(57)【要約】  安定的、持続的、かつ大量にグリチルリチンを提供するため、グリチルリチンの生合成系に関与する酵素、当該酵素遺伝子及びそれらの利用方法を提供することである。  オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸をさらに転移する活性を有するグルクロン酸転移酵素を同定し、当該酵素、その遺伝子及びそれらの利用方法を提供する。
2014163174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドが、β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソグリチルレチン酸モノグルクロニド、及びグリチルレチン酸モノグルクロニドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
カンゾウ属(Glychyrrhiza属：グルキルリザ属)植物又はウマゴヤシ属（Medicago属：メディカゴ属）植物に由来する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
カンゾウ属植物がG. uralensis（G．ウラレンシス）である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】
過剰発現型ベクター又は構成的発現型ベクターである、請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の組換えベクターを含む形質転換体又はその後代。
【請求項１２】
マメ科（Fabaceae）植物である、請求項１１に記載の形質転換体又はその後代。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の形質転換体又はその後代を培養する工程、及びその培養物から請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを抽出する工程を含む、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
β-アミリンからグリチルリチンを生合成できる個体又は細胞において、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの活性を抑制する工程を含むグリチルレチン酸モノグルクロニドの製造方法。
【請求項１５】
前記抑制が請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子発現の抑制、又は当該ポリペプチドの活性阻害物質処理による抑制である、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドの有無又はその発現を検出して、当該ポリヌクレオチドを有する植物を選抜する方法であって、対象植物から調製された核酸含有サンプルについて、前記ポリヌクレオチド若しくはその断片を用いて核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーションを行い、前記ポリヌクレオチドを検出又は定量することを含む、前記植物選抜法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにグルクロン酸を転移する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、及び当該酵素又は遺伝子の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マメ科の多年生草本植物であるカンゾウ属(Glychyrrhiza属：グルキルリザ属)植物は、漢方上重要な生薬として知られており、世界的に広く利用されている。この植物で生薬として利用される部分は、主として根部及びストロン(stolon：地下茎)である。これらの部分に含まれる主活性成分は、グリチルリチン（glycyrrhizin）であることがG. uralensis（G．ウラレンシス）、G. glabra（G．グラブラ）、及びG. inflata（G．インフラータ）を用いた成分分析から明らかとなっている（非特許文献１）。グリチルリチンは、オレアナン型トリテルペノイドサポニンに属する甘味物質であり、その生薬学的及び薬理学的有用性から様々な研究が行われている。【０００３】
医薬品として良質のグリチルリチンを生物生産系によって安定的かつ持続的に提供するためには、グリチルリチンの生合成系に関与する遺伝子や当該遺伝子の発現量をマーカーに用いて、最適産生条件の確立、グリチルリチン高生産株の選抜又は合成酵素遺伝子の導入によるグリチルリチン高産生植物の育種等を行う必要がある。そのためにはグリチルリチンの生合成系に関与する遺伝子群の同定が不可欠である。【０００４】
グリチルリチンは、植物に共通に含まれるβ-アミリンを出発物質として、二段階の酸化反応及び二段階の配糖化反応によって生合成されると考えられている。β-アミリンとは、オレアナン型トリテルペノイドに属し、トリテルペノイドサポニン生合成系において、グリチルリチンとソヤサポニン（soyasaponin）の生合成分岐点となる前駆体物質である（図１）。本発明者らは、これまでにβ-アミリンからグリチルリチンに至る経路の合成酵素として、グリチルリチンのアグリコン（非糖部）であるグリチルレチン酸をβ-アミリンから生合成するための前記二段階の酸化反応を触媒する2種の酸化酵素CYP88D6（特許文献１）及びCYP72A154（特許文献２）を単離した（図２）。しかし、グリチルレチン酸から二段階の配糖化反応を触媒してグリチルリチンを生合成する合成酵素遺伝子については、これまで全く明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2009/020231
【特許文献２】WO2010/024437
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gibson, M.R., 1978, Lloydia-the journal of Natural Products, 41(4): 348-354
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、グリチルリチンをはじめとするオレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドを生物生産系によって安定的かつ持続的に提供するために、オレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドの生合成系においてオレアナン型トリテルペノイドに糖への転移活性を有する糖転移酵素、及びそれをコードする遺伝子を同定し、当該酵素、その遺伝子及びそれらの利用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、β-アミリンからグリチルリチンに至る生合成系において、二段階目の配糖化反応を触媒する酵素、すなわちオレアナン型トリテルペノイドモノクロニドにグルクロン酸を転移する新規の糖転移酵素及びそれをコードする遺伝子を単離することに成功した。具体的には、マメ科植物からmRNAを調製した後、cDNAライブラリーを作製してEST解析を行った。前記生合成経路において、糖転移酵素が関係していると予想し、公知の糖転移酵素遺伝子の塩基配列を用いて前記cDNAライブラリーを検索し、候補遺伝子を絞り込んだ。各候補遺伝子について遺伝子発現解析を行い、目的の活性を有し、かつストロンや根部で高発現している遺伝子を同定することによって、本発明を完成するに至った。すなわち、本願は、以下の発明を提供する。【０００９】
（１）オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチド。【００１０】
（２）前記オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドが、β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソグリチルレチン酸モノグルクロニド、及びグリチルレチン酸モノグルクロニドからなる群から選択される、（１）に記載のポリペプチド。【００１１】
（３）カンゾウ属(Glychyrrhiza属：グルキルリザ属)植物又はウマゴヤシ属（Medicago属：メディカゴ属）植物に由来する、（１）又は（２）に記載のポリペプチド。【００１２】
（４）カンゾウ属植物がG. uralensis（G．ウラレンシス）である、（３）に記載のポリペプチド。【００１３】
（５）配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチド。【００１４】
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）に示すいずれかのアミノ酸配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００１５】
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１６】
（８）以下の（ｄ）〜（ｇ）に示すいずれかの塩基配列を含む、（７）に記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列、
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、
（ｆ）配列番号５に示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列【００１７】
（９）（７）又は（８）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。【００１８】
（１０）過剰発現型ベクター又は構成的発現型ベクターである、（９）に記載の組換えベクター。【００１９】
（１１）（９）又は（１０）に記載の組換えベクターを含む形質転換体又はその後代。【００２０】
（１２）マメ科（Fabaceae）植物である、（１１）に記載の形質転換体又はその後代。【００２１】
（１３）（１１）又は（１２）に記載の形質転換体又はその後代を培養する工程、及びその培養物から（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドを抽出する工程を含む、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチドの製造方法。【００２２】
（１４）β-アミリンからグリチルリチンを生合成できる個体又は細胞において、（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドの活性を抑制する工程を含むグリチルレチン酸モノグルクロニドの製造方法。【００２３】
（１５）前記抑制が（１）〜（６）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子発現の抑制、又は当該ポリペプチドの活性阻害物質処理による抑制である、（１４）に記載の製造方法。【００２４】
（１６）（７）又は（８）に記載のポリヌクレオチドの有無又はその発現を検出して、当該ポリヌクレオチドを有する植物を選抜する方法であって、対象植物から調製された核酸含有サンプルについて、前記ポリヌクレオチド若しくはその断片を用いて核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーションを行い、前記ポリヌクレオチドを検出又は定量することを含む、前記植物選抜法。【００２５】
なお、本明細書でいうグリチルリチン、β-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路、及び当該経路における中間産物は、原則としてグリチルリチンの20位異性体である20-エピ-グリチルリチン、β-アミリンから20-エピ-グリチルリチンに至る生合成経路、及び当該経路における中間産物を含むものとする。【００２６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-078847号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にグルクロン酸を転移する活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらを利用した方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】トリテルペノイドサポニン生合成系におけるグリチルリチン及びソヤサポニンIの生合成経路を示す。
【図２】β-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路におけるオレアナン型トリテルペノイド及び各変換反応に関与する既知の酵素（CYP88D6、CYP72A154、GuUGT73.8）の触媒位置を示す。GuUGT73.8が本発明のグルクロン酸第二転移酵素に該当する。
【図３】RT-PCR法による遺伝子発現の解析結果を示す。
【図４−１】A. サンプルAを用いたときの概念図である。B. 本発明のポリペプチド（GuUGT73.8）によりグリチルレチン酸モノグルクロニドからグリチルリチンへ変換される前のグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。白矢印のピークはグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。C. GuUGT73.8を発現する形質転換酵母から得られたタンパク質抽出物であるサンプルAを糖受容体基質であるグリチルレチン酸モノグルクロニドと糖供与体基質UDP-グルクロン酸を含む溶液に添加してin vitro酵素アッセイを行った反応溶液をLC-MSで分析した結果を示す。黒矢印のピークはグリチルリチンを示す。
【図４−２】A.図４−１の陰性対照であるサンプルBを用いたときの概念図である。B.GuUGT73.8を発現しない空ベクターのみの形質転換酵母から得られたタンパク質抽出物であるサンプルBを糖受容体基質であるグリチルレチン酸モノグルクロニドと糖供与体基質UDP-グルクロン酸を含む溶液に添加する前のグリチルレチン酸モノグルクロニドの検出結果を示す。白矢印のピークはグリチルレチン酸モノグルクロニドを示す。C. サンプルＢを添加してin vitro酵素アッセイを行った反応溶液をLC-MSで分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明について詳細に述べる。
【００３０】
１．グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片
本発明の第１の態様は、グルクロン酸第二転移活性を有するポリペプチドに関する。
【００３１】
本明細書において「グルクロン酸第二転移活性」とは、一段階目のグルクロン酸転移反応（グルクロン酸第一転移反応）を受けたオレアナン型トリテルペノイド、すなわちオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドに対して二段階目のグルクロン酸転移反応（グルクロン酸第二転移反応）を触媒する活性をいう。
【００３２】
本明細書において「グルクロン酸第二転移活性を有するポリペプチド」とは、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにグルクロン酸を転移する活性を有するグルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片である。
【００３３】
「オレアナン型トリテルペノイド」とは、5環性のオレアナン骨格を有し、6個のイソプレン単位からなるC30のイソプレノイドをいう。例えば、オレアノール酸、ヘデラゲニン、β-アミリン、カメリアゲニン、ソヤサポゲノール、サイコゲニン、11-オキソ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-β-アミリン、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリン、11-デオキソグリチルレチン酸、及びグリチルレチン酸が該当する。
【００３４】
「オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニド」とは、オレアナン型トリテルペノイドの3位のヒドロキシ基（OH基）にグルクロン酸が１つ転移した化合物をいう。例えば、オレアノール酸モノグルクロニド、ヘデラゲニンモノグルクロニド、β-アミリンモノグルクロニド、カメリアゲニンモノグルクロニド、ソヤサポゲノールモノグルクロニド、サイコゲニンモノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、11-デオキソグリチルレチン酸モノグルクロニド、及びグリチルレチン酸モノグルクロニドが該当する。
【００３５】
本明細書における「グルクロン酸第二転移酵素」とは、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにおけるグルクロン酸の2位のヒドロキシ基にさらにグルクロン酸を転移するグルクロン酸第二転移活性を有する酵素である。当該活性により、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドからオレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドが生成される。これによって、例えば、グリチルレチン酸モノグルクロニドからグリチルリチンを得ることができる。グルクロン酸第二転移酵素には、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列（Ser-His-Xaa-Ile-Arg-Val-Val：Xaaはいずれかのアミノ酸を示す。好ましくはLeu又はThrである。）を基質結合部位として含むポリペプチドが挙げられる。または、（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００３６】
前記「配列番号４に示すアミノ酸配列」は、G. uralensis由来のグルクロン酸第二転移酵素（GuUGT73.8）である。GuUGT73.8は、開始メチオニンを1位としたとき、28位〜34位の位置に前記配列番号３に示すアミノ酸配列で構成される基質結合部位を含む。また、GuUGT73.8の他種オルソログも本明細書におけるグルクロン酸第二転移酵素として好ましい。例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるGuUGT73.8のミヤコグサ（Lotus japonicus）オルソログが挙げられる。配列番号９に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して66.9％の同一性を有する。さらに、配列番号４に示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を本発明において使用してもよい。例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列から１〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個又は1〜2個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号４に示すアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個又は1〜2個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、あるいは配列番号４に示すアミノ酸配列の1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個又は1〜2個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列が挙げられる。具体的には、例えば、グルクロン酸第二転移活性を保持した、配列番号４に示すグルクロン酸第二転移酵素の変異体等が該当する。
【００３７】
前記「（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上、好ましくは85％以上、90％、95％、又は97％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をいう。
【００３８】
本発明において「その活性断片」とは、グルクロン酸第二転移酵素の一部領域を含み、かつグルクロン酸第二転移活性を保持するポリペプチド断片をいう。本活性断片を構成するポリペプチドのアミノ酸の長さは、特に制限はしない。例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドにおいて少なくとも10、15、20、25、30、50、100又は150アミノ酸の連続する領域であればよい。
【００３９】
本発明のグルクロン酸第二転移活性を有するポリペプチドの基質には、前述のオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドが挙げられる。好ましくは、β-アミリンからグリチルリチンに至る生合成経路に関与するオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドである。具体的には、β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソグリチルレチン酸モノグルクロニド、又はグリチルレチン酸モノグルクロニドである。
【００４０】
本発明のポリペプチドが由来する生物種は、特に限定されない。好ましくはマメ科（Fabaceae）植物である。例えば、ラッカセイ属（Arachis）植物、ヒヨコマメ属（Cicer）植物、アスパラトゥス属（Aspalathus）植物、ツルサイカチ属（Dalbergia）植物、シタン属（Pterocarpus）植物、ヌスビトハギ属（Desmodium）植物、ハギ属（Lespedeza）植物、フジボグサ属（Uraria）植物、ゲンゲ連（Galegeae）植物、ゲンゲ属（Astragalus）植物、カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物、オヤマノエンドウ属（Oxytropis）植物、ギンヨウエニシダ属（Augyrocytisus）植物、エニシダ属（Cytisus）植物、ヒトツバエニシダ属（Genista）植物、レタマ属（Spartium）植物、イワオウギ属（Hedysarum）植物、クアスタマメ属（Cyamopsis）植物、コマツナギ属（Indigofera）植物、ミヤコグサ属（Lotus）植物、ルピナス属（Lupinus）植物、フジ属（Wisteria）植物、キマメ属（Cajanus）植物、ナタマメ属（Canavalia）植物、デイゴ属（Erythrina）植物、ダイズ属（Glycine）植物、ハーデンベルギア属（Hardenbergia）植物、フジマメ属（Lablab）植物、トビカズラ属（Mucuna）植物、インゲン属（Phaseolus）植物、シカクマメ属（Psophocarpus）植物、クズ属（Pueraria）植物、ササゲ属（Vigna）植物、ハリエンジュ属（Robinia）植物、カスタノスペルマム属（Castanospermum）植物、イヌエンジュ属（Maackia）植物、オルモシア属（Ormosia）植物、クララ属（Sophora）植物、エンジュ属（Styphnolobium）植物、ウマゴヤシ属（Medicago）植物、フェヌグリーク属（Trigonella）植物、シャジクソウ属（Trifolium）植物、レンリソウ属（Lathyrus）植物、ヒラマメ属（Lens）植物、エンドウ属（Pisum）植物及びソラマメ属（Vicia）植物が挙げられる。好ましくはカンゾウ属植物又はウマゴヤシ属植物である。具体的にはG. uralensis、G. glabra、G. inflata、G. aspera（G.アスペラ）、G. eurycarpa（G.ユーリカルパ）、G. pallidiflora（G.パリディフローラ）、G. yunnanensis（G.ユンナネンシス）、G. lepidota（G.レピドータ）、G. echinata（G.エキナータ）、G. acanthocarpa（G.アカンソカルパ）又はM. truncatula（M.トランカツラ；タルウマゴヤシ）等が挙げられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、植物培養細胞から抽出する場合であれば、例えば、カンゾウ培養細胞からグルクロン酸転移酵素を抽出するHayashiらの方法 (Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42: 665-666)を参照すればよい。また、植物の器官又は組織（根又はストロン等）から抽出する場合であれば、例えば、ダイズからイソフラボンの配糖化酵素を抽出、精製するNoguchiらの方法（Noguchi et al., 2007, J. Biol. Chem., 282: 23581-23590）を参照すればよい。さらに、配列番号４又は９に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを公知の化学合成法によって合成してもよい。あるいは、後述の当該ポリペプチドをコードする遺伝子を取得して、公知の遺伝子組換え技術、及びタンパク質発現系によって生合成することもできる。具体的な方法については、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。
【００４２】
配列番号４に示すアミノ酸配列において1若しくは数個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、あるいは配列番号４に示すアミノ酸配列に対して80％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、例えば、後述する第２態様に記載のポリヌクレオチドを当該技術分野で公知の方法で改変することによって得ることができる。遺伝子に変異を導入する方法は、Kunkel法又はGapped duplex法等の公知方法又はこれに準ずる方法により行えばよい。部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キット（例えば、Mutant-K（TaKaRa社）やMutant-G（TaKaRa社））、又はLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（TaKaRa社）等を用いて変異導入することもできる。また、突然変異誘発剤（例えば、メタンスルホン酸エチル(EMS)、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)等のアルキル化剤）に接触作用させる方法、紫外線を照射する方法を用いてもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドによれば、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドを糖受容体基質として、グルクロン酸第二転移活性によりオレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドを得ることができる。また、本発明のポリペプチドを用いて、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドへのグルクロン酸転移方法を提供することができる。したがって、本発明のポリペプチド及びグルクロン酸転移方法を利用すれば、グリチルリチン生合成経路のさらなる解明やグリチルリチン合成に適用することが可能となる。
【００４４】
２．グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片をコードするポリヌクレオチド
本発明の第２の態様は、第１態様に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、すなわち、グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、グルクロン酸第二転移活性を有する第１態様に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば、その塩基配列は特には限定しない。好ましくは配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリペプチド、第１態様の（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はその活性断片をコードするポリヌクレオチドである。当該ポリヌクレオチドの具体的な例としては、（ｄ）配列番号５に示す塩基配列、（ｅ）配列番号５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、（ｆ）配列番号５に示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列、又は（ｇ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列、を含むポリヌクレオチドである。配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドは、G. uralensis由来のグルクロン酸第二転移酵素であるGuUGT73.8をコードする。また、GuUGT73.8の他種オルソログをコードする遺伝子も本態様におけるポリヌクレオチドとして好ましい。例えば、GuUGT73.8のミヤコグサオルソログである配列番号９に示すアミノ酸配列のポリペプチドをコードする配列番号８に示す塩基酸配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、配列番号５に示す塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を本発明において使用してもよい。例えば、配列番号５に示す塩基配列の1〜15個、好ましくは1〜9個、より好ましくは1〜6個、1〜3個又は1〜2個の塩基が欠失した塩基配列、配列番号５に示す塩基配列に1〜15個、好ましくは1〜9個、より好ましくは1〜6個、1〜3個又は1〜2個の塩基の塩基が付加された塩基配列、あるいは配列番号５に示す塩基配列の1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、又は1〜2個の塩基が他の塩基に置換された塩基配列が挙げられる。
【００４６】
前記「（ｆ）配列番号５に示す塩基配列と80％以上の同一性を有する塩基配列」では、配列番号５に示す85％以上、90％以上、95％以上、又は97％以上の塩基同一性を有する塩基配列が好ましい。
【００４７】
前記「（ｇ）ストリンジェントな条件」とは、核酸分子間で、塩基対合による特異的なハイブリッドは形成されるが、非特異的なハイブリッドは実質的に形成されない条件をいう。具体的には、塩基配列の同一性が高い（例えば80％以上、90％以上、95％以上、又は97％以上）核酸分子間では塩基対合によりハイブリッドを形成することができるが、それ以外の核酸分子間ではハイブリッドが実質的に形成されない条件である。例えば、ハイブリダイゼーションの反応温度が25〜70℃、好ましくは50〜70℃、より好ましくは55〜68℃の範囲内である条件、及び／又はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度が0〜50％、好ましくは20〜50％、より好ましくは35〜45％の範囲内である条件をいう。また、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄におけるナトリウム塩濃度が15〜750mM、好ましくは15〜500mM、より好ましくは15〜300mM、15〜200mM又は15〜100mMの条件である。
【００４８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、イントロンを含むmRNA前駆体に対応する塩基配列を有していてもよい。mRNA前駆体に対応する塩基配列はpre-mRNAスプライシング反応によって実質的に本発明のポリヌクレオチドと同じ配列となり、またそれにコードされるポリペプチドは第１態様に記載のポリペプチドと実質的に同一の機能を有し得るからである。例えば、G. uralensisゲノム上に存在する塩基配列を有し、スプライシング後の成熟ｍRNAの塩基配列が配列番号５で示す塩基配列を有するポリヌクレオチドが該当する。又は、ミヤコグサゲノム上に存在する塩基配列を有し、スプライシング後の成熟ｍRNAの塩基配列が配列番号８で示す塩基配列を有するポリヌクレオチドが該当する。
【００４９】
「グルクロン酸第二転移酵素の活性断片をコードするポリヌクレオチド」とは、第１態様の（ａ）〜（ｃ）に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は前記（ｄ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドの塩基配列において、連続する少なくとも10、15、20、25、30、50、100、若しくは150塩基の領域を含み、かつその塩基配列にコードされるペプチドがグルクロン酸第二転移活性を有するポリヌクレオチドをいう。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、適当な植物、例えば、マメ科植物、好ましくはカンゾウ属植物又はウマゴヤシ属植物から公知の方法を用いて単離してもよい。例えば、配列番号５に示す塩基配列に基づいて設計した適当な塩基配列長を有するプライマーペア（例えば、配列番号１及び２で示されるプライマーペア）を用いて、G. uralensis等のカンゾウ属植物のDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリー由来の核酸を鋳型としてPCR等の核酸増幅反応を行うことにより得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、前記ライブラリー等を鋳型とし、配列番号５に示す塩基配列の一部を有する核酸断片をプローブとしてハイブリダイゼーションにより得ることができる。これらの方法は、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５に示す塩基配列のような既知の塩基配列に基づいて化学合成法等の公知の核酸配列合成法によって合成することもできる。
【００５１】
配列番号５に示す塩基配列において1若しくは数個又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、又は配列番号５に示す塩基配列と80％以上、好ましくは85％以上、90％以上、95％以上、又は97％以上の同一性を有する塩基配列を第１態様で述べた方法により変異を導入する等して得ることができる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドによれば、それを直接又は次の第３態様の組換えベクターに組み込んで、様々な生物種又は細胞に導入し、高発現させることによって、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドにグルクロン酸を転移させることができる。
【００５３】
３．組換えベクター
本発明の第３の態様は、上記第２態様に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
【００５４】
本発明の組換えベクターは、第２態様に記載のポリヌクレオチドを適当なベクターに導入することによって構築することができる。ベクターの種類は特に限定しない。クローニング用、又は遺伝子発現用等の目的に応じて、又は導入する宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞若しくは植物体、特にマメ科の植物細胞若しくは植物体）に応じて、適宜選択すればよい。過剰発現型ベクター又は構成的発現型ベクターは特に好ましい。限定はしないが、使用可能なベクターの具体例としては、pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系（stratagene社）、pTriEXTM系（TaKaRa社）等のプラスミドベクターや、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等のウイルスベクター、又はpBI系等のバイナリーベクターが挙げられる。
【００５５】
前記ベクターに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法は、当該分野で公知の方法を用いることができる。通常は、精製された第２態様に記載のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、前記適当なベクターの対応する制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法等が採用される。具体的方法については、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照すればよい。
【００５６】
本発明の組換えベクターは、第２態様に記載の目的のポリヌクレオチドの他に、例えば、プロモーター、エンハンサー、若しくはターミネーター等の調節領域又は選抜マーカー遺伝子及び／若しくは他の遺伝子を含むことができる。
【００５７】
プロモーター、エンハンサー、ターミネーター又は選抜マーカーの種類は特に限定されない。前記ベクターと同様に目的又は導入する宿主によって適宜選択すればよい。
【００５８】
植物細胞で作動可能なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。また、細菌細胞で作動可能なプロモーターとしては、Bacillus stearothermophilus（バチルス・ステアロテルモフィルス）のマルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformis（B.リケニホルミス）のαアミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens（B.アミロリケファチエンス）のBANアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtillis（B.サブチリス）アルカリプロテアーゼ遺伝子若しくはBacillus pumilus（B.プミルス）のキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージ・ラムダのPR若しくはPLプロモーター、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモーター等が挙げられる。酵母宿主細胞で作動可能なプロモーターとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、TPI1プロモーター、ADH2-4cプロモーター等が挙げられる。真菌で作動可能なプロモーターとしては、ADH3プロモーター、tpiAプロモーター等が挙げられる。動物細胞で作動可能なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、CMVプロモーター等、昆虫細胞で作動可能なプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、バキュロウイルスであるAutographa californica polyhedrosis（オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス）の塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００５９】
エンハンサーとしては、CaMV 35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、SV40エンハンサー、CMVエンハンサー等が挙げられる。
【００６０】
ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素（NOS）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（OCS）遺伝子のターミネーター、CaMV 35Sターミネーター、大腸菌リポポリプロテインlppの3’ターミネーター、trpオペロンターミネーター、amyBターミネーター、ADH1遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００６１】
選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、又はネオマイシン耐性遺伝子）、蛍光又は発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ（GUS）、又はグリーンフルオレッセンスプロテイン（GFP））、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）、ジヒドロ葉酸還元酵素等の酵素遺伝子が挙げられる。
【００６２】
本発明の組換えベクターによれば、前記第２態様に記載のポリヌクレオチドの操作及び／又は発現等の制御が容易となる。
【００６３】
４．形質転換体又はその後代
本発明の第４の態様は、形質転換体又はその後代に関する。
【００６４】
本明細書において「形質転換体」とは、第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターの導入によって形質転換された宿主をいう。
【００６５】
形質転換される宿主は、導入される第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを発現できれば特に限定はしない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)又は枯草菌(Bacillus subtilis)のような細菌、例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)又はメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)のような酵母、コウジカビ(Aspergillus)、アカパンカビ(Neurospora)、フザリウム(Fuzarium)又はトリコデルマ(Trichoderma)のような真菌、例えば、イネ科のような単子葉植物、又は例えば、マメ科又はアブラナ科のような双子葉植物、あるいは植物細胞、動物細胞、又は昆虫細胞（例えば、sf9、又はsf21）が挙げられる。宿主が植物の場合、好ましくはマメ科植物、より好ましくはカンゾウ属植物、ウマゴヤシ属植物又はダイズ属植物である。G. uralensis、M. truncatula、又はダイズ（Glycine max）は特に好ましい。
【００６６】
本発明の形質転換体は、同一の遺伝情報を有するクローン体を包含する。例えば、宿主が大腸菌や酵母等の無性生殖を行う単細胞微生物であれば、形質転換体第１世代から分裂又は出芽等によって新たに生じたクローン体も本発明の形質転換体に包含される。また、宿主が植物であれば、形質転換体第１世代から採取した植物体の一部、例えば、表皮、師部、柔組織、木部若しくは維管束のような植物組織、葉、花弁、茎、根若しくは種子のような植物器官、又は植物細胞から植物組織培養法や挿し木、接木若しくは取り木によって得られるクローン体、あるいは根茎、塊根、球茎、ランナー等のような形質転換体第１世代から無性生殖で得られる栄養繁殖器官より新たに生じた新たなクローン体も本発明の形質転換体に含まれる。
【００６７】
本発明の形質転換体は、第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターに加え、さらに一以上の他のポリヌクレオチド又は他の組換えベクターを有していてもよい。ここでいう他のポリヌクレオチドとは、第２態様に記載のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドをいう。例えば、β-アミリン合成酵素遺伝子、CYP88D6若しくはCYP72A154、又はいずれかのオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニド合成酵素遺伝子が該当する。また、他の組換えベクターとは、第３態様に記載の組換えベクター以外の組換えベクターをいう。
【００６８】
本発明の形質転換体は、上記ポリヌクレオチド又は組換えベクターを適当な宿主に導入することによって作製することができる。
【００６９】
前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターの導入方法は、当該分野で公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法を用いることができる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主のゲノムDNA中に組み込まれてもよいし、導入されたポリヌクレオチドの状態（例えば、外来ベクターに含有されたまま）で存在していてもよい。さらに、導入されたポリヌクレオチドは、宿主のゲノムDNA中に組み込まれた場合のように宿主細胞内で維持され続けてもよいし、一過的に保持されてもよい。
【００７０】
上述の方法で第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを宿主に導入した後、目的のポリヌクレオチドの導入の有無をPCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、in situハイブリダイゼーション等によって確認することができる。
【００７１】
本明細書において「その後代」とは、前記形質転換体第1世代の有性生殖を介した子孫であって、本発明の第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを発現可能な状態で保持している宿主を意味する。例えば、形質転換体が植物の場合には、その形質転換体の実生が該当する。後代の世代は問わない。
【００７２】
本態様の形質転換体によれば、導入されたポリヌクレオチドの発現を増強することによって、宿主細胞内に存在するオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドをオレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドに効率的に変換することができる。それによって、β-アミリンからグリチルリチンへの生合成経路における中間産物又は最終産物の産生量が増加した形質転換体を提供し得る。
【００７３】
また、第２態様に記載のポリヌクレオチド又は第３態様に記載の組換えベクターを発現可能なように導入して、当該ポリヌクレオチドの発現を増強した形質転換体を提供することができる。
【００７４】
５．グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片の製造方法
本発明の第５の態様は、第４態様の形質転換体又はその後代を培養して、その培養物から第１態様に記載のグルクロン酸第二転移活性を有するポリペプチドを抽出することを含む、グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片の製造方法に関する。
【００７５】
本態様では、形質転換体又はその後代を培養することにより第１態様に記載のポリペプチドを産生する場合、第２態様に記載のポリヌクレオチドを過剰発現可能な形質転換体若しくは構成的に発現可能な形質転換体又はその後代を用いることが好ましい。例えば、第３態様に記載の組換えベクターを有する形質転換体又はその後代であれば、その組換えベクターに用いられるベクターが包含する第２態様に記載のポリヌクレオチドを構成的に、過剰に、又は発現誘導により大量に、発現可能な発現ベクターを使用すればよい。
【００７６】
形質転換体又はその後代を培養する培地には、宿主の培養に適した培地を用いればよい。培地は、当該分野で公知のものを使用することができる。例えば、限定はしないが、大腸菌等の細菌を宿主として培養する場合であれば、LB培地若しくはM９培地等、酵母を宿主として培養する場合であれば、YPD培地、YPG培地、YPM培地、YPDM培地、SMM培地等、植物を宿主として培養する場合であれば、適当な培養土や水耕栽培用培地が挙げられる。
【００７７】
培地は、炭素源（例えば、グルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトース等）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物等の有機窒素源）、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等）、ビタミン（ビタミンB１等）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質）等を適宜含有する。さらに、第１態様に記載のポリペプチドの糖受容体基質となるオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニド、好ましくはβ-アミリンモノグルクロニド、11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-11-オキソ-β-アミリンモノグルクロニド、30-ヒドロキシ-β-アミリンモノグルクロニド、11-オキソグリチルレチン酸モノグルクロニド又はグリチルレチン酸モノグルクロニド、及び／又は糖供与体基質であるグルクロン酸を含んでいてもよい。
【００７８】
培養条件は、ポリヌクレオチドの発現に適切であれば特に限定されないが、通常10〜45℃、15〜40℃、18〜37℃の温度下で、必要に応じて通気、照射、及び／又は攪拌をしながら、数時間〜数百時間培養する。具体的な方法については、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照すればよい。
【００７９】
培養物（培養上清又は培養された形質転換体を含む）から第１態様に記載のポリペプチドを回収するには、培養物に蓄積されたポリペプチドを公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば、溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、あるいは適宜組み合わせて、目的のポリペプチドを得ることができる。具体的には、前述のHayashiらの方法 (Hayashi et al., 1996, Phytochemistry, 42: 665-666)やNoguchiらの方法（Noguchi et al., 2007, J. Biol. Chem., 282: 23581-23590）を参照すればよい。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法によれば、宿主を生物生産系として利用することで、グルクロン酸第二転移酵素及びその活性断片を安定的に、かつ大量に得ることが可能となる。
【００８１】
６．グリチルレチン酸モノグルクロニドの製造方法
本発明の第６の態様は、グリチルレチン酸モノグルクロニドの製造方法に関する。
【００８２】
グリチルレチン酸モノグルクロニドは、グリチルリチンと同様の甘味物質であり、産業上の有用性が高いが、自然界では極めて僅かにしか存在しないため大量に入手することが困難である。しかし、β-アミリンからグリチルリチンを生合成できる個体又は細胞において、第１態様に記載のグルクロン酸第二転移酵素によってグリチルレチン酸モノグルクロニドからグリチルリチンが生成されることが本明細書で明らかとなった。前記生合成系を有する個体又は細胞内では、グリチルリチンが化学的に安定した最終産物として細胞内に蓄積される。ところが、その生合成系においてグルクロン酸第二転移酵素の活性が抑制された場合、オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドからオレアナン型トリテルペノイドジグルクロニドへの変換が抑制される。その結果、グリチルリチン（オレアナン型トリテルペノイドジグルクロニド）の前駆体であるグリチルレチン酸モノグルクロニド（オレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニド）が最終産物として細胞内に蓄積されることとなる。本発明は、当該原理を利用してグリチルレチン酸モノグルクロニドを製造する方法である。
【００８３】
本発明の製造方法は、抑制工程を含む。本態様の「抑制工程」は、β-アミリンからグリチルリチンを生合成できる個体又は細胞において、第１態様に記載のポリペプチドの活性を抑制する工程である。
【００８４】
本態様における第１態様に記載のポリペプチドには、主としてグルクロン酸第二転移酵素が該当する。具体的には配列番号３に示すアミノ酸配列を含むグルクロン酸第二転移酵素、又は配列番号４に示すアミノ酸配列（GuUGT73.8）、配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号４に示すアミノ酸配列と80％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むグルクロン酸第二転移酵素である。
【００８５】
本工程における「個体」は、β-アミリンからグリチルリチンを生合成できる個体であれば植物個体、動物個体、細菌、酵母、真菌を問わないが、好ましくは植物個体、より好ましくはマメ科植物個体、さらに好ましくはカンゾウ属植物個体、ウマゴヤシ属植物個体又はダイズ属植物個体である。例えば、G. uralensis個体、M. truncatula個体、又はダイズ個体が挙げられる。本工程における個体において、β-アミリンからグリチルリチンまでの生合成系に寄与する酵素をコードする遺伝子は、その個体の内在性遺伝子でなくともよい。例えば、個体が形質転換体で、その生合成系における酵素をコードする遺伝子の一部が外因性遺伝子であってもよい。例えば、オレアナン型トリテルペノイドの11位の炭素を酸化する活性を有する酵素をコードする遺伝子が存在しない個体において、外来性遺伝子であるCYP88D6遺伝子を導入した形質転換体を用いることができる。また、本工程における「細胞」は、前記個体由来の細胞（組織、器官等の個体の一部を含む）が挙げられる。
【００８６】
本工程においてグルクロン酸第二転移酵素の活性を抑制する方法として、例えば、グルクロン酸第二転移酵素をコードする遺伝子発現を抑制する方法、又はグルクロン酸第二転移酵素の活性阻害物質を用いて当該酵素の活性を直接的に抑制する方法が挙げられる。これらの抑制は、自然突然変異に基づくものであってもよいし、人為的処理又は人為突然変異に基づくものであってもよい。以下、遺伝子発現を抑制する方法、及び活性阻害物質を用いる方法について具体的に説明をする。
【００８７】
（１）遺伝子発現を抑制する方法
遺伝子発現を抑制する方法は、標的酵素であるグルクロン酸第二転移酵素の発現自体を抑制して、細胞内における当該標的酵素の絶対量を低減させることによって、その基質に対する比活性を低下させる方法である。遺伝子発現の抑制は、完全抑制のみならず、部分的抑制であってもよい。このような遺伝子発現抑制方法には、転写抑制方法及び転写後翻訳前抑制方法に大別することができる。
【００８８】
（ｉ）転写抑制方法
転写抑制方法は、前記個体又は細胞におけるグルクロン酸第二転移酵素をコードする遺伝子（以下、グルクロン酸第二転移酵素遺伝子とする）を発現段階で抑制する方法である。遺伝子の転写抑制方法は、特に限定はしないが、例えば、遺伝子発現を人為的に制御する分子遺伝学的方法、グルクロン酸第二転移酵素遺伝子の転写機構を制御する方法、又は当該遺伝子の突然変異株を利用する方法が挙げられる。
【００８９】
人為的制御による分子遺伝学的方法としては、例えば、グルクロン酸第二転移酵素遺伝子のプロモーター領域を改変したり、１以上の塩基が付加、欠失（遺伝子破壊を含む）及び／又は置換された変異型グルクロン酸第二転移酵素遺伝子を個体又は細胞に導入することによって所望の機能を付与する方法が知られている。個体又は細胞におけるグルクロン酸第二転移酵素遺伝子やそのプロモーター領域等に前記変異を導入する方法は、公知方法又はこれに準ずる方法により達成できる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の遺伝子変異導入用キット（例えば、Mutant-K（TaKaRa社）、Mutant-G（TaKaRa社））、又はLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（TaKaRa社）等を用いてクローン化したグルクロン酸第二転移酵素遺伝子に変異を導入した後、相同組換えにより内在性の野生型グルクロン酸第二転移酵素遺伝子と置換する方法が挙げられる。具体的な方法については、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。
【００９０】
グルクロン酸第二転移酵素遺伝子の転写機構を制御する方法としては、例えば、グルクロン酸第二転移酵素遺伝子の発現を特異的に制御する転写因子を抑制する方法が挙げられる。具体的には転写因子の機能又は活性を阻害する低分子化合物、アプタマー、抗体等を利用すればよい。
【００９１】
突然変異株を利用する方法としては、個体又は細胞をEMSやMNNG等の突然変異誘発剤、又は紫外線照射で処理した後、グルクロン酸第二転移酵素の活性に欠陥のある変異株をスクリーニングにより分離する方法が挙げられる。具体的な方法については、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。
【００９２】
グルクロン酸第二転移酵素遺伝子に変異を生じた変異株を、グリチルリチンの生合成系の解明に利用することもできる。
【００９３】
（ｉｉ）転写後翻訳前抑制方法、
転写後翻訳前抑制方法は、前記個体又は細胞におけるグルクロン酸第二転移酵素遺伝子の転写産物であるmRNAの段階で抑制する方法である。
【００９４】
転写後翻訳前抑制方法の具体例として、例えば、RNA干渉剤、アプタマー、アンチセンスDNA、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、U1アダプターを利用する方法が挙げられる。RNA干渉剤とは、生体内においてRNA干渉（RNA inteference：RNAi）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA)（pri-miRNA及びpre-miRNAを含む）が該当する。これらの方法は、標的遺伝子の転写産物に対する特異性が比較的高く、処理方法も容易であることから便利である。
【００９５】
前記RNA干渉剤、アプタマー、アンチセンスDNA、リボザイム、及びU1アダプターはいずれも公知の技術であり、RNA干渉剤に関しては、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162に記載の方法を、核酸アプタマーに関しては、例えば、Sumedha D. Jayasena, 1999, Clin. Chem. 45:1628-1650に記載の方法、アンチセンスDNA及びリボザイムに関しては、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を、そしてU1アダプターに関しては、Goraczniak R., et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263に記載の方法を参照すればよい。 
【００９６】
（２）活性阻害物質を用いる方法
活性阻害物質を用いる方法は、標的酵素であるグルクロン酸第二転移酵素を阻害する物質で個体又は細胞を処理することによって当該酵素の活性を直接的に、又は間接的に抑制方法である。グルクロン酸第二転移酵素の抑制は、完全抑制のみならず、部分的抑制であってもよい。
【００９７】
活性阻害物質には、標的であるグルクロン酸第二転移酵素に結合してその活性を直接的に抑制する物質、グルクロン酸第二転移酵素を分解する物質、基質であるオレアナン型トリテルペノイドモノグルクロニドを巡ってグルクロン酸第二転移酵素と競合することにより、その活性を間接的に抑制する物質等が挙げられる。
【００９８】
グルクロン酸第二転移酵素に結合してその活性を抑制する物質としては、例えば、グルクロン酸第二転移酵素又はその断片を抗原とする抗体、アプタマー、又は低分子化合物が挙げられる。抗体又はアプタマーは、当該分野の常法により作製することができる。
【００９９】
前記抑制工程後に個体又は細胞からグリチルレチン酸モノグルクロニドを抽出し、回収する方法は、当該分野で公知の、通常のグリチルリチンを抽出、回収する方法を用いればよい。例えば、Hayashiらの方法 (Hayashi et al., 2003, Biol. Pharm. Bull., 26: 867-871)を参照すればよい。本発明の製造方法によれば、最終産物としてグリチルレチン酸モノグルクロニドを安定的に、安価に、比較的多量に得ることができる。
【０１００】
７．植物選抜法
本発明の第７の態様は、第２態様に記載のポリヌクレオチドを用いた植物選抜法に関する。当該方法は、対象植物における第２態様に記載のポリヌクレオチドの有無又はその発現を検出することによって、第２態様に記載のポリヌクレオチドを有する植物を選抜する方法である。本方法は、対象植物から調製された核酸含有サンプルについて、前記ポリヌクレオチド若しくはその断片を用いて核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーションを行い、前記ポリヌクレオチドを検出又は定量することを含む。
【０１０１】
本発明において「対象植物」は、選抜法に供される植物である。使用する植物体の部位は特に限定はしないが、好ましくは第２態様に記載のポリヌクレオチドの発現している可能性が高い部位、例えば、根部やストロンである。
【０１０２】
前記核酸含有サンプルは、当該分野で公知の手法、例えば、フェノール抽出法、フェノール・クロロフォルム抽出法、CTAB法等を用いて対象植物から調製することができる。
【０１０３】
前記「核酸増幅法」とは、特定の核酸領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法、RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法、ICAN（等温遺伝子増幅）法、又はそれらの応用的な方法（例えば、リアルタイムPCR法）が挙げられる。好ましくはPCR法である。これは、当該方法が当該分野において現在世界で最も広く使用されている方法であり、試薬、キット、及び反応機器等が充実している他、様々な応用技術が知られているためである。
【０１０４】
前記「核酸ハイブリダイゼーション法」とは、目的とするポリヌクレオチド若しくはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸断片を用いて、当該ポリヌクレオチド若しくはその断片と核酸断片間の塩基対合を利用して、目的とするポリヌクレオチド若しくはその断片を検出、又は定量する方法である。核酸ハイブリダイゼーション法は、例えば、DNA-DNAハイブリダイゼーション法、DNA-RNAハイブリダイゼーション法又はRNA-RNAハイブリダイゼーション法が挙げられる。これらの具体的な方法については、例えば、ノザンハイブリダイゼーション（分子生物学実験プロトコルＩ（1997年），西野・佐野共訳，丸善株式会社参照）、DNAマイクロアレイ法（DNAマイクロアレイと最新PCR法（2000年）村松、那波監修、秀潤社参照）等を参照されたい。
【０１０５】
前記核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーションで用いるプライマー又はプローブは、第２態様に記載のいずれかの塩基配列、好ましくは配列番号５で示す塩基配列、又はそれらの変異体若しくはオルソログ遺伝子の塩基配列に基づいて設計すればよい。本発明のプライマー及び／又はプローブを構成する核酸は、通常DNA、RNAであるが、必要に応じてPNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸や擬似核酸を含んでいてもよい。又はそれらの組み合わせで構成することもできる。また、プライマー及びプローブは、蛍光色素（例えば、フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、FITC、cy3、cy5、FAM、HEX、VIC）、クエンチャー物質（TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3）、ビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質、あるいはアイソトープ（例えば、32P、33P、35S）等を用いて修飾又は標識することもできる。プライマー及びプローブにおけるこれら修飾物質等の修飾／標識位置は、その修飾物質等の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、一つのプライマー及びプローブ分子が一以上の修飾物質等で修飾されていても構わない。
【０１０６】
本発明で用いるプライマー及びプローブのサイズは特に限定されないが、プライマーの場合、通常、15〜50塩基長、好ましくは17〜30塩基長である。プローブの場合、サザン若しくはノザンハイブリダイゼーションに使用するのであれば、少なくとも10塩基長以上から全長、好ましくは15塩基長以上から全長、より好ましくは30塩基長以上から全長、さらに好ましくは50塩基長以上から全長であり、DNAマイクロアレイに使用するのであれば、10〜50塩基長、好ましくは15〜30塩基長、より好ましくは20〜25塩基長である。ただし、これらに限定はされない。一般に、プローブが長いほどハイブリダイゼーション効率が上昇し、感度は高くなる。一方、プローブが短いほど感度は低くなるが、逆に特異性が上昇する。固相上のプローブは、通常0.1μg〜0.5μgの溶液を用いてスポットする。プライマー、プローブの具体例として、例えば、G. uralensis用のプライマーセットであれば配列番号１及び２を、ミヤコグサ用のプライマーセットであれば配列番号６及び７を、利用することができる。
【０１０７】
核酸増幅条件は、増幅する核酸断片の塩基長及び量、並びに使用するプライマーの塩基長及びTm値等により変動するため、これらの条件に応じて適宜定める。一例として、PCR法であれば、通常、94〜95℃で5秒〜5分間、アニーリング反応を50〜70℃で10秒〜1分間、伸長反応を68〜72℃で30秒〜3分間行い、これを1サイクルとして15〜40サイクルほど行い、最後に68〜72℃で30秒〜10分間の伸長反応を行うことができる。
【０１０８】
核酸増幅産物は、例えば、アガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ドットハイブリダイゼーション等を用いて検出できる。また、これらの核酸増幅産物の定量は、ケミルミ撮影解析装置（例えば、ATTO社：ライトキャプチャーシリーズ）、イメージングアナライザ（例えば、FUJIFILM社：BASシリーズ）、を用いて行うことができる。
【０１０９】
第２態様に記載のポリヌクレオチドの発現量をPCR法で定量する方法の一例として、内部標準物質を用いたRT-PCR法が挙げられる（PCR法最前線（1996年）関谷、藤永編、共立出版参照）。使用する内部標準としては、一般にハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDH、β-アクチン等）が用いられる。この方法で、標的mRNA量の内部標準試料に対する相対的な結果が得られる。１つのサンプルについてのPCR中に、数サイクルごとに反応液をサンプリングして、PCR産物の量を定量し、グラフにプロットしていく。そうして得られたグラフの指数増加期のポイントに対して回帰分析を行い、ｙ切片を求めることにより、初期鋳型量を算出することができる（バイオ実験イラストレイティット３「本当に増えるPCR」（1998年）中山広樹著、秀潤社）。
【０１１０】
また、第２態様に記載のポリヌクレオチドの発現量をリアルタイム定量PCR法で定量することができる。PCR産物が特異的に蛍光標識される反応系で、蛍光強度を検出する装置の備わった温度サイクラー装置を用いてPCRを行うことで、反応中の産物の量をサンプリングの必要なくリアルタイムでモニターでき、その結果をコンピュータで回帰分析することができる。PCR産物を標識する方法としては、蛍光標識したプローブを用いる方法（例えば、TaqMan（登録商標）PCR法）と、2本鎖DNAに特異的に結合する試薬を用いる方法とがある。TaqMan（登録商標）PCR法は、5’末端部がクエンチャー物質で、また3’末端部が蛍光色素で修飾されたプローブを用いる。通常は、5’末端部のクエンチャー物質が3’末端部の蛍光色素を抑制しているが、PCRが行われるとTaqポリメラーゼのもつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により当該プローブが分解され、それによってクエンチャー物質の抑制が解除されるため蛍光を発するようになる。その蛍光量は、PCR生成物の量を反映する。PCR産物が検出限界に到達するときのサイクル数（CT）と初期鋳型量とは逆相関の関係にあることから、リアルタイム測定法ではCTを測定することによって初期鋳型量を定量している。数段階の既知量の鋳型を用いてCTを測定し検量線を作製すれば、未知試料の初期鋳型量の絶対値を算出することができる。RT-PCRで使用する逆転写酵素は、例えば、M-MLV RTase、ExScript RTase（TaKaRa社社）、Super Script II RT（GIBCO BRL社）等を使用することができる。
【０１１１】
核酸ハイブリダイゼーションを行う場合は、上記プローブだけでなく、サンプル中の核酸を修飾／標識してもよい。修飾／標識には、アイソトープ（例えば、32P、33P、35S）又は蛍光（フルオレサミン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、FITC、Cy３、Cy5）を使用することができる。目的に応じて、適当な修飾／標識をすればよく、特に限定はされない。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションは、上記ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。非特異的にハイブリダイズする目的外の核酸を排除するためである。
【０１１３】
ノザンハイブリダイゼーション法は、一般にRNA配列の検出、定量のために使用される。植物から公知の手法で得たRNAサンプルを、アガロースゲル電気泳動で分離し、その後、ナイロン若しくはニトロセルロースメンブレンにRNAを転写し、第２態様に記載のポリヌクレオチドを標識化したcDNA又はその断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、目的のポリヌクレオチドを検出、又は定量することができる。
【０１１４】
DNAマイクロアレイ法は、ガラスやフィルター等のアレイ上に本発明のポリヌクレオチドをコードするcDNA又はそのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖、あるいはそれらの断片をプローブとして固定化する。公知の手法で得たRNAについて逆転写反応を行い、Cy３-dUTP、Cy5−dUTP等を取り込ませてラベル化cDNAを得る。アレイ上の固定化プローブと標識化cDNAとのハイブリダイゼーションを行い、本発明のポリヌクレオチドを検出、定量する。これにより、グリチルリチン高含量の植物を選抜、スクリーニングできる。
【０１１５】
なお、上記分子生物学的手法に関する具体的方法等は、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照すればよい。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例において、本発明の一例を挙げて具体的に説明する。【０１１７】
＜実施例１：カンゾウ属植物からのmRNA調製とcDNAライブラリー作製（１）＞
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター北海道研究部（北海道名寄市）において圃場栽培されていた7年生のG. uralensisのストロンを6月に採取した。RNA抽出試薬RNAwizTM（Ambion社）を用いて添付のプロトコルに従い、トータルRNAを調製した。得られたトータルRNAからmRNAを調製し、ベクターキャッピング法 (Kato, S. et al., DNA Res., 12, 53-62, 2005) によってcDNA合成を行った。cDNA断片をプラスミドベクターpGCAPzf3（Tsugane, T. et al., Plant Biotechnology., 22, 161-165, 2005）に組み込み、cDNAライブラリーを構築した。【０１１８】
＜実施例２：カンゾウ属植物からのmRNA調製とcDNAライブラリー作製（２）＞
独立行政法人医薬基盤研究所の薬用植物資源研究センター筑波研究部（茨城県つくば市）において圃場栽培されていた定植後4年以上経過したと考えられるG. uralensisのストロンを10月に採取した。RNA抽出試薬TRIzol（登録商標）（life technologies社）及び精製カラムRNeasy（登録商標）（Quiagen社）を用いて添付のプロトコルに従い、トータルRNAを調製した。得られたトータルRNAからmRNAを調製し、オリゴキャップ法(Murayama, K. et al., Gene, 138, 171-174, 1994、及び、Suzuki, Y. et al., Gene, 200, 149-156)によりcDNA合成を行った。cDNA断片をプラスミドベクターpCMVFL3に組み込み、cDNAライブラリーを構築した。【０１１９】
＜実施例３：シークエンス解析（１）＞
実施例１で得られたcDNAライブラリーで大腸菌株DH12S（life technologies社）あるいはDH10B T1ファージレジスタント（life technologies社）を形質転換し、得られた約30,000個のシングルコロニーをピックアップし、384枚のプレート上に植菌した。コロニーPCRでシークエンス反応の鋳型にするDNAを増幅し、エタノール沈殿による精製を行った。それを鋳型にして、Applied Biosystems社のBigDye ver3.1を用いて、各cDNA断片の5’末端側から、シークエンス反応を行った。エタノール沈殿による精製後、Applied Biosystems社の3730xl DNA Analyzerを用いて塩基配列の解析を行った。【０１２０】
＜実施例４：シークエンス解析（２）＞
実施例２で得られたcDNAライブラリーで大腸菌株DH5αを形質転換し、得られた約26,000個のシングルコロニーをピックアップし、384枚のプレート上に植菌した。コロニーPCRでシークエンス反応の鋳型にするDNAを増幅し、エタノール沈殿による精製を行った。それを鋳型にして、Applied Biosystems社のBigDye ver3.1を用いて、各cDNA断片の5’末端側から、シークエンス反応を行った。エタノール沈殿による精製後、Applied Biosystems社の3730xl DNA Analyzer を用いて塩基配列の解析を行った。【０１２１】
＜実施例５：EST（Expression Sequence Tag）のクラスタリング＞
実施例３で得られた約30,000個のESTデータと実施例４で得られた約26,000個のESTデータを１つのデータセットに統合し、PHRAPプログラム（http://www.phrap.org）を用いてクラスタリングを行った。その結果、10,372個のユニークなコンティグを得た。【０１２２】
＜実施例６：相同性検索によるファミリー1糖転移酵素遺伝子の抽出＞
実施例５で得られた10,372個のコンティグ配列をクエリとして、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに登録されている既知タンパク質に対するBLASTX検索 (Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)を行った。ファミリー1糖転移酵素がグリチルレチン酸以降のグリチルリチン生合成経路（図２）に関与すると予測し、当該データベースに登録されている既知のファミリー1糖転移酵素に高い相同性を示すコンティグを選抜した。選抜したコンティグを構成する複数のESTクローンから、最も長い5’末端領域を保持すると判定されるものについて、プラスミドDNAを調製し、クローン化された各cDNA断片（31個）の全長塩基配列を決定した。【０１２３】
＜実施例７：遺伝子発現解析（候補遺伝子のスクリーニング）＞
実施例６で得られた31個のファミリー1糖転移酵素遺伝子群からグリチルリチン生合成に関わる可能性が高い分子種を選抜するために、各ファミリー1糖転移酵素分子種が植物体のどの組織で発現しているのかをRT-PCR法により調べた。グリチルリチンを高蓄積する地下部組織（肥大根及びストロン）とグリチルリチンが検出されない地上部組織（葉及び茎）の計4種の異なる組織からトータルRNAを調製した。得られたトータルRNA 1μgを用いて、SMART RACE cDNA amplification kit (clontech社)を用いて添付のプロトコルに従い、ファーストストランドcDNA合成を行った。【０１２４】
続いて、各ファミリー1糖転移酵素に特異的にアニールするセンス及びアンチセンスプライマーを設計し、上記4種のファーストストランドcDNA 各2μLを鋳型として、Ex TaqTM DNAポリメラーゼ（TaKaRa社）を用いて、25〜30サイクルのPCRを行った。得られたPCR断片をアガロースゲル電気泳動で分析し、根及びストロンでの発現が特に高いファミリー1糖転移酵素分子種を選抜した。【０１２５】
結果の一部を図３に示す。グリチルリチンの生合成系に関与するβ−アミリン合成酵素（bAS：β-amyrin synthetase）遺伝子（図１参照）、CYP88D6遺伝子及びCYP72A154遺伝子（図２参照）は、ストロンと根部で強い発現が確認できる。同様の発現パターンが実施例６で得られた31個の候補遺伝子のうち図３に示すGuUGT73.8遺伝子でも確認された。そこで、このGuUGT73.8遺伝子について、以下の実施例に示す実験を行った。【０１２６】
＜実施例８：GuUGT73.8遺伝子クローニング＞
実施例７のスクリーニングで得られたグルクロン酸転移酵素候補GuUGT73.8の全長遺伝子をクローニングした。【０１２７】
GuUGT73.8遺伝子の全長コード領域を単離した。具体的には、実施例７において作製した肥大根由来のトータルRNAを用いて調製したファーストストランドcDNAを鋳型に、GuUGT73.8ポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）として、KOD-plus-DNA Polymerase（TOYOBO社）を用いてアニール温度56℃、反応温度68℃で30サイクルのPCRを行った。なお、配列番号１で示すフォワードプライマーには5’末端に4塩基（cacc）が付加されているが、これはpENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（life technologies社）へのクローニング用である。PCRにより増幅されたDNA断片をpENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクターにクローニングし、得られた3個の独立クローン（pENTRTM/D-TOPO-GuUGT73.8）について塩基配列を決定した。その結果得られたGuUGT73.8遺伝子の塩基配列が配列番号５であり、またそれから推定されるGuUGT73.8のアミノ酸配列が配列番号４である。【０１２８】
BLASTを用いた相同性検索により、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するGuUGT73.8は、新規のタンパク質であることが明らかとなった。【０１２９】
＜実施例９：ミヤコグサ由来GuUGT73.8オルソログ遺伝子の探索＞
G. uralensisと同じマメ科植物であるミヤコグサにおいてGuUGT73.8遺伝子と類似した機能を有することが期待されるオルソログ遺伝子を探索した。【０１３０】
ミヤコグサのゲノム情報データベースであるmiyakogusa.jp（http://www.kazusa.or.jp/lotus/release1/index.html）内のBLAST相同性検索機能を使用し、GuUGT73.8に高いアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードしうる2種の部分塩基配列、LjSGA_046111及びLjSGA_014618を見出した。これらの配列の一部は重複しており、同一のポリペプチドのそれぞれN末端及びC末端側をコードするものと推定された。LjSGA_046111及びLjSGA_014618から推定されるポリペプチドはGuUGT73.8に対して66％のアミノ酸同一性を示した。【０１３１】
＜実施例１０：ミヤコグサ由来GuUGT73.8相同遺伝子の単離＞
ミヤコグサ（MG20）を人工気象器内（23℃、日長16時間）で育成し、発芽後4週間目の植物の葉、根からそれぞれトータルRNAを調製した。得られたトータルRNAを1μg用いて、SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech社)を用いて添付のプロトコルに従いファーストストランドcDNA合成を行った。ファーストストランドcDNA各2μLを鋳型として、LjSGA_046111及びLjSGA_014618から推定されるポリペプチドのN末端とC末端に相当する箇所のオリゴDNAをそれぞれフォワードプライマー（配列番号６）及びリバースプライマー（配列番号７）に用い、KOD plus ver.2 polymerase（TOYOBO社）を用いてアニール温度56℃、反応温度68℃で35サイクルのPCRを行った。なお、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）エントリーベクター（life technologies社）へのクローニングの際に必要であることから、配列番号Aのプライマーには、5’末端に4塩基（cacc）が人工的に付加されている。根由来のファーストストランドcDNAから増幅されたDNA断片をpENTRTM/D-TOPOエントリーベクターにクローニングし、得られた3個の独立クローンについてポリヌクレオチド配列を決定した。これにより得られた配列が配列番号８であり、それから推定されるポリペプチド配列が配列番号９である。配列番号９のアミノ酸配列は配列番号４に示すアミノ酸配列に対して66.9％の同一性を有していた。【０１３２】
＜実施例１１:酵母発現用ベクターの構築＞
実施例８において作製した、配列番号５に示すポリヌクレオチドを有するプラスミド（エントリークローン）とデスティネーションベクターpYES-DEST52（life technologies社）を混合し、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（life technologies社）を用いて塩基配列特異的な組み換え反応（GATEWAY attL × attR反応）により、配列番号５で示すDNA断片をpYES-DEST52に移し替えることで配列番号５に示す遺伝子の酵母発現ベクターpDEST52-GuUGT73.8を得た。【０１３３】
＜実施例１２：形質転換酵母の作製＞
酵母INVSc1株（life technologies社）（MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 MATAlpha his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52）に、実施例１１で得られたpDEST52-GuUGT73.8を導入した。陰性対照として、INVSc1株に空ベクターに相当するpYES2/CT（life technologies社）を導入した。酵母の形質転換は、Frozen-EZ Yeast Transformation II（Zymo Research社）を用いて添付のプロトコルに従い行った。【０１３４】
＜実施例１３：形質転換酵母におけるGuUGT73.8の発現＞
pDEST52-GuUGT73.8又は陰性対照用pYES2/CTを保持する形質転換酵母を、2％ラフィノースを含む10mLのYeast nitrogen base（YNB）培地（-Ura）を用いて、30℃、165rpmで25時間振とう培養した。その後、1mLの20％ガラクトースを添加し、30℃で25時間さらに振とう培養した。培養液を3,000g、4℃で10分間遠心して酵母細胞のペレットを得た。得られた酵母細胞のペレットを400μLの抽出バッファ（pH7.0、50mM Tris、1mM DTT、14.4mM β-メルカプトエタノール、20％ Glycerol）に懸濁した後、同体積のガラスビーズ（SIGMA社）を加えた。酵母細胞を破砕するために、30秒間ボルテクスミキサーで激しく撹拌した後、温度上昇による酵素活性の失活を防ぐため直ちに氷上に移し1分間置く操作を15回繰り返した。得られた液体を、10,000g、4℃で10分間遠心した後、上清を酵母タンパク抽出物として回収した。その結果、配列番号３に示すポリペプチド（GuUGT73.8）を発現する形質転換酵母由来のタンパク抽出物（サンプルA）と、GuUGT73.8を発現しない空ベクターのみの形質転換酵母由来のタンパク抽出物（サンプルB）を得た。Bio-Rad Protein Assay（Bio-Rad社)を用いてサンプルA及びサンプルBにおけるタンパク質濃度を測定した。【０１３５】
＜実施例１４：酵母タンパク抽出物を用いたin vitro酵素アッセイ＞
実施例１３で得られた200μgサンプルA及びサンプルB（80μLのボリュームに調整）、10μLの1Mトリス−塩酸バッファ（pH7.0）、5μLの400mM MgCl2、0.2μLの14.4mM β-メルカプトエタノール、4μLの30mM グリチルレチン酸モノグルクロニド（糖受容体基質）、10μLの100mM UDP-グルクロン酸（糖供与体基質）、91μLの滅菌水を混合した後、30℃、1,000rpmにて撹拌させながら24時間インキュベートし、糖（グルクロン酸）転移反応を行った。インキュベート後に得られた溶液をそれぞれ反応溶液A及び反応溶液Bとした。【０１３６】
＜実施例１５：変換物の同定＞
実施例１４で得られた反応溶液A及びBを200μLの1-ブタノールで抽出した。1-ブタノール区100μLとメタノール400μLを混合し、LC-MS分析の試料とした。LC-MS分析は、LC部 (1100 series, Agilent Technologies)とMS部(QSTAR PULSAR, Applied Biosystems)を連結した機器で行った。カラムにはセンシューパック25 cm × 2 mm i.dを用い、溶媒は0.1%酢酸-アセトニトリル:0.1%酢酸-水 = 20:80 (0〜2分), 20:80-95:5 (2〜12分), 95:5 (12〜20分)、流速は0.2 mL/分の条件にて分析した。変換物の同定は、実施例１４で調製したグリチルレチン酸モノグルクロニド及びグリチルリチンを標品としてLCの保持時間及びMSスペクトルを比較することで決定した。【０１３７】
実施例１４でサンプルAを用いて酵素アッセイを行った反応溶液Aからは、糖受容体基質であるグリチルレチン酸モノグルクロニドに相当するピークが検出された（図４−１：白矢印）ほか、グリチルレチン酸モノグルクロニドに1分子のグルクロン酸が付加したと考えられる1本のピーク（図４−１、黒矢印）が検出された。そのピークの保持時間及びマススペクトルが、グリチルリチンと良く一致した。【０１３８】
一方、陰性対照である実施例１４でサンプルBを用いて酵素アッセイを行った反応溶液Bからは、図４−１と同様に、糖受容体基質であるグリチルレチン酸モノグルクロニドに相当するピークは検出された（図４−２：白矢印）。しかし、図４−１の黒矢印で示されるグリチルリチンに相当するピークは検出されなかった。【０１３９】
以上の結果から前記実施例７で得られた新規酵素GuUGT73.8は、グリチルレチン酸モノグルクロニドの2位のヒドロキシ基にさらにグルクロン酸が転移することによってグリチルレチン酸モノグルクロニドをグリチルリチンに変換するグルクロン酸第二転移活性を有する新規のグルクロン酸第二転移酵素と同定された。【０１４０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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