(57)【要約】  がんおよびがん幹細胞特異的に提示される腫瘍抗原ペプチド、これを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等を提供することを目的とする。  アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ由来の部分ペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを有効成分として含有する医薬組成物、ＣＴＬを誘導することを特徴とする、がんの予防および／または治療剤等を提供することにより、上記課題が解決された。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ遺伝子を発現する細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導する方法であって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）前記ＢＯＲＩＳタンパク質の部分ペプチドであって、８〜２０アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のポリペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
in vitroで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法に用いるポリペプチドであって、配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドであり、８〜２０アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有する、前記ポリペプチド。
【請求項４】
８〜１１アミノ酸長である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１で表されるポリペプチドの部分ペプチドである、請求項３または４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７２で表される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドである、請求項３または４に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１０で表される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ１１抗原結合能を有する、前記ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号７２で表される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２抗原結合能を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７または配列番号５７で表される、前記ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４抗原結合能を有する、前記ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３または１０で表される、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項３〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチドにおいて１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換された、前記ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の方法に用いるポリヌクレオチドであって、請求項３〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項３〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも１つを有効成分として含む、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む、がん幹細胞処置用組成物。
【請求項１９】
請求項１６に記載のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む、がんの予防および／または治療用組成物。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の方法で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を有効成分として含む、がんの予防および／または治療用組成物。
【請求項２１】
がんが、女性特有の臓器におけるがんまたは肺がんである、請求項１９または２０に記載のがんの予防および／または治療用組成物。
【請求項２２】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１５に記載のポリヌクレオチド、または請求項２２に記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
【請求項２４】
請求項３〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドとＨＬＡとを含有するＨＬＡ−テトラマー。
【請求項２５】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）請求項３〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）記載のポリペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項２６】
配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の抗体を含む、ＢＯＲＩＳタンパク質検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防および／または治療剤として有用な、ＢＯＲＩＳ由来の腫瘍抗原ペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに開発された抗がん剤の治療効果は十分ではなく、抗がん剤による治療のみではがんを根治できる確率は極めて低い。その原因として、がん組織の根幹をなす細胞を、従来の治療剤が選択的にターゲッティングできていないことが挙げられる。近年になって、かかる「がん組織の根幹をなす細胞」として、がん幹細胞の存在が報告されている。がん幹細胞は、がん細胞の中にわずかな割合で存在する、高い腫瘍形成能、自己複製能および分化能を有する細胞であり、がんの発生、再発および転移に関わる原因細胞と考えられている。したがってがん幹細胞をターゲッティングすることができれば、がんの増殖、再発および転移を効果的に抑制できる可能性が高いと期待される。すなわち、がん幹細胞の検出技術とがん幹細胞を標的とする新規治療剤の開発は、がん医療にとって重要な課題となっている。【０００３】
一方、生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬと称する）が重要な働きをしている。腫瘍細胞の排除の場合、ＣＴＬは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド（腫瘍抗原ペプチド）とＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex）クラスＩ抗原（ヒトの場合はＨＬＡクラスＩ抗原と称する）との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質（腫瘍抗原タンパク質）が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡクラスＩ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。このようにして抗原提示された抗原ペプチドを含む複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生によって腫瘍細胞を攻撃することで抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆるがん免疫療法剤（がんワクチン）として利用することにより、がん患者の体内のがん特異的ＣＴＬを増強させる治療法が開発されつつある。【０００４】
ＢＯＲＩＳ（Brother of the Regulator of Imprinted Sites）遺伝子は、ＣＴＣＦ遺伝子のパラログであり、Ｎ末端ペプチド領域とＣ末端ペプチド領域の２つのペプチドをコードする領域の間に１１個のジンクフィンガー領域を有している。ＢＯＲＩＳは、様々な遺伝子発現のリプレッサーおよびアクチベーターのような一般的な転写因子として機能することが知られているほか、種々の腫瘍細胞、特にがん幹細胞において発現していることも知られている。また、ＢＯＲＩＳのジンクフィンガー領域は、ＣＴＣＦ遺伝子と高い相同性を有していること、ＢＯＲＩＳには、６群のサブファミリーに分類される２３個のアイソフォームが存在し、これらは全て転写後に生じるスプライシングバリアントであることが報告されている（非特許文献１）。またＢＯＲＩＳは、精巣以外の正常組織で発現しないことから、がん診断および治療の標的候補として注目されており、ＢＯＲＩＳの各サブファミリーに対する特異抗体やＢＯＲＩＳ遺伝子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡなどが報告されている（特許文献１、２など）。さらにＢＯＲＩＳタンパク質の配列を解析し、そこからＨＬＡ−Ａ０２０１に拘束される配列を予測し、その中の１つが実際に抗原提示された細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができたことも報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２８０６６号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／０１６９６１３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Pugacheva et al., PLoS ONE 5(11): e13872
【非特許文献２】Romagnoli et al., Rapporti ISTISAN. 2006;06(50), 36-40
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＢＯＲＩＳ由来の腫瘍抗原ペプチド、特にＢＯＲＩＳのアイソフォームまたはサブファミリー特異的な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等、とくにがん幹細胞を特異的に処置する医薬組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、がんワクチン治療に用いる腫瘍抗原としてのＢＯＲＩＳを研究する中で、ＢＯＲＩＳが子宮頚部癌や卵巣癌の中でも幹細胞様の性質を示す細胞において、特定のサブファミリーのＢＯＲＩＳが特異的に発現することを見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねたところ、特定のアイソフォームまたはサブファミリーのＢＯＲＩＳを発現する細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することにより、多くのがん細胞および／またはがん幹細胞を処置可能であることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち本発明は下記に掲げるものに関する：
［１］アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ遺伝子を発現する細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導する方法であって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）前記ＢＯＲＩＳタンパク質の部分ペプチドであって、８〜２０アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）記載のポリペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とを接触させることを含む、前記方法。
［２］in vitroで行われる、［１］の方法。
［３］［１］または［２］の方法に用いるポリペプチドであって、配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドであり、８〜２０アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有する、前記ポリペプチド。
［４］８〜１１アミノ酸長である、［３］のポリペプチド。
［５］配列番号１で表されるポリペプチドの部分ペプチドである、［３］または［４］のポリペプチド。
［６］配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７２で表される、［５］のポリペプチド。
［７］配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドである、［３］または［４］のポリペプチド。
［８］配列番号１０で表される、［５］のポリペプチド。
［９］［１］または［２］の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ１１抗原結合能を有する、前記ポリペプチド。
［１０］配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号７２で表される、［９］のポリペプチド。
［１１］［１］または［２］の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２抗原結合能を有し、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７または配列番号５７で表される、前記ポリペプチド。
［１２］［１］または［２］の方法に用いるポリペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４抗原結合能を有する、前記ポリペプチド。
［１３］配列番号３または１０で表される、［１２］のポリペプチド。
［１４］［３］〜［１３］のポリペプチドにおいて１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換された、前記ポリペプチド。
［１５］［１］または［２］の方法に用いるポリヌクレオチドであって、［３］〜［１４］のポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド。
［１６］［３］〜［１４］のポリペプチドの少なくとも１つを有効成分として含む、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導剤。
［１７］［１６］のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む医薬組成物。
［１８］［１６］のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む、がん幹細胞処置用組成物。
［１９］［１６］のＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む、がんの予防および／または治療用組成物。
［２０］［１］または［２］の方法で誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を有効成分として含む、がんの予防および／または治療用組成物。
［２１］がんが、女性特有の臓器におけるがんまたは肺がんである、［１９］または［２０］のがんの予防および／または治療用組成物。
［２２］［１５］のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［２３］［１５］のポリヌクレオチド、または［２２］の発現ベクターのいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
［２４］［３］〜［１４］のポリペプチドとＨＬＡとを含有するＨＬＡ−テトラマー。
［２５］以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）［３］〜［１４］のポリペプチド
（ｂ）上記（ａ）記載のポリペプチドの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。
［２６］配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体。
［２７］［２６］の抗体を含む、ＢＯＲＩＳタンパク質検出用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、特定のアイソフォームまたはサブファミリーのＢＯＲＩＳを認識するＣＴＬを誘導する方法、該方法に用いるＣＴＬの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および／または治療に有用な医薬組成物等が提供される。特にがんの中には、幹細胞様の性質を有する細胞（すなわちがん幹細胞）において特定のサブファミリーのＢＯＲＩＳを発現するものが存在するため、本発明の治療剤によりがん幹細胞選択的に処置することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、スフェロイド形成アッセイにより形成されたスフェロイドの写真である。
【図２】図２は、子宮頚部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＴＣＳ細胞株における幹細胞性遺伝子ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４の相対発現量を表すグラフである。
【図３】図３は、正常組織におけるＢＯＲＩＳの発現を表す図である。（ａ）はＲＴ−ＰＣＲの結果を表し、（ｂ）は相対発現量を表すグラフである。
【図４】図４は、種々の子宮頚部癌細胞株のバルク群細胞およびスフェア群細胞におけるＢＯＲＩＳの相対発現量を表すグラフである。
【図５】図５は、種々の癌細胞におけるＢＯＲＩＳの相対発現量を表すグラフである。
【図６】図６は、子宮頚部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＭＳ７５１細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図７】図７は、卵巣癌細胞株ＴＯＶ２１Ｇおよびｓｍｏｖ２細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図８−１】図８−１は、子宮頚部癌細胞株であるＴＣＳ細胞株において各ＢＯＲＩＳサブファミリーを大量発現させた場合のスフェア形成アッセイの結果を表す写真である。
【図８−２】図８−２は、子宮頚部癌細胞株であるＴＣＳ細胞株において各ＢＯＲＩＳサブファミリーを大量発現させた場合のスフェア形成アッセイの結果を表すグラフである。
【図９−１】図９−１は、子宮頚部癌細胞株であるＳＫＧ−ＩＩＩｂ細胞株において各ＢＯＲＩＳサブファミリーを大量発現させた場合のスフェア形成アッセイの結果を表す写真である。
【図９−２】図９−２は、子宮頚部癌細胞株であるＳＫＧ−ＩＩＩｂ細胞株において各ＢＯＲＩＳサブファミリーを大量発現させた場合のスフェア形成アッセイの結果を表すグラフである。
【図１０】図１０は、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的配列から抽出したＨＬＡ結合性ペプチド候補の、ＨＬＡ−Ａ０２結合アッセイの結果を表すグラフである。
【図１１】図１１は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテストの結果を表すグラフである。グラフはＨＬＡ−モノマーを表すピーク面積から推定したＨＬＡ−モノマー形成量を表している。
【図１２−１】図１２−１は、検体番号Ａ２４−３８から採取したサンプルを、ＲＭＭペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図１２−２】図１２−２は、検体番号Ａ２４−３８から採取したサンプルを、ＲＭＭペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン２、４、８および９にＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはこれらのレーンについて解析している。
【図１３】図１３は、ＲＭＭペプチド特異的なＣＴＬの機能をＲＭＭ−Ｔｅｔを用いて機能解析した結果を表す図である。ＲＭＭペプチドで刺激した場合にＲＭＭペプチド特異的にＩＦＮγが産生されていることがわかる。
【図１４−１】図１４−１は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞株におけるｍＲＮＡ発現（ａ）および細胞増殖（ｂ）を夫々比較したグラフを示す。
【図１４−２】図１４−２は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞の顕微鏡画像である。
【図１５】図１５は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞株の幹細胞性遺伝子発現を比較したグラフである。
【図１６−１】図１６−１は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞株（ａ）、ＭＳ７５１細胞株（ｂ）のスフェア形成能を比較したグラフである。
【図１６−２】図１６−２は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした各細胞株の顕微鏡画像である。
【図１７】図１７は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞株の放射線耐性を比較したグラフを示す。
【図１８】図１８は、ＢＯＲＩＳ発現が高いと生存率が著しく低くなることを示したカプランマイヤー生存曲線である。
【図１９−１】図１９−１は、小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ１、ＳＢＣ３，ＳＢＣ５およびＬｃ８１７細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図１９−２】図１９−２は、非小細胞肺癌細胞株Ｌｕ９９Ａおよび８６−２細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図１９−３】図１９−３は、肺扁平上皮癌細胞株ＬＫ２、ＥＢＣ１およびＳｑ１細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図１９−４】図１９−４は、肺腺癌細胞株Ａ５４９、ＬＨＫ２、ＬＨＫ２−ＳＯＸ２およびＰＣ３細胞株における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図１９−５】図１９−５は、肺腺癌初代培養細胞Ｐｒｉｍａｒｙ３、Ｐｒｉｍａｒｙ４、Ｐｒｉｍａｒｙ５およびＰｒｉｍａｒｙ７細胞における、バルク群細胞とスフェア群細胞との各ＢＯＲＩＳサブファミリーの発現量の比較を表す図である。
【図２０】図２０は、検体番号Ａ２−３４から採取したサンプルを、ＫＬＬペプチドと共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図２１】図２１は、検体番号Ａ２−３４から採取したサンプルを、ＫＬＬペプチドと共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン５および１１にＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはこれらのレーンについて解析している。
【図２２】図２２は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＬＬＦペプチドと共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図２３】図２３−１および２は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＬＬＦペプチドと共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン１、２、４、５、６、７、８、９、１０、および１１にＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはこれらのレーンについて解析している。
【図２４】図２４は、検体番号Ａ２−Ｓ１から採取したサンプルを、ＬＬＦペプチド提示細胞と共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図２５】図２５は、検体番号Ａ２−Ｓ１、Ａ２−Ｓ２、Ａ２−Ｓ３から採取したサンプルから、ＬＬＦペプチド提示細胞と共培養して誘導したＣＴＬのＩＦＮγの産生能をＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を表す図である。
【図２６】図２６は、検体番号Ａ２−Ｓ１から採取したサンプルから、ＬＬＦペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬを単クローン化及び増幅したのちに、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図２７】図２７は、検体番号Ａ２−Ｓ１から採取したサンプルから、ＬＬＦペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬを単クローン化及び増幅したのちに、ＩＦＮγの産生能をＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を表す図である。
【図２８】図２８は、検体番号Ａ２−Ｓ１から採取したサンプルから、ＬＬＦペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬを単クローン化及び増幅したのちに、細胞傷害性活性をＬＤＨ  ｋｉｌｌｉｎｇ  アッセイで解析した結果を表す図である。
【図２９】図２９は、検体番号Ａ２４−Ｓ４または検体番号Ａ２−Ｓ５から採取したサンプルを、ＲＭＭペプチド提示細胞と共培養したのち、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図３０】図３０は、検体番号Ａ２４−Ｓ４または検体番号Ａ２−Ｓ５から採取したサンプルから、ＲＭＭペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬのＩＦＮγの産生能をＥＬＩＳＰＯＴで解析した結果を表す図である。
【図３１】図３１は、検体番号Ａ２４−Ｓ４から採取したサンプルから、ＲＭＭペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬを単クローン化及び増幅したのちに、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図３２】図３２は、検体番号Ａ２−Ｓ５から採取したサンプルから、ＲＭＭペプチド提示細胞と共培養した際に誘導したＣＴＬを単クローン化及び増幅したのちに、ＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した結果を表す図である。
【図３３】図３３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテストの結果を表すグラフである。グラフはＨＬＡ−モノマーを表すピーク面積から推定したＨＬＡ−モノマー形成量を表している。
【図３４】図３４は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図３５】図３５は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン１０でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン１０について解析している。
【図３６】図３６は、検体番号Ａ２−２７から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図３７】図３７は、検体番号Ａ２−２７から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン３でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン３について解析している。
【図３８】図３８は、検体番号Ａ２−３４から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図３９】図３９は、検体番号Ａ２−３４から採取したサンプルを、ＶＬＥペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン４でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン４について解析している。
【図４０】図４０は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＫＬＡペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図４１】図４１は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＫＬＡペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン２、５、１１でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン２，５、１１について解析している。
【図４２】図４２は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＶＬＴペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図４３】図４３は、検体番号Ａ２−２９から採取したサンプルを、ＶＬＴペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン７および９にＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン７および９について解析している。
【図４４】図４４は、ＫＬＡペプチド特異的なＣＴＬの機能をＫＬＡ−Ｔｅｔを用いて機能解析した結果を表す図である。ＫＬＡペプチドで刺激した場合にＫＬＡペプチド特異的にＣＤ１０７ａが検出されていることがわかる。
【図４５】図４５は、ＶＬＴペプチド特異的なＣＴＬの機能をＶＬＴ−Ｔｅｔを用いて機能解析した結果を表す図である。ＶＬＴペプチドで刺激した場合にＶＬＴペプチド特異的にＣＤ１０７ａが誘導されていることがわかる。
【図４６】図４６は、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテストの結果を表すグラフである。グラフはＨＬＡモノマーを表すピーク面積を表している。
【図４７】図４７は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルを、ＳＶＬペプチド、ＮＴＨペプチド、ＫＱＬペプチド、ＧＬＩペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図４８】図４８は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルを、ＳＶＬペプチド、ＮＴＨペプチド、ＫＱＬペプチド、ＧＬＩペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン１でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン１について解析している。
【図４９】図４９は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルを、ＳＶＬペプチド、ＮＴＨペプチド、ＫＱＬペプチド、ＧＬＩペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第三段階解析の結果を表す図である。第二段階解析においてレーン１、ウェルＢでＣＴＬが検出されたため、第三段階解析においてはレーン１、ウェルＢについて解析している。
【図５０】図５０は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルを、ＳＬＡペプチド、ＣＳＹペプチド、ＴＶＹペプチド、ＴＶＬペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図５１】図５１は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルをＳＬＡペプチド、ＣＳＹペプチド、ＴＶＹペプチド、ＴＶＬペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン１２でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においてはレーン１２について解析している。
【図５２】図５２は、検体番号＊１１−１３から採取したサンプルをＳＬＡペプチド、ＣＳＹペプチド、ＴＶＹペプチド、ＴＶＬペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第三段階解析の結果を表す図である。第二段階解析においてレーン１２、ウェルＥでＣＴＬが検出されたため、第三段階解析においてはレーン１２、ウェルＥについて解析している。
【図５３】図５３は、検体番号＊１１−１６から採取したサンプルを、ＲＭＳペプチド、ＧＴＭペプチド、ＡＡＡペプチド、ＫＬＬＦペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第一段階解析の結果を表す図である。
【図５４】図５４は、検体番号＊１１−１６から採取したサンプルをＲＭＳペプチド、ＧＴＭペプチド、ＡＡＡペプチド、ＫＬＬＦペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第二段階解析の結果を表す図である。第一段階解析においてレーン７とレーン１１でＣＴＬが検出されたため、第二段階解析においては、レーン７と１１について解析している。
【図５５】図５５は、検体番号＊１１−１６から採取したサンプルをＲＭＳペプチド、ＧＴＭペプチド、ＡＡＡペプチド、ＫＬＬＦペプチドと共培養した際のＨＬＡ−テトラマー試薬との反応をフローサイトメーターで解析した第三段階解析の結果を表す図である。第二段階解析においてレーン７のウェルＥ、レーン１１のウェルＨでＣＴＬが検出されたため、第三段階解析においてはレーン７のウェルＥ、レーン１１のウェルＨについて解析している。
【図５６】図５６は、Ｍｙｃ  Ｔａｇを付けたＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６をそれぞれ一過性に強制発現させた２９３Ｔ細胞抽出液を用いたウェスタンブロッティングの結果を表す。どちらの特異抗体を用いた場合も、Ｍｙｃ  Ｔａｇ抗体を用いた場合と同じ位置にバンドが確認できたことから、これらの抗体の特異性が示された。
【図５７】図５７は、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５の特異抗体を用いて、肺癌組織切片を免疫染色した結果を表す。同じ肺癌組織であっても、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５の発現が陽性であるものと陰性であるものが確認された。（ａ）は陰性の、（ｂ）は陽性の染色像を表す。（ｂ）では茶色に染色された細胞が散見されるのに対し、（ａ）ではほとんど見られない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
（１）本発明のポリペプチド
本発明において「エピトープペプチド」とは、ＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）と結合して、細胞表面に抗原提示されるポリペプチドを意味する。エピトープペプチドには、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、およびＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のポリペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するポリペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるポリペプチドが好ましい。
【００１３】
一方、樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込まれた抗原タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示細胞の表面に抗原提示されることにより、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識され、最終的に細胞性免疫や液性免疫を活性化するヘルパーＴ細胞を誘導することができる。ヘルパーＴ細胞はＣＴＬのように細胞傷害活性を有するだけでなく、ＣＴＬの活性維持・生存維持でも重要な役割を担っているため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩＩと結合し、抗原提示されるポリペプチドもまた好ましい。ＭＨＣクラスＩと結合するポリペプチドはおよそ８〜１１アミノ酸長であり、ＭＨＣクラスＩＩと結合するポリペプチドはおよそ１２〜２０アミノ酸長であることが知られている。
本発明において、「腫瘍（tumor）」は、良性腫瘍および悪性腫瘍（がん、悪性新生物）を含む。がん（cancer）は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍(癌、carcinoma）と非上皮性の悪性腫瘍(肉腫、sarcoma）とを含む。
【００１４】
本発明において、単に「ＢＯＲＩＳ」といった場合、Brother of the Regulator of Imprinted Sites遺伝子またはその発現産物であるｍＲＮＡもしくはタンパク質のいずれかを意味する。ＢＯＲＩＳ遺伝子の発現制御には３種のプロモーター（上流のプロモーターから順にプロモーターＡ、プロモーターＢおよびプロモーターＣと称する）が関与していることが知られており、いずれのプロモーターにより転写が制御されているかによって３つのアイソフォーム（各プロモーターに対応して、それぞれアイソフォームＡ、アイソフォームＢおよびアイソフォームＣと称する）に大別される。さらにそれぞれのアイソフォームは転写時のスプライシングの受け方により複数のスプライシングバリアントにさらに分別される。これによりＢＯＲＩＳは、アイソフォームＡが６つ（Ａ１〜Ａ６）、アイソフォームＢが８つ（Ｂ０〜Ｂ７）、アイソフォームＣが９つ（Ｃ１〜Ｃ９）の計２３個のアイソフォームを有することが知られている。例えばＢＯＲＩＳ  Ｃ１アイソフォームは、配列番号７６で表される配列を有している。
【００１５】
上述のとおりＢＯＲＩＳは、１１−ジンクフィンガープロテインとも呼ばれるＣＴＣＦのパラログであり、ＢＯＲＩＳタンパク質は、１１個のジンクフィンガー領域のＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれにＮ末端ペプチド領域およびＣ末端ペプチド領域を有する構造をしている。Ｎ末端ペプチド領域は、アイソフォームによって２４アミノ酸長、５３アミノ酸長および２５８アミノ酸長のものが存在するが、同一の長さのものは、配列が高度に保存されている。Ｃ末端ペプチド領域は、様々な長さのものが存在し、その配列もそれぞれ異なっている。ＢＯＲＩＳは、かかるＣ末端ペプチド領域の配列により６つのサブファミリー（サブファミリー１〜６、本明細書において単にｓｆ１〜６と略される場合もある）に分類される。したがって各サブファミリーのＣ末端配列は、それぞれのサブファミリーに固有の配列となっており、同一サブファミリーに属するアイソフォーム間では高度に保存されている。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、特定のアイソフォームまたはサブファミリーのＢＯＲＩＳ、具体的にはアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを発現する細胞の細胞表面に抗原提示されるものである。したがって本発明のポリペプチドは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳの部分ペプチドであって、８〜２０アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有するポリペプチドである。がん幹細胞を含むがん細胞には、これらのＢＯＲＩＳを発現するものが多く存在し、そのため本発明のポリペプチドは、がんの免疫療法において有用である。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、一態様において、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６に固有の配列である配列番号１またはＢＯＲＩＳ  ｓｆ５に固有の配列である配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドであって、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するペプチド、好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されてＣＴＬを誘導可能なペプチドを含むポリペプチドである。ＨＬＡにはいくつかの型が存在するが、本発明のポリペプチドは、好ましくはＨＬＡクラスＩに結合可能であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ０２に結合可能であり、さらに好ましくはＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４のうちの２つ以上のＨＬＡに結合可能である。別の一態様において、ＨＬＡクラスＩＩに結合可能なポリペプチドもまた好ましい。
【００１８】
例えばＭＨＣがＨＬＡクラスＩである場合、ＨＬＡクラスＩ分子を介して提示されるほとんどの抗原は、細胞質内のプロテアソームにより分解された後、ＴＡＰ（transporter in antigen processing）へと移送され、粗面小胞体内においてＴＡＰに会合しているＨＬＡクラスＩ分子とβ２−ミクログロブリンの複合体と結合し、ゴルジ装置を経てエクソサイトーシスにより細胞表面へと運搬されることが知られている。したがって、本発明のポリペプチドは、ＭＨＣに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。例えば、前記一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンであるＨＳＰ７０やＨＳＰ９０、またはｇｐ９６と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効率的に抗原提示させる事が可能であるため、本発明のポリペプチドはその一態様において、抗原提示経路にて作用するシャペロンと融合している。
【００１９】
また本発明のエピトープペプチドは、生体内への導入を容易にし得る各種修飾を施されたものであってもよい。生体内への導入を容易にし得る各種修飾の例としては、ＨＩＶのＰＴ（Protein Transduction）ドメインが挙げられる。ＨＩＶのＰＴドメインは、Ｔａｔタンパク質の４９〜５７番目のアミノ酸で構成されたペプチドである。このような修飾を目的とするタンパク質またはペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加することで、目的のタンパク質またはペプチドを容易に細胞内に導入できる。
上述のとおり、本発明のポリペプチドはＭＨＣに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよいため、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のポリペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約８〜約２０アミノ酸程度が好ましく、約８〜約１１アミノ酸程度がより好ましく、約８〜約１０アミノ酸程度がさらに好ましい。
【００２０】
好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号１で表されるポリペプチドの部分ペプチドであって、８〜１１アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有するポリペプチドである。
別の好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドであって、８〜１１アミノ酸長であり、ＨＬＡ結合能を有するポリペプチドである。
【００２１】
ポリペプチドが「ＨＬＡ結合能を有する」か否かは、当該技術分野において知られた方法を用いて簡単に調べることができる。かかる方法としては、これに限定するものではないが、例えばＷＯ２０１０／５０１９０号公報に記載のように、ＨＬＡに対するモノクローナル抗体を用いて、細胞表面に発現したＨＬＡの量（すなわちポリペプチドと結合したＨＬＡの量）を蛍光強度として観察するＨＬＡ結合アッセイ、Kim et al., Methods Mol Biol. 2013;960:447-59などに記載のBIAcore surface plasmon resonance（ＳＰＲ）を用いた結合アッセイ、Shin et al., PNAS, Nov 2007; 104: 19073-19078などに記載の、固相に固定したHLAとポリペプチドが結合した時にのみ特異的に結合するHLA抗体を用いて観察するiTopia（iTopia Epitope Discovery System Assay、Beckman coulter社）を利用する方法などが挙げられる。
【００２２】
上記配列番号１および配列番号２で表されるポリペプチドの部分ペプチドを検討した結果、エピトープペプチド候補として配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号７２で表されるポリペプチド、ならびに配列番号１０で表されるポリペプチドが同定された。したがってより好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７２で表されるポリペプチドである。また、別のより好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号１０で表されるポリペプチドである。
【００２３】
別の一態様において、本発明のポリペプチドは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳの部分ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ１１抗原に対する結合能を有するポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ１１抗原はＨＬＡタイプＩに属するＨＬＡであるため、本態様のポリペプチドは、好ましくは約８〜約１１アミノ酸長を有する。
【００２４】
上記ＨＬＡ−Ａ１１抗原に対する結合能を有するＢＯＲＩＳの部分ペプチドを検討した結果、エピトープペプチド候補として配列番号６０〜７３で表されるポリペプチドが同定された。これらのポリペプチドについてさらに検討を重ねた結果、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７および配列番号７２において、高いＣＴＬ誘導能が確認された。したがってより好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号７２で表されるポリペプチドである。このうち配列番号７２で表されるポリペプチドは、上述のとおりＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の固有配列（配列番号１）の部分ポリペプチドであるため、さらに好ましい。別のさらに好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号６５、配列番号６６または配列番号６７で表されるポリペプチドであり、これらは配列番号７６で表されるポリペプチドの部分ペプチド、とくにジンクフィンガー領域に存在するペプチドでもある。従来ＢＯＲＩＳのジンクフィンガー領域は、体細胞にユビキタスに発現することが知られているＣＴＣＦと高い相同性を有するため、ＢＯＲＩＳ特異的な腫瘍抗原ペプチドを得るのは困難であると考えられてきた。したがって今回本発明者らの研究により、ジンクフィンガー領域由来のＢＯＲＩＳ特異的腫瘍抗原ペプチドが得られたことは驚くべきことである。
【００２５】
別の一態様において、本発明のポリペプチドは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳの部分ペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合能を有するポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ２抗原およびＨＬＡ−Ａ２４抗原はＨＬＡタイプＩに属するＨＬＡであるため、本態様のポリペプチドは、好ましくは約８〜約１１アミノ酸長を有する。
【００２６】
上記ＨＬＡ−Ａ２抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合能を有するＢＯＲＩＳの部分ペプチドを検討した結果、エピトープペプチド候補として配列番号３〜１６および４７〜５７で表されるポリペプチドが同定された。これらのポリペプチドについてさらに検討を重ねた結果、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５７において、好適なＨＬＡ結合能を示すことが確認された。したがってより好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５７で表されるポリペプチドである。このうち配列番号３、配列番号４および配列番号５で表されるポリペプチドは、上述のとおりＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の固有配列（配列番号１）の部分ポリペプチドであるため、さらに好ましい。また配列番号１０で表されるポリペプチドは、上述のとおりＢＯＲＩＳ  ｓｆ５の固有配列（配列番号２）の部分ポリペプチドであり、かつＨＬＡ−Ａ２抗原およびＨＬＡ−Ａ２４抗原の両方と結合能を有するため、さらに好ましい。別のさらに好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５７で表されるポリペプチドであり、これらは配列番号７６で表されるポリペプチドの部分ペプチドでもある。また、このうち配列番号４７および配列番号５７で表されるポリペプチドがより好ましい。
【００２７】
中でも特に好ましいのは、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７、配列番号４８および配列番号５７で表されるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、本発明者らの研究により、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導できることが確認されている。
【００２８】
本態様のポリペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２抗原に対する結合能を有するポリペプチドとしては、これに限定するものではないが、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７および配列番号５７で表されるポリペプチドなどが挙げられる。
本態様のポリペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合能を有するポリペプチドとしては、これに限定するものではないが、配列番号３または配列番号１０で表されるポリペプチドなどが挙げられる。
【００２９】
別の一態様において、本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドにおいて１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換されたポリペプチドである。当然ながら、本態様のポリペプチドは、１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換されてなおＨＬＡ結合能を有するポリペプチドである。
ＨＬＡ抗原、とくにＨＬＡクラスＩ抗原に結合性を有するペプチドは、特定の位置に特定のアミノ酸を有していることが知られており、これはアンカーモチーフと呼ばれ、あるアンカーモチーフを別のアンカーモチーフに置き換えてもＨＬＡ結合能を失わないと考えられる。したがって本発明のペプチドにおける付加、欠失、置換としては、アンカーモチーフを別のアンカーモチーフに置き換える付加、欠失、置換が好ましい。例えばＨＬＡ−Ａ１１抗原結合性を有するポリペプチドにおいては、Ｎ末端より２番目の位置にＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌのいずれかが配置され、９番目あるいは１０番目の位置にＬｙｓまたはＡｒｇのいずれかが配置されることが多いことが知られており、上記好ましい付加、欠失、置換としては例えばＮ末端より２番目の位置に存在するＩｌｅをＭｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換するものが挙げられる。
【００３０】
すなわち、本発明の好ましい付加、欠失、置換の例としては、
（ａ）ＨＬＡ−Ａ１１抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より２番目の位置のペプチドをＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌとするもの；
（ｂ）ＨＬＡ−Ａ１１抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より９番目あるいは１０番目のペプチドをＬｙｓまたはＡｒｇとするもの；
（ｃ）ＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より２番目の位置のペプチドをＴｒｐ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＴｙｒとするもの；
（ｄ）ＨＬＡ−Ａ２４抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より９番目あるいは１０番目のペプチドをＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＴｒｐとするもの；
（ｅ）ＨＬＡ−Ａ２抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より２番目の位置のペプチドをＩｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＴｈｒとするもの；および／または
（ｆ）ＨＬＡ−Ａ２抗原結合性ペプチドにおいて、Ｎ末端より９番目あるいは１０番目のペプチドをＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＭｅｔとするもの
などが挙げられる。
【００３１】
本発明のポリペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。かかる既知の方法としては文献（Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966； The Proteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する）などに記載されている方法が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、後述するＣＴＬ誘導方法や、ヒトモデル動物を用いたアッセイ（ＷＯ０２／４７４７４号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）等に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
【００３２】
がん幹細胞を含むがん細胞の多くは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを発現しているため、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のとおり、これらの細胞を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するために用いることができる。したがって本発明のポリペプチドは、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。特に、本発明者らにより、ＢＯＲＩＳサブファミリーのうちｓｆ５および／またはｓｆ６ががん幹細胞において特異的に発現していることが見出されたことから、かかるサブファミリー固有のアミノ酸配列由来の本発明のポリペプチドは、がん幹細胞を処置するための医薬組成物に特に好適に用いることができる。また、本発明のポリペプチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のポリペプチドの使用にも関する。
【００３３】
（２）本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のポリペプチドを少なくとも１つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または合成ＤＮＡのいずれであっても良い。また１本鎖、２本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５７、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７または配列番号７２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、一態様において、遺伝子組換え技術を用いて本発明のポリペプチドを宿主内で産生させるために用いられる。この場合、宿主間でアミノ酸コドンの使用頻度が異なる為、産生させる宿主の使用頻度に適合するようアミノ酸のコドンを変更してもよい。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のポリペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明のポリヌクレオチドの範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および／または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および／または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および／または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
【００３５】
本発明で用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて様々なものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。本発明で用い得る発現ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター（ＨＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ）等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＧＡＴＡ等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＹＡＣ４などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ、ｐＩＥｘ、ｐＢＡＣなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられる。
【００３６】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパク質ベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００３７】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、本発明のポリペプチドが有する機能を損なわない限りいかなる細胞を用いてもよく、例えば大腸菌、弱毒化サルモネラ菌などの細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E. coli  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株などが挙げられる。また酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９、Ｈｉ５、Ｓ２などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法（リポフェクション法）などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００３８】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。また、宿主細胞として弱毒化サルモネラ菌などの細菌を用いる場合、当該細菌を遺伝子送達担体として用いる、すなわち宿主細胞である細菌を直接対象の体内に送達するように用いてもよい。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
（３）本発明のポリペプチドを有効成分とする、ＣＴＬ誘導剤
本発明のポリペプチドは上述のとおり、がん細胞に対するＣＴＬを誘導する方法において用いることができるものであるため、腫瘍抗原ペプチドとしてＣＴＬ誘導剤となり得る。
すなわち、ヒト血液試料から末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のポリペプチドを添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ抗原陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる（J.Immunol.,154,p2257,1995）。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮγ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定することにより、確認することができる。また５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（５１Ｃｒリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、ＣＴＬクローンを樹立することもできる。
【００４０】
本発明のポリペプチドによって誘導されたＣＴＬは、本発明のポリペプチドを抗原として提示する細胞に対する傷害作用やリンフォカインの産生能を有する。本発明のポリペプチドは上述のとおり腫瘍抗原ペプチドであるため、それら機能を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。従って本発明のポリペプチドおよびそれにより誘導されたＣＴＬは、がんの予防および／または治療のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明のポリペプチドを有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に本発明のポリペプチドが提示され、ＨＬＡ抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的ＣＴＬが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および／または治療することができる。したがって、本発明のポリペプチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原、ＨＬＡ−Ａ１１抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象に対して使用することができる。中でもより好ましくは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを発現するがんに罹患している対象、さらに好ましくはＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんとしては、例えば子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防および／または治療のために使用することができる。特に、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌などの女性特有の臓器におけるがん、および肺がんの予防および／または治療のために好ましく使用することができる。
【００４１】
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「治療」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
【００４２】
本発明のポリペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性、好ましくはＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６陽性のがんに罹患している、ＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のがん患者に対して特に有効である。具体的には、例えば、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫等のがん（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。特に、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌などの女性特有の臓器におけるがんの予防および／または治療のために好ましく使用することができる。
本発明のポリペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
【００４３】
本発明のポリペプチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、または併用して投与することができる。
【００４４】
アジュバントとしては、当該技術分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、例えば、ゲルタイプとして水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなど、菌体タイプとしてＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A；ＭＰＬ）、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチド（Muramyl dipeptide；ＭＤＰ）など、油乳濁液タイプ（エマルション製剤）としてフロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９およびＳＡＦなど、高分子ナノ粒子タイプとして免疫刺激複合体（Immunostimulatory complex；ISCOMs）、リポソーム、生分解性マイクロスフェア（Biodegradable microsphere）およびサポニン由来のＱＳ−２１など、合成タイプとして非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ(Muramyl peptide analogue）、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなど、サイトカインタイプとして、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などを挙げることができる。
【００４５】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本発明のポリペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上述べたとおり、本発明のポリペプチドを有効成分として含有するＣＴＬ誘導剤を用いることにより、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを有効に処置することが可能である。したがって、本発明は一態様において、当該ＣＴＬ誘導剤を有効成分として含む医薬組成物、好ましくはがん幹細胞処置用組成物、あるいはがんの予防および／または治療用組成物を含む。
【００４６】
（４）本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬ誘導剤
本発明のポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のポリペプチドを抗原として提示する細胞となるため、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドもまたＣＴＬの誘導剤となり得る。誘導されたＣＴＬは、本発明のポリペプチドによって誘導されたＣＴＬと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。従って本発明のポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドを有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および／または予防し得るものである。
【００４７】
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを以下の方法によりがん患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ−Ａ０２抗原、ＨＬＡ−Ａ１１抗原またはＨＬＡ−Ａ２４抗原などと結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、がん特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。以上のようにして、がんの治療または予防が達成される。
本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするＣＴＬの誘導剤は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ０２抗原、ＨＬＡ−Ａ１１抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性の対象に対して使用することができる。中でもより好ましくは、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを発現するがんに罹患している対象、さらに好ましくはＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６陽性のがんに罹患した対象に対して使用することができる。アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんとしては、例えば子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫等のがん（腫瘍）などが挙げられ、本発明のＣＴＬ誘導剤は、これらのがんの予防または治療のために使用することができる。特に、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌などの女性特有の臓器におけるがん、および肺がんの予防および／または治療のために好ましく使用することができる。
【００４８】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、発現プラスミドを、弱毒化したサルモネラ菌などの細菌に導入し、該細菌を投与して本発明のポリペプチドを発現させる細菌ベクター法も用いることができる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドを投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００５０】
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、例えば、ポリヌクレオチドの含量として、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与することができる。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
【００５１】
（５）本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とを接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。抗原提示細胞の作製は、in vitroで行われてもin vivoで行われてもよいが、好ましくはin vitroで行われる。具体的には本発明は、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを、好ましくはin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面に、例えばＨＬＡ−Ａ０２抗原やＨＬＡ−Ａ１１抗原、ＨＬＡ−Ａ２４抗原などと本発明のポリペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
本発明の抗原提示細胞には、例えば（１）適当な培養液中で、抗原提示細胞とＣＴＬエピトープペプチドを３０分から１時間混合したエピトープペプチドパルス抗原提示細胞、（２）ＣＴＬエピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にＣＴＬエピトープペプチドを提示させた細胞、（３）人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞などが包含される。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のポリペプチドを提示することの可能なＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ−Ａ０２抗原、ＨＬＡ−Ａ１１抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞は、例えば脂質２重膜やプラスティックあるいはラテックス等のビーズにＨＬＡとＣＴＬエピトープペプチドとβ２−ミクログロブリンとの３者複合体を固定し、ＣＴＬを刺激し得るＣＤ８０、ＣＤ８３やＣＤ８６等の共刺激分子を固定するか、もしくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を固定することで作製可能である。
【００５２】
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のポリペプチドをin vitroでパルスして、ＨＬＡ−Ａ０２抗原、ＨＬＡ−Ａ１１抗原および／またはＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のポリペプチドとの複合体を提示させることにより得られる。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であっても、ＲＮＡの形態であっても良い。ポリヌクレオチドを導入して抗原提示細胞を作成する方法は当該技術分野において知られており、当業者は適宜選択することができる。
【００５３】
前記抗原提示細胞はＣＴＬの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんに罹患している患者の体内で、本発明のポリペプチドを抗原提示するがん細胞に特異的なＣＴＬが効率良く誘導され、結果として本発明のポリペプチドを抗原提示するアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを治療することができる。
【００５４】
（６）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、以下のように利用することができる。すなわち本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とを接触させることにより、ＣＴＬ、特にアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ遺伝子を発現する細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる。すなわち本発明は、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを接触させることにより誘導されたＣＴＬ、およびその誘導方法を提供するものである。かかる方法は、in vitroで行われてもin vivoで行われてもよいが、好ましくはin vitroで行われる。
本発明のＣＴＬを誘導する方法としては、具体的には例えば次の方法が挙げられる。まずＰＢＭＣあるいはＴ細胞を本発明のポリペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、または人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導されたＣＴＬを５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７〜１０日培養する。ＣＴＬエピトープペプチドとＩＬ−２、または抗原提示細胞とＩＬ−２による刺激を週に１度繰り返す事で必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【００５５】
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞を、in vitroで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２により刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている。これは、抗原提示細胞のＭＨＣと腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００５６】
当該ＣＴＬはがんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなＣＴＬを有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんに罹患した患者の体内でＣＴＬによるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
【００５７】
（７）本発明のＨＬＡ−マルチマー
ＨＬＡ−テトラマーとは、ＨＬＡとβ２ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（ＨＬＡ−モノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指し（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))、例えば米国特許第５，６３５，３６３号、フランス特許出願公開第ＦＲ９９１１１３３号、米国特許第５，７２３，５８４号、米国特許第５，８７４，２３９号、米国特許第５，９３２，４３３号、米国特許第６，２６５，５５２号、特許登録第４９７６２９４号などに記載されている。現在では種々の抗原ペプチドを含有するＨＬＡ−テトラマーが作製されており、本発明のポリペプチドとＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡ−テトラマーを容易に作製することができる。また、ＨＬＡ−ダイマーおよびＨＬＡ−ペンタマーも同様な原理に基づいており、これらにおいては、それぞれ、前記ＨＬＡモノマーが２量体化および５量体化されている。したがって、本発明のポリペプチド、すなわちアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳのＨＬＡ結合能、とくにＨＬＡクラスＩ結合能を有する部分ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡモノマーおよびＨＬＡマルチマー、特にＨＬＡ−テトラマーもまた、本発明の一態様である。
【００５８】
具体的には、例えば本発明のポリペプチドとＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ａ２４とを含有するＨＬＡ−テトラマーが挙げられる。当該ＨＬＡ−テトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の既知の検出手段により結合したＣＴＬを容易に選別または検出することができるように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）などにより標識されたＨＬＡ−テトラマーが挙げられる。
【００５９】
ＨＬＡ−テトラマーの製法例としては、例えば、米国特許番号５，６３５，３６３号、フランス国特許出願番号ＦＲ９９１１１３３号、Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)などの文献に記載のものが挙げられ、当業者であれば適切な方法を選択することができる。作製例としては、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１１あるいはＨＬＡ−Ａ０２の発現ベクターおよびβ２ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばＢＬ２１）を用いることが好ましい。得られた単量体ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１１あるいはＨＬＡ−Ａ０２複合体と本発明のポリペプチドとを混合し、可溶性のＨＬＡ−ペプチド複合体を形成させる。次にＨＬＡ−ペプチド複合体におけるＨＬＡ−Ａ０２、ＨＬＡ−Ａ１１あるいはＨＬＡ−Ａ２４のＣ末端部位の配列をＢｉｒＡ酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたＨＬＡ−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを４：１のモル比で混合することにより、ＨＬＡ−テトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
【００６０】
本発明のＨＬＡ−テトラマー（またはモノマー）を用いることにより、本発明の腫瘍特異的ＣＴＬを検出、精製することが可能となる。ＣＴＬを生成する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
（ｉ）ＰＢＭＣと、適当な濃度の本発明のＨＬＡ−テトラマーを反応させる。本発明のＨＬＡ−テトラマーと結合したＣＴＬは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡などを用いて染色されたＣＴＬのみを単離する。このようにして単離されたＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、必要な細胞数を確保する。
（ｉｉ）本発明のＨＬＡ−モノマーおよび／またはテトラマーを無菌プレートなどに固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。プレートに固相化された本発明のＨＬＡ−モノマーおよび／またはテトラマーに結合したＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残った特異的ＣＴＬだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、必要な細胞数を確保する。
（ｉｉｉ）本発明のＨＬＡ−モノマーおよび／またはテトラマーと、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の共刺激分子か、もしくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレートなどに固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。２日後にＩＬ−２を培地に添加し５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７〜１０日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返す事で必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
【００６１】
また細胞表面タンパク質に対する抗体（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７やＣＤ４５ＲＡ等）と組み合わせて用いる事で、ＣＴＬの分化段階を調べる事ができる（Seder RA, Ahmed R., Nat Immunol., 2003;4:835-842）。あるいは細胞内サイトカイン染色法と組み合わせることで、ＣＴＬの機能性評価に用いる事も可能であるである。したがってＣＴＬエピトープペプチドを同定し、ＨＬＡ−テトラマーを作製すれば、当該エピトープペプチドに対して誘導されるＣＴＬの定量と定性が可能になり、該エピトープペプチドが由来するタンパク質が関連する疾患に対する診断情報を得る上で多大な貢献が可能になる。
【００６２】
（８）腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）
本発明は、前述した本発明のＨＬＡ−テトラマーを利用した腫瘍の検出方法（検査方法、診断方法）もまた提供する。
本発明のＨＬＡ−テトラマーを用いる本発明の検出方法（診断方法）は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、本発明のＨＬＡ−テトラマーによって検出・測定することにより、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫等のアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがん（腫瘍）の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。特に、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌などの女性特有の臓器におけるがん、または肺癌の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断することができる。
【００６３】
本発明のＨＬＡ−テトラマーを用いて、対象から採取した生体試料中のＢＯＲＩＳ、とくにアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳに特異的なＣＴＬを定量することができる。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。対象から採取した末梢血あるいはＰＢＭＣを、適当な濃度のＨＬＡ−テトラマーと反応させる。ＨＬＡ−テトラマーと結合したＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。ＨＬＡ−テトラマー試薬と反応させる時に、ＨＬＡ−テトラマー試薬と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を反応させる事で、ＢＯＲＩＳ特異的なＣＴＬのＴ細胞サブセットも同時に判定できる。
本発明の検出（検査、診断）方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出（検査、診断）することもできる。さらに本発明の検出（検査、診断）方法は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できるがん患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。
【００６４】
本発明のＨＬＡ−テトラマーを用いる本発明の検出(検査)方法の特定の態様は、次の（ａ）および（ｂ）、および任意に（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者から得られた生体試料と本発明のＨＬＡ−テトラマーとを接触させる工程、
（ｂ）該生体試料中のＢＯＲＩＳ  ｓｆ５またはｓｆ６由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を認識するＣＴＬの量を、上記ＨＬＡ−テトラマーが結合した細胞の量を指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のＨＬＡ−テトラマーを用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む。
【００６５】
本発明のＨＬＡ−テトラマーを用いる本発明の検出方法（検査方法、診断方法）の一態様は、生体試料中の本発明のポリペプチド特異的ＣＴＬを検出し、その量を測定することによって実施される。例えば本発明のＨＬＡ−テトラマーを作製し、これを用いてがんが疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
【００６６】
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のポリペプチド特異的ＣＴＬの量、または、本発明のポリペプチドを提示する細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織におけるＢＯＲＩＳ遺伝子あるいはアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳのｍＲＮＡ発現レベル、本発明のポリペプチドレベルまたはＣＴＬレベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のポリペプチド特異的ＣＴＬの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
【００６７】
また、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のポリペプチド特異的ＣＴＬの量を測定することにより、実際にＣＴＬが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のポリペプチド特異的ＣＴＬの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。
【００６８】
（９）がんの予防および／または治療方法
本発明はまた、対象におけるがんを予防および／または治療する方法であって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬ、抗原提示細胞からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および／または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性、ＨＬＡ−Ａ１１陽性および／またはＨＬＡ−Ａ２４陽性である。本発明の一態様において、対象はアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はＨＬＡ−Ａ０２陽性、ＨＬＡ−Ａ１１および／またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
【００６９】
本発明の予防／治療方法に用いる本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＴＬおよび抗原提示細胞としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本発明における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
【００７０】
具体的な用量としては、例えば、本発明のポリペプチドの場合、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの場合、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。
【００７１】
本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性、ＨＬＡ−Ａ１１陽性および／またはＨＬＡ−Ａ２４陽性の対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のＨＬＡ型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんの検出は、上記（８）に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。本発明の予防／治療方法の一態様は、投与する工程の前に、ＨＬＡ−Ａ０２陽性、ＨＬＡ−Ａ１１陽性および／またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり、かつ、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを有する対象を予防／治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のＨＬＡ型を決定する工程および対象におけるアイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００７２】
（１０）本発明の抗体
本発明はまた、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳの少なくとも一部、好ましくは配列番号１、配列番号２または配列番号７６で表されるポリペプチドの少なくとも一部、より好ましくは配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体もまた提供する。したがって本発明の抗体は、好ましくはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを特異的に認識することができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
また、本発明の抗体にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙおよびｓｃ（Ｆｖ）２などの、抗体の機能的断片も含まれる。また、これら機能的断片の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の抗体に含まれる。
【００７３】
本発明の抗体の製造については、当該技術分野において既知の方法に準じて行うことができる。例えば、配列番号１または２で表されるポリペプチドの全部または一部を免疫原としてウサギなどを免疫し、その血清から精製することで抗体を得ることができる。
本発明の抗体は、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳに対して特異的に結合可能な抗体であり、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳを発現する細胞を検出したり、アイソフォームＡまたはＣ、あるいはサブファミリー５または６に属するＢＯＲＩＳ自体を検出したりすることが可能である。したがって本発明の一態様において、本発明の抗体を含むＢＯＲＩＳタンパク質の検出用キットおよび／または精製用キットが提供される。
【００７４】
本発明のキットは、本発明の抗体を含んでいれば特に制限されず、当該技術分野において知られたあらゆるキットが含まれ、これに限定するものではないが、例えばＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、クロマトグラフィー法、免疫染色法などに用いるキットが挙げられる。
本発明のキットは、本発明の抗体以外に、１または２以上のキットの用途に適した任意の構成部品をさらに含んでよく、かかる構成部品としては、これに限定するものではないが、例えば標識されていてもされていなくてもよい二次抗体、発色試薬、溶媒、緩衝液、陽性コントロール、陰性コントロール、反応容器、前処理試薬、ブロッキング試薬、スライドガラス、カバーガラス、各用途についての取扱説明書などが挙げられる。
【００７５】
（１０）その他
本発明は、子宮頚部癌や卵巣癌中の幹細胞性の性質を有する細胞において、ＢＯＲＩＳタンパク質、特にＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６が高発現しているという知見に基づくものである。したがって、かかる知見に基づく様々な技術が本発明に包含される。
本発明は、一態様において、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５またはｓｆ６を特異的に認識する抗体に関する。かかる抗体は、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその一部をエピトープとして認識するように、当該技術分野において知られた方法を用いて作製することができる。かかる抗体を用いることにより、例えば特定の組織および／または細胞におけるＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６の発現量を検出することが可能であり、それによって組織や対象におけるがん幹細胞や腫瘍の存在の有無を判定することが可能である。また、かかる抗体を用いてがん幹細胞の幹細胞性に影響するＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６の機能を抑制することにより、がん幹細胞を処置すること、がんの予防および／または治療を行うことが可能である。
【００７６】
また、本発明の別の一態様において、ＢＯＲＩＳ遺伝子と相補的な配列を有するポリヌクレオチドに関する。上述のとおりＢＯＲＩＳ遺伝子、特にその特定のサブファミリーはがん幹細胞において特に強く発現しており、幹細胞性に影響していると考えられる。したがってＢＯＲＩＳ遺伝子の発現を阻害することにより、がん幹細胞における幹細胞性を抑制できるものと考えられる。したがって好ましい一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、阻害性核酸、とくにｓｉＲＮＡとして用いることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、試料中のＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のＤＮＡやｍＲＮＡを検出するためのプライマーやプローブとして用いることもできる。
本発明のさらに別の一態様において、対象から得られた試料におけるＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを検出すること、および正常組織および／または細胞におけるＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを基準値として、前記検出されたレベルと前記基準とを比較することを含む、がん幹細胞の検出方法に関する。ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを検出する方法としては、当該技術分野において知られた方法を用いてよい。ｍＲＮＡのレベルを検出する方法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロッティングなどが挙げられる。かかるｍＲＮＡのレベルを検出する方法において、上記ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のプライマーおよび／またはプローブを用いてよい。ポリペプチドのレベルを検出する方法としては、例えば免疫組織染色、ウェスタンブロッティングなどが挙げられる。かかるポリペプチドのレベルを検出する方法において、上記ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６の特異的抗体を用いてよい。
【００７７】
本発明は、別の一態様において、対象から得られた試料におけるＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを検出すること、および正常組織および／または細胞におけるＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを基準値として、前記検出されたレベルと前記基準とを比較することを含む、対象における腫瘍の検出方法に関する。ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベルを検出する方法としては、当該技術分野において知られた方法を用いてよい。ｍＲＮＡのレベルを検出する方法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロッティングなどが挙げられる。かかるｍＲＮＡのレベルを検出する方法において、上記ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６のプライマーおよび／またはプローブを用いてよい。ポリペプチドのレベルを検出する方法としては、例えば免疫組織染色、ウェスタンブロッティングなどが挙げられる。かかるポリペプチドのレベルを検出する方法において、上記ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５および／またはｓｆ６の特異的抗体を用いてよい。本発明において、本態様の腫瘍の検出方法は、上記（８）の方法に代えて行うことができる。したがって、例えば上記（９）におけるがんの検出工程に用いてもよい。
【００７８】
本発明のさらに別の一態様において、ＢＯＲＩＳタンパク質またはそのアイソフォームの部分ペプチドを含み、女性特有の臓器におけるがんであってがん幹細胞に関連するがんを処置するための医薬組成物に関する。ＢＯＲＩＳはがん精巣抗原の中でも特に精巣以外の組織における発現が少ない一方、本発明者らにより、子宮頚部癌、卵巣癌、子宮癌などの女性特有の臓器におけるがん、中でも幹細胞性を有する細胞を含むがんにおいて強く発現しているとの知見が見出されたものである。したがって、女性特有の臓器におけるがんの処置において、低い副作用や高い特異性などの特に優れた効果を発揮することが期待されるものである。
【００７９】
実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に断りがない限り、実験法は、例えば「免疫実験操作法」、編集：右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、に記載の方法など、当該技術分野において通常用いられる方法を用いた。
また、以下の実施例において用いたＢＯＲＩＳのアイソフォームおよびサブファミリーを以下の表に示す。特段の記載のない限り、アイソフォーム名が記載されている場合は特定のアイソフォームを意味し、サブファミリー名が記載されている場合はサブファミリーに属するアイソフォームのいずれかを意味し、単に「ＢＯＲＩＳ」と記載した場合はアイソフォームやサブファミリーを特定しない一般的なＢＯＲＩＳ遺伝子の発現産物か、またはＢＯＲＩＳ  Ｂ０アイソフォームのことを意味するものとする。また以下の実施例において、「ペプチド名−Ｔｅｔ」は、ペプチド名で表されるペプチドと結合したＨＬＡテトラマーを意味する。
【００８０】
【表１】
2016047715.tif 000003
【００８１】
例１．がん幹細胞の単離・同定
（１）スフェロイド形成細胞の単離
子宮頚部癌においては、がん幹細胞マーカーの指標の一つとしてスフェア形成が報告されている。そこで、低接着性培養皿を用いたスフェロイド形成アッセイを行った。超低接着性表面を有するマルチウェルプレート（Ultra Low Attachment 6-well plate、Corning社製）を用いて各子宮頚部癌細胞株（ＣａＳｋｉ、ＴＣＳ、ＭＳ７５１、ＳＫＧ−ＩＩＩｂ、ＭＥ−１８０およびＳｉＨａ）を培養した。細胞は、接着培養したものを２ｍＭのＥＤＴＡに０．２５％のトリプシンを加えた溶液で剥離し、各ウェルに１０３個／ウェルとなるように播種した。培地として、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に２０ｎｇ／ｍｌのｈ−ＥＧＦ（R&D systemsより入手）、１０ｎｇ／ｍｌのｂ−ＦＧＦ（R&D systemsより入手）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCOより入手）、４μｇ／ｍｌのヘパリン、および終濃度１％のＮ２サプリメント（WAKOより入手）を加えたものを用い、通常の培養条件で７日または１４日間培養し、全ての細胞株において１００μｍ以上のスフェロイドの形成が確認された（図１）。以下の試験において、「スフェア（sphere）」と表示されている細胞群は、本試験と同様の非接着培養により形成されるスフェロイドから単離された細胞群を意味する。また、「バルク（bulk）」と表示されている細胞群は、通常の接着培養により得られる細胞群を意味する。
【００８２】
（２）スフェロイド形成細胞の性質
スフェロイド形成細胞が幹細胞様の性質を示す細胞であることを確認するために、放射線耐性試験、抗癌剤耐性試験、フローサイトメトリー分析を行いスフェア群がバルク群と比較して、より幹細胞様の性質を示す群であることを確認した。
【００８３】
（３）幹細胞性遺伝子の発現解析
幹細胞性遺伝子としてＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＯｃｔ３／４を用い、ＣａＳｋｉおよびＴＣＳ細胞株のバルク群およびスフェア群における前記各遺伝子の発現量について、定量的ＲＴ−ＰＣＲでそれぞれ解析した。ＰＣＲ機器はSTEPONE realtime PCR system（Applied Biosystems社製）を使用し、遺伝子の発現はthreshold cycle number（Ｃｔ）で検出し、ΔΔＣｔ法でバルク群における幹細胞性遺伝子の発現を１とした場合の相対発現量を定量した。ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、Ｏｃｔ３／４のプライマー・プローブミックスはTaqMan gene expression （Applied Biosystems）を使用した。
結果を図２に示す。どちらの細胞株においても、スフェア群の細胞において幹細胞性遺伝子が高発現していることがわかる。これは、スフェア群に幹細胞様の性質を示すがん細胞が濃縮されていることを示唆している。特に顕著に幹細胞性遺伝子を発現していたＣａＳｋｉ細胞株を用いて、下記ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
【００８４】
（４）ｃＤＮＡマイクロアレイ
バルク群と比較してスフェア群において高度に発現している遺伝子について解析するために、ｃＤＮＡマイクロアレイを行った。まず、市販のアミノアリルＲＮＡ増幅キットver2（高収率タイプ）（Sigma Aldrich）を用いて、キットに付属の説明書に従って、各細胞より全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ  ３μｇを市販のオリゴｄＴ  Ｔ７プロモータープライマーおよび逆転写酵素を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成し、同時にＣｙ３またはＣｙ５標識シチジントリホスフェートを取り込んだ。このプロセスにより、スフェア群細胞のサンプルをＣｙ５で標識し。バルク群細胞のサンプルをコントロール細胞としてＣｙ３で標識した。再度ｃＲＮＡの質を、NanoDrop（Thermo Scientific社）を用いて確認した。その後Ｃｙ３標識ｃＲＮＡおよびＣｙ５標識ｃＲＮＡと組み合わせ、ハイブリダイゼーションカクテル（Sigma Aldrich）中で断片化した。標識化されたｃＲＮＡを６０ｍｅｒプローブオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Panorama Human Micro Array、Sigma Aldrich）にハイブリダイズさせ、５０℃で２０時間インキュベートした。蛍光強度を、Genepix 4000B Microarray Scanner（Axon Instruments社）を用いて決定した。同様の方法で、スフェア群細胞のサンプルをＣｙ３で標識し、バルク群細胞のサンプルをＣｙ５で標識して再度実験を行った（Dye Swap法）。
【００８５】
（５）がん幹細胞特異的抗原候補タンパク質の選定
上記ｃＤＮＡマイクロアレイの結果において、がん・精巣抗原（ＣＴ抗原）を対象として、スフェア群における発現を確認した。結果を下表に示す。
【表２】
2016047715.tif 000004
スフェア群に特異的に発現しているＣＴ抗原として、ＢＯＲＩＳが同定された。したがってＢＯＲＩＳはがん幹細胞に対する有効な治療標的となり得ることが示唆される。
【００８６】
例２．がん幹細胞に対する治療標的としてのＢＯＲＩＳの評価
（１）正常組織におけるＢＯＲＩＳの発現解析
正常組織のｃＤＮＡライブラリーとして、Human Multiple Tissue cDNA Panels I and II（Clontech社）を用いた。ＰＣＲは０．１〜０．５μｌのｃＤＮＡ、０．１μｌのTaq DNA polymerase（Qiagen社）および１２ｐｍｏｌのプライマーを含むｃＤＮＡミクスチャを、まず９４℃で２分間温めた後、続いて９４℃で１５秒解離、６０℃で３０秒アニーリング、６８℃で３０秒伸長のサイクルを３０〜４０サイクル行った。プライマーは配列番号３５および３６を用いた。
結果を図３に示す。ＢＯＲＩＳは正常組織においては、精巣以外にはほとんど発現していないことがわかる。
【００８７】
（２）各子宮頚部癌細胞株におけるＢＯＲＩＳの発現解析
子宮頚部癌細胞株としてＭＳ７５１、ＴＣＳ、ＣａＳｋｉ、ＳＫＧ−ＩＩＩｂ、ＭＥ−１８０およびＳｉＨａを用い、各細胞株のバルク群およびスフェア群から上記例１（４）と同様の方法を用いてｃＤＮＡを採取し、各細胞株におけるＢＯＲＩＳの発現量を、例１（３）と同様の方法で、ＴＣＳ細胞株のバルク群における発現を１とした場合の相対発現量を定量した。ＢＯＲＩＳのプライマー・プローブミックスはTaqMan gene expression （Applied Biosystems）を使用した。
結果を図４に示す。半数以上の細胞株において、バルク群に比べてスフェア群でＢＯＲＩＳの発現量が大幅に増大していた。
【００８８】
（３）他の癌細胞株におけるＢＯＲＩＳの発現解析
子宮体癌細胞株としてＲＬ９５−２およびＨＥＣ−１−Ａ、卵巣癌細胞株としてＴＯＶ−２１Ｇ、ＥＳ−２、ＭＣＡＳ、Ｏｖｃａｒ−３、ＳＭＯＶ−２およびＳＫＯＶ−３のバルク群細胞におけるＢＯＲＩＳの発現量を、（２）と同様にＴＣＳのバルク群細胞における発現量を１とした相対発現量として定量した。
結果を図５に示す。ＢＯＲＩＳは子宮頚部癌だけでなく、子宮体癌や卵巣癌においても高い発現量を示した。
【００８９】
（４）子宮頚部癌細胞株における、ＢＯＲＩＳの各サブファミリーのアイソフォームの発現解析
子宮頚部癌細胞株におけるＢＯＲＩＳの各サブファミリーのアイソフォームの発現量を、（１）と同様にＲＴ−ＰＣＲにて解析した。各サブファミリーに特異的なプライマーとして下表のプライマーを用いた。
【表３】
2016047715.tif 000005
【００９０】
結果を図６に示す。ＣａＳｋｉ細胞株のバルク群細胞においては、サブファミリー（ｓｆ）１〜４に顕著な発現が見られたのに対し、スフェア群細胞においては、バルク群細胞においてほとんど発現が見られなかったｓｆ６が強く発現していた。また、ＭＳ７５１細胞株においても、バルク群細胞においては観察されなかったがスフェア群細胞において観察された発現としてｓｆ１およびｓｆ６が見出された。
【００９１】
（５）卵巣癌細胞株における、ＢＯＲＩＳの各サブファミリーのバリアントの発現解析
上記（４）と同様の実験を、子宮頚部癌細胞株ＣａＳｋｉおよびＭＳ７５１に代えて、卵巣癌細胞株ＴＯＶ２１ＧおよびＳＭＯＶ−２を用いて行った。結果を図７に示す。
上記子宮頚部癌細胞株の結果と同様、卵巣癌細胞株においても、スフェア群細胞においてＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の特異的発現が観察された。また、卵巣癌細胞株においては、どちらの細胞株でもｓｆ６のみならずｓｆ５の発現もバルク群細胞に比較して顕著に上昇していた。
【００９２】
（６）肺癌細胞株および肺がん患者手術切除片から樹立した初代培養細胞における、ＢＯＲＩＳの各サブファミリーのバリアントの発現解析
上記（５）と同様の実験を、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌由来の細胞株、および肺がん患者手術切除片から樹立した初代培養細胞を用いて行った。スフェロイド形成細胞は、Ｎ２サプリメントおよびヘパリンを加えない培地を用いた以外は上記例１（１）と同様の手順を用いて調製した。結果を図１９−１、図１９−２、図１９−３、図１９−４および図１９−５に示す。
肺癌由来の細胞株でもＢＯＲＩＳ遺伝子の発現が認められた。具体的には、図１９−１の小細胞肺癌株では、ＳＢＣ１とＳＢＣ５でＢＯＲＩＳ  ｓｆ５がスフェア群で発現増強しており、Ｌｃ８１７ではｓｆ６の発現増強が観察された。図１９−２ではＢＯＲＩＳ  ｓｆ５やｓｆ４aの発現が確認され、同様に肺扁平上皮癌や肺腺癌でのＢＯＲＩＳの発現もしくはスフェア群での発現増強が観察された。さらに図１９−５に示すように、肺がん患者手術切除片から樹立した初代培養細胞においてもＢＯＲＩＳの発現が確認されており、特にＰｒｉｍａｒｙ７細胞ではスフェア群において幾つかのsfでの発現増強が確認されることから肺癌においてもＢＯＲＩＳががん免疫療法の非常に有望な抗原になり得ることが示された。
【００９３】
例３．ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６についての検討
（１）ＢＯＲＩＳアイソフォームの過剰発現株の作製
ｐＭＸｐｕｒｏベクターおよびＰｌａｔ−Ａ細胞を含む、Platinumレトロウイルス発現システムを用いて、ＢＯＲＩＳのｓｆ１アイソフォームであるＢ０アイソフォーム、ｓｆ４アイソフォームであるＢ３アイソフォーム、ｓｆ６アイソフォームであるＢ６アイソフォームおよびＣ７アイソフォームをコードするレトロウイルスベクターを作製し、ＴＣＳ細胞株に導入してそれぞれのＢＯＲＩＳアイソフォームの過剰発現株を作製した。ＢＯＲＩＳアイソフォームの発現量を定量的ＰＣＲで確認したところ、それぞれｍｏｃｋベクターを導入したものと比較して約１万倍の発現を確認した。同様の方法により、ＳＫＧ−ＩＩＩｂ細胞株に導入した過剰発現株も作製した。
【００９４】
（２）スフェア形成アッセイ
上記例１（１）と同様の方法で、１０００個／ウェルの過剰発現ＴＣＳ細胞株および過剰発現ＳＫＧ−ＩＩＩｂ細胞株を播種して、２週間の培養によりスフェア形成アッセイを行った。
結果を図８および図９に示す。どちらの細胞株においても、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６、特にＢＯＲＩＳ  Ｂ６アイソフォームの大量発現株において有意なスフェア形成が確認された。
【００９５】
（３）ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＨＬＡ結合性エピトープ候補の抽出
ＨＬＡクラスＩ分子と結合して抗原提示されるエピトープペプチドは、８〜１０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側から２番目と、９あるいは１０番目のアミノ酸はＨＬＡクラスＩ分子との結合に対して最も重要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各々のＨＬＡクラスＩ分子の種類によって異なることが報告されている。例えば、世界的に最も研究が進められているＨＬＡ−Ａ２分子に結合するエピトープペプチドは、Ｎ末端より２番目の位置にロイシンを有し、９あるいは１０番目の位置にロイシンまたはバリンを有する、９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドが最も良く知られている。また、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかを有し、９あるいは１０番目の位置にロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはフェニルアラニンのいずれかを有する、９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている。
【００９６】
ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的なＣ末端配列（配列番号１）から、上記ＨＬＡ結合アンカーモチーフ構造を有するペプチドを抽出した。ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド候補としてＫＬＬＦＩＧＴＩＫＶ（ＫＬＬペプチド：配列番号４）およびＬＬＦＩＧＴＩＫＶ（ＬＬＦペプチド：配列番号５）、ならびにＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチド候補としてＳＦＫＫＬＬＦＩＧＴＩ（配列番号３）を抽出し、常法により合成した。
【００９７】
（４）ＨＬＡ−Ａ２結合アッセイ
Ｔ２細胞を、２６℃で一晩培養した。その後細胞をＰＢＳで洗浄し、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド候補として（３）で合成したＫＬＬペプチドおよびＬＬＦペプチド、ポジティブコントロールとしてサイトメガロウィルス由来のペプチドであるＣＭＶペプチド（配列番号３７）およびインフルエンザウィルス由来のペプチドであるＩｎｆｌｕｅｎｚａ（配列番号３８）、ならびにネガティブコントロールとしてＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドであるＧＫ−１２ペプチド（配列番号３９）を加えて、２６℃で３時間共培養した。温度を３７℃にしてさらに３時間共培養した後、遠心分離して上清を除き、細胞を単離した。単離した細胞にＨＬＡ−Ａ２抗体を加え、４℃で１時間静置し、その後ＰＢＳで洗浄した。２次抗体として蛍光標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体を加え、４℃で３０分静置した後、１％ホルマリンを加えて細胞を固定した。固定した細胞を、フローサイトメーター（BECTON DIKINSON社またはBeckman Coulter社）にて、ＦＩＴＣ蛍光強度を計測した。
【００９８】
結果を図１０に示す。ＫＬＬペプチドおよびＬＬＦペプチドとともにインキュベートしたＴ２細胞は、どちらもＣＭＶペプチドおよびＩｎｆｌｕｅｎｚａペプチドと同程度の蛍光強度を示しており、同程度に細胞表面にＨＬＡ−Ａ２分子を局在させていたことがわかる。このことはどちらのペプチドもＨＬＡ−Ａ２と結合して細胞表面に抗原提示されていることを示唆する。
【００９９】
（５）ポリペプチド刺激によるＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保持していることがわかっている健康な成人２名から末梢血を採取し、３，０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心処理して上清の血漿部分を回収した。血漿部分以外から、密度勾配遠心法にてＰＢＭＣを分離した。９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレート（BECTON DIKINSON社）の各ウェルに、Ｈｅｐｅｓ改変ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma社）に２−メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、抗生物質としてストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）とペニシリンＧ（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ）および５％の血漿成分を加えた培地を１０ｍＬおよび上記で分離したＰＢＭＣを約３×１０７個／プレート入れ、浮遊させて培養した。これに１０μｇ／ｍＬの濃度で配列番号４または、配列番号５のＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを加えた。２日間培養後、５０Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２を添加し、さらに２週間培養した。
【０１００】
上記培養細胞の適量に対して、１０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬と、２０μＬのＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体を加え、穏やかに混合し、４℃にて３０分静置した。１．５ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターにて分析した。
【０１０１】
解析は２段階で行った。まず１段階目は、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの縦列の８ウェル分の細胞を１サンプルとして回収し、このサンプル中のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。この段階でＣＴＬ誘導が確認されたサンプルについて、２段階目の解析を行った。２段階目は、１サンプルとした８ウェルから個別に細胞を回収し、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。
【０１０２】
フローサイトメーターでの分析結果の図は、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＨＬＡ−テトラマー試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で表されている。ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）、ＬＲ（右下）と表記した場合、（ＵＲ＋ＬＲ）分のＵＲの百分率、すなわちＣＤ８陽性である細胞のうちＨＬＡ−テトラマー試薬陽性の細胞の割合を示す。
【０１０３】
図２０は、検体番号Ａ２−３４のＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号４で１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＫＬＬ−Ｔｅｔで、配列番号４特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、検体番号Ａ２−３４で明らかなＣＤ８陽性ＫＬＬ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団がレーン５、レーン１１のＵＲに検出された。このことは、配列番号４のペプチドがＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−３４の生体内にＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１０４】
図２１は、上記第一段階の分析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン５、レーン１１の２段階目の結果を表す。レーン５のウェルＣ、レーン１１のウェルＦにて、ＫＬＬペプチド（配列番号４）特異的ＣＴＬが検出された。このことは、ＫＬＬペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。９６ウェル中２ウェルでＫＬＬペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＫＬＬペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＫＬＬペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝２／（３×１０７×０．１６）
＝４．１７×１０−７
【０１０５】
図２２は、検体番号Ａ２−２９のＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号５で１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＬＬＦ−Ｔｅｔで、配列番号５の特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、検体番号Ａ２−２９で明らかなＣＤ８陽性ＬＬＦ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団がレーン１、レーン２、レーン４、レーン５、レーン６、レーン７、レーン８、レーン９、レーン１０およびレーン１１のＵＲに検出された。このことは、配列番号５のペプチドがＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−２９の生体内にＢＯＩＲＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１０６】
図２３−１および２は、上記第一段階でＣＴＬの誘導が確認されたレーン１、レーン２、レーン４、レーン５、レーン６、レーン７、レーン８、レーン９、レーン１０、およびレーン１１の第二段階の結果を表す。レーン１のウェルＢ、レーン２のウェルＢとＤとＧとＨ、レーン４のウェルＣとＦとＧ、レーン５のウェルＢとＦとＧ、レーン６のウェルＥとＦ、レーン７のウェルＦ、レーン８のウェルＣとＧ、レーン９のウェルＣ、レーン１０のウェルＡ、レーン１１のウェルＥで、ＬＬＦぺプチド（配列番号５）特異的ＣＴＬが検出された。このことは、ＬＬＦペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。９６ウェル中１９ウェルでＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝１９／（３×１０７×０．１７）
＝３．７３×１０−６
【０１０７】
（６）ＰＨＡブラスト刺激によるＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保持していることがわかっている健康な成人３名から末梢血を５０ｍＬ採取し、遠心処理して上清の血漿部分を回収した。血漿を除いた後の血球部分から、リンフォプレップ（Axis-Shield Pros As社）を用いて、ＰＢＭＣを分離した。分離したＰＢＭＣは、１０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培養培地に懸濁し、細胞培養用ディッシュに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、４時間培養した。ＡＩＭ−Ｖ培養培地はライフテクノロジーズ社のＡＩＭ−Ｖに、終濃度１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ライフテクノロジーズ社）、終濃度５０μＭの２−メルカプトエタノール（ライフテクノロジーズ社）を添加した培地を意味する。その後、浮遊細胞のみを回収し、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社）を使用し、磁気細胞分離法を用いてＣＤ８陽性細胞と陰性細胞を分離した。
【０１０８】
ＣＤ８陰性細胞は、ＡＩＭ−Ｖ培養培地に懸濁した後、４８ウェルプレート（コーニング社）に、約４×１０５個／ウェル分注し、培養した。
上記培養を開始した同日に、ＣＤ８陰性細胞の一部のウェルに終濃度１μg/ｍＬのＰＨＡ（phytohemagglutinin、Wako社）、終濃度１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（ライフテクノロジーズ社）を添加した。培養開始から４日目、カルチャーチューブ（ＢＤ社）に細胞を回収し、１０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培養培地に懸濁し、７５ｃｍ2培養フラスコ（ヌンク社）に入れた。さらに、終濃度１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（シオノギ社）を添加した。培養開始から８日目、細胞をカルチャーチューブ（ＢＤ社）に回収し、１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ（ライフテクノロジーズ社）に懸濁し、配列番号５のペプチド（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を添加した。その後、室温にて１時間放置し、１００Ｇｙの放射線照射処置を行い、ＰＨＡブラスト細胞を調製した。
【０１０９】
ＣＤ８陽性細胞の培養は、ＡＩＭ−Ｖ培養培地に終濃度１０％のヒトＡＢ血清（ロンザジャパン社）を添加した培地に懸濁した後、４８ウェルプレート（コーニング社）に、約２×１０６個/ウェル分注し行った。
培養開始から８日目、各ウェルにＩＬ−７（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を１０ｎｇ添加した。さらに、ＣＤ８陽性細胞とＰＨＡブラスト細胞が５対１となるように混合し、共培養を開始した。培養開始から９日目、１６日目にＰＨＡブラスト細胞の調製を再度開始し、ＰＨＡブラスト細胞の調製が完了する１６日目、２３日目にＣＤ８陽性細胞とＰＨＡブラスト細胞が５対１となるように再度混合し、ＰＨＡブラスト細胞による刺激を合計３回行った。培養開始１６日目にＩＬ−２（シオノギ社）を１０Ｕ/ｍＬ添加し、段階的に濃度を上げ、最終的に５０Ｕ/ｍＬまで濃度を上げ、２８日目まで培養を継続した。
【０１１０】
この２８日間培養した細胞集団を、上記（５）と同様の方法を用いてＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬およびＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体で染色し、サンプル中のＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。
【０１１１】
図２４は、検体番号Ａ２−Ｓ１のＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号５で２８日間培養した細胞集団から分取したサンプルの分析結果を表す。ＬＬＦ−Ｔｅｔで、配列番号５特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、検体番号Ａ２−Ｓ１で明らかなＣＤ８陽性ＬＬＦ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団を検出した。このことは、ＬＬＦペプチド（配列番号５）のペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−Ｓ１の生体内にＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１１２】
（７）ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬの機能解析
ＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬの機能解析は、ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ（ＢＤ社）キットを用いて行った。まず、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬを誘導した細胞集団の一部を採取して、５×１０５個／ｍＬに調製した。このサンプルを、抗ＩＦＮγ抗体が固相されたＥＬＩＳＰＯＳＴアッセイ用プレートに１００μＬ／ウェルで撒き、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、３０分静置した。そのプレートに、Ｔ２細胞に配列番号５のペプチドをパルスした細胞を５×１０４個／ウェルとなるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、一晩静置した。洗浄後、ビオチン標識抗ＩＦＮγ抗体を加え、室温にて２時間反応した。反応液を洗い、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを加え反応させた。洗浄後、発色剤を１００μＬ／ウェル加え、１５〜３０分反応することにより、ＣＴＬが分泌したＩＦＮγをスポット化して測定した。
【０１１３】
結果を図２５に示す。ネガティブコントロールのＨＩＶ由来ペプチド（ＳＬＹペプチド）を加えた場合、またはペプチドを加えない場合（ＰＢＳ）と比較して、ＬＬＦペプチド（配列番号５）で刺激した場合は、ＩＦＮγのスポットが明らかに多く検出された。したがって、ＬＬＦペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、再刺激によりＩＦＮγを産生するＬＬＦペプチド（配列番号５）特異的なＣＴＬが誘導されていることが確認された。
【０１１４】
（８）ＣＴＬクローンのソーティング及び培養
上記（７）でＩＦＮγの産生能を確認したＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異的ＣＴＬを、ＨＬＡ−テトラマー試薬と抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（ＭＢＬ社）抗体で二重染色し、ＨＬＡ−テトラマー試薬および抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体と反応した細胞をフローサイトメーターで９６ウェルプレート（コーニング社）に１細胞ずつ播種した。この細胞を培養する培地は、ＡＩＭ−Ｖ培養培地に終濃度１０％のヒトＡＢ血清（ロンザジャパン社）、終濃度１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ社）、終濃度１％のGlutaMAX（ライフテクノロジーズ社）、終濃度１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（シオノギ社）、終濃度５μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Wako社）を添加したものを用いた。各ウェルには、健康な３人のドナーから採血し分取したＰＢＭＣ５００００個に、１００Ｇｙの放射線照射措置した細胞を添加した。
また、フローサイトメーターで単離した細胞は、培地の色を観察して随時、半分量の培地交換を行った。さらに、細胞が増えた段階で、４８ウェルプレートに移し替えた。
【０１１５】
培養したＣＴＬを、上記（５）と同様の方法を用いてＬＬＦ−ＴｅｔおよびＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体で染色し、ＣＴＬの増幅を確認した結果を図２６に示す。その結果、明らかなＣＤ８陽性ＬＬＦ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団を検出した。このことは、ＢＯＲＩＳ由来ＬＬＦペプチド特異的なＣＴＬの単クローン化および増幅に成功したことを示す。
【０１１６】
培養したＣＴＬを、上記（７）と同様の手順で処理し、ＣＴＬの機能解析を行った結果を図２７に示す。結果は、ペプチドを加えない場合（−）と比較して、ＬＬＦペプチドで刺激した場合に、ＩＦＮγのスポットが多く検出された。よって、培養したＣＴＬは、ＬＬＦペプチドの再刺激によりＩＦＮγを産生するＬＬＦペプチド（配列番号５）特異的なＣＴＬであることが確認された。
【０１１７】
（９）ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬの機能解析
（８）で培養を終えたＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬがＬＬＦペプチドを提示する細胞を攻撃するかを、LDH killingアッセイ（TaKaRa Bio社）で解析した。まず、ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬの攻撃の対象となる標的細胞（Target）を調製した。Ｔ２細胞に配列番号５のＬＬＦペプチドをパルスした細胞とそのネガティブコントロールとして、ＨＩＶ由来ペプチド（ＳＬＹペプチド）をＴ２細胞にパルスした細胞、Ｔ２細胞のみの３種類の細胞を準備した。標的細胞は、９６ウェルＶ底プレート（コーニング社）に、１×１０４個／ウェルずつ撒いた。ＬＬＦ特異的ＣＴＬ（Effector）は、９×１０５個／ｍＬ、３×１０５個／ｍＬ、１×１０５個／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製し、１ウェル１００μＬずつ撒き、９６ウェルプレートに撒いた標的細胞と混合した。その後、９６ウェルプレートを、１８００ｒｐｍ、１０分遠心後、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で４時間から１２時間静置した。９６ウェルプレートを遠心し、細胞を沈殿させた後、上清１００μＬを平底９６ウェルプレートに移した。それぞれのウェルに、diaphoraseを含む反応液を１００μＬ加えて室温で３０分静置し、そののち４９０ｎｍの吸光度を測定した。この操作により、通常は細胞膜内に存在するＬＤＨが、細胞が傷害を受けている場合細胞膜の損傷により細胞外に放出されるため、培養液中のＬＤＨ量を測定することにより細胞傷害性を査定することが可能である。この方法を用いて、ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬが、ＬＬＦペプチドを提示する標的細胞を認識し攻撃するかを検討した。
【０１１８】
その結果を図２８に示す。Ｘ軸にEffectorとTarget細胞の比率をＥ／Ｔ率で示し、Ｙ軸は細胞傷害性活性（％）で示した。細胞傷害活性は、次に示す式に従い算出することができる。［試料実測値（４９０ｎｍにおける吸光度：Ａ４９０）−低コントロール（Ａ４９０）］／［高コントロール（Ａ４９０）−低コントロール（Ａ４９０）］×１００で示される。高コントロール（Ａ４９０）はTarget細胞浮遊液に２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えたもの、低コントロール（Ａ４９０）はTarget細胞だけの浮遊液の測定値を示す。細胞傷害性活性（％）値は３試料の平均値で示した。
ＬＬＦペプチド特異的ＣＴＬは、ネガティブコントロールのＨＩＶ由来ぺプチド（ＳＬＹペプチド）をパルスしたＴ２細胞を標的細胞とした場合、またはペプチドを加えていないＴ２細胞を標的細胞とした場合と比較して、ＬＬＦペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞とした場合に高い割合で細胞傷害性活性を示した。すなわちＬＬＦペプチド（配列番号５）が提示されたがん細胞を特異的に認識し細胞傷害性活性を発揮することが明らかとなった。
【０１１９】
例４．ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５についての検討
（１）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ結合性エピトープ候補の抽出
上記例３（３）と同様に、ＢＯＲＩＳ特異的なＨＬＡ結合性エピトープ候補を抽出した。分析対象のＢＯＲＩＳとしては、最も長いアミノ酸配列を有し、かつがん幹細胞に特異的に発現しているＢＯＲＩＳの候補でもあるＢＯＲＩＳ  Ｂ１アイソフォーム（サブファミリー５）を用い、日本人の約６０％が保持するＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対して結合性を有するエピトープの候補を抽出し、合成した。合成したペプチドを以下に示す。
【０１２０】
【表４】
2016047715.tif 000006
【０１２１】
表５に合成したＢＯＲＩＳのＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性ペプチドの特徴を示す。合成したペプチドのＮ末端側から３つまたは４つのアミノ酸配列をペプチド名とした略号で示す。左から、ペプチド名、アミノ酸配列、ＢＯＲＩＳアイソフォームＢ１アミノ酸配列上の位置、アミノ酸数、解析に用いたＢＩＭＡＳ（BioInformatics & Molecular Analysis Section, http://thr.cit.nih.gov/index.shtml）のHLA Peptide Binding Predictions（http://thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）で算出されたスコアを示した。このスコアは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とペプチドとの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、ＨＬＡとペプチドが安定した複合体を形成する可能性があることを意味する。
【０１２２】
【表５】
2016047715.tif 000007
【０１２３】
（２）ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテスト
ＨＬＡ−テトラマー試薬製造の最初のステップは、原料であるＨＬＡとβ２−ミクログロブリンとペプチドを試験管内の適切な溶液中で混合するフォールディングから始まる。フォールディング溶液中では、この３種類の原料の会合反応により３者複合体（ＨＬＡ−モノマー）を形成する。この際、ＨＬＡとペプチドの結合力が高ければ、この会合反応はスムーズに進行し、ゲル濾過カラムで分析する事で、３種類の原料の複合体（ＨＬＡ−モノマー）の検出が可能になる。一方、ＨＬＡとペプチドの結合力が無い場合は、ＨＬＡ−モノマーは殆ど検出されない。従って、フォールディング溶液を経時的に分析する事で、或いは熱処理等を行う事で、ＨＬＡとペプチドの結合性と安定性を検証する事が可能である。本明細書においては、この試験を「フォールディングテスト」という。
上記合成した１１種類のペプチドを用いてフォールディングテストを実施した。簡潔には、大腸菌発現系を利用して発現精製したＨＬＡ−Ａ＊２４：０２（６０ｍｇ／Ｌ）、β２−ミクログロブリン（２０ｍｇ／Ｌ）、およびＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（３０μＭ）をフォールディング溶液（１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ＭのＥＤＴＡ、２Ｍのアルギニン、５ｍＭのＧＳＨ、０．５ｍＭのＧＳＳＧおよびプロテアーゼ阻害剤）に添加（括弧内の濃度はいずれも終濃度）して混合後、経時的にフォールディング溶液を分取し、ゲル濾過カラムにて分析を行った。９個のアミノ酸からなる陽性コントロールペプチド（配列番号４０）と、１０個のアミノ酸からなる陽性コントロールペプチド（配列番号４１）、およびそれぞれの陰性コントロール（配列番号４２および４３）を比較対象に用いた。
【０１２４】
結果を図１１に示す。ゲル濾過カラム分析の結果では、ＨＬＡ分子とβ２−ミクログロブリンは、大腸菌発現系を利用して発現精製する際に、８Ｍ尿素で可溶化されているが、難溶性であるＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−モノマー形成に至らないものが凝集体として７〜８分に検出され、次にＨＬＡ−モノマーのピークが１０分前後に検出され、β２−ミクログロブリンは１４分付近に検出される。１５分以降にはフォールディング溶液の成分やペプチドが検出される。したがって結果は、ＨＬＡ−モノマーの形成を示す１０分前後のピークのピーク面積を推定ＨＬＡ−モノマー形成量（ｍｇ）に換算した値を棒グラフで示したものである。
【０１２５】
（３）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−テトラマー試薬の製造
上記（２）のフォールディングテストの結果に基づき、配列番号１１以外の１０種のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を用いてＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬を製造した。本明細書において、製造したＨＬＡ−テトラマー試薬は例えばＫＹＡ−Ｔｅｔなどの略号で示すが、これは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とペプチドＫＹＡ（ＫＹＡＳＶＥＡＳＫＬ）とβ２−ミクログロブリンの３者複合体を用いて製造されたものを示す。簡潔には、上記（２）と同様に、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とβ２−ミクログロブリン、およびＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドをフォールディング溶液に添加して混合し、ＨＬＡ−モノマーを形成させた。ここで、組換えＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子のＣ末端側にビオチン結合部位が付加されるように発現タンパク質を設計しておき、ＨＬＡ−モノマー形成後、当該部位にビオチンを付加した。色素標識されたストレプトアビジンおよび上記ビオチン化ＨＬＡ−モノマーをモル比１：４で混合し、ＨＬＡ−テトラマー試薬を得た。
【０１２６】
（４）ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保持していることがわかっている健康な成人７名から末梢血を採取し、３，０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心処理して上清の血漿部分を回収した。血漿部分以外から、密度勾配遠心法にてＰＢＭＣを分離した。９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレート（BECTON DIKINSON社）の各ウェルに、Ｈｅｐｅｓ改変ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma社）に２−メルカプトエタノール（最終濃度５５μＭ）、Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、抗生物質としてストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）とペニシリンＧ（最終濃度１００Ｕ／ｍＬ）および５％の血漿成分を加えた培地を１０ｍＬおよび上記で分離したＰＢＭＣを約３×１０５個／ウェル入れ、浮遊させて培養した。これに１０μｇ／ｍＬの濃度で配列番号１１以外の上記ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを加えた。２日間培養後、５０Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２を添加し、さらに２週間培養した。
【０１２７】
上記培養細胞の適量に対して、１０μＬのＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬と、２０μＬのＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体を加え、穏やかに混合し、４℃にて３０分静置した。１．５ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターにて解析した。
解析は２段階で行った。まず１段階目は、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの縦列の８ウェル分の細胞を１サンプルとして回収し、このサンプル中のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。この段階でＣＴＬ誘導が確認されたサンプルについて、２段階目の解析を行った。２段階目は、１サンプルとした８ウェルから個別に細胞を回収し、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。
【０１２８】
図１２−１は、検体番号Ａ２４−３８のＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号１０で１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。図はＸ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＨＬＡ−テトラマー試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で表されており、ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）、ＬＲ（右下）と表記した場合、（ＵＲ＋ＬＲ）分のＵＲの百分率、すなわちＣＤ８陽性である細胞のうちＨＬＡ−テトラマー陽性の細胞の割合を示す。ＲＭＭ−Ｔｅｔで、配列番号１０の特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、検体番号Ａ２４−３８で明らかなＣＤ８陽性ＲＭＭ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団がレーン２、レーン４、レーン８、レーン９のＵＲに検出された。この事は、配列番号１０のペプチドがＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２４−３８の生体内にＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬが存在した事を示している。
【０１２９】
図１２−２は、第一段階でＣＴＬの誘導が確認されたレーン２、レーン４、レーン８、レーン９についてのさらなる解析結果である第二段階の結果を表す。レーン２のＨ、レーン４のＧとＨ、レーン８のＦ、レーン９のＡウェルにて、ＲＭＭペプチド（配列番号１０）特異的ＣＴＬが検出された。この事は、ＲＭＭペプチドがＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性を示すＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドである事を証明している。９６ウェル中５ウェルでＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝５／（３×１０７×０．１８）
＝９．２６×１０−７
【０１３０】
（５）抗原提示細胞の調製
Kuzushima et al., Clin Exp Immunol. 1996;103:192-198に記載の方法にしたがって、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株（以下ＥＢＶ感染ＬＣＬと称する）を樹立した。簡潔には、ＥＢＶ産生細胞株であるＢ９５−８細胞（JCRB Cell Bankより入手）の培養上清（生ＥＢＶウイルスを含む）とＰＢＭＣを混合培養してＥＢＶ感染ＬＣＬを得た。
【０１３１】
（６）ＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬの機能解析
（４）で誘導したＰＢＭＣの１／２量を９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートに移し、ＲＭＭペプチドを最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように加えた。さらにブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように加え、５％ＣＯ２恒温槽にて３７℃で５〜１６時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、ＰＥ（フィコエリスリン）標識ＨＬＡ−テトラマー試薬とＰＣ５（フィコエリスリン−Ｃｙ５）標識ＣＤ８抗体（Beckman Coulter社）を加え、室温にて１５〜３０分放置した。洗浄後、４％ホルムアルデヒドにて、４℃、１５分固定後、過剰量の洗浄液にて洗った。０．１％サポニンにて膜透過処理後、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（ＭＢＬ社製）を加え、室温にて１５〜３０分反応させた。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、Ｔ細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率あるいはＨＬＡ−テトラマー試薬陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量した。
【０１３２】
結果を図１３に示す。ＲＭＭペプチドで刺激された場合にのみ、ＵＲにＩＦＮγ陽性ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性細胞が出現し、ＲＭＭペプチドを加えない場合は殆ど出現しなかった。このことからＲＭＭペプチドで刺激した場合に、ＲＭＭ−Ｔｅｔが特異的に反応するＣＴＬが誘導されていることがわかる。この結果より、ＲＭＭペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、再刺激によりＩＦＮγを産生する細胞傷害性活性を有するＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬが誘導され、この細胞はＨＬＡ−テトラマー試薬で染色されることからＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性ＢＯＲＩＳ由来ペプチドであるＲＭＭペプチド（配列番号１０）に特異的なＣＴＬであることが明らかになった。
【０１３３】
（７）ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５特異的ＣＴＬの誘導
ＰＨＡブラスト細胞の調製の際に配列番号１０のペプチド（ＲＭＭペプチド）を用いた以外は例３（６）と同様の手順を用いて、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２または、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保持していることがわかっている健康な成人からＢＯＲＩＳ  ｓｆ５特異的なＣＴＬの誘導をおこなった。
【０１３４】
誘導したＣＴＬを、例３（５）と同様の方法で染色し、サンプル中のＢＯＲＩＳ  ｓｆ５特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。
【０１３５】
図２９は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を保持している検体番号Ａ２４−Ｓ４または、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保持している検体番号Ａ２−Ｓ５のＰＢＭＣをＲＭＭペプチド（配列番号１０）提示細胞と２８日間共培養した細胞集団の分析結果である。検体番号Ａ２４−Ｓ４とＡ２−Ｓ５におけるＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬ誘導の有無の確認は、ＲＭＭペプチドを用いて、それぞれの検体が保有するＨＬＡの型に対応して製造したＨＬＡテトラマー試薬を用いて解析した。その結果、検体番号Ａ２４−Ｓ４とＡ２−Ｓ５ともに明らかなＣＤ８陽性ＲＭＭ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団を検出した。このことは、配列番号１０のペプチドがＢＯＲＩＳ  ｓｆ５特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２４−Ｓ４とＡ２−Ｓ５の生体内にＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。また配列番号１０のペプチドがＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の両方のＨＬＡ型との結合性を有することが判明した。
【０１３６】
ＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬの機能解析は、ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ（ＢＤ社）キットを用いて、例３（７）と同様の手順で行い、ＲＭＭペプチド特異的ＣＴＬが分泌したＩＦＮγをスポット化して測定した。
【０１３７】
図３０は、スポット数を棒グラフで表した結果を示す。ネガティブコントロールのＨＩＶ由来ペプチド（検体Ａ２４−Ｓ４にはＲＹＬペプチド、検体Ａ２−Ｓ５にはＳＬＹペプチド）を加えた場合、またはペプチドを加えない場合（ＰＢＳ）と比較して、ＲＭＭペプチドで刺激した場合は、スポット数が、明らかに多く検出された。
【０１３８】
（８）ＲＭＭペプチドの解析
ＲＭＭペプチドは、ＢＯＲＩＳ  Ｂ１アイソフォームの６７０〜６７８番目のアミノ酸である。ここで、ＢＯＲＩＳ  Ｂ１はＢＯＲＩＳのサブファミリー５に属する、７００アミノ酸からなるアイソフォームであり、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５はＣ末端側の１３２アミノ酸、とくにＣ末端側３８アミノ酸（配列番号２）にサブファミリー特異的配列を有することが知られていることから、ＲＭＭペプチドはＢＯＲＩＳ  ｓｆ５に特異的な配列であり、本発明によりＢＯＲＩＳ  ｓｆ５を特異的に発現することが見いだされた卵巣癌由来のがん幹細胞も標的にすることができるＣＴＬを誘導可能なエピトープペプチドである。
【０１３９】
例５．ＢＯＲＩＳ  Ｃ１アイソフォームについての検討
（１）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ結合性エピトープ候補の抽出
分析対象のＢＯＲＩＳとしては、ＢＯＲＩＳ  Ｃ１アイソフォーム（サブファミリー１、配列番号７６）を用い、ＨＬＡ型としてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を用いた以外は例３（３）と同様にして、ＢＯＲＩＳ特異的なＨＬＡ結合性エピトープ候補を抽出した。合成したペプチドを以下に示す。
【０１４０】
【表６】
2016047715.tif 000008
【０１４１】
表７は、合成したＢＯＲＩＳのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性ペプチドの特徴を示す。合成したペプチドのＮ末端側から３から４つのアミノ酸配列をペプチド名とした略号で示す。左から、ペプチド名、アミノ酸配列、ＢＯＲＩＳ  Ｃ１アイソフォームアミノ酸配列上の位置、アミノ酸数、解析に用いたSYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm）のEPITOPE PREDICTION（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）で算出されたスコアを示した。このスコアは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子とペプチドの構造モチーフでＨＬＡとペプチドの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、ＨＬＡとペプチドが安定した複合体を形成する可能性があることを意味する。
【０１４２】
【表７】
2016047715.tif 000009
【０１４３】
（２）ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテスト
表７のとおり合成した１１種類のペプチドを用いてフォールディングテストを実施した。フォールディングテストは、ＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を用い、エピトープ候補ペプチドとして上記表７に記載のものを用い、陽性コントロールペプチドに配列番号５８のペプチドおよび陰性コントロールに配列番号５９のペプチドを比較対象として用いたこと以外は、例４（２）と同様の方法を用いて行った。
【０１４４】
その結果を図３３に示す。結果は、例４（２）と同様に、推定ＨＬＡ−モノマー形成量（ｍｇ）に換算した値を示す。その結果、配列番号５５を除く、配列番号４７から配列番号５７の１０種類のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドにおいて、陰性コントロールと比較して十分なＨＬＡ−モノマー形成が認められた。すなわち、ＭＡＡペプチド以外の表７に掲載したＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１と結合することが示された。
【０１４５】
（３）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−テトラマー試薬の製造
（２）のフォールディングテストの結果に基づき、配列番号５５を除く、配列番号４７から配列番号５７の１０種類のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を用いた以外は例４（３）と同様の手順にてＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬を製造した。
【０１４６】
（４）ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を保持していることがわかっている健康な成人４名を対象とし、配列番号５５を除く、配列番号４７から配列番号５７のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを用いた以外は例３（５）と同様の方法でＣＴＬの誘導を行った。
【０１４７】
ＣＴＬの誘導をした細胞集団は、例３（５）と同様の方法でＣＴＬの誘導の有無を確認した。ＣＴＬの染色は、誘導の際に用いたＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドに対応するＨＬＡ−テトラマー試薬を用いて行った。以下に、ＣＴＬの誘導が確認された代表的な結果を示す。
【０１４８】
図３４は検体番号Ａ２−２９、図３６は検体番号Ａ２−２７、図３８は検体番号Ａ２−３４から採取したＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号４７と１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＶＬＥ−Ｔｅｔで、配列番号４７の特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、明らかなＣＤ８陽性ＶＬＥ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団が検体番号Ａ２−２９でレーン１０に、検体番号Ａ２−２７でレーン３に、検体番号Ａ２−３４でレーン４のＵＲに検出された。このことは、配列番号４７のペプチドがＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−２９、検体番号Ａ２−２７、検体番号Ａ２−３４の生体内にＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１４９】
図３５、図３７，図３９，は、第一段階でＣＴＬの誘導が確認されたレーンの第二段階の結果を表す。図３５では、レーン１０のウェルＨにて、図３７では、レーン３のウェルＥにて、図３９では、レーン４のウェルＣにてＶＬＥペプチド（配列番号４７）特異的ＣＴＬが検出された。このことは、ＶＬＥペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。いずれの検体においても、９６ウェル中１ウェルでＶＬＥペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＶＬＥペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＶＬＥペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝１／（３×１０７×０．１８）
＝１．８５×１０−７
【０１５０】
図４０は、検体番号Ａ２−２９から採取したＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号４８と１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＫＬＡ−Ｔｅｔで、配列番号４８の特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、明らかなＣＤ８陽性ＫＬＡ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団が検体番号Ａ２−２９でレーン２、レーン５、レーン１１のＵＲに検出された。このことは、配列番号４８のペプチドがＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−２９の生体内にＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１５１】
図４１は、第一段階でＣＴＬの誘導が確認されたレーンの第二段階の結果を表す。図４１では、レーン２のウェルＨ、レーン５のウェルＤ、レーン１１のウェルＦにてＫＬＡペプチド（配列番号４８）特異的ＣＴＬが検出された。このことは、ＫＬＡペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。９６ウェル中３ウェルでＫＬＡペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＫＬＡペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＫＬＡペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝３／（３×１０７×０．１９）
＝５．２６×１０−７
【０１５２】
図４２は、検体番号Ａ２−２９から採取したＰＢＭＣをＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの配列番号５７と１３日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＶＬＴ−Ｔｅｔで、配列番号５７の特異的ＣＴＬの誘導を確認したところ、明らかなＣＤ８陽性ＶＬＴ−Ｔｅｔ陽性の細胞集団が検体番号Ａ２−２９でレーン７、レーン９のＵＲに検出された。このことは、配列番号５７のペプチドがＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであり、検体番号Ａ２−２９の生体内にＢＯＩＲＳ特異的ＣＴＬが存在したことを示している。
【０１５３】
図４３は、第一段階でＣＴＬの誘導が確認されたレーンの第二段階の結果を表す。図４３では、レーン７のウェルＡ、レーン９のウェルＧにてＶＬＴペプチド（配列番号５７）特異的ＣＴＬが検出された。このことは、ＶＬＴペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性を示すＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。９６ウェル中２ウェルでＶＬＴペプチド特異的ＣＴＬが検出されたことから、ＶＬＴペプチド特異的ＣＴＬの末梢血ＰＢＭＣ中での存在比率は以下の式で算出される。
ＶＬＴペプチド特異的ＣＴＬの頻度
＝（ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性ウェル数）／（実験に用いたＰＢＭＣの数×誘導前のＣＤ８陽性率）
＝２／（３×１０７×０．１９）
＝３．５１×１０−７
【０１５４】
（５）ペプチド特異的ＣＴＬの機能解析
検体Ａ２−２９から誘導したＫＬＡペプチド特異的ＣＴＬ含むＰＢＭＣまたは、検体Ａ２−２９から誘導したＶＬＴペプチド特異的ＣＴＬを含むＰＢＭＣを９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートに、約３×１０６個となるように各２ウェル分移した。ＫＬＡペプチド特異的ＣＴＬを含むＰＢＭＣにはＫＬＡペプチド、ＶＬＥペプチド特異的ＣＴＬを含むＰＢＭＣには、ＶＬＥペプチドを最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように２ウェルのうち、１ウェル分に加え、もう１ウェルは未処理のウェルとして準備をした。さらに、抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣ標識抗体とモネンシンをペプチド添加ウェル、未処理ウェルともに加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で、４時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、それぞれのペプチドに対応したＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬とＰＣ５（フィコエリスリン−Ｃｙ５）標識抗ＣＤ８抗体（Beckman Coulter社）を加え、室温にて１５〜３０分放置した。過剰量の洗浄液にて洗い、フローサイトメーターを用いて、ＣＴＬの脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａを検出し陽性細胞率を算出した。ＣＴＬは、パーフォリン、グランザイムなどの細胞傷害性因子を放出する際に、細胞内顆粒内膜に存在するＣＤ１０７ａを細胞膜上に表出することが知られており、ＣＤ１０７ａ分子を検出することで、細胞傷害因子の放出を間接的に調べることができる。
【０１５５】
結果を図４４、図４５に示す。図４４では、ＫＬＡペプチドで刺激された場合にのみ、ＵＲにＣＤ１０７ａ陽性ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性細胞が出現し、ＫＬＡペプチドを加えない場合は殆ど出現しなかった。このことからＫＬＡペプチドで刺激した場合に、ＫＬＡ−Ｔｅｔが特異的に反応するＣＴＬが誘導されていることがわかる。また、図４５では、ＶＬＴペプチドで刺激された場合にのみ、ＵＲにＣＤ１０７ａ陽性ＨＬＡ−テトラマー試薬陽性細胞が出現し、ＶＬＴペプチドを加えない場合は殆ど出現しなかった。このことからＶＬＴペプチドで刺激した場合に、ＶＬＴ−Ｔｅｔが特異的に反応するＣＴＬが誘導されていることがわかる。この結果より、ＫＬＡペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中また、ＶＬＴペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、再刺激によりグランザイムやパーフォリンを産生する細胞傷害性活性を有するＣＴＬが誘導されることがわかった。また、このＣＴＬはＨＬＡ−テトラマー試薬で染色されることからＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性ＢＯＲＩＳ  Ｃ１由来ペプチドであるＫＬＡペプチド（配列番号４８）または、ＶＬＴペプチド（配列番号５７）に特異的なＣＴＬであることが証明された。
【０１５６】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の検討結果のまとめを表８に示す。
【表８】
2016047715.tif 000010
【０１５７】
（６）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１結合性エピトープ候補の抽出
上記例３（３）と同様に、ＢＯＲＩＳ特異的なＨＬＡ結合性エピトープ候補を抽出した。ただし、日本人を含む東南アジアでは第３位の保有率を示すＨＬＡ−Ａ＊１１：０１に結合性を有するエピトープの候補を抽出した点のみ異なる。抽出したエピトープ候補のペプチド配列を合成し、その配列を表９−１に示し、コントロールペプチドを表９−２に示す。
【０１５８】
【表９−１】
2016047715.tif 000011
【表９−２】
2016047715.tif 000012
【０１５９】
表９−１は、合成したＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１結合性エピトープ候補の特徴を示す。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、Ｎ末端より２番目の位置にＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌのいずれかが配置され、９番目あるいは１０番目の位置にＬｙｓまたはＡｒｇのいずれかが配置さされることが多いことが知られている。またそのペプチドの長さは、９から１０個のアミノ酸からなるものがよく知られている（Rapin N et al., Curr Protoc Immunol. 2010;Chapter 18:Unit 18.17参照）。合成したペプチドのＮ末端側から３から４つのアミノ酸配列をペプチド名とした略号で示す。左から、ペプチド名、アミノ酸配列、ｓｆ５に属するＢＯＲＩＳ  Ｂ１アイソフォームおよび／またはｓｆ６に属するＣ７／Ｃ９アイソフォームのアミノ酸配列上の位置、アミノ酸数、解析に用いたＮｅｔＭＨＣ３．４（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/）のHLA Peptide Binding Predictionsで算出されたスコアを示した（Nielsen et al., Protein Sci. 2003;12:1007-1017、Lundegaard et al., Nucleic Acids Res. 2008;36 (Web Server issue):W509-512、Lundegaard et al., Bioinformatics. 2008;24:1397-1398参照）。このスコアは、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１とペプチドとの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、ＨＬＡとペプチドが安定した複合体を形成する可能性があることを意味する。なお表９−１、９−２に示したＮｅｔＭＨＣ  ３．４のスコアは、分析に用いた１１種類の分析ソフトで得られた代表例として示す。
【０１６０】
（７）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテスト
表９−１のとおり合成した１３種類のペプチドを用いてフォールディングテストを実施した。フォールディングテストは、ＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ＊１１：０１を用い、エピトープペプチドとして表９−１に記載のものを用い、陽性コントロールペプチドに配列番号７３のペプチドおよび陰性コントロールに配列番号４０のペプチドを比較対象に用いたこと以外は、例４（２）と同様の方法を用いて行った。
【０１６１】
１５種類のペプチドに対して実施したフォールディングテストの１、３、７日後の分析結果を図４６に示した。陽性コントロールペプチドとして、ＣＭＶのｐｐ６５タンパク質由来ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ペプチド（ＡＴＶペプチド、配列番号７３）、陰性コントロールとして、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−２Ｂ由来ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性ペプチド（ＡＹＡペプチド、配列番号４０）を比較対象に用いた。ＨＬＡ−モノマー形成を示すピークの面積を棒グラフで示した。その結果、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号６０から配列番号７２）は、陰性コントロールと比較して、十分なＨＬＡ−モノマー形成が認められた。すなわち、表９−１に掲載したＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１と結合することが示された。
【０１６２】
（８）ＢＯＲＩＳ特異的ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＨＬＡ−テトラマー試薬の製造
（７）のフォールディングテストの結果に基づき、例４（３）と同様の手順にてＰＥ標識ＨＬＡ−テトラマー試薬を製造した。但し、エピトープペプチドとして配列番号６０から配列番号７２の１３種類のＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを用い、ＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ＊１１：０１を用いた。その結果、配列番号６８ではＨＬＡ−テトラマー試薬の製造ができなかった。したがって配列番号６８を除く配列番号６０から配列番号７２のＣＴＬエピトープ候補ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊１１：０１をもつ１２種類のＨＬＡ−テトラマー試薬を製造した。
【０１６３】
（９）ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１を保持していることがわかっている健康な成人２名を対象とし例３（５）と同様の手順で、ＣＴＬの誘導を行った。ただし、エピトープペプチドとして、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＣＴＬエピトープ候補を４種類ずつ混合した４種類混合ペプチド１（配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６および配列番号７０）または、４種類混合ペプチド２（配列番号６１、配列番号６４、配列番号６７および配列番号７１）または、４種類混合ペプチド３（配列番号６２、配列番号６５、配列番号６９および配列番号７２）を用いた。
【０１６４】
ＣＴＬの誘導を試みた細胞集団の解析は３段階で行った。まず１段階目は、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの縦列の８ウェル分の細胞を１サンプルとして回収した。このサンプルを誘導の際に用いた４種類混合ペプチドに対応したＨＬＡ−テトラマー混合試薬１（ＳＶＬ−Ｔｅｔ、ＮＴＨ−Ｔｅｔ、ＫＱＬ−ＴｅｔおよびＧＬＩ−Ｔｅｔ）または、ＨＬＡ−テトラマー混合試薬２（ＳＬＡ−Ｔｅｔ、ＣＳＹ−Ｔｅｔ、ＴＶＹ−ＴｅｔおよびＴＶＬ−Ｔｅｔ）または、ＨＬＡ−テトラマー混合試薬３（ＲＭＳ−Ｔｅｔ、ＧＴＭ−Ｔｅｔ、ＡＡＡ−ＴｅｔおよびＫＬＬＦ−Ｔｅｔ）で、例３（５）と同様の手順にて染色し、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。この段階でＣＴＬの誘導が確認されたサンプルについて、２段階目の解析を行った。２段階目は、１サンプルとした８ウェルから個別に細胞を回収し、このサンプルを、ＨＬＡ−テトラマー混合試薬１、２、または３で染色し、ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬの誘導の有無を確認した。３段階目は、２段階目でＣＴＬの誘導が確認されたウェルの細胞がＨＬＡ−テトラマー混合試薬のいずれのＨＬＡ−テトラマー試薬と反応するか、ＨＬＡ−テトラマー試薬を別々に用いてＣＴＬの検出を実施した。この方法を用いて、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの何処のウェルに、どのペプチドに特異性を有するＣＴＬが誘導されているのかを確認した。
【０１６５】
図４７は、１段階目の解析結果である。検体番号＊１１−１３のＰＢＭＣを４種類混合ペプチド１と１４日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＨＬＡ−テトラマー混合試薬１で例３（５）と同様の手順で染色したところ、明らかなＣＤ８陽性ＨＬＡ−テトラマー混合試薬１陽性の細胞集団がレーン１のＵＲに検出された。この結果は、検討に用いたＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補の中に、少なくとも１種類のＣＴＬエピトープが存在していること、また、検体番号Ａ＊１１−１３の生体内にＢＯＲＩＳ特異的なＣＴＬが存在していたことを示している。
【０１６６】
図４８は、第一段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン１の第二段階の解析結果を表す。レーン１のウェルＢ（１−Ｂ）にて、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１結合性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬの誘導を確認した。
【０１６７】
図４９は、第二段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン１のウェルＢの第三段階の解析結果を示す。結果は、ＫＱＬ−Ｔｅｔで染色した場合のみＣＴＬを確認した。このことは、ＫＱＬペプチド（配列番号６６）が、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。
【０１６８】
図５０は、１段階目の解析結果である。検体番号＊１１−１３のＰＢＭＣを４種類混合ペプチド２と１４日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＨＬＡ−テトラマー混合試薬２で例３（５）と同様の手順で染色したところ、明らかなＣＤ８陽性ＨＬＡ−テトラマー混合試薬２陽性の細胞集団がレーン１２のＵＲに検出された。この結果は、検討に用いたＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補の中に、少なくとも１種類のＣＴＬエピトープが存在していること、また、検体番号Ａ＊１１−１３の生体内にＢＯＲＩＳ特異的なＣＴＬが存在していたことを示している。
【０１６９】
図５１は、第一段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン１２の第二段階の解析結果を表す。レーン１２のウェルＥ（１２−Ｅ）にて、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１結合性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬの誘導を確認した。
【０１７０】
図５２は、第二段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン１２のウェルＥの第三段階の解析結果を示す。ＴＶＹ−Ｔｅｔで染色した場合のみＣＴＬを確認した。このことは、ＴＶＹペプチド（配列番号６７）が、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。
【０１７１】
図５３は、１段階目の解析結果である。検体番号＊１１−１６のＰＢＭＣを４種類混合ペプチド３と１４日間培養したものから採取したサンプルの、第一段階の分析結果を表す。ＨＬＡ−テトラマー混合試薬３で例３（５）と同様の手順で染色したところ、明らかなＣＤ８陽性ＨＬＡ−テトラマー混合試薬３陽性の細胞集団がレーン７とレーン１１のＵＲに検出された。この結果は、検討に用いたＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープ候補の中に、少なくとも１種類のＣＴＬエピトープが存在していること、また、検体番号Ａ＊１１−１６の生体内にＢＯＲＩＳ特異的なＣＴＬが存在していたことを示している。
【０１７２】
図５４は、第一段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン７とレーン１１の第二段階の解析結果を表す。レーン７のウェルＥ（７−Ｅ）、レーン１１のウェルＨ（１１−Ｈ）にて、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬの誘導を確認した。
【０１７３】
図５５は、第二段階の解析でＣＴＬの誘導が確認されたレーン７のウェルＥ、レーン１１のウェルＨの第三段階の解析結果を示す。レーン７のウェルＥは、ＧＴＭ−Ｔｅｔで染色した場合のみ、レーン１１のウェルＨは、ＫＬＬＦ−Ｔｅｔで染色した場合のみＣＴＬを確認した。このことは、ＧＴＭペプチド（配列番号６５）およびＫＬＬＦペプチド（配列番号７２）が、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１拘束性ＢＯＲＩＳ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることを証明している。
【０１７４】
例６．ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびｓｆ６の特異抗体の調製
ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異抗体を取得する目的で、配列番号１および配列番号２からそれぞれ８〜２０個のアミノ酸で構成されるペプチド配列を合成し、このペプチドのC末端またはN末端にシステイン残基を付加し、定法に従ってＫＨＬ（Keyhole limpet hemocyanin）を結合させて免疫原に用いた。ウサギおよびモルモットに、隔週で、または毎週、４〜６回免疫した。免疫終了後、各個体から採血し、これを免疫原に用いたペプチドで作製したアフィニティーカラムにより精製して特異抗体を得た。
特異性の検証は、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６をそれぞれ一過性に発現させた培養細胞２９３Ｔの細胞抽出液と未処理の２９３Ｔ細胞の細胞抽出液を用いて実施した。一過性に発現させたＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６の遺伝子にはＭｙｃ  Ｔａｇ配列を付加しており、これに特異的なＭｙｃ  Ｔａｇ抗体を用いて陽性コントロールとした。
【０１７５】
図５６に示す通り、ウェスタンブロッティングでの検証の結果、得られたＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６特異抗体は、それぞれのＢＯＲＩＳ発現２９３Ｔ細胞の抽出液を用いた場合は、どちらも陽性コントロールで検出されたバンドと同じ分子サイズを示す位置にバンドが検出されたのに対し、未処理の２９３Ｔ細胞抽出物ではどちらもバンドが検出されなかった。このことから、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６にそれぞれ特異的に結合する抗体が取得できたと考えられた。なお、肺癌患者から切除された癌患部組織切片をＢＯＲＩＳ  ｓｆ５特異抗体で染色した場合、陰性と判定される場合と陽性と判定される場合があることが判明した（図５７参照）。得られた特異抗体をもちいる事で、ＢＯＲＩＳ  ｓｆ５およびＢＯＲＩＳ  ｓｆ６のそれぞれの発現有無の確認が可能であり、本発明で同定されたＣＴＬエピトープペプチドを用いたペプチドワクチン療法等の適応可否を判断する有力なツールになり得ることが示された。
【０１７６】
例７．ＢＯＲＩＳ  ｓｆ６に対するｓｉＲＮＡの調製
（１）ｓｉＲＮＡの設計
下表に示すような配列を有するよう設計したＢＯＲＩＳに対するｓｉＲＮＡを、Lipofectamine RNAiMAXを用いるメーカーの使用説明書に記載のプロトコールに従って、ＭＳ７５１およびＣａＳｋｉの夫々にトランスフェクションした。細胞を、トランスフェクション後４８時間で解析した。陰性対照としてTrilencer-27 Universal Scrambled Negative Control siRNA（SR30004、Origene）を用いた。
【表１０】
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【０１７７】
ノックダウンした結果を、図１４および１５に示す。図１４−１（ａ）は、３種のｓｉＲＮＡによって、ＢＯＲＩＳ（Ｂ０）の発現レベルが顕著に抑制されていることを示す（定量ＲＴ−ＰＣＲ）。また、図１４−１（ｂ）および図１４−２から、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２で、若干の細胞増殖抑制が観察された。おそらく、抑制しているＢＯＲＩＳサブファミリーの数が多いほど、増殖抑制効果が高いものと考えられる。ただし、ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２では、幹細胞性遺伝子の抑制が全く生じていなかった（図１５）。
また、図１６−１および１６−２に示すように、ＣａｓＫｉおよびＭＳ７５１の夫々におけるスフェア形成能については、ｓｉＲＮＡ２で顕著に抑制されていた（細胞増殖抑制の結果とは必ずしも一致しない）。
さらに、ｓｉＲＮＡ１〜３のノックダウンは放射線耐性に関係しなかった（図１７）。
図１８から、ＢＯＲＩＳ発現が高いと生存率が著しく低くなることがわかる。それゆえ、ＢＯＲＩＳは有意な予後不良因子と認められる。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明により、様々な癌に対して有効な治療剤を提供することができる。特に本発明のエピトープペプチドにより誘導されるＣＴＬは、種々のがん細胞、とくに悪性腫瘍の原因とされているがん幹細胞を特異的に攻撃することができるＣＴＬを誘導することが可能であり、副作用が少なく効果の高い抗がん剤として非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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