(57)【要約】  本発明は、毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、吸着体に好適な狭い細孔径分布と細孔形状を有する吸着性の優れたセルロースビーズを製造する方法を提供する。本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、ｂ）前記セルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加え混合液を作製する工程、ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、
ｂ）前記セルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加え混合液を作製する工程、
ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、
ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項２】
前記ａ）の工程における前記アルカリ水溶液の液温が０〜２５℃であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶性低分子有機化合物が、アミノ酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項４】
前記水溶性低分子有機化合物が、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択される１以上のアミノ酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項５】
前記分散媒が、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸トリグリセリド、脂肪族炭化水素系溶媒および芳香族炭化水素系溶媒からなる群から選択される１以上の油溶性溶媒であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項６】
前記凝固溶媒が、アルコール系溶媒、または水とアルコール系溶媒との混合溶媒であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法で得られたビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化したことを特徴とする吸着体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズ、および、目的物と相互作用するリガンドを含むことを特徴とする吸着体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより吸着体を得る工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の吸着体を用いることを特徴とする精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質セルロースビーズを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質セルロースビーズは、他の合成系高分子を用いる場合に比べて安全性が高く、非特異的吸着が少ないという利点がある。また、機械的強度が大きく、また、吸着すべき目的物質と相互作用するリガンドを導入するのに利用できる水酸基を多く含有する等の利点もある。そこで、多孔質セルロースビーズは、各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体などの各種吸着体用の基材として用いられている。特に、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製でき、且つ不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体または医療用吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。【０００３】
また、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる抗体医薬品精製用吸着体としての利用が注目されている。【０００４】
多孔質セルロースビーズの製造は、セルロースの溶解が困難であるとされていたことから、通常の合成ポリマーと比べて煩雑な工程を含むものが多い。その一つとして、チオシアン酸カルシウム水溶液など腐食性や毒性が高く、設備化の難易度を高くしてしまう溶媒に溶解し、凝固する方法が開示されている（例えば特許文献１）。この方法で用いられるセルロース溶液が特異な挙動を示し、また、この方法で得られる多孔質セルロースビーズは、かなり大きい細孔を有しており、また細孔径分布も広いことが知られている（例えば非特許文献３）。よって、当該方法で得られた多孔質セルロースビーズを抗体などの吸着体として用いる場合、比表面積が小さいことから、高い吸着性能を示すことは期待できない。一方、セルロースの溶解性を上げるためにセルロースの水酸基に置換基を付与し、汎用の溶媒に溶解させて造粒を行い、造粒後に置換基を脱離させて多孔質セルロース系担体を得る方法が例示されている（例えば特許文献２）が、工程が煩雑であり、置換基を付与したり脱離させたりする過程で分子量の低下が起こり、近年求められている高速処理や大スケールで使用するのに適切な強度が得られ難い傾向がある。【０００５】
一方、セルロースを低温の水酸化ナトリウム水溶液に溶解できるという方法が開示されている（例えば特許文献３、４）。しかしながら、特許文献３に記載の方法では、セルロースと水素結合切断剤（a hydrogen bond-cleaving solution）の混合物を、加圧下、１００〜３５０℃で加熱する工程を経てから、アルカリ水溶液に溶解している。このような工程は、工業的に不利である。また、特許文献４に記載の方法では、セルロースを強塩基溶液に分散させ、当該分散液をいったん凍結させた後に溶解するという工程が必要である。【０００６】
さらに、特許文献５にはアルカリ溶液に溶解性を示すセルロースが開示されているが、当該セルロースはミクロフィブリルの繊維径が１μｍ以下、さらには５００ｎｍ以下に微細化されたものである。このような微細化処理は、工業的製造には適さない。【０００７】
ごく最近、特許文献６に示されるように、微生物セルロースをアルカリ溶液に溶解してセルロース溶液を作製し、分散溶媒を添加後に粒子化した後、微生物セルロース粒子を凍結させ、次に洗浄することによりセルロースビーズを得る方法が開示されているが、工程が煩雑で工業的な製法には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−２４２７７０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０２５３７１
【特許文献３】米国特許４６３４４７０号公報
【特許文献４】米国特許５４１００３４号公報
【特許文献５】特開平９−１２４７０２号公報
【特許文献６】特開２０１０−２３６９７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０５１，２００５，ｐ．６３５−６４６
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５２，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２００６，ｐ．７１２ｅ１−７１２ｅ６
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．１９５，１９８０，ｐ．２２１−２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、効率良く、吸着体に好適な狭い細孔径分布と細孔形状を有する吸着能の優れたセルロースビーズを製造する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、低温のアルカリ水溶液とセルロース粉末とを混合して作製したセルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加えることで、よりシャープな細孔径分布を有し、また、リガンドを固定化した場合により高い吸着能を得られる多孔質セルロースビーズを良好に製造できることを見出して、本発明を完成した。【００１２】
以下、本発明を示す。【００１３】
［１］  ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、
ｂ）前記セルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加え混合液を作製する工程、
ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、
ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１４】
［２］  前記ａ）の工程における前記アルカリ水溶液の液温が０〜２５℃であることを特徴とする上記［１］に記載の方法。【００１５】
［３］  前記水溶性低分子有機化合物が、アミノ酸であることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１６】
［４］  前記水溶性低分子有機化合物が、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択される１以上のアミノ酸であることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１７】
［５］  前記分散媒が、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸トリグリセリド、脂肪族炭化水素系溶媒および芳香族炭化水素系溶媒からなる群から選択される１以上の油溶性溶媒であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１８】
［６］  前記凝固溶媒が、アルコール系溶媒、または水とアルコール系溶媒との混合溶媒であることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１９】
［７］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法で得られたビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化したことを特徴とする吸着体。【００２０】
［８］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズ、および、目的物と相互作用するリガンドを含むことを特徴とする吸着体。【００２１】
［９］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより吸着体を得る工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。【００２２】
［１０］  上記［７］または［８］に記載の吸着体を用いることを特徴とする精製方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、効率よく吸着体に好適な狭い細孔径分布と細孔形状を有する吸着性の優れたセルロースビーズを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１で得られたビーズの表面拡大ＳＥＭ観察像である。
【図２】比較例１で得られたビーズの表面拡大ＳＥＭ観察像である。
【図３】実施例３〜５および比較例３で得られたビーズの細孔径分布を示すグラフである。
【図４】実施例３，６および比較例３で得られたビーズの細孔径分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースを混合してセルロース微分散液を作製する工程、ｂ）前記セルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加え混合液を作製する工程、ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させて多孔質セルロースビーズを得る工程を含むことを特徴とする。低温の水酸化ナトリウム水溶液にセルロースを分散させ、凝固溶媒に接触させることにより、多孔質セルロースが得られることは、本出願人により開発済である（国際公開ＷＯ２０１２／１２１２５８など）。
【００２６】
理由は定かではないが、驚くべきことに、本発明者らは、水溶性低分子有機化合物をセルロース微分散液に添加することにより、水溶性低分子有機化合物を添加しない場合に比べ吸着量がより大きい吸着体を得ることができることを見出した。おそらく、水溶性低分子有機化合物がセルロース微分散液中で好適に分散され、微小領域を形成し、凝固溶媒または洗浄溶媒に水溶性低分子有機化合物が移動することで、吸着に有利な孔を形成せしめるためではないかと考えている。
【００２７】
以下、本発明方法を工程ごとに説明する。
【００２８】
工程ａ  セルロース微分散液の作製工程
本工程では、低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する。
【００２９】
ここで低温とは、常温より低い温度を指す。常温より低ければ大きな問題は無いが、−２０℃以上であれば温調設備が簡便でランニングコストも低くなるため好ましい。また１０℃以下であればセルロース分散液の着色が少なくなり、またセルロースの分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。当該温度としては、−１０℃以上、２０℃以下が好ましい。−１０℃以上であればアルカリ水溶液の凍結を抑制することができる。一方、２０℃以下であれば、セルロース分散液を効率的に調製でき、また、セルロース分散液の着色を抑制することができる。当該温度としては、−５℃以上がより好ましく、−２℃以上がさらに好ましく、−１℃以上が特に好ましく、セルロース分散液に用いる水のハンドリング性や温度調整の簡便さから０℃以上であることが最も好ましい。中でも、１５℃以下がより好ましく、９℃以下がさらに好ましく、５℃以下がさらに好ましく、４℃以下がさらに好ましく、１℃以下がさらに好ましい。また、当該温度が９℃以下であれば、得られる多孔質セルロースビーズの真球度が高くなるため好ましい。
【００３０】
アルカリは、水溶液となった際にアルカリ性を示すものであれば特に限定なく用いることができる。入手のしやすさから水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、製品安全性や価格の面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。
【００３１】
前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３〜２０重量％であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５〜１５重量％であり、さらに好ましくは７〜１０重量％、最も好ましくは８〜１０重量％である。
【００３２】
前記セルロースの種類には特に限定は無い。例えば、本発明方法では、セルロースを溶解させなくてもよいので、溶解性を上げるための置換基を導入したセルロースなど、置換セルロースを用いる必要はなく、通常の無置換セルロースを原料として用いることができる。但し、セルロースをアルカリ水溶液に効率的に分散させるために、セルロースとしてはセルロース粉末を用いることが好ましい。
【００３３】
用いるセルロース原料の分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られる多孔質セルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上５００以下、さらに好ましくは１００以上４００以下、特に好ましくは２００以上３５０以下、最も好ましくは２５０以上３５０以下である。
【００３４】
セルロース微分散液におけるセルロースの濃度は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、１重量％以上、２０重量％以下程度とすればよい。当該濃度としては、２重量％以上がより好ましく、５重量％以上がさらに好ましく、また、１５重量％以下がより好ましく、１０重量％以下がさらに好ましい。
【００３５】
セルロース微分散液の調製方法は、常法に従えばよい。例えば、アルカリ水溶液とセルロースとの混合物を、低温に維持しつつ、激しく攪拌すればよい。
【００３６】
工程ｂ  セルロースと水溶性低分子有機化合物を含む混合液の作製工程
次に、前記セルロース微分散液に水溶性低分子有機化合物を加え混合液を作製する。
【００３７】
本発明で用いることができる前記水溶性低分子有機化合物には特に限定は無い。ここでいう低分子とは、有機樹脂のように重合などにより高分子化していないものを指し、望ましくは分子量が１０００以下のものである。また、本発明でいう水溶性とは水に対して無限溶解することはもちろん、比較的高い溶解度を持つもので十分である。具体的には、例えば、２０±５℃において、１ｇまたは１ｍＬを溶解するのに要する水の量が３０ｍＬ未満である有機化合物を用いることができる。かかる水の量としては、１０ｍＬ未満がより好ましく、１ｍＬ未満がよりさらに好ましい。
【００３８】
具体的な水溶性低分子有機化合物としては、ブタノール、プロパノールなどのアルコール類；プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、トリエチレングリコールなどのポリオール類；蔗糖、果糖等の糖類；メチルセロソルブ、ブチルセロソルブなどのセロソルブ類；ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテルなどのカルビトール類；テトラエチレングリコールジメチルエーテル、１、４−ジオキサンなどのエーテル類；エチレングリコールモノメチルエーテルアセテートなどのエステル類などが使用できる。
【００３９】
また、本発明で用いることができる前記水溶性低分子有機化合物は、常温で固体であることが、吸着量がより大きくなるため好ましい。例えば、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などのアルキル硫酸エステル塩類；クエン酸などの固体有機酸またはその塩；塩化アルキルトリメチルアンモニウムや塩化ジアルキルジメチルアンモニウムなどの第四級アンモニウム塩；グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどのアミノ酸またはその塩；ビタミンＣ、ビタミンＢなどのビタミン類などが挙げられる。
【００４０】
また、前記水溶性低分子有機化合物は、毒性の低い化合物であることが、製品安全性の観点から、より好ましい。毒性の低い水溶性低分子有機化合物としては、アミノ酸やビタミン類などが挙げられる。アミノ酸の中ではグリシン、アラニン、リジンが、ビタミン類の中ではビタミンＣ、ビタミンＢが比較的安価に入手可能という観点から好ましい。
【００４１】
前記水溶性低分子有機化合物の使用量は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば、前記混合液における水溶性低分子有機化合物の濃度が０．１重量％以上、５重量％以下程度になるようにすればよい。
【００４２】
前記水溶性低分子有機化合物のセルロース分散液中への添加方法に特に限定は無い。例えば、セルロース分散液中に水溶性低分子有機化合物を添加してもよいし、セルロース分散液を作製中に水溶性低分子有機化合物を添加しておいてもよい。また、水溶性低分子有機化合物が液体であれ、固体であれ、そのまま添加してもよいし、溶媒に溶解させて溶液として添加してもよいし、分散液やスラリーとして添加してもよい。この場合の溶媒や分散媒に特に限定は無く、有機溶媒や水を使用することができる。水溶性低分子有機化合物添加時の温度条件に特に限定は無いが、２５℃以下であることがビーズの着色を防ぐ観点から好ましい。
【００４３】
また水溶性低分子有機化合物は必ずしもセルロース分散液中で均一分散、または溶解している必要は無いが、均一分散または溶解させたい場合は、自然拡散や攪拌、振盪といった操作を実施することができる。
【００４４】
前記混合液から多孔質ビーズを得る方法としては、ＷＯ２０１２／１２１２５８等に記載されている公知の造粒方法を適用することが出来る。また本発明の多孔質ビーズにさらに公知の架橋方法を適用することもできる。この国際公報の全内容が、本願に参考のため援用される。以下、以降の工程についても簡単に説明する。
【００４５】
工程ｃ  エマルションの作製工程
本工程では、前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する。
【００４６】
エマルションを構成する分散媒としては、例えば、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸グリセリド、脂肪族炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒を挙げることができる。また、非イオン界面活性剤などの界面活性剤を用いてもよい。
【００４７】
動植物油脂としては、パーム油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、豚脂、牛脂、ナタネ油、米油、落花生油、オリーブ油、コーン油、大豆油、シソ油、綿実油、ヒマワリ油、月見草油、ゴマ油、サフラワー油、ヤシ油、カカオ脂、パーム核油、魚油、ワカメ油、コンブ油などを挙げることができる。水素添加動植物油脂としては、パーム硬化油、パーム極度硬化油、ナタネ硬化油、ナタネ極度硬化油、大豆硬化油、豚脂硬化油、魚油硬化油などを挙げることができる。脂肪酸グリセリドとしては、トリ−、ジ−、モノ−グリセリドのいずれでもよく、ステアリングリセリド、パルミチングリセリド、ラウリングリセリドなどを挙げることができる。脂肪族炭化水素系溶媒としては、ミツロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウなどを挙げることができる。芳香族炭化水素系溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンなどを挙げることができる。
【００４８】
エマルション作製のために、さらに界面活性剤を適量添加してもよい。界面活性剤としては、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。
【００４９】
分散媒の使用量は、前記混合液の液滴を十分に分散できる量とすればよい。例えば、前記混合液に対して１質量倍以上とすることができる。一方、分散媒の量が多過ぎると廃液量が過剰に増えるおそれがあり得るので、当該割合としては１０質量倍以下が好ましい。当該割合としては、２質量倍以上がより好ましく、４質量倍以上がより好ましく、また、８質量倍以下がより好ましく、７質量倍以下がさらに好ましく、６質量倍以下が特に好ましい。
【００５０】
エマルションは、常法により調製すればよい。例えば、前記混合液、分散媒および界面活性剤を含む混合液を激しく攪拌することにより調製することができる。
【００５１】
工程ｄ  凝固工程
次に、前記エマルションを凝固溶媒に接触させることによりセルロース微分散液の液滴から溶媒を抽出し、多孔質セルロースビーズを得る。
【００５２】
凝固溶媒は、セルロースの微分散液の溶媒に親和性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、アルコール系溶媒、および水とアルコール系溶媒との混合溶媒を挙げることができる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどのＣ1-4アルコールを挙げることができる。アルコール水溶液における水とアルコール系溶媒の割合は、例えば、体積比で水：アルコール系溶媒＝８０：２０〜５：９５とすることができる。
【００５３】
凝固溶媒の使用量は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、使用した前記混合液に対して２０ｖ／ｗ％以上、１５０ｖ／ｗ％以下程度とすることができる。
【００５４】
凝固方法は特に制限されないが、エマルションは不安定である場合があるので、液滴同士が結合しないよう激しく攪拌した状態で凝固溶媒を添加することが好ましい。
【００５５】
凝固溶媒を添加した後は、凝固した多孔質セルロースビーズを濾過や遠心分離などにより分離し、水やアルコールなどで洗浄すればよい。得られた多孔質セルロースビーズは、粒径を揃えるため、篩などを用いて分級してもよい。
【００５６】
工程ｅ  多孔質セルロースビーズの架橋工程
以上で得られた多孔質セルロースビーズは、強度を高めるために、架橋剤により架橋して架橋多孔質セルロースビーズとすることが好ましい。
【００５７】
架橋剤は、セルロース上の水酸基と共有結合を形成できる反応性基を２以上有し、セルロース分子間を架橋できるものをいう。本発明で用いることができる架橋多孔質セルロースビーズの架橋の条件や架橋剤に特に限定は無い。例えばＷＯ２００８/１４６９０６に記載の方法を用いることができる。この国際公報の全内容が、本願に参考のため援用される。
【００５８】
架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、二種以上を併用してもよい。
【００５９】
多孔質セルロースビーズを架橋剤により架橋する反応の溶媒は適宜選択すればよいが、例えば、水の他、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール系溶媒や、アセトニトリルなどのニトリル系溶媒などの水混和性有機溶媒を挙げることができる。また、架橋反応溶媒は、２以上を混合して用いてもよい。
【００６０】
架橋反応は、複数回実施してもよく、各回で反応溶媒や架橋剤を変更してもよい。例えば、１回目の架橋反応を水混和性有機溶媒中で行い、最終回の架橋反応を水中で行ってもよい。この場合、途中の溶媒組成は、１回目と最終回のどちらかと同じであっても異なっていてもよく、それらの中間組成であってもよい。さらには全ての回を水溶媒中で実施してもよい。架橋剤についても同様である。なお、架橋反応を複数回繰り返す場合、各架橋反応の間では、架橋多孔質セルロースを水などで洗浄して架橋剤を除去することが好ましい。
【００６１】
架橋反応を促進するために、反応液には塩基を添加してもよい。かかる塩基としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物；炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウムなどアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸ナトリウムや炭酸カリウムなどアルカリ金属の炭酸塩；トリエチルアミンやピリジンなどの有機塩基を挙げることができる。
【００６２】
架橋反応後は、架橋多孔質セルロースビーズは不溶性であることから、水などの溶媒で洗浄すればよい。
【００６３】
工程ｆ  リガンドの固定化工程
本発明に係る多孔質セルロースビーズは、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより、吸着体とすることができる。本発明で得ることができる吸着体は非特異吸着が少ないといった特性を有していることから、安全性が高い薬や治療の提供が可能で、さらには精製や治療時に中間洗浄工程等を省力化することが可能となる。
【００６４】
本発明における「リガンド」とは、吸着体に吸着させることにより精製すべき目的物に対して特異的な親和力を有し、目的物と相互作用するアフィニティーリガンドをいう。例えば、目的物が抗体である場合、抗体に特異的に相互作用する抗原、タンパク質、ペプチド断片などを挙げることができる。本発明に係る吸着体のために用いることができるリガンドは、本発明に係る吸着体を用いて精製すべき目的物に特異的な親和性を有するものであれば特に制限されない。
【００６５】
本発明に係る多孔質セルロースビーズにリガンドを固定化する方法は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、笠井献一ら著，「アフィニティークロマトグラフィー」東京化学同人，１９９１年の表８・１、表８・２、図８・１５に示されるような、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニルジイミダゾール法、アシルアジド法等を用いてアミノ基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、ジアゾカップリング法等を用いて水酸基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法等を用いて、チオール基含有リガンドを固定化する方法；アミノ化担体にカルボン酸含有リガンドやホルミル基含有リガンドを固定化する方法等の様々な固定化方法を挙げることができる。当該文献の全内容が、本願に参考のため援用される。
【００６６】
本発明に係る吸着体は、精製用吸着体として用いることが可能であるが、近年注目されている抗体医薬品精製用吸着体や医療用吸着体としても用いることが可能である。抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬやそれらの変異体、抗体結合活性を有するペプチド等のアミノ基含有リガンドを挙げることができる。
【００６７】
特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる吸着体として、プロテインＡ、プロテインＧ、またはそれらの変異体をリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている。本発明に用いることができる上記プロテインＡ等には特に限定は無く、天然物や遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン、その変異体、それらのオリゴマーを含むもの、融合蛋白質等であってもよい。かかるオリゴマーの重合数としては、２以上、１０以下とすることができる。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡ等を用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０、ＷＯ２００３／０８０６５５、特開２００６−３０４６３３、ＷＯ２０１０／１１０２８８に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。これら公報の全内容が、本願に参考のため援用される。プロテインＡを固定化した本発明の吸着体は、拡張性心筋症などの治療に使用できる治療用吸着体として利用することもできる。また、デキストラン硫酸などを固定化した本発明の吸着体は、高コレステロール血症治療用吸着体として利用することができる。
【００６８】
リガンドを多孔質セルロースビーズに導入する方法としては、前述の様々な固定化方法から選択することができるが、より好ましいのは多孔質粒子が含有するホルミル基と、リガンドのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法である。例えば、特開平１−２７８５３４号公報に記載の方法がある。当該公報の全内容が、本願に参考のため援用される。
【００６９】
本発明の吸着体のリガンドの固定化量は特に制限されないが、例えば、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下とすることができる。当該割合が１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。リガンドの固定量としては、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、２ｍｇ以上がより好ましく、４ｍｇ以上がさらに好ましく、５ｍｇ以上が特に好ましく、また、５００ｍｇ以下がより好ましく、２５０ｍｇ以下がさらに好ましく、２００ｍｇ以下が特に好ましく、１００ｍｇ以下が最も好ましい。
【００７０】
本発明の吸着体の用途に特に限定は無いが、医療用吸着体、中でも表面開孔度を向上できることから、サイズの大きい病因物質（ＬＤＬコレステロール等）を吸着除去する治療用吸着体に好適に用いることができる。また、各種クロマト担体、なかでも大径カラムに充填される産業用クロマト担体として用いることができる。特に近年需要が旺盛な抗体医薬品精製用吸着体として用いる場合に、その効果を発揮することができる。このような観点から、本発明の多孔質ビーズにプロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬを導入した吸着体として好適に用いることができる。
【００７１】
本発明に係る吸着体を用いて、目的物を精製することができる。具体的には、本発明の吸着体と、目的物を含む溶液とを接触させればよい。接触方法は特に制限されず、目的物を含む溶液中に本発明に係る吸着体を添加してもよいし、上記のようにカラムに本発明の吸着体を充填し、目的物を含む溶液を通液することにより、本発明の吸着体に目的物を選択的に吸着させればよい。本発明に係る吸着体は強度が高いため、特にカラムに充填する場合、高速度での通液が可能になり、目的物を効率的に精製することができる。
【００７２】
次に、目的物が選択的に吸着した本発明の吸着体を、濾過や遠心分離などにより溶液から分離する。この工程により、目的物とその他の物質を分離することができる。さらに、溶出液を用い、目的物を本発明吸着体から分離する。溶出液としては、例えば、ｐＨが２．５以上、４．５以下程度の酸性緩衝液を用いることができる。
【００７３】
本願は、２０１３年１０月１５日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１５１２０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年１０月１５日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１５１２０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。先ず、製造された多孔質セルロースビーズの物性の試験方法につき説明する。【００７５】
試験例１  ビーズ表面のＳＥＭ観察
各製造例、参考例で得られた多孔質セルロースビーズ、または吸着体を５倍体積量の３０％エタノールで洗浄し、多孔質セルロースビーズに含まれる液体部分を３０％エタノールで置換した。次いで、５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、特級エタノール、特級エタノール、特級エタノールを順に用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理し、液体部分をエタノールで置換した。さらにｔ−ブチルアルコール／エタノールが３／７の混合液を用いて多孔質セルロースビーズを同様に処理した。次いで、ｔ−ブチルアルコール／エタノール＝５／５、７／７、９／１、１０／０、１０／０、１０／０の混合液を用いて多孔質セルロースビーズを処理し、液体部分をｔ−ブチルアルコールで置換した後、凍結乾燥した。凍結乾燥を行なった多孔質セルロースビーズに蒸着処理を行い、ＳＥＭ像を撮影した。【００７６】
試験例２  ＲＴ（Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ）３分での動的吸着量測定
（１）  溶液調製
以下の溶液を調製した。【００７７】
Ａ液：ｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）
Ｂ液：ｐＨ３．５Ｍの３５ｍＭ酢酸ナトリウム（ナカライテスク社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調製）
Ｃ液：１Ｍ酢酸（ナカライテスク社製の酢酸とＲＯ水で調製）
Ｄ液：１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（ニチヤク社製「ガンマグロブリンニチヤク」１５００ｍｇ／１０ｍＬとＡ液で調製）
Ｅ液：６Ｍ尿素（関東化学社製の尿素とＲＯ水で調製）
各溶液は、使用前に脱気した。【００７８】
（２）  充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調製）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットした。この溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。【００７９】
（３）  ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液を、ＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。ここで、５％破過した時のＩｇＧ負荷量をＲＴ３分での５％ＤＢＣとした。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ、Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、再生処理を行った。【００８０】
試験例３  エポキシ基定量
エポキシ化多孔質セルロースビーズを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製「３Ｇ−２」）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、サクションドライ後の多孔質担体１．５ｇをスクリュー管（マルエム社製）に秤量し、１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製チオ硫酸ナトリウムとＲＯ水で調製）４．５ｍＬを加えた。４５℃で３０分間加温した後、ＲＯ水を加えて液量を５０ｍＬとし、１００ｍＬのガラス製ビーカーに移し、１％フェノールフタレイン溶液（和光純薬工業社製フェノールフタレインとエタノールで調製）を数滴添加した。０．０１Ｎ塩酸（和光純薬工業社製、容量分析用）で滴定し、エポキシ基含量を求めた。【００８１】
試験例４  ＬＤＬコレステロール量の測定
健常人新鮮血１００ｍＬにヘパリン５００μＬを添加し、穏やかに混和することにより、抗凝固処理を行った。抗凝固処理した健常人新鮮血を３０００ｒｐｍで１５分間遠心処理を行い、ＬＤＬコレステロール濃度が７０ｍｇ／ｄＬの血漿を得た。この血漿３ｍＬを生理食塩水で洗浄した吸着体０．５ｍＬに加えて、３７℃で２時間振盪した。振盪後の上清のＬＤＬコレステロール量をＬＤＬコレステロールキット（積水メディカル社製「コレステストＬＤＬ」）を用いて測定し、吸着体に吸着されたＬＤＬコレステロール量を求めた。また比較のため、吸着体の代わりに生理食塩水を同量用いた以外、前記と同様の操作を行った溶液のＬＤＬコレステロール量を求めた。【００８２】
ＬＤＬコレステロールの吸着率（％）＝［（Ｃ0−Ｃ1）／Ｃ0］×１００
［式中、Ｃ0は生理食塩水を用いた吸着操作におけるＬＤＬコレステロールの濃度を示し、Ｃ1は吸着体を用いた吸着操作におけるＬＤＬコレステロールの濃度を示す］
製造例１  プロテインＡの調製
本発明で使用した無配向型プロテインＡは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分にあたり、ＷＯ２００６／００４０６７においてＳＰＡ’として記載されているものである。当該プロテインＡを、ＷＯ２００６／００４０６７の実施例に記載の方法に準じて調製した。なおこのＷＯ２００６／００４０６７の全内容が、本願に参考のため援用される。【００８３】
実施例１
（１）  アルカリ水溶液の作製
和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、３３ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、その温度を４℃に調整した。【００８４】
（２）  水溶性低分子有機化合物を添加したセルロース分散液の作製
セパラブルフラスコに７０ｇの蒸留水と９．３ｇのセルロースを投入し、二段ディスクタービン（ｒｕｓｈｔｏｎ  ｔｕｒｂｉｎｅ）翼を用いてスラリーの温度が４℃になるまで、１５０〜２００ｒｐｍで３０分間攪拌した。次いで、４℃に冷却した３３ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を４１ｇ添加し、５００ｒｐｍの速度で攪拌しながら３０分間保持した。その後、作製したセルロース分散液に水溶性低分子有機化合物として６ｗｔ％グリシン水溶液３３ｇを添加し、６００ｒｐｍの速度で１５分間撹拌を行った。【００８５】
（３）  液−液分散による多孔質セルロースビーズの作製
上記セルロース分散液に、１ｗｔ％のソルビタンモノオレエートが溶解した７８８ｇのｏ−ジクロロベンゼン溶液を投入し、４℃で６００ｒｐｍ、１５分間撹拌することでセルロース液滴を分散させた。凝固溶剤としてメタノールを７４ｍＬ添加し、４℃で６００ｒｐｍ、３０分間攪拌した。その後、ガラスフィルター（ＴＯＰ社製「２６Ｇ−３」）で溶液を濾過し、次いで５倍体積量のメタノール、５倍体積量の蒸留水の順に洗浄を行ない、セルロースビーズを回収した。【００８６】
（４）  多孔質セルロースビーズの分級
得られた多孔質セルロースビーズを、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。【００８７】
（５）  多孔質セルロースビーズの架橋
分級後の上記多孔質セルロースビーズ２０ｍＬに蒸留水を加えて３０ｍＬとし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３ｇ投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製水酸化ナトリウムと蒸留水で調製）７．１ｍＬを用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。さらに同じ架橋反応をもう１回実施し、架橋２回ビーズを得た。【００８８】
得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。【００８９】
（６）  吸着体作製
下記手順に従って、プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。上記（５）で得られた架橋多孔質セルロースビーズ１１．０ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を１７．０ｍＬとし、５０ｍＬの遠沈管に入れ、これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）上に取り付けた後、攪拌した。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させた、８．６４ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を６．０ｍＬ調製し、先程の架橋多孔質セルロースビーズを入れた遠沈管に加え、２５℃で１時間攪拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ９．０ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で０．５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物（関東化学社製）＋０．１５Ｍ塩化ナトリウム（関東化学社製）バッファー３０ｍＬで置換した。ｐＨ８の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物＋０．１５Ｍ塩化ナトリウムバッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に入れ、総体積量１４．０ｍＬとなるように液量を調整した。【００９０】
ここに、上記製造例１で調製したプロテインＡの濃度が、６７．５８ｍｇ／ｍＬの溶液を５．３２７ｇ加えた後、６℃にて、０．０８Ｎ  ＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を用いて、ｐＨを１２に調整した後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用い、攪拌させながら反応させた。２３時間反応後、反応液のｐＨが５．０になるように２．４Ｎクエン酸（関東化学社製クエン酸とＲＯ水で調製）を用いてｐＨ調整した後、６℃で４時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて、攪拌させた。引き続き、５．５％ジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）水溶液（キシダ化学社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調製）を０．３９ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇させ、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定しプロテインＡの導入量を求めた。反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、当該ビーズに３倍体積量の０．１Ｎクエン酸水溶液（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。【００９１】
酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク製水酸化ナトリウム、関東化学社製硫酸ナトリウム及びＲＯ水で調製）を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【００９２】
アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．５Ｎクエン酸三ナトリウム水溶液（関東化学社製クエン酸三ナトリウム二水和物＋ＲＯ水で調製）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。得られた吸着体の物性評価を行った結果、プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）で、ＲＴ３分での５％ＤＢＣが３９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）であった。また、このビーズ表面のＳＥＭ観察像を図１に示した。【００９３】
比較例１
セルロース分散液作製時に水溶性低分子有機化合物としてグリシン水溶液を添加しないこと以外は、実施例１と同様に吸着体を作製した。得られた吸着体の物性評価を行った結果、プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）で、ＲＴ３分での５％ＤＢＣが３１ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）であった。また、このビーズ表面のＳＥＭ観察像を図２に示した。【００９４】
実施例２
（１）エポキシ化
実施例１の（３）と同様に作製した未架橋セルロースビーズを、３８μｍと１５０μｍの篩を用いて湿式分級した。この分級後のビーズ１体積部にＲＯ水１体積部を加え、さらに２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１．０６体積部加えて４５℃で３０分間加温した。次にエピクロロヒドリンを０．３６体積部加えて４５℃２時間攪拌した。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、エポキシ基含有多孔質セルロースビーズを得た。エポキシ含有量は湿潤重量１ｇあたり３４μｍｏｌであった。【００９５】
（２）  デキストラン硫酸の固定化
エポキシ基含有多孔質セルロースビーズ０．７体積部に２６ｗｔ／ｖｏｌ％のデキストラン硫酸（硫黄含量約１８％、分子量約４０００）水溶液を添加して、液量を１．０体積部とした。次いで２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ｐＨを９．５に調整した。その後、４０℃１６時間攪拌した。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、デキストラン硫酸が固定化されたビーズを得た。【００９６】
（３）  残存エポキシ基の封止
デキストラン硫酸固定化ビーズ１体積部にＲＯ水１体積部とモノエタノールアミン０．２５体積部を添加し、４５℃で２時間攪拌し、残存エポキシ基の封止反応を行った。グラスフィルター上で濾過を行い、大量のＲＯ水でビーズを洗浄し、目的とする吸着体を得た。【００９７】
試験例４の方法により測定したところ、得られた吸着体のＬＤＬコレステロールの吸着率は９８．４％で、吸着量は３．７ｇ/Ｌ（吸着体体積）であった。【００９８】
比較例２
セルロース分散液作製時に水溶性低分子有機化合物としてグリシン水溶液を添加しないこと以外は、実施例２と同様に吸着体を作製した。得られた吸着体のＬＤＬコレステロールの吸着率は９１．９％で、吸着量は３．４ｇ／Ｌ（吸着体体積）であった。【００９９】
参考例１
吸着型血漿浄化器「リポソーバー  ＬＡ−１５」（カネカ社製）に充填されている吸着体を用いた以外は、実施例３と同様にＬＤＬコレステロール吸着試験を行った。その結果、ＬＤＬコレステロールの吸着率は９３．５％で、吸着量は３．５ｇ／Ｌ（吸着体体積）であった。【０１００】
実施例３
（１）  多孔質セルロースビーズの作製
上記実施例１（１）〜（３）と同様にして、多孔質セルロースビーズを作製した。得られた多孔質セルロースビーズを篩い分けし、粒子径３８μｍから１５０μｍの多孔質セルロースビーズを集めた。集めた多孔質セルロースビーズ１００ｍＬに含まれる液体部分をエタノールで置換した後、反応容器に移し、セルロースビーズとエタノールの合計量が９７ｇとなるようにした。そこに蒸留水２８ｇとエピクロロヒドリン８０ｍＬを添加した。溶液温度を４０℃に調整し、１．８Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製水酸化ナトリウムと蒸留水で調製）を９６ｍＬ添加し、架橋反応を開始させた。反応開始から１．５時間後に１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ添加し、反応開始から３時間後と４．５時間後にも１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ添加した。反応開始から６時間後にゲルを回収し、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄した。【０１０１】
上記架橋反応で得られた架橋セルロースビーズを反応容器に移し、セルロースビーズと蒸留水の合計量が１１６．７ｇとなるようにした。そこに硫酸ナトリウムを３７．８ｇ添加、溶解させた後、エピクロロヒドリンを３３ｍＬ添加し、４０℃で保持した。１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を２１ｍＬ添加し、架橋反応を開始させ、反応開始から２．５時間後に１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を５ｍＬ添加した。反応開始から５時間後にゲルを回収し、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄した。【０１０２】
（２）  Ｋav：ゲル分配係数の測定
上記多孔質セルロースビーズ２２．８ｍＬを蒸留水に分散させ、３０分間脱気した。脱気した多孔質セルロースビーズをカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製「Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００」）に充填した。島津製作所社製のサイズ排除クロマトグラフィーシステム（「ＤＧＵ−２０Ａ３」、「ＲＩＤ−１０Ａ」、「ＬＣ−２０ＡＤ」、「ＳＩＬ−２０ＡＣ」、「ＣＴＯ−２０ＡＣ」を含み、ソフトウェアとしては「ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎ」を使用）を用いて測定を行った。【０１０３】
マーカーとしては、以下のデキストランまたはグルコースを、１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）に溶解して用いた。【０１０４】
【表１】
2015056680.tif 000002
カラムに１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで通液しながら、先ず、カラム中のビーズ部分以外の体積を求めるために、分子量４×１０7のデキストランの溶液を注入し、注入からＲＩモニターでピークが観測されるまでの通液量を求めた。分子量４×１０7のデキストランの溶液の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、注入量は４０μＬとした。次いで、各マーカーの溶液でも同様に通液量を求めた。測定値を下記式に代入し、Ｋavの値を算出した。【０１０５】
Ｋav＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
［式中、ＶRは各マーカー溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖ0は分子量４×１０7のデキストラン溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖtはカラム内のビーズの体積（ｍＬ）を示す］
結果を表２に示す。【０１０６】
【表２】
2015056680.tif 000003
（３）  細孔径分布の計算
各マーカーの粘度半径と上記で求めたＫavの値を下記式に代入し、各マーカーが多孔質セルロースビーズに侵入する細孔の半径を求めた。【０１０７】
Ｋav＝（１−ｒm／ｒp）2
［式中、ｒmは各マーカーの粘度半径（ｎｍ）を示し、ｒpは各マーカーが多孔質セルロースビーズに侵入する細孔の半径（ｎｍ）を示す］
算出された多孔質セルロースビーズの細孔半径を横軸に、分子量１８０のマーカーがビーズ内に侵入した細孔体積（ＶR−Ｖ0）を１００％とした場合の細孔径分布を縦軸にプロットしたグラフを図３に示す。【０１０８】
比較例３：  水溶性低分子有機化合物を用いない架橋多孔質セルロースビーズの作製例
（１）  セルロース分散液の作製
セパラブルフラスコに１０３ｇの蒸留水と９．３ｇのセルロースを投入し、二段ディスクタービン（ｒｕｓｈｔｏｎ  ｔｕｒｂｉｎｅ）翼を用いてスラリーの温度が４℃になるまで、１５０〜２００ｒｐｍで３０分間攪拌した。次いで、４℃に冷却した３３ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を４１ｇ添加し、５００ｒｐｍの速度で攪拌しながら３０分間保持した。【０１０９】
（２）  液−液分散による多孔質セルロースビーズの作製
上記セルロース分散液に、１ｗｔ％のソルビタンモノオレエートが溶解した７８８ｇのｏ−ジクロロベンゼン溶液を投入し、４℃で６００ｒｐｍ、１５分間撹拌することでセルロース液滴を分散させた。凝固溶剤としてメタノールを７４ｍＬ添加し、４℃で６００ｒｐｍ、３０分間攪拌した。その後、ガラスフィルター（ＴＯＰ社製「２６Ｇ−３」）で溶液を濾過し、次いで５倍体積量のメタノール、５倍体積量の蒸留水の順に洗浄を行ない、セルロースビーズを回収した。【０１１０】
（３）  ゲル分配係数の測定と細孔径分布の計算
得られた多孔質セルロースビーズを上記実施例３（１）と同様の条件で架橋した後、上記実施例３（２）と同様にゲル分配係数を測定し、また、上記実施例３（３）と同様に細孔径分布を計算した。ゲル分配係数Ｋavの測定結果を表３に示す。【０１１１】
【表３】
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また、細孔径分布のグラフを上記実施例３の結果と共に図３に示す。図３のとおり、水溶性低分子有機化合物を用いずに作製された比較例３の架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布がブロードであるのに対して、水溶性低分子有機化合物を用いて作製された実施例３の架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布はよりシャープであることが示された。【０１１２】
実施例４
上記実施例３において、６ｗｔ％グリシン水溶液の代わりに６ｗｔ％アラニン水溶液を用いた以外は同様にして、多孔質セルロースビーズを作製した。【０１１３】
得られた多孔質セルロースビーズについて上記実施例３（２）と同様にゲル分配係数を測定し、また、上記実施例３（３）と同様に細孔径分布を計算した。ゲル分配係数Ｋavの測定結果を表４に示す。【０１１４】
【表４】
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また、細孔径分布のグラフを上記実施例３および比較例３の結果と共に図３に示す。図３のとおり、水溶性低分子有機化合物としてアラニンを用いて作製された実施例４の架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布は、実施例３の細孔径分布よりさらにシャープなものであった。【０１１５】
実施例５
上記実施例３において、６ｗｔ％グリシン水溶液の代わりに９ｗｔ％グリシン水溶液を用いた以外は同様にして、多孔質セルロースビーズを作製した。【０１１６】
得られた多孔質セルロースビーズについて上記実施例３（２）と同様にゲル分配係数を測定し、また、上記実施例３（３）と同様に細孔径分布を計算した。ゲル分配係数Ｋavの測定結果を表５に示す。【０１１７】
【表５】
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また、細孔径分布のグラフを上記実施例３などの結果と共に図３に示す。図３のとおり、水溶性低分子有機化合物をより高濃度で用いて作製された実施例５の架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布は、よりさらにシャープなものであった。【０１１８】
実施例６
上記実施例３において、セルロースの使用量を９．４ｇから７．７ｇに変更した以外は同様にして、多孔質セルロースビーズを作製した。【０１１９】
得られた多孔質セルロースビーズについて上記実施例３（２）と同様にゲル分配係数を測定し、また、上記実施例３（３）と同様に細孔径分布を計算した。ゲル分配係数Ｋavの測定結果を表６に示す。【０１２０】
【表６】
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また、細孔径分布のグラフを上記実施例３および比較例３の結果と共に図４に示す。図４のとおり、セルロースに対する水溶性低分子有機化合物の使用割合を高めることによって、架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布は、よりさらにシャープなものとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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