(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質を準備するステップであって、前記ＨＩＦ１−αタンパク質の３０番目の残基は、アルギニンからグルタミン残基に置換されたものであるステップと、
前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質の複合体に、前記ＳＥＴ７／９を活性化させると期待される試験物質を処理するステップであって、前記ＳＥＴ７／９の活性化は、ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基のメチル化で測定されるステップと、
前記３２番目の残基におけるメチル化を検出するステップと、
前記メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合において、前記３２番目の残基にメチル化が増加した場合に、前記試験物質を候補物質として選別するステップとを含む、血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１(Lysine Specific demethylase １)タンパク質を準備するステップであって、前記ＨＩＦ１−αタンパク質は、配列番号１の配列を基準として３０番目の残基がアルギニンからグルタミン残基に置換され、３２番目のリシン残基にメチル化されているステップと、
前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１タンパク質の複合体に、前記ＬＳＤ１の活性を抑制すると期待される試験物質を処理するステップであって、前記ＬＳＤ１の活性化は、前記ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基の脱メチル化で測定されるステップと、
前記３２番目の残基における脱メチル化を検出するステップと、
前記脱メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合において、前記３２番目の残基の脱メチル化が減少した場合に、前記試験物質を候補物質として選別するステップとを含む、血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ＨＩＦ１−αタンパク質またはＳＥＴ７／９タンパク質は、前記タンパク質を発現する細胞またはヒトを除く動物の形態で準備されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、ＨＥＫ−２９３Ｔ(human embryonic kidney cell)、ＨｅＬａ(human cervical cancer cell)またはＭＤＡ−ＭＢ２３１(human breast cancer cell)である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化は、前記ＨＩＦ１−αタンパク質のヒドロキシル化および前記ＨＩＦ１−αタンパク質のＶＨＬへの結合に非依存的なものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記血管新生抑制剤は、網膜症または癌治療剤または癌の転移抑制剤として使用されるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１タンパク質は、前記タンパク質を発現する細胞またはヒトを除く動物の形態で準備されるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、ＨＥＫ−２９３Ｔ(human embryonic kidney cell)、ＨｅＬａ(human cervical cancer cell)またはＭＤＡ−ＭＢ２３１(human breast cancer cell)である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＦ−１αのメチル化を標的とする血管新生抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低酸素−誘導因子−１（hypoxia-induciblefactor-1；ＨＩＦ−１）は、低酸素関連の反応を媒介し、血管新生性、侵入および代謝に関連する遺伝子の発現を調節する。ＨＩＦ−１は、異種性二重の転写因子で酸素調節されるα小単位（ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２α）と、コンスティテューティブに発現するβ小単位（ＨＩＦ−１β）とから構成されている。ＨＩＦ−１α／βヘテロダイマーは正常酸素条件では不安定であり、ＨＩＦ−１αは低酸素環境では安定化する。
【０００３】
ＨＩＦ−１αは、内皮細胞のマスター調節因子であるＶＥＧＦを直接的に調節することにより、病理生理学的な血管生成において重要な役割を果たす。マウスでＨＩＦ−１αの機能が獲得されると、ＶＥＧＦ、微細血管の密度、肉腫成長および血管形成の発現を増加させ、マウスでＨＩＦ−１αの機能が損失すると、肉腫成長および血管形成を抑制する(Ravi,R.et al.Regulation of tumor angiogenesis by p53-induceddegradation of hypoxia-inducible factor1alpha.Gene.Dev.14,34-44(2000);Stoeltzing,O.et al.Role of hypoxia-induciblefactor 1alpha in gastric cancer cell growth,angiogenesis、およびvessel maturation.J.Natl.Cancer Inst.96,946-956(2004))。
【０００４】
韓国公開特許番号第１０−２０１５−００１８４５７号は、「プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤またはヒストン脱アセチラーゼ阻害剤、および抗生剤を含む骨疾患の予防または治療用薬学的組成物」に関するもので、プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤を用いてＨＩＦ−１αを安定化させて癌治療をする方法が公開されている。
【０００５】
韓国公開特許番号第１４９２４３５号は、「ＨＩＦ−１α  ｓｉＲＮＡを有効成分として含有するＴＳＬＰによって媒介される疾患の予防または治療用薬剤学的組成物」に関するもので、ｓｉＲＮＡを用いてＨＩＦ−１αの活性を抑制することで、ＨＩＦ−１α関連疾患の治療を目的としている。
【０００６】
しかし、ＨＩＦ−１αの様々な転写後修飾のうち、ＨＩＦ−１αのメチル化の機序および生理的な役割はよく明らかにされておらず、前記機序の究明およびそれに基づく血管新生抑制剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なＨＩＦ−１αのメチル化の機序を標的とする血管新生抑制剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一様態において、本願は、ＨＩＦ１−αタンパク質のメチル化の調節による血管新生抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
一実現例において、本願による方法は、ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質を準備するステップ；前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質の複合体に、前記ＳＥＴ７／９を活性化させると期待される試験物質を処理するステップで、前記ＳＥＴ７／９の活性化は、ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基のメチル化で測定され；前記３２番目の残基におけるメチル化を検出するステップ；並びに前記メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記３２番目の残基にメチル化が増加した場合、前記試験物質を候補物質として選別するステップを含む。
【００１０】
他の実現例において、本願による方法に使用されるＨＩＦ１−αタンパク質は、配列番号１の配列を基準として３０番目の残基がアルギニンからグルタミンまたはこれと化学的に同等の残基、例えば、側鎖にアミド基を有するアスパラギンに置換されたものが使用できる。特定の癌において前記３０番目の残基で突然変異が発生し、本願では、この場合、３２番目の残基におけるメチル化が減少することを究明した。
【００１１】
さらに他の実現例において、ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１(LysinSpecific demehtylase)タンパク質を準備するステップで、前記ＨＩＦ１−αタンパク質は、配列番号１を基準として３２番目のリシン残基にメチル化されており、前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１タンパク質の複合体に、前記ＬＳＤ１の活性を抑制すると期待される試験物質を処理するステップで、前記ＬＳＤ１の活性化は、前記ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基の脱メチル化で測定され、前記３２番目の残基における脱メチル化を検出するステップ；並びに前記脱メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記３２番目の残基の脱メチル化が減少した場合、前記試験物質を候補物質として選別するステップを含む。
【００１２】
本願による方法に使用されるタンパク質は、これを発現する細胞または動物の形態で発現でき、タンパク質の発現のためにこれをコーディングする遺伝子を細胞または動物に伝達することを含む。
【００１３】
本願によるスクリーニング方法で選別された物質は、血管新生に関連する多様な疾患、例えば、網膜症、癌、特に癌の転移を抑制、治療に有用に使用できる。
【００１４】
本願によるスクリーニング方法は、従来知られたＨＩＦ１−αタンパク質のヒドロキシル化およびＨＩＦ１−αタンパク質のＶＨＬへの結合とは独立した、すなわち非依存的な方法である。従来、ＨＩＦ−１ａの調節機序としてヒドロキシル化を用いた薬物の開発は進んだものの、本願による新たな機序に基づく薬物の開発は、従来の薬物に反応しない癌や、従来開発された薬物と共にカクテル療法に適用されて、ＨＩＦ−１ａに依存的な多様な癌をより効果的に治療するのに有用に使用されるであろう。
【発明の効果】
【００１５】
本願で究明されたＨＩＦ−１αの特定残基におけるメチル化および脱メチル化に関与するタンパク質および機序を用いた血管新生抑制剤のスクリーニング方法は、癌の成長と転移を防止可能な物質の開発に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＳＥＴ７／９によってＨＩＦ−１αのＫ３２にメチル化が起こることを示すものである。（ａ）ＨＩＦ−１αの潜在的ＳＥＴ７／９標的サイトがあることを明らかにした。（ｂ）Ｍａｓｓ分析によりＨＩＦ−１α  Ｋ３２サイトでメチル化が起こることを確認した。（ｃ）ｃｏ−ＩＰによりＨＩＦ−１αとＳＥＴ７／９とが相互作用することを確認した。ＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況とで比較した。（ｄ）ＨＩＦ−１α  ＷＴとＫ３２Ａ、ＳＥＴ７／９ＷＴとＳＥＴ７／９酵素活性のないＨ２９７Ａをもってインビトロメチル化実験を行った。（ｅ）ＨｅＬａ細胞でメチル化されたリシンを認知する抗体を用いてＨＩＦ−１αのメチル化を確認した。ＳＥＴ７／９ＷＴとＨ２９７Ａが発現する状況で確認した。（ｆ）ＷＴ  ＭＥＦとＳｅｔ７／９−／−ＭＥＦでＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況とでＨＩＦ−１αのメチル化を確認した。（ｇ）ＨＩＦ−１α抗体で免疫沈降を行った後、ＨＩＦ−１α−ｍｅ抗体で免疫ブロットをした。（ｈ）ＨｅＬａ細胞株から核と細胞質とを分離した。そして、ＨＩＦ−１α−ｍｅ抗体でＨＩＦ−１αのメチル化を確認した。低酸素環境に定められた時間だけインキュベーションし、ＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況とで比較した。ラミン（Ｌａｍｉｎ）Ａ／Ｃを核マーカーとして、チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）を細胞質マーカーとして使用した。（ｉ）ＨｅＬａ細胞株にＨＩＦ−１α  ＷＴとＫ３２Ａを過発現させた。ＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況とで低酸素環境に定められた時間だけインキュベーションした後、Ｆｌａｇ抗体（赤）で染色した。核はＤＡＰＩ（青）で染色した。
【図２】図２は、ＬＳＤ１によるＨＩＦ−１αの脱メチル化がＨＩＦ−１αの安定性を増加させることを示すものである。（ａ）低酸素環境でＦｌａｇ  Ｍ２アガロースビーズを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＨＩＦ−１αと相互作用するタンパク質を精製した。相互作用するタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。（ｂ）ＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況とでＨＩＦ−１αとＬＳＤ１を共同−免疫沈降させた。（ｃ、ｄ）定められた時間だけ低酸素環境を処理した後、ＷＴ  ＭＥＦから得た核溶解物（ｌｙｓａｔｅ）でＬＳＤ１とＨＩＦ−１αのタンパク質の発現量を確認し（ｃ）、また、ＬＳＤ１  ｍＲＮＡを確認（ｄ）した。（ｅ）Ｌｓｄ１＋／−ＭＥＦとＬｓｄ１−／−ＭＥＦを低酸素環境にて６時間処理した後、核溶解物を得て、ＨＩＦ−１αタンパク質の量を確認した。（ｆ）Ｌｓｄ１−／−ＭＥＦにＬＳＤ１  ＷＴとＬＳＤ１酵素活性のないＫ６６１Ａを再び発現させた細胞株でＨＩＦ−１αタンパク質の量を確認した。（ｇ）Ｌｓｄ１＋／−ＭＥＦにパルギリン（ｐａｒｇｙｌｉｎｅ）を１２時間処理した後、低酸素環境にて６時間インキュベーションし、核にあるＨＩＦ−１αの発現量を確認した。（ｉ）ＨｅＬａ細胞株で特定抗体による免疫蛍光実験を行った。細胞はＭＧ１３２を処理した状況と処理していない状況それぞれ、低酸素環境にて６時間インキュベーションした後、実験した。（ｊ）ＨｅＬａ細胞で免疫ブロット実験を行った。（ｋ）ＨｅＬａ細胞株を低酸素環境に６時間インキュベーションした後、ＣＨＸ（２０ｍｇ／ｍｌ）を定められた時間だけ処理し、免疫ブロット実験でＨＩＦ−１αタンパク質を確認した。（ｌ）表示されたｐｌａｓｍｉｄをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＨｅＬａ細胞から得た溶解物をＮｉ２＋−ＮＴＡビーズで精製した。ＨＩＦ−１αのユビキチン化をＨＩＦ−１α抗体で確認した。（ｍ）ＭＧ１３２が処理された状況でＤＭＯＧを処理した状況と処理していない状況とでＨＩＦ−１α  ＷＴ、Ｋ３２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ａ／Ｋ３２Ａのヒドロキシル化を確認した。（ｎ）ＭＧ１３２が処理され、Ｆｌａｇ−ＨＩＦ−１α  ＷＴ、Ｋ３２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｐ２Ａ／Ｋ３２Ａが過発現した状況でＦｌａｇ抗体で沈殿させ、ＨＩＦ−１α−ｍｅ抗体で免疫ブロットを行った。（ｏ）ＨＩＦ−１α  ＷＴとＫ３２Ａ、Ｐ２Ａが過発現した状況でＳＥＴ７／９によるユビキチン化を確認した。ユビキチン化実験は（ｌ）の通りに行った。
【図３】図３は、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスでエリスロポエチン(erythropoietin)の発現が増加して血液学的に異常な表現型を呈することを示すものである。（ａ）Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスを作る過程を示すものである。部位−特異的変異(Site-directed mutagenesis)によりリシンをアラニンに代替し、この時、ＡｆｅＩサイトが生じるようにした。（ｂ）ＷＴ、Ｈｉｆ１ａ＋／ＫＡ、およびＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの遺伝型を分析した。Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ染色体はＡｆｅＩによって切断された。（ｃ）ＷＴ、Ｈｉｆ１ａ＋／ＫＡ、およびＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦでＨＩＦ−１αのメチル化を確認した。（ｄ）７日間ＰＢＳまたはＤＭＯＧを処理し、マウスの表現型を観察した。左側：足裏と鼻、中間：脾臓、右側：腹腔（ｅ）７日間ＰＢＳまたはＤＭＯＧを処理したマウスの肺と脾臓でＨＩＦ−１αの発現を確認した。（ｆ）ＷＴマウスとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスとで血液学的指標を比較した。ＲＢＣ：赤血球、Ｈｂ：ヘモグロビン、Ｈｃｔ：赤血球容積（ｇ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦでＶｅｇｆ−ａ、Ｇｌｕｔ−１、Ｅｐｏ  ｍＲＮＡの量を確認した。左側は低酸素環境にて定められた時間だけインキュベーションした後に比較し、右側はＤＭＯＧを処理し比較した。（ｈ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの肺でＶｅｇｆ−ａ、Ｇｌｕｔ−１、Ｅｐｏ  ｍＲＮＡの量を確認した。左側は低酸素環境で１４日間育てた後に比較し、右側はＤＭＯＧを７日間処理し比較した。
【図４】図４は、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦで細胞移動、コロニー形成、腫瘍成長がすべて増加することを示すものである。（ａ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦを表示された時間だけ低酸素環境にてインキュベーションした後、ＨＩＦ−１αタンパク質の量を確認した。（ｂ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦを６時間低酸素環境にてインキュベーションした後、ＣＨＸを処理し、ＨＩＦ−１αタンパク質の半減期を測定した。（ｃ）マウスを１０％酸素濃度に１４日間育てた後、マウスの肺で免疫ブロット実験を行った。（ｄ）ＭＥＦにＳＥＴ７／９とＬＳＤ１を過発現させた後、Scratch-cell motility実験を行った。表示された時間の間、低酸素環境でインキュベーションした。（ｅ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦを用いてtranswell cell migration実験を行った。一般酸素濃度環境または１２時間低酸素環境で実験した。（ｆ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦをもってanchorage independent細胞成長実験を行った。（ｇ）ＨＩＦ−１α  ｓｈＲＮＡが持続的に発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株にＨＩＦ−１α  ＷＴとＫ３２Ａを再び入れた後、ｘｅｎｏｇｒａｆｔ実験を行った。
【図５】図５は、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスで網膜血管生成が促進されることを示すものである。（ａ−ｄ）生まれて５日目のＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの生理学的網膜血管生成を示すものである。（ａ）５日目のマウスの網膜全体を固定してＣＤ３１とＨＩＦ−１α抗体で染色したものである。（ｂ−ｄ）血管の半径長さ、血管密度、ＨＩＦ−１αの染色程度などを比較した。（ｅ−ｊ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスのＯＩＲモデルで疾病学的網膜血管生成を示すものである。（ｅ）生まれて１７日目のＯＩＲモデルマウスの網膜全体を固定してＣＤ３１抗体で染色した。（ｆ、ｇ）血管が生成されない部分と新たに血管が生成された部分をＷＴマウスとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスとで比較した。（ｈ）１７日目のＯＩＲモデルマウスの網膜をｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４（ｉＢ４）とＶＥＧＦ  ＨＩＦ−１α抗体で染色した。（ｉ、ｊ）ＨＩＦ−１αとＶＥＧＦの染色程度を比較した。
【図６】図６は、ＨＩＦ−１α  Ｋ３２の修飾が腫瘍の成長と血管生成を促進することを示すものである。（ａ−ｌ）腫瘍細胞を移植して１８日後に摘出して組織学的分析を行った。（ａ）ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスで腫瘍の成長曲線を示すものである。（ｂ）腫瘍の重量の比較を示すものである。（ｃ）腫瘍をｓｅｃｔｉｏｎした後、Ｈ＆Ｅ染色を行った。黒い点線は腫瘍内の壊死した部分を意味する。（ｄ）腫瘍内の壊死程度を比較した。（ｅ、ｆ）腫瘍内部と腫瘍周辺のＣＤ３１で染色された血管を比較した。白い点線は腫瘍の境界を意味する。（ｇ、ｈ）腫瘍内の低酸素環境の部分を比較したものである。（ｉ、ｊ）腫瘍中心のＫｉ６７で染色された、増殖する細胞を比較したものである。（ｋ、ｌ）腫瘍中心でｃａｓｐａｓｅ３抗体で染色された、細胞死滅の起こる細胞を比較したものである。
【図７】図７は、ヒト癌におけるＨＩＦ−１αのメチル化の重要性を示すものである。（ａ）多様な癌患者と癌細胞株から知られたＨＩＦ−１αのｍｕｔａｔｉｏｎを示すものである。（ｂ、ｃ）ＳＥＴ７／９によるＨＩＦ−１αのメチル化とそれによる安定性の調節を確認した。（ｄ）ＨＩＦ−１α  ＷＴ、Ｋ３２Ａ、癌患者から知られたＨＩＦ−１αの突然変異などでインビトロメチル化実験を行った。（ｅ）Ｈｉｆ１α−／−ＭＥＦにＨＩＦ−１α  ＷＴとその他表示されたｍｕｔａｎｔを過発現させた後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ実験を行った。（ｆ）一般酸素濃度環境下、細胞質ではヒドロキシル化によってＨＩＦ−１αが分解されるが、ＳＥＴ７／９によるＨＩＦ−１αのメチル化は核内でヒドロキシル化とは独立して行われることを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願は、ＨＩＦ−１αが特定残基でＳＥＴ７／９メチルトランスフェラーゼによってメチル化されないか、リシン−特異的デメチラーゼ(Lysin-specific demethylase)によって脱メチル化されると、ＨＩＦ−１αの安定化が増加し、このようなＨＩＦ−１αの安定化によって血管生成が増加するという発見に基づくものである。
【００１８】
具体的には、本願では、特に核内でＨＩＦ−１αがＳＥＴ７／９メチルトランスフェラーゼと相互作用／結合して、ＳＥＴ７／９によって前記ＨＩＦ−１αの３２番目の残基位置にメチル化が行われると、ＨＩＦ−１αの安定性が減少して分解され、反面、ＨＩＦ−１αはさらにリシン−特異的デメチラーゼ１と相互作用／結合によって前記位置で脱メチル化されてＨＩＦ−１αの安定性が増加し、このような現象は癌の発生につながることを究明した。
【００１９】
本願で究明したＨＩＦ−１αのメチル化は、細胞質内でＨＩＦ−１αの安定化に寄与するプロリン残基におけるヒドロキシル化とは独立したものであり、長期間の低酸素条件で核内に移動して、ここでメチル化によって安定性が調節される（例えば、図７ｆの図式的に表示された機序参照）。特に、メチル化−欠乏Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ対立遺伝子を有するノックアウトマウスでは、メチル化によって安定性が増加したＨＩＦ−１αによって網膜の血管新生(retinal angiogenesis)と腫瘍血管化(tumourvascularization)が増加したことが分かった。
【００２０】
また、ヒトの癌で発生するＨＩＦ−１αの３２番目の残基（配列番号１の配列を基準とし、残基の位置を明確に表示するためのもので、前記配列に限定されるものではない）におけるメチル化が、２８番目の位置と３０番目の位置における突然変異（Ｓ２８Ｙ、Ｒ３０Ｑ）に関連していることを究明した。具体的には、２８、３０番目の残基に突然変異が発生した場合、３２番目のメチル化に影響を及ぼし、３２番目の残基でＳＥＴ７／９によるメチル化またはＬＳＤ１による脱メチル化を抑制する。
【００２１】
さらに、本願では、網膜や癌などのような疾患の進行に血管新生が伴う場合、３２番目の残基におけるメチル化または脱メチル化の調節によりＨＩＦ−１αの分解を促進して、前記のような疾患の血管生成を抑制することができる。したがって、ＨＩＦ−１αの３２番目の残基のメチル化を調節する物質は血管新生を抑制できるため、本願で究明された機序を用いて血管新生抑制剤をスクリーニングすることが可能である。
【００２２】
そこで、一様態において、本願は、本願で究明されたメチル化残基を含むＨＩＦ−１αタンパク質およびＳＥＴ７／９メチルトランスフェラーゼ、またはＨＩＦ−１αタンパク質およびＬＳＤ１デメチラーゼを標的とする血管新生抑制剤をスクリーニングする方法に関する。
【００２３】
一実現例において、前記方法は、ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質を準備するステップで、前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＳＥＴ７／９タンパク質の複合体に、前記ＳＥＴ７／９を活性化させると期待される試験物質を処理するステップで、前記ＳＥＴ７／９の活性化は、ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基のメチル化で測定され、前記３２番目の残基におけるメチル化を検出するステップ；並びに前記メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記３２番目の残基にメチル化が増加した場合、前記試験物質を候補物質として選別するステップを含む。
【００２４】
本願による方法に使用されるＨＩＦ−１αタンパク質は、３０番目の残基が野生型のアルギニンからグルタミンまたはこれと化学的に同等のアミノ酸、例えば、同じアミド残基を有するアスパラギンに置換されたものが使用され、グルタミンへの置換は特定の癌で発見される。
【００２５】
本願では、Ｒ３０Ｑ突然変異の場合には、ＳＥＴ７／９によって３２番目の残基におけるメチル化が阻害されて、メチル化の程度が野生型と比較して低くなることを究明した（図７ｄ参照）。したがって、前記突然変異を利用して当該抑制されたメチル化を再び戻す薬物は、前記突然変異を有する癌患者に有用に使用できる。
【００２６】
本願による方法を利用して究明された物質は、３２番目の残基のメチル化を増加させ、結局、ＨＩＦ１−αタンパク質を安定化させて、血管新生抑制剤としての発生および進行がそれに関連づけられている多様な疾患の治療に有用に使用できるであろう。
【００２７】
本願ではさらに、リシン−特異的デメチラーゼ１とＨＩＦ−１αとの相互作用／結合によって前記位置で脱メチル化されると、ＨＩＦ−１αの安定性が増加し、濃度が増加して癌が発生することを究明した。
【００２８】
したがって、他の様態において、本願は、ＬＳＤ１(LysinSpecific demehtylase1)タンパク質によってＨＩＦ１−αタンパク質の脱メチル化を抑制させる機序に基づく血管新生抑制剤をスクリーニングする方法に関する。
【００２９】
一実現例において、前記方法は、ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１(LysinSpecific demehtylase1)タンパク質を準備するステップで、前記ＨＩＦ１−αタンパク質は、配列番号１を基準として３２番目のリシン残基にメチル化されており、前記ＨＩＦ１−αタンパク質およびＬＳＤ１タンパク質の複合体に、前記ＬＳＤ１の活性を抑制すると期待される試験物質を処理するステップで、前記ＬＳＤ１の活性化は、前記ＨＩＦ１−αタンパク質における配列番号１の配列を基準として３２番目の残基の脱メチル化で測定され、前記３２番目の残基における脱メチル化を検出するステップ；並びに前記脱メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記３２番目の残基の脱メチル化が減少した場合、前記試験物質を候補物質として選別するステップを含む。
【００３０】
上述のように、３０番目の残基の突然変異は、ＳＥＴ７／９によるメチル化を抑制し、この場合、ＬＳＤ１もＨＩＦ１−αタンパク質に結合するという本願の結果（図２のａ、ｈ）に基づいて、脱メチル化も抑制すると判断され、したがって、前記方法において、ＨＩＦ１−αタンパク質における３０番目の残基がグルタミンまたは野生型でない他の残基、特にグルタミンと同等の化学的性質を有するアミノ酸、例えば、アスパラギンに置換されたものが使用できる。
【００３１】
ＬＳＤ１は、メチル化されたＨＩＦ１−αタンパク質を脱メチル化させ、結局、前記タンパク質を安定化させて血管新生を促進させて癌の発生を促進するため、本願で究明された残基におけるＨＩＦ１−αタンパク質の脱メチル化を抑制する物質は血管新生抑制剤として有用に使用できるであろう。
【００３２】
本願において、前記「ＨＩＦ１−α(hypoxia-induciblefactor-1)」は、低酸素関連の反応を媒介する異種性二重の転写因子で、酸素濃度によって調節されるα小単位（ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−２α）と、恒常発現するβ小単位（ＨＩＦ−１β）とから構成されており、ＨＩＦ−１αは低酸素環境では安定化する。ＨＩＦ−１αは、内皮細胞のマスター調節因子のＶＥＧＦを直接的に調節することにより、病理生理学的に血管を生成させる。
【００３３】
ＨＩＦ−１αの安定性の調節は、低酸素環境に適応するための重要なステップである。正常酸素条件では、ＨＩＦ−１αは、プロリルヒドロキシラーゼドメイン（prolyl hydroxylase domain；ＰＨＤ）−含有タンパク質１／２／３によってヒドロキシル化(hydroxylation)され、当該ヒドロキシル化されたＨＩＦ−１αをフォン・ヒッペル・リンドウ（von Hippel-Lindau；ＶＨＬ）腫瘍抑制タンパク質が認知して、カリン２（ｃｕｌｌｉｎ２）Ｅ３リガーゼ複合体によって分解される。反面、低酸素環境では、ＰＨＤは補助因子として酸素を使用し、ＰＨＤの酵素的活性は減少する。したがって、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化は減少し、ＨＩＦ−１αの安定化をもたらす。ヒドロキシル化のほか、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化およびリン酸化を含む他の転写後修飾がＨＩＦ−１αの機能を調節することが知られた。ＳＥＮＰ１がＨＩＦ−１αを脱ＳＵＭＯ化(desumoylation)し、ＨＩＦ−１αとＶＨＬとの間の相互作用を抑制して安定化する。ｐ３８によるＨＩＦ−１αのリン酸化は、局所貧血でＶＨＬへの結合を抑制して安定化に寄与する。これと対照的に、ＨＩＦ−１αのアセチル化は、ＶＨＬ−媒介ＨＩＦ−１αのユビキチン化を誘導することが分かった。
【００３４】
本願のＨＩＦ−１αのメチル化は、前記ＨＩＦ１−αタンパク質調節のためのヒドロキシル化およびＶＨＬへの結合とは独立した新たな調節機序である。本願による新たな機序に基づく薬物の開発は、従来の薬物に反応しない癌や、従来開発された薬物と共にカクテル療法に適用されて、ＨＩＦ−１αに依存的な多様な癌をより効果的に治療するのに有用に使用されるであろう。
【００３５】
本願によるＨＩＦ１−αまたはタンパク質の配列は、本願による効果を達成する限り、多様な形態およびそれ由来のものが使用できる。一実現例では、哺乳類、特にヒト来由のＨＩＦ１−αまたはこれと機能的に同等の変異体が使用され、そのタンパク質および核酸配列はそれぞれ配列番号１または２で表示されてもよいし、または、それぞれＮＰ＿００１５２１．１およびＮＭ＿００１５３０．３と公知である。本願による一実現例では、配列番号１のＨＩＦ１−αタンパク質の配列が使用される。また、上述のように、本願では、配列番号１の配列を基準として３０番目の残基がグルタミンまたは野生型でない他の残基、特にグルタミンと同等の化学的性質を有するアミノ酸、例えば、アスパラギンに置換されたものが使用できる。
【００３６】
本願による方法に使用されるＳＥＴ７／９タンパク質（遺伝子名：ＳＥＴＤ７（ｇｅｎｅＩＤ：８０８５４））は、ＳＥＴドメイン−含有メチルトランスフェラーゼであって、ヒストンＨ３Ｋ４およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、Ｅ２Ｆ１、およびＳＴＡＴ３を含む非−ヒストンタンパク質に作用する。ＤＮＭＴ１およびＥ２Ｆ１のＳＥＴ７／９−依存性メチル化は、これらタンパク質の安定性を調節する。ＳＥＴ７／９タンパク質および核酸配列はそれぞれ、ＮＰ＿０８５１５１．１およびＮＭ＿０３０６４８．３と公知である。
【００３７】
本願による方法に使用されるＬＳＤ１(Lysin-specificdemethylase1)タンパク質（遺伝子名：ＫＤＭ１Ａ（ｇｅｎｅＩＤ：２３０２８））は、ＫＤＭ１Ａともいうフラビン−依存性モノアミンオキシダーゼであって、モノ−およびジ−メチル化されたリシン、特にヒストン３、リシン４および９（Ｈ３Ｋ４およびＨ３Ｋ９）を脱メチル化させることができる。ＬＳＤ１は、インビボおよびインビトロでアンドロゲン受容体と相互作用をし、アンドロゲン受容体−依存性転写を促進する（３０）。ＬＳＤ１は、アンドロゲン遺伝子調節の脈絡から、基質をＨ３Ｋ４ｍｅ１／２からＨ３Ｋ９ｍｅ１／２に転換させることができると知られている。ヒストンデメチラーゼとしての役割のほか、ＬＳＤ１は、ｐ５３およびＤＮＭＴ１のような非−ヒストンタンパク質も脱メチル化する。ＬＳＤ１は、脱メチル化によってｐ５３の腫瘍抑制活性を調節する。ＬＳＤ１は、Ｄｎｍｔ１の脱メチル化を調節することにより、胚幹細胞におけるグローバルＤＮＡのメチル化において必須の役割を果たす。ＬＳＤ１タンパク質および核酸配列はそれぞれ、ＮＰ＿０５５８２８．２およびＮＭ＿０１５０１３．３と公知である。
【００３８】
本願による方法に使用されるタンパク質は、当業界における公知の方法、例えば、前記開示された配列を参照して、ＰＣＲ方法(Saiki et al.,Science,230:1350-1354,1985;Saiki etal.,Science,239:487-491,1988)を利用して製造できる。
【００３９】
本願による方法のタンパク質は、本願による効果を達成する限り、全長または切断された形態の断片とも含まれ、特にＳＥＴ７／９およびＬＳＤ１との相互作用に必要な領域およびメチル化残基を含む。
【００４０】
本願に含まれるタンパク質は、同一の宿主、例えば、ヒト由来のものでも、特定個人、地域、環境などに応じて配列変異があり得、これはもちろん、一部の配列が変異（欠失、置換、付加）したものの、機能的に同等の変異体がすべて本発明に使用できる。
【００４１】
本願による方法のタンパク質またはこれと機能的に同等の変異体を含む場合、例えば、前記ベクターを公知の方法によって細胞培養システムで適切な細胞にトランスフェクションして発現させた後、タンパク質を精製して使用することができる。このような本発明のタンパク質は、例えば、精製されたタンパク質、水溶性タンパク質、または標的細胞への伝達または投与のために担体に結合された形態のタンパク質またはアミノ酸残基と融合された形態のものを含むものである。
【００４２】
タンパク質のメチル化有無の分析のための方法は公知のもので、例えば、質量分光分析器(Mass spectrometer)、メチル化された残基を特異的に認識する、抗体のような物質を用いた、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ(enzyme linked immunosorbent assay)、組織免疫染色、免疫沈降分析法(Immunoprecipitation Assay)、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ(proteinchip)などが挙げられる。
【００４３】
本願によるタンパク質は、これを発現する細胞または動物、特に哺乳動物、特にマウスの形態で提供される。例えば、これに制限するわけではないが、タンパク質の発現のために、遺伝子伝達が容易なＨＥＫ−２９３Ｔ(human embryonic kidney cell line)、遺伝子伝達および低酸素露出時に反応性に優れたＨｅＬａ(human cervical cancer cell)、乳癌が進む時、ＨＩＦ−１αが重要な役割を果たすと知られている乳癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ２３１が使用できる。
【００４４】
前記方法に使用される検出試薬は公知のものであって、例えば、抗原−抗体反応、前記メチル化または脱メチル化されたタンパク質に特異的に結合する基質、核酸またはペプチドアプタマー、前記メチル化または脱メチル化されたタンパク質と特異的に相互作用する受容体またはリガンドまたは補助因子との反応により検出されるか、または質量分光分析器を用いてもよい。前記本願のメチル化または脱メチル化されたタンパク質と特異的に相互作用または結合する試薬または物質は、チップ方式またはナノ粒子(nanoparticle)と共に使用できる。上述した検出／分析過程による最終的なシグナルの強度を分析して、すなわち、対照群試料のシグナルと対照を行うことにより、タンパク質のメチル化の有無を検出することができる。
【００４５】
本願の方法に使用される試験物質は、上述した標的タンパク質のメチル化および／または脱メチル化を調節すると期待される物質で、例えば、薬物のスクリーニングの目的のためには、化合物は低分子量の治療効果を有するものが使用できる。例えば、重量が４００Ｄａ、６００Ｄａまたは８００Ｄａといった約１０００Ｄａ前後の化合物が使用できる。目的に応じて、このような化合物は化合物ライブラリの一部を構成することができ、ライブラリを構成する化合物の数字も数十個から数百万個まで多様である。このような化合物ライブラリは、ペプチド、ペプトイドおよびその他環状または線状のオリゴマー性化合物、および鋳型を基本とする低分子化合物、例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、カルボサイクルおよびポリサイクル化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、カルボハイドレートおよびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリルおよびヘテロサイクル（例えば、トリアジン、インドール、チアゾリジンなど）を含むものであってもよいが、これは単に例示的なもので、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記試験物質は、生物学的特徴の観点からは、ＨＩＦ−１αの相互結合を強くできる物質またはＳＥＴ７／９のメチル化作用に重要なＳＥＴ領域の活性を増加させる物質、またはＳＥＴ７／９によるメチル化に重要な役割を果たすメチル供与者のS-adenosylmethionineを基質により高い効率で伝達可能な物質である。同時に、ＬＳＤ１が使用される場合には、アミンオキシダーゼ系の脱メチル化酵素であるため、アミンオキシダーゼ抑制効果を奏したり、基質との結合を抑制する物質、ＦＡＤ(flavin adenine dinucleotide)依存的な酵素であるため、ＦＡＤを抑制する効果を有することができる。
【００４７】
候補物質は、前記試験物質で処理された細胞と前記試験物質で処理されていない対照群細胞とで前記ＨＩＦ−１αのメチル化の有無を比較して、前記試験物質で処理された細胞における前記ＨＩＦ−１αのメチル化が、前記対照群のＨＩＦ−１αのメチル化と比較して増加した場合、これを血管新生抑制剤候補物質として選別することができる。
【００４８】
また、候補物質は、ＬＳＤ１を標的として用いた場合、脱メチル化の検出結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記残基のうち１つ以上の残基の脱メチル化が減少した場合、これを血管新生抑制剤候補物質として選別することができる。
【００４９】
本願の方法によって選別された血管新生抑制剤は、ＨＩＦ−１αをメチル化、またはメチル化を増加させることにより、ＨＩＦ−１αを分解させて血管が形成されるのを防止する。前記のような血管新生抑制剤は、血管新生が伴う多様な疾患、例えば、固形腫瘍や網膜症、慢性関節リウマチまたは粥状動脈硬化症などのような血管新生病の予防および治療に有効である。具体的には、血管形成(vasculogenesis)および病的な血管新生(angiogenesis)に関連する分子機序の究明によって、疾患は次の２種類、すなわち、血管新生治療によって損傷した組織が治癒可能な疾患（動脈硬化、心筋梗塞、四肢虚血など）と、血管新生治療によって疾患自体が治療されたり疾患の進行が遅延可能な疾患（例えば、網膜症、悪性および陽性血管新生性腫瘍、悪性腫瘍の転移など）(Timar J et al.,Pathol Oncol Res.2001;7(2):85-94)が挙げられる。したがって、本願による血管新生抑制剤は、前記疾患の治療剤として有用に使用できる。
【００５０】
本願の前記方法は、試験管で前記タンパク質を混合して複合体を形成して行うか、または前記タンパク質を発現する遺伝子を細胞、特に真核細胞にトランスフェクションして、または前記細胞を哺乳動物に移植して行われる。
【００５１】
本方法で使用される細胞の種類および試験物質の量および種類などは、使用する具体的な実験方法および試験物質の種類に応じて異なり、当業者であれば適切な量を選択できるであろう。実験結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質の存在下、前記タンパク質をメチル化させる物質を候補物質として選別する。
【００５２】
以下、本発明の理解のために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例）
＜実験方法＞
−細胞培養−
【００５３】
ＭＥＦ(Mouse embryonic fibroblast)、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ細胞株は、１０％ウシ血清とペニシリン、ストレプトマイシン(Streptomycin)が入ったＤＭＥＭ(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium)に培養した。細胞株はすべてマイコプラズマ汚染テストをした。
−抗体−
【００５４】
HIF-1α(NB100-132, Novus; 10006421,Cayman; MAB1536, R&D systems); HIF-2α(NB100-122, Novus); Xpress(R910-25,Invitrogen); FLAG(F3165, Sigma); methyl-Lys(ab23366, Abcam); anti-CD31(clone2H8, MAB1398Z, Millipore); anti-HA(MMS-101R,Covance); VEGF(AF493NA, R&Dsystem); EPO(sc-7956), Brn3b(sc-6026)はSanta Cruz社にて作製し、LSD1(#2139)、hydroxyl-HIF-1α(#3434)、Caspase3(#9661)、Ki-67(#9027)、SET7/9抗体(#2813)はCellSignallingにて作製した。HIF-1α K32メチル化抗体はAbfrontier社にて作製した。
−動物−
【００５５】
８−１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを実験に用いた。マウスは表示された時間だけ１０％酸素濃度のチャンバで育てた。ＤＭＯＧ処理のために、ｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファー０．１ｍｌにＤＭＯＧ２ｍｇを溶かした後、腹腔注射をした。すべての実験手順はソウル大学動物実験倫理委員会(Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul NationalUniversity)から承認された。
【００５６】
＜Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ   ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの作製＞
【００５７】
ＨＩＦ−１αの３２番目のリシンをアラニンに置換するために、ＮｈｅＩサイトをＨＩＦ−１αの２番目のエクソン（ｅｘｏｎ）にＦＲＴが両方にあるＰｕｒｏ抵抗遺伝子カセットと共に挿入した。リシンをアラニンに変異させながらＡｆｅＩサイトが生じるようにした。作られた標的ベクターを電気穿孔(electroporation)方法でマウスのＥＳ  ｃｅｌｌに注入した。Ｈｉｆ−１α遺伝子において相同組換え(homologous recombination)が起こったＥＳ  ｃｅｌｌを選んで、Ｃｒｅ組換え酵素(recombinase)を用いてｐｕｒｏ抵抗遺伝子カセットを無くした。Ｈｉｆ１αＫＡ／＋ＥＳ細胞クローンをマウスの胚盤胞に注入して突然変異体の染色体を有するキメラ(chimeric)マウスを得た。７世代の間に逆交配を進行させ、尾ＤＮＡで対立形質の遺伝子特定プライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＡｆｅＩ制限酵素で切断してマウスの遺伝型を確認した。使用したプライマーは次の通りである。
【００５８】
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＧ−３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧ  ＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧ−３’
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
【００５９】
ｍＲＮＡの量を測定するために、ABI Prism 7500systemとYBR Green(Enzynomics)を使用した。プライマーは、増幅された時、９０−２００ｂｐの特定ｍＲＮＡ片となるように作製し、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ分析により適当なプライマーであるかを確認した。ＰＣＲ条件は、９５℃（１５分）の後に、９５℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、および７２℃（３０秒）の過程を４０回繰り返すようにした。ｍＲＮＡの量はΔΔＣｔ方法で計算し、β−アクチンにより量を補正した。すべての反応は３回繰り返した。使用したプライマーは次の通りである。
【００６０】
Ｖｅｇｆ−ａ  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡ−３’
Ｖｅｇｆ−ａ  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡ  ＡＣＴＴＧＡ−３’
Ｇｌｕｔ１  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＡＧＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＴＣ−３’
Ｇｌｕｔ１  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡ  ＣＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＴＡＧＣＡＧ−３’
Ｅｐｏ  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｃｔｇｇｃｔｔａｇｃｃｃｔｃｔｃａｃ−３’
Ｅｐｏ  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｃｔｇｔｃｃｇｃｔｃｃｔａｇｃａｔｇｔ−３’
Ｌｓｄ１  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧ  ＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＣ−３’
Ｌｓｄ１  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＡＧＴＴＴＣ−３’
Ｈｉｆ−１α  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＴＡＧＡＡＣ−３’
Ｈｉｆ−１α  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣ−３’
＜ユビキチン化実験＞
【００６１】
ＨｅＬａ細胞にＨｉｓｍａｘ−ユビキチンと共にＤＮＡプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションして４８時間後に、ＭＧ１３２（１０ｍｇ／ｍｌ）を６時間処理した。その後、buffer A(6M guanidium-HCl、0.1M Na2HPO4/NaH2PO4、0.01M Tris-HCl[pH8.0]、５ｍＭイミダゾールおよび10mMb-mercaptoethanol)で細胞を壊し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡビーズと共に常温で４時間インキュベーションさせた。ビーズを、buffer A、buffer B(8M urea、0.1M Na2PO4/NaH2PO4、0.01M Tris-Cl[pH8.0]、10mM β-mercaptoethanol)、buffer C(8M urea、0.1M Na2PO4/NaH2PO4、0.01M Tris-Cl[pH6.3]、および10mMβ-mercaptoethanol)の順に洗った後、ビーズに付いているタンパク質を、bufferD(200mM imidazole、0.15M Tris-Cl[pH6.7]、30%glycerol、0.72M 2-mercaptoethanol、および5%SDS)で抽出した。そして、免疫ブロットで分析した。
＜ソフト寒天培地コロニー形成分析(Soft agar colonyformation assay)＞
【００６２】
ＭＥＦを３Ｔ３方式で死なないようにした。Anchorageに依存せずに育つＭＥＦを分析するために、soft agarでコロニーが生成されることを確認した。１０５個の細胞を５％ＣＯ２インキュベータで、５週間０．４％noble agar(Sigma、A5431)上でＤＭＥＭと１０％ＦＢＳメディアに育てた。
＜ＯＩＲマウスモデルの作製＞
【００６３】
新たに生まれて７日目のマウスを母マウスと一緒に７５％酸素濃度のチャンバ(ProOx Model110、BioSpherix、NY)で５日間おいた後、一般酸素濃度に戻して５日間放置した。１７日目の日にマウスの網膜を得た。マウスはＡＲＶＯステートメント(ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and VisionResearch)に従って取り扱った。
＜網膜血管生成の組織学的分析＞
【００６４】
網膜は、イソレクチン（ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ）Ｂ４（Ｌ２１４０、Ｓｉｇｍａ）と１つ以上の抗体と共に、一晩インキュベーションした。使用した抗体は次の通りである。ハムスターａｎｔｉ−ＣＤ３１単クローン抗体(monoclonal antibody)、ウサギａｎｔｉ−ＨＩＦ−１α多クローン抗体(polyclonalantibody)、ヤギａｎｔｉ−ＶＥＧＦ多クローン抗体、またはヤギａｎｔｉ−Ｂｒｎ３ｂ多クローン抗体。数回洗った後、ＦＩＴＣの付いているストレプタビジン(streptavidin、BD Pharmingen社)またはＦＩＴＣの付いているハムスターＩｇＧ(JacksonImmunoResearch社)、Ｃｙ３の付いているヤギＩｇＧ、Ｃｙ３、Ｃｙ５の付いているウサギＩｇＧなどと共に、４時間常温でインキュベーションした。対照実験のために、抗体がないかまたは免疫反応が起こる前の血清(serum)を使用した。全体または一部(section)を固定した後、染色した網膜を見るために、ツァイス(Zeiss)ＬＳＭ５１０または７８０共焦点顕微鏡を用いた。網膜の形態測定分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij)とＬＳＭ ImageBrowser(Carl Zeiss)を用いて行われた。血管の半径長さは、４つの部分の網膜で視神経の頭部分から周辺の血管前までの最も短い長さを測定した。全体網膜の血管密度は、全体網膜の面積においてＣＤ３１＋によって染色された血管密度で割ったものをパーセンテージで表現した。ＯＩＲ実験でＮＶＴと血管が生成されない部分は、アドビフォトショップ（登録商標）ソフトウェアのラッソツール(Lasso tool of Adobe Photoshop software)を用いて測定した。血管が生成されない部分のＨＩＦ−１αの染色程度は、Image J softwareを用いて測定した。
＜腫瘍モデルおよび組織学的分析＞
【００６５】
マウスＬＬＣ細胞株はＡＴＣＣ(American TypeCulture Collection)から購入した。腫瘍を生成するために、ＬＬＣ  ｃｅｌｌに溶けている溶液をマウスの背の両側に注入した。腫瘍の体積は２日ごとにキャリパを用いて測定した。腫瘍の体積は０．５×Ａ×Ｂ２公式（Ａ：腫瘍の最も長い半径、Ｂ：腫瘍の垂直高さ）を用いた。腫瘍を移植して１８日後にマウスを麻酔下で腫瘍を摘出した。そして、切断して組織分析を行った。５０ｍｍに凍結切断した腫瘍組織をハムスターａｎｔｉ−ＣＤ３１、ａｎｔｉ−Ｋｉ６７、またはａｎｔｉ−カスパーゼ(caspase)３抗体と共に、一晩インキュベーションさせた。数回洗う過程を経た後、Ｃｙ３またはＦＩＴＣの付いている抗−ハムスターＩｇＧやＣｙ３の付いている抗−ウサギＩｇＧと共に、２時間インキュベーションさせた。その後、サンプルを固定させ、ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡(Carl Zeiss社)を用いて顕微鏡写真を得た。血管の密度、低酸素部分、ａｐｏｐｔｏｓｉｓ部分、壊死部分はImage-J softwareを用いて測定した。Ｋｉ６７＋細胞は直接数えて平均を計算した。腫瘍の低酸素部分を分析するために、ハイポキシプローブ(Hypoxyprobe)-1(60mg/kg、NaturalPharma International)を血管注射により注入した後、１時間経過後に固定させた。その後、腫瘍を得てＦＩＴＣの付いている抗−ハイポキシプローブ抗体で染色して分析した。
＜異種移植分析(Xenograft assay)＞
【００６６】
ｓｈＨＩＦ−１αが持続的に発現する細胞に、ｓｈＲＮＡに抵抗するＨＩＦ−１α  ＷＴとＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａを再び入れた。腫瘍が形成されるために、マトリゲル(matrigel、BD Biosciences社)を細胞の体積と同量を混合した後、５週齢の免疫反応が抑制された雌マウスの左皮下にはＨＩＦ−１α  ＷＴが発現する細胞株を、右皮下にはＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａが発現する細胞株を注入した。腫瘍の大きさは週ごとに測定した。腫瘍を注入してから４週後に実験を終えて、腫瘍を摘出して重量を測定した。腫瘍の体積は１／２×長さ２×幅で計算した。
＜インビトロメチル化および脱メチル化分析＞
【００６７】
インビトロメチル化実験は、ＧＳＴ−ＨＩＦ−１αとＧＳＴ−ＳＥＴ７／９タンパク質をバッファー(50mM Tris-HCl[pH8.5]、20mM KCl、10mM MgCl2、10mM b-mercaptoethanol、and 250mM sucrose)と１μＣｉ  ｏｆ  ３Ｈ−ＳＡＭを混合して３０℃で一晩反応させて行われた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脱メチル化実験のために、ＧＳＴ−ＨＩＦ−１αのメチル化実験を行った。以後、メチル化が起こったＨＩＦ−１αの付いているビーズをバッファー(50mM NaH2PO4[pH8.0]、10mMTris-HCl[pH8.0]、500mM NaCl、and0.5%TritonX-100)で洗って、ビーズに付いているＳＥＴ７／９を除去した。以後、Ｈｉｓ−ＬＳＤ１と共に、バッファー(50mM Tris-HCl[pH8.5]、50mM KCl、5mM MgCl2、5%glycerol、and 0.5mM PMSF)に入れて反応させた。３７℃で一晩反応させた後に反応バッファーを除去し、２Ｘサンプリングバッファーを入れた。以後、１０分間沸かしてからＳＤＳ−ＰＡＧＥを付着させてautoradiographyで確認した。
＜免疫沈降分析法＞
【００６８】
インビボ免疫沈降のために、ＨｅＬａ細胞を定められた時間の間低酸素チャンバに入れて、６時間５μＭ  ＭＧ１３２を処理した後に取った。細胞は１ｍＬのＥＢＣ２００バッファー(50mM Tris-HCl pH8、200mM NaCl0.5%NP-40)で壊した後、１５分間１３０００ｒｐｍでダウンさせて、計９００ｍｌの細胞溶解物(lysate)を得た。前記溶解物を定められた抗体と共に、４℃で一晩インキュベーションをした後、タンパク質Ｇ、タンパク質ＡのセファロースビーズとＩＰ１５０(25mM TrisHCl pH7.8、1mM EDTA、10%glycerol、150mM NaCl and 0.1%NP-40)を５０％ずつ混合して、２時間インキュベーションした。その後、ＩＰ１５０で５回洗った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロットで確認した。免疫ブロットに使用した抗体は、ＰＢＳ−Ｔ溶液に３％ＢＳＡが溶けているバッファーに溶かして使用した。
＜ＨＩＦ−１α結合タンパク質の精製＞
【００６９】
Ｆｌａｇ−ＨＩＦ−１αを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抽出物からＨＩＦ−１α結合タンパク質を精製した。対照群として空ベクターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株のlysateを使用した。ＨＩＦ−１α結合タンパク質をＦｌａｇ−Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅビーズを用いて沈殿させた。Ｌｙｓａｔｅとビーズを４℃で一晩インキュベーションした後、ＢＣ１５０バッファー(20mM Tris-HCl[pH7.9]、15%Glycerol、1mM EDTA、1mM DTT、0.2mMPMSF、0.05%Nonidet P40、and 150mMKCl)で３回、ＢＣ３００バッファー(20mM Tris-HCl[pH7.9]、15%Glycerol、1mM EDTA、1mM DTT、0.2mM PMSF、0.05%NonidetP40、and 300mM KCl)で２回、ＩＰ１５０バッファーで２回、ＴＢＳバッファー(50mM Tris-HCl[pH7.4]、and 150mM NaCl)で３回ビーズを洗った。その後、Ｆｌａｇペプチド（０．１ｍｇ／ｍｌ）でＨＩＦ−１α結合タンパク質を抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをした後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
＜免疫蛍光分析法＞
【００７０】
ＨｅＬａ細胞株をポリＤリシン(poly D lysine)でコーティングされたカバースリップで育てた。免疫蛍光実験のために、細胞をＰＢＳで２回洗い、２％ホルムアルデヒドで３０分間固定させた。その後、細胞を０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００が溶けているＰＢＳで２回洗った。抗体の侵入のために、細胞を０．５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００が溶けているＰＢＳで５分間インキュベーションさせた後、ブロッキング溶液(5%BSA in 0.1%PBS-T)でブロッキングさせた。その後、一次(primary)抗体をブロッキング溶液に入れて細胞とインキュベーションさせた。以後、０．１％ＰＢＳ−Ｔ溶液で４回洗った後、二次(secondary)抗体と共にインキュベーションさせた。以後、再び０．１％ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗った後、ベクタシールド(vectashield)（Ｈ−１０００）で固定し、顕微鏡で写真を得た。
＜統計分析＞
【００７１】
GraphPad Prism softwareを用いて、グループの差を見るためにStudent t-testを、条件の差とグループの差をそれぞれ見るためにone-wayANOVAを、そしてグループの差と条件の差を一緒に見るためにtwo-way ANOVAを行って、データを分析した。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
（実施例１．核内で現れるＳＥＴ７／９メチル化酵素によって起こるＨＩＦ−１αのメチル化）
【００７２】
ＨＩＦ−１αのユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、ヒドロキシル化などがＨＩＦ−１αの機能を調節するのに重要な役割を果たすことが究明されたにもかかわらず、ＨＩＦ−１αのメチル化はまだ明らかにされていない。タンパク質のメチル化はメチル化酵素によって起こるため、ＨＩＦ−１αが特定メチル化酵素によってメチル化可能と知られたアミノ酸配列を有しているかを確認した。３２番目のリシン残基付近で、ＳＥＴ７／９メチル化酵素がメチル化させることが可能な特定配列の「［Ｋ／Ｒ］−［Ｓ／Ｔ／Ａ］−Ｋ（メチル化の起こるリシン）」があることを発見した（図１ａ）。液体クロマトグラフィーマス分析(LC-MS/MS analysis)によりＨＩＦ−１αが３２番目のリシンでメチル化が起こることを確認した（図１ｂ）。２６Ｓプロテアソーム抑制剤のＭＧ１３２がある状況とない状況とでいずれもＨＩＦ−１αとＳＥＴ７／９とが細胞内で相互作用をすることを確認した（図１ｃ）。一般的な酸素濃度で細胞内のＨＩＦ−１αはＭＧ１３２を処理した時にのみ発見できるため、ＭＧ１３２を処理した状況でＨＩＦ−１αとＳＥＴ７／９との相互作用を確認した。
【００７３】
本発明者は、細胞外で精製されたＧＳＴ−ＳＥＴ７／９を酵素とし、ＧＳＴ−ＨＩＦ−１αを基質としてメチル化実験を行った。実験結果、ＨＩＦ−１α  ＷＴは正常にメチル化が起こることを見ることができるが、メチル化が起こると予想される３２番目のリシンをアラニンに変えたＨＩＦ−１αはメチル化が起こらないことを確認した（図１ｄ）。ＳＥＴ７／９がＨＩＦ−１αをメチル化させる時、ＳＥＴ７／９の酵素活性が重要であるかを確認するために、酵素活性のあるＳＥＴ７／９ＷＴと酵素活性のないＳＥＴ７／９Ｈ２９７Ａとをもって実験した結果、ＳＥＴ７／９ＷＴが入った時にのみＨＩＦ−１αのメチル化が現れることを確認した（図１ｅ）。これにより、ＨＩＦ−１αのメチル化が起こる時、ＳＥＴ７／９のメチル化酵素活性が必要であることが分かった。ＨＩＦ−１α  Ｋ３２のメチル化を認知する抗体を作製し、ドットブロット(dot blot)分析によりこの抗体がメチル化されているＨＩＦ−１αペプチドを特定的に認識することを確認した。マウス胚線維芽細胞（Mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）からＨＩＦ−１αのメチル化を確認した時、ＭＧ１３２を処理した状況で、ＳＥＴ７／９のないＭＥＦではＨＩＦ−１αのメチル化が現れておらず、ＷＴ  ＭＥＦでのみＨＩＦ−１αのメチル化を観察することができた。
【００７４】
次に、ＨＩＦ−１αのメチル化がいつどこで起こるかを確認した。ＨＩＦ−１αのメチル化は、ＭＧ１３２を処理して２６Ｓプロテアソームを抑制した時、一般酸素濃度で観察され、低酸素環境が持続するほどＨＩＦ−１αのメチル化が減少することを観察した（図１ｇ）。ところが、低酸素環境が持続すると、ＨＩＦ−１αのメチル化が回復することを観察することができた。本発明者は、ＨＩＦ−１αのメチル化がどこで起こるかを知るべく、核と細胞質とに分けてＨＩＦ−１αのメチル化を確認した結果、核でのみＨＩＦ−１αのメチル化が現れることを確認した（図１ｈ）。我々は、ＨＩＦ−１αのメチル化がＨＩＦ−１αの位置に影響を与えるかを確認した結果、メチル化が起こるＨＩＦ−１α  ＷＴとメチル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａがいずれも核内でのみ発見されることを確認した。この実験結果により、ＳＥＴ７／９によって起こるＨＩＦ−１αのメチル化は、細胞質でない核内でのみ起こることが分かった。
（実施例２．ＬＳＤ１によるＨＩＦ−１αの脱メチル化によるＨＩＦ−１αタンパク質の安定性増加の確認）
【００７５】
ＨＩＦ−１αのメチル化の機能を知るために、ＨＩＦ−１αと相互作用するタンパク質のうち、メチル化や脱メチル化に関連するタンパク質があるかを複合体の精製により調べた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果、ＬＳＤ１の脱メチル化酵素がＨＩＦ−１αと相互作用することを明らかにした（図２ａ）。共同−免疫沈降実験により細胞内でＭＧ１３２を処理した時、低酸素状況で実際に相互作用することを確認した（図２ｂ）。また、ＬＳＤ１のタンパク質の発現が低酸素環境で増加することを確認した。ＬＳＤ１  ｍＲＮＡも確認した結果、低酸素環境でわずかに増加することを確認した（図２ｄ）。
【００７６】
ＬＳＤ１が欠損しているＭＥＦでＨＩＦ−１αのタンパク質の発現が著しく減少していることを確認した（図２ｅ）。本発明者は、前記現象がＬＳＤ１の脱メチル化酵素活性と関連があるかを調べるために、ＬＳＤ１欠損しているＬｓｄ１−／−ＭＥＦにＬＳＤ１  ＷＴとＬＳＤ１の酵素活性がないＬＳＤ１  Ｋ６６１Ａを入れて、ＨＩＦ−１αタンパク質の発現量を確認した。確認した結果、ＬＳＤ１  ＷＴを入れた時は低酸素環境でＨＩＦ−１αの発現がよく増加したが、ＬＳＤ１  Ｋ６６１Ａを入れた時はＨＩＦ−１αの発現の増加がよく現れなかった（図２ｆ）。また、ＬＳＤ１の酵素活性抑制剤のパルギリン(pargyline)を処理した時もＨＩＦ−１αの不安定化が起こることを確認した（図２ｇ）。ＨＩＦ−１αがＳＥＴ７／９によってメチル化が起こるため、本発明者は、ＨＩＦ−１αのメチル化がＬＳＤ１によって脱メチル化されるかを確認した。実際に、ＬＳＤ１によってＨＩＦ−１αの脱メチル化が起こることをインビボとインビトロで確認した（図２ｈ）。ところが、ＬＳＤ１の酵素活性は、ＨＩＦ−１αとＬＳＤ１との相互作用に影響を与えなかった。そして、ＨＩＦ−１αとＬＳＤ１は、ＬＳＤ１のＮ末端で直接的に結合することを確認した。また、ＳＥＴ７／９メチル化酵素を過発現させた時とさせなかった時とにおけるＬＳＤ１とＨＩＦ−１αとの相互作用を確認した結果、差がないことを確認した。これにより、ＨＩＦ−１αのメチル化状態がＬＳＤ１とＨＩＦ−１αとの相互作用に影響を及ぼさないことを確認した。予想した通り、ＬＳＤ１が欠損しているＭＥＦでは、ＨＩＦ−１α標的遺伝子の転写が減少しており、ＳＥＴ７／９が欠損しているＭＥＦでは、ＨＩＦ−１α標的遺伝子の転写が増加していることを確認した。
【００７７】
メチル化によるＨＩＦ−１αの安定化をさらに確認するために、ＭＧ１３２がない状況と処理した状況とで免疫蛍光実験を行った。ＳＥＴ７／９が一緒に入った時、低酸素環境でＨＩＦ−１αの発現が減少していることを確認した。しかし、酵素活性のないＳＥＴ７／９を入れた時は、ＨＩＦ−１αの発現が減少しなかった（図２ｉ）。また、ＭＧ１３２を処理した状況では、ＳＥＴ７／９が一緒に発現してもＨＩＦ−１αの発現が減少しなかった。免疫ブロットにより確認した時も、ＳＥＴ７／９が過発現する時はＨＩＦ−１αの発現が減少し、ＬＳＤ１が一緒に過発現する時はＨＩＦ−１αの発現が減少する効果が無くなることを見ることができた。しかし、酵素活性のないＬＳＤ１が一緒に発現する時は、依然としてＳＥＴ７／９によるＨＩＦ−１αの発現の減少が現れた（図２ｊ）。タンパク質合成抑制剤のシクロヘキサミド（ＣＨＸ）を処理し、ＨＩＦ−１αタンパク質の半減期を調べた結果、ＳＥＴ７／９を過発現した時はＨＩＦ−１αの半減期が減少したのに対し、ＬＳＤ１を過発現した時はＨＩＦ−１αの半減期が増加したことを見ることができた（図２ｋ）。２６ＳプロテアソームによるＨＩＦ−１αタンパク質の分解について調べるために、ＭＧ１３２を処理したまま、ＳＥＴ７／９とＬＳＤ１によるＨＩＦ−１αのユビキチン化の変化を調べた。実際に、ＳＥＴ７／９はＨＩＦ−１αのユビキチン化を増加させ、ＬＳＤ１は減少させた。
【００７８】
ＨＩＦ−１αは、一般酸素濃度の時、細胞質でＰＨＤ１／２／３酵素によってヒドロキシル化が起こり、これにより、ＣＵＬ２  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅ複合体によって分解される。低酸素環境でＰＨＤの活性が減少し、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化の減少は、結局、ＨＩＦ−１αの安定化をもたらす。したがって、本発明者は、ＨＩＦ−１αのメチル化がヒドロキシル化に影響を及ぼすかを確認した。メチル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｋ３２ＡがＷＴのようにヒドロキシル化が起こり、ＰＨＤ抑制剤のＤＭＯＧによってヒドロキシル化が減少することを確認した（図２ｍ）。これは、ＨＩＦ−１αのメチル化がヒドロキシル化と独立した作用であることをいう。これと平行に、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化が起こらないＰ２Ａ（Ｐ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａ）の場合、ＨＩＦ−１α  ＷＴのように正常にメチル化が起こることを確認した（図２ｎ）。これは、ＨＩＦ−１αのヒドロキシル化がメチル化に影響を与えないことを意味する。我々は、ＨＩＦ−１α  ＷＴとメチル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａ、ヒドロキシル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｐ２Ａにおけるユビキチン化を比較した。ＭＧ１３２を処理し、ＳＥＴ７／９を過発現させた時、ＨＩＦ−１α  ＷＴとＨＩＦ−１α  Ｐ２Ａはユビキチン化が増加するのに対し、メチル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａはユビキチン化の増加が現れなかった（図２ｏ）。また、メチル化が起こったＨＩＦ−１αが同時にヒドロキシル化が起こり得ることも確認した。まとめてみれば、これらの結果は、低酸素環境でＨＩＦ−１αによって起こったメチル化がＬＳＤ１によって脱メチル化され、これにより、ＨＩＦ−１αが２６Ｓプロテアソームによって分解されることが防止されることを示す。そして、このような機序がＨＩＦ−１αのヒドロキシル化とは独立していることを示す。
（実施例３．Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅが血液学的に異常な表現型を呈する）
【００７９】
生体内でＨＩＦ−１αのメチル化が有する機能を調べるために、メチル化が起こらないＨＩＦ−１αが発現するＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅを作製した。マウス遺伝体においてＨＩＦ−１αの３２番目のリシン残基をアラニンに変えるために、ＦＲＴの側にピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）抵抗遺伝子とＨＩＦ−１αの２番目のエクソンを含む標的ベクターを作った。このベクターでリシンをアラニンに置換できるようにＤＮＡ配列を変えた。この時、ＡｆｅＩ制限酵素によって切断可能な配列を有するように作製した（図３ａ）。ＡｆｅＩ制限酵素で切断することとＰＣＲにより、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅがよく作製されたことを確認した（図３ｂ）。作られたＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅは少なくともＣ５７ＢＬ／６背景のマウスで７世代の逆交配を進行させた。Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｍｉｃｅは、生まれる時から成体に育つまで特異な表現型が現れなかった。また、受精にも問題がなかったし、メンデルの遺伝の法則通りに子の遺伝型が現れた。まず、作られたＷＴ、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏマウスとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｈｏｍｏマウスからＭＥＦを取り出してＨＩＦ−１αのメチル化状態を確認した。免疫沈降実験により確認した結果、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｈｏｍｏから取り出したＭＥＦでＨＩＦ−１αのメチル化が発見されなかった（図３ｃ）。ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αのタンパク質の発現量を比較した結果、ＨＩＦ−２αは、ＷＴやＨｉｆ１ａ＋／ＫＡ、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡとも大差がなかった。
【００８０】
ＨＩＦ−１αタンパク質の発現量の増加は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質の増加に関連し、これは結局、赤血球増加症(erythrocytosis)につながる。Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスでＨＩＦ−１αのメチル化の欠損がＨＩＦ−１αタンパク質の発現の増加を誘発して赤血球増加症が現れるかを調べるために、ＷＴとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスでＤＭＯＧ（ＨＩＦ−１αのhydroxylationを抑制）を処理し、血液に関連する表現型を検査した。外的な表現型を調べた結果、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの鼻部分と足裏、腹腔が赤くなっていることを見ることができ、脾臓が大きくなっていることを確認した（図３ｄ）。そして、ＨＩＦ−１αタンパク質の量がＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの肺と脾臓でＷＴマウスより増加していることを確認した（図３ｅ）。また、血液学的指標を比較した。Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスで赤血球が確実に増加しており、ヘモグロビンの比率も増加していることを確認した。ヘマトクリット比率も、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎで増加していることを確認した（図３ｆ）。しかも、Ｖｅｇｆ−ａ、ｇｌｕｔ−１、そしてＥｐｏのｍＲＮＡがＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦで低酸素環境の時とＤＭＯＧを処理した時に増加していることを確認した（図３ｇ）。Ｖｅｇｆ−ａ、Ｇｌｕｔ−１、そしてＥｐｏ  ｍＲＮＡの量がＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの肺でも、低酸素環境で１４日間あったりＤＭＯＧを７日間処理した時に増加していることを確認した（図３ｈ）。免疫ブロット分析により、Ｅｐｏタンパク質の量も、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの肺で増加していることを確認した。これをまとめてみれば、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスは、血液学的な異常表現型を呈し、ＨＩＦ−１αのタンパク質の発現が増加していることが分かる。
（実施例４．Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスで細胞移動と腫瘍の成長が増加している）
【００８１】
低酸素環境で時間帯別にＨＩＦ−１αタンパク質の量を比較した時、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦでＨＩＦ−１αタンパク質の量が増加していることを確認した（図４ａ）。シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を処理してタンパク質の合成を抑制した後、ＨＩＦ−１αタンパク質の半減期を測定した時、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ＭＥＦのＨＩＦ−１αは半減期が増加していることを確認した（図４ｂ）。我々はまた、マウスの肺でＨＩＦ−１αタンパク質の量とメチル化を比較した。マウスを１０％酸素濃度の低酸素環境で１４日間育てた後に分析した時、ＨＩＦ−１αタンパク質の量がＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスの肺で増加していることを確認し、ＨＩＦ−１αのメチル化が低酸素環境に露出した時、ＷＴマウスで減少することを確認した（図４ｃ）。
【００８２】
ＳＥＴ７／９とＬＳＤ１が細胞の移動を調節するかを調べるために、ＳＥＴ７／９とＬＳＤ１を過発現させ、通常の環境と低酸素環境とで細胞の移動を分析した。低酸素環境でＳＥＴ７／９を過発現させた時は細胞移動が減少し、ＬＳＤ１が過発現した時は細胞移動が増加することを確認した（図４ｄ）。ＨＩＦ−１αの発現の増加は癌の発達に関係があるため、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ＭＥＦで細胞移動とコロニー形成が増加しているかを確認した。ＷＴ  ＭＥＦと比較した時、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ＭＥＦで細胞移動が増加していることを確認した（図４ｅ）。しかも、細胞コロニー形成分析においても、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ＭＥＦがより良く形成することを確認した（図４ｆ）。ＨＩＦ−１αのメチル化が腫瘍形成を抑制することをインビボで証明するために、ＨＩＦ−１αをノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）した後、ＨＩＦ−１α  ＷＴとメチル化が起こらないＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａを発現させたＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞株を、免疫抑制されたマウスの皮下に注入した。以後、腫瘍形成程度を測定した結果、ＨＩＦ−１α  Ｋ３２Ａを発現する細胞株を注入した時、腫瘍形成と腫瘍の体積、腫瘍の重量が増加していることを確認した（図４ｇ）。したがって、メチル化が起こらないＨＩＦ−１αを発現させた時、腫瘍成長を誘導することが分かる。
（実施例５．Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎマウスで網膜血管生成が増加する）
【００８３】
低酸素環境によるＨＩＦ−１αの安定は、血管生成を増加させる因子をコーディングするいくつかの標的遺伝子の転写が活性化され、生理学的病理学的に血管生成が増大する。生理学的にＨＩＦ−１αのメチル化の役割を調べるために、生後５日後に、ＷＴ、Ｈｉｆ１ａ＋／ＫＡ、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの網膜血管の発達状態を調べた。ＷＴマウスとＨｉｆ１ａ＋／ＫＡマウスの網膜の血管発達半径と血管発達密度が大差はなかった。しかし、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスでは、血管発達半径および密度がいずれも増加していることを確認した（図５ａ−ｃ）。ＷＴマウスに比べて、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスでＨＩＦ−１αタンパク質の量も網膜の血管のない部分で増加していることを確認した（図５ａ、ｄ）。ＨＩＦ−１αのメチル化が疾病学的にどのような機能をするかを調べるために、虚血性網膜病症と類似の酸素濃度による網膜病症のマウスモデルを作った。このマウスで血管のない部分と新たな血管生成面積とを比較した結果、ＷＴマウスよりＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスが血管のない部分は７６％減少したが、新たに血管が生成された部分は４３％増加したことを確認した（図５ｅ−ｇ）。反面、Ｈｉｆ１ａ＋／ＫＡマウスは、ＷＴと大差がないことを確認した。Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの網膜では、ＨＩＦ−１αとＶＥＧＦの発現がＷＴより増加していることを確認した（図５ｈ−ｊ）。この結果は、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスでＨＩＦ−１αが安定化しており、これにより、血管のない領域で血管生成が活発に行われ、虚血の状況で異常な血管生成が行われることを意味する。
（実施例６．Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスで腫瘍の成長と血管生成が増加する）
【００８４】
ＨＩＦ−１αのメチル化が腫瘍の成長と腫瘍の血管生成にどのような影響を及ぼすかを確認するために、ルイス肺癌（Lewis Lung Carcinoma、ＬＬＣ）細胞株をＷＴマウスとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスの皮下に移植した。腫瘍細胞を移植し、１８日後に腫瘍の体積と重量を比較した時、ＷＴよりＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスに移植した腫瘍が、体積は２４％、重量は２６．１％増加したことを確認した（図６ａ、ｂ）。併せて、腫瘍内の細胞死滅も、ＷＴマウスに比べて、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスで３１．７％減少していることを確認した（図６ｃ、ｄ）。また、ＷＴマウスよりＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスで腫瘍周辺の血管と腫瘍内の血管がそれぞれ４７．２％、４４．１％増加していることを確認した（図６ｅ、ｆ）。これは、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスで腫瘍血管生成が促進されていることをいう。このような腫瘍血管生成によって、Ｈｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスがＷＴより腫瘍内の低酸素状態が減少していることを観察することができた（図６ｇ、ｈ）。腫瘍に関連してより詳細に調べた結果、細胞死滅はＷＴマウスとＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスとで大差がないのに対し、腫瘍細胞増殖はＨｉｆ１ａＫＡ／ＫＡマウスでより活発に起こることが分かった（図６ｉ、ｊ）。このような結果をまとめてみれば、ＨＩＦ−１αのメチル化の欠損は腫瘍血管生成を促進させ、結局、腫瘍成長を誘導する。
（実施例７．ヒト癌におけるＨＩＦ−１αのメチル化の生物学的意味性）
【００８５】
本発明者は、ＨＩＦ−１αのメチル化と癌の進行の関係を明らかにするために、ヒト癌で現れるＨＩＦ−１αの突然変異を探した。本発明者は、癌で現れる体細胞の突然変異に関連するデータベースのＣＯＳＭＩＣと、癌細胞株で現れる突然変異関連データベースのＣＣＬＥとを用いて、ＨＩＦ−１αの突然変異を探した。データベースでＳＥＴ７／９によってメチル化が起こるＨＩＦ−１α  Ｋ３２の突然変異は探せなかったものの、ヒトの癌の時、Ｋ３２付近のＳ２８とＲ３０で突然変異がよく現れることを確認した（図７ａ）。例えば、食道癌、血液癌、リンパ癌などでＨＩＦ−１α  Ｓ２８Ｙ突然変異が報告され、皮膚癌でＲ３０Ｑ突然変異が報告された。
【００８６】
癌で現れる突然変異がＨＩＦ−１αのメチル化に影響を与え、それによってＨＩＦ−１αの安定性を調節するかを調べるために、癌で現れる多様な突然変異をもってＨＩＦ−１αのメチル化を確認した。Ｓ１４Ｒ、Ｒ１７Ｇ、Ｒ１８Ｑ、Ｒ１９ＱではＨＩＦ−１αのメチル化が正常に起こったが、Ｓ２８Ｙ、Ｒ３０ＱではＫ３２Ａのようにメチル化が現れなかった（図７ｂ）。与えられたＳ２８とＲ３０は、螺旋−環−螺旋構造(helix-loop-helix)のドメインにあるＳＥＴ７／９標的配列であって、本発明者は、前記Ｓ２８ＹとＲ３０Ｑ突然変異がこのＳＥＴ７／９によるメチル化が起こらないことで、結局、ＨＩＦ−１αの安定化が誘導されるとの仮説を立てた。前記仮説が正しいかを確認するために、ＳＥＴ７／９によって突然変異体の安定性が変わるかを確認してみた。実際に、Ｒ１７Ｇ、Ｒ１８Ｑ、Ｒ１９ＱはＳＥＴ７／９によって安定性が減少したが、Ｓ２８ＹとＲ３０ＱはＳＥＴ７／９によるタンパク質の分解が現れなかった（図７ｃ）。これと共に、インビトロメチル化実験でも、Ｒ１７Ｇはメチル化が起こるが、Ｒ３０ＱとＫ３２Ａはメチル化が起こらないことを確認した（図７ｄ）。
【００８７】
また、本発明者は、トランスウェル細胞移動(Transwellcell migration)実験を行った。ＨＩＦ−１αがないＭＥＦにそれぞれＨＩＦ−１α  ＷＴ、Ｋ３２Ａ、Ｒ１７Ｇ、Ｒ３０Ｑを再び入れた後、ＳＥＴ７／９またはＬＳＤ１によって細胞移動がどのように変わるかを確認した結果、ＷＴとＲ１７Ｇは、ＳＥＴ７／９によって細胞移動が減少し、ＬＳＤ１によって増加することを観察した。しかし、Ｋ３２ＡとＲ３０Ｑは、ＳＥＴ７／９やＬＳＤ１に影響されないことを観察することができた（図７ｅ）。この結果は結局、ヒト癌でＳＥＴ７／９によって起こるＨＩＦ−１αのメチル化は重要性を有していることを意味する。
【００８８】
いくつかの論文によれば、癌でＳＥＴ７／９が強力な役割を果たすという。ｐ５３のＳＥＴ７／９−媒介メチル化は、アセチル化を促進させて、ｐ５３タンパク質の安定性を増加させる。ＬＳＤ１は多くの癌で過発現しており、アミンオキシダーゼ阻害剤でＬＳＤ１を阻害すると癌増殖が抑制される(Kashyap,V.et al.The lysine specificdemethylase-1(LSD1/KDM1A)regulates VEGF-A expression in prostatecancer.Mol.Oncol.7,555566(2013);Lim,S.et al.Lysine-specificdemethylase1(LSD1)is highly expressed in ER-negative breast cancers and abiomarker predicting aggressivebiology.Carcinogenesis31,512520(2010);Schulte,J.H.et al.Lysine-specificdemethylase1 is strongly expressed in poorly differentiatedneuroblastoma:implications for therapy.Cancer Res.69,20652071(2009).)。さらに、ＬＳＤ１は、前立腺および乳癌細胞でそれぞれアンドロゲン受容体−およびエストロゲン受容体依存性転写を促進させる。癌でＬＳＤ１の過発現がＨＩＦ−１αを安定化させ、腫瘍血管生成を促進する本願のデータにより、ＬＳＤ１がホルモン依存性癌だけでなく、他のタイプの癌もどのように促進させるかが分かる。
【００８９】
多様なヒト癌で遺伝的変化によって引き起こされたＨＩＦ−１αが過発現すると報告されている。ＨＩＦ−１αの過発現に関連づけられた通常の遺伝的変化も多くの頻度で癌患者に起こる。例えば、遺伝的変化によるＶＨＬ(Von Hippel-Lindau)の機能喪失によってＨＩＦ−１αが構成的に発現し、また、網膜およびＣＮＳ血管芽細胞腫(haemangioblastomas)、透明細胞腎細胞癌、褐色細胞腫(pheochromocytoma)、膵島細胞腫(pancreatic islet cell tumour)および網膜、膵膓および精巣上体嚢腺腫(epididymal cysts)に脆弱な特徴がある遺伝性家族力癌症候群のＶＨＬ疾病が始まる。ｐ５３が機能を喪失すると、癌でＨＩＦ−１αタンパク質のレベルおよびＨＩＦ−１α転写活性が増加することが知られている。
【００９０】
以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されるものではなく、次の請求の範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形および改良形態も本願の権利範囲に属する。
【００９１】
本発明で使われるすべての技術用語は、別途に定義されない以上、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解するのと同じ意味で使われる。本明細書に参考文献として記載されるすべての刊行物の内容は本発明に導入される。
【００９２】
この特許は、韓国未来創造科学部の財源により韓国研究財団の支援を受けて行われた研究に基づくものである［ＮＲＦ−２０１７Ｒ１Ａ３Ｂ１０２３３８７］。
【図１】
0006616848.tif 000002
【図２】
0006616848.tif 000003
【図３】
0006616848.tif 000004
【図４】
0006616848.tif 000005
【図５】
0006616848.tif 000006
【図６】
0006616848.tif 000007
【図７】
0006616848.tif 000008
【配列表】
0006616848000001.app