(57)【要約】  本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドを免疫原として用いたIL-17Aに対するワクチン、及び該ワクチンを含み、IL-17Aが増悪因子として関連する疾患の予防又は治療剤等を提供する。
2015099167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患の予防または治療用ワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項２】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、請求項１に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項３】
発現ベクターが、Ｂ型肝炎ウイルスコア（HBc）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
発現ベクターが、該（１）又は（２）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号：１７で示されるヌクレオチド配列の塩基番号：２４６と塩基番号：２４７の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項５】
キャリアタンパク質および／又はアジュバントを含む、請求項１−４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１−５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
以下の（１）または（２）を含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項１−６のいずれか１項に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（２）上記（１）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチである、請求項１−６のいずれか１項に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項９】
以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、請求項９に記載の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１１】
IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の予防または治療剤。
【請求項１２】
IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、請求項９−１１のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
【請求項１３】
IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチであり、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、請求項９−１１のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IL-17Aのエピトープを標的とするワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（SLE）は頭皮から足趾までの全身が侵されうる自己免疫疾患であり、種々の症状と多臓器が障害を受ける慢性炎症性疾患である。SLEの病態に関して、自己抗原と抗体との免疫複合体が各臓器に沈着して局所で炎症を惹起し、それが組織障害を引き起こして更なる自己免疫反応を招く、という悪循環が起きること、またその過程に１型インターフェロン等のサイトカインが関与していることが想定されているが、詳細は不明である。
また、SLE患者の多くは妊娠可能な年齢の女性であることから、女性ホルモンと病因との関連が疑われている。一方、北米では黒人女性の方が白人女性より有病率が高いとされており、遺伝的素因の存在が疑われているが、病因は依然として不明である。【０００３】
SLEの治療には、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、抗がん剤であるシクロフォスファミド等が用いられ、非特異的な免疫抑制作用によりSLEの病勢を抑制することができるものの、非特異的な免疫抑制作用により、感染症に罹患しやすくなる等の問題が存在する。しかも、副腎皮質ステロイドには高血圧症、糖尿病、脂質異常症、うつ等の副作用があり、シクロフォスファミドには骨髄抑制、発癌性、不妊症といった強い副作用がある。SLE患者の多くは妊娠可能な年齢の女性であるため、不妊症の問題は特に深刻である。
このような現状において、病態のより詳細な解明と、その病因に基づいた副作用の少ない分子特異的治療法の開発が望まれている。【０００４】
近年、SLE患者に対する臨床研究から、SLE患者の血中IL-17濃度が対照群と比較して有意に高いことが報告された（非特許文献１）。また、SLEに類似する病変が腎臓に認められるPP2Aトランスジェニックマウスにおいて、IL-17の血中濃度が上昇していること、該マウスにIL-17の中和抗体を投与すると、その腎病変が改善されたことが報告された（非特許文献２）。これらの知見から、一つの可能性として、SLEの病態では１型インターフェロンとIL-17が悪循環を形成し、その病変の進行に重要な役割を担っているという仮説が唱えられている（非特許文献３）。【０００５】
IL-17は、免疫担当細胞であるTh17細胞や、マクロファージ、好中球等から分泌されるサイトカインであり、関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、多発性硬化症、乾癬等多くの自己免疫疾患において、その病態の増悪に重要な役割を担っていることが明らかとなっている。
最近、乾癬患者に対して抗IL-17抗体医薬品が治療効果を示すことが報告された(非特許文献４)。しかし抗体医薬品は非常に高価であり、また継続使用の過程で抗体医薬品自身に対する自己抗体が産生され、有効性が失われる（二次無効）などの問題が知られるようになった。これらのことからIL-17を標的としたワクチンはこれらの疾患に有効であり、かつ安価で長期に渡り有効な治療剤となるものと考えられる。
IL-17に対するワクチンとしては、IL-17全長を免疫原としたペプチドワクチンの研究が報告されている（非特許文献５）。しかし、全長を免疫すると、IL-17に対する細胞性免疫も惹起され、細胞障害性T細胞によりIL-17を発現する細胞が攻撃され、有害な副作用が強く表れる危険性がある。また、IL-17に類似する他のサイトカインに交差反応を示す抗体も産生される危険性がある。そのため、他のタンパク質との相同性がないIL-17の一部分のエピトープだけを免疫原とするワクチンの方が安全面で望ましいと考えられる。そして、IL-17のエピトープワクチンを２種類作製して炎症性腸疾患モデルマウスに投与したとの報告がなされた（非特許文献６）。ところが、該報告では、ワクチン投与群で病態が改善されるのではなく、むしろ増悪し、大腸の炎症やコラーゲン沈着の増加が認められた。
このように、IL-17に対するエピトープワクチンについての報告は存在するものの、該ワクチンにより、何らかの疾患の治療効果が示されたという報告は、出願人の知る限り、皆無である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Immunology, 2009, 10(7):778-785
【非特許文献２】J Immunology, 2012, 188(8):3567-3571
【非特許文献３】Eur J Immunology 2012, 42(9):2274-2284
【非特許文献４】J Dermatol 2014; 41: 1039-1046
【非特許文献５】Eur J Immunology 2006, 36(11):2857-2867
【非特許文献６】Immunotherapy, 2012, 4(12):1799-1807
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、IL-17Aに対するワクチン、及び該ワクチンを含み、SLEのようにIL-17Aが病態の増悪に関与している疾患の治療及び／又は予防剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意工夫を重ねた結果、IL-17Aの構造から、IL-17A受容体への結合に重要なアミノ酸部位を特定した。そして、該アミノ酸部位の一部を抗原とし、それをコードするポリヌクレオチドを、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするベクターに挿入してDNAワクチンを作製した。該DNAワクチンをSLEモデルマウスであるNZBWF1マウスに投与したところ、抗体価の高い上昇を認め、該抗体と組み換えIL-17Aとの結合実験により、IL-17Aを正しく認識する抗体が産生されたことを確認した。また、該DNAワクチンを投与した、別のSLEモデルマウスであるMRL/lprマウスでの血中TNF-α、NZBWF1マウスでの血中IL-1βの低下をそれぞれ認めた。さらに、NZBWF1マウスの該DNAワクチン投与群の長期観察の結果、該DNAワクチン投与群での生存期間の有意な延長を認めた。またNZBWF1マウスの腎臓の病理所見の改善やF4/80発現の低下、MRL/lprマウスの脾臓重量の減少を認め、該DNAワクチンによるSLE病態の改善効果が確認できた。
また、本発明者らは、大腸炎モデルマウス、関節炎モデルマウス、大腸癌移植マウス、肺癌移植マウスにおいても、該DNAワクチンや該DNAによってコードされるペプチドワクチンを投与することによって、病態を改善できることを確認した。
そして、驚くべきことに、本発明者らは、本発明で見出されたワクチン投与群では、従来報告されていたIL-17のエピトープワクチンで観察されるような、病態の増悪が見られないことを確認した。
本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は下記に関するものである。
［１］以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患の予防または治療用ワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター、
［２］以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、［１］のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター、
［３］発現ベクターが、B型肝炎ウイルスコア（HBc）をコードするヌクレオチド配列を含む、［１］又は［２］のワクチン、
［４］発現ベクターが、該（１）又は（２）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号：１７で示されるヌクレオチド配列の塩基番号：２４６と塩基番号：２４７の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む、［１］又は［２］のワクチン、
［５］キャリアタンパク質および／又はアジュバントを含む、［１］−［４］のワクチン、
［５−１］［１］−［５］のいずれかのワクチンを含む組成物、
［６］IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、［１］−［５］のワクチン、
［７］以下の（１）又は（２）を含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、［１］−［６］のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（２）上記（１）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター、
［８］以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチである、［１］−［６］のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター、
［９］以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、IL-17Aが増悪因子として関与する疾患の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
［１０］以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、［９］の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［１０−１］IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、脳脊髄炎、腫瘍（非小細胞性肺癌、大腸癌、血球系腫瘍などを含むIL-17Aが増悪に関与する種々の腫瘍性疾患）、動脈硬化症、慢性炎症性疾患、及び、アレルギー疾患（遅延型過敏症、接触型過敏症）からなる群から選択される、［９］又は［１０］の予防または治療剤、
［１１］IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、［９］又は［１０］の予防または治療剤、
［１１−１］IL-17Aが憎悪因子として関与する疾患がSLEである、［９］又は［１０］の予防または治療剤、
［１２］IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、［９］−［１１］の予防または治療剤、
［１３］ IL-17Aが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチであり、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、［９］−［１１］の予防または治療剤、
［１４］配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［１４−１］［１４］をコードするポリヌクレオチド、
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のワクチンは、SLEのようにIL-17Aが病態の増悪因子として関与する疾患の治療等に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】IL-17Aエピトープを含む発現ベクターの構造を示す。Ａ）pcDNA3.1+HBcベクターの構造、Ｂ）Hbcの240番目と241番目の塩基の間にスペーサー及びIL-17Aの部分配列をコードする配列を挿入したベクターの構造、Ｃ）前記ＢのベクターにIL-17Aのエピトープを挿入した模式図、を示す。
【図２】組み換えIL-17Aタンパク質とIL-17A1 DNAワクチン（エピトープ配列：RPSDYLNR）又はIL-17A2 DNAワクチンで免疫したBalb/cマウスの血清由来の抗体との結合を示す。Ａ）１次抗体としてIL-17A1 DNAワクチン投与によって得られた抗血清を用いた。Ｂ）１次抗体として抗IL-17A抗体を用いた。Ｃ）１次抗体として抗BSA抗体を用いた。
【図３】IL-17A1 DNAワクチンで免疫したBalb/cマウスの第６週における抗体価の上昇を示す。No1〜No4の１次抗体(マウス抗血清)を、10倍希釈し、さらに10倍毎に段階的に希釈して用いた。No1:IL-17A1 No1 antisera, No2:IL-17A1 No2 antisera, No3:IL-17A1 No3 antisera, No4:IL-17A1 No4 antisera
【図４】Ａ）NZBWF1マウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与プランを示す。Ｂ）IL-17A1 DNAワクチン投与群での抗体価の上昇を示す。
【図５】IL-17A1 DNAワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清とBSA-IL-17A1(RPSDYLNR)コンジュゲート(No5 BSA conjugate)又はマウス組み換えIL-17A(No5 rIL-17)との結合を示す。１次抗体(マウス抗血清)を、100倍希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。
【図６】IL-17A1 DNAワクチンを投与したNZBWF1マウスまたはMRL/lprマウスの、Ａ）尿タンパク質(NZBWF1マウス)、Ｂ）尿中MCP-1濃度（pg/ml）(NZBWF1マウス)、Ｃ）血中IL-17A濃度（pg/ml）(NZBWF1マウス)、Ｄ）血中TNF-α濃度（pg/ml）(MRL/lprマウス)、Ｅ）血中IL-1β濃度（pg/ml）(NZBWF1マウス) 、Ｆ）血中TNF-α濃度（pg/ml）(NZBWF1マウス)を示す。
【図７】Ａ）IL-17A1 DNAワクチンを投与したNZBWF1マウスの生存率（図中矢印は、ワクチン投与を意味する）、Ｂ）抗IL-17A1抗体価を示す。
【図８】IL-17A1 DNAワクチンを投与したMRL/lprマウスの、Ａ）血中TNF-α濃度（pg/ml）、Ｂ）生存率（図中矢印は、ワクチン投与を意味する）を示す。
【図９】IL-17A1 DNAワクチンを投与したMRL/lprマウスの、Ａ）体重（ｇ）、Ｂ）全体重当たりの心臓重量の割合、Ｃ）脾臓重量（ｍｇ）、Ｄ）全体重当たりの脾臓重量の割合、を示す。
【図１０】病理組織の解析プランを示す。Ａ）NZBWF1マウスへのIL-17A1 DNAワクチン、Saline投与プラン、Ｂ）MRL/lprマウスへのIL-17A1 DNAワクチン、Saline投与プランを示す。
【図１１】NZBWF1マウス又はMRL/lprマウスへ、IL-17A1 DNAワクチン又はSalineを投与した後の腎臓の、Ａ）PAS染色の写真（弱拡大）、Ｂ）PAS染色の写真（強拡大）、Ｃ）F4/80の免疫染色の写真（NZBWF1マウス）、Ｄ）F4/80の免疫染色の写真（MRL/lprマウス）を示す。
【図１２】NZBWF1マウスへ、IL-17A1 DNAワクチン又はSalineを投与した後の顎下腺のHE染色の写真を示す。
【図１３】NZBWF1マウス又はMRL/lprマウスへ、IL-17A1 DNAワクチン又はSalineを投与した後の肝臓のHE染色の写真を示す。
【図１４】Ａ）Balb/cマウスへのTNBS投与とIL-17A1 DNAワクチン投与プランを示す。また、TNBSとIL-17A1 DNAワクチン又はSalineを投与したBalb/cマウスの、Ｂ）体重の増加割合（％）、Ｃ）大腸の長さ（ｍｍ）、Ｄ）大腸のHE染色の写真、Ｅ）大腸のHEスコアを示す。
【図１５】Ａ）DBA/1マウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与とType IIコラーゲン投与のプランを示す。また、IL-17A1 DNAワクチン又はSalineとType IIコラーゲンを投与したDBA/1マウスの、Ｂ）関節炎の臨床スコア、Ｃ）関節の写真を示す。
【図１６】Ａ）Balb/cマウスへのIL-17A1 ペプチドワクチン投与とCT26細胞接種のプランを示す。また、IL-17A1 ペプチドワクチン又はSalineを投与し、CT26細胞を接種したBalb/cマウスの、Ｂ）腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｃ）生存率を示す。
【図１７】Ａ）C57 BL/6マウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与とLLC細胞接種のプランを示す。また、IL-17A1 DNAワクチン又はSalineを投与し、LLC細胞を接種したC57 BL/6マウスの、Ｂ）体重（ｇ）、Ｃ）腫瘍体積（ｍｍ３）、Ｄ）LLC細胞接種２８日後の腫瘍重量（ｍｇ）、Ｅ）肺転移の写真像、Ｆ）癌の肺転移数（個）、Ｇ）癌の肝転移数（個）を示す。
【図１８】ヒトIL-17A1エピトープ（配列番号：１）からなるぺプチドを含むワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清(IL-17 Human)又はワクチン投与前の血清(Preimmune)とBSA-ヒトIL-17A1コンジュゲートとの結合を示す。１次抗体(マウス抗血清)を、10倍に希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。
【図１９】Ａ）ヒトIL-17A1エピトープ（配列番号：１）からなるぺプチドを含むワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清とBSA-ヒトIL-17A1コンジュゲート(No Y11-5weeks Human)、又はBSA-マウスIL-17A1コンジュゲート(No Y11-5weeks Mouse)との結合を示す。また、ワクチン投与前の血清とBSA-ヒトIL-17A1コンジュゲート(No Y11 Pre Human)、又はBSA-マウスIL-17A1コンジュゲート(No Y11 Pre Mouse) との結合を示す。１次抗体(マウス抗血清)を、10倍に希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。Ｂ）マウスIL-17A1エピトープ（配列番号：５）からなるぺプチドを含むワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清とBSA-マウスIL-17A1コンジュゲート(No G8-5weeks Mouse)、又はBSA-ヒトIL-17A1コンジュゲート(No G8-5weeks Human)との結合を示す。また、ワクチン投与前の血清とBSA-マウスIL-17A1コンジュゲート(No G8 Pre Mouse)、又はBSA-ヒトIL-17A1コンジュゲート(No G8 Pre Human) との結合を示す。１次抗体(マウス抗血清)を、10倍に希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。
【図２０】ヒトIL-17A2エピトープ（配列番号：８）からなるぺプチドを含むワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清とBSA-ヒトIL-17A2コンジュゲート(No AF975) との結合、またはヒトIL-17A3エピトープ（配列番号：９）からなるぺプチドを含むワクチンで免疫したマウスから得られた抗血清とBSA-ヒトIL-17A3コンジュゲート(No AF976)との結合を示す。１次抗体(マウス抗血清)を、10倍に希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。
【図２１】ヒトIL-17A4エピトープ（配列番号：１１）からなるぺプチドを含むワクチン、ヒトIL-17A5エピトープ（配列番号：１２）をコードするDNAを含むワクチン、ヒトIL-17A6エピトープ（SDY）をコードするDNAを含むワクチンまたはヒトIL-17A7エピトープ（DYY）をコードするDNAを含むワクチンで免疫したBalb/cマウスの第６週における抗体価の上昇を示す。各１次抗体(マウス抗血清)を、10倍希釈し、さらに5倍毎に段階的に希釈して用いた。
【図２２】Ａ）DBA/1マウスへの各種IL-17A ペプチドワクチンとType IIコラーゲン投与のプランを示す。Ｂ）各種IL-17A ペプチドワクチンを投与し、Type IIコラーゲンを投与したDBA/1マウスの関節炎の臨床スコアを示す。H17: ヒトIL-17A1エピトープ, AF4: ヒトIL-17A4エピトープ, AF5:ヒトIL-17A2エピトープ, Control(KLH):KLH, Collagen(-):Type IIコラーゲン非投与
【図２３】培地中の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）が分泌するIL-6濃度をELISAで測定した結果を示す。IL-17(-) control：IL-17非添加, IL-17 only：組み換えヒトIL-17A添加, IL-17+antisera：組み換えヒトIL-17Aおよび抗ヒトIL-17A1マウス抗体, IL-17+antisera：組み換えヒトIL-17Aおよび非免疫マウス抗体
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、IL-17Aに対するワクチン、及び該ワクチンを含み、SLEのようにIL-17Aが病態の増悪因子として関与する疾患の治療及び／又は予防剤等を提供する。
【００１３】
ワクチン
本発明のIL-17Aに対するワクチン（エピトープワクチンともいう）は、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される。
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
その中でも、本発明のIL-17Aに対するワクチンは、好ましくは、以下の（１’）〜（３’）からなる群より選択される。
（１’）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２’）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（３’）上記（１’）又は（２’）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
最も好ましい本発明のIL-17Aに対するワクチンは、以下の（１’’）または（２’’）からなる群より選択される。
（１’’）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２’’）上記（１’’）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【００１４】
IL-17Aが増悪因子として関与する疾患とは、IL-17Aにより病態が増悪されれば特に限定はない。例えば、SLE、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、脳脊髄炎、腫瘍（肺癌（その中でも非小細胞性肺癌が好ましい）、大腸癌、血球系腫瘍などを含むIL-17Aが増悪に関与する種々の腫瘍性疾患）、動脈硬化症、慢性炎症性疾患、及び、アレルギー疾患（遅延型過敏症、接触型過敏症等）等が挙げられ、好ましくは、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肺癌、大腸癌、乾癬、多発性硬化症が挙げられ、最も好ましくはSLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肺癌、大腸癌である。後述する実施例に記載の通り、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするDNAは、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肺癌、大腸癌に治療効果を示した。また、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに加えて、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするDNAも、関節リウマチに治療効果を示した。増悪とは、病態がさらに悪化することをいい、悪化の程度は問わない。
【００１５】
本発明のワクチンの投与対象は、任意の哺乳動物であって、IL-17Aが病態の増悪に関与している疾患を発症している哺乳動物又はそれを発症する虞のある哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類及びウサギ等の実験動物、イヌ及びネコ等のペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジ等の家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジー等の霊長類等が挙げられるが、好ましくはヒトである。投与対象は、治療を受けていても、受けていなくてもよい。
本発明のワクチンが投与される場合、該ワクチンに含まれる物質は、投与対象に由来する物質（すなわち、ヒトに投与する場合、該ワクチンはヒト由来の物質であり、マウスに投与する場合、該ワクチンはマウス由来の物質である）であることが好ましい。
【００１６】
本発明のワクチンに含まれる上記（１）（あるいは（１’）、（１’’）。以下同様）のポリペプチド（以下、上記（２）（あるいは（２’）。以下同様）のポリペプチドと併せて、本発明のポリペプチド、ともいう）は、IL-17Aの部分アミノ酸配列である。
本発明では、ヒトIL-17Aの６２〜６９番目のアミノ酸配列を配列番号：１とし、それに対応するマウスIL-17Aの６５〜７２番目のアミノ酸配列を配列番号：５とする。これらはそれぞれ、例えば、配列番号：２、配列番号：６で表されるヌクレオチド配列によりコードされる。また、ヒトIL-17Aの１０２〜１１８番目のアミノ酸配列を配列番号：８とし、それに対応するマウスIL-17Aの１０５〜１２１番目のアミノ酸配列を配列番号：１０とする。これらはそれぞれ、例えば、配列番号：１３、配列番号：１４で表されるヌクレオチド配列によりコードされる。
配列番号：１（配列番号：８）に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列としては、本明細書中の配列番号：１（配列番号：８）に開示された配列情報、公知の配列データベース等を利用して、適切なプライマーやプローブを設計し、ＲＴ−ＰＣＲ又はプラークハイブリダイゼーション等、通常の遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。
【００１７】
本発明のワクチンに含まれる上記（２）のポリペプチドは、IL-17Aアミノ酸配列の部分配列において１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列である。そのようなポリペプチドとしては、ヒトの場合、配列番号：１（配列番号：８）で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列も含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、(1)配列番号：１（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：１（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号：１（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：１（配列番号：８）に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わせられたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個））が含まれる。
【００１８】
また、上記（２）のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列としては、配列番号：１（配列番号：８）に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列の内、１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列も好ましく挙げることができる。
このようなポリペプチドとしては、マウスの場合、配列番号：５（配列番号：１０）で表されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列も含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、(1)配列番号：５（配列番号：１０）に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：５（配列番号：１０）に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号：５（配列番号：１０）に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：５（配列番号：１０）に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わせられたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、１又は数個（好ましくは１〜数（２〜５）個））が含まれる。
【００１９】
「アミノ酸残基の置換」としては、例えば、保存的アミノ酸置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、及び非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）等も挙げることができる。
【００２０】
「アミノ酸残基の欠失」としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることが挙げられる。そのようなアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１１、配列番号：１２、SDYまたはDYYが挙げられ、好ましくは、配列番号：１１、配列番号：１２が挙げられる。これらはそれぞれ、例えば、配列番号：１５、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２１】
「アミノ酸残基の挿入」又は「アミノ酸残基の付加」としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の内部、Ｎ末端側又はＣ末端側に、アミノ酸残基を挿入又は付加させることが挙げられる。ペプチドの水溶解性を増強するため、アミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側に塩基性アミノ酸であるアルギニン（Arg）又はリジン（Lys）を１〜２残基付加してもよい。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、付加的なアミノ酸を含んでもよい。このようなアミノ酸付加は、該ポリペプチドがIL-17Aに対する特異的免疫反応を誘導する限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることができる。タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、GFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を例示することができる。アミノ酸配列が付加される位置は、本発明のポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端である。
【００２３】
本発明のポリペプチドに用いられるアミノ酸はＬ体、Ｄ体及びＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体であることが好ましい。これらのポリペプチドは、通常のポリペプチド合成法により合成され、本発明に供することができるが、本発明においては、製造方法・合成方法、調達方法等については、特に限定されない。
【００２４】
上記（３）（あるいは（３’）、（２’’）。以下同様）の発現ベクターにおいて、上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA、好ましくはDNA）は、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に機能的に連結される。すなわち、（３）の発現ベクターは、プロモーターの制御下で、転写産物として（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る。（３）の発現ベクターを哺乳動物に投与し、該哺乳動物の体内で（１）又は（２）のポリペプチドが産生され、該哺乳動物に（１）又は（２）のポリペプチドに対する特異的免疫反応が誘導される。
【００２５】
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであればよく、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が用いられる。
【００２６】
上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有してもよい。
【００２７】
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を挙げることができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等が挙げられる。製造及び取り扱いの容易性や経済性を考慮すると、プラスミドベクターが好ましく用いられる。中でも、特に好ましくはB型肝炎ウイルスコア（以下、HBcという）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。これは、国際公開第２０１２／１４１２８０号等を参照することができる。
【００２８】
HBcは自己集合して球状になる性質を有し、該自己集合して形成されるコア粒子の外側に、IL-17Aエピトープがその構造を維持しながら安定に提示することができる。HBc及びIL-17Aエピトープは直接共有結合により連結されてもよいし、スペーサーを介して連結されてもよい。スペーサーは、HBcが自己集合して形成されるコア粒子の外側に、IL-17Aエピトープがその構造を維持しながら安定に提示されればよく、例えば、IT、GAT、CGG等が挙げられるが、これらに限定されない。該配列を含むプラスミドベクターとしては、pCAGGS、pCR-X8、pcDNA3.1、pZeoSV、pBK-CMV等が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、pcDNA3.1-HBcベクターが挙げられる。該ベクターは、HBcの80番目と81番目のアミノ酸に相当するHBcをコードするポリヌクレオチドの240番目と241番目の塩基の間にスペーサーを挿入している。従って、上記（３）の発現ベクターは、好ましくは、上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号：１７で示されるヌクレオチド配列の塩基番号：２４６と塩基番号：２４７の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。
【００２９】
本発明のワクチンは、上記（１）若しくは（２）のポリペプチド又は（３）の発現ベクターに加え、任意の担体、例えば、医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。
【００３０】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
さらに、本発明のワクチンが上記（３）の発現ベクターの場合、該発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明のワクチンは更に核酸導入用試薬を含むことができる。発現ベクターとしてウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、発現ベクターとしてプラスミドベクターを使用する場合には、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることができる。
【００３２】
本発明のワクチンは、上記（１）若しくは（２）のポリペプチド又は（３）の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの免疫原性を高めるために、キャリアタンパク質をさらに含んでもよい。キャリアタンパク質は、一般には、分子量が小さいために免疫原性を有さない分子に結合して免疫原性を付与する物質であり、当技術分野で公知である。キャリアタンパク質の例としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等が挙げられる。上記（３）の発現ベクターの場合は、上記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、該キャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【００３３】
本発明のワクチンはまた、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有してもよい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数の種々のアジュバントが当技術分野で公知である。アジュバントの例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（登録商標）、リゾレシチン、サポニン誘導体、プルロニックポリオール、モンタニドＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂａｙｏｌ（登録商標）及びＭａｒｋｏｌ（登録商標）。
【００３４】
本発明のワクチンは、経口又は非経口的に哺乳動物に対して投与することができる。ポリペプチドや発現ベクターは、胃の中で分解され得るので、非経口的に投与することが好ましい。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００３５】
医薬組成物中の有効成分の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明のワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、有効成分が上記（１）又は（２）のポリペプチドの場合は、通常成人１人当たりポリペプチドを、一回当たり１μg〜１０００μgの範囲、好ましくは２０μg〜１００μgの範囲で、通常４週間から１２週間に亘って、２回から３回投与し、抗体価が低下した場合にはその都度１回追加投与する。有効成分が上記（３）の発現ベクターの場合は、通常成人１人当たり発現ベクターを、一回当たり１μg〜１０００μgの範囲、好ましくは２０μg〜１００μgの範囲で、通常４週間から１２週間に亘って、２回から３回投与し、抗体価が低下した場合にはその都度１回追加投与する。
【００３６】
本発明のワクチンを哺乳動物へ投与することにより、IL-17Aに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が誘導され、該哺乳動物がIL-17Aに対する中和抗体を獲得し、IL-17Aの機能が阻害されることで、IL-17Aが増悪因子として関連する疾患に対する予防又は治療効果が発揮される。
【００３７】
本発明は、本発明のワクチンの１又は２以上の成分を包含する、１又は２以上の容器からなるキットを提供する。本発明のキットを用いても、IL-17が増悪因子として関連する疾患を予防する、あるいは、その症状を治療若しくは軽減する、ことができる。
【００３８】
IL-17Aが増悪因子として関連する疾患の予防又は治療用IL-17A中和抗体
本発明は、以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む、IL-17Aが増悪因子として関連する疾患の予防又は治療剤（本発明の予防又は治療剤）を提供する。
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
また、発明の予防又は治療剤は、好ましくは、以下の（１’）又は（２’）のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む。
（１’）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、または配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２’）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、または配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
最も好ましい発明の予防又は治療剤は、（１’’）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体を含む。
【００３９】
前記（１）又は（２）（あるいは（１’）、（２’）又は（１’’）。以下同様）のポリペプチドを認識する抗体は、IL-17Aに結合し、その機能を阻害することで、上述のIL-17Aが増悪因子として関連する疾患に対する有効な、予防及び／又は治療手段となり得る。すなわち、該抗体を投与することにより、IL-17Aが増悪因子として関連する疾患を発症した患者に対する治療効果、及び発症の虞のある対象に対する予防効果が期待できる。
上述のIL-17Aが憎悪因子として関連する疾患の中でも、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肺癌、大腸癌、乾癬、多発性硬化症、特に、SLE、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肺癌、大腸癌の予防及び／又は治療に本発明のIL-17A中和抗体を用いることができる。
【００４０】
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、トランスジェニックマウスや遺伝子組換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体、ヒト抗体産生遺伝子を導入したマウスやファージディスプレイ等により作製したヒト抗体、並びにこれらの断片等が含まれる。本発明の抗体は、それぞれ本発明のポリペプチドを認識し、IL-17Aの機能を阻害する抗体である限り特に限定されないが、IL-17Aに対する特異性の点からモノクローナル抗体であることが好ましい。あるいはヒトへの臨床応用の点から、本発明の抗体はヒト化抗体又はヒト抗体であることが好ましい。
【００４１】
上記抗体断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ領域を含む抗体断片、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）、ｄＡｂ（single domain antibody）等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００４２】
上記ヒト化抗体とは、抗原認識部位のみヒト以外の遺伝子を由来とし、かつ残りの部位をヒト遺伝子由来として、遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体のことをいう。また上記ヒト抗体とは、ヒト抗体産生遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（例、TransChromo Mouse（商標））が産生するヒト抗体や、ヒトのＢリンパ球のｍＲＮＡやゲノム由来のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とをランダムに組み合わせて構築したライブラリーから、ファージディスプレイ法等のディスプレイ技術によって抗体可変領域を発現させたヒト抗体ライブラリーを基に作製した抗体のことをいう。
【００４３】
また抗体のクラスも特に限定されず、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭであり、抗体の精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。
【００４４】
抗体の製造方法
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体は、自体公知の方法によって製造することができる。すなわち、免疫原（本発明のポリペプチド）を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund’s Adjuvant）と共に、哺乳動物、例えば、ポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ又はウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマ又はウサギに免疫する。モノクローナル抗体の場合は、同様の方法で、マウス、ラット、ハムスター等に免疫する。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物（例、キャリアタンパク質等）との複合体として免疫してもよい。例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを上記記載の方法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等のキャリアタンパク質との複合体を形成させ、免疫原として用いてもよい。
【００４６】
前記ポリペプチドとキャリアタンパク質との複合体を形成させる等の目的で、本発明のポリペプチドには１〜２個、好ましくは１個のアミノ酸を付加することができる。付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのいずれの位置でもよく、特に限定されないが、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端が好ましい。
【００４７】
複合体の形成においては、本発明のポリペプチドの抗原性を維持することができればよく、自体公知の方法を適用することができる。例えば、本発明のポリペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物（キャリアタンパク質）のアミノ基と結合させることもできる（ＭＢＳ法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基等のアミノ基同士を結合させることもできる（グルタルアルデヒド法）。
【００４８】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。すなわち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマ又はウサギ、好ましくはヤギ、ウマ又はウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清を取得する。
【００４９】
血清そのものをポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラム若しくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、該抗体を単離及び／又は精製し、得られた精製抗体を用いることも可能である。
【００５０】
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば、下記の方法が挙げられる。まず上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化する。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を検体として、免疫学的手法により、哺乳動物の免疫に用いた本発明のペプチドに対する特異的親和性を示しかつキャリアタンパク質と交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該ハイブリドーマの培養上清等から、自体公知の方法によって抗体を製造することができる。
【００５１】
具体的には、下記のようにしてモノクローナル抗体を製造することができる。すなわち、免疫原を、マウス、ラット又はハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内若しくは腹腔内に１〜数回注射するか、又は移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物の脾臓等から抗体産生細胞を取得する。
【００５２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature,Vol.256,p.495-497,1975）ならびにそれらに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマを得る。
【００５３】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えば、マウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０又はＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１又はＣＥＭ−Ｔ１５が挙げられる。
【００５４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、得られたハイブリドーマを、例えば、マイクロタイタープレート内で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた本発明のポリペプチドに対する反応性及び前記上清のキャリアタンパク質に対する反応性を、例えば、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、比較することによって行うことができる。
【００５５】
スクリーニングによりクローン化されたハイブリドーマは、培地（例えば、10%牛胎仔血清を含むDMEM）を用いて培養される。そして、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、該ハイブリドーマを、該ハイブリドーマに由来する動物の腹腔に注入することにより、動物に腹水を生成させ、該動物から得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様の方法で、単離及び／又は精製されることが好ましい。
【００５６】
また、キメラ抗体は、例えば、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば、特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば、Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997、Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994、特表平４−５０４３６５号公報、国際公開第９４／２５５８５号、Nature, Vol.368, p.856-859, 1994、特表平６−５００２３３号公報等を参考に、それぞれ製造することができる。
【００５７】
ファージディスプレイによる抗体作製は、例えば、ヒト抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより行うことができ、これによりＦａｂ等の抗体等を容易に得ることができる。この場合、本発明のポリペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。好ましい抗体ライブラリー及び抗体のスクリーニング方法については、Science, 228:4075, p.1315-1317, 1985、Nature, 348, p.552-554, 1990、Curr.Protein Pept.Sci.;1(2), p.155-169, 2000、国際公開第０１／０６２９０７号等を参考にすることができる。これにより得られた抗体断片を使用してもよく、あるいは、ファージが有するDNAを利用して抗体を調製してもよい。
【００５８】
本発明の予防又は治療剤中に含まれる前記抗体の配合量は、上記効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常、本発明の予防又は治療剤全体の０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％であり、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００５９】
本発明の予防又は治療剤は、有効成分である前記抗体以外に医薬的に許容される担体を含有していてもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６０】
本発明の予防又は治療剤の投与剤形としては、例えば、液剤、注射製剤等が挙げられるが、それらに限定されない。また本発明の予防又は治療剤は、その剤形が速放性製剤又は徐放性製剤等の放出制御製剤であってもよい。抗体は一般に水性溶媒に可溶であるため、上記いずれの剤形を採っても容易に吸収される。さらに自体公知の方法により抗体の溶解性を上昇させることも可能である。
【００６１】
IL-17Aが増悪因子として関連する疾患の予防、治療又は軽減のために用いることができる本発明の予防又は治療剤は、製剤製法として自体公知である手段に従って、上記抗体を有効成分として使用することで製造することができる。
【００６２】
例えば、全身投与に好適な本発明の予防又は治療剤は、水性又は非水性の等張な無菌の注射液に有効量の本発明の抗体を溶解させて製造（例、注射製剤）することができる。本発明の抗体を凍結乾燥させ（例、凍結乾燥製剤）、これを水性又は非水性の等張な無菌の希釈液に溶解させることで製造してもよい。また、局所投与に好適な本発明の予防又は治療剤は、水又は生理食塩水のような希釈液に本発明の抗体を溶解させて製造することができる（例、液剤）。液剤は、噴霧器を用いた気管支や肺等への吸入療法によって使用することも可能である。なお、これらの剤には抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。これらの本発明の予防又は治療剤は、アンプル及びバイアルのように、単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。
【００６３】
本発明の予防又は治療剤の投与量は、有効成分として含有する抗体の活性、種類若しくは配合量、投与対象、投与ルート、投与対象の年齢及び体重等により適宜設定することができるが、例えば、成人（体重６０ｋｇ）１日あたりの投与量（有効量）としては、抗体量として０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜３００ｍｇである。本発明の予防又は治療剤は、１日あたり、必要に応じて一度又は数回に分割して投与してもよく、また数日に分けて投与してもよい。
【００６４】
本発明の予防又は治療剤は、上述のIL-17Aが増悪因子として関連する疾患に有効な公知の予防・治療剤と併用することができる。これらは１種類のみ、又は複数の種類を併用してもよい。本明細書中、「併用」とは、本発明の予防又は治療剤と、IL-17Aが増悪因子として関連する疾患の既知の予防・治療剤とを組み合わせて使用することを意味し、その使用形態は特に限定されない。例えば、本発明の予防又は治療剤とIL-17Aが増悪因子として関連する疾患の既知の予防・治療剤とを共に含有した医薬組成物としての投与、又は混合することなく別途製剤し、同時若しくは時間間隔をあけて投与するいずれの場合も含まれる。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００６６】
［実験例１］
DNAワクチンの作製
DNAワクチンベクター
B型肝炎ウイルスコア抗原（HBc）を単離するため、BCCM/LMBP Plasmid Collectionよりplasmid pPLc3（Accession number LMBP 2470）を購入した。以下のプライマーを設計・合成した（国際公開第２０１２／１４１２８０号）。
HBcF  5’-gcc atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gc-3’（配列番号３）
HBcR  5’-ggc ctc tca cta aca ttg aga ttc ccg aga ttg aga-3’（配列番号４）
上記のプライマーセットを使用して、PCRによりHBcを増幅した。
pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit(Invitrogen)に前記で得られたHBcをクローニングした。MutagenesisによりpcDNA3.1-HBcベクターに、以下のマウスIL-17Aの２種類のエピトープA1又はエピトープA2をコードする核酸配列をそれぞれ挿入した。以下の実施例では、特に言及しない限り、マウスIL-17A1エピトープをコードする核酸配列を挿入したpcDNA3.1-HBcベクターを含むワクチンをIL-17A1 DNAワクチン、マウスIL-17A2エピトープをコードする核酸配列を挿入したpcDNA3.1-HBcベクターを含むワクチンをIL-17A2 DNAワクチンと表記する。ベクターの構造を図１に示す。
マウスIL-17A1エピトープ  RPSDYLNR（配列番号：５）
マウスIL-17A2エピトープ  DHHMNSV（配列番号：７）【００６７】
［実験例２］
DNAワクチンのマウスへの投与
６週齢の下記各雄マウスの大腿筋肉にDNAワクチンをシリンジで注射し、その部位にエレクトロポレーションを施行することで投与した。２週間毎に３回投与した（120μg/60μl×1カ所/回）。
実験１：抗体価測定、血中・尿中各種サイトカイン測定、生存率解析
NZBWF1マウス（SLE疾患モデル）
HBc-IL-17A1 (IL-17A1 DNAワクチン)群：６匹
HBc (pcDNA3.1-HBcベクター)群：６匹
Saline群：１０匹
毎週体重を測定し、４週間ごとに血清採取を行った。
投与プランを図４Ａに示す。
MRL/lprマウス（SLE疾患モデル）
HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNAワクチン)群：９匹
Saline群：９匹
毎週体重を測定し、４週間ごとに血清採取を行った。
実験２：抗体価測定、各臓器の解析
MRL/lprマウス
HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNAワクチン)群：６匹
Saline群：６匹
毎週体重を測定し、４週間ごとに血清採取を行った。【００６８】
実施例１  マウスIL-17A ペプチドの抗原性
ELISAによる抗IL-17A抗体価測定
プレートの作製：マウスIL-17A1エピトープ＋BSAコンジュゲート、マウスIL-17A2エピトープ＋BSAコンジュゲートを10μg/mlの濃度で96ウェルプレートに分注し、４℃で１晩静置した。組み換えマウスIL-17Aを0.25μg/mlの濃度で96ウェルプレートに分注し、４℃で１晩静置した。
前記プレートをPBS 200μlで1回洗浄後、5%スキムミルクin PBSで２時間ブロッキングを行った。１次抗体(マウス抗血清)を5%スキムミルクin PBSで段階希釈し、50μlずつ96ウェルプレートにアプライ、4℃で１晩インキュベートした。
前記プレートをPBS-T(0.05% Tween) 200μlで7回洗浄し、２次抗体（抗マウスIgG Ab-HRP標識）を1/1000希釈(5%スキムミルク)し、50μlずつ添加、常温で３時間インキュベートした。該プレートをPBS-T(0.05% Tween) 200μlで3回洗浄し、TMB溶液を50μl添加、遮光して常温で３０分間インキュベートした。0.5N H2SO450μlを添加し反応停止させ、450nmの吸光度を測定した。
Balb/cマウスをIL-17A1 DNAワクチンまたはIL-17A2 DNAワクチンで免疫した予備実験では、IL-17A1 DNAワクチンを投与したBalb/cマウスの抗体価の上昇が認められた（図３）。そして、図４Ａに示す投与プランでNZBWF1マウスにIL-17A1 DNAワクチンを投与した結果、第６週で抗体価の上昇が認められ（図４Ｂ）、組み換えマウスIL-17Aを正しく認識する抗体が産生されたことを確認した（図５）。しかも、抗IL-17A1抗体価は長時間持続することを確認した（図７Ｂ）。【００６９】
Western blottingによる抗マウスIL-17A抗体の組み換えマウスIL-17Aに対する反応性の確認
常法に従い、各レーンに蛋白質をアプライして電気泳動を行った。泳動後、メンブレンにトランスファーし、ブロッキング後、各１次抗体を添加して４℃で１晩インキュベートした。続いて２次抗体を反応させ、発色反応により抗体の結合を検出した。結果を図２に示す。
レーン１：組み換えマウスIL-17A
レーン２：マウスIL-17A1エピトープ＋BSAコンジュゲート
レーン３：マウスIL-17A2エピトープ＋BSAコンジュゲート
１次抗体
A：IL-17A1 DNAワクチン投与したBalb/cマウスの抗血清
B：市販の抗マウスIL-17A抗体
C：市販の抗BSA抗体【００７０】
IL-17A1 DNAワクチン投与したマウスの抗血清は、市販の抗マウスIL-17A抗体と同様に組み換えマウスIL-17Aと結合した。
IL-17A1 DNAワクチン投与したマウスの抗血清は、マウスIL-17A1エピトープ＋BSAコンジュゲートを特異的に認識し、マウスIL-17A2エピトープ＋BSAコンジュゲートとは反応しなかった。
なお、組み換えマウスIL-17Aには、安定化のために大量のBSAが添加されており、市販の抗BSA抗体は、マウスIL-17A1エピトープ＋BSAコンジュゲート、マウスIL-17A2エピトープ＋BSAコンジュゲートとともにこれを認識していた。【００７１】
実施例２  SLEモデルマウスにおけるIL-17Aワクチンの効果
血中IL-1β、TNF-α及びIL-17A濃度、尿中MCP-1濃度の測定
Quantikine ELISAキットを用いて、メーカーの指定するプロトコールに従いIL-1β、TNF-α、IL-17A及びMCP-1の濃度測定を行った。血清は25μlずつ使用した。尿は50μlずつ使用した。キットに添付の標準試料を用いて検量線を作製し、各サイトカイン濃度を定量した。NZBWF1マウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与群で血中IL-1βの有意な減少が認められた（図６Ｅ）。血中IL-17A濃度、尿中MCP-1濃度、血中TNF-α濃度の減少傾向も認められた（図６Ｃ、Ｂ、Ｆ）。また、実験１に記載したMRL/lprマウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与群でも、TNF-αの有意な減少が認められた（図６Ｄ、８Ａ）。【００７２】
尿定性検査
麻酔したマウスから随時尿を採取した。尿マルチスティック試験紙を用いて、尿蛋白、尿クレアチニン、尿アルブミン、尿潜血、尿比重等を測定した。NZBWF1マウスへのIL-17A1 DNAワクチン投与群で尿タンパク質の減少傾向が認められた（図６Ａ）。【００７３】
生存率
SLEのモデルマウスであるNZBWF1マウスにIL-17A1 DNAワクチンを投与後、毎日観察し、マウスが死亡した日を記録した。死亡したマウスの数を１週間毎にまとめて、生存率のグラフを作成した。IL-17A1 DNAワクチン投与群の長期観察の結果、該ワクチン投与群の生存期間の有意な延長を認めた（図７Ａ）。また、実験１に記載したMRL/lprマウスへのDNAワクチン投与群でも、寿命の延長傾向が認められた（図８Ｂ）。【００７４】
臓器重量解析
実験２に記載したMRL/lprマウスにIL-17A1 DNAワクチンを投与後、臓器の重量変化を調べた。HBc-IL-17A1群及びSaline群の２群間で、体重に有意差は無かった（図９Ａ）。対照として、全体重当たりの心臓重量を測定したが、有意差は無かった（図９Ｂ）。一方、IL-17A1 DNAワクチンを投与後の脾臓重量の有意な減少が認められた（図９Ｃ）。そして、全体重当たりの脾臓重量の割合も有意な減少が認められた（図９Ｄ）。SLE患者では脾腫がみられ、これらのモデルマウスにおいて全体重当たりの脾臓重量の増加はSLEの増悪を反映する。そのため本結果より、IL-17A1 DNAワクチンがSLE治療効果を有していることが明らかとなった。【００７５】
統計手法
生存率はKaplan-Meier法により統計処理を行った。【００７６】
病理組織の解析プランを図１０に示す。
実験３
NZBWF1マウス
HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNAワクチン)群：９匹
Saline群：９匹
毎週体重を測定し、４週間ごとに血清採取を行った。
MRL/lprマウス
HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNAワクチン)群：９匹
Saline群：９匹
毎週体重を測定し、４週間ごとに血清採取を行った。【００７７】
組織染色
免疫組織染色解析では、摘出した各臓器を４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、パラフィン中に埋包し、４μmの切片に切り出した。切片を１次抗体（抗F4/80抗体）および２次抗体（HRP標識抗ラットIgG抗体）で反応させた。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、顕微鏡観察に用いた。組織検査アッセイでは、腎臓、顎下腺及び肝臓を解剖し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィン中に埋包した。腎臓の４μm切片をPAS染色で染色した。顎下腺および肝臓の４μm切片をHE染色で染色した。【００７８】
腎臓
PAS染色でNZBWF1マウス、又はMRL/lprマウスでの腎病変の程度を確認した。結果を図１１Ａ、Ｂに示す。ワクチン投与群で、糸球体、間質の破壊が抑制されていた。F4/80の免疫染色でマクロファージの浸潤の程度を確認した。結果を図１１Ｃ、Ｄに示す。ワクチン投与群で糸球体周囲や間質へのマクロファージ浸潤の抑制が認められた。【００７９】
顎下腺
HE染色でNZBWF1マウスでの顎下腺炎の程度を確認した。結果を図１２に示す。ワクチン投与群で顎下腺炎の抑制が認められた。【００８０】
肝臓
ワクチンの安全性の確認のために肝臓の組織切片をHE染色し、観察した。結果を図１３に示す。NZBWF1マウス（図１３Ａ）及びMRL/lprマウス（図１３Ｂ）いずれのマウスにおいても、ワクチン投与群及びSaline投与群ともに、病的所見が無いことを確認した。【００８１】
実施例３  大腸炎モデルマウスにおけるIL-17Aワクチンの効果
６週齢の下記各雄マウスにTNBS溶液（2mg/100μl/回）を毎週注腸し、大腿筋肉にIL-17A1 DNAワクチンをエレクトロポレーションを用いて２週間毎に３回投与した（120μg/60μl×1カ所/回）。第8週にマウスを犠死させた。投与プランを図１４（Ａ）に示す。
実験４
Balb/cマウス
Normal群(TNBS(-))：１匹
Vaccine群(HBc-IL-17A1群;TNBS(+))：３匹
Saline群(TNBS(+))：３匹【００８２】
体重
実験４に記載したBalb/cマウスにTNBS投与８週後のマウスの体重の変化を調べた。マウスの体重増加量は、TNBSによる大腸炎の誘導に伴い減少した(Saline群)が、この減少効果はワクチン群では見られなかった（図１４（Ｂ））。【００８３】
大腸の長さ
実験４に記載したBalb/cマウスにTNBS投与８週後のマウスの大腸の長さを調べた。大腸の長さは、TNBSによる大腸炎の誘導に伴い短くなった(Saline群)が、この効果はワクチン群で抑制された（図１４（Ｃ））。【００８４】
大腸
犠死させたマウスの大腸を解剖し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、パラフィン中に埋包した。大腸の４μm切片をHE染色で染色し、組織学的検討を行った。Saline群で炎症細胞の浸潤などの病理所見が認められた（図１４（Ｄ））。また、HE染色切片の病理学的所見をスコア化した。ワクチン群でH&Eスコアの低下を認めた（図１４（Ｅ））。【００８５】
以上の結果から、IL-17AワクチンはTNBS誘導大腸炎モデルマウスにおいて大腸炎の抑制効果を示した。【００８６】
実施例４  関節炎モデルマウスにおけるIL-17Aワクチンの効果
６週齢の下記各雄マウスの大腿筋肉にマウスIL-17A1 DNAワクチンをエレクトロポレーションを用いて２週間毎に３回投与した（120μg/60μl×1カ所/回）。ワクチン初回投与の２８日後にType IIコラーゲンとCFA(完全フロイントアジュバント)、ワクチン初回投与の４２日後にType IIコラーゲンとIFA(不完全フロイントアジュバント)を投与することによって関節炎を誘導し、以後毎週３回関節炎の程度を観察し、スコア化した。投与プランを図１５（Ａ）に示す。
実験５
DBA/1マウス
Vaccine群(HBc-IL-17A1群)：６匹
Saline群(生理食塩水群)：６匹【００８７】
臨床スコア
実験５に記載したDBA/1マウスの関節炎の臨床スコアおよび臨床所見を調べた。ワクチン群は関節炎の発症と進行の抑制効果を有することが認められた（図１５（Ｂ）、（Ｃ））。【００８８】
以上の結果から、IL-17AワクチンはType IIコラーゲンによる関節炎モデルマウスにおいて、関節炎の抑制効果を示した。【００８９】
実施例５  大腸癌モデルマウスにおけるIL-17Aワクチンの効果
６週齢の下記各雄マウスの大腿筋肉にマウスIL-17A1エピトープからなるペプチドを含むワクチン（KLH conjugated）を２週間毎に３回投与した（25μg/25μl ＋アジュバント25μl /回（アジュバントは、初回投与時はCFA、２、３回目はIFA））。ワクチン初回投与の5週後にマウス大腸癌細胞株CT26細胞(5×105細胞/Body)を接種し、以後毎週腫瘍体積(0.5×長径×短径×短径)を計測した。また、全マウスが死亡するまで観察を続け、生存期間を確認した。投与プランを図１６（Ａ）に示す。
実験６
Balb/cマウス
Vaccine群(IL-17A1-KLH群)：６匹
Saline群(生理食塩水群)：６匹【００９０】
腫瘍体積
実験６に記載したBalb/cマウスにCT26細胞を接種８日および１５日後のマウスの腫瘍体積を調べた。ワクチン群は腫瘍体積の増大抑制効果を有することが認められた（図１６（Ｂ））。【００９１】
生存率
ワクチンを投与したBalb/cマウスにCT26細胞を接種後、毎日観察し、マウスが死亡した日を記録した。ワクチン投与群の長期観察の結果、生存期間の有意な延長を認めた（図１６（Ｃ））。【００９２】
以上の結果から、IL-17AワクチンはCT26細胞接種による大腸癌モデルマウスにおいて、腫瘍増大抑制効果および生存期間延長効果を示した。【００９３】
実施例６  肺癌モデルマウスにおけるIL-17Aワクチンの効果
６週齢の下記各雄マウスの大腿筋肉にマウスIL-17A1 DNAワクチンをエレクトロポレーションを用いて２週間毎に３回投与した（120μg/60μl×1カ所/回）。ワクチン初回投与の5週後にマウス肺癌細胞株LLC細胞(5×105細胞/Body)を接種し、以後毎週腫瘍体積(0.5×長径×短径×短径)を計測した。第9週にマウスを犠死させた後、腫瘍の重量、肺転移、肝転移の有無を確認した。投与プランを図１７（Ａ）に示す。
実験７
C57 BL/6マウス
Vaccine群(HBc-IL-17A1群)：５匹
Saline群(生理食塩水群)：５匹【００９４】
体重
実験７に記載した犠死させた後のマウスの体重を調べた。マウスの体重は、両群間で有意差は認められなかった（図１７（Ｂ））。【００９５】
腫瘍体積
実験７に記載したC57 BL/6マウスにLLC細胞を接種後、毎週腫瘍体積を調べた。ワクチン群は腫瘍の増大を抑制する効果を有することが認められた（図１７（Ｃ））。【００９６】
腫瘍重量
実験７に記載した犠死させた後のマウスの腫瘍重量を調べた。ワクチン群は腫瘍重量の増大を抑制する効果を有することが認められた（図１７（Ｄ））。【００９７】
転移の有無
ワクチン群において、肺転移、肝転移を認めなかった。ワクチン非投与群においては肺転移が認められた（図１７（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ））。【００９８】
以上の結果から、IL-17AワクチンはLLC細胞接種による肺癌モデルマウスにおいて、
腫瘍増大抑制効果および転移抑制効果を示した。【００９９】
実施例７  ヒトIL-17A ペプチドの抗原性
ELISAによる抗IL-17A抗体価測定
マウスIL-17A1エピトープ(RPSDYLNR（配列番号：５）)に対応する以下のヒトIL-17A1エピトープからなるペプチドを含むワクチン（KLH conjugated）を作製し、Balb/cマウスに2週間隔で3回皮内投与し、初回投与の6週後に実施例１に記載の方法に従って血清抗体価を測定した。
ヒトIL-17A1エピトープ  RSSDYYNR（配列番号：１）
その結果、ワクチンを投与したBalb/cマウスの抗体価の上昇が認められた（図１８）。また、前記血清は、マウスIL-17A1エピトープに対しても交差反応性を示した（図１９（Ａ））。さらに、マウスIL-17A1エピトープからなるペプチドを含むワクチンを投与することによって得られた血清も、ヒトIL-17A1エピトープに対して交差反応性を示した（図１９（Ｂ））。【０１００】
また、以下のヒトIL-17Aの２種類のエピトープ（ヒトIL-17A2エピトープ、ヒトIL-17A3エピトープ）からなるペプチドを含むワクチン（KLH conjugated）を作製し、Balb/cマウスに2週間隔で3回皮内投与し、初回投与の6週後に実施例１に記載の方法に従って血清抗体価を測定した。
ヒトIL-17A2エピトープ  ADGNVDYHMNSVPIQQE（配列番号：８）
ヒトIL-17A3エピトープ  LRREPPHCPNSFRL（配列番号：９）
その結果、ヒトIL-17A2エピトープからなるペプチドを含むワクチンを投与したBalb/cマウスの抗体価の上昇が認められた（図２０）。【０１０１】
さらに、以下のヒトIL-17A1エピトープの部分配列であるヒトIL-17A4からなるペプチドを含むワクチン（KLH conjugated）を作成した。また、ヒトIL-17A1エピトープの部分配列であるヒトIL-17A5、ヒトIL-17A6、またはヒトIL-17A7をコードするDNAを含むワクチンを実験例１に従って作成した。Balb/cマウスに2週間隔で3回皮内投与し、初回投与の6週後に実施例１に記載の方法に従って血清抗体価を測定した。
ヒトIL-17A4エピトープ  SDYYN（配列番号：１１）
ヒトIL-17A5エピトープ  SDYY（配列番号：１２）
ヒトIL-17A6エピトープ  SDY
ヒトIL-17A7エピトープ  DYY
その結果、ヒトIL-17A4エピトープからなるペプチドを含むワクチン、ヒトIL-17A5エピトープ、ヒトIL-17A6エピトープまたはヒトIL-17A7エピトープをコードするDNA含むワクチンを投与したBalb/cマウスの抗体価の上昇が認められた（図２１）。【０１０２】
実施例８  関節炎モデルマウスにおけるヒトIL-17Aワクチンの効果
６週齢の下記各雄マウスの大腿筋肉にヒトIL-17A1エピトープ、ヒトIL-17A2エピトープまたはヒトIL-17A4エピトープからなるペプチドを含むワクチン（KLH conjugated）を２週間毎に３回投与した（120μg/60μl×1カ所/回）。ワクチン初回投与の２８日後にType IIコラーゲンとCFA(完全フロイントアジュバント)、ワクチン初回投与の４２日後にType IIコラーゲンとIFA(不完全フロイントアジュバント)を投与することによって関節炎を誘導し、以後毎週３回関節炎の程度を観察し、スコア化した。投与プランを図２２（Ａ）に示す。
実験８
DBA/1マウス
H17(ヒトIL-17A1エピトープ)群：３匹
AF4(ヒトIL-17A4エピトープ)群：３匹
AF5(ヒトIL-17A2エピトープ)群：３匹
Control(KLH)群：４匹
Collagen(-)群：３匹【０１０３】
臨床スコア
実験８に記載したDBA/1マウスの関節炎の臨床スコアを調べた。ヒトIL-17A1エピトープ、ヒトIL-17A2エピトープまたはヒトIL-17A4エピトープからなるワクチン群は関節炎の発症と進行の抑制効果を有することが認められた（図２２（Ｂ））。【０１０４】
以上の結果から、ヒトIL-17AワクチンはType IIコラーゲンによる関節炎モデルマウスにおいて、関節炎の抑制効果を示した。【０１０５】
実施例９  IL-17Aに対するin vitro中和活性
培地中の正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）に組み換えヒトIL-17Aを添加した時のIL-6の分泌量をELISAで測定した結果、IL-17Aの添加によってIL-16の分泌が促進された（IL-17 only）。しかし、ヒトIL-17A1エピトープからなるペプチドを含むワクチンで免疫したマウスの抗血清から精製したIgGをIL-17Aと同時に添加した場合、IL-6の分泌が抑制された（IL-17 + antisera）。また、非免疫マウスの抗血清から精製したIgGをIL-17Aと同時に添加した場合、IL-6の分泌はほとんど抑制されなかった（IL-17 + control sera）。これらの結果を、図２３に示す。【０１０６】
以上の結果から、ヒトIL-17A1エピトープからなるペプチドを含むワクチンによる免疫で得られる抗体はin vitroにおいて培養細胞からのIL-6分泌を抑制した。従って、該抗体はIL-17A活性の中和作用を有することが示唆され、IL-17Aが憎悪に関わる疾患の治療効果に有効であることが示唆された。【０１０７】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。【０１０８】
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
以上詳述したように、本発明のワクチンは、IL-17Aに対する抗体価を上昇させ、SLEだけでなく、関節リウマチ、炎症性腸疾患、癌、乾癬、多発性硬化症、動脈硬化症等、IL-17Aが病態の増悪に関与している他の疾患にも使用可能であり、これらの疾患の治療等に大きく貢献することができる。
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２７３１３３（出願日：２０１３年１２月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図１０】
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【図１６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月3日(2015.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患の予防または治療用ワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項２】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、請求項１に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項３】
発現ベクターが、Ｂ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
発現ベクターが、該（１）又は（２）のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号：１７で示されるヌクレオチド配列の塩基番号：２４６と塩基番号：２４７の間に挿入されたヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項５】
キャリアタンパク質および／又はアジュバントを含む、請求項１−４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、ＳＬＥ、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１−５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
以下の（１）または（２）を含む、ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、ＳＬＥ、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項１−６のいずれか１項に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（２）上記（１）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）のいずれかを含む、ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチである、請求項１−６のいずれか１項に記載のワクチン：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（３）上記（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項９】
以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体を含む、ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：８に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列、又は配列番号：８に対応する非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１０】
以下の（１）又は（２）のポリペプチドを認識し、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体を含む、請求項９に記載の予防または治療剤：
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号：１１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１１】
ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、ＳＬＥ、炎症性腸疾患、関節リウマチ、腫瘍、乾癬、及び多発性硬化症からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の予防または治療剤。
【請求項１２】
ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、ＳＬＥ、炎症性腸疾患、関節リウマチ、大腸癌、及び肺癌からなる群から選択される、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体を含む、請求項９−１１のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
【請求項１３】
ＩＬ−１７Ａが増悪因子として関与する疾患が、関節リウマチであり、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識し、ＩＬ−１７Ａの機能を阻害する抗体を含む、請求項９−１１のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
【国際調査報告】
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