(57)【要約】  本発明の目的は、代謝変換に関与する物質をスクリーニングする方法、及び代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットを提供することである。  前記課題は、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む筋幹細胞又は筋芽細胞によって解決することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項２】
前記細胞が不死化細胞である、請求項１に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項３】
ミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子が、それぞれ異なる蛍光又は発光タンパク質遺伝子である、請求項１又は２に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項４】
前記蛍光又は発光タンパク質が、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｅｇＦＰ６７０及びルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの蛍光又は発光タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程；及び
前記細胞におけるミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、
を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ミオシン重鎖遺伝子の発現の分析が、蛍光又は発光タンパク質を発現している細胞の量又は細胞増殖の分析である、請求項５に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項９】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項１２】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項１１に記載の筋管細胞分化誘導剤。
【請求項１３】
（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は
（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、
を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１４】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は
（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、
を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項１７】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項１６に記載の筋幹細胞分化誘導剤。
【請求項１８】
β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１９】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項２２】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項２１に記載の筋幹細胞分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋幹細胞及び筋芽細胞、並びにそれを用いた代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、骨格筋の代謝変換に関与する物質を効率よくスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
超高齢社会を迎えサルコペニア（加齢性筋肉減少症）は、認知症と並び大きな課題だが、筋萎縮の早期診断及び予防は未解決の課題である。サルコペニアは、骨格筋の筋肉量の減少を伴うものと定義されているが、広義には骨格筋の筋力低下、又は機能低下を伴うものも含むと考えられている。
サルコペニアは骨格筋でおこるものである。骨格筋は、主として遅筋線維、及び速筋線維の２つの線維から構成され、これらの線維が各々の筋ごとに一定の割合でモザイク状に配列している。遅筋線維は有酸素的なエネルギー発揮能力に優れ、収縮速度は遅いが疲労耐性が高いという特性を持つことから、持久的な運動に適していると考えられている。一方、速筋線維は無酸素的なエネルギー発揮能力に優れ、発揮する張力も高いことから、瞬発的な運動に適した能力を持つと考えられている。【０００３】
更に、骨格筋の変化を伴う疾患として、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、神経筋難病、自己免疫性重症筋無力症、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、筋損傷、外傷又は外科治療後の筋組織再建又は筋ジストロフィー症などが知られており（非特許文献１〜３）、治療薬の開発が進められているが、有効な治療薬の開発には至っていないのが現状である。【０００４】
神経筋難病は、筋萎縮性側索硬化症、多発筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、及び脂質蓄積障害性ミオパチーを含む。【０００５】
一方、心筋のミオシン重鎖β（ベータ）を可視化する方法として、ミオシン重鎖βに蛍光タンパク質ＹＦＰを結合させたＭｙＨＣβ−ＹＦＰノックインマウスが報告されている（非特許文献４）。心筋のミオシン重鎖βは骨格筋のＭｙＨＣＩと同じ遺伝子であることから、本発明者らは骨格筋にもＭｙＨＣβ−ＹＦＰが発現して可視化できることを発見した（非特許文献５）。以下、ＭｙＨＣβ−ＹＦＰをＭｙＨＣＩ−ＹＦＰと表記する。更に、本発明者らは、このマウスに、骨格筋のミオシン重鎖ＩＩａに蛍光タンパク質Ｓｉｒｉｕｓを結合させた融合遺伝子、及び骨格筋のミオシン重鎖ＩＩｂに蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを結合させた融合遺伝子をノックインしたマウスを作製し、トレーニングによる筋線維組成変化を可視化できることを報告した（非特許文献５）。しかしながら、骨格筋の疾患のモデルマウスではなく、治療薬の開発に用いられてはいなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「マッスル・アンド・ナーブ（Muscle & Nerve）」、２０１３年（米国）第４７巻、ｐ．６９１−７０１
【非特許文献２】「インターナショナル・ジャーナル・オブ・カーディオロジー（International Journal of Cardiology）」、２０１３年（米国）第１６８巻、ｐ．２０１４−２１
【非特許文献３】「プログレス・イン・ブレイン・リサーチ（Progress in Brain Research）」、２０１２年（米国）第２０１巻、ｐ．３３３−５９
【非特許文献４】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイト・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、２００６年（米国）、第１０３巻、ｐ．１６８６４−９
【非特許文献５】森秀一、他３名、「トレーニングによる筋線維組成変化のバイオイメージングによる可視化〜新たな研究モデル動物の創出〜」、２０１０年、公益財団法人ミズノスポーツ振興財団、スポーツに関する科学的・学術的・医学的研究に対する助成［２０１３年１０月１５日検索］、インターネット<http://www.mizuno.co.jp/zaidan/ikagaku/josei_2010.html>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、骨格筋の代謝変換に関与する物質をスクリーニングする方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、サルコペニア、又はその他の骨格筋の変化を伴う疾患の治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、サルコペニア又は骨格筋の変化を伴う疾患の治療薬について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子が導入された筋幹細胞又は筋芽細胞を用いて、治療候補物質のスクリーニングを行うことにより、骨格筋の変化を伴う疾患の治療薬の候補をスクリーニングできることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む筋幹細胞又は筋芽細胞、
［２］前記細胞が不死化細胞である、［１］に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
［３］ミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子が、それぞれ異なる蛍光又は発光タンパク質遺伝子である、［１］又は［２］に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
［４］前記蛍光又は発光タンパク質が、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｅｇＦＰ６７０及びルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの蛍光又は発光タンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程；及び前記細胞におけるミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、
［６］前記ミオシン重鎖遺伝子の発現の分析が、蛍光又は発光タンパク質を発現している細胞の量又は細胞増殖の分析である、［５］に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、
［７］前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、［５］又は［６］に記載のスクリーニング方法、
［８］ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
［９］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、［８］に記載の医薬組成物、
［１０］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、［８］に記載の医薬組成物、
［１１］ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、
［１２］前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、［１１］に記載の筋管細胞分化誘導剤、
［１３］（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
［１４］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、［１３］に記載の医薬組成物、
［１５］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、［１３］に記載の医薬組成物、
［１６］（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、
［１７］前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、［１６］に記載の筋幹細胞分化誘導剤、
［１８］β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
［１９］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、［１８］に記載の医薬組成物、
［２０］前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、［１８］に記載の医薬組成物、
［２１］β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、及び
［２２］前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、［２１］に記載の筋幹細胞分化誘導剤、
に関する。
更に、本明細書は、
［２３］［１］〜［４］のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニングキット、
［２４］前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、［２３］に記載のスクリーニングキット、
［２５］［１］〜［４］のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞の、代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットの製造への使用、
［２６］前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、［２５］に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットの製造への使用、
［２７］［１］〜［４］のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞の、代謝変換に関与する物質のスクリーニングツールとしての使用、
［２８］前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、［２７］に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニングツールとしての使用、
を開示する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞によれば、骨格筋の代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることができる。また、骨格筋の代謝変換に関与する物質には、骨格筋の変化を伴う疾患の治療薬として用いることのできる物質が含まれており、そのような疾患の治療薬を開発することができる。更に、本発明のスクリーニング方法によれば、骨格筋の代謝変換に関与する体内の遺伝子及びタンパク質などをスクリーニングすることができる。これらの遺伝子及びタンパク質は、疾患のマーカーとして用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、骨格筋以外の代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、抗癌剤、免疫抑制剤、又は生活習慣病の治療若しくは予防剤をスクリーニングすることができる。
また、本発明の医薬組成物は、骨格筋の筋力低下、又は骨格筋の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光タンパク質ＹＦＰを導入するためのターゲッティングベクター（Ａ）、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光タンパク質Ｓｉｒｉｕｓを導入するためのターゲッティングベクター（Ｂ）、ミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを導入するためのターゲッティングベクター（Ｃ）、及びミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｅｒｕｌｅａｎを導入するためのターゲッティングベクター（Ｄ）を示した図である。
【図２】筋幹細胞（サテライト細胞）から筋芽細胞及び筋管細胞（筋線維細胞）へと分化誘導を示した模式図である。
【図３】ミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合したＹＦＰが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合したｓｉｒｉｕｓが発現した筋管細胞（Ａ）、及びミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合したｍＣｅｒｕｌｅａｎが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合したｍＣｈｅｒｒｙが発現した筋管細胞（Ｂ）を示した写真である。
【図４】ラパマイシンの添加により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したこと（Ａ）、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が減少したこと（Ｂ）を示したグラフである。
【図５】線維芽細胞増殖因子２１の添加により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したことを示したグラフである。
【図６】Ｔ３（トリヨードサイロニン）の添加により、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が増加したことを示したグラフである。
【図７】ＩＬ−１５の添加により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したこと、及びミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が増加したことを示したグラフである。
【図８】β３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）の添加により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したことを示したグラフである。
【図９】ラパマイシンの添加により、サテライト細胞の増殖が抑制されたことを示した写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］筋幹細胞又は筋芽細胞
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む。
【００１２】
（ノックインマウス、トランスジェニックマウス）
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、前記ミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子がノックインされたマウスから取得することができる。
前記ノックインマウスは、公知の方法によって作成することができる。具体的には、融合タンパク質のターゲッティングベクターをマウスＥＳ細胞に導入し、相同組換えを起こしたＥＳクローンを選択する。そのＥＳクローンを用いてキメラマウスを作成し、正常なマウスとの交配で得られた産仔から遺伝子が生殖系列に組み込まれたノックインマウスを選択することによって、得ることができる。
例えば、ミオシン重鎖遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子の結合した融合遺伝子を含むターゲティングベクターは、以下のように作成することができる。雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＢＡＣクローンから、標的とするミオシン重鎖遺伝子のゲノム配列をサブクローニングする。一方、蛍光又は発光タンパク質遺伝子は、それを含むベクターからＰＣＲで取得することができる。この蛍光又は発光タンパク質遺伝子をミオシン重鎖遺伝子の翻訳開始配列（ＡＴＧ）とコドンのフレームを合わせて５’側に挿入する。得られたターゲティングベクターを直鎖状にし、そしてエレクトロポレーションでマウスＥＳ細胞に導入する。ＰＣＲとサザンブロットで相同組換えを起こしたＥＳクローンを同定し、そのＥＳクローンを用いてアグリゲーション法によりキメラマウスを作製する。雌性のＣ５７ＢＬ／６との交配で得られた産仔のジェノタイピングを行って生殖系列への移行を確認することによって、ミオシン重鎖遺伝子と、蛍光又は発光タンパク質遺伝子とが結合した融合遺伝子が導入されたノックインマウスを得ることができる。
ノックインマウスには少なくとも１つ以上の融合遺伝子が含まれていればよい。すなわち、ノックインマウスは、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む。しかしながら、前記４つの融合遺伝子を含むノックインマウスが好ましい。
【００１３】
また、本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、又はミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子のプロモーター領域のゲノム遺伝子と蛍光又は発光タンパク質遺伝子を融合した遺伝子をマウスの受精卵に導入して作成したトランスジェニックマウスから作成することもできる。
更に、ノックインマウスは、人工ヌクレアーゼＺＦＮ（zinc-finger nuclease）、ＴＡＬＥＮ（transcription activator-like effector nuclease）あるいはRNA誘導型ヌクレアーゼＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats, CRISPR-associated）の技術を用いて作成することができる。
【００１４】
（筋幹細胞又は筋芽細胞の分離）
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、前記ノックインマウス又はトランスジェニックマウスからＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）により、サテライト細胞として、取得することが可能である。本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、ノックインマウス又はトランスジェニックマウスから分離され、継代培養された細胞が好ましい。
前記ノックインマウス又はトランスジェニックマウスの骨格筋から、コラゲナーゼ処理により細胞を取得する。得られた細胞を、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１、造血系の細胞マーカーであるＣＤ４５、及び線維芽細胞及び脂肪細胞に分化する細胞のマーカーであるＳｃａ１によりネガティブ選択をする。そして、サテライト細胞のマーカーであるＶＣＡＭ又はＳＭ／Ｃ−２．６により、ポジティブ選択することによって、筋幹細胞（サテライト細胞）を分離することが可能である。
【００１５】
（筋幹細胞又は筋芽細胞）
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、本発明のスクリーニング方法に用いることができる。すなわち、前記の方法によってノックインマウス又はトランスジェニックマウスから分離された初代継代培養細胞を用いて、本発明のスクリーニング方法を行うことができる。しかしながら、本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、不死化細胞であるものが好ましい。不死化細胞であることによって、実験ごとにノックインマウス又はトランスジェニックマウスからの筋幹細胞又は筋芽細胞の分離が不要になる。すなわち、筋幹細胞の長期間の培養が可能になり、本発明のスクリーニング方法迅速に、効率的に用いることができる。
【００１６】
不死化した筋幹細胞は、限定されるものではないが、実施例に示すように、ノックインマウス又はトランスジェニックマウスと、ＩＦＮ−γで誘導されるＨ−２Ｋｂ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ及び温度感受性ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を有するＩｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅとの交配によって、作成することができる。不死化細胞は、増殖可能な継代細胞である。
【００１７】
（マウス以外からの筋幹細胞又は筋芽細胞の作製）
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、前記ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの技術を用いて、作製することができる。すなわち、筋幹細胞又は筋芽細胞のミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、又はミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に、蛍光タンパク質遺伝子又は発光タンパク質遺伝子を、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの技術によって挿入することができる。これによって、本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞を作製することができる。
【００１８】
（分化誘導）
本発明の筋幹細胞（サテライト細胞）は筋芽細胞へと分化し、更に筋管細胞（筋線維細胞）へと分化する（図２）。
筋幹細胞及び筋芽細胞は増殖可能な細胞であり、筋管細胞（筋線維細胞）は多数の筋芽細胞が融合した多核細胞である
筋幹細胞から筋芽細胞への分化誘導は、限定されるものでないが、以下のように行うことができる。細胞培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）に１０％の胎児牛血清を加えて筋幹細胞を継代維持培養して、分化誘導時には胎児血清の代わりに２％馬血清を加えて培養することで分化を誘導する。
更に、筋芽細胞から筋管細胞（筋線維細胞）への分化誘導も限定されるものではないが、以下のように行うことができる。筋芽細胞を、２％馬血清を含む細胞培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）で継続して培養することで筋管細胞（筋線維細胞）へ分化を誘導する。
なお、前記のＩｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅとの交配によって得られた不死化細胞においては、３２℃から３７℃への温度シフトにより、温度感受性ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原の分解を行うことによって、筋芽細胞又は筋管細胞（筋線維細胞）へ分化誘導可能である。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法によって、得られる代謝変換に関与する物質は、前記の馬血清等による筋管細胞（筋線維細胞）への分化誘導と比較すると、特定の筋線維細胞への分化を誘導したり、分化誘導の時間を短縮することのできるものである。
【００２０】
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞に含まれる融合遺伝子に含まれる蛍光タンパク質遺伝子は、特に限定されるものではなく、本分野において通常使用されている蛍光タンパク質をコードしている遺伝子を用いることができる。具体的な蛍光タンパク質としては、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒなどの青色蛍光タンパク質；ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質；ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２などの橙色蛍光タンパク質；Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びｅｇＦＰ６７０などの赤色蛍光タンパク質の１つ以上を挙げることができる。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞に含まれる融合遺伝子に含まれる発光タンパク質遺伝子は、特に限定されるものではなく、本分野において通常使用されている発光タンパク質をコードしている遺伝子を用いることができる。具体的な発光タンパク質としては、ルシフェラーゼを挙げることができるが、ルシフェラーゼの由来も限定されるものではなく、ホタルルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はヒカリコメツキルシフェラーゼを挙げることができる。
【００２１】
ミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合する蛍光又は発光タンパク質遺伝子は、同じ蛍光又は発光タンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば、筋幹細胞又は筋芽細胞が１つの融合遺伝子を含んでいる場合は、同じ蛍光又は発光タンパク質をコードする遺伝子を用いても問題ない。
しかしながら、筋幹細胞又は筋芽細胞が２つ以上の融合遺伝子を含んでいる場合は、それぞれのミオシン重鎖に結合する蛍光タンパク質遺伝子等は、それぞれ異なる蛍光タンパク質遺伝子等であることが好ましい。筋管細胞（筋線維細胞）に発現しているミオシン重鎖遺伝子の種類を、蛍光タンパク質等の色調により判断することができるからである。なお、ミオシン重鎖遺伝子の発現を蛍光タンパク質等の色調により判断することができるのは、一般的に筋芽細胞の後期から筋管細胞（筋線維細胞）に分化誘導された時期である。
【００２２】
［２］代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、前記筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程；及び前記筋幹細胞ミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、を含む。
生体細胞は細胞増殖、分化、炎症反応、ストレス、栄養状態、固有機能（例えば、骨格筋、脂肪細胞又は免疫）に適合するためにエネルギー産生の効率の変換（例えば、解糖系からミトコンドリア系への変換、又はミトコンドリア系から解糖系への変換）又は生合成の機構の変換（例えば、同化（anabolic）作用から異化（catabolic）作用への変換、又は異化（catabolic）作用から同化（anabolic）作用への変換）を行う。これらの変換を代謝変換と称するが、本発明のスクリーニング方法は、これらの代謝変換に関連する物質をスクリーニングすることができる。
【００２３】
（接触工程）
本発明のスクリーニング方法における接触工程は、筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程である。
試験物質は、代謝変換に関連する可能性のある物質、又はそのような物質を含むものである限りにおいて限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、又は低分子化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、細胞の培養上清、生体内の体液、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。
【００２４】
筋幹細胞は、前記のように分化誘導刺激により、筋芽細胞、そして筋管細胞へ分化する。筋幹細胞及び筋芽細胞の時期には、細胞が増殖しているが、筋管細胞の時期には増殖していない。
接触工程における細胞と試験物質との接触のタイミング、すなわち、試験物質の添加の時期は、特に限定されるものではなく、筋幹細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞のいずれの時期でもよい。特に、細胞増殖に影響を与えない試験物質の場合は、いずれの時期でも代謝変換に関与する物質のスクリーニングが可能である。しかし、細胞増殖に影響を与える試験物質の場合は、筋芽細胞、又は筋管細胞に分化した後が好ましい。
例えば、筋幹細胞に試験物質を添加する場合、限定されるものでないが、培養開始時〜培養開始４日後程度に添加してもよく、好ましくは培養開始１〜３日後である。筋芽細胞、又は筋管細胞に試験物質を添加する場合、限定されるものでないが、筋芽細胞への分化誘導開始時〜分化誘導３日後に添加してもよく、好ましくは分化誘導１２時間後〜３６時間後である。
【００２５】
試験物質の濃度も、適宜決定することができるが、試験物質が代謝変換に影響を与える最適濃度があると考えられるため、何段階かに希釈して試験することが好ましい。
接触工程における培地も、筋幹細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞が培養される限りにおいて、限定されるものではないが、例えば１０％の胎児牛血清、あるいは２％馬血清を含む細胞培養液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）を挙げることができる。
【００２６】
（分析工程）
本発明における分析工程は、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程である。
遺伝子の発現の分析は、特に限定されるものではないが、例えばｍＲＮＡの合成量を分析してもよく、ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質量を分析してもよい。ｍＲＮＡの発現の検出方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えばｍＲＮＡを直接測定するノザンブロット分析、ドットブロット法、及びＲＮＡｓｅプロテクション法並びにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し分析するＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ノザンブロット分析法を挙げることができるが、最も好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＤＮＡチップ法である。また、タンパク質の発現を測定する方法としては、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、又は固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）を挙げることができる。しかしながら、本スクリーニング系では、蛍光タンパク質の発現量を蛍光又は発光で分析できるため、蛍光又は発光タンパク質量の分析が、容易で正確に分析可能である。すなわち、試験物質を添加してない（陰性）コントロールと比較して、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が増加していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が増加していると判断され、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が減少していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が減少していると判断される。また、ミオシン重鎖を発現している細胞数の増加又は減少が無い場合に、蛍光タンパク質の蛍光量が増加又は減少している場合には、１つの細胞におけるミオシン重鎖の発現が増加又は減少していると考えられる。本発明のスクリーニング方法は、１つの細胞におけるミオシン重鎖の発現を増加又は減少させる代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることもできる。蛍光タンパク質の量は、例えば蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、又は多光子レーザー顕微鏡で測定することが可能である。
更に、それぞれの蛍光タンパク質を発現した細胞数を計測することによって、ミオシン重鎖Ｉを発現する遅筋線維、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ、又はミオシン重鎖ＩＩｂを発現する速筋線維細胞数を測定することもできる。また、顕微鏡写真における、それぞれの筋線維を発現している細胞の面積を、蛍光を測定することによって計算し、細胞数に代えることも可能である。従って、本明細書においては、細胞数及び細胞の面積を、纏めて「細胞の量」と称することがある。また、筋管細胞の時期などの細胞が増殖していない時期において、例えば「ミオシン重鎖Ｉを発現する細胞の量が増加している」とは、細胞が分化していることを意味している。本発明のスクリーニング方法においては、１つの細胞のミオシン重鎖の発現を継時的に観察することできる。更に、１つの細胞において、２つ以上のミオシン重鎖が発現していることを確認することができる。すなわち、細胞の分化は、細胞単位で起こるが、本発明のスクリーニング方法では、細胞レベルでの変化を継時的に、観察することが可能である。この理由は、本発明においては、細胞を培養しながら観察できるためである。抗体などを用いたミオシン重鎖の発現の観察では、細胞内部に存在するミオシン重鎖を染色するため、細胞を固定する必要があり、生きた細胞の継時的な観察が困難である。
【００２７】
例えば、実施例に記載の筋幹細胞の場合、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光タンパク質ＹＦＰの融合タンパク質をコードする遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光タンパク質Ｓｉｒｉｕｓの融合タンパク質をコードする遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｅｒｕｌｅａｎの融合タンパク質をコードする遺伝子、並びにミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。
【００２８】
従って、黄色のＹＦＰ発現の増減は、ミオシン重鎖Ｉタンパク質の発現が増減していること（ミオシン重鎖Ｉタンパク質を発現している細胞が増減していること）を意味している。ミオシン重鎖Ｉタンパク質は、遅筋線維に発現し、酸化系の代謝に関係している（表１）。このミオシン重鎖Ｉタンパク質の増加は、ミトコンドリアの量増加、ミトコンドリア機能の上昇、ＡＴＰ産生量の増加、脂肪代謝とアミノ酸代謝を意味する。
また、ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の割合が増加し、そして遅筋が減少することによる筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、速筋の増加を伴う疾患、及び／又は遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防に有用である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる試験物質は、例えば廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療薬として用いることができる。これらの疾患は、遅筋が減少しており、ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させることのできる物質、すなわちミオシン重鎖Ｉ筋線維細胞を増加させることのできる物質は、直接これらの疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療薬に有用である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖Ｉ線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞をバランスよく分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる物質は、遅筋線維細胞の分化誘導能によって、筋線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
なお、本明細書において、筋力低下を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
また、本明細書において、筋萎縮を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
更に、本明細書において、筋損傷を伴う疾患とは運動神経損傷、又は外傷及び外科治療後の筋組織再建を意味する。
【００２９】
また、青色のＳｉｒｉｕｓの増減は、ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質の発現が増減していること（ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を発現している細胞が増減していること）を意味している。ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質は、速筋線維に発現し、酸化系／解糖系の代謝に関係している（表１）。このミオシン重鎖ＩＩａタンパク質の増加は、ミトコンドリアの量増加、ミトコンドリア機能の上昇、ＡＴＰ産生量の増加、脂肪代謝とアミノ酸代謝の増加を意味する。
また、ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の割合が増加し、そして遅筋が減少することによる筋力低下、筋萎縮、又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、速筋の増加を伴う疾患、及び／又は遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防に有用である。ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を増加させる試験物質は、例えば廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療薬として用いることができる。ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を増加させる試験物質は、ミオシン重鎖ＩＩａ線維を増加させることによって、直接これらの疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
更に、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療に有用である。ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩａ線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞をバランスよく分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩａ線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
【００３０】
更に、青色のｍＣｅｒｕｌｅａｎｓの増減は、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質の発現が増減していること（ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質を発現している細胞が増減していること）を意味している。ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質は、速筋線維に発現し、酸化系／解糖系の代謝に関係している（表１）。このミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質の増加は、糖代謝機能の上昇、脂肪合成とアミノ酸合成の増加を意味する。
また、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の減少する疾患の治療又は予防に有用である。具体的には、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）の予防薬及び治療薬、又はＡＬＳの治療薬として用いることができる。
更に、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療薬に有用である。ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞を対象となる骨格筋の特性に合わせて分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
【００３１】
また、赤色のｍＣｈｅｒｒｙの増減は、ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質の発現が増減していること（ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質を発現している細胞が増減していること）を意味している。ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質は、速筋線維に発現し、解糖系の代謝に関係している（表１）。このミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質の増加は、糖代謝機能の上昇、脂肪合成とアミノ酸合成の増加を意味する。
また、ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の減少する疾患の治療又は予防に有用である。具体的には、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）の予防薬及び治療薬、又はＡＬＳの治療薬として用いることができる。
更に、筋損傷、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療に有用である。ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩｂ線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞を対象となる骨格筋の特性に合わせて分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖ＩＩｂ線維細胞の分化誘導能によって、筋線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
【００３２】
【表１】
2015060430.tif 000002
【００３３】
また、本発明のスクリーニング法によって得られた骨格筋の代謝変換に関与する物質を用いて、骨格筋の代謝変換に関与する細胞の遺伝子又は細胞から産生される分子（タンパク質）を発見することも可能である。これらの遺伝子又は分子（タンパク質）の細胞からのスクリーニングは、公知の技術を用いて行うことができる。
【００３４】
（代謝変換に関与する物質）
本発明のスクリーニング方法によって得られる代謝変換に関与する物質は、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、筋管細胞（筋線維細胞）への分化を誘導することができるが、間葉系幹細胞から、筋幹細胞、筋芽細胞、そして筋管細胞（筋線維細胞）への分化を誘導することも可能である。
間葉系幹細胞としては、特に限定されるものではないが、間葉系に属する細胞への分化誘導能を有するものであり、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、骨格筋細胞、又は脂肪細胞などに分化することができる。間葉系幹細胞は、間葉系組織に存在すると考えられているが、骨髄由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、臍帯および臍帯血由来間葉系幹細胞を用いることができる。前記代謝変換に関与する物質は、例えば上記の間葉系幹細胞を筋幹細胞、筋芽細胞、そして筋管細胞（筋線維細胞）に分化誘導することができる。従って、前記代謝変換に関与する物質は、細胞の代謝変換に関与する受容体のリガンド、アゴニスト、又はアンタゴニストのことがある。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、骨格筋以外の細胞の代謝変換を誘導する物質をスクリーニングすることも可能である。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる代謝変換に関与する物質は、代謝変換に関与する限りにおいて、特に限定されるものではないが、前記の通り速筋の増加を伴う疾患の治療剤若しくは予防剤、速筋の減少を伴う疾患の治療剤若しくは予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療剤若しくは予防剤、又は遅筋の減少を伴う疾患の治療剤若しくは予防剤を挙げることができ、更に抗癌剤、免疫抑制剤、又は生活習慣病の治療剤若しくは予防剤を挙げることができる。
【００３６】
（速筋若しくは遅筋の増加若しくは減少を伴う疾患のスクリーニング）
実施例３に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、骨格筋の速筋を増加させることが知られているＴ３（トリヨードサイロニン）をスクリーニング可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、速筋の減少を伴う疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。更に、実施例４に示すように、本発明のスクリーニング方法によって、遅筋においてＩ型線維の増加を示し、そして速筋においてＩＩ型筋線維の増加を示すＩＬ−１５をスクリーニングすることが可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、遅筋の減少を伴う疾患、及び速筋の減少を伴う疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法は、直接的に、遅筋線維又は速筋線維の発現の増減を検出していることから、速筋の減少を伴う疾患、速筋の増加を伴う疾患の治療薬、遅筋の増加を伴う疾患の治療薬、又は遅筋の減少を伴う疾患の治療薬のスクリーニングが可能である。
【００３７】
（抗癌剤のスクリーニング）
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、抗癌剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例３に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、抗癌作用を有するラパマイシンをスクリーニングすることが可能であった。ラパマイシンは、Mammalian target of rapamycin（以下、ｍＴＯＲと称する）を抑制することによって、抗癌作用を示すｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲが恒常的に活性化された癌細胞が知られており、そのような癌細胞は、ラパマイシンによって抑制されると考えられる。更に、ラパマイシンは実施例５に記載のように筋幹細胞（サテライト細胞）の増殖を抑制する。ｍＴＯＲは細胞外シグナル（例、インシュリン及びインシュリン様成長因子）で活性化された受容体から、細胞内のセリンスレオニンキナーゼ（ＰＩ３キナーゼ、ＡＫＴ）を介して制御される。また、このｍＴＯＲシグナル経路はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼからも制御を受けて、細胞の生存および増殖を制御する。本発明のスクリーニング方法は、ｍＴＯＲシグナル経路に関連するセリンスレオニンキナーゼ又はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼなどの複数の因子を、抑制又は亢進する化合物をスクリーニングすることも可能である。そして、スクリーニングされた化合物は、ｍＴＯＲ阻害剤と同じように、抗癌剤としての作用を有することが期待される。従って、ｍＴＯＲに結合するラパマイシン以外にも、本発明のスクリーニング方法によって、抗癌剤をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法によって、ｍＴＯＲシグナル経路に関連して抗癌作用を示す化合物以外の抗癌剤をスクリーニングすることもできる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、抗癌剤のスクリーニングに用いることができる。
【００３８】
（免疫抑制剤のスクリーニング）
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例３に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、免疫抑制作用を有するラパマイシンをスクリーニングすることが可能であった。ラパマイシンは、ｍＴＯＲを抑制することによって、免疫抑制作用を示すｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲは細胞外シグナル（例、インシュリン及びインシュリン様成長因子）で活性化された受容体から、細胞内のセリンスレオニンキナーゼ（ＰＩ３キナーゼ、ＡＫＴ）を介して制御される。また、このｍＴＯＲシグナル経路はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼからも制御を受けて、細胞の生存および増殖を制御する。本発明のスクリーニング方法は、ｍＴＯＲシグナル経路に関連するセリンスレオニンキナーゼ又はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼなどの複数の因子を、抑制又は亢進する化合物をスクリーニングすることも可能である。そして、このような化合物は、ｍＴＯＲ阻害剤と同じように、免疫抑制剤としての作用を有することが期待される。従って、ｍＴＯＲに結合するラパマイシン以外にも、本発明のスクリーニング方法によって、免疫抑制作用を有する化合物をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法によって、ｍＴＯＲシグナル経路に関連して免疫抑制作用を示す化合物以外の免疫抑制剤をスクリーニングすることもできる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニングに用いることができる。
【００３９】
（生活習慣病の治療剤のスクリーニング）
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、生活習慣病の治療剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例３及び４に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させる効果を有するＦＧＦ２１及びβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）をスクリーニングすることが可能であった。褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞と比較すると、脂肪及び糖を燃焼させて大量の熱を産生することが可能である。従って、褐色脂肪細胞が増加すれば、脂肪が消費され生活習慣病の大きな原因である肥満症の治療に有効である。そして、肥満症が改善されれば、糖尿病、高血圧、動脈硬化、脳血管障害、又は心血管障害などの生活習慣病の治療にも効果を有する。従って、ＦＧＦ２１及びβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）は、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させることによって、生活習慣病の治療剤として用いることが可能である。
また、本発明のスクリーニング方法によって、ＦＧＦ２１及びβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）以外にも、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させることのできる物質、すなわち生活習慣病の治療剤をスクリーニングすることが可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、生活習慣病の治療剤のスクリーニングに用いることができる。
更に、実施例４に示すように、本発明のスクリーニング方法によって、肥満症に効果（内臓脂肪細胞の減少）のあるＩＬ−１５をスクリーニングすることが可能であった。従って、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させる効果以外の機構により、肥満症に効果を有する化合物を、本発明のスクリーニング方法によって、スクリーニングすることも可能である。
【００４０】
本発明のスクリーニングキットは、前記スクリーニング方法に用いることができる。従って、本発明のスクリーニングキットは、前記「［１］筋幹細胞又は筋芽細胞」に記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞を含む。更に、本発明のスクリーニングキットは、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、又はミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬を含んでもよい。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬（プローブ、プライマー、及び酵素など）を含んでもよい。
或いは、本発明のスクリーニングキットは、ミオシン重鎖Ｉタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、ミオシン重鎖ＩＩａタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、又はミオシン重鎖ＩＩｂタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質を検出する試薬を含んでもよい。具体的には、抗体、及び酵素などを含んでもよい。
更に、本発明のスクリーニングキットは、蛍光又は発光タンパク質量を測定するための試薬を含んでもよい。具体的には、発光用ルシフェリンなど、あるいは発色用ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができる。
【００４１】
本発明の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞は、前記代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットの製造に使用することができる。更に、本発明の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞は、代謝変換に関与する物質のスクリーニングツールとして使用することができる。前記代謝変換に関与する物質は、好ましくは遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である。
【００４２】
［３］医薬組成物
（１）ラパマイシン又はその誘導体を含む医薬組成物
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、ラパマイシン又はその誘導体を含む。ラパマイシンは、下記式（１）
【化１】
2015060430.tif 000003
で表される化合物であり、免疫制御剤、癌の抑制作用、寿命延長作用、及び平滑筋の増殖抑制作用が報告されている。しかしながら、ミオシン重鎖Ｉを増加させること、及びミオシン重鎖ＩＩｂを減少させることは知られていなかった。また、本発明の医薬組成物は、ラパマイシンの誘導体を含むこともできる。ラパマイシンの誘導体としては、Ｓｅｔｈ  Ａ．Ｗａｄｅｒらの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１１年（米国）第１２１巻、ｐ．１２３１−４１）に記載の誘導体を挙げることができる。
【００４３】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患は、特に限定されるものではないが、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建を挙げることができる。ラパマイシンを含む医薬組成物は、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療又は予防にそのまま用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療において、筋幹細胞及び／又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。また、本発明のラパマイシンを含む医薬組成物は、リハビリテーション（運動療法）及び栄養療法と併用することが有効である。
【００４４】
（２）線維芽細胞増殖因子２１を含む医薬組成物
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、線維芽細胞増殖因子２１（以下、ＦＧＦ２１と称することがある）を含む。線維芽細胞増殖因子２１は、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦファミリー）に属するタンパク質である。ＦＧＦ２１は、全身性の作用を示すことが知られている。ＦＧＦ２１が、ミオシン重鎖Ｉを増加させることは知られていなかった。なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウスの線維芽細胞増殖因子２１であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトの線維芽細胞増殖因子２１である。本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる線維芽細胞増殖因子２１は、筋幹細胞の代謝変換の機能を有する限りにおいて、マウス又はヒトの線維芽細胞増殖因子２１に限定されるものではない。例えば、マウスの線維芽細胞増殖因子２１（配列番号１）又はヒトの線維芽細胞増殖因子２１（配列番号２）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチドが含まれる。具体的には、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、イヌ、又はネコの線維芽細胞増殖因子２１を用いることができる。
【００４５】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮、又は筋損傷を伴う疾患は、特に限定されるものではないが、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建を挙げることができる。線維芽細胞増殖因子２１を含む医薬組成物は、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療又は予防にそのまま用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、筋芽細胞の選択的な移植治療において、間葉系幹細胞、筋幹細胞及び／又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。また、本発明の線維芽細胞増殖因子２１を含む医薬組成物は、単独、又は運動療法及び栄養療法と併用することで、骨格筋の持久力の回復が期待できる。
【００４６】
（３）β３受容体アゴニスト又はその誘導体を含む医薬組成物
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、β３受容体アゴニスト又はその誘導体を含む。β３受容体アゴニストは、β３アドレナリン受容体の作動薬である限りにおいて限定されるものではないが、下記式（２）
【化２】
2015060430.tif 000004
で表されるミラベグロン、ノルアドレナリン、下記式（３）
【化３】
2015060430.tif 000005
で表されるＢＲＬ３７３４４、下記式（４）
【化４】
2015060430.tif 000006
で表されるＣＬ３１６２４３、又はそれらの誘導体を挙げることができる。β３受容体は、脂肪細胞、消化管、又は肝臓に存在し、基礎代謝に関係すると考えられている。
【００４７】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患は、特に限定されるものではないが、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建を挙げることができる。β３受容体アゴニストを含む医薬組成物は、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療又は予防にそのまま用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療において、筋幹細胞及び／又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。
【００４８】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４９】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【００５１】
［４］筋管細胞分化誘導剤
（１）ラパマイシン又はその誘導体を含む筋管細胞分化誘導剤
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。ラパマイシンの誘導体としては、前記の「医薬組成物」に記載の誘導体を用いることができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞の移植治療において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
ラパマイシンを含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
【００５２】
（２）線維芽細胞増殖因子２１を含む筋管細胞分化誘導剤
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、線維芽細胞増殖因子２１を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞の移植治療において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
線維芽細胞増殖因子２１を含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
【００５３】
（３）β３受容体アゴニスト又はその誘導体を含む筋管細胞分化誘導剤
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。ラパマイシンの誘導体としては、前記の「医薬組成物」に記載の誘導体を用いることができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞の移植治療において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
β３受容体アゴニストを含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
【００５４】
本発明の筋管細胞分化誘導剤の濃度及び作用時間は、細胞の種類や培養条件にあわせて適宜決定することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００５６】
《作成例１》
本作成例では、ミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子の導入されたノックインマウスを作成した。ミオシン重鎖Ｉ遺伝子と、蛍光タンパク質ＹＦＰの結合した融合遺伝子が導入されているＭｙＨＣＩ−ＹＦＰノックインマウス（National Institute of Health）に、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光タンパク質Ｓｉｒｉｕｓ遺伝子が結合した融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が結合した融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光タンパク質ｍＣｅｒｕｌｅａｎ遺伝子が結合した融合遺伝子を導入した。
ノックインマウスのターゲティングベクターを作製するため、ＢＡＣＰＡＣ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから、雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＢＡＣクローンであるＲＰ２４−１４９Ｐ２２、ＲＰ２４−３７４Ｄ２４を購入し、ＭｙＨＣＩＩａ遺伝子、ＭｙＨＣＩＩｂ遺伝子、及びＭｙＨＣＩＩｄ／ｘの標的とするゲノム配列をそれぞれサブクローニングした。ＢＡＣ配列のサブクローニングにはRed/ETrecombination BAC subcloning kit（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用し、ネガティブ選択用のマーカー（ＭＣ１−ＴＫ）が挿入されたプラスミド（ＰＬ２５３）に約１０ｋｂのゲノムＤＮＡを導入した。紫外線領域蛍光タンパクであるＳｉｒｉｕｓ、赤色蛍光タンパクであるｍＣｈｅｒｒｙ、及び青色蛍光タンパク質であるｍＣｅｒｕｌｅａｎのｃＤＮＡ配列をＰＣＲでクローニングし、それぞれＭｙＨＣＩＩａ、ＩＩｂ、及びＩＩｄ／ｘ遺伝子の翻訳開始配列（ＡＴＧ）とコドンのフレームを合わせて５’側に挿入した。また、ＦＲＴ配列で挟んだPGK-gb2-Neomycin cassette（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）をポジティブ選択用のマーカーとしてターゲティングベクターに挿入した（図１）。直鎖状にしたターゲティングベクターをエレクトロポレーションでマウスＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８でポジティブ選択を行った後、ＰＣＲとサザンブロットで相同組換えを起こしたＥＳクローンを同定した。同定したＥＳクローンを用いてアグリゲーション法によりキメラマウスを作製し、雌性のＣ５７ＢＬ／６との交配で得られた産仔のジェノタイピングを行って生殖系列への移行を確認した。【００５７】
《実施例１》
本実施例では、作成例１で作成したノックインマウスから、筋幹細胞（サテライト細胞）のＦＡＣＳによる、ネガティブ選択及びポジィティブ選択により分離した。
マウスから単離した筋に２倍量の０．２％コラゲナーゼを添加し３７℃で１時間撹拌する。１８Ｇの注射針を用い溶液をトリチュレーション後、３７℃で３０分撹拌。４０μｍセルストレーナーを通し１５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、上清を除去し赤血球除去用塩化アンモニウム溶液を添加し、氷上３０秒静置して溶血させた。２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加え１５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心した。上清を除去し、沈殿をＳＭ／Ｃ−２．６−ｂｉｏｔｉｎ（ｘ２００）、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁、氷上で３０分静置した。２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心し、上清を除去し沈殿をＣＤ３１−ＦＩＴＣ（ｘ４００）、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ｘ８００）、Ｓｃａ１−ＰＥ（ｘ４００）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰＣ（ｘ４００）２％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁した。氷上で３０分静置後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加え１５００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心した。上清を除去し、沈殿を２％ＦＢＳ／ＰＢＳで懸濁した。セルストレーナーを通し１ｍｇ／ｍＬのＰＩ（ｘ５００）を添加し、ＦＡＣＳ解析で解析しながら筋幹細胞（サテライト細胞）を分離した。【００５８】
《実施例２》
本実施例では、筋幹細胞（サテライト細胞）の不死化細胞の取得を行った。不死化細胞の取得のために、ＩＦＮ−γで誘導されるＨ−２Ｋｂ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ及び温度感受性ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を有するＩｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅを用いた。Ｉｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅは、ＩＦＮ−γによりＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原が発現し、細胞の不死化を誘導することができる。
作成例１で作成したノックインマウスと、Ｉｍｍｏｒｔｍｏｕｓｅとを交配させて、産仔を取得した。得られた産仔から、実施例１の方法に従って、筋幹細胞（サテライト細胞）を分離した。分離した筋幹細胞を、３３℃、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下で培養することにより、不死化の誘導を行った。得られた細胞を、３７℃で培養することにより、温度感受性ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を分解し、不死化筋幹細胞（サテライト細胞）を取得した。【００５９】
《実施例３》
本実施例では、実施例２で作成した不死化筋幹細胞を用いて、２７種の試験化合物についての、代謝変換スクリーニングを行った。
不死化筋幹細胞１ｘ１０５の細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈあるいは２ｘ１０３の細胞を９６ウェルプレートに播種した。２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ含有ＤＭＥＭ培地で１日間３３℃で培養後、５％ＨＳ含有ＤＭＥＭ培地で３日間３７℃で培養する。その後、２日間５％ウマ血清含有ＤＭＥＭに適当な希釈倍率に段階希釈した試験物質をそれぞれのｄｉｓｈに添加して処理をした後、蛍光顕微鏡によって生細胞の状態で、ＹＦＰ、Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びｍＣｅｒｕｌｅａｎの蛍光を観察し、それぞれの蛍光を発現している細胞数を測定した。図３Ａにミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合したＹＦＰが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合したｓｉｒｉｕｓが発現した筋管細胞の写真を示し、そして図３Ｂにミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合したｍＣｅｒｕｌｅａｎが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合したｍＣｈｅｒｒｙが発現した筋管細胞の写真を示す。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が減少した試験物質であるラパマイシンの結果を図４に示す。「ｎｅｇａ」は、ラパマイシンを添加していない陰性コントロールである。ラパマイシンは、陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発症する筋管細胞数が増加し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数が減少していた。具体的には、前記筋管細胞に４ｎＭのラパマイシンを接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２５．３％から６０．９％に増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が４１．８％から８．４％に減少した。
すなわち、ラパマイシンは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ラパマイシンは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したマウス線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の結果を図５に示す。「ｎｅｇａ」は、マウス線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）を添加していない陰性コントロールである。線維芽細胞増殖因子２１では陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭのマウス線維芽細胞増殖因子２１を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２８．４％からそれぞれ４０．６％、４８．０％及び５４．９％に増加した。
すなわち、ＦＧＦ２１は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ＦＧＦ２１は遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
更に、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が増加した試験物質Ｔ３（トリヨードサイロニン）の結果を図６に示す。前記筋管細胞に１００ｎＭ、及び５００ｎＭのＴ３（トリヨードサイロニン）を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が４４．５％からそれぞれ７１．３％、及び７０．０％に増加した。すなわち、Ｔ３は骨格筋の機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、Ｔ３は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。Ｔ３（トリヨードサイロニン）は、骨格筋の速筋を増加させることが知られており、本実施例の結果は、従来の知見と一致するものであり、本発明のスクリーングシステムが、有用であること示している。【００６０】
《実施例４》
本実施例では、実施例２で作成した不死化筋幹細胞を用いて、更に試験化合物についての、実施例３の操作を繰り返して、代謝変換スクリーニングを行った。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞も増加した試験物質であるＩＬ−１５の結果を図７に示す。「ｎｅｇａ」は、ラパマイシンを添加していない陰性コントロールである。ＩＬ−１５は、陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発症する筋管細胞数が増加し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数も増加していた。具体的には、前記筋管細胞に１００ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が１９．５％から３５．０％又は３６．１％に増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が３６．２％から５３．０％に増加した。
すなわち、ＩＬ−１５は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ＩＬ−１５は遅筋及び／又は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）の結果を図８に示す。「ｎｅｇａ」は、β３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）を添加していない陰性コントロールである。線維芽細胞増殖因子２１では陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭのβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２８．４％からそれぞれ４９．３％、５３．８％及び５７．８％に増加した。
すなわち、β３受容体アゴニストは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、β３受容体アゴニストは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。【００６１】
《実施例５》
本実施例では、実施例３の代謝変換スクリーニングで得られたラパマイシンについて、サテライト細胞を用いて、増殖抑制スクリーニングによってスクリーニングされるか否かを検討した。
不死化筋幹細胞１ｘ１０4の細胞を３５ｍｍ  ｄｉｓｈに播種した。２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ含有ＤＭＥＭ培地で、１日間３３℃で培養後、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに５ｎＭに希釈したラパマイシンをｄｉｓｈに添加して処理をした後、５日間培養し、細胞数を測定した。図９Ａに５日間培養後の不死化筋幹細胞の顕微鏡写真を示し、図９Ｂに細胞数の増加のグラフを示す。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ラパマイシンを添加していない、陰性コントロールである。ラパマイシンを添加することによって、サテライト細胞の増殖が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞及びそれを用いたスクリーニング方法は、骨格筋の代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることが可能であり、従って、骨格筋の筋力低下又は筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防薬のスクリーニングが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法は、抗癌剤、免疫抑制剤、又は生活習慣病の治療又は予防剤のスクリーニングに用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2015060430.tif 000007
【図２】
2015060430.tif 000008
【図３】
2015060430.tif 000009
【図４】
2015060430.tif 000010
【図５】
2015060430.tif 000011
【図６】
2015060430.tif 000012
【図７】
2015060430.tif 000013
【図８】
2015060430.tif 000014
【図９】
2015060430.tif 000015
【配列表】
2015060430000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月19日(2016.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオシン重鎖Ｉ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖Ｉ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩａ融合遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ融合遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖ＩＩｂ融合遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項２】
前記細胞が不死化細胞である、請求項１に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項３】
ミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子が、それぞれ異なる蛍光又は発光タンパク質遺伝子である、請求項１又は２に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項４】
前記蛍光又は発光タンパク質が、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＳＢＰ２、ＥＢＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＴａｇＢＦＰ、ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＰ１、ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＣＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＡＧ（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）、ｍＡＧ１、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ）、ＥＧＦＰ、ＧＰ２、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＫＯ１、ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯ２、Ｋｅｉｍａ５７０、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＡｐｐｌｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ２、ＴａｇＦＰ６３５、ｍＰｌｕｍ、ｅｇＦＰ６５０、Ｎｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｅｇＦＰ６７０及びルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの蛍光又は発光タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程；及び
前記細胞におけるミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、
を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ミオシン重鎖遺伝子の発現の分析が、蛍光又は発光タンパク質を発現している細胞の量又は細胞増殖の分析である、請求項５に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項９】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項８に記載の筋管細胞分化誘導剤。
【請求項１０】
（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は
（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、
を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１１】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
（１）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１、又は
（２）配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、
を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項１４】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項１３に記載の筋幹細胞分化誘導剤。
【請求項１５】
β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤。
【請求項１６】
前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項１５に記載の筋幹細胞分化誘導剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
神経筋難病は、筋萎縮性側索硬化症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、及び脂質蓄積障害性ミオパチーを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（分析工程）
本発明における分析工程は、ミオシン重鎖Ｉ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子、及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程である。
遺伝子の発現の分析は、特に限定されるものではないが、例えばｍＲＮＡの合成量を分析してもよく、ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質量を分析してもよい。ｍＲＮＡの発現の検出方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えばｍＲＮＡを直接測定するノザンブロット分析、ドットブロット法、及びＲＮＡｓｅプロテクション法並びにｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し分析するＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＤＮＡチップ法、ノザンブロット分析法を挙げることができるが、最も好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＤＮＡチップ法である。また、タンパク質の発現を測定する方法としては、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、又は固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）を挙げることができる。しかしながら、本スクリーニング系では、蛍光タンパク質の発現量を蛍光又は発光で分析できるため、蛍光又は発光タンパク質量の分析が、容易で正確に分析可能である。すなわち、試験物質を添加してない（陰性）コントロールと比較して、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が増加していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が増加していると判断され、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が減少していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が減少していると判断される。また、ミオシン重鎖を発現している細胞数の増加又は減少が無い場合に、蛍光タンパク質の蛍光量が増加又は減少している場合には、１つの細胞におけるミオシン重鎖の発現が増加又は減少していると考えられる。本発明のスクリーニング方法は、１つの細胞におけるミオシン重鎖の発現を増加又は減少させる代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることもできる。蛍光タンパク質の量は、例えば蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、又は多光子レーザー顕微鏡で測定することが可能である。
更に、それぞれの蛍光タンパク質を発現した細胞数を計測することによって、ミオシン重鎖Ｉを発現する遅筋線維、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ、又はミオシン重鎖ＩＩｂを発現する速筋線維細胞数を測定することもできる。また、顕微鏡写真における、それぞれの筋線維を発現している細胞の面積を、蛍光を測定することによって計算し、細胞数に代えることも可能である。従って、本明細書においては、細胞数及び細胞の面積を、纏めて「細胞の量」と称することがある。また、筋管細胞の時期などの細胞が増殖していない時期において、例えば「ミオシン重鎖Ｉを発現する細胞の量が増加している」とは、細胞が分化していることを意味している。本発明のスクリーニング方法においては、１つの細胞のミオシン重鎖の発現を経時的に観察することできる。更に、１つの細胞において、２つ以上のミオシン重鎖が発現していることを確認することができる。すなわち、細胞の分化は、細胞単位で起こるが、本発明のスクリーニング方法では、細胞レベルでの変化を経時的に、観察することが可能である。この理由は、本発明においては、細胞を培養しながら観察できるためである。抗体などを用いたミオシン重鎖の発現の観察では、細胞内部に存在するミオシン重鎖を染色するため、細胞を固定する必要があり、生きた細胞の継時的な観察が困難である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
従って、黄色のＹＦＰ発現の増減は、ミオシン重鎖Ｉタンパク質の発現が増減していること（ミオシン重鎖Ｉタンパク質を発現している細胞が増減していること）を意味している。ミオシン重鎖Ｉタンパク質は、遅筋線維に発現し、酸化系の代謝に関係している（表１）。このミオシン重鎖Ｉタンパク質の増加は、ミトコンドリアの量増加、ミトコンドリア機能の上昇、ＡＴＰ産生量の増加、脂肪代謝とアミノ酸代謝の増加を意味する。
また、ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の割合が増加し、そして遅筋が減少することによる筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、速筋の増加を伴う疾患、及び／又は遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防に有用である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる試験物質は、例えば廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はＩ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症の治療薬として用いることができる。これらの疾患は、遅筋が減少しており、ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させることのできる物質、すなわちミオシン重鎖Ｉ筋線維細胞を増加させることのできる物質は、直接これらの疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞の選択的な移植治療薬に有用である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖Ｉ線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び／又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞をバランスよく分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖Ｉタンパク質を増加させる物質は、遅筋線維細胞の分化誘導能によって、筋線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
なお、本明細書において、筋力低下を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
また、本明細書において、筋萎縮を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
更に、本明細書において、筋損傷を伴う疾患とは運動神経損傷、又は外傷及び外科治療後の筋組織再建を意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
（３）β３受容体アゴニスト又はその誘導体を含む筋管細胞分化誘導剤
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、β３受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。β３受容体アゴニストの誘導体としては、前記の「医薬組成物」に記載の誘導体を用いることができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳ細胞）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア（加齢性筋肉減少症）、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞の移植治療において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び／又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
β３受容体アゴニストを含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
《実施例３》
本実施例では、実施例２で作成した不死化筋幹細胞を用いて、２７種の試験化合物についての、代謝変換スクリーニングを行った。
不死化筋幹細胞１ｘ１０５の細胞を６０ｍｍ  ｄｉｓｈあるいは２ｘ１０３の細胞を９６ウェルプレートに播種した。２０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ含有ＤＭＥＭ培地で１日間３３℃で培養後、５％ＨＳ含有ＤＭＥＭ培地で３日間３７℃で培養する。その後、２日間５％ウマ血清含有ＤＭＥＭに適当な希釈倍率に段階希釈した試験物質をそれぞれのｄｉｓｈに添加して処理をした後、蛍光顕微鏡によって生細胞の状態で、ＹＦＰ、Ｓｉｒｉｕｓ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びｍＣｅｒｕｌｅａｎの蛍光を観察し、それぞれの蛍光を発現している細胞数を測定した。図３Ａにミオシン重鎖Ｉ遺伝子に結合したＹＦＰが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩａ遺伝子に結合したｓｉｒｉｕｓが発現した筋管細胞の写真を示し、そして図３Ｂにミオシン重鎖ＩＩｄ／ｘ遺伝子に結合したｍＣｅｒｕｌｅａｎが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖ＩＩｂ遺伝子に結合したｍＣｈｅｒｒｙが発現した筋管細胞の写真を示す。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が減少した試験物質であるラパマイシンの結果を図４に示す。「ｎｅｇａ」は、ラパマイシンを添加していない陰性コントロールである。ラパマイシンは、陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発光する筋管細胞数が増加し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発光する筋管細胞数が減少していた。具体的には、前記筋管細胞に４ｎＭのラパマイシンを接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２５．３％から６０．９％に増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が４１．８％から８．４％に減少した。
すなわち、ラパマイシンは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ラパマイシンは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したマウス線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）の結果を図５に示す。「ｎｅｇａ」は、マウス線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）を添加していない陰性コントロールである。線維芽細胞増殖因子２１では陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭのマウス線維芽細胞増殖因子２１を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２８．４％からそれぞれ４０．６％、４８．０％及び５４．９％に増加した。
すなわち、ＦＧＦ２１は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ＦＧＦ２１は遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
更に、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞が増加した試験物質Ｔ３（トリヨードサイロニン）の結果を図６に示す。前記筋管細胞に１００ｎＭ、及び５００ｎＭのＴ３（トリヨードサイロニン）を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が４４．５％からそれぞれ７１．３％、及び７０．０％に増加した。すなわち、Ｔ３は骨格筋の機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、Ｔ３は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。Ｔ３（トリヨードサイロニン）は、骨格筋の速筋を増加させることが知られており、本実施例の結果は、従来の知見と一致するものであり、本発明のスクリーングシステムが、有用であること示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
《実施例４》
本実施例では、実施例２で作成した不死化筋幹細胞を用いて、更に試験化合物についての、実施例３の操作を繰り返して、代謝変換スクリーニングを行った。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞も増加した試験物質であるＩＬ−１５の結果を図７に示す。「ｎｅｇａ」は、ＩＬ−１５を添加していない陰性コントロールである。ＩＬ−１５は、陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発症する筋管細胞数が増加し、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数も増加していた。具体的には、前記筋管細胞に１００ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が１９．５％から３５．０％又は３６．１％に増加し、ミオシン重鎖タンパク質ＩＩｂを発現した細胞面積が３６．２％から５３．０％に増加した。
すなわち、ＩＬ−１５は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ＩＬ−１５は遅筋及び／又は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞が増加したβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）の結果を図８に示す。「ｎｅｇａ」は、β３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）を添加していない陰性コントロールである。β３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）では陰性コントロールと比較して、ＹＦＰの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に１ｎＭ、１０ｎＭ及び１００ｎＭのβ３受容体アゴニスト（ＣＬ３１６２４３）を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Ｉを発現した細胞面積が２８．４％からそれぞれ４９．３％、５３．８％及び５７．８％に増加した。
すなわち、β３受容体アゴニストは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、β３受容体アゴニストは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
【国際調査報告】
2015060430.tif 000016
2015060430.tif 000017
2015060430.tif 000018
2015060430.tif 000019
2015060430.tif 000020
2015060430.tif 000021