(57)【要約】  モノクローナル抗体のFabドメインの可変領域を位置選択的に消化し、一方Fcドメインの消化を抑制することで、タンパク質をより簡便に検出・定量する方法を提供する。  モノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを検出するものである、上記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものである、上記方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体がトラスツズマブ又はトラスツズマブ-DM1であり、検出対象が配列番号１、３、６及び／又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
表２又は３に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、検出対象が配列番号９〜１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
表４に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がリツキシマブであり、検出対象が配列番号１３、１５及び／又は１６に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
表５に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析を用いたモノクローナル抗体の検出方法に関し、より具体的には、モノクローナル抗体の特異的配列を含むペプチド断片を選択的に消化する前処理ステップと、得られたペプチド断片を選択的に検出するステップとを含む、上記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬領域における最大の課題は、副作用が少なく高い薬効を発揮する薬の開発である。そのために現在着目されているのが薬物動態、特に濃度モニタリング（therapeutic drug monitoring, TDM）である。処方した薬が適正量であるかどうか、病変部位に到達しているかどうかを指標にシーズのスクリーニングが行われることで、ドロップアウトする薬を早期に発見し、この情報を早期創薬開発や臨床試験で有効に利用することが出来るようになる。特にがんや自己免疫疾患等の分野では、昨今は分子標的薬と呼ばれる創薬が主流である。分子標的薬の効果的な薬効は、病変部位に蓄積し薬効を発揮しているかどうかを測定し、医師自身が判断できることが重要である。【０００３】
分子標的薬としては現在、病原タンパク質を標的抗原とする抗体医薬が注目されている。抗体は本来体内に存在するタンパク質であるため、副作用が低いことが予想され、分子標的効果を高めるために高濃度で投与することも可能である。また抗体はその性質上、極めて高い分子特異性を示し、標的となる病変に蓄積されると言われてきたが、抗体医薬そのものの薬価の問題もあり、適正使用による最適化医療を行うことが重要であると議論されるようになっている。そのためには抗体医薬の局在や濃度を測定することで、最適な投薬量を設定することも重要である。さらには、投薬した薬の薬効指標をきちんと観察するための、抗体医薬濃度の定量にも大きな需要がある。【０００４】
抗体等のタンパク質の定量のための最も一般的な技術はELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）である。これは測定対象のタンパク質に対する抗体を作製し、さらに検出用抗体でサンドイッチすることで、簡便に測定対象分子を定量する技術である。ELISAは極めて汎用性の高い技術であり、また自動化支援環境も整っているため、今後も診断技術としてはゴールデンスタンダードとなると予想される。【０００５】
しかしながら、ELISAには、例えば、測定対象を直接測定していないため、異常値が出ることがあること、また測定対象ごとに抗体を作製する必要があり、時間やコストがかかること、複数の解析対象を同時に測定できないことなど、多くの課題が存在する。特に抗体医薬に関しては、内在性抗体との交差反応も生じ、正確な測定が難しい。さらに、中和抗体と抗原が結合した状態では抗原認識部位がふさがれ、ELISAで測定出来ないことも多い。【０００６】
また、動物試験フェーズで採用されたELISAの分析条件では、種間交差の問題からそのまま大型動物やヒトには応用できないこともしばしばである。つまり、創薬開発段階とヒト臨床試験では、別々の測定条件で比較せざるを得ない。病変組織中の薬剤濃度のELISAでは、検出を阻害するマトリックス成分が異なるため、ELISAベースで薬物動態を行うためには、複数の抗体の作製が必要となってしまう。このことは、膨大なコストや後期開発におけるドロップアウトなど、非常に大きなリスクをはらんでいる。【０００７】
一方、質量分析を用いたタンパク質の定量及び構造解析は、質量分析技術やデータ解析サーバ・ソフトウェアの発展と共に、飛躍的にその応用範囲を広げている。特に、質量分析を用いた絶対定量技術は、特異的抗体に依存しない方法として、認知度が高まっている。【０００８】
例えば、市販抗体のないタンパク質を定量する場合、従来はタンパク質を大量に精製する必要があったが、質量分析を用いることで、このステップが省略されるため、飛躍的に効率的となった。医学の分野でも、従来は病理切片の薄切方法、保存方法など医師の手技などの問題で、免疫組織染色に差が出てしまい、陽性、偽陽性、陰性の判定が難しいことはしばしば起こり得た。これに対して病理切片中の目的病原タンパク質を質量分析で定量することで、高発現タンパク質であるかどうかの判定が可能である。さらに昨今では、レーザーマイクロダイセクションと呼ばれる、細胞一個を切り出してくる装置が汎用的に使える状況にある。例えば、がん細胞のみを回収し、その細胞内の病原タンパク質の発現変動解析を、質量分析で直接観察することが可能となる。これは特に病理や臨床の現場で極めて画期的な技術革新であり、分析技術の標準化などの整備が望まれている状況である。【０００９】
精度の高い分析技術である一方で、生体試料中のタンパク質を質量分析によって検出する場合には、測定対象のタンパク質をプロテアーゼ消化して断片化することが多いため、夾雑物を含む多様なペプチド断片から目的のペプチド断片を効率的に選択することが重要となってくる。【００１０】
特許文献１では、試料中の抗体の検出のために、ペプシンを用いて非免疫グロブリンタンパク質の分解と共に抗体を消化してF(ab')2断片を産生させた後に更にトリプシン消化を行うことが開示されている。また特許文献２は、質量分析に先立つ液体クロマトグラフィー段階で適切に分離されたペプチドのみを定量対象として選択するというものである。非特許文献１は抗ペプチド抗体を用いて測定対象ペプチドを濃縮するというものである。【００１１】
また近年、プロテアーゼ消化の高効率化手法として、ナノ粒子等の微小環境（マイクロリアクター）内で、プロテアーゼ消化を行う方法が注目されている。例えば、非特許文献２では、細孔内にトリプシンを固定したメソ多孔シリカを用いることで、分子量の小さいタンパク質を選択的にトリプシン消化できることが報告されている。非特許文献３では、ナイロン膜にトリプシンを固定化し、タンパク質のトリプシン消化を高効率化した例が報告されている。これらの方法はいずれも、多孔質体の細孔内にプロテアーゼを固定化し、固相表面のプロテアーゼと液相内の基質タンパク質とを反応させるものである。【００１２】
非特許文献４は試料中のモノクローナル抗体と内在性の抗体とを識別するためのハイスループット法を提案するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表2010-515020号
【特許文献２】特開2012-197258号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】N. Leigh Anderson等, Mass Spectrometric Quantitation of Peptides and Proteins Using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA), Journal of Proteome Research, 2004, 3(2), 235
【非特許文献２】Qianhao Min等, Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis, Chemical Communications, 2010, 46, 6144
【非特許文献３】Fei Xu等, Facile Trypsin Immobilization in Polymeric Membranes for Rapid, Efficient Protein Digestion, Analytical Chemistry, Analytical Chemistry, 2010, 82, 10045
【非特許文献４】Xiaotao Duan等, High-Throughput Method Development for Sensitive, Accurate, and Reproducible Quantification of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Tissues Using Orthogonal Array Optimization and Nano Liquid Chromatography/Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 2012, 84, 4373
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
質量分析法により、タンパク質を簡便に検出・定量するためには、測定対象のタンパク質を位置選択的に切断し、そのタンパク質に特異的なペプチド断片を効率的に産生させ、他のペプチド断片の産生量を小さくすることが求められる。従って、抗体の場合には、Fabドメイン、特にFabドメインの可変領域を位置選択的に消化し、一方Fcドメインの消化を抑制する必要がある。【００１６】
本発明者等のグループは、基質となる抗体とプロテアーゼ酵素の両方を固相に固定化することによって、モノクローナル抗体の位置選択的なプロテアーゼ消化を実現することができた（N. Iwamoto等, Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576）。この方法は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出するものである。プロテアーゼとしてはトリプシンとリジルエンドペプチダーゼ（Lys-C）を9:1の比率で使用する二重消化が最も効率的であると報告した。【００１７】
上記の方法は、固相-固相反応を用いてモノクローナル抗体の選択的なプロテアーゼ消化を行う画期的な方法であるが、実際に使用するためには更に検討する余地を残している。【００１８】
従って本発明は、
・抗体の高次構造に基づき、抗体に含まれる特異的アミノ酸配列をもつペプチドをより簡便に調製すること、
・プロテオミクスで用いられている前処理工程（変性、還元アルキル化）を省略し、生理条件下で分解することで、省力化を図ると共に、汎用化を可能とすること、
・解析ペプチドの母集団数を減らしつつ、サンプルの特異性を保つこと、
・抗体医薬の多様性に対応し、種間の交差反応や由来サンプルの共存マトリックスを克服できる、汎用的な分析手法を確立すること、及び
・血液や組織などのマトリックス成分が共存しているサンプルでも、特異性の担保を可能とすること
等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は上記課題を念頭に鋭意検討した結果、本発明の制限的なプロテアーゼ消化を用いた抗体の検出のためには、モノクローナル抗体の可変領域の中で、特にCDR2領域に含まれるプロテアーゼ消化断片を検出することが最も有効であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００２０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(１）測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものである、上記方法。
（２）前記モノクローナル抗体がトラスツズマブ又はトラスツズマブ-DM1であり、検出対象が配列番号１、３、６及び／又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、（１）記載の方法。
（３）表２又は３に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、（２）記載の方法。
（４）前記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、検出対象が配列番号９〜１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、（１）記載の方法。
（５）表４に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、（４）記載の方法。
（６）前記モノクローナル抗体がリツキシマブであり、検出対象が配列番号１３、１５及び／又は１６に示すアミノ酸配列を有するペプチドである、（１）記載の方法。
（７）表５に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、（６）記載の方法。【００２１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-046059号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法は、制限的なプロテアーゼ反応場であるため、抗体の可変領域、特にCDR2領域を選択的に分解し、回収することができる。CDR2領域は抗体において最も表面近くに露出している部位であるために優先的に分解される。このことを利用することで、質量分析におけるモノクローナル抗体の検出をより効率的に行うことが可能となる。抗体医薬のCDR2領域を選択的に回収できることから、その領域を含むペプチドを定量することで、生体試料から直接的に、抗体医薬の濃度を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】シングルイオンモニタリング（SIM）による解析方法を模式的に示す。
【図２】多重反応モニタリング（MRM）による解析方法を模式的に示す。
【図３】エレクトロスプレーイオン化法の原理を示す。
【図４】抗体の模式図を示す。
【図５】本発明の方法の原理を示す。
【図６】血漿中に添加したベバシズマブCDRペプチドの定量分析のための検量線を示す。(A)FTFSLDTSK（配列番号１０）、(B)VLIYFTSSLHSGVPSR（配列番号１１）
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものである、上記方法に関する。
【００２５】
「CDR領域」とは、抗体においてアミノ酸置換頻度の特に多い領域を表現する言葉であり、DNA編集の位置（エクソンとイントロン構成）で規定されている。本発明の方法において検出対象として定量するペプチドは、このCDR領域を指標に前後近傍の領域を見て選択し、配列アラインメント解析を経て特異性のあるペプチドを用い、更に血中内在性抗体と交差がないか、実測値によって検証を行うことができる。
【００２６】
本明細書において、「CDR2（領域）」とは、抗体の一次構造における特定の連続アミノ酸残基でCDR2として規定される領域に加え、抗体の立体構造においてこの領域と近接し、全体として抗体の特異性を規定している領域を含めるものとする。また、本明細書において、「CDR1（領域）」及び「CDR3（領域）」に関する言及も、上記と同様に、立体構造的に抗体の特異性を規定している領域を含めるものとする。一般的にフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域であっても、抗体によって配列に相違があることは知られている。FR領域の配列は抗体タンパク質の由来、作製工程等にも依存し得る。当業者であれば、目的の抗体と他の抗体とのアミノ酸配列のマルチプルアライメント、並びに目的の抗体と内在性抗体との交差反応性等を確認することにより、目的の抗体の特異性を効率的に検出するためのCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を決定し、検出対象のペプチド断片を選択することができる。
【００２７】
また、本明細書において、「CDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列」とは、目的の抗体に特異的なCDR2領域由来のアミノ酸を1個以上含むアミノ酸配列であることを意味し、換言すれば、CDR2領域の一部を含むアミノ酸配列ということもできる。質量分析を用いた分析では、特異性を規定するアミノ酸残基が1個以上あれば、その特異性を確実に検出することが可能である。尚、「CDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列」とは、「CDR2領域由来のアミノ酸」を含む任意のアミノ酸配列を意図するものではなく、当該アミノ酸配列が全体として目的の抗体のアミノ酸配列の一部の連続的配列を構成していることを意図するものである。
【００２８】
以下、本発明の方法を具体的に説明する。
＜質量分析の概要＞
質量分析を用いた定量技術は、近年では主に三連四重極と呼ばれるハイブリッド型質量分析装置によって行われる。具体的には、イオン化された生体分子はまず、オクトポールと呼ばれる部分を通過することで、そのイオン分子振動半径を小さくする。次に第１四重極の中で、特定の質量数を持つイオンを共振させることで選択し、他のイオンを排除する。このステップはシングルイオンモニタリング（single ion monitoring, SIM）とも呼ばれる（図１）。
【００２９】
選択されたイオンは第２四重極に運ばれ、アルゴンと衝突することで開裂が行われる。この反応は衝突誘起解離（collision-induced dissociation, CID）という。この開裂反応の結果、生成した特異的な断片を第３四重極で選択することで、非常に高感度で、かつ高選択的な定量が可能となる。この一連の分析を多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring, MRM）と呼ぶ（図２）。
【００３０】
質量分析を用いた生体試料の定量は、生体分子の構造特異的なイオンを指標に定量できるという最大の利点があり、これを高速液体クロマトグラフに連結することで、連続的解析を可能とすることができる。現存する分析機器の中で、ほぼ唯一といって良い利点を持つ技術である。
【００３１】
質量分析により抗体を検出するためには、まず血液や組織などの生体試料より抗体を抽出し、適切な溶媒に溶解することが必要である。また、抗体はそのまま分析するには分子が大きいため、プロテアーゼによりペプチドに分解し、その後液体クロマトグラフで分離した後に質量分析を行う。分析に適したペプチドの分子量は約1000〜3000 Da程度である。
【００３２】
しかしながら、一般的なタンパク質分子をプロテアーゼ分解すると、ペプチド断片が約100本程度、抗体の場合には200本を遙かに超えるペプチド断片が生成する。従って、単一のタンパク質だけでも測定対象数は膨大になり、複雑な生体試料を対象にした場合には、巨大なサンプルセットとなる。
【００３３】
また、抗体分子では、CDR領域等のごく一部の配列のみが異なり、残りの部分は共通配列であるため、上記の巨大で複雑なサンプルから、目的の特異的配列のみを分析、定量するためには、質量分析ステップの前に高分離能及び再現性のよい液体クロマトグラフが必須となる。現在は、超高速・高圧クロマトグラフ機器があり、それに対応した、粒径が均一で非常に細かいカラム樹脂なども開発されており、このような高速、高分離、耐高圧カラムを用いることで、飛躍的に分離能向上が図れるようになってきている。しかしながら、プロテオミクスなど、タンパク質セットを対象とする研究分野においてはまだまだ十分とは言えない現状がある。
【００３４】
次に、図３にエレクトロスプレーイオン化法の概要を示す。高精度な質量分析による解析における課題として、「マトリックス効果」というものがある。マトリックス効果とは、同じ液滴内にイオン化阻害物質が存在すること、もしくは同時に多種のイオンが存在することで、目的物質のイオン化効率が低減してしまう現象である。イオン化に与えられるエネルギーは等しいので、イオン化対象物質が増えると、必然的にエネルギーが分散し、イオン量が減少してしまう。
【００３５】
解析対象ペプチドの本数が増えると、カラム分離で完全に分離することは困難である。よって、マトリックス効果によるイオン化効率の低下、結果的には感度や定量再現性の低下を引き起こす要因となる。これを改善するために質量分析側で、高速チャンネル切り替え機能などを作り、改善を図っているが、根本的には母集団の低減をしない限りは、このマトリックス効果を克服することは出来ない。
【００３６】
上記のような種々の問題点を考慮し、本発明の方法は、測定対象の特異性を維持しながら、解析対象の母集団を減らすことを意図するものである。
＜抗体＞
本発明の方法における測定対象はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、免疫グロブリンIgGであり、図４に示すように、2本の重鎖（分子量50 kDa）と2本の軽鎖（分子量25 kDa）がジスルフィド結合でつながった構造を有する生体高分子である。FabドメインとFcドメインがヒンジを介してつながっており、また重鎖及び軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域から成る。定常領域は、抗体の特徴的なY字型の形を保つ構造（フレームワーク構造）を有し、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有している。一方、可変領域には、相補性決定領域（complementarity-determining region, CDR）と呼ばれる特異的な配列を持つ部位が各3つずつ存在する。このCDR（CDR1、CDR2、CDR3）領域が規定する立体構造が抗原との特異的結合に関わっており、それによって抗体−抗原複合体が形成される。
【００３７】
抗体の高次構造でさらに特徴的なものは、リジッドな構造を持つ定常領域に対し、非常にフレキシブルなヒンジ、及び可変領域である。重鎖のC末端にはProtein AやProtein Gと呼ばれる特定のタンパク質が結合する部位が存在することが分かっている。
【００３８】
近年では、種々の疾患に対して特異的に作用し得る抗体医薬として、数多くのモノクローナル抗体が開発されている。本発明の方法は、そうしたモノクローナル抗体の検出のために非常に有効な方法であって、本発明の方法において測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばパニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ等のヒト化抗体；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ等のキメラ抗体等が挙げられる。尚、モノクローナル抗体の分子径は約１４．５ｎｍである。
【００３９】
また、モノクローナル抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えばFc融合タンパク質、抗体-薬物複合体（例えばゲムツズマブ・オゾガマイシン、トラスツズマブ-エムタンシン等）も本発明の方法における測定対象のモノクローナル抗体に含めるものとする。この場合、測定に先立って複合体の結合を解離させて抗体のみをLC-MSに供しても良く、あるいは複合体の形態のままでLC-MSに供することもできる。当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、測定対象に応じて本発明の方法のための最適な条件を設定することができる。
【００４０】
本発明の方法によれば、モノクローナル抗体の特にCDR2領域を位置選択的にプロテアーゼ消化することができ、得られたペプチド断片の質量分析により、抗体の同定や定量を行い得る。本発明の分析方法は、抗体の可変領域由来のペプチド断片、特にCDR2領域の断片を検出することにより、抗体の検出や定量を行い、抗体由来のペプチド断片を直接測定する方法である。本発明の分析方法は、抗体の種類に関わらず適用可能であるため、本発明の方法は、上記例示の抗体に限定されず、新規に開発されたモノクローナル抗体等にも適用できる。
【００４１】
＜多孔質体＞
本発明の方法に使用する多孔質体（図５においては「抗体Fc固定化樹脂」）は、多数の細孔を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。これらの中でも、抗体を部位特異的に結合可能なものが特に好ましい。
【００４２】
図５では、半球形状の細孔が図示されているが、細孔の形状は特に限定されない。また、多孔質膜のように、多孔質体を貫通する細孔が形成されたものを用いることもできる。多孔質体の細孔の大きさは特に限定されず、抗体を固定化した際に、細孔の表層付近に選択的に消化されるべき部位が位置するように、抗体の分子径等を考慮して決定することが好ましい。多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の範囲で、かつナノ粒子の平均粒径Ｄ１よりも小さい範囲で適宜に設定される。多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、例えば、２０ｎｍ〜２００ｎｍ程度が好ましく、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度がより好ましい。抗体のFcドメインを細孔内に固定化し、Fabドメインを位置選択的にプロテアーゼ消化するためには、多孔質体の細孔径は、３０ｎｍ〜１５０ｎｍが好ましく、４０ｎｍ〜１２０ｎｍがより好ましく、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、特に約１００ｎｍがさらに好ましい。
【００４３】
本発明の方法は、測定対象のモノクローナル抗体を多孔質体の細孔内に固定化する。細孔内に抗体を固定化し、固相と液相の界面という微細な環境に存在させることで、抗体は変性を起こしやすく、分子の揺らぎが摂動を受け、プロテアーゼのアタックを受ける確率が向上する。また、本発明では、後述するようにプロテアーゼがナノ粒子に固定化されることで、立体的に安定で、自己消化が生じ難い環境となるため、プロテアーゼの安定性が増すと考えられる。そのため、本発明の方法によれば、位置選択的なプロテアーゼ消化が可能となることに加えて、プロテアーゼの高活性を維持できる。
【００４４】
本発明においては、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。抗体とリンカー分子との相互作用としては、化学結合、水素結合、イオン結合、錯体形成、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、立体選択的相互作用等が挙げられる。
【００４５】
リンカー分子としては、抗体のFcドメインと部位特異的に結合するProtein AやProtein G等が好ましく用いられる。細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内に抗体のFcドメインが固定化され、Fabドメインが細孔の表層付近に位置する。このように、細孔内での抗体の配向が制御されることで、プロテアーゼによるFabドメインの位置選択的消化が可能となる。
【００４６】
リンカー分子の大きさは、抗体の選択的切断部位が細孔の表層付近に位置するように選択される。リンカー分子と抗体とが結合した状態の分子サイズは、多孔質体の細孔径の０．５倍〜１．５倍程度が好ましく、０．６倍〜１．２倍程度がより好ましく、０．７倍〜１．１倍程度がさらに好ましく、０．８倍〜１倍程度が特に好ましい。なお、多孔質体にリンカー分子が固定されておらず、細孔内に抗体を直接結合させる場合は、抗体の分子径と多孔質体の細孔径が上記関係を満たすことが好ましい。
【００４７】
本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）、トヨパール、TSKgel（TOSOH社製）等が挙げられる。例えばProtein G Ultralink樹脂では、樹脂に結合したProtein Gの９５％は細孔内にあることがわかっている。
【００４８】
＜多孔質体への抗体の固定化＞
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、抗体と多孔質体あるいはリンカー分子の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、細孔内にprotein Aやprotein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。
【００４９】
多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。例えば、抗体の定量分析を行う場合、試料中の抗体のほぼ全量が多孔質体に固定化されることが望まれる。そのため、試料中の抗体の推定含有量に対して、多孔質体の量が過剰となるように量比を設定することが好ましい。
【００５０】
＜ナノ粒子＞
本発明の方法において、ナノ粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、多孔質体の細孔内に固定化された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、ナノ粒子は、多孔質体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径Ｄ１が、多孔質体の平均細孔径Ｄ２よりも大きいものとする（図５）。
【００５１】
ナノ粒子の形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスの均一化の観点から、球状のナノ粒子が好ましい。また、ナノ粒子は、分散性が高く、平均粒径が均一であることが好ましい。
【００５２】
ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、多孔質体の平均細孔径Ｄ２の１．２倍以上がより好ましく、１．５倍以上がさらに好ましく、１．８倍以上、例えば約２倍が特に好ましい。例えば多孔質体の平均細孔径が３０〜１５０ｎｍ程度の場合、ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は１００ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましい。多孔質体の平均細孔径が５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の場合、ナノ粒子の平均粒径は、１２０ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましく、１７０ｎｍ以上が特に好ましい。ナノ粒子の平均粒径Ｄ１の上限は、プロテアーゼによる消化効率を高める観点から５００ｎｍ以下が好ましく、３００ｎｍ以下がさらに好ましい。
【００５３】
ナノ粒子は、上記のプロテアーゼを表面に固定化できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属や樹脂等が適宜に用いられる。また、金属表面を樹脂で被覆したものや、樹脂表面を金属で被覆したもの等を用いることもできる。
【００５４】
ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。磁気ナノ粒子の基材としては、酸化鉄（マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γ‐Fe2O3））、フェライト（Fe/M)3O4などの強磁性合金が挙げられる。フェライト（Fe/M)3O4において、Mは、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンを意味し、典型的にはCo2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+などが用いられる。また、磁気ナノ粒子を被覆する有機ポリマーとしては、ポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）、GMAとスチレンのコポリマー、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリアクリル酸メチル（PMA)などを挙げることができる。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomagなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。
【００５５】
上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
【００５６】
スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。ナノ粒子表面に固定化されたプロテアーゼのアクセス範囲を制御する観点から、スペーサは分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましく、２ｎｍ以下がさらに好ましい。また、スペーサの分子量は２０００以下が好ましく、１５００以下がより好ましく、１０００以下がさらに好ましい。
【００５７】
上記分子径で、プロテアーゼを固定化できるスペーサ分子は、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えば、トリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサ分子が好ましい。また、スペーサ分子のうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコール及びその誘導体、ポリプロピレングリコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びその誘導体、ポリ（エチレンテレフタル酸）及びその誘導体などの親水性分子が用いられる。
【００５８】
このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、それらを利用すればよい。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。FG beads NHSの粒子径は約２００ｎｍ±２０ｎｍであり、ナノ粒子として非常に均質のものである。
【００５９】
＜プロテアーゼ＞
本発明の方法は、プロテアーゼが、多孔質体の細孔内に固定化された抗体を特定のアミノ酸配列部位で切断して、CDR2領域のアミノ酸を含むペプチド断片を生じさせるものである。
【００６０】
本発明においてナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量又は同定の対象となるタンパク質の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ（Asp-N）、ArgCプロテアーゼ（Arg-C）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼなどが挙げられる。プロテアーゼは２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６１】
上記プロテアーゼの中でも、本発明においては、トリプシンが特に好ましく用いられる。トリプシンは基質特異性が高く、また切断後のペプチドのＣ末端にLys又はArgがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のための試料の作製のために特に好適である。またトリプシンは分子径が小さく（約３．８ｎｍ）、かつ活性部位が分子の内部に存在している。そのため、活性部位が抗体にアクセスできる領域が制限され、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めることができる。
【００６２】
プロテアーゼ消化後の抗体のペプチド断片を測定資料として質量分析に供する場合は、自己消化が少なく、切断配列の選択性が高いプロテアーゼを用いることが好ましい。市販のプロテアーゼを用いる場合、質量分析グレードや配列決定（シーケンス）グレードのプロテアーゼを用いることが好ましい。例えば、生体由来のネイティブのトリプシンは、自己消化によりキモトリプシン様の活性を示す疑似トリプシンを生成するため、切断部位の特異性が低いことが知られている。そのため、質量分析グレードとして、トリプシンのリジン残基を還元メチル化して自己消化に対する抵抗性を高めたものが市販されている。
【００６３】
本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
【００６４】
＜ナノ粒子へのプロテアーゼの固定化＞
プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用でき、例えば、プロテアーゼをスペーサ修飾されたナノ粒子表面に固定化する場合は、ナノ粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化できる。上記のスペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、ナノ粒子に表面修飾したカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC)、ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド（DIPC)等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、ナノ粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、2官能性スクシンイミド、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3)、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。
【００６５】
スペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのカップリング法は、ナノ粒子の懸濁液にプロテアーゼ溶液を添加し、一定の条件下で混合撹拌するという簡便な操作で行うことができる。
【００６６】
ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化後に、ナノ粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化させることが好ましい。例えば、ナノ粒子表面にプロテアーゼが固定化されていないスペーサ分子が存在すると、未結合のスペーサ分子が、試料中の夾雑物等と結合して、プロテアーゼ消化に悪影響を及ぼしたり、プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片がナノ粒子に固定化される等の不具合を生じる場合がある。プロテアーゼを固定化後に、未結合のスペーサ分子をブロックすることにより、このような不具合が抑制される。プロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化する方法としては、化学修飾が好ましい。例えば、活性化エステル基は、一級アミンとの反応によりアミド結合を形成して不活性化させることができる。
【００６７】
＜プロテアーゼ消化＞
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子とを液体中で接触させることにより、抗体がプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。ここで、「液体」とは、基質（固相）及び酵素（固相）が液相中で接触することを意味するものであり、またプロテアーゼ消化反応に適した水性媒体を意図する。
【００６８】
本発明におけるプロテアーゼ消化の条件は特に限定されず、一般的なプロテアーゼ消化と同様の条件を適宜に採用できる。例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で、通常３７℃程度の温度で、１時間〜２０時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００６９】
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子との混合量比も特に制限されず、抗体の量に応じたプロテアーゼ量となるように設定すればよい。なお、一般的なプロテアーゼ消化条件は、基質：プロテアーゼ＝１００：１〜２０：１（重量比）程度である。これに対して、本発明では、多孔質体とナノ粒子との組み合わせにより、抗体とプロテアーゼとのアクセスが物理的に制限されるため、一般的なプロテアーゼ消化に比べて、プロテアーゼ量を多くすることが好ましい。例えば、抗体：プロテアーゼ＝３０：１〜３：１程度が好ましく、１５：１〜４：１程度がより好ましく、１０：１〜５：１程度がさらに好ましい。
【００７０】
本発明の方法では、多孔質体に抗体を固定化させたままの状態でプロテアーゼ消化が行われる。プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片は液相内に存在するため、抗体の溶出や変性操作を行うことなく、位置選択的に目的のペプチド断片が得られる。本発明の方法によれば、従来法に比して簡便な操作で、かつ位置選択的にペプチド断片の回収を行うことができる。
【００７１】
より具体的には、例えば細孔径１００ｎｍのProtein G樹脂上に抗体のC末端側を固定化し、抗体の可変領域は必ず溶液側に配向するようにする。次に、粒子径２００ｎｍのナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化する。プロテアーゼの抗体への接触を制限することで、可変領域選択的な抗体分解反応を行う反応場を形成することが可能となる。また相対表面積の非常に大きなナノ粒子表面をプロテアーゼ反応場として用いることで、抗原との接触確率を向上させることが可能となる。
【００７２】
プロテアーゼ消化は、特に限定するものではないが、緩やかな回転による撹拌とともに定期的なタッピングを伴うタッピングローテーション下で行うことができる。「緩やかな回転」は、例えば３〜１０ｒｐｍ程度の回転数を指し、また、「タッピング」は、弾くような、若しくは、ショックを与えるような瞬間動作（頻度：例えば、１分間あたり１〜５回、好ましくは２〜４回）を指す。これによって、抗体を固定化した多孔質体とプロテアーゼを固定化したナノ粒子が共に分散状態を保持しながら効果的に接触し、プロテアーゼ消化反応効率を高めることができる。
【００７３】
上記のように、本発明の方法によって基質であるモノクローナル抗体とプロテアーゼとの接触を制限することで、モノクローナル抗体の特異性を示すCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを効率的に消化し、質量分析に供することができる。
【００７４】
＜多孔質体及びナノ粒子の除去＞
プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。
【００７５】
ろ過によって多孔質体及びナノ粒子を除去する場合、使用するろ過膜の孔径は、上記の多孔質体及びナノ粒子が通過できず、かつ消化されたペプチドの通過を可能とする範囲で選択される。例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社製）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、ミリポア社製）等を用いてろ過することにより、多孔質体及びナノ粒子を簡便に除去することができる。ろ過は、遠心ろ過とすると迅速かつ簡便なろ過が可能である。
【００７６】
＜液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）＞
上記で得られたペプチド断片を含む試料を、LC-MSにより分析することで、抗体の同定や定量を行い得る。
【００７７】
ペプチド断片の分離をより確実として、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前の試料を、液体クロマトグラフ（LC）により、分離・濃縮する。LCにより試料の分離を行う場合、LCからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供しても良い。LCとタンデム質量分析を組み合わせたLC/MS/MSやLC/MSnにより分析を行うこともできる。また、LCからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。LCのカラムは特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるC30、C18、C8、C4等の疎水カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。
【００７８】
質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が抗体等の特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいて試料中のペプチド断片の濃度を決定できる。本発明では、抗体が位置選択的にプロテアーゼ処理されるため、試料中に含まれるペプチド断片の種類が減少されている。そのため、質量分析等による分析条件の設定を容易になし得る。分析に際しては、必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、試料を分析に用いてもよい。
【００７９】
質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、電界脱離（FD）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を採用し得る。イオン化された試料の分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（IT）型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析を行うこともできる。
【００８０】
本発明の方法の使用において特に適した装置は、特に限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、及びLCMS-8080（いずれも島津製作所）、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF（島津製作所）を挙げることができる。
【００８１】
質量分析結果に基づいて、抗体を同定するために、既存のデータベースを用いることもできる。本発明では、抗体が位置特異的にプロテアーゼ消化されたペプチド断片が用いられるため、データベース検索によるヒット率やデータの確度が高められる。また、多段階の質量分析等により、ペプチド断片のアミノ酸配列を特定することにより、抗体を同定することもできる。抗体に特異的なCDR2領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片が検出できれば、目的の抗体を同定・定量することができる。
【００８２】
なお、検出結果に基づいて、抗体の同定や定量を行う場合、検出対象のペプチドは、アミノ酸残基数が５〜３０程度のものが好ましく、７〜２５程度がより好ましい。アミノ酸残基数が過度に小さいと、夾雑物や同一タンパク質の別の部位に由来するペプチド断片との区別がつき難く、誤検出等の原因となり得る。また、アミノ酸残基数が過度に大きいと、イオン化が困難となる等の理由により、検出が困難となったり、定量性が低下する場合がある。
【００８３】
抗体の濃度を定量する場合、検出されたペプチド断片イオン（多段階MSの場合は、親イオンの開裂により得られたフラグメントイオン）のピーク面積やピーク強度に基づいて、抗体の量を算出できる。例えば、予め求められた検量線（較正曲線）とピーク面積との関連付けや、試料中に添加された内部標準に由来するピーク面積と試料由来のピーク面積との関連付け等によって、試料中のペプチド断片の濃度が算出され、ペプチド断片濃度に基づいて、抗体の量や濃度が算出される。
【００８４】
質量分析で検出するペプチド断片は、測定対象のモノクローナル抗体のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり、検出は1種のペプチドを用いるものであっても、2種以上のペプチドを用いるものであっても良い。また、本発明の方法は、CDR2領域以外の領域に由来するアミノ酸配列を有するペプチドの検出を排除するものではなく、CDR2領域由来のアミノ酸配列を有するペプチドと併せて、CDR1領域、CDR3領域等に由来するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するペプチドを検出しても良い。
【００８５】
また、質量分析では、1種のペプチドの検出において、数種のフラグメントイオンが生成することは周知である。内部標準ペプチドの分析結果や予め判明している分析結果と参照すれば、1種のペプチドの1種のイオンのみの検出で目的のモノクローナル抗体の同定が可能であるが、1種の親イオンより生成する複数のフラグメントイオン、例えば2種以上、3種以上、4種以上のフラグメントイオンを同時に検出・定量することで、より詳細な構造情報を得ることができる。しかしながら、フラグメント情報量が多すぎると、分析時間が長くなり、結果的に分析精度の低下にもつながるため、一般的には1種のペアレントイオンに対し、2〜5種程度のフラグメントイオンを同時モニターすることが好ましい。また、フラグメントイオンは、イオン系列としてｙイオン系列を選択することが望ましいが、その優位候補が無ければ、次にｂイオン系列を選択しても良い。フラグメントイオンの中で最もイオン収率が高いイオンを定量用、その他を構造確認用イオンとすることで、構造特異性を確保することができる。
【００８６】
＜CDR2領域のアミノ酸を含むペプチド＞
本発明の方法における検出対象のペプチド断片は、抗体医薬等のモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものである。抗体の立体構造上、CDR2領域が最も外側かつ上方に存在するため、本発明の方法における制限的なプロテアーゼ消化において、プロテアーゼのアクセスという意味でこの領域のペプチドが最も高い効率で検出され得る。
【００８７】
抗体医薬として使用することが意図されるモノクローナル抗体は、そのアミノ酸配列情報等が公開されており、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、Fab及びFcドメイン、CDR領域、ジスルフィド結合等の情報を入手することが可能である。本発明の方法を用いてトラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、及びリツキシマブをトリプシン消化して得られるペプチドの例を表１に示す。
【００８８】
【表１】
2016143224.tif 000002
【００８９】
表１において、CDR2領域のアミノ酸を含むペプチド配列を太字で示す。本発明の方法において、これらCDR2領域のアミノ酸を含むペプチド断片が、質量分析による抗体の同定・定量のために特に適している。
【００９０】
従って、測定対象となるモノクローナル抗体がトラスツズマブ又はトラスツズマブ-DM1である場合、配列番号１、３、６及び／又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドを検出対象として選択することが好ましい。この場合、例えば表２又は３に記載の条件を指標にして、三連四重極型質量分析装置（例えばLCMS-8050、島津製作所）による多重反応モニタリングによって検出することができる。
【００９１】
【表２】
2016143224.tif 000003
【００９２】
2016143224.tif 000004
【００９３】
【表３】
2016143224.tif 000005
【００９４】
2016143224.tif 000006
【００９５】
測定対象となるモノクローナル抗体がベバシズマブである場合、配列番号９〜１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドを検出対象として選択することが好ましい。この場合、例えば表４に記載の条件を指標にして、三連四重極型質量分析装置（例えばLCMS-8050、島津製作所）による多重反応モニタリングによって検出することができる。
【００９６】
【表４】
2016143224.tif 000007
【００９７】
2016143224.tif 000008
【００９８】
測定対象となるモノクローナル抗体がリツキシマブである場合、配列番号１３、１５及び／又は１６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを検出対象として選択することが好ましい。この場合、例えば表５に記載の条件を指標にして、三連四重極型質量分析装置（例えばLCMS-8050、島津製作所）による多重反応モニタリングによって検出することができる。
【００９９】
【表５】
2016143224.tif 000009
【０１００】
2016143224.tif 000010
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［プロテアーゼの固定化］
以下のステップによってナノ粒子にプロテアーゼを固定化した。
＜1. FGビーズ洗浄＞
FGビーズNHS 200 mg（多摩川精機社製）を遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）し、保存用上清イソプロパノールを除去する。上清は、沈殿しない浮遊物も含め、慎重に除去する。
＜2. 酵素準備＞
Trypsin Gold 1 mg、5本（プロメガ社製）を開封し、4 ℃に冷却した25 mM HEPES-NaOH, pH7.0 に溶解する。溶解後、50 ml遠沈管に取り、氷上に静置する。酵素は25 mM HEPES-NaOH, pH7.0を用いて1回共洗いし、できる限り回収する。最終緩衝液量は25 ml程度となる。
＜3. FGビーズ洗浄＞
それぞれ10 mlの氷冷したメタノールを加え、氷冷した超音波洗浄機の中で、FGビーズの懸濁を確認してから遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）し、上清メタノールを除去する。
＜4. 酵素固定化反応＞
FGビーズの沈殿200 mgに、トリプシン溶液を加える。氷冷した超音波洗浄機を用いてFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで30分間連続してボルテックスを行う。30分間反応させた後、遠心分離（15,000 g X 5 分, 4 ℃）を行い、上清を除去する。上清を回収し、BCAアッセイによるカップリング効率を確認する。
＜5. 活性基ブロック＞
FGビーズの沈殿200 mgに、それぞれ25 mlの1M 2-アミノエタノール塩酸塩、pH8.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで連続ボルテックスを行う。30分間反応させてブロッキングした後、遠心分離を行い、上清を除去する。
＜6. 酵素ビーズ洗浄＞
FGビーズの沈殿200 mgに、それぞれ25 mlの25 mM HEPES-NaOH、50 mM NaCl、pH7.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いFGビーズの懸濁を確認してから、懸濁を保てる最低限のスピードで連続ボルテックスを行う。洗浄5分後、遠心分離を行い、上清を除去する。
＜7. 保存＞
プロテアーゼ終濃度0.5 μg/μlとなるように25 mM Tris-HCl、pH8.0を加え、氷冷した超音波洗浄機を用いてFGビーズの懸濁を確認してから、それぞれ500μlに分注する。その後-80 ℃で保存する。【０１０２】
［プロテアーゼ消化］
以下のステップによって血漿試料中のモノクローナル抗体をプロテアーゼ消化した。
＜1. 血漿からのモノクローナル抗体の回収＞
モノクローナル抗体は、免疫グロブリンIgGのファミリーであるため、血漿中に内在する免疫グロブリンと同じ方法で回収が可能である。血漿20μlをとり、180μlのPBS  +  0.1 % n-オクチル-β-D-チオグリコシド（同仁化学）で希釈する。【０１０３】
ここにProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）の50%懸濁液を40μl加える。室温で1〜2時間緩やかにボルテックス、もしくはロータリーミキサーで回転させることで、血漿中の抗体分子を樹脂に結合させる。遠心分離により樹脂を沈殿させ、上清を捨てる。【０１０４】
200μlのPBS  +  0.1 % n-オクチル-β-D-チオグリコシドを添加して3回洗浄することで、樹脂に非特異的に結合した血漿中タンパク質を洗浄する。次いで、200μlのPBSで1回洗浄し、界面活性剤を除去する。
＜2. プロテアーゼ反応＞
Protein G Ultralink樹脂が残っているチューブに、200 μlの25 mM Tris-HCl, pH8.0を加える。次いで、これにトリプシンを固定化したナノ粒子を80μl加え、ローテーターにセットし、37℃で6時間ゆっくり回転する。
反応後、0.2 μmの低結合性親水性PVDF膜（ミリポア社製）で濾過することで、Protein G樹脂とトリプシンを固定化したナノ粒子を共に除去し、反応溶液を回収する。【０１０５】
［質量分析］
市販の血漿（シグマ社製）に抗体医薬をスパイクし、そのペプチドを検出した。モノクローナル抗体として、トラスツズマブ（医薬品名ハーセプチン、中外製薬）、トラスツズマブ-DM1（医薬品名カドサイラ、中外製薬）、ベバシズマブ（医薬品名アバスチン、ロシュ・ジェネンテック）、リツキシマブ（医薬品名リツキサン、中外製薬及び全薬工業）の4種を用いた。質量分析の条件は以下の通りである。
＜HPLC条件（Nexera LC30A液体クロマトグラフシステム）＞
溶媒A：0.1% ギ酸、溶媒B：0.1% ギ酸＋アセトニトリル
流速：0.5 ml/分
グラジェント時間：1%B（1.5分）、1-40%Bグラジェント（5分）、95%B（5分）、1%B（5分）
カラム：L-column2 ODS, 2 x 50 mm（化学物質評価研究機構）
カラム温度：50℃
＜MSインターフェイス条件（LCMS-8050(島津製作所)）＞
ネブライザーガス：3 L/分
ヒーティングガス：10 L/分
ドライイングガス：10 L/分
インターフェイス温度：300℃
DL温度：250℃
ヒートブロック温度：400℃
図６に、ベバシズマブを検出した例を挙げる。図６(A)は重鎖のCDR2領域のアミノ酸を含むペプチドFTFSLDTSK（配列番号１０）、図６(B)は軽鎖のCDR2領域のアミノ酸を含むペプチドVLIYFTSSLHSGVPSR（配列番号１１）を検出対象ペプチドとして質量分析を行った結果である。これらの検出のための質量分析情報は、上記の表４を参照することで得ることができる。
図６の結果から明らかなように、質量分析による上記のペプチドの検出は非常に精度が高く、取得したデータより検量線を作成すると、ベバシズマブ濃度100μg/mlまでの範囲で重相関係数R2=0.9999、R2=0.9998であった。【０１０６】
［イオン強度の比較］
上記と同様の条件でプロテアーゼ消化した抗体医薬のペプチドを質量分析で検出した。モノクローナル抗体として、トラスツズマブ（医薬品名ハーセプチン、中外製薬）、ベバシズマブ（医薬品名アバスチン、ロシュ・ジェネンテック）、リツキシマブ（医薬品名リツキサン、中外製薬及び全薬工業）の3種を用いた。【０１０７】
結果を表６〜８に示す。【０１０８】
【表６】
2016143224.tif 000011
【０１０９】
【表７】
2016143224.tif 000012
【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
表６〜８の結果から明らかなように、本発明の方法により、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブのいずれにおいても、CDR2領域由来のアミノ酸を含むペプチド断片が、他の領域由来のペプチド断片と比較して高いイオン強度で検出できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の方法は、特に、CDR2領域のアミノ酸を含むペプチドを選択的にプロテアーゼ消化して、得られたペプチド断片を質量分析することにより、そのペプチド断片の配列や量を決定し、抗体を同定・定量することができる。本発明の方法は、操作が簡便で、かつ再現性や定量性を確保できるとともに、自動化もなし得るため、薬物動態の解析、抗原抗体反応を用いた相互作用の解析、各種のインタラクトーム解析、免疫沈降タンパク質の同定等の基礎研究にも適用できる。その他、抗体医薬等の生体分子医薬の配列解析、品質保証、後発医薬品の同一性確認等への応用も期待できる。【０１１３】
現在、抗体医薬は40品目が上市されており、さらに前臨床試験は300程度、動物試験を含む全臨床試験では2,000種以上、研究段階やシーズも含めると5,000種を超えると言われている。本発明は、このような多種多様な抗体医薬に対し、極めて汎用性の高い分析手法を提供できるものであり、今後の抗体医薬開発の加速に寄与できる。【０１１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月11日(2017.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり、
前記モノクローナル抗体がトラスツズマブ又はトラスツズマブ-DM1であり、
検出対象が配列番号１、３、６及び／又は７に示すアミノ酸配列を有するペプチドであり、
表２又は３に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、
上記方法。
【請求項２】
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり、
前記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、
検出対象が配列番号９〜１１に示すアミノ酸配列を有するペプチドであり、
表４に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、
上記方法。
【請求項３】
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径よりも大きく、検出対象のペプチド断片が前記モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり、
前記モノクローナル抗体がリツキシマブであり、
検出対象が配列番号１３、１５及び／又は１６に示すアミノ酸配列を有するペプチドであり、
表５に記載の条件を用いて多重反応モニタリングによって検出する、
上記方法。
【国際調査報告】
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