(57)【要約】本発明は、抗原をコードするポリヌクレオチドを保有する抗原提示細胞を直接的に検出することによる、抗原の同定方法を提供する。 (1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、レポーター構築物を細胞に導入する工程であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものである、工程；および(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程を含み；蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択する方法による。
2014123231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を特定する方法であって：
(1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、レポーター構築物を細胞に導入する工程であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものである、工程；および
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程
を含み；
蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択する、方法。
【請求項２】
発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗原を特定する方法であって：
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程
を含み；
内在性のT細胞活性化マーカーの発現を指標に、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を選択する、方法。
【請求項５】
疾患関連抗原を特定するためのものである、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
がん特異的抗原を特定するためのものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入する細胞が、
(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞
である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗原候補をコードするポリヌクレオチドが、ライブラリー由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むレポーター構築物であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものが導入されているレポーター細胞であって、
抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入するために用い、蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択するための、レポーター細胞。
【請求項１０】
発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）である、請求項９に記載のレポーター細胞。
【請求項１１】
蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、請求項９または１０に記載のレポーター細胞。
【請求項１２】
疾患関連抗原を特定するためのものである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のレポーター細胞。
【請求項１３】
がん特異的抗原を特定するためのものである、請求項１２に記載のレポーター細胞。
【請求項１４】
レポーター構築物が導入されており、抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入する細胞が、
(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞
である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のレポーター細胞。
【請求項１５】
抗原候補をコードするポリヌクレオチドが、ライブラリー由来である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のレポーター細胞。
【請求項１６】
(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞であって、
抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入するために用い、
内在性のT細胞活性化マーカーの発現を指標に、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を選択するための、レポーター細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞受容体の抗原を同定するための方法および同定用のレポーター細胞に関する。本発明は、ライフサイエンスおよび医療の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
1991年にがん細胞に特異的な抗原が存在することが明らかになって以降、多くのがん特異的抗原が同定されてきた。これらの発見により、がん細胞も病原体と同様に、宿主（患者）の免疫によって排除されうることが明らかになり、がんの免疫療法が試みられるようになってきた。またがんに限らず、多くの疾患において、その疾患に関連した抗原が同定されれば、診断・治療の標的等としての応用が期待できる。【０００３】
抗原を同定するために、Buggenらは、がん細胞よりcDNAライブラリーを作製し、抗原提示細胞に遺伝子導入した。そして、遺伝子導入した抗原提示細胞と目的の抗原を認識するT細胞とを共培養し、T細胞が抗原により活性化されてサイトカインを分泌するか否かを指標に、抗原をコードするcDNAを特定した（非特許文献1）。また、Siewert らは、T細胞がTCRからの刺激により活性化されるとGFPを発現するようなレポーターT細胞を作製した。これにより、T細胞の活性化を単一細胞レベルで検出することが可能になった。そのため、cDNAライブラリーをグループ分けすることなく、抗原提示細胞に導入し、抗原cDNAが導入された1個の抗原提示細胞があれば、それに接触したT細胞を検出することが可能である。【０００４】
一方、T細胞はT細胞受容体（T cell receptor, TCR）をその細胞表面に発現しており、TCRを用いてウイルス感染細胞やがん細胞を認識し、免疫応答を惹起する。T細胞の抗原受容体であるTCRはウイルスや細菌の表面のタンパク質にそのままの形で結合・認識することはできない。T細胞はウイルスが感染した細胞でウイルス由来の蛋白が産生され、その蛋白が分解されたペプチドが、その細胞のMHC（主要組織適合遺伝子複合体）分子に結合した形で細胞表面に発現したものにTCRが結合することにより抗原を認識する。すなわち、T細胞を刺激・活性化するためには、抗原提示細胞が必要であることが知られている。この点、本発明者らは、T細胞の細胞表面にMHC分子が発現していることに注目し、1個の細胞のみ格納可能な大きさのマイクロウェル（特許文献1）に単独のT細胞を配し、抗原ペプチドを供給することにより、一つのT細胞上でTCRとMHC/ペプチド複合体とが相互作用してT細胞が刺激・活性化されることを見出している（特許文献2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2009-34047（特許4148367）
【特許文献２】特願2012-050018（本願の出願時には未公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Van der Buggen et al., A Gene Encoding an Antigen Recognized by Cytolytic T Lymphocytes on a Human Melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991
【非特許文献２】Katherina Siewert et al., Unbiased identification of target antigens of CD8+ T cells with combinatorial libraries coding for short peptides. Nature Medicine 18: 824-828, 2012
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Buggenらの方法では、cDNAライブラリーを数多くのグループに分け、少数のcDNAを導入した抗原提示細胞をT細胞と共培養し、サイトカインの分泌を測定する必要があった。そのため、時間と労力がかかり、簡単には抗原を同定することができなかった。またSiewertらの方法では、目的の抗原を提示する細胞ではなく、それに接触したレポーターT細胞が蛍光を発するので、目的の抗原cDNAが導入された抗原提示細胞の検出は間接的である。もし、ライブラリーの観察の途中でT細胞が動いてしまうと、目的細胞の同定・回収が困難になる。また、フローサイトメータを用いて目的細胞を単離することもできない。【０００８】
本発明は、抗原cDNAを保有する抗原提示細胞を直接的に検出することによる、抗原の同定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特願2012-050018は、T細胞の細胞表面に発現しているMHCクラスI分子に抗原ペプチドを結合させ、同じ細胞表面に発現しているT細胞受容体と結合させることで、T細胞を活性化できることを示している。そこで、今般我々は、この系を利用することを試みた。具体的には、内因性のTCRを発現していないTG40 T細胞株にIL2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）を接続したGFP遺伝子を導入した細胞（レポーターT細胞）を作製した（図1）。この細胞は、TCR遺伝子を導入することでTCRを発現させることができ、さらに、TCRが活性化されると、GFP分子が発現し、蛍光顕微鏡やフローサイトメータで直接的に特定できるものである。そして、このレポーターT細胞は、TCR遺伝子を導入することで目的の抗原に特異的なTCRを発現させることができ、さらに抗原cDNAを導入することにより、抗原が発現したT細胞では、抗原タンパク質が分解され、ペプチドとなり、MHCクラスI分子上に結合した結果、目的の抗原cDNAが導入された細胞であれば蛍光を発することとなる。このような細胞を用いると、抗原cDNAを保有する細胞を直接的に、単一細胞レベルで、さらにフローサイトメータを用いて、検出・分離できるようになる。【００１０】
本願は、以下を提供する。
[１]  抗原を特定する方法であって：
(1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、レポーター構築物を細胞に導入する工程であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものである、工程；および
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程
を含み；
蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択する、方法。
[２]  発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域 （IL2Ep）である、[１]に記載の方法。
[３]  蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、[１]または[２]に記載の方法。
[４]  疾患関連抗原を特定するためのものである、[１]〜[３]のいずれか一に記載の方法。
[５]  がん特異的抗原を特定するためのものである、[４]に記載の方法。
[６]  さらに
(3)目的の抗原に特異的なTCRをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程
含み、細胞上に発現している該TCRが、同じ細胞上のMHC分子-抗原候補結合体により刺激 される ものである、[１]〜[５]のいずれか一に記載の方法。
[７]  下記を含む、T細胞受容体（TCR）の抗原を特定するためのレポーター細胞：
(1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むレポーター構築物であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものであり；および
(2) 抗原候補をコードするポリヌクレオチドであって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、レポーター細胞であって、目的抗原をコードするポリヌクレオチドが導入されると、蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する、レポーター細胞。
[８]  発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）である、[７]に記載のレポーター細胞。
[９]  蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、[７]または[８]に記載の方法。
[１０]  疾患関連抗原を特定するためのものである、[７]〜[９]のいずれか一に記載の方法。
[１１]  がん特異的抗原を特定するためのものである、[１０]に記載の方法。
[１２]  さらに
(3)TCRをコードするポリヌクレオチド
を含み、細胞上に発現している該TCRが、同じ細胞上のMHC分子-抗原候補結合体により刺激されるものである、[７]〜[１１]のいずれか一に記載のレポーター細胞。【００１１】
本願はまた、以下を提供する。
[１]  抗原を特定する方法であって：
(1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、レポーター構築物を細胞に導入する工程であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものである、工程；および
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程
を含み；
蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択する、方法。
[２]  発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域 （IL2Ep）である、[１]に記載の方法。
[３]  蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、[１]または[２]に記載の方法。
[４]  抗原を特定する方法であって：
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示されるものである、工程
を含み；
内在性のT細胞活性化マーカーの発現を指標に、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を選択する、方法。
[５]  疾患関連抗原を特定するためのものである、[１]〜[４]のいずれか一に記載の方法。
[６]  がん特異的抗原を特定するためのものである、[５]に記載の方法。
[７]  抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入する細胞が、
(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞
である、[１]〜[６]のいずれか一に記載の方法。
[８]  抗原候補をコードするポリヌクレオチドが、ライブラリー由来である、[１]〜[７]のいずれか一に記載の細胞。
[９]  制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むレポーター構築物であって、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御するものが導入されているレポーター細胞であって、
抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入するために用い、蛍光タンパク質に由来する蛍光を発する細胞を、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞として選択するための、レポーター細胞。
[１０]  発現制御領域が、IL-2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）である、[９]に記載のレポーター細胞。
[１１]  蛍光タンパク質が、GFP、VENUSまたはmCherryである、[９]または[１０]に記載のレポーター細胞。
[１２]  疾患関連抗原を特定するためのものである、[９] 〜[１１]のいずれか一に記載のレポーター細胞。
[１３]  がん特異的抗原を特定するためのものである、[１２]に記載のレポーター細胞。
[１４]  レポーター構築物が導入されており、抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入する細胞が、
(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞
である、[９]〜[１３]のいずれか一に記載のレポーター細胞。
[１５]  抗原候補をコードするポリヌクレオチドが、ライブラリー由来である、[９]〜[１４]のいずれか一に記載のレポーター細胞。
[１６](a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞、または
(b)TCRを有さず、MHCとシグナル伝達分子ζ鎖の細胞内ドメインとを結合させたMHC/ζキメラ分子を有する細胞であって、
抗原候補をコードするポリヌクレオチドを導入するために用い、
内在性のT細胞活性化マーカーの発現を指標に、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を選択するための、レポーター細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、T細胞受容体の抗原の特定が省力化され、またそのために必要な時間が短縮される。
本発明の一の実施態様ではレポーターT細胞自身に抗原cDNAが導入され、検出可能となるので、目的の細胞は1個でもあればよい。そのため、従来法に比較して、感度が高いと期待できる。【００１３】
本発明の一の実施態様においては、検出可能なレポーターT細胞自身が抗原cDNAを保有し、また別の実施態様においては、検出可能なレポーター細胞は抗原提示細胞であるが、同様にレポーター細胞自身が抗原cDNAを保有しているので、直接的な同定方法であるということができる。また抗原cDNAを保有する細胞をフローサイトメータを用いて単離することができる。なお、Siewert らの方法においてもTCRからのシグナルにより、GFPタンパク質が産生され、蛍光の観察により刺激化T細胞が検出されるが、抗原cDNAはレポーターT細胞ではなく、抗原提示細胞に導入されている（図2）。抗原cDNAを有する抗原提示細胞に接触したレポーターT細胞が蛍光を発し、蛍光を発するレポーターT細胞に接触している抗原提示細胞を単離し、cDNAを回収する。抗原cDNAが導入された細胞自体は蛍光を発しないために、目的細胞の特定は間接的である。操作の途中でレポーターT細胞が目的抗原提示細胞から遊離してしまう可能性があり、また、フローサイトメータを用いては、目的抗原提示細胞を単離できない。本発明では、そのような不都合はない。本発明では、レポーターT細胞自身に抗原cDNAを導入するので、蛍光を発した細胞を回収すればよい。また、フローサイトメータを用いて目的細胞を回収できるため、Siewert らの方法に較べて正確性が向上し、操作もより簡便になる。【００１４】
本発明により、低い割合で存在する、例えば1,000個に1個の割合で存在する目的の抗原をコードするポリヌクレオチドであっても、特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】TCR抗原同定用レポーターT細胞（TG40_R1）。内因性のTCRを発現していないT細胞株（TG40）にIL2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）にGFP遺伝子を接続したものを遺伝子導入した細胞。それに、抗原ペプチドを結合させるMHC分子（ここではHLA-A24分子）と抗原を同定したいTCRを発現させている。この細胞に抗原タンパク質をコードするcDNAを遺伝子導入すると、タンパク質が細胞質で発現し、それが分解されペプチドになったものが、HLA-A24分子に結合して細胞表面に発現する。それを同じ細胞表面に発現しているTCRが認識してシグナルを伝達する。すると、IL2EpにNF-ATなどの転写因子が結合し、GFP遺伝子が発現し、GFPタンパク質が産生される。GFPの発現を蛍光顕微鏡あるいは、フローサイトメータで観察することにより、抗原cDNAが入っている細胞を同定・取得することができる。
【図２】Siewert ら（ Nature Medicine 18: 824-828, 2012）の方法。Tハイブリドーマ（58α−β−）細胞にTCR（CD3）からのシグナルでGFPが発現するレポーター遺伝子を導入した細胞を作製した。抗原提示細胞としてCOS-7細胞にHLA分子を発現させた細胞を用いている。この細胞にペプチドライブラリーを導入し、ペプチドを発現させ、HLA分子上に提示させる。その細胞をプレート上で培養し、その上に、抗原を同定したいTCRを発現させた58α−β−細胞由来レポーターT細胞を載せ培養する。抗原ペプチドをコードするcDNAが導入された抗原提示細胞に接触したレポーターT細胞はGFPを発現する。蛍光顕微鏡でGFPが発現したレポーターT細胞を検出し、そのT細胞が接触している抗原提示細胞をマイクロキャピラリーで回収する。
【図３】レポーター遺伝子。IL2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）の3’下流にGFP遺伝子が接続している。遺伝子導入のマーカーとしてCD23 cDNAが挿入されている。
【図４】レポーター遺伝子導入細胞。内因性のTCRを発現していないTG40  T細胞株にIL2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）を接続したGFP遺伝子（レポーター遺伝子）を導入した。遺伝子が導入された細胞はCD23分子が細胞表面に発現する。CD23分子の発現を指標にレポーター遺伝子が導入されたTG40細胞を選択した。図は、選択したTG40細胞を蛍光（APC）標識された抗CD23抗体で染色し、フローサイトメータにて解析したものである。CD23分子が陽性になっていることが確認された。
【図５】TCR刺激によりGFPが発現するレポーター細胞の樹立。（A）TCR遺伝子発現ベクター。核内で染色体に組み込まれずに複製するBCMG-neo（東京医科歯科大学  烏山博士より供与）ベクターにQ22 TCRのα鎖とβ鎖のcDNAを挿入したベクターを作製した。（B）TCR刺激によりGFPが発現するレポーター細胞。図4のレポーター遺伝子が導入されたTG40細胞に上のQ22 TCR_BCMG-neoベクターを導入し、CD3の発現を指標にQ22 TCRが発現したレポーター細胞を選択した。次に、その細胞をQ22 TCRの抗原であるBRLF1ペプチドの存在下、一晩培養し、次の日にCD23の発現とGFPの発現を解析した。図右のように、BRLF1刺激後にGFPの発現が観察された。
【図６】発現型cDNAライブラリーの構築。図のベクターは我々の教室で、抗体の抗原を同定するために発現型cDNAライブラリーを構築した時に用いたベクターである。Okumura A, Kishi H, Tagoh H, Minowada J, Muraguchi A. Expression of 18.6/CD23 antigen on human lymphoid progenitor cell lines and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced microglia-shaped cells. Microbiol Immunol. 39:879-890, 1995
【図７】発現型ペプチドをコードするベクター。抗原ペプチドSIINFEKL（OT-1ペプチド）をコードするcDNAのN末に開始コドンATG（メチオニン、M）、C末にストップコドンを付け加え、それを発現型ベクターのEcoRI/XhoIサイトに導入した。
【図８】ペプチド発現型ベクターによるペプチドの発現。図7のOT-1ペプチド（卵白アルブミン由来ペプチド）発現ベクターをOT-1ペプチドを認識するOT-1TCRトランスジェニックマウス由来T細胞および、LSB11-1 T細胞株（未熟胸腺細胞株）に遺伝子導入した。どちらの細胞も細胞表面にH-2Kb分子を発現している。細胞内で発現したOT-1ペプチドは小胞体内でH-2Kb分子と結合し、細胞表面に発現する。細胞表面にOT-1ペプチドを結合したH-2Kb分子が発現しているかを、OT-1ペプチドが結合したH-2Kb分子を特異的に認識する抗体を用いて染色し、フローサイトメータにて解析した。図下のように、OT-1ペプチドが発現していることが確認された。
【図９】発現型ペプチドベクター導入抗原提示細胞によるT細胞の活性化。OT-1ペプチド発現ベクターを遺伝子導入したLSB11-1細胞とOT-1ペプチドを認識するTCRを発現したOT-1 TCRトランスジェニックマウス由来T細胞（OT-1 T細胞）を共培養した。5時間後に活性化マーカーであるCD69の発現を解析した。左上：LSB11-1細胞とOT-1 T細胞が混合したサンプルを、フローサイトメータにて、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を解析した。LSB11-1細胞はOT-1T細胞に較べ、細胞のサイズが大きいため、FSCの強度が高くなり、OT-1 T細胞と識別することができる。図中は細胞のGFP（縦軸）とCD69（横軸）の発現を解析したもの。OT-1ペプチド発現ベクターを導入されたLSB11-1細胞はGFP陽性である。図右はOT-1 T細胞のCD69の発現を解析したもの。上より、OT-1ペプチド発現ベクターが導入されていないLSB11-1細胞とOT-1 T細胞を共培養したもの。CD69分子は発現していない。2番目は1番目の培養中にOT-1ペプチドを添加したもの。OT-1 T細胞が活性化され、CD69分子が発現している。3番目はOT-1ペプチド発現ベクターを導入したLSB11-1細胞（GFP陽性）とOT-1 T細胞を共培養したもの。OT-1 T細胞がOT-1ペプチド発現ベクターを導入したLSB11-1細胞により活性化され、CD69分子が発現している。4番目は3番目の培養中にOT-1ペプチドを添加したもの。OT-1 T細胞がOT-1ペプチド発現ベクターを導入したLSB11-1細胞あるいは添加したOT-1ペプチドにより活性化され、CD69分子が発現している。
【図１０】レポータT細胞（TG40 R1.0）による抗原ペプチドの認識・活性化。（A）EBウイルス由来EBNA3Aペプチド発現ベクターの部分配列。（B）作製したTG40 R1.0細胞にEBNA3Aペプチドを認識するE21 TCR cDNAを遺伝子導入し、さらにその細胞にEBNA3Aペプチド発現ベクター（EBNA3Ap RV）を遺伝子導入した。1日培養後、細胞を抗CD23抗体で染色し、フローサイトメータにてGFPの発現を解析した。EBNA3Aペプチド発現ベクターを導入したTG40 R1.0細胞にてGFPが発現することが確認された（B  右）。
【図１１】TCR抗原同定用抗原提示細胞。JurkatΔβ  T細胞あるいはTG40  T細胞にMHC分子の細胞質にζ鎖を結合させたキメラ分子（MHC-ζ chimera）を発現させ、さらにIL2遺伝子の発現制御領域（IL2Ep）にGFP遺伝子を接続したものを遺伝子導入した細胞。この細胞に抗原タンパク質をコードするcDNAを遺伝子導入すると、タンパク質が細胞質で発現し、それが分解されペプチドになったものが、MHC-ζ chimera分子に結合して細胞表面に発現する。cDNA抗原を同定したいTCRを発現したT細胞と共培養し、TCRがMHC-ζ chimera分子と相互作用すると、シグナルが伝達され、GFPが発現する。それを蛍光顕微鏡あるいはフローサイトメータで検出することで、抗原cDNAが入っている細胞を同定・取得することができる。
【図１２】MHC-ζキメラ（HLA-A24-ζキメラ）分子を発現させたTG40細胞と抗原（BRLF-1）特異的TCRを発現させたTG40細胞との相互作用。HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞とBRLF-1特異的TCRを発現させたTG40細胞を、BRLF-1ペプチドの非存在下あるいは存在下で、いっしょに一晩培養し、次の日に、活性化マーカーであるCD137分子の発現をフローサイトメータで解析した。HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞とBRLF-1特異的TCRを発現させたTG40細胞とを識別するために、HLA-A24特異的抗体で染色し、フローサイトメータで解析している。HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞はHLA-A24分子陽性（縦軸）である。BRLF-1ペプチドの非存在下で培養した場合には（上図）、CD137は陽性にならない（横軸）が、BRLF-1ペプチドの存在下で培養した場合には（下図）、HLA-A24陽性細胞にCD137分子が発現していることが観察される。HLA-A24陰性のBRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞の一部の細胞も、HLA-A24分子上のBRLF-1ペプチドを認識し活性化され、CD137分子が陽性になっている。
【図１３】pSV2-CD23-IL2Ep-GFPのヌクレオチド配列。直線下線部分がマウスのIL2Ep、波線下線部分がGFP遺伝子の配列を表す。
【図１４】抗原ペプチドをコードするレトロウイルスベクターが導入されたレポーター細胞のセルソータを用いた検出および濃縮。（Cisの実験、上段）レポーター細胞として、TG40 R1.0レポーター細胞にEBウイルス由来BRLF１ペプチドがHLA-A24分子に結合した複合体を認識するQ22 TCRを発現させた細胞（Q22-TG40 R1.0レポーター細胞）を用いるた。この細胞にはHLA-A24分子が発現しており、その分子上にBRLF1ペプチドが結合すると、同じ細胞上のTCRとcisの相互作用により細胞が活性化され、活性化マーカーであるCD137分子が発現する。ｐMX-BRLF1ｐ−IRES-GFPプラスミドDNAとpMX-IRES-GFPプラスミドDNA比が1:10,000のプラスミドDNAを用いて作製した組換えレトロウイルスを、Q22-TG40 R1.0レポーター細胞に感染させ、2日後にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した（上段のsorting time 1のドットプロット表示）。縦軸はGFPの発現で、レトロウイルスが感染した細胞を示す。横軸はCD137の発現を示す。GFP陽性CD137陽性細胞をソーティングした。ソーティングした細胞を培養し、CD137分子の発現を指標にさらに2回、3回、4回とソーティングした時のGFPとCD137の発現の結果が図14の上段に示してある。（Transの実験、下段）レポーター細胞として、HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞（HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞）を用いた。刺激細胞として、TG40細胞にEBウイルス由来BRLF１ペプチドがHLA-A24分子に結合した複合体を認識するQ22 TCRを発現させた細胞（Q22-TG40刺激細胞）を用いた。pMX-BRLF1p-IRES-GFPプラスミドDNAとpMX-IRES-GFPプラスミドDNA比が1:1,000のプラスミドDNAを用いて作製した組換えレトロウイルスを、HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞に感染させ、1日後に等量のQ22-TG40刺激細胞を加え、さらに1日混合培養した。レトロウイルスを感染させて、2日目にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した（下段のsorting time １のドットプロット表示）。ドットプロットにはHLA-A24陽性のHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞の結果だけが示されており、いっしょに混合培養したHLA-A24陰性のQ22-TG40刺激細胞のデータは表示されていない。GFP陽性CD137陽性細胞をFACSAriaセルソータによりソーティングした。ソーティングした細胞を培養・増殖させ、そのHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞と同量のQ22-TG40刺激細胞を混合培養し、次の日にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した（Sorting times 2の下段のドットプロットの図）。同様に、さらに3回、4回とソーティングを行った（Sorting times 3, 4の下段のドットプロットの図）。
【図１５】ソーティングした細胞にpMX-BRLF1p-IRES-GFPのベクターが導入されているかの検証。図14でソーティングし、回収した細胞を用いてRT-PCRを行った。（上段）PCRで増幅されるDNA断片。pMX-BRLF1p-IRES-GFPのベクターでは261塩基対のDNA断片が増幅される。pMX-IRES-GFPのベクターは、BRLF1pをコードする33塩基対がないので、228塩基対のDNA断片が増幅される。（下段）PCR産物をアガロースゲルで解析した結果。１レーン目はウイルスを感染させていないQ22-TG40 R1.0細胞を用いた結果。２レーン目はウイルスを感染させたQ22-TG40 R1.0細胞4回ソーティングを行った後の細胞を用いてRT-PCRをした結果。３レーン目はウイルスを感染させていないHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞を用いた結果。４レーン目はウイルスを感染させたHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞を4回ソーティングを行った後、該細胞を用いてRT-PCRをした結果。5レーン目はポジティブコントロールとしてpMX-BRLF1p-IRES-GFPのベクターを用いてPCRした結果。6レーン目はネガティブコントロールとしてpMX-IRES-GFPのベクターを用いてPCRした結果。左側の矢印は、それぞれ228塩基対のpMX-IRES-GFPを増幅したバンド、および、261塩基対のpMX-BRLF1p-IRES-GFPを増幅したバンドの位置を示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態（「（本発明の）実施形態」ということもある。）について説明する。
本発明の実施態様は、下記の工程(1)(2)を含む。
(1)制御領域と、制御領域の下流に連結された蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、レポーター構築物を細胞に導入する工程。このとき、該制御領域は、目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御（upregulate）する。
(2)抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程。このとき、該抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示される。
【００１７】
工程(1)は、レポーター細胞を作成する工程である。この工程に際しては、まず、図3に示すように、レポーター構築物（レポーター遺伝子ということもある。）を作製する。目的抗原でTCRが刺激されたときに、下流に連結された遺伝子の発現を上方制御することができる制御領域の下流に、蛍光タンパク質遺伝子を結合する。これにより、TCRからのシグナルが伝達されると蛍光タンパク質が発現する。
【００１８】
本発明の実施態様に用いることのできる制御領域の例は、TCRが刺激された際のシグナルにより転写が促進される、IL2遺伝子の転写制御領域（IL2Ep）である。他の例は、転写因子NFAT（Nuclear factor activated Tcell）が結合する領域である。制御領域は、レポーター細胞として用いる宿主細胞において所望の機能を発揮するものであればよく、種々の生物由来のものを用いることができる。例えば、マウス、ラット、ヒト由来であってよい。また、本発明の実施態様に用いることのできる蛍光タンパク質の例は、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、GFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami Green 1(mAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRである。制御領域と蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質が機能可能であるように連結され、このための手法は、当業者にはよく知られている。
【００１９】
本明細書では、IL2EpおよびGFPを用いた例に基づいて本発明およびその実施態様を説明することがあるが、その発明は、特に記載した場合を除き、他の制御領域および他の蛍光タンパク質を用いた態様にも当てはまる。
【００２０】
このレポーター構築物は、T細胞に導入される。あるいは、後述する特別な態様においては、抗原提示が可能な細胞に導入される。導入されるT細胞の例として、抗原を特定したいTCRを発現しているT細胞を挙げることができる。また、導入されるT細胞の別の例として、内因性のTCRを発現していない細胞、例えばTG40 T細胞株を挙げることができる。内因性のTCRを発現しない細胞を用いる際は、後述するように、抗原を特定したいTCRをコードするポリヌクレオチドをさらに導入して、本発明の実施態様に用いることができる。対象細胞にレポーター構築物が導入されたことは、当業者であれは種々の方法で確認可能である。導入される宿主細胞は、所望の機能を発揮するものであればよく、種々の生物由来のものを用いることができる。例えば、マウス、ラット、ヒト由来であってよい。
【００２１】
T細胞へは、さらに他の遺伝子、例えば、HLA-A*2402遺伝子、HLA-A*0201遺伝子、HLA-A*0206遺伝子、ヒトβ2-microglobulin遺伝子を導入することができる。
【００２２】
本発明の実施態様においては、レポーター構築物を用いることにより、抗原を有する細胞自体における蛍光タンパク質の発現を指標に、抗原を特定してゆくことが可能になる。このようにしてレポーター構築物が導入され、抗原の特定のために用いられる細胞を、本発明およびその実施態様では「レポーター細胞」と称する。
【００２３】
レポーター細胞をT細胞株として樹立する場合、様々なTCRを発現させて、そのTCRに特異的な抗原を特定するためのレポーター細胞として用い得る。本発明者らは、いったん導入したQ22 TCR遺伝子を欠失させることにより、レポーター細胞を樹立している（実施例参照）。本発明者らは、このレポーター細胞をTG40 R1.0と名付けた。Q22 TCRを導入する前の細胞は、染色体のいろいろな位置にレポーター遺伝子が挿入された細胞が混在しており、レポーター遺伝子が挿入された周りの環境によって、レポーター遺伝子がTCRからのシグナルで発現しやすい細胞と発現しにくい、あるいは発現しない細胞が混在している。そのため、一旦Q22 TCRを細胞に発現させ、BRLF1ペプチドで刺激し、TCRからの刺激でよく反応し、GFPを発現する細胞を選択した（図4参照）。その上で、抗原特定の目的で用いるためには、この細胞には以後様々なTCRを導入する必要があるので、Q22 TCRを欠落させた細胞を作製した。このようにして得たTG40 R1.0は、元の細胞に比較して、TCRからのシグナルによく反応する細胞となっている。
【００２４】
工程(2)は、抗原候補をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程である。抗原候補をコードするポリヌクレオチドは、種々のライブラリー由来のものであり得る。ライブラリーの構築方法は、当業者にはよく知られている。
【００２５】
ライブラリーは、例えば、抗原を発現している細胞（がん細胞、ウイルス感染細胞など）からmRNAを回収し、発現型のcDNAライブラリーを作製することができる。このようなライブラリーの作製のためには、図6に示すベクターを用いることができる。また、本発明者らの既報を参考にすることができる（Okumura A, KishiH, Tagoh H, Minowada J, MuraguchiA. Expression of 18.6/CD23 antigen on human lymphoid progenitor cell lines and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced microglia-shaped cells. Microbiol Immunol. 39:879-890, 1995）。
【００２６】
ライブラリーはまた、HLAに結合するランダムな発現型のペプチドについて、cDNAライブラリーを構築することによってもよい。より詳細には、図7に示すように、ペプチドのN末端側に開始コドンを付し、C末端側にストップコドンを付すことにより、発現型のペプチドが構築できる。そして、発現型ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだベクターを用いて、図8に示すように細胞に種々の抗原ペプチドを発現させることができる。
【００２７】
ライブラリー由来の抗原候補をコードするポリヌクレオチドは、レポーター細胞に導入される。そして、抗原候補は、細胞内で発現されてその全部または一部が、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子と結合して細胞表面に提示される。
【００２８】
本発明の別の実施態様においては、上述の工程(2)を含み、内在性のT細胞活性化マーカーの発現を指標に、目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を選択する。内在性のT細胞活性化マーカーとは、抗原候補をコードするポリヌクレオチドが導入される、T細胞由来の細胞が元来有する活性化マーカーであり、具体的には、CD25、CD54、CD69、CD38、CD45RO、CD62L、CD49d、CD40L、CD137、CD62L、CD134およびCD279からなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましく、CD69またはCD137であることがより好ましい。指標とするとは、典型的には標識化された抗体を用い、その発現が認められるか否かを基準とすることである。なお本明細書では、目的の抗原をコードするポリペプチドが導入された細胞の選択に際し、レポーター構築物中の蛍光タンパク質が発現している場合を例に説明することがあるが、当業者であれば、技術常識を参酌して、その説明を内在性のT細胞活性化マーカーを指標とする場合に拡張して理解することができる。
【００２９】
本発明の実施態様は、下記の工程(3)を含んでいてもよい。
(3)目的の抗原に特異的なTCRをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程。
細胞上に発現した該TCRは、同じ細胞上のMHC分子-抗原候補結合体により刺激され、その結果蛍光タンパク質を発現すると期待される。
【００３０】
工程(3)は、目的の抗原に特異的なTCRをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する工程である。工程(3)を含む本発明の実施態様は、本発明者らの見出した知見（前掲特許文献2)
に基づく。本発明者らは、T細胞の細胞表面にMHC分子が発現していることに注目し、T細胞上のMHC分子に抗原ペプチドを結合させれば、一つのT細胞上でTCRとMHC/ペプチド複合体とが相互作用し、T細胞が刺激・活性化されるのではないかと考えた。すなわち、T細胞は、通常はAPC上に発現したMHC分子の上に抗原ペプチドが提示されたものをTCRを用いて認識するが、T細胞上のMHC分子に抗原ペプチドを与えることができれば、そのT細胞の有するMHC分子にペプチドが結合し、同じT細胞のTCRでそれを認識することで、T細胞が活性化できるのではないかと考えた。本発明者らはT細胞を1個ずつマイクロウェルに格納することにより、他の細胞と相互作用することができない状況を作りだすことができた。そしてT細胞を1個ずつチップ上のマイクロウェルに格納して配置した後、MHC分子に結合可能な抗原ペプチドを添加したところ、抗原ペプチド特異的なサイトカイン分泌の誘導を示すことができた。この結果は、T細胞上のMHC分子に抗原ペプチドを結合させることにより、同じ細胞上のTCRとMHC/ペプチド複合体とが相互作用し、自分自身、すなわちT細胞が活性化されることを示している。これは、本発明者らにより初めて明らかにされたことである。
【００３１】
本発明の実施態様においては、導入されたTCRは、細胞上に発現し、同じ細胞上にMHC分子-抗原候補結合体が存在する場合、刺激され、そしてレポーターとしての蛍光タンパク質を発現することとなる。
【００３２】
本発明の実施態様において、確実に単一細胞レベルで刺激したい場合には、マイクロウェルアレイのようなものを用いるとよい。なお、本発明者らは、ペプチドを細胞の外から加える実験では、マイクロウェルアレイチップを用い、細胞が単一細胞レベルで活性化されることを確認している。
【００３３】
一方、細胞集団による実施は、簡易で実用的である。本発明の実施態様による抗原同定を、マイクロウェルアレイのような単一細胞レベルで刺激する手段を用いず、細胞集団で実施する場合、導入したTCRとそれを刺激するMHC分子-抗原候補結合体との双方を細胞上に有し、シスで反応する細胞があり、またその細胞の周りの細胞も、抗原ペプチドが発現した細胞と接触すると、トランスで活性化されうる。そのため、目的の抗原を発現する細胞以外に、その周りの数個の細胞が目的の抗原を有しない場合でも、レポーター遺伝子を発現し、蛍光を発する可能性がある。その場合、トランスで刺激された、目的外の細胞も回収される。それらはバックグランドになるが、頻度は高くないと考えられる。実験を進めていく中で、目的のペプチドを発現するベクターの頻度が高くなってきたときには、トランスで刺激される細胞について考慮するとよい。また、1個の細胞に複数個のベクターが導入される可能性がある。そのため、トランスフェクションと細胞ソーティングに加えて、回収したベクターが導入された大腸菌をプレートに播種し、1個ずつ回収し、ベクターを調製し、それを細胞に遺伝子導入するとよい。このようにすれば、どのベクターが目的の抗原ペプチドをコードしているかが同定できる。
【００３４】
本発明の実施態様においては、工程(1)〜(3)は任意の順番に実施することができる。典型的には、工程(1)、および工程(3)をこの順で実施し、得られた、レポーター細胞であって、かつ抗原を特定したいTCRを発現している細胞に対して工程(2)を実施する。この場合、細胞は、候補抗原をコードするポリヌクレオチドを導入した後の適当な期間経過後、例えば1〜2日後に蛍光タンパク質の発現を適切な方法で検出し、蛍光を発する細胞を分離・回収することができる。回収した細胞よりcDNAを回収し、抗原を特定するための工程に進むことができる。抗原を特定するための工程は、例えば、回収したｃDNAを大腸菌に導入する工程、大腸菌よりcDNAを調製する工程、cDNAを再度レポーターT細胞へ導入する工程、さらに蛍光タンパク質の発現を解析する工程を含みうる。このような工程は、繰り返し行ってもよい。
【００３５】
蛍光タンパク質を発現している細胞の特定・単離のためには、種々の既存の器具、装置、例えばフローサイトメータを使用することができる。
【００３６】
所望により、前掲特許文献1に記載されているような、マイクロウェルアレイを使用してもよい。マイクロウェルアレイは、典型的には、次のようなものである。
基体の一方の主表面に複数のウェルを有し、ウェルは1つの細胞のみが入る大きさである。複数個のマイクロウェルは同一間隔で縦横に配置されている。マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形、六角柱であり、円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径3〜100μmであることができ、好ましくは4〜25μｍ、より好ましくは10〜20μｍである。TG40細胞を用いる場合、通常のリンパ球より少し大きめであるので、15〜17μｍ程度の大きさのウェルが適している。また、深さは、例えば、3〜100μmであることができ、好ましくは4〜40μｍである。1つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、1cm2当たり、例えば、2,000〜1,000,000個の範囲であることができる。
【００３７】
上で述べてきたような工程(1)、工程(3)および工程(2)をこの順で実施する態様は、目的の抗原特異的TCRを発現させたレポーターT細胞に抗原ライブラリーを導入することで、目的抗原を同定する方法であるが、本発明は他の態様を含む。すなわち、別の実施態様においては、TCRとしては抗原特異的T細胞に発現されているものをそのまま用い、抗原提示細胞をレポーター細胞として、抗原の同定を行うことができる（図11参照）。この場合、抗原ペプチドが結合するMHC分子の細胞内の領域に、シグナル伝達分子（例えばζ鎖の細胞内ドメイン）を融合させたキメラ分子を作製し、TCRを発現していない細胞に導入し、発現させておく。この細胞対して工程(1)を実施する。すなわちレポーター構築物を導入する。また、この細胞に対して工程(2)を実施する。すなわち候補抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する。そして、先に述べた抗原特異的T細胞と得られた細胞とを接触させることにより、当該細胞において目的の抗原ペプチドが提示されていると、抗原特異的TCRとMHC-シグナル伝達分子キメラ体が相互作用し、細胞内にシグナルが伝達され、蛍光タンパク質が発現する。蛍光タンパク質を発現している細胞は、目的抗原をコードするポリヌクレオチドを有しているので、単離して、抗原の同定のために用いることができる。
【００３８】
本発明の実施態様においては、工程(1)においてレポーター構築物が導入され、工程(2)において抗原候補をコードするポリヌクレオチドが導入される細胞は、これまで述べてきたように(a)MHC分子、および目的の抗原に特異的なTCRを有する細胞であってもよく（抗原を提示しているMHC分子とそれを認識するTCRとが、Cis位置）、また別の態様においては(b)TCRを有さず、MHCと細胞内シグナル伝達ドメインとを結合させたキメラ分子を有する細胞であってもよい（抗原提示MHC分子とTCRとは、Trans位置）。具体的には、例えば、常法により、MHC分子の細胞内部分にζ鎖の細胞内ドメインを結合させたキメラ分子を、TCRを発現していない細胞に発現させ、この細胞にさらに、レポーター構築物を存在させることにより、レポーター細胞とすることができる。このように、MHC/細胞内シグナル伝達ドメインキメラ分子を有する細胞をレポーター細胞とする場合、図11に示したように、別の抗原特異的T細胞を用い、T細胞上のTCRとレポーター細胞上のMHC分子が相互作用し、細胞内にシグナルが伝達され、蛍光タンパク質が発現する。そして陽性細胞を選択・分離することで、抗原を同定することができる。
【００３９】
本明細の実施例では、TG40細胞をリポーター細胞として用いているが、TG40細胞はTCRからのシグナルが入ると、一部の細胞がアポトーシスを起こして死に至る場合がある。すなわち、TCRを有するcisの系では、TG40リポーター細胞に目的の抗原をコードするポリヌクレオチドが導入されると、TCRからのシグナルが入り続けることになるので、増殖しにくいという問題が起こりうる。その点、transの系では、TCRを発現した刺激細胞と分離されており、TCRからのシグナルはTG40レポーター細胞に入らず、TG40リポーター細胞は十分に増殖することができる。すなわち、ロスが少ないという利点がある。また、本明細書の実施例のtransの系では、抗原を同定したいTCR遺伝子を導入したTG40細胞を刺激細胞として用いているが、TG40細胞の代わりに抗原特異的T細胞クローンを刺激細胞として用いることができる。この場合、T細胞クローンがあれば、TCR遺伝子をクローニングする必要はない。一方、cisの場合には、TCR遺伝子をあらかじめクローニングしておく必要がある。TCR遺伝子のクローニングが不要であるとの観点からは、transの系が利用しやすい。
【００４０】
本発明の実施態様によりさまざまな抗原を同定することができる。抗原は、種々の疾患に関連したものであることができ、例えば、がん関連抗原であり、また、ウイルス等の病原体由来であってもよい。
【００４１】
本発明およびその実施態様で「抗原（ペプチド）」というときは、特に記載した場合を除き、抗原タンパク質の一部であってMHC分子に提示可能な長さ、例えば8〜20アミノ酸残基長、好ましくは8〜12アミノ酸残基長からなるペプチドであって、抗原特異的細胞障害性T細胞（CTL）を誘導できるペプチド、それと機能的に同等の特性を有するその改変ペプチド、またはそれらのペプチドを2以上連結したポリトープ等が含まれる。機能的に同等の特性を有する改変ぺプチドとは、抗原ペプチドのアミノ酸配列の1または数個（例えば、4個以下）のアミノ酸残基が、欠失、置換および／または付加（ペプチドのN末端、C末端へのアミノ酸の付加も含む）した改変体であって、かつ抗原ペプチド特異的にCTLを誘導できるものをいう。
【００４２】
MHCに結合可能と予想されるペプチド配列は、当業者にはよく知られた方法で、検索することができる（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ 、またはBIMAS HLA peptide binding prediction analysis(J.Immunol.,152,163,1994)。本発明の実施態様による抗原の特定に際しては、このような方法を組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
特定された抗原候補が 目的の抗原であること、すなわち抗原特異的T細胞刺激活性を有するか否かは、がん抗原ペプチドの場合、当業者にはよく知られた方法、例えばJ.Immunol.,154,p2257,1995に記載の測定方法により確認することができる。具体的には、MHC分子陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビトロで対象ペプチドを供給した場合に、該ペプチドをパルスしたMHC陽性細胞を特異的に認識する細胞障害性T細胞（CTL）が誘導された場合には、そのペプチドを抗原ペプチドであると判定することができる。CTLが誘導されたか否かは、CTLが産生し得るIL-2またはIFN-γの有無またはその量を、酵素免疫測定法（ELISA）により測定することにより、確認することができる。
【００４４】
本発明の実施態様は特に、がんの免疫療法への適用が期待できる。例えば、実施態様により特定された抗原は、ペプチドワクチンとしての使用が期待できる。また、多くの疾患において、実施態様によりその疾患に関連した抗原が同定されれば、診断・処置の標的等としての応用が期待できる。本発明およびその実施態様において疾患または状態に関連して「処置」というときは、特に記載した場合を除き、発症リスクの低減、予防、治療、進行の抑制を含む。
【００４５】
本発明の実施態様の適用が期待できる疾患には、がんまたは感染症が含まれ、がんには、成人のがんおよび幼児期のがんが含まれ、また消化器がん、肺がん、および難治性の食道がん、頭頸部がん、卵巣がん、多発性骨髄種等が含まれる。感染症には、ウイルス感染症（例えば、後天性免疫不全症候群 (AIDS)、成人T細胞性白血病、エボラ出血熱、インフルエンザ、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群 (SARS)、進行性多巣性白質脳症、水痘、帯状疱疹、手足口病、デング熱、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、ハンタウイルス腎出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱）、細菌感染症、リケッチア感染症、寄生性感染症、プリオン病が含まれる。
【実施例１】
【００４６】
〔レポーターT細胞の作製〕
図3に示すように、レポーター遺伝子を構築した。TCRからのシグナルにより転写が促進されるIL2遺伝子の転写制御領域（IL2Ep）の3’下流にGFP遺伝子を結合した。これにより、TCRからのシグナルが伝達されるとGFP遺伝子が発現する。GFPの発現を蛍光顕微鏡、フローサイトメータにて解析することによりTCRからのシグナルにより活性化された細胞を同定することが可能になる。【００４７】
次に、このレポーター遺伝子を内因性のTCRを発現していないTG40 T細胞株（理研  斉藤博士、熊本大学上野博士、本園博士より供与）に遺伝子導入した。用いたTG40 T細胞株にはヒトCD8分子が発現しており、また、同細胞に、我々の研究室でHLA-A*2402遺伝子とヒトβ2-microglobulin遺伝子（ともに、愛知県ガンセンター研究所  赤塚博士より供与）を遺伝子導入し、細胞表面にHLA-A24分子を発現させてある。目的の細胞にレポーター遺伝子が導入されたことは、CD23分子の細胞表面への発現を指標に検証した。すなわち、細胞をCy5標識抗CD23抗体で染色し、フローサイトメータにより解析した。【００４８】
図4に示すように、CD23が発現した細胞を樹立した。図4の横軸はGFPの発現を解析しているが、未刺激の場合は、図4のようにGFPは発現していない。【００４９】
次に、TCRからのシグナルによりGFPが発現するレポーター細胞を作製するために、図4のレポーター細胞に図5Aに示すようなQ22 TCR発現ベクターを遺伝子導入した。具体的には、核内で染色体に組み込まれずに複製するBCMG-neo（東京医科歯科大学  烏山博士より供与）ベクターに、Q22 TCRのα鎖とβ鎖のcDNAを挿入したベクターを作製した。この発現ベクターは遺伝子導入された細胞の核の中で染色体に組み込まれず、染色体外で複製するため、このベクターが導入された細胞より、ベクターのみが欠失した細胞を選択することができる。このベクターによる遺伝子導入は、CD3分子の発現を指標に検証した。すなわち、TG40細胞にTCRα鎖、β鎖遺伝子が導入されると、TCR分子がCD3分子を伴って細胞表面に発現する。そのCD3分子の発現を蛍光標識抗CD3抗体を用いて染色し、フローサイトメータにより解析・分取した。【００５０】
Q22 TCRはHLA-A24分子上に提示されたEBウイルス由来BRLF-1ペプチド（TYPVLEEMF(配列番号:6)、MBL社より購入）を認識する。そこで、次に、Q22 TCRが発現した細胞にBRLF-1ペプチドを添加し、一晩培養した。詳細には、細胞を105細胞/mLの細胞密度で10% FCS, RPMI1640 1mLで24ウェルプレートで培養した。BRLF-1ペプチドによる刺激は、BRLF-1ペプチドを1 μg/mLになるように細胞に添加し、37℃、5% CO2の存在下、一晩（約18時間）培養した。次の日にGFPの発現を解析した。フローサイトメータにより、GFP陽性細胞を選択することで、図5Bに示すようにTCRからの抗原刺激によりGFPが発現する細胞を取得することができた。【００５１】
樹立したT細胞株には、様々なTCRを発現させて、レポーター細胞として用いるので、特定のTCR遺伝子が導入されていることは不都合である。そこで、上で導入したQ22 TCR遺伝子が欠失したレポーター細胞を作製した。すなわち、レポーター細胞を蛍光標識CD3抗体で染色し、CD3陰性の細胞をフローサイトメータで解析し、選択した（データ非表示）。このレポーター細胞をTG40 R1.0と名付けた。【００５２】
〔発現型cDNAライブラリーの作製〕
抗原のcDNAを含むライブラリーを構築には2通りの方法がある。一つは、抗原を発現している細胞（がん細胞、ウイルス感染細胞など）からmRNAを回収し、発現型のcDNAライブラリーを作製する方法である。ライブラリーの作製には図6に示すベクターを用いることができる。我々の教室では、以前に、本ベクターを用いてcDNAライブラリーを構築し、抗体の抗原を同定している（Okumura A, Kishi H, Tagoh H, Minowada J, Muraguchi A. Expression of 18.6/CD23 antigen on human lymphoid progenitor cell lines and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced microglia-shaped cells. Microbiol Immunol. 39:879-890, 1995）。【００５３】
もうひとつの方法では、HLAに結合するランダムな発現型のペプチドcDNAライブラリーを構築する。図7に示すような構造となる。すなわち、ペプチドの前に開始コドン（ATG、メチオニンをコード）をつけ、最後にストップコドンを付けたものである。【００５４】
実際、図7のベクターを用いて、図8に示すように細胞に抗原ペプチドを発現させることができた。すなわち、OT-1ペプチド（卵白アルブミン由来ペプチド）発現ベクターを、OT-1ペプチドを認識するOT-1TCRトランスジェニックマウス由来T細胞、およびLSB11-1 T細胞株（未熟胸腺細胞株）に遺伝子導入した。どちらの細胞も細胞表面にH-2Kb分子を発現している。細胞内で発現したOT-1ペプチドは小胞体内でH-2Kb分子と結合し、細胞表面に発現する。細胞表面にOT-1ペプチドを結合したH-2Kb分子が発現しているかを、OT-1ペプチドが結合したH-2Kb分子を特異的に認識する抗体を用いて染色し、フローサイトメータにて解析した。図に示すように、OT-1ペプチドが発現していることが確認された。【００５５】
また、抗原ペプチドが発現した細胞を用いて、T細胞を活性化することができた。すなわち、抗原ペプチド（OT-1ペプチド）を発現するベクターをH-2Kb分子を発現するLSB11-1細胞株に遺伝子導入した細胞とH-2Kb分子上に提示されたOT-1ペプチドを認識するOT-1 TCRを発現したOT-1 TCRトランスジェニックT細胞（OT-1 T細胞）を共培養すると、LSB11-1細胞の上に発現したOT-1ペプチド/H-2Kb分子をOT-1 T細胞が認識し、活性化され、CD69分子が発現することが確認できた（図9右）。【００５６】
これら2通りの発現型ライブラリーを構築し、抗原を同定したいTCRを発現させたレポーターT細胞に遺伝子導入する。導入1〜2日後にGFPの発現を解析し、GFP陽性の細胞を分離・回収する。回収した細胞よりcDNAを回収し、それを大腸菌に遺伝子導入しcDNAを調製する。それを再度レポーターT細胞へ導入し、同様にGFPの発現を解析する。この操作を繰り返すことにより、目的の抗原cDNAを濃縮していき、最終的にクローンを得ることができる。【００５７】
〔レポーターT細胞による抗原ペプチドの認識〕
実際に作製したレポーターT細胞が発現ベクターに導入されたペプチドを認識し、GFPを発現するかを解析した。すなわち、TG40 R1.0レポーター細胞にEBウイルス由来EBNA3AペプチドがHLA-A24分子上に結合した複合体を認識するE21 TCRを遺伝子導入し、さらに、その細胞にEBNA3Aペプチド発現ベクター（図10(A) および図7参照）を遺伝子導入した。遺伝子導入後1日目にCD23分子の発現とGFPの発現を解析した。【００５８】
細胞を105細胞/mLの細胞密度で10% FCS, RPMI1640 1mLで24ウェルプレートで培養した。EBNA3Aペプチド(RYSIFFDYM, MBL社より購入)による刺激は、EBNA3Aペプチドを1 μg/mLになるように細胞に添加し、37℃、5% CO2の存在下、一晩（約18時間）培養した。その後、細胞を抗CD23抗体で染色し、フローサイトメータにてGFPの発現を解析した。EBNA3Aペプチド発現ベクターを導入したTG40 R1.0細胞にてGFPが発現することが確認された（B 右）。TG40 R1.0レポーター細胞にE21 TCRのみを導入した細胞についての結果を、図10(B)左に示した。【００５９】
実際には、ペプチド発現ライブラリーの中にこのような目的のペプチドを発現するものが含有されており、ライブラリーをTG40 R1.0細胞に遺伝子導入すると、目的のペプチドを発現するベクターが遺伝子導入された細胞がGFPを発現する。GFPを発現したTG40 R1.0細胞をフローサイトメータ等の手段を用いて分離し、分離した細胞から目的の遺伝子を回収することができる。所望により、得られた遺伝子をを再度TG40 R1.0細胞に導入する。そして、GFP陽性細胞をフローサイトメータにて分離する。この操作を繰り返すことにより、所望のTCRが認識する目的の抗原ペプチドを同定することができる。【００６０】
〔抗原提示細胞をレポーター細胞とした抗原の同定〕
通常の抗原特異的T細胞上のTCRを用い、抗原提示細胞をレポーター細胞として、抗原の同定を行う（図11）。すなわち、抗原ペプチドが結合するMHC分子の細胞内にシグナル伝達分子のζ鎖の細胞内ドメインを結合させたキメラ分子を作製し、TCRを発現していないTG40細胞に発現させる。この細胞にさらに、IL2遺伝子の転写制御領域（IL2Ep） の3’下流にGFP遺伝子を結合することにより作成したレポーター遺伝子を導入する。【００６１】
このような細胞にTCRの抗原ペプチドが発現していると、抗原特異的T細胞上のTCRとMHC/ζキメラ分子が相互作用し、MHC/ζキメラ分子が架橋され、細胞内にシグナルが伝達され、GFPが発現する。GFP陽性になった細胞をフローサイトメータを用いて選択・分離することで、抗原を同定することができる。【００６２】
実際に作製したレポーター抗原提示細胞が、発現ベクターに導入されたペプチドを認識し、GFPを発現するかを解析した。すなわち、200 μLの10% FCSを含むRPMI1640培地中で、HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞 1×104個とBRLF-1特異的TCRを発現させたTG40細胞1×104個とを混ぜ合わせ、10 μg/mLのBRLF-1ペプチドの非存在下あるいは存在下で、37℃、5% CO2のCO2インキュベータの中で18時間培養した。培養には96ウェルUプレートを用いた。次の日に、細胞を回収し、細胞をPE標識CD137特異的抗体とAPC標識HLA-A24特異的抗体で染色し、フローサイトメータにて解析した（図12）。【００６３】
HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞はHLA-A24特異的抗体で染色される。一方、BRLF-1特異的TCRを発現させたTG40細胞はHLA-A24分子を発現していないため、HLA-A24特異的抗体では染色されず、両者を識別できる。図12のドットプロットにおいて、縦軸がHLA-A24分子の発現を、横軸がCD137分子の発現を示している。BRLF-1ペプチドの非存在下で培養した場合には（図12上）、HLA-A24陽性のHLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞もHLA-A24陰性のBRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞も、どちらの細胞もCD137分子が陽性になっていない。一方、BRLF-1ペプチドの存在下で培養した場合には（図12下）、HLA-A24陽性のHLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞にCD137分子が発現することが観察された。これは、HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞上のHLA-A24分子にBRLF-1ペプチドが結合し、それにBRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞上のTCRが相互作用し、HLA-A24-ζキメラ分子を架橋するために、HLA-A24-ζキメラ分子からシグナルが伝達され、TG40細胞が活性化され、その結果、活性化マーカーであるCD137分子が発現したものと考えられる。このとき、HLA-A24陰性のBRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞の一部の細胞も、CD137分子が発現することが観察された。これは、HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞上のBRLF-1ペプチド／HLA-A24分子複合体分子に、BRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞上のTCRが相互作用し、BRLF-1特異的TCRを発現したTG40細胞が活性化されるためと考えられる。
【実施例２】
【００６４】
〔組換えレトロウイルスの作製〕
レトロウイルスベクターpMX-IRES-GFPおよびそれにEBウイルス抗原であるBRLF-1ペプチドをコードするDNAを挿入したものpMX-BRLF1p-IRES-GFPベクターを用いて以下の実験を行った。まず、pMX-IRES-GFPおよびpMX-BRLF1p-IRES-GFPベクターを大腸菌に導入し、Ampicillinを含む液体培地中で一晩培養した。大腸菌溶液を4℃で保存した。それぞれの大腸菌溶液を希釈し、Ampicillinを含む寒天培地に菌をまいて、一晩37℃で培養した。次の日、コロニーを数え、上記液体培地中に各ベクターを含む大腸菌が1mL中に何個存在するか、その密度を計測した。その計測値より、pMX-IRES-GFPが導入された大腸菌の懸濁液に、pMX-BRLF1p-IRES-GFPが導入された大腸菌の懸濁液を希釈して添加し、pMX-IRES-GFPが導入された大腸菌に対してpMX-BRLF1p-IRES-GFPが導入された大腸菌数が1,000分の１あるいは10,000分の１になるように大腸菌の液を調製し、それよりプラスミドDNAをそれぞれ調製した。調整されたプラスミドの中で、ｐMX-BRLF1ｐ−IRES-GFPプラスミドDNAのpMX-IRES-GFPプラスミドDNAに対する分子数の比は1:1,000あるいは1:10,000と考えられる。このようにして調製したプラスミドDNAを定法に従って、PLAT-Eパッケージング細胞に遺伝子導入し、組換えレトロウイルスを作製した。【００６５】
〔Cisの実験〕
レポーター細胞として、TG40 R1.0レポーター細胞にEBウイルス由来BRLF１ペプチドがHLA-A24分子に結合した複合体を認識するQ22 TCRを発現させた細胞を用いる（以下Q22-TG40 R1.0レポーター細胞と呼ぶ）。この細胞にはHLA-A24分子が発現しており、その分子上にBRLF1ペプチドが結合すると、同じ細胞上のTCRとcisの相互作用により細胞が活性化され、活性化マーカーであるCD137分子が発現する。【００６６】
pMX-BRLF1p-IRES-GFPプラスミドDNAとpMX-IRES-GFPプラスミドDNA比が1:10,000のプラスミドDNAを用いて作製した組換えレトロウイルスを、Q22-TG40 R1.0レポーター細胞に感染させ、2日後にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した（図14上）。図14の上の段のsorting time １のドットプロット表示にその結果が示してある。縦軸はGFPの発現で、レトロウイルスが感染した細胞を示す。横軸はCD137の発現で、0.72%の細胞がGFP陽性CD137陽性になっている。この細胞をFACSAriaセルソータによりソーティングした。ソーティングした細胞を培養し、さらに2回、3回、4回とソーティングした時のGFPとCD137の発現の結果が図14の上段に示してある。2回目、3回目のソーティングの時には、GFP陽性CD137陽性の細胞はそれぞれ0.54、0.70%であるが、4回目のソーティングの時には、22.7%になっている。これは、1回目、2回目のソーティングの時には、見かけ上GFP陽性CD137陽性になっている細胞はほとんど非特異的な染色結果で、実際にGFP陽性CD137陽性の細胞が非常に少ない結果、1回目から3回目までGFP陽性CD137陽性の細胞の割合がほとんど変化しなかったと考えられる。【００６７】
4回目のソーティングの後、BRLF1ペプチドを組み込んだプラスミドpMX-BRLF1p-IRES-GFPが陽性の細胞が濃縮されているか、回収した細胞を用いてRT-PCRを行った。PCRは図15に示してあるように、pMX-BRLF1p-IRES-GFPのベクターでは261塩基対のDNA断片が増幅し、pMX-IRES-GFPのベクターからは228塩基対のDNA断片が増幅する。PCR産物をアガロースゲルで解析した結果が下の写真で、１レーン目はウイルスを感染させていないQ22-TG40 R1.0細胞を用いた結果、２レーン目は4回ソーティングを行った後の細胞を用いてRT-PCRをした結果である。ソーティングした細胞では、228塩基対のバンドに加えて、261塩基対のpMX-BRLF1p-IRES-GFPのバンドが観察された。すなわち、10,000個に1個の割合で存在するBRLF1ペプチドをコードするプラスミドDNAをQ22-TG40 R1.0細胞を用いてクローニングすることが可能であることが示された。261塩基対のpMX-BRLF1p-IRES-GFPのバンドに加えて、228塩基対のpMX-IRES-GFPのバンドが観察される理由は以下の通りである。すなわち、レトロウイルスは1個の細胞に複数個感染するため、最初に感染した細胞にはpMX-BRLF1p-IRES-GFPに加えて、pMX-IRES-GFPも複数個組み込まれる。一度組み込まれたベクターは除かれないため、何度ソーティングを行っても、ソーティングした細胞からはpMX-BRLF1p-IRES-GFPに加えて、pMX-IRES-GFPのバンドも検出される。【００６８】
〔Transの実験〕
レポーター細胞として、HLA-A24-ζキメラ分子を発現させたTG40細胞を用いる（HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞と呼ぶ）。刺激細胞として、TG40細胞にEBウイルス由来BRLF１ペプチドがHLA-A24分子に結合した複合体を認識するQ22 TCRを発現させた細胞を用いる（以下Q22-TG40刺激細胞と呼ぶ）。この細胞にはHLA-A24分子は発現させておらず、上で観察したようなTCRとMHC/ペプチド複合体のcisの相互作用は起こらない。HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞上のHLA-A24分子にBRLF1ペプチドを結合させ、Q22-TG40刺激細胞と混合培養すると、Q22-TG40刺激細胞のTCRがHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞上のHLA-A24分子／BRLF1ペプチド複合体とtransの相互作用を行う。すると、HLA-A24分子に結合したζ分子からシグナルが伝達され、HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞が活性化され、CD137分子が発現する。【００６９】
pMX-BRLF1p-IRES-GFPプラスミドDNAとpMX-IRES-GFPプラスミドDNA比が1:1,000のプラスミドDNAを用いて作製した組換えレトロウイルスを、HLA-A24-ζ TG40レポーター細胞に感染させ、1日後に等量のQ22-TG40刺激細胞を加え、さらに1日混合培養した。レトロウイルスを感染させて、2日目にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した（図14下）。図14の下の段のsorting time １のドットプロット表示にその結果が示してある。縦軸はGFPの発現で、レトロウイルスが感染した細胞を示す。このドットプロットにはHLA-A24陽性のHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞の結果だけが示されており、いっしょに混合培養したHLA-A24陰性のQ22-TG40刺激細胞のデータは示されていない。横軸はCD137の発現で、1.5%の細胞がGFP陽性CD137陽性になっている。この細胞をFACSAriaセルソータによりソーティングした。ソーティングした細胞を培養・増殖させ、そのHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞と同量のQ22-TG40刺激細胞を混合培養し、次の日にCD137分子の発現をPE標識CD137特異的抗体で染色し、FACSAriaセルソータにより解析した。Sorting times 2の下段のドットプロットの図がその結果である。この時、27.2%の細胞がGFP陽性CD137陽性になっている。同様に、さらに3回、4回とソーティングを行った。【００７０】
4回目のソーティングの後、BRLF1ペプチドを組み込んだプラスミドpMX-BRLF1p-IRES-GFPが陽性の細胞が濃縮されているか、回収した細胞を用いてRT-PCRを行った。PCR産物をアガロースゲルで解析した結果が図15下の写真で、３レーン目はウイルスを感染させていないHLA-A24-ζ TG40レポーター細胞を用いた結果、４レーン目は4回ソーティングを行った後の細胞を用いてRT-PCRをした結果である。ソーティングした細胞では、228塩基対のバンドに加えて、261塩基対のpMX-BRLF1p-IRES-GFPのバンドが観察された。すなわち、1,000個に1個の割合で存在するBRLF1ペプチドをコードするプラスミドDNAをQ22-TG40 R1.0細胞を用いてクローニングすることが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
がんの免疫学的治療において、日本ではペプチドワクチンによる治療が試験されている。ペプチドワクチン療法が効果的に行われるためには、がん免疫を効果的に誘導するペプチドワクチンが不可欠であり、現在、使われているペプチドワクチンによりより効能の高い抗原の同定が望まれている。本発明の実施態様により、新規のペプチドワクチンのが期待できる。【００７２】
実施例で用いた材料に関し、下記の情報が参照できる。
TG40 T細胞株に関して：
(1) A. Zumla, C. Marguerie, A. So, W.M. Yokoyama, T. Saito, J.R. Batchelor and R.I. Lechler. Co-expression of human T cell receptor chains with mouse CD3 on the cell surface of a mouse T cell hybridoma. Journal of Immunological Methods, 149 (1992) 69-76.
(2) Chihiro Motozono, Saeko Yanaka, Kouhei Tsumoto, Masafumi Takiguchi and Takamasa Ueno. Impact of Intrinsic Cooperative Thermodynamics of Peptide-MHC Complexes on Antiviral Activity of HIV-Specific CTL. J Immunol 2009; 182:5528-5536
HLA-A*2402に関して：
(3) Akatsuka, Y., Goldberg, T.A., Kondo, E., Martin, E.G., Obata, Y., Morishima, Y., Takahashi, T. and Hansen, J.A., Efficient cloning and expression of HLA class I cDNA in human B-lymphoblastoid cell lines. Tissue Antigens, 59: 502-511, 2002.
BCMG-neoに関して：
(4) Hajime Karasuyama, Noriko Tohyama, and Tomio Tada, Autocrine Growth and Tumorigenicity of Interleukin 2-Dependent Helper T Cells Transfected with Il-2 Gene. J. Exp. Med. 169: 13-25, 1989.
ζ鎖の細胞内ドメインを結合させたキメラ分子に関して：
(5) Irving BA, Weiss A. The cytoplasmic domain of the T cell receptor zeta chain is sufficient to couple to receptor-associated signal transduction pathways.
Cell. 64: 891-901, 1991.
配列情報：
HLA-A*2402 Accession number: L47206
ヒトbeta2-globulin Accession number: NM_004048
Q_22_alpha Accession number: AB749876
Q_22_beta Accession number: AB749877
E_21_alpha Accession number: AB749826
E_21_beta Accession number: AB749827
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号1：Met OT-1のアミノ酸配列
配列番号2：Met OT-1をコードする配列を含む断片のヌクレオチド配列
配列番号3：Met EBNA3Aのアミノ酸配列
配列番号4：Met EBNA3Aをコードする配列を含む断片のヌクレオチド配列
配列場号5：pSV2-CD23-IL2Ep-GFPのヌクレオチド配列
配列番号6：EBウイルス由来BRLF-1ペプチドのアミノ酸配列
【図１】
2014123231.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014123231.tif 000019
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