(57)【要約】  飲食品のうま味向上や、ラセミ体からの光学異性体の分離、Ｌ−ピログルタミン酸の定量等の用途に好適に使用できる５−オキソプロリナーゼを提供する。  アスペルギルス属に属する微生物由来の５−オキソプロリナーゼ、それをコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子。５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含有する微生物または該５−オキソプロリナーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物から本発明の５−オキソプロリナーゼを採取できる。  公知の酵素よりもｐＨ変化の影響を受けにくく、広範なｐＨで用いることができ、安定性が高い中温域温度条件下で良好に作用し、基質との親和性も高い５−オキソプロリナーゼを提供できる。加えて、本発明の５−オキソプロリナーゼは長い食経験のあるアスペルギルス属菌由来であるため、飲食品の加工という用途に対しても安全性が高いという利点を有する。
2014126186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
下記の酵素学的性質を有し、５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。
ｉ）作用：Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換する
ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約１４０ｋＤａである
ｉｉｉ）至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０である
ｉｖ）安定ｐＨ：ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０である
ｖ）温度安定性：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、３７℃で１５分間処理後に８０％以上の活性が残存する
ｖｉ）至適温度：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５℃〜４５℃である
ｖｉｉ）ＡＴＰ、１価カチオン、および２価カチオン要求性を示す
【請求項３】
アスペルギルス属に属する微生物由来である、請求項２に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）由来である、請求項３に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
以下の（ｃ）または（ｄ）の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子。
（ｃ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡを有する、５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子。
（ｅ）配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
請求項５または６記載の５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、得られる培養物から５−オキソプロリナーゼを採取することを特徴とする５−オキソプロリナーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質、請求項５もしくは６に記載の遺伝子によりコードされる５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質、または請求項８記載の形質転換体もしくは形質導入体を含む、飲食品用のうま味改善剤。
【請求項１１】
Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品と請求項１０記載のうま味改善剤に含まれるタンパク質を混合する、または、Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品を請求項１０記載のうま味改善剤に含まれる形質転換体または形質導入体を用いて発酵させることを含む、うま味のある飲食品の製造方法。
【請求項１２】
Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の分割方法であって、以下の工程、
(i) Ｌ−ピログルタミン酸およびＤ−ピログルタミン酸を含む溶液に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質または請求項５もしくは６に記載の遺伝子によりコードされる５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸へと加水分解する工程、および
(ii)工程(i)において生成したＬ−グルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸を分離する工程、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−オキソプロリナーゼ、５−オキソプロリナーゼ遺伝子、および５−オキソプロリナーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
しょうゆ、酵母エキス、あるいは発酵調味料等の製造において、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼによる酵素的分解、あるいは酸による化学的分解等により、大豆、小麦、ゼラチン、カゼイン等の蛋白質原料から遊離されるＬ−グルタミン酸（「うま味」成分）が、熱や圧力の存在下、非酵素的な反応によってＬ−ピログルタミン酸（うま味を有さない）へと変化し、その結果、うま味が低下してしまう現象が報告されている（非特許文献１）。この課題に対する方策として、これらの食品に５−オキソプロリナーゼを作用させる酵素分解型調味料が提案されている（特許文献１）。特許文献１に開示されている５-オキソプリナーゼはパン酵母由来であり、そのアミノ酸配列の記載はない。【０００３】
５−オキソプロリナーゼ（５−ｏｘｏｐｒｏｌｉｎａｓｅ、５−ｏｘｏ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎａｓｅ）は、国際生化学連合の酵素委員会による分類基準においてＥＣ  ３．５．２．９に分類され、ピログルタマーゼ（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｓｅ）、ピログルタミン酸加水分解酵素（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ピロリドンカルボン酸加水分解酵素（Ｌ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）とも称される酵素である。５−オキソプロリナーゼは、Ｌ−ピログルタミン酸（Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、５−オキソプロリン、５−ｏｘｏｐｒｏｌｉｎｅ、５−ｏｘｏ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボン酸等ともいう）をＨ２ＯおよびＡＴＰの存在下で加水分解し、うま味成分として知られているＬ−グルタミン酸とリン酸を生成する反応を触媒する。【０００４】
Ｌ−ピログルタミン酸＋２Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ → Ｌ−グルタミン酸＋ＡＤＰ＋リン酸
上述の通り、５−オキソプロリナーゼは、Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸を生成できるので、Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品に作用させることにより、該飲食品中のＬ−グルタミン酸含有量を増加させて、うま味を向上させることが期待される。【０００５】
また、飲食品のうま味向上以外に期待される５−オキソプロリナーゼの用途としては、例えば、５−オキソプロリナーゼがＬ体に特異的に作用することを利用して、ピログルタミン酸やグルタミン酸のラセミ体からの光学異性体の分離が挙げられる。さらに、食品、血清、尿中等に含まれるＬ−ピログルタミン酸を定量する目的で、５−オキソプロリナーゼを利用することも可能である。このように、５−オキソプロリナーゼには、多岐に渡る産業上の用途が期待される。【０００６】
これまでに、いくつかの生物種から、５−オキソプロリナーゼ活性が確認され、酵素の抽出や酵素学的性質の解析がなされている。例えば、ラット（肝臓（非特許文献２）、腎臓（非特許文献３））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｓａｓ）属（非特許文献４）、小麦胚芽（非特許文献５）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属（非特許文献６）の５−オキソプロリナーゼが知られている。また、パン酵母において、５−オキソプロリナーゼタンパク質を強制発現させた例がある（非特許文献７）。【０００７】
しかし、先に述べたような多岐にわたる用途が期待されている酵素であるにも関わらず、今日まで、上述の各種公知の酵素を含め、５−オキソプロリナーゼが産業上利用可能な製品として量産され、市販されている実績はなく、各種用途に好適に利用可能な５−オキソプロリナーゼが提供されることが強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平８−２５２０７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】醤油の化学と技術、栃倉辰六郎編、１８１頁，日本醸造協会
【非特許文献２】Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ３２，  ２３３−２３７，  １９７３
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６８，  ２９８２−２９８５，１９７１
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５６，  ９０−９６，  １９７４
【非特許文献５】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６２，  ７９８−８０１，  １９７８
【非特許文献６】Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ７３５−７４１，  １９８８
【非特許文献７】ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．  １０，  ３９４-４０１，  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、各種用途に好適に利用可能な５−オキソプロリナーゼ、例えば、飲食品のうま味向上や、ラセミ体からの光学異性体の分離、Ｌ−ピログルタミン酸の定量等の用途に好適に使用できる５−オキソプロリナーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者等は、鋭意検討の結果、アスペルギルス属に属する微生物から、従来報告されていた各種５−オキソプロリナーゼとは酵素学的性質が顕著に異なる新規な５−オキソプロリナーゼを見出し、この酵素タンパク質をコードする遺伝子を単離した。さらに、この５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含有する微生物又は該５−オキソプロリナーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物から５−オキソプロリナーゼを採取して、この酵素が各種産業上の用途において好適に利用可能な性質を有していることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
即ち、本発明は、以下に関する。【００１３】
（１）以下の（ａ）または（ｂ）の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。   
（ａ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（２）下記の酵素学的性質を有し、５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。   
ｉ）作用：Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換する
ｉｉ）分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の分子量が約１４０ｋＤａである
ｉｉｉ）至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０である
ｉｖ）安定ｐＨ：ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０である
ｖ）温度安定性：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、３７℃で１５分間処理後に８０％以上の活性が残存する
ｖｉ）至適温度：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２５℃〜４５℃である
ｖｉｉ）ＡＴＰ、１価カチオン、および２価カチオン要求性を示す
（３）アスペルギルス属に属する微生物由来である、上記（２）に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。   
（４）アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）由来である、上記（３）に記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質。   
（５）以下の（ｃ）または（ｄ）の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子。   
（ｃ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質
（６）以下の（ｅ）または（ｆ）のＤＮＡを有する５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子。   
（ｅ）配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（７）上記（５）または（６）記載の５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクター。   
（８）上記（７）記載の組換えベクターを含む形質転換体または形質導入体。   
（９）上記（８）記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、得られる培養物から５−オキソプロリナーゼを採取することを特徴とする５−オキソプロリナーゼの製造法。   
（１０）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質、上記（５）もしくは（６）に記載の遺伝子によりコードされる５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質、または上記（８）記載の形質転換体もしくは形質導入体を含む、飲食品用のうま味改善剤。   
（１１）Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品と上記（１０）記載のうま味改善剤に含まれるタンパク質を混合する、または、Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品を上記（１０）記載のうま味改善剤に含まれる形質転換体または形質導入体を用いて発酵させることを含む、うま味のある飲食品の製造方法。   
（１２）Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の分割方法であって、以下の工程、
(i) Ｌ−ピログルタミン酸およびＤ−ピログルタミン酸を含む溶液に、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質または（５）もしくは（６）に記載の遺伝子によりコードされる５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸へと加水分解する工程、および
(ii)工程(i)において生成したＬ−グルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸を分離する工程、
を含む前記方法。【００１４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-027844号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上述の各種用途に好適に利用できる新規な５−オキソプロリナーゼを提供できる。本発明の一態様において、本発明の５−オキソプロリナーゼは、公知の酵素よりもｐＨ変化の影響を受けにくく、広範なｐＨで用いることができる。さらに、本発明の一態様において、本発明の５−オキソプロリナーゼは、基質との親和性も高い。加えて、本発明の５−オキソプロリナーゼの由来微生物の例であるアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）やアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus Tamarii）等は、味噌・醤油・日本酒・焼酎などの各種醸造食品の製造に古くから使われ、長い食経験のある微生物であり、特に、飲食品への利用という用途に対しては、安全の観点からも優れており、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の５−オキソプロリナーゼおよび酵母由来５−オキソプロリナーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明の５−オキソプロリナーゼおよび酵母由来５−オキソプロリナーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】アスペルギルス属菌発現用カセット作製用プラスミドｐＡｓＡｌｐＰの構造の概略を示す図である。５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子としては、scaffold00004.806、scaffold00004.820、scaffold00036.1302が挙げられる。
【図４】アスペルギルス・ソーヤの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のエクソン−イントロン構造の予測図である。括弧内は塩基数を示す。
【図５】アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質をアスペルギルス・ソーヤにおいて発現させた菌体抽出液およびＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムにより精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルのＣＢＢ染色像を示す図である。
【図６】アスペルギルス属菌で発現させた３種のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の添加量と、反応後の反応液中のＬ−グルタミン酸濃度の関係を示す図である。
【図７】反応系に添加した１価カチオンの種類と相対活性の関係を示す図である。
【図８】反応系に添加した２価カチオンの種類と相対活性の関係を示す図である。
【図９】本発明の５−オキソプロリナーゼおよび酵母由来５−オキソプロリナーゼの至適温度を示す図である。
【図１０】本発明の５−オキソプロリナーゼおよび酵母由来５−オキソプロリナーゼの温度安定性を示す図である。
【図１１】本発明の５−オキソプロリナーゼの基質特異性を示す図である。
【図１２】アスペルギルス属菌で発現させたアスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の添加量と、反応後の反応液中のＬ−グルタミン酸濃度の関係を示す図である。
【図１３】トマトエキス希釈液と本発明の５−オキソプロリナーゼとの反応後の、反応液中のグルタミン酸濃度、およびピログルタミン酸濃度の関係を示す図である。（括弧内は、酵素未添加を１００としたときの相対値を示す。）
【図１４】濃口しょうゆ希釈液と本発明の５−オキソプロリナーゼとの反応後の、反応液中のグルタミン酸濃度、およびピログルタミン酸濃度の関係を示す図である。（括弧内は、酵素未添加を１００としたときの相対値を示す。）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
（５−オキソプロリナーゼの活性測定法）
本発明の５−オキソプロリナーゼ（以下、文脈により「本酵素」という）の活性は、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．１０、３９４頁〜４０１頁、２０１０年）に記載の方法を改変した方法により測定することができる。本方法においては、Ｌ−ピログルタミン酸の分子内アミド結合が加水分解されて生じるＬ−グルタミン酸を測定することにより酵素活性を算出する。Ｌ−グルタミン酸量の測定には、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ等、Ｌ−グルタミン酸に働く酵素を用いた方法や、液体クロマトグラフィー等を用いることができ、例えば、下記の測定法を用いることができる。
【００１９】
[測定法１]
基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、製造番号１０２７８１）、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと、活性測定対象の酵素溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で任意の濃度に希釈して調製する）０．０２ｍＬを混合し、３７℃で１時間酵素反応を行わせる。次いで、前記酵素反応液を１００℃、３分間加熱して酵素反応を停止後、酵素反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定する。加熱後の反応液は、必要に応じ、遠心分離（１５，０００×ｇ、１０分間）した上清をＬ−グルタミン酸の測定に用いてもよい。なお、その他本明細書に記載の試薬は、特に記載のない限り、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製、Ｓｉｇｍａ社製、同仁化学研究所社製、ベクトン・ディッキンソン社製、日本製薬社製、タカラバイオ社製等の試薬、純度に区別のあるものは特級グレードの試薬を用いる。
【００２０】
Ｌ−グルタミン酸の定量には、「ヤマサＬ−グルタミン酸検出キットＩＩ」（ヤマサ醤油社製、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが含まれる）を用い、酵素反応液０．０２ｍＬに対し、前記キットのＬ−グルタミン酸検出用発色試薬０．１５ｍＬを混合、あるいは、酵素反応液０．０３ｍＬに対し、Ｌ−グルタミン酸検出用発色試薬０．１２ｍＬを混合し、２０〜３０分間、室温で反応後の６００ｎｍの吸光度を測定し、Ｌ−グルタミン酸標品による検量線に基づいて、酵素反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を算出する（測定値）。また、前記基質溶液の代わりに緩衝液を加えて同様に反応を行い、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を算出する（ブランク値）。得られた「ブランク値」と「測定値」から下式に基づいて、５−オキソプロリナーゼの活性が計算できる。酵素活性の単位は、前述の条件下で１分間に1μｍｏｌのＬ−グルタミン酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義する。
【数１】
2014126186.tif 000003
【００２１】
なお、式中の［Ｇｌｕ］は酵素反応液におけるＬ−グルタミン酸濃度（測定値）、［Ｇｌｕ  ｂｌａｎｋ］は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を基質溶液の代わりに添加した反応液のＬ−グルタミン酸濃度（ブランク値）、［ｅｎｚｙｍｅ］は反応液中の５−オキソプロリナーゼの濃度、６０は１時間の分数を表す。
【００２２】
（本発明の５−オキソプロリナーゼの酵素学的性質）
実施の一態様においては、本発明の５−オキソプロリナーゼは、以下の酵素学的性質を有する。
【００２３】
（１）作用：分子内アミド結合を有するＬ−ピログルタミン酸を加水分解する。
【００２４】
（反応例：
Ｌ−ピログルタミン酸＋２Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ → Ｌ−グルタミン酸＋ＡＤＰ＋リン酸）
（２）要求性：本酵素は、ＡＴＰ、１価カチオン、２価カチオン要求性を示す。
【００２５】
（３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：前述の測定法１を用い、緩衝液のｐＨを変化させ、各ｐＨにおいて本酵素の活性を測定したとき、本酵素の至適ｐＨはｐＨ７．０〜ｐＨ８．０である（図１参照）。図１に示す通り、本酵素は前記至適ｐＨ範囲において、最大活性の７０％以上を保持し得る。
【００２６】
また、本酵素液を、測定法１を用い、ｐＨ４．０〜１１．０の範囲において、４℃、１６時間処理した後の残存活性を測定した場合において、本酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ６．０〜９．０である（図２参照）。図２に示す通り、本酵素は前記安定ｐＨ範囲で処理した場合において、最大活性の７０％以上を保持し得る。また、本酵素はｐＨ５．０以下およびｐＨ１１．０以上のｐＨ条件下で処理した場合には、ほぼ完全に失活する。
【００２７】
（４）至適温度範囲：測定法１を用い、反応時の温度を変化させ、各温度における活性を測定した場合において、本酵素の至適温度は３７℃である（図９参照）。
【００２８】
（５）温度安定性：前記測定法１を用い、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、各温度で１５分間処理後の残存活性を測定した場合において、本酵素は３７℃で１５分間処理後に８０％以上の活性を保持する。
【００２９】
（６）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した結果、本酵素の分子量は約１４０ｋＤａである。
【００３０】
（７）基質特異性：本酵素はＬ−ピログルタミン酸を特異的にＬ−グルタミン酸に加水分解し、Ｄ−ピログルタミン酸は加水分解しない。
【００３１】
なお、実施の一態様においては、本発明の５−オキソプロリナーゼの親和性をＬ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値として表した場合において、本酵素のひとつのオルソログ（Ａｓ４．８０６、後述）ではＫｍ値は９３μＭ、本酵素の別のひとつのオルソログ（Ａｓ４．８２０、後述）ではＫｍ値は７６μＭである。
【００３２】
（本発明の５−オキソプロリナーゼの由来）
本発明の５−オキソプロリナーゼは、本明細書記載の酵素学的性質を有する限り、その由来により限定されるものではないが、実施の一態様において、本発明の５−オキソプロリナーゼは、好ましくは微生物由来のタンパク質であり、さらに好ましくは糸状菌由来のタンパク質であり、さらに好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等由来のタンパク質である。
【００３３】
アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリおよびアスペルギルス・ニガーは、味噌・醤油・日本酒・焼酎などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。
【００３４】
さらに、本発明の５−オキソプロリナーゼは、遺伝子組換え技術により得られる５−オキソプロリナーゼも含むものである。
【００３５】
（本発明の５−オキソプロリナーゼのアミノ酸配列）
実施の一態様において、本発明の５−オキソプロリナーゼは、配列番号１および２のいずれかに表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。例えば、配列番号１および２のいずれかに表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の５−オキソプロリナーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得ることもできる。
【００３６】
さらに、本発明は、５−オキソプロリナーゼ活性を有し、配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質も包含する。「１もしくは数個（複数）のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」とあるのは、目的とする５−オキソプロリナーゼ活性が得られる限り、配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列に、該アミノ酸配列とは異なる配列が付加されてもよく、また、該アミノ酸配列の一部が欠失または置換されてもよいことを意味する。アミノ酸の付加、欠失もしくは置換に関し、１もしくは数個のアミノ酸とは、１〜１０個、例えば１〜９個、例えば１〜８個、例えば１〜７個、例えば１〜６個、例えば１〜５個、例えば１〜４個、例えば１〜３個のアミノ酸をいう。例えば、配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニンが欠失しても、本発明の５−オキソプロリナーゼと同様の酵素学的性質を有する５−オキソプロリナーゼ活性を示す限り、かかる付加・欠失・置換等を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明に含まれる。また、本発明の５−オキソプロリナーゼは、配列番号１および２のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。
【００３７】
（本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子）
実施の一態様としては、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、上記酵素学的性質を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子である。
【００３８】
また、実施の一態様としては、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は配列番号５６および５７のいずれかで表される塩基配列を有する５−オキソプロリナーゼ遺伝子である。
【００３９】
さらには、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、宿主に導入し、該遺伝子の転写後に、上記酵素学的性質を有するタンパク質をコードする遺伝子へとスプライシングされる５−オキソプロリナーゼ遺伝子である。そのような遺伝子には、例えば、配列番号４および５のいずれかで表される塩基配列を有する５−オキソプロリナーゼ遺伝子が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５−オキソプロリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子をも包含する。
【００４１】
前記「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行い得るものである。
【００４２】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）  核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ  、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【００４３】
また、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、配列番号４、５、５６および５７のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を示し、かつ５−オキソプロリナーゼの機能を有するタンパク質をコードする５−オキソプロリナーゼ遺伝子も包含する。
【００４４】
（配列同一性を算出するための手段）
２つのアミノ酸配列または塩基配列における配列同一性を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  および  Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌ等によって開発されている（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において利用可能である。
【００４５】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられるが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０．６（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳまたはＯＲＦ）を用いる。
【００４６】
（遺伝子工学的手法による５−オキソプロリナーゼ遺伝子のクローニング）
本発明の５−オキソプロリナーゼをコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の各宿主に導入して、５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体または形質導入体を作製できる。これらの遺伝子の取得方法や、遺伝子配列、アミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法は、当業者にとって公知であり、一例を後述する。
【００４７】
本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、５−オキソプロリナーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００４８】
一態様において、５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、該遺伝子を有する微生物由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の遺伝子を鋳型としたクローニングにより、得ることができる。そのような遺伝子の由来微生物として、例えば、糸状菌、好ましくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌、さらに好ましくは、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）  ＮＢＲＣ４２３９株等が挙げられる。より詳細には、まず、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）ＮＢＲＣ４２３９株を培養し、得られた菌体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢等を用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。該抽出操作には、市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
【００４９】
次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列および３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば、いかなる配列のプライマーを用いてもよい。その例としては、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）のゲノム配列を参考として設計した配列番号７および８、配列番号９および１０、および配列番号１１および１２で表されるプライマー等が挙げられる。作製したプライマーＤＮＡを用いて、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００５０】
また、一態様においては、微生物から取得する以外に、化学合成法を用いて５−オキソプロリナーゼ遺伝子を構築することも可能である。
【００５１】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や、化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば以下のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販のキット、あるいは、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の市販のプラスミドベクターＤＮＡ、λＥＭＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞、例えば、大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）  Ｋ−１２株、好ましくはＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）、ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を用いて精製する。
【００５２】
そして、該組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定を、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３）等により行う。具体的な配列解析装置としては、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）等を用いて解析できる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるポリペプチド、すなわち、５−オキソプロリナーゼタンパク質のアミノ酸配列が確定される。
【００５３】
（５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクターの構築）
本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）を構築し、該組換えベクターにより形質転換または形質導入を行うことにより、本酵素を生産し得る組換え微生物を取得することができる。該組み換え微生物は、本酵素を効率的に生産するための一手法としても有用である。
【００５４】
５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と、各種ベクターとを、５−オキソプロリナーゼ遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。すなわち、例えば適当な制限酵素で５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、適当な制限酵素で切断したプラスミドに挿入することにより構築することができる。あるいは、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結させることにより得ることがができる。
【００５５】
（形質変換体または形質導入体の取得）
上記のようにして得られた組換えベクターを用いて微生物を形質転換する方法は、宿主として用いる微生物および該組換えベクターの種類により異なるが、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、相同組換えやトランスポゾンを利用することにより宿主の染色体上に直接的に挿入する手法、およびプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体等のベクター上に連結することにより宿主内に導入する手法などが挙げられる。
【００５６】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域、下流領域と相同な配列、適当なプロモーターおよびターミネーターと、５−オキソプロリナーゼ遺伝子とを連結し、糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主に強制発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは、例えば、糸状菌に属する微生物の場合、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１プロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域等が挙げられる。
【００５７】
ベクターを利用する方法では、クローニングした５−オキソプロリナーゼ遺伝子を、常法により、原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組込み型、人工染色体等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により形質転換または形質導入することができる。
【００５８】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主中で５−オキソプロリナーゼを生産させ得るものであればいかなるものでも用いることができ、糸状菌発現ベクターｐＳＴ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  ２１８、９９−１０４、１９８９）および糸状菌の系、酵母発現ベクター〔ＹＥｐＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）〕および酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の系、大腸菌発現ベクター〔ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＵＣ（タカラバイオ社製）ｐＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）〕および大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の系等が挙げられる。
【００５９】
また、上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーターまたはその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、適当な誘導プロモーターまたは構成的プロモーターが挙げられ、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙＢプロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。但し、５−オキソプロリナーゼ遺伝子の発現に必要な機能については、挿入する５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が、その機能を有している場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ベクターＤＮＡ上に必ずしもマーカー遺伝子を有する必要はない。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、５−オキソプロリナーゼ遺伝子の上流、もしくは下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００６０】
（形質変換体または形質導入体の宿主）
宿主細胞としては、５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換または形質導入により、本酵素を生産することができる生物であればいかなる生物も用いることができ、原核細胞、真核細胞、または真核生物、例えば大腸菌または酵母の他、他の細菌、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞が使用できるがこれに限られない。
【００６１】
下等真核宿主細胞の一例としては、糸状菌や酵母が挙げられる。糸状菌に分類される微生物としては、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属またはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属などに属する糸状菌が挙げられる。これらの属に分類される微生物であって、本発明に用いる５−オキソプロリナーゼを生産する具体的な好ましい微生物としては、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）などが挙げられる。より具体的には、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）  ＮＢＲＣ４２３９株が挙げられる。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコールおよび塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  ２１８、９９−１０４、１９８９）を用いることができる。
【００６２】
酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。これらの属に分類される微生物であって、本発明に用いる５−オキソプロリナーゼを生産する具体的な好ましい微生物としては、チゴサッカロマイセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）等が挙げられる。より具体的には、Zygosaccharomyces rouxii  ＮＢＲＣ１８７６株が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、  ５、  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【００６３】
高等真核宿主細胞の一例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞が挙げられる。より具体的には、カイコの細胞（Ｓｆ９  ｃｅｌｌ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃｅｌｌ  ：  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ）（いずれもＡＴＣＣより分与）などが挙げられる。哺乳類細胞への形質転換方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法等を用いることができるが、これに限定されず、各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【００６４】
原核宿主細胞の一例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）  Ｋ−１２株、好ましくは、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株（いずれも、タカラバイオ社製）等が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得ることができる。こうした宿主細胞に組換えベクターを移入する方法としては、例えば、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行う方法やエレクトロポレーション法を用いることができる。さらには市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン社製）を用いても良い。
【００６５】
（本発明の５−オキソプロリナーゼの製造）
本発明の５−オキソプロリナーゼは、各種公知の酵素生産方法を用いて製造することができる。例えば、５−オキソプロリナーゼ生産微生物を培地中で培養して目的とする５−オキソプロリナーゼを産生させ、培養物あるいは培養菌体内部より酵素を採取することができる。また、本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子または該５−オキソプロリナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを包含し、５−オキソプロリナーゼ生産能を有する微生物を培養し、該培養物より５−オキソプロリナーゼを採取することができる。
【００６６】
本酵素を製造するために使用される微生物としては、本酵素の生産能を有する限り、遺伝子組換えの有無に関わらず、いかなる微生物を使用してもよく、大腸菌または酵母の他、他の細菌、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞が使用できる。具体的には、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する大腸菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌、哺乳類細胞などが挙げられる。具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）  ＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ  ４２１４９）株、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）  ＮＢＲＣ４２３９株等を挙げることができる。また、該菌株の変異株を用いることも可能である。該菌株の変異株を得る方法としては、例えば、ラジオアイソトープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を用いて原株に突然変異を起こさせる方法を用いることができる。
【００６７】
当然のことながら、本酵素の生産に使用する微生物は、本酵素の生産能を有すると同時に、従来の別種の５−オキソプロリナーゼの生産能を兼ね備えたものであってもよい。例えば、組換えにより本酵素を生産させる際に、宿主として使用する微生物が本来保有している宿主自身の別種の５−オキソプロリナーゼも同時に生産される場合等が想定される。また、本来、本酵素を含む複数種の両方の５−オキソプロリナーゼの生産能を兼ね備えた微生物や、ある種の５−オキソプロリナーゼの生産能を有する微生物に、本酵素を含む複数種の５−オキソプロリナーゼをコードする遺伝子を導入して複数種の５−オキソプロリナーゼの生産能を兼ね備えさせる場合等も想定される。
【００６８】
このような複数種の５−オキソプロリナーゼの生産能を兼ね備えた微生物を用いて５−オキソプロリナーゼを生産する場合には、各種の培養条件下で培養することによって、目的に応じ、各５−オキソプロリナーゼの生産比率を任意に変化させて酵素生産させることも可能であるし、任意の公知の分離精製技術を利用して所望の５−オキソプロリナーゼのみを得ることもできるし、あるいは、特段の分離精製工程を経ることなく、本酵素を含む５−オキソプロリナーゼ粗精製物を得ることもできる。
【００６９】
上記の微生物を培地に培養し、得られる培養物から本酵素を採取する。培養法は、通常の固体培養法もしくは液体培養法を採用することができる。
【００７０】
培地は、微生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地または天然培地のいずれでも使用できる。
【００７１】
炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、マルトース、デンプン加水分解物、グリセリン、フルクトース、糖蜜等が使用される。また、窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆もしくは小麦ふすま侵出液、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等が挙げられる。無機物としては、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム等の種々の塩類が挙げられる。必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。その他にも、添加することにより本発明の５−オキソプロリナーゼ製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせて用いてもよい。また、形質転換微生物の場合は必要に応じて、ガラクトース、イソプロピル−１−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）などのプロモーターの誘導物質を添加し、５−オキソプロリナーゼの生産を行う。これらの培地成分は、単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
【００７２】
培養条件は、培養する微生物により異なる。例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５〜１０に調整し、培養温度は、２０〜４０℃、培養時間は、１０〜２５時間、あるいは１〜７日間等、適宜設定することができ、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などにより実施する。
【００７３】
例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物を培養する場合の培地および培養条件の一例として、２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸、ｐＨ調整せず弱酸性になる）を用いた、３０℃、１２０ｒｐｍで２〜４日間の振盪培養が挙げられる。酵母を培養する場合の培地および培養条件の一例として、２％（ｗ／ｖ）  バクトペプトン、１％（ｗ／ｖ）  バクトイースト・エクストラクト、２％（ｗ／ｖ）  グルコースの培地を用いた、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間の振盪培養が挙げられる。例えば、大腸菌の培養は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。哺乳類細胞や昆虫細胞の培養では、それぞれの細胞に合わせて、各種糖、アミノ酸、無機塩、ビタミン、血清、成長ホルモン等を混合した培地を選択する、３７℃で１〜７日間の、静置培養、あるいは振盪培養が挙げられる。必要に応じて、５％二酸化炭素の供給されるインキュベーター内で、培養することができる。また、市販の培養用培地（日水製薬社製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製等）を用いてもよい。
【００７４】
酵素生産微生物の培養終了後、培養物から５−オキソプロリナーゼを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。例えば、５−オキソプロリナーゼが菌体外部に放出される場合には、濾過または遠心分離等により菌体を分離して、５−オキソプロリナーゼを含む培養液を粗酵素液として回収することができる。
【００７５】
あるいは、５−オキソプロリナーゼが菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から５−オキソプロリナーゼを採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用し、次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、粗酵素液を得ることができる。
【００７６】
得られた粗酵素液から、５−オキソプロリナーゼをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。具体的には、例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ニッケルカラム等）、電気泳動法等が挙げられ、単独または適宜組み合わせて用いることができる。
【００７７】
（本発明の５−オキソプロリナーゼの各種用途への応用における優位性）
本発明の５−オキソプロリナーゼは、ｐＨ７．０〜８．０で良好に作用するため、中性域を含む広範なｐＨ域における用途・使用工程に対して好適に使用することができる。また、本発明の５−オキソプロリナーゼの安定ｐＨ範囲は広範にわたるため、本酵素を定量試薬、食品加工用助剤等として利用する場合にも、ｐＨ環境が変化したときの影響を受けにくいという利点を有する。
【００７８】
また、本発明の５−オキソプロリナーゼは、至適温度範囲が中温領域にある。そのため、試薬として、あるいは、食品加工等に本発明の５−オキソプロリナーゼを使用するにあたり、必要以上に加温することなく、所定の作用効果を奏することができ、食品中や試薬中に配合して反応を行わせる際に、食品中や試薬中の各種成分の熱変性等を少なく抑えられることも期待できる。
【００７９】
上記の通り、本酵素は、必要以上に加温しなくても良好に作用する一方で、一定の耐熱性を有しており、食品加工等に使用するにあたり行われる加熱工程との共存も可能であるという点でも、実用化に適しているといえる。
【００８０】
なお、本発明の５−オキソプロリナーゼは、上述の通り、一定の耐熱性を有しつつ、通常の調味料製造等で広く用いられる加熱殺菌条件、例えば、達温９５℃等の条件では迅速に完全に失活するため、製造工程中に、本酵素失活のための特別の加熱工程を組み入れる必要を生じない。
【００８１】
さらに、本酵素のＬ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値は小さく、より効率的に反応を触媒でき、反応時間の短縮や酵素の使用量低減も期待できる。
【００８２】
以上、これまでに５−オキソプロリナーゼが食品用や試薬用に実用化されたという報告はないが、いくつかの文献で報告されている公知の酵素の特性等と比較した限りでも、本発明の５−オキソプロリナーゼは上記のような点で優れており、各種用途への応用における優位性を有する。
【００８３】
（各種用途における応用に向けた、本発明の５−オキソプロリナーゼの製造上の工夫）
各種用途における応用に向けて、本発明の５−オキソプロリナーゼを製造する際には、後の工程においてよりよい効果を奏することを意図して、当業者として想定可能な各種の製造段階の工夫を採用することもできる。
【００８４】
例えば、特定のｐＨでの粉末化やセンサー等への固定化、高温での加熱などが想定される用途、特定の成分の除去や添加が好まれる配合で製剤化する場合、あるいは、本酵素の特性とは異なる特定範囲のｐＨや温度条件が好適であることがわかっている別の酵素や試薬成分と共存させる必要がある場合、等、必要に応じ、上流の製造工程における条件設定を個別に最適化することもできる。
【００８５】
（本発明の５−オキソプロリナーゼを用いた、飲食品の製造）
上述のように得られた本発明の５−オキソプロリナーゼを用いて各種飲食品を加工することにより、Ｌ−グルタミン酸をより高い濃度にて含有する、うま味のある飲食品やうま味の改善された飲食品を製造することができる。具体的には、Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品と本酵素とを接触もしくは混合する、または、Ｌ−ピログルタミン酸を含有する飲食品を本酵素を発現する微生物により発酵させることにより、前記飲食品中のＬ−ピログルタミン酸を加水分解し、呈味成分として重要なＬ−グルタミン酸に変換することにより、従来にない優れた呈味力を有する飲食品を得ることができる。本願明細書において飲食品に含まれるＬ−グルタミン酸濃度を高めることおよび／またはＬ−ピログルタミン酸濃度を低下させることを、飲食品のうま味の改善という。Ｌ−グルタミン酸は熱や圧力の存在下で非酵素的反応によってＬ−ピログルタミン酸へと変化する。したがって本酵素は、飲食品中のＬ−グルタミン酸がＬ−ピログルタミン酸へと変化したものを、再度Ｌ−グルタミン酸へと加水分解することにより飲食品のうま味を維持するために用いることもできる。このような、うま味の維持も本願明細書にいう、うま味の改善に包含されるものとする。
【００８６】
すなわち本酵素はうま味のないＬ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換するうま味改善剤として利用でき、本酵素を発現する微生物はうま味に富んだ発酵食品を製造するための微生物として利用できる。微生物は好ましくは本酵素を高発現する微生物、または本酵素活性の高い微生物である。
【００８７】
本酵素を適用できる飲食品としてはＬ−グルタミン酸またはＬ−ピログルタミン酸を含むものであれば特に限定されないが、例えばトマトや白菜等の野菜、小麦粉等の穀類、マッシュルームやシイタケ等のキノコ類、大豆等の豆類、昆布等の海草、海苔、しょうゆ、魚醤、味噌、鰹節、削り節等の各種発酵食品や缶詰、レトルト食品、インスタント食品、冷凍食品を含む各種加工食品等が挙げられる。
【００８８】
ある実施形態において本発明のうま味改善剤は、本酵素を任意の適当な形態で含む。例えば本酵素は溶解状態（希釈状態および濃縮状態を含む）、ゲル、固形粉末、顆粒等の形態であり得る。別の実施形態において、本発明のうま味改善剤は本酵素を発現する形質転換体または形質導入体（微生物）を含有する。この場合、本酵素を発現する微生物は培養液、培養物、懸濁物、固形粉末、顆粒等の任意の形態とすることができる。本発明のうま味改善剤は賦形剤や安定化剤等の、任意の他の成分を必要に応じて含み得る。
【００８９】
うま味のある飲食品やうま味の改善された飲食品の製造にあたり好適な５−オキソプロリナーゼの添加量や酵素処理条件の詳細は、加工対象の飲食品および要求するＬ−グルタミン酸の濃度に応じて、適宜設定すればよい。本酵素の酵素反応の進行状況を検証したり、発酵後のうま味向上の評価は、飲食品中のＬ−グルタミン酸濃度を、酵素法やクロマトグラフィー等の公知の手段を用いて測定したり、各種公知の官能評価を行えばればよい。なお、一般に、ヒトがうま味を感じるＬ−グルタミン酸濃度の域値は０．０３％程度といわれるが、共存成分による影響を受け、その効果は相乗的であると考えられる。本酵素はｐＨ７．０〜８．０で良好に作用するため、中性域を含む広範なｐＨ域において使用できる。食品は一般に低ｐＨのものが多いが、本酵素はこうした飲食品の加工に広く用いることができる。
【００９０】
本酵素を飲食品に利用し、あるいは、本酵素の生産微生物を用いて飲食品を発酵させる場合には、飲食品に安全に利用できる微生物から本酵素を取得することや、飲食品に安全に利用できる微生物を用いて飲食品を発酵させることも重要である。本酵素の由来微生物の一例である、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）およびアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）は、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼性が高い麹カビ（黄麹菌）に属し、味噌・しょうゆ・日本酒等、日本における醸造食品の製造にも古くから使われている。このような微生物は、飲食品を加工するという用途において、好適に用いることができる。
【００９１】
（本発明の５−オキソプロリナーゼを用いた、Ｌ−ピログルタミン酸測定用試薬の製造）
本発明の５−オキソプロリナーゼは、Ｌ−ピログルタミン酸の測定に用いることもできる。例えば、Ｌ−ピログルタミン酸含量を測定したい検体を限外濾過して、タンパク質成分を除き、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈した溶液を測定用の溶液とする。限外濾過には、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等を使用できる。該測定用の溶液をＡＴＰ、１価カチオン、２価カチオンの存在下で本酵素と反応させることにより、Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を行わせ、反応により生じたＬ−グルタミン酸を、例えば、測定法１の方法で測定することにより、検体中のＬ−ピログルタミン酸濃度を算出できる。反応に際しては、適宜、酵素濃度と反応時間を設定することができる。また、測定用試薬中には、防腐剤、緩衝液、安定剤等、本酵素の反応に直接的に関与しない諸成分を含め、任意の成分を配合することもできる。
【００９２】
（本発明の５−オキソプロリナーゼを用いた、ラセミ体の分割）
本酵素は、Ｌ−ピログルタミン酸を基質とし、Ｄ−ピログルタミン酸は基質とはならない。Ｄ−グルタミン酸やＤ−ピログルタミン酸は薬品や食品添加物、農薬の生成における重要な出発物質であるが、その製造工程には有機合成やラセミ体の分割等が必要であるため、Ｌ−体やラセミ体と比較して、高価である。本酵素により、不純物となるＬ−ピログルタミン酸を加水分解することにより、高純度のＤ−ピログルタミン酸を得、得られたＤ−ピログルタミン酸を任意の方法により加水分解することにより、Ｄ−グルタミン酸を得ることができる。
【００９３】
例えば、Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合液について、測定法１に準じた反応液中で本酵素と反応させることにより、Ｌ−ピログルタミン酸を特異的にＬ−グルタミン酸に変換する。Ｌ−グルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸を分離する方法は、通常の化合物の分離方法を用いることができる。具体的には、例えば、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、結晶化法等を用いることができる。こうした一連の工程を含む方法を本願明細書においてラセミ体のピログルタミン酸の分割方法という。また、ラセミ体の分割において適宜、誘導体化等の修飾を行うこともできる。
【００９４】
Ｌ−ピログルタミン酸がＬ−グルタミン酸へと変換されたことの確認は、Ｌ−ピログルタミン酸の残存量を検出することにより行うか、または、ＤＬ−ピログルタミン酸、ＤＬ−グルタミン酸、およびＬ−グルタミン酸を測定することにより行うこともできる。例えば、ＤＬ−ピログルタミン酸は、液体クロマトグラフィーで分離、ブロモチモールブルーによる誘導体化後、紫外線吸収程度を検出し、標品を用いた検量線から算出することができ、Ｌ−グルタミン酸は、測定法１で示すように、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いた酵素法により測定することができる。ＤＬ−ピログルタミン酸混合液中において本酵素によりＬ−グルタミン酸へと変換されたＬ−ピログルタミン酸は、反応後に生じたＬ−グルタミン酸濃度、あるいは、反応前のＤＬ−ピログルタミン酸濃度と反応後のＤＬ−ピログルタミン酸濃度の差から算出することができる。
【００９５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００９６】
（Ａ．アスペルギルス属に属する微生物からの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の取得）
１．アスペルギルス・ソーヤにおける５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の検索
ラット５−オキソプロリナーゼ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＰ＿４４６３５６．１）、およびその酵母オルソログであるＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＮＰ＿０１２７０７．１）のタンパク質配列データを用い、それらと比較的配列同一性の高い遺伝子を、糸状菌に属するアスペルギルス属菌から探索することを試みた。検索にはＢｌａｓｔプログラム（ｔｂｌａｓｔｎ）を用いた。アスペルギルス属菌のＤＮＡデータとしては、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）  ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅｓ、  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ６５  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；  ＤＦ０９３５５７-ＤＦ０９３５８５、ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １８，１６５-１７６，２０１１）を用いた。【００９７】
検索の結果、比較的遺伝子配列の同一性が高かった配列領域として、配列番号４〜６で示す３つの遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）がみつかった。【００９８】
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０．６（ゼネティックス社製）によりアミノ酸レベルでの配列同一性の比較を行うと、前記ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２と、ラット５−オキソプロリナーゼとの配列同一性は、それぞれ５１．５％、５５．２％、４８．６％、酵母オルソログＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃとの配列同一性は、それぞれ５１．１％、５４．１％、４６．９％であった。【００９９】
これら３領域の配列情報をアスペルギルス属菌における５−オキソプロリナーゼオルソログ候補分子探索の手がかりとすることとし、以下の操作を進めた。【０１００】
２．アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）からのゲノムＤＮＡ抽出
アスペルギルス・ソーヤ  ＮＢＲＣ４２３９株をバッフル付き三角フラスコにて、ＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）中、３０℃で１〜２日間振盪培養し、濾過により菌体を回収した。回収して得た菌体を、液体窒素中で凍結させ乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした。【０１０１】
６５℃に温めたＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  ３００μＬにスパーテル１杯程度の前記粉末状の菌体片を加え、ボルテックスした後、６５℃で１５分間、インキュベートした。次いで、５０μｇ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  １２５μＬを加え、２０秒間、激しくボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心した。得られた上清をイソプロパノール３００μＬと混合し、１１，０００×ｇで３分間遠心して得た沈殿を、７０％エタノールでリンスすることにより、アスペルギルス・ソーヤ  ＮＢＲＣ４２３９株由来のゲノムＤＮＡを回収した。このゲノムＤＮＡにＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、５０℃、５分間インキュベートして溶解することにより、所望の濃度のゲノムＤＮＡ溶液を調製した。【０１０２】
３．アスペルギルス・ソーヤにおける５−オキソプロリナーゼのオルソログ候補遺伝子のクローニング
上記で得られたゲノムＤＮＡを鋳型に、アスペルギルス・ソーヤの３つの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）をＰＣＲによりそれぞれ増幅することを試みた。具体的には、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６には配列番号７および８、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０には配列番号９および１０、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２には配列番号１１および１２のプライマーを用い、反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。前記のＰＣＲにより増幅した３種類の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片（約４０００塩基対）は、それぞれ１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。また、クローニング用のベクターとして、ｐＵＣ１９由来のプラスミドベクターであるｐＡｓＮを用いた。ｐＡｓＮは、ｐＵＣ１９のＬａｃＺ遺伝子座に、アスペルギルス・ソーヤ由来硝酸還元酵素遺伝子（プロモーター領域、ターミネーター領域を含む）、アスペルギルス・ソーヤ由来ｔｅｆ１遺伝子のプロモーター領域（Ｐｔｅｆ１、上流７４８ｂｐ、配列番号１５）、およびアスペルギルス・ソーヤ由来アルカリプロテアーゼ遺伝子のターミネーター領域（Ｔａｌｐ、下流８００ｂｐ、配列番号１６）を導入することにより作製したベクターである。ｐＡｓＮを鋳型とし、配列番号１３および１４のインバースＰＣＲ用のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、５‘側にＴａｌｐ、および３’側にＰｔｅｆ１を含むプラスミドの配列をＤＮＡ断片として増幅し、次いでＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中で分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。【０１０３】
そして、精製した３種類の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、プラスミドｐＡｓＮ由来のＤＮＡ断片とそれぞれ連結した。これにより、ＰＣＲにより増幅した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片を、プラスミドｐＡｓＮのＰｔｅｆ１領域およびＴａｌｐ領域の間にそれぞれ連結した組換えプラスミドを得た。【０１０４】
これらの組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入された各ＤＮＡ配列の解析を行った。解析の結果、前記の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片は、それぞれアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡに存在するｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２の配列と一致することを確認した。【０１０５】
データベース検索で見出された遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、各プラスミドをそれぞれ、ｐＡｓＮ−４．８０６  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、ｐＡｓＮ−４．８２０  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、ｐＡｓＮ−３６．１３０２  ｐｒｅ  ｍＲＮＡと名付けた。【０１０６】
４．アスペルギルス属菌用発現ベクターの作製
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株ゲノムＤＮＡに、上述の方法により取得した５−オキソプロリナーゼのオルソログ候補遺伝子を導入するために、形質転換用ＤＮＡ断片作製用のプラスミドを下記のように作製した。アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株ゲノムＤＮＡ上の遺伝子組換え部位としては、アスペルギルス属菌の生育に影響を与えないことを確認したアルカリプロテアーゼ遺伝子座を選択した。【０１０７】
まず、上述の方法により取得した３種の組換えプラスミド（ｐＡｓＮ−４．８０６、ｐＡｓＮ−４．８２０、ｐＡｓＮ−３６．１３０２）中の各５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子を、その上流に位置するＰｔｅｆ１領域および下流に位置するＴａｌｐ領域とともに、配列番号１７および１８のプライマーを用いてＰＣＲによりそれぞれ増幅した。Ｐｔｅｆ１は、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子を発現させる際のプロモーターであり、Ｔａｌｐは、遺伝子相同組換え部位の下流領域と相補的な配列である。【０１０８】
また、遺伝子相同組換え部位の上流領域と相補的な配列として、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１９および２０のプライマーを用いてアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域（Ｐａｌｐ、上流１５１５ｂｐ、配列番号２１）をＰＣＲにより増幅した。また、後述の形質転換の操作において、形質転換体が得られたことを確認するために用いる、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２２および２３のプライマーを用いてウリジン要求性を相補する遺伝子周辺領域（ｐｙｒＧ、上流４０７ｂｐ、コード領域８９６ｂｐおよび下流５３５ｂｐを含む１８３８ｂｐ、配列番号２４）をＰＣＲにより増幅した。【０１０９】
さらに、プラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）を鋳型として、配列番号２５および２６のインバースＰＣＲ用のプライマーを用いてプラスミドｐＵＣ１９の１６６塩基目〜３９３塩基目（塩基番号は試薬に添付された制限酵素地図による）を除いた配列（ＭＣＳ、複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子を含む）をＰＣＲにより増幅した。なお、反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）を用い、添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０１１０】
前記のＰＣＲにより増幅したそれぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中で分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。前記の各プライマーには、次の操作でＤＮＡ断片どうしを連結させる際に隣接するＤＮＡ断片と同一の配列１５ｂｐ程度が付加されており、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、それぞれを連結することができる。すなわち、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰａｌｐのＤＮＡ断片、ＰａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片、ｐｙｒＧのＤＮＡ断片とＰｔｅｆ１のＤＮＡ断片、Ｐｔｅｆ１のＤＮＡ断片と５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）のＤＮＡ断片、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片、およびＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片を連結することができる。これにより、図３に示すように、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）、およびＴａｌｐの配列が順に連結された３種の組換えプラスミドを取得した。【０１１１】
該組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入された各ＤＮＡ配列の解析を行い、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）の配列が、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡに存在するｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２の配列と一致することを確認した。【０１１２】
由来する遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、各プラスミドをそれぞれ、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ｐｒｅ  ｍＲＮＡおよびｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ｐｒｅ  ｍＲＮＡと名付けた。【０１１３】
５．アスペルギルス・ソーヤにおける５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ配列の取得とＨｉｓタグ配列の付加
上述の３種の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のエクソン−イントロン構造を予測すると、いずれの遺伝子中にも２つのエクソンと１つのイントロンが存在すると考えられた（図４参照）。具体的には、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６（オルソログ候補遺伝子１、配列番号４）の３９８６塩基のうち３１０９番から３１５８番が、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０（オルソログ候補遺伝子２、配列番号５）の３８９９塩基のうち２５２４番から２５７９番が、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２（オルソログ候補遺伝子３、配列番号６）の３９１７塩基のうち３５番から９０番が、それぞれイントロンであると予測された。【０１１４】
イントロンを除いた配列（以下、ＣＤＳと表記する）を得るために、ＰＣＲによりエクソンと予測される領域を増幅し、エクソン１とエクソン２を連結した。すなわち、上記で作製したプラスミドｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号１７および２７のプライマーを用いて、上流側にＰｔｅｆ１が連結されたｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のエクソン１領域を、配列番号３０および３１のプライマーを用いて、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のエクソン２領域をＰＣＲにより増幅した。ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号１７および２８のプライマーを用いて、上流側にＰｔｅｆ１が連結されたｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０のエクソン１領域を、配列番号３２および３３のプライマーを用いて、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０のエクソン２領域をＰＣＲにより増幅した。ｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号１７および２９のプライマーを用いて、上流側にＰｔｅｆ１が連結されたｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２のエクソン１領域を、配列番号３４および３５のプライマーを用いて、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２のエクソン２領域をＰＣＲにより増幅した。また、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３および２３のインバースＰＣＲ用のプライマーを用いて５‘側にＴａｌｐ、３’側にＰａｌｐおよびｐｙｒＧを含むプラスミドの配列をＰＣＲにより増幅し、ＤＮＡ断片を得た。反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘを用い、添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０１１５】
前記のＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中で分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製し、３種類の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子それぞれについて、上流側にＰｔｅｆ１が連結されたエクソン１領域のＤＮＡ断片およびエクソン２領域のＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、プラスミド由来のＤＮＡ断片に連結することにより、３種類の５−オキソプロリナーゼのオルソログ候補遺伝子のイントロン予測配列を除いた配列を組み込んだプラスミドを得た。【０１１６】
該組換えプラスミドを、データベース検索で見出された遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ＣＤＳ、およびｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ＣＤＳと名付けた。【０１１７】
次に、発現させたタンパク質の精製過程を簡略化するために、Ｈｉｓタグ融合タンパク質発現用プラスミドの構築を行った。上記で作製した３種類のプラスミドｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ＣＤＳ、およびｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ＣＤＳを鋳型とし、それぞれ配列番号３６および３１、配列番号３７および３３、配列番号３８および３５のプライマーを用いて、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）ＣＤＳの５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した３種類のＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。【０１１８】
また、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３および１４のインバースＰＣＲ用のプライマーを用いて５‘側にＴａｌｐ、３’側にＰａｌｐ、ｐｙｒＧおよびＰｔｅｆ１を含むプラスミド側の配列をＰＣＲにより増幅した。反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘを用い、添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０１１９】
前記のＰＣＲにより増幅したそれぞれのＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中で分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、３種類の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳの５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したＤＮＡ断片それぞれを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、５‘側にＴａｌｐ、３’側にＰａｌｐ、ｐｙｒＧおよびＰｔｅｆ１を含むプラスミド由来のＤＮＡ断片に連結することにより、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）のＣＤＳ、およびＴａｌｐの配列が順に連結された３種の組換えプラスミドを取得した。【０１２０】
該組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入された各ＤＮＡ配列の解析を行った。解析の結果、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ、およびＴａｌｐのそれぞれの配列がアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡ上の配列と一致することを確認した。【０１２１】
以上のようにして、３種の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２））に対し、Ｈｉｓタグ配列を付加し、かつ、イントロンであることが予測される配列を除去する操作を行った。【０１２２】
上記操作を経た３種の遺伝子をそれぞれ含むプラスミドを、由来する遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ、およびｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳと名付けた。【０１２３】
６．アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子形質転換体の取得
上記のように作製したｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳを鋳型として、配列番号３９および４０のプライマーを用い、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のＣＤＳ領域、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片を、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳを鋳型として、配列番４１および４０のプライマーを用い、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０のＣＤＳ領域、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片を、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳを鋳型として、配列番４１および４２のプライマーを用い、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２のＣＤＳ領域、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片を、それぞれＰＣＲにより増幅した。なお、反応試薬としてＫＯＤ  Ｄａｓｈ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０１２４】
上記増幅した３種のＤＮＡ断片（５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子それぞれについて、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ領域、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片）は、エタノール沈殿後、ＴＥに溶解して、所望の濃度のＤＮＡ溶液を調製し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。【０１２５】
まず、形質転換に用いるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（マルツプレートに培養したアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子、９ｃｍシャーレに１０分の１程度）を、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液に懸濁し、１０ｍＭとなるようにウリジンを添加したＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）１５０ｍＬに植菌し、１８時間程度、振盪培養した。培養後、濾過により菌体を回収し、形質転換用にＰＣＲにより増幅しておいたＤＮＡ断片（３種の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子それぞれについて、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ領域、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片）のＴＥ溶液（ＤＮＡ１０μｇ程度／２０μＬ）を用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法により、形質転換を行った。【０１２６】
得られた各形質転換体においては、ＮＢＲＣ４２３９株のアルカリプロテアーゼ遺伝子座にｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、およびＨｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ領域が連結された配列がそれぞれ導入される。これらの株は、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株を選択できる。【０１２７】
さらに、該形質転換体について、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子座に遺伝子導入された株であることの確認を行なった。すなわち、爪楊枝で掻きとった該形質転換体の分生子をＴＥに懸濁してＰＣＲの鋳型とし、配列番号４３および４４のプライマーを用い、アルカリプロテアーゼ遺伝子座の上流２３７塩基目から下流２７７塩基目に挟まれた領域をＰＣＲにより増幅した。反応試薬には、ＫＯＤ  ＦＸ  （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９４℃、５分間の熱処理後、添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。その結果、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡのアルカリプロテアーゼ遺伝子座のアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ、１３８９ｂｐ、配列番号４５）に換えて、形質転換体株では、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳ領域が連結されたＤＮＡ（約６．６ｋｂｐ）の存在を示す約７ｋｂｐのシグナルが検出されたことにより、前記の形質転換体ではアルカリプロテアーゼ遺伝子座において相同組換えされたことを確認した。【０１２８】
上記の方法により、３種のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子に各々由来する遺伝子による形質転換体（５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体）を取得することができた。各５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体は、由来する遺伝子の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、それぞれＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株と名付けた。【０１２９】
７．アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の取得
上記のようにして取得した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体のゲノムＤＮＡに導入された、５−オキソプロリナーゼ候補遺伝子の上流にはヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、アスペルギルス属菌形質転換体を培養することにより、Ｎ末側にヒスチジン８個のタグが融合された５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を発現させることができる。【０１３０】
該Ｎ末Ｈｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質は、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。すなわち、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体（ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株）の分生子を、ＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）に１×１０５個／ｍＬとなるように植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで、２日間培養し、濾過により菌体を回収した。【０１３１】
回収した菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒を用いて磨砕して得た細かい粉末状の菌体片を、培養液の１／１０〜１／２０量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、菌体抽出液（粗酵素溶液）とした。【０１３２】
その後、この菌体抽出液の一部を、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、イミダゾール２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出された５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分を得た。なお、必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、前記５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分をさらに濃縮した。５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分は、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液とした。【０１３３】
上記の酵素の精製操作により、培養１００ｍＬあたり、１００〜３００μｇの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質が得られた。以下、それぞれの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を、由来する遺伝子の名称（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２））に対応して、Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、Ａｓ３６．１３０２と表記する。【０１３４】
８．各５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の確認
Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、Ａｓ３６．１３０２をそれぞれ含む上記形質転換体由来の菌体抽出液（５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質粗酵素溶液）、および精製タンパク質（精製酵素溶液）の一部を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動はＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液（コスモバイオ社製）を添加し、１００℃、５分間の熱処理後、アクリルアミド５−２０％のグラジェントゲル（和光純薬工業社製）、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて泳動した。泳動終了後にゲルのＣＢＢ染色を行った結果を図５に示す。これにより、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、Ａｓ３６．１３０２）が、高い純度で精製されていることを確認した。分子量は約１４０ｋＤａ（黒三角でマークした部分）であり、本発明中に開示した遺伝子の配列から算出される大きさと一致していた。【０１３５】
なお、各タンパク質の量は、アスペルギルス・ソーヤ由来酵素の菌体抽出液では湿菌５００μｇ相当、アスペルギルス・ソーヤ由来酵素の精製タンパク質溶液ではタンパク質１μｇを電気泳動に供した。参照として、公知の５−オキソプロリナーゼである酵母オルソログＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃについて、後述する手順で同様に菌体抽出液と精製タンパク質溶液を調製し、菌体抽出液１００μＬ相当、精製タンパク質１μｇを電気泳動に供した。【０１３６】
（Ｂ．酵母由来５−オキソプロリナーゼの取得）
本発明の５−オキソプロリナーゼの諸性質を公知酵素と比較するための参照用酵素として、本発明と同様に微生物由来の５−オキソプロリナーゼのオルソログタンパク質として報告されている酵母由来のＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃを調製した。なお、酵母からの前記５−オキソプロリナーゼの取得に関しては、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．１０、３９４頁〜４０１頁、２０１０年）等に開示されている手順等に準じて各種操作を行った。【０１３７】
１．サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）からのゲノムＤＮＡ抽出
サッカロマイセス・セレビシエ  ＩＮＶｓｃ１株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＹＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）  イーストエキストラクト、２％（ｗ／ｖ）  ペプトン、２％（ｗ／ｖ）  Ｄ−グルコース）で一晩、振盪培養後、１３，０００×ｇ、１分間の遠心により菌体を回収した。回収した菌体を、滅菌ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した後、Ｎｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  ３００μＬと直径０．５ｍｍのマルチビーズショッカー用専用グラスビーズ（安井器械社製）を加え、ビーズショッカー（安井器械社製）により破砕した（２０００ｒｐｍ、６０秒間破砕後、３０秒間静置、これを８回繰り返した）。その後、６５℃で１５分間インキュベートした後、５０μｇ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）を添加、３７℃で１５分間インキュベートした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  １２５μＬを加え、１０秒間、激しくボルテックスし、１７，０００×ｇで３分間遠心した。【０１３８】
得られた上清をイソプロパノール３００μＬと混合し、１７，０００×ｇで１０分間遠心して得た沈殿を、７０％エタノールでリンスすることにより、酵母由来ゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡに対して適量のＴＥを加え、５０℃、５分間インキュベートして溶解することにより、所望の濃度のゲノムＤＮＡ溶液を調製した。【０１３９】
２．酵母ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃのクローニングと酵母形質転換体の作製
サッカロマイセス・セレビシエ  ＩＮＶｓｃ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４６および４７に示したプライマーを用いて、５’側に制限酵素ＳａｃＩの認識配列およびヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列、３’側に制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加した、ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃのコード領域（３８６１ｂｐ、配列番号４８）をＰＣＲにより増幅した。反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０１４０】
前記のＰＣＲにより増幅した、制限酵素認識配列およびヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃと考えられるＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素ＳａｃＩ（タカラバイオ社製）およびＸｈｏＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）で切断後、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、再度精製した。精製された前記ＤＮＡ断片を、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、酵母発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＳａｃＩ−ＸｈｏＩサイトに連結することにより、酵母形質転換体作製用の組換えプラスミドｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−ＹＫＬ２１５ｃを構築した。【０１４１】
次いで、前記組換えプラスミドｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−ＹＫＬ２１５ｃを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換し、該形質転換体から前期組換えプラスミドｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−ＹＫＬ２１５ｃを抽出し、該プラスミド中に挿入されたＤＮＡ配列解析を行った。解析の結果、上記のヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃと考えられるＤＮＡ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃの配列と一致することを確認した。【０１４２】
次いで、前記プラスミドｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−ＹＫＬ２１５ｃを用いて、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、サッカロマイセス・セレビシエ  ＩＮＶｓｃ１株を形質転換し、ｐＹＥＳ２／ＣＴにコードされたウラシル合成遺伝子であるＵＲＡ３の発現により、ウラシル無添加培地に生育できるようになることで、ウラシル非要求性となることを指標に、ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃによる酵母形質転換体を選抜した。【０１４３】
３．酵母ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質の取得
上記のようにして取得したＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃによる酵母形質転換体に導入されたプラスミド中のＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃ遺伝子の上流には、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、酵母形質転換体をガラクトースの存在下で培養することにより、Ｎ末側にヒスチジン８個のタグが融合されたＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質を発現誘導することができる。該Ｎ末Ｈｉｓタグ融合ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質は、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。【０１４４】
すなわち、前記のＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃによる酵母形質転換体を、前培養用液体培地（０．６７％（ｗ／ｖ）  アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース  （ベクトン・ディッキンソン社製）、０．１９２％（ｗ／ｖ）  ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物  （ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）  ラフィノース）中、３０℃で２４時間、振盪培養した。その後、本培養用液体培地（０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ−ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース）で１０倍に希釈し、３０℃で１２〜１８時間培養し、５００×ｇ、１〜５分間の遠心により菌体を回収した。回収した菌体は、培養液の１／１０〜１／２０量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁し、マルチビーズショッカーを用いて破砕した。あるいは、前記回収した菌体を液体窒素中で凍結させ乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした後に、培養液の１／１０〜１／２５量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファーに懸濁した。【０１４５】
前記２種類の破砕菌体懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、菌体抽出液（粗酵素溶液）とした。その後、この菌体抽出液をＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質を結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出されるＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質含有画分を得た。【０１４６】
なお、必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて前記ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質含有画分をさらに濃縮した。ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質含有画分は、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液とした。上記の酵素精製により、培養１００ｍｌあたり、５５〜２００μｇのＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃタンパク質（以下、「ＹＫＬ２１５ｃ」と表記する）が得られた。【０１４７】
４．ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の確認
ＯＸＰ１／ＹＫＬ２１５ｃによる酵母形質転換体由来の菌体抽出液（粗酵素溶液）、および精製タンパク質（精製酵素溶液）の一部を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動はＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液（コスモバイオ社製）を添加し、１００℃、５分間の熱処理後、アクリルアミド５−２０％のグラジェントゲル（和光純薬工業社製）、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて泳動した。泳動終了後にゲルのＣＢＢ染色を行った結果を図５に示す。これにより、ＹＫＬ２１５ｃが、高い純度で精製されていることを確認した。分子量は約１４０ｋＤａであり、ＹＫＬ２１５ｃのアミノ酸配列（１２８６アミノ酸、配列番号５５）から算出される大きさと一致していた。【０１４８】
なお、各タンパク質の量は、菌体抽出液では培養液１００μＬ相当、精製タンパク質溶液ではタンパク質１μｇを電気泳動に供した。【０１４９】
（Ｃ．アスペルギルス属菌中で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の活性確認）
１．５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質とＬ−ピログルタミン酸との反応によるＬ−グルタミン酸生成活性の検出
上述のＡ．の７．により得られたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）、および上述のＢ．の３．により得られた酵母由来５−オキソプロリナーゼ酵母オルソログタンパク質ＹＫＬ２１５ｃを用いて、以下の手順に従って、５−オキソプロリナーゼ活性を確認した。【０１５０】
Ｌ−ピログルタミン酸溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００μｇ／ｍＬに希釈した前記の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）溶液０．０２ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。参照として、Ｌ−ピログルタミン酸溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００μｇ／ｍＬに希釈したＹＫＬ２１５ｃ溶液０．０２ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。前記の反応液を１００℃、３分間加熱して酵素反応を停止後、酵素反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。【０１５１】
Ｌ−グルタミン酸の定量には、「ヤマサＬ−グルタミン酸検出キットＩＩ」（ヤマサ醤油社製）を用い、酵素反応液０．０２ｍＬに対して前記キットのＬ−グルタミン酸検出用発色試薬０．１５ｍＬを混合し、室温で２０〜３０分間反応後の６００ｎｍの吸光度を測定した。Ｌ−グルタミン酸標品による検量線を用いて、酵素反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を算出し、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度から酵素の活性の有無を調べた。【０１５２】
その結果、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）、および５−オキソプロリナーゼ酵母オルソログタンパク質ＹＫＬ２１５ｃのいずれを反応に用いた場合にも、反応液中のＬ−グルタミン酸は検出限界（５μＭ）以下であった。すなわち、反応液中に添加したＬ−ピログルタミン酸（０．５ｍＭ）のほとんどがＬ−グルタミン酸へと変換されておらず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出できなかった。【０１５３】
２．ＡＴＰおよび金属イオンの存在下における、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質とＬ−ピログルタミン酸との反応と活性の検出
上記の結果を受けて、発明者らは、Ｌ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への変換において、リン酸化を伴う反応機構が存在する可能性を予想した。また、ＡＴＰ要求性の酵素は、その触媒活性に金属イオンの存在を要求する場合がある。５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質とＬ−ピログルタミン酸との反応によりＬ−グルタミン酸への変換を検出できなかった要因は、反応系に補助因子が不足していることであるとも考えられた。そこで、次に、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質と基質であるＬ−ピログルタミン酸との反応を、ＡＴＰ及び金属イオンの存在下で行った。【０１５４】
具体的には、上述のＡ．の７．により得られたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）、および上述のＢ．の３．により得られた酵母由来５−オキソプロリナーゼ酵母オルソログタンパク質ＹＫＬ２１５ｃを用いて、以下の手順に従って、５−オキソプロリナーゼ活性を確認した。なお、酵素の活性測定に関しては、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．（Ｖｏｌ．１０、３９４頁〜４０１頁、２０１０年）に記載の方法を改変した方法により測定した。Ｌ−ピログルタミン酸の分子内アミド結合が加水分解されて生じるＬ−グルタミン酸の増加程度を酵素学的に測定することにより酵素活性を算出することができる。【０１５５】
基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ（ＯＲＩＥＮＴＡＬ  ＹＥＡＳＴ社製）、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと、前記の各５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて２００μｇ／ｍＬに希釈）０．０２ｍＬをそれぞれ混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。なお、Ｌ−ピログルタミン酸は強酸性を示すため、緩衝液に溶解して、使用時のｐＨに調整後、他の試薬と混合して基質溶液の調製を行った。具体的には、Ｌ−ピログルタミン酸  １０ｍｍｏｌとＴｒｉｓ  １０ｍｍｏｌを水８０ｍＬ程度に溶解し、塩酸でｐＨ８に調整後、１００ｍＬにメスアップした。同様に、以降の実施例においても、Ｌ−ピログルタミン酸を様々な緩衝液中に溶解した試薬は、Ｌ−ピログルタミン酸を各種緩衝液に溶解後に、使用時のｐＨになるよう調整して用いた。【０１５６】
その他、本明細書に記載の試薬は、特に記載のない限り、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製、Ｓｉｇｍａ社製、同仁化学研究所社製、ベクトン・ディッキンソン社製、日本製薬社製、タカラバイオ社製等の試薬、純度に区別のあるものは特級グレードの試薬を用いた。【０１５７】
また、参照として、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと、ＹＫＬ２１５ｃ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００μｇ／ｍＬに希釈）０．０２ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。【０１５８】
反応後、前記の各酵素反応液を１００℃、３分間加熱して酵素反応を停止後、酵素反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した。【０１５９】
Ｌ−グルタミン酸の定量には、「ヤマサＬ−グルタミン酸検出キットＩＩ」（ヤマサ醤油社製）を用い、前記酵素反応液０．０２ｍＬに対して前記キットのＬ−グルタミン酸検出用発色試薬０．１５ｍＬを混合し、室温で２０〜３０分間反応後の６００ｎｍの吸光度を測定した（測定値）。また、前記基質溶液の代わりに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）０．０８ｍＬを用い、該緩衝液と前記の各５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０、およびＡｓ３６．１３０２）、または酵母オルソログタンパク質ＹＫＬ２１５ｃ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて２００μｇ／ｍＬに希釈）をそれぞれ混合し、３７℃で１時間反応を行った後、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定した（ブランク値）。得られた「ブランク値」と「測定値」から下式に基づいて、５−オキソプロリナーゼの活性を計算した。酵素活性の単位は、前述の条件下で１分間に1μｍｏｌのＬ−グルタミン酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。
【数２】
2014126186.tif 000004
【０１６０】
なお、式中の［Ｇｌｕ］は酵素反応液におけるＬ−グルタミン酸濃度（測定値）、［Ｇｌｕ  ｂｌａｎｋ］は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を基質溶液の代わりに添加した反応液のＬ−グルタミン酸濃度（ブランク値）、［ｅｎｚｙｍｅ］は反応液中の５−オキソプロリナーゼの濃度、６０は１時間の分数を表す。【０１６１】
各アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質、および酵母由来オルソログタンパク質ＹＫＬ２１５ｃについて、上記活性測定法に基づいて算出した５−オキソプロリナーゼの活性を調べた結果を表１に示す。
【表１】
2014126186.tif 000005
【０１６２】
上述のＣ．の１．に示したように、いずれの精製タンパク質もＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液との反応では、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度は検出限界以下であったが、表１に示すように、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０の精製タンパク質を基質溶液と反応させた場合には、公知の５−オキソプロリナーゼであるＹＫＬ２１５ｃと同様に、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度が１００μＭ以上に上昇した。【０１６３】
このことから、ＹＫＬ２１５ｃ、Ａｓ４．８０６、およびＡｓ４．８２０は、ＡＴＰ、１価カチオンであるカリウムイオン、および２価カチオンであるマグネシウムイオンの存在下、Ｌ−ピログルタミン酸をＬ−グルタミン酸に変換する反応を触媒する活性、つまり、５−オキソプロリナーゼ活性を持つことが確認された。【０１６４】
一方で、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２では、ＡＴＰ、１価カチオンであるカリウムイオン、および２価カチオンであるマグネシウムイオンの存在下でも、Ｌ−ピログルタミン酸との反応により反応液中のＬ−グルタミン酸濃度は上昇せず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出できなかった。【０１６５】
５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２の５−オキソプロリナーゼ活性が検出されなかった要因として、酵素の力価が低く酵素量が不足していたことも予想されたので、反応液中の酵素量をさらに増やして同様に活性の有無の確認をした。【０１６６】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ３６．１３０２）溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０）溶液を調製し、それぞれ０．０２ｍＬを、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０８ｍＬと混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。上述、Ｃ．の２．記載の方法に準じ、酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、酵素の活性の有無を調べた。各アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログおよび５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質について、タンパク質添加量とＬ−グルタミン酸濃度の関係は図６に示す通りであった。【０１６７】
図６に示すように、Ａｓ４．８０６（図中白抜き三角印でプロット）およびＡｓ４．８２０（図中白抜き丸印でプロット）では、添加したタンパク質濃度依存的にＬ−グルタミン酸濃度が上昇した。【０１６８】
一方で、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２（図中白抜き四角印でプロット）を添加した反応系においては、添加量を２００μｇ／ｍＬまで増やしても、反応液中のＬ−グルタミン酸濃度が上昇せず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出できなかった。【０１６９】
これにより、上記の一連の手法により、同程度の配列同一性を示す３つの候補遺伝子から取得してきた３種のタンパク質のうち、Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０が５−オキソプロリナーゼのアスペルギルス・ソーヤオルソログであることが判明した。【０１７０】
Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０およびＡｓ３６．１３０２のアミノ酸配列に相当する、配列番号５６、５７および５８の各配列から予想されるオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を、配列番号１、２および３に示す。
【実施例２】
【０１７１】
（アスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼの酵素学的性質）
実施例１において活性が確認された本発明の５−オキソプロリナーゼであるＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０の酵素の諸性質を、下記のように調べた。また、参照酵素として、公知の５−オキソプロリナーゼである酵母由来ＹＫＬ２１５ｃについても、同様に酵素の諸性質を調べた。それらの結果は、表２に示す通りである。【０１７２】
なお、各５−オキソプロリナーゼは、特に記載しない限り、実施例１のＡ．の７．に記載の方法により得られたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６、およびＡｓ４．８２０）、および実施例１のＢ．の３．に記載の方法により得られた酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃを用いた。
【表２】
2014126186.tif 000006
【０１７３】
（１）ＡＴＰ要求性
上述の実施例１のＣ．の２．において、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０は、ＡＴＰ、１価カチオンであるカリウムイオン、および２価カチオンであるマグネシウムイオンの存在下で、５−オキソプロリナーゼ活性を持つことがわかった。そこで、ＡＴＰがＬ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を触媒するために必要な補助因子であるのかどうかを調べた。【０１７４】
具体的には、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じて、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕に加えて、ＡＴＰを含まない基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕を用い、前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０）溶液との反応を行った。該反応液中のＬ−グルタミン酸の濃度を測定し、得られたＬ−グルタミン酸濃度から実施例１のＣ．の２．記載の式に基づいて、５−オキソプロリナーゼの活性を計算した。酵素活性の単位は、本試験の条件下で１分間に1μｍｏｌのＬ−グルタミン酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定義した。【０１７５】
各アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼについて、ＡＴＰの存在、あるいは非存在下でＬ−ピログルタミン酸との反応を行い、上記活性測定法に基づいて算出した５−オキソプロリナーゼの活性を表３に示す。その結果、ＡＴＰ存在下では５−オキソプロリナーゼ活性が検出されたが、ＡＴＰ非存在下では、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０のどちらも、５−オキソプロリナーゼ活性は検出されなかった。【０１７６】
このことから、本発明の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０はＡＴＰ要求性の５−オキソプロリナーゼであることがわかった。
【表３】
2014126186.tif 000007
【０１７７】
（２）１価カチオン、２価カチオン要求性
上述の実施例１のＣ．の２．において、本発明の５−オキソプロリナーゼであるＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０は、ＡＴＰ、１価カチオンであるカリウムイオン、および２価カチオンであるマグネシウムイオンの存在下で、５−オキソプロリナーゼ活性を持つことがわかった。そこで、１価カチオン、および２価カチオンがＬ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を触媒するために必要な補助因子であるのかどうかを調べた。【０１７８】
具体的には、まず、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕、カリウムイオンを含まない基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０〕、およびマグネシウムイオンを含まない基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕を調製した。次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０）溶液を調製した。前記３種類の基質溶液０．０８ｍＬと、前記２種類の酵素溶液０．０２ｍＬとを、それぞれを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じ、該酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、５−オキソプロリナーゼの活性を計算した。【０１７９】
各アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼについて、ＡＴＰの存在、あるいは非存在下でＬ−ピログルタミン酸との反応を行い、上記活性測定法に基づいて算出した５−オキソプロリナーゼの活性を表４に示した。その結果、カリウムイオンとマグネシウムイオンの両者の存在下では５−オキソプロリナーゼ活性が検出されたが、カリウムイオン非存在下、あるいはマグネシウムイオン非存在下では、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０のどちらも、５−オキソプロリナーゼ活性は検出されなかった。【０１８０】
このことから、本発明の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０は、１価カチオン要求性、かつ２価カチオン要求性の５−オキソプロリナーゼであることがわかった。
【表４】
2014126186.tif 000008
【０１８１】
次いで、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０によるＬ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を触媒することのできる、１価カチオン、および２価カチオンの種類を調べた。【０１８２】
１価カチオンの種類の検討では、１価カチオンを含まない基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＫＣｌを含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕、ＮＨ４Ｃｌを含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１８７．５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ８．０〕、ＣｓＣｌを含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１８７．５ｍＭ  ＣｓＣｌ、ｐＨ８．０〕、ＬｉＣｌを含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１８７．５ｍＭ  ＬｉＣｌ、ｐＨ８．０〕、ＮａＣｌを含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１８７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０〕をそれぞれ調製した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０）溶液を調製し、それぞれ０．０２ｍＬと、前記６種類の基質溶液０．０８ｍＬとを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。参照として、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で３００μｇ／ｍＬに希釈した前記の酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ溶液０．０２ｍＬと、前記６種類の基質溶液０．０８ｍＬとを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じ、該酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、酵素の活性の有無を調べた。【０１８３】
その結果、図７で示す通り、添加することによって、Ａｓ４．８０６（図中白地に黒の斜線のバー）およびＡｓ４．８２０（図中黒のバー）の５−オキソプロリナーゼ活性が検出される１価カチオンが複数確認された。カリウムイオンの他にも、アンモニウムイオン、セシウムイオンなどを添加した場合に、活性が検出された。特に、アンモニウムイオンを添加することにより比較的高い活性が検出された。参照酵素であるＹＫＬ２１５ｃ（図中白のバー）では、アンモニウムイオンおよびセシウムイオンを添加した場合に、活性が検出された。各カチオンの濃度検討を行うことにより、５−オキソプロリナーゼによるＬ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を触媒することができる１価カチオンを、カリウムイオン以外にも選択できると考えられる。【０１８４】
２価カチオンの種類の検討では、２価カチオンを含まない基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕、ＭｇＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＣｏＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＣｏＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＭｎＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＭｎＳＯ４、ｐＨ８．０〕、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯＨ）２、ｐＨ８．０〕、ＦｅＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＦｅＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＮｉＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＮｉＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＣｕＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＣｕＳＯ４、ｐＨ８．０〕、ＺｎＳＯ４を含む基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．６２５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、１２．５ｍＭ  ＺｎＳＯ４、ｐＨ８．０〕をそれぞれ調製した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０）溶液を調製し、それぞれ０．０２ｍＬと、前記９種類の基質溶液０．０８ｍＬとを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。【０１８５】
参照として、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３００μｇ／ｍＬに希釈した前記の酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ溶液０．０２ｍＬと、前記９種類の基質溶液０．０８ｍＬとを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。前記の反応液を１００℃、３分間加熱して酵素反応を停止後、該反応液に１Ｍ  ＨＣｌを５μＬ加えて混合し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた、限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後のアミノ酸をニンヒドリンによるポストラベル法で検出した。Ｌ−グルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を算出し、酵素の活性の有無を調べた。【０１８６】
その結果、図８で示す通り、添加することによって、Ａｓ４．８０６（図中白地に黒の斜線のバー）およびＡｓ４．８２０（図中黒のバー）の５−オキソプロリナーゼ活性が検出される２価カチオンが複数確認された。マグネシウムイオンの他にも、マンガンイオン、または鉄イオンなどを添加した場合に、比較的高い活性が検出された。参照酵素であるＹＫＬ２１５ｃ（図中白のバー）では、コバルトイオン、マンガンイオン、鉄イオンまたはニッケルイオンを添加した場合に、活性が検出された。各カチオンの濃度検討を行うことにより、５−オキソプロリナーゼによるＬ−ピログルタミン酸からＬ−グルタミン酸への反応を触媒することができる２価カチオンを、マグネシウムイオン以外にも選択できると考えられる。【０１８７】
（３）至適ｐＨ
本発明の５−オキソプロリナーゼであるＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０における至適ｐＨを調べた。結果を図１に示す。【０１８８】
具体的には、５５．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、９．０、図中黒丸印でプロット）、５５．６ｍＭ  クエン酸−ＮａＯＨ緩衝液バッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、図中黒四角印でプロット）、５５．６ｍＭ  リン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、図中白抜き三角印でプロット）、５５．６ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、図中×印でプロット）、５５．６ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０、Ｈ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、図中白抜き斜め四角印でプロット）、５５．６ｍＭ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、図中白抜き四角印でプロット）、５５．６ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．０、図中米印でプロット）でｐＨ調整した基質溶液（０．５５６ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、５．５６ｍＭ  ＡＴＰ、１１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６６．７ｍＭ  ＫＣｌを含む）０．０９ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で４００μｇ／ｍＬに希釈した前記の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０）溶液０．０１ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。【０１８９】
参照として、前記のｐＨの異なる緩衝液で調製した基質溶液０．０９ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）緩衝液で６００μｇ／ｍＬに希釈した前記の酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ溶液０．０１ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じ、酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、最もＬ−グルタミン酸濃度が高いｐＨにおける測定値を１００とし、相対活性を比較した。【０１９０】
その結果、上記の本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０は、ｐＨ７．０もしくはｐＨ８．０において最も高い活性を示し、ｐＨ７．０−８．０に至適ｐＨを有していた。個別にみると、Ａｓ４．８０６の相対活性が最も高かったのはｐＨ７．０においてであり、その周辺域として、ｐＨ７．０−９．０の範囲で最大相対活性値の７０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。【０１９１】
また、Ａｓ４．８２０の相対活性が最も高かったのはｐＨ８．０においてであり、その周辺域として、ｐＨ７．０−９．０の範囲で最大相対活性値の７０％以上を示したことから、この範囲で好適に使用できると考えられた。【０１９２】
一方、公知の酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃの相対活性が最も高かったのはｐＨ１０．０においてであり、ｐＨ９．５以下、およびｐＨ１０．５以上では、最大相対活性値の７０％以下の活性となった。さらに、アスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０が好適に使用できるｐＨ７．０−８．０の範囲では、最大相対活性値の４０％以下の活性しか示さなかった。以上より、本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼは、公知の酵素と比較して、中性領域での実用に適していると考えられた。【０１９３】
（４）ｐＨ安定性
本発明の５−オキソプロリナーゼであるＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０について、ｐＨ４．０〜１１．０の範囲におけるｐＨ安定性を調べた。結果を図２に示す。【０１９４】
具体的には、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、９．０、図中黒丸印でプロット）、１００ｍＭ  クエン酸−ＮａＯＨ緩衝液バッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、図中黒四角印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、図中白抜き三角印でプロット）、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、図中×印でプロット）、１００ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０、Ｈ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１０．５、図中白抜き斜め四角印でプロット）、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、図中白抜き四角印でプロット）、１００ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．０、図中米印でプロット）０．０１５ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で６００μｇ／ｍＬに希釈した前記のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０）溶液０．０１５ｍＬを、それぞれを混合し、４℃で１６時間保存した。該Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０を４℃で保存した溶液０．０１ｍＬと基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５５６ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、５．５６ｍＭ  ＡＴＰ、１１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６６．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０９ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。【０１９５】
参照として、前記のｐＨの異なる各種１００ｍＭの緩衝液０．０１５ｍＬと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２００μｇ／ｍＬに希釈した前記の酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ溶液０．０１５ｍＬを、それぞれを混合し、４℃で１６時間保存した。該ＹＫＬ２１５ｃを４℃で保存した溶液０．０１ｍＬと基質溶液〔５０ｍＭ  ＣＨＥＳ、０．５５６ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、５．５６ｍＭ  ＡＴＰ、１１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６６．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ１０．０〕０．０９ｍＬを混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。前記の酵素反応させた溶液は、１００℃、３分間加熱して酵素反応を停止後、遠心した（１５，０００×ｇ、１０分間）上清をＬ−グルタミン酸の測定用の検体として得た。該Ｌ−グルタミン酸測定用の検体は、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じ、酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、最もＬ−グルタミン酸濃度が高いｐＨにおける測定値を１００とし、相対活性を比較した。【０１９６】
その結果、上記の本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０は、４℃、１６時間処理後に、ｐＨ６．０〜９．０の範囲で最大相対活性値の７０％以上の残存活性を示したことから、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼの安定ｐＨ範囲は、ｐＨ６．０〜９．０であると考えらえた。また、ｐＨ５．０以下およびｐＨ１１．０以上で保存した場合には、ほぼ完全に失活することがわかった。【０１９７】
なお、参照酵素である酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃは、ｐＨ９．０〜１０．０の範囲で最大相対活性値の７０％以上の残存活性を示したことから、酵母由来５−オキソプロリナーゼの安定ｐＨ範囲は、ｐＨ９．０〜１０．０であると考えられた。【０１９８】
以上より、本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼの安定ｐＨ範囲は、弱酸性領域から弱アルカリ性に渡っており、公知の酵素ＹＫＬ２１５ｃよりも中性〜酸性域を含む広範のｐＨ範囲での安定性が高いことがわかった。【０１９９】
（５）至適温度
至適温度の決定では、実施例１のＣ．の２．に記載の５−オキソプロリナーゼ活性検出反応液を、４、１５、２５、３７、４５、５５、６５℃で１時間インキュベートし、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じ、Ｌ−グルタミン酸濃度を測定した。最もＬ−グルタミン酸濃度が高い温度における測定値を１００とし、相対活性を比較した。【０２００】
図９に示すとおり、本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６（図中白抜き三角印でプロット）およびＡｓ４．８２０（図中白抜き四角印でプロット）では、３７℃付近で最大相対活性を示し、２５℃以下および４５℃以上では最大相対活性の８０％以下を示したことから、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０の至適温度は３７℃付近であると考えられた。【０２０１】
なお、酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ（図中×印でプロット）では、４５℃付近で最大相対活性を、３７℃付近で最大相対活性の９０％の活性を示した。２５℃以下および５５℃以上では最大相対活性の８０％以下を示した。よって、ＹＫＬ２１５ｃの至適温度は４５℃付近であると考えられた。【０２０２】
（６）温度安定性
温度安定性の検討では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した本発明の５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６またはＡｓ４．８２０）溶液０．０３ｍＬを、４、３７、４５、５０、５５、６０、６５、７０℃で１５分間インキュベートした後、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．７１４ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、７．１４ｍＭ  ＡＴＰ、１４．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２１４．３ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕０．０７ｍＬと混合し、３７℃で１時間の酵素反応を行った。実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じ、酵素反応後の溶液中のＬ−グルタミン酸濃度を測定し、熱処理せずに４℃で保存した酵素の反応液における測定値を１００とし、相対活性を比較した。【０２０３】
図１０に示す通り、上記の本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６（図中白抜き三角印でプロット）は、３７℃、１５分間の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約３７℃まで安定であることがわかった。【０２０４】
本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８２０（図中白抜き四角印でプロット）では、４５℃の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約４５℃まで安定であることがわかった。また、酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃ（図中×印でプロット）では、４５℃の熱処理後に８０％以上の残存活性を有しており、約４５℃まで安定であることがわかった。【０２０５】
以上より、Ａｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０において、反応至適温度である３７℃においては活性の低下は検出されず、安定的に酵素反応を行うことができることがわかった。【０２０６】
（７）Ｌ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値
基質であるＬ−ピログルタミン酸に対する本酵素の親和性を調べるために、前記、実施例１のＣ．の２．記載の活性測定法において、基質であるＬ−ピログルタミン酸濃度を変化させて活性測定を行い、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  Ｐｌｏｔを用いて、ミカエリス定数（Ｋｍ）を算定した。【０２０７】
その結果、本発明の５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６のＬ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値は９３μＭ、Ａｓ４．８２０のＬ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値は７６μＭであった。【０２０８】
これに対し、酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃのＬ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値は５１３μＭであった。【０２０９】
すなわち、本発明の５−オキソプロリナーゼは、公知の酵母５−オキソプロリナーゼよりもＫｍ値が数〜６倍低く、親和性の高い酵素であることを示しており、より効率的に基質との反応を進行させることができることが期待される。【０２１０】
（８）基質特異性
本発明の５−オキソプロリナーゼであるＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０がＬ−ピログルタミン酸に特異的に反応して加水分解するのに対し、Ｄ−ピログルタミン酸を基質とはしないことを確認した。基質特異性の決定では、グルタミン酸の生成とピログルタミン酸の減少により、５−オキソプロリナーゼ活性の有無を決定した。【０２１１】
具体的には、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じて、基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕、およびＬ−ピログルタミン酸をＤ−ピログルタミン酸に変えた基質溶液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  Ｄ−ピログルタミン酸（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製、製造番号１５６４６１）、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕を調製した。次に、実施例５の２．記載の方法に準じて取得した小麦ふすまで生産したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄ溶液（後述、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて７．６８ｕｎｉｔ／１２００μｇ／ｍＬに希釈）、および実施例３の２．記載の方法に準じて取得した酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＳＣ−Ａｓ４．８２０溶液（後述、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１２．７５ｕｎｉｔ／１５００μｇ／ｍＬに希釈）を調製した。前記２種類の基質溶液０．２８ｍＬと、前記２種類の酵素溶液０．０７ｍＬとをそれぞれを混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２１２】
また、参照として、前記２種類の基質溶液０．２８ｍＬと酵素を含まない１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）０．０７ｍＬとをそれぞれを混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２１３】
反応後、該反応液０．０４ｍＬに０．０２２Ｍ  ＨＣｌを３６０μＬ加えて混合し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後のアミノ酸をニンヒドリンによるポストラベル法で検出した。グルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のグルタミン酸濃度を算出し、酵素の活性の有無を調べた。【０２１４】
続いて、該反応液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後の有機酸をブロモチモールブルーによるポストラベル法で検出した。ピログルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のピログルタミン酸濃度を算出し、ピログルタミン酸濃度の減少の有無を調べた。結果を図１１に示す。【０２１５】
図１１で示すように、Ｌ−ピログルタミン酸とＡｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄを反応させたとき、あるいはＬ−ピログルタミン酸とＳＣ−Ａｓ４．８２０を反応させたときに反応液中のグルタミン酸濃度が上昇し（図中上段、黒のバー）、ピログルタミン酸濃度が減少した（図中下段、黒のバー）。一方で、Ｄ−ピログルタミン酸とそれぞれの５−オキソプロリナーゼを反応させたときにはグルタミン酸濃度はほとんど変化せず（図中上段、白地に黒の斜線のバー）、ピログルタミン酸の減少も見られなかった（図中下段、白地に黒の斜線のバー）。【０２１６】
これにより、５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６、及びＡｓ４．８２０はＬ−ピログルタミン酸を基質とし、Ｄ−ピログルタミン酸を基質としないことが示された。【０２１７】
上述のように本発明の５−オキソプロリナーゼは、至適ｐＨが公知の５−オキソプロリナーゼと異なることから、異なる用途、使用場面を提供し、特に、アルカリ性に偏った至適ｐＨやｐＨ安定性を有する公知酵素では効果を上げにくかった弱酸性〜中性〜弱アルカリ性条件下の使用において特に優れている。例えば、そのようなｐＨ条件下での使用の例としては、各種食品加工の実際の使用工程中等を想定することができ、それ以外にも、公知酵素では好適に使用できなかった新たな使用場面を提供することが期待される。【０２１８】
また、本発明の５−オキソプロリナーゼは、試薬あるいは食品加工等の用途に利用する場合に、試験環境のｐＨが変化したときの影響を受けにくく、その取扱いが容易で利用しやすいと考えられることから、公知の５−オキソプロリナーゼよりも優れているといえる。このような特性により汎用性が広がることから、公知の５−オキソプロリナーゼでは使用しにくかった用途・使用工程に対しでも好適に使用することができ、５−オキソプロリナーゼの実用化のバリエーション化に貢献するものであるといえる。【０２１９】
さらに、本発明の５−オキソプロリナーゼは、Ｌ−ピログルタミン酸に対するＫｍ値は小さく、より効率的に反応を触媒でき、反応時間の短縮や酵素の使用量低減も期待できる利点を有する。
【実施例３】
【０２２０】
（アスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼの酵母による生産）
実施例１のＣ．の２．で取得した本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０を、異種宿主である酵母を宿主としても生産できることを確認すること、さらに、上述の実施例においては活性を確認できなかったアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補Ａｓ３６．１３０２について、酵母を宿主とすることにより活性を持ったタンパク質を取得することについて、確認を行った。【０２２１】
１．アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の酵母発現用プラスミドの作製と酵母形質転換体の取得
実施例１のＡ．の５．で取得した５−オキソプロリナーゼオルソログ遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０）、および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）のイントロン予測配列を除いた配列を導入したプラスミドｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ＣＤＳから、ＰＣＲにより増幅した各遺伝子のＤＮＡ断片をｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入することにより、酵母発現用プラスミドを得た。【０２２２】
具体的には、ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ＣＤＳを鋳型とし、配列番号４９および５０に示したプライマーを用いて、５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列およびヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列、３’側に制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を付加したｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のＣＤＳのＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。ｐＡｓＡｌｐＰ−４．８２０  ＣＤＳを鋳型とし、配列番号５１および５２に示したプライマーを用いて、５’側に制限酵素ＫｐｎＩの認識配列およびヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列、３’側に制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を付加したｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０のＣＤＳのＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。ｐＡｓＡｌｐＰ−３６．１３０２  ＣＤＳを鋳型とし、配列番号５３および５４に示したプライマーを用いて、５’側に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列およびヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列、３’側に制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を付加したｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２のＣＤＳのＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。【０２２３】
反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０２２４】
前記のＰＣＲにより増幅した３種類のＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社製）、ＫｐｎＩ−ＨＦ（ＢｉｏＬａｂｓ社製）、およびＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で切断後、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、再度精製した。精製された前記ＤＮＡ断片を、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイト、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩサイトに連結し、ｐＹＥＳ２／ＣＴのマルチクローニングサイトに５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）のＣＤＳを組み込んだ、３種類の酵母形質転換体作製用の組換えプラスミドを得た。【０２２５】
該組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入されたＤＮＡ配列の解析を行った。解析の結果、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳの配列が、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡ上の配列と一致することを確認した。上記操作を経た３種の遺伝子をそれぞれ含むプラスミドを、由来する遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、ｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−４．８０６、ｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−４．８２０、およびｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−３６．１３０２と名付けた。【０２２６】
前記３種類のプラスミドｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ、およびｐＹＥＳ２−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳを用いて、Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、サッカロマイセス・セレビシエ  ＩＮＶｓｃ１株を形質転換し、ｐＹＥＳ２／ＣＴにコードされたウラシル合成遺伝子であるＵＲＡ３の発現により、ウラシル無添加培地に生育できるようになることで、ウラシル非要求性となることを指標に、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子による酵母形質転換体を選抜した。３種類のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子による酵母形質転換体は、由来する遺伝子の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２に対応させて、それぞれＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株と名付けた。【０２２７】
２．酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼおよびオルソログ候補タンパク質の取得
上記のようにして取得したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子による酵母形質転換体ＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株に導入されたプラスミド中の、５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の上流には、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、酵母形質転換体をガラクトースの存在下で培養することにより、Ｎ末側にヒスチジン８個のタグが融合された５−オキソプロリナーゼおよび５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を発現誘導することができ、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。すなわち、前記のＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＩＮＶｓｃ１−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株を、前培養用液体培地（０．６７％（ｗ／ｖ）  アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース  （ベクトン・ディッキンソン社製）、０．１９２％（ｗ／ｖ）  ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物  （ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）  ラフィノース）中、３０℃で２４時間、振盪培養した。その後、本培養用液体培地（０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ−ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース）で１０倍に希釈し、３０℃で１２〜１８時間培養し、１，５００×ｇ、１〜５分間の遠心により菌体を回収した。【０２２８】
回収した菌体は、培養液の１／１０〜１／２０量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．１  ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁し、直径０．５ｍｍのマルチビーズショッカー用専用グラスビーズ（安井器械社製）を加えて、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて破砕した（２０００ｒｐｍ、６０秒間破砕後、３０秒間静置、これを８回繰り返した）。破砕後の菌体懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、菌体抽出液とした。【０２２９】
その後、この菌体抽出液をＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼおよびＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出されるＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分を得た。【０２３０】
なお、前記３種類のＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてさらに濃縮後、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液を得た。以下、それぞれのＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼおよびＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を、由来する遺伝子の名称（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）に対応して、ＳＣ−Ａｓ４．８０６、ＳＣ−Ａｓ４．８２０、ＳＣ−Ａｓ３６．１３０２と表記する。上記の酵素精製により、培養１００ｍｌあたり、ＳＣ−Ａｓ４．８０６では１０〜２０μｇ、ＳＣ−Ａｓ４．８２０では７５〜４００μｇ、ＳＣ−Ａｓ３６．１３０２では１０〜２０μｇのタンパク質が得られた。【０２３１】
３．酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼの活性確認
上述の実施例３の２．により得られた、酵母で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼタンパク質（ＳＣ−Ａｓ４．８０６およびＳＣ−Ａｓ４．８２０）および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（ＳＣ−Ａｓ３６．１３０２）、実施例１のＢ．の３．により得られた酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃについて、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じて、５−オキソプロリナーゼ活性を測定した。結果を表５に示す。
【表５】
2014126186.tif 000009
【０２３２】
表５に示すように、酵母で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＳＣ−Ａｓ４．８０６、ＳＣ−Ａｓ４．８２０、および酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃは、基質溶液との反応により、５−オキソプロリナーゼ活性が検出された。このことから、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６、Ａｓ４．８２０は、酵母で発現させた場合にも５−オキソプロリナーゼ活性を示し、異種発現した場合にも活性を持って発現可能であることが確認された。【０２３３】
また、酵母で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質ＳＣ−Ａｓ３６．１３０２では、基質溶液との反応によりＬ−グルタミン酸濃度が上昇せず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出されなかった。すなわち、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２は、酵母で発現させた場合にも５−オキソプロリナーゼ活性を示さないことが確認された。
【実施例４】
【０２３４】
（アスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼの大腸菌による生産）
酵母由来５−オキソプロリナーゼＹＫＬ２１５ｃは、大腸菌で発現させることができなかったと報告されている（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．  １０，  ３９４-４０１，  ２０１０）。しかし、麹菌由来ピログルタミン酸開環酵素に関しては不明であり、活性を保持した酵素の大腸菌での発現・大量精製が可能となれば、性能評価に用いる酵素が容易に得られるようになる。実施例１のＣ．の２．で取得した本発明のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６およびＡｓ４．８２０を、異種宿主である大腸菌を宿主としても生産できることについて、確認を行った。【０２３５】
１．アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子の大腸菌発現用プラスミドの作製と大腸菌形質転換体の取得
実施例１のＡ．の５．で取得した、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、およびｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０）のＣＤＳを導入したプラスミドｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳから、ＰＣＲにより増幅した各遺伝子のＤＮＡ断片をｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入することにより、大腸菌発現用プラスミドを得た。【０２３６】
具体的には、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳを鋳型とし、配列番号５９および６０に示したプライマーを用いて、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のＣＤＳのＤＮＡ断片を、ｐＡｓＡｌｐＰ−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳを鋳型とし、配列番号６１および６２に示したプライマーを用いて、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０のＣＤＳのＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。【０２３７】
さらに、プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）を鋳型として、配列番号６３および６４のインバースＰＣＲ用プライマーを用いて、プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）の制限酵素サイトＮｄｅＩとＮｏｔＩで挟まれた領域を除いた配列をＰＣＲにより増幅した。なお、反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０２３８】
前記のＰＣＲにより増幅したそれぞれのＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。２種類の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳの５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したＤＮＡ断片それぞれを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、制限酵素サイトＮｄｅＩとＮｏｔＩで挟まれた領域を除いたプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）に連結することにより、プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＮｄｅＩとＮｏｔＩに挟まれた領域に５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ遺伝子（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、あるいはｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０）のＣＤＳを組み込んだ、２種類の大腸菌形質転換体作製用の組換えプラスミドを得た。【０２３９】
該組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入されたＤＮＡ配列の解析を行った。解析の結果、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のＣＤＳの配列が、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡ上の配列と一致することを確認した。上記操作を経た２種の遺伝子をそれぞれ含むプラスミドを、由来する遺伝子配列の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、およびｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０に対応させて、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ、およびｐＥＴ−２２ｂ（＋）−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳと名付けた。【０２４０】
前記２種類のプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ、およびｐＥＴ−２２ｂ（＋）−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳを用いて、大腸菌ＥＣＯＳ（商標）コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３)株（ニッポンジーン社製）を定法により形質転換し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）にコードされたアンピシリン耐性遺伝子の発現によりアンピシリン添加培地に生育できるようになることを指標に、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子による大腸菌形質転換体を選抜した。各アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子による大腸菌形質転換体は、由来する遺伝子の名称であるｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、およびｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０に対応させて、それぞれＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、およびＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株と名付けた。【０２４１】
２．大腸菌発現アスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼタンパク質の取得
上記のようにして取得したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子による大腸菌形質転換体ＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、およびＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株に導入された、プラスミド中の５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の上流には、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、大腸菌形質転換体をＩＰＴＧの存在下で培養することにより、Ｎ末側にヒスチジン８個のタグが融合された５−オキソプロリナーゼタンパク質を発現誘導することができ、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。すなわち、前記のＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、およびＢＬ２１−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地（１．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトン（ベクトン・ディッキンソン社製）、０．５％（ｗ／ｖ）イーストエキス（ベクトン・ディッキンソン社製）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（和光純薬社製）中、３０℃で一晩、振盪培養した。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地で１００倍に希釈して３．０時間振盪培養し、その後、０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で２．５〜３．０時間、振盪培養した。５，０００×ｇ、３分間の遠心により菌体を回収した。【０２４２】
回収した菌体は液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした後に、培養液の１／１２量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁し、懸濁液の粘度を下げるために、超音波処理を行った。破砕後の菌体懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、菌体抽出液とした。【０２４３】
その後、この菌体抽出液をＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼを結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出されるＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分を得た。【０２４４】
なお、前記２種類のＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてさらに濃縮後、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液を得た。以下、それぞれのＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼを、由来する遺伝子の名称（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、およびｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０）に対応して、ＥＣ−Ａｓ４．８０６、およびＥＣ−Ａｓ４．８２０と表記する。上記の酵素精製により、培養１００ｍｌあたり、ＥＣ−Ａｓ４．８０６では５５μｇ、ＥＣ−Ａｓ４．８２０では６３μｇのタンパクが得られた。【０２４５】
３．大腸菌発現アスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼの活性確認
上述の実施例４の２．により得られた、大腸菌で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼタンパク質（ＥＣ−Ａｓ４．８０６およびＥＣ−Ａｓ４．８２０）について、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じて、５−オキソプロリナーゼ活性を測定した。結果を表６に示す。
【表６】
2014126186.tif 000010
【０２４６】
表６に示すように、大腸菌で発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＥＣ−Ａｓ４．８０６、およびＥＣ−Ａｓ４．８２０は、基質溶液との反応により、５−オキソプロリナーゼ活性が検出された。このことから、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６、およびＡｓ４．８２０は、大腸菌で発現させた場合にも５−オキソプロリナーゼ活性を示し、異種発現した場合にも活性を持って発現可能であることが確認された。また、麹菌由来ピログルタミン酸開環酵素機能を持つためには糖鎖が不要であることも明らかとなり、活性を保持した酵素の大腸菌での発現・大量精製が可能となれば、性能評価に用いる酵素が容易に得られるようになる。【０２４７】
上述のように本発明の５−オキソプロリナーゼは、宿主をアスペルギルス属菌等の糸状菌に限定されることなく、生産することができる。異種発現が可能であることは、発現量増加を目的とした宿主の選択や、酵素の改良時のタンパク質レベルでの確認の際に有利であり、本発明の実用上の有意性に貢献する。
【実施例５】
【０２４８】
（アスペルギルス属菌に発現させたアスペルギルス属菌由来５−オキソプロリナーゼおよび５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の固体培養における生産）
味噌・醤油・日本酒・焼酎などの各種醸造食品の製造では、麹菌を固体培養して麹を作製する。一般的に、固体培養と液体培養とでは、異なる発現パターンを示すことが知られており、酵素の発現量や比活性も液体培養とは異なる可能性があると考えられる。【０２４９】
そこで、実施例１のＡ．の６．で取得した本発明のアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６による形質転換体およびＡｓ４．８２０による形質転換体を、小麦ふすまを用いた固体培養で培養することにより活性を持ったタンパク質を生産できることを確認すること、さらに、実施例１のＣ．の２．においては活性を確認できなかったアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２について、小麦ふすまを用いた固体培養を行うことにより、活性を持ったタンパク質を取得することについて確認を行った。【０２５０】
１．小麦ふすま培養物からのアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼおよび５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質の取得
実施例１のＡ．の６．で取得したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株のゲノムＤＮＡに導入された、５−オキソプロリナーゼ遺伝子および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の上流には、ヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、アスペルギルス属菌形質転換体を培養することによりＮ末側にヒスチジン８個のタグが融合された５−オキソプロリナーゼおよび５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を発現誘導することができ、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。【０２５１】
まず、小麦ふすま１０ｇに対して水８ｍＬを加え、１５０ｍＬ 三角フラスコに５ｇずつ入れてオートクレーブすることにより、８０％散水小麦ふすま固体培地を作製した。次に、実施例１のＡ．の６．で取得したＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８０６  ＣＤＳ株、ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−４．８２０  ＣＤＳ株、およびＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−３６．１３０２  ＣＤＳ株の分生子５×１０６個を、前述の８０％散水小麦ふすま固体培地に培養し、３０℃で培養した。菌糸が伸びてきた頃に手入れをし、再び培養した。菌糸の伸長が進んでおり、分生子はほとんど存在しない形態を示した４２時間培養した培養物を回収し、液体窒素で凍結した。【０２５２】
回収した小麦ふすま培養物１ｇを、液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて磨砕して得た細かい粉末状の菌体片を、１０ｍＬの２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、小麦ふすま培養物抽出液とした。【０２５３】
その後、この小麦ふすま培養物抽出液をＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼおよびＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出されるＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分を得た。【０２５４】
なお、前記３種類のＨｉｓタグ融合タンパク質含有画分は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてさらに濃縮後、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液を得た。以下、それぞれのＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼタンパク質およびＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を、由来する遺伝子の名称（ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６、ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８２０、およびｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６．１３０２）に対応して、Ａｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄ、Ａｓ４．８２０−ｓｏｌｉｄ、Ａｓ３６．１３０２−ｓｏｌｉｄと表記する。上記の酵素精製により、培養１００ｍｌあたり、Ａｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄでは４３μｇ、Ａｓ４．８２０−ｓｏｌｉｄでは５７μｇ、Ａｓ３６．１３０２−ｓｏｌｉｄでは４７μｇのタンパク質が得られた。【０２５５】
２．上述の実施例５の１．により得られた、小麦ふすま培養物から精製したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼおよび５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質の活性確認
上述の実施例５の１．により得られた、小麦ふすま培養物から精製したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼ（Ａｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄおよびＡｓ４．８２０−ｓｏｌｉｄ）および５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質（Ａｓ３６．１３０２−ｓｏｌｉｄ）について、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じて、５−オキソプロリナーゼ活性を測定した。結果を表７に示す。
【表７】
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【０２５６】
表７に示すように、小麦ふすま培養物から精製したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼタンパク質Ａｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄ、およびＡｓ４．８２０−ｓｏｌｉｄは、基質溶液との反応によりグルタミン酸濃度が上昇した。このことから、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６、およびＡｓ４．８２０は、小麦ふすまで発現させた場合にも５−オキソプロリナーゼ活性を示し、活性を持って生産可能であることが確認された。【０２５７】
また、小麦ふすまで発現させたアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２−ｓｏｌｉｄでは、基質溶液との反応によりＬ−グルタミン酸濃度が上昇せず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出されなかった。すなわち、アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質Ａｓ３６．１３０２は、小麦ふすまで発現させた場合にも５−オキソプロリナーゼ活性を示さないことが確認された。【０２５８】
さらに、小麦ふすまで生産したアスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８０６−ｓｏｌｉｄは、液体培養時の数倍以上に高い活性を保ったまま発現させることができることが示され、固体培養時に効率的にグルタミン酸の生産が可能であることが示唆された。
【実施例６】
【０２５９】
（アスペルギルス・オリゼからの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の取得）
１．アスペルギルス・オリゼにおける５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子の検索
アスペルギルス・ソーヤの５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８２０のタンパク質の配列データを用い、それらと比較的配列同一性の高い遺伝子を、アスペルギルス・オリゼから探索することを試みた。検索にはＢｌａｓｔプログラム（ｔｂｌａｓｔｎ）を用いた。アスペルギルス・オリゼのＤＮＡデータとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）  ＲＩＢ４０株のゲノム配列（独立行政法人  製品評価技術基盤機構のデータベース：ＤＯＧＡＮ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（７０７１）,１１５７−１１６１，２００５）を用いた。【０２６０】
検索の結果、比較的遺伝子配列同一性が高かった配列領域として、配列番号６５で示す遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３（３８４３ｂｐ）がみつかった。ＡＯ０９０１０３０００４４３のＤＮＡ配列から予想されるオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を配列番号６６に示す。【０２６１】
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０．６（ゼネティックス社製）によりアミノ酸レベルでの配列同一性の比較を行うと、ＡＯ０９０１０３０００４４３とアスペルギルス・ソーヤの５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８２０との配列同一性は９９．０％であり、アスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログであることが示唆された。また、ＡＯ０９０１０３０００４４３とラット５−オキソプロリナーゼとの配列同一性は５５．０％、酵母由来５−オキソプロリナーゼであるＯＸＰ／ＹＫＬ２１５ｃとの配列同一性は５４．１％であった。これは実施例１のＣ．の２．で５−オキソプロリナーゼ活性のあることが示されたアスペルギルス・ソーヤの５−オキソプロリナーゼＡｓ４．８２０とラット５−オキソプロリナーゼとの配列同一性５１．５％、およびＡｓ４．８２０と酵母オルソログ５−オキソプロリナーゼとの配列同一性５１．１％と同程度であることからも、ＡＯ０９０１０３０００４４３がアスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログであることが示唆された。【０２６２】
そこで、ＡＯ０９０１０３０００４４３のＤＮＡ配列情報を利用して、ＡＯ０９０１０３０００４４３にコードされるタンパク質の５−オキソプロリナーゼ活性の有無を確認する実験を進めた。【０２６３】
２．アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）からのゲノムＤＮＡ抽出
アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０株をバッフル付き三角フラスコにて、ＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）中、３０℃で１〜２日間振盪培養し、濾過により菌体を回収した。回収して得た菌体を、液体窒素中で凍結させ乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした。【０２６４】
６５℃に温めたＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  ３００μＬにスパーテル１杯程度の前記粉末状の菌体片を加え、ボルテックスした後、６５℃で１５分間、インキュベートした。次いで、５０μｇ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｅ（ニッポンジーン社製）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  １２５μＬを加え、２０秒間、激しくボルテックスし、１４，０００×ｇで５分間遠心した。得られた上清をイソプロパノール３００μＬと混合し、１１，０００×ｇで３分間遠心して得た沈殿を、７０％エタノールでリンスすることにより、アスペルギルス・オリゼ  ＲＩＢ４０株由来のゲノムＤＮＡを回収した。このゲノムＤＮＡにＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、５０℃、５分間インキュベートして溶解することにより、所望の濃度のゲノムＤＮＡ溶液を調製した。【０２６５】
３．アスペルギルス・オリゼにおける５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子のクローニングとアスペルギルス属菌用発現ベクターの作製
上述のアスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３のエクソン−イントロン構造を予測すると、アスペルギルス・ソーヤの５−オキソプロリナーゼオルソログ遺伝子と同様に、２つのエクソンと１つのイントロンが存在すると考えられた。具体的には、配列番号６７で示したの３８９９塩基のうち２５２４番から２５７９番がイントロンであると予測され、スプライシングにより配列番号６５のＣＤＳが生成されると予想された。本実験では、予測されたイントロンの配列を除去せずに配列番号６７で示されるｐｒｅ  ｍＲＮＡの配列を次の操作に用いた。【０２６６】
実験６の２．により取得したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号６８および６９のプライマーを用いて、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したアスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３のｐｒｅ  ｍＲＮＡの配列をＰＣＲにより増幅した。反応試薬としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。前記のＰＣＲにより増幅したヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したＡＯ０９０１０３０００４４３のｐｒｅ  ｍＲＮＡと考えられるＤＮＡ断片は、１％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。また、クローニング用のベクターとして、実施例１のＡ．の４．で作製した組換えプラスミドｐＡｓＡｌｐＰ−４．８０６  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ（ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ｓｃａｆｆｏｌｄ００００４．８０６のｐｒｅ  ｍＲＮＡ、およびＴａｌｐの配列が順に連結された組換えプラスミド）を鋳型とし、配列番号１３および２３のインバースＰＣＲ用のプライマーを用いて５‘側にＴａｌｐ、３’側にＰａｌｐ、ｐｙｒＧおよびＰｔｅｆ１を含むプラスミド側の配列をＰＣＲにより増幅した。次いでＤＮＡ断片を１％アガロースゲル中で分離、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。【０２６７】
上記のようにして取得した２種類のＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、５’側にヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列を付加したアスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡのＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片を、プラスミドｐＡｓＡｌｐＰのＰｔｅｆ１領域およびＴａｌｐ領域の間に連結し、麹菌形質転換体作製用の組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドは、由来する遺伝子の名称であるＡＯ０９０１０３０００４４３に対応させて、ｐＡｓＡｌｐＰ-ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡと名付けた。【０２６８】
この組換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を定法により形質転換後、該形質転換体から前記組換えプラスミドをそれぞれ抽出し、該プラスミド中に挿入された各ＤＮＡ配列の解析を行った。解析の結果、前記の５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡのＤＮＡ断片と考えられるＤＮＡ断片は、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡに存在するＡＯ０９０１０３０００４４３の配列（配列番号６７）と一致することを確認した。【０２６９】
４．アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のアスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子による形質転換体の取得
上記のように作製したｐＡｓＡｌｐＰ-ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡを鋳型として、配列番４１および４０のプライマーを用い、Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。なお、反応試薬としてＫＯＤ  Ｄａｓｈ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、装置としてＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、反応試薬キットに添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。【０２７０】
上記ように増幅したＤＮＡ断片（Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片）は、エタノール沈殿後、ＴＥに溶解して、所望の濃度のＤＮＡ溶液を調製し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。【０２７１】
まず、形質転換に用いるアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株（マルツプレートに培養したアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子、９ｃｍシャーレに１０分の１程度）を、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０溶液に懸濁し、１０ｍＭとなるようにウリジンを添加したＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）１５０ｍＬに植菌し、１８時間程度、振盪培養した。培養後、濾過により菌体を回収し、形質転換用にＰＣＲにより増幅しておいたＤＮＡ断片（Ｐａｌｐ、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ、およびＴａｌｐが連結されたＤＮＡ断片）のＴＥ溶液（ＤＮＡ１０μｇ程度／２０μＬ）を用いて、プロトプラスト−ＰＥＧ法により、形質転換を行った。【０２７２】
得られた各形質転換体においては、ＮＢＲＣ４２３９株のアルカリプロテアーゼ遺伝子座にｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、およびＨｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡが連結された配列がそれぞれ導入される。これらの株は、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株を選択できる。【０２７３】
さらに、該形質転換体について、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子座に遺伝子導入された株であることの確認を行なった。すなわち、爪楊枝で掻きとった該形質転換体の分生子をＴＥに懸濁してＰＣＲの鋳型とし、配列番号４３および４４のプライマーを用い、アルカリプロテアーゼ遺伝子座の上流２３７塩基目から下流２７７塩基目に挟まれた領域をＰＣＲにより増幅した。反応試薬には、ＫＯＤ  ＦＸ  （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９４℃、５分間の熱処理後、添付されたプロトコールに従って伸長反応を行った。その結果、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株のゲノムＤＮＡのアルカリプロテアーゼ遺伝子座のアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ、１３８９ｂｐ、配列番号４５）に換えて、形質転換体株では、ｐｙｒＧ、Ｐｔｅｆ１、Ｈｉｓタグ配列を付加した５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡが連結されたＤＮＡ（約６．６ｋｂｐ）の存在を示す約７ｋｂｐのシグナルが検出されたことにより、前記の形質転換体ではアルカリプロテアーゼ遺伝子座において相同組換えされたことを確認した。【０２７４】
上記の方法により、アスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子に由来する遺伝子による形質転換体（アスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体）を取得することができた。該形質転換体は、由来する遺伝子の名称ＡＯ０９０１０３０００４４３に対応させて、ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ株と名付けた。【０２７５】
５．アスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質の取得
上記のようにして取得したアスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体のゲノムＤＮＡに導入された、５−オキソプロリナーゼ候補遺伝子の上流にはヒスチジン８個の配列をコードする２４塩基の配列が付加されており、アスペルギルス属菌形質転換体を培養することにより、Ｎ末側にヒスチジン８個のタグが融合された５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質を発現させることができる。【０２７６】
該Ｎ末Ｈｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質は、定法によりＮｉカラムを用いて精製することができる。すなわち、アスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補遺伝子によるアスペルギルス属菌形質転換体（ＮＢＲＣ４２３９−Ｈｉｓ−ＡＯ０９０１０３０００４４３  ｐｒｅ  ｍＲＮＡ株）の分生子を、ＰＤ培地（２％（ｗ／ｖ）  デキストリン、１％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）  カザミノ酸）に１×１０５個／ｍＬとなるように植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍで、２日間培養し、濾過により菌体を回収した。【０２７７】
回収した菌体を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒を用いて磨砕して得た細かい粉末状の菌体片を、培養液の１／１３量の２ｍＭ  ＰＭＳＦを含む抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）  グリセロール、０．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液の遠心上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、菌体抽出液（粗酵素溶液）とした。【０２７８】
その後、この菌体抽出液の一部を、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に供してＨｉｓタグ融合５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質を結合させ、イミダゾール２０ｍＭを含む抽出バッファーで洗浄後、イミダゾール２５０ｍＭを含む抽出バッファーで溶出された５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分を得た。なお、必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、前記５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分をさらに濃縮した。５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質含有画分は、抽出バッファーに対して透析を行い、精製酵素溶液とした。【０２７９】
上記の酵素の精製操作により、培養１００ｍＬあたり２８３μｇの５−オキソプロリナーゼオルソログ候補タンパク質が得られた。【０２８０】
６．アスペルギルス属菌で発現させたアスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質の活性確認
上述の実施例６の５．により得られたアスペルギルス・オリゼ由来５−オキソプロリナーゼ候補タンパク質について、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じて、５−オキソプロリナーゼ活性を測定した。タンパク質添加量とＬ−グルタミン酸濃度の関係は図１２に示す通りであった。【０２８１】
図１２に示すように、添加したＡＯ０９０１０３０００４４３タンパク質の濃度依存的にＬ−グルタミン酸濃度が上昇し、アスペルギルス・オリゼの５−オキソプロリナーゼオルソログであることが判明した。【０２８２】
このことから、アスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼはアスペルギルス・ソーヤに限定されることなく、相同性の高い分子がアスペルギルス属菌に広く存在することが示された。
【実施例７】
【０２８３】
本発明の５−オキソプロリナーゼを飲食品の加工に用いることにより、飲食品のうま味向上に使用できると考えられる。すなわち、ピログルタミン酸を多く含んだ飲食品中で、５−オキソプロリナーゼによりピログルタミン酸を加水分解処理すると、呈味成分として重要なグルタミン酸を大量に遊離でき、従来にない優れた呈味力を有する飲食品を得ることができると予想される。【０２８４】
そこで、以下の手順に従って、ピログルタミン酸含量が高い食品であるトマトエキス、およびしょうゆをアスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼで処理することにより、グルタミン酸濃度を上昇させる効果を調べた。【０２８５】
（Ａ．アスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼによるトマトエキス中のグルタミン酸量の増加）
トマトエキス（ライコレッド社製、Ｂｒｉｘ  ６０％）はミリＱ水で希釈し、１Ｍ  ＫＯＨによりｐＨ８に調整した。反応に用いた５−オキソプロリナーゼは、実施例３の２．記載の方法に準じて取得した酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＳＣ−Ａｓ４．８２０を、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じて５−オキソプロリナーゼの活性を測定し、トマトエキスとの反応液に用いた。【０２８６】
具体的には、トマトエキス希釈液〔８倍希釈したマトエキス、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０〕０．１６ｍＬと、実施例３の２．記載の方法に準じて取得した５−オキソプロリナーゼオルソログタンパク質ＳＣ−Ａｓ４．８２０溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１０．６ｕｎｉｔ／１２００μｇ／ｍＬに希釈）０．０４ｍＬをそれぞれ混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２８７】
また、参照として、トマトエキス希釈液〔８倍希釈したマトエキス、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０〕０．１６ｍＬと、前記５−オキソプロリナーゼオルソログタンパク質溶液の代わりに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１２００μｇ／ｍＬに希釈）、あるいは実施例１のＡ．の７．記載の方法に準じて取得したＡｓ３６．１３０２溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、１２００μｇ／ｍＬに希釈）０．０４ｍＬをそれぞれ混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２８８】
反応後、前記の反応液にミリＱ水を０．４ｍＬ加えて３倍希釈液を調製した。該希釈液は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後の有機酸をブロモチモールブルーによるポストラベル法で検出した。ピログルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のピログルタミン酸濃度を算出し、ピログルタミン酸濃度の減少の有無を調べた。続いて、該希釈液０．１２ｍＬに０．０３Ｍ  ＨＣｌを０．２８ｍＬ加えて混合し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた限外濾過により除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後のアミノ酸をニンヒドリンによるポストラベル法で検出した。グルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のグルタミン酸濃度を算出し、酵素の活性の有無を調べた。【０２８９】
その結果、図１３で示す通り、希釈したトマトエキスにＳＣ−Ａｓ４．８２０を添加することによって反応液中のグルタミン酸濃度が上昇し（図中白のバー）で、ピログルタミン酸濃度が減少した（図中白地に黒の斜線のバー）。【０２９０】
一方で、ＳＣ−Ａｓ４．８２０の代わりに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、ＢＳＡ溶液、および実施例１のＣ．の２．で示すように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で５−オキソプロリナーゼ活性を示さなかったＡｓ３６．１３０２溶液を添加しても、反応液中のグルタミン酸濃度が上昇せず、ピログルタミン酸濃度にもほとんど変化がなく、５−オキソプロリナーゼ活性は検出できなかった。【０２９１】
これにより、上記一連の手法により、ピログルタミン酸含量が高い食品であるトマトエキスをアスペルギルス・ソーヤ由来の５−オキソプロリナーゼで処理することにより、グルタミン酸濃度を上昇させる効果があることが示された。【０２９２】
（Ｂ．アスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼによるしょうゆ中のグルタミン酸量の増加）
濃口しょうゆ（キッコーマン社製、特選丸大豆しょうゆ）はミリＱ水で希釈し、１Ｍ  ＫＯＨによりｐＨ８に調整した。反応に用いた５−オキソプロリナーゼは、実施例３の２．記載の方法に準じて取得した酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＳＣ−Ａｓ４．８２０を、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じて５−オキソプロリナーゼの活性を測定し、濃口しょうゆとの反応液に用いた。【０２９３】
具体的には、濃口しょうゆ希釈液〔３倍希釈した濃口しょうゆ、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０〕０．１６ｍＬと、実施例３の２．記載の方法に準じて取得した５−オキソプロリナーゼオルソログタンパク質ＳＣ−Ａｓ４．８２０溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて４．４３ｕｎｉｔ／６００μｇ／ｍＬに希釈）０．０４ｍＬをそれぞれ混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２９４】
また、参照として、濃口しょうゆ希釈液〔３倍希釈した濃口しょうゆ、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０〕０．１６ｍＬと、前記５−オキソプロリナーゼオルソログタンパク質溶液の代わりに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、ＢＳＡ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１２００μｇ／ｍＬに希釈）、あるいは実施例１のＡ．の７．記載の方法に準じて取得したＡｓ３６．１３０２溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて６００μｇ／ｍＬに希釈）０．０４ｍＬをそれぞれ混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０２９５】
反応後、前記の反応液にミリＱ水を０．４ｍＬ加えて３倍希釈液を調製した。該希釈液は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後の有機酸をブロモチモールブルーによるポストラベル法で検出した。ピログルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のピログルタミン酸濃度を算出し、ピログルタミン酸濃度の減少の有無を調べた。続いて、該希釈液０．１２ｍＬに０．０３Ｍ  ＨＣｌを０．２８ｍＬ加えて混合し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）用いた限外濾過により、除タンパク質画分を調製した。該除タンパク質画分をイオン交換クロマトグラフィーに供し、分離後のアミノ酸をニンヒドリンによるポストラベル法で検出した。グルタミン酸標品による検量線を用いて、前記の酵素反応後の溶液中のグルタミン酸濃度を算出し、酵素の活性の有無を調べた。【０２９６】
その結果、図１４で示す通り、希釈した濃口しょうゆにＳＣ−Ａｓ４．８２０を添加することによって反応液中のグルタミン酸濃度が上昇し（図中白のバー）、ピログルタミン酸濃度が減少した（図中白地に黒の斜線のバー）。【０２９７】
一方で、ＳＣ−Ａｓ４．８２０の代わりに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、ＢＳＡ溶液、および実施例１のＣ．の２．で示すように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で５−オキソプロリナーゼ活性を示さなかったＡｓ３６．１３０２溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１２００μｇ／ｍＬに希釈）を添加しても、反応液中のグルタミン酸濃度が上昇せず、５−オキソプロリナーゼ活性は検出できなかった。【０２９８】
これにより、上記一連の手法により、ピログルタミン酸含量が高い食品であるしょうゆをアスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼで処理することにより、グルタミン酸濃度を上昇させる効果があることが示された。【０２９９】
以上の結果より、ピログルタミン酸を多く含んだ飲食品中で、本発明の５−オキソプロリナーゼによりピログルタミン酸を呈味成分として重要なグルタミン酸に加水分解処理することができ、従来にない優れた呈味力を有する飲食品を得ることができると予想される。
【実施例８】
【０３００】
（本発明の５−オキソプロリナーゼを用いた、ラセミ体の分割）
ラセミ体は化学的、物理的性質が同じであり、通常の条件下では区別が難しい。光学分割剤を用いジアステレオマーを形成させ分離する方法、結晶化よる方法、光学分割用カラムを用いる方法が用いられるが、万能な方法ではなく、物質により適した方法を選択する必要がある。実施例２に示したとおり、本酵素は、Ｌ−ピログルタミン酸を基質とし、Ｄ−ピログルタミン酸は基質とはならない。この性質を利用してラセミ体のピログルタミン酸を光学分割することができる。【０３０１】
一例として、次の手順を用いることができる。具体的には、実施例１のＣ．の２．記載の方法に準じて、Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の混合液〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  Ｌ−ピログルタミン酸、２．５ｍＭ  Ｄ−ピログルタミン酸、６．２５ｍＭ  ＡＴＰ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１８７．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０〕、および、実施例３の２．記載の方法に準じて取得した酵母発現アスペルギルス・ソーヤ由来５−オキソプロリナーゼＳＣ−Ａｓ４．８２０溶液（後述、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて希釈）を調製した。前記２種類の基質溶液０．４ｍＬと、前記２種類の酵素溶液０．１ｍＬとをそれぞれを混合し、３７℃で４時間の酵素反応を行った。【０３０２】
反応後、該反応液をポアサイズ０．４５μmのＰＶＤＦフィルターで濾過して除タンパク質画分を調製し、逆相クロマトグラフィー用のカラムＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧＩＩＩ（資生堂、２０×２５０ｍｍ）に供した。反応液を注入後、溶離液として溶離液Ａ（０．１％  トリクロロ酢酸水溶液）と溶離液Ｂ（０．１％  トリクロロ酢酸／８０％  アセトニトリル溶液）を用い、溶離液Ｂの割合を次第に上昇させることにより溶出画分を得た。該溶出液の２１０ｎｍの紫外線吸収を測定すると、２つのピークが検出された。それぞれのピークに相当する複数の画分を混合し、定法により、エバポレーターで濃縮した。該濃縮画分について、実施例２の（８）に記載の方法に準じて、グルタミン酸、およびピログルタミン酸の濃度を測定した。また、実施例１のＣ．の２．に記載の方法に準じて、Ｌ−グルタミン酸濃度を測定した。【０３０３】
その結果、保持時間の早いピークを含む画分ではグルタミン酸（Ｌ−グルタミン酸とほぼ同じ濃度）が検出され、ピログルタミン酸は検出されなかったことから、Ｌ−グルタミン酸が分取できたことを確認した。保持時間の遅いピークを含む画分では、グルタミン酸は検出されずピログルタミン酸が検出された。また、Ｌ−ピログルタミン酸を検出すると検出限界以下であったことから、保持時間の遅いピークを含む画分ではＬ−ピログルタミン酸は存在せず、Ｄ−ピログルタミン酸が高純度で得られたことを確認した。Ｌ−グルタミン酸溶液は、酸性条件下、高温高圧下で処理することにより、再びＬ−ピログルタミン酸が得られることが知られている。以上により、本酵素を使用することにより、ピログルタミン酸のラセミ体から、Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸の分割が可能であることが示された。【０３０４】
用いるカラムの種類によっては保持時間の早いピークを含む画分にピログルタミン酸が含まれ、保持時間の遅いピークを含む画分にＬ−グルタミン酸が含まれ得る。この場合は、予め標準物質（ピログルタミン酸またはＬ−グルタミン酸）を用いてピーク位置を決定しておき、上記と同様の手順でピログルタミン酸のラセミ体から、Ｌ−ピログルタミン酸とＤ−ピログルタミン酸とを分離することができる。【０３０５】
本酵素を飲食品に利用し、あるいは、本酵素の生産微生物を用いて飲食品を発酵させる場合には、飲食品に安全に利用できる微生物から本酵素を取得することや、飲食品に安全に利用できる微生物を用いて飲食品を発酵させることも重要である。本発明の５−オキソプロリナーゼ遺伝子は、食経験のあるアスペルギルス属菌から単離された遺伝子である。飲食品の加工への使用の際には、アスペルギルス属菌由来の５−オキソプロリナーゼ遺伝子、タンパク質を使用することは食の安心安全につながり、産業上極めて有用であると考えられる。【０３０６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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