(57)【要約】  両方の抗原に対する高い結合能を保持し、商業生産プロセスにおいて効率的に生産され得る、新規なフォーマットの二重特異的抗体を提供することを課題とする。  二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの重鎖、２つの第１の軽鎖、及び２つの第２の軽鎖を含み、該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域、ＣＨ１領域、第１のリンカー、第２の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、該第１の軽鎖は、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含み、該第２の軽鎖は、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含み、該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの重鎖、２つの第１の軽鎖、及び２つの第２の軽鎖を含み、  該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域、ＣＨ１領域、第１のリンカー、第２の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、  該第１の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含み、  該第２の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、  該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、  該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体。
【請求項２】
以下のａ）〜ｃ）：ａ）請求項１に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；ｂ）請求項１に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びにｃ）請求項１に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から選択される、宿主細胞であって、  ここで、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の軽鎖のカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞。
【請求項３】
第２のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
二重特異的抗体を生産する方法であって、請求項２に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
【請求項６】
二重特異的抗体を生産する方法であって、請求項３に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項７】
培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第２のペプチドリンカーが切断される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である請求項９に記載の抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規なフォーマットの二重特異的抗体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  二重特異的抗体とは、２つの異なる抗原を認識し、それぞれの抗原に対する２つの抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体である。二重特異的抗体には種々のフォーマット（構造）が報告されている（Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐ．４９１，２０１０）。例えば、（１）一方の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ末端（Ｎ末端）側にリンカーを介してもう一方の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のカルボキシ末端（Ｃ末端）がそれぞれ連結された、四価の二重特異的抗体（ＤＶＤ−Ｉｇとも称する。特許文献１）、（２）各抗体の重鎖及び軽鎖をｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術によりＣＨ３を介して接合した、二価の二重特異的抗体（ＷＯ１９９８／０５０４３１）、（３）一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＣ末端が連結された、或いは一方の抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端にリンカーを介してもう一方の抗体のｓｃＦｖのＮ末端が連結された、四価の二重特異的抗体（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．２，ｐ．１５９，１９９７）等が報告されている。【０００３】  現在までに知られている二重特異的抗体のフォーマットのうち、上記（１）のフォーマットのような、一方のＩｇＧ型抗体のＮ末端側に別のＩｇＧ型抗体の可変領域が連結されたフォーマットは、連結された外側（Ｎ末端側）の抗体の可変領域の抗原結合能が維持されやすく、多様な抗体の組み合わせの二重特異的抗体を作製するのに適している。しかし、上記（１）のフォーマットの場合、内側（Ｃ末端側）に位置する可変領域と対応する抗原との親和性が低下する傾向がある（非特許文献１）。この親和性低下を回復するための１つの手段として、長いアミノ酸長のリンカーの使用及び柔軟性を有するリンカー配列の使用（特許文献１）が挙げられる。しかし、このようなリンカーは汎用的に使用できるものではなく、使用する２つの抗体に応じて内側の可変領域の親和性低下を生じないリンカーをスクリーニングする必要がある。また、別の手段として、二重特異的抗体の精製後に軽鎖中のリンカーを酵素的に切断すること等によって、内側に位置する可変領域の抗原結合能がある程度回復することが報告されている（非特許文献１）。しかし、酵素切断により外側（Ｎ末端側）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の構造を保つことができなくなり、安定性が低下する。また、抗体精製後のリンカー切断工程は抗体製造プロセスの煩雑化、抗体収率の低下をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２４１８８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「マブス（ｍＡｂｓ）」（米国）、２０１１；３（５）：４８７−４９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の課題は、２つの異なる抗原に対する高い結合能を保持し、商業生産プロセスにおいて効率的に生産され得る、新規なフォーマットの二重特異的抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、以下の発明を含んでもよい。［１］二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの重鎖、２つの第１の軽鎖、及び２つの第２の軽鎖を含み、  該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域、ＣＨ１領域、第１のリンカー、第２の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、  該第１の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含み、  該第２の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、  該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、  該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体。［２］以下のａ）〜ｃ）：ａ）［１］に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；ｂ）［１］に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びにｃ）［１］に記載の二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から選択される、宿主細胞であって、  ここで、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の軽鎖のカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞。［３］第２のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、［２］に記載の宿主細胞。［４］二重特異的抗体を生産する方法であって、［２］に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。［５］［４］に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。［６］二重特異的抗体を生産する方法であって、［３］に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。［７］培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第２のリンカーが切断される、［６］に記載の方法。［８］［６］又は［７］に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。［９］［１］に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。［１０］Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である［９］に記載の抗原結合フラグメント。【０００８】  本発明はまた、以下の発明を含むものである。［１１］二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの軽鎖、２つの第１の重鎖のフラグメント、及び２つの第２の重鎖を含み、  該軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域、第１の軽鎖定常領域、第１のリンカー、第２の軽鎖可変領域、及び第２の軽鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖のフラグメントは、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域及びＣＨ１領域を含み、  該第２の重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、  該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、  該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体。［１２］以下のａ）〜ｃ）：ａ）［１１］に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；ｂ）［１１］に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びにｃ）［１１］に記載の二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から選択される、宿主細胞であって、  ここで、該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の重鎖のフラグメントのカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の重鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞。［１３］第２のリンカーが細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、［１２］に記載の宿主細胞。［１４］二重特異的抗体を生産する方法であって、［１２］に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。［１５］［１４］に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。［１６］二重特異的抗体を生産する方法であって、［１３］に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。［１７］培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第２のリンカーが切断される、［１６］に記載の方法。［１８］［１６］又は［１７］に記載の方法によって生産できる二重特異的抗体。［１９］［１１］に記載の二重特異的抗体の抗原結合フラグメント。［２０］Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である［１９］に記載の抗原結合フラグメント。
【発明の効果】
【０００９】  本発明の新規なフォーマットの二重特異的抗体によって、２つの異なる抗原に対する高い結合能を保持し、商業生産プロセスにおいて効率的に生産することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の二重特異的抗体の構造例（タンデムフォームａ及びｂ）、並びに参照の二重特異的抗体の構造例（タンデムフォームｃ、タンデムフォームｄ及びＤＶＤ−Ｉｇフォームｂ）を示す。図中、ＶＨ（１）及びＶＬ（１）は、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を示し、ＶＨ（２）及びＶＬ（２）は、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を示す。
【図２】タンデムフォームａ及びｃの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。図中、バンド１は重鎖、バンド２は未切断の軽鎖（軽鎖フラグメント）、バンド３及び４はプロテアーゼによるリンカー切断により生じた各軽鎖を示す。
【図３】各種プロテアーゼ認識配列を有するタンデムフォームａの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。左はＥｘｐｉ２９３細胞で発現させた抗体、右はＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させた抗体の分析結果である。レーン１、２、３、及び４は、それぞれ配列番号５、６、７、及び８のプロテアーゼ認識配列を有するリンカーを用いて発現させたタンデムフォームａの結果である。
【図４】タンデムフォームｂのヒトＴＬＲ２に対する中和活性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】  以下に、本発明について詳述する。
【００１２】  抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在し、抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００１３】  鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにアミノ末端（Ｎ末端）側に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりカルボキシ末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは重鎖定常領域（ＣＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）とよばれている。重鎖定常領域（ＣＨ）はさらに、Ｎ末端側からＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つの領域に分けられる。抗体の重鎖定常領域のＣＨ１領域とＣＨ２領域との間にある領域はヒンジ領域とよばれ、重鎖可変領域及びＣＨ１領域からなる構造の可動性に関与している。
【００１４】＜本発明の二重特異的抗体＞  本発明の二重特異的抗体には、以下の（１）及び（２）に記載の二重特異的抗体が含まれる：（１）重鎖連結二重特異的抗体  二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの重鎖、２つの第１の軽鎖、及び２つの第２の軽鎖を含み、  該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域、ＣＨ１領域、第１のリンカー、第２の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、  該第１の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含み、  該第２の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、  該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、  該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体。（２）軽鎖連結二重特異的抗体  二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、２つの軽鎖、２つの第１の重鎖のフラグメント、及び２つの第２の重鎖を含み、  該軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域、第１の軽鎖定常領域、第１のリンカー、第２の軽鎖可変領域、及び第２の軽鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖のフラグメントは、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域及びＣＨ１領域を含み、  該第２の重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、  該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、  該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、  該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、二重特異的抗体。
【００１５】  本明細書中で「二重特異的抗体」とは、２つの異なる抗原を認識し、それぞれの抗原に対する２つの抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体を意味する。本明細書中で「抗原」とは、抗体が結合する任意の物質（例えば、蛋白質）又はその部分を意味する。本発明の二重特異的抗体が認識する抗原の組み合わせは限定されず、当業者は、例えば、異なる蛋白質に対する２つの抗体の組み合わせ、又は同一の蛋白質の互いに異なる部分に結合する２つの抗体の組み合わせ等、目的の治療適用に応じて、２つの抗体の組み合わせを適宜選択し得る。本発明の二重特異的抗体の構造の例を図１（タンデムフォームａ及びｂ）に示す。
【００１６】  本発明の二重特異的抗体で使用される第１及び第２の重鎖可変領域並びに第１及び第２の軽鎖可変領域としては、ヒト抗体、ヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、任意の形態の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を用いることができる。
【００１７】  ＣＨ１領域は、どのようなサブクラスの重鎖定常領域（例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、又はＩｇγ４の定常領域）のＣＨ１領域も選択可能である。１つの実施形態において、重鎖における第１の重鎖可変領域とリンカーの間のＣＨ１領域は、ヒトＩｇγ１定常領域のＣＨ１領域である。
【００１８】  重鎖定常領域は、どのようなサブクラスの重鎖定常領域（例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、又はＩｇγ４の定常領域）も選択可能であり、前記ＣＨ１領域のサブクラスと同じであっても、異なってもよい。好ましくは、前記ＣＨ１領域のサブクラスと重鎖定常領域のサブクラスは同じである。１つの実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇγ１定常領域である。
【００１９】  第１の軽鎖定常領域及び第２の軽鎖定常領域は、どのようなサブクラスの軽鎖定常領域（例えば、Ｉｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり、互いに同一であっても、異なってもよい。１つの実施形態において、第１の軽鎖定常領域及び第２の軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。
【００２０】  第１のリンカーは、重鎖連結二重特異的抗体についてはＣＨ１領域と第２の重鎖可変領域とを連結し、軽鎖連結二重特異的抗体については第１の軽鎖定常領域と第２の軽鎖可変領域とを連結し、二重特異的抗体がその機能を有する限り、任意のペプチド（ペプチドリンカー）を使用し得る。第１のリンカーの長さ及びアミノ酸配列は、当業者に適宜選択され得る。好ましくは、第１のリンカーは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０個、さらに好ましくは、１５〜５０個のアミノ酸からなるペプチドである。好ましい第１のリンカーとしては、アミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒとも表す）を含むペプチドリンカー（ＧＳリンカーとも称する）であり、好ましくは、複数の、より好ましくは、３〜５個の（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒを含む。第１のリンカーの例としては、配列番号２のアミノ酸番号２２２から２３６までのアミノ酸配列からなるペプチドリンカー（（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3とも表す）である。
【００２１】  本発明の二重特異的抗体は、異なる２つの抗原に対する結合活性を有する。各抗原に対する結合活性を有するか否かは、当該分野で公知の測定方法を用いて確認することができる。このような測定方法としては、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析等の方法が挙げられ、目的の抗原に応じて当業者に適宜選択される。
【００２２】  本発明には、本発明の二重特異的抗体の抗原結合フラグメントも含まれる。本発明の二重特異的抗体の抗原結合フラグメントとは、第１及び第２の重鎖可変領域並びに第１及び第２の軽鎖可変領域を含み、各２つの抗原に対する結合活性を有する二重特異的抗体のフラグメントを意味し、代表的な抗原結合フラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）2が挙げられる。
【００２３】  重鎖連結二重特異的抗体について、Ｆａｂとは、重鎖の第１の重鎖可変領域から重鎖定常領域のヒンジ領域の一部までの領域からなる重鎖のフラグメント、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ’とは、重鎖の第１の重鎖可変領域から重鎖定常領域のヒンジ領域の一部までの領域からなる重鎖のフラグメント、第１の軽鎖、及び第２の軽鎖を含む、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2とは、２つのＦａｂ’がヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントである。
【００２４】  軽鎖連結二重特異的抗体について、Ｆａｂとは、軽鎖（第１の軽鎖可変領域から第２の軽鎖定常領域までを含む）、第１の重鎖のフラグメント、並びに第２の重鎖の重鎖可変領域及び重鎖定常領域のＣＨ１領域とヒンジ領域の一部からなる第２の重鎖のフラグメントを含む、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ’とは、軽鎖（第１の軽鎖可変領域から第２の軽鎖定常領域までを含む）、第１の重鎖のフラグメント、並びに第２の重鎖の重鎖可変領域及び重鎖定常領域のＣＨ１領域とヒンジ領域の一部からなる第２の重鎖のフラグメントを含む、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2とは、２つのＦａｂ’がヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した、二重特異的抗体の抗原結合フラグメントである。
【００２５】＜本発明の宿主細胞＞  本発明の宿主細胞には、以下の特徴を有する宿主細胞が含まれる：（１）重鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞  以下のａ）〜ｃ）：ａ）重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；ｂ）重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びにｃ）重鎖連結二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から選択される、宿主細胞であって、  ここで、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の軽鎖のカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞。（２）軽鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞  以下のａ）〜ｃ）：ａ）軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；ｂ）軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びにｃ）軽鎖連結二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から選択される、宿主細胞であって、  ここで、該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の重鎖のフラグメントのカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の重鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーはプロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞。
【００２６】  本発明の宿主細胞を作るために用いる細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、本発明の二重特異的抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞等の種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（例えば、エシェリキア属菌）、酵母（例えば、サッカロマイセス属、ピキア属））が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。
【００２７】  第２のリンカーは、プロテアーゼ認識配列を含むペプチド（ペプチドリンカー）であり、重鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞について、第２のリンカーは、第１の軽鎖と第２の軽鎖を連結し、軽鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞について、第２のリンカーは、第１の重鎖のフラグメントと第２の重鎖を連結する。第２のリンカーの長さは、当業者に適宜選択され得るが、好ましくは、第２のリンカーは、５個〜６０個のアミノ酸からなるペプチドである。プロテアーゼ認識配列としては、当該分野で公知の種々のプロテアーゼ認識配列が使用され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３，Ｎｏ．３０，ｐ２０８９７，２００８）。好ましくは、プロテアーゼ認識配列は、宿主細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列である。細胞内プロテアーゼ認識配列としては、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列（細胞内プロテアーゼＦｕｒｉｎ、ＰＣ７、及びＰＡＣＥ４が認識する）、配列番号６に示されるアミノ酸配列（ＰＣ７及びＰＡＣＥ４が認識する）、配列番号７に示されるアミノ酸配列（Ｆｕｒｉｎが認識する）、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列（Ｆｕｒｉｎが認識する）が挙げられる。第２のリンカーは、プロテアーゼ認識配列からなるペプチドであるか、或いはプロテアーゼ認識配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側にさらなるアミノ酸配列を含んでもよい。さらなるアミノ酸配列の例としては、（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒが挙げられ、例えば、第２のリンカーは、１又は数個の（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒを含む。第２のリンカーの例としては、配列番号９、１０、１１、又は１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーが挙げられる。
【００２８】  １つの実施形態において、重鎖連結二重特異的抗体を作製するための本発明の宿主細胞は、上記（１）のａ）及びｂ）から選ばれる宿主細胞であり、第２のリンカーが宿主細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞である。
【００２９】  １つの実施形態において、軽鎖連結二重特異的抗体を作製するための本発明の宿主細胞は、上記（２）のａ）及びｂ）から選ばれる宿主細胞であり、第２のリンカーが宿主細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞である。
【００３０】  重鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞において使用される該二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド並びに該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、軽鎖連結二重特異的抗体を作製するための宿主細胞において使用される該二重特異的抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド並びに該二重特異的抗体の第１の重鎖のフラグメント及び第２の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、まとめて「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）は、二重特異的抗体の重鎖及び軽鎖、並びに第１及び第２のリンカーの各アミノ酸配列に基づいて設計した塩基配列に従って、当該分野で公知の遺伝子合成方法（例えば、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法）を使用して、当業者によって容易に作製され得る。
【００３１】  本発明の宿主細胞において使用される発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明のポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、例えば、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の発現ベクターを使用することができる。
【００３２】  本発明の宿主細胞において使用される発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で当該ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
【００３３】  宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明のポリヌクレオチドの５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、或いは複製可能単位等を含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００３４】  発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
【００３５】＜本発明の二重特異的抗体を生産する方法、及び該方法により生産できる二重特異的抗体＞  本発明の二重特異的抗体を生産する方法には、本発明の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、二重特異的抗体を生産する方法が含まれる。
【００３６】  本発明の宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．３３７３，ｐ．４３２，１９５９）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．３，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，Ｎｏ．８，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．１，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．２４，ｐ．８４０４，１９８５）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源、又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類等）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｖｏｌ．３，Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜４３℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．８，ｐ．４５０４，１９８０）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の二重特異的抗体を発現させることができる。
【００３７】  １つの実施形態において、使用される本発明の宿主細胞における第２のリンカーは、細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである。
【００３８】  １つの実施形態において、重鎖連結二重特異的抗体を作製するために使用される本発明の宿主細胞は、＜本発明の宿主細胞＞（１）のａ）及びｂ）から選ばれる宿主細胞であり、第２のリンカーが宿主細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞である。
【００３９】  １つの実施形態において、軽鎖連結二重特異的抗体を作製するために使用される本発明の宿主細胞は、＜本発明の宿主細胞＞（２）のａ）及びｂ）から選ばれる宿主細胞であり、第２のリンカーが宿主細胞内の細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、宿主細胞である。
【００４０】  好ましい実施形態において、使用される本発明の宿主細胞における第２のリンカーは、細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーであり、培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第２のリンカーが切断される。
【００４１】  本発明の二重特異的抗体を生産する方法は、本発明の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程に加えて、必要に応じて、第２のリンカー中のプロテアーゼ認識配列を切断し得るプロテアーゼにより二重特異的抗体を処理する工程を含んでもよい。プロテアーゼ処理工程を行うか否かは、使用するプロテアーゼ認識配列、宿主細胞、培養条件等に基づき当業者により適宜選択され得る。プロテアーゼ処理工程は、使用するプロテアーゼ認識配列に応じて、当該分野で公知の方法を用いて実施することができる。例えば、第２のリンカー中のプロテアーゼ認識配列としてプレシジョンプロテアーゼ認識配列（配列番号１３）を用い、培養工程後にプレシジョンプロテアーゼ（ＧＥヘルスケアジャパン社）による処理を行ってもよい。
【００４２】  本発明の二重特異的抗体を生産する方法は、本発明の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程に加えて、さらには、該宿主細胞から二重特異的抗体を回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００４３】  本発明の二重特異的抗体には、本発明の二重特異的抗体を生産する方法で生産できる二重特異的抗体も含まれる。
【００４４】  本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４５】  市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表わす。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。【００４６】（実施例１：二重特異的抗体の作製）  本実施例では、本発明の二重特異的抗体として以下の２種類の二重特異的抗体を作製した。  １）抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖のＮ末端側に抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域及びＣＨ１領域をリンカーを介して連結した重鎖、抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖、及び抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖を含む二重特異的抗体（図１、タンデムフォームａと称する）；並びに  ２）タンデムフォームａの抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をそれぞれ置き換えた二重特異的抗体（図１、タンデムフォームｂと称する）【００４７】  ＜タンデムフォームａの作製＞  二重特異的抗体の重鎖をコードする遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ．，Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６，ｐ．４９９，１９８７）をコードする遺伝子を繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。この二重特異的抗体の重鎖の塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２のアミノ酸番号１から１１７までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域である。配列番号２のアミノ酸番号１１８から２２１までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトＩｇγ１のＣＨ１領域である。配列番号２のアミノ酸番号２２２から２３６までのアミノ酸配列からなる領域は、リンカー配列である。配列番号２のアミノ酸番号２３７から３５５までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域である。配列番号２のアミノ酸番号３５６から６８５までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトＩｇγ１の重鎖定常領域である。【００４８】  抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖のＮ末端にリンカーを介して抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖のＣ末端が連結されたポリペプチドをコードする遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．６，ｐ．４９９，１９８７）をコードする遺伝子を繋げ、この軽鎖ポリペプチド遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。この軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域である。配列番号４のアミノ酸番号１０９から２１４までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトＩｇκの定常領域である。配列番号４のアミノ酸番号２１５から２７０までのアミノ酸配列からなる領域は、リンカー配列（配列番号９）である。配列番号４のアミノ酸番号２７１から３７８までのアミノ酸配列からなる領域は、抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域である。配列番号４のアミノ酸番号３７９から４８４までのアミノ酸配列からなる領域は、ヒトＩｇκの定常領域である。【００４９】  二重特異的抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）又はライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）で約３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３細胞（ライフテクノロジーズ社）に対し、遺伝子導入試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、精製抗体を得た。【００５０】  ＜タンデムフォームｂの作製＞  配列番号１に示される塩基配列において抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域をコードする部分（配列番号１の塩基番号１から３５１まで）と抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域（配列番号１の塩基番号７０９から１０６５まで）を置き換えた塩基配列を有する重鎖遺伝子を作製し、タンデムフォームａの重鎖ベクターと同様にして重鎖のＧＳベクターを作製した。配列番号３に示される塩基配列において抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖をコードする部分（配列番号３の塩基番号１から３２４まで）と抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖をコードする部分（配列番号３の塩基番号８１１から１１３４まで）を置き換えた塩基配列を有する軽鎖ポリペプチド遺伝子を作製し、タンデムフォームａの軽鎖ポリペプチドベクターと同様にして軽鎖ポリペプチドのＧＳベクターを作製した。両ＧＳベクターを用いて、タンデムフォームａと同様の方法で二重特異的抗体を発現させ、タンデムフォームｂの精製抗体を得た。【００５１】  ＜タンデムフォームｃの作製＞  配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖ポリペプチドにおいてリンカー配列（配列番号４のアミノ酸番号２１５から２７０までのアミノ酸配列からなる）を（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3に置換した軽鎖ポリペプチドを用いることを除き、タンデムフォームａと同様の方法を用いて、参照の二重特異的抗体（タンデムフォームｃと称する）を作製した。【００５２】  タンデムフォームａ及びｃの精製抗体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。タンデムフォームａについては、軽鎖ポリペプチドが細胞内プロテアーゼにより切断され、抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖と抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖に分かれていた（図２中、バンド３及び４）。一方、タンデムフォームｃは、軽鎖間のリンカーにプロテアーゼ認識部位を含まないため、両方の軽鎖が連結された状態で発現された（図２中、バンド２）。【００５３】  ＜タンデムフォームｄの作製＞  タンデムフォームｂの軽鎖ポリペプチドにおいてリンカー配列（配列番号９のアミノ酸配列からなる）を（（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ）3に置換した軽鎖ポリペプチドを用いることを除き、タンデムフォームｂと同様の方法を用いて、参照の二重特異的抗体（タンデムフォームｄと称する）を作製した。【００５４】（参考例：参照抗体の作製）  ���ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂ＞  参照抗体として、ＤＶＤ−Ｉｇ型の二重特異的抗体（ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂと称する）を作製した。該二重特異的抗体における抗ヒトＴＬＲ４抗体部分及び抗ヒトＴＬＲ２抗体部分の可変領域としては、タンデムフォームｂで用いた各可変領域と同じ可変領域を用い、重鎖及び軽鎖の定常領域としては、それぞれヒトＩｇγ１定常領域及びヒトＩｇκ定常領域を用いた。培養及び精製方法としてはタンデムフォームｂと同様の方法を用い、各精製抗体を得た。【００５５】  文献（非特許文献１）に記載の方法に従い、抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖及び軽鎖のＮ末端にリンカーを介して抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそれぞれ連結されたＤＶＤ−Ｉｇ型の二重特異的抗体を作製した（図１、ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂと称する）。重鎖のリンカーとして、タンデムフォームａの重鎖で用いたリンカーと同じリンカーを用いた。軽鎖のリンカーとして、プレシジョンプロテアーゼ認識配列である配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるリンカーを用いた。精製抗体は、プロテアーゼ反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、プレシジョンプロテアーゼ（ＧＥヘルスケアジャパン社）５ｕｎｉｔ）にて酵素処理を行った。酵素処理後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＧＥヘルスケアジャパン社）にてプロテアーゼを除去し、実施例１０において使用した。【００５６】  ＜ＩｇＧ型抗体の作製＞  参照抗体として、以下のＩｇＧ型の抗ヒトＴＬＲ２抗体（ＴＬＲ２−ＩｇＧと称する）及び抗ヒトＴＬＲ４抗体（ＴＬＲ４−ＩｇＧと称する）を作製した。  ＴＬＲ２−ＩｇＧ：タンデムフォームａで用いた抗ヒトＴＬＲ２抗体の重鎖可変領域及びヒトＩｇγ１定常領域を含む重鎖、並びにタンデムフォームａで用いた抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖可変領域及びヒトＩｇκ定常領域を含む軽鎖を含む、ＩｇＧ抗体  ＴＬＲ４−ＩｇＧ：タンデムフォームａで用いた抗ヒトＴＬＲ４抗体の重鎖可変領域及びヒトＩｇγ１定常領域を含む重鎖、並びにタンデムフォームａで用いた抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖可変領域及びヒトＩｇκ定常領域を含む軽鎖を含む、ＩｇＧ抗体【００５７】  タンデムフォームａと同様に、各抗体の重鎖及び軽鎖がそれぞれ挿入されたＧＳベクターを作製し、各ＧＳベクターから重鎖及び軽鎖の両発現ベクターを構築した。培養及び精製方法としてはタンデムフォームａと同様の方法を用い、各精製抗体を得た。【００５８】（実施例２：ヒトＴＬＲ４に対する結合活性評価−タンデムフォームａ）  実施例１で作製したタンデムフォームａ（外側に抗ヒトＴＬＲ２抗体部分を、内側に抗ヒトＴＬＲ４抗体部分を有する二重特異的抗体フォーマット）のヒトＴＬＲ４に対する結合活性を評価するために、細胞ＥＬＩＳＡを実施した。参照抗体として、タンデムフォームｃ及びＴＬＲ４−ＩｇＧを用いた。ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２発現ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルでＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  ポリＤ−リジン３８４ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にα−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社）を用いて播種し、一晩培養した。翌日培地を捨てて、希釈液（１％ウシ血清由来アルブミン���ＢＳＡ）及び１０ｍＭ  ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）含有ハンクス緩衝塩溶液）で希釈した各精製抗体（タンデムフォームａ、タンデムフォームｃ、又はＴＬＲ４−ＩｇＧ）の希釈溶液（タンデムフォームａ及びｃは最終濃度１００ｎＭから０．００００５ｎＭの濃度域で、ＴＬＲ４−ＩｇＧは最終濃度９９ｎＭから０．００００５ｎＭの濃度域で、それぞれ公比５倍の１０段階希釈系列）を３０μＬ添加した。３７℃にて１時間培養した後、洗浄液（０．１％ＢＳＡ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ハンクス緩衝塩溶液）にて洗浄し、洗浄液で５０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社）を添加した。３７℃にて１時間培養した後、洗浄液で洗浄し、呈色試薬であるＴＭＢ（ＭＯＳＳ社）２５μＬを加えた。２０分後に１Ｍ硫酸２５μＬを添加して呈色反応を停止させ、その呈色強度をＳａｆｉｒｅ  ＩＩ（テカン社）で測定することで、抗体の結合活性を評価した。得られた測定結果を用いて統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）による４パラメータロジスティック曲線回帰から、各抗体の５０％効果濃度（ＥＣ50）を算出した。【００５９】  結果を表１に示す。タンデムフォームｃと比較して、軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームａにおいて、内側の抗ヒトＴＬＲ４抗体部分の抗原結合能が上昇したことが明らかとなった。この結果から、本発明の二重特異的抗体において内側の可変領域の抗原結合能が回復されることが示された。表１：ヒトＴＬＲ４に対する結合活性【表１】
2016080510.tif 000002
【００６０】（実施例３：ヒトＴＬＲ２に対する結合活性評価−タンデムフォームａ）  実施例１で作製したタンデムフォームａのヒトＴＬＲ２への結合活性を評価するために、ＳＰＲ解析を実施した。参照抗体として、タンデムフォームｃ及びＴＬＲ２−ＩｇＧを用いた。ＳＰＲ解析においては、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いた。ＣＭ５センサーチップにＨｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社、２８−９９５０−５６）とＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社、ＢＲ−１０００−５０）を用いてＡｎｔｉ−Ｈｉｓ  ＩｇＧ（Ｈｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ付属）を固定した。流路Ｎｏ．１をリファレンスとし、この流路にはヒトＴＬＲ２蛋白質を結合させず、その他の流路（Ｎｏ．２）に、ＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアジャパン社、ＢＲ−１００６−６９）で０．６６μｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＬＲ２蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、２６１６ＴＲ／ＣＦ）を流速５μＬ／分にて２分間添加し固相化させた。その後、各精製抗体（タンデムフォームａ、タンデムフォームｃ、又はＴＬＲ２−ＩｇＧ）をＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒで系列希釈した溶液（最終濃度１００ｎＭから０．７８１ｎＭの濃度域で公比２倍の８段階希釈系列）を、流速５０μＬ／分にて２分間添加し、精製抗体とＴＬＲ２の結合を測定した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋  ｂｕｆｆｅｒを流速５０μＬ／分にて５分間添加し、精製抗体とヒトＴＬＲ２の解離を測定した。Ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅ  ｍｏｄｅｌ、ＲｍａｘをＦｉｔ  ｌｏｃａｌで解析し、結合速度定数（ｋa）及び解離速度定数（ｋd）を算出し、ｋdをｋaで割ることによって結合解離定数（ＫD）を算出した。【００６１】  結果を表２に示す。軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームａは、外側の抗ヒトＴＬＲ２抗体部分の抗原結合能を維持していたことが明らかとなった。この結果から、本発明の二重特異的抗体において、軽鎖間のリンカーの切断によっても外側の可変領域の抗原結合能が影響されないことが示された。表２：ヒトＴＬＲ２に対する結合活性【表２】
2016080510.tif 000003
【００６２】（実施例４：各種発現細胞を用いた抗体作製−タンデムフォームａ）  実施例１のタンデムフォームａの作製において、Ｅｘｐｉ２９３細胞に代えてＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させることにより、タンデムフォームａを作製した。具体的には、ＣＤ−ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）で約１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬに培養されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対して、実施例１に記載のタンデムフォームａの重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、精製抗体を得た。【００６３】  Ｅｘｐｉ２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させたタンデムフォームａについて、実施例２に記載の方法を用いてヒトＴＬＲ４に対する結合活性を評価した。但し、精製抗体の希釈系列として、Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させたタンデムフォームａは４２ｎＭから０．００００２ｎＭの濃度域で、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させたタンデムフォームａは最終濃度３５ｎＭから０．００００２ｎＭの濃度域でそれぞれ評価した。【００６４】  結果を表３に示す。いずれの細胞で発現させた場合も、内側の抗ヒトＴＬＲ４抗体部分の抗原結合活性が維持されていたことが明らかとなった。表３：ヒトＴＬＲ４に対する結合活性【表３】
2016080510.tif 000004
【００６５】  （実施例５：ヒトＴＬＲ４に対する中和活性評価−タンデムフォームａ）  実施例４で作製したタンデムフォームａのヒトＴＬＲ４に対する中和活性を評価するために、ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２を内在的に発現するヒト単球系細胞であるＵ９３７細胞を用いて、ＴＬＲ４リガンドであるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘発ＩＬ−６産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームｃ及びＴＬＲ４−ＩｇＧを用いた。【００６６】  Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５９３．２）を、実験の２日前に２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、３８４ウェルプレート（サーモサイエンティフィック社）に３０μＬ／ウェルにてＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）下で播種した。その際、培地には終濃度１００ｎＭとなるようにＰＭＡ（フォルボールエステル（フナコシ社、ＰＥ−１６０））を添加した。翌日、培地で希釈した各精製抗体（タンデムフォームａ、タンデムフォームｃ、又はＴＬＲ４−ＩｇＧ）の希釈溶液（最終濃度２０ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域で公比５倍の１０段階希釈系列）１０μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分間培養した。さらに、培地で希釈したＬＰＳ（アレクシス社；最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した。翌日、培養上清を回収し、培養上清に含まれるヒトＩＬ−６濃度を市販のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）キット（サーモサイエンティフィック社）を用いて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）（パーキンエルマー社）にて測定した。得られた測定結果を用いて統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）による４パラメータロジスティック曲線回帰から、各抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ50）を算出した。【００６７】  結果を表４に示す。タンデムフォームｃと比較して、軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームａにおいて、内側の抗ヒトＴＬＲ４抗体部分の中和活性が回復されたことが明らかとなった。表４：ヒトＴＬＲ４に対する中和活性【表４】
2016080510.tif 000005
【００６８】（実施例６：ヒトＴＬＲ２に対する中和活性評価−タンデムフォームａ）  実施例４で作製したタンデムフォームａのヒトＴＬＲ２に対する中和活性を評価するために、ヒトＴＬＲ２を内在的に発現するヒト単球系細胞であるＵ９３７細胞を用いて、ＴＬＲ２リガンドであるＰａｍ２ＣＳＫ４誘発ＩＬ−６産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームｃ及びＴＬＲ２−ＩｇＧを用いた。【００６９】  Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５９３．２）を、実験の２日前に２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、３８４ウェルプレート（サーモサイエンティフィック社）に３０μＬ／ウェルにてＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）下で播種した。その際、培地には終濃度１００ｎＭとなるようにＰＭＡ（フォルボールエステル（フナコシ社、ＰＥ−１６０））を添加した。翌日、培地で希釈した精製抗体（タンデムフォームａ、タンデムフォームｃ、又はＴＬＲ２−ＩｇＧ）の希釈溶液（タンデムフォームａ及びｃは最終濃度２０ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域で、ＴＬＲ２−ＩｇＧは最終濃度１９ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域でそれぞれ公比５倍の１０段階希釈系列）１０μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分間培養した。さらに、培地で希釈したＰａｍ２ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、ｔｌｒｌ−ｐｍ２ｓ；最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で一晩培養した。翌日、培養上清を回収し、培養上清に含まれるヒトＩＬ−６濃度を市販のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）キット（サーモサイエンティフィック社）を用いて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）（パーキンエルマー社）にて測定した。各抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ50）を、実施例５に示した手法で算出した。【００７０】  結果を表５に示す。軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームａは、外側の抗ヒトＴＬＲ２抗体部分の中和活性を維持していたことが明らかとなった。表５：ヒトＴＬＲ２に対する中和活性【表５】
2016080510.tif 000006
【００７１】（実施例７：各種プロテアーゼ認識配列を用いた抗体の作製及び結合活性評価−タンデムフォームａ）  実施例１及び実施例４のタンデムフォームａの作製において、軽鎖ポリペプチドのリンカー中のプロテアーゼ認識配列（配列番号５）を各種細胞内プロテアーゼ認識配列（配列番号６、配列番号７、又は配列番号８）に置き換えた３種類のリンカー（それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２）を用いて、タンデムフォームａを作製した。本実施例で作製したタンデムフォームａについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。さらに実施例２に記載の方法を用いてヒトＴＬＲ４に対する結合活性を評価した。但し、各精製抗体の希釈系列は、４２ｎＭから０．００００２ｎＭの濃度域で評価した。【００７２】  還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。いずれの二重特異的抗体についても、Ｅｘｐｉ２９３細胞及びＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で発現させた場合に軽鎖ポリペプチドのリンカーが細胞内プロテアーゼにより切断され、抗ヒトＴＬＲ２抗体の軽鎖と抗ヒトＴＬＲ４抗体の軽鎖に分かれていた。【００７３】  Ｅｘｐｉ２９３細胞で発現させた各抗体のヒトＴＬＲ４に対する結合活性の結果を表６に示す。軽鎖間のリンカーにいずれのプロテアーゼ認識配列を用いた場合においても、内側の抗ヒトＴＬＲ４抗体部分の抗原結合活性が維持されていた。表６：ヒトＴＬＲ４に対する結合活性【表６】
2016080510.tif 000007
【００７４】（実施例８：ヒトＴＬＲ４に対する中和活性評価−タンデムフォームｂ）  実施例１で作製したタンデムフォームｂ（外側に抗ヒトＴＬＲ４抗体部分を、内側に抗ヒトＴＬＲ２抗体部分を有する二重特異的抗体フォーマット）のヒトＴＬＲ４に対する中和活性を評価するために、実施例５で用いたＬＰＳ誘発ＩＬ−６産生阻害アッセイを実施した。被験抗体として、実施例１のタンデムフォームｂの作製において、軽鎖ポリペプチドのリンカー中のプロテアーゼ認識配列（配列番号５）を各種細胞内プロテアーゼ認識配列（配列番号６、配列番号７、又は配列番号８）に置き換えた３種類のリンカー（それぞれ、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞で作製したタンデムフォームｂを使用した。参照抗体として、タンデムフォームｄ及びＴＬＲ４−ＩｇＧを用いた。被験抗体の最終濃度に関して、最終濃度２０ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域でそれぞれ実施した。【００７５】  結果を表７に示す。軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームｂは、外側の抗ヒトＴＬＲ４抗体部分の中和活性を維持していた。実施例６及び本実施例の結果から、本発明の二重特異的抗体において、軽鎖間のリンカーの切断によっても外側の可変領域の中和活性が影響されないことが示された。表７：ヒトＴＬＲ４に対する中和活性【表７】
2016080510.tif 000008
【００７６】（実施例９：ヒトＴＬＲ２に対する中和活性評価−タンデムフォームｂ）  実施例８で作製したタンデムフォームｂのヒトＴＬＲ２に対する中和活性を評価するために、実施例６で用いたＰａｍ２ＣＳＫ４誘発ＩＬ−６産生阻害アッセイを実施した。参照抗体として、タンデムフォームｄ及びＴＬＲ２−ＩｇＧを用いた。被験抗体の最終濃度に関して、タンデムフォームｂ及びタンデムフォームｄは最終濃度２０ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域で、ＴＬＲ２−ＩｇＧは最終濃度１９ｎＭから０．００００１ｎＭの濃度域でそれぞれ実施した。【００７７】  結果を図４に示す。タンデムフォームｄと比較して、軽鎖間のリンカーが切断されたタンデムフォームｂにおいて、内側の抗ヒトＴＬＲ２抗体部分の中和活性が回復されたことが明らかとなった。実施例５及び本実施例の結果から、重鎖間及び軽鎖間のリンカーが接続された二重特異的抗体と比較して、本発明の二重特異的抗体において内側の可変領域の中和活性が改善することが示された。【００７８】（実施例１０：二重特異的抗体の構造安定性）  本発明の二重特異的抗体の可変領域における構造安定性を評価するために、示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ（ＤＳＣ））による熱変性中間温度（Ｔｍ値）の評価を行った。タンデムフォームｂ及びＤＶＤ−Ｉｇフォームｂの精製抗体を、２０ｍＭ  クエン酸及び１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）の溶液で濃縮カセットＶｉｖａｐｏｒｅ５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社）を用いてバッファー置換を行った。得られた各抗体溶液について、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて、約０．１２ｍｇ／ｍＬの蛋白質で、２５℃から１００℃まで１℃／分の昇温速度でＤＳＣ測定を行った。得られたＤＳＣの変性曲線より、各抗体の可変領域のＴｍ値を解析ソフトＯｒｉｇｉｎ７（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社）を用いて算出した。【００７９】  結果を表８に示す。表中、Ｏｎｓｅｔとは、抗体分子構造の崩壊開始温度を示す。Ｔｍ１は、ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂのみに確認されたＴｍ値であり、ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂの第１の可変領域（ＶＨ（１）及びＶＬ（１））の構造変化に起因する。タンデムフォームｂのＴｍ２は、第１の可変領域、第１の可変領域のＣ末端側のＣＨ１領域及びＣＬ領域、第２の可変領域（ＶＨ（２）、ＶＬ（２））、第２の可変領域のＣ末端側のＣＨ１領域及びＣＬ領域、並びに、ＣＨ２領域からなる構造の変化に起因するＴｍ値である。ＤＶＤ−ＩｇフォームｂのＴｍ２は、第２の可変領域、第２の可変領域のＣ末端側のＣＨ１領域及びＣＬ領域、並びに、ＣＨ２領域からなる構造の変化に起因するＴｍ値である。Ｔｍ３は、各抗体のＣＨ３領域の構造の変化に起因するＴｍ値である。ＤＶＤ−Ｉｇフォームｂは、低い温度で可変領域の構造変化が生じ、構造的に不安定であるのに対し、タンデムフォームｂは、より高い温度で安定であり、本発明の二重特異的抗体が、ＤＶＤ−Ｉｇ型の二重特異的抗体よりも熱に対して安定であることが明らかとなった。表８：ＤＳＣ試験の結果【表８】
2016080510.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００８０】  本発明の新規なフォーマットの二重特異的抗体は、両方の抗原に対する高い結合能を保持し、商業生産プロセスにおいて効率的に生産されることが期待できる。例えば、各種治療用の二重特異的抗体の研究開発、商業生産に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１に示される塩基配列は、タンデムフォームａの重鎖の塩基配列であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列である。配列表の配列番号３に示される塩基配列は、タンデムフォームａの軽鎖フラグメントの塩基配列であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされるアミノ酸配列である。配列表の配列番号５、６、７、及び８に示されるアミノ酸配列は、プロテアーゼ認識配列である。配列表の配列番号９、１０、１１、及び１２に示されるアミノ酸配列は、軽鎖ポリペプチド中のリンカー配列である。配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列は、プレシジョンプロテアーゼ認識配列である。
【図１】
2016080510.tif 000010
【図２】
2016080510.tif 000011
【図３】
2016080510.tif 000012
【図４】
2016080510.tif 000013
【配列表】
2016080510000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月19日(2017.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）〜ｃ）：
ａ）二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
ｂ）二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
ｃ）二重特異的抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞
から選択される、宿主細胞であって、
ここで、該二重特異的抗体は、２つの重鎖、２つの第１の軽鎖、及び２つの第２の軽鎖を含み、
該重鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の重鎖可変領域、ＣＨ１領域、第１のリンカー、第２の重鎖可変領域、及び重鎖定常領域を含み、
該第１の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含み、
該第２の軽鎖は、それぞれアミノ末端側から順に、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含み、
該第１の重鎖可変領域と該第１の軽鎖可変領域は、第１の抗原結合部位を形成し、
該第２の重鎖可変領域と該第２の軽鎖可変領域は、第２の抗原結合部位を形成し、
該第１の抗原結合部位及び該第２の抗原結合部位は互いに異なる抗原を認識する、
二重特異的抗体であり、
該二重特異的抗体の第１の軽鎖及び第２の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、該第１の軽鎖のカルボキシ末端に第２のリンカーを介して該第２の軽鎖のアミノ末端が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含み、該第２のリンカーは細胞内プロテアーゼ認識配列を含むペプチドリンカーである、
宿主細胞。
【請求項２】
二重特異的抗体を生産する方法であって、請求項１に記載の宿主細胞を培養し、二重特異的抗体を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項３】
培養工程において宿主細胞内のプロテアーゼによって第２のペプチドリンカーが切断される、請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
2016080510.tif 000014
2016080510.tif 000015
2016080510.tif 000016
2016080510.tif 000017