(57)【要約】  本発明は、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力による亜臨界処理工程を経て得られるコーヒー豆の抽出液であって、アンジオテンシン変換酵素の阻害活性率が５０％のとき、該コーヒー豆の抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤に関する。さらに本発明は糖化抑制剤及びそれらの製造方法に関する。本発明により、コーヒー豆に由来する、より活性の高い血圧上昇抑制剤又は糖化抑制剤及びそれらの製造方法、並びに血圧上昇抑制作用及び糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤であって、
前記コーヒー豆の抽出液は、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力による亜臨界処理工程を経て得られ、
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率が５０％のとき、コーヒー豆の抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤。
【請求項２】
前記コーヒー豆がコーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆である、請求項１に記載の血圧上昇抑制剤。
【請求項３】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜３０分間である、請求項１又は２に記載の血圧上昇抑制剤。
【請求項４】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜１５分間である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血圧上昇抑制剤。
【請求項５】
コーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する糖化抑制剤であって、
前記コーヒー豆の抽出液は、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力による亜臨界処理工程を経て得られ、
糖化産物の生成阻害率が５０％のとき、コーヒー抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する糖化抑制剤。
【請求項６】
前記コーヒー豆がコーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆のいずれかである、請求項５に記載の糖化抑制剤。
【請求項７】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜３０分間である、請求項５又は６に記載の糖化抑制剤。
【請求項８】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜１５分間である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の糖化抑制剤。
【請求項９】
コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、血圧上昇抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【請求項１０】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜３０分間である、請求項９に記載の血圧上昇抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【請求項１１】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜１５分間である、請求項９又は１０に記載の血圧上昇抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【請求項１２】
コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【請求項１３】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜３０分間である、請求項１２に記載の糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【請求項１４】
前記亜臨界処理の処理時間が３〜１５分間である、請求項１２又は１３に記載の糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コーヒー豆を亜臨界処理して得られる抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤に関する。さらに本発明は、コーヒー豆を亜臨界処理して得られる抽出液を有効成分として含有する糖化抑制剤に関する。さらに本発明は、コーヒー豆からこのような血圧上昇抑制作用又は糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーは古くから世界各地で嗜好飲料として楽しまれている。一般的にコーヒーは水、熱水などによりコーヒー豆から成分を抽出した香りや味に代表される風味を楽しむ飲料として提供されている。近年、コーヒーの生理活性作用についても注目されつつあり、コーヒー中に含まれるクロロゲン酸などによる血圧降下作用について報告されている（特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−４８７２８号公報
【特許文献２】特開２００７−３１３９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、コーヒーより血圧降下もしくは血圧上昇抑制作用や糖化抑制作用の生理活性を得るための熱水等の抽出方法には、ポリフェノールに代表される溶存成分濃度の抽出できる量に限界があった。そのため、血圧上昇抑制や糖化抑制の評価を行うと、抑制率が一定値以下にはならなかった。そのため、血圧上昇抑制作用や糖化抑制作用などの機能性を充分に発揮することができないことが推定された。【０００５】
そのため、コーヒー豆より血圧上昇抑制作用もしくは糖化抑制作用の生理活性を得るための熱水抽出方法以外の方法を検討することが必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らがコーヒーについて鋭意研究した結果、コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を亜臨界状態（各温度の飽和蒸気圧以上）で加水分解させることで得られる抽出組成液および抽出液の製造方法に特徴を見出し、ポリフェノールに代表される溶存成分共存組成液が一定量以上得られ、血圧上昇抑制作用、糖化抑制作用などの機能性が充分に発揮されることを見出した。その結果本発明のコーヒー豆の亜臨界処理により得られた抽出液は、従来の熱水抽出法により得られる抽出液よりも優れた血圧上昇抑制作用、糖化抑制作用を有することがわかった。【０００７】
即ち、本発明の要旨は、
[1]  コーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤であって、
前記コーヒー豆の抽出液は、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力による亜臨界処理工程を経て得られ、
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率が５０％のとき、コーヒー豆の抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤；
[2]  コーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する糖化抑制剤であって、
前記コーヒー豆の抽出液は、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力による亜臨界処理工程を経て得られ、
糖化産物の生成阻害率が５０％のとき、コーヒー抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する糖化抑制剤；【０００８】
[3]  コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、血圧上昇抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法；並びに
[4]  コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法；に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のコーヒー豆の亜臨界処理による抽出液は、従来の熱水抽出法により得られる抽出液よりも優れた血圧上昇抑制作用、糖化抑制作用を有する。またその抽出方法は吸着剤処理および加熱殺菌処理や、酸、アルカリ、酵素の添加といった余分な工程を必要とせず、比較的低温で簡易的な手法により抽出液を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＡＣＥ阻害活性測定に関するサンプル液量と阻害率の関係を示すグラフである。
【図２】図２は、糖化産物の生成阻害率測定に関するサンプル液量と阻害率の関係を示すグラフである。
【図３】図３−１及び図３−２は、各サンプルの溶存成分濃度及びポリフェノール濃度を示すグラフである。
【図４】図４−１及び図４−２は、アンジオテンシン変換酵素の活性を５０％阻害する、各サンプルの抽出液量（μＬ）を示すグラフである。
【図５】図５は、糖化産物の生成を５０％阻害する、各サンプルの抽出液量（μＬ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のコーヒー豆の抽出液は、コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を亜臨界状態（各温度の飽和蒸気圧以上）で加水分解させることで得られる抽出液である。具体的な亜臨界状態としては、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で亜臨界処理工程を経ることである。この亜臨界処理工程を経て得られたコーヒー豆の抽出液は、血圧上昇抑制作用、糖化抑制作用を有する。本明細書において、各温度の飽和蒸気圧としては、好ましくは各温度の飽和水蒸気圧を意味する。
【００１２】
前記コーヒー豆の抽出液は、後述する具体的な方法で抽出液を作成したとき、溶存成分濃度が３０ｍｇ／ｍＬ以上であることが望ましい。さらに、具体的には、コーヒー豆と水が１：８の比率（質量比）の場合での溶存成分濃度が３０ｍｇ／ｍＬ以上であることが望ましい。この溶存成分濃度は、加熱乾燥法により濃度測定を行う。加熱乾燥法とは、試料を一定条件下で乾燥し、揮発する成分を水分、残るものを乾燥物（溶存成分）とし、（乾燥物の質量）／（乾燥前の水を含んだ状態の試料の体積）として算出している。実際には、水分以外の揮発成分（アルコールなど）も除去されるが、それらは極微量で測定結果にほとんど影響を与えないと仮定して測定する。
【００１３】
溶存成分とは、ポリフェノール、糖類、タンパク質、無機質等が混合されたものであり、また、溶存成分中には、ポリフェノール、糖類、タンパク質、無機質等以外の副生成物が得られ、これらの副生成物が血圧上昇抑制や糖化抑制に対して、異なる作用（例えば、即効性と遅効性、機能性作用と機能性補助作用）での複合的な機能性に対応することができるようになると、本発明者らは推定した。この推定により、コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を亜臨界状態（各温度の飽和蒸気圧以上）で加水分解させることで機能性が高い抽出液を得ることができるとも推定した。
【００１４】
また、前述の抽出液中のポリフェノール濃度は、後述する具体的な方法で抽出液を作成したとき、６．８ｍｇ／ｍＬ以上であることが望ましい。さらに、具体的には、コーヒー豆と水が１：８の比率（質量比）の場合での抽出液中のポリフェノール濃度は、６．８ｍｇ／ｍＬ以上であることが望ましい。６．８ｍｇ／ｍＬ以上であるとき、血圧上昇抑制や糖化抑制に関する効果が得やすくなる。ポリフェノール濃度は、Folin-Ciocalteu法により測定することができる。Folin-Ciocalteu法とは、コーヒー抽出液に後述するFolin-Ciocalteu液と炭酸ナトリウム溶液とを混合させて混合液を作製し、この混合液の７６５ｎｍにおける吸光度を測定し、同様に作成したクロロゲン酸水溶液による検量線からポリフェノール量をクロロゲン酸相当量（ｍｇ／ｍＬ）で算出する方法である。
【００１５】
コーヒー抽出液は、後述する具体的な方法で抽出液を作成したとき、溶存成分濃度が３０ｍｇ／ｍＬ以上であり、ポリフェノール濃度は、６．８ｍｇ／ｍＬ以上であることがより望ましい。さらに、具体的には、コーヒー豆と水が１：８の比率（質量比）の場合でのコーヒー抽出液は、溶存成分濃度が３０ｍｇ／ｍＬ以上であり、ポリフェノール濃度は、６．８ｍｇ／ｍＬ以上であることがより望ましい。この２つの濃度を満たすことで、血圧上昇抑制や糖化抑制に関する効果が得やすくなる。
【００１６】
本願発明の一つは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率が５０％のとき、コーヒー抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であるコーヒー豆の抽出液を有効成分として含有する血圧上昇抑制剤である。
【００１７】
本発明における血圧上昇抑制作用は、後述する測定方法によって、血圧上昇作用を引き起こすアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性を測定し、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率が５０％のときの活性阻害を示す抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）で規定される。
【００１８】
ここで、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）について説明をする。アンジオテンシン変換酵素は血管内皮細胞の表面に存在し、アンジオテンシンIをアンジオテンシンIIに変換する酵素である。この作用を妨げるアンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥ阻害薬）は昇圧抑制剤や心不全の治療薬として用いられる。ＡＣＥはangiotensin-converting enzymeの略である。アンジオテンシンは血液中に存在するペプチドの一つで、アンジオテンシンＩ〜IVの４種類がある。このうちアンジオテンシンII〜IVには細動脈の平滑筋を収縮させ血圧を上昇させる作用や、副腎皮質でアルドステロンの分泌を促進する作用などがある。アンジオテンシンII〜IVは特に強い血圧上昇作用をもつ。アンジオテンシンIにはそうした生理活性はない。
【００１９】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、体内の血圧調整メカニズムの一つであるレニン-アンジオテンシン系において、アンジオテンシンIから昇圧作用を有するアンジオテンシンIIに変換させる働きを持つ。アンジオテンシンIIにより血圧を昇圧させることで体内の血圧を調整しているのである。アンジオテンシンIからアンジオテンシンIIへの変換を阻害する割合は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性率と呼ばれている。
【００２０】
本願発明においては、アンジオテンシンIからアンジオテンシンIIへの変換を阻害する割合が５０％の時、すなわちアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率５０％時のコーヒー抽出液中の固形分濃度（ＩＣ５０値）での評価を行う。
【００２１】
本発明における血圧上昇抑制作用は、後述する測定方法で血圧上昇作用を引き起こすアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性阻害率を測定することにより評価されるのが一般的である。通常は一定固形分濃度下で何％のＡＣＥ阻害活性率を示すかで規定され、その濃度は低い方が望ましい。通常は試料間の比較を容易にするため、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害活性率５０％における阻害活性を示す抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）で規定される。（参考文献：“食品機能性の科学”、食品機能性の科学編集員会編、株式会社産業技術サービスセンター発行）
【００２２】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性阻害率の測定について、今回行った測定例に基づいて説明をする。ＡＣＥ阻害活性測定は株式会社同仁化学研究所製ＡＣＥ−Ｋｉｔ ＷＳＴのキットを使用する。まず、コーヒー豆の抽出液を用いて希釈率の異なるもしくは抽出液濃度の異なる希釈サンプルを４つもしくは５つを用意する。具体的には、予め溶存成分濃度を測定しておいたコーヒー抽出液（ここでは４５．３ｍｇ／ｍＬとする。）を０．０４μＬ（サンプルＡ１）、０．１２μＬ（サンプルＢ１）、０．２０μＬ（サンプルＣ１）、０．２８μＬ（サンプルＤ１）とサンプル液量が異なる４つのサンプルを用意する。それぞれのサンプルに水（例えば、純水）を追加して、２０μＬとなるように希釈サンプルを作成する。また、希釈サンプルの標準サンプルとして、コーヒー抽出液を添加しない水２０μＬ（サンプルＥ１）も用意する。それぞれの希釈サンプルＡ１〜Ｅ１（液量：２０μＬ）に、キットに付属しているサブストレート  バッファー２０μＬを入れて、その後、キット内付属のEnzyme Working溶液２０μＬを加えて、希釈サンプルの全量を６０μＬ（＝０．０６ｍＬ）としてＡＣＥの活性阻害率の測定サンプルを準備する。その後、ＡＣＥの活性阻害率の測定サンプルを温度３７℃、４０分培養してアンジオテンシン変換酵素を生成させる。培養後、各ウェルにキット内付属のIndicator Working溶液２００μＬを加え、室温で、１０分間静置させる。その後、吸光プレートリーダー  マルチスキャンＪＸ(Thermo Scientific)を使用し、４５０ｎｍの吸光度によりアンジオテンシン変換酵素の活性を算出する。なお、吸光度の測定値から、アンジオテンシン変換酵素活性の阻害率を以下の算出式により求める。
阻害率（％）＝{（サンプルＥ１の吸光度）−（希釈サンプルの吸光度）／（サンプルＥ１の吸光度）}＊１００
各サンプルの阻害率を下記表１に示す。
【００２３】
【表１】
2015002209.tif 000002
【００２４】
表１で得られた結果を元に、横軸にサンプル液量、縦軸に阻害率（％）をプロットする（図１）。そのとき、阻害率の軸の阻害率５０％の点から水平方向に直線を引いて、上記プロットとの交点として交点Ｘが得られる。この交点Ｘから、垂直方向に直線を引くと、サンプル液量軸との交点Ｔ１（０．１８２μＬ（０．１８２×１０-3ｍＬ））が得られる。
【００２５】
交点Ｔ１で得られたサンプル液量からアンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％でサンプルの固形分濃度（ＩＣ５０値）は、下式により求める。
固形分濃度（ＩＣ５０値）[ｍｇ／ｍＬ]
＝（アンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％における抽出液量[ｍＬ]）＊溶存成分濃度[ｍｇ／ｍＬ]／測定サンプル全量（０．０６[ｍＬ]）
＝（０．１８２×１０-3ｍＬ）＊（４５．３ｍｇ／ｍＬ）／（０．０６ｍＬ）
＝０．１３７ｍｇ／ｍＬ
【００２６】
このサンプルの測定結果は一例であり、サンプルの抽出量、溶存成分濃度等により、希釈サンプルの液量は変えることが必要である。アンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％におけるサンプル液量については、上記記載に従って得られる。
【００２７】
コーヒー豆の抽出液の有効成分の特徴として、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性阻害率が５０％の活性阻害を示す抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であることが挙げられる。この固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬ以下であることで血圧上昇抑制の効果を最大限に発揮する。また、固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．１６ｍｇ／ｍＬを越えると、血圧上昇抑制の効力が発揮されにくくなり、好ましくない。
【００２８】
また、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の活性阻害率が５０％のとき、活性阻害を示す抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）は０．００１ｍｇ／ｍＬが測定限界などの理由により下限値となる。この下限値までは、血圧上昇抑制の効力を確認することができる。
【００２９】
従って、本発明の血圧上昇抑制剤において、ＡＣＥ阻害に関するＩＣ５０値としては、０．１５７ｍｇ／ｍＬ以下のコーヒー豆の抽出液がより好ましく、０．１５０ｍｇ／ｍＬ以下のコーヒー豆の抽出液がさらに好ましい。
【００３０】
このような優れた作用を発揮するコーヒー豆の抽出液は、後述の亜臨界処理工程を経て得ることができる。
【００３１】
本発明における糖化抑制作用は、後述する測定方法で老化現象を引き起こす還元糖化物質の生成を抑制する生成阻害率を測定し、糖化産物の生成阻害率が５０％のときコーヒー豆の抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）で規定される。
【００３２】
糖化とは体内における老化メカニズムの一つであり、糖とタンパク質が結合し、糖化産物を生成する反応である。この糖化反応による糖化産物の生成を抑制する割合を糖化産物の生成阻害率と呼ぶ。本願発明においては、糖とタンパク質が結合する糖化産物の生成阻害割合が５０％の時、すなわち糖化産物の生成阻害率５０％時のコーヒー豆の抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）での評価を行う。
【００３３】
本発明における糖化抑制作用は、後述する測定方法で老化現象を引き起こす還元糖化物質の生成を抑制する生成阻害率を測定することにより評価されるのが一般的である。通常は一定固形分濃度下で何％の生成阻害率を示すかで規定され、その濃度は低い方が望ましい。通常は試料間の比較を容易にする糖化産物の生成阻害率５０％での抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）により規定されることが薬学研究においては広く一般的に用いられている。（参考文献：M. Hori et al., Anti-Aging Medicine, 9 (2012) 135.）
【００３４】
糖化抑制作用を評価するための糖化産物の生成阻害率測定について、今回行った測定例に基づいて説明をする。まず、コーヒー豆の抽出液を用いて希釈率の異なるもしくは抽出液濃度の異なる希釈サンプルを４つもしくは５つを用意する。具体的には、予め溶存成分濃度を測定しておいたコーヒー豆の抽出液（ここでは２７．２ｍｇ／ｍＬとする。）を１．３３μＬ（サンプルＡ２）、２．００μＬ（サンプルＢ２）、２．６７μＬ（サンプルＣ２）、４．００μＬ（サンプルＤ２）、５．３３μＬ（サンプルＥ２）とサンプル液量が異なる５つのサンプルを用意する。それぞれのサンプルに水（例えば、純水）を追加して、１００μＬとなるように希釈サンプルを作成する。また、希釈サンプルの標準サンプルとして、コーヒー抽出液を添加しない水１００μL（サンプルＦ２）も作成する。それぞれの希釈サンプル（１００μＬ）に、１０ｍｇ/ｍＬ牛血清アルブミン(BSA)２００μＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液５００μＬ、蒸留水１００μＬ及び２Ｍフルクトース１００μＬを混合し、全量１ｍＬに調整した測定サンプルを準備する。その後、Infinite F200-マイクロプレートリーダー(TECMAN)を使用し、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで還元糖化物質由来の蛍光を測定し、希釈サンプルにおける還元糖物質の蛍光強度を測定する。その後、以下の算出式により、希釈率サンプルにおける還元糖物質の生成阻害率を求める。
【００３５】
阻害率（％）＝{（サンプルＦ２の蛍光強度）−（希釈サンプルの蛍光強度）／（サンプルＦ２の蛍光強度）}＊１００
【００３６】
各希釈サンプルの阻害率を下記の表２に示す。
【００３７】
【表２】
2015002209.tif 000003
【００３８】
表２で得られた結果を元に、横軸にサンプル液量、縦軸に阻害率（％）をプロットする（図２）。そのとき、阻害率の軸から阻害率５０％から水平方向に直線を引いて、検量線との交点として交点Ｙが得られる。この交点Ｙから、垂直方向に直線を引くと、サンプル液量軸との交点Ｔ２（２．６４μＬ（２．６４×１０-3ｍＬ））が得られる。
【００３９】
交点Ｔ２で得られた抽出液量から糖化産物の生成阻害率５０％でサンプルの固形分濃度（ＩＣ５０値）は、下式により求める。
固形分濃度（ＩＣ５０値）[ｍｇ／ｍＬ]
＝（糖化産物の生成阻害率５０％における抽出液量[ｍＬ]）＊溶液成分濃度[ｍｇ／ｍＬ]／測定サンプル全量（１[ｍＬ]）
＝（２．６４×１０-3ｍＬ）＊（２７．２ｍｇ／ｍＬ）／（１ｍＬ）
＝０．０７１８ｍｇ／ｍＬ
【００４０】
このサンプルの測定結果は一例であり、サンプルの抽出量、溶存成分濃度等により、希釈サンプルの液量を変えることが必要である。糖化産物の生成阻害率５０％におけるサンプル液量については、上記記載に従って得られる。
【００４１】
コーヒー豆の抽出液の有効成分の特徴として、糖化産物の生成阻害率が５０％におけるコーヒー抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．０６ｍｇ／ｍＬ以下であることが挙げられる。この固形分濃度（ＩＣ５０値）を０．０６ｍｇ／ｍＬ以下にすることで糖化抑制の降下を最大限に発揮することができるのである。
【００４２】
糖化産物の生成阻害率５０％におけるコーヒー抽出液の固形分濃度（ＩＣ５０値）は０．００１ｍｇ／ｍＬが測定限界などの理由により下限値となる。この下限値までは、糖化抑制の効力を確認することができる。
【００４３】
また、固形分濃度（ＩＣ５０値）が０．０６ｍｇ／ｍＬを越えると糖化抑制の効力が発揮されにくくなり、好ましくない。
【００４４】
従って、本発明の糖化抑制剤において、糖化産物の生成阻害に関するＩＣ５０値としては、０．０５９７ｍｇ／ｍＬ以下のコーヒー豆の抽出液がより好ましく、０．０５９０ｍｇ／ｍＬ以下のコーヒー豆の抽出液がさらに好ましい。
【００４５】
このような優れた作用を発揮するコーヒー豆の抽出液は、後述の亜臨界処理工程を経て得ることができる。また、本発明の血圧上昇抑制剤及び糖化抑制剤は、種々の動物に対して有効であり、哺乳動物（例えばヒト、サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ等）に対してより有効に作用する。
【００４６】
次に、本発明の製造方法について説明する。
本発明の製造方法の一つの態様としては、
コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、血圧上昇抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法である。
【００４７】
本発明の製造方法の別の態様としては、
コーヒー生豆及び／又は焙煎コーヒー豆を粉砕してコーヒー豆の粉砕物を得る工程、
コーヒー豆の粉砕物に水を加えてコーヒー豆の粉砕物と水との混合物を得る工程、及び
コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力の亜臨界条件で処理して、コーヒー豆の抽出液を回収する工程
を含む、糖化抑制作用を有するコーヒー豆の抽出液の製造方法である。
【００４８】
本発明における、水による亜臨界処理、即ち加水分解反応に用いる水は、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にしたいわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。
【００４９】
亜臨界処理とは、所定温度及び圧力の条件下で亜臨界状態にした亜臨界流体と抽出原料とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度・圧力の熱水を亜臨界水という。亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
【００５０】
より具体的には金属やセラミックスなどの耐圧容器にコーヒー豆と抽出剤である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、亜臨界状態（コーヒー豆の粉砕物と水との混合物を、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力）を一定時間維持することによってコーヒー豆の抽出液を得、これを亜臨界処理抽出液としている。
【００５１】
亜臨界処理に用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノール、及びそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。
【００５２】
コーヒー豆の亜臨界処理を行うための温度は、１４０〜２００℃の間で行うことが望ましく、１４０〜１８０℃の間で行うことがより望ましい。この温度範囲にすることにより、ポリフェノールに代表される溶存成分が生成しやすくなるからである。亜臨界処理の温度が１４０℃未満では、溶存成分を生成させることが難しいことがある。亜臨界処理の温度が２００℃を越えると、コーヒー豆中の溶存成分が分解を起こしてしまい、溶存成分の生成量を減少させてしまうのである。
【００５３】
コーヒー豆の亜臨界処理における処理圧力は、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力で行うことである。また、各温度の飽和蒸気圧以上とは、その一例としては、１６０℃のときには、０．６２ＭＰａ以上、２００℃以上の時には１．５５ＭＰａ以上で行うことである。この圧力にすることにより、ポリフェノールに代表される溶存成分を生成しやすくなるからである。亜臨界の処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧未満では、溶存成分を生成させることが難しいし、処理時間を要することもある。亜臨界の処理の圧力の上限は特に上記に限定されるものではないが、高圧装置の仕様上、２０〜３０ＭＰａあたりに抑えることが望ましい。
【００５４】
コーヒーの亜臨界の処理時間は、３〜３０分の間で行うことが望ましい。亜臨界の処理時間が３分未満では、ポリフェノールに代表される溶存成分を生成させることが難しい。亜臨界の処理時間が３０分を越えると、コーヒー豆中のポリフェノールが分解を起こしてしまい、ポリフェノールの生成量を減少させてしまうのである。
【００５５】
焙煎コーヒー豆の亜臨界の処理時間は、３〜１５分の間で行うことがより望ましく、３〜９分の間で行うことがさらに望ましい。この処理時間の範囲にすることにより、ポリフェノールに代表される溶存成分を生成しやすくなるからである。亜臨界の処理時間が１５分を越えると、コーヒー豆中のポリフェノールが分解を起こしてしまい、ポリフェノールの生成量を減少させてしまう傾向がある。
【００５６】
コーヒー生豆の亜臨界の処理時間は、１０〜３０分の間で行うことがより望ましい。この処理時間の範囲にすることにより、ポリフェノールに代表される溶存成分を生成しやすくなるからである。
【００５７】
このとき、コーヒー豆の抽出液を亜臨界処理による加水分解条件の一例としては、温度：１４０〜２００℃、圧力：０．１５〜１．８ＭＰａ、かつ、各温度の飽和蒸気圧以上の圧力、処理時間は、３〜３０分、より好ましくは３〜１５分で行うことが望ましいのである。この条件で行うことで、ポリフェノールに代表される溶存成分を生成しやすくなるからである。
【００５８】
亜臨界処理を行った後、耐圧容器内の圧力を大気圧まで戻し、亜臨界処理物、容器洗浄水を回収する。この２つの回収物に蒸留水を加えて、全量を調整し、コーヒー豆：蒸留水が一定比率になるように調整液を得る。この調整液をろ過し、得られたろ過液を亜臨界処理液とすることができる。
【００５９】
このとき、調整液のろ過は、一般的な方法により行うことができ、具体的には、ろ紙やコーヒーフィルターを用いた濾過、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水のいずれかで行うことができるのである。
【００６０】
本発明に用いられるコーヒー豆は、生豆でもよく、焙煎した豆でも良い。
焙煎コーヒー豆は、コーヒーの生豆を適切な焙煎度まで焙煎したものである。コーヒー生豆の焙煎は、直火式、熱風式、又は半熱風式などの方法によって行うことができる。焙煎方法、温度、及び時間は、所望の焙煎度を達成するために適宜選択してよい。
【００６１】
コーヒー生豆の種類は、特に限定されないが、アラビカ種及びロブスタ種の何れであってもよい。より詳細には、ブラジル、コロンビア、ベトナム、タンザニア及びモカから選択されるコーヒー豆であってよいがこれらに限定されない。コーヒー豆は１種を単独で用いてもよく、或いは複数種をブレンドして用いてもよい。
【００６２】
焙煎コーヒー豆の粉砕は、ロールグラインダータイプやフラットカッタータイプおよびコニカルカッタータイプなどいずれのタイプの粉砕機を用いて実施することができる。ここで、血圧上昇抑制には、生豆、焙煎した豆のどちらを用いてもよいが、生豆を用いることがより望ましい。糖化抑制には、生豆、焙煎した豆のどちらを用いてもよいが、焙煎した豆を用いることがより望ましい。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等により何ら制限されるものではない。【００６４】
実施例１
容積２Ｌの耐圧容器に、焙煎され粉砕されたコーヒー豆１００ｇ、蒸留水５００ｇを入れて、処理温度：１４０℃、処理圧力：０．３６ＭＰａ、処理時間３分間で亜臨界処理を行った。【００６５】
亜臨界処理を行った後、耐圧容器内の圧力を大気圧まで戻し、亜臨界処理物、容器洗浄水を回収した。この回収物に蒸留水を加えて、全量を９００ｇに調整し、コーヒー豆：蒸留水＝１：８（質量比）となるように調整液を得た。この調整液をコーヒーフィルター（市販）でろ過し、得られたろ過液を亜臨界処理液とした。【００６６】
実施例２
亜臨界処理を処理温度：１４０℃、処理圧力：０．３６ＭＰａ、処理時間９分で行った以外は、実施例１と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００６７】
実施例３
亜臨界処理を処理温度：１６０℃、処理圧力：０．６２ＭＰａ、処理時間６分で行った以外は、実施例１と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００６８】
実施例４
亜臨界処理を処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間３分で行った以外は、実施例１と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００６９】
実施例５
亜臨界処理を処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間９分で行った以外は、実施例１と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００７０】
実施例６
容積２Ｌの耐圧容器に、粉砕されたコーヒー生豆１００ｇ、蒸留水５００ｇを入れて、処理温度：１６５℃、処理圧力：０．７０ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界処理を行った。【００７１】
亜臨界処理を行った後、耐圧容器内の圧力を大気圧まで戻し、亜臨界処理物、容器洗浄水を回収した。この回収物に蒸留水を加えて、全量を９００ｇに調整し、コーヒー豆：蒸留水＝１：８（質量比）となるように調整液を得た。この調整液をコーヒーフィルター（市販）でろ過し、得られたろ過液を亜臨界処理液とした。【００７２】
実施例７
亜臨界処理を処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間２０分で行った以外は、実施例６と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００７３】
実施例８
亜臨界処理を処理温度：１９５℃、処理圧力：１．４ＭＰａ、処理時間１０分で行った以外は、実施例６と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００７４】
実施例９
亜臨界処理を処理温度：１９５℃、処理圧力：１．４ＭＰａ、処理時間３０分で行った以外は、実施例６と同じ条件で亜臨界処理による亜臨界処理液を作製した。【００７５】
比較例１  熱水抽出
焙煎され粉砕されたコーヒー豆４０ｇ、蒸留水３２０ｇ（コーヒー豆：蒸留水＝１：８（質量比））を用意し、市販のコーヒーメーカー（ＴＯＰＶＡＬＵＥ社製、品番：ＴＣＯ-ＣＡ６）を用いて熱水抽出を行った。コーヒーメーカーにコーヒー豆、蒸留水をセットし、９５℃に加熱された蒸留水を、コーヒー用ペーパーフィルター上のコーヒー豆に滴下した。このフィルターを通過したコーヒー豆の抽出液を回収することで熱水抽出液を得た。【００７６】
比較例２  熱水抽出
粉砕されたコーヒー生豆２０ｇ、蒸留水１６０ｇ（コーヒー生豆：蒸留水＝１：８（質量比））を用意し、市販のコーヒーメーカー（ＴＯＰＶＡＬＵＥ社製、品番：ＴＣＯ-ＣＡ６）を用いて熱水抽出を行った。コーヒーメーカーにコーヒー豆、蒸留水をセットし、９５℃に加熱された蒸留水を、コーヒー用ペーパーフィルター上のコーヒー豆に滴下した。このフィルターを通過したコーヒー豆の抽出液を回収することで熱水抽出液を得た。【００７７】
物性値特定結果
実施例１〜９および比較例１、２で得られた、亜臨界処理液、熱水抽出液の２種類の抽出液の物性値を測定した。測定した物性値は、ポリフェノール濃度、溶存成分濃度であった。【００７８】
ポリフェノール濃度は、Folin-Ciocalteu法により測定した。
蒸留水により２倍に希釈したFolin-Ciocalteu液(MP Biomedicals, Inc.)１ｍＬ、各抽出液１ｍＬ、０．４Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを混合した。混合液を５０℃で５分間保持した後、３０分間、常温の水で冷却した。その後、各混合液の７６５ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき、クロロゲン酸水溶液により検量線を作成し、ポリフェノール量をクロロゲン酸相当量（ｍｇ／ｍＬ）で算出した。その結果を図３−１及び図３−２に示す。【００７９】
溶存成分濃度は加熱乾燥法により測定した。
各抽出液１０ｍＬをセラミックス容器に分注し、乾燥機中１０５℃で一晩乾燥させ、抽出液中の水分を蒸発させて容器の乾燥前後の重量差より各抽出液の溶存成分濃度（ｍｇ／ｍＬ）を算出した。その結果を図３−１及び図３−２に示す。【００８０】
図３−１及び図３−２から、熱水抽出処理よりも、亜臨界処理の方が、コーヒー豆からの溶存成分やポリフェノールをより多く抽出できることが分かった。【００８１】
ＡＣＥ阻害活性試験
亜臨界処理液、熱水抽出液の２種類の抽出液のＡＣＥ阻害活性試験を行った。【００８２】
１．サンプル準備
亜臨界処理液、熱水抽出液の２種類の抽出液を用意した。その用意した抽出液を表３に示す。【００８３】
【表３】
2015002209.tif 000004
【００８４】
２．ＡＣＥ阻害活性測定
ＡＣＥ阻害活性測定は株式会社同仁化学研究所製ＡＣＥ−Ｋｉｔ ＷＳＴを使用して実施した。
上記の１で準備した亜臨界処理液、熱水抽出液のそれぞれ試験サンプルの所定量（以下、抽出液量と呼ぶ）を採取し、蒸留水により適宜希釈した。希釈率は測定した阻害率の値が５０％を挟むように設定し、各サンプルにつき４点もしくは５点の希釈溶液を作製した。マイクロプレートの各ウェルに各希釈サンプル溶液２０μＬ、キット内付属のサブストレート バッファー２０μＬを入れて、その後、キット内付属のEnzyme Working溶液２０μＬを加えて全量を６０μＬ（＝０．０６ｍＬ）とし、温度３７℃、４０分培養してアンジオテンシン変換酵素を生成させた。培養後、各ウェルにキット内付属のIndicator Working溶液２００μＬを加え、室温で、１０分間静置させた。その後、吸光プレートリーダー マルチスキャンＪＸ(Thermo Scientific)を使用し、４５０ｎｍの吸光度でアンジオテンシン変換酵素の阻害活性を測定し、各希釈率における阻害率を求めた。また、得られた阻害率の挙動から、アンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％における抽出液量を求めた。また、下記の式を用いて、得られた抽出液量からアンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％である各サンプルの固形分濃度（ＩＣ５０値）を求めた。【００８５】
ＩＣ５０[ｍｇ／ｍＬ]＝（アンジオテンシン変換酵素の阻害活性率５０％における抽出液量[ｍＬ]）＊溶存成分濃度[ｍｇ／ｍＬ]／０．０６[ｍＬ]【００８６】
３．評価結果
上記の試験結果を図４−１、図４−２及び表４にまとめた。【００８７】
【表４】
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【００８８】
参考として、日本国特許第３１４９１９９号公報の段落００１８〜００１９に開示の、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドによる同様のＡＣＥ阻害試験の結果を表４に記載した。該公報の段落００２０〜００２１においては、自然発症高血圧ラットにこのペプチドを経口投与した結果、１００ｍｇの経口投与において十分な血圧上昇抑制効果を示したことが記載されている。実施例１〜５のＩＣ５０値はこの参考の値よりも十分に低いので、このペプチドよりもさらに十分な血圧上昇抑制効果が期待できる。【００８９】
以上の結果から、表４より、実施例１〜５においては、比較例１に比べて優れた血圧上昇抑制作用を有することがわかる。表４より、実施例６〜９においては比較例２に比べて優れた血圧上昇抑制作用を有することがわかる。【００９０】
糖化抑制試験
亜臨界処理液、熱水抽出液の２種類の抽出液の糖化抑制試験を行った。
糖化抑制試験は、生体タンパクのアミノ基や脂質とグルコースなどの還元糖化物質の生成を測定するものである。皮膚における還元糖化物質の形成や蓄積は、皮膚の弾力性や柔軟性の低下および黄色化を招きやすくするのであり、結果としての老化の原因とされている。それ故に、糖化抑制作用は、抗老化剤という位置付けになり、還元糖化物質（糖化産物）の生成を抑制することができれば、糖化抑制作用に優れるという指標となるのである。【００９１】
１．サンプル準備
亜臨界処理液、熱水抽出液の２種類の抽出液を用意した。その用意した抽出液を表５に示す。【００９２】
【表５】
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【００９３】
２．糖化抑制測定
上記の１で準備した亜臨界処理液、熱水抽出液のそれぞれ試験サンプルを蒸留水により段階希釈した。希釈率は測定した阻害率の値が５０％を超過、もしくは下回るように約５０倍〜２００倍に設定し、各サンプルにつき４点もしくは５点の希釈溶液を作製した。これらの各希釈サンプル溶液１００μＬと、１０ｍｇ/ｍＬ牛血清アルブミン(BSA)２００μＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液５００μＬ、蒸留水１００μＬ及び２Ｍフルクトース１００μＬを混合し、全量１ｍＬに調整した。その後、温度：６０℃、４０時間インキュベートして還元糖化物質を生成させた。その後、Infinite F200-マイクロプレートリーダー(TECMAN)を使用し、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで還元糖化物質由来の蛍光を測定し、各希釈率における還元糖物質の生成阻害率を求めた。また得られた阻害率の挙動から、糖化産物の生成阻害率が５０％のときの抽出液量を求めた。また、下記の式を用いて、得られた抽出液量から糖化産物の生成阻害率５０％である各サンプルの固形分濃度（ＩＣ５０値）を求めた。また、比較対照として、糖化抑制作用を有するアミノグアニジンを用いた。アミノグアンジも、試験サンプルと同様の手順により、糖化産物の生成阻害率５０％である固形分濃度（ＩＣ５０値）を求めた。【００９４】
ＩＣ５０[ｍｇ／ｍＬ]＝（糖化産物の生成阻害率５０％における抽出液量[ｍＬ]）＊溶存成分濃度[ｍｇ／ｍＬ]／１[ｍＬ]【００９５】
３．評価結果
上記の糖化抑制試験の結果を図５及び表６に示した。【００９６】
【表６】
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【００９７】
以上の結果から実施例１〜５においては、比較例１に比べて優れた糖化抑制作用を有することがわかる。また対照として用いたアミノグアニジンの値と比べても、比較例１はアミノグアニジンと同等の活性を示しているのに対し、実施例１〜５においてはアミノグアニジンを上回る活性を示していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明のコーヒー豆の抽出液は、血圧上昇抑制効果、糖化抑制効果が高いので、医薬品原料に用いたり、化粧料の配合成分やサプリメント等の健康食品に用いたりすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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