(57)【要約】検体中に含まれる細菌のゲノムDNAを鋳型とするLAMP（loop-mediated isothermal amplification）法によって配列番号１のヌクレオチド配列を増幅し、前記ヌクレオチド配列が増幅された場合に、検体中に含まれる細菌がKPC β-ラクタマーゼ産生菌であることを15分から40分で判定する。KPC-2からKPC-17のいずれのβ-ラクタマーゼ産生菌も対象とすることができる。本法の精度は、他の耐性遺伝子に対する擬陽性もない高い特異性と100CFUでも検出でき、かつ検体からも直接検出できる高感度な特徴を合わせ持つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Klebsiella pneumoniae carbapenemase（KPC） β-ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、検体中に含まれる細菌のDNAを鋳型とするLAMP（loop-mediated isothermal amplification）法によって配列番号１のヌクレオチド配列を増幅し、前記ヌクレオチド配列が増幅された場合に、検体中に含まれる細菌がKPC β-ラクタマーゼ産生菌であることを15分から40分で判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
検体中の細菌が腸内細菌科を含むグラム陰性桿菌であり、検出されるKPC β-ラクタマーゼ産生菌がKPC-2からKPC-17のいずれかのβ-ラクタマーゼ産生菌である請求項１の方法。
【請求項３】
LAMP法に使用するプライマーが、配列番号２−５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項１または２の方法。
【請求項４】
LAMP法に使用するプライマーが、配列番号２−６のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項１または２の方法。
【請求項５】
LAMP法に使用するプライマーが、配列番号７、８、４、５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項１または２の方法。
【請求項６】
LAMP法に使用するプライマーが、配列番号７、８、４および５、または配列番号７、８、４、５と配列番号９または１０、もしくは配列番号７、８、４、５と配列番号９および１０のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドである請求項１または２の方法。
【請求項７】
KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号２−５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【請求項８】
KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号２−６のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【請求項９】
KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号７、８、４および５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【請求項１０】
KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号７、８、４、５と配列番号９または１０、もしくは配列番号７、８、４、５、９および１０のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれかに記載のプライマーセット、DNAポリメラーゼおよびLAMP反応混合物を含むKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、院内感染等の原因となるカルバペネム系薬耐性菌であるKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（１）KPC β-ラクタマーゼについて
カルバペネム系薬（carbapenem）耐性グラム陰性桿菌が世界的規模で報告されている。この耐性は主に、カルバペネマーゼ（carbapenemase）遺伝子の獲得の結果として生じる（非特許文献１、２）。多種類のカルバペネマーゼが同定されているが、これらは3クラスのβ-ラクタマーゼ（β-lactamases）に分類される：アンブラー（Ambler）クラスA、BおよびDのβ-ラクタマーゼである（非特許文献３）。カルバペネマーゼは抗生物質ペニシリン系とセファロスポリン系のみならずカルバペネム系も加水分解して、その抗菌効果を無効にする。特効薬であるカルバペネム系薬まで無効にするため、カルバペネマーゼ産生菌の出現は感染症治療において脅威となっている。【０００３】
Klebsiella pneumoniae carbapenemase（KPC）は機能性グループf2に属するクラスAのセリンβ-ラクタマーゼである（非特許文献３）。KPC産生菌は近年になって世界各地に出現しており、特にアメリカ合衆国、プエルトリコ、コロンビア、ギリシャ、イスラエルおよび中国で流行している（非特許文献２、４）。多くの欧州諸国および南アフリカでも報告されており、中国以外のアジア諸国やアフリカでは比較的少ない。台湾や日本などでは、カルバペネム系薬耐性菌のほとんどがIMP型β-ラクタマーゼ産生菌であることが報告されている（非特許文献２、５）。KPC産生菌の感染による致死率は27.5％〜57％であるが（非特許文献６、７）、このような高い致死率は、一部には不適切、不効率な抗菌治療が原因とされる。現在の感受性試験法を用いたカルバペネム耐性菌の検出では非効果的なために見逃すことがしばしばある（非特許文献８）。
KPC産生菌の検出法は感受性試験法を改良したHodge testなどに限られている（非特許文献９）。その他のカルバペネマーゼであるIMP型β-ラクタマーゼ（クラスB）やOXA-48型β-ラクタマーゼ（クラスD）などに対する検出法とは異なるため、KPC産生菌を見逃すことで誤った治療を施すことがある。日本など検出率の低い地域ではKPC産生菌を見逃すことで耐性菌の蔓延を招く可能性がある。臨床現場でのKPC産生菌の迅速検出法の開発は感染症治療と感染制御の上で重要である。腸内細菌科を含むグラム陰性桿菌の幾つかの菌種からKPC β-ラクタマーゼ遺伝子（KPC-2 β-ラクタマーゼ遺伝子）が同定され（非特許文献１０）、この遺伝子を標的とするKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出が検討されている。ただし、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子には構造的変異を有する変異体（KPC-3〜KPC-17）が世界中で報告されており（非特許文献１１−１３）、全ての種類のKPC β-ラクタマーゼ産生菌を迅速に検出する手段は見出されていない。【０００４】
（２）LAMP法について
短時間でのDNA増幅法としてLAMP（loop-mediated isothermal amplification）法が知られている（特許文献１、非特許文献１４−１６）。このLAMP法は等温条件下（60〜69℃、30〜60分間）で標的DNA配列を増幅する方法であり、PCR法では不可欠な温度制御が不要であるという利点を有している。また、標的DNA配列の増幅に際して高い特異性と感度を有しており、結果は裸眼でも判定可能である（非特許文献１７）。さらに、以下のような利点をも有している：PCR法は血清および血漿のへパリンによって抑制されることが知られているが（非特許文献１８）、LAMP法はこれらによって影響されない；LAMP法の感度は非標的DNAの存在によって影響を受けない（非特許文献１３）；サンプルからのDNA精製を必要としない（非特許文献１９）。LAMP法によるβ-ラクタマーゼ遺伝子の検出としては、IMP型β-ラクタマーゼ遺伝子の検出（特許文献２）や、NDM型 β-ラクタマーゼ遺伝子の検出（非特許文献２０）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第00/28082号パンフレット
【特許文献２】特開2007-195421号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gupta, N., Limbago, B. M., Patel J. B. & Kallen A. J. (2011). Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology and prevention. Clin Infect Dis 53, 60-67.
【非特許文献２】Nordmann, P., Naas T. & Poirel L. (2011). Global spread of Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis 17, 1791-1798.
【非特許文献３】Queenan, A. M. & Bush K. (2007). Carbapenemases: the versatile β-lactamases. Clin Microbiol Rev 20, 440-458, table of contents.
【非特許文献４】Canton, R., Akova, M., Carmeli, Y., Giske, C. G., Glupczynski, Y., Gniadkowski, M., Livermore, D. M., Miriagou, V., Naas, T., Rossolini G. M. & other authors (2012). Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect 18, 413-431.
【非特許文献５】Kurokawa, H., Yagi, T., Shibata, N., Shibayama K. & Arakawa Y. (1999). Worldwide proliferation of carbapenem-resistant gram-negative bacteria. Lancet 354, 955.
【非特許文献６】Woodford, N., Tierno, P. M. Jr., Young, K., Tysall, L., Palepou, M. F., Ward, E., Painter, R. E., Suber, D. F., Shungu, D., Silver L. L. & other authors (2004). Outbreak of Klebsiella pneumoniae producing a new carbapenem-hydrolyzing class A β-lactamase, KPC-3, in a New York Medical Center. Antimicrob Agents Chemother 48, 4793-4799.
【非特許文献７】Mangold, K. A., Santiano, K., Broekman, R., Krafft, C. A., Voss, B., Wang, V., Hacek, D. M., Usacheva, E. A., Thomson, R. B. Jr., & other authors (2011). Real-time detection of blaKPC in clinical samples and surveillance specimens. J Clin Microbiol 49, 3338-3339.
【非特許文献８】Weisenberg, S. A., Morgan, D. J., Espinal-Witter, R. & Larone D. H. (2009). Clinical outcomes of patients with Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae after treatment with imipenem or meropenem. Diagn Microbiol Infect Dis 64, 233-235.
【非特許文献９】Doyle, D., Peirano, G., Lascols, C., Lloyd, T., Church, DL., Pitout, JD. (2012). Laboratory detection of Enterobacteriaceae that produce carbapenemases. J Clin Microbiol 50, 3877-3880.
【非特許文献１０】Smith, Moland, E., Hanson, ND., Herrera, VL., Black, JA., Lockhart, TJ., Hossain, A., Johnson, JA., Goering, RV., Thomson, KS. (2003). Plasmid-mediated, carbapenem-hydrolysing β-lactamase, KPC-2, in Klebsiella pneumoniae isolates. J Antimicrob Chemother 51, 711-714.
【非特許文献１１】Lascols, C., Hackel, M., Hujer, A. M., Marshall, S. H., Bouchillon, S. K., Hoban, D. J., Hawser, S. P., Badal R. E. & Bonomo R. A. (2012). Using nucleic acid microarrays to perform molecular epidemiology and detect novel β-lactamases: a snapshot of extended-spectrum β-lactamases throughout the world. J Clin Microbiol 50, 1632-1639.
【非特許文献１２】Rapp, R. P. & Urban, C. (2012). Klebsiella pneumoniae carbapenemases in Enterobacteriaceae: history, evolution, and microbiology concerns. Pharmacotherapy 32, 399-407.
【非特許文献１３】Tzouvelekis, L. S., Markogiannakis, A., Psichogiou, M., Tassios, P. T.& Daikos, G. L. (2012). Carbapenemases in Klebsiella pneumoniae and other Enterobacteriaceae: an evolving crisis of global dimensions. Clin Microbiol Rev 25, 682-707.Notomi et al. 2000; Nagamine et al. 2002; Njiru 2012
【非特許文献１４】Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino N. & Hase, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63.
【非特許文献１５】Nagamine, K., Hase T. & Notomi, T. (2002). Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-229.
【非特許文献１６】Njiru, Z. K. (2012). Loop-mediated isothermal amplification technology: towards point of care diagnostics. PLoS Negl Trop Dis 6, e1572.
【非特許文献１７】Mori, Y. & Notomi, T. (2009). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother 15, 62-69.
【非特許文献１８】Enosawa, M., Kageyama, S., Sawai, K., Watanabe, K., Notomi, T., Onoe, S., Mori Y. & Yokomizo Y. (2003). Use of loop-mediated isothermal amplification of the IS900 sequence for rapid detection of cultured Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. J Clin Microbiol 41, 4359-4365.
【非特許文献１９】Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima E. & T. Suzutani (2007). Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J Biochem Biophys Methods 70, 499-501.
【非特許文献２０】Liu, W., Zou, D., Li, Y., Wang, X., He, X., Wei, X., Shao, C., Li, X., Shang, W., & other authors (2012). Sensitive and rapid detection of the new Delhi metallo-β-lactamase gene by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol 50, 1580-1585）.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
種々のβ-ラクタマーゼ遺伝子が知られており、また細菌の特定遺伝子を検出する手段としてLAMP法は優れた方法である。実際に、IMP型β-ラクタマーゼ遺伝子やNDM 型β-ラクタマーゼ遺伝子をLAMP法によって検出する技術が知られている（非特許文献２、２０）。しかしながら、KPC β-ラクタマーゼ産生菌は、IMP型β-ラクタマーゼ産生菌やNDM 型β-ラクタマーゼ産生菌とは薬剤耐性の獲得機序やその流行パターン、対処方法などが異なる。薬剤耐性菌の出現を正確に監視し、予防し、適切な処置を行うためには、個々に異なる薬剤耐性菌をそれぞれ正確かつ迅速にスクリーニングすることが求められる。その流行が問題視されているKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出手段の確立は重要な課題である。【０００８】
また、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子は少なくとも16種が存在し、単一のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子を標的としたLAMP法では他の遺伝子を有するKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出することができない。【０００９】
本願発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、これまで確立されていなかったKPC β-ラクタマーゼ産生菌を正確かつ迅速に検出する方法である。特に、少なくとも16種のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子のいずれを有する菌体であっても正確かつ迅速にそれを検出することのできる方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明は、前記の課題を解決する手段として、Klebsiella pneumoniae carbapenemase（KPC） β-ラクタマーゼ産生菌の検出方法であって、検体中に含まれる細菌のDNAを鋳型とするLAMP（loop-mediated isothermal amplification）法によって配列番号１のヌクレオチド配列を増幅し、前記ヌクレオチド配列が増幅された場合に、検体中に含まれる細菌がKPC β-ラクタマーゼ産生菌であることを15分から40分で判定することを特徴とする方法を提供する。【００１１】
この方法においては、検体中の細菌が腸内細菌科を含むグラム陰性桿菌であり、検出されるKPC β-ラクタマーゼ産生菌がKPC-2からKPC-17のいずれかのβ-ラクタマーゼ産生菌であることを好ましい態様としている。【００１２】
またこの方法においては、LAMP法に使用するプライマーが、配列番号２−５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドであるか、または配列番号２−６のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドであることを別の好ましい態様としている。あるいは、LAMP法に使用するプライマーが、配列番号７、８、４および５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチド、配列番号７、８、４、５と配列番号９または１０、もしくは配列番号７、８、４、５、９および１０のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドであることを好ましい態様としている。【００１３】
また本願発明は、KPC β-ラクタマーゼ産生菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号２−５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、または配列番号２−６のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを提供する。このプライマーセットは、また、配列番号７、８、４および５のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセット、あるいは配列番号７、８、４、５と配列番号９または１０、もしくは配列番号７、８、４、５、９および１０のそれぞれのヌクレオチド配列からなる合成オリゴヌクレオチドを含むプライマーセットであってもよい。【００１４】
さらに本願発明は、前記のプライマーセット、DNAポリメラーゼおよびLAMP反応溶液を含むKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出キットを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明によって、少なくとも16種の異なったKPC β-ラクタマーゼ遺伝子のいずれかを発現するKPC β-ラクタマーゼ産生菌を迅速（15分から40分）かつ正確に検出することが可能となる。PCR法では104CFU/mlが検出限界である検体に対しても、LAMP法では100 CFU/mlの検出限界を示す高感度な特性を示す。本願発明は、臨床場面において適切な抗生物質治療を迅速に選択し、不適切な抗生物質の選択を回避することに貢献する。さらに、KPC産生菌の短時間の検出は、KPC産生菌の疫学的な研究の促進やその出現の監視体制に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１において、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子の検出に用いたLAMPプライマーである。(a)LAMPプライマーの設計に使用したKPC β-ラクタマーゼ遺伝子の相同領域のヌクレオチド配列。LAMPプライマーの配列は矢印で示した。右側の数字は各遺伝子の開始コドン（ATG）のAを１とした時のヌクレオチド数である。(b)LAMP反応に使用した5個のプライマー配列。F1cおよびB2c配列はF1およびB2領域に相補的な配列を示す。
【図２】実施例１において、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子の迅速検出のためのLAMP反応における至適温度を検討した結果。Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株の精製プラスミドDNAをLAMP反応の鋳型として用いた。LAMP反応は、60℃から69℃の温度範囲、50分間で査定した。
【図３】実施例１において、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子の（a）LAMP産物および(b)PCR産物を電気泳動分析した結果。レーンMは100-bp段階的マーカー；レーン1-8はKlebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株から精製した鋳型DNAの反応毎に106、105、104、103、102、101、100および0 CFUをそれぞれ示す。
【図４】実施例１において、LAMP法によるKPC β-ラクタマーゼ遺伝子の検出感度を測定した結果。増幅は68℃、50分間で行った。DNAは、Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株の段階希釈培養物（106から100 CFU）から抽出し、LAMP反応の鋳型として使用した。カーブは、左から右に細菌の減少濃度（反応毎に106から100 CFU）を示す。
【図５】実施例１において、LAMP法による検体からの直接検出の感度を測定した結果。増幅は68℃、50分間で行った。Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株の段階希釈（107、105、103、101、100 CFU/ml）を添加した検体よりそれぞれDNAを直接抽出して用いた。喀痰(a)、尿(b)、便(c)、血液(d)に対する結果をそれぞれ示す。
【図６】実施例１において、PCR法による検体からの直接検出の感度を測定した結果。Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株の段階希釈（107〜100、0 CFU/ml）を添加した検体よりそれぞれDNAを直接抽出して用いた。喀痰(a)、尿(b)、便(c)、血液(d)に対する結果をそれぞれ示す。7、6、5、4、3、2、1、NCはそれぞれ106、105、104、103、102、101、100、0 CFU/mlを示す。
【図７】（a）は、実施例２においてLAMP法によるKPC β-ラクタマーゼ遺伝子の検出感度を測定した結果。増幅は68℃、50分間で行った。DNAは、Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705株の段階希釈培養物（106から100 CFU）から抽出し、LAMP反応の鋳型として使用した。カーブは、左から右に細菌の減少濃度（反応毎に106から100 CFU）を示す。（b）は、LAMP反応に使用した６個のプライマー配列。F1cおよびB2c配列はF1およびB2領域に相補的な配列を示す
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願発明のKPC β-ラクタマーゼ産生菌検出方法は、検体中に含まれる細菌のDNAを鋳型とするLAMPによって配列番号１のヌクレオチド配列を増幅し、このヌクレオチド配列が増幅された場合に、検体中に含まれる細菌がKPC β-ラクタマーゼ産生菌であると判定する。
【００１８】
配列番号１のヌクレオチド配列は、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子の16種（KPC-2からKPC-17）の全てに共通して存在する相同領域である。16種のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子は公知である： KPC-2（GenBank/AY034847）、KCP-3（AB557734）、KPC-4（FJ473382）、KPC-5（EU400222）、KPC-6（EU555534）、KPC-7（EU729727）、KPC-8（FJ234412）、KPC-9（FJ624872）、KPC-10（GQ140348）、KPC-11（HM066995）、KPC-12（HQ641421）、KPC-13（HQ342890）、KPC-14（JX524191）、KPC-15（KC433553）、KPC-16（KC465199）およびKPC-17（KC465200）。本願発明者らは、配列番号１のヌクレオチド配列領域（図１a）がこれら全てのKPC β-ラクタマーゼ遺伝子に共通する相同領域であることを見出して、本願発明を完成させた。すなわち、配列番号１のヌクレオチド配列は、KPC-2 β-ラクタマーゼ遺伝子（GenBank/AY034847）の46番から245番までの配列である。他のKPC-3〜17 β-ラクタマーゼ遺伝子にもこの配列番号１のヌクレオチド配列が存在する。なお、KPC-2〜KPC-17とは別の新たなKPC β-ラクタマーゼ遺伝子を保有する新規な細菌が存在するとしても、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有するものである限り、検出可能である。
【００１９】
この配列番号１のヌクレオチド配列領域の増幅は、公知のLAMP法（特許文献１、２、非特許文献１４−１６）に従って行うことができる。すなわち、LAMP法は４種類のプライマーセットと鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼを用いて、30分から60分間、60℃から69℃の範囲の一定温度で標的DNAを増幅する方法である。４種類のプライマーセットのうち、２種類のプライマーは標的DNAの5’側領域（F3）にアニールするアウタープライマーF3と、3’側領域（B3）にアニールするアウタープライマーB3であり、他の2種類のプライマーは、標的DNAの5’側の２つの領域（F1、F2）を認識するインナープライマーFIPと3’側の２つの領域（B1、B2）を認識するインナープライマーBIPである。これらインナープライマーの5’側の配列はその3’側からの伸長反応で合成した相補鎖領域内にアニールするよう設定されており、増幅反応はこのインナープライマーから生成するステムループ構造からの自己伸長反応と、ループ部分に新たにアニールしたインナープライマーからの鎖置換合成反応を繰り返すことによって進行する。
【００２０】
さらに、これら4種のプライマーに「ループプライマー（LB）（LF）」のいずれか一方または両方を追加して使用することもできる。ループプライマーLB、LFは、標的DNAの中央部分の、前記プライマーがアニールしない領域を対象として設計する。このループプライマーの使用によって反応時間を短縮することができる。
【００２１】
KPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出するためのLAMP法に使用するプライマーセットは、配列番号１のヌクレオチド配列を標的DNAとして、Primer Explorer version V4 software (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)などの公知のプライマー設計手段を用いて設計することができる。本願発明は、その一例として以下のプライマーセット（Ａ）を提供する。
FIP：5′-AGCCGCCAAAGTCCTGTTCGAGCCACCGCGCTGACCAA-3′(F1c+F2)：配列番号２
BIP：5′-CATCGGTGTGTACGCGATGAGCTGCACAGTGGGAAG-3′(B1+B2c)：配列番号３
F3： 5′-CGCTGGCTGGCTTTTCTG-3′：配列番号４
B3： 5′-CACAGCGGCAGCAAGAA-3′：配列番号５
LB： 5′-GGCGCAACTGTAAGTTACCG-3′：配列番号６
【００２２】
これらの各プライマーは、図１(a)に示したとおり、16種のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子の相同領域（配列番号１）の各領域（F3-1、LB、B1-3）に対応している。なお、FIPプライマー（配列番号２）の下線部がF2領域に対応し、BIPプライマー（配列番号３）の下線部がB2c領域に対応している。KPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出するには、FIP、BIP、F3およびB3の４プライマーのセットでもよいが、反応時間を短縮させるためにはLBプライマーを追加して使用することが好ましい。
【００２３】
あるはまた、以下のプライマーセット（Ｂ）によってもKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出することができる。
FIP：5′-GGAGCCGCCAAAGTCCTGTTCGCCACCGCGCTGACCAA-3′(F1c+F2)：配列番号７
BIP：5′-ATACCGGCTCAGGCGCAACGAGCTGCACAGTGGGAAG-3′(B1+B2c)：配列番号８
F3： 5′-CGCTGGCTGGCTTTTCTG-3′：配列番号４
B3： 5′-CACAGCGGCAGCAAGAA-3′：配列番号５
LF： 5’-ATGGTTCCGCGACGAGG-3’：配列番号９
LB： 5′-TGTAAGTTACCGCGCTGAGG-3′：配列番号１０
【００２４】
FIPプライマー（配列番号７）のF2領域（下線部）とBIPプライマー（配列番号８）のB2c領域（下線部）は、それぞれ前記のプライマーセット（Ａ）のそれら（各下線部）と同一配列である。F3プライマーおよびB3プライマーは前記プライマーセット（Ａ）と同一である。FIPプライマー（配列７）のF1c領域は、図１(a)のヌクレオチド番号108-129の領域、BIPプライマー（配列番号９）のB1領域は149-167領域、LFプライマー（配列番号９）は81-97領域、LBプライマー（配列番号１０）は168-187領域に、それぞれ対応している。このプライマーセット（Ｂ）においても、FIP、BIP、F3およびB3の４プライマーのセットでKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出することができるが、LFプライマーおよび／またはLBプライマーを追加して使用することが好ましい。
【００２５】
LAMP反応は、検体中のDNAを鋳型として、前記のプライマーセット、DNAポリメラーゼ（例えばBst DNA ポリメラーゼ）および公知のLAMP反応溶液を用いて行うことができる。LAMP反応溶液の組成は、例えば、Tris−HCl（pH8.8） 40 mM；KCl 20 mM；MgSO4 16 mM；（NH4）2SO4 20 mM；Tween20 0.2 ％；Betaine 1.6 M；dNTPs 各2.8 mMなどとすることができる。本願発明は、このようなLAMP反応溶液と、前記のプライマーセットおよびDNAポリメラーゼを含むKPC β-ラクタマーゼ産生菌検出キットを提供する。
【００２６】
また、KPC β-ラクタマーゼ産生菌の存在を検出する対象である検体は、細菌感染が疑われるヒトまたは他の動物の生体由来の検体であり、例えば、患者カテーテル拭き取り検体、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、糞便、組織等であり、あるいはこれらの検体から分離培養した発育コロニー、培養液等である。これらの検体は、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後、フェノールおよびクロロホルム抽出により精製したり、市販の抽出キットを用いて精製してDNAの純度を高めて使用することができる。
【００２７】
以下、実施例を示して本願発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１：LAMPプライマーセット（Ａ）によるKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出
１．方法
（1）菌株
KPC-2を産生するK. pneumoniae ATCC BAA-1705株をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から購入し、参考株として用いた。LAMP法のKPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出感度を評価するため15の菌株を用いた。これらのうち、KPC-2 β-ラクタマーゼを産生する４菌株（Escherichia coli、Salmonella enterica、Pseudomonas aeruginosaおよび Acinetobacter baumannii）をポジティブコントロールとして用いた。また、以下の各β-ラクタマーゼを産生する11種の菌株（E. coli、K. pneumoniae、A. baumanniiおよびP. aeruginosa）をネガティブコントロールとして用いた：クラスA（CTX-M-2、CTX-M-9、TEM-1およびSHV-1）（Nakano, R., Nakano, A., Abe, M., Inoue M. & Okamoto R. (2012). Regional outbreak of CTX-M-2 β-lactamase-producing Proteus mirabilis in Japan. J Med Microbiol 61(Pt 12), 1727-1735）、クラスB（IMP-1、NDM-1およびVIM-2）（非特許文献３、table of contents）、クラスC（CMY-4、MOX-1およびDHA-1）（Nakano, R., Okamoto, R., Nagano N. & Inoue M. (2007). Resistance to gram-negative organisms due to high-level expression of plasmid-encoded ampC β-lactamase blaCMY-4 promoted by insertion sequence ISEcp1. J Infect Chemother 13, 18-23）、およびクラスD（OXA-48）（Nagano, N., Endoh, Y., Nagano, Y., Toyama, M., Matsui, M., Shibayama K. & Arakawa Y. (2013). First Report of OXA-48 Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan from a Patient Returned from Southeast Asia. Jpn J Infect Dis 66, 79-81)。【００２９】
（2）DNA抽出
LAMP法の適切な温度を決定するため、Genopure Plasmid Midi Kit (Roche, Germany)を用いてK. pneumoniaeATCC BAA-1705株からプラスミドDNAを抽出した。LAMP法の特異性と感度を検定するため、ゲノムDNAおよびプラスミドDNAを含む細菌のトータルDNAを、90℃で10分間加熱することによって抽出した。【００３０】
（3）LAMP法
LAMP法は、25μl容量の反応溶液中でLoopamp DNA amplification kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) を用いて行った（非特許文献１４、１５）。反応溶液の組成は以下のとおりである：５個のプライマーのセット、すなわち２個のインナープライマー（FIPおよびBIP、各40 pmol）、２個のアウタープライマー（F3およびB3、各5 pmol）およびループプライマー（LB、20 pmol）；1 μlのBst DNA ポリメラーゼ（8 units）；2 μlの鋳型DNA；およびキットに付属の12.5 μl 反応溶液。LAMP反応は、Loopamp real-time turbidimeter (LoopampEXIA; Eiken Chemical)のもとで6秒毎に650 nmの濁度計測を行いながら、60℃から69℃の範囲の等温条件で50分間行い、5分間80℃で反応を停止させた。【００３１】
（4）プライマーの設計
LAMPプライマーセットの候補は、KPC-2〜KPC-17 β-ラクタマーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（GenBank/AY034847、AB557734、FJ473382、EU400222、EU555534、EU729727、FJ234412、FJ624872、GQ140348、HM066995、HQ641421、HQ342890、JX524191、KC433553、KC465199およびKC465200）に基づき、Primer Explorer version V4 software (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)を用いて設計した。３つのプライマーセットの候補うち、KPC-2〜KPC-17 β-ラクタマーゼ遺伝子の相同領域から設計され、最短時間で標的遺伝子を増幅することのできる適切なプライマーを選択した。LAMPアッセイの最初の標準化と最適化は同一の反応条件下で行った。選択したプライマーセット（Ａ）を図１に示した。また、各プライマーのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２−６である。【００３２】
（5）LAMPアッセイの感度の決定
LAMPアッセイによるKPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出感度を決定するため、培養したK. pneumoniae ATCC BAA-1705株から抽出したDNAの段階希釈液（106-100CFU per reaction）を用いた。さらに、感度の比較対象として、文献（Poirel, L., Walsh, T. R., Cuvillier V. & Nordmann, P. (2011). Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes. Diagn Microbiol Infect Dis 70, 119-123）記載の方法に基づきPCR増幅を実施した。LAMP産物およびPCR産物は1.2％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、UV光の下で可視化した。【００３３】
（6）検体からの直接検出
KPC β-ラクタマーゼ産生菌を含む臨床検体より、培地にて産生菌を分離培養することなく直接LAMPアッセイにより検出できる感度を測定した。健常人から提供された検体（喀痰、尿、便、血液）にKPC-2産生K. pneumoniae ATCC BAA-1705を107〜100、0 CFU/mlになるように添加したものをサンプルとして用いた。MORA-EXTRACT（極東製薬）を用いて、それぞれの検体からDNAを直接抽出し、LAMP法を試した。比較として同じサンプルを用いてPCR法を行った。【００３４】
（7）DNA配列決定
LAMP反応の確度を確認するため、BigDye Terminator kit（Applied Biosystems）およびDNA Sequencer ABI Prism310（Applied Biosystems）を用いて、メーカーの指示のとおりにLAMP産物の配列決定を行った。【００３５】
２．結果
反応混合物を60℃から69℃でインキュベートすることによって、効果的な増幅のための至適温度を特定した（図２）。濁度測定により、増幅のための至適温度は68℃であることが確認された。また、ループプライマー添加による反応効率を確認したところ、初期増幅の時間はループプライマーがない場合は約36分間であるのに対し、有りの場合は約15分間に短縮された。創出したループプライマーが反応速度を加速させるのに適当であることが見いだされた。【００３６】
LAMP法によるKPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出の特異性を確認するため、他のタイプのβ-ラクタマーゼを産生する菌株を用いて反応性を査定した。クラスA（CTX-M-2、CTX-M-9、TEM-1およびSHV-1)、クラスB（IMP-1、NDM-1およびVIM-2）、またはクラスD（OXA-48）のβ-ラクタマーゼを産生するE. coli、K. pneumoniae、A. baumanniiまたはP. aeruginosaの11株を対象とし、DNAを抽出して試験した。またネガティブコントロールとして蒸留水を使用した。その結果、いずれの鋳型DNAも増幅されず、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出におけるLAMP法の特異性が確認された。【００３７】
また、KPC-2 β-ラクタマーゼを産生する4種類のグラム陰性菌（E. coli、S. enterica、P. aeruginosaおよびA. baumannii）を試験した結果、これら全てのDNAはうまく増幅された。さらにこの増幅の特異性は、増幅産物のDNAシークエンス解析により確認した。【００３８】
培養したK. pneumoniae ATCC BAA-1705株から抽出したDNAの段階的な10倍希釈液（106-100 CFU per reaction）を用いてLAMP法による増幅を行い、PCRテストの結果と比較することによって、KPC β-ラクタマーゼ遺伝子検出におけるLAMP法の感度を試験した。その結果、LAMP法は100 CFU濃度の細菌の標的遺伝子を検出することが可能であったが（図３、４）、PCR法はその増幅には101 CFU濃度の細菌を必要とした。すなわち、LAMP法はPCRより10倍の感度を有することが確認された。検出限界である100 CFUでさえ、LAMP法ではポジティブコントロール菌株をわずか25分以内で検出することが可能であった（図４）。【００３９】
臨床現場での利用を想定し、臨床検体（喀痰、尿、便、血液）にKPC-2産生K. pneumoniae ATCC BAA-1705を107〜100 、0 CFU/mlになるように添加したものをサンプルとしてLAMP法を試した。その結果、いずれの検体からもKPC-2産生株を検出することが可能であった（図5）。100 CFU/mlの産生菌であっても、いずれも40分以内に検出可能であった。一方、同じサンプルに対するPCRの感度を測定したところ、検出限界は104  CFU/mlであった。LAMP法による検体からの直接検出では、PCR法と比較して非常に高い感度と迅速性を備わっていることが判った。【００４０】
実施例２：LAMPプライマーセット（Ｂ）によるKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出
図７（下段）に示した６個のプライマーセット（Ｂ）を用いたことを除き、実施例１と同様の方法によって菌株から抽出したDNAを対象としてLAMP法の感度を測定した。
結果は図７（上段）に示したとおりであり、プライマーセット（Ｂ）を用いた場合でも100 CFU濃度の細菌の標的遺伝子を検出することが可能であることが確認された。また、臨床検体（喀痰、尿、便、血液）を対象とした場合も、100CFU濃度のKPC β-ラクタマーゼ産生菌を検出することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本願発明方法は、迅速かつ安価、かつ正確なKPC β-ラクタマーゼ産生菌の検出方法であり、この方法はポイントオブケア（poin-of-care）検査または外来診療場面に適用可能である。このKPC β-ラクタマーゼ産生菌の水平的および垂直的な感染力を考慮すれば、その迅速かつ正確な検出は疫学的な調査の重要な手段であり、適切な抗生物質治療を選択するための手助けであり、これらの耐性決定因子の拡大を最小限に留め、院内感染を制御するための手段となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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