(57)【要約】本発明は、酵素触媒によるメタクリリル−ＣｏＡの製造方法として、デヒドラターゼ活性を有する酵素により、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法を提供する。この製造法において、デヒドラターゼ活性を有する酵素の３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへの変換率は、５０％以上である。また、この製造法において、デヒドラターゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属あるいはロドコッカス属に属する微生物由来のものとできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドラターゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
【請求項２】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへの変換率が５０％以上であるデヒドラターゼを用いる、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
ｐＨ４〜１０の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
温度５〜８０℃の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
時間１分〜１週間の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製されたものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
デヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下で、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
デヒドラターゼをコードする遺伝子が微生物由来の遺伝子である、請求項７に記載の製造法。
【請求項９】
微生物が、シュードモナス属又はロドコッカス属に属する微生物である請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
デヒドラターゼが下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される請求項７に記載の製造法。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
微生物由来のデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製された３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水溶液を、ｐＨ４〜１０、温度５〜８０℃、時間１分〜１週間の反応条件で反応させることにより、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換率５０％以上で変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素触媒を用いたメタクリリル−ＣｏＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸エステルは主にアクリル樹脂の原料として使われている。また、その他、塗料、接着剤、樹脂改質剤などの分野のコモノマーとしても多くの需要がある。工業的な製法としてはいくつかの方法があり、例えば、アセトンおよびシアン化水素を原料とするＡＣＨ（アセトンシアノヒドリン）法、イソブチレン、ｔ−ブチルアルコールを原料とする直酸法が知られている。これら化学的な製造方法は、化石原料に依存しており、また多くのエネルギーを必要とする。【０００３】
近年では、地球温暖化防止及び環境保護の観点から、従来の化石原料の代替となる炭素源として、バイオマスから種々の化学製品を製造する技術が注目されている。メタクリル酸及びメタクリル酸エステルもバイオマス原料からの製造が期待されている。【０００４】
例えば、天然に存在する微生物を利用し、糖などの天然物からメタクリル酸の前駆体となる２−ヒドロキシイソ酪酸及び３−ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法が提案されている（特許文献１、２及び非特許文献１参照）。また、酵素遺伝子を導入した、天然に存在しない組換え微生物を用いてグルコースからメタクリル酸を生成する方法が提案されているが、これらは既知の酵素反応及びそれから類推される仮想の酵素反応を組み合わせたものであり、実証されたものではない（特許文献３〜５参照）。これらの公報には、３−ヒドロキシイソ酪酸あるいは３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの酵素的な脱水反応について、類似反応を触媒する酵素の利用が可能な旨の記載がある。確かに、アセトン／ブタノール発酵経路にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは脱水反応を触媒することから、これらの酵素が前記化合物を基質とするのであれば、利用可能と考えられる。一方、脂肪酸のβ−酸化あるいは分岐鎖アミノ酸の分解経路のエノイルＣｏＡヒドラターゼは水和反応を触媒する酵素であり、脱水反応を触媒するものではない。【０００５】
非特許文献２には、ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産菌より精製されたエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの脱水反応とその逆反応（水和反応）の活性を有していることが示されているが、他のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが両方向の反応を行うかどうかは不明である。さらに、これら先行技術においては、実際に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを原料として、メタクリリル−ＣｏＡを合成可能かどうかは報告されていない。酵素の多様性、基質特異性を考慮すると、類似反応を触媒する酵素で本来の基質と構造が異なるメタクリリル−ＣｏＡの製造が可能であるかは不明であった。【０００６】
一方、メタクリリル−ＣｏＡはバリン分解経路中の中間体として知られている。また、細胞毒性を有すると言われており、生体内では、エノイルＣｏＡヒドラターゼの作用により、メタクリリル−ＣｏＡは速やかに水和され、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを経て、３−ヒドロキシイソ酪酸へと代謝されると推定されている。【０００７】
非特許文献３には、メタクリリル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡへのクロトナーゼによる水和反応の例が示されている。本反応は他の反応（アクリリル−ＣｏＡ→ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ）に比べ、反応が低転化率で平衡に達している旨の記載があるが、本反応は原料をメタクリリル−ＣｏＡを用いた水和反応の場合であり、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを原料として実際に脱水反応が進行するかどうかは全く不明であった。さらに、非特許文献４にはメタクリリル−ＣｏＡが自発的に水和されることが記載されている。メタクリリル−ＣｏＡ自身が自発的に水和されるような水中の環境下で、実際に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの脱水反応が進行し、本発明の目的物であるメタクリリル−ＣｏＡの製造が可能かどうかは全く不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／１１０３９４号
【特許文献２】国際公開第２００８／１４５７３７号
【特許文献３】国際公開第２００９／１３５０７４号
【特許文献４】国際公開第２０１１／０３１８９７号
【特許文献５】国際公開第２０１２／１３５７８９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１２，  １４，  １９４２−１９４８
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，８，２７４８−２７５５
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，２６９，１４２４８−１４２５３
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９５７，  ２２４，  １−１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、酵素触媒によるメタクリリル−ＣｏＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからデヒドラターゼ活性を有する酵素の作用により、メタクリリル−ＣｏＡを合成しうること見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１２】
（１）デヒドラターゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
（２）３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへの変換率が５０％以上であるデヒドラターゼを用いる、（１）の製造法。
（３）ｐＨ４〜１０の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、（１）又は（２）の製造法。
（４）温度５〜８０℃の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、（１）から（３）のいずれかの製造法。
（５）時間１分〜１週間の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、（１）から（４）のいずれかの製造法。
（６）３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製されたものである、（１）から（５）のいずれかの製造法。
（７）デヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下で、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、（１）から（６）のいずれかの製造法。
（８）デヒドラターゼをコードする遺伝子が微生物由来の遺伝子である、（７）の製造法。
（９）微生物が、シュードモナス属又はロドコッカス属に属する微生物である（８）の製造法。
（１０）デヒドラターゼが下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される（７）の製造法。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（１１）微生物由来のデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製された３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水溶液を、ｐＨ４〜１０、温度５〜８０℃、時間１分〜１週間の反応条件で反応させることにより、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換率５０％以上で変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、酵素触媒によるメタクリリル−ＣｏＡの製造が可能となり、本発明の製造法と生体内代謝等を組み合わせることにより、メタクリル酸およびそのエステルの発酵生産も達成できる。その結果、従来の化学製造プロセスと比較して、エネルギー、資源、環境への負荷を格段に低減でき、かつ効率的にメタクリル酸エステルを製造することが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、メタクリリル−ＣｏＡとは、以下の式（１）で示される化合物であり、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。
【００１５】
【化１】
2015015784.tif 000002
【００１６】
本発明におけるメタクリリル−ＣｏＡの製造の原料となる３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは以下の式（２）で示される化合物であり、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。
【００１７】
【化２】
2015015784.tif 000003
【００１８】
本発明で使用する３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡは公知又は新規な方法で製造したものを使用することができる。その合成方法としては有機化学的に合成する方法（Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  １９５３，６５，  １８６−１８７）あるいは酵素反応を用いた合成方法が知られている。さらに、バイオマス等から代謝工学（発酵）的に合成されたものを用いることができる。
【００１９】
本発明において、デヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）活性とは、基質分子から水分子を除去する反応を触媒する活性を表し、特に３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡから水分子を除去してメタクリリル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性を意味する。デヒドラターゼ活性を有する具体的な酵素として、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）、クロトナーゼ（ｃｒｏｔｏｎａｓｅ）などに分類される酵素が挙げられる。これらの酵素は一般に、脂肪酸のβ−酸化、アセトン／ブタノール発酵、および分岐鎖アミノ酸の代謝に関与している。
【００２０】
本発明において使用するデヒドラターゼ活性を有する酵素（以下、単に「デヒドラターゼ」と表記する場合がある。）とは、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへ変換する能力を有する触媒であれば、特に限定されず、その種類及び起源を問わない。好ましくは、生体由来の触媒であり、さらに好ましくは、脂肪酸のβ−酸化、アセトン／ブタノール発酵、および分岐鎖アミノ酸の分解能を有する微生物由来のデヒドラターゼである。
【００２１】
これら生物からの本発明に有効なデヒドラターゼの選択はこれら生物の全ゲノム配列を利用することができる。全ゲノム配列から本発明者らが明らかにしたデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列情報あるいは一般的なエノイルＣｏＡヒドラターゼまたはクロトナーゼのタンパク質をコードする遺伝子配列情報から相同性検索を用いて配列の相同性の高い遺伝子配列を探し、以下に示す方法により、本発明に適した酵素を選択することが可能である。前記生物で全ゲノム配列の不明なものについては、全ゲノム配列決定後、同様に実施することができる。なお、次世代シーケンサーの普及により、同業者であれば、全ゲノム配列は容易に解析可能である。
【００２２】
本発明に用いられるデヒドラターゼの選択は、前記生物等のデヒドラターゼ活性を有すると推定される酵素遺伝子を単離、あるいは公知の方法で全合成し、一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で形質転換した微生物によって候補タンパクを発現させ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む溶液に添加し、例えば、３０℃で反応させ、液体クロマトグラフィーによりメタクリリル−ＣｏＡの生成の有無を確認することにで、合成活性を確認可能である。
【００２３】
本発明において、好ましい酵素の由来としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物由来のものが挙げられる。
【００２４】
具体的にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に分類される微生物として、例えば、シュードモナス  エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス  アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒｉｃｉ）、シュードモナス  アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス  アミグダレ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｅ）、シュードモナス  アングイリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｉｓｅｐｔｉｃａ）、シュードモナス  アンチミクロビカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｃａ）、シュードモナス  アスプレニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｓｐｌｅｎｉ）、シュードモナス  オーランチアカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、シュードモナス  オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス  アベラナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｌｌａｎａｅ）、シュードモナス  アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス  バレアリカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ）、シュードモナス  ベイジェリンスキイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｓｃｋｉｉ）、シュードモナス  ベテリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｅｔｅｌｉ）、シュードモナス  ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス  カルボキシヒドロゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｇｅｎａ）、シュードモナス  カリカパパヤエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）、シュードモナス  シコリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス  シッシコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｓｓｉｃｏｌａ）、シュードモナス  シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス  コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス  コルガテ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）、シュードモナス  ドゥードロフィイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｏｕｄｏｒｏｆｆｉｉ）、シュードモナス  エキノイズス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｃｈｉｎｏｉｄｓ）、シュードモナス  エロンガテ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅ）、シュードモナス  フィクセレクタエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）、シュードモナス  フラベッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス  フレクテンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｅｃｔｅｎｓ）、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス  フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、シュードモナス  フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）、シュードモナス  フスコバギナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）、シュードモナス  ゲリディコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｌｉｄｉｃｏｌａ）、シュードモナス  ゲニクラタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）、シュー��モナス  グラテイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｌａｔｈｅｉ）、シュードモナス  ハロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス  ヒビシコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ）、シュードモナス  フッチエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ）、シュードモナス  イネルス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｉｎｅｒｓ）、シュードモナス  ランセロタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌａｎｃｅｌｏｔａ）、シュードモナス  レモイグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｅｍｏｉｇｎｅｉ）、シュードモナス  ルンデンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス  ルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｔｅｏｌａ）  、シュードモナス  マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス  メリアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｉａｅ）、シュードモナス  メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス  ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス  モンテイリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｌｉ）、シュードモナス  ナウチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎａｕｔｉｃａ）、シュードモナス  ニトロレデュセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、シュードモナス  オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス  オリジハビタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）、シュードモナス  パーツシノゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）、シュードモナス  フェナジニウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、シュードモナス  ピクトルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｔｏｒｕｍ）、シュードモナス  シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス  ピロシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、シュードモナス  レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス  ローデシアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、シュードモナス  サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス  サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス  スピノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）、シュードモナス  スタニエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔａｎｉｅｒｉ）、シュードモナス  ストラミナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎａｅ）、シュードモナス  スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス  シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス  シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス  シジギイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、シュードモナス  タエロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス  トラアシイ（Ｐｓｅｕｄｏ���ｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ）、シュードモナス  ベロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）、シュードモナス  ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、シュードモナス  ブルガリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス  ウィスコンシエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）等が挙げられる。
【００２５】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される微生物としては、例えば、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス  ジョスティイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、  ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス  ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）、  ロドコッカス  コラリヌス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、ロドコッカス  ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ロドコッカス  コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドコッカス  グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス  クロロフェノリカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、ロドコッカス  ルテウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ロドコッカス  アイシェンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｉｃｈｉｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス  チュブエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｕｂｕｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス  マリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｓ）、ロドコッカス  ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉｎｅｓ）等が挙げられる。
【００２６】
これらの微生物を由来とするデヒドラターゼが好ましく、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへ変換率が５０％以上である酵素が特に好ましい。変換率は、より好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上である。
【００２７】
ここで、変換率が５０％以上とは、原料３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの半量以上がメタクリリル−ＣｏＡへ変換したことを意味し、反応終了時のメタクリリル−ＣｏＡの生成量が、原料の３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの残存量を超えた状態にあることを意味する。
【００２８】
本発明おける変換率は、以下の式で求められる。
[メタクリリル−ＣｏＡ生成量]／[３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ残存量＋メタクリリル−ＣｏＡ生成量]×１００
【００２９】
本発明において、特に有用なデヒドラターゼは以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００３０】
本発明において、デヒドラターゼは配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する。
本発明において、デヒドラターゼは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号１または３記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のデヒドラターゼに含まれる。
上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。また、本発明においてデヒドラターゼには、配列番号１または３記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質も含まれる。
【００３１】
（ｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００３２】
アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が置換する場合は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００３３】
本発明において、デヒドラターゼをコードする遺伝子は、例えば配列番号２または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む。
本発明において、デヒドラターゼをコードする遺伝子は、上記配列に限定されるものではなく、配列番号２または４記載の塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。
【００３４】
また、前述したアミノ酸配列の欠失、置換、付加及び／又は挿入に対応して、配列番号２または４記載の塩基配列において、数個の塩基に欠失、置換、付加及び／又は挿入等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明においてデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。なお、欠失、置換、付加及び／又は挿入される塩基の個数は、３０個以下、好ましくは１５個以下、特に好ましくは６個以下である。
【００３５】
さらに、配列番号２または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。
【００３６】
本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））等を参照することができる。
【００３７】
上述した本発明におけるデヒドラターゼをコードする遺伝子は、宿主に導入して形質転換体を作成することができる。例えば、前記遺伝子を、宿主内で機能的である発現調節配列に作動可能に連結された状態で含む、１つまたは複数の発現ベクターを構築することで可能となる。本発明において使用可能な発現ベクターには、プラスミドベクター、ファージ（ウィルス）ベクター、コスミドベクターおよび人工染色体ベクターなどが含まれ、さらに、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含むことができる。多くの宿主・ベクター系が知られているが、必要に応じて、同様の手法にて開発することができる。
【００３８】
例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１のゲノム配列からデヒドラターゼをコードする遺伝子を増幅するためのＰｒｉｍｅｒを設計し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により前記遺伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターに組込むことにより、デヒドラターゼを発現するためのベクターを構築することができる。前記ベクターを含む発現プラスミドを作成し、これを大腸菌等の宿主に導入して組換え体（形質転換体）を作製することができる。前記組換え体を培養して得られた細胞抽出液を用いて、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡを生成させることができる。
【００３９】
デヒドラターゼを発現させるための宿主としては、細菌では大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
【００４０】
デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いてメタクリリル−ＣｏＡを製造することができる。具体的には、デヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、デヒドラターゼを発現させる。
【００４１】
メタクリリル−ＣｏＡ合成反応には３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを基質にデヒドラターゼが作用する条件下で接触させることにより、メタクリリル−ＣｏＡを得ることができる。例えば、組換え微生物を培養して得られる培養液をそのまま用いるか、又は、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体又はその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素又は精製酵素等が挙げられる。好ましくは、形質転換体を培養して菌体からタンパク質を破砕、抽出、遠心分離等の方法により採取する。
【００４２】
また、メタクリリル−ＣｏＡ合成反応は、上記の通り、デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いて、該形質転換体の存在下で、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換することもできる。デヒドラターゼをコードする遺伝子に加え、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを合成しうる酵素遺伝子群が同時に導入された形質転換体を作成し、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの前駆体を原料にメタクリリル−ＣｏＡを製造してもよい。そうすることで、前述のようにバイオマス等から代謝工学（発酵）的にメタクリリル−ＣｏＡを効率よく製造することができる。
【００４３】
メタクリリル−ＣｏＡの製造は、以下の方法で行うことができる。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの水溶液に又は懸濁液に、デヒドラターゼを接触させ、温度等の条件を制御しながら反応させる。反応により、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが脱水されて、メタクリリル−ＣｏＡが生成する。
【００４４】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む水溶液は、通常、緩衝液等の水性媒体で調製する。ここで、反応を円滑に進行させるために、浸透圧調整剤等によりモル浸透圧濃度および／またはイオン強度を制御することが可能である。浸透圧調整剤（ｐＨ緩衝液としても使用されることがある）としては、細胞内部等の溶液の浸透圧に対して等張または高張になるように調節する目的で加えられる水溶性物質であればよく、例えば、有機および無機の塩又は糖類であり、好ましくは塩である。塩は、好ましくは金属塩あるいは無機酸塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩あるいは塩酸塩であり、例えば、リン酸とのアルカリ金属塩、アミノ酸あるいはトリスヒドロキシメチルアミノメタンのようにアミノ基と塩酸との塩、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが挙げられる。糖類は、好ましくは単糖類又はオリゴ糖類、より好ましくは単糖類又は二糖類であり、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール等が挙げられる。浸透圧調整剤は１ｍＭ以上の濃度で添加することが好ましく、使用する生体細胞内の溶液と比して等張または高張になるように調節ことが特に好ましい。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを含む水溶液中の浸透圧調整剤の濃度は、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上である。
【００４５】
反応液中の３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの濃度は任意であり、特に制限はない。また、デヒドラターゼ活性を有する酵素の使用量または反応条件は、用いる原料に応じて適宜決定される。通常、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの濃度は０．００００１〜１０重量％の範囲に設定する。好ましくは、０．０００１〜１重量％の範囲である。
【００４６】
その他の反応温度又は反応時間等の各種条件は使用する原料、生体触媒の活性等により、適宜決定されるもので、特に制限はないが、通常５〜８０℃で、１分〜１週間反応させればよい。好ましくは、１０〜７０℃で、１分〜１２０時間であり、１０分以上がより好ましい。このような条件で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応液のｐＨについても反応が効率良く進行すれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲、好ましくはｐＨ５．５〜８．５である。
【００４７】
本発明において、デヒドラターゼは、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡの変換率が５０％以上であることが好ましい。変換率は、より好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上である。反応条件は、デヒドラターゼの諸性質に適した範囲になるよう適宜調整して実施することが好ましい。
【００４８】
また、効率的に反応を進行させる目的で、あらかじめ、有機溶剤を添加した系で反応させることも可能である。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば、炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）、エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）、エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。
【００４９】
本発明の方法によって生成されたメタクリリル−ＣｏＡは、必要に応じて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定又は定量分析することができる。反応液からのメタクリリル−ＣｏＡの単離する場合は、カラム分離等の公知の単離法のより行うことができる。
【００５０】
さらに、得られたメタクリリル−ＣｏＡはチオエステル結合を化学的あるいは酵素的に切断することで、メタクリル酸へ、あるいは、同じく、アルコールと反応させ、メタクリル酸エステルへ変換すること可能である。すなわち、本発明の方法は、メタクリリル−ＣｏＡからメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルを製造する工程を更に含むことができる。
【００５１】
デヒドラターゼをコードする遺伝子に加えて、バイオマス等から３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを合成しうる酵素遺伝子群およびチオエステル結合に作用する酵素遺伝子を全て導入された形質転換体を作製することで、バイオマス等から代謝工学（発酵）的にメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルの直接合成が可能となる。
【００５２】
このようにして得られたメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルはエネルギー、資源、環境に対する負荷を格段に低減することができ、石油製品を出発原料とした従来の化学製造品と比較して環境低負荷材料として非常に大きな社会的価値を有するものである。
【００５３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４  （ＮＢＲＣ１００８８７）由来デヒドラターゼ遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製
＜ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓからのゲノムＤＮＡの調製＞
ＬＢ寒天培地培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で生育させたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４  （ＮＢＲＣ１００８８７）株を１０ｍｌのＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３０℃にて３６時間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。【００５５】
＜デヒドラターゼ発現用プラスミドの作製＞
得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、デヒドラターゼをコ−ドすることが推定された遺伝子を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により調製した。【００５６】
オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＭＡ−０３１：  ５’−ＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣ  −３’（配列番号５）
ＭＭＡ−０３２：  ５’−ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣ  −３’（配列番号６）【００５７】
反応液組成：
滅菌水                                        ２２  μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）    ２５  μｌ
ＭＭＡ−０３１（配列番号５）                    １  μｌ
ＭＭＡ−０３２（配列番号６）                    １  μｌ
ゲノムＤＮＡ                                    １  μｌ
総量                                          ５０  μｌ
温度サイクル：
９８℃  １０秒、５５℃  １５秒及び７２℃  １５０秒の反応を３０サイクル【００５８】
得られた約０．８ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＨＩ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−０３１中に切断認識部位が含まれる）およびＳｓｅ８３８７Ｉ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ−０３２中に切断認識部位が含まれる）で切断した。アガロースゲル電気泳動により分離を行い、ゲルから目的のバンドをＧｅｌ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて精製し、３０μＬの滅菌水に溶出した。精製したＤＮＡ断片（５μＬ）、ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで予め消化しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（１μＬ）、蒸留水（４μＬ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μＬ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ−トして、ＰＣＲ増幅産物とベクターをライゲーションした。【００５９】
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍＬに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物０．４ｍＬをＳＯＢ培地４０ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ４、１ｍＭＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍＬ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍＬに懸濁し、０．２２ｍＬのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。【００６０】
こうして作製したコンピテントセル２００μＬに上記のライゲーション溶液を１０μＬ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１ｍＬを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。【００６１】
培養後、１００μＬずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ−複数個を１．５ｍＬのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。【００６２】
得られた組換えプラスミドＤＮＡについて、その塩基配列をＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔおよび蛍光シ−ケンサＣＥＱ  ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて確認し、プラスミドｐＭＭＡ０１１と命名した。プラスミドｐＭＭＡ０１１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、デヒドラターゼ発現組換え体を作製した。
【実施例２】
【００６３】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４  （ＮＢＲＣ１００８８７）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞抽出液を用いた、３−ヒドロキシイソ酪酸−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡの合成
１）デヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液の調製
実施例１で得られたデヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ０１１を２ｍｌのＬＢＡｍｐ培地に植菌し、３７℃にて２４時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む１００ｍｌの同培地に加え、３７℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、同緩衝液にＯＤ６３０ｎｍが６となるように懸濁した。【００６４】
得られた菌体懸濁液から１ｍｌを以下のようにして細胞破砕液を調製した。超音波式ホモジナイザーVP-300（タイテック、日本）を用いて、出力（振幅）：１５％／Ｏｎ：１秒，ｏｆｆ：１秒の条件で氷冷しながら５分間破砕した。【００６５】
２）デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞破砕液を用いたメタクリリル−ＣｏＡ合成反応
１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．０５ｍｌ、５ｍＭ  ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを０．２ｍｌ及び水０．６５ｍｌを混合したものに、上記のようにして得られたエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液０．１ｍｌを加え、反応液１ｍｌに調整した。３７℃で３時間反応させ、以下に示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、０．６ｍＭのメタクリリル−ＣｏＡの生成を確認した。そのとき、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ残存量は０．３３ｍＭであった。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへ変換率は、６５％（＝0.6/(0.33＋0.6）×100）であった。【００６６】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ ＯＤＳ-ＵＧ１２０（ｓｈｉｓｅｉｄｏ），２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：２５％ ＭｅＯＨ，５０ｍＭ Ｈ3ＰＯ4，ｐＨ５．７
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ  
カラム温度：４０℃  
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
注入量１０μｌ（反応溶液を移動相で１０倍希釈）
【実施例３】
【００６７】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製
＜ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからのゲノムＤＮＡの調製＞
１０ｍｌのＬＢ液体培地で培養したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１株より、実施例１と同様にしてゲノムＤＮＡを取得した。【００６８】
＜デヒドラターゼ発現用プラスミドの作製＞
下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、上記で得られたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）株ゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様にして、デヒドラターゼをコ−ドすることが推定された遺伝子を含むＤＮＡ断片（約０．８ｋｂ）を増幅した。【００６９】
オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＭＡ−０２５：５’−ＧＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＧＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＧ−３’（配列番号７）
ＭＭＡ−０２６：５’−ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣ−３’（配列番号８）【００７０】
このＤＮＡ断片をＢｓｐＨＩ及びＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、実施例１と同様にして、ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだ。得られたプラスミドをｐＭＭＡ０１５と命名した。プラスミドｐＭＭＡ０１５を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、デヒドラターゼ発現組換え体を作製した。
【実施例４】
【００７１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞抽出液を用いた、３−ヒドロキシイソ酪酸−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡの合成
１）デヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液の調製
実施例３で得られたデヒドラターゼ遺伝子が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ０１５を実施例２の１）記載の方法と同様の方法を用いて培養及び菌体の回収を行い、菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液から実施例２の１）記載の方法と同様の方法を用いて細胞破砕液を調製した。【００７２】
２）デヒドラターゼ遺伝子発現大腸菌組換え体細胞破砕液を用いたメタクリリル−ＣｏＡ合成反応
１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．０５ｍｌ、５ｍＭ  ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡを０．２ｍｌ及び水０．６５ｍｌを混合したものに、上記のようにして得られたエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液０．１ｍｌを加え、反応液１ｍｌに調整した。３７℃で３時間反応させ、実施例２の２）に示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、０．６ｍＭのメタクリリル−ＣｏＡの生成を確認した。そのとき、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ残存量は０．３７ｍＭであった。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡからメタクリリル−ＣｏＡへ変換率は、６２％（＝0.6/(0.37＋0.6）×100）であった。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
配列番号５：ＭＭＡ−０３１
配列番号６：ＭＭＡ−０３２
配列番号７：ＭＭＡ−０２５
配列番号８：ＭＭＡ−０２６
【配列表】
2015015784000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月5日(2016.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドラターゼの存在下、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ、変換率５０％以上で変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
【請求項２】
ｐＨ４〜１０の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
温度５〜８０℃の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
時間１分〜１週間の反応条件でメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡが、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製されたものである、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
デヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下で、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換する、請求項１から５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
デヒドラターゼをコードする遺伝子が微生物由来の遺伝子である、請求項６記載の製造法。
【請求項８】
微生物が、シュードモナス属又はロドコッカス属に属する微生物である請求項７記載の製造法。
【請求項９】
デヒドラターゼが下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される請求項６記載の製造法。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
微生物由来のデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製された３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ水溶液を、ｐＨ４〜１０、温度５〜８０℃、時間１分〜１週間の反応条件で反応させることにより、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡへ変換率５０％以上で変換するメタクリリル−ＣｏＡの製造法。
【国際調査報告】
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