(57)【要約】本発明は、プラスミドを菌体内に安定に保持した状態で培養時の菌体の増殖速度を増大させ、組換え蛋白質の生産量を向上させることのできる、組換え蛋白質の製造方法を提供する。本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程、および前記高温培養工程後、前記ブレビバチルス属細菌を３２℃未満で培養する低温培養工程を含む、組換え蛋白質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程、および
前記高温培養工程後、前記ブレビバチルス属細菌を３２℃未満で培養する低温培養工程
を含む、組換え蛋白質の製造方法。
【請求項２】
高温培養工程から低温培養工程への移行がブレビバチルス属細菌の生育における対数増殖期初期から中期の間に行われる、請求項１に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項３】
組換え蛋白質が抗体結合性蛋白質である、請求項１または２に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項４】
抗体結合性蛋白質がプロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのＣドメインまたはＤドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体である、請求項３に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項５】
組換え蛋白質が生理活性蛋白質である、請求項１または２に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項６】
生理活性蛋白質がペプチドホルモンまたはその前駆体である、請求項５に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項７】
組換え蛋白質が抗体または抗体様分子である、請求項１または２に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え微生物を使用した組換え蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え微生物を使用した組換え蛋白質の生産は、種々の異種蛋白質の製造に用いられている（非特許文献１）。組換え蛋白質の生産性向上のために種々の培養条件が検討されているが、単位時間当たりの生産性向上のためには、菌体増殖速度の増大が有効な手段となる。一般的に、微生物が生育可能な範囲内であれば、培養温度が高くなるほど菌体の増殖速度は増大することが知られている。しかしながら、組換え微生物において、異種蛋白質の発現のために導入するプラスミドは、培養温度が高いと菌体内で安定に保持されにくく菌体から脱落しやすいため、迅速に菌体が増殖しても組換え蛋白質の生産量は低下する。一方、培養温度が低いとプラスミドを安定に保持させることができるが、その場合には菌体増殖速度が低下し、生産性が低下する。【０００３】
ところで、遺伝子組換え技術を用いて生産される蛋白質医薬品のうち、抗体医薬品は急速にその需要を拡大している。【０００４】
抗体医薬品の製造には、一般に抗体結合能を有するアフィニティークロマトグラフィーが使用されており、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどの蛋白質を適当な樹脂に固定化して得られる抗体精製用担体による、クロマトグラフィーが最も多く使用されている。抗体結合能を有するリガンドとしては、プロテインＡが特に多く使用されている。【０００５】
蛋白質をリガンドとするアフィニティー担体は、医薬品製造用資材として高い品質が求められる。蛋白質からなるリガンド自体も蛋白質医薬品と同等レベルの品質を要求され、生産コストが高いので、アフィニティー担体を安価に供給できない状況となっている。抗体医薬品の製造コストのうち、アフィニティー担体の生産コストが占める割合は大きく、抗体医薬品の製造コスト低減に大きな足かせとなっている。よって、蛋白質からなるリガンドを高品質で安価に調達する方法が望まれている。【０００６】
本発明者らは、これまでに、プロテインＡの部分配列を安定的かつ大量に生産するために、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い、プロテインＡの部分配列を効率良く大量に分泌発現し、培養液中に安定的に蓄積させ、容易に高純度で分離回収できる方法を見出している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０６／００４０６７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｙ  Ｔｅｒｐｅ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７２：２１１−２２２（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はブレビバチルス属細菌を用いて組換え蛋白質を製造する際に、プラスミドを菌体内に安定に保持した状態で培養時の菌体の増殖速度を増大させ、組換え蛋白質の生産量を向上させることのできる、組換え蛋白質の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、培養前半は高温で培養を行う高温培養工程と、培養後半はより低温で培養を行う低温培養工程を組み合わせることで、プラスミドを菌体内に安定に保持したままブレビバチルス属細菌の菌体の増殖速度を増大させ、組換え蛋白質の生産量を向上させることができることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程、および前記高温培養工程後、前記ブレビバチルス属細菌を３２℃未満で培養する低温培養工程を含む、組換え蛋白質の製造方法に関する。【００１２】
高温培養工程から低温培養工程への移行がブレビバチルス属細菌の生育における対数増殖期初期から中期の間に行われることが好ましい。【００１３】
組換え蛋白質が抗体結合性蛋白質であることが好ましい。【００１４】
抗体結合性蛋白質がプロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのＣドメインまたはＤドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体であることが好ましい。【００１５】
組換え蛋白質が生理活性蛋白質であることが好ましい。【００１６】
生理活性蛋白質がペプチドホルモンまたはその前駆体であることが好ましい。【００１７】
組換え蛋白質が抗体または抗体様分子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ブレビバチルス属細菌を用いた組換え蛋白質の製造において、プラスミドを菌体内に安定に保持したまま菌体の増殖速度を増大させ、コストを抑えながら組換え蛋白質の生産量を向上させることができる。本発明の方法は工業的規模にスケールアップすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】発現プラスミドＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０の模式図である。
【図２】Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０に含まれるプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程、および前記高温培養工程後、前記ブレビバチルス属細菌を３２℃未満で培養する低温培養工程を含む、組換え蛋白質の製造方法に関する。
【００２１】
組換え蛋白質としては、例えば抗体結合性蛋白質、抗体、抗体様分子、酵素、その他の有用生理活性蛋白質が挙げられる。
【００２２】
抗体結合性蛋白質は、抗体の抗原認識部位以外の部分（例えば、Ｆｃ部分）と結合可能な蛋白質である。抗体の抗原認識部位以外の部分と結合し得る蛋白質であれば、その構造は特に限定されない。このような蛋白質としては、例えば、プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのＣドメインまたはＤドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体が挙げられる。
【００２３】
プロテインＡとは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約４２，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は７つの機能ドメイン（アミノ末端からシグナル配列Ｓ、イムノグロブリン結合ドメインＥ、イムノグロブリン結合ドメインＤ、イムノグロブリン結合ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢ、イムノグロブリン結合ドメインＣ、スタフィロコッカス・アウレウス細菌細胞壁結合ドメインＸ）から構成されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３，８０：６９７−７０１、Ｇｅｎｅ，１９８７，５８：２８３−２９５、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２５９：１６９５−１７０２）。
【００２４】
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、ｐＨ、スタフィロコッカス・アウレウス菌株種（Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８７，５５：８４３−８４７）、またイムノグロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）などの多くの因子に依存することが知られ、特にイムノグロブリンのクラスではヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ，マウスＩｇＧ３のＦｃ部分と強い結合を示す。
【００２５】
プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメインとしては、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。
【００２６】
プロテインＧとは、グループＣ及びＧのストレプトコッカス属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）によって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約５９，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は５つの機能ドメイン（アミノ末端から、シグナル配列ＳＳ、配列ＡおよびＢの繰り返しによるアルブミン結合ドメイン、配列ＣおよびＤの繰り返しによるイムノグロブリン結合ドメイン、細胞壁貫通ドメインＷ、細胞膜貫通ドメインＭ）から構成されている。
【００２７】
プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインは、プロテインＡのそれと比較して、広範に哺乳動物ＩｇＧのＦｃ部分と結合を示す（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８４，１３３：９６９−９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６：３９９−４０５）。
【００２８】
プロテインＧのＣドメインまたはＤドメインとしては、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。
【００２９】
プロテインＬとは、ペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）によって生産される蛋白質の１種であり、約７９，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は６つの機能ドメイン（アミノ末端から、シグナル配列ＳＳ、アミノ末端ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢの５回繰り返し、機能不明ドメインＣの２回繰り返し、細胞壁貫通ドメインＷ、細胞膜貫通ドメインＭ）から構成されている。
【００３０】
このプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインはイムノグロブリンのκ軽鎖と結合を示す。（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４：１９７４０−１９７４６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：１２８２０−１２８２５）。
【００３１】
プロテインＬのＢドメインとしては、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。
【００３２】
抗体結合性蛋白質の機能的変異体は、抗体結合性蛋白質の変異体のうち、抗体に結合する活性を有する蛋白質である。抗体結合性蛋白質の機能的変異体と、配列番号５に示すプロテインＡのＣドメインとの配列同一性は、６０％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、７５％以上であることがさらにより好ましく、８０％以上であることがなお好ましく、８５％以上であることがさらになお好ましく、９０％以上であることが特に好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
【００３３】
抗体結合性蛋白質の連結体は、抗体結合性蛋白質を直列に連結して得られる蛋白質である。異なる抗体結合性蛋白質を連結してもよく、同じ抗体結合性蛋白質を連結してもよい。連結される抗体結合性蛋白質の数としては、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個が挙げられる。連結体としては、プロテインＡのＣドメインの機能的変異体５個を含む、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。
【００３４】
抗体、または抗体様分子としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの完全長抗体、およびそれらの抗原結合部位からなる部分断片化抗体などが挙げられる。
【００３５】
酵素としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、アシラーゼ、アミダーゼ、ヒダントイナーゼ、ヒダントインラセマーゼ、デカルバミラーゼ、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、Ｄ−スクシニラーゼ、Ｌ−スクシニラーゼ、カルバミルアミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸アミドラセマーゼ、アミノペプチダーゼ、オキシゲナーゼなどが挙げられる。
【００３６】
その他の有用生理活性蛋白質とは、医薬活性成分として用いられる蛋白質であり、例えばインシュリン、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、成長ホルモン、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、造血因子、およびこれらの前駆体、およびそれらの受容体蛋白質などが挙げられる。
【００３７】
組換え蛋白質をコードする遺伝子は、組換え蛋白質をコードする塩基配列を有していれば特に限定されない。前記遺伝子を含むＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法で取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８４．１２：４３５９）、ＤＮＡライブラリーからも取得できる。当該ＤＮＡにおいて、コドンが縮重コドンで置換されていてもよい。
【００３８】
ブレビバチルス属細菌で組換え蛋白質を発現させるために、発現ベクターを使用できる。発現ベクターは、組換え蛋白質をコードする遺伝子を含む。当該遺伝子を発現させるプロモーターとして、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを使用できる。
【００３９】
当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでもよいが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌に由来し、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましい。ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｅｂｉｓｕ．Ｓら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０．１７２：１３１２−１３２０）をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。具体例として、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域や、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域が挙げられる。
【００４０】
発現ベクターは、前記プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列及びシグナル配列をさらに含むことが好ましい。シャインダルガノ配列は、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なシャインダルガノ配列が好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰをコードする遺伝子の上流に存在するシャインダルガノ配列がより好ましい。発現ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでもよい。
【００４１】
発現ベクターは、シャインダルガノ配列の下流に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでいても良い。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ブレビバチルス・ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性はない。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌由来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰの分泌シグナルペプチドがより好ましい。また従来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものも使用できる。
【００４２】
分泌シグナルペプチドの具体例としては、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）のシグナルペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号１９）をＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（配列番号２０）の下線部のように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加または消失させた分泌シグナルペプチドも使用できる。また従来からブレビバチルス属の分泌蛋白質において使われている分泌シグナルペプチドも使用できる。
【００４３】
さらに該プロテインＡが本来有するシグナルペプチド、すなわち、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ（配列番号２１）も使用できる。
【００４４】
上記のプロモーター、シャインダルガノ配列、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、ブレビバチルス属細菌から得ることができる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
【００４５】
発現ベクターにおいては、前記プロモーター、前記シャインダルガノ配列、前記シグナルペプチド配列、および組換え蛋白質をコードする遺伝子が、ブレビバチルス属細菌内において作動可能に連結されていることが好ましい。
【００４６】
発現ベクターは、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、またはｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８７．１２３９−１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７．６１：６６９−６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５−８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８−４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ｓｈｉｇａ．Ｙ．ら．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２．５８：５２５−５３１．）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｉｓｈｉｈａｒａ．Ｔら、１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７７：７４５−７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８−３６３）、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）が挙げられる。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャインダルガノ配列と目的蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを含んだ発現ベクター、または、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いてもよい。
【００４７】
組換え蛋白質は、ブレビバチルス属細菌において分泌させる方法、または分泌させない方法のいずれで生産されてもよいが、分離精製が容易であることから、培養液中へ分泌させる方法が好ましい。
【００４８】
組換え蛋白質を培養液中へ分泌させるためには、組換え蛋白質をコードする遺伝子の上流にブレビバチルス属細菌で機能するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加または連結するのが好ましい。
【００４９】
形質転換体を得るために用いる宿主細胞としては、任意のブレビバチルス属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属細菌は、特に限定されないが、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロポラス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー等を含む。
【００５０】
好ましくは、ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）からなる群より選択される。特に上記のブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株が適している。
【００５１】
上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用してもよい。変異株として、例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（特開平６−２９６４８５号公報）、ヒト唾液アミラーゼ高生産株であるブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ら．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９０．３４：２９７−３０２）が挙げられる。また前記ブレビバチルス属細菌群に含まれるいずれかの株の変異体を使用してもよい。
【００５２】
上記微生物のうち、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）、及びブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ；〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１−１中央第６）に、上記それぞれの受託番号にて寄託されている。また、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）及びブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）は、独立行政法人  理化学研究所バイオリソースセンター  微生物材料開発室（ＪＣＭ；〒３０５−００７４  茨城県つくば市高野台３−１−１）から入手することができる。前述したブレビバチルス属細菌は変異等を加えることなくそのまま用いることが可能であり、その他に、前述したブレビバチルス属細菌から、さらに組換え蛋白質の生産量や品質が優れるブレビバチルス属細菌を取得して、組換え蛋白質の生産に用いることも可能である。
【００５３】
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および／またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶性化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）および／またはＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報）である。
【００５４】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。
【００５５】
本発明による組換え蛋白質の発現の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン蛋白質、ジスルフィド結合酸化還元酵素、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。具体的に挙げれば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフィド結合に関与し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの類縁と考えられている大腸菌のＤｓｂＡ（Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．Ａ．ら．Ｃｅｌｌ．１９９１．６７：５８２−５８９、Ｋａｍｉｔａｎｉ．Ｓら．ＥＭＢＯ．Ｊ．１９９２．１１：５７−６２．）および／または、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正確なジスルフィド結合に関与している酵素ＰＤＩ（特願２００１−５６７３６７号公報）、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ，Ｖ，Ｐ．ら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９３．８：７２７−７３７）、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向上させることもできる。
【００５６】
組換え蛋白質をコードする遺伝子による、ブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のＴａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｗら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３．１５６：１１３０−１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ｔａｋａｇｉ．Ｈ．ら．１９８９．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５３：３０９９−３１００）、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｏｋａｍｏｔｏ．Ａ．ら  １９９７．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：２０２−２０３）により行うことができる。
【００５７】
ブレビバチルス属細菌の培養に用いる培地は、組換え蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に限定されない。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類を添加してもよい。また、必要であれば、大豆油、ラード油、界面活性剤等の消泡効果のある、または、細胞膜の物質透過性を変化させ、菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上が期待される化合物を添加してもよい。界面活性剤の使用は、本発明の効果を増強する場合があり好ましい。界面活性剤としては、組換えブレビバチルス属細菌の生育および／または組換え蛋白質生産に悪影響を及ぼさない限り、特に制限されないが、好ましくはポリオキシアルキレングリコール系の界面活性剤である。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加してもよい。ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質を添加してもよい。菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解や低分子化を抑えるために、公知のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。プロテアーゼ阻害剤として、例えばＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）などが挙げられる。
【００５８】
培養開始時に培地に含まれる炭素源の濃度は、１％以上、または１０％以下が好ましく、初発１〜１０％がより好ましい。培養途中に炭素源の濃度が１０％以下、５％以下、３％以下、特には１％以下となるように適宜炭素源を追加的に添加することがさらに好ましい。炭素源の追加的な添加方法として、分割添加または連続添加が挙げられる。
【００５９】
培養は、通気攪拌条件で行う好気的培養、または通気を遮断した嫌気的培養が挙げられ、好気的培養が好ましい。また、ｐＨは４から９で培養できるが、５から８であることが好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００６０】
本発明の製造方法は、ブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程、および前記高温培養工程後、３２℃未満で培養する低温培養工程を含む。高温培養工程、および低温培養工程では、液体培地、または固体培地でブレビバチルス属細菌を培養する。
【００６１】
ブレビバチルス属細菌を３２℃以上で培養する高温培養工程では、培養開始から、３２℃以上の温度でブレビバチルス属細菌を培養する。高温培養工程における培養温度は、３２〜６０℃であることが好ましく、３２〜５０℃であることがより好ましく、３２〜４０℃であることがさらに好ましい。６０℃を超えると菌体増殖が悪くなる傾向があり、３２℃未満では菌体増殖速度が遅くなる傾向がある。
【００６２】
高温培養工程後、３２℃未満で培養する低温培養工程では、３２℃未満の温度でブレビバチルス属細菌を培養する。低温培養工程における培養温度は、１０℃以上３２℃未満であることが好ましく、１５℃以上３２℃未満であることがより好ましく、２０℃以上３２℃未満であることがさらに好ましく、２５℃以上３２℃未満であることがさらにより好ましい。３２℃以上であると菌体内でのプラスミド保持が不安定になる傾向があり、１０℃未満では菌体増殖が悪くなる傾向がある。
【００６３】
高温培養工程から低温培養工程への移行が、ブレビバチルス属細菌の生育における対数増殖期初期から中期の間に行われることが好ましい。対数増殖期初期から中期の間に高温培養工程から低温培養工程へ移行することにより、プラスミドを菌体内に安定に保持した状態で、培養時の菌体の増殖速度を増大させ、組換え蛋白質の生産量を向上させることができるという効果を奏する。
【００６４】
なお、一般的に対数増殖期とは、培養系に含まれるすべての細胞が一定の間隔で細胞分裂して増殖し、培養系全体に含まれる細胞の総数がそれぞれ２倍ずつになるために時間軸に対して細胞数の対数が直線となる期間のことである。使用する培地の種類によってブレビバチルス属細菌の到達菌体密度が異なるため、対数増殖期を培地の濁度の絶対値で定義することはできない。そこで、対数増殖期を、使用する培地で菌体密度が最大となった培地の濁度を１００％とした場合の培地の相対濁度（％）を指標として定義する。当該指標を用いた場合、ブレビバチルス属細菌の生育における対数増殖期の初期とは、培地の相対濁度が１〜３５％の期間であり、ブレビバチルス属細菌の生育における対数増殖期の中期とは、培地の相対濁度が３５％より大きく、７０％以下の期間である。
【００６５】
高温培養工程から低温培養工程への移行は、前述した指標を用いた場合、相対濁度が１〜７０％である時に行われることが好ましく、５〜６０％である時に行われることがより好ましく、１０〜５０％である時に行われることがさらに好ましく、１５〜４０％である時に行われることがさらにより好ましい。
【００６６】
高温培養工程から低温培養工程への移行は、培養装置の設定温度を変更し、高温培養工程で使用された液体培地の温度を低下させることにより行われる。通常、高温培養工程から低温培養工程への移行に際して培地の交換は必要ないが、培地を交換してもよい。
【００６７】
なお、培地の濁度は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長で測定される培地の吸光度である。
【００６８】
生産された組換え蛋白質は、菌体外、すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、組換え蛋白質は培養上清中から回収し精製できる。また菌体内、及び菌体表層に存在する組換え蛋白質も、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリ処理、ＳＤＳ処理などの公知の方法により菌を破砕して、回収できる。培養上清や菌体から回収された蛋白質は、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトンなどを用いた濃縮、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、組換え蛋白質が有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて精製できる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。【００７０】
（製造例１）プロテインＡのＣドメインの機能的変異体の５連結体を発現した形質転換体の調製
プロテインＡのＣドメインの２９番目のＧｌｙをＡｌａに改変し５連結したタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８、以下Ｃ−Ｇ２９Ａとする。）から逆翻訳を行い、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を設計した。該タンパク質のコドン使用頻度が、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株で大量に発現している細胞表層タンパク質であるＨＷＰ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，ｐ．１３１２−１３２０，１９９０）のコドン使用頻度に近くなるように、かつ、５個の各ドメインをコードする塩基配列の配列同一性が低くなるように考慮して、コドンを分配した。また、５連結ドメインをコードする配列の５’側にＰｓｔＩ、および、３’側にＸｂａＩの制限酵素認識部位を作製した。作製したＤＮＡ断片の配列を配列番号２２に記した。作製したＤＮＡ断片をＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（ともにＴａｋａｒａ社製）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画、精製した。一方、ブレビバチルス属細菌用のプラスミドベクターであるｐＮＣＭＯ２（Ｔａｋａｒａ社製）を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩにより消化後、精製回収した。両者を混合後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結して、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築した。このプラスミドベクターを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）の形質転換を行い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）を作製した。【００７１】
（参考例１）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）の培養温度の違いによる組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ生産量とプラスミド保持率の比較
製造例１にて得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）を、Ａ培地（ペプトン１．５％、酵母エキス０．４％、グルコース２％、リン酸塩０．３８％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．００２％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００２％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００２％  ｐＨ７．２、培養開始後６時間目から４８時間目にかけてグルコース３．８％分を連続添加）にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、２８、３０、３２、３４、３６℃の各培養温度にて、好気的条件下でｐＨを７．０から７．２に制御しながら培養を行った。【００７２】
培養開始から４６時間後に培養液を採取し、培養液中のブレビバチルス・チョウシネンシスのプラスミド保持率を以下に示す方法により測定した。まず、採取した培養液を０．９％の生理食塩水で適宜希釈し、希釈液１００μｌを標準寒天培地（日水製薬株式会社製）プレートにて塗布した後、３０℃で２０時間静置培養した。プレート上に得られたコロニーを、ネオマイシンを６０ｐｐｍ含んだ標準寒天培地プレート上にレプリカし、３０℃で２４時間静置培養した後のコロニーの生育の有無からプラスミド保持の有無を判断した。【００７３】
また、培養開始から６７時間後に培養液を採取し、遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度を測定した。各培養温度における組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度とプラスミド保持率の結果を表１に示す。【００７４】
【表１】
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【００７５】
表１に示すように、培養温度が２８℃および３０℃の場合には、プラスミドが１００％安定に保持されていたのに対し、培養温度が３２℃以上の場合には、プラスミド保持率が低下し、培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度も低下した。【００７６】
（実施例１）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）の温度シフト培養１
製造例１にて得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）を、Ａ培地（ただしグルコースの連続添加は、培養開始６時間後から３０時間後にかけて４．８％分を添加することで行った）にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、好気的条件下でｐＨを７．０から７．２に制御しながら培養した。培養は、培養温度を培養開始から１３．５時間目まで３６℃で培養し、培地の相対濁度が３３％になった後、３０℃に温度シフトして培養終了まで培養する条件により行った。【００７７】
培養開始から４１時間後に培養液を採取し、参考例１と同様に培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度を測定した。また、培養開始から４１時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。また、培養開始から４６時間後に培養液を採取し、参考例１と同様にプラスミド保持率を測定した。結果を表２に示す。【００７８】
（比較例１）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）の培養１
培養を、培養開始から終了まで３０℃の一定温度の条件で行った以外は、実施例１と同じ操作を行った。結果を表２に示す。【００７９】
【表２】
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【００８０】
表２に示すように、培養温度をシフトさせた実施例１では、３０℃一定培養の比較例１と比較して、培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度が大きく増加した。また、実施例１では比較例１と比較して、菌体量の指標となる濁度も増加した。また、表１に示すように、３６℃一定培養では、培養開始４６時間後のプラスミド保持率が２５％と極めて低かったのに対し、３６℃から３０℃に温度シフトした場合には、培養開始４６時間後でもプラスミドを１００％安定に保持できていた。【００８１】
（実施例２）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）の温度シフト培養２
製造例１にて得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）を、Ａ培地にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、好気的条件下でｐＨを７．０から７．２に制御しながら培養した。培養は、培養温度を培養開始から１３．５時間目まで３４℃で培養し、培地の相対濁度が２２％になった後、３０℃に温度シフトして培養終了まで培養する条件により行った。【００８２】
培養開始から３７時間後に培養液を採取し、参考例１と同様に培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度を測定した。また、培養開始から３７時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。また、培養開始から４１時間後に培養液を採取し、参考例１と同様にプラスミド保持率を測定した。結果を表３に示す。【００８３】
（比較例２）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａ）の培養２
培養を、培養開始から終了まで３０℃の一定温度の条件で行った以外は、実施例２と同じ操作を行った。結果を表３に示す。【００８４】
【表３】
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【００８５】
表３に示すように、培養温度をシフトさせた実施例２では、３０℃一定培養の比較例２と比較して、培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａ濃度が有意に増加した。また、実施例２では比較例２と比較して、菌体量の指標となる濁度も増加した。また、表１に示すように、３４℃一定培養では、培養開始４６時間後のプラスミド保持率が４４％と極めて低かったのに対し、３４℃から３０℃に温度シフトした場合には、培養開始４１時間後でもプラスミドを１００％安定に保持できていた。【００８６】
（製造例２）ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０の構築
ｐＮＨ３２６（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５−７４９）に含まれるＭＷＰのＰ５プロモーターをＭＷＰのＰ２プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０を以下のように構築した。まず、ｐＮＨ３２６を鋳型として、配列番号２３および２４に示した塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーＰｒｉｍｅｒ−１およびＰｒｉｍｅｒ−２を用いてＰＣＲを行い、ｐＮＨ３２６のうちＭＷＰのＰ５プロモーターを除く部分を増幅し、その末端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴａｋａｒａ社製）とで消化した。次に、配列番号２５に示した塩基配列を有するＭＷＰのＰ２プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡ断片を定法に従い調製し、その末端を制限酵素ＭｕｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（共にＴａｋａｒａ社製）で消化した。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて連結し、ｐＮＫ３２６０を構築した。【００８７】
（製造例３）スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、グルコース１％、魚肉エキス０．５％、ｐＨ７．０）で３７℃一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。なお、スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）は独立行政法人  理化学研究所バイオリソースセンター  微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３０５−００７４  茨城県つくば市高野台３−１−１）より入手することが出来る。【００８８】
次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ，Ｈ．Ｌら．Ｇｅｎｅ，１９８７，５８：２８３−２９５．）を基に、配列番号２６及び２７に示した塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーＰｒｉｍｅｒ−３およびＰｒｉｍｅｒ−４を調製した。上記のスタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（ＪＣＭ２１７９）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーＰｒｉｍｅｒ−３およびＰｒｉｍｅｒ−４を用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分（これ以降ＳＰＡ’と称する）をコードするＤＮＡ断片（約０．９ｋｂｐ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。【００８９】
一方、製造例２で構築したブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。【００９０】
制限酵素処理後のＳＰＡ’をコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＫ３２６０とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、図１に示すＳＰＡ’発現プラスミドＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を構築した。図２には、Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０に含まれるプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡを示した。配列番号２８に示した塩基配列は、Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０に含まれるプロモーター、ＳＤ配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡを示し、配列番号２９はシグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を示す。【００９１】
図１および図２において、「ＭＷＰ−Ｐ２」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ’」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列を一部改変した改変型シグナルペプチド配列、「ｓｐａ’」はＳＰＡ’をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＫ３２６０の複製開始点を意味する。また図２において、「Ｐ２−３５」および「Ｐ２−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーターの−３５領域および−１０領域を意味する。【００９２】
Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０を、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３）に電気導入することで、形質転換体ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）を作製した。【００９３】
（実施例３）ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）の温度シフト培養
製造例３にて得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）を、Ａ培地（ただしグルコースの連続添加は、培養開始６時間後から４８時間後にかけて５．０％分を添加することで行った）にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、好気的条件下でｐＨを７．０から７．２に制御しながら培養した。培養は、培養温度を培養開始から１３．５時間目まで３４℃で培養し、培地の相対濁度が２１％になった後、３０℃に温度シフトして培養終了まで培養する条件により行った。培養開始から４８時間後に培養液を採取し、参考例１と同様に培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’濃度を測定した。また、培養開始から４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６００ｎｍにおける濁度を分析した。結果を表４に示す。【００９４】
（比較例３）ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）の培養
培養を、培養開始から終了まで３０℃の一定温度の条件で行った以外は、実施例３と同じ操作を行った。結果を表４に示す。【００９５】
【表４】
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【００９６】
表４に示すように、培養温度をシフトさせた実施例３では、３０℃一定培養の比較例３と比較して、培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’濃度が大きく増加した。また、実施例３では比較例３と比較して、菌体量の指標となる濁度も大きく増加した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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