(57)【要約】  本発明は、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーを提供することを目的とする。具体的には、体外に取り出された、動物雄個体の精母細胞または精子のＨ３Ｋ７９ｍｅ３をマーカーとし、雄個体から採取された精母細胞または精子において、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを調べると、雄個体のＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルが低いほど、次世代の個体の自閉症発症または自閉症様行動発生の確率が高くなる。
2016080416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーであって、
体外に取り出された、動物雄個体の精母細胞または精子のＨ３Ｋ７９ｍｅ３である、マーカー。
【請求項２】
前記行動が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動である、請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
動物雄個体における次世代の個体の行動を予測する方法であって、
前記雄から採取された精母細胞または精子における、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを調べる工程を含む、方法。
【請求項４】
前記行動が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症スペクトラム障害とは、社会的相互交渉の質的異常、コミュニケーションの質的異常、および興味の限局と反復的行動のパターンを特徴とする発達障害群である。【０００３】
これまで、自閉症スペクトラム障害モデルマウスを確立するための基準作りが行われており、例えば社会的相互作用の質的欠如を示すための試験として３チャンバー社会的相互作用試験、コミュニケーションの異常を調べるための試験として超音波啼鳴反応試験、また固執性に対してはモリス水迷路などを用いた逆転学習試験などが提唱されてきた。そして、これらを用いて、実際に自閉症スペクトラム障害モデルマウスが作製されている（生化学  第８３巻９号  ８４１−８４５頁  ２０１１年）。【０００４】
自閉症スペクトラム障害の原因は完全には明らかで無いが、先天的な脳の機能障害であるとされている。ヒトでは、子供を持ったときの父親の年齢と子供の自閉症スペクトラム障害などの精神疾患のかかりやすさに相関があることが報告されている（D'Onofrio BM et al. “Paternal age at childbearing and offspring psychiatric and academic morbidity.” JAMA Psychiatry 2014 vol.71 p.432-438.；Reichenberg A et al. “Advancing paternal age and autism.” Arch Gen Psychiatry 2006 vol.63 p.1026-1032.）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、動物雄個体における、次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、動物雄個体から採取された精母細胞または精子において、核タンパクであるヒストン３の７９位のリジンのトリメチル化レベルを調べると、雄個体のトリメチル化レベルが高いほど、次世代の個体の自閉症発症または自閉症様行動発生の確率が高くなることを見いだし、本発明を完成させた。【０００７】
本発明の一実施態様は、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーであって、体外に取り出された、動物雄個体の精母細胞または精子のＨ３Ｋ７９ｍｅ３である、マーカーである。前記行動が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動であってもよい。【０００８】
本発明の他の一実施態様は、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測する方法であって、前記雄から採取された精母細胞または精子における、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを調べる工程を含む、方法である。前記行動が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動であってもよい。【０００９】
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１４年１１月１８日付で出願した日本国特許出願２０１４−２３３８２３に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施例において、親マウス（雄）の月齢とＨ３Ｋ７９ｍｅ３のレベルとの相関関係を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、親マウス（雄）におけるＨ３Ｋ７９ｍｅ３のレベルと次世代の仔マウスの行動との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
（１）動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカー
本発明の予測マーカーは、体外に取り出された（isolated）、雄の精母細胞または精子のＨ３Ｋ７９ｍｅ３である。Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３は、７９番目のリジンがトリメチル化体されたヒストンＨ３であって、抗Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３抗体などによって容易に検出可能である。Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルによって、次世代の個体の行動を予測することができる。ここで、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルとは、ヒストンＨ３分子のなかで、７９番目のリジンがトリメチル化されている割合を意味し、絶対値で表されても、何らかの個体におけるＨ３Ｋ７９ｍｅ３メチル化レベルを基準にした相対値で表されてもかまわない。
【００１５】
ここで、次世代に対し、予測対象の行動は、自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動が例示できる。
【００１６】
雄の由来となる動物は特に限定されないが、脊椎動物であってもよく、ほ乳類であってもよく、齧歯類や霊長類であってもよく、特にマウス、ラット、ハムスター、サル、マーモセットなどの実験動物であることが好ましく、ヒトが最も好ましい。
【００１７】
（２）動物個体における次世代の個体の行動を予測するための方法
本発明の予測方法は、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測する方法であって、雄から採取された精母細胞または精子における、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを測定する工程を含む。そして、得られたメチル化レベルを、標準雄個体における標準レベルと比較し、得られたメチル化レベルが標準レベルより高い場合に、標準雄個体の次世代個体より、次世代個体が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動を採りやすい、または自閉症スペクトラムに罹患しやすいと判断する。自閉症スペクトラム様の行動とは、自閉症スペクトラムに罹患していない個体が、自閉症スペクトラムに罹患した個体と同じ行動を採る場合の、その行動のことを意味する。
【００１８】
標準雄個体における標準レベルは、当業者の定法に従って決定すればよく、例えば、あらかじめ決定されている標準レベル並びに標準レベル範囲またはその場でサンプルと同時に測定した標準サンプルのメチル化レベルであってもよい。
【００１９】
例えば、予測する対象の雄と同年代の雄を標準雄個体とするとき、その１以上の個体のメチル化レベルまたはその平均を予め調べておいて、それを標準レベルとしてもよい。具体的には、その平均からある程度の範囲（例えば、誤差や標準偏差）を採って、その範囲を標準レベルとしてもよく、得られたメチル化レベルの値がカバーする範囲を標準レベルとしてもよく、個体総数の一定の割合（例えば、８０％、９０％、９５％、９９％など）がおさまる範囲を標準レベルとしてもよい。また、同年代の１以上の雄のサンプルを、予測する対象の雄のサンプルと同時に処理し、同じ条件の下で測定することで、上記のような標準レベルを決定してもよい。対象の雄のメチル化レベルが標準レベルより高ければ、対象の雄の子供は、他の同年代の雄に比べ、自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動を採りやすいと判断できる。
【００２０】
標準雄個体を他の年齢の雄個体とすることもできる。その場合、あらかじめ、各年齢で、上記のような標準レベルを決めておき、検査対象の雄のメチル化レベルが、どの年齢の標準レベルに合致するかによって、検査対象の雄が、どの年齢の雄と同じ程度に、その子供が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動を採りやすいかを判断することができる。さらに、各年齢で、実際に、次世代の個体が、自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動を採る割合を調べておけば、検査対象の雄のメチル化レベルを測定しただけで、その雄個体の次世代の個体が、自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動を採る確率も推定できる。
【００２１】
Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルの測定方法は特に限定されず、常法に従って測定すれば良い。例えば、抗Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３抗体を用いたウエスタンブロット法に加えて、ＥＬＩＳＡ法、細胞染色法やフローサイトメトリー法等によって、精子中のメチル化レベルを測定することができる。
【実施例】
【００２２】
雄マウス（C57BL6/J、３ヶ月齢、６−８ヶ月齢、１２ヶ月齢以上、それぞれ３匹ずつ）より精子を採取し、氷上で、Laemmliサンプルバッファー（1xSDS、50mM DTT、1mM PMSF、protease inhibitor cocktail（Roch社）含有）中、ソニケーター（Microson社）を用いて（レベル１０、５秒、３回）溶解させた後、９５℃で１０分処理して変性させた。ＳＤＳアクリルアミド電気泳動でタンパク質を分離した後、ウエスタンブロッティングを行った。まず、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Hybond-P）にトランスファーし、一次抗体として、ウサギ抗Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３抗体（Abcam社）を用い、二次抗体として、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（ミリポア社）を用い、検出には、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare Life sciences社）を用いて、得られたシグナルをＣＣＤカメラで撮影した。その後、内部コントロールとしてｐａｎＨ３発現レベルを測定するため、メンブレンから、stripping buffer（100mM beta-mercaptoethanol、2% SDS、62.5mM Tris-HCl pH6.8）で抗体を外し、一次抗体としてウサギ抗ｐａｎＨ３抗体（Abcam社）を用いてＨ３Ｋ７９ｍｅ３と同様に抗体処理を行い、ｐａｎＨ３発現レベルを得た。このｐａｎＨ３発現レベルによって、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを標準化した。その後、３ヶ月齢の親マウス（雄）の平均メチル化レベルを１として、他の月齢の親マウス（雄）それぞれの平均相対値を算出したところ、６−８ヶ月齢の親マウス（雄）では、１．７０、１２ヶ月齢以上の親マウス（雄）では、４．１３となった。このように、親マウス（雄）の月齢とＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルは、ほぼ比例関係にあった（図１）。相関係数ｒは０.９９３、有意差ｐは０．００１未満であった（ｔ検定）。【００２３】
一方、それぞれの親マウス（雄）に由来する仔マウス（生後３ヶ月：１６匹、生後６−８ヶ月：１６匹、生後１２ヶ月以上：１７匹）の生後６日目の超音波発声を５分間測定し、それらの平均値を算出した。具体的には、仔マウスを母マウス及び兄弟マウスから１匹ずつ分離し、遮音した箱の中のディッシュの中に入れ、UltraSound Gate 416H detector set（Avisoft Bioacoustics社）に繋いだマイクで、２５−１２５ｋＨｚの音を５分間記録し、その回数を算定した。【００２４】
まず、親マウス（雄）のＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルと、仔マウスの超音波発声の回数の相関を調べたところ、図２に示すように、それらは反比例の関係にあり、相関係数ｒはマイナス０．９９８、有意差ｐは０．０２であった（t検定）。このように、親マウス（雄）の精子におけるＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルが高いほど、仔マウスの超音波発声の回数が減る。【００２５】
マウスにおける超音波発声の回数の減少は、自閉症のモデル行動とされており、従って、親マウス（雄）のＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルは、子の自閉症発症を予測するマーカーとなり得る。すなわち、親マウス（雄）のＨ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルが高いほど、子の自閉症行動または自閉症様行動の発生確率が高くなると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によって、動物雄個体における次世代の個体の行動を予測するための予測マーカーを提供することができるようになった。
【図１】
2016080416.tif 000003
【図２】
2016080416.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月16日(2016.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
動物雄個体における次世代の個体の行動を予測する方法であって、
前記雄から採取された精母細胞または精子における、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３のメチル化レベルを調べる工程を含む、方法。
【請求項４】
前記行動が自閉症スペクトラムまたは自閉症スペクトラム様の行動である、請求項３に記載の方法。
【国際調査報告】
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