(57)【要約】  本発明は、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する１種または２種以上のペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸がそれぞれ独立して、置換、欠失または付加されていてもよいペプチド、糖類および無機塩を含有する組成物であって、安定性が高く、長期間保存可能なペプチド組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する１種または２種以上のペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸がそれぞれ独立して、置換、欠失または付加されていてもよいペプチド、糖類および無機塩を含有する組成物。
【請求項２】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファンまたはトレオニンであるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｃ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであるペプチドを含有する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列からなる５種のペプチドを含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
糖類が、単糖類、二糖類および多糖類からなる群から選択される１または２以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストランおよびグリセロールからなる群から選択される１または２以上である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
糖類が、スクロースである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、亜硫酸ナトリウムおよびピロ亜硫酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
無機塩が、塩化ナトリウムである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
凍結乾燥製剤である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
ペプチドの重量が、１．０〜２０ｍｇである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
全量が２．０ｇになるように水で溶解した時におけるペプチドの濃度が、０．０５〜１．０重量％である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
糖類の重量が、２０〜７０ｍｇである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
組成物中のペプチドと糖類の重量比が、１：１．７〜１：２９．２である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
全量が２．０ｇになるように水で溶解した時における糖類の濃度が、１．０〜３．５重量％である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
無機塩の重量が、０．１〜３．０ｍｇである、請求項１０〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
組成物中のペプチドと無機塩の重量比が、１：０．００８〜１：１．２５である、請求項１０〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
全量が２．０ｇになるように水で溶解した時における無機塩の濃度が、０．０１〜０．３重量％である、請求項１０〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
水で溶解した時に、ｐＨ７．０〜９．５である、請求項１０〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
油中水滴エマルション製剤である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１０〜１９のいずれかに記載の組成物から調製された請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
注射剤である、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
バイアル中の酸素濃度が０．０１％以上、３．０％未満である、請求項１０〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１０〜１９のいずれかに記載の組成物とアジュバントを混合することにより、エマルションを調製する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物を含むキット。
【請求項２６】
少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、安定性の高いペプチド、糖類および無機塩を混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、ｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調製する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、安定性の低いペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、ｐＨ７．０以上、９．０未満に調製する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法。
【請求項２７】
少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調製する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調製する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法。
【請求項２８】
少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１１．０以上、１２．０未満に調製する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ９．０以上、１１．０未満に調製する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した液に、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｆ）該ｅ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調製する工程、
ｇ）該ｆ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法。
【請求項２９】
さらに、バイアル中の酸素濃度を０．０１％以上、３．０％未満に制御する工程を含有する請求項２６〜２８のいずれかに記載の凍結乾燥製剤調製法。
【請求項３０】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法で調製した凍結乾燥製剤。
【請求項３１】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されていてもよいペプチドを含み、バイアル中の酸素濃度が０．０１％以上、３．０％未満である組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを含む組成物に関する。詳しくは、糖および無機塩を含有することで、さらに詳しくは、スクロースおよび塩化ナトリウムを含有することで、複数種類のペプチドの安定性を向上した組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療または予防のためのワクチンとして用いられる細胞障害性Ｔ細胞誘導能を有するペプチドとして複数知られている（特許文献１〜３）。これらのペプチドによっては、長期安定性試験をおこなうと、類縁体が生じ、残存率が低下するものもある。【０００３】
複数種類のペプチドを含むワクチン製剤の効果は、配合するペプチドの種類が多いほど高くなる。しかし、複数種類のペプチドを有効量含ませようとすれば、単位量当たりのペプチド含量が増えるため、全ペプチドを完全に溶解することはより困難になる。また、性質の異なる複数種類のペプチドが共存することになるため、すべてのペプチドを安定に維持することもより困難となる。【０００４】
ペプチドを含む癌ワクチンの製剤の例として、炭酸ナトリウムおよび／またはアルギニンを含有する製剤（特許文献４）が開示されている。さらに、スクロース等の糖類および塩化ナトリウム等の無機塩を含有することで、タンパク質またはペプチドが安定化した注射剤の例としては、不活性化デング熱ウイルス、ポロキサマー界面活性剤、塩化ナトリウム、スクロース等を含有する製剤（特許文献５）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子、塩化ナトリウム、スクロース等を含有する製剤（特許文献６）、第ＶＩＩＩ因子、表面活性剤、塩化カルシウム、スクロース、塩化ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、アミノ酸を含まない緩衝剤等を含有する製剤（特許文献７）、高濃度濃縮タンパク質、塩化ナトリウム、スクロース等を含有する製剤（特許文献８）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０、５０：５０ＤＬ  ＰＬＧ  ４Ａポリマー、エキセンディン−４、スクロース等を含有する製剤（特許文献９）、Ｆｃドメイン含有ペプチド、Ｌ−アルギニン、塩化ナトリウム、スクロース等を含有する製剤（特許文献１０）、ヒト血清アルブミン、スクロース、グルタミン酸、塩化ナトリウム、リン酸アルカリ金属塩等を含有する製剤（特許文献１１）、ヘパランＮ−スルファターゼタンパク質、塩化ナトリウム、緩衝剤、ポリソルベート界面活性剤、スクロース等を含有する製剤（特許文献１２）が開示されている。しかし、ペプチドのアミノ酸配列が異なると、安定性も大きく異なり、開示されている組成を適用しても安定性向上に寄与するとは限らない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０４７４７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０９０８１０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９／１５３９９２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１３／１３３４０５号パンフレット
【特許文献５】特表２０１４−５１５３６７号公報
【特許文献６】特表２００９−５２４５９５号公報
【特許文献７】特表２００５−５３０７１４号公報
【特許文献８】特表２０１３−５２１２９６号公報
【特許文献９】特表２００７−５３２６８２号公報
【特許文献１０】特表２００５−５２７５０３号公報
【特許文献１１】特表２００１−５１８４４７号公報
【特許文献１２】特表２０１３−５３０９８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１種または２種以上のペプチドを含み、水に種々のペプチドを溶解可能であり、安定性が高く、長期保存可能な組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖および無機塩を含有することで、種々のペプチドが水に溶解し、かつ、安定性を高めた組成物を見出し、以下に示す本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する１種または２種以上のペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸がそれぞれ独立して、置換、欠失または付加されていてもよいペプチド、糖類および無機塩を含有する組成物、
［２］Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファンまたはトレオニンであるペプチドを有する、前記［１］記載の組成物、
［３］Ｃ末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであるペプチドを含有する、前記［１］または［２］記載の組成物、
［４］配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列からなる５種のペプチドを含有する、前記［１］記載の組成物、
［５］糖類が、単糖類、二糖類および多糖類からなる群から選択される１または２以上である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物、
［６］糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストランおよびグリセロールからなる群から選択される１または２以上である、前記［５］に記載の組成物、
［７］糖類が、スクロースである、前記［６］記載の組成物、
［８］無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、亜硫酸ナトリウムおよびピロ亜硫酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上である、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の組成物、
［９］無機塩が、塩化ナトリウムである、前記［８］記載の組成物、
［１０］凍結乾燥製剤である、前記［１］〜［９］のいずれかに記載の組成物、
［１１］ペプチドの重量が、１．０〜２０ｍｇである、前記［１０］記載の組成物、
［１２］全量が２．０ｇになるように水で溶解した時におけるペプチドの濃度が、０．０５〜１．０重量％である、前記［１０］記載の組成物、
［１３］糖類の重量が、２０〜７０ｍｇである、前記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の組成物、
［１４］組成物中のペプチドと糖類の重量比が、１：１．７〜１：２９．２である、前記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の組成物、
［１５］全量が２．０ｇになるように水で溶解した時における糖類の濃度が、１．０〜３．５重量％である、前記［１０］〜［１２］のいずれかに記載の組成物、
［１６］無機塩の重量が、０．１〜３．０ｍｇである、前記［１０］〜［１５］のいずれかに記載の組成物、
［１７］組成物中のペプチドと無機塩の重量比が、１：０．００８〜１：１．２５である、前記［１０］〜［１５］のいずれかに記載の組成物、
［１８］全量が２．０ｇになるように水で溶解した時における無機塩の濃度が、０．０１〜０．３重量％である、前記［１０］〜［１５］のいずれかに記載の組成物、
［１９］水で溶解した時に、ｐＨ７．０〜９．５である、前記［１０］〜［１８］のいずれかに記載の組成物、
［２０］油中水滴エマルション製剤である、前記［１］〜［９］のいずれかに記載の組成物、
［２１］前記［１０］〜［１９］のいずれかに記載の組成物から調製された前記［２０］記載の組成物、
［２２］注射剤である、前記［１］〜［２１］のいずれかに記載の組成物、
［２３］バイアル中の酸素濃度が０．０１％以上、３．０％未満である、前記［１０］〜［２２］のいずれかに記載の組成物、
［２４］前記［１０］〜［１９］のいずれかに記載の組成物とアジュバントを混合することにより、エマルションを調製する方法、
［２５］前記［１］〜［２３］のいずれかに記載の組成物を含むキット、
［２６］少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、安定性の高いペプチド、糖類および無機塩を混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、ｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調整する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、安定性の低いペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、ｐＨ７．０以上、９．０未満に調整する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法、
［２７］少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調整する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調整する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法、
［２８］少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１１．０以上、１２．０未満に調製する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ９．０以上、１１．０未満に調製する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した液に、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｆ）該ｅ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調製する工程、
ｇ）該ｆ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法、
［２９］さらに、バイアル中の酸素濃度を０．０１％以上、３．０％未満に制御する工程を含有する前記［２６］〜［２８］のいずれかに記載の凍結乾燥製剤調製法、
［３０］前記［２６］〜［２８］のいずれかに記載の方法で調製した凍結乾燥製剤、
［３１］配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されていてもよいペプチドを含み、バイアル中の酸素濃度が０．０１％以上、３．０％未満である組成物、
［３２］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを含有する組成物、
［３３］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが１．０〜２．４ｍｇ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが１．０〜２．４ｍｇ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが１．０〜２．４ｍｇ、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが１．０〜２．４ｍｇ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが１．０〜２．４ｍｇ、スクロースが２０〜６０ｍｇおよび塩化ナトリウムが１〜２ｍｇである前記［３２］記載の組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖と無機塩とを含有することで、１種または２種以上のペプチドを安定な状態で長期間保存可能な組成物が提供される。さらに溶液のｐＨを制御することにより、安定性の向上を実現し得る。さらに別の側面では、バイアル中の酸素濃度を制御することにより、ペプチドの安定性の向上を実現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各ペプチドの溶解性のｐＨ依存を示す。
【図２−１】組成物のｐＨが、ｐＨ８〜１１である組成物の溶液をそれぞれ２５℃、６時間静置した場合の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【図２−２】組成物のｐＨが、ｐＨ８〜１１である組成物の溶液をそれぞれ２５℃、６時間静置した場合の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【図２−３】組成物のｐＨが、ｐＨ８〜１１である組成物の溶液をそれぞれ２５℃、６時間静置した場合の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【図２−４】組成物のｐＨが、ｐＨ８〜１１である組成物の溶液をそれぞれ２５℃、６時間静置した場合の配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの調製直後に対する残存率を示す。
【図２−５】組成物のｐＨが、ｐＨ８〜１１である組成物の溶液をそれぞれ２５℃、６時間静置した場合の配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの調製直後に対する残存率を示す。
【図３】スクロース、トレハロース、ブドウ糖、デキストランまたはグリセリンのいずれかを含む組成物の凍結乾燥製剤をそれぞれ４０℃、７５％湿度下で２週間静置した場合の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の調製直後に対する類縁物質の増加量を示す。
【図４】組成物に含まれるスクロースの量が、３０ｍｇ、６０ｍｇまたは１００ｍｇである組成物の凍結乾燥製剤をそれぞれ４０℃、７５％湿度下で３か月間静置した場合の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【図５−１】組成物に含まれる塩化ナトリウムの量が、０ｍｇ、２ｍｇまたは４ｍｇである組成物の凍結乾燥製剤をそれぞれ４０℃、７５％湿度下で３か月間静置した場合の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【図５−２】組成物に含まれる塩化ナトリウムの量が２ｍｇである組成物の凍結乾燥製剤のうち、収縮のないバイアルの乾燥状態を示す。
【図５−３】組成物に含まれる塩化ナトリウムの量が４ｍｇである組成物の凍結乾燥製剤のうち、完全収縮したバイアルの乾燥状態を示す。
【図６】溶液での組成物のｐＨが、８．０、８．５、９．０または９．５である組成物の凍結乾燥製剤をそれぞれ２５℃、６０％湿度下で３か月間静置した場合の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は特に断りのない限り、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わせて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
【００１２】
「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、２〜１００個のアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものも包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００１３】
「ペプチドカクテル」は、２種以上のペプチドを含む組成物をいう。
【００１４】
「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００１５】
アミノ酸の「置換」は、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、異なるアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換から生じる。
アミノ酸の「欠失」は、１つ以上のアミノ酸残基が、それぞれ、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に存在していない、アミノ酸配列のいずれかにおける変化として規定される。
アミノ酸の「付加」は、参照アミノ酸配列（野生型タンパク質のアミノ酸配列）と比較した場合に、それぞれ、１つ以上のアミノ酸残基の付加を生じた、アミノ酸配列中又はアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端における変化である。
【００１６】
「溶液状態で安定性の高いペプチド」は、ペプチドの残存率が、通常、ｐＨ１２、２５℃かつ６０％相対湿度で６時間以上静置した場合において、９５％以上、好ましくは９８％以上であり、かつ、ペプチドが配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである場合、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量が、通常、ｐＨ１１、２５℃かつ６０％相対湿度で６時間以上静置した場合において、０．９％以下、好ましくは０．８％以下、より好ましくは０．５％以下であるペプチドをいう。
「安定性の高いペプチド凍結乾燥製剤」とは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのみを有するペプチド凍結乾燥製剤であり、通常、２５℃で３か月間以上静置した場合において、該ペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量が、２．０％以下、好ましくは１．５％以下、より好ましくは１．０％以下であるペプチドの凍結乾燥製剤をいう。
「ペプチドカクテルの安定性が高い」とは、凍結乾燥状態において、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量が、通常、２５℃かつ６０％相対湿度で３か月間静置した場合において、１．０％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．３％以下、または４０℃かつ７５％相対湿度で２週間静置した場合において、１．０％以下、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．３％以下、または４０℃かつ７５％相対湿度で３か月間静置した場合において、１．５％以下、好ましくは１．０％以下、より好ましくは０．５％以下であるペプチドカクテルをいう。
【００１７】
「配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質」は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの酸化体および／または二量体を含むが、本明細書において配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質とは、特に酸化体のことをいう。
【００１８】
「酸化体」とは、ペプチドを構成するシステインのチオールが酸化され、スルフィン酸になった構造をいう。
【００１９】
「Ｗ／Ｏエマルション」または「油中水滴エマルション」は、油相への水相の分散をいう。
【００２０】
「重量比」は、組成物中のペプチドに対する対象組成物の割合を示す。特にペプチドの重量を１とした場合の対象組成物の重量の比を示す。
【００２１】
「アジュバント」は、体液または細胞での免疫応答レベルを大きくし、応答期間を長くするものである。したがって、アジュバントを用いることによって注射の回数およびワクチンに含まれる抗原量を減らすことができ、ワクチンの接種コストを低く維持することができる。
【００２２】
「酸素濃度」は、空気などの媒体１００ｍｌ中に含まれる酸素のｍｌ体積であり、その値は％によって表される。
【００２３】
「投与１回分のバイアル」は、１回分の投与に用いられる組成物が含まれているバイアルである。バイアル中に含まれる組成物の全量を投与する場合のみならず、バイアル中に含まれる組成物の部分量を投与する場合も含まれる。
【００２４】
本発明のペプチドを含む組成物は、ペプチドおよび下記の添加物を溶解した溶液（例：注射剤）として用いることができるが、該溶液の液媒体を乾燥し、固形剤（例：凍結乾燥製剤）にする場合もある。固形剤であるならば、組成物を長期保存することも可能である。
【００２５】
本発明に含まれるペプチドとしては、例えば、ＤＥＰＤＣ１、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＵＲＬＣ１０、ＣＤＣＡ１およびＫＯＣ１タンパク質由来のペプチドから選択される１種または２種以上のペプチドがある。ＤＥＰＤＣ１タンパク質由来のペプチドとしては、アミノ酸配列ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ（配列番号：１）を有するペプチドが例示される（特許文献１（ＷＯ２００８／０４７４７３））。ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質由来のペプチドとしては、アミノ酸配列ＩＹＮＥＹＩＹＤＬ（配列番号：２）を有するペプチドが例示される（特許文献１（ＷＯ２００８／０４７４７３））。ＵＲＬＣ１０タンパク質由来のペプチドとしては、アミノ酸配列ＲＹＣＮＬＥＧＰＰＩ（配列番号：３）を有するペプチドが例示される（特許文献２（ＷＯ２００６／０９０８１０））。ＣＤＣＡ１タンパク質由来のペプチドとしては、アミノ酸配列ＶＹＧＩＲＬＥＨＦ（配列番号：４）を有するペプチドが例示される（特許文献３（ＷＯ２００９／１５３９９２））。ＫＯＣ１タンパク質由来のペプチドとしては、アミノ酸配列ＫＴＶＮＥＬＱＮＬ（配列番号：５）を有するペプチドが例示される（特許文献２（ＷＯ２００６／０９０８１０））。さらに、これらのペプチドのアミノ酸のうち、１または２個のアミノ酸が、置換、欠失または付加されていても良く、もしくは、１または２個のアミノ酸が、置換されていても良い。
本発明に含まれるペプチドは、好ましくは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファンまたはトレオニンであり、および／または、Ｃ末端のアミノ酸 が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
本発明に含まれるペプチドは、特に好ましくは、配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列からなる５種のペプチドである。
【００２６】
本発明に含まれるペプチドの含有量は、溶液製剤、凍結乾燥製剤等の製剤を問わず、投与１回分のバイアル中に、好ましくは、１．０〜２０ｍｇ、より好ましくは、２．０〜１５ｍｇ、さらに好ましくは、５．０〜１４ｍｇ、特に好ましくは、１０〜１３ｍｇ、さらに好ましくは、１２ｍｇである。特に投与１回分のバイアル中にペプチドが５種含まれる場合は、ペプチドの含有量は、９〜１３ｍｇが好ましく、１０〜１２ｍｇが特に好ましい。
または、投与１回分のバイアルの凍結乾燥製剤を全量が２．０ｇになるように水（例：蒸留水、精製水、生理食塩水等）で溶解した時におけるペプチドの濃度は、好ましくは、０．０５〜１．０重量％、より好ましくは、０．１〜１．０重量％、さらに好ましくは、０．３〜１．０重量％、特に好ましくは、０．４〜０．８重量％、さらに好ましくは０．６重量％である。特に投与１回分のバイアル中にペプチドが５種含まれる場合は、ペプチドの濃度は、０．４５％〜０．６５重量％が好ましく、０．５％〜０．６％が特に好ましい。
【００２７】
本発明に含まれる糖類は、日本薬局方、日本薬局方外医薬品規格または医薬品添加物規格等に収載されている糖類を使用することができる。例えば、単糖類（ブドウ糖、果糖、リボース、キシロース、マンノース、マルトトリオース）、二糖類（乳糖、セロビオース、精製白糖、麦芽糖、トレハロース等）、三糖類（ラフィノース等）、糖アルコール（Ｄ−ソルビトール、イノシトール、Ｄ−マンニトール等）、多糖類（デキストリン、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸デキストリン等）およびその塩（コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等）、環状糖類（シクロデキストリン、分岐シクロデキストリン等）、アルギン酸ナトリウム等である。好ましくは、単糖類、二糖類および多糖類からなる群から選択される１または２以上の糖類である。より好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストランおよびグリセロールからなる群から選択される１または２以上の糖類である。特に好ましくは、スクロースである。
【００２８】
本発明に含まれる糖類の含有量は、溶液製剤、凍結乾燥製剤等の製剤を問わず、投与１回分のバイアル中に、好ましくは、２０〜７０ｍｇ、さらに好ましくは、４０〜７０ｍｇ、より好ましくは、５０〜７０ｍｇ、さらに好ましくは、５５〜６５ｍｇ、特に好ましくは、６０ｍｇである。
または、凍結乾燥製剤である本発明の組成物中のペプチドと糖類の重量比は、好ましくは、１：１．７〜１：２９．２、さらに好ましくは、１：３．３〜１：５．８、より好ましくは、１：４．２〜１：５．８、さらに好ましくは、１：４．６〜１：５．４、特に好ましくは、１：５である。
または、投与１回分のバイアルの凍結乾燥製剤を全量が２．０ｇになるように水（例：蒸留水、精製水、生理食塩水等）で溶解した時における糖類の濃度は、好ましくは、１．０〜３．５重量％、さらに好ましくは、２．５〜３．５重量％、より好ましくは、２．８〜３．２重量％、さらに好ましくは、２．９〜３．１重量％、特に好ましくは３．０重量％である。
【００２９】
本発明の組成物中に含まれる糖類の量が、過剰または不足の場合、ペプチドの安定性が低下し、ペプチド由来の不純物、特に、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁体の増加がみられ得る。したがって、組成物中の糖類の量は、上記範囲が好ましい。
【００３０】
本発明に含まれる無機塩は、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、亜硫酸ナトリウムおよびピロ亜硫酸ナトリウムからなる群から選択される１または２以上の無機塩である。より好ましくは、塩化ナトリウムである。
【００３１】
本発明に含まれる無機塩の含有量は、溶液製剤、凍結乾燥製剤等の製剤を問わず、投与１回分のバイアル中に、好ましくは、０．１〜３．０ｍｇ、より好ましくは、１．０〜３．０ｍｇ、さらに好ましくは、１．５〜２．５ｍｇ、特に好ましくは、２．０ｍｇである。
または、凍結乾燥製剤である本発明の組成物中のペプチドと無機塩の重量比は、好ましくは、１：０．００８〜１：１．２５、より好ましくは、１：０．０８３〜１：０．２５、さらに好ましくは、１：０．１２５〜１：０．２０８、特に好ましくは、１：０．１７である。
または、投与１回分のバイアルの凍結乾燥製剤を全量が２．０ｇになるように水（例：蒸留水、精製水、生理食塩水等）で溶解した時における無機塩の濃度は、好ましくは、０．０１〜０．３重量％、より好ましくは、０．０５〜０．２重量％、さらに好ましくは、０．０５〜０．１５重量％、特に好ましくは０．１重量％である。
【００３２】
本発明の組成物中に含まれる無機塩の量が、上記範囲を下回る場合、ペプチドの安定性が低下し、ペプチド由来の不純物の量が増加し得る。組成物中の無機塩の含有量が不足した場合、特に配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁体の増加がみられ得る。
一方、本発明の組成物中に含まれる無機塩の量が、上記範囲を上回る場合、本発明組成物を凍結乾燥した場合、凍結乾燥不良が起こり、凍結乾燥物（ケーキ）の形状が悪くなる。したがって、組成物中の無機塩の量は、上記範囲が好ましい。
【００３３】
本発明の組成物中には、ｐＨ調整剤を含有してもよく、日本薬局方、日本薬局方外医薬品規格または医薬品添加物規格等に収載されているｐＨ調整剤を使用することができる。例えば、炭酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、リン酸、塩酸、水酸化ナトリウム、アルギニン、リジンおよびそれらの塩やメグルミン等である。好ましくは、塩酸および水酸化ナトリウムである。組成物中のこれらのｐＨ調整剤の量は、所定のｐＨに調整できればよく、任意の量である。
【００３４】
ｐＨの測定方法は、日本薬局方の一般試験法に記載されているｐＨ測定法に従い実施する。ＨＯＲＩＢＡ Ｌｔｄ．社製のｐＨメーター（ＨＯＲＩＢＡ ｐＨ ＭＥＴＥＲ Ｆ−５２）を用いて２０℃〜２５℃の範囲内でｐＨを測定する。
【００３５】
凍結乾燥製剤である、本発明の組成物を水（例：蒸留水、精製水、生理食塩水等）で溶解した時におけるｐＨは、好ましくは、ｐＨ７．０〜９．５、より好ましくは、ｐＨ８．０〜９．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．２〜９．０、特に好ましくは、ｐＨ８．４〜８．６である。
【００３６】
本発明の溶液状態の組成物のｐＨが、上記範囲を上回る場合、ペプチドの安定性が低下し、ペプチド由来の不純物、特に、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁体の量が増加し得る。
一方、本発明の溶液状態の組成物のｐＨが、上記範囲を下回る場合、本発明の組成物に含まれるペプチドの溶解度が低下し、ペプチドが析出する恐れがある。特に、配列番号１、配列番号２および配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、上記範囲を下回るｐＨで溶解度が低く、析出し得る。
【００３７】
本発明の最適な組成物は、糖類がスクロースであり、無機塩が塩化ナトリウムである組成物である。
【００３８】
本発明の最も好ましい組成物は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを含有する組成物である。
【００３９】
本発明のさらに好ましい組成物は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを１．０〜２．４ｍｇ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを１．０〜２．４ｍｇ、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを１．０〜２．４ｍｇ、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを１．０〜２．４ｍｇ、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを１．０〜２．４ｍｇ、スクロースを３０〜６０ｍｇおよび塩化ナトリウムを１〜２ｍｇ含有する組成物である。
【００４０】
本組成物は、例えば、溶液製剤、凍結乾燥製剤、エマルション製剤等である。好ましくは、凍結乾燥製剤である。凍結乾燥は、公知の方法にしたがって、例えば、凍結乾燥機（Ｋｙｏｗａ  Ｖａｃｕｕｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ製）によって行う。
【００４１】
本組成物が凍結乾燥製剤であるとき、１種類のペプチドの濃度が、２．０ｍｇ／ｍｌ（５種類のペプチドが含まれる場合１０ｍｇ／ｍｌ）になるよう、例えば、蒸留水、精製水、好ましくは、注射用精製水、生理食塩水等の水で溶解させ、その溶液とアジュバント等の油相と混合させることにより、油中水滴（Ｗ／Ｏ）エマルションを調製し得る。水相と油相の混合には、国際公開２０１３／１３３２０９号公報に記載のデバイスを用いることが好ましい。
【００４２】
本組成物は、経口剤、注射剤を問わないが、注射剤が好ましい。
【００４３】
本組成物は、バイアルに封入した際のバイアル中の酸素濃度が、好ましくは、０．０１％以上、３．０％未満、より好ましくは、０．０１％以上、２．０％未満、さらに好ましくは、０．０１％以上、１．５％未満、特に好ましくは、０．０１％以上、１．０％未満である。
【００４４】
バイアル中の酸素濃度が、上記範囲を上回る場合、ペプチドの安定性が低下し、ペプチド由来の不純物の量が増加し得る。バイアル中の酸素濃度が上記範囲を上回る場合、特に配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁体の増加がみられ得る。したがって、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは酸素によって安定性の低下がみられる。
本発明の凍結乾燥製剤のバイアルをアルミパウチ等の袋で密封して保存することで、バイアル中の酸素濃度を長期間にわたり上記範囲内で維持することができる。
【００４５】
酸素濃度の測定は、非破壊式ヘッドスペースアナライザ（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製等）を用いて、バイアル内のガスにレーザーを照射し、吸収量をモニタリングすることでバイアル中の酸素濃度を非破壊的に測定し得る。
【００４６】
本発明はまた、（ａ）本発明の組成物の凍結乾燥製剤、（ｂ）当該本発明の組成物の凍結乾燥製剤の再構成液、（ｃ）当該本発明の組成物の凍結乾燥製剤の再構成液とアジュバントを混合した油中水滴エマルション製剤、のいずれかを含むキットを提供する。
本発明のキットに凍結乾燥製剤として含まれる本発明の組成物は、上記のいずれの組成物であってもよい。
【００４７】
本発明はまた、少なくとも以下の工程： 
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、安定性の高いペプチド、糖類および無機塩を混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、ｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調整する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、安定性の低いペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、ｐＨ７．０以上、９．０未満に調整する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法を提供する。
【００４８】
別の側面では、本発明はまた、少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１０．０以上、１２．０未満に調整する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調整する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法を提供する。
【００４９】
さらに本発明はまた、少なくとも以下の工程：
ａ）ｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液に、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、スクロースおよび塩化ナトリウムを混合する工程、
ｂ）該ａ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ１１．０以上、１２．０未満に調製する工程、
ｃ）該ｂ）の工程で調製した液に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｄ）該ｃ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ９．０以上、１１．０未満に調製する工程、
ｅ）該ｄ）の工程で調製した液に、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを混合する工程、
ｆ）該ｅ）の工程で調製した液を、酸性物質でｐＨ７．０以上、９．０未満に調製する工程、
ｇ）該ｆ）の工程で調製した混合物を凍結乾燥する工程、
を含有する、凍結乾燥製剤調製法を提供する。
【００５０】
上記工程ａ）のｐＨ１２．０以上、１３．０未満の液、上記工程ｂ）のｐＨ１０．０以上、１２．０未満の液、および上記工程ｄ）のｐＨ７．０以上、９．０未満の液は、ｐＨ調整剤によって調整し得る。
【００５１】
本発明はまた、さらに、上記最終工程で得た凍結乾燥製剤のバイアル中の酸素濃度を０．０１％以上、３．０％未満に制御する工程を含む凍結乾燥製剤調製法を提供する。この工程により、ペプチド（特に配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）の安定性を向上させることができる。
【００５２】
本発明はまた、上記凍結乾燥製剤調製法で調製した凍結乾燥製剤を提供する。
【００５３】
本発明はまた、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、または該ペプチドの１〜２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されていてもよいペプチドを含み、バイアル中の酸素濃度が０．０１％以上、３．０％未満である組成物を提供する。
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、バイアル中の酸素濃度が３．０％以上であるとき、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁体の増加がみられ得る。したがって、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、酸素の影響を受けるため、低酸素濃度条件下で保存することが好ましい。
【００５４】
このようにして得られ本発明の組成物は、経時保存しても安定性に優れる。したがって、該発明組成物は、保存安定性に優れ、かつ安定した薬効を奏する製剤として有用である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５６】
（バルク注射剤製造法）
８９８７．５ｇの注射用精製水に６２５ｇの１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、３７５ｇのスクロースおよび１２．５ｇの塩化ナトリウムを添加した。次いで、１６．７ｇの配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび１７．７ｇの配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを添加した。次いで、該溶液のｐＨを塩酸水溶液でｐＨ１１．５に調整し、１５．９ｇの配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、１６．５ｇの配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび１６．９ｇの配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを添加した。次いで、該溶液のｐＨを塩酸水溶液でｐＨ８．４〜８．６に調整し、全量１２５００ｇになるよう注射用精製水で調製した。上記製造した組成物の溶液を無菌濾過した後、上記製造した組成物の溶液２．０ｇをそれぞれ３ｍｌ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥を行った。【００５７】
（凍結乾燥組成物の安定性試験）
上記凍結乾燥組成物をガラスバイアルに密封した状態で２５℃かつ６０％相対湿度または４０℃かつ７５％相対湿度で一定期間静置し、該組成物の目視による外観、含量、類縁物質量について試験を行った。【００５８】
（含量および類縁物質量の測定）
含量および類縁物質量は、日本薬局方の一般試験法に記載の液体クロマトグラフィーにより測定した。凍結乾燥組成物に注射用精製水を添加し、各ペプチドの濃度が０．１２ｍｇ／ｍＬになるように希釈した溶液を試料溶液とした。含量は試料溶液から得られる各原薬のピーク面積と下記記載の標準溶液から得られる各原薬のピーク面積を定量し、希釈倍率及びピーク面積の比率から算出した。安定性試験時の含量の残存率は対調製直後の含量の比率とした。類縁物質量は試料溶液から得られる各原薬および類縁物質のピーク面積を定量し、ピーク面積の比率から算出した。安定性試験時の類縁物質の増加量は対調製直後の差分とした。【００５９】
（高速液体クロマトグラフィーの条件）
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの含量を測定するための標準溶液として、１．６ｍｇ／ｍＬのリン酸溶液に上記のペプチドを添加し、各ペプチドの濃度を０．１５ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈した溶液を標準溶液とした。配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの含量を測定するための標準溶液として、１２．１ｍｇ／ｍＬの２‐アミノ‐２‐ヒドロキシメチル‐１，３‐プロパンジオール水溶液に上記のペプチドを添加し、各ペプチドの濃度を０．１５ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈した溶液を標準溶液とした。固定相にはオクタデシル基を有するカラムを用い、移動相には１．６ｍｇ／ｍＬのリン酸溶液及びアセトニトリルを使用し、グラジエント溶出法により測定した。測定中の流速は１．０ｍＬ／分とした。
【実施例１】
【００６０】
（ｐＨによる各ペプチド溶解度の検討１）
ｐＨ２〜１２における、配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列を有する各ペプチドの溶解度を検討した。注射用水に塩酸または水酸化ナトリウム溶液を入れ、ｐＨ調整した溶液に各ペプチドを３ｍｇ／ｍＬとなるように混合した。混合後の溶液をフィルターでろ過し、ろ過液をそのまま、または注射用精製水で１０〜２０倍に希釈し、液体クロマトグラフィー（上記の条件と同一）を用いてそれぞれのペプチドのピーク面積を定量した。それぞれのペプチドのピーク面積、ろ過液の希釈倍率、上記の標準溶液のピーク面積および濃度から、ペプチドの濃度を算出した。各ペプチドの溶解性のｐＨ依存を図１に示す。配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有する各ペプチドは、ｐＨが低下するほど溶解度が低下することが判明した。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、中性付近のｐＨで溶解度が低下することが判明した。【００６１】
（ｐＨによる各ペプチド溶解度の検討２）
上記検討１のように、注射用水に直接ペプチドを添加すると、塊になり溶解しにくくなる。そこで、高ｐＨで完全に溶解させた後、溶液のｐＨを徐々に下げて白濁するｐＨを見出すことで、熱力学的な溶解度を検討した。
配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有する各ペプチドをｐＨ１０の溶液にそれぞれ溶解させ、その後ｐＨを低下させた場合の溶解度について検討した。配列番号１および２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド１５ｍｇにそれぞれ注射用精製水および０．１ ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加え、溶液のｐＨを１０に調整し、ペプチドの濃度が１．５ｍｇ／ｇとなるようにした。それぞれの溶液に対して塩酸水溶液を加え、ｐＨを徐々に下げたときの溶解性を目視により確認した。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、溶液のｐＨが５．６を下回ると溶液が白濁することが判明した（表１−１）。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、溶液のｐＨが５．５を下回ると溶液が白濁することが判明した（表１−２）。
【表１−１】
2016080367.tif 000002
【表１−２】
2016080367.tif 000003
【実施例２】
【００６２】
（ｐＨによる各ペプチドの溶液状態での安定性の検討）
ｐＨ８〜１１における、配列番号１〜５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの溶液状態での各ペプチドの安定性について検討した。組成物の組成は表２のとおりである。
【表２】
2016080367.tif 000004
上記組成の調製した溶液を２５℃で６時間静置し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量をそれぞれ測定した。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの残存率、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの残存率をそれぞれ測定した。類縁物質およびペプチド含量の測定方法は上述の手法に従った。その結果を図２−１〜図２−５に示す。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質は、溶液ｐＨによって増加量が著しく変わらず、比較的安定であることが判明した（図２−１）。配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質は、溶液ｐＨが高くなると増加し、安定性が低下することが判明した（図２−２）。配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質は溶液ｐＨが１０．０〜１１．０の場合に増加し、安定性が低下することが判明した（図２−３）。配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの残存率は、溶液ｐＨによって著しく変わらず、比較的安定であることが判明した（図２−４）。配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの残存率は、溶液ｐＨが高くなると著しく低下し、安定性が低下することが判明した（図２−５）。
【実施例３】
【００６３】
（糖類による安定性の検討）
組成物に含まれる糖類が、スクロース、トレハロース、ブドウ糖、デキストランまたはグリセリンのうち、いずれがペプチドカクテルの安定性向上に寄与するか検討した。組成物の組成は表３のとおりである。
【表３】
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上記組成物を上記表の濃度となるよう混合し、塩酸水溶液でｐＨ８に調整した後、上記組成物の溶液２．５ｇをそれぞれ３ｍｌ容のガラスバイアルに分注した。該組成物の溶液を凍結乾燥した。
該凍結乾燥製剤を４０℃、７５％湿度下で２週間静置し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を測定した。その結果を図３に示す。この結果から、類縁物質の増加量が最も低いスクロースがペプチドカクテルの安定性向上に寄与することが判明した。
【実施例４】
【００６４】
（糖類の量による安定性の検討）
組成物に含まれるスクロースの量が、いずれの場合にペプチドカクテルの安定性向上に寄与するか検討した。組成物の組成は表４のとおりである。
【表４】
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上記組成物を上記表の濃度となるよう混合し、塩酸水溶液でｐＨ８．５に調整した後、該組成物の溶液２．０ｇをそれぞれ３ｍｌ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥した。該凍結乾燥製剤を４０℃、７５％湿度下で３か月間静置し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の調製直後に対する増加量を測定した。その結果を図４に示す。この結果から、スクロースの量が１バイアルあたり６０ｍｇ（容液濃度として３０ｍｇ／ｇ）の方が、類縁物質の調製直後に対する増加量が低く、ペプチドカクテルの安定性向上に寄与することが判明した。
【実施例５】
【００６５】
（無機塩の濃度による安定性の検討）
組成物に含まれる塩化ナトリウムの量が、いずれの場合にペプチドカクテルの安定性向上に寄与するか検討した。組成物の組成は表５のとおりである。
【表５−１】
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上記組成物を上記の表の濃度となるよう混合し、塩酸水溶液でｐＨ８．５に調整した後、該組成物の溶液２．０ｇをそれぞれ３ｍｌ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥した。
該凍結乾燥製剤を４０℃、７５％湿度下で３か月間静置し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量を測定した。その結果は、図５に示す。この結果から、塩化ナトリウムの量が１バイアルあたり４．０ｍｇ（溶液濃度として２．０ｍｇ／ｇ）の方が、類縁物質の増加量が低く、ペプチドカクテルの安定性向上に寄与することが判明した。【００６６】
（無機塩の濃度による凍結乾燥状態の検討）
凍結乾燥不良により、凍結乾燥物（ケーキ）が完全収縮することで、凍結乾燥物の形状が悪くなったものは不良品となる。そこで、組成物中の塩化ナトリウム含有量による凍結乾燥物の収縮の有無を検討した。塩化ナトリウムの含有量が１バイアルあたり２ｍｇ（溶液濃度として１．０ｍｇ／ｇ）または４ｍｇ（溶液濃度として２．０ｍｇ／ｇ）である上記組成物（実施例５−２、実施例５−３）をそれぞれ８２７バイアル、８０９バイアル、合計１６３６バイアル調製し、同条件で凍結乾燥した。そのときの凍結乾燥製剤の乾燥状態の内訳を表５−２に示し、代表的な凍結乾燥物を図５−２、図５−３に示す。図５−２は塩化ナトリウム１ｍｇ／ｇで収縮のないバイアルの写真である。図５−３は塩化ナトリウム２ｍｇ／ｇで完全収縮したバイアルの写真である。この結果から、塩化ナトリウムの含有量が１バイアルあたり２ｍｇ（溶液濃度として１．０ｍｇ／ｇ）の方が、完全収縮した凍結乾燥製剤の数が少なく、凍結乾燥状態が良いことが判明した。
【表５−２】
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【００６７】
上記の塩化ナトリウムの濃度によるペプチドカクテルの安定性の検討および塩化ナトリウムの濃度による凍結乾燥状態の結果より、塩化ナトリウムの含有量は１バイアルあたり２．０ｍｇ（溶液濃度として１．０ｍｇ／ｇ）が最も良いと判断した。
【実施例６】
【００６８】
（最終溶液のｐＨによる安定性の検討）
組成物の溶液のｐＨが、いずれの場合にペプチドカクテルの安定性向上に寄与するか検討した。組成物の組成は表６のとおりである。
【表６】
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上記組成物を上記の表の濃度で混合し、塩酸水溶液でｐＨ８．０、８．５、９．０または９．５に調整し、該組成物の溶液２．０ｇをそれぞれ３ｍｌ容のガラスバイアルに分注し、凍結乾燥した。
該凍結乾燥製剤を２５℃、６０％湿度下で３か月間静置し、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量を測定した。その結果は、図６に示す。この結果から、溶液ｐＨが８．０の方が、類縁物質の増加量が低く、ペプチドカクテルの安定性向上に寄与することが判明した。【００６９】
上記のｐＨによる各ペプチドの溶液状態での安定性の検討およびｐＨによる各ペプチド溶解度の検討より、溶液状態のｐＨは８．５が最適であると判断した。また、ペプチドの溶解の順序は、溶液状態で安定性の高いペプチド（配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）を溶解させた後、溶液状態で安定性が低いペプチド（配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号３で表されるアミノ酸配列）を溶解させることとした。好ましくは、溶液状態で安定性の高いペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの順に溶解させることが好ましい。さらに、溶液状態で安定性の低いペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの順に溶解させることが好ましいと判断した。
【実施例７】
【００７０】
（バイアル中の酸素濃度による類縁物質の量の検討）
配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの凍結乾燥製剤のバイアル中の酸素濃度を測定することで、ペプチド凍結乾燥製剤の安定性を検討した。凍結乾燥製剤の組成は表７−１のとおりである。
【表７−１】
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凍結乾燥バイアルを２５℃、３か月間静置し、各バイアル中の酸素濃度を非破壊式ヘッドスペースアナライザで測定し、また、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の量を測定した。その結果は表７−２のとおりである。この結果より、バイアル中の酸素濃度が低いほど、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド由来の類縁物質の増加量が小さいことが判明した。したがって、安定性の高いペプチド凍結乾燥製剤であるためには、バイアル中の酸素濃度が３．０％未満であることが好ましいことが判明した。
【表７−２】
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【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、ペプチドを含む医薬組成物、特にペプチドを含む癌治療用ペプチドワクチン製剤として有用である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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