥ法は、ｍＲＮＡ等の長いキャップ付ＲＮＡを選択し、その５’末端を無作為かつ大量に配列決定することで転写開始点の活性を網羅的に定量できるという特徴を有する。【０００７】
しかしながら、ヒトゲノムにおける転写開始領域の発現レベルと特定の疾患との関係についてはこれまでに全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２２２８３５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63
【非特許文献２】Genome Res. 2011 Jul;21(7):1150-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、乳がんにおける化学療法の薬剤効果の有無、再発リスク又は転移の可能性を高い精度で、客観的かつ迅速に鑑別する手法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、手術によって得られる乳がん組織のうち、再発があるものとないもの、及びリンパ節転移のあるものとないものからＲＮＡを抽出し、ＣＡＧＥ解析法を用いて転写開始領域（Transcript Start Site；ＴＳＳ）付近の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の転写開始領域を含むＤＮＡの発現レベルが当該２群間で有意に異なり、これを指標として、「再発あり」と「再発なし」、「リンパ節転移あり」と「リンパ節転移なし」とを判別できることを見出した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の乳がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
２）前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する、１）の方法に用いる乳がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キット。
３）転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、乳がんの転移又は再発のリスクを評価するためのマーカーとしての使用。
４）病型がTNタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者、又は病型がHER2-positiveタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、ＨＬＡ−ＤＱＡ１のＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、当該患者の乳がんの転移又は再発リスクを評価する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、化学療法の薬剤効果予測や再発有無の迅速かつ的確な判断ができるようになり、リスクの高い患者を高い確度で識別することができる。例えば、化学療法の効果のある乳がんには積極的に化学療法を行い、化学療法の効果のない乳がんには手術先行や、レジメンの変更など、個々の乳がんに適合した治療戦略確立が期待される。
また、前記病型のうちＴＮタイプでは、他の３タイプと比べると標準治療の奏効率が低く、再発率が高いが、本発明の方法を用いることにより、生物学的根拠を持ってＴＮタイプを細分化することが可能となり、より良い治療法の選択や新たな治療法の開発への道を開くことになる。
また、本発明によれば、トレーニングを積んだ病理診断医や臨床検査技師のような専門家の主観によらなくても、本発明を用いることで同程度あるいはそれ以上の分類を客観的に行うことが可能になり、患者検体の採取から解析まで患者の傍らで医療従事者が行う検査（POCT：Point of Care Testing）にも好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】免疫組織化学像。（左図）再発・転移あり、褐色：ＨＬＡ−ＤＱＡ１発現細胞、倍率：２００倍、（右図）再発・転移なし、倍率：２００倍
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、乳がんとは、乳房組織に発生する癌腫を意味する。乳がんは、生物学的な特性から、Luminal A、Luminal B、HER2-positive、Triple-negative (TN) の4病型に分類され、また、病期によって、０〜４のステージに分けられている。
本発明において、転移とは、乳がんがリンパ節や他の臓器において増殖することを意味し、転移の評価とは、転移の有無又は転移能（乳がんが多臓器へ転移して増殖する能力）の有無を評価又は測定することを意味する。好適には、リンパ節転移を評価又は測定することが挙げられる。
【００１６】
本発明において、「再発リスク」とは再発のしやすさを意味する。「再発」とは、生体から腫瘍を摘出して一定期間経過した後、同じ部位に悪性腫瘍が再現する場合、及び腫瘍細胞が原発巣から分離して遠隔組織へ運ばれそこで自立的に増殖する場合をいう。再発が起こるか否かは腫瘍細胞の増殖能、生存能、移動能等に左右される。
本発明の評価方法は、特に、術前化学療法を行っていない患者、及び病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない患者の再発リスクの評価、病型がＴＮタイプであってステージが２ａ又は２ｂである患者、及び病型がＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプであってステージが２ａ又は２ｂである患者のリンパ節転移を評価することに適する。
ここで、ＴＮタイプの病型とは、免疫病理学的検査でエストロジェン受容体陰性かつプロゲステロン受容体陰性かつＨＥＲ２陰性であるタイプ、ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプの病型とは、免疫病理学的検査でＨＥＲ２が過剰発現しているタイプである。
また、ステージ２ａとは、腫瘍の最大径が２ｃｍ以下かつ１〜３個の所属リンパ節転移（ただし最大径が２ｍｍを越えるものを少なくとも１個含む）があるもの、または腫瘍の最大径が２ｃｍを越えて５ｃｍ以下かつ所属リンパ節転移がないものであり、２ｂとは、腫瘍の最大径が２ｃｍを越えて５ｃｍ以下かつ１〜３個の所属リンパ節転移（最大径が０．２ｍｍ以上）があるもの、または腫瘍の最大径が５ｃｍを越えて所属リンパ節転移がないものを指す。
【００１７】
本発明において用いられる生体試料は、評価対象となる乳がん患者から分離された乳がん組織である。当該生体試料は、測定に供するために適宜調製・処理される。例えば試料を核酸レベルでの測定に供する場合はＲＮＡ抽出液が調製され、試料をタンパク質レベルでの測定に供する場合はタンパク質抽出液が調製される。
生体試料からＲＮＡを抽出する方法は、公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、ライフテクノロジーズ社製Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅキット、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ、同社製ＲＮｅａｓｙが例示できるが、これらのうちキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙキットが好適に用いられる。
【００１８】
本明細書において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。また、「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。従って、ＤＮＡには、２本鎖のゲノムＤＮＡ、１本鎖のｃＤＮＡや該ＤＮＡと相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ等が包含される。また、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００１９】
本発明において、配列番号１〜１９９で示される塩基配列からなるＤＮＡ（転写開始領域とその下流に連続する１００塩基からなるヒトゲノムＤＮＡ）の転写産物は、実施例で示すとおり、１）術前化学療法を行わず術後化学療法を行った乳がん患者において、再発があった検体と再発がない検体、２）病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない乳がん患者において、再発があった検体と再発がない検体、３）病型がＴＮタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者において、リンパ節転移がない検体とリンパ節転移がある検体、４）病型がＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者において、リンパ節転移がない検体とリンパ節転移がある検体について、ＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression）解析法を用いて、ゲノム上の転写開始領域を含む下流１００ベース以上のＤＮＡの発現状態を網羅的に解析した結果、夫々の２群間でその発現レベル（転写活性）に有意な差異が認められたものである。具体的には、１）〜４）の検体のＲＮＡの転写活性について、「再発あり」又は「転移あり」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「再発なし」又は「転移なし」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用い、閾値としてＦＤＲ（false discovery rate）５％を設定し、抽出されたものである。
したがって、配列番号１〜１９９で示される塩基配列における転写開始領域の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡ（以下、「配列番号１〜１９９における転写開始点を含むＤＮＡ」と称する）の（又はそれによってコードされる）発現産物（「本発明の発現産物」と云う）は、乳がんの転移又は再発リスクを評価するためのバイオマーカーとなり得る。
【００２０】
より詳細には以下のとおりである。
１）配列番号１〜３２における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
術前化学療法を行っていない乳がん患者において、再発リスクを評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号１〜５における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号６〜３２における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は再発リスクが高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
２）配列番号３３〜１０７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない乳がん患者において、再発リスクを評価するためバイオマーカー。
当該ＤＮＡの発現産物は、何れも再発リスクが高い場合に発現レベルが上がるマーカーである。
３）配列番号１０８〜１７７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
病型がTNタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者において、リンパ節転移を評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号１０８〜１６４における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、リンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号１６５〜１７７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物はリンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
４）配列番号１７８〜１９９における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物
病型がHER2-positiveタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者において、リンパ節転移を評価するためバイオマーカー。
このうち、配列番号１７８〜１８４における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、リンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号１８５〜１９９における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物はリンパ節転移の可能性が高い場合に発現レベルが下がるマーカーである。
【００２１】
本発明において、「転写開始領域」は、転写開始点を含む領域をいう。特定のプロモーターからの転写開始点は単一の塩基に限定されず、ゲノム上のプロモーターの下流の複数の位置に存在する塩基であり得る。これらの複数の転写開始点を含む領域を本明細書において転写開始領域と称する。より詳細には、転写開始領域は、複数の転写開始点のうち最も５’側に位置する転写開始点と最も３’側に位置する転写開始点との間の領域である。配列番号１〜１９９で示される塩基配列の各々において転写開始領域は１位（５’末端）の塩基と３’末端から１０１番目の塩基とによって両端が規定される領域に相当する５’末端を形成する塩基領域である。換言すると、配列番号１〜１９９で示される塩基配列の各々には、転写開始領域と、転写開始領域中の最も３’側に位置する転写開始点に続く１００個の塩基が示されている。本明細書においては、斯かる転写開始領域を「配列番号１〜１９９において示される転写開始領域」とも称する。
配列番号１〜１９９において示される転写開始領域のゲノム上の位置、及びそれに関連する遺伝子情報等は後記表１−１〜１−２、表２−１〜２−３、表３−１〜３−３及び表４に示すとおりである。
【００２２】
本発明において、発現産物の発現レベルが測定されるＤＮＡは、配列番号１〜１９９で示される塩基配列における、上記転写開始領域中の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に続く１塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡである。
ここで、下流に続く塩基配列の塩基数は、発現産物を特定できる数であればよい。当該塩基数としては、例えば１塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上が挙げられる。また、当該塩基数としては、例えば１０塩基以下、１５塩基以下、２０塩基以下、２５塩基以下、３０塩基以下、４０塩基以下、５０塩基以下、１００塩基以下が挙げられる。
下流側の塩基は、ＣＡＧＥ法による測定の場合には特に必要ないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによる測定の際にはその精度を担保するために下流１００塩基程度までの何れかの部分を対象とすることができ、転写開始領域とその下流１００塩基からなるＤＮＡのうち、少なくとも２０塩基以上の長さのものであればゲノム全体を対象にした実験系であっても特定できる確率が高い。
また、当該ＤＮＡには、その発現産物が乳がんの転移又は再発リスクを評価するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該ＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡも包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３の条件にて検索をした場合、配列番号１〜１９９に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましく９８％以上の同一性があることを意味する。
【００２３】
斯かる本発明の発現産物は、1種又は２種以上を適宜組み合わせてその発現レベルを把握することにより、乳がんの転移又は再発リスクを評価することが可能である。
このうち、後記表５〜７に示す閾値を設定した場合に、特異度１００％・感度１００％で分類できるもの、すなわち、一つの発現レベルのみを以って確実な判別が可能なＤＮＡとして、以下のものが挙げられる。
【００２４】
前記、１）術前化学療法を行っていない乳がん患者の再発リスクの評価における、配列番号２９における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、３）病型がTNタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者のリンパ節転移の評価における、配列番号１５０又は配列番号１４７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
前記、４）病型がHER2-positiveタイプであってステージが2a又は2bである乳がん患者のリンパ節転移の評価における、配列番号１９４、配列番号１８７、配列番号１８６、配列番号１９２又は配列番号１９３における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物。
【００２５】
また、少なくとも２つのＤＮＡの発現産物を用いる場合の好適な組み合わせ、すなわち上記転写開始領域から選択した２個のすべての組み合わせについて、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関する再発又はリンパ節転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものとして、後記表８〜１１に示すＤＮＡの発現産物が其々挙げられる。
尚、更なる精度向上を目的として、これらを適宜２セット若しくは３セット以上を組み合わせて用いることができる。また、斯かる２つのＤＮＡの発現産物の組み合わせに加えて、配列番号１〜１９９における転写開始点を含むＤＮＡのうち、当該組み合わせとして示された以外のＤＮＡの発現産物と組み合わせてもよく、更には本発明の評価に寄与し得る範囲でそれ以外の任意の塩基配列からなるＤＮＡの発現産物を組み合わせてもよい。
【００２６】
本発明の発現産物としては、当該ＤＮＡから発現される転写産物及び翻訳産物が挙げられる。転写産物としては、具体的には、当該ＤＮＡから転写されて生じるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。また、翻訳産物としては、具体的には、当該ＲＮＡによってコードされるタンパク質が挙げられる。例えば、表１〜表４で示した転写開始点を含むＤＮＡの発現産物のうち、配列番号１１２及び配列番号１９６における転写開始点を含むＤＮＡから発現されるタンパク質は、「ＨＬＡ−ＤＱＡ１」（Major Histocompatibility Complex, Class II, DQ Alpha 1；UniProtKB/Swiss-Prot: DQA1_HUMAN, P01909）として同定されている。
発現産物の測定又は検出の対象には、そのＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等も包含される。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。
また、発現レベルとは、当該発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
【００２７】
発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロッ、トハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【００２８】
ここで、測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、配列番号１〜１９９で示される塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ−ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが生成される如く、上記検出物又は生成物が当該転写産物又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、配列番号１〜１９９で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、配列番号１〜１９９で示される塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。又はイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
【００２９】
例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用する場合は、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出、測定する方法を用いることができる。
【００３０】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の本発明の発現産物（この場合、転写産物）が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【００３１】
また、ＤＮＡマイクロアレイを用いて検体中のｍＲＮＡの発現量を測定する場合、支持体に本発明の発現産物（この場合、転写産物）由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡ発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の発現産物（転写産物）の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５〜２５塩基からなる核酸が挙げられる。
ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)などに記載されている。
【００３２】
また、塩基配列を決定する方法としては、ＣＡＧＥ法、ＴＳＳ−ｓｅｑ法、ＲＮＡ−ｓｅｑ法、ＤＧＥ法、ＳＡＧＥ法等が挙げられるが、ＣＡＧＥ法が好適である。
ＣＡＧＥ法を用いて、発現レベルを測定する場合、後記実施例に記載した方法に準じて実施することができる。
【００３３】
また、配列番号１〜１９９における転写開始点を含むＤＮＡからコードされるタンパク質（すなわち、翻訳産物）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、１−ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２−ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物（この場合、翻訳産物）に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチドを検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
【００３４】
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。
また、免疫組織化学分析法を行う場合には、患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用するのが好ましい。さらには、患者から分離した生体試料を速やかに凍結した後、組織片に薄切しスライドガラスに貼り付けてからホルマリン固定したものを切片試料として使用することもできる。二次抗体としては、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素標識抗体を用いることができるが、ＡＢＣ法やＬＳＡＢ法等の三段階法、またＤＡＫＯ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ検出システム等を用いて高感度な検出を行うのが好ましい。
【００３５】
斯くして、乳がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中の本発明の発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて、乳がんの転移又は再発リスクが評価される。具体的には、検出された本発明の発現産物の発現レベルを対照レベルと比較することによって評価される。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、転移又は再発がない乳がん患者から分離されたがん組織若しくは乳がん患者から分離された正常組織における当該発現産物の発現レベル、若しくは乳がんを発症していない健常人群における当該発現産物の発現レベルが挙げられる。
例えば、対象患者のがん組織の当該発現産物の発現レベルが、転移又は再発がない乳がん患者から分離されたがん組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い（又は低い）場合には、当該患者の乳がんは転移がない若しくは転移能が低い、又は再発リスクが低いと評価できる。
【００３６】
また、本発明における乳がんの転移又は再発リスクの評価は、本発明の発現産物の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、対照レベルとして、例えば正常組織、転移又は再発がない乳がん患者から分離されたがん組織或いは健常人の組織由来の当該発現産物の発現レベルに基いて、標準値（閾値レベル）を設定し、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルを標準値と比較する（例えば±２Ｓ．Ｄ．の範囲を許容範囲とする）ことにより行うことができる。例えば、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルが閾値レベルより高い（又は低い）場合に、当該患者の乳がんは転移がない若しくは転移能が低い、又は再発リスクが低いと評価できる。
【００３７】
本発明の方法に従い、必要に応じて他の方法（CT,MRIやPET-CTなど）との組み合わせで、提供された情報に基づいて、乳がんの転移又は再発リスクが評価される。転移又は再発の可能性があると判断された場合には、例えば化学療法及び／又は分子標的療法、又は放射線療法若しくは内分泌療法を行うことができる。一方、転移又は再発の可能性が低いと判断された場合には、これらの処置を行う必要はないと考えられる。
【００３８】
本発明の乳がんの転移又は再発リスクを評価するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の発現産物（転写産物）等と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の発現産物（翻訳産物）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００３９】
実施例１  乳がんにおける「再発あり」と「再発なし」、「リンパ節転移あり」と「リンパ節転移なし」とを判別するための転写開始領域の抽出と検証【００４０】
（１）検体試料の入手
乳がん手術で切除された組織から、がん組織の一部を切り取ってすぐさまマイクロチューブに入れ液体窒素中で凍結後、?80℃の超低温槽で保管し、適宜、解析に使用した。使用したサンプルは、以下のとおりである。
＜１：術前化学療法を行わず術後化学療法を行った乳がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル１０検体（再発なし：５検体、再発あり：５検体）
・検証用サンプル４検体（再発なし：２検体、再発あり：２検体）
＜２：病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない乳がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル１６検体（再発なし：１４検体、再発あり：２検体）
・検証用サンプル３検体（再発なし：２検体、再発あり：１検体）
＜３：病型がＴＮタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル１０検体（リンパ節転移なし：６検体、リンパ節転移あり：４検体）
・検証用サンプル３検体（リンパ節転移なし：２検体、リンパ節転移あり：１検体）
＜４：病型がＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者＞
・転写開始領域抽出用サンプル６検体（リンパ節転移なし：３検体、リンパ節転移あり：３検体）
・検証用サンプル３検体（リンパ節転移なし：２検体、リンパ節転移あり：１検体）【００４１】
（２）試料の保存・調製
摘出された組織片は、適宜冷凍処理されて−８０℃で保存した。保存組織片は、凍ったままの状態でアルミホイルに包み、液体窒素にてさらに冷凍処理を施した後に、ゴムハンマーにて破砕処理を行った。破砕試料を２ｍＬチューブに５０ｍｇ以下になるように入れてキアゲン社製ＱＩＡｚｏｌを添加して密閉し、キアゲン社製ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて浸透処理により破砕した。【００４２】
（３）ＲＮＡの調製
破砕・抽出処理を行った試料は、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔにより、添付されたプロトコルに従ってＲＮＡ調製を行った。調製後のＲＮＡは、分光高度計による紫外吸収（２３０、２６０、２８０ｎｍ）を測定して、２６０／２３０、２６０／２８０比を算出し、そのＲＮＡの質を検定した。また、アジレント社製ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ｎａｎｏ  ｃｈｉｐにより電気泳動を行い、ＲＮＡ分解度を示すＲＩＮ値を算出して、ＲＮＡの分解度合いを検定した。【００４３】
（４）ＣＡＧＥライブラリー調製
精製ＲＮＡを５μｇ用意し、非増幅非タグ化ＣＡＧＥ法（「細胞工学別冊  次世代シークエンサー目的別アドバンストメソッド」、菅野純夫、鈴木穣監修、学研メディカル秀潤社、2012年09月19日発行」内、第３章３“網羅的プロモーター解析（イルミナシーケンサーを用いた非増幅ＣＡＧＥ法）”参照）により、ＣＡＧＥライブラリーを調製した。具体的には、精製ＲＮＡを逆転写反応に供して精製後、過ヨウ素酸ナトリウムによりリボースのジオールを参加してアルデヒド化し、ビオチンヒドラジドを添加してアルデヒド基にビオチンを付加した。ＲＮａｓｅＩにより一本鎖ＲＮＡ部分を消化・精製後、アビジン磁気ビーズによりビオチン化されたＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖のみをビーズ表面に結合させ、ＲＮａｓｅＨ消化及び熱処理によりｃＤＮＡを遊離させて回収した。回収したｃＤＮＡの両端にシーケンスに必要なアダプターを連結させた後、イルミナ社製ＨｉＳｅｑ２５００によりシーケンスを行った。なお、本工程において精製・緩衝液置換等に用いるＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター社製）の標準的な条件では、二本鎖の場合で１００塩基以上の長さの核酸が回収される条件であり、これを採用した本工程により生産されるＣＡＧＥライブラリーは１００塩基以上の鎖長をもつ二本鎖ＤＮＡからなる。【００４４】
（５）ＲＮＡ発現解析
ｉ）リファレンス転写開始領域の準備
ヒトの初代培養細胞や細胞株、さらに組織等を含め合計約１０００ものヒトサンプルについて転写開始点の活性がゲノムワイドに測定されたプロファイルするプロジェクトである「ＦＡＮＴＯＭ５」（論文投稿中）において同定された転写開始領域のうち、ヒトリファレンスゲノムｈｇ１９上に定義された約１８万の転写開始領域をリファレンス転写開始領域とした。【００４５】
ｉｉ）転写活性の定量
シーケンシングにより得られたリードとヒトのリファレンスゲノム(hg19)のアラインメントをbwa(Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60.)を用いて行った。マッピングクオリティが20以上、かつアラインメントの開始位置が、リファレンス転写開始領域内に位置するようなアラインメントだけを選択し、各転写開始領域ごとのリード数を数え上げた。各ライブラリーの総リード数と、RLE(Genome Biol. 2010;11(10):R106.)法により推定されたライブラリサイズを用いて、カウントを100万あたりのリード数(counts per million)に変換する。【００４６】
（６）結果
（Ａ）活性の異なる転写開始領域の抽出
上記で定量された、転写開始領域抽出・評価用各サンプルでの転写活性について、「再発あり」及び「再発なし」、又は「リンパ節転移あり」及び「リンパ節転移なし」の夫々から得られた各臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用いて行った。すなわち、二群間で発現量の平均が異なるかどうか（発現量の平均が等しいことを帰無仮説とし、この帰無仮説が真であることを仮定した場合、測定結果が偶然に起きる確率を計算する）を統計的に検定するものである。閾値としてＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）５％を設定したところ、これよりも小さな転写開始領域を含むＤＮＡを夫々同定した（表１−１〜１−２、表２−１〜２−３、表３−１〜３−３及び表４）。この基準は、該当する閾値により抽出される候補のうち95%は真に発現差があると統計的に推定されたものであり、通常広く使われるP値(発現差が無いことを仮定した場合に偶然起きる確率)を５%とする場合よりも厳しい基準である。【００４７】
【表１−１】
2015115545.tif 000002
【００４８】
【表１−２】
2015115545.tif 000003
【００４９】
【表２−１】
2015115545.tif 000004
【００５０】
【表２−２】
2015115545.tif 000005
【００５１】
【表２−３】
2015115545.tif 000006
【００５２】
【表３−１】
2015115545.tif 000007
【００５３】
【表３−２】
2015115545.tif 000008
【００５４】
【表３−３】
2015115545.tif 000009
【００５５】
【表４】
2015115545.tif 000010
【００５６】
（Ｂ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（１）
上記（Ａ）で同定された転写開始領域のうち、一つの発現レベルのみを用いて転移の有無、又は再発の有無を分類できるかどうかを考える。それぞれについて、何らかの閾値を設定することで、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できることを確認した。以下に、その閾値の例を示す（ある群における最大値の方が、その他の群における最小値よりも小さい場合、これらの平均を表５〜７に示している）。【００５７】
１：術前化学療法を行っていない乳がん患者の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【００５８】
【表５】
2015115545.tif 000011
【００５９】
３：病型がＴＮタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【００６０】
【表６】
2015115545.tif 000012
【００６１】
４：病型がＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【００６２】
【表７】
2015115545.tif 000013
【００６３】
（Ｃ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（２）
上記で同定された転写開始領域の発現レベルのうち、複数を用いて転移の有無、又は再発の有無を分類できるかどうかを考える。例としてここでは、一般化線形モデルの一種であるロジスティック回帰モデルを構成することを考える。これは、再発又はリンパ節転移の有無を示す従属変数（Ｙ）を、転写開始領域の発現レベルである説明変数（Ｘｉ、上記ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎの対数をとったもの）で確率的に予測することを考える場合、最もシンプルなモデルの一つである。【００６４】
上記の転写開始領域から選択した二個のすべての組み合わせについて、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関する再発又はリンパ節転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものを選択した（表８〜１１）。
ここでは、機械学習器の中でも最も単純なものの一つであるロジスティック回帰モデルを採用しているが、当該転写開始領域の発現を測定する方法や、他の遺伝子等の発現レベルや遺伝子型との組み合わせ等によって、他の数理モデルを適切に利用することで、より頑健な予測が可能になる。【００６５】
１：術前化学療法を行っていない乳がん患者の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【００６６】
【表８】
2015115545.tif 000014
【００６７】
２：病型がＴＮタイプであって術前化学療法を行っていない乳がん患者の再発リスクの評価のためのＤＮＡ【００６８】
【表９】
2015115545.tif 000015
【００６９】
３：病型がＴＮタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【００７０】
【表１０】
2015115545.tif 000016
【００７１】
４：病型がＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅタイプであってステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者のリンパ節転移の評価のためのＤＮＡ【００７２】
【表１１】
2015115545.tif 000017
【００７３】
実施例２  ＨＬＡ−ＤＱＡ１をマーカーとして用いた転移又は再発リスクの判別
（１）検体
術前に包括的同意を頂いた患者（病型がＴＮタイプであって、ステージが２ａ又は２ｂである乳がん患者）の手術摘出検体の一部を凍結保存したもののうち手術後３年が経過して再発あり（手術時にリンパ節転移あり）又は再発なし（手術時にリンパ節転移なし）と診断がなされている検体を使用した。【００７４】
（２）免疫化学染色によるタンパク質の検出
患者から分離した生体試料を速やかに凍結した後、組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けホルマリン固定したものを切片試料とした。次いで、抗ＨＬＡ−ＤＱＡ１抗体（ａｂｃａｍ社、「ａｂ１２８９５９」）（一次抗体、濃度0.5μg／ｍL）を１時間（20℃）反応させた。緩衝液にて十分に洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体(ニチレイバイオサイエンス  ＃４２４１４１)を用い、30分間（20℃）反応させた。緩衝液にて十分に洗浄後、ＤＡＢを用いて発色させた。細胞核をヘマトキシリンで弱く染色し、その標本を光学顕微鏡下で陽性・陰性を観察した。その一例を図１に示す。
その結果、再発・転移あり／再発・転移なしの間で染色パターンが異なり、ＨＬＡ−ＤＱＡ１をマーカーとして両者を区別可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、術前又は術中に採取した乳がんの原発巣を調べることで、乳がんの転移又は再発リスクの判断や予測を、客観的に行うことができる。これにより、医療分野や臨床検査分野へ貢献が期待できる。
【図１】
2015115545.tif 000022
【配列表】
2015115545000001.app
【国際調査報告】
2015115545.tif 000023
2015115545.tif 000024
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