(57)【要約】本発明のエキソソームの分析方法は、（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板にエキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、（ｂ）前記エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子と、前記エキソソームとを接触させて、基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させる工程と、（ｃ）基板上の前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程と、を有することを特徴とする。
2015029979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板にエキソソーム含有試料を接触させて、前記化合物に前記エキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子と、前記エキソソームとを接触させて、前記基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させる工程と、
（ｃ）前記基板上の前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程と、を有することを特徴とするエキソソームの分析方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）は、前記化合物にエキソソームを特異的に結合させる請求項１に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項３】
前記疎水性鎖は、脂質を含む請求項１又は２に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項４】
前記化合物は、脂質−ＰＥＧ誘導体を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項５】
前記化合物は、前記エキソソームに結合するオレイル基を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項６】
前記基板は、非特異的吸着抑制部を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項７】
前記第１の分子は、種類の異なる抗体、アプタマー、又はこれらの組み合わせからなる請求項１〜６のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）は、蛍光標識した前記第１の分子−エキソソーム複合体の蛍光を検出する工程である請求項１〜７のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項９】
基板上のエキソソームを洗浄する工程を有する請求項１〜８のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１０】
前記基板として、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する試験部と、前記インレットと前記試験部を繋ぐ流路と、を備えた基板を用いる請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１１】
前記基板として、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する複数の試験部と、前記インレットと前記試験部を繋ぐ、バルブを有する流路と、を備えた基板を用いる請求項１〜１０のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）は、各試験部上のエキソソームに、種類の異なる抗体又はアプタマーを接触させて、抗体又はアプタマー−エキソソーム複合体を形成させる工程である請求項１１に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１３】
前記複数の試験部は、互いに密度の異なる疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する請求項１１又は１２に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）は、各試験部上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層に、濃度の異なるエキソソーム含有試料を接触させて、前記試験部にエキソソームを固定する工程である請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）は、前記エキソソーム含有試料を一定の流速で導入し、前記基板上の化合物と反応させる工程である、請求項１に記載のエキソソームの分析方法。
【請求項１６】
インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する試験部と、前記インレットと前記試験部を繋ぐ流路と、を備えたことを特徴とするエキソソーム分析チップ。
【請求項１７】
インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する複数の試験部と、前記インレットと前記試験部を繋ぐ、バルブを有する流路と、を備えた請求項１６に記載のエキソソーム分析チップ。
【請求項１８】
前記複数の試験部は、互いに密度の異なる疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する請求項１７に記載のエキソソーム分析チップ。
【請求項１９】
エキソソーム含有試料を導入するインレットと、
疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾されたエキソソーム結合部を有する試験部と、
アウトレットと、
前記インレットと前記試験部とを繋ぐ第一の流路と、
前記試験部と前記アウトレットとを繋ぐ第二の流路と、
を備えることを特徴とするエキソソーム分析チップ。
【請求項２０】
１又は２以上のインレットが前記試験部に繋がれており、
前記インレットは、エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子を含む試料と、
前記第１の分子に相互作用する、標識された第２の分子を含む試料と、
を前記エキソソーム結合部に導入することを特徴とする、請求項１９に記載のエキソソーム分析チップ。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のエキソソーム分析チップの前記試験部に吸着した前記エキソソームを検出する検出部を有することを特徴とするエキソソーム分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキソソームの分析方法、エキソソーム分析チップ、及びエキソソーム分析装置に関する。
本願は、２０１３年８月３０日に、日本に出願された特願２０１３−１８０５７５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームは、直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。【０００３】
がん細胞等の異常細胞は、細胞膜に特有のタンパク質を発現している場合がある。そして、エキソソームの膜表面は、分泌源の細胞由来のタンパク質を発現しているため、体液中のエキソソームの膜表面に存在するタンパク質を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。
なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。【０００４】
このような期待に対して、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を利用してエキソソームを分析する方法が提案されている（特許文献１参照。）。ＥＬＩＳＡの具体的手法としては、サンドイッチ法と直接吸着法が挙げられる。【０００５】
サンドイッチ法は、エキソソームの膜表面に発現しているタンパク質（以下、第１のタンパク質という。）に対する抗体（以下、第１の抗体という。）を固相化させた後、エキソソームを含有する試料を接触させて複合体を形成させ、そこに、エキソソームの膜表面に発現している別のタンパク質（以下、第２のタンパク質という。）に対する抗体（以下、第２の抗体という。）に修飾を加えた標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させて標識を検出することにより、試料に含まれるエキソソームに由来するシグナル量を測定する方法である。 【０００６】
また、直接吸着法は、上記第１の抗体を固相化させず、エキソソームを含有する試料を固相に接触させて、固相上にエキソソームを直接吸着させ、そこに上記第２の抗体に修飾を加えた標識抗体を添加して、複合体を形成させて標識を検出することにより、試料に含まれるエキソソームに由来するシグナル量を測定する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１１−５１０３０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、サンドイッチ法では、第１のタンパク質の発現量が低い場合にはエキソソームを固相上に捕捉できず、抗体が認識するエキソソーム膜表面のタンパク質の発現量によって、エキソソーム吸着量が制限されてしまう。
また、直接吸着法では、試料中に夾雑タンパク質が多い場合には、固相に非特異的に吸着するタンパク質量が増加し、エキソソーム吸着量が制限されてしまう。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高感度にエキソソームを分析できる、エキソソームの分析方法、エキソソーム分析チップ、及びエキソソーム分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板を用いてエキソソームを固定することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（３）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様におけるエキソソームの分析方法は、
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板にエキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子と、前記エキソソームとを接触させて、基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させる工程と、
（ｃ）基板上の前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程と、を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるエキソソーム分析チップは、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する試験部と、前記インレットと前記試験部を繋ぐ流路と、を備えたことを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるエキソソーム分析装置は、先に記載のエキソソーム分析チップと、分析結果を検出する検出部を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、エキソソーム吸着量が制限されず、試料中の微量のエキソソームを固定でき、高感度、高精度にエキソソームを検出し、分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの工程（ｃ）の一態様の模式図である。
【図１Ｂ】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの工程（ｃ）の一態様の模式図である。
【図２】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの一態様の模式図である。
【図３】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの一態様の模式図である。
【図４】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの一態様の模式図である。
【図５】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの一態様の模式図である。
【図６】本実施形態におけるエキソソーム分析チップの一態様の模式図である。
【図７】本実施形態におけるエキソソーム分析装置の一態様の模式図である。
【図８Ａ】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの蛍光観察結果である。
【図８Ｂ】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの蛍光観察結果である。
【図９】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの定量結果である。
【図１０】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの定量結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪エキソソームの分析方法≫
本実施形態のエキソソームの分析方法は、
（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板にエキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
（ｂ）前記エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子と、前記エキソソームとを接触させて、基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させる工程と、
（ｃ）基板上の前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程と、を有する。
【００１４】
エキソソームは、細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来の生体分子、例えばタンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質などを発現している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質などを発現している。
そのため、エキソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エキソソームの表面とは、細胞から分泌される膜小胞の膜表面であって、分泌されたエキソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
更に、エキソソームは、生体内で循環している血液、尿、唾液などの体液中で検出されるため、エキソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
以下、各工程について説明する。
【００１５】
工程（ａ）は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板にエキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程である。
疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。係る化合物を用いることにより、基板上に脂質二重膜を有するエキソソームを固定することができる。
尚、本明細書において、「基板上にエキソソームを固定する」とは、基板にエキソソームを吸着させることも含む。
【００１６】
疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。
飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数６〜２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる
中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
【００１７】
親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、ＰＥＧが好ましい。
係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）を有することが特に好ましい。
【００１８】
即ち、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、脂質−ＰＥＧ誘導体が好ましい。
脂質−ＰＥＧ誘導体は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる。ＢＡＭとしては、例えば下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１９】
【化１】
2015029979.tif 000003
【００２０】
［式中、ｎは１以上の整数である。］
工程（ａ）において用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００２１】
エキソソーム含有試料としては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られる試料であって、該細胞が分泌したエキソソームを含有する試料であれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等の試料が挙げられる。中でも、エキソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エキソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。
また、係る試料には、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
エキソソーム含有試料は、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよい。また本実施形態においては、調製を加えていない試料そのものであってもよい。
【００２２】
検出対象の細胞としては、エキソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
【００２３】
工程（ａ）は、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを特異的に結合させる工程であることが好ましい。基板にエキソソームを特異的に結合させる方法としては、例えば、基板に非特異的吸着抑制部を設ける方法が挙げられる。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理する方法が挙げられる。
【００２４】
工程（ｂ）は、前記エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する第１の分子と、前記エキソソームとを接触させて、基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させる工程である。
【００２５】
工程（ｂ）において、接触とは、例えば、エキソソームの表面に存在する生体分子と該生体分子と特異的に結合する第１の分子とが相互作用することを含む。相互作用の一例として、例えば抗原−抗体反応といった結合反応が挙げられる。
エキソソームを分泌する異常細胞は、その細胞表面に、生体分子として特有のタンパク質を発現しているか、又は、該異常細胞において、特有のタンパク質の発現が欠損している。従って、正常細胞と比較して、発現パターンの異なるタンパク質を抗原とする抗体を第１の分子として用いることで、細胞の異常を検出できる。
係る観点から、用いられる抗体は、異常細胞又は正常細胞に高発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることが好ましく、異常細胞特異的又は正常細胞特異的に発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることがより好ましい。
また、第１の分子としては、抗体に限られず、アプタマーも好適に用いられる。アプタマーの一例として、核酸アプタマーやペプチドアプタマーが挙げられる。
【００２６】
例えば、正常の乳腺上皮細胞株において、ＣＤ１０、ＣＤ５／６、ＣＡＶ１、ＭＯＥＳＩＮ、ＥＴＳ１等のタンパク質が高発現している一方、乳がん細胞株においては、これらのタンパク質の発現が低下している旨の報告がなされている（Ｃｈａｒａｆｅ−Ｊａｕｆｆｒｅｔ Ｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００６） ｖｏｌ．２５，ｐｐ２２７３−２２８４．）。乳腺上皮細胞の異常を検出する場合、例えばこれらの抗体を用いる。
抗体がエキソソームとの複合体を形成しやすいという観点からは、レセプター等の膜タンパク質を抗原としたものであることがより好ましい。
従って、乳腺上皮細胞の異常を検出する場合、ＣＤ１０、ＣＤ５／６、ＣＤ４４等の膜タンパク質を抗原とする抗体を用いることが好ましい。
【００２７】
また、第１の分子は、種類の異なる抗体、アプタマー、又はこれらの組み合わせからなるものであってもよく、これらは、同一の生体分子の異なるエピトープを認識するものであってもよい。係る第１の分子を用いることにより、特定の生体分子を有するエキソソームの認識精度を高めることができる。
また、種類の異なる抗体、アプタマー、又はこれらの組み合わせは、異なる生体分子を認識するものであってもよい。例えば、乳がん細胞又は乳腺上皮正常細胞に高発現が認められる複数種類のタンパク質を抗原とする複数種類の抗体を用いることによって、乳腺上皮細胞の異常を検出する際の精度を高めることができる。
【００２８】
用いる抗体又はアプタマーは、がんに関連するものに限定されず、肥満、糖尿病、神経変性疾患等に関連するものでもよい。これらを用いることにより、対象細胞における疾患に関連する異常を検出することができる。
【００２９】
工程（ｃ）は、基板上の前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程である。
工程（ｃ）は、一例として標識された前記第１の分子−エキソソーム複合体を検出する工程である。一例として、標識された前記第１の分子に特異的に相互作用する分子を、前記第１の分子−エキソソーム複合体に反応させる。標識の方法としては、例えば蛍光標識や酵素標識が挙げられる。このように、標識された前記第１の分子−エキソソーム複合体を選択的に検出することが可能である。
工程（ｃ）は、例えば蛍光標識した前記第１の分子−エキソソーム複合体の蛍光を検出する工程である。一例として、第１の分子として抗体を用いる場合、前記工程（ｂ）で用いた抗体に対する二次抗体を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識したもの、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識したものを用いることが好ましい（図１Ａ参照）。
量子ドットとしては、ＣｄＳｅやＣｄＴｅが挙げられる。これらの量子ドットは、従来の有機系色素や蛍光タンパク質と比べて明るく光退色しにくい点で優れている。
また、ＥＬＩＳＡによる検出方法を利用してもよい。一例としては、酵素標識された二次抗体を一次抗体に作用させ、発色性の基質を加え、酵素反応生成物の発色を検出する方法が挙げられる（図１Ｂ参照）。この場合においても、上記蛍光標識の場合と同様に、後述のエキソソーム分析装置によってエキソソームの検出が可能である。
【００３０】
血液中には、エキソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞も基板に固定される可能性がある。基板からこれらの細胞外小胞を除去する観点から、基板上のエキソソームを洗浄する工程を有することが好ましい。係る洗浄工程は、基板上にエキソソームを固定した工程（ａ）の後、該エキソソームに第１の分子を接触させて、基板上に第１の分子−エキソソーム複合体を形成させた工程（ｂ）の後、及び、第１の分子−エキソソーム複合体を蛍光標識した工程（ｃ）の後に設けられることが好ましい。
洗浄工程においては、本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板とエキソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。また、洗浄工程における流速としては、例えば１０ｍｍ／ｓ以下であり、一例として５ｍｍ／ｓ以下である。
以下、本実施形態のエキソソームの分析方法について、本実施形態のエキソソーム分析チップを用いて詳細に説明する。
【００３１】
≪エキソソーム分析チップ≫
［第１実施形態］
図２は、本実施形態のエキソソーム分析チップ１の基本構成を示す模式図である。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１は、インレット２と、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する試験部３と、前記インレット２と前記試験部３を繋ぐ流路４と、を備えたものである。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１は、更に例えば、アウトレット１０と、前記アウトレット１０と前記試験部３を繋ぐバルブ７を有する流路８と、を備える。アウトレット１０は、廃液を排出する機能を有する。また、アウトレット１０は、吸引送液を行う場合には、吸引ポンプ等とのコネクタとしての機能も有し、インレットからの押し込み送液を行う場合又は駆動力がエキソソーム分析チップ内に存在する場合には、ベントフィルター等の空気抜きとしての機能も有する。バルブ７は洗浄工程等に応じて適宜開閉される。
また、本実施形態のエキソソーム分析チップ１は、試験部の後に廃液槽を有していてもよい。また、本実施形態のエキソソーム分析チップ１は、アウトレットと廃液槽と両方を備えていてもよく、例えば廃液槽の後にアウトレットを備える。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１を用いたエキソソームの分析方法として、例えば以下の方法が挙げられる。
先ず、血液検体から調製したエキソソーム含有試料をインレット２に注入する。インレット２に注入された血液検体から調製したエキソソーム含有試料は、流路４を通り、試験部３に到達する。試験部３は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有しているため、この層上の疎水性鎖が、脂質二重膜を有するエキソソームを捕捉する。
尚、以下の実施形態において、血液検体から調製したエキソソーム含有試料に替えて、血液検体を直接インレット２に注入してもよい。
次いで、インレット２に、第１の分子として抗体を注入する。該抗体は、流路４を通り、試験部３に到達する。試験部３に固定されたエキソソームの表面に、注入された抗体が認識する生体分子としてのタンパク質が存在する場合には、試験部３上で、抗体−エキソソーム複合体が形成される。
次いで、インレット２に蛍光標識した二次抗体を注入する。試験部３上に、抗体−エキソソーム複合体が形成されている場合には、注入された二次抗体がこの複合体に結合し、さらなる複合体が形成される。この場合、試験部３は、二次抗体に標識された蛍光により、蛍光を発する。
本実施形態によれば、エキソソーム含有試料がその表面に所定の生体分子を発現しているかどうかを分析することができる。上述したように、エキソソームの膜表面は、分泌源の細胞由来のタンパク質を発現しているため、エキソソームの分析を介して、分泌源の細胞の異常を検出することができる。
また、基板上に修飾された疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物と、エキソソームとの親和性が高いため、インレット２に注入した試料中のエキソソームは、試験部３に即座に固定される。従って、本実施形態によれば、吸着時間が短く、短時間でエキソソームを分析できる。
【００３２】
［第２実施形態］
図３は、本実施形態のエキソソーム分析チップ１１の基本構成を示す模式図である。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１１は、インレット２と、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有する複数の試験部３ａ，３ｂ，３ｃと、前記インレット２と前記試験部３ａ，３ｂ，３ｃを繋ぐバルブ５ａ，５ｂ，５ｃを有する流路４ａ，４ｂ，４ｃと、を備えたものである。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１１は、更に、例えば、アウトレット１０ａ，１０ｂ，１０ｃと、前記アウトレット１０ａ，１０ｂ，１０ｃと前記試験部３ａ，３ｂ，３ｃを繋ぐバルブ７ａ，７ｂ，７ｃを有する流路８ａ，８ｂ，８ｃと、を備える。
前記試験部３ａ，３ｂ，３ｃは、例えばインレット１２ａ，１２ｂ，１２ｃと、バルブ６ａ，６ｂ，６ｃを有する流路１３ａ，１３ｂ，１３ｃを介して繋がれている。
また、本実施形態のエキソソーム分析チップ１１は、試験部の後に廃液槽を有していてもよい。また、本実施形態のエキソソーム分析チップ１１は、アウトレットと廃液槽と両方を備えていてもよく、例えば廃液槽の後にアウトレットを備える。
本実施形態のエキソソーム分析チップ１１を用いたエキソソームの分析方法としては、工程（ｂ）において、各試験部上のエキソソームに、種類の異なる抗体又はアプタマーを接触させて、抗体又はアプタマー−エキソソーム複合体を形成させる方法が挙げられる。
例えば以下の方法が挙げられる。
先ず、血液検体から調製したエキソソーム含有試料をインレット２に注入する。このとき、バルブ５ａ，５ｂ，５ｃは開状態であり、バルブ６ａ，６ｂ，６ｃは閉状態である。
インレット２に注入された血液検体から調製したエキソソーム含有試料は、流路４ａ，４ｂ，４ｃを通り、試験部３ａ，３ｂ，３ｃに到達する。試験部３ａ，３ｂ，３ｃの疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層にエキソソームが捕捉される。
次いで、バルブ５ａ，５ｂ，５ｃを閉状態にし、バルブ６ａを開状態にし、インレット１２ａに、第１の分子として抗ＣＤ９抗体を注入する。抗ＣＤ９抗体は、流路１３ａを通り、試験部３ａに到達する。試験部３に固定されたエキソソームの表面に、ＣＤ９が存在する場合には、試験部３ａ上で、抗ＣＤ９抗体−エキソソーム複合体が形成される。
次いで、バルブ６ｂを開状態にし、インレット１２ｂに、第２の分子として抗ＣＤ６３抗体を注入する。試験部３ｂに固定されたエキソソームの表面に、ＣＤ６３が存在する場合には、試験部３ｂ上で、抗ＣＤ６３抗体−エキソソーム複合体が形成される。
次いで、バルブ６ｃを開状態にし、インレットインレット１２ｃに、第３の分子として抗ＣＤ８１抗体を注入する。試験部３ｃに固定されたエキソソームの表面に、ＣＤ８１が存在する場合には、試験部３ｃ上で、抗ＣＤ８１抗体−エキソソーム複合体が形成される。
次いで、バルブ５ａ，５ｂ，５ｃを開状態にし、バルブ６ａ，６ｂ，６ｃを閉状態にし、インレット２に蛍光標識した二次抗体を注入する。試験部３ａ，３ｂ，３ｃ上に、抗体−エキソソーム複合体が形成されている場合には、注入された二次抗体がこの複合体に結合し、さらなる複合体が形成される。この場合、試験部３ａ，３ｂ，３ｃは、二次抗体に標識された蛍光により、蛍光を発する。
本実施形態によれば、エキソソーム含有試料がその表面に複数の所定の生体分子を発現しているかどうかを一度に分析することができる。
【００３３】
エキソソームの表面に存在する生体分子と特異的に結合する複数の分子を用いることにより、第１の分子を用いることにより特定される検出細胞の性質とは異なる性質を特定できる。例えば、第１の分子としてがん特異的に発現するタンパク質を抗原とするものを用いた場合、第２の分子として臓器特異的に発現するタンパク質を抗原とするものを用いる。これにより、エキソソームの分泌源の細胞ががん細胞であるかどうかを特定できるだけではなく、エキソソームの分泌源の細胞が生体内のどの臓器由来であるかを特定できる。
【００３４】
例えば、臓器特異的に発現しているタンパク質としては、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ等の前立腺がんマーカー；ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＨＥＲ２等の乳がんマーカー等が挙げられる。これを抗原とする抗体を第２の分子として用いることにより、検出対象のがん細胞の癌腫を特定できる。
【００３５】
また、図４に示すように、第１の分子として、一種類の抗体（例えば、抗ＣＤ９抗体）を用い、各試験部における疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の密度（例えば、ＢＡＭ密度）を互いに異なるものとしてもよい。これにより、試験部に捕捉されるエキソソームの量が飽和することなく、最適な条件下でエキソソーム含有試料中の所定のタンパク質の発現を分析することができる。
【００３６】
更に、図５に示すように、複数種類の分子（例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗タンパク質Ｘ（任意のタンパク質）抗体）を用い、各試験部における疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の密度（例えば、ＢＡＭ密度）を異なるものとしてもよい。これにより、試験部に捕捉されるエキソソームの量が飽和することなく、最適な条件下でエキソソーム含有試料中の複数の所定の生体分子の発現を一度に分析することができる。
【００３７】
また、図６に示すように、工程（ａ）において、各試験部上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層に、濃度の異なるエキソソーム含有試料を接触させて、前記試験部にエキソソームを固定してもよい。これにより、試験部に捕捉されるエキソソームの量が飽和することなく、最適な条件下でエキソソーム含有試料中の所定のタンパク質の発現を分析することができる。
【００３８】
≪エキソソーム分析装置≫
本実施形態のエキソソーム分析装置は、上述したエキソソーム分析チップの前記試験部に吸着した前記エキソソームを検出する検出部を有する。
図７を参照して、本実施形態のエキソソーム分析装置の一実施形態について説明する。
図７に示すように、本実施形態のエキソソーム分析装置２１は、分析結果を検出する検出部を備えている。エキソソーム分析装置２１は、例えば光源（図示略）と、エキソソーム分析チップ２２と、検出部２３と、パソコンなどの制御部２４とを有する。
光源としては、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
エキソソーム分析チップ２２の試験部に固定されたエキソソームの分析結果が、検出部２３を介して検出される。
【００３９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
［ＢＡＭ基板上へのエキソソームの固定］
ガラス基板を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下、ＡＰＴＥＳともいう。）で修飾し、ＡＰＴＥＳのアミノ基と、前記式（１）で表されるＢＡＭのＮＨＳ基を反応させ、脂質二重膜を選択的に固定するオレイル基で基板を修飾した。更に、非特異吸着を抑制するために、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＯＣＨ３を反応させた。その後、マスクを通して真空紫外光を照射し、修飾層をパターニングしてＢＡＭ基板を得た。
超遠心分離によりヒト血清からエキソソームを回収した。このエキソソームを用いて、様々な濃度（２．０×１０７粒子／ｍＬ、２．０×１０８粒子／ｍＬ、２．０×１０９粒子／ｍＬ、２．０×１０１０粒子／ｍＬ）のエキソソーム含有溶液を調製し、ＢＡＭ基板と３０ｍｉｎ，ＲＴで反応させた。
次いで、スキムミルク溶液（１％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）を用いて１ｈｒ，ＲＴでブロッキングを行った。
次いで、抗ヒトＣＤ９抗体（マウス；２μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ）を用いて３０ｍｉｎ，ＲＴで反応させた後、量子ドット修飾抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、蛍光観察した。観察結果を図８に示す。【００４１】
図８Ａに示すように、パターニングされたＢＡＭ基板上に高い輝度が観察された。
これは、ＢＡＭ基板上にエキソソームが固定化され、抗体を介して量子ドットが特異的に結合した結果であると考えられる。
一方、図８Ｂに示すように、エキソソームを含有しない溶液を用いたネガティブコントロールでは、高い輝度は観察されなかった。これは、エキソソームが固定されていないＢＡＭ基板上に抗体が非特異的に吸着していないことを示す。
また、図９に示すように、用いる溶液中のエキソソーム濃度が高くなるほど、蛍光強度が高くなり、徐々に飽和することが観察された。この結果は、固定化されたエキソソームの絶対量と蛍光強度の相関関係を利用した検量線を予め用意することにより、蛍光強度からエキソソーム固定量を定量できることを示唆している。【００４２】
［固定化されたエキソソーム数密度と基板上の導入部からの距離の関係］
デバイス中に基板を固定し、試料１ｍＬを流速１６．２ｍＬ／ｍｉｎで導入した。液中ＡＦＭ法により基板表面の直径３０−２００ｎｍの粒子をカウントし、エキソソーム数密度を計測した。試料として、ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞培養上清から分画超遠心法によって回収したエキソソームを生理食塩水に懸濁して得られた精製済みエキソソーム懸濁液と、ヒト血清をそれぞれ用いた。固定化されたエキソソーム数密度と基板上の導入部からの距離の関係を表す結果を図１０に示す。図１０に示すように、ヒト血清と培養上清由来の精製液では、同程度のエキソソームが固定できることを確認した。【００４３】
以上の結果から、本実施形態によれば、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板を用いることにより、試料中の微量のエキソソームを固定でき、高感度にエキソソームを分析できる。
【符号の説明】
【００４４】
１，１１，２２…エキソソーム分析チップ、２，１２ａ，１２ｂ，１２ｃ…インレット、３，３ａ，３ｂ，３ｃ…試験部、４，４ａ，４ｂ，４ｃ，８ａ，８ｂ，８ｃ，１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…流路、５ａ，５ｂ，５ｃ，７，７ａ，７ｂ，７ｃ…バルブ、１０，１０ａ，１０ｂ，１０ｃ…アウトレット、２１…エキソソーム分析装置、２３…検出部、２４…制御部。
【図１Ａ】
2015029979.tif 000004
【図１Ｂ】
2015029979.tif 000005
【図２】
2015029979.tif 000006
【図３】
2015029979.tif 000007
【図４】
2015029979.tif 000008
【図５】
2015029979.tif 000009
【図６】
2015029979.tif 000010
【図７】
2015029979.tif 000011
【図９】
2015029979.tif 000012
【図８Ａ】
2015029979.tif 000013
【図８Ｂ】
2015029979.tif 000014
【図１０】
2015029979.tif 000015
【国際調査報告】
2015029979.tif 000016
2015029979.tif 000017
2015029979.tif 000018
2015029979.tif 000019