(57)【要約】  本発明は、破骨細胞の融合を抑制する薬剤を提供し、骨破壊疾患に有用な予防剤又は治療剤を提供することを課題とする。  本発明は、前記課題の解決手段として、ネトリン１を含有する破骨細胞形成抑制剤を提供する。
2015072527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネトリン１を含有する破骨細胞形成抑制剤。
【請求項２】
ネトリン１を含有する破骨細胞多核化抑制剤。
【請求項３】
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療用である、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項４】
骨粗鬆症の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の抑制剤。
【請求項５】
経血管投与剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞形成抑制剤に関し、詳細にはネトリン１を含有する破骨細胞多核化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネトリン１（Ｎｅｔｒｉｎ−１）は、神経細胞の軸索を誘導する軸索ガイダンス分子として見出されたタンパク質であり（Ishii et al, Neuron 1992：非特許文献１）、現在も研究が進められており、様々な役割を有することが徐々に明らかになってきている。【０００３】
特許文献１においては、ネトリン１は滑膜線維芽細胞の遊走抑制作用を有し、軟骨欠損の予防又は治療に用い得ることが示唆されている。しかしながら、ネトリン１の実際のその効果は顕著ではないことが記載され（同特許文献［0133］）、また、軟骨欠損および変性疾患には骨粗鬆症が含まれないと記載されている、（同特許文献［0047］）。  破骨細胞に作用する薬剤としては、ビスフォスフォネートや抗RANKLモノクローナル抗体が知られている。ビスフォスフォネートは、破骨細胞の動員、分化、接着、生存を阻止する。抗RANKLモノクローナル抗体は、RANK/RANKLシグナルによる破骨細胞の分化、増殖を阻止する。これら薬剤は骨粗鬆症治療剤として用いられているが、顎骨壊死等の副作用があると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３９１２３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ishii et al, Neuron 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、破骨細胞の融合を抑制する薬剤を提供し、骨破壊疾患に有用な予防剤又は治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
破骨細胞は大型で樹枝状の運動性細胞である。骨髄由来の単球系細胞が分化・融合して破骨細胞になることが知られており、このため、破骨細胞は数個から数十個の核を有する多核巨細胞である。【０００８】
本発明者らは、驚くべき事に、ネトリンファミリーの中で、ネトリン１が特異的に骨芽細胞・滑膜細胞に発現していること、また、多核細胞となるための融合を抑制することで破骨細胞形成を阻害すること、を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。なお、ネトリンファミリーの中でもネトリン１が特異的に破骨細胞の形成過程における融合を抑制し多核細胞化を抑制するという点については、上記特許文献１には全く示唆されていない。【０００９】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ネトリン１を含有する破骨細胞形成抑制剤。
項２．
ネトリン１を含有する破骨細胞多核化抑制剤。
項３．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療用である、請求項１又は２に記載の抑制剤。
項４．
骨粗鬆症の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の抑制剤。
項５．
経血管投与剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の抑制剤。【００１０】
更に、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１Ａ．
破骨細胞形成抑制方法であって、これを必要とする対象にネトリン１を投与することを含む方法。
項２Ａ．
破骨細胞多核化抑制方法であって、これを必要とする対象にネトリン１を投与することを含む方法。
項３Ａ．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療方法である、項１Ａ又は２Ａに記載の方法。
項４Ａ．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患が骨粗鬆症である、項３Ａに記載の方法。
項５Ａ．
ネトリン１が経血管投与される、項１Ａ〜４Ａのいずれかに記載の方法。【００１１】
更に、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１Ｂ．
破骨細胞形成抑制のためのネトリン１の使用。
項２Ｂ．
破骨細胞多核化抑制のためのネトリン１の使用。
項３Ｂ．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療のためのものである、項１Ｂ又は２Ｂに記載の使用。
項４Ｂ．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患が骨粗鬆症である、項３Ｂに記載の使用。
項５Ｂ．
ネトリン１が経血管投与される、項１Ｂ〜４Ｂのいずれかに記載の使用。【００１２】
更に、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１Ｃ．
破骨細胞形成抑制剤の製造におけるネトリン１の使用。
項２Ｃ．
破骨細胞多核化抑制剤の製造におけるネトリン１の使用。
項３Ｃ．
破骨細胞形成抑制剤、又は破骨細胞多核化抑制剤が、破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療用医薬である、請求項１Ｃ又は２Ｃに記載の使用。
項４Ｃ．
破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患が骨粗鬆症である、請求項３Ｃに記載の使用。
項５Ｃ．
前記剤又は前記医薬が経血管投与剤である、請求項１Ｃ〜４Ｃのいずれかに記載の抑制剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抑制剤により、破骨細胞の融合を抑制することができ、破骨細胞の形成を抑制することができる。よって、本発明の抑制剤により、特に破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患を予防及び／又は治療することができる。特に、骨粗鬆症等の予防及び／又は治療に有用である。また、本発明の阻害剤は、破骨細胞の分化に影響を与えることなく融合のみを特異的に抑制することができる（すなわち、分化に関わる転写因子の活性及びそれらの標的遺伝子の発現状態に影響を与えることなく作用する）ため、副作用がほとんどないことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウスの骨芽細胞（Osteoblast）、滑膜線維芽細胞（Synovial fibroblast）、マクロファージ（Macrophage）、又は破骨細胞（Osteoclast）から調製したＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ネトリンファミリーの各遺伝子の発現レベルを調べ、骨芽細胞におけるネトリン１の発現量を１としたときの相対発現比を示したグラフである。
【図２】単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を各濃度のネトリン１及び５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（receptor activator of nuclear factor-κB ligand）が添加された培地で培養し、３日後にＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓ（ＴＲＡＰポジティブ多核細胞）の数を測定した結果を示すグラフである。ネトリン１の濃度に応じて破骨細胞（ＴＲＡＰポジティブ多核細胞）の形成が抑制されることがわかる。
【図３】単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を各濃度のネトリン１及び５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬが添加された培地で培養した後、ＴＲＡＰ染色、及び吸収窩（resorption pit）の形成状況の確認を行った結果を示す写真である。
【図４】ＭＤＭの培養スケジュールを示す図である。
【図５】図４に示すスケジュールでＭＤＭを培養した後、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数の測定した結果を示すグラフである。
【図６】Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地でヒト単球を５日間培養し、その後、ヒトネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地にて４日間培養した後、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数を測定した結果を示すグラフである。ネトリン１により、破骨細胞の形成が抑制されていることがわかる。
【図７】Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地でヒト単球を５日間培養し、その後、ヒトネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地にて４日間培養した後、ＴＲＡＰ染色を行った結果を示す写真である。ネトリン１により、破骨細胞の形成が抑制されていることがわかる。
【図８】ネトリン１の濃度を４００ｎｇ／ｍｌとし、ＲＡＮＫＬと同時に刺激を行って経時的に観察を行い、図２のデータを取得した際と同様にして、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数を測定した結果を示すグラフである。ネトリン１により、破骨細胞の形成が抑制されていることがわかる。
【図９】ネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及び各種濃度のＲＡＮＫＬを添加した培地でＭＤＭを培養し、４日後にＴＲＡＰポジティブの細胞の核数を計測した結果を示すグラフである。ネトリン１により、破骨細胞の多核化が抑制されていることがわかる。
【図１０】ネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（６０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地でＭＤＭを培養し、破骨細胞の分化マーカーとして既に知られている分子の発現量（相対比）をリアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
【図１１】１２週齢マウスに対して卵巣切除手術又は偽手術を行い、閉経後骨粗鬆症モデルマウス及びその対照マウスを作製し、ネトリン１を投与した。ネトリン１投与スケジュールを示す図である。
【図１２】図１１のスケジュールに従って調製された各マウスの大腿骨をマイクロＣＴスキャナで解析した結果を示す写真である。ネトリン１により骨粗鬆症が改善されていることが分かる。
【図１３】図１１のスケジュールに従って調製された各マウスの大腿骨における骨量／組織容量（ＢＶ／ＴＶ）及び子宮重量（Uterine weight）を解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、ネトリン１を含有する破骨細胞形成抑制剤に係り、より詳細にはネトリン１を含有する破骨細胞多核化抑制剤に係る。
【００１７】
本明細書における「ネトリン１」は、各種生物のネトリン１（好ましくは脊椎動物のネトリン１、より好ましくは哺乳動物のネトリン１）であり、特にヒトネトリン１と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、及び遺伝子組換え法により得られたものを含む。天然由来のネトリン１は、各種生物より種々の方法で抽出、精製することができる。遺伝子組換え法によるネトリン１としては、大腸菌などの細菌類、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものを用いることができる。遺伝子組み換え法により得られるネトリン１としては、破骨細胞多核化抑制作用を有する限り、ネトリン１の変異体や断片等も包含する。例えば、ネトリン１のアイソフォーム、スプライシングバリアント、変異体（点変異、挿入変異、欠失変異を含む）、誘導体や、ネトリン１前駆体タンパク質から切断されたタンパク質、ネトリン１遺伝子と他の遺伝子とが融合して発現したタンパク質等も包含される。好ましいネトリン１の具体例としては、以下の（ａ）及び（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）各種生物のネトリン１の全長アミノ酸配列からなるタンパク質（すなわち、各種生物の全長ネトリン１タンパク質）
（ｂ）各種生物のネトリン１の全長アミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ破骨細胞多核化抑制作用を有するタンパク質
各種生物のネトリン１の全長アミノ酸配列は、公知のネトリン１の全長アミノ酸配列であれば、特に限定はされない。好ましいものとして、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ等のネトリン１の全長アミノ酸配列が例示できる。ヒトネトリン１の全長アミノ酸配列例を配列番号１として、また、マウスネトリン１の全長アミノ酸配列例を配列番号２として、配列表に示す。
【００１８】
なお、（ｂ）における１若しくは複数個とは、１〜１００個が好ましく、１〜７５個がより好ましく、１〜５０個がさらに好ましく、１〜３０個がよりさらに好ましく、１〜２０個がなお好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個が特に好ましい。
【００１９】
また、（ｂ）のタンパク質の好ましい具体例として、次の（ｂ−１）〜（ｂ−６）を挙げることができる。
（ｂ−１）：配列番号３（配列番号１の２８〜６０４番目）のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ−２）：配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、より特に好ましくは９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなり、破骨細胞多核化抑制作用を有するタンパク質
（ｂ−３）：配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、より特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、破骨細胞多核化抑制作用を有するタンパク質
（ｂ−４）：配列番号４（配列番号２の２２〜６０４番目）のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ−５）：配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、より特に好ましくは９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなり、破骨細胞多核化抑制作用を有するタンパク質
（ｂ−６）：配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、より特に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、破骨細胞多核化抑制作用を有するタンパク質
本発明は、ネトリンファミリーの中でも、ネトリン１のみが骨芽細胞及び滑膜線維芽細胞に発現しており、ネトリン１により破骨細胞の融合が抑制されるという新規な知見に基づいてなされたものである。本発明の破骨細胞形成抑制剤はネトリン１を含有することから、破骨細胞が融合して多核化するのを抑制し、ひいては破骨細胞の形成を抑制することができる。このために、破骨細胞の亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び・又は治療のために有用である。
【００２０】
当該骨破壊疾患としては、破骨細胞の亢進に起因することが知られている骨破壊疾患であれば特に限定はされないが、例えば骨粗鬆症（加齢性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症など）、糖尿病性骨減少症、腎性骨異栄養症、関節リウマチの骨破壊、廃用症候群に伴う骨量減少、骨髄炎に伴う骨破壊、歯周病による骨破壊や骨量減少、痛風性関節炎に伴う骨破壊、チェルビズムによる骨破壊、感染性関節炎に伴う関節破壊、真珠腫性中耳炎による骨破壊等が例示できる。なかでも、骨粗鬆症が好ましい。
【００２１】
本発明のネトリン１を含有する破骨細胞形成抑制剤又は破骨細胞多核化抑制剤（以下、「本発明の抑制剤」ともいう）は、本発明の効果が発揮される限りその形態は制限されないが、経血管投与剤であることが好ましい。すなわち、血管を通して投与される剤形であることが好ましい。例えば、注射剤、点滴剤、輸液剤が例示できる。
【００２２】
ネトリン１はタンパク質であるため、本発明の抑制剤はタンパク質製剤の形態を好ましく包含しており、これは公知のタンパク質製剤と同様にして調製することができる。特に調製方法が限定されるわけではない。
【００２３】
例えば、本発明の抑制剤は、ネトリン１の他、薬理学的に許容される担体を含み得、またさらに等張化剤、アミノ酸、界面活性剤、含硫還元剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、無痛化剤、緩衝剤、又はこれらの組み合わせを含有してもよい。これらを混合することにより、本発明の抑制剤を調製することができる。
【００２４】
薬理学的に許容される担体としては、水（特に注射水）が好ましく例示できる。なお、注射水は用時添加してもよく、その場合本発明の抑制剤は乾燥製剤であり得る。
【００２５】
等張化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノースなどの糖類が挙げられる。これらの等張化剤は単独で使用してもよく、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２６】
アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、アスパラギン酸 、グリシン、セリン、バリンが挙げられる。これらのアミノ酸は単独で使用してもよく、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。これらの界面活性剤は単独で使用してもよく、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２８】
含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。これらの含硫還元剤は単独で使用してもよく、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらに、酸化防止剤として通常添加される、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩；も挙げられる。これらの酸化防止剤は単独で使用してもよく、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
ｐＨ調整剤を添加することにより、ｐＨを調整することができる。本発明の抑制剤のｐＨは、好ましくは４〜８であり、さらに好ましくは５〜７．５である。しかしながら、ｐＨはこれらに限定されるものではない。
【００３１】
このような成分を、溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液又はそれらの混合物に溶解し、その水性緩衝液を用いて、溶液製剤が調製される。水性緩衝液としては、リン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）；クエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）；及び、酢酸緩衝液；などが挙げられる。特に制限はされないが、緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜５０ｍＭである。
【００３２】
本発明の抑制剤におけるネトリン１の含有割合は特に制限されず、例えば０．１質量％〜９９．９質量％、より好ましくは１〜５０質量％程度が例示できる。
【００３３】
本発明の抑制剤の投与量としては、本発明の効果が奏されるよう、患者の重傷度や性別、年齢等に応じて適宜設定することができる。
【００３４】
なお、本発明は、本発明の抑制剤を投与することにより、破骨細胞亢進に起因する骨破壊疾患の予防及び／又は治療する方法も包含する。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。【００３６】
なお、実験に用いた試験材料について、次に記載する。滑膜線維芽細胞（Synovial fibroblast）は、ＤＢＡ／１Ｊ雌マウス（日本ＳＬＣ（株）より購入）から、Gao, B., et. al., Arthritis Res Ther 8, R172 (2006).の記載に従って作製したコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウスから採取した。単球由来マクロファージ（monocyte-derived macrophage；ＭＤＭ）は、Maruyama, K., et al. J Immunol 177, 3799-3805 (2006).の記載に従って調製した。各タンパク質は次のものを用いた。マウスＲＡＮＫＬ (462-TR, R&D Systems)、マウスＭ−ＣＳＦ(315-02, PeproTech)、マウスネトリン１ (1109-N1, R&D Systems)、ヒトネトリン１ (ALX-522-100, Enzo Life Sciences)。なお、当該マウスネトリン１は、配列番号４のアミノ酸配列からなる。また、当該ヒトネトリン１は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。なお、以下特に断らない限り、用いた生体由来試験材料はマウス由来である。【００３７】
ネトリンファミリーの発現部位の検討
マウスの骨芽細胞（Osteoblast）、滑膜線維芽細胞（Synovial fibroblast）、マクロファージ（Macrophage）、又は破骨細胞（Osteoclast）から調製したＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ネトリンファミリーの各遺伝子の発現レベルを調べた。骨芽細胞におけるネトリン１の発現量を１としたときの相対発現比を図１に示す。ネトリン１のみ、骨芽細胞及び滑膜線維芽細胞で発現していることが確認できた。また、ネトリン１も、マクロファージ及び破骨細胞では発現していないこともわかった。【００３８】
ネトリン１による破骨細胞形成抑制の検討
＜検討１＞
単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を各濃度のネトリン１及び５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ（receptor activator of nuclear factor-κB ligand）が添加された培地（基本組成：α−ＭＥＭに１０％ＦＣＳを添加）で培養（培地下にbone resorption assay plates（岩井化学薬品（株））設置）３日後にＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓ（tartrate- resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells；ＴＲＡＰポジティブ多核細胞）の数を測定した。TRAP（酒石酸耐性酸ホスファターゼ）は、破骨細胞のマーカーの一つである。また、結果を図２（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４）に示す。なお、ＴＲＡＰ染色は、TRAP/ALP Stain kit（和光純薬工業株式会社）を用いて行い、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの計測は、ＴＲＡＰ陽性の３核以上の細胞数を顕微鏡下で数えることで行った。【００３９】
＜検討２＞
上記検討１における各条件下での培養後、ＴＲＡＰ染色、及び吸収窩（resorption pit）の形成状況の確認を行った。なお、ＴＲＡＰ染色は、TRAP/ALP Stain kit（和光株式会社）を用いて行った。結果を図３に示す。図３の下段（Pit formation）の黒矢印が吸収窩部位を示す。【００４０】
＜検討３＞
検討１とは異なる培養条件でＭＤＭの培養を行い、６日後にＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数を測定した。具体的には、４種の培養条件１〜４を用意し、いずれの条件においても、Ｍ−ＣＳＦ（Macrophage colony-stimulating factor）（２５ｎｇ／ｍｌ）を常に培地に添加し、ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を３日目以降培地に添加し、培養条件１〜４でネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）を加える日数を変化させた（図４参照）。ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数の測定結果を図５（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４）に示す。【００４１】
＜検討４＞
Ｍ−ＣＦＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地でヒト単球を５日間培養し、その後、ヒトネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地にて４日間培養した後、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数を測定した。なお、ネトリン１の対照としてＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を用いた。当該測定結果を図６（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４）に示す。また、検討２と同様にＴＲＡＰ染色を行った結果を図７に示す。【００４２】
以上の検討１〜４から、ネトリン１を加えることにより、破骨細胞の形成が抑制されることがわかった。【００４３】
ネトリン１による破骨細胞融合抑制の確認
ネトリン１の濃度を４００ｎｇ／ｍｌとし、ＲＡＮＫＬと同時に刺激を行って経時的に観察を行い、上記検討１と同様にして、ＴＲＡＰ＋ＭＮＣｓの数を測定した。また、ネトリン１の対照としてＰＢＳを用いた。結果を図８（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）に示す。【００４４】
また、ネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及び各種濃度のＲＡＮＫＬを添加した培地でＭＤＭを培養し、４日後にＴＲＡＰポジティブの細胞の核数を計測した。結果を図９（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４）に示す。【００４５】
これらの結果から、ネトリン１が破骨細胞の多核化（すなわち融合）を抑制することがわかった。【００４６】
またさらに、ネトリン１（４００ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（６０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地でＭＤＭを培養し、ＲＡＮＫＬ添加後０時間、３６時間、及び７２時間の時点において、破骨細胞の分化マーカーとして既に知られている分子の発現量（相対比）をリアルタイムＰＣＲにより測定した。なお、対照として、ネトリン１の代わりにＰＢＳを添加した実験も併せて行った。結果を図１０に示す。図１０に記載される各グラフの上に記載しているのが、分子マーカー名である。
当該結果から、ネトリン１の添加の有無によっては分子マーカーの発現量は変らないこと、従ってネトリン１は破骨細胞への分化は抑制しないことがわかった。【００４７】
以上の結果から、ネトリン１は、破骨細胞への分化は抑制せず、多核化（すなわち融合）を抑制することにより、破骨細胞の形成を抑制していることがわかった。【００４８】
ネトリン１による骨破壊疾患の回復の検討
１２週齢マウスに対して卵巣切除手術（ＯＶＸ）又は偽手術（Ｓｈａｍ）を行い、閉経後骨粗鬆症モデルマウス及びその対照マウスを作製した。手術から３週間（すなわち１５週齢まで）、図１１に示すスケジュールにて飼育し、屠殺した。なお、図１１に示すように、閉経後骨粗鬆症モデルマウスには、１０μｇ／ｈｅａｄ／０．５週の条件でネトリン１又はＰＢＳを静脈注射した。【００４９】
屠殺後、大腿骨及び子宮を摘出し、大腿骨についてはマイクロＣＴスキャナで解析した。スキャン画像を図１２に示す。また、それぞれのマウスの大腿骨における骨量／組織容量（ＢＶ／ＴＶ）及び子宮重量（Uterine weight）を解析した。結果を図１３（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４）に示す。【００５０】
以上の結果から、ネトリン１は骨粗鬆症を改善する効果を有していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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