(57)【要約】  細胞の培養法を提供する。血清を実質的に含有せず、且つ、（Ａ）レチノイドと、（Ｂ）インターロイキン−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤と、を含有する培地を用いて細胞を培養する。
2015046315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を実質的に含有せず、且つ、下記成分（Ａ）および（Ｂ）を含有する、細胞培養用の培地：
（Ａ）レチノイド；
（Ｂ）インターロイキン−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤。
【請求項２】
前記レチノイドが、レチノイン酸、レチノール、およびレチナールからなる群より選択される、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記レチノイドの培地中の濃度が、１ｎＭ以上である、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
前記インターロイキン−１阻害剤が、インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび抗インターロイキン−１抗体からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストの培地中の濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以上である、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
前記抗インターロイキン−１抗体の培地中の濃度が、０．１５μｇ／ｍＬ以上である、請求項４に記載の培地。
【請求項７】
前記カルパイン阻害剤が、カルボキシベンゾイル−ロイシニル−ノルロイシナール、カルボキシベンゾイル−バリニル−フェニルアラニナール、およびＢｏｃ−Ｌ−ノルロイシナールからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
前記カルパイン阻害剤の培地中の濃度が、５００ｎＭ以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
少なくともインターロイキン−１阻害剤を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１０】
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培地で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
【請求項１２】
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、または口腔粘膜に由来する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、またはチンパンジーに由来する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養細胞が、細胞シートである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ラミニンで被覆された培養基材上で培養が行われる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用の培地、および同培地を用いた細胞の培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療技術の著しい発展により、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。しかしながら、未だにドナー数の少なさが問題となっている。角膜移植を例にとると、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人出てくるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。すなわち、角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため治療が患者全員へ行きわたらないのが現状である。【０００３】
このような背景のもと、人工代替物や組織化させた培養細胞を移植に利用する技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚及び培養皮膚が挙げられる。ここで、合成高分子を用いた人工皮膚は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用皮膚としては好ましくない。一方、培養皮膚は本人の正常な皮膚の一部を所望の大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、移植用皮膚として好ましい。【０００４】
特許文献１には、ヒト新生児由来表皮角化細胞を、ケラチン組織の膜が容器表面上に形成される条件下で培養し、生成したケラチン組織膜を酵素によって分解し剥離させることを特徴とする移植可能な培養細胞膜を製造する方法が記載されている。この方法では、３Ｔ３細胞をフィーダーレイヤーとして利用する。ここでの３Ｔ３細胞の役割の一つは、培養した表皮細胞中の幹細胞の未分化性を維持しつつ増殖させることとされている。この方法は、今や表皮角化細胞を培養する方法の主流である。しかしながら、この方法には、３Ｔ３細胞がマウス由来の細胞であるという欠点がある。表皮角化細胞を培養している間にこの３Ｔ３細胞は消失すると言われているが、未だに１００％消失するとは証明されていない。よって、ヒトに応用する場合、３Ｔ３細胞の非存在下で細胞を培養する技術の開発が望まれている。【０００５】
また、上皮幹細胞の増殖にコレラトキシンを含む培地が慣習的に使われている。コレラトキシンは、上皮幹細胞の未分化性を維持する効果を有しているものと考えられている。しかしながら、例えばヒトへの治療を目的としたとき、培養液中のコレラトキシンは極力排除されるのが好ましい。よって、コレラトキシンの非存在下で細胞を培養する技術の開発が望まれている。【０００６】
これらの課題を解決するため、インターロイキン阻害剤を含有する血清添加培地を用いて上皮細胞を培養する方法が報告されている（特許文献２）。同方法によれば、３Ｔ３細胞やコレラトキシンの非存在下で、上皮細胞を効率的に培養できる。【０００７】
また、血清添加培地にレチノイドを添加することにより、上皮細胞の増殖を促進できることが知られている（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公平２−２３１９１号公報
【特許文献２】特開２０１３−０００１２１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Virchows Arch. 1994; 424: 525-531
【非特許文献２】Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994; 35: 2405-2420
【発明の概要】
【００１０】
上皮細胞等の細胞の培養には、通常、血清を含有する培地が用いられている。ここで、細胞培養を制御するためには、組成とその作用が明らかな因子を用いて培養をおこなうことが好ましいが、血清の組成は明らかでないものがほとんどである。また、患者の自己血清を調製するためには採血が必要であり、採血量に制限があること、採血へのストレス、および組成の個人差が問題となっている。そこで、本発明は、血清を必要としない細胞培養用の培地、およびそれを利用した細胞培養法を提供することを課題とする。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、レチノイン酸と、インターロイキン−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤とを含有する培地を用いることにより、血清の非存在下で上皮細胞を効率的に培養できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のとおり例示できる。
［項１］
血清を実質的に含有せず、且つ、下記成分（Ａ）および（Ｂ）を含有する、細胞培養用の培地：
（Ａ）レチノイド；
（Ｂ）インターロイキン−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤。
［項２］
前記レチノイドが、レチノイン酸、レチノール、およびレチナールからなる群より選択される、項１に記載の培地。
［項３］
前記レチノイドの培地中の濃度が、１ｎＭ以上である、項１または２に記載の培地。
［項４］
前記インターロイキン−１阻害剤が、インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび抗インターロイキン−１抗体からなる群より選択される、項１〜３のいずれか１項に記載の培地。
［項５］
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストの培地中の濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以上である、項４に記載の培地。
［項６］
前記抗インターロイキン−１抗体の培地中の濃度が、０．１５μｇ／ｍＬ以上である、項４に記載の培地。
［項７］
前記カルパイン阻害剤が、カルボキシベンゾイル−ロイシニル−ノルロイシナール、カルボキシベンゾイル−バリニル−フェニルアラニナール、およびＢｏｃ−Ｌ−ノルロイシナールからなる群より選択される、項１〜６のいずれか１項に記載の培地。
［項８］
前記カルパイン阻害剤の培地中の濃度が、５００ｎＭ以上である、項１〜７のいずれか１項に記載の培地。
［項９］
少なくともインターロイキン−１阻害剤を含有する、項１〜８のいずれか１項に記載の培地。
［項１０］
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、項１〜９のいずれか１項に記載の培地。
［項１１］
項１〜１０のいずれか１項に記載の培地で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
［項１２］
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、項１１に記載の方法。
［項１３］
前記細胞が、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、または口腔粘膜に由来する、項１１または１２に記載の方法。
［項１４］
前記細胞が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、またはチンパンジーに由来する、項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
［項１５］
前記培養細胞が、細胞シートである、項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
［項１６］
ラミニンで被覆された培養基材上で培養が行われる、項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、効率的に細胞を培養することができる。具体的には、例えば、血清を用いることなく、効率的に細胞を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種培地成分の細胞増殖促進効果を示す図。
【図２】カルパイン阻害剤の細胞増殖促進効果を示す図。
【図３】カルパイン阻害剤の細胞増殖促進効果を示す写真。
【図４】カルパイン阻害剤が培養上清中のＩＬ−１α量に与える影響を示す図。
【図５】カルパイン阻害剤が培養細胞中の前駆型および成熟型ＩＬ−１αの量に与える影響を示す写真。
【図６】カルパイン阻害剤が培養細胞中のＩＬ−１α発現量に与える影響を示す図。
【図７】ラミニン等の細胞外マトリックス（ECM）で被覆した培養基材での培養における細胞増殖促進効果を示す図。
【図８】ラミニン等の細胞外マトリックス（ECM）で被覆した培養基材での培養における初期接着促進効果を示す図。
【図９】ラミニン被覆培養基材においてATRA及びIL-1RAが細胞接着・増殖作用に及ぼす効果を示す写真（培養３日目）。
【図１０】ラミニン被覆培養基材においてATRA及びIL-1RAが細胞接着・増殖作用に及ぼす効果を示す写真（培養５日目）。
【図１１】ラミニン被覆培養基材においてATRA及びIL-1RAが細胞接着・増殖作用に及ぼす効果を示す写真（培養７日目）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜１＞本発明の培地
本発明の培地は、下記成分（Ａ）および（Ｂ）を含有する、細胞培養用の培地である：
（Ａ）レチノイド；
（Ｂ）インターロイキン−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤。
【００１６】
本発明において、上記成分（Ａ）および（Ｂ）を総称して、「有効成分」という場合がある。
【００１７】
「レチノイド」とは、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）および／またはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）のリガンドとなる物質をいう。レチノイドとしては、レチノイン酸、レチノール、レチナール、レチノールのエステル、各種ＲＡＲアゴニスト、および各種ＲＸＲアゴニストが挙げられる。レチノイン酸としては、例えば、オールトランスレチノイン酸（all-trans retinoic acid；ＡＴＲＡ）、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸が挙げられる。レチノイン酸は、特記しない限り、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩やカルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。レチノールとしては、例えば、オールトランスレチノール（ビタミンＡ）が挙げられる。レチナールとしては、例えば、オールトランスレチナールが挙げられる。レチノールのエステルとしては、例えば、酢酸レチノール（retinyl acetate）やパルミチン酸レチノール（retinyl parmitate）が挙げられる。レチノイドとしては、市販のものを用いてもよく、適宜製造したものを用いてもよい。本発明の培地は、１種のレチノイドを含有していてもよく、２種またはそれ以上のレチノイドを含有していてもよい。本発明の培地が２種またはそれ以上のレチノイドを含有する場合、その混合比率は特に制限されない。
【００１８】
「インターロイキン−１阻害剤」とは、インターロイキン−１（ＩＬ−１）の作用を阻害する物質をいう。ＩＬ−１阻害剤としては、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１ＲＡ）や抗インターロイキン−１抗体が挙げられる。抗インターロイキン−１抗体としては、抗インターロイキン−１α抗体や抗インターロイキン−１β抗体が挙げられる。インターロイキン−１阻害剤としては、市販のものを用いてもよく、適宜製造したものを用いてもよい。本発明の培地は、１種のインターロイキン−１阻害剤を含有していてもよく、２種またはそれ以上のインターロイキン−１阻害剤を含有していてもよい。本発明の培地が２種またはそれ以上のインターロイキン−１阻害剤を含有する場合、その混合比率は特に制限されない。
【００１９】
「カルパイン阻害剤」とは、カルパインの作用を阻害する物質をいう。カルパイン阻害剤は、細胞膜透過型のカルパイン阻害剤であるのが好ましい。細胞膜透過型のカルパイン阻害剤としては、Ｎ−アセチル−ロイシニル−ロイシニル−ノルロイシナール（N-Acetyl-Leu-Leu-norleucinal；「カルパインインヒビターＩ」ともいう）、Ｎ−アセチル−ロイシニル−ロイシニル−メチオニナール（N-Acetyl-Leu-Leu-methioninal；「カルパインインヒビターＩＩ」ともいう）、カルボキシベンゾイル−バリニル−フェニルアラニナール（Carbobenzoxy-Val-Phenylalaninal；「カルパインインヒビターＩＩＩ」ともいう）、カルボキシベンゾイル−ロイシニル−ノルロイシナール（Carbobenzoxy-Leu-Norleucinal；「カルペプチン」ともいう）、Ｂｏｃ−Ｌ−ノルロイシナール（Boc-L-norleucinal；「ＢＭＬ２４４」ともいう）、および（２Ｓ，３Ｓ）−トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−３−メチルブタンエチルエステル（(2S,3S)-trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-3-methylbutane Ethyl Ester；「Ｅ−６４ｄ」や「ＥＳＴ」ともいう）が挙げられる。カルパイン阻害剤としては、市販のものを用いてもよく、適宜製造したものを用いてもよい。本発明の培地は、１種のカルパイン阻害剤を含有していてもよく、２種またはそれ以上のカルパイン阻害剤を含有していてもよい。本発明の培地が２種またはそれ以上のカルパイン阻害剤を含有する場合、その混合比率は特に制限されない。
【００２０】
成分（Ｂ）としては、本発明の培地は、インターロイキン−１阻害剤およびカルパイン阻害剤の片方のみを含有してもよく、両方を含有してもよい。本発明の培地は、少なくとも、インターロイキン−１阻害剤を含有するのが好ましい。
【００２１】
本発明の培地における各有効成分の濃度は、細胞の増殖が向上する限り、特に制限されない。本発明の培地における各有効成分の濃度は、有効成分の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００２２】
本発明の培地におけるレチノイドの濃度は、例えば、０．１ｎＭ以上、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、２０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、または１μＭ以上であってよい。また、本発明の培地におけるレチノイドの濃度は、例えば、１ｍＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下であってよい。本発明の培地におけるレチノイドの濃度は、具体的には、例えば、１ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１００ｎＭであってよい。
【００２３】
ＩＬ−１阻害剤としてインターロイキン−１受容体アンタゴニストを用いる場合、本発明の培地におけるインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、または１００ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。また、本発明の培地におけるインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、または２００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。本発明の培地におけるインターロイキン−１受容体アンタゴニストの濃度は、具体的には、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬであってよい。
【００２４】
ＩＬ−１阻害剤として抗インターロイキン−１抗体を用いる場合、本発明の培地における抗インターロイキン−１抗体の濃度は、例えば、０．１５μｇ／ｍＬ以上、０．２５μｇ／ｍＬ以上、２．５μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、または２５μｇ／ｍＬ以上であってよい。また、本発明の培地における抗インターロイキン−１抗体の濃度は、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、５００μｇ／ｍＬ以下、２５０μｇ／ｍＬ以下、または１００μｇ／ｍＬ以下であってよい。本発明の培地における抗インターロイキン−１抗体の濃度は、具体的には、例えば、５μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってよい。
【００２５】
本発明の培地におけるカルパイン阻害剤の濃度は、例えば、５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、または４μＭ以上であってよい。また、本発明の培地におけるカルパイン阻害剤の濃度は、例えば、５０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、５００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、または５０μＭ以下であってよい。本発明の培地におけるカルパイン阻害剤の濃度は、例えば、５００ｎＭ〜５００μＭ、好ましくは１μＭ〜１００μＭであってよい。
【００２６】
本発明の培地は、さらに、その他の成分を含有してよい。その他の培地成分の種類や濃度は、培養する細胞の性質等に応じて適宜設定できる。その他の成分としては、グルコース等の炭素源、アミノ酸、ビタミン、リン酸塩、緩衝剤が挙げられる。本発明の培地は、例えば、上皮細胞等の細胞の培養に用いられる通常の培地に有効成分を添加したものであってよい。細胞の培養に用いられる通常の培地としては、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＫＣＭが挙げられる。
【００２７】
また、本発明の培地は、例えば、成長因子を含有してよい。成長因子としては、上皮成長因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Fibroblast Growth Factor；ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor；ＤＧＦ）、肝細胞成長因子（Hepatocyto Growth Factor；ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、幹細胞因子（Stem Cell Factor；ＳＣＦ）が挙げられる。本発明の培地における成長因子の濃度は、例えば、２ｎｇ／ｍＬ以上、４ｎｇ／ｍＬ以上、または１０ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。
【００２８】
本発明の培地を用いることで、血清を使用せずに細胞を培養することができる。しかしながら、このことは、血清を使用することを妨げるものではない。すなわち、本発明の培地は、血清を含有してもよく、しなくてもよい。血清としては、ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）が挙げられる。本発明の培地における血清の濃度は特に制限されないが、例えば、上皮細胞等の細胞の培養に通常用いられる濃度（例えば５％（ｖ／ｖ））であってもよく、それより低い濃度であってもよい。本発明の培地は、血清を実質的に含有しないのが好ましい。「血清を実質的に含有しない」とは、本発明の培地における血清の濃度が、好ましくは０．０５％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは０．００５％（ｖ／ｖ）以下、特に好ましくは０であることをいう。「血清を実質的に含有しない」とは、本発明の培地に血清が全く添加されていないことを意味してもよい。
【００２９】
本発明の培地を用いることで、コレラトキシンを使用せずに細胞を培養することができる。しかしながら、このことは、コレラトキシンを使用することを妨げるものではない。すなわち、本発明の培地は、コレラトキシンを含有してもよく、しなくてもよい。本発明の培地におけるコレラトキシンの濃度は特に制限されないが、例えば、上皮細胞等の細胞の培養に通常用いられる濃度（例えば１０ｎＭ）であってもよく、それより低い濃度であってもよい。本発明の培地は、コレラトキシンを実質的に含有しないのが好ましい。「コレラトキシンを実質的に含有しない」とは、本発明の培地におけるコレラトキシンの濃度が、好ましくは０．１ｎＭ以下、より好ましくは０．０１ｎＭ以下、特に好ましくは０であることをいう。「コレラトキシンを実質的に含有しない」とは、本発明の培地にコレラトキシンが全く添加されていないことを意味してもよい。  
【００３０】
＜２＞本発明の方法
本発明の培地を用いることで、細胞を効率よく増殖させることができる。すなわち、本発明は、本発明の培地で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法を提供する。同方法を、本発明の方法ともいう。
【００３１】
培養される細胞の種類は特に制限されない。細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、各種幹細胞、各種前駆細胞、各種分化した細胞が挙げられる。細胞としては、例えば、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、上皮細胞から選択されるものが好ましい。細胞は、いずれの生体組織に由来するものであってもよい。生体組織としては、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、口腔粘膜が挙げられる。生体組織としては、例えば、皮膚、角膜、口腔粘膜から選択される箇所が好ましい。すなわち、好ましい細胞として、具体的には、例えば、表皮幹細胞、表皮前駆細胞、表皮細胞、角膜上皮幹細胞、角膜上皮前駆細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮幹細胞、口腔粘膜上皮前駆細胞、口腔粘膜上皮細胞が挙げられる。細胞は、生体組織から分離された細胞であってもよく、生体組織から分離された細胞を培養および／または分化させて得られた細胞であってもよく、それらを遺伝子工学等の手法により改変して得られた細胞であってもよい。細胞が由来する生物は特に制限されず、使用目的等に応じて適宜選択することができる。細胞が由来する生物として、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類として、具体的には、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーが挙げられる。哺乳類は、免疫不全動物であってもよい。培養した細胞をヒトの治療に用いる場合、細胞が由来する生物としては、例えば、ヒト、ブタ、チンパンジーから選択される哺乳類が好ましい。本発明の方法においては、１種の細胞のみを培養してもよく、２種またはそれ以上の細胞を共培養してもよい。
【００３２】
本発明の方法においては、上述したような細胞を本発明の培地で培養する。培養条件は、培養の全期間において一定であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、各培地成分は、適宜、培養中に培地に追加添加してもよい。細胞は、培養の全期間において本発明の培地で培養されてもよく、培養の一部の期間においてのみ本発明の培地で培養されてもよい。例えば、別の培地で培養した細胞を本発明の培地に移して培養を継続してもよく、本発明の培地で培養した細胞を別の培地に移して培養を継続してもよく、それらの組み合わせであってもよい。別の培地としては、例えば、上皮細胞等の細胞の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。また、例えば、成分（Ａ）および／または（Ｂ）を含有しない培地で細胞の培養を開始し、培養途中で成分（Ａ）および／または（Ｂ）を培地に補填することにより、培地が成分（Ａ）および（Ｂ）の両方を含有するようになってもよい。このように、少なくとも一部の期間、成分（Ａ）と成分（Ｂ）の両方を含有する本発明の培地での培養期間が存在する限り、「本発明の培地で細胞を培養する」ことに含まれる。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。通常は、培養の全期間において本発明の培地で細胞を培養するのが好ましい。
【００３３】
培養条件は、細胞が増殖できる条件であれば特に制限されない。培養条件は、本発明の培地を用いること以外は、例えば、上皮細胞等の細胞の培養に用いられる通常の条件と同じであってよい。培養条件は、細胞の種類や細胞が由来する生物種等の諸条件に応じて適宜設定できる。
【００３４】
培養開始時に播種する細胞数は、例えば、１×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上、または２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以上であってよい。また、培養開始時に播種する細胞数は、例えば、１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、または５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下であってよい。
【００３５】
培養温度は、例えば、通常は３６℃〜３８であってよく、好ましくは約３７℃であってよい。
【００３６】
培養ｐＨは、例えば、中性付近であってよい。「中性付近」とは、例えば、ｐＨ６．８〜７．２であってよい。
【００３７】
培養時の気相は、例えば、空気と炭酸ガスの混合ガスであってよい。具体的には、例えば、５％炭酸ガスと９５％空気の雰囲気下で培養を行ってよい。
【００３８】
培養期間は、例えば、５〜３０日、好ましくは７〜１６日であってよい。
【００３９】
培養は適当な培養基材（培養容器）上で実施することができる。培養基材は、細胞と培地を保持できる材質と形状を有する限り、特に制限されない。培養基材の形状としては、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート、メンブレンが挙げられる。培養基材の材質としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のプラスチック類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクタン、それらの共重合体等の生分解性ポリマー類、ガラス、改質ガラス等のガラス類、セラミックス類、金属類、セルロース、その他各種高分子化合物が挙げられる。
【００４０】
培養基材の表面は、機能性材料で被覆されていてもよい。ここでいう「培養基材の表面」とは、細胞が培養される側の表面をいう。機能性材料は、その機能が発揮される限り、培養基材表面の全体を被覆していてもよく、そうでなくてもよい。通常は、機能性材料は、培養基材表面の全体を被覆しているのが好ましい。
【００４１】
例えば、培養基材の表面は、温度に応じて水和力が変化するポリマーで被覆されていてもよい。そのようなポリマーを、「温度応答性ポリマー」ともいう。温度応答性ポリマーは、好ましくは、０〜８０℃で水和力が変化するポリマーであってよい。温度応答性ポリマーは、下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature；ＬＣＳＴ）以下において可溶性を示すＬＣＳＴ型と、上限臨界溶解温度（Upper Critical Solution Temperature；ＵＣＳＴ）以上において可溶性を示すＵＣＳＴ型に分類される。すなわち、例えば、ＬＣＳＴ型の温度応答性ポリマーは、ＬＣＳＴを越える温度域では、ポリマー鎖が脱水和を起こして凝集し、白濁するが、ＬＣＳＴ以下の温度域では、ポリマー鎖が水和し、水に溶解する。よって、ＬＣＳＴ型の温度応答性ポリマーで培養基材の表面を被覆している場合、ＬＣＳＴを越える温度域では、脱水和したポリマー鎖に覆われた培養基材表面が疎水性を示し、細胞が培養基材表面に付着して増殖できる。一方、ＬＣＳＴ以下の温度域では、水和したポリマー鎖に覆われた培養基材表面が親水性を示し、細胞は培養基材表面に付着できない。したがって、ＬＣＳＴを越える温度域で細胞を培養し、培養後に培養基材をＬＣＳＴ以下の温度に冷却することにより、培養細胞を培養基材から剥離することができる。あるいは、ＵＣＳＴ型の温度応答性ポリマーで培養基材の表面を被覆している場合、逆に、ＵＣＳＴを下回る温度域で細胞を培養し、培養後に培養基材をＵＣＳＴ以上の温度に加温することにより、培養細胞を培養基材から剥離することができる。
【００４２】
培養細胞の剥離は、例えば、培養液中でそのまま実施してもよく、培養液を他の液体に置換してから実施してもよい。他の液体としては、新鮮な培地やその他適当な等張液が挙げられる。培養細胞の剥離は、温度変化のみにより実施してもよく、温度変化と他の操作を併用して実施してもよい。例えば、培養細胞を迅速かつ高効率に剥離するために、培養基材を軽く叩いたり揺らしたりしてもよく、ピペット等を用いて培養液等を撹拌してもよい。
【００４３】
温度応答性ポリマーを利用する場合、培養細胞の剥離に、ディスパーゼやトリプシン等のタンパク質分解酵素を利用する必要がない。よって、培養細胞をタンパク質分解酵素により損傷することなく培養基材から剥離できる。この場合、剥離された培養細胞は接着性タンパク質を有する。そのため、剥離された培養細胞は、移植時に患部組織と良好に接着することができ、移植を効率的に実施することができる。
【００４４】
温度応答性ポリマーとしては、特開平2-211865号公報に記載されているポリマーが挙げられる。温度応答性ポリマーは、１種のモノマーの単一重合体（ホモポリマー）であってもよく、２種またはそれ以上のモノマーの共重合体（コポリマー）であってもよい。共重合体は、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれであってもよい。温度応答性ポリマーの製造に使用できるモノマーとしては、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、およびビニルエーテル誘導体が挙げられる。また、上記モノマー以外の成分を共重合に使用してもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲でポリマー鎖を架橋してもよい。本発明の方法においては、１種の温度応答性ポリマーのみを用いてもよく、２種またはそれ以上の温度応答性ポリマーを併用してもよい。ＬＣＳＴ型の温度応答性ポリマーとして、具体的には、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＬＣＳＴ２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）が挙げられる。温度応答性ポリマーは、培養温度等の諸条件に応じて、適宜選択することができる。温度応答性ポリマーとしては、例えば、一般的な細胞培養温度である約３７℃以下のＬＣＳＴを示すものが好ましい。上記の内では、例えば、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドが好ましく、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがより好ましい。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのＬＣＳＴは３２℃であるため、例えば、３７℃で培養を行い、次いで培養液を２０℃前後に冷却することにより、培養細胞を培養基材から剥離することができる。
【００４５】
培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆は、例えば、特開平2-211865号公報に記載されている方法に従って実施できる。具体的には、被覆は、培養基材と、温度応答性ポリマーまたはその原料であるモノマーとを、電子線照射、ガンマ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応、塗布、またはそれらの組み合わせに供することにより、実施できる。また、培養基材の製造時に、培養基材の原料と温度応答性ポリマーを混練してもよい。
【００４６】
培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、温度応答性を発揮できる限り、特に制限されない。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、例えば、培養基材表面での温度応答性ポリマーの膜厚が０．５ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍとなるような量であってよい。また、温度応答性ポリマーの被覆量は、例えば、１．１μｇ／ｃｍ2以上、１．４μｇ／ｃｍ2以上、１．５μｇ／ｃｍ2以上であってよく、９μｇ／ｃｍ2以下、８μｇ／ｃｍ2以下、７μｇ／ｃｍ2以下、２．３μｇ／ｃｍ2以下、１．９μｇ／ｃｍ2以下、１．８μｇ／ｃｍ2以下であってもよい。
【００４７】
培養基材の表面において、前記温度応答性ポリマーの被覆層の上には、さらに細胞の付着性を高める成分が被覆されていてもよい。そのような成分としては、コラーゲン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、マトリゲル等の細胞接着性タンパク質が挙げられる。ラミニンとしては、ラミニン−５１１、ラミニン−５２１、ラミニン−３３２が挙げられる。本発明の方法においては、これらの内、１種の成分のみを用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を併用してもよい。例えば、一態様において、ラミニン−５１１、ラミニン−５１１-Ｅ８、あるいはラミニン−５２１を被覆した培養基材では、それを被覆していない基材に比べ、培養開始５〜６日後の細胞数が約２倍に増大することが認められた（図７；実験条件；５ｎＭのレチノイン酸および１０００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１レセプターアンタゴニストを含み、且つ血清を含まないケラチノサイト培養培地（Keratinocyte Culture Medium；ＫＣＭ）でラット口腔粘膜上皮細胞を５〜６日間培養）。また、それらを被覆した培養基材では、培養初期段階における細胞の接着が顕著に増大することがわかった（図８；５ｎＭのレチノイン酸および１０００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１レセプターアンタゴニストを含み、且つ血清を含まないＫＣＭでラット口腔粘膜上皮細胞を１９時間培養）。
【００４８】
本発明の培地を用いることで、３Ｔ３細胞等のフィーダー細胞を使用せずに細胞を培養することができる。しかしながら、このことは、フィーダー細胞を使用することを妨げるものではない。すなわち、本発明の方法においては、フィーダー細胞を使用してもよく、しなくてもよい。本発明の方法においては、フィーダー細胞を使用しない方法が好ましい。
【００４９】
このようにして細胞を培養することにより、培養細胞が得られる。本発明の方法においては、細胞は、培養により分化してもよく、しなくてもよい。
【００５０】
培養細胞は、適宜、培養基材から剥離して回収できる。培養細胞の剥離は、常法により実施できる。温度応答性ポリマーを利用している場合は、例えば、上述したようにして培養細胞を培養基材から剥離することができる。また、温度応答性ポリマーを利用していない場合は、例えば、ディスパーゼやトリプシン等のタンパク質分解酵素を利用して、培養細胞を培養基材から剥離することができる。
【００５１】
回収される培養細胞の形状は、特に制限されない。回収される培養細胞は、例えば、シート状の細胞（細胞シート）であってよい。
【００５２】
本発明の方法により得られる培養細胞の用途は、特に制限されない。本発明の方法により得られる培養細胞は、例えば、外傷や疾病により損傷した生体組織を修復するための移植医療や再生医療に好適に使用できる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。【００５４】
実施例１：血清代替成分の検討
本実施例では、血清の代替となり得る培地成分の検討を行った。【００５５】
ラット口腔粘膜上皮細胞を、４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、37℃、5% CO2雰囲気下で培養を行った。培養５日目に細胞数をカウントし、後日細胞シートを回収した。培養には、表１の通り調製したケラチノサイト培養培地（Keratinocyte Culture Medium；ＫＣＭ）を用いた。【００５６】
【表１】
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【００５７】
陽性対照としては、血清（ＦＢＳ）を５％（ｖ／ｖ）で含有するＫＣＭを用いた。また、陰性対照としては、血清（ＦＢＳ）およびいずれの有効成分も含有しないＫＣＭを用いた。また、試験区１〜１３として、血清（ＦＢＳ）を含有せず、且つ各有効成分を含有するＫＣＭを用いた。レチノイドとしては、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を１０ｎＭで用いた。ＩＬ−１阻害剤としては、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１ＲＡ）を１００ｎｇ／ｍＬで用いた。カルパイン阻害剤としては、カルペプチン（calpeptin）を５０μＭで、カルパインインヒビターＩＩＩ（calp. I III）を４μＭで、ＢＭＬ２４４を４０μＭで、それぞれ用いた。【００５８】
培養５日目の細胞数を図１に示す。図に示すように、レチノイド、ＩＬ−１阻害剤、およびカルパイン阻害剤のいずれか単独を添加した試験区１〜５では、血清（ＦＢＳ）を添加した陽性対照１と比較して、細胞数が低かった。すなわち、レチノイド、ＩＬ−１阻害剤、およびカルパイン阻害剤のいずれか単独では、血清（ＦＢＳ）の効果を十分には補うことができなかった。一方、レチノイドに加えて、ＩＬ−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤を添加した試験区６〜１３では、試験区１〜５と比較して、増殖の促進が認められた。特に、レチノイドに加えてＩＬ−１阻害剤を添加した試験区６、７、１２、１３では、陽性対照１と同等以上の増殖が認められた。【００５９】
以上の通り、レチノイドに加えて、ＩＬ−１阻害剤および／またはカルパイン阻害剤を添加した培地を用いることにより、細胞の増殖が顕著に促進されることが明らかとなった。【００６０】
実施例２：カルパイン阻害剤の作用機序の検討
本実施例では、カルパイン阻害剤の作用機序の検討を行った。【００６１】
（１）細胞膜透過性の検討
ラット口腔粘膜上皮細胞を、４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、３７℃、５％ CO2雰囲気下で培養を行った。培養８〜１１日目に細胞数をカウントした。培養には、ＫＣＭ（血清なし）に、ＡＴＲＡとカルパイン阻害剤を添加して用いた。【００６２】
結果を図２、３に示す。細胞膜透過型のカルパイン阻害剤であるカルペプチン（calpeptin）またはカルパインインヒビターＩＩＩ（calpain inh. III）を添加した系では細胞の増殖が促進されたのに対し、細胞膜非透過型のカルパイン阻害剤であるカルパスタチン（calpastatin）、Ｂ２７−ＷＴ、またはシスタチンＣ（cystatin C）を添加した系では細胞の増殖が促進されなかった（図２）。また、細胞膜透過型のカルパイン阻害剤を添加した系では、細胞が敷石状形状を保ちながら増殖した（図３）。【００６３】
以上より、細胞内のカルパイン阻害により、細胞増殖が促進されるものと考えられる。【００６４】
（２）ＩＬ−１との関連性の検討
上記培養系において、培養上清中のＩＬ−１α量を、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図４に示す。結果として、細胞膜透過型のカルパイン阻害剤を添加した系では、培養上清中のＩＬ−１α量の顕著な低下が認められた。【００６５】
カルパインは、前駆型ＩＬ−１α（pro IL-1α）から成熟型ＩＬ−１α（mature IL-1α）への成熟を促進することが知られている。そこで、上記培養系において、培養細胞中の前駆型および成熟型ＩＬ−１αの量を、ウェスタンブロットにより測定した。結果を図５に示す。結果として、細胞膜透過型のカルパイン阻害剤を添加した系では、成熟型ＩＬ−１αだけでなく、前駆型ＩＬ−１α量も低下していることが明らかとなった。【００６６】
次いで、上記培養系において、培養細胞中のＩＬ−１α発現量を、定量ＰＣＲにより測定した。結果を図６に示す。結果として、細胞膜透過型のカルパイン阻害剤を添加した系では、ＩＬ−１αの発現自体が低下していることが明らかとなった。【００６７】
以上より、カルパイン阻害剤は、ＩＬ−１αの発現低下を介して、間接的に、ＩＬ−１阻害剤と同様のメカニズムで細胞の増殖を促進している可能性が示唆された。【００６８】
実施例３：ラミニン被覆培養基材の検討
本実施例では、ラミニン被覆培養基材を用いて、ＡＴＲＡとＩＬ―１ＲＡ（ＩＬ−１阻害剤）を含む培地、または市販の培地（Ｅｐｌｉｆｅ）が、細胞接着・増殖作用に及ぼす影響の検討を行った。【００６９】
ラット口腔粘膜上皮細胞を、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で培養基材に播種し、３７℃、５％ CO2雰囲気下で培養を行った。ラミニン−５１１（Ｌｍ５１１）、ラミニン−５１１-Ｅ８（Ｌｍ５１１Ｅ８）、あるいはラミニン−５２１（Ｌｍ５２１）で被覆した培養基材、または被覆していない培養基材において、５ｎＭのＡＴＲＡ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ＲＡを含むKCMを用いて培養した。対照として、市販の無血清培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、コラーゲンまたはＬｍ５１１Ｅ８で被覆した培養基材における培養を行った。培養後３日目、５日目、及び７日目の状態を示す写真を図９、１０、及び１１にてそれぞれ示す。図９、１０及び１１から、ラミニン被覆培養基材を用いることにより、ＡＴＲＡ及びＩＬ−１ＲＡの細胞接着・増殖作用がさらに向上することがわかった。また、ラミニン被覆培養基材において、市販の培地（Ｅｐｌｉｆｅ）を用いた場合よりも、ＡＴＲＡ及びＩＬ−１ＲＡを含む培地を用いた方が、細胞接着・増殖作用は高くなることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月29日(2015.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を実質的に含有せず、且つ、下記成分（Ａ）および（Ｂ）を含有する、細胞培養用の培地：
（Ａ）レチノイド；
（Ｂ）インターロイキン−１阻害剤。
【請求項２】
前記レチノイドが、レチノイン酸、レチノール、およびレチナールからなる群より選択される、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記レチノイドの培地中の濃度が、１ｎＭ以上である、請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
前記インターロイキン−１阻害剤が、インターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび抗インターロイキン−１抗体からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
前記インターロイキン−１受容体アンタゴニストの培地中の濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以上である、請求項４に記載の培地。
【請求項６】
前記抗インターロイキン−１抗体の培地中の濃度が、０．１５μｇ／ｍＬ以上である、請求項４に記載の培地。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１１】
請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の培地で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
【請求項１２】
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、または口腔粘膜に由来する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、またはチンパンジーに由来する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養細胞が、細胞シートである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ラミニンで被覆された培養基材上で培養が行われる、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
さらにカルパイン阻害剤を含有する、請求項１〜６及び１０のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１８】
前記カルパイン阻害剤が、カルボキシベンゾイル−ロイシニル−ノルロイシナール、カルボキシベンゾイル−バリニル−フェニルアラニナール、およびＢｏｃ−Ｌ−ノルロイシナールからなる群より選択される、請求項１７に記載の培地。
【請求項１９】
前記カルパイン阻害剤の培地中の濃度が、５００ｎＭ以上である、請求項１７または１８に記載の培地。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の培地で細胞を培養することを含む、培養細胞を製造する方法。
【請求項２１】
前記細胞が、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、および上皮細胞からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、または口腔粘膜に由来する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、またはチンパンジーに由来する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養細胞が、細胞シートである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ラミニンで被覆された培養基材上で培養が行われる、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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