(57)【要約】  被検物質の検出システムは、被検物質の結合部位を介して被検物質と結合することのできる第一物質で修飾された担体と、結合部位とは異なる部位を介して被検物質と結合することのできる第二物質で修飾された標識体とを含む第一層と、外部引力を印加する前には、担体および標識体を含まない第二層と、を備え、外部引力によって担体および被検物質と結合した複合体が、第一層から第二層へ移動可能である。
2015046293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の結合部位を介して前記被検物質と結合することのできる第一物質で修飾された担体と、前記結合部位とは異なる部位を介して前記被検物質と結合することのできる第二物質で修飾された標識体とを含む第一層と、
外部引力を印加する前には、担体および標識体を含まない第二層と、を備え、
外部引力によって前記担体および前記被検物質と結合した複合体が、前記第一層から前記第二層へ移動可能である、被検物質の検出システム。
【請求項２】
更に、前記第一層と前記第二層とを分離し、前記担体および前記被検物質と結合した複合体が通過可能な分離層を備える、請求項１に記載の被検物質の検出システム。
【請求項３】
前記第二層内から発せられるシグナルを検出する検出部を更に備え、
前記標識体は、少なくとも前記被検物質と結合した状態で発光および反応が可能である、請求項１または２に記載の被検物質の検出システム。
【請求項４】
前記外部引力が、磁力、遠心力、および電気泳動力からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項５】
前記第一物質が、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項６】
前記第二物質が、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項７】
前記分離層が、オイル、多孔質素材、高分子膜、高分子ゲル、および高濃度溶液からなる群から選ばれる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項８】
前記第二層が、オイル、多孔質素材、高分子膜、高分子ゲル、および高濃度溶液からなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項９】
前記担体が、磁性体、金属、無機物質、有機物質、高分子、およびこれらの組み合わせを含む物質からなる群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項１０】
前記標識体が、比色物質、発光物質、酸化還元物質、核酸および酵素からなる群から選ばれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項１１】
前記第二層内に、前記標識体と反応する物質を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項１２】
前記標識体と反応する物質が、基質、化学発光物質、および酸化還元物質からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の被検物質の検出システム。
【請求項１３】
前記検出部は、所定の波長の光のみを透過する第一フィルタと、前記第一フィルタを透過した光を検出する検出部とを備え、
前記標識体は、非色物質、発光物質、および酵素からなる群によって標識されている請求項３〜１２のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【請求項１４】
前記検出部は、所定の波長の励起光を含んだ光を発する光源と、前記励起光のみを透過させる第一フィルタと、前記第一フィルタを透過した前記励起光を前記第二層へ照射する光路部材と、前記励起光を除去する第二フィルタと、前記第二フィルタを透過した光を検出する検出部とを備え、
前記標識体は前記励起光により蛍光を発する蛍光物質によって標識されている、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の被検物質の検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体および標識体を用いた被検物質の検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微量の被検物質を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ（enzyme‐linked immunosorbent assay）法やＭＥＩＡ（microparticle enzyme-based immunoassay）法等が普及している。
これら検出法は、抗体で特異的・選択的に被検物質を捕捉する手法であり、基板あるいは粒子表面上に固定化された抗体によって、被検物質を捕捉し、更に酵素等を予め標識された抗体と反応させ、サンドイッチ構造を構築している。
ここで、試料中に被検物質が含まれていない場合、標識抗体は捕捉・結合すべき被検物質がないために残存し、反応容器の洗浄によって除去される。即ち、試料中に被検物質が存在すれば、固定化抗体−被検物質−標識抗体からなるサンドイッチ構造が構築される。一方、被検物質がなければ、標識抗体は残存し、洗浄によって除去されることになる。
このような原理を利用して、試料中の被検物質量の違いを、標識抗体の捕捉・結合によって検出する。
従って最終的には反応容器に留まった酵素を発色させると、被検物質の有無を判別したり、被検物質量を求めることができる。【０００３】
しかしながら、これらの手法を実行するためには、未反応の標識抗体を除去する必要がある。洗浄は流体操作ステップを必要とし、洗浄が多すぎれば、検出されるべき標識が除去される可能性もある。
しかし、洗浄が少なければ未反応の標識抗体による擬陽性が生じる可能性がある。そのためこれらの手法では、洗浄操作は複数回行う必要があるため、操作時間に長時間を要し、また、測定操作が煩雑である。【０００４】
そこで抗体固定化担体として磁性粒子を使用し、磁石により磁性粒子を固定化して、未反応の標識抗体の洗浄・除去する方法が広く使用されている。磁石を用いて固定、洗浄することで洗浄操作時間が短縮される。しかしながら、洗浄操作は複数回行う必要があり、操作も煩雑となる場合がある。【０００５】
また、磁性粒子を含む液滴に磁場の変動を与えることにより、液滴を移動させて化学反応に必要な操作を行うことによる、微量化学反応方法が提案されている（特許文献１参照）。提案されている手法では、磁場の変動により、磁性粒子を含む液滴を液中から分取、移動、液滴内攪拌、および洗浄を行うことで、ポンプ、バルブ等の流体制御素子を必要とすることなく、化学反応操作を可能とし、その結果生じる化学反応、生化学反応、および生物学的相互作用等を行わせることが可能である。しかしながら、磁場によって反応液中から切り取られる液滴においては、磁性体粒子とともに反応液の一部も切り取られ、残存するため、特に洗浄操作においては、複数回の操作が必要となる場合がある。【０００６】
更に、貴金属コート磁性粒子を用いて、磁場によって移動させることによる、被検物質の検出方法も提案されている（特許文献２参照）。提案されている手法では、被検物質との複合体形成を磁場の影響下で行うことで、貴金属コート磁性粒子を磁場により移動させ、貴金属の呈色を検出することにより、比較的短い時間で検出が可能である。
しかしながら、磁場によって貴金属コート磁性粒子が検出部分に残存することにより、被検物質がない場合に擬陽性と誤判定される恐れがある。【０００７】
一方、粒子および沈殿試薬を用いて、液相から粒子を遠心分離によって分離し、検出可能な活性を粒子上に残存させることによる、被検物質の検出方法も提案されている（特許文献３参照）。提案されている手法では、被検物質と複合体を形成した粒子を、沈殿試薬を用いて沈殿、遠心分離を行うことにより、臨床化学的分析装置に適用可能な分離、検出が可能である。
しかしながら、沈殿試薬の添加および遠心分離後に検出試薬の添加が必要であり、操作が煩雑となる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】日本国特許第４８４４２６３号公報
【特許文献２】日本国特許第４７９１８６７号公報
【特許文献３】日本国特許第３６８４４５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料中の被検物質の検出を迅速且つ簡便に行うことが可能な被検物質の検出システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１態様は、被検物質の検出システムであって、被検物質の結合部位を介して該被検物質と結合することのできる第一物質で修飾された担体と、結合部位とは異なる部位を介して被検物質と結合することのできる第二物質で修飾された標識体とを含む第一層と、外部引力を印加する前には、担体および標識体を含まない第二層と、を備え、外部引力によって担体および被検物質と結合した複合体が、第一層から第二層へ移動可能である。【００１１】
本発明の第２態様は、上記第１態様の被検物質の検出システムにおいて、更に、第一層と第二層を分離し、担体および被検物質と結合した複合体が通過可能な分離層を備えていてもよい。【００１２】
本発明の第３態様は、上記第１または第２態様の被検物質の検出システムにおいて、第二層内から発せられるシグナルを検出する検出部を更に備え、標識体は、少なくとも被検物質と結合した状態で発光、および反応可能であってもよい。【００１３】
本発明の第４態様は、上記第１から第３態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、外部引力が、磁力、遠心力、および電気泳動力からなる群から選ばれてもよい。【００１４】
本発明の第５態様は、上記第１から第４態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、第一物質が、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれてもよい。
本発明の第６態様は、上記第１から第５態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、第二物質が、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれてもよい。【００１５】
本発明の第７態様は、上記第２から第６態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、分離層が、オイル、多孔質素材、高分子膜、高分子ゲル、および高濃度溶液からなる群から選ばれてもよい。【００１６】
本発明の第８態様は、上記第１から第７態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、第二層が、オイル、多孔質素材、高分子膜、高分子ゲル、および高濃度溶液からなる群から選ばれてもよい。【００１７】
本発明の第９態様は、上記第１から第８態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、担体が、磁性体、金属、無機物質、有機物質、高分子、およびこれらの組み合わせを含む物質からなる群から選ばれてもよい。【００１８】
本発明の第１０態様は、上記第１から第９態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、標識体が、比色物質、発光物質、酸化還元物質、核酸、および酵素からなる群から選ばれてもよい。【００１９】
本発明の第１１態様は、上記第１から第１０態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、第二層内に、標識体と反応する物質を含んでもよい。【００２０】
本発明の第１２態様は、上記第１１態様の被検物質の検出システムにおいて、標識体と反応する物質が、基質、化学発光物質、および酸化還元物質からなる群から選ばれてもよい。【００２１】
本発明の第１３態様は、上記第３から第１２態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、検出部は、所定の波長の光のみを透過する第一フィルタと、第一フィルタを透過した光を検出する検出部とを備え、標識体は、非色物質、発光物質、および酵素からなる群によって標識されていてもよい。【００２２】
本発明の第１４態様は、上記第３から第１２態様のいずれか一つの被検物質の検出システムにおいて、検出部は、所定の波長の励起光を含んだ光を発する光源と、励起光のみを透過させる第一フィルタと、第一フィルタを透過した励起光を第二層へ照射する光路部材と、励起光を除去する第二フィルタと、第二フィルタを透過した光を検出する検出部とを備え、標識体は、励起光により蛍光を発する蛍光物質によって標識されていてもよい。【００２３】
上記本発明の第１態様によれば、第一層において、被検物質と担体、および標識体とで形成される複合体を外部引力により、容易に第二層に移動できる。外部引力により、担体および上記複合体のみが移動され、未反応の標識体を容易に分離することができる。【００２４】
また、第二層において、標識体から発せられるシグナルを検出、あるいは標識体との反応により生じるシグナルを検出することである。外部引力により移動された複合体の検出を特別な操作を必要とせず、検出することができる。
【発明の効果】
【００２５】
上記本発明の態様によれば、試料中の被検物質の高感度な検出を迅速且つ簡便に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の第一の実施形態の被検物質の検出システムの模式図である。
【図２Ａ】本発明の第一の実施形態の検出システムの作用を説明する図である。
【図２Ｂ】本発明の第一の実施形態の検出システムの作用を説明する図である。
【図３】本発明の第二の実施形態の被検物質の検出システムの模式図である。
【図４Ａ】本発明の第二の実施形態の検出システムの作用を説明する図である。
【図４Ｂ】本発明の第二の実施形態の検出システムの作用を説明する図である。
【図５】参考例１の試験結果を示す図である。
【図６】実施例１の試験結果を示す図である。
【図７】参考例２の試験結果を示す図である。
【図８】実施例２の試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（第一実施形態）
本発明の一実施形態の被検物質の検出システムについて説明する。図１は、本実施形態の検出システム１の模式図である。図２Ａ，図２Ｂは、検出システム１の作用を説明する図である。
【００２８】
図１に示すように、検出システム１は、試料中の被検物質１０の有無を検出するシステムである。本実施形態においては、生体物質、合成物質等あらゆる物質を被検物質１０とすることができる。また、試料としては、例えば血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、これらを調製して得られた溶液等を、任意に用いることができる。
【００２９】
検出システム１は、担体２と標識体３とを含む第一層４と、第二層５と、分離層６と、磁力発生部７と、検出部８とを備える。
担体２は、磁性体、金属、無機物質、有機物質、高分子、およびこれらの組み合わせを含む物質からなる群から選ばれる。
担体２の一例を挙げると、磁性体が挙げられる。以下、本実施形態では、担体が磁性体である場合を例に説明する。磁性体は、任意の適切な形状の一つ以上の磁性物質または磁化可能粒子を含み、磁力発生部によって引き付けられる。磁性体のサイズは最大直径が５ｎｍ〜１００μｍが好ましく、１００ｎｍ〜１０μｍがより好ましい。また、磁性体は、被検物質１０の結合部位を介して該被検物質１０と結合する第一物質１１によって表面修飾されている。なお、第一物質１１による磁性体の修飾方法は表面修飾でなくてもよい。
【００３０】
磁性体の一例を挙げると、磁性物質と、磁性物質を被覆するポリマー層とを備える磁性ポリマー粒子である。磁性ポリマー粒子は、１個のポリマー粒子に、複数個の磁性粒子が被覆されて存在していてもよい。ポリマー粒子を被覆する磁性粒子としては、水中での微粒子生成が可能なマグネタイトなどのフェライト粒子が好ましい。他方、フェライト以外の磁性粒子としては、例えば各種磁性金属の微粒子、または各種磁性化合物が用いられ、これらの磁性粒子がそれぞれに有する特徴的な磁気的性質をさまざまに利用することもできる。
【００３１】
第一物質１１は、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれ、被検物質に応じて選択して採用される。第一物質１１は、被検物質１０に対する特異性が高いことが好ましい。例えば、第一物質は、試料中において被検物質１０に対して結合しやすく、被検物質１０とは別の物質には結合しにくい。
また、第一物質１１は、標識体３および後述する第二物質１２に対する特異性が低いことが好ましい。
【００３２】
標識体３は、比色物質、発光物質、酸化還元物質、核酸、および酵素からなる群から選ばれる標識物質であり、発光物質としては、蛍光分子、リン光分子、化学発光分子、酵素結合分子等が挙げられる。核酸を標識物質とした時の検出方法としては、イムノＰＣＲ、インベーダー法（登録商標）、Ｔａｑｍａｎ法、蛍光プローブ法等の核酸検出法が挙げられる。また標識体３は、第一物質１１が結合する部位とは異なる部位を介して被検物質１０と結合する第二物質１２によって修飾されている。
第二物質１２は、第一物質１１とは異なる物質であり、被検物質１０における第一物質１１の結合部位とは異なる部位に結合する。第二物質１２は、抗体、断片化抗体、完全抗原、およびハプテンからなる群から選ばれ、被検物質１０に応じて選択して採用される。第二物質１２は、被検物質１０に対する特異性が高いことが好ましい。例えば、第二物質１２は、試料中において被検物質１０に対して結合しやすく、被検物質１０とは別の物質には結合しにくい。
また、第二物質１２は、担体２および第一物質１１に対する特異性が低いことが好ましい。
【００３３】
尚、第一層４および第二層５は、担体２、標識体３、および被検物質１０を分散できれば、いずれの形状でもよく、また物質も特に制限はない。例えば、水溶液、オイル、高濃度溶液等を第一層４、および第二層５とすることができる。また、第一層４、および第二層５として、多孔質部材等が採用されてもよい。例えば、高分子ゲル、不織布、濾紙、高分子膜、多孔質膜等を第一層、および第二層とすることもできる。
【００３４】
また、分離層６としては、第一層４と第二層５を分離でき、担体、標識体、および被検物質１０による複合体が通過できれば、いずれの形状でもよく、また物質も特に制限はない。例えば、水溶液、オイル、高濃度溶液等を分離層６とすることができる。
また、分離層６として、多孔質部材等が採用されてもよい。例えば、高分子ゲル、不織布、濾紙、高分子膜、多孔質膜等を分離層６とすることもできる。
【００３５】
磁力発生部７は、担体２を第一層４から第二層５に移動させるため、第二層５下に設けられている。磁力発生部７は、例えば永久磁石や電磁石である。また磁力発生部７は、第二層５下において、着脱可能であってもよい。
【００３６】
検出部８は、標識体３の存在を検出する。本実施形態では、検出部８は、標識体３から発せられるシグナルあるいは標識体３との反応により生じるシグナルを検出する。具体的には、所定の波長の光のみを透過する第一フィルタと、第一フィルタを透過した光を検出する検出部とを有する。
【００３７】
次に、検出システム１の作用について、検出システム１を用いた被検物質１０の検出方法とともに説明する。
まず、被検物質１０の有無を検出する対象となる試料と、担体２および標識体３を含んだ第一層４で混合する。
試料中に被検物質が含まれている場合には、担体２と被検物質１０とが第一物質１１を介して結合し、標識体３と被検物質１０とが第二物質１２を介して結合する。すなわち、担体２と標識体３とが被検物質１０を介して結合した状態となる（図２Ａ（陽性）参照）。
試料中に被検物質１０が含まれていない場合には、担体２と標識体３とを結合させる物質がないので、担体２と標識体３とは互いに独立して存在している（図２Ｂ（陰性）参照）。
【００３８】
ここで、被検物質１０が担体２と標識体３との両方に結合している場合（図２Ａ（陽性）参照）には、被検物質１０、担体２、および標識体３が複合体を形成して磁力発生部７に引き付けられる。その結果、第一層４に広がった混合物中に含まれる被検物質１０は、被検物質１０に結合した担体２により、標識体３とともに磁力発生部７からの磁力によって第二層５に移動する。
これに対して、担体２と標識体３とが被検物質１０を介して結合していない場合（図２Ｂ（陰性）参照）には、担体２は磁力発生部７からの磁力により引き付けられる。しかし、標識体３は磁力の影響を受けずに第一層４に存在する。
【００３９】
また検出部８は、第二層５において磁力発生部７によって引き付けられた標識体３から発せられるシグナルを検出する。なお、標識体３のうち担体２および被検物質１０に対して結合していないものは、第一層４に分散しているため、検出部８には検出されない。
【００４０】
以上説明したように、本実施形態の検出システム１によれば、従来のイムノアッセイ法における煩雑な洗浄操作等を必要とせず、高感度な検出を迅速且つ簡便に得ることができる。
【００４１】
次に、本発明の他の実施形態について、上述の実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００４２】
（第二実施形態）
本発明における第二の実施形態の被検物質の検出システム３１について説明する。図３は、本実施形態の検出システム３１の模式図である。図４Ａ，図４Ｂは、検出システム３１の作用を説明するための図である。
【００４３】
本実施形態によれば、担体２、標識体３、および被検物質１０を含む第一層４と、第二層５は混合することなく、互いに独立して存在している（図３参照）。また、担体２は磁力発生部７の磁力によって引き付けられ、第一層４から第二層５に移動する。
しかしながら磁力発生部７の磁力が無い場合には、担体２は第一層４に存在する。また標識体３および被検物質１０は、磁力発生部７の磁力によらず、第一層４に存在する。
【００４４】
尚、第一層４および第二層５としては、例えば、第一層４を水溶液とし、第二層５を高濃度溶液とした組み合わせが挙げられる。
【００４５】
ここで、被検物質１０が担体２と標識体３との両方に結合している場合（図４Ａ（陽性）参照）には、被検物質１０、担体２、および標識体３が複合体を形成して磁力発生部７に引き付けられる。その結果、第一層４に広がった混合物中に含まれる被検物質１０は、この被検物質１０に結合した担体２により、標識体３とともに磁力発生部７からの磁力によって第二層５に移動する。
これに対して、担体２と標識体３とが被検物質１０を介して結合していない場合（図４Ｂ（陰性）参照）には、担体２は磁力発生部７からの磁力により引き付けられる。しかし、標識体３は磁力の影響を受けずに第一層４に存在する。
【００４６】
また検出部８は、第二層５において磁力発生部７によって引き付けられた標識体３から発せられるシグナルを検出する。なお、標識体３のうち担体２および被検物質１０に対して結合していない標識体３は、第一層４に分散しているため、検出部には検出されない。
【００４７】
（第三実施形態）
本実施形態では、担体２を第一層４から第二層５に移動する手段が上述の実施形態は異なっている。本実施形態では遠心力、あるいは電気泳動力により、担体および担体が結合した被検物質１０を含む複合体が、第一層４から第二層５に移動される。磁力によって集積されない。従って、移動した担体２および上記複合体が第二層５内で分散して存在することができる。
【００４８】
（第四実施形態）
本実施形態では、第二層５内において、標識体３と反応する物質を含んだ状態で形成される。反応する物質としては、基質、化学発光物質、および酸化還元物質等が挙げられる。本実施形態では、標識体３と上記物質との反応によるシグナルを検出することにより、標識体３が結合した被検物質１０を含む複合体が、第二層５に移動した場合にのみ、検出することができる。すなわち、層位置によらず検出することが可能となることから、検出装置を簡便にすることができる。
【００４９】
（第五実施形態）
本実施形態では、検出部８は、標識体３から発せられる蛍光を検出する。具体的には、検出部３は、所定の波長の励起光を含んだ光を発する光源、第一フィルタを透過した励起光を第二層５へ照射する光路部材、ダイクロイックミラー（励起光のみを透過させる第一フィルタおよび励起光を除去する第二フィルタ）、ならびに第二フィルタを透過した光を検出する検出部を有する。また、本実施形態において、磁力発生部７によって第二層５に移動された担体２および標識体３をそれぞれ磁気検出、蛍光検出し、担体２と標識体３との存在比を算出することができる。
本実施形態では、担体２と標識体３との使用量を予め既知としておくことにより、被検物質１０の含有量を定量することができる。
【００５０】
（第六実施形態）
本実施形態では、上述の実施形態で説明した検出部に代えて、酵素反応を電気化学的に測定する電極およびセンサが設けられている。本実施形態における電極は、銀、金、ステンレス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等によって形成することができる。
また、本実施形態においても、磁力発生部７によって第二層５に移動された担体２を磁気センサにより定量することができる。なお、本実施形態では、上記電極およびセンサと、上記磁気センサとの少なくとも何れかが設けられていればよい。
【００５１】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
また、上述の各実施形態において示した構成要素は適宜に組み合わせて構成することが可能である。
【００５２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
本実施例では、被検物質として前立腺癌のバイオマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を用いて、被検物質の検出実験を行った。第１物質としてはＰＳＡを認識するモノクローナル抗体（１Ｈ１２）を用いた。第２物質としては、ＰＳＡの別の部位を認識するモノクローナル抗体（５Ａ６）を用いた。【００５４】
先ず、粒径１μｍの磁性ビーズに対して、第１物質のＰＳＡ抗体を結合させ、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子を得た。更に西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に対して、第２物質の抗ＰＳＡ抗体を結合させ、ＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を得た。同様にアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）に対して、第２物質の抗ＰＳＡ抗体を結合させ、ＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を得た。【００５５】
（参考例１）
参考例１では上記の抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、９６穴プレートを用いてＰＳＡの検出を行った。先ず、抗原溶液（ＰＳＡ濃度：０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）に対して、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子を加え混合した。混合した溶液を９６穴プレートの各ウェルに移した後、９６穴プレート用磁石を用いてウォッシングを３回行った。次いで、ＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を加え混合した後、同様に９６穴プレート用磁石を用いてウォッシングを３回行った。更にＨＲＰの色原性基質として、３,３’,５, ５'−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）溶液を加え混合後、反応停止液として１％塩酸を加え、各ウェルの呈色をプレートリーダー（吸光度：４５０ｎｍ）にて確認した結果を図５に示す。【００５６】
（実施例１）
実施例１では、参考例１と同様に抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いてＰＳＡの検出を行った。先ず、抗原溶液（ＰＳＡ濃度：０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）に対して、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を加え混合した。次いで飽和ショ糖溶液とＴＭＢ溶液を１：１で混合した混合溶液を、マイクロチューブ内に移し第二層とした。更に抗原、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子、およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体混合溶液をチューブに加え、第一層とした。第一層および第二層を保持したマイクロチューブに対して遠心分離（６０００ｒｐｍ）を加え、第一層より磁性粒子および複合体の移動を行った後、第二層溶液を９６穴プレートの各ウェルに移し、反応停止液として１％塩酸を加え、各ウェルの呈色をプレートリーダー（吸光度：４５０ｎｍ）にて確認した結果を図６に示す。【００５７】
参考例１の結果より、抗原の有無（０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）に対して、吸光度の違いが確認され、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、ビーズアッセイ中でのＰＳＡの検出が確認された。【００５８】
実施例１の結果より、抗原の有無（０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）に対して、吸光度の違いが確認され、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＨＲＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、遠心分離により第一層から第二層へ粒子および複合体を移動することでのＰＳＡの検出が確認された。【００５９】
（参考例２）
参考例２では上記の抗ＰＳＡ抗体およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、９６穴プレートを用いてＰＳＡの検出を行った。先ず、抗ＰＳＡ抗体を固定化した９６穴プレートの各ウェルに対して、５％スキムミルクを用いてブロッキングを行い、ウォッシングを３回行った後、抗原溶液（ＰＳＡ濃度：０ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）を加え混合した。反応後ウォッシングを３回行った。次いでＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を加え混合し、反応後同様にウォッシングを３回行った。更にＡＬＰの化学発光基質としてＣＳＰＤ＋Ｅｍｅｒａｌｄを加え混合後、各ウェルの化学発光をプレートリーダーにて確認した結果を図７に示す。【００６０】
（実施例２）
実施例２では、参考例２と同様に抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いてＰＳＡの検出を行った。先ず、抗原溶液（ＰＳＡ濃度：０ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ）に対して、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を加え混合した。次いで飽和ショ糖溶液とＣＳＰＤ＋Ｅｍｅｒａｌｄ溶液を１：１で混合した混合溶液を、マイクロチューブ内に移し第二層とした。更に抗原、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体混合溶液をチューブに加え、第一層とした。第一層および第二層を保持したマイクロチューブに対して遠心分離（６０００ｒｐｍ）を加え、第一層より磁性粒子および複合体の移動を行った後、第二層溶液を９６穴プレートの各ウェルに移し、各ウェルの化学発光をプレートリーダーにて確認した結果を図８に示す。【００６１】
参考例２の結果より、抗原濃度に対して、化学発光強度の変化が確認され、抗ＰＳＡ抗体およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、プレート中でのＰＳＡの高感度検出が確認された。【００６２】
実施例２の結果より、抗原濃度に対して、化学発光強度の違いが確認され、抗ＰＳＡ抗体修飾磁性粒子およびＡＬＰ修飾抗ＰＳＡ抗体を用いて、遠心分離により第一層から第二層へ粒子および複合体を移動することでのＰＳＡの高感度検出が確認された。【００６３】
以上の結果が示すように、第一層から第二層へ粒子および複合体を移動することでの抗原の検出が確認され、バックグラウンドおよびシグナルにおいても、ビーズアッセイ及びプレートアッセイでの洗浄を行った場合と同等であることが確認された。これより、通常のイムノアッセイでの煩雑な洗浄工程を行わずに、迅速且つ簡便に抗原を検出することが可能となった。
【符号の説明】
【００６４】
１，３１…検出システム、２…担体、３…標識体、４…第一層、５…第二層、６…第二層、７…磁力発生部、８…検出部、１０…被検物質、１１…第一物質、１２…第二物質
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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