(57)【要約】  樹状細胞について、簡便に免疫賦活能を促進できる方法を提供する。  樹状細胞のＴＧＦ−βを阻害する処理工程を含むことを特徴とする、樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法である。前記ＴＧＦ−βの阻害とは、例えば、ＴＧＦ−βシグナルに関与するＳｍａｄ２の発現阻害である。
2016024628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞のＴＧＦ−βを阻害する処理工程を含むことを特徴とする、樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法。
【請求項２】
前記処理工程が、樹状細胞を、ＴＧＦ−β阻害剤で処理する工程である、請求項１記載の促進方法。
【請求項３】
ＴＧＦ−β阻害剤が、Ｓｍａｄ２阻害剤である、請求項２記載の促進方法。
【請求項４】
Ｓｍａｄ２阻害剤が、Ｓｍａｄ２の発現抑制剤である、請求項３記載の促進方法。
【請求項５】
前記発現抑制剤が、Ｓｍａｄ２  ｍＲＮＡの転写を抑制する核酸分子である、請求項４記載の促進方法。
【請求項６】
前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡである、請求項５記載の促進方法。
【請求項７】
前記樹状細胞が、骨髄由来または単球由来である、請求項１から６のいずれか一項に記載の促進方法。
【請求項８】
前記単球が、末梢血単球である、請求項７記載の促進方法。
【請求項９】
前記樹状細胞が、ヒト由来または非ヒト動物由来である、請求項１から８のいずれか一項に記載の促進方法。
【請求項１０】
前記処理工程が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１から９のいずれか一項に記載の促進方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗癌免疫賦活能の促進方法により、樹状細胞を処理する工程を含むことを特徴とする、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の製造方法により得られることを特徴とする、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞。
【請求項１３】
ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進する促進剤。
【請求項１４】
ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする、抗癌剤調製キット。
【請求項１５】
さらに、樹状細胞用の培養試薬を含む、請求項１４記載の抗癌剤調製キット。
【請求項１６】
前記培養試薬が、培地を含む、請求項１５記載の抗癌剤調製キット。
【請求項１７】
前記培地が、前記ＴＧＦ−β阻害剤を含む、請求項１６記載の抗癌剤調製キット。
【請求項１８】
請求項１２記載の樹状細胞を患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞の製造方法、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進する促進剤、抗癌剤調製キット、癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌の治療方法として、免疫機能が抑制されている癌患者に対して、免疫機能を活性化して、抗癌効果を向上させる方法が注目されている。この方法は、例えば、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、ＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）、樹状細胞等の細胞が使用され、免疫細胞療法とも呼ばれている。免疫細胞の中でも樹状細胞は、リンパ球（例えば、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞等）に対して抗原を提示し、免疫防御機能を司る細胞であり、癌やウイルスを排除する細胞免疫を活性化することが知られている。【０００３】
しかしながら、これらの免疫細胞は、免疫賦活能の活性化を促進するため、サイトカインを添加して培養する必要があり、コストがかかり、費用対効果が低いと考えられている。また、ＮＫ細胞療法には、例えば、癌非特異性反応の問題、ＣＴＬ療法には、効果が特定の抗原に限られているという問題がある。【０００４】
また、樹状細胞を用いた療法は、例えば、癌患者から手術切除により調製した癌組織を、癌患者から採取した樹状細胞にパルスしてから、前記樹状細胞を体内に戻す自己癌細胞感作、または、人工合成した癌抗原ペプチドを、癌患者から採取した樹状細胞にパルスしてから、前記樹状細胞を体内に戻すペプチド感作樹状細胞ワクチン療法がある。しかし、このような療法は、手術適応症例および癌抗原ペプチドが同定されている癌への適応に限定されるという問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、樹状細胞について、簡便に免疫賦活能を促進できる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法は、樹状細胞のＴＧＦ−βを阻害する処理工程を含むことを特徴とする。【０００７】
本発明の抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞の製造方法は、前記本発明の抗原免疫賦活能の促進方法により、樹状細胞を処理する工程を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明の抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞は、前記本発明の製造方法により得られることを特徴とする。【０００９】
本発明の樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進する促進剤は、ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする。また、本発明は、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進する方法に使用するためのＴＧＦ−β阻害剤である。【００１０】
本発明の抗癌剤調製キットは、ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の癌の治療方法は、本発明の樹状細胞を患者に投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＴＧＦ−βを阻害する処理を施すのみで、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例Ａ１の結果である。
【図２】図２は、本発明の実施例Ａ１の結果である。
【図３】図３は、本発明の実施例Ａ１の結果である。
【図４】図４は、本発明の実施例Ａ２の結果である。
【図５】図５は、本発明の実施例Ａ２の結果である。
【図６】図６は、本発明の実施例Ａ３の結果である。
【図７】図７は、本発明の実施例Ａ３の結果である。
【図８】図８は、本発明の実施例Ａ３の結果である。
【図９】図９は、本発明の実施例Ａ３の結果である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例Ａ３の結果である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１３】図１３は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１５】図１５は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例Ａ４の結果である。
【図１７】図１７は、本発明の実施例Ａ５の結果である。
【図１８】図１８は、本発明の実施例Ａ５の結果である。
【図１９】図１９は、本発明の実施例Ａ５の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の促進方法は、例えば、前記処理工程が、樹状細胞を、ＴＧＦ‐β阻害剤で処理する工程である。
【００１５】
本発明の促進方法は、例えば、前記ＴＧＦ−β阻害剤が、Ｓｍａｄ２阻害剤である。
【００１６】
本発明の促進方法は、例えば、前記Ｓｍａｄ２阻害剤が、Ｓｍａｄ２の発現抑制剤である。
【００１７】
本発明の促進方法は、例えば、前記発現抑制剤が、Ｓｍａｄ２  ｍＲＮＡの転写を抑制する核酸分子である。
【００１８】
本発明の促進方法は、例えば、前記核酸分子が、ｓｉＲＮＡである。
【００１９】
本発明の促進方法は、例えば、前記樹状細胞が、骨髄由来または単球由来である。
【００２０】
本発明の促進方法は、例えば、前記単球が、末梢血単球である。
【００２１】
本発明の促進方法は、例えば、前記樹状細胞が、ヒト由来または非ヒト動物由来である。
【００２２】
本発明の促進方法は、例えば、前記処理工程が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
【００２３】
本発明の抗癌剤調製キットは、例えば、さらに、樹状細胞用の培養試薬を含む。
【００２４】
本発明の抗癌剤調製キットは、例えば、前記培養試薬が、培地を含む。
【００２５】
本発明の抗癌調製キットは、例えば、前記培地が、前記ＴＧＦ−β阻害剤を含む。
【００２６】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００２７】
以下に、本発明について、詳細に説明する。
【００２８】
（１）樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法
本発明の樹状細胞の抗癌免疫賦活能の促進方法は、例えば、樹状細胞のＴＧＦ−βを阻害する処理工程を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明において、ＴＧＦ−βを阻害する処理方法は、特に制限されず、前記処理工程は、例えば、樹状細胞を、ＴＧＦ−β阻害剤で処理する工程である。本発明において、ＴＧＦ−βの阻害は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達の阻害であり、具体的には、例えば、Ｓｍａｄ２シグナルの阻害であり、Ｓｍａｄ２の発現阻害であることが好ましい。このため、前記ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、Ｓｍａｄ２阻害剤であり、具体的には、Ｓｍａｄ２の発現抑制剤である。
【００３０】
本発明の促進方法は、例えば、前記発現抑制剤が、Ｓｍａｄ２  ｍＲＮＡの転写を抑制する核酸分子である。
【００３１】
前記Ｓｍａｄ２阻害剤は、特に制限されず、例えば、Ｓｍａｄ２の発現を抑制する発現抑制核酸分子等が使用できる。前記発現抑制酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等があげられる。前記Ｓｍａｄ２の発現の抑制とは、例えば、Ｓｍａｄ２遺伝子の発現抑制、すなわち、Ｓｍａｄ２遺伝子がコードするＳｍａｄ２タンパク質の翻訳の抑制である。前記Ｓｍａｄ２遺伝子の発現抑制は、例えば、前記Ｓｍａｄ２遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物（Ｓｍａｄ２  ｍＲＮＡ）の活性の減少、前記Ｓｍａｄ２遺伝子からの翻訳産物（Ｓｍａｄ２タンパク質）の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。
【００３２】
本発明において、前記樹状細胞の由来は、特に制限されず、例えば、骨髄、単球、リンパ節、脾臓等の由来があげられる。前記単球は、例えば、末梢血単球である。
【００３３】
本発明において、前記樹状細胞の生物由来は、特に制限されず、例えば、ヒトまたは非ヒト動物の由来があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ヤギ、ラクダ等の非ヒト哺乳類動物等があげられる。
【００３４】
本発明の促進方法は、例えば、前記処理工程が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われても、ｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合、前記樹状細胞は、例えば、生体から単離された細胞でもよいし、単離後に培養された培養細胞でもよい。
【００３５】
前記処理工程は、例えば、前記ＴＧＦ−β阻害剤を含む培地で前記樹状細胞を培養することにより行える。前記培地は、特に制限されず、例えば、前記樹状細胞の種類に応じて適宜設定できる。また、前記樹状細胞の培養条件は、特に制限されず、例えば、前記樹状細胞の種類に応じて適宜設定できる。前記ＴＧＦ−β阻害剤は、例えば、前記樹状細胞の培養において、予め前記培地に添加されてもよいし、培養開始後に前記培地に添加されてもよい。
【００３６】
前記培地における前記ＴＧＦ−β阻害剤の添加割合は、特に制限されず、例えば、前記樹状細胞の種類および前記ＴＧＦ−βの種類等に応じて、適宜設定できる。
【００３７】
前記ＴＧＦ−β阻害剤が発現抑制核酸分子の場合、前記処理工程は、例えば、以下のような条件で行うことができる。前記発現抑制核酸分子の添加割合は、例えば、細胞１０００個あたり１〜１０００ｎｍｏｌである。前記発現抑制核酸分子は、前記処理工程において、前記樹状細胞にトランスフェクションさせることが好ましい。前記トランスフェクションは、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記トランスフェクション試薬は、例えば、市販のトランスフェクション試薬が使用できる。
【００３８】
本発明の促進方法によれば、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞を得ることができる。このような樹状細胞は、後述するように、癌の治療に有用である。
【００３９】
本発明の促進方法は、例えば、樹状細胞には制限されず、ＮＫ細胞、ＣＴＬ等の免疫細胞にも適用できる。以下、同様である。
【００４０】
（２）抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞の製造方法
本発明の製造方法は、前述のように、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞の製造方法であり、前記本発明の抗原免疫賦活能の促進方法により、樹状細胞を処理する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記抗原免疫賦活能の促進方法により、樹状細胞を処理することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。また、本発明の製造方法は、前記本発明の促進方法の記載を援用できる。
【００４１】
（３）抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞
本発明の樹状細胞は、前述のように、抗癌免疫賦活能が促進された樹状細胞であり、前記本発明の製造方法により得られることを特徴とする。
【００４２】
（４）抗癌免疫賦活能の促進剤
本発明の促進剤は、前述のように、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進する促進剤であり、前記ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする。
【００４３】
本発明の促進剤は、例えば、前記本発明の促進方法および前記本発明の製造方法に使用できる。本発明において、前記ＴＧＦ−β阻害剤は、前述と同様である。
【００４４】
本発明の促進剤は、例えば、前記ＴＧＦ−β阻害剤のみを含んでもよいし、さらにその他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、例えば、前記本発明の促進方法において、樹状細胞を前記ＴＧＦ−β阻害剤で処理する際に使用できる成分があげられる。具体例として、前記その他の成分は、例えば、樹状細胞用の培養試薬があげられる。前記培養試薬は、例えば、培地があげられ、前記培地が、前記ＴＧＦ−β阻害剤を含んでもよい。また、前記ＴＧＦ−β阻害剤が、前記発現抑制核酸分子の場合、前記その他の成分は、例えば、培地の他に、前記トランスフェクション試薬があげられる。
【００４５】
本発明の促進剤は、例えば、前記ＴＧＦ−β阻害剤と前記その他の成分とが混合された形態でもよいし、別個に分離した形態であって、使用時に混合されてもよい。
【００４６】
（５）抗癌剤調製キット
本発明の抗癌剤調製キットは、前述のように、ＴＧＦ−β阻害剤を含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明の促進剤は、例えば、前記本発明の促進方法および前記本発明の製造方法に使用できる。本発明において、前記ＴＧＦ−β阻害剤は、前述と同様であり、また、前記本発明の促進剤の記載を援用できる。
【００４８】
本発明の抗癌剤調製キットは、例えば、さらに使用説明書を含んでもよい。
【００４９】
（６）癌の治療方法
本発明の治療方法は、前述のように、癌の治療方法であり、前記本発明の樹状細胞を患者に投与することを特徴とする。
【００５０】
本発明の治療方法において、患者に投与する前記樹状細胞は、前記本発明の樹状細胞であり、前記本発明の樹状細胞の説明における記載を援用できる。
【００５１】
本発明において、治療は、例えば、予防、改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。本発明において、治療対象となる癌は、特に制限されず、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等があげられる。
【００５２】
本発明において、前記本発明の樹状細胞の投与方法は、例えば、非経口投与があげられる。具体的には、例えば、病巣に、前記本発明の樹状細胞を配置することにより投与できる。
【００５３】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
まず、実施例Ａで使用した試薬および方法等を以下に示す。【００５５】
（１）マウス
conditional  Smad2  alleleがホモ接合型  (Smad2  loxp/loxp)のC57BL/6マウスを、Mx-1CreマウスまたはCd11cCre  recombinase  Tg  マウス(Jackson  Laboratory)と交配させ、Mx-1Cre;Smad2fl/flマウス、または、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスを作製した。なお、Mx-1Creマウスは、2-3週齢時に、PolyI:Cを腹腔内投与したものを用いた。また、以下の実施例においては、全て、同齢(8-16  weeks)のマウスを使用した。【００５６】
（２）マウスBMDCsの発生
マウスの大腿骨および脛骨から、骨髄細胞（BM細胞）を採取し、培地で培養した。培養条件は、37℃で７日間とした。前記培地は、10%  非働化ウシ胎児血清（FBS）(Gibco)、50μM  2-メルカプトエタノール、1%  ペニシリン/ストレプトマイシン、マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）(20ng/mL、PeproTech)およびIL-4(20ng/mL、PeproTech)を含むRPMI  1640を使用し、TGF-β1(5ng/mL、R&D  Systems)含有もしくは非含有、または、Activin  A(10ng/mL、R&D  Systems)含有もしくは非含有とした。前記培地に対する前記BM細胞の割合は、3×106  cells/3mLとした。【００５７】
（３）ヒトMoDCsの発生
ヒト血液から、試薬  (Histopaque-1077、Sigma-Aldrich)を用いた密度勾配遠心法により、末梢単核球を調製した。ヒト血液から、試薬キット（Human  Monocyte  Isolation  kit  II、Miltenyi  Biotec)を用いて、CD14+細胞を単離し、これを、組換えヒトGM-CSF(20ng/mL、PeproTech)およびIL-4(10ng/mL、PeproTech)とともに37℃で7日間培養し、CD14-CD1a+  MoDCs(>90  %)を発生させた。【００５８】
（４）siRNAのトランスフェクション
バッファー中で、単離したCD14+細胞（2-3×106  cells)に、200nmol／Lの各種核酸分子をトランスフェクションした。前記核酸分子は、ノンターゲットsiRNAプール、Smad2  siRNA(Dharmacon  RNA  Technologies、GenBankアクセッションNo.  NM_005901)、または、Smad3  siRNA(GenBankアクセッション  accession  No.  NM_005902)を使用した。また、トランスフェクションは、Human  Monocyte  Nucleofector  kit(Amaxa)を用い、使用説明書に従って行った。【００５９】
（５）免疫細胞化学（Immunocytochemistry）
6穴プレート(NUNC)のウェル中のポリ-L-リジンでコーティングされたガラススライド上で、BM細胞および単球を、前述のようにして培養した。これらの細胞およびCD4+  T細胞を、4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で固定し、May-Grunwald/Giemsa染色を行った。そして、キット（Duolink  II  in  situ  PLA  kits、OLINK)を用いたproximity  ligationのため、固定後の前記スライドを0.1%  Triton  X-100を含むTBSで透過処理した。抗体は、抗Smad2ウサギ抗体、抗Smad3ウサギ抗体、抗リン酸化-Smad2ウサギ抗体(S465/467)、および、抗リン酸化-Smad3ウサギ抗体(S423/425)を用いた(いずれも、Cell  Signaling  Technology)。なお、核は、DAPI（ジアミジノフェニルインドール）により染色した。前記スライドは、光学顕微鏡（Imager  Z1、Carl  Zeiss)、または、共焦点顕微鏡（LSM700、Carl  Zeiss)を用いて観察した。シグナルは、BlobFinderソフトウェア(Uppsala  University)を用いて、定量化した。【００６０】
（６）細胞の単離
マウスから採取した脾臓およびリンパ節を刻み、これらを、type  III  コラゲナーゼ  (Worthington  Biomedical  Corporation)およびDNase  I(Roche)を溶解させた10%  FBS含有RPMI  1640を用いて、室温で25分間、酵素処理することにより消化した。酵素処理の開始から20分の時点で、さらにEDTA(5mmol／L、Sigma-Aldrich)を添加した。そして、脾臓CD11c+細胞およびCD115+  lineage  marker-  BM細胞を、MACS  system(Miltenyi  Biotech)で濃縮した。脾臓CD11c+細胞およびCD115+  lineage  marker-  BM細胞の純度が、それぞれ80%であることを確認した。CD3+  T細胞は、脾臓から、T  cell  enrichment  columns(R&D  Systems)を用いて、濃縮した(>90%)。【００６１】
（７）フローサイトメトリー
マウス細胞は、最適濃度の抗体とともに、氷上で30分インキュベートした。前記抗体は、抗マウスCD16/CD32抗体、ならびに、蛍光色素をコンジュゲートした抗CD11c抗体、抗MHC  Class  II  (I-A/I-E)抗体、抗CD11b抗体、抗D40抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗B220抗体、抗CD115抗体、抗Gr-1抗体、抗CD3ε抗体、抗CD8抗体、抗CD4抗体、抗CD19抗体、抗DX5抗体、抗CD25抗体および抗CD45RA抗体を使用した。ヒト細胞は、蛍光色素をコンジュゲートした抗CD14抗体、抗CD1a抗体、抗CD11c抗体、抗HLA-DR/DP/DQ抗体、抗CD80抗体および抗CD86抗体により染色した。サイトカインの産生を測定するため、細胞は、GolgiPlug(BD  Pharmingen)を用いて、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート  (2.5ng/mL、Sigma-Aldrich)およびイオノマイシン(2.5ng/mL、Sigma-Aldrich)で、4時間刺激した。そして、前記細胞を、Cytoperm/Cytofix  Kit(eBiosciences)により固定し、透過処理した。また、細胞内染色のため、蛍光色素とコンジュゲートした抗Tbet抗体、抗Eomes抗体、抗FoxP3抗体、抗perforin抗体、抗granzyme  B抗体、抗IFN-γ抗体および抗TNF-α抗体を使用した。前記各抗体は、BD  PharmingenおよびeBiosciencesから購入した。フローサイトメトリーのデータは、LSRII(BD  Bioscience)により取得し、FlowJo(Tree  Star)により解析した。【００６２】
（８）定量的RT-PCR
全RNAは、試薬Trizol（登録商標）を用いて、使用説明書にしたがって抽出した。抽出したRNAは、cDNA  RT  kit(Invitrogen)を用いて逆転写した。そして、得られたマウスのcDNAは、ABI  7900(Applied  Biosystems)を用いて、SYBR  green(Applied  Biosystems)により定量化した。なお、RT-PCRのプライマーには、以下のものを使用した。【００６３】
GAPDH
配列番号１    5’-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’
配列番号２    5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3’
Smad2
配列番号３    5’-GGAACCTGCATTCTGGTGTT-3’
配列番号４    5’-ACGTTGGAGAGCAAGCCTAA-3’
Smad3
配列番号５    5’-TTAGGCACCAGCCTGTTTCT-3’
配列番号６    5’-TGGCGATACACCACCTGTTA-3’
granzyme  B
配列番号７    5’-GGACTGCAAAGACTGGCTTC-3’
配列番号８    5’-ATAACATTCTCGGGGCACTG-3’
Perforin
配列番号９    5’-TTTCGCCTGGTACAAAAACC-3’
配列番号１０  5’-AGGGCTGTAAGGACCGAGAT-3’
FasL
配列番号１１  5’-CATCACAACCACTCCCACTG-3’
配列番号１２  5’-GTTCTGCCAGTTCCTTCTGC-3’
IFN-γ
配列番号１３  5’-ACTGGCAAAAGGATGGTGAC-3’
配列番号１４  5’-GACCTGTGGGTTGTTGACCT-3’
TNF-α
配列番号１５  5’-TATGGCTCAGGGTCCAACTC-3’
配列番号１６  5’-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3’,
IL-6
配列番号１７  5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’  
配列番号１８  5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’
IL-12p35
配列番号１９  5’-CACCCTTGCCCTCCTAAACC-3’
配列番号２０  5’-CACCTGGCAGGTCCAGAGA-3’
IL-12p40
配列番号２１  5’-GCTCAGGATCGCTATTACAATTCC-3’
配列番号２２  5’-TCTTCCTTAATGTCTTCCACTTTTCTT-3’
IL-15
配列番号２３  5’-CATCCATCTCGTGCTACTTGTGTT-3’
配列番号２４  5’-CATCTATCCAGTTGGCCTCTGTTT-3’【００６４】
また、ヒトcDNAは、pre-synthesized  TaqMan  Gene  Expression  Assays(Applied  Biosystems)を用いて、ヒトSmad2(Hs00183425_m1)、ヒトSmad3(Hs00969210_m1)およびヒトGAPDH(Hs99999905_m1)を定量化した。comparative  Ct法により、各mRNAについて、GAPDHに対する相対mRNAレベルを算出した。【００６５】
（９）ウェスタンブロッティング
細胞を、試薬（RIPA  buffer）で溶解し、10%  SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。前記ゲル内のタンパク質を、ニトロセルロース膜(Millipore)に転写し、抗Smad2抗体、抗p-Smad2抗体および抗Smad3抗体(いずれも、Cell  Signaling  Technology)ならびに抗β-actin抗体(Santa  Cruz  Biotechnology)で標識し、ECL  kit(GE  Healthcare)により可視化した。【００６６】
（１０）EL4  リンパ腫
EL4細胞に、GFP-expressing  FG12  レンチウイルスベクターをトランスフェクションし、10%  FBSおよび抗生物質を含むDMEM(WelGene  Inc.)で培養した。培養したEL4細胞(1×106  cells）を、8週齢のCd11cCre;Smad2+/+マウスまたはCd11cCre;Smad2fl/flマウスの右下腹部に接種した。癌のサイズをデジタルカリパーにより測定し、癌体積を下記計算式により算出した。
（［短径]2×長径)/2【００６７】
そして、接種したガン、流入領域リンパ節(右鼠蹊部)、非流入リンパ節および脾臓を採取し、評価に用いた。【００６８】
（１１）EL4ライセートをDCs（樹状細胞）にパルスすることによるEx  vivoでのT細胞刺激
前述のように、ELを接種したCd11cCre;Smad2+/+マウスまたはCd11cCre;Smad2fl/flマウスの脾臓から、DCs（樹状細胞）およびT細胞を単離した。そして、精製したDCsを所定濃度(2×105、4×104、2×104cells/well)とし、CFSE(Molecular  Probe)で標識したT細胞(2×105cells/well)と共培養した。前記共培養は、U-bottom  96ウェルプレートを使用し、液体窒素で凍結させたEL4細胞ライセート(7×104  凍結細胞/well)の存在下で、5日間行った。そして、CFSE希釈および細胞内サイトカインは、フローサイトメトリーにより測定した。【００６９】
なお、共培養において、DCsとT細胞との比率は、1:1、1:5および1:10とし、DCsとT細胞との遺伝子型の組合せ（DC/T）は、以下の通りとした。
Cd11cCreSmad2+/+  /  Cd11cCre;Smad2+/+
Cd11cCre;Smad2+/+  /  Cd11cCre;Smad2fl/fl
Cd11cCre;Smad2fl/fl  /  Cd11cCre;Smad2+/+
Cd11cCre;Smad2fl/fl  /  Cd11cCre;Smad2fl/fl【００７０】
（１２）細胞毒性解析
EL4接種マウスの脾臓由来のCD8+  T細胞  (0、1×104、2×104、1×105、2×105  cells）を、CD8+  (Ly-2)  microbeads(Miltenyi  Biotec)を用いた免疫磁気ビーズ法（MACS）により濃縮した。また、全流入領域リンパ節細胞(0、1×104、2×104、1×105  cells)を、U-bottom  96ウェルプレートで、EL4細胞(2×103  cells)と3日間共培養した。細胞毒性は、LDH  cytotoxicity  detection  assay  kit(Promega)を用いて、490nmの吸光度を測定することで算出した。特異的溶解パーセンテージは、使用説明書に従って算出した。【００７１】
（１３）組織学的解析
原発腫瘍を回収し、10%  中性緩衝ホルマリンで固定した。固定したサンプルを、70%  エタノールで脱水し、パラフィンで包埋した。これを3μmの切片に切り出し、エマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を行った。また、免疫組織化学のため、パラフィン固定した腫瘍の切片を、60℃で一晩回収し、キシレンによる脱パラフィン、エタノールによる脱水、peroxidase  blocking  reagent(Dako)によるブロッキングを行った。それから、前記切片のスライドは、抗CD3抗体、抗CD8抗体(abcam)または抗CD11c抗体(eBioscience)と一晩反応させ、続けてHRP-conjugated  secondary  antibody(Vector)と反応させた。なお、対比染色には、Mayer’s  hematoxylin(Sigma)を使用した。【００７２】
（１４）統計
各種データは、unpaired  Student’s  t-testおよびtwo-way  repeated  ANOVA  testにより解析した。なお、P値<0.05は、統計的に有意であることを示す。【００７３】
（実施例Ａ１）
樹状細胞におけるＴＧＦ−βＲ−Ｓｍａｄｓの発現パターンを確認した。【００７４】
Smad2は、TGF-β経路において特異的なシグナルを伝えるR-smadの一種であり、マウスおよびヒトの樹状細胞（DSc）において発現する主要なTGF-β  R-Smadとして知られている。そこで、マウス脾臓由来樹状細胞、マウス骨髄（BM）由来樹状細胞(BMDCs)およびヒト単球由来樹状細胞(MoDCs)を、GM-CSFおよびIL-4による7日間の処理で分化させ、TGF-β  R-Smadsの基本的な発現パターンを、確認した。【００７５】
C57BL/6  mice由来のBM細胞を、マウスGM-CSF(20ng/mL)およびIL-4(20ng/mL)の存在下、７日間培養して、BMDCsを生じさせ、ヒト単球を、ヒトGMCSF(20ng/mL)およびIL-4(10ng/mL)の存在下、7日間培養して、MoDCsを生じさせた。そして、マウスCD115+  lineage  marker-  BM細胞およびCD11c+  細胞を、脾臓およびBMから、それぞれ精製した。【００７６】
そして、まず、Smad2  mRNAおよびSmad3  mRNAの発現量を、定量的RT-PCRにより確認した(n=3-5)。これらの結果を図１（A）〜（D）に示す。図１（A）および（B）は、マウス全BM細胞、マウスCD115+  lineage  marker-  BM細胞、マウスBMDCsおよびマウス脾臓DCsにおける結果であり、(A)が、Smad2  mRNA、(B)が、Smad3  mRNAの発現量を示す。また、図１（C）および（D）は、ヒト単球およびヒトMoDCsにおける結果であり、(C)が、Smad2  mRNA、(D)が、Smad3  mRNAの発現量を示す。【００７７】
つぎに、Smad2、リン酸化Smad2、Smad3およびリン酸化Smad3の発現を、proximity  ligation  assayにより決定した。具体的には、細胞の核を、DAPIにより染色し、画像を、共焦点顕微鏡（LSM700）により取得した。そして、10個の視野において、核中の染色された赤いドット（黒）および細胞質中の青いドット(白)を定量化した。これらの結果を、図２（E）および（F）のグラフに示す。図２（E）は、マウス全BM細胞、マウスCD115+  lineage  marker-  BM細胞、マウスBMDCsおよびマウス脾臓DCsの結果であり、図２(F)は、ヒト単球およびヒトMoDCsの結果であり、それぞれ、Smad2、リン酸化Smad2、Smad3、およびリン酸化Smad3の発現を示す。各グラフは、平均値＋SDを示す。また、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。各グラフにいおいて、N.S.は、有意でないことを示す。さらに、図中の黒色のバーは、核内のドット数を示し、白色のバーは、細胞質中のドット数を示す。【００７８】
さらに、Smad2、リン酸化Smad2、Smad3およびβ-アクチンの発現を、ウエスタンブロットにより検出した。これらの結果を、図３（G）の写真に示す。図３（G）は、マウス全BM細胞、マウスBMDCs、ヒト単球およびヒトMoDCsの結果である。【００７９】
図１（A）および（C）に示すように、GAPDHに対し正規化したSmad2  mRNAは、DC前駆細胞である、マウス全BM細胞、マウスCD115+  lineage-  BM細胞およびヒト単球において、高発現していた(マウス全BM細胞:0.02037±0.00208、マウスCD115+  lineage-  BM細胞：0.01712±0.00166、マウスBMDC:0.01154±0.00117、マウス脾臓DC:0.15405±0.00216)。これに対して、図１（B）および（D）に示すように、マウス脾臓DCsおよび前記DC前駆細胞において、正規化したSmad3  mRNAは、Smad2  mRNAに較べて非常に低かった。中でもマウスBMDCsおよびヒトMoDCsにおいては、検出できないレベルにまで減少していた(マウス全BM細胞:0.00098±0.00009、マウスCD115+  lineage-  BM細胞:0.00057±0.00006、マウスBMDC:0.00009±0.00003、マウス脾臓DC:0.00015±0.00001)。【００８０】
また、Proximity  ligation  assayでは、図２（E）および（F）に示すように、マウスDCsおよびヒトDCsにおいて、Smad2が、Smad3に対して有意に発現したことがわかった。そして、図３（G）に示すように、Smad2タンパク質の発現レベルは、前記DC前駆細胞とDCsとの間において同程度であった。また、図３（G）に示すように、前記DC前駆細胞におけるSmad3タンパク質の発現レベルは、Smad2タンパク質の発現レベルよりも低く、DCsにおいては、さらに減少していた。また、前記前駆細胞およびDCsにおいて、Smad2は、大部分がリン酸化されていたが、Smad3のリン酸化は、ほとんど検出できなかった。【００８１】
また、Smad2(60kDa)、リン酸化Smad2およびSmad3(50kDa)に対するウエスタンブロットでも、同様に、DCsにおいて、Smad2タンパク質の発現レベルは、Smad3タンパク質の発現レベルよりも非常に有意に高いことが確認できた。【００８２】
このように、マウス脾臓DCs、GM-CSF/IL-4で誘導されたマウスDCsおよびヒトDCsにおける、Smad3よりも有意なSmad2の発現は、Smad2が、DCsにおける主要なTGF-β  R-Smadであることを示唆している。【００８３】
（実施例Ａ２）
DCsは、T細胞を活性化するために、樹状突起および共刺激分子を発現している。そこで、DCsの免疫原性におけるSmad2の役割の確認を行った。【００８４】
DCsとして、Mx-1Cre;Smad2+/+マウス(以下、「Smad2+/+」という)とMx-1Cre;Smad2fl/flマウス(以下、「Smad2-/-」という）とから取得したマウスBMDCs、および、siRNAによってSmad2をノックダウンしたヒトMoDCsを使用した。なお、siRNAによりSmad2がノックダウンされたことは確認済みである。【００８５】
まず、May-Grunwald/Giemsa染色を行い、光学顕微鏡（Imager  Z1、Carl  Zeiss)により画像を取得し、TGF−βがDCsの免疫免疫原性を抑制することを確認した。これらの結果を、図４（A）および（B）に示す。図４（A）は、マウスのBMDCの染色結果であり、左欄が、Smad2+/+マウスのBMDCの結果、右欄が、Smad2-/-マウスのBMDCの結果であり、下段は、上段の拡大図である。また、図４（B）は、ヒトMoDCの染色結果であり、左欄が、コントロールsiRNAで処理した結果（コントロール）、右欄が、Smad2に対するsiRNA（siSmad2）で処理した結果であり、下段は、上段の拡大図である。各図において、スケールバーは、上段が100μmを示し、下段が20μmを示す。【００８６】
図４（A）に示すように、Smad2-/-マウスのBMDCsは、Smad2+/+マウスのBMDCsに比べ、樹状突起が顕著に発達しており、図４（B）に示すように、Smad2をsiRNAでノックダウンしたヒトMoDCsにおいても、樹状突起の形成が増強されていた。【００８７】
つぎに、Mx-1Cre;Smad2+/+マウスおよびMx-1Cre;Smad2fl/flマウスのBM細胞を、TGF−β1(5ng/mL)もしくはアクチビンA(10ng/mL)の存在下または非存在下で処理し、BMDCを発生させた。これらのBMDCにおけるCD40、CD80およびCD86の発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラム、および、CD11c+  MHC  class  II+  細胞におけるCD40+、CD80+およびCD86+の割合（％）のグラフを、図５（C）、（D）および（F）に示す（n=5-7）。図５において、右側の各棒グラフは、平均値＋SDを示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。各棒グラフにいおいて、N.S.は、有意でないことを示す。図５（C）は、TGF−β存在下または非存在下におけるマウスBMDCの結果、図５（D）は、アクチビンAの存在下または非存在下におけるマウスBMDCの結果であり、図５（E）は、コントロールsiRNAまたはsiSmad2を導入したヒトMoDCsの結果である。【００８８】
また、図５（C）に示すように、Smad2-/-マウスのBMDCにおけるCD40、CD80およびCD86の発現レベルは、Smad2+/+マウスのBMDCに比べて、顕著に増加しており、外来性のTGF-β1による阻害効果は、Smad2を欠失することによって、完全に消失していた。他方、TGF-β  スーパーファミリーサイトカインの一種であるアクチビンAも、Smad2およびSmad3を活性化する。しかし、図５（D）に示すように、TGF-β1とは異なり、アクチビンA(5ng/mL)は、BMDCにおけるCD40、CD80およびCD86の発現に影響を与えなかった。また、図５（E）に示すように、siRNAによりSmad2をノックダウンしたヒトMoDCは、B7ファミリー分子(CD80およびCD86)の発現が増加した。これらの結果から、Smad2が媒介するTGF-βシグナルは、DCsの免疫原性を阻害するといえる。【００８９】
（実施例Ａ３）
Smad2欠失によって、DCsの免疫原性が増強されることは、Smad2が、DCを使用する癌免疫療法の効果を高めるための、ターゲットとなることを示唆する。そこで、マウスEL4  Ｔ細胞リンパ腫モデルを用いて、Smad2を欠失したDCsが、抗癌免疫賦活能を増強するかを確認した。【００９０】
（１）腫瘍の発生率および成長
Smad2を有するCd11cCre;Smad2+/+マウスおよびDCs-特異的Smad2欠失マウス(Cd11cCre;Smad2fl/flマウス)の右下腹部にEL4細胞(1×106  cells）を接種し、接種後の癌のサイズを経時的に測定した(n=15/genotype)。これらの結果を、図６（A）および（B）に示す。図６（A）は、直径5mm以上の癌の割合（％）であり、図６（B）は、癌の体積の結果を示す。図６において、各グラフは、平均値＋SDまたは平均値−SDを示し、P値は、two-way  repeated  ANOVA  testにより計算した。【００９１】
図６（A）および（B）に示すように、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスでは、EL4腫瘍の発生率および成長は、著しく抑制された。【００９２】
（２）CD11c+  MHC  II+  細胞の増加
EL4腫瘍を接種したマウスについて、流入領域リンパ節におけるCD11c+  MHC  class  II+細胞の割合を確認した。これらの結果を、図７（C）に示す。図７において、上図は、細胞の分布を示し、下図は、流入領域リンパ節におけるCD11c+  MHC  class  II+細胞の割合を示すグラフである。図７の下図において、白いバーが、EL4腫瘍を接種したCd11cCre;Smad2+/+マウスの結果であり、黒いバーが、EL4腫瘍を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウスの結果であり、平均値+SDを示す(n=10/genotype).  【００９３】
図７に示すように、CD11c+  MHC  II+  細胞は、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスの流入領域リンパ節において有意に増加していた。【００９４】
（３）免疫組織化学
Cd11cCre;Smad2+/+マウスおよびCd11cCre;Smad2fl/flマウスのパラフィン切片を準備し、CD11c+細胞の免疫組織化学検査を行った。スライドは、光学顕微鏡（Imager  Z1、Carl  Zeiss)を用いて確認した。これらの結果を、図８（D）に示す。図８（D）は、免疫組織化学の写真であり、スケールバーは、20μmである。図８（D）に示すように、単核細胞を伴う樹状突起を有するCD11c+細胞は、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスのリンパ腫に浸潤していることが確認された。他方、Cd11cCre;Smad2+/+マウスにおいては、前記浸潤は、確認されなかった。【００９５】
（４）共刺激分子の発現
Cd11cCre;Smad2+/+マウスおよびCd11cCre;Smad2fl/flマウスの流入領域リンパ節におけるCD11c+  MHC  class  II+  DCsのCD40、CD80およびCD86の発現を確認した。これらの結果を、図９（E）に示す。図９（E）は、CD11c+  MHC  class  II+  DCsにおけるCD40+、CD80+およびCD86+細胞の割合（％）を示す。図９（E）において、下側の棒グラフは、％の平均値＋SDを示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。また、図９（E）において、白いバーは、Cd11cCre;Smad2+/+マウス、黒いバーは、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスの結果を示す。【００９６】
図９（E）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスは、流入領域リンパ節におけるCD11c+  MHC  class  II+  DCsの共刺激分子（CD40、CD80およびCD86）の発現は、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して有意に増加した。【００９７】
（５）サイトカインの発現
DCsは、Th1細胞、CTLsおよびNK細胞を活性化するIL-12およびIL-15を分泌する。DCsによるIL-12の産生は、初期のT細胞が関与する免疫応答の開始に必須であり、DCsは、IL-12に応答して、高レベルのIFN-γを産生する。そして、DCsは、TNF-αおよびIL-6のような、様々な炎症性サイトカインも分泌する。そこで、脾臓DCsにおける炎症性サイトカインの発現を、定量的RT-PCRにより測定した。【００９８】
これらの結果を図１０（F）および（G）に示す。図１０（F）および（G）は、EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウス（黒いバー）およびCd11cCre;Smad2+/+マウス（白いバー）の脾臓DCsにおける各種サイトカインのmRNAの発現量を示す。各グラフは、平均値＋SD(n=11/genotype)を示す。また、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。各グラフにいおいて、N.S.は、有意でないことを示す。図１０（F）および（G）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスの脾臓DCsにおけるIL-12  p35、IL-15、IL-6およびTNF-α  mRNAの発現は、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、有意に増加した。【００９９】
これらの結果から、DC特異的Smad2欠失は、DCsの免疫原性を増強し、これによって、同所性リンパ腫の発達を抑制することがわかった。【０１００】
（実施例Ａ４）
Smad2欠失が、抗リンパ腫エフェクターT細胞分化に与える影響について確認した。【０１０１】
EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウスおよびCd11cCre;Smad2+/+マウスの流入領域リンパ節の免疫学表現型タイピングを、フローサイトメトリーにより行った。これらの結果を図１１（A）に示す。図１１（A）は、平均値+SDを示す(n=10/genotype)。図１１（A）に示すように、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスは、CD8+  T細胞およびCD4+  T細胞が有意に増加した。【０１０２】
EomesおよびT-betは、CTLおよびTh1エフェクター細胞の抗腫瘍機能に必須のT-box  転写因子である。そこで、フローサイトメトリーにより、EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウスおよびCd11cCre;Smad2+/+マウスの流入領域リンパ節におけるCD8+  T細胞のEomes+およびCD4+  T細胞のT-bet+の割合（％）を確認した。これらの結果を、図１２（B）に示す。図１２（B）において、下側の各棒グラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１２（B）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス（黒いバー）は、Cd11cCre;Smad2+/+マウス（白いバー）と比較して、流入リンパ節で増加していたCD8+  T細胞およびCD4+  T細胞が、それぞれEomesとT-betを、非常に高いレベルで有意に発現していた。【０１０３】
定量的RT-PCRにより、EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウスおよびCd11cCre;Smad2+/+マウスの脾臓T細胞のRNAについて、サイトカイン  mRNAの発現量を測定した。これらの結果を、図１３（C）に示す。図１３（C）のグラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１３に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス（黒いバー）は、Cd11cCre;Smad2+/+マウス（白いバー）と比較して、脾臓T細胞が、IFN-γ  mRNAおよびTNF-α  mRNAを非常に高いレベルで有意に発現していた。【０１０４】
フローサイトメトリーにより、EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2fl/flマウスおよびCd11cCre;Smad2+/+マウスの流入領域リンパ節のCD8+  T細胞におけるIFN-γ+およびTNF-α+の割合（％）を測定した。これらの結果を、図１４（D）に示す。図１4（D）において、下側のグラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１４（D）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス（黒いバー）は、Cd11cCre;Smad2+/+マウス（白いバー）と比較して、PMAおよびイオノマイシンの刺激によるCD8+  T細胞でのIFN-γおよびTNF-αの細胞内発現、および、CD4+  T細胞におけるIFN-γの細胞内発現は、有意に増加した。【０１０５】
DCsにおけるSmad2欠失が、抗原特異的エフェクターT細胞応答に与える影響を確認した。具体的には、CFSE希釈によりEL4-特異的T細胞分裂を確認するため、EL4を接種したマウスの脾臓から精製したCD3+  T細胞とDCsとを、EL4凍結ライセート存在下、5日間共培養した。そして、フローサイトメトリーにより、CD8+  T細胞における分裂細胞の割合（％）を求めた。これらの結果を、図１５（E）に示す。図１５（E）において、下側の各棒グラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１５（E）に示すように、最も効果的なT細胞増殖は、DC:T細胞の割合が1:1のときに誘導され、他の割合と比較して、Smad2-/-  DCsは、CD8+  T細胞およびCD4+  T細胞の増殖を著しく誘導した。【０１０６】
また、あわせて、フローサイトメトリーにより、CD8+  T細胞におけるIFN-γ+およびTNF-α+の割合を求めた。これらの結果を、図１６（F）に示す。図１６（F）において、各棒グラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。各グラフにおいて、各バーの種類は、前記図１５（E）と同様であり、N.S.は、有意でないことを示す。図１６（F）に示すように、最大のサイトカイン産生は、DC:T細胞の割合が1:10のときに誘導され、そして、ex  vivoにおいて、Smad2-/-  DCsおよびEL4ライセートによって刺激されたT細胞は、Smad2+/+  DCsによって刺激されたT細胞に比べ、炎症性サイトカインを有意に産生した。【０１０７】
このように、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス由来のよく分化したCD8+  T細胞およびCD4+  T細胞でさえも、ex  vivoにおいて、Smad2+/+  DCsによる再刺激した場合、優れた増殖、または、多くのエフェクターサイトカインの産出ができなかった。これに対して、Smad2-/-  DCsは、Smad2+/+  DCsと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス由来のみならずCd11cCre;Smad2+/+マウス由来のCD8+  T細胞およびCD4+  T細胞の増殖およびサイトカイン産生を誘導した。これらの結果から、Smad2シグナルが、DCsの効果的な抗癌T細胞応答の誘導を阻害することがわかった。【０１０８】
（実施例Ａ５）
DC特異的Smad2の欠失が、抗リンパ腫細胞溶解活性に与える影響を確認した。【０１０９】
EL4リンパ腫を接種したCd11cCre;Smad2+/+マウスおよびCd11cCre;Smad2fl/flマウスについて、CD8+  T細胞のHE染色および免疫組織化学検査のパラフィン切片を作製した。そして、パラフィン切片のスライドを光学顕微鏡（Imager  Z1、Carl  Zeiss)で観察した。これらの結果を、図１７（A）および（B）に示す。図１７（A）は、HE染色の結果であり、図１７（B）は、免疫組織化学検査の結果であり、両図において、スケールバーは、100μmである。図１７（A）に示すように、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、Cd11cCre;Smad2fl/flマウスに接種されたリンパ腫は、単核細胞の浸潤が著しく増加した。また、図１７（B）に示すように、流入領域リンパ節においてCD8+  T細胞が増加しているのと一致して、多くの癌-浸潤単核細胞が、CD3+  T細胞およびCD8+  T細胞であることもわかった。【０１１０】
つぎに、エフェクター免疫細胞による標的癌細胞の溶解を検出するため、エフェクター細胞としてEL4接種したマウス由来のNK細胞およびCTLsの両方を含む全流入領域リンパ節、または脾臓CD8+  T細胞を、標的癌細胞（EL4細胞）と、様々な割合（エフェクター細胞E：標的細胞T）で共培養した。そして、細胞溶解は、上清におけるLDH放出の測定により評価した。これらの結果を、図１８（C）および（D）に示す。図１８（C）および（D）は、細胞溶解の割合（％）を示すグラフであり、図１８（C）が、流入領域リンパ節を使用した結果、図１８（D）が、脾臓CD8+  T細胞を使用した結果であり、両グラフは、平均値＋SDまたは平均値−SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１８（C）および（D）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス由来の全流入領域リンパ節および脾臓CD8+  T細胞は、それぞれ、Cd11cCre;Smad2+/+マウスと比較して、有意に増強されたLDH放出が確認された。【０１１１】
Perforin、granzyme  BおよびFasL等の細胞溶解エフェクター分子は、NK細胞およびCTLsの細胞毒性の原因となる。そこで、定量的RT-PCRにより、EL4接種したCd11cCre;Smad2+/+マウスおよびCd11cCre;Smad2fl/flマウスの脾臓T細胞について、これらの発現を確認した。また、フローサイトメトリーにより、流入領域リンパ節のCD8+  T細胞におけるperforin+およびgranzyme  B+の割合（％）を求めた。これらの結果を、図１９（E）および（F）に示す。図１９（E）は、細胞溶解エフェクター分子の発現量を示すグラフであり、図１９（F）は、CD8+  T細胞の割合（％）を示すグラフである。各グラフは、平均値＋SD(n=5/genotype)を示し、P値は、2-tailed  unpaired  Student’s  t-testにより計算した。図１９（E）および（F）に示すように、Cd11cCre;Smad2fl/flマウス（黒いバー）は、脾臓T細胞における細胞溶解エフェクター分子のmRNAの発現、および流入領域リンパ節のCD8+  T細胞におけるpeforinおよびgranzyme  Bのタンパク質レベルが、Cd11cCre;Smad2+/+マウス（白いバー）と比較して、有意に増加した。これらの結果から、Smad2欠失DCsは、in  vivoにおいて、効果的に抗リンパ腫瘍細胞溶解能を活性化させることがわかる。【０１１２】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１１３】
この出願は、２０１４年８月１４日に出願された日本出願特願２０１４−１６５２８７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によれば、例えば、ＴＧＦ−βを阻害する処理を施すのみで、樹状細胞の抗癌免疫賦活能を促進できる。
【図１】
2016024628.tif 000003
【図２】
2016024628.tif 000004
【図３】
2016024628.tif 000005
【図４】
2016024628.tif 000006
【図５】
2016024628.tif 000007
【図６】
2016024628.tif 000008
【図７】
2016024628.tif 000009
【図８】
2016024628.tif 000010
【図９】
2016024628.tif 000011
【図１０】
2016024628.tif 000012
【図１１】
2016024628.tif 000013
【図１２】
2016024628.tif 000014
【図１３】
2016024628.tif 000015
【図１４】
2016024628.tif 000016
【図１５】
2016024628.tif 000017
【図１６】
2016024628.tif 000018
【図１７】
2016024628.tif 000019
【図１８】
2016024628.tif 000020
【図１９】
2016024628.tif 000021
【配列表】
2016024628000001.app
【国際調査報告】
2016024628.tif 000022
2016024628.tif 000023
2016024628.tif 000024
2016024628.tif 000025
2016024628.tif 000026
2016024628.tif 000027