(57)【要約】  本発明が解決しようとする課題は、従来のペプチドよりも高い効率で目的とする高分子化合物及びナノキャリアを細胞内に導入することができるターゲット分子細胞導入用ペプチドを提供することである。本発明は、ｐＨ依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン（PTD）を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が２１以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン（PTD）を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が２１以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項２】
前記膜融合ペプチドが配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３
［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は同一又は異なって、Ｗ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｌ、又はＴを示す］
を有する、請求項１に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項３】
下記のいずれかである請求項１に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCLもしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCL であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCLもしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCLで示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項４】
下記のいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記PTDのアミノ酸配列が、YGRKKRRQRRR、RRRRRRRRRRR、もしくはRQIKIWFQNRRMKWKK、であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記PTDのアミノ酸配列がYGRKKRRQRRR、RRRRRRRRRRRもしくはRQIKIWFQNRRMKWKKで示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有する該ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体。
【請求項６】
ターゲット分子１個に対し、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドが２個以上結合されている、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項９】
細胞に請求項６又は７に記載の複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を細胞内に導入する方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含む、ターゲット分子の細胞内導入剤。
【請求項１１】
ターゲット分子の細胞内導入剤を製造するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１２年１２月２８日に出願された、日本国特許出願第2012-287128号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、所望の分子を細胞内に導入するために用いるターゲット分子細胞内導入用ペプチド、当該ターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体及び当該ターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
高分子化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の分子の生体内での機能解析、またドラックデリバリーシステムの構築のため、目的の物質を細胞内に導入することは非常に重要である。【０００４】
従来、HIV-1 由来Trans-activator of transcription protein (TAT蛋白質)を培養液中に添加すると細胞膜を通過し細胞内に移行することがしられている（非特許文献１, 2）。その後ハエ由来の蛋白質やHSV-1の構造タンパク質なども細胞膜を通過する性質を有することが明らかとなった。膜通過のために必要なアミノ酸配列が決定され，その10から20個のアミノ酸からなるドメインはProtein Transduction domain（PTD）/Cell penetrating peptide (CPP) と呼ばれるようになった。【０００５】
しかし、PTDの細胞内導入効率が導入しようとする目的の蛋白質自体の性質や高分子化合物の性質に大きく影響を受け、ほとんどの場合、in vitroでも十分な導入効率が得られず、細胞導入効率が不安定であるという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Green M., Loewenstein P.M. Autonomous functional domains of chemically synthesized Human Immunodeficiency Virus TAT trans-activator protein. Cell. 1988;55:1179-1188.
【非特許文献２】Frankel A.D., Pabo C.O. Cellular uptake of the TAT protein from human immunodeficiency virus. Cell.1988;55:1189-1193.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、従来のペプチドよりも高い効率で目的とする高分子化合物及びナノキャリアを細胞内に導入することができるターゲット分子細胞導入用ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の状況の下、鋭意研究した結果、ｐＨ依存性膜融合ペプチドと蛋白質導入ドメイン（PTD）を融合させたターゲット分子細胞内導入用ペプチドにおいて、ｐＨ依存性膜融合ペプチド部分の構成アミノ酸数を従来用いられていたもの（最長で２０アミノ酸）よりも長い２１アミノ酸以上とすることにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者らはさらに、上記新規の知見に基づき、ペプチドのアミノ酸配列、ターゲット分子１分子に対し結合させる細胞内導入用ペプチドの数等を検討し、本発明を完成させた。【０００９】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．ｐＨ依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン（PTD）を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が２１以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。【００１０】
項２．前記膜融合ペプチドが配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３
［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は同一又は異なって、Ｗ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、又はＴを示す］
を有する、項１に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。【００１１】
項３．下記のいずれかである項１に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF（配列番号１）、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG（配列番号２）、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY（配列番号３）、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG（配列番号４）、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY（配列番号５）、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT（配列番号６）、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT（配列番号７）、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL（配列番号８）、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL（配列番号９）、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCL（配列番号１０）もしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCL （配列番号１１）であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF（配列番号１）、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG（配列番号２）、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY（配列番号３）、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG（配列番号４）、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY（配列番号５）、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT（配列番号６）、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT（配列番号７）、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL（配列番号８）、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL（配列番号９）、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCL（配列番号１０）もしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCL（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチド。【００１２】
項４．  下記のいずれかである項１〜３のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記PTDのアミノ酸配列が、YGRKKRRQRRR（配列番号１２）、RRRRRRRRRRR（配列番号１３）、もしくはRQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１４）であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記PTDのアミノ酸配列がYGRKKRRQRRR（配列番号１２）、RRRRRRRRRRR（配列番号１３）もしくはRQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１４）で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有する該ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。【００１３】
項５．上記項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体。【００１４】
項６．ターゲット分子１個に対し、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドが２個以上結合されている、項５に記載の複合体。【００１５】
項７．前記項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。【００１６】
項８．前記項６又は７に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。【００１７】
項９．細胞に前記項６又は７に記載の複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を細胞内に導入する方法。【００１８】
項１０．項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含む、ターゲット分子の細胞内導入剤。【００１９】
項１１．ターゲット分子の細胞内導入剤を製造するための、項１〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドの使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、従来のターゲット分子細胞導入用ペプチドよりも高い効率で目的とする物質を細胞内に導入することができるターゲット分子細胞導入用ペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の複合体による細胞膜透過の概略図を示す。尚、図１においては、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドを単にPTDと示す。
【図２】（A）本発明におけるターゲット分子細胞内導入用ペプチドを様々な価数で量子ドット上に負荷したものを細胞上に30pM添加して４５分後に一細胞あたりに取り込まれた量子ドットの数を示す。（B）公知の2価PTD と本発明におけるターゲット分子細胞内導入用ペプチド(20価)の量子ドット上に負荷したものを細胞上に30pM添加して４５分後に一細胞あたりに取り込まれた量子ドットの数を示す。
【図３】本発明におけるターゲット分子細胞内導入用ペプチドおよび公知のPTDを量子ドットでラベルし、蛍光色素でエンドソームを標識し双方を同時に観察することで、エンドソームから離脱した量子ドットの割合を測定することで、エンドソームから離脱する割合を測定した実験の代表的な一分子顕微鏡像（左）と、定量化した結果（右）を示す。
【図４】Tag蛋白質を、ミトコンドリア上の蛋白質MFN2に融合して発現する発現ベクターを細胞に導入して４８時間後（Ａ）、細胞培養液に合成したターゲット分子細胞内導入用ペプチドをs-s結合で付着させ、さらにTag-ligandを付加した量子ドットを15pM濃度で添加すると（Ｂ）、量子ドットは細胞に取り込まれ、細胞内でＴａｇタンパク質とリガンドとの結合が起きる。その後、量子ドットはミトコンドリアに局在し、ミトコンドリア上で運動するのが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、特段の規定がない場合、本発明のペプチドが有するアミノ酸配列には、左側がＮ末端のものと左側がＣ末端のものの両方が包含される。例えば、配列「GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF」は、N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF-C又はN-FGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-Cを示し、
配列「YGRKKRRQRRR」は、N-YGRKKRRQRRR-C又はN-RRRQRRKKRGY-Cを示し、
配列「GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR」は、N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C又はN-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-Cを示す。
【００２３】
ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
本発明は、ｐＨ依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン（PTD）を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が２１以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドを提供する。
【００２４】
本発明において、蛋白質導入ドメイン（PTD）とは、細胞膜表面受容体に吸着後局所刺激を引き起こし、エンドサイトーシスによりターゲット分子細胞内導入用ペプチドを細胞内に取り込ませる機能を有するペプチドおよび同等の機能を有するアミノ酸配列を示す。
【００２５】
PTD自体としては、公知の配列を適宜用いることができる。アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、YGRKKRRQRRR、RRRRRRRRRRR、RQIKIWFQNRRMKWKK、QWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、KLALKLALKALKAALKLA、MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV等が挙げられる。また、本発明においては、PTDには、YGRKKRRQRRR、RRRRRRRRRRR、RQIKIWFQNRRMKWKK、QWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（配列番号１５）、KLALKLALKALKAALKLA（配列番号１６）、またはMVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV（配列番号１７）で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるもの（例えば、YGRKKRRQRRR の末端にPPQを付加したYGRKKRRQRRRPPQ（配列番号１８）、さらに反対側の末端からYを欠失させたGRKKRRQRRRPPQ（配列番号１９）、RRRRRRRRRRRからRRを欠失させたRRRRRRRRR（配列番号２０）等）も含まれる。
【００２６】
上記PTDにおいて、「１または複数」の範囲は、当該PTDにｐＨ依存性膜融合ペプチドを組み合わせたターゲット分子細胞内導入用ペプチドが細胞膜透過性を有することを限度として特に制限されないが、例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、さらに特に好ましくは１又は２個が挙げられる。特定のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸を欠失、置換及び／または付加させる技術は公知である。なお、このように欠失、置換及び／または付加されたペプチドとしては、欠失、置換及び付加をする前のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、PTDにｐＨ依存性膜融合ペプチドを組み合わせたターゲット分子細胞内導入用ペプチドが細胞膜透過性を有するペプチドが例示される。また、当該ぺプチドとして、アミノ酸の同一性は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、さらに特に好ましくは９８％以上である。
【００２７】
本発明において、細胞膜透過性とは、単にエンドサイトーシスによりエンドソームに取り込まれるだけでなく、エンドソーム膜に小孔を開けて、細胞質内に到達する性質を示す。
【００２８】
本発明において、ｐＨ依存性膜融合ペプチドとは、エンドソームに取り込まれた後、エンドソーム膜に挿入されるペプチドであって、ｐＨによりその二次構造が変化するものを示す。より具体的には、ｐＨが中性条件とｐＨ５以下（例えば、ｐＨ４以下又はｐＨ３以下）等の酸性領域とで立体構造が変化するペプチドを示す。
【００２９】
かかるｐＨ依存性膜融合ペプチドとしては、例えば、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は同一又は異なって、Ｗ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｌ、又はＴ（好ましくはＷ、Ｈ、Ｇ、Ｆ又はＹ）を示す］
を有するものが挙げられる。配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３の位置としては特に限定されないが、PTDと結合する側の末端が好ましい。配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３としては、例えば、ＹＧＦ、ＷＹＧ、ＨＧＹ、ＷＨＧ、ＡＬＹ、ＣＬＴ、ＹＣＬ等が挙げられる。
【００３０】
かかるｐＨ依存性膜融合ペプチドとしては、例えば、各種ウイルス（例えば、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、インフルエンザＣ型等）に由来する膜融合ペプチドであってｐＨ依存性を有するもののアミノ酸配列の全部又は一部を用いることができるが、当該ｐＨ依存性膜融合ペプチドは構成アミノ酸数が２１以上、好ましくは２３個以上であることが重要である。構成アミノ酸の上限は特に限定されないが、例えば、26以下が好ましく、24以下がより好ましい。
【００３１】
このようなｐＨ依存性膜融合ペプチドのアミノ酸配列としては、上記構成アミノ酸数を有するものであれば特に限定されないが、例えば、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG、LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCL、GIFSWTITDAVGNDMPGGYCL等を挙げることができる。また、本発明において、ｐＨ依存性膜融合ペプチドには、上記GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF、GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGY、GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG、AGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALY、GTFTWTLSDSEGKDTPGGYCLT、GTFTWTLSDSSGVENPGGYCLT、AFFSWSLTDSSGKDTPGGYCL、AFFSWSLTDSSGKDMPGGYCL、AFFSWSLSDPKGNDMPGGYCLもしくはGIFSWTITDAVGNDMPGGYCLで示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。
【００３２】
上記ｐＨ依存性膜融合ペプチドにおいて、「１または複数」の範囲は、当該ｐＨ依存性膜融合ペプチドにPTDを組み合わせたターゲット分子細胞内導入用ペプチドが細胞膜透過性を有することを限度として特に制限されないが、例えば１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個が挙げられる。特定のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸を欠失、置換及び／または付加させる技術は公知である。
【００３３】
なお、このように欠失、置換及び／または付加されたペプチドとして、欠失、置換及びおよび付加をする前のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、当該ｐＨ依存性膜融合ペプチドにPTDを組み合わせたターゲット分子細胞内導入用ペプチドが細胞膜透過性を有するようなペプチドが例示される。また、当該ぺプチドとして、アミノ酸の同一性は通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、さらに特に好ましくは９８％以上である。
【００３４】
このようなペプチドとしては、例えば、GLFX4AIAX5FIEX6GWEGX7IX8GWYG（配列番号２１）
［式中、Ｘ４はＤ、Ｅ、Ｇ又Ｎを示す。Ｘ５はＤ、Ｅ、Ｇ又Ｎを示す。Ｘ６はＤ、Ｅ、Ｇ又Ｎを示す。Ｘ７はＭ又はＬを示す。Ｘ８はＤ、Ｅ、Ｇ又Ｎを示す。但し、（Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８）＝（Ｇ、Ｇ、Ｎ、Ｍ、Ｄ）の組み合わせを除く。］
からなるペプチド等を挙げることができる。より具体的には、例えば、配列GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG のうち４個を置換した配列、例えば、GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYG（下線は置換部分、配列番号２２）からなるペプチド等が挙げられる。
【００３５】
本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドにおいて、ｐＨ依存性膜融合ペプチドとPTDとは直接結合しても、リンカーを介して結合してもよい。リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができる。
【００３６】
本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドには、目的物質を結合させるためのドメイン、具体的には、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガードメイン、HMG-box等）、二本鎖RNA結合ドメイン（ヒストン、RDE-4タンパク質、プロタミン等由来の二本鎖RNA結合ドメイン）、各種標識タグ蛋白質認識化合物（抗Myc結合蛋白質（Myc-tagに対して）、Halotagリガンド（Halotag蛋白質結合分子）、nickel分子 (His-tag蛋白質結合分子)等）等を融合ペプチド側の末端及びPTD側の末端のうち、PTD側の末端に有していてもよい。
【００３７】
より具体的には、本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとしては、例えば、以下のものが挙げられる：
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C  （ペプチド１、配列番号２３）
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRRRQRRKKRGY-C  （ペプチド２、配列番号２４）
N-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド３、配列番号２５）
N-RRRQRRKKRGYFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド４、配列番号２６）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYYGRKKRRQRRR-C  （ペプチド５、配列番号２７）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYRRRQRRKKRGY-C  （ペプチド６、配列番号２８）
N-YGRKKRRQRRRYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド７、配列番号２９）
N-RRRQRRKKRGYYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド８、配列番号３０）
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGYGRKKRRQRRR-C  （ペプチド９、配列番号３１）
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGRRRQRRKKRGY-C  （ペプチド１０、配列番号３２）
N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド１１、配列番号３３）
N-RRRQRRKKRGYGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド１２、配列番号３４）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYGRKKRRQRRR-C  （ペプチド１３、配列番号３５）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGRRRQRRKKRGY-C  （ペプチド１４、配列番号３６）
N-YGRKKRRQRRRGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド１５、配列番号３７）
N-RRRQRRKKRGYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド１６、配列番号３８）
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRRRRRRRRRRR-C  （ペプチド１７、配列番号３９）
N-RRRRRRRRRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド１８、配列番号４０）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYRRRRRRRRRRR-C  （ペプチド１９、配列番号４１）
N-RRRRRRRRRRRYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド２０、配列番号４２）
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGRRRRRRRRRRR-C  （ペプチド２１、配列番号４３）
N-RRRRRRRRRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C  （ペプチド２２、配列番号４４）
N-GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGRRRRRRRRRRR-C  （ペプチド２３、配列番号４５）
N-RRRRRRRRRRRGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C  （ペプチド２４、配列番号４６）
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGRRRRRRRRRRR-C  （ペプチド２５、配列番号４７）
N-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C  （ペプチド２６、配列番号４８）
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGYGRKKRRQRRR-C  （ペプチド２７、配列番号４９）
N-GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGWYGRRRQRRKKRGY-C  （ペプチド２８、配列番号５０）
N-YGRKKRRQRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C  （ペプチド２９、配列番号５１）
N-RRRQRRKKRGYGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C  （ペプチド３０、配列番号５２）。
上記配列において、下線部はPTDを示し、それ以外の部分は、ｐＨ依存性膜融合ペプチドである。
【００３８】
本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドは、従来公知の遺伝子工学的手法や化学合成法などによって作製できる。例えば、前述のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクター等に挿入し、次いで、当該ベクターが組み込まれた形質転換体を培養したのち、所望のペプチドを取得すればよい。また、本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドは、当該ペプチドの産生能を有するよう形質転換した微生物から単離・精製することによって取得してもよい。また、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドのアミノ酸配列またはこれをコードするヌクレオチド配列の情報に従って、本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを従来公知の化学合成法により合成して取得してもよい。なお、化学合成法には、液相法や固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００３９】
その際、本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドは、ｐＨ依存性膜融合ペプチドとPTDとが結合したもの（またはさらに目的物質を結合させるためのドメインが結合したもの）を上記の方法により製造しても、ｐＨ依存性膜融合ペプチド及びPTD（またはPTDに目的物質を結合させるためのドメインが結合したもの）をそれぞれ上記の方法により合成した後にこれらを結合させて製造してもよい。
【００４０】
複合体
本発明は、前述ターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体を提供する。
【００４１】
ターゲット分子とターゲット分子細胞内導入用ペプチドとの結合様式は特に限定されず、例えば、前述の結合ドメインを介して結合してもよく、−Ｓ−Ｓ−結合等により架橋されてもよく、ビオチン、アビジンシステムを利用してもよく、静電的に結合してもよく、化学的に修飾して結合させても良い。
【００４２】
ターゲット１分子に対しターゲット分子細胞内導入用ペプチドを結合させる数も特に限定されないが、２個以上（例えば、３個以上、より好ましくは８個以上）のターゲット分子細胞内導入用ペプチドがターゲット分子に結合することが、細胞表面受容体結合の効率上昇び細胞表面受容体の取り込み機序の活性化の観点から好ましい。ターゲット１分子に対しターゲット分子細胞内導入用ペプチドを結合させる数の上限も特に限定されないが、例えば、30個以下が好ましく、20個以下がより好ましい。
【００４３】
目的物質としては、特に限定されず、高分子及び低分子のいずれであってもよい。例えば、高分子化合物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ（siRNA、shRNA等）等の核酸分子；オリゴペプチド、タンパク質（抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン、レセプターポリペプチド、等）等のペプチド等、糖鎖等が挙げられる。低分子としては、例えば、抗生物質、抗癌剤、抗炎症剤、リポソーム、ミセル、デンドリマー、ナノチューブ、アミノ酸ナノ粒子等のナノキャリア、量子ドット等、蛍光色素等、細胞内分子可視化試薬、ナノ磁性体、ナノゴールド等、生体内での標的細胞動態を可視化できる化合物等が挙げられる。
【００４４】
例えば、転写因子の異常により発生する癌については、当該転写因子をターゲット分子として含む本発明の複合体を調製し、これを被験体に投与して癌の治療をすることも可能である。
【００４５】
また、本発明の方法を用いて抗原提示細胞に抗原を導入すると抗原がMHC-クラスIに提示されて細胞障害性T細胞が活性される。そこで、細胞障害性T細胞を誘導する必要がある多くのウイルス感染症および癌に対するワクチンへの応用が考えられる。
【００４６】
本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチド及び複合体には、さらに特定の抗原に対し特異的に結合する物質（例えば、抗体、抗体フラグメント（scFv(Single-chain variable fragment)等））を結合させてもよい。当該実施形態によれば、種々の細胞を含む試料又は被験体において、特定の細胞に特異的にターゲット分子を導入することができる。
【００４７】
本発明の複合体は、コンディショナルノックアウト動物への応用も可能である。具体的には、例えば、標的となる遺伝子領域をCreリコンビナーゼ標的配列loxPで挟んだ遺伝子座を有するfloxマウスに、本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとCreリコンビナーゼ又はこれをコードする遺伝子とを結合した複合体を投与する方法があげられる。当該実施形態においては、Creリコンビナーゼ又はこれをコードする遺伝子がfloxマウスの体細胞に導入され、リコンビナーゼにより標的遺伝子を欠失させることができる。そのため、当該実施形態においては、所望のタイミングで標的となる遺伝子領域を欠失させることができるため有用である。また、当該複合体に特定の抗原等に結合する物質を結合させておくことにより、さらに、標的となる遺伝子領域の欠失を所望のタイミングでかつ所望の部位で生じさせることができる。
【００４８】
別の実施形態において、本発明の複合体はｉＰＳ細胞の作製にも使用することができる。具体的には例えば、OCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４遺伝子発現ベクター、もしくは４蛋白質等をターゲット分子として本発明の複合体を作製し、これをin vitroで細胞に添加するか、または被験体となる動物に直接投与することにより、ターゲット分子である遺伝子が細胞に導入され、iPS細胞を樹立することができる。
【００４９】
また、細胞内での細胞外との環境変化に反応する反応基質を活用する例えば、エンドソームに取り込まれた後のpHの低下をpH反応性に応答して構造が変化し目的物質が導入ペプチドから離れるようにする、例えばpH反応性のpara-nitrophenyl (pNP)-PEG-PE、システイン-システイン間のSS結合等を用いて細胞内で目的物質より乖離する方法を含む。
【００５０】
ベクター
本発明は、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明においては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等いずれのベクターであっても利用できる。
【００５１】
当該ベクターにターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む塩基配列をクローニングする方法としては、自体公知の方法を用いて行うことができ、例えば、発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）等をコード領域の上流に配置する等して、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるよう設計することができる。
【００５２】
本発明のベクターには、上記ターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするものだけでなく、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドと目的物質とが結合した複合体をコードするものも含む。当該実施形態においては、遺伝子発現により、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドと目的物質とを共有結合したかたちで産生することができる。
【００５３】
医薬組成物
本発明は、前記複合体を有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において、有効成分である前記複合体は単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じ、薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、被験体に対し、種々の投与経路、具体的には、経口又は非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、経鼻粘膜投与、経口腔粘膜投与、経皮投与、皮下投与、皮内投与、直腸投与等）で投与することができる。好ましくは静脈注射、筋肉注射、経鼻粘膜投与等どの非経口的な局所投与である。被験体としては、哺乳動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物）等が挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル等が挙げられる。
【００５４】
好ましい剤形としては、非経口剤では、例えば、注射剤（点滴剤を含む）、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等が好ましく挙げられる。経口剤では、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、及びトローチ剤等が好ましく挙げられる。
【００５５】
これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、医薬分野において通常使用される、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、及び矯味矯臭剤、また必要に応じて、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等が挙げられる。
【００５６】
細胞内にターゲット分子を導入する方法
本発明は、細胞に前記複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を細胞内に導入する方法を提供する。当該方法は、前記複合体をin vitro及びin vivoのいずれで細胞に添加してもよい。
【００５７】
添加された複合体は、細胞膜表面付近でPTDが膜表面のへパラン硫酸プロテオグリカン等に結合して局所刺激を引き起こし、エンドサイトーシスによりターゲット分子細胞内導入用ペプチドを細胞内に取り込まれる（図１）。そして、ｐＨ依存性膜融合ペプチドがエンドソーム膜に挿入される。その後、時間と共にエンドソーム内のｐＨは早急に酸性に変化する。ｐＨの変化に伴い、ｐＨ依存性膜融合ペプチドはエンドソーム膜に挿入された状態でその立体構造が変化して湾曲し、エンドソーム膜に小孔を生じさせる。その結果、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドは、エンドソーム膜を介して細胞質内に放出される。
【００５８】
ターゲット分子の細胞内導入剤
本発明は、前述したターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含むターゲット分子の細胞内導入剤を提供する。本発明においては、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド自体をターゲット分子の細胞内導入剤として用いてもよく、またターゲット分子細胞内導入用ペプチドを、前述した担体等と混合し製剤化したものを用いてもよい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは明らかである。【００６０】
実施例１
東レ株式会社に依頼し、Fmoc (N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)固相合成法で下記アミノ酸配列からなるペプチドを合成した：
N-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFYGRKKRRQRRR-C  ペプチド１
合成したペプチドはアセトニトリル/H2O/トリフルオロ酢酸グラディエントによる逆相HPLCで９５％以上に精製した（分子量4149.7）。【００６１】
実施例２〜６
下記のアミノ酸配列からなるペプチドを合成する以外、実施例１と同様にして、ペプチドを合成した：
N-YGRKKRRQRRRFGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C（ペプチド３、分子量4149.7）
N-RRRQRRKKRGYYGHWGAIMGEWGGELFGAIAGFFG-C（ペプチド８、分子量4072.6）
N-YGRKKRRQRRRGYWGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C（ペプチド１１、分子量4002.6）
N-RRRRRRRRRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C（ペプチド２６、分子量4261.9）
N-YGRKKRRQRRRGYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLG-C（ペプチド２９、分子量4085.6）
上記配列において、下線部はPTDを示し、それ以外の部分は、ｐＨ依存性膜融合ペプチドである。【００６２】
実施例１’
また、上記Fmoc固相合成法において最後のアミノ酸(ペプチド１においてはＮ末端のＧ)の伸長に、ビオチン化アミノ酸を用いてPTD側をビオチン化したこと以外、実施例１と同様にして、Ｎ末端をビオチン化したペプチドを合成した。得られた化合物を化合物１とする（分子量4394.1）。【００６３】
実施例２’〜６’
また、上記Fmoc固相合成法において最後のアミノ酸(ペプチド１においてはＮ末端のＧ)の伸長に、ビオチン化アミノ酸を用いることによりPTD側をビオチン化した（化合物３、８、１１、２６）。各化合物の分子量は以下の通り：
化合物３、分子量4394.1
化合物８、分子量4316.9
化合物１１、分子量4246.9
化合物２６、分子量4329.9
また、下記アミノ酸配列を有しＮ末端をビオチン化したペプチドも同様にして合成した（化合物３３）
N-GYWGEILGEWGGEIFEAIAEFLGRRRRRRRRRRR-C（ペプチド33、分子量4506.2）
比較例１及び２
下記のアミノ酸配列としてからなるペプチドを合成する以外、実施例１’と同様にして、ビオチン化ペプチドを合成した（それぞれ、化合物３１〜３２とする）：
N-RRRQRRKKRGYGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-C（ペプチド３１）
N-YGRKKRRQRRR-C（ペプチド３２）
実施例３１及び３２ならびに比較例３及び４
市販のストレプトアビジン蛍光性量子ドット（QD）（QD655, invitrogen; 直径30nm）1 μｍｏｌに前述の化合物11及び26を1,2,4,8,12,16,20までの様々なモル比で反応させ、様々な数のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをQD上に重合させた（これを価数と表現し、x価の場合、１個のQD上にx個のペプチドが結合していることになる）（価数１〜２０の複合体をそれぞれ複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20とする）。実験では生細胞としてHeLa細胞を用い、HeLa細胞は細胞培養液X-VIVO bufferで培養した。複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20、50 pMをendosome染色試薬0.25%のDiOと同時に細胞に添加して1時間後に細胞を培養液で洗浄して、さらに2時間培養後に、文献1.Duan H, Nie S. J Am Chem Soc. (2007) Vol. 129,3333-8.と2.Imamura J, Suzuki Y, Gonda K, Roy CN, Gatanaga H, Ohuchi N, Higuchi H. J Biol Chem. (2011) Vol.286, 10581-92.に記載の方法に従って一分子顕微鏡で観察を行い何%のQD粒子がエンドソームに残存するか定量的に観察した。この結果、力価が2,4,8、16、20価と価数が上昇するに従い、QD粒子の取り込みの向上が観察された（図２A）。【００６４】
次に、比較例として１及び２で合成した化合物３１及び３２を用いる以外、実施例３１と同様にして、複合体３１及び３２を調製し、QD粒子のエンドソームへの残存率を測定した。この結果、コントロールとして複合体３２（HIV-1 Tat由来）（我々の検討で最も効率が高い8価）と、現時点で最も強力な細胞導入能を有するとされる複合体３１（HA-PTD）（同様の検討で最も効率が高い20価）を用いて観察しても、それぞれ平均で0.2%と2%前後しか細胞内に導入されないことが明らかになった(図3)。他方新たに合成した複合体ではエンドソームからの遊出が著名に改善し、うち２つの複合体（複合体11−20及び26−20）では、平均値でQDの60〜70％がエンドソームから遊出し（図3）、高いものではQDの70-90%近くがエンドソームから遊出することが明らかになった。【００６５】
ストレプトアビジンQDに化合物11及び26を同様に様々な濃度で重合させ、様々な力価（複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20）で作成した複合体11−1〜11−20及び26−1〜26−20を30pM、Hela細胞に添加して、45分後に細胞内に取り込まれた１個の細胞あたりのQD数で比較した場合、20価複合体11及び26は、2価の複合体３２（HIV-1 TatPTD-QD）と比較して、取り込まれる数でそれぞれ7.5倍および5倍改善した（図2B）。この結果、細胞内に実際に導入されるQD数としては20価複合体11及び26で2価の複合体３２と比較して、それぞれ2000倍および1740倍改善したことになった。以上のことより、QD導入能において、従来のPTDに対して1000倍以上の改善を行うことが可能であることが示された。【００６６】
複合体11及び26をQD上に15分子をSS結合を用いて重合させて、さらにHaloTagリガンド分子(Halo-L)（この実験では確実にHaloTagを認識できるように8分子NH2を用いて結合させた）を表面に結合させたQD(QD 564)の合成を四国産総研に依頼し作成した。このQD粒子を用いてミトコンドリア外膜蛋白Mitofusin-2(MFN2)を標的分子に選んで可視化できるか検討した。【００６７】
HaloTag付加MFN2発現ベクターを細胞に導入後48時間経過した時点で、細胞培養液に合成したQDを15pM濃度で添加し、2時間後、細胞内に取り込まれなかったQDを洗浄し、さらに30分間培養後、一分子顕微鏡を用いて細胞内QDを観察した(図４)。MFN2とQDが共局在するか明らかにする目的で、HaloTag付加MFN2は更にHaloTag TMR Ligandで可視化した。その結果、我々の作成したQDは2時間ほどで細胞に取り込まれて、HaloTag融合MFN2に結合し、高速度でミトコンドリア表面を往復運動することが示された(図４)。一方HaloTag付加MFN2発現ベクターを細胞に導入していない細胞ではQDのミトコンドリア上への集積は認められず細胞内にびまん性に集積していた。以上より、我々が開発した複合体11及び26とHalo-LをQDに結合させた系を活用すると簡便な操作で、生細胞内分子の一分子イメージングが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを用いることにより、ターゲット分子を単にエンドソーム内に封入されたかたちで導入するだけでなく、エンドソームに小孔を生じさせて細胞質にまで導入することができる。従って、ターゲット分子の細胞質における機能の研究に非常に有用である。また、多くの医薬の作用点は細胞質内にあると考えられるため、ドラッグデリバリーシステムへの応用の点からも非常に重要である。本発明のターゲット分子細胞内導入用ペプチドの用途としては、例えば、急性虚血性心疾患による心筋の虚血性ダメージに対して、アンチアポプトシスペプチドを冠動脈から導入し、細胞内に直接導入することで心筋を保護することに用いること等が挙げられる。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１  膜融合ペプチド
配列番号２  膜融合ペプチド
配列番号３  膜融合ペプチド
配列番号４  膜融合ペプチド
配列番号５  膜融合ペプチド
配列番号６  膜融合ペプチド
配列番号７  膜融合ペプチド
配列番号８  膜融合ペプチド
配列番号９  膜融合ペプチド
配列番号１０  膜融合ペプチド
配列番号１１  膜融合ペプチド
配列番号１２  蛋白質導入ドメイン
配列番号１３  蛋白質導入ドメイン
配列番号１４  蛋白質導入ドメイン
配列番号１５  蛋白質導入ドメイン
配列番号１６  蛋白質導入ドメイン
配列番号１７  蛋白質導入ドメイン
配列番号１８  蛋白質導入ドメイン
配列番号１９  蛋白質導入ドメイン
配列番号２０  蛋白質導入ドメイン
配列番号２１  膜融合ペプチド
配列番号２２  膜融合ペプチド
配列番号２３  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２４  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２５  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２６  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２７  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２８  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号２９  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３０  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３１  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３２  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３３  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３４  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３５  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３６  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３７  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３８  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号３９  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４０  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４１  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４２  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４３  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４４  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４５  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４６  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４７  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４８  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号４９  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号５０  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号５１  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
配列番号５２  ターゲット分子細胞内導入用ペプチド
【図１】
2014104227.tif 000002
【図２】
2014104227.tif 000003
【図３】
2014104227.tif 000004
【図４】
2014104227.tif 000005
【配列表】
2014104227000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月1日(2014.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ依存性膜融合ペプチド及び蛋白質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチドであって、該膜融合ペプチドの構成アミノ酸数が２１以上である、ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項２】
前記ＰＴＤが前記ｐＨ依存性膜融合ペプチドのＮ末端側に結合している、請求項１に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項３】
前記膜融合ペプチドが配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３
［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は同一又は異なって、Ｗ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｙ、Ａ、Ｃ、Ｌ、又はＴを示す］
を有する、請求項２に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項４】
下記のいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がＮ−ＦＧＹＷＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧ−Ｃ、Ｎ−ＧＹＷＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧ−Ｃ、Ｎ−ＹＧＨＷＧＡＩＭＧＥＷＧＧＥＬＦＧＡＩＡＧＦＦＧ−Ｃ、Ｎ−ＧＨＷＧＡＩＭＧＥＷＧＧＥＬＦＧＡＩＡＧＦＦＧ−Ｃ、Ｎ−ＹＬＡＶＧＡＴＩＱＡＡＴＡＩＧＩＡＶＧＡＭＩＶＧＡＬ−Ｃ、Ｎ−ＴＬＣＹＧＧＰＴＤＫＧＥＳＤＳＬＴＷＴＦＴＧ−Ｃ、Ｎ−ＴＬＣＹＧＧＰＮＥＶＧＳＳＤＳＬＴＷＴＦＴＧ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＴＤＫＧＳＳＤＴＬＳＷＳＦＦＡ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＫＧＳＳＤＴＬＳＷＳＦＦＡ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＮＧＫＰＤＳＬＳＷＳＦＦＡ−ＣもしくはＮ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＮＧＶＡＤＴＩＴＷＳＦＩＧ−Ｃであるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記膜融合ペプチドのアミノ酸配列がＮ−ＦＧＹＷＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧ−Ｃ、Ｎ−ＧＹＷＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧ−Ｃ、Ｎ−ＹＧＨＷＧＡＩＭＧＥＷＧＧＥＬＦＧＡＩＡＧＦＦＧ−Ｃ、Ｎ−ＧＨＷＧＡＩＭＧＥＷＧＧＥＬＦＧＡＩＡＧＦＦＧ−Ｃ、Ｎ−ＹＬＡＶＧＡＴＩＱＡＡＴＡＩＧＩＡＶＧＡＭＩＶＧＡＬ−Ｃ、Ｎ−ＴＬＣＹＧＧＰＴＤＫＧＥＳＤＳＬＴＷＴＦＴＧ−Ｃ、Ｎ−ＴＬＣＹＧＧＰＮＥＶＧＳＳＤＳＬＴＷＴＦＴＧ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＴＤＫＧＳＳＤＴＬＳＷＳＦＦＡ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＫＧＳＳＤＴＬＳＷＳＦＦＡ−Ｃ、Ｎ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＮＧＫＰＤＳＬＳＷＳＦＦＡ−ＣもしくはＮ−ＬＣＹＧＧＰＭＤＮＧＶＡＤＴＩＴＷＳＦＩＧ−Ｃで示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有するターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項５】
下記のいずれかである請求項２〜４のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチド：
（１）前記ＰＴＤのアミノ酸配列が、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、もしくはＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、であるターゲット分子細胞内導入用ペプチド
（２）前記ＰＴＤのアミノ酸配列がＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲもしくはＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫで示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であり、かつ細胞膜透過性を有する該ターゲット分子細胞内導入用ペプチド。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドとターゲット分子とを結合させてなるターゲット分子複合体。
【請求項７】
ターゲット分子１個に対し、ターゲット分子細胞内導入用ペプチドが２個以上結合されている、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の複合体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１０】
細胞に請求項７又は８に記載の複合体を添加する工程を含む、ターゲット分子を細胞内に導入する方法。
【請求項１１】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドを含む、ターゲット分子の細胞内導入剤。
【請求項１２】
ターゲット分子の細胞内導入剤を製造するための、請求項２〜５のいずれか１項に記載のターゲット分子細胞内導入用ペプチドの使用。
【国際調査報告】
2014104227.tif 000006
2014104227.tif 000007
2014104227.tif 000008
2014104227.tif 000009
2014104227.tif 000010
2014104227.tif 000011