(57)【要約】  平坦な底面に細胞Ｃを担持する容器Ｄを保持する保持手段１１と、保持手段１１に保持された容器Ｄから離間して配置され、容器Ｄの底面のうちの処理対象領域に向けて超音波を出射し、容器Ｄの底面を介して細胞Ｃに超音波を入射させて、細胞の少なくとも一部を容器Ｄから剥離させる超音波出射手段１２１と、超音波出射手段１２１と処理対象領域との間の空間に超音波伝達物質を供給して超音波出射手段１２１と処理対象領域とを超音波伝達物質により接続する伝達物質供給手段１０５，１２２とを備える。
2016047368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を担持する容器を保持する保持手段と、
前記保持手段に保持された前記容器から離間して配置され、前記容器の外面のうちの処理対象領域に向けて超音波を出射し、前記容器の外面を介して前記細胞に前記超音波を入射させて、前記細胞の少なくとも一部を前記容器から剥離させる超音波出射手段と、
前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間の空間に超音波伝達物質を供給して、前記超音波出射手段と前記処理対象領域とを前記超音波伝達物質により接続する伝達物質供給手段と
を備える細胞剥離装置。
【請求項２】
前記伝達物質供給手段は、前記超音波伝達物質としての液体を供給して、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間を液密状態にする請求項１に記載の細胞剥離装置。
【請求項３】
前記伝達物質供給手段は、一方端が前記容器の外面に向けて開口し内部空間に前記液体を保持する筒状体と、前記筒状体の前記内部空間に前記液体を注入する液体注入部とを有し、前記筒状体の開口から前記液体を吐出させて前記容器の外面に供給し、
前記超音波出射手段は、前記筒状体の前記内部空間にまたは前記筒状体の前記一方端と反対側の他方端に設けられる請求項２に記載の細胞剥離装置。
【請求項４】
前記超音波出射手段と前記容器との距離を変化させる距離変更手段を備え、
前記距離変更手段が前記超音波出射手段と前記容器との距離を変化させながら、前記超音波出射手段が前記超音波を出射する請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項５】
前記容器内の前記細胞を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段が撮像した画像に基づき、前記容器内で剥離すべき細胞の位置を特定する剥離位置特定手段と、
前記剥離位置特定手段により特定された位置の情報に応じて、前記容器の外面への前記超音波の入射位置を設定する入射位置設定手段と
を備える請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項６】
前記入射位置設定手段は、前記剥離位置特定手段により特定された位置の情報に応じて、前記容器に対し相対的に前記超音波出射手段を移動位置決めする位置決め機構を有する請求項５に記載の細胞剥離装置。
【請求項７】
前記伝達物質供給手段が、前記超音波伝達物質の前記容器の外面への供給位置を変更可能であり、
前記入射位置設定手段は、前記剥離位置特定手段により特定された位置の情報に応じて、前記伝達物質供給手段から前記容器の底面への前記超音波伝達物質の供給位置を設定する請求項５に記載の細胞剥離装置。
【請求項８】
前記伝達物質供給手段が、前記容器の外面の互いに異なる位置に向けて前記超音波伝達物質としての液体を吐出する複数の吐出口を有し、
前記入射位置設定手段は、前記剥離位置特定手段により特定された位置の情報に応じて、前記吐出口の各々からの前記超音波伝達物質の吐出量を個別に制御する請求項５ないし７のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項９】
前記超音波出射手段が、前記容器の外面の互いに異なる位置に向けて前記超音波を出射する複数の出射部を有し、
前記入射位置設定手段は、前記剥離位置特定手段により特定された位置の情報に応じて、前記出射部の各々からの前記超音波の出射量を個別に制御する請求項５ないし８のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項１０】
前記伝達物質供給手段から前記容器の外面に供給される前記超音波伝達物質としての液体を、前記容器外面から吸引する吸引手段を備える請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項１１】
前記超音波出射手段は、前記容器の外面に入射させる前記超音波の強度を変更可能である請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞剥離装置。
【請求項１２】
細胞を担持する容器の外面のうちの処理対象領域に向けて、超音波出射手段を前記容器から離間させて配置する工程と、
前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間の空間に超音波伝達物質を供給して、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間を前記超音波伝達物質で接続しながら、前記超音波出射手段から前記処理対象領域に超音波を入射させて、前記細胞の少なくとも一部を前記容器から剥離させる工程と
を備える細胞剥離方法。
【請求項１３】
前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間の空間に前記超音波伝達物質としての液体を供給し、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間を液密状態にして前記超音波出射手段から前記超音波を出射する請求項１２に記載の細胞剥離方法。
【請求項１４】
前記超音波出射手段と前記容器との距離を変化させながら、前記超音波出射手段から前記超音波を出射する請求項１２または１３に記載の細胞剥離方法。
【請求項１５】
前記容器内の前記細胞を撮像する工程と、
撮像された画像に基づき、前記容器内で剥離すべき細胞の位置を特定する工程と、
特定された位置に前記超音波の入射位置を調整する工程と
を備える請求項１２ないし１４のいずれかに記載の細胞剥離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、容器内で培養された細胞を選択的に容器から剥離する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
培養プレートやディッシュ（シャーレ）などの容器の底面で細胞を接着培養した試料を用いた実験・研究においては、培養される細胞の一部を容器から剥離させて取り出すことが必要になる場合がある。このようなケースとしては、容器内に分布する細胞から有用なものを選抜して取り出すケースと、不要な細胞を除去するケースとの両方が含まれ得る。このような細胞の剥離を行う方法として、オペレータが例えば顕微鏡観察下で手作業により細胞を剥離させる方法以外に、例えば超音波を入射させることで細胞に振動エネルギーを与えて容器から剥離させる方法が考えられている。【０００３】
例えば特許文献１に記載の技術においては、平坦な担体に担持された細胞群のうち切り出したい細胞に収束された超音波が上方から照射され、これにより当該細胞が遊離する。また特許文献２には、培養容器のうち細胞が培養された培養面に対し裏側に当たる、培養容器外部から高周波振動発生部を接触させて、または非接触で振動を付与することで、一部の細胞を選択的に剥離させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−０２２２２６号公報
【特許文献２】特開２０１４−０１８１８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の技術は、剥離したい細胞の上方に広い処理空間があることが前提となっているが、容器の種類や培養の状態によっては、このような前提が満足されない場合がある。したがって、特許文献２に記載のように、容器外面、特に底面側からの操作によって細胞を剥離することが求められる。しかしながら、特許文献２に記載のように、振動発生部を接触させた場合には振動発生部からの機械振動が容器の広い範囲に拡散し、剥離する領域を絞り込むことが難しい。また、細胞を担持する培地の表面で振動波が反射することで定在波が生じ、十分なエネルギーを細胞に与えることができず剥離を良好に行えないことがある。また振動発生部を容器に対し非接触に設けた場合にも、容器での反射により細胞に入射する超音波のエネルギーが小さくなり、やはり剥離を良好に行えない。【０００６】
このように、容器内に担持される細胞を、容器外面からの操作により優れた選択性で確実に剥離する剥離技術については、これまでのところ十分に実用的な技術が確立されているとは言えない。【０００７】
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、容器外面からの操作により、容器内に担持される細胞を優れた選択性で確実に剥離することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明にかかる細胞剥離装置の一の態様は、上記目的を達成するため、細胞を担持する容器を保持する保持手段と、前記保持手段に保持された前記容器から離間して配置され、前記容器の外面のうちの処理対象領域に向けて超音波を出射し、前記容器の外面を介して前記細胞に前記超音波を入射させて、前記細胞の少なくとも一部を前記容器から剥離させる超音波出射手段と、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間の空間に超音波伝達物質を供給して、前記超音波出射手段と前記処理対象領域とを前記超音波伝達物質により接続する伝達物質供給手段とを備えている。【０００９】
また、この発明にかかる細胞剥離方法の一の態様は、上記目的を達成するため、細胞を担持する容器の外面のうちの処理対象領域に向けて、超音波出射手段を前記容器から離間させて配置する工程と、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間の空間に超音波伝達物質を供給して、前記超音波出射手段と前記処理対象領域との間を前記超音波伝達物質で接続しながら、前記超音波出射手段から前記処理対象領域に超音波を入射させて、前記細胞の少なくとも一部を前記容器から剥離させる工程とを備えている。【００１０】
本発明において、「超音波」の語は、気体、液体、固体等の媒質中を伝搬する弾性波であって細胞を破壊することができる程度のエネルギーを持つもの全般を意味しており、人間の可聴域外の周波数を持つ弾性波に限定されるものではない。【００１１】
このように構成された発明では、容器外面の処理対象領域に対し離間配置された超音波出射手段から超音波が出射される。そして、超音波出射手段と処理対象領域との間は超音波伝達物質により接続される。空気伝搬により超音波を容器に入射させる場合、超音波が散乱したり容器外面で反射したりするため、容器外面を隔てた細胞に選択的にかつ効率よく超音波を入射させることが難しい。また、容器外面に超音波出射手段を接触させた場合、機械振動が容器に伝わって特定の領域のみに超音波を入射させることが難しい。また剥離対象たる細胞と超音波出射手段との距離が固定されてしまうため、定在波が発生して剥離に十分なエネルギーを細胞に与えることができなくなる場合がある。【００１２】
本発明では、超音波出射手段を直接容器に接触させるのではなく、超音波出射手段と処理対象領域との間に超音波伝達物質を介在させるので、超音波を効率よく剥離対象たる細胞に入射させることができる。また超音波の入射範囲も、容器外面と超音波伝達物質との接触面の位置と大きさとにより制御することが可能である。また超音波出射手段と容器外面との距離についても制限されないので、定在波による影響を抑制することが可能となる。このように、本発明によれば、容器外面側からの操作であっても、容器内に担持される細胞を優れた選択性で確実に剥離させることが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、超音波出射手段が容器外面から離間して配置され、超音波出射手段と容器外面の処理対象領域との間が超音波伝達物質で接続される。超音波出射手段から出射される超音波は超音波伝達物質を介して処理対象領域に入射する。そのため、空気中での散乱や容器外面での反射が抑えられ、剥離対象たる細胞に対し優れた選択性で超音波が入射し、細胞を容器から剥離させることができる。【００１４】
この発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、添付図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。ただし、図面は専ら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】この発明にかかる細胞剥離装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。
【図２Ａ】この実施形態における細胞剥離の原理を説明する第１の図である。
【図２Ｂ】この実施形態における細胞剥離の原理を説明する第２の図である。
【図３Ａ】この実施形態における細胞剥離の原理を説明する第３の図である。
【図３Ｂ】この実施形態における細胞剥離の原理を説明する第４の図である。
【図４Ａ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第１の図である。
【図４Ｂ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第２の図である。
【図４Ｃ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第３の図である。
【図５Ａ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第４の図である。
【図５Ｂ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第５の図である。
【図５Ｃ】第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す第６の図である。
【図６】この発明にかかる細胞剥離装置の第２実施形態の概略構成を示す図である。
【図７】この発明にかかる細胞剥離装置の第３実施形態を示す図である。
【図８】第３実施形態の主要部を示す上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜第１実施形態＞
図１はこの発明にかかる細胞剥離装置の第１実施形態の概略構成を示す図である。この細胞剥離装置１は、シャーレ、ディッシュ等の試料容器に注入された培地内で培養された細胞のうち、特定の領域の細胞を容器から剥離させるための装置である。本明細書において「細胞」というとき、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる細胞塊や細胞コロニーも含む概念を表すものとする。すなわち、この細胞剥離装置１は、試料容器内で接着培養された細胞のうち単一の細胞を剥離する用途、および、複数の細胞からなる細胞塊または細胞コロニーを剥離する用途の少なくとも一方に用いられるものである。
【００１７】
細胞を剥離させる目的としては、容器内で培養される細胞のうち不要なものを除去することを目的とするケースと、必要な細胞を採取して利用したり他の容器等に移し替えたりすることを目的とするケースとがあり得る。そのために、所望の位置の細胞のみを剥離させることができ、周囲の細胞にダメージを与えない位置選択性が必要とされる。本明細書で説明する細胞剥離装置は、このいずれの目的にも利用することができる。
【００１８】
以下、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここで、ＸＹ平面が水平面を表す一方、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。
【００１９】
この細胞剥離装置１は、装置全体の動作を制御するＣＰＵ１０１を有する制御ユニット１００を備えている。また、細胞剥離装置１は、試料容器の一例としての浅皿型のディッシュＤを保持する保持ステージ１１を備えている。保持ステージ１１は、ディッシュＤの外底面Ｂｂの周縁部に当接することでディッシュＤを水平姿勢に、かつディッシュＤの外底面Ｂｂの下方が開放された状態で保持する。ディッシュＤは、内底面Ｂａが直径数十ミリメートル程度の略円形で平坦に形成された、例えばガラスまたは樹脂製で浅皿型の容器である。ディッシュＤ内には予め液状またはゲル状の培地Ｍが注入されており、培地Ｍ内で細胞Ｃが培養されている。すなわち、ディッシュＤの内底面Ｂａに細胞Ｃが担持されている。
【００２０】
保持ステージ１１に保持されるディッシュＤの下方には超音波照射ユニット１２が配置されている。超音波照射ユニット１２は、超音波を出射する超音波振動子１２１と、超音波振動子１２１を収容する筒状のノズル１２２とを備えている。超音波振動子１２１は、制御ユニット１００に設けられた振動子駆動部１０４からの駆動信号に応じて所定の周波数および強度の超音波を発生し、上方に向けて、つまりディッシュＤの外底面Ｂｂに向けて超音波を出射する。種々の容器や細胞、その厚さ等に対応して良好に剥離を行うために、振動子駆動部１０４は、超音波振動子１２１から出射させる超音波の周波数および強度を変更可能となっていることが好ましい。
【００２１】
また、超音波振動子１２１は、制御ユニット１００に設けられた昇降機構１０３により、ノズル１２２の筒内で昇降可能に支持されている。昇降機構１０３は、ＣＰＵ１０１からの制御指令に応じて超音波振動子１２１を昇降させ、その鉛直方向（Ｚ方向）位置を変化させる。
【００２２】
ノズル１２２は上向きに開いた開口１２２ａを有する筒型形状となっており、内部に超音波振動子１２１が配置されている。ノズル１２２の下部側面には導入口１２２ｂが設けられている。導入口１２２ｂは制御ユニット１００の伝達媒体供給部１０５と連通しており、伝達媒体供給部１０５から供給される超音波伝達媒体が導入口１２２ｂからノズル１２２の内部に導入される。
【００２３】
詳しくは後述するが、この細胞剥離装置１は、超音波振動子１２１の振動面（上面）とディッシュＤ下面（外底面Ｂｂ）との間が超音波伝達媒体で接続された状態で、外底面Ｂｂおよび内底面Ｂａを含むディッシュＤ底面を介して超音波振動を付与することで細胞の剥離を行う。超音波伝達媒体としては、超音波振動を低損失で伝達する性質を有する種々の液体、ゲル状体または弾性体を用いることができ、例えば水を好適に用いることができる。以下では超音波伝達媒体として水が用いられるものとする。
【００２４】
伝達媒体供給部１０５からノズル１２２に導入される超音波伝達媒体（水）はノズル１２２の内部空間を満たし、さらに上部の開口１２２ａから吐出される。こうして吐出された水がディッシュＤの下面（外底面Ｂｂ）に接触し、水が伝達媒体供給部１０５から継続的にノズル１２２に供給されることにより、超音波振動子１２１の上面とディッシュＤの外底面Ｂｂとの間が液密状態とされる。
【００２５】
ノズル１２２から吐出されて流下する水を回収するために、ノズル１２２の下方に回収容器１２３が設けられている。ノズル１２２から流下し回収容器１２３に受け止められた水は、制御ユニット１００に設けられた廃液回収部１０６に回収され処理される。超音波振動子１２１、ノズル１２２、回収容器１２３等が一体として超音波照射ユニット１２を構成する。
【００２６】
超音波照射ユニット１２は、保持ステージ１１に保持されるディッシュＤに対して相対的に、ＸＹ方向、すなわち水平方向に移動自在となっている。具体的には、制御ユニット１００に走査移動機構１０２が設けられており、走査移動機構１０２が保持ステージ１１および超音波照射ユニット１２の少なくとも一方をＸＹ方向（水平方向）に移動させることで、ディッシュＤと超音波照射ユニット１２との相対移動が実現される。ＣＰＵ１０１は、走査移動機構１０２を制御することで、ディッシュＤと超音波照射ユニット１２との相対位置を調整する。これにより、ディッシュＤ底面のうち超音波が照射される処理対象領域と対向する処理位置に、超音波照射ユニット１２が位置決めされる。
【００２７】
超音波照射ユニット１２および保持ステージ１１のいずれを可動とするかは任意であるが、保持ステージ１１を固定し超音波照射ユニット１２を可動とすることがより好ましい。保持ステージ１１に保持されるディッシュＤには培地Ｍが担持されており、また細胞が培地Ｍ中に浮遊している場合もあるため、培地Ｍが流動性を有する場合、ディッシュＤの振動や移動によって内容物の位置や姿勢が変わってしまうことがあり得るからである。超音波照射ユニット１２の移動においては、走査移動機構１０２は超音波振動子１２１、ノズル１２２および回収容器１２３を一体的に、つまりこれら相互の位置関係を維持しつつ水平移動させる。
【００２８】
図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａおよび図３Ｂはこの実施形態における細胞剥離の原理を説明する図である。このうち図２Ａは剥離すべき細胞Ｃｘに対し超音波照射ユニット１２が位置決めされた状態を示す側面図であり、図２Ｂはその上面図である。また、図３Ａは超音波照射ユニット１２において定在波が発生する様子を模式的に示す図であり、図３Ｂは定在波の発生を防止するための構成例を示す図である。
【００２９】
細胞の剥離は以下のようにして実行される。図２Ａに示すように、ディッシュＤ内で培養された細胞Ｃのうち剥離させるべき細胞Ｃｘの直下位置に超音波照射ユニット１２が位置決めされる。より正確には、走査移動機構１０２が超音波照射ユニット１２を保持ステージ１１に対し水平方向に相対移動させることで、超音波照射ユニット１２が細胞Ｃｘの直下位置となるように超音波照射ユニット１２を位置決めする。このとき、図２Ｂに示す平面視において、ノズル１２２の開口周縁部が細胞Ｃｘを含む処理対象領域Ｒｐを囲むように配置される。剥離させるべき細胞Ｃｘの位置については、例えば、図示しない入力インターフェースを介してユーザーが座標情報を入力することでＣＰＵ１０１に教示することができる。
【００３０】
そして、ノズル１２２に超音波伝達媒体Ｔとしての水が継続的に供給され、ノズル１２２の開口１２２ａから水が吐出されることで、超音波振動子１２１と、細胞Ｃｘ直下のディッシュＤ下面（外底面Ｂｂ）との間が水により液密状態となる。この状態で、超音波振動子１２１が超音波をディッシュＤ底面に向け出射する。これにより、超音波振動がディッシュＤ底面を介して培地Ｍ中の細胞Ｃｘに付与される。細胞種やその厚さに応じた周波数および強度の超音波による機械的振動が細胞Ｃｘに加えられることにより、細胞ＣｘがディッシュＤの内底面Ｂａから剥離する。
【００３１】
この場合、超音波振動子１２１とディッシュＤの外底面Ｂｂとの間に超音波伝達媒体Ｔとして水が満たされている。そのため、超音波振動子１２１と超音波伝達媒体Ｔとの間、超音波伝達媒体ＴとディッシュＤ底面との間およびディッシュＤ底面と培地Ｍとの間での超音波の反射は少ない。また、超音波が水流に沿って伝搬することで散乱が抑えられる。これにより、超音波による機械振動のエネルギーが培地Ｍ中の細胞Ｃｘに効率よく伝えられ、細胞Ｃｘの剥離を効果的に行うことができる。
【００３２】
一方、培地Ｍの上面とその上方の雰囲気との間の界面では超音波の反射が比較的多くなる。このため、図３Ａに点線で模式的に示すように、超音波振動子１２１の振動面と培地Ｍ上面との間に定在波が発生し、細胞Ｃｘに与えられる振動のエネルギーが小さくなってしまうことがある。これに起因する剥離の失敗を防止するために、この実施形態では、図３Ｂに示すように、昇降機構１０３により超音波振動子１２１を上下方向に移動させながら、超音波振動子１２１からの超音波の出射が行われる。
【００３３】
これにより、超音波振動子１２１とディッシュＤ底面との距離が変化することで定在波の発生が防止され、振動のエネルギーを効率よく細胞Ｃｘに作用させることができる。その結果、細胞ＣｘをディッシュＤの内底面から確実に剥離させることが可能となる。昇降移動における超音波振動子１２１の振幅Ａｚについては、定在波防止の観点から、超音波の波長の４分の１以上、より好ましくは波長の２分の１以上とすることができる。
【００３４】
以上のように、この実施形態では、保持ステージ１１により水平姿勢に保持されたディッシュＤの下方に超音波照射ユニット１２が配置される。ディッシュＤ底面のうち剥離すべき細胞Ｃｘの直下位置に当たる位置に超音波振動が与えられることで、細胞ＣｘがディッシュＤから剥離する。超音波照射ユニット１２では、筒状のノズル１２２内に超音波振動子１２１が配置され、さらにノズル１２２内には超音波伝達媒体Ｔとしての水が満たされる。ノズル１２２上部の開口１２２ａから吐出される水がディッシュＤ下面に接触することで超音波振動子１２１とディッシュＤ下面との間の空間が液密状態となる。
【００３５】
このように、剥離すべき細胞Ｃｘの直下位置に当たるディッシュＤ底面と超音波振動子１２１との間が超音波伝達媒体Ｔにより接続された状態で超音波振動子１２１から超音波が出射されるようにすることで、以下のような効果が得られる。第１に、超音波振動子１２１の振動面から剥離すべき細胞Ｃｘまでの間の空間が液体または固体により満たされ、気体層が介在しないため、超音波の反射が少なく、振動のエネルギーを効率よく細胞Ｃｘに伝えることができる。これにより、細胞Ｃｘを確実に剥離するために必要な超音波のパワーを低減することができる。
【００３６】
第２に、水中を伝わる超音波が周囲雰囲気との界面を超えて雰囲気中に伝搬する確率が非常に低いため、ディッシュＤ底面への超音波の入射範囲を、水に触れている領域のみに制限することができる。これにより超音波の散乱を抑え特定の位置に集中させることでエネルギー効率をさらに向上させることができるだけでなく、入射位置の選択性を高めることが可能となる。すなわち、所望の処理対象領域Ｒｐのみに超音波を入射させて、周囲の細胞に影響を与えずに特定の細胞のみを剥離させることが可能となる。
【００３７】
剥離させた細胞については、必要に応じて、外部から導入されるピペットやマニピュレータ等を用いてディッシュＤから搬出することができ、またディッシュＤに液体を供給することにより流し出すようにしてもよい。
【００３８】
本願発明者の実験によれば、ガラス製のディッシュＤ内で接着培養された細胞を剥離させるのに適した超音波の周波数は、１０ｋＨｚないし１ＭＨｚ程度である。例えば細胞種としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた実験では、超音波の周波数を８０ｋＨｚ、出力を約２５Ｗとして、ディッシュ下面と超音波振動子との距離を１５ミリメートルないし３５ミリメートルの間で変化させることにより、良好に細胞を剥離させることができた。
【００３９】
なお、上記実施形態の超音波照射ユニット１２では超音波伝達媒体Ｔである水を満たしたノズル１２２内で超音波振動子１２１が上下動する構成となっているが、これに代えて、例えば以下のような構成としてもよい。なお、以下の変形例の説明においては、上記した第１実施形態と同一の構成については記載を省略または同一符号を付して詳しい説明を省略する。しかしながら、特に断りのない限り、第１実施形態に備えられた各構成は以下の変形例においても備えられているものとする。
【００４０】
図４Ａないし４Ｃおよび図５Ａないし５Ｃは第１実施形態における超音波照射ユニットの変形例を示す図である。このうち図４Ａに示す変形例では、上面がディッシュＤ底面と平行な平面に仕上げられた第１実施形態の超音波振動子１２１に代えて、上面を窪ませた超音波振動子１２１１が設けられる。この点を除く構成は第１実施形態のものと同じであり、同一構成には同一符号を付して説明を省略する。このような構成では、超音波振動子１２１１から出射された超音波振動がディッシュＤ底面に向けて収束される。そのため、超音波振動子の出力が同じであっても、剥離させるべき細胞Ｃｘに入射する超音波振動の強度をより高めることができる。
【００４１】
また、図４Ｂおよび図４Ｃに示す変形例の超音波照射ユニット１５では、超音波振動子１５１がノズル１５２の内部に固定されている。そして、第１実施形態の昇降機構１０３に代えて制御ユニット１００に設けられる昇降機構１０７がノズル１５２を昇降させることで、ディッシュＤ下面と超音波振動子１５１との距離Ｄｚが変化する。このような構成によっても、上記した第１実施形態の装置と同様にして細胞の剥離を行うことができる。なお、超音波振動子１５１とディッシュＤ下面との間の液密状態が確実に維持されるようにするために、ノズル１５２の昇降に応じて、伝達媒体供給部１０５が超音波伝達媒体の供給量を変化させてもよい。
【００４２】
図５Ａに示す変形例の超音波照射ユニット１６では、図２Ａに示すノズル１２２と同様の構成を有するノズル１６２内に設けられた超音波振動子１６１の上部に、上部ほど水平方向断面積が小さくなるテーパー部材１６３が振動伝達部材として取り付けられている。そのため、超音波はテーパー部材１６３の上面からディッシュＤ下面に向けて出射されることとなり、超音波の放射面積を規制することができる。これにより、ディッシュＤ底面において超音波が入射する領域のサイズをより小さくすることができ、超音波入射範囲の位置選択性をより高めることができる。
【００４３】
なお、このようなテーパー部材に代えて、超音波の伝搬方向を規制するホーンが設けられてもよい。特に、筒状のホーンまたは振動伝達部材を設けた場合には、筒内に超音波伝達媒体を供給することで振動伝達部材にノズルとしての機能を兼備させることができる。
【００４４】
図５Ｂに示す変形例の超音波照射ユニット１７では、超音波振動子１７１とノズル１７２とが独立に設けられている。具体的には、ディッシュＤの下方に超音波振動子１７１が配置される。一方、ディッシュＤ下面と超音波振動子１７１上面との間の空間に向けて吐出口が開口するように、ノズル１７２が超音波振動子１７１の側方に配置される。そして、ノズル１７２から超音波伝達媒体Ｔとしての水が吐出されて、ディッシュＤ下面と超音波振動子１７１上面との間が液密状態とされる。流下する水は回収容器１７３により受け止められ、廃液回収部１０６に回収される。このような構成によれば、第１実施形態の装置と同様の作用効果を得つつ、超音波伝達媒体Ｔの使用量を削減することができる。
【００４５】
図５Ｃに示す変形例の超音波照射ユニット１８では、図５Ｂに示す超音波照射ユニット１７と同様の構成に加えて、吸引ノズル１８４がさらに設けられる。具体的には、ディッシュＤの下方に配置された超音波振動子１８１を水平方向から挟むように、供給ノズル１８２および吸引ノズル１８４が配置される。吸引ノズル１８４は廃液回収部１０６に接続され、ノズル内には負圧が供給される。
【００４６】
供給ノズル１８２から吐出される超音波伝達媒体Ｔとしての水はディッシュＤ下面と超音波振動子１８１との間の空間を満たし、吸引ノズル１８４により吸引されて廃液回収部１０６に回収される。これにより、容器Ｄの底部に沿って水が広がることが抑制され、特定の領域にのみ超音波を照射することが可能となる。超音波振動子１８１の下方には、吸引ノズル１８４により吸引しきれなかった水を受け止めるための回収容器１８３が設けられる。吸引ノズル１８４により全ての水を回収することが可能であれば、回収容器１８３は省略することができる。
【００４７】
＜第２実施形態＞
図６はこの発明にかかる細胞剥離装置の第２実施形態の概略構成を示す図である。この実施形態の細胞剥離装置２は、上記した第１実施形態の細胞剥離装置１に、ディッシュＤ内を撮像し剥離させるべき細胞の位置を特定するための構成が追加されたものである。この点を除く各部の構成およびその動作は第１実施形態のものと同一であるため、ここでは第１実施形態と同一の構成には同一符号を付して詳しい説明を省略する。
【００４８】
細胞剥離装置２は、保持ステージ１１に保持されるディッシュＤの上方に配置された撮像部２３を備えている。撮像部２３は例えばＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサなどの撮像素子を有し、ディッシュＤを上方から撮像して画像データを生成する。撮像部２３としては、二次元画像を撮像する機能を有するエリアイメージセンサによるもの、一次元画像を撮像するリニアイメージセンサと走査機構との組み合わせにより二次元画像を撮像するもののいずれであってもよい。また、ディッシュＤの全体がいくつかの領域に分けて撮像され、それらが合成されてもよい。
【００４９】
細胞剥離装置２の制御ユニット２００は、撮像部２３から出力される画像データを用いて種々の画像処理を実行する画像処理部２０８を備え、ＣＰＵ２０１は画像処理部２０８の処理結果に基づき装置各部を制御する機能を有する。これらの点を除き、制御ユニット２００の構成および機能は第１実施形態の制御ユニット１００のものと同じである。
【００５０】
この実施形態では、撮像部２３により撮像された画像を画像処理部２０８が適宜の画像処理により解析し、これにより剥離させるべき細胞の位置が自動的に特定される。ＣＰＵ２０１は、画像処理部２０８により特定された位置情報に応じて走査移動機構１０２を制御することで、剥離させるべき細胞Ｃｘの直下位置に超音波振動子１２１が配置されるように、ディッシュＤと超音波照射ユニット１２との間の位置決めを行う。このように、この実施形態では、ユーザーが位置情報を入力しなくても、自動的に処理位置を決定することができる。また、画像処理により認識することが可能な光学的特徴を有する細胞であれば、ユーザーが細かい設定を行うことなくそれを自動的に剥離させることができる。
【００５１】
なお、上記のように処理位置を自動的に決定するのに代えて、あるいはこれに加えて、例えば撮像された画像や画像処理の結果がユーザーに報知され、処理位置の決定についてはユーザーに委ねられるようにしてもよい。
【００５２】
また、第１実施形態における超音波照射ユニットの各変形例は、第２実施形態に対しても同様に適用することができる。すなわち、図６の超音波照射ユニット１２に代えて、図４Ａないし図５Ｃに示した変形例の超音波照射ユニットのいずれかが採用されてもよい。
【００５３】
＜第３実施形態＞
上記した第１および第２実施形態の細胞剥離装置は、保持ステージ１１に保持されたディッシュＤと超音波照射ユニット１２との間のＸＹ方向における相対移動によって、処理位置すなわちディッシュＤ下面のうち超音波を入射させる処理対象領域との対向位置に、超音波照射ユニット１２を位置決めしている。一方、次に説明するこの発明にかかる細胞剥離装置の第３実施形態は、超音波振動子およびノズルの吐出口をＸ方向にそれぞれ複数配した超音波照射ユニットを、ディッシュＤに対しＹ方向に相対移動させる構成となっている。
【００５４】
図７はこの発明にかかる細胞剥離装置の第３実施形態を示す図である。また、図８はその主要部を示す上面図である。この実施形態の細胞剥離装置３は、装置全体の動作を制御するＣＰＵ３０１を有する制御ユニット３００を備えている。また、細胞剥離装置３は、ディッシュＤを保持する保持ステージ３１を備えている。保持ステージ３１は、ディッシュＤの外底面周縁部に当接することでディッシュＤを水平姿勢に、かつディッシュＤ底面の下方を開放した状態で保持する。なお、図７ではディッシュＤが平面視において四隅を丸めた略矩形形状として示されているが、これまで説明してきたように平面視において円形のものであってもよい。
【００５５】
保持ステージ３１に保持されるディッシュＤの下方には、超音波照射ユニット３２が配置されている。超音波照射ユニット３２は、ディッシュＤの下面に対向配置され上向きに超音波を出射する超音波振動子３２１と、その側方位置に配置されたノズル３２２と、超音波振動子３２１の下方に配置された回収容器３２３とを備えている。また、超音波照射ユニット３２は、伝達媒体供給部３０５からノズル３２２に至る超音波伝達媒体の流路上に脱気ユニット３２５を備えている。
【００５６】
図８に示すように、この実施形態では互いに同一形状の複数の超音波振動子３２１がＸ方向に配列されている。これらの超音波振動子３２１が一体化された超音波振動子アレイが、Ｘ方向におけるディッシュＤの長さよりも長い領域を覆うように設けられる。制御ユニット３００に設けられた振動子駆動部３０４は、複数の超音波振動子３２１を個別に駆動する。すなわち、各超音波振動子３２１は、互いに独立して超音波を出射および停止することができる。一方、制御ユニット３００に設けられた振動子昇降機構３０３は、各超音波振動子３２１を一体的に昇降させて定在波の発生を防止する。
【００５７】
ノズル３２２は、Ｘ方向に等間隔に配列された複数の吐出口３２２ａを有している。制御ユニット３００に設けられた伝達媒体供給部３０５は、超音波伝達媒体としての水をノズル３２２に供給し、各吐出口３２２ａからの水の吐出およびその停止を個別に制御することができる。また脱気ユニット３２５により、ノズル３２２に供給される水中の溶存気体量を減少させることで、水中を伝搬する超音波の減衰を少なくすることができる。なお、このような脱気ユニットは、他の実施形態との組み合わせても同様に、有効に機能するものである。
【００５８】
Ｘ方向において、各超音波振動子３２１の位置と各吐出口３２２ａの位置とが互いにずれている。具体的には、Ｘ方向において超音波振動子３２１の配列ピッチと吐出口３２２ａの配列ピッチとが等しい。そして、各超音波振動子３２１のＸ方向における中心位置と各吐出口３２２ａのＸ方向における中心位置とが配列ピッチの（１／２）だけ、Ｘ方向にずれている。
【００５９】
このような構成によれば、ディッシュＤ底面の各位置に選択的に超音波を入射させることができる。すなわち、ディッシュＤ底面のうち超音波振動が入射する処理対象領域は、当該領域の直下位置にある超音波振動子３２１が超音波を出射し、かつ当該領域にノズル３２２から超音波伝達媒体（水）が供給されている領域のみとなる。超音波振動子３２１と吐出口３２２ａとの間でＸ方向における位置が異なっているため、作動させる超音波振動子３２１と吐出口３２２ａとの組み合わせを選択することにより、Ｘ方向におけるこれらの配列ピッチの概ね（１／２）の分解能でＸ方向における超音波の入射位置を制御することができる。Ｙ方向の入射位置決めについては、第１実施形態と同様、制御ユニット３００に設けられた走査移動機構３０２が保持ステージ３１と超音波照射ユニット３２とをＹ方向に相対移動させることにより実現される。
【００６０】
このように、本実施形態では、Ｘ方向における超音波の入射位置は、超音波を出射する超音波振動子３２１と超音波伝達媒体を吐出する吐出口３２２ａとの組み合わせによって設定される。一方、Ｙ方向における超音波の入射位置は、保持ステージ３１と超音波照射ユニット３２との相対移動により設定される。
【００６１】
第１実施形態のように保持ステージと超音波照射ユニットとのＸＹ方向における相対移動によって超音波の入射位置を決定する態様では、超音波が入射する領域は１箇所に限定され、またそのサイズも固定される。これに対して、本実施形態における位置決め態様では、Ｘ方向において複数箇所に同時に超音波を入射させたり、入射領域を拡張したりすることが可能である。したがって、Ｙ方向において超音波照射ユニット３２をディッシュＤに対し相対移動させながら、Ｘ方向における超音波入射位置を随時調整することにより、１回の相対移動でディッシュＤ全体を走査して細胞の剥離を実行することができる。
【００６２】
このため、図８に示すように、剥離させるべき細胞Ｃｘが複数ある場合でも、それらの位置が事前にわかっていれば、ディッシュＤに対する超音波照射ユニット３２の１回の相対移動でその全てを剥離させることが可能である。したがって、この実施形態では、剥離させるべき細胞が多数である場合や広範囲に分布している場合でも、短時間で効率よくそれらを剥離させることが可能である。
【００６３】
剥離させるべき細胞Ｃｘの位置を特定するために、この実施形態の細胞剥離装置３には、保持ステージ３１に保持されるディッシュＤの上方に撮像部３３が設けられる。撮像部３３は、微小な撮像素子がＸ方向に多数配列されたリニアイメージセンサを備えている。また、ディッシュＤを挟んで撮像部３３の反対側、つまりディッシュＤの下面側で撮像部３３の直下に当たる位置に照明光源３４が設けられている。照明光源３４の点灯は、制御ユニット３００に設けられた照明制御部３０９により制御される。
【００６４】
撮像部３３は、照明光源３４による照明下でディッシュＤの上方からＸ方向の一次元画像をリニアイメージセンサにより撮像する。図８において破線で囲まれた領域Ｒは、リニアイメージセンサの撮像範囲を模式的に示している。そして、撮像部３３および照明光源３４が一体的にディッシュＤに対しＹ方向に相対移動することにより、ディッシュＤを上から撮像した二次元画像が取得される。
【００６５】
撮像部３３および照明光源３４のディッシュＤに対する相対移動は、保持ステージ３１が可動に構成されている場合には、走査移動機構３０２が撮像部３３および照明光源３４を固定し保持ステージ３１がディッシュＤをＹ方向に移動させることにより実現される。また、保持ステージ３１が固定され、超音波照射ユニット３２が可動となった構成では、超音波ユニット３２と一体的に撮像部３３および照明光源３４がＹ方向に移動することにより実現される。
【００６６】
撮像されたディッシュＤの画像は、制御ユニット３００に設けられた画像処理部３０８により解析され、これにより剥離させるべき細胞の位置が特定される。この位置情報に基づき、ＣＰＵ３０１は、走査移動機構３０２、昇降機構３０３、振動子駆動部３０４および伝達媒体供給部３０５を制御して、細胞Ｃｘへの超音波照射を行い、ディッシュＤから剥離させる。
【００６７】
画像から剥離させるべき細胞Ｃｘを特定するための画像処理が短時間で可能であれば、超音波照射ユニット３２および撮像部３３に対し相対的に、図８において白矢印で示す方向にディッシュＤを移動させながら、撮像および画像処理と、超音波照射による細胞の剥離とを並行して行うこともできる。より一般的には、まず画像を撮像するための撮像部３３のディッシュＤに対する走査移動を行い、画像処理によって剥離させるべき細胞の位置を特定した後、超音波照射ユニット３２のディッシュＤに対する走査移動を行って、当該細胞に超音波を照射し剥離させる。
【００６８】
また、剥離作業の終了後に再度撮像を行って剥離が適切に行われたかどうかを観察し、剥離すべき細胞が残留している場合には当該細胞について再度剥離が実行されるようにしてもよい。
【００６９】
この実施形態においても、超音波照射ユニットの構成についてはいくつかの変形例が考えられる。例えば、図５Ｃに示される吸引ノズルがさらに設けられてもよい。また、図２Ａまたは図４Ｂに示されるように、ノズルの筒体の内部に超音波振動子が設けられたユニットが、Ｘ方向に複数並べて配置されてもよい。この場合、超音波振動子の位置とノズル吐出口の位置との関係が制約されるが、これを解決するために、例えばこのようなユニットを２列に並べて超音波振動子の配置がいわゆる千鳥配置となるようにしてもよい。
【００７０】
＜その他＞
以上説明したように、上記各実施形態においては、保持ステージ１１，３１が本発明の「保持手段」として機能している。また、超音波振動子１２１，１５１，１６１，１７１，１８１，３２１が本発明の「超音波出射手段」として機能している。また、超音波伝達媒体Ｔとしての水が本発明の「超音波伝達物質」に相当し、ノズル１２２，１５２，１６２，１７２，１８２，３２２、伝達媒体供給部１０５，３０５等が本発明の「伝達物質供給手段」として機能している。より具体的には、このうちノズル１２２，１５２，１６２，１７２，１８２，３２２は本発明の「筒状体」に相当し、伝達媒体供給部１０５，３０５が本発明の「液体注入部」に相当している。また、昇降機構１０３，１０７，３０３が本発明の「距離変更手段」として機能している。
【００７１】
また、第２および第３実施形態における撮像部２３，３３が本発明の「撮像手段」として機能し、画像処理部２０８，３０８が本発明の「剥離位置特定手段」として機能している。また、ＣＰＵ２０１，３０１が、本発明の「位置決め機構」として機能する走査移動機構１０２，３０２とともに、本発明の「入射位置設定手段」として機能している。
【００７２】
また、第３実施形態における複数の超音波振動子３２１が本発明の「複数の出射部」に相当しており、ノズル３２２に設けられた複数の吐出口３２２ａが本発明の「複数の吐出口」に相当している。また、第１実施形態の変形例における吸引ノズル１８４が、本発明の「吸引手段」として機能している。
【００７３】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記第１実施形態では、ディッシュＤの内底面Ｂａが平坦に形成されたものを使用したが、底部が曲面を持つ容器や、底部から側部にかけて連続的な曲面を有する容器が使用されてもよい。また超音波の供給位置は容器底部に限定されず、例えば容器の外側面に超音波伝達媒体を介して超音波が入射するように構成されてもよい。この場合、剥離させたい細胞の存在する位置に集中的に超音波を作用させるために、容器の外面のうち容器壁面を挟んで対向する内面側が容器内に注入された培地または液体により覆われている領域に、超音波を入射させることがより好ましい。
【００７４】
また例えば、第１実施形態では、ディッシュＤ下面のうち超音波を入射させたい領域のみに超音波伝達媒体（水）が供給される。しかしながら、例えば超音波振動子が単独でも十分な分解能で超音波の入射範囲を制御することができる程度の高い指向性を有するものであれば、超音波伝達媒体の供給範囲を限定する必要は必ずしもない。この意味では、例えば、水槽に貯留された水の水面にディッシュＤの下面全体を触れさせ、水槽中に超音波振動子を配置した構成とすることもできる。
【００７５】
また、上記実施形態の細胞剥離装置は上部が開放された浅皿型の試料容器であるディッシュＤ内で培養された細胞を剥離させるものである。しかしながら、上記したように細胞の剥離はディッシュ下面側に設けた超音波照射ユニットにより行われ、上方からのアクセスは必ずしも必要ない。したがって、培養プレートやフラスコのような上部が閉じた形状の容器に担持される細胞の剥離にも、上記した細胞剥離装置を適用することができる。また、容器内で剥離した細胞を除去し容器外へ搬出するための構成、例えば吸引ノズルがさらに設けられてもよい。
【００７６】
また、上記実施形態ではディッシュ下面の１箇所に対して１つの超音波振動子から出射される超音波を入射させている。しかしながら、より強力な超音波振動を与えるために、２以上の超音波振動子から出射される超音波を１箇所に集中させたり、回折または反射により超音波の伝搬方向を変化させて１箇所に収束させたりしてもよい。
【００７７】
また、ディッシュＤで培養された細胞のうちどの領域のものをどのような態様で剥離させるかについては、例えば、当該細胞剥離装置と通信回線を介して接続された培養管理装置から加工情報が与えられるようにしてもよい。すなわち、外部の培養管理装置（例えばインキュベータ）または分析装置により、細胞を担持する容器の識別情報（容器に付されたマーキング、バーコード、ＲＦＩＤ用タグなど）と当該容器内の画像とが取得される。そして、細胞種や形状、大きさなどの分析結果に基づき、当該容器内の細胞に対しどのような剥離加工を行うかを表す加工情報が予め作成される。なお、通信回線を介した通信に代えて、ＵＳＢメモリ、フラッシュメモリカードおよび光ディスク等の適宜の記憶媒体を用いて情報の受け渡しが行われてもよい。
【００７８】
細胞剥離装置は、培養管理装置から容器の識別情報、細胞が分布する領域に関する情報、容器の位置合わせのための情報、上記した加工情報等を取得し、これらの情報により特定される位置の細胞に対し、上記した細胞剥離処理を実行して指定された細胞を剥離させる。このように、実行すべき剥離処理の内容に関する情報については、装置内での分析により取得することができるほか、外部装置との連携により外部装置から取得することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、容器中に分布する細胞のうち不要なものを取り除く用途、あるいは、それらの細胞のうち必要なもののみを取り出す用途に特に好適である。【００８０】
以上、特定の実施例に沿って発明を説明したが、この説明は限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。発明の説明を参照すれば、本発明のその他の実施形態と同様に、開示された実施形態の様々な変形例が、この技術に精通した者に明らかとなるであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、発明の真の範囲を逸脱しない範囲内で、当該変形例または実施形態を含むものと考えられる。
【符号の説明】
【００８１】
１，２，３  細胞剥離装置
１１，３１  保持ステージ（保持手段）
２３，３３  撮像部（撮像手段）
１０２，３０２  走査移動機構（位置決め機構、入射位置設定手段）
１０３，１０７，３０３  昇降機構（距離変更手段）
１０５，３０５  伝達媒体供給部（液体注入部、伝達物質供給手段）
１２１，１５１，１６１，１７１，１８１  超音波振動子（超音波出射手段）
１２２，１５２，１６２，１７２，１８２，３２２  ノズル（超音波出射手段、筒状体）
１８４  吸引ノズル（吸引手段）
２０１，３０１  ＣＰＵ（入射位置設定手段）
２０８，３０８  画像処理部（剥離位置特定手段）
３２１  超音波振動子（超音波出射手段、出射部）
３２２ａ  吐出口
Ｄ  ディッシュ（容器）
Ｔ  超音波伝達媒体（超音波伝達物質）
【図１】
2016047368.tif 000003
【図２Ａ】
2016047368.tif 000004
【図２Ｂ】
2016047368.tif 000005
【図３Ａ】
2016047368.tif 000006
【図３Ｂ】
2016047368.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2016047368.tif 000009
【図４Ｃ】
2016047368.tif 000010
【図５Ａ】
2016047368.tif 000011
【図５Ｂ】
2016047368.tif 000012
【図５Ｃ】
2016047368.tif 000013
【図６】
2016047368.tif 000014
【図７】
2016047368.tif 000015
【図８】
2016047368.tif 000016
【国際調査報告】
2016047368.tif 000017
2016047368.tif 000018