(57)【要約】  ヒト検体からの簡易な核酸抽出方法を確立するとともに、迅速性、簡便性に優れる等温遺伝子増幅法であるLAMP法に、これまでとは異なる測定の概念を付与することによって、測定機器による検出までの工程を含む検査方法を確立する。鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域、F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域に基づいて設計された4種類のプライマー、FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマーを用いるLAMP法において：鋳型ポリヌクレオチドが標的部位を含み、4種類のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されており；F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー、および標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用い、このときループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計されており、ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されていることを特徴とする、標的部位の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域、F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域に基づいて設計された4種類のプライマー、FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマーを用いるLAMP法において：
鋳型ポリヌクレオチドが標的部位を含み、4種類のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されており；
F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー、および標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用い、このとき
ループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計されており、
ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されていることを特徴とする、標的部位の検出方法。
【請求項２】
標的部位が、会合したループプライマーの5'末端から3〜20塩基上流に位置するように設計されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的部位が、1塩基多型(SNP; single nucleotide polymorphism)である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
SNPが、rs8099917、rs12978960、rs11881222、rs8103142、rs1127354、rs7270101、rs1229984、rs671、rs1800592、rs1042713、rs4994、rs1057910、rs9934438およびrs9923231からなる群より選択されるいずれかである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
系の温度を、プローブの会合または解離が生じる温度帯で変化させ、その際に生じる蛍光の変化をモニターする工程を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
等温反応後、系の温度を上げ、次いで温度を下げながらその際に生じる蛍光の変化をモニターする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
蛍光の変化率を一次微分により算出する工程を含む、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
蛍光の変化率を一次微分による算出値を、さらに微分する工程を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
プローブの3'末端付近が蛍光分子で修飾されており、ループプライマーの5'末端付近が消光分子で修飾されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
生体由来の検体をタンパク質分解酵素で処理した試料に含まれるDNAを、鋳型ポリヌクレオチドとして用いる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
試料が、さらにタンパク質分解酵素の失活処理を施されたものである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
検体が、毛髪、血液、口腔粘膜、爪、血痕および臍帯からなる群より選択されるいずれかである、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
増幅反応に用いるDNA合成酵素が、Geobacillus属菌由来のDNA Polymerase I、または85℃以上の発酵によって得られた堆肥中より単離されたCsa DNA Polymeraseまたは96-7 DNA Polymeraseである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法を実施するためのキットであって：
鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域（F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域）に基づいて設計された4種類のプライマー（FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマー）；
F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー；および
標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、このとき、
4種のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されており；
ループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計されており；そして
ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、
キット。
【請求項１５】
rs8099917を検出するためのものであり、C型肝炎治療におけるペグインターフェロンおよびリバビリンの併用療法の効果を予測するために用いられる、請求項14に記載のキット。
【請求項１６】
遺伝子増幅反応のための、検体の処理方法であって、タンパク質分解酵素で検体を処理する工程を含む、方法。
【請求項１７】
遺伝子増幅反応が、PCR法、SDA法、TMA法、NASBA法、TRC法、ICAN法、SmartAmp法、RCA法である請求項16に記載の、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子配列の検出に関する。より詳細には、本発明は、例えばヒトや動物の遺伝子多型、特に一塩基多型 (SNP; single nucleotide polymorphism)の検出のためのプライマーとプローブのセット、さらにこれらを用いた検査方法および検査キット、ならびにその測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の新薬開発においては、治療を受ける患者側の遺伝子情報を事前に検査することにより、患者ごとに最適な治療方針を選択する、個別化医療の概念が指示されている。その一部として、新薬の有効性や副作用について患者側の核酸やタンパク質のいわゆる遺伝子の情報を事前に調べるためのコンパニオン診断薬の重要性が示唆されている。即ち、従来は一つの疾患に対し施される治療または医薬品は疾患ごとにある程度決定されていたが、治療効果や副作用には個人差が認められるため、患者ごとに遺伝子のタイプを識別し、患者群ごとに最適な治療および医薬品を選択するのが個別化医療であり、テーラーメード医療とも呼ばれる。【０００３】
ヒトのウイルス性肝炎は、肝炎ウイルス感染と宿主の免疫応答により肝臓を主たる病変とする全身性感染症である。C型肝炎は日本における慢性肝疾患の70%を占め、肝硬変を経て肝癌へ進展する重大な疾患である。
現在、ヒトのC型肝炎治療にはペグインターフェロン、リバビリン、テラプレビルの三剤併用療法が最も有効な治療法として用いられており、インターフェロンは、細胞の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導することでウイルス量の減少を促すとされる。しかしながら、日本の重症C型肝炎患者の約7-8割が難治性であるC型肝炎ウイルス1b型に感染しており、その中でウイルス量が増加した患者の約5割は、ペグインターフェロンとリバビリンの併用療法が効かないことが示されている。この背景を受けて多くの研究が実施され、有効性に関与する遺伝子多型 (SNPs) がヒトのインターロイキン28B (IL28B) 遺伝子の周辺領域に複数存在することが、国内および海外の研究グループから2009年に相次いで報告された (特許文献1、非特許文献1〜4)。【０００４】
例えば、IL28B遺伝子に存在するSNPsのうち、rs8099917のタイプ (TT、TG、GG) がペグインターフェロンとリバビリンの併用療法効果予測に有力な因子の一つとして知られている。rs8099917は日本人のC型肝炎患者の遺伝子情報をGWAS (ゲノムワイド関連解析； Genome-wide association study) により大規模に解析し発見された。TGまたはGGのリスクアリルを有する患者群は、ペグインターフェロンとリバビリンの併用療法が効かないことが分かっている(特許文献2、非特許文献5および6)。【０００５】
したがって、事前にSNPを識別することによって、根治の見込める患者は高い確率で選別できることになる。また、高い効果を見込めないと判定された患者においても、治療期間および治療方針の決定指標とすることが可能となる。さらに、SNPsの判定によっては次世代治療を待つことも望ましいとされ、患者側は無用な出費や副作用の苦痛から免れることが可能となり、このことは治療のための国家負担 (一人あたり200-600万円) の低減にも繋がると考えられる。rs8099917の有用性は日本においても重要視されており、厚生労働省「平成24年B型C型慢性肝炎・肝硬変治療のガイドライン」および日本肝臓学会「C型肝炎治療ガイドライン」で治療開始前の遺伝子検査が推奨されている。ここでは、rs8099917に並んで、rs11881222、rs8103142も併用療法効果予測に加えることが望ましいとされており、また日本人には多くないが、諸外国においてはrs12979860も治療の効果を決定する主要な因子として知られている。【０００６】
併用療法に用いられるリバビリンはプリンヌクレオシドアナログであるが、副作用に溶血性貧血が知られており、ここでもrs1127354、rs7270101など、ペグインターフェロン同様に副作用に関連性のあるSNPsが発見されている（非特許文献7）。【０００７】
これまで、SNPの識別のためには、PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)、Exo-proofreading法、TDI法(template directed dye-terminator incorporation)に加えて、ダイレクトシーケンス法（非特許文献8）による解析が信頼性の高い方法として用いられてきた。また近年では、蛍光をリアルタイムにモニターできるPCR装置の普及に伴い、蛍光発光または消光の特性を有する化合物で標識された核酸からなる（特許文献3）、プライマーとは異なる第三または第四のプローブを遺伝子領域に会合させることで達成される、TaqMan法（非特許文献9）、Quenching Probe法、Hybridization probe法、Molecular beacons法（非特許文献10）、Invader法、Invader-plus法などが研究者の間で用いられている。またプローブを用いない事例としては、二本鎖核酸に結合するインターカレーターを用いた融解曲線解析により標的塩基の識別を行う方法がある。【０００８】
さらには、標的遺伝子の6つの領域（F1、F2、F3、B1、B2、B3）に対して4種類のプライマー（FIP(Forward Inner Primer)、F3プライマー、BIP(Backward Inner Primer)、B3プライマー）を設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることを特徴とする遺伝子増幅法が開発されている（特許文献4および非特許文献11）。この方法は、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法と称されている。さらにこの方法は、増幅産物におけるダンベル構造の5'末端側のLoopの1本鎖部分（F1領域とF2領域の間、およびB1領域とB2領域の間）に相補的な配列を持つLoop Primer（それぞれLoop Primer F、Loop Primer B）を用いることにより、DNA合成の起点を増やし、より迅速な増幅を可能としている（非特許文献12）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2011-41526（特願2009-192615）
【特許文献２】特開2011-193786（特願2010-63622）
【特許文献３】特開平05-211872（特願平3-7777）
【特許文献４】WO2000/028082
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Enomoto N Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C virus 1b. Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region. J. Clin. Invest 96 224 (1995)
【非特許文献２】Akuta N Association of amino acid substitution pattern in core protein of hepatitis C virus genotype 1b high viral load and non-virological response to interferon-ribavirin combination therapy. Intervirology 48 372 (2005)
【非特許文献３】Dongliang Ge et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment -induced viral clearance. Nature 2009 ; 461:399-40
【非特許文献４】Yasuhito Tanaka et al. Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-α and ribavirin therapy for chronic hepatitis C. Nature Genetics 2009;40(Issue 10):1105-1109
【非特許文献５】Hidenori Ochi et al. ITPA Polymorphism Affects Ribavirin-Induced Anemia and Outcomes of Therapy-A Genome-Wide Study of Japanese HCV Virus Patients. Gastroenterology 2010; 139:1190-1197.
【非特許文献６】Fumitaka Suzuki et al. Influence of ITPA Polymorphisms on Decreases of Hemoglobin During Treatment with Pegylated Interferon, Ribavirin, and Telaprevir. Hepatology 2011 ; 53:415-421.
【非特許文献７】Jacques Fellay et al. ITPA gene variants protect against anaemia in patients treated for chronic hepatitis C. Nature 2010 ; 464:405-408.
【非特許文献８】Kwok, P.-Y. 1994. Comparative analysis of human DNA variations by fluorescence-based sequencing of PCR products. Genomics 23: 138-144
【非特許文献９】Livak Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assayGenetic Analysis 14, 143-149 (1999)
【非特許文献１０】Belinda A.J. Giesendorf. Molecular beacons: a new approach forsemiautomated mutation analysisClinical Chemistry, 44, 482-486 (1998)
【非特許文献１１】Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12, e63, 2000
【非特許文献１２】Nagamine K. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes, 16, 3, 223-229, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のSNP識別法においてはPCR-RFLP法が有用であるが、単一のPCR産物を得た上で制限酵素を用いた処理と電気泳動による解析が必要となり、時間を要する上、検査の設計およびハンドリングによる誤判定、また増幅産物による検査環境の汚染が懸念されていた。Exo-proofreading法、TDI法は、いずれも増幅と検出を別々の機器で行う必要があり、十分な効果が得られるものではなかった。プローブを用いず、インターカレーターを用いて融解曲線解析により標的塩基の識別を行う方法は、一塩基の差異を識別するためには高精度な温度の制御が必要となる。マイクロアレイを用いた解析は技術的にも成熟しているが、専用の機器や知識、経験が必要である。【００１２】
そして、前記のいずれの方法を用いる場合も、正確性の高いプライマーやプローブの設計は極めて重要かつ労力を要するものであり、また原則、PCRが必要となる点で、高価な機器や試薬キットを要するなど、必ずしも臨床現場や個人医レベルでの識別をルーチンに実施するために適した方法とは言えなかった。したがって、多くの検査は外部専門機関に委託されるケースが少なくないと考えられ、個人情報の保護、倫理上の手続、またそれらに掛かる時間や費用などの観点で多くの課題を残している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒトの遺伝子情報を利用した個別化医療の実現を推進するとともに、コンパニオン診断薬の開発の一助とすることを主な目的として、SNPの迅速、簡便な検出技術を開発するため、鋭意研究を行った。具体的には、ヒト検体からの簡易な核酸抽出方法を確立するとともに、迅速性、簡便性に優れる等温遺伝子増幅法であるLAMP法に、これまでとは異なる測定の概念を付与することによって、測定機器による検出までの工程を含む検査方法を確立した。本技術は、従来の方法であるダイレクトシーケンス法の結果とも一致し、正確性が示された。【００１４】
具体的には、発明者らは遺伝子増幅産物の末端となる、プライマーまたはインビトロ転写反応産物の5'末端を、増幅領域に会合させることで標的塩基の識別に利用することに着目した。即ち、LAMP法では増幅産物の5'末端のほぼ全てにLoop Primerが導入されており、かつLAMP法増幅産物は特定単位の遺伝子領域を連結しながら複製することに最大の特徴が見出されるため、このLoop Primerと塩基対を構成する相補鎖は必ずしも3'末端に含まれうるものではなく、複雑な高次構造を形成しうると推測し、この増幅領域に配置することができるLoop Primerまたはインビトロ転写反応産物の5'末端に特定のエネルギー転移系を応用することで、増幅反応の速度を低下させることなく、また高い感度と検出効率を実現し、本発明を完成させた。【００１５】
本発明は、以下を提供する。
[１]  鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域、F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域に基づいて設計された4種類のプライマー、FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマーを用いるLAMP法において：
鋳型ポリヌクレオチドが標的部位を含み、4種類のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されており；
F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー、および標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用い、このとき
ループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計されており、
ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されていることを特徴とする、LAMP-FLP法。
[２]  標的部位が、会合したループプライマーの5'末端から3〜20塩基上流に位置するように設計されている、[１]に記載の方法。
[３]  標的部位が、1塩基多型(SNP; single nucleotide polymorphism)である、[１]または[２]に記載の方法。
[４]  SNPが、rs8099917、rs12978960、rs11881222、rs8103142、rs1127354、rs7270101、rs1229984、rs671、rs1800592、rs1042713、rs4994、rs1057910、rs9934438およびrs9923231からなる群より選択されるいずれかである、[3]に記載の方法。
[５]  系の温度を、プローブの会合または解離が生じる温度帯で変化させ、その際に生じる蛍光の変化をモニターする工程を含む、[１]〜[４]のいずれか一に記載の方法。
[６]  等温反応後、系の温度を上げ、次いで温度を下げながらその際に生じる蛍光の変化をモニターする、[５]に記載の方法。
[７]  蛍光の変化率を一次微分により算出する工程を含む、[５]または[６]に記載の方法。
[８]  蛍光の変化率を一次微分による算出値を、さらに微分する工程を含む、[７]に記載の方法。
[９]  プローブの3'末端付近が蛍光分子で修飾されており、ループプライマーの5'末端付近が消光分子で修飾されている、[１]〜[８]のいずれか一に記載の方法。
[１０]  生体由来の検体をタンパク質分解酵素で処理した試料に含まれるDNAを、鋳型ポリヌクレオチドとして用いる、[１]〜[９]のいずれか一に記載の方法。
[１１]  試料が、さらにタンパク質分解酵素の失活処理を施されたものである、[１０]に記載の方法。
[１２]  検体が、毛髪、血液、口腔粘膜、爪、血痕および臍帯からなる群より選択されるいずれかである、[１０]または[１１]に記載の方法。
[１３]  増幅反応に用いるDNA合成酵素が、Geobacillus属菌由来のDNA Polymerase I、または85℃以上の発酵によって得られた堆肥中より単離されたCsa DNA Polymeraseまたは96-7 DNA Polymeraseである、[１]〜[１２]のいずれか一に記載の方法。
[１４]  [１]〜[１３]のいずれか一に記載の方法を実施するためのキットであって：
鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域（F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域）に基づいて設計された4種類のプライマー（FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマー）；
F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー；および
標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、このとき、
4種のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されており；
ループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計されており；そして
ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、
キット。
[１５]  rs8099917を検出するためのものであり、C型肝炎治療におけるペグインターフェロンおよびリバビリンの併用療法の効果を予測するために用いられる、[１４]に記載のキット。
[１６]  遺伝子増幅反応のための、検体の処理方法であって、タンパク質分解酵素で検体を処理する工程を含む、方法。
[１７]  遺伝子増幅反応が、PCR法、SDA法、TMA法、NASBA法、TRC法、ICAN法、SmartAmp法、RCA法である[１６]に記載の、方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、短時間かつ高効率で正確性の高い遺伝子の検査を提供するものであり、汎用性に優れ、個別化医療の実現および医薬品並びにコンパニオン診断薬の開発に寄与するものである。また、臨床現場や個人医レベルでも迅速に検査を行うことが可能となる。さらには、医薬・診断薬の開発分野への利用のみならず、体質の情報を現場で得ることにより、生活習慣病の予防、喫煙や飲酒などの指標にも用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】LAMP-FLP法を良好に実施する際の、プライマー、プローブ、塩濃度等の調整スキームの一例。
【図２】LAMP-QP法による、IL28B rs8099917タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図３−１】LAMP-FLP法による、IL28B rs8099917タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図３−２】LAMP-FLP法による、IL28B rs8099917タイピング。人工的に当該SNPをT（Major）として合成した鋳型DNAを用い、得られた蛍光強度曲線を各温度において一次微分した。
【図４】LAMP-QP法による、IL28B rs12978960タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図５】LAMP-FLP法による、IL28B rs12978960タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図６】LAMP-QP法による、IL28B rs11881222タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図７】LAMP-FLP法による、IL28B rs11881222タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図８】LAMP-QP法による、IL28B rs8103142タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図９】LAMP-FLP法による、IL28B rs8103142タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図１０】LAMP-QP法による、ITPA rs1127354タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図１１】LAMP-FLP法による、ITPA rs1127354タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図１２】LAMP-QP法による、ITPA rs7270101タイピング。左図は、0.2℃/秒で上昇させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図１３】LAMP-FLP法による、ITPA rs7270101タイピング。左図は、0.05℃/秒で下降させた温度に対して蛍光強度をプロットしたものであり、右図は得られた蛍光強度曲線（左図）を各温度において一次微分したもの。
【図１４】Probe性能比較（5'側削除）。
【図１５】Probe性能比較（3'側削除）。
【図１６】プローブが設計可能な領域の検討。
【図１７】ミスマッチの影響。
【図１８】rs8099917タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。縦線で区切られた範囲を鋳型DNAとしてクローニングした。下線は、プライマーに関連した領域を表す。詳細には、実線がF3領域およびB3領域、一点鎖線がF2領域またはB2領域、点線が、F1領域またはB1領域、破線がLFプライマーが会合する領域またはLBプライマー会合する領域を表す。囲みは、プローブが会合する領域を表し、囲み中の小文字は標的SNPを表す（以下の図において同じ）。
【図１９】rs12979860タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２０】rs11881222タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２１】rs8103142タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２２】rs1127354タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２３】rs7270101タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２４】ADH1B (ヒトアルコール脱水素酵素1B) rs1229984タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２５】ALDH2 (ヒトアルデヒド脱水素酵素2) rs671タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２６】UCP1 (ヒト脱共役タンパク質1) rs1800592タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２７】ADRB2 (ヒトアドレナリン受容体beta2) rs1042713タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２８】ADRB3 (ヒトアドレナリン受容体beta3) rs4994タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図２９】CYP2C9*3 (チトクロームp450 2c9*3) rs1057910タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図３０】VKORC1#1 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#1) rs9934438タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【図３１】VKORC1#2 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#2) rs9923231タイピングのために、人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、数値範囲を「m〜n」で表すときは、特に記載した場合を除き、その範囲は両端mおよびnを含む。
【００１９】
[LAMP-FLP法] 
本発明の方法は、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法において、従来の4種類のプライマーに加えて、蛍光分子または消光分子で修飾されたループプライマーとオリゴヌクレオチドプローブとを用いる。本発明の方法を、LAMP-FLP法と称することができる。
【００２０】
LAMP法は、標的遺伝子の配列から6つの領域を選んで組み合わせた4種類のプライマーを用いて、鎖置換反応を利用して増幅させる方法である。LAMP 法プライマーの設計は増幅対象となる領域（本発明では、「鋳型（ヌクレオチド、DNA）」ということもある。）において、5'側から、F3領域、F2領域、F1領域、B1領域、B2領域、B3領域という6つの領域を利用して実施される。これらの6つの領域に相補的な領域は、それぞれF3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域と表される。基本的なLAMP法では4種類のプライマー、より詳細にはInner primer 2種類、すなわちFIPおよびBIP、並びにOuter primer 2種類、すなわちF3プライマーおよびB3プライマー）のプライマーを用いる。Inner primer は、F1c（F1領域に相補的な領域）領域とF2領域、B1c（B1領域に相補的な領域）領域とB2領域を連結して構成される。一般にLAMP法は、PCR法と比較して、1本鎖から2本鎖への変性反応が必要なく、60〜65℃の定温で反応が進行するという特徴があり、サーマルサイクラーのような機器を必要としない。また、増幅速度が速く、特異性も高い。
【００２１】
本発明でF3領域、F2領域、F1領域、B1領域、B2領域、B3領域、FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマーというときは、特に記載した場合を除き、一般的なLAMP法におけるそれらと同じ意味で用いている（下記参照）。
【００２２】
【表１】
2014157377.tif 000002
【００２３】
本発明の方法（LAMP-FLP法ということもある。）においては、鋳型ポリヌクレオチドが標的部位を含み、4種類のプライマーが、標的部位がF1領域とF2領域との間またはB1領域とB2領域との間に存在するように設計されている。本発明で「標的部位」というときは、特に記載した場合を除き、鋳型ヌクレオチド上に存在し、本発明の方法により、検出の対象とする部位である。標的部位の例は、1塩基多型(SNP; single nucleotide polymorphism)、1または数個の塩基の欠失、置換、付加または削除である。本発明においては、本発明のLAMP-FLP法を、標的部位がSNPを含み、SNPを検出するために実施する場合を例に説明することがあるが、その説明は、当業者であれば適宜、SNP以外の配列を検出するために当てはめて理解することができる。
【００２４】
本発明のLAMP-FLP法においては、少なくとも一つのループプライマーを用いる。ループプライマーを用いるLAMP法は、当業者にはよく知られている。ループプライマーは通常、LAMP法の増幅産物のダンベル構造の5'末端側のループの1本鎖部分（B1領域とB2領域の間、またはF1領域とF2領域の間）に相補的な配列を持つものとして設計される。それぞれループプライマーB（LB）、ループプライマーF（LF）と称される（上記参照）。ループプライマーを用いることにより、DNA合成の起点を増やすことができる。LAMP法の典型的な6個のループを持つような増幅産物においては、4つのプライマーを用いるオリジナルの方法では4個のループが利用されないが、ループプライマーを利用することにより、すべてのループが利用可能となる。本発明でループプライマーというときは、特に記載した場合を除き、一般的なループプライマーを用いるLAMP法におけるそれと同じ意味で用いている。
【００２５】
本発明において少なくとも一つ存在するループプライマーは、F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマーである。なお、本明細書においては、標的部位がB1領域とB2領域との間の領域に存在する場合を例に説明することがあるが、その説明は、当業者であれば、F1領域とF2領域との間の領域に標的部位が存在する場合に読み替えて理解することは容易である。本発明においては、ループプライマーは、2つ以上存在してもよい。
【００２６】
本発明においてはまた、標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いる。プローブは、典型的には、標的部位を含む領域の、メジャーアリルまたはマイナーアリルに基づいて設計される。そのため本発明のLAMP-FLP法においては、プローブとその会合領域のフルマッチ、ミスマッチによるTm値の差が、後述するように蛍光強度の変化の差として表れる。
【００２７】
本発明のLAMP法においては、上述の少なくとも一つ存在するループプライマーとプローブとは、ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが近接して鋳型ポリヌクレオチドに会合するように設計される。ループプライマーの5'末端とプローブの3'末端とが「近接して」鋳型ポリヌクレオチドに会合するとは、それぞれの末端が会合する塩基が連続している（ギャップ0）かまたは数塩基のギャップが存在することをいう。ギャップは、好ましくは0〜5塩基であり、より好ましくは0〜3塩基であり、さらに好ましくは0〜1塩基である。
【００２８】
ループプライマーおよびプローブはまた、標的部位との関係では、会合したループプライマーの5'末端から3〜20塩基上流に、好ましくは5〜15塩基上流に、標的部位が位置するように設計される。またプローブは、ループプライマーがいずれの場合であっても、ほぼ中央で、具体的意味は中央から上下5塩基ずつの領域で、標的部位と会合するように設計することが好ましい。B1領域とB2領域の間、またはF1領域とF2領域の間に、プローブとループプライマーが全部含まれる（FIPまたはBIPが会合する領域とプローブが会合する領域がとが重複しない）ような設計とする場合、プローブとループプライマーは、典型的には共に20塩基前後であることから、B1領域とB2領域の間（B1自体およびB2自体は含まない。）またはF1領域とF2領域の間（F1自体およびF2自体は含まない。）は、多くのケースにおいて、概ね40〜50塩基程度である。
【００２９】
本発明のLAMP-FLP法においては、ループプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近またはのいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている。そのため、ループプライマーに近接してプローブが会合する際には、FRET（fluorescence resonance energy transfer、蛍光共鳴エネルギー移動）が生じ、蛍光強度が変化する。本発明のLAMP-FLP法においては、従来のLAMP法で通常用いるループプライマーの5'末端を蛍光分子または消光分子で修飾して用いるが、LAMP法において、ループプライマーが必ず増幅産物の末端に配置される性質を利用したものである。またプローブの3'末端付近に蛍光分子または消光分子が付加されているため、プローブはプライマーとしては機能しない。
【００３０】
本発明のLAMP-FLP法においては、蛍光分子としては、例えば、N-(3-フルオランチル)マレイミド（N-(3-Fluoranthyl)maleimide 、FAM）、フルオレセイン、ダンシル、カスケードイエロー、フルオレスカミン、オレゴングリーン、ピレン、テキサスレッド、パシフィックブルー、マリンブルー、アレクサ、ルシファーイエロー、ボディパイ（BODIPY）、クーマリン、ピンポ（PyMPO）、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、VIC、HEX、TAMRA、SYBR Green、NBD等を用いることができる。消光分子としては、例えば、4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-カルボン酸（4-dimethylaminoazobenzene-4'-carboxylic acid、Dabcyl）、QSY-7、QSY-21、QSY-35、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等の蛍光を発しない物質（ダーククエンチャーと言われる）を用いてもよいし、上記蛍光分子が発する波長領域に吸収帯を持つ蛍光物質を消光分子として利用してもよい。蛍光分子および消光分子をオリゴヌクレオチドに結合させる方法、ならびに蛍光強度の変化を検出する方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００３１】
[LAMP-FLP法のためのプライマーおよびプローブの設計]
本発明のLAMP-FLP法に用いられるプライマーおよびプローブは、上述のLAMP-FLP法の原理に基づき、また従来のLAMP法のプライマーの設計方法や他のプローブの設計方法を参考に、適宜設計できる。LAMPプライマーの設計方法のためには、ソフトウェアが市販されており、本発明のLAMP-FLP法のためにも使用できる。
【００３２】
設計方法を、以下、標的部位がSNPである場合を例に説明する。
(1) プローブ領域（鋳型ヌクレオチド中のプローブが会合する領域）を定める際、SNPは、プローブの中央部に近い塩基と相補するようにするとよい。具体的には、SNPはプローブの中央部の8〜10塩基に相補するように設計するとよい。プローブ設計上、長さは15〜30塩基、好ましくは18〜25塩基である。この塩基長であれば、意図した相補配列との特異的な会合のために有効だからである。
(2) プローブ領域の当該SNPが、B1領域とB2領域との間（B1自体およびB2自体は含まない。）またはF1領域とF2領域との間（F1自体およびF2自体は含まない。）のループ領域に存在ように、LAMP法の基本の4本のプライマーセットを設計する。いずれのプライマーにもSNPは含まれないよう設計するが、プローブとFIPまたはBIPとの重複は許容することができる。F3プライマーおよびB3プライマーの長さは、各々独立して、15〜30塩基長、好ましくは18〜25塩基長である。FIPおよびBIPの長さは、各々独立して、30〜60塩基長、好ましくは35〜55塩基長である。
(3) ループプライマーは、SNPとの関係では、会合したループプライマーの5'末端から3〜20塩基上流に、好ましくは5〜15塩基上流に、SNPが存在するように設計される。ループプライマーはいずれも、各々独立して、15〜30塩基長、好ましくは18〜25塩基長である。
【００３３】
一般に、LAMP法の4つのプライマーの設計は、通常、Tm値、各プライマー領域の末端安定性、GC含量、二次構造の4つに留意して行う。本発明のLAMP-FLP法においても同様である。
各領域のTm値は、F1cおよびB1c領域で60〜68℃、場合により64〜66℃、F2領域、B2領域、F3領域、B3領域で55-63℃、場合により59〜61℃、ループプライマーは64〜66℃とすることができる。また適宜微調整することができる。各プライマー領域の末端は、核酸合成の起点となるため安定性が要求される。F2/B2、F3/B3、LF/LB の3'末端およびF1c/B1cの5’末端の自由エネルギーが、−4kcal/ mol 以下になるように設定するとよい。F1cの5'末端は、複製後にF1領域の3'末端に相当するため、安定性が重要である。プライマーのGC含量は、35〜75%、場合により40〜65％になるように設計することができる。好ましくは、50〜60％となるように設計することもできる。二次構造に関しては、特にFIPおよびBIPが極端に二次構造をとらないように設計するとよい。また、プライマーダイマーの生成を防ぐために、3'末端が相補的にならないように設計する。
【００３４】
プライマー間の距離は、F2領域の外側からB2領域の外側まで（LAMP法による増幅領域）が120〜160塩基長となるように設計することができ、必要に応じ、20塩基長程度ずつ増やしたものを設計してみてもよく、120〜220塩基長とすることもできる。また、F2領域の5'末端からF1領域の5'末端まで（ループを形成する部分）は、40〜80塩基長になるように設計することができ、必要に応じ、〜100、または〜120まで拡げてもよい。F2領域とF3領域との間は0〜20塩基長、必要に応じ、0〜60塩基長となるように設計することができる。
【００３５】
より具体的には、下記のように設計することができる。
(1) 基本の4本のプライマーの設計
Primer Explorer V4 (富士通、http://primerexplorer.jp/v4#manual/pdf/PEver4.pdf))等の市販のLAMPプライマー設計のためのソフトウェアを起動し、Default設定で設計を行う。鋳型ヌクレオチドの配列を読み込み、まずプローブ設計位置に目安を付ける。Default設定では適したプライマーが設計されない場合は、Distancesを変更してもよい。それでも設計困難な場合には、鎖長、Tm値を緩和する。
(2) ループプライマーの設計
設計されたプライマーセットを読み込み、Default設定で設計を行う。そのままだと適したループプライマーが設計されない場合は、鎖長、Tm、GC含量のパラメータを変更する。
(3) プローブ配列の確定
ループプライマーに合わせてプローブ領域の微調整を行う。当該SNPに対応するプローブ上の塩基は、メジャーアリルとマイナーアリルのうち、フルマッチの場合とミスマッチの場合のTm差が生じやすいほうのアリルに対応した塩基を選択することができる。
【００３６】
設計されたプライマーおよびプローブは、当業者にはよく知られた既存の方法により合成することができる。
【００３７】
[LAMP-FLP法の実施]
上述のプライマーおよびプローブを用いて実施されるLAMP-FLP法は、典型的には、LAMP法による等温増幅工程、加温工程、緩やかに温度を下げながら、またはいったん下げた温度を緩やかに上げながら、蛍光の挙動を観察する工程を含む。
【００３８】
等温増幅工程は、LAMP法のための種々の鎖置換反応を触媒する酵素が利用できる。より具体的には、Geobacillus属菌由来のDNA Polymerase I、Bst DNA Polymerase（Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ複合体の一部、特許第特許3046142号公報、特許第4220557号公報、特許第4446498号公報参照）、85℃以上の発酵によって得られた堆肥中より単離されたCsa DNA Polymeraseおよび96-7 DNA Polymerase（特願2011-539375 (PCT/JP2010/069560)参照）が挙げられる。いずれも市販のものを利用することができる。
【００３９】
等温増幅工程の温度および時間は、使用する酵素等に応じて適宜設定することができる。温度は、例えば55〜70℃、より特定すると60〜68℃とすることができ、時間は、15〜80分、より特定すると20分〜40分とすることができる。
【００４０】
続く加温工程もまた、使用する酵素や使用するプローブのTm値等に応じて適宜設定することができる。温度は、例えば90〜100℃、より特定すると95〜99℃とすることができ、時間は、1〜10分、より特定すると3分〜7分とすることができる。
【００４１】
加温工程の後、系の温度を、プローブの会合または解離が生じる温度帯で変化させ、その際に生じる蛍光の変化をモニターする。会合または解離が生じる温度帯で変化させるとは、等温増幅工程、次いで加温工程を実施した後、加温工程の温度から適宜温度を下降させ、プローブの会合または解離が生じる温度を経てより低い温度にまですること（例えば、63℃→94℃→下降）と、等温増幅工程、次いで加温工程を実施した後、いったん下げた温度から適宜温度を上昇させ、プローブの会合または解離が生じる温度を経てよりも高い温度にまですること（例えば、63℃→94℃→35℃→上昇）とを含む。プローブは、前者の場合は徐々に会合し、後者の場合は徐々に解離する。LAMP-FLP法の好ましい態様においては、温度を下降させながら、その際に生じる蛍光の変化をモニターするが、温度の下降に伴い、プローブは徐々に会合する。なお、典型的なLAMP-QP法は、温度を上昇させながらその際に生じる蛍光の変化をモニターするものである。
【００４２】
本発明者らの検討によると、解離させる場合と会合させる場合とでは、得られるデータが異なることがある。また、上述のLAMP-FLP法の好ましい態様においては、加温工程では酵素を失活させる一方でプライマーを解離させ、温度を下降させながらプローブを会合させつつ蛍光の変化をモニターするので、検出のための時間が短縮され、かつ測定の機構をシンプルにできる。
【００４３】
蛍光の変化をモニターする工程で、温度を下げる際は、緩やかに、例えば0.005〜2.0℃/秒、好ましくは0.01〜1.0℃/秒、さらに好ましくは0.025〜0.075℃/秒の、ほぼ一定の速度で変化させるとよい。LAMP-FLP法は、プローブと標的部位の塩基のフルマッチ、ミスマッチによるTm値の差を用いるものであり、この降温工程における蛍光強度の変化をモニターすることで、蛍光強度の変化率を求め、標的部位の特定の塩基が識別できる。
【００４４】
蛍光強度の変化率は、温度に対して蛍光強度をプロットした曲線の一次微分により算出することができる。一次微分による算出値は、さらに微分してもよい。
【００４５】
一次微分値は、プローブが会合する領域とフルマッチの場合とミスマッチがある場合とでは異なるピークを形成しうる。また双方が存在する場合は双方のピークが形成されうる。これによりSNPの場合は、検体由来の染色体多型の２つのアリルがホモであるか、ヘテロであるかも、ピークの形状により判定することができる。プローブのTm値は、塩、夾雑物の存在、標的SNPの周辺のSNPの存在等により変動することがあるため、多くの検体について評価する場合にはピークの位置をピンポイントで規定するのが困難である場合があるが、評価結果同士の比較により、適宜判定は可能である。
【００４６】
LAMP-FLP法は、通常のLAMP法と同様、数十μl程度のスケールで実施することができる。用いる鋳型ヌクレオチド、プライマー、プローブの量は、当業者であれば適宜設定できるが、例えば、鋳型ヌクレオチドは0.005〜0.50 ng/μL、FIPおよびBIPは0.1〜10μM、F3プライマーおよびB3プライマーは0.02〜2.0μM、蛍光分子や消光分子で修飾されていないループプライマーは0.08〜8.0μMの範囲で用いることができる。蛍光分子または消光分子で修飾されたループプライマーおよびプローブは、修飾される分子の種類および測定に使用する機器にもよるが、FAMで修飾されたループプライマーBであれば0.02〜2.0μM、それと一緒に使用されるDabcylで修飾されたプローブであれば0.04〜4.0μMの範囲で用いることができる。
【００４７】
系の組成は、上述の鋳型、プライマーおよびプローブの使用量または濃度のほか、当業者には明らかであるように、4種のdNTP、緩衝剤、塩、界面活性剤、LAMP法のための鎖置換反応を触媒する酵素を含むことができる。ピークが明確に観察でき、判定が十分に行えるように、系に含まれる各試薬の濃度を適宜設計することができる。図1に、LAMP-FLP法を良好に実施する際の、プライマー、プローブ、塩濃度等の調整スキームの一例を示した。
【００４８】
[LAMP-FLP法の利点]
本発明のLAMP-FLP法の利点を、LAMP-QP法と比較して説明する。LAMP-QP法は、LAMP-FLP法と同様、蛍光プローブと標的塩基のフルマッチ、ミスマッチによるTm値の差を用いて塩基を識別する方法である。LAMP-QP法では、LAMP法産物のループ領域を標的とし、この位置にクエンチングプローブを設計する。クエンチングプローブは、プローブの5'末端か3'末端を蛍光体で標識し、プローブが標的核酸に結合した際に蛍光分子が標的核酸配列中のグアニン（Ｇ）と相互作用することによって蛍光が消光する現象を利用している。標的核酸が存在すると、蛍光が消光し、存在しない場合には蛍光が消光しないため、標的核酸の有無を判定できる。プローブは単独で機能するが、標的核酸配列中のＧと相互作用する位置、すなわち末端の蛍光分子付近にＣを配置するように設計しなければならず、設計の自由度に制約が生じるという問題がある。場合により、プローブ設計の都合上、意図した鋳型ヌクレオチド以外の領域も増幅しうるようなLAMPプライマーを設計せざるを得ず、誤判定に結びつく恐れがある。
【００４９】
これに対し、本発明のLAMP-FLP法は、LAMP法において、ループプライマーが必ず増幅産物の末端に配置する性質を利用したものである。LAMP法通常用いるループプライマーの5’末端を蛍光分子または消光分子で修飾する。プローブの設計に際して制約は特にない。ループプライマーの量に応じ、プローブを比較的多く用いることができるため、紫外線やブラックライト照射下で発光・消光を肉眼での判定も可能となる。原理上、LAMP-QP法よりも感度が高いと考えられる。本発明者らの検討によると、実際に、LAMP-FLP法はLAMP-QPより遥かに感度が高かった。また標的部位への特異性はプローブだけでなく、ループプライマーとの位置関係にも依存するため、正確性にもより優れていると考えられる。
【００５０】
LAMP-FLP法はまた、種々の改変が可能であるという利点も有する。典型的なLAMP-FLP法は、蛍光分子を有するループプライマーと消光分子を有するオリゴヌクレオチドプローブを1ペア用いるが、2以上の標的部位を同時に検出するために、多色の蛍光分子を用いたマルチプレックス系として設計することもできる。例えば、IL28B遺伝子のrs8099917、ITPA遺伝子のrs1127354を同時に判定するためには、rs8099917の判定のためにTAMRA-EclipseDarkクエンチャー系、rs1127354の判定のためにFAM-Dabcyl系を利用することが考えられる。
【００５１】
またループプライマーに消光分子を付加し、2種類の蛍光プローブを用いることもできる。例えば、GにフルマッチのプローブをFAMで標識し、、AにフルマッチのプローブをTAMRAで標識して用いる。この改変法により、蛍光強度の変化率（蛍光変化を温度変化に対してプロットして得られた融解曲線の波形）からではなく、色調変化に基づく判定が期待できる。
【００５２】
[用途]
本発明のLAMP-FLP法は、種々のSNPsのタイピングのために用いることができる。タイピングの対象となりうるSNPsには特に制限はない。例えば、C型肝炎の治療効果を予測するためには、下記から選択することができる：rs12043519, rs1986953, rs13392065, rs16987149, rs16987155, rs2374341, rs2374342,rs7566701, rs12713624, rs10208788, rs10208883, rs9876122, rs2036081, rs13122167, rs4488950, rs13150115, rs7663113, rs1379606, rs913500, rs6458003, rs6906840, rs2224068, rs9390164, rs4512312, rs757844, rs4876271, rs7942675, rs17787293, rs917334, rs6489019, rs6489020, rs6489021, rs11610391, rs9528038, rs341554, rs2325219, rs1353348, rs2076954, rs12907066, rs8075713, rs4795794, rs955155, rs12972991,rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs8103142, rs28416813, rs4803219, rs8099917,rs7248668, rs10853728, rs4803223, rs12980602，rs4803224、rs11881222、rs8103142、rs12979860。
【００５３】
本発明者らにより、rs8099917、rs12979860、rs11881222、rs8103142、rs1127354、rs7270101のタイピングのためのLAMP-FLP法のためのプライマーおよびプローブが設計され、実際にタイピングに用いられ、有効なことが確認されている。
【００５４】
また本発明者らにより、ADH1B (ヒトアルコール脱水素酵素1B) rs1229984、ALDH2 (ヒトアルデヒド脱水素酵素2) rs671、UCP1 (ヒト脱共役タンパク質1) rs1800592、ADRB2 (ヒトアドレナリン受容体beta2) rs1042713、ADRB3 (ヒトアドレナリン受容体beta3) rs4994、CYP2C9*3 (チトクロームp450 2c9*3) rs1057910、VKORC1#1 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#1) rs9934438、VKORC1#2 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#2) rs9923231について、LAMP-FLPプライマーおよびプローブが設計されている。それ以外のSNPsに対しても、またSNPs以外の標的部位に対しても、検出またはタイピングを目的としたLAMP-FLP法のためのプライマーおよびプローブが本明細書の記載に基づき設計できる。
【００５５】
本発明の方法は、疾病に罹患しやすいまたは罹患している被験者が薬物での治療の恩恵に浴するかどうかを判定するために、および治療（例えば、C型肝炎のためのもの等）を受けている被験者の応答を予想するために、用いることができる。すなわち本発明は、コンパニオン診断方法および製品も提供する。具体的には、本発明により少なくとも、rs8099917、rs12979860、rs11881222、rs8103142、rs1127354、rs7270101、rs1229984、rs671、rs1800592、rs1042713、rs4994、rs1057910、rs9934438、rs9923231に関連した疾患または状態に対する薬物治療のための、コンパニオン診断方法、およびそのための製品（プローブ、プローブおよびプライマーのセット、キット等）が提供される。
【００５６】
例えば、IL28B遺伝子に存在するSNPsのうち、rs8099917のタイプ(TT、TG、GG)がペグインターフェロンとリバビリンの併用療法効果予測に有力な因子の一つとして知られている。TGまたはGGのリスクアリルを有する患者群は、ペグインターフェロンとリバビリンの併用療法が効かないことが分かっている(特許文献2、非特許文献5および6)。またリバビリンの副作用として知られる溶血性貧血に関与するSNPsとして、rs1127354、rs7270101が報告されている（非特許文献7）。したがって、本発明により、C型肝炎のリスクのある者またはC型肝炎患者を対象とした、ペグインターフェロンとリバビリンの併用療法のためのコンパニオン診断方法、およびそのための製品プローブ、プローブおよびプライマーのセット、キット等）が提供される。
【００５７】
本発明は、LAMP-FLP法を実施するための、プローブ、プローブおよびプライマーのセット、並びにキットを提供する。本発明により提供されるプローブの具体的な例は、rs8099917に対しては配列番号:13または配列番号:143（好ましくは配列番号:143）、rs12979860に対しては配列番号:26、rs11881222に対しては配列番号:39、rs8103142に対しては配列番号:52、rs1127354に対しては配列番号:65、rs7270101に対しては配列番号:78、rs1229984に対しては配列番号:85、rs671に対しては配列番号:92、rs1800592に対しては配列番号:99、rs1042713に対しては配列番号:106、rs4994に対しては配列番号:113、rs1057910に対しては配列番号:120、rs9934438に対しては配列番号:127、rs9923231に対しては配列番号:134からなるオリゴヌクレオチドの3'末端付近に、消光分子または蛍光分子を配したものである。これらのプローブはいずれも、1または数個分（例えば、1〜4個、1〜3個、1または2個）の末端の塩基を欠失するかまたは伸長することにより、改変することができる。伸長する場合、その部分は、会合する領域に相補する配列を有するようにすることができる。またこれらのプローブ（欠失することにより改変した場合、伸長することにより改変した場合も含む。）はいずれも、標的部位に対応する配列を、もう一方のアリルと相補するように改変することができる。例えば、あるSNPについて、メジャーアリルを選択してそれと相補するプローブを設計した場合は、SNPに対応する塩基をマイナーアリルに相補する塩基に置換したプローブを、改変体として設計することができる。本発明は、このような改変プローブも提供する。
【００５８】
本発明により提供されるプライマーおよびプローブのセットの具体的な例は、rs8099917に対しては配列番号:7〜13または配列番号:7〜12および143（好ましくは配列番号:7〜12および143）、rs12979860に対しては配列番号:20〜26、rs11881222に対しては配列番号:33〜39、rs8103142に対しては配列番号:46〜52、rs1127354に対しては配列番号:59〜65、rs7270101に対しては配列番号:72〜78、rs1229984に対しては配列番号:79〜85、rs671に対しては配列番号:86〜92、rs1800592に対しては配列番号:93〜99、rs1042713に対しては配列番号:100〜106、rs4994に対しては配列番号:107〜113、rs1057910に対しては配列番号:114〜120、rs9934438に対しては配列番号:121〜127、rs9923231に対しては配列番号:128〜134からなる、オリゴヌクレオチドのセットである。これらのセットのうち、ループプライマーBに該当するプライマーの5'末端付近またはプローブの3'末端付近のいずれか一方に消光分子が配され、また他方に蛍光分子が配されている。プライマーはいずれも、1または数個分（例えば、1〜4個、1〜3個、1または2個）の末端の塩基を欠失するかまたは伸長することにより、改変することができる。伸長する場合、その部分は、会合する領域に相補する配列を有するようにすることができる。プローブはいずれも、上述したように、欠失、伸長または置換により改変することができる。本発明は、このようなものから選択される任意の改変プライマーおよび改変プローブからなるセットも提供する。
【００５９】
本発明により提供されるキットは、下記を含む：
・鋳型ポリヌクレオチドの6つの領域（F1領域、F2領域、F3領域、B1領域、B2領域およびB3領域）に基づいて設計された4種類のプライマー（FIP、F3プライマー、BIPおよびB3プライマー）；
・F1領域とF2領域との間の領域またはB1領域とB2領域との間の領域であって、標的部位が存在する側の領域に基づいて設計された、ループプライマー；および
・標的部位を含む領域に会合することができるオリゴヌクレオチドプローブ。
キットは他に、LAMP-FLPによりコンパニオン診断を行うためのインストラクションを含んでもよい。キットに使用されるプライマーおよびプローブのセットは、上述した構成（改変プライマーおよび改変プローブからなるセットも含む。）とすることができる。キットは、rs8099917を検出するためのものとして設計することができ、このようなキットは、C型肝炎治療におけるペグインターフェロンおよびリバビリンの併用療法の効果を予測するために用いることができる。
【００６０】
[核酸の調製方法]
本発明のLAMP-FLP法において、遺伝子増幅の対象となる鋳型核酸の由来は、特に限定されない。また鋳型核酸の調製方法も特に限定されない。毛根の他、血液や組織から、既知の方法により調製しても良い。代表的なものとしては、爪、口腔粘膜、血液、尿、髄液、喀痰、病理組織からキットを用いて精製されたものが挙げられる。既存の核酸精製方法としては、ヨウ化ナトリウム法、アルカリ抽出法、フェノールクロロホルム法、キットとしては、Genomix (Talent SRL)、MagExtractor (東洋紡)、QIAamp DNA Blood Mini Kit (キアゲン) などが知られる。
【００６１】
検体をProteinase K処理した溶液であれば、鋳型核酸を含む溶液として、そのまま増幅反応に供することができる。Proteinase Kを用いる方法は、具体的には、0.5 mg/ml Proteinase K、37.5 mM Dithiothreitol、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA (pH 8.0)、100 mM NaClを含む抽出液に検体を加え、55℃で20分間以上加熱する。さらに94℃で10分間以上加熱することでProteinase Kを失活させる。検体として毛髪（毛根部）を用いる場合、約1cmのもの1〜3本を先の抽出液50μｌに加える。検体としての毛髪は、毛根部を含んでいれば、毛髪の染毛、白髪など状態は問わない。また毛髪は頭髪に限らず、毛根部を含む体毛であれば良い。
【００６２】
このようにして得られる上清は、直接、遺伝子増幅の鋳型DNAとして用いることが可能である。
【００６３】
この方法は、本発明のLAMP-FLP法のみならず、LAMP法、PCR法、SDA法、TMA法、NASBA法、TRC法、ICAN法、SmartAmp法、RCA法等の核酸の増幅方法に用いるための、鋳型となる核酸の調製方法とすることができる。
【００６４】
核酸の増幅は、主に遺伝子関連検査のために行われる。遺伝子関連検査には、感染症の原因となるウイルスや細菌などの外来遺伝子を調べる病原体遺伝子検査、腫瘍細胞における体細胞系列の遺伝子の後天的変異や発現異常を調べる体細胞遺伝子検査、および生来的に保有し、生涯変化しない遺伝学的情報を明らかにする遺伝学的検査または生殖細胞系列遺伝子検査が含まれる。本発明の核酸の調製方法は、これらの検査のために用いることができる。核酸を調製するための検体の種類は、検査の目的や対象ごとに異なるが、本発明の方法は、種々の検体からの核酸の調製に用いることができる。本発明が適用可能な検体には、末梢血白血球、口腔細胞、毛髪（毛根細胞)、爪、血痕、臍帯、臓器組織、血清、血漿、血液（白血球）、骨髄、骨離単核球、脳脊髄液、患部擦過物、患部ぬぐい液、眼房水、リンパ節、気管支肺胞洗浄液、胸水、腹水、心嚢液、膵液、喀痰、骨、膿、尿、糞便、吐潟物、胃液、リンパ節、皮虜、腸組織、固形組織（生検手術）、パラフイン包埋ブロック、凍結切片用包埋ブロック、剖検材料（組織）、培養細胞が含まれる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６６】
[サンプル調製方法]
0.5 mg/ml Proteinase K、37.5 mM Dithiothreitol、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA (pH 8.0)、100 mM NaClを含む抽出液50 μlに毛根部を含むヒト毛髪1 cmを3本分加え、55℃で20分間以上加熱した。さらに94℃で10分間以上加熱することでProteinase Kを失活させた。ここで得られた上清を、直接、LAMP法などの遺伝子増幅の鋳型DNAとして用いた。【００６７】
[プライマーセットおよびプローブの設計]
本実施例では、LAMP-QP法と本発明のLAMP-FLP法とを比較した。LAMP-FLP法で用いたプライマーセットおよびプローブの設計は下記のように行った。
(1)SNPを含む形でプローブ位置を設定した。
(2)LAMP法の場合、プローブ領域の当該SNPがF1-F2間またはB1-B2間のLoop領域に配置するように基本の4本のプライマーセットを設計した。いずれのプライマーにもSNPは含まれないよう設計するが、プローブとFIP、またはプローブとBIPの重複は許容した（比較評価例1: IL28B rs8099917タイピング参照）。
(3)次いで、Loop Primerの設計を行った。LAMP-FLP法においては、SNPをB1-B2間に配置した場合、Loop Primer Bの5'末端をFAM分子で標識し、プローブよりもTm値が高くなるLAMP法産物側にドナーを取り込ませることとした。【００６８】
より詳細には、プライマーセットおよびプローブの設計は、次の手順で行った。
(1) 基本の4本のPrimerの設計
LAMP法プライマー設計支援ソフトウェアPrimerExplorer V4 (株式会社富士通システムズ・イースト) を起動し、Default設定で設計を行った。この際、配列を読み込み、まずプローブ設計位置に目安を付けた。そのままだと適したプライマーが設計されない場合は、Distancesを変更した。それでも設計困難な場合には、鎖長、Tm値を緩和した。
(2) Loop Primerの設計
上述のソフトウェアを用い、設計されたプライマーセットを読み込み、Default設定でLoop Primerの設計を行った。そのままだと適したプライマーが設計されない場合は、鎖長、Tm、GC含量のパラメータを変更した。
(3) プローブ配列の確定
Loop Primerに合わせてプローブ位置の微調整を行った。当該SNPに対応する塩基は、メジャーアリルとマイナーアリルのうち、フルマッチの場合とミスマッチの場合のTm差が生じやすい方のアリルに対応した塩基を選択した。【００６９】
[オリゴヌクレオチドの合成]
実験で用いたオリゴヌクレオチドはすべて、株式会社ニッポンジーンマテリアルにて合成を行った。各評価において、鋳型として用いた領域（LAMP-FLP法、LAMP-QP法共通）はすべて、Cloning Vector pTS1 DNA（株式会社ニッポンジーンテク）を用いてクローニングした。【００７０】
[評価系における鋳型、プライマーおよびプローブの濃度]
以下の評価例においては、25μLの評価系において、鋳型DNAは、毛根から抽出した実検体の場合、上記の溶液4μlを使用し、人工鋳型DNAの場合は、25μLあたり1.6ngを使用した。またプライマーおよびプローブは、以下の濃度で使用した。【００７１】
LAMP-QP法の場合
1.6μM    FIP
1.6μM    BIP
0.2μM    F3 
0.2μM    B3 
0.8μM    LF 
0.4μM    QProbe【００７２】
LAMP-FLP法の場合
1.6μM    FIP
1.6μM    BIP
0.2μM    F3
0.2μM    B3
0.8μM    LF
0.2μM    LB-FAM
0.4μM    Dabcyl Probe【００７３】
[比較評価例1: IL28B rs8099917タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【００７４】
【表２】
2014157377.tif 000003
【００７５】
LAMP-QP法
rs8099917 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号1から6の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe（配列番号6）の3'末端はBODIPY FL分子で修飾した。【００７６】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、0.42 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、2.4 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、40から80℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。蛍光値の変動をモニターし、変動曲線を一次微分し、蛍光値の変化が大きいところをピークとして表した。【００７７】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、49℃付近もしくは58℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図2に示した。毛根部より抽出した鋳型DNAについてのLAMP-QP法の結果は、ダイレクトシーケンス法の結果に一致していた。【００７８】
人工的に当該SNPをTとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、49℃付近にピークを形成し、当該SNPをGとして合成した鋳型DNAを用いた場合は58℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。【００７９】
LAMP-FLP法
rs8099917 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号7から13の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FB（配列番号12）の5'末端はFAM分子により修飾した。Quencher Probe (配列番号13、フルマッチプローブ)の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図18に示した。【００８０】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、24 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【００８１】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、フルマッチプローブでは50℃付近もしくは58℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。また、ミスマッチプローブ（後掲配列番号:143）を用いた場合は、43℃付近もしくは53℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例（ミスマッチプローブの場合）を図3−1に示した。【００８２】
人工的に当該SNPをT（Major）として合成した鋳型DNAを用いた場合は、43℃付近にピークを形成し、当該SNPをG（Minor）として合成した鋳型DNAを用いた場合は53℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合（hetero）には、前記温度の両方でピークを形成した（図3−2）。【００８３】
ダイレクトシーケンス法との一致率
IL28B rs8099917タイピングに関し、ダイレクトシーケンス法との一致率を確認したところ、毛根部より抽出した鋳型DNAについてのLAMP-FLP法の結果は、ダイレクトシーケンス法の結果にも一致していた。【００８４】
[比較評価例2: IL28B rs12978960タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【００８５】
【表３】
2014157377.tif 000004
【００８６】
LAMP-QP法
rs12979860 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブは、配列番号14から19の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe (配列番号19) の3'末端はBODIPY FL分子により修飾した。【００８７】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25 μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、40から80℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。【００８８】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、55℃付近もしくは67℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図4に示した。人工的に当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、67℃付近にピークを形成し、当該SNPをTとして合成した鋳型DNAを用いた場合は55℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。【００８９】
LAMP-FLP法
rs12979860 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号20から26の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FB（配列番号25）の5'末端はFAM分子により修飾し、Quencher Probe (配列番号26)の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図19に示した。【００９０】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、13 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25 μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【００９１】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、56℃付近もしくは67℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図5に示した。人工的に当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、67℃付近にピークを形成し、当該SNPをTとして合成した鋳型DNAを用いた場合は56℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。【００９２】
[比較評価例3: IL28B rs11881222タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【００９３】
【表４】
2014157377.tif 000005
【００９４】
LAMP-QP法
rs11881222 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号27から32の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe (配列番号32)の3'末端はBODIPY FL分子により修飾した。【００９５】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、40から80℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。【００９６】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、54℃付近もしくは64℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図6に示した。人工的に当該SNPをAとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、54℃付近にピークを形成し、当該SNPをGとして合成した鋳型DNAを用いた場合は64℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。【００９７】
LAMP-FLP法
rs11881222 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号33から39の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FB(配列番号38)の5'末端はFAM分子により修飾し、Quencher Probe (配列番号39)の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図20に示した。【００９８】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、13 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【００９９】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、57℃付近もしくは67℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図7に示した。人工的に当該SNPをAとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、57℃付近にピークを形成し、当該SNPをGとして合成した鋳型DNAを用いた場合は67℃付近にピークを形成した。【０１００】
[比較評価例4: IL28B rs8103142タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【０１０１】
【表５】
2014157377.tif 000006
【０１０２】
LAMP-QP法
rs8103142 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号40から45の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe (配列番号45)の3'末端はBODIPY FL分子により修飾した。【０１０３】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、40から80℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１０４】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、62℃付近もしくは68℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図8に示した。人工的に当該SNPをTとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、62℃付近にピークを形成し、当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は68℃付近にピークを形成した。【０１０５】
LAMP-FLP法
rs8103142 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブは、配列番号46から52の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FBのプライマー(配列番号51)の5'末端はFAM分子により修飾し、Quencher Probe (配列番号52)の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図21に示した。【０１０６】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、13 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１０７】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、55〜58℃付近もしくは65℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図9に示した。実際に、人工的に当該SNPをTとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、58℃付近にピークを形成し（図9のMajorコントロール）、当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は67℃付近にピークを形成した（図9のMinorコントロール）。【０１０８】
[比較評価例5: ITPA rs1127354タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【０１０９】
【表６】
2014157377.tif 000007
【０１１０】
LAMP-QP法
rs1127354 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号53から58の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe (配列番号58) の3'末端はBODIPY FL分子により修飾した。【０１１１】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、40から80℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１１２】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、49〜51℃付近もしくは58〜60℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図10に示した。人工的に当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、58℃付近にピークを形成し、当該SNPをAとして合成した鋳型DNAを用いた場合は49℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。【０１１３】
LAMP-FLP法
rs1127354 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号59から65の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FB(配列番号64)の5'末端はFAM分子により修飾し、Quencher Probe (配列番号65) の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図22に示した。【０１１４】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、13 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１１５】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、48〜51℃付近もしくは56〜59℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図11に示した。人工的に当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、61℃付近にピークを形成し、当該SNPをAとして合成した鋳型DNAを用いた場合は51℃付近にピークを形成した。またこれらの人工鋳型DNAを混合した場合には、前記温度の両方でピークを形成した。毛根部より抽出した鋳型DNAから識別を行った場合にも、同様のピーク形成が見られ、その結果はQuenching Probe法およびダイレクトシーケンス法の結果にも一致していた。【０１１６】
[比較評価例6: ITPA rs7270101タイピング]
用いたプライマーおよびプローブの配列を下記に示す。【０１１７】
【表７】
2014157377.tif 000008
【０１１８】
LAMP-QP法
rs7270101 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号66から71の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Quenching Probe (配列番号71) の3'末端はBODIPY FL分子により修飾した。【０１１９】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、37.5から65℃まで、1秒間に0.2℃ずつ温度を上昇させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１２０】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、46℃付近もしくは52℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図12に示した。人工的に当該SNPをAとして合成した鋳型DNAを用いた場合は、46℃付近にピークを形成し（図12のMajorコントロール）、当該SNPをCとして合成した鋳型DNAを用いた場合は52℃付近にピークを形成した（図12のMinorコントロール）。【０１２１】
LAMP-FLP法
rs7270101 SNP識別用のプライマーセットおよびプローブとして、配列番号72から78の配列からなるオリゴヌクレオチドを準備した。Loop Primer FB(配列番号77)の5'末端はFAM分子により修飾し、Quencher Probe (配列番号78) の3'末端はDABCYL分子により修飾した。また人工的に鋳型DNAとして合成した領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を図23に示した。【０１２２】
鋳型DNA、プライマーセット、プローブ、1.4 mM each dNTPs、75 mM Tris-HCl (pH 8.0)、13 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% Tween 20、および8 units Bst DNA Polymerase（株式会社ニッポンジーン）を含んだ全量25μlを、Genie（登録商標） II (OptiGene社製) で30分間保温した後、プローブの会合曲線解析を行った。具体的には、63℃・30分間、98℃・5分間の処理の後、98から30℃まで、1秒間に0.05℃ずつ温度を下降させながら蛍光強度の変化を測定した。【０１２３】
毛根部より抽出した鋳型を用いた場合、50℃付近もしくは55℃付近、またはその両方に特異なピークを形成した。結果の一例を図13に示した。人工的に当該SNPをAとして合成した鋳型DNAと当該SNPをCとして合成した鋳型DNAとを混合して用いた場合には、50℃付近および55℃付近にピークを形成した（図13のヘテロコントロール）。【０１２４】
[設計例7〜13] 
上述の比較評価例と同様にして、ADH1B (ヒトアルコール脱水素酵素1B) rs1229984、ALDH2 (ヒトアルデヒド脱水素酵素2) rs671、UCP1 (ヒト脱共役タンパク質1) rs1800592、ADRB2 (ヒトアドレナリン受容体beta2) rs1042713、ADRB3 (ヒトアドレナリン受容体beta3) rs4994、CYP2C9*3 (チトクロームp450 2c9*3) rs1057910、VKORC1#1 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#1) rs9934438、VKORC1#2 (ビタミンKエポキシド還元酵素複合体1#2) rs9923231について、下表のようにLAMP-FLPプライマーおよびプローブを設計した。またそれぞれについて、鋳型DNAとしてクローニングした領域と、LAMP法の各領域およびプローブの位置関係を、図24〜31に示した。【０１２５】
【表８】
2014157377.tif 000009
【０１２６】
[プローブ性能比較]
5'側を削除したプローブ、3'側を削除したプローブの性能を比較した。下記のプローブを作製し、プローブ以外は比較評価例1と同様の方法で、評価した。【０１２７】
【表９】
2014157377.tif 000010
【０１２８】
5'側の削除の影響を検討するため、Dabcyl 2と、それよりDabcyl 1、Dab-4およびDab-6を比較した。結果を図14に示した。プローブ鎖長が短くなることで、Tm値が全体的に低下した。一方、フルマッチとミスマッチのTm差は大きくなる傾向が見られた。鎖長が短くなっても、ピークの分離能は改善しなかった。Dab-6の分離能が改善したのは、ステムループ構造またはプライマー多量体形成 が解消されたためと考えられる。【０１２９】
3'側の削除の影響を検討するため、Dabcyl 2と、それより3'側を削除したDab3'-1、Dab3'-2およびDab3'-3を比較した。結果を図15に示した。1塩基のギャップは、検出に影響しなかったが、2塩基と3塩基は、ピークに乱れが見られた。ギャップが原因である可能性と、鎖長が短くなったことが原因である可能性が考えられた。【０１３０】
プローブが設計可能な領域を検討するため、Dabcyl 2と、Dab+half（Dabcyl 2の5'側をB1c領域の半分まで延長したもの）および Dab+full（Dabcyl 2の5'側をB1c領域全体まで延長したもの）を比較した。 結果を図16に示した。プローブ鎖長が長くなったことにより、Tm値が上昇した。一方、フルマッチとミスマッチのTm差は小さくなった。Isothermal Ratioより、B1c領域を含めて設計しても、増幅反応には影響が見られないことが分かった。【０１３１】
ミスマッチの影響について検討した。Dabcyl 2（前掲配列番号:13）の7番目のGをTに変更して、misDab（配列番号:143）を作製して用いた。結果を図23に示した。共通のミスマッチを入れたため、Tm値は大幅に低下した。一方、ピーク分離能は大幅に改善された（図17）。【０１３２】
【表１０】
2014157377.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
配列番号:1    rs8099917 FIP (LAMP-QP)
配列番号:2    rs8099917 BIP (LAMP-QP)
配列番号:3    rs8099917 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:4    rs8099917 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:5    rs8099917 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:6    rs8099917 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:7    rs8099917 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:8    rs8099917 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:9    rs8099917 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:10    rs8099917 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:11    rs8099917 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:12    rs8099917 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:13    rs8099917 Quencher Probe (LAMP-FLP), Dabcyl 2
配列番号:14    rs12979860 FIP (LAMP-QP)
配列番号:15    rs12979860 BIP (LAMP-QP)
配列番号:16    rs12979860 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:17    rs12979860 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:18    rs12979860 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:19    rs12979860 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:20    rs12979860 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:21    rs12979860 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:22    rs12979860 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:23    rs12979860 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:24    rs12979860 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:25    rs12979860 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:26    rs12979860 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:27    rs11881222 FIP (LAMP-QP)
配列番号:28    rs11881222 BIP (LAMP-QP)
配列番号:29    rs11881222 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:30    rs11881222 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:31    rs11881222 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:32    rs11881222 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:33    rs11881222 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:34    rs11881222 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:35    rs11881222 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:36    rs11881222 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:37    rs11881222 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:38    rs11881222 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:39    rs11881222 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:40    rs8103142 FIP (LAMP-QP)
配列番号:41    rs8103142 BIP (LAMP-QP)
配列番号:42    rs8103142 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:43    rs8103142 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:44    rs8103142 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:45    rs8103142 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:46    rs8103142 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:47    rs8103142 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:48    rs8103142 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:49    rs8103142 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:50    rs8103142 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:51    rs8103142 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:52    rs8103142 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:53    rs1127354 FIP (LAMP-QP)
配列番号:54    rs1127354 BIP (LAMP-QP)
配列番号:55    rs1127354 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:56    rs1127354 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:57    rs1127354 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:58    rs1127354 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:59    rs1127354 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:60    rs1127354 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:61    rs1127354 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:62    rs1127354 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:63    rs1127354 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:64    rs1127354 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:65    rs1127354 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:66    rs7270101 FIP (LAMP-QP)
配列番号:67    rs7270101 BIP (LAMP-QP)
配列番号:68    rs7270101 F3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:69    rs7270101 B3 Primer (LAMP-QP)
配列番号:70    rs7270101 Loop Primer F (LAMP-QP)
配列番号:71    rs7270101 Quenching Probe (LAMP-QP)
配列番号:72    rs7270101 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:73    rs7270101 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:74    rs7270101 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:75    rs7270101 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:76    rs7270101 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:77    rs7270101 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:78    rs7270101 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:79    rs1229984 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:80    rs1229984 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:81    rs1229984 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:82    rs1229984 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:83    rs1229984 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:84    rs1229984 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:85    rs1229984 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:86    rs671 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:87    rs671 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:88    rs671 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:89    rs671 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:90    rs671 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:91    rs671 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:92    rs671 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:93    rs1800592 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:94    rs1800592 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:95    rs1800592 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:96    rs1800592 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:97    rs1800592 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:98    rs1800592 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:99    rs1800592 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:100    rs1042713 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:101    rs1042713 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:102    rs1042713 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:103    rs1042713 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:104    rs1042713 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:105    rs1042713 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:106    rs1042713 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:107    rs4994 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:108    rs4994 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:109    rs4994 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:110    rs4994 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:111    rs4994 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:112    rs4994 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:113    rs4994 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:114    rs1057910 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:115    rs1057910 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:116    rs1057910 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:117    rs1057910 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:118    rs1057910 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:119    rs1057910 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:120    rs1057910 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:121    rs9934438 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:122    rs9934438 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:123    rs9934438 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:124    rs9934438 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:125    rs9934438 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:126    rs9934438 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:127    rs9934438 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:128    rs9923231 FIP (LAMP-FLP)
配列番号:129    rs9923231 BIP (LAMP-FLP)
配列番号:130    rs9923231 F3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:131    rs9923231 B3 Primer (LAMP-FLP)
配列番号:132    rs9923231 Loop Primer F (LAMP-FLP)
配列番号:133    rs9923231 Loop Primer FB (LAMP-FLP)
配列番号:134    rs9923231 Quencher Probe (LAMP-FLP)
配列番号:135    Dab3'-3
配列番号:136    Dab3'-2
配列番号:137    Dab3'-1
配列番号:138    Dab-6
配列番号:139    Dab-4
配列番号:140    Dabcyl 1
配列番号:141    Dab + half
配列番号:142    Dab + full
配列番号:143    misDab
配列番号:144    DNA Fragment contaning rs8099917
配列番号:145    DNA Fragment contaning rs12979860
配列番号:146    DNA Fragment contaning rs11881222
配列番号:147    DNA Fragment contaning rs8103142
配列番号:148    DNA Fragment contaning rs1127354
配列番号:149    DNA Fragment contaning rs7270101
配列番号:150    DNA ADH1B fragment contaning rs1229984
配列番号:151    DNA ALDH2 fragment contaning rs671
配列番号:152    UCP1 DNA fragment contaning rs1800592
配列番号:153    ADRB2 DNA fragment contaning rs1042713
配列番号:154    ADRB3 DNA fragment contaning rs4994
配列番号:155    CYP2C9*3 DNA fragment contaning rs1057910
配列番号:156    VKORC1#1 DNA fragment contaning rs9934438
配列番号:157    VKORC1#2 DNA fragment contaning rs9923231
【図１】
2014157377.tif 000012
【図２】
2014157377.tif 000013
【図３−１】
2014157377.tif 000014
【図３−２】
2014157377.tif 000015
【図４】
2014157377.tif 000016
【図５】
2014157377.tif 000017
【図６】
2014157377.tif 000018
【図７】
2014157377.tif 000019
【図８】
2014157377.tif 000020
【図９】
2014157377.tif 000021
【図１０】
2014157377.tif 000022
【図１１】
2014157377.tif 000023
【図１２】
2014157377.tif 000024
【図１３】
2014157377.tif 000025
【図１４】
2014157377.tif 000026
【図１５】
2014157377.tif 000027
【図１６】
2014157377.tif 000028
【図１７】
2014157377.tif 000029
【図１８】
2014157377.tif 000030
【図１９】
2014157377.tif 000031
【図２０】
2014157377.tif 000032
【図２１】
2014157377.tif 000033
【図２２】
2014157377.tif 000034
【図２３】
2014157377.tif 000035
【図２４】
2014157377.tif 000036
【図２５】
2014157377.tif 000037
【図２６】
2014157377.tif 000038
【図２７】
2014157377.tif 000039
【図２８】
2014157377.tif 000040
【図２９】
2014157377.tif 000041
【図３０】
2014157377.tif 000042
【図３１】
2014157377.tif 000043
【配列表】
2014157377000001.app
【国際調査報告】
2014157377.tif 000044
2014157377.tif 000045
2014157377.tif 000046
2014157377.tif 000047