(57)【要約】  本発明の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有し、配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項２】
さらに、セルロース結合モジュールを有する、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
原核生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
真核生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項９】
植物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項１０に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
【請求項１２】
前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、請求項１１に記載のセルラーゼ混合物。
【請求項１３】
セルロースを含む材料を、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項６〜９のいずれか一項に記載の形質転換体、又は請求項１０に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
【請求項１４】
前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させる、請求項１３に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１５】
前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、請求項１４に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１６】
生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項１７】
配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー。
【請求項１８】
配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロビオハイドロラーゼ酵素の耐熱性に関する。セロビオハイドロラーゼは、セルロース、ヘミセルロース等のリグノセルロースを加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わるグリコシド加水分解酵素の一つである。より詳細には、新規の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
本願は、２０１３年３月２７日に国際出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０５９０２８に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロース、ヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。例えば、多糖類は、セルラーゼ酵素と総称されるグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。【０００３】
複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。リグノセルロースの加水分解には、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）や、他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。【０００４】
リグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷による糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、酵素反応が進みにくいが、高温で行うことによってバイオマス糖化液の粘性が低下する結果、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が図られると期待される。また、一般に化学反応は、ファント・ホッフ−アレニウス（ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆ−Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）の法則により、温度が１０℃上がると反応速度が２〜３倍上がる。そこで、耐熱性セルラーゼ酵素を用いて従来よりも高い温度でリグノセルロース糖化処理を行った場合には、この経験則に従って高い酵素反応速度が得られるであろう。このような理由から、耐熱性酵素を用いてリグノセルロース糖化処理を高温で行うことにより、酵素量と糖化時間が大幅に削減され、酵素コストの大幅低減が可能であると考えられる。【０００５】
真核生物である好熱性糸状菌は、原核生物の好熱性細菌や超好熱性アーキアと比べ、その生存限界温度は低く、５５℃程度である。このため、好熱性糸状菌が発現、分泌するグリコシド加水分解酵素の耐熱性は、一般的にあまり高くない。これまで報告された中で最も耐熱性が高い糸状菌由来ＣＢＨ（セロビオハイドロラーゼ）は、好熱性糸状菌Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのセロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIが、それぞれ至適温度７５℃と７０℃を示し（例えば、非特許文献１参照。）、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのセロビオハイドロラーゼＣＢＨIは至適温度６５℃である（例えば、非特許文献２参照。）。セロビオハイドロラーゼ中の１個又は複数個のアミノ酸を置換することによって、より耐熱性を向上させる方法もあるが（例えば、特許文献１又は２参照。）、こうして得られた変異型セロビオハイドロラーゼの耐熱性は未だ不充分である。【０００６】
一方、温泉や熱水噴出孔、油田、鉱山などの極限環境から５５℃以上で増殖する好熱菌や８０℃以上で増殖する超好熱菌が分離、培養されている。これらの好熱性細菌や超好熱性アーキアに由来する耐熱性グリコシド加水分解酵素は、その大部分がエンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はグルコシダーゼ活性を持つ酵素である。リグノセルロース加水分解プロセスにおいて最も重要な役割を果たすセロビオハイドロラーゼは、わずか数個が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属に属する３種の好熱性細菌から分離されているにすぎない。例えば、好熱性嫌気性菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、高いリグノセルロース加水分解活性を持つ酵素複合体セルロソームを菌体外に提示する。セルロソームの主要酵素はセロビオハイドロラーゼであり、ＧＨ５ファミリーに属するＣｅｌＯ、ＧＨ９ファミリーに属するＣｂｈＡとＣｅｌＫの３種類が単離され、いずれも至適温度Ｔｏｐｔ＝６０〜６５℃である（例えば、非特許文献３〜５参照。）。好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａからＧＨ６ファミリーに属するＥ３（例えば、非特許文献６参照。）と、ＧＨ４８ファミリーに属するＣｅｌ４８Ａ（例えば、非特許文献７参照。）の２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子が単離されている。これらのセロビオハイドロラーゼは比較的熱安定性が高く、最大値の５０％活性を示す温度範囲は４０〜６０℃であり、５５℃で少なくとも１６時間安定した活性を有する。但し、これら２種類のセロビオハイドロラーゼは、７０℃以上では活性が不充分であり、これらを用いてセルロースの糖化処理を行う場合には、糖化処理温度は６０〜６５℃が上限となる。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の好熱性細菌由来セロビオハイドロラーゼは最も耐熱性が高く、至適温度Ｔｏｐｔ＝１０５℃、活性半減期Ｔｈａｌｆが１０８℃で７０分と報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。しかし、当該酵素は、エンドグルカナーゼ様の基質特異性を示し、アモルファス構造のセルロースとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に対してのみ分解活性を示す。さらに、濾紙の加水分解活性が弱いことから、当該酵素によっては、結晶性リグノセルロースの効率的糖化は期待できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５１５５０６号公報
【特許文献２】特開２０１２−３９９６７号公報
【特許文献３】特開２００５−２３７２３３号公報
【特許文献４】特開２００７−５３９９４号公報
【特許文献５】特開２００８−１９３９５３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ganju et al., Biochim. Biophys. Acta., 1989, vol. 993, p. 266-274.
【非特許文献２】Hong et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, vol. 63, p. 42-50.
【非特許文献３】Zverlov et al., Microbiology, 2002, vol. 148, p. 247-255.
【非特許文献４】Zverlov et al., Microbiology, 1998, vol. 143, p. 3537-3542.
【非特許文献５】Kataeva et al., Journal of Bacteriology, 1995, vol. 181, p. 5288-5295.
【非特許文献６】Zhang et al., Biochemistry, 1995, vol. 34, p. 3386-3395.
【非特許文献７】Irwin et al., Eur. J. Biochem., 2000, vol. 267, p. 4988-4997.
【非特許文献８】Ruttersmith and Daniel, Biochemical Journal, 1991, vol. 277, p. 887-890.
【非特許文献９】Herai, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, vol. 101, p. 14031-14035
【非特許文献１０】Ogino, S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, vol. 64, p. 823-828
【非特許文献１１】Tamura, T. et al., J. Environmental Biotechnol., 2007, vol. 7, p. 3-10
【非特許文献１２】DN. Bolam et al., Biochem. J., 1998, vol. 331, p. 775-781
【非特許文献１３】N. DIN et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, p. 11383-11387
【非特許文献１４】K. Riedel et al., FEMS Microbiology Letters, 1998, vol. 164, p. 261-267
【非特許文献１５】Mahadevan SA, Wi SG, Lee DS, Bae HJ: Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett., 2008, vol. 287, p. 205-211
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、少なくとも７５℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示す新規な耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。【００１１】
本発明の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物、セルロース分解物の製造方法、ポリヌクレオチドの製造方法、及びプライマーは、例えば下記［１］〜［１７］の態様を有する。
［１］本発明の第一の態様は、
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
［２］前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、さらに、セルロース結合モジュールを有することが好ましい。
［３］本発明の第二の態様は、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
［４］前記［３］のポリヌクレオチドとしては、さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有することが好ましい。
［５］本発明の第三の態様は、前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクターである。
［６］本発明の第四の態様は、前記［５］の発現ベクターが導入されている形質転換体である。
［７］前記［６］の形質転換体は、真核微生物であることが好ましい。
［８］前記［６］の形質転換体は、植物であることが好ましい。
［９］本発明の第五の態様は、前記［６］〜［８］のいずれかの形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法である。
［１０］本発明の第六の態様は、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［９］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物である。
［１１］前記［１０］のセルラーゼ混合物において、前記その他のセルラーゼはヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１２］本発明の第七の態様は、セルロースを含む材料を、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［６］〜［８］のいずれかの形質転換体、又は前記［９］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることによりセルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法である。
［１３］前記［１２］のセルロース分解物の製造方法において、前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを接触させることが好ましい。
［１４］前記［１３］のセルロース分解物の製造方法において、前記その他のセルラーゼは、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１５］本発明の第八の態様は、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法である。
［１６］本発明の第九の態様は、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーである。
［１７］本発明の第十の態様は、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーである。【００１２】
また、本発明は以下の側面を有する。
〔１〕（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ、
〔２〕さらに、セルロース結合モジュールを有する、〔１〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、
〔３〕（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド、
〔４〕さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有する、〔３〕に記載のポリヌクレオチド、
〔５〕〔３〕又は〔４〕に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター、
〔６〕〔５〕に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体、
〔７〕原核生物である、〔６〕に記載の形質転換体、
〔８〕真核生物である、〔６〕に記載の形質転換体、
〔９〕植物である、〔６〕に記載の形質転換体、
〔１０〕〔６〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、
〔１１〕〔１〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、〔２〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は〔１０〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物、
〔１２〕前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、〔１１〕に記載のセルラーゼ混合物、
〔１３〕セルロースを含む材料を、〔１〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、〔２〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、〔６〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の形質転換体、又は〔１０〕に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法、
〔１４〕前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させる、〔１３〕に記載のセルロース分解物の製造方法、
〔１５〕前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、〔１４〕に記載のセルロース分解物の製造方法、
〔１６〕生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法、
〔１７〕配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー、及び
〔１８〕配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（及びＯＪ１−２）、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列の有根分子系統樹である。ＯＪ１−２は、アミノ酸配列がＡＲ１９Ｇ−１２と１００％相同（同一）であることから、ＡＲ１９Ｇ−１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ−１２の部分配列である、と推察される。
【図２Ａ】オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列、及びこれらアミノ酸配列と最も配列同一性の高いクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼの触媒領域のアミノ酸配列アライメント図である。
【図２Ｂ】オープンリーディングフレームＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸配列アライメント図である。
【図３Ａ】オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びこれらアミノ酸配列と最も配列同一性の高いクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼの塩基配列から推定されるポリペプチドのアミノ酸模式図である。
【図３Ｂ】オープンリーディングフレームＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸模式図である。
【図４】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果（Ａ）とウェスタンブロット解析結果（Ｂ）を示した図である。
【図５Ａ】実施例１において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のＰＳＡ加水分解反応産物の分析結果を示した図である。
【図５Ｂ】実施例１において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのファミリー６セロビオハイドロラーゼＴｒＣＢＨIIのＰＳＡ加水分解反応産物の分析結果を示した図である。
【図６Ａ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図６Ｂ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図７Ａ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図７Ｂ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図８Ａ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のプリインキュベーション時間の影響を計測した結果を示した図である。
【図８Ｂ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のプリインキュベーション時間の影響を計測した結果を示した図である。
【図９Ａ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のプリインキュベーション温度の影響を計測した結果を示した図である。
【図９Ｂ】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のプリインキュベーション温度の影響を計測した結果を示した図である。
【図１０】実施例２において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ遺伝子を導入したコウジカビ形質転換体及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ遺伝子を導入したコウジカビ形質転換体の培地上清と、実施例１で調製したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
【図１１Ａ】各温度における、実施例１において大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）と、実施例２においてコウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（相対値（％））を求めた結果を示した図である。
【図１１Ｂ】各ｐＨにおける、実施例１において大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）と、実施例２においてコウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（相対値（％））を求めた結果を示した図である。
【図１２Ａ】実施例３において、タバコ葉緑体形質転換体作製に用いた、タバコ葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬの模式図である。
【図１２Ｂ】実施例３において、タバコ葉緑体形質転換体作製に用いた、タバコ葉緑体形質転換用カセットｐＰＸＴ及びｐＰＸＴＰＬの模式図である。
【図１２Ｃ】実施例３において、タバコ葉緑体形質転換体作製に用いた、タバコ葉緑体形質転換用発現カセットを組込んだ発現ベクターｐＮｔａＧＬ−ＱＶとｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡの模式図である。
【図１３Ａ】実施例３において、ｐＮｔａＧＬ−ＱＶの導入により得られた２系統の葉緑体形質転換タバコ（ＱＶ−２、ＱＶ−１７）と野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ−１））のサザンハイブリダイゼーションの結果を示した図である。
【図１３Ｂ】実施例３において、ｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡの導入により得られた３系統の葉緑体形質転換タバコ（ＲＡ−６−２−１、ＲＡ−６−２−２、ＲＡ−６−２−３）と野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ−１））のサザンハイブリダイゼーションの結果を示した図である。
【図１３Ｃ】実施例３において、ｐＮｔａＧＬおよびｐＮｔａＧＬＰＬベクターの導入により得られた葉緑体形質転換タバコのサザンハイブリダイゼーションの結果を示した図である。
【図１４Ａ】実施例３において、組換え体温室移植後７７日目の、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体（Ｔ１世代）と野生型タバコ（ＳＲ−１）の写真である。
【図１４Ｂ】実施例３において、開花期の、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体（Ｔ１世代）の写真である。
【図１５Ａ】実施例３において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体から抽出した、可溶性タンパク質抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図１５Ｂ】実施例３において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体から抽出した、可溶性タンパク質抽出液のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
【図１５Ｃ】実施例３において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬＰＬの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体から抽出した、可溶性タンパク質抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図１５Ｄ】実施例３において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬＰＬの導入により得られた葉緑体形質転換タバコ植物体から抽出した、可溶性タンパク質抽出液のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
【図１６Ａ】各温度における、実施例３においてタバコ葉緑体に発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のＰＳＡ加水分解活性を還元糖量（ｍＭ）で表した図である。
【図１６Ｂ】各温度における、実施例３においてタバコ葉緑体に発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のＰＳＡ加水分解活性を還元糖量（ｍＭ）で表した図である。
【図１７】実施例４において、シロイヌナズナに発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
【図１８】実施例４において、シロイヌナズナに発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（ｍＭ還元糖／２０ｍｉｎ）の温度依存性を示した図である。
【図１９】実施例５において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの導入により得られた遺伝子組換え放線菌から抽出した無細胞抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２０】実施例５において、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓに発現させた、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子がコードする酵素タンパク質（無細胞抽出液）のリン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）加水分解活性の温度依存性を示した図である。
【図２１Ａ】実施例６において、ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質を大腸菌に発現させて得られた酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図２１Ｂ】実施例６において、ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質を大腸菌に発現させて得られた酵素タンパク質のウェスタンブロット解析結果を示した図である。
【図２２Ａ】各温度における、実施例６において大腸菌に発現させたＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）の温度依存性を示した図である。
【図２２Ｂ】各温度における、実施例６において大腸菌に発現させたＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の、Ａｖｉｃｅｌ分解活性（Ｕ／ｍｇ）の温度依存性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発が進まない一因である。
【００１６】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１７】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内５ヶ所から採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）４４個を得た。これらのＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）分解活性及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、１個のＯＲＦからＰＳＡ分解活性を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼを得た。
【００１８】
当該ＯＲＦからは、ＰＣＲクローニングにより、２アミノ酸が置換されている２種類の耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られた。この２種類の遺伝子型のうち、２９９位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）であり、３５１位のアミノ酸がアラニン（Ａ）であるものをＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとし、２９９位のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）であり、３５１位のアミノ酸がバリン（Ｖ）であるものをＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶとした。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの塩基配列を配列番号２に、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのアミノ酸配列を配列番号１にそれぞれ示す。また、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの塩基配列を配列番号４に、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶのアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。ＰＣＲクローニングにより得られたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、開始メチオニンがなかったため、これらは、前記高温温泉土壌に含まれていた微生物が有していたセロビオハイドロラーゼ遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみの部分遺伝子であると推察された。
【００１９】
後記実施例１等に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるＬｉｃｈｅｎａｎや結晶性セルロースのアビセルに対し、弱いながらも分解活性を示した。一方、ＣＭＣやβ−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるＬａｍｉｎａｒｉｎに対し、ほとんど分解活性は示さなかった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行ったところ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡはＰＳＡを加水分解し、セロビオースと少量のセロトリオースを生成した。また、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶのアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６ファミリーに属するグルコシドハイドロラーゼ（配列番号１５）であり、その配列同一性はわずか６６％しかなかった。基質特異性、ＰＳＡ加水分解反応産物のＨＰＬＣ分析、及び既知のセロビオハイドロラーゼとのアミノ酸配列の配列同一性（相同性）から、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、ＧＨ６ファミリーに属する新規なセロビオハイドロラーゼであることが明らかとなった。
【００２０】
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶはいずれも、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜１３＞に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、いずれも３０〜１００℃の広い温度範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。但し、両者のセロビオハイドロラーゼ活性の至適温度範囲は異なっていた。大腸菌を宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０〜８０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、８０〜１００℃の範囲内では、温度が高くなるにつれてセロビオハイドロラーゼ活性は低下する傾向にあった。これに対し、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０〜７０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、７０℃付近でピークとなり、７０〜１００℃の範囲内では温度が高くなるにつれて低下する傾向を示した。
【００２１】
本発明及び本願明細書において「セロビオハイドロラーゼ活性」とは、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン及び結晶性セルロースからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、並びにリン酸膨潤アビセルを基質とし、前記基質を非還元末端側から加水分解することにより、セロビオースを生成する活性を意味する。
本発明及び本願明細書において「少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、前記ポリペプチドを含有する溶液のｐＨが５．５の時に７５℃で最も高いセロビオハイドロラーゼ活性を有することを意味する。すなわち、前記ポリペプチドを含有する溶液がｐＨ５．５以外、かつ７５℃以外の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有していなくとも、前記溶液をｐＨ５．５かつ７５℃の条件にした時に前記溶液がセロビオハイドロラーゼ活性を有していれば、前記ポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
本発明及び本願明細書において「耐熱性セロビオハイドロラーゼ」とは、５５〜８０℃、ｐＨ３．５〜７．０で前記セロビオハイドロラーゼ活性を有する酵素が好ましく、７０〜１００℃、ｐＨ４．０〜６．０で前記セロビオハイドロラーゼ活性を有する酵素がより好ましい。
【００２２】
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの３５１位のアミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷと、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの３５１位のアミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷも、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶと同様に、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷのアミノ酸配列を配列番号５に、それをコードする塩基配列を配列番号６にそれぞれ示し、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのアミノ酸配列を配列番号７に、それをコードする塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。コウジカビを宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０〜１００℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１００℃で、最も高いセロビオハイドロラーゼ活性を示した。
【００２３】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ、又はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷに対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２４】
すなわち、本発明の第一の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｌ）のいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２５】
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
【００２６】
前記（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）、及び（Ｋ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。各アミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の位置は特に限定されるものではないが、２９９位のアミノ酸はアルギニンであることが好ましい。
【００２７】
前記（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）、及び（Ｌ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
【００２８】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２９】
前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００３０】
前記（Ａ）〜（Ｌ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明の第二の態様に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００３１】
前記（Ａ）〜（Ｌ）のポリペプチドは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｌ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られる。中でも、７０〜１００℃においても高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことから、前記（Ｄ）〜（Ｌ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域とすることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）を基質とする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるＬｉｃｈｅｎａｎ、Ａｖｉｃｅｌ、結晶性バクテリアセルロース（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ）、濾紙などの結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ）、β−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン、β−１，３結合からなるグルカン、β−１，６結合からなるグルカン、及びキシラン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えて、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカンと結晶性セルロースの少なくとも一方を基質とするものが好ましく、ＰＳＡ、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン、及び結晶性セルロースを基質とするものがより好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ４．５〜６．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ４．５〜６．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜６．５の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましく、ｐＨ３．５〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがさらに好ましい。
【００３４】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記（Ａ）〜（Ｌ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、セロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、セロビオハイドロラーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｌ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３６】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３７】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。本発明においては、当該セルロース結合モジュールとしては、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の３５位のトレオニン（Ｔ）から１８２位のプロリン（Ｐ）までの１４８アミノ酸（Ｔ３５−Ｐ１８２）からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチド中の１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルロース結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００３８】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。このようなリンカー配列としては、具体的には、例えば、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニン（Ｔ）までの１１２アミノ酸（Ｓ１８３−Ｔ２９４）からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチド中の１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３９】
なお、配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、後記実施例１において、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから取得されたオープンリーディングフレームＯＪ１−１、及びそれからＰＣＲクローニングによって得られた新規な遺伝子ＯＪ１−１−１１がコードするポリペプチドのアミノ酸配列である。ＯＪ１−１−１１の３５位のトレオニンから１８２位のプロリンまでの１４８アミノ酸（Ｔ３５−Ｐ１８２）がセルロース結合モジュールＣＢＭ３であり、１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニンまでの１１２アミノ酸（Ｓ１８３−Ｔ２９４）がリンカー配列であると考えられる。
【００４０】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。Ｎ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを付加することにより、形質転換植物中で発現させた耐熱性セロビオハイドロラーゼを、アポプラストや細胞中の小胞体等に局在させることができる。
【００４１】
アポプラスト移行シグナルペプチドは、ポリペプチドをアポプラストに移行させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知のアポプラスト移行シグナルペプチドを適宜用いることができる。アポプラスト移行シグナルペプチドとして、例えば、ジャガイモのプロテアーゼインヒビターIIのシグナルペプチド（例えば、Wang et al.  ２００５年、Transgenic Research、第１４巻、１６７〜１７８ページ参照。）等がある。また、小胞体保留シグナルペプチドは、ポリペプチドを小胞体に保留させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知の小胞体保留シグナルペプチドを適宜用いることができる。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
【００４２】
また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００４３】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、本発明の第一の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００４４】
具体的には、本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｎ）のいずれかの塩基配列からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４５】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４６】
前記（ａ）〜（ｌ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。同様に、前記（ｄ）、（ｇ）、及び（ｊ）の塩基配列としては、それぞれ配列番号４、６、及び８で表される塩基配列であってもよく、これらの塩基配列中の縮重コドンを、宿主においてより使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。なお、コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
【００４７】
配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ等をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４８】
前記（ｍ）の塩基配列において、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％以下であれば特に限定されないが、８５％以上１００％以下であることが好ましく、９０％以上１００％以下であることがより好ましく、９５％以上１００％以下であることがさらに好ましい。
【００４９】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、前記技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００５０】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｌ）、又は（ｍ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は複数個の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｋ）、又は（ｌ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｌ）、又は（ｍ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成する際に、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列に対して欠失、置換若しくは付加される塩基の数は、合成後のポリヌクレオチドの塩基配列が配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有していれば特に限定されないが、１〜２５６個が好ましく、１〜１９２個がより好ましく、１〜１２８個がさらに好ましく、１〜６４個が特に好ましい。
【００５１】
本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００５２】
［発現ベクター］
本発明の第三の態様である発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。
本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。
具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５３】
当該発現ベクターとしては、大腸菌又は放線菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５４】
植物細胞へ導入される発現ベクターとしては、例えば、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ、耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させることができるため、例えば、食用植物の非食用部分にのみ耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得ることが期待できる。
【００５５】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。前記薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００５６】
［形質転換体］
本発明の第四の態様である形質転換体は、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
【００５７】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５８】
発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌又は放線菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌又は放線菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産できる。特に、当該形質転換体がコウジカビ等の糸状菌や酵母等の真核微生物（又は真核生物）である場合には、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを比較的簡便に大量生産することができる。また、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入された形質転換植物は、一個体当たりに生産される本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの量が比較的多いことに加えて、野外栽培等で大量栽培することも可能である。さらに、当該形質転換植物は、元々植物体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含むため、バイオマス資源として好適である。
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させるための宿主細胞としては、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、及び植物からなる群より選択される少なくとも１の宿主細胞が好ましく、酵母、糸状菌、放線菌、及び植物からなる群より選択される少なくとも１の宿主細胞がより好ましく、植物がさらに好ましい。
【００５９】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００６０】
本発明に係る形質転換体が植物である場合、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００６１】
本発明に係る形質転換体が植物である場合、前記本発明の第三の態様の発現ベクターに由来する本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現カセットは、植物の核ゲノムに組込ませてもよいが、葉緑体ゲノムに組込ませることが好ましい。葉緑体形質転換体では、挿入された外来遺伝子が細胞質遺伝するため、花粉を通した組換え遺伝子の環境漏洩を防ぐことができる。形質転換植物の野外栽培による大規模生産においては、組換え遺伝子の環境漏えいが懸念されるが、葉緑体形質転換体は、核ゲノム形質転換体よりも、組換え遺伝子の環境漏えいが抑えられるという点で優位性がある。
【００６２】
また、本発明に係る形質転換体が植物である場合、当該形質転換体には、形質転換により直接得られた植物に加えて、当該植物と同様に本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現している当該植物の子孫である植物も含まれる。ここで、植物の子孫とは、植物から得られた種子を発芽して得られる植物や、挿し木により得られた植物等を意味する。
【００６３】
宿主とされる植物の種類は、特に限定されるものではなく、双子葉植物であってもよく、単子葉植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよく、藻類や微小藻類であってもよい。例えば、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、キク科、ヒルガオ科、トウダイグサ科等に属する植物が挙げられる。アグロバクテリウムを介した形質転換に好適な植物であるため、ナス科、アブラナ科、又はイネ科の植物が好ましい。ナス科の植物として、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ピーマン等がある。アブラナ科の植物として、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、ワサビ等がある。また、イネ科の植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ等がある。その他、マメ科の植物として、例えば、ラッカセイ、ヒヨコマメ、ダイズ、インゲンマメ等がある。キク科の植物として、例えば、ゴボウ、ヨモギ、キンセンカ、ヤグルマギク、ヒマワリ等がある。ヒルガオ科の植物として、例えば、ヒルガオ、ハマヒルガオ、ネナシカズラ、セイヨウヒルガオ等がある。トウダイグサ科の植物として、例えば、トウダイグサ、ナツトウダイ、タカトウダイ等がある。
本発明に係る形質転換体が植物である場合、これらの中でも単子葉植物が好ましく、イネ科植物がより好ましく、バイオマス量の多いイネ科植物がさらに好ましい。
【００６４】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
本発明の第五の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明の第四の態様の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。
【００６５】
形質転換体によって生産された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００６６】
形質転換体から耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出・精製する方法は、耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００６７】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。
すなわち、本発明の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、本発明の第四の態様の形質転換体内で耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出し精製することを含む。
【００６８】
［セルラーゼ混合物］
本発明の第六の態様であるセルラーゼ混合物は、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む。前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出・精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００６９】
当該セルラーゼ混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るセルラーゼ混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼを含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００７０】
当該セルラーゼ混合物に含まれるその他のセルラーゼは、少なくとも７０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましく、７０〜９０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることがより好ましい。当該セルラーゼ混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該セルラーゼ混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該セルラーゼ混合物が耐熱性セルラーゼのみを含む場合、当該セルラーゼ混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００７１】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明の第七の態様であるセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
本発明及び本願明細書における「セルロース分解物」とは、セロビオースを含む。
【００７２】
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕・細断等の物理的処理、酸・アルカリ等の化学処理、適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００７３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、５５〜８０℃、ｐＨ３．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、７０〜１００℃、ｐＨ４．０〜６．０で反応を行うことがより好ましい。反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で行うことができる。
【００７４】
セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、少なくとも１種のその他のセルラーゼを用いることも好ましい。当該その他のセルラーゼとしては、前記セルラーゼ混合物に含められるセルラーゼと同様のものを用いることができ、少なくとも７０℃で、好ましくは少なくとも７０〜１００℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに代えて、前記本発明の第六の態様のセルラーゼ混合物を用いてもよい。
【００７５】
［ポリヌクレオチドの製造方法及びそれに用いるプライマー］
本発明の第八の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法は、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマー（本発明の第九の態様であるプライマー）と、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマー（本発明の第十の態様であるプライマー）とを用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る方法である。
【００７６】
配列番号１２で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２２位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号１３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１２６３〜１２８４位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。このため、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーをフォワードプライマーとし、配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーをリバースプライマーとして用い、配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）を増幅産物として得ることができる。
【００７７】
ＰＣＲにおいては、プライマーの５’末端側には、鋳型とのハイブリダイズには供しない付加的な塩基配列を有していてもよい。例えば、配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを用いることにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域の５’末端に当該フォワードプライマー由来の１若しくは複数個の塩基が付加されており、３’末端に当該リバースプライマー由来の１若しくは複数個の塩基が付加されているポリヌクレオチドを得ることができる。各プライマーの５’末端に付加される塩基配列としては、例えば、増幅産物を発現ベクターへ組込む際に必要とされる配列や、制限酵素部位、タグをコードする塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列等が挙げられる。また、配列番号１２で表される塩基配列の５’末端には、開始メチオニン（ＡＴＧ）を付加することも好ましい。
【００７８】
ＰＣＲの鋳型とするＤＮＡは、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）である。当該生物は、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドが組込まれたプラスミドを人工的に導入した微生物や、前記形質転換体であってもよく、自然界から採取されたサンプル中に含まれている生物であってもよい。自然界から採取されたサンプルから鋳型となるＤＮＡを調製する場合には、当該サンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００７９】
本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法において、ＰＣＲの条件等は、当業者であれば、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、当該ＰＣＲにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。
【００８０】
セロビオハイドロラーゼ触媒領域のアミノ酸配列は、ホモログ遺伝子間での保存性が高い。このため、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーを用いることにより、鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該ホモログ遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法により、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。
【００８１】
また、鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子以外の遺伝子であって、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子と類似した塩基配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該ホモログ遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法により、当該遺伝子の全領域又は部分領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。このため、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法は、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子と類似したアミノ酸配列からなる新規セロビオハイドロラーゼのクローニングにも有用である。
【実施例】
【００８２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８３】
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：５５℃以上）、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：８０℃以上）の遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。【００８４】
採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ量が１０μｇ以上得られたゲノム試料では、このうち５μｇを使用し、メタゲノムシーケンスを行った。すなわち、抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡ及び１６ｓｒＤＮＡアンプリコンのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、セルラーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。一方、ＤＮＡ量が少なかった試料（１０μｇ以下）では、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてゲノム増幅を行い、得られた増幅産物に対して、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。
各温泉土壌サンプル当たり３〜４回、計１９回、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９４ｂｐ、総リード数２６，２９５，４６３、総ゲノム解読量１０．３Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。【００８５】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
温泉メタゲノムから抽出したゲノムＤＮＡを使い、Ｒｏｃｈｅ社製  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙショットガンシーケンス用の標準プロトコールに従って、シーケンスライブラリーを構築した。Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods, 2008, vol.5, p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３又は２．５．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．）」に設定して行った。
Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計２．５Ｇｂｐあり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２６，２９４，１９３リードのうち１７，９９１，５６７リードが、平均で１ｋｂ以上のコンティグにアセンブルされ（計５９５，６０２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は２７８，１８５ｂｐであった。【００８６】
アセンブル後の配列は、ＫＥＧＧデータベース（Kanehisa, M. Science & Technology Japan, 1996, No. 59, p. 34-38、http://www.genome.jp/kegg/、2011/5/11（検索））に参照し、全てのコンティグ及びシングルトンを、バクテリア、アーキア（古細菌）、真核生物、ウィルス、いずれにも属さないものの５カテゴリーに系統分類した。アセンブル後の配列長（＝総コンティグ長＋総シングルトン長）２．５Ｇｂｐのうち、バクテリアにヒットした配列長２５８Ｍｂｐ、アーキアにヒットした配列長２７Ｍｂｐ、真核生物にヒットした配列長１９３，５６１ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．００８％）、ウィルスにヒットした配列長６８５，６４０ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．０２７％）であった。真核生物に属する配列が少なかった理由は、温泉土壌メタゲノムの温度が５８〜７０℃の範囲にあり、糸状菌等の真核生物の生存限界温度を超えていることを反映しているため、と考えられた。これらの結果から、このメタゲノムデータベースは、わずか１１．３％の既知ＤＮＡ配列を含んでいるにすぎないことがわかった。いずれにも属さない配列長は２．２Ｇｂｐあり、アセンブル後の配列全体の８８．７％を占めた。これらは、バクテリア、アーキア、又は真核生物のいずれかに由来する、新規な配列である。従来の微生物ゲノム研究アプローチ、すなわち、微生物を培養、単離し、その後、全ゲノムＤＮＡのサンガーシーケンスを行い、ゲノムを記述する方法では、ある特定環境の微生物コミュニティーを構成するゲノムＤＮＡの大半が捉えられていない、というHandelsmanらの指摘（Handelsman et al., Chem. Biol., 1998, vol. 5, p. R245-R249）を追認する結果となった。【００８７】
＜３＞  セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルロース）、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ）、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ）、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２００９／４／１３）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。メタゲノムＡＲ１５及びＡＲ１９ではアノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al., Nucleic Acids Research, 2009, 37 (Web Server issue: W101-W105）を使用し、メタゲノムＨ１、Ｎ２、ＯＪ１ではＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research, 2008,15 (6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ  ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０）、Ｍｅｔａｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ.２．２．１８）を使い、ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。【００８８】
アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ及びＭｅｔａｇｅｎｅは、読み取りエラー等によって生じるフレームシフトに対応していないため、以下に述べる方法でフレームシフト補正を行った。まず、コンティグを１ｋｂｐずらしながら２ｋｂｐの長さに切断した。このため、切断された配列は前後の配列と１ｋｂｐ配列が重なっていた。切断した各コンティグ配列を、前述したグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースに参照し（Ｅ＜１ｅ−２０）、Ｂｌａｓｔｘによりスクリーングした。ヒットしたコンティグ配列に対してＧｅｎｅｗｉｓｅ（Ｗｉｓｅ２  ｐａｃｋａｇｅ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/Wise2/）を使い、グリコシド加水分解酵素のコーディング領域を取得した。このとき、１００ｂｐ以下のコーディング領域を持つ配列は除去した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅソフトウェアでは、ターゲットコンティグについて、ローカルデータベース上のヒットした酵素配列と参照し、アライメントスコアーが最大になるように空白（ｇａｐ）を挿入又は削除することによって、配列のフレームシフトが補正される。【００８９】
こうして得られたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al., Nucleic Acids Research Database, 2010, Issue 38, p. D211-222）を基準に、機能分類を行った。具体的には、隠れマルコフモデルを応用した配列相同性検索アルゴリズムＨＭＭＥＲ（Durbin et al., ‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998, Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５；Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．））を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。ＢＬＡＳＴＰによるスクリーニングを行い、ＣＢＨ（セロビオハイドロラーゼ）配列としてヒットした４４個のＯＲＦをＧＨファミリーに分類した。【００９０】
＜４＞  Ｏｒｐｈｅｌｉａ出力に見られるレア開始コドンの補正
アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａは、ＡＴＧ（メチオニン）の他、レアコドンのＧＴＧ（バリン）、ＴＴＧ（ロイシン）、及びＡＴＡ（イソロイシン）を開始コドンとしてＯＲＦ検出する。このため、アセンブルされたコンティグにＡＴＧを開始コドンとする完全長ＯＲＦが含まれない場合、Ｏｒｐｈｅｌｉａはレアコドンを開始コドンとして認識するエラーが発生する。前記＜３＞においてＯｒｐｈｅｌｉａにより完全長と出力されたＯＲＦのうち、レアコドンＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＡを開始コドンとするＯＲＦは８個あった。ｇｅｎｅｗｉｓｅによるＯＲＦ出力とＯＲＦが含まれるコンティグのアミノ酸配列を参照し、これらのＯＲＦがレアコドンを開始コドンとする完全長配列か、あるいは、出力エラーであるか、確認を行った。その結果、Ｏｒｐｈｅｌｉａが出力したレアコドンを開始コドンとする８個のＯＲＦは、全て出力エラーであること、すなわち不完全長配列であることが判明した。【００９１】
【表１】
2014157492.tif 000002
【００９２】
セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定されたＯＲＦ４４個のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。表１中、括弧内はメチオニンを開始コドンとする完全長ＯＲＦ数を表している。表１に示すように、ＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼＯＲＦがメタゲノムＡＲ１９から２個（ＡＲ１９Ｇ−１６６とＡＲ１９Ｇ−１２）、メタゲノムＯＪ１から２個（ＯＪ１−１とＯＪ１−２）、合計４個得られた。一方、ＧＨ７ファミリーに属するＯＲＦ配列は得られなかった。ＧＨ９、ＧＨ４８ファミリーに属するＯＲＦはそれぞれ、１５個と１２個得られた。その他のＧＨファミリー（ＧＨ１０、ＧＨ１２、ＧＨ２６）に属するセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＯＲＦは合計１３個得られた。これら、セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定された、不完全長配列を含むすべてのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。【００９３】
なお、現在、実用化されているバイオ燃料用のセルラーゼ酵素液は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）  ＣＴｅｃ２（http://www.bioenergy.novozymes.com/cellulosic-ethanol/）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）  ＴＲＩＯ（http://www.genencor.com/industries/biofuels/fuel_ethanol_from_biomass_cellulosic_biofuels/）であり、いずれも木材腐朽菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉが分泌する酵素をベースにしている。この糸状菌が分泌するグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）の主要な構成酵素は、セロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIであり、それぞれ、ＧＨ７ファミリーとＧＨ６ファミリーに属している。【００９４】
＜５＞  オープンリーディングフレームＯＪ１−１及びＯＪ１−２
オープンリーディングフレームＯＪ１−１は、５４８アミノ酸からなり、セルロース結合モジュールＣＢＭ３（１４９ｂｐ）−リンカー（１１１ｂｐ）−ＧＨ６触媒領域を持つマルチドメイン酵素をコードしていた。但し、触媒領域の後半部は終止コドンが欠落し、不完全長であった。また、このセルロース結合モジュール配列は、好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセロビオハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＦ２２２７３．１）が有するセルロース結合モジュールＣＢＭ３（配列番号１６）とアミノ酸配列で６３％の配列同一性を示す新規なＣＢＭ３配列である。ＯＪ１−１のセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  Ｕ３２のセルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＪ４６９５４．１）とアミノ酸配列で５８％の配列同一性を示し、強力なセルラーゼ酵素を有している好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸのβ−１，４−セロビオハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）とアミノ酸配列で４８％の配列同一性を示した。【００９５】
ＰＣＲクローニングにより、ＯＪ１−１から１個の遺伝子クローン（ＯＪ１−１−１１）が得られた。ＯＪ１−１−１１は、５４８アミノ酸からなり、開始コドンのメチオニン（Ｍ）（１位）から３２位のアラニンまでの３２アミノ酸（Ｍ１−Ａ３２）が分泌シグナル（ｓｉｇｎａｌＰ  ４．０）であり、３５位のトレオニンから１８２位のプロリンまでの１４８アミノ酸（Ｔ３５−Ｐ１８３）がセルロース結合モジュールＣＢＭ３であり、１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニンまでの１１２アミノ酸（Ｓ１８３−Ｔ２９４）がリンカー配列であり、２９５位のヒスチジン（Ｈ）から最後までの２５４アミノ酸がＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ触媒領域の部分的なアミノ酸配列を示すポリペプチドをコードしている。但し、後記実施例１＜１０＞において、当該遺伝子クローンの全長を大腸菌発現させ、ＰＳＡ、ＣＭＣ分解活性をアッセイしたところ、いずれの基質に対する加水分解活性も確認されなかった。【００９６】
オープンリーディングフレームＯＪ１−２は、２４７アミノ酸からなり、ＧＨ６触媒領域だけからなるポリペプチドをコードする塩基配列であった。ＯＪ１−２は開始コドン、終止コドンいずれも欠いていること、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼは、通常、４００以上のアミノ酸から構成されていることから、ＯＪ１−２は不完全配列である。ＯＪ１−２から推定されるアミノ酸配列はＡＲ１９Ｇ−１２のアミノ酸配列と１００％同一の配列であり、このことから、ＯＪ１−２はＡＲ１９Ｇ−１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ−１２の部分配列であると考えられる。ＯＪ１−２からＰＣＲクローニングにより得た遺伝子クローンは、その触媒領域を形質転換ベクターに組込み、大腸菌発現させたところ、ＰＳＡ、ＣＭＣいずれの基質に対しても酵素活性は得られなかった。【００９７】
＜６＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６とＡＲ１９Ｇ−１２
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６は、４７４アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号９）をコードしていたが、開始コドンが失われている不完全長配列であって、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域だけから構成されていた。ＡＲ１９Ｇ−１６６のＧＨ６触媒領域は、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のグルコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６６％のアミノ酸配列同一性を示した。配列番号１４で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＡＧ−３’：配列番号１２で表される塩基配列の５’末端側に７塩基（ＣＡＣＣＡＴＧ）付加したもの。当該付加配列中、３’側のＡＴＧは開始コドンであり、５’側のＣＡＣＣはベクターに挿入するための配列である。）と配列番号１３で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＧ−３’）を用いたＰＣＲクローニングにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６から２個の遺伝子クローン（ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ）が得られた。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、２９９位と３５１位の２アミノ酸のみが相違していた。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは、２９９位のアミノ酸がアルギニンであり、３５１位のアミノ酸がアラニンであった（配列番号１）。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、２９９位のアミノ酸がグルタミンであり、３５１位のアミノ酸がバリンであった（配列番号３）。【００９８】
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２は、４５９アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１０）をコードしていたが、ＡＲ１９Ｇ−１６６と同様、開始コドンが失われている不完全長配列であり、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域から構成されていた。ＡＲ１９Ｇ−１２のＧＨ６触媒領域はＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６４％のアミノ酸配列同一性を示した。但し、ＡＲ１９Ｇ−１２からＰＣＲにより得た遺伝子クローンは、その触媒領域を形質転換ベクターに組込み、大腸菌発現させたところ、ＰＳＡ、ＣＭＣいずれの基質に対しても、酵素活性は得られなかった。【００９９】
＜系統遺伝学解析＞
培養分離された菌体からクローニングされた遺伝子とは違い、メタゲノム解析によりクローニングされた遺伝子の由来は不明である。高温土壌メタゲノムから得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、ＯＪ１−１）が、バクテリアやアーキア（古細菌）など原核生物に由来するのか、あるいは、糸状菌やキノコなど真核生物に由来するのか、わからない。そこで、触媒領域アミノ酸配列のマルチプルアライメントと分子系統樹による系統遺伝学解析を行い、これらオープンリーディングフレームの由来を推定した。【０１００】
図１はＧＨ６ファミリーに属するエキソ型グルコシドハイドロラーゼ（セロビオハイドロラーゼ、グルコシドハイドロラーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビオシダーゼ）の有根分子系統樹である。オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列及びセルロース分解能を有する好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）の触媒領域アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰによりＧｅｎｂａｎｋに対しホモロジー検索を行い、ファミリー６エキソ型グルコシドハイドロラーゼ２１種の配列を得た。次に、好熱性糸状菌Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ  Ｃｅｌ６Ａ（ＰＤＢ：１ＶＢＷ）の触媒領域アミノ酸配列について、同様にホモロジー検索を行い、１９種の配列を得た。これらホモロジー検索によりヒットしたバクテリア２１配列と糸状菌１９配列、及びオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列について、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｐｒｏ  ５．６．５を用いてマルチプルアライメント（Cost Matrix = Blosum80; Gap open penalty = 12; Gap extension penalty = 3; Alignment type = Global alignment with free end gaps）を行った後、近隣接続法により系統樹を作成した。ＧＨ６ファミリーに属するエンドグルカナーゼＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＣ０６３８８．１）をアウトグループとした。ブートストラップ確率は１，０００レプリカにより算出し、系統樹の各分岐点にパーセントで示した。図１中、下部に示したスケールは遺伝距離（平均アミノ酸置換数／サイト）である。また、括弧内に示した酵素名の「ＣＢＨ」はセロビオハイドロラーゼ、「ＧＨ」はグルコシドハイドロラーゼの省略である。【０１０１】
系統樹のレファレンスに用いたバクテリア及び糸状菌のファミリー６グルコシドハイドロラーゼは以下の通りである（カッコ内は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  ｂａｎｋ（ＰＤＢ）又はＥＭＢＬ−Ｂａｎｋのアクセッション番号。）。
糸状菌ファミリー６グルコシドハイドロラーゼ：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｙ−９４  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＡ７４４５８．１）；  Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ５０６０８．１）；  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ  ＩＦＯ  ４３０８  １，４−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＧＡＡ８９５７１．１）；  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  １０１５  １，４−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＨＡ２５８２８．１）；  Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＷ６４９２７．１）；  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＦ３３２５２．１）；  Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ  ＭＦ３／２２  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＣＥＬ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＪＤ０２２０１．１）；Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ  Ｍ１．００１  ｇｌｕｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＱ２５８０７．１）；  Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ  Ｃｅｌ６Ａ  （ＰＤＢ：１ＢＶＷ）；  Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ  ＪＮ３  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ：ＣＢＸ９７０３９．１）；  Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ７０−１５  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＨＡ５７７７３．１）；  Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ  ４２４６４  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６  （Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＯ５５７８７．１）；  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＯＲ７４Ａ  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＡＡ３１５３４．１）；  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＸ８６８９５．１）；  Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ  ｓｔｒｉｇｏｓｏｚｏｎａｔａ  ＨＨＢ−１１１７３  ＳＳ５  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＩＮ０７０９８．１）；  Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＬ３３６０４．４）；  Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＮＲＲＬ  ８１２６  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＯ６２２１０．１）；  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ３４２１０．１）；  Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ  ＶｄＬｓ．１７  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ−６Ａ  （Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＧＹ１６０４６．１）。
バクテリアファミリー６グルコシドハイドロラーゼ：Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  １１Ｂ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＫ５２３８８．１）；  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  Ｕ３２  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ  （Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＪ４６９５４．１）；  Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ  ＡＴＣＣ  ４８４  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＥ４６０５５．１）；  Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｕｅｄａ  １０７  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＥ８５９７８．１）；  Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）；  Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＶ０８３９９．１）；  Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ  ＤＳＭ  ４４９６３  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＨ８５８６４．１）；  Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｌｕｐｉｎｉ  ｓｔｒ．  Ｌｕｐａｃ  ０８  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＨ２０９６９．１）；  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＹＫ９  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＭ０８８８０．１）；  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  Ｐｏ８２  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＧ７１０５０．１）；  Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ＣＮＳ−２０５  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＶ９９７７３．１）；  Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ４４７２８  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＤ４２６２２．１）；  Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＤＷ４／３−１  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＡＵ６７０５０．１）；  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＣ６９５６４．１）；  Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｅｒａｅ  Ｔ７９０１  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＲ１２７２３．１）；  Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）；  Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ  ｍａｒｉｓ  ＡＢ−１８−０３２  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＢ４６９４４．１）；  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｒａｐｈａｎｉ  ７５６Ｃ  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＬ０８３５９．１）；  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ  ＫＡＣＣ  １０３３１  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ  （Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＷ７７２８９．１）；  Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  ＤＳＭ  １５８９４  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＺ３０１８１．１）；  Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ａｎｎ−１  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＧＯ８１２０４．１）。【０１０２】
ＧＨ６ファミリーに属するエキソ型グルコシドハイドロラーゼは、互いに遺伝距離が大きく離れた２つの分岐群、すなわち、バクテリアに由来する分岐群と糸状菌に由来する分岐群に分かれた。図１下部の分岐群はすべて糸状菌のファミリー６グルコシドハイドロラーゼであり、一方、上部の分岐群はすべてバクテリアのファミリー６グルコシドハイドロラーゼである。オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２、及びＯＪ１−１は、いずれもバクテリア分岐群に位置し、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼ、グラム陰性木質分解バクテリアＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓのセロビオハイドロラーゼｃｅｌ６Ａ、海洋性γプロテオバクテリアＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｅｒａｅのセロビオハイドロラーゼと１つの分岐群を構成している。【０１０３】
図１に示すように、メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、ＯＪ１−１）は、好熱性糸状菌Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓやＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、木材腐朽菌Ｈｙｐｏｃｅｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオハイドロラーゼ遺伝子とは遺伝的距離が大きく離れ、バクテリアの好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸのセロビオハイドロラーゼやＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼと近縁であることがわかった。このことから、これらＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレームはバクテリアのセロビオハイドロラーゼ遺伝子であると推定される。ＯＪ１−１はバクテリア特異的なセルロース結合モジュールＣＢＭ３を持っており、この推定を強く支持している。【０１０４】
＜７＞  アミノ酸配列アラインメント
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶと高いアミノ酸配列同一性を示したＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼは、１１２８アミノ酸から構成されている。当該遺伝子は、１位から２９位までの２９アミノ酸からなる移行シグナル配列から始まり、３７位から１３６位までの１００アミノ酸からなるセルロース結合モジュールＣＢＭ２、２４１位から６１１位までの３７０アミノ酸からなるＧＨ６触媒領域、さらに、その下流に７１３位から１０８２位までの３７０アミノ酸からなるもう一つのＧＨ６触媒領域から構成されるマルチドメイン遺伝子である。Ｐｆａｍが示したこれらＧＨ６触媒領域は、いずれも３７０アミノ酸残基から構成され、バクテリアＧＨ６触媒領域、例えば、４２３アミノ酸残基から構成されるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ｂの触媒領域よりも５０アミノ酸残基以上も短く、実際の触媒領域をカバーできていないと考えられた。そこで、ＢＬＡＳＴＰにより、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ｂと相同なＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６触媒領域を検索したところ、図２Ａにあるように、１番目のＧＨ６触媒領域は２３０位のバリン（Ｖ）から６５７位のグルタミン（Ｑ）までの４２８アミノ酸残基から構成されていた。【０１０５】
また、ＯＪ１−１のＧＨ６触媒領域は不完全長であるが、この部分配列は、ＡＲ１９Ｇ−１６６のＧＨ６触媒領域に対し５７％のアミノ酸配列同一性を示し、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのファミリー６ＣＢＨ（ＴｒＣＢＨII）に対し、わずか２５％の配列同一性を示しただけだった。【０１０６】
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６は、ＧＨ６触媒領域配列の前に４７アミノ酸残基が存在する。このアミノ酸配列は、多数回、プロリン（Ｐ）とトレオニン（Ｔ）が繰り返されることから、リンカーの一部であると考えられた。したがって、ＡＲ１９Ｇ−１６６は、ＯＪ１−１と同様に、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流に、リンカー配列を介してセルロース結合モジュールＣＢＭを持つマルチドメイン遺伝子であると推測された。【０１０７】
図２Ａに、オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列アライメントを示す。また、図２Ｂに、オープンリーディングフレームＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＦ２２２７３．１）のアミノ酸配列アライメントを示す。図２Ａ及びＢ中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において一部変異はあるものの大部分のアミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示す。【０１０８】
図３Ａに、オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２、ＯＪ１−１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＣＢＨ遺伝子のアミノ酸模式図を示す。また、図３Ｂに、オープンリーディングフレームＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸模式図を示す。図３Ａ及びＢ中、「触媒領域（部分）」、「リンカー（部分）」は、それぞれ各領域の一部分のみが在ることを示す。【０１０９】
＜８＞  遺伝子クローニング
ＰＣＲクローニングにより得られたセロビオハイドロラーゼ候補遺伝子を、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサを用いて配列確認を行った。【０１１０】
＜９＞  遺伝子発現及びセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に付属のＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株若しくはＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）を用いて、３０秒間破砕−３０秒間休止工程を１０サイクル繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。【０１１１】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて１００〜０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。【０１１２】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製したセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析とウェスタンブロッティングにより確認した。
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、それぞれ４−２０％のミニグラジェントゲルと１０％のミニゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて行った。前記上清及び精製酵素とＴｒｉｓ−ＳＤＳβＭＥ処理液（コスモバイオ社製）を１：１で混合した後に１００℃で１０分間処理し、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は５μＬ、精製酵素は０．５μＬをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、固定化したゲルをクマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｍｅｒｃｋ社製）で染色し、タンパク質のバンドを可視化した。
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のウェスタンブロッティングは、１０％ミニゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ電気泳動を行った後、転写装置Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ（バイオラッド社製）を用いてポリフッ化ビニリデン膜（ＡＴＴＯ社製）へ転写した。膜上のタンパク質は１０００倍に希釈したウサギ１次抗体と反応させた。当該ウサギ１次抗体は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶがコードする３８４〜４０３位の２０アミノ酸残基（ＣＤＰＮＧＱＳＲＹＮＳＡＹＰＴＧＡＬＰＮ）からなるポリペプチドを合成し、ウサギを免疫して得られた血清をアフィニティー精製することによって作製した（オペロンバイオテクノロジー社製）。タンパク質と結合した１次抗体の検出は、ＦａｓｔＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて行い、化学発光シグナルの検出には、イメージング装置Ｅｚ−Ｃａｐｔｕｒｅ  ＭＧ（ＡＴＴＯ社製）を使用した。【０１１３】
図４に、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを大腸菌に発現させて得られた酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図４（Ａ））とウェスタンブロット解析（図４（Ｂ））の結果を示す。レーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２及び３はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清であり、レーン４及び５は精製したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質の電気泳動パターンである。【０１１４】
セロビオハイドロラーゼ遺伝子は、一般に、発現性が非常に悪い。例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させた場合、当該遺伝子が糸状菌由来、あるいはバクテリア由来に関わらずほとんど発現しない。ところが、ＰＣＲクローンＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、いずれも大腸菌内で良く発現した。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、アミノ酸配列（配列番号１及び３）から予想される分子量４６．７ｋＤａに強いバンドが認められた（図４（Ａ）のレーン２と３）。当該タンパク質を精製したところ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶでは、いずれも、上記バンドに対応する単一バンドが認められた（図４（Ａ）のレーン４と５）。ＡＲ１９Ｇ−１６６の３８４〜４０３位の２０アミノ酸残基からなるポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、遺伝子組換え大腸菌破砕上清（図４（Ｂ）のレーン２、３）と精製酵素（図４（Ｂ）のレーン４、５）の双方において、４６．７ｋＤａに酵素タンパク質の単一バンドが検出された。【０１１５】
＜１０＞  ＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性測定（ＰＳＡ加水分解活性）
セロビオハイドロラーゼ活性測定には、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）を基質として用いた。ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料の活性測定は、５０μＬの１質量％ＰＳＡ含有２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と５０μＬの遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料からなる混合液を、３０〜１００℃で２０分間反応させることにより行った。
全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応中、いずれの混合液も不溶性基質の沈殿を防ぐため、エッペンドルフ社のサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。【０１１６】
この結果、ＰＣＲクローニングにより得られた４４個のセロビオハイドロラーゼ候補遺伝子のうち、ＧＨ６ファミリーに属するＣＢＨ遺伝子のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６がコードするポリペプチドのみが、ＰＳＡ加水分解活性を示した。ＡＲ１９Ｇ−１６６から得られた２種類のＰＣＲクローン（ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ）は、いずれもＰＳＡ加水分解活性を示した。【０１１７】
＜１１＞  セロビオハイドロラーゼの基質特異性
ＰＳＡ加水分解活性が確認されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶに対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１６６の基質特異性は、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製）、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて計測した。具体的には、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と４０μＬの精製水と１０μＬの精製酵素からなる混合液を５０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに１００μＬの各基質の１質量％水溶液を添加し、５０℃で２０分間（アビセル粉末を基質とした場合は２時間）反応させることにより行った。前記＜１０＞と同様にして酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準偏差を求めた。さらに、ＰＳＡに対する比活性を１００％とした場合の各基質に対する比活性の相対活性値（％）を算出した。結果を表２に示す。【０１１８】
【表２】
2014157492.tif 000003
【０１１９】
その結果、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは水溶性ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示した。また、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるＬｉｃｈｅｎａｎや結晶性セルロースのアビセルに対しても分解活性を示した。一方、ＣＭＣ、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるＬａｍｉｎａｒｉｎ、及びキシランに対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。非常に弱いながらも結晶性セルロースのアビセルに対して加水分解活性を示し、かつキシランに対し分解活性を示さなかったという酵素基質特異性は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶがＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼであることを示している。【０１２０】
＜１２＞ＰＳＡ分解産物のＨＰＬＣ分析
リン酸膨潤アビセルＰＳＡを基質とし、セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１６６―ＲＡ及び木材腐朽糸状菌Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのファミリー６ＣＢＨ（ＴｒＣＢＨII）による加水分解反応産物について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による成分分析を行った。ＡＲ１９Ｇ−１６６―ＲＡでは０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、７０℃で、ＴｒＣＢＨIIでは０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、４０℃で、それぞれ１時間と２４時間、ＰＳＡの加水分解反応を行った後、０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液の添加により反応を停止させた。加水分解反応産物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ分析に供試した。ＨＰＬＣ装置はＡｌｌｉａｎｃｅ  ｅ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用し、糖の検出にはＲＩ検出器（２４１４ＲＩ）を用いた。ＨＰＬＣ装置の制御及び解析ソフトはＥｍｐｏｗｅｒバージョン３．０を使用した。カラムはＨＰＬＣ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｌｕｍｎ  ３００ｍｍ×７．８ｍｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、溶媒は超純水を使用した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度８５℃で加水分解試料１０μＬを分析した。検量線は標準物質（グルコース、セロビオース、セロトリオース）を用いて作成し、糖類の定量を行った。検量線サンプルの最大濃度は、グルコースでは０．２質量％、セロビオースでは０．４質量％、セロトリオースでは０．５質量％であり、希釈系列を作成して６点で検量線を作成した。【０１２１】
ＨＰＬＣによる成分分析の計測結果を図５Ａ及びＢに示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６―ＲＡによるＰＳＡ加水分解反応産物は、１時間後では、主にセロビオース（８６．５％）と少量のセロトリオース（１３．５％）であり、２４時間後では、セロビオース８６．２％、セロトリオース１３．０％と極めて少量のグルコース（０．７％）であった（図５Ａ）。一方、ＴｒＣＢＨIIによるＰＳＡ加水分解反応産物は、主にセロビオース（８７．５％）と少量のセロトリオース（１２．５％）であり、２４時間後では、セロビオース８８．４％、セロトリオース９．４％と極めて少量のグルコース（２．２％）であった（図５Ｂ）。このＨＰＬＣ分析の結果からも、ＡＲ１９Ｇ−１６６はセロビオハイドロラーゼであることが示された。【０１２２】
＜１３＞  セロビオハイドロラーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶによるＰＳＡ加水分解活性の温度依存性及びｐＨ依存性及を調べた。計測には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
精製酵素のＰＳＡ加水分解活性の測定は、１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液と、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と、４０μＬの精製水と、１０μＬの精製酵素からなる混合液を、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は１００℃で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
計測結果を図６Ａ及びＢ、並びに図７Ａ及びＢに示す。図６Ａ及びＢは、横軸を温度として、各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図であり、図７Ａ及びＢは、横軸をｐＨとして各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。【０１２３】
精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは、温度範囲６０〜８０℃において高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図６Ａ）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．５で７０℃、ｐＨ５．０〜６．０で７５℃であった。酵素反応温度を８５℃以上にした場合には、いずれのｐＨ範囲においても、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのＰＳＡ加水分解活性は急激に減少した。一方、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、６５℃以上において、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡよりもＰＳＡ加水分解活性が低かった（図６Ｂ）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５で７０℃、ｐＨ６．０で７５℃であった。いずれのｐＨ範囲においても、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのＰＳＡ加水分解活性は、酵素反応温度が８０℃以上で急激に減少した。【０１２４】
また、精製ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは、反応温度６５〜８０℃、ｐＨ４〜６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図７Ａ）。最適ｐＨは反応温度に依存して変化し、６０〜６５℃でｐＨ４．６（実測値）、７０〜７５℃でｐＨ５．２〜５．３（実測値）であり、８０℃でｐＨ５．８（実測値）であった。ｐＨ３．２〜４．５、ｐＨ７〜８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた。一方、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡと同様、ｐＨ４〜６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示し、ｐＨ３．２〜４．５、ｐＨ７〜８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた（図７Ｂ）。【０１２５】
＜１４＞  セロビオハイドロラーゼの熱安定性（酵素活性の半減期）
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの熱安定性（耐熱性）を調べるため、２０分間〜１４４０分間プリインキュベーションを行い、各温度における酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性を計測した。
測定には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。精製酵素のプリインキュベーションは、精製酵素１０μＬと、精製水４０μＬと、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬからなる混合液（ｐＨ５．０）を、５０〜８０℃の各温度で０、２０、４０、６０、１２０、２４０、４８０、９６０、又は１４４０分間保温し、行った。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に５０℃で５分間加温した後、ＰＳＡ水溶液１００μＬを前記混合液に加え、２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。【０１２６】
計測結果を図８Ａ及びＢに示す。酵素活性は、無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。図８Ａの破線ドロップラインで示すように、酵素活性が無処理区の５０％に低下するプリインキュベーション時間を半減期Ｔｈａｌｆとした。
精製ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは、プリインキュベーション温度５０〜６０℃の場合、計測時間内にＰＳＡ加水分解活性が失われることはなく、半減期Ｔｈａｌｆは計測上限の２４時間以上であった。７０℃では、図８Ａの太線で示した指数関数による近似曲線により半減期Ｔｈａｌｆが２２６分と算出された。８０℃では、プリインキュベーションにより酵素活性は直ちに失われた（図８Ａ）。
一方、精製ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの耐熱性はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡと比べ、かなり低かった。プリインキュベーション温度５０℃では、計測時間内にＰＳＡ加水分解活性はほとんど失われず、半減期Ｔｈａｌｆは２４時間以上であった。プリインキュベーション温度の上昇とともに酵素活性半減期Ｔｈａｌｆは短くなり、６０℃で１６時間、７０℃でさらに短くなり、４０分であった。８０℃では、酵素活性は直ちに失われた（図８Ｂ）。【０１２７】
＜１５＞  セロビオハイドロラーゼの熱安定性（二価金属イオンの効果）
一般に二価金属イオンは、タンパク質に結合することでタンパク質の構造を安定させ、耐熱性を向上させることが知られている。カルシウム（Ｃａ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、二価鉄（Ｆｅ２＋）、三価鉄（Ｆｅ３＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）の各二価金属イオン（濃度１ｍＭ）を酵素−基質（ＰＳＡ）反応液中に投与し、酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性に対する効果を計測した。まず、精製酵素液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ、精製水又は各二価金属の５ｍＭ塩化物水溶液４０μＬ、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬ（ｐＨ５．５）の混合液を、３０℃で３０分間プリインキュベーションした。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に３０〜１００℃の各温度で５分間加温した後、ＰＳＡ水溶液１００μＬを前記混合液に加え、各温度で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。【０１２８】
その結果、最終濃度１ｍＭのカルシウムイオン又はコバルトイオン投与により、８５℃以上でＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの酵素活性が上昇し、マンガンイオンでは６０〜９０℃の温度範囲において酵素活性が著しく上昇した（図示省略。）。他の二価金属イオンは効果が見られないか（Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎｉ２＋）、むしろ、酵素活性を低下させた（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋）。【０１２９】
＜１６＞  セロビオハイドロラーゼの熱安定性（酵素タンパク質の熱崩壊温度）
タンパク質の熱安定性に関わるもう一つの指標は、熱変性温度又は熱崩壊温度Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。一定時間の予備加温（プリインキュベーション）により酵素活性が無処理区の５０％に減少するプリインキュベーション温度はタンパク質の熱崩壊温度Ｔｍに等しく、図９Ａの破線ドロップラインが示すように、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの熱崩壊温度Ｔｍを求めた。【０１３０】
精製酵素液（濃度約１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ、精製水又は５ｍＭ二価金属イオン塩化物（ＣａＣｌ２又はＭｎＣｌ２）水溶液４０μＬ、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬ（ｐＨ５．０）の混合液を３０℃で３０分間インキュベーションした後に、４０〜１００℃で３０分間プリインキュベーションした。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に５０℃で５分間加温した後、１００μＬのＰＳＡ水溶液を前記混合液に加え、５０℃で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。各プリインキュベーション温度に対し、酵素のＰＳＡ加水分解活性値を３回計測し、平均値及び標準誤差を求めた。加水分解活性が飽和する低温度領域（４０〜６５℃）及び高温度領域（９０〜１００℃）の加水分解活性の平均値を、それぞれ１と０として、データの正規化を行った。【０１３１】
各プリインキュベーション温度におけるＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質のＰＳＡ加水分解活性、及びシグモイド関数による近似曲線を図９Ａ及びＢに示した。この近似曲線から酵素タンパク質の熱崩壊温度Ｔｍ値（すなわち、Ｎｏｒｍａｒｉｚｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ＝０．５時点のプリインキュベーション温度）を求めた。ＰＳＡ加水分解活性データの近似曲線から算出した酵素タンパク質の熱崩壊温度Ｔｍ値を表３に示す。表３中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は５ｍＭ二価金属イオン塩化物水溶液に代えて精製水を添加した反応の結果である。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのＴｍ値は７６．４℃、一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶのＴｍ値は６８．５℃であり、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのほうがＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶよりＴｍ値が約８℃高かった。また、濃度１ｍＭのマンガンイオン投与により、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの熱崩壊温度Ｔｍが、それぞれ３．０℃と４．１℃上昇した。濃度１ｍＭのカルシウムイオン投与により、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのＴｍ値はわずかに（０．７℃）上昇したのに対し、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶのＴｍ値は３．１℃上昇した。【０１３２】
【表３】
2014157492.tif 000004
【０１３３】
［実施例２］
糸状菌や植物など真核生物を宿主として任意の遺伝子を導入すると、発現したタンパク質は一般に至適温度が５〜１０℃程度上昇する。これは、グリコシル化（糖鎖修飾）と呼ばれる、タンパク質へ糖類が付加する翻訳後修飾反応によるものであり、グリコシル化されたタンパク質は熱に対し安定的になる。糸状菌であるコウジカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅにＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子を導入し、コードする酵素タンパク質の耐熱性に対する糖鎖修飾の効果を検証した。【０１３４】
＜１＞  コウジカビ形質転換体の作製
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの３５１位アミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ（アミノ酸配列：配列番号５、塩基配列：配列番号６）及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）を作製し、これらを含む発現カセットをコウジカビに導入し、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ又はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷを発現するコウジカビ形質転換体を作製した。【０１３５】
これらのＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のアミノ酸置換変異体を形質転換ベクターに組込んで発現ベクターを構築し、これを用いてコウジカビを宿主として形質転換した。コウジカビ形質転換体は、大関株式会社のタンパク質受託発現サービス（http://www.ozeki.co.jp/）により作製された。当該サービスによるコウジカビ形質転換は相同組換え法を特徴とし、導入遺伝子が染色体の特定部位に組込みこまれるため、糸状菌の形質転換効率は低いが、一旦染色体上に組込まれると導入遺伝子は安定して保持され、導入遺伝子がコードするタンパク質を安定的に生産できる。また、分泌シグナルが付加されているため、導入遺伝子がコードするタンパク質は、培養液中に菌体外分泌される。【０１３６】
＜２＞  コウジカビ形質転換体により生成されたタンパク質の濃縮
こうして得られたコウジカビ形質転換体を培養した後、培養液上清を回収した。この培養上清を、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）を用いて１／１０容量への濃縮と５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換を行い、これを濃縮上清とした。【０１３７】
各コウジカビ形質転換体の濃縮上清各５μＬと、実施例１で調製したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清５μＬに対しウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析は実施例１の＜９＞と同様に行い、その結果を図１０に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ導入コウジカビ形質転換体とＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ導入コウジカビ形質転換体の濃縮上清からは、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子組換え大腸菌破砕上清（図１０中のレーン２と３）の単一バンドに対応した非常に弱いバンドが４６．７ｋＤに認められ、さらに５０〜５５ｋＤａにブロードな強いバンドが現れた（図１０中のレーン２と３）。このように、コウジカビを宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子がコードするタンパク質の大部分は、見かけの分子量が３〜８ｋＤａ程度増加し、この分子量増加は糖鎖付加によるものと考えられる。【０１３８】
＜３＞  ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ遺伝子の大腸菌形質転換体の作製、及びセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の精製
実施例１の＜８＞と同様にして、変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷをｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入したプラスミドを作製した。実施例１の＜９＞と同様にして、これらのプラスミドをタンパク質発現用大腸菌へ導入した大腸菌形質転換体を作製し、得られた大腸菌形質転換体に対して発現誘導を行い、培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、目的タンパク質を含む組換え大腸菌粗抽出物を得、これを濾過して大腸菌破砕上清を得た。実施例１の＜９＞と同様にして、イオン交換カラム、疎水性相互作用分離カラム、及びゲル濾過カラムによって分画、精製し、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。【０１３９】
＜４＞  セロビオハイドロラーゼ活性の温度依存性
当該遺伝子組換えコウジカビ形質転換体及び当該遺伝子組換え大腸菌により生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜２＞で得られた濃縮上清及び＜３＞で得られた精製酵素を用いた。
各温度におけるＰＳＡ加水分解活性の計測は、前記＜２＞で得られた濃縮上清を用い、反応液のｐＨを５．５とした以外は、実施例１の＜１３＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。大腸菌発現させた精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのＰＳＡ加水分解活性は、実施例１の＜１０＞と同様にして、１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。一方、コウジカビ形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのＰＳＡ加水分解活性は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷが最大加水分解活性を示した１００℃での還元糖量を１００％として、相対活性値（％）を算出した。【０１４０】
算出された各温度におけるＰＳＡ加水分解活性の相対活性値（％）を図１１Ａに示す。図１１Ａには、実施例１の＜１３＞で計測した大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」）のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）の計測結果も共に示す。大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷの至適温度（Ｔｏｐｔ）は、それぞれ、８０℃と７５℃であった。一方、コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ  ｂｙ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ」及び「ＱＷ  ｂｙ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ」）の至適温度は、いずれも１００℃以上であった。このように、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子はコウジカビ発現させることで１０％程度分子量が増大し、至適温度が２０〜３０℃上昇することが判明した。コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６は、従来の好熱性糸状菌に由来するセロビオハイドロラーゼよりも至適温度が３０℃以上も高く、耐熱性に優れていた。【０１４１】
これらの結果から、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、糸状菌等の真核生物の発現系によって発現させることにより、８０℃以上でも良好なセロビオハイドロラーゼ活性を有する酵素を得ることができることが明らかである。８０〜１００℃においても高い酵素活性を示す耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他の耐熱性セルラーゼと共に用いることによって、リグノセルロースの糖化処理を８０℃以上の高温条件で行うことが可能になる。【０１４２】
＜５＞  セロビオハイドロラーゼ活性のｐＨ特性
コウジカビ形質転換体及び大腸菌形質転換体により生産された、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷのＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜２＞で得られた濃縮上清と、前記＜３＞で得られた精製酵素を用いた。
各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性の計測は、前記＜２＞で得られた濃縮上清を用いた以外は、実施例１の＜１３＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。大腸菌形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷは、それぞれ８０℃と７５℃でＰＳＡ加水分解反応を行い、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。コウジカビ形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷでは、温度８０℃でＰＳＡ加水分解反応を行い、各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を、最大活性が得られたｐＨ５．２のＰＳＡ加水分解活性を１００％とした相対活性値（％）として算出した。【０１４３】
算出された各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性の相対活性値（％）を図１１Ｂに示す。図１１Ｂには、実施例１の＜１３＞で計測した大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」）のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）の計測結果も共に示す。コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６酵素（図中、「ＲＷ  ｂｙ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ」及び「ＱＷ  ｂｙ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ」）は、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６酵素（図中、「ＲＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ  ｂｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ」）よりも広いｐＨ特性を示し、最大値の５０％活性を示すｐＨは反応温度８０℃で３．３〜８．０のレンジにあった。一方、大腸菌発現させた場合、このｐＨレンジは４．５〜６．８であった。【０１４４】
［実施例３］
一般的に、植物を宿主とする組換え遺伝子のタンパク質生産は、大腸菌、又はバチルス等の細菌発現系やコウジカビ等の糸状菌発現系と比べ、はるかに高い発現量が得られる。特に、葉緑体形質転換体は、形質転換葉中に外来タンパク質を全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）比で５〜１０質量％蓄積させ、時にはＴＳＰ比４０質量％以上の高い蓄積を示すことがある。一方、核ゲノム形質転換は、形質転換体組織に外来タンパク質をＴＳＰ比１質量％程度蓄積する。このように、植物によるタンパク質生産、特に葉緑体形質転換体による外来タンパク質生産は、従来のタンパク質生産プラットフォームである細菌や糸状菌培養をはるかに凌ぐ経済メリットがある。そこで、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶをタバコ葉緑体ゲノム内に挿入したタバコ葉緑体形質転換体を作製した。【０１４５】
＜１＞  タバコ葉緑体形質転換体の作製
葉緑体形質転換コンストラクトを構成する葉緑体ゲノム内導入領域、５’／３’発現調節領域、及び選抜マーカー遺伝子等は、これまでに報告されている外来タンパク質の高発現例を参考に設計した（Daniell et al., Methods in Molecular Biology, 2005, Vol. 286, p. 111-138; Verma and Daniell, Plant Physiol., 2007, Vol. 145, p. 1129-1143）。【０１４６】
まず、図１２Ａに示す構造を持つタバコ葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬを作製した。当該ベクターは、タバコ葉緑体ゲノム内の逆位反復配列内のｔｒｎＩ遺伝子−ｔｒｎＡ遺伝子間領域に、相同組換えにより目的遺伝子を導入するためのベクターである。前記ベクターはスペクチノマイシン耐性を指標とする選抜マーカーとして、ａａｄＡ（アミノグルコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ）遺伝子の発現カセットを持ち、ａａｄＡ遺伝子発現カセットの下流に目的遺伝子の発現カセット導入部位（ＣｌａＩ−ＢｓｉＷＩ部位）を持つ。ｐＮｔａＧＬベクターにはａａｄＡ遺伝子の発現制御領域としてタバコ由来１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のプロモーター（Ｐｒｒｎ）が挿入されているが、ｐＮｔａＧＬＰＬベクターはプロモーター領域を含まないベクターであり、ａａｄＡ遺伝子の発現は相同組換え領域上流の内生プロモーターに依存する。【０１４７】
図１２Ｂに目的遺伝子の発現カセットｐＰＸＴ及びｐＰＸＴＰＬを示す。いずれもＢａｍＨＩ部位に目的遺伝子を挿入するよう設計されており、目的遺伝子の５’側にはそれぞれＰｒｒｎプロモーターとバクテリオファージＴ７由来のｇｅｎｅ１０（Ｔ７ｇ１０）配列、又はＴ７ｇ１０配列のみを持つ。Ｔ７ｇ１０配列は、外来遺伝子の葉緑体内発現において外来タンパク質の高蓄積に有効であることが示唆されている配列である。目的遺伝子の３’側には共通してタバコ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子の３’−ＵＴＲ（ＴｒｂｃＬ）を配置し、いずれもカセット両端のＣｌａＩ部位及びＢｓｉＷＩ部位により、図１２Ａに示す葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬベクターに導入することができる。【０１４８】
ＰＣＲクローンＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを、それぞれＢａｍＨＩリンカー付きプライマーにより増幅し、得られた増幅産物を発現カセットｐＰＸＴ又はｐＰＸＴＰＬのＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを挿入した発現カセットｐＰＸＴを、ＣｌａＩ部位及びＢｓｉＷＩ部位を利用してｐＮｔａＧＬに組込むことにより、ｔｒｎＩ遺伝子−ｔｒｎＡ遺伝子間領域にａａｄＡ遺伝子発現カセットとＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶの発現カセットがタンデムに連結された構造を持つ葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬ−ＱＶを作製した。同様にして、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを挿入した発現カセットｐＰＸＴＰＬをｐＮｔａＧＬＰＬに組込み、葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡを作製した。図１２Ｃに、葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬ−ＱＶ及びｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡの構造を模式的に示す。図１２Ｃにおいて、「ＱＶ」はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを、「ＲＡ」はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを、それぞれ意味する。【０１４９】
タバコ葉緑体形質転換は、基本的にDaniellらの方法（Daniell et al., Methods in Molecular Biology, 2005, Vol. 286, p. 111-138）に準じて行った。具体的には、ＭＳ平板培地（３０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（ｐＨ５．８）を３ｇ／Ｌのゲランガムで固化した培地）で無菌的に播種、育成させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ＳＲ−１）の緑葉を、０．５ｃｍ四方に切断し、葉の向軸側が培地に接するようにＲＭＯＰ培地（Sbav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, Vol. 87, p. 8526-8530）を充填したシャーレの中央に並べた。１６時間明期／８時間暗期条件で１日間培養した後、パーティクルガン（ＰＤＳ−１０００Ｈｅ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてｐＮｔａＱＶまたはｐＮｔａＲＡおよび比較解析用のコントロールとしてｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬベクターをそれぞれ導入した。パーティクルガンには０．６μｍの金粒子と１１００ｐｓｉのラプチャーディスクを用い、ラプチャーディスクからサンプルまでの距離は約９ｃｍとした。【０１５０】
遺伝子コンストラクト導入後のタバコ葉は、暗所２５℃で３日間培養した後、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地に移植し、２５℃で１６時間明期／８時間暗期条件で２週間おきに植え継いだ。途中、再生したシュートの葉を切断して、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地に移植し、脱分化及びシュート再分化を繰り返すことにより、へテロプラズミック状態の植物体のホモプラズミック化を促進した。【０１５１】
３、４回の脱分化及び再分化を経て得られたスペクチノマイシン耐性シュートから約１００ｍｇの葉片を採取し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、導入配列を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲを行い、タバコ葉緑体ゲノムのｔｒｎＩ−ｔｒｎＡ間に目的配列が導入された個体を選抜した。【０１５２】
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ又はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びそれぞれのベクターコントロールの導入が確認された個体を、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＭＳ培地に移植し、発根及び植物体の成長を促した。１０ｃｍ程度の大きさになった植物体から、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、サザンブロッティングにより導入遺伝子のホモプラズミック状態を調べた。具体的には、まず、葉緑体形質転換タバコ又は野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ−１））の葉から抽出したＤＮＡ各１μｇを、制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した。ＢｇｌＩＩ消化後のＤＮＡに対して、ｔｒｎＩ上流領域約１ｋｂと同一の塩基配列からなるプローブを用いてサザンブロッティングを行い、ＧＥヘルスケア社のＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔにより、当該プローブを化学発光検出した。理論的には、当該プローブにより、野生型タバコでは約４．５ｋｂ、ｐＮｔａＧＬ−ＱＶおよびｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡ葉緑体形質転換タバコでは７．１ｋｂ、ｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬベクターの葉緑体形質転換タバコではそれぞれ６．０ｋｂまたは５．９ｋｂのＤＮＡ断片が検出される。ｐＮｔａＧＬ−ＱＶの導入により得られた２系統の葉緑体形質転換タバコ（ＱＶ−２、ＱＶ−１７）とｐＮｔａＧＬＰＬ−ＲＡの導入により得られた３系統の葉緑体形質転換タバコ（ＲＡ−６−２−１、ＲＡ−６−２−２、ＲＡ−６−２−３）のサザンハイブリダイゼーションの結果を図１３Ａ及びＢに示す。また、ｐＮｔａＧＬおよびｐＮｔａＧＬＰＬベクターの導入により得られた葉緑体形質転換タバコのサザンハイブリダイゼーションの結果を図１３Ｃに示す。いずれも組換え型葉緑体由来の７．１ｋｂまたは６．０ｋｂ、若しくは５．９ｋｂのバンドのみが検出され、野生型葉緑体に由来する約４．５ｋｂのバンドは検出されなかったことから、これらの系統が、全ての葉緑体が組換え型であるホモプラズミックな葉緑体形質転換体であると確認された。【０１５３】
ホモプラズミック葉緑体形質転換体をさらに成長させ、７葉程度の時期に１８ｃｍポットの培養土に移植し、組換え体温室で栽培した。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡをそれぞれ導入した葉緑体形質転換体は、その後の生長において形態的な異常は見られず結実した。Ｔ１植物を用いて表現型を解析した結果、野生型およびベクターコントロール導入葉緑体形質転換体より生育が若干遅れるものの形態異常は確認されず、開花期のバイオマス量はベクターコントロールと同程度であった。図１４Ａは、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ導入葉緑体形質転換タバコ植物体（Ｔ1世代）とベクターコントロール（ｐＮｔａＧＬ）の開花期の写真であり、図１４Ｂは同様にＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ（Ｔ1世代）とベクターコントロール（ｐＮｔａＧＬＰＬ）の開花期の写真である。【０１５４】
＜２＞  葉緑体形質転換タバコからのセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の抽出
セロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の抽出は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶまたはＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ導入葉緑体形質転換タバコ植物体から各一系統を選出し、それぞれ別々の３個体から以下のように行った。開花期になった葉緑体形質転換タバコ植物体の中間部の葉３枚から、１００ｍｇ前後の葉片を各５〜１０枚切り出した。各々の葉片は、予め直径３ｍｍのタングステンビーズ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を３個入れた２ｍＬのサンプルチューブに入れ、その状態で液体窒素に投入し凍結させた。凍結した葉片に対し、ミキサーミル  ＭＭ４００（レッチェ社製）を用いて３０Ｈｚで９０秒間の破砕を行った後、葉片重量の１０倍容の１容量％のプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ社製）を含む５０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加えた懸濁液を調製した。当該懸濁液を充分に撹拌した後に遠心分離を行うことにより、酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ）を含む可溶性タンパク質の抽出液を調製した。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡについては、抽出液を遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって、５〜１０倍の濃縮を行った。また、比較解析用のコントロールとして、ｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬベクター導入葉緑体形質転換タバコ植物体からも同様の処理によって、可溶性タンパク質の抽出液を調製した。【０１５５】
前記可溶性タンパク質抽出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析とウェスタンブロット解析により確認した。ＳＤＳ電気泳動及びウェスタンブロッティングは、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（バイオラッド社製）を用いて行った。前記抽出液及び精製酵素とＴｒｉｓ−ＳＤＳ  β−ＭＥ処理液（コスモバイオ社製）を１：１で混合した後に１００℃で１０分間処理し、１サンプルあたり、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶは５μＬ、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとコントロール個体は１０μＬ、精製酵素は０．２μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色によって、タンパク質のバンドを検出した。ウェスタンブロッティングは、実施例１の＜９＞と同様に行った。【０１５６】
図１５Ａ〜図１５Ｄに、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体から得られた可溶性タンパク質の抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図１５Ａ）とそのウェスタンブロット解析（図１５Ｂ）、およびＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体とｐＮｔａＧＬＰＬを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体から得られた可溶性タンパク質の抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図１５Ｃ）とそのウェスタンブロット解析（図１５Ｄ）の結果を示す。図１５Ａ〜図１５Ｄのレーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２は精製酵素タンパク質であり、レーン３〜５は３個体のＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶまたはＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体から得られた可溶性タンパク質の抽出液であり、レーン６〜８は３個体のｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬを導入した葉緑体形質転換タバコ植物体から得られた可溶性タンパク質の抽出液である。【０１５７】
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ酵素タンパク質は、いずれもタバコ葉緑体内で発現した。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡの葉緑体形質転換タバコ植物体の可溶性タンパク質の抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、それぞれの精製酵素タンパク質（図１５Ａ、図１５Ｃのレーン２）に対応する位置にバンドが認められた（図１５Ａ、図１５Ｃのレーン３〜５）。一方、ｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬを導入したコントロール個体においては、バンドは認められなかった（図１５Ａ、図１５Ｃのレーン６〜８）。
ＡＲ１９Ｇ−１６６の３８４〜４０３位の２０アミノ酸残基からなるポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ（図１５Ｂのレーン３〜５）及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ（図１５Ｄのレーン３〜５）の葉緑体形質転換タバコ植物体の可溶性タンパク質の抽出液の双方において、それぞれの精製酵素タンパク質（図１５Ｂ、図１５Ｄのレーン２）に対応する位置にバンドが認められた。また、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡにおいて、当該酵素タンパク質よりも分子量が小さい位置にもバンドが認められた。おそらくは、植物体内で酵素タンパク質の一部が消化された、あるいは発現が不十分な酵素タンパク質が混在していることが考えられる。一方、ｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬを導入したコントロール個体においては、バンドは全く認められなかった（図１５Ｂ、図１５Ｄのレーン６〜８）。【０１５８】
＜３＞  セロビオハイドロラーゼ活性の温度依存性
葉緑体形質転換タバコにより生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡのＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記で得られた可溶性タンパク質抽出液を用いた。
各温度におけるＰＳＡ加水分解活性の計測は、前記で得られた可溶性タンパク質抽出液を用い、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖濃度を求めた。【０１５９】
各温度における、タバコ葉緑体発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶタンパク質及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のＰＳＡ加水分解活性を図１６Ａ及び図１６Ｂに示す。図１６Ａ及び図１６Ｂでは、３０℃〜１００℃の温度範囲において、酵素活性を還元糖量で表した。この結果、タバコ葉緑体発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡと同様のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を示し、正常に機能することが確認された。タバコ葉緑体発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ（図１６Ａ）は、個体により異なるが、至適温度（Ｔｏｐｔ）が７０〜７５℃であり、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶとほぼ同程度の耐熱性を示した。また、タバコ葉緑体発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ（図１６Ｂ）においても、個体により異なるが、至適温度（Ｔｏｐｔ）が７５〜８０℃であり、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとほぼ同程度の耐熱性を示した。一方、ｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬを導入したコントロール個体においては、ＰＳＡ加水分解活性は認められなかった。【０１６０】
［実施例４］
糸状菌や植物など真核生物を宿主として任意の遺伝子を導入すると、発現したタンパク質は一般に至適温度が５〜１０℃程度上昇する。これは、グリコシル化（糖鎖修飾）と呼ばれる、タンパク質へ糖類が付加する翻訳後修飾反応によるものであり、グリコシル化されたタンパク質は熱に対し安定的になる。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ遺伝子のアミノ酸残基配列中に、Ｎ−結合型グリコシル化モチーフAsn-Xaa-Ser/Thrが4ヵ所、存在している。真核生物を宿主として遺伝子発現させると、これらモチーフおいて糖鎖修飾が起こる可能性があり、耐熱性の向上が期待される。アブラナ科の植物であるシロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ遺伝子を導入し、コードする酵素タンパク質の耐熱性に対する糖鎖修飾の効果を検証した。【０１６１】
＜１＞シロイヌナズナ形質転換体の作製
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ遺伝子をテンプレートにしてＰＣＲを行い、アポプラスト蓄積型の植物発現ベクターｐＩＧ１２１Ｂａｒに組み込んだ。前記発現ベクターを、凍結融解法を用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入した。具体的には、氷中で融解したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株のコンピテントセルに、約１μｇのプラスミド（発現ベクター）を加え、軽く混合した後、液体窒素を用いて瞬時に凍結させた。その後、３７℃で４分間温めて融解し、０．５ｍＬのＳＯＣ培地を加えて、２８℃で１〜３時間培養した。得られた培養液を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴ（ホスフィノトリシン）を含有させたＬＢ寒天培地に塗布し、２８℃のインキュベーターで２日間静置培養することにより形質転換アグロバクテリウムを得た。形質転換アグロバクテリウムを液体培養後、プラスミドを抽出し３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて配列確認を行った。
次に、２２℃、２４時間明期で約２ヶ月間生育させたシロイヌナズナ植物体と、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含有させたＬＢ培地を用いて培養した形質転換アグロバクテリウムを用いて、形質転換シロイヌナズナを作製した。
まず、ＯＤ６００＝１程度のアグロバクテリウム培養液を集菌後、５％シュークロース、０．０５％シルウェット溶液に懸濁した。その後、シロイヌナズナ植物体をアグロバクテリウム懸濁液に数秒間浸け、種子への感染を行った。種子成熟後、回収し５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含有させた１／２ＭＳ培地を用いて形質転換体の選抜を行い、ＡＲ１９Ｇ−１６６―ＲＡについて６個体、ＡＲ１９Ｇ−１６６―ＱＶについて４個体、セロビオハイドロラーゼ形質転換シロイヌナズナを得た。このうちの２個体、Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４、及び、Ａｒａｂｉ＿ＱＶ４について、セロビオハイドロラーゼ酵素活性を調査した。【０１６２】
＜２＞  シロイヌナズナ形質転換体により生成されたセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の抽出と酵素活性のアッセイ
前記タンパク質の抽出は、１００ｍｇの形質転換シロイヌナズナ個体の葉を液体窒素下で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した後、１ｍＬの１容量％プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマアルドリッチ社製）含有２０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加え、よく混合した。得られた混合物を、２ｍＬマイクロチューブに移して１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離を行って、上清を回収し、粗酵素抽出液とした。なお、野生型シロイヌナズナの葉を用いて、同様にして調製した粗酵素抽出液をコントロール（非形質転換区）とした。【０１６３】
シロイヌナズナ形質転換体Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４、Ａｒａｂｉ＿ＱＶ４、及びコントロール（非組み換え）個体について、粗酵素抽出液を用いてウェスタンブロット解析を行い、セロビオハイドロラーゼ組換え遺伝子発現を確認した。ウェスタンブロット解析は実施例１の＜９＞と同様に行い、その結果を図１７に示す。図１７のレーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子組換えシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４）葉の粗酵素抽出物であり、レーン３はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ遺伝子組換えシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉ＿ＱＶ４）葉の粗酵素抽出物であり、レーン４は野生型シロイヌナズナ（ＷＴ）葉の粗酵素抽出物である。
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを導入したシロイヌナズナ形質転換体（Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４）とＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶを導入したシロイヌナズナ形質転換体（Ａｒａｂｉ＿ＱＶ４）の粗酵素抽出液は、それぞれ、５３．９ｋＤａと５２．１ｋＤａに強いバンドが現れた。形質転換体Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４の酵素タンパク質の分子量は形質転換体Ａｒａｂｉ＿ＱＶ４のそれより、やや大きい（図１７のレーン２、３）。当該タンパク質を大腸菌で生産した場合のサイズは４６．７ｋＤａであり、シロイヌナズナを宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子、及び、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ遺伝子がコードするタンパク質は、見かけの分子量が、それぞれ、７．２ｋＤａと５．４ｋＤａ増加した。この分子量増加は糖鎖付加によるものであり、形質転換体Ａｒａｂｉ＿ＲＡ４とＡｒａｂｉ＿ＱＶ４における発現酵素タンパク質の分子量の違いは、糖鎖付加の程度の違いによるものと考えられる。【０１６４】
＜３＞シロイヌナズナ発現ＡＲ１９Ｇ−１６６タンパク質のセロビオハイドロラーゼ活性の温度依存性
当該遺伝子組換えシロイヌナズナ形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ酵素タンパク質、及びＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜２＞で得られた粗酵素溶液を用い、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。
算出された各温度におけるＰＳＡ加水分解活性（還元糖量）を図１８に示す。図１８では、比較対照区として、野生型シロイヌナズナ植物体（ＷＴ）のセロビオハイドロラーゼ活性を計測し、プロットした。
シロイヌナズナをホストとして発現したＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ酵素タンパク質は、最も高い酵素活性を示した温度が計測上限の１００℃であり、至適温度は１００℃以上であると推定される。一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＱＶ酵素タンパク質の至適温度は９０℃であった。このように、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子はシロイヌナズナ核ゲノム系において発現させると約１０％分子量が増大し、至適温度が１５〜３０℃上昇する。特に、シロイヌナズナ発現ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡは耐熱性に極めて優れており、好熱性糸状菌に由来する従来の耐熱性セロビオハイドロラーゼより至適温度が３０℃以上も高い。【０１６５】
これらの結果から、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、植物、又は糸状菌等の真核生物の核ゲノム発現系によって発現させることにより、８０℃以上でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を有する酵素を得ることができることが明らかである。８０〜１００℃の温度範囲において高い酵素活性を示す、本発明の超耐熱性セロビオハイドロラーゼを、同様に熱安定性の高いエンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、又はβ−グルコシダーゼ等と共に用いることによって、リグノセルロースの糖化処理を８０℃以上の高温条件で行うことが可能になる。【０１６６】
［実施例５］
放線菌であるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌は、有用な抗生物質や生理活性物質を生産することで知られており、工業的に広く利用されている有用細菌である。その物質生産能を応用した外来遺伝子の大量発現系が開発され、いくつかの成功例が報告されている（特許文献３、４、５、非特許文献９、１０、１１）。特に放線菌は高ＧＣ含量のゲノムを持つため、大腸菌では発現が困難なＧＣ含量の高い遺伝子の発現が良い傾向にあり（非特許文献１１）、また異種タンパク質の発現が放線菌無細胞抽出液の４０％にまで及ぶ極めて高いレベルの発現性も報告されている（非特許文献９）。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをより安価に大量生産するための手段としてＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子を導入した放線菌における当該タンパク質の発現性を検証した。【０１６７】
＜１＞ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子導入放線菌の作製
ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ  ベクター（ライフテクノロジーズ社製）にクローニングされたＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子をテンプレートにしてＰＣＲにより放線菌発現ベクターｐＨＳＡ８１（特許文献４）に乗せ換え、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４株に形質転換した。前記ＴＫ２４株はＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  （Norwich Research Park, Norwich, NR4 7UH, UK）等から入手可能である。
前記形質転換は、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．”に記載の方法（プロトプラストポリエチレングリコール融合法）に準じて行なった。形質転換後、コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、ＹＥＭＥ培地（酵母エキス０．３％、バクトペプトン０．５％、麦芽エキス０．３％、グルコース１％、スクロース３４％、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、グリシン０．５％）にて振とう培養後、組換えプラスミドを抽出し、３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて配列確認を行った。【０１６８】
＜２＞放線菌におけるＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の発現
得られた形質転換体を５μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＥＭＥ培地に植菌し２８℃で５日間振とう培養し、遠心分離により集菌した。菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で洗浄後、培養液の１／１０容量の同Ｂｕｆｆｅｒを加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）で３０秒間破砕した後に３０秒間休止する処理を１０回行い、遠心後の上清（無細胞抽出液）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図１９に示す。図１９のレーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２は大腸菌発現ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ精製タンパク質（矢印）であり、レーン３はＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子組換え放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓの無細胞抽出液である。図１９において、想定されるサイズ（４６．７ｋＤａ）に目的タンパク質の強い発現を確認した（図１９のレーン３）。【０１６９】
＜３＞放線菌発現ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の酵素活性測定
ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子組換え放線菌の無細胞抽出液を用いてセロビオハイドロラーゼの活性測定を行なった。活性測定は５０μＬの無細胞抽出液試料、及び５０μＬの１質量％リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）含有２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）からなる混合液を、３０〜１００℃で２０分間反応させることにより行った。
基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応中、いずれの混合液も不溶性基質の沈殿を防ぐため、エッペンドルフ社のサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。全ての計測において、５０μＬの１質量％リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）含有２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）のみを各温度で反応させ、反応停止の後に５０μＬの無細胞抽出液試料を加えた混合液をコントロール区とした。反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。分光光度計を用いて前記上清の５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて上清中の還元糖量を算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。その結果を図２０に示す。図２０では、各データポイントにおいて３回計測し、平均値と標準誤差を温度に対しプロットした。
１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、酵素タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした場合、８０℃における比活性は３．０２であった。以上のように、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡセロビオハイドロラーゼ酵素は放線菌においても良好な発現および活性を示したことから、本発明の遺伝子導入ホストとして利用できることが明らかになった。【０１７０】
［実施例６］
セルラーゼの中には、セルロースを加水分解する触媒ドメインだけでなく、セルロース結合機能を持つモジュール（ＣＢＭ、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ）を持つものがある。ＣＢＭそれ自身は分解活性を持たないが、単独でセルロースに結合する能力を有する。ＣＢＭの機能として、不溶性の基質に吸着することで、基質周辺におけるＣＢＭに付随する触媒ドメインの濃度を上昇させてセルロースの分解速度を向上させたり、ＣＢＭの結合によってセルロース鎖間の水素結合を切り離して結晶構造を崩したりすることが知られている（非特許文献１２、１３）。また、結晶性セルロースを分解するＣＢＨからＣＢＭを除くと可溶性基質に対する反応性は変わらないにも係わらず、結晶性セルロースに対する分解活性や親和性が極端に低下することから、ＣＢＭは酵素が結晶性セルロースに作用するために必要なドメインであると考えられている（非特許文献１４）。逆に、本来ＣＢＭを持たないエンドグルカナーゼの一種にＣＢＭを付加することで結晶性セルロースへの親和性や分解能が上昇するという報告もある（非特許文献５）。
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼのセルロース分解活性をより高めるための手段として、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡにＣＢＭを付加した遺伝子を作製し、そのコードする酵素タンパク質のセルロース分解活性に対するＣＢＭ付加の効果を検証した。【０１７１】
＜１＞ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子の作製
ＣＢＭ配列およびリンカー配列は、実施例１＜５＞に示したオープンリーディングフレームＯＪ１−１の配列を用いた。ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子のＣ末端側にオープンリーディングフレームＯＪ１−１のリンカー配列を付加し、そのＣ末端側にオープンリーディングフレームＯＪ１−１のＣＢＭ３配列を付加した。ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子全長の塩基配列を大腸菌のコドン使用頻度に最適化し、人工的に合成した。付加したリンカーおよびＣＢＭ３遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１７に、塩基配列を配列番号１８に、大腸菌のコドン使用頻度に最適化したＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ遺伝子全長のアミノ酸配列を配列番号１９に、塩基配列を配列番号２０に、それぞれ表す。配列番号１８の８０８位から８１０位の３塩基ＴＡＡ、及び配列番号２０の２０９２位から２０９４位の３塩基ＴＡＡは何れもストップコドンである。
上述のように合成した遺伝子をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＬＥＡＤ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）に組み込み、ＪＭ１０９株で形質転換を行い、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサを用いて配列確認を行った。【０１７２】
＜２＞ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の発現
配列確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを保持していた大腸菌クローンを１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で２０時間振とう培養した。培養後、遠心分離により大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）で、３０秒間破砕した後に３０秒間休止する処理を１０回行い、遠心後の上清（大腸菌粗抽出物）を得た。前記大腸菌粗抽出物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、想定されるサイズに目的タンパク質の発現を確認した。タンパク質の発現確認後、３７℃で一晩培養した大腸菌液を前培養液とし、その１００倍量の１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地で本培養を行った。【０１７３】
＜３＞ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の精製
培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７−８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。【０１７４】
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）への溶液交換と濃縮を行い、同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムＣＨＴ５−１（バイオラッド社）に充填し、４００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０によって、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）への溶液交換と濃縮を行い、同液で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。【０１７５】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製したＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析とウェスタンブロット解析により確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析及びウェスタンブロット解析は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（バイオラッド社製）を用いた以外は、実施例１の＜９＞と同様に行い、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は０．５μｇをそれぞれ泳動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、タンパク質のバンドはＧｅｌ  Ｄｏｃ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（バイオラッド社）によって検出した。
図２１Ａ及び図２１Ｂに、ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質を大腸菌に発現させて得られた酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図２１Ａ）とウェスタンブロット解析（図２１Ｂ）の結果を示す。図２１Ａ及び図２１Ｂのレーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清であり、レーン３は精製したＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質であり、レーン４は実施例１の＜９＞で精製したセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の電気泳動パターンである。【０１７６】
ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質は大腸菌内で発現した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、アミノ酸配列（配列番号１９）から予想される分子量７４．５ｋＤａ付近にバンドが認められた（図２１Ａのレーン２）。当該タンパク質を精製したところ、上記バンドに対応する強いバンドが認められたが、分子量６０ｋＤａ付近にも弱いバンドが認められた（図２１Ａのレーン３）。ＡＲ１９Ｇ−１６６の３８４〜４０３位の２０アミノ酸残基からなるポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、遺伝子組換え大腸菌破砕上清（図２１Ｂのレーン２）において、分子量７４．５ｋＤａ付近に酵素タンパク質のバンドが検出された。また、分子量６０ｋＤａ付近にもバンドが検出されたが、おそらくは、大腸菌体内で酵素タンパク質の一部が消化された、あるいは発現が不十分な酵素タンパク質が混在していることが考えられる。精製酵素（図２１Ｂのレーン３）においても、分子量７４．５ｋＤａ付近に酵素タンパク質の強いバンドと共に分子量６０ｋＤａ付近に弱いバンドが検出されたが、主な含有タンパク質は当該酵素タンパク質であることが確認された。【０１７７】
＜４＞ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質の活性
ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質よるＰＳＡとＡｖｉｃｅｌの加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
精製酵素のＰＳＡとＡｖｉｃｅｌに対する加水分解活性の測定は、１００μＬの１質量％基質水溶液と、５０μＬの２００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と、４０μＬの精製水もしくは１０ｍＭのＣａＣｌ２水溶液と、１０μＬの精製酵素からなる混合液を、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、又は９９℃で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
各温度における、ＣＢＭ付加ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質のＰＳＡ加水分解活性及びＡｖｉｃｅｌ分解活性を図２２Ａ及び図２２Ｂに示す。この結果、ＰＳＡ分解活性においては、カルシウムイオンの存在の有無に関わらず、ＣＢＭ付加の効果は認められず、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡタンパク質単独による分解活性よりも、むしろ低下した（図２２Ａ）。ところが、Ａｖｉｃｅｌ分解活性においては、カルシウムイオン存在下において、５０℃から８５℃の広範な温度域で顕著な分解活性の上昇が見られた（図２２Ｂ）。一方、カルシウムイオン非存在下では、７０℃以上の温度域におけるＡｖｉｃｅｌ分解活性の上昇は見られなかった。これは、ＣＢＭの熱安定性にカルシウムイオンが寄与していることを示している。
これらの結果から、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにＣＢＭを付加させることにより、少なくともカルシウムイオンの存在下において、結晶性セルロースの加水分解活性を上昇させることができることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有しており、７５℃以上の高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2014157492.tif 000013
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図４】
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【図１０】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年4月27日(2016.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項２】
さらに、セルロース結合モジュールを有する、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
原核生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
真核生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項９】
植物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項１０に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
【請求項１２】
前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、請求項１１に記載のセルラーゼ混合物。
【請求項１３】
セルロースを含む材料を、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項６〜９のいずれか一項に記載の形質転換体、又は請求項１０に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
【請求項１４】
前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させる、請求項１３に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１５】
前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、請求項１４に記載のセルロース分解物の製造方法。
【請求項１６】
生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
【請求項１７】
配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、
からなるプライマーセット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物、セルロース分解物の製造方法、ポリヌクレオチドの製造方法、及びプライマーは、下記［１］〜［１７］である。
［１］（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［２］  さらに、セルロース結合モジュールを有する、前記［１］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［３］（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ）配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］  さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有する、前記［３］に記載のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  原核生物である、前記［６］に記載の形質転換体。
［８］  真核生物である、前記［６］に記載の形質転換体。
［９］  植物である、前記［６］に記載の形質転換体。
［１０］  前記［６］〜［９］のいずれかに記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
［１１］  前記［１］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［１０］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
［１２］  前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、前記［１１］に記載のセルラーゼ混合物。
［１３］  セルロースを含む材料を、前記［１］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［６］〜［９］のいずれかに記載の形質転換体、又は前記［１０］に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
［１４］  前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種のその他のセルラーゼを接触させる、前記［１３］に記載のセルロース分解物の製造方法。
［１５］  前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のセルラーゼである、前記［１４］に記載のセルロース分解物の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
［１６］  生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
［１７］  配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、
配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは複数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、
からなるプライマーセット。
【国際調査報告】
2014157492.tif 000046
2014157492.tif 000047
2014157492.tif 000048
2014157492.tif 000049