(57)【要約】  メソトリプシンの活性を阻害する新規な内因性インヒビターを用いた、角層剥離の亢進・抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法、角層剥離の抑制・亢進の評価方法、及び角層剥離促進剤・角層剥離抑制剤のスクリーニング方法を提供する。  セルピンＢ１２が、角層剥離の出発プロテアーゼとして知られるメソトリプシンの活性を阻害する、内因性トリプシンインヒビターとして機能するという、知見に基づく。
2016063991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を亢進することにより、角層剥離の亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法。
【請求項２】
前記セルピンＢ１２の発現の亢進が、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の促進、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の阻害によりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を抑制することにより、角層剥離の抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法。
【請求項４】
前記セルピンＢ１２の発現の抑制が、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の阻害、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の促進によりもたらされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の増大を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、角層剥離の抑制の評価方法。
【請求項６】
さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の増大、及び／又は前記サイレンサー活性の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記角層剥離の抑制が肌老化に起因する、請求項５〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記角層剥離の抑制が尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患に起因する、請求項５〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の減少を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、角層剥離の亢進の評価方法。
【請求項１１】
さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の減少、及び／又は前記サイレンサー活性の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記角層剥離の亢進が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患に起因する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
角層剥離促進剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を阻害する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を亢進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を阻害する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を促進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記角層剥離促進剤が、肌老化の予防又は改善に用いられる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記角層剥離促進剤が、尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患の予防又は治療に用いられる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
角層剥離抑制剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を亢進する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする方法。
【請求項２０】
さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を促進する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記角層剥離抑制剤が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患の予防、改善又は治療に用いられる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養細胞が表皮角化細胞である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層剥離においてセルピンＢ１２の発現が密接に関与しているという新たな知見に基づく、角層剥離の亢進・抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法、角層剥離の抑制・亢進の評価方法、及び角層剥離促進剤・角層剥離抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の最外層である角層（ＳＣ）は、角化した細胞（角質細胞）と、連続的な細胞外脂質層とからなり、生理化学的障壁を形成して環境災害から身体を効果的に保護している。ＳＣは、ケラチノサイトの最終分化を通じて継続的に作り出される。それと同時に細胞シェディング（剥離）も起こってＳＣが一定の厚さに維持される。正常な剥離では、個々の角質細胞すなわち小さな凝集体が皮膚表面から剥がれる。このプロセスは、健康な人では感知できないが、ある病的状態ではＳＣの創出と剥離の間に不均衡が存在する。【０００３】
ＬｕｎｄｓｔｒｏｍとＥｇｅｌｒｕｄは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼがＳＣに存在していて剥離に関与していることを報告している（非特許文献１）。この酵素は、ヒトの足裏のＳＣから角層キモトリプシン酵素として精製され、角層キモトリプシン酵素をコードしているｃＤＮＡは、ヒトケラチノサイトｃＤＮＡライブラリーから単離された（非特許文献２；非特許文献３）。本発明者は、キモトリプシン酵素だけでなく、トリプシン様セリンプロテアーゼも足裏以外でのＳＣの剥離プロセスに関与していることを示した。最近の研究により、１５種類のセリンプロテアーゼ（それをカリクレイン１〜１５（ＫＬＫ１〜１５）と呼ぶ）をコードしているヒト組織カリクレイン遺伝子ファミリーが染色体１９ｑ１３．４にクラスターとして位置していることが明らかにされた（非特許文献４；非特許文献５）。これらセリンプロテアーゼの多くはヒト組織で広く発現しており、その中に皮膚が含まれる。これらのカリクレインファミリーのメンバーのうち、カリクレイン７（ＫＬＫ７、ｈＫ７）及びカリクレイン５（ＫＬＫ５、ｈＫ５）が角層剥離に関与することが報告されている（非特許文献６及び非特許文献７）。また、カリクレイン８（ＫＬＫ８、ｈＫ８）は、ヒト表皮において活性なセリンプロテアーゼであり、皮膚バリアにおけるタンパク質分解カスケードに関与していることが報告されている（非特許文献８）。【０００４】
その一方で、異なる３種類のトリプシノーゲンがヒト膵液に存在する。これらトリプシノーゲンは、その等電位点に基づき、カチオン性トリプシノーゲン、アニオン性トリプシノーゲン、メソトリプシノーゲンと呼ばれている。最近の研究により、これらトリプシノーゲンは、それぞれ異なる遺伝子ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ３によりコードされる（非特許文献９）。ＰＲＳＳ１遺伝子産物であるトリプシノーゲン１と、ＰＲＳＳ２遺伝子産物であるトリプシノーゲン２は、主要な消化性膵臓プロテアーゼである。ＰＲＳＳ３はメソトリプシノーゲン遺伝子であり、少なくとも２つのスプライシング変異体が生成される（トリプシノーゲン３と４）。これらのトリプシノーゲンはすべて、様々な種に由来する膵臓トリプシノーゲンに存在する非常に高度に保存された、エンテロペプチダーゼによって活性化される推定の切断部位配列ＤＤＤＤＫ−Ｉを有する（ＬｉｇｈｔとＪａｎｓｋａ、１９８９年）。トリプシノーゲンは膵臓だけでなく他の組織でも発現しており、その中にはさまざまな組織の上皮細胞とヒトの脳が含まれる。興味深いことに、メソトリプシンは他の２つのトリプシンとは基質特異性と阻害剤感受性が異なっている。メソトリプシンはタンパク質基質を余り切断しない。その最も特徴的な性質は、天然のトリプシンインヒビターであるα１−トリプシンインヒビター、膵臓分泌トリプシンインヒビター（Ｋａｚａｌタイプ）、ダイズトリプシンインヒビター（Ｋｕｎｉｔｚタイプ）などに対する耐性である。これらの知見は、トリプシンの、腸での消化に加えて、さまざまな生理学的反応における関与の可能性を示唆している。【０００５】
本発明者は、ヒトケラチノサイトｃＤＮＡライブラリーからトリプシノーゲン遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行い、その結果メソトリプシノーゲン遺伝子ＰＲＳＳ３の２つのスプライシングアイソフォームを単離し、その一方はトリプシノーゲン４（脳トリプシノーゲン）と同一であり、そして他方はＮ末端領域をコードするエキソンにおいてのみ相違して、それをトリプシノーゲン５と命名した（非特許文献１０）。【０００６】
両アイソフォーム共に、活性化配列ＤＤＤＤＫ−Ｉを有す。ＤＤＤＤＫ−Ｉは、切断部位での主に負に帯電した残基の存在を理由に、トリプシン自身ではほとんど切断されない。対照的に、エンテロペプチダーゼはＤＤＤＤＫ−Ｉ配列に対して特異性が高い（非特許文献１１）。例えば、牛トリプシノーゲンに対するエンテロペプチダーゼの触媒効率は、牛トリプシンに対するそれの３４，０００倍である。したがって、エンテロペプチダーゼがトリプシノーゲンをトリプシンに生理学的に変換する唯一の酵素である。エンテロペプチダーゼが表皮の顆粒層にもっぱら存在することも見出された。これらのトリプシノーゲンとその活性化酵素エンテロペプチダーゼの発現及び存在箇所は、メソトリプシンがケラチノサイトの末端分化に関与する見解と一致する。【０００７】
末端分化の際、多くの現象がタンパク質分解作用に関連している。最外層の顆粒細胞において、核と全てのオルガネラは消失し、ケラチンの分子量は減少し、そしてプロフィラグリンはフィラグリンへとプロセッシングされる。最近の研究では、セリンプロテアーゼインヒビターであるリンホ−エピセリアル−カザール−タイプ５インヒビター（ＬＥＫＴＩ）が角層剥離に重要であることが示されている。ＬＥＫＴＩ遺伝子の突然変異体ＳＰＩＮＫ５がネザートン症候群として知られる重篤な先天性魚鱗癬様紅皮症を有する患者の欠陥遺伝子として同定されている。主要角層剥離プロテアーゼはＬＥＫＴＩにより強力に阻害される（非特許文献１２）。ＳＰＩＮＫ５欠損マウスは表皮プロテアーゼの過剰亢進を示し、またデスモグレン１の過剰分解を通じてネザートン症候群に似た症状を示す。複数の表皮カリクレインがデスモグレン１の切断を通じて角層剥離に関与していることもあり、それらはＬＥＫＴＩにより調節される。【０００８】
角層剥離は、細胞接着の働きを示すデスモゾームにＫＬＫが作用してそれを分解することによって生じ、ＬＥＫＴＩがＫＬＫの作用を抑制すると角層剥離も抑えられる。これまで、メソトリプシンの活性を阻害する内因性インヒビターの存在は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｒｅｓ． ２８２: ２３４―７ （１９９０）
【非特許文献２】Ｊ. Ｉｎｖｅｓｔ. Ｄｅｒｍａｔｏｌ. １０１: ２００−４ （１９９３）
【非特許文献３】Ａｒｃｈ. Ｄｅｒｍａｔｏｌ. Ｒｅｓ. ２８３:１０８−１２ （１９９１）
【非特許文献４】Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７５: ３７３９７−４０６ （２０００）
【非特許文献５】Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ３８２: ５−１４ （２００１）
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ ２５４: １１９−２８ （２０００）
【非特許文献７】Ｊ. Ｉｎｖｅｓｔ. Ｄｅｒｍａｔｏｌ. １２２: １２３５−４４ （２００４）
【非特許文献８】Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２８６: ６８７−７０６ （２０１１）
【非特許文献９】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ. Ｌｅｔｔ. １２: ４５７−６４ （２００５）
【非特許文献１０】Ｊ. Ｉｎｖｅｓｔ. Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ, １３０: ９４４−９５２ （２０１０）
【非特許文献１１】Ｔｒｅｎｄｓ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｓｃｉ. １４: １１０‐２ （１９８９）
【非特許文献１２】Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ３８６: １１７３−８４ （２００５）
【非特許文献１３】Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７６: ４９３２０−４９３３０ （２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまで、メソトリプシンの活性を阻害する内因性インヒビターの存在は全く知られていなかった。本発明の課題は、メソトリプシンの活性を阻害する新規な内因性インヒビターを用いた、角層剥離の亢進・抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法、角層剥離の抑制・亢進の評価方法、及び角層剥離促進剤・角層剥離抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、誠意検討した結果、セルピンＢ１２が、角層剥離の出発プロテアーゼとして知られるメソトリプシンの活性を阻害する、内因性トリプシンインヒビターとして機能する、という驚くべき知見を得た。【００１２】
したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］  被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を亢進することにより、角層剥離の亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法。
［２］  前記セルピンＢ１２の発現の亢進が、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の促進、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の阻害によりもたらされる、１に記載の方法。
［３］  被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を抑制することにより、角層剥離の抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法。
［４］  前記セルピンＢ１２の発現の抑制が、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の阻害、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の促進によりもたらされる、３に記載の方法。
［５］  被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の増大を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、角層剥離の抑制の評価方法。
［６］  さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、５に記載の方法。
［７］  セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の増大、及び／又は前記サイレンサー活性の減少を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、５又は６に記載の方法。
［８］  前記角層剥離の抑制が肌老化に起因する、５〜７いずれかに記載の方法。
［９］  前記角層剥離の抑制が尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患に起因する、５〜７いずれかに記載の方法。
［１０］  被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の減少を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、角層剥離の亢進の評価方法。
［１１］  さらに、前記角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、前記メソトリプシンの発現量の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、１０に記載の方法。
［１２］  セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の減少、及び／又は前記サイレンサー活性の増大を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、１０又は１１に記載の方法。
［１３］  前記角層剥離の亢進が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患に起因する、１０〜１２のいずれかに記載の方法。
［１４］  角層剥離促進剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を阻害する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする方法。
［１５］  さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を亢進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、１４に記載の方法。
［１６］  セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を阻害する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を促進する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする、１４又は１５に記載の方法。
［１７］  前記角層剥離促進剤が、肌老化の予防又は改善に用いられる、１４〜１６のいずれかに記載の方法。
［１８］  前記角層剥離促進剤が、尋常性魚鱗癬又は疣贅から選択される皮膚疾患の予防又は治療に用いられる、１４〜１６のいずれかに記載の方法。
［１９］  角層剥離抑制剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を亢進する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする方法。
［２０］  さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、１９に記載の方法。
［２１］セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を促進する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする、１９又は２０に記載の方法。
［２２］  前記角層剥離抑制剤が、日焼け、乾燥肌、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群又は先天性魚鱗癬様紅皮症から選択される肌状態又は皮膚疾患の予防、改善又は治療に用いられる、１９〜２１のいずれかに記載の方法。
［２３］  前記培養細胞が表皮角化細胞である、１４〜２１のいずれかに記載の方法。
［２４］  被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を亢進することにより、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法。
［２５］  被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を抑制することにより、角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法。
［２６］  セルピンＢ１２発現亢進剤を含んで成る、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患を治療するための医薬組成物。
［２７］  セルピンＢ１２の発現抑制を含んで成る、角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患を治療するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新規かつ有用な角層剥離の亢進・抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法、角層剥離の抑制・亢進の評価方法、及び角層剥離促進剤・角層剥離抑制剤のスクリーニング方法を提供することが可能となる。これにより、角層剥離を制御し、角層剥離の抑制・亢進に起因する肌状態又は皮膚疾患の予防、改善又は治療に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】セルピンＢ１２の発現に基づく角層剥離メカニズムを示す。新規トリプシンインヒビターであるセルピンＢ１２は、角層剥離の出発プロテアーゼであるメソトリプシンの活性、及び角層剥離酵素であるＫＬＫ５／７／８の活性を阻害し、角層剥離に関与する。
【図２】角層抽出液のセルピンＢ１２（吸光度）とメソトリプシン阻害活性の相関性を示すグラフである。
【図３】セルピンＢ１２のＫＬＫ８に対する阻害活性を示すグラフである。
【図４】セルピンＢ１２のＫＬＫ５／７に対する阻害活性を示すグラフである。
【図５】角層の薄い皮膚組織（まぶた、腹部）、及び角層の厚い皮膚組織（踵）におけるメソトリプシン及びセルピンＢ１２の発現を示す組織染色写真である。
【図６】ケラチノサイトの分化（角化）に及ぼすセルピンＢ１２の影響を示す写真である。
【図７】ケラチノサイトの分化（角化）に及ぼすセルピンＢ１２の発現量における影響を示す写真である。
【図８】アトピー性皮膚炎の患者から採取した病変部において、メソトリプシンの発現が亢進していることを示す組織染色写真である。
【図９】各薬剤のセルピンＢ１２発現亢進活性を示すグラフである。
【図１０】各薬剤のセルピンＢ１２発現阻害活性を示すグラフである。
【図１１】セルピンＢ１２プロモーター領域中の各領域（−１５００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ)、−１２００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１２００ｂｐ)、−９００ｂｐ(−１ｂｐ〜−９００ｂｐ)、−６００ｂｐ(−１ｂｐ〜−６００ｂｐ)、−３００ｂｐ(−１ｂｐ〜−３００ｂｐ)、−１５０ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ））における転写活性を示すグラフである。
【図１２】セルピンＢ１２プロモーター領域中の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域の欠失による転写活性を示すグラフである。
【図１３】セルピンＢ１２プロモーター領域中の−３００ｂｐ〜−６００ｂｐの領域の欠失による転写活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
セルピンＢ１２は、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅによって発見され、セルピン・スーパーファミリーに属するトリプシンインヒビターとして知られる。セルピンＢ１２は、脳、骨髄、リンパ節、心臓、肺、肝臓、すい臓、精巣、卵巣又は腸管など多様な器官で発現し、トリプシンやプラスミンなどの活性を阻害することが報告されている（非特許文献１３）。しかしながら、セルピンＢ１２の生体内での具体的な作用については、これまで殆ど知られていない。
【００１６】
本発明者は、表皮メソトリプシンの角層剥離への関与を研究する過程で、セルピンＢ１２がメソトリプシンの内因性インヒビターとして機能するという驚くべき知見を得た。メソトリプシンは、カチオン性トリプシノーゲンとアニオン性トリプシノーゲンの中間の等電点を有し、これらの２つのトリプシンと異なり、高分子タンパク質に対する分解性が低いことから、これまで、メソトリプシンを制御できる内因性インヒビターは存在しないと考えられていた。さらに、本発明者は、セルピンＢ１２が、角層剥離酵素であるＫＬＫ５／７／８と結合し、これらの活性を阻害することを見出した。このたび発見された、新たな角層剥離メカニズムを図１に示す。図１からもわかるように、角層中のセルピンＢ１２の発現が亢進すれば、メソトリプシン及びＫＬＫ５／７／８の活性が阻害されるため、角層剥離は抑制される。反対に、角層中のセルピンＢ１２の発現が抑制されれば、メソトリプシン及びＫＬＫ５／７／８の活性は阻害されないため、角層剥離は促進される。
【００１７】
したがって、本発明の１つの観点において、被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を亢進することにより、角層剥離の亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法、及び被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を抑制することにより、角層剥離の抑制に起因する肌状態を改善するための美容方法が提供される。
【００１８】
角層剥離の亢進に起因する肌状態とは、例えば、日焼けや肌荒れなど急性の炎症を起こした肌が挙げられる。角層剥離の抑制に起因する肌状態とは、例えば、加齢、紫外線や乾燥などの環境変化が誘導する慢性炎症によって生じる肌老化が挙げられる。
【００１９】
同様に、被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を亢進することにより、角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法、及び被験者の角層におけるセルピンＢ１２の発現を抑制することにより、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患を治療するための医療方法が提供される。
【００２０】
角層剥離の亢進に起因する皮膚疾患とは、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、ネザートン症候群及び先天性魚鱗癬様紅皮症が挙げられ、角層剥離の抑制に起因する皮膚疾患とは、例えば、尋常性魚鱗癬、疣贅などが挙げられる。
【００２１】
さらに、本発明者は、このたび、セルピンＢ１２遺伝子（ＮＭ＿０８０４７４．２）［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を参照］における転写開始点の上流領域（−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ）をプロモーター領域と予想し、その領域内における発現制御領域を調べたところ、−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ領域にコアプロモーターが存在しており、また、−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域にサイレンサーが存在し、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域は強いサイレンサー機能していることを見出した。したがって、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の促進、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の阻害によって、セルピンＢ１２の発現を亢進することが可能となる。一方、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性の阻害、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性の促進によって、セルピンＢ１２の発現を抑制することが可能となる。本願において、「コアプロモーター活性」とは、遺伝子の転写開始を制御するための活性を意味し、「サイレンサー活性」とは、遺伝子の転写を抑制するための活性を意味する。ヒト・セルピンＢ１２の発現制御領域に関するこれらの知見は、上述の角層剥離の抑制・亢進に起因する肌状態の改善や、角層剥離の抑制・亢進に起因する皮膚疾患の治療への応用に寄与する。
【００２２】
本発明の別の観点において、被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の増大を角層剥離の抑制の指標とすることを特徴とする、角層剥離の抑制の評価方法、及び被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量を測定し、前記セルピンＢ１２の発現量の減少を角層剥離の亢進の指標とすることを特徴とする、角層剥離の亢進の評価方法が提供される。
【００２３】
角層試料の採取は任意の方法で実施することができるが、例えば、踵などの角質をやすり等で削り、角層粉末として採取してもよい。また、簡便性の観点から、テープストリッピングにより採取することもできる。テープストリッピングとは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、剥がし、皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層試料を採取する方法である。テープストリッピング法を利用すれば、角層をテープ一枚採取するだけでセルピンＢ１２の発現の測定が可能となり、セルピンＢ１２を指標とした角層肥厚の評価が可能となる。テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば２×５ｃｍ）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばＳｃｏｔｃｈ Ｓｕｐｅｒｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍａｉｌｉｎｇ Ｔａｐｅ（３Ｍ社製）、セロファンテープ（セロテープ（登録商標）；ニチバン株式会社）等が使用できる。粘着テープに付着した皮膚角層試料中のセルピンＢ１２は、テープ片を適当な抽出液、例えばＴｒｉｓ−バッファー（ｐＨ８．０）（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸漬し、角層を抽出することでテープから単離・抽出させることができる。
【００２４】
本発明の好ましい態様において、セルピンＢ１２の発現は、好ましくはセルピンＢ１２に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。ＥＬＩＳＡにおいて使用するセルピンＢ１２に特異的な抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作成方法は当業者に周知であり、例えばＬｕｎｓｔｒｕｍ ｅｔ ｅｌ.,Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１：９０４２‐９０４８；Ｈｕｒｌｅ ｅｔ ａｌ.Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，１０７：２６２３−２６３４に記載されている。本発明に係る方法においては、サンドイッチ免疫測定法が特に好ましい。
【００２５】
あるいは、角層試料からＲＮＡを抽出し、セルピンＢ１２をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。ＲＴ−ＰＣＲに適切なプライマーの選定は当業者に周知な方法により実施することができる。
セルピンＢ１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析には、例えば、以下のプライマーを使用することができる。
フォワード・プライマー：ＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号１）
リバース・プライマー  ：ＣＡＣＣＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡ（配列番号２）
【００２６】
上述の測定において、対照値と比較して、被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量が有意に高い場合やメソトリプシンの発現量が有意に低い場合に、角層剥離が抑制されている、と評価することができる。一方、対照値と比較して、被験者の皮膚から採取した角層試料中のセルピンＢ１２の発現量が有意に低い場合やメソトリプシンの発現量が有意に高い場合に、角層剥離が亢進されている、と評価することができる。例えば、角層試料中のセルピンＢ１２の発現量が対照値と比べ３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上高い場合、「角層剥離が抑制されている」と判断する、としてよい。一方、例えば、角層試料中のセルピンＢ１２の発現量が対照値と比べ３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上低い場合、「角層剥離が亢進されている」と判断する、としてよい。対照値は、健常な角層中のセルピンＢ１２の発現量を示すものである限り特に制限されないが、例えば統計学的に有意な数の肌状態が良好な健常人から採取した対応の部位における角層試料中のセルピンＢ１２の発現量の平均値であってよい。
【００２７】
前記角層剥離の抑制の評価方法においては、さらに、角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、その発現量の減少を角層剥離の抑制の指標として用いることができる。一方、前記角層剥離の亢進の評価方法においては、さらに、角層試料中のメソトリプシンの発現量を測定し、その発現量の増大を角層剥離の亢進の指標として用いることができる。
【００２８】
前記角層剥離の抑制の評価方法においては、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の増大、及び／又は前記サイレンサー活性の減少を角層剥離の抑制の指標として用いることができる。一方、前記角層剥離の亢進の評価方法においては、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を測定し、前記コアプロモーター活性の減少、及び／又は前記サイレンサー活性の増大を角層剥離の亢進の指標として用いることができる。転写調節領域のクローニング方法、プラスミドの作成方法及び転写制御活性の測定方法は当業界において周知である。制御制御活性は、例えば、ルシフェラーゼアッセイによって測定することが可能であり、下記の例１１と同様の手法を用いることができる。
【００２９】
被験者の角層剥離の抑制・亢進を評価することにより、上述の角層剥離の抑制・亢進に起因する肌状態や、角層剥離の抑制・亢進に起因する皮膚疾患の診断を行うことができる。
【００３０】
さらに別の観点において、本発明は、角層剥離促進剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を阻害する薬剤を角層剥離促進剤として選定することを特徴とする方法、及び角層剥離抑制剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を培養細胞に適用した場合、該細胞におけるセルピンＢ１２の発現を亢進する薬剤を角層剥離抑制剤として選定することを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
セルピンＢ１２の発現は、候補薬剤を水や培地（例えばＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地）に溶解し、培養細胞を含むスクリーニング系に添加した後、上述のとおり、当業界に周知の方法を用いて、培養細胞中のセルピンＢ１２の発現量を測定することにより決定ことができる。培養細胞は、皮膚細胞、典型的には表皮細胞であり、特に好ましくは角化細胞である。培養細胞は、ヒト由来であっても、その他の動物、例えばラット、マウス、ウサギなどであってもよい。
【００３２】
候補薬剤の添加量は、一概には規定できないが、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度とする。候補薬剤の添加は、好ましくは塩化カルシウム、及び／又はＳ１００Ａ８又はＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下で行う。培養条件は特に制限されることはないが、好ましくは５％ＣＯ2下で、典型的には３０〜３７℃で１〜１４時間、好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間インキュベーションを行う。
【００３３】
上述の測定において、例えば培養細胞中のセルピンＢ１２の発現が対照値と比べ３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上阻害したら、「角層剥離促進剤」と判断する、としてよい。一方、例えば培養細胞中のセルピンＢ１２の発現が対照値と比べ３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上亢進したら、「角層剥離抑制剤」と判断する、としてよい。対照値は、健常な角層中のセルピンＢ１２の発現量を示すものである限り特に制限されないが、例えば統計学的に有意な数の肌状態が良好な健常人から採取した対応の部位における培養細胞中のセルピンＢ１２の発現量の平均値であってよい。
【００３４】
前記角層剥離促進剤のスクリーニング方法においては、さらに、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を亢進する薬剤を角層剥離促進剤として選定してもよく、また、角層剥離抑制剤のスクリーニング方法においては、前記細胞におけるメソトリプシンの発現を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定してもよい。
【００３５】
さらに、前記角層剥離促進剤のスクリーニング方法においては、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を阻害する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を促進する薬剤を角層剥離促進剤として選定してもよく、また、角層剥離抑制剤のスクリーニング方法においては、セルピンＢ１２プロモーター領域の−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域におけるコアプロモーター活性を促進する薬剤、及び／又はセルピンＢ１２プロモーター領域の−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域、特に−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域におけるサイレンサー活性を阻害する薬剤を角層剥離抑制剤として選定してもよい。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法によって得られた角層剥離促進剤・角層剥離抑制剤は、上述の角層剥離の抑制・亢進に起因する肌状態の改善や、角層剥離の抑制・亢進に起因する皮膚疾患の治療に用いることができる。
【００３７】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
１．角層の採取
美容器具ＷＩＤＥ ＳＣＲＡＴＣＨ（素数株式会社）で踵を製品マニュアルの方法で削り、その削った角層を回収した。【００３９】
２．角層抽出液の作成
回収した角層は、重量を測定後、溶解バッファー（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）＋ ０．１４ Ｍ ＮａＣｌ ＋ ０．１% Ｔｗｅｅｎ ２０）を加え、氷上でテンブロック型ホモジナイザー（Ｃａｔ．Ｎｏ．３５７４２８, ＷＨＥＡＴＯＮ社）を用いて全て液状になるまでホモジナイズした。タンパク量はＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。【００４０】
３．精製
ステップ１：脱塩処理
精製には、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。脱塩処理に用いた脱塩カラムはＨｉｐｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であり、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
ステップ２：陰イオン交換
精製には、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。陰イオン交換には、陰イオン交換カラムＨｉｐｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＸＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた精製を行った。作業は、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋ＮａＣｌを用い、ＮａＣｌの濃度は０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ３：ハイドロキシアパタイト
精製には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ・ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＬＣＣ−５０１ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。ハイドロキシアパタイトカラムＣＨＴ２−Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用い、０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ４：強陽イオン交換
精製には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ・ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＬＣＣ−５０１ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。Ｍｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、リン酸バッファー（ｐＨ６．０）＋ＮａＣｌを用い、０ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度変化をつけて溶出を行った。
ステップ５：等電点の差
精製には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ・ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＬＣＣ−５０１ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。Ｍｏｎｏ Ｐ ５／５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製品マニュアルの条件で行った。バッファーには、開始バッファーとして０．０２５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ, ｐＨ６．３, ＨＣｌを用い、溶出にはＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ ７４, ｐＨ４．０, ＨＣｌを用いた。
ステップ６：ゲルろ過
精製には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ・ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ＬＣＣ−５０１ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）のシステムを用いて、低温条件（４℃）で行った。Ｍｏｎｏ Ｐ ５／５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製品マニュアルの条件で行った。溶出バッファーには、ＰＢＳ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ‘Ｓ リン酸バッファーＥＤ ＳＡＬＩＮＥ（Ｓｉｇｍａ））を用いた。【００４１】
４．メソトリプシン活性阻害の測定
活性測定のバッファーにはセリンプロテアーゼ・バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した。メソトリプシンの活性測定には、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＰＲＳＳ３（Ｃａｔ．Ｎｏ．３７１４−ＳＥ−０１０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。酵素基質として、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３１３５−Ｖ）、ペプチド研究所）を使用した。基質反応は２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ ＡＲＶＯ Ｘ３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）による測定によって定量化した。【００４２】
５．新規トリプシンインヒビターの同定
角層抽出液由来のメソトリプシン阻害画分を回収し、以下の試験を行った。
（１）ＣＢＢ染色
角層抽出液由来のメソトリプシン阻害画分は、５〜２０％ ｅ−ＰＡＧＥＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ−Ｔ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルのみを容器に入れ、ＭｉｌｌｉＱ水による洗浄を５分×３回行い、ＣＢＢ Ｓｔａｉｎ Ｏｎｅ Ｓｕｐｅｒ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１６４２−３１、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）による染色を行った。
（２）ウェスタンブロット解析
精製によって得られたサンプルは、５〜２０％ ｅ−ＰＡＧＥＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ―Ｔ５２０Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ｉＢｌｏｔ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくは半乾式法によってPVDF 膜に転写した。転写膜は、PBSによる洗浄を５分×２回を行った後、イムノブロック（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＫＮ００１Ａ、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）で約１時間のブロッキングを行った。ブロッキング後、ＰＢＳＴによる洗浄を１０分×２回、ＰＢＳによる洗浄を１０分×１回を行い、一次抗体を転写膜上に加え、室温で１時間、もしくは４℃で一晩反応させた。セルピンＢ１２の抗体は、ａｎｔｉ−ＳＥＲＰＩＮＢ１２ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓ−１５）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−８５１４５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ者）［濃度：１／１０００］、ａｎｔｉ−ＳＥＲＰＩＮＢ１２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ３−１Ｂ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−３２２３４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）［濃度：１／１０００］を用いた。一次抗体反応後、ＰＢＳＴによる洗浄を１０分×２回、ＰＢＳによる洗浄を１０分×１回を行い、二次抗体を転写膜上に加え、室温で１時間、もしくは４℃で一晩反応させた。二次抗体反応後、ＰＢＳＴによる洗浄を１０分×２回、ＰＢＳによる洗浄を１０分×１回を行い、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア社）を転写膜上に加え、ＦＵＪＩ ＭＥＤＩＣＡＬ Ｘ−ＲＡＹ ＦＩＬＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４７４１０ ０７５４７、富士フィルム株式会社）に焼付けを行った。
（３）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
（ｉ）タンパク質混合物のトリプシン消化
透析したタンパク質混合物をそれぞれ２０μｌの０．１％ ＲａｐｉＧｅｓｔ （Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ., Ｍｉｌｆｏｒｄ, ＭＡ）／５０ ｍＭ炭酸アンモニウム溶液に懸濁させた。ボルテックス攪拌した後、常法に従って還元・アルキル化処理，Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン処理トリプシン（ＴＰＣＫトリプシン）による酵素消化を行った。消化後、消化反応の停止及び界面活性剤（ＲａｐｉＧｅｓｔ）の不活化のため、トリフルオロ酢酸を終濃度０．５％ になるように加えた。
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析によるタンパク質の同定
酵素消化したタンパク質混合物中のタンパク質同定は、既報のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により行った。概略としては、混合物をオートサンプラー （ＳＩ−２ ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ, Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃｏ., Ｌｔｄ., Ｔｏｋｙｏ, Ｊａｐａｎ）でフューズドシリカ製トラップカラム（１００μｍ内径×１ｃｍ長さ, ＪｕｐｉｔｅｒＰｒｏｔｅｏ Ｃ１４, １０μｍ, Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ, Ｔｏｒｒａｎｃｅ, ＣＡ）にロードした。トラップカラムにグラジエントの初期バッファー（０．１％ ギ酸, ５％アセトニトリル／蒸留水）を30分間流して脱塩した後、二方バルブを切り替えることでフューズドシリカ製分析カラム（１００μｍ内径× １２ｃｍ長さ, ＪｕｐｉｔｅｒＰｒｏｔｅｏ Ｃ１４, ４μｍ, Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に直結させた。酵素消化液中のペプチドは、９０分の有機溶媒グラジエント（５〜７５％ アセトニトリル）で分離した。カラム流速はスプリット抵抗キャピラリー（５０μｍ内径）の長さの調節（５０〜２００mm）により３００〜４００ ｎｌ／ｍｉｎに調節した。カラムから溶出したペプチドは、ハイブリッド型タンデム質量分析計（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ, Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ）に直接エレクトロスプレーイオン化することにより導入した。質量分析計は、自動データ異存ＭＳ／ＭＳ並行測定モードで動作させた。電場ＦＴ型質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）で高分解能サーベイスキャンスペクトル（分解能６０，０００）を取得後、強度の強い５つのピークをプリカーサーイオンとしたMS/MSスペクトルを自動的にイオントラップ型質量分析計（ＬＴＱ）で取得した。取得したMS/MSスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウエア上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてデータベースサーチに供し、配列との一致度からタンパク質同定を行った。タンパク質同定を行う際の配列データベースには、非冗長ヒトタンパク質データベース （ＮＣＢＩ, ２０１０）を用いた。タンパク質の偽同定を最小化するため、厳しいサーチ基準を用いた（Ｓｆ ｓｃｏｒｅ ０．８５, ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ０．００１，ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｏｐ ｍａｔｃｈｅｓ：１， ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ： １０ ｐｐｍ, ｍｉｎｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： １, ｅｎｚｙｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ： ｈａｌｆ−ｔｒｙｐｔｉｃ ｏｒ ｆｕｌｌｙ ｔｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎｌｙ）。【００４３】
上記実験により、セルピンＢ１２の発現とメソトリプシン阻害との間に極めて密接な相関性を有することが判明した（図２）。なお、ウェスタンブロット解析において観察されたバンドは、約７２〜７４ｋＤであり、セルピンＢ１２の４６ｋＤに一致しなかったが、これは、セルピンＢ１２がＫＬＫ８（２８ｋＤ）と複合体を形成していることを強く示唆するものである。【００４４】
６．セルピンＢ１２のＫＬＫ（ＫＬＫ５／７／８）阻害活性
活性測定のバッファーにはセリンプロテアーゼ・バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して、各ＫＬＫに対するセルピンＢ１２の阻害活性を測定した。ＫＬＫ８の活性測定には、メソトリプシン（ＰＲＳＳ３）と共に、精製したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＫＬＫ８を用いて行った。同様に、ＫＬＫ５の活性測定には、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＫＬＫ５（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０８−ＳＥ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＫＬＫ７の活性測定には、精製したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ＫＬＫ７を用いて行った。酵素基質として、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ． ３１３５−Ｖ、ペプチド研究所）を使用した。基質反応は２０３０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ ＡＲＶＯ Ｘ３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）による測定によって定量化した。
図３及び図４に示されるとおり、セルピンＢ１２は各ＫＬＫ（ＫＬＫ５／７／８）の活性を阻害することが判明した。【００４５】
７．ヒト組織におけるセルピンＢ１２及びメソトリプシンの発現
ヒトのまぶた及び腹部、踵から皮膚組織を採取し、マウス抗セルピンＢ１２抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−３２２３４、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）及びメソトリプシンを認識するウサギ抗トリプシン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．０１−１９−０３２０００、ＡＴＨＥＮＳ社）による免疫染色をおこなった。図５に示されるとおり、比較的角層が薄いまぶたや腹部では、メソトリプシンが強く発現している一方、セルピンＢ１２の発現は殆ど検出されなかった。反対に、比較的角層が厚い踵では、顆粒層において、セルピンＢ１２の強い発現が見られた。【００４６】
８．３次元皮膚モデルにおけるセルピンＢ１２の表皮分化作用
ヒトケラチノサイト初代培養細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ （ＮＨＥＫ）） を７５ｃｍ2シャーレで培養し、セルピンＢ１２の過剰発現のためにｐＣＭＶ−ＨＡ／Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１２ （２μｇ／ｍｌ） をＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェクションし、セルピンＢ１２のノックダウンのためにｓｉ−Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１２（Ｃａｔ.Ｎｏ. ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０２＿００３６２２７３、ｓｉｇｍａ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.１３７７８０７５、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである。
Ｈｓ＿ＳＥＲＰＩＮＢ１＿２２７３＿ｓ： ５‘ｒＧｒＧｒＡｒＡＵｒＣＵｒＣＵｒＣｒＣｒＡｒＡｒＧＵｒＣｒＣｒＣｒＡＴＴ
Ｈｓ＿ＳＥＲＰＩＮＢ１＿２２７３ａｓ： ５‘ＵｒＧｒＧｒＧｒＡｒＣＵＵｒＧｒＧｒＡｒＧｒＡｒＧｒＡＵＵｒＣｒＣＴＴ
トランスフェクション後は、インキュベーターの中でコンフルエントになるまで２日間培養を行い、空気暴露させた。その後、３Ｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.ＰＲ３Ｄ−Ｋ−５０、ＣＥＬＬｎＴＥＣ）の標準プロトコールに従って培養し、１４日目で回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色によって、組織解析を行った。３Ｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.ＰＲ３Ｄ−Ｋ−５０、ＣＥＬＬｎＴＥＣ）の標準プロトコールの手順として、具体的には、付属しているセルインサートを細胞培養ディッシュ（６０ ｍｍ）に設置し、前駆細胞のニッチ環境を正確に再現した各種上皮細胞用の Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＰＣＴ）培地ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ.Ｎｏ. ＣｎＴ−ＰＲ）で浸潤させた。その後、ＮＨＥＫにｐＣＭＶ−ＨＡ／Ｓｅｒｐｉｎ Ｂ１２をトランスフェクションした培養細胞の懸濁液を、各インサートに添加し、細胞培養ディッシュ（６０ ｍｍ）にはＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ ｍｅｄｉｕｍを添加した。ディッシュをＣＯ2インキュベーターに入れ、細胞がコンフルエントになるまで２日間培養した。迅速な細胞の分化と多層化を可能にするケラチノサイト３次元培養用特殊培地ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ  ３Ｄ Ｂａｒｒｉｅｒ ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ.Ｎｏ.ＣｎＴ−ＰＲ−３Ｄ、ＣＥＬＬｎＴＥＣ）にインサート内外の培地を交換し、ディッシュをＣＯ2インキュベーターに入れ、一晩培養した。表皮層を多層化させるための空気暴露操作として、インサート内外のすべての培地をアスピレーターで除去し、インサート外に分化用培地ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ ３Ｄ Ｂａｒｒｉｅｒ ｍｅｄｉｕｍを添加した。その後、インサート外にのみ、分化用培地ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ ３Ｄ Ｂａｒｒｉｅｒ ｍｅｄｉｕｍの交換を3日毎に行った。
セルピンＢ１２を亢進させた場合には、角層細胞内に残存核成分がみられ、角層が厚くなる一方で、セルピンＢ１２を抑制した場合には、角層が非常に薄くなることが確認された（図６）。【００４７】
また、セルピンＢ１２のトランスフェクションの添加量（０．５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ又は２．０μｇ/ｍｌ）およびトランスフェクション後の培養期間（3日間）を除き上記と同じ手順により、ケラチノサイトの分化（角化）におけるセルピンB12の濃度依存性を調べた。
その結果、セルピンＢ１２の発現量とケラチノサイトの角化には、有意な相関性が存在することが確認された（図７）。特に、２．０μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＨＡ／ＳｅｒｐｉｎＢ１２を用いた場合には、角層が非常に厚くなり、角層ないに残存核成分が見られる一方で、顆粒層が扁平化していないことがわかる。【００４８】
９．アトピー性皮膚炎の患者におけるメソトリプシンの発現
アトピー性皮膚炎の患者から皮膚組織を採取し、メソトリプシンを認識するウサギ抗トリプシン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．０１−１９−０３２０００、ＡＴＨＥＮＳ社）による免疫染色を行った。図８に示されるとおり、アトピー性皮膚炎の患者ではメソトリプシンが強く発現している部分が見られる。【００４９】
１０．セルピンＢ１２発現調節薬剤のスクリーニング
以下のプライマー・セットを用いて定量的PCRを行い、各薬剤の添加前後のケラチノサイト中のセルピンＢ１２の発現を測定した。
フォワード・プライマー：ＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＣＣ（配列番号１）
リバース・プライマー  ：ＣＡＣＣＧＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡ（配列番号２）
得られた値は、Ｇ３ＰＤＨ（フォワード・プライマー：ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ（配列番号３），リバース・プライマー：ＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧ（配列番号４））の発現量をもとに補正して比較した。
用いたｃＤＮＡは、ケラチノサイトを無血清培地で培養し、コンフルエント後、１．５ｍＭカルシウム添加し、さらに２日間培養した後、以下の薬剤を添加し２４時間培養、その後、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン）処理を行い通常の方法でｍＲＮＡを調製した。具体的には、１００μｌのクロロホルムを加え、クロロホルムとＩｓｏｇｅｎが混ざるまで上下に振った。２〜３分室温で静止させて後、４℃、１２０００ｇで15分遠心した。上清を新チューブに移し、イソプロパノールを２５０μｌ加えた。上下に振って混ぜ、室温で１０分静止させた。４℃、１２０００ｇで１５分遠心し、上清を除去した後、沈殿に７０％エタノールを１ｍｌ加え、沈殿を剥がす程度に上下に振った。４℃、１２０００ｇで５分遠心後、上清を捨て、完全にエタノールを除去した。１０分ほど沈殿を乾かした後、適切な量の水で沈殿を溶かした。１μｇのＲＮＡを用い、通常の方法で、逆転写を行い、ＰＣＲに供した。
各薬剤は、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、その後、ＰＢＳもしくは、培地を用いて、最終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう希釈して用いた。
結果を図９及び図１０に示す。【００５０】
１１．ヒト・セルピンＢ１２の転写調節領域の同定
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ３０４１）［ＰＲＯＭＥＧＡ］を鋳型として、セルピンＢ１２遺伝子の転写開始点の上流約１５００ｂｐの領域(−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ)をターゲットにクローニングを行った。領域として、−１５００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ)、−１２００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１２００ｂｐ)、−９００ｂｐ(−１ｂｐ〜−９００ｂｐ)、−６００ｂｐ(−１ｂｐ〜−６００ｂｐ)、−３００ｂｐ(−１ｂｐ〜−３００ｂｐ)、−１５０ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ）をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で下記の配列番号５〜１１のプライマーを用いて増幅した。
−１５００ｂｐフォワード・プライマー：ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号５）
−１２００ｂｐフォワード・プライマー：ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧ（配列番号６）
−９００ｂｐフォワード・プライマー ：ＴＴＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡＣＡＡＧＧ（配列番号７）
−６００ｂｐフォワード・プライマー ：ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧ（配列番号８）
−３００ｂｐフォワード・プライマー ：ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号９）
−１５０ｂｐフォワード・プライマー ：ＴＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＣ（配列番号１０）
共通リバース・プライマー     ：ＧＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＡＴＡＡＣＧＡＴＣ（配列番号１１）
ＰＣＲ反応には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｒ０４５Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。それらには、制限酵素ＫｐｎＩとＮｈｅＩで切断される配列を付加しており、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．１２［ｌｕｃ２ＣＰ］（Ｃａｔ.Ｎｏ. Ｅ６６７１、ＰＲＯＭＥＧＡ）にライゲーション反応で組み込み、その後コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。ライゲーション反応には、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（Ｃａｔ.Ｎｏ. ＬＧＫ−１０１、ＴＯＹＯＢＯ）を用い、コンピテントセルにはＯｎｅ Ｓｈｏｔ（Ｒ） ＯｍｎｉＭＡＸTM ２ Ｔ１Ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ. ｃｏｌｉ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｃ８５４０−０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.２７１０６、ＱＩＡＧＥＮ）、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.１２３６２、ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ （ＮＨＥＫ）） にＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で４８時間培養を行った。その後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ１９８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンＢ１２の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ６９２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
結果を図１１に示す。【００５１】
転写調節領域の同定のために作成した−１５００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ)、−１２００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１２００ｂｐ)、−９００ｂｐ(−１ｂｐ〜−９００ｂｐ)、−６００ｂｐ(−１ｂｐ〜−６００ｂｐ)、−３００ｂｐ (−１ｂｐ〜−３００ｂｐ) の領域を含んだｐＧＬ４．１２プラスミドを鋳型として、−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ領域を欠失させる（Δ−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ）ために部位特異的変異導入をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で下記の配列番号１２〜１３のプライマーを用いて増幅した。
−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ欠失用フォワード・プライマー：ＡＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣ（配列番号１２）
−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ欠失用リバース・プライマー  ：ＡＧＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＣＣＴＧ（配列番号１３）
部位特異的変異導入ポリメラーゼ連鎖反応法にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ （Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｒ０４６Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。その後、コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。コンピテントセルにはＯｎｅ Ｓｈｏｔ（Ｒ） ＯｍｎｉＭＡＸTM ２ Ｔ１Ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ. ｃｏｌｉ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｃ８５４０−０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.２７１０６、ＱＩＡＧＥＮ）、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.１２３６２、ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ （ＮＨＥＫ）） にＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で４８時間培養を行った。その後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ１９８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンＢ１２の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ６９２１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。
図１２に示されるとおり、−１ｂｐ〜−１５０ｂｐの領域の欠失により転写活性がほとんど見られなくなったことから、−１ｂｐ〜−１５０ｂｐ領域はコアプロモーターとして機能することがわかる。【００５２】
転写調節領域の同定のために作成した−１５００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１５００ｂｐ)、−１２００ｂｐ(−１ｂｐ〜−１２００ｂｐ)、−９００ｂｐ(−１ｂｐ〜−９００ｂｐ) の領域を含んだｐＧＬ４．１２プラスミドを鋳型として、−３００ｂｐ〜−６００ｂｐ領域を欠失させる（Δ−３００ｂｐ〜−６００ｂｐ）ために部位特異的変異導入をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で下記の配列番号１４〜１５のプライマーを用いて増幅した。
−３００ｂｐ〜−６００ｂｐ欠失用フォワード・プライマー：ＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧ（配列番号１４）
−３００ｂｐ〜−６００ｂｐ欠失用リバース・プライマー  ：ＴＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＣＡＴ（配列番号１５）
部位特異的変異導入ポリメラーゼ連鎖反応法にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ （Ｒ） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ （Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｒ０４６Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
また、−３００ｂｐ〜−６００ｂｐ領域のクローニングにはＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （Ｇ３０４１）［ＰＲＯＭＥＧＡ］を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で下記の配列番号８および１６のプライマーを用いて増幅した。
−６００ｂｐフォワード・プライマー ：ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧ（配列番号８）
−３００ｂｐリバース・プライマー ：ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＣ（配列番号１６）
ＰＣＲ反応には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｒ０４５Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。それらには、制限酵素ＫｐｎＩとＮｈｅＩで切断される配列を付加しており、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．１２［ｌｕｃ２ＣＰ］（Ｃａｔ.Ｎｏ. Ｅ６６７１、ＰＲＯＭＥＧＡ）にライゲーション反応で組み込み、その後コンピテントセルをプラスミドで形質転換した。ライゲーション反応には、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（Ｃａｔ.Ｎｏ. ＬＧＫ−１０１、ＴＯＹＯＢＯ）を用い、コンピテントセルにはＯｎｅ Ｓｈｏｔ（Ｒ） ＯｍｎｉＭＡＸTM ２ Ｔ１Ｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ. ｃｏｌｉ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｃ８５４０−０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
その後、形質転換体から目的のプラスミドを精製した。プラスミドの精製には、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.２７１０６、ＱＩＡＧＥＮ）、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.１２３６２、ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。精製されたプラスミドを用いて、ヒトケラチノサイト初代培養細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ （ＮＨＥＫ）） にＦｕＧＥＮＥ（Ｒ） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）でトランスフェスションした。トランスフェクション後は、インキュベーターの中で４８時間培養を行った。その後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｒ） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ１９８０、ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことで、セルピンＢ１２の転写調節領域の決定を行った。ルシフェラーゼアッセイの標準化として、ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｃａｔ.Ｎｏ.Ｅ６９２１、ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用した。
図１３には、−１５０ｂｐ〜−６００ｂｐの領域はサイレンサー機能することが示されている。このうち、−３００ｂｐ〜−６００ｂｐの領域は、サイレンサー領域としてプロモーター領域に影響を与えているものの、単独ではサイレンサーとしての機能を有さない。一方、−１５０ｂｐ〜−３００ｂｐの領域は、単独でもサイレンサーとして機能するものと考えられる。
【図１】
2016063991.tif 000003
【図２】
2016063991.tif 000004
【図３】
2016063991.tif 000005
【図４】
2016063991.tif 000006
【図５】
2016063991.tif 000007
【図６】
2016063991.tif 000008
【図７】
2016063991.tif 000009
【図８】
2016063991.tif 000010
【図９】
2016063991.tif 000011
【図１０】
2016063991.tif 000012
【図１１】
2016063991.tif 000013
【図１２】
2016063991.tif 000014
【図１３】
2016063991.tif 000015
【配列表】
2016063991000001.app
【国際調査報告】
2016063991.tif 000016
2016063991.tif 000017
2016063991.tif 000018
2016063991.tif 000019
2016063991.tif 000020
2016063991.tif 000021
2016063991.tif 000022
2016063991.tif 000023