(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することを含む人工多能性幹細胞から神経細胞系統への分化誘導方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ神経細胞のマーカーを少なくとも１つ発現する前記の分化誘導方法。
【請求項２】
前記の同じ神経細胞のマーカーが、ネスチン、ミエリン塩基性蛋白、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、及びニューロフィラメントからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経細胞を含む構造物がシート状構造物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
神経細胞を含む構造物が生体組織、または臓器の切片をコーティングした培養基材である、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
神経細胞が、脳又は脊髄である、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
神経細胞を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することを含む、神経細胞系統へと分化誘導された細胞の製造方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ神経細胞のマーカーを少なくとも１つ発現する前記の製造方法。
【請求項７】
前記の同じ神経細胞のマーカーが、ネスチン、ミエリン塩基性蛋白、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、及びニューロフィラメントからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
神経細胞を含む構造物がシート状構造物である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
神経細胞を含む構造物が生体組織、または臓器の切片をコーティングした培養基材である、請求項６から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
神経細胞が、脳又は脊髄である、請求項６から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
神経細胞を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することによって人工多能性幹細胞を神経細胞系統へと分化誘導し、分化誘導効率が高い人工多能性幹細胞を選別することを含む人工多能性幹細胞の選別方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ神経細胞のマーカーを少なくとも１つ発現する前記の選別方法。
【請求項１２】
前記の同じ神経細胞のマーカーが、ネスチン、ミエリン塩基性蛋白、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、及びニューロフィラメントからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
神経細胞を含む構造物がシート状構造物である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
神経細胞を含む構造物が生体組織、または臓器の切片をコーティングした培養基材である、請求項１１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、脳又は脊髄である、請求項１１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
神経細胞を含む構造物を少なくとも含む、人工多能性幹細胞の選別のためのキット。
【請求項１７】
神経細胞を含む構造物がシート状構造物である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
神経細胞を含む構造物が生体組織、または臓器の切片をコーティングした培養基材である、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
神経細胞が、脳又は脊髄である、請求項１６から１８の何れか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞の分化誘導方法、人工多能性幹細胞の選別方法、並びに人工多能性幹細胞の選別キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は再生医療において重要な役割を担う。分化万能性を有する幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）、核移植ES細胞、体細胞由来ES細胞（ntES細胞）及び人工多能性幹細胞（iPS細胞）が知られており、 分化多能性を有する幹細胞としては、体性幹細胞、組織幹細胞及び成体幹細胞が知られている。上記の中でも、人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、分化万能性を有し、体細胞から人工的に作製される細胞であることから胚や卵子の破壊に伴う倫理上の問題がなく、移植の際の適合性の問題もないことから、再生医療への応用が期待されている。【０００３】
人工多能性幹細胞（iPS細胞）を所望の細胞に分化誘導する方法は、各種方法が報告されており、例えば、膵細胞、肝細胞、心筋細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞などへの分化誘導が報告されている。しかし、人工多能性幹細胞（iPS細胞）を用いた再生医療を実用化するにあたっては、高効率に目的の機能を有する細胞に分化誘導する方法を確立することが必要である。【０００４】
特許文献１には、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって、幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養することを含み、その際、該分化した幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が記載されている。特許文献１で使用されている幹細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であり、人工多能性幹細胞（iPS細胞）に関する記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５２０５１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
人工多能性幹細胞（iPS細胞）を用いた再生医療を実用化する際における課題として、未分化状態のiPS細胞を、目的の機能を有する細胞に高効率に分化誘導する技術を確立することが挙げられる。また、別の課題としては、iPS細胞の品質の評価・管理する方法を確立することが挙げられる。即ち、本発明は、iPS細胞を目的の機能を有する細胞に高効率に分化誘導する方法、並びに作製したiPS細胞の中から目的とする細胞への分化誘導効率が高いiPS細胞を選別する方法を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記方法で使用するためのiPS細胞選別キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行い、再生を目指す組織・臓器の凍結切片上でiPS細胞を培養することにより目的とする細胞への分化誘導を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すわなち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することを含む人工多能性幹細胞の分化誘導方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ細胞型である前記の分化誘導方法。
（２）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物がシート状構造物である、（１）に記載の方法。
（３）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物が生体組織、臓器の切片または細胞に由来する成分をコーティングした培養基材である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  細胞が、肝臓、脳又は脊髄である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。【０００９】
（５）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することを含む、分化誘導された細胞の製造方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ細胞型である前記の製造方法。
（６）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物がシート状構造物である、（５）に記載の方法。
（７）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物が生体組織、臓器の切片または細胞に由来する成分をコーティングした培養基材である、（６）又は（７）に記載の方法。
（８）  細胞が、肝臓、脳又は脊髄である、（５）から（７）の何れかに記載の方法。【００１０】
（９）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することによって人工多能性幹細胞を分化誘導し、分化誘導効率が高い人工多能性幹細胞を選別することを含む人工多能性幹細胞の選別方法であって、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ細胞型である前記の選別方法。
（１０）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物がシート状構造物である、（９）に記載の方法。
（１１）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物が生体組織、臓器の切片または細胞に由来する成分をコーティングした培養基材である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）  細胞が、肝臓、脳又は脊髄である、（９）から（１１）の何れかに記載の方法。【００１１】
（１３）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物を少なくとも含む、人工多能性幹細胞の選別のためのキット。
（１４）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物がシート状構造物である、（１３）に記載のキット。
（１５）  細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物が生体組織、臓器の切片または細胞に由来する成分をコーティングした培養基材である、（１３）又は（１４）に記載のキット。
（１６）  細胞が、肝臓、脳又は脊髄である、（１３）から（１５）の何れかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、iPS細胞を目的の機能を有する細胞に高効率に分化誘導することが可能である。さらに本発明の方法によれば、作製したiPS細胞の中から目的とする細胞への分化誘導効率が高いiPS細胞を選別することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、カバーグラス上（対照）、正常肝臓切片上、又は肝炎肝臓切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養２日目と培養８日目）を示す。
【図２】図２は、カバーグラス上（対照）又は正常肝臓切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養３日目と９日目）を示す。
【図３】図３は、脳切片上又は脊髄切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養３日目と９日目）を示す。
【図４】図４は、肝細胞の関連遺伝子（ＡＦＰ、ＡＡＴ、ＡＬＢ）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を図４に示す。
【図５】図５は、神経細胞の関連遺伝子（Nestin、ＭＢＰ、CNPase、及びGFAP）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を示す。
【図６】図６は、ＡＦＰの発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す。
【図７】図７は、有核細胞におけるＡＦＰ陽性細胞の割合を計測した結果を示す。
【図８】図８は、ＡＡＴの発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す。
【図９】図９は、有核細胞におけるＡＡＴ陽性細胞の割合を計測した結果を示す。
【図１０】図１０は、ＧＦＡＰの発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す。
【図１１】図１１は、有核細胞におけるＧＦＡＰ陽性細胞の割合を計測した結果を示す。
【図１２】図１２は、ＣＮＰａｓｅの発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す。
【図１３】図１３は、ＣＮＰａｓｅの発現を免疫細胞化学的に分析した結果を示す。
【図１４】図１４は、有核細胞におけるＣＮＰａｓｅ陽性細胞の割合を計測した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）人工多能性幹細胞の分化誘導方、並びに分化誘導された細胞の製造方法
本発明は、細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することを含む人工多能性幹細胞の分化誘導方法又は分化誘導された細胞の製造方法に関し、特に、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ細胞型である。なお、構造物中の細胞と分化誘導された細胞とが同じ細胞型であるかどうかは、例えば、発現するマーカーが同じであることにより判断することができる。
【００１５】
肝細胞の細胞マーカーとしては、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、アルブミン（ＡＬＢ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)、トリプトファン2,3ジオキシゲナーゼ(TDO2)、及びシトクロムP450などが挙げられるが、特に限定されない。
神経細胞のマーカーとしては、ネスチンNestin）、ミエリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（CNPase）、グリア細胞線維性酸性タンパク質（GFAP）、及びニューロフィラメント（Neurofilament）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００１６】
骨芽細胞のマーカーとしては、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオポンチン、及びオステオカルシンなどが挙げられるが、特に限定されない。
膵臓細胞のマーカーとしては、Pdx1、アミラーゼ、及びカルボキシペプチターゼなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００１７】
軟骨細胞のマーカーとしては、Sox9、II型コラーゲン、及びアグリカンなどが挙げられるが、特に限定されない。
心筋細胞のマーカーとしては、心筋型トロポニンI（cardiac troponin I：cTnI）、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）、α心筋アクチン（α−cardiac actin）、及びホメオボックスプロテインNkx-2.5などが挙げられるが、特に限定されない。
【００１８】
本発明で用いる「細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物」の形態は特に限定されないが、当該構造物上で人工多能性幹細胞（iPS細胞）を培養することを鑑みると、シート状構造物であることが好ましい。細胞及び／又は細胞に由来する成分を含むシート状構造物の一例としては、生体組織、臓器の切片または細胞に由来する成分をコーティングした培養基材を使用することができる。細胞を含むシート状構造物（好ましくは、生体組織又は臓器の切片）の厚さは特に限定されないが、一般的には１〜１００μｍ程度であり、好ましくは２〜５０μｍ程度であり、より好ましくは２〜２０μｍ程度である。
細胞に由来する成分を含む構造物は、細胞に由来する成分と相互作用を有する核酸、マイクロＲＮＡ、抗体または化合物を用いて細胞に由来する成分を精製し、精製した細胞に由来する成分を培養基材上に付着させ、酵素や界面活性剤等を用いてコーティングさせることで得ることができる。また、コーティングした培養基材をさらに乾燥させることで、長期に保存可能な培養基材を提供できる。
本発明で用いる「培養基材」の形態は特に限定されないが、フィルム、プレートまたはカバーガラスであることが好ましい。
【００１９】
組織又は臓器の切片は、好ましくは哺乳動物（好ましくは、マウス又はヒトなど）から採取することができる。生体組織又は臓器の切片を使用する場合、組織又は臓器の種類は特に限定されず、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から分化誘導する分化細胞の細胞型と同じ細胞型の細胞を含む組織又は臓器の切片を使用すればよい。組織又は臓器の例としては、肝臓、脳、脊髄、心臓、呼吸器、生殖器官、腎臓、膵臓、皮膚、筋肉及び骨格器官などを挙げることができるが、特に限定されない。例えば、iPS細胞から肝細胞に分化誘導することを意図する場合には、肝臓切片を使用すればよく、iPS細胞から神経細胞に分化誘導することを意図する場合には、神経細胞を含む切片（例えば、脳切片又は脊髄切片など）を使用すればよい。
【００２０】
細胞に由来する成分としては、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡなど）又はタンパク質などを挙げられ、特に上記細胞に特異的に発現されているような核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、特にマイクロＲＮＡ）又はタンパク質が好ましい。
【００２１】
本発明の方法では、人工多能性幹細胞は、特定細胞系統へ、好ましくは、肝臓、神経、肺、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、骨格、血管、造血、心筋、骨格筋などの細胞系統へ分化誘導される。
【００２２】
人工多能性幹細胞は、マウス繊維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより初めて樹立されｉＰＳ細胞と命名された（Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676）。その後、同様の４因子を用いてヒトｉＰＳも樹立されている（Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131:861-872.）。さらにｃ−Ｍｙｃを含まない３因子を用いる方法（Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106）も報告されている。また、ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＮＡＮＯＧ，ＬＩＮ２８の４遺伝子をヒト繊維芽細胞に導入して人工多能性幹細胞を樹立することも報告されている（Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.）。また、皮膚細胞にＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔの６遺伝子を導入して人工多能性幹細胞を樹立すること（Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146）、体細胞ではなく出生後の組織に存在する未分化幹細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ等を導入することで人工多能性幹細胞を樹立すること（特開２００８−３０７００７）も報告されている。
【００２３】
上記の通り、人工多能性幹細胞（iPS細胞）とは、体細胞又は未分化な幹細胞を初期化することにより誘導された多分化能及び自己増殖能を有する細胞である。体細胞の由来は限定されず、胚由来、胎児由来、又は成体由来の何れでもよい。体細胞が由来する動物種も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、ヒト又はマウスなどがさらに好ましい。体細胞としては、例えば、繊維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、血液細胞などが挙げられるが、特に限定されない。本発明で使用する人工多能性幹細胞の製造方法は特に限定されず、導入因子や導入方法等も特に限定されない。人工多能性幹細胞に関する公知の文献としては、上記以外にも、特開２００８−２８３９７２、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２等を挙げることができる。
【００２４】
本発明においては、常法に従いフィーダー細胞上においてiPS細胞を培養後に、フィーダー細胞を剥離してiPS細胞を回収し、適当な培地（例えば、ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）など）に懸濁する。次いで、細胞を含む構造物（好ましくは、生体組織又は臓器の切片）を載せたカルチャーカバーグラスを設置し、ここにiPS細胞の懸濁液を播種すればよい。播種後静置することで、浮遊しているiPS細胞を含む構造物へ付着させ、その後、適当な培地（5%FBSを含むDMEMなど）を加え、常法に従って培養を行えばよい。
【００２５】
細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養する際の条件は、人工多能性幹細胞の分化を誘導できる限り、特に限定はない。培地としては、例えば、ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、又は霊長類ES細胞用培地（株式会社リプロセル）などを使用することができる。人工多能性幹細胞の分化を誘導するための各種の増殖因子、サイトカイン又は分化誘導因子などを添加して培養してもよいが、本発明においては細胞を含む構造物上で培養を行うことにより、上記した増殖因子や分化誘導因子を添加しなくても分化誘導を達成することができる。人工多能性幹細胞の分化を誘導するための各種の増殖因子、サイトカイン又は分化誘導因子の例としては、アクチンビン、bFGF、ノギン、ニコチンアミド、レチノイン酸、EGF、グルココルチコイドなどを挙げることができるが特に限定はされない。
【００２６】
（２）人工多能性幹細胞の選別方法
本発明によれば、細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することによって人工多能性幹細胞を分化誘導し、分化誘導効率が高い人工多能性幹細胞を選別することができる。上記した通り、人工多能性幹細胞は現在、様々な方法で作成されている。作成された人工多能性幹細胞は、所望の細胞へと分化誘導され、再生医療などに適用されることが期待されている。しかしながら、作成された人工多能性幹細胞の中には、所望の細胞への分化誘導効率が高い細胞と、所望の細胞への分化誘導効率が低い細胞とが混在しているのが普通である。作成した人工多能性幹細胞の中から所望の細胞への分化誘導効率が高い細胞を選別することが望まれていた。
【００２７】
本発明によれば、細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物上で人工多能性幹細胞を培養することによって人工多能性幹細胞を分化誘導し、所望の細胞への分化誘導効率が高い人工多能性幹細胞を選別することができる。このようにして選別された分化誘導効率が高い人工多能性幹細胞をストックとして保管しておき、再生医療の現場において必要時に分化誘導して使用することができる。
【００２８】
また、生体組織又は臓器の切片などの細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物は、人工多能性幹細胞の選別のためのキットとして提供することができる。上記キットには、細胞及び／又は細胞に由来する成分を含む構造物以外にも、人工多能性幹細胞を培養するための培地、細胞を含む構造物を設置するためのカバーグラスなどを適宜含めてもよい。
【００２９】
以下の実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
（１）凍結切片の作製
雄性、６週齢のICRマウスから正常な肝臓、脳および脊髄を摘出した。また、1 ml/kgの四塩化炭素をオリーブ油に1:4の割合で混和したものを腹腔内投与することにより人工的に薬剤性肝炎を発症させたICRマウスから、四塩化炭素投与後1、2、3、5日目に肝炎肝臓を摘出した。
それぞれの臓器をOCTコンパウンドであるTissue-TekR（Sakura Finethechnical）に、包埋、マウントした後、液体窒素に浸漬し凍結切片作成用ブロックを作製した。これらのブロックから、それぞれ厚さ6 μmの凍結切片を作成し、円形のカルチャーカバーグラス（ポリLリジンコートタイプ、松浪ガラス）に載せた。乾燥後、リン酸緩衝液（Phosphate Buffered Saline:以下PBSと略記する、pH 7.4）にて２回洗浄し、OCTコンパウンドを洗い流した後、iPS細胞の培養に用いた。【００３１】
（２）iPS細胞の培養および分化誘導
常法に従いiPS細胞を培養後、iPS/ ES細胞剥離液(CTK solution,株式会社リプロセル)を用いてフィーダー細胞を剥離し、PBSにて洗浄後、iPS細胞を回収し、5%ウシ胎児血清（以下FBSと略記する、Biological Industries）を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下DMEMと略記する、SIGMA）に懸濁した。35 mm径のディッシュ（ノンコートタイプ、松浪ガラス）に前述の凍結切片を載せた円形カルチャーカバーグラスを設置し、ここにiPS細胞の懸濁液を播種した。播種後1日間静置することで、浮遊しているiPS細胞を凍結切片へ付着させ、その後5%FBSを含むDMEMを2ml加え培養を行った。その後は3日に1度培地交換を行い、計9日間培養した。【００３２】
カバーグラス上（対照）、正常肝臓切片上、又は肝炎肝臓切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養２日目と培養８日目）を図１に示す。対照、正常肝臓、肝炎肝臓のいずれも播種したiPS細胞のコロニーが拡がりがり細胞がばらけていくことが認められた。また細胞の形態の変化も認められ、対照では培養２日目と比較すると８日目では拡がったiPS細胞が、矢印で示すように様々な形態を呈し統一性は認められなかった。一方、正常肝臓、肝炎肝臓では拡がった細胞は矢印で示すような比較的大型で多角形の形態を呈する傾向が認められた。
また、カバーグラス上（対照）又は正常肝臓切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養３日目と９日目）を図２に示し、脳切片上又は脊髄切片上で培養したiPS細胞の顕微鏡像（培養３日目と９日目）を図３に示す。【００３３】
（３）遺伝子発現の確認
iPS細胞の肝細胞あるいは神経細胞への分化状態を確認するため、神経細胞および肝細胞の各種分化マーカーのmRNA発現について、半定量的Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction法（以下RT-PCR法と略する）を用いて、検討を行った。肝臓、脳、脊髄の凍結切片上で培養を行ったiPS細より、TRIzol reagent（Invitrogen Corp.、Carlsbad、 CA、USA）を用いてtotal RNAを回収した。得られたtotal RNA １μgを室温で100 units/ml デオキシリボヌクレアーゼI（以下DNase Iと略す）で処理した後、1 mlの25 mM EDTAを添加し、65℃、５分間処理し、DNase Iを失活させた。ランダムヘキサマープライマー（Invitrogen）を加え、逆転写酵素SUPERSCRIPT III Preamplification System（Invitrogen）を用いて５０℃、５０分の条件で逆転写反応を行った。さらに３７℃、２０分間リボヌクレアーゼHで処理しcDNA を得た。ヒトの各遺伝子に特異的なプライマーおよびPCR MasterMix Kit（Thermo、Rockford、USA）を用いて、PCRを行い各遺伝子のmRNA発現について検討した。検討した分化マーカー、プライマーおよびPCRの条件を表１に示す。PCR産物は２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色後、UV撮影装置FAS-III（東洋紡績、大阪）を用いて可視化した。【００３４】
肝細胞の関連遺伝子（ＡＦＰ、ＡＡＴ、ＡＬＢ）の発現を調べた結果を図４に示す。
AFPの発現は対照群、正常肝臓群、肝炎肝臓群で認められたが、対照群と比較すると肝炎肝臓群で発現が強い傾向がみられ、正常肝臓群ではさらにその発現が増強されていた。AATの発現も対照群、正常肝臓群、肝炎肝臓群で認められたが、対照群と比較すると正常肝臓群で発現が強く認められた。一方、ALBの発現は対照群においては、その発現は認められなかったのに対し、正常肝臓群、肝炎肝臓群では発現が確認され、肝炎肝臓群と比較し正常肝臓群でより強い発現を認めた。この結果から正常肝臓、肝炎肝臓の凍結切片上で培養することによりiPS細胞の固有肝細胞への分化が誘導されていることが確かめられた。
同様に、神経細胞の関連遺伝子（Nestin、ＭＢＰ、CNPase、及びGFAP）の発現を調べた結果を図５に示す。【００３５】
【表１】
0006611170.tif 000002
【００３６】
GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
AFP：α-フェトプロテイン
AAT：α１-アンチトリプシン
ALB：アルブミン
MBP：ミエリン塩基性蛋白
CNPase：2', 3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ
GFAP：グリア繊維性酸性タンパク質
NES：ネスチン【００３７】
（４）タンパク質発現の確認
各種凍結切片上で培養したiPS細胞をPBSにて洗浄した後、凍結切片ごと、２% パラホルムアルデヒドにて、室温で６０分間固定を行った。PBSにて洗浄後、１％Triton-Xにて１５分間処理し、１０％正常ウサギ血清または正常ヤギ血清にて室温、１０分間ブロッキングを行った。その後、ウサギ抗ヒトα-フェトプロテイン抗体（Abcam、５００倍希釈）またはヤギ抗ヒトα１-アンチトリプシン抗体（Abcam、３００倍希釈）を４℃、一晩反応させた。PBSにて洗浄後、二次抗体としてFITC-conjugated anti-rabbit IgGまたはFITC-conjugated anti-goat IgGを室温で１時間反応させた。PBSにて洗浄後、核をDAPIにて染色し、蛍光顕微鏡にて観察した（図６及び図８）。図６では、対照群ではAFP陽性細胞はほとんど認められなかったが、正常肝臓群、肝炎肝臓群でAFP陽性細胞が多く認められた。図８では、AFPの場合と同様に対照群と比較し正常肝臓群および肝炎肝臓群でAAT陽性細胞が多く認められた。α-フェトプロテインおよびα１-アンチトリプシンを発現しているiPS細胞の数を計測、有核細胞に占める割合を算出することにより（図７及び図９）、分化誘導効率を検討した。図７に示す通り、対照群に比較して正常肝臓群及び肝炎肝臓１日目の群で、AFP陽性細胞の割合が有意に多く認められた。また、図９に示す通り、対照群に比較して、正常肝臓群、肝炎肝臓１，２，５日目の群でAAT陽性細胞の割合が有意に多く認められた。【００３８】
また、一次抗体として、抗ヒトGFAP抗体又は抗CNPase抗体を使用して、タンパク質発現を蛍光顕微鏡にて観察した。各種凍結切片上で培養したiPS細胞を、2％パラホルムアルデヒドにて１時間固定し、 PBSで2回洗浄した後、0.1% BSA含有PBSにて希釈した1% TRITON X-100 (ICN Biomedical)にて15分処理した。PBSで2回洗浄後、10%ヤギ正常血清にて1時間ブロッキングした。PBSで2回洗浄後、1% BSA含有PBSにて希釈した一次抗体にて４℃で一晩反応させた。一次抗体としては、Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody (SIGMA、８０倍希釈）又はRabbit anti-CNPase antibody (Abcam、１００倍希釈）を使用した。PBSで3回洗浄後、1% BSA含有PBSにて希釈した二次抗体にて１時間反応させた。二次抗体としては、GFAPについては、Goat anti-rabbit IgG FITC (Wako、４０倍希釈)を使用し、CNPaseについては、Goat anti-rabbit IgG Alexa（Invitergen、１００倍希釈）を使用した。 PBSで2回洗浄後、DAPIにて30分染色した。PBSで2回洗浄し、VECTASHIELD にて封入し、蛍光顕微鏡にて観察した。【００３９】
一次抗体として、抗ヒトGFAP抗体を使用してタンパク質発現を蛍光顕微鏡にて観察した結果を図１０に示す。GFAPを発現しているiPS細胞の数を計測、有核細胞に占める割合を算出することにより（図１１）、分化誘導効率を検討した。
一次抗体として、抗CNPase抗体を使用してタンパク質発現を蛍光顕微鏡にて観察した結果を図１２及び図１３に示す。CNPaseを発現しているiPS細胞の数を計測、有核細胞に占める割合を算出することにより（図１４）、分化誘導効率を検討した。【００４０】
カバーグラス上（対照）、正常肝臓切片上、又は肝炎肝臓切片上でiPS細胞を培養した場合について、細胞形態及び遺伝子（ＡＦＰ、ＡＡＴ、ＡＬＢ）発現の結果を表２に示し、タンパク質（ＡＦＰ、ＡＡＴ）発現の結果を表３に示す。また、ＧＦＡＰとＣＮＰａｓｅの遺伝子及びタンパク質発現の結果を表４に示す。【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【００４４】
上記した結果から、本発明の方法により、ｉＰＳ細胞から肝細胞及び神経細胞への分化誘導が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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