(57)【要約】  蛍光免疫染色の反応系における終濃度が低い場合（例えば０．０２ｎＭ）であっても十分なシグナル強度が得られ、プローブ生体物質や標識体を検出対象以外の物質に対する非特異的な吸着を抑制し、ノイズを抑えた蛍光免疫染色画像が得られる蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた免疫染色法を提供する。長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下の第１親水性高分子由来のスペーサー１を介して第１結合基物質Ａに連結されるとともに、生体分子２と特異的に結合するプローブ生体物質３と、第１結合基物質Ａと特異的に結合可能な第２結合基物質Ｂを有する蛍光体集積ナノ粒子５とからなるセット蛍光体集積ナノ粒子標識剤とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下の高分子由来のスペーサーを介して第１結合基物質に連結され生体分子と特異的に結合するプローブ生体物質と、
該第１結合基物質と特異的に結合可能な第２結合基物質を有する蛍光体集積ナノ粒子とからなるセットを含む、蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項２】
前記高分子が親水性の高分子（第１親水性高分子）である、請求項１に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項３】
前記第１親水性高分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のオキシエチレン単位（ｎ）の数が、６〜２３０である、請求項２または３に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項５】
前記第１結合基物質がストレプトアビジンおよびビオチンのいずれか一方であり、
前記第２結合基物質がビオチンまたはストレプトアビジンのいずれか他方である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項６】
前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が、５０ｎｍ以上２３０ｎｍ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項７】
前記第１親水性高分子のスペーサーの長さが、５０オングストローム以上１２０オングストローム以下である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項８】
前記生体分子が抗原または１次抗体であり、前記プローブ生体物質が１次抗体または２次抗体であり、蛍光免疫染色に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて行う、蛍光免疫染色法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光体集積ナノ粒子標識剤および該蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いた蛍光免疫染色法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光体集積ナノ粒子標識剤が知られている（例えば、特許文献１）。この蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、検出目的の生体分子と結合可能なプローブ生体物質と、蛍光体集積ナノ粒子とを含む。【０００３】
特許文献１には、第１結合基（例えば実施例では（以下同様）ビオチン）を検出目的の生体分子（ＨＥＲ２）と結合可能なプローブ生体物質（一次抗体＝抗ＨＥＲ２抗体）に連結するとともに、第１結合基と結合可能な第２結合基（ストレプトアビジン）を蛍光体集積ナノ粒子に連結するときに、第１結合基とプローブ生体物質との間、および、第２結合基と蛍光体集積ナノ粒子との間に、それぞれ適当な鎖長のスペーサーを介在させてもよいことが開示されている。第２結合基と蛍光体集積ナノ粒子とを連結するスペーサーを生成するためのリンカーの具体例として、特許文献１の実施例では、ＳＭ（ＰＥＧ）12が用いられている。また、特許文献１には、実施例に示されているように一次抗体に蛍光体集積ナノ粒子をビオチン−ストレプトアビジンを介して結合させるような実施形態のみならず、一次抗体に二次抗体を結合させた後、その二次抗体に蛍光体集積ナノ粒子をビオチン−ストレプトアビジンを介して結合させるような実施形態であってもよいことも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３／０３５６８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載されているような従来の蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いた蛍光免疫染色において、蛍光シグナルの強度を高める、すなわち検出対象とする物質の存在が輝点によって示されることの確実性を向上させるために、プローブ生体物質および／または蛍光体集積ナノ粒子の濃度を高めると、上記の目的は一定程度達成できるが、それと同時に、プローブ生体物質や蛍光体集積ナノ粒子が検出対象以外の物質に非特異的に吸着しやすくなり、検出対象とする物質が存在しない箇所にも基点が表れるというノイズも高くなってしまうという問題があった。【０００６】
本願発明は上記問題に着目してなされたものであり、蛍光体集積ナノ粒子の終濃度が低い場合（例えば０．０２ｎＭ）であっても十分なシグナル強度が得られ、プローブ生体物質や標識体の検出対象以外の物質に対する非特異的な吸着を抑制し、ノイズを抑えた蛍光免疫染色画像が得られる蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた免疫染色法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、以下の蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた蛍光免疫染色法が提供される。【０００８】
上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した画像形成装置は、長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下の高分子由来のスペーサーを介して第１結合基物質に連結され生体分子と特異的に結合するプローブ生体物質と、該第１結合基物質と特異的に結合可能な第２結合基物質を有する蛍光体集積ナノ粒子とからなるセットを含む、蛍光体集積ナノ粒子標識剤である。【０００９】
上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した蛍光免疫染色法は、上記の蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて行うことを特徴とする蛍光免疫染色法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、蛍光体集積ナノ粒子の終濃度が低い場合（例えば０．０２ｎＭ）であっても十分なシグナル強度が得られ、プローブ生体物質や標識体の検出対象以外の物質に対する非特異的な吸着を抑制し、ノイズを抑えた蛍光免疫染色画像が得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて、蛍光免疫染色をしている状態を説明した図である。
【図２】図２（Ａ）は一端にビオチン（第１結合基物質）が結合したリンカーを示す。（Ｂ）は、（Ａ）のリンカーの他端が抗体（プローブ生体物質）に結合した状態を示し、高分子に由来する部分の長さ（スペーサーの長さ）を説明した図である。
【図３】図３は、従来技術に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて、蛍光免疫染色をしている状態を説明した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、図１に例示したように、高分子由来のスペーサー１を介して第１結合基物質Ａに連結され生体分子２と特異的に結合するプローブ生体物質３と、該第１結合基物質Ａと特異的に結合可能な第２結合基物質Ｂが結合した蛍光体集積ナノ粒子５からなるセットを含むことを特徴とする。
【００１３】
《生体分子》
本発明において、「生体分子」とは、特に限定されるものではないが、抗原、または、該抗原と特異的に結合した１次〜ｎ次の抗体（試薬Ｉ）が挙げられる。ここで、本発明において、「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などの各種抗体を含む。
【００１４】
（抗原）
「抗原」として、例えば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）であるが、該タンパク質またはアミノ酸と、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子との複合体なども含まれる。具体的には、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００１５】
例えば、がんの増殖制御因子，転移制御因子，増殖制御因子受容体および転移制御因子受容体等のがんに関連する抗原の他に、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α），ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）受容体などの炎症性サイトカイン、ＲＳＶ Ｆ蛋白質等のウィルス関連分子なども「抗原」に含まれる。
【００１６】
蛍光免疫染色法で、プローブ生体物質が直接抗原に対して結合せずに１次抗体〜ｎ次抗体を介して前記抗原に固定される場合、プローブ生体物質が特異的に結合する対象の「生体分子」は、前記抗原と特異的に結合した１次〜ｎ次の抗体（試薬Ｉ）であり、プローブ生体物質は２次〜ｎ＋１次の抗体となる。
【００１７】
また、前記抗体として、例えば、関節リウマチなどの自己免疫疾患、がんなどの悪性腫瘍、ウィルス感染症等の治療に一般的に用いられている抗体医薬を用いることができる。
【００１８】
臨床に用いられている代表的な抗体医薬を、下記表１に示す。ここで、表１には、参考のために、自己免疫疾患や感染症の治療に用いられる抗体医薬も併せて記載している。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
《プローブ生体物質》
プローブ生体物質は、「生体分子」と特異的に結合する分子であり、上述したように、「生体分子」が抗原または１次〜ｎ次抗体（試薬Ｉ）である場合、それぞれ１次抗体または２次〜（ｎ＋１）次抗体が「プローブ生体物質」に該当する。
【００２１】
図１に示した例では、高分子由来のスペーサー１の一端にプローブ生体物質３が化学結合されている。
スペーサー１とプローブ生体物質３との化学結合は、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合が好ましい。
【００２２】
高分子の一端にプローブ生体物質３を化学結合させる具体的な方法としては、チオール基−マレイミド基のカップリング反応法、架橋剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができる。
【００２３】
《高分子》
スペーサー１を形成するための高分子としては、所定の長さを有する疎水性高分子や親水性高分子、およびこれらの組合せが好適に用いられる。
疎水性高分子の例としては、後述する所定の長さを有する、ポリアミド、飽和炭化水素、環状炭化水素、疎水性ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル等が挙げられる。
【００２４】
この親水性高分子の例としては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸、およびこれらに類する物により形成される群から選択された１種類または２種以上の親水性高分子を用いることができる。前述の例示された親水性高分子の中では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい観点から好ましい。
【００２５】
上記高分子については、以下の反応により、マレイミド化、アミノ化、ビオチン化、チオール化等した高分子として得た後に、リンカー試薬としてプローブ生体物質３や第１結合基物質Ａと結合させることが好ましい。
【００２６】
アミド化反応によりアルカンジカルボン酸とジアミノアルカンから、両末端にアミノ基を有する高分子を得る方法、アミノ基を有する高分子にビオチン４-ニトロフェニルエステルと反応させてアミノ基をビオチン化する方法、さらに、アミノ基を有する高分子に３-マレイミドプロピオン酸  Ｎ‐スクシンイミジルと反応させ、該アミノ基をマレイミド化する方法等によって、リンカーの形態として上記高分子を得ることができる。
【００２７】
この場合、合成後の高分子の主鎖（炭素原子以外にもヘテロ原子を含んでもよいもの）のリンカーの長さ（後述）が、３０オングストローム以上１０００オングストローム以下となるように、合成に用いるアルカンジカルボン酸とジアミノアルカンとを選択することが好ましく、ゲル濾過して目的のリンカーの長さに相当する分子量の画分を回収し、後述のリンカーの長さの高分子を回収することが好ましい。
【００２８】
この他にも、マレイミド化した高分子を得る方法として、例えば、無水マレイン酸と第１級アミン（Ｒ１−ＮＨ2）とを一段階で脱水反応させることにより得る方法等の従来から知られている多くの方法で行うことができる。この場合、第１級アミンは、第１級アミンのＲ１の末端の炭素原子から窒素原子までの長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下のものとすべきである。
【００２９】
アミノ化した上記高分子を得る方法としては、例えば、アルデヒドまたはケトンと、第１級アミン（Ｒ１−ＮＨ2）とを還元的アミノ化反応させることで得ることができる。この場合、（１）アルデヒドまたはケトンの分子中のＲ１の主鎖の一端の炭素原子からカルボニル基の炭素原子までの長さ、および（２）第１級アミンのＲ１の主鎖の末端の炭素原子から窒素原子までの距離、（３）（１）のカルボニル基と（２）の窒素原子との結合の長さの合計が３０オングストローム以上１０００オングストローム以下であるものとすべきである。
【００３０】
ビオチン化した上記高分子を得る方法は、福山カップリング法を利用したビオチン化により得ることができる（Shimizu, T.; Seki, M. (2000). "Facile synthesis of (+)-biotin via Fukuyama coupling reaction". Tetrahedron Lett. 41 (26): 5099-5101.参照）。この場合、ビオチンと反応させる分子の主鎖の長さを３０オングストローム以上１０００オングストローム以下とすべきである。
【００３１】
また、ハロゲン化アルキル（Ｒの主鎖の酸素からハロゲン原子までの距離が３０オングストローム以上１０００オングストローム以下のもの）をアルカリの存在下に硫化水素と反応させる（R-Br + NaSH → R-SH + NaBr）方法で行うことができる。
【００３２】
（スペーサーの長さ）
スペーサーの長さとは、図１に示したように、第１親水性高分子をビオチン等の第１結合基物質Ａと抗体等のプローブ生体物質３とに結合させたときに、第１結合基物質Ａとプローブ生体物質３との間の第１親水性高分子に由来する化学構造の部分（スペーサー１）の長さを意味する。
【００３３】
図２（Ａ）に示した具体例のＰＥＧリンカーについて説明すると、該ＰＥＧリンカーの一端（図２（Ａ）に示す分子の右端）にはビオチンが結合されており、該ＰＥＧリンカーの他端（図２（Ａ）に示す分子の左端）にはマレイミド基が結合されている。このＰＥＧリンカーの他端のマレイミド基に抗体等のプローブ生体物質３を反応させて結合させた場合、第１親水性高分子に由来するスペーサーの長さ（スペーサー１の長さ）は、図２（Ｂ）で示したように、両方向の矢印で示した部分に相当するアミド結合の窒素原子から次のアミド結合の酸素原子までの部分の長さとなる。
【００３４】
ここで、化学結合の距離はセルフコンシステントアプローチに基づく理論値である。それによると、Ｎ−Ｃ結合距離は１．４６オングストロームであり、Ｃ−Ｃ結合距離は１．５０オングストロームであり、Ｃ−Ｏ結合距離は１．３８オングストロームである。図２（Ｂ）の両方向の矢印で示した部分のアミド結合の窒素原子から次のアミド結合の酸素原子までのスペーサー１の部分には、Ｎ−Ｃ結合が５個、Ｃ−Ｃ結合が１５個、およびＣ−Ｏ結合が２２個存在するため、図２に示したように、スペーサーの長さは、合計理論値の６０．１６オングストロームとなる。
【００３５】
このスペーサー１の長さは、好ましくは３３．６オングストローム以上９８０．７オングストローム以下、より好ましくは３３．６オングストローム以上１０４．７オングストローム以下、特に好ましくは５５．５オングストローム以上１０４．７オングストローム以下である。
【００３６】
スペーサー１の長さを３０オングストローム以上とすることで、蛍光免疫染色を行った際に、生体分子２に結合したプローブ生体物質３に連結された第１結合基物質Ａと、蛍光体集積ナノ粒子５に連結された第２結合基物質Ｂとの反応効率を改善することができ、それによってシグナルの強度を向上させることができる。つまり、検出すべき生体分子が存在するときにその存在が蛍光体集積ナノ粒子の輝点として示されることの確実性を向上させることができる。逆に、スペーサー１の長さが１０００オングストロームを上回ると（例えば約１５００オングストロームとなると）、スペーサー１が、結合組織や脂肪組織などで、疎水性アミノ酸の割合が高い組織切片中の間質やその他の生体分子２が存在しない部位に非特異的に吸着しやすくなる。そうすると、プローブ生体物質３が生体分子２に結合していなくても、つまり生体分子２が存在していない箇所でも、輝点として示される場合が出てきてしまい、かえってノイズを高めることとなりかねない。このような非特異的な吸着の程度は、例えば、目的の生体分子２を発現していない細胞に対して免疫蛍光染色を行うことによって調べることができる。したがって、スペーサー１の長さが上記の所定の範囲内であれば、得られる蛍光シグナルの向上とノイズの抑制のバランスを好適に取ることができ、疾病に関連する抗原等の生体分子２の定量性を優れたものとすることができる。
【００３７】
上述したＰＥＧリンカー等は、例えばサーモサイエンティフィック社等の市販のものを購入したり、第１親水性高分子を上述のように化学結合させて形成されるスペーサー１の長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下となるように、第１親水性高分子に含まれる化学構造の繰り返しの単位の数を設定して、試薬メーカー等に製造を依頼したりすることで入手することができる。
【００３８】
それ以外にも、第１親水性高分子を上述のように化学結合させて形成されるスペーサー１の長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下となるように、市販されている第１親水性高分子を選択するとともに、この溶液を分子量分画（ゲル濾過等）に供して所定の分子量を有する第１親水性高分子のみを回収し、回収した第１親水性高分子に対して第１結合基物質Ａとプローブ生体物質３を付加してスペーサー１を形成することにより入手してもよい。なお、第１親水性高分子に由来するスペーサー１の長さは、例えば、得られたプローブ生体物質３、スペーサー１、および第１結合基物質Ａの複合体（試薬ＩＩ）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによる質量分析にかけることで確認することができる。
【００３９】
上述したリンカーは、例えば、図２（Ａ）に示したように、第１親水性高分子１の両端にそれぞれ第１結合基物質Ａ（図２（Ａ）の例ではビオチン）と、プローブ生体物質（図２（Ａ）の例では２次抗体）に結合反応する官能基（図２（Ａ）の例ではマレイミド基）とをそれぞれ結合させたものが好ましい。例えば、リンカーの一端と中央にそれぞれ第１結合基物質Ａと前記官能基とがある場合、スペーサー１の長さが、およそ当該リンカーの一端から中央までの長さとなってしまい、リンカーの中央から他端までの部分がスペーサーとして機能しなくなってしまうからである。このような両端に官能基を有する第１親水性高分子は、例えば、一般に知られている試薬メーカ（サーモサイエンティフィック社）から購入することで入手することができる。
【００４０】
《第１結合基物質》
第１結合基物質Ａは、例えば、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ハプテン、抗ハプテン抗体等であり、図１に示したように、後述する蛍光体集積ナノ粒子５に結合した第２結合基物質Ｂと特異的に結合する分子である。上記ハプテンとしては、例えば、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）を挙げることができる。
【００４１】
スペーサー１と第１結合基物質Ａとの結合は、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合が好ましい。
【００４２】
第１親水性高分子と第１結合基物質Ａとを化学結合する具体的な方法としては、チオール基−マレイミド基のカップリング反応法、架橋剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができる。
【００４３】
架橋反応法を用いて第１親水性高分子と第１結合基物質Ａとを結合させる場合、上述した第１親水性高分子由来のリンカー１とプローブ結合物質３との結合と同様に、第１親水性高分子は、分子末端にカルボキシ基を有する第１親水性高分子を用いることが好ましい。第１親水性高分子の分子鎖の中央部にカルボキシ基がある場合、中央部のカルボキシ基に第１結合基物質Ａが結合してしまい、第１親水性高分子に由来する部分の長さが十分に確保できなくなる場合（スペーサー１の長さ３０以上１０００オングストローム以下に入らない場合）があるからである。
【００４４】
《第２結合基物質》
第２結合基物質Ｂは、第１結合基物質Ａと特異的に結合する分子であればよく、例えば、ビオチン、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、抗ハプテン抗体、ハプテン等である。上記ハプテンとしては、例えば、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）を挙げることができる。
【００４５】
（第２結合基物質と蛍光体集積ナノ粒子との結合）
蛍光体集積ナノ粒子５と第２結合基物質Ｂとの結合は、直接的な結合であってもよいし、図１に示したように他の分子を介在させる間接的な結合であってもよい。
【００４６】
蛍光体集積ナノ粒子５に対して第２結合基物質Ｂを直接的に結合させる態様としては、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられ、公知の方法で行うことができる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
【００４７】
蛍光体集積ナノ粒子５に対して第２結合基物質Ｂを間接的に結合する場合の態様としては、蛍光体集積ナノ粒子５と第２結合基物質Ｂとに第２親水性高分子由来を結合させて、蛍光体集積ナノ粒子５と第２結合基物質Ｂとの間に別のスペーサー４を介在させる態様が挙げられる。
【００４８】
第２親水性高分子は、上述した第１親水性高分子と同じく、ポリエチレングリコール、フィコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸およびこれらに類する物により形成される群から選択された１種類または２種以上の親水性高分子を用いることができる。ここで、第２親水性高分子は、非特異的吸着を抑制する観点から、ポリエチレングリコールを用いることが好ましい。
【００４９】
第２親水性高分子由来のスペーサー４と第２結合基物質Ｂとの結合は、例えば、上述した第１親水性高分子由来のスペーサー１と第１結合基物質Ａとの結合と同様に、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、好ましくはマレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合である。
【００５０】
第２親水性高分子由来のスペーサー４と蛍光体集積ナノ粒子５との結合は、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合等が好ましい。この結合の方法例として、チオール基−マレイミド基のカップリング反応法、架橋剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができる。
【００５１】
《蛍光体集積ナノ粒子》
蛍光体集積ナノ粒子５は、蛍光体を集積したものである。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、１分子の蛍光体と比較して、１分子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標識する輝点の輝度を高めることができる。
【００５２】
（蛍光体）
本明細書において「蛍光体」とは、外部からのＸ線、紫外線、可視光線または近赤外光線等の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
【００５３】
また、本発明にいう「蛍光体」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。このような蛍光体は、有機蛍光体および無機蛍光体に大別することができる。
【００５４】
（有機蛍光体）
蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
【００５５】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，４'，５'，７，７'−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２'，４，７，７'−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４'，５'−ジクロロ−２'，７'−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
【００５６】
（無機蛍光体）
蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、又はＩＶ族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「ＩＩ−ＶＩ族量子ドット」、「ＩＩＩ−Ｖ族量子ドット」、「ＩＶ族量子ドット」ともいう。）のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
【００５７】
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００５９】
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００６０】
《蛍光体集積ナノ粒子の製造方法》
蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる（当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する）製造方法を用いることができる。
【００６１】
<有機蛍光体の場合>
有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂（熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂）を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、蛍光体を添加し、当該（共）重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
【００６２】
上記の熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。上記の熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、キシレン等の有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、色素樹脂に内包させた色素の溶出を抑制することができる点で好ましい。
【００６３】
例えば、有機の蛍光色素（蛍光体）を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
【００６４】
一方で、有機蛍光体をシリカからなる母体の内部または表面に固定化したシリカナノ粒子を製造することもできる。そのような製造方法としては、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成方法を参考にすることができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
【００６５】
<無機蛍光体の場合>
無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
【００６６】
また、上記とは異なる蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、シリカビーズをシランカップリング剤で処理して末端をアミノ化し、カルボキシ基末端を有する蛍光体としての半導体微粒子をシリカビーズの表面にアミド結合により結合することで集積し、蛍光体集積ナノ粒子とする方法も挙げられる。
【００６７】
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル−ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス状の粒子を形成し、蛍光体集積ナノ粒子とする例が挙げられる。
【００６８】
さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、1-エチル‐３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在化で、アミノ基末端の半導体ナノ粒子と、カルボキシ基末端の半導体ナノ粒子を混合し、半導体ナノ粒子間をアミド結合で介して結合することで半導体ナノ粒子を集積し、蛍光体集積ナノ粒子を製造する例が挙げられる。
【００６９】
さらに、無機蛍光体を樹脂からなる母体の内部または表面に固定化した集積体を製造することもできる。たとえば、量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
【００７０】
《蛍光免疫染色法》
以下、本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いた組織免疫染色法（蛍光免疫染色法）について説明する。
【００７１】
（１）脱パラフィン処理工程
キシレンを入れた容器に、パラフィンコートされた被験者（特定の疾患が疑われるヒト、イヌ、ネコ等）の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により、浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００７２】
ついで、エタノールを入れた容器に組織切片を浸漬させて、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００７３】
水を入れた容器に病理切片を浸漬させて、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００７４】
（２）賦活化処理工程
公知の方法にならい、組織切片に含まれる染色対象の抗原の賦活化処理をすることが好ましい。賦活化処理の条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器としては、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。賦活化処理の加熱処理の温度は５０〜１３０℃、加熱処理の時間は５〜３０分で行うことができる。
【００７５】
ついでＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ）を入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００７６】
（３）免疫染色処理工程
免疫染色処理工程では、本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤のプローブ生体物質と組織切片にある抗原や１次〜ｎ次抗体（生体分子）と結合させる。
具体的には、蛍光体集積ナノ粒子標識剤のバッファー（ＰＢＳ等）分散液を調製し、組織切片に載せて、蛍光体集積ナノ粒子標識剤のプローブ生体物質と前記生体分子とを結合させる。次に、バッファー（ＰＢＳ等）を入れた容器に染色後の組織切片を浸漬させて、未反応の蛍光ナノ粒子標識剤や抗体等を除去する。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でバッファー（ＰＢＳ等）を交換してもよい。上記免疫染色処理工程の後に、ヘマトキシリン−エオジン染色などの、形態観察染色工程をさらに行うことが望ましい。
【００７７】
（その他の染色）
ある組織アレイスライドと同一の被験者に由来する別の組織アレイスライドについて、蛍光免疫染色と同一または異なる抗原の有無を確認するための化学免疫染色（ＤＡＢ染色等）を行っても良い。また、ある組織アレイスライドについて、蛍光免疫染色と、それとは異なる抗原を対象とした化学免疫染色とによる二重染色を行ってもよい。これらの場合、病理切片中の特定の抗原に対して、発色用酵素が連結された抗体等を抗原抗体反応等により結合させ、該結合後に発色基質を反応系に添加して前記発色用酵素により発色させる。
【００７８】
抗原抗体反応の段階において、抗原に対する上記結合は公知の方法により行うことができる。なお、抗原抗体反応の結合の前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤を滴下して室温で所定時間（例えば１時間）インキュベートしておくことが好ましい。
発色工程において、前記発色用酵素の基質、発色剤を反応系に添加して化学発色させるが、発色剤は以下のものを例示することができる。
発色用酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合、ＴＭＢ(３，３，５，５−テトラメチル  ベンジジン）、３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、4-クロロ-1-ナフトール等が挙げられる。また、発色用酵素として酵素アルカリホスファターゼを用いる場合、ニューフクシン等が挙げられる。
【００７９】
（４）固定処理工程
固定処理工程は、（３）染色処理工程により導入された蛍光体集積ナノ粒子標識剤等を組織切片に固定する工程である。固定処理溶液として、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質等が挙げられる。固定処理は、従来公知の手法により行うことができる。固定処理は、具体的には、上述したような固定処理溶液に、（３）染色処理工程により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、稀パラホルムアルデヒド水溶液中に、（３）染色処理工程により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
【００８０】
（５）観察工程
（５−１）明視野観察工程
明視野観察工程は、前記工程（１）〜（４）において可視光として観察可能な発色剤（色素）を用いた染色（形態観察染色、酵素免疫染色等）を行った場合に、染色された組織切片に照明光を当て、組織切片に沈着した発色剤の色素を観察し、細胞または組織内の染色対象とする抗原の分布情報（発色点数等）を取得する工程である。
【００８１】
なお、形態観察染色に用いられるエオジンは、明視野において観察できるだけでなく、所定の波長の励起光を照射した時に自家蛍光も発するので、蛍光顕微鏡によっても観察できる。励起光は、組織および必要に応じて用いられるエオシンが所望の波長の自家蛍光を発するものであればよく、励起光の照射手段も特に限定されるものではない。たとえば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。
【００８２】
細胞形態情報は、蛍光の視野に含まれる細胞形態情報を取得することが好適である。もちろん、必要であれば、たとえば組織の自家蛍光または蛍光標識材料が発する蛍光の一方を十分に低減しうる適切なフィルターを用いることにより、ある視野で細胞形態情報のみを取得するようにすることが好ましい。
【００８３】
一方、前記その他の染色として、例えば、乳がんにおけるＨＥＲ２タンパク質を検出対象とする生体分子として組織化学染色（ＤＡＢ染色等）をおこなった場合の明視野観察においては、適切な照明光の照射下で、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、検体組織内の癌細胞のＨＥＲ２タンパク陽性染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察する。次に対物レンズを１０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認し、必要に応じてさらに対物レンズ２０倍で検索する。
【００８４】
上述したいずれの明視野観察も、迅速な観察が行えるように、顕微鏡の鏡筒から明視野の画像を取得するようにしてもよいし、顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示し、それを観察することにより取得するようにしてもよい。
【００８５】
（５−２）蛍光観察工程
蛍光観察工程は、上記工程により染色された組織切片中の蛍光体集積ナノ粒子の蛍光体に励起光を照射することにより、該蛍光体の発する蛍光に基づく生体分子の分布情報（輝点数等）を取得する工程である。
【００８６】
前記励起光は、前記蛍光体に対して適した励起光を照射して蛍光体を励起し、染色対象の生体分子を蛍光で染色する。また、励起光の照射手段も特に限定されるものではない。例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。
【００８７】
前記励起光は、組織切片の自家蛍光との関係で蛍光体が発する蛍光が識別可能である限り特に限定されないものの、組織切片からの自家蛍光強度が高くなりすぎないようにする観点から、４５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長を有する励起光が好ましい。また、前記蛍光体を構成する蛍光物質としては当該励起光により４８０ｎｍ以上の範囲、好ましくは５８０〜６９０ｎｍの範囲にピークを有する蛍光を発するものを用いる（したがってこの領域の発光波長を有する蛍光を測定するようにする）。
【００８８】
また、本工程において生体分子の分布情報は、迅速な観察が行えるよう（蛍光）顕微鏡の鏡筒から取得するようにしてもよいし、（蛍光）顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示し、それを観察することにより取得するようにしてもよい。標識体として用いる蛍光体を構成する蛍光物質によるが、顕微鏡の鏡筒からの目視により十分に生体分子分布情報を取得することができなくても、カメラが撮影した画像から生体分子分布情報を取得することが可能な場合もある。
【００８９】
前記生体分子の分布情報を取得することとしては、例えば、蛍光の輝点数または発光輝度を基に、一細胞あたりの染色対象の生体分子の数もしくは密度を計測することが挙げられる。前記蛍光体の励起には、吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターを選択すればよい。輝点数または発光輝度の計測には、市販の画像解析ソフト（例えば、全輝点自動計測ソフト「Ｇ−Ｃｏｕｎｔ」（ジーオングストローム社製））を用いることが好適であるが、計測手段は特に限定されるものではない。
【００９０】
本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた蛍光免疫染色法の作用、効果について説明する。
（１）本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、所定の長さの親水性高分子１由来のスペーサーを介して第１結合基物質Ａに連結され抗原または１次〜ｎ次抗体等の生体分子２と特異的に結合するプローブ生体物質３と、該第１結合基物質Ａと特異的に結合可能な第２結合基物質Ｂが結合された蛍光体集積ナノ粒子５とからなるセットを含む（図１参照）。
【００９１】
第１親水性高分子由来のスペーサー１の長さを所定の値（３０オングストローム）以上とすることで、蛍光免疫染色を行った際に、生体分子２に結合したプローブ生体物質３に連結された第１結合基物質Ａと、蛍光体集積ナノ粒子５に連結された第２結合基物質との反応効率を改善してシグナルを向上させ、かつ所定の値（１０００オングストローム）以下とすることで、反応効率の低下や非特異的な吸着を抑制し、ノイズを低下させることができる。その結果、疾病に関連する抗原などの生体分子２の検出感度および定量精度を高め、病理判定の信頼性を高めることができる。
【００９２】
（２）スペーサー１が高い親水性を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性の高分子（第１親水性高分子）由来のものであれば、プローブ生体物質３、スペーサー１、および第１結合基物質Ａの複合体（試薬ＩＩ）の、疎水性組織で構成される間質細胞への非特異的な吸着を防止することができる。また、オキシエチレン単位の数を変更して、スペーサー１の長さを調節しやすい点でも有利となる。
【００９３】
（３）スペーサー１がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）由来であり、このスペーサー１のオキシエチレン単位（ｎ）の数が６〜２３０であれば、上述した前記（１），（２）の非特異的な吸着を防止する効果を特に高めることができる。
【００９４】
（４）第１結合基物質Ａ，Ｂがビオチンまたはストレプトアビジンであれば、これらの分子間の結合は、非常に特異的な結合であるので、上述した（１）の効果が高まる。
さらに、第１結合基物質Ａ，Ｂがビオチン，ストレプトアビジンであれば、第１結合基物質Ａ，Ｂがストレプトアビジン、ビオチンである場合より、プローブ生体物質３、スペーサー１、および第１結合基物質Ａの複合体（試薬ＩＩ）全体の分子サイズを小さくすることができるため、蛍光免疫染色における生体分子２とプローブ生体物質３との抗原抗体反応に悪影響を及ぼしにくい点で有利となる。
【００９５】
（５）蛍光体集積ナノ粒子５の平均粒子径が、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることで、汎用顕微鏡での蛍光観察が可能となる。ここで、蛍光体集積ナノ粒子５の平均粒子径が５０ｎｍ未満であると、汎用顕微鏡での蛍光観察での輝点を観察するのが困難となる。ここで、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が２００ｎｍを超えると、第１，２結合基物質の結合を介した蛍光体集積ナノ粒子とプローブ生体物質との結合効率が低下する。
【００９６】
（６）スペーサー１の長さが、５０オングストローム以上１００オングストローム以下であれば、特に上述した（１）の効果を高めることができる。
【００９７】
（７）前記生体分子は抗原または１次〜ｎ次抗体、前記プローブ生体物質は１次または２次〜ｎ＋１次抗体とすることができるので、本発明の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、様々な実施形態の蛍光免疫染色に用いることができる。
【実施例】
【００９８】
［実施例１］
《ストレプトアビジン結合テキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の製造》
スルホローダミン１０１（「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１」、シグマアルドリッチ社製、ＴｅｘａｓＲｅｄ色素）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持ながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。【００９９】
撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、該溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子（以下、粒子Ｘと略称する。）を沈殿させて上澄みを除去した。その後、沈殿した粒子Ｘの洗浄をエタノールと水で行った。【０１００】
洗浄後の粒子Ｘ０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。【０１０１】
表面がアミノ化された粒子Ｘの濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようリンカー試薬「ＳＭ（ＰＥＧ）12」（サーモサイエンティフィック社製、cat.No. 22112）を混合して、撹拌しながら室温で１時間反応した。【０１０２】
反応液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘを得た。【０１０３】
一方、スルフヒドリル基を有するストレプトアビジンの作製は以下のように行った。まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬに対して、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ，ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）７０μＬを室温で1時間より反応させた。すなわち、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ3）を導入した。【０１０４】
その後、公知のヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（−ＳＨ）を生成して、ストレプトアビジンにチオール基（−ＳＨ）を付加する処理を行った。【０１０５】
このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘに結合可能なストレプトアビジンを得た。【０１０６】
マレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ｘと、ＳＨ基を有する上記ストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプアビジン（第２結合基物質）で末端修飾されたＰＥＧ（３３．６オングストローム）を有する粒子Ｘ（試薬ＩＩＩ）を得た。【０１０７】
（蛍光ナノ粒子の平均粒子径の計測方法）
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて前記蛍光体集積ナノ粒子を撮像し、十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。具体的には、１０００個の前記蛍光体集積ナノ粒子の粒径の算術平均を平均粒子径とした。実施例１の蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径は、１５０ｎｍであった。【０１０８】
《ビオチン修飾された２次抗体の調製》
５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。該溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｏｌ）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０オングストロームであるリンカー試薬「Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ6‐ＮＨ‐Ｍａｌ」（ＰｕｒｅＰＥＧ社製,製品番号2461006-250）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。【０１０９】
この反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社製，Cat.#89882）に供して精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）により計測して反応溶液に含まれるタンパク質の量を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整し、該溶液をビオチン化２次抗体（試薬ＩＩ）の溶液とした。【０１１０】
《蛍光免疫染色法》
（１）脱パラフィン処理工程
上記ビオチン化２次抗体等を用いて、ヒト乳房組織の組織免疫染色と形態観察染色とを以下のように行った。染色用の組織切片として、ＨＥＲ２（３＋）とＨＥＲ２（−）の組織アレイスライド（コスモバイオ社製「ＣＢ−Ａ７１２のシリーズ」）を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。【０１１１】
なお、ＨＥＲ２のスコア「３＋」は、トラスツヅマブ病理部会作成のＨＥＲ２ガイドライン（第３版）に準じており、ＤＡＢ法によって「強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞＞３０％」であることが確認された組織切片であることを示す。
一方、ＨＥＲ２のスコア「−」は、トラスツヅマブ病理部会作成のＨＥＲ２ガイドライン（第３版）においてスコア「０」と規定される組織切片、すなわち「細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞＜１０％（細胞膜に限局する陽性染色は判定対象外）」に該当する組織切片のうち、ＤＡＢ法によって「細胞膜に陽性染色なし」であることが確認された組織切片であることを示す。
このようなＤＡＢ染色による確認は、実施例で用いた切片（組織アレイスライド）と同じ組織に由来する別の切片（組織アレイスライド）を用いて行った。【０１１２】
（２）賦活化処理工程
組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキング処理を行った。【０１１３】
（３）免疫染色処理工程
（３−１）１次反応
ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、ベンタナ社製「抗ＨＥＲ２ウサギモノクロナール抗体（４Ｂ５）」（試薬Ｉ）を０．０５ｎＭに調整し、該１次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。【０１１４】
（３−２）２次反応
１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで６μｇ／ｍＬに希釈した上記ビオチン化２次抗体（試薬ＩＩ）と室温３０分間反応させた。
（３−３）
２次反応を行った組織アレイスライドに対して、１％ＢＳＡ含有のＰＢＳで０．０２ｎＭに希釈した前述の蛍光体集積ナノ粒子（試薬ＩＩＩ）を、中性のｐＨ環境（ｐＨ６．９〜７.４）室温の条件下で３時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１１５】
（４）形態観察染色工程
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を４５℃の流水で３分間洗浄した。次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行った。
（５）固定処理工程
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に、封入剤（メルク社製「エンテランニュー」）を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。【０１１６】
（６）観察・計測工程
固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ−５３」）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで５７５〜６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、光学フィルターを通すことで６１２〜６９２ｎｍに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）して撮像した。ＨＥＲ２（３＋）、ＨＥＲ（−）の組織の輝点数は、４００倍で撮像した画像をもとにＩｍａｇｅＪ  ＦｉｎｄＭａｘｉｍｓ法により計測した１０００細胞の平均値とした。また、撮像した画像から、１輝点の平均輝度を算出した。【０１１７】
（考察）
実施例１の結果を表２に示す。
（ＨＥＲ２（３＋）細胞切片細胞当たりの平均輝点数）
ＨＥＲ２（３＋）細胞切片細胞当たりの平均輝点数の評価基準は、該輝点数が２未満のものは「×」（検出すべきＨＥＲ２抗原への結合性が比較的低い、つまり低シグナルである）、該輝点数が２以上５未満のものは「○」（検出すべきＨＥＲ２抗原への結合性が比較的高い、つまり高シグナルである）、該輝点数が５以上のものは「◎」（検出すべきＨＥＲ２抗原への結合性が極めて高い、つまり極めて高シグナルである）とした。【０１１８】
実施例１で、スペーサー１の構造単位がＰＥＧ、スペーサー１の長さ（第１親水性高分子に由来する部分の長さ）を３０オングストロームとして、組織免疫染色を行ったところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片では、１細胞当たりの平均輝点数が「２．４」であり、評価が「○」であった。【０１１９】
（ＨＥＲ２（−）細胞切片細胞当たりの平均輝点数）
一方、ＨＥＲ２（−）細胞切片細胞当たりの平均輝点数の評価基準は、該輝点数が１以下のものは「○」（非特異的な吸着を起こしにくい、つまり低ノイズである）、該輝点数が０．５以下のものは「◎」（非特異的な吸着を極めて起こしにくい、つまり極めて低ノイズである）とした。【０１２０】
実施例１では、ＨＥＲ２（−）の正常組織の組織切片では、１細胞当たりの平均輝点数が「０．３」であり、評価が「◎」であった。【０１２１】
（１輝点の平均輝度）
実施例１の１輝点の平均輝度は「４１２００」あり、低い粒子濃度であっても十分なシグナルが得られていることがわかる。【０１２２】
（間質１画面当たりの輝点数）
また、間質は、細胞と細胞との間を埋めている疎水性の組織であるが、この間質には細胞核が存在しないため、ＨＥＲ２遺伝子は発現することはない。したがって、本来であれば輝点数は０となるはずであり、輝点が観察されるとすればそれは非特異的な吸着を表すノイズであるため、そのようなノイズの輝点数は極力少ない範囲に抑える必要がある。ここで、上述の観察および撮像において、オリンパス社製カメラ「ＤＰ７３」を用い、対物レンズ×４０で撮影した画像そのもの（１６００ピクセル×１２００ピクセル）を「間質１画面当たりの輝点数」とした場合に、該輝点数が２００個以下の場合は「○」（疎水性部位への非特異的な吸着を起こしにくい、つまり低ノイズである）、１００個以下の場合は「◎」（疎水性部位への非特異的な吸着を極めて起こしにくい、つまり極めて低ノイズである）とした（表４参照）。実施例１では、間質１画面当たりの輝点数が「６８個」であった（表４参照）。【０１２３】
また、上記のＨＥＲ２（３＋）の評価およびＨＥＲ２（−）の評価から、染色性を総合的に評価した。染色性の総合評価の基準は、ＨＥＲ２（３＋）の評価およびＨＥＲ２（−）の評価のいずれもが「◎」の場合は「◎」（ＨＥＲ２の過剰発現の陽性および陰性の判定精度について総合的に極めて優れた染色性を有する）であり、ＨＥＲ２（３＋）の評価およびＨＥＲ２（−）の評価のいずれにも「×」がない場合「○」（ＨＥＲ２の過剰発現の陽性および陰性の判定精度について総合的に優れた染色性を有する）、ＨＥＲ２（３＋）の評価およびＨＥＲ２（−）の評価のいずれかに「×」がある場合「×」（ＨＥＲ２の過剰発現の陽性および陰性の判定精度について総合的に劣った染色性を有する）とした。実施例１の染色性の総合評価は「○」であった（表２参照）。【０１２４】
［実施例２］
実施例２では、実施例１でリンカーとして用いた「Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ６−ＮＨ−Ｍａｌ」の代わりに、スペーサーの長さが４６．２オングストロームのプロピレン製のリンカーを以下のように合成して、これを用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１２５】
（リンカーの作製）
１，１８‐オクタデカンジカルボン酸（１，１８−Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，プロピレン単位＝６）と、５等量の１,６-ジアミノヘキサン（１，６−Ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ，プロピレン単位＝２）で、ヘキサン中でアミド化反応を行なった。アミド化反応は触媒としてジイソプロピルカルボジイミドを2等量混合することで行った。【０１２６】
得られた反応物（プロピレン単位＝８）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びＧＰＣにより精製し、両末端がアミンの炭化水素化合物（プロピレン単位＝８相当）を得た。アミノ化した合成物を０．５等量のビオチン４-ニトロフェニルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｅｓｔｅｒ，ＴＣＩ社製，製品番号Ｂ４００９）と、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で反応した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びＧＰＣにより精製し、片末端がビオチン化され、もう片末端がアミンとなった反応生成物を得た。得られた生成物と、１．２等量の３-マレイミドプロピオン酸  Ｎ‐スクシンイミジル（N-Succinimidyl 3-Maleimidopropionate，ＴＣＩ社製、製品番号Ｓ０４２７）とをＴＨＦ中で反応させた。得られた化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びＧＰＣにより精製することで、片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（プロピレン単位＝８相当）を得た。【０１２７】
（結果考察）  実施例２では、スペーサーの長さを４６．２オングストロームにし、スペーサーをプロピレン製としたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「２．６」であり、評価「○」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．４」で評価「◎」であった。染色性の総合評価は「○」であった。これらの結果から、蛍光体集積ナノ粒子標識剤に含まれるスペーサーがプロピレン由来のものである場合、スペーサーがＰＥＧ由来のものに比べて、親水性が低下する分、非特異的吸着（ノイズ）がやや増すが、ほぼ同等の優れた染色性を有することが分かる。【０１２８】
［実施例３］
実施例３では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが５５．５オングストロームである「Maleimide-PEG11-Biotin（サーモサイエンティフィック社、製品番号21911）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１２９】
（結果考察）
実施例３では、スペーサーの長さを５５．５オングストロームのＰＥＧリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「６．１」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．３」で評価は「◎」であった。染色性の総合評価は「◎」であった。これらの結果から、実施例３の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１３０】
［実施例４］
実施例４では、実施例１で用いたリンカーとして「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが９４オングストロームである「Biotin PEG Maleimide, Biotin-PEG-Mal, MW 1000（Nanocs, Cat.No. PG2-BNML-1k）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１３１】
（結果考察）
実施例４では、スペーサーの長さが１０４．７オングストロームのＰＥＧリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「８．２」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．４」で評価は「◎」であった。また、染色性の総合評価は「◎」であった。これらの結果から、実施例４の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１３２】
［実施例５］
実施例５では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが５５．２オングストロームのプロピレン製のリンカーを以下のように合成して、これを用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１３３】
（リンカーの作製）
実施例２のリンカーの作製において、１,６-ジアミノヘキサン（１，６−Ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ，プロピレン単位＝２）の代わりに、１，１２-ジアミノドデカン（１，１２−Ｄｏｄｅｃａｎｅｄｉａｍｉｎｅ，プロピレン単位＝４）を使用することで、片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（プロピレン単位＝１０相当）を得た。【０１３４】
（結果考察）
実施例５では、スペーサーの長さが５５．２オングストロームのプロピレンリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「６．４」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．９」で評価は「○」であった。染色性の総合評価は「○」であった。これらの結果から、実施例５の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１３５】
［実施例６］
実施例６では、実施例１で用いたリンカーとして「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが２０２．０オングストロームである「Biotin PEG Maleimide, Biotin-PEG-Mal,  MW 2000（Nanocs, Cat.No.PG2-BNML-2k）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１３６】
（結果考察）
実施例６では、スペーサーの長さが２０２．０オングストロームのＰＥＧリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「８．０」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．８」で評価は「○」であった。染色性の総合評価は「○」であった。これらの結果から、実施例６の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１３７】
［実施例７］
実施例７では、実施例１で用いたリンカーとして「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが４９４．０オングストロームである「Biotin PEG Maleimide, Biotin-PEG-Mal,  MW 5000（Nanocs,Cat.No.PG2-BNML-5k）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１３８】
（結果考察）
実施例７では、スペーサーの長さが４９４．０オングストロームのＰＥＧリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「８．２」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．８」で評価は「○」であった。染色性の総合評価は「○」であった。これらの結果から、実施例７の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１３９】
［実施例８］
実施例８では、実施例１で用いたリンカーとして「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが９８０．７オングストロームである「Biotin PEG Maleimide, Biotin-PEG-Mal, MW 10000（Nanocs,Cat.No.PG2-BNML-10k）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１４０】
（結果考察）
実施例８では、スペーサーの長さが９８０．７オングストロームのＰＥＧリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「６．２」であり、評価「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は、「０．６」で評価は「○」であった。染色性の総合評価は「○」であった。これらの結果から、実施例８の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、実施例１のスペーサーを含むものよりもシグナルが強く、総合的に極めて優れた染色性を有することが分かる。【０１４１】
［比較例１］
比較例１では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが１６．１オングストロームである「Maleimide-PEG2-Biotin（サーモサイエンティフィック社，製品番号21901）を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１４２】
（結果考察）
比較例１では、スペーサーの長さを１６．１オングストロームのＰＥＧリンカーとしたが、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「１．６」で、評価「×」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「０．２」で、評価は「◎」であった。染色性の総合評価は「×」であった。これらの結果から、比較例１の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、スペーサーの長さが本発明の規定より短いため、本発明（実施例）の蛍光体集積ナノ粒子標識剤と比較するとシグナルが弱く、染色性が相対的に劣っていることが分かる。【０１４３】
［比較例２］
比較例２では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが１３．３オングストロームのプロピレン製のリンカーを以下のように合成して、これを用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１４４】
（リンカーの作製）
実施例２のリンカーの作製において、両末端がアミンの炭化水素化合物として１,６-ジアミノヘキサン（1,6-Hexanediamine）を使用することで片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（プロピレン単位＝２相当）を得た。【０１４５】
（結果考察）
比較例２では、スペーサーの長さを１３．３オングストロームのプロピレンリンカーとしたところ、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「１．４」で、評価は「×」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「０．８」で、評価は「○」であった。また、染色性の総合評価は「×」であった。これらの結果から、比較例２の蛍光体集積ナノ粒子標識剤も、本発明（実施例）の蛍光体集積ナノ粒子標識剤と比較するとシグナルが弱く、またスペーサーがプロピレン由来である分、スペーサーがＰＥＧ由来の比較例１よりも多少ノイズが多くなり、総合的には比較例１と同様、染色性が相対的に劣っていることが分かる。【０１４６】
［比較例３］
比較例３では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが２２オングストロームである「Biotin-PEG3-maleimide（ChemPep社、cat No.271608）」を用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。
比較例３では、スペーサーの長さを２０．５オングストロームのＰＥＧリンカーとしたが、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「１．８」で、評価は「×」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「０．４」で、評価は「◎」であった。また、染色性の総合評価は「×」であった。これらの結果から、比較例３の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、比較例１の蛍光体集積ナノ粒子標識剤と同様、本発明（実施例）の蛍光体集積ナノ粒子標識剤よりも染色性が相対的に劣っていることが分かる。【０１４７】
［比較例４］
比較例４では、実施例１でリンカーとして用いた「Biotin-PEG6-NH-Mal」の代わりに、スペーサーの長さが１４９６．５オングストロームのＰＥＧ製のリンカーを以下のように合成して、これを用いたこと以外は、実施例１と同様に行った。【０１４８】
（リンカーの作製）
実施例２のリンカーの作製において、等量の「Poly(ethylene glycol) 2-aminoethyl ether biotin  5300 （シク゛マアルト゛リッチ）, 製品番号757772」と、「Maleimide PEG NHS, MW 10000（Nanocs，Cat.No.PG2-MLNS-10k）」をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で３０分間混合後、ＧＰＣ（ＪＡＩＧＥＬ-２．５Ｈ、日本分析工業）により精製することで片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（ポリオキシエチレン単位＝３４０相当）を得た。【０１４９】
（結果考察）
比較例４では、スペーサーの長さを４２０オングストロームのＰＥＧリンカーとしたが、ＨＥＲ２（３＋）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「６．８」で、評価は「◎」であった。また、ＨＥＲ２（−）の組織切片の１細胞当たりの平均輝点数は「１．６」で、評価は「×」であった。また、染色性の総合評価は「×」であった。これらの結果から、比較例４の蛍光体集積ナノ粒子標識剤は、スペーサーの長さが本発明の規定より長いため、本発明（実施例）の蛍光体集積ナノ粒子標識剤と比較すると非特異的な吸着が多く、染色性が相対的に劣っていることが分かる。【０１５０】
【表２】
2015133523.tif 000004
ユニット数は、単位がＰＥＧの場合は、オキシエチレン単位を示し、単位がプロピレンの場合は、一般的な分岐構造のプロピレン単位ではなく、連続する３つの炭素の単位を意味する。【０１５１】
【表３】
2015133523.tif 000005
【０１５２】
【表４】
2015133523.tif 000006
【０１５３】
［実施例９］
実施例１〜８の各蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径を５０μｍ未満、または２００μｍを超えるものとした結果、平均粒子径を５０μｍ未満の粒子を使用した場合、汎用蛍光顕微鏡での輝点視認性が低下し、２３０μｍを超えるものとした場合、第１，２結合基物質の結合を介した蛍光体集積ナノ粒子とプローブ生体物質との結合効率が低下した（不図示）。【０１５４】
以上、本発明に係る蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた蛍光免疫染色法について実施形態および実施例に基づいて詳細に説明してきたが、本発明は、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更は許容される。
【符号の説明】
【０１５５】
１  スペーサー
２  生体分子
３  プローブ生体物質
４  スペーサー
５  蛍光体集積ナノ粒子
Ａ  第１結合基物質
Ｂ  第２結合基物質
【図１】
2015133523.tif 000007
【図２】
2015133523.tif 000008
【図３】
2015133523.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月29日(2016.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下の高分子由来のスペーサーを介して第１結合基物質に連結され生体分子と特異的に結合するプローブ生体物質と、
該第１結合基物質と特異的に結合可能な第２結合基物質を有し、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定してなる蛍光体集積ナノ粒子とからなるセットを含む、蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項２】
前記高分子が親水性の高分子（第１親水性高分子）である、請求項１に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項３】
前記第１親水性高分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のオキシエチレン単位（ｎ）の数が、６〜２３０である、請求項２または３に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項５】
前記第１結合基物質がストレプトアビジンおよびビオチンのいずれか一方であり、
前記第２結合基物質がビオチンまたはストレプトアビジンのいずれか他方である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項６】
前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が、５０ｎｍ以上２３０ｎｍ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項７】
前記第１親水性高分子のスペーサーの長さが、５０オングストローム以上１２０オングストローム以下である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項８】
前記生体分子が抗原または１次抗体であり、前記プローブ生体物質が１次抗体または２次抗体であり、蛍光免疫染色に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項９】
前記樹脂がメラミン樹脂である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項１０】
前記蛍光体集積ナノ粒子が、表面がアミノ化された蛍光体集積ナノ粒子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて行う、蛍光免疫染色法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
［実施例９］
実施例１〜８の各蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径を５０ｎｍ未満、または２００ｎｍを超えるものとした結果、平均粒子径を５０ｎｍ未満の粒子を使用した場合、汎用蛍光顕微鏡での輝点視認性が低下し、２３０ｎｍを超えるものとした場合、第１，２結合基物質の結合を介した蛍光体集積ナノ粒子とプローブ生体物質との結合効率が低下した（不図示）。
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月5日(2016.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さが３０オングストローム以上１０００オングストローム以下の高分子由来のスペーサーを介して第１結合基物質に連結され生体分子と特異的に結合するプローブ生体物質と、
該第１結合基物質と特異的に結合可能な第２結合基物質を有し、ギ酸処理およびアミノプロピルトリメトキシシラン処理を経由して得られた表面アミノ化粒子を経由して作成された、蛍光体である蛍光色素をメラミン樹脂からなる母体の内部または表面に固定してなる蛍光体集積ナノ粒子とからなるセットを含む、蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項２】
前記高分子が親水性の高分子（第１親水性高分子）である、請求項１に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項３】
前記第１親水性高分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のオキシエチレン単位（ｎ）の数が、６〜２３０である、請求項３に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項５】
前記第１親水性高分子のスペーサーの長さが、５０オングストローム以上１２０オングストローム以下であり、
前記第１親水性高分子のスペーサーが、
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ6‐ＮＨ‐Ｍａｌ、
１，１８-オクタデカンジカルボン酸と１,６-ジアミノヘキサンとの反応生成物をビオチン４-ニトロフェニルエステルとさせて得られた反応生成物を３-マレイミドプロピオン酸  Ｎ-スクシンイミジルと反応させて得られた、片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（プロピレン単位＝８相当）、
Maleimide-PEG11-Biotin、
Biotin PEG Maleimide, Biotin-PEG-Mal, MW 1000、または
１，１８-オクタデカンジカルボン酸と１，１２-ジアミノドデカンとの反応生成物をビオチン４-ニトロフェニルエステルとさせて得られた反応生成物を３-マレイミドプロピオン酸  Ｎ-スクシンイミジルと反応させて得られた、片末端がビオチン化され、もう片末端がマレイミドとなったリンカー（プロピレン単位＝１０相当）
である請求項２〜４のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項６】
前記第１結合基物質がストレプトアビジンおよびビオチンのいずれか一方であり、
前記第２結合基物質がビオチンまたはストレプトアビジンのいずれか他方である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項７】
前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が、５０ｎｍ以上２３０ｎｍ以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項８】
前記生体分子が抗原または１次抗体であり、前記プローブ生体物質が１次抗体または２次抗体であり、蛍光免疫染色に用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光体集積ナノ粒子標識剤を用いて行う、蛍光免疫染色法。
【国際調査報告】
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