(57)【要約】  本発明は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患や播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療できるセマフォリン３Ａタンパク質に対する抗体を提供することを主な課題とする。  特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ（配列番号１〜６、６０〜６２、６４〜６６、６８〜７０、７２〜７４、７６〜７８、８０〜８２、８４〜８６及び８８〜９０）を備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患や播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療でき、当該疾患に伴う症状が顕著に改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
（Ａ）  配列番号１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｂ）  配列番号６０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号６４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｃ）  配列番号６８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号７２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｄ）  配列番号７６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７７に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｅ）  配列番号８４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号９０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
【請求項２】
キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項１に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を含有する、医薬組成物。
【請求項４】
神経再生促進用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
敗血症の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
がんの予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
中枢又は末梢神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、又は神経変性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、又は脊髄小脳変性症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、又は多発性硬化症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患が、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、又はシェーグレン症候群である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
感染症が、細菌感染症、脳炎、髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群、肺炎、敗血症、火傷性、又は外傷性感染症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、又は食物アレルギーである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
神経再生が求められる患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、神経再生方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法。
【請求項２０】
敗血症を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、敗血症の治療方法。
【請求項２１】
がんを罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、がんの治療方法。
【請求項２２】
播種性血管内凝固症候群を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、播種性血管内凝固症候群の治療方法。
【請求項２３】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、前記疾患の治療方法。
【請求項２４】
神経再生用の医薬の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２５】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２６】
敗血症の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２７】
がんの予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２８】
播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２９】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項３０】
請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を用いて免疫測定により検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する工程を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法。
【請求項３１】
請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セマフォリン３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療に有効である抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片に関する。更に、本発明は、当該抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を利用した医薬組成物に関する。更に、本発明は、抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を利用したセマフォリン３Ａタンパク質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は高齢者における痴呆（記憶の喪失）の最も一般的な形態である。現在使用されているアルツハイマー病の治療薬は、コリンエステラーゼ阻害薬による中枢神経系内におけるコリン作動性神経伝達の改善、あるいはΝ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）グルタミン酸受容体阻害薬による興奮毒性の抑制をその作用機序としているが、いずれも軽度の症状改善が認められるにとどまっている。原因となる神経変性の進行を抑制し、また改善できるような、根本的な治療法の開発が待たれている。【０００３】
脳中で見出されるＡＤの主たる病理学的傷害は、斑及び血管障害の形態のβアミロイドタンパク質の細胞外沈着物、並びに凝集型の過剰リン酸化されたτタンパク質の細胞内神経原線維変化に起因している。最近の証拠は、脳中の上昇されたβアミロイドレベルがτの病態に先行するのみならず、認識低下ともまた相関することを示している。最近の研究では、ＡＤにおけるβアミロイドの原因としての役割をさらに示唆しており、凝集型βアミロイドが細胞培養物中のニューロンに対し毒性を示すことが明らかにされている。【０００４】
βアミロイドタンパク質は、主として３９〜４２アミノ酸のペプチドから構成され、プロテアーゼ、β及びγ−分泌酵素の連続的作用により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きな前駆体タンパク質から産生される。稀とは言え、早期発症のＡＤの症例は、全βアミロイドタンパク質若しくはそのアイソフォームのいずれかの過剰産生につながるＡＰＰの遺伝子突然変異に起因している。さらに、ダウン症を伴う人は、ＡＰＰをコードする遺伝子を含有する余分な染色体を所有し、βアミロイドレベルが上昇しており、かつ加齢によって必ずＡＤを発症する。【０００５】
一方、セマフォリンは、神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質である。セマフォリン遺伝子は、その構造に基づいて８つの遺伝子サブファミリー、クラス、に分類されており、これまでに約２０種の分子種が知られている（非特許文献１）。しかしながら、多くのセマフォリンファミリーの大部分の機能について詳しいことはわかっていない。最も良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、中でも最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（非特許文献２、３）である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は１０ｐＭという低濃度で短時間のうちに培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発し、神経再生伸長を阻害することが知られている。【０００６】
近年、樹状細胞がＳｅｍａ３Ａタンパク質を感知してリンパ管に入り、リンパ節に移動していくことも報告されており、自己免疫疾患に関与していること（例えば、非特許文献４参照）や、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とその受容体であるＰｌｅｘｉｎ−Ａ４を介したシグナルが敗血症の発症において重要であることも明らかにされており（例えば、非特許文献６参照）、免疫・感染症等の病態形成においても深く関与していることが知られている。更に、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は、がん細胞・組織から分泌され、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのシグナル経路を阻止してＴ細胞の活性化を抑制することや、膵癌患者の癌組織でＳｅｍａ３Ａ発現の高い患者群では予後が不良であることも報告されており、がんの悪性化に関与していることも明らかにされている（例えば、非特許文献５、７参照）。【０００７】
また、播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ＤＩＣ）は、基礎疾患の悪化に伴って全身性かつ持続性の著しい凝固活性化が起こる重篤な病態である。主な症状は出血症状と臓器症状であるが、臨床症状が出現すると予後は極めて不良となることが知られている。ＤＩＣの誘因となる基礎疾患としては、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、重症感染症などが知られているが、Ｓｅｍａ３Ａとの関連については明らかにされていない。【０００８】
従来、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体についても報告されている。例えば、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体等Ｓｅｍａ３Ａタンパク質活性阻害物質が、アルツハイマーやパーキンソン病の治療に有効であること（特許文献１参照）や、免疫疾患や炎症性疾患の治療に有効であること（特許文献２参照）が報告されている。しかしながら、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患について、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて予防及び／又は治療する際に、その薬効をより高めて発揮させるには如何なる構造の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が有効であるかについては明らかにされていない。【０００９】
また、このようにＳｅｍａ３Ａタンパク質が様々な病態に関与していることが知られており、その病態の解明や治療薬の開発をする上で、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を高精度に測定する技術も不可欠となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  ９７，５５１，１９９９
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  ７５，２１７，１９９３
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  ７５，１３８９，１９９３
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，５９４−６００，２０１０
【非特許文献５】Ｂｌｏｏｄ  １０７，３３２１−３３２９，２００６
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７，２９４３，２０１０
【非特許文献７】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ    １２１，２４２１−２４３３，２００７
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０３／００７８０３号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ２０１１／０６６２８４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患、及び播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療できるＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体を提供することを課題とする。また、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療、並びに当該疾患に伴う症状の緩和を可能にする医薬組成物を提供することを課題とする。更に、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定に有効なＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体、及び当該抗体を用いてＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、アルツハイマー病等の神経変性疾患を効果的に予防及び／又は治療でき、当該神経変性疾患に伴う症状が顕著に改善されることを見出した。また、致死的な敗血症病態モデルにおいて、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が劇的な生存率の改善、及び生存期間延長効果を示した。加えて、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が、播種性血管内凝固症候群の増悪因子の一つである血中Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（ＰＡＩ−１）を減少させることを見出した。更に、癌細胞の遊走・浸潤や薬剤抵抗性がＳｅｍａ３Ａにより誘導されるが、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によって癌細胞の遊走・浸潤や薬剤抵抗性を抑制できることから、がんの悪性化を抑えることもできることを見出した。【００１４】
また、特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲを備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を利用したＥＬＩＳＡによって、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定が可能になることをも見出した。【００１５】
本発明はこのような知見に基づき、さらに研究を重ねた結果完成されたものである。即ち、本発明は、以下の態様の発明を提供する。
項１．  下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
（Ａ）  配列番号１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｂ）  配列番号６０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号６４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｃ）  配列番号６８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号７２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｄ）  配列番号７６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７７に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｅ）  配列番号８４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号９０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
項２．  キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、項１に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項３．  神経再生促進のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項４．  アルツハイマー病の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項５．  敗血症の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項６．  がんの予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項７．  播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項８．  中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項９．  項１〜８のいずれかに記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を含有する、医薬組成物。
項１０．  神経再生促進用である、項９に記載の医薬組成物。
項１１．  アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１２．  敗血症の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１３．  がんの予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１４．  がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、項１３に記載の医薬組成物。
項１５．  播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１６．  播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、項１５に記載の医薬組成物。
項１７．  中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１８．  中枢又は末梢神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、又は神経変性疾患である、項１７に記載の医薬組成物。
項１９．  神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、又は脊髄小脳変性症である、項１８に記載の医薬組成物。
項２０．  自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、又は多発性硬化症である、項１７に記載の医薬組成物。
項２１．  炎症性疾患が、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、又はシェーグレン症候群である、項１７に記載の医薬組成物。
項２２．  感染症が、細菌感染症、脳炎、髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群、肺炎、敗血症、火傷性、又は外傷性感染症である、項１７に記載の医薬組成物。
項２３．  アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、又は食物アレルギーである、項１７に記載の医薬組成物。
項２４．  神経再生が求められる患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、神経再生方法。
項２５．  アルツハイマー病を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法。
項２６．  敗血症を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、敗血症の治療方法。
項２７．  がんを罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、癌の治療方法。
項２８．  がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、項２７に記載の治療方法。
項２９．  播種性血管内凝固症候群を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、播種性血管内凝固症候群の治療方法。
項３０．  播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、項２９に記載の播種性血管内凝固症候群の治療方法。
項３０．  中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、前記疾患の治療方法。
項３１．  神経再生用の医薬の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３２．  アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３３．  敗血症の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項
項３４．  がんの予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３５．  播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３６．  中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３７．項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を用いて免疫測定により検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する工程を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法。
項３８．項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、アルツハイマー病等の神経変性疾患を効果的に予防及び／又は治療でき、当該神経変性疾患に伴う症状の緩和が顕著に改善することができる。本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の作用機序について限定的な解釈を望むものではないが、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害することによりＳｅｍａ３Ａのシグナル伝達を阻害し、その結果、神経原線維変化における、リン酸化型Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＭＰ）の蓄積が阻害されるからであると考えられる。更に、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、神経変性疾患以外の中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患等の予防及び／又は治療にも有効であり、とりわけ、敗血症のように感染や強い炎症誘発刺激により免疫力機構が破綻した炎症性疾患に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すことができる。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞の遊走・浸潤活性を効果的に抑制でき、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤不応答性を解除し、薬剤感受性を回復できるので、がんの予防及び／又は治療にも有効である。更に、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、血中ＰＡＩ−１量の増加を抑制する作用があり、播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療にも有効である。【００１７】
また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定にも使用することができる。とりわけ、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用することにより、血清存在下でもＳｅｍａ３Ａタンパク質を高精度に測定でき、生体由来検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１において、１３株の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンが得られたことを示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体のＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合特異性を評価した結果を示すグラフである。
【図３】図３には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及び抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−ヒトキメラ抗体を電気泳動してＣＢＢ染色した結果を示す。
【図４】図４には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及びトリ−ヒトキメラ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａ抗原に対する反応性を試験した結果を示す。
【図５】図５には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及びトリ−ヒトキメラ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、競合ＥＬＩＳＡ法により、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する親和性を測定した結果を示す。
【図６】図６には、実施例２〜４で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、血清を含まない試験サンプル中のＳｅｍａ３ＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す。
【図７】図７には、実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、血清を含む試験サンプル中のＳｅｍａ３ＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す。
【図８】図８には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。
【図９】図９には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。
【図１０】図１０には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。
【図１１】図１１には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。
【図１２】図１２には、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。
【図１３】図１３には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。
【図１４】図１４には、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。
【図１５】図１５は、実施例１０の結果を示す図である。図１５Ａは、Ｎｏｖｅｌ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔａｓｋの獲得試行時における、物体Ｂに対するアクセス率の結果を示すグラフである。図１５Ｂは、Ｎｏｖｅｌ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔａｓｋのテスト試行時における、物体Ｃに対するアクセス率の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は実施例１５の結果を示す図である。抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を投与した３試験を併合し、その生存率曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。
【図１７】図１７は実施例１６の結果を示す図である。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇを投与した群と陰性対照群について、生存率曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。
【図１８】図１８は実施例１７の結果を示す図である。Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅをマウスに接種し、炎症病態を惹起した後、１時間後に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇを投与した群と陰性対照群の生存率曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。
【図１９】図１９は実施例１８の結果を示す図である。播種性血管内凝固症候群モデルマウスに与える抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響を確認するため、マウスのＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１血中濃度を測定した結果を示す図である。
【図２０】図２０は実施例１９の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ−２）に対する細胞遊走能について、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質及び／又は抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が及ぼす影響を分析した結果である。
【図２１】図２１は実施例２０の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。
【図２２】図２２は実施例２０の結果を示す図である。ヒト膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。
【図２３】図２３は実施例２０の結果を示す図である。マウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。
【図２４】図２４は実施例２０の結果を示す図である。マウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を用いて細胞浸潤アッセイを行い、染色した浸潤細胞を顕微鏡観察した像である。
【図２５】図２５は実施例２１の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ−２）におけるゲムシタビン塩酸塩の感受性について、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質及び／又は抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が及ぼす影響を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体及びその抗体断片
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及びＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に特異的に結合し、当該タンパク質の機能を効果的に阻害することができる。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は、セマフォリンのクラス３型サブファミリーに属する遺伝子にコードされており、神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質のアミノ酸配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号；ヒト由来はＮＰ＿００６０７１．１、マウス由来はＮＰ＿０３３１７８．２）。
【００２１】
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の好適な一態様として、以下の（Ａ）〜（Ｅ）に示す重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むものが挙げられる。
（Ａ）  配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｂ）  配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｃ）  配列番号６８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｄ）  配列番号７６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号８０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｅ）  配列番号８４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号８８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
【００２２】
また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、重鎖及び軽鎖におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号１〜６、６０〜６２、６４〜６６、６８〜７０、７２〜７４、７６〜７８、８０〜８２、８４〜８６及び８８〜９０）は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入されたＣＤＲ配列を含む抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前のＣＤＲ配列を含む抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体と同等又同等以上であることが望ましい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのＣＤＲにつき１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個が挙げられる。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体において、重鎖及び軽鎖におけるＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列の中で、１つのアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよく、２以上のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されてもよい。
【００２３】
また、前記ＣＤＲのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換に関しては、類似アミノ酸による置換（即ち保存的アミノ酸置換）は、抗体の結合活性に変化をもたらさないことが予測されるため好適である。具体的には、アミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン
酸性アミノ酸：グルタミン酸、アスパラギン酸
中性アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、プロリン
更に、前記中性アミノ酸は、極性側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、アミド含有側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン）、硫黄含有側鎖を有するもの（メチオニン、システイン）、芳香族側鎖を有するもの（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基含有側鎖を有するもの（セリン、トレオニン、チロシン）、脂肪族側鎖を有するもの（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等に分類することもできる。
【００２４】
１又は数個のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法については、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．１５２，ｐ．２７１−２７５（１９９５）；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＭＪ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１００，ｐ．４６８−５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，ｐ．９４４１−９４５６（１９８４）；  Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０−３６７（１９８７）；  Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．４８８−４９２（１９８５）等）が知られており、当該部位特異的変異誘発法を用いてＣＤＲのアミノ酸配列にアミノ酸置換を行うことができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、ＷＯ２００５／０８０４３２に記載されているライブラリー技術が挙げられる。
【００２５】
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体において、可変領域中のフレームワーク領域、及び定常領域のアミノ酸配列は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。
【００２６】
前記ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号１〜６、６０〜６２、６４〜６６、６８〜７０、７２〜７４、７６〜７８、８０〜８２、８４〜８６及び８８〜９０）は、トリ抗体由来であり、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、トリ抗体であってもよいが、好ましくはキメラ抗体及びヒト化抗体が挙げられる。
【００２７】
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる領域同士を連結した抗体である。本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体をキメラ抗体にする場合、医薬組成物や各種疾患の治療剤として用いる場合には、トリ抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域から構成されるトリ−ヒトキメラ抗体ないしはトリ抗体由来の可変領域とマウス抗体由来の定常領域から構成されるトリ−マウスキメラ抗体であることが望ましく、トリ−ヒトキメラ抗体がより好ましい。また、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の免疫測定及び測定用キットに用いる場合には、トリ‐ヒトキメラ抗体、トリ−マウスキメラ抗体の他、トリ抗体由来の可変領域とウサギ抗体由来の定常領域から構成されるトリ−ウサギキメラ抗体やトリ抗体由来の可変領域とヤギ抗体由来の定常領域から構成されるトリ−ヤギキメラ抗体も使用できる。トリ−ヒトキメラ抗体、トリ−マウスキメラ抗体、トリ−ウサギキメラ抗体又はトリ−ウサギキメラ抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号７、８、５９、６７、７５、及び８３に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、トリ−ヒトキメラ抗体、トリ−マウスキメラ抗体、トリ−ウサギキメラ抗体又はトリ−ウサギキメラ抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号９及び１０、６３、７１、７９、８７に示すアミノ酸配列が挙げられる。これらの可変領域のアミノ酸配列（配列番号７〜１０、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、及び８７）は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前と同等又は同等以上であれば、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、重鎖可変領域（配列番号７、８、５９、６７、７５、８３）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号９、１０、６３、７１、７９、８７）において、１〜２１個、好ましくは１〜１４個、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。なお、重鎖可変領域（配列番号７、８、５９、６７、７５、８３）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号９、１０、６３、７１、７９、８７）において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸は、前記ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列以外の領域であることが望ましい。また、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換は、前記する保存的アミノ酸置換であることが望ましい。
【００２８】
また、ヒト化抗体とは、非ヒト由来のＣＤＲ配列をヒト抗体のフレームワーク領域上に移植したものであり、非ヒト由来抗体のＣＤＲとヒト抗体由来のフレームワーク領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成される抗体である。ヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を医薬用途に使用する場合に好適である。ヒト化抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号１１に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、ヒト化抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列が挙げられる。これらの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１〜１３）は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前と同等であれば、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、重鎖可変領域（配列番号１１）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号１２、１３）において、１〜２１個、好ましくは１〜１４個、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。なお、重鎖可変領域（配列番号１１）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号１２、１３）において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸は、前記ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列以外の領域であることが望ましい。また、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換は、前記する保存的アミノ酸置換であることが望ましい。
【００２９】
キメラ抗体は、例えば、前記各ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するトリ抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８１，ｐ．６８５１−６８５５（１９８４）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．６０４−６０８（１９８４）；  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１４，ｐ．４５２−４５４（１９８５）等）。トリ−ヒトキメラ抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号７、８、５９、６７、７５、及び８３をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号１４、１５、１０３、１１１、１１９、及び１２７にそれぞれ示す。また、トリ−ヒトキメラ抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号９、１０、６３、７１、７９、及び８７をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号１６、１７、１０４、１１２、１２０、及び１２８にそれぞれに示す。ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。具体的には、以下の方法により、トリ−ヒトキメラ抗体を作製することができる。
【００３０】
まず、所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むトリ重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様の方法で、軽鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のキメラ抗体を分離する。また、トリ−ヒトキメラ抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域中のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，  Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１−８５６（１９９３））。
【００３１】
また、ヒト化抗体は、例えば、前記各アミノ酸配列を含むＣＤＲ１〜３をヒト抗体のフレームワーク領域上に移植することにより作製できる（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１，ｐ．５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２，ｐ．３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐ．１５３４−１５３６（１９８８））。重鎖ＣＤＲ１（配列番号１、６０、６８、７６、及び８４）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１８、９７、１０５、１１３、及び１２１に示す。重鎖ＣＤＲ２（配列番号２、６１、６９、７７、及び８５）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１９、９８、１０６、１１４、及び１２２に示す。重鎖ＣＤＲ３（配列番号３、６２、７０、７８、及び８６）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２０、９９、１０７、１１５、及び１２３に示す。軽鎖ＣＤＲ１（配列番号４、６４、７２、８０及び８８）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２１、１００、１０８、１１６、及び１２４に示す。軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５、６５、７３、８１、及び８９）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２２、１０１、１０９、１１７、及び１２５に示す。軽鎖ＣＤＲ３（配列番号６、６６、７４、８２、及び９０）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２３、１０２、１１０、１１８、及び１２６に示す。具体的には、以下の方法により、ヒト化抗体を作製することができる。
【００３２】
所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜３と、４つのヒト抗体由来のフレームワーク領域を所定の順に連結した重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。ここで、ヒト化抗体の各ＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成できるようにフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失及び／又は付加等の変異を加えていてもよい（Ｓａｔｏ，  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１−８５６（１９９３））。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様に、軽鎖重鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のヒト化抗体を分離する。ヒト化抗体に用いられる重鎖可変領域である配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２４に示す。また、ヒト化抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号１２及び１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２５及び２６にそれぞれ示す。ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。
【００３３】
また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のアイソタイプについては、特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1、ＩｇＡ2）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好適である。
【００３４】
また、本発明では、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の抗原結合領域を含む限り、その抗体断片を使用することもできる。このような抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ等が挙げられる。これらの抗体断片は、従来公知の方法に従って作製することができる。
【００３５】
本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又はその抗体断片は、ポリエチレングリコール、放射性物質、トキシン等の各種化合物と結合したコンジュゲート抗体又はコンジュゲート抗体断片であってもよい。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又はその抗体断片は、必要に応じて、結合している糖鎖を改変したり、他のタンパク質が融合していてもよい。
【００３６】
２．医薬組成物
本発明は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片によって、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害することができ、各種薬理効果を奏することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物において、有効成分として含有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、前記（Ａ）〜（Ｅ）の態様のいずれであってもよいが、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能をより一層効果的に阻害させて卓越した薬効を奏させるという観点から、好ましくは前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が挙げられる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を有効量含んでさえあればよく、その他に、医薬的に許容される担体又は添加剤を含むものであってもよい。このような担体又は添加剤としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他に、医薬組成物において一般的に使用されている担体又は添加剤が適宜使用できる。
【００３９】
また、本発明の医薬組成物の投与形態については、経口的又は非経口的のいずれであってもよく、具体的には、経口投与；静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与、眼内投与等の非経口投与が挙げられる。
【００４０】
本発明の医薬組成物の製剤形態については、採用する投与形態に応じて、その製剤形態を適宜設定することができる。例えば、経口投与で使用される場合には、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の製剤形態に調製すればよく、非経口投与で使用される場合には、液剤、懸濁液、エマルジョン、スプレー剤、坐剤、点眼剤等の製剤形態に調製すればよい。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の作用により、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害できるので、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療に有用である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患としては、例えば、中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、アレルギー性疾患、がん等が挙げられる。中枢又は末梢神経系疾患としては、具体的には、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、脊髄小脳変性症等）等が挙げられる。自己免疫疾患としては、具体的には、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症等が挙げられる。炎症性疾患としては、具体的には、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、シェーグレン症候群等が挙げられる。感染症としては、具体的には、細菌感染症、脳炎／髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ／重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、敗血症、火傷性、外傷性感染症等が挙げられる。アレルギー性疾患としては、具体的には、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、食物アレルギー等が挙げられる。がんとしては、具体的には、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌等が挙げられる。
【００４２】
特に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の神経再生阻害能を効果的に抑制でき、神経の再生及び伸長を促進することが可能であることから、本発明の医薬組成物は、神経再生伸長を目的とした医薬組成物（即ち、神経再生伸長用医薬組成物）として有用である。また、本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片によって神経そのものを再生及び伸長させることが可能であるので、神経変性疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物として特に有用である。
【００４３】
更に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、敗血症や、他のサイトカインストームを伴う疾患、例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、トリインフルエンザ、天然痘、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、薬物誘発性サイトカインストーム等、感染や強い炎症誘発刺激によって免疫機構が破綻する炎症性疾患に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すので、これらの疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物としての有用性も高い。
【００４４】
また、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞の遊走・浸潤活性を効果的に抑制する作用を発揮し、癌の憎悪・進展に関する病態に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すので、癌の疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物としての有用性も高い。また、本発明の医薬組成物を癌の予防及び／又は治療用途に使用する場合には、他の抗癌剤と併用してもよい。特に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導されるがん細胞の抗がん剤不応答性を解除し、薬剤感受性を回復できるので、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を他の抗がん剤と併用することによって卓越したがんの予防及び／又は治療効果を示すことができる。前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を他の抗がん剤と併用する場合、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と他の抗がん剤を同一の医薬組成物に含有させて製剤化してもよく、また前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と他の抗がん剤を別々の医薬組成物に含有させて製剤化してもよい。
【００４５】
また、本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の作用により、血中ＰＡＩ−１量の増加を抑制できるので、播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療にも有効である。播種性血管内凝固症候群を伴う基礎疾患としては、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、血栓症、重症感染症等が挙げられる。
【００４６】
本発明の医薬組成物の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢や体重、疾患の種類や症状の程度等によって異なり、一律に規定することはできないが、神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要することから、その間セマフォリンの活性を抑制するために必要な回数投与することが好ましい。例えば、１回の投与当たり、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の重量換算で０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇに相当する量を、１〜３０日に１回程度の頻度で投与すればよい。なお、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いたり、オスモティックポンプ等で長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。そして、これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてＳｅｍａ３Ａタンパク質の活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
【００４７】
３．Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法及び測定キット
本発明は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を利用したＳｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法を提供する。本発明の測定方法では、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と、検体中のＳｅｍａ３Ａとの抗原抗体反応を利用して検体中のＳｅｍａ３Ａを免疫測定する。
【００４８】
本発明の測定方法では、検体中のＳｅｍａ３Ａと反応させる抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、前記（Ａ）〜（Ｅ）の態様のいずれであってもよいが、より高精度にＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定するという観点から、好ましくは前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が挙げられる。
【００４９】
検体としては、Ｓｅｍａ３Ａの測定が求められるものであることを限度として特に制限されないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、関節液、リンパ液、羊水、乳汁、各種組織液、海馬抽出液、各種組織抽出液等の生体由来検体が挙げられる。
【００５０】
本発明の測定方法は、サンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれの免疫測定を採用してもよい。サンドイッチ法では、抗原を捕獲するキャプチャー抗体と、当該キャプチャー抗体に結合した抗原に対して結合する一次抗体を使用するが、本発明の測定方法において、サンドイッチ法を採用する場合には、前記（Ａ）〜（Ｅ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の中から、１つの態様のものをキャプチャー抗体として使用し、他の態様のものを一次抗体として使用すればよい。サンドイッチ法を採用する場合、前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片をキャプチャー抗体として使用し、前記（Ｂ）又は（Ｃ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を一次抗体として使用すると、より一層高精度なＳｅｍａ３Ａタンパク質の測定、とりわけ血清存在下でのＳｅｍａ３Ａタンパク質の高精度な測定が可能になるため、特に好適である。
【００５１】
また、免疫測定は、標識の種類に応じて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射性同位体免疫測定法等があるが、本発明の測定方法では、これらのいずれを使用してもよい。測定の簡易性や迅速性の観点から、好ましくは酵素免疫測定法が挙げられる。
【００５２】
抗原抗体反応を利用した免疫測定自体は公知であり、本発明の測定方法は、免疫測定の測定原理や標識の種類に応じた公知の手法で行うことができる。
【００５３】
更に、本発明は、前記測定方法に使用される測定キットについても提供する。本発明の測定キットには、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が含まれる。
【００５４】
また、本発明の測定キットには、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片以外に、更に免疫測定の測定原理や標識の種類に応じて、他の試薬や器具が含まれていてもよい。例えば、酵素免疫測定法を選択する場合、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片以外に、測定プレート、色原性基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液等が含まれていてもよい。また、サンドイッチ法を採用する場合には、キャプチャー抗体として使用される前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、固相に固定化された状態で提供されてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されて解釈されるものではない。【００５６】
実施例１：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ抗体、トリ−マウスキメラ抗体）の作製
１）細胞培養
ニワトリＢ細胞由来のＤＴ４０細胞の細胞培養を以下の方法で行った。培養機はＣＯ2恒温槽を用い、５％のＣＯ2存在下で３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）を用い、１０容量％ＦＢＳ、１容量％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、２−メルカプトエタノール５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬに溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ又は２．５ｎｇ／ｍＬとなるように、適宜培地で希釈して用いた。【００５７】
２）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生細胞取得
横浜市立大学医学部分子薬理神経生物学教室で所有しているマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質発現株を用いて作製したマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原として、Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＡＤＬｉｂ）システム（カイオム・バイオサイエンス社）を用いて抗体産生細胞を得た。具体的には以下の実験プロセスを経ている。【００５８】
２−１）抗原固定磁気ビーズの作製
Ｈｉｓ−ｔａｇ用磁気ビーズへのマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質の固定は、以下の手順に従って実施した。磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＴＡＬＯＮ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、磁気スタンドはＤｙｎａｌ  ＭＰＣ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。【００５９】
ビーズ２２．５μＬを４５μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗った後、ＰＢＳ緩衝液中で６．１μｇのマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質と４℃で１０分間、回転により攪拌しながら反応させた。その後４５μＬのＢｕｆｆｅｒＣ（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）で４回洗浄した後、ＢｕｆｆｅｒＣ４５μＬに懸濁した。【００６０】
２−２）抗原固定磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択
トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍＬ又は２．５ｎｇ／ｍＬを含むＩＭＤＭ培地で５週間以上培養した野生型ＤＴ４０細胞約８×１０8個を１×１０8個ずつ８分割し、それぞれを洗浄液（１重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）１０ｍＬで１回、更に同洗浄液１ｍＬで１回洗浄した後、１ｍＬの洗浄液中において２−１）で作製した抗原固定磁気ビーズ５×１０6個とそれぞれ混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  ｍＬ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、１．７ｍＬの洗浄液で３分、３回洗浄した。最後に、抗原固定磁気ビーズに結合した細胞を５００μＬ培地に懸濁し、これを２０ｍＬの培地に加えたのち、９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、３９．５℃で培養した。この作業以降の培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に、１０容量％ＦＢＳ、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ，２−メルカプトエタノール５５μＭを加えたものを使用した。【００６１】
２−３）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡは直接固相法で、以下の手順に従って行った。前記２−２）のステップの６日後、マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を２．５μｇ／ｍＬで３８４ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）に２０μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、オボアルブミン（ＯＡ）、ウサギＩｇＧ（ｒＩｇＧ）も同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）４５μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５重量％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）１２０μＬで５回洗浄し、前記２−２）で選別して生じたコロニー由来の培養上清それぞれ２５μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄液１２０μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をブロッキングバッファーで２０００倍に希釈したものを２５μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお、二次抗体はａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＭ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄液１２０μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）を２５μＬ入れ、３０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸２５μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００６２】
この結果、図１に示すように、抗原固定磁気ビーズへの直接固定法セレクションにより、直接固相ＥＬＩＳＡで、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローン１３株が得られた。【００６３】
得られた陽性クローンの内、Ｎｏ．４及びＮｏ．６株について限界希釈法により抗体産生細胞のクローニングを以下のように行った。【００６４】
各株の各々を細胞１×１０3個／ｍＬに調製し、その１５０μＬを６０ｍＬの培地に加え、２００μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）３枚に撒きこみ、７日間静置培養を行った。各株より細胞コロニーが確認できた２０クローンについて２−３）の欄に記載の方法でマウスＳｅｍａ３Ａ抗体産生クローンのスクリーニングを実施した。各株について、マウスＳｅｍａ３Ａ抗体産生が陽性を示すクローンから２クローンずつ選択し、高密度培養を行った。【００６５】
高密度培養は、各クローンを拡大培養し、細胞数が４×１０7個になるまで増殖させた。十分な細胞数にまで増殖したことを確認し、２０容量％ニワトリ血清成分入りＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）を使用して、ＣＥＬＬｉｎｅ  ＣＬ−１０００（ＢＤ社）での培養を行った。ニワトリ血清成分は、抗体除去ニワトリ血清のことである。作製方法は、ニワトリ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）から５０％飽和硫安によりイムノグロブリンを沈殿として除去し、上清をＰＢＳ緩衝液に透析し、透析により生じた体積増加をＣｅｎｔｒｉ  Ｐｒｅｐ（Ａｍｉｃｏｎ社）による濃縮で補正した。約９６時間程度培養後、細胞の生存率を測定しながら、生存率が５０％以下になるまで培養を継続した。生存率が５０％以下になった時点で、培養上清を回収した。【００６６】
３）ＥＬＩＳＡ用培養上清の作製
ＥＬＩＳＡにより力価を解析した培養上清は、血清由来のＩｇＭ等を除去するため、以下のようにして調製した。ニワトリ血清成分をＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）に３％の濃度で加えた。ここに約１×１０6個／ｍＬの濃度になるように細胞を加え、２日培養して、培養上清を取得した。【００６７】
４）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンの選択
前記３）で得られたＥＬＩＳＡ用培養上清について、ＥＬＩＳＡにより抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体濃度の測定を行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生能が高いクローンＮｏ．４−２株を得た。【００６８】
５）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（ＩｇＭ）を含む培養上清の調製
前記４）で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体産生クローンＮｏ．４−２株を用いて、ＩＭＤＭ培地で５％ＣＯ2存在下、３９．５℃でＣＯ2恒温槽を用いて培養し、その培養上清を回収した。【００６９】
６）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）の作製
前記４）で得た抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンＮｏ．４−２株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー１：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２７））、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列とマウス抗体軽鎖定常領域の配列を含むアンチセンスプライマー（プライマー２：ＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣ（配列番号２８））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。その一方で、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー３：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧ（配列番号２９））、トリ抗体重鎖可変領域の領域とマウスＩｇＧ２ａ抗体定常領域を含むアンチセンスプライマー（プライマー４：ＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号３０））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。一方、マウス抗体λ軽鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域のセンスプライマー配列とマウス抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー５：ＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ（配列番号３１））、及びアンチセンスプライマー（プライマー６：ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号３２））を用いたＰＣＲにより、マウス軽鎖定常領域遺伝子を増幅した。さらにマウスＩｇＧ２ａ抗体重鎖定常領域のｃＤＮＡ配列を鋳型とし、トリ抗体重鎖可変領域のセンスプライマー配列とマウスＩｇＧ２ａ抗体重鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー７：ＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴ（配列番号３３））、及びアンチセンスプライマー（プライマー８：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧ（配列番号３４））を用いたＰＣＲにより、マウス重鎖定常領域遺伝子を増幅した。【００７０】
増幅された軽鎖可変領域断片と軽鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマー１及びプライマー６を用いたＰＣＲにより、トリ−マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子を増幅した。さらに、増幅された重鎖可変領域断片と重鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマー３及びプライマー８を用いたＰＣＲにより、トリ−マウスキメラ抗体重鎖遺伝子を増幅した。【００７１】
トリ−マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子とトリ−マウスキメラ抗体重鎖遺伝子をそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで処理した後、哺乳細胞発現用プラスミドｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングした。クローニングした抗体遺伝子配列はＤＮＡシークエンサーを用いたシークエンシングによって確認した。決定された塩基配列をもとに、トリ−マウスキメラ抗体軽鎖とトリ−マウスキメラ抗体重鎖のアミノ酸配列を翻訳した。最終的に決定されたトリ−マウスキメラ抗体重鎖のアミノ酸配列を配列番号３５に、最終的に決定されたトリ−マウスキメラ抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に示す。【００７２】
上記にて作製したプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）へポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養で７日間培養した培養上清を回収した。【００７３】
培養上清中に含まれる抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）の濃度はＥＬＩＳＡで定量した。この培養上清から、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）を充填して作製したカラムを用いて、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を精製した。ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した。【００７４】
精製した抗体の抗原に対する特異性の測定は、ＰＢＳ緩衝液を用いたＥＬＩＳＡにより行った。２．５μｇ／ｍＬの抗原を９６Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原（マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質）によるプレートのコートを行った。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、別途、オボアルブミン、ウサギＩｇＧ、スキムミルクも同様にプレートに固定した。翌日、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（０．５％スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを加え、３０分反応させた。洗浄液２００μＬで３回洗浄し、抗体を含む培養上清を１００μＬ加え、１時間反応させた。洗浄液２００μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈したものを１００μＬ加え、一時間反応させた。洗浄液２００μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬを加え、５分発色反応させ、１Ｍ硫酸１００μＬを加えて反応を停止させた。μＱｕａｎｔＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。【００７５】
７）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体の可変領域におけるＣＤＲ配列の決定
上記で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体について、ＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２）に従って行った。その結果、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列として、下記配列が特定された。【００７６】
【表１】
2014123186.tif 000002
【００７７】
実施例２：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（ヒト化抗体、トリ−ヒトキメラ抗体）の作製
１）ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）遺伝子の構築
前記実施例１の４）で得たクローンＮｏ．４−２株が産生する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の可変領域のフレームワーク領域を、ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸に変更することにより２種のヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）の設計を行なった。【００７８】
設計された重鎖（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１、２共通）及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−１の軽鎖アミノ酸配列をコードする遺伝子を、ヒト細胞で発現させるためのコドンオプティマイゼーションを考慮して、それぞれ合成した。一方、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２の軽鎖は、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１の軽鎖遺伝子配列を鋳型として、センスプライマー（プライマーＡγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴ（配列番号３７））とアンチセンスプライマー（プライマーＢγ：ＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＡ（配列番号３８））でＰＣＲ増幅した産物と、センスプライマー（プライマーＣγ：ＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号３９））とアンチセンスプライマー（プライマーＤγ：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣ（配列番号４０））でＰＣＲ増幅した産物を、センスプライマーＡγとアンチセンスプライマーＤγでアセンブルＰＣＲすることで合成した。【００７９】
２）トリ‐ヒトキメラ抗体遺伝子の構築
トリ‐ヒトキメラ抗体遺伝子を次のように構築した。前記実施例１の４）で得たクローンＮｏ．４−２株のｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＥγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴ（配列番号４１））及びトリ抗体λ軽鎖可変領域の配列とヒト抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むアンチセンスプライマー（プライマーＦγ：  ＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号４２））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。また、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＧγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧ（配列番号４３））、トリ抗体重鎖可変領域の領域とヒト抗体ＩｇＧ１定常領域を含むアンチセンスプライマー（プライマーＨγ：  ＧＣＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号４４））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。一方、合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ−１のヒト抗体λ軽鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、ヒト抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＩγ：  ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＧＴＧ（配列番号４５））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＪγ：  ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＧＧＴＴ（配列番号４６））を用いたＰＣＲにより、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子を増幅した。さらに合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ−１のヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＫγ：ＧＣＴＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号４７））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＬγ：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧ（配列番号４８））を用いたＰＣＲにより、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を増幅した。【００８０】
増幅された軽鎖可変領域断片と軽鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマーＥγ及びプライマーＪγを用いたＰＣＲにより、トリーヒトキメラ抗体軽鎖遺伝子を増幅した。更に、増幅された重鎖可変領域断片と重鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマーＧγ及びプライマーＬγを用いたＰＣＲにより、トリーヒトキメラ抗体重鎖遺伝子を増幅した。【００８１】
３）発現ベクターの構築とタンパク質発現、精製、濃度測定
合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ−１の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子、並びにトリ‐ヒトキメラ抗体の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで処理した後、哺乳細胞発現用プラスミドｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングした。クローニングされた抗体遺伝子配列はＤＮＡシークエンサーを用いたシークエンシングによって確認した。決定された塩基配列をもとに、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）とトリ‐ヒトキメラ抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を翻訳した。【００８２】
最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）の重鎖のアミノ酸配列を配列番号４９に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５０に示す。当該重鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）には、配列番号１１に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５２に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５１）には、配列番号１２に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５３に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５４に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）には、配列番号１３に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。【００８３】
また、最終的に決定されたトリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２由来）の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５５に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５６に示す。当該重鎖のアミノ酸配列（配列番号５５）には、配列番号８に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたトリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２由来）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５７に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５８に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５７）には、配列番号１０に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。【００８４】
上記にて作製した発現プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）にポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養で７日間培養した後、培養上清を回収した。【００８５】
この培養上清から、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）を充填して作製したカラムを用いて、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）、及びトリーヒトキメラ抗体を精製した。ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した。【００８６】
精製した抗体のアミノ酸組成より分子吸光係数を算出し、紫外吸光法により濃度を決定した。精製した抗体５００ｎｇを還元又は非還元の状態で電気泳動し、ゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した。結果を図３に示す。なお、図３には、実施例１で得られたトリ−マウス抗体、及びＣＬ１８Ｍ（＋）トリ−マウスキメラ抗体（コントロール）について、同様に電気泳動してＣＢＢ染色した結果も併せて示す。【００８７】
実施例３：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ−マウスキメラ抗体）の作製
ヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原とし、ニワトリＩｇＭの定常領域をマウスＩｇＧに置換したＤＴ４０細胞を用いたこと以外は、実施例１に記載の１）及び２）と同様の手法で抗体のスクリーニングを行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローン８株を得た。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローンの中の１６５株及び５８２株を使用し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の製造及び精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）（クローンＮｏ．１６５株由来及びクローンＮｏ．５８２株由来）を得た。各抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２）に従って行った。得られた結果を表２及び３に示す。【００８８】
【表２】
2014123186.tif 000003
【００８９】
【表３】
2014123186.tif 000004
【００９０】
実施例４：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ抗体、トリ−ヒトキメラ抗体）の作製
１）トリ抗体（ＩｇＭ）の作製
マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原として、実施例１に記載の１）及び２）と同様の手法で抗体のスクリーニングを行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローンを得て、その中の２４０−４０株及び２５５−７２株を使用し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の製造及び精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来及びクローンＮｏ．２５５−７２株由来）を得た。各抗Ｓｅｍａ３Ａ  トリ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＮＩＨ  ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１−３２４２）に従って行った。得られた結果を表４及び５に示す。【００９１】
【表４】
2014123186.tif 000005
【００９２】
【表５】
2014123186.tif 000006
【００９３】
２）トリ−ヒトキメラ抗体（ＩｇＧ１）の作製
抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローン２４０−４０株及び２５５−７２株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＭγ：ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣ（配列番号９１））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＮγ：ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＣ（配列番号９２））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。その一方で、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＯγ：ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号９３））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＰγ：ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号９４））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。【００９４】
また、重鎖定常領域については配列番号９５、軽鎖定常領域については配列番号９６のＤＮＡ配列を遺伝子全合成によって作製し、いずれもＮｏｔＩ処理およびＥａｇＩ処理を行った後、ベクターｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＮｏｔＩサイトに接続した。【００９５】
上記のように作製した定常領域を含むベクターに対して、上記で増幅した可変領域の配列をクローニングした。具体的には、重鎖定常領域ベクター、軽鎖定常領域ベクターをいずれもＮｏｔＩ処理し、それぞれ重鎖可変領域ｃＤＮＡ、軽鎖可変領域ｃＤＮＡをＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて接続した。【００９６】
上記にて作製したプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）へポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養し、培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＡによる精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−ヒトキメラ抗体（ＩｇＧ１）（クローンＮｏ．２４０−４０株由来及びクローンＮｏ．２５５−７２株由来）を得た。【００９７】
実施例５：抗原に対する特異性の測定
実施例１で得られたトリ−マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）及びトリ−ヒトキメラ抗体について、抗原に対する特異性をＰＢＳ緩衝液を用いた抗原固相ＥＬＩＳＡによって測定した。また、実施例１で得られたトリ−マウスキメラ抗体をビオチン標識したものについても、同様に、抗原に対する特異性を測定した。更に、ネガティブコントロールとしてＣＬ１８Ｍ（＋）トリ−マウスキメラ抗体についても、同様に、抗原に対する特異性を測定した。具体的測定条件は、以下の通りである。【００９８】
先ず、２．５μｇ／ｍＬの抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を３８４Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、別途、オボアルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）も同様にプレートに固定した。反応後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）５０μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ）２５μＬを加え、３０分反応させた。洗浄液５０μＬで３回洗浄し、各抗体を２０μＬ加え、１時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗ヒトλ軽鎖ヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）をＰＢＳ緩衝液で４０００倍に希釈したもの、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈したもの、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社）をＰＢＳ緩衝液で１００００倍に希釈したものを２０μＬ加え、一時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｍ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００９９】
結果を図４に示す。図４から明らかなように、実施例１及び２で得られた各抗体は、ヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａ抗原に対する反応性が確認され、陰性抗原として用いられたオボアルブミンやＢＳＡには反応が認められなかった。この結果、実施例１及び２で得られた各抗体は、Ｓｅｍａ３Ａに対して特異的に交差性を示すことが確認された。【０１００】
実施例６：抗原に対する親和性の測定−１
実施例１で得られたクローンＮｏ．４−２由来のトリ−マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）及びトリ−ヒトキメラ抗体について、抗原に対する親和性の評価を競合ＥＬＩＳＡにより行った。また、ネガティブコントロールとしてＣＬ１８Ｍ（＋）トリ−マウス抗体についても、同様に、抗原に対する親和性を測定した。具体的測定条件は、以下の通りである。【０１０１】
まず、２．５μｇ／ｍＬの抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を３８４Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。翌日、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）５０μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ）２５μＬを加え、３０分反応させた。ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）、トリ−ヒトキメラ抗体、及びトリ−マウスキメラ抗体をそれぞれ２倍連続希釈し、ビオチン標識した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を最終濃度が６０ｎｇ／ｍＬになるように混合し、洗浄液５０μＬで３回洗浄した抗原固相プレートと１時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社）をＰＢＳ緩衝液で１００００倍に希釈したものを２０μＬ加え、３０分反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｍ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１０２】
得られた結果を図５に示す。また、各抗体について抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体の抗原抗体反応に対する５０％阻害濃度ＩＣ50（μｇ／ｍＬ）を算出した結果を表６に示す。その結果、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）、トリ−ヒトキメラ抗体、及びトリ−マウスキメラ抗体の親和性はほぼ同等であり、ヒト化による親和性の大きな変化は認められなかった。【０１０３】
【表６】
2014123186.tif 000007
【０１０４】
実施例７：抗原に対する親和性の測定−２
実施例１で得られたクローンＮｏ．４−２由来のトリ−マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）及びトリ−ヒトキメラ抗体について、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗原に対する親和性の評価を行った。具体的条件は、以下の通りである。【０１０５】
センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）をＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）にて活性化し、Ａｃｅｔａｔｅ５．０（ＧＥヘルスケア社）で５０μｇ／ｍＬに希釈されたＰｒｏｔｅｉｎＡ（ナカライテスク社）を反応、センサーとアミンカップリングした。キャプチャー量が約２００ＲＵになる抗体濃度で各抗体を反応させて、抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭの濃度で反応させた。結合時間は３分で乖離時間を４分とし、反応により得られたセンサグラムをＬａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎ  ｍｏｄｅｌ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１）（ＧＥヘルスケア社）にて解析してＫＤ値（解離定数）を算出した。【０１０６】
その結果、ヒトＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）では３〜４ｎＭ、トリ−ヒトキメラ抗体及びトリ−マウスキメラ抗体では１４〜１５ｎＭであった。また、マウスＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２）では４〜５ｎＭ、トリ−ヒトキメラ抗体及びトリ−マウスキメラ抗体では１７〜１８ｎＭであった。Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ−２のいずれのヒト化抗体も、キメラ抗体に比べてＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は低く、ヒト化により親和性が向上していることが分かった。【０１０７】
実施例８：サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＳｅｍａ３Ａの測定
実施例２〜４で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＳｅｍａ３Ａの測定を行った。具体的条件は、以下の通りである。【０１０８】
先ず、表７に示すキャプチャー抗体を１／２０００に希釈して、３８４Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｐ  Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、キャプチャー抗体によるプレートのコートを行った。反応後、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）４５μＬを加え、室温で２時間反応させた。次いで、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、各抗体を２０μＬ加え、１時間反応させた。その後、各ウェルに試験サンプルを２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。なお、試験サンプルとしては、組換えヒトＳｅｍａ３Ａ−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１２５０−Ｓ３−０２Ｊ）をＰＢＳで段階希釈したもの、又は組換えヒトＳｅｍａ３Ａ−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１２５０−Ｓ３−０２Ｊ）を、ＰＢＳで５倍希釈したヒト血清ｔｙｐｅ  ＡＢ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ４５２２）で段階希釈したものを使用した。次いで、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、表７に示す一次抗体（濃度０．１μｇ／ｍＬ、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した後に、以下の方法で二次抗体の反応及び検出を行った。【０１０９】
（条件１、２及び５〜８の場合）
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  ＃ＮＡ９３１；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／１０００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１１０】
（条件３及び４の場合）
ビオチン標識されたマウス抗トリＩｇＭ抗体（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ  ＃７３３０８７；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／２００００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  ２１１３０；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１００００倍希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１１１】
（条件９の場合）
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗ヤギＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社  ＃Ａ５０；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／１００００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１１２】
得られた結果を表７、図６及び７に示す。なお、図６には、条件１〜４及び８で血清を含まない試験サンプルを測定した結果として、抗原（Ｓｅｍａ３Ａ）とＯＤ４５０（４５０ｎｍの吸光度）値の関係を示す。また、図７には、条件１及び２で血清を含む試験サンプルを測定した結果として、抗原（Ｓｅｍａ３Ａ）とＯＤ４５０（４５０ｎｍの吸光度）値の関係を示す。これらの結果から、実施例１〜４で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用することによって、ＥＬＩＳＡにてＳｅｍａ３Ａを測定できることが明らかとなった。また、キャプチャー抗体として実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を使用し、一次抗体として実施例３で得られたトリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来及びクローンＮｏ．５８２株由来）を使用した場合（条件１及び２）には、血清中のＳｅｍａ３Ａについても高精度な測定ができ、生体由来の検体中のＳｅｍａ３Ａを測定可能であることも確認された。一方、市販されている抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用した場合（条件９）では、Ｓｅｍａ３Ａの検出はできなかった。【０１１３】
【表７】
2014123186.tif 000008
【０１１４】
実施例９：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ  ａｓｓａｙ）−１
１）試験方法
ニワトリ７日胚の後根神経節（ＤＲＧ）を摘出した。摘出したＤＲＧをＮＧＦ含有培地２５０μＬ入りのＰＬＬ・ラミニンコートした２４ウェルディッシュにて、３７℃で１６〜２０時間静置培養し、ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンが伸長しているのを確認した。別途、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（３ｎＭ）と、実施例１で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（培養上清）（抗体濃度として１０μｇ／ｍＬ）又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体（１０μｇ／ｍＬ）とを含む混合液を氷上で３０分間プレインキュベートした。この混合液を、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の最終濃度が、０、０．１、０．３ｎＭになるように、前記２４ウェルディッシュに添加し、３７℃で３０分間静置培養した。次いで、３．７％ホルマリン溶液で固定後、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎにて、培養ニューロンの軸索先端に形成される成長円錐の可視化を行った。蛍光顕微鏡下にて、全ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンのうち、成長円錐が退縮（ｃｏｌｌａｐｓｅ）しているニューロンの割合（％）を求めた。また、コントロールとして、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体の代わりに、抗ウサギＩｇＧ抗体又はマウスＩｇＧを使用して、上記と同様に退縮アッセイを行った。【０１１５】
２）結果
抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図８に、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図９に示す。図８及び９から明らかなように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体及び抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体には、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質によって成長円錐が退縮するのを抑制する作用があることが認められた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。【０１１６】
実施例１０：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ  ａｓｓａｙ）−２
１）試験方法
ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の代わりにヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を使用したこと以外は、上記実施例９と同様の手法で、退縮アッセイを行った。【０１１７】
２）結果
抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図１０に示す。図１０から分かるように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体がヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に抑制し、成長円錐の退縮を抑制できていた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒトにおいても、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。【０１１８】
実施例１１：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ  ａｓｓａｙ）−３
１）試験方法
ニワトリ７日胚の後根神経節（ＤＲＧ）を摘出した。摘出したＤＲＧをＮＧＦ含有培地２５０μＬ入りのＰＬＬ・ラミニンコートした２４ウェルディッシュにて、３７℃で１６〜２０時間静置培養し、ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンが伸長しているのを確認した。別途、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（３ｎＭ）と、実施例２で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）（培養上清）（抗体濃度として１００μｇ／ｍＬ）とを含む混合液を氷上で３０分間プレインキュベートした。この混合液を、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の最終濃度が、０、０．０５、０．１、０．３ｎＭになるように、前記２４ウェルディッシュに添加し、３７℃で３０分間静置培養した。次いで、３．７％ホルマリン溶液で固定後、Ａｌｅｘａ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎにて、培養ニューロンの軸索先端に形成される成長円錐の可視化を行った。蛍光顕微鏡下にて、全ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンのうち、成長円錐が退縮（ｃｏｌｌａｐｓｅ）しているニューロンの割合（％）を求めた。また、コントロールとして、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の代わりに、Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ｌａｍｂｄａを使用して、上記と同様に退縮アッセイを行った。【０１１９】
２）結果
抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を使用した退縮アッセイの結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体には、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質によって成長円錐が退縮するのを抑制する作用があることが認められた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒト化した場合にもＳｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。【０１２０】
実施例１２：ヒトＳｅｍａ３Ａに対する結合アッセイ
１）試験方法
野生型ＣＯＳ−７細胞、又はＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）を発現するように形質転換させたＣＯＳ−７細胞（ＮＲＰ１発現ＣＯＳ−７細胞）を準備した。別途、アルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（０．１ｎＭ）と、実施例１で得られたトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（培養上清）（抗体濃度として１０μｇ／ｍＬ）又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体（１０μｇ／ｍＬ）とを含むＤＭＥＭ培地を氷上で３０分間プレインキュベートしておき、この培地５００μＬを、予めＨＢＨバッファー（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．００，０．０５容量％ＢＳＡ，及び１０容量％ＦＢＳを含むハンクス平衡塩類溶液）でブロッキングしておいた野生型ＣＯＳ−７細胞又はＮＲＰ１発現ＣＯＳ−７細胞に添加して、氷上で１時間静置した。次いで、ＨＢＨバッファーを用いて細胞を４回洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞の固定化を行った。固定化された細胞をＨＨバッファー（２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．００を含むハンクス平衡塩類溶液）で１回洗浄した後、５００μＬのアルカリフォスファターゼ基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ：ｎｉｔｒｏ−ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／  ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３’−ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｓａｌｔ）を添加して、室温で一晩静置した。その後、顕微鏡にて細胞の発色の程度を観察した。また、コントロールとして、アルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を添加しなかったこと、或いは抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体の代わりにウサギＩｇＧを使用したこと以外は、上記と同様の手法で、結合アッセイを行った。なお、本試験に供したＮＲＰ１発現ＣＯＳ−７細胞において、ＮＲＰ１発現量に差がないことは、細胞から発せられるＥＧＦＰの蛍光強度から確認している。【０１２１】
２）結果
抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１２に、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１３に示す。図１２及び１３から明らかなように、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体と、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質との混合物を添加した場合には、ＮＲＰ１発現ＣＯＳ−７細胞へのヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の結合が阻害された。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に結合し、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とＮＲＰ１との結合を阻害できることが明らかとなった。【０１２２】
実施例１３：ヒトＳｅｍａ３Ｆに対する結合アッセイ
１）試験方法
ＮＲＰ１発現ＣＯＳ−７細胞の代わりに、ＥＧＦＰ融合ＮＲＰ２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−２）を発現するように形質転換したＣＯＳ−７細胞（ＮＲＰ２発現ＣＯＳ−７細胞）を使用し、且つアルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の代わりにアルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質を使用したこと以外は、上記実施例１２と同様の手法で、結合アッセイを行った。【０１２３】
２）結果
抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１４に示す。図１４から分かるように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体と、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質との混合物を添加した場合でも、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質のＮＲＰ２発現ＣＯＳ−７細胞への結合は阻害されなかった。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と相同性の高いサブファミリー分子であるＳｅｍａ３Ｆタンパク質には結合せず、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対して特異的に結合する可能性が示唆された。【０１２４】
実施例１４：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が認知機能に与える影響の分析
１）試験材料
１−１）Ａβ（２５−３５）及びＡβ（３５−２５）
Ａβ（２５−３５）（Ａｍｙｌｏｉｄ  β−Ｐｒｏｔｅｉｎ（２５−３５））（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ−１１９２）及びＡβ（３５−２５）（Ａｍｙｌｏｉｄ  β−Ｐｒｏｔｅｉｎ（３５−２５））（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ−２９６４）を蒸留水にて１ｍｇ／ｍＬに調製した後、３７℃にて４日間インキュベートし、Ａβ（２５−３５）溶液及びＡβ（３５−２５）溶液を調製した。この操作により、Ａβ（２５−３５）は凝集し、細胞毒性を獲得するようになる。また、Ａβ（３５−２５）は、活性型であるＡβ２５−３５のアミノ酸配列を逆転させた不活性型のＡβであり、上記操作後でも細胞毒性を発揮しない。Ａβ（３５−２５）は、ネガティブコントロールとして使用した。【０１２５】
１−２）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体
前記実施例１で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を生理食塩水にて１ｍｇ／ｍＬに調製し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体溶液を調製した。【０１２６】
１−４）ｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ
１ｍｇ／ｍＬのｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより入手）をｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ溶液として用いた。【０１２７】
１−５）マウス
日本チャールス・リバー社より購入した３週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。【０１２８】
２）試験方法
Ｎｏｖｅｌ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ  （ＮＯＲＴ）を以下の方法に従い行った。
まず、３週齢のマウスを用意し、マウスが実験者に慣れるよう、２週間の間、一日１０分間、実験者の手の上にマウスをのせるという、ハンドリング作業を行った。次に、マウスを表８に示す５群に分けて、表８に示す条件でＡβ及び抗体を脳室内に投与した。これらの溶液は、ｂｒｅｇｍａから右下１ｍｍに投与した。投与には、マイクロシリンジの針先にテフロンチューブ（エイコム）を連結させ、その先端に針先３．３ｍｍの部分を直角にした２７Ｇの注射針（テルモ）を挿入したものを用いた。【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
脳室内投与から３日後、マウスを３５ｃｍ×３５ｃｍ×３５ｃｍのテストケージに移し、１０分間テストケージに慣れさせた。翌日（投与４日後）、テストケージの所定の位置に物体Ａと物体Ｂを設置して１０分間の間にそれぞれの物体にアクセスした時間を測定した（獲得試行）。この時、物体と鼻先との距離が１ｃｍ以下になった時間をアクセス時間として測定した。さらに翌日（投与５日後）、物体Ｂを新規物体Ｃに替えて１０分間の試行中のアクセス時間を測定した（テスト試行）。【０１３１】
なお、物体Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ形状及び色が異なるものを使用した。物体Ａ、Ｂ、及びＣの具体的な形状・色は以下の通りである。
物体Ａ：水平方向に延びる基部（緑色）と、その中央から垂直に伸びる延長部（緑色）とで構成され、正面視Ｔ字型に形成されている。当該基部と延長部の形状は、共に直方体である。
物体Ｂ：基部が黄色、延長部が円柱形状で赤色であること以外は、上記物体Ａと同様である。
物体Ｃ：基部が黄色、延長部が側面の正面視で円弧状にくり抜かれた形状で黄色であること以外は、上記物体Ａと同様である。
物体Ａ、Ｂ、及びＣの基部をテストケージの底面に配置し、延長部が上方に延びるように設置した。【０１３２】
３）統計解析
獲得試行において、物体Ａ及び物体Ｂへの合計アクセス時間に対する、物体Ｂへのアクセス時間の割合（物体Ｂに対するアクセス率）を算出した。獲得試行時は物体Ａ及び物体Ｂ共に、新規物体であるので、どちらも同程度にアクセスすることが見込まれる。この時どちらかの物体に偏ったアクセスを示した場合は、薬物投与によって、認知機能等が障害された可能性があるので、本実験では評価できないということになる。更に、テスト試行において、物体Ａ及び物体Ｃへの合計アクセス時間に対する、物体Ｃへのアクセス時間の割合（物体Ｃに対するアクセス率）を算出した。テスト試行時は物体Ｃのみが新規物体であるので、もし物体Ａについての記憶を獲得していれば、物体Ｃに偏ったアクセスが見込まれる。以上から算出した物体Ｂに対するアクセス率、物体Ｃに対するアクセス率を、それぞれ一元配置分散分析を用いて統計解析を行った。群間比較はＴｕｋｅｙ−ＫｒａｍｅｒのＨＳＤ検定により行った。【０１３３】
４）結果
得られた結果を図１５Ａ（獲得試行）及び１５Ｂ（テスト試行）に示す。【０１３４】
図１５Ａから明らかなように、獲得試行時は全ての群の物体Ｂに対するアクセス率がほぼ約５０％で、どの群間も有意な差は認められなかった。従って、認知機能等の障害が認められず、本実験での記憶獲得に対する評価が可能であることが示された。一方、図１５Ｂに示されるように、テスト試行において、Ｉｎｔａｃｔ群及びＡβ（３５−２５）投与群（ネガティブコントロール）では、物体Ｃに対するアクセス率７５％程度であった。一方、Ａβ（２５−３５）投与群では、物体Ｃに対するアクセス率が５０％程度に止まり、Ｉｎｔａｃｔ群と比べて物体Ｃに対する嗜好性の減少が有意差を持って認められた（ｐ＜０．０００１，対Ｉｎｔａｃｔ群）。この結果は、Ａβ（２５−３５）投与による記憶障害により、物体Ａに対する記憶を獲得しなかったことを示している。【０１３５】
一方、図１５Ｂから明らかなように、Ａβ（２５−３５）＋抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体投与群では、物体Ｃに対するアクセス率が７５％程度であり、Ａβ（２５−３５）投与群、及びＡβ（２５−３５）＋ｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ投与群と比べ、有意差を持った回復を示した（ｐ＜０．０００１，対Ａβ（２５−３５）投与群ないしはＡβ（２５−３５）＋ｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ投与群）。【０１３６】
以上の結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体には、Ａβにより惹起される記憶障害誘導を阻害する効果が確認された。既に、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの発現上昇がアルツハイマー病患者の死後脳において認められていること、またＳｅｍａ３Ａシグナル伝達経路においてリン酸化修飾を受けるＣｏｌｌａｐｓｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＭＰ）が、アルツハイマー病変の一つである神経原線維変化にて、高度にリン酸化ＣＲＭＰされていることが知られている。従って、このような薬理効果は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が、Ｓｅｍａ３Ａ−ＣＲＭＰシグナルを遮断したものであると考察される。【０１３７】
実施例１５：抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体が免疫・炎症性疾患に与える影響の分析
実施例２で得られたトリ−マウスキメラ抗体について、敗血症の疑似病態モデルとされるＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  接種モデルを用い、致死的炎症病態に対する影響を分析した。【０１３８】
１）試験材料
１−１）Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（以下ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ番号：０３２Ｍ４０８２Ｖ）を生理食塩水にて６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。【０１３９】
１−２）トリ−マウス抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体
実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体を生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体溶液とした。【０１４０】
１−３）陰性対照用キメラ抗体
ニワトリＢ細胞由来のＤＴ４０細胞によって構築される抗体ライブラリーを用いて作製された非特異的トリ‐マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）（陰性対照用キメラ抗体）を、生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、陰性対照用キメラ抗体溶液とした。【０１４１】
１−４）マウス
日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。【０１４２】
２）試験方法
入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群５匹に分けて、表９に示す試験群を設定した。各抗体を尾静脈より投与した後、３０分後にＬＰＳを腹腔内に接種した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。同一の試験を計３回実施し再現性の確認を行った。【０１４３】
３試験間の非解離性を確認したうえで、これらの結果を併合しＤａｙ  ４における生存率改善効果とその有効性を判定した。また、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｙｅｒ法により生存率曲線を作成し、生存期間延長効果を判定した。【０１４４】
【表９】
2014123186.tif 000010
【０１４５】
３）統計解析
投与４日以前の死亡例を生存期間の延長なし（無効）とし、４日まで生存した例を生存期間の延長有り（有効）と判定した。これらの２値化データについて、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定を用いて３試験間の同一性を判定した上で、Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌ検定により３試験を併合した有効率の差を判定した。生存期間延長効果はｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を適用し判定した。【０１４６】
４）結果
得られた結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、３試験すべてにおいて抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体投与群の生存率が、陰性対照である非特異配列キメラ抗体投与群に比べ優れていた。これらの試験間での非乖離性を確認するため実施したＢｒｅｓｓｌｏｗ−Ｄａｙ検定が有意ではないことから３試験間に乖離はないと判断した（ｐ＝０．６２０２）。そのうえで３試験の結果を併合し、Ｃｏｃｈｒａｎ−Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｚｅｌ検定を実施したところ、ｐ＝０．０３６４となり、陰性対照群と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体群間の生存率には有意水準５％で統計的有意差が認められた。これらの結果から抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体は、致死的炎症病態を有するモデル動物において生存率を改善する効果を示し、かつその効果には再現性のあることが明らかとなった。【０１４７】
【表１０】
2014123186.tif 000011
【０１４８】
併合した３試験についてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により生存率曲線を作成し、その有意性を検討するためｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を実施した。その結果を図１６に示す。図１６に示す如く、生存期間分析においてもｐ＝０．０１１５という有意性を示し、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体には生存期間延長効果のあることが明らかとなった。【０１４９】
実施例１６：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が免疫・炎症性疾患に与える影響の分析
実施例２で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体についても、実施例１２と同様にＬＰＳ誘発炎症疾患モデルに対する影響を分析した。【０１５０】
１）試験材料
１−１）ＬＰＳ
ＬＰＳの調製は実施例１５と同様に行った。【０１５１】
１−２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を生理食塩水にて希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体溶液とした。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用い、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１００μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用いた。【０１５２】
１−３）陰性対照群用ヒト抗体
非特異的なヒトポリクローナル抗体（ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＰＯＬＹＣＬＯＮＡＬ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ；  ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、＃ＢＥ００９２）を、生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、陰性対照用ヒト抗体溶液とした。【０１５３】
１−４）マウス
日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。【０１５４】
２）試験方法
入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群１０匹に分けて、表１１に示す試験群を設定した。各抗体を尾静脈より投与した後、３０分後にＬＰＳを腹腔内に接種した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。【０１５５】
【表１１】
2014123186.tif 000012
【０１５６】
３）統計解析
実施例１２と同様に無効及び有効の２値化した生存割合に対し、片側によるＣｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を用い、想定される３種類の用量反応型、即ち直線的増加、低用量飽和、及び高用量立ち上がり型の対比を設定して生存率改善効果の用量反応性を判定した。また、生存期間延長効果はｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を適用し判定した。【０１５７】
４）結果
表１２に各群の生存率を示す。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体投与１００μｇ投与群では、陰性対照群（３０％）の２倍の生存率（６０％）となり、更に５００μｇ投与群は、１００μｇ投与群の結果を上回る生存率（８０％）が観察された。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体両用量において生存率が改善され、かつ用量依存傾向が認められた。【０１５８】
【表１２】
2014123186.tif 000013
【０１５９】
２値化された生存率に対するＣｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ検定では、直線増加型（ｐ＝０．０２１５）、低用量飽和型（ｐ＝０．０４５１）、および高用量立上り型（ｐ＝０．０７４３）の結果となり、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体による生存率改善効果は、１００μｇ以上の用量でほぼ直線的に増加したと判定された。【０１６０】
以上の結果は、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体も、実施例１５で示した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ−マウスキメラ抗体と同様に、ＬＰＳ誘発性の致死的炎症病態を抑え、生存率を改善し得る効果を有することを明瞭に示している。【０１６１】
明瞭な生存率改善効果の認められた５００μｇ投与群の生存率曲線を図１７に示す。ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定においてｐ＝０．０３０３となり、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が生存期間延長効果をもたらし得ることが示された。【０１６２】
実施例１７：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が病態誘発後の致死的炎症性疾患に与える影響の分析
実施例１６で得られた結果をもとに、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の効果について、ＬＰＳを先に接種し、病態を誘発した後からの処置による影響を判定した。【０１６３】
１）試験材料
１−１）ＬＰＳ
ＬＰＳの調製は実施例１５と同様に行った。【０１６４】
１−２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を生理食塩水にて希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体溶液とした。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ、２５０μｇ、１２５μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）をそれぞれ５、２．５、１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用いた。【０１６５】
１−３）陰性対照群用ヒト抗体
実施例１６と同様の方法で、陰性対照用ヒト抗体溶液を調製した。【０１６６】
１−４）マウス
日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。【０１６７】
２）試験方法
入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群１０匹に分けて、表１３に示す試験群を設定した。本試験では実施例１５及び１６と異なり、実医療に則した使用を想定し、既に炎症が惹起された後からの投与による効力判定を行った。まずＬＰＳを腹腔内に接種し炎症反応を惹起した。各抗体はＬＰＳ腹腔内接種１時間後に尾静脈より投与した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。【０１６８】
【表１３】
2014123186.tif 000014
【０１６９】
３）統計解析
陰性対照群を含む４群がとり得る用量反応型として、（１）実用量の直線回帰、（２）直線増加、（３）中用量立上り、（４）高用量立上り、（５）中用量飽和、（６）低用量飽和、及び（７）中用量立上り飽和型、の７つのタイプが想定される。この計７種の反応パターンに対しＣｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を用い、並べ替え再抽出法で多重調整したｐ値を算出したうえで、そのｐ値が最小となる対比反応型を適切な用量反応型として採択することとした。また、生存期間延長効果はｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を適用し判定した。【０１７０】
４）結果
表１４に投与４日後の各群の生存率を示す。陰性対照群の生存率は１０％であったが、ＬＰＳ接種後１時間に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１２５、２５０、及び５００μｇを投与した各群の生存率はそれぞれ、３０、４０、１００％であり、用量増加に伴い生存率も上がる傾向が観察された。特に、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群ではマウス１０匹全個体が生存するという特筆すべき効果が確認された。【０１７１】
【表１４】
2014123186.tif 000015
【０１７２】
２値化した生存率がとり得る７種の用量反応型を設定し、並べ換え再抽出法による多重調整Ｃｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を実施した。そのｐ値の計算結果を表１５に示す。なお、ｐ値の序列を示すため、表示桁数は不必要に多くしてある。【０１７３】
【表１５】
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【０１７４】
解析の結果、想定した全ての用量反応型において、有意性を示す結果が得られた。もっとも小さなｐ値を示した用量反応型は実用量直線増加型（ｐ＝０．００００１７９０）で、次いで直線増加型（ｐ＝０．００００４５４）、中用量立上り型（ｐ＝０．００００５７３０）、高用量立上り型（ｐ＝０．００００８０４０）の順であった。これらの結果は、本試験における生存率改善効果には明瞭な用量依存性があったことを科学的に示していると同時に、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が致死的炎症病態を制御し、生存率を改善し得る効力を有していることを示すものである。【０１７５】
全例が生存し明瞭な生存率改善効果の認められた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群の生存率曲線を図１８に示す。ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定ではｐ＜０．０００１となり有意水準を満たす結果が得られた。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体は致死性炎症病態発症後も、その病態を制御し生存期間延長効果を示すことが明瞭となった。【０１７６】
実施例１８：播種性血管内凝固症候群モデルマウスに与える抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響
敗血症や固形腫瘍等に伴う播種性血管内凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、以下ＤＩＣ）では、血中Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（以下ＰＡＩ−１）が増加し、線溶系を抑制することから多臓器不全を起こし重篤化する。血中ＰＡＩ−１量の増加を抑制できれば播種性血管内凝固症候群の進行を阻止できると考えられることから、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の血中ＰＡＩ−１量変動への影響を検討した。【０１７７】
１）試験材料
１−１）ＬＰＳ
ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ番号：１０２Ｍ４０１７Ｖ）を生理食塩水にて１．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。【０１７８】
１−２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。【０１７９】
１−３）マウス
日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。【０１８０】
２）試験方法
２−１）群構成
入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群５匹に分けて、表１６に示す試験群を設定した。【０１８１】
２−２）ＬＰＳ接種と抗体投与
ＬＰＳは１５ｍｇ／ｋｇの接種量となるよう腹腔内に接種した。抗体溶液は５００μｇ／マウスの接種量となるよう、５ｍｇ／ｍＬ溶液を０．１ｍＬ尾静脈より投与した。なお、ＬＰＳ非接種の条件１群には生理食塩水を腹腔内接種した。【０１８２】
２−３）マウスＰＡＩ−１の測定
ＬＰＳ接種から１．５、３、及び９時間後に血漿を採取し、マウスＰＡＩ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用い処置動物の血中ＰＡＩ−１濃度を測定した。【０１８３】
【表１６】
2014123186.tif 000017
【０１８４】
３）統計解析
抗体非投与群に対する抗体投与群について両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。【０１８５】
４）結果
図１９に血中ＰＡＩ−１濃度の測定結果を示す。ＬＰＳ非処置群（条件１）では血中ＰＡＩ−１量はごくわずかであったが、ＬＰＳ接種後の血中ＰＡＩ−１量は１．５時間から増加傾向を示し、３時間後及び９時間後ではＬＰＳ非処置動物に比べ著しく増加していた（条件２、５及び８）。【０１８６】
ＬＰＳ接種後３時間の抗体投与群ではＬＰＳ前投与群（条件６、ｐ＝０．００２７）、ＬＰＳ後投与群（条件７、ｐ＝０．００５１）のいずれの群においても抗体非投与群に比べ血中ＰＡＩ−１量の増加が抑制されていた。この抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体によるＰＡＩ−１増加抑制効果は、ＬＰＳ接種後９時間においても持続し、ＬＰＳ後３時間の結果と同様にＬＰＳ前投与群（条件９、ｐ＜０．０００１）、ＬＰＳ後投与群（条件１０、ｐ＝０．００２９）いずれの抗体投与群においても血中ＰＡＩ−１量の増加が抑制されていた。【０１８７】
以上の結果から、実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）は、ＤＩＣの増悪因子の一つである血中ＰＡＩ−１量の増加を抑制する作用を有していることが明らかとなった。【０１８８】
実施例１９：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の癌細胞遊走能に与える影響
外科治療、又は化学療法寛解導入後に起こる播種性転移や遠隔転移により、癌患者の生存率が大きく低下することが知られている。癌細胞の遊走能の活性化は、癌細胞が原発巣から離脱し、播種性転移や遠隔転移につながることから、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導されるがんの悪性化に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響を確認した。【０１８９】
１）試験方法
実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）を用い、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞遊走能に与える影響について評価した。ここでは、Ｓｅｍａ３Ａ高発現患者の予後が不良とされている膵癌の細胞を用いてその効果を検討した。具体的な実験手法は以下の通りである。【０１９０】
フィブロネクチンをＰＢＳ緩衝液で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈してフィブロネクチン希釈液を調製し、このフィブロネクチン希釈液１０μＬを、２４穴用チャンバー（クラボウ・ケモタキセルチャンバー、８μｍ孔）のフィルター下面に塗布し、室温で約１時間静置し乾燥させ、マイグレーションチャンバーを作製した。【０１９１】
次いで、前記で調製したマイグレーションチャンバーを２４穴プレートにセットし、外層に０．１％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地６００μＬを添加した。また、チャンバー内層には、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２）と表１７に示す各添加成分を含む無血清ＤＭＥＭ培地２００μＬとを添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で４時間培養を行った。その後チャンバーを取り出して、チャンバー内層の癌細胞を吸引除去し、さらにＰＢＳ緩衝液で湿らせた綿棒でチャンバー内に残留した細胞を除去した。次いで、チャンバーを細胞染色液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ、国際試薬）に１０分以上浸した後に、超純水で洗浄を２回行って乾燥させた。乾燥後に、チャンバーのフィルター下面に遊走した細胞数を顕微鏡で計測した。【０１９２】
【表１７】
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【０１９３】
２）統計解析
多重性を考慮し、条件２に対する条件３〜５、及び条件６〜８について両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。【０１９４】
３）試験結果
得られた結果を図２０に示す。ヒトＳｅｍａ３Ａの刺激により膵癌細胞ＭＩＡＰａＣａ−２の遊走活性は２倍以上亢進した（条件２）。しかし、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体存在下では、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される膵癌細胞の遊走活性が抑制された（条件３〜５）。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体１μｇ／ｍＬ処置群（Ｐ＝０．００３１）と１０μｇ／ｍＬ処置群（Ｐ＜０．００１）では、Ｓｅｍａ３Ａ非処置群（条件１）と同程度にまで癌細胞の遊走が抑制されていた。一方、陰性対照群では、Ｓｅｍａ３Ａによる癌細胞遊走を抑制しなかった（条件６〜８）。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される膵癌細胞の遊走を特異的に抑制することが明らかとなった。【０１９５】
実施例２０：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の癌細胞浸潤能に与える影響
遊走能が活性化された癌細胞は周辺の細胞外基質を融解・浸潤し、基底膜を破壊して血管やリンパ管に移行し、やがて遠隔臓器へと転移する。癌細胞の浸潤・転移能の抑制は、転移性再発の抑止につながり、癌患者の生存率を改善する上で有用と考えられている。実施例１９で検討したＳｅｍａ３Ａ誘導性遊走能亢進に対する抑制効果に加え、癌細胞浸潤能に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の効果についても検討した。【０１９６】
１）試験方法
増殖因子を除去した細胞外基質（ＢＤ社、ＭａｔｒｉｇｅｌTM Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｓｅｄ）を内層に充填したインベージョンチャンバー（ＢＤ社、ＢｉｏＣｏａｔTM  ８μｍ孔、＃３５４４８３）を用いてＳｅｍａ３Ａ誘導性の癌細胞浸潤能に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が与える影響について評価した。具体的な実験手法は以下の通りである。【０１９７】
癌細胞は、ヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２）、ヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）、及びマウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を使用した。先ず、インベージョンチャンバー内に充填された細胞外基質に膨潤処置を施した後、そのインベージョンチャンバーを２４穴プレートにセットし、外層に０．１％ウシ胎児血清（３ＬＬ細胞の場合は１％ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地を０．７５ｍＬ添加し、内層に２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの癌細胞と表１８に示す各濃度の添加成分を含む無血清ＤＭＥＭ培地を１２５μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養を行った。その後、インベージョンチャンバーを取り出し、実施例１９と同様にインベージョンチャンバー内層の残留細胞を除去した後、フィルター下面に移動した浸潤細胞数を顕微鏡で計測した。【０１９８】
【表１８】
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【０１９９】
２）統計解析
Ｓｅｍａ３Ａ誘導性の浸潤活性に対する阻害作用について、多重性を考慮し、条件５に対する条件６〜８および条件９〜１０についてそれぞれ両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。ｐ値一覧を表１９に示す。【０２００】
３）試験結果
図２１にＭＩＡＰａＣａ−２細胞を用いた場合、図２２にＵ８７ＭＧ細胞を用いた場合、及び図２３に３ＬＬ細胞を用いた場合について、各条件での浸潤細胞を計測した結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａを添加した場合（条件５）、いずれの細胞株においてもＳｅｍａ３Ａ非刺激群（条件１）に比べ癌細胞の浸潤能が明らかに亢進していた。そして、ヒトＳｅｍａ３Ａと共に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を添加した場合、いずれの癌細胞株においてもＳｅｍａ３Ａ非刺激と同程度にまで癌細胞の浸潤が抑制されていた（条件６〜８）。Ｓｅｍａ３Ａ非刺激条件下では、３ＬＬを除いて特筆すべき浸潤抑制作用は観察されなかった（条件１〜４）。一方、陰性対照抗体添加群ではＳｅｍａ３Ａによる癌細胞浸潤能の亢進をほとんど抑制しなかった（条件９〜１１）。また、図２４には浸潤した３ＬＬ細胞の顕微鏡下撮影像を示す。Ｓｅｍａ３Ａ非添加の条件１に対し、Ｓｅｍａ３Ａを添加した条件５において癌細胞浸潤が顕著であること、Ｓｅｍａ３Ａ存在下で抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を処置した条件７および条件８において、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導される癌細胞の浸潤活性が明らかに抑制されていることが可視的にも確認できる。これらの結果から明らかなように、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導される癌細胞の浸潤活性をＳｅｍａ３Ａ非刺激と同程度にまで抑制する作用を有することが明らかとなった。【０２０１】
【表１９】
2014123186.tif 000020
【０２０２】
実施例２１：Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤不応答性に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響
膵癌は、がんの中でも５年生存率が非常に低いことが知られている。その原因として、膵癌組織は乏血管性の状態となっているが、このような栄養飢餓状態でも癌細胞の増殖・進展が起こり、しばしばゲムシタビン塩酸塩（以下ＧＥＭ）等の抗がん剤に対し耐性化を示すことが挙げられる。即ち、膵癌治療において、抗がん剤不応答性の克服は重要な課題となっていることから、栄養飢餓条件におけるＳｅｍａ３Ａの薬剤耐性誘導と抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体によるその解除作用について評価した。【０２０３】
１）試験方法
膵癌の特徴である栄養飢餓条件において、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導されるＧＥＭ不応答性に対するヒト化抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（実施例２で作製したｈｕｍａｎｉｚｅｄ−２）が与える影響について評価した。具体的な実験手法は以下の通りである。【０２０４】
４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ−２）を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地に浮遊させた細胞浮遊液を９６穴プレートの各穴に１００μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養を行った後に、培地を０．１％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地１００μＬに交換し、更に２４時間培養を行った。次いで、表２０に示す各成分を所定量含有させた０．１％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地１００μＬを各穴に添加して、２日間培養を行った。その後、各穴から培養上清を１００μＬ除去して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で１時間培養した後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。【０２０５】
【表２０】
2014123186.tif 000021
【０２０６】
２）統計解析
条件３に対する条件４〜６、及び条件７〜９について多重性を考慮し、両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を実施しによりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。ｐ値を表２１に示す。【０２０７】
３）試験結果
図２５に膵癌細胞増殖判定試験の結果を示す。ＧＥＭにより膵癌細胞の増殖は抑制されたが（条件１に対し条件２）、ヒトＳｅｍａ３Ａは、ＧＥＭに対する感受性を減弱させ薬剤不応答性を誘導した（条件２に対し条件３）。このＳｅｍａ３Ａにより誘導されるＧＥＭ抵抗性は、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１ないし１０μｇ／ｍＬ処置により解除され、Ｓｅｍａ３Ａ非存在条件と同程度にまでＧＥＭ感受性を回復させることが示された（条件３に対し条件４〜６）。一方、陰性対照ヒト抗体添加群では、Ｓｅｍａ３Ａ非存在条件と同程度までのＧＥＭ感受性を回復することはできなかった（条件７〜９）。本結果から、実施例２によって作製したヒト化抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体には、膵癌組織のような栄養飢餓条件において、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤抵抗性を解除する作用も有していることが明らかとなった。【０２０８】
【表２１】
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【配列表フリーテキスト】
【０２０９】
配列番号１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号３は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号４は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号５は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号６は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号８は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号９は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒト化抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）をコードしている塩基配列である。
配列番号１５は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）をコードしている塩基配列である。
配列番号１６は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）をコードしている塩基配列である。
配列番号１７は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードしている塩基配列である。
配列番号１８は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号１９は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号２０は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号２１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号２２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号２３は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号２４は、ヒト化抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）をコードしている塩基配列である。
配列番号２５は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）をコードしている塩基配列である。
配列番号２６は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）をコードしている塩基配列である。
配列番号２７は、前記プライマー１の塩基配列である。
配列番号２８は、前記プライマー２の塩基配列である。
配列番号２９は、前記プライマー３の塩基配列である。
配列番号３０は、前記プライマー４の塩基配列である。
配列番号３１は、前記プライマー５の塩基配列である。
配列番号３２は、前記プライマー６の塩基配列である。
配列番号３３は、前記プライマー７の塩基配列である。
配列番号３４は、前記プライマー８の塩基配列である。
配列番号３５は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、前記プライマーＡγの塩基配列である。
配列番号３８は、前記プライマーＢγの塩基配列である。
配列番号３９は、前記プライマーＣγの塩基配列である。
配列番号４０は、前記プライマーＤγの塩基配列である。
配列番号４１は、前記プライマーＥγの塩基配列である。
配列番号４２は、前記プライマーＦγの塩基配列である。
配列番号４３は、前記プライマーＧγの塩基配列である。
配列番号４４は、前記プライマーＨγの塩基配列である。
配列番号４５は、前記プライマーＩγの塩基配列である。
配列番号４６は、前記プライマーＪγの塩基配列である。
配列番号４７は、前記プライマーＫγの塩基配列である。
配列番号４８は、前記プライマーＬγの塩基配列である。
配列番号４９は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号５０は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号５１は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号５２は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −１）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号５３は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号５４は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  −２）（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号５５は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号５６は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の重鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号５７は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号５８は、トリ−ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４−２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号５９は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号６０は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号６１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号６２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号６３は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号６４は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号６５は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号６６は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号６７は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号６８は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号６９は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号７０は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号７２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号７３は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号７４は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号７６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号７７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号７８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号７９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号８０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号８１は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号８２は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号８３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号８４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号８５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号８６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号８７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号８８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号８９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号９０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号９１は、前記プライマーＭγの塩基配列である。
配列番号９２は、前記プライマーＮγの塩基配列である。
配列番号９３は、前記プライマーＯγの塩基配列である。
配列番号９４は、前記プライマーＰγの塩基配列である。
配列番号９５は、ヒト化抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号９６は、ヒト化抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
配列番号９７は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６０）をコードしている塩基配列である。
配列番号９８は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６１）をコードしている塩基配列である。
配列番号９９は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６２）をコードしている塩基配列である。
配列番号１００は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６４）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６５）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６６）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０３は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５９）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０４は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６３）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０５は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６８）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０６は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６９）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０７は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７０）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０８は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７２）をコードしている塩基配列である。
配列番号１０９は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号７３）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１０は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７４）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１１は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６７）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１２は、トリ−マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７１）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７６）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号７７）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７８）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８０）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８１）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号８２）をコードしている塩基配列である。
配列番号１１９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７５）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０−４０株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７９）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２１は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８４）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２２は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８５）をコードしている塩基配列である。
配列番号Ｄ１２３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号８６）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８８）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８９）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号９０）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８３）をコードしている塩基配列である。
配列番号１２８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５−７２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８７）をコードしている塩基配列である。
【図１】
2014123186.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2014123186.tif 000032
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月8日(2014.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
（Ａ）  配列番号１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｂ）  配列番号６０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号６４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｃ）  配列番号６８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号７２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７３に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｄ）  配列番号７６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７７に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８２に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｅ）  配列番号８４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８４に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８５に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８６に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８８に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８９に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号９０に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
【請求項２】
キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項１に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を含有する、医薬組成物。
【請求項４】
神経再生促進用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
敗血症の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
がんの予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
中枢又は末梢神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、又は神経変性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、又は脊髄小脳変性症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、又は多発性硬化症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
炎症性疾患が、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、又はシェーグレン症候群である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
感染症が、細菌感染症、脳炎、髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群、肺炎、敗血症、火傷性、又は外傷性感染症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、又は食物アレルギーである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
神経再生が求められる患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、神経再生方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法。
【請求項２０】
敗血症を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、敗血症の治療方法。
【請求項２１】
がんを罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、がんの治療方法。
【請求項２２】
播種性血管内凝固症候群を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、播種性血管内凝固症候群の治療方法。
【請求項２３】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、前記疾患の治療方法。
【請求項２４】
神経再生用の医薬の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２５】
アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２６】
敗血症の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２７】
がんの予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２８】
播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項２９】
中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
【請求項３０】
請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を用いて免疫測定により検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する工程を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法。
【請求項３１】
請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キット。
【請求項３２】
下記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号４に示すアミノ酸配列ＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
【請求項３３】
下記（Ｂ）〜（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
（Ｂ）  配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｃ）  配列番号６８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｄ）  配列番号７６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｅ）  配列番号８４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
配列番号８８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
【請求項３４】
キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項３２又は３３に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
【請求項３５】
前記抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片が、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに配列番号４に示すアミノ酸配列ＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項３〜１７に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
サンドイッチ法によってＳｅｍａ３Ａタンパク質を免疫測定する方法であり、
キャプチャー抗体として、請求項３２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を使用し、
一次抗体として、請求項３３に記載の（Ｂ）又は（Ｃ）に示す抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を使用する、請求項３０に記載の測定方法。
【請求項３７】
サンドイッチ法によってＳｅｍａ３Ａタンパク質を免疫測定する方法であり、
キャプチャー抗体として、請求項３３に記載の（Ｄ）又は（Ｅ）に示す抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を使用し、
一次抗体として、請求項３２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を使用する、請求項３０に記載の測定方法。
【請求項３８】
サンドイッチ法による免疫測定に使用される、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キットであって、
キャプチャー抗体として、請求項３２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を含み、
一次抗体として、請求項３３に記載の（Ｂ）又は（Ｃ）に示す抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を含む、請求項３１に記載の測定用キット。
【請求項３９】
サンドイッチ法による免疫測定に使用される、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キットであって、
キャプチャー抗体として、請求項３３に記載の（Ｄ）又は（Ｅ）に示す抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を含み、
一次抗体として、請求項３２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を含む、請求項３１に記載の測定用キット。
【国際調査報告】
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