(57)【要約】  高周波重畳を行わずに、信頼性の高い検出データが得られる粒子分析装置及び粒子分析方法を提供する。  粒子分析装置を、流路内を通流する粒子にレーザ光を照射する光照射部と、レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する光検出部と、光検出部から出力された蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を処理する信号処理部とを備えた構成とし、光照射部に、少なくとも、レーザを発生する光源と、光源から出射されたレーザ光の一部を検出するレーザ光検出器とを設け、信号処理部により、レーザ光検出器での検出結果に基づいて、蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する。
2015012004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内を通流する粒子にレーザ光を照射する光照射部と、
前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する光検出部と、
前記光検出部から出力された蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を処理する信号処理部と、
を有し、
前記光照射部は、少なくとも、
レーザを発生する光源と、
前記光源から出射されたレーザ光の一部を検出するレーザ光検出器と、
を備え、
前記信号処理部は、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する粒子分析装置。
【請求項２】
前記信号処理部は、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正する請求項１に記載の粒子分析装置。
【請求項３】
前記信号処理部は、前記光検出部からの出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正する請求項２に記載の粒子分析装置。
【請求項４】
前記光照射部には、前記レーザ光の一部を前記レーザ光検出器に向けて反射するビームスプリッターが設けられている請求項１に記載の粒子分析装置。
【請求項５】
前記光照射部には、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記光源から出射されるレーザ光の出力を調整する光源駆動制御部が設けられている請求項１に記載の粒子分析装置。
【請求項６】
光源から出射したレーザ光の一部をレーザ光検出器で検出する工程と、
前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程と、
信号処理部により、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する工程と、
を有する粒子分析方法。
【請求項７】
前記検出信号を補正する工程は、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正する請求項６に記載の粒子分析方法。
【請求項８】
前記検出信号を補正する工程は、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程で得た出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正する請求項７に記載の粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、粒子を光学的に検出する粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。より詳しくは、光照射された粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出する粒子分析装置及び粒子分析方法において検出精度を向上させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、微生物及びリポソームなどの生体関連微小粒子の識別には、フローサイトメトリー（フローサイトメーター）を用いた光学的検出方法が利用されている。フローサイトメトリーは、流路内を１列になって通流する粒子に特定波長のレーザ光を照射し、各粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、複数の粒子を１個ずつ識別する分析手法である。【０００３】
一方、フローサイトメトリーでは、流路や粒子からの戻り光などの影響で、レーザの発振波長が数１０μｓオーダーで変動し、これによりレーザから出力される光量に変化が生じ、これがノイズとして検出される。このようなノイズは、一般に、「モードポップノイズ」と言われ、検出データのばらつきや信頼性低下の原因となる。【０００４】
フローサイトメトリーには、温度などの影響によるレーザ出力レベルの変動を防止するために、レーザ出力調整系（Auto Power Control：ＡＰＣ）が設けられている。しかしながら、ＡＰＣによるフィードバック制御は、数ｍｓオーダーで行われており、数１０μｓオーダーで発生するモードポップノイズに対応することはできない。【０００５】
従来、モードポップノイズを低減し、レーザ出力を安定化させる方法として、高周波重畳の使用が提案されている（特許文献１参照）。例えば、特許文献１に記載の試料分析装置では、レーザダイオードに供給される直流電流に高周波成分を重畳させる高周波重畳回路を設け、レーザダイオードに供給された直流電流の大きさに応じて、直流電流に重畳される高周波の振幅を制御している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−５３０２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、高周波重畳を用いたレーザ出力安定化技術は、効果を高めるためには、レーザを高速点滅させる必要があり、その結果、ピーク出力が高くなって、最大出力定格が高いレーザの使用や、平均出力の低減などが必要となる。また、その場合、高周波重畳の振幅が大きくなるため、不要輻射も増加する。【０００８】
そこで、本開示は、高周波重畳を用いなくとも、信頼性の高い検出データを得ることが可能な粒子分析装置及び粒子分析方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示に係る粒子分析装置は、流路内を通流する粒子にレーザ光を照射する光照射部と、前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する光検出部と、前記光検出部から出力された蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を処理する信号処理部と、を有し、前記光照射部は、少なくとも、レーザを発生する光源と、前記光源から出射されたレーザ光の一部を検出するレーザ光検出器と、を備え、前記信号処理部は、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する構成のものである。
前記信号処理部は、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正する構成とすることができる。
その場合、前記信号処理部は、前記光検出部からの出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正する構成としてもよい。
一方、前記光照射部には、前記レーザ光の一部を前記レーザ光検出器に向けて反射するビームスプリッターが設けられていてもよい。
また、前記光照射部には、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記光源から出射されるレーザ光の出力を調整する光源駆動制御部を設けることもできる。【００１０】
本開示に係る粒子分析方法は、光源から出射したレーザ光の一部をレーザ光検出器で検出する工程と、前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程と、信号処理部により、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する工程と、を有する。
前記検出信号を補正する工程では、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正することができる。
その場合、前記検出信号を補正する工程において、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程で得た出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、高周波重畳を用いずに、信頼性の高い検出データを得ることができる。なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の第１の実施形態の粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】Ａはレーザ光検出器の出力変動を示す図であり、Ｂは従来の粒子分析装置の光検出部からの出力信号を示す図である。
【図３】Ａはレーザ光検出器の出力変動を示す図であり、Ｂは本実施形態の粒子分析装置の光検出部からの出力信号を示す図である。
【図４】本開示の第１の実施形態の変形例の粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本開示を実施するための形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、本開示は、以下に示す各実施形態に限定されるものではない。また、説明は、以下の順序で行う。
１．第１の実施形態
（レーザ光検出器での検出結果に基づいて検出信号を補正する粒子分析装置の例）
２．第１の実施形態の変形例
（レーザ光検出器が光源駆動制御部に設けられている粒子分析装置の例）
【００１４】
＜１．第１の実施形態＞
［装置の全体構成］
先ず、本開示の第１の実施形態の粒子分析装置について、流路内を通流する微小粒子を検出する場合を例にして説明する。図１は本実施形態の粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態の粒子分析装置は、微小粒子３にレーザ光６を照射する光照射部１と、光照射された微小粒子３から発せられた蛍光７や散乱光８を検出する光検出部４と、光検出部４から出力された検出信号を処理する信号処理部５を備えている。
【００１５】
［光照射部１］
光照射部１には、レーザ光６を発生するレーザ１１、レーザ光６を微小粒子３に向けて集光するレンズ１４が設けられている。また、光照射部１には、レーザ光６を検出するレーザ光検出器１２が設けられており、レーザ１１から出射されたレーザ光６の一部が、例えばビームスプリッター１３などによって反射されて、レーザ光検出器１２に入射する構成となっている。ここで、レーザ光検出器１２は、数１０μｓオーダーで発生するレーザ光６の出力変動を検出可能なものであればよく、フォトダイオードなどを使用することができる。
【００１６】
［マイクロチップ２］
マイクロチップ２には、微小粒子３が通流可能な流路２１が設けられており、流路２１内に、例えば検出対象の微小粒子３を含むサンプル液が導入される。このマイクロチップ２は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ，ＰＣ，ＣＯＰ、ＰＤＭＳなど）により形成することができる。マイクロチップ２の材質は、特に限定されるものではないが、光照射部１から照射されるレーザ光６に対して透過性を有し、光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
【００１７】
マイクロチップ２の成形は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、機械加工によって行うことができる。そして、流路２１などを成形した基板を、同じ材質又は異なる材質の基板で封止することでマイクロチップ２を形成することができる。
【００１８】
［微小粒子３］
本実施形態の粒子分析装置で検出される「微小粒子３」には、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、又はラテックス粒子、ゲル粒子及び工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれる。
【００１９】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれる。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。この生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
【００２０】
工業用粒子としては、有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成されたものが挙げられる。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどを使用することができる。また、無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用することができる。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用することができる。なお、これら微小粒子の形状は、一般には球形であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【００２１】
［光検出部４］
光検出部４は、レーザ光６が照射された微小粒子３から発せられる蛍光７若しくは散乱光８又はその両方を検出するものであり、例えば蛍光検出器４１若しくは散乱光検出器４２又はその両方が設けられている。ここで、蛍光検出器４１には光電子増倍管（Photomultiplier Tube：ＰＭＴ）などを使用することができ、散乱光検出器４２にはフォトダイオードなどを使用することができる。
【００２２】
また、光検出部４は、ダイクロイックミラー４４により、微小粒子３から発せられ、光検出部４に入射した光から蛍光７及び散乱光８を分離し、それぞれ蛍光検出器４１及び散乱光検出器４２に入射させる構成とすることができる。その際使用するダイクロイックミラー４４としては、例えば蛍光７を透過し、散乱光８を反射するものを使用することができる。
【００２３】
更に、光検出部４には、励起光であるレーザ光６などの蛍光７及び散乱光８以外の光成分（０次光９）を遮断する０次光除去部材４３が設けられていてもよい。この０次光除去部材４３としては、マスクや特定光を選択的に遮断する光学フィルタなどを使用することができるが、これらに限定されるものではなく、０次光９を遮断可能な光学部材であればよい。また、０次光除去部材４３を配置する位置も特に限定されるものではなく、蛍光検出器４１及び散乱光検出器４２の手前であればよい。
【００２４】
［信号処理部５］
信号処理部５は、レーザ光検出器１２での検出結果に基づいて、蛍光７若しくは散乱光８又はその両方の検出信号を補正するものであり、検出される光に対応して蛍光信号処理部５ａや散乱光信号処理部５ｂなどを備えている。前述したように、高周波重畳を行わない場合、戻り光１０によりレーザ１１の出力にレベル変動が生じ、波形が乱れることがある。この乱れは、微小粒子３からの蛍光７や散乱光８に由来する信号にも影響を与える。
【００２５】
そこで、本実施形態の粒子分析装置では、レーザ光検出器１２の出力変動に応じて、蛍光信号処理部５ａにおいて蛍光７の検出信号を補正すると共に、散乱光信号処理部５ｂにおいて散乱光８の検出信号を補正する。ここで、各検出信号の補正方法は、特に限定されるものではないが、例えば、光検出部４からの出力電圧に、レーザ光検出器１２の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより蛍光７や散乱光８検出信号を補正することができる。
【００２６】
また、Ｇａｉｎは、例えば、下記数式１に示すように、任意の時間の出力電圧を基準電圧Ｖｓｔｄを、この時間以降の出力電圧Ｖｏｕｔで割った値とすることができる。
【００２７】
【数１】
2015012004.tif 000003
【００２８】
［動作］
次に、本実施形態の粒子分析装置の動作、即ち、本実施形態の粒子分析装置を使用して微小粒子３を分析する方法について説明する。本実施形態の粒子分析装置では、マイクロチップ２に設けられた流路２１内に、例えば検出対象の微小粒子３を含むサンプル液を導入する。そして、レーザ１１から出射したレーザ光６をレンズ１４などで集光して、マイクロチップ２の流路２１内を通流する微小粒子３に照射する。
【００２９】
このとき、ビームスプリッター１３などにより、レーザ１１から出射されるレーザ光６の一部を分離し、レーザ光検出器１２に入射させる。レーザ光検出器１２は、分離されたレーザ光６の強度を検出し、その結果を信号処理部５に出力する。
【００３０】
また、レーザ光６が照射された微小粒子３から発せられ、光検出部４に入射した光は、０次光除去部材４３により０次光が除去された後、ダイクロイックミラー４４により、蛍光７と散乱光８とに分離され、それぞれ個別に検出される。具体的には、ダイクロイックミラー４４を透過した蛍光７は蛍光検出器４１で検出され、ダイクロイックミラー４４で反射された散乱光８は、散乱光検出器４２で検出される。
【００３１】
蛍光検出器４１及び散乱光検出器４２での検出結果は、信号処理部５に出力される。具体的には、蛍光検出器４１の検出信号は、信号処理部５の蛍光信号処理部５ａに出力され、散乱光検出器４２の検出信号は、信号処理部５の散乱光信号処理部５ｂに出力される。図２Ａはレーザ光検出器の出力変動を示す図であり、図２Ｂは従来の粒子分析装置の光検出部からの出力信号を示す図である。図３Ａはレーザ光検出器の出力変動を示す図であり、図３Ｂは本実施形態の粒子分析装置の光検出部からの出力信号を示す図である。
【００３２】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、レーザ出力変動に応じた補正を行わない従来の粒子分析装置では、レーザ１１の出力変動の影響によりピーク値にばらつきが生じる（図２Ｂの破線で囲んでいる部分参照。）。これに対して、本実施形態の粒子分析装置は、レーザ光検出器１２の出力に基づいて設定されたＧａｉｎを用いて検出信号を補正しているため、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、信号のばらつきが抑えられ、信頼性の高い検出データを得ることができる（図３Ｂの破線で囲んでいる部分参照。）。
【００３３】
以上詳述したように、本実施形態の粒子分析装置では、レーザ１１の出力変動を検出し、その検出結果に基づいて検出信号を補正しているため、高周波重畳を用いなくても、精度よく蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出することができる。このように、本実施形態の粒子分析装置は、高周波重畳を用いなくても、信頼性の高い検出データが得られるため、最大定格が低いレーザを使用することが可能となり、不要輻射の対策も不要となる。
【００３４】
なお、図１ではマイクロチップを用いて測定を行う構成を示しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、フローセルを用いた構成など、レーザの出力変動によりモードホップノイズなどの問題が生じる装置全般に有効である。また、図１には、蛍光及び散乱光の両方を検出し、補正する装置を示しているが、本開示はこれに限定されるものではなく、いずれか一方のみを検出し補正する系としてもよい。
【００３５】
＜２．第１の実施の形態の変形例＞
次に、本開示の第１の実施形態の変形例に係る粒子分析装置について説明する。図４は本変形例の粒子分析装置の構成を模式的に示す図である。なお、図４では、前述した第１の実施形態の粒子分析装置の構成要素と同じものには、同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
【００３６】
図４に示すように、本変形例の粒子分析装置には、光照射部１にレーザ１１の出力調整を行う光源駆動制御部１７が設けられており、そのフィードバック制御用のレーザ光検出器１５の検出結果を、検出信号の補正に用いる。本変形例の粒子分析装置の光源駆動制御部１７には、レーザ１１、ビームスプリッター１３、レーザ光検出器１５及びレーザ出力調整部１６などが設けられており、レーザ１１から出力されたレーザ光６の一部を、ビームスプリッター１３で反射し、レーザ光検出器１５で検出する。
【００３７】
そして、本変形例の粒子分析装置では、レーザ光検出器１５での検出結果に基づいて、レーザ出力調整部１６がレーザ１１の出力を調整する。これにより、温度などの影響によるレーザ出力レベルの変動を防止することができる。このフィードバック制御は、通常数ｍｓオーダーで実施される。
【００３８】
また、本変形例の粒子分析装置では、レーザ光検出器１５での検出結果を信号処理部５に出力し、その検出結果に基づいて蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する。この補正は、例えばデータ処理ごとに行う。
【００３９】
このように、検出信号の補正に、光源駆動制御部１７に設けられたレーザ光検出器１５の検出結果（出力変動）を用いることにより、別途補正用の検出器を設ける必要がなくなる。その結果、装置や部品などを追加しなくても、蛍光や散乱光の検出性能を向上させることができ、信頼性の高い検出データを取得することができる。なお、本変形例における上記以外の構成、動作及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
【００４０】
また、本開示は、以下のような構成をとることもできる。
（１）
流路内を通流する粒子にレーザ光を照射する光照射部と、
前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する光検出部と、
前記光検出部から出力された蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を処理する信号処理部と、
を有し、
前記光照射部は、少なくとも、
レーザを発生する光源と、
前記光源から出射されたレーザ光の一部を検出するレーザ光検出器と、
を備え、
前記信号処理部は、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する粒子分析装置。
（２）
前記信号処理部は、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正する（１）に記載の粒子分析装置。
（３）
前記信号処理部は、前記光検出部からの出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正する（１）又は（２）に記載の粒子分析装置。
（４）
前記光照射部には、前記レーザ光の一部を前記レーザ光検出器に向けて反射するビームスプリッターが設けられている（１）〜（３）のいずれかに記載の粒子分析装置。
（５）
前記光照射部には、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記光源から出射されるレーザ光の出力を調整する光源駆動制御部が設けられている（１）〜（４）のいずれかに記載の粒子分析装置。
（６）
光源から出射したレーザ光の一部をレーザ光検出器で検出する工程と、
前記レーザ光が照射された粒子から発せられた蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程と、
信号処理部により、前記レーザ光検出器での検出結果に基づいて、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方の検出信号を補正する工程と、
を有する粒子分析方法。
（７）
前記検出信号を補正する工程は、前記レーザ光検出器の出力変動に応じて、前記検出信号を補正する（６）に記載の粒子分析方法。
（８）
前記検出信号を補正する工程は、前記蛍光若しくは散乱光又はその両方を検出する工程で得た出力電圧に、前記レーザ光検出器の出力変動の大きさに応じて設定される値（Ｇａｉｎ）を乗じることにより前記検出信号を補正する（６）又は（７）に記載の粒子分析方法。
【符号の説明】
【００４１】
１  光照射部
２  マイクロチップ
３  微小粒子
４  光検出部
５  信号処理部
５ａ  蛍光信号処理部
５ｂ  散乱光信号処理部
６  レーザ光
７  蛍光
８  散乱光
９  ０次光
１０  戻り光
１１  レーザ
１２、１５  レーザ光検出器
１３  ビームスプリッター
１４  レンズ
１６  レーザ出力調整部
１７  光源駆動制御部
２１  流路
４１  蛍光検出器
４２  散乱光検出器
４３  ０次光除去部材
４４  ダイクロイックミラー
【図１】
2015012004.tif 000004
【図２】
2015012004.tif 000005
【図３】
2015012004.tif 000006
【図４】
2015012004.tif 000007
【国際調査報告】
2015012004.tif 000008
2015012004.tif 000009
2015012004.tif 000010
2015012004.tif 000011