(57)【要約】  本開示のペプチドは、（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号１〜５のいずれか１つにおいて１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、（ｃ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに膜透過ペプチドが融合されたペプチド、（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチド、のいずれか１種のペプチドであり、ＮＦκＢ阻害作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦκＢ阻害作用を有する、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれるいずれか１種のペプチド：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか１つにおいて１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに膜透過ペプチドが融合されたペプチド、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチド。
【請求項２】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号１又は２において１個〜４個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜５のいずれか１つにおいて１個又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記（ｄ）のペプチドが、前記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＣ末端に膜透過ペプチドが融合されたペプチドである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ阻害剤。
【請求項６】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤。
【請求項７】
前記ＮＦκＢ亢進性疾患が炎症性疾患である、請求項６に記載のＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤。
【請求項８】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターが導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＮＦκＢ（nuclear factor-kappa B）阻害作用を有する新規なペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換体、並びに該ペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ阻害剤及びＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応には種々のサイトカインや細胞接着分子の発現も関わっていることが知られている。この炎症性サイトカインがそれぞれに対応した受容体と結合することによって細胞内で各種分子のリン酸化が生じる。このリン酸化のカスケードは最終的に、核内の転写因子であるＮＦκＢを活性化し、各種炎症物質の転写が促進されると考えられている。このように、炎症反応は最終的にＮＦκＢの活性化に集約されており、このＮＦκＢの活性を効果的に阻害する薬剤として、ステロイド薬が広く用いられている。【０００３】
ステロイド薬は非常に強力な効果を有する一方で、重篤な副作用を引き起こすことも知られている。このため、ステロイド薬に代わるＮＦκＢ阻害剤が望まれていた。【０００４】
このような背景の下、本発明者は、ステロイド薬と同様にＮＦκＢの転写促進活性を直接阻害することができる一方、ステロイド薬のようなホルモン作用を有しない新規なペプチドとして、ＭＴＩ−ＩＩを発見している（例えば、特許第４８７４７９８号公報を参照）。
ＭＴＩ−ＩＩは、１０２個のアミノ酸残基からなる小さなペプチドであり、その中でＮＦκＢ阻害作用を有する部分は、３２番目から７５番目までのアミノ酸配列に対応する酸性アミノ酸領域であると考えられている。本発明者は、３６番目から７５番目までのアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端に８個のアルギニン残基からなる膜透過ペプチドを融合したペプチド（ＭＰＡＩＤ（MTI peptide anti-inflammatory drug）とも称する）を化学合成し、ＨｅＬａ細胞に添加したところ、ＮＦκＢの転写促進活性が阻害されることが確認された（例えば、「日本ビタミン学会第６６回大会、ビタミン、第８８巻第４号、第２６０頁」及び「第８７回日本生化学会大会、生化学、第８６巻臨時増刊号、第１０１頁「４Ｔ１３ａ−０４」、第１３６頁「３Ｐ−００６」」を参照）。また、このペプチドをアトピー性皮膚炎モデル動物に塗布投与したところ、in vivoでの抗炎症効果が確認された（例えば、「第８７回日本生化学会大会、生化学、第８６巻臨時増刊号、第１０１頁「４Ｔ１３ａ−０４」、第１３６頁「３Ｐ−００６」」を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の「日本ビタミン学会第６６回大会、ビタミン、第８８巻第４号、第２６０頁」及び「第８７回日本生化学会大会、生化学、第８６巻臨時増刊号、第１０１頁「４Ｔ１３ａ−０４」、第１３６頁「３Ｐ−００６」」で用いられているペプチドは、膜透過性ペプチドを含めて４８個のアミノ酸残基からなる小さなペプチドであるが、抗原性、生産性等を考慮すると、ペプチド長のより短いペプチドが望まれる。しかし、本発明者の実験によれば、酸性アミノ酸領域のＮ末端側の断片である３６番目から６５番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、中央部分の断片である４１番目から７０番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、及びＣ末端側の断片である４６番目から７５番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、のいずれもＮＦκＢ阻害作用を示さなかった。【０００６】
そこで、本発明は、ＮＦκＢ阻害作用を有する新規なペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換体、並びに該ペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ阻害剤及びＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明に至った。すなわち、本発明は以下の態様を包含する。【０００８】
＜１＞  ＮＦκＢ阻害作用を有する、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれるいずれか１種のペプチド：
（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか１つにおいて１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに膜透過ペプチドが融合されたペプチド、
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチド。【０００９】
＜２＞  上記（ｂ）のペプチドが、配列番号１又は２において１個〜４個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである、上記＜１＞に記載のペプチド。【００１０】
＜３＞  上記（ｂ）のペプチドが、配列番号３〜５のいずれか１つにおいて１個又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである、上記＜１＞に記載のペプチド。【００１１】
＜４＞  上記（ｄ）のペプチドが、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＣ末端に膜透過ペプチドが融合されたペプチドである、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のペプチド。【００１２】
＜５＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ阻害剤。【００１３】
＜６＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤。【００１４】
＜７＞  上記ＮＦκＢ亢進性疾患が炎症性疾患である、上記＜６＞に記載のＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤。【００１５】
＜８＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１６】
＜９＞  上記＜８＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。【００１７】
＜１０＞  上記＜９＞に記載のベクターが導入された形質転換体。【００１８】
＜１１＞  上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与することを含むＮＦκＢ亢進性疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ＮＦκＢ阻害作用を有する新規なペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターが導入された形質転換体、並びに該ペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ阻害剤及びＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のペプチドを発現するベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【図２】実施例１のペプチドを発現するベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【図３】実施例１のペプチドを発現するベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【図４】２０Ａ５６７５（配列番号２４）を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときの、ＴＮＦα添加後のＣＯＸ２量及びＧＡＰＤＨ量の変化を示す図である。
【図５】１２Ａ５１６２（配列番号２７）を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときの、ＴＮＦα添加後のＣＯＸ２量及びＧＡＰＤＨ量の変化を示す図である。
【図６】実施例４のペプチドを発現するベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【図７】実施例６のペプチドを発現するベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【図８】１２Ａ５１６２−ｐｅｐ（配列番号３９）又は６Ａ５６６１−ｐｅｐ（配列番号４０）のペプチドの存在下でＨｅＬａ細胞を培養したときのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写促進活性の阻害作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
アミノ酸配列の記載は左側がＮ末端側であり、アミノ酸残基は本技術分野で周知の一文字表記（例えば、アラニン残基であれば「Ａ」）又は三文字表記（例えば、アラニン残基であれば「Ａｌａ」）で表記する。
【００２２】
＜ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド＞
本開示のペプチドは、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれるいずれか１種である。
（ａ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１〜５のいずれか１つにおいて１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチド。
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに膜透過ペプチドが融合されたペプチド。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチド。
【００２３】
本開示のペプチドの作製手法は、遺伝子工学的手法及び有機合成化学的手法のいずれであってもよい。遺伝子工学的手法の場合、後述する本開示の形質転換体を利用することができる。
【００２４】
上記（ａ）のペプチドは、詳細には以下のいずれか１つのアミノ酸配列からなる（アミノ酸残基は一文字表記で示す）。
ＧＥＤＤＤＥＧＤＥＥＤＥＥＥＥＥＥＥＤＥ（配列番号１）
ＥＴＡＥＤＧＥＤＤＤＥＧ（配列番号２）
ＥＤＧＥＤＤ（配列番号３）
ＧＥＤＤＤＥ（配列番号４）
ＤＥＥＤＥＥ（配列番号５）
【００２５】
配列番号１のアミノ酸配列は、ＭＴＩ−ＩＩの５６番目から７５番目までのアミノ酸配列に対応する。また、配列番号２のアミノ酸配列は、ＭＴＩ−ＩＩの５１番目から６２番目までのアミノ酸配列に対応する。また、配列番号３のアミノ酸配列は、ＭＴＩ−ＩＩの５４番目から５９番目までのアミノ酸配列に対応する。また、配列番号４のアミノ酸配列は、ＭＴＩ−ＩＩの５６番目から６１番目までのアミノ酸配列に対応する。また、配列番号５のアミノ酸配列は、ＭＴＩ−ＩＩの６３番目から６８番目までのアミノ酸配列に対応する。
ＭＴＩ−ＩＩの中でＮＦκＢ阻害作用を有する部分は、３２番目から７５番目までのアミノ酸配列に対応する酸性アミノ酸領域であると考えられている。しかし、本発明者の実験によれば、酸性アミノ酸領域のＮ末端側の断片である３６番目から６５番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、中央部分の断片である４１番目から７０番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、及びＣ末端側の断片である４６番目から７５番目までのアミノ酸配列からなるペプチド、のいずれもＮＦκＢ阻害作用を示さなかった。配列番号１〜５のようにより短い断片であるペプチドがＮＦκＢ阻害作用を示すことは驚くべきことである。
【００２６】
上記（ｂ）のペプチドは、配列番号１〜５のいずれか１つにおいて１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである。
置換、欠失、及び／又は付加されるアミノ酸残基の数は、ＮＦκＢ阻害作用が維持される限り特に限定されない。置換、欠失、及び／又は付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、１個〜４個であってもよく、１個〜３個であってもよく、１個又は２個であってもよく、１個であってもよい。
【００２７】
任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する場合、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質によってアミノ酸を分類する場合、例えば、親水性アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）；疎水性アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｃ、Ｐ）；酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）；塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、Ｌ）；芳香族基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（Ｍ、Ｃ）；等に分類することができる（括弧内のアルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す）。
【００２８】
アミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加される位置は、ＮＦκＢ阻害作用が維持される限り特に限定されない。
例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの場合、Ｃ末端側に酸性アミノ酸残基が１３個連続した領域が存在するため、この領域の１個又は数個のアミノ酸残基を他の酸性アミノ酸残基に置換してもよく、この領域の１個又は数個のアミノ酸残基を欠失させてもよく、この領域に１個又は数個の酸性アミノ酸残基を付加してもよい。
また、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの場合、Ｎ末端側から７番目〜１１番目に酸性アミノ酸残基が５個連続した領域が存在するため、この領域の１個又は数個のアミノ酸残基を他の酸性アミノ酸残基に置換してもよく、この領域の１個又は数個のアミノ酸残基を欠失させてもよく、この領域に１個又は数個の酸性アミノ酸残基を付加してもよい。
また、配列番号３又は４のアミノ酸配列からなるペプチドの場合、１個のグリシン残基を除いて酸性アミノ酸残基で構成されるため、１個又は２個の酸性アミノ酸残基を他の酸性アミノ酸残基に置換してもよく、１個又は２個の酸性アミノ酸残基を付加してもよい。
また、配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドの場合、酸性アミノ酸残基で構成されるため、１個又は２個の酸性アミノ酸残基を他の酸性アミノ酸残基に置換してもよく、１個又は２個の酸性アミノ酸残基を付加してもよい。
【００２９】
上記（ｂ）のペプチドの具体例としては、以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる（アミノ酸残基は一文字表記で示す）。
ＧＥＤＤＤＥＧＤＥＥＤＥＥＥＥＥＤＤＤＥ（配列番号６）
ＥＴＡＥＤＧＥＤＤＤＧ（配列番号７）
ＥＴＡＥＤＧＥＤＤＤＤＧ（配列番号８）
ＥＴＡＥＤＧＤＥＤＤＥＧ（配列番号９）
ＥＤＧＤＥＤ（配列番号１０）
ＧＥＤＤＤＤ（配列番号１１）
ＧＤＥＤＤＥ（配列番号１２）
ＤＥＥＤＥＤ（配列番号１３）
【００３０】
配列番号６のペプチドは、配列番号１のＮ末端側から１７番目及び１８番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
配列番号７のペプチドは、配列番号２のＮ末端側から１１番目のグルタミン酸残基を欠失させたものである。
配列番号８のペプチドは、配列番号２のＮ末端側から１１番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
配列番号９のペプチドは、配列番号２のＮ末端側から７番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換するとともに、Ｎ末端側から８番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に置換したものである。
配列番号１０のペプチドは、配列番号３のＮ末端側から４番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換するとともに、Ｎ末端側から５番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に置換したものである。
配列番号１１のペプチドは、配列番号４のＣ末端のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
配列番号１２のペプチドは、配列番号４のＮ末端側から２番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換するとともに、Ｎ末端側から３番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に置換したものである。
配列番号１３のペプチドは、配列番号５のＣ末端のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
なお、上記（ｂ）のペプチドがこれらの例に限定されるものでないことは勿論である。
【００３１】
上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮＦκＢ阻害作用を有するペプチドである。
配列番号１〜５のいずれか１つのアミノ酸配列との相同性は、ＮＦκＢ阻害作用が維持される限り特に限定されないが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましい。
上記（ｃ）のペプチドの具体例としては、配列番号６〜１３のいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。なお、上記（ｃ）のペプチドがこれらの例に限定されるものでないことは勿論である。
【００３２】
上記（ｄ）のペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに膜透過ペプチドが融合されたペプチドである。膜透過ペプチドが融合されることにより、細胞内への導入が促進されて、ＮＦκＢの転写促進活性を効果的に阻害することができる。
【００３３】
膜透過ペプチドとしては、細胞膜透過性を付与することができるペプチドであれば特に制限されない。膜透過ペプチドの具体例としては、オリゴアルギニン（Ｒｎ；ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）、ＨＩＶ−ＴＡＴ（配列番号１４）、ＨＳＶ／ＶＰ２２（配列番号１５）、ＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡ（配列番号１６）等が挙げられる。この中でも、オリゴアルギニン（Ｒｎ；ｎはアルギニン残基の数であり６〜１２）が好ましい。なお、オリゴアルギニンは核移行シグナルとしても機能する。
【００３４】
膜透過ペプチドの融合位置は、ＮＦκＢ阻害作用が維持される限り特に限定されない。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に膜透過ペプチドが融合されていてもよい。また、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドの途中に膜透過ペプチドが融合され、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドが膜透過ペプチドによって分断されていてもよい。ＮＦκＢ阻害作用を維持する観点から、膜透過ペプチドの融合位置は、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＣ末端側であることが好ましい。
【００３５】
上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端側又はＣ末端側に膜透過ペプチドが融合される場合、膜透過ペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）から選ばれるいずれか１種のペプチドに直接融合されたものであってもよく、リンカーを介して融合されたものであってもよい。リンカーとしては、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基からなるものが挙げられる。
【００３６】
なお、本開示のペプチドが膜透過ペプチドを含まない場合であっても、リポソーム等の公知の細胞導入手段を用いて、本開示のペプチドを細胞内に導入することが可能である。
【００３７】
上記（ｅ）のペプチドは、上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれるいずれか１種のペプチドのＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチドである。
本開示のペプチドを遺伝子工学的手法で作製する場合、ポリヌクレオチドの５’末端に開始コドンが付加されることにより、Ｍｅｔ残基がＮ末端に付加した状態のペプチドが得られることがある。また、後述する実施例に示すように、Ｍｅｔ残基に対応する開始コドン（ＡＴＧ）を発現ベクターの制限酵素サイトの開始部位（Nco I、ＣＣＡＴＧＧ）に合わせるため、ＭｅｔＡｌａ残基に対応するヌクレオチド配列（ＡＴＧＧＣＧ）がポリヌクレオチドの５’末端に付加されることにより、ＭｅｔＡｌａ残基がＮ末端に付加した状態のペプチドが得られることもある。後者の場合、Ｍｅｔ残基が翻訳後切断される結果、Ａｌａ残基がＮ末端に付加した状態のペプチドが得られることもある。本開示のペプチドは、このようにＮ末端にＭｅｔ残基、ＭｅｔＡｌａ残基、又はＡｌａ残基が付加されたペプチドであってもよい。
【００３８】
本開示のペプチドを構成するアミノ酸残基は、ＮＦκＢ阻害作用が維持される限り、Ｌ体及びＤ体のいずれであってもよい。生体内でのペプチドの分解を抑制する観点からは、本開示のペプチドを構成するアミノ酸残基の少なくとも一部をＤ体とすることが好ましい。
【００３９】
また、本開示のペプチドを構成するアミノ酸残基は、用途に応じて種々の修飾が施されていてもよい。このようなアミノ酸修飾としては、アミノ基修飾（ビオチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化、マレイミド化等）；カルボキシ基修飾（アミド化、エステル化等）；チオール基修飾（ファルネシル化、ゲラニル化、メチル化、パルミトイル化等）；水酸基修飾（リン酸化、硫酸化、オクタノイル化、パルミトイル化等）；各種蛍光標識；ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）；等が挙げられる。
【００４０】
本開示のペプチドは、ステロイド薬と同様にＮＦκＢの転写促進活性を直接阻害することができる一方、ステロイド薬のようなホルモン作用を有しないため、副作用の懸念が少ない。また、既報のＭＴＩ−ＩＩやその酸性アミノ酸領域のペプチドと比較してペプチド長が非常に短いため、抗原性が低く、かつ、多量生産にも適している。
【００４１】
＜ポリヌクレオチド＞
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のペプチドをコードするものである。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれであってもよい。また、該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリッドのいずれであってもよい。
【００４２】
本開示のポリヌクレオチドは、公知の配列情報に基づき、公知の遺伝子組換え技術を利用することにより容易に製造することができる。例えば、配列情報に基づき適当なプライマーを設計し、本開示のペプチドをコードするＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅し、ＤＮＡフラグメントをリガーゼ等の適切な酵素を用いて連結することにより、本開示のポリヌクレオチドを製造することができる。また、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により本開示のポリヌクレオチドを合成してもよい。
取得された本開示のポリヌクレオチドは、必要に応じて制限酵素で消化するかリンカーを付加した後に使用してもよく、そのまま使用してもよい。
【００４３】
＜ベクター＞
本開示のベクターは、本開示のポリヌクレオチドを含むものである。このベクターは、本開示のポリヌクレオチドをベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより作製することができる。
【００４４】
ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があり、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター、枯草菌由来のプラスミドベクター、酵母由来のプラスミドベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター等が挙げられる。
【００４５】
プロモーターとしては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等があり、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本開示のベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、選択マーカー等を、それぞれ機能可能な態様で含んでいてもよい。選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４７】
＜形質転換体＞
本開示の形質転換体は、本開示のベクターが導入されたものである。
ベクターが導入される宿主としては、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等がある。細菌としては、エシェリヒア属菌（Escherichia coli等）、バチルス属菌（Bacillus subtilis等）等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞等が挙げられる。
宿主にベクターを導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法等が挙げられる。
【００４８】
なお、本開示のベクターとして発現ベクターを用い、この発現ベクターを適切な宿主に導入した場合、得られる形質転換体は本開示のペプチドを発現し得る。したがって、形質転換体を宿主の種類に応じた方法で培養し、培養物から本開示のペプチドを単離することにより、本開示のペプチドを製造することができる。本開示のペプチドを単離又は精製するには、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等に供すればよい。
【００４９】
＜ＮＦκＢ阻害剤＞
本開示のＮＦκＢ阻害剤は、本開示のペプチドを有効成分として含むものである。上記のとおり本開示のペプチドはＮＦκＢ阻害作用を有するため、本開示のペプチドを用いることにより、ＮＦκＢ阻害剤を製造することができる。
【００５０】
本開示のＮＦκＢ阻害剤は、使用態様に応じて本開示のペプチド以外の成分を含んでいてもよい。本開示のペプチド以外の成分としては、薬剤の調製に一般に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。媒質及び製剤用添加物の種類は特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、防腐剤等が挙げられる。
【００５１】
本開示のＮＦκＢ阻害剤の形態は特に制限されず、固体組成物及び液体組成物のいずれであってもよい。
【００５２】
＜ＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤＞
本開示のＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤（以下、単に「治療剤」ともいう。）は、本開示のペプチドを有効成分として含むものである。上記のとおり本開示のペプチドはＮＦκＢ阻害作用を有するため、本開示のペプチドを用いることにより、ＮＦκＢ亢進性疾患の治療剤（医薬組成物）を製造することができる。
【００５３】
ＮＦκＢ亢進性疾患は、ＮＦκＢ阻害作用が有効な疾患であれば特に制限されない。具体的には、関節リウマチ、膠原病、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎、乾癬、乾燥性角結膜炎（ドライアイ）、花粉症、気管支喘息、肺炎、肝炎、腎炎、炎症性腸疾患、痛風、悪性腫瘍（がん）等が挙げられる。本開示の治療剤は、例えば炎症性疾患の治療に好適に用いられる。
なお、「治療」には、ＮＦκＢ亢進性疾患に起因する症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
【００５４】
本開示の治療剤は、使用態様に応じて本開示のペプチド以外の成分を含んでいてもよい。本開示のペプチド以外の成分としては、薬剤の調製に一般に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。媒質及び製剤用添加物の種類は特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、アルコール、水、生理食塩水）が挙げられる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、防腐剤等が挙げられる。
【００５５】
本開示の治療剤の剤形は特に制限されず、注射剤、点眼剤、点鼻剤、外用剤等の非経口投与に適した剤形；錠剤、カプセル剤、液剤等の経口投与に適した剤形；等のいずれであってもよい。
【００５６】
本開示の治療剤をＮＦκＢ亢進性疾患の患者に投与することにより、ＮＦκＢ亢進性疾患の治療方法が提供される。すなわち、本開示のペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与することを含むＮＦκＢ亢進性疾患の治療方法が提供される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００５８】
＜実施例１＞
配列番号１７〜２９のアミノ酸配列からなる１３種類のペプチドをコードするＤＮＡを合成し、このＤＮＡをｐＴｒｉＥｘ−４ベクター（Novagen社製、カタログ番号：70824-3）のNco I−EcoR I部位に組み込むことによって、各ペプチドを発現するペプチド発現ベクターを構築した。
実施例１における１３種類のペプチドと、ＭＴＩ−ＩＩの酸性アミノ酸領域（ＭＴＩ−ＩＩの３６番目から７５番目までのアミノ酸配列；ＡＲ（３６−７５））との位置関係を表１に示す。【００５９】
【表１】
2016098838.tif 000002
【００６０】
表１に示す１３種類のペプチドはいずれも、ＭＴＩ−ＩＩの断片であるペプチドのＮ末端にＭｅｔＡｌａ残基を付加し、Ｃ末端に膜透過ペプチドであるオリゴアルギニン（ＲＲＲＲＲＲ）を付加したものである。ペプチドの名称中、「Ａ」の前の２桁の数字は、ＭＴＩ−ＩＩの断片であるアミノ酸残基の残基数を示す。また、「Ａ」の後の４桁の数字は、ＭＴＩ−ＩＩの断片のＮ末端側の位置（前半２桁）及びＣ末端側の位置（後半２桁）を示す。例えば、「３０Ａ３６６５」は、ＭＴＩ−ＩＩの３６番目から６５番目までの３０アミノ酸残基からなるペプチドのＮ末端にＭｅｔＡｌａ残基を付加し、Ｃ末端にオリゴアルギニン（ＲＲＲＲＲＲ）を付加したペプチドを示す。【００６１】
ポジティブコントロール用プラスミド（ｐＴｒｉ−ＭＴＩ）は、ｐＴｒｉＥｘ−４ベクターのNco I−EcoR I部位にＭＴＩ−ＩＩ（Gene Bank Accession No. M24398）のｃＤＮＡを組み込むことによって構築した。
ネガティブコントロール用プラスミド（ｐＴｒｉ−ＮＣ）は、ｐＴｒｉＥｘ−４ベクターをXcm I、EcoR Iで切断し、切断断片を除去した後にセルフライゲーションを行うことによって構築した。【００６２】
なお、ＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼレポーターベクターとしては、ｐＧＬ４．３２（プロメガ社製、カタログ番号：E8491）を準備した。【００６３】
＜実施例２＞
本開示のペプチドのＮＦκＢ阻害作用を確認するため、以下のようなルシフェラーゼアッセイを行った。【００６４】
まず、ＨｅＬａ細胞（DS Pharma Biomedical社製、カタログ番号：03-117）を、４８ウェルマイクロプレート（IWAKI社製、カタログ番号：3830-048）に１ウェル当たり０．１２×１０５細胞となるように播種し、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30070.03）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma社製、カタログ番号：P0781）を添加したＤＭＥＭ培地（Sigma社製、カタログ番号：D6047）中で５％ＣＯ２及び３７℃の条件下で培養した。１８時間後に、培地中の種々のホルモンを除く目的で、チャコール・デキストラン処理した１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30068.03）入りのＤＭＥＭ培地に換えた。【００６５】
次いで、ＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（１ウェル当たり６０ｎｇ）と、各ペプチド発現ベクター、ｐＴｒｉ−ＭＴＩ、及びｐＴｒｉ−ＮＣから選ばれる１種（１ウェル当たり１２０ｎｇ）とを混合した後、トランスフェクション試薬（プロメガ社製FuGENE HD、カタログ番号：E2311）（FuGENEは登録商標）を加え、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を調製した。このＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を培地交換２４時間後の細胞に添加してインキュベートすることにより、各ＤＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。【００６６】
次いで、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液の添加４８時間後の細胞に、終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦα（Sigma社製、カタログ番号：T0157）を添加した。ＴＮＦαの添加４時間後に、１ウェル当たり５０μＬの細胞溶解剤（プロメガ社製、カタログ番号：E1941）を添加して細胞をウェル中で溶解した後、細胞溶解液を回収した。そして、細胞溶解液中のＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼ発現量（発光量）を、デュアル・ルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ社製、カタログ番号：E1980）を用い、ルミノメーター（プロメガ社製TD-20/20、カタログ番号：E2351）で測定した。結果を図１〜３に示す。図１〜３の縦軸はＮＦκＢの転写促進活性に依存したルシフェラーゼ発現量（発光量）を示す。【００６７】
図１〜３に示されるとおり、２０Ａ５６７５又は１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が顕著に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が顕著に阻害されていた。これに対して、他のペプチドを発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＮＦκＢ転写促進活性の阻害効果は確認できなかった。【００６８】
＜実施例３＞
本開示のペプチドのＮＦκＢ阻害作用をルシフェラーゼアッセイ以外の方法で確認するため、ＮＦκＢにより誘導されるＣＯＸ２と誘導されないＧＡＰＤＨとについて、ＴＮＦα添加後の発現量の変化をウエスタンブロット法により解析した。【００６９】
まず、ＨｅＬａ細胞（DS Pharma Biomedical社製、カタログ番号：03-117）を、４８ウェルマイクロプレート（IWAKI社製、カタログ番号：3830-048）に１ウェル当たり０．１２×１０５細胞となるように播種し、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30070.03）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma社製、カタログ番号：P0781）を添加したＤＭＥＭ培地（Sigma社製、カタログ番号：D6047）中で５％ＣＯ２及び３７℃の条件下で培養した。１８時間後に、培地中の種々のホルモンを除く目的で、チャコール・デキストラン処理した１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30068.03）入りのＤＭＥＭ培地に換えた。【００７０】
次いで、２０Ａ５６７５を発現するペプチド発現ベクター、１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクター、及びｐＴｒｉ−ＮＣから選ばれる１種（１ウェル当たり１２０ｎｇ）をトランスフェクション試薬（プロメガ社製FuGENE HD、カタログ番号：E2311）（FuGENEは登録商標）と混合し、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を調製した。このＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を培地交換２４時間後の細胞に添加してインキュベートすることにより、各ＤＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。【００７１】
次いで、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液の添加４８時間後の細胞に、終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦα（Sigma社製、カタログ番号：T0157）を添加した。ＴＮＦαの添加０〜１０時間後に、１ウェル当たり５０μＬの細胞溶解剤（プロメガ社製、カタログ番号：E1941）を添加して細胞をウェル中で溶解した後、細胞溶解液を回収した。そして、細胞溶解液５０μＬに１０μＬの６×ＳＤＳバッファを添加後、１００℃で１０分間の加熱を行い、ＳＤＳ処理サンプルを得た。このＳＤＳ処理サンプルを１２．５％アクリルアミドゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルからタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜上のＣＯＸ２及びＧＡＰＤＨを、抗ＣＯＸ２抗体（アブカム社製、COX2 rabbit polyclonal antibody (ab52237)）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（アブカム社製、GAPDH rabbit polyclonal antibody (ab9485)）及びＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ミリポア社製、１２−３４８）で検出した。検出には、ＧＥヘルスケア社製のECL-plus化学発光試薬を用いた。【００７２】
２０Ａ５６７５を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときの、ＴＮＦα添加後のＣＯＸ２量及びＧＡＰＤＨ量の変化を図４に示す。また、１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトしたときの、ＴＮＦα添加後のＣＯＸ２量及びＧＡＰＤＨ量の変化を図５に示す。図４、５の横軸はＴＮＦα添加後の経過時間を示し、縦軸はＴＮＦα添加０時間後のＣＯＸ２又はＧＡＰＤＨの量を１００としたときの相対量を示す。
図４、５に示されるとおり、２０Ａ５６７５又は１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＮＦκＢによるＣＯＸ２の誘導が阻害されたが、ＧＡＰＤＨ量には影響を与えなかった。このことから、２０Ａ５６７５及び１２Ａ５１６２はＮＦκＢの転写促進活性を阻害することが分かる。【００７３】
＜実施例４＞
配列番号３０〜３３のアミノ酸配列からなる４種類のペプチドをコードするＤＮＡを合成し、このＤＮＡをｐＴｒｉＥｘ−４ベクター（Novagen社製、カタログ番号：70824-3）のNco I−EcoR I部位に組み込むことによって、各ペプチドを発現するペプチド発現ベクターを構築した。
実施例４における４種類のペプチドと、ＭＴＩ−ＩＩの酸性アミノ酸領域（ＭＴＩ−ＩＩの３６番目から７５番目までのアミノ酸配列；ＡＲ（３６−７５））との位置関係を表２に示す。【００７４】
【表２】
2016098838.tif 000003
【００７５】
２０ＡＥＥＤＤは、２０Ａ５６７５のＮ末端側から１９番目及び２０番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
１２ＡｄｅｌＥは、１２Ａ５１６２のＮ末端側から１３番目のグルタミン酸残基を欠失させたものである。
１２ＡＥＤは、１２Ａ５１６２のＮ末端側から１３番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換したものである。
１２ＡＥＤＤＥは、１２Ａ５１６２のＮ末端側から９番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換するとともに、Ｎ末端側から１０番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に置換したものである。【００７６】
ポジティブコントロールとしては、２０Ａ５６７５又は１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクターを準備した。
ネガティブコントロールとしてはｐＴｒｉ−ＮＣを準備し、ＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼレポーターベクターとしてはｐＧＬ４．３２（プロメガ社製、カタログ番号：E8491）を準備した。【００７７】
＜実施例５＞
実施例４で構築したペプチド発現ベクターを用い、ポジティブコントロールとして２０Ａ５６７５又は１２Ａ５１６２を発現するペプチド発現ベクターを用いた以外は、実施例２と同様にしてルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図６に示す。図６の縦軸はＮＦκＢの転写促進活性に依存したルシフェラーゼ発現量（発光量）を示す。【００７８】
図６に示されるとおり、２０ＡＥＥＤＤを発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が顕著に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が顕著に阻害されていた。また、１２ＡｄｅｌＥ、１２ＡＥＤ、又は１２ＡＥＤＤＥを発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が有意に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が有意に阻害されていた。【００７９】
＜実施例６＞
配列番号３４〜３８のアミノ酸配列からなる５種類のペプチドをコードするＤＮＡを合成し、このＤＮＡをｐＴｒｉＥｘ−４ベクター（Novagen社製、カタログ番号：70824-3）のNco I−EcoR I部位に組み込むことによって、各ペプチドを発現するペプチド発現ベクターを構築した。
実施例６における５種類のペプチドと、ＭＴＩ−ＩＩの酸性アミノ酸領域（ＭＴＩ−ＩＩの３６番目から７５番目までのアミノ酸配列；ＡＲ（３６−７５））との位置関係を表３に示す。【００８０】
【表３】
2016098838.tif 000004
【００８１】
表３に示す５種類のペプチドはいずれも、ＭＴＩ−ＩＩの断片であるペプチドのＮ末端にＭｅｔＡｌａ残基を付加し、Ｃ末端に膜透過ペプチドであるオリゴアルギニン（ＲＲＲＲＲＲ）を付加したものである。【００８２】
ポジティブコントロールとしてはｐＴｒｉ−ＭＴＩを準備し、ネガティブコントロールとしてはｐＴｒｉ−ＮＣを準備した。また、ＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼレポーターベクターとしてはｐＧＬ４．３２（プロメガ社製、カタログ番号：E8491）を準備した。【００８３】
＜実施例７＞
実施例６で構築したペプチド発現ベクターを用いた以外は、実施例２と同様にしてルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図７に示す。図７の縦軸はＮＦκＢの転写促進活性に依存したルシフェラーゼ発現量（発光量）を示す。【００８４】
図７に示されるとおり、６Ａ５６６１を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が顕著に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が顕著に阻害されていた。また、６Ａ５４５９又は６Ａ６３６８を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が有意に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が有意に阻害されていた。これに対して、６Ａ５１５６又は６Ａ５７６２を発現するペプチド発現ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした場合には、ＮＦκＢ転写促進活性の阻害効果は確認できなかった。【００８５】
＜実施例８＞
化学合成した本開示のペプチドのＮＦκＢ阻害作用を確認するため、表４に示す２種類のペプチドを化学合成した。【００８６】
【表４】
2016098838.tif 000005
【００８７】
上記の２種類のペプチドを用いて、以下のようなルシフェラーゼアッセイを行った。【００８８】
まず、ＨｅＬａ細胞（DS Pharma Biomedical社製、カタログ番号：03-117）を、４８ウェルマイクロプレート（IWAKI社製、カタログ番号：3830-048）に１ウェル当たり０．１２×１０５細胞となるように播種し、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30070.03）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma社製、カタログ番号：P0781）を添加したＤＭＥＭ培地（Sigma社製、カタログ番号：D6047）中で５％ＣＯ２及び３７℃の条件下で培養した。１８時間後に、培地中の種々のホルモンを除く目的で、チャコール・デキストラン処理した１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30068.03）入りのＤＭＥＭ培地に換えた。【００８９】
次いで、ＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼレポーターベクター（１ウェル当たり６０ｎｇ）とトランスフェクション試薬（プロメガ社製FuGENE HD、カタログ番号：E2311）（FuGENEは登録商標）とを混合し、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を調製した。このＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液を培地交換２４時間後の細胞に添加してインキュベートすることにより、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。【００９０】
次いで、ＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合液の添加１０時間後に、１２Ａ５１６２−ｐｅｐ（終濃度１．５ｍｇ／ｍＬ又は３．０ｍｇ／ｍＬ）又は６Ａ５６６１−ｐｅｐ（終濃度１．５ｍｇ／ｍＬ又は３．０ｍｇ／ｍＬ）と、チャコール・デキストラン処理した１０％ウシ胎児血清（ハイクローン社製、カタログ番号：SH30068.03）とを添加したＤＭＥＭ培地に換えた。ネガティブコントロール（ＮＣ）としては、ペプチドの代わりにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を添加した。【００９１】
次いで、培地交換３８時間後の細胞に、終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦα（Sigma社製、カタログ番号：T0157）を添加した。ＴＮＦαの添加４．５時間後に、１ウェル当たり５０μＬの細胞溶解剤（プロメガ社製、カタログ番号：E1941）を添加して細胞をウェル中で溶解した後、細胞溶解液を回収した。そして、細胞溶解液中のＮＦκＢ依存性ホタルルシフェラーゼ発現量（発光量）を、デュアル・ルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ社製、カタログ番号：E1980）を用い、ルミノメーター（プロメガ社製TD-20/20、カタログ番号：E2351）で測定した。結果を図８に示す。図８の縦軸はＮＦκＢの転写促進活性に依存したルシフェラーゼ発現量（発光量）を示す。【００９２】
図８に示されるとおり、１２Ａ５１６２−ｐｅｐ又は６Ａ５６６１−ｐｅｐの存在下でＨｅＬａ細胞を培養した場合には、ＴＮＦαを添加したときのルシフェラーゼ発現量（発光量）が濃度依存的に抑制されていた。すなわち、ＴＮＦα誘導性のＮＦκＢ転写促進活性が濃度依存的に阻害されていた。【００９３】
２０１４年１２月１９日に出願された日本出願２０１４−２５７８２７の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2016098838.tif 000006
【図２】
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【図３】
2016098838.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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