(57)【要約】本発明は、モルティエレラ属微生物内で高発現活性を示すプロモーターを提供することを目的とする。  本発明は、配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド又はその変異体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド；及び
（ｃ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記プロモーター活性は、モルティエレラ属に属する微生物細胞内でＧＵＳレポーター遺伝子を発現させた場合に少なくとも５００ｎｍｏｌ／（ｍｇ・分）のＧＵＳタンパク質活性が確認されるものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＤＮＡである、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項８】
前記形質転換体が脂質生産菌である、請求項７又は８に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）である、請求項８に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物細胞内で高発現活性を示すプロモーター、同プロモーターを含むベクター、同プロモーターが導入された非ヒト形質転換体並びに同プロモーター又は形質転換体を用いたタンパク質、脂質若しくは脂肪酸の製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、微生物の代謝により有用な化合物を生産させる技術（広義の醗酵技術）が開発、実用化されている。例えば、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）等のモルティエレラ属の菌類は、アラキドン酸をはじめとする高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生産することが知られており、工業的に特に有用な菌類である（特許文献１）。
このような菌類を利用する上で、育種、すなわち有用生物の遺伝的性質をより望ましい性質に改良する（品種改良する）ことがなされている。特に醗酵技術では、微生物による有用化合物の生産効率を向上し、当該化合物の製造コストを低減する等の観点から、育種は非常に重要なものとなっている。
より好ましい性質を持った有用生物を育種するためには、形質転換による方法が利用されている。この場合、目的の形質を獲得するために必要なタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、適切な遺伝子プロモーターの制御下で発現するようにして、育種しようとする有用生物（宿主）に導入し、形質転換体の集団を得る。その後、この中から望ましい品種（株）を選抜することになる。この際、宿主となる生物種に応じて、また改変しようとする性質に応じて適切な遺伝子プロモーターが必要である。
モルティエレラ属の菌類が属する糸状菌の形質転換方法については、多くの技術が報告されている。また、モルティエレラ属の菌類の脂質生産能力に関連して、脂質合成系に関与する多数の酵素遺伝子が取得されている。しかしながら、これらの有用な酵素遺伝子をモルティエレラ属へ導入し、高いレベルで発現させるために必要となる遺伝子プロモーターについては、これまでほとんど報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−０４４８９１
【発明の開示】
【０００４】
上記のような状況下で、効率的に有用脂質を生産する菌株の育種が求められているが、そのためには、モルティエレラ属の菌類に適した遺伝子プロモーターが必要となる。
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、モルティエレラ・アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）において高発現する遺伝子のプロモーターをクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、該ポリヌクレオチド及び形質転換体を用いるタンパク質、脂質若しくは脂肪酸の製造方法を提供する。
【０００６】
具体的には、本発明は、以下のとおりである。
［１］  以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド；及び
（ｃ）配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド
［２］  前記プロモーター活性は、モルティエレラ属に属する微生物細胞内でＧＵＳレポーター遺伝子を発現させた場合に少なくとも５００ｎｍｏｌ／（ｍｇ・分）のＧＵＳタンパク質活性が確認されるものである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］  配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか一つの塩基配列を含有する、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
［４］  ＤＮＡである、前記［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチド。
［５］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
［６］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
［７］  前記［６］に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
［８］  前記形質転換体が脂質生産菌である、前記［７］又は［８］に記載の形質転換体。
［９］  前記脂質生産菌が、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）である、前記［８］に記載の形質転換体。
【０００７】
本発明のポリヌクレオチドをプロモーターとして用いた場合、モルティエレラ属に属する微生物の細胞内で目的遺伝子を高効率に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のプロモーターを評価するためのベクターの例を示す図である。ＨｉｓＰ配列を本発明のプロモーターと入れ替えて使用する。
【図２】本発明のプロモーター配列で形質転換した形質転換体を各種培地（灰色バー：ＧＹ培地、白色バー：大豆粉培地）で培養したときのプロモーター活性を示す図である。各培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養
【図３】プロモーターＧＡＬ１０−２ｐの活性を示す図である。ガラクトース添加により誘導されたプロモーター活性を示す。
【図４】プロモーターＰＰ７ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養。
【図５】プロモーターＣＩＴ１ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで３日間培養。
【図６】プロモーターＰＰ３ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで１０日間培養。
【図７】プロモーターＰＰ６ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養
【図８】プロモーターＨＳＣ８２ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養。
【図９】プロモーターＳＳＡ２ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養。
【図１０】プロモーターＧＡＰｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。ＧＹ培地１０ｍｌ、２８℃、３００ｒｐｍで５日間培養。
【図１１】プロモーターＧＡＬ１０−２ｐとその短縮型プロモーターの活性を示す図である。
【図１２Ａ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＧＵＳ遺伝子（ＣＤＳ配列：配列番号２９、アミノ酸配列：配列番号３０）と、大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子のコドンの使用をモルティエレラ属の微生物用に改変したＧＵＳｍ遺伝子（ＣＤＳ配列：配列番号３１、アミノ酸配列：配列番号３２）とのアラインメントを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａの続き。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１３年３月２７日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１３−０６６２６５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。【００１０】
本明細書において、特に記載のない場合は、塩基配列は、５’末端を左側に、３’末端を右側に記載するものとする。【００１１】
１．プロモーター
本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａから複数種類のプロモーター配列をクローニングすることに初めて成功した。また、本発明者らは、これらのプロモーターにより発現されるタンパク質がその生物活性を示すことも確認した。
本発明のプロモーターは、ＰＰ７ｐ、ＣＩＴ１ｐ、ＰＰ３ｐ、ＰＰ２ｐ、ＰＰ６ｐｓ、ＨＳＣ８２ｐ、ＳＳＡ２ｐ、ＧＡＬ１０−２ｐ及び又はこれらの部分配列（短縮型）である。これらのプロモーター領域配列及びその短縮型配列を以下の表に示す。
上記表に示す塩基配列、つまり、配列番号１〜２８からなる群より選択されるいずれか１つの任意の配列を、以下、「本発明のプロモーター配列」と総称する。【００１２】
【表１】
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【００１３】
そこで、本発明は、モルティエレラ属に属する微生物細胞内で高発現活性を示すプロモーターとして、以下のポリヌクレオチドを提供する。
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）本発明のプロモーター配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）本発明のプロモーター配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド；及び
（ｃ）本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつモルティエレラ属に属する微生物細胞内でプロモーター活性を示すポリヌクレオチド【００１４】
上記（ａ）〜（ｃ）に記載のポリヌクレオチドを、以下「本発明のポリヌクレオチド」と称する。
また、本発明において、本発明のプロモーター配列を「有する」とは、本発明のプロモーター配列を「含む」ことを意味する。従って、本発明のプロモーター配列以外の付加的な配列、例えば、エンハンサー配列等が本発明のプロモーター配列の上流（５’末端側）又は下流（３’末端側）に付加されていてもよい。このような付加的な配列は、本発明のプロモーター配列との間に１〜１０００ｂｐ、１〜９００ｂｐ、１〜８００ｂｐ、１〜７００ｂｐ、１〜６００ｂｐ、１〜５００ｂｐ、１〜４００ｂｐ、１〜３００ｂｐ、１〜２００ｂｐ、１〜１００ｂｐ、１〜７５ｂｐ、１〜５０ｂｐ、１〜２５ｂｐ、１〜１０ｂｐの塩基配列を介して付加されていてもよく、あるいは本発明のプロモーター配列に直結（つまり本発明のプロモーター配列と付加的な配列との間に介在するヌクレオチド残基数が０）していてもよい。【００１５】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″及び″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７″などに記載されている方法を利用することができる。【００１６】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、（４）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、又は（５）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００１７】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、本発明のプロモーター配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。【００１８】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、本発明のプロモーター配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。【００１９】
なお、塩基配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。【００２０】
本発明において、「プロモーター活性」とは、本発明のプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子配列（以下、「目的遺伝子」という）を挿入した場合に、同遺伝子の発現産物が得られることをいう。
ここで、「発現産物」とは、同遺伝子の転写産物であるＲＮＡ（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）及び同遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のいずれか一方又は両方を意味する。【００２１】
目的遺伝子の挿入は、本発明のプロモーター配列の３’末端から、５００ｂｐ以内、４００ｂｐ以内、３００ｂｐ以内、２００ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、３０ｂｐ以内、１０ｂｐ以内の領域に目的遺伝子の５’末端が位置するように行われる。【００２２】
本発明のプロモーター配列の活性を確認することを目的とする場合、目的遺伝子は特に限定されないが、好ましくは活性測定方法が確立したタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。【００２３】
このような遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のセレクションマーカー遺伝子、並びにＬａｃＺ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。【００２４】
好ましくは、プロモーター活性の確認は、β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を用いてＧＵＳ活性を測定することにより行われる。宿主としてＭ．ａｌｐｉｎａを用いる場合、ＧＵＳ遺伝子は、好ましくは、コドン使用頻度をＭ．ａｌｐｉｎａに合わせたＧＵＳｍ遺伝子である。
ＧＵＳ活性は、モルティエレラ属に属する微生物の細胞内で本発明のプロモーター配列を用いてＧＵＳ遺伝子を発現させ、前記細胞から回収したＧＵＳタンパク質をｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドと反応させて、反応系の波長４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定し、その測定値を以下の式に当てはめることによって測定することができる。
ＧＵＳ活性（ｎｍｏｌ／（ｍｇ・ｍｉｎ））＝
１０００×［（各サンプルにおける吸光度の経時変化グラフの勾配値）／（検量線グラフの勾配値）］／［（サンプルのタンパク濃度）／５］【００２５】
ＧＵＳ遺伝子は、一般的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＧＵＳ遺伝子（ＣＤＳ配列：配列番号２９、アミノ酸配列：配列番号３０）が用いられるが、モルティエレラ属に属する微生物の細胞内で本発明のプロモーター配列を用いてＧＵＳ遺伝子を発現させる場合は、大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子のコドンの使用をモルティエレラ属の微生物用に改変したＧＵＳｍ遺伝子（ＣＤＳ配列：配列番号３１、アミノ酸配列：配列番号３２）を用いてもよい。
コドンの使用の改変の例については、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すＧＵＳｍ  ｖｓ  ＧＵＳアラインメントを参照することができる。【００２６】
好ましくは、本発明においてプロモーター活性は、上記の方法によりモルティエレラ属に属する微生物細胞内でＧＵＳレポーター遺伝子を発現させた場合に少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００ｎｍｏｌ／（ｍｇ・ｍｉｎ）のＧＵＳタンパク質活性が得られるものである。
宿主細胞に遺伝子を導入する方法については、後述のとおりである。【００２７】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。【００２８】
２．ベクター及び形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、「本発明のベクター」）を提供する。
本発明のベクターは、通常、
（ｉ）本発明のプロモーター；及び
（ｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例としては、脂質生産菌、酵母等が挙げられる。【００２９】
脂質生産菌としては、例えば、ＭＹＣＯＴＡＸＯＮ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＶ，Ｎｏ．２，ｐｐ．２５７−２６５（１９９２）に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２８．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等のモルティエレラ亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ  Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＣＢＳ１９４．２８、ＩＦＯ６３３６、ＩＦＯ７８２４、ＩＦＯ７８７３、ＩＦＯ７８７４、ＩＦＯ８２８６、ＩＦＯ８３０８、ＩＦＯ７８８４、モルティエレラ・ナナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｎａｎａ）ＩＦＯ８１９０、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）ＩＦＯ５４２６、ＩＦＯ８１８６、ＣＢＳ１１２．０８、ＣＢＳ２１２．７２、ＩＦＯ７８２５、ＩＦＯ８１８４、ＩＦＯ８１８５、ＩＦＯ８２８７、モルティエレラ・ヴィナセア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａ）ＣＢＳ２３６．８２等のマイクロムコール亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ  Ｍｉｃｒｏｍｕｃｏｒ）に属する微生物等を挙げることができる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）が好ましい。【００３０】
このようなベクターは、例えばｐＤｕｒａ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６５，４１９−４２５，（２００４））やｐＢＩＧ３５（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００９），ｖｏｌ．７５，ｐ．５５２９−５５３５）、ｐＤ４（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０００，６６（１１），ｐ．４６５５−４６６１）、ｐＤＺｅｏ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００５，１００（６），ｐ．６１７−６２２）、ｐＤＸベクター（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９，５５（３），ｐ．３４９−３５６）、ｐＢＩＧ３ｕｒａ５（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，７５，ｐ．５５２９−５５３５）等の既存の発現ベクターをベースとし、これらのベクターのプロモーター領域を本発明のプロモーター配列と入れ替えることにより作製することが可能であるが、ベースとなる発現ベクターはこれらに限定されない。【００３１】
宿主細胞の形質転換では、ベクターが導入されたかどうかを確認するために選択マーカーを利用してもよい。選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ、ｔｒｐ１）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７  １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）等が利用可能である。【００３２】
栄養要求性マーカーの例としては、以下の（１）〜（１５）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）  メチオニン要求性マーカー：ｍｅｔ１、ｍｅｔ２、ｍｅｔ３、ｍｅｔ４、ｍｅｔ５、ｍｅｔ６、ｍｅｔ７、ｍｅｔ８、ｍｅｔ１０、ｍｅｔ１３、ｍｅｔ１４、ｍｅｔ２０；
（２）  チロシン要求性マーカー：ｔｙｒ１、イソロイシン；
（３）  バリン要求性マーカー：ｉｌｖ１、ｉｌｖ２、ｉｌｖ３、ｉｌｖ５；
（４）  フェニルアラニン要求性マーカー：ｐｈａ２；
（５）  グルタミン酸要求性マーカー：ＧＬＵ３；
（６）  トレオニン要求性マーカーｔｈｒ１、ｔｈｒ４；
（７）  アスパラギン酸要求性マーカー：ａｓｐ１、ａｓｐ５；
（８）  セリン要求性マーカー：ｓｅｒ１、ｓｅｒ２；
（９）  アルギニン要求性マーカー：ａｒｇ１、ａｒｇ３、ａｒｇ４、ａｒｇ５、ａｒｇ８、ａｒｇ９、ａｒｇ８０、ａｒｇ８１、ａｒｇ８２、ａｒｇ８４；
（１０）  ウラシル要求性マーカー：ｕｒａ１、ｕｒａ２、ｕｒａ３、ｕｒａ４、ｕｒａ５、ｕｒａ６；
（１１）  アデニン要求性マーカー：ａｄｅ１、ａｄｅ２、ａｄｅ３、ａｄｅ４、ａｄｅ５、ａｄｅ６、ａｄｅ８、ａｄｅ９、ａｄｅ１２、ＡＤＥ１５；
（１２）  リシン要求性マーカー：ｌｙｓ１、ｌｙｓ２、ｌｙｓ４、ｌｙｓ５、ｌｙｓ７、ｌｙｓ９、ｌｙｓ１１、ｌｙｓ１３、ｌｙｓ１４；
（１３）  トリプトファン要求性マーカー：ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ｔｒｐ３、ｔｒｐ４、ｔｒｐ５；
（１４）  ロイシン要求性マーカー：ｌｅｕ１、ｌｅｕ２、ｌｅｕ３、ｌｅｕ４、ｌｅｕ５；
（１５）  ヒスチジン要求性マーカー：ｈｉｓ１、ｈｉｓ２、ｈｉｓ３、ｈｉｓ４、ｈｉｓ５、ｈｉｓ６、ｈｉｓ７、ｈｉｓ８【００３３】
薬剤耐性マーカーの例としては、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）耐性遺伝子、ブレオマイシンｔ（ｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  ｂ  ａｎｄ  ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２１６，１９９２，Ｐａｇｅｓ  ４４７−４５７  Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｐｕｎｔ，Ｃｅｅｓ  Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）、ビアラフォス（Ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）耐性遺伝子（Ａｖａｌｏｓ，Ｊ．，Ｇｅｅｖｅｒ，Ｒ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｃａｓｅ，Ｍ．Ｅ．１９８９．Ｂｉａｌａｐｈｏｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｓ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３６９−３７２．）、スルホニル尿素（Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）耐性遺伝子（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｆａｎ，Ｙ．，Ｘｉａ，Ｙ．Ｘ．，ａｎｄ  Ｋｅｙｈａｎｉ，Ｎ．Ｏ．（２０１０）Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８７：  １１５１−１１５６．）、ベノミル（Ｂｅｎｏｍｙｌ）耐性遺伝子（Ｋｏｅｎｒａａｄｔ，Ｈ．，Ｓ．Ｃ．Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓ．１９９２．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｂｅｎｏｍｙｌ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．８２：１３４８−１３５４．）、アセトアミド資化遺伝子（Ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ，ＡｍｄＳ）（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｂｙ  ｔｈ  Ｅａｍｄｓ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｉｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．４，４７５−４７９．）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３４】
宿主細胞の形質転換方法としては、一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、脂質生産菌の場合、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ  Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）又はアグロバクテリウム法が利用できるが、これらに限定されない。【００３５】
その他、一般的なクローニング技術に関しては、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）″等を参照することができる。【００３６】
３．タンパク質、脂質又は脂肪酸の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いたタンパク質、脂質又は脂肪酸の製造方法を提供する。
本発明のプロモーターが導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」）、特に、モルティエレラ属に属する微生物を宿主細胞として作成された形質転換体では目的遺伝子が高発現する。従って、本発明の形質転換体を用いれば、効率的に目的タンパク質を生成することができる。【００３７】
例えば、本発明のベクターに目的遺伝子を作動的に導入し、同ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、形質転換体細胞内で目的遺伝子から目的タンパク質を発現させることができる。
発現された目的タンパク質は、例えば、形質転換体から細胞溶解物を調製し、同溶解物から公知の方法に沿って回収することができる。目的タンパク質回収の詳細については″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）″等を参照することができる。【００３８】
目的遺伝子は特に限定されないが、好ましくは脂質合成酵素をコードする遺伝子（以下、「脂質合成遺伝子」）であり、例えば、アシルＣｏＡシンターゼ、グリセロール‐３−リン酸アシル基転移酵素、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素、脂肪酸鎖長延長酵素、Δ９脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、リゾリン脂質アシル基転移酵素遺伝子、ホスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子、脂肪酸合成酵素遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシル化酵素遺伝子、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。【００３９】
脂質合成能を持つ細胞、例えば、脂質生産菌等を宿主として脂質合成遺伝子を発現させた場合、該遺伝子から発現する脂質合成酵素が脂質及び／又は脂肪酸を合成するので、これを回収することができる。従って、本発明の形質転換体を培養することにより、高効率に脂質及び／又は脂肪酸を製造することができる。【００４０】
脂質又は脂肪酸は、本発明に従って形質転換した細胞から以下のようにして抽出することができる。生物（例えば、脂質生産菌又は酵母）の形質転換株について、培養終了後、遠心分離法、ろ過等の常法に従って培養細胞を得る。細胞を十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥細胞を、必要に応じて、ダイノミルや超音波等により破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又はメタノール及び石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。抽出した脂肪酸は、塩酸メタノール法等によってメチルエステル化してもよい。【００４１】
さらに、上記脂肪酸を含有する脂質からの脂肪酸の分離は、混合脂肪酸又は混合脂肪酸エステルの状態で、常法（例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法等）により濃縮分離することにより行うことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００４３】
モルティエレラアルピナのゲノム解析
Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキス  ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、ＤＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のＳｕｐｅｒ  Ｃｏｎｔｉｇが得られた。【００４４】
発現解析
Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０Ｌ培養槽（Ａｂｌｅ  Ｃｏ．，東京）に５Ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアジニン／ＣｓＣｌ法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。ＳＯＬｉＤＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｆｏｒ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（アプライドバイオシステムズ）により、ｃＤＮＡを合成し、ＳＯＬｉＤでシーケンシングを行った。【００４５】
プロモーター領域のクローニング
発現解析の結果より、Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株で発現量が多いと考えられる遺伝子のプロモーター領域、または、ガラクトース代謝系遺伝子のホモログのプロモーター領域を以下のとおりクローニングした。
まず、各プロモーター領域をＰＣＲにて増幅するためのプライマーを以下の通り設計した。なお、以下に示すプライマーの塩基配列において下線部は制限酵素認識部位を示す。プライマーはプロモーター領域両端にそれぞれＸｂａＩ、ＳｐｅＩ認識配列を付加するよう設計した。ただし、ＧＡＬ１０−２ｐに限り、配列中にＳｐｅＩ認識配列が存在するため、両端に共にＸｂａＩ認識配列を付加するよう設計した。プライマーの名称に含まれる「Ｆ」及び「Ｒ」は、そのプライマーがそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーであることを示す。【００４６】
プロモーターＰＰ７ｐ
2014157736.tif 000003
プロモーターＣＩＴ１ｐ
2014157736.tif 000004
プロモーターＰＰ３ｐ
2014157736.tif 000005
プロモーターＰＰ２ｐ
2014157736.tif 000006
プロモーターＰＰ６ｐｓ
2014157736.tif 000007
プロモーターＨＳＣ８２ｐ
2014157736.tif 000008
プロモーターＳＳＡ２ｐ
2014157736.tif 000009
プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ
2014157736.tif 000010
Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株のゲノムを鋳型としてＰＣＲにて各プロモーター領域をクローニングした。ポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（ＴａＫａＲａ）を使用した。【００４７】
プロモーター評価用ベクターの構築
大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子（配列番号２９）のコドンの使用をモルティエレラ属の微生物用に改変したＧＵＳｍ遺伝子（配列番号３１）（図１２Ａ及び図１２Ｂ）をレポーター遺伝子として用いた。
ＧＵＳｍを恒常的発現プロモーターであるヒストンプロモーター（ＨｉｓＰ）を含むプラスミドｐＢＩＧ３５（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００９），ｖｏｌ．７５，ｐ．５５２９−５５３５）に連結し、発現カセットを構築した。当該発現カセットを、さらに、ウラシル要求性のマーカー遺伝子（ｕｒａ５）とタンデムに連結させ、形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＧ３５ＺｈＧＵＳｍを構築した（図１）。なお、ベクターに使用したＧＵＳｍ遺伝子はコドン使用頻度をＭ．ａｌｐｉｎａに合わせて人工的に合成したβ−Ｄ−グルクロニダーゼ遺伝子である。Ｕｒａ５は、Ｍ．ａｌｐｉｎａのオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子である。ＨｉｓＰは、Ｍ．ａｌｐｉｎａのヒストンＨ４．１遺伝子のプロモーターである。ＳｄｈＢｔは、Ｍ．ａｌｐｉｎａのコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のターミネーターである。ＣｏｌＥ１  ｏｒｉは、複製起点、ＮＰＴＩＩはカナマイシン耐性遺伝子、ＴｒｆＡはプラスミドの増幅にかかる遺伝子であり、Ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒとＲｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒは遺伝子転移のための繰返し配列である。
上述のとおりクローニングしたプロモーター領域を制限酵素ＸｂａＩとＳｐｅＩ、またはＸｂａＩで切り出し、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ消化したベクターｐＢＩＧ３５ＺｈＧＵＳｍにＨｉｓＰの代わりに挿入した。【００４８】
モルティエレラ・アルピナの形質転換
Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株より特許文献（ＷＯ２００５／０１９４３７）に記載された方法にしたがって誘導したウラシル要求性株Δｕｒａ−３を０．０５ｍｇ／ｍＬウラシル含有Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地（３％スクロース、０．２％  ＮａＮＯ３、０．１％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％  ＫＣｌ、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％寒天、ｐＨ６．０）で培養して得た培養物を集菌し、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でろ過することで、Ｍ．ａｌｐｉｎａΔｕｒａ−３の胞子懸濁液を調製した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８Ｃ１）に、作製した各プロモーター評価用ベクターをエレクトロポレーションで形質転換し、ＬＢ−Ｍｇ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、８５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ  ＮａＯＨ、１．５％寒天、ｐＨ７．０）上で２８℃、４８時間培養した。ＰＣＲ法で当該ベクターを含むアグロバクテリウムを確認した。当該ベクターを有するアグロバクテリウムを１００ｍＬ  ＭＭ培地（１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、９μＭ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．０）で２８℃、１２０ｒｐｍ、２日間振とう培養し、５，８００×ｇで遠心分離し、新鮮なＩＭ培地（ＭＭ培地に０．５％グリセロール、２００μＭアセトシリンゴン、４０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を加え、ｐＨ５．３に調製）を加えて懸濁液を調製した。当該懸濁液を、８〜１２時間、２８℃、３００ｒｐｍでＯＤ  ６６０＝０．４−３．７になるまで振とう培養した。当該菌懸濁液１００μＬを、等量の前記Ｍ．ａｌｐｉｎａΔｕｒａ−３懸濁液（１０８ｍＬ−１）と混合し、ニトロセルロース膜（直径７０ｍｍ；ｈａｒｄｅｎｅｄ  ｌｏｗ−ａｓｈ  ｇｒａｄｅ  ５０、Ｗｈａｔｍａｎ）を載せた共培養培地（ＩＭ培地と同様の組成、ただし、１０ｍＭグルコースの代わりに５ｍＭグルコース及び１．５％寒天を含む）上に塗布し、２３℃で２−５日間培養した。共培養後、当該膜をウラシルフリー、０．０３％  Ｎｉｌｅ  ｂｌｕｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）を含むＳＣ寒天培地（５．０ｇ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ）、１．７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、、２０ｇグルコース、２０ｍｇアデニン、３０ｍｇチロシン、１．０ｍｇメチオニン、２．０ｍｇアルギニン、２．０ｍｇヒスチジン、４．０ｍｇリジン、４．０ｍｇトリプトファン、５．０ｍｇスレオニン、６．０ｍｇイソロイシン、６．０ｍｇロイシン、６．０ｍｇフェニルアラニン、寒天２０ｇ／Ｌ）に移し、２８℃で５日間培養した。視認可能な真菌コロニーからの菌糸を、ウラシルフリーＳＣ培地に移した。新鮮なウラシルフリーＳＣ培地に移す作業を２回おこなうことにより、形質を安定して保持する形質転換体を選抜した。【００４９】
高発現プロモーターの選抜
菌株の培養および回収
ＧＹ寒天培地（２％グルコース、１％酵母エキス、１．５％寒天）にて２８℃、２日間培養した。培養終了後の菌体は、菌体を寒天ごと削り取って回収した。【００５０】
菌体からのタンパク質の抽出
回収した菌体に５００μＬ破砕バッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を添加し、０．１ｍｍ径ガラスビーズを用いてＴＯＭＹ製ビーズショッカーにて５０００ｒｐｍ、３０ｓｅｃ、２回破砕した。８０００×ｇ、１０ｍｉｎ遠心し、回収した上清をさらに２０４００×ｇ、１０ｍｉｎ遠心し、上清をタンパク質溶液として回収した。タンパク質濃度を測定し、必要に応じて破砕バッファで任意の濃度に希釈した。以上の操作は全て氷上で行なった。【００５１】
ＧＵＳ活性測定
基質（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド）を終濃度１．２５ｍＭとなるようアッセイ用バッファ（２１．７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３３．９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．１１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解した。この基質溶液１６０μＬとタンパク質サンプル４０μＬとを９６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレート上で混合し、３７℃、４０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。０．０５、０．１、０．２、０．５ｍＭ  ｐ−ニトロフェノールの吸光度を測定して検量線を作成し、以下の計算式によって各サンプルのＧＵＳ活性値を算出した。
ＧＵＳ活性（ｎｍｏｌ／（ｍｇ・ｍｉｎ））＝
１０００×［（各サンプルにおける吸光度の経時変化グラフの勾配値）／（検量線グラフの勾配値）］／［（サンプルのタンパク質濃度）／５］【００５２】
タンパク質１ｍｇ／ｍＬが１分間にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドをｐ−ニトロフェノールに変換する量（ｎｍｏｌ）を１ユニットとしている。【００５３】
ＧＵＳ活性評価用株の選抜
各プロモーター評価用に選抜した安定形質転換株３０株を、上述のとおりＧＹ寒天培地で培養し、ＧＵＳ活性を測定した。３０株中で中程度のＧＵＳ活性を示した１０株を選抜した。【００５４】
プロモーター活性の評価
選抜した株をＧＹ液体培地１０ｍｌ、または大豆粉培地１０ｍｌにて、２８℃、３００ｒｐｍで５日間振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、ＧＵＳ活性を測定した。その平均値を当該プロモーターの活性として評価した。その結果を図２に示す。
評価したプロモーターは、ＧＹ培地および／または大豆粉培地において、既知のモルティエレラ由来のプロモーターであるＨｉｓＰやＧＡＰｐよりもプロモーター活性が高かった。【００５５】
培養時間と各プロモーターの活性の検討
培養時間によるプロモーター活性の変化を調べるため、各プロモーターにつき選抜した株をＧＹ液体培地  １０ｍｌ、２８℃にて２日間、５日間、７日間、１４日間、振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、ＧＵＳ活性を測定した。結果を表に示す。【００５６】
【表２】
2014157736.tif 000011
【００５７】
誘導型プロモーターの評価
プロモーターＧＡＬ１０−２ｐの評価は以下のとおり行った。
まず、安定形質転換株３０株をＳＣ＋ｇａｌ寒天培地（２％グルコースの代わりに２％ガラクトースを含むＳＣ寒天培地）にて２８℃、３日間培養し、上述のとおりＧＵＳ活性を測定し、中程度のＧＵＳ活性を示す株を１０株選抜した。ＧＹ液体培地に植菌し、４日目または７日目にガラクトースを２％になるように添加した。培養条件は、２８℃、３００ｒｐｍとした。培養開始２日目から１４日目までのＧＵＳ活性を図３に示す。プロモーターＧＡＬ１０−２ｐは、ガラクトースの添加により、発現誘導された。【００５８】
プロモーター活性に必要な領域の検討
各プロモーターのプロモーター活性に必要な領域を調べるため、各プロモーターの上流領域を削ったＤＮＡ断片を作製し、プロモーター活性を評価した。
ＤＮＡ断片を得るために、各プロモーターにつき以下のプライマーを作製した。なお、下線部は制限酵素認識部位である。【００５９】
ＰＰ７ｐ
プロモーターＰＰ７ｐ−Ｄ１０００増幅用プライマー
2014157736.tif 000012
プロモーターＰＰ７ｐ−Ｄ７５０増幅用プライマー
2014157736.tif 000013
プロモーターＰＰ７ｐ−Ｄ５００増幅用プライマー
2014157736.tif 000014
プロモーターＰＰ７ｐ−Ｄ２５０増幅用プライマー
2014157736.tif 000015
ＣＩＴ１ｐ
プロモーターＣＩＴ１ｐ−Ｄ１３００増幅用プライマー
2014157736.tif 000016
プロモーターＣＩＴ１ｐ−Ｄ１０００増幅用プライマー
2014157736.tif 000017
プロモーターＣＩＴ１ｐ−Ｄ７００増幅用プライマー
2014157736.tif 000018
プロモーターＣＩＴ１ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
2014157736.tif 000019
ＰＰ３ｐ
プロモーターＰＰ３ｐ−Ｄ１６００増幅用プライマー
2014157736.tif 000020
プロモーターＰＰ３ｐ−Ｄ１２００増幅用プライマー
2014157736.tif 000021
プロモーターＰＰ３ｐ−Ｄ８００増幅用プライマー
2014157736.tif 000022
プロモーターＰＰ３ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
2014157736.tif 000023
プロモーターＰＰ３ｐ−Ｄ２００増幅用プライマー
2014157736.tif 000024
ＰＰ２ｐ
プロモーターＰＰ２ｐ−Ｄ１２００増幅用プライマー
2014157736.tif 000025
プロモーターＰＰ２ｐ−Ｄ８００増幅用プライマー
2014157736.tif 000026
プロモーターＰＰ２ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
2014157736.tif 000027
プロモーターＰＰ２ｐ−Ｄ２００増幅用プライマー
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プロモーターＰＰ６ｐｓ増幅用プライマー
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プロモーターＰＰ６ｐｓ−Ｄ７５０増幅用プライマー
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プロモーターＰＰ６ｐｓ−Ｄ５００増幅用プライマー
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プロモーターＰＰ６ｐｓ−Ｄ１００増幅用プライマー
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ＨＳＣ８２ｐ
プロモーターＨＳＣ８２ｐ−Ｄ８００増幅用プライマー
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プロモーターＨＳＣ８２ｐ−Ｄ６００増幅用プライマー
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プロモーターＨＳＣ８２ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
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プロモーターＨＳＣ８２ｐ−Ｄ２００増幅用プライマー
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ＳＳＡ２ｐ
プロモーターＳＳＡ２ｐ−Ｄ８５０増幅用プライマー
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プロモーターＳＳＡ２ｐ−Ｄ６００増幅用プライマー
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プロモーターＳＳＡ２ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
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プロモーターＳＳＡ２ｐ−Ｄ２００増幅用プライマー
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ＧＡＬ１０−２ｐ
プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ−Ｄ２０００増幅用プライマー
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プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ−Ｄ１６００増幅用プライマー
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プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ−Ｄ１２００増幅用プライマー
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プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ−Ｄ８００増幅用プライマー
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プロモーターＧＡＬ１０−２ｐ−Ｄ４００増幅用プライマー
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【００６０】
各プロモーターの短縮型のプロモーターを作製するために、先に作製した各プロモーターの評価用ベクターを鋳型として、上記プライマーと、実施例で使用した各プロモーターの３´側に対応するリバースプライマー（ＰＰ７ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＣＩＴ１ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＰＰ３ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＰＰ２ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＰＰ６ｐｓ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＨＳＣ８２ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＳＳＡ２ｐ  Ｒ  ＳｐｅＩ、ＧＡＬ１０−２ｐ  Ｒ  ＸｂａＩ）を用いてＰＣＲをおこなった。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＸｂａＩとＳｐｅＩまたは、ＸｂａＩで切り出し、プロモーター評価用ベクターに挿入した。
項目「モルティエレラ・アルピナの形質転換」に記載の手法と同様にＭ．ａｌｐｉｎａを形質転換し、安定形質転換株を選抜した。実施例と同様にＧＵＳ活性を測定した。なお、培養日数は、各プロモーターの特性に応じて３日間（ＣＩＴ１ｐ）、５日間（ＰＰ７ｐ、ＰＰ６ｐ、ＨＳＣ８２ｐ、ＳＳＡ２ｐ、ＧＡＰｐ）、あるいは１０日間（ＰＰ３ｐ）とした。結果を図４〜１０に示す。【００６１】
ガラクトース誘導性のプロモーターの場合は、ＳＣ＋ｇａｌ寒天培地（２％グルコースの代わりに２％ガラクトースを含むＳＣ寒天培地）にて２８℃、３日間、あるいはＳＣ＋ｒａｆ培地（２％グルコースの代わりに２％ラフィノースを含むＳＣ液体培地）にて２８℃、３００ｒｐｍ、４日間にて前培養した後ガラクトースを終濃度２％となるよう添加しさらに１日間培養し、菌体のＧＵＳ活性を測定した。結果を図１１に示す。【００６２】
図４〜１１に示すように、上記表１に示す完全長プロモーター及び短縮型プロモーターはいずれも、５００ｎｍｏｌ／（ｍｇ・分）以上のＧＵＳタンパク質活性を発現することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により脂質生産菌内で目的遺伝子を高発現させることが可能であり、これによって効率的に目的のタンパク質、脂質及び脂肪酸を合成し、回収することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号３１〜８２：合成ＤＮＡ【００６５】
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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