(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含む筋形成促進剤。
【化１】
0006616190.tif 000022
［一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ２はアリール基又は複素環基を表す。Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６又は−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８又は−ＣＯＯＲ９を表し、Ｒ７は−ＮＲ１０Ｒ１１、アリール基又は複素環基を表し、Ｒ８は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ９は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２を表し、Ｒ１２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基を表す。］
【請求項２】
サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療薬である、請求項１に記載の筋形成促進剤。
【請求項３】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含む筋萎縮抑制剤。
【化２】
0006616190.tif 000023
［一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ２はアリール基又は複素環基を表す。Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６又は−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８又は−ＣＯＯＲ９を表し、Ｒ７は−ＮＲ１０Ｒ１１、アリール基又は複素環基を表し、Ｒ８は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ９は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２を表し、Ｒ１２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基を表す。］
【請求項４】
サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療薬である、請求項３に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項５】
下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含むＴＡＺ活性化剤。
【化４】
0006616190.tif 000024
［一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ２はアリール基又は複素環基を表す。Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６又は−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８又は−ＣＯＯＲ９を表し、Ｒ７は−ＮＲ１０Ｒ１１、アリール基又は複素環基を表し、Ｒ８は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ９は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２を表し、Ｒ１２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基を表す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物及びＴＡＺ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉の損傷や萎縮、発育不良による減少や不足が原因となっている疾患には、サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー等様々なものが存在する。代表的な疾患として、加齢によって生じる筋肉の減少に伴う症候群であるサルコペニアが挙げられる。サルコペニアの治療方法の開発は、高齢者の健康上の重要な関心事となっている。運動療法や食事療法と並び、薬剤による治療および予防はサルコペニアの症状を軽減する有力な方策として位置づけられる。さらに、筋力の低下が著しいために運動療法を行うことができない患者にとっては、薬剤により筋力を増強して運動療法が可能になることは非常に有益である。【０００３】
サルコペニア治療薬としては、筋形成の負の調節因子であるミオスタチンの活性を阻害する物質（例えば、特表２００８−５３０００４号広報参照）、筋形成を誘導するインスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）を阻害するＦｂｘｏ４０アンタゴニスト（例えば、特表２０１３−５１９８６９号広報参照）等が提案されているが、未だ実用化には至っていない。【０００４】
他方、転写コアクチベーターであるＴＡＺの活性と、骨格筋の形成及び分化との関係について複数の研究成果が報告されている（例えば、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２４：３３１０−３３２０及びＢｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３９：５３３−５３９参照）。よって、ＴＡＺを活性化する物質は、骨格筋の形成及び分化を促進する作用を有すると考えられる。ＴＡＺを活性化する物質としては、フェニルテトラゾール誘導体（例えば、特開２０１０−２８０６５８号公報参照）、ケンフェロール（例えば、Ｂｏｎｅ  ５０：３６４−３７２参照）、ＴＭ−２５６５９（例えば、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６５：１５８４−１５９４参照）などが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、筋肉の形成及び分化に関係する医薬や治療方法は複数提案されているが、実用において十分なものではない。本発明は上記状況の下に、ＴＡＺ活性化に着目してなされたものであり、新しい筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物及びＴＡＺ活性化剤を提供することを目的とする。また本発明は、特定の構造を有する化合物の筋芽細胞の分化促進、筋委縮抑制、及びＴＡＺ活性化という新しい作用、並びにＴＡＺ活性化作用を応用しうる新しい用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための具体的手段には以下の実施態様が含まれる。
＜１＞下記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含む筋形成促進剤又は筋萎縮抑制剤。【０００７】
【化１】
0006616190.tif 000002
【０００８】
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６又は−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８又は−ＣＯＯＲ９を表し、Ｒ７は−ＮＲ１０Ｒ１１、アリール基又は複素環基を表し、Ｒ８は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ９は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２を表し、Ｒ１２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基を表す。【０００９】
＜２＞Ｒ２が、下記一般式（２）又は一般式（３）で表される基である、＜１＞に記載の筋形成促進剤又は筋萎縮抑制。【００１０】
【化２】
0006616190.tif 000003
【００１１】
一般式（２）及び一般式（３）中、Ｒ２−１〜Ｒ２−１０はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基又はハロゲン原子を表す。ｎは複素環中の窒素原子の数を表し、１〜６の整数である。【００１２】
＜３＞サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療薬である、＜１＞又は＜２＞に記載の筋形成促進剤又は筋萎縮抑制。
＜４＞上記一般式（１）で表される化合物を有効成分として含む医薬組成物。
＜５＞筋形成の促進又は筋萎縮の抑制に用いるための、＜４＞に記載の医薬組成物。
＜６＞前記筋形成の促進又は筋萎縮の抑制がサルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療のためである、＜５＞に記載の医薬組成物。
＜７＞上記一般式（１）で表される化合物を含むＴＡＺ活性化剤。【００１３】
＜８＞筋形成を促進又は筋萎縮を抑制するための医薬として用いる、上記一般式（１）で表される化合物。
＜９＞前記筋形成を促進又は筋萎縮を抑制する医薬がサルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療薬である、＜８＞に記載の化合物。【００１４】
＜１０＞医薬の製造における、上記一般式（１）で表される化合物の使用。
＜１１＞前記医薬が筋形成を促進又は筋萎縮を抑制するための医薬である、＜１０＞に記載の使用。
＜１２＞前記筋形成を促進又は筋萎縮を抑制する医薬がサルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療薬である、＜１１＞に記載の使用。【００１５】
＜１３＞下記の（１）〜（３）に示すいずれかを含む、筋形成促進方法又は筋萎縮抑制方法。
（１）上記一般式（１）で表される化合物を個体に投与すること
（２）上記一般式（１）で表される化合物を臓器又は組織と接触させること
（３）上記一般式（１）で表される化合物を細胞と接触させること
＜１４＞上記一般式（１）で表される化合物を患者に投与することを含む、サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮からなる群から選択される疾患の治療方法。
＜１５＞下記の（１）〜（３）に示すいずれかを含む、ＴＡＺ活性化方法。
（１）上記一般式（１）で表される化合物を個体に投与すること
（２）上記一般式（１）で表される化合物を臓器又は組織と接触させること
（３）上記一般式（１）で表される化合物を細胞と接触させること
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、新しい筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物及びＴＡＺ活性化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＭＣＦ１０Ａ細胞のスフィア形成試験の結果を示す図である。
【図１Ｂ】ＭＣＦ１０Ａ細胞のスフィア形成試験の結果を示す図である。
【図１Ｃ】ＭＣＦ１０Ａ細胞のスフィア形成試験の結果を示す図である。
【図１Ｄ】ＭＣＦ１０Ａ細胞のスフィア形成試験の結果を示す図である。
【図２Ａ】Ｃ２Ｃ１２細胞の筋形成の評価結果を示す図である。
【図２Ｂ】Ｃ２Ｃ１２細胞の筋形成の評価結果を示す図である。
【図２Ｃ】Ｃ２Ｃ１２細胞の筋形成の評価結果を示す図である。
【図３Ａ】免疫ブロット法及び免疫染色法による筋分化の評価結果を示す図である。
【図３Ｂ】免疫ブロット法及び免疫染色法による筋分化の評価結果を示す図である。
【図３Ｃ】免疫ブロット法及び免疫染色法による筋分化の評価結果を示す図である。
【図４】定量リアルタイムＰＣＲによる筋分化の評価結果を示す図である。
【図５】レポーターアッセイによる評価結果を示す図である。
【図６】クロマチン免疫沈降法による評価結果を示す図である。
【図７Ａ】免疫蛍光法による評価結果を示す図である。
【図７Ｂ】免疫蛍光法による評価結果を示す図である。
【図８Ａ】ミオスタチンに対する拮抗作用の評価結果を示す図である。
【図８Ｂ】ミオスタチンに対する拮抗作用の評価結果を示す図である。
【図８Ｃ】ミオスタチンに対する拮抗作用の評価結果を示す図である。
【図９Ａ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図９Ｂ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図９Ｃ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図９Ｄ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図９Ｅ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図９Ｆ】損傷又は萎縮した筋肉の再生の評価結果を示す図である。
【図１０】ＴＡＺの細胞内の位置に与える影響の評価結果を示す図である。
【図１１】細胞の増殖に与える影響の評価結果を示す図である。
【図１２Ａ】腫瘍形成に与える影響の評価結果を示す図である。
【図１２Ｂ】腫瘍形成に与える影響の評価結果を示す図である。
【図１２Ｃ】腫瘍形成に与える影響の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において「筋形成」とは、筋芽細胞が増殖、分化を経て筋繊維を形成するまでの過程を意味する。筋芽細胞の種類は特に制限されない。「筋形成促進」には、筋繊維の数や大きさを増大させて筋肉の体積を増加させることのほか、筋繊維の萎縮や損傷により減少した筋肉の体積の全部又は一部を新たに生成した筋繊維によって補うことも含まれる。「筋萎縮」には、筋肉そのものに原因のある筋原性の筋萎縮、運動ニューロンに原因のある神経原性の筋萎縮、長期にわたり筋肉を使用しないことにより生じる廃用性の筋萎縮、ステロイド筋症等の薬剤による筋委縮、等が含まれる。さらに、加齢、悪液質、内分泌の状態、栄養状態、外傷、疾患等が直接的又は間接的な原因となって生じる筋萎縮も含まれる。ここで、悪液質は、癌、及び、心不全、腎不全、慢性呼吸器疾患等の種々の慢性疾患に起因して生じる悪液質を含む。「治療」には、症状を消失させることのほか、重症化の抑制や症状の軽減若しくは緩和も含まれる。表中の数値は、小数点以下第３位を四捨五入した値である。
【００１９】
ＴＡＺ（ＷＷＴＲ１とも呼ばれる）は既に公知のタンパク質であり、その遺伝子の塩基配列は、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２５９３７、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＢＣ０１４０５２．２のうち２３５番目〜１４３７番目の塩基の配列に相当する。ＴＡＺはＮ末端ＴＥＡＤ結合ドメイン、ＷＷドメイン及び転写活性ドメインからなる１４−３−３結合性のタンパク質であり、転写コアクチベーターとして機能する。
【００２０】
ＴＡＺと共役する転写因子としては、細胞増殖又は上皮間葉転移（ＥＭＴ）を促進する転写因子であるＴＥＡＤｓ、細胞増殖又は上皮間葉転移（ＥＭＴ）を促進する転写因子であるＷｂｐ２、組織幹細胞の自己複製の促進又は分化を制御するＳＭＡＤ２／３、骨形成を促進するＲｕｎｘ２、アディポジェネシスを抑制するＰＰＡＲγ、筋形成を促進するＭｙｏＤ、肺又は甲状腺の形成を促進するＴＴＦ１（ＮＫＸ２．１）、筋形成を促進するＰＡＸ３、甲状腺の形成を促進するＰＡＸ８、心臓又は上肢の形成を促進するＴＢＸ５、などが挙げられる。
【００２１】
ＴＡＺは、Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙ、ジャンクションタンパク、アクチン細胞骨格、および、Ｗｎｔ  Ｐａｔｈｗａｙなどの制御を受けることが知られているが、最もよく知られているのは、Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙによる制御である。
【００２２】
Ｈｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙは上流制御分子（細胞接着、細胞極性に関わる膜タンパク質、膜裏打ちタンパク質）、中核キナーゼカスケード（２種類のセリン／スレオニンキナーゼとアダプター分子、キナーゼ活性化分子）及び下流標的分子（キナーゼカスケードによってリン酸化される転写コアクチベーターとそれに結合する転写因子）から構成されるシグナル伝達経路である。細胞密度が高いときはＨｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙの機能がオンになり、中核キナーゼカスケードの構成分子であるＬＡＴＳ１／２によってＴＡＺがリン酸化される。リン酸化されたＴＡＺは細胞核内から細胞質へと移行して分解される。その結果、細胞増殖促進的又は細胞死抑制的な遺伝子の転写が抑制され、細胞数が減少する。一方、細胞密度が高いときはＨｉｐｐｏ  Ｐａｔｈｗａｙの機能がオフになり、ＴＡＺはリン酸化されずに細胞核内に留まり、ＴＡＺが転写因子に結合することによって、細胞増殖促進的又は細胞死抑制的な遺伝子の転写が促進され（すなわちＴＡＺが活性化し）、細胞数が増加する。
【００２３】
本明細書において「ＴＡＺ活性化剤」とは、後述するヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａを用いた系において、スフィアを形成させる作用を有する物質を示す。ＴＡＺが活性化された状態では、ＴＡＺはリン酸化されずに核内において転写因子と結合する。その結果、細胞増殖が促進されてスフィアが形成されると考えられる。ＴＡＺは、活性化されない状態では、ＴＡＺはリン酸化され、細胞質に移行し分解される。
【００２４】
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤は、下記一般式（１）で表される化合物（以下、特定化合物とも称する）を有効成分として含む。
【００２５】
【化３】
0006616190.tif 000004
【００２６】
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。Ｒ２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ３は−ＮＲ５Ｒ６又は−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表し、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８又は−ＣＯＯＲ９を表し、Ｒ７は−ＮＲ１０Ｒ１１、アリール基又は複素環基を表し、Ｒ８は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ９は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表し、Ｒ１０及びＲ１１はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基又は炭素数２〜１０のアルキニル基を表す。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２を表し、Ｒ１２はアリール基、複素環基、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基を表す。
【００２７】
一般式（１）においてＲ１〜Ｒ１２のうち該当するもので表されるアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基の構造は特に制限されず、直鎖状であっても、可能な場合には分岐状又は環状であってもよい。アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、可能な場合にはさらに置換基を有していてもよい。
【００２８】
アルキル基として具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、これらのアルキル基が分岐した構造を有する置換基、これらのアルキル基が環を形成した構造を有する置換基等を挙げることができる。
【００２９】
アルケニル基として具体的には、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基、これらのアルケニル基が分岐した構造を有する置換基、これらのアルケニル基が環を形成した構造を有する置換基等を挙げることができる。
【００３０】
アルキニル基として具体的には、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基、これらのアルキニル基が分岐した構造を有する置換基、これらのアルキニル基が環を形成した構造を有する置換基等を挙げることができる。
【００３１】
一般式（１）においてＲ１〜Ｒ１２のうち該当するもので表されるアルコキシ基の構造は特に制限されず、直鎖状であっても、可能な場合には分岐状又は環状であってもよい。アルコキシ基は、可能な場合にはさらに置換基を有していてもよい。アルコキシ基として具体的には、上述したアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基の具体例に酸素原子が結合した構造を有する置換基を挙げることができる。
【００３２】
一般式（１）においてＲ１〜Ｒ１２のうち該当するもので表されるアリール基の構造は特に制限されず、単環式であっても、多環式であってもよい。アリール基は、可能な場合にはさらに置換基を有していてもよい。アリール基として具体的には、フェニル基、ナフチル基等を挙げることができる。
【００３３】
一般式（１）においてＲ１〜Ｒ１２のうち該当するもので表される複素環基の構造は特に制限されず、単環式であっても、多環式であってもよい。複素環基としては、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群より選択される１種又は２種以上のヘテロ原子を１個以上含む複素環式化合物に由来する置換基を挙げることができる。複素環基は、可能な場合にはさらに置換基を有していてもよい。
【００３４】
複素環基の具体例としては、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピリジニル基、ピラジニル基、ピラジノイル基、ピペラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル等の６員複素環に由来する置換基、ピロリジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、フラニル基、オキソラニル基、チオフェニル基等の５員複素環に由来する置換基などを挙げることができる。
【００３５】
一般式（１）におけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリール基、複素環基、アダマンチル基又はノルボルニル基が置換基を有する場合の置換基として具体的には、上述したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアルコキシ基の具体例、炭素数１〜１０のアルキルカルボニル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜１０のアリールカルボニル基、炭素数１〜１０のアルキルカルボニルアミノ基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニルアミノ基、炭素数１〜１０のアリールカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、ヨウ素原子、臭素原子等のハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、アミノ基などを挙げることができる。
【００３６】
Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。
【００３７】
Ｒ２は下記一般式（２）又は一般式（３）で表される基であることが好ましい。
【００３８】
【化４】
0006616190.tif 000005
【００３９】
一般式（２）及び一般式（３）中、Ｒ２−１〜Ｒ２−１０はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基又はハロゲン原子を表す。ｎは複素環中の窒素原子の数を表し、１〜６の整数である。
【００４０】
一般式（２）及び一般式（３）においてＲ２−１〜Ｒ２−１０で表されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基の構造は特に制限されず、直鎖状であっても、可能な場合には分岐状又は環状であってもよい。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基は、可能な場合にはさらに置換基を有していてもよい。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基及びハロゲン原子の具体例、及びアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基が置換基を有している場合の置換基の具体例は、一般式（１）におけるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基及びハロゲン原子の具体例、及びアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルコキシ基が置換基を有している場合の置換基の具体例と同様である。
【００４１】
Ｒ２は一般式（２）で表される基であることがより好ましい。また、一般式（２）及び一般式（３）におけるＲ２−１〜Ｒ２−１０はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜５の無置換のアルキル基、アミノ基、シアノ基若しくは炭素数１〜５のアルコキシカルボニルアミノ基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基、無置換で炭素数１〜５のアルコキシ基又はハロゲン原子であることがより好ましい。一般式（２）及び一般式（３）におけるＲ２−１〜Ｒ２−１０はそれぞれ独立に、水素原子、無置換若しくはシアノ基を置換基として有するメチル基、アミノエチル基、無置換のペンチル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基を置換基として有するエチル基、メトキシ基、臭素原子又は塩素原子であることがさらに好ましい。
【００４２】
Ｒ３が−ＮＲ５Ｒ６を表すとき、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８であってＲ８は水素原子若しくは炭素数１〜３のアルキル基、又は−ＣＯＯＲ９であってＲ９は炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましい。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、メチル基、ホルミル基、アセチル基又はエトキシカルボニル基であることがより好ましい。
【００４３】
Ｒ３が−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７を表すとき、Ｒ７はジアルキルアミノ基、フェニル基、モルホリニル基又はピペリジニル基であることが好ましい。Ｒ７はジメチルアミノ基、無置換のフェニル基、無置換のモルホリニル基又は無置換のピペリジニル基であることがより好ましい。
【００４４】
Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２であってＲ１２はフェニル基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アダマンチル基又はノルボルニル基であることが好ましい。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２であってＲ１２はメチル基若しくはエチル基、フェニル基又はアダマンチル基であることがより好ましい。Ｒ４はシアノ基又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１２であってＲ１２は無置換のメチル基若しくはエチル基、無置換のフェニル基、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ニトロ基若しくはメトキシ基を置換基として有するフェニル基又は無置換のアダマンチル基であることがさらに好ましい。
【００４５】
＜特定化合物の製造方法＞
特定化合物及び／又はその医薬的に許容され得る塩の製造方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｕｅｒ  Ｐｒａｋｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、１９７６年、３１８巻２号、３４７〜３４９頁に記載の方法に準じて製造される下記一般式（４）の化合物を経て、Ｍｏｎａｔｓｃｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  １９７６年、１０７巻、１４１３〜１４２１頁、又はＭｏｎａｔｓｃｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  １９９６年、１２７巻、３１３〜３１８頁に記載の方法に準じて下記一般式（５）の化合物を経て、一般式（１）の化合物のうちＲ３が−ＮＨ２である化合物を製造することができる。さらに、常法のアルキル化法、アシル化法、又はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２０００年、５６巻、８２５３〜８２６２頁に記載の方法に準じてＲ３の誘導体へと変換できる。
【００４６】
より具体的には、等量のシアナミドとアミン類及び１．５〜２等量のトリアルキルオルト脂肪酸エステル類を１３０℃〜１４０℃に加熱して得られる一般式（４）の化合物に、例えば炭酸カリウム等の塩基類の存在下にハロゲン化アルキル類を例えばジメチルホルホルムアミド、アセトン、テトラヒドロフラン等の適当な溶媒中で、室温又は加温下で反応させると一般式（５）の化合物が得られる。さらに、メタノール、エタノール、ジメチルホルホルムアミド等の溶媒中で少量のナトリウムアルコキシドや水素化ナトリウムの存在下、数分間室温で反応させると、一般式（１）のＲ３が−ＮＨ２である化合物が得られる。この化合物にパラトルエンスルホン酸クロリドの存在下、ホルムアミド類を室温で反応させると、Ｒ３が−Ｎ＝Ｃ−Ｒ７である化合物が得られる。
【００４７】
【化５】
0006616190.tif 000006
【００４８】
特定化合物として具体的には、以下の例示化合物１〜４４を挙げることができる。
【００４９】
【化６】
0006616190.tif 000007
【００５０】
【化７】
0006616190.tif 000008
【００５１】
【化８】
0006616190.tif 000009
【００５２】
【化９】
0006616190.tif 000010
【００５３】
本発明者らは、特定化合物の存在下でヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａを培養するとＴＡＺの活性化に起因するスフィアの形成が促進される（すなわち、ＴＡＺ活性化作用を有する）、及び筋芽細胞の分化が促進される（すなわち、筋形成促進又は筋萎縮抑制作用を有する）という知見を得た。かかる知見は、上記構造を有する化合物についてこれまで見出されていなかったものである。
【００５４】
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤又は医薬組成物は、筋繊維の縮小、減少、発育不良等による筋肉の減少又は不足を原因として生じる種々の疾患の治療に有用である。本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤又は医薬組成物が適用される疾患の例としては、サルコペニア、ステロイド筋症、筋ジストロフィー、運動神経疾患に起因する筋委縮、及び悪液質に起因する筋委縮等を挙げることができる。
【００５５】
本発明のＴＡＺ活性化剤は、ＴＡＺの活性化を応用しうる種々の用途に有用である。例えば、骨粗鬆症治療又は予防、肥満抑制等を挙げることができる。
【００５６】
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤は、特定化合物以外の成分を含んでもよい。例えば、ゼラチン、乳糖等の固体媒質、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の液体媒質、糖類、多価アルコール、多価アルコールエステル等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の緩衝剤などを挙げることができる。
【００５７】
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤の個体への投与方法は特に制限されない。例えば、口腔内投与、舌下投与等の経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等の非経口投与などを挙げることができる。中でも静脈内投与、筋肉内投与、経口投与であることが好ましく、特に筋肉内投与が好ましい。侵襲性が低いという観点からは、経皮投与が好ましい。
【００５８】
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤の投与対象となる個体はヒトに制限されず、家畜動物、愛玩動物、実験動物等も投与対象に含まれる。
本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤は、インビトロで使用してもよい。例えば、本発明の筋形成促進剤、筋萎縮抑制剤、医薬組成物又はＴＡＺ活性化剤を、臓器、組織又は細胞と接触させればよい。
【００５９】
本発明の筋形成促進剤を使用する態様として、対象から採取した筋芽細胞又は対象から得たｉＰＳ細胞等の万能細胞を筋芽細胞に分化させた細胞を、本発明の筋形成促進剤と共に対象の筋肉に注射する態様、あるいは本発明の筋形成促進剤と共に培養し筋繊維を形成した後に対象に移植する態様、などを挙げることができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例をもとに本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６１】
特定化合物がＴＡＺを活性化する作用を有することを、以下の実験によって確認した（図１Ａ〜Ｄ）。図中の線は２００μｍである。
（１）ヒト乳腺上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）、ＴＡＺを発現したＭＣＦ１０Ａ細胞（ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ）、セリン８９をアラニンに置換したＴＡＺ  Ｓ８９Ａ変異体である恒常活性型のＴＡＺを発現したＭＣＦ１０Ａ細胞（ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ  ＳＡ）をそれぞれマンモスフィア形成条件で培養した。その結果、図１Ａに示すように、ＭＣＦ１０−ＴＡＺ  ＳＡ細胞のみがスフィアを形成した。【００６２】
（２）後述するノックダウンコンストラクションを用いてＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２をノックダウンしたＭＣＦ１０Ａ細胞とＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ細胞を、それぞれマンモスフィア形成条件で培養した。その結果、図１Ｂに示すように、ＭＣＦ１０−ＴＡＺ細胞がスフィアを形成した。ＭＣＦ１０Ａ細胞はＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２をノックダウンしてもスフィアを形成しなかった。【００６３】
（３）ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２に加えて、後述するノックダウンコンストラクションを用いてＴＡＺをノックダウンしたＭＣＦ１０−ＴＡＺ細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）をマンモスフィア形成条件で培養した。その結果、図１Ｃに示すように、スフィアを形成する能力が消失した。これらの結果より、ヒト乳腺上皮細胞ＭＣＦ１０ＡはＴＡＺが活性化されたときにスフィアを形成することがわかった。【００６４】
（４）ＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２及びＴＡＺのノックダウンの検証結果を表１及び図１Ｄに示す。図中のライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。【００６５】
【表１】
0006616190.tif 000011
【００６６】
（５）次に、ＭＣＦ１０−ＴＡＺ細胞を例示化合物１（下記構造、ＩｎｔｅｒＢｉｏＳｃｒｅｅｎ社、ＩＢＳ００８７３８とも称する）が１０μＭの濃度となるように添加した培地にて１４日間、スフィア形成条件で培養した。その結果、ＭＣＦ１０−ＴＡＺ細胞がスフィア（最大径が１５０μｍ以上である細胞の凝集体をスフィアと定義する）を形成した。このことから、ＩＢＳ００８７３８がＴＡＺを活性化する作用を有することが確認された。【００６７】
【化１０】
0006616190.tif 000012
【００６８】
＜特定化合物を用いたＣ２Ｃ１２細胞の筋形成の評価＞
特定化合物として、上記に示した構造を有する例示化合物２〜４４を上記した方法にて作製した。例示化合物１〜４４について、以下のようにしてＣ２Ｃ１２細胞の筋形成の状態を評価した。【００６９】
（１）増殖条件下でＣ２Ｃ１２細胞をコンフルエンスに達するまで増殖した後、分化条件で７２時間、ＤＭＳＯ、ＩＢＳ００８７３８（例示化合物１）又は例示化合物２〜４４を、それぞれ１μＭ、３μＭ、１０μＭの濃度となるように添加した培地にて培養した。その後、筋形成の度合いを融合インデックス（多核化したミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞中で検出された核の数を核の総数で割った値）で評価した。具体的には例示化合物を５グループに分けて行い、ＤＭＳＯとＩＢＳ００８７３８についてはコントロールとして各グループで評価を行った。評価はそれぞれ３回行い、得られた融合インデックスの平均値及び標準偏差をＤＭＳＯを添加した場合の測定値を１として相対化した値を表２に示す。表２に示すように、ＩＢＳ００８７３８（例示化合物１）及び例示化合物２〜４４を培地に添加した場合の相対融合インデックス（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）は、ＤＭＳＯを添加した場合を上回っていた。【００７０】
【表２】
0006616190.tif 000013
【００７１】
（２）コンフルエンスに達するまで増殖したＣ２Ｃ１２細胞の培地にＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを添加した直後、及び分化条件に変更してから２４時間後、４８時間後、７２時間後にＣ２Ｃ１２細胞を固定し、抗ＭＨＣ抗体で免疫染色を行った。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて可視化した。その結果、ＩＢＳ００８７３８を培地に添加した場合はＤＭＳＯを添加した場合よりも細胞分化及びＭＨＣの発現が進行していた（図２Ａ及び図２Ｂ）。【００７２】
（３）ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地にて、Ｃ２Ｃ１２細胞を増殖条件下で２４時間培養し、その後に分化条件に切り替えて培養を継続した。増殖条件下で２４時間培養した直後、及び分化条件に変更してから２４時間後、４８時間後、７２時間後にＣ２Ｃ１２細胞を固定し、抗ＭＨＣ抗体で免疫染色を行った。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて可視化した。その結果、増殖条件下で２４時間培養した後は、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合とＤＭＳＯを添加した場合との間にＣ２Ｃ１２細胞の筋形成の程度の顕著な差は認められなかったが、分化条件ではＩＢＳ００８７３８を添加した場合の方が細胞分化がより進んでいた（図２Ｃ）。
以上の結果より、特定化合物がＣ２Ｃ１２細胞の筋形成を促進することがわかった。【００７３】
＜例示化合物２〜４４の融点及び１Ｈ  ＮＭＲスペクトル＞
例示化合物２
メタノールより再結晶し、淡黄色粒状晶として得た。融点は１６５℃〜１６５．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２４（３Ｈ、ｓ）、５．５６（２Ｈ、ｂｒ）、６．９０（２Ｈ、ｄ）、６．９４（２Ｈ、ｄ）、７．１０（２Ｈ、ｄ）、７．２２（１Ｈ、ｔ）、７．３２（２Ｈ、ｑ）、７．３８（１Ｈ、ｓ）【００７４】
例示化合物３
含水メタノールより再結晶し、淡黄色粒状晶として得た。融点は１４１℃〜１４２℃であった。
。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３８（３Ｈ、ｓ）、２．５７（３Ｈ、ｓ）、２．９１（３Ｈ、ｓ）、７．１９（２Ｈ、ｄ）、７．２０（２Ｈ、ｃ）、７．３７（２Ｈ、ｍ）、７．４６（１Ｈ、ｔ）、７．５３（１Ｈ、ｓ）、７．８８（２Ｈ、ｄ）、８．１７（１Ｈ、ｓ）【００７５】
例示化合物４
メタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１３１．５℃〜１３２℃であった。
。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３８（３Ｈ、ｓ）、３．１３（２Ｈ、ｔ）、３．２２（２Ｈ、ｔ）、７．１８（２Ｈ、ｄ）、７．２１（２Ｈ、ｄ）、７．３６（２Ｈ、ｔ）、７．４４（１Ｈ、ｔ）、７．５２（１Ｈ、ｓ）、７．８６（２Ｈ、ｄ）、８．１３（１Ｈ、ｓ）【００７６】
例示化合物５
メタノールより再結晶し、無色針状晶として得た。融点は１８７℃〜１８８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２２（３Ｈ、ｓ）、２．２６（３Ｈ、ｓ）、７．１７（２Ｈ、ｔ）、７．３０（１Ｈ、ｔ）、７．４１（１Ｈ、ｄ）、９．１４（１Ｈ、ｓ）、７．６１（１Ｈ、ｓ）【００７７】
例示化合物６
ジエチルエーテル／ヘキサンより再結晶し、無色針状晶として得た。融点は１２０℃〜１２０．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．４１（３Ｈ、ｓ）、７．２３（２Ｈ、ｄ）、７．２６（２Ｈ、ｄ）、７．３１（２Ｈ、ｔ）、７．４０（１Ｈ、ｔ）、７．４６（２Ｈ、ｔ）、７．４９（２Ｈ、ｄ）、７．６０（１Ｈ、ｔ）、７．１０（１Ｈ、ｓ）、７．９６（１Ｈ、ｄ）、９．１３（１Ｈ、ｓ）【００７８】
例示化合物７
メタノールより再結晶し、無色板状晶として得た。融点は１２４．５℃〜１２５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．１３（３Ｈ、ｔ）、２．４０（３Ｈ、ｓ）、４．１５（２Ｈ、四重線）、４．９６（２Ｈ、ｂｒ）、７．１７（２Ｈ、ｄ）、７．２３（２Ｈ、ｄ）、７．２７（１Ｈ、ｓ）  【００７９】
例示化合物８
メタノールより再結晶し、無色針状晶として得た。融点は１４２．５℃〜１４３℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．２７（３Ｈ、ｔ）、２．４０（３Ｈ、ｓ）、３．０９（３Ｈ、ｓ）、３．１３（３Ｈ、ｓ）、４．１８（２Ｈ、四重線）、７．１６（２Ｈ、ｄ）、７．２３（２Ｈ、ｄ）、７．３６（１Ｈ、ｓ）、８．４２（（１Ｈ、ｓ）【００８０】
例示化合物９
メタノールより再結晶し、無色針状晶として得た。融点は１６７℃〜１６８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．５０（３Ｈ、ｔ）、２．４３（３Ｈ、ｓ）、４．２０（２Ｈ、四重線）、７．１８（２Ｈ、ｄ）、７．２７（２Ｈ、ｄ）、７．４０（１Ｈ、ｓ）、８．６８（１Ｈ、ｄ）、９．３２（１Ｈ、ｄ）【００８１】
例示化合物１０
メタノールより再結晶し、無色針状晶として得た。融点は９５℃〜９６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．１９（３Ｈ、ｔ）、２．４１（３Ｈ、ｓ）、３．４６（２Ｈ、ｂｒｓ）、３．７６（２Ｈ、ｔ）、３．８３（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．１６（２Ｈ、ｑ）、７．１６（２Ｈ、ｄ）、７．２４（２Ｈ、ｄ）、８．４６（１Ｈ、ｓ）  【００８２】
例示化合物１１
酢酸エチルより再結晶し、無色粒状結晶として得た。融点は２０４℃〜２０５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．２２（３Ｈ、ｔ）、２．２７（３Ｈ、ｓ）、４．１５（２Ｈ、ｑ）、６．９９（２Ｈ、ｄ）、７．０１（２Ｈ、ｄ）、７．１８（２Ｈ、ｔ）、７．３２（２Ｈ、ｔ）、７．４５（２Ｈ、ｄ）、７．８４（１Ｈ、ｓ）、８．８４（１Ｈ、ｓ）  【００８３】
例示化合物１２
酢酸エチルより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１７８℃〜１７８．５℃。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２１（３Ｈ、ｓ）、３．１９（３Ｈ、ｄ）、６．８３（２Ｈ、ｄ）、６．８７（２Ｈ、ｄ）、７．０１（２Ｈ、ｔ）、７．１４（（２Ｈ、ｄ）、７．１９（２Ｈ、ｄ）、７．４０（１Ｈ、ｓ）  【００８４】
例示化合物１３
メタノールより再結晶し、黄色針状晶として得た。融点は１５３℃〜１５４℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ３．７２（３Ｈ、ｓ）、５．５８（２Ｈ、ｂｒ）、６．６５（２Ｈ、ｄ）、６．９４（２Ｈ、ｄ）、７．１０（２Ｈ、ｔ）、７．２２  （１Ｈ、ｔ）、７．３０  （２Ｈ、ｄ）、７．３５（３Ｈ、ｓ）【００８５】
例示化合物１４
含水メタノールより再結晶し、黄色粉末として得た。融点は１３９．５℃〜１４０℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．５７（３Ｈ、ｓ）、２．９２（３Ｈ、ｓ）、３．８３（３Ｈ、ｓ）、６．９３（２Ｈ、ｄ）、７．２４（２Ｈ、ｄ）、７．３７（２Ｈ、ｔ）、７．４６  （１Ｈ、ｔ）、７．５０（１Ｈ、ｓ）、７．８７  （２Ｈ、ｄ）、８．１７（１Ｈ、ｓ）【００８６】
例示化合物１５
エタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１３７℃〜１３８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ３．１９（２Ｈ、ｂｒ）、３．２９（２Ｈ、ｂｒ）、３．４８（２Ｈ、ｂｒ）、３．６２（２Ｈ、ｂｒ）、３．８３（３Ｈ、ｓ）、６．２３  （２Ｈ、ｄ）、７．２４（２Ｈ、ｄ）、７．３６（２Ｈ、ｔ）、７．４６（１Ｈ、ｔ）、７．８２（２Ｈ、ｄ）、８．１６（３Ｈ、ｓ）【００８７】
例示化合物１６
メタノールより再結晶し、黄色板状晶として得た。融点は１９７℃〜１９７．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３０（３Ｈ、ｓ）、２．３８（３Ｈ、ｓ）、６．０１（２Ｈ、ｂｒ）、６．９４（２Ｈ、ｄ）、７．０６（２Ｈ、ｄ）、７．１７（２Ｈ、ｔ）、７．２９（１Ｈ、ｔ）、７．３０（２Ｈ、ｄ）【００８８】
例示化合物１７
メタノールより再結晶し、乳白色針状晶として得た。融点は２２４℃〜２２６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ６．５７（２Ｈ、ｂｒ）、６．９１（２Ｈ、ｄ）、７．１６（２Ｈ、ｔ）、７．２８（２Ｈ、ｄ）、７．２９（１Ｈ、ｔ）、７．３４（２Ｈ、ｄ）、７．３９（１Ｈ、ｓ）【００８９】
例示化合物１８
ジエチルエーテル／ヘキサンより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１７０℃〜１７１℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３１（３Ｈ、ｓ）、２．８０（３Ｈ、ｓ）、２．８１（３Ｈ、ｓ）、７．０５（２Ｈ、ｄ）、７．１６（２Ｈ、ｄ）、７．３３（２Ｈ、ｔ）、７．４０（１Ｈ、ｔ）、７．１６（２Ｈ、ｄ）、７．９０（１Ｈ、ｓ）  【００９０】
例示化合物１９
エタノール／ヘキサンより再結晶し、黄色棒状晶として得た。融点は１５４℃〜１５４．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．５７（３Ｈ、ｓ）、２．９４（３Ｈ、ｓ）、７．１９（２Ｈ、ｄ）、７．３８（２Ｈ、ｔ）、７．４９（１Ｈ、ｔ）、７．５４（２Ｈ、ｄ）、７．８９（２Ｈ、ｄ）、８．２０（１Ｈ、ｓ）【００９１】
例示化合物２０
エタノールより再結晶し、黄色棒状晶として得た。融点は１７０℃〜１７１℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ３．１９（１Ｈ、ｔ）、３．３１（１Ｈ、ｔ）、３．４８（１Ｈ、ｔ）、３．６３（１Ｈ、ｔ）、７．１９（２Ｈ、ｄ）、７．３８（２Ｈ、ｔ）、７．４９（１Ｈ、ｔ）、７．５４（１Ｈ、ｓ）、７．５５（２Ｈ、ｄ）、７．８４（２Ｈ、ｄ）、８．１９（１Ｈ、ｓ）【００９２】
例示化合物２１
メタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１４５．５℃〜１４６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９０（３Ｈ、ｔ）、１．２１（２Ｈ、ｍ）、１．３１（２Ｈ、ｍ）、１．４９（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ）、２．４８（２Ｈ、ｔ）、５．６３（２Ｈ、ｂｒ）、６．９０（４Ｈ、ｄ）、７．０６（２Ｈ、ｔ）、７．１７（１Ｈ、ｔ）、７．２９（２Ｈ、ｄ）、７．３９（１Ｈ、ｓ）  【００９３】
例示化合物２２
ジエチルエーテル／ヘキサンより再結晶し、黄色針状晶として得た。融点は９５．５℃〜９６．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．９０（３Ｈ、ｔ）、１．３３（４Ｈ、ｍ）、１．６１（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ）、２．５７（３Ｈ、ｓ）、２．６２（２Ｈ、ｔ）、３．１８（２Ｈ、ｂｒｓ）、２．９２（２Ｈ、ｓ）、７．２１（４Ｈ、ｓ）、７．３７  （２Ｈ、ｔ）、７．４６（１Ｈ、ｔ）、７．５４（１Ｈ、ｓ）、７．８８（２Ｈ、ｄ）、８．１８（１Ｈ、ｓ）【００９４】
例示化合物２３
ジエチルエーテルより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１０１℃〜１０１．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ０．８９（３Ｈ、ｔ）、１．３３（４Ｈ、ｍ）、１．６２（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ）、２．６２（２Ｈ、ｔ）、３．１８（２Ｈ、ｂｒｓ）、３．２９（２Ｈ、ｂｒｓ）、３．４８（２Ｈ、ｂｒｓ）、３．６２  （２Ｈ、ｂｒｓ）、７．２０（２Ｈ、ｄ）、７．２２（２Ｈ、ｄ）、７．３６（２Ｈ、ｔ）、７．４６（１Ｈ、ｔ）、７．５５（３Ｈ、ｓ）、７．８４（２Ｈ、ｄ）、８．１７（１Ｈ、ｓ）  【００９５】
例示化合物２４
メタノールより再結晶し、乳白色菱形結晶として得た。融点は１９３℃〜１９６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．７９（３Ｈ、ｓ）、２．４４（３Ｈ、ｓ）、５．７３（２Ｈ、ｂｒ）、７．２１（１Ｈ、ｓ）、７．２３（２Ｈ、ｄ）、７．３０（２Ｈ、ｄ）  【００９６】
例示化合物２５
メタノールより再結晶し、淡黄色針状晶として得た。融点は１５０℃〜１５１．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．４０（３Ｈ、ｓ）、２．６５（３Ｈ、ｓ）、３．１０（３Ｈ、ｓ）、３．１２（３Ｈ、ｓ）、７．１３（２Ｈ、ｄ）、７．２１（２Ｈ、ｄ）、７．３５（１Ｈ、ｓ）、８．４９（１Ｈ、ｓ）【００９７】
例示化合物２６
メタノールより再結晶し、乳白色粉末として得た。融点は１８４℃〜１８５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３４（３Ｈ、ｓ）、６．１３（２Ｈ、ｂｒ）、７．３４（２Ｈ、ｄ）、７．３８（２Ｈ、ｄ）、７．８１（１Ｈ、ｓ）  【００９８】
例示化合物２７
メタノールより再結晶し、黄色粉末として得た。融点は１４９℃〜１５０．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．４７（９Ｈ、ｓ）、２．６８（２Ｈ、ｔ）、３．２６（２Ｈ、ｍ）、４．３３（１Ｈ、ｂｒ）、５．６７（２Ｈ、ｂｒ）、６．９４（４Ｈ、ｓ）、７．０８（２Ｈ、ｔ）、７．２２（１Ｈ、ｔ）、７．２８（２Ｈ、ｄ）、７．３９（１Ｈ、ｓ）  【００９９】
例示化合物２８  
エタノール／ヘキサンより再結晶し、淡黄色針状晶として得た。融点は１５１℃〜１５３．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．３６（２Ｈ、ｔ）、２．８５（２Ｈ、ｔ）、５．５６（２Ｈ、ｂｒ）、６．９５（４Ｈ、ｓ）、７．０８（２Ｈ、ｔ）、７．１９（１Ｈ、ｔ）、７．２９（２Ｈ、ｄ）、７．４０（１Ｈ、ｓ）  【０１００】
例示化合物２９
酢酸エチルより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１７４℃〜１７５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ３．６６（２Ｈ、ｓ）、５．５３（２Ｈ、ｂｒ）、７．０６（２Ｈ、ｄ）、７．１３（２Ｈ、ｄ）、７．１０（２Ｈ、ｄ）、７．１４（２Ｈ、ｔ）、７．２７（１Ｈ、ｔ）、７．３４（２Ｈ、ｄ）、７．１（１Ｈ、ｓ）【０１０１】
例示化合物３０
メタノールより再結晶し、無色棒状結晶として得た。融点は１４１．５℃〜１４２℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２７（３Ｈ、ｓ）、３．７５（３Ｈ、ｓ）、５．３６（２Ｈ、ｂｒ）、６．６４（２Ｈ、ｄ）、６．９５（２Ｈ、ｄ）、６．９９（２Ｈ、ｄ）、７．３２（２Ｈ、ｄ）、７．３９（１Ｈ、ｓ）【０１０２】
例示化合物３１
メタノールより再結晶し、黄色菱形結晶として得た。融点は１８０℃〜１８１．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２５（３Ｈ、ｓ）、５．７６（２Ｈ、ｂｒ）、６．８９（２Ｈ、ｄ）、６．９６（２Ｈ、ｄ）、７．０３（１Ｈ、ｔ）、７．１５（２Ｈ、ｄ）、７．１６（１Ｈ、ｓ）、７．２０（２Ｈ、ｄ）、７．３８（１Ｈ、ｓ）【０１０３】
例示化合物３２
メタノールより再結晶し、無色棒状結晶として得た。融点は２１０℃〜２１２℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２８（３Ｈ、ｓ）、５．６７（２Ｈ、ｂｒ）、６．８７（２Ｈ、ｄ）、６．９６（２Ｈ、ｄ）、７．０４（２Ｈ、ｄ）、７．２１（２Ｈ、ｄ）、７．３７（１Ｈ、ｓ）【０１０４】
例示化合物３３
メタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は２７６℃〜２７８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ＤＭＳＯ  ２．１３（３Ｈ、ｓ）、６．８４（２Ｈ、ｂｒ）、６．９２（２Ｈ、ｄ）、６．９６（２Ｈ、ｄ）、７．４２（２Ｈ、ｄ）、７．７９（１Ｈ、ｓ）、７．８８（２Ｈ、ｄ）【０１０５】
例示化合物３４  
メタノールより再結晶し、無色板状結晶として得た。融点は１９８．５〜１９９℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２７（３Ｈ、ｓ）、５．６３（２Ｈ、ｂｒ）、６．７６（２Ｈ、ｔ）、６．８９（２Ｈ、ｄ）、６．９６（２Ｈ、ｄ）、７．３２（２Ｈ、ｑ）、７．３８（１Ｈ、ｓ）【０１０６】
例示化合物３５
メタノールより再結晶し、淡黄色粒状晶として得た。融点は２２６℃〜２２８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２４（３Ｈ、ｓ）、５．５６（２Ｈ、ｂｒ）、６．９０（２Ｈ、ｄ）、６．９４（２Ｈ、ｄ）、７．１０（２Ｈ、ｄ）、７．２２（１Ｈ、ｔ）、７．３２（２Ｈ、ｑ）、７．３８（１Ｈ、ｓ）【０１０７】
例示化合物３６  
メタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は２１６℃〜２１８℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．２９（３Ｈ、ｓ）、５．６９  （２Ｈ、ｂｒ）、６．８６（２Ｈ、ｄ）、６．９６（２Ｈ、ｄ）、７．１４（２Ｈ、ｄ）、７．２０（２Ｈ、ｄ）、７．３８（１Ｈ、ｓ）【０１０８】
例示化合物３７
メタノールより再結晶し、淡黄色板状結晶として得た。融点は１５４℃〜１５５．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．５０（３Ｈ、ｂｒ）、１．６４（３Ｈ、ｂｒ）、１．７６（６Ｈ、ｂｒ）、１．９１（３Ｈ、ｂｒ）、２．４５（３Ｈ、ｓ）、５．０８（２Ｈ、ｂｒ）、７．２０（２Ｈ、ｄ）、７．３０（２Ｈ、ｄ）、７．３１（１Ｈ、ｓ）【０１０９】
例示化合物３８
メタノールより再結晶し、乳白色プリズム状晶として得た。融点は１５５℃〜１５６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ５．７５（２Ｈ、ｂｒｓ）、６．７２（２Ｈ、ｄｄ）、７．０３（１Ｈ、ｄｄｄ）、７．１４（２Ｈ、ｔ）、７．２４（１Ｈ、ｔ）、７．３４（１Ｈ、ｄｄｄ）、７．４２（２Ｈ、ｄ）、７．８５（１Ｈ、ｓ）、８．３２（１Ｈ、ｄｄ）【０１１０】
例示化合物３９
メタノールより再結晶し、淡黄色プリズム状晶として得た。融点は２３４．５℃〜２３５．５℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ５．５４（２Ｈ、ｂｒｓ）、７．１６（２Ｈ、ｄ）、７．１８（２Ｈ、ｔ）、７．３２（１Ｈ、ｔ）、７．３８（２Ｈ、ｄ）、７．４７（１Ｈ、ｓ）、７．４８（２Ｈ、ｄ）【０１１１】
例示化合物４０
メタノールより再結晶し、無色プリズム状晶として得た。融点は１０３℃〜１０４℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．０２（３Ｈ、ｔ）、２．１０（３Ｈ、ｓ）、４．０８（２Ｈ、ｍ）、４．９６（２Ｈ、ｂｒｓ）、７．１７（２Ｈ、ｄ）、７．１９（１Ｈ、ｓ）、７．２５（１Ｈ、ｔ）、７．２８（１Ｈ、ｄ）、７．３５（１Ｈ、ｔ）【０１１２】
例示化合物４１
酢酸エチルより再結晶し、無色プリズム状晶として得た。融点は１６１℃〜１６３℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．１４（３Ｈ、ｓ）、５．７５（２Ｈ、ｂｒｓ）、７．１５（１Ｈ、ｓ）、７．２８（１Ｈ、ｄｄ）、７．３４（１Ｈ、ｄｄｄ）、７．３６（１Ｈ、ｄｄ）、７．４３（１Ｈ、ｄｄｄ）【０１１３】
例示化合物４２
ジエチルエーテル／ヘキサンより再結晶し、乳白色粒状晶として得た。融点は７５℃〜７６℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．４６（３Ｈ、ｂｒ）、１．６０（３Ｈ、ｂｒ）、１．７１（６Ｈ、ｂｒ）、１．８８（３Ｈ、ｂｒ）、２．１０（３Ｈ、ｓ）、５．１９（２Ｈ、ｂｒｓ）、７．２−７．３５（４Ｈ、ｍ）【０１１４】
例示化合物４３
メタノールより再結晶し、黄色粒状晶として得た。融点は１４５℃〜１４７℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ２．００（３Ｈ、ｓ）、２．２２（３Ｈ、ｓ）、５．４５（２Ｈ、ｂｒｓ）、６．７９（１Ｈ、ｓ）、６．８５（１Ｈ、ｄｄ）、６．９２（１Ｈ、ｄｄ）、７．１０（２Ｈ、ｔ）、７．２２（１Ｈ、ｔ）、７．２４（１Ｈ、ｓ）、  ７．２８（２Ｈ、ｄ）【０１１５】
例示化合物４４
メタノールより再結晶し、無色粒状晶として得た。融点は１９０℃〜１９１℃であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １．９９（６Ｈ、ｓ）、２．２０（３Ｈ、ｓ）、５．３６（２Ｈ、ｂｒｓ）、６．７１（２Ｈ、ｓ）、７．１３（２Ｈ、ｔ）、７．１５（１Ｈ、ｓ）、７．２４（１Ｈ、ｔ）、７．２６（２Ｈ、ｄ）【０１１６】
＜免疫ブロット法及び免疫染色法による筋分化の評価＞
（１）ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地にて、増殖条件下で２４時間Ｃ２Ｃ１２細胞を培養し、その後分化条件に切り替えて培養を継続した。増殖条件下での培養直後（０ｈ）、分化条件下での培養に切り替えてから２４時間後（２４ｈ）、４８時間後（４８ｈ）、７２時間後（７２ｈ）のＣ２Ｃ１２細胞について、所定の抗体を用いて筋分化の指標となるマーカーの発現を調べた。ローディングコントロールとしてチューブリンを使用した（図３Ａ）。【０１１７】
ＩＢＳ００８７３８を添加した場合の１日目のＭｙｏＤの発現はＤＭＳＯを添加した場合よりもわずかに高く、ＩＢＳ００８７３８が増殖条件下でのＭｙｏＤの発現に寄与している可能性が示唆された。ＭｙｏＤの発現は２日目及び３日目に顕著となり、４日目に減少傾向が認められた。ミオゲニンの発現は２日目からＩＢＳ００８７３８を添加した場合とＤＭＳＯを添加した場合の両方でみられたが、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合は２日目以降に発現が強まる傾向が認められた。ＭＨＣの発現はＩＢＳ００８７３８を添加した場合に２日目からみられ始め、３日目と４日目ではＤＭＳＯを添加した場合よりも顕著な発現がみられた。ＩＢＳ００８７３８を添加した場合のＴＡＺの発現は２日目に最も顕著となった。ＩＢＳ００８７３８を添加した場合はＰａｘ７の発現がＤＭＳＯを添加した場合よりも早く弱まる傾向がみられたが、Ｐａｘ３にそのような傾向はみられなかった。【０１１８】
（２）Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２：ｒａ５９に記載の方法により、ＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）とＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  Ｃｏｎｔ）のそれぞれを、ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地にて７２時間培養し、抗ＭＨＣ抗体で免疫染色した（図３Ｂの白色部分。図中の線は１００μｍである）。また、抗ＭＨＣ抗体と抗ＴＡＺ抗体を用いて免疫ブロット法により評価した（図３Ｃ）。ＴＡＺの発現が消失していることから、ＴＡＺが有効にノックダウンされていることがわかる。また、ＴＡＺのノックダウンによりＭＨＣの発現は消失した。ＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  Ｃｏｎｔ）ではＩＢＳ００８７３８が筋形成を促進しているのに対して、ＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）ではＩＢＳ００８７３８は筋形成を促進しなかった。【０１１９】
＜定量リアルタイムＰＣＲによる筋形成及び筋融合マーカーの評価＞
（１）筋形成誘発直前（０ｈ）のＣ２Ｃ１２細胞、ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地にて分化条件下で２４時間培養した後（２４ｈ）のＣ２Ｃ１２細胞、７２時間培養後の（７２ｈ）Ｃ２Ｃ１２細胞について、それぞれ定量リアルタイムＰＣＲによる評価を行った。評価は３回実施し、その結果を表３及び図４に示す。評価結果によれば、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合はＤＭＳＯを添加した場合よりもミオゲニンとＭｙｏＤの遺伝子転写の度合いが高かったが、７２時間後に有意な差は見られなかった。これに対してＴＡＺの発現は変化しなかった。図中のライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊＊ｐ＜０．０５、ｎｓは非有意を示す。【０１２０】
（２）上皮細胞中のＴＡＺ標的とされている結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）とｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１についても同様の条件で評価を行ったところ、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合とＤＭＳＯを添加した場合との間で有意な差は見られなかった。筋融合（ｍｙｏｆｕｓｉｏｎ）マーカーであるＭ−カドヘリン、カルパイン１、カベオリン３についても同様の条件で評価を行ったところ、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合に遺伝子転写の度合いが高まる傾向は見られなかった。【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
定量リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＡＢＩ７５００  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。使用したプライマーの遺伝子配列を表４に示す。【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
＜レポーターアッセイによる転写因子の活性の評価＞
Ｃ２Ｃ１２細胞においてＴＡＺと相互作用する転写因子に起因するレポーターの活性に対するＩＢＳ００８７３８の影響の有無及びその度合いを調べた。具体的には、ＭｙｏＤ、ＴＥＡＤ、ＳＭＡＤ及びＰａｘ３にそれぞれ対応するルシフェラーゼレポーターを発現させたＣ２Ｃ１２細胞と、ルシフェラーゼレポーターとＴＡＺを発現させたＣ２Ｃ１２細胞のそれぞれを、ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地で培養した。評価は３回実施し、結果を表５及び図５に示す。評価結果によれば、ＴＡＺの過剰発現によってＭｙｏＤ、ＴＥＡＤ、ＳＭＡＤ及びＰａｘ３のレポーターの活性が高まる傾向が認められた。ＩＢＳ００８７３８を培地に添加した場合は、ＭｙｏＤのレポーターの活性がＤＭＳＯを添加した場合と比べてさらに顕著に高まった。他方、ＴＥＡＤ、ＳＭＡＤ及びＰａｘ３の各レポーターの活性は、ＤＭＳＯを添加した場合と比べて顕著な差はみられなかった。図中のライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ｎｓは非有意を示す。【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
Ｃ２Ｃ１２細胞へのルシフェラーゼレポーターの導入は、Ｃ２Ｃ１２細胞を１２ウェルプレート（１×１０５個／ウェル）にて一晩培養した後、ｐＧＬ３  Ｍｙｏ−１８４（ＭｙｏＤに対応）、８ｘＧＴ−ＩＩＣ−δ５１ＬｕｃＩＩ（ＴＥＡＤに対応）、９ｘＣＡＧＡ−ＭＬＰ（ＳＭＡＤに対応）及びｐ（ＰＲＳ−１／−４）３（Ｐａｘ３に対応）を単独で又はＴＡＺとともに細胞内に導入した。これらのレポーターベクターは、宮澤恵二氏（山梨大学）、佐々木洋氏（熊本大学）、栗原裕基氏（東京大学）の提供による。導入後直ちにＤＭＳＯ又はＩＢＳ００８７３８を１０μＭの濃度となるように添加した。細胞をコンフルエンスに達するまで増殖させた後、ＤＭＳＯ又はＩＢＳ００８７３８とともに分化誘導培地に移し、ルシフェラーゼアッセイ実施前の２４時間培養した。【０１２７】
＜クロマチン免疫沈降法による評価＞
（１）ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを１０μＭの濃度となるように添加した培地にて、分化条件下で２４時間培養したＣ２Ｃ１２細胞について、ＭｙｏＤ、ＴＥＡＤ及びＰａｘ３のクロマチン免疫沈降を行った。ＰＣＲによりミオゲニン、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ｍｙｆ５をそれぞれ検出した。プロテインＧセファロースを用いた免疫沈降を対照（Ｍｏｃｋ  ＣｈＩＰ）とした。評価は３回実施し、その結果を表６及び図６に示す。評価結果によれば、ＩＢＳ００８７３８を添加した場合はＭｙｏＤのミオゲニンプロモーターへの結合が顕著になったが、ＴＥＡＤのＣＴＧＦとの会合には殆ど影響を与えず、Ｐａｘ３のＭｙｆ５プロモーターへの結合はＤＭＳＯの場合よりも低下した。図中のライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓは非有意を示す。【０１２８】
【表６】
0006616190.tif 000017
【０１２９】
（２）ＩＢＳ００８７３８がＴＡＺとＭｙｏＤの相互作用に与える影響について調べるため、ヒト胎児由来腎臓細胞であるＨＥＫ２９３細胞でＦＬＡＧ−ＴＡＺ及びＨＡ−ＭｙｏＤを発現させ、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降を行った。その結果、ＩＢＳ００８７３８で処理した場合はＤＭＳＯで処理した場合に比べてＨＡ−ＭｙｏＤとＦＬＡＧ−ＴＡＺの相互作用がやや促進された（図７Ａの矢印）。【０１３０】
クロマチン免疫沈降は以下のようにして行った。Ｃ２Ｃ１２細胞をコンフルエンスに達するまで培養しＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯをそれぞれ１０μＭの濃度となるように分化誘導培地にて２４時間処理した。その後、細胞を１．４２％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドで１５分間架橋させ、１２５ｍＭのグリシンで５分間処理して反応を止めた。架橋した細胞をバッファー（５０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解し、ソニケーターバス（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社）で、最大出力にて３０秒オン／６０秒オフを２５サイクル行ってクロマチンを切断した。切断の状態をアガロースゲル電気泳動によって確認した。約２×１０６個の細胞から得られたクロマチンを２μｇの抗体とともに４℃で３時間インキュベートした。次いで、免疫沈降を２０μｌのプロテインＧセファロースビーズを用いて行った。対照として、プロテインＧセファロースビーズを無抗体で使用した（Ｍｏｃｋ  ＣｈＩＰ）。沈降したＤＮＡ切片をＣｈｅｌｅｘ−１００樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で単離し、定量ＰＣＲ分析のために１：２．５に希釈した。Ｉｎｐｕｔ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅを確認した。【０１３１】
＜免疫蛍光法による評価＞
ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯをそれぞれ１０μＭの濃度となるように添加した培地において増殖条件下で２４時間培養後、分化条件下で２４時間後、及び分化条件下で７２時間後の３段階におけるＣ２Ｃ１２細胞に内在するＭｙｏＤ及びＴＡＺの免疫染色を行い観察した（図７Ｂ）。ＭｙｏＤ及びＴＡＺは３段階すべてにおいて細胞核内に存在していた。増殖条件下で２４時間培養後のＭｙｏＤ及びＴＡＺは細胞核内に分散して存在していた（上段）が、分化条件下で培養すると細胞核内でドットを形成した。分化条件下で２４時間培養後には、ＴＡＺを強く発現する細胞とＭｙｏＤを強く発現する細胞とが混在していた（中段）。分化条件下で７２時間培養後には、単核細胞中ではＴＡＺの発現が弱まりＭｙｏＤの発現が維持される傾向がみられ、多核細胞中ではＴＡＺとＭｙｏＤの双方が発現し、核内で共局在していた（下段）。ＩＢＳ００８７３８を添加した場合は、ＤＭＳＯを添加した場合に比べて増殖条件下では顕著な差がみられなかったが、分化条件下で２４時間培養後には単核細胞中のＴＡＺとＭｙｏＤとが共在化して２又は３の核を有する細胞の生成がＤＭＳＯの場合に比べて促進されていた（中段）。７２時間培養後には、ＤＭＳＯの場合に比べて多核細胞が顕著に増加していた（下段）。免疫染色法及び免疫蛍光法は、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１３：１４８４−１４９５に記載の方法で実施した。図中の線は５０μｍである。【０１３２】
＜ミオスタチンに対する拮抗作用＞
ミオスタチンはトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーに属するタンパク質の一種であり、筋肉の増殖及び分化を阻害する。ミオスタチンはアクチビン受容体ＩＩ型と結合してＳＭＡＤ２／３依存性のシグナル伝達を開始する。ＴＡＺはＳＭＡＤ２／３と相互作用することから、ＩＢＳ００８７３８がミオスタチンのシグナル伝達に与える影響について調べた（図８Ａ〜Ｃ）。図中の線は１００μｍである。ライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓは非有意を示す。【０１３３】
（１）ＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）と、ＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  Ｃｏｎｔ）をそれぞれコンフルエンスまで増殖させた。０．１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡを含む４ｍＭ ＨＣｌに溶かした１００μｇ／ｍＬミオスタチンストック溶液、ＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭ ＩＢＳ００８７３８ストック溶液を用意した。１ｍＬの培地に１μＬのＤＭＳＯを加えた培地、１μＬのミオスタチンストック溶液を加えた培地、１μＬのミオスタチンストック溶液と１μＬのＩＢＳ００８７３８ストック溶液を加えた培地を用いて、分化条件で７２時間培養した。
その結果、ミオスタチンのみを添加した場合はＣ２Ｃ１２細胞の筋形成が阻害されたが、ミオスタチンとＩＢＳ００８７３８を添加した場合は筋形成が回復した。一方、ＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞はＩＢＳ００８７３８を添加した場合でも筋形成が回復しなかった（図８Ａ）。【０１３４】
（２）分化条件で７２時間培養後のＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）と、ＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  Ｃｏｎｔ）について融合インデックスを調べた。評価は３回実施し、その結果を表７及び図８Ｂに示す。評価結果によれば、ＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞ではミオスタチンとＩＢＳ００８７３８を添加した場合の融合インデックスがミオスタチンのみを添加した場合に比べて有意に上昇した。一方、ＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞では、ミオスタチンとＩＢＳ００８７３８を添加した場合とミオスタチンのみを添加した場合との間に有意な差は認められなかった。【０１３５】
【表７】
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【０１３６】
（３）分化条件で７２時間培養後のＴＡＺをノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  ＴＡＺ）と、ＴＡＺをノックダウンしていないＣ２Ｃ１２細胞（ｓｉ  Ｃｏｎｔ）について免疫ブロッティング法によりＭＨＣの発現を調べた。その結果、ミオスタチンのみを添加した場合にＭＨＣの発現が低下したが、ミオスタチンとＩＢＳ００８７３８を添加した場合にはＭＨＣの発現が回復した（図８Ｃ）。【０１３７】
＜カルジオトキシンにより誘発した筋損傷の回復＞
学内動物使用管理委員会の認可を受けた手続に従ってマウスを用いた実験を実施した（図９Ａ〜Ｆ）。実験にはＢａｌｂ／ｃ  ＢｙＪマウス（６週齢、メス）を使用した。図中の線は５０μｍである。ライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、＊ｐ＜０．０５である。「ｉ．ｍ」は筋肉注射、「ｉ．ｐ」は腹腔内注射を示す。【０１３８】
（１）カルジオトキシンを１０μＭの濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。得られたカルジオトキシン溶液（１００μｌ）にＤＭＳＯ ０．３μＬ、あるいは、ＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭ ＩＢＳ００８７３８ストック溶液０．３μＬを加え、マウスの右の前脛骨筋及び左の前脛骨筋にそれぞれ注射した。１回の実験にマウス３匹を用い、実験を２回反復した。これらのマウスは５日後に殺処理を行った。【０１３９】
（２）６個体のマウスに、１日目に右の前脛骨筋にカルジオトキシンを１０μＭの濃度となるように溶かしたＰＢＳ溶液（１００μｌ）を、左の前脛骨筋にビヒクル（ＰＢＳ１００μｌ）を、それぞれ注射した。ＤＭＳＯに溶かした１００ｍＭのＩＢＳ００８７３８ストック溶液を用意した。２、４及び６日目に、３個体のマウスの腹腔内に２５μＬのＤＭＳＯを、残り３個体のマウスの腹腔内にＩＢＳ００８７３８ストック溶液を注射した。これらのマウスは７日後に殺処理を行った。【０１４０】
（３）筋肉組織の観察は、前脛骨筋を４％フォルマリンで固定し、パラフィン又はＯＣＴコンパウンド内に包埋し、５μｍ厚の筋肉切片をヘマトキシリン及びエオジンで染色して行った。さらに、Ｐａｘ７を抗Ｐａｘ７抗体で検出し、３，３’−ジアミノベンジジンで可視化した。観察したところ、カルジオトキシンとともにＩＢＳ００８７３８を注射した場合は、筋再生の指標であるＰａｘ７陽性細胞（図９Ａ中の黒矢印で示す）の数、及び中心に核を有する筋繊維（図９Ａ中の白矢印で示す）の数がともにＤＭＳＯを注射した場合に比べて多かった。さらに、筋肉組織の９箇所を任意に選択して観察されたＰａｘ７陽性細胞の数、及び中心に核を有する筋繊維の数を比較したところ、ＩＢＳ００８７３８を注射した場合がＤＭＳＯを注射した場合を上回っていた。Ｐａｘ７陽性細胞及び中心に核を有する筋繊維の数は、２０倍の拡大視野を用い、６視野中のＰａｘ７陽性細胞及び中心に核を有する筋繊維の数を数えることによって評価した。結果を表８及び図９Ｂに示す。【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
（４）腹腔内にＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを注射した個体についても上記と同様にして筋肉組織を観察した。ＩＢＳ００８７３８を注射した場合はＰａｘ７陽性細胞（図９Ｃ中の黒矢印で示す）の数、及び中心に核を有する筋繊維（図９Ｃ中の白矢印で示す）の数がともにＤＭＳＯを注射した場合に比べて多かった。【０１４３】
（５）Ｐａｘ７の免疫ブロッティングにはＭｏｕｓｅ−ｏｎ−Ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＭ）キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と抗Ｐａｘ７抗体、２次ビオチン化抗体とを使用した。３，３’−ジアミノベンジジン染色（ＤＡＢ）は、切片をＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で３０分間インキュベートしてからＰＢＳで再度洗浄し、ＤＡＢでインキュベートした。細胞核をヘマトキシリンで対比染色した。【０１４４】
＜デキサメタゾンにより誘発される筋萎縮の抑制＞
（１）ＤＭＳＯに溶かした２５ｍｇ／ｍＬのデキサメサゾンストック溶液を用意した。３個体のＢａｌｂ／ｃ  ＢｙＪマウス（６週齢、メス）の腹腔内に１週間、毎日このデキサメサゾンストック溶液を２０μＬ注射した。別の３個体にはＤＭＳＯを２０μＬ注射し、デキサメサゾン処理をしないコントロール群とした。デキサメサゾン投与群、コントロール群、いずれのマウスについても、９、１１及び１３日目の計３回、片方の後肢筋にＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭのＩＢＳ００８７３８ストック溶液０．３μＬをさらに１００μＬのＰＢＳに溶かして注射し、対側の後肢筋には１００μＬのＰＢＳを注射した。１４日後に殺処理し、筋肉組織を固定してヘマトキシリン及びエオジンで染色した（図８Ｄ）。デキサメタゾンを投与したマウスでは筋繊維が縮小していることが観察された。ＤＭＳＯを腹腔内に注射したマウスではＩＢＳ００８７３８の注射による有意な影響は観察されなかったが、デキサメタゾンを腹腔内に注射したマウスではＩＢＳ００８７３８の注射により部分的に筋萎縮が抑制されていた。【０１４５】
（２）デキサメタゾンを腹腔内に注射した個体の筋繊維の断面を抗ラミニン抗体で染色して観察したところ、ＤＭＳＯを後肢筋に注射した個体に比べてＩＢＳ００８７３８を後肢筋に注射した個体の筋繊維の萎縮が抑制されていた（図９Ｅ）。３個体のマウスについて１個体あたり５００の筋繊維の断面積を測定したところ、ＤＭＳＯを後肢筋に注射した個体に比べてＩＢＳ００８７３８を後肢筋に注射した個体の筋繊維の断面積のほうが大きい傾向が確認された（図９Ｆ）。筋繊維の断面積はＩｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェアを用いて解析した。【０１４６】
＜ＴＡＺの細胞内の位置に与える影響の評価＞
ＴＡＺのリン酸化と細胞内の位置はＴＡＺの活性を制御する上で重要な要素である。そこで、ＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯを添加した培地において分化条件下で２４時間培養後のＣ２Ｃ１２細胞について細胞分画を行い、ＴＡＺの細胞内の位置を調べた。その結果、Ｃ２Ｃ１２細胞中のＴＡＺは主に細胞核部分に存在しており、ＩＢＳ００８７３８のＴＡＺの細胞内の位置に対する影響は見られなかった（図１０）。【０１４７】
＜細胞の増殖に与える影響の評価＞
ＩＢＳ００８７３８がＣ２Ｃ１２細胞の増殖に影響を与えるかを調べるため、ＩＢＳ００８７３８の培地への添加量を０μＭ（無添加）、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭとしてそれぞれ増殖条件下で５日間培養し、各日の細胞数をＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法により測定した。測定は３回行い、得られた値を１日目の数を１として相対化した。結果を表９及び図１１に示す。その結果、ＩＢＳ００８７３８はＣ２Ｃ１２細胞の増殖には影響しないことがわかった。【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
＜腫瘍形成に与える影響の評価＞
ＴＡＺは発がん遺伝子としても知られており、ＴＡＺの活性亢進はがん細胞の上皮間葉転換を誘発すると考えられている。そこで、ＩＢＳ００８７３８とがん発生の関係について確認するための試験を行った（図１２Ａ〜Ｃ）。
（１）Ａ４３１（ヒト上皮様細胞癌由来細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌細胞）をそれぞれＩＢＳ００８７３８又はＤＭＳＯで処理し、免疫ブロット法で評価した。その結果、ＥＭＴの指標となるマーカー（フィブロネクチン、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン）のいずれにおいても、ＩＢＳ００８７３８で処理した場合とＤＭＳＯで処理した場合との間に有意な差は認められなかった（図１２Ａ）。【０１５０】
（２）９６ウェルプレートの各ウェルを３０μＬのＢＤマトリゲル（商品名、ベクトン・ディッキンソン社製）でプレコートした。Ａ４３１細胞を２．１ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で２％ＢＤマトリゲルにサスペンドした。その細胞液１４０μＬに、ＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭＩＢＳ００８７３９ストック溶液０．１７μＬ、又は、ＤＭＳＯ  ０．１７μＬを加えて、プレコートした各ウェルに重層し、３Ｄマトリゲル内の増殖を観察した（図１２Ｂ）ウルトラ・ロー・アタッチメント９６ウェルプレートを用いて、各ウェルに３００個のＡ４３１細胞を入れ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、５μｇ／ｍＬのインスリン、０．４％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む血清フリーのＤＭＥＭ／Ｆ-１２培地内で培養し、最終濃度１０μＭになるようにＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭのＩＢＳ００８７３８ストック溶液を加えた条件、又は、同じ容量のＤＭＳＯを加えた条件で腫瘍スフィアの形成を観察した（図１２Ｃ）。３Ｄコロニー及びスフィアの大きさ（μｍ）は、３Ｄマトリゲル、ないし、スフィア形成条件下で観察される１５０μｍ以上の大きさの細胞塊３０個についてその最大径を測定した。結果を表１０及び図１２Ｂ、１２Ｃに示す。図中の線は２００μｍである。ライン及びエラーバーは平均値と標準誤差を示し、ｎｓは非有意を示す。【０１５１】
【表１０】
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【０１５２】
スフィアの観察及び３Ｄマトリゲル培養は以下のようにして行った。すなわち、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６の各細胞を、９６ウェルプレート（Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｌａｔｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にて１０日間、塩基性繊維芽細胞増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、上皮成長因子２０ｎｇ／ｍｌ、インスリン５μｇ／ｍｌ、ウシ血清アルブミン０．４％（ｗ／ｖ）を含む血清フリーＤＭＥＭ／Ｆ−１２  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて培養した（３００個／ウェル）。直径１５０μｍ以上の細胞の凝集体をスフィアと定義した。３次元マトリゲル培養のため、９６ウェルプレートをウェルあたり３０μｌのＢＤ  マトリゲルでプレコートした。２％のＢＤ  マトリゲルを含む媒体中に、２．１×１０６個／ｌとなるように細胞を懸濁させた。各ウェルに３００個の細胞を含む懸濁液１４０μＬを入れ、ＤＭＳＯ又はＩＢＳ００８７３８をそれぞれ１０μＭの濃度となるように添加して１０日間培養した。【０１５３】
＜ＤＮＡコンストラクション及びウイルスの作製＞
ベクターとして、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５０：１９９−２０８、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２：ｒａ５９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：４２８１−４２９２に記載のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ−ｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔ、ｐＣｌｎｅｏＦＨ及びｐＣｌｎｅｏＨＡを使用した。セリン８９をアラニンに置換したＴＡＺ  Ｓ８９Ａ変異体を、Ｈ−２３３９、５’−ｃｇｃｔｃｇｃａｔｇｃｇｔｃｇｃｃｃｇｃｇｔｃｃｃｔｇｃａ−３’とＨ−２３４０、５’−ｃｇｇｇｃｇａｃｇｃａｔｇｃｇａｇｃｇｇａｃａｔｇｃｔｇｇｇ−３’を用いてＰＣＲ法により作製した。ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ−ＦＨ−ＴＡＺ及びＴＡＺ  ＳＡ−ｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔを、ｐＣｌｎｅｏＦＨ−ＴＡＺ及びｐＣｌｎｅｏＦＨ−ＴＡＺ  ＳＡからＮｈｅＩ／ＳａｌｌフラグメントをｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ−ｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔベクターにサブクローニングすることで作製した。【０１５４】
ヒトＬＡＴＳ１及びヒトＬＡＴＳ２のためのｐｃＤＮＡノックアウトコンストラクトの作製にはＢＬＯＣＫ−ｉＴ（登録商標）Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。ターゲットシーケンスはＡＦ１０４４１３．１（ＬＡＴＳ１）の１０７４ｂｐサイト及びＡＦ２０７５４７．１（ＬＡＴＳ２）の１５９８ｂｐサイトとした。【０１５５】
アニーリングオリゴを製造元のプロトコールに従ってｐｃＤＮＡ  ６．２−ＧＷ／ｍｉＲベクターにライゲートして、ｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ１  ＫＤ及びｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ２  ＫＤを作製した。ｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ２  ＫＤからＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを単離し、ｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ１  ＫＤのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩサイトにライゲートしてｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ１／２  ＫＤを作製した。【０１５６】
ＰＣＲ法によりｐＢｕｄＣＥについてプライマー（Ｈ１６７４、５’−ａｔｃｇａｔｇｔｃｇａｇｃｔａｇｃｔｔｃｇｔｇａｇ−３’及びＨ１６７５、５’−ａｃｔａｇｔｃｔｃｇａｇａｃｃａｃｇｔｇｔｔｃａｃｇａｃａｃｃ−３’）を用いて伸長因子（ＥＦ）を増幅した。得られた生成物をＣｌａＩ及びＳｐｅＩで切断し、ｐＬｅｎｔｉ４／ＴＯ／Ｖ５−ＤＥＳＴの同じサイトにライゲートして、ｐＣＭＶ／ＶＯプロモーターをＥＦプロモーターで置換してｐＬｅｎｔｉ４−ＥＦ／Ｖ５−ＤＥＳＴを作製した。【０１５７】
ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ  Ｔ−ＲｅｘＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ｐｃＤＮＡ  ６．２  ＬＡＴＳ１／２  ＫＤ及びｐＬｅｎｔｉ４−ＥＦ／Ｖ５−ＤＥＳＴからｐＬｅｎｔｉ−ＥｍＧＦＰ  ＬＡＴＳ１／２  ＫＤベクターを作製した。【０１５８】
ｐＢｕＣＥ４．１のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントをｐＱＣＸＩＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＸｂａＩ／ＮｏｔＩサイトにライゲートしてｐＱＣＸＩＰ  ＥＦを作製した。【０１５９】
リンカー（Ｈ３１４２、５’−ｇｇｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｔａａａｃａａｔｔｇｇａｔｃｃ−３’及びＨ−３１４３、５’−ａａｔｔｇｇａｔｃｃａａｔｔｇｔｔｔａａａｃｔｃｇａｇｃ−３’）をＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングしてｐＱＣＸＩＰ  ＥＦ  Ｈ３１４２／Ｈ３１４３を作製した。【０１６０】
ｐＣｌｎｅｏｍＣｈｅｒｒｙのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントをｐＱＣＸＩＰ  ＥＦ  Ｈ３１４２／Ｈ３１４３のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩサイトにライゲートしてｐＱＣＸＩＰ  ｍＣｈｅｒｒｙを作製し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、ｆｉｌｌ  ｉｎし、再度ライゲートしてＩＲＥＳ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを除去した。得られたベクターをｐＱＣＸＩ  ｍＣｈｅｒｒｙと名づけた。【０１６１】
ｐＬｅｎｔｉ−ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．社）をＳｐｅＩ／ＭｌｕＩで切断した。単離したＧＦＰ−２Ａ−ｐｕｒｏフラグメントをｐＣｌｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｈｅＩ／ＭｌｕＩサイトにサブクローニングしてｐＣｌｎｅｏ  ＧＦＰ−２Ａ−ｐｕｒｏを作製し、次いでこれをＢｇＩＩ／ＭｌｕＩで切断した。単離したフラグメントをｐＱＣＸＩ  ｍＣｈｅｒｒｙのＢｇｌＩＩ／ＭｌｕにライゲートしてｐＱＣＸＩ  ＧＦＰ２Ａ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを作製した。【０１６２】
ＷＷＴＲ１  ｍｏｕｓｅ  ｐＲＦＰ−ＲＳ  ｓｈＲＮＡ（ＴＦ５０５５３３、５６１７５０）（ＯｒｉＧｅｎｅ社）についてプライマー（Ｈ３１６３、５’−ｃａａｔｔｇａａｔｔｃｃｃｃａｇｔｇｇａａａｇａｃｇｃｇｃａ−３’及びＨ３１６４、５’−ａｃｇｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｃｔｇｇｇｇａｃｔｔｔｃａｃａｃ−３’）を用いてＰＣＲ法によりＵ６プロモーターとターゲットシーケンスを増幅した。生成物をＴＡＫＮ２ベクター（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．社）にサブクローニングし、ＭｌｕＩ／ＮｏｔＩで切断した。単離したフラグメントをｐＱＣＸＩ  ＧＦＰ２Ａ−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎのＭｌｕＩ／ＮｏｔＩサイトにライゲートした。ベクターをｐＣＬ１０Ａ−１  レトロウイルスパッケージングベクターとともにＨＥＫ２９３細胞に共導入してマウスＴＡＺノックダウン用のレトロウイルスを作製した。レンチウイルスは（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １４：１３６９−１３８１）に記載の方法に従って作製した。【０１６３】
ヒトＴＡＺ又はマウスＴＡＺの、ＭＣＦ１０Ａ細胞又はＣ２Ｃ１２細胞におけるノックダウンは、既報（Ｉｋｅｄａ  Ｍ  ら、Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２：ｒａ５９）の通り行った。ヒトＴＡＺ二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡはアンビオン社製ｓ２４７８９、マウスＴＡＺｄｓＲＮＡはダーマコン社製ｓｉＲＮＡ  Ｄ−０４１０５７を用いた。【０１６４】
＜使用した抗体及び試薬＞
本明細書に記載の実験における抗体及び試薬としては、以下の市販品を使用した。
・マウス抗ＴＡＺ抗体（５６０２３５）、マウス抗ＭｙｏＤ抗体（５５４１３０）、マウス抗ＰＡＲＰ抗体（５１−６６３９ＧＲ）、マウス抗フィブロネクチン抗体（６１００７７）、マウス抗Ｅ−カドヘリン抗体（６１０１８１）、マウス抗Ｎ−カドヘリン抗体（６１０９２１）、マトリゲル（以上、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）
・ウサギ抗ミオゲニン抗体（ｓｃ−５７６）、ウサギ抗ＭｙｏＤ抗体（ｓｃ−７６０）、マウス抗ビメンチン抗体（ｓｃ−６２６０）（以上、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）
・マウス抗ＭＨＣ抗体（ＭＦ２０）、マウス抗Ｐａｘ７抗体、マウス抗Ｐａｘ３抗体（以上、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、アイオワ大学）
・ウサギ抗ラミニン抗体（Ｌ９２９３）、マウス抗チューブリン抗体（Ｔ９０２６）、マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｆ３１６５）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ムフェジコブラ由来カルジオトキシン、デキサメタゾン（Ｃ９７５９）、上皮成長因子（Ｅ９６４４）、インスリン（Ｉ５５００）（以上、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）
・塩基性線維芽細胞増殖因子（０６４−０４５４１）（和光純薬工業株式会社）
・マウス抗ミオゲニン抗体（ａｂ１８３５）（Ａｂｃａｍ社）
・マウス抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ社）
・マウス抗アクチン抗体（ｃｌｏｎｅ  ４）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
・ウサギ抗ＴＥＡＤ４抗体（ＡＰＲ３８７２６＿Ｐ０５０）（Ａｖｉｖａ社）
・ヤギ抗Ｐａｘ３抗体（ＧＷＢ−３ＡＥ０ａ５）（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）
・ミオスタチン組み換え体（７８８−Ｇ８−０１０）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）【０１６５】
＜細胞培養及びトランスフェクション＞
ＨＥＫ２９３、Ａ４３１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７及びＳＷ４８０の各細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含有）で５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。
ＭＣＦ１０Ａ細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に５％のウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを添加した培地で培養した。
ＤＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。
ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ細胞及びＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ  ＳＡ細胞は、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ−ＦＨ  ＴＡＺ−ｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔ及びｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ−ＦＨ−ＴＡＺ  ＳＡ−ｉｒｅｓ−ｂｌａｓｔ）とブラストサイジンセレクションを用いて作製した。
Ｃ２Ｃ１２細胞は、増殖条件においては、増殖培地（１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）で継代培養した。分化条件においては、分化培地（２％のウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ）で培養を行った。
ＴＡＺを安定的にノックダウンしたＣ２Ｃ１２細胞は、ｐＱＣＸＩ−ＧＦＰ−２Ａ−ｓｈ  ｍｏｕｓｅ  ＴＡＺレトロウイルスを用いて作製した。
ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ細胞のＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２を安定的にノックダウンするため、細胞をｐＬｅｎｔｉ−ＥｍＧＦＰ−ＬＡＴＳ１／２  ＫＤレンチウイルスに感染させ、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳで回収した。【０１６６】
＜統計的解析＞
２サンプル間の比較はｔ検定により、多数のサンプル間の比較はＤｕｎｎｅｔｔ検定による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。【０１６７】
日本国特許出願第２０１４−０２２２８７号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006616190.tif 000037
【図７Ａ】
0006616190.tif 000038
【図７Ｂ】
0006616190.tif 000039
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
0006616190.tif 000050
【図１２Ａ】
0006616190.tif 000051
【図１２Ｂ】
0006616190.tif 000052
【図１２Ｃ】
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【配列表】
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