(57)【要約】  新規なＰＰＡＲα活性化剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法を提供する。ＰＰＡＲα活性化剤は、９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を有効成分として含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を有効成分として含む、ＰＰＡＲα活性化剤。
【請求項２】
前記麹は米麹である、請求項１に記載のＰＰＡＲα活性化剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、飲食品。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、食品添加物。
【請求項６】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、サプリメント。
【請求項７】
溶媒を用いて麹から９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する抽出物を抽出する工程、を含む、ＰＰＡＲα活性化剤の製造方法。
【請求項８】
さらに、前記抽出物を分画精製して、９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する画分を得ることを含む、請求項７に記載のＰＰＡＲα活性化剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の食品添加物を飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む、飲食品の製造方法。
【請求項１１】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、食品用添加物用の他の成分とを混合する工程を含む、食品添加物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１又は請求項２に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、サプリメント用の他の成分とを混合する工程を含む、サプリメントの製造方法。
【請求項１３】
９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を体内に摂取させることを含む、ＰＰＡＲα活性化方法。
【請求項１４】
９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を体内に摂取させることを含む、脂肪蓄積抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲα活性化剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品に含まれる機能性成分を利用した加工食品、栄養補助剤、医薬品等の開発研究が盛んに進められている。日本の伝統食品である味噌、醤油等の原料となる麹についてもその効能に関する研究成果は多数存在し、麹由来の成分に肥満を抑制する効果があるとする報告もなされている。【０００３】
例えば、特開平７−１１２９３７号公報には米麹を含む肥満予防・治療剤が、特開２００１−１４５４９８号公報には大麦麹の抽出成分を含む脂肪肝抑制作用を有する組成物が、特開２０１２−２１９０７７号公報には黒麹を用いて発酵させた茶葉由来の成分を含む中性脂肪低減効果を有する組成物が記載されている。【０００４】
他方、肥満抑制効果を有する成分として、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＰＡＲｓ）を活性化する成分の探索が注目されている。ＰＰＡＲは核内レセプタースーパーファミリーの一つで、α、γ及びδの３つのサブタイプが知られている。特に、ＰＰＡＲαは肝臓や骨格筋などに高発現しており、脂質代謝に関与する標的遺伝子の転写を制御することが報告されている。【０００５】
ＰＰＡＲαを活性化する成分については、トマト、ナス等のナス科植物（例えば、特開２０１１−１８４４１１号公報参照）、大豆由来の発酵物（例えば、特開２０１２−１７１９２４号公報及び特開２００８−１７９５７３号公報参照）、アカシア属樹皮の抽出物（例えば、特開２００９−２０３２０９号公報）、紅麹菌発酵物（例えば、特開２０１１−１４４１７２号公報）等に含まれるという報告がなされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＰＡＲαは活性化されると脂肪酸のβ酸化を亢進するため、脂質代謝異常及び肥満の改善に有効であると考えられている。従って、ＰＰＡＲαを活性化する成分を含む食品等を摂取することにより、肥満を抑制する効果が期待できる。また、ＰＰＡＲαを活性化する成分を複数見出すことは、脂質代謝異常及び肥満の改善手段の選択肢を広げる上で有益である。本発明は上記事情に鑑み、新規なＰＰＡＲα活性化剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための手段は、以下の通りである。
＜１＞９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を有効成分として含む、ＰＰＡＲα活性化剤。
＜２＞前記麹は米麹である、＜１＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤。
＜３＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、医薬組成物。
＜４＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、飲食品。
＜５＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、食品添加物。
＜６＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤を含む、サプリメント。
＜７＞溶媒を用いて麹から９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する抽出物を抽出する工程、を含む、ＰＰＡＲα活性化剤の製造方法。
＜８＞さらに、前記抽出物を分画精製して、９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する画分を得ることを含む、＜７＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤の製造方法。
＜９＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
＜１０＞＜５＞に記載の食品添加物を飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む、飲食品の製造方法。
＜１１＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、食品用添加物用の他の成分とを混合する工程を含む、食品添加物の製造方法。
＜１２＞＜１＞又は＜２＞に記載のＰＰＡＲα活性化剤と、サプリメント用の他の成分とを混合する工程を含む、サプリメントの製造方法。
＜１３＞９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を体内に摂取させることを含む、ＰＰＡＲα活性化方法。
＜１４＞９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ）を含有する麹抽出物又はその活性画分を体内に摂取させることを含む、脂肪蓄積抑制方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規なＰＰＡＲα活性化剤、医薬組成物、飲食品、食品添加物、サプリメント及びこれらの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】麹抽出物のＰＰＡＲα活性化作用の評価結果を示す図である。
【図２】麹抽出物のトリグリセリド蓄積抑制作用の評価結果を示す図である。
【図３Ａ】麹抽出物の脂肪酸酸化関連遺伝子発現量に与える影響の評価結果を示す図である。
【図３Ｂ】麹抽出物の脂肪酸酸化関連遺伝子発現量に与える影響の評価結果を示す図である。
【図３Ｃ】麹抽出物の脂肪酸酸化関連遺伝子発現量に与える影響の評価結果を示す図である。
【図４Ａ】麹抽出物より得られた活性画分のＰＰＡＲα活性の評価結果を示す図である。
【図４Ｂ】麹抽出物より得られた活性画分のＰＰＡＲα活性の評価結果を示す図である。
【図４Ｃ】麹抽出物より得られた活性画分のＰＰＡＲα活性の評価結果を示す図である。
【図５Ａ】麹抽出物より得られた活性画分のＬＣ／ＭＳ解析結果を示す図である。
【図５Ｂ】麹抽出物より得られた活性画分のＬＣ／ＭＳ解析結果を示す図である。
【図６】ＰＰＡＲα活性化成分のＰＰＡＲα活性化能の比較結果を示す図である。
【図７】ＰＰＡＲα活性化成分のＰＰＡＲα活性化能の比較結果を示す図である。
【図８】９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅのトリグリセリド蓄積抑制作用の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、以下の説明によって本発明の範囲が制限されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１１】
＜ＰＰＡＲα活性化剤＞
本発明のＰＰＡＲα活性化剤は、９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（以下、単に９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅとも称する）を含有する麹抽出物またはその活性画分を有効成分として含む。本発明のＰＰＡＲα活性化剤は、体内に摂取されるとＰＰＡＲαを活性化する。また、食品由来の成分であるため、安全性が高い。
【００１２】
９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅは、下記式で表される化合物である。
【化１】
2016125805.tif 000002
【００１３】
本発明者らによる研究により、麹中にＰＰＡＲα活性化能を有する成分が含まれることを見出した。また、さらなる研究の結果、本発明者らは、麹中に含まれるＰＰＡＲα活性化能を有する成分には、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅ、１３−ヒドロキシ−９，１１−オクタデカジエン酸（１３−ＨＯＤＥ：９Ｚ，１１Ｅ及び９Ｅ，１１Ｅ）、リノール酸及びオレイン酸が含まれることを見出した。また、これらの成分の中でも９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２ＥのＰＰＡＲα活性化能が著しく高いことを見出した。
【００１４】
９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２ＥがＰＰＡＲα活性化能を有するという報告はこれまでになされている（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７１（２０００）３４−３８参照）。また、特開２０１１−１８４４１１号公報は、ＰＰＡＲα活性化成分として９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅをナス科植物中に見出している。しかしながら、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅが麹中に含まれるという報告はこれまでになされておらず、本発明がはじめて見出したものである。
【００１５】
本発明において麹とは、蒸した米、麦、大豆などの穀物に麹菌を付着させて繁殖させたものを意味する。麹の種類は特に制限されず、本発明の効果が達成される範囲内において選択することができる。ある実施態様では、本発明のＰＰＡＲα活性化剤は、米麹の抽出物又はその活性画分を有効成分として含む。
【００１６】
本発明において麹菌とは、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の不完全菌のうち、食用に利用されるものを意味する。麹菌としてはニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、タマリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ）、カワチコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、サイトウコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）等が挙げられ、これらのアルビノ等の変異種も麹菌に含まれる。麹菌の種類は特に制限されず、本発明の効果が達成される範囲内において選択することができる。
【００１７】
ある実施態様では、本発明のＰＰＡＲα活性化剤は、麹菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．３０３０株を用いて得られる麹の抽出物又はその活性画分を有効成分として含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．３０３０株はアミラーゼ活性及びプロテアーゼ活性は中庸で、長毛菌の中でも菌糸が長い部類に属する。その増殖は速く、グルタミナーゼ活性の高いことが特徴である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．３０３０株は、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託（識別の表示：Ｎｏ．３０３０、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０００）されている。あるいは、例えば、株式会社  樋口松之助商店より入手可能である。
【００１８】
ＰＰＡＲα活性化剤の原料となる麹に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度は、麹の原料となる穀物及び麹菌の種類、発酵の条件等によって異なるため、用途に応じて所望の濃度で９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含む麹を用いることが好ましい。麹に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの量は、例えば、ＬＣ−ＭＳ  により測定することができる。ある実施態様では、原料となる麹６００ｍｇに７０％エタノール６ｍＬを添加して得た抽出液を７０％エタノールで２倍に希釈した希釈液中の９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度を測定した場合、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度が３０ｎＭ以上であり、好ましくは１μＭ以上であり、より好ましくは３０μＭ以上である。
【００１９】
ＰＰＡＲα活性化剤の状態は特に制限されず、液体、粉末、ゲル、固形等から用途に応じて選択できる。ＰＰＡＲα活性化剤に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの含有量は特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。
【００２０】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を含む。本発明のＰＰＡＲα活性化剤を含むことにより、医薬組成物の投与対象の体内において、脂肪酸のβ酸化が促進され、その結果、脂肪、特にトリグリセリド、の蓄積が抑制されるといった効果が得られる。本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患は、ＰＰＡＲαの活性化が治療、軽減又は予防につながる疾患であれば特に制限されない。このような疾患としては、肥満（特に内臓脂肪蓄積型の肥満）及び肥満に起因する糖尿病、脂質異常症、高血圧、脂肪肝等のいわゆるメタボリックシンドロームの諸症状などが挙げられる。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤以外の添加物又は薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。このような添加物又は薬学的に許容可能な担体としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、溶剤、増粘剤、粘液溶解剤、湿潤剤、防腐剤などが挙げられる。
【００２２】
本発明の医薬組成物に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの含有量は特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。      
【００２３】
本発明の医薬組成物の形態は特に制限されず、経口剤又は非経口剤のいずれであってもよい。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、軟膏剤、点鼻剤、坐剤等が挙げられる。
【００２４】
本発明の医薬組成物の投与量は特に制限されない。例えば、本発明の医薬組成物を経口投与する場合、成人１日当たりの９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの摂取量が０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となるような投与量とすることができる。また、本発明の医薬組成物を非経口的に投与する場合、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの摂取量が０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重となるような含有量とすることができる。
【００２５】
＜食品添加物＞
本発明の食品添加物は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を含む。本発明の食品添加物を飲食品に添加することにより、前記飲食品が摂取された際に、脂肪蓄積の抑制などの効果を得ることができる。本発明の食品添加物は、必要に応じて食品用添加物用の他の成分を含んでもよい。他の成分としては、着色料、保存料、甘味料、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、酸化防止剤、乳化剤、香料などが挙げられる。
【００２６】
食品添加物中における９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの含有量は、本発明の効果が達成される限りにおいて特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。  
【００２７】
＜飲食品＞
本発明の飲食品は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を含む。飲食品の種類は、特に制限されず、飲料類、麺類、菓子類、肉類又は畜産加工食品、乳製品、油脂加工品、調味料等が挙げられる。本発明の飲食品は、本発明の食品添加物を上記のような一般的な飲食品に添加することにより得ることができる。
【００２８】
本発明の飲食品の摂取量は特に制限されないが、例えば、成人１日当たりの９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの摂取量が１００ｍｇ／ｋｇ体重〜６０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ体重〜３０００ｍｇ／ｋｇの範囲となるようにすることができる。
【００２９】
＜サプリメント＞
本発明のサプリメント（栄養補助食品）は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を含む。サプリメントの形態は特に制限されず、錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。本発明のサプリメントは、本発明のＰＰＡＲα活性剤のみからなるものでもよいし、サプリメント用の成分として知られている別の成分との組み合わせにより構成されていてもよい。そのような他の成分としては、多糖類、酸化防止剤、タンパク質、塩類などが挙げられる。
【００３０】
本発明のサプリメントにおける９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの含有量は、本発明の効果が達成される限りにおいて特に制限されないが、例えば、０．０１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０１質量％〜８０質量％、より好ましくは０．０１質量％〜５０質量％とすることができる。
【００３１】
本発明のサプリメントの摂取量は特に制限されないが、例えば、成人１日当たりの９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの摂取量が１００ｍｇ／ｋｇ体重〜６０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ体重〜３０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となるようにすることができる。
【００３２】
＜ＰＰＡＲα活性化剤の製造方法＞
本発明のＰＰＡＲα活性化剤の製造方法は、溶媒を用いて麹から９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含む抽出物を抽出する工程を含む。前記麹は、米、麦又は大豆などの穀物に麹菌を付着させ、前記菌を付着させた穀物を、４℃で１６時間培養すること、により得られたものであってもよい。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。ＰＰＡＲα活性化剤の製造条件は、ＰＰＡＲα活性化剤を摂取した際に９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅが体内で有効にＰＰＡＲαを活性化できるような条件であれば特に制限されない。
【００３３】
前記方法において用いる麹は、特に制限されない。ある実施態様では、米麹を使用する。麹に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度は、麹の原料となる穀物及び麹菌の種類、発酵の条件等によって異なるため、用途に応じて所望の濃度で９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含む麹を用いることが好ましい。麹に含まれる９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度は、例えば、ＬＣ−ＭＳにより測定することができる。ある実施態様では、原料となる麹６００ｍｇに７０％エタノール６ｍＬを添加して得た抽出液を７０％エタノールで２倍に希釈した希釈液中の９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度を測定した場合、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの濃度が３０ｎＭ以上であり、好ましくは１μＭ以上であり、より好ましくは３０μＭ以上である。
【００３４】
麹から９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含有する抽出物を得る際には、その抽出方法は特に制限されず、一般的な抽出方法を用いることができる。例えば、麹に溶媒を加えて抽出液を作製し、必要に応じて濃縮、乾燥等を行う方法が挙げられる。例えば、麹に溶媒を加えて粉砕し、遠心分離して得た上清を回収して抽出液を作製し、必要に応じてさらに抽出液の希釈、濃縮、乾燥等を行うことを含む方法が挙げられる。ＰＰＡＲα活性化成分である９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅは脂溶性であるため、前記溶媒はこれを十分溶解できるものであることが好ましい。このような溶媒としては、エタノール等のアルコール溶媒もしくはアルコール溶媒と水との混合溶媒、ヘキサン等の炭化水素溶媒、酢酸エチル等のエステル溶媒、アセトン等のケトン溶媒、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム等のアルキルハライド溶媒などを挙げることができる。
【００３５】
溶媒は、好ましくはアルコール溶媒と水との混合溶媒であり、混合溶媒中におけるアルコール濃度は好ましくは７０％であり。アルコールは、好ましくはエタノールである。抽出温度は、好ましくは４℃である。
【００３６】
必要に応じ、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含有する抽出物をさらに分画精製してもよい。精製は、例えば、オープンカラム、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、などにより行うことができる。活性画分とは、こうして得られた画分のうち、９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅを含有する画分を意味する。活性画分における９−ＨＯＤＥ−１０Ｅ，１２Ｅの含有量は、本発明の効果が達成される限りにおいて特に制限されないが、例えば、２０〜１００ｍｇ／ｇ麹であることが好ましい。
【００３７】
調製されるＰＰＡＲα活性化剤の状態は特に制限されず、液体、粉末、ゲル、固形等から用途に応じて選択できる。
【００３８】
＜医薬組成物の製造方法＞
本発明の医薬組成物の製造方法は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤と、添加剤又は薬学的に許容可能な担体とを混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。添加物又は薬学的に許容可能な担体としては、本発明の医薬組成物に関連して例示したものを挙げることができる。
【００３９】
＜食品添加物の製造方法＞
本発明の食品添加物の製造方法は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を、必要に応じて食品添加用の他の成分と混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。食品添加用成分の例としては、本発明の食品添加物に関連して例示したものを挙げることができる。
【００４０】
＜飲食品の製造方法＞
本発明の飲食品の製造方法は、本発明の食品添加物を、飲食品又は飲食品の原料に添加して混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。添加及び混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。
【００４１】
＜サプリメントの製造方法＞
本発明のサプリメントの製造方法は、本発明のＰＰＡＲα活性化剤を、必要に応じてサプリメント用の他の成分と混合する工程を含む。前記方法は、必要に応じてその他の工程を含んでもよい。混合の方法は特に制限されず、公知の方法により行うことができる。サプリメント用成分の例としては、本発明のサプリメントに関連して例示したものを挙げることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、統計処理はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。【００４３】
＜実施例１  麹抽出液のＰＰＡＲα活性化作用の評価＞
（麹抽出物１の作製）
麹（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．３０３０株を用いて得られた米麹、株式会社  樋口松之助商店より購入）５００ｍｇに７０％エタノール  ５ｍＬを添加し、クラッシャーを用いて破砕した（速度：３２００回／分、５分間）。得られた破砕物を回収し、１０分間静置した。その後遠心分離を行い（速度：１２０００回／分、１０分間）、得られた上清を回収した。この上清１ｍＬをロータリーエバポレーター（３７℃、一晩）で濃縮し、さらに７０％エタノールで濃縮率５０倍になるように溶解して、麹抽出物１を作製した。【００４４】
（ＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイ）
麹抽出物１のＰＰＡＲα活性化能について調べるため、ＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイを行った。ＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイは、既報（Ｔ．Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３３７（２００５）４４０−４４５）に記載の方法に準じて行った。【００４５】
すなわち、細胞としては、ｐ４ｘＵＡＳｇ−ｔｋ−ｌｕｃ（レポータープラスミド）、ｐＭ−ｈＰＰＡＲα（ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとヒトＰＰＡＲαのリガンド結合ドメインとのキメラタンパク質用発現ベクター）、ｐＲＬ−ＣＭＶ（トランスフェクション効率を標準化するための内部のコントロール）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ  ＲｅａｇｅｎｔをトランスフェクションしたＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株）を使用した。培地としては、１０％牛胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ培地を使用した。【００４６】
ＣＶ−１細胞にリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて上記ベクターをトランスフェクションし、２４時間培養した。続いて、麹抽出物１の７０％エタノール濃縮液（５０倍）を０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬ添加した培地に交換し、さらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性の測定には、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ）  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびルミノメーター（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ、ベルトールジャパン社）を使用し、試薬および装置の取扱説明書に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、ポジティブコントロールとして、既知のＰＰＡＲαアゴニストであるＧＷ−７６４７（２−［４−［２−［１−（４−シクロヘキシルブチル）−３−シクロヘキシルウレイド］エチル］フェニルチオ］イソ酪酸）を１０ｎＭ添加した培地を使用し、ネガティブコントロールとして、７０％のエタノールを培地の１００倍希釈になるように添加したものを使用した。【００４７】
その結果、図１に示すように、麹抽出物１のＰＰＡＲα活性がネガティブコントロールに対して有意に高かった。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（対コントロール）である。【００４８】
以上の結果より、麹抽出物にＰＰＡＲα活性化成分が含まれていることがわかった。【００４９】
＜実施例２  麹抽出物の脂肪蓄積抑作用の評価＞
実施例１で使用した麹抽出物１を用いて、麹抽出物がマウス初代培養幹細胞のトリグリセリド（ＴＧ）蓄積に与える影響を調べた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、オス）から肝細胞を分離し、初代培養肝細胞を調製し、１２ウェルプレートに播種（２×１０５細胞／ｍｌ）した。播種から３〜５時間後、細胞がプレートに貼り付いたことを顕微鏡で確認し、オレイン酸入り無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ、１％Ｐ／Ｓ、５００μＭオレイン酸、２０μｇ／ｍＬＢＳＡ）に交換した。同時に、麹抽出物１を０．１ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬの量で添加した。ポジティブコントロールとして、ＧＷ−７６４７（１００ｍＭ）を添加した。【００５０】
添加から２４時間経過後に、初代培養肝細胞のＴＧ蓄積量をＴＧキット（Ｗａｋｏ）を用いて測定した。その結果、図２に示すように、麹抽出物を添加した初代培養肝細胞のＴＧ蓄積量がネガティブコントロールに対して有意に低下していた。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝４）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（対コントロール）である。【００５１】
以上の結果より、麹抽出物に脂肪蓄積を抑制する成分が含まれていることがわかった。【００５２】
＜実施例３  麹抽出物の脂肪酸酸化関連遺伝子発現量に与える影響＞
実施例２で確認された脂肪蓄積抑制作用がＰＰＡＲαの活性化に関係するものであるか否かを調べるために、麹抽出物がマウス初代培養幹細胞の脂肪酸酸化関連遺伝子発現量に与える影響を調べた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、オス）から肝細胞を分離し、初代培養肝細胞を調製し、１２ウェルプレートに播種（２×１０５細胞／ｍｌ）した。播種から３〜５時間後、細胞がプレートに貼り付いたことを顕微鏡で確認し、無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ、１％Ｐ／Ｓ）に交換した。同時に、麹抽出物１を０．１ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬの量で添加した。ポジティブコントロールとして、ＧＷ−７６４７（１００ｍＭ）を添加した培地を使用し、ネガティブコントロールとして、７０％のエタノールを培地の５００倍希釈になるように添加したものを使用した。【００５３】
添加から２４時間後に、脂肪酸酸化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ法により測定しところ、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、麹抽出液を添加することによりＣｐｔ１−ａ（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１ａ）及びＡＯＸの発現がネガティブコントロールに対して有意に上昇した。一方、図３Ｃに示すように、ＡＣＳの発現量には影響を及ぼさなかった。以上の結果より、麹抽出物に含まれる脂肪蓄積抑制成分は、脂肪酸酸化関連遺伝子の発現量を上昇させることによってＴＧ蓄積を抑制することが示唆された。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝４）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（対コントロール）である。【００５４】
以上の結果より、麹抽出物の脂肪蓄積抑制作用はＰＰＡＲαの活性化と関係するものであることがわかった。【００５５】
＜実施例４  麹抽出物のＰＰＡＲα活性化成分の探索＞
麹抽出物に含まれるＰＰＡＲα活性化成分の探索以下の方法により行った。
実施例１で麹抽出物１の作製に用いた麹を破砕し、７０％エタノールで１６時間振とう抽出し、遠心分離して上清を回収した。この上清をロータリーエバポレーターで濃縮し、少量を７０％エタノールに溶解し、遠心エバポレーターで濃縮乾固し、分画用麹抽出物を作製した。【００５６】
作製した分画用麹抽出物について、以下の条件でオープンカラム分画を行った。各フラクションは、５００ｍｌずつ回収した。
・クロマトグラフ管：２５×５００ｍｍ（フィルター付）
・１００％ヘキサン（Ｆ１）→ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５（Ｆ２）→ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０（Ｆ３）→ヘキサン：酢酸エチル＝２５：７５（Ｆ４）→１００％酢酸エチル（Ｆ５）→１００％メタノール（Ｆ６）【００５７】
得られたフラクションサンプルについて、実施例１と同様の方法によりＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイを行った（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）ところ、Ｆ２及びＦ３のＰＰＡＲα活性が比較的高かった。そこで、Ｆ２及びＦ３についてさらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて以下の条件で分画を行った。各フラクションは、１ｍＬ／分ずつ回収した。
・カラム：逆相５Ｃ１８−ＡＲ−２  ＯＤＳ
・移動相：水／アセトニトリル（ＡＣＮ）混合液、０．１体積％ギ酸含有
・流速：１．０ｍＬ／分
・プログラム：１０〜９０％ＡＣＮ、６０分→９９％ＡＣＮ、６０．１〜７０分→１０％ＡＣＮ、７０．１〜８５分【００５８】
ＨＰＬＣで分画したフラクションサンプルについて、実施例１と同様の方法によりＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイを行ったところ、Ｆ２より得られたフラクションサンプルのうちフラクション５７、６２、６６（ｆ５７、ｆ６２、ｆ６６）のＰＰＡＲα活性が高く、Ｆ３より得られたフラクションサンプルのうちフラクション４７（ｆ４７）のＰＰＡＲα活性が高いことが確認された（図４）。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１（対コントロール）である。【００５９】
ＰＰＡＲα活性の高い４つのフラクションサンプルについて、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）にて以下の条件で分析した。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．１×１００ｍｍ
・移動相：水／アセトニトリル（ＡＣＮ）混合液、０．１体積％ギ酸含有
・流速：０．３ｍＬ／分
・プログラム：３０〜５０％ＡＣＮ、４分→５０〜８５％ＡＣＮ、４．１〜１４分、９９％ＡＣＮ、１４．０〜１７分→３０％ＡＣＮ、１７．１〜２０分
・イオン化モード：ＥＳＩネガティブモード【００６０】
分析の結果、Ｆ２のｆ６２からはリノール酸、Ｆ２のｆ６６からはオレイン酸、Ｆ３のｆ４７からは９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ及び１３−ヒドロキシ−９，１１−オクタデカジエン酸（１３−ＨＯＤＥ：９Ｚ，１１Ｅ及び９Ｅ，１１Ｅ）がそれぞれ同定された（図５Ａ及び図５Ｂ。Ｆ２のｆ５７からはＣ１９Ｈ３０Ｏ３の物質が同定され、これはデータベース検索やピーク特徴からＤｉｈｙｄｒｏｍｏｎａｃｏｌｉｎ  Ｌと推定される。【００６１】
以上の結果より、麹抽出物中にはＰＰＡＲα活性化成分としてリノール酸、オレイン酸、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ、１３−ＨＯＤＥ：９Ｚ，１１Ｅ、１３−ＨＯＤＥ：９Ｅ，１１Ｅ、及びＤｉｈｙｄｒｏｍｏｎａｃｏｌｉｎ  Ｌと推定されるＣ１９Ｈ３０Ｏ３が含まれることがわかった。【００６２】
＜実施例５  ＰＰＡＲα活性化成分のＰＰＡＲα活性化能の比較＞
麹抽出物中に見出されたＰＰＡＲα活性化成分のＰＰＡＲα活性化能を、以下の方法によって比較した。【００６３】
（１）９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅと１３−ＨＯＤＥ：９Ｚ，１１Ｅ及び１３−ＨＯＤＥ：９Ｅ，１１Ｅの活性比較
実施例１と同様の方法で作製したＣＶ−１細胞を用いて、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ、１３−ＨＯＤＥ：９Ｚ，１１Ｅ及び１３−ＨＯＤＥ：９Ｅ，１１Ｅ（いずれも市販の試薬を使用）をそれぞれ１．３μＭ添加し、添加から２４時間後にＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、図６に示すように、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２ＥのＰＰＡＲα活性が極めて高いことが確認された。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１（対コントロール）である。【００６４】
（２）９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ、リノール酸及びオレイン酸の活性比較
実施例１と同様の方法で作製したＣＶ−１細胞を用いて、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ、リノール酸及びオレイン酸（いずれも市販の試薬を使用）をそれぞれ１．３μＭ添加し、添加から２４時間後にＰＰＡＲαルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、図７に示すように、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２ＥのＰＰＡＲα活性が比較的高いことが確認された。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１（対コントロール）である。【００６５】
以上の結果より、麹抽出物に含まれるＰＰＡＲα活性化成分の中でも９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２ＥのＰＰＡＲα活性化能が特に高いことがわかった。【００６６】
＜実施例６  ９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅの脂肪蓄積抑制能の評価＞
マウス初代培養幹細胞を用いて、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅがトリグリセリド（ＴＧ）蓄積に与える影響を調べた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢、オス）から肝細胞を分離し、初代培養肝細胞を調製し、１２ウェルプレートに播種（２×１０５細胞／ｍｌ）した。播種から３〜５時間後、細胞がプレートに貼り付いたことを顕微鏡で確認し、オレイン酸入り無血清培地（低グルコースＤＭＥＭ、１％Ｐ／Ｓ、５００μＭオレイン酸、２０μｇ／ｍｌＢＳＡ）に交換した。同時に、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅ（試薬を使用）を１μＭ、３μＭ、１０μＭの量で添加した。ポジティブコントロールとして、ＧＷ−７６４７（１μＭ）を添加した培地を使用し、オレイン酸を添加した培地（ＣＴ＋）をネガティブコントロールとした。【００６７】
添加から２４時間経過後に、初代培養肝細胞のＴＧ蓄積量をＴＧキット（Ｗａｋｏ）を用いて測定した。その結果、図８に示すように、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅを３μＭ又は１０μＭ添加した場合はネガティブコントロール（ＣＴ＋）と比較してＴＧ蓄積量が有意に減少した。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝４〜５）であり、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（対コントロール）である。【００６８】
以上の結果より、ＰＰＡＲα活性化成分である９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅが脂肪蓄積抑制能を有することが確認された。このことから、９−ＨＯＤＥ：１０Ｅ，１２Ｅを含有する麹抽出物又はその活性画分は、ＰＰＡＲα活性化剤の有効成分として有用であることがわかった。【００６９】
日本国特許出願第２０１５−０１８５０２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
2016125805.tif 000003
【図２】
2016125805.tif 000004
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2016125805.tif 000008
【図４Ｂ】
2016125805.tif 000009
【図４Ｃ】
2016125805.tif 000010
【図５Ａ】
2016125805.tif 000011
【図５Ｂ】
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【図６】
2016125805.tif 000013
【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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