(57)【要約】  本発明は、Ｆｃ領域への結合力とＦａｂ領域への結合力の両方が一定以上であるペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。特定の配列を有するペプチドを提供することによって、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ2＝ＴｈｒまたはＡｒｇ
Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
Ｘａａ10＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
Ｘａａ31＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
【請求項２】
Ｘａａ2がＴｈｒである請求項１に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項３】
Ｘａａ6がＩｌｅである請求項１または２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項４】
Ｘａａ7がＬｅｕである請求項１〜３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項５】
Ｘａａ24がＡｌａである請求項１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項６】
Ｘａａ29がＶａｌである請求項１〜５のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項７】
Ｘａａ31がＬｙｓである請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項８】
Ｘａａ40がＡｓｐである請求項１〜７のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項９】
Ｘａａ42がＧｌｕである請求項１〜８のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧのＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に対して一定以上の結合能を示す免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。治療・検査などの様々な用途で、この機能を利用した技術開発がなされている。特定の分子に特異的に結合するタンパク質として最も産業利用されているものの１つに抗体が挙げられる。そして、抗原抗体反応とは別の様式で様々な抗体に特異的に結合するタンパク質も、抗体の検出や分離精製に利用できるため、産業的価値は極めて高い。【０００３】
産業的に利用される抗体は、基本的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。ＩｇＧ結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨおよびプロテインＬと呼ばれる細菌の細胞壁タンパク質がよく知られている（非特許文献１）。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）によって生産され、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するタンパク質である。プロテインＧは、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）によって生産され、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するタンパク質である。プロテインＨも、グループＧの連鎖球菌の一種（Streptococcus pyogenes）によって生産され、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するタンパク質である。プロテインＬは、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus spp.）によって産生され、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合するタンパク質である。各々のタンパク質には、１００アミノ酸残基未満のＩｇＧ結合性ドメインが複数含まれる。【０００４】
近年、免疫グロブリンＧを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる研究用試薬や臨床用医薬が盛んに開発されている。したがって、上記に挙げたタンパク質とは異なる結合特性、具体的にはＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示す免疫グロブリン結合性タンパク質も有用である。プロテインＡは、Ｆａｂ領域にも結合する特性を示すことが知られているが、結合できるＦａｂ領域はＶＨ生殖細胞遺伝子の特定のサブファミリーに属する免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に限定され、その結合力もＦｃに対する結合に比べると強くない（非特許文献１，２）。プロテインＧもＦａｂ領域に弱いながら結合することが分かっているが、プロテインＡと同様に、プロテインＧのＦａｂ領域に対する結合力は、Ｆｃ領域に対する結合に比べると結合定数（ＫA）にして１０倍程度弱いことが知られている（非特許文献１，２）。Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示すタンパク質として、例えば、プロテインＧまたはプロテインＡとプロテインＬのＩｇＧ結合性ドメインを連結したハイブリッド型タンパク質が開発されている（特許文献１，非特許文献３）。しかし、プロテインＬはκ鎖からなるＦａｂ領域のみに結合活性を示すことから、汎用性に関し改良の余地があると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平７−５０６５７３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nezlin R．ら，「Adv．Immunol．」，2004，vol．82，pp．155-215
【非特許文献２】Bostrom T．ら，「Protein Purification」（ISBN：978-953-307-831-1），2012，pp．89-136
【非特許文献３】Svensson H．ら，「BIAJOURNAL」，1999，vol．2，pp．21-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した通り、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示す免疫グロブリンＧ結合性タンパク質としては、Ｆｃ領域に結合するドメインとＦａｂ領域に結合するドメインを連結したハイブリッド型タンパク質が挙げられる。しかし、単に既存のドメインを連結するのみでは、連結するためのリンカー配列のプロテアーゼ等に対する安定性などに問題がある。したがって、１つのＩｇＧ結合性ドメインがＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示す免疫グロブリンＧ結合性タンパク質がより望まれていると言える。しかし、プロテインＡやプロテインＧは、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示すが、特にＦａｂ領域に対する結合力が低い点や特定配列に限定される点などで、十分にニーズを満たすとは言い難い。【０００８】
そこで本発明は、Ｆｃ領域への結合力とＦａｂ領域への結合力の両方が一定以上であるペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、プロテインＧのＩｇＧ結合性ドメインをベースとして、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合を示すことが期待されるアミノ酸配列を設計し、実際にそのアミノ酸配列を有するペプチドを取得して評価を行い、その結果をフィードバックして再度設計を行うというサイクルを回すことによって、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する各々の結合力が結合定数（ＫA）にして１０6［１／Ｍ］以上であるＩｇＧ結合性ペプチドを発明するに至った。【００１０】
その結果として完成した本発明を以下に示す。【００１１】
［１］  下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ2＝ＴｈｒまたはＡｒｇ
Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
Ｘａａ10＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
Ｘａａ31＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ【００１２】
［２］  Ｘａａ2がＴｈｒである上記［１］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１３】
［３］  Ｘａａ6がＩｌｅである上記［１］または［２］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１４】
［４］  Ｘａａ7がＬｅｕである上記［１］〜［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１５】
［５］  Ｘａａ24がＡｌａである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１６】
［６］  Ｘａａ29がＶａｌである上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１７】
［７］  Ｘａａ31がＬｙｓである上記［１］〜［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１８】
［８］  Ｘａａ40がＡｓｐである上記［１］〜［７］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００１９】
［９］  Ｘａａ42がＧｌｕである上記［１］〜［８］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。【００２０】
［１０］  上記［１］〜［９］のいずれかに記載のペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。【００２１】
［１１］  上記［１０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。【００２２】
［１２］  上記［１１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧのＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に対する結合力が結合定数（ＫA）にしてＫA＝１０6［１／Ｍ］以上であり、免疫グロブリンＧに対して優れた結合能を示す。Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合するペプチドは、例えば、断片化したＩｇＧと全長のＩｇＧの混合物である場合や、対象のＩｇＧの構造が不明である場合において、ＩｇＧの検出や分離精製に有効に利用することができる。よって、本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、ＩｇＧやその断片誘導体の検出や精製において新たなソリューションを提供する汎用ツールとして有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチドの発現プラスミドの作製方法を示す図である。
【図２】図２は、配列番号９〜１７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合パラメータに関し、配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを基準とした対数値のグラフである。
【図３】図３は、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーを用いた親和性測定の結果から、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合レスポンスを縦軸に、ペプチド濃度を横軸にプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明において「ペプチド」という用語は、ペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものとする。本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、その必須構造を構成するアミノ酸の数から、一般的には「タンパク質」または「（タンパク質の）ドメイン」と呼ばれることもある。
【００２６】
「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００２７】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＳｐＧ−βのＩｇＧへの結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であり、特にＣＨ１への結合が主要である（Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁）。
【００２８】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００２９】
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ2＝ＴｈｒまたはＡｒｇ
Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
Ｘａａ10＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
Ｘａａ31＝ＬｙｓまたはＡｒｇ
Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
【００３０】
本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むものであってもよいし、これらアミノ酸配列に加えて他のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、或いは他の化合物が結合しているものであってもよい。他のアミノ酸配列としては、例えば、後述するペプチド多量体において各ドメインを結合するリンカーペプチド、機能の異なる他のペプチド、水不溶性担体に本発明ペプチドを結合させるためのリンカーペプチドなどを挙げることができる。但し、本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなることが好ましい。この場合であっても、本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、後述するようにリンカー基によって水不溶性担体に固定化されていてもよいし、また、多量体の場合にはリンカー基により免疫グロブリンＧ結合性ペプチドが連結されていてもよい。
【００３１】
本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対して高い結合能を示す。具体的には、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する各々の結合力が、結合定数（ＫA）にしてＫA＝１０6［１／Ｍ］以上である。
【００３２】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドの、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合力（親和性）は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域それぞれに結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０〜４０℃の一定温度にてｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
【００３４】
結合相手の免疫グロブリンＧ分子は、Ｆｃ領域またはＦａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされない。しかし、両方を含む免疫グロブリンＧ分子を用いた場合には、２つの領域への結合を区別して検出することが難しいので、Ｆｃ領域かＦａｂ領域のどちらかのみを含む断片化ＩｇＧを用いることが好ましい。
【００３５】
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明に係るペプチドとＦｃ断片またはＦａｂ断片との親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦｃ断片またはＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明で得られたペプチドを流路に添加する実験系で求めることができる。
【００３６】
Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用した実験では、実験条件、解析方法および／または元となるＩｇＧの種類によって、パラメータのオーダーが大きく変わることがある。この場合の判断基準の１つとしては、野生型のプロテインＧを同じ実験条件や解析方法で評価した場合に、野生型のプロテインＧのＦａｂ領域への結合定数よりも大きいことが基準となる。従来の野生型プロテインＧでは、Ｆａｂ領域への結合力が小さいために、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域の両方に結合するペプチドというには性能が不十分であった。この野生型プロテインＧのＦａｂ領域への結合力を優位に上回るＦａｂ結合性を示すことが、本発明の大きな特徴と言える。なお、野生型プロテインＧは、市販の研究用試薬（例えばライフテクノロジーズ社）として容易に入手可能である。または、非特許文献２のプロテインＧの図５のＩｇＧ結合性ドメインのアミノ酸配列を有するタンパク質を調製してもよい。野生型プロテインＧのＦａｂ断片に対する結合定数ＫAを上記条件で測定・解析した場合、オーダーにして１０の５乗程度を示す。
【００３７】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、Ｆｃ断片に対する結合定数ＫAがオーダーにして１０の６乗以上で、かつ、Ｆａｂ断片に対する結合定数ＫAもオーダーにして１０の６乗以上であり、さらに好ましくは、Ｆｃ断片に対する結合定数とＦａｂ断片に対する結合定数が同じオーダーである。別の側面からは、Ｆａｂ断片に対する結合定数がＦｃ断片に対する結合定数よりも１０倍を超えない程度に強いことが、さらにより好ましい。
【００３８】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドに関し、配列同一性としては、９５％以上が好ましく、９６％以上がさらに好ましく、９７％以上がさらにより好ましく、９８％以上が特に好ましい。配列同一性は、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。また、上記範囲内でアミノ酸配列の一部が変異しても、配列番号１のアミノ酸配列の特定位置に対応するアミノ酸残基は、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。
【００３９】
本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列において、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域に対する結合性の観点から、第２位がＴｈｒ、第６位がＩｌｅ、第７位がＬｅｕ、第２４位がＡｌａ、第２９位がＶａｌ、第３１がＬｙｓ、第４０位がＡｓｐ、第４２位がＧｌｕであることが好ましい。また、第１３位がＴｈｒ、第１５位がＴｙｒ、第１９位がＩｌｅ、第３０位がＬｅｕおよび／または第３３位がＰｈｅであることも好ましい。
【００４０】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、上記アミノ酸配列に対して、１または数個のアミノ酸が付加されても本発明に含まれる。
【００４１】
付加される部位としては、Ｎ末端およびＣ末端が好ましい。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個もしくは２個、または１個程度であることができる。いずれにしても、本発明のアミノ酸配列を含有する場合には、本発明に含まれる。実施形態の１つとして、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸（Ｘａａ1またはＸａａ56）が欠失されていても、本発明に含まれる。
【００４２】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、当該配列を単ドメインとして、その単ドメインが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。これらの多量体は、単一のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００４３】
本発明によって得られる単量体タンパク質の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。また、別の観点からは、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００４４】
また、実施形態の１つとして、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【００４５】
本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンＧまたはその断片に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンＧまたはその断片に対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
【００４６】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００４７】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００４８】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００４９】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数１以上１００以下程度のペプチドをリンカー基として加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。上記ペプチドリンカー基のアミノ酸残基数としては、５０以下が好ましく、４０以下または２０以下がより好ましく、１０以下がさらに好ましい。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＦａｂ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンＧまたはその断片をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンＧまたはその断片の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、免疫グロブリンＧまたはその断片を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンＧまたはその断片はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンＧまたはその断片を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
【００５１】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該洗浄液としては、適当な変性剤や有機溶剤を含む溶液も使用できる。
【００５２】
本発明は、上記ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００５３】
また、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物や細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００５４】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００５５】
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００５６】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
【００５７】
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００５８】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００５９】
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００６０】
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
【００６１】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００６２】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００６３】
さらに、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
【００６５】
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００６６】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００６７】
本願は、２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７３号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６９】
実施例１：  ＩｇＧ結合性ペプチドの調製
（１）  ＳｐＧ変異体の発現プラスミド調製
本発明に係るアミノ酸配列（配列番号２）から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号３）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。コードＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２またはｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号４）／ｆ１−２（配列番号５）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号６）／ｆ２−２（配列番号７）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。【００７０】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、当該コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したペプチドを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製，「Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従ってプラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製，「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製，「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製，「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。【００７１】
（２）  ペプチドの調製
上記（１）で得られた、ペプチド（配列番号２）を発現するプラスミドを導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて３７℃で終夜培養した。これらの培養液を１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。【００７２】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、無細胞抽出液のレーンの分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。【００７３】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。具体的には、無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。【００７４】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後のペプチドに関して、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳｅｒがＮ末端側に付加された配列となる。【００７５】
実施例２：  ペプチドのＩｇＧ−Ｆｃ／Ｆａｂへの親和性評価
（１）  ＩｇＧ由来Ｆｃ／Ｆａｂフラグメントの調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによりＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。ここでは、抗ＲＳＶモノクローナル抗体（ＲＳＶとはＲＳウイルスの略、一般名「パリビズマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆｃ／ＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法を示す。なお、明細書中において、他のＩｇＧ−ＦｃやＩｇＧ−Ｆａｂを評価に用いている場合においても、基本的には同様の方法で調製している。【００７６】
具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤（抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体の場合には、中外製薬社製の「シナジス」）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。ＩｇＧ−Ｆｃに関しては、パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆｃを回収することで分離精製した。ＩｇＧ−Ｆａｂに関しては、ＫａｎＣａｐＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取した粗ＩｇＧ−Ｆｃ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ−Ｆｃ溶液を得た。分取した粗ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液も、同様の手法にて精製した。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。【００７７】
（２）  ペプチドのＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得したペプチドの抗ＲＳＶモノクローナル抗体のＦｃ領域とＦａｂ領域との親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−ＦｃまたはＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂまたはＩｇＧ−ＦｃのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンのみを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。ペプチドは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、１６ｎＭ、６４ｎＭ、２５６ｎＭに濃度を調整した各々のペプチド溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、１分）、および、添加終了後（解離相、１分）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ  ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。解析結果を表１に示す。【００７８】
【表１】
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【００７９】
表１に示した結果の通り、本発明で得られたペプチドは、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片に対する各々の結合力が、結合定数（ＫA）にしてＫA＝１０6［１／Ｍ］以上であることを確認した。抗ＲＳＶモノクローナル抗体から調製したＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂを用いた評価からは、Ｆａｂへの結合力の方が若干高いこと（結合定数にして１０倍も変わらないこと）が確認できた。既存のプロテインＡやプロテインＧ、およびそれらを含むハイブリッド型タンパク質では、Ｆｃへの結合の方がＦａｂへの結合よりも強いため（非特許文献２）、逆の特徴を示しつつ、両方の領域へ十分な結合力を示す本発明のペプチドは、従来に無い特徴を示すペプチドであると言える。【００８０】
（３）  様々なＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の確認
本発明で得られたペプチド（配列番号２）の、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ブリストル・マイヤーズスクイブ社販売の「アービタックス」）および抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（田辺三菱社販売の「レミケード」）から調製したＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性についても確認を実施した。ＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法は（１）と同様であり、親和性の評価も基本的には（２）と同様である。但し、ペプチド溶液の濃度は、２５ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎＭとした。解析結果を表２に示す。【００８１】
【表２】
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【００８２】
表２に示した通り、他のＩｇＧ−Ｆａｂに対しても、同オーダーの結合定数で結合することを確認した。このように、Ｆａｂに対する結合は、抗原結合部位とは異なる部位で同じ様式で結合していると考えられる。また、上記２つの抗体はキメラ抗体であり、プロテインＬが結合しにくいと言われるマウスのＶＬκのサブファミリーＶ由来のＩｇＧ−Ｆａｂを有する。この結果は、本発明で得られたペプチドの汎用性が高いことを示すデータであると捉えることも可能である。【００８３】
実施例３：  ＩｇＧ結合性ペプチドの調製と評価
本発明によって得られる、配列番号２とは異なる配列からなるペプチドに関しても、個々のペプチドを調製し、その結合性能に関して評価した。本実施例に用いたＩｇＧ結合性ペプチドの配列、コードＤＮＡ配列および発現プラスミドを以下の表に示した。【００８４】
【表３】
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【００８５】
各々のペプチドの調製に関しては、発現プラスミドの調製に用いた一本鎖オリゴＤＮＡを表３に示した組合せとした以外は、実施例１の記載と同様の方法にて調製した。得られたペプチドが、ＩｇＧ−Ｆａｂ／Ｆｃに対し、概ね同様の結合性能を示すことを確認した。代表的なデータとして、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体ＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を実施例２に記載の方法で評価し、各々の結合パラメータに関し、一緒に再測定した配列番号２のペプチドのパラメータとの比較という形で図２にグラフで示した。例えば、左のグラフの数値は、各々のペプチドの親和定数（ＫA）を配列番号２の親和定数で割った値を対数（Ｌｏｇ１０）で示している。この値が０であると同じ数値であり、１０倍大きいと１、１／１０であると−１となる。同様に、結合速度定数（ｋon）および解離速度定数（ｋoff）に関しても示した。なお、解離速度定数は小さい方が結合にプラスに作用するので、軸を反転させている。結果として、各々のペプチドのグラフの絶対値は、大きくても０．３程度となった。すなわち、各々のペプチドの結合パラメータは、配列番号２のペプチドに対応する結合パラメータに対し、０．５倍〜２倍程度の範囲に収まっている。この結果は、これらのＩｇＧ結合性ぺプチドも、ＩｇＧに対して優れた結合性を示すペプチドであることを示す結果と言える。【００８６】
比較例１：  プロテインＧのβ１ドメインの配列からなるＩｇＧ結合性ペプチドの調製
実施例１と同様の手法にて、プロテインＧのβ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２）から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号３３）を設計した。この際、実験上の都合で、第１位はＴｈｒとしている。発現プラスミドの調製に用いた一本鎖オリゴＤＮＡが、ｆ１−１（配列番号３４）、ｆ１−２（配列番号３５）およびｆ２−１（配列番号３６）である以外は、実施例１と同じ方法にて調製した。このペプチドを下記実施例４の比較対照サンプルとして用いた。【００８７】
実施例４：  濃度定量用ペプチドとしてのポテンシャル評価
実施例２（２）と同様に、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆｃ／Ｆａｂを固定化量が約１００００ＲＵとなるように別々のレーンに固定化したセンサーチップを作製した。そのセンサーチップを用いて、実施例２（２）と同様に、濃度２５，５０，１００，２００ｎＭに調製した配列番号１４で示されるＩｇＧ結合性ぺプチドを１０μＬ／ｍｉｎで流した際の、添加１分後の結合レスポンス（レゾナンスユニット値）を観測する実験を行った。結合レスポンスを縦軸に、ペプチド濃度を横軸にとったプロットを図３に示した。結合相手がＩｇＧ−Ｆｃの場合を図３（１）に、ＩｇＧ−Ｆａｂの場合を図３（２）に示す。また、比較例１で調整した公知の野生型プロテインＧのβ１ドメインと同じ配列のペプチド（配列番号３２）を用いた場合のデータも示した。【００８８】
図３に示した通り、ペプチド濃度と結合レスポンスの間には線形相関が見られた。一次の近似曲線の近似式も併せて図３に示した。また、配列番号１４のペプチドの近似曲線の傾きは、ＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂの場合のどちらでも０．５程度（０．４〜０．６）であった。一方、比較例のペプチドは、ＩｇＧ−Ｆｃの場合は０．９程度に対し、Ｆａｂの場合は０．１程度であった。本発明のペプチドは、Ｆｃに対する結合力とＦａｂに対する結合力の差が同程度であるため、同じような傾きになったと言える。標的分子への結合量を指標とした生化学的アッセイでは、濃度既知のサンプルを用いて図３のような検量線を作成し、濃度未知のサンプルの結合量を測定し、当該検量線から濃度未知のサンプルの濃度を推定する。本発明で得られたペプチドは、免疫アッセイ等で広く有用なＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−Ｆａｂの両方に結合するだけでなく、このように両方に対し同程度の結合力を示すため、検量線の傾きも同程度となる。これは、定量する相手分子がＩｇＧ−Ｆｃの場合とＩｇＧ−Ｆａｂの場合で、同じようなシグナルが得られるため、別々に定量系をカスタマイズする必要が省けるというメリットをもたらすと言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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