(57)【要約】簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整できる核酸リンカーを提供する。本発明の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする。
2014080766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする核酸リンカー。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド部分と、前記アーム部分とがホスホジエステル結合で連結した請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体がホスホジエステル結合のみにより連結されてなる請求項１又は２に記載の核酸リンカー。
【請求項４】
前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項５】
前記アーム部分が、該アーム部分を切断するための１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項６】
前記アーム部分が、標識物質を、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位よりも、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分側に有する請求項５に記載の核酸リンカー。
【請求項７】
固相結合部位を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項８】
前記タンパク質又はペプチドは、分子間相互作用解析に用いられる請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項９】
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分は、前記アーム部分の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体。
【請求項１１】
請求項５〜９のいずれか一項に記載の核酸リンカーを前記１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位で切断することにより生じる二つの断片のうち、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片と、前記タンパク質又はペプチドと、からなることを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体。
【請求項１２】
請求項１０に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、
（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１０又は１１に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
【請求項１７】
請求項１０又は１１に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする分子間相互作用解析方法。
【請求項１８】
蛍光相関分光法を用いる請求項１７に記載の分子間相互作用解析方法。
【請求項１９】
分子間相互作用解析方法であって、
（ａ）請求項１０に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、
を有することを特徴とする分子間相互作用解析方法。  
【請求項２０】
プレイタンパク質のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１０に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、
（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、
を有することを特徴とするプレイタンパク質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸リンカー、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、分子間相互作用解析方法、プレイタンパク質のスクリーニング方法に関する。
本願は、２０１２年１１月２１日に、日本に出願された特願２０１２−２５５７３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。【０００３】
新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であった。しかし、より有用なタンパク質を取得するためには、従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要がある。したがって、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。【０００４】
進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、タンパク質（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、前記核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。【０００５】
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質のＣ末端に特異的に共有結合する。【０００６】
ｃＤＮＡディスプレイ法を用いた有用タンパク質のスクリーニング方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成する。これにより、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次いで、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造する。製造したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを製造する。
次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつタンパク質を選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択した後でもよい（非特許文献２参照）。【０００７】
また、上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質チップは、網羅的解析により、短期間で機能タンパク質を取得するためのツールとして重要である。このような網羅的解析をするにあたり、アレイを構成する個々のタンパク質が、基板上に適当量固定されている必要がある。さらに、タンパク質相互作用解析の様に、高感度検出を必要とする繊細なアッセイを行う場合には、基板上のタンパク質が、蛍光分子等の所定量の標識物質によって、適切に標識されている必要がある。【０００８】
従来、タンパク質相互作用解析用に用いられるペプチドやタンパク質は、ペプチド固相合成法や大腸菌タンパク質発現系を利用することにより製造されてきた。しかし、ペプチド固相合成法においては、合成可能なアミノ酸残基数に限度があり、大腸菌発現系においては、精製タンパク質を得るまでの時間を要しているという問題点があった。また、タンパク質相互作用解析に用いられるペプチドやタンパク質は、数μｇ程度合成されれば足りるが、これらの製造方法によると、数ｍｇ程度合成され、無駄が多く、コスト面で難がある。【０００９】
これに対して、無細胞タンパク質合成系において、蛍光標識されたビオチン化ピューロマイシンを用いる方法が提案されている（非特許文献３参照）。この方法は、タンパク質合成の際に、ビオチン化ピューロマイシンを取り込ませることにより、自動的に合成タンパク質が蛍光標識される点で優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４３１８７２１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第３７巻、ｅ１０８頁、２００９年
【非特許文献３】Ｏｙａｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第３４巻、ｅ１０２頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、非特許文献３に記載された方法では、合成したタンパク質の精製の際に、合成に用いられなかったピューロマイシンを除く必要がある。
一例には、無細胞翻訳系において、ヒスチジンタグ融合タンパク質を合成した反応液をＲＮａｓｅで処理し、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用バッファーで透析した後、ニッケルカラムを用いてアフィニティー精製を行い、更にアビジン精製を行うことにより蛍光標識された精製タンパク質を得る。このように、非特許文献３に記載された方法では、精製工程が複雑であり、収率及び簡便性という点から難がある。【００１３】
更に、従来の核酸リンカーは、構造が複雑であるため、より簡便に合成可能な単純化されたものが求められている。【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整できる核酸リンカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーを一本鎖とすることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１１）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなることを特徴とする。【００１６】
（２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位で切断することにより生じる二つの断片のうち、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片と、前記タンパク質又はペプチドと、からなることを特徴とする。【００１７】
（４）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、を有することを特徴とする。【００１８】
（５）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、を有することを特徴とする。【００１９】
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。【００２０】
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。【００２１】
（８）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とする。【００２２】
（９）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする。【００２３】
（１０）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。【００２４】
（１１）本発明の一実施態様におけるプレイタンパク質のスクリーニング方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記ベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、 を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質を簡単に調整できる核酸リンカーが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の核酸リンカーの一態様を示した図である。
【図２】本発明の核酸リンカーの一態様を示した図である。
【図３】本発明のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の一態様を示した図である。
【図４】本発明のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の一態様を示した図である。
【図５】本発明の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法の一態様を示した図である。
【図６】本発明の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法の一態様を示した図である。
【図７】実験例１における電気泳動の結果である。
【図８】実験例１における電気泳動の結果である。
【図９】実験例１における蛍光相関分光法を用いた解析結果である。
【図１０】実験例１における蛍光相関分光法を用いた解析結果である。
【図１１】実験例１における蛍光相関分光法を用いた解析結果である。
【図１２】実験例１における蛍光相関分光法を用いた解析結果である。
【図１３】実験例２の模式図及び核酸リンカーのコンストラクトを示す図である。
【図１４】実験例２における電気泳動の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
≪核酸リンカー≫［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐｕはピューロマイシン、ＡＴＣＧはＤＮＡ配列を示している。また、ｓｐｃ１８はアーム部分を構成するスペーサーを示し、ｒＧはＲＮＡ配列を示している。
【００２８】
本実施形態の核酸リンカー２は、５’側にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂと、を有し、これらが一本鎖を形成している。
【００２９】
ポリヌクレオチド部分５１ａは、ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。
修飾ＤＮＡとしては、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。
【００３０】
アーム部分５１ｂは、ｍＲＮＡ２３とタンパク質又はペプチドとの連結部分２ａとを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部分５１ｂの５’末端は、ポリヌクレオチド部分５１aの３’末端と結合し、アーム部分５１ｂの３’末端はタンパク質連結部分２ａを有する。
【００３１】
従来の核酸リンカーにおいては、アーム部分の５’末端は、ポリヌクレオチド部分の３’末端から数塩基５’側の位置でポリヌクレオチド部分と結合し、Ｔ字型の構造を形成していた。スクリーニングすべきタンパク質をコードするｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、逆転写の際にポリヌクレオチド部分の３’末端がプライマーとして機能するからである。
しかしながら、本実施形態においては、ｍＲＮＡを逆転写させる必要がないため、ポリヌクレオチド部分５１aと、アーム部分５１ｂが連結して一本鎖を形成している。本実施形態の核酸リンカー２は、一本鎖という単純な構造を有しているため、従来の核酸リンカーと比較して容易に製造できる。
【００３２】
３’末端を除くアーム部分５１ｂは、標識物質２ｄを用いて標識されてもよい。標識物質２ｄとしては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
本実施形態においては、アーム部分５１ｂが、標識物質２ｄを、後述する切断部位２ｅ（１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位）よりも、タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａ側に有する。標識物質２ｄにより核酸リンカー２が標識される結果、タンパク質又はペプチド３３が標識物質２ｄで標識されたことになる。標識物質２ｄの分子数は合成により適宜変更することができるため、本実施形態によれば、例えば蛍光相関分光法に必要とされる蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。
【００３３】
アーム部分５１ｂの３’末端にはタンパク質又はペプチド３３の連結部分２ａが存在する。タンパク質又はペプチド連結部分２ａとは、所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質３３の連結部分２ａとしては、伸張中のタンパク質又はペプチド３３のＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
ＰＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ＡＡＮＳ−アミノ酸としては、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、又はアミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸混合物を挙げることができる。
ピューロマイシン以外に好適に使用できるアミノアシルｔＲＮＡ３’末端アナログとしては、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などを挙げることができる。
【００３４】
アーム部分５１ｂは、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。
アーム部分５１ｂにはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や、複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。
【００３５】
本実施形態の核酸リンカー２は、切断部位２ｅとして、１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位を、標識物質２ｄの結合位置よりも５’側に含む。切断部位２ｅで核酸リンカー２を切断することにより、タンパク質３３を分子間相互作用解析に用いる際に、標識物質２ｄが結合している部分のみを残し、立体障害を起こす可能性のある他の核酸部分を除外することができる。
１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。本実施形態においては、ＲＮａｓｅＴ１によって切断される部位としてｒＧが設けられている。
また、光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいう。かかる基を用いたものとして、例えば、ＰＣ  Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。
【００３６】
本実施形態の核酸リンカー２は、ｍＲＮＡ２３の３’末端側との結合部位２ｆを、ポリヌクレオチド部分５１ａの５’末端側に有する。結合部位２ｆは、核酸リンカー２の末端側とｍＲＮＡ２３の末端側とをライゲーション又はハイブリダイズ可能な部位であれば特に限定されないが、図１に示すように、ｍＲＮＡ２３の塩基と相補的な塩基からなるもの（例えば、ｍＲＮＡ２３の３’末端がｐｏｌｙＡである場合には、ｐｏｌｙＡと相補的な塩基であるｐｏｌｙＴ）であることが好ましい。
結合部位２ｆを有することにより、核酸リンカー２とｍＲＮＡ２３との結合の安定度を増すことができる。
【００３７】
本実施形態の核酸リンカー２は、一本鎖という単純な構造を有しているため、従来の核酸リンカーと比較して容易に製造できる。このため、この核酸リンカーを用いることにより、ペプチド又はタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。更に、本実施形態の核酸リンカー２は、アーム部分５１ｂを標識物質２ｄにより標識可能である。また、標識物質２ｄの分子数を合成により適宜変更可能である。従って、本実施形態によれば、例えば蛍光相関分光法に必要とされる蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できる。
【００３８】
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー１２の構造について、図２を用いて説明する。
図２において、図１の核酸リンカー２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００３９】
本実施形態の核酸リンカー１２は、第１実施形態と同様に、５’側にスクリーニングすべきｍＲＮＡ２３の少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分５１ａと、前記タンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａを３’末端に有するアーム部分５１ｂ’と、を有し、これらが一本鎖を形成している。また、アーム部分とポリヌクレオチド部分とがホスホジエステル結合により連結している。
本実施形態においては、アーム部分５１ｂ’が、核酸又は核酸誘導体のみからなる。即ち、本実施形態の核酸リンカー１２は、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体がホスホジエステル結合のみにより連結されてなる。本実施形態の核酸リンカー１２は、核酸又は核酸誘導体のみの一本鎖から構成されているため、第１実施形態に加えて、更に容易に製造することができる。
【００４０】
≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体及びその製造方法≫
［第１実施形態］
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、本実施形態の核酸リンカーを用いて製造される。
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を作製する工程と、を有することを特徴とする。
以下、図３を用いて各工程について説明する。
【００４１】
工程（ａ）において、ｍＲＮＡ２３と核酸リンカー２とをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡ２３は、スクリーニングすべきタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを調製し、そのＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
作製されるタンパク質又はペプチドを精製しやすいように、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの末端にポリヒスチジンやＦＬＡＧ等のタグをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。
【００４２】
次にｍＲＮＡ２３の３’末端領域と核酸リンカー２の５’末端領域とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡ２３を変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡ２３が核酸リンカー２に確実にハイブリダイズされる。
【００４３】
次に工程（ｂ）において、前記工程（ａ）の後、ｍＲＮＡ２３の３’末端と核酸リンカー２の５’末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する。
ライゲーションに際し、前記ｍＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。
【００４４】
次に工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡ２３からタンパク質又はペプチド３３を合成し、タンパク質又はペプチド３３のＣ末端と核酸リンカー２のタンパク質又はペプチド３３との連結部分２ａとを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を作製する。
【００４５】
無細胞タンパク質翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体が製造される。
【００４６】
［第２実施形態］
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカー、とをそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程、を有する。
【００４７】
上述した第１実施形態におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法によれば、ｍＲＮＡから翻訳したタンパク質又はペプチドのＣ末にピューロマイシンを含む核酸リンカーが結合することにより、蛍光色素等の標識物質を導入することができる。
かかる方法は、タンパク質又はペプチドと標的分子の相互作用を、例えば蛍光色素を使用して測定する際に非常に有用な標識方法を提供するものである。
更に、本実施形態におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、上記蛍光色素を使用して分子間相互作用を解析する場合において、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）を使用するときに、有用性を発揮する。
以下、図４を用いて各工程について説明する。
【００４８】
本実施形態においては、簡略化のため２種類のｍＲＮＡ５３，６３と、互いに異なる種類の標識物質２２ｄ，３２ｄを有する２種類の核酸リンカー２２，３２について説明する。
工程（ａ１）は、２種類のｍＲＮＡ５３，６３と、互いに異なる種類の標識物質２２ｄ，３２ｄを有する２種類の核酸リンカー２２，３２とを、それぞれ別の反応容器中に用意し、別個にアニールさせる工程である。
用いられる標識物質としては、蛍光色素が好ましく、例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
【００４９】
工程（ｂ１）は、前記工程（ａ１）の後、ｍＲＮＡ５３，６３の３’末端と核酸リンカー２２，３２の５’末端とをライゲーションさせて、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程である。ライゲーションの詳細については、第１実施形態の工程（ｂ）と同様である。工程（ｂ１）により、例えば、Ａ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体とＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体がそれぞれ別個に製造される。
【００５０】
工程（ｃ１）は、前記工程（ｂ１）の後、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いてｍＲＮＡ５３，６３からタンパク質又はペプチド１３３，２３３を合成し、タンパク質又はペプチド１３３，２３３のＣ末端と核酸リンカー２２，３２のタンパク質又はペプチドとの連結部分２２ａ，３２ａとを各々結合させて、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程である。
無細胞タンパク質翻訳系の詳細については、第１実施形態の工程（ｃ）と同様である。
工程（ｃ１）により、例えば、Ａ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体とＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体が同一反応液中に製造される。
蛍光色素を使用して、分子間相互作用等を解析する場合、数種類のタンパク質分子又はペプチド分子に、それぞれ異なる色の蛍光標識をそれぞれ施すことにより、同時に数種類の分子における分子間相互作用等の解析が可能となる。
本実施形態においては、２種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造することにより、この反応混合液を、その後の分子間相互作用解析に用いることができる。
本実施形態によれば、複数種類のタンパク質分子又はペプチド分子に比較的容易に、様々な色の蛍光標識を、簡便に、確実に標識できる。
【００５１】
≪核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法≫
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体は、核酸リンカーを１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位で切断することにより生じる二つの断片のうち、タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片と、タンパク質又はペプチドと、からなる。かかる核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法としては、特に限定されないが、好ましい実施形態について以下、説明する。
【００５２】
［第１実施形態］
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有する。
以下、図５を用いて各工程について説明するが、図５において、図３のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００５３】
工程（ａ）〜工程（ｃ）は、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の第１実施形態の工程と同様である。
工程（ｄ２）は、工程（ｃ）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカー２を、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程である。
【００５４】
工程（ｄ２）における１本鎖核酸切断酵素の作用方法は、ＲＮａｓｅＴ１等の酵素の至適ｐＨ、至適温度等を考慮して定法に従った方法が挙げられる。
また、光照射方法としては、紫外線等の光切断部位を切断し得る波長の光を照射する方法が挙げられる。
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断することにより、切断産物として、タンパク質又はペプチド３３との連結部分を含む断片（核酸リンカー断片６６）とタンパク質又はペプチド３３とからなる核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体、及び、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片６８）とｍＲＮＡ２３との複合体が得られる。
【００５５】
工程（ｅ２）は、前記工程（ｄ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程である。
工程（ｅ２）において、切断産物として存在する、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片６８）とｍＲＮＡとの複合体、及び、前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体とから、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体のみを精製する。切断産物中には、複合体を形成しなかったフリーのｍＲＮＡや核酸リンカーの切断産物も含まれるため、精製により、併せてこれらも除去する。
【００５６】
精製方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン精製交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等、クロマトグラフィーを用いた精製方法が挙げられる。中でも、簡便且つ精製効率が高いという観点から、アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製方法が好ましい。
アフィニティークロマトグラフィーとしては、スクリーニングすべきｍＲＮＡがコードするタンパク質又はペプチドを構成するアミノ酸配列に応じて適宜選択される。ｍＲＮＡに、ポリヒスチジンやＦＬＡＧ等のタグをコードする塩基配列が付加されている場合には、これらのタグ配列に親和性を示す物質を用いることができる。例えば、スクリーニングすべきｍＲＮＡがポリヒスチジンをコードする塩基配列を有している場合には、ニッケルカラムやコバルトカラムを用いることができる。ここで、ニッケルカラムやコバルトカラムを用いる場合には、カラムにキレートしているニッケルやコバルトの脱離を防止するために、透析等、バッファー交換を行い予め切断産物から還元剤を除いておくことが好ましい。
また、精製方法としては、樹脂担体をそのまま用いたバッチ精製法でもよい。
工程（ｅ２）により、核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体が得られる。これら複合体は、三次元構造を形成することによりアプタマーとして機能するおそれのあるｍＲＮＡを排除してあるため、分子間相互作用解析に好適に用いられる。
【００５７】
［第２実施形態］
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有する。
以下、図６を用いて各工程について説明するが、図６において、図４のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００５８】
工程（ａ１）〜工程（ｃ１）は、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法の第２実施形態の工程と同様である。
工程（ｄ３）は、工程（ｃ１）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程である。
【００５９】
工程（ｄ３）における１本鎖核酸切断酵素の作用方法及び光照射方法は、第１実施形態における工程（ｄ２）におけるものと同様である。
工程（ｄ３）により、例えば、Ａ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断することにより、切断産物として、タンパク質又はペプチドとの連結部分を含む断片（核酸リンカー断片１６６，２６６）と、タンパク質又はペプチド１３３，２３３と、からなるＡ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体、及び、切断部位より５’末端側の核酸リンカー断片（その他の核酸リンカー断片１６８，２６８）とｍＲＮＡ５３，６３との複合体を一度に得られる。
【００６０】
工程（ｅ３）は、前記工程（ｄ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程である。
工程（ｅ３）における精製方法は、第１実施形態における工程（ｅ２）におけるものと同様である。
工程（ｅ３）により、例えば、Ａ色の蛍光色素又はＢ色の蛍光色素が結合した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体が一度に得られる。
これら複合体は、三次元構造を形成することによりアプタマーとして機能するおそれのあるｍＲＮＡを排除してあるため、これら複合体をそのまま分子間相互作用解析に供することができる。
【００６１】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、上述したタンパク質複合体又はペプチド複合体をマイクロアレイ基板上に固定化されてなるものである。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。本実施形態のタンパク質複合体又はペプチド複合体に、固相結合部位を設け、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、タンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基／アミノ基、ヨウ化アセチル基／アミノ基、マレイミド基／チオール基（‐ＳＨ）、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
【００６２】
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法である。固相がスチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。
【００６３】
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイが、上述した核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を固相に固定したものである場合には、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を切断する際、切断除去されるｍＲＮＡを別途回収して、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ上の各スポットの遺伝情報を集積しておく必要がある。固相の例として、ビーズや基板が挙げられる。
なお、核酸リンカー−タンパク質複合体又は核酸リンカー−ペプチド複合体を固相に固定する場合には、固相結合部位は核酸リンカーのポリヌクレオチド部分またはアーム部分に設けてもよい。
【００６４】
≪分子間相互作用解析方法≫
本実施形態の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を用いて、標的分子との相互作用を解析することができる。また、本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を用いて、標的分子との相互作用を解析することができる。「標的分子」とは、本実施形態において合成されるタンパク質又はペプチドと相互作用するか否かを調べるための物質を意味し、有機化合物、無機化合物、あるいはこれらの複合体を示し、一例として、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。
この際、餌となるタンパク質側を「ベイト（ｂａｉｔ）」といい、釣られるタンパク質側を「プレイ（ｐｒｅｙ、餌食）」という。ここで、ベイトタンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としては、所望のタンパク質を使用することができる。また、プレイタンパク質（ｐｒｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としては、例えば、サバイビンモノマー、サバイビンダイマー、及び低分子化合物からなる群から選ばれることが好ましく、サバイビンモノマー又はサバイビンダイマーであることが、特に好ましい。ここで、上記「低分子化合物」とは、分子量３０〜１，５００の範囲にある化合物をいい、糖鎖の有無を問わない。例えば、アフラトキシンＢ１、シガトキシン、フルオロセイン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等を挙げることができる。たとえば、標識したプレイタンパク質（例として蛍光標識したプレイタンパク質）とタンパク質複合体又はペプチド複合体を反応させ、結合体を生成し、標識したプレイタンパク質を検出することで、その結合体の相互作用を解析することができる。
【００６５】
分子間相互作用を測定する手法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）等が挙げられ、蛍光相関分光法を用いることが好ましい。
【００６６】
蛍光相関分光法は、蛍光分子が微小な焦点領域を出入りする際に生じる「蛍光強度のゆらぎ」を解析することで、その蛍光分子の持つ「動き」と「数」という動的な情報を得ることができる方法である。
本実施形態のタンパク質複合体又はペプチド複合体は、蛍光１分子でラベル化されたペプチドやタンパク質を迅速かつ簡単に調整できるため、蛍光相関分光法に好適に用いられる。
【００６７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
［実験例１］（核酸リンカーの合成１）
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ［配列：５’−Ｘ１−（Ａｌｅｘａ４８８）−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘ１は以下の配列を表す。
ＣＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＡＡ（ｒＧ）ＴＣ（配列番号１：２８ｍｅｒ）
また、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  ＣＰＧ、（ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。【００６９】
（ｍＲＮＡの合成）
５’上流にＴ７プロモーター配列と翻訳促進配列、３’側下流にスペーサー領域及びＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒとの相補鎖領域を有する配列を付加したＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（以下、ＢＤＡという。配列番号２：３６７ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲにより得られたＤＮＡからＴ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って５〜３０ｐｍｏｌ／μｌのｍＲＮＡを合成した（３３７ｂ）。【００７０】
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
前記ｍＲＮＡ５ｐｍｏｌと、前記ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  １０ｐｍｏｌをＴ４ ＲＮＡＬｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ (タカラバイオ社製)中で混合し、９０℃に加熱した後、１５分間かけて２５℃まで冷却した。この溶液に、０．５μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、東洋紡績社製)と、０．５μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製)を加えて混合し、２５℃で１５分間反応させた。
反応産物を８Ｍ尿素８％変性アクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＳＹＢＲＧＯＬＤ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)にて染色した。また、核酸リンカーは、Ａｌｅｘａ４８８により蛍光標識されており、この標識を指標に、蛍光イメージを取得した。結果を図７に示す。
レーン１はＦＣＳ  ＬｉｎｋｅｒとｍＲＮＡ（ＢＤＡ）とのライゲーション産物、レーン２はｍＲＮＡ（ＢＤＡ）を泳動したものである。
矢印はｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ−ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ、又はＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒを示す。左図及び右図の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。左図は、Ａｌｅｘａ４８８による蛍光イメージを取得した結果であり、右図は、ＳＹＢＲＧＯＬＤを用いて核酸を染色した結果である。【００７１】
レーン１において、未反応のＢＤＡのｍＲＮＡが検出されないことから、本実施形態の核酸リンカーを用いた場合のライゲーション効率は高いことが分かる。【００７２】
（無細胞タンパク質翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡの複合体に無細胞タンパク質翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３０μｌ加え、３０℃、３０分翻訳反応を行った。その後、３Ｍ  ＫＣｌを１０μｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を３μｌ加えて３７℃で４０分間放置し、０．４Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ加え、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。【００７３】
（Ｎｉカラムによる核酸リンカー断片−タンパク質複合体の精製）
上記のように合成したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体にＲＮａｓｅＴ１を添加し、３７℃、３０分間インキュベーションした。次いで、この反応溶液を、平衡化バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）で平衡化した簡易カラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ ６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてバッファー交換をした。
Ｎｉカラムを平衡化バッファーを用いて平衡化した後、バッファー交換をしたｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体分解物（核酸リンカー断片−タンパク質複合体）をＮｉカラムに添加した。
次いで、洗浄バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、４０ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）を添加して、Ｎｉカラムから夾雑物を取り除いた後、溶出バッファー（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、３００ｍＭ イミダゾール；ｐＨ ７．４）を添加し、精製された核酸リンカー断片−タンパク質複合体を回収した。
上記に従って精製した核酸リンカー断片−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。核酸リンカーは、Ａｌｅｘａ４８８により蛍光標識されているため、泳動後、この標識を指標に、蛍光イメージを取得した。
結果を図８に示す。【００７４】
図８中、レーン１はＮｉカラムで精製後の核酸リンカー断片−タンパク質複合体（３ｐｍｏｌ）、レーン２は精製前のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体分解物（０．５ｐｍｏｌ）、レーン３は核酸リンカーのみの分解物（１ｐｍｏｌ）を泳動したものである。矢印は核酸リンカー断片−タンパク質複合体（ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ−Ｂ  ｄｏｍａｉｎ複合体）、核酸リンカー（ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ）、又は核酸リンカー断片（ＦＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ断片）を示す。レーン１に示されるように、精製された核酸リンカー断片−タンパク質複合体の純度は非常に高いことが確認された。【００７５】
（ＦＣＳによる核酸リンカー断片−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ複合体とＩｇＧ間の相互作用解析）
サンプル容器に、核酸リンカー断片−Ｂ−ｄｏｍａｉｎ複合体１．５９ｎＭと、ＢＤＡと強い相互作用を示すことが知られているＩｇＧを、それぞれ０ｎＭ，０．１７ｎＭ，０．３３ｎＭ，１．６７ｎＭ，３．３３ｎＭ，１６．７ｎＭ，３３．３ｎＭ，１６７ｎＭ，３３３ｎＭ添加し、各試料の測定を行った。
各試料の実測データより自己相関関数を演算し、フィッティングカーブをとった結果を図９〜図１１に示す。また、各ＩｇＧ濃度における拡散時間を表１に示す。【００７６】
【表１】
2014080766.tif 000003
【００７７】
表１に示すように、ＦＣＳの結果よりフリーのＢＤＡの拡散時間は、０．０９３９８３ ｍｓであった。フリーのＢＤＡとＩｇＧ−ＢＤＡ複合体の分子量の差は１６１１６９／１１１６９＝１４．４３０倍であるため、それぞれのタンパク質が球状と仮定すると、拡散時間は１４．４３１／３＝２．４３６倍となり、０．２２３３９５７１ ｍｓとなる。
結合率ｘ％は拡散時間をｔｍｓとすると、ｘ＝(ｔ−０．０９３９８３)／（０．２２３３９５７１−０．０９３９８３)で求められる。図１２は、ＩｇＧとＢＤＡのモル比と結合率のプロットである。ＢＤＡ＝１．５９ｎＭであるため結合率５０％の濃度（Ｋｄ値）は１．５９×６．８１６＝１０．８ｎＭとなる。【００７８】
また、各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値は、
Ｋｄ＝［フリーなＡ分子］［フリーなＢ分子］／［結合したＡ分子］で求められる。各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値を表２に示す。【００７９】
【表２】
2014080766.tif 000004
【００８０】
各ＩｇＧ濃度に基づくＫｄ値は、図１２から算出された値とほぼ一致していることが確認された。【００８１】
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、簡便に合成可能で、標識ペプチド又は標識タンパク質を迅速かつ簡単に調整することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いて、分子間相互作用解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。【００８２】
［実験例２］
下記の核酸リンカーを用いて分子間相互作用解析（ｂａｉｔタンパク質とｐｒｅｙタンパク質との相互作用解析）を行った。図１３に、実験例２の模式図及び核酸リンカーのコンストラクトを示す。分子間相互作用解析としてプルダウン法を用い、相互作用を示すことが知られている３種類の組み合わせ（ＢＤＡとＩｇＧ；ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体；マウスＦａｓリガンド（以下、ＦａｓＬという。）と抗ＦａｓＬモノクローナル抗体）について評価した。
ＢＤＡ、ＦＬＡＧタグ、ＦａｓＬを、磁気ビーズにｂａｉｔタンパク質として固定した。図１３に示すように、ｂａｉｔタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔ７プロモーター配列、オメガ配列、コザック配列、ｂａｉｔタンパク質コード領域、及び核酸リンカーとハイブリダイズする領域（以下、ＨＲという。）から構成される。ｂａｉｔタンパク質をコードするＤＮＡをＴ７ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってｍＲＮＡを合成し、ＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。【００８３】
（核酸リンカーの合成２）
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）ビオチン化核酸リンカー［配列：５’−ＣＣＧＣ−（Ｂ）−Ｘ２−（ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘ２は以下の配列を表す。
ＣＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ（配列番号３：２２ｍｅｒ）
また、（Ｂ）はＢｉｏｔｉｎＴＥＧで修飾されたＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  ＣＰＧ、（ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。【００８４】
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
上述した精製ｍＲＮＡと、ビオチン化核酸リンカーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて結合（ライゲーション）させた。【００８５】
（無細胞タンパク質翻訳系による翻訳）
ライゲーション産物に対して、Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  ｋｉｔを用いて、翻訳反応を行い、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。翻訳反応産物にＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ，ｐＨ８．０）を加え、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体に結合しているリボソームを取り除いた。次いで、ＲＮａｓｅ  Ｏｎｅ（プロメガ社製）を加え、ｍＲＮＡ−ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体中のｍＲＮＡを分解した。磁気ビーズとしてＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（インビトロジェン社製)を用いて、各ビオチン化核酸リンカー−タンパク質複合体溶解液からビオチン化ｂａｉｔタンパク質を捕捉した。【００８６】
（プルダウンアッセイ）
各ｐｒｅｙタンパク質（ＩｇＧ：シグマーアルドリチ社製、マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体：シグマーアルドリチ社製、ハムスターモノクローナル抗ＦａｓＬ抗体：医学生物学研究所製）をＮ―ヒドロキシスクシニミド−フルオロセイン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で標識した。フルオロセイン標識ｐｒｅｙタンパク質溶解液（２００ｎＭ又は４００ｎＭ）をビオチン化ｂａｉｔタンパク質が結合した磁気ビーズに加え、２５℃で３０分インキュベーションを行った後、この磁気ビーズを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという。）で３回洗浄した。洗浄後の磁気ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁し、９０℃で５分インキュベーションを行い、磁気ビーズ上に残ったｐｒｅｙタンパク質−ビオチン化ｂａｉｔタンパク質複合体を溶出した。
溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。泳動後、ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（バイオラッド社製）を用いて蛍光イメージを取得した。結果を図１４に示す。図１４上段は、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の蛍光イメージを示し、図１４下段は、各イメージ（バンド）の蛍光強度を定量化したグラフである。図１４に示されるように、相互作用を示すことが知られている組み合わせにおいては、ビオチン化ｂａｉｔタンパク質によりｐｒｅｙタンパク質がプルダウンされることが確認された。また、ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体との結合の度合いは、ＦａｓＬと抗ＦａｓＬモノクローナル抗体の結合の度合いより強い等、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の蛍光強度は、概ね各相互作用における解離定数に依存していた。
更に、プルダウンされたｐｒｅｙタンパク質の分子数がＩｎｐｕｔされるｐｒｅｙタンパク質の濃度に依存するかどうかを、２種類の異なる濃度（２００ｎＭ，４００ｎＭ）の抗ＦＬＡＧ抗体を用いて評価した。図１４上段に示されるように、４００ｎＭの抗ＦＬＡＧ抗体を用いた場合は、２００ｎＭの抗ＦＬＡＧ抗体を用いた場合よりも、より多分子数のｐｒｅｙタンパク質がプルダウンされることが分かった。【００８７】
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、分子間相互作用解析に必要な量のｂａｉｔタンパク質を迅速かつ簡単に低コストで調整することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いて、分子間相互作用解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質を簡単に調整できる核酸リンカーが得られる。したがって、本発明は相互作用解析等に好適に利用でき、産業上極めて重要である。
【符号の説明】
【００８９】
２，１２，２２，３２…核酸リンカー
２ａ，２２ａ，３２ａ…連結部分
２ｄ, ２２ｄ，３２ｄ…標識物質
２ｅ…切断部位
２ｆ…結合部位
２３，５３，６３…ｍＲＮＡ
３３，１３３，２３３…タンパク質又はペプチド
５１ａ…ポリヌクレオチド部分
５１ｂ，５１ｂ’…アーム部分
６６，１６６，２６６…核酸リンカー断片
６８，１６８，２６８…その他の核酸リンカー断片
【図１】
2014080766.tif 000005
【図２】
2014080766.tif 000006
【図３】
2014080766.tif 000007
【図４】
2014080766.tif 000008
【図５】
2014080766.tif 000009
【図６】
2014080766.tif 000010
【図９】
2014080766.tif 000011
【図１０】
2014080766.tif 000012
【図１１】
2014080766.tif 000013
【図１２】
2014080766.tif 000014
【図１３】
2014080766.tif 000015
【図７】
2014080766.tif 000016
【図８】
2014080766.tif 000017
【図１４】
2014080766.tif 000018
【配列表】
2014080766000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月26日(2016.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと、該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、
前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、
前記結合部位に固相結合部位を有することを特徴とする核酸リンカー。
【請求項２】
前記固相結合部位がビオチンである請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド部分と、前記アーム部分とがホスホジエステル結合で連結した請求項１又は２に記載の核酸リンカー。
【請求項４】
ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体がホスホジエステル結合のみにより連結されてなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項５】
前記アーム部分が、該アーム部分を切断するための１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項６】
前記アーム部分が、標識物質を、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は光切断部位よりも、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分側に有する請求項５に記載の核酸リンカー。
【請求項７】
前記タンパク質又はペプチドは、分子間相互作用解析に用いられる請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項８】
前記タンパク質又はペプチドとの連結部分は、前記アーム部分の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、又は３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体。
【請求項１０】
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、
をアニールさせる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１１】
ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、
をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
（ｄ１）前記工程（ｃ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、
を有することを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１２】
核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ２）前記ｍＲＮＡと、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、
をアニールさせる工程と、
（ｂ２）前記工程（ａ２）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、
（ｃ２）前記工程（ｂ２）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、
（ｄ２）前記工程（ｃ２）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、
（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、
（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、
を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１３】
核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ３）複数種類のｍＲＮＡと、
前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、
をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、
（ｂ３）前記工程（ａ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、
（ｃ３）前記工程（ｂ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、
（ｄ３）前記工程（ｃ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、
（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、
（ｆ３）前記工程（ｅ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、
を有することを特徴とする核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項９に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とするタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
【請求項１５】
請求項９に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする分子間相互作用解析方法。
【請求項１６】
蛍光相関分光法を用いる請求項１５に記載の分子間相互作用解析方法。
【請求項１７】
分子間相互作用解析方法であって、
（ａ）請求項９に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、
を有することを特徴とする分子間相互作用解析方法。
【請求項１８】
プレイタンパク質のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項９に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、
（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、
（ｃ）前記ベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、
（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質‐プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、
を有することを特徴とするプレイタンパク質のスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーを一本鎖とすることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１０）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、そのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドとの複合体を製造するための核酸リンカーであって、  前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、  前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有することを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（２）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質又はペプチドと、を連結してなることを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
（３）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ）前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、をアニールさせる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、  （ｃ）前記工程（ｂ）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
（４）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ１）複数種類のｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ１）前記工程（ａ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ１）前記工程（ｂ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ１）前記工程（ｃ１）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ２）前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有する核酸リンカーと、をアニールさせる工程と、（ｂ２）前記工程（ａ２）の後、前記ｍＲＮＡの末端と前記核酸リンカーの末端とをライゲーションさせて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を製造する工程と、（ｃ２）前記工程（ｂ２）の後、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を製造する工程と、（ｄ２）前記工程（ｃ２）の後、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、（ｅ２）前記工程（ｄ２）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して切断産物を得る工程と、（ｆ２）前記工程（ｅ２）の後、前記切断産物から前記核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体の製造方法であって、（ａ３）複数種類のｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡの少なくとも一部の配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド部分と、前記タンパク質又はペプチドとの連結部分を末端に有するアーム部分と、が一本鎖を形成してなり、前記ｍＲＮＡの末端との結合部位を、前記ポリヌクレオチド部分側の末端に有し、前記結合部位に固相結合部位を有し、互いに異なる種類の標識物質を有する複数種類の核酸リンカーと、をそれぞれ別個にアニールさせる工程と、（ｂ３）前記工程（ａ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡの末端と前記複数種類の核酸リンカーの末端とをそれぞれ別個にライゲーションさせて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体をそれぞれ別個に製造する工程と、（ｃ３）前記工程（ｂ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体を混合し、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドのＣ末端と前記核酸リンカーの前記タンパク質又はペプチドとの連結部分とを結合させて、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を同一反応液中に製造する工程と、（ｄ３）前記工程（ｃ３）の後、前記複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体を、固相結合部位認識部位を有する固相に結合させて精製する工程と、（ｅ３）前記工程（ｄ３）の後、１本鎖核酸切断酵素を作用させることにより、又は、光照射により、複数種類のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体又はｍＲＮＡ−核酸リンカー−ペプチド複合体中の核酸リンカーを、前記１本鎖核酸切断酵素部位又は前記光切断部位で切断して複数種類の切断産物を得る工程と、（ｆ３）前記工程（ｅ３）の後、前記複数種類の切断産物から前記複数種類の核酸リンカー断片−タンパク質複合体又は核酸リンカー断片−ペプチド複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
（７）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体が基板上に固定化されてなることを特徴とする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
（８）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、先に記載のタンパク質複合体又はペプチド複合体を標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体又はペプチド複合体との相互作用を解析することを特徴とする。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
（９）本発明の一実施態様における分子間相互作用解析方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記標識されたプレイタンパク質を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
（１０）本発明の一実施態様におけるプレイタンパク質のスクリーニング方法は、（ａ）前記タンパク質複合体又はペプチド複合体の、前記タンパク質又は前記ペプチドをベイトタンパク質として固相に固定する固定化工程と、（ｂ）前記ベイトタンパク質と、標識されたプレイタンパク質とを反応させてベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を生成させる反応工程と、（ｃ）前記ベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を集める収集工程と、（ｄ）前記収集されたベイトタンパク質−プレイタンパク質結合体を洗浄して、前記プレイタンパク質を溶出させる溶出工程と、 を有することを特徴とする。
【国際調査報告】
2014080766.tif 000019
2014080766.tif 000020