(57)【要約】  １，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを併用することにより優れた抗うつ作用、うつに伴う認知機能改善作用、ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制改善作用及びストレス誘導ＧＳＫ−３β活性化抑制作用が得られる。従って、本願発明は抗うつ用併用剤、うつに伴う認知機能改善用剤、ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制改善剤及びストレス誘導ＧＳＫ−３β活性化抑制剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含有することを特徴とする、抗うつ用併用剤。
【請求項２】
食品である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含有することを特徴とする、ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制改善剤。
【請求項４】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含有することを特徴とする、ストレス誘導ＧＳＫ−３β活性化抑制剤。
【請求項５】
研究用試薬である、請求項３又は４に記載の剤。
【請求項６】
有効量の１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び有効量の１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを、それを必要とする対象に併用して投与することを特徴とする、うつを予防、改善及び／又は治療する方法。
【請求項７】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンで細胞・組織を処理することを特徴とする、ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制を改善する方法。
【請求項８】
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンで細胞・組織を処理することを特徴とする、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗うつ用併用剤、より詳細にはうつ病の治療、うつに伴う認知機能の改善のための２種類のホスファチジルコリンの併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病は精神疾患の中で一般的な疾患であるが、診断が見過ごされて治療が施されないことが多いため、罹患率が高く、患者は社会心理的な不適応に陥る。うつ病は、主に、激しい気分の変動が認められる両極性疾患と、重度の抑うつ状態を示すが躁状態は伴わないことを特徴とする大うつ病と、特定の診断基準（例えば、気分変調性障害）を満たさない、より不確定で軽症の両極性疾患および大うつ病とに分類することができる。【０００３】
うつ病の治療に有効な薬剤として、三環系抗うつ剤（ＴＣＡ）、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）が挙げられ、その多くは、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるカテコールアミン（ノルアドレナリンおよびドーパミン）およびインドールアミン（セロトニン）の利用性を増加させる。これらの薬剤の臨床的な有効性は、うつ病のカテコールアミン−インドールアミン仮説をもたらし、現在のうつ病の薬物治療はこの仮説に基づいている。【０００４】
しかしながら、例えば、ＴＣＡには副作用が伴い、ＥＫＧおよび血漿薬物濃度をモニターする必要がある。ＳＳＲＩには性機能に対する悪影響（主として、無オルガズム症および遅発射精）が報告されている。他の一般的な副作用には、睡眠障害、あくび、体重の変化、自殺志望、およびジストニー反応などの錐体外路様副作用が含まれる。
このように、既存の薬剤の有害な副作用を示さずに、効果が向上した新しいうつ病の治療薬の開発が望まれている。【０００５】
一方、本発明者は、ホスファチジルコリンに認知機能改善作用があること、及び特定の２種類のホスファチジルコリンの併用が認知機能の改善に対してより効果的であることを報告している（特許文献１）。しかしながら、特定の２種類のホスファチジルコリンの併用が、優れた抗うつ作用を発揮することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−７３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗うつ用併用剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、以前の研究から、特定の２種類のホスファチジルコリンの併用が、認知機能の改善に対してより効果的であることを見出している。当該併用について種々検討を行なう過程で、驚くべきことに、特定の２種類のホスファチジルコリン、即ち１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬ−ＰＣ）及び１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯ−ＰＣ）の併用にストレスによって誘導されるＡｋｔ活性化抑制（以下、ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制）を改善する作用、及びストレスによって誘導されるＧＳＫ−３β活性化（以下、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化）を抑制する作用があることを見出し、さらに、優れた抗うつ作用、うつに伴う認知機能改善作用があることを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有することを特徴とする、抗うつ用併用剤。
（２）食品である、上記（１）記載の剤。
（３）ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有することを特徴とする、ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制改善剤。
（４）ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有することを特徴とする、ストレス誘導ＧＳＫ−３β活性化抑制剤。
（５）研究用試薬である、上記（３）又は（４）に記載の剤。
（６）有効量のＤＬ−ＰＣ及び有効量のＰＯ−ＰＣを、それを必要とする対象に併用して投与することを特徴とする、うつを予防、改善及び／又は治療する方法。
（７）ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣで細胞・組織を処理することを特徴とする、ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制を改善する方法。
（８）ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣで細胞・組織を処理することを特徴とする、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する方法。
【発明の効果】
【０００９】
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は、ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制を改善する作用、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用を有し、それらの作用に基づいた各種研究用試薬（剤）、並びに抗うつ用併用剤及びうつに伴う認知機能改善剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用投与が、ストレス誘導性うつに伴う延長された無動時間を用量依存的に改善することを示したグラフである。拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、強制水泳試験を行なった。グラフ中、各カラムは、無動時間の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４〜９）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.  DL-/PO-PC: ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ
【図２】図２は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用投与が、ストレス誘導性記憶障害を改善することを示したグラフである。拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、水迷路試験を行った。グラフ中、各カラムは、滞納潜時の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝８）。Ｐ値、Dunnett’s test.  DL-/PO-PC: ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ
【図３】図３は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用投与が、習得潜時には影響を与えないことを示したグラフである。拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、水迷路試験を行った。グラフ中、各カラムは、習得潜時の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝８）。Ｐ値、Dunnett’s test.  DL-/PO-PC: ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ
【図４】図４は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用投与が、ＧＳＫ−３βのストレス誘導性の脱リン酸化を改善することを示すグラフである。拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に強制水泳試験を行ったマウスを用いて実験した。グラフ中、各カラムは、全ＧＳＫ−３βに対するSer9リン酸化されたＧＳＫ−３β（pS9）の割合の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. DL-/PO-PC: ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ
【図５】図５は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用投与が、Ａｋｔのストレス誘導性の脱リン酸化を改善することを示したグラフである。拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に強制水泳試験を行ったマウスを用いて実験した。グラフ中、各カラムは、全Ａｋｔに対するリン酸化Ａｋｔの割合の平均値(±SEM)を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.  DL-/PO-PC: ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は２種類の特定のホスファチジルコリンを併用することに特徴がある。本明細書中、２種類のホスファチルコリンを併用する本発明を、便宜上、本発明の併用剤とも称する。
一方のホスファチジルコリンは、下記式
【００１２】
【化１】
2015056675.tif 000002
【００１３】
（式中、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ２はそれぞれリノール酸残基である）
で表される、ジリノレオイルホスファチジルコリン（１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＤＬ−ＰＣ）である。
もう一方のホスファチジルコリンは、下記式
【００１４】
【化２】
2015056675.tif 000003
【００１５】
（式中、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３はパルミチン酸残基であり、−Ｃ（Ｏ）Ｒ４はオレイン酸残基である）
で表される、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＯ−ＰＣ）である。
【００１６】
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣは、その活性や安全性の面から誘導体化されていてもよい。例えば、水素添加、水酸化、アルキル化、ハロゲン化等の誘導体化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明に用いるＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣは、動物（卵黄など）、植物（大豆など）、真菌（酵母、カビ）などから単離精製されたもの、化学的に合成されたもの等、特に制限はない。そして本発明に用いるＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣは、これを医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、特に制限無く用いることができる。また、市販されているものを用いることもできる。
【００１８】
本発明の併用剤におけるＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの量は、それぞれ、該併用剤の投与形態（後述）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なる。通常、成人１日あたり、５０〜５００ｍｇ、好ましくは１００〜３００ｍｇのＤＬ−ＰＣ、及び５０〜５００ｍｇ、好ましくは１００〜３００ｍｇのＰＯ−ＰＣが対象に投与される。ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの摂取比は１：１程度であることが好ましい。ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣは併用することにより、それぞれを単独で用いた場合より、より少ない投与量とすることができる。
【００１９】
本発明の併用剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、
（１）ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを同時に製剤化して得られる単一の製剤としての投与、
（２）ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、
（３）ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、
（４）ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、
（５）ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与
等が挙げられる。
簡便性の観点から、単一の製剤としての投与、又は２種の製剤の同一経路での同時投与が好ましい。
【００２０】
以下、本発明において、「製剤」と称する場合は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣとを同時に製剤化して得られる単一の製剤、及びＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の各々、のいずれをも包含する。
【００２１】
本発明の併用剤は、有効成分であるＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２２】
一つの実施態様において、本発明の併用剤は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２３】
別の実施態様において、本発明の併用剤は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２４】
有効成分としてＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して抗うつ作用及びうつに伴う認知機能を改善する作用を有し、従ってＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、うつ病の治療（抗うつ用併用剤）、及びうつに伴う認知機能障害の改善剤として有用であり、医薬品として提供される（以下、単に本発明の医薬とも称する場合がある）。また、有効成分としてのＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用によるかかる薬理作用により、本発明はうつを予防、改善及び／又は治療する方法（以下、単に本発明の方法とも称する）を提供することができる。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、「治療」とは、うつ症状を示す被験体（対象）において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。「改善」とは、うつに伴う認知障害を示す被験体（対象）において、該症状を緩和、好ましくは日常生活に差し支えない程度にまで症状を緩和することを意味する。「予防」とは、うつ症状を示さない被験体（対象）において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味する。
【００２６】
また、本発明の併用剤は、食品として提供することができる。有効成分としてＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して抗うつ作用及びうつに伴う認知機能を改善する作用を有し、従って有効成分としてＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、うつ病やうつに伴う認知障害の予防や改善に効果的である。特にうつ病、うつに伴う認知機能障害の予防や改善に効果的な機能性食品として提供することができる。
【００２７】
本発明において「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の併用剤を食品として用いる場合には、食品としては、例えば、一般食品（例えば、パン、乳製品（例、牛乳、ヨーグルト）、菓子、キャンデー、飴、チョコレート、ケーキ、プリン、ゼリー、清涼飲料水、麺類）、健康食品、ダイエタリーサプリメント、並びに厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品及び栄養機能食品が挙げられる。該食品は、液状物（水溶性、不溶性）、粉末、顆粒、錠剤、カプセル等の固形物、ゼリー状等の半固形物などの任意の形態であり得る。本発明の併用剤は水又は所定の水溶液に溶解して用いることができる。このような場合、本発明の併用剤は溶解補助物（例、リノール酸）、安定化剤を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明の併用剤を食品として用いる場合、その摂取量は、用いる形態（例、液状物、固形物、半固形物）、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの含有濃度、並びにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ以外に含まれる成分の有無、種類及び量等によって異なり一概に云えないが、通常、食品中に、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの合計量が好ましくは３０％以上、より好ましくは９０％以上の割合で含められる。食品中のＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ以外の成分としては、上記した任意の添加物が挙げられる。
【００３０】
本発明の併用剤は、該併用剤の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
本発明の併用剤が、単一の製剤として提供される場合には、該併用剤の単位摂取量又はその分割量は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ両方の、即ち、ホスファチジルコリン全体の単位摂取量又はその分割量である。本発明の併用剤が、２種の製剤の併用として提供される場合には、該併用剤の単位摂取量又はその分割量は、ＤＬ−ＰＣの単位摂取量又は分割量と、ＰＯ−ＰＣの単位摂取量又はその分割量との組み合わせである。
【００３１】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬品あるいは食品としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬品あるいは食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬品あるいは食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬品あるいは食品はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００３２】
本発明の併用剤には、必須の有効成分であるＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣに加え、他の、うつ病やうつに伴う認知機能障害を治療又は改善し得る１種類以上の化合物を含めてもよい。
【００３３】
本発明において明らかになったＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用により提供される薬理作用としては以下のものが挙げられる。
（１）ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化を抑制する作用
ＧＳＫ−３βの抑制（ＧＳＫ−３βリン酸化）が抗うつ作用を示すことが数多く報告されている（参考文献）。拘束ストレス等のストレスによってＧＳＫ−３βのリン酸化が抑制されることは後述の実施例に示す通りであるが、ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用はかかるリン酸化の抑制を阻害するのみならず、リン酸化を促進することができる。
ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用はストレス誘導性のＧＳＫ−３β活性化を抑制することで抗うつ作用が期待できるので抗うつ剤として有用であると言える。
（参考文献）
Latapy C, RiouxV, Guitton MJ, Beaulieu JM. Selective deletion of forebrain glycogen synthase kinase 3β reveals a central role in serotonin-sensitive anxiety and social behaviour. Philos Trans R Soc Lond B BiolSci 2012;367(1601):2460-2474. 
【００３４】
（２）ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制を改善する作用
Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢとも称される）はセリンスレオニンリン酸化酵素の１種であり、その活性化にはスレオニン３０８基（Ｔｈｒ３０８）、セリン４７３基（Ｓｅｒ４７３）の２つのアミノ酸のリン酸化が必須であると考えられている。Ａｋｔは、細胞内タンパク質のセリン又はスレオニン残基を特異的にリン酸化する機能を有している。例えば、活性化されたＡｋｔはＧＳＫ−３βをリン酸化することで不活性化させる。
拘束ストレス等のストレスによってＡｋｔのリン酸化が抑制される（すなわちＡｋｔ活性化が抑制される）ことは後述の実施例に示す通りであるが、ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用はかかるリン酸化の抑制を阻害するのみならず、リン酸化を促進することができる。
ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用はストレス誘導性のＡｋｔ活性化抑制を改善することでＧＳＫ−３βの活性化を抑制することが考えられる（参考文献）。従って、ＤＬ−ＰＣとＰＯ−ＰＣとの併用は抗うつ作用が期待できるので抗うつ剤として有用であると言える。
（参考文献）
1. LeibrockC, Ackermann TF, Hierlmeier M, Lang F, Borgwardt S, Lang UE. Akt2 deficiency is associated with anxiety and depressive behavior in mice. Cell PhysiolBiochem 2013;32:766-777.
2. Marsden WN. Synaptic plasticity in depression: molecular, cellular and functional correlates. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2013;43:168-184.
【００３５】
有効成分としてＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対してストレスによって誘導されるＡｋｔ活性化抑制を改善する作用、及びストレスによって誘導されるＧＳＫ３β活性化を抑制する作用を有し、従ってＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを含有する本発明の併用剤は、ストレス誘導性Ａｋｔ活性化抑制改善剤、ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制剤として有用であり、試薬として提供される（以下、本発明の剤とも称する）。
本発明の剤で処理する対象となる細胞・組織は、活性型Ａｋｔや活性型ＧＳＫ−３βを発現し得る細胞・組織であれば特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の脳神経細胞、ＰＣ−１２細胞株（副腎髄質由来の褐色細胞腫）等の神経細胞モデル細胞株あるいは哺乳動物由来の脳組織である。ここで「処理」とは、上記細胞・組織と本発明の剤とを必要十分な時間接触させることであり、その時間は所望される効果や用いる細胞の種類によっても異なるが、通常１分〜１時間、好ましくは３〜３０分程度である。簡便には、本発明の剤を含有する溶液（例、培養液）中でインキュベートすることによって実施される。
【００３６】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３７】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実験方法及び材料）
動物に関する取扱い
全ての手法は兵庫医科大学動物実験委員会の認可を受け、ＮＩＨ（国立衛生研究所）の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。【００３９】
うつ病モデル
現在、実験動物の行動を用いたうつ病の研究では、うつ病の両側面である抗うつ剤の効能とストレスに対する反応が主に利用される。うつ病のモデルでは、主に孤立、電気ショック、強制的に水につけること、周辺環境や温度変化などのストレスを加えることにより、動物にうつ病を誘発する方法を使用している。本実験例では、拘束ストレス（restraint stress）の動物モデルを使用した。動けない狭い空間に実験動物を閉じ込めるストレスを加えて、うつ病に相当する症状を誘発し、試験化合物を投与した時、抗うつ効果があるか否かを調べた。雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを８週齢の時点でJapan SLC Inc. (Shizuoka. Japan)から入手した。マウスを１１．５ｃｍのプラスチック製のシリンダー（直径，２．７ｃｍ）に１日３時間閉じ込め、それを４日間連続して行いストレスを与えた。【００４０】
強制水泳試験
強制水泳試験は、化合物の抗うつ効果をスクリーニングするために用いられる行動学的な試験である。本実験例においても、拘束ストレスを４日間与え、その後ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、強制水泳試験を既報に従って行なった（Porsolt RD, Le Pichon M, Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature 1977;266:730-732.）。マウスを、１５ｃｍの高さまで水を満たしたプラスチック製のシリンダー（高さ：２５ｃｍ、直径：１０ｃｍ）に入れ２３℃で６分間放置した。後半の４分間の間に観察される、後肢を動かすことも泳ぐこともせず浮いている時間を、無動時間として測定し、うつ状態の指標とした。【００４１】
水迷路試験
雄性ウィスターラット（７週）を水迷路試験に用いた。円形のプラスチック製の水槽（直径９０ｃｍ、深さ３６ｃｍ）を用いた。水槽の内側は全て黒色に塗り、底から２０ｃｍまで墨汁で濁った水を満たした（２２℃）。黒色に塗ったプラットホーム（直径１１ｃｍ）を水中に置き、水面下０．５ｃｍ水没するようにした。水槽は試験室に置き、ラットが水槽から見られる目印を幾つか設けた。試験を行っている間は、目印の位置は変えずにおいた。プラットホームを水槽の中央と端から等距離のところにある一定の位置、すなわち、４分円の一つの中心に設けた。無作為に選択した５箇所のうちの一つに水槽の壁に向き合わせてラットを放し、プラットホーム上に退避するまでの時間（習得潜時：acquisition latency）を測定した。うまく退避できれば、ラットをそのままプラットホーム上で１０秒間滞在させた。９０秒以内にプラットホームを見つけることができなければ、試験は中止しプラットホーム上にマウスを１０秒間滞在させた。２分間隔で１日４回、連続して４日間試験を行なった。７日後、プラットホームを除去し、プラットホームがあった場所に到達するまでの時間（滞納潜時：retention latency、最大で３０秒）を測定した。【００４２】
ウエスタンブロッティング
細胞質画分、細胞膜画分及び全ライセートの蛋白質を1% (w/v)ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で溶解した。タンパク質をTGXゲル(BioRad, Hercules, CA, USA)を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳道で分離し、ポリビニリデンフルオライド膜に転写した。ブロッティング膜は5% (w/v)BSAを含むTBS-T[150 mMNaCl, 0.1% (v/v) Tween20及び20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、続いて、以下の抗体とそれぞれ反応させた。
抗ホスホ-スレオニン308-Akt(pThr308)抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
抗ホスホ-セリン473-Akt(pSer473)抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
抗Akt抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
抗ホスホ-GSK-3β(pSer9)抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
抗-GSK-3β抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)
洗浄後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG抗体あるいはヤギ抗マウスIgG抗体と反応させた。免疫反応性は、ECLキット(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて検出し、化学発光検出システム(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて可視化した。シグナル密度をImageQuant ソフトウェア(GE Healthcare)で測定した。【００４３】
（結果）
実験例１：ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は用量依存的にうつ状態を改善する。
４日間の拘束ストレスによりうつ状態にしたマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、強制水泳試験を行い、無動時間を測定することによってＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用の抗うつ効果を調べた。ポジティブコントロールとしては拘束ストレスを与えていないマウスを用い、ネガティブコントロールとしてはＰＥＧを用いた。
拘束ストレスを与えたマウス及び拘束ストレスを与えていないマウスに下記(i)〜（vi）のプロトコルに従って、ＤＬ−ＰＣ及び／又はＰＯ−ＰＣを経口ゾンデを用いて、ストレスモデル作成後から試験終了まで、１日１回経口投与した。
［投与プロトコル］
(i) ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (0.05 mg/kg) + PO-PC (0.05 mg/kg), PCとして0.1 mg/kg]
(ii) ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (0.25 mg/kg) + PO-PC (0.25 mg/kg), PCとして0.5 mg/kg]
(iii) ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (0.5 mg/kg) + PO-PC (0.5 mg/kg), PCとして1 mg/kg]
(iv) ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (2.5 mg/kg) + PO-PC (2.5 mg/kg), PCとして5 mg/kg]
(v) ＤＬ−ＰＣ単独 [1 mg/kg]
(vi) ＰＯ−ＰＣ単独 [1 mg/kg]
結果を図１に示す［(i)〜(iv)の結果：図１Ａ、(v)〜(vi)の結果：図１Ｂ］。ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを併用して投与することにより拘束ストレスによるうつ状態を改善できることがわかった。【００４４】
実験例２：ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用はストレス誘導性の記憶障害を改善する。
４日間の拘束ストレスによりうつ状態にしたマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与した後に、水迷路試験を行い、滞納潜時を測定することによってＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用の記憶障害改善作用を調べた。ポジティブコントロールとしては拘束ストレスを与えていないマウスを用い、ネガティブコントロールとしてはＰＥＧを用いた。マウスにはＰＥＧあるいはＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを、経口ゾンデを用いて投与した。
結果を図２に示す。ストレスにより滞納潜時が有意に延長した。この結果は、ストレスにより記憶障害（うつに伴う記憶障害）が誘導されることを示している。ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は、有意にストレス誘導性の滞納潜時の延長を改善した。この結果は、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用がストレス誘導性の記憶障害（うつに伴う記憶障害）を改善させる作用があることを意味する。
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は、ストレスを与えていない（即ちうつ状態ではない）場合の記憶機能に対しては影響を与えなかった。
一方、ストレスは習得潜時には影響を与えず、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用もストレスの有無にかかわらず習得潜時に影響を与えなかった（図３）。【００４５】
実験例３：ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は、ストレス誘発性のＧＳＫ−３βのＳｅｒ９での脱リン酸化を回復する（ストレス誘導性ＧＳＫ−３β活性化抑制）。
４日間の拘束ストレスによりうつ状態にしたマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与し、強制水泳試験を行った後、視床下部を単離し、試料を調製してウエスタンブロッティングによりＧｓｋ−３βのリン酸化の状態を調べた。ポジティブコントロールとしては拘束ストレスを与えていないマウスを用い、ネガティブコントロールとしてはＰＥＧを用いた。
拘束ストレスを与えたマウス及び拘束ストレスを与えていないマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを経口ゾンデを用いて、毎日１日１回経口投与した。
［投与プロトコル］
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (0.05 mg/kg) + PO-PC (0.05 mg/kg), PCとして0.1 mg/kg]
結果を図４に示す。拘束ストレスを与えることによりＧＳＫ−３βが脱リン酸化（即ちＧＳＫ−３βが活性化）され、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は当該脱リン酸化を改善（即ちＧＳＫ−３βが非活性化）することが確認された。この結果は、ストレスによってＧＳＫ−３βが脱リン酸化（ＧＳＫ−３βの活性化）し、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用はそのＧＳＫ−３βの脱リン酸化を改善する（ＧＳＫ−３βの非活性化）ことを示している。ＧＳＫ−３βの活性化はうつ状態を悪化させると考えられており、ＤＣＰ−ＬＡはＧＳＫ−３βの非活性化によりうつ病を改善する可能性を示唆している。【００４６】
実験例４：ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用はストレス誘導性のＡｋｔのＳｅｒ４７３での脱リン酸化を改善する（ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制の改善）。
４日間の拘束ストレスによりうつ状態にしたマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣ、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３日間経口投与し、強制水泳試験を行った後、視床下部を単離し、試料を調製してウエスタンブロッティングによりＡｋｔのリン酸化の状態を調べた。ポジティブコントロールとしては拘束ストレスを与えていないマウスを用い、ネガティブコントロールとしてはＰＥＧを用いた。
拘束ストレスを与えたマウス及び拘束ストレスを与えていないマウスにＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣを経口ゾンデを用いて、毎日１日１回経口投与した。
［投与プロトコル］
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用 [DL-PC (0.05 mg/kg) + PO-PC (0.05 mg/kg), PCとして0.1 mg/kg]
結果を図５に示す。ｐＴ３０８あるいはｐＳ４７３のシグナル強度は全Ａｋｔについての強度で標準化した。
拘束ストレスを与えることによりＡｋｔが脱リン酸化（即ちＡｋｔ活性化の抑制）されるが、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は当該脱リン酸化を改善（即ちＡｋｔ活性化抑制を改善）することが確認された。ＡｋｔはＧＳＫ−３βをリン酸化することで不活性化させることが知られているので、ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用により、Ａｋｔ活性化抑制を改善してＧＳＫ−３βのリン酸化（ＧＳＫ−３βの非活性化）に寄与することが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
ＤＬ−ＰＣ及びＰＯ−ＰＣの併用は、ストレス誘導Ａｋｔ活性化抑制に対する改善作用、ストレス誘導ＧＳＫ−３β活性化抑制作用を有し、それらの作用に基づいた各種研究用試薬（剤）、並びに抗うつ剤及びうつに伴う認知機能改善剤として有用である。【００４８】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−２１４４７５（出願日２０１３年１０月１５日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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