(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｆタンパク質と、
エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｈタンパク質と、
を有する組換え麻疹ウイルスであって、
前記変異型Ｆタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列、または、ＲＳＶのＦタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって、かつ、ＲＳＶのＦタンパク質が有する、ヒト気道上皮細胞に対する細胞融合活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｆタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有し、
前記変異型Ｈタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、ＲＳＶのＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列、または、ＲＳＶのＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって、かつ、ＲＳＶのＧタンパク質が有する、ヒト気道上皮細胞に対する細胞吸着活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｈタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＨタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有する、
組換え麻疹ウイルス。
【請求項２】
ＡＩＫ−Ｃの組換え麻疹ウイルスである、請求項１に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項３】
前記変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１位〜第５２４位の領域のアミノ酸配列、または、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１位〜第５２４位の領域のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項４】
前記変異型Ｆタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列である、請求項３に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項５】
前記変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第６７位〜第２９８位の領域のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第６７位〜第２９８位の領域のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項６】
前記変異型Ｈタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２６に記載のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列である、請求項５に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項７】
前記変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１位〜第５２４位の領域のアミノ酸配列を有し、
前記変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第６７位〜第２９８位の領域のアミノ酸配列を有する、
請求項１または２に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項８】
前記変異型Ｆタンパク質のアミノ酸配列が配列番号２５に記載のアミノ酸配列であり、前記変異型Ｈタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列である、請求項１または２に記載の組換え麻疹ウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムである、組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
【請求項１０】
蛍光タンパク質を規定する領域を有する、請求項９に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡから調製された、組換え麻疹ウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
配列番号５に記載の塩基配列、または、配列番号５に記載の塩基配列と９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなる、請求項１または２に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号５または６に記載の塩基配列からなる、請求項１１に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルスを有効成分として含む、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症のワクチン。
【請求項１５】
被験物質の存在下で、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルスを細胞と培養する第一工程と、
前記第一工程の前記組換え麻疹ウイルスの前記細胞に対する感染レベルを測定する第二工程と、
前記第二工程において測定した感染レベルを、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルと比較し、前記被験物質の存在下で細胞と培養した前記組換え麻疹ウイルスの感染レベルが、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルよりも小さい場合は、前記被験物質を選択する第三工程と、
を有する、吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症の治療用薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記組換え麻疹ウイルスは蛍光タンパク質を規定する遺伝子を有し、
前記組換え麻疹ウイルスの感染レベルを蛍光タンパク質の蛍光強度で測定する、
請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染症のワクチン及びパラミクソウイルス科のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニング方法に使用するための組換え麻疹ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
パラミクソウイルス科のウイルスには、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が属するニューモウイルス、麻疹ウイルスが属するモルビリウイルス、ムンプスウイルスの属するルブラウイルスなどの、一本鎖（−）鎖ＲＮＡをゲノムとするエンベロープウイルスが含まれる。ウイルス粒子は外殻にエンベロープを有し、エンベロープには２種類のタンパク質を有する。この２種類のタンパク質のうちの１つが、細胞融合活性を有する膜融合（Fusion:Ｆ）タンパク質である。パラミクソウイルス科のウイルスは、Fタンパク質の細胞融合の働きによって隣接する細胞に感染が拡大する。そして、細胞融合活性を有するＦタンパク質が重要な感染防御抗原と考えられている（非特許文献１１）。もう一種類のタンパク質が、細胞に吸着する活性を有するタンパク質である、ヘマグルチニン（Hemagglutinin：Ｈ）タンパク質、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（hemagglutinin neuraminidase:ＨＮ）タンパク質、又はラージグリコプロテイン（large glycoprotein:Ｇ）タンパク質である。麻疹ウイルスはＨタンパク質、ムンプスウイルスはＨＮタンパク質、ＲＳＶはＧタンパク質を有する。
【０００３】
ＲＳＶは１９５５年に分離され、１９６０年代にホルマリン不活化全粒子ワクチンがアメリカで開発されたが、ワクチン接種者がその後にＲＳＶに罹患するとかえって重症化し、８０％が入院し死亡例も認められた（非特許文献１）。ＲＳＶ全粒子不活化ワクチンの失敗の原因は、ワクチンの作製工程において行ったホルマリン不活化の過程でＦタンパク質が変性し、結合抗体は誘導できるが、感染防御に有効な中和抗体は誘導できず、粘膜局所にＩｇＡ抗体を誘導できずにＲＳＶ感染を防ぐことができなかったことにある。Ｆタンパク質は、Ｔｈ１応答を誘導し、Ｇタンパク質は、Ｔｈ２応答を誘導する事が知られており、Ｆタンパク質が変性する事でＴｈ１応答が誘導されず、Ｔｈ２応答に偏った免疫を誘導し、ＲＳＶ感染時には好中球・好酸球の浸潤した細気管支炎、間質性肺炎を起こし、重症化したものと考えられる（非特許文献２）。
【０００４】
その後、低温馴化株を選択する方法で弱毒株の選択や、遺伝子改変による弱毒化がこころみられ、遺伝子改変による研究がなされていたが、弱毒化された生ワクチン株を樹立する事ができなった（非特許文献３，４，５）。牛のパラインフルエンザウイルス遺伝子をウイルスベクターとして、ヒトのパラインフルエンザウイルスのＨＮ遺伝子とＲＳＶのＦタンパク遺伝子を組込んだ組換えウイルスは、サルの実験では良好な免疫原性を示したが、ヒトでのｐｈａｓｅ  ＩＩ試験では、免疫原性が弱く、臨床試験は頓挫している。不活化ワクチンは、Ｆタンパク質を精製し，もしくはサブユニット抗原にアジュバントを添加したワクチンが考えられている。しかしながら未だに有効なワクチンは開発されていない（非特許文献６）。
【０００５】
ＲＳＶのＧタンパク質は、細胞のグリコプロテイン（glycoprotein）/ヘパリン（heparin）に結合するが、その中和活性は低い。一方、Ｆタンパク質の受容体は不明であったが、最近になって、ヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）がＦタンパク質の結合タンパク質である事が明らかとなりＲＳＶの主たる感染防御抗原はＦタンパク質と考えられている（非特許文献７）。このため、Ｆタンパク質に対するヒト化単クローン抗体が予防薬として用いられるようになった（非特許文献８）。しかしながら、流行期に毎月１回筋注で投与され、未熟児、循環系又は呼吸器系に異常をもつ児、及びダウン症に使用は制限されているものであり、また、高価なものである。また、ＲＳＶ感染をおこした小児へ投与してもウイルス増殖は軽減できず、その治療効果に関しての有効性は確立されていない（非特許文献９）。このため、ＲＳＶに対して有効なワクチンと治療薬の開発が望まれている。
【０００６】
ＲＳＶ感染症は２歳までにはほぼ全員が感染を経験するが、特に新生児期から６ヶ月までの感染は重症化し細気管支炎、間質性肺炎をおこし不幸な転帰をとる事が知られている。ＷＨＯの統計では世界中で年間に３０００万人が下気道感染をおこし、３００万人が入院し、未熟児で出生し肺疾患、心疾患、免疫不全等の基礎疾患を有する小児は重症化し１６万人が死亡しているものと推定されている（非特許文献１０）。小児だけでなく６５歳以上の老人でもインフルエンザに次いで下気道感染症の起因ウイルスとなっている。
【０００７】
一方、麻疹ウイルスは、有効なワクチンが開発されており世界中で使用され、その免疫原性と安全性が確立されている。分子生物学的手法が進化し、麻疹ウイルス全長ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して回収するreverse genetics法が確立され、麻疹ワクチンＡＩＫ−Ｃ株の全塩基配列の決定と共に、感染性麻疹ワクチンウイルスを作製する方法が確立された（非特許文献１２，１３）。
【０００８】
麻疹ウイルスのＦタンパク質及びＨタンパク質は、ウイルス粒子膜に膜貫通領域(transmembrane domain: ＴＭ)でanchoringし、粒子内では、Membrane（Ｍ)タンパク質と結合して粒子形成をしているものと考えられている。麻疹ウイルスの感染後には、粒子内のNucleocapsid（Ｎ）タンパク質と、Phospho（Ｐ）タンパク質と、Large（Ｌ）タンパク質との複合体がゲノムＲＮＡと結合し、ウイルスの転写複製を担っている(非特許文献14)。Ｐタンパク質翻訳領域からはＰタンパク以外にもＶタンパク質及びＣタンパクが翻訳されウイルスの転写・複製活性を修飾している。
【０００９】
麻疹ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、感染性ウイルスを回収するreverse geneticsの手法は既に開発されており、弱毒麻疹ウイルスを生ワクチンウイルスベクターとして利用する方法は既に報告されている（非特許文献１５，１６）。そして、ＲＳＶのＦタンパク質を挿入したウイルスが作製されたが、アカゲザルに対する実験において、このウイルスの免疫原性は十分ではないということが分かった。（非特許文献１７）。
【００１０】
発明者らは、既にＡＩＫ−Ｃの麻疹ウイルスベクターを用いてＲＳＶのＦ，Ｇ，ＮＰ，Ｍ２タンパク質の遺伝子を麻疹ウイルス全長ｃＤＮＡのＰタンパク質を規定する領域と、Ｍタンパク質を規定する領域の間のP/M junction部位に挿入する方法で組換えウイルスを作製し中和抗体、細胞性免疫を誘導する事を報告している（非特許文献１８，１９）。このウイルスが感染した細胞では、麻疹ウイルスＦタンパク質及びＨタンパク質と共に、ＲＳＶのＦタンパク質及びＧタンパク質も発現するが、感染細胞から放出されるウイルス粒子のエンベロープには、麻疹ウイルスＦタンパク質及びＨタンパク質が含まれるが、ＲＳＶのＦタンパク質及びＧタンパク質は含まれないため、麻疹ウイルスの感染スペクトラムを有する。
麻疹ウイルスのＦタンパク質及びＨタンパク質をコードする領域をゲノムから除去しＦタンパク質の細胞内領域にsimian immunodeficiency virus (SIV)のｇｐ１６０タンパク質を発現するようにデザインしたキメラウイルスも報告されている（非特許文献20)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kapikian AZ, Mitchell RH, Chanock RM, Shevedoff RA, Stewart CE.: An epidemiologic study of altered clinical reactivity to respiratory syncytial (RS) virus infection in children previously vaccinated with an inactivated RS virus vaccine. Am J Epidemiol 1969; 89: 405-21.
【非特許文献２】Graham BS : Biological challenges and technical opportunities for respiratory syncytial virus vaccine development. Immunol Rev 2011; 239: 149-66.
【非特許文献３】Wright PF, Belshe RB, Kim HW, Van Voris LP, Chanock RM. Administration of a highly attenuated, live respiratory syncytial virus vaccine to adults and children. Infect Immun 1982; 37: 397-400.
【非特許文献４】Whitehead SS, Firestone CY, Karron RA, Crowe JE Jr, Elkins WR, Collins PL, et al. Addition of a missense mutation present in the L gene of respiratory syncytial virus (RSV) cpts530/1030 to RSV vaccine candidate cpts248/404 increases its attenuation and temperature sensitivity. J Virol 1999; 73: 871-7.
【非特許文献５】Tang RS, MacPhail M, Schickli JH, Kaur J, Robinson CL, Lawlor HA, et al. Parainfluenza virus type 3 expressing the native or soluble fusion (F) Protein of Respiratory Syncytial Virus (RSV) confers protection from RSV infection in African green monkeys. J Virol 2004; 78:11198-207.
【非特許文献６】Graham BS : Biological challenges and technical opportunities for respiratory syncytial virus vaccine development. Immunol Rev 2011; 239: 149-66.
【非特許文献７】Tayyari F, Marchant D, Moraes TJ, Duan W, Mastrangelo P, Hegele RG.: Identification of nucleolin as a cellular receptor for human respiratory syncytial virus. Nature Medicine 2011; 17: 1132-6.
【非特許文献８】The Imapact-RSV Study Group. Palivizumab, a humanized respiratory syncytial virus monoclonal antibody, reduces hospitalization from respiratory syncytial virus infection in high-risk infants. Pediatrics 1998; 102: 531-7.
【非特許文献９】Hu J, Robinson JL : Treatment of respiratory syncytial virus with palivizumab: a systematic review. World J Pediatr 2010; 6: 296-300.
【非特許文献１０】Nair H, Nokes DJ, Gessner BD, Dherani M, Madhi SA, Singleton RJ, at al. : Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet 2010; 375: 1545-55.
【非特許文献１１】Chang A, Dutch RE. Paramyxovirus fusion and entry: multiple paths to a common end. Virus 2012; 4: 613-36.
【非特許文献１２】Nakayama T, Komase K, Uzuka R, Hoshi A, Okafuji T. Leucine at position 278 of the AIK-C measles virus vaccine strain fusion protein is responsible for reduced syncytium formation. J Gen Virol 2001; 82: 2143-50.
【非特許文献１３】Komase K, Nakayama T, Iijima M, Miki K, Kawanishi R, Uejima H. The phosphoprotein of attenuated measles AIK-C vaccine strain contributes to its temperature-sensitive phenotype. Vaccine 2006; 24: 826-34.
【非特許文献１４】Griffin DE. Measles virus. In: Knipe DM, Howley PM, editors. Fields virology. 5th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer, Lippincott, Williams & Wilkins; 2007. pp1551-85.
【非特許文献１５】Radecke F, Spielhofer P, Schneider H, Kaelin K, Huber M, Dotsch C, et al. Rescue of measles viruses from cloned cDNA. EMBO J 1995; 14: 5773-84.
【非特許文献１６】Zuniga A, Wang Z, Liniger M, Hangartner L, Caballero M, Pavlovic J, et al. Attenuated measles virus as a vaccine vector. Vaccine 2007; 25: 2974-2983.
【非特許文献１７】Mok H, Cheng X, Xu Q, Zengel JR, Parhy B, Zhao J, et al. Evaluation of measles vaccine virus as a vector to deliver respiratory syncytial virus fusion protein or Epstein-Barr virus glycoprotein gp350. Open Virol J 2012; 6:12-22.
【非特許文献１８】Sawada A, Komase K, Nakayama T. AIK-C measles vaccine expressing fusion protein of respiratory syncytial virus induces protective antibodies in cotton rats. Vaccine 2011; 29: 1481-90.
【非特許文献１９】Yamaji Y, Nakayama T. Recombinant measles viruses expressing respiratory syncytial virus proteins induced virus-specific CTL responses in cotton rats. Vaccine 2014; doi.org/10.1016/j.vaccine.2014.06.024
【非特許文献２０】Mourez T, Mesel-Lemoinw M, Combredet C, Najburg V, Cayet N, Tangy F. A chimeric measles virus with a lentiviral envelope replicates exclusively in CD4+/CCR5+ cells. Virology 2011; 419: 117-125.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＲＳＶは乳幼児の気道感染症の中でインフルエンザに次いで重要なウイルス感染症である。通常2歳まですべての小児が罹患し、特に未熟児で出生し呼吸器系の基礎疾患を有する小児や、心血管系の基礎疾患を持つ小児が感染すると重症の肺炎、細気管支炎を起こし、時に死亡に至る感染症である。世界中で毎年3000万人が感染し16万人が死亡している。小児だけはなく、高齢者においても肺炎、気管支炎の原因ウイルスで細菌性肺炎を合併し高齢者においても注目されている。その予防には乳幼児期にはRSVの外殻タンパク質であるFタンパク質に対するヒト型単クローン抗体が使用されている。しかしながら、高価な薬剤でありその使用は限定されている。また、多くのワクチン候補株が作成されてきたが、安全性と免疫原性に優れたワクチンはいまだ開発されていない。また、その治療薬も開発されていない。そして、これらの問題は、ＲＳＶに限らず、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスに共通する問題である。
【００１３】
本発明の目的は、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染症のワクチン及びパラミクソウイルス科のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニングに使用するための組換え麻疹ウイルスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、麻疹ワクチンについて鋭意研究を行った。その結果、本願発明者は、麻疹ウイルスの外殻タンパク質であるＦタンパク質及びＨタンパク質について、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列を、特定のパラミクソウイルス科のウイルスの外殻タンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に組み換えることによって、そのパラミクソウイルス科のウイルスの感染可能な細胞に対して感染能を有し、感染細胞において増殖能の高い組換え麻疹ウイルスを作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1]エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｆタンパク質と、
エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｈタンパク質と、
を有する組換え麻疹ウイルスであって、
前記変異型Ｆタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞融合活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｆタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有し、
前記変異型Ｈタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質の、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞吸着活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｈタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＨタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有する、
組換え麻疹ウイルス。
[2]ＡＩＫ−Ｃの組換え麻疹ウイルスである、[1]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[3]前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、[1]又は[2]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[4]前記変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、ＲＳＶのＦタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列、または、ＲＳＶのＦタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって、かつ、ヒト気道上皮細胞に対する細胞融合活性を組換え麻疹ウイルスの前記変異型Ｆタンパク質に付与するアミノ酸配列の領域を有する、
[1]〜[3]のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルス。
[5]前記変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１位〜第５２４位の領域のアミノ酸配列、または、配列番号４に記載のアミノ酸配列の第１位〜第５２４位の領域のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列を有する、[4]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[6]前記変異型Ｆタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列である、[5]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[7]前記変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、ＲＳＶのＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列、または、ＲＳＶのＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列であって、かつ、ヒト気道上皮細胞に対する細胞吸着活性を前記変異型Ｈタンパク質に付与するアミノ酸配列の領域を有する、
[1]〜[6]のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルス。
[8]前記変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第６７位〜第２９８位の領域のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第６７位〜第２９８位の領域のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列を有する、[7]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[9]前記変異型Ｈタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２６に記載のアミノ酸配列のうち１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換されてなるアミノ酸配列である、[8]に記載の組換え麻疹ウイルス。
[10] [1]〜[9]に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムである、組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
[11]蛍光タンパク質を規定する領域を有する、[10]に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ。
[12] [10]又は[11]に記載の組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡから調製された、組換え麻疹ウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ。
[13]配列番号５に記載の塩基配列、または、配列番号５に記載の塩基配列と９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなる、組換え麻疹ウイルスのゲノムをコードするＤＮＡ。
[14] [1]〜[9]のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルスを有効成分として含む、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症のワクチン。
[15]被験物質の存在下で、[1]〜[9]のいずれか１項に記載の組換え麻疹ウイルスを細胞と培養する第一工程と、
前記第一工程の前記組換え麻疹ウイルスの前記細胞に対する感染レベルを測定する第二工程と、
前記第二工程において測定した感染レベルを、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルと比較し、前記被験物質の存在下で細胞と培養した前記組換え麻疹ウイルスの感染レベルが、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルよりも小さい場合は、前記被験物質を選択する第三工程と、
を有する、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニング方法。
[16]前記組換え麻疹ウイルスは蛍光タンパク質を規定する遺伝子を有し、
前記組換え麻疹ウイルスの感染レベルを蛍光タンパク質の蛍光強度で測定する、
[15]に記載のパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の組換え麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスが細胞に感染する際に機能する外殻タンパク質のウイルス粒子の外側に突出するアミノ酸配列を有するため、そのアミノ酸配列の由来するパラミクソウイルス科のウイルスが感染可能な細胞に対して感染できる。また、本発明の組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスのウイルス粒子を形成する上で重要な役割を有する、Ｆタンパク質及びＨタンパク質とＭタンパク質との結合構造を有し、感染細胞においてウイルス粒子形成を円滑に行うことができるため、高い増殖能を有する。
【００１７】
本発明の組換え麻疹ウイルスは、以上のような特徴を有することにより感染先で免疫を十分に誘導できるため、これを用いたパラミクソウイルス科のウイルスによる感染症のワクチンを提供することができる。また、本発明の組換え麻疹ウイルスは治療用薬の対象とするウイルスと同様の感染スペクトラムを有するため、これを用いた治療用薬のスクリーニング方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１において変異型Ｆタンパク質の構築に用いた領域を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１で構築した変異型Ｆタンパク質の塩基配列を表す図である。
【図３】図３は、実施例２において変異型Ｈタンパク質の構築に用いた領域を示す模式図である。
【図４】図４は、実施例２で構築した変異型Ｈタンパク質の塩基配列を表す図である。
【図５】図５は、実施例３における、組換え麻疹ウイルス全長遺伝子を構築する際の組み込み領域を示す模式図である。
【図６】図６は、実施例４で組換え麻疹ウイルスを回収した方法を表す模式図である。
【図７】図７は、実施例４で作製した組換え麻疹ウイルスを表す模式図である。
【図８】図８は、Ｖｅｒｏ細胞及びＡ５４９細胞における麻疹ウイルス、組換え麻疹ウイルス、ＲＳＶの増殖能を示す図である。
【図９】図９は、リンパ球系細胞における麻疹ウイルス及び組換え麻疹ウイルスの増殖能を示す図である。
【図１０】上皮細胞系における麻疹ウイルス、組換え麻疹ウイルス及びＲＳＶの増殖能を示す図である。
【図１１】リンパ球系細胞における麻疹ウイルス、組換え麻疹ウイルス及びＲＳＶの増殖能を示す図である。
【図１２】組換え麻疹ウイルスが、Ａ５４９細胞に感染後に発現するタンパク質を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）組換え麻疹ウイルス
本発明により提供される組換え麻疹ウイルスは、
エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｆタンパク質と、
エンベロープ貫通型タンパク質である変異型Ｈタンパク質と、
を有する組換え麻疹ウイルスであって、
前記変異型Ｆタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞融合活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｆタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有し、
前記変異型Ｈタンパク質は、
ウイルス粒子の外側に、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質の、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、前記パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞吸着活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｈタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有し、
ウイルス粒子の内側に、麻疹ウイルスのＨタンパク質の、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であって、かつ、麻疹ウイルスのＭタンパク質と結合可能なアミノ酸配列の領域を有する。
【００２０】
本明細書において、「エンベロープ」とは、パラミクソウイルス科のウイルスに見られる、ヌクレオキャプシドをとり巻く脂質二重層を基本とする膜構造であり、パラミクソウイルス科のウイルスのゲノムにコードされた、ウイルス粒子膜を貫通する、エンベロープ貫通型タンパク質からなる小突起構造物と、宿主細胞由来の脂質と、を有するものを意味する。
【００２１】
本明細書において、「ウイルス粒子の外側」とは、そのエンベロープを有するパラミクソウイルス科のウイルス粒子のエンベロープのうちウイルス粒子の外側に位置する層の親水表面から、ウイルス粒子の外側を意味する。本明細書において、「ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列」とは、エンベロープのうちウイルス粒子の外側に位置する層の親水表面から、ウイルス粒子の外側に向けて突出しているアミノ酸の配列を意味する。例えば、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＦタンパク質の場合は、膜貫通領域よりもＮ末端側の領域の領域を意味し、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＧタンパク質、Ｈタンパク質又はＨＮタンパク質の場合は、膜貫通領域よりもＣ末端側の領域を意味する。
【００２２】
本明細書において、「ウイルス粒子の内側」とは、そのエンベロープを有するウイルス粒子のエンベロープのうちウイルス粒子の内側に位置する層の親水表面から、ウイルス粒子中心側を意味する。本明細書において、「ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列」とは、エンベロープのうちウイルス粒子の内側に位置する層の親水表面から、ウイルス粒子の中心部に向けて突出しているアミノ酸の配列を意味する。例えば、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＦタンパク質の場合は、膜貫通領域よりもＣ末端側の親水性の領域を意味し、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＧタンパク質、Ｈタンパク質又はＨＮタンパク質の場合は、疎水性の膜貫通領域よりもＮ末端側の領域を意味する。
【００２３】
タンパク質の膜貫通領域とは疎水性の領域である。ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＦタンパク質の膜貫通領域はＣ末端付近に位置し、ＲＳＶ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスのＧタンパク質、Ｈタンパク質又はＨＮタンパク質の膜貫通領域はＮ末端付近に位置する。
【００２４】
タンパク質の疎水性領域及び親水性領域、並びに膜貫通領域は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて推定できる。
【００２５】
由来する麻疹ウイルス
本発明の組換え麻疹ウイルスは、安全性の高い麻疹ワクチンウイルスに由来することが好ましい。例えば、CAM-70、Schwarz FF8、AIK-C、AIK-HDC、TD97、Moraten、Connaught、Schwarz、Edmonston B、Edmonston-Zagreb、Leningrad-16、Shanghai-191、Changchum-47、及びBeijingなどに由来することが好ましく、Schwarz、Moraten及びAIK-Cに由来することがより好ましい。AIK-Cは39℃以上では増殖しない性状特徴を有し、安全性が特に高いため、AIK-Cを用いることが最も好ましい。
【００２６】
本発明の組換え麻疹ウイルスは、変異型Ｈタンパク質及び変異型Ｆタンパク質以外のタンパク質のNucleocapsid（N）タンパク質, Phospho（P）タンパク質，Ｖタンパク質,Ｃタンパク質、Large（L）タンパク質及びMembrane(Ｍ)タンパク質については、麻疹ウイルスと同様のタンパク質を有することが好ましい。麻疹ウイルスの安全性や増殖能等の特性を、組換え麻疹ウイルスでも維持することができる。
パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルス
本明細書において、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスは、例えば、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ムンプスウイルス、メタニューモウイルス及びニパウイルスなどを意味する。
変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質
本発明の組換え麻疹ウイルスが有する変異型Ｈタンパク質及び変異型Ｆタンパク質は、エンベロープ貫通型タンパク質である。変異型Ｈタンパク質及び変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列の領域と、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列の領域と、エンベロープ膜貫通領域と、を有する。そして、変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質には、同一種のパラミクソウイルス由来のアミノ酸を組み込む。組換え麻疹ウイルスに発現した変異型Ｈタンパク質及び変異型Ｆタンパク質について以下に説明する。
【００２７】
変異型Ｈタンパク質
変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の内側のアミノ酸配列の領域に、本発明の組換え麻疹ウイルスの発現するMembrane（Ｍ)タンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有する。このアミノ酸配列は、例えば、麻疹ウイルスのＨタンパク質の、ウイルス粒子の内側に位置するアミノ酸配列を有することが好ましいが、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、Ｍタンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有してもよい。例えば、配列番号１に示すＡＩＫ−ＣのＨタンパク質のアミノ酸配列のうち第１位〜第３４位のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するか、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換された、Ｍタンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有してもよい。
【００２８】
変異型Ｈタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。そのＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞吸着活性を、変異型Ｈタンパク質に付与できるアミノ酸配列を有すれば制限されない。本明細書において、「細胞吸着活性」とは、パラミクソウイルス科のウイルスのＨＮタンパク質、Ｈタンパク質及びＧタンパク質が有する、細胞側のウイルス受容体（レセプター）と結合する活性をいう。また、変異型Ｈタンパク質が、「パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞吸着活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｈタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有する」とは、その変異型Ｈタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列が由来するウイルス種が感染可能な細胞種に対する細胞吸着活性を意味する。
【００２９】
例えば、変異型Ｈタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列がＲＳＶ、ムンプスウイルス、又はメタニューモウイルスに由来する場合、この変異型Ｈタンパク質は、ＲＳＶのＧタンパク質、ムンプスウイルスのＨＮタンパク質、又はメタニューモウイルスのＧタンパク質が有する「ヒト気道粘膜上皮細胞に対する細胞吸着活性」を有する。
【００３０】
ＲＳＶのＧタンパクは糖鎖が付着しケモカイン(CX3C: fractalkine)に類似しているため、CX3CRに結合する。また、ＲＳＶのＧタンパク質はheparin、annexin IIにも結合する。このため、組換え麻疹ウイルスの変異型Ｈタンパク質がＲＳＶのＧタンパク質由来のアミノ酸配列を有する場合、組換え麻疹ウイルスは、CX3CR、heparin、又はannexin IIに結合する機能を有する。
【００３１】
例えば、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するか、または、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有してもよい。例えば、配列番号２に示すＲＳＶ／Ｏｈｔａ／１９９８株のＧタンパク質のアミノ酸配列のうち第６７位〜第２９８位のアミノ酸配列を、変異型Ｈタンパク質がウイルス粒子の外側に有してもよく、又は、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、かつ、特定の細胞に対する細胞吸着活性を変異型Ｈタンパク質に付与できるアミノ酸配列を、変異型Ｈタンパク質がウイルス粒子の外側に有してもよい。
【００３２】
変異型Ｈタンパク質の、エンベロープ膜貫通領域のアミノ酸配列は、エンベロープ膜貫通領域として機能可能なアミノ酸配列を有する。特に制限されないが、パラミクソウイルス科のウイルスのＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質のエンベロープ膜貫通領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有することが好ましいが、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、疎水性を有し、ウイルス粒子内での変異型Ｈタンパク質とＭタンパク質との結合を阻害しないアミノ酸配列を有してもよい。例えば、配列番号１に示すＡＩＫ−ＣのＨタンパク質のアミノ酸配列のうち第３５位〜第５８位のアミノ酸配列を有することが好ましいが、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、疎水性を有し、ウイルス粒子内での変異型Ｈタンパク質とＭタンパク質との結合を阻害しないアミノ酸配列を有してもよい。
変異型Ｆタンパク質
変異型Ｆタンパク質のウイルス粒子の内側のアミノ酸配列の領域に、本発明の組換え麻疹ウイルスのMembrane（Ｍ)タンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有する。このアミノ酸配列は、例えば、麻疹ウイルスのＦタンパク質の、ウイルス粒子の内側に位置するアミノ酸配列を有することが好ましいが、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、Ｍタンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有してもよい。例えば、配列番号３に示すＡＩＫ−ＣのＦタンパク質のアミノ酸配列のうち第５２１位〜第５５３位のアミノ酸配列、又は、そのアミノ酸配列を有することが好ましいが、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、Ｍタンパク質と結合可能なアミノ酸配列を有してもよい。
【００３３】
変異型Ｆタンパク質は、ウイルス粒子の外側に、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質のウイルス粒子の外側に位置するアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。そのＦタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞融合活性を、変異型Ｆタンパク質に付与できるアミノ酸配列を有すれば制限されない。本明細書において、「細胞融合活性」とは、パラミクソウイルス科のウイルスのＦタンパク質が有する、Ｆタンパク質の作用によって細胞膜脂質二重構造を一時崩壊させて、その回復過程で、接近した細胞の細胞膜に融合を起こさせる活性をいう。細胞融合は、例えば次のように生じる。Ｆタンパクの疎水性アミノ酸が並んでいるfusion domainが細胞の脂質二重膜に突き刺さる。この構造は安定していないため元の構造に戻ろうとする。この時に細胞膜同士が細胞融合を起こす。また、変異型Ｆタンパク質が、「パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのＦタンパク質が有する、特定の細胞に対する細胞融合活性を、前記組換え麻疹ウイルスの変異型Ｆタンパク質に付与する、アミノ酸配列の領域を有する」場合は、感染した細胞が細胞融合を起こす。このことは顕微鏡下で観察することにより確認できる。また、本明細書において、変異型Ｆタンパク質の「特定の細胞に対する細胞融合活性」とは、その変異型Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列が由来するウイルス種が感染可能な細胞種に対する細胞融合活性を意味する。
【００３４】
例えば、変異型Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列がＲＳＶに由来する場合、この変異型Ｆタンパク質は、ＲＳＶのＦタンパク質が有する「ヒト気道上皮細胞に対する細胞融合活性」を有する。また、変異型Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列がムンプスウイルスに由来する場合、この変異型Ｆタンパク質は、ムンプスウイルスのＦタンパク質が有する「Vero細胞に対する細胞融合活性」を有する。
【００３５】
例えば、Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するか、または、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有してもよい。
【００３６】
例えば、配列番号４に示すRSV/Nao/1998株のＦタンパク質のアミノ酸配列のうち第１位〜第５２４位のアミノ酸配列を、変異型Ｆタンパク質がウイルス粒子の外側に有してもよい。又は、これらのアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、かつ、ヒト気道上皮細胞に対する細胞融合活性を変異型Ｆタンパク質に付与できるアミノ酸配列を、変異型Ｆタンパク質がウイルス粒子の外側に有してもよい。
【００３７】
変異型Ｆタンパク質の、エンベロープ膜貫通領域のアミノ酸配列は、エンベロープ膜貫通領域として機能可能なアミノ酸配列を有する。特に制限されないが、パラミクソウイルス科のウイルスのＦタンパク質のエンベロープ膜貫通領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有することが好ましい。または、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、疎水性を有し、ウイルス粒子内での変異型Ｆタンパク質とＭタンパク質との結合を阻害しないアミノ酸配列を有してもよい。例えば、配列番号３に示すＡＩＫ−ＣのＦタンパク質のアミノ酸配列のうち第４９８位〜第５２０位のアミノ酸配列を有することが好ましい。または、このアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個、２個又は数個の）アミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列であって、疎水性を有し、ウイルス粒子内での変異型Ｆタンパク質とＭタンパク質との結合を阻害しないアミノ酸配列を有してもよい。
【００３８】
変異型Ｆタンパク質としては、例えば、配列番号２５に記載の配列を有することが好ましい。
組換え麻疹ウイルス
本発明の組換え麻疹ウイルスは、後述するように、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症のワクチンとしての用途や、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニングの用途に用いることができる。
（２）組換え麻疹ウイルスのゲノム
本発明は、上記組換え麻疹ウイルスをコードするｃＤＮＡを提供する。
【００３９】
組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡは、一本鎖（マイナス鎖）ＲＮＡである。そのゲノム上には、麻疹ウイルスの、Nucleocapsid（N）タンパク質, Phospho（P）タンパク質，Large（L）タンパク質及びMembrane(Ｍ)タンパク質、並びに、上記の変異型Ｆタンパク質、及び上記の変異型Ｈタンパク質の６つの遺伝子、又は、これらの遺伝子の塩基配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の塩基配列相同性を有し、かつ、これらのタンパク質と同じ機能を有するタンパク質を規定する遺伝子が規定されている。
【００４０】
組換え麻疹ウイルスのゲノムは、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質を規定する領域を有してもよい。
【００４１】
組換え麻疹ウイルスの全長ゲノムの例として、ＲＳＶであるRS/Nao/1998株由来のタンパク質を組み込んで作製した、麻疹ウイルスであるＡＩＫ−Ｃの組換え体の全長ゲノムのｃＤＮＡ配列を配列番号５に示す。また、ＧＦＰを規定する領域も有する組換え体の全長ゲノムのｃＤＮＡ配列を配列番号６に示す。
【００４２】
野生型麻疹ウイルスのゲノムから組換え麻疹ウイルスを作製するには、ＰＣＲ法や市販の変異導入キットを用いることができる。ＰＣＲ法としては、例えば、野生型のパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型とし、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質若しくはＧタンパク質又はＦタンパク質の、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列を規定する領域をターゲットにする１組のプライマーを用いたＰＣＲを実施することによって、目的の配列部分を増幅することができる。合成した核酸の各末端を制限酵素で切断し、同じ酵素で切断した野生型の麻疹ウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターに連結することにより、目的の変異を導入できる。これにより得られたキメラ麻疹ウイルスｃＤＮＡを、Ｎ，Ｐ，Ｌタンパク質の発現プラスミドを導入した細胞に導入して、組換え麻疹ウイルスを取得する。
（３）ワクチン
本発明は、上記組換え麻疹ウイルスを有効成分として含む、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症のワクチンを提供する。
【００４３】
ワクチンは、ワクチンの有効成分に含まれる変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質が、上述のように、一種類のパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのタンパク質に由来しており、その種類のパラミクソウイルス科のウイルスによる感染症のワクチンとして機能する。例えば、ＲＳＶのＦタンパク質及びＧタンパク質に由来するアミノ酸配列を、変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質に有する組換え麻疹ウイルスは、ＲＳＶの感染症のワクチンの有効成分として機能する。
【００４４】
本発明のワクチンに含まれる組換え麻疹ウイルス粒子の表面上に、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスの、Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側の領域のアミノ酸配列と、ＨＮタンパク質、Ｈタンパク質又はＧタンパク質のウイルス粒子の外側の領域のアミノ酸配列と、を発現しているため、被験者に対してＴｈ１応答とＴｈ２応答とを両方誘導可能である。また、本発明のワクチンに含まれる組換え麻疹ウイルスはウイルス粒子を形成できるため、感染細胞から離れた細胞に新たに感染できる。こうしてウイルスが広く増殖することで、被験者に対する抗体の誘導や細胞性免疫能の誘導が効率的に生じ、生ワクチンとして高い効果を発揮する。さらに、ワクチンに含まれる本発明の組換え麻疹ウイルスが、ＡＩＫ−Ｃに由来し、かつ、変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質が、ＲＳＶのＦタンパク質及びＧタンパク質に由来する場合は、ＡＩＫ−Ｃと同様の温度感受性を示し、ＲＳＶよりは増殖能が低い。このため、経鼻生ワクチンとして応用できる。
【００４５】
ワクチンは、溶液、懸濁液、又は凍結乾燥製剤の形態をとりうる。また、投与剤形に適した方法で、そして予防及び治療効果を有する量で投与する。そして、鼻腔内、粘膜、経口、皮下、筋肉内投与経路などの経路によって投与できる。例えば、ＲＳＶのＦタンパク質及びＧタンパク質のウイルス粒子の外側のアミノ酸配列を組み込んだ変異型Ｆタンパク質及びＦタンパク質を含むワクチンや、それらのタンパク質を規定する構築物を含むワクチンの場合は、鼻腔内に投与することができる。
【００４６】
ワクチンは、健常人に投与し、健常人にパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスに対する免疫応答を誘導し、感染症に対して予防的に使用する方法がある。
【００４７】
ワクチンは、上記組換え麻疹ウイルス、上記組換え麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡ、又は上記麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを有効成分として含む場合、医薬として、医薬上許容される溶解剤、添加剤、安定剤、バッファーなどをさらに有してもよい。
（４）抗パラミクソウイルス薬のスクリーニング方法
本発明は、被験物質の存在下で、上記の組換え麻疹ウイルスを細胞と培養する第一工程と、前記第一工程の前記組換え麻疹ウイルスの前記細胞に対する感染レベルを測定する第二工程と、前記第二工程において測定した感染レベルを、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルと比較し、前記被験物質の存在下で細胞と培養した前記組換え麻疹ウイルスの感染レベルが、前記被験物質の非存在下で細胞と培養した組換え麻疹ウイルスの感染レベルよりも小さい場合は、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療薬の候補として、前記被験物質を選択する第三工程と、を有する、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
感染レベルの測定は、感染細胞の細胞変性効果を比較することにより行ってもよい。例えば、細胞同士が融合して形成される巨細胞数を数えて感染レベルを測定してもよい。例えば、被験物質の存在する条件と、非存在の条件において、細胞と組換え麻疹ウイルスを、およそ1週間培養した後に、両条件の巨細胞数を確認して感染レベルを比較する。そして、被験物質の存在する培養条件の巨細胞数のほうが被験物質の非存在の培養条件の巨細胞数よりも少ない場合には、被験物質をパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスに対する薬の候補にできる。
【００４９】
蛍光タンパク質を規定する遺伝子を有する組換え麻疹ウイルスを用いた場合は、組換え麻疹ウイルスの感染レベルを蛍光タンパク質の蛍光強度で測定することができる。例えば、被験物質の存在する条件と、非存在の条件において、細胞と組換え麻疹ウイルスを、およそ１週間培養した後に、両条件におけるＧＦＰの蛍光量を測定して、感染レベルを比較する。そして、被験物質の存在する培養条件の蛍光量のほうが被験物質の非存在の培養条件の蛍光量よりも小さい場合には、被験物質をパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスに対する薬の候補にできる。
【００５０】
以下の実施例に示すとおり、本発明の組換え麻疹ウイルスは、ウイルス粒子の外側のアミノ酸配列に由来するウイルスが感染可能である細胞に対して感染能を有し、また、麻疹ウイルスと同様に高い増殖能を有する。このため、本発明の組換え麻疹ウイルスは高い免疫原性を有すると考えられる。また、本発明の組換え麻疹ウイルスは、安全性が確認されているＡＩＫ−Ｃ株等の麻疹ウイルスのウイルス粒子の外側のアミノ酸配列以外を組み換えずに作製すると、安全面において特に優れると考えられる。このため、本発明の組換え麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症のワクチンとして有用であり、また、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスによる感染症の治療用薬のスクリーニング方法に用いる場合に有用であると考えられる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。但し、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００５２】
［実施例１］変異型Fタンパク質を規定する遺伝子の作製
実施例１では、麻疹ウイルスＡＩＫ-ＣのＦタンパク質のウイルス粒子の内側の領域のアミノ酸配列及びエンベロープ膜貫通領域のアミノ酸配列と、パラミクソウイルスであるＲＳＶ（RSV/Nao/1998株、1998年臨床分離株）のＦタンパク質のウイルス粒子の外側の領域のアミノ酸配列とを有する変異型Ｆタンパク質である変異型Ｆタンパク質を規定する遺伝子を作製した。図１に、変異型Ｆタンパク質の構築に用いた領域を示す。
【００５３】
まず、非特許文献１８で作製した、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の全長をコードする塩基配列（配列番号２８）が組み込まれたプラスミド（ｐＭＶＡＩＫ/ＲＳＶ/Ｆ）を鋳型にして、プライマーＭＶ／ＲＳＦ  ＡＴＧ＋（5’- ATCAAGACTCATCCAATGGAGTTGCCAATC -3’（配列番号８））と、プライマーＲＳＦ−ＡＩＫ  Ｆ  ＴＭ−（5’- CAGGATGTAGACTATATTTGTGGTGGATTT -3’ （配列番号９））を用いてＰＣＲによってターゲット配列を増幅した。これをフラグメントＡとした。フラグメントＡは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域をコードする塩基配列（配列番号１０）である。
【００５４】
非特許文献１２で作製した、ＡＩＫ-Ｃ株の全長をコードする塩基配列（配列番号２７）が組み込まれたプラスミドを鋳型にして、麻疹ワクチン株ＡＩＫ−Ｃの全長ｃＤＮＡ（配列番号２７）の４９２２位のＮａｒ  Ｉ制限酵素切断部位を含む領域をターゲットにするプライマーＭＶ４８６６（5’- ACAAAACTTAGGGCCAAGGAACATACACAC -3’ （配列番号１１））と、プライマーＭＶ  ＲＳ  Ｆ  ＡＴＧ−（5’- GATTGGCAACTCCATTGGATGAGTCTTGAT -3’ （配列番号１２））を用いてＰＣＲによってターゲット配列を増幅した。得られたフラグメントをフラグメントＢ（配列番号１３）とした。
【００５５】
また、ＡＩＫ-Ｃのウイルス粒子の内側の領域とエンベロープ膜貫通領域からＰａｃ  Ｉ  制限酵素領域までのフラグメントＣの作製は以下のＰＣＲ産物を結合させた。ＡＩＫ-Ｃ株の全長をコードする塩基配列（配列番号２７）が組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマーＲＳＦ−ＡＩＫ  Ｆ  ＴＭ＋（5’-AAATCAACCACAAATATAGTCTACATCCTG-3’（配列番号３０））と、プライマーＡＩＫ  Ｆ  ＴＧＡＴＡＧ  ＮｏｔＩ−（5’-TTATATGCGGCCGCCTATCAGAGCGACCTTA -3’ （配列番号３１））を用いて、ＰＣＲにより作製したフラグメントをBluescript SK II-に組み込む。この組換えRSVF/MVFタンパクの遺伝子にAIK-Cの非翻訳領域を付加するためにAIK-C cDNAを鋳型としてプライマーAIK F stop-UTR（5' -GAGAGTTGTAGAGGACTATCAGAGCGACCT- 3’（配列番号３２））とプライマーAIK Pac- (5’- TTGCACCCTAAGTTTTAATTAACTACCGAT -3’ （配列番号３３）)で ＰＣＲを行い結合することでフラグメントＣを作成した。ＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のエンベロープ膜貫通領域とウイルス粒子の内側に位置する領域をコードする塩基配列（配列番号１４）である。
【００５６】
次に、フラグメントＡ，Ｂ及びＣを混合し、ライゲーションし、得られた構築物の塩基配列を確認した。Ｎａｒ  Ｉ制限酵素切断部位を5’末端に、Ｐａｃ  Ｉ制限酵素切断部位を3’末端に含み、両制限酵素切断部位の間に、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域と、ＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のエンベロープ膜貫通領域と、ＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の内側に位置する領域と、を含む、変異型Ｆタンパク質の遺伝子（配列番号７）が含まれるポリヌクレオチドが得られた。
【００５７】
そして、得られた変異型Ｆタンパク質を規定する遺伝子が含まれるポリヌクレオチドを、Ｎａｒ  Ｉ及び  Ｐａｃ  Ｉで処理した、特許文献１８で作製したpMVAIK/20-77プラスミドに挿入した。大腸菌への形質転換後、２ＹＴプレート培地にて３７℃で一晩培養した。翌日、生えたコロニーから数クローンを選んで２ＹＴ培地にて培養後、プラスミドの抽出を行った。
【００５８】
図２には、変異型Ｆタンパク質のＲＳＶ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域と、ＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のエンベロープ膜貫通領域と、ＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の内側に位置する領域と、をコードする領域の塩基配列（配列番号７）を示す。大文字で示す塩基はＲＳＶ  Ｆタンパク質のウイルス粒子の外側の領域をコードする部分の塩基、小文字で示す塩基はＡＩＫ−Ｃ  Ｆタンパク質のエンベロープ膜貫通領域とウイルス粒子の内側の領域をコードする部分の塩基である。ウイルス粒子の外側の領域を規定する領域は１位から１５７２位の領域であり、ウイルス粒子の内側の領域と膜貫通領域を規定する領域は１５７３位から１７４３位の領域である。
【００５９】
［実施例２］変異型Ｈタンパク質を規定する遺伝子の作製
実施例２では、麻疹ウイルスであるＡＩＫ−ＣのＨタンパク質のウイルス粒子の内側の領域とエンベロープ膜貫通領域とパラミクソウイルスであるＲＳＶ（RS/Ohta/1998株）のＧタンパク質のウイルス粒子の外側の領域とを有する変異型Ｈタンパク質を規定する遺伝子を作製した。
【００６０】
図３は、ＡＩＫ−ＣのＨタンパク質のウイルス粒子の内側の領域及びエンベロープ膜貫通領域と、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のウイルス粒子の外側の領域とを結合する手順を示す。ＡＩＫ−Ｃの全長ゲノムのｃＤＮＡ（配列番号２７）が組み込まれた、非特許文献１８で作製したプラスミドｐＭＶＡＩＫをＳａｌＩで制限酵素処理し、セルフライゲーションさせたプラスミドを鋳型として用いて、プライマーＭＶ  ＴＭ  ＲＳＧ−（5’-  TGTGACTTTGTGAATGCCTGCAAT  -3’ （配列番号１５）とプライマーＭＶ３０７１＋（5’- TGACAAATGGACGGACCAGT-3’ （配列番号１６））を用いてＰＣＲによってターゲット配列を増幅した。得られたフラグメントをフラグメントＡとした。フラグメントＡは、ＡＩＫ−Ｃ  Ｈタンパク質の、エンベロープ膜貫通領域をコードする塩基配列からＳａｌ  Ｉ制限酵素切断部位を含む塩基配列（配列番号１７）である。
【００６１】
ＡＩＫ−Ｃの全長ゲノムのｃＤＮＡ（配列番号２７）が組み込まれた、非特許文献１８で作製したプラスミドをＳａｌＩで制限酵素処理し、セルフライゲーションさせたプラスミドを鋳型として用いて、プライマーＲＳＶ  Ｇ  ｓｔｏｐ  ＋（5’- AACGAGTAGTGAGGCTGCTAGTGA -3’ （配列番号１８））と、プライマーＭＶ９１７５−（5’- ATTAACTAGTGGGTATGCCTGATG -3’ （配列番号１９））を用いて、ＰＣＲによってターゲット配列を増幅した。得られたフラグメントをフラグメントＢとした。フラグメントＢは、ＡＩＫ−Ｃ  ＨＡタンパク質の、終始コドン及びＳｐｅ  Ｉ制限酵素切断部位を含む塩基配列（配列番号２０）である。
【００６２】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質の全長をコードする塩基配列（配列番号２９）が組み込まれた、先行文献１８に記載のプラスミド（ｐＭＶＡＩＫ/ＲＳＶ/Ｇ）を鋳型として用いて、ＲＳＶのＧタンパク質の領域は、プライマーＭＶ  ＴＭ  ＲＳＧ  ＋（5’- ATTGCAGGCATTCACAAAGTCACA -3’ （配列番号２１））及びプライマーＲＳＶ  Ｇ  ｓｔｏｐ  −（5’-  TCACTAGCAGCCTCACTACTCGTT  -3’（配列番号２２）を用いて、ＰＣＲによってターゲット配列を増幅した。得られたフラグメントをフラグメントＣとした。フラグメントＣは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域をコードする塩基配列（配列番号２３）である。
【００６３】
次に、フラグメントＡ、Ｂ及びＣを混合してライゲーションし、得られた構築物の塩基配列を確認した。Ｓａｌ  Ｉ制限酵素切断部位を5’末端に、Ｓｐｅ  Ｉ制限酵素切断部位を3’末端に含み、両制限酵素切断部位の間に、ＡＩＫ−Ｃ  ＨＡタンパク質のウイルス粒子の内側に位置する領域と、ＡＩＫ−Ｃ  ＨＡタンパク質のエンベロープ膜貫通領域と、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域と、を含む、変異型Ｈタンパク質を規定する遺伝子が含まれるポリヌクレオチドが得られた（配列番号２４）。
【００６４】
そして、得られた変異型Ｈタンパク質を規定する遺伝子が含まれるポリヌクレオチドを、ＡＩＫ−Ｃの全長ゲノムのｃＤＮＡ（配列番号２７）が組み込まれた、非特許文献１８で作製したプラスミド（ｐＭＶＡＩＫ）をＳａｌＩで制限酵素処理し、セルフライゲーションさせたプラスミドに挿入した。大腸菌への形質転換後、２ＹＴ寒天プレート培地にて３７℃で一晩培養した。翌日、生えたコロニーから数クローンを選んで２ＹＴ培地にて培養後、プラスミドの抽出を行った。
【００６５】
図４には、この遺伝子のＡＩＫ−Ｃ  Ｈタンパク質のウイルス粒子の内側に位置する領域と、ＡＩＫ−Ｃ  Ｈタンパク質のエンベロープ膜貫通領域と、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のウイルス粒子の外側に位置する領域と、をコードする領域の塩基配列を示す。小文字で示す塩基はＡＩＫ−Ｃ  Ｈタンパク質の、エンベロープ膜貫通領域とウイルス粒子の内側の領域、大文字で示す塩基はＲＳＶ  Ｇタンパク質のウイルス粒子の外側の領域をコードする部分の塩基である。ウイルス粒子の内側の領域を規定する領域は１位から１７４位の領域であり、ウイルス粒子の外側の領域と膜貫通領域を規定する領域は１７５位から８７６位の領域である。
【００６６】
［実施例３］ＧＦＰ遺伝子を組み込んだ、組換えウイルス全長遺伝子の作成
実施例３では、ＧＦＰ遺伝子を組み込んだ、組換えウイルス全長遺伝子を作製した。作製手順を図５に示す。
【００６７】
まず、非特許文献１８に記載の、Ｐ/Ｃ/Ｖ遺伝子、ＧＦＰ、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｈタンパク質の入ったプラスミド（pMVAIK/20-77）を以下のように作製した。
【００６８】
ＡＩＫ−Ｃの全長ゲノムのｃＤＮＡ（配列番号２７）をSac II(2040位)、EcoT22I(7761位)で切断しpBluescript SK-のmulti-cloning situe(SacII, Pst I)に挿入しpMVAIK/20-77を作成した。麻疹ウイルスＡＩＫ−ＣのP/M junction のgenome position３４３３位のＣの前にggcgcgを挿入しAscI部位を導入しatgの上流にR1配列GGCGCGCCGGTCGCCACCatgg（配列番号３４）(ccatggはNcoI siteで、この中のＡＴＧを開始コドンとして用いる)、終止コドンの下流にNot I配列(GCGGCCGC) 及びAscI(GGCGCGCC)を含むR2配列（TAGCGGCCGCACCCTCCATCATTGTTATAAAAAACTTAGGAACCAGGTCCACACAGCGGCGCGCC（配列番号３５））を付加した。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子はNcoI NotI部位を使って挿入した。(図5)
そして、このプラスミドと、実施例１で得た、変異型Ｆタンパク質が挿入されたプラスミドを、制限酵素Ｎａｒ  Ｉと制限酵素Ｐａｃ  Ｉで処理し、回収した変異型Ｆタンパク質の遺伝子を含む断片を、塩基配列（MVAIK/20-77）のＮａｒ  Ｉ制限酵素切断部位とＰａｃ  Ｉ制限酵素切断部位との間に挿入し、塩基配列（MVAIK/20-77/F chimera）を有するプラスミドを作製した。
【００６９】
塩基配列（MVAIK/20-77/F chimera）を有するプラスミドと、実施例２で得た、変異型Ｈタンパク質が挿入されたプラスミドを、制限酵素Ｓａｃ  ＩＩ及び制限酵素Ｐａｃ  Ｉで処理した。回収した変異型Ｈタンパク質の遺伝子を含む断片を、塩基配列（MVAIK/20-77/F chimera）のＳａｃ  ＩＩ制限酵素切断部位とＰａｃ  Ｉ制限酵素切断部位との間に挿入し、塩基配列（MVAIK/RSV FG GFP chimera）を有するプラスミドを作製した。塩基配列（MVAIK/RSV FG GFP chimera）は、ＧＦＰ遺伝子を有する組換えＡＩＫ−Ｃのゲノム全長配列である。
【００７０】
［実施例４］組換えＡＩＫ−Ｃのウイルス粒子の回収
実施例４では、実施例３で作製した組換えＡＩＫ-Ｃのゲノムを用いて、組換えＡＩＫ−Ｃのウイルス粒子の回収を行った。
【００７１】
塩基配列（MVAIK/RSV FG GFP chimera）はP/M junctionにＧＦＰ遺伝子が挿入されており制限酵素Ａｓｃ  Ｉで処理後、セルフライゲーションさせることでＧＦＰを欠失した塩基配列（MVAIK/RSV FG chimera）を得た。感染性ウイルスを回収するために必要なＡＩＫ−ＣのＮ，Ｐ，Ｌタンパク質発現プラスミド（ｐＡＩＫ−Ｎ，ｐＡＩＫ−Ｐ，ｐＡＩＫ−Ｌ）（非特許文献１２、１３、１８、１９）を使用した。これらのプラスミドでは、ｐＡＩＫ−Ｎ，ｐＡＩＫ−Ｐ，ｐＡＩＫ−ＬがＴ７  ＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒの下流に挿入してある。
【００７２】
Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現させる組換えワクシニアウイルスを２９３Ｔ細胞に感染させた。ｐＡＩＫ−Ｎ，ｐＡＩＫ−Ｐ，ｐＡＩＫ−Ｌのヘルパープラスミドと共に組換えＡＩＫ−Ｃのゲノム全長が挿入されたプラスミドを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１  Ｒｅａｇｅｎｔ(Mirus Bio Corporation, US)）と共に混和し、ワクシニアウイルスを感染させた２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを行った。混和後３時間後に上清を捨てて、５％胎児血清を含んだＭＥＭ培養液を加えた。
【００７３】
細胞にワクシニアウイルスが感染すると、細胞内でＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが発現してヘルパープラスミドのＴ７  プロモーターに結合し、麻疹ウイルスのＮタンパク質，Ｐタンパク質，及びＬタンパク質を発現させる。実施例３で作製した組換えＡＩＫ-Ｃのゲノムを含むプラスミドにＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎ−Ｐ−Ｌ複合体が結合し、ウイルスゲノム複製が始まる。
【００７４】
培養３日後に２９３Ｔ細胞を剥離した。新鮮Ｖｅｒｏ細胞と混合培養を行い、３日毎に培地交換を行った。ＡＩＫ−Ｃに特異的な細胞変性効果の有るものを回収し、組換えウイルス（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）を得た（図６）。
【００７５】
図７は、得られた組換えＡＩＫ−Ｃを模式的に説明する図である。図７の上部には、上から、変異型Ｆタンパク質の模式図、変異型Ｈタンパク質の模式図、及び、組換えＡＩＫ−Ｃのゲノムを含むプラスミドの模式図が記載されている。変異型Ｆタンパク質は、Ｎ末端側にRS/Nao/1998株のＦタンパク質のウイルス粒子の外側の領域を有し、Ｃ末端側にＡＩＫ-Ｃの膜貫通領域からＦタンパク質のウイルス粒子の内側の領域を有している。変異型Ｈタンパク質は、Ｎ末端側にＡＩＫ-ＣのＨタンパク質のウイルス粒子の内側から膜貫通領域の領域を有し、Ｃ末端側にRS/Ohta/1998株のＧタンパク質のウイルス粒子の外側の領域を有している。組換えＡＩＫ−Ｃのゲノムは、ＡＩＫ−ＣのＮタンパク質、Ｐタンパク質、Ｖタンパク質、Ｃタンパク質、Ｍタンパク質及びＬタンパク質の遺伝子と、変異型Ｆタンパク質及び変異型Ｈタンパク質の遺伝子と、ＧＦＰタンパク質の遺伝子と、を有する。図７中、下部左図は、ＡＩＫ−Ｃのウイルス粒子断面図及びＡＩＫ−Ｃのエンベロープの模式図であり、下部右図は、組換えＡＩＫ−Ｃのウイルス粒子断面図及び組換えＡＩＫ−Ｃのエンベロープの模式図である。ＡＩＫ−Ｃのエンベロープでは、Ｆタンパク質及びＨタンパク質がＭタンパク質にウイルス粒子の内側で結合している。組換えＡＩＫ−Ｃの変異型Ｆタンパク質及びＨタンパク質は、ＡＩＫ−ＣのＦタンパク質及びＨタンパク質のウイルス粒子の内側の領域を有している。このため、組換えＡＩＫ−Ｃも、変異型Ｆタンパク質及びＨタンパク質がＭタンパク質に結合する。
【００７６】
［実施例５］組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）の性状および増殖性の検討
実施例５では、組換えＡＩＫ−Ｃの性状及び増殖性を、ＭＶＡＩＫ及びＲＳＶ−Ｌｏｎｇと比較した。
【００７７】
麻疹ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞及びリンパ球系細胞のいずれの細胞にも感染し増殖することが知れられている。一方、ＲＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞やヒト気道上皮細胞のＡ５４９細胞には感染するが、リンパ球系の細胞には感染しないことが知られている。
【００７８】
Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞を、２４穴プレートに培養し、実施例４で回収した組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）、麻疹ワクチンＡＩＫ−Ｃ、及び、ＲＳＶであるＲＳＶ−Ｌｏｎｇを感染させ、１，３，５，７日後の培養上清を採取しＴＣＩＤ５０法により細胞への感染価を測定した。即ち、サンプル液を１０倍段階希釈し、各希釈液の一定量と、細胞の一定数を、９６穴の細胞培養プレートで培養し、５０％細胞感染を示すウイルス希釈倍数の逆数をＴＣＩＤ５０値とした。Ｖｅｒｏ細胞についての結果を図８の左図に示し、Ａ５４９細胞についての結果を図８の右図に示す。図８の横軸は培養後の日数を表し、縦軸はTCID50法によるウイルス感染価の測定値に基づく値を表す。
【００７９】
麻疹ウイルスＭＶＡＩＫは、Ｖｅｒｏ細胞にはＲＳＶ−Ｌｏｎｇと同様に感染し、培養５日後に増殖ピークが認められた。組換えＡＩＫ−Ｃは、麻疹ウイルスＭＶＡＩＫ及びＲＳＶ−Ｌｏｎｇよりも早期に増殖が認められた。
【００８０】
Ａ５４９細胞に対する感染価については、麻疹ウイルスＭＶＡＩＫは増殖しなかった。ＲＳＶ−Ｌｏｎｇは培養５日後に増殖のピークが認められた。組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）も感染が認められ、増殖パターンはＲＳＶ−Ｌｏｎｇと同様であった。
【００８１】
次に、Ｂ９５ａ細胞（マーモセットのＢリンパ球をＥＢＶでトランスフォーメーションした株化細胞）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトリンパ腫細胞）、Ｕ９３７細胞（ヒト単球株化細胞）に対するＭＶＡＩＫ及び組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）の感染価を調べた。リンパ球系細胞には麻疹ウイルスは感染するが、ＲＳＶは感染しないことが知られている。
【００８２】
Ｂ９５ａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｕ９３７細胞を２４穴プレートに培養し各ウイルスを接種し１，３，５，７日後の培養上清を採取し上記と同様に感染価を測定した。結果を図９に示す。図９の右図はＭＶＡＩＫについての結果を示し、左図は、組換えＡＩＫ−Ｃ及びＲＳＶ−Ｌｏｎｇについての結果を示す。各図の横軸は培養後の日数を表し、縦軸はTCID50法によるウイルス感染価の測定値に基づく値を表す。
【００８３】
ＭＶＡＩＫは、Ｂ９５ａ細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞ではよく増殖しているがＵ９３７細胞では５日後に増殖が認められたが７日後には減少した。一方、ＲＳＶ−Ｌｏｎｇ及び組換えＡＩＫ−Ｃは、いずれの細胞に対しても感染せずウイルス増殖は認められなかった。
【００８４】
［実施例６］上皮細胞系に対する細胞変性効果
実施例６では、組換えＡＩＫ−Ｃの上皮細胞系に対する細胞変性効果を、ＭＶＡＩＫ及びＲＳＶ−Ｌｏｎｇと比較した。
【００８５】
Ａ５４９細胞及びＶｅｒｏ細胞に感染させ、その細胞変性効果を観察した。細胞の顕微鏡撮影画像を図１０に示す。ＲＳＶ−Ｌｏｎｇを感染させたＡ５４９細胞及びＶｅｒｏ細胞には細胞変性効果が観察され、ＲＳＶ−ＬｏｎｇはＡ５４９細胞及びＶｅｒｏ細胞のいずれに対しても細胞融合効果が認められた。一方、ＭＶＡＩＫはＶｅｒｏ細胞に細胞融合を示し巨細胞を形成したが、Ａ５４９細胞に対する細胞変性効果は顕著ではなかった。組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）は、ＲＳＶ−Ｌｏｎｇと同様に、Ａ５４９細胞及びＶｅｒｏ細胞に感染し細胞変性効果を示した。
【００８６】
［実施例７］リンパ球系細胞に対する細胞変性効果
実施例７では、組換えＡＩＫ−Ｃのリンパ球系細胞に対する細胞変性効果を調べた。
【００８７】
リンパ球系細胞である、Ｂ９５ａ細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞，Ｕ９３７細胞に対する、組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）の細胞変性効果を検討した。細胞の顕微鏡撮影画像を図１１に示す。Ｂ９５ａ細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞、又はＵ９３７細胞にＭＶＡＩＫを感染させた場合、細胞融合が生じ、巨細胞が認められた。一方、ＲＳＶ−Ｌｏｎｇ及び組換えＡＩＫ−Ｃについては、どのリンパ球系細胞においても細胞変性効果が観察されなかった（図１１）。
【００８８】
［実施例８］Ａ５４９細胞感染時に発現するタンパク質の解析
実施例８では、組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）がＡ５４９細胞に感染した場合に発現するタンパク質を解析した。
【００８９】
まず、組換えＡＩＫ−Ｃ（Ｆ／Ｆ  Ｈ／Ｇ  ＭＶ  Ｐ/Ｍ  ＧＦＰ）をＡ５４９細胞に感染させた。そして、ＲＳＶのＧタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＨｙＴｅｓｔ；３ＲｅＳ２１）、ＲＳＶのＦタンパク質に対するモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ；ａｂ４３８１２）、麻疹ウイルスのＮタンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；ＮＢ１００−１８５６）、及び麻疹ウイルスのＨタンパク質に対するモノクローナル抗体（国立感染症研究所  ウイルス３部  佐藤先生から分与）を使用した。また、抗ＲＳＶポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ；ａｂ２０７４５）を用いた。各一次抗体を反応させて洗浄した後、二次抗体（Alexa Fluor(R) 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody; Molecular Probes）を反応させた。ＧＦＰの発現は、細胞を固定せずに観察した。
【００９０】
蛍光顕微鏡で撮影した画像を図１２に示す。Ｎタンパク質は二次抗体にローダミンでラベルした二次抗体（Alexa Fluor(R) 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody;Molecular Probes）を用いた。抗ＲＳＶポリクローナル抗体にはCF488A Donkey Anti-Goat IgG (H+L)を用いた。ＧＦＰと麻疹ウイルスのＮタンパク質は同じレベルで発現していた。また、ＲＳＶ−ＬｏｎｇのＧタンパク質及びＦタンパク質のウイルス粒子の外側の領域が発現していた。そして、ＡＩＫ−ＣのＨタンパク質に由来する領域は、組換えＡＩＫ−Ｃのウイルス粒子の外側に存在しなかった。
【００９１】
麻疹ウイルスはゲノムオーダーで発現量が少なくなることが知られておりＮタンパク質発現量が多く、ついでP/M junctionに挿入されたＧＦＰ、次いでＦタンパク質及び、Ｇタンパク質の順に発現量は減少する。組換えＡＩＫ−Ｃのタンパク質は、麻疹ウイルスの構成タンパク質の転写・翻訳の原則通りに発現していることが確認された。
（結果）
以上より、本発明の組換え麻疹ウイルスは、ウイルス粒子の外側にパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスのエンベロープ貫通型タンパク質のウイルス粒子の外側の領域を発現していれば、そのパラミクソウイルス科の麻疹ウイルス以外のウイルスと同様の細胞親和性を示し、麻疹ウイルスと同様の特徴を持って増殖することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染症の予防及び治療に有用である。また、パラミクソウイルス科のウイルスによる感染症の治療用薬の開発にも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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