(57)【要約】  本発明は、本発明者らの既発名の一連の人工ルシフェラーゼ（ALuc）に好適に利用可能な発光基質に関するものであり、ALucと共に用いることにより選択的な高輝度発光で、かつ発光安定性が高く、波長シフトしたスペクトルを提供するものである。  本発明により得られたALuc用の発光基質は、好適の発光発光溶液と共に発光キットを制作できるものである。本発明のALuc用生物発光基質は、従来の生物発光プローブ、ツーハイブリットアッセイ、発光カプセル、レポータージーンアッセイなどにおいて従来にない優れた発光特異性と機能性を提供できる。
2015056762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発光基質として用いるための、下記の一般式（１）で表される化合物の使用：
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【化１】
2015056762.tif 000013
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、セレンテラジンｎ（CTZ n）、セレンテラジンｉ（CTZ i）、セレンテラジンｆ（CTZ f）、セレンテラジンｈ（CTZ h）またはセレンテラジン400Ａ（CTZ 400A）である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
下記の化合物（Ａ）と、下記のポリペプチド（Ｂ）とを接触させる工程、及び
上記接触に基づく発光輝度を測定する工程を含む、生物発光アッセイ方法：
化合物（Ａ）：下記の一般式（１）で表される化合物；
【化２】
2015056762.tif 000014
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
ポリペプチド（Ｂ）：(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【請求項４】
下記の一般式（１）で表される化合物を含む、請求項３に記載の生物発光アッセイ方法に用いるための生物発光測定キット。
【化３】
2015056762.tif 000015
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、他の発光酵素と組み合わせて２つ以上の発光色を測定することを特徴とするマルチカラーイメージング法。
【請求項６】
レポータージーンアッセイ法、ツーハイブリットアッセイ法、発光カプセルアッセイ法又は一分子型生物発光プローブ測定法である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
下記の化合物（Ａ）と、下記のポリペプチド（Ｂ）とを接触させる工程、及び
上記接触に基づく発光エネルギーが他の蛍光蛋白質に遷移する工程、
上記発光エネルギーが遷移した蛍光蛋白質の発光輝度を測定する工程を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法：
化合物（Ａ）：下記の一般式（１）で表される化合物；
【化４】
2015056762.tif 000016
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
ポリペプチド（Ｂ）：(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年１０月１８日に出願された、日本国特許出願第２０１３−２１７５６０号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、海洋動物由来の生物発光酵素における共通遺伝情報を基に創製された人工生物発光酵素（ALuc）に好適に用いられる生物発光基質に関する。具体的には、ALucの利点である高輝度発光特性と発光持続性を導き出すために必要な基質に関するものであり、とりわけALucの立体構造を基盤した効率的な発光基質の設計及び開発に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年、生物発光酵素(ルシフェラーゼ)に関する多数の新規生物発光酵素の樹立が報告されている。例えば、プロメガ社によって深海海老由来の新規発光酵素の樹立が報告された(非特許文献１)。この酵素は従来のウミシイタケ由来の発光酵素(Renilla luciferase；RLuc)に比べて１/２の分子量(19kD)であり、100倍の発光輝度を示す。また、茂里らによって11種類のプランクトン由来の生物発光酵素が報告された(非特許文献２０)。これらの一部の発光酵素は、RLuc同様の輝度を示していると評価された。【０００４】
また、以前からAugaptiloidea superfamilyに属する深海発光動物が発見されてきた(非特許文献２)。他にMetridinidae familyに属するGaussia princeps由来の発光酵素(GLuc)やMetridia longa由来の発光酵素(MLuc)、Metridia pacifica由来の発光酵素類(MpLuc1，MpLuc2)が発見された(非特許文献１５，１９，２１)。【０００５】
また、最近ではInvivoGen社からLuciaと称された、カイアシ類発光酵素に類似した人工生物発光酵素が樹立された（http://www.invivogen.com/lucia）。【０００６】
一方で、これらの発光酵素の輝度や発光安定性を向上させるための研究も進められてきた。LoeningらはRLucにアミノ酸変異を導入する方法で、高輝度で安定的なRLuc変異体を樹立した(非特許文献１４)。この研究では、変異の導入箇所を特定するために、“consensus sequence-driven mutagenesis strategy”を用いた(非特許文献１３)。さらに、本研究者らは、親水性アミノ酸分布図を基に酵素活性部位を想定し変異を導入する手法で深海発光動物由来の発光酵素であるGLuc，MpLuc1及びMLucの高輝度化・高発光安定化に成功した(非特許文献１１)。【０００７】
本発明者らは、以前一つの発光酵素の配列を２つに分けて前と後の配列を、類似アミノ酸を中心に整列することによって、その発光特性に関わるヒントを得ようとするアプローチ(single sequence alignment；SSA)により熱力学的に安定な発光酵素配列を作り上げる提案を行った(非特許文献３)。この手法は、海洋動物由来の発光酵素には２つの酵素活性部位が存在するという前提に基づいている。この２つの酵素活性部位を、類似アミノ酸を中心に整列することによって前後の酵素活性部位の類似性を簡便に比較できる。前述したようにアミノ酸の頻度が熱力学的安定性に繋がるという仮説があることから、この前後の配列間の類似性を高めることによって熱力学的に安定的な発光酵素配列を作り上げようとするものである（特許出願番号：特願2012-237043）。【０００８】
一方、前述した生物発光酵素を「レポーター」として用いる様々な応用法も開発されてきた。Niuらは、このような生物発光酵素を「レポーター」とするバイオアッセイを“basic”、“inducible”，“activatable”の３つの類に分類した(非特許文献１６)。この分類は、レポータージーンの特性による分類である。まず、“basic”と“inducible”の違いは、レポーターの発現がプロモーターによって制御され尚且つ発現量の違いがあるかないかによる違いである。後で詳述する生物発光酵素をつけた抗体はBasicに該当し、bioluminescence resonance energy transfer(BRET)法やツーハイブリットアッセイは“inducible”の類に属する。一方、“activatable”の類に属するレポータージーンプローブは、レポーター自体がリガンド刺激に能動的に反応して発光することを特徴とする。後で詳述するprotein complentation assay(PCA)，protein splicing assay(PSA)や一分子型生物発光プローブ、発光カプセルなどは、“activatable”の類に属する。【０００９】
これらの生物発光酵素を「レポーター」とするバイオアッセイ(以下、単に「レポーター分析法」ともいう。)のうち、発光プローブについては、前述した新規発光酵素を基盤に様々な発光プローブの開発が活発に行われてきた。本発明者らは、従来から独自の分子設計技術を利用した生物発光イメージングに関する研究開発を行っている。具体的には、転写因子の核内移行や細胞質内非ゲノム的な蛋白質−蛋白質間相互作用を、蛋白質スプライシング法を用いて計測する手法を開発し(非特許文献７，８)、一つの分子内に、信号認識と生物発光に必要なすべての要素を集積した形態の一分子型生物発光プローブを開発した(非特許文献４，６)。その後、このプローブをマルチカラー化し、複数の信号伝達過程を同時にイメージングできるように発展させた(非特許文献１２)。さらに、生物発光プローブそのもののリガンド感受性を高める手法として、円順列置換(非特許文献９)や低分子量の発光酵素を用いた分子設計技術(非特許文献１２)を開発した。これらの研究は、いずれも細胞・非細胞系における分子現象を効率よく計測する手段として使われてきた。【００１０】
細胞内及び細胞外の分子現象を探索する主な方法で、発光イメージング以上に広く使用されている方法として、蛍光イメージングがある。しかし、蛍光蛋白質は、自家蛍光(autoluminescence)のためバックグラウンドが高く、外部光源を必要とし、蛍光顕微鏡のような大きな装置と精密なフィルターシステムを必要とする。また蛍光発色団が成熟するまでに短くても数時間から数日がかかる問題点があった。また蛍光顕微鏡を使う場合、一回に観察できる細胞数に限界があり、定量性に問題があった(非特許文献８)。【００１１】
これに対して、生物発光酵素を用いる発光イメージングの場合、多くの長所にも関らず、蛍光イメージングに比べて使用されにくい最大の原因は、生物発光酵素の低輝度にあった。生物発光酵素が低輝度であるために、高感度の計測装置を必要とし、単一細胞イメージングや細胞小器官の探索などには不向きであるとされていた。【００１２】
また、蛍光蛋白質については、多色蛍光蛋白質の研究が十分進んでおり、その発色原理に関する知見が多く得られているため、これらの研究成果を利用して多様な蛍光特質を持つ蛍光蛋白質が多く開発されている。【００１３】
一方、生物発光酵素については、多様な色の生物発光を示す酵素そのものの数が乏しい。発光の多色化の利点として、（i）マルチ信号の同時計測、（ii）長波長発光の生体組織透過性のよさが取り上げられるにもかかわらず、今まで生物発光酵素に関しては、その発光原理に基づいた体系的な多色化研究がほとんどなされてこなかった。【００１４】
また、バイオアッセイにおける適切な反応溶液の選択・使用は結果を左右する重要条件である。特に反応溶液の選択が重視されるバイオアッセイとしては、(１)レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、(２)ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、(３)酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)、(４)放射免疫アッセイ(ラジオイムノアッセイ、RIA)等を取り上げられる(非特許文献２２、非特許文献２３)。【００１５】
近年本発明者らは、レポータージーンアッセイと一分子型生物発光プローブを合体した多重認識型生物発光プローブ(multiple recognition-type bioluminescent probe)を開発した(非特許文献２７)。このプローブは、一つの検量物質に対して２回センシングすることを特徴とする。更に２色の一分子型生物発光プローブを組み合わせることによってマルチカラー生物発光イメージングプローブセットを開発した(特許文献５)。このプローブは、検体の多面的な生理活性の多色イメージングできることを特徴とする。【００１６】
バイオアッセイは必ず反応溶液を必要とし、その発光信号の種類によって、(１)蛍光蛋白質を利用する手法と、(２)生物発光酵素(ルシフェラーゼ)を用いる手法に大別される。蛍光蛋白質を利用する場合には、自己蛍光によってバックグラウンドが非常に高くなることに加え、外部光源が必要となる。蛍光を測定するためには精密な分光フィルターを取り付けた、比較的大型の発光検出器(例、蛍光顕微鏡)が必要となるという問題点がある(非特許文献８)。一方、生物発光的な手法の場合は、前記問題は生じないが、蛍光に比べて弱光であり、基質を必ず必要とする問題点があった。また、発光酵素に依存するため、塩濃度、温度、pH、重金属イオンの濃度等によって発光量が容易に変動する問題がある。蛍光を基盤とした手法においても同様な問題点を有する。したがって、pHを固定し発光反応条件を最適化するために、蛍光法・発光法ともに幅広く反応溶液が使用されている。【００１７】
反応溶液(アッセイバッファー)には、アッセイ効果を向上させるために様々な添加物が使用されてきた。添加物に求められる機能としては、(１)プロテアーゼによる蛋白質の分解を阻止し、(２)干渉物質の影響を抑え、(３)緩衝溶液として働いてもらうことによって安定的な信号発信をサポートし、(４)細胞膜を穏やかに壊すなど、homogenousなアッセイ条件を整えるものであり、(５)蛋白質を安定化させ、(６)発光反応の中核になるプローブの性能には阻害しないことが求められる。【００１８】
反応溶液における主な添加物のうち、塩類としては、NaCl，KCl,(NH4)2SO4などを添加し、SH試薬としてメルカプトエタノール、DTT等を添加し、ポリオールとしてグリセロールやスクロース等を添加し、キレート試薬としてEGTA、EDTA等を添加する。【００１９】
界面活性剤としては、polyoxyethylene(10)octylphenyl ether (TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40 (NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween80；TW80)，polyoxyethylene(20)cetyl ether (Brij58)，sodium dodecyl sulfate (SDS)等を添加する。界面活性剤の選択にあたっては、親水性の度合いが、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40の順であり、界面活性作用の度合いがNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であることを参考として、適宜選択してきた。【００２０】
蛋白質分解を阻止するために使うProtease Inhibitorとしては、アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)等が使われる。他に、Pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等の蛋白質分解阻害剤として利用されてきた。【００２１】
また、以下の機能性化学物質を添加することもある。Sodium molybdateを添加することによって受容体を安定化させ、分解から守る役割を得られる。Glycerolは蛋白質のブロッキング剤などで使えるものであり、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)は還元剤として使われてきた。【００２２】
また、バッファー剤として、p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic acid，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，glycine，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこの組み合わせが使われてきた。【００２３】
前記記述からも分かるように今までの研究傾向は、新規高輝度生物発光酵素の樹立および発光安定性、耐熱性耐塩性を高める方向で研究が進んできており、同時に発光スペクトルが長波長シフトした発光酵素の樹立も、近年の重要な研究傾向だと言える。また、発光酵素の樹立だけでなく、その反応溶液を最適化することによって発光信号の安定性、輝度の向上、信号対ノイズ比（S/N比）の改善などが見込まれる。そのため、各種添加剤（保存剤、界面活性剤、プロティアーゼ阻害剤など）を最適に調製することによってこの課題を解決しょうとする努力が行われてきた。【００２４】
一方、発光輝度、発光安定性、長波長シフトを可能とするもう一つの因子である基質は数十年前の研究成果に基づいており、その技術的な進歩は大変遅いペースてあった。この停滞の理由としては、（１）発光基質研究は有機合成を前提にするものであるため、有機合成のできる限られた研究者のみが可能な研究領域だったことと、（２）発光酵素の中でも特に海洋生物由来の発光酵素は、空気中の酸素により酸化されやすいため、合成環境の整備が必要であった。【００２５】
基質に関する定義は正確に定義されておらず、時代によって意味が変わってきた。ルシフェリンの最初定義は、発光反応に必須な物質であり生物の発光器官から抽出されたものを意味した。1960年ころにCypridinaのルシフェリンが発光魚parapriacanthusなどから発見されており、1970-1980年ころにセレンテラジン（coelenterazine）が発見され、多様な発光生物から単離され、多くの海洋生物由来の発光酵素の基質であることが判明した（非特許文献５）。【００２６】
本発明は、人工生物発光酵素の発光反応に資する基質としてセレンテラジンに焦点を合わせており、人工生物発光酵素に最適な基質の化学構造と反応メカニズムを明らかにするものである。ウミシイタケからセレンテラジンが最初に分離されたのは、1960年代中盤であり、その化学構造が確認されたのは1977年の井上などによる成果であった（非特許文献１０）。セレンテラジンと命名されたのは1975年に下村（2008年、ノーベル化学賞）によるものであった。【００２７】
このような先陣たちにより確立されたセレンテラジンに関する知見をもとに、その後の研究により50種類を超える至るセレンテラジン誘導体が合成された (非特許文献３０、３１)。セレンテラジン誘導体そのものは30年以上の歴史があり、多数の非特許文献が発表されてきたため、今日に至っては、セレンテラジンやその誘導体に関する特許性はないとされており、最近の関連特許出願の傾向は新規合成ルートの開発に関するものである（特許文献６）。【００２８】
伝統的にセレンテラジンとその誘導体は以下の合成ルートで合成が行われてきた（非特許文献１７、１８、２４、２６、２８、２９）。【００２９】
【化１】
2015056762.tif 000003
【００３０】
より簡単なセレンテラミン合成法として、Pdを介したクロスカプリング法（スティルカップリング）が比較的に近年確立された。その合成ルートは以下の手順を辿る（非特許文献３２、３３、３４）。【００３１】
【化２】
2015056762.tif 000004
【００３２】
前述した基本合成法に基づいて、最近数十年間に渡り数多くのセレンテラジン誘導体が合成されたにも関わらず、作られたその殆どの誘導体は、発光輝度や発光安定性に問題があったため、あまり使われない状況であった。そのため、誘導体合成の大変さには裏腹に、未だに自然本来のネイティブセレンテラジンが汎用されているのが現状である。また、各発光酵素に適した効率的な基質の検討は殆どなされていないことも、当該分野が停滞している理由になっている。【００３３】
そこで従来の輝度、発光安定性の問題を克服し、発光酵素に適した効率的な基質の検討は喫緊の課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３４】
【特許文献１】米国特許第8124424号明細書
【特許文献２】米国特許第8043827号明細書
【特許文献３】米国公開番号US-2009-0269781(A1)
【特許文献４】国際公開WO2008/084869（国際出願番号PCT/JP2008/050370）
【特許文献５】特開2009-034059号公報
【特許文献６】国際公開WO2010/090319 （公開日2010年8月12日）
【特許文献７】国際公開WO2014/065047（国際出願番号PCT/JP2013/075202）
【非特許文献】
【００３５】
【非特許文献１】Hall，M. P.，Unch，J.，Binkowski，B. F.，et al. ACS Chem. Biol. 7 2012 1848.
【非特許文献２】Herring，P. J.，Latz，M. I.，Bannister，N. J.，et al. Marine Ecology-Progress Series，94 1993 297.
【非特許文献３】Kim，S. B.  Protein Engineering Design & Selection，25 2012 261.
【非特許文献４】Kim，S. B.，Awais，M.，Sato，M.，et al. Anal. Chem.，79 2007 1874.
【非特許文献５】Osamu Shimomura "bioluminescence" Book, World Scientific (Singapore), 2006.
【非特許文献６】Kim，S. B.，Otani，Y.，Umezawa，Y.，et al. Anal. Chem.，79 2007 4820.
【非特許文献７】Kim，S. B.，Ozawa，T.，Umezawa，Y. Anal. Chem.，77 2005 6588.
【非特許文献８】Kim，S. B.，Ozawa，T.，Watanabe，S.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，101 2004 11542.
【非特許文献９】Kim，S. B.，Sato，M.，Tao，H. Bioconjugate Chem.，19 2008 2480.
【非特許文献１０】Inoue et al. 1977 Tetrahedron Lett. 2685。
【非特許文献１１】Kim，S. B.，Suzuki，H.，Sato，M.，et al. Anal. Chem.，83 2011 8732.
【非特許文献１２】Kim，S. B.，Umezawa，Y.，Kanno，K. A.，et al. ACS Chem. Biol.，3 2008 359.
【非特許文献１３】Lehmann，M.，Loch，C.，Middendorf，A.，et al. Protein Eng.，15 2002 403.
【非特許文献１４】Loening，A. M.，Wu，A. M.，Gambhir，S. S. Nat. Methods，4 2007 641.
【非特許文献１５】Markova，S. V.，Golz，S.，Frank，L. A.，et al. J. Biol. Chem.，279 2004  3212.
【非特許文献１６】Niu，G.，Chen，X. Y. Theranostics，2 2012 413.
【非特許文献１７】Kishi et al.  Tetrahedron Lett. 1972, 27, 2747.
【非特許文献１８】Inoue et al.  Chem Lett 1975, 141.
【非特許文献１９】Takenaka，Y.，Masuda，H.，Yamaguchi，A.，et al. Gene，425 2008 28.
【非特許文献２０】Takenaka，Y.，Yamaguchi，A.，Tsuruoka，N.，et al. Molecular Biology and Evolution，29 2012 1669.
【非特許文献２１】Verhaegent，M.，Christopoulos，T. K. Anal. Chem.，74 2002 4378.
【非特許文献２２】S．B．Kim，H．Tao，and Y．Umezawa eds.，"Cellular and Biomolecular Recognition"，Edited by R．Jelinek，p．299．((2009) (Wiley-VCH，Darmstadt)).
【非特許文献２３】W．Li and N．B．Caberoy，Applied Microbiology and Biotechnology 85 (4)，909 (2010).
【非特許文献２４】Shimomura et al.  Photochem Photohiol 1989, 49, 355.
【非特許文献２５】S．W．Michnick，P．H．Ear，C．Landry et al.，Meth．Enzymol．470，335 (2010).
【非特許文献２６】Teranishi et al.  Bull Chem Soc Japan  1990, 63, 3132.
【非特許文献２７】S．B．Kim，Y．Takenaka，and M．Torimura，Bioconjugate Chem．22 (9)，1835 (2011).
【非特許文献２８】Teranishi K  Bull Chem Soc Japan  1990, 63, 3132.
【非特許文献２９】Teranishi K  Anal Biochem 1997, 249, 37.
【非特許文献３０】Shimomura et al. Biochem J, 1988,  251, 405.
【非特許文献３１】Inouye et al. Biochem Biophys Res Comm, 2008, 265, 96.
【非特許文献３２】Nakamura et al.  Synlett 1995, 1227.
【非特許文献３３】Wu et al.  Tetrahedron Lett 2000, 42, 2997.
【非特許文献３４】Jones et al.  Synlett 1996, 509.
【非特許文献３５】Izumi et al. J. Chem. Inf. Model., 2013, 53 (3), 584.
【非特許文献３６】Okita，K.，Ichisaka，T.，Yamanaka，S. Nature，448 2007 313.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
本発明は、先願の人工生物発光酵素（ALuc）のアミノ酸配列に関する精査とその立体構造に関する構造解析によりALucに最適な発光基質に関する新たな知見を示すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明者らが開発した人工生物発光酵素(ALuc)に最適な発光基質を明らかにするために、今まで得た発光酵素に関する知見を総動員しつつ、ALucの超２次元構造を予測し、その立体構造と好適に合致できる発光酵素の化学構造に関する研究を行った。【００３８】
生物発光酵素全体の中で海洋動物由来の生物発光酵素に限ってみれば、配列の類似性が比較的に高く、同じ又は類似基質(coelenterazine)で発光する共通点を持つ。本発明者らは、以前親水性領域検索(hydrophilicity search)による酵素活性部位特定法を見出した(非特許文献１１)。この手法は、大まかな酵素活性部位を推定するものではあるが、具体的にどのアミノ酸が重要かという知見を与えるものではなかった。【００３９】
そこで、より深く発光酵素配列情報を精査するために天然にない新規発光酵素配列を以下の要領で創製した。まず公的データベース(NCBI)上の海洋生物発光酵素配列を、類似したアミノ酸を中心に整列し、その整列から独自の思想で頻度の高いアミノ酸を抽出した。このことによって、従来に全く存在しなかった新しい人工生物発光酵素(ALuc)配列を多数作り上げた。【００４０】
更に、本発明者らは以前に１つの生物発光酵素の酵素活性部位が２つ存在するという見解を示したことがあった(非特許文献３)。そこで、NCBIから得た発光カイアシ由来の全ての生物発光酵素のアミノ酸配列を、任意の位置で３つに分けた。前側と後ろ側のドメインを重ねて整列させた後、アミノ酸配列の中で互いに対応するアミノ酸を比較し、類似性を高める方向でアミノ酸配列を決定した。このやり方で、新規人工発光酵素になりうる多数のアミノ酸配列を決定した（特許文献7）。【００４１】
人工的に作り上げたN末側の配列特性をPSORTIIで調べることによって、in silicoで局在化予測ができる。このような配列の挙動を予測する公的データベースが提供するバイオインフォマティクスソフトを利用することによって配列が有効に作動する確率を向上させた。【００４２】
前記研究により、人工生物発光酵素を実際に作り上げることにより、その２次元情報は十分得られた。ところが、これだけでは最適基質に関する知見を得ることは困難であるため、当該人工生物発光酵素の２次元情報から立体構造を作り上げ、その立体構造から最適基質を以下の要領で決定した（図２）。【００４３】
まず先行文献（非特許文献３５）記載の方法を用いて、Coelenterazine-Binding Protein（CBP）のX線結晶構造データ（PDBID: 2hpsA, 2hq8A）について、アミノ酸残基ごとの主鎖のコンフォメーションをαへリックス型 (h)、βシート型 (s)、その他の型 (o) の3種類の符号にコード化変換を行い、超二次構造の記述を行った。【００４４】
次に、CBPとALuc30について、アミノ酸配列の相同性の比較を行ったところ、16.7%の相同性が確認された。この相同性に基づき、アミノ酸配列のアラインメントを行い、MolFeat v4.5（http://www.fiatlux.co.jp/product/lifescience/molfeat/mol-index.html）を用いて、2hpsA の構造データのアミノ酸残基の置換を行って分子モデルの作成を行った。次に、アミノ酸残基の挿入及び欠失については、HyperProtein  v1.0 （http://www.hyper.com/Products/HyperProtein/tabid/504/Default.aspx）及びChem3D Ultra v8.0（http://www.cambridgesoft.com/Ensemble_for_Chemistry/ChemBio3D/）を用いて、アラインメントに沿って、超二次構造が一致するようにCOELENTERAZINEも含めて注意深く分子モデリングを行った。最終的には、Polak-Ribiere AlgorithmによるMolecular Mechanics (MM)計算を行い、構造最適化した。【００４５】
ALuc30の立体構造を例えば、Loop構造も含めたCBPの主要な超二次構造を維持した形で分子モデルが構築できることがわかった。ネイティブセレンテラジン（Coelenterazine）のヒドロキシベンジル基の水酸基、ヒドロキシフェニル基の水酸基及び基質反応部位から4 Åの近傍にあるアミノ酸残基の解析から、例えば、17LYS、20THR、37ILE、72ASN、143VAL、145LEU、149CYS、189LYS、192GLYのアミノ酸残基が生物発光に特に大きな影響を与える可能性が示唆される。２０番―３０番付近にあるHISタグについて、リジッドな超二次構造を形成しているαへリックス部位に位置しており、周りのアミノ酸残基の影響から本来のHISタグの機能への影響も懸念される。
人工生物発光酵素の一例としてALuc30を構成する各アミノ酸の３次元的位置情報（即ち、立体構造）を解析した。解析により得られたモデルを図１Ｂに示す。【００４６】
セレンテラジンとその誘導体（以下、セレンテラジン類と称する）の化学構造を以下に精査することにより、人工生物発光酵素に特異的に反応するセレンテラジン類を見出した（図１）。図１で示しているようにセレンテラジンはイミダゾール骨格と３つのレジデューにより形成されている。各レジデューは、以下の特徴を持ってそれぞれ人工発光酵素と相互作用する。【００４７】
（I）  図２で示す人工生物発光酵素の立体構造からも分かるようにレジデューA（R-A）は、発光酵素の最も奥側に至っており、R-Aの周りには大きい空洞があることが立体構造から明らかになった。この空洞はR-Aの官能基の空間的許容範囲を明らかにするものである。この知見から、今まで知られている数十種類のセレンテラジン誘導体から特にR-Aの官能基の大きさに注目した数種類のセレンテラジン誘導体を選別し、その発光輝度を調べた（図３）。【００４８】
（II）また図２の立体構造から分かるように、セレンテラジンのレジデューB（R-B）の近傍には、157番Pheを有し、149番Lys、136番Gly、137番Glu、133番Glyなどのアミノ酸があることから分かるように、R-Bの位置にはベンゼンリングのようにπ−πスタッキング（stacking）や疎水性相互作用のできるレジデューが好ましいと思った。この知見から、今まで知られている数十種類のセレンテラジン誘導体の中で特にR-Bがベンゼンリング骨格の場合とそうではない場合に分けて検証実験を行った（図３）。【００４９】
（III）また、レジデューC（R-C）においては、図２の立体構造からも分かるように、発光酵素のアミノ酸配列の中でも特に後ろ側のアミノ酸と相互作用することが分かる。例えば、165番Leu、169番Cys、209番Lys、212番Glyなどのアミノ酸と相互作用することが分かっている。これらのアミノ酸は、人工生物発光酵素の末端に位置することもあり、構造的に柔らかい構造に加え比較的に親水性環境にあると思われる。このような環境に最適なR-Cの性質は一定の親水性を持つことであるため、R-Cはベンゼンリングの骨格に親水性の官能基（例、ヒドロオキシ基）を持つことが理想的であることが分かる。この知見から従来のセレンテラジン誘導体の中でR-Cのベンゼンリングに官能基を持たない誘導体（即ち、セレンテラジン400A）を用いて比較実験を行った（図３）。【００５０】
このように人工発光酵素の立体構造に基づく精査から理想的な発光基質の化学構造を明らかにすることにより本発明を完成した。【００５１】
すなわち、本発明は、具体的には以下の態様を包含する。【００５２】
項１、下記の(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発光基質として用いるための、下記の一般式（１）で表される化合物の使用：
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。【００５３】
【化３】
2015056762.tif 000005
【００５４】
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
項２、前記一般式（１）で表される化合物が、セレンテラジンｎ（CTZ n）、セレンテラジンｉ（CTZ i）、セレンテラジンｆ（CTZ f）、セレンテラジンｈ（CTZ h）またはセレンテラジン400Ａ（CTZ 400A）である、項１に記載の使用。【００５５】
項３、下記の化合物（Ａ）と、下記のポリペプチド（Ｂ）とを接触させる工程、及び
上記接触に基づく発光輝度を測定する工程を含む、生物発光アッセイ方法：
化合物（Ａ）：下記の一般式（１）で表される化合物；【００５６】
【化４】
2015056762.tif 000006
【００５７】
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水酸基又はチオール基を示す。］
ポリペプチド（Ｂ）：(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。【００５８】
項４、下記の一般式（１）で表される化合物を含む、項３に記載の生物発光アッセイ方法に用いるための生物発光測定キット。【００５９】
【化５】
2015056762.tif 000007
【００６０】
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
項５、項３に記載の方法において、他の発光酵素と組み合わせて２つ以上の発光色を測定することを特徴とするマルチカラーイメージング法。【００６１】
項６、レポータージーンアッセイ法、ツーハイブリットアッセイ法、発光カプセルアッセイ法又は一分子型生物発光プローブ測定法である、項３に記載の方法。【００６２】
項７、下記の化合物（Ａ）と、下記のポリペプチド（Ｂ）とを接触させる工程、及び
上記接触に基づく発光エネルギーが他の蛍光蛋白質に遷移する工程、
上記発光エネルギーが遷移した蛍光蛋白質の発光輝度を測定する工程を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法：
化合物（Ａ）：下記の一般式（１）で表される化合物；【００６３】
【化６】
2015056762.tif 000008
【００６４】
［式中、
Ｘaは、ハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基またはナフチル基を示す。
Ｘbは、フェニル基を示す。
Ｍcは、水素原子、水酸基又はチオール基を示す。］
ポリペプチド（Ｂ）：(i)又は(ii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（i）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（ii）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【発明の効果】
【００６５】
本発明は、本発明者の既発明の天然にない人工生物発光酵素（ALuc）に最適な発光基質の開発に関するものであり、この目的を達成するためにALucの立体構造（特に、基質結合部位と重要アミノ酸）を明らかにしその立体構造に好適に嵌る基質の化学構造に関する知見を得ることができた。この知見に合致する多数のセレンテラジン誘導体の発光特性を調べることにより、ALucに最適な発光基質を明らかにした。【００６６】
図３で示したように、本発明の実施例で選定されたR-Aの大きさを制御したセレンテラジン誘導体類（CTZ n, CTZ i, CTZf, CTZ iなど）は、レニラールシフェラーゼ8.6-535（RLuc-8.6-535；従来代表）に比べてALucに対して100倍から1万倍程度の高い選択性（輝度基準）を示した。【００６７】
このように前記基質がALucに対して高い基質選択性を示している点を利用すれば、多様なバイオアッセイ系の開発が可能となる。例えば、CTZ iはALucのみに対して強い輝度を示すため、RLuc8.6-535と組み合わせることにより、マルチカラーイメージングシステム（デュアルアッセイ系も含む）を構成できる。例えば、色違いの3種類の発光酵素（ALuc, RLuc8.6-535とCLuc）を同一培養細胞に発現しておき、まずALuc専用の発光基質（例、CTZ i）で発光させたのち消光し、次にRLuc8.6-535を特異的な基質で発光させたのち、SDSで前の発光酵素を失活（消光）させる。最後にCLuc専用の基質で発光させる。CLucはCysが多いため丈夫であるため、SDSにより失活しないため、このアッセイ系が構築できる。勿論、この際、それぞれの発光酵素の色が違う点を利用して、適当なフィルターを光検出機に付けることにより相互間のクロストークも防げる。【００６８】
他のALucを用いるバイオアッセイ系においても、この専用の基質の特異性を利用すれば、従来にできなかった特異的発光反応やマルチカラー特性、発光信号間のクロストークがない故の高精度を生み出すことができる。この技術を利用できる従来のバイオアッセイ系としては、レポータージーンアッセイ(reporter gene assay)、Yeast Two-hybrid assay、Mammalian Two-hybrid assay、protein splicing assay (PSA)、protein complementation assay (PCA)、circular permutation assay、bioluminescence resonance energy transfer(BRET) assay、発光カプセル（bioluminescent capsule）法がある。【００６９】
本発明により性能改善された前記バイオアッセイ法は、本発明者の先願発明のバイオアッセイ用最適反応溶液（特開2014-085311（特願2012-236872））を組み合わせて利用することにより、更なる利便性が見込まれる。例えば、前記アッセイ時に前記最適反応溶液（one-shot buffer）を用いることにより、バックグラウンド光が押さえられ、信号強度の増加、輝度の増加が見込まれる。さらに、実験手順が簡便化、省略できたため、時間と労働力の節約が可能である。その結果、バイオアッセイにおけるS/N比の改善、再現性の向上、コストダウンに繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】人工生物発光酵素(ALuc)の遺伝系統学的特徴と立体構造。(A)製品化されているcopepod発光酵素とALucの遺伝系統学的相関性の検証。点線は、本発明者らが開発した人工生物発光酵素類を示す。(B) ALuc30の超2次元立体構造。化学構造は基質（セレンテラジン）を示す。R-A、R-B、R-Cはそれぞれ発光基質のレジデューを示す。H1-H9はそれぞれのヘリックスのナンバーを示す。
【図２】本研究で用いたセレンテラジン誘導体の化学構造。上段はセレンテラジンのR-A部位がそれぞれ異なる誘導体を示す。下段はセレンテラジンのR-B部位がそれぞれ異なる誘導体を示す。各矢印と囲みは各誘導体の特徴的な官能基を示す。
【図３Ａ】セレンテラジン誘導体によるALucとRLuc8.6-535の発光輝度とスペクトルの比較。（Ａ）セレンテラジン誘導体に依存した発光輝度の比較。青バーと青のＹ軸（左）はRLuc8.6-535を示し、赤バーと赤のＹ軸（右）ALuc34を示す。挿入図Ａは、セレンテラジン誘導体に依存した発光輝度のイメージを示す。
【図３Ｂ】セレンテラジン誘導体によるALucとRLuc8.6-535の発光輝度とスペクトルの比較。（Ｂ）セレンテラジン誘導体に依存したALucとRLuc8.6-535の発光スペクトルの比較。
【図４Ａ】ALucの基質選択性と立体構造間の相関関係。（Ａ）ALuc30の超2次元立体構造を示す。中央はセレンテラジンの骨格を示す。
【図４Ｂ】ALucの基質選択性と立体構造間の相関関係。（Ｂ）ALuc30の立体構造の内部プロファイル。R-Aの先端に空洞がある。白黒反転図（Monochrome inversion image）を併せて示す。
【図５】デュアルアッセイの結果を示す。ＳＤＳ処理により、ALucの発光活性はほぼ失活するため、CLucの発光活性しか残らない。下テーブルに、発光強度の定量値を示す。
【図６Ａ】本発明の人工生物発光酵素の配列の一例。配列番号３に示されたアミノ酸配列を示す。図中、“ｘ"はどのアミノ酸でも良いことを意味する。小文字の“ｙ"は疎水性アミノ酸であることを意味する。“ｚ"は親水性アミノ酸であることを意味する。
【図６Ｂ】本発明の人工生物発光酵素の配列の一例。「ALucCM」は配列番号２に示されたアミノ酸配列を示す。図中、“ｘ"はどのアミノ酸でも良いことを意味する（ブランク（空欄）でも良い）。“o"は疎水性のアミノ酸であること、“j"は親水性のアミノ酸であること、“."は低分子量脂肪族のアミノ酸であること、“@"は高分子量脂肪族アミノ酸であること、“+"は正電荷を有するアミノ酸であること、“-"は負電荷を有するアミノ酸であることをそれぞれ意味する。
【図６Ｃ】本発明の人工生物発光酵素の配列の一例。「ALucCM」は配列番号１に示されたアミノ酸配列を示す。図中、“ｘ"はどのアミノ酸でも良いことを意味する（ブランク（空欄）でも良い）。“o"は疎水性のアミノ酸であること、“j"は親水性のアミノ酸であること、“."は低分子量脂肪族のアミノ酸であること、“@"は高分子量脂肪族アミノ酸であること、“+"は正電荷を有するアミノ酸であること、“-"は負電荷を有するアミノ酸であることをそれぞれ意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
［Ｉ］人工発光酵素及び発光基質
１．人工発光酵素(ALuc)群に最適な発光基質について
（発光基質）
本願発明の発光基質は、下記の一般式（１）で表される化合物である。
【００７２】
【化７】
2015056762.tif 000009
【００７３】
式中、Ｘaは、１つのハロゲン原子により置換されていてもよいフェニル基、または、ナフチル基（ナフタレン基）を示す。置換基の位置（オルト位、メタ位、パラ位）は限定されるものではないが、フェニル基が置換基を有する場合は、メタ位又はパラ位、特にパラ位であることが好ましい。
【００７４】
本明細書において、ハロゲン原子とは、塩素、臭素、フッ素、ヨウ素を指す。
【００７５】
Ｘbは、フェニル基を示す。
【００７６】
Ｍcは、１つの水素原子、水酸基又はチオール基を示す。水酸基又はチオール基のベンゼン環上の位置（オルト位、メタ位、パラ位）は限定されるものではないが、メタ位又はパラ位、特にパラ位が好ましい。
【００７７】
本発明の化合物として、典型的にはセレンテラジンｎ（CTZ n）、セレンテラジンｉ（CTZ i）、セレンテラジンｆ（CTZ f）、セレンテラジンｈ（CTZ h）、セレンテラジン400Ａ（CTZ 400A）が例示され、CTZ n、CTZ i、CTZ f、CTZ hが特に好ましいが、これに限定されるものではない。
【００７８】
セレンテラジンｎ（CTZ n）、セレンテラジンｉ（CTZ i）、セレンテラジンｆ（CTZ f）、セレンテラジンｈ（CTZ h）及びセレンテラジン400Ａ（CTZ 400A）の化学構造式を以下に示す。
【００７９】
【化８】
2015056762.tif 000010
【００８０】
本発明の発光基質は、例えば、以下の文献が示す合成ルートに準じてで合成できる（非特許文献１７、１８、２４、２６、２８、２９）。
【００８１】
また、以下の文献に記載のPdを介したクロスカプリング法(スティルカップリング)に準じて合成をすることもできる（非特許文献３２、３３、３４）。
【００８２】
（人工発光酵素）
本発明において、上記発光基質は、下記の人工発光酵素（本明細書において、「人工ルシフェラーゼ」もしくは「ALuc」（artificial luciferase）と言う場合がある。）の発光基質として用いる。
【００８３】
本発明における典型的な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、ALuc10(配列番号４)，ALuc15(配列番号５)，ALuc16(配列番号６)，ALuc17(配列番号７)，ALuc18(配列番号８)，ALuc19(配列番号９)，ALuc21(配列番号１０)，ALuc22(配列番号１１)，ALuc23(配列番号１２)，ALuc24(配列番号１３)，ALuc25(配列番号１４)，ALuc26(配列番号１５)，ALuc27(配列番号１６，ALuc28(配列番号１７)，ALuc29(配列番号１８)，ALuc30(配列番号１９)，ALuc31(配列番号２０)，ALuc32(配列番号２１)，ALuc33(配列番号２２)及びALuc34(配列番号２３)である。
【００８４】
本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、以下の(i)〜(iii)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、と表現することができる。
（i）配列番号４〜２３のいずれかに示されたアミノ酸配列、
（ii）配列番号４〜２３のいずれかに示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
（iii）配列番号４〜２３のいずれかに示されたアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、例えば、95％以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上の同一性を有するアミノ酸配列であればさらに好ましい。
【００８５】
また、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)のアミノ酸配列はいずれも図６Ａ〜Ｃで表されるような共通の基本骨格を有する。これらの基本骨格を有する限り、他の位置のアミノ酸は任意のアミノ酸であっても同等の高性能のカイアシルシフェラーゼ活性を有する。したがって、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、以下の(iv)〜又は(vii)に記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、と表現することもできる。
（iv）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又は、
（v）配列番号２に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は214-218位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
（iv）配列番号１に示されたアミノ酸配列、又は、
（v）配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-31位、又は217-221位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
（vi）配列番号３に示されたアミノ酸配列、又は、
（vii）配列番号３に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は211-215位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【００８６】
ここで、配列番号３に示されたアミノ酸配列のうち、N末端側の1-20位までのアミノ酸は分泌シグナル(secretion peptide；SP)であり、また、C末側の211-215位のペプチドはGlycineリッチなリンカー性のペプチド(通称、GSリンカーという)であるため、いずれの領域の一部又は全部のアミノ酸が欠損しても良い。配列番号２に示されたアミノ酸配列のうち、N末端側の1-20位及びC末側の214-218位、並びに、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、N末端側の1-20位及びC末側の217-221位についても同様である。分泌シグナルに関しては、例えば、カイアシ類発光酵素であるMetridia pacifica luciferase 1(MpLuc1)の場合は1-18位、pleuromamma luciferaseの場合は1-19位のアミノ酸に該当し、何れも欠損してもよいことが分かっている。
【００８７】
配列番号３に示されたアミノ酸配列のうち20-29位（配列番号２に示されたアミノ酸配列のうち、20-29位、及び、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、20-31位の領域に相当する。）を、機能性アミノ酸配列（例えば、抗原認識部位、アフィニティカラム認識部位、局在シグナルなど。）に置換しても、人工発光酵素の機能は著しく阻害されない。従って、当該領域の一部又は全部のアミノ酸が欠損しても良い。
【００８８】
配列番号１〜３に示されたアミノ酸配列のうち、Xaaで表されるアミノ酸について、以下に詳細に説明する。
【００８９】
配列番号２中のXaaで表されるアミノ酸のうち、3，20-27，29，30，33，35，62-64，67，74，75，83，84，87，88，127，137-145，147, 156，158，185，188，199，203位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよい。このうち、74-75，137-140位は欠失していてもよい。好ましくは、3位がE又はGであり、20-27位がPTENKDDI配列（配列番号２６），ATINEEDI配列（配列番号２７），ATINENFE配列（配列番号２８）、HHHHHHHH配列（配列番号２９），EKLISEE配列（配列番号３０），MMYPYDVP配列（配列番号３１）又はMMDYKDDD配列（配列番号３２）であり、29位がI，L，Y又はKであり、30位がV，D又はAであり、33位がE，G又はAであり、35位がK，S又はGであり、62-64位がANS配列又はDAN配列であり、67位がD又はGであり、75-76位がGG配列若しくはK（１残基欠失）であるか又は欠失していてもよく、83-84位がLE，KA又はKE配列であり、87-88位がKE配列，IE配列，LE配列又はKI配列であり、127位がE，G又はAであり、137-145位がIGEA配列（4残基欠失、配列番号３３），IVGA配列（4残基欠失、配列番号３４），ITEEE配列（3残基欠失、配列番号３５）又はIGGPIVD配列（配列番号３６）であり、147位がD又はLであり、156位がD，E，N，F，Y又はWであり、158位がE又はLであり、185位がK，F，Y又はWであり、188位がD，A，N，F，Y又はWであり、199位がA又はKであり、203位はS，D，N，F，Y又はWである。
【００９０】
また、同13，16，36，148，171，215位のアミノ酸は疎水性アミノ酸（例えば、V，F，A，L。）であって、好ましくは、13位がV又はFであり、16位がV又はAであり、36位がF又はGであり、148位がI又はGであり、168位がV又はAであり、215位がA又はLである。
【００９１】
同5，65，73，99，117，211位は親水性アミノ酸（例えばQ，K，D，R，H，E，T。）であって、好ましくは、5位がQ又はKであり、65位がD又はRであり、73位がK，H，R又はEであり、99位がT又はHであり、117位がK，E又はQであり、211位がK又はTである。
【００９２】
同4，6，7，10，11，15，31，32，37-39，61，66，72，76，81，136，157，200位は、脂肪族アミノ酸である。好ましくは、4，6，7，10，11，15，32，61，76，81，157位が高分子量脂肪族アミノ酸（例えば、I，V，L，M。）であり、より好ましくは、4位がI又はVであり、6位がV又はLであり、7位がL又はIであり、10位がL又はVであり、11位がI又はLであり、15位がL又はVであり、32位がI又はVであり、61位がL又はVであり、76位がL又はMであり、81位がL又はMであり、157位がL又はMである。また、好ましくは、31，34，37-39，66，72，136，200位が低分子量脂肪族アミノ酸（例えば、A，G，T，L）であり、より好ましくは、31位がG，L又はAであり、34位がG又はIであり、37位がG，A，S又はFであり、38位がT又はFであり、39位がT又はAであり、66位がA又はGであり、72位がGであるか又は欠失していてもよく、136位がG又はAであり、200位がT又はGである。
【００９３】
70，71，95，108位は正電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸。例えば、K，R，H。）であり、好ましくは、70位及び71位がRであるか又は欠失していてもよく、95位がK又はRであり、108位がH又はKである。
【００９４】
60位及び208位は負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸。例えば、N，D，Q，E。）であり、好ましくは、60位がN又はDであり、208位がQ又はEである。
【００９５】
配列番号１中のXaaで表されるアミノ酸のうち、3，20-29，31，32，35，37，64-66，69，76-77，85-86，89-90，129，140-144，148-151，159，161，188，191，202，206位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよい。このうち、22-23，39-40，76-77，140，148-151位は欠失していてもよい。好ましくは、3位がE又はGであり、20-29位がPTENKDDI配列（2残基欠失、配列番号３７），ATINEEDI配列（2残基欠失、配列番号３８），ATINENFEDI配列（配列番号３９）、HHHHHHHH配列（2残基欠失、配列番号４０），EKLISEE配列（2残基欠失、配列番号４１），MMYPYDVP配列（2残基欠失、配列番号４２）又はMMDYKDDD配列（2残基欠失、配列番号４３）であり、31位がI，L，Y又はKであり、32位がV又はAであり、35位がE又はGであり、37位がK又はSであり、64-66位がANS配列又はDAN配列であり、69位がD又はGであり、76-77位がGG配列若しくはK（１残基欠失）であるか又は欠失していてもよく、85-86位がLE，KA又はKE配列であり、89-90位がKE配列，IE配列，LE配列又はKI配列であり、129位がE，G又はAであり、140-144位がTEEET配列（配列番号４４），GEAI配列（1残基欠失、配列番号４５）又はVGAI配列（1残基欠失、配列番号４６）であり、148-151位がGVLG配列（配列番号４７）であるか又はI（3残基欠失）若しくはすべて欠失してもよく、159位がD，E，N，F，Y又はWであり、161位がE又はLであり、188位がK，F，Y又はWであり、191位がD，A，N，F，Y又はWであり、202位がA又はKであり、206位はS，D，N，F，Y又はWである。
【００９６】
同13，16，174，218位のアミノ酸は疎水性アミノ酸（例えば、V，F，A，L。）であって、好ましくは、13位がV又はFであり、16位がV又はAであり、174位がV又はAであり、218位がA又はLである。
【００９７】
同5，67，75，101，119，214位は親水性アミノ酸（例えばQ，K，D，R，H，E，T。）であって、好ましくは、5位がQ又はKであり、67位がD又はRであり、75位がK，H，R又はEであり、101位がT又はHであり、119位がK，E又はQであり、211位がK又はTである。
【００９８】
同4，6，7，10，11，15，33，34，39-41，63，68，77，78，83，138，160，203位は、脂肪族アミノ酸である。ただし、39，40，70位は、欠失していてもよい。好ましくは、4，6，7，10，11，15，34，63，78，83，160位が高分子量脂肪族アミノ酸（例えば、I，V，L，M。）が好ましいが、低頻度の低分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、4位がI又はVであり、6位がV又はLであり、7位がL又はIであり、10位がL又はVであり、11位がI又はLであり、15位がL又はVであり、34位がI又はVであり、63位がL又はVであり、78位がL又はMであり、83位がL又はMであり、160位がL又はMである。また、好ましくは、33，39-41，68，74，137，203位が低分子量脂肪族アミノ酸（例えば、A，G，T）が好ましいが、低頻度の高分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、33位がG，L又はAであり、39位がG若しくはAであるかか又は欠失していてもよく，S又はFであり、40位がTであるか又は欠失していてもよく、41位がT又はAであり、68位がA又はGであり、74位がGであるか又は欠失していてもよく、137位がG又はAであり、203位がT又はGである。
【００９９】
72，73，97，110位は正電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸。例えば、K，R，H。）である。ただし、72位及び73位は、欠失していてもよい。好ましくは、72位及び73位がRであるか又は欠失していてもよく、97位がK又はRであり、110位がH又はKである。
【０１００】
62位及び211位は負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸。例えば、N，D，Q，E。）であり、好ましくは、62位がN又はDであり、211位がQ又はEである。
【０１０１】
配列番号３中のXaaで表されるアミノ酸のうち、3，22，26，27，30，33，35，37-39，62，63，67，71-75，87，127，138，140-142，155，185，197位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよく、そのうちの71−75位、140-142位のアミノ酸はその一部又は全部欠失していてもよい。親水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、22位、27位、33位、127位、140位、141位、155位はEであり、26位、30位、62位、67位、185位はDであり、35位、87位はKであり、37位はSであり、38位、39位、138位、142位、197位はTであり、63位はNであり、71位はRであり、そして73位はD又はHである。疎水性アミノ酸のうちで好ましい場合は、3位、37位、67位、72位、74位、75位、138位、197位はGであり、22位、27位、141位はIであり、30位はVであり、33位、39位、62位、63位、127位、140位、155位、185位はAであり、87位はLであり、そして26位、38位はFである。
【０１０２】
また、同4，6，7，10，11，13，15，16，20，31，34，36，61，66，81，168位のアミノ酸は疎水性アミノ酸であって、好ましくは、4位がI又はVであり、6位がV又はLであり、7位がI又はLであり、10位がV又はLであり、11位がI又はLであり、13位がV又はFであり、15位がV又はLであり、16位がV又はAであり、20位がA又はPであり、31位がL又はGであり、34位はI又はGであり36位はF又はGであり、61位はV又はLであり、66位はA又はGであり、81位はL又はMであり、そして168位はV又はAである。
【０１０３】
同5，24，25，60，64，65，70，95，108，153，200，208位のアミノ酸は親水性アミノ酸であって、好ましくは、5位がQ又はKであり、24位がK又はEであり、25位がD又はNであり、60位がD又はNであり、64位がN又はSであり、65位がD又はRであり、70位がK又はRであり、95位がK又はRであり、108位がK又はHであり、153位がE又はDであり200位がD又はSであり、そして208位がK，H又はTである。
【０１０４】
配列番号３に示されたアミノ酸配列の典型例として、ALuc10，ALuc15，ALuc16，ALuc18，ALuc22，ALuc23及びALuc25挙げられる。
【０１０５】
本発明の人工ルシフェラーゼの1つの態様においては、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち1-71位の領域（配列番号２に示されたアミノ酸配列のうち1-69位の領域、及び、配列番号３に示されたアミノ酸配列のうち1-69位の領域にも該当する。）として、配列番号２４に示すアミノ酸配列を有する。典型例として、ALuc15，ALuc16，ALuc17，ALuc18，ALuc24が挙げられる。
【０１０６】
本発明の人工ルシフェラーゼの別の態様においては、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち1-157位の領域（配列番号２に示されたアミノ酸配列のうち1-155位の領域、及び、配列番号３に示されたアミノ酸配列のうち1-152位の領域にも該当する。）として、配列番号２５に示すアミノ酸配列を有する。典型例として、ALuc22，ALuc25，ALuc26，ALuc27，ALuc28，ALuc29が挙げられる。
【０１０７】
本発明の人工ルシフェラーゼのまた別の態様においては、抗体認識部位（epitope配列）を内部に有する。「抗体認識部位」もしくは「epitope配列」は、「抗原サイト」と換言することができる。典型的には、ALuc30，ALuc31，ALuc32，ALuc34が該当する。
【０１０８】
具体的には、抗体認識部位（epitope配列）を内部に有する人工ルシフェラーゼは、配列番号２中20-29位又は配列番号１中20-31位の領域が抗体認識部位（epitope配列）を含む。抗体認識部位（epitope配列）の好ましい例としては、His-tag(HHHHHH) (配列番号４８)、FLAG-tag(DYKDDDDK) (配列番号４９)、Myc-tag(EQKLISEEDL) (配列番号５０)、HA-tag(YPYDVPDYA) (配列番号５１)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
His-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号２中20-29位又は配列番号１中20-31位のアミノ酸が全てH（His x 8配列）である。典型例としては、ALuc30及びALuc31が挙げられる。
【０１１０】
c-Myc-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号２中20-29位又は配列番号１中20-31位の領域の配列がEQKLISEEDL（Myc-tag配列、配列番号５０）である。典型例としては、ALuc32が挙げられる。
【０１１１】
HA-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては配列番号２中20-29位又は配列番号１中20-31位のアミノ酸がYPYDVPDYA（HA-tag配列、配列番号５１）である。典型例としては、ALuc33が挙げられる。
【０１１２】
FLAG-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号２中20-29位又は配列番号１中20-31位のアミノ酸がDYKDDDDK（FLAG-tag配列、配列番号４９）である。典型例としては、ALuc34が挙げられる。
【０１１３】
本明細書において、「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、カイアシ類と呼ばれる発光性プランクトンとして生活する微小な甲殻類が産生する発光酵素(ルシフェラーゼ)を指す。具体的には、MoLuc1、MoLuc2、PaLuc1、PaLuc2、LoLuc、HtLuc1、HtLuc2、HmLuc1、HmLuc2、ガウシアルシフェラーゼ(GLuc)、カイアシルシフェラーゼ(MLuc、MpLuc1、MpLuc2)などが含まれる。「カイアシ類ルシフェラーゼ」は、基質特異性としては、「セレンテラジン」を特異的に酸化させる。一般的に深海環境、即ち、至適pH約7.5〜8、至適温度約4〜10℃で発光反応を触媒する酵素的特性を有しているが、この範囲に以外の条件でも広く発光を触媒する。本明細書で「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、既知のカイアシ類に由来するルシフェラーゼと共通した酵素活性上及び構造上の特徴を有するルシフェラーゼをいう。具体的には、至適pH約5〜8、至適温度約4〜25℃を有し、「セレンテラジン」を基質として発光反応を触媒する酵素活性を有するルシフェラーゼであって、構造的には２つの酵素活性ドメインを有し、N末端に分泌シグナルを有し、分子量が20ｋD程度(18kD−28kD)で他の発光酵素と比較して最も小さい分子量を有するルシフェラーゼであることを意味する。
【０１１４】
「セレンテラジン」とは、天然型のセレンテラジン（Native CTZ、n CTZ）に限定されるものではなく、天然型のセレンテラジンの各種誘導体も包含する。すなわち、「セレンテラジン」は、「セレンテラジン類」と換言することもできる。セレンテラジンの具体例として、天然型のセレンテラジン（Native CTZ）、セレンテラジンip（CTZ ip）、セレンテラジンi（CTZ i）、セレンテラジンhcp（CTZ hcp）、セレンテラジン400A（CTZ 400A）、セレンテラジンfcp（CTZ fcp）、セレンテラジンcp（CTZ cp）、セレンテラジンf（CTZ f）、セレンテラジンh（CTZ h）、セレンテラジンn（CTZ n）などが例示される。
【０１１５】
２．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)に最適な発光基質の発光性能評価について。
【０１１６】
（２−１）酵素活性の確認方法
最適発光基質によるALucの酵素活性は、例えば、以下の方法で検証することができる。
【０１１７】
まず、公知の遺伝子導入用脂質試薬を用いて、ALucをコードする真核細胞発現ベクター（例、pcDNA3.1(+)）をアフリカ猿由来のCOS-7細胞に導入し、比較のために従来のカイアシ類発光酵素を持つ発現ベクターも、同法で細胞に導入する。ベクターを導入してから一定時間(10〜20時間、例えば16時間)が経過した後、各細胞を公知の細胞溶解溶液を用いて溶解する。
【０１１８】
ALucをコードする塩基配列の一例を、配列番号として示す。
【０１１９】
その後、前記細胞溶解液を、本発明の最適発光基質を含む公知のバッファー溶液と混合して発色強度や発光の経時安定性などを測定する。
【０１２０】
発光強度は、従来の発光分光光度計を用い、本発明の最適発光基質添加後に測定する方法で特定の波長での強度を計測すればよく、毎分計測することで発光の経時的変化からその安定性が評価できる。長波長側へのシフトを測定するには、全波長スキャンする。
【０１２１】
以上のように、本発明によって、従来の海洋生物由来のルシフェラーゼに比べて、本発明者のALuc類に対して100倍から1万倍の選択性示しているなど、本発明の最適発光基質を利用することにより、ALuc類を用いる様々なバイオアッセイ系においてその発光特異性を保証できることが確認できた。
【０１２２】
以下、本発明の「ALucに最適な発光基質を用いることのできるレポーター分析法」を、Niuらにより非特許文献１６において示された３つの分類である“basic”、“inducible”及び“activatable”の３種類に分けて説明する。ここで、“basic”法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、各種の被検蛋白質に対して単にALucを繋いで標識しただけのレポーター分析系であるともいえる。典型的なものとしては、抗体に繋げた生物発光酵素融合蛋白質(即ち、生物発光酵素標識抗体)があげられる。“inducible”法は、“basic”法と比較してレポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。典型的には、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法の他、いわゆるレポータージーンアッセイやツーハイブリットアッセイ(刺激に依存してレポーターを発現する)があげられる。また、“activatable”法は、レポーター自体がリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法であり、典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にprotein complentation assay(PCA)，protein splicing assay(PSA)などに適用できる。
【０１２３】
（２−２）“basic”法について
本発明のALucをレポーター蛋白質として「basic法」に適用する場合、ALucを単純に標的蛋白質に繋げた融合蛋白質を作ればよい。この際に非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。
【０１２４】
なお、本明細書において「融合蛋白質」とは、（i）ALucであるレポーター蛋白質と標的蛋白質又は標的蛋白質を認識するペプチドとを含む融合蛋白質をコードする遺伝子から一体として発現させたもの、（ii）ALucであるレポーター蛋白質及び標的蛋白質又は標的蛋白質を認識するペプチドを別々に発現させ、これを化学反応により連結させたものなどを包含する。別々に発現させた蛋白質等を化学反応により連結させる手段としては、例えば、クロスリンカーによる連結、アビジン‐ビオチンの結合能を利用した連結、アミノ酸残基の化学反応性を利用した結合などが例示される。
【０１２５】
典型的な抗体と結合させた生物発光融合蛋白質の場合について説明すると、抗体の単鎖可変領域フラグメント(scFv)のcDNAの上流や下流にALucの遺伝子を繋げたキメラDNAを作成し、適当な発現ベクターに挿入することで完成できる。
【０１２６】
（２−３）“inducible”法について
生物発光酵素をレポーター蛋白質として「inducible法」に適用することは、組換えDNA技術によって組換え蛋白質が作製される際の遺伝子発現の時期及び発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期及び発現量変化を示す指標として広く用いられている。「inducible法」に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ(reporter gene assay)、Yeast Two-hybrid assay、Mammalian Two-hybrid assay、protein splicing assay(PSA)、protein complementation assay(PCA)、circular permutation assay、bioluminescence resonance energy transfer assay(BRET)等があるが、これらの分析システムに必須のレポーター遺伝子としてALucを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。
【０１２７】
以下、典型的な「inducible法」分析システムである、レポータージーンアッセイ、及びツーハイブリッド・アッセイについて詳細に説明する。
【０１２８】
（i）レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化及び遺伝子の発現調節の解析手段として繁用されているが、典型的には核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質(環境ホルモン)の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子(例えば、ホルモン応答性遺伝子)の発現は、リガンドと受容体の複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域(ホルモン応答配列；hormone response element)に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子又は内分泌攪乱物質量を生物発光量などで検出するアッセイ法である。
【０１２９】
その際の宿主細胞としては、一般的な遺伝子組換えに用いられる哺乳動物細胞のCOS細胞、CHO-K1細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、NIH3T3細胞などが好ましく用いられるが、酵母細胞、大腸菌など細菌細胞、昆虫細胞などでも良いが、主要な用途としては、ヒトをはじめ哺乳動物の生体内で、又はインビトロの哺乳動物細胞内で用いる場合が多い。
【０１３０】
レポータージーンアッセイ法において、従来から広く用いられていたホタルルシフェラーゼの場合、[1]分子量が大きくて発現までに時間がかかるので、宿主細胞に大きな負担をかけることになり、[2]発光強度が低いため、十分ルシフェラーゼ(レポーター)量が蓄積するまでに、通常刺激後1〜2日の時間を待つ必要がある、という欠点があったが、ALucをレポーター蛋白質として選択することでこれらの問題点が解消される。
【０１３１】
本発明の発光基質と共にALucをレポーター蛋白質として使用すれば、レポーターの発光強度が極めて高いため、刺激後にごく短時間で測定ができる利点がある。そのため、従来のレポーター蛋白質より大幅に計測時間を短縮でき、かつ経時的な発光の安定性も高いことから、遺伝子導入効率の悪い細胞株においても発光測定ができる。また、長波長側にシフトしているので、細胞膜、皮膚を通しての透過性が高まっているため、バックグラウンド値が下がり測定精度も高い。
【０１３２】
具体的に、本発明の発光基質と共にALucをこれらのレポータージーンアッセイに適用するためには、上流に特殊なプロモーターを搭載している既知の真核細胞発現ベクターに当該発光酵素を繋いで、真核細胞に導入し、一定時間が過ぎた後、信号(刺激)有り無しの条件で測定に用いればよい(非特許文献２０)。当該ALucを搭載できる、レポータージーンアッセイ用の発現ベクターとしては、公知のpTransLucentベクターを利用し、既知の方法を使って簡単に搭載させることができる。
【０１３３】
（ii）ツー・ハイブリッド法
ツー・ハイブリッド法(Two-hybrid法)は蛋白質間の相互作用を調べる手法の１つであり、1989年に酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いたyeast two-hybrid(Y2H)システムがまず構築された。転写活性化因子であるGAL4蛋白質のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、GAL4 DBDと任意の蛋白質Ａ(bait)を融合蛋白質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン(TA)と融合蛋白質とした蛋白質Ｂ(prey)と相互作用をするかどうかを判定できる。前記蛋白質ＡとＢが結合する場合にはDBDとTAが近接してDNA結合ドメイン(DBD)が、「UASG」塩基配列に結合するのでその下流に連結したレポーター遺伝子発現を促すことになる。レポーター遺伝子がルシフェラーゼであれば、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、Ａ,Ｂ両蛋白質の親和性が測定でき、蛋白質Ａ(bait)と相互作用をする蛋白質、ペプチドのスクリーニングができる。その際の蛋白質Ｂ(prey)は発現ライブラリーによって提供させることもできる。
【０１３４】
宿主細胞としては、酵母細胞に限らず、大腸菌など細菌類や、哺乳動物細胞、昆虫細胞も用いられる。その際、酵母由来の転写活性化因子であるGAL4 DBD以外に、大腸菌由来のリプレッサー蛋白質の「LexA」等を用いることもできる。これらをコードするDNAと、リガンド応答性転写調節因子のリガンド結合領域などbait蛋白質(即ち、前記の任意の蛋白質Ａ)をコードするDNAとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。一方、「転写活性化因子の転写活性化領域」としては、例えば、GAL4の転写活性化領域、大腸菌由来のB42酸性転写活性化領域、ヘルペス単純ウイルスVP16の転写活性化領域等を用いることができる。これら転写活性化領域をコードするDNAと、prey蛋白質(即ち、前記の任意の蛋白質Ｂ)をコードするDNAとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。
【０１３５】
具体的には、転写調節因子GAL4のDNA結合領域をコードするDNAを有し、出芽酵母を宿主細胞において利用可能なベクターとして、プラスミドpGBT9(Clontech社製)等をあげることができ、GAL4の転写活性化領域をコードするDNAを有し、出芽酵母において利用可能なベクターとして、プラスミドpGAD424(Clontech社製)等をあげることができる。また、GAL4のDNA結合領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pM(Clontech社製)、pBIND(Promega社製)等をあげることができ、単純ヘルペスウィルスVP16の転写活性化領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pVP16(Clontech社製)、pACT(Promega社製)等をあげることができる。また、LexAのDNA結合領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pLexA(Clontech社製)等をあげることができ、B42をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pB42AD(Clontech社製)等をあげることができる。
【０１３６】
その際、例えば、ALuc遺伝子を、GAL4が結合する領域(「UASG」)などの下流にレポーター遺伝子として挿入したベクターを構築すればよく、哺乳動物宿主の場合であれば、市販のpG5Lucベクター(Promega)やpFR-Lucベクター(Stratagene)を利用し、当該ベクターに搭載されているホタルルシフェラーゼの代わりに周知の方法で簡単に本発明の基質ととものALucを搭載して使用することができる。また、市販のpG5CATベクター(Clontech)のChloramphenicol acetyltransferase(CAT)の代わりに用いることもできる。
【０１３７】
（２−４）“activatable”法について
生物発光酵素を“activatable”法のレポーター蛋白質として搭載する分析システムも、従来から本発明者らが「生物酵素発光プローブ」技術として研究開発し、発展させてきた。以下、典型的な“activatable”法の例として、ALucの「生物酵素発光プローブ」への適用例、及びそれを用いた「細胞内イメージング法」について述べるが、それに先立ち、まず、以前開発した「発光性融合蛋白質(発光カプセル)」について述べる。その他、ALucは、“activatable”法に含まれるprotein complentation assay(PCA)，protein splicing assay (PSA)におけるレポーター蛋白質として好適に適用できる。このような方法を、本明細書では、発光カプセル法もしくは発光カプセルアッセイ法という場合がある。
【０１３８】
（i）発光性融合蛋白質(発光カプセル)の製造
ALucのC末端側に膜局在シグナル(MLS)を結合することで、ALuc本体を細胞膜に局在させることができるが、このように細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、ALuc本体とシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドや蛋白質の遺伝子をカーゴ(貨物という)として挿入することが可能である。こうすることによってカーゴとなる蛋白質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るように仕掛けたことになる。典型的な例としては、各蛋白質の繋ぎ目に、細胞死に応答するDEVD配列やIETD配列を入れ込んだ場合では、細胞死の際caspase-3やcaspase-8の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。本発明者はこの構造の発光性融合蛋白質を「発光カプセル」と名付けた。
【０１３９】
この発光カプセルは、従来の発光プローブと比較し、極めて高輝度で安定な発光特質を示し、細胞膜を透過できない検体に対しても応答する利点を持つ。この発光カプセルは「発光酵素本体のC末端」に「膜局在シグナル(MLS)」をつけた構造を基本骨格とする。このままで、又はALucをタンデムに繋いで発光量を増強した場合でも、細胞死を誘発する化合物など細胞表面の形態変化を引き起こす化合物の作用を、細胞膜表面の形態変化として可視化できるから、観察が容易になる。好ましくは、発光酵素本体のC末端とMLSとの間に、細胞膜表面の形態変化を引き起こすポリペプチドもしくはその一部認識配列、具体的には、例えば、G-protein coupled receptor(GPCR)やc-Srcなどの全長もしくは一部認識配列を挿入することが可能である。また、発光酵素本体のC末端とMLSとの間に細胞死を誘発するポリペプチド、もしくはその認識配列を貨物として挿入することで、細胞死の可視化が可能である。より具体的には、各種caspaseやプロテアーゼ(セリンプロティアーゼ、システインプロティアーゼなど)、消化酵素(トリプシン、アミラーゼなど)によって認識されるペプチド配列(通常20アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下)、例えば、実施例１−７で用いた「DEVD」又は「IETD」を含むアミノ酸配列を貨物として挿入した場合、Caspase-3活性による細胞死の可視化が可能である。更に発光酵素本体とMLSとの間に蛍光蛋白質もしくは他の発光酵素を貨物としてつなげることによって、本発明で示す発光基質と共に発光酵素をタンデムで繋いだ場合と同様に、細胞膜表面での光発生量が強力となるため、より細胞膜の形態観察が容易となり、細胞膜を透過できないリガンドに対しても応答するため、幅広い刺激物に対するスクリーニングが可能である。
【０１４０】
即ち発光カプセルは、ALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、細胞膜表面で発現させたい任意の蛋白質又はポリペプチドが挿入された発光性融合蛋白質であり、典型的には、
（ａ）ALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、蛍光蛋白質又はルシフェラーゼが挿入された発光性融合蛋白質、(なお、ルシフェラーゼとしては他のALucであってもよい。
（ｂ）ALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識する20アミノ酸以下の、好ましくは10アミノ酸以下のポリペプチドが挿入された発光性融合蛋白質。ここで、特に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、Caspase及びその認識配列である「DEVD」又は「IETD」を含む20アミノ酸以下のポリペプチドが特に好ましい。
【０１４１】
（ii）発光プローブへの応用
また、ALucを、本発明者らが既に特許出願している発明に係る一分子型発光プローブ(非特許文献４，６，９，１０、特許文献１−４)、又は二分子型発光プローブ(非特許文献７，８)に組み込むことによって、リガンドの有無、リガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、[1]２つに分割された当該発光酵素(ＮとＣ末側断片)の近傍に、[2]標的リガンドに応答するリガンド結合蛋白質と、[3]リガンド結合蛋白質にリガンドが結合したことを認識する認識蛋白質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合蛋白質にリガンドが結合したことを前記認識蛋白質が認識した場合に、２つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。
【０１４２】
本発明において、「一分子型発光プローブ」というとき、可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とする、公知の生物発光プローブの一つである(特許文献１−２)。例えば、ALucを２分割したNとC末側断片を、リガンド結合蛋白質及びリガンド結合蛋白質の認識蛋白質を基本構成要素として含む融合蛋白質である。同様に「二分子型発光プローブ」というときは、ALucのN末側断片とC末側断片を、リガンド結合蛋白質を含む融合蛋白質、及び認識蛋白質を含む融合蛋白質内にそれぞれ存在させたタイプの生物発光プローブを指す。
【０１４３】
これらの生物発光プローブにおいてALucを用いる場合には、N末側断片とC末側断片とに２分割する必要がある。
【０１４４】
ALucを用いた一分子型発光プローブとして用いる際の具体的な手法は、(特許文献１−４)に詳細に記載された手法に従う。具体的には、ALucを２分割し、リガンド結合性の蛋白質及び当該蛋白質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するペプチド配列とを直線上に結合させた発光プローブをコードするキメラDNAを設計する。一般には、そのキメラDNAを発現させたい細胞に適したベクター内にサブクローンし、当該ベクターを細胞内に導入して、細胞内で発現させるが、キメラDNAの上流に制御配列を繋いで細胞内に直接導入することもできる。ここで、対象の細胞としては、ヒトを含めた哺乳動物由来の細胞が好ましく、生体内に存在する状態の細胞であっても、細胞本来の機能を維持した状態の培養細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞の他、大腸菌などの原核細胞であってもよい。ベクターの具体的な種類も特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。細胞内への導入法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法を用いることができる。あるいは脂質による細胞内導入法(BioPORTER(Gene Therapy Systems社)、Chariot(Active Motif社)等)を採用することもできる。
【０１４５】
本発明でいう最適発光基質と共に高輝度発光酵素を用いた生物発光プローブは、キメラDNAとして細胞内に導入された後に細胞内で融合蛋白質として発現されるため、当該形質転換細胞に対してリガンド刺激を行った後、当該細胞からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。
【０１４６】
ALucを生物発光プローブ内に構成する際、当該ALucと共に搭載できる「リガンド結合蛋白質」としては、そのリガンド結合部位にリガンドが結合する蛋白質が意図される。リガンド結合蛋白質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化するか、リン酸化を起こすか、蛋白質間相互作用を促すものであり得る。このようなリガンド結合蛋白質としては、例えば、ホルモン、化学物質又は信号伝達蛋白質をリガンドとする核内受容体(NR)、サイトカイン受容体、あるいは各種蛋白質キナーゼが用いられる。リガンド結合蛋白質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合蛋白質に結合するリガンドとしては、リガンド結合蛋白質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。例えば、受容体蛋白質(例えば核内受容体、Ｇ蛋白質結合型受容体等)に対するアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。また、細胞内の情報伝達に関与する蛋白質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達蛋白質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇ蛋白質結合型受容体リガンド等であり得る。
【０１４７】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合蛋白質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、cGMP、AMP、PIP、PIP2、PIP3、イノシトール3リン酸(IP3：inositol triphosphate)、IP4、Ca2+、diacylglycerol、arachidonic achid等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのCa2+に対しては、リガンド結合蛋白質としてカルモジュリン(CaM)を用いることができる。
【０１４８】
（iii）細胞内イメージング
また、当該ALucをコードする遺伝子を用いることで、様々な細胞株に安定的に導入できる。一例として、胚内未分化細胞、ES細胞や新型万能細胞(iPS)に当該ALucを安定的に導入できる。前記細胞そのものは、光らないため内部で起こる分子現象、組織特異性を探索するのは大変困難であった。この困難を克服するために、まず、体細胞に当該ALucを含む分子プローブを導入してから胚を作成し、様々な臓器組織に分化させる。すると、臓器ごとに起こる特異的な分子現象を高感度に計測できる。
【０１４９】
その際には、山中らの手法に従う(非特許文献３６)。
【０１５０】
また、前記ALucに適選のシグナルペプチドを繋げることによって、各細胞小器官の高輝度イメージングに使用できる。例えば、GAP-43由来の「MLCCMRRTKQV配列」(配列番号５２)をALucのＮ又はＣ末に付けることによって、細胞膜に局在化できる。また、細胞質局在のために「GRKKRRQRRR配列」(配列番号５３)を付ける。また、小胞体(ER)と細胞核に局在化させるためには、それぞれ「KDEL」(配列番号５４)と「DPKKKRKV配列」(配列番号５５)を繋げることによって可能となる。他に、HIS-tag(HHHHHH) (配列番号４８)、FLAG-tag(DYKDDDDK) (配列番号４９)、Myc-tag(EQKLISEEDL)(配列番号５０)、HA-tag(YPYDVPDYA)(配列番号５１)、V5-tag(GKPIPNPLLGLDST)(配列番号５５６)、T7-tag(MASMTGGQQMG)(配列番号５７)などの抗原サイトをつけることによって、非細胞系における免疫染色、分離精製に利用できる。その際には、周知の免疫染色法、immunocytochemistry等の手法が適用できる。
【０１５１】
［ＩＩ］本発明の発光基質を有するバイオアッセイ用反応溶液の決定
１．バイオアッセイ用反応溶液
（１−１）ライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)
従来、バイオアッセイはライシスバッファー(細胞溶解液)とアッセイバッファー(反応液)に分けてアッセイを行ってきた。細胞を速やかに溶解するためには、高い溶解力、発光酵素への低い阻害性が必須であると考えられ、一方、バイオアッセイ反応の際には安定したアッセイ条件及びバックグラウンドを下げるために、自己発光を誘発する成分の除去や検討が必須であると考えられていたことによる。
【０１５２】
従来、プロメガ(Promega)社でも、ライシスバッファー及びアッセイバッファーをそれぞれ、製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E290A)及び製品名Luciferase Lysis Buffer(カタログ番号：E291A)として販売しており、NEB社でもそれぞれ製品名Luciferase Assay Buffer(カタログ番号：E3300S)及びLuciferase Lysis Buffer(カタログ番号：B3321)として販売している。なお、プロメガ(Promega)社、NEB社の市販品の成分組成は公表されていないが、いずれもアッセイバッファーとライシスバッファーに分けた複雑なプロトコールを提示している。
【０１５３】
本発明でいうALuc用最適発光基質と共に利用できる反応溶液成分の組成の検討を行っている。
（ａ）界面活性剤：polyoxyethylene octylphenyl ether(TritonX-100；TX100)，Nonidet P-40(NP40)，polyoxyethylene sorbitan monolaurate(Tween20；TW20)，polyoxyethylene sorbitan monooleate(TW80)，polyoxyethylene cetyl ether(Brij58)，sodium dodecyl sulfate(SDS)等。
親水度の度合いとしては、TW20＞Brij58＞TW80＞TX100＞NP40、界面活性度の度合いとしてはNP40＞TX100＞Brij58＞TW20＞TW80の順であるとされている。（ｂ）塩類：NaCl，KCl,(NH4)2SO4など
（ｃ）SH試薬：メルカプトエタノール、DTT等
（ｄ）ポリオール：グリセロール、グルコース、スクロース等
（ｅ）グリコール類：ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)（ｆ）キレート試薬：EGTA、EDTA等
（ｇ）Protease Inhibitor：アプロチニン(分子量6.5kD)、ロイペプチン(分子量：427)、ペプスタチンＡ(pepstatin，分子量：686)、phenylmetylsulfonyl Fluoride(PMSF、分子量：174)、アンチパイン(Antipain，分子量：605)、キモスタチン(chymostatin，分子量：608)、pefabloc SC(AEBSF，240 Da)，DFP(184 Da)，p-APMSF(216 Da)，STI(20,100 Da)，Leupeptin(460 Da)，N-Tosyl-L-phenylalaninechloromethylketone，3,4-dichloroisocoumarin(215 Da)，EDTA-Na2(372 Da)，EGTA(380 Da)，1,10-phenanthroline(198 Da)，phosphoramidon(580 Da)，Dithiobis(2-amino-4-methylpentane)，E-64(357 Da)，cystatin，bestatin，Epibestatin hydrochloride，aprotinin，minocycline，ALLN(384 Da)等
（ｈ）バッファー剤：p-Toluenesulphonic acid，tartaric acid，citric acid，phthalate，glycine，trans-aconitic acid，formic aicd，3,3-dimethylglutaric acid，phenylacetic acid，sodium acetate，succinic acid，sodium cacodylate，sodium hydrogen maleate，maleic acid，sodium phosphate，KH2PO4，imidazole，2,4,6-trimethylpyridine，Triethanolamine hydrochloride，sodium 5,5-diethylbarbiturate，N-ethylmorpholine，sodium pyrophosphate，Tris(hydroxymethyl)aminomethane，bicine，2-amino-2-methylpropane-1,3-diol，diethanolamine，potassium p-phenolsulphonate，boric acid，sodium borate，ammonia，グリシン(glycine)，Na2CO3/NaHCO3，sodium borate，またはこれらの組み合わせ
（ｉ）その他：Sodium molybdate(受容体の安定化)、ジチオトレイトール(dithiothreitol，DTT)(還元剤)。
【０１５４】
（１−２）本発明のALucに最適な発光基質を添加できる、基本となる反応溶液成分１：  本発明では、HBSSバッファー(Hanks' Balanced Salt Solution)を基本組成物として用いる。その調製手法は、公知のプロトコール(例えば、独立行政法人医薬基盤研究所のウェブページhttp://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htmに記載のもの。)に従い、以下のように調製した。
【０１５５】
まず以下の４種類の溶液をあらかじめ調製し，混合して利用する。
−溶液１：1.4％ NaHCO3 溶液
−溶液２：NaCl 80.0g，KCl 4.0g，MgSO4・7H2O 2.0 g，Na2HPO4・2H2O 0.6g，glucose 10.0g，KH2PO4 0.6gを水800mlに溶かした溶液。
−溶液３：CaCl2 1.4 gを水100mlに溶解した溶液。
−溶液４：Phenol red 0.4gを秤量し，少量の水でペースト状にし，ついで水を加えて150mlとする。
【０１５６】
水酸化ナトリウム溶液(N/20)でpHを7.0に調整し全量を200mlとする。
【０１５７】
使用する際には、87.5mlの滅菌水に溶液１を2.5ml、溶液２を8ml、溶液３を1ml、溶液４を1ml、それぞれ加えたものを使用する。Phenol redを使わない場合には、溶液４の混合を省略できる。
【０１５８】
（１−３）ALucに最適な発光基質を添加できる、基本となる反応溶液成分２
トリスバッファーそのものは従来から広く使われているバッファー成分(ここでいうトリスはトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称であり、一般的な組成はトリス塩10mMにHClでpHを調整したもので、添加剤としてEDTA 1mMを入れる場合もある)であり、生体適合性が高い理由で、さまざまなバイオ研究で用いられている。しかし、トリスバッファーが生物発光反応に与える影響に関する研究は今まで十分されてなかった。
【０１５９】
本発明用の反応溶液としてはトリスバッファーが生物発光に好適に使えるものであり、細胞溶解(Lysis)用にもアッセイ用にも共通に用いられる基礎バッファー成分である。
【０１６０】
（１−４）本発明におけるバッファー組成
上記基本的なバッファー成分のHBSSバッファー及びTris−バッファーを組み合わせて用いるが、その際両者を容量(v/v)％で20〜50：50〜20、好ましくは40〜60：60〜40、最も好ましくは、60：40で配合する。
【０１６１】
界面活性剤としては、NP-40及びTW80、さらにSDSを組み合わせて用いるが、その際、NP-40：TW80：SDSを容量(v/v)％で1：0.1〜1：0〜0.5、好ましくは、1〜2：0.5〜2：0.1〜1、最も好ましくは、1：1：0.1の比で配合する。
【０１６２】
界面活性剤のTW80を他の界面活性剤と組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜10(v/v)％、好ましくは5〜10(v/v)％範囲で配合する。
【０１６３】
ポリオールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)及び糖成分(スクロース，グルコース)を組み合わせるが、PEG400が0.01〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は0〜20 mg/mL範囲で配合するが、好ましくはそれぞれPEG400が0.1〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は2〜10 mg/mL範囲で配合する。
【０１６４】
重金属として、(Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)やZn(II))を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が0.01〜1PPM範囲で、好ましくは１PPM配合する。
【０１６５】
ハロゲンイオン(Br-やＩ)を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜100mM、好ましくは50〜100mMの範囲で配合する。
【０１６６】
その他、発光安定性を向上させるためにビタミンCなどの還元剤を適宜配合すると、さらによい。
【０１６７】
以上の検討から、ALucに特異的な発光基質を含むone-shot反応溶液として好ましいバッファー組成を以下のように絞り込んだ。
【０１６８】
すなわち、素早い溶解性が求められ、かつ高輝度での観察性が要求される、生物発光酵素利用技術における「one-shot反応溶液」の場合の基本的な組成としては、C3バッファーで基本としたTris-HClバッファーに、HBSSバッファーを組合せ、界面活性剤のNP-40、又はSDS、塩類のAl(III)，Ca(II)，Cu(II)，Fe(III),またはMg(II)、PEG又はPPG、ハロゲンイオン類(I-、Br-)、D(+)glucose又はGlycineを組み合わせて構築すればよい。
【０１６９】
４．本発明において用いる測定方法、測定装置
リガンド活性の測定は、通常の生物発光アッセイに準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコールが適用できる。
【０１７０】
生物発光強度を測定するためには、ルミノメーター(例、MiniLumat LB 9506 (Berthold)；GloMax 20/20n(Promega))が一般的に利用されてきた。プレート上で培養された細胞にライセートバッファーをかけることによって細胞溶解液を作り、本発明のALuc最適な発光基質と混合した後の発光値を即時に測定する。
【０１７１】
96穴プレート上に培養された細胞を対象にリガンド活性を計測する場合には、既製の生物発光プレートリーダー(例、Mithras LB 940(Berthold)；SH-9000(Corona))を用いることができる。リガンド共存下で、発現されたプローブによる生物発光は、前記プレートリーダーに付いている自動基質溶液インジェクターを用いることによって瞬時に基質導入・発光測定ができる。
【０１７２】
５．スクリーニング方法の対象被検物質
これらのスクリーニング方法の対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物(特に低分子量の化合物)、生物活性を持つ蛋白質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照)。さらには、市販のライブラリー(例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos，Inc.社製、ロシアChemStar，Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー)を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
【０１７３】
６．キット
本発明はまた、ALuc特異的な発光基質を含むバイオアッセイ用キットをも提供する。本発明のキットは、バイオアッセイを実施するための各種成分を必要に応じて含めることができる。このような成分としては、発光酵素、発光酵素をコードする遺伝子を含むベクター、発光酵素を発現する細胞、本発明のALuc特異的な発光基質、各種器具（96穴プレート若しくはチューブなど。）、対照試料などが例示されるが、これに限定されない。また、本発明のバイオアッセイ法を実施するための方法を記載した手順書を含めてもよい。
【０１７４】
発光酵素としては、昆虫由来および海洋動物由来の生物発光酵素、典型的には、firefly luicferase、click beetle luciferase、Renilla luciferase、カイアシ類ルシフェラーゼ(Metridia longa luciferase、Metridia pacifica luciferase)などや、本発明者の既発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)が好適な例として挙げられる。人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、特に好適な態様の1つである。
【０１７５】
発光酵素をコードする遺伝子を含むベクターは、意図されるバイオアッセイ（レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、蛋白質相補法(protein complementation assay)、インテインを介した蛋白質スプライシング法(intein-mediated protein splicing assay)、一分子型生物発光プローブ法(single-chain probe-based assay)など。）に応じて、公知の手法により製造することができる。
【０１７６】
対照試料としては、所定量の発光酵素を含むポジティブコントロール、発光酵素を含まないネガティブコントロールなどが挙げられる。
【０１７７】
本発明のキットは、上記成分を公知の手法により組み合わせることで、製造することができる。本発明のキットは、前述の本発明のバイオアッセイ法を実施するために用いることができる。
【０１７８】
［ＩＩＩ］本発明で用いる用語、概念について
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ．Sambrook，E．F．Fritsch & T．Maniatis，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)"，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D．M．Glover et al．ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；Ausubel，F．M．et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人(1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸III(組換えDNA技術)」、東京化学同人(1992)；R．Wu ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.100(Recombinant DNA，Part B) & 101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R．Wu et al．ed.，"Methods in Enzymology"，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E) & 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)から入手することができる。
【実施例】
【０１７９】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。【０１８０】
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。【０１８１】
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【０１８２】
〔実施例１〕人工生物発光酵素の遺伝系統学的特徴と立体構造に関する考察
本発明者らの先願特許により一連の人工生物発光酵素（ALuc）が合成されたが、その特異的な発光基質に関する情報は未だに明らかになっていなかった。そこで、まず、遺伝系統学的な観点からALucと他の発光酵素間の遺伝的相関性を明らかにした。【０１８３】
アメリカ生物情報センター（NCBI）が提供するアミノ酸配列の多重整列解析プログラムであるCLUSTALW2.1を利用して、代表的な海洋生物由来の発光酵素であり、セレンテラジンを基質とする共通点を持つMetridia longa luciferase (MLuc), Metridia pacifica luciferase 2 (MpLuc2), Gaussia luciferase (GLuc), Luciaの配列をALucと比較した。その結果、図１（A）で示すように従来の配列とは大きく異なる系統位置にALucが位置していることが分かった。この遺伝系統上での特徴は、ALucが従来とは異なる発光基質特異性を示す可能性を強く示唆するものであった。この示唆点を解明するために、ALucの立体構造を明らかにすることにより、その立体構造に合致する基質の構造を見出していくことに思い至った。【０１８４】
ALucの立体構造を明らかにするために、以下の実験を行った。まず先行文献（非特許文献３５）に記載の方法を用いて、Coelenterazine-Binding Protein（CBP）のX線結晶構造データ（PDBID: 2hpsA, 2hq8A）について、アミノ酸残基ごとの主鎖のコンフォメーションをαへリックス型 (h)、βシート型 (s)、その他の型 (o) の3種類の符号にコード化変換を行い、超二次構造の記述を行った。【０１８５】
次に、CBPとALuc30について、アミノ酸配列の相同性の比較を行ったところ、16.7%の相同性が確認された。この相同性に基づき、アミノ酸配列のアラインメントを行い、MolFeat v4.5（http://www.fiatlux.co.jp/product/lifescience/molfeat/mol-index.html）を用いて、2hpsA の構造データのアミノ酸残基の置換を行って分子モデルの作成を行った。次に、アミノ酸残基の挿入及び欠失については、HyperProtein  v1.0 （http://www.hyper.com/Products/HyperProtein/tabid/504/Default.aspx）及びChem3D Ultra v8.0（http://www.cambridgesoft.com/Ensemble_for_Chemistry/ChemBio3D/）を用いて、アラインメントに沿って、超二次構造が一致するようにCOELENTERAZINEも含めて注意深く分子モデリングを行った。最終的には、Polak-Ribiere AlgorithmによるMolecular Mechanics (MM)計算を行い、構造最適化をした。【０１８６】
前述した手法によりALuc30の立体構造を明らかにした（図１B）。この結果によれば、ALuc30は9つのαへリックスにより形成されており、各へリックスは発光基質（中央部の赤の化合物）を取り囲む形で配置されていることが分かる。また基質はイミダゾール骨格と３つのレジデュー（即ち、R-A、R-B、R-C）により形成されており、R-Aから奥側に突き刺さる態様でALucに挿入されている。R-Aは折れた矢先の形状の構造を取っており、その周りは空洞が存在していることが分かる。また、R-BはR-Aとは背向く態様で上に刺さっており周りには疎水性アミノ酸に囲まれている。一方、R-Cは発光酵素のポケットの入り口近傍に位置しており、ALuc30のC末端のアミノ酸（例えば、9番目のへリックス）と相互作用していることが分かった。【０１８７】
〔実施例２〕セレンテラジン誘導体の化学構造に関する考察
前記実施例により明らかになったALucの立体構造に基づき、この立体構造に合致するセレンテラジン誘導体の化学構造を考察した（図２）。図２の左上はネイティブセレンテラジンの化学構造である。上段は、レジデューA（R-A）の官能基を考慮した化学構造の羅列である。一方、下段は、主にレジデューB（R-B）の官能基に焦点を合わせて化学構造を羅列した。囲み線及び矢印は、各レジデューや官能基の違いを示す。【０１８８】
セレンテラジンは、イミダゾール骨格とそれに連結した３つのレジデュー（ここではR-A、R-B、R-Cと表示する）で構成されている。各レジデューの構造と官能基によってそれぞれのルシフェラーゼ特異性が出ると考えられている。【０１８９】
ネイティブセレンテラジンは、R-AとR-C位置がフェノール構造であり、R-B位置はベンゼン構造である。図１Bの立体構造から明らかなように、R-Aの近傍には広いスペースがあるため、R-Aには比較的に大きい官能基も許容できる。この点に着目し、セレンテラジン誘導体のうち、R-Aに結合する官能基の大きさを中心に一連の発光基質を選定した（図２上段の矢印部分）。また、R-Bの周りにおける疎水性環境に着目しπ−πスタッキングが可能なレジデューがALuc特異的な発光基質の必須条件であると推定した。それでこの仮説を証明するために、セレンテラジン誘導体のうち、R-Bのレジデューがベンゼン環ではない基質（図２下段）を選定し、ベンゼン環である基質（図２上段）の発光輝度と比較した。【０１９０】
〔実施例３〕セレンテラジン誘導体によるALucの生物発光輝度の比較
前記実施例を根拠に、ALucに特異的な発光基質を明らかにするために、以下の実験を行った。【０１９１】
まずアフリカサル腎臓由来の培養細胞であるCOS-7を96穴プレートに培養しその培養面積がプレートの下面積の90％を覆うまで培養した。この時点でプレートウェルの細胞を２つに分け、それぞれにはALuc34やRLuc8.6-535を発現するpcDNA3.1(+)ベクターをlipofection方式（TransIT-LT1）で導入し、16時間程度培養した。培養後、細胞を溶解し10μLずつ別の96穴プレートに分注し、各発光基質をマルチチャンネルピペットを用いて同時に加え、その相対的な発光輝度を、発光イメージング装置LAS-4000 (FujiFilm)を用いて直ちに測定した。その結果を図３Ａ及び表１に示す。結果に示されるように、R-A部位の大きさに依存して発光輝度が変化していることが明らかになった（例、CTZ n, CTZ i, CTZ f, CTZ hを比較）。R-Aの官能基がハロゲン原子である場合には、特に大きい基質選択性が見られた（CTZ iの場合に1:9400、CTZ fの場合に1:134）。ここでいう基質選択性とは、同じ発光基質に対してRLuc8.6-535が示す発光輝度に比べたALucの発光輝度を意味する。挿入図Ａは、LAS-4000から取られた生物発光の疑似色イメージである。【０１９２】
一方、R-B位置にベンゼン環以外のレジデューを有する発光基質は一般的に弱い発光輝度および選択性を示していることが明らかになった（例、CTZ ip, CTZ cp, CTZ fcp, CTZ hcpを比較）。【０１９３】
また、R-C位置がフェノール（ヒドロキシベンゼン）基であることが良いという前記実施例の考察を検証するためにCTZ400AとCTZ hの発光輝度を比較したところ、「R-C位置にフェノール（ヒドロキシベンゼン）基」を有する場合（CTZ h）の強い発光に比べ、ない場合（CTZ400A）には殆ど発光輝度が観測できなかった。【０１９４】
この実験結果は、ALucに最適な発光基質はR-Aにベンゼン環骨格が好ましくその骨格に一定大きさの官能基を許容するものであり、より好ましくはハロゲンイオンを官能基として有しているもの、特に好ましくはヨウ素、フッ素、塩素を有する発光基質が好適である。また、R-Bにはベンゼン環骨格が好ましい。、R-Cには親水性官能基（例えば、水酸基、チオール基）を有するベンゼン環レジデューが好ましく、より好ましくはフェノール（ヒドロキシベンゼン）構造が好適であることが分かった。【０１９５】
前記実施例３Ａと同様の手法でできた細胞溶解液（lysate）から生物発光スペクトルを調べた。まず前記細胞溶解液5μLを図３Ｂで示す発光基質30μLと混ぜた後、すぐ全波長同時測定の可能な高精度発光スペクトロメーター（AB-1850, ATTO）を用いて測定した。【０１９６】
そのスペクトル結果によれば、RLuc8.6-535は同一発光基質に対してもALuc34より30nmほど長波長発光することが分かった。またALuc34を用いる場合、CTZ fに比べてCTZ iの方が若干長波長シフトしていることが分かった（表２）。【０１９７】
【表１】
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【０１９８】
【表２】
2015056762.tif 000012
【０１９９】
〔実施例４〕ALucの基質選択性と立体構造間の相関関係に関する考察
一般的に生物発光はルシフェリンとルシフェラーゼ間の酸化触媒反応により産生される。多様なルシフェラーゼの種類が知られているが、ルシフェリンにおいては化学構造の多様性がない。海洋生物由来の発光酵素に用いられるルシフェリンも同様に数少なく、セレンテラジン、ウミホタルルシフェリンが代表的である。特にセレンテラジンは多数の海洋生物由来の発光酵素に用いられるため、以前から約50種類以上の誘導体が合成されてきた（非特許文献３０、３１）。【０２００】
セレンテラジンは、イミダゾール骨格とそれに繋がる３つのレジデュー（ここではR-A、R-B、R-Cと表示する）で構成されている。各レジデューの構造と官能基によってそれぞれのルシフェラーゼ特異性が出ると考えられている。【０２０１】
ネイティブセレンテラジンは、R-AとR-C位置にフェノール構造であり、R-B位置はベンゼン構造である（図４Ａ）。前記実施例から明らかになったように、R-Aのベンゼン骨格には比較的に大きい官能基も許容できる空間が存在している。この点をより明らかにするために、ALuc30の立体構造の内部構造を明らかにした（図４Ｂ）。白い矢印から分かるように一定の空洞が見られることから、R-Aに付く官能基は比較的に大きいものでも許容できることが立体構造から説明つけられる。特にCTZ iの場合から明らかなように、ヨウ素を官能基とした場合、１万倍に近い強い発光基質選択性を示すことから、このような選択性は、立体構造における「サイズ効果」によるものであることを強く示唆している。【０２０２】
また、ヨウ素は一般的に生体タンパク質の中で頻度の低い元素であり、電子供与体でもある。この事実から明らかなように、CTZ iが示した驚くべき発光酵素選択性は、ヨウ素が単純に「サイズ効果」だけでなく電子供与体としてALuc内のアミノ酸と好適に相互作用した結果であることを強く示唆する。【０２０３】
〔実施例５〕ALucとCypridina Luciferase (CLuc)の共存下でデュアルアッセイによる発光検出。【０２０４】
２つ以上の発光酵素共存下でデュアルアッセイを行えることは、多数バイオマーカーの同時計測等に有利な性能である。この点に着目し、２つの発光酵素（ALucとCLuc）が共存する条件で発光測定を行った（図５）。まず９６穴プレートにCOS−７細胞を培養し、それぞれの細胞区画にALuc又はCLucを発現するプラスミドをLipofectionにより導入した。この条件ではCLucは分泌されるが、ALucは末端に付けた小胞体局在シグナル（KDEL）のため細胞内に多く留まる。１６時間後、CLuc培養溶液10μLとALucのライセット２μLを混合した。更に0.1％SDS有り無しの条件で発光輝度を比較した。この際、それぞれの特異的な発光基質を添加した輝度比較であった。【０２０５】
その結果、0.1％SDS無しの条件ではいぞれも強い発光輝度を示した（図５、上の２行）が、SDS有りの条件ではALucの場合は殆どの光が消えていたが、CLucの場合はやや発光活性を維持していた（図５、下の２行）。この結果は、両方の発光酵素が共存するデュアルアッセイ条件でも、それぞれの発光活性を、[(1)酵素１測定、(2)SDSによる酵素１の失活、(3)酵素２の測定]の手順を踏めば、２つの異なる酵素の発光活性の同時計測が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０２０６】
従来から広く用いられているレポータージーンアッセイ法をベースとしたリガンド計測、又は従来の生物発光プローブなどにおけるALuc専用の発光基質として用いることによって、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できるため、基礎生物学研究、医学、薬学、分析化学における診断試薬開発等の広範な用途に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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