(57)【要約】  凝集抑制パッドとコンジュゲートパッドとメンブレンとを具備するイムノクロマトグラフィー用試験片であって、前記メンブレンが標的物質を捕捉する試験領域を有し、前記凝集抑制パッドが脱塩剤を含み、前記コンジュゲートパッドが標識剤を含むイムノクロマトグラフィー用試験片。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集抑制パッドとコンジュゲートパッドとメンブレンとを具備するイムノクロマトグラフィー用試験片であって、前記メンブレンが標的物質を捕捉する試験領域を有し、前記凝集抑制パッドが脱塩剤を含み、前記コンジュゲートパッドが標識剤を含むイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項２】
前記脱塩剤がキレート剤またはアプタマーである請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項３】
前記キレート剤がアミノカルボン酸系キレート剤である請求項２に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項４】
前記標識剤が蛍光シリカ微粒子である請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項５】
前記凝集抑制パッドに連結分子を導入し、当該連結分子を介して脱塩剤を導入した請求項１〜４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
【請求項６】
アルカリもしくは酸と標的物質と脱塩剤とを含むイムノクロマトグラフィー用展開液。
【請求項７】
前記脱塩剤がキレート剤またはアプタマーである請求項６に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
【請求項８】
前記キレート剤がアミノカルボン酸系キレート剤である請求項７に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
【請求項９】
検体液にアルカリまたは酸を付与する工程、加熱する工程、およびアルカリまたは酸で中和する工程を介して処理された請求項６〜８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の試験片を用いて行うイムノクロマトグラフィーであって、前記試験片に、アルカリまたは酸と標的物質とを含む展開液を付与して、当該検体液中の標的物質の検出を行うイムノクロマトグラフィー。
【請求項１１】
標的物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンを具備するイムノクロマトグラフィー用試験片に、請求項６〜９のいずれか１項に記載の脱塩剤を含む展開液を付与して、その標的物質の検出を行うイムノクロマトグラフィー。
【請求項１２】
アルカルもしくは酸と標的物質とを含む展開液を付与してメンブレンを通過させて、標的物質をメンブレンの試験領域に捕捉して検査を行うイムノクロマトグラフィーであって、脱塩剤を含有させた脱塩パッドを用いるか、検体液を脱塩処理することで、展開液の脱塩を行い標的物質の凝集を防止するイムノクロマトグラフィー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー用試験片、これに用いられる展開液、およびこれを用いたイムノクロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の抗原などの微量物質を検出する手法としてラテラルフロー型のイムノクロマトグラフィーによる検査法がある。この方法では、検体に含まれる被検物質を標識粒子に捕捉させ、多孔質支持体を毛細管現象により移動させる。そして、当該被検物質を、多孔質支持体に固定された捕捉物質と接触させる。それによって、前記被検物質を捕捉して濃縮し、捕捉物質が固定された部分で標的物質を発色させる。この発色によって被検物質の有無を判定することができる。かかるイムノクロマトグラフィーの特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、イムノクロマトグラフィーは妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。【０００３】
本出願人は、イムノクロマトグラフィーに関する上記の特徴に鑑み、メンブレンに適用する試薬について研究開発を行い、蛍光シリカ微粒子を用いる技術を開発した（特許文献１等参照）。これにより、従来の生体物質や生体細胞、あるいは金コロイド粒子を試薬に用いたものと比べ、安価かつ格段に安定した測定及び検出を可能とした。また、検出感度の向上や定量化といった要望にもより的確に応えることができ、イムノクロマトグラフィーの利用領域の拡大に貢献するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８５６６号パンフレット
【特許文献２】特許第４５７８５７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、さらに上記蛍光微粒子を用いたイムノクロマトグラフィー技術について研究を継続したところ、標識剤をなす微粒子に凝集が生じ、試験片内を移行しにくくなることがあることが分かってきた。具体的には、以下のような現象である。検体は、イムノクロマトグラフィーに適用される際、しばしばアルカリや酸によりにより滅菌処理される。処理後そのままではメンブレン等の部材にダメージを与えるため、通常試験前に中和処理を必要とする。この中和で発生する塩の影響を受け、メンブレン内で標識剤に凝集が生じ、試験領域まで移行せずにとどまってしまうことがある。その結果、標的物質を捕捉した標識粒子が試験領域に到達せず、感度の高い検出が困難となるものである（アルカリ処理をせず、検体をトリス塩酸緩衝液で希釈し、そこにＥＤＴＡを適用した例としては前記特許文献２参照）。この影響は、特にシリカ微粒子を利用した標識剤において顕著となり、その改善が求められた。
本発明は、検体にアルカリもしくは酸による滅菌処理を施した際にも、標識剤の良好な流動性を確保し、より高い感度および精度で標的物質の検出や測定を行うことができるイムノクロマトグラフィー用試験片、これに用いられる展開液、およびこれを用いたイムノクロマトグラフィーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題は、下記の手段により解決された。
〔１〕凝集抑制パッドとコンジュゲートパッドとメンブレンとを具備するイムノクロマトグラフィー用試験片であって、前記メンブレンが標的物質を捕捉する試験領域を有し、前記凝集抑制パッドが脱塩剤を含み、前記コンジュゲートパッドが標識剤を含むイムノクロマトグラフィー用試験片。
〔２〕前記脱塩剤がキレート剤またはアプタマーである〔１〕に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
〔３〕前記キレート剤がアミノカルボン酸系キレート剤である〔２〕に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
〔４〕前記標識剤が蛍光シリカ微粒子である〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
〔５〕前記凝集抑制パッドに連結分子を導入し、当該連結分子を介して脱塩剤を導入した請求項〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片。
〔６〕アルカリもしくは酸と標的物質と脱塩剤とを含むイムノクロマトグラフィー用展開液。
〔７〕前記脱塩剤がキレート剤またはアプタマーである〔６〕に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
〔８〕前記キレート剤がアミノカルボン酸系キレート剤である〔７〕に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
〔９〕検体液にアルカリまたは酸を付与する工程、加熱する工程、およびアルカリまたは酸で中和する工程を介して処理された〔６〕〜〔８〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー用展開液。
〔１０〕〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の試験片を用いて行うイムノクロマトグラフィーであって、前記試験片に、アルカリまたは酸と標的物質とを含む展開液を付与して、当該検体液中の標的物質の検出を行うイムノクロマトグラフィー。
〔１１〕標的物質を捕捉する試験領域を有するメンブレンを具備するイムノクロマトグラフィー用試験片に、〔６〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の脱塩剤を含む展開液を付与して、その標的物質の検出を行うイムノクロマトグラフィー。
〔１２〕アルカルもしくは酸と標的物質とを含む展開液を付与してメンブレンを通過させて、標的物質をメンブレンの試験領域に捕捉して検査を行うイムノクロマトグラフィーであって、脱塩剤を含有させた脱塩パッドを用いるか、検体液を脱塩処理することで、展開液の脱塩を行い標的物質の凝集を防止するイムノクロマトグラフィー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験片、これに用いられる展開液、およびこれを用いたイムノクロマトグラフィーによれば、検体にアルカリもしくは酸による滅菌処理を施した際にも、標識剤の良好な流動性を確保し、より高い感度および精度で標的物質の検出や測定を行うことができる。特に、シリカ微粒子を利用した標識剤において顕著な効果を発揮し、メンブレン内を好適に移行させ、良好な標的物質の検出等を実現する。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載および添付の図面からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明に好適に用いられる長尺試験体を模式的に示す分解斜視図である。
【図２】本発明に好適に用いられるテストストリップの説明図であり、（ａ）が平面図であり、（ｂ）が展開断面図である。
【図３】本発明に好適に用いられるテストストリップの変形例を模式的に示した部分展開断面図である。
【図４】本発明に好適に用いられるテストストリップの別の変形例を模式的に示した部分展開断面図である。
【図５】実施例および比較例で行った標的物質の検出試験の結果（蛍光強度）を示すグラフである。
【図６】標識粒子のメンブレン内での移行状態（粒子集積割合）を示すグラフである。
【図７】比較例における試験を行った後のメンブレンの内部を観察した電子顕微鏡写真を示す図面代用写真である。
【図８】参考例で得たシリカ粒子の分散液中の粒度分布を示すグラフである。
【図９】実施例で用いた凝集パッドを利用した実験の結果（標識粒子のメンブレン内での移行状態）を示す顕微鏡写真である。
【図１０】実施例で用いた凝集パッドを利用した実験の結果（標識粒子のメンブレン内での移行状態）を示す別の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のイムノクロマトグラフィー用試験片について、その好ましい実施形態を図面を参照しながら以下に説明する。
【００１０】
［テストストリップ（試験片）］
本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ（試験片）は、下記の部材が相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることが好ましい。
・凝集抑制パッド８ａ
・コンジュゲートパッド（標識体を含浸し乾燥して得られる部材）８ｂ
・メンブレン（抗体固定化メンブレン）８ｃ
・吸収パッド８ｄ
【００１１】
本実施形態においては、図１及び図２に示したように、上述した試験領域ｎｔと参照領域ｎｒとを有するメンブレン８ｃを具備するテストストリップ１０が筐体上部６ａと筐体下部６ｂとで挟持内包され、長尺試験体１００をなしている。筐体上部６ａには、検出開口部６１と検体導入開口部６２とが設けられている。この検出開口部６１を介して、照射光を内部のテストストリップ１０に送り、そこで発せられる蛍光ないし吸光を検出・観測することができる。一方、検体導入開口部６２を介して検体液Ｓをテストストリップ１０に供給し測定試験を行うことができる。
【００１２】
図２（ａ）及び（ｂ）を参照して、本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの好ましい１つの実施形態について説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。図２（ａ）は、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの好ましい一実施形態の平面図を示し、図２（ｂ）は、図１（ａ）で示したイムノクロマトグラフィー用テストストリップの展開縦断面図を示す図である。本実施形態のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ１０は、上述のように、凝集抑制パッド８ａ、コンジュゲートパッド８ｂ、抗体固定化メンブレン８ｃ、吸収パッド８ｄを具備してなる。さらに、上記各構成部材は、本実施形態のように、粘着剤付きバッキングシート８ｅにより裏打ちされていることが好ましい。
【００１３】
（標的物質）
本発明において、検出、定量の対象としての標的物質１は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。本発明において、標的物質１を含有する試料としては特に制限はないが、尿、血液などの液体試料が挙げられる。
【００１４】
（凝集抑制パッド）
本実施形態において、凝集抑制パッド８ａは標的物質を含むサンプル（検体）を滴下する構成部材である。凝集抑制パッドの材料や寸法等は特に限定されず、例えば、サンプルパッドに適用される一般的なものを利用することができる。この凝集抑制パッド８ａには、後述する脱塩剤９が付与されている。
凝集抑制パッドの作製方法は特に限定されないが、例えばサンプルパッドやコンジュゲートパッドに利用されるメンブレン素材に、脱塩剤を含浸させる方法が挙げられる。具体的には、脱塩剤の溶液にメンブレン素材を浸漬し、その後乾燥して得ることができる。あるいは、メンブレン素材に、脱塩剤の溶液や分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。脱塩剤の適用量は特に限定されないが、パッド８ａにおける単位面積（ｃｍ2）当たりの脱塩剤の含有量は１μｇ〜１０００μｇが好ましい。
【００１５】
その他、凝集剤をパッド材料に固定化する方法は例えば凍結乾燥による固定化が挙げられる。具体的には、１％ＥＤＴＡ溶液をガラス繊維製のコンジュゲートパッドへ含浸させ、その後−８０℃〜−１０℃凍結させる。凍結後に凍結乾燥処理を行いパッドへ固定化することができる。
【００１６】
また別の方法として、前記凝集抑制パッドに連結分子を導入し、当該連結分子を介して脱塩剤（連結部位をもつものが好ましい）を導入する方法が挙げられる。このパッドと連結分子あるいは連結分子と脱塩剤の連結は、化合物間の共有結合が好ましい。例えばガラス繊維へＳＨ基を有するＭＰＭＳ（３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン）のようなシランカップリング剤（連結分子）を用いてＳＨ基を付加した後、そこへ下記スキームのようにマレイミド構造を持つキレート化合物（連結部位をもつ脱塩剤）を共有結合させることができる。導入する順序は特に限定されず、連結分子をパッドに導入してから脱塩剤を導入しても、連結分子と脱塩剤をあらかじめ連結させておきパッドに導入してもよい。あるいは、結合性を有する組み合わせであれば、連結分子を用いずに、脱塩剤をパッドに直接連結（共有結合等）させてもよい。脱塩剤（凝集抑制剤）を固定化した脱塩パッドは、イムノクロマトグラフィーのキットにおけるメンブレンの上流側に配置することが好ましい。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
（サンプルパッド）
図１に示した形態のテストストリップではサンプルパッドを用いていないが、図３に示した変形例のように、凝集抑制パッドの上部にサンプルパッド８ｇを設けてもよい。サンプルパッド８ｇは標的物質を含むサンプルを滴下する構成部材である。その材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
【００１９】
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド８ｂは標識試薬シリカ微粒子（標識体）２，３が含浸された構成部材である。そして、凝集抑制パッド８ａから毛細管現象により移動してきた試料に含まれる標的物質が抗原抗体反応等の特異的分子認識反応で、前記標識試薬シリカ微粒子（標識体）によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッド８ｂにおける単位面積（ｃｍ2）当たりの前記標識試薬シリカ微粒子（標識体）の含有量は特に制限はないが１μｇ〜１００μｇが好ましい。含浸方法としては、前記標識試薬シリカ微粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
【００２０】
（抗体固定化メンブレン）
前記抗体固定化メンブレン８ｃにおける抗体固定化部に、標的物質の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するための標的物質捕捉用抗体が固定化されたテストラインｎｔを設ける。抗体固定化メンブレン８ｃには、標識試薬シリカ微粒子を捕捉するための抗体が固定化されたコントロールラインｎｒを含むことが好ましい。
メンブレン８ｃはシリカ微粒子（標識体）２,３により標識された標的物質１が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体−標的物質−標識試薬シリカ微粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる抗体固定化部（判定部）を有する。前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
【００２１】
前記抗体固定化部（試験領域）ｎｔにおける抗体固定化量は特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの０．５μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記抗体固定化メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
メンブレン８ｃには、さらに参照領域ｎｒがあり、そこには標的物質が捕捉されていない標識粒子（標識体）３が捕捉される。これにより、テスト領域ｎｔでの蛍光・吸光と対比して、標的物質の有無や量を判定することができる。この機能を果たすために、試験用標識体２はシリカ微粒子２ａと試験用結合性物質２ｂとからなる。試験用結合性物質２ｂは標的物質との結合性を有する。一方、参照用標識体３はシリカ微粒子３ａと参照用結合性物３ｂとからなる。参照用捕結合性物質は、標的物質との結合性はなく、参照用捕捉性物質との結合性を有する。
【００２２】
（吸収パッド）
吸収パッド８ｄは、毛細管現象でメンブレンを移動してきた検体Ｓ（標的物質）及び標識試薬シリカ微粒子（標識体）２,３を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。
【００２３】
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられる部材が使用できるが、サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００２４】
図３および図４は本発明の好ましい実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用試験片の変形例を示す展開断面図である。図３の例においては、凝集抑制パッド８ａの上部にサンプルパッド８ｇが適用されている。これにより、サンプルパッドの素材を好適化することで検体のより確実な吸収および内部への移行を促すことができる。図４の例においては、凝集抑制パッド８ａ’に標識体が含浸されており、コンジュゲートパッドの機能を兼ねている。これにより部材点数を減らし、より簡素かつ安価な試験片を提供することができる。これらの変形例においても、凝集抑制パッドに含有させた脱塩剤が、検体の流通とともに移行し、標識剤（シリカ微粒子等）と接触して、良好な凝集抑制効果を発揮する。
【００２５】
[脱塩剤]
本実施形態において脱塩剤の種類は特に限定されないが、検体処理後の酸・塩基中和処理で添加され、標識剤の凝集の原因となる塩成分を除去する化合物であることが好ましい。塩成分としては、アルカリ成分が挙げられ、具体的には、アルカリ金属、そのイオン、またはその塩（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、またはそのイオンもしくはその塩など）、アルカリ土類金属、そのイオン、またはその塩（例えば、カルシウム、マグネシウム、バリウム、またはそのイオンもしくはその塩など）などが挙げられる。あるいは、塩成分として酸成分が挙げられ、具体的には、塩酸、そのイオン、またはその塩、フッ化水素酸、そのイオン、またはその塩などが挙げられる。さらに、脱塩剤としては、前記塩成分に対して吸着性のある化合物であることが好ましく、これらの金属とともに金属錯体を形成する配位子化合物（キレート剤）が好ましい。キレート剤として具体的には、ヘテロ原子を有する有機化合物が挙げられ、含窒素炭化水素化合物、含酸素炭化水素化合物、含硫黄炭化水素化合物などが挙げられる。
【００２６】
含窒素炭化水素化合物としては、分子内にアミノ基（ＮＲＮ２）、イミノ基（ＮＲＮ）を有する化合物であることが好ましい。さらに好ましくは、アミノ基（ＮＲＮ２）またはイミノ基（ＮＲＮ）とともに、カルボキシル基を有する化合物であることが好ましい。このとき、その構造内にエーテル基（Ｏ）を有していてもよい。ここで、ＲＮは水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基である。このアルキル基、アルケニル基、アリール基はさらに置換基を有していてもよく、当該置換基としてはヒドロキシ基またはカルボキシル基が挙げられる。
より具体的には、＞Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは１〜４の整数）の構造または−Ｎ−（（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ）２の構造を分子内に有する化合物が挙げられる。
【００２７】
脱塩剤をなす化合物の分子量は特に限定されないが、この種の典型的なキレート剤の例を考慮すると、５０〜１０００程度であることが好ましい。
【００２８】
前記キレート剤としては、アミノカルボン酸系キレート剤（炭素数２〜２４が好ましく、２〜１２がより好ましく、２〜１０が特に好ましい。）であることが好ましい。その例としては、下記のものが挙げられる。アミノカルボン酸系キレート剤のカルボキシル基の数は１〜１２が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６が特に好ましい。アミノカルボン酸系キレート剤のアミノ基もしくはイミノ基の数は１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４が特に好ましい。
【００２９】
【化２】
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ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ：グリコールエーテルジアミン四酢酸
ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミン５酢酸
【００３０】
その他、キレート剤をなす含窒素炭化水素化合物としては、エチレンジアミン、イミダゾール部位を有する化合物、ピラゾール部位を有する化合物、トリアゾール部位を有する化合物、ピペラジン部位を有する化合物、ピペリジン部位を有する化合物、モルホリン部位を有する化合物、ピロリジン部位を有する化合物、チアゾール部位を有する化合物、ピロール部位を有する化合物などが挙げられる。さらに、含酸素炭化水素化合物としては、フラン部位を有する化合物、エーテル化合物（クラウンエーテル：Ｃ８〜Ｃ２４）、カルボン酸化合物（クエン酸、コハク酸、フタル酸、マレイン酸等）が挙げられる。
【００３１】
本発明において効果のある脱塩剤は以下のようにして選定することができる。具体的には脱塩剤の添加有無によるシリカ粒子の生理食塩水中での挙動の差を評価することで判断できる。脱塩剤の非存在下では時間と共に平均粒径が増大し、脱塩剤の存在下では平均粒径を維持することで選定できる。これは、つまり、脱塩剤を添加しない場合は塩により粒子表面の電荷が打ち消され、粒子の分散性の低下が始まり、粒子同士が凝集し、その結果として動的光散乱法（ＤＬＳ）測定上の見かけの粒径が大きくなる。これに対し、脱塩剤を添加することで塩成分（Ｎａイオン等）をトラップし粒子表面の電荷が維持されることで粒子同士の凝集を防ぐことができるというものである。具体例は、図８に示している。
【００３２】
本発明においては、脱塩剤としてアプタマーを用いることも好ましい。アプタマーとは特定の分子や原子と特異的に結合する核酸分子やペプチドなどである。本発明においては、塩成分（アルカリ成分、酸成分）と特異的に結合し、系内からアルカリを除去する効果のあるアプタマーを用いることが好ましい。このような性質をもつアプタマーとしては、例えば次に示す論文に記載のようなものが使用できる。この論文内ではＫイオンに親和性のあるアプタマーが開示されている。
「Colorimetric  detection  of  potassium  ions  using  aptamer-functionalized  gold  nanoparticles」Zhengbo  Chena,Yanqin  Huangb,Xiaoxiao  Lia,Tong  Zhoua,He  Maa,Hong  Qianga,Yifei  Liua，
a  Department  of  Chemistry,Capital  Normal  University,Beijing  100048,  China
b  College  of  Chemistry  and  Chemical  Engineering,  Xinxiang  University,  Xinxiang  453003,  China
【００３３】
［展開液］
本発明の好ましい実施形態に係る展開液は、標的物質と前記脱塩剤とを含有する。このとき展開液は塩成分（アルカリ成分または酸成分）を含むものが好ましく、さらに、加熱した後、酸またはアルカリで中和したものであることがより好ましい。加熱は高温で行うことが好ましく、煮沸温度（１００℃強）であることが特に好ましい。酸で中和した後は、ボルテックスミキサーなどで十分に混合することが好ましい。
【００３４】
従来の展開液では、塩存在下で粒子の凝集が発生し、メンブレンの孔サイズを上回る凝集体が多くなり、結果的にシリカ粒子がテストラインまで到達することができない。一方、本発明によれば、特定の脱塩剤を添加することで粒子（特にシリカ粒子）の凝集を防ぐことができる。そのため、メンブレンの孔サイズを通過できる粒子が多くなり、テストラインまで効率よく粒子を運ぶことが可能となる。その結果、感度向上につなげることができる。
【００３５】
［技術用語の意味］
本明細書で用いる技術用語の意味を確認すると、標的物質１（図１中の符号を併せて示すが、これにより限定して解釈されるものではない。）はラテラルフロー法による検出対象となる物質であり、検体中の被検物質と同義である。結合性物質２ｂ，３ｂはそれぞれ前記標的物質及び捕捉性物質に対する結合能を有する物質であり、好ましくは生体分子である。結合性物質が導入された標識粒子２ａ，３ａを標識体２，３と呼ぶ。ただし、広義には、標識粒子という用語を標識体を含む意味で用いることがある。一方、試験領域でメンブレンに固定され、標的物質１を介して標識体２を捕捉するものが試験用捕捉性物質４である。他方、参照領域でメンブレンに固定されたものが参照用捕捉性物質５であり、これに標識体３が標的物質１を介さずに捕捉される。
なお、本明細書において物質とは、化合物ないし化学合成された分子などを意味するほか、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含し、人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。広義には生体細胞や微生物（細菌等）、ウィルスをも包含する意味である。また、結合ないし連結とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、結合とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
【００３６】
・検体
本実施形態に適用される検体Ｓとしては、特に制限はないが、ヒトや動物の血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等に代表される臨床検体、液体飲料、半固形食品、固形食品等に代表される食品検体、土壌、河川、海水等の自然界からのサンプリング検体、工場内の生産ラインやクリーンルームのふき取り検体、エアーサンプラーによるサンプリング検体等に代表される環境サンプリング検体等が挙げられる。検体は液体であればそのまま用いることもできるし、半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
【００３７】
・結合性物質
本実施形態において試験用の結合性物質２ｂは上記標識粒子２ａと一体化して用いる（標識体２）。結合性物質２ｂの具体的な例は特に限定されないが、上記標的粒子と結合能を有する生体分子が挙げられ、具体的には抗体が挙げられる。結合性物質は標識粒子に直接結合して一体化されていてもよいし、他の物質を介して間接的に結合していてもよい。標識粒子と結合性物質との結合は、疎水的相互作用等により物理的に吸着させる方法、スクシンイミド基とアミノ基との結合やマレイミド基とチオール基との結合のように、官能基を介して化学的に結合させる方法等の常法により行うことができる。標識粒子が微粒子である場合には、一つの標識体の表面に複数の結合性物質が結合しうる。なお、標識粒子として蛍光シリカ微粒子を用い結合性物質と一体化した標識体の実施形態については、例えば、国際公開第２００８／０１８５６６号パンフレットを参照することができる。
【００３８】
本実施形態においては、上記試験用の結合性物質２ｂとは別に、参照用の結合性物質３ｂを用いる。この参照用結合性物質３ｂは、後述する参照用の捕捉性物質５と結合性を有する。そして、標識粒子３ａと参照用結合性物質３ｂとは一体化され参照用の標識体３をなしている。したがって、この標識体３がメンブレンを移行していく過程で、捕捉性物質５に捕捉される。標識粒子３aと結合性物質３ｂとの結合一体化の態様あるいは結合性物質３ｂの好ましい物質の種類は、前記試験用の結合性物質２ｂと同様である。ただし、この参照用結合性物質３ｂは試験用の捕捉性物質４や標的物質とは結合性をもたないことが好ましい。一方、上記試験用の結合性物質２ｂは参照用の捕捉性物質５と結合性を有していてもよいが、その結合性を有さないことがより好ましい。
なお、標識粒子は１種類でも良く、３ａ（３ｂ）を使わずに２ａ（２ｂ）だけで試験用と参照用に用いる形態でも良い。
【００３９】
・試験用捕捉性物質
本実施形態に用いられるメンブレンは、上記のメンブレンの材料に試験用捕捉性物質４が固定化されている。この捕捉性物質４は、前記標識粒子２ａと結合性物質２ｂと前記標的物質１とを含む複合体を捕捉するよう、標的物質１への結合能を有する。捕捉性物質４が上記のような結合能を有することで、標識体２と標的物質１とからなる複合体を捕捉することが可能になる。その結果、標識体２による蛍光を発するあるいは吸光により着色するラインが試験領域ｎｔに形成される。「結合性物質」−「標的物質」−「捕捉性物質」の組合わせの例として、抗体（Ｂ）−抗体（Ｂ）の抗原（Ｃ）−抗原（Ｃ）の抗体（Ｄ）、抗原（Ｅ）−抗原（Ｅ）の抗体（Ｆ）−抗体（Ｆ）の抗体（Ｇ）、核酸（Ｈ）−核酸（Ｈ）に相補的な配列を有する核酸（Ｉ）−核酸（Ｉ）に相補的な配列であって核酸（Ｈ）の配列とは異なる配列を有する核酸（Ｊ）、受容体（Ｋ）−受容体（Ｋ）のリガンド（Ｌ）−リガンド（Ｌ）に対する抗体（Ｍ）、アプタマー（Ｎ）−アプタマー（Ｎ）が特異的に結合するタンパク質（Ｏ）−タンパク質（Ｏ）とアプタマー（Ｎ）とは異なる部位で特異的に結合するアプタマー（Ｐ）、アプタマー（Ｑ）−アプタマー（Ｑ）と特異的に結合するタンパク質（Ｒ）−タンパク質（Ｒ）に対する抗体（Ｓ）等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
・参照用捕捉性物質
本実施形態においては、メンブレンの参照領域ｎｒに参照用捕捉性物質５が固定されている。これは、標的物質１を介さずに、直接、参照用の結合性物質３ｂと結合するものである。したがって、移行してくる検体液ｓに混合されて標的物質１と結合していない標識体３が移行してくると、これを直接捕捉する（図２参照）。その結果、標識体３による吸光ないし蛍光を呈するラインが参照領域ｎｒに形成される。参照用捕捉性物質５は特に限定されないが、結合性物質と結合能を有する生体分子が挙げられ、具体的には抗体等が挙げられる。
【００４１】
この参照領域の参照用捕捉性物質５と試験用結合性物質２ｂが結合性を有していてもよい。その場合、試験用の標識粒子２ａが参照領域ｎｒに捕捉されることとなる。つまり、参照領域に標識粒子３ａと標識粒子２ａとがともに捕捉された状態となるが、その場合にも、参照領域の標識粒子の着色・蛍光状態を視認することができる。一方で、試験領域には標的物質を伴った蛍光性の標識体２が捕捉されているため、通常の使用において支障はない。
【００４２】
・素材
本実施形態の平面試験片（テストストリップ）１０に採用しうる各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられる通常の部材が使用できる。サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしては、例えば、Ｇｌａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましい。メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましい。吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｆｉｂｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。前記粘着剤付きバッキングシートを用いる場合には、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
【００４３】
・標識粒子のコンジュゲートパッドへの導入
本実施形態のイムノクロマトグラフィーにおいては、前記コンジュゲートパッドに、前記標識体として、結合性物質を結合させた着色粒子または蛍光微粒子とを導入しておくことが好ましい。コンジュゲートパッドにおける単位面積（ｃｍ２）当たりの前記標識粒子の含有量は特に制限ないが２０μｇ／ｃｍ２〜２ｍｇ／ｃｍ２が好ましく、２０〜２００μｇ／ｃｍ２であることがより好ましい。含有量が多すぎると、１粒子当りの検体結合数が低下し、検出感度が低下する。含有させる方法としては、前記標識粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。このとき着色粒子または蛍光微粒子を含有させ、一旦乾燥させた後、蛍光微粒子または着色粒子を含有させてもよく、予め着色粒子と蛍光微粒子を混合し、この混合コロイドを含有させてもよい。
【００４４】
［標識剤］
標識剤としては、この種の試験に適用されるものを適宜使用することができるが、例えば、蛍光・吸光シリカ粒子や蛍光・吸光ラテックス粒子、半導体微粒子、金コロイド粒子などの標識粒子２ａ，３ａと、結合性生体分子２ｂ，３ｂとを組み合わせたものを用いることができる。また、粒子状のものでなくてもよく、タンパク質や抗体などの生体分子、あるいはその複合体などであってもよい。本発明においては、前述の塩成分（酸成分またはアルカリ成分）による凝集の問題が顕著になることから、標識剤として、特にシリカ粒子を用いる実施態様に対応することが好ましい。
【００４５】
・蛍光シリカ粒子
蛍光シリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法が挙げられる。
本発明において、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法に準じて得られた、機能性化合物を含有するシリカ粒子を用いることが特に好ましい。前記機能性化合物の具体例としては、蛍光色素化合物、吸光化合物、磁性化合物、放射線標識化合物、ｐＨ感受性色素化合物等が挙げられる。
【００４６】
具体的には、前記機能性化合物を含有するシリカ粒子は、前記機能性化合物とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。
前記機能性化合物を含有するシリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した前記機能性化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００４７】
前記シランカップリング剤としてＡＰＳ、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００４８】
【化３】
2015012384.tif 000005
【００４９】
前記活性基を有する又は付加した前記機能性化合物の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式でそれぞれ表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００５０】
【化４】
2015012384.tif 000006
【００５１】
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００５２】
前記縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００５３】
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
【００５４】
前記シリカ粒子の表面に吸着又は結合させる生体分子（結合性物質）としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質又はペプチドが挙げられる。ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
【００５５】
標識粒子（好ましくは蛍光シリカ粒子）の平均粒径が１ｎｍ〜１μｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましく、５０ｎｍ〜３００ｎｍであることがより好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から標識試薬シリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した標識試薬シリカ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
【００５６】
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００５７】
蛍光シリカ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００５８】
・ラテックス粒子
本発明においては、その効果が顕著であることから、上記のシリカ微粒子を適用することが好ましいが、これに替え、あるいはこれに加え、標識粒子としてラテックス粒子を用いてもよい。ラテックス粒子としては、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スルホン酸共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等からなる合成高分子粒子を挙げることができる。また、ラテックス粒子の着色方法としては、特開２０００−１７８３０９、特開平１０−４８２１５号、特開平８−２６９２０７号、特開平６−３０６１０８号などに記載の方法で行うことができる。なお、この種の粒子に対する蛍光物質（標識物質）の固定化は、適宜定法により行うことができる。例えば、特表2005-534907、特開2010-156642、特開2010-156640などを参照することができる。商品化されている蛍光ラテックス粒子としては、Luminex社  製品名xMAP（登録商標）Multi-Analyte  COOH  Microspheres，（http://hitachisoft.jp/products/lifescience/lineup/luminex/about/bead.htmlhttp://hitachisoft.jp/products/lifescience/pdf/the_luminex_labmap_system.pdf）が知られている。
【００５９】
・半導体粒子等
標識剤には半導体粒子を適用してもよい。半導体粒子の材質は特に制限されないが、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅが好ましく例示される。例えば、特許第３８９７２８５号公報等に記載の半導体微粒子を用いることができる。前記半導体微粒子は、チオール化合物の−ＳＨ基が半導体微粒子の表面のＳ、Ｏ、Ｓｅ、Ｔｅ、Ｐ、Ａｓ、Ｎ等の原子と置換することにより表面修飾することができる。前記金粒子、前記金属微粒子としては、特開２００３−２６６３８明細書等に記載の金コロイド粒子及び金属コロイド粒子を用いることができる。前記金属コロイド粒子の具体例としては、白金、銅、酸化鉄等の金属コロイド粒子が挙げられる。前記無機結晶としては、酸化鉄（III）（Ｆｅ２Ｏ３）、酸化銀（Ｉ）（Ａｇ２Ｏ）、酸化スズ（IV）（ＳｎＯ２）、酸化チタン（IV）（ＴｉＯ２）、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等が挙げられる。例えば、特開２００５−７６０６４公報に記載の無機結晶を用いることができる。
【００６０】
・吸光係数
標識剤が吸光微粒子を有してなる場合、可視光を吸収し着色して視認できるものであることが好ましい。そのモル吸光係数εが５×１０６Ｍ−１ｃｍ−１以上である粒子であることが好ましく、モル吸光係数εが５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１〜１×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１であることがより好ましい。
【００６１】
ここで、モル吸光係数εは下記ランベルト−ベールの式から算出することができる。
Ａ＝Ｌｏｇ１０（Ｉ０／Ｉ）＝εｂｐ＝ａｓｂｐ’
［Ａ：吸光度、Ｉ：透過光の強度、Ｉ０：入射光の強度、ε：モル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）、ｂ：光路長（ｃｍ）、ｐ：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（Ｍ（ｍｏｌ／ｌ））、ａｓ：比吸光度、ｐ’：標識粒子（着色粒子及び蛍光微粒子の混合分散液を含む。）の濃度（ｇ／ｌ）］
【００６２】
上記濃度ｐ’（ｇ／ｌ）は、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた質量を決定して得られた値である。一方、上記濃度ｐ（ｍｏｌ／ｌ）は、標識粒子の大きさをＴＥＭ写真から求め、一粒子の体積を決定し、粒子の密度（例えばシリカ粒子の場合は２．３ｇ／ｃｍ３）から一粒子の質量を決定し、一定量（例えば１ｍｌ）の標識粒子分散液から標識粒子のみを回収し、乾燥させて得られた標識粒子の質量からモル数を決定して得られた値である。本発明において、「標識粒子のモル吸光係数ε」とは、標識粒子分散液について吸光度を測定し、前記ランベルト−ベールの式に適用することにより得られた、前記分散液中における標識粒子のモル吸光係数εをいう。標識粒子の吸光度、吸光スペクトル及びεは、任意の吸光光度計ないしはプレートリーダーを用いて、水分散液、エタノール分散液、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド分散液等の分散液として測定できる。
【００６３】
吸光微粒子の表面修飾や結合性物質の導入に係る実施形態は前記蛍光微粒子と同様である。
【００６４】
［検出方法］
イムノクロマトグラフィーは、通常、毛細管現象等を利用して移動する標識試薬シリカ微粒子（標識体）２，３を利用して、判定部で前記粒子を集積させ、判定を行う検出方法である。例えばイムノクロマトグラフィーやマイクロ流路チップ等を利用して行うことが好ましい。このとき、標識試薬シリカ微粒子はラテラルフロー用標識体として好適に用いることができる。さらに、本発明の標的物質の検出方法において、ラテラルフロータイプのイムノクロマトグラフィーを利用して標的物質を検出することが好ましい。
【００６５】
前記テストストリップの作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
【００６６】
前記イムノクロマトグラフィー用蛍光検出システムとしては、少なくとも（１）サンプルパッド、蛍光物質を含有してなる標識試薬シリカ微粒子又はラテラルフロー用標識試薬シリカ微粒子を含浸した部材（コンジュゲートパッド）、抗体固定化メンブレン及び吸収パッドからなるテストストリップ、並びに（２）励起光源からなることが好ましい。
前記蛍光検出システムにおいて、前記標識試薬シリカ微粒子（標識体）が発する蛍光を目視等によって検出する観点から、前記励起光源が、波長２００ｎｍ〜４００ｎｍの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプが挙げられる。本発明においては、特にレーザダイオードまたは発光ダイオードから照射した励起光を用いることが好ましい。
また、前記蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましく、さらに、蛍光のみを目視等で検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。
前記蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから標的物質の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。
【００６７】
前記励起光の波長は、３００ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましい。前記蛍光の波長は目視で認識できる波長が好ましく、３５０ｎｍ〜８００ｎｍであることが好ましい。また、目視で観察した時に高い視感度が得られることから、５３０ｎｍ〜５８０ｎｍであることがより好ましい。このとき、励起光の波長は、上記の波長帯域の蛍光を効率的に生成させるために、５００ｎｍ〜５５０ｎｍであることが好ましい。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態に係るテストストリップは、手技の習熟していない一般需要者でも操作し易くし、かつＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）の観点から、テストストリップの検出ラインを目視にて観察する観察窓のプラスチック材料等でハウジング（ケーシング）されていることが好ましい。例えば、特開２０００−３５６６３８等に記載されているハウジング等が挙げられる。
ここで、ＰＯＣＴとは、患者にできる限り近い場所で診断するための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた（例えば、１日以上）。ＰＯＣＴによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療が可能となることから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００７０】
（シリカ微粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）２．９ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μＬのＡＰＳを加え、室温（２４℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）６．５ｍＬ、蒸留水３５ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１５０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１５０００×ｇの重力加速度で２０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、シリカ微粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２００ｎｍのシリカ微粒子１．７１ｇを得た（収率約９７％）。【００７１】
＜比較例１＞
２Ｎの水酸化ナトリウムへ中和量の塩酸を追加して得られる塩成分含有水溶液へ前記で作製したシリカ微粒子を０．０２質量％含有するように添加して展開液試料を調製した。これを用いて、展開液の移行試験を行った。その結果が図５（ｂ）である。このときのＳＥＭ像を図７に示した。標識剤（シリカ微粒子）が局部的に偏在し、メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ１２０  メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の繊維表面に固着してしまっていることが分かる。図６は図５（ａ）および（ｂ）の結果を、縦軸を粒子の集積割合として示したものである。【００７２】
＜実施例１＞
前記比較例の展開液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を１質量％となるように添加した。これを比較例１と同様にして展開液の移行試験を行った。図５（ａ）はその結果を示す。
図５（ａ）および図５（ｂ）を対比して分かるとおり、比較例では試験領域（ｎｔ）に相当する位置（８０００μｍ付近）に到達する前に標識剤が滞留してしまっているが、本発明においては検体物質が的確に試験領域（ｎｔ）の位置に到達し捕捉されている。この結果より、本発明によれば、標識剤の凝集ないしメンブレンへの局部的な固着が抑えられ、その好適な流動性が実現されていることが分かる。【００７３】
＜実施例２＞
前記脱塩剤として、ＥＤＴＡに変え、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡを用いて同様の展開液の移行試験を行った。その結果、ＥＤＴＡと同様の良好な凝集抑制効果が見られた。【００７４】
＜参考例＞
図８に高濃度（６質量％）のＮａＣｌ塩中にシリカ粒子を添加しその粒度分布の経時変化の測定結果を示す。図８の各曲線の数値は、試験開始からの経過時間（秒）を意味する。図８（ａ）より添加時は平均粒径が４００ｎｍ程度であったものが３０分後に６００ｎｍ、１時間後には８００ｎｍまで大きくなっている。一方、ＥＤＴＡを添加すると添加時が５００ｎｍで時間を経過しても大きな変化は見られない（図８（ｂ））。この結果より、ＥＤＴＡを添加することで粒子の表面電荷を維持することができることが分かる。これは、粒子に凝集が発生せず、粒子の集合体の粒径（大きさ）が変化しないためだと考えられる。なお、０分では本発明のほうが、粒径が大きいが、４００ｎｍと５００ｎｍの違いは有意ではなく、時間が経っても凝集が進行しないことが重要である。【００７５】
図９、図１０は、別の実施例における脱塩処理した（連結材料で脱塩剤を固定化した）パッドを用いたときの状態を示した顕微鏡写真である。大きな凝集塊はなく粒子がまだらに存在し、１視野（２４μｍ□）あたり、６個の粒子が観察された。この結果からも、本発明の実施例においては、標識粒子のつまりが大幅に改善されることが分かる。
【符号の説明】
【００７６】
１  標的物質（被検物質）
２  標識体
２ａ  標識粒子
２ｂ  試験用結合性物質
３  標識体
３ａ  標識粒子
３ｂ  参照用結合性物質
４  試験用捕捉性物質
５  参照用捕捉性物質
６  筐体
６１  検出開口部
６２  検体導入開口部
６ａ  筐体上部
６ｂ  筐体下部
８ａ  凝集抑制パッド
８ｂ  コンジュゲートパッド
８ｃ  メンブレン
８ｄ  吸収パッド
８ｇ  サンプルパッド
９  脱塩剤
１０  テストストリップ
１００  長尺試験体
ｎｒ  参照領域
ｎｔ  試験領域
Ｌ  ラテラルフロー方向
Ｓ  検体【００７７】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
本願は、２０１３年７月２５日に日本国で特許出願された特願２０１３−１５４７６３に基づく優先権を主張するものであり、これらはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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