(57)【要約】  ８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）は、エラスチンの合成及び再生を促進する作用を有し、従ってしわの予防又は改善剤や抗老化薬として有用である。
2014163178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、エラスチン合成促進剤。
【請求項２】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、エラスチン再生促進剤。
【請求項３】
ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、フィブリン−５分泌促進剤。
【請求項４】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、しわの予防及び／又は改善剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の促進剤を有効成分として含有する、しわの予防及び／又は改善剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤を含む抗老化薬。
【請求項７】
研究用試薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）の新規用途、より詳細にはＤＣＰ−ＬＡのエラスチンの合成及び／又は再生の促進剤としての用途、エラスチン線維化促進剤としての用途、しわの予防及び／又は改善剤としての用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
リノール酸誘導体である８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）は、体内での代謝の遅延を可能とし、且つシナプス伝達の安定なＬＴＰ（long-term potentiation）様増強を持続できる、シナプス伝達効率の長期増強作用を有する化合物である（特許文献１）。
ＤＣＰ−ＬＡについてはまた、幾つかの報告がなされている。例えば、ＤＣＰ−ＬＡが選択的かつ直接的にＰＫＣ−εを活性化すること（非特許文献１）、ＤＣＰ−ＬＡが老化促進マウスの認知機能障害を改善すること（非特許文献２）、ＤＣＰ−ＬＡが海馬神経細胞からのγアミノ酪酸の放出を増加させること（非特許文献３）、ＤＣＰ−ＬＡがアミロイドβペプチドあるいはスコポラミン処理ラットの認知機能障害を改善すること（非特許文献４）、ＤＣＰ−ＬＡがグルタミン酸作動性シナプス前細胞に発現するα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的として海馬シナプス伝達を促進させること（非特許文献５）が報告されている。さらに、近年ＤＣＰ−ＬＡに酸化ストレスによって誘導される神経細胞死を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。【０００３】
一方、エラスチン線維は、ヒト等のほ乳類や魚類などの体内の血管・靭帯・肺・皮膚をはじめとする、ほぼ全身の臓器・組織に分布する細胞外マトリックスの結合組織の線維の一種で、伸縮可能なαへリックス構造が架橋することによって形成され、組織の柔軟性維持に重要な役割を担っていることが知られている。
皮膚は表皮、真皮、皮下組織からなる。表皮は外部の乾燥や異物から体を守り、皮下組織は皮下脂肪等により外部からの衝撃を和らげ、真皮は線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持する真皮細胞外マトリックスによって構成されており、皮膚の構造維持に重要な役割を果たしている。【０００４】
皮膚のしわ形成、くすみ、きめの消失、弾力性の低下といった肌の老化といわれる現象は、加齢による線維芽細胞の増殖能の低下によるエラスチン線維等の産生能の低下が一因とされているが、皮膚の紫外線への暴露、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等の外部刺激などが、エラスチン線維の分解を引き起こす結果、しわ形成、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等を原因とする肌荒れや皮膚の老化などの症状が現れるともいわれている。【０００５】
従って、エラスチン線維の分解を防止すること、あるいはエラスチン線維の合成や再生を促進することが、しわやたるみ等の肌の老化防止に有効であるとされるが、現在のところエラスチン線維の再生や合成を促進する薬剤は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／５００１３号
【特許文献２】特開２００８−１４３８１９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kanno Tら，J Lipid Res., 2006, 47(6):1146-1156
【非特許文献２】Yaguchi Tら，Neuroreport, 2006, 23;17(1):105-108.
【非特許文献３】Kanno Tら，J Neurochem., 2005, 95(3):695-702.
【非特許文献４】Nagataら T, Psychogeriatrics, 2005, 5:122-126.
【非特許文献５】Yamamotoら, Neuroscience 2005, 130(1):207-213.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を解明し、ＤＣＰ−ＬＡの新規用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を詳細に検討する過程で、驚くべきことに、ＤＣＰ−ＬＡに従来知られていた認知機能の改善に有用な薬理作用以外にエラスチンに対する合成・再生促進、あるいはエラスチンを分解から保護する作用があることを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、エラスチン合成促進剤。
［２］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、エラスチン再生促進剤。
［３］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、フィブリン−５分泌促進剤。
［４］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、しわの予防及び／又は改善剤。
［５］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の促進剤を有効成分として含有する、しわの予防及び／又は改善剤。
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の剤を含む抗老化薬。
［７］研究用試薬である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の促進剤。
［８］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、エラスチン合成を促進する方法。
［９］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、エラスチン再生を促進する方法。
［１０］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、フィブリン−５分泌を促進する方法。
［１１］ＤＣＰ−ＬＡの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、しわを予防及び／又は改善する方法。
【発明の効果】
【００１０】
ＤＣＰ−ＬＡはエラスチン合成促進作用及びエラスチン再生促進作用を有する。さらにＤＣＰ−ＬＡはフィブリン−５の分泌を刺激する作用を有し、エラスチン線維化を促進させる。しわの原因はエラスチンの退化・低下が原因であると言われているので、エラスチンの再生・合成を促進し、エラスチン線維化を促進する本発明は、しわの予防及び／又は改善剤、各種研究用試薬、並び抗老化薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＤＣＰ−ＬＡがエラスチンの合成を促進する作用を有し、且つニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ）誘導性の分解からエラスチンを保護する作用を有することを示したグラフである。正常ヒト皮膚線維芽細胞を、ＤＣＰ−ＬＡ(100 nM)存在下あるいは非存在下で、ＳＮＰ未処理で、あるいはＳＮＰ（1 mM）で１２時間処理した。グラフ中、各カラムは、ＤＡＰＩ密度に対するエラスチン線維の相対密度の平均値(±SD)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test.
【図２】図２は、ＤＣＰ−ＬＡが紫外線照射によるエラスチン損失からエラスチン線維を保護する作用を有することを示したグラフである。ＤＣＰ−ＬＡ (1 mg/ml)をマウスの背中の皮膚に塗布のあるなし、紫外線照射せず、あるいは２週間、紫外線照射した。グラフ中、各カラムは、ＤＡＰＩ密度に対するエラスチン線維の相対密度の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test.
【図３】図３は、ＤＣＰ−ＬＡが正常ヒト皮膚線維芽細胞からのフィブリン−５の分泌を刺激する作用を有することを示したグラフである。正常ヒト線維芽細胞から分泌された培養液中のフィブリン−５の量をＤＣＰ−ＬＡ(100 nM)処理の前後、所定の時間に測定した。測定は抗フィブリン−５抗体を用いたウェスタンブロットにより行なった。グラフ中、各ポイントは、基準となる時点（0h）でのフィブリン−５の発色強度に対する相対値の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。*P<0.05, **P<0.01, 基準となる時点でのフィブリン−５の発色強度に対し, Dunnett’s test.
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において有効成分として用いられる８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（本明細書中、必要に応じてＤＣＰ−ＬＡと省略）は、以下の構造式を有する。
【００１３】
【化１】
2014163178.tif 000003
【００１４】
ＤＣＰ−ＬＡは、例えば、ＷＯ０２／５００１３で示される方法によって製造することができる。また、ＤＣＰ−ＬＡには４つの光学異性体が存在する（α，α−ＤＣＰ−ＬＡ、α，β−ＤＣＰ−ＬＡ、β，α−ＤＣＰ−ＬＡ、β，β−ＤＣＰ−ＬＡ）が、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。これらの異性体は、例えば、ＷＯ２０１２／０６７１１１で示される方法によって製造することができる。
【００１５】
本発明においてＤＣＰ−ＬＡはまた、その塩として用いられてもよい。かかる塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、被験体は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、ＤＣＰ−ＬＡで処理する対象となる細胞は、上記哺乳動物由来の細胞であり、好ましくは、線維芽細胞、ケラチノサイト（角化細胞）等が挙げられる。ここで「処理」とは、上記細胞とＤＣＰ−ＬＡとを必要十分な時間接触させることであり、その時間は所望される効果や用いる細胞の種類によっても異なるが、通常０．５〜２４時間、好ましくは０．５〜１２時間程度である。簡便には、ＤＣＰ-ＬＡを含有する培養液中で培養することによって実施される。
【００１８】
ＤＣＰ−ＬＡは、実施例にてデータで示されるように、エラスチン合成促進及び酸化窒素（ＮＯ）ストレス誘導エラスチン退化に対して再生を促す作用を有し、また紫外線照射によるエラスチン障害（エラスチンの低下）に対しても保護作用を有している。さらにＤＣＰ−ＬＡは、実施例にてデータで示されるように、線維芽細胞からのフィブリン−５の分泌を促進する作用を有する。フィブリン−５は、エラスチン線維の集合・伸展に関与し、エラスチンが生体内で弾性線維として働く（即ち線維化）為に欠かすことができない。ＤＣＰ−ＬＡがフィブリン−５の分泌を促進することによってエラスチン線維化を促進させ、皮膚に弾力をもたせることができる。これらの優れた薬理作用は、ＤＣＰ−ＬＡがしわの予防剤及び／又は改善剤（以下、単に本発明の剤と称する場合がある）として有用であることを示唆しており、さらに抗老化薬（以下、単に本発明の医薬と称する場合がある）としての用途も期待できる。
【００１９】
エラスチンの合成を促進する作用や再生を促す作用は、免疫組織学的手法等により直接エラスチン線維の量の変動を測定することにより評価することができる。より詳細には実施例に記載の方法によりその作用を確認することができる。エラスチンの線維化を促進する作用は、免疫組織学的手法等によりフィブリン−５の分泌量（合成量）の変動を測定することにより評価することができる。より詳細には実施例に記載の方法によりその作用を確認することができる。
【００２０】
一つの実施態様において、本発明の剤又は医薬は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２１】
別の実施態様において、本発明の剤又は医薬は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２２】
別の実施態様において、本発明の剤又は医薬は、皮膚外用剤として処方され得る。即ちＤＣＰ−ＬＡを外用基剤に配合して、化粧料、医薬品、医薬部外品等として用いることができる。当該皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤形は特に問わない。外用基剤としては、白色ワセリン、セタノール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、サラシミツロウ、流動パラフィン、ラウロマクロゴール、スクワラン、スクワレン、ラノリン、ミリスチン酸イソブチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
その薬理作用の点から、本発明の剤又は医薬は非経口的な投与、特に皮膚外用剤として対象に投与されることが好ましい。
【００２４】
本発明の剤または医薬は、投与対象となる各々の年齢及び状態に応じて変動するが、静脈内投与の場合には、ＤＣＰ−ＬＡの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１００ｍｇ、筋肉内投与の場合には、該化合物の１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇ、経口投与の場合には、該化合物の１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇが、上記症状の予防及び／又は改善のために一般的に与えられる。皮膚外用剤として投与される場合には、該剤全体へのＤＣＰ−ＬＡの配合量は期待される作用の程度により異なり、特に限定されないが、通常該剤全量中、０.００１〜１０重量％、好ましくは０.０１〜１重量％である。
【００２５】
本発明の剤及び／又は医薬は、有効成分であるＤＣＰ−ＬＡ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、所望される剤形によって異なるが、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２６】
ＤＣＰ−ＬＡは、食品として提供することができる。有効成分であるＤＣＰ−ＬＡは、上述の通り、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対してエラスチン合成促進作用及びエラスチン再生促進作用を有することから、しわの予防・改善のための剤、及び抗老化薬として、あるいはしわの予防・改善のために効果的な機能性食品として提供することができる。また、抗老化効果を期待した機能性食品として提供することができる。
【００２７】
本発明において「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の剤及び／又は医薬は、それらの単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
本発明の剤及び／又は医薬が、単一の製剤として提供される場合には、それらの単位摂取量又はその分割量は、ＤＣＰ−ＬＡの単位摂取量又はその分割量である。
【００２９】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された剤、医薬品あるいは食品としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された剤、医薬品あるいは食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬品あるいは食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の剤、医薬品あるいは食品はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００３０】
本発明の剤及び／又は医薬には、必須の有効成分であるＤＣＰ−ＬＡに加え、他の、しわの予防・改善に、あるいは抗老化に有用な１種類以上の成分を含めてもよい。
【００３１】
そのような成分としてはビタミン類、アミノ酸、保湿剤、紫外線吸収剤、収斂剤、抗酸化剤、抗炎症剤、殺菌・消毒剤等が挙げられる。
【００３２】
ビタミン類としては、ビタミンＡ群ではレチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群では、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群では、アスコルビン酸及びその誘導体、ビタミンＤ群では、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ群では、トコフェロール及びその誘導体、ユビキノン類、ビタミンＫ群では、フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）などが挙げられる。
【００３３】
アミノ酸としては、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジンなどや、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、あるいはピロリドンカルボン酸のようなアミノ酸誘導体などが挙げられる。
【００３４】
保湿剤としては、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、セリン、グリシン、スレオニン、アラニン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ヒドロネクチン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸ヘパリン、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リノール酸又はそのエステル類、エイコサペンタエン酸又はそのエステル類、ペクチン、ビフィズス菌発酵物、乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物又はその抽出物、小麦胚芽油、アボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、γ−オリザノール、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、カイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、小麦フスマなどが挙げられる。
【００３５】
紫外線吸収剤としては、ｐ−アミノ安息香酸誘導体、サリチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジオキサン誘導体、カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、ニコチン酸誘導体、ビタミンＢ６誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリンなどが挙げられる。
【００３６】
収斂剤としては、乳酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、アラントイン、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、カラミン、ｐ−フェノールスルホン酸亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム、レソルシン、塩化第二鉄、タンニン酸などが挙げられる。
【００３７】
抗酸化剤としては、アスコルビン酸及びその塩、ステアリン酸エステル、トコフェロール及びそのエステル誘導体、ノルジヒドログアセレテン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポールなどが挙げられる。
【００３８】
抗炎症剤としては、イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、ｄ又はｄｌ−カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸及びその塩などが挙げられる。
【００３９】
殺菌・消毒剤としては、アクリノール、イオウ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化メチルロザニリン、クレゾール、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、スルファミン、マーキュロクロム、ラクトフェリン又はその加水分解物などが挙げられる。
【００４０】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００４１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：エラスチン線維の合成・再生促進作用及びエラスチン障害に対する保護作用
（材料と方法）
１．細胞培養
正常ヒト線維芽細胞は、Lonza (Verviers, Belgium)より購入した。細胞は、FGMTM-2 BulletKitTM(Lonza)中、5% CO2及び95% airの湿雰囲気下、３７℃で培養した。【００４３】
２．動物
雄性ＨＲ−１ヘアレスマウス（７〜８週齢）はJapan SLC. Inc. (Shizuoka, Japan)から購入した。マウスは温度調節された部屋で１２時間明条件／１２時間暗条件のサイクルで飼育した。【００４４】
３．紫外線（ＵＶ）照射
マウスを別に移し屋根にＵＶ光を備えた特別なケージで飼育した。２週間ずっと１２ｃｍの距離で背部の皮膚上にＵＶ光を連続照射した。【００４５】
４．ＤＣＰ−ＬＡの調製
ＵＶ照射の間、１日１回、ポリエチレングリコール（PEG）で希釈したＤＣＰ−ＬＡ（1mg/ml）をマウスの背部の皮膚に塗布した。【００４６】
５．免疫細胞学的測定
ＤＣＰ−ＬＡ（100nM）の存在下、及び非存在下で、ニトロプルシッドナトリウム（SNP）（1mM）で正常ヒト皮膚線維芽細胞を処理した。次いで、細胞をメタノールで−２０℃、３０分間固定し、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用い室温でブロッキングした。細胞を抗エラスチン抗体（1:100）(Millipore, Temecula, CA, USA)と４℃で一晩反応させ、次いで、Alexa488コンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を用い室温で１時間反応させた。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）で染色後、蛍光標識された細胞を共焦点走査性レーザー顕微鏡(Axiovert/LSM510; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)を用いて可視化した。エラスチン線維の蛍光シグナル強度をImageJ (Bethesda, MD, USA)を用いて解析した。エラスチン線維の強度はＤＡＰＩの強度で標準化した。【００４７】
６．免疫組織学的測定
マウスを犠死させた後、皮膚ブロックをＯＴＣ（optimal cutting temperature compound）にマウントし、クライオスタットを用いておよそ１０μｍの厚さに切り出した。切片をＰＢＳ−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、５％（ｖ／ｖ）ヤギ血清で１時間ブロッキングした。次いで、切片を１次抗体である抗エラスチンマウスモノクローナル抗体(1:2000)(Millipore)で４℃で一晩インキュベートし、次いで、２次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(1:500)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)で１時間室温でインキュベートした。DAPIで染色後、切片を共焦点走査性レーザー顕微鏡(Axiovert/LSM510; Carl Zeiss)を用いて可視化した。エラスチン線維の蛍光シグナル強度をNIH imageを用いて定量した。エラスチン線維の強度はＤＡＰＩの強度で標準化した。 【００４８】
７．ウェスタンブロッティング
培養正常ヒト皮膚線維芽細胞を０〜２４時間、ＤＣＰ−ＬＡ(100nM)で処理し、その後培養メディウムを回収した。５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸で沈殿させた後、ＴＧＸゲル(BioRad, Hercules, CA, USA)を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）によりタンパク質を分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜に転写した。ブロッティング膜は５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ[150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20 及び 20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、続いて、抗フィブリン−５抗体(Sigma, St Louis, MO, USA)と反応させた。洗浄後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性は、ＥＣＬキット(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて検出し、化学発光検出システム(chemiluminescence detection system; GE Healthcare)を用いて可視化した。各サンプルの蛋白質濃度はＢＣＡプロテインアッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。【００４９】
８．統計学的解析
統計学的解析はDunnett’s testを用いて行なった。【００５０】
（結果）
正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた実験の結果を図１に、動物（マウス）を用いた実験の結果を図２に示す。
図１に示されるように、ＤＣＰ−ＬＡはエラスチン合成促進及びＮＯストレスに誘導されるエラスチン退化に対して再生を促す作用があることを示している。換言すれば、ＤＣＰ−ＬＡがしわの予防、しわの改善に働く事を示唆している。
また、しわの最も大きな要因は紫外線被爆といわれているが、図２に示されるように、ＤＣＰ−ＬＡは紫外線照射によるエラスチン障害（エラスチンの低下）に対して保護作用を有する。このことは、in vivoしわモデルに対してもＤＣＰ−ＬＡがしわの予防、しわの改善に働く事を示している。
また、図３に示されるようにＤＣＰ−ＬＡで処理することによりフィブリン−５の分泌量が増加した。エラスチンの線維化に必要なフィブリン−５の分泌量が増加することによりエラスチンの線維化が促進され、ひいては皮膚に弾力を付与することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
ＤＣＰ−ＬＡは、エラスチン合成促進及び酸化窒素（ＮＯ）ストレス誘導エラスチン退化に対して再生を促す作用を有し、また紫外線照射によるエラスチン障害（エラスチンの低下）に対しても保護作用を有している。従ってしわの予防及び／又は改善に有用であり、抗老化薬としての用途が期待できる。【００５２】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−０７８８２８（出願日２０１３年４月４日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2014163178.tif 000004
【図２】
2014163178.tif 000005
【図３】
2014163178.tif 000006
【国際調査報告】
2014163178.tif 000007
2014163178.tif 000008
2014163178.tif 000009
2014163178.tif 000010