(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケールと糖類からなる混合物を発酵させた後、得られた発酵物を遠心分離して得られる沈殿物を有効成分とするＴＮＦ−α産生促進剤。
【請求項２】
発酵の最終ｐＨが４以下である請求項１に記載のＴＮＦ−α産生促進剤。
【請求項３】
下記の工程からなるＴＮＦ−α産生促進剤の製造方法。
１）ケール葉を常在菌が残留するように軽度に水洗する工程
２）ケール葉を裁断する工程
３）ケール葉の水分量に相当する質量の糖類と混合し、好気性〜通性嫌気性条件で発酵させる工程
４）発酵終了後、固形物をろ過して除去し、ＴＮＦ−α産生促進活性を有するろ過液を回収する工程
５）遠心分離を行い、沈殿物を回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ−α分泌促進作用を有するケール由来の発酵組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）とは、サイトカインの１種であり、狭義にはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン（ＬＴ）-α）およびＬＴ−βの３種類である。ＴＮＦ−αは主にマクロファージにより産生され、固形がんに対して出血性の壊死を生じさせるサイトカインとして発見された。腫瘍壊死因子といえば一般にＴＮＦ−αを指している。本発明においても、ＴＮＦと略記する場合は、ＴＮＦ−αを意味する。ＴＮＦ−αはマウスに移植した腫瘍に対して出血性壊死を誘発させる因子として１９７５年に単離され、１９８４年に遺伝子がクローニングされた。ＴＮＦ−αは分子量２５ｋＤａの前駆体タンパク質である膜結合型ＴＮＦ−α（ｍＴＮＦ−α）として産生されるが、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）により細胞外に存在するカルボキシル基側末端ドメインの切断を受けて１７ｋＤａの可溶性ＴＮＦ−α（ｓＴＮＦ−α）タンパク質（１５７アミノ酸残基）となる。ｍＴＮＦ−αとｓＴＮＦ−αのいずれも活性を有する。さらにＴＮＦ−αは５１ｋＤａのホモ３量体を形成し、血液中を循環する。ＴＮＦ−αは主に活性化されたマクロファージによって産生される他、単球、Ｔ細胞やＮＫ細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞も産生源となる。このようなＴＮＦ−αの分泌を促進する医薬品や食品が知られている。生体や免疫細胞のＴＮＦ−α産生を促進することができれば、免疫力の向上や感染治療などに有効である。
特許文献１には大豆蛋白質の酵素分解物が免疫促進効果を有していること、そしてその中に含まれる特定の配列を有するペプチドがＴＮＦ−α分泌を促進することが記載されている。
【０００３】
一方、野菜類の搾り汁である野菜飲料は、各種ビタミン、ミネラルを豊富に含むため、消費者の野菜不足への意識や健康志向の高まりに伴い、その需要が増大している。特にケールの搾汁液である青汁に代表される緑色野菜を含有した飲料は、年々その消費が拡大している。特にケールの青汁には、種々の生理活性を有することが知られており、生理的な作用を期待して飲用される。例えばケールの免疫に関わる生理作用としては、インターロイキン４抑制作用（特許文献２）、ブラジキニン受容体拮抗作用（特許文献３）、抗アレルギー・抗炎症作用（特許文献４）などが知られている。
また、ケールなどの青汁と乳酸菌を併用することで便秘改善作用を付与した食品を調製する方法（特許文献５）や乳酸菌により青汁を発酵させて異臭を改善する方法（特許文献６）などのケールの加工技術が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０８−０７３３７４号公報
【特許文献２】特開２００５−０８２５５２号公報
【特許文献３】特開２００３−３３５６８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２６７８８０号公報
【特許文献５】特開２００４−０８１１０５号公報
【特許文献６】特開２００２−０２７９５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＴＮＦ−α産生促進作用を有するケール由来の発酵物を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ケールを原料とする発酵食品を製造する過程で、ケールの発酵産物が免疫細胞のＴＮＦ−α産生能を向上させることを見いだし、本発明を提案するものである。
【０００７】
本発明の主な構成は次のとおりである。
（１）ケールと糖類からなる混合物を発酵させた後、得られた発酵物を遠心分離して得られる沈殿物を有効成分とするＴＮＦ−α産生促進剤。
（２）発酵の最終ｐＨが４以下である（１）に記載のＴＮＦ−α産生促進剤。
（３）下記の工程からなるＴＮＦ−α産生促進剤の製造方法。
１）ケール葉を常在菌が残留するように軽度に水洗する工程
２）ケール葉を裁断する工程
３）ケール葉の水分量に相当する質量の糖類と混合し、好気性〜通性嫌気性条件で発酵させる工程
４）発酵終了後、固形物をろ過して除去し、ＴＮＦ−α産生促進活性を有するろ過液を回収する工程
５）遠心分離を行い、沈殿物を回収する工程
【発明の効果】
【０００８】
新たなＴＮＦ−α産生促進剤が提供される。このＴＮＦ−α産生促進剤は、感染症や癌などの予防治療剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ケールと黒糖の混合物を発酵させた発酵物のＴＮＦ−α産生促進活性の発酵期間を追って測定した結果を示す。
【図２】ケールと黒糖の混合物を発酵させた発酵物の発酵開始から１ヶ月目、１．５ヶ月目、２ヶ月目のＴＮＦ−α産生促進活性の測定結果を示す。
【図３】ケールと黒糖の混合物を発酵させた発酵物の発酵開始から２ヶ月目の発酵物を遠心分離操作して、ＴＮＦ−α産生促進活性を濃縮する操作手順を示す。
【図４】ケールと黒糖の混合物を発酵させた発酵物の発酵開始から２ヶ月目の発酵エキス（Ａ）の活性を１００％としたときの、当該発酵物から遠心分離して得られた上清分画（Ｂ）、遠心分離による沈殿残渣分画（Ｃ）の相対活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ケールと糖類の混合物を発酵させた発酵物を有効成分とするＴＮＦ−α産生促進剤に関する。
発酵にあたっては、好気性〜通性嫌気性発酵させる。発酵方法は、特開平９−２９４５６０号に公報に１次発酵方法として開示されている手法を採用することができる。なおこの先行技術の発酵方法は、通性好気発酵を行うために、植物原料に黒糖を添加する操作は同一であるが、先行技術は、さらに酵母を添加して発酵させる点で本発明の手法とは異なる。
より具体的には、次の方法を例示することができる。
まずケールとケールに含有されている水分量と同量の糖類を混合する。この混合物を暫時静置し、ケール中の水分や蛋白質等の各種成分を滲出させながらケールに常在している微生物（または常在菌）によって、通性好気性条件にて自然発酵させる。
発酵させるための操作手順としては、まず十分成熟したケールの葉を採取し、次いで前処理として、採取した葉を収穫後軽く水で洗浄し、水気を切り、また傷や腐敗した部分は予め切除する。ケールは、カッターや裁断機を用いて１〜５ｃｍ程度の大きさに切断する。かくして裁断されたケール葉を、発酵容器中でケールに含まれる水分量と同量の糖類と混合して、重石を載せ、発酵の初期はケールに常在する微生物（常在菌）による通性好気性発酵を行わせる。ケールと混合する糖類は、黒糖、三温糖、精白糖、グラニュー糖などショ糖を主成分とする糖類が好ましく、黒糖が特に好ましい。またケール中の水分量は、予め測定するか、５訂食品標準成分表に開示されている水分量と同量（約９０％相当）を混合する。ケールに含有されている各種成分や蛋白質などが、糖類と混合すると浸透圧によって抽出される。これらの成分が発酵によりＴＮＦ−α産生促進作用を有する組成物へと変換されるものと考えられる。なおケールの５訂食品標準成分表に基づく水分量は、１００ｇあたり９０．２ｇであるので、ケールの水分量を測定しない場合は、ケール重量の９０％重量を目途として糖類を配合すればよい。
発酵容器中では、通性好気性発酵条件を維持するため、蓋の上に、重し（重石）を載せて静置する。重しの重量は、１００平方センチ当たり０．２〜２ｋｇとする。発酵開始時は１日１回〜数回撹拌を行い、その後２５〜３５℃の温度を維持しながら２〜１０ヶ月間好気性発酵を持続させる。この発酵過程では、主としてケールに常在する微生物（常在菌）による発酵が同時進行し、発酵過程でケールの組織が酵素分解を受けて、液体と固体の混在する粘質性のケール発酵物となる。このケール発酵物を金網等でろ過することで、本発明の目的物であるＴＮＦ−α産生促進作用を有するケール発酵物を得る。
【００１１】
本発明のＴＮＦ-α産生促進活性は、ＴＮＦ−α活性の産生量（ＴＮＦ−α産生量）を指標として経時的に測定を行ったところ、発酵開始１ヶ月経過後にＴＮＦ−α産生量が増加し、２ヶ月経過後に活性の総量はピークに到達し、９ヶ月経過まで緩やかに減少してゆくことが下記に示す試験例によって判明している。したがって最も効率よくＴＮＦ−α産生促進剤を生産するためには、実施例に示すように発酵期間を２ヶ月とすることが好ましい。
なおＴＮＦ−α活性の測定は、市販のＴＮＦ−α抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法によって容易に測定可能である。
この測定方法は、マクロファージに分化する細胞であるマウスリンパ球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＴＣ社製）を１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）に分散し、１０５個／ｗｅｌｌの割合で２４ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、培養した細胞培養系に被験試料を添加すると、ＴＮＦ−α産生促進作用を有する物質は、ＲＡＷ２６４．７をマクロファージ様細胞に分化増殖させるとともに、ＴＮＦ−αを培養液中に産生させることを利用するものである。そして細胞培養液中のＴＮＦ−α量は、上記のとおりＴＮＦ−α抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法によって測定する。
【００１２】
発酵に伴ってＴＮＦ−α産生量が上昇し、所期の想定値に到達した時点で発酵終了とする。目途とする発酵期間は２５℃で約２ヶ月程度である。発酵終了後、粗大な固形物をろ過し除去したケール発酵物は、そのまま、あるいはさらに遠心分離操作などの固液分離を行って、得られた沈殿部分をＴＮＦ−α産生促進剤とすることができる。また、ＴＮＦ−α産生促進剤とするため、発酵物は、各種方法で乾燥させ、乾燥物とすることが取り扱い上好ましい。発酵物中のＴＮＦ−α産生促進活性は、主として遠心分離によって沈殿する固体部分に存在するため、あらかじめ水分を精密ろ過、あるいは遠心分離により固液分離操作をおこない、液体部分を除去して、さらに乾燥させることでより効率よく、ＴＮＦ−α産生促進活性を有する粉末とすることができる。乾燥は、どのような乾燥方法であっても採用することができるが、低温の凍結乾燥が特に好ましい。
【００１３】
上記で得たＴＮＦ−α産生促進活性を有する粉末は、賦形剤としてでんぷん分解物を、バインダーとして造粒することで、ＴＮＦ−α産生促進活性を有する取り扱い操作のしやすい粉末とすることができる。具体的な造粒方法としては、流動層造粒、撹拌造粒、押し出し造粒などが挙げられる。本発明には、これらの造粒方法に通常用いられている装置を使用することができる。
中でも本発明には、流動層造粒が好ましく用いられる。流動層造粒は、簡便に且つ大量に造粒物を生産できることから好ましい。さらに、流動層造粒によれば、比較的低温で造粒操作を実施することができるので栄養素の破壊を抑えることができ、また、嵩密度の低い造粒物が得られ、造粒物の風味や食感をソフトにすることができ、また水溶けのよい造粒物が得られることから好ましい。
この造粒物は、ケール葉を搾汁して製造された所謂青汁の粉末と同様にして飲食することができる。例えば、カレー、シチュー、みそ汁、蒸しパン、ホットケーキ、ワッフル、クレープなどに加えて食してもよい。また、水、お湯、牛乳、果汁、豆乳などの飲料とともに服用することもできる。
さらに、賦形剤、滑沢剤などと混合し打錠成型して錠剤とすることもできる。またゼラチンやヒドロキシメチルセルロース製のカプセルに充填しカプセル剤とすることもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例、試験例を示し本発明のＴＮＦ−α産生促進剤の製造を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試験１．ＴＮＦ−α産生促進活性の測定方法
次の操作手順によって測定する
（１）１０％ＦＢＳ, １０，０００Ｕｎｉｔ/ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００μｇ/ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、 ２００ｍＭグルタミン酸を含むＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地）でマウス白血病細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ社製）を３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養する。
（２）０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む液でＲＡＷ２６４．７を剥がし、遠心分離（３０００ｒｐｍ,５ｍｉｎ）を行い、細胞を回収する。
（３）ＤＭＥＭ培地を添加し、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるように細胞密度を調整する。
（４）２４ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４００μＬずつ細胞播種し３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間インキュベートする。
（５）インキュベート後、各ウェルのＤＭＥＭ培地を吸引除去する。
（６）次いで、各ウェルに１０，０００Ｕｎｉｔ/ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、 １０，０００Ｕｎｉｔ/ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を４９５μＬ、及び各測定サンプルを５μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間インキュベートする。
（７）上澄みを回収し、ＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Thermo Scientific社製）を使用してＴＮＦ−α産生量を測定する。
（８）試験試料無添加の細胞（対照）のＴＮＦ−α産生量と比較し、対照（試料無添加）と比較して増加したＴＮＦ−α活性をＴＮＦ−α産生促進活性とする。
【００１５】
試験２．ケール発酵方法
ケールの発酵は次のとおり実施した。
（１）ケールの葉５．１ｋｇを水で洗浄し、よく水を切る。
（２）裁断機で約５ｃｍに裁断する。
（３）黒糖４．６ｋｇを添加し、良く混合する。
（４）プラスチック製容器（漬物樽）に入れ、蓋をし、蓋の上に６ｋｇの重石を載せ、２５℃で静置し自然発酵させる。
【００１６】
試験３．発酵期間とＴＮＦ−α産生促進活性の変化
発酵開始から１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、９ヶ月経過後に発酵物の固液混合物から液体部分を採取し、これを、試験試料とした。上記の１に記載の手法でＴＮＦ−α活性を測定し、これを試験試料１ｍＬあたりのＴＮＦ−αの産生量に換算し、ＴＮＦ−α促進活性とした。ＴＮＦ−α産生促進活性量の変化を図１に示す。
【００１７】
ＴＮＦ−α産生促進活性量は、発酵１ヶ月は、低値（２４４ｐｇ／ｍＬ）であったが、２ヶ月目に急上昇し（１７６８ｐｇ／ｍＬ）となった。その後緩やかに低下し、発酵開始から９ヶ月後は約１５１２ｐｇ／ｍＬとなった。
【００１８】
試験４．最適発酵条件の確認試験
試験３により、発酵期間中もっともＴＮＦ−α産生促進活性が高まる時期は、発酵開始から２ヶ月目であることが明らかとなった。この期間中に、発酵環境がどのような変化を示すのか確認するため、試験２と同様に発酵物を調製し、発酵開始１ヶ月目、１．５ヶ月目、２ヶ月目の３時点で、ＴＮＦ−α産生促進活性量、ｐＨ変化、微生物相の変化を観察した。微生物相の変化は、標準寒天培地、BCP加プレートカウントアガール培地、ポテトデキストロース寒天培地を用いて発酵物１ｍＬ当たりの一般細菌数、乳酸菌数、真菌（酵母）数の変化を測定した。
ＴＮＦ−α産生促進活性の変化を図２に示した。またＴＮＦ−α産生促進活性、ｐＨ変化、微生物相の測定結果を一括して下記の表１に示した。
【００１９】
【表１】
0006616631.tif 000002
【００２０】
図２から、ＴＮＦ−α産生促進活性は、発酵開始１．５ヶ月から２ヶ月の間で３倍に増加することが確認できた。したがってＴＮＦ−α産生促進剤を得るためには、ケールと糖類からなる混合物を最低２ヶ月間発酵させることが必要であることが明らかとなった。
一方ｐＨは、ｐＨ４．１７からｐＨ３．８９まで低下していることがわかった。また微生物相は、発酵開始直後１ヶ月目の菌叢を１．５ヶ月、２ヶ月目も維持していたが菌数は減少していた。菌数の減少は発酵にともなう菌体のオートリシスによるものと推測される。
この試験からＴＮＦ−α産生促進活性は、発酵期間とｐＨの管理が重要であることが予想された。
【００２１】
試験５．発酵物中のＴＮＦ−α産生促進活性の存在状態の確認試験
試験４で得た発酵２ヶ月経過後の発酵物中に存在するＴＮＦ−α産生促進活性の存在状態を確認するために以下の試験を行った。
発酵開始２ヶ月経過した容器から内容物を取り出し、これを目の細かな金網を用いてろ過し、ろ過液を回収した。この液を用いて試験を行った。なお、ろ過済みの発酵ろ過液を、以下の試験では発酵エキス（Ａ）と呼ぶ。
発酵エキス１．０ｍＬを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（上澄み）と沈殿物の２層に分離させた。次いで上清を、ピペットで回収した。回収した上清は、０．９８４ｍＬであった。
次いで、この上清を０．４５μｍのミリポアフィルターを用いて精密ろ過し、この精密ろ過液（Ｂ）を試料として試験１の方法でＴＮＦ−α産生活性を測定した。
また遠心分離して沈殿した沈殿残渣分画は、別に回収した。そして０．９８４ｍＬになるように精製水を添加し、これを同様にＴＮＦ−α産生活性測定試料（Ｃ）とした。
以上の操作手順を模式図として図３に示す。
精密ろ過液（Ｂ）及び沈殿残渣（Ｂ）のＴＮＦ−α産生活性測定結果は、発酵エキス（Ａ）の活性を１００％とした相対値で表した。結果を図３に示す。
図４の結果から、発酵物中のＴＮＦ−α産生活性は、上清（Ｂ）には殆ど存在せず、沈殿残渣分画（Ｃ）に存在することが確認できた。ＴＮＦ−α産生促進活性は、水に不溶の状態で発酵物中に存在することが予想された。
【図１】
0006616631.tif 000003
【図２】
0006616631.tif 000004
【図３】
0006616631.tif 000005
【図４】
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