(57)【要約】【課題】水中におけるゲルの膨潤度を制御することによって、生体温度において作製当初の形状を維持し、かつ高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することを課題とする。【解決手段】ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物。
【請求項２】
前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）である、請求項１に記載のハイドゲル組成物。
【請求項３】
前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、水中において５〜４０℃の範囲である、請求項１に記載のハイドゲル組成物。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーが、下記式（Ｉ）で表されるポリマー
【化１】
2014157186.tif 000016
（ここで、式（Ｉ）中、
各ｍは、それぞれ同一又は異なり、２５〜２５０の整数であり、
各Ｘ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示し、ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し、及び
各Ｙ１は、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
であり、及び、
前記温度応答性の四分岐型ポリマーが、下記式（ＩＩ）で表されるポリマー
【化２】
2014157186.tif 000017
（ここで、式（ＩＩ）中、
各ｎは、それぞれ同一又は異なり、２５〜２５０の整数であり、
各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ５アルキル基であり、
各Ｘ２は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示し、ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し、及び
各Ｙ２は、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
である、請求項１に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項５】
前記式（ＩＩ）で表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である、請求項４に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項６】
前記Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、前記Ｒ１がエチルであるモノマー成分のモル比が、１：９〜５：５である、請求項５に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項７】
各Ｙ１が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基であり、及び、
各Ｙ２が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基である、
請求項４乃至６のいずれか１項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項８】
Ｙ１がＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり、Ｙ２がアミノ基である、請求項７に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項９】
水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８〜１．５の体積変化の範囲の膨潤度である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項１０】
６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有する、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項１１】
前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０〜９０：１０である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のハイドロゲル組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性ポリマーを含むハイドロゲルであって、溶液中における膨潤を抑え、その形状や力学特性を維持できる新規なハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、網状構造の親水性ポリマーを含むゲル状の材料であるハイドロゲルが注目されている。ハイドロゲルは、優れた保水能力及び生体適合性等の特性を有することから、シーリング、癒着防止、ドラッグデリバリー、コンタクトレンズなどの医療目的だけでなく、センサーや表面コーティングなどの多様な用途への応用が期待されている材料である（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１）。しかしながら、優れた特性の一方で、ハイドロゲルはその体積の大部分が水で占められた開放系の物質であるため、水中ではゲル内部と外部環境の濃度差から生じる浸透圧によって膨潤してしまい、十分な力学的強度が得られないという問題があった。【０００３】
特に、軟骨部位等の低侵襲医療への応用において、注射によって患部内で直接ゲルを形成させるインジェクタブルゲルの開発も広く行われつつあるが、ここでも、軟骨等の生体内の環境は閉鎖系ではないため、ゲルは外界との濃度勾配から膨潤してしまう。すなわち、軟骨部位で用いるためには高い破断強度が求められるが、当該部位ではゲルの膨潤によって内圧がかかるだけでなく、時間の経過とともに、ゲル化時の形状は崩れ、さらには力学的強度の低下が生じる。従って、軟骨の置換を指向した際には、インジェクタブルであることに加えて、そのような膨潤による形状変化や力学的強度の低下を生じないハイドロゲルの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１８９６２６号公報
【特許文献２】特開２００５−６０５７０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｋａｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４１、Ｎｏ.１４、ｐｐ.５３７９−５３８４、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記ハイドロゲルにおける強度や持続使用性の問題点を解消するため、水中におけるゲルの膨潤度を制御することによって、生体温度において作製当初の形状を維持し、かつ高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ハイドロゲルを形成し得るポリエチレングリコール骨格を有するポリマーと、相転移温度を有する温度応答性ポリマーを組み合わせ、これらを架橋させて網目構造を有するハイドロゲルを作成することによって、溶液中における当該ゲルの膨潤度を制御できることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。【０００８】
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）  ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物に関する。【０００９】
また、本発明のハイドゲル組成物の好ましい態様は、
（２）  前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）である、上記（１）に記載のハイドゲル組成物；
（３）  前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、水中において５〜４０℃の範囲である、上記（１）に記載のハイドゲル組成物；
（４）  前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーが、下記式（Ｉ）で表されるポリマー
【化１】
2014157186.tif 000002
（ここで、式（Ｉ）中、
各ｍは、それぞれ同一又は異なり、２５〜２５０の整数であり、
各Ｘ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示し、ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し、及び
各Ｙ１は、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
であり、及び、
前記温度応答性の四分岐型ポリマーが、下記式（ＩＩ）で表されるポリマー
【化２】
2014157186.tif 000003
（ここで、式（ＩＩ）中、
各ｎは、それぞれ同一又は異なり、２５〜２５０の整数であり、
各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ５アルキル基であり、
各Ｘ２は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示し、ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し、及び
各Ｙ２は、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
である、上記（１）に記載のハイドロゲル組成物；
（５）  前記式（ＩＩ）で表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である、上記（４）に記載のハイドロゲル組成物；
（６）  前記Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、前記Ｒ１がエチルであるモノマー成分のモル比が、１：９〜４：６である、上記（５）に記載のハイドロゲル組成物；
（７）  各Ｙ１が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基であり、及び、
各Ｙ２が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基である、
上記（４）乃至（６）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（８）  Ｙ１がＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり、Ｙ２がアミノ基である、上記（７）に記載のハイドロゲル組成物；
（９）  水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８〜１．５の体積変化の範囲の膨潤度である、上記（１）乃至（８）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（１０）  ６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有する、上記（１）乃至（９）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（１１）  前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０〜９０：１０である、上記（１）乃至（１０）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ハイドロゲルの膨潤度を制御することによって従来のハイドロゲルにおける強度や持続使用性の問題点を解消することができ、生体条件・体液浸漬環境下に導入した場合であっても、生体温度において作製当初の形状を維持しつつ、人間の軟骨に匹敵する高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することができる。【００１１】
具体的には、本発明のハイドロゲル組成物では、ゲルの構成セグメントとして、相転移温度を有する温度応答性ポリマーを導入することによって、一定温度以上において、当該温度応答性ポリマーが収縮してゲルの膨張を妨げ、かつ、他の親水性ポリマーセグメントのにおける膨潤も抑え、ゲル全体の膨潤を抑制できるという効果を奏する。また、導入する温度応答性ポリマーの比率を適宜変更することによって、或いは相転移温度が異なる温度応答性ポリマーを用いること等によって、所望の用途に応じて、ハイドロゲル全体の膨潤度・収縮率を制御することが可能となる。【００１２】
上述のように、生体内の、特に軟骨等のような過重部においてゲルを応用する場合には、高い力学特性及び形態維持能が必要となるが、本発明は従来にはない発想で当該課題を解決するものであり、高分子ゲルの実用化において極めて有益である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーと温度応答性の四分岐型ポリマーよりなる本発明のハイドロゲル組成物の構造、及びゲル中の温度応答性ポリマー成分が温度に応じて収縮することによる膨潤抑制の機構を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明のハイドロゲル組成物における体積変化（膨張度）の温度依存性を比率をプロットしたグラフである。
【図３】図３は、本発明のハイドロゲル組成物における応力―ひずみ曲線の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１５】
本発明のハイドロゲル組成物は、ａ）ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマー、及び、ｂ）相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有するものである。
【００１６】
（１）ポリエチレングリコール骨格を有する親水性ポリマー成分
本発明のハイドロゲル組成物において用いられる親水性ポリマー成分は、ポリエチレングリコール骨格を有し、その末端において当該親水性ポリマーどうし、及び／又は後述の温度応答性ポリマーと架橋することによって網目構造を有するものである。好ましくは、水を含むことによって、ハイドロゲルを形成し得る親水性ポリマーである。ここで、「ハイドロゲル」とは、多量の水を含んだ親水性の高分子を含むゲル状の物質であり、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った分散系をいう。
【００１７】
そのようなハイドロゲルを形成し得るポリマーとして、４つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマー成分が、互いに架橋して均一な網目構造ネットワークを形成するものが挙げられる。かかる四分岐型のポリエチレングリコール骨格よりなるゲルは、一般に、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルとして知られており、それぞれ末端に活性エステル構造等の求電子性の官能基とアミノ基等の求核性の官能基を有する二種の四分岐高分子間のＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される。Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、これまでの研究から、２００ｎｍ以下のサイズ領域で高分子網目に不均一性がなく、理想的な均一網目構造を有することが報告されている（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４２、Ｎｏ.４、ｐｐ.１３４４−１３５１、２００９）。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは各高分子溶液の単純な二液混合で簡便にその場で作製可能であり、ゲル調製時のｐＨやイオン強度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。そして、このゲルはＰＥＧを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
【００１８】
本発明のハイドロゲル組成物において用いられるポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物である。
【化３】
2014157186.tif 000004
【００１９】
上記式（Ｉ）中、各ｍは、それぞれ同一でも又は異なってもよい。各ｍの値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となる。このため、高強度のゲルを得るためには、同一であることが好ましい。各ｍの値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、各ｍの値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、各ｍは、２５〜２５０の整数値があげられ、３５〜１８０が好ましく、５０〜１１５がさらに好ましく、５０〜６０が特に好ましい。そして、その分子量としては、５×１０３〜５×１０４Ｄａがあげられ、７．５×１０３〜３×１０４Ｄａが好ましく、１×１０４〜２×１０４Ｄａがより好ましい。
【００２０】
上記式（Ｉ）中、各Ｘ１は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。各Ｘ１は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。各Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示す。ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
【００２１】
ここで、「Ｃ１−Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１−Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２−Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、−ＣＨ2−、−(ＣＨ2)2−、−(ＣＨ2)3−、−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)3−、−(ＣＨ(ＣＨ3))2−、−(ＣＨ2)2−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)3−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)2−ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)−、−(ＣＨ2)6−、−(ＣＨ2)2−Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2−、及び−(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2−などが挙げられる。
【００２２】
「Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２〜７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２〜５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００２４】
また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
【００２５】
各Ｙ２は、上述のように、共有結合による架橋反応であるＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークを形成させるためのものであり、求核性官能基又は求電子性官能基から選択される。典型的には、ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーは末端に求電子性官能基を有し、その場合、後述の温度応答性の四分岐型ポリマーのＹ２は求核性官能基である。例えば、親水性ポリマーの末端がアミノ基であり、温度応答性ポリマーの末端がＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）を含むエステル構造である場合には、各ポリマーの末端は、アミド結合によって架橋してゲルを形成する。しかしながら、合成の容易さ等の観点から、逆の組み合わせであることも可能である。さらに、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーを等量以外で含む態様においては、末端が求核性官能基である親水性ポリマーと求電子性官能基である親水性ポリマーを混在して用いることもでき、これによって、ハイドロゲル組成物中における親水性ポリマー成分と温度応答性ポリマー成分の比率を適宜変更することができる。
【００２６】
当該親水性ポリマーの末端が求核性官能基である場合には、アミノ基が好ましい。しかし、高強度な立体構造になる架橋を得られれば、当該官能基は、アミノ基以外の求核性官能基を用いることもできる。このような求核性官能基として、−ＳＨ、又は−ＣＯ２ＰｈＮＯ２(Ｐｈは、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フェニレン基を示す)などがあげられ、当業者であれば公知の求核性官能基を適宜用いることができる。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。
【００２７】
また、当該親水性ポリマーの末端が求電子性官能基である場合には、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基が好ましい。しかし、求電子性を有する他の活性エステル基を用いてもよい。このような活性エステル基としては、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、又はニトロフェニル基などがあげられ、当業者であれば公知の活性エステル基を適宜用いることができる。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。
【００２８】
（２）温度応答性ポリマー成分
本発明のハイドロゲル組成物において用いられる温度応答性ポリマー成分は、溶液中で相転移温度を有するポリマーであって、上記親水性ポリマー成分と架橋することによってハイドロゲルを形成することができるポリマーである。
【００２９】
そのような相転移温度を有するポリマーとしては、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子（天然物及び合成高分子のいずれをも含み得る）であることが好ましい。ここで、「下限臨界溶液温度を有する高分子」は、ある温度以下では水等の溶媒にに可溶化するが、ある温度以上では、可逆的に分子内で収縮して或いは分子間で凝集して当該溶媒に不溶化し、相分離を示す性質を有するものである。これとは逆に、「上限臨界溶液温度を有する高分子」は、ある温度以上では水等の溶媒にに可溶化するが、ある温度以下では、可逆的に分子内で収縮して或いは分子間で凝集して当該溶媒に不溶化し、相分離を示す性質を有するものである。
【００３０】
温度応答性ポリマー成分における相転移温度は、水中において５〜４０℃、好ましくは、１０〜３５℃である。特に、相転移温度が下限臨界溶液温度である場合、当該温度は、１０〜３５℃、より好ましくは、２５〜３５℃である。ハイドロゲル組成物の膨張を抑制するという観点からは、当該温度は、ハイドロゲルを使用する温度において、当該ゲル中における温度応答性ポリマー成分が収縮する状態となることが好ましい。
【００３１】
上記親水性ポリマー成分が式（Ｉ）で表されるような四分岐型のポリマーである場合には、温度応答性ポリマー成分もまた四分岐型のポリマーであることが、均一な網目構造ネットワークのハイドロゲルを構成するために好ましい。
【００３２】
本発明のハイドロゲル組成物において用いられる相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーは、一態様において、以下の一般式（ＩＩ）で表されるポリアルキルグリシジルエーテル骨格の構造を有する化合物である。
【化４】
2014157186.tif 000005
【００３３】
上記式（ＩＩ）中、各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なっていてもよい、Ｃ１−Ｃ５アルキル基であり、好ましくはメチル又はエチルである。より好ましくは、式（ＩＩ）表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である。かかる共重合体におけるＲ１の比率を調節ことによって、温度応答性ポリマー全体の相転移温度を所望のものに変更することが可能となる。ここで、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成のモル比は、好ましくは、１：９〜３：７であり、好ましくは２：８である。
【００３４】
上記式（ＩＩ）中、ｎ、Ｘ２、及びＹ２の定義は、上記式（Ｉ）におけるｍ、Ｘ１、及びＹ１の定義とそれぞれ同様である。
【００３５】
（３）本発明のハイドロゲル組成物
上述のように、本発明では、ハイドロゲルを形成し得る親水性ポリマー成分とともに、温度応答性ポリマー成分を用いてゲルを形成させることで、最終的なハイドロゲル組成物における膨潤度を制御することができる。例えば、親水性ポリマー成分として式（Ｉ）のＴｅｔｒａ−ＰＥＧゲルを用い、その一部を式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分で置換することで、従来のＴｅｔｒａ−ＰＥＧゲルが有する均一な網目構造を維持したまま、ゲルに温度応答能を付与することができる。
【００３６】
図１に示すように、ゲル中の温度応答性ポリマー成分が温度に応じて収縮することで、ゲル全体としての体積相転移が生じ、これによって、ゲル全体の膨潤を抑制することができ、当該膨張による形状変化及び力学的強度の低下を回避することが可能となる。ここで重要なのは、網目構造に親水性ＰＥＧ相が均一に分散して存在すること、すなわち、両親媒性の温度応答性ポリマー成分のセグメントは、常に親水性ポリマー成分のセグメントで囲まれることである。そのため、ゲルの収縮の際には、収縮が進行している相の周囲に、常に水の透過経路が確保されることになり、従来のゲルで生じていたような、ゲルの表面において水を透過できない脱水和層であるスキン層の形成を抑制することができる。従って、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルへの温度応答性ポリマー成分の導入量を調節し、或いは適切な相転移温度の温度応答性ポリマー成分を用いることで、収縮状態のゲルの膨潤度の調節が可能となるのである。
【００３７】
このような温度応答性ポリマー成分の収縮によってゲル全体の膨張が抑制されることによって、好ましくは、水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８５〜１．５の体積変化の範囲の膨潤度となる。より好ましくは、０．９〜１．２の膨潤度である。これによって、生体条件・体液浸漬環境下に導入した場合であっても、膨潤による形状変化や強度の低下を回避し、生体温度において作製当初の形状及び強度を維持可能なハイドロゲル組成物を得ることができる。
【００３８】
温度応答性ポリマー成分の導入量については、所望の膨潤度に応じて適宜調整することができるが、好ましくは、前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０〜９０：１０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０である。かかるモル比の範囲は、上述のように、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基を調整することで適宜変更することができる。例えば、（末端が求核性官能基である親水性ポリマー）：（末端が求電子性官能基である親水性ポリマー）：（末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマー）を５０：１０：４０とすることによって、親水性ポリマー成分と温度応答性ポリマー成分を６０：４０とするハイドロゲル組成物を得ることができる。
【００３９】
本発明のハイドロゲル組成物は、１０〜１００ＭＰａ、好ましくは、生体軟骨を超える１０ＭＰａ以上、より好ましくは６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有することが好ましい。このような圧縮破断強度を有するハイドロゲルを用いることで、高い負荷がかかる骨欠損分や骨変形部において好適に用いることができる。圧縮破断強度は、公知の測定機器を用いて、公知の方法で調べることができる。圧縮破断強度測定機器としては、たとえば、Ｓｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の圧縮試験機（Ｒｈｅｏ  Ｍｅｔｅｒ:ＣＲ−５００ＤＸ−ＳＩＩ）があげられる。圧縮破断強度とは、ゲル試料に圧縮荷重を加えた時に、ゲル試料が破断する最大応力のことをさす。圧縮破断強度は、円柱状のゲル試料に対して、１軸荷重をかけた時の圧縮力をその軸に垂直な断面積で割った値で表わすことができる。
【００４０】
本発明のハイドロゲル組成物は、上述のポリマーを用いて、当該技術分野において公知の方法により作製することができる。
【００４１】
上記式（Ｉ）の親水性ポリマー成分及び式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分からハイドロゲルを得る方法としては、式（Ｉ）のポリマー成分と適切な緩衝液（「第１の緩衝液」）を含む溶液（「第１の溶液」）と、式（ＩＩ）のポリマー成分と適切な緩衝液（「第２の緩衝液」）を含む溶液（「第２の溶液」）とを混合する方法が好ましい。この場合、第１の緩衝液のｐＨが５〜９、及び濃度が２０〜２００ｍＭであり、第２の緩衝液のｐＨが５〜９、及び第２の緩衝液の濃度が２０〜２００ｍＭである。ここで、末端がアミノ基であるポリマーを含む溶液のｐＨは、末端が求電子性官能基である他の溶液のｐＨよりも高くする必要がある。これにより、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリマー成分の間でアミド結合の形成反応が起こり、均一な網目構造を有するハイドロゲルを製造することができる。以下、式（Ｉ）の親水性ポリマー成分の末端がアミノ基であり、式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分の末端がＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）である場合を例として、述べる。
【００４２】
酸性溶液中では、第１の溶液のアミノ基がカチオンの状態となりやすく、互いに反発しやすくなり、そして、カチオン状態のアミノ基は、もう一方のポリマー成分の官能基（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ））との反応性が低下する。一方、第１の溶液のｐＨが高くなる（アルカリ性側に傾く）と、式（Ｉ）のポリマー成分のアミノ基が−ＮＨ３＋から−ＮＨ２へと移りやすくなるので、式（ＩＩ）のポリマー成分との反応性が高くなる。しかし、式（ＩＩ）のポリマー成分は、溶液のｐＨが７以上になると、エステル結合が分解されやすくなり、式（Ｉ）のポリマー成分との反応性が低下してくる。そのため、ゲル強度が弱くなってしまう。従って、第１及び第２の緩衝液のｐＨを調節する必要がある。
【００４３】
混合前の第２の溶液のｐＨは５〜６.５であることが好ましい。また、混合後の溶液においては、不均一な混合を防ぐために、式（Ｉ）のポリマー成分の９５〜９９％は式（ＩＩ）のポリマー成分との結合能を有する非カチオン性のアミノ基の状態で存在することが好ましい。このような工程を経るためには、混合直後の溶液のｐＨは６〜８であることが望ましい。このため、第１の溶液のｐＨは、第２の溶液のｐＨよりも高い方が好ましい。溶液のｐＨは、市販のｐＨメーターを用いるなど公知の方法で測定することができる。このように、混合後のｐＨを６〜８に保ち、ＮＨＳと反応可能な非カチオン性のアミノ基を５％以下に保つことにより、均一で強固なハイドロゲルを製造することが可能になる。
【００４４】
また、緩衝液濃度が低すぎると、溶液中のｐＨ緩衝能が低下し、高強度のハイドロゲルを製造することができず、逆に、緩衝液濃度が高すぎても、式（Ｉ）のポリマー成分と式（ＩＩ）のポリマー成分の混合を阻害するために、高強度のハイドロゲルを製造することができない。よって、上記のように、緩衝液の濃度を２０ｍＭ〜２００ｍＭとすることで、均一構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができる。
【００４５】
用いられる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸・リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、又はクエン酸・リン酸緩衝生理食塩水があげられる。第１の緩衝液と第２の緩衝液は、同じでも異なってもよい。また、第１の緩衝液及び第２の緩衝液は、それぞれ２種以上の緩衝液を混合して用いてもよい。
【００４６】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリマー成分の溶液中濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬがあげられる。四分岐型ポリマーの濃度が、低すぎるとゲルの強度が弱くなり、四分岐型ポリマーの濃度が高すぎるとハイドロゲルの構造が不均一になりゲルの強度が弱くなる。そのため、２０〜４００ｍｇ／ｍＬが好ましく、５０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１００〜２００ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００４７】
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリマー成分は各々求核性、求電子性の末端官能基を有するが、求核性官能基と求電子性官能基のモル比が０．５：１〜１．５：１となるように混合すればよい。当該ポリマー成分の官能基はそれぞれ１：１で反応して架橋し得るので、混合モル比は１：１に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを得るためには０．８：１〜１．２：１が特に好ましい。
【００４８】
上記の混合工程としては、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基が各々１種類の場合（例えば、末端が求核性官能基である親水性ポリマーと末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマーの２成分系である場合）には、第１の溶液に第２の溶液を添加して混合する工程、第２の溶液に第１の溶液を添加して混合する工程、第１の溶液と第２の溶液とを等量ずつ混合する工程があげられる。第１の溶液又は第２の溶液の添加速度、混合速度は特に限定されず、当業者であれば適宜調整することができる。また、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基のいずれか又は両方が２種類である場合（例えば、末端が求核性官能基である親水性ポリマー、末端が求電子性官能基である親水性ポリマー、及び末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマーの３成分系である場合）における各溶液の添加も同様に、順次添加する工程、又は求核性官能基と求電子性官能基が所望の比率となるように溶液を混合する工程を用いることができる。
【００４９】
本発明の混合工程は、たとえば国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号パンフレットに開示されたような二液混合シリンジを用いて行うことができる。混合時の二液の温度は、特に限定されず、ポリマー成分がそれぞれ溶解され、それぞれの液が流動性を有する状態の温度であればよい。温度が低すぎると化合物が溶解されにくく、または溶液の流動性が低くなり、均一に混ざり難くなる。一方、温度が高すぎると第１の四分岐型ポリマーと第２の四分岐型ポリマーのの反応性を制御し難くなる。そのため、混合するときの溶液の温度としては、１℃〜１００℃が挙げられ、５℃〜５０℃が好ましく、１０℃〜３０℃がより好ましい。二液の温度は異なってもよいが、温度が同じである方が、二液が混合されやすいので好ましい。
【００５０】
当該混合工程によって得られる混合溶液は、塩濃度が０〜１×１０２ｍＭであることが好ましく、１×１０−１〜１×１０２であってもよい。そのため、混合溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下であることが好ましく、５０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
【００５１】
また、本発明のハイドロゲル組成物は、溶液のｐＨを調整することで、ゲル化までの時間を調節することができるので、導入部に適合した形状を作りやすい。そのため、膝軟骨手術や椎間板手術など、生体において荷重負荷がかかる骨、軟骨、又は椎間板の整形外科的手術において、骨、軟骨、若しくは椎間板の欠損部補填物質、又は骨、軟骨、若しくは椎間板の変性部補填物質として好適に用いることができる。整形外科手術において、本発明のハイドロゲル組成物は、上記した二液混合シリンジを用いて、患部に直接投与してもよいし、あらかじめ導入する部位の型に合わせてハイドロゲルを形成して形成後のハイドロゲルを患部に導入してもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
温度応答性の四分岐型ポリマー成分の合成
温度応答性の四分岐型ポリマー成分である、ポリエチルグリシジルエーテル（ＰＥＧＥ）の四分岐モジュール（Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ）、及び、エチルグリシジルエーテル（ＥＧＥ）とメチルグリシジルエーテル（ＭＧＥ）の共重合体よりなる四分岐モジュール（Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ））を以下のとおり合成した。【００５４】
以下の実験では、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、日本電子のＪＮＭ−ＥＣＳ４００(４００ＭＨｚ)を用いて解析した。重水素化クロロホルムを溶媒として用い、テトラメチルシランを内部標準とした。分子量はブルカーダルトニクスの質量分析計Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩのリニアポジティブイオンモードを用いて決定した。【００５５】
１）  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥモジュールの合成
１−１  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＨの合成
ペンタエリトリトールを重合起点として、ＥＧＥを開環重合させることで、末端にヒドロキシ基を有する四分岐ポリエチルグリシジルエーテルであるＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＨを合成した。
【化５】
2014157186.tif 000006
ペンタエリトリトール（０．２０８ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）が溶解している９０ｍＬのＤＭＳＯとＴＨＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝３／２）に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（３．５６ｍＬ）をゆっくりと添加した。アルコキシドが形成されると共に、カリウムナフタレンの緑色が黄色に変化した。ＥＧＥの添加によって重合を開始させ、その後６０℃で攪拌した。質量分析計で高分子の成長を観察しながら、目的の分子量に達するまでＥＧＥの添加を続けた。添加したＥＧＥ（４４．１ｍＬ，４１０ｍｍｏｌ）が完全に消費されたことを確認した後、５Ｎの塩酸を用いて重合を停止させた。ＴＨＦをロータリーエバポレータで減圧留去した後、残渣を過剰量のジエチルエーテルに溶解させ、ＤＭＳＯを取り除くために食塩水で洗浄した。さらに、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に濃縮した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を−２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を減圧乾燥することで、黄色の液体Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＨ（３９．４ｇ，９４％）を得た。
質量分析:  Ｍｎ＝２２，０００。ゲル濾過クロマトグラフィー：Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３−３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−およびＥＧＥ),δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。【００５６】
１−２  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＣＯＯＨの合成
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＨに対してブロモ酢酸エチルを付加した後、エステル部位を脱保護することで末端にカルボキシル基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＣＯＯＨを得た。
【化６】
2014157186.tif 000007
二口フラスコ中でＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＨ（４．００ｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１２０ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（２４．３２ｍＬ）をゆっくりと滴下し、攪拌した。３０分後も溶液が緑色であったことから、ヒドロキシ基の脱プロトン化が完全に進行したことを確認した。溶液を０℃に冷却し、ブロモ酢酸エチル（１．６１ｍＬ，１４．６ｍｍｏｌ）をシリンジで添加したところ、溶液の色が黄色に変化した。その後、反応系を室温に戻し、２４時間攪拌した。白色の沈殿物が見られる反応液を濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いてＴＨＦと過剰のブロモ酢酸エチルを除去した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を−２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を１Ｎの水酸化ナトリウムと１，４−ジオキサンの混合溶液（ｖ／ｖ＝１／１）の中で生成物を８０℃で２４時間攪拌することでエステルの脱保護を行った。５Ｎの塩酸を用いて反応液のｐＨを１にした上で、クロロホルムで抽出し、水と食塩水で洗浄を行った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、クロロホルムを減圧留去した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を−２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を減圧下で乾燥させることで、黄色がかった液体Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＣＯＯＨを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２７（ｓ，８Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ），δ３．３−３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−およびＥＧＥ），δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。【００５７】
１−３  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕの合成
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＣＯＯＨに、縮合剤ＥＤＣを用いてＮ−ヒドロキシスクシンイミドを付加させることで、末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕを得た。
【化７】
2014157186.tif 000008
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＣＯＯＨ（１．００ｇ，０．０４５５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４１９ｇ，３．６４ｍｍｏｌ）を二口フラスコに量りとり、その中にジクロロメタン（３０ｍＬ）を加えた。その容器へ、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かしたＥＤＣ（０．５６５ｇ，３．６４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと滴下した。室温で２４時間攪拌した後、ロータリーエバポレータで溶媒を留去した。得られた液体を酢酸エチルに溶解させ、濾過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、減圧乾燥することで、粘性がある液体Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３−３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−ａｎｄＥＧＥ），δ２．８４（ｍ，１６Ｈ＊，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＳｕ),δ１．１７(ｔ，６４２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３)。
なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕの末端スクシンイミジル化率はおおよそ１００％であると見積もった。【００５８】
１−４  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＮＨ２の合成
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕにエチレンジアミンを付加させることで、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＮＨ２を得た。
【化８】
2014157186.tif 000009
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕ（１ｇ）をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させた。高分子溶液に対してジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させたエチレンジアミン（１．２１５ｍＬ，１８．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。混合液を室温で３時間攪拌した後、水と食塩水で洗浄した。最後に硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、ジクロロメタンを減圧下で留去することで、薄い黄色の液体Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＮＨ２を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１４（ｓ，６．５Ｈ＊，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−），δ３．３−３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−，−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−およびＥＧＥ），δ２．８２（ｔ，７Ｈ＊，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２），δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＮＨ２の末端アミノ化率は８１〜８８％程度であると見積もった。【００５９】
２）  Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）モジュールの合成
２−１  Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＨの合成
ペンタエリトリトールを重合起点として、ＥＧＥとＭＧＥを開環重合させることで、末端にヒドロキシ基を有するＥＧＥとＭＧＥの四分岐コポリマーであるＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＨを合成した。
【化９】
2014157186.tif 000010
ペンタエリトリトール（０．２０８ｇ，１．５３ｍｍｏｌ）が溶解している９０ｍＬのＤＭＳＯとＴＨＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝３／２）に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（４．０５ｍＬ）をゆっくりと添加した。アルコキシドが形成されると共に、カリウムナフタレンの緑色が黄色に変化した。ＥＧＥとＭＧＥの混合液（ＥＧＥ／ＭＧＥ＝０．８／０．２）を添加することで重合を開始させ、その後６０℃で攪拌した。質量分析計で高分子の成長を観察しながら、目的の分子量に達するまでモノマーの添加を続けた。添加したＥＧＥ（４１．６ｍＬ，３８７ｍｍｏｌ）とＭＧＥ（８．６１ｍＬ，９６．８ｍｍｏｌ）が完全に消費されたことを確認した後、５Ｎの塩酸を用いて重合を停止させた。ＴＨＦをロータリーエバポレータで減圧留去した後、残渣を過剰量のジエチルエーテルに溶解させ、ＤＭＳＯを取り除くために食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に濃縮した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を−２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗生成物を減圧乾燥することで、黄色の液体Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＨ（４１．６８ｇ）を得た。
質量分析:Ｍｎ＝２２，５００。ゲル濾過クロマトグラフィー：Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３−３．７５（ｍ，１５９５Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−，ＥＧＥおよびＭＧＥ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３)。【００６０】
２−２  Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＣＯＯＨの合成
Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＨに対してブロモ酢酸エチルを付加した後、エステル部位を脱保護することで末端にカルボキシル基を有するＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＣＯＯＨを得た。
【化１０】
2014157186.tif 000011
二口フラスコ中でＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＨ（２０ｇ，０．８８９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６００ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（１２３．２ｍＬ）をゆっくりと滴下し、攪拌した。３０分後も溶液が緑色であったことから、ヒドロキシ基の脱プロトン化が完全に進行したことを確認した。溶液を０℃に冷却し、ブロモ酢酸エチル（７．６３５ｍＬ，７３．７０ｍｍｏｌ）をシリンジで添加したところ、溶液の色が黄色に変化した。その後、反応系を室温に戻し、２４時間攪拌した。ロータリーエバポレーターを用いてＴＨＦと過剰のブロモ酢酸エチルを除去し、残渣を過剰のジエチルエーテルに溶解させた後、白色の沈殿物を濾過して取り除いた。ナフタレンを除去するため、ジエチルエーテルを減圧留去し、得られた液体を−２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を１Ｎの水酸化ナトリウムと１，４−ジオキサンの混合溶液（ｖ／ｖ＝１／１）の中で生成物を８０℃で２４時間攪拌することでエステルの脱保護を行った。５Ｎの塩酸を用いて反応液のｐＨを１にした上で、クロロホルムで抽出し、水と食塩水で洗浄を行った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、減圧下で乾燥させることで、黄色がかった液体Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＣＯＯＨを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２７（ｓ，８Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ），δ３．３−３．７５(ｍ、１５９５Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−，ＥＧＥおよびＭＧＥ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。【００６１】
２−３  Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＳｕの合成
Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＣＯＯＨに、縮合剤EDCを用いてN-ヒドロキシスクシンイミドを付加させることで、末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＳｕを得た。
【化１１】
2014157186.tif 000012
Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＣＯＯＨ（１７ｇ，０．７５６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．９６ｇ，６０．４８ｍｍｏｌ）を二口フラスコに量りとり、その中にジクロロメタン（５１０ｍＬ）を加えた。その容器へ、ジクロロメタン（３４０ｍＬ）に溶かしたＥＤＣ（９．３９ｇ，６０．４８ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと滴下した。室温で２４時間攪拌した後、ロータリーエバポレータで溶媒を留去した。得られた液体を酢酸エチルに溶解させ、濾過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で二回、食塩水で一回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、減圧乾燥することで、粘性がある液体Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ−ＯＳｕを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３−３．７５（ｍ，１５９５Ｈ，−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−，ＥＧＥおよびＭＧＥ）,δ２．８４（ｍ，１６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＳｕ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。【００６２】
２−４  Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＮＨ２の合成
Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＳｕにエチレンジアミンを付加させることで、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＮＨ２を得た。
【化１２】
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Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＯＳｕ（１０ｇ，０．４４４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４００ｍＬ）に溶解させた。高分子溶液に対してジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させたエチレンジアミン（５８．８６ｍＬ，８８９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。混合液を室温で３時間攪拌した後、ロータリーエバポレータでジクロロメタンを減圧留去した。残渣をメタノールに溶解させ、濾過した後、メタノールを外液に透析を行った。透析で精製された溶液を減圧乾燥することで、薄い黄色の液体Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＮＨ２を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３)：δ４．１４（ｓ，７．５Ｈ＊，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−），δ３．３−３．７５（ｍ，1595Ｈ,−Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−，−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−およびＥＧＥ），δ２．８２（ｔ，７Ｈ＊，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ３）。
なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）−ＮＨ２の末端アミノ化率は８８〜９４%程度であると見積もった。
【実施例２】
【００６３】
ハイドロゲル組成物の作成
上記で得た温度応答性ポリマー成分及び親水性ポリマー成分を用いて、以下の手順で本発明のハイドロゲル組成物を調製した。
１）  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＰＥＧＥゲルの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２およびＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕを、それぞれ別の容器に１０ｍＭの濃度になるよう、シクロヘキサノン中に溶解させた。ここで、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２は、市販のものをそのまま用いた（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＰＡ、Ｍｎ＝１０，０００，日油）。
【化１３】
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得られた二液を同量ずつ取り、別の容器で混合させ、さらにボルテックスミキサーを用いて良く攪拌した。ゲル化が始まる前に、混合液を素早く直径６４０μｍのキャピラリーに移し取り、乾燥を防ぐために両端を粘土でキャップした上で、室温で２４時間静置した。得られたゲルをキャピラリーから丁寧に取り出した後、ゲル化反応の副生成物であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドを取り除くため、シクロヘキサノン中で１０℃以下の環境で２４時間静置した。次に、ゲルをシクロヘキサノンとメタノールの混合液（シクロヘキサノン／メタノール＝０．７５／０．２５）に浸し、さらにメタノールの比率を０．５、０．７５、１．０と増加させていくことで、ゲルの溶媒をメタノールへと置換した。同様の手順で、さらにゲルをメタノールと水の混合液（メタノール／水＝０．７５／０．２５）に漬け、水の混合比を０．５、０．７５、１．０と増加させていき、最終的に水で膨潤したＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＰＥＧＥハイドロゲルを得た。【００６４】
同様の手順を用いて、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２とＴｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＮＨ２および末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧＥ−ＯＳｕの４種類のポリマーを異なる比率で混合させることで、温度応答性ポリマー成分の導入比が異なるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＰＥＧＥハイドロゲルを得た。ここで、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕは、市販のものをそのまま用いた（ＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＨＳ、Ｍｎ＝１０，０００，日油）。得られた各種Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＰＥＧＥハイドロゲルをその組成とともに、表１に示す。
【表１】
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【００６５】
２）  Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルの調製
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２、Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ＮＨ２の３種類のポリマー成分を用いて、ＥＧＥ＝ＭＧＥ共重合体の温度応答性ポリマー成分を含むハイドロゲルを調製した。ここで、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕ及びＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２は、分子量２０，０００の市販品を用いた（それぞれ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−２００ＨＳ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−２００ＰＡ、いずれも日油）。Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕおよびＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２は温度に寄らず水溶性であり、Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ＮＨ２は10℃以下の環境で水に易溶であるため（＞１３５ｇ／Ｌ）、水中でのハイドロゲル調製が可能である。ここで、上記のように、四分岐型ポリマー間のスクシンイミジル基とアミノ基の反応速度を制御することで、ゲル化時間を制御すると共に最終ゲル化反応率を向上させることが出来るため、ここでも反応場として、クエン酸―リン酸緩衝液(ＣＰＢ)およびクエン酸―リン酸緩衝液(ＰＢ)を用いた。緩衝液は０．２Ｍのリン酸二水素ナトリウム（１９．０ｍＬ）と０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム（８１．０ｍＬ）を混合することでＰＢとし、０．１Ｍのクエン酸（１９．７ｍＬ）と０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウムを混合することで、ＣＰＢとした。ｐＨは、それぞれ５．８及び７．４であった。ここでは調製段階の高分子溶液の相分離を防ぐために、以下の作業は全て１０℃以下の環境で行った。【００６６】
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕをＣＰＢ、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２をＰＢ、及び、Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ＮＨ２をＰＢに、それぞれ高分子濃度が６ｍＭになるように溶解させた。調製した三液を最終モル比がＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＯＳｕ:Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＮＨ２:Ｔｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ＮＨ２＝１０：２：８になるように混合し、ボルテックスミキサーを用いてよく攪拌した後、キャピラリーおよび円筒型ゲル枠にそれぞれ流し込み成形を行った。反応液を２４時間静置することで、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルを得た。得られたゲルを水中に２４時間漬けておくことで、ゲル化反応の副生成物であるN-ヒドロキシスクシンイミドを取り除いた。
【実施例３】
【００６７】
本発明のハイドロゲルにおける膨潤度の測定
実施例２で得たＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルを用いて、膨潤度を測定した。具体的には、直径６４０μmのキャピラリーで作製した円筒状のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルを、水中で３℃で２時間膨潤させ、ゲルが平衡膨潤状態にあることを確認した上で、恒温槽の温度を上昇させながら、各温度でゲルが平衡膨潤状態になるまで待機した後にゲルの直径を記録した。ゲルが等方的に変形すると仮定して、各温度での直径を体積に換算し、各温度でのゲルの体積をＶとして、各温度における体積変化を得た。結果を図２に示す。【００６８】
図２は、ゲル作製時の体積をＶ０とし、各温度での体積をＶとしたとき、このゲルの温度に依存する体積変化の比率をプロットしたものである。Ｖ／Ｖ０が１の場合には、ゲル作製状態を維持し、すなわちほとんど膨潤していないことを意味している。図の結果から、おおよそ３５〜４０℃の領域では、水中でもゲル作製時の状態を保持していることが分かる。人間の体温の平均が３６．５℃であるから、この結果は、本発明のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルでは、生体環境においてゲルの膨潤を抑制できることを実証するものである。また、当該温度は、水中におけるＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ポリマーの相転移温度である１０℃に対応するものであり、ここで得られたゲルの膨潤抑制の効果は、ゲル中の網目構造におけるＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ポリマーのセグメントが当該相転移温度以上で収縮するという構造変化に起因するものといえる。
【実施例４】
【００６９】
本発明のハイドロゲルにおける破断強度の測定
次に、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルの破断強度の評価を行った。ゲルの圧縮試験には、３３６５卓上型万能試験機(インストロン)を用いた。高さ７．５ｍｍで直径９．０ｍｍの円筒型の鋳型で作製したゲルを３７℃の水中に２時間浸漬し、そのサイズを測定したところ、ゲル作製時のものから変化が無いことを確認した。その後、水中からゲルを取り出し、１０ｍｍ／分の速度で圧縮試験を行い、応力―ひずみ曲線を得た。得られた結果を図３に示す。【００７０】
図３の結果より、今回調整されたＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルは、長時間水中で静置された後でも６０ＭＰａを超える高い破断強度を有することが明らかになった。当該結果は、温度応答性ポリマー成分であるＴｅｔｒａ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ポリマーのセグメントがゲル中に組み込まれたことで、ゲルの膨潤が抑制され、それによってゲル作製時の高分子体積分率を維持することができ、高い破断強度が得られたものと考えられる。人間の軟骨の破断強度は数ＭＰａ程度であることを考慮すると、本発明のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−Ｐ（ＥＧＥ−ｃｏ−ＭＧＥ）ゲルは、軟骨を置換する用途においても必要十分な高い力学的強度を有しているといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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