(57)【要約】  無細胞系において、環状DNA、特に長鎖環状DNAを簡便かつ指数的に増幅することのできる方法を提供する。具体的には、複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を有する環状DNAを、以下の酵素群：（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；（２）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および（３）２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群を含む反応液と混合して生成した反応混合物を等温で反応させることを含む、環状DNAの増幅方法を提供する。
2016080424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む環状DNAの増幅方法：
（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程、ここで環状DNAがDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を含む；および
（２）工程（１）において形成した反応混合物を等温条件下で保温する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、方法。
【請求項３】
DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、大腸菌の複製開始配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
環状DNAのサイズが５０ｋｂ以上である、請求項２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
１種以上の核様体タンパク質がIhfAおよびIhfBの組み合わせである、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群が、GyrAおよびGyrBの組み合わせである、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
DNAヘリカーゼ活性を有する酵素がDnaBヘリカーゼである、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素がDnaCヘリカーゼローダーである、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
DNAプライマーゼ活性を有する酵素がDnaGプライマーゼである、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
DNAクランプ活性を有する酵素がDnaNクランプである、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群が、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEの組み合わせである、請求項２〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、DNAリガーゼ活性を有する酵素、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素が大腸菌由来である、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（１）における反応液が、副次的産物の生成を抑制する成分をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程（２）における等温条件が、２５℃〜５０℃の範囲に含まれる一定の温度である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、組成物。
【請求項１７】
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用キット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットであって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状DNAの増幅方法に関する。より詳細には、無細胞系において環状DNAを指数的に増幅することのできる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー発展の基盤となったDNAクローニング技術は、DNA断片の切り貼りにより調製した環状DNAを大腸菌等の細胞内でプラスミドとして増幅させる手法である。細胞を用いたDNAクローニング技術を用いて環状DNAを増幅する場合、細胞培養および増幅産物の抽出・精製等の煩雑な手順が必要となる。また、細胞を用いたDNAクローニングを行うためには遺伝子組換え生物を作出する必要があるため、実験できる環境に制限がある。【０００３】
試験管内でDNAを増幅する方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が一般的に用いられている。しかし、PCRによる試験管内DNA増幅法では、環状DNAをそのまま増幅することはできない。環状DNAの試験管内増幅法としては、ローリングサークル増幅法（RCA）などがある（非特許文献１、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。しかし、ローリングサークル増幅法で環状DNAを増幅するためには、標的DNAに特異的なプライマーを都度設計する必要がある。また、ローリングサークル増幅法による直接的な増幅産物は直鎖型DNAであり、得られた増幅産物を環状化するためには、組換え酵素とインキュベーションする等のさらなる環状化工程が必要となる。大腸菌のミニ染色体（oriC環状DNA）を複製したのち、これを分離し、単量体の複製産物を得る方法も報告されているが（非特許文献２）、増幅できるのは6 kbp程度の環状DNAにとどまる。また、大腸菌由来の精製酵素群を用いて、大腸菌のミニ染色体の複製を再構成したことが報告されているが（非特許文献３）、１つの試験管内で複製サイクルを繰り返し、長大な環状DNAを試験管内でまるごと指数的に増幅する方法は知られていない。【０００４】
このように、従来の試験管内DNA増幅法で環状DNAを増幅するためには、プライマーの鋳型DNAへの結合が必要であり、増幅産物は直鎖型DNAであり、また、増幅可能なDNAサイズは数kbにとどまるという問題があった。【０００５】
長大なDNAを調製する技術としては、SLIC法やGibson Assembly法などが提案されているが、いずれの技術を用いた場合も、最終的に長鎖環状DNAを調製するためには細胞の利用が必要である（非特許文献４）。細胞を利用して長鎖環状DNAを作成する方法としては、たとえば枯草菌を用いた方法が報告されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２２９９５０
【特許文献２】特開２００８−１６１１８２
【特許文献３】特表２０１２−５０１１７３
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fakruddin M et al., J Pharm Bioallied Sci. 2013, 5: 245-252
【非特許文献２】Peng H & Marians KJ. PNAS. 1993, 90: 8571-8575
【非特許文献３】Kaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90
【非特許文献４】Chao R et al., FEMS YEAST Res. 2014
【非特許文献５】Tsuge et al., Nucleic Acids Res. 2003, 31:e133
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、無細胞系において、環状DNA、特に長鎖環状DNAを簡便かつ指数的に増幅することのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を有する環状DNAを、以下の酵素群：
（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
（２）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
（３）２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と混合して生成した反応混合物を等温で反応させることにより、「複製の開始（DNA２重鎖開裂）・伸長（複製フォーク進行）・複製された姉妹DNAの分離（Decatenation）」のサイクルが繰り返し、指数的に環状DNAを増幅することができることを見出した。【００１０】
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は以下の態様の発明を包含する。
［１］
以下の工程を含む環状DNAの増幅方法：
（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程、ここで環状DNAがDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を含む；および
（２）工程（１）において形成した反応混合物を等温条件下で保温する工程。
［２］
［１］に記載の方法であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、方法。
［３］
DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、大腸菌の複製開始配列である、［２］に記載の方法。
［４］
環状DNAのサイズが５０ｋｂ以上である、［２］または［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
１種以上の核様体タンパク質がIhfAおよびIhfBの組み合わせである、［２］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群が、GyrAおよびGyrBの組み合わせである、［２］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
DNAヘリカーゼ活性を有する酵素がDnaBヘリカーゼである、［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素がDnaCヘリカーゼローダーである、［２］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
DNAプライマーゼ活性を有する酵素がDnaGプライマーゼである、［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
DNAクランプ活性を有する酵素がDnaNクランプである、［２］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群が、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEの組み合わせである、［２］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、DNAリガーゼ活性を有する酵素、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素が大腸菌由来である、［２］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
工程（１）における反応液が、副次的産物の生成を抑制する成分をさらに含む、［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
工程（２）における等温条件が、２５℃〜５０℃の範囲に含まれる一定の温度である、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用組成物。
［１６］
［１５］に記載の組成物であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、組成物。
［１７］
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用キット。
［１８］
［１７］に記載のキットであって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、大腸菌細胞やプラスミドベクターを用いることなく、環状DNA、特に長鎖環状DNAを簡便かつ指数的に増幅することのできる方法が提供される。本発明によれば、環状DNAを増幅するのに温度制御サイクルやプライマーは不要であり、200 kbを超える長鎖環状DNAの増幅も可能である。また、本発明によって得られる増幅産物は、もとの鋳型と同じ環状構造のままのコピーである。さらに、複数のDNA断片を連結したのち、そのまま当該反応系に加えると、連結により環状化したDNAのみを特異的に増幅して調製することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明による複製サイクルのモデルを示す。
【図２】図２は、Gibson Assembly法を用いた試験管内連結により環状化したDNAの構造を示す。
【図３】図３は、9.6 kbの環状DNAを鋳型として用いた場合の反応時間ごとの増幅産物をアガロース電気泳動し、SyberGreenによって検出した結果を示す。
【図４】図４は、200 kb及び80 kbの長鎖環状DNAを鋳型として用いた場合の増幅産物をアガロース電気泳動し、SyberGreenによって検出した結果を示す。図４ａは、200 kbの長鎖環状DNA（15 pM, 20 ng）を鋳型として用いた場合の、反応時間ごとの増副産物の結果を示す。図４ｂは80 kb（15 pM, 8 ng）及び200 kb（5 pM, 6.7 ng）の長鎖環状DNAを鋳型として用いた場合の反応３時間後の増副産物の結果を示す。
【図５】図５は、Gibson Assembly法を用いた試験管内連結により環状化したDNAを鋳型として用いた場合の増幅産物をアガロース電気泳動し、SyberGreenによって検出した結果を示す。
【図６】図６は、微量（１分子レベル）の9.6 kbの環状DNAを鋳型として用いた増幅実験の結果を示す。図６ａは、9.6 kbの環状DNAを鋳型として用いた場合の増幅産物をアガロース電気泳動し、SyberGreenによって検出した結果を示す。図６ｂは、増副産物のDNA量をPicoGreen法あるいは大腸菌形質転換法により定量し、その増幅度合いを示した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、9.6 kbの環状DNAを鋳型として用いた場合の増幅時間に対する増幅した環状DNA分子数を示すグラフである。
【図８】図８は、混合物からの単一な環状DNAクローンの増幅試験結果を示す図である。図８ａは、環状DNAの混合物の希釈についての模式図である。図８ｂは、環状DNAの混合物を希釈して増幅した場合の増幅産物をアガロース電気泳動し、SyberGreenによって検出した結果を示す。
【図９】図９は、環状DNAの継代増幅試験結果を示す図である。図９ａは、実験手順についての模式図である。図９ｂは、増幅反応後のDNA産物を希新たな反応液に希釈して、再度増幅を導くという継代増幅を１０回くりかえした場合の結果を示す。増幅産物はアガロース電気泳動およびSyberGreenによって検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜環状DNA＞
鋳型として用いる環状DNAは、２重鎖であることが好ましい。鋳型として用いる環状DNAは、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を含むものであれば、特に制限はされず、微生物の環状染色体等の天然の環状DNA、天然の環状DNAを酵素処理等によって切断したもの等に別のDNA断片を連結し、それを環状化した環状DNA、すべて人工的に合成した環状DNA等を例示することができる。DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（origin of chromosome（oriC））（以下、単に「複製開始配列」ということがある）としては、たとえば大腸菌、枯草菌等の細菌に存在する公知の複製開始配列を、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公的なデータベースから入手することができる。また、DnaA活性を有する酵素と結合可能なDNA断片をクローニングし、その塩基配列を解析することによって、複製開始配列を得ることもできる。
【００１４】
本発明において鋳型として用いる環状DNAは、もともと複製開始配列を含む環状DNAであってもよいし、もともとは複製開始配列を含まない環状DNAに複製開始配列を導入したものであってもよい。
【００１５】
本発明において鋳型として用いる環状DNAは、目的に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の薬剤耐性マーカー遺伝子配列を含むものであってよい。
【００１６】
本発明において鋳型として用いる環状DNAは、精製されたものであってもよいが、環状DNAを含む菌体抽出物等の懸濁液の形態であってもよい。また、１種類の環状DNAを鋳型として用いてもよいが、たとえばDNAライブラリーのような複数種類の環状DNAの混合物を１つの試験管内で鋳型として用いてもよい。
【００１７】
１反応あたりに用いる鋳型DNAの量に特に制限はなく、１反応あたり１分子の環状DNAを鋳型として用いることもできる。
【００１８】
本発明において鋳型として用いる環状DNAの長さに制限はないが、たとえば1 kb（1000塩基長）以上、5 kb（5000塩基長）以上、8 kb（8,000塩基長）以上、10 kb（10,000塩基長）以上、50 kb（50,000塩基長）以上、100 kb（100,000塩基長）以上、200 kb（200,000塩基長）以上、500 kb（500,000塩基長）以上、1000 kb（1,000,000塩基長）以上、または2000 kb（2,000,000塩基長）以上の長さとすることができる。
【００１９】
本発明では、上記の環状DNAを鋳型として用いて、それを少なくとも10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、または10000倍に増幅することができる。
【００２０】
＜第一、第二および第三の酵素群＞
本発明は、複製開始配列（origin of chromosome（oriC））を有する環状DNAを以下の酵素群：
（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；
（２）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および
（３）２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と混合して生成した反応混合物を等温で反応させることに関する。
【００２１】
理論により制限されるものではないが、本発明は図１に示すように複製サイクルを繰り返し、環状DNAを指数的に増幅する。
【００２２】
＜（１）環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群＞
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群としては、たとえばKaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第一の酵素群として、以下：DnaA活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群、からなる群より選択される酵素または酵素群の１つ、または当該酵素または酵素群の組合せ、を例示することができる。
【００２３】
第一の酵素群は、反応液中１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよい。好ましくは、第一の酵素群は反応液中に１ｎＭ〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２４】
DnaA活性を有する酵素としては、大腸菌のイニシエータータンパク質であるDnaAと同様のイニシエーター活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaAを好適に用いることができる。DnaAは、反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜２００ｎＭ、５０ｎＭ〜１５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２５】
核様体タンパク質は、核様体に含まれるタンパク質をいう。本発明に用いる１種以上の核様体タンパク質は、大腸菌の核様体タンパク質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のIHF、すなわちIhfAおよびIhfBの組み合わせや、HU、すなわちhupAおよびhupBの複合体を好適に用いることができる。IHFまたはHUは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２６】
DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群としては、大腸菌のDNAジャイレースと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のGyrAおよびGyrBの組み合わせを好適に用いることができる。GyrAおよびGyrBの組み合わせは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２７】
一本鎖DNA結合タンパク質（single-strand binding protein（SSB））としては、大腸菌の一本鎖DNA結合タンパク質と同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のSSBを好適に用いることができる。SSBは、反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２８】
DNAヘリカーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のDnaBと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaBを好適に用いることができる。DnaBは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００２９】
DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素としては、大腸菌のDnaCと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaCを好適に用いることができる。DnaCは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３０】
DNAプライマーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のDnaGと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaGを好適に用いることができる。DnaGは、反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３１】
DNAクランプ活性を有する酵素としては、大腸菌のDnaNと同様の活性を有する酵素であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaNを好適に用いることができる。DnaNは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３２】
DNAポリメラーゼIII*活性を有する酵素または酵素群としては、大腸菌のDNAポリメラーゼIII*複合体と同様の活性を有する酵素または酵素群であれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEの組み合わせを好適に用いることができる。DNAポリメラーゼIII*複合体は反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３３】
＜（２）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群＞
本発明において、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAとは、DNA複製反応によって合成された２つの環状DNAがつながった状態にあるものをいう。
【００３４】
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群としては、たとえばRNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素、からなる群より選択される１つの酵素または当該酵素の組み合わせを例示することができる。
【００３５】
第二の酵素群は、反応液中１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよい。好ましくは、第二の酵素群は反応液中に１ｎＭ〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３６】
RNaseH活性を有する酵素としては、RNA:DNAハイブリッドのRNA鎖を分解する活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のRNaseHを好適に用いることができる。RNaseHは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３７】
DNAポリメラーゼI活性を有する酵素としては、大腸菌のDNAポリメラーゼIと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDNAポリメラーゼIを好適に用いることができる。DNAポリメラーゼIは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３８】
DNAリガーゼ活性を有する酵素としては、大腸菌のDNAリガーゼと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のDNAリガーゼを好適に用いることができる。DNAリガーゼは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００３９】
＜（３）２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群＞
２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群としては、たとえばPeng & Marians 1993 PNASに記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第三の酵素群として、以下：トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素、から成る群より選択される１つの酵素または当該酵素の組み合わせを例示することができる。
【００４０】
第三の酵素群は、反応液中１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよい。好ましくは、第三の酵素群は反応液中に１ｎＭ〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００４１】
トポイソメラーゼIV活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼIVと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえばParCとParEの複合体である大腸菌由来のトポイソメラーゼIVを好適に用いることができる。トポイソメラーゼIVは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００４２】
トポイソメラーゼIII活性を有する酵素としては、大腸菌のトポイソメラーゼIIIと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のトポイソメラーゼIIIを好適に用いることができる。トポイソメラーゼIIIは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００４３】
RecQ活性を有する酵素としては、大腸菌のRecQと同様の活性を有するものであれば、その生物学的由来に特に制限はないが、たとえば大腸菌由来のRecQを好適に用いることができる。RecQは反応液中、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で含まれていてもよく、好ましくは１ｎＭ〜〜５μＭ、１ｎＭ〜３μＭ、１ｎＭ〜１．５μＭ、１ｎＭ〜１．０μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ，１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で含まれていてもよいが、これに限定されない。
【００４４】
特に好適には、第一の酵素群として、いずれも大腸菌由来のDnaA、IHF、GyrA及びGyrB、SSB、DnaBおよびDnaC、DnaG、DnaN、並びにpolIII*の組合せ；第二の酵素群としていずれも大腸菌由来のRNase H、DNAポリメラーゼI、及びDNAリガーゼの組合せ；並びに、第三の酵素群として、いずれも大腸菌由来のトポイソメラーゼIV、トポイソメラーゼIII、及びRecQの組合せ；を用いてもよい。そして、前記の酵素群の組合せを用いる場合の好適な各酵素の濃度としては、以下が例示されるが、これに限定されない。
【００４５】
【表１】
2016080424.tif 000003
【００４６】
上記の第一、第二および第三の酵素群は、市販されているものを用いてもよいし、微生物等から抽出し、必要に応じて精製したものを用いてもよい。微生物からの酵素の抽出および精製は、当業者に利用可能な手法を用いて適宜実施することができる。
【００４７】
上記酵素の無細胞タンパク質発現系を含む反応液を、そのまま鋳型となる環状DNAと混合して、環状DNAの増幅のための反応混合液を形成してもよい。
【００４８】
無細胞タンパク質発現系は、上記酵素をコードする遺伝子の塩基配列に相補的な配列からなるRNAを含む総RNA（total RNA）、mRNA、またはin vitro転写産物などを鋳型RNAとする無細胞翻訳系であってもよいし、各酵素をコードする遺伝子または各酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターなどを鋳型DNAとする無細胞転写翻訳系であってもよい。
【００４９】
＜環状DNAの増幅方法＞
本発明の方法は、上記第一から第三の酵素群を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程を含む。
【００５０】
第一から第三の酵素群を含む反応液の組成は、DNA複製反応が進行することのできるものであれば特に制限はないが、たとえば、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に、rNTP、dNTP、マグネシウムイオン源、ATP源等を添加した溶液に、第一から第三の酵素群を添加したもの等を用いることができる。また、上記反応液は、副次的産物の生成を抑制する成分等の追加の成分をさらに含むものであってよい。具体的な反応液としては、後述する実施例に記載されたものが例示できる。
【００５１】
本発明の方法は、上記反応混合物を等温条件下で保温する工程をさらに含む。等温条件としては、DNA複製反応が進行することのできるものであれば特に制限はないが、たとえばDNAポリメラーゼの至適温度である２０〜８０℃の範囲に含まれる一定の温度とすることができ、２５℃〜５０℃の範囲に含まれる一定の温度とすることができ、３０℃程度とすることができる。保温時間は、目的とする環状DNAの増幅産物の量に応じて適宜設定することができるが、たとえば１〜２４時間とすることができる。
【００５２】
本発明の方法は、上記反応混合物を等温条件下で保温する工程の後に、目的に応じて、環状DNAの増幅産物を精製する工程を含んでもよい。環状DNAの精製は、当業者に利用可能な手法を用いて適宜実施することができる。
【００５３】
本発明の方法を用いて増幅した環状DNAは、反応後の反応混合物をそのまま、あるいは適宜精製したものを、形質転換等のその後の目的に用いることができる。
【００５４】
＜環状DNAの増幅用組成物およびキット＞
本発明は、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群を含む、環状DNAの増幅用組成物にも関する。本発明の組成物は、本発明の効果を妨げない限り、安定剤、還元剤、反応バッファー等の追加の成分を含んでいてよい。
【００５５】
また、本発明は、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群を含む、環状DNAの増幅用キットにも関する。本発明のキットは、上記酵素の混合物を１つに包装したものを含むものであってもよいが、上記酵素を個別に、あるいは数種類ずつまとめて混合したものを別個に包装したものを含むものであってよい。
【００５６】
また、本発明は、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群；岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群；および２つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群に属する各酵素の無細胞タンパク質発現系を含む、環状DNAの増幅用キットにも関する。
【００５７】
本発明のキットは、目的に応じて、反応バッファーの濃縮物あるいは反応バッファー等の追加の構成品を含むものであってよい。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の範囲に限定されるものではない。【００５９】
実施例１：環状ＤＮＡの増幅
＜材料と方法＞
表１に示す組成の反応液に鋳型DNAを添加して氷上で混合した後、３０℃のインキュベータで１時間、２時間、または３時間保温した。１反応あたりの総容量は１０マイクロリットルとなるようにした。３０℃における反応後、反応産物をアガロースゲル電気泳動（0.5%  1×TAE、150 V、１００分間、１４℃）したのち、SyberGreen（タカラバイオ株式会社）を用いてDNAを検出した。【００６０】
【表２】
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【００６１】
表中、SSBは大腸菌由来SSB、IHFは大腸菌由来IhfAおよびIhfBの組み合わせ、DnaGは大腸菌由来DnaG、DnaNは大腸菌由来DnaN、PolIII*は大腸菌由来DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEの組み合わせからなるDNAポリメラーゼIII*複合体、DnaBは大腸菌由来DnaB、DnaCは大腸菌由来DnaC、DnaAは大腸菌由来RNaseH、Ligaseは大腸菌由来DNAリガーゼ、PolIは大腸菌由来DNAポリメラーゼI、GyrAは大腸菌由来GyrA、GyrBは大腸菌由来GyrB、Topo IVは大腸菌由来ParCおよびParEの組合せ、Topo IIIは大腸菌由来トポイソメラーゼIII、RecQは大腸菌由来RecQを表す。【００６２】
SSBは、SSBの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びイオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６３】
IHFは、IhfA及びIhfBの大腸菌共発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６４】
DnaGは、DnaGの大腸菌発現株から、硫安沈殿、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６５】
DnaNは、DnaNの大腸菌発現株から、硫安沈殿及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６６】
PolIII*は、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ及びHolEの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６７】
DnaB, DnaCは、DnaB及びDnaCの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６８】
DnaAは、DnaAの大腸菌発現株から、硫安沈殿、透析沈殿、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００６９】
GyrA, GyrBは、GyrAの大腸菌発現株とGyrBの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００７０】
Topo IVは、ParCの大腸菌発現株とParEの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００７１】
Topo IIIは、Topo IIIの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００７２】
RecQは、RecQの大腸菌発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。【００７３】
RNaseH、Ligase、PolIは市販の大腸菌由来の酵素を用いた（タカラバイオ株式会社）。【００７４】
鋳型DNAとしては、9.6 kbの環状DNA（複製開始配列oriCを持つ環状DNA、カナマイシン耐性（Km））、80 kbの長鎖環状DNA（複製開始配列oriCを持つ環状DNA、カナマイシン耐性（Km））、200 kbの長鎖環状DNA（複製開始配列oriCを持つ環状DNA、カナマイシン耐性（Km））、または試験管内連結により環状化したDNAを用いた。【００７５】
9.6 kbの環状DNAおよび80 kb 、200 kbの長鎖環状DNAは、大腸菌細胞内組換え反応によって調製した。具体的には、λファージの組換えタンパク質群を発現している大腸菌を用い、細胞内組換え反応によって、カナマイシン耐性カセットと大腸菌染色体のうちoriCを含む領域とを含む、所望の長さの環状DNAを調製した。【００７６】
試験管内連結による環状化DNAの調製方法を、図２に示す。具体的には、複製開始配列oriCとカナマイシン耐性（Km）を持つもののPCR断片（2.3kb）に、dnaA遺伝子およびdnaN遺伝子配列を有するPCR断片（以下、dnaA−dnaN断片と記載する）（2.6 kb）を、Gibson assembly法により反応させることにより連結した。２つのPCR断片は両端に付加した20塩基の相同配列（H1, H2と記載する）を介して連結し、環状構造となる。反応は、Gibson Assembly Master Mix（NEB社）に上記2種類のPCR断片を混合し、50℃で15分間反応させることによって行った。反応後、反応溶液0.1マイクロリットル分（反応溶液の１０倍希釈溶液１マイクロリットル分）を鋳型DNAとして、10マイクロリットルの増幅反応系（表２の組成）に直接添加し、３０℃で１時間反応させた。【００７７】
＜結果１＞  9.6 kbの環状DNA（0.08 ng、環状分子数にして約107個）を鋳型として用いた場合
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図３に示す。【００７８】
副次的産物（反応中間産物）もみられるものの、スーパーコイル構造の環状DNA増幅産物（黒枠で示す）を確認することができた。【００７９】
反応後の溶液をそのまま用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、カナマイシン含有寒天培地で培養し、コロニー数を計測することによって、環状DNAの増幅量を求めた結果を表３に示す。対照としては、保温時間０時間の反応溶液を用いた。【００８０】
【表３】
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【００８１】
本発明の方法により、9.6 kbの環状DNAを環状DNAとしておよそ6,000倍に増幅することができた。【００８２】
＜結果２＞  80 kbおよび200 kbの長鎖環状DNAを鋳型として用いた場合
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図４に示す。【００８３】
スーパーコイル構造の環状DNA増幅産物（黒枠または矢印で示す）を確認することができた。【００８４】
本発明の方法により、80 kb又は200 kbという長大な環状DNAを鋳型として用いた場合でも、良好に増幅産物が得られることがわかった。【００８５】
＜結果３＞  試験管内連結により環状化したDNAを鋳型として用いた場合
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図５に示す。【００８６】
本発明の方法により、試験管内連結により環状化したDNAを鋳型として用いた場合でも、良好に増幅産物が得られることがわかった。【００８７】
反応後の溶液をそのまま用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、カナマイシン含有寒天培地で培養し、コロニー数を計測することによって、環状DNAの増幅量を求めた結果を表４に示す。対照として、増幅反応を行わなかったサンプルを用いた。【００８８】
【表４】
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【００８９】
Gibson Assembly法を用いて環状化したDNAが、本発明の方法により、環状分子としておよそ2,000倍に増幅されたことがわかった。【００９０】
実施例２：少数の鋳型分子からの環状DNAの増幅
実施例１に記載の9.6 kbの環状DNAを用い、実施例１と同様に増幅反応を行った。【００９１】
（２−１）増幅効率の検討
増幅反応液（実施例１、表２）１０μｌに、9.6 kbの環状DNAを環状分子として１〜１０００分子含まれるように加え、３０℃で３時間保温することにより増幅反応を行った。反応物について、０．５％アガロースゲル電気泳動を行い、SybrGreen（タカラバイオ株式会社）で染色し、増幅DNAを検出した（図６ａ）。また、増副産物の総DNA量を、PicoGreen検出キット（ThermoFisher社）により定量した（図６ｂ：PicoGreen法）。環状DNA分子としての増幅量を、増幅産物を直接、大腸菌に形質転換し、カナマイシン耐性コロニー数を求めることにより定量した（図６ｂ：形質転換法）。定量結果から、初期DNA量に対する増幅度合いを求め（増幅）、グラフに示した。
上記の結果より、鋳型DNAとして１分子の環状DNAを、わずか３時間の等温反応で約1011分子にまで、増幅可能であることが明らかとなった（約１，０００億倍の増幅）。【００９２】
（２−２）倍加時間の検討
増幅反応液（実施例１、表２）８０μｌに、上記の環状DNAを加え、３０℃で保温することにより増幅反応を行った。環状DNAは反応液１μｌあたり105分子となるよう加えた。経時的にサンプリングし、サンプルを直接、大腸菌に形質転換し、カナマイシン耐性コロニー数を求めることにより増幅された環状DNA分子数を定量した（図７）。
上記の結果より、9.6 kbの環状DNA分子の倍加時間は約５分であることが確認された。【００９３】
実施例３：混合物から単一な環状DNAクローンの増幅
実施例１に記載の9.6 kbの環状DNA及び12.0 kbの環状DNA（複製開始配列oriCを持つ環状DNA、カナマイシン耐性（Km））の混合物から単一な環状DNAクローンの増幅を行った。【００９４】
12.0 kbの環状DNAは、大腸菌細胞内組換え反応によって調製した。具体的には、λファージの組換えタンパク質群を発現している大腸菌を用い、細胞内組換え反応によって、oriCとカナマイシン耐性遺伝子からなるカセットと大腸菌染色体の一部の領域とを含む、所望の長さの環状DNAを調製した。【００９５】
増幅反応液（実施例１、表２）１０μｌに、上記２種の環状DNAの混合物を反応液中に各１５分子あるいは各１．５分子となるように希釈して加え、３０度で６時間保温することにより増幅反応を行った。反応物について、０．５％アガロースゲル電気泳動を行い、SybrGreen（タカラバイオ株式会社）で染色し、増幅DNAを検出した（図８）。【００９６】
その結果、環状DNAが１．５分子にまで希釈された反応液では、各反応サンプルごとに、どちらか一方のクローンのみが増幅された。このことは、鋳型DNAが混合物であっても、それを反応液中に１分子レベルにまで希釈することで、単一な環状DNAクローンの増幅が可能であることを示す。【００９７】
実施例４：継代増幅
lacZ環状DNAを用いて、環状DNAの継代増幅について試験した。【００９８】
lacZ環状DNA（9.0 kb）は、oriCを含む二本鎖DNA断片（1.0 kb）、カナマイシン耐性遺伝子（Km）を含む二本鎖DNA断片（4.6 kb）及びlacZ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を含む二本鎖DNA断片（3.4 kb）を連結させることにより調製した。  増幅反応液（実施例１、表２）１０μｌに、lacZ環状DNAを１，０００分子含まれるように加え、３０℃で３時間保温することにより増幅反応を行い、これを１継代とした。前の継代数での増幅反応物を１０５倍希釈し、これを１μｌ、新たな増幅反応液に添加して同様に反応させることで次の継代増幅とした。この継代増幅を１０回まで繰り返した。継代ごとの増幅産物について、０．５％アガロースゲル電気泳動を行い、SybrGreen（タカラバイオ株式会社）で染色し、検出した（図９）。また、その増幅産物の一部を大腸研形質転換し、カナマイシン耐性コロニー数よりDNA増幅度合を定量、この値より、何世代指数増幅を繰り返したかを算出し総世代数として示した。【００９９】
その結果、１０回の継代後も環状DNAの増幅が効率よく進行している事が分かった。実施例２（図７）の結果が示すように、環状DNAがある程度増幅すると、基質や酵素の枯渇により、増幅速度は頭打ちになる。一方で、本実施例の結果は、増幅反応物の一部を新たな反応液にて継代することで、環状DNAの指数増幅を半永久的に繰り返すことが可能であることを示している。すなわち、本発明の方法は、環状DNAの増幅を、細胞の継代増殖のように行うことが可能な方法である。【０１００】
実施例５：増幅反応における複製エラー発生率
実施例４における鋳型の環状DNAにはlacZ遺伝子が含まれているため、この環状遺伝子で形質転換した大腸菌をX-galプレート上で培養すると、lacZ遺伝子が正常に発現したコロニー（lacZ+）はX-galを分解できるため青色を呈し、複製エラーによる変異導入でlacZ遺伝子が正常に機能しなくなったコロニー（lacZ−）はX-galを分解できないため白色を呈する。すなわち、この環状遺伝子で形質転換した大腸菌がX-galプレート上で呈する色によって、増幅した環状DNAにおける複製エラーを判定できる。【０１０１】
各継代サンプルの増幅反応物を直接大腸菌に形質転換し、X-galプレート上で培養して、lacZ-出現率を求めた。このlacZ-出現率と実施例４で求めた総世代数とから、Barnes の手法 (Barnes WM Gene. 1992, 112, 29-35) に従い、複製サイクル１世代あたりのエラー発生率を算出した。結果を以下の表５に示す。【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
上記の結果は、複製エラーは１億塩基につき１箇所程度（塩基当たり平均1.4 x 10-8エラー）であることを示す。これは、細胞内（ミスマッチ修復系をもたない株）の変異率と同程度であり、Taqポリメラーゼの約１万倍の正確性である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月15日(2016.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（ａ）環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
（ｂ）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および
（ｃ）２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
を含む反応液と、鋳型となる環状ＤＮＡとの反応混合物を形成する工程を含み、ここで環状ＤＮＡがＤｎａＡ活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ｏｒｉＣ））を含む、複製サイクルを繰り返し、指数的に環状ＤＮＡを増幅する方法。
【請求項２０】
前記第三の酵素群が、トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素、トポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素、およびＲｅｃＱ活性を有する酵素、からなる群より選択される少なくとも２つの酵素を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の酵素群が、ＤｎａＡ活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ））、ＤＮＡヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ＊活性を有する酵素または酵素群、の組み合わせを含み、
前記第二の酵素群が、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素およびＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記環状ＤＮＡのサイズが８ｋｂ以上である、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記反応液が、さらにｔＲＮＡを含む、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記反応液が、さらにグルタミン酸カリウムを含む、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記反応混合物を等温条件下で保温する工程を含む、請求項１９〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記保温する工程を１．５時間以上行う、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応混合物を形成する工程において、鋳型となる環状ＤＮＡが１分子〜１５ｐＭの範囲で存在する、請求項１９〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
環状ＤＮＡの増幅用キットであって、以下：
（ａ）環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
（ｂ）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および
（ｃ）２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群であって、トポイソメラーゼＩＩＩ活性を有する酵素、トポイソメラーゼＩＶ活性を有する酵素、およびＲｅｃＱ活性を有する酵素からなる群より選択される少なくとも２つの酵素を含む酵素群；
を含む、前記キット。
【請求項２９】
前記第一の酵素群が、ＤｎａＡ活性を有する酵素、１種以上の核様体タンパク質、ＤＮＡジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ））、ＤＮＡヘリカーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡヘリカーゼローダー活性を有する酵素、ＤＮＡプライマーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡクランプ活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ＊活性を有する酵素または酵素群、の組み合わせを含み、
前記第二の酵素群が、ＤＮＡポリメラーゼＩ活性を有する酵素およびＤＮＡリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせを含む、
請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
さらにｔＲＮＡを含む、請求項２８または２９に記載のキット。
【請求項３１】
さらにグルタミン酸カリウムを含む、請求項２８〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
複製サイクルを繰り返し、指数的に環状ＤＮＡを増幅するためのキットであって、以下：
（ａ）環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
（ｂ）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および
（ｃ）２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
を含む、前記キット。
【請求項３３】
環状ＤＮＡの増幅用キットであって、以下：
（ａ）環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；
（ｂ）岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および
（ｃ）２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群；
ならびに、追加の構成品を含む、
ここで当該追加の構成品は、当該第一、第二および第三の酵素群を含む反応液と鋳型となる環状ＤＮＡとの反応混合物において複製サイクルを繰り返すことで環状ＤＮＡを指数的に増幅する方法を記載した構成品である、
前記キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
環状ＤＮＡの増幅用組成物にも関する。本発明の組成物は、本発明の効果を妨げない限り、安定剤、還元剤、反応バッファー等の追加の成分を含んでいてよい。
［００５５］
また、本発明は、環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群を含む、環状ＤＮＡの増幅用キットにも関する。本発明のキットは、上記酵素の混合物を１つに包装したものを含むものであってもよいが、上記酵素を個別に、あるいは数種類ずつまとめて混合したものを別個に包装したものを含むものであってよい。
［００５６］
また、本発明は、環状ＤＮＡの複製を触媒する第一の酵素群；岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する２つの姉妹環状ＤＮＡを合成する第二の酵素群；および２つの姉妹環状ＤＮＡの分離反応を触媒する第三の酵素群に属する各酵素の無細胞タンパク質発現系を含む、環状ＤＮＡの増幅用キットにも関する。
［００５７］
本発明のキットは、目的に応じて、反応バッファーの濃縮物あるいは反応バッファー等の追加の構成品を含むものであってよい。
実施例
［００５８］
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の範囲に限定されるものではない。
［００５９］
実施例１：環状ＤＮＡの増幅
＜材料と方法＞
表２に示す組成の反応液に鋳型ＤＮＡを添加して氷上で混合した後、３０℃のインキュベータで１時間、２時間、または３時間保温した。１反応あたりの総容量は１０マイクロリットルとなるようにした。３０℃における反応後、反応産物をアガロースゲル電気泳動（０．５％  １×ＴＡＥ、１５０Ｖ、１００分間、１４℃）したのち、ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ（タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡを検出した。
【国際調査報告】
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