(57)【要約】  迅速、簡便、かつ高精度なインプリンティング疾患判定方法の提供。プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者から得られた検体の判定方法であって：（１）ヒト検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する工程；（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；（４）工程（３）で得られた検出シグナルのパターンにより、該検体をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないヒトから得られた検体であるか、プラダーウィリ候群患者から得られた検体であるか、アンジェルマン症候群患者から得られた検体であると判定する工程、を含む方法。
2016024634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者から得られた検体の判定方法であって：
（１）ヒト検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該検体をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないヒトから得られた検体であると判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をプラダーウィリ候群患者から得られた検体であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をアンジェルマン症候群患者から得られた検体であると判定する、工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーセットが、配列番号８で示される塩基配列のプライマーと配列番号９で示される塩基配列のプライマーからなるプライマーセットである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者の判定方法であって：
（１）被験者から採取された検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該被験者をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないと判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をプラダーウィリ候群患者であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をアンジェルマン症候群患者であると判定する、工程、
を含む方法。
【請求項６】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーセットが、配列番号８で示される塩基配列のプライマーと配列番号９で示される塩基配列のプライマーからなるプライマーセットである、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者を判定するための情報の取得方法であって：
（１）ヒト検体由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのタイプを以下のいずれかに分類する工程、
（i）メチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰であるシグナル
（ii）メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
（iii）非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
を含む方法。
【請求項１０】
前記プライマーセットが、配列番号８で示される塩基配列のプライマーと配列番号９で示される塩基配列のプライマーからなるプライマーセットである、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ＤＮＡの検出を利用した染色体機能異常の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エピジェネティックが様々な生命現象に関与することが認識され、その解析に関わる研究が盛んに行われている。特に、ＤＮＡの異常なメチル化が遺伝子疾患に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。異常なＤＮＡメチル化により引き起こされる代表的な遺伝子疾患の１つに、ゲノムインプリンティングを原因とするインプリンティング疾患がある。ゲノムインプリンティング（遺伝子刷り込み、単にインプリンティングともいう）とは、特定の遺伝子について、定められた一方の親（父または母）から継承した遺伝子のみが選択的に機能し、他方の遺伝子は機能しないというアレル特異的発現が見られる現象である。インプリンティングは、哺乳類胎児の正常な発生、胎盤機能または神経行動学的発達において重要な役割を果たす。ゲノムインプリンティングを受ける遺伝子（インプリンティング遺伝子）は、２本あるアレル（対立遺伝子）のうち特定の片親由来のものが識別されて、片親性発現を示す。そしてこのようなインプリンティング遺伝子の片親性発現には、アレル特異的メチル化領域（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ；ＤＭＲ）でのＤＮＡメチル化が必須であることが、これまでの研究から明らかになっている。ＤＭＲは遺伝子のプロモーター領域やイントロン等に多く存在し、特に、ＣｐＧ部位（ＣｐＧジヌクレオチド、ＣＧ配列）が密集したＣｐＧアイランドでのＤＮＡメチル化がゲノムインプリンティングに重要な影響を及ぼすと考えられている。インプリンティング遺伝子のＤＭＲにおけるメチル化異常は、様々な疾患、例えばインプリンティング疾患、発達異常、悪性腫瘍等に関連するとされている。【０００３】
既に確立されたメチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）反応を利用した方法がある。この方法は、メチル化ＤＮＡの解析に最も汎用されている方法である。一本鎖ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すると、非メチル化シトシンはスルホン化、加水脱アミノ化、脱スルホン化を経て、ウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、最初に起こるスルホン化の反応速度が極めて遅いため、実際に行われる亜硫酸水素塩処理の反応時間の中ではシトシンのままである。従って、亜硫酸水素塩処理をしたＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、メチル化シトシンはシトシンのままであるが、非メチル化シトシンは、ウラシルからチミンに置き換わって増幅される。このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシンとチミンという塩基の違いを利用してメチル化状態を解析する。これを基本原理として汎用されている方法が、特許文献１、非特許文献１に記載のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ法（メチル化特異的ＰＣＲ解析法）、および非特許文献２、３に記載のバイサルファイトシークエンス法である。【０００４】
メチル化特異的ＰＣＲ解析法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅、およびアガロースゲル電気泳動を順に行い、両プライマーによる増幅産物の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。この方法は、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法であるが、解析に電気泳動法を利用する点で手間と時間がかかるという課題があった。【０００５】
バイサルファイトシークエンス法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡに共通のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）などにクローニングした後、シークエンス反応によりメチル化の有無を検出するものである。増幅した領域内の全てのＣｐＧ配列のメチル化の状態が分かるという利点があるが、解析に労力を要するので、多数の検体の解析には向いていない場合もある。【０００６】
一方、生化学や医学等の分野における核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子の分離分析には、簡便かつ短時間に精度良く検出できる方法としてイオン交換クロマトグラフィーが汎用されている。核酸のＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離する場合、一般的には核酸分子中に含まれるリン酸のマイナス電荷を利用して分離するアニオン交換クロマトグラフィーが用いられる。カチオン性の官能基をイオン交換基として有するカラム充填剤が充填されたアニオン交換クロマトグラフィー用カラムは既に市販され、各種研究分野で使用されている。【０００７】
さらに、カチオン性の官能基として強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有するカラム充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、２０ｍｅｒの非メチル化合成オリゴヌクレオチド間における一塩基の相違を分離分析できることが報告されている（特許文献２）。【０００８】
インプリンティング疾患の診断に有用な染色体異常の判定方法として、メチル化特異的ＰＣＲ解析法による染色体異常の判定方法が知られている。このメチル化特異的ＰＣＲ解析法による染色体異常の判定方法は、診断対象者の遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られる電気泳動パターンを観察することにより、染色体上における所定の遺伝子がメチル化されているか否かを判定して、この判定結果に基づいて染色体機能異常の判定を行なう方法である（例えば、特許文献３および非特許文献４〜７参照）。【０００９】
メチル化特異的ＰＣＲ解析法により判定され得る染色体機能異常の例に、プラダーウィリ症候群（Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＷＳ）およびアンジェルマン症候群（Ａｎｇｅｌｍａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＳ）がある。これらの疾患はどちらも、インプリンティング遺伝子の片親性発現が染色体の構造異常（欠失）または機能異常（片親性ダイソミー）により喪失していることで発症する疾患（インプリンティング疾患）である。プラダーウィリ症候群では、欠失例（母由来遺伝子がメチル化による刷り込みをうけて発現が抑制されている上に父由来遺伝子が欠失している場合）および非欠失例（片親性ダイソミーの場合）の両方で、父由来遺伝子の発現機能が喪失している。アンジェルマン症候群では、欠失例（父由来遺伝子が非メチル化による刷り込みをうけている上に母由来遺伝子が欠失している場合）および非欠失例（片親性ダイソミーの場合）の両方で、母由来遺伝子の発現機能が喪失している。【００１０】
図１は、メチル化特異的ＰＣＲ解析法によるプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群の判定方法の原理を示す図である。メチル化特異的ＰＣＲ解析法により、正常者から得られる電気泳動パターンと患者から得られる電気泳動パターンとを比較することによって、患者がプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群に該当するか否かについての診断に有用な染色体機能異常の判定を行なうことができる。【００１１】
すなわち、プラダーウィリ症候群の場合、正常者から得られる電気泳動パターンには、父方の染色体（ｐ）上に存在するメチル化されていない遺伝子によるバンド（図１の場合、１００ｂｐバンド）と母方の染色体（ｍ）に存在するメチル化された遺伝子（インプリンティング遺伝子）によるバンド（図１の場合、１７４ｂｐバンド）とが観測される。これに対して、患者から得られる電気泳動パターンには、欠失例の場合、非欠失例の場合を問わず、メチル化されていない遺伝子によるバンド（１００ｂｐ）が観測されず、母方の染色体（ｍ）に存在するメチル化された遺伝子（インプリンティング遺伝子）によるバンド（１７４ｂｐ）のみが観測される。【００１２】
また図１では、アンジェルマン症候群の場合、正常者から得られる電気泳動パターンには、父方の染色体（ｐ）上に存在するメチル化されていない遺伝子（インプリンティング遺伝子）によるバンド（図１の場合、１００ｂｐバンド）と母方の染色体（ｍ）に存在するメチル化された遺伝子によるバンド（図１の場合、１７４ｂｐバンド）とが観測される。これに対して、患者から得られる電気泳動パターンには、欠失例の場合、非欠失例の場合を問わず、メチル化された遺伝子によるバンド（１７４ｂｐ）が観測されず、父方の染色体（ｐ）に存在するメチル化されていない遺伝子（インプリンティング遺伝子）によるバンド（１００ｂｐ）のみが観測される。【００１３】
このため、メチル化特異的ＰＣＲ解析法によるプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群の判定方法は、欠失例の場合、非欠失例の場合を問わず染色体機能異常の判定を行なうことができる優れた判定方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５７８６１４６号公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１２／１０８５１６号パンフレット
【特許文献３】特開２００５−１２４４３１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,98 21−9826（1996）
【非特許文献２】Clark, S. J. et al., Nucleic acids Res (1994) 22, pp.2990-2997, "High sensitivity mapping of methylated cytosines"
【非特許文献３】新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版（村松正實・山本雅編），羊土社，pp.99-106,2003
【非特許文献４】A. Kuwano et al., Hum Mol Genet (1992), 6, pp.417-425, "Molecular dissection of the Prader-Willi/ Angelman syndrome region (15q11-13) by YAC cloning and FISH analysis."
【非特許文献５】T. Kubota et al., Hum Genet (1999), 104, pp.49-55, "A new assay for the analysis of X-chromosome inactivation based on methylation-specific PCR."
【非特許文献６】T. Kubota et al., Nature Genet (1997) 16, pp.16-17, "Methylation-specific PCR simplifies imprinting analysis"
【非特許文献７】T. Kubota et al., Cytogenet Genome Res (2002) 99, pp.276-284, "The proportion of cells with functional X disomy is associated with the severity of mental retardation in mosaic ring X Turner syndrome females"
【非特許文献８】Mutirangura A. et al., Genomics. 1993 Dec;18(3), pp.546-552, "A complete YAC contig of the Prader-Willi/Angelman chromosome region (15q11-q13) and refined localization of the SNRPN gene."
【非特許文献９】Zeschnigk M. et al., Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3), pp.387-95, "Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method."
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記したメチル化特異的ＰＣＲ解析法による染色体異常の判定方法は、プラダーウィリ症候群患者およびアンジェルマン症候群患者のいずれの診断にも有用な染色体機能異常の判定を行なうことができる優れた染色体異常の判定方法である。しかしながら、メチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅の工程において、ＰＣＲ増幅が十分に行われないことがあると、判定に誤りが生じる恐れがある。【００１７】
具体的には、父方の染色体（ｐ）上に存在するメチル化されていない遺伝子に対応する非メチル化配列特異的プライマー（以下、ｐ用プライマーセットという）によるＰＣＲ増幅が十分に行われない場合には、本来ＰＣＲ増幅される（ｐ）上に存在するメチル化されていない遺伝子領域が増幅されず、メチル化されていない遺伝子によるバンド（１００ｂｐ）が観測されないため、正常者であってもプラダーウィリ症候群と誤判定される恐れがある。【００１８】
その逆に、母方の染色体（ｍ）に存在するメチル化された遺伝子に対応するメチル化配列特異的プライマー（以下、ｍ用プライマーセットという）によるＰＣＲ増幅が十分に行われない場合には、本来ＰＣＲ増幅される（ｍ）上に存在するメチル化された遺伝子領域が増幅されず、メチル化された遺伝子によるバンド（１７４ｂｐ）が観測されないため、正常者であってもアンジェルマン症候群と誤判定される恐れがある。すなわち、コントロール測定なしで被験者の染色体のみを測定に供すると、偽陽性を生む場合がある。なおＰＣＲ増幅が十分に行われない要因として、凍結融解を繰り返したことによるプライマーの分解、酵素の失活、試薬の劣化等が挙げられる。【００１９】
このような判定の誤りを避けるためには、コントロールとして正常者の染色体を用いて、ｐ用プライマーセットとｍ用プライマーセットとの両方のプライマーを用いたときにＰＣＲ産物のバンドが観測されることを必ず確認しなければならない。さらには、ｐ用プライマーセットとｍ用プライマーセットの混合物を用いた場合にそれぞれのＰＣＲ産物の両方のバンドが観測されることを確認することが望ましい。このように、上記従来のメチル化特異的ＰＣＲ解析法では、偽陽性を防止するためのコントロールの測定に余分な手間がかかっていた。また、当該測定毎に電気泳動用のアガロースゲルを調製しなければならず、測定者にアガロースゲル調製の手間がかかっていた。【００２０】
そこで、本発明は、偽陽性を防止することができ、しかもコントロールの測定が不要な、迅速かつ簡便で信頼性の高いインプリンティング疾患の判定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡをＰＣＲで増幅して得たＰＣＲ増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することで、迅速かつ簡便にメチル化ＤＮＡを検出できることを見出した。さらに本発明者らは、該イオン交換クロマトグラフィーで得られるシグナルのパターンが、インプリンティング疾患の一種であるプラダーウィリ症候群患者およびアンジェルマン症候群患者から得られたＤＮＡとで異なること、当該パターンの違いを解析することでインプリンティング疾患を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００２２】
また本発明者らは、上記ＰＣＲ増幅産物とイオン交換クロマトグラフィーを用いた判定方法によれば、（１）ＰＣＲ増幅に用いるプライマーとして、ＤＮＡのメチル化によらず増幅させるプライマー、すなわち非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡとの区別なく増幅させる１セットのプライマーを使用すればよく、メチル化特異的ＰＣＲ解析法で一般的に使用されていたようなメチル化ＤＮＡ特異的プライマーおよび非メチル化ＤＮＡ特異的プライマーの２セットのプライマーを使用する必要がないこと、（２）メチル化特異的ＰＣＲ解析法およびバイサルファイトシークエンス法に比べて、分析時間および解析時間を短縮できること、（３）コントロールを置くことなくＰＣＲ増幅の異常を判断でき、偽陽性が原理的に生じないこと、を見出した。【００２３】
従って、本発明は以下を提供する。
〔１〕プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者から得られた検体の判定方法であって：
（１）ヒト検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該検体をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないヒトから得られた検体であると判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をプラダーウィリ候群患者から得られた検体であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をアンジェルマン症候群患者から得られた検体であると判定する、工程、
を含む方法。
〔２〕プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者の判定方法であって：
（１）被験者から採取された検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該被験者をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないと判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をプラダーウィリ候群患者であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をアンジェルマン症候群患者であると判定する、工程、
を含む方法。
〔３〕プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者を判定するための情報の取得方法であって：
（１）ヒト検体由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのタイプを以下のいずれかに分類する工程、
（i）メチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰であるシグナル
（ii）メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
（iii）非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
を含む方法。
〔４〕上記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕上記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕上記プライマーセットが、配列番号８で示される塩基配列のプライマーと配列番号９で示される塩基配列のプライマーからなるプライマーセットである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、迅速、簡便、かつ高精度なインプリンティング疾患判定方法を提供する。本発明によれば、メチル化特異的ＰＣＲ解析法で生じる恐れのあった偽陽性を生じることなく遺伝子のメチル化状態を判定できる。また、従来では偽陽性の有無を確認するために設置していたコントロールを置く必要がなくなる。また、詳細は後述するが、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーセットが一組で済み、かつバイサルファイトシークエンス法より迅速、簡便に遺伝子のメチル化状態を判定することができる。したがって本発明は、インプリンティング疾患の迅速な臨床検査に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】従来法（メチル化特異的ＰＣＲ解析法）によるプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群の判定方法を示す図。
【図２】正常者からの検体より得られたクロマトグラム。
【図３】プラダーウィリ症候群（ＰＷＳ）患者からの検体より得られたクロマトグラム。
【図４】アンジェルマン症候群（ＡＳ）患者からの検体より得られたクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書において、「インプリンティング疾患」とは、母性または父性インプリンティング遺伝子のアレル特異的メチル化領域におけるメチル化異常に起因する疾患を意味するものであり、具体的にはプラダーウィリ症候群、アンジェルマン症候群等を例示できる。また、本明細書において、「検体」又は「ヒト検体」を採取される被験者としては、インプリンティング疾患に特徴的な臨床症状、例えば、発達の遅れ、言語障害、動作の異常等によってインプリンティング疾患の疑いがある被験者が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、ＤＮＡの「メチル化を検出する」とは、当該ＤＮＡ領域におけるメチル化ＤＮＡの存在の有無もしくは存在量、存在量の比、または当該ＤＮＡのメチル化率を測定することを意味する。本明細書において、「ＤＮＡメチル化率」とは、検出の対象とする特定のＤＮＡ領域においてＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＤＮＡのＣｐＧアイランドにおける、全シトシン数（メチル化シトシンおよび非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表すことができる。
【００２８】
本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。また本明細書において、「ＣｐＧ領域（またはＣｐＧアイランド）」とは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列（すなわちＣｐＧサイト）が高頻度で出現する領域をいう。ＣｐＧアイランドは、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧ領域」とは、好ましくは、当該遺伝子のコード領域またはそれに近い領域に存在するＣｐＧ領域を意味し、または「（ある）遺伝子のＣｐＧサイト」とは、好ましくは、当該遺伝子のコード領域またはそれに近い領域に存在するＣｐＧサイト、より好ましくは上記ＣｐＧ領域に含まれるＣｐＧサイトを意味する。また好ましくは、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域」とは、当該遺伝子のプロモーターおよびその周辺領域に存在するＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域を意味する。本明細書において、「（ある）遺伝子のプロモーターおよびその周辺領域」とは、プロモーター領域とその下流に隣接するｅｘｏｎ領域および当該ｅｘｏｎ領域に隣接するイントロン領域を意味する。特定の遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法に基づいて同定することができる。
【００２９】
本明細書において、「高メチル化ＤＮＡ（または単にメチル化ＤＮＡともいう）を示すピーク」とは、測定の対象とされた遺伝子領域のＤＮＡメチル化率が、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上であるときに得られる検出シグナルを意味する。また、「低メチル化ＤＮＡ（または非メチル化ＤＮＡともいう）を示すピーク」とは、当該遺伝子領域のＤＮＡメチル化率が、例えば２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下であるときに得られる検出シグナルを意味する。なお、正常個体のゲノムＤＮＡにおいては、１５番染色体上のＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域におけるＤＮＡメチル化率がほぼ１００％のアレルと、ほぼ０％のアレルが１：１で混在していることが知られている。一方、同じ遺伝子領域におけるＤＮＡメチル化率が、プラダーウィリ症候群個体ではほぼ１００％であること、またアンジェルマン症候群ではほぼ０％であること、が知られている。
【００３０】
本明細書において、「検出シグナル（またはそのピーク）が実質的に二峰である」、「検出シグナル（またはそのピーク）が実質的に一峰である」、「検出シグナル（またはそのピーク）が実質的に認められない」といった、ピークの「実質的な」判定は、ＪＩＳ  Ｋ  ０１２７：２０１３  イオンクロマトグラフィー通則に従い、定量下限、好ましくは検出下限を求め、ピークを判定することを意味する。
【００３１】
本明細書において、「コントロール」とは、期待通りにＰＣＲ増幅が行われたことを確認するための対照試料（例えば、正常検体）を指す。
【００３２】
本発明は、以下、
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者から得られた検体の判定方法であって：
（１）ヒト検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該検体をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないヒトから得られた検体であると判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をプラダーウィリ候群患者から得られた検体であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をアンジェルマン症候群患者から得られた検体であると判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３３】
あるいは、本発明は、以下、
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者の判定方法であって：
（１）被験者から採取された検体から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該被験者をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないと判定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をプラダーウィリ候群患者であると判定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該被験者をアンジェルマン症候群患者であると判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３４】
さらに本発明は、以下、
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者から得られた検体の同定方法であって：
（１）ヒト検体由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）（i）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰である場合、該検体をプラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していないヒトから得られた検体であると同定し、
（ii）工程（３）で得られた検出シグナルがメチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をプラダーウィリ候群患者から得られた検体であると同定し、
（iii）工程（３）で得られた検出シグナルが非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰である場合、該検体をアンジェルマン症候群患者から得られた検体であると同定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、以下、
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群から選択される疾患を有する患者を判定するための情報の取得方法であって：
（１）ヒト検体由来のゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅するプライマーセットであって、メチル化された該ＤＮＡとメチル化されていない該ＤＮＡの両方の亜硫酸水素塩処理物を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのタイプを以下のいずれかに分類する工程、
（i）メチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰であるシグナル
（ii）メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
（iii）非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に一峰であるシグナル
を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明の方法において、被験者から採取されたヒト検体としては、ＤＮＡを含む組織またはその細胞であればよく、例えば、血液、血球、皮膚線維芽細胞などの組織細胞、尿、糞便、唾液、その他体液や分泌液中に存在する細胞等が挙げられる。検体採取による被験者への侵襲を軽減させ、より効率よくＤＮＡメチル化検出を行えるという観点からは、末梢血、リンパ球、リンパ芽球等を、胎児の遺伝子を診断するという観点からは、羊水細胞、絨毛組織を用いることが望ましい。
【００３７】
上記検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ゲノムＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、または市販のＤＮＡ抽出キット、例えば後述するＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。
【００３８】
次いで、抽出したゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｔｕｒｂｏ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００３９】
次いで、亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては特に制限はなく、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。
【００４０】
プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群については、ヒト１５番染色体領域のＳＮＲＰＮ遺伝子におけるＤＮＡメチル化と関連していることが報告されている（非特許文献８）。したがって、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、好ましくは、ＳＮＲＰＮ遺伝子を含む上記疾患の関連遺伝子におけるＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化を検出できるように選択され、より好ましくは、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域のＤＮＡメチル化を検出できるように選択される。例えば、標的ＤＮＡは、上記疾患の関連遺伝子のいずれかのコード領域および／またはプロモーターとその周辺領域の一部または全部をコードするＤＮＡである。好ましくは、上記疾患の関連遺伝子のいずれかのプロモーターとその周辺領域の一部または全部をコードするＤＮＡである。より好ましくは、標的ＤＮＡは、ＳＮＲＰＮ遺伝子のコード領域および／またはプロモーターとその周辺領域のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域の一部または全部をコードするＤＮＡであり、さらに好ましくは、ＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーターとその周辺領域のＣｐＧサイトまたはＣｐＧ領域の一部または全部をコードするＤＮＡである。
【００４１】
ＳＮＲＰＮ遺伝子はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０７３７１６、ＮＰ＿０７３７１７、ＮＰ＿０７３７１８、またはＮＰ＿０７３７１９で特定されるタンパク質（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ）をコードする遺伝子であり、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ４１３８４にゲノム配列が示される。
【００４２】
表１には、ＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーター領域、ｅｘｏｎ  １領域、およびｉｎｔｒｏｎ  １領域を含むｅｘｏｎ  αの塩基配列（配列番号１；ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ３２７０２）を示す。本発明において、ＤＮＡメチル化の検出対象として好ましいＣｐＧサイトとしては、配列番号１で示す配列上の、７６〜７７位、１０８〜１０９位、１２１〜１２２位、１２７〜１２８位、１２９〜１３０位、１３３〜１３４位、１４９〜１５０位、１５１〜１５２位、１６３〜１６４位、１７５〜１７６位、１８５〜１８６位、１９６〜１９７位、２０５〜２０６位、２１７〜２１８位、２２１〜２２２位、２２４〜２２５位、２３７〜２３８位、２５４〜２５５位、２６４〜２６５位、２６６〜２６７位、２７４〜２７５位、２９３〜２９４位、および３２７〜３２８位からなる群（２３箇所）より選択される少なくとも１つの位置に存在するＣｐＧサイトである。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
従って、本発明の方法におけるＰＣＲ増幅に用いるＰＣＲプライマーセットは、好ましくは、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである。より具体的には、メチル化されたＳＮＲＰＮ遺伝子ＣｐＧ領域ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物と、メチル化されていないＳＮＲＰＮ遺伝子ＣｐＧ領域ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物との両方を増幅することができるプライマーセットである。言い換えれば、ＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡであってＣｐＧ領域のシトシンがウラシルに変換されているＤＮＡと、ＣｐＧ領域のシトシンがそのまま保存されているＳＮＲＰＮ遺伝子のＣｐＧ領域のＤＮＡとを、両方とも増幅することができるプライマーセットである。
【００４５】
上記プライマーセットの各プライマーの鎖長は、増幅すべき標的ＤＮＡの鎖長や、標的ＤＮＡ中に含まれるＣｐＧサイトの数に依存するが、好ましくは１５〜３５ｍｅｒである。
【００４６】
本発明の方法におけるＰＣＲ増幅に用いるＰＣＲプライマーセットのより好ましい例としては、実施例１に示す、配列番号８で示される塩基配列のプライマーと配列番号９で示される塩基配列のプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。
【００４７】
ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧサイトが多いＤＮＡの亜硫酸水素塩物を鋳型に用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧサイトが少ないＤＮＡの亜硫酸水素塩物を鋳型に用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは７００ｂｐ、さらに好ましくは５００ｂｐを上限とし、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０〜４０ｂｐが下限となる。一方で、ＰＣＲ増幅産物中におけるＣｐＧサイトに相当する領域の含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンに由来する塩基の数が、ＰＣＲ増幅産物の塩基数（鎖長）に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。
【００４８】
続いて、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、特許文献２に示される充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。
【００４９】
本明細書において、上記強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、上記強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。
【００５０】
上記強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。また、上記強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
【００５１】
上記基材粒子の表面に導入される上記強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。上記強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００５２】
本明細書において、上記弱カチオン性基とは、ｐＫａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、上記弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、上記弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、上記弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。
【００５３】
上記弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等が挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。
【００５４】
上記基材粒子の表面に導入される上記弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。上記弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００５５】
上記基材粒子表面の強カチオン性基または弱カチオン性基量は、アミノ基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として例えばケルダール法が挙げられる。後述の実施例に記載の充填剤の場合には、まず、重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量し、次いで、弱カチオン性基を導入した後の強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素を定量することにより、後から導入した弱カチオン性基量を算出することができる。このように定量することにより、充填剤を調製する際に、強カチオン性基量および弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。
【００５６】
上記基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。
【００５７】
上記疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
【００５８】
上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、またはジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレートまたはメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリルまたはメタクリルを意味する。
【００５９】
上記反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００６０】
上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。
【００６１】
上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、上記疎水性架橋重合体における上記疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。
【００６２】
本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記基材粒子の表面に、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体において、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。
【００６３】
上記強カチオン性基を有する親水性重合体は、強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、上記強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、強カチオン性基を有する親水性単量体と強カチオン性基を有しない親水性単量体を共重合させる方法等が挙げられる。
【００６４】
上記強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。
【００６５】
上記被覆重合体粒子の表面に上記弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、上記弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いでグリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法、上記疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法、３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて上記強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法、カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法、エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、エステル結合部を加水分解した後、次いで、加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法等が挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。
【００６６】
グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる上記３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基を有する試薬であれば、特に限定されない。上記３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な試薬としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。
【００６７】
上記強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、上記弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、上記強カチオン性基が上記弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、上記弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、上記強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。
【００６８】
本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に用いられる上記基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。上記平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。上記平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお、本明細書において上記平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。
【００６９】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。
【００７０】
上記溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。
【００７１】
上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、上記弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。
【００７２】
上記溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩や、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。上記塩は、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。
【００７３】
上記溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７４】
さらに、本発明のイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明のイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。
【００７５】
上記溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ43-）、硫酸イオン（ＳＯ42-）、アンモニウムイオン（ＮＨ4+）、カリウムイオン（Ｋ+）、ナトリウムイオン（Ｎａ+）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオンおよびアンモニウムイオンが好適に用いられる。上記アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。なお、上述のアンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれる。このような成分を使用する場合、溶離液に含まれる塩としての性質または緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。
【００７６】
本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるアンチカオトロピックイオンの分析時の濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。
【００７７】
上記アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また上記アンチカオトロピックイオンは、充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用を強める効果または緩衝能と、ＰＣＲ増幅産物をカラムから溶出させる効果の両方の役割を備えていても良い。
【００７８】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上である。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が３０℃未満であると充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が４５℃未満である場合、メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（メチル化ＤＮＡサンプル）と非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（非メチル化ＤＮＡサンプル）との保持時間の差が小さいことがある。さらに、カラム温度が５５℃以上、好ましくは６０℃以上では、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間の差がさらに広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出が可能になる。
【００７９】
さらに、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が高くなると、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルとが明瞭に分離されるので、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの存在比率に従って両者の保持時間のピーク面積またはピーク高さに差異が生じやすくなる。したがって、カラム温度を高くすれば、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間のピークの面積または高さに基づいて、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡそれぞれの存在量や存在比率を測定することがより容易になる。
【００８０】
一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、ＰＣＲ増幅産物中の核酸分子の二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらにより好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。
【００８１】
上記イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されずカラムのイオン交換容量および試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、上記流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能および分析対象物（ここではＰＣＲ増幅産物）の特性に合わせ適宜調整すればよい。
【００８２】
本発明においては、上述した手順で亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、検体から調製したゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡのメチル化を検出する。
【００８３】
ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、当該ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。したがって、ＰＣＲ増幅産物中のＤＮＡは、メチル化率に応じた異なる配列を有する。上記ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけると、当該増幅産物中に含まれるＤＮＡの塩基配列に応じて、異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。
【００８４】
すなわち、検体から抽出したＤＮＡがメチル化しているほど、上記ＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間は短くなり、逆にメチル化の程度が低ければ、検出シグナルのピークの保持時間は長くなる。また、各検出シグナルのピークの高さは、該ピークに相当するメチル化率のＤＮＡの存在比率が高いことを表す。
【００８５】
ＳＮＲＰＮ遺伝子は、正常者の場合、父方の染色体（ｐ）に由来する非メチル化遺伝子と母方の染色体（ｍ）に由来するメチル化遺伝子（インプリンティング遺伝子）とが存在する。従って、正常者（非プラダーウィリ症候群、非アンジェルマン症候群）から得られた上記ＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークは、保持時間の長い非メチル化ＤＮＡ由来のピークと保持時間の短いメチル化ＤＮＡ由来のピークとの、実質的に二峰性になる。
【００８６】
一方、プラダーウィリ症候群患者では、欠失例（母方刷込の上に父由来遺伝子が欠失している場合）および非欠失例（片親性ダイソミーの場合）の両方で父由来の非メチル化ＳＮＲＰＮ遺伝子が欠失しているため、母方の染色体（ｍ）に由来するメチル化ＳＮＲＰＮ遺伝子のみが存在する。したがって、上記ＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークは、実質的に、保持時間の短いメチル化ＤＮＡ由来のピークのみとなる。
【００８７】
また一方、アンジェルマン症候群患者では、欠失例（父方刷込の上に母由来遺伝子が欠失している場合）および非欠失例（片親性ダイソミーの場合）の両方で母由来のメチル化遺伝子が欠失しているため、父方の染色体（ｐ）に由来する非メチル化ＳＮＲＰＮ遺伝子のみが存在する。したがって、上記ＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークは、実質的に、保持時間の長い非メチル化ＤＮＡ由来のピークのみとなる。
【００８８】
本発明の方法において、クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ/ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示すると、具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、選択した遺伝子マーカーの種類、検体の量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。
【００８９】
クロマトグラフィーにより得られた検出シグナルのピークの保持時間は、ＰＣＲ増幅産物、クロマトグラフィーの条件などに依存して変動し得る。例えば、ＰＣＲ増幅産物の長さや、クロマトグラフィーの条件を予め決定してメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡのピークの保持時間を調べておくか、または同じ条件で調べた正常検体の結果とピークの保持時間を比較することにより、目的のピークがメチル化ＤＮＡに由来するか非メチル化ＤＮＡに由来するかをより正確に判断することができる。
【００９０】
本発明の方法においては、上記検体由来のＰＣＲ増幅産物のイオン交換クロマトグラフィーによる検出シグナルのパターンについて調べる。その結果、（i）メチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの実質的に二峰が得られる場合には、該検体を、正常者（プラダーウィリ症候群およびアンジェルマン症候群のいずれにも罹患していない被験者）から得られた検体であると判定し、（ii）メチル化を示すピーク（保持時間の短いピーク）の実質的に一峰のみが得られる場合には、該検体を、プラダーウィリ症候群患者から得られた検体であると判定し、（iii）非メチル化を示すピーク（保持時間の長いピーク）の実質的に一峰のみが得られる場合には、該検体を、アンジェルマン症候群患者から得られた検体であると判定する。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９２】
〔組織サンプル〕
２０１０年１月から２０１４年５月までに、計８検体についてインプリンティング疾患（プラダーウィリ症候群、アンジェルマン症候群）の診断依頼があった。検体は全て末梢血であった。なお、参考例１および実施例１で用いた検体はすべて、遺伝学的研究について同意を得た上で、入手時点で匿名化されていた検体である。【００９３】
〔参考例１〕従来法によるインプリンティング疾患判定
従来法によるインプリンティング疾患判定は全て、非特許文献６に記載のメチル化特異的ＰＣＲ解析法を用いたインプリンティング疾患の判定方法に従って行った。メチル化ＤＮＡ判定方法の１つであるメチル化特異的ＰＣＲ解析法にて、ＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーター領域およびｅｘｏｎ１領域のＣｐＧサイト（表１）についてのＤＮＡメチル化レベルを検出した。メチル化特異的ＰＣＲ解析法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅、アガロースゲル電気泳動を順に行い、両プライマーによる増幅産物の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。【００９４】
まず、前記ＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランドに対し、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてメチル化配列特異的プライマーおよび非メチル化配列特異的プライマーのプライマー設計を行った。【００９５】
続いて、前記検体である末梢血からリンパ球を得て、ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の指示説明書に従ってＤＮＡを抽出した。そしてＤＮＡ（０．２〜２ｍｇ）を既報（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２９９０−２９９７，１９９４；Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９８２１−９８２６，１９９６）に従って亜硫酸水素塩で処理した。すなわち、ＤＮＡ（０．２〜２ｍｇ）を水酸化ナトリウムで変性させ、ヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ）および亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）と共に一晩５５℃でインキュベートした。ＤＮＡはＷｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、化学反応は水酸化ナトリウムにより終了させた。エタノール沈殿後、処理したＤＮＡを５０μＬ  ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に再懸濁した。処理したＤＮＡを鋳型として用いて、それぞれ、下記のように設計された２種のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。【００９６】
ＳＮＲＰＮ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ３２７０２：ｅｘｏｎ  α）のＣｐＧアイランドについて、メチル化アレルの増幅のためにＳＮＲＰＮ−Ｍプライマーセット（ＳＮＲＰＮ−Ｍ  ｆｏｒおよびＳＮＲＰＮ−Ｍ  ｒｅｖ）を、同様に、非メチル化アレルの増幅のためにＳＮＲＰＮ−Ｐプライマーセット（ＳＮＲＰＮ−Ｐ  ｆｏｒおよびＳＮＲＰＮ−Ｐ  ｒｅｖ）を、亜硫酸水素ナトリウムで改変されたＤＮＡ配列に対して設計した（表２）。【００９７】
本解析に用いたプライマーの配列（配列番号２〜５）と該プライマーのセットを用いて増幅されたＰＣＲ増幅産物の配列（配列番号６〜７）を、表２および３に示す。【００９８】
【表２】
2016024634.tif 000004
【００９９】
【表３】
2016024634.tif 000005
【０１００】
ＰＣＲにおいて、ポリメラーゼは９５℃で１０分間活性化した。ＤＮＡは、パーキンエルマーモデル９６００サーモサイクラーにより、９４℃３０秒、６０℃３０秒、および７２℃３０秒の３５サイクル、次いで最後に７２℃７分間の伸長という条件で行った。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ  ３０ｎｇ、１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，０．６Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、０．４μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含んだ３０μＬの反応液で行った。ただし、ｄｕｐｌｅｘ  ＰＣＲにおいては、１．２μｍｏｌ／Ｌ  ＳＮＲＰＮ−Ｍプライマーおよび０．４μｍｏｌ／Ｌ  ＳＮＲＰＮ−Ｐプライマーの濃度で反応させた。サイズマーカーは、各試料の正確なバンドサイズを得るために内部コントロールとして使用した。ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μＬを混ぜた後アプライして電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物を観察して目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。【０１０１】
メチル化特異的ＰＣＲ解析法の解析対象とした全ての領域に関し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、依頼のあった８検体についてプラダーウィリ症候群と、アンジェルマン症候群とを判別した。測定に供した計８検体の内訳は、プラダーウィリ症候群と判定された検体が２検体、アンジェルマン症候群と判定された検体が１検体、正常パターンと判定された検体が５検体であった。【０１０２】
〔実施例１〕クロマトグラフィーによるＤＮＡメチル化解析とインプリンティング疾患の判定
（１）サンプル調製
参考例１でインプリンティング疾患と判定された検体のうち、プラダーウィリ症候群と判定された２検体、アンジェルマン症候群と判定された１検体、正常パターンと判定された２検体とからゲノムＤＮＡを調製した。【０１０３】
（２）アニオン交換カラムの調製
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇおよび過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水およびアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。【０１０４】
得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。【０１０５】
（３）亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲ
（１）で得られたゲノムＤＮＡを、参考例１と同様の手順で亜硫酸水素塩処理し、次いでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ  ２５ｎｇ、１×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ2+ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ社製）、ならびに０．２μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマー、を含んだ５０μＬの反応液で行った。ポリメラーゼは９５℃で１０分間活性化した。ＤＮＡは、ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーにより、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃３０秒の３８サイクル、次いで最後に７２℃７分間の伸長という条件で行った。ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μＬを混ぜた後アプライして電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物を観察して目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。【０１０６】
次いでＰＣＲ増幅産物を、バイオダイナミクス社製ＴＡクローニングキットを使用し、クローニング、形質転換を行い、約２０個のコロニーを回収した。各コロニーからプラスミドを抽出し、Ｍ１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いてシークエンスし亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡ配列を決定した。メチル化状態を確認するため、ＱＵＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｑｕｍａ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／）を用いて解析した。【０１０７】
ＰＣＲでは、ＳＮＲＰＮ遺伝子のプロモーター領域およびｅｘｏｎ１領域を含む３４０ｂｐ領域を増幅した。本解析に用いたプライマーは、非特許文献９に開示されたプライマー（配列番号８および９）を用いた。各プライマーの配列を表４に、プライマー設計に用いたＳＮＲＰＮ遺伝子の推定配列（配列番号１０）を表５に、ＰＣＲ増幅産物の配列の例として、メチル化率０％の場合のＰＣＲ増幅産物の配列（配列番号１１）と、メチル化率１００％の場合のＰＣＲ増幅産物の配列（配列番号１２）を表６に示す。【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
【表６】
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【０１１１】
（４）ＨＰＬＣ分析
（２）で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行い、（３）で得られた各ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
分析時間：分析時間は１５分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：（２）で得られたＰＣＲ増幅産物
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：５μＬ
カラム温度：７０℃【０１１２】
正常パターン検体から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図２に、プラダーウィリ症候群検体から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に、アンジェルマン症候群検体から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。【０１１３】
本実施例にて用いたＳＮＲＰＮ遺伝子プロモーター領域およびｅｘｏｎ１領域の３４０ｂｐ領域においては、正常パターン検体の場合、図２に示されるように、父方の染色体（ｐ）上に存在するメチル化されていない遺伝子によるピーク（７．４５分付近）と母方の染色体（ｍ）に存在するメチル化された遺伝子によるピーク（７．２０分付近）とがクロマトグラム上に観測された。すなわち、正常パターン検体においては、父方染色体由来の非メチル化ＤＮＡの検出シグナルと、母方由来のメチル化ＤＮＡの検出シグナルとの、実質的に二峰のクロマトグラムが得られた。【０１１４】
プラダーウィリ症候群検体の場合、図３に示されるように、メチル化されていない遺伝子によるピーク（７．４５分付近）は観測されず、メチル化された遺伝子によるピーク（７．２０分付近）のみが観測された。すなわち、プラダーウィリ症候群検体においては、メチル化ＤＮＡの検出シグナルの、実質的に一峰のクロマトグラムが得られた。【０１１５】
アンジェルマン症候群検体の場合、図４に示されるように、メチル化されていない遺伝子によるピーク（７．４５分付近）のみが観測され、メチル化された遺伝子によるピーク（７．２０分付近）は観測されない。すなわち、アンジェルマン症候群検体においては、非メチル化ＤＮＡの検出シグナルの、実質的に一峰のクロマトグラムが得られた。【０１１６】
上記のようなクロマトグラフィーを用いた本発明の方法においては、ＰＣＲ増幅が十分に行われない場合には、メチル化されていない遺伝子によるピーク、およびメチル化された遺伝子によるピークのいずれもクロマトグラム上に観測されない。すなわち、ＰＣＲ増幅が十分に行われない場合には、実質的にピークの認められないクロマトグラムが得られる。そのため、本発明の方法においては、従来のメチル化特異的ＰＣＲ解析法による疾患判定において問題となっていた、ＰＣＲ増幅が十分に行われない場合の誤判定が生じない。また、同様に誤判定を生じないバイサルファイトシークエンス法が解析に数日程度かかるのに対し、本発明の方法では約１０分でクロマトグラムが得られるので、迅速かつ容易に疾患判定を行うことができる。【０１１７】
このように、本発明の方法では、ＰＣＲ増幅に非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物とメチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物とを区別なく増幅させるプライマーを使用し、得られる増幅産物をイオン交換クロマトグラフィー法にて分析し、クロマトグラムのパターンを解析することで、疾患判定において必要なプライマーセットを、メチル化特異的ＰＣＲ解析法で一般的に使用されていたメチル化ＤＮＡ特異的プライマーおよび非メチル化ＤＮＡ特異的プライマーの２セットから、１セットに減らすことができる。また、メチル化特異的ＰＣＲ解析法およびバイサルファイトシークエンス法に比べて、分析時間および解析時間を短縮することができる。さらに、本発明の方法では、コントロールを置くことなくＰＣＲ増幅の異常を判断でき、測定者の負担を軽減できる。さらに、メチル化特異的ＰＣＲ解析法によるインプリンティング疾患判定において問題となっていた、偽陽性の発生を回避することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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