(57)【要約】  配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置されるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含み、好ましくはアミノ酸配列（Ａ２）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目〜６８番目のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する配列を含み、さらに好ましくはアミノ酸数が３００〜４００であるポリペプチドで構成される酵素は、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化できる新規な酵素である。
2016080549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化するための酵素であって、配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置されるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成され、クピン・スーパーファミリーに属するタンパク質である酵素。
【請求項２】
アミノ酸配列（Ａ２）が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目〜６８番目のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する配列を含む請求項１記載の酵素。
【請求項３】
前記ポリペプチドのアミノ酸数が３００〜４００である請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
前記アミノ酸配列（Ａ）からなるポリペプチドで構成された請求項１〜３のいずれかに記載の酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の酵素を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含む請求項５記載のポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列に対する相同性が９０％以上である塩基配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかにおいて１又は２〜２０個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列。
【請求項７】
請求項５又は６記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１〜４のいずれかに記載の酵素を採取する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の酵素を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化（変換）するための酵素、この酵素を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（又は遺伝子又はＤＮＡ）、このポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターにより形質転換された形質転換体、及び前記酵素を含む飲食品（例えば、野菜ジュースなどの野菜含有飲食品）に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物からは緑の香り物質が大量に放出されている。このような物質は、植物の匂いを特徴付けるだけではなく、いくつかは生理活性を示すことが明らかにされてきており、植物生理学的にも重要な物質である。
なお、緑の香り物質は、炭素数６の直鎖不飽和炭化水素化合物のアルデヒド体、アルコール体などから成り立っており、葉緑体に含まれる脂肪酸の一種であるリノレン酸に由来し、いくつかの酵素が作用して生合成される。【０００３】
このような香り物質の中でも、（Ｚ）−３−ヘキセナール（シス−３−ヘキセナール）は、植物が傷害（切断等）を受けると大量に生成される、青臭さの原因となる匂い物質であり、植物由来の食味を損なう要因となっているが、効果的な除去法は知られていない。【０００４】
なお、（Ｚ）−３−ヘキセナールは、植物において、（Ｅ）−２−ヘキセナール（トランス−２−ヘキセナール）に異性化されることが知られている。例えば、非特許文献１には、シス−３−エナールをトランス−２−エナールに変換するイソメラーゼをキュウリ果実により抽出し、ゲル濾過法などにより部分精製し、この酵素の基質特異性を調べたところ、シス−３−ヘキセナールが適していたことが記載されている。【０００５】
また、非特許文献２には、可溶性の（３Ｚ）:（２Ｅ）−エナールイソメラーゼが、（３Ｚ）−ヘキセナールを対応する（３Ｚ）−アルケナールに変換する経路が存在することが記載されている。
さらに、非特許文献３には、アルファルファの種が、３Ｚ：２Ｅ−エナールイソメラーゼ活性を示したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Phytochemistry (1979) 18, 401-404
【非特許文献２】Biochim Biophys Acta. （1996) 1303, 83-91.
【非特許文献３】FEBS Letters (1999) 443, 201-204
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化できる新規な酵素、この酵素を得るためのポリヌクレオチド、ベクター及び形質転換体を提供することにある。【０００８】
本発明の他の目的は、植物（野菜等）を含んでいても、植物由来の青臭さを抑制（又は消失）できる飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、パプリカ等の植物から（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化できる酵素（（Ｚ）−３：（Ｅ）−２−ヘキセナールイソメラーゼ）を単離できること、また、この酵素が、新規なアミノ酸配列を有しており、補因子などの添加物がなくても、広いｐＨ範囲で高活性を有する優れた酵素であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の各発明を包含する。【００１０】
［１］（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化するための酵素であって、配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置されるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成され、クピン・スーパーファミリーに属するタンパク質である酵素。
［２］アミノ酸配列（Ａ２）が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目〜６８番目のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する配列を含む前記［１］記載の酵素。
［３］前記ポリペプチドのアミノ酸数が３００〜４００である前記［１］又は［２］に記載の酵素。
［４］前記アミノ酸配列（Ａ）からなるポリペプチドで構成された前記［１］〜［３］のいずれかに記載の酵素。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［６］下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含む前記［５］記載のポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列に対する相同性が９０％以上である塩基配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかにおいて１又は２〜２０個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列。
［７］前記［５］又は［６］記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［８］前記［７］記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
［９］前記［８］記載の形質転換体を培養し、培養物から前記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素を採取する方法。
［１０］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素を含む飲食品。【００１１】
なお、本明細書では、アミノ酸を１文字略号（アラニンを「Ａ」、グリシンを「Ｇ」など）として記載する場合がある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化できる新規な酵素（さらには、この酵素を得るためのポリヌクレオチド、ベクター及び形質転換体）を得ることができる。このような異性化酵素は、補因子などの添加物を共存させなくても、酵素活性を発揮できる。しかも、中性〜弱酸性といった広いｐＨ範囲でも高活性を示す酵素であり、非常に有用性が高い。【００１３】
また、本発明によれば、このような異性化酵素を、効率よく得ることができるポリヌクレオチド（さらにはベクター及び形質転換体）を提供することができる。【００１４】
さらに、本発明の酵素は、上記のように高活性であり、植物に適用することで、植物由来の青臭さを抑制（又は消失）できる。特に、パプリカのような植物に含まれる成分であるため、安全に使用可能である。例えば、植物（野菜等）を含む飲食品（野菜ジュースなど）に当該酵素を含有させることで、植物を含んでいても、植物由来の青臭さを抑制（又は消失）できる。【００１５】
なお、（Ｚ）−３−ヘキセナールは青臭さの原因となる一方で、（Ｅ）−２−ヘキセナールは、甘い匂いを有している。そのため、本発明の酵素の使用により、青臭さを抑制（又は消失）しつつ、甘い匂いを付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例１におけるクロマトグラフィー及びＳＤＳＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】図２は、ＣａＨｌのアミノ酸配列（配列番号１）である。
【図３】図３は、ＣａＨＩ、ＳｌＨＩ１、ＳｌＨＩ３、ＳｔＨＩ１、ＳｔＨＩ２、ＳｌＨＩ２、ＡｔＨｌ１−ｌｉｋｅ及びＡｔＨｌ２−ｌｉｋｅのそれぞれについて酵素活性の有無を確認したＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、ＣａＨＩ、ＳｌＨＩ１、ＳｌＨＩ３、ＳｔＨＩ１、ＳｔＨＩ２、ＳｌＨＩ２、ＡｔＨＩ１−ｌｉｋｅ及びＡｔＨＩ２−ｌｉｋｅのアラインメントである。
【図５】図５は、配列番号１において５４番目に位置するＨをＡに置換したアミノ酸配列からなる組換えタンパク質について、酵素活性の有無を確認したＨＰＬＣチャートである。
【図６】図６は、ＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１のそれぞれについて酵素活性の有無を確認したＨＰＬＣチャートである。
【図７】図７は、ＣａＨＩ、ＳｌＨＩ１、ＳｌＨＩ３、ＳｔＨＩ１、ＳｔＨＩ２、ＭｓＨＩ１、ＣｓＨＩ３、ＯｓＨＩ１、ＳｌＨＩ２、ＣｓＨＩ−ｌｉｋｅ、ＡｔＨＩ１−ｌｉｋｅ及びＡｔＨＩ２−ｌｉｋｅのアラインメントである。
【図８】図８は、ＣａＨＩの立体構造である。
【図９】図９は、ＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１の立体構造中の活性中心付近の拡大図である。
【図１０】図１０は、配列番号１において１２８番目のチロシン及び６０番目のリシンをそれぞれアラニンに置換した組換えタンパク質について、酵素活性の有無を確認したＨＰＬＣチャートである。
【図１１】図１１は、パプリカヘキセナールイソメラーゼ高発現遺伝子組換えトマトの葉の揮発性成分の（Ｚ）―３−ヘキセナール及び（Ｅ）―２−ヘキセナールを測定したＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１２】図１２は、パプリカヘキセナールイソメラーゼ高発現遺伝子組換えトマトの果実の揮発性成分の（Ｚ）―３−ヘキセナール及び（Ｅ）―２−ヘキセナールを測定したＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１３】図１３は、ＣａＨＩの立体構造中の活性中心付近の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［異性化酵素及び異性化酵素を含む飲食品］
本発明の酵素は、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化（又は変換）するための酵素（異性化酵素、イソメラーゼ）である。また、本発明の酵素は、クピン（ｃｕｐｉｎ）・スーパーファミリーに属するタンパク質である。そして、このような酵素は、配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置されるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成されている。
【００１８】
アミノ酸配列（Ａ２）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目、６０番目及び１２８番目にそれぞれ相当する位置のアミノ酸がヒスチジン、リシン及びチロシンであることを要する。対応する位置は、配列アラインメントを利用して決定することができる。対応する位置は配列番号１の番号（５４番目、６０番目及び１２８番目）と同じである必要はなく、前後してもよい。例えば、配列番号１における５４番目のヒスチジンに対応する位置のヒスチジン（以下、「Ｈ５４」とも称する。）は、アミノ酸配列（Ａ２）において５４番目より小さい番号に位置してもよいし、大きい番号に位置してもよい。配列番号１における６０番目のリシンに対応する位置のリジン（以下、「Ｋ６０」とも称する。）及び１２８番目のチロシンに対応する位置のチロシン（以下、「Ｙ１２８」とも称する。）も同様に、６０番目および１２８番目よりそれそれ小さい番号に位置してもよいし、大きい番号に位置してもよい。また、例えば配列番号１においてＨ５４とＫ６０との間に存在するアミノ酸は５個であるが、アミノ酸配列（Ａ２）においては４個以下でもよく、６個以上でもよい。
【００１９】
アミノ酸配列（Ａ２）は、当該アミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、Ｈ５４、Ｋ６０及びＹ１２８が、酵素の活性中心に配置されることを要する。アミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造は、公知のソフトウェアやウェブサイトを利用することにより、作製することができ、作製された立体構造に基づいて、Ｈ５４、Ｋ６０及びＹ１２８が、酵素の活性中心に配置されるか否かを確認することができる。例えば、本発明者はＳＷＩＳＳ−ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）を使用しているが、これに限定されない。図１３に、ＳＷＩＳＳ−ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）を使用し、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて作製したパプリカヘキセナールイソメラーゼの立体構造中の活性中心付近の拡大図を示す。図１３中、点線は直径約５Åの円を表し、３．８はＨ５４と基質との距離を示してている。図１３に示したように、パプリカヘキセナールイソメラーゼでは、Ｈ５４、Ｋ６０及びＹ１２８は近接して反応中心を形成し、この位置に基質である（Ｚ）−３−ヘキセナール（図中３−ヘキセナール）が結合して、（Ｅ）−２−ヘキセナールへの変換反応が進行すると考えられる。したがって、アミノ酸配列（Ａ２）においても、ヘキセナールイソメラーゼ活性を発現するために、当該アミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、Ｈ５４、Ｋ６０及びＹ１２８が、酵素の活性中心に配置される必要がある。これら３つのアミノ酸間の距離は特に限定されないが、約１０Å以下であることが好ましく、約７Å以下であることがより好ましく、約５Å以下であることがさらに好ましい。また、これら３つのアミノ酸間の距離は２Å以上であることが好ましい。
【００２０】
アミノ酸配列（Ａ２）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目〜６８番目のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する配列を含むことが好ましい。より好ましくは５０％以上の相同性、さらに好ましくは６５％以上の相同性を有する。この領域は配列番号１で示されるアミノ酸配列のＨ５４の前後の配列であり、Ｋ６０を含む配列である。この領域のアミノ酸配列の相同性が５０％以上であれば、立体構造においてＹ１２８を含む活性中心が形成されていると推認することができる。
【００２１】
本発明の酵素は、上記Ｈ５４、Ｋ６０及びＹ１２８以外に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２３番目、６４番目、８６番目、１０２番目、１１４番目、１２６番目および１３０番目から選択された１以上の対応する位置において、配列番号１と同じアミノ酸を有することが好ましい。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２３番目はチロシン（Ｙ２３）、６４番目はバリン（Ｖ６４）、８６番目はイソロイシン（Ｉ８６）、１０２番目はトリプトファン（Ｗ１０２）、１１４番目はフェニルアラニン（Ｆ１１４）、１２６番目はフェニルアラニン（Ｆ１２６）、１３０番目はフェニルアラニン（Ｆ１３０）である。これらの中で、配列番号１と同じアミノ酸を有する位置の数は、１以上であればよく、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上である。
【００２２】
本発明の酵素は、クピン（ｃｕｐｉｎ）・スーパーファミリーに属するタンパク質であるが、その中でも１１Ｓグロブリン様タンパク質であることが好ましい。１１Ｓグロブリン様タンパク質は、広く植物の種子中に分布し、貯蔵タンパク質の機能を有する１１Ｓグロブリンと構造が類似しているタンパク質を意味する。また、本発明の酵素を構成するポリペプチドのアミノ酸数は特に限定されないが、約３００〜約４００アミノ酸であることが好ましく、約３２０〜約３８０アミノ酸であることがより好ましく、約３３０〜約３７０アミノ酸であることがさらに好ましい。
【００２３】
なお、本発明の酵素を構成するポリペプチドは、アミノ酸配列（Ａ）のみからなるポリペプチドであってもよく、酵素活性を有する限り、さらに、他のアミノ酸（又はアミノ酸配列）を有していてもよい。
【００２４】
本発明の酵素は、前記の通り、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化するための酵素（異性化酵素）として使用できる。このような酵素は、補因子等の添加物がなくても、活性を有しており、活性なｐＨの範囲も広い。例えば、本発明の酵素は、ｐＨ２〜９、好ましくは３〜８．５、さらに好ましくは４〜８（例えば、４．５〜７．５）程度で酵素活性を発揮できる。
【００２５】
酵素の利用方法としては、特に限定されないが、例えば、飲食品に、本発明の酵素を含有させることで、植物由来の青臭さを抑制（又は消失）させることができる。
【００２６】
そのため、本発明には、前記酵素を含む飲食品も含まれる。飲食品としては、例えば、植物成分（植物由来成分）を含んでいればよく、加工食品、健康食品、飲料、調味料などが挙げられる。
【００２７】
また、本発明には、前記酵素を植物成分（植物由来成分）を含む飲食品に添加する工程を有する植物由来の青臭さを抑制する方法が含まれる。
【００２８】
飲食品において、酵素の含有量は、植物由来の成分の含有量等に応じて適宜選択できるが、例えば、５０重量％以下、３０重量％以下（例えば、２０重量％以下）、１０重量％以下（例えば、０．０００１〜８重量％）、好ましくは５重量％以下（例えば、０．００１〜３重量％）、さらに好ましくは２重量％以下（例えば、０．０１〜１重量％）であってもよく、０．１〜３０重量％（例えば、０．５〜２５重量％、好ましくは１〜２０重量％、さらに好ましくは２〜１５重量％）程度であってもよい。
なお、飲食品を構成する植物由来成分は、本発明の酵素を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。本発明の酵素を含んでいる場合、上記割合は、元来、植物由来の成分に含まれる酵素を含まないものとする。
【００２９】
本発明の酵素は、植物（例えば、パプリカ、トマト、じゃがいもなどのナス科植物、アルファルファ等のマメ科植物、キュウリ等のウリ科植物、イネ等のイネ科植物）等から慣用の手法を用いて単離（精製）することで得てもよく、後述するように、酵素を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用して得ることもできる。
【００３０】
［ポリヌクレオチド、ベクター及び形質転換体］
本発明のポリヌクレオチドは、前記ポリペプチド（又は前記アミノ酸配列（Ａ））をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、前記酵素を生成するため、前記酵素を生成するための成分（酵素生成剤）ということもできる。
【００３１】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（又はＤＮＡ断片又は遺伝子）であってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、ポリヌクレオチドは、二本鎖（例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドなど）であってもよく、一本鎖であってもよい。なお、一本鎖は、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれでもよい。
ポリヌクレオチドとしては、前記ポリペプチドをコードするものであれば特に限定されないが、例えば、配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）をコードする塩基配列（Ｂ１）、及びアミノ酸配列（Ａ１）と類似するアミノ酸配列（Ａ２）をコードする塩基配列（Ｂ２）から選択された塩基配列（Ｂ）を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
塩基配列（Ｂ１）としては、例えば、配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列が含まれる。なお、これらの塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７のアミノ酸配列に対応している。
【００３３】
また、塩基配列（Ｂ２）としては、例えば、塩基配列（Ｂ１）に対して高い相同性を有する塩基配列が挙げられる。このような塩基配列において、塩基配列（Ｂ１）に対する相同性は、アミノ酸配列（Ａ）（又はポリペプチド）をコードできる限り限定されないが、６０％以上の範囲から選択でき、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に９５％以上であってもよく、さらに高い相同性（例えば、９７％以上、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であってもよい。
【００３４】
さらに、塩基配列（Ｂ２）には、アミノ酸配列（Ａ）（又はポリペプチド）をコードできる限り、塩基配列（Ｂ１）において、一部の塩基（塩基配列）が置換、欠失などにより改変した塩基配列も含まれる。
【００３５】
代表的な塩基配列（Ｂ）としては、（ｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列、（ｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列に対する相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、特に９０％以上）である塩基配列、（ｉｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかにおいて１又は複数個の塩基（塩基配列）が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列などが挙げられる。
【００３６】
塩基配列（ｉｉｉ）において、複数個としては、例えば、２〜３０個（例えば、２〜２５個）、好ましくは２〜２０個（例えば、２〜１５個）、さらに好ましくは２〜１０個（例えば、２〜５個）程度であってもよい。
【００３７】
なお、本発明のポリヌクレオチドは、塩基配列（Ｂ）のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、前記ポリペプチド（又はアミノ酸配列（Ａ））をコードする限り、さらに、他の塩基（塩基配列）等を有していてもよい。
例えば、前記ポリヌクレオチドは、５’側又は３’側にタグ標識をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。また、非翻訳領域の配列、ベクター配列などの他の配列を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ法、化学合成法、ハイブリダイゼーション法などの慣用の方法により得ることができる。
【００３９】
また、本発明の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。このような組換えベクターは、宿主（宿主細胞）中で発現可能なベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクターなどが挙げられる。
【００４０】
組換えベクターは、慣用の方法（例えば、プラスミド、ファージ、コスミドなどを用いる方法）により得ることができる。例えば、宿主（又は宿主細胞）の種類に応じて、本発明のポリヌクレオチドを発現できるプロモーター配列と、本発明のポリヌクレオチドをベクター（例えば、各種プラスミドなど）に組み込むことにより得ることができる。
【００４１】
また、本発明の形質転換体は、組換えベクターにより形質転換された構造を有している。このような形質転換体は、組換えベクターを、慣用の方法により宿主中に形質転換（及び形質導入）することに得ることができる。
【００４２】
宿主（又は宿主細胞）としては、目的とするポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、微生物、細菌（大腸菌など）、酵母、動物細胞などが挙げられる。
【００４３】
本発明では、このような形質転換体を培養し、培養物から前記酵素を採取（又は回収）することができる。すなわち、培養により、培養物中に前記酵素を生成（蓄積）させ、この培養物から前記酵素を採取（回収）できる。培養方法としては、特に限定されず、慣用の方法を利用できる。
【００４４】
培養に用いる培地としては、完全培地又は合成培地であってもよく、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられる。培養条件（ｐＨ、培養温度、培養時間など）は、特に限定されず、適宜選択できる。
【００４５】
なお、酵素の採取は、慣用の方法（例えば、培養物を破砕処理する方法など）により得られた粗酵素を、各種クロマトグラフィーにて精製するなどして行うことができる。
【００４６】
本発明には、以下の各発明も含まれる。
＜１＞（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化するための酵素であって、配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成された酵素。
＜２＞アミノ酸配列（Ａ２）が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、１６７番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、１７７番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、２３９番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２６２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、２６６番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２９９番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、３３９番目に対応する位置のアミノ酸がプロリンである前記＜１＞に記載の酵素。
＜３＞アミノ酸配列（Ａ２）が、配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、７５％以上の相同性を有する前記＜１＞又は＜２＞に記載の酵素。
＜４＞アミノ酸配列（Ａ）が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列である前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の酵素。
（ｉ）配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかで示されるアミノ酸配列に対する相同性が７５％以上であり、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の３２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、１６７番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、１７７番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、２３９番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２６２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、２６６番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２９９番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、３３９番目に対応する位置のアミノ酸がプロリンであるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号１〜５のいずれかにおいて１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加され、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の３２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、１６７番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、１７７番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、２３９番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２６２番目に対応する位置のアミノ酸がバリン、２６６番目に対応する位置のアミノ酸がロイシン、２９９番目に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、３３９番目に対応する位置のアミノ酸がプロリンであるアミノ酸配列
＜５＞前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜６＞下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含む前記＜５＞記載のポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号９〜１３のいずれかで示される塩基配列
（ｉｉ）配列番号９〜１３のいずれかで示される塩基配列に対する相同性が９０％以上である塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号９〜１３のいずれかにおいて１又は２〜２０個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列
＜７＞前記＜５＞又は＜６＞に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
＜８＞前記＜７＞に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
＜９＞前記＜８＞に記載の形質転換体を培養し、培養物から前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の酵素を採取する方法。
＜１０＞前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の酵素を含む飲食品。
【００４７】
なお、本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４９】
なお、実施例において、酵素活性は、次のようにして測定した。
［酵素活性の測定］
酵素溶液１００μＬを、３９５μＬのＨｅｐｅｓ［４−（２−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジンエタンスルホン酸］−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）と、５μＬの（Ｚ）−３−ヘキセナール（ゼオン社、濃度１Ｍ）と混合し、任意時間（５〜３０分間）、室温で反応させた。反応後、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）のアセトニトリル溶液（２５ｍＭ）２５μＬと、２０μＬのギ酸を加え、アルデヒド成分［（Ｚ）−３−ヘキセナール（生成している場合にはさらに（Ｅ）−２−ヘキセナール）］をＤＮＰ誘導体化した。３００μＬのヘキサンを加えてよく撹拌してから静置した。ヘキサン層（上層）を回収し、遠心濃縮機によりヘキサンを除去した。残渣を２００μＬのアセトニトリルに溶解したものを、ＨＰＬＣにより分析し、（Ｅ）−２−ヘキセナールの生成の有無を確認した。【００５０】
［実施例１：パプリカからの酵素の精製・単離］
新鮮な赤パプリカから種子とワタを取り除き、良く水洗した果皮部のみを３００ｇはかり取り、４５０ｍｌのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）とともにミキサーで破砕抽出した。二重のガーゼでろ過し残渣を取り除いた後、遠心分離器（ＲＰＲ１２−２、日立社製）にて、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
上清を回収し、３０％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、３０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア製）に全量供した。
非吸着物質を３０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で十分洗い流した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で吸着したタンパク質を溶出した。各溶出画分について酵素活性を測定し、活性のあった画分を集め、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムに供した。【００５１】
２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを良く洗浄した後、１％（ｖ／ｖ）の非イオン系界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で、吸着タンパク質を溶出し、各画分の酵素活性を測定した。
活性画分を集め、その液量の９倍量の０．１％（ｗ／ｖ）β−Ｄ−ドデシルマルトシドを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた後、同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ（２ｍｌ、ＧＥヘルスケア製）カラムに吸着させた。吸着したタンパク質は、１ＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）β−Ｄ−ドデシルマルトシドを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、各画分の酵素活性を測定した。【００５２】
活性画分の液量の９倍量の０．１％（ｗ／ｖ）β−Ｄ−ドデシルマルトシドを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた後、０．１％（ｗ／ｖ）β−Ｄ−ドデシルマルトシドを含む２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏＱ（ＳＭＡＲＴ−ＳＹＳＴＥＭ、ＧＥヘルスケア社製）に吸着させた。
吸着タンパク質は０Ｍから０．３ＭまでのＮａＣｌグラジエント溶出により分画した後、活性測定とＳＤＳ電気泳動を行うことにより、目的酵素が単一に精製されたことを確認した。結果を図１に示す。【００５３】
［実施例２：精製タンパク質の断片化及び断片化ペプチドのアミノ酸配列の決定］
実施例１で得られた精製タンパク質を７０％（ｖ／ｖ）ギ酸に溶解し、臭化シアン片を加え、暗所で一晩反応させた後、減圧乾固した。
回収後のペプチドは、１５％ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いたトリストリシン（Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液系によるＳＤＳ電気泳動法で分離した後、Ｔｒｉｓ−アミノカプロン酸緩衝液系によるセミドライブロッティング法を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。転写後、ＰＶＤＦに転写された断片化ペプチドを４５％メタノール、５％酢酸溶液に溶解した０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０により染色した。【００５４】
そして、ＰＶＤＦ膜に転写された断片化ペプチドの中から、強く染色された２つのペプチドを選択し、プロテインシーケンサーを用いてアミノ酸配列を決定した。すなわち、アルコールで洗浄したはさみで解析対象とするペプチドを切り出し、ピンセットを用いてプロテインシーケンサー（ＡＢＩ、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２モデル）のサンプルブロックにセットし、ＡＢＩ社から提供されているプロトコルに従って解析した。結果を以下の表に示す。【００５５】
【表１】
2016080549.tif 000003
【００５６】
［実施例３：決定したアミノ酸配列の相同性検索］
実施例２で決定した２つのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、Ｓｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ）のＢＬＡＳＴ検索により、タンパク質をコードすると考えられる遺伝子を検索したところ、トマトの１３Ｓ貯蔵タンパク質２との類似性が示されたＣａＨＩ（ＣＡ０８ｇ１４６２０）が２つのアミノ酸配列を含むことがわかった。【００５７】
図２にＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。図２において、下線部は、実施例２で決定した２つのペプチドのアミノ酸配列である。【００５８】
［実施例４：組換え酵素の作製］
植物由来の酵素を大腸菌で安定的に発現させるために、より低温で大腸菌を培養することが効果的であることが多い。そこで培養温度を低温にシフトさせることにより組換え酵素を発現させることが出来るコールドショック発現ベクターをベースとし、粘液細菌由来のＰｒｏｔｅｉｎＳ（ＰｒｏＳ）を可溶化タグとして利用する発現ベクターｐＣｏｌｄ  ＰｒｏＳ２を用いて組換え酵素の発現を行った。【００５９】
組換え酵素作製に用いる鋳型ｃＤＮＡはパプリカからＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて得た全ＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｋｉｔ（東洋紡社）により調製した。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２に組み込めるように制限酵素認識部位配列を加えたプライマーを用いて、パプリカのｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化し、組換えｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２プラスミドを構築した。なお、増幅反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。【００６０】
【表２】
2016080549.tif 000004
【００６１】
構築したプラスミドはサブクローニング用大腸菌（ＤＨ−５α株）に形質転換後、抗生物質である５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ固体培地で培養し、生育した大腸菌から抽出したプラスミドについて制限酵素処理によるインサートチェックとＤＮＡ配列の確認を行い、目的の遺伝子（配列番号９）が導入されていることを確認した。
なお、ＤＮＡ配列の決定はビッグダイ・ターミネーター・ヴァージョン３．１サイクル・シークエンシング・キット（ＡＢＩ社製）を用いたサイクルシーケンシング反応により増幅したＤＮＡ断片を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１３０ジェネチックアナライザ（ＡＢＩ社製）により解析することで行った。【００６２】
大腸菌にはＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。プラスミド導入は、コンピテントセルに３μＬのプラスミド溶液を添加し、氷上に３０分放置後、４２℃１分間のヒートショックを与えた。ＳＯＣ培地を加え１時間培養後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ固体培地で培養し、組換え酵素発現用の大腸菌を得た。
組換え酵素発現用の大腸菌は５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃でＯＤ値が０．５になるまで培養したのち、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう加え、１５℃で一晩培養した。培養終了後、５０００ｇで１５分遠心を行い、ＰＢＳを１０ｍｌで懸濁し３回洗浄を行った。ソニケーションによって菌体を破砕し、１５０００ｒｐｍで３０分遠心分離後の上清を可溶性画分として酵素活性測定を行い、酵素活性を有することを確認した。【００６３】
［実施例５：配列情報に基づく酵素活性の確認］
パプリカのヘキセナールイソメラーゼ遺伝子配列をもとにＢＬＡＳＴ検索を行い、草本植物で相同性が高い遺伝子を選択し、配列情報を得た。【００６４】
得られた配列情報は以下の通りである。
ＳｌＨＩ１：配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性７９％、トマト由来、対応する遺伝子は配列番号１０で示される塩基配列
ＳｌＨＩ３：配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性７９％、トマト由来、対応する遺伝子は配列番号１１で示される塩基配列
ＳｔＨＩ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性８０％、じゃがいも由来、対応する遺伝子は配列番号１２で示される塩基配列
ＳｔＨＩ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性８１％、じゃがいも由来、対応する遺伝子は配列番号１３で示される塩基配列
ＳｌＨＩ２：配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性７１％、トマト由来、対応する遺伝子は配列番号１４で示される塩基配列
ＡｔＨＩ１−ｌｉｋｅ：配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性３８％、シロイヌナズナ由来、対応する遺伝子は配列番号１５で示される塩基配列
ＡｔＨＩ２−ｌｉｋｅ：配列番号８で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性３８％、シロイヌナズナ由来、対応する遺伝子は配列番号１６で示される塩基配列【００６５】
そして、得られた配列情報に基づいて、実施例４と同様にして組換え酵素を得、酵素活性測定を行った。
なお、増幅反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。【００６６】
【表３】
2016080549.tif 000005
【００６７】
ＣａＨＩを含めた各酵素について得られたＨＰＬＣチャートを図３に示す。
図３の結果から明らかなように、ＳｌＨＩ１、ＳｌＨＩ３、ＳｔＨＩ１及びＳｔＨＩ２については、ＣａＨＩと同様に酵素活性があり、ＳｌＨＩ２、ＡｔＨＩ１−ｌｉｋｅ及びＡｔＨＩ２−ｌｉｋｅについては酵素活性を確認できなかった。【００６８】
また、図４に、ＣａＨＩを含めた上記アミノ酸配列のアラインメント（配列アラインメント）を示す。なお、図４において、「Ｓｌ１」は「ＳｌＨＩ１」、「Ｓｌ３」は「ＳｌＨＩ３」、「Ｓｔ１」は「ＳｔＨＩ１」、「Ｓｔ２」は「ＳｔＨＩ２」、「Ｓｌ２」は「ＳｌＨＩ２」を意味する。
また、「有」「無」は、酵素活性の有無を意味し、四角枠で囲った部分は、酵素活性を有するアミノ酸配列のみに共通するアミノ酸を示す。【００６９】
［実施例６：酵素活性に関係するアミノ酸の探索］
ＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）において、酵素活性を有するアミノ酸配列のみに共通する５４番目のヒスチジン（Ｈ５４）をアラニン（Ａ）に置換したアミノ酸配列からなる組換え酵素（ＣａＨＩ  Ｈ５４Ａ）を実施例４と同様にして作製し、その酵素活性を確認したところ、酵素活性が見られなかった。
なお、ＣａＨＩのアミノ酸配列において、５４番目のヒスチジンをアラニンに変えるようなプライマーを設計し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＲＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔを用いて、ＣａＨＩ−ｐＣｏｌｄベクターに点置換変異を導入した。
プライマー配列は以下の通りである。【００７０】
【表４】
2016080549.tif 000006
【００７１】
図５に、ＣａＨＩ  Ｈ５４Ａについて得られたＨＰＬＣチャートを示す。なお、図５には、比較のため、ＣａＨＩのＨＰＬＣチャートも合わせて示す。
この結果から明らかなように、ＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）において、５４番目に位置するヒスチジンは、酵素活性に必須であることがわかった。【００７２】
同様にして、ＣａＨＩのアミノ酸配列において、５７番目のアスパラギン酸（Ｄ）、３０５番目のリシン（Ｋ）、及び３４３番目のリシン（Ｋ）について、それぞれ、アラニン（Ａ）に置換した各アミノ酸配列からなる組換え酵素をそれぞれ作製して酵素活性を確認したところ、いずれも酵素活性を有することがわかった。【００７３】
また、５４番目のヒスチジン以外にも、活性を示すアミノ酸配列に共通して保存されているという分子系統学上の観点から、ＣａＨＩのアミノ酸配列の３２番目のＶ（バリン）、１６７番目のＬ（ロイシン）、１７７番目のＩ（イソロイシン）、２３９番目のＬ（ロイシン）、２６２番目のＶ（バリン）、２６６番目のＬ（ロイシン）、２９９番目のＩ（イソロイシン）、３３９番目のＰ（プロリン）が、酵素活性に関係する可能性が示唆された。【００７４】
［実施例７：官能評価］
小松菜の新鮮重量に対し２倍量の水を加えてミキサーにかけ、ジュースを得た。得られたジュースは、特有の青臭い香りを有し、強い青臭さを感じる味を有していた。
一方、得られたジュース（１ｇ）に、実施例４で得られた酵素（０．１ｇ）を添加して１０分振とうした後、同様に評価したところ、香り・味とも、明らかに青臭さが抑制されていた。
なお、香り及び味の評価は、５人のパネリストが行い、いずれのパネリストも同じ評価であった。【００７５】
［実施例８：ナス科以外の植物のヘキセナールイソメラーゼの探索］
ナス科以外の植物のヘキセナールイソメラーゼを見出すために、ＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）と相同性の高いアミノ酸配列を、アルファルファ、キュウリ及びイネのデータベースに登録されているアミノ酸配列から検索した。検索により相同性の高い上位に挙げられたアミノ酸配列（４〜６配列）をアライメントし、ＣａＨＩの５４番目のヒスチジン（Ｈ５４）に相当する位置のアミノ酸前後のアミノ酸配列が、ＣａＨＩのアミノ酸配列と相同性が高いアミノ酸配列を選択し、ヘキセナールイソメラーゼの有無を確認した。【００７６】
選択した配列情報は以下の通りである。
ＭｓＨＩ１：配列番号３５で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性４２％、アルファルファ由来、対応する遺伝子は配列番号３９で示される塩基配列
ＣｓＨＩ３：配列番号３６で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性３８％、キュウリ由来、対応する遺伝子は配列番号４０で示される塩基配列
ＯｓＨＩ１：配列番号３７で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性３３％、イネ由来、対応する遺伝子は配列番号４１で示される塩基配列
ＣｓＨＩ−ｌｉｋｅ：配列番号３８で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する相同性４０％、キュウリ由来、対応する遺伝子は配列番号４２で示される塩基配列【００７７】
選択したアミノ酸配列に基づいて、実施例４と同様にして各組換えタンパク質を作製しヘキセナールイソメラーゼ活性を測定した。なお、増幅反応に用いたプライマーは以下のとおりである。【００７８】
【表５】
2016080549.tif 000007
【００７９】
その結果、ＣａＨＩの５４番目に相当する位置のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ５４）であるＭｓＨｌ１、ＯｓＨｌ１及びＣｓＨｌ３はヘキセナールイソメラーゼ活性を有していたが、ＣａＨＩの５４番目に相当する位置のアミノ酸がアルギニンのＣｓＨＩ−ｌｉｋｅはヘキセナールイソメラーゼ活性を有しなかった。【００８０】
ＭｓＨｌ１、ＯｓＨｌ１及びＣｓＨｌ３のヘキセナールイソメラーゼ活性を測定した結果を図６に示す。（Ａ）がＭｓＨｌ１、（Ｂ）がＣｓＨｌ３、（Ｃ）がＯｓＨｌ１である。図中「ｅｍｐｔｙ」は、ヘキセナールイソメラーゼ遺伝子を挿入していないプラスミドで形質転換した大腸菌から調製した可溶性画分を用いた結果である。図６から明らかなように、ＭｓＨｌ１、ＯｓＨｌ１及びＣｓＨｌ３のヘキセナールイソメラーゼ活性が確認できた。【００８１】
［実施例９：酵素活性に必須のアミノ酸の特定］
９−１  アライメント
図４のアライメントに、実施例８で酵素活性を確認したＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３、ＯｓＨｌ１およびＣｓＨＩ−ｌｉｋｅの各アミノ酸配列を追加して再度アライメントを行った結果を、図７に示す。その結果、酵素活性を有するアミノ酸配列の全てに保存されているが、酵素活性がないアミノ酸配列には保存されていないアミノ酸として、ＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）の５４番目のヒスチジン（Ｈ５４）及び１２８番目のチロシン（Ｙ１２８）が該当することが見出された。【００８２】
９−２  ヘキセナールイソメラーゼの立体構造
（１）ＣａＨＩの立体構造
ＳＷＩＳＳ−ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）を利用して、配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいてＣａＨＩの立体構造を予測した。図８にＣａＨＩの立体構造を示す。図８から明らかなように、Ｈ５４とＹ１２８は非常に近接していることが明らかになった。【００８３】
（２）ＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１の立体構造
ＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１についても、ＳＷＩＳＳ−ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）を利用して、それぞれ配列番号３５、３６及び３７に示されるアミノ酸配列に基づいて立体構造を予測した。図９にＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１の立体構造中のＨ５４及びＹ１２８の近傍の拡大図を示す。（Ａ）がＭｓＨｌ１、（Ｂ）がＣｓＨｌ３、（Ｃ）がＯｓＨｌ１であり、図中の点線は直径約５Åの円を表す。いずれの酵素もＣａＨＩと同様に、Ｈ５４とＹ１２８は近接していることが明らかになった。【００８４】
（３）他の共通アミノ酸
ＣａＨＩ、ＭｓＨｌ１、ＣｓＨｌ３及びＯｓＨｌ１の立体構造解析から、いずれのヘキセナールイソメラーゼもＨ５４とＹ１２８は近接していることが明らかになったことから、Ｈ５４及びＹ１２８の近傍にさらに共通のアミノ酸が存在するか否かを確認したところ、いずれのヘキセナールイソメラーゼもＨ５４及びＹ１２８の近傍にリシン（Ｋ）を有することが見出された。このリシンはＣａＨＩのアミノ酸配列（配列番号１）の６０番目リシン（Ｋ６０）に相当するリシンであった（図７、図８、図９参照）。【００８５】
９−３  アラニン置換による酵素活性の確認
実施例６において、ＣａＨＩの５４番目のヒスチジンをアラニンに置換（Ｈ５４Ａ）した組換えタンパク質は酵素活性を持たないことが確認されている。そこで、ＣａＨＩの１２８番目のチロシン及び６０番目のリシンをそれぞれアラニンに置換した組換えタンパク質（Ｙ１２８Ａ及びＫ６０Ａ）を、実施例６と同様の方法で作製し、これらの酵素活性を測定した。なお、変異導入に用いたプライマーは以下のとおりである。【００８６】
【表６】
2016080549.tif 000008
【００８７】
結果を図１０に示す。なお、図１０には、比較のため野生型ＣａＨＩのＨＰＬＣチャートも合わせて示す。図１０から明らかなようにＹ１２８Ａ及びＫ６０Ａはいずれも酵素活性を持っていなかった。この結果から、ＣａＨＩにおいてＨ５４、Ｋ６０及びＹ１２８は酵素活性に必須のアミノ酸であり、立体構造からこれら３つのアミノ酸の存在位置が活性中心であると考えられた。【００８８】
［実施例１０：パプリカヘキセナールイソメラーゼ高発現遺伝子組換えトマトの作製］
（１）パプリカヘキセナールイソメラーゼ（ＣａＨＩ）高発現ベクターの構築
ＣａＨＩを高発現させるための発現ベクターとしてｐＲＩ１０１−ＡＮベクター（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼとしてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ｐＲＩ１０１−ＡＮベクターに組み込めるように制限酵素認識部位配列（下線）を加えたプライマーを用いて、実施例４で調製したパプリカのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＮｄｅＩ、ＳａｌＩで消化し、ｐＲＩ１０１−ＡＮベクターにＣａＨＩ遺伝子を導入したプラスミドを構築した。なお、増幅反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。【００８９】
【表７】
2016080549.tif 000009
【００９０】
（２）形質転換トマトの作製
定法に従い、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８株をＣａＨＩ遺伝子を導入したｐＲＩ１０１−ＡＮベクターで形質転換した。トマトの系統は、ｍｉｃｒｏ ＴＯＭを用いた。トマトの子葉切片に形質転換アグロバクテリウムを感染させた。感染させた子葉切片を再分化させ、不定芽を誘導させた。これを培養し、発根させた後、ゲノムＰＣＲを行い形質転換体であるかどうかを確認した。形質転換体の確認実験は、トマト葉を３ｍｍ角に切り取り、１００μＬのＤＮＡ抽出用緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ９．５、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、摩砕した。その後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＤＮＡ抽出液とした。このＤＮＡ抽出液を鋳型ＤＮＡとして、ゲノムＰＣＲ反応を行い、ＣａＨＩの増幅が確認できた個体を形質転換体とした。＃８、＃１２、＃２８、＃２９、＃３７、＃４０の計６個体の形質転換体が得られた。ゲノムＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下の通りである。【００９１】
【表８】
2016080549.tif 000010
【００９２】
（３）遺伝子組み換えトマトの葉における酵素活性の評価
得られた遺伝子組み換えトマトの葉を切り取り、重さを測定後、３０個のステンレスビーズ（３ｍｍ）とともにガラスバイアルに入れた。密栓し、激しく撹拌して組織を破砕し、２５℃で５分間静置した後に、１ｍＬの飽和ＣａＣｌ２溶液を加えた。その後、固相抽出サンプリングファイバー（ＳＰＭＥ）をガラスバイアル上部に挿し、２５℃で３０分間静置し、ファイバーに揮発性成分を吸着させた状態でＧＣ―ＭＳ解析に供した。装置にはＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用い、Ｍａｔｓｕｉら（Ｍａｔｓｕｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（４）： ｅ３６４３３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｏｎｅ.００３６４３３）に記載の条件で解析を実施した。【００９３】
図１１に、６個体の遺伝子組み換えトマトの葉の揮発性成分についてＧＣ−ＭＳ解析した結果を示す。なお、図１１には、比較のため、野生型（ＷＴ）トマトの葉の揮発成分、（Ｅ）―２−ヘキセナール標品及び（Ｚ）―３−ヘキセナール標品の結果も合わせて示す。
図１１から明らかなように、ＣａＨＩを高発現させた遺伝子組み換えトマトの葉では、（Ｚ）―３−ヘキセナールが減少し、（Ｅ）―２−ヘキセナールが増加していることが示された。【００９４】
（４）遺伝子組み換えトマトの果実における酵素活性の評価
得られた遺伝子組み換えトマトの果実（＃２８、＃２９、＃３７、＃４０）を５ｇ量り取り、液体窒素により凍結後、乳鉢で粉砕した。冷やしたファルコンチューブにサンプルを移し、パラフィルムで密栓後、固相抽出サンプリングファイバー（ＳＰＭＥ）を挿しこみ、６０分間放置してファイバーに揮発性成分を吸着させた状態でＧＣ−ＭＳ解析に供した。解析条件は、上記（３）と同じである。【００９５】
図１２に、４個体の遺伝子組み換えトマトの果実の揮発性成分についてＧＣ−ＭＳ解析した結果を示す。なお、図１２には、比較のため、野生型（ＷＴ）トマトの果実の揮発成分、（Ｅ）―２−ヘキセナール標品及び（Ｚ）―３−ヘキセナール標品の結果も合わせて示す。
図１２から明らかなように、ＣａＨＩを高発現させた遺伝子組み換えトマトの果実では、（Ｚ）―３−ヘキセナールが減少し、（Ｅ）―２−ヘキセナールが増加していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の酵素は、（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに効率よく異性化する機能を有している。そのため、植物に適用することで、植物由来の青臭さを抑制又は消失させることができる。また、パプリカのような植物由来の酵素であるため、青臭さの抑制（又は消失又は消臭）成分として、野菜ジュースのような飲食品においても安全に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年1月18日(2017.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化するための酵素であって、
配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）、及び
配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置され、アミノ酸数が３００〜４００であり、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目〜６８番目のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（Ａ２）
から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成される酵素。
【請求項１５】
アミノ酸配列（Ａ）が、アミノ酸配列（Ａ１）である請求項１４記載の酵素。
【請求項１６】
アミノ酸配列（Ａ）が、アミノ酸配列（Ａ２）である請求項１４に記載の酵素。
【請求項１７】
アミノ酸配列（Ａ２）が、さらに、配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドで構成された請求項１６に記載の酵素。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の酵素を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、さらに、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含む、組換えベクター：
（ｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列、
（ｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかで示される塩基配列に対する相同性が９０％以上である塩基配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号９〜１３、３９〜４１のいずれかにおいて１又は２〜２０個の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は付加された塩基配列。
【請求項１９】
請求項１８記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項２０】
請求項１９記載の形質転換体を培養し、培養物から請求項１４〜１７のいずれかに記載の酵素を採取する方法。
【請求項２１】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の酵素を含む飲食品。
【請求項２２】
配列番号１〜５、３５〜３７のいずれかで示されるアミノ酸配列（Ａ１）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４番目に対応する位置のアミノ酸がヒスチジン、６０番目に対応する位置のアミノ酸がリシン、１２８番目に対応する位置のアミノ酸がチロシンであり、かつアミノ酸配列に基づくタンパク質の立体構造において、前記ヒスチジン、リシンおよびチロシンが、酵素の活性中心に配置されるアミノ酸配列（Ａ２）から選択されたアミノ酸配列（Ａ）を含むポリペプチドで構成されるタンパク質を用いて（Ｚ）−３−ヘキセナールを（Ｅ）−２−ヘキセナールに異性化する方法。
【国際調査報告】
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