(57)【要約】  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程と、前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程とを含む方法。
2015190529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項２】
前記第２の融合タンパク質が、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項５】
前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）請求項６に記載のベクター
（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｇ）第１の融合タンパク質
（ｈ）第２の融合タンパク質。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項４又は５に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第３の融合タンパク質
（ｇ）第４の融合タンパク質
（ｈ）第５の融合タンパク質。
【請求項９】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項１０】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項９に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の標識化タンパク質
（ｇ）第２の標識化タンパク質
（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
【請求項１１】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１１に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第７の融合タンパク質
（ｇ）第８の融合タンパク質
（ｈ）第９の融合タンパク質。
【請求項１３】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１３に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１０の融合タンパク質
（ｇ）第１１の融合タンパク質
（ｈ）第１２の融合タンパク質。
【請求項１５】
第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項１６】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１５に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）第１３の融合タンパク質
（ｇ）第１４の融合タンパク質
（ｈ）第１５の融合タンパク質。
【請求項１７】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項１８】
下記（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１７に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１６の融合タンパク質
（ｆ）第１７の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法、並びに当該方法に用いられるためのベクター及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用の判定方法は、主に２つのグループに分けることができる。一つ目は、生細胞から分離された状態のタンパク質を用いることを特徴とする方法である。例えば、表面プラズモン共鳴法、タンパク質質量分析法、異方性測定法（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）が挙げられる。しかしながら、これらの方法では、実際の細胞内環境と同様の環境で相互作用を判定することは困難である。【０００３】
そこで、二つ目の方法として、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の判定を行う方法も開発されている。代表的な方法としては、レポーターの転写活性を検出する酵母ツーハイブリッドシステムやその変法が挙げられる。その他、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の酵素の再構成を利用する方法も開発されている。【０００４】
しかしながら、これら方法には、タンパク質間相互作用が発生した位置（タンパク質間相互作用の位置情報）や、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間、該相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等（タンパク質間相互作用の時間情報）を判定することができないという問題がある。【０００５】
また、生細胞を用いてタンパク質間相互作用の判定を行う方法として、蛍光タンパク質の再構成を利用する方法もあるが、一度再構成した蛍光タンパク質は解離しないため、タンパク質間相互作用が消失するまでの時間及び該相互作用の持続時間等を判定することができないという問題がある。さらには、タンパク質間相互作用が発生してから、蛍光を発するまでに時間を要するため、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間等を判定することができないという問題もある。【０００６】
一方、生細胞内でタンパク質間相互作用の判定を行う方法として、分子間の距離に依存したエネルギー転移を検出する蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）が開発されている。この方法は、タンパク質間相互作用が発生した位置情報と時間情報が得られるという利点を有するものの、この方法に用いられるドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質との相互の位置関係が、タンパク質間相互作用の判定において重要であるため、これら蛍光タンパク質と検出の対象となるタンパク質とを繋ぐリンカー（スぺーサー）の最適化を検討する工程が煩雑であり、系の構築が困難であった。さらに、アクセプター蛍光タンパク質を励起してしまうｃｒｏｓｓ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎや、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光を検出するフィルター（吸収フィルター）セットにドナー蛍光タンパク質の蛍光が漏れ込むｂｌｅｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈが発生してしまうため、結果の解析が困難であった。また、２色の蛍光タンパク質（ドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質）を使用するため、検出対象となるタンパク質以外の情報を取得する目的で使用できる蛍光タンパク質が限定されるという問題もあった。【０００７】
近年、Ｔｏｂｉａｓ  Ｍｅｙｅｒらによって、細胞内局在化を利用したタンパク質間相互作用の判定方法が報告された（特許文献１）。この方法においては、相互作用を判定するタンパク質の一方に細胞内の特定の部位に特異的に結合するタンパク質を融合し、相互作用を判定するタンパク質の他方に蛍光タンパク質等を融合する。そして、これら融合タンパク質を細胞内で発現させ、細胞内の特定の部位における蛍光タンパク質等のシグナルを指標としてタンパク質間相互作用を判定する。【０００８】
また、Ｎｉｂｅｒｔらによって、相互作用を判定するタンパク質の一方にウィルス封入体を形成するタンパク質を融合した融合タンパク質を用い、相互作用を判定するタンパク質の他方がウィルス封入体に集積することを指標として、タンパク質間相互作用を判定する方法が報告されている（特許文献２）。【０００９】
しかしながら、これら細胞内局在化を利用したタンパク質間相互作用の判定方法は、相互作用を判定するタンパク質の一方を強制的（人工的）に細胞内の特定の部位に移行させて拘束するため、本来タンパク質間相互作用が生じる部位、すなわちタンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下での判定ができず、タンパク質間相互作用の位置情報が得られない等の問題点がある。また、天然の状態で、細胞内局在化される部位と同じ部位に局在するタンパク質同士の相互作用を判定することもできない。【００１０】
この問題点に対しては、Ｓａｒａ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｂｊｏｒｎらによって、タンパク質が本来機能する細胞内環境下にて相互作用させた上で、薬剤等の刺激を該細胞に与えることにより、相互作用するタンパク質からなる凝集体の形成を誘導し、該凝集体の形成をもって、タンパク質間相互作用を判定する方法（ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ−ｔｒａｐ  ｍｅｔｈｏｄ）が報告されている（特許文献３）。【００１１】
しかしながら、この方法は任意の時点において凝集体の形成を誘導するための刺激を細胞に与える必要があり、刺激を与えた後に引き続き相互作用の有無を判定するためには、刺激を与えるために用いた薬剤等を除く必要がある。従って、かかる方法においては、タンパク質間相互作用が発生した時間情報を得ることができず、また、任意の期間に任意の場所にて変化（発生、消失、再発生等）するタンパク質間相互作用は判定できない等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０００／０１７２２１号
【特許文献２】国際公開第２００６／０９９４８６号
【特許文献３】米国特許第７２８２３４７号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１３／０８４９５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞内におけるタンパク質間相互作用を、タンパク質間相互作用に固有な細胞内環境下において判定することができ、かつ、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、２つのタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）の相互作用の判定において、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質との利用を構想した（図１及び２  参照）。より具体的には、これら２つの融合タンパク質を細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系を考えた。【００１５】
そして、実際にこの系を構築し、これら融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。また、この系によって、タンパク質間相互作用が発生した位置（タンパク質間相互作用の位置情報）や、タンパク質間相互作用が発生するまでの時間及び該相互作用が消失するまでの時間等（タンパク質間相互作用の時間情報）も判定できることも明らかになった。さらに、この方法と、本発明者らが従前発明した、蛍光輝点を指標としてタンパク質間相互作用を判定する別の方法（特許文献４）とを比較した結果、本発明の方法は、特許文献４に記載の方法よりも、少なくとも第１のタンパク質及び第２のタンパク質が同一分子であり、その分子同士が２量体以上を形成する、ホモ多量体形成の判定効率の上では優れていることも明らかになった。【００１６】
また、図１及び２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系の有効性が実証されたことを受け、タンパク質間相互作用を判定するための別の検出系を構想した（図３〜６  参照）。すなわち、前記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入し、当該細胞内における各融合タンパク質の再構成を介した、タンパク質間相互作用を判定するための検出系を構想した。【００１７】
より具体的には、図３に示す通り、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の相互作用の判定において、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することが想定される。そして、かかる想定通りであれば、図１及び２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることが、図３に示す第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系においても期待できる。【００１８】
また、図４に示す通り、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質複合体が該細胞内において発現することが想定される。すなわち、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び結合パートナーと、アフィニティタグ及び第１のタンパク質とからなる複合体が、図２に示す第１の融合タンパク質のように機能し、また、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び結合パートナーと、アフィニティタグ及び第２のタンパク質とからなる複合体が、図２に示す第２の融合タンパク質のように機能することが想定される。そして、これらタンパク質複合体の発現に伴い、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【００１９】
さらに、図５に示す通り、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって蛍光タンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【００２０】
さらにまた、図６に示す通り、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって多量化能を有するタンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、図２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【００２１】
そこで、実際に図３に示す検出系も構築し、上記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。また、図４に示す検出系も構築し、上記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。【００２２】
さらに、本発明者らは、図１等に示した系に基づき、３以上のタンパク質間の相互作用を検出するための態様として、図７に示す系を構想した。すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【００２３】
そこで、実際に図７に示す検出系も構築し、前記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。【００２４】
さらに、本発明者らは、上記結果に基づき、タンパク質間相互作用を判定するための系として、図８に示す系を構想した。すなわち、第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入し、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質である場合、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用し、さらに多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導されることにより、融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。【００２５】
そして、実際に図８に示す検出系も構築し、前記融合タンパク質を細胞内において発現させたところ、第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系によっても、該細胞内において検出された蛍光輝点を指標に、任意のタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。【００２６】
したがって、本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法、並びに当該方法に用いられるためのベクター及びキットに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜２＞  前記第２の融合タンパク質が、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜５＞  前記蛍光タンパク質が単量体蛍光タンパク質である、＜４＞に記載の方法。
＜６＞  多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター。
＜７＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）＜６＞に記載のベクター
（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｇ）第１の融合タンパク質
（ｈ）第２の融合タンパク質。
＜８＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜４＞又は＜５＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第３の融合タンパク質
（ｇ）第４の融合タンパク質
（ｈ）第５の融合タンパク質。
＜９＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１０＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜９＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の標識化タンパク質
（ｇ）第２の標識化タンパク質
（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
＜１１＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１２＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１１＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第７の融合タンパク質
（ｇ）第８の融合タンパク質
（ｈ）第９の融合タンパク質。
＜１３＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１４＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１３＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１０の融合タンパク質
（ｇ）第１１の融合タンパク質
（ｈ）第１２の融合タンパク質。
＜１５＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１６＞  下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１５＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）第１３の融合タンパク質
（ｇ）第１４の融合タンパク質
（ｈ）第１５の融合タンパク質。
＜１７＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜１８＞  下記（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１７＞に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１６の融合タンパク質
（ｆ）第１７の融合タンパク質。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において判定することができ、また当該判定の結果に基づき、タンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することが可能となる。特に、本発明によれば、ホモ多量体形成をその固有な細胞内環境下において効率良く判定することができ、また当該判定の結果に基づき、ホモ多量体形成の位置情報及び時間情報も効率良く取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のタンパク質間相互作用の第１の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図２】本発明のタンパク質間相互作用の第１の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含み、さらに蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図３】本発明のタンパク質間相互作用の第２の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図４】本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及びアフィニティタグ（図中、Ｅ１）を含む第１の標識化タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及びアフィニティタグ（図中、Ｅ１）を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナー（図中、Ｅ２）が結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１の標識化タンパク質と第２の標識化タンパク質と前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図５】本発明のタンパク質間相互作用の第４の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド（図中、ｄ１）を含む第７の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド（図中、ｄ１）を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド（図中、ｄ２）、及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図６】本発明のタンパク質間相互作用の第５の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド（図中、ｃ１）を含む第１０の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド（図中、ｃ１）を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド（図中、ｃ２）、及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図７】本発明のタンパク質間相互作用の第６の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１のタンパク質（図中、Ａ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質（図中、Ｆ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合に、該細胞内において、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図８】本発明のタンパク質間相互作用の第７の判定方法の一態様を示す概念図である。すなわち、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であって、第１のタンパク質（図中、Ａ）、第１の多量化能を有するタンパク質（図中、Ｃ）及び蛍光タンパク質（図中、Ｄ）を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質（図中、Ｂ）及び第２の多量化能を有するタンパク質（図中、Ｇ）を含む第１７の融合タンパク質とを細胞内に発現させた又は細胞内に導入した場合に、該細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定することができることを示す図である。
【図９】多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体に融合してなる、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから３８分後の細胞、薬剤を添加してから７６分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１０】国際公開第２０１３／０８４９５０号に記載の方法により、薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点を検出した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから５８分後の細胞、薬剤を添加してから６６分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１１】ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加することにより形成されたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成が、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加することにより解消（消失）されることを、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加してから９０分後の細胞、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを洗浄し、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加してから９０分後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１２】ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加することにより形成されたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成が、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加することにより解消されることを、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示すグラフである。図中、Ａは、細胞にＢ／Ｂホモダイメリザーを添加してからの経過時間を示す。Ｂは、細胞に添加したＢ／Ｂホモダイメリザーを洗浄している時間を示す。Ｃは、該洗浄後、細胞にＢ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加してからの経過時間を示す。
【図１３】多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１とを、解析対象であるｐ５３に融合してなる、本発明にかかる融合タンパク質（ｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３又はｐ５３−ｍＡＧ１−ＰＢ１）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３」はｐ５３のＮ末に本発明にかかるタンパク質タグ（多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む融合タンパク質）が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。また、「ｐ５３−ｍＡＧ１−ＰＢ１」はｐ５３のＣ末に本発明にかかるタンパク質タグが融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１４】蛍光タンパク質としてｍＡＧ１のみを解析対象であるｐ５３に融合してなる、融合タンパク質（ｍＡＧ１−ｐ５３又はｐ５３−ｍＡＧ１）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｍＡＧ１−ｐ５３」はｐ５３のＮ末に蛍光タンパク質が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。また、「ｐ５３−ｍＡＧ１」はｐ５３のＣ末に蛍光タンパク質が融合してなるタンパク質に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示し、その右側のパネルは、同細胞をヘキスト３３３４２で処理することにより、核を検出した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１５】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｐ５３（７０））と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（−）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン−３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン−３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１６】ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１−ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（−）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン−３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン−３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１７】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＦＫＢＰ１２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）とを細胞内に発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（−）」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（＋）、３０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは１００μｍを示す。
【図１８】ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＮ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（−）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン−３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン−３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図１９】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるｐ５３の部分ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＭＤＭ２のＮ末に融合させた（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを細胞内に発現させ、ｐ５３（７０）とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（−）」は、前記タンパク質間相互作用の阻害剤であるヌトリン−３を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｎｕｔｌｉｎ−３（＋）、３０ｍｉｎ」は、ヌトリン−３を添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２０】ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｍＡＧ１−ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を解析対象であるＦＫＢＰ１２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）とを細胞内に発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（−）」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（＋）、３０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから３０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは１００μｍを示す。
【図２１】図２０に示した顕微鏡写真の一部を拡大した写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２２】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてＤＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体、すなわちＰＢ１−ＤＧ１−ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから１時間後の細胞、薬剤を添加してから２時間後の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２３】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインと、蛍光タンパク質としてｍＣｈｅｒｒｙとを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体、すなわちＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから１時間後の細胞、薬剤を添加してから２時間後の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２４】多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインと、ｍＡＧ１とを、解析対象であるＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））を細胞内に発現させ、薬剤Ｂ／Ｂホモダイメリザーを該細胞に添加することにより、該薬剤添加に応じたＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左から順に、薬剤添加前の細胞、薬剤を添加してから３時間後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２５】多量化能を有するタンパク質として、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン又はＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインとを、ｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３、ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ｐ５３、ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ｐ５３又はＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ｐ５３）を細胞内に発現させ、ｐ５３のホモ多量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２６】ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを、ＥＲＫ２のＣ末に融合してなるタンパク質（ＥＲＫ２−ｍＡＧ１−ＰＢ１）を細胞内に発現させ、ＥＧＦを該細胞に添加することにより、該添加に応じたＥＲＫ２のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ＥＧＦ添加前」は、ＥＧＦを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、８ｍｉｎ」は、ＥＧＦを添加してから８分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２７】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を、ＥＲＫ２のＣ末に融合してなるタンパク質（ＥＲＫ２−ＰＢ１−ｍＡＧ１）を恒常的に発現させた細胞を、ＥＧＦを添加してから８分後に観察し、該添加に応じたＥＲＫ２のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２８】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を、ＳＴＡＴ３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３）を細胞内に発現させ、ＩＬ−６を該細胞に添加することにより、該添加に応じたＳＴＡＴ３のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ｂｅｆｏｒｅ」は、ＩＬ−６を添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ＩＬ６（１００ｎｇ／ｍｌ）、５０ｍｉｎ」は、ＩＬ−６を添加してから５０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図２９】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を含む融合タンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１）を恒常的に発現させている細胞において、ｐ５３−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２、ＰＢ１−ＭＤＭ２及びＰＢ１、又は、ｐ５３−ＰＢ１及びＰＢ１を一過的に発現させ、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、「ｐ５３−ＰＢ１」は、ｐ５３タンパク質の一部のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合してなるタンパク質を示し、「ＰＢ１−ＭＤＭ２」は、ＭＤＭ２のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合してなるタンパク質を示し、「ＰＢ１」はｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを示す。また、図中のスケールバーは２０μｍを示し、矢印は検出された蛍光輝点を示す。
【図３０】ＰＢ１−ｍＡＧ１を恒常的に発現し、さらにｐ５３（７０）−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２を一過的に発現させている細胞において、ヌトリン３添加によるｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の解消を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側の写真がヌトリン３添加前の細胞を分析した結果を示し、右側の写真がヌトリン３添加後の細胞を分析した結果を示す。また、図中のスケールバーは１０μｍを示す。
【図３１】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）のＮ末又はＣ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）又はｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＦＫＢＰ１２のＮ末又はＣ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２又はＦＫＢＰ１２−ＰＢ１）と、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン（ｍＡＧ１−ＰＢ１）とを、下記（Ａ）〜（Ｄ）の組み合わせにて、細胞において発現させ、ＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。なお、図中、「ラパマイシン添加前」は、前記タンパク質間相互作用の誘導剤であるラパマイシンを添加する前の細胞を観察した結果を示し、「ラパマイシン（５００ｎＭ）、室温６０ｍｉｎ」は、ラパマイシンを添加してから６０分経過した細胞を観察した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。（Ａ）ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）、ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１−ＰＢ１（Ｂ）ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）、ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１及びｍＡＧ１−ＰＢ１（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１、ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１−ＰＢ１（Ｄ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１、ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１及びｍＡＧ１−ＰＢ１。
【図３２】アフィニティタグとしてｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインを、解析対象であるＣＤ８０のＮ末に融合してなるタンパク質（ＣＤ８０−ＦＲＢ）と、アフィニティタグの結合パートナーとしてＦＫＢＰ１２、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及び蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）とを発現させた細胞において、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２との結合を誘導するラパマイシンを添加した後、ＣＤ８０のホモ２量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、上部のパネルは、前述のＣＤ８０を分析した結果を示し、下部のパネルは、陰性対照として、ＣＤ８０の代わりにＣＤ２を用いて分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３３】ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ５０のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｐ５０）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ６５のＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ６５−ＰＢ１）と、蛍光タンパク質としてｍＫＯ２をＩκＢαのＮ末に融合してなるタンパク質（ｍＫＯ２−ＩκＢα）とを発現させた細胞において、ｐ５０、ｐ６５及びＩκＢαからなる３量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、その結果を示し、右側のパネルは、陰性対照として、ｐ６５−ＰＢ１を発現させることなく分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３４】ｍＡＧ１を解析対象であるＣｙｃｌｉｎＤ１のＮ末に融合してなるタンパク質（ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるｐ２１のＣ末に融合してなるタンパク質（ｐ２１−ＰＢ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＣＤＫ４のＣ末に融合してなるタンパク質（ＣＤＫ４−ＰＢ１）とを発現させた細胞において、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１及びＣＤＫ４からなる３量体形成を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、その結果を示し、真中のパネルは、陰性対照として、ＣＤＫ４−ＰＢ１の代わりにＰＢ１のみを発現させて分析した結果を示し、右側のパネルは、陰性対照として、ＣＤＫ４−ＰＢ１の代わりに他のタンパク質を融合させていないＣＤＫ４を発現させて分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３５】ｍＡＧ１を解析対象であるカルモジュリンのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭ１３ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１）とを発現させた細胞において、カルモジュリン及びＭ１３ペプチドからなるヘテロ４量体形成を、当該４量体形成を誘導するヒスタミンを添加し、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヒスタミン添加前の細胞を分析した結果を示し、真ん中のパネルは、ヒスタミンを添加してから６０秒後の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヒスタミンを添加してから３００秒後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３６】蛍光タンパク質としてｍＵｋＧ１を解析対象であるカルモジュリンのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＵｋＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを解析対象であるＭ１３ペプチドのＣ末に融合してなるタンパク質（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１）とを発現させた細胞において、カルモジュリン及びＭ１３ペプチドからなるヘテロ４量体形成を、当該４量体形成を誘導するヒスタミンを添加し、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヒスタミン添加前の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヒスタミンを添加してから６０秒後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは２０μｍを示す。
【図３７】多量化能を有するタンパク質としてＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。図中、左側のパネルは、ヌトリン−３添加前の細胞を分析した結果を示し、右側のパネルは、ヌトリン−３を添加してから６０分後の細胞を分析した結果を示す。図中のスケールバーは１０μｍを示す（以下、図中の表記に関しては、図３８〜４５において同様である）。
【図３８】ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ｐ５３と、多量化能を有するタンパク質としてＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図３９】多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４０】Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３とＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４１】Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３とＴＥＬ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４２】多量化能を有するタンパク質としてＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ｐ５３）と、ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４３】ＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ｐ５３とＴＥＬ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４４】多量化能を有するタンパク質としてＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をｐ５３のＮ末に融合してなるタンパク質（ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ｐ５３）と、多量化能を有するタンパク質としてＴａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、及びｍＡＧ１をＭＤＭ２のＮ末に融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４５】ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ｐ５３とＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させた細胞において、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用を、蛍光輝点を指標として判定できるかどうかを分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。また、下記各項目において説明する事項に関しては、当然のことながら特に断りがない限り、本発明全体を通し、他の項目等においても同様に解釈される。
【００３０】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法１＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第１の態様は、
第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程（１）と、
前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程（２）と、
前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程（３）と
を含む方法である。
【００３１】
かかる方法によれば、後述の実施例１〜１２において示す通り、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる（図１及び２  参照）。
【００３２】
本発明において「タンパク質」とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。したがって、完全長のタンパク質のみならず、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドをも含む概念である。タンパク質の修飾としては、例えば、リン酸化、グリコシル化、パルミトイル化、プレニル化（例えば、ゲラニルゲラニル化）、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、アミド化が挙げられる。
【００３３】
本発明にかかる「第１のタンパク質」及び「第２のタンパク質」としては、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは異なっていてもよく、同一であってもよいが、後述の実施例１〜１２及び比較例１において示す通り、本発明の方法によれば、ホモ多量体の形成及び解消（消失）を効率良く判定できるため、本発明の方法は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが同一の場合に、より有用である。
【００３４】
本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
【００３５】
本発明にかかる「多量化能を有するタンパク質」は、多量体を形成できるタンパク質であればよく特に制限はないが、本発明の方法において蛍光輝点をより検出し易いという観点から、３量体以上の多量体を形成できるタンパク質であることが好ましい。このような多量化能を有するタンパク質としては、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインが挙げられ、これらの中においては、ホモ４〜８量体を形成するため、本発明の方法において蛍光輝点をより検出し易いという観点から、ｐ６２のＰＢ１ドメインがより好ましい。
【００３６】
なお、ｐ６２のＰＢ１ドメイン、ＴＦＧのＰＢ１ドメイン、ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン、ＴＥＬのＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン及びＴａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメインは、典型的には各々、配列番号：２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：６で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号：１２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３７】
これら「多量化能を有するタンパク質」のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得、また人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、多量化能を有し、融合させた第１のタンパク質及び第２のタンパク質が相互作用した場合に、会合体（蛍光輝点）を形成する性質を有する限り、本発明において用いることができる。
【００３８】
本発明にかかる「蛍光タンパク質」は、蛍光を発することのできるタンパク質であればよく、例えば、単量体アザミグリーン１（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｍＡＧ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｕｍｉｋｉｎｏｋｏ−Ｇｒｅｅｎ（単量体ウミキノコ−グリーン、ｍＵｋＧ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ２（単量体クサビラオレンジ２、ｍＫＯ２）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ（単量体ケイマ−レッド、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（単量体ミドリイシ−シアン１、ｍＭｉＣｙ）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（単量体クサビラオレンジ１、ｍＫＯ１）、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｃｈｅｒｒｙ（単量体チェリー、ｍＣｈｅｒｒｙ）、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ（フュージョンレッド）、Ｄｒｏｎｐａ―Ｇｒｅｅｎ１（ドロンパ−グリーン１、ＤＧ１）、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ１（ミドリイシ−シアン１、ＭｉＣｙ１）、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｃｙａｎ１（クサビラ−シアン１、ＫＣｙ１）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＢ）（二量体アザミグリーン（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＢ））、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ１（クサビラオレンジ１、ＫＯ１）、ｄｉｍｅｒｉｃ  Ｋｅｉｍａ−Ｒｅｄ（二量体ケイマ−レッド、ｄＫｅｉｍａ、ｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ）、ＴＧｕｖが挙げられるが、蛍光タンパク質が多量体を形成できるタンパク質である場合には、前述の多量化能を有するタンパク質と融合させた際に、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の相互作用の如何を問わずに、会合体（蛍光輝点）を形成し易くなるという観点から、単量体蛍光タンパク質（ｍＡＧ１、ｍＵｋＧ、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ、ｍＫＯ１、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ、ＤＧ１等）が好ましく、ｍＡＧ１、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄがより好ましく、ｍＡＧ１がさらに好ましい。
【００３９】
なお、ｍＡＧ１、ｍＵｋＧ、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ、ｍＭｉＣｙ、ｍＫＯ１、ＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１、ｄＡＧ（ＡＢ）、ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ＴＧｕｖ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ及びＤＧ１は、典型的には各々、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６９で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２２で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ１２８８２０で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＢ２０９９６８で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＡＶ５２１６４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質及びＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＢＡＤ７２８７４で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００４０】
これら蛍光タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。このような変異体も、蛍光を発することができる限り、本発明において用いることができる。
【００４１】
また、本発明においては、前述の蛍光タンパク質の代わりに、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質も使用することができる。蛍光タンパク質は、電磁波照射によって当該タンパク質の電子が励起され、該電子が基底状態に戻る際に放出される電磁波（光）を発する（ｐｈｏｔｏ  ｌｕｍｉｎｅｓｓｅｎｃｅ）。一方、化学発光タンパク質は、当該タンパク質が触媒する化学反応によって、発光基質の電子が励起され、電磁波（光）を発する。このように、発光機構において、蛍光タンパク質と化学発光タンパク質とは原理的に類似しているため、本発明において、化学発光タンパク質も使用可能である。
【００４２】
このような化学発光タンパク質として、特に制限はなく、例えば、ルシフェラーゼが挙げられ、その好適な例として、プロメガ  ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標、Ｎｌｕｃ）ルシフェラーゼ（プロメガ株式会社製）、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２０１３年、４巻、第４３９５〜４４００ページ  参照）が挙げられる。
【００４３】
また、本発明においては、上述の蛍光タンパク質の代わりに、化学反応のエネルギーによって、蛍光タンパク質が電磁波（光）を出す、蛍光タンパク質とルシフェラーゼとの融合タンパク質（ナノ−ランタン（Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ）、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１２年、３巻、１２６２ページ  参照）も使用し得る。
【００４４】
さらに、蛍光タンパク質の代わりに、蛍光色素に特異的に結合するタンパク質を用いることができる。かかるタンパク質を細胞内に発現させておき、該蛍光色素を細胞に導入することにより、蛍光タンパク質として使用することができるからである。このような蛍光色素に特異的に結合するタンパク質の例として、ＨａｌｏＴａｇ（プロメガ株式会社製）が挙げられる。
【００４５】
本発明にかかる「第１の融合タンパク質」においては、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含み、第２の融合タンパク質との会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、Ｎ末側から順に、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質にて融合されてなるものであってもよく、第１のタンパク質、蛍光タンパク質及び多量化能を有するタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、多量化能を有するタンパク質、第１のタンパク質及び蛍光タンパク質にて融合されてなるものであってもよく、多量化能を有するタンパク質、蛍光タンパク質及び第１のタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、蛍光タンパク質、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質にて融合されてなるものであってもよく、蛍光タンパク質、多量化能を有するタンパク質及び第１のタンパク質にて融合されてなるものであってもよい。
【００４６】
本発明にかかる「第２の融合タンパク質」においては、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含み、第１の融合タンパク質との会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、蛍光輝点がより検出し易くなるという観点から、第２の融合タンパク質は、さらに蛍光タンパク質を含む融合タンパク質であることが好ましい（図２  参照）。また、蛍光タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質の間に融合させることができる。第２の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質としては、上述の通りであり、第１の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質と同一のものであってもよく、異なるものであってもよいが、タンパク質間相互作用の発生及び解消等に応じた、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の各々の細胞内局在の変化を追跡できるという観点から、第１の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質と第２の融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質とは異なるものであることが好ましい。また、このように分光可能な異なる蛍光タンパク質を用いることにより、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の各々の発現量も測定することもできる。さらに、異なる蛍光タンパク質は、会合体（蛍光輝点）内部にて高い濃度で存在し、非常に近接することになるため、ＦＲＥＴ又は蛍光再吸収が生じ得る。そして、このような場合、画像化等せずとも、ＦＲＥＴ又は蛍光再吸収の結果、蛍光輝点から放射される蛍光の強度を測定することにより、タンパク質間相互作用を判定することが可能となる（蛍光再吸収については、「蛍光イメージング革命（第２７回）ＦＲＥＴを再吸収と区別して理解するために」  細胞工学  ２５（１），６７−６９，２００６−０１  参照）。
【００４７】
「第１の融合タンパク質」及び「第２の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。また、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、第１のタンパク質若しくは第２のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質の精製を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【００４８】
本発明にかかる「細胞」としては特に制限はなく、真核細胞であってもよく、原核細胞であってもよく、例えば、動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）、植物細胞、酵母、大腸菌が挙げられる。また、かかる細胞は、生体外で培養した状態（例えば、培地中又は培地上にて生育している細胞）であってもよく、生体内に存在する状態（例えば、第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡと第２の融合タンパク質をコードするＤＮＡとが導入されているトランスジェニック動物内の細胞）であってもよい。また、本発明にかかる融合タンパク質等は、通常同一の細胞に導入又は発現させることになるが、異なる細胞であってもよい。そして、このような場合、サイトカインと受容体との相互作用、受容体間の相互作用等の、異なる細胞間のタンパク質間相互作用も判定することが可能となる。
【００４９】
融合タンパク質の前記細胞内における発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。融合タンパク質の細胞における発現は、後述の本発明にかかるベクターを前記細胞に導入することにより行うことができる。細胞にベクターを導入する公知の手法としては、動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）、マイクロインジェクション法を利用した方法が挙げられる。また、昆虫細胞に対しては、バキュロウィルスを利用した方法が挙げられる。さらに、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法が挙げられる。さらに、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。
【００５０】
また、本発明において、融合タンパク質の前記細胞内への導入は、当業者であれば細胞の種類に合わせて適宜公知の手法を選択して行うことができる。タンパク質を細胞に導入する公知の手法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法が挙げられる。
【００５１】
本発明において検出する「蛍光輝点」は、本発明にかかるタンパク質間相互作用の結果、融合タンパク質等の会合体形成によって会合体に含まれる蛍光タンパク質の高密度の局在化が生じるものであり、典型的には、拡散状態で存在している蛍光タンパク質の蛍光強度よりも高い蛍光強度を有する、顕微鏡による二次元観察では、大きさ直径０．２〜５μｍ（０．０３〜２０μｍ2）の領域である。
【００５２】
「蛍光輝点の検出」は、例えば、蛍光タンパク質に対応した励起フィルター及び吸収フィルターを備えた蛍光顕微鏡による観察、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーターによる解析により行うことができる。また、得られた画像を画像解析プログラム（例えば、後述のｉｃｙスポット検出プログラム）により処理することによっても、蛍光輝点を検出することができる。なお、かかる蛍光輝点の検出において、検出する蛍光輝点の特性（蛍光輝点が発する蛍光の波長、強度等）、並びに用いる装置及びプログラム等に合わせて、フィルター、検出器、各種パラメーター等の選択、設定は、当業者であれば適宜行うことができる。
【００５３】
例えば、後述の実施例２に示す通り、スポット検出解析プログムＩｃｙ．５．４．２（Ｊ．−Ｃ．Ｏｌｉｖｏ−Ｍａｒｉｎ「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍａｇｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」  Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．３５−９，１９８９〜１９９６ページ，２００２年、ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｏｍ  参照）における、設定値  Ｓｐｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒプラグイン（Ｓｃａｌｅ１，Ｓｃａｌｅ２，Ｓｃａｌｅ３  全てにチェックを入れ、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を全て１００に設定した際の条件）にて検出可能な「解析プログラムで算出された単位当たりの蛍光強度値」が、バックグランド（例えば、陰性対照となる細胞における同蛍光強度値）の少なくとも２．０倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらにより好ましくは５．０倍以上、特に好ましくは１０倍以上であれば、蛍光輝点を検出できたと判定できる。
【００５４】
本発明の方法においては、細胞において前記蛍光輝点が検出されれば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していると判定することができ、前記蛍光輝点が検出されなければ、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していないと判定することができる。
【００５５】
以上、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の１態様について説明したが、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法は上記態様に限定されるものではない。例えば、前記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入し、その後、当該細胞内における各融合タンパク質の再構成を介し、タンパク質間相互作用を判定することも、本発明によれば可能となる。より具体的には、以下に示す第２〜５の態様も本発明はとり得る。
【００５６】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法２＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第２の態様は、
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を検出するための方法であって、下記工程（１）〜（３）を含む方法である
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００５７】
かかる方法によれば、後述の実施例１３及び１４において示す通り、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現したこととなる（図３  参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
【００５８】
本発明にかかる「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」は、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質、並びに第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を各々含むものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、第１のタンパク質又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００５９】
さらに、「第３の融合タンパク質」及び「第４の融合タンパク質」は、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、各々他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、第１のタンパク質又は第２のタンパク質と、多量化能を有するタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
【００６０】
本発明にかかる「第５の融合タンパク質」は、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含むものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、多量化能を有するタンパク質は、蛍光タンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００６１】
さらに、「第５の融合タンパク質」は、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
【００６２】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法３＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第３の態様は、下記工程（１）〜（３）を含む方法である。
（１）アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００６３】
かかる方法によれば、後述の実施例１５において示す通り、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図４  参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
【００６４】
本発明にかかる「アフィニティタグ」及び「結合パートナー」は、細胞内において結合し得る関係にあり、またタンパク質に結合できる化合物であれば特に制限はなく、例えば、相互作用することが知られているタンパク質の組み合わせを用いることができる。このような組み合わせとして、後述の実施例において示すような、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン及びＦＫＢＰ１２等が好適に用いられ、また、光照射依存的に結合する、フィトクロームＢ（ＰＨＹＢ）及びフィとクローム結合因子（ＰＩＦ）、クリプトクロム２（ＣＲＹ２）及びクリプトクロム結合ｂＨＬＨ１（ＣＩＢ１）、ＬＯＶ及びｅＰＤＺ、Ｄｒｏｎｐａ１４５Ｋ−ＣＡＡＸ及びｍＮｅｐｔｕｎｅ等も好適に用いることができる（光照射依存的に結合するタンパク質の組み合わせについては、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２０１４年、１５巻、８号、５５１〜５５８ページ  参照）。さらに、ジヒドロ葉酸還元酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ等の酵素を構成するサブユニットも好適に用いることができる。また、本発明にかかる「アフィニティタグ」及び「結合パートナー」としては、このような公知のタンパク質間相互作用を利用することのみならず、例えば、ビオチン及びアビジン、レクチン及び糖、プロテインＡ（又はＧ）及びイムノグロビン定常領域、抗原及び抗体等も利用することができる。
【００６５】
アフィニティタグと結合パートナーとの結合は、抗原抗体反応のような自発的に生じるものであってもよく、刺激に応じて誘導されて生じるものであってもよい。かかる結合を誘導する刺激としては特に制限はなく、例えば、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２との結合を誘導するラパマイシンのような低分子化合物、ＰＨＹＢとＰＩＦとの結合等を誘導するような光照射が挙げられる。また、かかる刺激によって結合が誘導されるアフィニティタグ及び結合パートナーを用いる場合には、前記工程（１）、又は、前記工程（１）及び（２）の間に、細胞に当該刺激を与えることが必要となる。
【００６６】
本発明にかかる「第１の標識化タンパク質」及び「第２の標識化タンパク質」は、第１のタンパク質及び第２のタンパク質が各々アフィニティタグによって標識されているものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、アフィニティタグは、第１のタンパク質又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末、さらには中間部の領域のいずれに結合させてもよい。
【００６７】
本発明にかかる「第６の融合タンパク質」は、前記多量化能を有するタンパク質及び前記蛍光タンパク質を含み、かつ前記結合パートナーが結合されているものであればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、結合パートナーは、第６の融合タンパク質のＮ末、Ｃ末、さらには中間部の領域のいずれに結合させてもよい。また、「第６の融合タンパク質」において、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００６８】
前記アフィニティタグ又は結合パートナーの各タンパク質への「結合」としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの結合であってもよく、また化学的な結合であってもよい。遺伝子レベルでの結合は、前述又は後述の実施例において示すような、所謂「融合」であり、アフィニティタグ又は結合パートナーをコードするＤＮＡを、第１のタンパク質、第２のタンパク質又は第６の融合タンパク質をコードするＤＮＡに、その読み枠を合わせて付加又は挿入することにより達成される。また、化学的な結合は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエステル結合が挙げられる。
【００６９】
また、第１の標識化タンパク質、第２の標識化タンパク質及び第６の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質（例えば、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質）の間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
【００７０】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法４＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第４の態様は、下記工程（１）〜（３）を含む方法である。
（１）蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００７１】
かかる方法によれば、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第７の融合タンパク質と、蛍光タンパク質を構成する第１の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第８の融合タンパク質と、第１の部分ペプチドに結合することによって蛍光タンパク質が再構成し得る第２の部分ペプチド、及び多量化能を有するタンパク質を含む第９の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって蛍光タンパク質が該細胞内において発現することになり、ひいては、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図５  参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
【００７２】
本発明にかかる「第１の部分ペプチド」及び「第２の部分ペプチド」としては、細胞内において、これらペプチドが結合することにより、蛍光タンパク質を再構成できるものであればよい。なお、本発明において「再構成」とは、このように複数の部分ペプチドが結合することにより、それらが元来構成していたタンパク質が機能し得る状態（例えば、蛍光タンパク質であれば、蛍光を発し得る状態、多量化能を有するタンパク質であれば、多量体を形成し得る状態）に戻ることを意味する。
【００７３】
また、このような再構成し得る部分ペプチドは、当業者であれば、例えば、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５年、２３巻、１０２〜１０７ページ等の記載を参酌しながら、適宜設計、調製することができる。
【００７４】
なお、Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  Ｓら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．、２０１３年１０月、４；３：２８５４等に記載の通り、蛍光タンパク質を３つ以上に分割しても再構成し得ることが明らかになっている。したがって、第１の部分ペプチド及び第２の部分ペプチドは、このような３以上の断片の中から選択されるものでもあってよい。また、この場合、第１及び第２の部分ペプチドとして用いなかった断片は、前記工程（１）、又は、前記工程（１）及び（２）の間に、細胞内において発現又は細胞に導入する必要がある。
【００７５】
また、第１の部分ペプチド及び第２の部分ペプチドは各々、第１又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。さらに、第７の融合タンパク質、第８の融合タンパク質及び第９の融合タンパク質のいずれにおいて、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００７６】
また、第７の融合タンパク質、第８の融合タンパク質及び第９の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質の間（例えば、第１の部分ペプチドと第１又は第２のタンパク質との間、第２の部分ペプチドと多量化能を有するタンパク質との間）に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
【００７７】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法５＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第５の態様は、下記工程（１）〜（３）を含む方法である。
（１）多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００７８】
かかる方法によれば、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第１のタンパク質を含む第１０の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質を構成する第３の部分ペプチド及び第２のタンパク質を含む第１１の融合タンパク質と、第３の部分ペプチドに結合することによって多量化能を有するタンパク質が再構成し得る第４の部分ペプチド、及び蛍光タンパク質を含む第１２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、当該再構成によって多量化能を有するタンパク質が該細胞内において発現することになり、ひいては、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる（図６  参照）。そして、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を利用する方法同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、再構成された多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることとなる。
【００７９】
本発明にかかる「第３の部分ペプチド」及び「第４の部分ペプチド」としては、細胞内において、これらペプチドが結合することにより、多量化能を有するタンパク質を再構成できるものであればよく、当業者であれば、上述の通り、Ｏｈａｓｈｉ  Ｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．、２０１２年、５２巻、１号、４５〜５０ページ等の記載を参酌しながら、かかる部分ペプチドを適宜設計、調製し得る。
【００８０】
また、第３の部分ペプチド及び第４の部分ペプチドは各々、第１又は第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。また、第１０の融合タンパク質、第１１の融合タンパク質及び第１２の融合タンパク質のいずれにおいて、各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００８１】
さらに、第１０の融合タンパク質、第１１の融合タンパク質及び第１２の融合タンパク質はいずれも、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、他の機能性タンパク質を含むものであってもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、各融合タンパク質のＮ末、Ｃ末のどちらか一方若しくは両側、又は、構成するタンパク質の間（例えば、第３の部分ペプチドと第１又は第２のタンパク質との間、第４の部分ペプチドと蛍光タンパク質との間）に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、上述の第１及び第２の融合タンパク質同様に、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。
【００８２】
以上、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法の第２〜５の態様について説明したが、これらの方法においては、上記第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを各々分割して細胞内に発現させ又は細胞に導入することになるため、解析対象となる第１又は第２のタンパク質に融合するタンパク質等のタグの分子量が小さくて済むことになる。故に、タンパク質間相互作用の判定等において、解析対象となるタンパク質の機能、局在の変化等はより阻害されにくくなる。
【００８３】
また、このように、分子量の小さいタグが融合した状態にて解析対象となるタンパク質を細胞内に維持することができるため、上述の通り、化合物の添加や光照射等の刺激に応じて本発明にかかる融合タンパク質が再構成される系を構築することにより、タンパク質間相互作用を任意のタイミングにて判定し得る状態に設定することができる。
【００８４】
また、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うこともできる。
【００８５】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法６＞
解析対象を３以上のタンパク質とする場合には、上述の第１の態様を応用することにより、下記工程（１）〜（３）を含む方法を、タンパク質間相互作用を判定するための方法の第６の態様として、本発明は提供することもできる。
（１）  第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１３の融合タンパク質と第１４の融合タンパク質と第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００８６】
かかる方法によれば、後述の実施例１６〜１８において示す通り、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる（図７  参照）。
【００８７】
本発明にかかる「第３のタンパク質」としては、上述の第１及び第２のタンパク質同様に、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質とは異なっていてもよく、そのうち２つが同一であってもよく、３つ全てが同じであってもよい。
【００８８】
本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、タンパク質間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
【００８９】
本発明にかかる「第１３の融合タンパク質」は、第１のタンパク質及び前記多量化能を有するタンパク質を含むタンパク質であればよく、また「第１４の融合タンパク質」は、第２のタンパク質及び前記多量化能を有するタンパク質を含むタンパク質であればよい。これら融合タンパク質において、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、前記多量化能を有するタンパク質は、第１又は第２のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよく、また各タンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００９０】
本発明にかかる「第１５の融合タンパク質」は、第３のタンパク質及び前記蛍光タンパク質を含むタンパク質であればよく、会合体（蛍光輝点）の形成を阻害しない限り、前記蛍光タンパク質は、第３のタンパク質のＮ末、Ｃ末のいずれに融合させてもよい。またタンパク質間の融合は、直接的なものであってもよく、リンカー又はスぺーサータンパク質を介した間接的なものであってもよい。
【００９１】
＜タンパク質間相互作用を検出するための方法７＞
本発明は、タンパク質間相互作用を判定するための第７の態様として、以下の方法も提供し得る。
【００９２】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１６の融合タンパク質と第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【００９３】
本発明にかかる「第１６の融合タンパク質」及び「第１７の融合タンパク質」は、多量化能を有するタンパク質（第１の多量化能を有するタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質）が異なるという点を除いては、上述の第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質と各々同様のタンパク質である。なお、第１のタンパク質と第２のタンパク質についても同様であり、これらタンパク質は異なっていてもよく、同一であってもよいが、後述の実施例において示す通り、本発明のタンパク質間相互作用を判定するための第７の態様は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが異なっていている場合に、より有用である。
【００９４】
以上、タンパク質間相互作用を判定するための好適な実施態様について説明したが、本発明は、これらの方法を利用する、以下に示す方法も提供することができる。
【００９５】
＜タンパク質間相互作用の時間情報等を得るための方法＞
後述の実施例２及び１１〜１３等において示す通り、本発明の方法は、蛍光輝点の存在又は非存在を指標として、タンパク質間相互作用の発生のみならず、タンパク質間相互作用の消失を判定することができる。また、かかるタンパク質間相互作用の発生等を経時的に追跡することもできる。さらに、多量化能を有するタンパク質や蛍光タンパク質の局在等に影響を受けることなく、本発明においては細胞内の任意の領域においてタンパク質間相互作用を判定することもできる。
【００９６】
したがって、本発明は、蛍光輝点を検出することによって、タンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を判定する方法を提供することができる。
【００９７】
このような「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の判定に関して、本発明においては、タンパク質間相互作用が生じる細胞内の領域をも特定することもできる。また、本発明によれば、「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の判定を通して、当該タンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達の発生及び消失、該シグナル伝達の発生若しくは消失するまでの時間並びに該シグナル伝達の持続時間を判定することができ、さらに該シグナル伝達が生じている細胞内の領域をも特定することもできる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用（又は、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質との相互作用）が特定の刺激に応答して発生又は消失するものであっても、本発明において判定することができる。したがって、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激に応答するタンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を判定するために、前記蛍光輝点を検出する方法も提供することができる。
【００９８】
本発明にかかる「特定の刺激」とは、タンパク質間相互作用を直接的に又は間接的に誘導又は阻害できる刺激であればよく、また細胞内で生じる内在性因子による刺激（例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の増減、酵素の活性化又は不活性化）であってよく、細胞に与えられる外部からの刺激（例えば、受容体に対するリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）の細胞への投与）であってもよい。
【００９９】
また、本発明の方法においては、蛍光輝点を検出することによって、特定の刺激の発生若しくは消失、該刺激の発生若しくは消失するまでの時間、又は該刺激の持続時間を判定することもできる。
【０１００】
さらに、本発明の方法においては、特定の刺激の程度（例えば、特定の刺激が薬剤である場合には、その濃度）に応じたタンパク質間相互作用の増減も判定することができる。したがって、特定の刺激が薬剤である場合には、タンパク質間相互作用に対する、その薬剤の５０％効果濃度（ＥＣ５０）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、本発明によって決定することができる。
【０１０１】
また、本発明の方法においては、同一の細胞において、多種類のタンパク質間相互作用、特定の刺激に各々依存的な多種類のタンパク質間相互作用、ひいてはこれらタンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達も判定することができる。
【０１０２】
＜特定のタンパク質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法＞
本発明においては、任意のタンパク質間相互作用を判定することができる。したがって、本発明は、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方を該特定のタンパク質とし、他方を被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。また、３以上のタンパク質間の相互作用を対象とする場合には、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１〜３のタンパク質のうちの２つのタンパク質を該特定のタンパク質とし、残りの一つを被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。
【０１０３】
本発明にかかる「被検タンパク質」としては特に制限はない。網羅的に効率良く特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択できるという観点から、ｃＤＮＡライブラリーがコードするタンパク質群を好適に用いることができる。
【０１０４】
＜タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定方法＞
後述の実施例２等に示す通り、本発明において、蛍光輝点の蛍光強度を通してタンパク質間相互作用の強弱を定量的に分析することもできる。したがって、本発明によれば、タンパク質間相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基（又は、第１〜３のタンパク質中のアミノ酸残基）を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質（又は、第１〜３のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質）を用い、前記蛍光輝点の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する方法を提供することができる。
【０１０５】
本発明にかかる「蛍光輝点の蛍光強度」には、一蛍光輝点の蛍光強度のみならず、一定領域内（例えば、一細胞内、蛍光顕微鏡観察における一視野内、一蛍光画像内）に存在する蛍光輝点の総蛍光強度も含まれる。
【０１０６】
「第１のタンパク質等に変異が導入されたタンパク質」の調製は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して行うことができる。かかる公知の手法としては、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法が挙げられる。
【０１０７】
＜タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニング方法＞
前述の通り、本発明の方法において、蛍光輝点の蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用の強弱を把握することができる。したがって、本発明によれば、被検化合物存在下で、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、
を含む方法を提供することができる。
【０１０８】
本発明のスクリーニング方法において使用する被検化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【０１０９】
また、被検化合物存在下の状態とは、例えば、被検化合物の培地への添加等による被検化合物と本発明にかかる細胞とが接触している状態や、被検化合物が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
【０１１０】
なお、本発明のスクリーニング方法は、蛍光輝点の強度を指標とするものであればよく、上記実施態様に限定されるものではない。したがって、別の態様として、以下に示す態様もとり得る。
【０１１１】
被検化合物存在下で、第３の融合タンパク質と、第４の融合タンパク質と、第５の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において第３の融合タンパク質と第４の融合タンパク質と第５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１２】
被検化合物存在下で、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において、第１の標識化タンパク質と、第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１３】
被検化合物存在下で、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において、第７の融合タンパク質と、第８の融合タンパク質と、第９の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１４】
被検化合物存在下で、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において、第１０の融合タンパク質と、第１１の融合タンパク質と、第１２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１５】
被検化合物存在下で、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において、第１３の融合タンパク質と、第１４の融合タンパク質と、第１５の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１６】
被検化合物存在下で、第１６の融合タンパク質と、第１７の融合タンパク質とを細胞内に発現させる又は細胞内に導入する工程と、
前記細胞内において、第１６の融合タンパク質と、第１７の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、
前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法。
【０１１７】
＜本発明の方法に用いられるためのキット＞
本発明は、上記方法に用いられるためのキットを提供することができる。本発明のキットは、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含むキットである。
【０１１８】
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｅ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｇ）第１の融合タンパク質
（ｈ）第２の融合タンパク質。
【０１１９】
本発明にかかるベクターとしては、上述の細胞において、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよい。かかる制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）が挙げられる。さらに、本発明にかかるベクターにおいては、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等）を含んでいてもよい。また、このような本発明にかかるベクターの態様としては、例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
【０１２０】
本発明にかかるベクターにおいてコードされるタンパク質は、上述の各融合タンパク質等であるが、かかるタンパク質の発現効率をより向上させるという観点から、当該タンパク質を発現させる細胞の種に合わせて、コドンを最適化したＤＮＡ（例えば、コドンがヒト化されたＤＮＡ）が、本発明にかかるベクターには、挿入されていてもよい。
【０１２１】
また、本発明にかかるベクターは、後述の実施例において示す通り、当業者であれば、適宜、ＤＮＡ化学合成法、遺伝子組み換え技術等の公知の技術を利用することにより、調製することができる。
【０１２２】
前記（ａ）に記載の「任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
【０１２３】
本発明にかかる融合タンパク質は、当業者であれば、これら融合タンパク質のヌクレオチド配列に基づき、無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用い、遺伝学的手法により合成し、調製することができる。また、本発明にかかる融合タンパク質は、そのアミノ酸配列に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成し、調製することができる。
【０１２４】
本発明にかかるベクター又は融合タンパク質の標品においては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
【０１２５】
本発明にかかる形質転換細胞は、前述の通り、本発明にかかるベクターを細胞に導入することにより調製することができる。また、本発明にかかる形質転換細胞の標品には、当該細胞の保存、培養に必要な培地、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加又は付属してあってもよい。
【０１２６】
本発明にかかる「使用説明書」は、前記ベクターや形質転換細胞を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明の標品に関する情報（例えば、ベクターの塩基配列やクローニングサイト等が示されているベクターマップ等の情報、形質転換細胞の由来、性質、当該細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
【０１２７】
なお、本発明のキットは、上記実施態様に限定されるものではなく、上述のタンパク質間相互作用を判定するための実施態様に応じ、以下のような態様もとり得る。
【０１２８】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第２の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記多量化能を有するタンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第５の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第３の融合タンパク質
（ｇ）第４の融合タンパク質
（ｈ）第５の融合タンパク質。
【０１２９】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第３の方法に用いられるためのキット
（ａ）アフィニティタグをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、前記アフィニティタグを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第２の標識化タンパク質をコードするベクター
（ｄ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質を、コードするベクター
（ｅ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質をコードするベクターを、保持する形質転換細胞
（ｆ）第１の標識化タンパク質
（ｇ）第２の標識化タンパク質
（ｈ）前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質。
【０１３０】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第４の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第８の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第９の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第９の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第７の融合タンパク質
（ｇ）第８の融合タンパク質
（ｈ）第９の融合タンパク質。
【０１３１】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第５の方法に用いられるためのキット
（ａ）第３の部分ペプチドをコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第３の部分ペプチドを含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第１０の融合タンパク質をコードするベクター
（ｃ）第１１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｆ）第１０の融合タンパク質
（ｇ）第１１の融合タンパク質
（ｈ）第１２の融合タンパク質。
【０１３２】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第６の方法に用いられるためのキット
（ａ）多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、多量化能を有するタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡとクローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１３の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１４の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１５の融合タンパク質をコードするベクター
（ｆ）第１３の融合タンパク質
（ｇ）第１４の融合タンパク質
（ｈ）第１５の融合タンパク質。
【０１３３】
下記（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、タンパク質間相互作用を判定するための第７の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第１の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｂ）第２の多量化能を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、クローニング部位とを含み、該クローニング部位に任意のタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されることにより、第２の多量化能を有するタンパク質、前記蛍光タンパク質及び前記任意のタンパク質を含む融合タンパク質を発現させることができるベクター
（ｃ）第１６の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第１７の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）第１６の融合タンパク質
（ｆ）第１７の融合タンパク質。
【実施例】
【０１３４】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１３５】
（実施例１）
本発明者らは、２つのタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）の相互作用の判定において、第１のタンパク質、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第２の融合タンパク質との利用を構想した（図１  参照）。より具体的には、これら２つの融合タンパク質を細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。【０１３６】
そして、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを選択し、蛍光タンパク質として単量体アザミグリーン１（ｍＡＧ１）を選択し、実際にこの系の有効性について検証した。さらに、蛍光輝点の検出のし易さを考慮し、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の双方にｍＡＧ１が含まれている態様にて、本検証を行った（図２  参照）。また、ｍＡＧ１の発現においては、当該蛍光タンパク質をコードし、コドンをヒト化したＤＮＡ（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ−ｃｏｄｏｎ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ  １、ｈｍＡＧ１）を用いた。【０１３７】
また、この検証においては、薬剤（ＡＰ１９０３又はＡＰ２０１８７）添加によりホモ２量体を形成することが知られているＦＫＢＰ１２タンパク質変異体を用いた。すなわち、今回の検証においては、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は同一のタンパク質となり、また第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は同一のタンパク質となる。なお、ＡＰ１９０３等により制御されるＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成については、ＴＩＭ  ＣＬＡＣＫＳＯＮら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８年、９５巻、第１０４３７〜１０４４２ページ参照のこと。以下に本検出系を構築するための材料及び方法を示す。【０１３８】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒの作製＞
本検出系において、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質からなる融合タンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ１を融合してなるタンパク質タグ（ＰＢ１−ｍＡＧ１）と、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＮ末にｍＡＧ１を融合してなるタンパク質タグ（ｍＡＧ１−ＰＢ１）とを各々コードする発現ベクター（ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ）を作製した。すなわち、ＰＢ１−ｍＡＧ１をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：２７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。また、ｍＡＧ１−ＰＢ１をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：２９に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、このようにして得られた合成ＤＮＡをＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒを各々構築した。【０１３９】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
次に、前記の通り作製したｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒを用い、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１を融合したＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクターを作製した。すなわち、ＦＫＢＰ１２変異体をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した前記ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を構築した。【０１４０】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
次に、前記の通り作製したｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体をＨＥＫ２９３細胞に導入し、該細胞において本発明にかかる融合タンパク質を発現させた。すなわち、先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、遺伝子導入の前日に、このようにして培養したＨＥＫ２９３細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり２００μＬの培養液にて培養を行った。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬにｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体１００ｎｇを希釈し、ターボフェクトトランスフェクション試薬（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．４μＬ添加した後、攪拌した。そして、それを更に培養液１００μＬと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。【０１４１】
＜細胞の観察＞
前記遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ＩＸ−７１倒立顕微鏡（オリンパス社製、対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター（オリンパス社製）及びＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）を用いて観察した。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成は、５００ｎＭ  Ｂ／Ｂホモダイメリザー（ＡＰ２０１８７、Ｂ／Ｂ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ、タカラバイオ社製）を培地に添加して誘導した。また、薬剤添加後、継時的に画像を取得した。得られた結果を図９に示す。【０１４２】
図９に示した結果から明らかな通り、薬剤添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された（図９  左側の画像参照）。その後、薬剤添加３８分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察されるようになり（図９  真ん中の画像参照）、さらに観察を続けると、７６分後には明瞭な蛍光輝点を示す多数の細胞を観察することができた（図９  右側の画像参照）。したがって、本検証結果により、図１又は２に示す、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質からなるタンパク質タグを利用した系を用いることにより、ホモ２量体形成の判定、ひいてはタンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。さらに、図９に示す通り、本発明によれば、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を、その固有な細胞内環境であるところの細胞質内にて判定できることも明らかになった。【０１４３】
（比較例１）
本発明者らは、タンパク質間相互作用を判定する別の系、すなわち第１のタンパク質及び会合誘導タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出することにより、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する系を発明している（特許文献４  参照）。【０１４４】
そこで、当該系を用い、前述のＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成を判定し、前述の実施例１に記載の結果と比較することで、本発明の有効性を評価することにした。以下に特許文献４に記載の検出系を構築するための材料及び方法を示す。【０１４５】
＜ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２変異体及びｐｈＡＧ−ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
特許文献４に記載の検出系において、前記会合誘導タンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを選択し、また多量化能を有する蛍光タンパク質としてＡＧを選択し、コドンをヒト化したＡＧをコードするＤＮＡ（ｈＡＧ）を用いた。【０１４６】
そして、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にＦＫＢＰ１２変異体を融合してなる融合タンパク質をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を以下の通りに作製した。すなわち、ＦＫＢＰ１２変異体をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。そして、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２変異体を構築した。【０１４７】
また、ＡＧタンパク質のＣ末にＦＫＢＰ１２変異体を融合してなる融合タンパク質をコードする発現ベクター（ｐｈＡＧ−ＦＫＢＰ１２変異体）を、前記同様の方法にて、ｐｈＡＧ−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）にＦＫＢＰ１２変異体をコードする合成ＤＮＡを挿入することにより構築した。【０１４８】
また、このようにして構築した発現ベクターを各１００ｎｇずつ混合、計２００ｎｇ混合し、実施例１に記載の＜細胞培養と遺伝子導入＞及び＜細胞の観察＞と同様の方法にて、薬剤添加前後の細胞内における蛍光輝点を検出した。得られた結果を図１０に示す。【０１４９】
図１０に示す通り、特許文献４に記載の方法によってもＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点を検出できることが確認された。しかしながら、当該方法においては、薬剤添加後６６分の時点であっても、僅かな細胞において蛍光輝点が形成されるに留まっていた。したがって、本発明の方法は、国際公開第２０１３／０８４９５０号に記載の方法よりも、少なくともホモ２量体形成判定の効率の上では優れていることが明らかになった。【０１５０】
（実施例２）
次に、本発明の方法により、ホモ２量体の可逆的な形成を判定できるかどうか、すなわち一度形成された蛍光輝点がホモ２量体の解消に応じて消失するかどうかを検証した。【０１５１】
前述のＢ／Ｂホモダイメリザー（ＡＰ２０１８７）により誘導され、形成されるＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体は、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンド（Ｂ／Ｂ  Ｗａｓｈｏｕｔ  Ｌｉｇａｎｄ、タカラバイオ社製）によって解消されることが知られている。そこで、以下に示す材料及び方法にて、前記検証を行った。【０１５２】
＜ＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞の作製＞
前記ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体をＨＥＫ２９３細胞に導入し、本発明にかかる融合タンパク質（ＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を恒常的に発現する細胞を作製した。すなわち、前記発現ベクター導入の前日に、ＨＥＫ２９３細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍＬの前記培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬにｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬを添加した後、攪拌した。次いで、更に培養液６００μＬと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、さらに１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。【０１５３】
＜細胞の観察＞
前記にて樹立した、ＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を恒常的に発現する細胞を実施例１に記載の方法と同様の方法にて観察した。また、定常状態にて蛍光輝点が無いことを確認した後、５００ｎＭ  Ｂ／Ｂホモダイメリザーを培養液に加え、１５０分間、継時的に細胞を撮影した。なお、この観察において、前記実施例１同様に、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成を示す蛍光輝点の発生が確認された。次に、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを含む培養液を、通常培養に用いる培養液に置換することにより細胞を洗浄した。その後、５００ｎＭ  Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加し、１００分間、継時的に画像を取得した。得られた結果を図１１に示す。【０１５４】
＜画像解析＞
前記方法により継時的に撮影した画像を、ｉｃｙ画像解析プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）のスポット検出（ｓｐｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて解析した。また、各画像にて、操作時間（分）をＸ軸とし、蛍光輝点の領域を線で囲い、その囲みの中の蛍光強度を合計した数値をＹ軸とし、グラフに示した。なお、ｓｐｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｏｒによる解析は、各パラメーター（各処理経路）を以下のようにセッティングして行った。
プレプロセッシング（Ｐｒｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）：無し、
検出（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）：冗長ウェーブレット変換による検出（ＵＤＷＴＷａｖｅｌｅｔＤｅｔｅｃｔｏｒ）、暗背景よりも明るい輝点を検出する（Ｄｅｔｅｃｔ  ｂｒｉｇｈｔ  ｓｐｏｔ  ｏｖｅｒ  ｄａｒｋ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）、
測定可能なスケール（Ｓｃａｌｅ  ｅｎａｂｌｅｄ）：スケール  ３、閾値  ５０。
得られた結果を図１２に示す。【０１５５】
図１１に示した結果から明らかな通り、実施例１に示した結果同様に、薬剤添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された（図１１  左側の画像参照）。その後、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加してから９０分後には複数の細胞にて明瞭な蛍光輝点が観察された（図１１  真ん中の画像参照）。【０１５６】
そして、Ｂ／Ｂウオッシュアウトリガンドを添加した結果、大部分の蛍光輝点は消失することが明らかになった（図１１  右側の画像参照）。また、図１２に示したグラフから、蛍光輝点は段階的に形成し、消失することが見て取れたことから、本発明によって、該蛍光輝点の発生、消失を指標として、各薬剤添加に応じたタンパク質間相互作用の継時的な変化を捉えることができることが明らかになった。さらに、図１１に示す通り、本発明によれば、ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体の形成及び消失を、その固有な細胞内環境であるところの細胞質内にて判定できることも明らかになった。また、Ｂ／Ｂホモダイメリザーを添加した直後で、顕微鏡観察下で蛍光輝点の発生を確認し始めた際の蛍光強度の値は、添加前のその値の１．９倍であったことから、陰性対照（例えば、タンパク質間相互作用が生じる前の細胞）における蛍光強度の少なくとも２倍の値が検出できれば、タンパク質間相互作用を示す蛍光輝点が発生したと判定できることが明らかになった。【０１５７】
以上の通り、本発明によれば、検出される蛍光輝点の発生、消失を指標としてタンパク質間相互作用における可逆的な変化を判定することができることも明らかになった。また、時間経過に従い、段階的に蛍光輝点が増加又は減少していく事から、本発明によりタンパク質間相互作用を定量的に分析することもできることが明らかになった。さらに、本発明にかかる融合タンパク質を細胞に導入し、該融合タンパク質を恒常的に発現する細胞を作製できたことから、前記融合タンパク質に含まれるタンパク質タグは細胞毒性等を示さない事が確認された。【０１５８】
（実施例３）
本発明により、ホモ多量体形成も判定できるかどうかを以下に示す材料及び方法にて検証した。なお、この検証は、ｐ５３タンパク質のホモ多量体形成を対象として行った（当該ホモ多量体形成については、Ｙｏｋｏ  Ｉｔａｈａｎａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００９年、２８４巻、８号、５１５８〜５１６４ページ  参照のこと）。【０１５９】
＜ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３及びｐｈｍＡＧ１−ｐ５３の作製＞
ｐ５３をコードするヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿０００５３７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列）の５’末端及び３’末端に、各々ＢａｍＨＩ認識配列及び終止コドンとＮｏｔＩ認識配列が付加してなるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３及びｐｈｍＡＧ１−ｐ５３を作製した。【０１６０】
＜ｐｐ５３−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１及びｐｐ５３−ｈｍＡＧ１の作製＞
ｐ５３タンパク質のＮ末にタンパク質タグを有する融合タンパク質をコードする前記発現ベクターの他、Ｃ末にタンパク質タグを有する融合タンパク質をコードする発現ベクターも、以下に示す方法にて作製した。【０１６１】
すなわち、ｐ５３をコードする前記合成ＤＮＡから終止コドンを除いた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｐｐ５３−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１及びｐｐ５３−ｈｍＡＧ１を作製した。【０１６２】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＵ２ＯＳ細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬにて、発現ベクター（ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３、ｐｈｍＡＧ１−ｐ５３、ｐｐ５３−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１又はｐｐ５３−ｈｍＡＧ１）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター混合溶液を培養細胞に添加し、さらに２０時間培養した。【０１６３】
＜細胞の観察＞
前記にて、各遺伝子導入を行った細胞を、ヘキスト３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を１μｇ／ｍｌとなるように希釈したハンクス平衡塩液（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（同仁化学社製）からなるｐＨ７．４緩衝液中にて観察した。得られた結果を、図１３及び１４に示す。なお、図１３及び１４に示した顕微鏡写真は、対物レンズの倍率を４０倍にして観察した結果である。【０１６４】
図１３に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３融合タンパク質を発現する細胞及びｐ５３−ｍＡＧ１−ＰＢ１融合タンパク質を発現する細胞、すなわち本発明にかかる融合タンパク質を発現させた細胞にて、明瞭な蛍光輝点の形成が確認された。【０１６５】
一方、図１４に示す通り、ｍＡＧ１−ｐ５３融合タンパク質を発現する細胞及びｐ５３−ｍＡＧ１融合タンパク質を発現する細胞においては、蛍光輝点は観察されず、蛍光シグナルは分散した状態にて観察された。【０１６６】
したがって、本発明によれば、ホモ２量体形成のみならず、ホモ多量体形成も判定することが可能であることが明らかになった。さらに、図１３に示す通り、本発明によれば、核内及び細胞質内において生じるｐ５３のホモ多量体形成を、一様な蛍光輝点の形成を通して、細胞内で偏りなく判定できることも明らかになった。また、本発明にかかるタンパク質タグを、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も確認された。【０１６７】
（実施例４）
上述のホモ多量体形成のみならず、ヘテロ多量体形成の判定においても、図１に示す系は有効であることを確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているＮｕｔｌｉｎ−３（ヌトリン−３）も本確認実験において用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ＬＴ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４〜８４８ページ  参照）。さらに、本確認実験において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０１６８】
＜ｐＰＢ１−ｐ５３（７０）の作製＞
ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ＰＢ１−ｐ５３（７０））を、第２の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐＰＢ１−ｐ５３（７０）ベクターを調製した。【０１６９】
ｐＰＢ１−ｐ５３（７０）の作製においては、先ずｐ５３の一部（ｐ５３タンパク質の１〜７０アミノ酸からなる領域（ｐ５３（７０））、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩ認識配列が付加してあり、当該ＤＮＡの３’末端に終止コドン及びＮｏｔＩ認識配列が付加してあるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。【０１７０】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２の作製＞
ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＮ末に融合させたＭＤＭ２（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２ベクターを調製した。【０１７１】
ｐＰＢ１−ＭＤＭ２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した
なお、ｐＰＢ１−ＭＤＭ２は、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたＭＤＭ２タンパク質（ＰＢ１−ＭＤＭ２）を、第２の融合タンパク質として発現させるためのプラスミドベクターであり、その調製方法等については後述の実施例１３を参照のこと。【０１７２】
＜ｐｐ５３（７０）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１の作製＞
ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＣ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１））を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐｐ５３（７０）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１ベクターを調製した。【０１７３】
ｐｐ５３（７０）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１の作製においては、先ず前記ｐ５３（７０）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端にＢａｍＨＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列を各々付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。【０１７４】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、以下に示す方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＰＢ１−ｐ５３（７０）及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２。【０１７５】
先ずＨＥＫ２９３細胞を培養液（ＤＭＥＭ  高グルコース（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）、１％  ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製））にて培養した。同細胞を遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬに各ベクター１００ｎｇを混合したＤＮＡ溶液を希釈し、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を０．８μｌ添加した後、攪拌した。さらに培養液１００μｌと混合した後、培養細胞に添加し、２０時間培養した。【０１７６】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ＩＸ−８１倒立顕微鏡、Ｕ−ＭＮＩＢＡ３フィルター（オリンパス社製）、ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  ４．０デジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）を用いて観察した。ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤として、ヌトリン−３を最終濃度４０μＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。ヌトリン−３の添加前と添加してから３０分後の画像を図１５及び１６に示す。【０１７７】
図１５及び１６に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１−ｐ５３（７０）及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現する細胞、並びにｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２を発現する細胞において、明確な蛍光輝点が観察された。さらに、これら蛍光輝点はヌトリン−３の添加によって解消され、蛍光シグナルが分散したことから明らかな通り、当該蛍光輝点は、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。【０１７８】
したがって、本発明によれば、ホモ多量体形成のみならず、ヘテロ多量体形成も判定できることが確認された。実施例３においても実証した通り、本発明にかかるタンパク質タグを、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も、実施例４において確認された。【０１７９】
（実施例５）
タンパク質間相互作用の判定における、図１に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメイン（以下「ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）」とも称する）とＦＫＢＰ１２タンパク質とであり、これらタンパク質は、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の存在下において相互作用することが知られている（Ｃｈｅｎ  Ｊ  ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、１９９５年５月２３日、９２巻１１号、４９４７〜４９５１ページ  参照）。また、本確認実験においても、実施例５同様に、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０１８０】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２の作製＞
ＦＫＢＰ１２タンパク質のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）を構築するに際して、先ずｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２ベクターを以下のようにして作製した。【０１８１】
ＦＫＢＰ１２タンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿４６３４６０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）認識サイトと終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭCＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２）を構築した。【０１８２】
次に、ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を作製した。【０１８３】
＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１の作製＞
ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合しているタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）を、以下の通りにして調製した。  ｍＴＯＲタンパク質の一部（ｍＴＯＲタンパク質の２０２５〜２１１４位のアミノ酸からなる領域、配列番号：４１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識サイトを各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）を作製した。【０１８４】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ｃ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例４に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ｃ）ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例４に記載の方法と同様の方法にて観察した。また、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用の誘導剤として、ラパマイシンを最終濃度５００ｎＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。各薬剤の添加前と添加してから３０分後の画像を図１７に示す。【０１８５】
図１７に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１を発現する細胞において、ラパマイシンを添加する前は、蛍光輝点が観察されなかった。しかし、ラパマイシンを添加してから３０分後には、蛍光輝点が観察された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が形成されたことから、これらの蛍光輝点はＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。【０１８６】
したがって、実施例４においても実証した通り、本発明によれば、実施例１〜３において示したようなホモ多量体形成に限らず、異なるタンパク質間の相互作用も検出できることが確認された。【０１８７】
（実施例６）
タンパク質間相互作用の判定における、図２に示す系の有効性について以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているヌトリン−３も本確認実験において用いた。さらに、本確認実験において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用いた。また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用い、当該蛍光タンパク質を、ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質双方に直接又は間接的に結合させてなる融合タンパク質を用いた。【０１８８】
＜ｐＰＢ１ｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒの作製＞
ＰＢ１ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ融合させてなるタンパク質をコードするＤＮＡ断片の両端に、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの認識サイトを各々配したＤＮＡ（配列番号：２７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。当該ＤＮＡをＮｈｅＩ及びＡｇｅＩで切断し、ＰＢ１ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをコードするDNAを除いたｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１ｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒプラスミドベクターを調製した。【０１８９】
＜ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１の作製＞
ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１をＣ末に融合させたｐ５３の部分ペプチド（ｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｍＡＧ１）を、第１の融合タンパク質として細胞において発現させるべく、以下の通りにして、ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１ベクターを調製した。【０１９０】
ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１の作製においては、先ずｐ５３（７０）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端に、ＢａｍＨＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列をそれぞれ付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより作製した。【０１９１】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例５に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｐ５３（７０）−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐ５３（７０）−ＰＢ１−ｍＡＧ１及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＭＤＭ２。【０１９２】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例４に記載の方法と同様の方法にて観察した。すなわち、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤として、ヌトリン−３を最終濃度４０μＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。ヌトリン−３の添加前と添加してから３０分後の画像を図１８及び１９に示す。【０１９３】
図１８及び１９に示した結果から明らかな通り、いずれの細胞においても明確な蛍光輝点が観察された。さらに、これら蛍光輝点はヌトリン−３の添加によって解消され、蛍光シグナルが分散したことから明らかな通り、当該蛍光輝点は、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。また、ｐ５３（７０）に直接融合するタンパク質をｍＡＧ１としても（前記（Ａ）の場合）、ＰＢ１ドメインとしても（前記（Ｂ）の場合）、本発明の方法においては変わることなく、タンパク質間相互作用を判定できることも確認された。【０１９４】
（実施例７）
タンパク質間相互作用の判定における、図２に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質とのタンパク質間相互作用であり、また当該相互作用を誘導するラパマイシンも本系において用いた。また、本確認実験においても、実施例７同様に、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０１９５】
＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１の作製＞
ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインのＣ末に、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが融合しているタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｍＡＧ１−ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１）を、以下の通りにして調製した。【０１９６】
ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１をＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで切断し、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）断片を精製した。次いで、当該断片を、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１を作製した。【０１９７】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ｃ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例５に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２。【０１９８】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、実施例５に記載の方法と同様の方法にて観察した。すなわち、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２とのタンパク質間相互作用の誘導剤として、ラパマイシンを最終濃度５００ｎＭになるよう培養液に添加した。当該薬剤を添加した後、室温で３０分間静置し、細胞を観察した。各薬剤の添加前と添加してから３０分後の画像を図２０及び２１に示す。【０１９９】
図２０及び２１に示した結果から明らかな通り、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現する細胞において、ラパマイシンを添加する前は、蛍光輝点が観察されなかった。しかし、ラパマイシンを添加してから３０分後には、蛍光輝点が観察された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が形成されたことから、これらの蛍光輝点はＦＫＢＰ１２とｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とのタンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。【０２００】
実施例１〜３においても実証した通り、図２に示す第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合体形成により生じる蛍光輝点を検出する系の有効性が、実施例６及び７においても確認された。特に、本発明によれば、実施例１〜３において示したようなホモ多量体形成に限らず、異なるタンパク質間の相互作用も図２に示す系においても判定できることが確認された。【０２０１】
（実施例８）
実施例１における蛍光タンパク質をｍＡＧ１からＤＧ１又はｍＣｈｅｒｒｙに変更し、以下に示す方法にて、本発明において用いる蛍光タンパク質はｍＡＧ１に限定されないことを確認した。【０２０２】
＜ｐＰＢ１−ｈＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びＤｒｏｎｐａ―Ｇｒｅｅｎ１蛍光タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１−ＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１−ｈＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。【０２０３】
ＤＧ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＢＡＤ７２８７４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＳｐｅＩ認識配列と、３’末端にＡｇｅＩ認識配列とを有するＤＮＡ配列を人工合成した。次いで、得られたＤＮＡをこれら制限酵素にて切断し、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＰＢ１−ｈＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を作製した。【０２０４】
＜ｐＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質が融合しているタンパク質（ＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。【０２０５】
ｐＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２の作製においては、先ずｍＣｈｅｒｒｙ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＡＡＶ５２１６４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端に、ＳｐｅＩ認識配及びとＡｇｅＩ認識配列に各々付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＳｐｅＩとＡｇｅＩとで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体を作製した。【０２０６】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
ＰＢ１−ｈＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体又はＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体を、細胞内に発現させるべく、これら融合タンパク質をコードする前記ベクターを、実施例４に記載の方法と同様の方法にてＨＥＫ２９３細胞に導入した。【０２０７】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ−８１倒立顕微鏡、ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  ４．０デジタルカメラを用いて観察した。ＤＧ１及びｍＣｈｅｒｒｙの観察には、それぞれＵ−ＭＮＩＢＡ３フィルター（オリンパス社製）及びＵ−ＭＷＩＧ３フィルター（オリンパス社製）を用いた。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体の形成は、５００ｎＭ  Ｂ／Ｂホモダイメリザーを加えて誘導した。当該薬剤を添加してから室温で静置し、添加してから１、２及び３時間経過後に細胞を観察した。薬剤の添加前と添加してから１、２及び３時間後の画像を、図２２及び２３に示す。【０２０８】
図２２及び２３に示した結果から明らかなように、ＰＢ１−ＤＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞及びＰＢ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞の双方において、薬剤添加依存的な蛍光輝点の増加が観察された。したがって、本発明に用いる蛍光タンパク質はｍＡＧ１に限られないことが確認された。【０２０９】
（実施例９）
本発明において、多量化能を有するタンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン以外のタンパク質も利用できることを確認した。すなわち、実施例１に記載の方法において、当該ＰＢ１ドメインの代わりに、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインを用いて、ＦＫＢＰ１２タンパク質変異体のホモ２量体形成の検出を、以下に示す材料及び方法にて行った。【０２１０】
＜ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体の作製＞
ＦＫＢＰ１２変異体のＮ末に、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体）を、以下の通りにして調製した。【０２１１】
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ＰＢ１−ｈｍＡＧ１部分を除いたｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体に挿入することにより、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体ベクターを作製した。【０２１２】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライドに播種した。１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬにプラスミドを２００ｎｇ混合したＤＮＡ溶液を調製し、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を０．８μｌ添加した後、攪拌した。それを更に培養液１００μｌと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、２０時間培養した。【０２１３】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ−８１倒立顕微鏡及びＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  ４．０デジタルカメラを用いて観察した。観察には、Ｕ−ＭＮＩＢＡ３フィルターを用いた。ＦＫＢＰ１２変異体のホモ２量体形成は、５００ｎＭ  Ｂ／Ｂホモダイメリザーを培地に添加し、誘導した。また、薬剤添加後、室温にて静置し、３時間経過後に細胞を観察した。薬剤の添加前と添加３時間後とに得られた画像を図２４に示す。【０２１４】
図２４に示した結果から明らかな通り、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２変異体を発現する細胞において、この変異体のホモ２量体形成を誘導する薬剤の添加に応じ、蛍光輝点の発生が観察された。したがって、本発明において、多量体を形成できるタンパク質であれば利用できることが確認された。【０２１５】
（実施例１０）
実施例９同様に、本発明において、多量化能を有するタンパク質として、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン以外のタンパク質も利用できることを確認した。すなわち、実施例３に記載の方法において、当該ＰＢ１ドメインの代わりに、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン又はＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインを用いて、ｐ５３タンパク質のホモ多量体形成の検出を、以下に示す材料及び方法にて行った。【０２１６】
＜ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３の作製＞
ｐ５３のＮ末に、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。【０２１７】
Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１、配列番号：４３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１−ｐ５３に挿入することにより、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３ベクターを作製した。【０２１８】
＜ｐＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３の作製＞
ｐ５３のＮ末に、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。【０２１９】
ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１、配列番号：４５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１−ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１−ｐ５３に挿入することにより、ｐＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３ベクターを作製した。【０２２０】
＜ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３の作製＞
ｐ５３のＮ末に、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。【０２２１】
ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＴＥＬ−ｍＡＧ１、配列番号：４７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１−ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ｐ５３に挿入することにより、ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３ベクターを作製した。【０２２２】
＜ｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３の作製＞
ｐ５３のＮ末に、ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメイン及びｍＡＧ１が融合しているタンパク質（ＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ｐ５３）を発現させるためのベクター（ｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３）を、以下の通りにして調製した。【０２２３】
ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインのＣ末にｍＡＧ１が融合してなるタンパク質（ＤＧＫｄ−ｍＡＧ１、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードし、５’末端にＮｈｅＩ認識配列、３’末端にＡｇｅＩ認識配列を有するＤＮＡ配列を人工合成し、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて切断した。その後、同制限酵素にて処理し、ｈｍＡＧ１−ＰＢ１部分を除いたｐｈｍＡＧ１ＰＢ１−ｐ５３に挿入することにより、ｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３ベクターを作製した。【０２２４】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライドに播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬにプラスミドを２００ｎｇ混合したＤＮＡ溶液を調製し、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ  を０．８μｌ添加した後、攪拌した。それを更に培養液１００μｌと混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加し、４８時間培養した。【０２２５】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞はＩＸ−８１倒立顕微鏡、ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  ４．０デジタルカメラを用いて観察した。観察には、Ｕ−ＭＮＩＢＡ３フィルターを用いた。得られた結果を図２５に示す。【０２２６】
図２５に示した結果から明らかな通り、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｍＡＧ１−ｐ５３を発現する細胞、ＰＫＣｉ−ｍＡＧ１−ｐ５３を発現する細胞、ＴＥＬ−ｍＡＧ１−ｐ５３を発現する細胞及びＤＧＫｄ−ｍＡＧ１−ｐ５３を発現する細胞のいずれにおいても、ｐ５３のホモ多量体形成を示す、蛍光輝点の発生が観察された。したがって、本発明において、多量体を形成できるタンパク質であれば利用できることが確認された。【０２２７】
（実施例１１）
本発明によって、シグナル伝達依存的に形成されるホモ２量体を検出できることを、以下に示す方法にて確認した。ＥＧＦ、ＧＰＣＲ等が関与するシグナル伝達経路が活性化されると、その下流に位置するＥＲＫ２がリン酸化され、活性化される。そして当該活性化に伴い、ＥＲＫ２はホモ２量体を形成することが知られている（Ｈａｒｖｅｙ  ＣＤら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００８年、１０５巻、４９号、１９２６４〜１９２６９ページ、Ｋｈｏｋｈｌａｔｃｈｅｖ  ＡＶら、Ｃｅｌｌ、１９９８年、９３巻、４号、６０５〜６１５ページ  参照）。そこで、本発明によって当該ホモ２量体形成の検出を試みた。なお、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。また、前記ＥＲＫ２の活性化は、細胞質及び核内にて生じることも明らかになっている（Ｅｂｉｓｕｙａ  Ｍら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、２００５年、１１８（Ｐｔ  １４）、２９９７〜３００２ページ  参照）。【０２２８】
＜ｐＥＲＫ２−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１及びｐＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１の作製＞
ＥＲＫ２のＣ末に、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合しているタンパク質（ＥＲＫ２−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＥＲＫ２−ＰＢ１−ｍＡＧ１）を発現させるためのベクター（ｐＥＲＫ２−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１及びｐＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１）を、以下の通りにして調製した。【０２２９】
ＥＲＫ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿００２７３６．３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、ＸｈｏＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列が各々付加してなるヌクレオチド配列を設計した。次いで、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＸｈｏＩとＮｏｔＩとで切断した。また、同じ制限酵素の組み合わせにて、ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒを処理した。そして、前記合成ＤＮＡの断片を、これらベクターに挿入することにより、ＥＲＫ２−ｍＡＧ１−ＰＢ１及びＥＲＫ２−ＰＢ１−ｍＡＧ１をコードするベクター（ｐＥＲＫ２−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１及びｐＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１）を作製した。【０２３０】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＨＥＫ２９３細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ  １００μＬにて、発現ベクター（ｐＥＲＫ２−ｈｍＡＧ１−ＰＢ１又はｐＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター溶液を培養細胞に添加した。ｐＥＲＫ２−ｈｍＡＧ１ＰＢ１導入細胞については、ベクターを導入してから２０時間後に観察を行った。ｐＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１導入細胞については、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。【０２３１】
＜細胞の観察＞
前記遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中で４時間培養し、血清飢餓状態とした。その後、ＩＸ−７１倒立顕微鏡（対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。ＥＲＫ２のホモ２量体形成は、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌとなるように同緩衝液に添加して誘導した。ＥＧＦ添加前、及び、添加８分後の画像を、図２６及び２７に示す。【０２３２】
図２６に示した結果から明らかな通り、ＥＧＦ添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された。その後、ＥＧＦ添加８分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察された。【０２３３】
また図２７に示した結果から明らかな通り、ＥＲＫ２−ＰＢ１−ｈｍＡＧ１を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞の全体において、ＥＲＫ２のホモ２量体形成を示す蛍光輝点が検出された。【０２３４】
したがって、本発明によれば、細胞内シグナル伝達経路の活性化に伴うＥＲＫ２のホモ２量体形成を検出できることが確認された。また、蛍光輝点の検出を通して、ＥＲＫ２のリン酸化に伴う活性化、ひいてはその上流であるＥＧＦ等が関与するシグナル伝達経路の活性化も、本発明によって検出できることが確認された。【０２３５】
（実施例１２）
本発明によって、シグナル伝達依存的に形成されるホモ２量体を検出できることを、以下に示す方法にて確認した。すなわち、ＩＬ−６等が関与するシグナル伝達経路が活性化されると、その下流に位置するＳＴＡＴ３がリン酸化され、活性化される。そして当該活性化に伴い、ＳＴＡＴ３はホモ２量体を形成し、細胞外のシグナルが核内に伝達されることが知られている（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３９４巻、６６８９号、１４５〜１５１ページ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＰＡら、Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ．、２０１１年、１１巻、１号、１８〜２６ページ  参照）。そこで、本発明によってＳＴＡＴ３のホモ２量体形成の検出を試みた。なお、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０２３６】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３の作製＞
ＳＴＡＴ３のＮ末に、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン及びｍＡＧ１を融合しているタンパク質（ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３）を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３）を、以下の通りにして調製した。【０２３７】
ＳＴＡＴ３（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿６４４８０５．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を付加し、当該ヌクレオチド配列の３’末端に、終止コドン及びＮｏｔＩ認識配列が付加してなるヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＸｈｏＩとＮｏｔＩとで切断した後、同じ制限酵素の組み合わせにて処理した、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３を作製した。【０２３８】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
前記にて作製した発現ベクターを導入する細胞としてＨＥＫ２９３細胞を選択し、先ず、この細胞を１０％  ＦＢＳ及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。そして、前記発現ベクター導入の前日に、これら細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、１．５ｍｌの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ  １００μＬにて、発現ベクター（ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３）１μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、各発現ベクター混合溶液を培養細胞に添加した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。【０２３９】
＜細胞の観察＞
前記ＰＢ１−ｍＡＧ１−ＳＴＡＴ３を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中で４時間培養し、血清飢餓状態とした。その後、ＩＸ−７１倒立顕微鏡（対物レンズの倍率：２０倍）、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。ＳＴＡＴ３のホモ２量体形成は、ヒトリコンビナントＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように同緩衝液に添加して誘導した。ＩＬ−６添加前、及び、添加５０分後の画像を、図２８に示す。【０２４０】
図２８に示した結果から明らかな通り、ＩＬ−６添加前は蛍光輝点が検出されず、蛍光シグナルは細胞質に分散して観察された。その後、ＩＬ−６添加５０分後には複数の細胞にて蛍光輝点が観察された。【０２４１】
したがって、本発明によれば、細胞内シグナル伝達経路の活性化に伴うＳＴＡＴ３のホモ２量体形成を検出できることが確認された。また、蛍光輝点の検出を通して、ＳＴＡＴ３のリン酸化に伴う活性化、ひいてはその上流であるＩＬ−６等が関与するシグナル伝達経路の活性化も、本発明によって検出できることが確認された。【０２４２】
（実施例１３）
実施例１〜１２において示した通り、タンパク質間相互作用の判定において、図１及び２に示す系は有効であることが明らかになった。次に、本発明者は、かかる系の別態様として図３に示す系を構想した。【０２４３】
すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第４の融合タンパク質と、多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、多量化能を有するタンパク質どうしが会合することにより、第３の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、また第４の融合タンパク質及び第５の融合タンパク質が結合し、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することが想定される。そして、かかる想定通りであれば、図１及び２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることが、図３に示す系においても想定される。【０２４４】
そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図３に示す系の有効性について検証した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤として知られているヌトリン−３（Ｎｕｔｌｉｎ−３）も本検証において用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ＬＴ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４〜８４８ページ  参照）。さらに、本検証において、前記多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｈｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０２４５】
＜ｐｐ５３−ＰＢ１及びｐＰＢ１−ＭＤＭ２の作製＞
本発明にかかる第３及び第４の融合タンパク質、すなわちｐ５３タンパク質及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを含む融合タンパク質（ｐ５３−ＰＢ１）と、ＭＤＭ２タンパク質及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを含む融合タンパク質（ＰＢ１−ＭＤＭ２）とを、細胞内において発現させるため、以下に示す方法にて各融合タンパク質をコードする発現ベクターを作製した。【０２４６】
ｐ５３タンパク質の一部（ｐ５３タンパク質の１〜７０位のアミノ酸からなる領域、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列からなる領域、以下「ｐ５３（７０）」とも称する）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素サイトを配したＤＮＡ（配列番号：３３に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐ５３（７０）−ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１）を構築した。なお、ｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒのマルチクローニングサイトに任意のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて挿入することにより、該タンパク質のＣ末にリンカーペプチドを介してＡｓｈタンパク質タグ（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）が融合されたタンパク質を細胞内において発現させることが可能となる。【０２４７】
また、ＭＤＭ２の一部（ＭＤＭ２タンパク質の１〜１１９位のアミノ酸からなる領域、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素サイトを配したＤＮＡ（配列番号：３５に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ＰＢ１−ＭＤＭ２をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１−ＭＤＭ２）を構築した。なお、ｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒのマルチクローニングサイトに任意のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて挿入することにより、該タンパク質のＮ末にリンカーペプチドを介してＡｓｈタンパク質タグ（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）が融合されたタンパク質を細胞内において発現させることが可能となる。【０２４８】
＜ｐｈｍＡＧ１ＰＢ１の作製＞
前記第５の融合タンパク質を細胞内において発現させるため、以下に示す方法にて発現ベクターを作製した。すなわち先ず、ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ（配列番号：３８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ）の両端に、制限酵素サイトを配した配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにて切断し、同じ制限酵素に組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（Ａｍａｌｇａａｍ有限会社製）に挿入することにより、ｍＡＧ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインからなる融合タンパク質（ｍＡＧ１−ＰＢ１）をコードする発現ベクター（ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１）を構築した。【０２４９】
＜ｍＡＧ１−ＰＢ１を恒常的に発現する細胞の作製＞
次に、前記にて作製したｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１をＨｅＬａＳ３細胞に導入し、本発明にかかる第５の融合タンパク質（ｍＡＧ１−ＰＢ１）を恒常的に発現する細胞を樹立した。すなわち、先ず、ＨｅＬａＳ３細胞を、１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を添加したＤＭＥＭ（低グルコース、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。そして、遺伝子導入の前日に、ＨｅＬａＳ３細胞を３５ｍｍディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、１．５ｍＬの培養液にて培養した。次いで、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬに、ｐｈｍＡＧ１−ＰＢ１  １μｇを希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１０μＬ添加した後、攪拌した。更に培養液６００μＬと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２０時間培養した。その後、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにＧ４１８を添加し、更に１週間培養した。次いで、生存した細胞をトリプシン溶液で剥離し、０．５個／ウェルとなるようにＧ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を含む培養液にて希釈した後、９６ウェルプレートにて培養した。そして、単一コロニーを形成した細胞を拡大培養した。【０２５０】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
前記細胞にて、恒常的に発現させているｍＡＧ１−ＰＢ１に加え、ｐ５３（７０）−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２を発現させるために、以下に示す方法にてｐｐ５３（７０）−ＰＢ１及びｐＰＢ１−ＭＤＭ２を該細胞に導入した。【０２５１】
すなわち先ず、前記にて樹立したｍＡＧ１−ＰＢ１を恒常的に発現する細胞を、１０％  ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社）及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり２００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１０μＬに、ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１及びｐＰＢ１−ＭＤＭ２を１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ターボフェクト（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．４μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液１００μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。【０２５２】
また、陰性対照として、ｐｐ５３（７０）−ＰＢ１及びｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒを１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液、並びにｐＰＢ１−ＭＤＭ及びｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒを１００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を各々、ｍＡＧ１−ＰＢ１を恒常的に発現する細胞に、前記同様の方法にて導入した。【０２５３】
＜細胞の観察＞
前記にて調製した、以下に示す３種の細胞を実施例１に記載の方法にて観察した
ｍＡＧ１−ＰＢ１が恒常的に発現し、更にｐ５３（７０）−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２が発現している細胞、
ｍＡＧ１−ＰＢ１が恒常的に発現し、更にｐ５３（７０）−ＰＢ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞（陰性対照）、
ｍＡＧ１−ＰＢ１が恒常的に発現し、更にＰＢ１−ＭＤＭ及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞（陰性対照）。
得られた結果を図２９に示す。【０２５４】
また、前記ｐ５３（７０）−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２が発現している細胞にヌトリン−３を最終濃度が２０μＭになるよう添加することにより、ｐ５３及びＭＤＭ２間相互作用を阻害する条件下においても当該細胞を観察した。得られた結果を図３０に示す。なお、図２９は実施例１同様に対物レンズの倍率を２０倍にして観察した結果を示しているが、図３０は対物レンズの倍率を４０倍にして観察した結果を示すものである。【０２５５】
図２９に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１−ＰＢ１、ｐ５３（７０）−ＰＢ１及びＰＢ１−ＭＤＭ２が発現している細胞において、蛍光輝点が検出された（図２９の左側の画像  参照）。他方、ｍＡＧ１−ＰＢ１、ｐ５３（７０）−ＰＢ１及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞、並びに、ｍＡＧ１−ＰＢ１、ＰＢ１−ＭＤＭ２及びｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインが発現している細胞においては、蛍光輝点が検出されなかった。【０２５６】
さらに、図３０に示す通り、蛍光輝点が検出された前記細胞にヌトリン−３を添加し、その１５分後に観察したところ、蛍光輝点は消失していた。したがって、この蛍光輝点は、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用に依存して形成されたものであることが確認された。【０２５７】
（実施例１４）
実施例１３同様に、タンパク質間相互作用の判定における、図３に示す系の有効性について、以下に示す方法にて確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２タンパク質とのタンパク質間相互作用であり、また当該相互作用を誘導するラパマイシンも本系において用いた。さらに、本確認実験において、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを用い、また蛍光タンパク質としてｍＡＧ１タンパク質を用いた。【０２５８】
＜ｐｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１の作製＞
本発明にかかる第３の融合タンパク質として、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１）を発現させるためのベクターを、実施例５に記載の通りに作製した。【０２５９】
＜ｐＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）の作製＞
本発明にかかる第３の融合タンパク質として、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ））を発現させるためのベクター（ｐＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ））を、以下の通りに作製した。【０２６０】
ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）認識サイトと終止コドンとを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）をコードする発現ベクター（ｐＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ））を構築した。【０２６１】
＜ｐＦＫＢＰ１２−ＰＢ１の作製＞
本発明にかかる第４の融合タンパク質として、ＦＫＢＰ１２タンパク質のＣ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１）を発現させるためのベクター（ｐＦＫＢＰ１２−ＰＢ１）を、以下の通りに作製した。【０２６２】
ＦＫＢＰ１２タンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿４６３４６０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識サイトを各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１をコードする発現ベクター（ｐＦＫＢＰ１２−ＰＢ１）を構築した。【０２６３】
＜ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２の作製＞
本発明にかかる第４の融合タンパク質として、ＦＫＢＰ１２タンパク質のＮ末にｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメインを融合してなるタンパク質（ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＰＢ１−ＦＫＢＰ１２）を、実施例５に記載の通りに調製した。【０２６４】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
（Ａ）ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）、ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｂ）ＰＢ１−ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）、ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｃ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１、ＰＢ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＡＧ１ＰＢ１
（Ｄ）ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）−ＰＢ１、ＦＫＢＰ１２−ＰＢ１及びｍＡＧ１ＰＢ１
上記（Ａ）〜（Ｄ）に記載の組み合わせにて、融合タンパク質を発現させるために、以下に示す方法にて各ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。【０２６５】
すなわち先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を９６ウェルマルチウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１４０μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬに、各プラスミドベクターを１３３ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。【０２６６】
＜細胞の観察＞
前記にて調製した細胞の培養液を除き、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液１００μＬを添加した。次いで、細胞をＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００を用いて観察した。また、各ウェルに、最終濃度５００ｎＭとなるようにラパマイシンを添加し、室温で１時間静置した後、細胞を観察した。得られた結果を図３１に示す。【０２６７】
図３１に示した結果から明らかなように、ラパマイシン添加前は、いずれの細胞においても、蛍光輝点は検出されなかった。しかし、ラパマイシンを添加した結果、蛍光輝点が検出された。このように、ラパマイシン依存的に蛍光輝点が検出されたことから、この蛍光輝点は、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）とＦＫＢＰ１２との相互作用に依存して形成されたものであることが確認された。また、本発明にかかるタンパク質タグ（多量化能を有するタンパク質又は蛍光タンパク質を含むタンパク質）を、解析対象タンパク質のＮ末及びＣ末のいずれに融合しても機能する事も、本実施例において確認された。【０２６８】
以上、実施例４及び５において示した通り、本発明によれば、図３に示すように、多量化能を有するタンパク質どうしの自己会合を介し、細胞内において多量化能を有するタンパク質と蛍光タンパク質とを会合させることによっても、タンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。さらに、本発明にかかる第５の融合タンパク質を恒常的に発現する細胞を樹立できたことから、該タンパク質は細胞毒性等を示さない事が確認された。【０２６９】
また、図３に示す方法において、解析対象となるタンパク質（第１及び第２のタンパク質）に融合させるタンパク質は、多量化能を有するタンパク質である。一方、図１及び２に示す方法においては、解析対象となるタンパク質に融合させるタンパク質には、多量化能を有するタンパク質に加え、蛍光タンパク質も含まれる。したがって、図３に示す方法は、図１及び２に示す方法と比較して、解析対象となるタンパク質に融合するタンパク質タグの分子量が小さくて済むため、解析対象となるタンパク質の機能はより阻害されにくくなる。【０２７０】
さらに、図３に示す方法においては、実施例４に記載の通り、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うことができる。【０２７１】
（実施例１５）
以上の通り、タンパク質間相互作用の判定において、図１〜３に示す系は有効であることが明らかになった。次に、本発明者は、かかる系の別態様として図４に示す系を構想した。【０２７２】
すなわち、アフィニティタグ及び第１のタンパク質を含む第１の標識化タンパク質と、アフィニティタグ及び第２のタンパク質を含む第２の標識化タンパク質と、前記アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーが結合しており、かつ多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む、第６の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、前記アフィニティタグと前記結合パートナーとが結合することにより、第１の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合し、また第２の標識化タンパク質と、前記結合パートナーが結合している第６の融合タンパク質とが結合することにより、図１及び２に示す第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質に各々相当するタンパク質が該細胞内において発現することになる。そして、これらタンパク質の発現に伴い、図１及び２に示す系同様に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【０２７３】
そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図４に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、細胞膜貫通タンパク質  ＣＤ８０のホモ２量体形成である。また、その陰性対照として細胞内でモノマーとして存在することが知られている、細胞膜貫通タンパク質  ＣＤ２も用いた（これらタンパク質のタンパク質間相互作用に関しては、Ｊａｍｅｓ  ＪＲら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００６年、３巻、１２号、１００１〜１００６ページ  参照）。【０２７４】
＜ｐＣＤ８０−ＦＲＢの作製＞
アフィニティタグとして前記ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）を選択し、このタグを融合させたＣＤ８０タンパク質（ＣＤ８０−ＦＲＢ）を、第１及び第２の標識化タンパク質として細胞内において発現させるべく、以下の通りにｐＣＤ８０−ＦＲＢベクターを調製した。【０２７５】
先ず、ＣＤ８０（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセッション番号：ＮＰ＿００５１８２．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤ８０−ｈｍＡＧ１ベクターを構築した。【０２７６】
次に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩの認識配列、並びに終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理し、ｈｍＡＧ１領域を除いたｐＣＤ８０−ｈｍＡＧ１に挿入することにより、ＣＤ８０−ＦＲＢをコードする発現ベクター（ｐＣＤ８０−ＦＲＢ）を構築した。【０２７７】
＜ｐＣＤ２−ＦＲＢの作製＞
前記同様に、アフィニティタグとしてｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）を融合させたＣＤ２タンパク質（ＣＤ２−ＦＲＢ）を、第１及び第２の標識化タンパク質として細胞内において発現させるべく、以下の通りにベクターを調製した。【０２７８】
先ず、ＣＤ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＡＡ５１９４６．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤ２−ｈｍＡＧ１を構築した。【０２７９】
次に、ｍＴＯＲ（ＦＲＢ  ｄｏｍａｉｎ）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩの認識配列、並びに終止コドンを配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡをＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて切断し、同じ制限酵素の組み合わせにて処理し、ｈｍＡＧ１領域を除いたｐＣＤ２−ｈｍＡＧ１に挿入することにより、ＣＤ２−ＦＲＢをコードする発現ベクター（ｐＣＤ２−ＦＲＢ）を構築した。【０２８０】
＜ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２の調製＞
アフィニティタグに対して親和性を有する結合パートナーとしてＦＫＢＰ１２を、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインを、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１を選択した。そして、これらタンパク質が融合してなる、ＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を、第６の融合タンパク質として細胞内において発現させるべく、実施例５に記載の通り、ｐＰＢ１−ｈｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２ベクターを調製した。【０２８１】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて、融合タンパク質を発現させるべく、以下に示す方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターを、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＣＤ８０−ＦＲＢ及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２
（Ｂ）ＣＤ２−ＦＲＢ及びＰＢ１−ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２。【０２８２】
すなわち先ず、ＨＥＫ２９３細胞を、培養液（ＤＭＥＭ  高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン・ストレプトマイシン）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を８ウェルチャンバーに播種し、１ウェルあたり１００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬに、各プラスミドを２００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。【０２８３】
＜細胞の観察＞
観察前に、遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞の培養液を、５００ｎＭのラパマイシンを含有する観察緩衝液（ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなる、ｐＨ７．４の緩衝液）に置換した。当該薬剤を添加した緩衝液に置換した後、室温で３０分間静置した。そして、ＩＸ−７１倒立顕微鏡、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラを用いて、細胞を観察した。得られた結果を、図３２に示す。【０２８４】
図３２に示す通り、ＣＤ８０を検出対象として用いた場合には、細胞膜において蛍光輝点が観察された。一方、ＣＤ２を検出対象として用いた場合には、蛍光輝点が観察されなかった。したがって、図４に示した系の有効性が確認された。【０２８５】
また、図４に示す本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法においては、図３に示す方法同様に、解析対象となるタンパク質に直接又は間接的に蛍光タンパク質を融合させることを要さない。そのため、図１及び２に示す方法と比較して、解析対象となるタンパク質に融合するタンパク質タグの分子量が小さくて済むため、解析対象となるタンパク質の機能はより阻害されにくくなる。【０２８６】
また、このように、分子量の小さいタグが融合した状態にて解析対象となるタンパク質を細胞内に維持することができるため、上述の通り、ラパマイシン添加等の刺激に応じて本発明にかかる融合タンパク質が再構成される系を構築することにより、タンパク質間相互作用を任意のタイミングにて判定し得る状態に設定することができる。【０２８７】
さらに、蛍光タンパク質を含む第６の融合タンパク質を恒常的に発現させた細胞を事前に調製しておくことで、これら細胞に解析対象となるタンパク質を含む融合タンパク質を一過的に発現させても、蛍光シグナルの細胞間のバラツキの影響が抑えられ、タンパク質間相互作用の判定をより安定的に行うこともできる。【０２８８】
また、ＣＤ８０等の細胞膜貫通タンパク質は、ゴルジ体等の細胞内小器官を通過して細胞膜へと局在する。そのため、当該タンパク質をタグと融合させて発現させた場合には、同器官を通過して細胞膜に到達することは困難となる、ゆえに、一般的に、細胞質タンパク質等における相互作用とは異なり、細胞膜タンパク質のそれを検出することは困難であると言われている。【０２８９】
一方、本発明のタンパク質間相互作用の第３の判定方法によれば、融合させるタグは比較的小さく済むので、細胞膜貫通タンパク質の細胞膜への到達が容易となる。そして、当該タグが融合した状態で細胞膜貫通タンパク質を膜上に発現させ、細胞質に発現させた多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を、あとからそのタグに結合させることによって、図２６に示した結果から明らかなように、ＣＤ８０等の細胞膜貫通タンパク質におけるタンパク質間相互作用をも容易に検出することが可能となる。【０２９０】
さらに、この第３の判定方法を用いることにより、ＦＲＥＴ／ＢＲＥＴ／ＢｉＦＣ等、タグの近接を利用する手法では検出できない、別々の細胞間におけるタンパク質間相互作用（例えば、ＰＤ１とＰＤＬ１とのタンパク質間相互作用）を判定することも可能となる。【０２９１】
（実施例１６）
次に、本発明者は、図１等に示した系に基づき、３以上のタンパク質間の相互作用を検出するための一態様として、図７に示す系を構想した。【０２９２】
すなわち、第１のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１３の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び多量化能を有するタンパク質を含む第１４の融合タンパク質と、第３のタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１５の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入した場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質と第３のタンパク質が相互作用すれば、図１等に示した系同様に、多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導され、これにより融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出されることになる。【０２９３】
そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、ｐ５０、ｐ６０及びＩκＢαによるヘテロ３量体形成である。【０２９４】
なお、ｐ５０とｐ６５とはヘテロ２量体を形成し、ＮＦκＢを構成することが知られている。さらに、ＮＦκＢは炎症性サイトカインの発現調節を担う転写因子として核内で機能するが、ＩκＢαとさらに相互作用することによって細胞質に保持され、その転写機能は抑制されることが知られている（Ｍａｒｃ  Ｄ．Ｊａｃｏｂｓら、Ｃｅｌｌ、１９９８年１２月１１日、９５巻、７４９〜７５８ページ  参照）。したがって、本実施例において、ｐ５０、ｐ６５各々に多量化能を有するタンパク質を融合し、ＩκＢαには蛍光タンパク質を融合させて、細胞内に発現させることで、ｐ５０とｐ６５との相互作用によって形成される会合体に、さらに蛍光タンパク質を融合したＩκＢαが集積する事で、蛍光輝点が形成され、３量体複合体を検出できることを確認した。【０２９５】
＜ｐＰＢ１−ｐ５０の作製＞
細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＮ末に融合させたｐ５０タンパク質（ＰＢ１−ｐ５０）を、第１３の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＰＢ１−ｐ５０ベクターを構築した。【０２９６】
ｐ５０（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿００３９８９．２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＰＢ１−ｐ５０を作製した。【０２９７】
＜ｐｐ６５−ＰＢ１の作製＞
細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたｐ６５タンパク質（ｐ６５−ＰＢ１）を、第１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｐ６５−ＰＢ１ベクターを構築した。【０２９８】
ｐ６５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿０６８８１０．３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ６５−ＰＢ１ベクターを作製した。【０２９９】
＜ｐｈｍＫＯ２−ＩκＢαの作製＞
細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＫＯ２をＮ末に融合させたＩκＢαタンパク質（ｍＫＯ２−ＩκＢα）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｈｍＫＯ２−ＩκＢαベクターを構築した。【０３００】
ＩκＢα（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿０６５３９０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＫＯ２−ＭＣＬｉｎｋｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）に挿入することにより、ｐｈｍＫＯ２−ＩκＢαベクターを作製した。【０３０１】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、実施例１２に示す方法と同様の方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ＰＢ１−ｐ５０、ｐ６５−ＰＢ１及びｍＫＯ２−ＩκＢα
（Ｂ）ＰＢ１−ｐ５０及びｍＫＯ２−ＩκＢα（陰性対照）。【０３０２】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞は、ＩＸ−７１倒立顕微鏡、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター及びＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０デジタルカメラを用いて観察した。得られた結果を図３３に示す。【０３０３】
図３３に示した結果から明らかな通り、ＰＢ１−ｐ５０、ｐ６５−ＰＢ１及びｍＫＯ２−ＩκＢαを細胞内にて発現させた場合に、蛍光輝点が検出された。一方、ＰＢ１−ｐ５０及びｍＫＯ２−ＩκＢαを細胞内にて発現させた場合には、蛍光輝点を検出することができなかった。したがって、図７に示す通り、ｐ５０とｐ６５が相互作用することにより、多量化能を有するタンパク質を利用して会合体が形成され、そこへ蛍光タンパク質を融合したＩκＢαがさらに集積することによって、蛍光輝点が生じることが確認された。すなわち、当該蛍光輝点の検出を介して、３種のタンパク質間の相互作用を判定できることが確認された。【０３０４】
（実施例１７）
実施例１６同様に、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、ＣＤＫ４、ＣｙｃｌｉｎＤ１及びｐ２１によるヘテロ３量体形成である。細胞の核内にて、ｐ２１は、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体を認識し、相互作用することが知られている（ＬａＢａｅｒ  Ｊら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９７年４月１日、１１巻７号８４７〜８６２ページ  参照）。そして、かかるヘテロ３量体の形成により、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とからなる複合体によって促進される細胞周期の進行（Ｇ１期からＳ期への移行）が阻害されることも明らかになっている。【０３０５】
＜ｐｐ２１−ＰＢ１の作製＞
細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたｐ２１タンパク質（ｐ２１−ＰＢ１）を、第１３の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｐ２１−ＰＢ１ベクターを構築した。【０３０６】
ｐ２１（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿５１０８６７．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｐ２１−ＰＢ１ベクターを作製した。【０３０７】
＜ｐＣＤＫ４−ＰＢ１の作製＞
細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたＣＤＫ４タンパク質（ＣＤＫ４−ＰＢ１）を第１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣＤＫ４−ＰＢ１ベクターを構築した。【０３０８】
ＣＤＫ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿００００６６．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤＫ４−ＰＢ１ベクターを作製した。【０３０９】
＜ｐＣＤＫ４の作製＞
陰性対照として、他のタンパク質を融合させていないＣＤＫ４タンパク質（ＣＤＫ４）を発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣＤＫ４ベクターを構築した。【０３１０】
ＣＤＫ４をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩの認識配列と、終止コドン及びＮｏｔＩの認識配列とを、各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＣＤＫ４ベクターを作製した。【０３１１】
＜ｐｈｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１＞
細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１をＮ末に融合させたＣｙｃｌｉｎＤ１タンパク質（ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐｈｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１ベクターを構築した。【０３１２】
ＣｙｃｌｉｎＤ１（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  アクセション番号：ＮＰ＿４４４２８４．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードするヌクレオチド配列の両端に、ＢａｍＨＩの認識配列と、終止コドン及びＮｏｔＩの認識配列とを、各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐｈｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１ベクターを作製した。【０３１３】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、実施例１４に示す方法と同様の方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１−ＰＢ１及びＣＤＫ４−ＰＢ１
（Ｂ）ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１−ＰＢ１及びＰＢ１（陰性対照）
（Ｃ）ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１−ＰＢ１及びＣＤＫ４（陰性対照）
なお、（Ｂ）においては、ＰＢ１（ｐ６２タンパク質のＰＢ１ドメイン）を発現させるべく、ｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒを細胞に導入した。【０３１４】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞は、実施例１４に示す方法と同様の方法にて観察した。得られた結果を図３４に示す。【０３１５】
図３４に示した結果から明らかな通り、ｍＡＧ１−ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１−ＰＢ１及びＣＤＫ４−ＰＢ１を発現する細胞では、蛍光輝点が検出された。一方、ＣＤＫ４を細胞内にて発現させなかった場合、多量化能を有するタンパク質を融合させずにＣＤＫ４を細胞内にて発現させた場合においては、蛍光輝点を検出することができなかった。したがって、図７に示す通り、ＣＤＫ４とＣｙｃｌｉｎＤ１とが相互作用することにより、多量化能を有するタンパク質と蛍光タンパク質とを有する複合体が形成され、そこへ多量化能を有するタンパク質を融合したｐ２１が相互作用することで、蛍光輝点が生じることが確認された。すなわち、当該蛍光輝点の検出を介して、３種のタンパク質間の相互作用を判定できることが確認された。【０３１６】
（実施例１８）
実施例１６及び１７同様に、タンパク質間相互作用の判定における、図７に示す系の有効性について確認した。なお、この確認実験において検出対象としたのは、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）と、ミオシン軽鎖キナーゼ２（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２）の部分配列（Ｍ１３ペプチド、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ）とによる４量体形成である。カルモジュリンとＭ１３ペプチドとの相互作用は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）がリガンドを受容した際に生じる細胞内カルシウムイオン濃度の一過的な上昇（セカンドメッセンジャー）に応答して発生することが明らかになっている（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年８月２８日、３８８巻、６６４５号、８８２〜８８７ページ  参照）。また、カルモジュリンと、Ｍ１３ペプチド等のカルモジュリン結合ペプチドとの相互作用によって、これら各２分子からなる４量体が形成されることも明らかになっている（Ｙｅ  Ｑ  ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年１月２４日、４５巻、３号、７３８〜７４５ページ  参照）。そこで、かかる４量体形成を、図７に示した系によって検出できることを、以下に示す材料及び方法にて確認した。さらに、蛍光輝点の検出を通じて、細胞内カルシウムイオン濃度の経時的な変化を検出することも確認した。【０３１７】
＜ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１の作製＞
細胞内にて、多量化能を有するタンパク質としてｐ６２のＰＢ１ドメインをＣ末に融合させたＭ１３ペプチド（Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１）を、第１３及び１４の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１ベクターを構築した。【０３１８】
Ｍ１３ペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５０に記載のヌクレオチド配列）の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐＡｓｈ−ＭＮＬｉｎｋｅｒに挿入することにより、ｐＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１ベクターを作製した。【０３１９】
＜ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＡＧ１及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＵｋＧ１の作製＞
細胞内にて、蛍光タンパク質としてｍＡＧ１をＣ末に融合させたカルモジュリンタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＡＧ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、または蛍光タンパク質としてｍＵｋＧ１をＣ末に融合させたカルモジュリンタンパク質（Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＵｋＧ１）を、第１５の融合タンパク質として発現させるべく、以下に示す通り、ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＡＧ１ベクター及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＵｋＧ１ベクターを構築した。【０３２０】
カルモジュリンをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５２に記載のヌクレオチド配列）の両端に、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩの認識配列を各々配したＤＮＡを人工合成した。次いで、得られた合成ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同制限酵素にて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ及びｐｈｍＵｋＧ１−ＭＮＬｉｎｋｅｒ（いずれも株式会社医学生物学研究所社製）各々に挿入する事により、ｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＡＧ１ベクター及びｐＣａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｈｍＵｋＧ１ベクターを作製した。【０３２１】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
下記（Ａ）又は（Ｂ）の組み合わせにて融合タンパク質を発現させるために、以下に示す方法にて、前記にて調製したプラスミドベクターをＨｅＬａＳ３細胞に導入した。
（Ａ）Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＡＧ１及びＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１
（Ｂ）Ｃａｌｕｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＵｋＧ１及びＭ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１
先ず、ＨｅＬａＳ３細胞を、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）を含有するＤＭＥＭ（低グルコース）にて培養した。次いで、ＨｅＬａＳ３細胞を遺伝子導入の前日に３５ｍｍガラスベースディッシュ（旭硝子社製）に播種した。そして、遺伝子導入の際には、ＯｐｔｉＭＥＭにプラスミド（１μｇ＋１μｇ）を希釈し、ポリフェクト（登録商標）トランスフェクション試薬を１０μｌ添加し、攪拌した。さらに培養液６００μｌと混合した後、ＨｅＬａＳ３細胞に添加し、２２時間培養した。【０３２２】
＜細胞の観察＞
前記にて遺伝子導入し、２２時間培養したＨｅｌａＳ３細胞を、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液中にて、ＩＸ−７１倒立顕微鏡、Ｕ−ＭＧＦＰＨＱフィルター、ＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラを用いて観察した。その後、１００μＭ  ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、和光純薬工業社製）を添加し、継時的に蛍光画像を撮影した。なお、ヒスタミンは、ＨｅＬａＳ３細胞にも発現しているＧＰＣＲの１種  Ｈ１レセプターのリガンドとして機能することが明らかになっている。得られた結果を図３５及び３６に示す。【０３２３】
図３５及び３６に示した結果から明らかなように、リガンド（ヒスタミン）添加前は、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＡＧ１及びＣａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｍＵｋＧ１は細胞内に拡散して存在していたが、リガンドを添加してから６０秒後には、蛍光輝点の発生が検出され、Ｍ１３ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＢ１を含む会合体の形成が確認された。また、図３５に示す通り、その後も継続して観察した結果、リガンド添加に伴って一過的に上昇した細胞質カルシウムイオン濃度が、その後低下したことに伴い、リガンド添加３００秒後には蛍光輝点（会合体）は消失した。【０３２４】
したがって、本発明によって、このようなヘテロ４量体形成も検出できることが確認された。さらに、本発明のタンパク質間相互作用の検出方法を利用することにより、Ｈ１レセプターからのシグナル伝達により、一過的に上昇するカルシウムイオン濃度の実時間測定が可能であることも明らかになった。また、この実施例の結果から、ひいては、タンパク質間相互作用を発生させるセカンドメッセンジャー等の内在性因子、該セカンドメッセンジャー等が寄与するシグナル伝達、及び該シグナル伝達を惹起する細胞外リガンド等の外部からの刺激の検出並びにスクリーニングに適用できることも示された。【０３２５】
（実施例１９）
本発明者らは、上記結果に基づき、タンパク質間相互作用を判定するための系として、図８に示す系を構想した。【０３２６】
すなわち、第１のタンパク質、第１の多量化能を有するタンパク質及び蛍光タンパク質を含む第１６の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の多量化能を有するタンパク質を含む第１７の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた又は細胞に導入し、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは異なるタンパク質であり、また第１の多量化能を有するタンパク質と第２の多量化能を有するタンパク質とは異なるタンパク質である場合、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用し、さらに多量化能を有するタンパク質同士の多量体形成が誘導されることにより、融合タンパク質が自立的に会合体を形成し、融合タンパク質に含まれる蛍光タンパク質が蛍光輝点として検出される系の構築を考えた。【０３２７】
そこで、以下に示す材料及び方法にて、タンパク質間相互作用の判定における、図８に示す系の有効性について確認した。なお、この検証において検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用であり、また該相互作用の阻害剤  ヌトリン−３も本検証において用いた。さらに、本検証において、多量化能を有するタンパク質として、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ１タンパク質のＳＡＭドメイン、ＰＫＣｉｏｔａタンパク質のＰＢ１ドメイン、ＴＥＬタンパク質のＳＡＭドメイン、ＤＧＫｄｅｌｔａタンパク質のＳＡＭドメインを適宜組み合わせて用いた。また、蛍光タンパク質として、ｍＡＧ１タンパク質を用いた。なお、図８に示す系においては、タンパク質相互作用の解析対象である１のタンパク質のみに蛍光タンパク質を融合させているが、本実施例においては双方のタンパク質に融合して検証を行った。【０３２８】
＜各種融合タンパク質を発現させるためのプラスミドベクターの調製＞
上述の通りに調製した、ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３、ｐＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３、ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３及びｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて制限酵素処理し、ヌクレオチド断片  Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１、ＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１、ＴＥＬ−ｈｍＡＧ１及びＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１を調製した。そして、これらを同制限酵素にて処理し、ＰＢ１領域を除いたｐＰＢ１−ｐ５３（７０）に、各々挿入することにより、以下のプラスミドベクターを調製した。
（ａ）ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３（７０）、
（ｂ）ｐＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３（７０）、
（ｃ）ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３（７０）、
（ｄ）ｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ｐ５３（７０）。【０３２９】
また、実施例４において調製したｐＰＢ１−ＭＤＭ２を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理し、ＰＢ１領域を除いた後、前記ヌクレオチド断片を各々挿入することにより、以下のプラスミドベクターも調製した。（ｅ）ｐＴａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２、
（ｆ）ｐＰＫＣｉ−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２、
（ｇ）ｐＴＥＬ−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２、
（ｈ）ｐＤＧＫｄ−ｈｍＡＧ１−ＭＤＭ２。【０３３０】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
前述の通りにして調製したプラスミドベクター（ａ）〜（ｈ）を、下記組み合わせにて、以下に示す方法により、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。
組み合わせ１：プラスミドベクター（ｂ）及び（ｈ）、
組み合わせ２：プラスミドベクター（ｂ）及び（ｇ）、
組み合わせ３：プラスミドベクター（ａ）及び（ｆ）、
組み合わせ４：プラスミドベクター（ａ）及び（ｈ）、
組み合わせ５：プラスミドベクター（ａ）及び（ｇ）、
組み合わせ６：プラスミドベクター（ｄ）及び（ｆ）、
組み合わせ７：プラスミドベクター（ｄ）及び（ｇ）、
組み合わせ８：プラスミドベクター（ｃ）及び（ｅ）、
組み合わせ９：プラスミドベクター（ｃ）及び（ｈ）。【０３３１】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ及び１％  ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）にて培養した。次いで、遺伝子導入の前日に、当該細胞を９６ウェルマルチウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社製）に播種し、１ウェルあたり１００μＬの培養液にて培養した。そして、ＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬに、各プラスミドを２００ｎｇずつ混合して調製したＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、ＦｕｇｅｎｅＨＤを０．８μＬ添加した後、攪拌し、更に培養液９０μｌと混合した。そして、得られた混合液を前記培養細胞に添加し、２０時間培養した。【０３３２】
＜細胞の観察＞
前記培養後に細胞の培養液を除き、ハンクス平衡塩液及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳからなるｐＨ７．４緩衝液１００μＬを添加した。そして、細胞をＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００を用いて観察を行なった。次に、各ウェルに、最終濃度４０μＭとなるようにヌトリン−３を添加した。室温で１時間静置したのち細胞を観察した。得られた結果を図３７〜４５に示す。【０３３３】
図３７〜４５に示した結果から明らかなように、全ての組み合わせに置いて、ヌトリン−３を添加する前には、明確な蛍光輝点が観察された。一方、ヌトリン−３を添加して３０分後に再度観察した結果、当該蛍光輝点は解消され、蛍光シグナルは分散されていた。【０３３４】
このように、図８に示す系でも、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用に依存して形成された蛍光輝点を検出することができ、当該系の有効性を示すことができた。
【産業上の利用可能性】
【０３３５】
以上説明したように、本発明によれば、タンパク質間相互作用をその固有な細胞内環境下において判定することができ、またタンパク質間相互作用の位置情報及び時間情報を取得することができる。また、本発明においては、タンパク質間相互作用の強弱と蛍光輝点の蛍光強度とが相関しているので、前記蛍光強度を指標として、タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定や、タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニングにもこの方法を利用できる。【０３３６】
したがって、本発明のタンパク質間相互作用の判定方法等、並びにこれらの方法に用いられるためのベクター又はキットは、生体内における様々なシグナル伝達や、様々な生体反応の制御等の解明、ひいては疾患メカニズムの解明を通した医薬品等の開発において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０３３７】
配列番号：１及び２
＜２２３＞  ｐ６２のＰＢ１ドメイン
配列番号：３及び４
＜２２３＞  ＴＦＧのＰＢ１ドメイン
配列番号：５及び６
＜２２３＞  ＰＫＣｉｏｔａのＰＢ１ドメイン
配列番号：７及び８
＜２２３＞  ＴＥＬのＳＡＭドメイン
配列番号：９及び１０
＜２２３＞  ＤＧＫｄｅｌｔａのＳＡＭドメイン
配列番号：１１及び１２
＜２２３＞  Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−１のＳＡＭドメイン
配列番号：１３及び１４
＜２２３＞  コドンをヒト化した単量体アザミグリーン１（ｍＡＧ１）
配列番号：１５及び１６
＜２２３＞  単量体ウミキノコ−グリーン（ｍＵｋＧ）
配列番号：１７及び１８
＜２２３＞  単量体クサビラオレンジ２（ｍＫＯ２）
配列番号：１９及び２０
＜２２３＞  単量体ミドリイシ−シアン１（ｍＭｉＣｙ）
配列番号：２１及び２２
＜２２３＞  クサビラ−シアン１（ＫＣｙ１）
配列番号：２３及び２４
＜２２３＞  二量体アザミグリーン（ＡＢ）（ｄＡＧ（ＡＢ））
配列番号：２５及び２６
＜２２３＞  ＴＧｕｖ
配列番号：２７及び２８
＜２２３＞  ＰＢ１ｈｍＡＧ１
配列番号：２９及び３０
＜２２３＞  ｈｍＡＧ１ＰＢ１
配列番号：３１及び３２
＜２２３＞  ＦＫＢＰ１２変異体
配列番号：３３及び３４
＜２２３＞  ｐ５３
配列番号：３５及び３６
＜２２３＞  ＭＤＭ２
配列番号：３７及び３８
＜２２３＞  ＰＢ１
配列番号：３９及び４０
＜２２３＞  フュージョンレッド
配列番号：４２及び４３
＜２２３＞  Ｔａｎｋｙｒａｓｅ−ｈｍＡＧ１
配列番号：４４及び４５
＜２２３＞  ＰＫＣｉｏｔａ−ｈｍＡＧ１
配列番号：４６及び４７
＜２２３＞  ＴＥＬ−ｈｍＡＧ１
配列番号：４８及び４９
＜２２３＞  ＤＧＫｄｅｌｔ−ｈｍＡＧ１
配列番号：５０及び５１
＜２２３＞  Ｍ１３ペプチド
配列番号：５２及び５３
＜２２３＞  カルモジュリン
【図１】
2015190529.tif 000003
【図２】
2015190529.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015190529.tif 000007
【図６】
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【図７】
2015190529.tif 000009
【図８】
2015190529.tif 000010
【図９】
2015190529.tif 000011
【図１０】
2015190529.tif 000012
【図１１】
2015190529.tif 000013
【図１２】
2015190529.tif 000014
【図１３】
2015190529.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2015190529.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
2015190529.tif 000019
【図１８】
2015190529.tif 000020
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2015190529.tif 000023
【図２２】
2015190529.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2015190529.tif 000037
【図３６】
2015190529.tif 000038
【図３７】
2015190529.tif 000039
【図３８】
2015190529.tif 000040
【図３９】
2015190529.tif 000041
【図４０】
2015190529.tif 000042
【図４１】
2015190529.tif 000043
【図４２】
2015190529.tif 000044
【図４３】
2015190529.tif 000045
【図４４】
2015190529.tif 000046
【図４５】
2015190529.tif 000047
【配列表】
2015190529000001.app
【国際調査報告】
2015190529.tif 000048
2015190529.tif 000049
2015190529.tif 000050
2015190529.tif 000051