(57)【要約】  簡便な３−ヒドロキシプロリンの分析を可能とする新たな分析方法の提供を目的とする。  下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程により、被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを分析する。（ｓ１）３−ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程（ｓ２）Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
2015033636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
（ｓ１）３−ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
【請求項２】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｔｌ）〜（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｔｌ）  配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ａｂ）〜（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ａｂ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項４】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）〜（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｐｓ）  配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｔｌ）〜（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｔｌ）  配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項７】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ａｂ）〜（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ａｂ）  配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｃｐ）〜（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｃｐ）  配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項９】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）〜（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｈｓ）  配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１０】
下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中のコラーゲンの測定方法。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３−ヒドロキシプロリンの量を、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３−ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程
【請求項１１】
前記コラーゲンが、コラーゲンIVである、請求項１０記載の測定方法。
【請求項１２】
下記（Ｒ１Ｔｌ）〜（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｒ１Ｔｌ）  配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１３】
下記（Ｒ１Ａｂ）〜（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｒ１Ａｂ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１４】
下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１５】
下記（Ｄ１Ｔｌ）〜（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素。
（Ｄ１Ｔｌ）  配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１６】
下記（Ｄ１Ａｂ）〜（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｄ１Ａｂ）  配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１７】
下記（Ｄ１Ｃｐ）〜（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素。
（Ｄ１Ｃｐ）  配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１８】
３−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
３−ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、分析試薬。
【請求項１９】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１２記載のタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２０】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１３記載のタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２１】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１４記載のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２２】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）〜（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
（Ｒ１Ｐｓ）  配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項２３】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１５記載の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２４】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１６記載のタンパク質である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２５】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１７記載の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２６】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）〜（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
（Ｄ１Ｈｓ）  配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項２７】
コラーゲンの測定試薬であって、
請求項１８から２６のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする、測定試薬。
【請求項２８】
下記（ｒ１Ｔｌ）〜（ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子。
（ｒ１Ｔｌ）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項２９】
下記（ｒ１Ａｂ）〜（ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
（ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３０】
下記（ｒ１Ｃｐ）〜（ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子。
（ｒ１Ｃｐ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３１】
下記（ｄ１Ｔｌ）〜（ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
（ｄ１Ｔｌ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２Ｔｌ）前記（ｄ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３Ｔｌ）前記（ｄ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３２】
下記（ｄ１Ａｂ）〜（ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
（ｄ１Ａｂ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項３３】
下記（ｄ１Ｃｐ）〜（ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
（ｄ１Ｃｐ）配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２Ｃｐ）前記（ｄ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３Ｃｐ）前記（ｄ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いた３−ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康および美容の観点から、コラーゲンが注目されており、コラーゲンの定性分析および定量分析が、重要視されている。【０００３】
試料中のコラーゲンの分析方法としては、コラーゲンに含まれるヒドロキシプロリンの含有量を測定することによって、間接的にコラーゲンを測定する方法が一般的である。コラーゲンは、一般的なタンパク質、すなわち非コラーゲンタンパク質を構成する基本アミノ酸には該当しないヒドロキシプロリンを含有している。このため、試料におけるヒドロキシプロリンを分析すれば、間接的に、前記試料におけるコラーゲンの分析が可能である。そして、ヒドロキシプロリンの測定は、ＨＰＬＣ分析が汎用されている（特許文献１）。具体的な方法としては、まず、試料に前処理を施し、コラーゲンの分解によりヒドロキシプロリンを遊離させる。前処理済みの試料をＨＰＬＣに供し、ヒドロキシプロリンのピーク面積からヒドロキシプロリン量を算出する。そして、前記算出値と、コラーゲン１分子あたりのヒドロキシプロリン量とから、前記試料のコラーゲン量を求めることができる。【０００４】
ＨＰＬＣ分析によりヒドロキシプロリンを分析する場合、ヒドロキシプロリンを、コラーゲンの分解により遊離するＬ−ヒドロキシプロリンから分離しなければならない。しかしながら、ＨＰＬＣ分析によっても、ヒドロキシプロリンとＬ−ヒドロキシプロリンとの分離は、困難である。また、ヒドロキシプロリンは２級アミンであることから、特殊な展開溶媒で開環する必要がある。さらに、ＨＰＬＣ分析は、高額な分析カラムおよび機器が必要であり、分析に時間を要するという問題がある。【０００５】
他方、コラーゲンの中でも、コラーゲンIVは、癌患者の尿中で濃度が上昇することが報告されており、癌のマーカーとなり得る。そして、コラーゲンIVには、他のタイプ（例えば、Ｉ〜III）と比較して、約８〜２５倍の３−ヒドロキシプロリンが含まれていることから、３−ヒドロキシプロリンを分析することで、間接的に癌マーカーとなるコラーゲンIVを分析することができる。このため、３−ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許公表２０１０−５０４５３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、３−ヒドロキシプロリンの簡便な分析を可能とする新たな分析方法、それを用いたコラーゲンの測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法は、被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）３−ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程【０００９】
本発明のコラーゲンの測定方法は、被検試料中のコラーゲンの測定方法であり、下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３−ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３−ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程【００１０】
本発明の新規タンパク質は、下記（Ｒ１Ｔｌ）〜（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１Ｔｌ）  配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質【００１１】
本発明の新規タンパク質は、下記（Ｒ１Ａｂ）〜（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１Ａｂ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質【００１２】
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素は、下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質【００１３】
本発明の分析試薬は、３−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする。【００１４】
本発明の測定試薬は、コラーゲンの測定試薬であって、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする。【００１５】
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子は、下記（ｒ１Ｔｌ）〜（ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ｔｌ）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００１６】
本発明の新規遺伝子は、下記（ｒ１Ａｂ）〜（ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００１７】
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子は、下記（ｒ１Ｃｐ）〜（ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ｃｐ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｃｐ）前記（ｒ１Ｃｐ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【発明の効果】
【００１８】
本発明者は、鋭意研究の結果、３−ヒドロキシプロリンの分析方法として、酵素を用いる新たな方法を見出した。具体的には、まず、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素によって、３−ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に変換し、さらに、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素によって、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸の還元反応を行う。そして、この還元反応を分析することで、酵素的に３−ヒドロキシプロリンの分析が可能となるとの知見を得て、本発明を完成するに到った。本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって簡便に３−ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によって３−ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、医療、食品および美容等の分野において、極めて有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Δ１−ピロリン−２−カルボン酸（以下、「Ｐｙｒ２Ｃ」ともいう。）還元酵素のＣＢＢ染色の結果を示す写真である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、３−ヒドロキシプロリン（以下、３−Ｈｙｐ）ともいう。）の濃度を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を用いて作成した検量線を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２において、３−Ｈｙｐ脱水酵素の量およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の量を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２において、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を添加するタイミングを代えたときの、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３において、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のＣＢＢ染色の結果を示す写真である。
【図７】図７は、本発明の実施例３において、補酵素を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例３において、基質を変えたときのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例４において、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例５において、炭素源を変えたときのＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来無細胞抽出物の３−Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例６において、リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例６において、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例６において、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例７において、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例７において、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例８において、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフ
【図１７】図１７は、本発明の実施例９において、相対活性を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の実施例１０において、ＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例１１において、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を用いて作成した検量線を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の実施例１１において、検量線から求めた３−ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３−ヒドロキシプロリンの濃度とを示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の実施例１２において、相対活性を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明の実施例１２において、相対活性を示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の実施例１３において、リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２４】図２４は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。
【図２６】図２６は、本発明の実施例１３において、相対活性を示すグラフである。
【図２７】図２７は、本発明の実施例１３において、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜３−ヒドロキシプロリンの分析方法＞
本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法は、前述のように、被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法であり、下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（ｓ１）３−ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
【００２１】
本発明において、以下、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素を、３−Ｈｙｐ脱水酵素、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素ともいう。
【００２２】
本発明において、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、３−ヒドロキシプロリンの脱水反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、Ｈｏｍｏ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｍｕｓ属、Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ属、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来等あげられる。Ｈｏｍｏ属は、例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等があげられる。また、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属は、例えば、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｓｐ．３８３等があげられる。また、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ等があげられ、具体例として、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５があげられる。Ｍｕｓ属は、例えば、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ等があげられる。Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ属は、例えば、Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ等があげられる。Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ等があげられ、具体例として、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ等があげられる。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ等があげられる。
【００２３】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のようなものが例示できる。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿６５３１８２．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号３）からなるタンパク質等があげられる。また、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０８０３１４．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号７）からなるタンパク質等があげられる。Ｓａｃｃｏｇｌｏｓｓｕｓ ｋｏｗａｌｅｖｓｋｉｉ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＸＰ＿００２７３４１８２．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号８）からなるタンパク質等があげられる。Ｂ．ｓｐ．３８３由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２４１８．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質等があげられる。
【００２４】
以下に、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の具体例を示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３−Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
【００２５】
2015033636.tif 000003
【００２６】
2015033636.tif 000004
【００２７】
2015033636.tif 000005
【００２８】
2015033636.tif 000006
【００２９】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素および本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方を使用できる。本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素および本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素については、後述する。
【００３０】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、下記（Ｄ１）〜（Ｄ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｄ１）  配列番号３、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２）  前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３）  前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【００３１】
前記（Ｄ１）において配列番号３の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｈｓ）、（Ｄ２Ｈｓ）および（Ｄ３Ｈｓ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号９の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｃｐ）、（Ｄ２Ｃｐ）および（Ｄ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１１の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ａｂ）、（Ｄ２Ａｂ）および（Ｄ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１２の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｔｌ）、（Ｄ２Ｔｌ）および（Ｄ３Ｔｌ）ともいう。
【００３２】
前記（Ｄ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜３個」との記載は、「１、２、３個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００３３】
前記（Ｄ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３）の「同一性」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００３４】
前記（Ｄ２）および（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
【００３５】
前記（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
【００３６】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３０℃、ｐＨ８の条件下、１分間に１μｍｏｌのＬ−プロリンを生成する酵素量と定義できる。
【００３７】
３−ヒドロキシプロリンは、例えば、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（以下、シス−３−ヒドロキシプロリンともいう）およびトランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（以下、トランス−３−ヒドロキシプロリンともいう）があげられる。本発明において、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、シス型およびトランス型のいずれを基質としてもよく、両方を基質としてもよい。例えば、生体内における３−ヒドロキシプロリンを分析する場合、前記３−ヒドロキシプロリンはトランス型であるため、トランス型を基質とする３−Ｈｙｐ脱水酵素が好ましい。
【００３８】
本発明において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸の還元反応の触媒機能を有するタンパク質であればよく、その種類および由来等は、特に制限されない。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属由来等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属は、例えば、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ等があげられる。Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、具体例として、ＰＡＯ１株（例えば、Bater,  A.  J.,  Venables,  W.  A.,  and  Thomas,  S.  (1977)  Arch.  Microbiol.  112,  287-289、Manoharan,  H.  T.  (1980)  J.  Biosci.  2,  107-120参照）等があげられる。Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａは、具体例として、ＫＴ２４２２株（例えば、Gryder,  R.  M.,  and  Adams,  E.  (1969)  J.  Bacteriol.  97,  292-306参照）等があげられる。Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ等があげられる。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅは、具体例として、ＡＴＣＣ２９１４５株等があげられる。Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属は、例えば、Ｂ．ｓｐ．３８３等があげられる。Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ属は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ等があげられ、具体例として、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ等があげられる。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ等があげられる。
【００３９】
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿２４９９４３．１で登録されているアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質等があげられる。
【００４０】
以下に、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の具体例を示すが、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００４１】
Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号２）
MIRMTLDEVRELAVRILRRHAFSEAHVQAVADTLVAGERDECASHGIWRLLGCIATLKAGKVSADAEPELHDIAPGLLRVDAHGGFSQCAFRLGLPHLLEKARSQGIAAMAVNRCVHFSALWVEVEALTEAGLVALATTPSHAWVAPAGGRKPIFGTNPIAFGWPRPDGPPFVFDFATSAVARGEIQLHERAGKPIPLGWGVDEQGEPTTDASAALRGAMLTFGGHKGSALAAMVELLAGPLIGDLTSAESLAYDEGSRSSPYGGELLIAIDPRRMLGASAEEHLARAETLFEGIVEQGARLPSQRRFEARERSARDGVTIPEALHRELLALLE
【００４２】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、この他に、例えば、ｄｐｋＡ−ｌｉｋｅ酵素またはオルニチンシクロデアミナーゼ様（ＯＣＤ−ｌｉｋｅ）酵素等を用いてもよい。Ｐｓ．ｐｕｔｉｄａ由来ｄｐｋＡ−ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ＿７４５７２７．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ由来ｄｐｋＡ−ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＰ_７９２１７５．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｂ．ｓｐ．３８３由来ｄｐｋＡ−ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２６５６．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。
【００４３】
Ｂ．ｓｐ．３８３由来ＯＣＤ−ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿３７２４２１．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ由来ＯＣＤ−ｌｉｋｅ酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＥＩＭ１６９４８で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質等があげられる。
【００４４】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を使用できる。本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素については、後述する。
【００４５】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、下記（Ｒ１）〜（Ｒ３）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である。
（Ｒ１）  配列番号１、２、１３および１４からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２）  前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３）  前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【００４６】
前記（Ｒ１）において配列番号１の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、後述するように、それぞれ、（Ｒ１Ａｂ）、（Ｒ２Ａｂ）および（Ｒ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号２の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｐｓ）、（Ｒ２Ｐｓ）および（Ｒ３Ｐｓ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１３の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｃｐ）、（Ｒ２Ｃｐ）および（Ｒ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１４の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｔｌ）、（Ｒ２Ｔｌ）および（Ｒ３Ｔｌ）ともいう。
【００４７】
前記（Ｒ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｒ２）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００４８】
前記（Ｒ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｒ３）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ３）の「同一性」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００４９】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の酵素活性は、特に制限されず、１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、例えば、３０℃、ｐＨ８の条件下、１分間に１μｍｏｌのＬ−プロリンを生成する酵素量と定義できる。
【００５０】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、粗酵素（非精製酵素）、部分的に精製した部分精製酵素、および、単一に精製した精製酵素のいずれでもよく、好ましくは精製酵素である。
【００５１】
前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、３−ヒドロキシプロリンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が固体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の分析方法に供することが好ましい。また、前記被検試料が、コラーゲン等のタンパク質を含み、前記タンパク質における３−ヒドロキシプロリンを分析する場合は、例えば、前記タンパク質を分解して前記３−ヒドロキシプロリンを遊離する前処理を施すことが好ましい。前記３−ヒドロキシプロリンを遊離する前処理の方法は、特に制限されず、例えば、タンパク質の加水分解処理があげられる。
【００５２】
前記（ｓ１）工程は、前述のように、３−Ｈｙｐ脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程である。前記（ｓ１）工程は、例えば、前記被検試料と前記３−Ｈｙｐ脱水酵素との接触により行うことができる。前記接触方法は、特に制限されず、例えば、酵素を用いる一般的な手段が採用でき、具体例として、前記被検試料と前記３−Ｈｙｐ脱水酵素とを含む反応系が使用できる。前記反応系において、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、例えば、プレート、容器等の基板、ビーズ、フィルター等、公知の担体が使用できる。前記反応系は、例えば、反応液である。
【００５３】
前記（ｓ１）工程において、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、特に制限されず、単位Ｕの場合、前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．０１〜１０Ｕであり、好ましくは０．０１〜１Ｕであり、より好ましくは０．０１〜０．０５Ｕである。また、タンパク質量の場合、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．１〜１０μｇであり、好ましくは０．１〜１μｇであり、より好ましくは０．１〜０．５μｇである。また、例えば、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の使用量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
【００５４】
前記（ｓ１）工程において、脱水反応の条件は、特に制限されず、例えば、使用する前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、１０〜１００℃であり、好ましくは１５〜９０℃であり、より好ましくは２０〜８０℃である。反応時間は、例えば、０〜１０分であり、好ましくは０.５〜５分であり、より好ましくは１〜５分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５〜１０であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜９である。
【００５５】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素がＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、３０〜５０℃であり、好ましくは３５〜４５℃であり、より好ましくは３７〜４０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５〜１０であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜９である。
【００５６】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素がＣｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、１０〜５０℃であり、好ましくは１５〜３０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５〜１０であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜９である。
【００５７】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素である場合、反応温度は、例えば、５０〜１００℃であり、好ましくは６０〜９０℃であり、より好ましくは７０〜８０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、５〜１０であり、好ましくは６〜９であり、より好ましくは７〜９である。
【００５８】
前記反応系は、前記被検試料および前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の他に、例えば、溶媒、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素に対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の還元剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられ、前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。
【００５９】
つぎに、前記（ｓ２）工程は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程である。前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程で得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素との接触により行うことができる。本発明において、前記（ｓ１）工程および前記（ｓ２）工程は、例えば、前記（ｓ１）工程の後に、前記（ｓ２）工程を行ってもよいし、前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行ってもよい。
【００６０】
前記（ｓ１）工程を行った後に前記（ｓ２）工程を行う場合、前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素との接触は、例えば、前記（ｓ１）工程で脱水反応を行った後の前記反応系を、そのまま前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させてもよいし、前記反応系に処理を施したものを前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させてもよい。後者の場合、前記処理は、特に制限されず、例えば、前記反応系の濃縮処理、前記反応系からの前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸の単離処理等でもよい。前記濃縮処理を行った場合、前記反応系の濃縮物と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを接触させればよく、また、前記単離処理を行った場合、単離した前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させればよい。また、前述のように、前記（ｓ１）工程において固定化した前記３−Ｈｙｐ脱水酵素を使用した場合、例えば、前記反応系について、液体画分と固形画分とを分離し、前記（ｓ２）工程において、前記液体画分を、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と接触させることが好ましい。本発明においては、操作が簡便であることから、例えば、前記（ｓ１）工程後の前記反応系または前記反応系の前記液体画分と、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを接触させることが好ましい。
【００６１】
前記（ｓ１）工程と前記（ｓ２）工程とを並行して行う場合、例えば、前記被検試料と前記３−Ｈｙｐ脱水酵素と前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素とを含む反応系を用いて、前記反応系中で、３−ヒドロキシプロリンからΔ１−ピロリン−２−カルボン酸への脱水化と、前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸の水素化を行うことができる。
【００６２】
前記反応系において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、遊離した状態で使用してもよいし、担体に固定化した状態で使用してもよい。後者の固定化酵素の場合、前記担体の種類は、特に制限されず、前述と同様である。
【００６３】
前記（ｓ２）工程において使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の由来は、前記（ｓ１）工程において使用する前記３−Ｈｙｐ脱水酵素の由来と同じであってもよいし、異なってもよい。前記（ｓ１）工程において使用する前記３−Ｈｙｐ脱水酵素および前記（ｓ２）において使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せは、特に制限されない。前記組合せは、例えば、酵素活性がより高く、より短時間で３−Ｈｙｐを測定できることから、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素がの組合せが好ましい。前記組合せは、例えば、耐熱性が高く、より長期の保存が可能なことから、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せが好ましい。前記組合せは、例えば、耐寒性が高く、より低温で３−Ｈｙｐを測定できることから、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来の３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＣｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の組合せが好ましい。
【００６４】
前記（ｓ２）工程において、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、特に制限されず、単位Ｕの場合、前記（ｓ１）工程における前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．０１〜１０Ｕであり、より好ましくは０．０１〜１Ｕであり、さらに好ましくは０．０１〜０．０５Ｕである。また、タンパク質量の場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、前記（ｓ１）工程における前記被検試料１ｍｌに対して、例えば、０．１〜１０μｇであり、好ましくは０．１〜１μｇであり、より好ましくは０．１〜０．５μｇである。また、後述するようにコラーゲンの測定を行う場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量は、例えば、前記被検試料中のタンパク質に対する添加量でもよい。前記被検試料中のタンパク質量は、例えば、コラーゲンタンパク質および非コラーゲンタンパク質の総量から設定できる。
【００６５】
前記（ｓ２）工程において、還元反応の条件は、特に制限されず、使用する前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の化学特性に応じて適宜設定できる。反応温度は、例えば、１０〜１００℃であり、好ましくは１５〜９０℃であり、より好ましくは２０〜８０℃である。反応時間は、例えば、０.５〜１０分であり、好ましくは０.５〜５分であり、好ましくは１〜５分である。反応ｐＨは、例えば、４〜９であり、好ましくは５〜８であり、より好ましくは６〜８である。
【００６６】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＡ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、３０〜５０℃であり、好ましくは３５〜４５℃であり、より好ましくは３７〜４０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、６〜８であり、好ましくは６．５〜７．５であり、より好ましくは６．８〜７．２である。
【００６７】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＣｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、１０〜５０℃であり、好ましくは１５〜３０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、６〜８であり、好ましくは６．５〜７．５であり、より好ましくは６．８〜７．２である。
【００６８】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素がＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来のＰｙｒ２Ｃ還元酵素である場合、反応温度は、例えば、５０〜１００℃であり、好ましくは６０〜９０℃であり、より好ましくは７０〜８０℃である。反応時間は、例えば、１〜１０分であり、好ましくは１〜５分であり、より好ましくは１〜２分である。前記反応系のｐＨは、例えば、４〜９であり、好ましくは５〜８であり、より好ましくは６〜８である。
【００６９】
前記反応系は、前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の他に、例えば、溶媒、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素に対する補酵素、イオン性化合物、ジチオスレイトール等の前記還元剤等を含んでもよい。前記溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が使用でき、前記緩衝液によって、例えば、前記反応系のｐＨを調整することが好ましい。前記イオン性化合物は、例えば、二価イオンを遊離する化合物等があげられ、前記二価イオンとしては、例えば、マグネシウム等があげられる。
【００７０】
前記補酵素は、特に制限されず、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
【００７１】
そして、前記（ｓ３）工程は、前記（ｓ２）の還元反応を分析する分析工程である。本発明において、前記分析は、例えば、定性分析、定量分析および半定量分析のいずれでもよい。
【００７２】
前記還元反応の分析は、例えば、前記反応により生じるシグナルの検出により行うことができる。前記シグナルは、例えば、前記還元反応によりシグナルを生じる基質、または、前記還元反応によりシグナルが消失または減少する基質等を併用することが好ましい。
【００７３】
前記基質の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記（ｓ１）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（ｓ２）工程において、前記反応系が基質を含んでもよいし、前記（ｓ２）工程の後であり前記（ｓ３）工程の前に、前記反応系が基質を含んでもよい。
【００７４】
前記（ｓ３）工程において、前記還元反応の分析方法は、特に制限されず、例えば、光学的分析および電気的分析のいずれでもよい。
【００７５】
光学的分析の場合、例えば、前記還元反応によって生じる光学的シグナルを測定する方法があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色、発光もしくは蛍光等のシグナルがあげられ、前記光学的シグナルの測定は、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等の測定により行うことができる。前記（ｓ３）工程において光学的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における還元反応において、例えば、前記還元反応によって、発色、発光もしくは蛍光を発する基質、発色、発光もしくは蛍光が消失または減少する基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の還元反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に依存した光学的シグナルの測定を行うことができる。
【００７６】
また、電気的分析の場合、例えば、前記還元反応によって生じる電子の授受を、電気的シグナルとして測定する方法があげられる。前記電気的シグナルの測定は、例えば、電流等の電気シグナルの強度を測定する方法があげられる。前記（ｓ３）工程において電気的シグナルを測定する場合、前記（ｓ２）工程における還元反応において、例えば、前記還元反応によって、電子の授受が可能な基質等を併用することが好ましい。前記基質の存在下で、前記（ｓ２）工程の還元反応を行うことによって、例えば、前記（ｓ３）工程において、前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に依存した電気的シグナルの測定を行うことができる。
【００７７】
前記基質は、特に制限されず、例えば、電子供与体が好ましく、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
【００７８】
前記補酵素および前記基質として、例えば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用した場合、以下のようなメカニズムによりＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を測定できると推定される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、酸化により、それぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋を生成する。また、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、３４０ｎｍの紫外光線を吸収するのに対し、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、３４０ｎｍの紫外光線を吸収しない。このため、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素により、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸が還元されＬ-プロリンが生成すると同時に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからそれぞれＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋が生成される。そこで、３４０ｎｍの吸光度を測定することによって、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸の還元、つまり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の活性を測定できる。なお、前記推定メカニズムは、本発明を何ら制限しない。
【００７９】
前記基質の添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記（ｓ２）工程において前記基質が前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素と共存していることが好ましい。また、前記（ｓ２）工程において、前記（ｓ１）工程における反応系を使用する場合、例えば、前記（ｓ１）工程において、その反応系が前記基質を含有してもよい。
【００８０】
本発明は、さらに、下記（ｓ４）工程を有してもよい。
（ｓ４）既知量の３−ヒドロキシプロリンを含む標準試料の３−ヒドロキシプロリンの量と、前記標準試料に対する前記（ｓ１）〜（ｓ３）工程の実行により得られる分析結果との相関関係に基づいて、前記（ｓ３）工程における前記被検試料の分析結果から、前記被検試料中の３−ヒドロキシプロリンの量を算出する算出工程
【００８１】
本発明において、各工程の順序は、特に制限されず、例えば、以下のような順序が例示できる。各工程を実行する順序は、例えば、３−Ｈｙｐ脱水酵素、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および／または前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応における基質の添加のタイミングによって、適宜、調節できる。
１：  （ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）の順序で、処理を行う
２：  （ｓ１）および（ｓ２）を並行して行った後、（ｓ３）を行う
３：  （ｓ１）を行った後、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
４：  （ｓ１）、（ｓ２）および（ｓ３）を並行して行う
【００８２】
本発明の分析方法について、以下に、光学的分析の一例を示すが、例示であって、本発明は、この方法には制限されない。
【００８３】
まず、被検試料、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素、および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素に対する基質を含む反応液ｓ１を調製する。前記反応液ｓ１について、例えば、１ｍｌあたりの組成を以下に示す。前記基質は、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
【００８４】
（反応液ｓ１の組成：１ｍｌあたり）
３−Ｈｙｐ脱水酵素    ０．１〜０．５μｇまたは０．０１〜０．０５Ｕ
緩衝液                ５０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ
基質                  ０．１〜０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ                  ６〜８
被検試料              １００〜５００μL
【００８５】
前記反応液ｓ１をインキュベートして、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素による脱水反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、温度が、例えば、１０〜１００℃であり、好ましくは１５〜９０℃であり、時間が、例えば、０〜１０分間であり、好ましくは、０．５〜５分間であり、より好ましくは、１〜５分間である。
【００８６】
つぎに、前記反応液ｓ１に、さらに、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を添加して、還元反応の反応液ｓ２を調製する。前記反応液ｓ２について、１ｍｌあたりの前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の濃度は、例えば、０．１〜０．５μｇまたは０．０１〜０．０５Ｕである。なお、本例では、前記反応液ｓ１にＰｙｒ２Ｃ還元酵素に対する基質（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）を添加したが、例えば、これらを、前記反応液ｓ１への添加に代えて、前記反応液ｓ２の調製において添加してもよい。
【００８７】
前記反応液ｓ２をインキュベートして、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応を行う。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、温度が、例えば、１０〜１００℃であり、好ましくは１５〜９０℃であり、時間が、例えば、０.５〜１０分間であり、好ましくは０.５〜５分間である。
【００８８】
そして、前記反応液ｓ２について、吸光度測定を行う。前記吸光度の測定波長は、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の基質の種類に応じて適宜決定でき、具体例として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを使用した場合、３４０ｎｍがあげられる。
【００８９】
他方、既知濃度の３−ヒドロキシプロリンを含む複数の標準試料を使用し、同様の条件で、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素による脱水反応および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素による還元反応を行い、吸光度を測定する。そして、前記各標準試料の濃度と、これらに対応する吸光度との相関関係を求める。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。そして、前記被検試料に関する吸光度の測定結果と前記相関関係とから、前記被検試料における３−ヒドロキシプロリンの量を算出する。このように、例えば、前記相関関係を利用することによって、前記被検試料における３−ヒドロキシプロリンの量を定量できる。
【００９０】
＜コラーゲンの測定方法＞
本発明のコラーゲンの測定方法は、前述のように、被検試料中のコラーゲンの測定方法であって、下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３−ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３−ヒドロキシプロリンの量からコラーゲン量を算出する算出工程
【００９１】
前述のように、被検試料におけるコラーゲンの分析は、被検試料における３−ヒドロキシプロリンの分析によって、間接的に行うことができる。このため、前述の本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法に利用すれば、従来のＨＰＬＣ法とは異なり、酵素反応を行うのみで、簡便に前記３−ヒドロキシプロリンを分析し、その分析結果から、間接的に前記被検試料におけるコラーゲンを測定できる。
【００９２】
本発明は、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法により前記被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを測定することが特徴であって、その他の工程およびその他の条件は、何ら制限されない。
【００９３】
前記被検試料の種類は、特に制限されず、例えば、コラーゲンを含有する試料、含有すると考えられる試料、含有の有無が不明な試料等が対象となる。前記被検試料は、例えば、固体でも液体でもよい。前記被検試料が個体の場合、例えば、溶媒への懸濁、分散または溶解等の前処理を施し、前処理後の試料を被検試料として、本発明の測定方法に供することが好ましい。前記被検試料の具体例としては、例えば、食品、化粧品、医薬品、生体由来の組織等があげられる。
【００９４】
前記コラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンII、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンＶ、コラーゲンVIII、コラーゲンＸ、コラーゲンXI、コラーゲンXVIII等があげられ、好ましくは、コラーゲンIVである。
【００９５】
前記（Ｓ１）工程は、被検試料中のコラーゲンから、３−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程である。前記コラーゲンから前記３−ヒドロキシプロリンを遊離させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、前記コラーゲンの加水分解処理があげられる。前記加水分解処理は、例えば、前記被検試料を、酸性条件および加熱条件で処理することにより行える。前記酸性条件への調整は、例えば、前記被検試料への酸の添加により行える。前記酸は、特に制限されず、例えば、塩酸、硫酸等が使用できる。
【００９６】
前記加水分解処理後の処理液は、次工程である前記（Ｓ２）工程に使用できる。前記処理液は、例えば、酸性条件であることから、前記（Ｓ２）工程に適したｐＨに調整しておくことが好ましい。前記ｐＨの調整は、例えば、アルカリ、緩衝液等が使用できる。前記ｐＨは、特に制限されず、前記（Ｓ２）工程、すなわち、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法における前記（ｓ１）工程で示したｐＨがあげられる。
【００９７】
つぎに、前記（Ｓ２）工程は、前記（Ｓ１）工程で遊離した３−ヒドロキシプロリンの量を、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法により測定する工程である。前記（Ｓ２）工程は、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法の記載を援用できる。
【００９８】
続いて、前記（Ｓ３）工程は、予め求めた前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３−ヒドロキシプロリンの量からコラーゲン量を算出する工程である。
【００９９】
前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数は、例えば、公知の割合係数があげられる。また、前記割合係数は、例えば、既知量のコラーゲンを含む標準試料のコラーゲン量と、前記標準試料に対する前記（Ｓ１）および（Ｓ２）工程の実行により得られる３−ヒドロキシプロリンの量との相関関係であってもよい。前記相関関係は、例えば、一次式、検量線等で表わすことができる。
【０１００】
＜新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素＞
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｒ１）〜（Ｒ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｒ１）  配列番号１および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２）  前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３）  前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
【０１０１】
前記新規タンパク質は、以下、新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸（Ｐｙｒ２Ｃ）還元酵素ともいう。前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、本発明者らが新たに同定したタンパク質である。
【０１０２】
前記（Ｒ１）において配列番号１の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ａｂ）、（Ｒ２Ａｂ）および（Ｒ３Ａｂ）ともいう。前記（Ｒ１）において配列番号１４の場合、前記（Ｒ１）、（Ｒ２）および（Ｒ３）は、それぞれ、（Ｒ１Ｔｌ）、（Ｒ２Ｔｌ）および（Ｒ３Ｔｌ）ともいう。
【０１０３】
前記（Ｒ１Ａｂ）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
【０１０４】
（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列（配列番号１）
MTALSPIPVFDAADTAALLDYPALLATLRQAVADYAAGEIVSPERLVVPLQAGGVMLSMPSSARDLATHKLVNVCPGNGARGLPTILGQVTAYDATTGEMRFALDGPTVTGRRTAAITALGIQALHGVAPRDILLIGTGKQAANHAEALAAIFPDARLHVRGTSADSAAAFCAAHRTQAPHLVPLDGDAIPDAIDVVVTLTTSRTPVYREAAREGRLVVGVGAFTADAAEIDANTVRASRLVVDDPAGARHEAGDLIVAQVDWQDVASLADVLRGAFDRSGPLLFKSVGCAAWDLAACRTARDALAARRAG
【０１０５】
前記（Ｒ１Ｔｌ）における配列番号１４のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３から得ることができる。
【０１０６】
（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列（配列番号１４）
MLLLSRSDLEKLISMKEVIESVERAFLELYNGKAKVPLRTIIEVEKHNGFILYMPSYLEDSEALAVKVVSLYPENTKKGLPSVLASILLNDPKTGAPLALMEGTFITAMRTGAASGVATKYLARKDSKIAGIIGAGVQARTQLWAVCEVRNIEKALVYDINPKNAKKFAEEMSKKLGIEIKTVESAREATEKSDILIVATTAREPVVKGGWIREGTHINSVGWVGRDARELDSETVRKSKLVVDSKEGVLNESGDIIIPMKEGVIDEGHIHAELAEIVAGVKKGRENNREITLFKSVGLAIEDAITAKLAYEKALEHGVGTNVEL
【０１０７】
前記（Ｒ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｒ２）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
【０１０８】
前記（Ｒ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｒ３）が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｒ３）の「同一性」は、前記（Ｒ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１０９】
本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
【０１１０】
前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を基質とする還元酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
【０１１１】
前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に対する基質特異性が、Δ１−ピペリジン−２−カルボン酸に対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Δ１−ピペリジン−２−カルボン酸を基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【０１１２】
前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは１ｍＭ以下である。
【０１１３】
前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、補酵素として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのいずれも使用できる。
【０１１４】
＜Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素＞
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素は、前述のように、下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質
【０１１５】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、本発明者らが新たに同定したＰｙｒ２Ｃ還元酵素である。
【０１１６】
前記（Ｒ１Ｃｐ）における配列番号１３のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｒ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＹＰ＿２６８１９７．１で登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号１３）があげられる。
【０１１７】
（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列（配列番号１３）
MKIISAEQVHQNLNFEELIPLLKQSFSRPFSMPQRQVYSLAPEQSENHDAFALLPSWNEEVIGNKAFTYFPDNAKKHDLPGLFSKIMLFKRQTGEPLALVDGTSVTYWRTAAISALASQLLSRKNSQHLMLFGTGNLASYLVKAHLTVRDIKQVTLWGRNAKKVSKLIADFSILYPAVTFKTSVDVNAEVASADIICCATGAKTPLFDGNSVSAGCHIDCLGNHMTDARECDTTTILRARVFVDSLTNTLNEAGELLIPMAEDAFNKDEIVGELADMCKTPSMLRQSSDEITLFKSVGTAISDLVAAHSVVEKLAD
【０１１８】
本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
【０１１９】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を基質とする還元酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
【０１２０】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に対する基質特異性が、Δ１−ピペリジン−２−カルボン酸に対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、Δ１−ピペリジン−２−カルボン酸を基質とした相対活性が２０％以下であることが好ましく、より好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【０１２１】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に対するＫｍ値が、例えば、５ｍＭ以下であり、好ましくは１ｍＭ以下である。
【０１２２】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、補酵素として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのいずれも使用できる。
【０１２３】
＜新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子＞
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｒ１Ａｂ）〜（ｒ７Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１Ａｂ）配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ４Ａｂ）前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ５Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ６Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ７Ａｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１２４】
前記新規遺伝子は、前記本発明の新規タンパク質（新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素）をコードする遺伝子であることから、以下、新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子ともいう。前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子は、本発明者らが新たに同定した遺伝子である。
【０１２５】
本発明の新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
【０１２６】
配列番号４の塩基配列は、以下の通りである。配列番号４の塩基配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなる本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ａｂ）のコード配列である。配列番号４のポリヌクレオチド（ｒ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
【０１２７】
（ｒ１Ａｂ）のポリヌクレオチド（配列番号４）
ATGACCGCTCTTTCCCCGATTCCCGTTTTCGATGCGGCCGACACGGCCGCGCTGCTCGACTACCCGGCGCTGCTCGCCACGCTCAGGCAGGCCGTCGCCGACTATGCGGCGGGCGAGATCGTCAGCCCCGAACGCCTGGTCGTGCCGTTGCAGGCGGGCGGCGTGATGCTGTCGATGCCGTCGAGCGCGCGCGACCTCGCGACCCACAAGCTCGTGAACGTGTGCCCGGGCAACGGCGCGCGCGGGCTGCCGACGATCCTCGGCCAGGTCACCGCATACGACGCGACCACCGGCGAGATGCGTTTCGCGCTCGACGGCCCGACGGTCACCGGACGCCGCACGGCGGCCATCACCGCGCTCGGCATCCAGGCGCTGCATGGCGTCGCCCCGCGCGACATCCTGCTGATCGGCACCGGGAAACAGGCAGCGAATCACGCGGAAGCGCTCGCCGCGATCTTTCCCGACGCGCGCCTTCACGTGCGCGGCACGAGCGCCGACAGCGCGGCTGCCTTCTGCGCCGCGCACCGCACACAGGCACCGCATCTCGTGCCGCTCGACGGCGACGCGATTCCCGATGCGATCGACGTCGTCGTCACGCTCACGACCAGCCGCACGCCCGTCTATCGCGAAGCCGCGCGCGAAGGCCGGCTGGTGGTCGGCGTCGGCGCGTTCACCGCGGACGCGGCCGAGATCGACGCGAACACCGTGCGCGCCAGCCGGCTGGTCGTCGACGATCCGGCCGGCGCGCGCCACGAAGCCGGCGACCTGATCGTCGCGCAGGTCGACTGGCAGGATGTCGCGTCGCTCGCCGACGTGCTGCGCGGCGCATTCGACCGCAGCGGGCCGCTGCTGTTCAAGAGCGTCGGCTGTGCCGCGTGGGATCTGGCCGCGTGCCGCACCGCGCGCGATGCGCTGGCCGCACGCCGGGCCGGCTGA
【０１２８】
前記（ｒ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｒ２Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
【０１２９】
前記（ｒ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｒ３Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ３Ａｂ）の同一性は、前記（ｒ１Ａｂ）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１３０】
前記（ｒ４Ａｂ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｒ１Ａｂ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【０１３１】
前記（ｒ４Ａｂ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【０１３２】
前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｒ５Ａｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【０１３３】
前記（ｒ６Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｒ６Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ６Ａｂ）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１３４】
前記（ｒ７Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｒ７Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｒ７Ａｂ）の同一性は、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１３５】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
【０１３６】
＜Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子＞
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子は、前述のように、下記（ｒ１）〜（ｒ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｒ１）配列番号１５および１６の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２）前記（ｒ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３）前記（ｒ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ４）前記（ｒ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ５）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ６）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ７）配列番号１３および１４の少なくとも一方のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１３７】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子は、本発明者らが新たに同定したＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である。
【０１３８】
本発明のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
【０１３９】
前記（ｒ１）において配列番号１５の場合、前記（ｒ１）、（ｒ２）、（ｒ３）、（ｒ４）、（ｒ５）、（ｒ６）および（ｒ７）は、それぞれ、（ｒ１Ｃｐ）、（ｒ２Ｃｐ）、（ｒ３Ｃｐ）、（ｒ４Ｃｐ）、（ｒ５Ｃｐ）、（ｒ６Ｃｐ）および（ｒ７Ｃｐ）ともいう。前記（ｒ１）において配列番号１６の場合、前記ｒ１）、（ｒ２）、（ｒ３）、（ｒ４）、（ｒ５）、（ｒ６）および（ｒ７）は、それぞれ、（ｒ１Ｔｌ）、（ｒ２Ｔｌ）、（ｒ３Ｔｌ）、（ｒ４Ｔｌ）、（ｒ５Ｔｌ）、（ｒ６Ｔｌ）および（ｒ７Ｔｌ）ともいう。
【０１４０】
前記（ｒ１ｃｐ）における配列番号１５の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１５の塩基配列は、前記配列番号１３のアミノ酸配列からなる本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ｃｐ）のコード配列である。配列番号１５のポリヌクレオチド（ｒ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ_１４５５で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１５）があげられる。
【０１４１】
（ｒ１Ｃｐ）のポリヌクレオチド（配列番号１５）
ATGAAAATTATTAGCGCCGAACAAGTCCACCAAAACCTAAACTTTGAAGAGTTGATCCCTTTACTAAAACAGAGTTTTAGTCGCCCATTTAGTATGCCTCAGCGTCAGGTTTACTCACTAGCGCCTGAGCAAAGTGAAAATCATGATGCGTTTGCCTTATTACCTTCATGGAATGAAGAAGTGATTGGTAATAAAGCTTTCACTTACTTTCCTGACAACGCGAAAAAGCATGATTTACCGGGTTTGTTTTCGAAAATAATGCTGTTTAAACGCCAAACAGGTGAGCCGTTAGCACTGGTTGATGGCACCAGTGTTACGTATTGGCGAACAGCAGCTATTTCAGCATTAGCCAGCCAATTACTTTCTCGAAAAAATAGCCAACATCTGATGTTATTTGGTACCGGAAATCTAGCAAGTTATTTAGTAAAAGCGCATTTAACTGTGCGAGATATTAAGCAAGTTACTCTGTGGGGACGTAATGCAAAAAAAGTTAGCAAACTGATTGCAGACTTTAGTATTTTGTATCCAGCTGTTACGTTTAAAACCAGTGTTGATGTCAATGCTGAGGTAGCAAGTGCTGATATTATTTGCTGTGCAACGGGGGCAAAAACACCTCTTTTTGATGGGAATAGCGTGAGTGCAGGTTGTCATATTGATTGCTTAGGTAATCACATGACTGATGCGCGTGAATGCGATACAACAACAATATTACGCGCTAGGGTATTTGTTGATAGTTTAACGAATACCTTAAATGAAGCGGGTGAATTACTTATCCCTATGGCAGAAGATGCTTTTAACAAGGATGAGATTGTAGGCGAATTAGCTGACATGTGTAAAACGCCATCAATGCTGCGCCAATCAAGCGATGAAATAACGTTATTTAAGTCTGTGGGCACAGCGATTAGTGATTTAGTAGCGGCACATAGCGTAGTAGAAAAGTTAGCAGATTAA
【０１４２】
前記（ｒ１Ｔｌ）における配列番号１６の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１６の塩基配列は、前記配列番号１４のアミノ酸配列からなる本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素（Ｒ１Ｔｌ）のコード配列である。配列番号１６のポリヌクレオチド（ｒ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３から得ることができる。
【０１４３】
（ｒ１Ｔｌ）のポリヌクレオチド（配列番号１６）
ATGTTGCTCCTCAGCAGAAGTGATCTTGAGAAGTTGATCTCAATGAAGGAAGTCATAGAGTCCGTTGAAAGAGCATTCTTAGAGCTCTATAACGGAAAAGCAAAAGTTCCGTTAAGGACTATAATAGAGGTTGAGAAGCACAACGGGTTCATTCTGTACATGCCAAGTTACTTAGAAGATTCCGAGGCTTTGGCTGTAAAGGTGGTTTCTTTATACCCTGAAAATACCAAGAAAGGTCTGCCGAGCGTTTTGGCGTCAATTCTTCTCAACGACCCAAAAACAGGTGCTCCATTGGCCTTGATGGAAGGCACCTTCATAACTGCCATGAGAACTGGGGCTGCAAGTGGTGTTGCCACAAAGTATCTTGCCAGAAAAGACTCAAAAATCGCGGGAATTATTGGCGCGGGGGTTCAAGCGAGAACTCAGCTCTGGGCAGTTTGCGAAGTTAGAAACATAGAAAAGGCACTTGTCTATGATATTAACCCCAAAAATGCTAAAAAATTTGCCGAAGAGATGTCTAAAAAGCTTGGAATCGAGATAAAAACAGTTGAATCTGCAAGGGAAGCTACTGAGAAGTCCGATATCCTAATAGTAGCAACAACGGCAAGAGAACCAGTAGTTAAGGGGGAaTGGATTAGGGAAGGCACGCACATCAACTCCGTAGGCTGGGTGGGGAGAGATGCCAGGGAACTCGATTCCGAAACAGTGAGAAAGTCTAAGCTGGTTGTGGACTCAAAAGAGGGTGTCCTAAATGAATCAGGGGACATAATAATTCCCATGAAAGAGGGGGTAATTGACGAGGGCCATATCCATGCCGAGCTTGCTGAAATCGTTGCTGGAGTTAAAAAAGGAAGGGAAAACAACAGAGAGATAACCCTTTTCAAGAGCGTCGGTTTGGCAATAGAAGATGCAATAACAGCCAAGTTAGCATATGAAAAAGCCCTTGAACATGGAGTTGGTACTAACGTGGAGCTTTAG
【０１４４】
前記（ｒ２）〜（ｒ７）の説明は、前記本発明の新規Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子の説明において、「（ｒ２Ａｂ）」を「（ｒ２）」に、「（ｒ３Ａｂ）」を「（ｒ３）」に、「（ｒ４Ａｂ）」を「（ｒ４）」に、「（ｒ５Ａｂ）」を「（ｒ５）」に、「（ｒ６Ａｂ）」を「（ｒ６）」に、「（ｒ７Ａｂ）」を「（ｒ７）」に、「配列番号１」を「配列番号１３および１４の少なくも一方」読み替えて援用できる。
【０１４５】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
【０１４６】
＜Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素の発現ベクター＞
本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドおよび前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドの少なくとも一方（以下、「本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」ともいう。）を含むことを特徴とする。本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターによれば、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を容易に製造できる。
【０１４７】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドがコードするＰｙｒ２Ｃ還元酵素を発現可能なように、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は何ら制限されない。
【０１４８】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター、ｐＱＥ−８０ＬベクターおよびｐＵＣＰ２６Ｋｍベクター等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターは、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、例えば、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）等があげられる。
【０１４９】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドがコードする前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【０１５０】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【０１５１】
＜Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素の製造方法＞
本発明の新規タンパク質（新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素）の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を発現する細菌等を公知の手段で培養し、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を産生させることにより製造してもよい。前者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の新規遺伝子（新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子）およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子の少なくとも一方を発現させる工程を有する。後者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を発現する細菌を培養し、新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方を産生させる工程を有する。これによって、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を製造できる。
【０１５２】
また、本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法は、特に制限されない。本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法は、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法の説明において、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方」を「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」に、読み替えて援用できる（以下、同様）。
【０１５３】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを使用して行ってもよい。
【０１５４】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
【０１５５】
前者の場合、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を合成できる。
【０１５６】
前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
【０１５７】
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
【０１５８】
前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドは、例えば、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【０１５９】
後者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドの発現には、前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のＰｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
【０１６０】
前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を発現する細菌の培養方法は、特に制限されず、従来公知の培養方法に基づいて、適宜実施できる。
【０１６１】
前記細菌は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【０１６２】
前記細菌の培養に使用する培地の形態は、特に制限されず、例えば、固体培地、液体培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、塩類等が挙げられる。前記窒素源としては、特に制限されず、例えば、カゼイン、ゼラチン、魚由来タンパク質、豆由来タンパク質等のタンパク質が挙げられる。また、前記炭素源は、特に制限されず、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、ラフィノース等が挙げられる。前記塩類も、特に制限されず、例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。また、前記培地は、さらに、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現誘導剤を含んでもよく、前記発現誘導剤は、例えば、Ｌ−プロリン、Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｄ−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、Ｄ−リジン等があげられる。前記培地は、例えば、市販培地を含んでもよい。前記市販培地としては、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等が挙げられる。これらは、一種類で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６〜８の範囲であり、好ましくは、ｐＨ６．５〜７．５の範囲である。
【０１６３】
前記細菌の培養方法は、特に制限されず、前記固体培地を用いた場合には、例えば、平板培養法、斜面培養法等が挙げられる。また、前記液体培地を用いた場合にも、特に制限されず、例えば、静置培養法、通気培養法、振とう培養法等が挙げられる。
【０１６４】
培養温度は、特に制限されないが、例えば、前述した前記細菌の生育可能温度や、前記生育最適温度等が挙げられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、０〜８０℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅの場合、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈの場合、前記培養温度は、例えば、０〜１０℃の範囲等で行うことができる。前記細菌が、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３の場合、前記培養温度は、例えば、７０〜８０℃の範囲等で行うことができる。
【０１６５】
前記細菌は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
【０１６６】
本発明の製造方法は、例えば、前記新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の精製工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。前記溶媒のｐＨは、例えば、６〜８である。本発明の製造方法により得られた新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、例えば、そのまま粗酵素（非精製酵素）として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製酵素として使用してもよいし、単一に精製した精製酵素として使用してもよい。
【０１６７】
＜新規３−ヒドロキシプロリン脱水酵素＞
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｄ１Ａｂ）〜（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｄ１Ａｂ）  配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
【０１６８】
前記新規タンパク質は、以下、新規３−ヒドロキシプロリン（３−Ｈｙｐ）脱水酵素ともいう。前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、本発明者らが新たに同定したタンパク質である。
【０１６９】
前記（Ｄ１Ａｂ）における配列番号１１のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３−Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
【０１７０】
2015033636.tif 000007
【０１７１】
前記（Ｄ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２Ａｂ）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
【０１７２】
前記（Ｄ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３Ａｂ）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３Ａｂ）の「同一性」は、前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１７３】
前記（Ｄ２Ａｂ）および（Ｄ３Ａｂ）のタンパク質は、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
【０１７４】
前記（Ｄ３Ａｂ）のタンパク質は、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
【０１７５】
本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
【０１７６】
前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、３−ヒドロキシプロリンを基質とする脱水酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
【０１７７】
前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、４−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、３−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、４−ヒドロキシプロリンを基質とした相対活性が１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【０１７８】
前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．５ｍＭ以下である。
【０１７９】
＜３−ヒドロキシプロリン脱水酵素＞
本発明の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素は、前述のように、下記（Ｄ１）〜（Ｄ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｄ１）  配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２）  前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３）  前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質
【０１８０】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、本発明者らが新たに同定した３−Ｈｙｐ脱水酵素である。
【０１８１】
前記（Ｄ１）において配列番号９の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｃｐ）、（Ｄ２Ｃｐ）および（Ｄ３Ｃｐ）ともいう。前記（Ｄ１）において配列番号１２の場合、前記（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）は、それぞれ、（Ｄ１Ｔｌ）、（Ｄ２Ｔｌ）および（Ｄ３Ｔｌ）ともいう。
【０１８２】
前記（Ｄ１Ｃｐ）における配列番号９のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ＿１４５３で登録されているアミノ酸配列（配列番号９）からなるタンパク質等があげられる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３−Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
【０１８３】
2015033636.tif 000008
【０１８４】
前記（Ｄ１Ｔｌ）における配列番号１２のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記（Ｄ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来３−Ｈｙｐ脱水酵素としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＯＣＣ＿００３８７で登録されているアミノ酸配列（配列番号１２）からなるタンパク質等があげられる。以下の配列において２カ所の四角で囲んだ残基（Ｃ／Ｔ）は、３−Ｈｙｐ脱水酵素の触媒機能に関与する活性部位である。
【０１８５】
2015033636.tif 000009
【０１８６】
前記（Ｄ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｄ２）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ２）の「１もしくは数個」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
【０１８７】
前記（Ｄ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｄ３）が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（Ｄ３）の「同一性」は、前記（Ｄ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０１８８】
前記（Ｄ２）および（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されていることが好ましい。前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記二か所の活性部位は、例えば、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）を基準として、アライメントを行い、対応する２カ所の部位を活性部位と判断できる。
【０１８９】
前記（Ｄ３）のタンパク質は、前記各配列番号のアミノ酸配列において、前記２カ所の活性部位の残基がＣ／Ｔに保存されている場合、前記同一性は、例えば、４０％以上であり、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは８０％以上である。
【０１９０】
本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、以下のような化学的特性を有する。
【０１９１】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、３−ヒドロキシプロリンを基質とする脱水酵素活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の触媒活性を有してもよい。
【０１９２】
前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性が、４−ヒドロキシプロリンに対する基質特異性よりも高いことが好ましい。具体的には、３−ヒドロキシプロリンを基質とした代謝効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を相対活性１００％とした場合に、４−ヒドロキシプロリンを基質とした相対活性が１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【０１９３】
前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素は、例えば、３−ヒドロキシプロリンに対するＫｍ値が、例えば、１ｍＭ以下であり、好ましくは０．５ｍＭ以下である。
【０１９４】
＜新規３−ヒドロキシプロリン酵素遺伝子＞
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｄ１Ａｂ）〜（ｄ７Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｄ１Ａｂ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ４Ａｂ）前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ５Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ６Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ７Ａｂ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１９５】
前記新規遺伝子は、前記本発明の新規タンパク質（新規３−ヒドロキシプロリン脱水酵素）をコードする遺伝子であることから、以下、新規３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子ともいう。前記新規３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子は、本発明の発明者らが新たに同定した遺伝子である。
【０１９６】
本発明の新規３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
【０１９７】
配列番号１７の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１７の塩基配列は、前記配列番号１１のアミノ酸配列からなる本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ａｂ）のコード配列である。配列番号１７のポリヌクレオチド（ｄ１Ａｂ）は、例えば、Ａ．ｂｄａｓｉｌｅｎｓｅから得ることができる。
【０１９８】
（ｄ１Ａｂ）のポリヌクレオチド（配列番号１７）
ATGAAAATTACCCGATCCCTTTCCACCGTCGAAGTCCACACCGGCGGCGAAGCGTTCCGCATCGTCACGAGCGGGCTGCCGCGCGCGCCCGGCGACACGATCGTCCAGCGCCGCGCGTGGCTCAAGGAAAACGCCGACGAGATCCGCCGCGCGCTGATGTTCGAACCGCGCGGCCACGCCGACATGTACGGCGGCTACCTGACCGAGCCCGTGTCGCCGAACGCGGATTTCGGCGTGATCTTCGTGCACAACGAAGGCTACAGCGACCATTGCGGGCACGGCGTGATCGCGCTGTCGACCGCGGCCGTCGAGCTCGGCTGGGTGCAGCGCACGGTACCGGAAACGCGGGTCGGCATCGATGCGCCGTGCGGCTTCATCGAAGCGTTCGTCAAGTGGGACGGCGAGCATGCGGGACCGGTGCGCTTCGTCAACGTGCCGTCGTTCATCTGGCAGCGCGACGTGTCGGTCGAGACGCCGTCGTTCGGCACCGTGACCGGCGACATCGCGTACGGCGGCGCGTTCTACTTCTACGTCGACGGTGCGCCGTTCGACCTGCCGGTGCGCGAAGCGGCGGTGGAAAAGCTGATCCGTTTCGGCGCGGAAGTGAAGGCCGCCGCGAACGCGAAGTACCCGGTCGTGCATCCGGAGATCCCGGAAATCAACCATATCTACGGCACGATCATCGCGAATGCGCCGCGCCACCCGGGCTCGACGCAGGCGAACTGCTGCGTGTTCGCGGATCGCGAGGTCGACCGCTCGCCGACCGGTTCCGGCACCGGCGGCCGGGTCGCGCAGCTCTACCAGCGCGGGCTGCTCGCGGCGGGCGACACGCTCGTCAACGAATCGATCGTCGGCACGGTCTTCAAGGGGCGCGTGCTGCGCGAAACGACGGTCGGCGACATCCCGGCCGTGATTCCGGAAGTGGAAGGCAGCGCGCATATCTGCGGGTTCGCGAACTGGATCGTCGACGAGCGCGATCCGCTGACCTACGGTTTTCTCGTGCGCTGA
【０１９９】
前記（ｄ２Ａｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ２Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ２Ａｂ）の「１もしくは数個」は、前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個、欠失、置換、挿入および／または付加されてもよい。
【０２００】
前記（ｄ３Ａｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｄ３Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ３Ａｂ）の同一性は、前記（ｄ１Ａｂ）の塩基配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０２０１】
前記（ｄ４Ａｂ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｄ１Ａｂ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｄｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｄｉｎｇ  Ｈａｄｂｏｄ  Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ  Ｐｄｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【０２０２】
前記（ｄ４Ａｂ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｄｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｄｉｎｇ  Ｈａｄｂｏｄ  Ｌａｂｏｄａｔｏｄｙ  Ｐｄｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【０２０３】
前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｄ５Ａｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１１のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【０２０４】
前記（ｄ６Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ６Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ６Ａｂ）の「１もしくは数個」は、例えば、前記配列番号１１のアミノ酸配列において、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０２０５】
前記（ｄ７Ａｂ）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｄ７Ａｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有する範囲であればよい。前記（ｄ７Ａｂ）の同一性は、前記配列番号１１のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【０２０６】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
【０２０７】
＜３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子＞
本発明の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、前述のように、下記（ｄ１）〜（ｄ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｄ１）配列番号１８および１９の少なくとも一方の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）前記（ｄ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ５）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ６）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ７）配列番号９および１２の少なくとも一方のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０２０８】
前記３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子は、本発明の発明者らが新たに同定した３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である。
【０２０９】
本発明の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子は、例えば、前述のような本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の遺伝子工学的手法による合成に有用である。
【０２１０】
前記（ｄ１）において配列番号１８の場合、前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）、（ｄ６）および（ｄ７）は、それぞれ、（ｄ１Ｃｐ）、（ｄ２Ｃｐ）、（ｄ３Ｃｐ）、（ｄ４Ｃｐ）、（ｄ５Ｃｐ）、（ｄ６Ｃｐ）および（ｄ７Ｃｐ）ともいう。前記（ｄ１）において配列番号１９の場合、、前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）、（ｄ４）、（ｄ５）、（ｄ６）および（ｄ７）は、それぞれ、（ｄ１Ｔｌ）、（ｄ２Ｔｌ）、（ｄ３Ｔｌ）、（ｄ４Ｔｌ）、（ｄ５Ｔｌ）、（ｄ６Ｔｌ）および（ｄ７Ｔｌ）ともいう。
【０２１１】
前記（ｄ１ｃｐ）における配列番号１８の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１８の塩基配列は、前記配列番号９のアミノ酸配列からなる本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ｃｐ）のコード配列である。配列番号１８のポリヌクレオチド（ｄ１Ｃｐ）は、例えば、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＣＰＳ_１４５３で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１８）があげられる。
【０２１２】
（ｄ１Ｃｐ）のポリヌクレオチド（配列番号１８）
ATGACAAAAAATATAGCGCAAGCAGCTGTAAAATTTGAACAATGGCAGCCAAAAATTGAGCAAGAAAGTTATTTAACCATTAATTCCCTTGAGTGCCATACCGGTGGTGAGCCATTGCGTATTATCACCAGTGGTTTTCCTGTATTAAAAGGCAATACCATTTTGGCAAAAGCAAATGATTGTAAGCAAAACTATGATCAACTTCGTCGAGCATTGATGTTTGAGCCTCGGGGGCATGCTGATATGTATGGCGCTATTATTACTGACGCTGAGCGAGACGATAGCCACTTTGGTGCTGTGTTTATTCATAACGAAGGTTATAGCAGTATGTGTGGTCATGCAGTTATAGCTTTGACAAAAACTGCGGTAGAGTCAGGTGTAGTTGCCAGAACAGGCGATGTTACTCAAGTTGTTATCGATGTACCTTGTGGACAGATTTACGCAATGGCTTATAGCCACAATAATGTAGTGAAACACGTTAGCTTTCAATGCGTACCTTCATTTGTTTATGCCAAAGATCAACAGGTTGAGGTTGATGGCATTGGCATGGTTCAGTTTGATATTGCTTACGGTGGTGCTTTTTATGCTTATGTACAAGCCTCTTCTCTTGGTTTGTCATTGGTGCCTGAGCAACAAGAAAAGCTCATAGCGTATGGCCGAAAAATCAAACAAGCCATTATTCCTCAGTTTGAAATTAATCATCCAACGACCGCAGAATTGAGTTTTTTATATGGCGTTATTTTTATTGATGACTCACCGAATCAAGATGTGCATTCACGCAATGTCTGTATTTTTGCTGATGGCGAATTAGATAGGAGTCCTACTGGCAGTGGGGTTAGTGGACGTATCGCTTTGCATCATGCCAAACAGCAAATAGTTTTAAATGAAACGATTACCATAGAGAGCATTTTAGCGAGTTCGTTTAGTGTCCGAGCTATTGAAACAGTATGCTTTGCCGGTTTTGATGCGGTGATTCCTGAGGTAACAGGCGATGCCTATGTCTGTGGTAAAGGCCAGTGGTTTATTAACGCTGAAGATCCGTTGAAATATGGTTTTTTATTAAGATAA
【０２１３】
前記（ｄ１Ｔｌ）における配列番号１９の塩基配列は、以下の通りである。配列番号１９の塩基配列は、前記配列番号１２のアミノ酸配列からなる本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素（Ｄ１Ｔｌ）のコード配列である。配列番号１９のポリヌクレオチド（ｄ１Ｔｌ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＯＣＣ_００３８で登録されている塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１９）があげられる。
【０２１４】
（ｄ１Ｔｌ）のポリヌクレオチド（配列番号１９）
ATGTTCAAAAAACTTGAGAACTTAGAGAAATGGGAACCCCCAAAAGATTGGATGGTAATTAAAACTCTCGATACTCACACTGCTGGAGAACCACTAAGGATAATCTTAAGCGGTTTCCCAGAGATTCCCGGAAAAACAATACTAGAAAAGAGGCGCTATCTCATGGAAAACCTAGATCACCTTAGAAAAGCCCTAATGTGGGAGCCAAGAGGACATGCAGATATGTATGGGGCAATAATAACGGAACCTGTTAGTGAAGAAGCAGACTTCGGCGTAATATTCATGCACAACGAAGGTTATAGTACAATGTGTGGTCATGCGACCATAGCCCTTGGAAAAGTTGCTGTGGAGTGCGGGCTTGTTGAAGCTAAAGAACCAATAACCGAGATAAAGATGGACAGCCCAGCTGGTCTAATCAAGATTTACGTTAAGGTTAGGGATGGAAAAGTGGAGAAAGTTTACTTCCACAACGTGCCATCTTTTGTTCTTTTCAAAGATGAAACTATCAACGTTCCAGGAATAGGGGAAGTTAAATACGATCTTGCCTATGGGGGAGCGTTCTACGCATTCGTGAATGCTGAAGAGATTGGATTAAAGTGCACTCCAGAATATTACAGGCAACTCATTGACGTCGGCATGAAAATTAAAAGAGCTATAATGTCCGAAAAAGAAATAAGGCACCCATTTGAGGAGGATTTAAGCTTTCTGTATGGGACGATATTCATAGGAGAGCCGGAAGATGAGAACTCTCACAGCAGGCATGTTTGCATATTCGCCGATGGTGAAGTTGATAGAAGTCCAACGGGAACCGGCGTAAGTGCAAGGCTTGCAATCCTCTATGAAAAAGGAGAAATCGACATAGGAGAAGAGATAACAATCGAGAGCATAATCGGCACAAAGTTCACCGGAAAAGTTGTTGAAGAGACAAGATACGGCCTTTACAGGGCAATAATCCCTGAAGTTGGAGGAAACGCCTACATAGTGGCTAAGAATACCTTTTTAATCGACCCCCAAGATCCACTCAAGTACGGATTTTTCTTAAGATGA
【０２１５】
前記（ｄ２）〜（ｄ７）の説明は、前記本発明の新規３−ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子の説明において、「（ｄ２Ａｂ）」を「（ｄ２）」に、「（ｄ３Ａｂ）」を「（ｄ３）」に、「（ｄ４Ａｂ）」を「（ｄ４）」に、「（ｄ５Ａｂ）」を「（ｄ５）」に、「（ｄ６Ａｂ）」を「（ｄ６）」に、「（ｄ７Ａｂ）」を「（ｄ７）」に、「配列番号１１」を「配列番号９および１２の少なくとも一方」に読み替えて援用できる。
【０２１６】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。
【０２１７】
＜３−ヒドロキシプロリン脱水酵素の発現ベクター＞
本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターは、前記本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドおよび前記本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子である前記ポリヌクレオチドの少なくとも一方（以下、「本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」ともいう。）を含むことを特徴とする。本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターによれば、例えば、前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素の発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素および前記本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方を容易に製造できる。
【０２１８】
本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクターの説明は、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクターの説明において、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクター」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクター」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素」に読み替えて援用できる。
【０２１９】
＜３−ヒドロキシプロリン脱水酵素の製造方法＞
本発明の新規タンパク質（新規３−Ｈｙｐ脱水酵素）の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、新規３−Ｈｙｐ脱水酵素を発現する細菌等を公知の手段で培養し、新規３−Ｈｙｐ脱水酵素を産生させることにより製造してもよい。前者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の新規遺伝子（新規３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子）を発現させる工程を有する。後者の場合、具体例としては、本発明の製造方法は、例えば、新規３−Ｈｙｐ脱水酵素を発現する細菌を培養し、新規３−Ｈｙｐ脱水酵素を産生させる工程を有する。これによって、前記本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素を製造できる。
【０２２０】
本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法の説明は、前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の製造方法の説明において、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の発現ベクター」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素の発現ベクター」に、「Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素のポリヌクレオチド」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素のポリヌクレオチド」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素」を「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素遺伝子の少なくとも一方」を「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」に、「新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方」を「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素」に読み替えて援用できる。
【０２２１】
また、本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法は、特に制限されない。本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法は、前記本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素の製造方法の説明において、「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素」に、「新規３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」を「３−Ｈｙｐ脱水酵素遺伝子」に読み替えて援用できる。
【０２２２】
＜３−ヒドロキシプロリンの分析試薬＞
本発明の分析試薬は、３−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする。
【０２２３】
本発明の分析試薬によれば、前記本発明の３−ヒドロキシプロリンの分析方法を、より簡便に行うことができる。本発明の分析試薬は、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。前記３−Ｈｙｐ脱水酵素および前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、前述の通りである。前記Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素は、前記本発明の新規Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素および前記本発明のＰｙｒ２Ｃ還元酵素の少なくとも一方であることが好ましい。また、前記３−Ｈｙｐ脱水酵素は、前記本発明の新規３−Ｈｙｐ脱水酵素および前記本発明の３−Ｈｙｐ脱水酵素の少なくとも一方であることが好ましい。
【０２２４】
本発明の分析試薬は、例えば、さらに、前記本発明の分析方法において使用できる成分を備えてもよい。前記成分は、例えば、前述のような、緩衝液、基質等があげられる。前記基質は、特に制限されず、例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ等があげられる。
【０２２５】
本発明の分析試薬は、例えば、一つの容器に各成分が収容されてもよいし、複数の容器に各成分が別個に収容されてもよい。後者の場合、本発明の分析試薬は、例えば、分析用キットともいう。本発明の分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。また、本発明の分析方法において、前記（ｓ４）工程における「相関関係」を準備するための、前記３−ヒドロキシプロリンの標準試料を備えてもよい。
【０２２６】
＜コラーゲンの測定試薬＞
本発明の測定試薬は、コラーゲンの測定試薬であって、３−ヒドロキシプロリンの分析試薬を含み、前記分析試薬が、前記本発明の分析試薬であることを特徴とする。
【０２２７】
本発明の測定試薬を用いれば、前記本発明のコラーゲンの測定方法を、より簡便に行うことができる。本発明の測定試薬は、前記本発明の分析試薬を含むことが特徴であって、その他の構成等は、特に制限されない。本発明の測定試薬は、例えば、測定用キットともいう。本発明の測定用キットは、例えば、さらに、使用説明書を備えてもよい。
【実施例】
【０２２８】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【０２２９】
［実施例１］
本例では、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（Ｃ１４ｏｒｆ１４９）およびＰｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＰａＬｈｐＤ）を使用し、３−ヒドロキシプロリンの測定を行った。【０２３０】
（１）発現ベクターの構築
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号３）をコードするＣ１４ｏｒｆ１４９  ｃＤＮＡ（配列番号５）は、理研バイオリソースセンターより取得した。また、Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰａＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号２）をコードするＰａＬｈｐＤ  ｃＤＮＡ（配列番号６）を増幅した。【０２３１】
Ｃ１４ｏｒｆ１４９  ｃＤＮＡ（配列番号５）
ATGGAGAGCGCGCTGGCGGTGCCCCGGCTGCCCCCGCATGATCCAGGGACGCCGGTGCTGTCGGTGGTGGACATGCACACGGGCGGCGAGCCCTTGCGTATCGTGCTGGCGGGGTGTCCGGAGGTGTCTGGGCCCACCCTGCTGGCCAAGCGGCGCTACATGCGCCAGCACCTTGACCACGTGCGGCGACGGCTCATGTTCGAGCCCCGAGGGCACCGGGACATGTACGGGGCGGTCCTAGTCCCGAGCGAGCTGCCGGACGCGCATCTGGGCGTCCTGTTCCTGCACAACGAGGGCTACAGCTCCATGTGCGGCCACGCAGTGCTGGCGCTGGGCCGCTTCGCTTTGGACTTCGGGCTTGTGCCGGCGCCCCCTGCGGGCACCCGCGAGGCCCGCGTCAATATCCACTGCCCCTGCGGGCTGGTGACCGCCTTCGTGGCATGCGAGGACGGCCGCAGCCACGGACCGGTGCGCTTCCACAGCGTCCCGGCCTTCGTGCTGGCCACAGATCTCATGGTGGATGTTCCTGGACATGGAAAGGTGATGGTGGACATTGCATATGGCGGTGCATTTTATGCATTTGTTACTGCTGAAAAGTTAGGACTAGACATTTGTTCTGCAAAGACCAGGGACCTTGTGGATGCAGCGAGTGCAGTGACAGAGGCAGTGAAAGCTCAGTTTAAAATTAATCATCCTGATAGTGAAGACCTTGCCTTTTTATATGGAACTATATTAACAGATGGAAAAGATGCTTATACCAAGGAACCAACCACCAACATTTGTGTTTTTGCAGATGAACAGGTTGACAGAAGTCCCACTGGCTCAGGAGTGACAGCCCGAATTGCCTTACAGTATCACAAAGGGCTTCTGGAACTGAACCAGATGAGAGCCTTCAAAAGCAGTGCAACTGGCTCAGTATTCACAGGGAAAGCTGTGAGGGAAGCGAAATGTGGTGATTTTAAAGCTGTTATAGTGGAAGTATCAGGACAAGCCCATTACACGGGTACAGCAAGCTTTATAATAGAAGATGACGACCCATTGAGGGATGGATTTCTTCTCAAGTGA【０２３２】
ＰａＬｈｐＤ  ｃＤＮＡ（配列番号６）
GTGATCCGAATGACGCTGGACGAGGTCCGCGAGCTGGCCGTGCGCATCCTGCGCCGGCACGCTTTCAGCGAAGCCCATGTACAGGCGGTGGCCGATACCCTGGTGGCGGGGGAGCGTGACGAATGCGCGTCCCACGGTATCTGGCGGTTGCTCGGCTGCATCGCCACCCTGAAGGCCGGCAAGGTATCCGCCGACGCCGAGCCGGAACTGCACGACATCGCTCCCGGCCTGCTGCGGGTCGACGCCCATGGCGGGTTCTCCCAGTGCGCATTCCGGCTGGGGCTGCCGCATCTGCTGGAGAAGGCCCGCAGCCAGGGTATCGCGGCGATGGCGGTGAACCGCTGTGTGCATTTCTCCGCGCTATGGGTTGAGGTCGAGGCACTCACCGAGGCGGGCCTGGTGGCCCTGGCGACCACGCCGAGTCATGCCTGGGTGGCGCCGGCGGGCGGACGCAAGCCGATCTTCGGCACCAACCCGATCGCCTTTGGCTGGCCGCGTCCGGACGGCCCGCCGTTCGTCTTCGACTTCGCCACCAGCGCCGTGGCGCGTGGCGAGATCCAGTTGCACGAACGCGCCGGCAAGCCGATCCCGCTGGGCTGGGGGGTGGACGAGCAGGGCGAGCCGACCACCGATGCCAGCGCCGCGTTGCGAGGCGCCATGCTTACTTTCGGCGGGCACAAGGGCTCGGCCCTGGCGGCGATGGTCGAACTGCTCGCCGGTCCGCTGATCGGCGACCTGACCAGTGCCGAGTCGCTGGCCTACGACGAGGGCAGCCGTTCTTCTCCCTACGGTGGCGAACTGCTGATCGCCATCGATCCGCGGCGCATGCTCGGCGCCTCGGCGGAGGAGCACCTGGCGCGCGCCGAGACGCTGTTCGAAGGCATCGTCGAACAGGGCGCGCGCTTGCCCTCGCAGCGACGCTTCGAAGCGCGCGAACGCAGCGCCAGGGACGGCGTGACGATTCCCGAGGCGTTGCACCGGGAGCTGCTGGCGTTGCTGGAGTGA【０２３３】
前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９  ｃＤＮＡおよび得られたＰＣＲ産物を、それぞれアンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社製）およびｐＱＥ−８０Ｌベクター（キアゲン社製）に連結した。Ｃ１４ｏｒｆ１４９  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクター、ＰａＬｈｐＤ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＰａＬｈｐＤ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、いずれも発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。【０２３４】
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＤＨ５α株に、前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクターおよび前記ＰａＬｈｐＤ発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）を含有するＬＢ培地を用いて、ＯＤ６００＝０．６程度になるまで３７℃で培養した。前記培地における前記抗生物質濃度は、５０ｍｇ／Ｌとした。前記培養後、さらに、１ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＩＰＴＧを前記培養液に添加し、６時間培養した。ＰａＬｈｐＤの発現の際には、ＩＰＴＧを添加し、前記添加後は、１８℃で培養した。培養した菌体を集菌し、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、超音波破砕した。そして、遠心分離によって上清（無細胞抽出液）を回収して、下記条件のカラムクロマトグラフィーに供して、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記Ｃ１４ｏｒｆ１４９発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「Ｃ１４ｏｒｆ１４９」、前記ＰａＬｈｐＤ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を「ＰａＬｈｐＤ」とした。【０２３５】
（カラムクロマトグラフィー）
カラム：Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製)
洗浄用緩衝液：３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび５０ｍｍｏｌ  イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）
溶出用緩衝液：３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）【０２３６】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図１に示す。図１は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＰａＬｈｐＤの結果である。【０２３７】
図１に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９について、約４１ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＰａＬｈｐＤについて、約３９ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＣ１４ｏｒｆ１４９の理論値３９６１８．７２Ｄａ、ＰａＬｈｐＤの理論値３６９５０．６１Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。【０２３８】
（４）３−ヒドロキシプロリンの測定
分光光度計（商品名シマズUV-1800分光光度計、島津GLC）のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９および１μＬ（１μｇ）のＰａＬｈｐＤを添加し、さらに、所定濃度（１、２、４、６、８または１０ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０２３９】
【表１】
2015033636.tif 000010
【０２４０】
これらの結果を図２に示す。図２は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図２に示すように、いずれの３−ヒドロキシプロリンの濃度においても、同程度の直線性が得られた。【０２４１】
（５）検量線の作成
前記（４）の測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロット（検量線）を作成した。【０２４２】
これらの結果を図３に示す。図３において、横軸は、基質濃度の逆数（１／Ｓ）を示し、縦軸は、反応速度の逆数（１／Ｖ）を示し、各グラフ内の関数は、相関関数を示し、Ｒ２は、相関係数を示す。図３に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤを用いた場合、基質濃度１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が作成できた。これらの結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤを使用することで、広い濃度範囲について、３−ヒドロキシプロリンの精度に優れる定量が可能であることがわかった。【０２４３】
［実施例２］
本例では、３−Ｈｙｐ脱水酵素とＰｙｒ２Ｃ還元酵素とを用いた３−ヒドロキシプロリンの分析について、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の添加量、ならびに、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の添加前における３−Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間による影響を確認した。３−Ｈｙｐ脱水酵素として、前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを使用した。【０２４４】
（１）酵素の添加量
反応液における３−ヒドロキシプロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ/Ｌとし、Ｃ１４ｏｒｆ１４９（Ｈ）およびＰａＬｈｐＤ（Ｄ）の添加量（Ｈ：Ｄ）を、それぞれ、下記条件とした以外は実施例１（４）と同様にして、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
条件（ｉ）   Ｈ：１０μｇ          Ｄ：１０μｇ
条件（ii）   Ｈ：３３．９μｇ      Ｄ：１０μｇ
条件（iii）  Ｈ：１０μｇ          Ｄ：８４μｇ【０２４５】
これらの結果を、図４に示す。図４は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示し、図中に示した（ｉ）−（iii）は、添加したＣ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤの前記条件を示す。図４に示すように、条件（ｉ）−（iii）のいずれにおいても、吸光度の減少がみられた。中でも、前記条件（ii）および条件（iii）は、前記条件（ｉ）と比較して、吸光度の減少がより速く、また、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、３−Ｈｙｐ脱水酵素またはＰｙｒ２Ｃ還元酵素の量を増やすことにより、反応開始直後でも、３−ヒドロキシプロリンを精度よく測定できることがわかった。【０２４６】
（２）３−Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間
前記反応セルに、前記表１の組成の反応試薬、Ｃ１４ｏｒｆ１４９  １μＬおよび３−ヒドロキシプロリン  １００μＬを添加し、所定時間（０、１、２、５、１０分）インキュベートした後、ＰａＬｈｐＤ  １μＬを添加した。ＰａＬｈｐＤの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＰａＬｈｐＤの添加量は、それぞれ、１０μｇとし、前記反応液における３−ヒドロキシプロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記（１）と同様とした。【０２４７】
これらの結果を図５に示す。図５は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示し、図中の時間は、ＰａＬｈｐＤ添加前における３−Ｈｙｐ脱水酵素のインキュベート時間（０、１、２、５、１０分）である。【０２４８】
図５に示すように、インキュベート時間にかかわらず、経時的に吸光度の減少が見られた。中でも、インキュベート時間が５分以上である場合、吸光度の減少がより速く、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、インキュベート０時間であっても、３−ヒドロキシプロリンを精度よく測定でき、インキュベート時間５分以上とすることで、さらに精度を向上できることがわかった。【０２４９】
［実施例３］
本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＡｂＬｈｐＩ）を精製し、特性を確認した。【０２５０】
（１）発現ベクターの構築
Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＡｂＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１）をコードするＡｂＬｈｐＩ  ｃＤＮＡ（配列番号４）を増幅した。【０２５１】
得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＡｂＬｈｐＩ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。【０２５２】
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＡｂＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＡｂＬｈｐＩ」とした。【０２５３】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
２５μｇの前記無細胞抽出液および１０μｇのＡｂＬｈｐＩについて、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図６に示す。図６は、前記無細胞抽出液および前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図６において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍ）、前記無細胞抽出液、ＡｂＬｈｐＩの結果である。【０２５４】
図６に示すように、前記無細胞抽出液およびＡｂＬｈｐＩについて、約３７ＫＤａ付近にバンドが観察された。このバンドの分子量は、ＡｂＬｈｐＩの理論値３３５５５．７３Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＡｂＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。【０２５５】
（４）補酵素特異性
前記反応セルに、下記表２の組成の反応試薬、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを添加した。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１−ピロリン−２−カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの終濃度を０．０００１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。【０２５６】
【表２】
2015033636.tif 000011
【０２５７】
これらの結果を図７に示す。図７は、前記反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図７に示すように、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨのいずれの場合においても、経時的に吸光度の減少が見られ、優れた直線性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨのいずれも、補酵素として利用できることがわかった。【０２５８】
また、ＮＡＤＰＨを使用した際のＡｂＬｈｐＩの比活性は、１７１．５ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、ＮＡＤＨを使用した際のＡｂＬｈｐＩの比活性は、１２６．２ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。そして、前記実施例１で使用したＰａＬｈｐＤは、ＮＡＤＨを使用した際の比活性が１８．６ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであることから、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤに対し、約１０倍高い比活性を示すことがわかった。このことから、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素としてＡｐＬｈｐＩを使用することで、使用する酵素のタンパク質量を低減することが可能といえる。【０２５９】
（５）基質特異性
前記反応セルに、下記表３の組成の反応試薬、１μＬ（２０μｇ）ＡｂＬｈｐＩおよびＮＡＤＰ＋を添加し、さらに、下記基質を添加した。基質の添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。そして、ＡｂＬｈｐＩのＬ−プロリンに対する比活性を１００％として、その他の基質に対する相対活性を算出した。前記反応液において、ＮＡＤＰ＋の終濃度は０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌとし、基質の終濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌとした。また、ＡｂＬｈｐＩに代えて、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを添加した以外は同様にして、ＰａＬｈｐＤの基質に対する相対活性を算出した。【０２６０】
【表３】
2015033636.tif 000012
【０２６１】
（基質）
Ｌ−プロリン、トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、Ｄ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン【０２６２】
これらの結果を図８に示す。図８は、ＡｂＬｈｐＩおよびＰａＬｈｐＤの基質特異性を示すグラフである。図８において、横軸は、基質を示し、縦軸は、相対的活性を示す。図８に示すように、ＰａＬｈｐＤは、トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに対し、弱い活性を示し、また、Ｌ−プロリンに対し、強い活性を示した。また、ＡｂＬｈｐＩは、Ｌ−プロリン以外のプロリンアナログに対し、活性を示さなかった。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩおよびＰａＬｈｐＤは、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化し、Ｌ−プロリンを生成するＰｙｒ２Ｃ還元酵素であることがわかった。また、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤと比較して、トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに対する活性が弱いことから、３−ヒドロキシプロリンの分析に、より適していることがわかった。【０２６３】
［実施例４］
本例では、３−Ｈｙｐ脱水酵素として前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを使用し、３−ヒドロキシプロリンを測定した。【０２６４】
３−ヒドロキシプロリンの測定は、ＡｂＬｈｐＩを用い、３−ヒドロキシプロリン添加後に５分間インキュベートしてから測定を開始した以外は、前記実施例１（４）と同様にして、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。ＡｂＬｈｐＩの添加量は、１μＬ（０．４μｇ）とした。また、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素として、実施例１（２）のＰａＬｈｐＤを使用し、添加量を１μＬ（１０μｇ）とした以外は同様に測定した。【０２６５】
これらの結果を図９に示す。図９は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、測定時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図９において、測定時間は、５分間のインキュベートが終了した時点を基準としたときの時間である。図９に示すように、ＡｂＬｈｐＩ（ＬｈｐＩ）を用いた場合、経時的に吸光度の減少が見られ、優れた直線性を示した。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＩを用いることで、優れた精度で３−ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。また、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤ（ＬｈｐＤ）よりも、吸光度の減少がより速く、また測定開始０−６０秒の間においても優れた直線性を示した。これらの結果から、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の中でもＡｂＬｈｐＩが極めて優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示し、その直線性から、３−ヒドロキシプロリンの分析に適していることがわかった。【０２６６】
［実施例５］
本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株を培養して、無細胞抽出液を調製し、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を測定した。【０２６７】
Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株ついて、好気条件下、３０℃で振とう培養を行った。培地は、１Ｌあたり、０．８ｇ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、２ｇ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００２ｇ  ＦｅＳＯ４、０．０８０ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび３７ｍｍｏｌ／Ｌの炭素源を含む最小培地（ｐＨ６．８）を使用した。前記炭素源は、グルコース、Ｌ−プロリン、Ｄ−プロリン、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｌ−Ｈｙｐ）、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン（Ｄ−Ｈｙｐ）、３−ヒドロキシプロリン（３−Ｌ−Ｈｙｐ）またはＤ−リジン（Ｄ−Ｌｙｓ）を使用した。そして、遠心分離（３００００×ｇ、２０分）により培養細胞を回収し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉs−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁して、超音波破砕した。そして、前記懸濁液を遠心分離して上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。なお、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の安定化のため、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌには、１％（ｖ／ｖ）となるようにＴｗｅｅｎ−２０を添加した。【０２６８】
そして、前記各培地を使用して調製した無細胞抽出液について、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を確認した。３−Ｈｙｐ脱水酵素活性の測定については、リコンビナントタンパク質に代えて、前記無細胞抽出液を用いた以外は前記実施例２（１）と同様に測定した。【０２６９】
また、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性の測定については、前記反応セルに、９００μＬの１ｍｍｏｌ／Ｌ  Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および前記無細胞抽出液を添加し、さらに、１００μＬの０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰＨを添加し、３０℃の条件下でインキュベートした。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定し、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性とした。そして、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素について、１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。【０２７０】
これらの結果を図１０に示す。図１０において、（Ａ）は、無細胞抽出液における３−Ｈｙｐ脱水酵素の活性を示すグラフであり、（Ｂ）は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の活性を示すグラフである。図１０において、横軸は、炭素源を示し、縦軸は、比活性を示す。図１０（Ａ）に示すように、Ｄ−プロリン、３−ヒドロキシプロリンおよびＤ−リジンを炭素源として用いた場合、３−Ｈｙｐ脱水酵素活性が高かった。また、図１０（Ｂ）に示すように、Ｄ−プロリン、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリンおよびＤ−リジンを炭素源として用いた場合、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素活性が高かった。これらの結果から、Ｄ−プロリン、シス−Ｌ−ヒドロキシプロリン、シス−Ｄ−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリンおよびＤ−リジンを炭素源とし、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株を培養することで、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の高い発現を誘導できることがわかった。また、中でも、Ｄ−プロリン、３−ヒドロキシプロリンおよびＤ−リジンを炭素源とし、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株を培養することで、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の高い発現を誘導できることがわかった。【０２７１】
［実施例６］
本例では、Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（ＡｂＬｈｐＨ）、ならびにＣｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ由来Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素（ＣｐＬｈｐＩ）および３−Ｈｙｐ脱水酵素（ＣｐＬｈｐＨ）を精製した。また、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨ、および前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９の３−Ｈｙｐ脱水酵素活性、ならびにＣｐＬｈｐＩ、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩのＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を比較した。【０２７２】
（１）発現ベクターの構築
Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ  ＡＴＣＣ２９１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ａｂ３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号１１）をコードするＡｂＬｈｐＨ  ｃＤＮＡ（配列番号１７）を増幅した。また、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣｐＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１３）をコードするＣｐＬｈｐＩ  ｃＤＮＡ（配列番号１５）およびＣｐ３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号９）をコードするＣｐＬｈｐＨ  ｃＤＮＡ（配列番号１８）を増幅した。【０２７３】
得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＡｂＬｈｐＨ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＡｂＬｈｐＨ発現ベクター、ＣｐＬｈｐＩ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＣｐＬｈｐＩ発現ベクター、ＣｐＬｈｐＨ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。【０２７４】
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＡｂＬｈｐＨ発現ベクター、前記ＣｐＬｈｐＩ発現ベクターまたは前記ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＡｂＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＡｂＬｈｐＨ」、前記ＣｐＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＣｐＬｈｐＩ」、前記ＣｐＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＣｐＬｈｐＨ」とした。【０２７５】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図１１に示す。図１１は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１１において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐIの結果である。【０２７６】
図１１に示すように、ＡｂＬｈｐＨについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＣｐＬｈｐＨについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＣｐＬｈｐＩについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＡｂＬｈｐＨの理論値３７８０５．８７Ｄａ、ＣｐＬｈｐＨの理論値４０４３７．１５Ｄａ、ＣｐＬｈｐＩの理論値３６１８１．７６Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。【０２７７】
（４）３−Ｈｙｐ脱水酵素の酵素活性の比較
分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、および１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨまたはＣｐＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０２７８】
【表１】
2015033636.tif 000013
【０２７９】
そして、得られた測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロットを作成した。そして、前記ラインウィンバー・バークプロットから、各酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）および速度定数（Ｋｃａｔ）を算出した。そして、ＫｍおよびＫｃａｔから、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。【０２８０】
また、得られた測定結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。【０２８１】
これらの結果を図１２に示す。図１２は、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。図１２において、横軸は、３−Ｈｙｐ脱水酵素の種類を示し、縦軸は、比活性またはＫｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１２において、白色のバーは、比活性を示し、黒色のバーは、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１２に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、格段に優れた比活性を示した。また、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値においては、ＡｂＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、より高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。さらに、ＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９およびＡｂＬｈｐＨと比較して、さらに高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、Ｃ１４ｏｒｆ１４９と比較して、高い３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有することが分かった。また、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、高い３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を有することから、より少量のタンパク質量を使用した場合においても、３−ヒドロキシプロリンを測定できることが分かった。【０２８２】
（５）Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の酵素活性の比較
前記反応セルに、下記表４の組成の反応試薬、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸、および１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加し、さらに、ＮＡＤＰＨを添加した。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１−ピロリン−２−カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。なお、ＰａＬｈｐＤは、ｐＨ７．０の条件下で、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩは、ｐＨ６．５の条件下で測定を行った。【０２８３】
【表４】
2015033636.tif 000014
【０２８４】
そして、得られた測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロットを作成した。そして、前記ラインウィンバー・バークプロットから、各酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）および速度定数（Ｋｃａｔ）を算出した。そして、ＫｍおよびＫｃａｔから、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を算出した。【０２８５】
また、得られた測定結果から、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。【０２８６】
これらの結果を図１３に示す。図１３は、比活性およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示すグラフである。図１３において、横軸は、Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の種類を示し、縦軸は、比活性またはＫｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１３において、白色のバーは、比活性を示し、黒色のバーは、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値を示す。図１３に示すように、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、格段に優れた比活性を示した。また、Ｋｃａｔ／Ｋｍ値においても、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、より高いＫｃａｔ／Ｋｍ値を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＩは、ＰａＬｈｐＤおよびＣｐＬｈｐＩと比較して、高いＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有することが分かった。また、ＡｂＬｈｐＩは、高いＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を有することから、より少量のタンパク質量を使用した場合においても、３−ヒドロキシプロリンを測定できることが分かった。【０２８７】
［実施例７］
本例では、前記実施例１（２）のＣ１４ｏｒｆ１４９、前記実施例６（１）のＡｂＬｈｐＨ、および前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＨの至適ｐＨを確認した。また、前記実施例１（２）のＰａＬｈｐＤ、前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩおよび前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＩの至適ｐＨを確認した。【０２８８】
（１）３−Ｈｙｐ脱水酵素の至適ｐＨ
分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表５の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、および１μＬ（１μｇ）のＣ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨまたはＣｐＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、各種バッファーは、酢酸ナトリウムバッファー（酢酸バッファー）、リン酸カリウムバッファー（リン酸バッファー）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、またはグリシン−ＮａＯＨを使用した。また、前記酢酸バッファーのｐＨは、ｐＨ４、４．５、５、５．５または６とし、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ６、６．５、７、７．５、８または８．５とし、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨは、７、７．５、８、８．５または９とし、前記グリシン−ＮａＯＨのｐＨは、９、９．５、１０、１０．５または１１とした。【０２８９】
【表５】
2015033636.tif 000015
【０２９０】
そして、得られた測定結果から、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。【０２９１】
これらの結果を図１４に示す。図１４において、（Ａ）は、Ｃ１４ｏｒｆ１４９の結果を示し、（Ｂ）は、ＡｂＬｈｐＨの結果を示し、（Ｃ）は、ＣｐＬｈｐＨの結果を示す。また、図１４において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、比活性を示し、図中の□は、前記酢酸バッファーの結果を示し、○は、リン酸バッファーの結果を示し、△は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの結果を示し、◇は、グリシン−ＮａＯＨの結果を示す。図１４に示すように、Ｃ１４ｏｒｆ１４９、ＡｂＬｈｐＨおよびＣｐＬｈｐＨは、いずれもｐＨが中性付近（ｐＨ７〜９）の際に高い比活性を示した。【０２９２】
（２）Ｐｙｒ２Ｃ還元酵素の至適ｐＨ
前記反応セルに、下記表６の組成の反応試薬、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸またはＬ−プロリン、および１μＬ（１０μｇ）のＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加した。さらに、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を添加した前記反応セルに、ＮＡＤＰＨを、Ｌ−プロリンを添加した前記反応セルに、ＮＡＤＰ＋を添加した。ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰ＋の添加時を０秒として、経時的に、反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１−ピロリン−２−カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとし、Ｌ−プロリンの終濃度を１０ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰ＋の終濃度を１．５ｍｍｏｌ／Ｌとした。なお、各種バッファーは、酢酸バッファー、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、またはグリシン−ＮａＯＨを使用した。また、前記酢酸バッファーのｐＨは、ｐＨ５、５．２５、５．５、５．７５または６とし、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５または８．５とし、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨは、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５または８．７５とし、前記グリシン−ＮａＯＨのｐＨは、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５または１２とした。そして、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸を添加した前記反応セルでは、前記各種バッファーとして、酢酸バッファー、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用し、Ｌ−プロリンを添加した前記反応セルでは、前記各種バッファーとして、グリシン−ＮａＯＨを使用した。【０２９３】
【表６】
2015033636.tif 000016
【０２９４】
そして、得られた測定結果から、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの１ｍｇのタンパク質当たりの比活性（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。【０２９５】
これらの結果を図１５に示す。図１５は、異なるｐＨにおける比活性を示すグラフである。図１５において、（Ａ）は、ＰａＬｈｐＤの結果を示し、（Ｂ）は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、（Ｃ）は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。また、図１５において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、比活性を示し、図中の□は、酢酸バッファーの結果を示し、○は、リン酸バッファーの結果を示し、△は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの結果を示し、◇は、グリシン−ＮａＯＨの結果を示す。図１５に示すように、ＰａＬｈｐＤ、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩは、いずれもｐＨが中性付近（ｐＨ６〜７）およびアルカリ性付近（ｐＨ１０〜１１）の際に高い比活性を示した。【０２９６】
［実施例８］
本例では、３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を組合せて、３−ヒドロキシプロリンの測定能を比較した。【０２９７】
分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、下記条件（ｉ）〜（ｖ）の３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素を添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。
条件（ｉ）         ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ      ＡｂＬｈｐＩ：１μｇ
条件（ii）         ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ      ＣｐＬｈｐＩ：１０μｇ
条件（iii）  Ｃ１４ｏｒｆ１４９：１０μｇ      ＰａＬｈｐＤ：１０μｇ
条件（iv）         ＡｂＬｈｐＨ：１０μｇ      ＰａＬｈｐＤ：１０μｇ
条件（ｖ）   Ｃ１４ｏｒｆ１４９：１０μｇ      ＡｂＬｈｐＩ：１０μｇ【０２９８】
【表１】
2015033636.tif 000017
【０２９９】
この結果を図１６に示す。図１６は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、測定時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図１６に示すように、条件（ii）、条件（ｉ）、条件（iv）、条件（ｖ）および条件（iii）の順番で、吸光度の減少がより速かった。また、条件（ｉ）は、１／１０の量のＰｙｒ２Ｃ還元酵素を使用した際にも、条件（ii）と同等の吸光度の減少を示した。これらのことから、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを組合せることで、少ない３−Ｈｙｐ脱水酵素およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素の使用量で、３−ヒドロキシプロリンをより精度よく測定できることがわかった。【０３００】
［実施例９］
本例では、前記実施例６（１）ＡｂＬｈｐＨおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを組合せた際の至適ｐＨを確認した。【０３０１】
分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表５の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。なお、各種バッファーは、リン酸バッファーまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用した。また、前記リン酸バッファーのｐＨは、ｐＨ７、７．５または８とし、前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨは、ｐＨ７．５、８、８．５または９とした。【０３０２】
【表５】
2015033636.tif 000018
【０３０３】
そして、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用したときの吸光度を１００％とし、前記各種バッファーの各ｐＨにおける相対活性を算出した。【０３０４】
この結果を図１７に示す。図１７は、相対活性を示すグラフである。図１７において、横軸は、前記各種バッファーのｐＨを示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、リン酸バッファーの結果を示し、○は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの結果を示す。図１７に示すように、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用した際に、３−ヒドロキシプロリンをより精度よく測定できることがわかった。【０３０５】
［実施例１０］
本例では、前記実施例６（１）ＡｂＬｈｐＨおよび前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩを使用した際に、３−ヒドロキシプロリンが、ＡｂＬｈｐＨにより、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水され、さらに、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸が、ＡｂＬｈｐＩにより、Ｌ−プロリンに還元されることを確認した。【０３０６】
反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。前記反応は、３０℃とし、一晩行った。【０３０７】
【表１】
2015033636.tif 000019
【０３０８】
前記反応後の反応液について、ＨＰＬＣ分析装置（日立高速アミノ酸分析計Ｌ−８９００、日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し、分析した。また、コントロールは、ＡｂＬｈｐＩを添加しない以外は同様にして、分析した。さららに、標準試料１として、３−ヒドロキシプロリンを、標準試料２として、Ｌ−プロリンを同様にして、分析した。【０３０９】
これらの結果を図１８に示す。図１８は、ＨＰＬＣの分析結果を示すグラフである。図１８において、（Ａ）は、標準試料１の結果を示し、（Ｂ）は、コントロールの結果を示し、（Ｃ）は、実施例の結果を示し、（Ｄ）は標準試料２の結果を示す。また、図１８において、横軸は、リテンション時間を示し、縦軸は、電圧を示し、図中の白矢印は、３−ヒドロキシプロリンのピークを示し、黒矢印は、Ｌ−プロリンのピークを示す。図１８（Ｂ）に示すように、３−Ｈｙｐ脱水酵素であるＡｂＬｈｐＨのみで処理したコントロールでは、Ｌ−プロリンのピークが見られなくなった。また、図１８（Ｃ）に示すように、３−Ｈｙｐ脱水酵素であるＡｂＬｈｐＨおよびＰｙｒ２Ｃ還元酵素であるＡｂＬｈｐＩで処理した実施例では、黒矢印で示すＬ−プロリンのピークがみられた。これらの結果から、３−ヒドロキシプロリンが、ＡｂＬｈｐＨにより、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水され、さらに、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸が、ＡｂＬｈｐＩにより、Ｌ−プロリンに還元されることがわかった。【０３１０】
［実施例１１］
本例では、３−ヒドロキシプロリンの検量線を作製し、優れた精度で３−ヒドロキシプロリンを定量できることを確認した。【０３１１】
（１）検量線の作製
分光光度計のインキュベート温度を３０℃に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨおよび１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩを添加し、さらに、所定濃度（０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５または１ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３１２】
【表１】
2015033636.tif 000020
【０３１３】
前記測定結果から、基質濃度の逆数（１／Ｓ）および反応速度の逆数（１／Ｖ）を計算し、ラインウィンバー・バークプロット（検量線）を作成した。【０３１４】
これらの結果を図１９に示す。図１９において、横軸は、基質濃度の逆数（１／Ｓ）を示し、縦軸は、反応速度の逆数（１／Ｖ）を示し、各グラフ内の関数は、相関関数を示し、Ｒ２は、相関係数を示す。図１９に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを用いた場合、基質濃度０．０５〜１ｍｍｏｌ／Ｌの間で、相関係数が０．９９以上の相関性の高い検量線が作成できた。これらの結果から、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、広い濃度範囲について、３−ヒドロキシプロリンの精度に優れる定量が可能であることがわかった。【０３１５】
（２）３−ヒドロキシプロリンの定量
１００ｍｍｏｌ／Ｌの３−ヒドロキシプロリン標準液を、任意に希釈した希釈サンプルＡ−Ｄを調製した。そして、前記３−ヒドロキシプロリン１００μＬに代えて前記希釈サンプルＡ−Ｄを各１００μＬ使用した以外は、前記（１）と同様にして、反応を行い、吸光度を測定した。そして、測定した吸光度と前記（１）の検量線とから、３−ヒドロキシプロリンの濃度を決定した。他方、前記希釈サンプルＡ−Ｄの３−ヒドロキシプロリンの濃度を、ＨＰＬＣ分析装置により決定した。【０３１６】
検量線から求めた３−ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３−ヒドロキシプロリンの濃度とを、表７に示す。表７に示すように、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、ＨＰＬＣと同程度の精度で３−ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。【０３１７】
【表７】
2015033636.tif 000021
【０３１８】
（３）３−ヒドロキシプロリンおよび４−ヒドロキシプロリンの混合物の測定
１００ｍｍｏｌ／Ｌの３−ヒドロキシプロリン標準液および１００ｍｍｏｌ／Ｌの４−ヒドロキシプロリン標準液を作製した。そして、それぞれを任意に希釈および混合した混合サンプルＡ−Ｄを調製した。そして、前記３−ヒドロキシプロリン１００μＬに代えて前記混合サンプルＡ−Ｄを各１００μＬ使用した以外は、前記（１）と同様にして、反応を行い、吸光度を測定した。そして、測定した吸光度と前記（１）の検量線とから、３−ヒドロキシプロリンの濃度を決定した。他方、前記混合サンプルＡ−Ｄの３−ヒドロキシプロリンの濃度を、ＨＰＬＣ分析装置により決定した。【０３１９】
この結果を図２０に示す。図２０は、検量線から求めた３−ヒドロキシプロリンの濃度と、ＨＰＬＣにより測定した３−ヒドロキシプロリンの濃度とを示すグラフである。図２０において、横軸が、前記混合サンプルの種類を示し、縦軸が、３−ヒドロキシプロリンの濃度を示す。また、図中の黒色のバーは、ＨＬＰＣにより測定した３−ヒドロキシプロリンの濃度を示し、白色のバーは、前記検量線から求めた３−ヒドロキシプロリンの濃度を示す。図２０に示すように、混合サンプルＡ−Ｄのいずれにおいても、ＨＰＬＣと同程度の精度で３−ヒドロキシプロリンを測定できた。すなわち、４−ヒドロキシプロリンの共存下においても、ＡｂＬｈｐＨおよびＡｂＬｈｐＩを使用することで、ＨＰＬＣと同程度の精度で測定できることがわかった。これらのことから、４−ヒドロキシプロリン等が存在する生体試料においても、ＨＰＬＣと同程度の精度で３−ヒドロキシプロリンを測定できることがわかった。【０３２０】
［実施例１２］
本例では、前記実施例３（２）のＡｂＬｈｐＩおよび前記実施例６（１）のＣｐＬｈｐＩの至適温度および熱安定性を確認した。【０３２１】
（１）至適温度
分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３２２】
【表１】
2015033636.tif 000022
【０３２３】
そして、ＣｐＬｈｐＩを使用し、３０℃でインキュベートしたときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの各温度における相対活性を算出した。【０３２４】
この結果を図２１に示す。図２１は、相対活性を示すグラフである。図２１において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。図２１に示すように、ＡｂＬｈｐＩは、４５〜６０℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。また、ＣｐＬｈｐＩは、１０〜３０℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。【０３２５】
（２）温度安定性
反応セルに前記表１の反応試薬、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩを添加した。そして、前記反応セルを、所定温度（３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０℃）とし、１０分間処理した。前記処理後の反応セルに、さらに、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３２６】
そして、熱処理しなかったときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＩまたはＣｐＬｈｐＩの各温度における相対活性を算出した。【０３２７】
この結果を図２２に示す。図２２は、相対活性を示すグラフである。図２２において、横軸は、処理温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＩの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＩの結果を示す。図２２に示すように、ＡｂＬｈｐＩおよびＣｐＬｈｐＩは、５５℃未満の処理温度において、高い相対活性を維持することがわかった。【０３２８】
［実施例１３］
本例では、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３由来３−Ｈｙｐ脱水酵素（ＴｌＬｈｐＨ）およびＰｙｒ２Ｃ還元酵素（ＴｌＬｈｐＩ）を精製した。また、ＴｌＬｈｐＨおよびＴｌＬｈｐＩの化学特性を確認した。【０３２９】
（１）発現ベクターの構築
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＳＭ  ５４７３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｔｌ３−Ｈｙｐ脱水酵素（配列番号１２）をコードするＴｌＬｈｐＨ  ｃＤＮＡ（配列番号１９）およびＴｌＰｙｒ２Ｃ還元酵素（配列番号１４）をコードするＴｌＬｈｐＩ  ｃＤＮＡ（配列番号１６）を増幅した。【０３３０】
得られたＰＣＲ産物を、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社製）に連結した。ＴｌＬｈｐＨ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＴｌＬｈｐＨ発現ベクター、ＴｌＬｈｐＩ  ｃＤＮＡを挿入したベクターを、ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターとした。なお、前記ベクターは、発現タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６分子が連結したペプチド（ヒスチジンタグ）を付加するように設計されている。【０３３１】
（２）リコンビナントタンパク質の精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に、前記ＴｌＬｈｐＨ発現ベクターまたは前記ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターを導入した以外は前記実施例１（２）と同様にして、上清（無細胞抽出液）を回収した。そして、前記上清を、前記実施例１（２）と同様にして、カラムクロマトグラフィーに供し、発現したリコンビナントタンパク質を精製した。以下、前記ＴｌＬｈｐＨ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＴｌＬｈｐＨ」、前記ＴｌＬｈｐＩ発現ベクターを導入した形質転換体から得られたリコンビナントタンパク質を、「ＴｌＬｈｐＩ」とした。【０３３２】
（３）リコンビナントタンパク質の発現の確認
前記リコンビナントタンパク質について、１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。前記電気泳動後、ＣＢＢ染色により、バンドの検出を行った。これらの結果を図２３に示す。図２３は、前記リコンビナントタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２３において、写真の左側が、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、ＴｌＬｈｐＩ、ＴｌＬｈｐＨの結果である。【０３３３】
図２３に示すように、ＴｌＬｈｐＨについて、約４５ＫＤａ付近にバンドが観察され、ＴｌＬｈｐＩについて、約４０ＫＤａ付近にバンドが観察された。これらのバンドの分子量は、それぞれＴｌＬｈｐＨの理論値４０７８１．０５Ｄａ、ＴｌＬｈｐＩの理論値３６９４３．０１Ｄａと近似していた。これらの結果から、前記発現ベクターから、ＴｌＬｈｐＨおよびＴｌＬｈｐＩが発現され、且つ、単一に精製されていることが確認された。【０３３４】
（４）３−Ｈｙｐ脱水酵素の至適温度
分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、前記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１μＬ（１μｇ）のＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨまたはＴｌＬｈｐＨを添加し、さらに、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３３５】
そして、最大活性を示したときの吸光度を１００％とし、ＡｂＬｈｐＨ、ＣｐＬｈｐＨまたはＴｌＬｈｐＨの各温度における相対活性を算出した。【０３３６】
この結果を図２４に示す。図２４は、相対活性を示すグラフである。図２４において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示し、図中の□は、ＡｂＬｈｐＨの結果を示し、○は、ＣｐＬｈｐＨの結果を示し、△は、ＴｌＬｈｐＨの結果を示す。図２４に示すように、ＡｂＬｈｐＨは、３５〜４５℃の範囲で、優れた３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。ＣｐＬｈｐＨは、４５〜５０℃の範囲で、優れた３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。ＴｌＬｈｐＨは、８０〜１００℃の範囲で、優れた３−Ｈｙｐ脱水酵素活性を示すことが分かった。【０３３７】
（５）ＴｌＬｈｐＩの至適温度
分光光度計のインキュベート温度を所定温度（１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００℃）に保持し、反応セルをセットした。前記反応セルに、下記表３の組成の反応試薬、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸および１μＬ（１０μｇ）のＴｌＬｈｐＩを添加した。さらに、前記反応セルに、ＮＡＤＰＨを添加した。ＮＡＤＰＨの添加時を０秒として、６０秒における反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。前記反応液におけるΔ１−ピロリン−２−カルボン酸の終濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌとし、ＮＡＤＰＨの終濃度を０．１５ｍｍｏｌ／Ｌとした。【０３３８】
【表３】
2015033636.tif 000023
【０３３９】
そして、８０℃でインキュベートしたしたときの吸光度を１００％とし、各温度における相対活性を算出した。【０３４０】
この結果を図２５に示す。図２５は、相対活性を示すグラフである。図２５において、横軸は、インキュベート温度を示し、縦軸は、相対活性を示す。図２５に示すように、ＴｌＬｈｐＩは、７０〜８５℃の範囲で、優れたＰｙｒ２Ｃ還元酵素活性を示すことが分かった。【０３４１】
（６）ＴｌＬｈｐＨの熱安定性
反応セルに前記表１の反応試薬、および１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＨを添加した。そして、前記反応セルを、１００℃で所定時間（０、０．５、１、２、３、４または５時間）処理した。前記処理後の反応セルに、さらに、１μＬ（１０μｇ）のＡｂＬｈｐＩ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、６０秒における前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３４２】
そして、０時間処理したときの吸光度を１００％とし、各処理時間における相対活性を算出した。【０３４３】
この結果を図２６に示す。図２６は、相対活性を示すグラフである。図２６において、横軸は、処理時間を示し、縦軸は、相対活性を示す。図２６に示すように、１００℃で５時間処理しても、２０％を超える相対活性を有していた。これらのことから、ＴｌＬｈｐＨは、極めて耐熱性が高いことが分かった。また、極めて耐熱性が高いことから、例えば、長期保存した場合においても、反応性を維持できることが分かった。【０３４４】
（７）３−ヒドロキシプロリンの測定
分光光度計のインキュベート温度を所定温度（５０、６０または７０℃）に保持し、反応セルをセットした。そして、前記反応セルに、下記表１の組成の反応試薬、１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＨおよび１μＬ（１μｇ）のＴｌＬｈｐＩを添加し、さらに１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように３−ヒドロキシプロリン１００μＬを添加することにより、反応を開始した。３−ヒドロキシプロリンの添加時を０秒として、経時的に、前記反応液の波長３４０ｎｍの吸光度を測定した。【０３４５】
【表１】
2015033636.tif 000024
【０３４６】
これらの結果を図２７に示す。図２７は、３−ヒドロキシプロリン測定の反応液における吸光度を示すグラフであり、横軸は、反応時間を示し、縦軸は、３４０ｎｍの吸光度を示す。図２７に示すように、いずれのインキュベートにおいても、直線性が得られた。また、インキュベート温度が高くなるにつれ、吸光度の減少がより速く、また、反応開始直後においても優れた直線性を示した。これらの結果から、インキュベート温度を高くすることで、反応開始直後でも、３−ヒドロキシプロリンを精度よく測定できることがわかった。【０３４７】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０３４８】
この出願は、２０１３年９月９日に出願された日本出願特願２０１３−１８６６４７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０３４９】
以上のように、本発明の分析方法によれば、従来のように、ＨＰＬＣを用いることなく、酵素反応によって、簡便に３−ヒドロキシプロリンを分析できる。また、本発明の分析方法によって３−ヒドロキシプロリンが分析できることから、間接的に、コラーゲンの測定も簡便に行うことができる。このため、本発明は、医療、食品および美容等の分野において、極めて有用な技術といえる。
【図３】
2015033636.tif 000025
【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年7月6日(2015.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｓ１）〜（ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中の３−ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
（ｓ１）３−ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の３―ヒドロキシプロリンをΔ１−ピロリン−２−カルボン酸に脱水する脱水工程
（ｓ２）Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素により、前記（ｓ１）工程において得られたΔ１−ピロリン−２−カルボン酸を水素化する還元工程
（ｓ３）前記（ｓ２）工程の還元反応を分析する分析工程
【請求項２】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｔｌ）〜（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｔｌ）  配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ａｂ）〜（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ａｂ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項４】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記（ｓ２）工程のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）〜（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１記載の分析方法。
（Ｒ１Ｐｓ）  配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｔｌ）〜（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｔｌ）  配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ａｂ）〜（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ａｂ）  配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｃｐ）〜（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｃｐ）  配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項９】
前記（ｓ１）工程の３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）〜（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
（Ｄ１Ｈｓ）  配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１０】
下記（Ｓ１）〜（Ｓ３）工程を含むことを特徴とする、被検試料中のコラーゲンの測定方法。
（Ｓ１）被検試料中のコラーゲンから、３−ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
（Ｓ２）前記（Ｓ１）工程で遊離した３−ヒドロキシプロリンの量を、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
（Ｓ３）予め求めた前記コラーゲンに対する３−ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記（Ｓ２）工程で測定した３−ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程
【請求項１１】
前記コラーゲンが、コラーゲンＩＶである、請求項１０記載の測定方法。
【請求項１２】
下記（Ｒ１Ｔｌ）〜（Ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｒ１Ｔｌ）  配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｔｌ）  前記（Ｒ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１３】
下記（Ｒ１Ａｂ）〜（Ｒ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つのΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元剤。
（Ｒ１Ａｂ）  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ａｂ）  前記（Ｒ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１４】
下記（Ｒ１Ｃｐ）〜（Ｒ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つのΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元剤。
（Ｒ１Ｃｐ）  配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｃｐ）  前記（Ｒ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項１５】
下記（Ｄ１Ｔｌ）〜（Ｄ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つの３−ヒドロキシプロリン脱水酵素を含むことを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水剤。
（Ｄ１Ｔｌ）  配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｔｌ）  前記（Ｄ１Ｔｌ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１６】
下記（Ｄ１Ａｂ）〜（Ｄ３Ａｂ）からなる群から選択された少なくとも一つの３−ヒドロキシプロリン脱水酵素を含むことを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水剤。
（Ｄ１Ａｂ）  配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ａｂ）  前記（Ｄ１Ａｂ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１７】
下記（Ｄ１Ｃｐ）〜（Ｄ３Ｃｐ）からなる群から選択された少なくとも一つの３−ヒドロキシプロリン脱水酵素を含むことを特徴とする、３−ヒドロキシプロリン脱水剤。
（Ｄ１Ｃｐ）  配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｃｐ）  前記（Ｄ１Ｃｐ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項１８】
３−ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
３−ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、分析試薬。
【請求項１９】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１２記載のタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２０】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１３記載のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元剤である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２１】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、請求項１４記載のΔ１−ピロリン−２−カルボン酸還元剤である、請求項１８記載の分析試薬。
【請求項２２】
前記Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素が、下記（Ｒ１Ｐｓ）〜（Ｒ３Ｐｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８記載の分析試薬。
（Ｒ１Ｐｓ）  配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｒ２Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
（Ｒ３Ｐｓ）  前記（Ｒ１Ｐｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
【請求項２３】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１５記載の３−ヒドロキシプロリン脱水剤である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２４】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１６記載の３−ヒドロキシプロリン脱水剤である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２５】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項１７記載の３−ヒドロキシプロリン脱水剤である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
【請求項２６】
前記３−ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記（Ｄ１Ｈｓ）〜（Ｄ３Ｈｓ）からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の分析試薬。
（Ｄ１Ｈｓ）  配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｄ２Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
（Ｄ３Ｈｓ）  前記（Ｄ１Ｈｓ）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３−ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
【請求項２７】
コラーゲンの測定試薬であって、
請求項１８から２６のいずれか一項に記載の３−ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする、測定試薬。
【請求項２８】
下記（ｒ１Ｔｌ）〜（ｒ３Ｔｌ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素遺伝子。
（ｒ１Ｔｌ）配列番号１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｒ２Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｒ３Ｔｌ）前記（ｒ１Ｔｌ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ１−ピロリン−２−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【国際調査報告】
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