(57)【要約】  この発明は、自己抗原に対する抗体の誘導が可能である合成ペプチドを提供し、具体的には、樹状コアとＢ細胞認識ペプチドとを含む多重同種抗原ペプチドであって、樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種のＢ細胞認識ペプチドを含み、各ペプチドが樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合されている、多重同種抗原ペプチド、前記ペプチドを含む抗体産生誘導剤、ならびに、前記ペプチドの製造法を提供する。
2015190555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状コアとＢ細胞認識ペプチドとを含む多重同種抗原ペプチドであって、樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種のＢ細胞認識ペプチドを含み、かつ、Ｔ細胞エピトープ非存在下で生体内のＢ細胞を直接刺激してクラススイッチした抗体産生を誘導することを特徴とする、多重同種抗原ペプチド。
【請求項２】
樹状コアが、リジン残基を含む、請求項１に記載の多重同種抗原ペプチド。
【請求項３】
樹状コアが、システイン残基をさらに含む、請求項２に記載の多重同種抗原ペプチド。
【請求項４】
Ｂ細胞認識ペプチドが、７〜５０アミノ酸残基からなるペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多重同種抗原ペプチド。
【請求項５】
Ｂ細胞認識ペプチドが、自己抗原である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多重同種抗原ペプチド。
【請求項６】
自己抗原が、ＩｇＥ由来の抗原である、請求項５に記載の多重同種抗原ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多重同種抗原ペプチドを有効成分として含有する、抗体産生誘導剤。
【請求項８】
インターフェロンγおよび／またはインターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、請求項７に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項９】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項７または８に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１０】
ワクチンである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１１】
疾患の治療または予防のために使用される、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１２】
疾患が、アレルギー性疾患、癌、骨疾患、加齢黄斑変性症、多発性硬化症、尋常性乾癬および感染症からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体産生誘導剤。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の抗体産生誘導剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多重同種抗原ペプチドの製造方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法。
（ａ）反応性官能基を有する樹状コアを用意する工程
（ｂ）反応性官能基を有する複数の同種のＢ細胞認識ペプチドを用意する工程
（ｃ）樹状コアの反応性官能基と上記の各Ｂ細胞認識ペプチドの反応性官能基を結合反応して多重抗原ペプチドを作製する工程
（ｄ）多重抗原ペプチドを回収する工程
【請求項１５】
前記反応性官能基を有する樹状コアが、下記の構造：
【化１】
2015190555.tif 000011
を有する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重同種抗原ペプチドおよびそれを含む抗体産生誘導剤、前記ペプチドの製造方法、ならびに、前記ペプチドによる抗体の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、体内でウイルスや細菌などの外来異物、癌細胞などの自己抗原に結合して、それらを体内から排除する免疫反応の主たる役割を担っている。そのため、抗体反応の対象となるこれら物質に対して、人工的に効率よく体内で抗体産生を誘導する方法は、感染症や癌などの治療法、予防法として大いに活用できる。しかしながら、現状ではあらゆる抗原に対して抗体産生を効率良く行う方法がなく、対処できない感染症や癌などがまだ多く存在している。【０００３】
体内でＢ細胞を形質細胞へ分化させてクラススイッチされた抗体を産生させるためには、まずＴ細胞による抗原認識が行われなければならない。すなわち、Ｔ細胞の反応が起こらなければ目的となる抗体産生も起こらない。このＴ細胞の反応はＴ細胞受容体の抗原認識パターンに依存しているため、それに当てはまらない抗原に対してＴ細胞の反応は起こらない（Ｔ細胞拘束性という）。例えば、癌免疫療法などにおいて自己抗原との違いが不明瞭な癌抗原に対する抗体誘導が困難であるのは、Ｂ細胞の自己抗原認識の可能性はわずかに残っているが、そもそも自己抗原の一部である癌抗原を認識するＴ細胞受容体を持つＴ細胞が胸腺で排除されているため体内に存在しないからである。そこで、強制的にＴ細胞に抗原認識させる物質としてアジュバントを癌抗原とともに投与する方法が現在では取られているが、それをもってしても元々Ｔ細胞が認識しない抗原に対しては劇的な効果は得られていない。【０００４】
また、感染症に対するワクチンでは病原体を準備すれば作製することが可能である。しかし、病原体を大量に準備する培養システムが確立されなければ、ワクチンを開発することができない。特に、新興感染症に対しては、従来のような病原体の大量培養システムを用いたワクチン開発方法では対応することが困難であり、対応できたとしてもそのシステム構築にはかなりの年数を必要とする。さらに、たとえ病原体の大量培養方法が確立しても病原体が頻繁に素早く変異するものでは、すなわちいわゆる抗原遺伝子多型を有する病原体においては、新たな大量培養方法を確立するのに時間がかかるためワクチン製造が追いつかないという問題がある。【０００５】
このような状況において、近年では合成ペプチドワクチンの開発が盛んに行われるようになった。そのなかで特に、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）が注目されている。ＭＡＰペプチドは、例えばアミノ酸の一つである複数のリジン（Ｌｙｓ）および、場合により、システイン（Ｃｙｓ）を含む結合体をコアとし、Ｌｙｓの場合そのαアミノ基とεアミノ基に、あるいは、Ｃｙｓの場合、スルフヒドリル基に、ペプチド（細胞が認識する抗原の一部分）を結合させることによって得ることができる。【０００６】
例えば、特許文献１には、肺炎双球菌に対してＭＡＰを使用している。具体的には、肺炎双球菌の抗原のペプチドから２箇所を選定し、この２種類のペプチドを交互に、合計４つのペプチドを有するＭＡＰ−４構造を作ったことが記載されている。【０００７】
特許文献２には、体液性免疫応答および細胞傷害性Ｔリンパ球免疫応答の両方を誘発できる、Ｔ細胞エピトープを結合して含む多重抗原ペプチドが記載されている。【０００８】
非特許文献１には、髄膜炎菌の抗原グループＢの中のＢ細胞エピトープ（Ｂ細胞受容体、つまりＢ細胞表面の膜型抗体が認識しやすいペプチド部位）とＴ細胞エピトープ（Ｔ細胞が認識するペプチド部位）を合成ペプチドとして作製し、それらを結合したＭＡＰをマウスとウサギにアジュバントとともに投与して抗体価の上昇を検討したこと、Ｂ細胞エピトープを８個結合させたＭＡＰ（ＭＡＰ−８）は抗体価の上昇が得られなかったが、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープを混合したＭＡＰ（ＭＡＰ−４）は抗体価の上昇があったことなどが記載されている。【０００９】
非特許文献２には、マラリア原虫に対するＴ細胞エピトープを結合したＭＡＰ、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープを混合したＭＡＰを作製し、抗体誘導を確認したことが記載されている。【００１０】
非特許文献３には、炭疽菌の抗原のエピトープを４つ結合したＭＡＰ（ＭＡＰ−４）をフロイントアジュバントとともに使って、当該エピトープをＴ細胞エピトープとして認識できるウサギを投与対象として用いており、強制的に抗原を認識させることで中和抗体価が上昇することをウサギで確認したことが記載されている。なお、当該エピトープはマウスにおいてはハプテンであるか、又はヘルパーＴ細胞エピトープになり得ない部位である。【００１１】
これらいずれの先行知見もＴ細胞に強制的にＭＡＰを認識させることが共通しており、抗体産生においてはヘルパーＴ細胞の介在が必須であることが前提となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2011-57691号公報
【特許文献２】国際公開WO1993/022343A1
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Myron Christodoulides and John E. Heckels, Microbiology 1994, 140:2951-2960
【非特許文献２】Manju B. Joshi et al., Infection and Immunity 2001 69:4884-4890
【非特許文献３】Jon Oscherwitz et al., Infection and Immunity 2009, 77:3380-3388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
Ｂ細胞が形質細胞へ分化してクラススイッチした抗体を産生するためには、１）Ｂ細胞受容体（Ｂ細胞の表面の膜型抗体）を介して抗原がＢ細胞に取り込まれ、２）Ｂ細胞が細胞内消化した抗原の一部（Ｔ細胞エピトープ）をヘルパーＴ細胞へ提示し、３）それをヘルパーＴ細胞が認識して活性化することでサイトカインを産生し、抗原提示したＢ細胞を逆に刺激する、という一連のプロセスが必須と考えられていた。従って、ヘルパーＴ細胞による抗原認識に必要なＴ細胞エピトープの種類の制約は、抗体産生の制約にもなる。【００１５】
そこで本発明の目的は、Ｔ細胞による抗原認識の制約を受けずに、Ｂ細胞を直接刺激するだけで体内で目的の抗体の産生を誘導することが可能な免疫刺激方法、いわゆるワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を克服するために鋭意研究を行った結果、同種のＢ細胞認識ペプチドを有する多重構造の人工ペプチドを用いることで、当該ペプチドを認識するＴ細胞をアジュバントなどで体内に強制的に誘導しなくても、Ｔ細胞エピトープ非存在下で生体内のＢ細胞を直接刺激してクラススイッチした抗体産生を誘導することを見出した。【００１７】
そのような構造を持つ人工ペプチドは、Ｔ細胞エピトープが存在しなくとも抗体を産生させることができるため、当該ペプチドを用いることで簡便にペプチドに対する抗体産生を誘導することができる。また、ヘルパーＴ細胞による認識の制約のために抗体産生を誘導することが難しかった抗原部位（例えば自己抗原）に対しても体内で抗体を誘導することが可能となった。【００１８】
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。【００１９】
（１）樹状コアとＢ細胞認識ペプチドとを含む多重同種抗原ペプチドであって、樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種のＢ細胞認識ペプチドを含み、かつ、Ｔ細胞エピトープ非存在下で生体内のＢ細胞を直接刺激してクラススイッチした抗体産生を誘導することを特徴とする、多重同種抗原ペプチド。【００２０】
（２）樹状コアが、リジン残基を含む、上記（１）に記載の多重同種抗原ペプチド。【００２１】
（３）樹状コアが、システイン残基をさらに含む、上記（２）に記載の多重同種抗原ペプチド。【００２２】
（４）Ｂ細胞認識ペプチドが、７〜５０アミノ酸残基からなるペプチドである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチド。【００２３】
（５）Ｂ細胞認識ペプチドが、自己抗原である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチド。【００２４】
（６）自己抗原が、ＩｇＥ由来の抗原である、上記（５）に記載の多重同種抗原ペプチド。【００２５】
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチドを有効成分として含有する、抗体産生誘導剤。【００２６】
（８）インターフェロンγおよび／またはインターフェロンγ産生能を有するアジュバントをさらに含む、上記（７）に記載の抗体産生誘導剤。【００２７】
（９）抗体がＩｇＧ抗体である、上記（７）または（８）に記載の抗体産生誘導剤。【００２８】
（１０）ワクチンである、上記（７）〜（９）のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。【００２９】
（１１）疾患の治療または予防のために使用される、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗体産生誘導剤。【００３０】
（１２）疾患が、アレルギー性疾患、癌、骨疾患、加齢黄斑変性症、多発性硬化症、尋常性乾癬および感染症からなる群から選択される、上記（１１）に記載の抗体産生誘導剤。【００３１】
（１３）上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の抗体産生誘導剤を含む医薬組成物。【００３２】
（１４）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチドの製造方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法。【００３３】
（ａ）反応性官能基を有する樹状コアを用意する工程
（ｂ）反応性官能基を有する複数の同種のＢ細胞認識ペプチドを用意する工程
（ｃ）樹状コアの反応性官能基と上記の各Ｂ細胞認識ペプチドの反応性官能基を結合反応して多重抗原ペプチドを作製する工程
（ｄ）多重抗原ペプチドを回収する工程
（１５）上記反応性官能基を有する樹状コアが、下記の構造：【００３４】
【化１】
2015190555.tif 000003
【００３５】
を有する、上記（１４）に記載の方法。【００３６】
（１６）樹状コアの反応性官能基とＢ細胞認識ペプチドの反応性官能基の結合反応をヒュスゲン反応によって行う、上記（１４）または（１５）に記載の方法。【００３７】
（１７）以下の工程（ａ）を含む、抗体の産生方法。【００３８】
（ａ）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチドを対象に投与する工程
（１８）以下の工程（ｂ）〜（ｄ）をさらに含む、上記（１７）に記載の方法。【００３９】
（ｂ）上記多重同種抗原ペプチドのＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体を産生するＢ細胞を含む生体試料を投与対象より採取する工程
（ｃ）工程（ｂ）で採取した生体試料から上記Ｂ細胞を選択する工程
（ｄ）上記Ｂ細胞を培養して抗体を回収する工程
（１９）上記（１）に記載の多重同種抗原ペプチドを投与された対象から採取した生体試料から、上記多重同種抗原ペプチドのＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法。【００４０】
（２０）上記（１）に記載の多重同種抗原ペプチドを投与された対象から採取した生体試料から、上記多重同種抗原ペプチドのＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体を回収する方法。【００４１】
（２１）以下の工程（ａ’’）および（ｂ’’）を含む、アレルゲンを認識する、ＩｇＥ産生抑制のためのＩｇＧ抗体の作製方法。【００４２】
（ａ’’）アレルゲンの構造の一部からなるＢ細胞認識ペプチドを含む上記（１）〜（６）のいずれかに記載の多重抗原ペプチドを対象に投与する工程
（ｂ’’）投与した対象から生体試料を採取し、アレルゲンを認識するＩｇＧ抗体を採取する工程
（２２）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の多重同種抗原ペプチドを対象に投与して得られた当該対象の抗体産生Ｂ細胞より、抗体の抗原認識部位の遺伝子配列、または、抗体の抗原認識部位のアミノ酸配列を特定する方法。【００４３】
本発明によれば、Ｔ細胞の抗原認識の制約を受けずに体内での抗体産生が可能であるため、従来の抗体産生技術に比べて抗体産生の成功率、特に自己抗原に対する抗体産生の成功率が向上する。本発明の多重同種抗原ペプチドによる抗体産生は、疾患の治療および／または予防に利用することができる。【００４４】
既存の抗体医薬の場合、その効果が一過性であるため継続的に投与する必要があるが、本発明であれば自己抗原に対する抗体の誘導が可能であり、その効果も長期的であることが予想される。また、抗体医薬製剤はヒト型抗体といえども体内からみれば異物であり、投与回数を重ねるにつれてやがては抗体医薬製剤に対する中和抗体を体内で獲得してしまうことで抗体医薬の作用が低減する状況になってしまうが、本発明による抗体誘導であればこのようなことは起こらず、接種するたびに目的の抗体産生を刺激することができる。【００４５】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-120999号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】この図は、ＭＡＰペプチド（ＭＡＰ−２，ＭＡＰ−４，ＭＡＰ−８およびＭＡＰ−１６）の構造を例示的に示す。
【図２】この図は、ＭＡＰ−２、ＭＡＰ−４、ＭＡＰ−８およびＭＡＰ−１６のうち抗体誘導能の高いものを選択することを目的とする、各ＭＡＰペプチド（群１〜群４）または生理的食塩水（陰性対照、群５）をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢）にアジュバントなしで静脈内に投与し、抗体誘導能を評価するための、投与・採血スケジュール（Ａ）と、各群におけるＩｇＭ（Ｂの左）抗体価およびＩｇＧ（Ｂの右）抗体価の測定結果を示す。
【図３】この図は、ＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８の投与量を変えて抗体誘導に最適な投与量を決定するために、ＭＡＰ−４（群１〜群４）、ＭＡＰ−８（群５〜群８）または生理食塩水（陰性対照、群９）をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢）に投与するための投与・採血スケジュール（Ａ）と、各群におけるマウスＩｇＥ（Ｍｓ  ＩｇＥ）またはイヌＩｇＥ（Ｄｏｇ  ＩｇＥ）に対するＩｇＭ（Ｂの左上および右上）抗体価およびＩｇＧ（Ｂの左下および右下）のｐｒｅ比の測定結果を示す。
【図４】この図は、Ｔ細胞欠損マウス（ヌードマウス、８週齢、雌）にＭＡＰ−４とマウスインターフェロン−γ製剤（ぺプロテック社）を同時に投与したとき（群１）と、ＭＡＰ−４のみを投与したとき（群２）の投与・採血スケジュール（Ａ）と、群１（左）と群２（右）についてイヌＩｇＥに対するＩｇＧ量の測定結果（Ｂ）を示す。群１では、■マウス１、xマウス２、▲マウス３、＊マウス４、◆マウス５、群２では、■マウス６、xマウス７、▲マウス８、◆マウス９をそれぞれ示す。
【図５】この図は、マウス体内においてＩｇＥに対する自己抗体がＭＡＰ−４で誘導されることを示すグラフである。
【図６】この図は、コナヒョウヒダニ抗原（アレルゲン）で感作したイヌにＭＡＰ−８をアラムアジュバントと一緒に静脈内投与したときのコナヒョウヒダニ特異的ＩｇＥの経時的な変化（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）を示す。図中、治療を施したイヌは、１２−３５（◆）および１２−３６（■）であり、生理食塩水が投与された陰性対照のイヌは、１２−１５（▲）である。
【図７】この図は、コナヒョウヒダニ抗原（アレルゲン）で感作したイヌにＭＡＰ−８をアラムアジュバントと一緒に静脈内投与したときのコナヒョウヒダニＩｇＥ値の比率を示す。図中アレルゲン投与時のＩｇＥ値を１．０とした。また、治療を施したイヌは、１２−３５（■）および１２−３６（▲）であり、生理食塩水が投与された陰性対照のイヌは、１２−１５（◆）である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．多重同種抗原ペプチド
本発明は、第１の態様により、樹状コアとＢ細胞認識ペプチドとを含む多重同種抗原ペプチドであって、樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合された４〜８個の同種のＢ細胞認識ペプチドを含み、かつ、Ｔ細胞エピトープ非存在下で生体内のＢ細胞を直接刺激してクラススイッチした抗体産生を誘導することを特徴とする、多重同種抗原ペプチドを提供する。
【００４８】
本明細書中で使用する「多重同種抗原ペプチド」（ＭＡＰ）は、樹状高分子（すなわち、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ））構造を有する樹状コアと、当該コアの樹状末端に直接またはスペーサーを介して結合した複数個の同種のＢ細胞認識ペプチドとを含む高分子物質である。
【００４９】
樹状コアは、Ｂ細胞認識ペプチド（以下、便宜的に「抗原ペプチド」とも呼ぶ）を複数個、好ましくは４〜８個を結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、樹状ポリマーは少なくとも２個の官能基をもつコア分子から発生する２またはそれ以上の同一の枝を基礎とするものを好適に選択すればよい。当該樹状コアは樹状ポリマーとも呼ばれ、例えば米国特許第４，２８９，８７２号、米国特許第４，５１５，９２０号等に記載された構造体が挙げられるがこれらに限定されず、製造上の簡便さなどから好ましくは複数のリジン残基（Ｋ）を含むペプチドである。当該リジン残基を含むペプチドは、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。例えば、３個のリジン残基（Ｋ）からなるＫ−Ｋ−Ｋ構造の場合、各末端のリジン残基（Ｋ）のα−アミノ基側とε−アミノ基側にそれぞれ１個のＢ細胞認識ペプチドを結合することができる。この場合、最高４個のＢ細胞認識ペプチドを結合することができる。また、リジン残基（Ｋ）には、そのα−カルボキシル基を介してスペーサーを結合してもよい。スペーサーは、好ましくは２個以上１０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ（ここで、βＡはβ−アラニン残基を表し、Ｃはシステイン残基を表す。）などを挙げることができる。スペーサーのＮ末端のアミノ酸基には、例えばリジン残基（Ｋ）であれば、そのα−アミノ基を介して上記と同様の最高４個のＢ細胞認識ペプチドを結合したＫ−Ｋ−Ｋ−構造を連結することができる。この場合、作製されるＭＡＰは最高８個のＢ細胞認識ペプチドを有する。
【００５０】
Ｂ細胞認識ペプチドは、Ｂ細胞受容体によって認識され、かつ抗原性を決定する抗原セグメントである。Ｂ細胞認識ペプチドは、目的とするタンパク質のアミノ酸配列情報より選択される任意の７個以上のアミノ酸であり、好ましくはタンパク質表面上の連続するペプチド（リニアエピトープ）である。Ｂ細胞認識ペプチドは、Ｂ細胞受容体が認識するタンパク質の立体構造を構成するペプチドであっても良く、例えばタンパク質表面上で近接するペプチドの不連続な組合せ（コンホメーショナルエピトープ）を選択しても良い。
【００５１】
リニアエピトープは、抗原タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列の連続した線状エピトープであり、当該エピトープに対する抗体と特異的に結合する。一方、コンホメーショナルエピトープは、例えば、タンパク質表面上で近接する２以上の立体構造のそれぞれを構成するペプチドを組み合わせたものである。これらのペプチドは、抗原タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列では不連続に存在している。このような対応関係にあるペプチドを２以上組合せたものがコンホメーショナルエピトープとなり、当該エピトープに対する抗体は抗原タンパク質の高次構造を特異的に認識して結合する。
【００５２】
本明細書においてＢ細胞認識ペプチドは、Ｂ細胞受容体によって認識され、かつ抗原性を決定する抗原セグメントという点において、Ｂ細胞エピトープとも呼ぶことができる。以下、Ｂ細胞認識ペプチドは、便宜的に「Ｂ細胞エピトープ」とも記載することがある。Ｂ細胞認識ペプチドは、Ｔ細胞受容体に結合してＴ細胞が認識する抗原部分を指すＴ細胞エピトープと多くの場合異なるものであるので、一般的にはＴ細胞非介在性である。一般には、抗原提示細胞によって抗原提示されるＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合することによってヘルパーＴ細胞を活性化し、細胞性免疫または体液性免疫を起こすことが知られている。一方、Ｂ細胞認識ペプチド（Ｂ細胞エピトープ）は、ＴＣＲに抗原提示されずに、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合することによって抗体の産生過程に寄与するため、体液性免疫のみに関与する。
【００５３】
Ｂ細胞認識ペプチドは、典型的には７〜５０アミノ酸、好ましくは１０〜２０アミノ酸、より好ましくは１２〜１６アミノ酸からなるアミノ酸配列を有することができる。
【００５４】
Ｂ細胞認識ペプチドは、タンパク質（生体内での代謝物などを含む）の表面に露出されている部分に該当していることが好ましい。従って、Ｂ細胞認識ペプチドは、抗体の認識対象となるタンパク質のアミノ酸配列、立体構造などの情報に関する解析結果または予測結果に基づいて、当業者であれば任意にタンパク質等の生体高分子表面に露出されている部分を選択して設計することができる。例えば、公知技術として種々の予測法を利用しても良い。そのような予測法は、例えばJulia V. PonomarenkoとMarc H.V. van Regenmortel, “B-Cell Epitope Prediction” (Jenny GuとPhilip E. Bourne編,Structural Bioinformatics, Second Edition, 2009 John Wiley & Sons, Inc.)に例示されている。このなかでは、４つの方法が紹介されている。これらの方法は、（１）配列に基づく方法（sequence-based methods）、（２）アミノ酸スケールに基づく方法（amino acid scale-based methods）、（３）構造に基づく方法（structure-based methods)、(4)タンパク質−タンパク質結合部位予測法(protein-protein binding site prediction methods)である。
【００５５】
配列に基づく方法は、連続エピトープの予測に限られる。この方法の大半は、エピトープが抗体との結合のために抗体にアクセス可能である必要があるという仮定に基づいている。したがって、この方法は表面露出と関連したエピトープ特性を利用することを基本としている。
【００５６】
アミノ酸スケールに基づく方法では、アミノ酸スケールを使用して所定のタンパク質配列中の特定のアミノ酸残基のスコアをコンピュータで計算する。この残基の最終スコアはウインドウズ内のアミノ酸数に対するスケール値の平均である。具体的方法として、人工ニューラルネットワークを利用するＡＢＣｐｒｅｄ法（S. Saha and GP Raghava, Proteins 2006, 65(1): 40-48)、hidden Markov modelとtwo amino acid scaleの組み合わせに基づいたBepiPred法(JE Larsen et al., Immunome Res., 2006, 2: 2)などが挙げられる。
【００５７】
構造に基づく方法は、抗原の三次元構造に基づく方法であり、２つの方法、すなわちCEP(U. Kulkarni-Kale et al., Nucleic Acids Res 33: W168-W171)およびDiscoTope(P.H. Andersen et al., 2006, Protein Sci 15(11): 2558-2567)が知られている。
【００５８】
タンパク質−タンパク質結合部位予測法として、例えばPPI-PRED法(J.R. Bradford et al., Bioinformatics 2005, 21(8): 1487-1494)が挙げられる。
【００５９】
従来では、Ｂ細胞エピトープに加えてＴ細胞エピトープとなり得る部分も考慮する必要があったところ、本発明によれば単一のエピトープの設計のみによって当該エピトープを認識するクラススイッチした抗体（好ましくは抗原特異的ＩｇＧ）産生を誘導できる。
【００６０】
本発明のＢ細胞認識ペプチドは、既存のＢ細胞エピトープとなるペプチド部位に加えて、自然界では通常はＢ細胞エピトープになりえない部位から選択することが可能である。これによって、既存のＢ細胞エピトープに加えて、新しいＢ細胞エピトープを人工的に誘導することが可能であり、新しいＢ細胞エピトープに対するＩｇＧが関与する抑制性シグナルを、従来のＢ細胞エピトープを認識する膜型ＩｇＧを細胞表面に持つ記憶Ｂ細胞や同様のＩｇＥを細胞表面に持つ肥満細胞に入れることができる。このことによって、既存の抗体産生Ｂ細胞の抑制による自己免疫疾患の治療や肥満細胞脱顆粒の抑制によるアレルギー治療が可能である。
【００６１】
本発明のＭＡＰの第１の特徴として、Ｂ細胞認識ペプチドは、上記樹状コアの末端に直接またはスペーサーを介して結合される（好ましくは、各末端に１個ずつ共有結合される）。例えば、官能化された固相レジンに、官能化された樹状コアを結合し、この樹状末端の反応性官能基にＢ細胞認識ペプチドの反応性官能基を結合反応することができる（W. kowalczyk et al., J. Pep. Sci. 2011, 17: 247-251）。この場合、Ｂ細胞認識ペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて自動ペプチド合成機等を用いて合成するなど、公知の技術によって合成することができる（J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nded., Pierce Chemical Company, 1984, G.B. Fields et al., Principles and Practice of Peptide Synthesis, in G.A. Grant (ed): Synthetic Peptides: A User’s Guide, W.H. Freeman, 1992）。
【００６２】
本発明のＭＡＰは、Ｂ細胞認識ペプチドを複数個、好ましくは４〜８個を含み、前記の各ペプチドは同一または相互に高い同一性を有する。ペプチドは既知のＢ細胞エピトープであってもよく、あるいは全く新しいエピトープでも良い。本明細書において「同種のＢ細胞認識ペプチド」とは、エピトープとして同じ性質を持つペプチドであって、高い同一性を有するペプチドを含む意味である。「高い同一性を有するペプチド」とは、複数のＢ細胞認識ペプチドのうち任意の一つのＢ細胞認識ペプチドを基準として、当該ペプチドとの配列同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、から１００％である、または、当該ペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の数では、１〜４個の相違、好ましくは１〜３個の相違、より好ましくは１〜２個の相違、さらに好ましくは１個の相違を有するペプチドを意味する。ここで「エピトープとして同じ性質」とは、目的の標的タンパク質もしくはポリペプチドと結合可能な抗体の産生をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で誘導できるという性質をいう。また、アミノ酸に関する「相違」は、アミノ酸の置換、欠失もしくは付加によるアミノ酸数の相違を意味する。
【００６３】
本発明のＭＡＰの第２の特徴として、Ｂ細胞認識ペプチドは自己抗原または非自己抗原のいずれか、好ましくは自己抗原、に由来するペプチドである。
【００６４】
本明細書において「自己抗原」とは、本発明のＭＡＰを投与する対象と同一の生物種の間で共通する遺伝子産物または当該遺伝子産物由来の代謝物を意味し、同種同系と同種異系の双方を指す。従って、投与対象における個々の遺伝情報などを読み取らずとも、投与対象と同じ生物種における公知の遺伝子情報などを基にしてＢ細胞認識ペプチドを設計することができる。同じ遺伝子産物であっても一塩基多型などの変異によって各対象においてアミノ酸配列が異なる場合は、各対象が有する個別の遺伝情報に基づいて本発明のＭＡＰを設計して投与しても良い。この場合、個々に最適化した設計である反面、汎用性は失われる。そのような観点では、同じ生物種における公知の遺伝情報は、同種異系の遺伝情報ではあるものの同じ生物種であれば高い同一性を有するＢ細胞認識ペプチドを設計することができる。従って、当該情報を基にしたＢ細胞認識ペプチドも「自己抗原」に由来するペプチドである。
【００６５】
Ｂ細胞認識ペプチドが自己抗原に由来するペプチドである場合、本発明によって誘導される抗体は自己抗体となる。
【００６６】
遺伝子産物は、例えば、抗体、サイトカイン、成長因子、膜貫通型タンパク質、細胞表面タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。また、腫瘍細胞に由来する抗原や腫瘍産生因子などの抗原、疾患に直接的または間接的に関係する自己の遺伝子産物に由来する因子のすべてが、本明細書では自己抗原として含まれる。
【００６７】
さらに具体的な例示を次に述べる。
【００６８】
本発明によって誘導できる自己抗体の具体的な例示としては、ＩｇＥに対する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＥ由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、喘息、花粉症、食物アレルギーなどのアレルギー性疾患の治療または予防に利用することができる。
【００６９】
サイトカインの具体的な例示としては、ＴＮＦα、ＩＬ−１βが挙げられるがこれらに限定されない。ＴＮＦα由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、関節リウマチの治療または予防に利用することができる。ＩＬ−１β由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、クリオピリン関連周期性症候群の治療または予防に利用することができる。
【００７０】
成長因子の具体的な例示としては、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。ＶＥＧＦ由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、結腸・直腸癌などのがん若しくは加齢黄斑変性症の治療または予防に利用することができる。
【００７１】
膜貫通型タンパク質の具体的な例示としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−кＢ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、α４インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）が挙げられるがこれらに限定されない。ＥＧＦＲ由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、頭頸部癌、結腸・直腸癌などのがんの治療または予防に利用することができる。ＲＡＮＫＬ由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、骨病変、骨粗鬆症などの骨疾患の治療または予防に利用することができる。α４インテグリン由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、多発性硬化症の治療または予防に利用することができる。ＣＤ２由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、尋常性乾癬の治療または予防に利用することができる。ＣＤ３由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、急性拒絶反応の治療または予防に利用することができる。ＣＤ１１由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、尋常性乾癬の治療または予防に利用することができる。ＣＤ２０由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病などの癌の治療または予防に利用することができる。ＣＤ２５由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、急性拒絶反応の治療または予防に利用することができる。ＣＤ３０由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、ホジキンリンパ腫などの癌の治療または予防に利用することができる。ＣＤ３３由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、急性骨髄性白血病などの癌の治療または予防に利用することができる。ＣＤ５２由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病などの癌の治療または予防に利用することができる。ＣＤ１５２由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、黒色腫などの癌の治療または予防に利用することができる。
【００７２】
細胞表面タンパク質の具体的な例示としては、ＨＥＲ２が挙げられるがこれらに限定されない。ＨＥＲ２由来のＢ細胞認識ペプチドを有する本発明のＭＡＰは、乳癌などの癌の治療または予防に利用することができる。
【００７３】
本明細書では、「非自己抗原」とは、本発明のＭＡＰを投与する対象と同一の生物種において共通に有しない遺伝子産物または当該遺伝子産物由来の代謝物に含まれるエピトープを意味し、投与対象または投与する対象と同一の生物種にとって外来異物を指す。そのような非自己抗原としては、例えば、細菌やウイルスなどの病原体に由来する抗原が挙げられる。本発明によれば、対象となる病原体の構造が明らかになった時点で任意の一つのエピトープとなり得るペプチドを選択するだけでＭＡＰを設計して作製することができる。そのため、病原体の培養方法を確立方法は必要ない。
【００７４】
また、本発明によって、自然界ではＢ細胞エピトープにならない部位を認識する抗体を誘導することが可能である。この新規Ｂ細胞エピトープを認識するＩｇＧは体内で抗原と結合したまま、Ｂ細胞や肥満細胞のＩｇＧ受容体に結合することができる。これは、免疫原罪の機序によって、アレルギー症状を抑制する治療薬や予防薬に活用することができる。
【００７５】
即ち、たとえＢ細胞が同抗原を認識する膜型抗体を持っていて、同様に肥満細胞の表面に同抗原を認識するＩｇＥが結合していても、新規Ｂ細胞エピトープを認識する抗体がＢ細胞や肥満細胞の表面のＩｇＧ受容体に結合してしまうため、これによってこれらＢ細胞や肥満細胞に活性化を抑制するシグナルを送ることが可能である。活性化抑制シグナルが入ったＢ細胞は活性化できず、抗体産生を行うことができない。従って、この作用によって自己抗体産生Ｂ細胞を抑制する治療薬や予防薬に活用できる。同様に肥満細胞は脱顆粒することができないため、アレルギー症状を抑制する治療薬や予防薬に活用することができる。
【００７６】
本明細書中で使用する「多重同種抗原ペプチドを投与する対象」（以下、便宜的に被験体ともいう）には、ヒト、家畜動物（例えばウシ、ブタ、家禽、ラクダ、等）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ、トリ、等）、競争用動物（例えば、ウマ、等）、動物園で飼育される観賞用動物などの哺乳動物が含まれ、好ましくは、ヒトである。
【００７７】
本発明のＭＡＰの第３の特徴として、ＭＡＰは被験体の体内でＴ細胞非介在性にクラススイッチされた抗体産生を誘導する。
【００７８】
本明細書中で使用する「Ｔ細胞非介在性」とは、Ｔ細胞エピトープのようにＴ細胞レセプターに結合することによって細胞性免疫および体液性免疫を指令する通常の免疫系を経ることなく、Ｂ細胞レセプターに直接作用することによってＭＡＰに対する抗体産生を惹起させることを意味する。
【００７９】
本発明によって産生される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥであり、好ましくはＩｇＧである。ＩｇＧ産生をＴ細胞非介在性で誘導できることは重要である。一般に、体内に異物が侵入した場合には最初の約１週間以内にＩｇＭ抗体が産生されて初期の生体内防御が機能するが、ＩｇＭは半減期が短く１週間から１０日間程度で血中のその抗体価は低下する。ＩｇＭ産生に遅れて次第にその異物に反応するＴ細胞が体内で活性化されることにより、通常はＴ細胞からのインターフェロンγが産生されることで、ＩｇＧ抗体が産生されて液性免疫による防御が強化されるようになる。ＩｇＧは一旦産生されるとその半減期が長く、数週間から数カ月以上血中の抗体価は持続する。本発明のＢ細胞認識ペプチドは、Ｂ細胞が認識するペプチド部位、すなわち既知のＢ細胞エピトープもしくは新規のＢ細胞エピトープである。Ｂ細胞認識ペプチドはＴ細胞非介在性であるため、そのようなエピトープの場合、ＩｇＭからＩｇＧへの免疫グロブリンクラススイッチは起こらないと言われてきたが、体内で恒常的に産生される非特異的なインターフェロンγの刺激を受けてＭＡＰにより刺激されたＢ細胞がＩｇＧを産生可能であることが今回示された。そのため、ＭＡＰを被験体に投与するときにインターフェロンγもしくはインターフェロンγを誘導する物質とともに投与することによってＢ細胞が確実にＩｇＧを産生するようになる。
【００８０】
本発明のＭＡＰは、例えば図１に示すような構造を有するが、とりわけＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８に示されるような４〜８個の同種のＢ細胞認識ペプチド、好ましくは同一のＢ細胞認識ペプチド、を含む樹状構造を有する。以下にＭＡＰの製造例を示す。
２．多重同種抗原ペプチドの製造
本発明は、第２の態様により、上記のＭＡＰの製造方法であって、以下の工程（１）〜（４）：
（１）反応性官能基を有する樹状コアを用意する工程、
（２）反応性官能基を有する複数の同種のＢ細胞認識ペプチドを用意する工程、
（３）樹状コアの反応性官能基と上記の各Ｂ細胞認識ペプチドの反応性官能基を結合反応して多重抗原ペプチドを作製する工程、および
（４）多重抗原ペプチドを回収する工程
を含む方法を提供する。
【００８１】
樹状コアは、上で説明したように、複数個の同種のＢ細胞認識ペプチド、好ましくは４〜８個の同種の（好ましくは同一の）Ｂ細胞認識ペプチドを結合するための樹状の支持コアである。樹状コアは、通常知られる構造であってよく、複数のリジン残基（Ｋ）を含むのがよく、および、さらにシステイン残基（Ｃ）を含んでもよい。図１に、本発明のＭＡＰの構造（好ましくはＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８のような構造）を例示するように、４〜８個のＢ細胞認識ペプチド（Ｂ細胞エピトープ）以外の部分を形成するのが樹状コアである。樹状コアは、ＭＡＰ−４の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよいし、また、ＭＡＰ−８の場合、例えばＫ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を含むのがよい。これらの配列の中央のＫには、通常、スペーサーが結合する。スペーサーは、好ましくは２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドであり、例えばＫ−Ｋ−Ｃ、Ｋ−βＡ−Ｃ（ここで、βＡはβ−アラニン残基を表す。）などであるが、これらに限定されないものとする。中央のＫ以外の左右のＫまたはＫ−Ｋには、Ｋ１個あたり２個のＢ細胞認識ペプチドが結合するように設計される。
【００８２】
樹状コアの末端には、Ｂ細胞認識ペプチドと結合するための適切な官能基を有することができる。官能基は、タンパク質の修飾に使用可能な官能基であればよく、例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、アセチレン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基などである。
【００８３】
一方のＢ細胞認識ペプチドの側の官能基は、樹状コアの末端官能基と結合反応しうる任意の官能基であり、例えばアミノ基に対するＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基、スルフヒドリル基に対するスルフヒドリル基またはカルボキシル基、アセチレン基に対するアジド基、などである。Ｂ細胞認識ペプチドは、上で説明したとおりである。
【００８４】
本発明の実施形態により、Ｋ−Ｋ−Ｋ配列を有する樹状コアは、末端官能基がアセチレン基を有する下記の構造：
【００８５】
【化２】
2015190555.tif 000004
【００８６】
を有してもよい。
【００８７】
上記構造のＢ細胞認識ペプチドの末端官能基はアジド基である。この場合の結合反応は、ヒュスゲン反応である。この反応は、アルキンとアジドを一価の銅イオンを触媒とし結合させる反応であり、反応生成物は安定で副反応がほとんど無いとされ、クリックケミストリーとして注目されている。銅イオン触媒溶液は、硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸を用いて調製しうる。この反応の具体例は、後述の実施例２に記載されている。
【００８８】
ＭＡＰを回収する工程では、該ペプチドを精製する。ペプチドの回収の手法は、一般的なタンパク質またはポリペプチドの精製法でよく、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて行われうる。目的物の同定は、核磁気共鳴スペクトル分析法ＮＭＲ、マススペクトル分析法、アミノ酸分析法などによって行うことができる。
３．抗体産生誘導剤
本発明はさらに、第３の態様により、上記のＭＡＰを含む抗体産生誘導剤を提供する。本発明の抗体産生誘導剤は、Ｔ細胞非介在性でクラススイッチされた抗体産生を誘導する製剤である。
【００８９】
本発明の抗体産生誘導剤は、医薬組成物として、抗体産生を顕著に誘導することにより、疾患治療用または疾患予防用に用いることができ、治療目的および／または予防目的の「ワクチン」として使用することができる。
【００９０】
本発明の抗体産生誘導剤は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のように分類することができる。
（ａ）自己抗体誘導用の抗体産生誘導剤
本発明の抗体産生誘導剤はＴ細胞非依存性であるため、抗体の産生がＴ細胞によって制限されている自己抗原に対する抗体（自己抗体）を人工的に誘導することが可能である。自己抗体を産生させることで、例えば健康維持に関係の無い分子を体内から排除することができる。多くの腫瘍性細胞は、正常細胞では微弱な発現である抗原を過剰に産生し、そのような抗原は血流に放出されるか細胞表面上に残る。これら腫瘍抗原に対する免疫反応は多様であり、しばしば腫瘍増殖の抑制には不十分である。本発明の抗体産生誘導剤は、腫瘍抗原に対する抗体を誘導することが可能である。
（ｂ）これまでにワクチンを作ることができなかった疾患に対する抗体産生誘導剤
化学合成物によるワクチン製剤は、感染源である細菌やウイルスの構造が判明した時点でワクチン開発が可能であり、従来技術のように感染源の培養方法が確立してようやくワクチン製剤開発に進むものとはそのワクチン開発のスピード感が大きく異なる。このことは、本発明が従来技術では対応できなかった感染症や新興感染症に適したワクチン製剤を作製可能であることを示している。
（ｃ）外来物質に対応できる抗体産生誘導剤
本発明は化学合成により外来物質に対しては容易に目的の抗体産生を誘導できる方法であるといえる。従来技術では抗体作製が困難な箇所にも計画的に人工的に抗体を誘導することが可能である。具体的には、インフルエンザウイルスに対して従来の方法では変異が起こり易い抗原性の高い箇所にのみ抗体を誘導するワクチンしかできなかったが、本発明によって変異が起こらない抗原性の低い箇所にも強力に抗体産生を誘導することが可能である。
【００９１】
本発明では、ヒト、ヒト以外の動物で保存性の高いタンパク質またはポリペプチドにおいてそのアミノ酸配列が相同の、または同一性の高いペプチド部位を選択することによって、動物実験によってヒト製剤の安全性や有効性の担保を直接取ることができる。このことはさらに、本発明の利用が人体薬のみならず、動物医薬への導出も可能であることを意味し、幅広い応用範囲を持っているといえる。
【００９２】
また、本発明では、化学合成ペプチドを製剤とするため、対象となる病原体の構造が明らかになった時点で製剤を準備することができる。化学合成であるため病原体の培養方法を確立する方法も不要である。また、Ｂ細胞に強制的に抗体産生を誘導できるため、抗原認識部位となるペプチド配列を自由に設定できる。これらのことは、新興感染症に対するワクチン開発や、変異が頻繁に起こるウイルスに対しても変異しない定常部位に抗体を誘導させるワクチン開発が可能である。例えば、西ナイル熱ウイルス、エボラ出血熱、インフルエンザ、口蹄疫など従来技術では対応ができないウイルス性疾患にも対応可能である。また、本発明では、対象となる病原体の構造が明らかになった時点で製剤を準備することができるため、抗原変異が明らかになれば、その変異に対しても同様にペプチドを設計して本発明の抗体産生誘導剤を準備することも当然可能である。
【００９３】
本発明者らは、Ｔ細胞非依存性抗原として多重抗原構造を考えた。そして、抗体誘導の対象となるペプチドは化学合成によって準備し、この合成ペプチドを２個から１６個を樹状に結合したもの（ＭＡＰ−２からＭＡＰ−１６）を化学合成によって作製し、後述の実施例の一つでは抗体誘導の対象となる分子としてＩｇＥを選択し、さらにそのＣＨ３領域でヒト、マウス、イヌで同一性の高い部位を選択した。これをマウスやイヌに投与して、自己抗体の上昇程度について検討した。まず最初にＭＡＰに結合するペプチド数について検討し、ＭＡＰ−４、ＭＡＰ−８に対して抗体上昇が認められたため、本発明の効果を得るために必要なペプチド数は４個から８個であると決定した。
【００９４】
本発明のＭＡＰのヒトでの有効量は、非限定的に、１回投与量としてＭＡＰ−４では約０．０５〜２．５μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、ＭＡＰ−８では、０．５〜２５．０μｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。ここで、投与量は、ヒトを含む被験体の体重、年齢、性別、症状、病気の種類、重症度、投与方法などによって適宜変更しうるものとする。
【００９５】
上昇した抗体がマウスＩｇＥに対する自己抗体であるかどうか、マウスにとっては非自己の配列部位に対する抗体（イヌあるいはヒトの配列部位）であるかを調べるため、イヌＩｇＥ試薬（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いた抑制試験を行い、マウスＩｇＥに対する自己抗体が産生されていること、さらに非自己配列にも抗体産生が行われていることを確認し、ＭＡＰによって自己抗体、外来抗原に対する抗体の両方が誘導されたことを確認した。
【００９６】
また、本発明によってＴ細胞非依存性で上昇する抗体のアイソタイプは好ましくはＩｇＧである。このＩｇＧ誘導は抗原非特異的にＴ細胞から産生されたインターフェロンγの作用によるものと考えられ、そのコンセプトを示すために、Ｔ細胞を持っていないマウス（ヌードマウス）にＭＡＰ−４とインターフェロンγを投与し、抗原非特異的なインターフェロンγによってＴ細胞非依存性の抗体（ＩｇＧ）産生が起こることを確認した。したがって、本発明の抗体産生誘導剤には好ましくはインターフェロンγを含む。
【００９７】
本発明の抗体産生誘導剤の形態は、例えば溶液剤、懸濁剤、錠剤、注射剤、顆粒剤、乳化剤などであり、賦形剤、希釈剤、結合剤、香味剤、界面活性化剤などの添加剤を適宜含むことができる。アジュバントは投与対象においてインターフェロンγの産生が確認される限りにおいて基本的に必要ないが、必要に応じて添加する。
【００９８】
本発明の抗体産生誘導剤は、好ましくはインターフェロンγまたはインターフェロンγ産生能を有するアジュバントを含む。インターフェロンγ産生能を有するアジュバントは特に限定されないが、例えば、α‐ガラクトシルセラミド、α‐ガラクトシルセラミド類縁体、細菌のオリゴヌクレオチドであるＣｐＧ、水酸化アルミニウム（アラム；Ａｌｕｍ）、などが挙げられる。α‐ガラクトシルセラミド類縁体としては、例えば国際公開ＷＯ２００７／０９９９９９号（米国特許８１６３７０５号）、国際公開ＷＯ２００９／１１９６９２号（米国特許８５５１９５９号）、国際公開ＷＯ２００８／１０２８８８号（米国特許８２９９２２３号）、国際公開ＷＯ２０１０／０３００１２号（米国特許８５８０７５１号）、国際公開ＷＯ２０１１／０９６５３６号（米国特許８８５３１７３号）、国際公開ＷＯ２０１３／１６２０１６号（米国公開番号２０１５−０１５２１２８）に記載された化合物が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの文献に記載された該化合物はいずれもα‐ガラクトシルセラミド類縁体の具体例として本明細書の開示の一部とする。ＩｇＡを優位に産生させる場合では、アジュバントはベータ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）またはＴＧＦ−β産生を優位に誘導する物質である。ＴＧＦ−β産生を誘導する物質は特に限定されないが、例えば、コレラトキシンサブユニットＢ、レチノイン酸などが挙げられる。ＩｇＥを優位に産生させる場合には、インターロイキン−４、インターロイキン−１３などのサイトカインまたは当該サイトカインの産生を優位に誘導する物質である。インターロイキン−４、インターロイキン−１３などのサイトカイン産生を誘導する物質は特に限定されないが、例えば、フォルスコリン、Ｄｅｒｐ１（ダニ主要アレルゲン）などが挙げられる。
【００９９】
なお、インターフェロンγ、ＴＧＦ−β、インターロイキン−４、インターロイキン−１３などのサイトカインを産生されるがいずれかを優位に産生しない場合は、本発明の効果としては好ましくない。
【０１００】
本発明の抗体産生誘導剤は、医薬組成物として、上記のアレルギー性疾患、癌などの増殖性疾患、骨疾患、加齢黄斑変性症、多発性硬化症、尋常性乾癬、感染症などの疾患の予防または治療のために使用することができる。すなわち、本発明によれば、上記の抗体産生誘導剤を含む医薬組成物も提供する。
【０１０１】
したがって、本発明はさらに、上記のＭＡＰまたは上記の抗体産生誘導剤を被験体に投与することを含む、上記疾患の予防または治療方法を提供する。この方法では、抗体の産生は、Ｔ細胞非介在性のクラススイッチされた抗体の産生であり、特にはＴ細胞非介在性のＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、またはＩｇＥ抗体の産生を含み、好ましくはＩｇＧ抗体の産生である。既知のＢ細胞エピトープ配列に縛られることなく、ＭＡＰに結合させるペプチドを自由に設定できるため、理論上は実施者が求める抗体を体内で誘導することが可能である。本発明の方法における抗体の産生は、疾患治療または疾患予防の目的で行うことができる。
【０１０２】
投与経路は、静脈内投与、経粘膜投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与などであるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明はさらに、目的の抗体を作製する方法を提供し、当該方法には、本発明のＭＡＰを被験体に投与する工程（ａ）が含まれる。この方法はさらに、前記ＭＡＰに含まれるＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体を産生するＢ細胞を含む生体試料を投与対象より採取する工程（ｂ）；工程（ｂ）で採取した生体試料から前記Ｂ細胞を選択する工程（ｃ）；および前記Ｂ細胞を培養して抗体を回収する工程（ｄ）を含んでもよい。
【０１０４】
本発明はさらに、本発明のＭＡＰを投与された対象から採取した生体試料から、前記ＭＡＰに含まれるＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法を提供する。また、別の態様として、本発明のＭＡＰを投与された対象から採取した生体試料から、前記ＭＡＰに含まれるＢ細胞認識ペプチドに結合する抗体を回収する方法が含まれる。これらの方法は、本発明のＭＡＰを投与した対象において抗体が産生されたことを評価することに利用できる。
【０１０５】
また、本発明の別の態様としては、モノクローナル抗体を作製する場合にも応用できる。これまでモノクローナル抗体を作製する場合、実験動物（例えばマウス）を抗原で免疫して十分にＴ細胞とＢ細胞の反応が起こったところで、脾臓細胞と取り出してハイブリドーマと融合させた後、うまく抗体産生する融合細胞を選別することによって作製するが、Ｔ細胞とＢ細胞の両方の反応がうまく起こらなければ目的のモノクローナル抗体を取得することは困難である。しかし、本発明ではＴ細胞非介在性に抗体産生が可能であり、Ｔ細胞を無視してＢ細胞だけを活性化することにより目的の抗原を認識する抗体を取得しやすくなる。
【０１０６】
さらに、本発明では抗体の認識部位もペプチド配列によって自由にデザインできるため、従来の方法では作製するモノクローナル抗体の認識部位は免疫動物体内のＴ細胞とＢ細胞の認識に依存していたが、目的の部位を認識する抗体を得ることが可能である。このように、本発明は治療薬、予防薬の開発のみならず、研究に必要なモノクローナル抗体の取得も容易にするものである。
【０１０７】
さらに、上記モノクローナル抗体を産生する抗体産生Ｂ細胞より、抗体の重鎖および軽鎖の抗原認識部位（すなわち、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む部位）をコードする遺伝子配列、または、抗体の当該抗原認識部位のアミノ酸配列を特定することができる。この配列情報に基づいて、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体などの組換え抗体を遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
＜ペプチド配列＞
ヒト、イヌおよびマウスのＩｇＥのＣＨ３領域のアミノ酸配列のうち、相同性の高い部位で、かつタンパク質立体構造として外部に突出している部位（ａａ２９３−３０４）の配列を実験で使用する合成ペプチドとした。特に、肥満細胞にすでに結合しているＩｇＥがあった場合、ＭＡＰで誘導した抗ＩｇＥ抗体がそのＩｇＥを架橋して肥満細胞の脱顆粒を誘導しないよう、ＭＡＰで使用するペプチドを設計しなければならない。そのため、今回、ＩｇＥ受容体との結合部分のペプチドに焦点を当てて設計した。合成ペプチドの配列を表１に示す。ただし、実際に、以下の実験に使用した配列はヒトの配列である。ちなみに、これをイヌの配列とマウスの配列と比較した場合、下線を付したアミノ酸が異なる。マウスへ投与した場合のこれらアミノ酸の認識については、下線部アミノ酸部分はマウスにとって外来異物となり、その他はマウスの自己になる。また、３０３および３０４番目のアミノ酸（ＴおよびＨ）は、抗ＩｇＥヒト型抗体医薬であるオマリズマブの認識部位である。【０１０９】
【表１】
2015190555.tif 000005
【０１１０】
また、ＭＡＰコア構造については下記のものを使用した。【０１１１】
【化３】
2015190555.tif 000006
【０１１２】
上記のヒトの配列のペプチドと上記のＭＡＰコア構造とを結合することにより、図１に示した４種類のＭＡＰ（すなわち、ＭＡＰ−２，ＭＡＰ−４，ＭＡＰ−８，ＭＡＰ−１６）を合成した。
［実施例２］
＜Ｂ細胞認識ペプチドおよびＭＡＰコアペプチドの合成＞
Ｂ細胞認識ペプチドおよびＭＡＰコアペプチドの具体的な合成方法は以下のとおりである。【０１１３】
Ｂ細胞認識ペプチドおよびＭＡＰコアペプチドの合成はＦｍｏｃ固相合成法を用いて行った。具体的には、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＴｒｔＡ−ＰＥＧ  Ｒｅｓｉｎ  ０．１ｍｍｏｌを固相担体として用い表２に示す手順で合成した。Ｂ細胞認識ペプチドの配列はＮ３−ＰＥＧ−ＤＷＩＥＧＥＴＹＱＣＲＶＴＨ−ＯＨでありＣ末端からＮ末端に向かいペプチドを伸長した。【０１１４】
【表２】
2015190555.tif 000007
【０１１５】
合成終了後、固相０．１ｍｍｏｌに対しチオアニソール（ｍｌ）：ｍ−クレゾール（ｍｌ）：ＴＩＰＳ（ｍｌ）：ＴＦＡ（ｍｌ）＝１．８：０．５：０．３：１３を加え１．５時間撹拌し、切出と脱保護を行った。切出後は、ろ過により溶液を回収しこれを減圧濃縮した。さらにエーテルを加え沈殿を回収し未精製ペプチドを得た。未精製ペプチドは０．１％ＴＦＡとアセトニトリル（ＡＣＮ）を溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。精製物はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析にて目的物の確認を行った。
［実施例３］
＜ＭＡＰ−ペプチドの合成＞
ＭＡＰコアペプチドとＢ細胞認識ペプチドは、ヒュスゲン反応を利用し結合させた。具体的には、ＭＡＰコア中のアルキンをＣｕ（Ｉ）で活性化しＢ細胞認識ペプチドＮ末端のアジド基と反応させトリアゾールにより結合させた。【０１１６】
ＭＡＰ４を例として具体的な合成工程を以下に説明する。
（工程１）
ＭＡＰコアペプチドとＢ細胞認識ペプチドを８Ｍ尿素水溶液に溶解する。混合比は、ＭＡＰコアペプチド１ｍｇ（０．９μｍｏｌ）：Ｂ細胞認識ペプチド１４ｍｇ（７．２μｍｏｌ）であり、８Ｍ尿素水溶液１．８ｍｌに溶解する。この溶液を「ペプチド溶液」と称する。
（工程２）
硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸水溶液を調製する。【０１１７】
硫酸銅・５水和物水溶液は、硫酸銅・５水和物１８ｍｇ（７２μｍｏｌ）を０．５ｍｌの蒸留水（Ｄ．Ｗ．）に溶解することによって調製する。この溶液を「硫酸銅水溶液」と称する。【０１１８】
アスコルビン酸水溶液は、アスコルビン酸６３ｍｇ（３５８μｍｏｌ）を０．５ｍｌのＤ．Ｗ．に溶解することによって調製する。この溶液を「アスコルビン酸水溶液」と称する。【０１１９】
上記の硫酸銅水溶液と上記のアスコルビン酸水溶液を各０．２ｍｌずつ混和する。この混和液を「Ｃｕ＋溶液」と称する。
（工程３）
ＭＡＰコアペプチドとＢ細胞認識ペプチドとの結合を、ヒュスゲン反応を利用して行う。【０１２０】
ヒュスゲン反応は、アルキンとアジドを一価の銅イオンを触媒とし結合させる反応であり、反応生成物は安定で副反応がほとんど無いとされ、クリックケミストリーとして注目されている。以下にヒュスゲン反応の概要を記載する。【０１２１】
Ｃｕ＋溶液は、硫酸銅・５水和物水溶液とアスコルビン酸を用いて上記の工程２のとおり調製し、ヒュスゲン反応に使用した。【０１２２】
【化４】
2015190555.tif 000008
【０１２３】
反応系全体の混合比（ｍｏｌ比）は、ＭＡＰコア：Ｂ細胞認識ペプチド：硫酸銅・５水和物：アスコルビン酸＝１：８：８：４０である。【０１２４】
ペプチド溶液１．８ｍｌとＣｕ＋溶液０．２ｍｌを混和し、室温で数時間から一晩反応させた。目的物を０．１％ＴＦＡとＡＣＮを溶出液に用いた逆相ＨＰＬＣにて精製・凍結乾燥した。【０１２５】
目的物の確認は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳを用いた質量分析にて行った。
［実施例４］
＜マウスへの投与実験１：ＭＡＰに結合するペプチド数の決定＞
ＭＡＰ−２、ＭＡＰ−４、ＭＡＰ−８およびＭＡＰ−１６のうち抗体誘導能の高いものを選択するためにこの実験を行った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢）を用いて表３に記載のように群わけしてＭＡＰおよび生理的食塩水（陰性対照）を投与した。【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
図２Ａに示すスケジュールに従って７週間（０Ｗ〜７Ｗ）にわたる実験を行った（Ｗは週を示す）。その間、ＭＡＰを３回投与するとともに（投与時点：０Ｗ，２Ｗ，６Ｗ）３回の採血を実施した（採血時点：０Ｗ、１Ｗ、７Ｗ）。【０１２８】
抗体価の測定は、イヌＩｇＥを固相化に用いたＥＬＩＳＡ法を用いて行った。具体的には、イヌＩｇＥ（Ｂｅｔｈｙｌ社）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩固相化した後、マウス血清をブロッキングバッファーで５００倍希釈したものを添加して反応させた。その後、プレートを洗浄し、マウスＩｇＧの検出にはビオチン標識抗マウスＩｇＧロバ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）を、マウスＩｇＭの検出にはビオチン標識抗マウスＩｇＭヤギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）をそれぞれ５０００倍希釈で用い、ストレプトアビジン結合βガラクトシダーゼを添加し、蛍光基質として４−Ｍｅｔｈｙｌ  Ｕｍｂｅｒｌｌｉｆｅｒｙｌ  β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（４ＭＵ）を加え、最終的に蛍光プレートリーダにて蛍光強度を測定した。各個体で０Ｗのときの値を１としてＩｇＭ値は１Ｗの値を、ＩｇＧ値は７Ｗの値を比で表示した。【０１２９】
その結果を図２Ｂに示した。群２（ＭＡＰ−４）および群３（ＭＡＰ−８）で他の群と比較してＩｇＭもＩｇＧも上昇する傾向がみられた。したがって、ＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８に、期待する抗体産生効果があることが示された。群４（ＭＡＰ−１６）ではＩｇＭ、ＩｇＧともに上昇は認められず、ＭＡＰ−１６では免疫反応または抗体産生が起きないことがさらに判った。
［実施例５］
＜マウスへの投与実験２：ＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８の最適投与量の決定＞
次にＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８の投与量を変えて抗体誘導に最適な投与量を検討した本実験にはＢａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢）を使用した。群わけは表４に記載のとおりである。これらＭＡＰの一回投与量はマウス１匹あたり０．００１μｇから１μｇまで設定し、群１〜４はＭＡＰ−４、群５〜８はＭＡＰ−８、そして群９は陰性対照として生理的食塩水を投与した。【０１３０】
【表４】
2015190555.tif 000010
【０１３１】
投与スケジュールは図３Ａに示すとおりである。０週（０Ｗ）と２週目（２Ｗ）に投与を行い、０Ｗ、１Ｗ、３Ｗで採血を行って上記のとおりＩｇＭとＩｇＧを測定した。０Ｗの値と１Ｗの値を（ＩｇＭ測定）、ＯＷの値と３Ｗの値を（ＩｇＧ測定）比較した。この実験ではさらに、イヌＩｇＥだけでなくマウスＩｇＥに対する抗体価も測定した。【０１３２】
その結果を図３Ｂに示した。ＭＡＰ−４投与群の中では群３（１回投与量０．０１μｇ）が、ＭＡＰ−８投与群の中では群６（１回投与量０．１μｇ）が最も抗体誘導に適した投与量であると考えられた。また、ＭＡＰ−４とＭＡＰ−８で最適投与量が異なることも判明した。
［実施例６］
＜ヌードマウスへの投与実験３：ＭＡＰ−ペプチドだけによるＩｇＧ誘導の概念証明＞
これまでＴ細胞非介在性抗原によってＩｇＭは誘導されるものの、ＩｇＧへの抗体クラススイッチは起こらないとされてきた。それはＩｇＧへのクラススイッチにはＴ細胞からのインターフェロンγ刺激を抗体産生Ｂ細胞が受け取ることが必要であり、そのためにはＴ細胞とＢ細胞の間での抗原情報（のやり取りＴ細胞エピトープの認識）が必要であった。すわわち、ＭＡＰ−ペプチドによるＩｇＧ産生にはＴ細胞介在性の抗原特異的な反応が不可欠であった。このことから、これまでの知見によると、ＭＡＰ−ペプチドを使ってＴ細胞介在性反応を起こすために、ＭＡＰ−ペプチドのペプチド部分にはＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープを合わせたものが挿入されてきた（非特許文献１および非特許文献２）。さらにはＴ細胞に強制的に認識させるために、その作用を持つアジュバントとともに投与されてきた。【０１３３】
これに対し、本発明のＭＡＰであるＭＡＰ−４およびＭＡＰ−８によるＩｇＧ産生は、本発明者らが抗体誘導を望むＢ細胞エピトープのみの投与によって起こり、Ｔ細胞非介在性によって起こる。そこで、非特異的（Ｔ細胞エピトープに依存しない）なインターフェロンγの刺激を受けてＭＡＰ−４またはＭＡＰ−８により刺激されたＢ細胞がＩｇＧ産生を行うだろうと予想し、以下の実験を行った。【０１３４】
上記の概念を証明するために、本発明者らは、Ｔ細胞欠損マウス（ヌードマウス）を用いてＭＡＰ−４の投与実験を行った。ヌードマウス（８週齢、雌）に図４Ａに示すとおりＭＡＰ−４とマウスインターフェロンγ製剤（ぺプロテック社）を同時に投与した群とＭＡＰ−４投与のみでインターフェロンγ製剤を投与しない群との間でＩｇＧ産生を検討した。インターフェロンγ製剤の投与はＭＡＰ−４の投与日に６時間間隔で３回、静脈内投与を実施した。投与前と投与後１週間毎に４週間後まで採血し、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体価の推移を調べた。【０１３５】
その結果、図４Ｂのグラフに示すとおり、インターフェロンγを投与した群（群１）では、５匹中３匹で抗イヌＩｇＥに対するＩｇＧ抗体価の上昇が認められたが、インターフェロンγを投与しなかった群（群２）では、すべてのマウスでＩｇＧ抗体価の上昇は認められなかった。【０１３６】
この結果から、本発明者らが予想したように、ＭＡＰ投与で認められた非特異的なインターフェロンγの刺激を受けて、ＭＡＰ−４あるいはＭＡＰ−８で刺激されたＢ細胞はＩｇＧ産生を行うことが判明した。【０１３７】
上記の実験で群１におけるイヌＩｇＥに対するＩｇＧがマウスＩｇＥに対するＩｇＧと同じであること（すなわち、本当にマウスＩｇＥの自己抗体であること）を証明するために、次にマウスＩｇＥに対するＩｇＧ抗体価を測定するとともにイヌＩｇＥを予め血清に添加することによる抑制試験を実施した。この実験に使用した血清は上記ヌードマウス実験で最も高い抗体価を示した血清を用いた。【０１３８】
具体的には、固相化にマウスＩｇＥを使用したＥＬＩＳＡ法でマウスＩｇＧの抗体価を測定し、一方で同じ血清にイヌＩｇＥ（Ｂｅｔｈｙｌ社）を予め加えて反応させた後にマウスＩｇＥに対するマウスＩｇＧを測定した。【０１３９】
その結果を図５に示した。図から、マウスＩｇＥに対するＩｇＧの上昇が認められたと同時に、イヌＩｇＥを予め加えた血清においては測定値の低下が認められた。コントロールとしてイヌＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ社）を血清に加えた測定では低下はわずかであった。したがって、イヌＩｇＥによって抑制された部分がイヌＩｇＥとマウスＩｇＥをともに認識する抗体であることが分かり、マウス体内においてマウスＩｇＥに対する自己抗体がＭＡＰ−４で誘導されていることが示された。【０１４０】
以上のように、上記の実験を通して、ＩｇＥについてＭＡＰ−ペプチドが自己抗体を誘導することが示された。このことは、Ｔ細胞の関与なしでＭＡＰ−ペプチド構造を持つ化学合成物だけで目的のＩｇＧ産生が可能であることを示すと同時に、自己抗体以外の外来抗原についてもＩｇＧ誘導が可能であることを示している。さらにまた、本発明では、そのＭＡＰペプチドにおけるＩｇＧ誘導に有効なペプチド数を４個から８個までと決定することができた。
［実施例７］
＜感作犬におけるコナヒョウヒダニ特異的ＩｇＥの変化＞
ビーグル犬３頭を使用し、コナヒョウヒダニ抗原（Ｇｒｅｅｒ社）２５０μｇをアラム（Alum；水酸化アルミニウム）アジュバント２５ｍｇとともに１週間間隔で２回皮下投与した。コナヒョウヒダニ特異的ＩｇＥの上昇を認めた後（０ｗ）、治療実施犬２頭（１２−３５および１２−３６）には実施例５と同じＭＡＰ−８を５００μｇ含む１ｍＬの生理食塩水を静脈注射した。陰性対照として残りの１頭（１２−１５）に１ｍＬの生理食塩水を静注した。ＭＡＰ−８の投与によって抗ＩｇＥ自己抗体が生じると考えられる２回目のＭＡＰ−８投与後、１週間目にコナヒョウヒダニＩｇＥの低下が認められた。一方、陰性対照のイヌのコナヒョウヒダニＩｇＥは低下しなかった。結果を図６に示す。なお、ＩｇＥは血中に一定濃度が存在するようマウス体内で調節されるため、翌週には治療実施犬においてもＩｇＥ量が増加した。このような場合は、ＭＡＰ−８の複数回投与、又はＭＡＰ−８と同時にインターフェロンγ産生を上げる（もしくは、高める）ことなどにより、治療効果を改善することが期待できる。
［実施例８］
＜アレルゲンによるブースト状態におけるＩｇＥ上昇の抑制効果の検討＞
３頭のビーグル犬（１歳、メス２頭、オス１頭）を用いて、コナヒョウヒダニの粗抗原（Ｇｒｅｅｒ社製）２５０μｇをアラムアジュバント２５ｍｇとともに２回皮下注射し、アレルゲン感作した。コナヒョウヒダニに対するＩｇＥ値が十分に上昇したことを確認した後、２週間毎に３回、生理的食塩水１ｍｌに溶解したＭＡＰ−８を５００μｇ／頭／回で静脈注射した（投与群１２−３５および１２−３６の２頭）。対照群として残りの１頭には同量の生理的食塩水を注射した。その後、定期的にコナヒョウヒダニに対するＩｇＥ値を測定したが、値に変化が見られなかったため、８週間後にコナヒョウヒダニ粗抗原を１００μｇで皮下注射し、アレルゲンブーストした（グラフ中表示、アレルゲン投与）。このアレルゲン投与後４日目にこれまでと同量のＭＡＰ−８を静注し、アレルゲン投与後５日および１３日目にコナヒョウヒダニに対するＩｇＥ値を測定した。その結果、アレルゲン投与時の測定値を１．０としてコナヒョウヒダニに対するＩｇＥの上昇比を算出したところ、投与群のコナヒョウヒダニのＩｇＥ値の上昇は対照群の犬に比較して弱いことがわかった。これによって、ＭＡＰ−８の投与によりアレルゲン暴露下においてもそのＩｇＥ上昇が抑制されることがわかった。結果を図７に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、Ｂ細胞認識ペプチドを４〜８個有する多重同種抗原ペプチドを提供する。本発明の多重同種抗原ペプチドは、アジュバントなしであっても、体内でＴ細胞非介在性にクラススイッチされた抗体産生を可能にする。本発明により、これまでに抗体誘導が困難であった対象に対しても抗体を作ることができることが示された。【０１４２】
例えば、疾患に関連する特定のタンパク質に含まれるペプチド由来のＢ細胞認識ペプチドを有する多重同種抗原ペプチドであれば、抗体医薬の代替法となり得る。また本発明によれば、ワクチンが製造できなかった感染症や新興感染症に対してもワクチンとして利用することが可能となる。【０１４３】
このように本発明は、これまで不可能とされてきた自己抗体、外来抗原に対する抗体をも容易に作製することができ、産業上の有用性が極めて高いといえる。【０１４４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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