(57)【要約】  蠕虫（Helminth）および原虫（Protozoa）の双方に効果を有する医薬用、動物医薬用、農薬用及び魚類用の新たな駆虫剤を提供する。糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産するシッカニンあるいは合成のシッカニン、又はその修飾された誘導体を１種以上用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シッカニン又はその修飾された誘導体から選択された少なくとも１種の化合物を有効成分として含む駆虫剤。
【請求項２】
シッカニンが糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産する物質である請求項１記載の駆虫剤。
【請求項３】
シッカニンが化学的に合成された化合物である請求項１記載の駆虫剤。
【請求項４】
医薬用として使用する請求項１ないし３のいずれか１項記載の駆虫剤。
【請求項５】
動物用医薬として使用する請求項１ないし４のいずれか１項記載の駆虫剤。
【請求項６】
農薬として使用する請求項１ないし３のいずれか１項記載の駆虫剤。
【請求項７】
魚類用医薬としてとして使用する請求項１ないし４のいずれか１項記載の駆虫剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分（活性化合物）としてシッカニンおよびその修飾された誘導体から選択される少なくとも１種の化合物を含有し、ヒト、ヒト以外の動物、魚類等の幅広い生物における寄生虫感染に対する予防及び治療剤を提供するものである。【０００２】
換言すれば、本発明は、糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産するシッカニンあるいは合成のシッカニン又はその修飾された誘導体を有効成分として含む駆虫剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
寄生虫症は多細胞の蠕虫が引き起こす蠕虫症と単細胞の原虫が引き起こす原虫症の2種類に分類され、それぞれが発展途上国を中心に大きな健康被害をもたらしている。【０００４】
蠕虫症（Helminth）は真核生物、無脊椎動物である蠕虫類により引き起こされる。条虫感染症（Cestode infection）、動物蠕虫症（Animal Helminth）、線虫感染症（Nematode Infection）及び吸虫感染症（Trematode）に分類される。【０００５】
蠕虫症のうち最も罹患者の多いものの一つが土壌伝播蠕虫感染で、感染者はアジア、アフリカ、ラテンアメリカを中心に15億人、年間の死者は子供を中心に13万人と推定されている（WHO  2011）。土壌伝播蠕虫感染の大部分は回虫によるもので、アジアを中心に12億人の感染者が存在する。回虫症は下痢や腹痛、幼児の栄養不良や発育障害を引き起こし、場合によっては死に至る他、家畜への感染も大きな経済的被害をもたらしている。現在、蠕虫症への治療薬としてはレバミゾール、ピランテル、ベンズミダゾール系のアルベンダゾールやメベンダゾール、大環状ラクトン系のアベルメクチン、ミルベマイシンが知られている。だが新たな駆虫薬の実用化は1970年代以降なされておらず、薬剤耐性の懸念から新たな薬剤の開発が求められている。【０００６】
一方、原虫症は、単細胞の真核生物である原虫感染により引き起こされ、形態学的には鞭毛虫類、胞子虫類、根足中類、繊毛虫類に分類されている。【０００７】
原虫症においてはマラリアおよびトリパノソーマ症を始めとする疾病が多大な健康被害をもたらしている。マラリアはマラリア原虫（Plasmodium spp.）の感染によって引き起こされ、罹患者は世界195カ国で2億1600万人、年間の死亡者は66万5千人と推定される。抗マラリア薬としてはこれまでクロロキン、メフロキン、サルファドキシン、アルテミシニンなどが開発されているが、いずれの薬剤も耐性株の出現が報告されており（非特許文献１、２）、複合投薬による治療が主流と成っている。トリパノソーマ症はトリパノソーマ科原虫（Trypanosomatid）によって引き起こされる疾病で、特に Trypanosoma brucei によるアフリカトリパノソーマ症、T. cruzi によるシャーガス病、リーシュマニア属原虫（Leishmania spp.）によるリーシュマニア症が3大トリパノソーマ症と呼ばれる。アフリカ睡眠病の感染者は2009年にはアフリカを中心に年間で3万人程度（WHO、2009）、シャーガス病の感染者は中南米を中心に1000万人と推定される（WHO、2010）。リーシュマニア症は皮膚リューシュマニア症、粘膜リーシュマニア症、内臓リーシュマニア症に分類され、感染者は東南アジアおよび中南米を中心に3億5千万人と推定される。これらのうち、アフリカトリパノソーマ症、内臓リーシュマニア症、及び慢性化後のシャーガス病は適切な治療を行わなければ死に至る。治療薬としてはアフリカ睡眠病においてベンズニダゾール、スラミン、メラルソプロール、ニフロチモックス、エフロルニチン（非特許文献３）、シャーガス病においてベンズニダゾール及びニフロチモックス（非特許文献４）、リーシュマニア症においてGlucantime、Pentaptom、アンホテリシンB、ミルテホシン、パラモマイシンなどが用いられている（非特許文献５）。しかしこれらの多くは重篤な副作用を伴う上に疾病の進行段階によっては効果が低く、近年は薬剤耐性株も出現し始めている（非特許文献６、７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mita, T., Tanabe, K., and Kita, K. (2009). Spread and evolution of Plasmodium falciparum drug resistance. Parasitol Int 58, 201-209.
【非特許文献２】Denis, M.B., Tsuyuoka, R., Lim, P., Lindegardh, N., Yi, P., Top, S.N., Socheat, D., Fandeur, T., Annerberg, A., Christophel, E.M., et al. (2006). Efficacy of artemether-lumefantrine for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in northwest Cambodia. Trop Med Int Health 11, 1800-1807.
【非特許文献３】Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., and Burri, C. (2010). Human African trypanosomiasis. Lancet 375, 148-159.
【非特許文献４】Rassi, A., and Marin-Neto, J.A. (2010). Chagas disease. Lancet 375, 1388-1402.
【非特許文献５】Singh, N., Kumar, M., and Singh, R.K. (2012). Leishmaniasis: current status of available drugs and new potential drug targets. Asian Pac J Trop Med 5, 485-497.
【非特許文献６】Chakravarty, J., and Sundar, S. (2010). Drug resistance in leishmaniasis. J Glob Infect Dis 2, 167-176.
【非特許文献７】Baker, N., de Koning, H.P., Maser, P., and Horn, D. (2013). Drug resistance in African trypanosomiasis: the melarsoprol and pentamidine story. Trends Parasitol 29, 110-118.
【非特許文献８】Harada, S., Inaoka, D.K., Ohmori, J., and Kita, K. (2013). Diversity of parasite complex II. Biochim Biophys Acta 1827, 658-667.
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【非特許文献１０】Pereira, M.M., Carita, J.N., and Teixeira, M. (1999). Membrane-bound electron transfer chain of the thermohalophilic bacterium Rhodothermus marinus: characterization of the iron-sulfur centers from the dehydrogenases and investigation of the high-potential iron-sulfur protein function by in vitro reconstitution of the respiratory chain. Biochemistry 38, 1276-1283.
【非特許文献１１】Millar, A.H., Eubel, H., Jansch, L., Kruft, V., Heazlewood, J.L., and Braun, H.P. (2004). Mitochondrial cytochrome c oxidase and succinate dehydrogenase complexes contain plant specific subunits. Plant Mol Biol 56, 77-90.
【非特許文献１２】Morales, J., Mogi, T., Mineki, S., Takashima, E., Mineki, R., Hirawake, H., Sakamoto, K., Omura, S., and Kita, K. (2009). Novel mitochondrial complex II isolated from Trypanosoma cruzi is composed of 12 peptides including a heterodimeric Ip subunit. J Biol Chem 284, 7255-7263.
【非特許文献１３】Luque-Ortega, J.R., and Rivas, L. (2007). Miltefosine (hexadecylphosphocholine) inhibits cytochrome c oxidase in Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother 51, 1327-1332.
【非特許文献１４】Carvalho, L., Luque-Ortega, J.R., Manzano, J.I., Castanys, S., Rivas, L., and Gamarro, F. (2010). Tafenoquine, an antiplasmodial 8-aminoquinoline, targets leishmania respiratory complex III and induces apoptosis. Antimicrob Agents Chemother 54, 5344-5351.
【非特許文献１５】Carvalho, L., Luque-Ortega, J.R., Lopez-Martin, C., Castanys, S., Rivas, L., and Gamarro, F. (2011). The 8-aminoquinoline analogue sitamaquine causes oxidative stress in Leishmania donovani promastigotes by targeting succinate dehydrogenase. Antimicrob Agents Chemother 55, 4204-4210.
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【非特許文献２１】Mogi, T., Kawakami, T., Arai, H., Igarashi, Y., Matsushita, K., Mori, M., Shiomi, K., Omura, S., Harada, S., and Kita, K. (2009). Siccanin rediscovered as a species-selective succinate dehydrogenase inhibitor. J Biochem 146, 383-387.
【非特許文献２２】Osanai, A., Harada, S., Sakamoto, K., Shimizu, H., Inaoka, D.K., and Kita, K. (2009). Crystallization of mitochondrial rhodoquinol-fumarate reductase from the parasitic nematode Ascaris suum with the specific inhibitor flutolanil. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 65, 941-944.
【非特許文献２３】Shimizu, H., Osanai, A., Sakamoto, K., Inaoka, D.K., Shiba, T., Harada, S., and Kita, K. (2012). Crystal structure of mitochondrial quinol-fumarate reductase from the parasitic nematode Ascaris suum. J Biochem 151, 589-592.
【非特許文献２４】Sun, F., Huo, X., Zhai, Y., Wang, A., Xu, J., Su, D., Bartlam, M., and Rao, Z. (2005). Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell 121, 1043-1057.
【非特許文献２５】Escobar, P., Matu, S., Marques, C., and Croft, S.L. (2002). Sensitivities of Leishmania species to hexadecylphosphocholine (miltefosine), ET-18-OCH(3) (edelfosine) and amphotericin B. Acta Trop 81, 151-157.
【非特許文献２６】Luna, K.P., Hernandez, I.P., Rueda, C.M., Zorro, M.M., Croft, S.L., and Escobar, P. (2009). In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi strains from Santander, Colombia, to hexadecylphosphocholine (miltefosine), nifurtimox and benznidazole. Biomedica 29, 448-455.
【非特許文献２７】Raz, B., Iten, M., Grether-Buhler, Y., Kaminsky, R., and Brun, R. (1997). The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T.b. rhodesiense and T.b. gambiense) in vitro. Acta Trop 68, 139-147.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、それぞれの寄生虫感染にたいして、多くの寄生虫駆除剤が使用されているが、これらは様々な問題、例えば、活性スペクトルが限定されていることも、上記の耐性出現と共に大きな問題となっている。したがって、新規の広範囲の寄生虫に効果を有し、しかも、安全性の高い駆虫剤の開発が必須である。【００１０】
本発明の目的は、新たな有効成分を含む駆虫剤、特に、抗蠕虫と抗原虫作用とを併せ持つ駆虫剤としての医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために、糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産する少なくとも１つの有効な作用物質、すなわちモノサイクロファルネゾール（たとえば、シッカニンあるいは化学的に合成された化合物又は修飾された誘導体）に着目した。【００１２】
本発明者らは蠕虫と原虫の幅広い効果を期待するために、これらの寄生虫の共通ターゲットである呼吸鎖複合体IIに着目し、研究をスタートした。【００１３】
呼吸鎖複合体IIはミトコンドリア呼吸鎖を構成する酵素の一つで、コハク酸の還元力を利用して細胞のATP産生に寄与するコハク酸-キノン酸化還元酵素（SQR）と、その逆反応を行うキノール-フマル酸酸化還元酵素（QFR）の二種類が存在する。他の呼吸鎖構成酵素と同様、複合体IIのサブユニット構造は生物種毎に多様性を持つが（非特許文献８）、一般的な呼吸鎖複合体IIのサブユニットは親水性のフラビンタンパク質サブユニット（Fp）と鉄硫黄タンパク質サブユニット（Ip）、そして疎水性である2種類のシトクロームbサブユニット（CybL およびCybS )の4つから成る（非特許文献９）。Fpはコハク酸およびフマル酸結合部位を含むサブユニットで、電子受容体としてFADを共有結合している。Ipは3種の鉄硫黄クラスターを含む親水性サブユニットで、FADとキノンの間の電子伝達をリレーする役割を果たす。膜へのアンカーであるCybLとCybSはIpサブユニットの一部とともにキノン結合部位を形成する。この4サブユニットから成る複合体IIの他、グラム陰性細菌の一部等でCybLとCybSが融合した3サブユニットの複合体IIが（非特許文献１０）、さらに植物において合計8サブユニットの複合体が（非特許文献１１）、トリパノソーマ科原虫においては12サブユニットの複合体IIが、それぞれ確認されている（非特許文献１２）。【００１４】
抗寄生虫薬の標的としての複合体IIはTCA回路と呼吸鎖を直接結ぶ酵素であり、重要な薬剤標的の一つでもある。カルボキシンやフルトラニル、フルオピランといった化合物は主に真菌呼吸鎖複合体IIに対して高い阻害効果を示すことが知られており、そのいくつかは近年農薬として実用化がなされている。また回虫を始めとする蠕虫の一部は、宿主環境内における低酸素状態に適応するためQFRを嫌気的エネルギー代謝に用いており、その生存に呼吸鎖複合体IIが大きな役割を果たす。先に上げた真菌複合体II阻害剤のうち、フルトラニルは豚回虫 Ascaris suum の複合体IIを豚複合体IIの800倍の選択性で阻害することが知られている（非特許文献８）。トリパノソーマ科原虫においても、呼吸鎖複合体は重要な薬剤標的であり、特にリーシュマニア症において抗原虫作用を示すミルテホシン（呼吸鎖複合体IV（非特許文献１３））、タフェノキン（呼吸鎖複合体III（非特許文献１４））、シタマキン（呼吸鎖複合体II（非特許文献１５））といった化合物が呼吸鎖酵素に作用している事が示唆されている。中でもトリパノソーマ科原虫の複合体IIは12サブユニットからなる特殊な構造を持ち、阻害剤感受性も哺乳類複合体IIと大きく異なることが知られている。このサブユニット構成は T. cruzi、T. brucei、病原性リーシュマニアのゲノム上で保存されていることから、この酵素は3大トリパノソーマ症の全てにおける薬剤標的となり得る。しかし12サブユニット複合体IIは既知の複合体II阻害剤に対して哺乳類より低い感受性を示し、強力な選択的阻害剤が見つかっていなかった。先に述べた抗リーシュマニア化合物シタマキンも、ミトコンドリアのコハク酸依存的酸素消費を選択的に阻害するものの、酵素自体に対する阻害効果は弱い（非特許文献１５）。さらにアフリカ睡眠病およびシャーガス病に治療薬において、呼吸鎖複合体酵素を標的とするものは見つかっていない。【００１５】
本発明では、抗真菌剤として知られていた化合物シッカニンの線虫およびトリパノソーマ科原虫呼吸鎖複合体IIに対する選択的阻害効果、および細胞増殖阻害効果を観察した。【００１６】
シッカニンは1962年に糸状菌 Helminthosporium siccans から単離された化合物であり（非特許文献１６）、2つのシクロヘキサン環、1つのオキサン環、1つのベンゼン環から成る cis, syn, cis- 融合式脂環状構造を取る（非特許文献１７）。抗真菌活性を有し、Trychophyton spp.、Epidermophyton floccosum、Microsporium gypseum といった感染性菌類に増殖阻害効果を示すことが知られている（MIC:０．６〜６．３μｇ／ｍｌ（非特許文献１８））。アルビノモルモット（体重350 g、雄）を用いた。【００１７】
T. mentagrophytes感染実験においては、感染後3〜8日後の患部への1％シッカニン含有サリチル酸グリコール軟膏塗布により８５−１００％の検体の皮膚が完治した（N=20（非特許文献１９））。臨床検査後に皮膚感染症治療剤として実用化され、第一三共株式会社（旧三共株式会社）により2005年まで販売されていた。シッカニンはT. mentagrophytesミトコンドリアのNADHおよびアスコルビン酸依存型酸素消費を阻害しない一方、呼吸鎖複合体II活性を強力に阻害する（IC50 = 87 nM（非特許文献２０））。【００１８】
加えて近年、新たにシッカニンの特殊な種選択的阻害効果が見出された（非特許文献２１）。シッカニンは緑膿菌（IC50 = 0.87 μM）およびラット（IC50 = 9.3 μM）複合体IIに対して阻害効果を示し、大腸菌（IC50 = 268 μM）および豚（IC50 = 861 μM）複合体IIに対しては示さない。緑膿菌膜画分を用いたカイネティクスでは、シッカニンの阻害様式はキノンに対して混合阻害と予想され、複合体IIとの作用部位はキノン結合部位と推定された。【００１９】
本発明は、上記知見に基づいて完成されたものである。【００２０】
即ち、本発明は、シッカニン又はその修飾された誘導体から選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含む駆虫剤或いは駆虫用組成物を提供する。【００２１】
当該駆虫剤或いは駆虫剤組成物は、医薬、動物医薬、農薬、魚類用医薬として使用することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の駆虫剤は、ヒト、ヒト以外の動物、魚類等の幅広い生物における寄生虫感染に対する予防及び治療剤として極めて有用である。更に、本発明の駆虫剤は、農園芸用の駆虫剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】シッカニンによる A. suum 呼吸鎖複合体II阻害様式を示すグラフである。デシルユビキノンに対するシッカニンの A. suum SQR 活性阻害をラインウェーバープロットで示した。シッカニン濃度は20 nM、10 nM、5 nM、0 Mで、直線群の交点の位置から阻害機構は混合阻害と推定される（Ki1 = 3.0nM、Ki2 = 8.7nM）。
【図２】シッカニンによる L. tarentolae 呼吸鎖複合体II阻害様式を示すグラフである。ユビキノン１に対するシッカニンの L. tarentolae SQR 活性阻害をラインウェーバープロットで示した。シッカニン濃度は500 nM、250 nM、125 nM、0 Mで、直線群の交点の位置から阻害機構は混合阻害と推定される（Ki1 = 39 nM、Ki2 = 102 nM）。
【図３】シッカニン-A. suum複合体II結合モデルを示す図である。フルトラニル-A. suum複合体II 共結晶(3VR9)を元に、シッカニンとA. suum複合体II結合モデルをインシリコで作成した。サブユニット第197トリプトファンおよびCybSサブユニット第107タイロシンとの間で水素結合が推定された他、CybLサブユニット第76アルギニン残基近傍にπ電子キャリアーであるベンゼン環構造が存在していた。さらにCybLサブユニット題73グリシン残基とシッカニン第7位メチル基が2.9Åの位置にあり、疎水性相互作用形成の可能性を示唆している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は以下の駆虫剤又は寄生虫を駆除する方法の開示を包含する。
[１]
シッカニン又はその修飾された誘導体から選択された少なくとも１種の化合物を有効成分として含む駆虫剤。
[２]
シッカニンが糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産する物質である[１]記載の駆虫剤。
[３]
シッカニンが化学的に合成された化合物である[１]記載の駆虫剤。
[４]
医薬用として使用する[１]ないし[３]のいずれか１項記載の駆虫剤。
[５]
動物用医薬として使用する [１]ないし[４]のいずれか１項記載の駆虫剤。
[６]
農薬として使用する[１]ないし[３]のいずれか１項記載の駆虫剤。
[７]
魚類用医薬としてとして使用する[１]ないし[４]のいずれか１項記載の駆虫剤。
[８]
寄生虫を保有する宿主に[１]ないし[７]のいずれか１項記載の駆虫剤を投与する工程を含む寄生虫を駆除する方法。
【００２５】
本発明において使用されるシッカニンは、ライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が産生する白色〜淡黄色の結晶で、下記式で示される化合物である。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
シッカニンは、抗真菌性抗生物質として、汗疱状白癬、頑癬、斑状小水泡性白癬等の皮膚糸状菌症の治療に外用剤として使用されているが、これまで駆虫剤として有用であることは全く知られていなかった。
【００２８】
本明細書において、「駆虫剤」及び「駆虫用組成物」は同じ意味を表す。
【００２９】
本明細書において、「シッカニンあるいは化学的に合成された化合物又は修飾された誘導体」とは、ライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）から得られた天然のシッカニン、化学的に合成されたシッカニン、又は天然のシッカニン若しくは化学的に合成されたシッカニンの任意の誘導体（シッカニンの塩を含む）を意味する。なお、本発明において使用されるシッカニンは、天然のシッカニンでも合成のシッカニンでも良い。シッカニンの任意の誘導体の例としては、シッカニンの塩、例えば、シッカニンのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびアンモニウム塩、シッカニンのエステル、例えば、シッカニンと酢酸、プロピオン酸、酪酸、アクリル酸、および安息香酸とのエステル、等が挙げられる。
【００３０】
本明細書において「シッカニン又はその修飾された誘導体」は、上記「シッカニンあるいは化学的に合成された化合物又は修飾された誘導体」と同じ意味を有する。
【００３１】
本明細書において、「シッカニン」は、天然のシッカニン又は合成のシッカニンを包含する。
【００３２】
本明細書において、「本発明の化合物」とは、シッカニンあるいは化学的に合成された化合物又は修飾された誘導体を意味する。
【００３３】
本発明はまた、本発明の化合物又はその塩を活性成分として含有する、抗蠕虫と抗原虫作用とを併せ持つ駆虫用医薬組成物を提供する。本発明の化合物は単剤で抗蠕虫作用と抗原虫作用を有することを特徴とする。従って、前記医薬組成物は、活性成分として本発明の化合物又はその塩のみが含まれるものであることが好ましい。また、前記医薬組成物は活性成分として他の駆虫剤を更に含むものであってもよい。他の駆虫剤としては、蠕虫症への治療薬としてはレバミゾール、ピランテル、ベンズミダゾール系のアルベンダゾールやメベンダゾール、大環状ラクトン系のアベルメクチン、ミルベマイシン、等が挙げられる。また、抗マラリア薬としてはクロロキン、メフロキン、サルファドキシン、アルテミシニン、アフリカ睡眠病においてベンズニダゾール、スラミン、メラルソプロール、ニフロチモックス、エフロルニチン、シャーガス病においてベンズニダゾール及びニフロチモックス、リーシュマニア症においてGlucantime、Pentaptom、アンホテリシンB、ミルテホシン、パラモマイシン等が、それぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の化合物又はその塩を医薬として用いるにあたっては、予防または治療目的に応じて各種の投与形態を採用することが可能である。例えば、投与剤型としては経口用固形製剤（例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤及びカプセル剤）、経口用液体製剤（例えばドライシロップ剤、シロップ剤、内服液剤及びエリキシル剤）、注射剤（例えば皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤）、寄生虫の種類によっては皮膚塗布剤等が挙げられる。これらの医薬は活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体等を適宜含有し得る。
【００３５】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、コーンスターチ、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビット、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、アラビアゴム、トラガント、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニールピロリドン等が用いられ、崩壊剤としては、ゼラチン末、結晶セルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、カンテン末、カルボキシメチルセルロース、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては、シリカ、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等の添加することを認められているものを、矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００３６】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味・矯臭剤としては、上記に挙げられたものでよく、緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム等が、安定剤としては、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３７】
注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤および緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００３８】
皮膚塗布剤としては、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、パップ剤、プラスター剤、パッチ剤等が挙げられる。軟膏、クリーム剤およびジェル剤として使用する場合は、担体として油脂性基剤、乳剤性基剤等を用いる。油脂性基剤としては、油脂、ロウ類、炭化水素、脂肪酸、アルコール類、アルキルグリセリルエーテル、エステル類、シリコン油・フッ素油、多価アルコール類等が挙げられる。油脂としては、植物性及び動物性油脂が幅広く使用されている。植物油としては、オリーブ油、サフラワー油、パーシック油、ククイナッツ油、小麦胚芽油、コメヌカ油、コメ胚芽油、月見草油ハイオレックヒマワリ油、マカデミアナッツ油、メドウホーム油等が挙げられ、動物油としては、牛脂、硬化油、卵黄脂肪油が挙げられる。
【００３９】
ロウ類は高級脂肪酸と高級アルコールのエステル（ロウエステル）を主成分としている。エステル体を構成する炭素数はＣ１２〜Ｃ３４と幅広く使用される。動物系としては、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、セラックロウ、液状のオレンジラフィー油が挙げられ、植物系ではカルナウバロウ、キャンデリラロウ、液状のホホバ油が挙げられる。
【００４０】
炭化水素としては、たとえば鎖式炭化水素や、種々の炭化水素の混合物である流動パラフィン、分岐状パラフィン、固形パラフィン、ワセリン等が挙げられる。
【００４１】
脂肪酸としては、天然及び合成脂肪酸がある。例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシル酸等が挙げられる。
【００４２】
アルコール類としては、例えばＣ８〜Ｃ３２程度の高級アルコール、すなわちカプリリルアルコール、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ベヘイルアルコール、セリルアルコール、ラクセリルアルコール等が挙げられる。また、動植物性のステロール類も挙げられる。
【００４３】
アルキルグリセリルエーテルとしては、バチルアルコール、キミルアルコール、セラキルアルコール、イソステアリルグリセリルエーテル等が挙げられる。
【００４４】
エステルは、脂肪酸とアルコールの脱水反応によって得られる化合物である。直鎖の脂肪酸と低級アルコールとのエステルとしては、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル等が挙げられ、直鎖脂肪酸と直鎖高級アルコールとのエステルはパルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル等が挙げられる。直鎖脂肪酸と分鎖高級アルコールのエステルは、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル等が挙げられ、直鎖脂肪酸と多価アルコールのエステルは、中鎖脂肪酸トリグリセリドが挙げられる。分岐脂肪酸と低級アルコールのエステルとしては、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ブチル等が挙げられ、分岐脂肪酸と直鎖高級アルコールのエステルとしては、２−エチルへキサン酸セチル、２−エチルへキサン酸ステアリルが挙げられる。分岐脂肪酸と直鎖高級アルコールのエステルや、分岐脂肪酸と分岐高級アルコールのエステルとしては、イソステアリン酸磯セチル、ジメチルオクタン酸オクチルドデシル等が挙げられる。その他、ヒドロキシカルボン酸とアルコールのエステルとしては、乳酸ミリスチル、クエン酸トリオクチルドデシル、リンゴ酸ジイソステアリル等が挙げられる。
【００４５】
シリコン油としては、ジメチルシリコン油、メチルフェニルシリコン油、環状ジメチルシリコン油、メチルハイドロジェンシリコン油や変性シリコン油が挙げられ、フッ素油としては、パーフルオロポリエーテルが挙げられる。
【００４６】
多価アルコール類としては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、3-メチル−1，3−ブタンジオール、1，3−ブチレングリコール等が挙げられる。
【００４７】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき本発明化合物の量は、これを適用すべき患者の症状により、あるいはその剤形等により一定ではないが、一般に投与単位形態当たり、経口剤では約１〜１２００ｍｇ、注射剤では約０．１〜５００ｍｇ、皮膚塗布剤としては約１〜５％とするのが望ましい。また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日当たり約０．１〜５０００ｍｇ、好ましくは１〜１２００ｍｇとすればよく、これを１日１回または２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下に、実施例により本発明を更に詳しく説明する。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００４９】
［実施例１］
［シッカニンの寄生虫呼吸鎖複合体II阻害作用］
豚回虫 A. suum、犬糸状虫Dirofilaria immitis, 捻轉胃虫Haemonchus contortus、アニサキスAnisakis simplex、シャーガス病病原体T. cruzi、アフリカトリパノソーマ症病原体の亜種Trypanosoma brucei brucei、非病原性トリパノソーマ科リーシュマニア属原虫Leishmania tarentolae、熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumの呼吸鎖複合体IIに対するシッカニンの阻害活性を測定した（表１）。阻害強度の評価は酵素活性の50％阻害濃度（IC50）による。【００５０】
まず A. suum成虫複合体IIを用いてシッカニンの阻害効果を測定したところ、そのIC50は5.7 nMであった。ヒトを始めとする大型哺乳類由来複合体IIに対するシッカニンの副作用の目安として、ブタ複合体IIに対するシッカニンのIC50と比較すると、A. suum に対する選択性は180000倍と推定される。これは先に知られていた A. suum複合体IIの選択的阻害剤フルトラニルの選択性の約２０倍であり（非特許文献８）、報告されている回虫複合体IIの阻害剤で最大の値である。【００５１】
D. immitis、H. contortus、A. simplexに対するシッカニンのIC50は、それぞれ13.8 nM、18.2 nM、11.2 nMであり、ブタ複合体IIに対する選択性は６２３９１倍、４７３０８倍、７６８７５倍であった。また、T. cruzi、T. brucei、L. tarentolae のトリパノソーマ科原虫3種に対するシッカニンのIC50は、それぞれ1200 nM、396 nM、190 nMであり、ブタ複合体IIに対する選択性は７１８倍、３１８９倍、４５３２倍であった。さらに、シッカニンはマラリア原虫 P. falciparum の複合体IIを98 nMのIC50で阻害した。トリパノソーマ科原虫の複合体IIを哺乳類に対して選択的に阻害する化合物は、本研究で見出したシッカニン以外にこれまで報告されていない。既存のトリパノソーマ症治療薬、特にシャーガス病治療薬は副作用の重篤さが投薬治療の継続性の点で大きな問題となっており、代替の治療薬の開発が強く求められてきた。今回報告するシッカニンは3大トリパノソーマ症の病原体 T. cruzi、T. brucei 及びリーシュマニア属原虫の複合体IIを大型哺乳類（ブタ）に対して極めて高い選択性で阻害しており、副作用の観点から優れた抗トリパノソーマ症薬剤の可能性が高いことが判明した。【００５２】
【表１】
2015056768.tif 000003
【００５３】
［実施例２］
［線虫およびトリパノソーマ科原虫複合体IIに対するシッカニンの阻害機構］
シッカニンの複合体II阻害機構推定のため、コハク酸及びキノンを基質として用いたラインウェーバー・バーグプロット阻害様式決定を行った。測定標品は A. suum 由来の線虫複合体II と、トリパノソーマ科原虫の中で取り扱いが容易な L. tarentolae 由来複合体IIを用いた。まずシッカニンの A. suum 呼吸鎖複合体II阻害様式はキノンに対して混合阻害であった一方（Ki1 = 5.2 nM、Ki2 = 9.9 nM）（図1）、コハク酸に対しては非競合阻害であった。L. tarentolae 複合体IIについても、シッカニンはキノンに対する混合阻害様式を示した（L. tarentolae：Ki1 = 39 nM、Ki2 = 102 nM）（図2）。いずれの場合においても、シッカニンの複合体II単体に対するKi（Ki1）は呼吸鎖複合体II−ユビキノンの複合体に対するKi（Ki2）よりも低く、シッカニンの複合体IIに対する親和性がユビキノンの結合により低下していることが示唆された。さらに、これらの酵素に対してキノンの代わりに人工基質PMSおよびMTTを用いたコハク酸脱水素酵素(SDH)反応の活性測定を行った所、50 μMのシッカニン存在下でも活性の阻害効果が認められなかった。SDH活性は複合体IIのFp及びIpサブユニットのみを触媒とし、キノン結合部位は反応に必須ではない。これらの結果から、シッカニンの複合体IIに対する結合部位はキノン結合部位周辺であると推定される。【００５４】
［実施例３］
［A. suum複合体II-シッカニン複合体立体構造モデル］
シッカニンと呼吸鎖複合体IIの複合体は現時点で立体構造の解析が報告されておらず、直接シッカニンの結合様式を原子レベルで解明することはできていない。そこでシッカニンがキノン結合部位における複合体IIの阻害剤であることに着目し、既にpdbファイルが登録されている A. suum複合体IIとキノン系阻害剤の共結晶を元にシッカニンの結合様式のモデルを作成した（図3）。In silico でのドッキング計算の結果、フルトラニルとの共結晶（非特許文献２２、２３）で結合化合物とシッカニンの座標が最もよく適応された。【００５５】
A. suum複合体II−フルトラニル複合体において、阻害剤の結合部位はIpサブユニット第197トリプトファン、CybSサブユニット第107タイロシン、CybLサブユニット第69トリプトファンと第76アルギニンで形成されることがわかっている。フルトラニルの選択性はこのCybLサブユニット第69トリプトファンおよび第76アルギニン残基における回虫特異的なπ相互作用によってもたらされる（非特許文献８、２３）。【００５６】
ドッキングモデルにおける A. suum複合体IIとシッカニンの結合様式は、フルトラニルの場合と類似し、Ipサブユニット第197トリプトファンおよびCybSサブユニット第107タイロシンとの間で水素結合が推定された他、CybLサブユニット第76アルギニン残基近傍にπ電子キャリアーであるベンゼン環構造が存在していた。一方で、CybLサブユニット第69トリプトファン近傍にはシッカニン構成原子は配置されておらず、π相互作用は予測されなかった。シッカニン特異的な結合としては、シッカニン7位メチル基とCybLサブユニット第73グリシン残基の間で疎水性相互作用が予測される。ブタ複合体II（非特許文献２４）においてはこのグリシンがより大きな側鎖を持つイソロイシンに置き変わっており、この部位における立体障害がブタ複合体IIに対するシッカニンの低感受性を生んでいる可能性が示唆される。【００５７】
［実施例４］
［シッカニンの抗ミクロフィラリア効果］
シッカニンは表１に示すとおりブタ回虫と同様に犬糸状虫の複合体IIをIC50 = 13.8 nMで阻害した。さらにシッカニンの抗線虫効果を犬糸状虫のミクロフィラリア期を用いて評価を行った。その結果、シッカニン5μM存在下においてはコントロールとして用いたイベルメクチン 5μMと同様の効果を示し、50μM存在下においてはイベルメクチンよりはるかに強力にミクロフィラリアの運動性を阻害した（表２）。【００５８】
【表２】
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【００５９】
［実施例５］
［シッカニンの抗原虫効果］
シッカニンはトリパノソーマ科原虫、マラリア原虫の複合体IIをnMオーダーのIC50で阻害する。これを踏まえ、本研究では更にシッカニンが寄生虫の増殖に対して与える影響を測定した（表３）。使用した生物種は非病原性リーシュマニア原虫 L. tarentolae 昆虫内型（promastigote）、皮膚リーシュマニア症病原体 L. major 昆虫内型、内蔵リーシュマニア症病原体 L. donovani 昆虫内型、アフリカ睡眠病の病原体の近縁種 T. b. brucei血内型、シャーガス病病原体 T. cruzi 細胞内型（amastigote）、マラリア原虫 P. falciparum 血内型である（表３）。T. brucei 血内型および T. cruzi amastigote は哺乳類宿主内のステージに相当しており、アフリカトリパノソーマ症及びシャーガス病において薬剤治療の標的となる形態である。【００６０】
0.05〜50 μMシッカニンの存在下で L. tarentolae promastigote、L. donovani promastigote、L. major promastigote、T. brucei 血内型の増殖をアラマブルー法により測定した。ここで算出されたシッカニンIC50は L. tarentolae が4.4 μM、L. donovani が700 nM、L. major が13 μM、T. b. bruceiが8.3 μMであった（表３）。シッカニンの T. cruzi に対する増殖阻害効果の評価は、マウス細胞内に感染した T. cruzi amastigote の計数によって行った。DMSOコントロールと比較して、10 μMのシッカニン存在下で細胞内の原虫数は50%低下した。これに加え、シッカニンは P. falsiparum 増殖に対する弱い阻害効果を示した。IC50はLDHアッセイ法によって算出され、その値は15.53 μMである。【００６１】
【表３】
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【００６２】
［実施例６］
［既存のトリパノソーマ症治療薬とシッカニンのin vitro細胞増殖効果の比較］
現在リーシュマニア症治療薬として用いられている薬剤のうち、最も抗原虫作用が強いのは静脈注射摂取によるアンホテリシンBであり、そのIC50はL. donovani promastigoteに対して約12 nM、L. major の promastigote に対して約43 nMである（非特許文献２５）。しかしアンホテリシンBを始めとする注射薬は副作用が強く、代替薬剤が求められている。現状リーシュマニア症治療薬で唯一経口摂取薬であるミルテホシンのIC50はL. donovani promastigoteに対して〜450 nM、L. major のpromastigoteに対して約13.1 μMと報告されている（非特許文献２５）。これらの薬剤はいずれも耐性株が報告されており、現在は合剤による治療法が広く用いられている。シャーガス病の治療薬として用いられているベンズニダゾールとニフロチモックスは、T. cruzi amastigote に対してin vitro で約22 μM及び約3.5 μM（非特許文献２６）のIC50で阻害効果を示すことが知られている。これらの薬剤は静脈注射によって投与され、極めて強い副作用を持つ。アフリカ睡眠病の主要な治療薬であるスラミン、ペンタミジン、メラルソプロールの in vitro におけるIC50は、T. brucei rhodensiense 血内型に対してそれぞれ15 nM、0.6 nM、7 nMで、T. brucei gambiense 血内型に対してそれぞれ349 nM、0.9 nM、4 nMとなっている（非特許文献２７）。【００６３】
実施したシッカニンの病原性リーシュマニア原虫に対するIC50はアンホテリシンBの数十倍で、ミルテホシンと同等である。T. cruzi amastigote に対するIC50はニフロチモックスの2倍、ペンタミジンの約半分であった。すなわちin vitroの段階において、シッカニンは既存のリーシュマニア症およびシャーガス病治療薬と遜色ない抗原虫効果を示している。対して T. brucei に対するシッカニンのIC50は既存のスラミン、ペンタミジン、メラルソプロールと比べて大きな値を示している。しかしこれらの副作用が強い化合物に比べ、シッカニンは標的酵素に対して高い選択性を示すため、既存の化合物より副作用の少ない新規薬剤となる可能性がある。加えてシッカニンは4つの環状炭素の連なった複雑な骨格を持ち、既存のトリパノソーマ薬剤の属するアンチモン系、フォスファチジルコリン系、アゾール系、アミノキノリン系化合物と大きく異なる構造を有する。既存の薬剤に耐性株が存在する事を考慮すれば、シッカニンの特殊な構造は薬剤治療において大きな利点となり得る。【００６４】
結論
上記実施例から明らかなように、抗菌薬であるシッカニンの抗寄生虫薬としての性質が初めて明らかになった。シッカニンは極めて選択的な寄生虫呼吸鎖複合体IIの阻害剤であり、線虫およびトリパノソーマ科原虫の酵素を強力に阻害する一方、哺乳類ではほぼ効果を示さない。加えてシッカニンはアフリカトリパノソーマ症、シャーガス病、リーシュマニア症、熱帯熱マラリアといった多様な寄生虫症の病原体に対して増殖阻害効果を示し、さらに線虫に対しても発育阻害効果を示した。すなわちシッカニン及びその修飾された誘導体は、哺乳類に対して副作用が低く、かつ複数の原虫症と寄生性線虫症を作用スペクトルに持つ例のない抗寄生虫薬となり得る化合物である。【００６５】
以下に本発明の駆虫剤の製剤例を示す。【００６６】
製剤例１ 錠剤
【表４】
2015056768.tif 000006
上記配合割合で、常法に従い、１錠当たり100mgの錠剤を調製した。【００６７】
製剤例２ 顆粒剤
【表５】
2015056768.tif 000007
上記配合割合で、常法に従い、１包当たり1000mgの顆粒剤を調製した。【００６８】
製剤例３ カプセル剤
【表６】
2015056768.tif 000008
上記配合割合で、常法に従い、１カプセル当たり96.5mgのカプセル剤を調製した。【００６９】
製剤例４ 注射剤
【表７】
2015056768.tif 000009
上記配合割合で、常法に従い、注射剤を調製した。【００７０】
製剤例５ シロップ剤
【表８】
2015056768.tif 000010
上記配合割合で、常法に従い、シロップ剤を調製した。【００７１】
製剤例６ 錠剤
【表９】
2015056768.tif 000011
上記配合割合で、常法に従い、１錠当たり120 mgの錠剤を調製した。【００７２】
製剤例７ 軟膏剤
【表１０】
2015056768.tif 000012
上記配合割合で、常法に従い、1%軟膏剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明者らによって抗菌薬（抗真菌薬）として使用されているシッカニンが、ヒト、ヒト以外の動物、魚類等の幅広い生物における寄生虫感染に対する予防及び治療剤として使用できることが明らかにされた。【００７４】
本発明は、有効成分としてシッカニンおよびその修飾された誘導体から選択される少なくとも１種の化合物を含有する駆虫剤、即ち駆虫用組成物を提供するものであり、上で詳細に説明したように極めて顕著な効果を有する。しかも、本発明の駆虫剤は、医薬、動物用医薬、農薬、及び魚類用医薬として多方面で使用することができる。かかる本発明は、産業上極めて有用な発明である。
【図１】
2015056768.tif 000013
【図２】
2015056768.tif 000014
【図３】
2015056768.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月29日(2016.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シッカニンを有効成分として含む、寄生虫に対する医薬として使用する駆虫剤。
【請求項２】
シッカニンが糸状菌であるライグラス斑点病菌（Helminthosporium siccans）が生産する物質である請求項１記載の駆虫剤。
【請求項３】
シッカニンが化学的に合成された化合物である請求項１記載の駆虫剤。
【請求項４】
前記寄生虫が、A. suum、D. immitis、H. contortus、A. simplex、T. cruzi、T. b. brucei、L. tarentolae、又はP. falciparumである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の駆虫剤。
【請求項５】
ヒト又はヒト以外の動物用の医薬として使用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の駆虫剤。
【請求項６】
経口投与又は静脈注射するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の駆虫剤。
【請求項７】
寄生虫を保有する宿主に請求項１〜６のいずれか１項に記載の駆虫剤を投与する工程を含む寄生虫を駆除する方法。
【国際調査報告】
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