(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１
【化１】
0006616846.tif 000034
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化２】
0006616846.tif 000035
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を含むマグノリアエ・フロス（Magnoliae flos）のメタノール抽出物のクロロホルム画分を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３が、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３が一体となって
【化３】
0006616846.tif 000036
を形成してよく、ここでｎは１〜２の整数である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、独立してメトキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３が、独立してメトキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３が一体となって
【化４】
0006616846.tif 000037
を形成してよく、ここでｎは１である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記式１の化合物が以下の式２〜８のいずれか１つにより表される化合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【化５】
0006616846.tif 000038
【化６】
0006616846.tif 000039
【化７】
0006616846.tif 000040
【請求項５】
マグノリアエ・フロスのメタノール抽出物のクロロホルム画分を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善するための健康機能性食品。
【請求項６】
以下の式１
【化８】
0006616846.tif 000041
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化９】
0006616846.tif 000042
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を含むマグノリアエ・フロス（Magnoliae flos）のメタノール抽出物のクロロホルム画分を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善するための健康機能性食品。
【請求項７】
上記式１の化合物が以下の式２〜８のいずれか１つにより表される化合物である、請求項６に記載の健康機能性食品。
【化１０】
0006616846.tif 000043
【化１１】
0006616846.tif 000044
【化１２】
0006616846.tif 000045
【請求項８】
慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を製造するための、マグノリアエ・フロスのメタノール抽出物のクロロホルム画分の使用。
【請求項９】
以下の式１
【化１３】
0006616846.tif 000046
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化１４】
0006616846.tif 000047
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を含むマグノリアエ・フロス（Magnoliae flos）のメタノール抽出物のクロロホルム画分の、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マグノリアエ・フロス（Magnoliae flos）抽出物、有機溶媒を用いたその分画により得られる画分もしくは活性画分またはそこから分離される化合物の使用、特に慢性閉塞性肺疾患を予防および処置するための有効成分として、マグノリアエ・フロスの抽出物、有機溶媒を用いた分画により得られるその画分または活性画分およびそこから分離される化合物の何れかを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な肺疾患である慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、不可逆的な気道閉塞が関連する点で喘息と異なる。現在、慢性閉塞性肺疾患は多くの国における主要な死因であり；特に、２０２０年にはヒトの死因の第三位になると予測されている（Vestbo et al., 2013）。ＣＯＰＤは、気道および肺実質における炎症による気管支および肺実質の病理学的変化により引き起こされる疾患である。ＣＯＰＤは閉塞性細気管支炎および肺気腫（肺実質破壊）により特徴付けられ、それは肺組織中の気流を持続的に阻害および閉塞し、最終的に患者の死をもたらす（Le et al., 2009）。慢性閉塞性肺疾患の型は、慢性閉塞性気管支炎、慢性細気管支炎および肺気腫を含む。このような慢性閉塞性肺疾患は、タバコの煙、埃、化学物質、大気汚染および細菌感染のような種々の原因により引き起こされる（Li et al., 2012）。
【０００３】
特に、喫煙は慢性閉塞性肺疾患の主な原因であると考えられており、実際の慢性閉塞性肺疾患を有する患者の８０％以上は喫煙者である（Rabe et al., 2007）。タバコの煙は、喫煙による肺組織中の有害な変化を引き起こす数多くの有毒化学物質を含む（Stampfli and Anderson, 2009）。これらの有毒化学物質は、肺組織中の好中球を含む種々の炎症細胞の浸潤の原因となり、肺炎症を引き起こす（Terashima et al., 1997）。臨床試験はまた、慢性閉塞性肺疾患を有する患者における気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）または唾液中の好中球およびマクロファージの数の顕著な増加も示している（O'Donnell et al., 2006）。これらの炎症細胞は組織損傷を引き起こす活性酸素種、炎症性サイトカイン、ケモカインおよび種々の酵素を産生する（Profita et al., 2010）。特に、好中球は、慢性閉塞性肺疾患の発症に重要な役割を果たす（Hiemstra et al., 1998）。好中球は多くの炎症性サイトカイン、ケモカインおよび走化性因子を産生するのみならず、エラスチナーゼを分泌し、それにより正常な肺胞形態を破壊し、最終的に肺気腫を引き起こす（Hoenderdos and Condliffe, 2013）。従って、タバコの煙により引き起こされる、炎症細胞、特に好中球の浸潤の阻害は、慢性閉塞性肺疾患の処置における重要な治療的手段であると認識されている。
【０００４】
気道粘液分泌は、外部からの病原体（細菌、ウイルスおよび真菌）および刺激から気道粘膜表面を保護するために不可欠な自然免疫応答である（Voynow et al., 2009）。しかしながら、気道粘液の過剰分泌および過剰産生は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の主要な病態生理学的特徴である（Rogers et al., 2006）。気道粘液の過剰分泌および過剰生産の阻害は、慢性閉塞性肺疾患の処置のための主要な戦略であり得る。
【０００５】
ムチンの粘液分泌に関与する遺伝子の１つであるＭＵＣ５ＡＣは、ＣＯＰＤ患者におけるその発現の著しい増加のため、重要な標的因子であると考えられている（Caramora et al., 2004）。ＭＵＣ５ＡＣの発現は、ＣＯＰＤを引き起こす主要なサイトカインであるＴＮＦ−αにより制御されると報告されている（Matera et al., 2010）。実際に、ＴＮＦ−αの過剰発現を有する動物モデルは、肺への細胞流入、気管支傷害および肺気腫のようなＣＯＰＤの病理学的特徴を示す（Lundblad et al., 2005）。従って、ＭＵＣ５ＡＣの発現および産生は、慢性閉塞性肺疾患の機序を解明するための重要な要因であり、この疾患を予防または処置するための研究が、該疾患を阻害する薬物の探索を通して積極的に行われている。
【０００６】
マグノリアエ・フロスはモクレン科に属するモクレンの花の芽を指す言葉であり、その花芽は僅かに辛い。モクレンは、園芸の目的で全国的に栽培されている背の高い落葉樹である。その花は葉より早く咲き、開花時期は３月から４月までである。マグノリアエ・フロスは漢方薬において本来、温であると考えられている。また、頭痛、背痛、および鼻炎に有効であり、副鼻腔炎を処置することができ、そして鎮痛薬としての医薬特性を有するとも認識されている。
【０００７】
従って、本発明の発明者らは、ＴＮＦ−αにより誘導されるＭＵＣ５ＡＣの発現を制御することにより、および好中球浸潤を阻害することにより慢性閉塞性肺疾患を処置できる物質を調査し、ＭＵＣ５ＡＣの発現を阻害するために有効なマグノリアエ・フロスから分離された化合物群の中からある化合物を選択し、マグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られる画分もしくは活性画分、またはそこから分離された化合物が、慢性閉塞性肺疾患マウスモデルの気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞を阻害すること、活性酸素種の産生を阻害することおよびサイトカインを減少させることにより慢性閉塞性肺疾患を処置するために使用され得ることを確認し、それにより本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、有効成分としてマグノリアエ・フロスの抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分を含む、医薬組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、マグノリアエ・フロスの画分から分離された化合物を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、マグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、以下の式１
【化１】
0006616846.tif 000002
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化２】
0006616846.tif 000003
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本発明はマグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られる画分または活性画分を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善する健康機能性食品を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は上記式１により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善するための健康機能性食品を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は薬学的に有効量のマグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分を、慢性閉塞性肺疾患を有する対象に投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明はマグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分の、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物としての使用を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は以下の式１
【化３】
0006616846.tif 000004
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化４】
0006616846.tif 000005
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を、慢性閉塞性肺疾患の患者に有効量投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は上記式１により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩の、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物としての使用を提供する。
【００１８】
次に、本発明を詳細に記載する。
【００１９】
本発明は、有効成分としてマグノリアエ・フロス抽出物を含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００２０】
マグノリアエ・フロス抽出物は以下の工程を含むが、これらに限定されない方法により調製され得る：
（１）マグノリアエ・フロスを乾燥させて水分を除去し、その後粉砕し；
（２）抽出溶媒を添加することにより、工程（１）で乾燥させたマグノリアエ・フロスを室温で抽出し；そして
（３）工程（２）で得られた抽出物をろ過し、減圧下で濃縮する。
【００２１】
上記方法において、栽培したものであれ、市販のものであれ、あらゆるマグノリアエ・フロスを、何ら制限なく使用できる。
【００２２】
上記方法の工程（１）において、乾燥は減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥（boiling drying）、噴霧乾燥または凍結乾燥のいずれかであり得るが、これに限定されるものではない。
【００２３】
上記方法の工程（２）において、抽出はろ過、熱水抽出、熱水抽出、浸漬抽出、還流冷却抽出および超音波抽出のような、慣用の方法で実施され得る。抽出は熱水抽出により１〜５回実施してよく、より具体的には３回繰り返してよいが、これに限定されるものではない。抽出溶媒は乾燥マグノリアエ・フロスに対して０．１〜１０倍、好ましくは０．３〜５倍添加され得る。抽出温度は２０〜４０℃であり得るが、これに限定されるものではない。さらに、抽出時間は、１２〜４８時間であり得るが、これに限定されるものではない。
【００２４】
上記方法の工程（２）において、抽出溶媒は水、Ｃ１〜Ｃ２低級アルコールまたはそれらの混合物であり得るが、これに限定されるものではない。
【００２５】
上記方法の工程（３）において、減圧下での濃縮は真空減圧濃縮装置または真空ロータリーエバポレーターを使用して行われ得るが、これに限定されるものではない。
【００２６】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は慢性気管支炎および肺気腫を指し、通常は慢性気管支炎および肺気腫が肺に共存するために気道が狭くなる減少を指す。
【００２７】
本発明の特定の実施態様において、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現に対するマグノリアエ・フロス抽出の効果を試験した。結果として、ＭＵＣ５ＡＣ分泌量はＴＮＦ−αで処理したＨ２９２細胞群で増加した。マグノリアエ・フロス抽出物の量の関数としてのＭＵＣ５ＡＣ分泌量と１００％の基準としてＴＮＦ−αで処理した群との比較は、ＭＵＣ５ＡＣの産生は、マグノリアエ・フロス抽出物の濃度依存的に阻害されることを示した（表４を参照）。
【００２８】
従って、本発明のマグノリアエ・フロス抽出物は有利に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防または処置に使用され得る。
【００２９】
本発明の組成物は、組成物の総重量に基づいて、有効成分として０．１〜９９．９重量％の本発明のマグノリアエ・フロス抽出物を含み得て、かつ薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。
【００３０】
本発明の組成物は、種々の経口または非経腸製剤のものであり得る。そのような製剤は通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などのような希釈剤または賦形剤を用いて調製され得る。経口投与のための固体製剤は、錠剤、丸剤、散剤、粒剤、カプセル剤などを含み、これらは少なくとも１つの化合物とデンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどのような少なくとも１つの賦形剤を混合させることにより調製され得る。単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤もまた使用され得る。経口投与のための液体製剤は懸濁剤、液剤、乳剤およびシロップ剤を含み、これらは単純な希釈剤である水および液体パラフィンに加えて、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含む。非経腸投与のための製剤は、滅菌水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤を含む。ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどは、非水溶液および懸濁剤として使用され得る。ウィテップゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ  ６１、カカオバター、ラウリン、グリセロゼラチンなどは坐剤の基剤として使用され得る。
【００３１】
本発明の組成物は、経口または非経腸で投与され得る。非経腸投与については、真皮外、腹腔内、直腸、静脈内、筋肉内、皮下、子宮内または脳内注射を使用することが好ましい。最も好ましいのは真皮外使用である。
【００３２】
本発明の組成物の用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度および疾患の重症度により変化する。一日用量は、マグノリアエ・フロス抽出物の量に基づいて０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３０〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは５０〜３００ｍｇ／ｋｇであり、一日あたり１〜６回投与され得る。
【００３３】
本発明の組成物は、単独でまたは手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法および生物学的反応修飾物質を使用する方法と組み合わせて使用され得る。
【００３４】
さらに本発明は、有効成分として、有機溶媒を用いてマグノリアエ・フロス抽出物を分画することにより得られた画分または活性画分を含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００３５】
有機溶媒はヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノールおよび水から選択され得るが、これに限定されるものではない。
【００３６】
画分はマグノリアエ・フロス抽出物をヘキサン、酢酸エチル、クロロホルムおよび水でこの順で連続して分画することにより得られるヘキサン画分、酢酸エチル画分、クロロホルム画分または水画分であり得る。本発明の好ましい実施態様によって、画分は好ましくは抽出物をヘキサン、酢酸エチル、クロロホルムおよび水でこの順で連続して分画することにより得られたヘキサン画分、クロロホルム画分または水画分であり得る。
【００３７】
活性画分は、ヘキサンと酢酸エチルを３：１比で混合した、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で分画することにより得られた１０の追加画分の画分１０（Ｆｒ．１０）である。
【００３８】
さらに、本発明は以下の式１
【化５】
0006616846.tif 000006
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化６】
0006616846.tif 000007
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００３９】
上記化合物は、次の式２〜８のいずれか１つにより表される化合物により特徴付けられる。
【化７】
0006616846.tif 000008
【化８】
0006616846.tif 000009
【化９】
0006616846.tif 000010
【００４０】
本発明の特定の実施態様において、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現に対するマグノリアエ・フロス抽出物の効果を試験した。結果として、ＭＵＣ５ＡＣ分泌量はＴＮＦ−αで処理したＨ２９２細胞群で増加した。マグノリアエ・フロス抽出物の量の関数としてのＭＵＣ５ＡＣ分泌量と１００％の基準としてＴＮＦ−αで処理した群との比較は、ＭＵＣ５ＡＣの産生は、マグノリアエ・フロス抽出物の濃度依存的に阻害されることを示した（表４を参照）。また、マグノリアエ・フロス抽出物から得られた画分から分離された上記式２〜８により表される化合物の中で、式２、３、４および５により表される化合物が、濃度依存的にＭＵＣ５ＡＣの産生を阻害したことが確認された（表６を参照）。
【００４１】
さらに、慢性閉塞性肺疾患の処置に対するマグノリアエ・フロス活性画分（Ｆｒ．１０）およびそこから分離された化合物の効果を確認するためにＣＯＰＤマウスモデルを作製し、そこへ活性画分およびそこから分離された化合物を経口投与した。結果として、マグノリアエ・フロスの活性画分およびそこから分離された化合物を投与された群における炎症細胞浸潤の阻害率は、ロフルミラスト（ＲＯＦ）で処置した薬物対照群のそれと同等であるか、それよりも高かった（表８参照）。
【００４２】
さらに、気管支肺胞洗浄液中の活性酸素種の産生に対するマグノリアエ・フロス活性画分およびそこから分離された化合物の阻害効果を試験した。結果として、マグノリアエ・フロス活性画分（３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物２（３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物４（３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物６（１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ）、化合物７（１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ）および化合物８（１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ）を投与された群は、ＲＯＦ（ロフルミラスト）で処置された薬物対照群よりも高い、活性酸素の阻害率を示した。（表８を参照）。
【００４３】
さらに、ＣＯＰＤ誘発群において、正常群と比較して広範な炎症細胞の浸潤が気管支および肺胞区画の周辺で観察されたが、炎症細胞の浸潤はロフルミラスト処置群において減少した。炎症細胞の浸潤はまた、マグノリアエ・フロスの活性画分および化合物を投与された群において、ＣＯＰＤ誘発群と比較して減少した。特に、炎症細胞の浸潤における減少は、マグノリアエ・フロス活性画分を投与した群の中で、３０ｍｇ／ｋｇ投与群において顕著に観察された（図５を参照）。
【００４４】
さらに、気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン量の減少を試験し、マグノリアエ・フロスの活性画分およびその化合物群の大部分で処置した群が、ＲＯＦで処置した薬物対照群と同等であるか、それよりも高い阻害率（表１０を参照）を示したことを示した。
【００４５】
従って、本発明のマグノリアエ・フロス画分もしくは活性画分またはそこから分離された化合物は、慢性閉塞性肺疾患の予防または処置のための医薬組成物の有効成分として有用であり得る。
【００４６】
式１で表される本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で使用され得る。薬学的に許容される遊離酸により形成される酸付加塩が、塩として望ましい。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸および亜リン酸のような無機酸；ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸およびアルカン二酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸のような非毒性有機酸；ならびに酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、酒石酸およびフマル酸のような有機酸から形成される。そのような薬学的に非毒性の塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、ブチン−１，４−ジオエート塩、ヘキサン−１，６−ジオエート塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩およびマンデル酸塩を含む。
【００４７】
本発明の酸付加塩は、慣用の方法、例えば式１で表される化合物をメタノール、エタノール、アセトン、塩化メチレン、アセトニトリルなどのような有機溶媒に溶解し、続いて有機酸または無機酸の添加により形成した沈殿をろ過および乾燥させることにより、または溶媒および過剰の酸を減圧下で蒸留し、その後乾燥させるかもしくは有機酸中で結晶化させることにより製造できる。
【００４８】
さらに、塩基は薬学的に許容される金属塩を製造するために使用され得る。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、過剰のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液に化合物を溶解し、不溶性の化合物塩をろ過し、そしてろ液を蒸発および乾燥させることにより得られる。ここで、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩が金属塩として好ましい。また、対応する銀塩はアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させることにより得られる。
【００４９】
さらに、本発明は式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩のみならず、それらから製造され得るあらゆる溶媒和物、水和物、異性体なども含む。
【００５０】
さらに、本発明は有効成分としてマグノリアエ・フロス抽出物、または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分を含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善するための健康機能性食品を提供する。
【００５１】
さらに本発明は、有効成分として以下の式１：
【化１０】
0006616846.tif 000011
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してＣ１−３直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖または分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１−３直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化１１】
0006616846.tif 000012
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または改善するための健康機能性食品を提供する。
【００５２】
上記化合物は、次の式２〜８のいずれか１つにより表される化合物により特徴付けられる。
【化１２】
0006616846.tif 000013
【化１３】
0006616846.tif 000014
【化１４】
0006616846.tif 000015
【００５３】
本発明の健康機能性食品は、追加成分として種々の風味剤または天然炭水化物を含み得る。上記天然炭水化物は、グルコースおよびフルクトースのような単糖、マルトースおよびスクロースのような二糖、デキストリンおよびシクロデキストリンのような多糖およびキシリトール、ソルビトールおよびエリスリトールのような糖アルコールである。タウマチンおよびステビア抽出物のような天然甘味剤ならびにサッカリンおよびアスパルテームのような合成甘味剤は、甘味剤として使用され得る。天然炭水化物の含有量は、本発明の健康機能性食品の１００重量部あたり０．０１〜０．０４重量部、特に約０．０２〜０．０３重量部の範囲内であり得る。
【００５４】
上に加えて、本発明の健康機能性食品は種々の栄養素、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含み得る。これらの成分は単独でまたはこれらの組合せで使用され得る。このような添加剤の含有量は重要ではないが、一般的に、本発明の健康機能性食品の１００重量部あたり０．０１〜０．１重量部の範囲内であり得る。
【００５５】
さらに、本発明はマグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られた画分もしくは活性画分を、慢性閉塞性肺疾患の対象に投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【００５６】
さらに、本発明はマグノリアエ・フロス抽出物または有機溶媒を用いたその分画により得られる画分もしくは活性画分の、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物としての使用を提供する。
【００５７】
さらに、本発明は以下の式１：
【化１５】
0006616846.tif 000016
〔式中、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であり；そして
Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ１−３直鎖もしくは分岐鎖アルコキシまたは水素であるか、Ｒ２およびＲ３は一体となって
【化１６】
0006616846.tif 000017
を形成してよく、ここでｎは１〜３の整数である〕
により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩を慢性閉塞性肺疾患の対象に有効量投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【００５８】
さらに、本発明は上記式１により表される化合物、その立体異性体またはその薬学的に許容される塩の、慢性閉塞性肺疾患を予防または処置するための医薬組成物としての使用を提供する。
【発明の効果】
【００５９】
本発明のマグノリアエ・フロス抽出物、有機溶媒を用いたその分画により得られる画分もしくは活性画分またはそこから分離される化合物は、ヒト肺癌粘膜細胞（Ｈ２９２）におけるＴＮＦ−αにより誘導されるＭＵＣ５ＡＣの発現およびそのプロモーター活性を阻害し、慢性閉塞性肺疾患マウスモデルの気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数を減少させ、反応性酸素種の産生を阻害し、そしてサイトカインを減少させる。従って、ＭＵＣ５ＡＣの発現および好中球の浸潤を阻害する方法により慢性閉塞性肺疾患を処置するために、有利に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１はマグノリアエ・フロス抽出物ならびにその画分および活性画分を調製するための方法を説明する略図である。
【図２】図２はマグノリアエ・フロス抽出物から活性画分を調製するための薄層フィルムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図３】図３はマグノリアエ・フロス活性成分を分離および精製するための超高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
【図４】図４はマグノリアエ・フロス抽出物から分離された化合物の質量スペクトルの結果およびそれらの化学式を示す。
【図５】図５はマグノリアエ・フロス活性画分および化合物で処理したＣＯＰＤモデルにおける肺組織の病理学的試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
次に、以下の実施例および試験例を参照し、本発明をより詳細に記載する。
しかしながら、これらの実施例および試験例は、本発明を詳細に説明するために記載されるものであり、本発明の範囲をこれらに限定するものではない。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞マグノリアエ・フロス抽出物の調製
マグノリアエ・フロス（８０ｋｇ）を、乾燥機（５０〜５５℃で）を用いて日陰で乾燥させて水分を除去し、その後約１ｃｍの大きさまで粉砕した。粉砕した粉末試料のこの乾燥重量あたりメタノール（６００リットル）を添加し、続いて室温で抽出した。その後減圧下でのろ過および濃縮により、マグノリアエ・フロスのメタノール抽出物（１２ｋｇ；抽出収率１４．５％）を得た。
【００６３】
＜実施例２＞マグノリアエ・フロス画分の調製
以下のように、上記＜実施例１＞において得られたマグノリアエ・フロスのメタノール抽出物からマグノリアエ・フロス画分を調製した。
【００６４】
具体的には、マグノリアエ・フロスのメタノール抽出物（５００ｇ）を２．５リットルの蒸留水に懸濁し、ヘキサン層と水層に分離させるために同量のヘキサンをそこへ添加し、減圧下でろ過および濃縮し、ヘキサン画分（８７．０ｇ）を得た。その後、ヘキサン画分を除去した残りの水層に、上記と同様の方法で同量のクロロホルムを添加し、それによりクロロホルム画分（５７．６ｇ）を得た。残った水層を濃縮し、３１０ｇの水画分を得た（図１）。
【００６５】
＜実施例３＞追加画分の調製
上記＜実施例２＞において得られたマグノリアエ・フロス画分から追加画分を分離および調製するために、フラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。
【００６６】
具体的には、オープンカラム（１０ｃｍ×５０ｃｍ；樹脂；シリカゲル８００ｇ）を取り付け、上記＜実施例２＞において得られた画分の中から、クロロホルム層を充填した。ヘキサン／酢酸エチルを溶媒として使用し、薄層フィルムクロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ、順相および逆相プレート）を順相で実施（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１の展開溶媒）し、１０の追加画分（Ｆｒｓ．１〜１０）を得た（表１、図１および２を参照）。
【００６７】
【表１】
0006616846.tif 000018
【００６８】
＜実施例４＞マグノリアエ・フロス抽出物および画分の分析
＜実施例１＞および＜実施例３＞において得られた抽出物および画分を分析するために、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を実施した。
【００６９】
具体的には、マグノリアエ・フロス抽出物および画分を、ＵＰＬＣのために０．２５ｍｍメンブレンフィルターで一度ろ過した。その後、カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム、２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）をＵＰＬＣ装置（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）に取り付け、そのようにしてろ過した各画分を５μｌの量で充填した。このとき、アセトニトリル＋０．１％ギ酸／水＋０．１％ギ酸（１０：９０から１００：０（ｖ／ｖ））を溶媒として使用し、溶出速度は０．４ｍｌ／分であった。ＵＶおよびＭＳ（質量スペクトル）を検出器として使用して、ＵＰＬＣにより分離された物質の分離度をクロマトグラフィーで確認した（図３参照）。
【００７０】
＜実施例５＞画分１０（Ｆｒ．１０）からの小画分の分離
小画分は、上記＜実施例４＞において得られた１０の追加画分の中から以下のようにして調製された。
【００７１】
具体的には、オープンカラム（１８ｃｍ×７５ｃｍ；樹脂；ＯＤＳ、３，０００ｇ）を取り付け、画分１０を繰り返し充填した。メタノール／水（４０％メタノール（５Ｌ）から５０％メタノール（２Ｌ）、その後７０％メタノール（２Ｌ）、さらに１００％メタノール（２Ｌ））を溶媒として使用した。各溶媒について、画分１０をカラム（ＹＭＣＰＡＫ  Ｐｒｏ  Ｃ８、５ｍｍ、４．６×２５０ｍｍ）を取り付けた超高速液体クロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ  ＦＩＮＮＩＧＡＮ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ、ＵＳＡ）に溶出速度１ｍｌ／分で供し、波長２５４ｎｍで検出し、それにより４つの小画分（Ｆｒｓ．１０Ａ〜Ｄ）を得た。
【００７２】
＜実施例６＞小画分（Ｆｒｓ．１０Ａ−Ｄ）からの化合物の分離
化合物は、上記＜実施例５＞において得られた小画分から以下のようにして分離された。
【００７３】
具体的には、小画分１０Ａをオープンカラム（２ｃｍ×２５ｃｍ；樹脂；シリカゲル（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ、１０μｍ））で、５５％メタノールのアイソクラチック条件下で分画し、リグナン構造および以下の物理学的特性を有する、式２により表される化合物１（ジメチルピノレジノール、２．１ｇ）および式５により表される化合物４（エピマグノリン、１．５ｇ）を得て；ヘキサン／クロロホルム／酢酸エチル（５：２：１）のアイソクラチック条件下、オープンカラム（１０ｃｍｘ９０ｃｍ；樹脂；シリカゲル（ＹＭＣ  ＧＥＬ  ＳＩＬ−ＨＧ  ２０ｍｍ，２０μｍ），２２０ｇ）を用いて分画し、リグナン構造および以下の物理学的特性を有する、式３により表される化合物２（マグノリン、６．３ｇ）を得て；そして、クロロホルム／アセトン／メタノール（４０：１：０．１）のアイソクラチック条件下、オープンカラム（１０ｃｍ×９０ｃｍ；樹脂；シリカゲル（ｓｉｌｉａ−ｐ  フラッシュシリカゲル，４０−６３μｍ）、１，７００ｇ）を用いて分画し、リグナン構造および以下の物理学的特性を有する、式４により表される化合物３（ジメチルリロレジノール、１．７１ｇ）を得た。
【００７４】
小画分１０Ｃをクロロホルム／酢酸エチル（１９：１）のアイソクラチック条件下、カラム（３ｃｍ×５０ｃｍ；樹脂；シリカゲル（ＹＭＣパックシリカゲル、２５μｍ），１２０ｇ）を用いて、リグナン構造および以下の物理学的特性を有する、式６により表される化合物５（ジメトキシアシャンチン、６．９６ｇ）、式７により表される化合物６（アシャンチン、３．３９ｇ）および式８により表される化合物７（ファルゲシン，３．８６ｇ）を得た（表２および図４を参照）。
【００７５】
【表２−１】
0006616846.tif 000019
【表２−２】
0006616846.tif 000020
【表２−３】
0006616846.tif 000021
【表２−４】
0006616846.tif 000022
【００７６】
＜試験例１＞ヒト肺癌粘膜細胞（Ｈ２９２）におけるマグノリアエ・フロス抽出物および画分の細胞毒性
本試験の前に、Ｈ２９２細胞に対するマグノリアエ・フロス抽出物および画分の細胞毒性を確認するため、文献（Ishiyama et al., Talanta, 44, pp. 1299-1305, 1997; Tominaga et al., Anal. Commun., 36, pp.47-50, 1999）に記載の方法により、試験を実施した。
【００７７】
＜１−１＞細胞の調製および培養
Ｈ２９２（ＣＲＬ−１８４８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質（ＳＨ３００２７．０１，ＲＰＭＩ  １６４０，Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ培地で培養し、そして加湿した５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。ＴＮＦ−α（３００−０１Ａ，Ｐｅｐｒｐｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を、使用のために購入した。
【００７８】
＜１−２＞細胞生存率アッセイ
上記細胞を９６ウェルプレートで、１×１０３細胞／ウェルで２４時間培養し、マグノリアエ・フロス抽出物または画分とともに、さらに１日または２日間培養した。細胞生存率を、製造者のマニュアルに従って、リーディングキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、ＣＫ０４−０１、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＬ）を用いて３回読み取った。リーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー、ＳＭＰ５００−１４９１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて吸光度を測定し、測定された吸光度を標準曲線を用いて細胞数に変換した。
【００７９】
具体的には、Ｈ２９２細胞を５×１０４細胞／ｍｌの濃度で、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）培地に懸濁し、その１００μｌをそれぞれ９６ウェルプレート上に接種し、１２時間接着させ、種々の濃度の抽出物で処理し、さらに２４時間培養した。その後、細胞数をカウントできるＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）キットに記載の通り、ＣＣＫ−８溶液（１０μｌ）を培地９０μｌと混合し、その１００μｌを各ウェルに添加した。最短３０分から最大４時間のインキュベート後、５７０ｎｍで吸光度を測定した。０．２％ＤＭＳＯで処理した陰性対照群を１００％の基準として、以下の数式１に従って細胞生存率を計算し、そして結果を以下の表３に示す。
【数１】
0006616846.tif 000023
【００８０】
抽出物および画分の濃度についてＨ２９２細胞の細胞生存率を調査した試験の結果、表３に示す通り、４０μｇ／ｍＬ以下では細胞毒性を有さないことが確認された。
【００８１】
【表３】
0006616846.tif 000024
【００８２】
＜試験例２＞ＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現に対するマグノリアエ・フロス抽出物および画分の効果
文献（Sikder, MA. et al., Phytotherapy research: PTR. 28, 62-8. 2014）に記載の方法に従って、マグノリアエ・フロス抽出物および画分がＨ２９２細胞においてＴＮＦ−αにより誘導されるＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現を阻害するか否かを調べるため、試験を実施した。
【００８３】
具体的には、ＴＮＦ−αにより誘導されるＭＵＣ５ＡＣ免疫アッセイを使用した。細胞の調製のために、Ｈ２９２細胞を２×１０４細胞／ウェルの濃度で４８ウェルプレート上に分注し、２４時間接着させ、そしてその後２０μｇ／ｍＬまたは４０μｇ／ｍＬの抽出物で２時間処理した０．１％ＦＢＳを含む培地で２４時間培養し、２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ−αで処理し、１２時間培養した。その後、細胞を回収して遠心分離し、そして上清（５０μＬ）を９６ウェルプレートに分注し、５０℃設定のサーモスタットセットで乾燥させた。１％ＢＳＡを添加したＰＢＳでそれらを洗浄し、ＭＵＣ５ＡＣ抗体（ａｂ３６４９、ａｂｃａｍ）と室温で２時間反応させた。それに二次抗体を分注し、２時間反応させた。それらをＰＢＳで再び洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンペルオキシド溶液（５４８２７−１７−７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０分間反応させた。硫酸溶液で反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー，ＳＭＰ５００−１４９１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて、４５０ｎｍで発色度を測定した（8. Sikder, M. A., Lee, H. J., Mia, M. Z., Park, S. H., Ryu, J., Kim, J. H., Min, S. Y., Hong, J. H., Seok, J. H. & Lee, C. J. (2014) Inhibition of TNF-α-induced MUC5AC mucin gene expression and production by wogonin through the inactivation of NF-kappaB signaling in airway epithelial cells, Phytotherapy research:PTR. 28, 62-8;Takeyama, K., Dabbagh, K., Lee, H. M., Agusti, C., Lausier, J. A., Ueki, I. F., Grattan, K. M. & Nadel, J. A. (1999) Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 3081-6）。
【００８４】
結果として、表４に示すように、ＭＵＣ５ＡＣ分泌量はＴＮＦ−α処理群で増加した。ＴＮＦ−α処理群を１００％の基準として、抽出物および画分で処理したときのＭＵＣ５ＡＣ分泌量を比較したとき、ＭＵＣ５ＡＣの産生はマグノリアエ・フロス抽出物および画分の濃度に依存して阻害されることが確認された。
【００８５】
【表４】
0006616846.tif 000025
【００８６】
＜試験例３＞ヒト肺癌粘膜細胞（Ｈ２９２）におけるマグノリアエ・フロス化合物の細胞毒性
Ｈ２９２細胞を９６ウェルプレートに接種し、１２時間接着させ、続いて種々の濃度のマグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ７）で処理し、２４時間培養した。その後、１０μｌのＣＣＫ−８溶液（同仁化学研究所、日本）を９０μｌの培地と混合し、各ウェルにその１００μｌを添加した。最短３０分間から最大４時間インキュベート後、吸光度を５７０ｎｍで測定した。０．２％ＤＭＳＯで処理した陰性対照群を１００％の基準とした以下の数式２を用いて細胞生存率を計算した。
【００８７】
結果として、以下の表５に示すように、２０μＭ以下のマグノリアエ・フロス化合物濃度では細胞毒性は観察されないことが確認された（表５を参照）。
【数２】
0006616846.tif 000026
【００８８】
【表５】
0006616846.tif 000027
【００８９】
＜試験例４＞ＭＵＣ５ＡＣタンパク質産生に対するマグノリアエ・フロス化合物の阻害効果
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の予防および処置効果を評価するために、以下の方法に従ってＭＵＣ５ＡＣ分泌に対するマグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ７）の阻害効果を確認した。
【００９０】
得られたＭＵＣ５ＡＣの免疫アッセイについて、回収した上清（５０ｕＬ）を９６ウェルプレートに分注し、５０℃設定のサーモスタットセットで乾燥させた。それを１％ＢＳＡを添加したＰＢＳで洗浄し、ＭＵＣ５ＡＣ抗体（ａｂｃａｍ，ＵＳＡ）と室温で１時間反応させた。そこに二次抗体を分注し、１時間反応させた。それを再び洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンペルオキシド溶液と２０分間反応させた。硫酸溶液で反応を停止させた後、４５０ｎｍで発色度を測定した
【００９１】
結果として、以下の表６に示すように、ＭＵＣ５ＡＣ分泌はＴＮＦ−α処理群で増加した。ＭＵＣ５ＡＣの産生は、ＴＮＦ−α処理群を１００％の基準として比較すると、マグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４）の濃度に依存して阻害されることが確認された（表６を参照）。
【００９２】
【表６】
0006616846.tif 000028
【００９３】
＜試験例５＞ＭＵＣ５ＡＣプロモーター活性に対するマグノリアエ・フロス化合物の阻害効果
上記＜試験例４＞の結果に基づいて、ＭＵＣ５ＡＣタンパク質の発現に対するマグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ４）の阻害活性を確認するために、以下の試験を実施した。
【００９４】
具体的には、Ｈ２９２細胞にルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．１４（ｌｕｃ２Ｐ／ＭＵＣ５ＡＣプロモーター／Ｈｙｇｒｏ）をトランスフェクションし、１２時間培養した後、マグノリアエ・フロス（Ｓ１〜Ｓ４、１０μＭ）の標的化合物で処理し、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、１２時間培養した。ルシフェラーゼの活性の程度を、Ｏｎｅ−ｇｌｏｗ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて確認した。
【００９５】
結果として、以下の表７に示すように、ＭＵＣ５ＡＣプロモーターの活性はＴＮＦ−α処理群で増加した。ＴＮＦ−α処理群を１００％（表７を参照）の基準として比較すると、ＭＵＣ５ＡＣプロモーター活性はマグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ４）により顕著に阻害されることが確認された。
【００９６】
【表７】
0006616846.tif 000029
【００９７】
＜試験例６＞慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデルの炎症細胞に対するマグノリアエ・フロス画分１０および化合物の阻害効果
【００９８】
＜６−１＞慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）動物モデルの作製
慢性閉塞性肺疾患の処置に対する、上記＜実施例３＞で分離された追加画分の画分１０（以下活性画分と称する）および上記＜実施例５＞で分離された化合物（Ｓ１〜Ｓ７）の効果を評価するために、慢性閉塞性肺疾患動物モデルを以下の方法に従って調製した。
【００９９】
６週齢の（特異病原体除去）雄性ＳＰＦＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２２〜２４ｇ）は、Ｋｏａｔｅｃｈ（韓国）により供給された。これらの動物に、実験当日までに十分な量の固形飼料（無抗生物質、Ｓａｍｙａｎｇ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏ．）および水を与えた。それらを温度２２±２℃および湿度５５±１５％で、明暗サイクル環境で１週間適応させ、その後試験に供した。
【０１００】
慢性閉塞性肺疾患を誘発するために、動物モデルをタバコの煙に曝露させた。タバコの煙を発生させるために使用する標準タバコである３Ｒ４Ｆ  Ｋｅｎｔｕｃｈｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓは、カリフォルニア大学（ＵＳＡ）により供給された。標準タバコは、タバコ１本あたり９．４ｍｇのタール、１１ｍｇの全粒子状物質（ＴＰＭ）、および１２ｍｇの一酸化炭素を含む。標準タバコを温度２２±１℃および湿度６０±２％で４８時間〜７２時間調和させた後、使用した。さらに、タバコの煙に暴露させるために、Ｋｏｒｅａ  ＢｉｏＬｉｎｋ（Ｋｏｒｅａ）により製造されたタバコ煙発生装置を使用した。タバコの煙をサンプルの経口投与１時間後から１時間（８本／時間）、７日間吸入させた。タバコの煙に曝露させる１時間前にマウスをソレチルで麻酔した後、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）１０μｇのＰＢＳ（５０μＬ）溶液を、各マウスに鼻腔内注射した。喫煙条件は、標準タバコ１本あたり吸引が８回（容量４５ｍＬ、持続時間：２秒、間隔：１回／分）であった。
【０１０１】
＜６−２＞マグノリアエ・フロスの活性画分および化合物を用いた慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）動物モデルの処置
治療物質としてマグノリアエ・フロス活性画分（１５．３０ｍｇ／ｋｇ）およびロフルミラスト（１０ｍｇ／ｋｇ）を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウムに溶解し、タバコの煙に曝露させる１時間前に経口投与した。
【０１０２】
実験群を（ｉ）正常対照（ＮＣ）群；（ｉｉ）タバコの煙＋ＬＰＳ曝露群（ＣＯＰＤ）；（ｉｉｉ）ロフルミラスト（ＲＯＦ）（１０ｍｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ）（タバコの煙＋ＬＰＳ曝露１時間前）投与群；および（ｉｖ）マグノリアエ・フロス活性画分（１５ｍｇ／ｋｇ，３０ｍｇ／ｋｇ，ｐ．ｏ；マグノリアエ・フロス１５およびマグノリアエ・フロス３０）投与群（タバコの煙＋ＬＰＳ曝露１時間前）に分割した。さらに化合物Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４をそれぞれ、１０％のエタノールを含むＰＢＳに溶解し、化合物Ｓ５、Ｓ６およびＳ７を１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むＰＢＳに溶解した。その後、それらを上記と同様の方法で投与した。
【０１０３】
＜６−３＞気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分離および炎症細胞の減少に対する効果
以下の方法に従って、上記＜試験例６−２＞でマグノリアエ・フロスの活性画分および化合物で処理した動物モデルから気管支肺胞洗浄液を分離し、炎症細胞数を測定した。
【０１０４】
具体的には、マウスゾンデを気管支チューブに挿入し、０．７ｍＬのＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝食塩水）を含む１ｍＬシリンジをそれに接続し、ＤＰＢＳを肺に注入した。注入したＤＰＢＳを回収し、この操作を２回繰り返した。ＤＰＢＳにより分離した気管支肺胞洗浄液を１，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞ペレットを作製した。サイトカイン分析のために、上清を−７０℃で冷凍保存した。得られた各細胞をＤＰＢＳに懸濁し、サイトスピン遠心分離機を用いてスライドグラスに接触させ、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色した。顕微鏡検査を通して各サンプル中の炎症細胞数をカウントし、以下の数式３に従って阻害率を計算した。
【０１０５】
結果として、以下の表８に示すように、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数は、ＣＯＰＤ誘発群と比較して、マグノリアエ・フロス活性画分で処理した群において減少し、好中球数は、ＣＯＰＤ誘発群と比較して、１５ｍｇ／ｋｇ投与群で２１．１％まで、および３０ｍｇ／ｋｇ投与群で５４．４％まで減少した。
【０１０６】
さらに、炎症細胞における増加は、マグノリアエ・フロス化合物投与群、特にＳ１、Ｓ３、Ｓ６およびＳ７で処理した群において、ＣＯＰＤ誘発群と比較して効果的に阻害された（表８を参照）。
【数３】
0006616846.tif 000030
【０１０７】
【表８】
0006616846.tif 000031
【０１０８】
＜試験例７＞慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデルの気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞に対するマグノリアエ・フロスの阻害効果
以下の方法により、上記＜試験例６−３＞で得られた気管支肺胞洗浄液における活性酸素種の産生を測定した。
【０１０９】
具体的には、分離したＢＡＬＦ（２００μＬ）を最終濃度２０μＭのＤＣＦ−ＤＡ（ジヒドロジクロロフルオレセインジアセテート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で処理し、続いて３０分間培養し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を用いて測定した。阻害率を上記数式３により計算した。
【０１１０】
結果として、以下の表９に示すように、活性酸素種の産生は、ＣＯＰＤ誘発群において顕著に増加したが、マグノリアエ・フロス活性画分を投与した群において正常群と比較して減少し、１５ｍｇ／ｋｇ投与群では１７．２％まで、および３０ｍｇ／ｋｇ投与群では３３．０％まで阻害した。
【０１１１】
さらに、活性酸素種の産生はまた、マグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ７）を投与した群においても阻害された。特に、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ５およびＳ６を投与した群は他の基質を投与した群よりも比較的高い阻害率を濃度依存的に示した。Ｓ７を投与した群は低用量群でより高い阻害率を示した（表９）。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
＜試験例８＞慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデルの気管支肺胞洗浄液中のサイトカインの減少に対するマグノリアエ・フロスの効果
以下の方法により、上記＜試験例６−３＞で得られた細胞上清中、サイトカインを測定した。
【０１１４】
具体的には、分離したＢＡＬＦ中のＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）およびＴＮＦ−α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）の量を、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。製造者の試験方法に従って、各サイトカイン分析を実施した。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、阻害率を上記数式３を用いて計算した。
【０１１５】
結果として、以下の表１０に示すように、気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−６は誘発群において、正常群と比較して顕著に増加したが、気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−６はロフルミラスト投与群およびマグノリアエ・フロス活性画分投与群において、ＣＯＰＤ誘発群と比較して減少した。特に、マグノリアエ・フロス活性画分投与群の場合、ＩＬ−６は、ＣＯＰＤ誘発群と比較して、１５ｍｇ／ｋｇ投与群において２６．０％まで、および３０ｍｇ／ｋｇ投与群において４１．３％まで減少した。また、ＴＮＦ−αの場合、マグノリアエ・フロス活性画分投与群において、ＣＯＰＤ誘発群と比較して、１５ｍｇ／ｋｇ投与群で２８．８％減少し、３０ｍｇ／ｋｇ投与群で３３．４％減少した。
【０１１６】
さらに、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌は、マグノリアエ・フロス化合物（Ｓ１〜Ｓ７）投与群において阻害された。Ｓ１、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６投与群において、濃度依存的なＩＬ−６分泌の減少が観察され、ＴＮＦ−αの場合、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５およびＳ６投与群において、濃度依存的阻害が観察された（表１０を参照）。
【０１１７】
【表１０】
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【０１１８】
＜試験例９＞ＣＯＰＤモデルの肺組織における炎症に対するマグノリアエ・フロスの阻害効果
以下の方法に従って、上の＜試験例６−２＞のＣＯＰＤモデルの肺組織における炎症に対するマグノリアエ・フロス活性画分および化合物（Ｓ１〜Ｓ７）の阻害効果を確認した。
【０１１９】
具体的には、肺を摘出し、すぐに１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、その後薄切りにし、流水で８時間洗浄した。それをその後エポキシに包埋し、ヘマトキシリン・エオジン染色し、顕微鏡を用いて肺組織中の病理学的変化を試験した。
【０１２０】
結果として、図５に示すように、正常群と比較して、ＣＯＰＤ誘発群において肺胞および気管支周辺の広範な炎症細胞の浸潤が観察された。対照的に、ＣＯＰＤ誘発群と比較して、炎症細胞の浸潤はロフルミラスト投与群において減少し、炎症細胞の浸潤もまたマグノリアエ・フロス活性画分および化合物投与群において減少した。炎症細胞の浸潤におけるこの減少は、マグノリアエ・フロス活性画分の３０ｍｇ／ｋｇ投与群において顕著に観察された（図５を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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