(57)【要約】  本発明の課題は、特有の性質および粒子サイズ分布を有する多孔質マイクロキャリアを得ることができる調整方法を提供すること、および、優れた細胞増殖特性を有するゼラチン多孔質マイクロキャリアを提供することである。本発明によれば、特定のＨＬＢ値を有する乳化剤の含有量を用いた乳化工程を含む、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法、および、特定の空隙を有するゼラチン多孔質マイクロキャリアが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）水、遺伝子組み換えゼラチン、非水溶性液体、および、乳化剤を含む組成物を混合し、第一エマルションを生成する工程、
（ｂ）ゼラチンのゲル化温度より高い温度で、前記第一エマルションと、非水溶性液体とを混合し、第二エマルションを生成する工程、および、
（ｃ）ゼラチンが凝固する温度に第二エマルションを冷却する工程を含み、
前記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含有量０．５重量%未満で含む、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含まない、請求項１に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、乳化剤を含まない、請求項１に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）で使用する乳化剤のＨＬＢ値が９より大きい、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項５】
前記第一エマルションのｐＨが３〜１１の範囲内である、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項６】
前記遺伝子組み換えゼラチンの等電点が少なくとも５である、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項７】
前記遺伝子組み換えゼラチンがヒドロキシプロリンを含まない、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項８】
更に（ｄ）第二エマルションから凝固したゼラチンを除去する工程を含む、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項９】
前記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１０】
前記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも二個のリシン残基を含み、二個のリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れている、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）で前記非水溶性液体の体積が、前記第一エマルションの体積より大きい、請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１２】
前記工程（ｃ）で、０．１〜２０℃／分で冷却を行う、請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１３】
前記第一エマルションが少なくとも１〜１５重量％の遺伝子組み換えゼラチンを含む、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）で使用される組成物が、
１〜１５重量％の遺伝子組み換えゼラチン、
１０〜７０重量％の水、
２０〜９０重量％の非水溶性液体、および
０．５〜２０重量％の乳化剤、
を含む、請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１５】
更に、前記工程（ｂ）中、および／または、工程（ｂ）の後に、ゼラチンを架橋する工程を含む、請求項１〜１４のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１６】
更に、前記工程（ｂ）の後に、ゼラチンの脱水熱架橋を行う工程を含む、請求項１〜１５のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
【請求項１７】
空隙を有し、
少なく半分の前記空隙が球状、および／または
少なく半分の前記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有する、
ゼラチン多孔質マイクロキャリア。
【請求項１８】
少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔を有する請求項１７に記載のマイクロキャリア。
【請求項１９】
少なくとも５０体積％の平均空隙率を有する、請求項１７または１８に記載のマイクロキャリア。
【請求項２０】
前記空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲にある、請求項１７〜１９のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２１】
平均粒子径が２０〜８００μｍである、請求項１７〜２０のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２２】
平均密度が、０．０４〜０．５ｇ／ｃｍ3である、請求項１７〜２１のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２３】
平均体積が、２〜２５ｃｍ3／ｇである、請求項１７〜２２のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２４】
平均粒子径が２０〜８００μｍであり、少なくとも８０％のマイクロキャリアが、平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有する、請求項１７〜２３のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２５】
少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔、
少なくとも５０体積％の平均空隙率、および、
２０〜８００μｍの平均粒子径を有し、
少なく半分以上の空隙が球状であり、
少なくとも８０％のマイクロキャリアが平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有し、
空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲である、
請求項１７に記載のマイクロキャリア。
【請求項２６】
少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔、
少なくとも５０体積％の平均空隙率、および、
２０〜８００μｍの平均粒子径を有し、
少なく半分以上の空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有し、
少なくとも８０％のマイクロキャリアが平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有し、
空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲である、
請求項１７に記載のマイクロキャリア。
【請求項２７】
少なくとも７５％の空隙が球状である、請求項２５または２６に記載のマイクロキャリア。
【請求項２８】
前記ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１７〜２７のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項２９】
前記ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１７〜２８のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項３０】
前記ゼラチンが、ヒドロキシプロリンを含まない遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１７〜２９のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項３１】
前記ゼラチンが、少なくとも３つのＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１７〜３０のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項３２】
前記ゼラチンが、少なくとも二つのリシン残基を含み、二つのリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れている、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１７〜３１のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
【請求項３３】
請求項１７〜３２のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
【請求項３４】
請求項１７〜３２のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアの組織損傷修復のための足場としての使用。
【請求項３５】
請求項１７〜３２のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアと細胞とを含み、前記細胞が前記マイクロキャリアの表面および／または内部に存在する複合材料。
【請求項３６】
薬理学上許容できるキャリアと、請求項１７〜３２のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアまたは請求項３５に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
【請求項３７】
８０〜４０００μｍの内部口径を有するシリンジを通して注入できる、請求項３６に記載の注入用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン多孔質マイクロキャリア、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法、および、多孔質マイクロキャリアの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトまたは動物の体が損傷した場合、小規模な組織損傷であれば通常、自身の本来備わっている修復システムにより修復することができる。しかしながら、心筋梗塞や外傷のような深刻な組織損傷を伴う損傷は、しばしば、自身の再生能力を超える。深刻な組織損傷の場合には、組織修復を助ける処置が必要である。【０００３】
広範な組織損傷から生じる問題の一つとして、生じた空間または穴をどのように閉じるか、または、埋めるか、という点がある。この問題を考慮して、組織が欠損した部位の空間または穴に詰め込むための、（半）永久的な充填材として、足場を使用することができる。また、足場は、増殖因子や薬品を放出するための、または、細胞を運ぶための、徐放貯蔵場所としても使用することができる。細胞を身体に注入または移植する前に足場に所望の細胞を事前に播種することにより、細胞運搬を行うことができる。【０００４】
ゼラチンは時々、多孔質マイクロキャリアなどの形態で、足場の構成素材として使用される。そのため、ゼラチン多孔質マイクロキャリアの製品は注目を集めている。【０００５】
特許文献１（WO03/104313）で、ニルソン（Nilsson）は、組織再生の足場として使用することができる、天然ゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法を提案している。ニルソンの調整方法は、二段階の乳化工程を含み、それぞれの工程で、ＨＬＢ値（hydrophilic- balance）が規定された、界面活性剤を使用している。ニルソンは、第一の乳化工程で、ＨＬＢ値が９より大きい乳化剤を含む、均一の水溶性ゼラチン溶液を調整し、有機溶媒およびＨＬＢ値が９より大きい乳化剤を含む第一の組成物を添加する。そして、ニルソンは、第二の乳化工程で、有機溶媒およびＨＬＢ値が８未満である乳化剤を含む第二の組成物を加え、最終的に、ゼラチン素材を冷却、凝固させ、マイクロキャリアを得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らの研究で、本研究者らは、ニルソンらの天然ゼラチンの方法により、遺伝子組み換えゼラチンから、多孔質マイクロキャリアの調整を試みた。しかしながら、ニルソンの方法を遺伝子組み換えゼラチンに使用したとき、練り粉のような粒子または不均一な粒子の塊が得られ、いずれも細胞培養にとって、理想的なものではなかった。そこで、本発明は、特有の性質および粒子サイズ分布を有する多孔質マイクロキャリアを得ることができる調整方法を提供することを課題とする。【０００７】
また、本発明者らの研究で、本研究者らは、改良された細胞増殖特性を有する多孔質マイクロキャリアを調整することを試みた。そこで、本発明は、優れた細胞増殖特性を有するゼラチン多孔質マイクロキャリアを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討した結果、驚くべきことに本発明者らはニルソンらの上記方法を変更し、ＨＬＢが８未満である乳化剤をほとんど、または全く含まない非水溶性液体を使用する、第二の乳化工程を実施することにより、細胞増殖に優れた性質を有する遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアを得ることができることを見出した。この発見は、第二の乳化工程で、乳化剤を有意量で使用する、ニルソンの方法とは完全に反対の知見である。また、ニルソンの方法からのこの変更は、以下に詳述するように、遺伝子組み換えゼラチンのために、以前から知られていない、特有の性質および粒子サイズ分布を有する多孔質マイクロキャリアを提供するために、使用することができる。【０００９】
また、本発明者らは、驚くべきことに、後述するように定義された特性を有するマイクロキャリアは、上記の方法等により、調整することができ、市販で入手可能なマイクロ粒子と比較して特に優れた細胞増殖特性を有することを見出した。【００１０】
[１]（ａ）水、遺伝子組み換えゼラチン、非水溶性液体、および、乳化剤を含む組成物を混合し、第一エマルションを生成する工程、（ｂ）ゼラチンのゲル化温度より高い温度で、上記第一エマルションと、非水溶性液体とを混合し、第二エマルションを生成する工程、および、（ｃ）ゼラチンが凝固する温度に第二エマルションを冷却する工程を含み、上記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含有量０．５重量%未満で含む、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[２]上記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含まない、[１]に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[３]上記工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、乳化剤を含まない、[１]に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[４]上記工程（ａ）で使用する乳化剤のＨＬＢ値が９より大きい、[１]〜[３]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[５]上記第一エマルションのｐＨが３〜１１の範囲内である、[１]〜[４]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[６]上記遺伝子組み換えゼラチンの等電点が少なくとも５である、[１]〜[５]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[７]上記遺伝子組み換えゼラチンがヒドロキシプロリンを含まない、[１]〜[６]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[８]更に（ｄ）第二エマルションから凝固したゼラチンを除去する工程を含む、[１]〜[７]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[９]上記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む、[１]〜[８]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１０]上記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも二個のリシン残基を含み、二個のリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れている、[１]〜[９]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１１]上記工程（ｂ）で上記非水溶性液体の体積が、上記第一エマルションの体積より大きい、[１]〜[１０]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１２]上記工程（ｃ）で、０．１〜２０℃／分で冷却を行う、[１]〜[１１]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１３]上記第一エマルションが少なくとも１〜１５重量％の遺伝子組み換えゼラチンを含む、[１]〜[１２]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１４]上記工程（ａ）で使用される組成物が、１〜１５重量％の遺伝子組み換えゼラチン、１０〜７０重量％の水、２０〜９０重量％の非水溶性液体、および０．５〜２０重量％の乳化剤、を含む、[１]〜[１３]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１５]更に、上記工程（ｂ）中、および／または、工程（ｂ）の後に、ゼラチンを架橋する工程を含む、[１]〜[１４]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１６]更に、上記工程（ｂ）の後に、ゼラチンの脱水熱架橋を行う工程を含む、[１]〜[１５]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[１７]  [１]〜[１６]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法により得られる、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[１８]少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔を有し、少なくとも５０体積％の平均空隙率を有する、[１７]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[１９]平均粒子径が２０〜８００μｍである、[１７]または[１８]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[２０]平均密度が、０．０４〜０．５ｇ／ｃｍ3である、[１７]〜[１９]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[２１]平均体積が、２〜２５ｃｍ3／ｇである、[１７]〜[２０]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[２２]  [１]〜[１６]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法により得られる、[１８]〜[２１]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[２３]平均粒子径が２０〜８００μｍであり、少なくとも８０％のマイクロキャリアが平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有する、[１７]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[２４]  [１７]〜[２３]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
[２５]  [１７]〜[２３]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの組織損傷修復のための足場としての使用。
[２６]  [１７]〜[２３]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアと細胞とを含み、上記細胞が上記マイクロキャリアの表面および／または内部に存在する複合材料。
[２７]  薬理学上許容できるキャリアと、[１７]〜[２３]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアまたは[２６]に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
[２８]８０〜４０００μｍの内部口径を有するシリンジを通じて注入できる、[２７]に記載の注入用組成物。【００１１】
[２９]空隙を有し、少なく半分の上記空隙が球状、および／または、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有する、ゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[３０]少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔を有する[２９]に記載のマイクロキャリア。
[３１]少なくとも５０体積％の平均空隙率を有する、[２９]または[３０]に記載のマイクロキャリア。
[３２]上記空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲にある、[２９]〜[３１]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[３３]平均粒子径が２０〜８００μｍである、[２９]〜[３２]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[３４]平均密度が、０．０４〜０．５ｇ／ｃｍ3である、[２９]〜[３３]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[３５]平均体積が、２〜２５ｃｍ3／ｇである、[２９]〜[３４]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[３６]平均粒子径が２０〜８００μｍであり、少なくとも８０％のマイクロキャリアが、平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有する、[２９]〜[３５]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[３７]少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔、少なくとも５０体積％の平均空隙率、および、２０〜８００μｍの平均粒子径を有し、少なく半分以上の空隙が球状であり、少なくとも８０％のマイクロキャリアが平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有し、空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲である、[２９]に記載のマイクロキャリア。
[３８]少なくとも５μｍの平均径を有する表面孔、少なくとも５０体積％の平均空隙率、および、２０〜８００μｍの平均粒子径を有し、少なく半分以上の空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有し、少なくとも８０％のマイクロキャリアが平均粒子径の３０％〜２００％の粒子径を有し、空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲である、[２９]に記載のマイクロキャリア。
[３９]少なくとも７５％の空隙が球状である、[３７]または[３８]に記載のマイクロキャリア。
[４０]上記ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、[２９]〜[３９]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[４１]上記ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、[２９]〜[４０]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[４２]上記ゼラチンが、ヒドロキシプロリンを含まない遺伝子組み換えゼラチンである、[２９]〜[４１]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[４３]上記ゼラチンが、少なくとも３つのＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、[２９]〜[４２]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[４４]上記ゼラチンが、少なくとも二つのリシン残基を含み、二つのリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れている、遺伝子組み換えゼラチンである、[２９]〜[４３]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[４５]  [２９]〜[４４]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
[４６]   [２９]〜[４４]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアの組織損傷修復のための足場としての使用。
[４７]   [２９]〜[４４]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアと細胞とを含み、上記細胞が上記マイクロキャリアの表面および／または内部に存在する複合材料。
[４８]  薬理学上許容できるキャリアと、[２９]〜[４４]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアまたは[４７]に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
[４９]８０〜４０００μｍの内部口径を有するシリンジを通して注入できる、[４７]に記載の注入用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法により、以下に詳述するように、遺伝子組み換えゼラチンのために、以前から知られていない、特有の性質および粒子サイズ分布を有する多孔質マイクロキャリアを提供することができる。【００１３】
また、本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアは、市販で入手可能なマイクロ粒子と比較して特に優れた細胞増殖特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ａ〜１ｃは、工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含有量０．５重量％未満で含む、本発明の方法により得られたマイクロキャリアのＳＥＭ（scanning electron microscope：走査型電子顕微鏡）写真を示す。
【図２】図２ａ〜２ｃは、工程（ｂ）で使用する非水溶性液体が、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含有量０．５重量％以上含む、本発明の方法から変更した、比較例のマイクロキャリアのＳＥＭ写真を示す。
【図３】図３ａ〜３ｃは、ＧＥ社から入手可能な市販の、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒＧ（登録商標）マイクロキャリアのＳＥＭ写真を示す。
【００１５】
図１ａは５０倍の倍率での、本発明の方法により得られた、マイクロキャリアの概観を示す。図１ａのマイクロキャリアは、うまく球状であり、狭い範囲のサイズ分布を有し、粒子が一緒になった塊がほとんどないまたは全くない。図１ｂは２３０倍の高倍率での本発明の方法により得られたマイクロキャリアを示し、表面孔（１）を明確に観察することができる。表面孔（１）はマイクロ粒子内の空隙に繋がる（これらの内部空隙は、この写真では見ることができない）。図１ｃは本発明の方法により得られたマイクロキャリアの断面図であり、内部空隙（２）を示しており、少なく半分の空隙が球状、および、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有する。また、図２ｃおよび３ｃの比較例のマイクロキャリアで示される、対応する断面図のものより、内部の空隙が大きいことを示している。更に、図１ｃの空隙（２）は、ほとんど球状であり、球状の空洞同士が重複する、または、接触する場合、隣の空隙に結合する、空隙の壁に小さな細孔を有している。空隙（２）は、マイクロキャリアの大きさとの関係で、ほとんどが大きく、狭い範囲のサイズ分布を有する（例えば、空隙（２）は、それぞれ、ほとんど同じ大きさである）。【００１６】
本発明のマイクロキャリアは、細胞の量および率の観点で良好な細胞増殖を伴う細胞培養を提供することができ、特に培養のマイクロキャリアのけん濁を維持した、動的な細胞培養で好適に使用することができ、取り扱いも容易である。【００１７】
図２ａは、１００倍の倍率での、上記した比較例の方法により得られた、マイクロキャリアの概観である。比較例のマイクロキャリアは、実施例の項目で詳細に記載するように、工程（ｂ）のコーンオイルが、５重量％のＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含む、別の方法により得られたものである。図２ａのマイクロキャリアは、大部分がそれぞれ一緒に塊となり、その結果、一様でない形状の二次粒子を形成し、広い範囲のサイズ分布を有している。図２ｂは、７５０倍の倍率での比較例の方法により得られたマイクロキャリアである。比較例のマイクロキャリアは、非球状の形状であり、大きい表面孔を（３）を有し、それぞれ一緒に塊となり、二次構造を形成している。図２ｃは比較例の方法により得られたマイクロキャリアの断面図であり、内部空隙（４）が大きさ、形状の観点で不規則であり、その多くが、図１ｂに示した本発明のマイクロキャリアと比較して、マイクロキャリアの直径に対して、とても小さいことが分かる。さらに、図２ｃのマイクロ粒子中の空隙（４）は、とても広い範囲のサイズ分布を有している。図２ｃのほとんどの空隙（４）は球状ではなく、その空隙の半分未満が、平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有する。【００１８】
図３ａは、５０倍の倍率での、市販のＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒＧ（登録商標）マイクロキャリアの概観である。図３ｂは、６００倍の倍率での一つのＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒＧ（登録商標）マイクロキャリアであり、表面孔（５）を明確に観察することができる。図３ｃは、３００倍の倍率での、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒＧ（登録商標）マイクロキャリアの断面図である。図１ｃと比較して、図３ｃに示される、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒＧ（登録商標）マイクロキャリア内の空隙（６）は、不規則な大きさおよび形状であり、多くは、球状の空隙というよりむしろ、円筒状または管状の孔である。図３ｃに示した、多くの空隙（６）は、マイクロキャリアの粒子径に対して小さく、図１ｃのマイクロキャリアと比較して、広い範囲のサイズ分布である。このように、図３ｃのほとんどの空隙（６）は球状ではなく、その空隙の半分未満が、平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書に使用される用語「遺伝子組み換えゼラチン」は、遺伝子組み換えコラーゲンを含む、用語「ゼラチン」は、コラーゲンを含む。従って、本明細書で、用語「ゼラチン」、「コラーゲン」、「コラーゲンポリペプチド」および「ゼラチンポリペプチド」は、同じ意味で使用される。
空隙は、空間または空洞と記載することがある。
【００２０】
本発明にかかる遺伝子組み換えゼラチンは、平均分子量が好ましくは、１５０ｋＤａ未満であり、より好ましくは１００ｋＤａ未満であり、好ましくは、少なくとも５ｋＤａであり、より好ましくは、少なくとも１０ｋＤａであり、更に好ましくは、少なくとも３０ｋＤａである。遺伝子組み換えゼラチンの平均分子量の好ましい範囲は、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜７５ｋＤａ、および、５ｋＤａ〜４０ｋＤａである。低粘度のために、高い質量濃度のゼラチンが求められるときには、より低い分子量が好ましい。また、本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアのゼラチンは遺伝子組み換えゼラチンに限定されないが、ゼラチンの平均分子量の好ましい範囲は、上記遺伝子組み換えゼラチンに関する記載と同様の範囲である。
なお、本発明にかかるゼラチンは、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。
【００２１】
遺伝子組み換えゼラチンは市販で、例えば富士フイルム（株）製のものを入手することができる。遺伝子組み換えゼラチンは、既知の方法で調整することができ、例えば、特許出願EP0926543、EP1014176に記載されている方法を用いることができ、その方法の内容は参照して、本明細書に含まれる。遺伝子組み換えゼラチンを調整する手法は「High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia patoris, M. W. T. Werten et al. Yeast 15, 1087-1096(1999)」にも記載されている。好適な遺伝子組み換えゼラチンは、WO2004/85473にも記載されている。
【００２２】
一実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンが、少なくとも二つのリシン残基を含み、二つのリシン残基が、端のリシン残基（extreme lysine residue）であり、第一の端のリシン残基は、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基は、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、端のリシン残基は、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れているものを挙げることができる。そのような遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、US2009/0246282に記載の方法で得ることができる。
【００２３】
更に、本発明の他の実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンが、少なくとも二つのアミノ酸残基を含み、その二つのアミノ残基は、端のアミノ酸残基（extreme amino acid residue）であり、それらは、それぞれ独立に、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から選択され、第一の端のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、第二の端のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、これら端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が、遺伝子組み換えゼラチンポリペプチド中の総アミノ酸残基数の少なくとも２５％離れているものを挙げることができる。更に、本発明の他の実施態様としては、遺伝子組み換えゼラチンが、少なくとも一つのアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基を、上記端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基の間に有するものである。
【００２４】
一実施態様としては、遺伝子組み換えゼラチンのポリペプチドが、特に５℃より高い温度でなく、または２５℃より高い温度で、安定した三重らせんを形成しないものである。
【００２５】
本発明にかかる遺伝子組み換えゼラチンは、哺乳動物または魚のような低温動物由来のゼラチンに相当するＧＸＹトリプレット中にプロリンを含むことが好ましい。
【００２６】
安定した三重らせん形成を防ぐため、遺伝子組み換えゼラチン中にあるアミノ酸の、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満が、水酸基を有するアミノ酸であることが好ましい。ヒドロキシプロリンの存在は、プロリン残基の水酸化を行う酵素を共発現しない微生物での発現により、または、他の方法でその作用を満たすことにより、防ぐことができる。実質的に０とは、酵母等の成長培地中でのヒドロキシプロリンの存在が、いくつかのこれらのアミノ酸のゼラチンへの組み込みをもたらすことを意味する。
【００２７】
好適な実施形態として、遺伝子組み換えゼラチンが、優れた細胞接着特性を有し、好ましくは、いかなる健康関係のリスクを示さないことである。このことは、ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチン、例えば、アミノ酸の総数に対して、ＲＧＤモチーフの割合が少なくとも０．４である遺伝子組み換えゼラチンを使用することにより達成することができる。もし、ＲＧＤを増加したゼラチンが３５０以上のアミノ酸を有する場合には、３５０個のアミノ酸の各範囲が少なくとも一つＲＤＧモチーフを有することが好ましい。ＲＧＤモチーフの割合は、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．８、更に好ましくは少なくとも１．０、更に好ましくは少なくとも１．２、最も好ましくは少なくとも１．５である。
【００２８】
ＲＧＤモチーフの割合０．４は、２５０個のアミノ酸ごとに１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、そのため、少なくとも０．４％に対応するためには、２５１個のアミノ酸を含むゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を持たなければならない。ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチンは、２５０個のアミノ酸ごとに少なくとも２つのＲＧＤを有することが好ましく、２５０個のアミノ酸ごとに少なくとも３つのＲＧＤを有することがより好ましく、２５０個のアミノ酸ごとに少なくとも４つのＲＧＤを有することが最も好ましい。他の実施態様として、ＲＧＤを増加したゼラチンは少なくとも４つのＲＧＤモチーフを有し、好ましくは少なくとも６つのＲＧＤモチーフ、より好ましくは、少なくとも８つのＲＧＤモチーフ、最も好ましくは１２〜１６のＲＧＤモチーフを有するものである。
【００２９】
本発明にかかる遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲン配列由来であることが好ましい。コラーゲンをエンコードする核酸は、大抵、公知文献に記載されている（例えば、Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61 : 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48 ; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; and Ala-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516参照）
【００３０】
ＲＧＤモチーフを増加した遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、US2006/0241032に記載されている一般的な方法により調整することができる。
医薬または医療用途の使用のために、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸配列と近いまたは同一のアミノ酸配列を有する、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。ゼラチンのアミノ酸配列は、天然ヒトコラーゲンにある繰り返しアミノ酸配列、特に、ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチンを作るために、ＲＧＤモチーフを含む配列を含むゼラチンであることがより好ましい。選択された配列中のＲＧＤモチーフの割合は、選択された配列の選択された長さに依存し、より短い配列の選択は、必然的に、最終的な遺伝子組み換えゼラチンのより高いＲＧＤモチーフの割合をもたらす。選択されたアミノ酸配列の繰り返しの使用は、天然ゼラチンより高い分子量を有する遺伝子組み換えゼラチンを提供するために使用することができる。更に、天然ゼラチンと比較して、非抗原性であり、ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチンを得ることができる。
【００３１】
従って、好適な実施形態としては、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ヒトコラーゲン配列の一部を含む。ゼラチンは、一以上の天然ヒトゼラチンアミノ酸配列の一以上の部位を少なくとも８０％含むＲＧＤを増加したゼラチンであることが好ましい。ヒトゼラチン配列のそのような部位は、それぞれ、好ましくは、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも４５個のアミノ酸、更に好ましくは、少なくとも６０個のアミノ酸の長さを持ち、例えば、２４０個まで、好ましくは１５０個まで、より好ましくは１２０個までの長さを持ち、それぞれの部位は、一以上のＲＧＤ配列を含むことが好ましい。ＲＧＤを増加したゼラチンは、一以上の天然ヒトコラーゲン配列の一以上の部位を含むことが好ましい。
【００３２】
本発明の方法で使用する遺伝子組み換えゼラチンに、適した起源の例は、ヒトCOL1A1-1である。ＲＧＤ配列を含む２５０個のアミノ酸の部位はWO04/85473に記載されている。遺伝子組み換えゼラチンのＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞表面上の特定のレセプターに結合することができる。
【００３３】
ＲＧＤを増加したゼラチンは、例えば、EP-A-0926543、EP-A-1014176またはWO 01/34646、特に最初の二つの特許公開公報の実施例に記載された遺伝子組み換え方法により製造することができる。ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチンを製造する、好ましい方法は、ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンプロテインの一部をエンコードする天然核酸配列で始めることを含むものである。この配列を繰り返すことにより、ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチンを得ることができる。
【００３４】
このように、遺伝子組み換えゼラチンは、適切な微生物により、ゼラチンをエンコードする核酸を発現させることにより、製造することができる。この方法は、真菌細胞または酵母細胞で適切に行うことができる。宿主細胞は、ハンゼヌラ（Hansenula）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、アカパンカビ（Neurospora）またはピチア（Pichia）のような高い発現の宿主細胞が適している。真菌および酵母細胞は、それらが、繰り返しの配列の不適切な発現に影響を受け難いため、細菌より好ましい。宿主は、ゼラチン構造の発現を攻撃するプロテアーゼを高いレベルで有していないことが、より好ましい。この点において、ピチア（Pichia）またはハンゼヌラ（Hansenula）はとても適した発現系の例として、挙げることができる。発現系として、ピチアパトリス（Pichia pastoris）の使用は、EP0926543およびEP1014176に開示されている。微生物は、特定の、プロリンの水酸化、リシンの水酸化のような、翻訳後のプロセッシング機構の活性化をなくすることができる。代わりに宿主系は、高効率で、ゼラチンを水酸化することにより、内因性のプロリン水酸化活性を有することができる。
【００３５】
他の実施態様としては、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンより、より高いガラス転移温度（Ｔｇ）、例えば、１７０℃以上、特に、１８０度以上、を有する。天然ゼラチンより、高いＴｇを有する遺伝子組み換えゼラチンは、WO 05/11740に記載されている。
更に他の実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンより低いグリコシル化、例えば、２重量％未満、好ましくは１重量％未満、より好ましくは０．５重量％未満、更に好ましくは０．２重量％未満、更に好ましくは０．１重量％未満のグリコシル化を有する。好ましい実施形態としては、遺伝子組み換えゼラチンがグリコシル化を有さないものである。グリコシル化の重量％の程度は、ゼラチンのユニット重量毎に総糖質（carbohydrate）重量を意味し、例えば、MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry)またはデュボア（Dubois）による滴定法により、決定される。用語「グリコシル化」は、単糖だけでなく、多糖、例えば、ジ−、トリ−およびテトラ−サッカリドも意味する。
【００３６】
グリコシル化が少ないまたはなくす様々な方法がある。グリコシル化は、翻訳後の修飾であり、それによって、糖質が、ゼラチンのあるアミノ酸に共有結合する。アミノ酸配列および宿主細胞（および酵素、特に、グリコシルトランスフェラーゼ）がグリコシル化の程度を決定する。２種類のグリコシル化があり、Ｎ―グリコシル化は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）のアミド基に、GIcNAc (N-actylglucosamine)を結び付けることより始まり、Ｏ−グリコキシル化は、一般に、アミノ酸のセリン（ＳまたはＳｅｒ）またはスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）にGaINAcを結びつける。
【００３７】
そのため、適切な発現宿主を選択することにより、および／または宿主のグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるコンセンサス部位を欠如する配列を修飾または選択することにより、グリコシル化は、コントロール、特に減らす、または防ぐことができる。ゼラチンの化学合成も、グリコシル化がないゼラチンを調整するために用いることができる。既知の方法を使用し、グリコシル化を含む遺伝子組み換えゼラチンは生成後、全てまたはほとんどの糖質を除去する、または、グリコシル化されていないゼラチンをグリコシル化されているゼラチンから分けることができる。
【００３８】
他の好ましい実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンの、１０％未満、好ましくは５％未満のアミノ酸残基がヒロドキシプロリンである。好ましくは遺伝子組み換えゼラチンは、ヒロドキシプロリン残基を含まない。遺伝子組み換えゼラチンが、水酸化されたアミノ酸残基を含まないことも好ましい。
他の実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンが、少なくとも５、例えば、５〜１１の等電点を有し、より好ましくは６以上、更に好ましくは７以上の等電点を有する。この目的は、生理学の条件のとき、正味の正電荷をもった遺伝子組み換えゼラチンを提供することである。理論に捉われることなく、この正電荷は、しばしば、全体として負に電荷された膜を有する細胞の引き付ける力、相互作用および結合を助けると考えられる。
【００３９】
本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアは、ゼラチンが、遺伝子組み換えゼラチンの場合には、本発明の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法により、調整することができる。
【００４０】
工程（ａ）で使用される組成物は、好ましくは３〜１１、より好ましくは４〜８の範囲でｐＨを有することが好ましい。第二エマルションは、好ましくは３〜１１、より好ましくは４〜８の範囲でｐＨを有することが好ましい。工程（ａ）で使用する組成物は、好ましくは９より大きい、より好ましくは１０より大きい、特に好ましくは１３〜１９のＨＬＢ（hydrophilic-lipophilic balance）を有する乳化剤を含むことが好ましい。そのような乳化剤を二以上使用することもできる。適した乳化剤の例として、PEG400モノオレイン酸  ポリオキシエチレンモノオレイン酸（HLB 11.4）、PEG400モノステアレート  ポリオキシエチレンモノステアレート（HLB：11.6)、PEG 400モノラウレート  ポリオキシエチレンモノラウレート(HLB：13.1)、オレイン酸カリウム(HLB：20.0)、ラウリル硫酸ナトリウム(HLB：40)、オレイン酸ナトリウム(HLB：18)、Myrj（登録商標）52 (ポリオキシエチレンステアリン酸、HLB：17)、Brij（登録商標）58 (ポリオキシエチレンセチルアルコール、HLB：16)、Tween（登録商標）20 (ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸モノエステル、HLB：16.7)、Tween21 (ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸モノエステル、HLB：13.3)、Tween40 (ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、HLB：15.6)、Tween60 (ポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタン、HLB：14.9)、Tween61 (ポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタン、HLB 9.6)、Tween65 (ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、HLB：10.5)、Tween80 (ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステル、HLB：15.0)、Tween81 (ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステル、 HLB ：10.0)およびTween85 (ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、HLB：11.0)を挙げることができる。上記のうち、好ましくは、Tween80、Tween40、Myrj52およびBrij58ならびにそれらの２以上を含む組合せである。
【００４１】
工程（ａ）で使用する、適した、非水溶性液体は、アルキルアセテート（例えば、エチルアセテート）、炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素（例えば、メチレンクロライド、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼンなど）およびオイル（例えば、植物油（例えば、コーンオイル）、パラフィンオイルまたは工業潤滑油およびそれらの２またはそれ以上を含む組合せである。特に好ましい非水溶性液体は、コーンオイルである。
【００４２】
工程（ｂ）で使用する、非水溶性液体は、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含有量０．１重量%未満で含むことが好ましく、工程（ｂ）で使用する、非水溶性液体は、ＨＬＢ値が８未満の乳化剤を含まないことがより好ましく、工程（ｂ）で使用する、非水溶性液体は、乳化剤を含まないことが更に好ましい。
【００４３】
ＨＬＢ値が８未満の乳化剤の例として、モノステアリン酸グリセリン(HLB：3.8)、Span（登録商標）40(ソルビタンモノパルミテート、HLB：6.7)、Span60 (ソルビタンモノステアレート、HLB：4.7)、Span65 (ソルビタントリ ステアレート、HLB：2.1)、Span80（ソルビタンオレイン酸モノエステル、HLB：4.3）およびSpan85(ソルビタントリオレート、HLB：1.8)を挙げることができる。
工程（ｂ）で使用する、非水溶性液体は、工程（ａ）で使用する、非水溶性液体と同じでも異なっていてもよい。工程（ａ）では、非水溶性液体に対する水の体積比は、１：１より少なく、特に１：２より少ないことが好ましく、工程（ｂ）では、非水溶性液体に対する水の体積比は、２：１より少なく、特に１：１より少ないことが好ましい。
【００４４】
通常は、第一エマルションおよび第二エマルションはそれぞれ二相、つまり、非水溶性の相と、水相を含む。工程（ａ）は、非水溶性の相の体積は水相の体積と同等またはそれより大きく、例えば、２倍またはそれより大きく、行われることが好ましい。工程（ｂ）は、非水溶性の相の体積は第一エマルションの体積より大きく、例えば、２倍以上大きく、行われることが好ましい。
【００４５】
本発明の方法は、更に、工程（ｂ）中、および／または、工程（ｂ）の後に、ゼラチンを架橋する工程を含むことができる。架橋は化学架橋、例えば、架橋剤を使用した化学架橋、好ましくは、熱架橋、例えば、脱水熱架橋である。ゼラチンは、例えば、リシンのアミン基を介して、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のカルボキシル基またはそれらの組合せを介して、架橋を行うことができる。
【００４６】
化学架橋の好適な架橋剤としては、生分解中に放出されるとき、毒性または抗原性を引き起こさないものが好ましい。好適な架橋剤として、例えば、グルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ビス−ヒドロキシ−スクシンイミド、グリシジルエーテル（例えば、アルキレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリグリセロールポリグリシジルエーテル）、ジイソシアネート（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）、ジフェニルホスホリルアジド、Ｄリボースおよびゲニピンならびにそれらの組合せを挙げることができる。架橋の方法は、「Weadock et. al. in Evaluation of collagen cross-linking techniques (Biomater. Med. Devices Artif. Organs, 1983-1984, 11 (4): 293-318)」にも記載されている。中でも、水溶性の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を好適に使用することができる。その他、ヘキサメチレンジイソシアネートを好適に使用することができる。他の好適な架橋剤は、ジクロロヒドロキシトリアジン等のトリアジンが挙げられる。その他の架橋化合物としては、ジビニルスルホン、ジ−アンハイドリド、 二官能性のイミデート、ジ−エポキシドまたはジマレイイミジンを挙げることができる。一化合物中にエポキシドおよびアンハイドライドを含む二官能性の架橋化合物のように異なる活性置換基を有する、二官能性の架橋剤を使用することもできる。酵素による架橋剤、例えば、トランス−グルタミナーゼも有用である。
【００４７】
架橋剤は、２より多い官能基を有してもよく、例えば、塩化シアヌル（三官能基）、および、二つのエポキシドおよびアンハイドリドを含む化合物を挙げられる。そのような架橋剤は、通常、ゼラチンのアミノ酸に存在するアミン基および／またはスルフヒドリル基と反応する。必要であれば、一より多い架橋剤を使用することができる。架橋剤がゼラチンと接触したとき、もしくはｐＨ等を調整した後、または光開始、もしくは他の活性化メカニズムにより、架橋は自発的に始まる。
【００４８】
特に有用な架橋剤はグルタルアルデヒドであり、それは、二つのリシン残基を架橋する。他の好適な生体適合性の架橋剤は、ＥＤＣであり、それは、アミン基とカルボキシル基を結合させる。ヘキサメチレンジイソシアネートも架橋剤として使用することができる。脱水熱架橋は、ゼラチンに存在するアミン基とカルボキシル基の縮合により架橋を誘導し、アミド結合を形成する。脱水熱架橋は、１２０℃以上の温度で行うことが好ましい。
【００４９】
本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアが、遺伝子組み換えゼラチン以外のゼラチンである場合、架橋についての好適な実施態様は、上記架橋に関する記載と同様である。
【００５０】
粒子形成に寄与するため、本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも二つのリシン残基を有することが好ましい。本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも３、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のリシン残基を有することが好ましい。更に他の実施態様として、本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、リシン残基に加えて、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択されるアミノ酸を、好ましくは少なくとも２つ含むことが好ましく、本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも３、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含むことがより好ましい。
【００５１】
マイクロキャリアの三次元ネットワーク構造に寄与するため、本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、ゼラチン分子に分散された、リシン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸を含むことが好ましい。そのため、一実施態様として、各５０個のアミノ酸残基に、少なくとも１、好ましくは少なくとも２個のリシン残基、もしくは、少なくとも１、好ましくは、少なくとも２個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基、または、少なくとも１個のリシン残基および少なくとも１個のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基を含むことが好ましい。好ましくは各４０個のアミノ酸残基に、より好ましくは各２５個のアミノ酸残基に、少なくとも１個のリシン残基および／または少なくとも１個のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基を含むことが好ましい。
【００５２】
本発明にかかるゼラチンおよび遺伝子組み換えゼラチンは、それぞれが隣接していない架橋可能なアミノ酸残基を含むことが好ましく、例えば、架橋可能なアミノ酸残基が、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個の、架橋可能でないアミノ酸により、離れていることが好ましい。架橋可能なアミノ酸残基には、第１級アミン基（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するすために通常使用される第１級アミン基に加えて）、−ＳＨおよび／またはカルボン酸（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するすために通常使用されるカルボン酸に加えて）を含む。
【００５３】
遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンより、高い割合（％）または多い数のリシン残基を含むことが、特に後に続く架橋のために、好ましい。多くの架橋剤は、リシン残基および／またはＮ末端アミンに結合する。天然ゼラチンは、通常、１０００個のアミノ酸毎に、２５〜２７個のリシン残基をおよび１１２〜１３３個のグルタミン酸およびアスパラギン酸を含んでいる。本発明に使用する遺伝子組み換えゼラチンでは、リシン残基の数を、例えば、同じ、または、１０００個のアミノ酸毎に、約２０、１５、１０または５個より少ないリシンに減らすことができ、また、必要に応じて、例えば、同じ、または、１０００個のアミノ酸毎に、約３０、４０または５０個より多いリシンに増やすことができる。本発明に使用する遺伝子組み換えゼラチンに存在する、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基の数は、例えば、同じ、または、１０００個のアミノ酸毎に、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５個より少なく、減らすことができ、また、必要に応じて、例えば、同じ、または、１０００個のアミノ酸毎に、１５０個より多いリシンに増やすことができる。必要に応じて、遺伝子組み換えゼラチンに存在する、いくつかまたは全てのグルタミンおよびアスパラギン残基を脱アミノ化し、それらをアスパラギン酸およびグルタミン酸残基に変換することもできる。
【００５４】
一実施態様としては、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン１グラムあたり０．０２〜１．０ｍｍｏｌの架橋剤とを接触させることを含む工程により、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを架橋する。例えば、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン１グラムあたり、約０．０２、０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．９ｍｍｏｌの架橋剤を使用することができる。
他の実施態様としては、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン１グラムあたり０．５〜５．０ｍｍｏｌの架橋剤とを接触させることを含む工程により、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを架橋する。例えば、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン１グラムあたり、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０および５．０ｍｍｏｌの架橋剤を使用することができる。
【００５５】
このように、マイクロキャリアの物理的特性を決定またはカスタマイズするために、使用する架橋剤の量と共に架橋可能なアミノ酸残基の数を使用することができる。架橋可能な残基の数が多いこと、および／または、架橋化合物の濃度が高いことにより、機械的なストレスがかかる用途へ特に役立つ、堅固なマイクロキャリアを得ることができる。架橋可能なアミノ酸残基の数が少ないこと、および／または架橋化合物の濃度が低いことにより、特に、注入や、薬剤用途に適した、容易に変形し易いマイクロキャリアを得ることができる。
【００５６】
マイクロキャリアが薬剤用途に使用されるときに特に望ましい、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンの潜在的な化学的汚染を、熱架橋は避けることができるため、熱架橋が好ましい。
架橋の程度は、ゼラチンマイクロキャリアが体内で分解する時間に影響を与える。そのため、意図した用途のためのマイクロキャリアの分解の割合をコントロールすることができる。これの一例は、細胞を伴わない本発明のマイクロキャリアが皺の部位で注入されるときの形成外科である。マイクロキャリア周辺の細胞は、マイクロキャリアに移動し、コロニーを作る。徐々にマイクロキャリアが周辺の酵素（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ）により分解されていき、移動した細胞は、皺の部位を占領する。これは皺が伸ばされることになる。
【００５７】
工程（ａ）で、非水溶性液体に対する水の体積：体積割合は、好ましくは、５：１〜１：１０、より好ましくは１：１〜１：５、特に好ましくは、２：３〜１：３である。
工程（ａ）で使用される組成物（および得られる第一得エマルション）は、１〜１５重量％、より好ましくは１．５〜１０重量％、特に好ましくは３〜５重量％の遺伝子組み換えゼラチンを含み、１０〜７０重量％、より好ましくは２０〜５０重量％、特に好ましくは３０〜４０重量％の水を含み、２０〜９０重量％、より好ましくは４０〜８０重量％、特に好ましくは５０〜７０重量％の非水溶性液体を含み、０．５〜２０重量％、より好ましくは１〜１０重量％、特に好ましくは２〜６重量％の乳化剤を含むことが好ましい。
【００５８】
工程（ａ）は１０〜１００℃、より好ましくは２０〜８０℃、特に好ましくは３０〜６０℃の温度で行うことが好ましい。
工程（ａ）および工程（ｂ）で行われる混合は、いかなる適切な方法で行ってもよく、例えば、振とうまたは攪拌により行うことができる。攪拌により混合を行うことが好ましく、特に、溶解機タイプの攪拌を用いるときに、２０〜５０００rpm（revolutions per minute）、より好ましくは２００〜１０００rpm、特に好ましくは２５０〜６００rpmの速度で攪拌することが好ましい。工程（ａ）での混合スピードは、工程（ｂ）での混合スピードと同じであっても異なっていてもよい。
【００５９】
工程（ｂ）で、第一エマルションと混合する非水溶性液体に対する第一エマルションの体積：体積割合は、好ましくは、５：１〜１：１００、より好ましくは２：１〜１：１０、特に好ましくは、１：１〜１：３である。
第二エマルションは、１〜８５重量％、より好ましくは１０〜６５重量％、特に好ましくは２５〜５０重量％の第一エマルションを含み、１５〜９９重量％、より好ましくは３５〜９０重量、特に好ましくは５０〜７５重量％の上記非水溶性液体（即ち、工程（ａ）からの第一エマルションで既に存在する非水溶性液体に加える、工程（ｂ）でのはじめて含む非水溶性液体）を含むことが好ましい。工程（ｂ）で第一エマルションと混合する非水溶性液体は、好ましくは０〜０．１重量％、より好ましくは０重量％のＨＬＢが８未満の乳化剤を含むことが好ましい。工程（ｂ）で第一エマルションと混合する非水溶性液体は乳化剤を含まないことが好ましい。
【００６０】
工程（ｂ）は、ゼラチンのゲル化温度より高い温度で行うことが好ましい。いかなる適切な方法によっても、ゼラチンのゲル化温度を決定することができる。例えば、「Tosh et al in Applied Physics Letters, Vol. 84, Number 21, 24 May 2004」に記載の方法を用いることができ、特に、そこに記載された三番目の方法を用いることができる。ゲル化温度は、ゼラチンの同一性およびゼラチンの濃度の程度に依存する。
工程（ｂ）はゼラチンのゲル化温度より、１〜８０℃、好ましくは、３〜７０℃、特に好ましくは５〜６０℃高い温度で行うことが好ましい。
ゼラチンに依存するが、工程（ｂ）は１０〜１００℃、例えば、１５〜７０℃、特に２０〜６０℃の範囲の温度で通常行われる。
【００６１】
実際には、高い程度の正確性でゼラチンのゲル化温度を把握することは通常重要ではなく、おおよその認識で十分である。それは、実際にゲル化温度を測定せずに、または算定される、おおよそのゲル化温度のみを把握されるだけで、ゲル化が確かに起こるゲル化温度より十分に高い温度で工程（ｂ）を行うことができるためである。
工程（ｃ）で行われる冷却は、受動的でも能動的でもよい。例えば、受動的な冷却は、簡単に第二エマルションをゼラチンが凝固する温度まで自然に冷やすことにより行うことができる。能動的な冷却は、第二エマルションの温度を下げる（例えば、コントロールされた冷却速度で）ための、冷却方法（例えば氷または氷水）を使用することにより、行うことができる。能動的な冷却は、最終的なマイクロキャリアの性質を調整するのに有用である。
しかし、工程（ｃ）は、１分あたり０．１〜２０℃、より好ましくは１〜１０℃の割合で、第二エマルションを冷やすように行うことが好ましい。これらの冷却速度は、特に有用な特性を有するマイクロキャリアを提供することができる。例えば、第二エマルションが６０℃である場合、好ましい冷却速度は、１分あたり１．８℃である。３０分後、得られる混合物は最終的に６℃の温度となる。冷却速度は、直線的であっても直線的でなくもよい。
【００６２】
本発明の方法は、更に工程（ｄ）第二エマルションから凝固したゼラチンを除去する工程、好ましくはろ過により除去する工程を含むことが好ましい。
前述のことを考慮し、第一の本発明である方法は、以下の特徴をもつことが好ましい。
（ｉ）工程（ａ）で使用される組成物が、３〜５重量％の遺伝子組み換えゼラチン、３０〜４０重量％の水、５０〜７０重量％の非水溶性液体、および２〜６重量％の乳化剤を含む、
（ｉｉ）工程（ａ）および工程（ｂ）の混合は、それぞれ独立に、２５０〜６００rpmの速度で攪拌されることにより行われる、
（ｉｉｉ）工程（ａ）で非水溶性液体に対する水の体積：体積割合は、２：３〜１：３の範囲とする、
（ｉｖ）工程（ａ）は３０〜６０℃の範囲の温度で行うことが好ましい、
（ｖ）工程（ｂ）で使用される組成物が、２５〜５０重量％の第一エマルション、５０〜７５重量％の非水溶性液体を含み、非水溶性液体が乳化剤を含まない、
（ｖｉ）第二エマルションを１分あたり１〜１０℃の割合で冷やすように、工程（ｃ）を行うことが好ましい、および
（ｖｉｉ）本発明の方法は、得られる遺伝子組み換えゼラチンマイクロキャリアを架橋する工程、好ましくは、脱水熱架橋により架橋する工程を任意に更に含む。
【００６３】
第二の本発明によると、一またはそれ以上の以下の特徴を有する遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアを提供する。また、本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアは、一またはそれ以上の以下の特徴を有することが好ましい。
（ａ）少なくとも５μｍ、例えば、６〜３０μｍ、特に１０〜２０μｍの平均径を有する表面孔。表面孔はマイクロキャリアの粒子径の５％未満の平均径を有することが好ましい。
（ｂ）少なくとも５０体積％、例えば、５１〜９５体積％、特に６０〜９０体積％の平均空隙率。
（ｃ）２０〜８００μｍ、例えば、４０〜６００μｍ、特に１００〜５００μｍの平均粒子径。
（ｄ）０．０４〜０．５０g/cm3、例えば、０．０６〜０．２５g/cm3、特に０．１〜０．２g/cm3の平均      密度。
（ｅ）２〜２５cm3/g、例えば、４〜１７cm3/g、特に５〜１０cm3/gのタップ体積。
（ｆ）２０〜８００μｍの平均粒子径。少なくとも８０％のマイクロキャリアは、平均粒子径の３０〜２００％の粒子径を有する。
【００６４】
平均粒子径は、体積加重平均径（volume-weighted mean diameter）であり、マルヴァーン・マスターサイザー（Malvern Mastersizer）を用い、測定することができる。
表面孔の平均径は、マイクロコンピューテッドトモグラフィー（ＣＴ）画像分析により測定することができる。例えば、Skyscan 1172 MicroCT apparatus（Bruker社製）を使用でき、VGStudio MAX 2.2 softwareを備えたものが好ましい。
マイクロキャリアの平均空隙率は、下記式（１）により定義される。
P=(pvI/V)x100  ％  式（１）
ここで、Ｐは平均空隙率であり、pvIはマイクロキャリア内の平均総空間体積であり、Vはマイクロキャリアの総体積であり、空間体積も含む。
pvIはマイクロＣＴ測定により決定できる（例えば、Skyscan 1172 MicroCT apparatus（Bruker社製）を使用でき、VGStudio MAX 2.2 softwareを備えたものが好ましい。）。
Vはマクロキャリアの体積を測定すること（例えば、マイクロキャリアの、マイクロＣＴ測定画像の分析により決定した大きさを使用することにより）、および、数学的な平均体積を計算することにより、算出できる。
【００６５】
第一の本発明である方法により得られる遺伝子組み換えゼラチンマイクロキャリアは、上記特徴（ａ）〜（ｆ）の一またはそれ以上、および／または第三の本発明に関する、下記特徴の一またはそれ以上を有することが好ましい。第一の本発明である方法により、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアを得ることができる。上記特徴（ａ）から（ｆ）は、架橋されている、または架橋さいてない、本発明のマイクロキャリアの両方に適用できる。市場で現在入手可能なマイクロキャリアとは全く異なる三次元構造を有するゼラチンマイクロキャリアを得るために、本発明の方法を使用することができる。
【００６６】
このように、第三の本発明によれば、空隙を有し、その空隙が、マイクロキャリアの粒子径の５〜２５％（好ましくは１０〜２０％）の平均径を有する、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアを提供することができる。本発明の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア、および、ゼラチン多孔質マイクロキャリアは、空隙は隣接する空隙と細孔により結合していることが好ましい。空隙の平均直径はマイクロキャリアの平均粒子径の５〜２５％の範囲にあることが好ましい。生体細胞が空隙に入ることを許容するため、少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは９０％の空隙が、十分に相互に接続し、マイクロキャリアの外部と（例えば、細孔を介して）接続されていることが好ましい。空隙は、生体細胞が入ることができる、多孔質の壁（例えば、穴を含む壁）を有することが好ましい。空隙壁中の細孔（または穴）は、少なくとも５μｍ、より好ましくは少なくとも１０μｍの平均直径を有することが好ましい。
【００６７】
少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは８０％の空隙が、平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有することが好ましい。少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは８０％の空隙が球状であることが好ましい。少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に好ましくは８０％の空隙が、窪んだ壁を有することが好ましい。このように、ゼラチンマイクロ粒子は、例えば、二つの空隙が重なりあったときに、細胞または医薬物質が空隙に入ることを許容する足場中の、複数の、球状の空隙／窪んだ壁、および、細孔／穴に特徴付けられる足場を提供することができる。
空隙を含むマイクロキャリアを作るために使用されるゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンであることが好ましく、他の本発明に関して、ここに記載されている遺伝子組み換えゼラチンが特に好ましい。
【００６８】
本発明は、個々に、および、集合として両方でもマイクロキャリアを提供する。本発明は、平均して、上記性質を有する、複数のマイクロキャリア（１バッチの、少なくとも５００ｍｇのマイクロキャリア）も提供する。本発明のゼラチンマイクロキャリアはどのような外形でもよいが、本発明の方法は球状の粒子を調整することに特に適している。このように、本発明の方法により得られるマイクロキャリアは、球形であることが好ましく、例えば、それらがマイクロスフェアであることが好ましい。
第四の本発明によれば、ゼラチン多孔質マイクロキャリアおよび細胞を含み、細胞はマイクロキャリアの表面および／または内部に存在する、複合材料を提供し、そのマイクロキャリアは、本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアまたは本発明の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアである。
【００６９】
本発明の複合材料にかかる細胞の種類は制限なく、ヒトまたは動物細胞も含まれる。例えば、皮膚の細胞を使用することができ、得られる複合材料は、様々な種類の皮膚の損傷の治療に使用することができる。他の例は、例えば心筋梗塞の治療に使用できる筋芽細胞（筋細胞）である。他の例は、傷のない肝臓の病変中の毒物に使用することができる肝細胞である。好適な実施態様として、細胞は幹細胞、例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、ニューロンの幹細胞、表皮幹細胞および、間葉系幹細胞である。使用することができる他の細胞には、多能性細胞、内皮細胞、前駆細胞、および骨髄由来の細胞も含まれる。
【００７０】
本発明の複合材料は、所望の細胞とマイクロキャリアを培養することにより調整することができる。一般的にマイクロキャリアおよび所望の細胞を含む懸濁液を栄養素とともに培養容器で混合する。使用する培養容器は製造のスケールに依存する。小スケールの製造のためには、小さい実験室ベースの攪拌容器を使用することができる。大スケールの製造のためには、数千リットルの体積を持ったタンクを使用することができる。
栄養素は、成長させる細胞により通常選択され、多くの栄養素の混合物および培地を市販で入手できる。例えば、DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）、BME（basal medium eagle）、DMEM/F12培地、Ham's F-10およびF-12培地、medium 199、MEM、Ames' media、BGJb medium (Fitton-Jackson Modification)、 Click's medium、CMRL-1066 medium、Fischer's medium、GMEM（Glascow Minimum Essential Medium）、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、L-15 Medium (Leibovitz)、McCoy's 5A Modified Medium、NCTC Medium、Swim's S-77 Medium、Waymouth Medium、William's Medium EおよびRPMI 1640 Mediaを使用することができる。
【００７１】
本発明のマイクロキャリアは、多くの用途に、例えば、細胞キャリアとして、組織損傷修復のための足場として、使用することができる。従って、人工皮膚、人工組織、脂肪細胞、筋肉、血管などを培養するために、マイクロキャリアは、使用することができる。使用するマイクロキャリアは、細胞培養の細胞のキャリアとして、および、ヒトまたは動物の体に移植される前または後に所望の物質の生産のために生存する細胞のキャリアとして、両方に使用することができる。細胞は、宿主自身（自家移植）の細胞または他の起源の細胞（同種または異種）であってもよい。いくつかのケースとして、所望の生成物である細胞、例えば、移植後の初期段階のキャリア上の脂肪細胞（前脂肪細胞）を脂肪細胞変換するために増殖させることができる。用途の一つの分野は、例えば、形成外科である。
【００７２】
本発明のマイクロキャリアをヒトまたは動物の体の中に細胞の添加なしで移植することもできる。移植後、体の中の近接した細胞はマイクロキャリアに移動し、コロニーを形成する。移植されたマイクロキャリアが分解された後、コロニー形成した細胞は、移植に対応した構造を形成する。第五の本発明によれば、薬理学上許容できるキャリアと本発明のマイクロキャリアまたは組成物を含む注入用組成物を提供できる。
組成物は、８０〜４０００μｍの内部口径を有するシリンジを通して注入できることが好ましい。好適な薬理学上許容できるキャリアには、液体、例えば、水、エタノールならびに水および／またはエタノールを含む混合物を含む。薬理学上許容できるキャリアは無菌であることが好ましく、任意に防腐剤を含めることができる。
【実施例】
【００７３】
以下の限定されない実施例により、本発明を説明する。
以下の略称を使用する。
「RG1」は、１０重量％溶液、ｐＨ５．４の、ＲＧＤを増加した遺伝子組み換えゼラチン溶液（MWT：51.2 kDa）を意味する。ヒトCOLlAl-Iゼラチンのアミノ酸配列の部分をエンコードし、核酸配列を変更した核酸配列を基にゼラチンを調整した。EP-A-0926543、EP- A-1014176およびWO01/34646に記載されている方法を使用した。このゼラチンはヒドロキシプロリンを含まず、配列番号１に記載されている、以下のアミノ酸配列からなる。
配列番号１のアミノ酸配列:
GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG;
配列番号１は、５７１個のアミノ酸長であり、１２個のＲＧＤモチーフを含む。
「RG2」は１０重量％の代わりに４重量％のゼラチンを含むことを除き、「RG1」と同じである。
「RG3」は１０重量％の代わりに１５重量％のゼラチンを含むことを除き、「RG1」と同じである。
「Tween（登録商標）80」はポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。
「PBS」はリン酸緩衝生理食塩水である。
「DAPI」は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（細胞の染色）である。【００７４】
実施例１
工程（ａ）第一エマルションの調整
RG1 (15g)およびTween80(1.0g)の混合物を６０℃に加熱し、その温度を１５分維持した。非水溶性液体（コーンオイル30cm3）を５５０rpmで混合物を攪拌しながら、７分かけて添加した。６０℃の温度を維持しながら、更に３分間、５５０rpmで攪拌を続けて、第一エマルションを得た。
工程（ｂ）第二エマルションの調整
３５０rpmで攪拌しながら３分かけて室温で非水溶性液体（コーンオイル55cm3）に第一エマルションを滴下し加えた。添加完了したとき、２０℃で３分間、攪拌を続けて、第二エマルションを得た。
工程（ｃ）第二エマルションの冷却
工程（ｂ）で記載した３分間の後、第二エマルションを３５０rpmで攪拌を続けながら５分間かけて５．５℃に冷却した。混合物が５．５℃になったとき、更に１５分間、この温度で攪拌を続けた。氷浴を使用し、−１〜＋１℃の温度に、アセトン（300 ml）を含む容器を冷却した。その後、３５０rpmで攪拌しながら、第二エマルションを冷却したアセトンに加えた。３５０rpmで５分攪拌した後、氷浴から容器を取り除き、室温で一時間攪拌を続け、アセトンは、混合物中に形成されたマイクロキャリアを脱水した。マイクロキャリアをろ過し取り除き、水およびコーンオイルがマイクロキャリアから除去されるまで、アセトンで数回洗浄した。その後、６０℃で、オーブン中でマイクロキャリアを乾燥させた。
任意の工程（ｄ）架橋
工程（ｃ）から得られたマイクロキャリアを、次にように脱水熱処理することにより架橋した。
乾燥したマイクロキャリアをガラスのバイアルに置き、Binder VD53 vacuum stove中で、９６時間、真空下で、１４５℃の温度に置いた。得られた遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアはMS1と称し、その特性を以下の表１（マイクロキャリアMS1の特性）に記載する。なお、MS1は、少なくとも半分の空隙が球状であり、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有していた。【００７５】
【表１】
2016063935.tif 000002
【００７６】
平均空隙直径および形状は、マクロキャリアを切断し、その断面をマイクロＣＴデータ（Bruker 社のVGStudio MAX 2.2 software を備えたSkyscan 1172 MicroCT apparatusを使用）を使用し、分析することにより決定した（図１ｃ参照）。
平均空隙率は上記した式（１）により決定した。
平均粒子径は、マイクロキャリアの体積加重平均径（volume-weighted mean diameter）であり、マルヴァーン・マスターサイザー（Malvern Mastersizer）を使用し算出した。
マイクロキャリアの平均密度は１ｇのマイクロキャリアの総体積（空隙およびスフェア間の空間を含む）を測定し、１ｇをマイクロキャリアの総体積で割ることにより、算出し決定した。
マイクロキャリアの平均体積は、１ｇのマイクロキャリアの体積（空隙およびスフェア間の空間を含む）を測定し決定した。【００７７】
実施例２〜９および比較例１
下記表２に示す変更を除き、実施例１を繰り返した。得られたマイクロキャリアの特性は表３に示す。なお、MS2〜9のマイクロキャリアは、いずれも、少なくとも半分の空隙が球状であり、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有していた。一方、CMS1およびCultispher Gは、いずれも、少なくとも半分の空隙が球状ではなく、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−３０％〜＋３０％の直径を有していなかった。【００７８】
【表２】
2016063935.tif 000003
【００７９】
【表３】
2016063935.tif 000004
【００８０】
平均空隙直径、平均空隙率、平均粒子直、平均密度および平均体積は、実施例１に記載したように測定した。
CMS1またはCultispherGの空隙は球状ではかったため、表中の*は測定できなかった。
試料MS1、CMS1および市販のCultiSpher Gは、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により分析した。得られた写真は図面に示す。MS1は図1a〜1c、比較例CMS1は図2a〜2c、および市販の CultiSpherGは図3a〜3cに示す。
図面は、MS1マイクロキャリアがうまく分離されており、よく区別された、球状の空隙を有する、実質的に球状であることを示している。一方、比較例のマイクロキャリアCMS1では、マイクロキャリアは非球形の形状、大きな表面の穴を有し、一緒に固まりとなり二次構造を与える。図2cは、比較例の方法で得られたマイクロキャリアの断面を示し、空隙が、図1aに示す本発明のマイクロキャリアと比較して、マイクロ粒子の粒子径に対して、より小さいことを示している。更に、図2cで示すマイクロ粒子の空隙は、大きさおよび形状が不規則である。【００８１】
マイクロキャリア−細胞組成物の調整およびテスト
染色により測定した細胞増殖
上記実施例および比較例で記載された、架橋された、ゼラチン多孔質マイクロキャリアを含む合成物は、以下のように調整した。【００８２】
殺菌工程
それぞれのマイクロキャリア(100 mg)を評価段階でリン酸緩衝食塩水(PBS、10cm3、カルシウムおよびマグネシウムなし)中に置いた。室温で１時間後、ＰＢＳを除去することなく、マイクロキャリアをオートクレーブにより、殺菌した。殺菌後、ＰＢＳを除去し、新しいＰＢＳを加えた。このサイクルを三回繰り返した。最終的に得られた、殺菌したマイクロキャリアは、使用するまで、４℃で１０％FBS(foetal bovine serum)を含むDMEM培地中で保存した。【００８３】
C2C12細胞(筋線維芽細胞マウス, ATCC CRL 1772)の調整
細胞をT75培養フラスコ中で前培養し、細胞を５０〜６０％密集させ、活発に増殖したとき、継代させた。細胞をPBS(1 ml/ 5 cm2)でリンスし、１０％FBS(foetal bovine serum)を含むDMEM培地を除去した。トリプシン／EDTA溶液を細胞に加え（3-4 ml/75cm2）、６分間３７℃でインキュベートさせた。完全培地を加え、トリプシンの量に対して、１：２の割合で使用し、トリプシンを中和させた。得られた単一細胞溶液を室温で５分間、１２５rpmで遠心分離させた。上澄みをとり、得られた細胞ペレット内の細胞を優しく、10% FBSを含むDMEM培地で再けん濁させた。細胞密度は顕微鏡を用い決定した。【００８４】
スピナーフラスコ培養
25 mlの無菌のスピナーフラスコ（Wheaton）を純水（10 cm3）で洗浄した。評価段階で乾燥したマイクロスフェア(40mg)をそのスピナーフラスコに加えた。フラスコは細胞培養DMEM/10% FBS培地でエンド体積の8 mlまでいっぱいにした。フラスコは３０分間、平衡にするためにインキュベーターに放置した。次に、培養培地に、上記したC2C12細胞(2 cm3に2 x106細胞)を加え、得られた混合物を、５分間、50 rpmで攪拌し、攪拌を止め、４０分間、静置する、というサイクルで３時間、攪拌した。このサイクルは４回行った。次に、培養培地（10 cm3）の一部を加え、37℃、5%CO2、80 rpmの条件で、加湿インキュベーター中で７日間、細胞を培養した。毎日、培養培地の５０％を取り除き、未使用の培養培地と取り替えた。【００８５】
分析
細胞培養７日後、得られた合成物（マイクロキャリア＋細胞）をDAPIで染色した。二本鎖DNAに結合したとき、DAPIは358 nm（紫外線）の波長で吸収極大を有し、その発光極大は461 nm（青）である。細胞の核が青くハイライトされたスポットとして見ることができた。細胞の核の数をカウントし、これは、架橋されたマイクロキャリアに関連した細胞増殖の程度を示した。細胞培養後のスフェアの断面のSEM分析はマイクロスフェア内の細胞増殖の程度を明らかにした。マイクロキャリアの外表面もわずかに染色された。結果を表４（DAPI染色法により評価された増殖結果）に示す。【００８６】
【表４】
2016063935.tif 000005
【００８７】
表４中、以下のスコアを使用した。
「+++」は目視検査により決定した「とても良好な細胞増殖」を意味する。
「++」は目視検査により決定した「良好な細胞増殖」を意味する。
「+」は目視検査により決定した「ほどほどの細胞増殖」を意味する。
表４から分かるように、実施例の細胞増殖は、CMS1およびCultiSpherGの比較例より、優れていた。
【図１】
2016063935.tif 000006
【図２】
2016063935.tif 000007
【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016063935.tif 000010
2016063935.tif 000011
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