(57)【要約】 ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤は、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とする。細胞性粘菌から分泌された物質は、例えば、細胞性粘菌を子実体に培養し、細胞性粘菌を分離して抽出して得られる。細胞性粘菌として、D.discoideum,  D.purpureum, D.mucoroides，D.fasciculatum，D.monochasioides，D.lacteumまたはD.giganteumを使用し得る。農作物や作業者に悪影響を与えることなくネコブ線虫を忌避させることができる。
2015029872.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とすることを特徴とする忌避剤。
【請求項２】
前記細胞性粘菌から分泌された物質が、多細胞期の前記細胞性粘菌から分泌された物質であることを特徴とする請求項１に記載の忌避剤。
【請求項３】
前記多細胞期の細胞性粘菌が、細胞性粘菌の子実体であることを特徴とする請求項２に記載の忌避剤。
【請求項４】
前記細胞性粘菌が、D.discoideum、 D.purpureum、D.mucoroides、D.fasciculatum、D.monochasioides、D.lacteum及びD.giganteumからなる群から選ばれる一種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の忌避剤。
【請求項５】
前記細胞性粘菌から分泌された物質は、細胞性粘菌を培地で培養させ、培養した細胞性粘菌を培地から除去した後に、培地から抽出して得られることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の忌避剤。
【請求項６】
前記培地からの抽出が、有機溶媒による抽出であることを特徴とする請求項５に記載の忌避剤。
【請求項７】
前記培地からの抽出が、吸着剤による吸着であることを特徴とする請求項５に記載の忌避剤。
【請求項８】
さらに、前記細胞性粘菌を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の忌避剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の忌避剤を、ネコブ線虫が存在するエリアに適用することでネコブ線虫を忌避させる方法。
【請求項１０】
ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤の製造方法であって、
Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培養して多細胞期の細胞性粘菌に変化させ、
前記多細胞期の細胞性粘菌から有機溶媒によって前記多細胞期の細胞性粘菌の分泌物質を抽出することを含む前記忌避剤の製造方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒がメタノールまたはエタノールである請求項１０に記載の忌避剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農作物の根に寄生するネコブ線虫を忌避させるための物質及びその製造方法並びにその忌避剤を用いた忌避方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、線形動物門に属する動物の総称であり、極めて多くの種が実在している。これらの線虫の殆どは人間にとって無害であるが、植物に寄生して加害する線虫が知られている。例えば、ネコブ線虫類、シスト線虫類、ネグサレ線虫類が挙げられる。このうち、キタネコブ線虫やサツマイモネコブ線虫に代表されるネコブ線虫は、ジャガイモ、ニンジン、イチゴなどの農作物の根に寄生し、根にコブを作って構造を破壊して腐敗させるとともに、青枯病などの土壌病害の発生を助長する。全世界の農業生産物の害虫被害のうち約５％がキタネコブ線虫によるものといわれている。このようなネコブ線虫による被害に対処するため、日本では欧州や米国で使用が禁止されている燻煙剤(臭化メチル)と有機リン化合物を主体とした毒性の高い駆除剤が使用されている。【０００３】
しかしながら、このような化学物質の散布は、作物や作業者の安全性という見地から好ましくない。特に、作物の育成中に線虫の感染が見られた場合に、作物にそのような毒性が高い化学物質を使用することはできない。このため、作物や作業者の安全性を維持しつつ、ネコブ線虫を駆除する方法が望まれている。【０００４】
特許文献１には、ネコブ線虫などの線虫を駆除するために特定の置換基を有するアルキルベンゼンを使用することが開示されている。しかし、このような化合物が農作物に与える影響については、この文献に述べられていない。また、特許文献２には、生コーヒー豆抽出物の有効成分を用いたネグサレ線虫の防除剤が開示されている。生コーヒー豆抽出物の有効成分として、例えば、クロロゲン酸等のフェノール化合物が含まれており、このような有効成分がネグサレ線虫の駆除に効果的であり、一方、天然由来成分であるために人体や作物に対する安全性が高いことが示されている。特許文献３には、特定のキク科植物の抽出物を有効成分とするネコブ線虫防除剤が開示されている。【０００５】
ところで、細胞性粘菌は、土壌に普遍的に生息する真核微生物であり、通常は単細胞状態でバクテリアを餌として増殖する。細胞性粘菌と同じ生息域を持つ非寄生性線虫であるCaenorhabditis elegansは、細胞性粘菌と被食−捕食者の関係性を持つ一方で、この線虫の幼虫は細胞性粘菌の一種であるDictyostelium purpureumと同一容器内で共培養すると、細胞性粘菌を避けるような行動を示すことが知られている（非特許文献１）。しかし、細胞性粘菌と、植物寄生性線虫であるネコブ線虫との具体的なコミュニケーションはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】R. Kessin, et al.  Proc. Natl. Acad. Sci. USAVol. 93, pp. 4857-4861, May 1996 Development Biology
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２５７０７号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３２９５０号公報
【特許文献３】特許第４５２８９８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、農作物や作業者に悪影響を与えることなくネコブ線虫を忌避させるための忌避剤及びそれを用いた方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、土壌中に生息する細胞性粘菌とキタネコブ線虫などのネコブ線虫が生物学的コミュニケーションを行っていることを発見し、この発見に基づいてネコブ線虫を忌避させる忌避剤を細胞性粘菌から製造することに成功した。本発明の第１の態様に従えば、ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌から分泌された物質を有効成分とすることを特徴とする忌避剤が提供される。【００１０】
本発明の忌避剤において、前記細胞性粘菌から分泌された物質が、多細胞期の細胞性粘菌、特に細胞性粘菌の子実体から分泌された物質でもよい。また、前記細胞性粘菌が、D.discoideum,D.purpureum,D.mucoroides，D.fasciculatum，D.monochasioides，D.lacteum及びD.giganteumからなる群から選ばれる一種であり得る。【００１１】
本発明の忌避剤において、前記細胞性粘菌から分泌された物質は、細胞性粘菌を培地で培養させ、培養した細胞性粘菌を培地から除去した後に、培地から抽出して得てもよい。この場合、前記培地からの抽出が、有機溶媒による抽出であるか、あるいは、吸着剤による吸着であってもよい。本発明の忌避剤は、さらに、前記細胞性粘菌を含んでいてもよい。【００１２】
本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様に従う忌避剤を、ネコブ線虫が存在するエリアに適用することでネコブ線虫を忌避させる方法が提供される。【００１３】
本発明の第３の態様に従えば、ネコブ線虫を忌避させるための忌避剤の製造方法であって、Dictyostelium属に属する細胞性粘菌を培養して多細胞期の細胞性粘菌に変化させ、前記多細胞期の細胞性粘菌から有機溶媒によって前記多細胞期の細胞性粘菌の分泌物質を抽出することを含む前記忌避剤の製造方法が提供される。前記有機溶媒は、メタノールまたはエタノールであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ａ）は、細胞性粘菌が不在の場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のキタネコブ線虫の挙動を示す顕微鏡写真であり、図１（ｂ）〜（ｄ）は、それぞれ、細胞性粘菌としてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｄ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ及びＤ．ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓをキタネコブ線虫の左側に存在させた場合のキタネコブ線虫の挙動を示す顕微鏡合成写真である。
【図２】実験例２における操作と結果を示す図であり、（ａ）はシャーレ内におけるキタネコブ線虫と細胞性粘菌の配置を示す概念図であり、（ｂ）は領域１〜３に対するキタネコブ線虫の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図３】実験例２において領域１〜３におけるキタネコブ線虫の存在を定量的に表したグラフである。
【図４】実験例３における操作と結果を示す図であり、（ａ）は、ろ紙上に発生させた細胞性粘菌が４８時間経過後に子実体に形態変化した様子を示す図であり、（ｂ）は子実体が存在しているろ紙を培地から除去して、培地内にキタネコブ線虫を播種した様子を示す概念図であり、（ｃ）は顕微鏡写真で撮影したキタネコブ線虫の領域１、２に対する移動軌跡を示す図である。
【図５】実験例３において領域１及び２におけるキタネコブ線虫の行動軌跡を数値化して表したグラフである。
【図６】実験例４における操作と結果を示す図であり、（ａ）は、ビーズが存在する培地上に、細胞性粘菌を発生させたろ紙を配置した様子を示す図であり、（ｂ）はビーズから抽出された細胞性粘菌抽出物が付いたろ紙を培地に設置するとともにキタネコブ線虫を播種した様子を示す概念図であり、（ｃ）は領域１及び２に対するキタネコブ線虫の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図７】実験例４の結果を示し、（ａ）〜（ｃ）は濃度の異なる粘菌抽出物の試料１〜３を用いた場合における領域１及び２におけるキタネコブ線虫の行動軌跡を数値化して比較したグラフである。
【図８】実験例５の実験条件を概念的に示す図である。
【図９】実験例５における３本のミヤコグサの根のキタネコブ線虫による感染数を表す表である。
【図１０】実験例５における３本のミヤコグサの根のキタネコブ線虫による感染状態を示す写真である。
【図１１】実験例７におけるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属に属する細胞性粘菌に対するキタネコブ線虫の移動軌跡を示す顕微鏡写真であり、細胞性粘菌として（ａ）はＤ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｕｍを、（ｂ）はＤ．ｍｏｎｏｃｈａｓｉｏｉｄｅｓを、（ｃ）はＤ．ｌａｃｔｅｕｍを、（ｄ）はＤ．ｇｉｇａｎｔｅｕｍをそれぞれ用いた場合を示す。
【図１２】実験例７におけるＰｏｌｙｓｐｈｏｎｄｙｌｉｕｍ属に属する細胞性粘菌に対するキタネコブ線虫の移動軌跡を示す顕微鏡写真であり、細胞性粘菌として（ａ）はＰ．ｐａｌｌｉｄｕｍを、（ｂ）はＰ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍをそれぞれ用いた場合を示す。
【図１３】実験例７におけるＡ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｍに対するキタネコブ線虫の移動軌跡を示す顕微鏡写真である。
【図１４】実験例７におけるｃｏｎｔｒｏｌの顕微鏡写真である。
【図１５】実験例６における３本のミヤコグサの根のキタネコブ線虫による感染数を表す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明のネコブ線虫の忌避剤及びそれを用いるネコブ線虫を忌避させる方法の実施形態について説明する。
【００１６】
＜忌避対象物＞
農作物の根に寄生する植物寄生性線虫として、主に、ネグサレ線虫、シスト線虫、ネコブ線虫が知られているが、本発明では、ネコブ線虫を忌避対象とし、特に、キタネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｈａｐｌａ）、サツマイモネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、ジャワネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｊａｖａｎｉｃａ）、アレナリアネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅａｒｅｎａｒｉａ）のようなネコブ線虫を忌避対象とする。これらのネコブ線虫は、トマト、じゃがいも、さつまいも、メロン、すいか、かぼちゃ、きゅうり、ほうれんそう、にんじん等の農作物に寄生するが、根の中に定着して増やした次世代の線虫を土中に放出しながら加害する。
【００１７】
＜細胞性粘菌及びその入手＞
細胞性粘菌は、主に、Dictyostelium属、Polysphondylium属、及びAcytostelium属の三つの属に分類され、本発明で用いる細胞性粘菌は、Dictyostelium属（以下、適宜、D.またはＤ属と略することがある）に属する細胞性粘菌であり、例えば、D.discoideum、D.purpureum、D.mucoroides、D.fasciculatum、D.monochasioides、D.lacteum、D.giganteumが挙げられる。これらのうち、D.discoideum、D.fasciculatum、D.lacteum、D.giganteumが、培養がしやすく、高密度でも子実体を作り易い点で好ましく、同様の観点で特に、D.discoideumまたはD.giganteumが好ましい。D.giganteumは和名セイタカタマホコリカビと呼ばれ、大きな子実体を作ることが知られている。
【００１８】
Dictyostelium属は、形態的に枝分かれしておらず、細胞性のしっかりした柄を持ち、柄が１本で胞子塊を支えることができる。これに対して、Ploysphondylium属（以下、適宜、P.またはＰ属と略することがある）は、横方向にWhorl（輪生枝）と呼ばれる枝分かれ構造を持ち、柄が細く、Acytostelium属（以下、適宜、A.またはＡ属と略することがある）は細胞性の柄を持たずセルロースのチューブ状の柄を持つ。胞子は休眠状態でいるため活動を停止しているが、柄細胞は遺伝的には死んでいても生理学的には生きており、化合物を合成・分泌している。本発明者は、ネコブ線虫の忌避活性は、柄細胞から分泌されている物質によるものと推定しており、上記の３つの属の中で最もしっかりした柄細胞を持つものはDictyostelium属であるため、ネコブ線虫の忌避活性を示す物質を多く分泌すると考えられる。
【００１９】
なお、細胞性粘菌は遺伝子的な分類方法（ＤＮＡの塩基配列よる分類）ではグループＩからIVに分けることもできる（P.Schaap  et  al.  Science,  27  OCTOBER 2006,  Vol.  314  no.  5799  pp.  661-663）。例えば、D.discoideum，  D.purpureum,  D.mucoroides，  D.giganteumはグループIVに属し、D.lacteumはグループIIIに属し、Acytostelium属に属するA.subglobosumやPolysphondylium属に属するP.pallidumはグループIIに属し、D.fasciculatumはグループＩに属する。これらの細胞性粘菌は、例えば、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から胞子の状態で入手し、培養することができる。あるいは、土壌から採取したものを分離して用いることができる。
【００２０】
＜細胞性粘菌分泌物＞
本発明者は、後述する実施例の結果より、ネコブ線虫を忌避させる物質(忌避剤の有効成分)は、細胞性粘菌そのものではなく、細胞性粘菌から分泌される物質（細胞性粘菌分泌物）が線虫に対して忌避性を示すことを見出した。細胞性粘菌は、胞子の状態で入手した場合、発芽して、単細胞化し、次いで、飢餓状態において多細胞化し、さらに、子実体が形成される。本発明者によれば、ネコブ線虫を忌避させる細胞性粘菌分泌物は、特に、細胞性粘菌の子実体から多量に得ることができることを見出した。細胞性粘菌分泌物は、細胞性粘菌による代謝産物であると考えられるが、その化合物（または生体物質、微生物）などの特定は現段階ではできていない。しかしながら、細胞性粘菌からネコブ線虫を忌避させる物質（忌避剤）を生成することができることは後述する実施例で実証されており、有機溶媒で抽出されることからすれば疎水性物質（例えば有機化合物）と考えられる。
【００２１】
＜細胞性粘菌分泌物の抽出方法(製造方法)＞
ネコブ線虫を忌避させる細胞性粘菌分泌物は、例えば、以下のような方法で得ることができる。細胞性粘菌は、通常、粉末（胞子）状で入手することができる。このような粉末状の細胞性粘菌を、寒天内に大腸菌と共に培養する。寒天培地内で細胞性粘菌の胞子が発芽してアメーバ(単細胞)となる。アメーバは大腸菌を餌として増殖するが、餌が尽きると飢餓状態となり集合して多細胞化し、その後、子実体となる。得られた子実体を回収し、メタノールやエタノール等の有機溶媒中に加えて静置する。子実体は有機溶液中で沈殿し、エタノールの上層（上澄液）には子実体から分泌された物質のうち、疎水性物質が溶解または分散している。この上澄液を子実体からろ過等により分離して取り出すことで細胞性粘菌分泌物溶液が得られる。必要に応じて細胞性粘菌分泌物溶液を乾燥することで固形分として取り出すこともできる。なお、細胞性粘菌は必ずしも子実体(多細胞期)に形態変化するまで培養しなくともよい。但し、単細胞期の細胞性粘菌から分泌された物質は、多細胞期から分泌された物質よりも忌避活性が低い。
【００２２】
あるいは、細胞性粘菌分泌物を分離・抽出するために、吸着剤により吸着させることもできる。例えば、細胞性粘菌（またはその子実体）をイオン交換樹脂などの吸着剤（例えば、大腸菌の吸着に使用されるアンバーライトＸＡＤ−２）を含む緩衝液上にろ紙などのフィルター上で培養する。細胞性粘菌から分泌された物質はフィルターを通過することで細胞性粘菌から分離されて吸着剤に吸着する。吸着剤は疎水性物質を吸着するものが望ましい。吸着剤をエタノールなどの有機溶媒に加えて、溶媒抽出することで細胞性粘菌分泌物溶液が得られる。細胞性粘菌分泌物溶液を、さらに乾燥することで固形分として得ることもできる。なお、後述する実施例より、ネコブ線虫の細胞性粘菌分泌物に対する忌避性は細胞性粘菌分泌物の濃度依存性を示すことが判明しているので、得られた細胞性粘菌分泌物又はその溶液又は分散液を濃縮するか、濃縮した形で抽出することが望ましい。
【００２３】
＜ネコブ線虫を忌避させる方法＞
上記のようにして得られた細胞性粘菌分泌物またはその溶液を、農地など土壌や植物に適用することでネコブ線虫を忌避させることができる。農地は、サツマイモ、ジャガイモ、ピーマン、ナス、ダイコン、ハクサイ、サトイモ、ダイズ、イチゴ、トマト、スイカ、メロン、タマネギ、落花生、ニンジン、ゴボウ、ナガイモ、トウモロコシ、アスパラガス、ブドウなどを栽培する農地が挙げられるが、これらに限定されず、ネコブ線虫が存在するまたは存在するであろういかなるエリアでもよい。
【００２４】
農地などの土壌に適用するには、細胞性粘菌分泌物の溶液や分散液を噴霧したり、粉体として散布してもよく、任意の形態で散布することができる。噴霧や散布方法は任意の方法及び装置を用い得る。細胞性粘菌分泌物を粉体として散布する際、細胞性粘菌分泌物を担体に担持させてもよい。そのような担体は、細胞性粘菌をその分泌物から分離させるときに使用したろ紙やビーズであってもよく、あるいは農地などに散布する観点からゼオライトなどの土壌改質剤に担持させてもよい。或いは農薬や肥料に混合して農地などに散布してもよい。細胞性粘菌分泌物またはその溶液の使用量は、土壌中に生息するネコブ線虫を十分に忌避させる量であればよく、特に限定されず、例えば、土壌１リットル当たり、細胞性粘菌分泌物を１００〜５００ｍｇ使用することができる。あるいは、細胞性粘菌分泌物の溶液に植物の根を浸漬したり、根に溶液を散布することで直接、細胞性粘菌分泌物またはその溶液を植物に適用してもよい。細胞性粘菌分泌物は、自然界に存在している物質を分離抽出したものであるために、農作物を枯れさせたり生物を殺すことなく、ネコブ線虫を有効に忌避させることができる。
【００２５】
上記のようにして得られる細胞性粘菌分泌物をネコブ線虫の忌避剤の有効成分として用いることができる。忌避剤は細胞性粘菌分泌物単独でもよく、他の成分が添加されていてもよい。他の成分として、例えば、肥料、農薬、土壌改質剤、細胞性粘菌分泌物を担持する担体などが挙げられる。また、忌避剤には、製造の容易性や忌避効果という観点からすれば、細胞性粘菌自体が含まれていてもよい。但し、前述のようにネコブ線虫を忌避する有効成分を濃縮して使用する場合には、細胞性粘菌や脂質などが除去された細胞性粘菌分泌物だけを使用するのが望ましい。
【００２６】
以下、本発明の忌避剤の実施例を、以下の実験例１〜５を通じて具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００２７】
＜実験例１：細胞性粘菌によるネコブ線虫の忌避実験＞
表１に示す４種類の細胞性粘菌（D.discoideum，D.purpureum,D.mucoroides，P.violaceum）に対するキタネコブ線虫の忌避行動を調査するために以下のような実験を行った。４種類の細胞性粘菌はＮＢＲＰなどから入手し、キタネコブ線虫は本発明者の一人であるDerek Gotoが所属する北海道大学農学部Derek Goto研究室で培養したものを用いた。
【００２８】
細胞性粘菌は、大腸菌やクレブシエラを餌として寒天培地で増殖させ、対数増殖期に薬サジで回収して、リン酸バッファに懸濁させた後、餌を遠心処理によって洗浄・取り除いて飢餓処理を行った。
こうして前処理した細胞性粘菌を１．０×１０８ cells／ｃｍ２となるよう、フィタゲル(phytagel)を加えたシャーレ左側に発生させた。１．５時間後に(単細胞期)、図２（ａ）に示すように、シャーレ中央地点にキタネコブ線虫１０匹を播種した。顕微鏡(Nikon  AZ100  Multizoom  microscope)を用いてキタネコブ線虫の行動を観察した。
【００２９】
同様の実験を、細胞性粘菌をシャーレ左側に発生させた後、２４時間経過させて細胞性粘菌が子実体に形態変化したことを確認してから、シャーレ中央にキタネコブ線虫１０匹を播種して行った。
【００３０】
Controlとして、細胞性粘菌を含まないリン酸緩衝液を用いた。図１（ａ）は、細胞性粘菌が存在していない場合（Control）を、図１（ｂ）は多細胞期のD. discoideumが存在している場合、図１（ｃ）は多細胞期のD. purpureum が存在している場合、図１（ｄ）は多細胞期のD. mucoroides が存在している場合のキタネコブ線虫の挙動を示す顕微鏡写真である。なお、写真は、デジタルカメラ(Nikon DS-2MBWC camera head)を用いて画像を撮影した後、それらの画像を繋ぎ合せる画像処理を行ってシャーレ全域を表してある。図１（ａ）に示すようにControlではキタネコブ線虫の移動した跡がシャーレ全面、特にシャーレ中央から右側にも左側にも及んでいる。それゆえ、キタネコブ線虫は、通常、ランダムな行動を示すことが分かる。一方、図１（ｂ）に示すように、全てのキタネコブ線虫が、シャーレの左側のD. discoideumを避けるような忌避行動が観察された。また、図１（ｃ）に示すように、１または２匹のキタネコブ線虫だけがシャーレの左側のD. purpureumに向かうような行動が確認された。図１（ｄ）でも図１（ｃ）と同様の挙動が確認された。一方、細胞性粘菌として、P. violaceumを用いた場合には、図１（ａ）〜（ｃ）に示したような挙動は確認されず、Controlと同様の結果であった。表１に結果を示す。なお、表１中、キタネコブ線虫が細胞性粘菌を避けた度合いを以下の基準で表した。＋＋＋：１０匹のいずれのキタネコブ線虫も細胞性粘菌の方に向わなかった。＋＋：１〜２匹のキタネコブ線虫だけが細胞性粘菌の方に向かった。＋：３〜４匹のキタネコブ線虫が細胞性粘菌の方に向かった。−：キタネコブ線虫はランダムに動いた（シャーレ中央から左側にも右側にも同じ割合で動いた）。
【００３１】
【表１】
2015029872.tif 000003
【００３２】
なお、単細胞期の細胞性粘菌については、表１に示す通り、多細胞期の細胞性粘菌ほどではないが、D.discoideum，D.purpureum,D.mucoroidesについてキタネコブ線虫がそれらの細胞性粘菌をわずかながら避ける行動をとることが確認された。
【００３３】
＜実験例２：キタネコブ線虫の忌避行動の定量的解析＞
実験例１では、キタネコブ線虫が細胞性粘菌を忌避する行動を顕微鏡写真の画像処理により視覚的に追跡したが、この実験例ではキタネコブ線虫の行動を以下のようにして定量的に解析した。実験例１と同様にしてフィタゲルを加えたシャーレの左側に細胞性粘菌としてD. discoideumを１．０×１０８ cells／ｃｍ２の密度で発生させた。次いで、細胞性粘菌の端から右側１９ｍｍの地点にキタネコブ線虫を５匹播種した(図２（ａ）参照)。播種から２４時間経過後にキタネコブ線虫の行動を次のようにして解析した。図２（ｂ）に示すように、キタネコブ線虫の両側に領域１及び２を設定し、さらに領域２のキタネコブ線虫から離れる側に領域３を設定した。各領域のサイズは０．７５×１．７８ｃｍであり、領域１と領域２の間隔は０．５６ｃｍであった。各領域について顕微鏡用デジタルカメラ(Nikon DS-2MBWC camera head)を用いて２４時間に渡って画像を撮影した。撮影した画像を画像解析ソフトImageJを用い、各領域でどの程度、キタネコブ線虫が移動した跡があるかをドット数をカウントして数値化した。
【００３４】
画像解析により得られた結果を、図３に示す。図３中、左側はControl、右は細胞性粘菌の存在する試料の結果である。Controlでは領域１〜３で有意の差は見られなかったが、細胞性粘菌が存在する試料では、領域１の値が明らかに領域２及び３より低く、キタネコブ線虫がD. discoideumを忌避したことが定量的に確認することができる。なお、図の縦軸の相対量は、線虫が移動した移動軌跡（トラック）について、全ての領域の合計に対するそれぞれの領域の面積比で表したものである。
【００３５】
＜実験例３：細胞性粘菌分泌物によるキタネコブ線虫の忌避行動の確認＞
この例では、キタネコブ線虫の忌避行動を引き起こす原因について調査した。図４（ａ）に示すように、シャーレ内のフィタゲル培地の端に直径２ｃｍのろ紙を置き、ろ紙上に実験例１と同様にして前処理した単細胞の細胞性粘菌としてのD. discoideum を１．０×１０８ cellsで発生させた。４８時間後に、ろ紙を子実体の細胞性粘菌ごとシャーレから取り出して、細胞性粘菌をフィタゲル培地から除去した。次いで、図４（ｂ）に示すようにろ紙跡の右端から右側１２ｍｍの地点にキタネコブ線虫５匹を播種し、２４時間経過後に顕微鏡(Nikon AZ100 Multizoom microscope)を用いてキタネコブ線虫の行動を観察した。この観察では、実験例２と同様にしてキタネコブ線虫を播種したフィタゲル培地の両側に領域１及び領域２を設定し、それらの領域におけるキタネコブ線虫の行動を定量的に解析した。図４（ｃ）に示すように、領域１及び領域２におけるキタネコブ線虫の移動軌跡が観察され、キタネコブ線虫の領域１よりも領域２における軌跡が多いことから、ろ紙跡に存在する物質がキタネコブ線虫を忌避させたと考えられる。
【００３６】
実験例２と同様にして行った定量的解析の結果を、図５に示す。図５中、左側はControl、右は細胞性粘菌をろ紙ごと除去した試料の結果である。Controlではいずれの領域もほぼ同程度にキタネコブ線虫の行動が確認されたが、細胞性粘菌をろ紙ごと除去した試料では、領域１の数値が明らかに領域２より低く、キタネコブ線虫が試料中に存在するなんらかの物質を忌避したことを定量的に確認することができた。この実験結果より、キタネコブ線虫を忌避させているのは細胞性粘菌そのものや二酸化炭素などの物理的要因ではないことが分かる。また、細胞性粘菌は飢餓処理がされて４８時間経過しているので、キタネコブ線虫を忌避させているのは細胞性粘菌の餌であったバクテリアでもないことが分かる。それゆえ、キタネコブ線虫を忌避させているのは、細胞性粘菌から分泌（または放出）されている何らかの物質のうち、ろ紙を通過した物質であると考えられる。特に、細胞性粘菌を発生させて４８時間が経過していることからすれば、細胞性粘菌は多細胞体である子実体となっており、キタネコブ線虫を忌避させている物質は子実体から分泌された物質と考えられる。
【００３７】
＜実験例４：細胞性粘菌分泌物の忌避特性に対する濃度依存性＞
実験例３の結果より、キタネコブ線虫を忌避させているのは細胞性粘菌から分泌または放出された物質であることが明らかとなったので、その忌避特性に細胞性粘菌分泌物の濃度依存性があるかどうかについてこの実験例で調査した。
【００３８】
水洗したイオン交換樹脂ビーズ(Amberlite XAS-2)１．５ｇを金属製のトレイに入れ、リン酸緩衝液を注いだ後、ろ紙を載置した金網をリン酸緩衝液の液面上方に配置した(図６（ａ）)。ろ紙上に飢餓処理をした細胞性粘菌としてのD. discoideumを２．０×１０６cells/cm２を超えない密度で発生させ、２２℃で、ロータリシェーカー（ROTARY  SHAKER  NR-2(TAITEC  JAPAN)）で４０rpmで７２時間撹拌して培養した。ロータリシェーカーの撹拌により、リン酸緩衝液の液面が定期的に金網のろ紙に接触するようにした。この７２時間の間に細胞性粘菌は子実体に変化したことを目視で確認した。その後、トレイからビーズを回収し、水洗及び水切りした後、ビーズを９９．５％エタノール１０ｍｌに浸して、４℃にて２週間保存した。次いで、ビーズを浸したエタノールにさらに９９．５％エタノールを１０ｍｌ加え撹拌し、ビーズに付着した物質（疎水性物質）をエタノールで抽出した。その後、５０％エタノールを用いて遠心分離して上澄みを回収する作業を、５０％エタノールが透明になるまで繰り返した。回収した抽出液をナス型フラスコに移し、ロータリエバポレータで水を除去し、得られた固形物を４０％メタノールに溶解し、やや黄色みを帯びた透明な液体を粘菌抽出液とした。
【００３９】
この粘菌抽出液について、固形物を溶解した濃度が４．０ｍｇ／ｍｌ（試料１）、２．０ｍｇ／ｍｌ（試料２）及び０．４ｍｇ／ｍｌ（試料３）となるように３種類の溶液を用意した。これらの溶液をそれぞれろ紙に１００μｌ浸みこませ、クリーンベンチ内で１時間風乾させた。次に、図６（ｂ）に示すように、ろ紙をシャーレ内のフィタゲルに置き、ろ紙右端から右側１２ｍｍの地点にキタネコブ線虫を５匹播種した。２４時間後に、実験例２と同様にして顕微鏡を用いてキタネコブ線虫の行動を定量的に解析した。
【００４０】
実験例３と同様に、キタネコブ線虫の両側に領域１及び２を設定し、それらの領域におけるキタネコブ線虫の行動を顕微鏡で観察した。濃度が４．０ｍｇ／ｍｌの試料１００μｌ（試料０．４ｍｇ相当）をろ紙に浸みこませた場合の観察結果を図６（ｃ）に示す。図６（ｃ）より、キタネコブ線虫が領域１には殆ど侵入していないことが分かる。また、三種類の濃度の試料について領域１と領域２におけるキタネコブ線虫の行動を定量的に解析した結果を、図７（ａ）〜（ｃ）のグラフに示す。図７（ｃ）に示した試料３では、粘菌抽出液の濃度が低いために、領域１と領域２との間で明確な数値差は見られないが、図７（ｂ）では、領域２の方が領域１より明らかに高い数値を示しており、さらに図７（ａ）では、領域２の方が領域１より２倍以上高い数値を示している。よって、粘菌抽出液の濃度が高いほど、キタネコブキタネコブ線虫の忌避効果が顕著に表れることが分かった。
【００４１】
＜実験例５：細胞性粘菌分泌物の存在下における植物へのキタネコブ線虫の感染試験＞
この実験例では、実際の植物が線虫に感染される際に、細胞性粘菌分泌物がどのように作用するかを試験した。植物として、以下のようにして用意したマメ科に属するミヤコグサを用いた。予め保水及び滅菌を行ったミヤコグサ種子の外皮を取り除き、Ｃａ、Ｐ、クエン酸鉄、ＫＮＯ３から調製した培地上に５ｍｍ以上の間隔をあけて種子を並べ、２２℃で保存した。２日後に、発芽したミヤコグサを新たな培地上に移し代えた。３本のミヤコグサ（試料No．１〜３）を図８に示すように１つのプレート上に３５ｍｍの間隔を隔てて並列して感染実験用プレートとした。
【００４２】
実験例４で得られた濃度４．０ｍｇ／ｍｌの粘菌抽出液を、半径１ｃｍのろ紙を半分に切ったろ紙片に１００μｌ浸みこませ、クリーンベンチ内で１時間風乾させた。ろ紙を図８に示すように、感染実験用プレート上のミヤコグサのうち、最も左側に生育しているミヤコグサ（試料No．１）の根から２ｍｍの地点に置いた。それぞれのミヤコグサの根の先端から１０ｍｍ離れた地点に、線虫を約５０匹播種し、４８時間２３℃で培養した。ミヤコグサの根を水で軽く洗浄し、２５%アンチホルミンに３分間浸した。根を水でよく洗浄し、酸性フクシンストックを加えた６ wellプレートのwellに入れた後、１００℃の恒温槽で５分間加熱を行った。その後、室温で１０分間放熱し、酸添加グリセリンを一面に広げたシャーレの中に浸し、９５℃で３０分間加熱した。染色したキタネコブ線虫を試料No．１〜３の根ごとカバーガラスで押しつぶし、目視によって感染線虫数を数えた。図１０に３本のミヤコグサの根中のキタネコブ線虫による感染状態を拡大写真で示す。図１０の試料No.１〜３において、複数の細長線状のものがキタネコブ線虫であり、黒い楕円及び円状のものは気泡である。
【００４３】
また、試料No．１〜３のミヤコグサ根中のキタネコブ線虫による感染数を図９のグラフに示す。Controlでは、粘菌抽出液が存在していないが、試料No．２の数値が有意に高くなっている。これは、３本のミヤコグサのうち試料No．２が中間に位置するために試料No．２には試料１及び３に比べて試料直下に存在するキタネコブ線虫以外のキタネコブ線虫がアクセスし易くなるからであると考えられる。一方、粘菌抽出液が存在している場合には、試料No．１中のキタネコブ線虫の数が著しく低下している。このことからキタネコブ線虫が粘菌抽出液に近いミヤコグサの根に侵入することを忌避したことが分かる。この実験例の結果からすれば、細胞性粘菌分泌物又はそれを含む液体を土壌などに散布することで、そこに存在するまたは侵入しようとするキタネコブ線虫を忌避させることができる。
【００４４】
＜実験例６：別の抽出方法で抽出した細胞性粘菌分泌物の忌避特性＞
２５ｃｍ×２５ｃｍのシャーレ３０枚に、実験例１と同様にして細胞性粘菌を載置し、１週間経過させて完全に子実体に変化させた。子実体を回収し、１００％エタノール１０ｍｌを入れた容器に加え、４℃で１０日保管した。この後、この容器に、総量が２００ｍｌになるようにエタノールを加え、ろ紙で子実体を分離してロータリエバポレータで乾固した。乾固した子実体を４０％メタノール５０ｍｌに加えて懸濁させた後、再びろ紙で濾過し、ロータリエバポレータで乾固した。次いで、乾固した抽出物を、最終濃度８０ｍｇ／ｍｌになるように４０％メタノールに溶解した。こうして黄色みを帯びた透明な液体（粘菌抽出液）を得た。
【００４５】
得られた粘菌抽出液を用いて、実験例５と同様にして、ミヤコグサへのキタネコブ線虫の感染試験を行った。すなわち、予め保水および滅菌したミヤコグサ種子の外皮を取り除き、Ｃａ、Ｐ、クエン酸鉄、ＫＮＯ３から調製した培地上に５ｍｍ以上の間隔を隔てて種子を並べ、２２℃で保存した。２日後に、発芽したミヤコグサを新たな培地上に移し代えた。３本のミヤコグサ(試験No.１〜３)を図８に示すように１つのプレート上に３５ｍｍの間隔を隔てて並列して感染実験用プレートとした。
【００４６】
この実験例で得られた濃度８０ｍｇ／ｍｌの粘菌抽出液を、半径１ｃｍのろ紙を半分に切ったろ紙片に１００μｌ浸みこませ、クリーンベンチ内で１時間風乾させた。ろ紙を図８に示すように、感染実験用プレート上のミヤコグサのうち、左側に生育しているミヤコグサ（試料No．１）の根から２ｍｍ左側に離れた地点に置いた。それぞれのミヤコグサの根の先端から１０ｍｍ下方に離れた地点に、線虫を約５０匹播種し、４８時間２３℃で培養した。次いで、ミヤコグサの根を水で軽く洗浄し、２５％アンチホルミンに３分間浸した。根を水でよく洗浄し、酸性フクシンストックを加えた６ wellプレートのwellに入れた後、１００℃の恒温槽で５分間加熱を行った。その後、室温で１０分間放熱し、酸添加グリセリンを一面に広げたシャーレの中に浸し、９５℃で２０分間加熱した。染色したキタネコブ線虫を試料No．１〜３の根ごとカバーガラスで押しつぶし、目視によって線虫数を数えた。
【００４７】
試料No．１〜３のミヤコグサ根中のキタネコブ線虫による感染数を図１５のグラフに示す。Controlでは、粘菌抽出液が存在していないが、試料No．２の数値が有意に高くなっている。これは、３本のミヤコグサのうち試料No．２が中間に位置するために試料No．２には試料１及び３に比べて試料直下に存在するキタネコブ線虫以外のキタネコブ線虫がアクセスし易くなるからであると考えられる。一方、粘菌抽出液が存在している場合には、試料No．１中のキタネコブ線虫の数が著しく少ない。このことからキタネコブ線虫が粘菌抽出液に近いミヤコグサの根に侵入することを忌避したことが分かる。さらに、注目すべきは、試料No．３のキタネコブ線虫の数が試料No．２のキタネコブ線虫の数よりも多くなっていることである。図９に示した実験例５の結果（試料No．３のキタネコブ線虫の数が試料No．２のキタネコブ線虫の数よりも少ない）と比べると、本実験例で調製した粘菌抽出液を使用すると、キタネコブ線虫をより一層ミヤコグサから忌避させることができることが分かる。
【００４８】
本発明者は、この粘菌抽出液によるキタネコブ線虫の著しい忌避効果について以下のように考えている。実験例５では、細胞性粘菌の子実体から発生した物質をろ紙を通過させてビーズで回収したが、この実験例では細胞性粘菌の子実体から発生した物質をメタノール中に直接抽出して回収している。特に、キタネコブ線虫の忌避物質は、細胞性粘菌の子実体の基盤（basal disc）の部分よりも柄または胞子の部分に多く含まれていると考えられる。このようなことからすれば、子実体をメタノールに浸漬してその柄や胞子などから忌避物質を直接回収した方が、ろ紙を通して回収するよりも高い収率で忌避物質を回収することができると考えられる。さらに、本発明者は子実体の基盤にはミヤコグサの根の成長を阻害する成長阻害物質（現時点では同定していない）が含まれていると推測しており、実験例５では子実体の基盤がろ紙に付着していたために、成長阻害物質が比較的高い割合でろ紙を通過することができたと考えている。これに対して、この実験例では成長阻害物質もキタネコブ線虫の忌避物質のいずれもがメタノールで直接抽出されており、そのうち、忌避物質の成長阻害物質に対する抽出割合が実験例５の場合よりも高くなっていると考えられる。
【００４９】
以上のことより、キタネコブ線虫の忌避物質を細胞性粘菌から製造するには、メタノールのような有機溶媒中に細胞性粘菌の子実体を直接浸漬させて抽出・精製するのが有効であることが分かる。なお、この実験例で有機溶媒としてメタノールを用いたが、エタノール、イソプロパノール、クロロホルム、酢酸エチルなどの他の有機溶媒でも構わない。
【００５０】
＜実験例７：他の細胞性粘菌の忌避特性の有無の観察＞
上記実験例で使用した細胞性粘菌以外の細胞性粘菌として、Ｄ属に属するＤ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｕｍ、Ｄ．ｍｏｎｏｃｈａｓｉｏｉｄｅｓ、Ｄ．ｌａｃｔｅｕｍ、Ｄ．ｇｉｇａｎｔｅｕｍについてキタネコブ線虫の忌避特性について観察した。また、Ｐ属に属するＰ．ｐａｌｌｉｄｕｍ及びＰ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ（実験例１で用いたもの）、Ａ属に属するＡ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｍについてもキタネコブ線虫の忌避特性について観察した。
【００５１】
それらの７種類の細胞性粘菌について、実験例１と同様にして、それぞれ、シャーレ左側に発生させた後、２４時間経過させて細胞性粘菌が子実体に形態変化したことを確認してから、シャーレ中央にキタネコブ線虫１０匹を播種し、キタネコブ線虫の軌跡を観察した。観察結果は実験例２と同様にして顕微鏡用デジタルカメラを用いて２４時間に渡って画像を撮影した。なお、Controlとして、細胞性粘菌を含まないリン酸緩衝液を用いた。Ｄ属のD.fasciculatum、D.monochasioides、D.lacteum及びD.giganteumについて撮影した画像を図１１（ａ）〜（ｄ）にそれぞれ示す。いずれも、細胞性粘菌から離れた領域（図面右側）により多くのキタネコブ線虫の移動軌跡が見られることから、キタネコブ線虫はそれらのＤ属の細胞性粘菌を忌避したことが分かる。
【００５２】
一方、図１２（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｐ属に属するP.pallidum及びP.violaceumのうち、P.pallidumに対してはキタネコブ線虫は忌避行動を示していたが、P.violaceumに対しては実験例１と同様に忌避行動を示さなかった。また、図１３に示すように、Ａ属に属するA.subglobosumに対してはキタネコブ線虫は、図１４に示すControlと同様に忌避行動を示さなかった。
【００５３】
以上の結果からすれば、細胞性粘菌のうち特にＤ属に属する細胞性粘菌は、キタネコブ線虫を忌避させるのに有効であることが分かる。
【００５４】
以上、本発明を実施例により具体的に説明してきたが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲に記載の技術的思想の範囲内で種々の改変・改良・代替され得るもの及び方法も包含する。上記実施例の実験例２〜６では、細胞性粘菌としてD.discoideumの子実体を用いたが、実験例１及び７の結果からすればD.discoideum以外のＤ属に属する細胞性粘菌分泌物についても、ネコブ線虫の忌避剤の有効成分となることが分かろう。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の細胞性粘菌分泌物は、自然界にもともと存在している細胞性粘菌から分離抽出したものであるために、農作物や生物に被害を与えることなくネコブ線虫を有効に忌避させることができる。本発明は、農作物や作業者の安全性を維持しつつ、全世界の農業分野における生産性を高めることができるため、農業分野における著しい国際貢献が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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