(57)【要約】本発明は、細胞質への核酸送達に利用でき、脂質複合体における物理的安定性の課題を解決することが可能なカチオン性脂質を提供する。本発明のカチオン性脂質は、下記一般式（３）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であることを特徴とする。【化６６】2015105131.tif 000077 [式（３）中、Ｌが炭素数７〜１２のアルキル基、又は炭素数７〜１２のアルケニル基を表し、Ｒが炭素数１〜２のアルキル基を表す。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に１〜３の整数を表す。]
2015105131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（３）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であることを特徴とするカチオン性脂質。
【化５４】
2015105131.tif 000065
［前記一般式（３）中、Ｌは炭素数７〜１２のアルキル基、又は炭素数７〜１２のアルケニル基を表し、Ｒは炭素数１〜２のアルキル基を表す。ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に１〜３の整数である。］
【請求項２】
請求項１において、一般式（３）中、ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立に１〜２の整数であることを特徴とするカチオン性脂質。
【請求項３】
以下の化合物（４）〜（１１）から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１または２に記載のカチオン性脂質。
【化５５】
2015105131.tif 000066
【化５６】
2015105131.tif 000067
【化５７】
2015105131.tif 000068
【化５８】
2015105131.tif 000069
【化５９】
2015105131.tif 000070
【化６０】
2015105131.tif 000071
【化６１】
2015105131.tif 000072
【化６２】
2015105131.tif 000073
【請求項４】
下記式（４）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【化６３】
2015105131.tif 000074
【請求項５】
下記式（５）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【化６４】
2015105131.tif 000075
【請求項６】
下記式（１０）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【化６５】
2015105131.tif 000076
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカチオン性脂質に関する。
本願は、２０１４年１月９日に、米国に出願された仮出願６１／９２５，２６７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、または、ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド等の核酸は、生体内で配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する核酸であり、核酸医薬として知られている。
これら核酸医薬の中でも、特にｓｉＲＮＡが注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３塩基対からなる二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する。【０００３】
しかしながら、ｓｉＲＮＡは、化学的には安定であるが、血しょう中のＲＮａｓｅ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により分解されやすい点、及び、単独では細胞膜を透過しにくいという点で治療用用途としての問題点を有している（例えば、特許文献１）。【０００４】
かかる問題点に対して、カチオン性脂質を含有する微粒子内にｓｉＲＮＡを封入することにより、封入されたｓｉＲＮＡを血しょう中での分解から保護し、かつ、脂溶性の細胞膜への透過を可能とすることが知られており、このようなカチオン性脂質を含有する脂質粒子として、所定のカチオン性脂質を含有し、エクストルージョン法またはインライン混合法により調製した脂質製剤が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。    
特許文献１に記載の脂質製剤は、微粒子に核酸等高分子が封入されている核酸−脂質粒子組成物であり、核酸を細胞に導入できることが示されている。【０００５】
また、核酸医薬への利用が期待されるカチオン性脂質として様々な化合物が開発されている（例えば、特許文献２〜６、及び、非特許文献１参照。）が、非対称な構造を有するカチオン性脂質を含有するLipid nanoparticles(LNPs)は、保管期間中に粒子径が増大するという物理的安定性に課題があることが知られている（非特許文献２）。      【０００６】
かかる問題点に対して、非対称な構造を有するカチオン性脂質を含有するLNPsに、ある種のリン脂質を選択的に使用することで、粒子径の増大が抑制されたことが非特許文献２において示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５３００５９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０４０１８４号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０５９４９６号
【特許文献４】国際公開第２０１０／１４４７４０号
【特許文献５】米国公開第２０１３／０１７８５４１号
【特許文献６】米国特許第８１５８６０１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９-８５３３
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２０１４，３，  １１（１１），４１４３−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、最近の進展にもかかわらず、細胞質への核酸送達に利用でき、上記のような物理的安定性の課題を解決することが可能なカチオン性脂質は、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のカチオン性脂質は、下記一般式（１）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であることを特徴とする。【００１１】
【化１】
2015105131.tif 000003
【００１２】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアルキル基、又は炭素数４〜２４のアルケニル基を表し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に１〜３の整数であり、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基である。【００１３】
上記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素鎖の一部が縮合して形成されたシクロプロパンを１以上有していてもよい。【００１４】
上記一般式（１）中、Ｒ１は、炭素鎖の一部が縮合して形成されたシクロプロパンを１つ有してもよい。【００１５】
上記一般式（１）中、Ｒ１が、【００１６】
【化２】
2015105131.tif 000004
であり、Ｒ２が炭素数７〜１２のアルキル基、又は炭素数７〜１２のアルケニル基を表すＬ、Ｒ３が炭素数１〜２のアルキル基Ｒである本発明のカチオン性脂質は、下記一般式（３）で表される。【００１７】
【化３】
2015105131.tif 000005
【００１８】
本発明のカチオン性脂質は、一般式（３）中、ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立に１〜２の整数であってもよい。【００１９】
本発明のカチオン性脂質は、以下の化合物から選ばれる化合物又はその薬剤学的に許容される塩であってもよい。
１）
【化４】
2015105131.tif 000006
２）
【化５】
2015105131.tif 000007
３）
【化６】
2015105131.tif 000008
４）
【化７】
2015105131.tif 000009
５）
【化８】
2015105131.tif 000010
６）
【化９】
2015105131.tif 000011
７）
【化１０】
2015105131.tif 000012
８）
【化１１】
2015105131.tif 000013
【００２０】
本発明のカチオン性脂質は、下記式（４）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であってもよい。
【化１２】
2015105131.tif 000014
【００２１】
本発明のカチオン性脂質は、下記式（５）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であってもよい。
【化１３】
2015105131.tif 000015
【００２２】
本発明のカチオン性脂質は、下記式（１０）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であってもよい。
【化１４】
2015105131.tif 000016
【００２３】
本発明の組成物は、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有することを特徴とする。【００２４】
本発明の組成物は、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質とを含む極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程と、前記混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程と、を備える製造方法により製造することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のカチオン性脂質によれば、核酸を細胞質へ効率よく放出することを可能とする。また、本発明のカチオン性脂質によれば、上記のような物理的安定性の課題を解決することが可能となる。従って、本発明のカチオン性脂質は、細胞質への核酸送達用の脂質としての利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例２０及び比較例１の組成物の平均粒子径の経時変化を示す。
【図２】実施例２１〜２５及び比較例２の組成物の保管前後の平均粒子径変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
≪カチオン性脂質≫
一実施形態において、本発明は、下記一般式（１）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩であるカチオン性脂質を提供する。カチオン性脂質は、前記塩の水和物又は前記塩の溶媒和物であってもよい。
【００２８】
【化１５】
2015105131.tif 000017
【００２９】
一般式（１）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に炭素数４〜２４のアルキル基、又は炭素数４〜２４のアルケニル基を表し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に１〜３の整数であり、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基である。
【００３０】
一般式（１）中、Ｒ１は炭素鎖の一部が縮合して形成されたシクロプロパンを１以上有してもよく、シクロプロパンを１つ有していてもよい。
上記一般式（１）中、Ｒ１が、
【００３１】
【化１６】
2015105131.tif 000018
で表され、Ｒ２が炭素数７〜１２のアルキル基、又は炭素数７〜１２のアルケニル基を表すＬ、Ｒ３が炭素数１〜２のアルキル基Ｒである本発明のカチオン性脂質は、下記一般式（３）で表される。
【００３２】
【化１７】
2015105131.tif 000019
【００３３】
本発明のカチオン性脂質は、一般式（３）中、ｎ１及びｎ２がそれぞれ独立に１〜２の整数であってもよい。
【００３４】
本発明において、カチオン性脂質とは、下記式で表されるような一つ以上の炭化水素基を含む脂質親和性領域Ｘと、生理的ｐＨでプロトン化する極性基を含む親水性領域Ｚを有する両親媒性分子である。尚、本発明のカチオン性脂質は、脂質親和性領域と親水性領域の間にリンカー領域Ｙがあってもよい。
【００３５】
【化１８】
2015105131.tif 000020
【００３６】
本明細書において、「アルキル」とは、指定された数の炭素原子を有する直鎖状、環状または分岐状の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。
【００３７】
本明細書において、「アルケニル」とは、指定された数の炭素数を有する直鎖状、環状または分岐状の不飽和脂肪族炭化水素基を意味し、例えば、ジエン、トリエン及びテトラエンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
上記環状「アルキル」または環状「アルケニル」としては、例えば、炭素鎖の一部が縮合して形成されたシクロプロパンやシクロブタンなどの環を１以上有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。    
【００３９】
前記一般式（３）で表される化合物として、以下の化合物が挙げられる。
【００４０】
【化１９】
2015105131.tif 000021
【００４１】
【化２０】
2015105131.tif 000022
【００４２】
【化２１】
2015105131.tif 000023
【００４３】
【化２２】
2015105131.tif 000024
【００４４】
【化２３】
2015105131.tif 000025
【００４５】
【化２４】
2015105131.tif 000026
【００４６】
【化２５】
2015105131.tif 000027
【００４７】
【化２６】
2015105131.tif 000028
【００４８】
本発明のカチオン性脂質は、前記一般式（１）で表される化合物又はその薬剤学的に許容される塩である。即ち、本発明のカチオン性脂質は、プロトン化し、下記一般式（１’）で表される陽イオンを含有し得る。
【００４９】
【化２７】
2015105131.tif 000029
【００５０】
［一般式（１’）中、Ｒ１〜Ｒ３、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記一般式（１）におけるものと同じ意味を表す。]
前記一般式（１’）で表される陽イオンと対になって、本発明のカチオン性脂質が含有し得る陰イオンとしては、薬剤学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン；酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
【００５１】
≪カチオン性脂質の製造方法≫
本発明のカチオン性脂質の製造方法について説明する。下記式（１２）および（１３）に、カチオン性脂質の合成スキームの一実施形態を示す。
【００５２】
【化２８】
2015105131.tif 000030
【００５３】
一般式中、Ｒ４は下記一般式（１４）で表される。
【００５４】
【化２９】
2015105131.tif 000031
【００５５】
一般式中、Ｒ３、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記一般式（１）におけるものと同じ意味を表す。
一般式中、aおよびｂはそれぞれ０以上かつaとｂの和が１７以下となる整数を表す。
【００５６】
新規カチオン性脂質（１−５）の合成は、例えば合成スキーム１に従って合成できる。化合物（１−１）に対してＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンを縮合することで、ワインレブアミド（１−２）が得られる。グリニャール試薬を加えることでケトン（１−３）が得られる。さらに水素化リチウムアルミニウムで還元することでアルコール（１−４）が得られる。これをカルボン酸と縮合することでエステル（１−５）が得られる。
シクロプロピルを含む新規カチオン性脂質（１−１０）の合成は、例えば合成スキーム２に従って合成できる。不飽和のワインレブアミド（１−６）をシモンズスミスシクロプロパン化によりシクロプロピルを含むワインレブアミド（１−７）が得られる。グリニャール試薬を加えることでケトン（１−８）が得られる。さらに水素化リチウムアルミニウムで還元することでアルコール（１−９）が得られる。これをカルボン酸と縮合することでエステル（１−１０）が得られる。
【００５７】
≪組成物≫
一実施形態において、本発明は、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、（ＩＩＩ）核酸と、を含有する組成物を提供する。
以下、本発明の組成物の好ましい実施形態について説明するが、この実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００５８】
本実施形態の組成物における脂質組成は、本発明のカチオン性脂質を１０モル％〜１００モル％含有することが好ましく、２０モル％〜９０モル％含有することがより好ましく、４０モル％〜７０モル％含有することが特に好ましい。
【００５９】
本実施形態の組成物における核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ発現ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が挙げられ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが好ましい。
本実施形態の組成物は、核酸を０．０１重量％〜５０重量％含有することが好ましく、０．１重量％〜３０重量％含有することがより好ましく、１重量％〜１０重量％含有することが特に好ましい。
【００６０】
本実施形態の組成物における脂質組成は、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質と、を含有する。
【００６１】
中性脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジリグノセロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、セラミド、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）等が挙げられる。
【００６２】
本実施形態の組成物における脂質組成は、中性脂質を０モル％〜５０モル％含有することが好ましく、０モル％〜４０モル％含有することがより好ましく、０モル％〜３０モル％含有することが特に好ましい。
【００６３】
ポリエチレングリコール修飾脂質としては、ＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（ＰＥＧ２０００−ジミリスチルグリセロール、ＰＥＧ２０００−ＤＰＧ（ＰＥＧ２０００−ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ２０００−ＤＳＧ（ＰＥＧ２０００−ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００−ＤＭＧ（ＰＥＧ５０００−ジミリスチルグリセロール、ＰＥＧ５０００−ＤＰＧ（ＰＥＧ５０００−ジパルミトイルグリセロール）、ＰＥＧ５０００−ＤＳＧ（ＰＥＧ５０００−ジステアロイルグリセロール）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン）、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）等が挙げられる。
【００６４】
ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピルとしては、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル等が挙げられる。
【００６５】
本実施形態の組成物における脂質組成は、ポリエチレングリコール修飾脂質を０モル％〜３０モル％含有することが好ましく、０モル％〜２０モル％含有することがより好ましく、０モル％〜１０モル％含有することが特に好ましい。
【００６６】
ステロールとしては、コレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β−[Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル]コレステロール(ＤＣ−Ｃｈｏｌ)等が挙げられる。
【００６７】
本実施形態の組成物における脂質組成は、ステロールを０モル％〜９０モル％含有することが好ましく、１０モル％〜８０モル％含有することがより好ましく、２０モル％〜５０モル％含有することが特に好ましい。
【００６８】
本実施形態の組成物における脂質組成の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、本発明のカチオン性脂質、中性脂質、及びステロールの組み合わせ、又は、本発明のカチオン性脂質、中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールの組み合わせが好ましい。
【００６９】
本実施形態の組成物は、その他、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、乳糖等の糖；グルタミン、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸；クエン酸、リン酸、酢酸、乳酸、炭酸、酒石酸等の酸の塩等を含有してもよい。
【００７０】
本実施形態の組成物は、医薬組成物として製剤化されていてもよい。医薬組成物の剤型としては、例えば注射剤が挙げられる。
【００７１】
本実施形態の組成物は、例えば、凍結乾燥等により溶媒を除去した粉末状態であってもよく、液体状態であってもよい。組成物が粉末状態である場合には、使用前に薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。組成物が液体状態である場合には、そのままで又は薬学的に許容される媒体に懸濁又は溶解させて注射剤として用いることができる。
【００７２】
薬学的に許容される媒体としては、滅菌水；生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられる。本実施形態の組成物は、更に、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール等の溶解補助剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加剤を含有していてもよい。
【００７３】
本実施形態の組成物は、カチオン性脂質を含有する脂質で構成された微粒子内に核酸が封入された脂質複合体を形成している。脂質複合体の「平均粒子径」は、体積平均、数平均、Ｚ−平均のいずれかの方法で算出することができる。本実施形態の組成物において、脂質複合体の平均粒子径（Ｚ−平均）は、例えば、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであるものが好ましく、３０ｎｍ〜５００ｎｍであるものがより好ましく、３０ｎｍ〜２００ｎｍであるものが特に好ましい。
【００７４】
本実施形態の組成物は、保管期間中、粒子径が保管前と比べて極力増大しないものが好ましい。例えば、４℃で６ヶ月保管した場合の粒子径の大きさが保管前の粒子径の大きさに対して１．６倍以下であるものが好ましく、１．３倍以下であるものがより好ましく、１．２倍以下であるものが特に好ましい。
【００７５】
本実施形態の組成物は、非特異的な吸着や免疫反応が起こり難くするため、約ｐＨ７．４の環境下において（例えば、血液中）、その表面の荷電がほとんどないものが好ましい。また、本実施形態の組成物は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる際、エンドソーム膜と融合しやすくするため、低ｐＨ環境下で正に帯電するものが好ましい。
【００７６】
≪組成物の製造方法≫
一実施形態において、本発明は、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質とを含有する極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る工程（ａ）と、前記混合液中の極性有機溶媒の含有量を減少させる工程（ｂ）とを備える、組成物の製造方法を提供する。
以下、本発明の組成物の製造方法の好ましい実施形態について説明するが、この実施形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００７７】
水溶性の核酸と上述したカチオン性脂質との静電的相互作用、及び脂質間の疎水的相互作用により、脂質で構成された微粒子内に核酸が封入された脂質複合体を形成することができる。例えば、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質、及びステロールからなる群から選ばれる少なくとも一種の脂質を含む脂質成分の、極性有機溶媒含有水溶液に対する溶解度を変化させることにより、脂質複合体を形成させることができる。極性有機溶媒としては、エタノール等のアルコールが挙げられる。
【００７８】
まず、工程（ａ）において、（Ｉ）本発明のカチオン性脂質と、（ＩＩ）中性脂質、ポリエチレングリコール修飾脂質及びステロールからなる群より選択される少なくとも一種の脂質とを溶解させた、極性有機溶媒含有水溶液と、（ＩＩＩ）核酸を含有する水溶液とを混合して混合液を得る。極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の濃度は、核酸の水溶液と混合後も、脂質分子が溶解する条件を満たしていれば特に限定されない。
【００７９】
続いて、工程（ｂ）において、上記の混合液に水等を添加することにより、極性有機溶媒の含有量を減少させる。これにより、脂質複合体を形成させることができる。脂質複合体を効率よく形成させるためには、極性有機溶媒の含有量を急激に低下させることが好ましい。  
【００８０】
本実施形態の組成物の製造方法によれば、核酸が効率よく微粒子内部に封入された脂質複合体を得ることができる。
【００８１】
組成物に封入される核酸が核酸医薬である場合には、医薬組成物として利用することができる。      
【実施例】
【００８２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例中の化合物名は、Ｍａｒｖｉｎ  Ｓｋｅｔｃｈ  ｖｅｒ．  ５．４（ＣｈｅｍＡｘｉｏｎ）を用いて命名した。【００８３】
＜カチオン性脂質の合成＞
[実施例１] １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン-8-イル１−メチルピペリジン−４−カルボキシレート （１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（以下、「カチオン性脂質１」という。）の合成
前記合成スキーム１または２に従って、カチオン性脂質１を合成した。
第１工程：
オレイン酸（７５．０ｇ、２６５．５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５３１．０ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（１０１．８ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５３．７４ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（５１．８ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。得られた組成生物１（８８．９２ｇ）は精製を行わずに次のステップへ用いた。
第２工程：
ジエチル亜鉛（７６４．９ｍＬ、７６４．９ｍｍｏｌ［１Ｍ溶液］）を塩化メチレン（１４１６．５ｍＬ）に溶かし、０℃まで冷却した。その溶液にＴＦＡ（８７．２ｇ、７６４．９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。昇温があったため再度０℃まで冷却した後にジヨードメタン（２０４．９ｇ、７６４．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃のまま３０分撹拌した。この溶液に粗生成物１（８３．０ｇ、２５５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温まで昇温し１時間撹拌した。反応終了を確認した後に反応を塩化アンモニウム（３００ｍＬ）でクエンチした。分液して得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物２（７３．０ｇ）を得た。
第３工程：
化合物２（１７．０ｇ、５０．０７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、１Ｍのノニルマグネシウムブロミド（１００ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下室温で滴下した。１時間撹拌し、反応の終了を確認した後に十分量の塩化アンモニウム水溶液を加えて反応をクエンチした。反応溶液を水洗し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物３（１１．７ｇ）を得た。
第４工程：
得られた化合物３（２５．０ｇ、６１．５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１２３ｍＬ）に溶かした溶液中に、水素化リチウムアルミニウム（２．３  ｇ、６１．４７ｍｍｏｌ）を添加し、一時間加熱還流した。反応終了を確認した後に、反応系中に水（２．３ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（２．３ｍＬ）、水（６．９ｍＬ）の順にゆっくり加え反応をクエンチした。この溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物４を得た。
第５工程：
得られた化合物（０．５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．９ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（０．４７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．０３ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、１−メチルピペリジン−４−カルボン酸（０．３５ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、下記式（４）で表されるカチオン性脂質１  （０．２ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を得た。【００８４】
【化３０】
2015105131.tif 000032
【００８５】
得られた化合物を以下の条件でＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳにより確認した。カラム：ＹＭＣ−ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０−４．６ｍｍ、５μｍ、溶離液：ＭｅＯＨ（均一溶媒）、流速：１．０ｍＬ／分、ランタイム：１５分、カラム温度：４５℃、検出：ＵＶ（２１５ｎｍ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）。【００８６】
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ  １１．３分、ＥＳＩ−ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５３３．５、ｆｏｕｎｄ  ５３４．６、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．８７（１Ｈ，ｑ）、２．８１（２Ｈ，ｄ）、２．２６（３Ｈ，ｓ）、２．２３（１Ｈ，ｍ）、１．９８（２Ｈ，ｔ）、１．９３（２Ｈ，ｄ）、１．８０（２Ｈ，ｍ）、１．５０（４Ｈ，ｍ）、１．３７（６Ｈ，ｍ）、１．２７（３２Ｈ，ｍ）、１．１３（２Ｈ，ｓ）、０．８７（６Ｈ，ｄｄ）、０．６４（２Ｈ，ｄｄ）、０．５５（１Ｈ，ｍ）、−０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００８７】
[実施例２〜９、参考例１〜４]
実施例１と同様にして、下記のカチオン性脂質２〜１３を合成した。【００８８】
[実施例２]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル１−メチルピロリジン−３−カルボキシレート  （１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）  （カチオン性脂質２）【００８９】
【化３１】
2015105131.tif 000033
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １１．０  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５１９．５，  ｆｏｕｎｄ  ５２０．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ４．８５（１Ｈ，ｄｄｄ），  ３．０３（１Ｈ，ｔ），  ２．８７（１Ｈ，ｔ），  ２．６４（１Ｈ，ｄｄ），  ２．５９（１Ｈ，ｄｄ），  ２．４７（１Ｈ，ｄ），  ２．３５（３Ｈ，ｓ），  ２．０９（２ｈ，ｄｄｄ），  １．５０（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３７Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００９０】
[実施例３]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル１−エチルピロリジン−４−カルボキシレート  （１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質３）【００９１】
【化３２】
2015105131.tif 000034
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １２．１  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５４７．５，  ｆｏｕｎｄ  ５４８．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８８（１Ｈ，ｄｄｄ），  ２．９０（２Ｈ，ｄ），  ２．４９（２Ｈ，ｄｄ），  ２．２７（１Ｈ，ｍ），  １．９８（４Ｈ，ｍ），  １．７８（２Ｈ，ｍ），    １．４９（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３７Ｈ，ｍ），  １．１２（６Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００９２】
[実施例４]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル１−メチルアゼチジン−３−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌａｚｅｔｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質４）【００９３】
【化３３】
2015105131.tif 000035
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ９．６５  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５０５．５，  ｆｏｕｎｄ  ５０６．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８８（１Ｈ，ｄ），  ３．５６（２Ｈ，ｍ），  ３．２６（３Ｈ，ｍ），  ２．３１（３Ｈ，ｓ），  １．７６（１Ｈ，ｍ），  １．５１（４Ｈ，ｍ），    １．３６−１．２５（３６Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００９４】
[実施例５]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ペンタデカン−８−イル１−メチルピペリジン−４−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｅｎｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質５）【００９５】
【化３４】
2015105131.tif 000036
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １１．５  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５０５．５，  ｆｏｕｎｄ  ５０６．７，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｄ），  ２．８１（２Ｈ，ｄ），  ２．３３（３Ｈ，ｓ），  ２．２５（１Ｈ，ｍ），  ２．０１（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．９０（２Ｈ，ｄｄ），  １．７９（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．７２（１Ｈ，ｍ），  １．５０（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３２Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００９６】
[実施例６]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘキサデカン−８−イル１−メチルピペリジン−４−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｘａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質６）【００９７】
【化３５】
2015105131.tif 000037
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １３．１  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５１９．５，  ｆｏｕｎｄ  ５２０．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｄ），  ２．８１（２Ｈ，ｄ），  ２．３３（３Ｈ，ｓ），  ２．２５（１Ｈ，ｍ），  ２．０１（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．９０（２Ｈ，ｄｄ），  １．７９（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．７２（１Ｈ，ｍ），  １．５０（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３４Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【００９８】
[実施例７]  １−（２−オクチルシクロプロピル）オクタデカン−８−イル１−メチルピペリジン−４−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｏｃｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質７）【００９９】
【化３６】
2015105131.tif 000038
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １７．１  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５４７．５，  ｆｏｕｎｄ  ５４８．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｄ），  ２．８１（２Ｈ，ｄ），  ２．３３（３Ｈ，ｓ），  ２．２５（１Ｈ，ｍ），  ２．０１（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．９０（２Ｈ，ｄｄ），  １．７９（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．７２（１Ｈ，ｍ），  １．５０（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３８Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１００】
[実施例８]  １−（２−オクチルシクロプロピル）イコサン−８−イル１−メチルピペリジン−４−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｉｃｏｓａｎ−８−ｙｌ  １−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質８）【０１０１】
【化３７】
2015105131.tif 000039
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ２２．６  ｍｉｎ，    ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）    ｃａｃｌｄ  ５７５．５，  ｆｏｕｎｄ  ５７６．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｄ），  ２．８１（２Ｈ，ｄ），  ２．３３（３Ｈ，ｓ），  ２．２５（１Ｈ，ｍ），  ２．０１（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．９０（２Ｈ，ｄｄ），  １．７９（２Ｈ，ｄｄｄ），  １．７２（１Ｈ，ｍ），  １．５０（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（４２Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１０２】
[実施例９]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカ−８−イル１−エチルピロリジン−３−カルボキシレート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  １−ｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（カチオン性脂質９）【０１０３】
【化３８】
2015105131.tif 000040
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １１．９  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５３３．５，  ｆｏｕｎｄ  ５３４．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８６（１Ｈ，ｄｄｄ），  ３．００（２Ｈ，ｍ），  ２．７３（１Ｈ，ｄｄ），  ２．５４（２Ｈ，ｄｄ），  ２．４７（２Ｈ，ｄｄｄ），  ２．０８（２Ｈ，ｍ），  １．５０（５Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２５（３６Ｈ，ｍ），  １．１２（６Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１０４】
[参考例１]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル３−（ジメチルアミノ）プロパノエート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  ３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）（カチオン性脂質１０）【０１０５】
【化３９】
2015105131.tif 000041
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １０．４  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５０７．５，  ｆｏｕｎｄ  ５０８．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８８（１Ｈ，ｑ），  ２．６１（２Ｈ，ｄｄ），  ２．４５（２Ｈ，ｄｄ），  ２．２４（６Ｈ，ｓ），  １．５１（４Ｈ，ｍ），  １．３４（６Ｈ，ｍ），  １．２７（３２Ｈ，ｍ），    １．１３（２Ｈ，ｍ），  ０．８８（６Ｈ，ｍ），  ０．６４（２Ｈ，ｍ），  ０．５６（１Ｈ，ｄｄ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１０６】
[参考例２]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  ４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔａｎｏａｔｅ）（カチオン性脂質１１）【０１０７】
【化４０】
2015105131.tif 000042
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １０．５  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５２１．５，  ｆｏｕｎｄ  ５２２．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｑ），  ２．３１（４Ｈ，ｍ），  ２．２１（６Ｈ，ｓ），  ２．１７（１Ｈ，ｓ），  １．８０（２Ｈ，ｍ），  １．６１（１Ｈ，ｓ），  １．５０（２Ｈ，ｄ），    １．３７（６Ｈ，ｍ），  １．２７（３２Ｈ，ｍ），  １．１４（２Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｄｄ），  ０．６４（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１０８】
[参考例３]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル３−（ジメチルアミノ）−２−メチルプロパノエート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  ３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）（カチオン性脂質１２）【０１０９】
【化４１】
2015105131.tif 000043
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １２．５  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５２１．５，  ｆｏｕｎｄ  ５２２．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｑ），  ２．６６（２Ｈ，ｔ），  ２．２２（６Ｈ，ｓ），  １．５１（４Ｈ，ｍ），  １．３６−１．２７（３８Ｈ，ｍ），  １．１５（６Ｈ，ｍ），  ０．８８（６Ｈ，ｄｄ），  ０．６４（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１１０】
[参考例４]  １−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル３−（ピペリジ−１−イル）プロパノエート（１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ  ３−（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）（カチオン性脂質１３）【０１１１】
【化４２】
2015105131.tif 000044
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  １４．１  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５４７．５，  ｆｏｕｎｄ  ５４８．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ４．８７（１Ｈ，ｑ），  ３．５９（２Ｈ，ｍ），  ２．６６（２Ｈ，ｔ），  ２．４８（２Ｈ，ｔ），  ２．３９（２Ｈ，ｍ），  １．５８（４Ｈ，ｍ），  １．４９（４Ｈ，ｍ），  １．４３−１．２７（３８Ｈ，ｍ），  １．１３（４Ｈ，ｍ），  ０．８８（６Ｈ，ｄｄ），  ０．６４（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１１２】
［参考例５］２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ（以下、「カチオン性脂質１４」という。）の合成
下記合成スキーム３または４に従って、カチオン性脂質１４を合成した。【０１１３】
【化４３】
2015105131.tif 000045
【０１１４】
第１工程：
オレイン酸（７５．０ｇ、２６５．５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５３１．０ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（１０１．８ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５３．７４ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（５１．８ｇ、５３１．０５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。得られた粗生成物１（８８．９２ｇ）は精製を行わずに次のステップへ用いた。【０１１５】
第２工程：
ジエチル亜鉛（７６４．９ｍＬ、７６４．９ｍｍｏｌ  ［１Ｍ溶液］）を塩化メチレン（１４１６．５ｍＬ）に溶かし、０℃まで冷却した。その溶液にＴＦＡ（８７．２ｇ、７６４．９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。昇温があったため再度０℃まで冷却した後にジヨードメタン（２０４．９ｇ、７６４．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃のまま３０分撹拌した。この溶液に粗生成物１（８３．０ｇ、２５５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温まで昇温し１時間撹拌した。反応終了を確認した後に反応を塩化アンモニウム（３００ｍＬ）でクエンチした。分液して得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物２（７３．０ｇ）を得た。【０１１６】
第３工程：
化合物２（１７．０ｇ、５０．０７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、１Ｍのノニルマグネシウムブロミド（１００ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下室温で滴下した。１時間撹拌し、反応の終了を確認した後に十分量の塩化アンモニウム水溶液を加えて反応をクエンチした。反応溶液を水洗し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物３（１１．７ｇ）を得た。【０１１７】
第４工程：
得られた化合物３（１１．０ｇ、２７．０ｍｍｏｌ）をエタノール（１０８ｍＬ）に溶かした溶液中に、ヒドロキシアミン塩酸塩（２．４ｇ、３５．１ｍｍｏｌ）、ピリジン（１８．０ｍＬ）を添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルで抽出、水洗し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物４（１０．８ｇ）を得た。【０１１８】
第５工程：
得られた化合物４（１０．０ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２３７ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却した。その溶液に水素化リチウムアルミニウム（０．９ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）を添加し、１時間加熱還流した。反応終了を確認した後に、反応系中に水（０．９ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（２．７ｍＬ）の順にゆっくり加え反応をクエンチした。この溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物５（５．５ｇ）を得た。【０１１９】
第６工程：
得られた化合物（０．５ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．９ｍＬ）に溶かした溶液中に、ＷＳＣ（０．４７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２５ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルグリシン（０．２５ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で翌日まで撹拌した後、水を加え、有機層を分液した。有機層を水で５回洗浄後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１度洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤をろ過で除き、ろ液を減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、下記式（２０）で表されるカチオン性脂質１４（０．４ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を得た。【０１２０】
【化４４】
2015105131.tif 000046
【０１２１】
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ、Ｒｔ  ６．９１分、ＥＳＩ−ＭＳ  （Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ４９２．５、ｆｏｕｎｄ  ４９３．６、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ６．８４（１Ｈ，ｄ）、３．８８（１Ｈ，ｄｄ）、２．９３（２Ｈ，ｓ）、２．２９（６Ｈ，ｓ）、１．６４（１Ｈ，ｍ）、１．４９（２Ｈ，ｍ）、１．２７（３９Ｈ，ｍ）、０．８９（２Ｈ，ｍ）、０．８８（６Ｈ，ｍ）、０．６４（２Ｈ，ｍ）、０．５６（１Ｈ，ｄｄ）、−０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１２２】
[参考例６〜１３]
参考例５と同様にして、前記合成スキーム３または４に従って下記のカチオン性脂質１５〜２２を合成した。【０１２３】
[参考例６]  ３−（ジメチルアミノ）―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  プロパンアミド（３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質１５）【０１２４】
【化４５】
2015105131.tif 000047
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ７．１０  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５０６．５，  ｆｏｕｎｄ  ５０７．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ６．８４（１Ｈ，ｄ），  ３．８８（１Ｈ，ｄｄ），  ２．９３（２Ｈ，ｓ），  ２．２９（６Ｈ，ｓ），  １．６４（１Ｈ，ｍ），  １．４９（２Ｈ，ｍ），  １．２７（４１Ｈ，ｍ），  ０．８９（２Ｈ，ｍ），  ０．８８（６Ｈ，ｍ），  ０．６４（２Ｈ，ｍ），  ０．５６（１Ｈ，ｄｄ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１２５】
[参考例７]  ４−（ジメチルアミノ）―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  ブタンアミド（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｂｕｔａｎａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質１６）【０１２６】
【化４６】
2015105131.tif 000048
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ７．２０  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５２０．５，  ｆｏｕｎｄ  ５２１．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ６．０６（１Ｈ，ｄ），  ３．８８（１Ｈ，ｄｄ），  ２．２８（４Ｈ，ｍ），  ２．２１（６Ｈ，ｓ），  １．７８（２Ｈ，ｑ），  １．６４（４Ｈ，ｓ），  １．２７（４０Ｈ，ｍ），    ０．８８（６Ｈ，ｍ），  ０．６４（２Ｈ，ｍ），  ０．５６（１Ｈ，ｄｄ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１２７】
[参考例８]  ２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［（２０Ｚ、２３Ｚ）−ヘプタコサ−２０，２３―ジエン−１０−イル］アセトアミド（２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−［（２０Ｚ，２３Ｚ）−ｈｅｐｔａｃｏｓａ−２０，２３−ｄｉｅｎ−１０−ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質１７）【０１２８】
【化４７】
2015105131.tif 000049
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ６．５０  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ４７６．５，  ｆｏｕｎｄ  ４７７．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ６．８４（１Ｈ，ｄ），  ５．３５（４Ｈ，ｍ），  ３．８８（１Ｈ，ｄｄ），  ２．９３（２Ｈ，ｓ），  ２．７７（２Ｈ，ｔ），  ２．２９（６Ｈ，ｓ），  ２．１７（２Ｈ，ｓ），  ２．０５（４Ｈ，ｍ），  １．６３（４Ｈ，ｍ），  １．３６（３Ｈ，ｔ），  １．２５（２５Ｈ，ｍ），  ０．８８（６Ｈ，ｄｄ）【０１２９】
[参考例９]  ２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−［（１８Ｚ）−ヘプタコサ−１８―エン−１０−イル］アセトアミド（２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−Ｎ−［（１８Ｚ）−ｈｅｐｔａｃｏｓ−１８−ｅｎ−１０−ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質１８）【０１３０】
【化４８】
2015105131.tif 000050
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ７．９８  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ４７８．５，  ｆｏｕｎｄ  ４７９．５，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ６．８３（１Ｈ，ｄ），  ５．３６（２Ｈ，ｍ），  ３．８８（２Ｈ，ｍ），  ３．７４（１Ｈ，ｔ），  ２．９３（２Ｈ，ｓ），  ２．２８（２Ｈ，ｍ），  ２．１７（２Ｈ，ｓ），  ２．００（３Ｈ，ｍ），  １．８５（１Ｈ，ｍ），  １．５０（３Ｈ，ｍ），  １．２５（３７Ｈ，ｍ），  ０．８６（６Ｈ，ｄｄ）【０１３１】
[参考例１０]  １−メチル―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  ピロリジン−２−カルボキサミド（１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質１９）【０１３２】
【化４９】
2015105131.tif 000051
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ８．１４  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５１８．５，  ｆｏｕｎｄ  ５１９．７，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ６．９９（１Ｈ，ｄ），  ３．８５（１Ｈ，ｍ），  ３．０７（１Ｈ，ｍ），  ２．８５（１Ｈ，ｍ），  ２．３５（３Ｈ，ｓ），  ２．３３（２Ｈ，ｍ），  ２．２３（１Ｈ，ｍ），  １．７６（４Ｈ，ｍ），  １．４７（４Ｈ，ｍ），  １．２６−１．２５（３５Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１３３】
[参考例１１]  １−エチル―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  ピロリジン−２−カルボキサミド（１−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質２０）【０１３４】
【化５０】
2015105131.tif 000052
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ８．９５  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５３２．５，  ｆｏｕｎｄ  ５３３．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ７．１７（１Ｈ，ｄ），  ３．８４（１Ｈ，ｍ），  ３．１６（１Ｈ，ｔ），  ３．００（１Ｈ，ｄｄ），  ２．６４（１Ｈ，ｄｄｄ），  ２．４７（１Ｈ，ｄｄｄ），  ２．２７（１Ｈ，ｄｄｄ），  ２．１５（１Ｈ，ｄｄｄ），  １．７６（４Ｈ，ｍ），  １．４７（２Ｈ，ｍ），  １．２６−１．２５（３７Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  １．０６（４Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１３５】
[参考例１２]  １−メチル―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  ピペリジン−２−カルボキサミド（１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質２１）【０１３６】
【化５１】
2015105131.tif 000053
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ７．４３  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５３２．５，  ｆｏｕｎｄ  ５３３．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ６．２８（１Ｈ，ｄ），  ３．８８（１Ｈ，ｍ），  ２．８９（１Ｈ，ｄ），  ２．４２（１Ｈ，ｄｄ），  ２．２１（３Ｈ，ｓ），  ２．００（２Ｈ，ｍ），  １．７２（２Ｈ，ｍ），  １．４９（４Ｈ，ｍ），  １．２６−１．２５（４０Ｈ，ｍ），  １．１２（３Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１３７】
[参考例１３]  １−エチル―Ｎ−［１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル］  ピペリジン−２−カルボキサミド（１−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−［１−（２−ｏｃｔｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｈｅｐｔａｄｅｃａｎ−８−ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）（カチオン性脂質２２）【０１３８】
【化５２】
2015105131.tif 000054
ＨＰＬＣ−ＬＣ／ＭＳ，  Ｒｔ  ８．０３  ｍｉｎ，  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  ｃａｃｌｄ  ５４６．６，  ｆｏｕｎｄ  ５４７．６，  １Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ３．８８（１Ｈ，ｍ），  ２．８９（１Ｈ，ｍ），  ２．８５（１Ｈ，ｍ），  ２．４８（３Ｈ，ｓ），  １．８９（１Ｈ，ｍ），  １．７６（２Ｈ，ｍ），  １．６３（２Ｈ，ｍ），  １．４７（２Ｈ，ｍ），  １．２６−１．２５（４１Ｈ，ｍ），  １．１２（６Ｈ，ｍ），  ０．８７（６Ｈ，ｍ），  ０．６２（２Ｈ，ｄｄ），  ０．５５（１Ｈ，ｍ），  −０．３４（１Ｈ，ｄｄ）【０１３９】
＜組成物の調製（１）＞
［実施例１０］
実施例１のカチオン性脂質１を用いて組成物を調製した。核酸としては、センス鎖５’−ＧＧＡｆＵｆＣＡｆＵｆＣｆＵｆＣＡＡＧｆＵｆＣｆＵｆＵＡｆＣＴ＊Ｔ−３’（配列番号１、Ｔ：ＤＮＡ、ｆＵ，ｆＣ＝２’−Ｆｌｕｏｒｏ  ＲＮＡ、＊＝Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）、アンチセンス鎖５’−ＧｆＵＡＡＧＡｆＣｆＵｆＵＧＡＧＡｆＵＧＡｆＵｆＣｆＣＴ＊Ｔ−３’（配列番号２、Ｔ：ＤＮＡ、ｆＵ，ｆＣ＝２’−Ｆｌｕｏｒｏ  ＲＮＡ、＊＝Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）の塩基配列からなる、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ（血液凝固第ＶＩＩ因子）遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであり、アニーリング済みのもの（株式会社ジーンデザイン、以下「Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ」という場合がある。）を使用した。    【０１４０】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で２１６μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質１、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８．５／３０／１．５（モル比）の割合で総脂質濃度１５ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．４ｍＬ／分、１．２９ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を９．２５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例１０の組成物を得た。【０１４１】
［実施例１１］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例４のカチオン性脂質４を用いた以外は実施例１０と同様にして、実施例１１の組成物を得た。【０１４２】
［実施例１２］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例５のカチオン性脂質５を用いた以外は実施例１０と同様にして、実施例１２の組成物を得た。【０１４３】
［実施例１３］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例６のカチオン性脂質６を用いた以外は実施例１０と同様にして、実施例１３の組成物を得た。【０１４４】
［実施例１４］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例７のカチオン性脂質７を用いた以外は実施例１０と同様にして、実施例１４の組成物を得た。【０１４５】
［実施例１５］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例８のカチオン性脂質８を用いた以外は実施例１０と同様にして、実施例１５の組成物を得た。【０１４６】
＜組成物の解析（１）＞
実施例１０〜１５の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率を測定した。【０１４７】
具体的には、組成物をＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで希釈し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して測定したｓｉＲＮＡ濃度（Ａ）を、脂質複合体外液に存在するｓｉＲＮＡとした。      
また、組成物を１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈して測定したｓｉＲＮＡ濃度（Ｂ）を脂質組成物中の全ｓｉＲＮＡ濃度とした。続いて、次式（Ｆ１）により、核酸の封入率を算出した。
封入率（％）＝１００−（Ａ／Ｂ）×１００  （Ｆ１）【０１４８】
また、粒子径測定装置（商品名「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ」、Ｍａｌｖｅｒｎ社製）で脂質複合体の平均粒子径を測定した。【０１４９】
表１に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ-平均）を示す。【０１５０】
【表１】
2015105131.tif 000055
【０１５１】
＜組成物の調製（２）＞
［実施例１６］
実施例２のカチオン性脂質２を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例１０の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを使用した。【０１５２】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で５３８μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質２、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８／３０／２（モル比）の割合で総脂質濃度３０ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．０ｍＬ／分、１．０８ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を１８．４５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例１６の組成物を得た。【０１５３】
［実施例１７］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質２の代わりに実施例３のカチオン性脂質３を用いた以外は実施例１６と同様にして、実施例１７の組成物を得た。【０１５４】
［参考例１４］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質２の代わりに参考例１０のカチオン性脂質１９を用いた以外は実施例１６と同様にして、参考例１４の組成物を得た。【０１５５】
［参考例１５］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質２の代わりに参考例１２のカチオン性脂質２１を用いた以外は実施例１６と同様にして、実施例１５の組成物を得た。【０１５６】
＜組成物の解析（２）＞
実施例１０の組成物と同様にして、実施例１６、１７及び参考例１４、１５の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び平均粒子径を測定した。【０１５７】
表２に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ-平均）を示す。【０１５８】
【表２】
2015105131.tif 000056
【０１５９】
＜組成物の調製（３）＞
［実施例１８］
実施例１のカチオン性脂質１を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例１０の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを使用した。【０１６０】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で４００μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質１、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８／３０／２（モル比）の割合で総脂質濃度１２ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ２．０ｍＬ／分、２．０ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を１２．０ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例１８の組成物を得た。【０１６１】
［実施例１９］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例９のカチオン性脂質９を用いた以外は実施例１８と同様にして、実施例１９の組成物を得た。【０１６２】
［参考例１６］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例１のカチオン性脂質１０を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例１６の組成物を得た。【０１６３】
［参考例１７］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例２のカチオン性脂質１１を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例１７の組成物を得た。【０１６４】
［参考例１８］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例３のカチオン性脂質１２を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例１８の組成物を得た。【０１６５】
［参考例１９］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例４のカチオン性脂質１３を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例１９の組成物を得た。【０１６６】
［参考例２０］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例５のカチオン性脂質１４を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例２０の組成物を得た。【０１６７】
［参考例２１］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例８のカチオン性脂質１７を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例２１の組成物を得た。【０１６８】
［参考例２２］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例９のカチオン性脂質１８を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例２２の組成物を得た。【０１６９】
［参考例２３］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例１１のカチオン性脂質２０を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例２３の組成物を得た。【０１７０】
［参考例２４］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに参考例１３のカチオン性脂質２２を用いた以外は実施例１８と同様にして、参考例２４の組成物を得た。【０１７１】
＜組成物の解析（３）＞
実施例１０の組成物と同様にして、実施例１８、１９及び参考例１６〜２４の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び平均粒子径を測定した。【０１７２】
表３に、ｓｉＲＮＡの封入率及び脂質複合体の平均粒子径（Ｚ-平均）を示す。【０１７３】
【表３】
2015105131.tif 000057
【０１７４】
＜組成物の調製（４）＞
［実施例２０］
実施例１のカチオン性脂質１を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例１０の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを使用した。【０１７５】
実施例１８と同様にして、実施例２０の組成物を得た。【０１７６】
［比較例１］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに特許文献２に記載された下記式（２９）で表される（化学名）（以下、ＭＬ−５という。）を、特許文献２に記載された方法にしたがって合成して用いた以外は実施例２０と同様にして、比較例１の組成物を得た。【０１７７】
【化５３】
2015105131.tif 000058
【０１７８】
＜組成物の解析（４）＞
実施例１０の組成物と同様にして、実施例２０及び比較例１の組成物について、脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率、及び粒子径を測定した。また、前記組成物を密閉したバイアルにて４℃で保管し、保管後１ヵ月目、２ヶ月目、４ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目、及び１２ヶ月目のｓｉＲＮＡの封入率、及び粒子径を同様にして測定した。【０１７９】
表４、表５及び図１に、それぞれ実施例２０及び比較例１の脂質複合体へのｓｉＲＮＡの封入率及び平均粒子径（Ｚ-平均）の経時変化を示す。【０１８０】
【表４】
2015105131.tif 000059
【０１８１】
【表５】
2015105131.tif 000060
【０１８２】
実施例２０の組成物は、比較例１の組成物よりも保管期間中、粒子径の増大が抑制されることが示された。【０１８３】
＜組成物の調製（５）＞
［実施例２１］
実施例１のカチオン性脂質１を用いて組成物を調製した。核酸としては、実施例１０の組成物で用いたものと同じＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを使用した。【０１８４】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で１０８μｇ／ｍＬに溶解し、ｓｉＲＮＡ希釈液とした。また、カチオン性脂質１、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を６０／８／３０／２（モル比）の割合で総脂質濃度６ｍＭとなるようにエタノールに溶解し、脂質溶液とした。ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液とを、それぞれ３．３６ｍＬ／分、１．８１ｍＬ／分の流速で混合し、更に２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を１２．９５ｍＬ／分の流速で混合することにより、脂質複合体水溶液を得た。得られた脂質複合体水溶液を、透析膜（商品名「Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２」、ＳＰＥＣＴＲＵＭ社、５０Ｋ  ＭＷＣＯ）を用いた透析に供し、外液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）に置換した。透析後、濃縮及び濾過滅菌を行い、実施例２１の組成物を得た。【０１８５】
［実施例２２］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例２のカチオン性脂質２を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２２の組成物を得た。【０１８６】
［実施例２３］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例４のカチオン性脂質４を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２３の組成物を得た。【０１８７】
［実施例２４］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例５のカチオン性脂質５を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２４の組成物を得た。【０１８８】
［実施例２５］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに実施例８のカチオン性脂質８を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２５の組成物を得た。【０１８９】
［比較例２］
カチオン性脂質として、カチオン性脂質１の代わりに前記のＭＬ−５を用いた以外は実施例２１と同様にして、比較例２の組成物を得た。【０１９０】
＜組成物の解析（５）＞
実施例１０の組成物と同様にして、実施例２１〜２５及び比較例２の組成物について、平均粒子径を測定した。また、前記組成物を密閉したバイアルにて４℃で保管し、２週間後の平均粒子径を測定した。【０１９１】
表６及び図２に、組成物の平均粒子径（体積平均）の経時変化を示す。【０１９２】
【表６】
2015105131.tif 000061
【０１９３】
実施例２１〜２５の組成物は、比較例２の組成物よりも保管期間中、粒子径の増大が抑制されることが示された。【０１９４】
＜組成物の活性評価（１）＞  
［試験例１］
実施例１０〜１５の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。【０１９５】
ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。結果を表７に示す。 【０１９６】
【表７】
2015105131.tif 000062
【０１９７】
実施例１０〜１５の組成物は、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質の発現抑制効果が高いことが示された。つまり、本発明のカチオン性脂質により、核酸を細胞質に効率よく放出していることを示すものである。【０１９８】
＜組成物の活性評価（２）＞  
［試験例２］
実施例１６、１７及び参考例１４、１５の組成物を、脂質複合体に封入されたＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ濃度が３０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。各組成物を、Ｃ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血及び肝臓の採取を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を市販のキット（商品名「ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ」、ＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社）により定量した。陰性対照として、ＰＢＳを投与した群に同様の処理を行った。【０１９９】
ＰＢＳ投与群のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、組成物投与群のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度を相対値として算出した。結果を表８に示す。【０２００】
【表８】
2015105131.tif 000063
【０２０１】
実施例１６、１７の組成物は、参考例１４、１５の組成物よりもＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質の発現抑制効果が高いことが示された。つまり、本発明のカチオン性脂質により、核酸を細胞質に効率よく放出していることを示すものである。【０２０２】
＜組成物の活性評価（３）＞  
［試験例３］
実施例１８、１９及び参考例１６〜２４の組成物を試験例２と同様にしてＣ５７／ＢＬ６マウス（５週齢、オス）に投与し、投与から２４時間後の血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度の相対値及び肝臓に残存していたカチオン性脂質量の相対値を算出した。結果を表９に示す。【０２０３】
【表９】
2015105131.tif 000064
【０２０４】
実施例１８の組成物は、参考例１６〜２４のいずれの組成物よりもＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質の発現抑制効果が高いことが示された。つまり、本発明のカチオン性脂質により、核酸を細胞質に効率よく放出していることを示すものである。【０２０５】
以上の結果から、本発明によれば、核酸を細胞質に効率よく放出することを可能とするカチオン性脂質を提供することができる。
また、本発明によれば、脂質複合体を一定期間保管した際に、粒子径が増大するという物理的安定性の課題を解決することを可能とするカチオン性脂質を提供することができる。
【図１】
2015105131.tif 000078
【図２】
2015105131.tif 000079
【国際調査報告】
2015105131.tif 000080
2015105131.tif 000081
2015105131.tif 000082
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