(57)【要約】  多色CARS顕微鏡において励起光、ストークス光の光軸を正確に一致させ、安定的にスペクトル信号を取得することが困難であった。  そこで、光導波路に導入した励起光の残留成分と、光導波路中で発生したストークス光を用いて試料からCARS光を発生させる光学分析装置とする。
2016063322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短パルスレーザ光源と、
光励起によりスーパーコンティニューム光を生じる光導波路と、
前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する第１の集光光学系と、
前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束の波長よりも短い波長成分を除去するフィルタと、
前記フィルタを透過した光束を試料に集光する第２の集光光学系と、
前記試料より生じるCARS光を検出する分光器と、
からなることを特徴とする光学分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光学分析装置において、前記光導波路はフォトニック結晶ファイバであることを特徴とする光学分析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の光学分析装置において、前記フォトニック結晶ファイバの長さは1m以内であることを特徴とする光学分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の光学分析装置において、前記第２の集光光学系と前記試料を保持する手段との相対位置を制御する制御手段を、さらに有することを特徴とする光学分析装置。
【請求項５】
請求項４に記載の光学分析装置において、前記制御手段は、前記第２の集光光学系の入射角を走査するミラーであることを特徴とする光学分析装置。
【請求項６】
出力が500フェムト秒以内のパルス幅を有する短パルスレーザ光源と、
光励起によりスーパーコンティニューム光を生じる光導波路と、
前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する集光光学系と、
前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束のスペクトル成分のうち一部のスペクトル成分と、前記光源からの光束のスペクトルよりも長い波長成分を透過するフィルタと、
前記フィルタを透過した光束を試料に集光する集光光学系と、
前記試料より生じるCARS光を検出する分光器と、
からなることを特徴とする光学分析装置。
【請求項７】
短パルスレーザ光源と、
光励起によりスーパーコンティニューム光を生じる光導波路と、
前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する集光光学系と、
前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束のスペクトル成分のうち一部のスペクトル成分と、前記光源からの光束のスペクトルよりも長い波長成分を透過し、前記光源からの光束のスペクトルよりも短い波長成分を部分的に透過するフィルタと、
前記フィルタを透過した光束を試料に集光する集光光学系と、
前記試料より生じるCARS光と前記短い波長成分の光との干渉光を検出する分光器と、
からなることを特徴とする光学分析装置。
【請求項８】
短パルスレーザ光源と、
光励起によりスーパーコンティニューム光を生じる光導波路と、
前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する集光光学系と、
前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束の波長よりも短い波長成分を除去するフィルタと、
試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、
前記試料保持部に保持された細胞を観察する観察部と、
前記フィルタを透過した光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、
光照射によって細胞から発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を分光する分光部と、
前記分光部により分光された光を検出する検出部と、
前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、
前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、
破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備えることを特徴とする生体分子解析装置。
【請求項９】
請求項８に記載の生体分子解析装置において、
前記細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することを特徴とする生体分子解析装置。
【請求項１０】
請求項８に記載の生体分子解析装置において、
前記出力されたスペクトルと、前記生体分子捕捉デバイスを用いて解析されたデータとを対応づけて保存するメモリを有することを特徴とする生体分子解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学分析装置の高性能化に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡は言うまでも無く自然科学、工学、産業分野において無くてはならない観察ツールである。特に近年は、照明光源としてレーザを用いたより高機能な顕微鏡が先端技術開発において必須となりつつある。その代表例として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡（特許文献１、２）があり、ＣＡＲＳ顕微鏡は、励起光とストークス光の２種類のレーザ光を試料に照射し、これらの光の差周波が試料分子の固有振動に共鳴した結果生じるアンチストークス光（以下ＣＡＲＳ光と呼ぶ）を観測する顕微鏡である。ＣＡＲＳ光のスペクトルにより試料中の物質を定量的に分析観測することができ、非侵襲な定量分析手段として注目されている。【０００３】
ここでＣＡＲＳ顕微鏡の動作原理について説明する。ＣＡＲＳは３次の非線形分極による発光であり、ＣＡＲＳを発生させるためには、励起光、ストークス光、プローブ光が必要とされる。多くの場合、光源の数を少なくするために、プローブ光は励起光で代用される。この場合、誘起される３次の分極はＰ(ω)＝(χr(3)(ω)＋χnr(3))ＥP2(ωP)Ｅ*S(ωS) で表される。ここに、χr(3)(ω)は３次の電気感受率の分子振動の共鳴項であり、χnr(3)は非共鳴項である。また、励起光及びプローブ光の電場をＥPで表し、ストークス光の電場はＥSで表されている。非共鳴項は周波数依存性がない。ＥSの肩についたアスタリスクは複素共役を示す。ＣＡＲＳ光の強度はP（ω）の絶対値の自乗となる。図１５に示した分子のエネルギー準位図を用いて、ＣＡＲＳ光が発生する機構を説明する。１４０１は分子の振動基底状態を表し、１４０２は振動励起状態を表す。周波数ωPの励起光と周波数ωSのストークス光を同時に照射する。このとき分子は仮想準位１４０３を介して、１４０２のある振動励起準位に励起される。この励起状態にある分子に周波数ωPのプローブ光を照射すると、仮想準位１４０４を介して周波数ωASのＣＡＲＳ光を発生しながら、分子は振動基底状態に戻る。このときのＣＡＲＳ光の周波数はω＝２ωP−ωSと表される。【０００４】
CARS顕微鏡のうち、ストークス光として広帯域な光源を用い、発生するCARS光を分光検出するものは多色CARS顕微鏡（もしくはマルチプレックスCARS顕微鏡）と呼ばれる。多色CARS顕微鏡は、CARS光の分光スペクトルからラマンスペクトルを推定できるため、特許文献１のように特定のスペクトル成分のみを検出する方式（これを便宜的に単色CARSもしくはシングルCARSと呼ぶ）に比べて取得できる情報が多く、測定対象のより詳細な解析に適している。多色CARS顕微鏡の基本的な構成を１６に示す。（本構成は特許文献２に基づく。）短パルスレーザ光源1601からの出力はビームスプリッタ1602で２分岐され、一方がフォトニック結晶ファイバ1603などの光導波路に導入され、内部で広帯域な光（スーパーコンティニューム光と呼ばれる）が発生する。スーパーコンティニューム光はファイバからの出射後に所望の波長成分（励起光よりも波長が長い成分）のみをロングパスフィルタ1604により抽出され、これをストークス光として用いる。もう一方の励起光とストークス光はダイクロイックミラー1605等により合波され、試料1606に集光、照射されてCARS光が発生し、これを分光器1607で検出してスペクトルを取得する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US6108081
【特許文献２】特許第5100461号
【特許文献３】US7092086
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nirit Dudovich et al., Nature 418, 512-514 (2002)
【非特許文献２】Kazuhiro Tada and Naoki Karasawa, Applied Physics Express 4, 092701(2011)
【非特許文献３】Erik M. Vartiainen et al., Optics Express, Vol. 14, Issue 8, pp. 3622-3630 (2006)
【非特許文献４】Conor L. Evans, et al., Optics Letters, Vol. 29, Issue 24, pp. 2923-2925 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上に述べた多色ＣＡＲＳ顕微鏡において、試料に照射する励起光とストークス光は光軸位置、角度ともに正確に一致させる必要があり、わずかなずれによって著しくCARS光の発生効率が低下する。しかし、空間的に別々の光路をたどる励起光とストークス光を合波させる構成のため、環境温度変化や経時的な装置の変形により励起光、CARS光の光軸は徐々にずれるため、安定的にデータを取得するのが困難であるという課題を有する。この課題は、多色CARS顕微鏡に限らず、単色CARSも含めたほとんどのCARS顕微鏡に共通の課題である。例外的に特許文献３では励起光をマイクロストラクチャファイバ（フォトニック結晶ファイバと同義）に導入したスーパーコンティニューム光の２つの波長成分を波長フィルタにより抽出して励起光、ストークス光として用いる構成がとられており、励起光、ストークス光が常に同軸となっているために光軸を安定的に一致させることができるが、本実施例は単色CARS顕微鏡であるためにスペクトル情報を取得することが困難であり、依然、多色CARS顕微鏡において安定的に信号を取得することが課題となっている。【０００８】
また、非特許文献１、２は非常に短いパルス（50fs以内程度）の時間波形を回折格子、空間光変調器などで構成されるパスルシェーパで整形することで励起光、ストークス光を作り出しており、励起光、ストークス光の光軸が常に一致した構成となっているが、50fs以内程度のパルス幅を持つレーザ光源は現状、モードロックレーザに限られるために大型かつ効果であり、さらにパルスシェーパも構成が複雑かつ高価であり、装置全体が大型、複雑かつ高価になるという課題がある。【０００９】
上記の課題に鑑み、本発明の目的は、構成が簡易で、長時間安定的に試料の分析を可能とする光学分析装置と、それを適用した生体分子分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特許文献２において、フォトニック結晶ファイバに導入された励起光は大部分がスーパーコンティニューム光に変換されるため、ファイバ出射の際には励起光の波長成分は大幅に強度が低下する。このために特許文献２ではフォトニック結晶ファイバを通過しない励起光をストークス光とファイバ外部で合波する構成としていた。これに対して発明者は、フォトニック結晶ファイバを通過する励起光成分をCARS光の発生のための励起光として利用することを着想し、フォトニック結晶ファイバの長さを適切に設定することにより、これを効率的に行うことが可能であることを見出した。これにより励起光、ストークス光が常に同軸となり、安定的に多色CARS顕微鏡のデータ取得を行うことが可能となる。【００１１】
より具体的には以下の手段を用いた。【００１２】
（１）マイクロチップレーザ等の短パルスレーザ光源と、光励起によりスーパーコンティニューム光を生じるフォトニック結晶ファイバ等の光導波路と、光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する非球面レンズ等の集光光学系と、前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束の波長よりも短い波長成分を除去するロングパスフィルタ等のフィルタと、記フィルタを透過した光束を試料に集光する対物レンズ等の第二の集光光学系と、試料より生じるCARS光を検出する分光器と、からなる構成とした。【００１３】
これにより、従来よりも安定的にCARS光の検出が可能となる。【００１４】
（２）（１）において、光導波路はフォトニック結晶ファイバであることとした。これにより、簡易にスーパーコンティニューム光が生成され、構成が簡素化できる。【００１５】
（３）（２）において、前記フォトニック結晶ファイバの長さは1m以内であることとした。これにより、簡易な構成でCARS光を効率よく発生させることが可能となる
（４）出力が500フェムト秒以内のパルス幅を有するチタンサファイアレーザ等の短パルスレーザ光源と、光励起によりスーパーコンティニューム光を生じるフォトニック結晶ファイバ等の光導波路と、前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する非球面レンズ等の集光光学系と、前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束のスペクトル成分のうち一部のスペクトル成分と、前記光源からの光束のスペクトルよりも長い波長成分を透過するバンドパスフィルタと、前記フィルタを透過した光束を試料に集光する対物レンズ等の第二の集光光学系と、試料より生じるCARS光を検出する分光器と、からなる構成とした。【００１６】
これにより、光導波路からのスーパーコンティニューム光の生成効率が高く、導波路長さを短くすることができ、装置構成の小型、簡素化が可能である。【００１７】
（５）チタンサファイアレーザ等の短パルスレーザ光源と、光励起によりスーパーコンティニューム光を生じるフォトニック結晶ファイバ等の光導波路と、前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する非球面レンズ等の集光光学系と、前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束のスペクトル成分のうち一部のスペクトル成分と、前記光源からの光束のスペクトルよりも長い波長成分を透過し、前記光源からの光束のスペクトルよりも短い波長成分を部分的に透過するバンドパスフィルタと、前記フィルタを透過した光束を試料に集光する集光光学系と、前記フィルタを透過した光束を試料に集光する対物レンズ等の第二の集光光学系と、試料より生じるCARS光を検出する分光器と、からなる構成とした。【００１８】
これにより、ヘテロダイン検出の効果により検出信号が増幅され、高感度かつ安定にデータの取得が可能となる。【００１９】
（６）マイクロチップレーザ等の短パルスレーザ光源と、光励起によりスーパーコンティニューム光を生じるフォトニック結晶ファイバ等の光導波路と、前記光源からの光束を前記光導波路に集光して導入する非球面レンズ等の集光光学系と、前記光導波路から出射される光を透過させ、前記光源からの光束の波長よりも短い波長成分を除去するフィルタと、試料として複数の細胞を保持する試料保持部と、前記試料保持部に保持された細胞を観察する微分干渉顕微鏡等の観察部と、前記フィルタを透過した光束を前記試料保持部に保持された細胞に集光して照射する照射光学系と、光照射によって細胞から発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を分光する分光部と、前記分光部により分光された光を検出するCCDカメラ等の検出部と、前記照射光学系による細胞への光照射位置を制御する照射制御部と、前記試料保持部に保持された細胞を破壊する細胞破壊手段と、破壊によって細胞から放出される細胞中の生体分子を捕捉する生体分子捕捉デバイスと、を備えることとした。【００２０】
これにより、生体試料の高速かつ高精度な解析が可能となる。【００２１】
（７）（６）において細胞破壊手段はレーザ光照射によって細胞を破壊することした。これにより、装置を小型化することができる。【００２２】
（８）（６）において前記出力されたスペクトルと、前記生体分子捕捉デバイスを用いて解析されたデータとを対応づけて保存するメモリを有することとした。これにより、生体分子の分光スペクトル情報を効率的に管理することが可能となり、より効率的なデータ解析が可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、構成が簡易で、従来よりも安定的にデータの取得が可能な光学分析装置の提供が可能となる。【００２４】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のCARS顕微鏡の構成例を示す模式図。
【図２】ＣＣＤカメラの受光部の模式図。
【図３】データ取得動作のシーケンス図。
【図４】本発明により取得されたデータにより復元されたポリスチレンビーズのラマンスペクトル
【図５】スキャンミラーを用いる場合の構成図
【図６】ＣＡＲＳ光の後方散乱を検出する光学分析装置の構成図。
【図７】本発明の第２実施形態におけるバンドパスフィルタの透過特性
【図８】本発明の第３実施形態におけるバンドパスフィルタの透過特性
【図９】光学分析装置の構成例を示す模式図。
【図１０】光学分析装置の構成例を示す模式図。
【図１１】細孔アレイシートの上面図。
【図１２】生体分子解析装置の動作を説明するフローチャート。
【図１３】遺伝子発現データ解析の手順を示すフローチャート。
【図１４】主因子分析の結果を示す図。
【図１５】共鳴ＣＡＲＳ過程を表すエネルギーダイアグラム。
【図１６】従来の多色CARS顕微鏡の構成図
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００２７】
図１は、本発明の光学分析装置の基本的な構成例を示す模式図である。以下、図１に従って本実施例の動作を説明する。【００２８】
コンピュータ１１からの指示によりドライバ１０を通して発光制御される光源すなわち短パルスレーザ光源１０１（中心波長１０６４ｎｍ、パルス幅９００ｐｓ、繰り返し周波数３０ｋＨｚ、平均出力２００ｍＷ）から出射したレーザ光は、集光レンズ１０2によりフォトニック結晶ファイバ１０3に結合され、ファイバ内部で広帯域なスーパーコンティニューム光が生成される。生成されたスーパーコンティニューム光はコリメートレンズ１０4により平行光とされた後、ロングパスフィルタ１０５に入射して短パルスレーザ光源の波長より短い波長の成分が遮断される。すなわち、ロングパスフィルタ105を透過した光は励起光として用いられるレーザ光源波長成分と、ストークス光成分として用いられる、励起光よりも波長の長い成分からなる。この光束は対物レンズ１０６（ＮＡ０．９、倍率４０倍）により試料１０７の一点に集光され、試料の集光箇所に存在する分子の共鳴振動を反映したＣＡＲＳ光が生成される。ＣＡＲＳ光はコンデンサレンズ１０８（ＮＡ０．６５）により平行光とされ、ショートパスフィルタ１０９を通過して同軸成分である励起光とストークス光が遮断された後、分光器１１０に入射し、分光部１１１により分光され、検出部１１２により波長ごとに別々に検出されて、スペクトルが検出信号として出力される。【００２９】
ここで、分光器１１０の検出動作について説明する。分光器１１０は、入射した光を回折格子で波長ごとに異なる方向に回折させる分光部１１１と、分光部１１１により回折した光を１次元もしくは２次元の検出器アレイ（ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等）で検出する検出部１１２からなる。本実施例では検出部１１２としてＣＣＤカメラを用いており、その受光部２０１は図２に示されるように画素２０２が２次元的に配列したものになっている。分光部１１１で分光された光は横長のビーム２０３として受光部に入射し、横方向の位置により波長が異なる。ここで検出部１１２のＣＣＤカメラは外部からの制御により所定時間の間露光状態、すなわち各画素が入射した光に露光され入射光を電荷に変換して電荷を蓄積する状態となる。そして露光終了後、縦に並んだ画素列に蓄積された総電荷量がバッファ２０４に転送され（full vertical binning）、バッファ２０４の電荷が外部にシリアル信号として出力される。このため出力信号は入射光の波長ごとの強度に比例した信号、すなわち入射光のスペクトル信号となっている。【００３０】
ここで本実施例では、試料107を保持しているＸＹＺステージ１２を駆動して、試料への励起光及びストークス光の集光位置が試料を３次元的もしくは２次元的に走査し、集光位置が変わる度にスペクトル信号を取得する。従って、最終的に試料の各位置からのスペクトルデータが得られ、また各点の特定のスペクトル値をマッピングすることによりスペクトルごとのイメージ画像が得られる（ハイパースペクトルイメージング）。【００３１】
本実施例のデータ取得のシーケンスは図３のようになっており、露光、データ転送、位置移動の動作をデータ点数分だけ繰り返す。なお、データ転送と位置移動の順番は逆であっても構わないし、同時に行ってもよい。【００３２】
データ取得終了後、測定された各スペクトルデータは最大エントロピー法などのデータ処理が施され、ラマンスペクトルが復元される。復元されたラマンスペクトルの各共鳴ピーク値を読み取るなどして、ユーザが測定対象物質の濃度分布や、試料全体に含まれる総分子量を取得し、各種の分析に用いる。なお、目的に応じて最大エントロピー法を行わず、生のスペクトルデータのピーク値を読み取るなどして分析に用いてもよい。【００３３】
本実施例の実験結果として、ポリスチレンビーズのラマンスペクトルを復元した結果を図４に示す。フォトニック結晶ファイバの長さは0.5ｍであり、試料は水に浸したポリスチレンビーズである。ポリスチレンビーズから取得したCARS光のスペクトルを、水から取得したCARS光スペクトルで除算して規格化したものに最大エントロピー法を適用し、さらに位相オフセットを補正する補完処理を施してラマンスペクトルを復元した。(これらのデータ処理の詳細は非特許文献３に記載されている。)結果、ポリスチレンの特徴的なラマンスペクトルが復元された。同様のデータを、フォトニック結晶ファイバが0.65m,1mのそれぞれの場合についても実験した結果、同様のスペクトルが復元された。これらの結果は、本発明のフィージビリティを保証するものである。なお、ファイバが長くなるほど信号レベルは低下する傾向がみられ、長さ１ｍにおいては信号レベルが非常に微弱であった。すなわちファイバの長さは１ｍ以内であることが望ましい。逆にファイバが極端に短いとスーパーコンティニューム光が発生せず、少なくとも10cm程度の長さは必要である。【００３４】
本実施例のロングパスフィルタ105の役割は重要であるためここに改めて説明する。ロングパスフィルタ105は、フォトニック結晶ファイバ103から発生したスーパーコンティニューム光のうち、試料107から発生するCARS光の波長帯域の部分をカットする役割がある。スーパーコンティニューム光は通常、試料から発生するCARS光よりもはるかに強度が高いため、これが分光器で検出されると本来検出されるべきCARS光に大きなオフセット成分として現れるため、CARS光の正しい検出が困難になる。従ってロングパスフィルタによりこの波長成分を選択的に除去することが正確なデータの取得のために必須である。【００３５】
ここで、本実施例と特許文献３の構成との相違を明確にする。もっとも重要な違いは、本実施例は多色CARS顕微鏡であるのに対し、特許文献３は単色CARS顕微鏡である、という点である。このため、本実施例ではロングパスフィルタ106が使用されているのに対し、特許文献３ではスーパーコンティニューム光の２つの波長成分を抽出するフィルタの使用が前提となっている。すなわち、本実施例は広帯域なスーパーコンティニューム光のうち励起光の波長よりも長い成分を全て試料に照射しており、結果として特許文献３の構成では取得が不可能な、CARS光のスペクトル情報の取得が可能である。なお、特許文献３の構成において、分光器を使用してCARS光を検出する例が示されているが、検出されるCARS光はほぼ単色であり、本来試料から発せられるCARS光のスペクトルを取得するものではない。【００３６】
本実施例では照射光学系による試料への光照射位置を制御する照射制御部としてＸＹＺステージ１２を用い、測定点の走査のために試料位置を走査したが、照射制御部による光照射位置の制御方法はこの限りではない。例えば、照射制御部として励起光・ストークス光の試料への入射角度を外部制御により走査するガルバノミラー、MEMSミラーなどのスキャンミラーを用いてもよいし、対物レンズ１０６の位置を走査しても構わない。あるいは上に述べた方法の組み合わせであっても構わない。特にガルバノミラーを用いて1軸をスキャンする場合の例について図５を用いて説明する。この場合、ロングパスフィルタ105と対物レンズ10６の間にガルバノミラー５01を挿入し、励起光・ストークス光が反射してから対物レンズ10６に入射する構成とする。ここで、ガルバノミラーはコンピュータ13からの外部制御により設置角度が制御され、これにより励起光・ストークス光の光束の角度を制御することができる。ガルバノミラーにより角度が変化した励起光・ストークス光は試料中で角度変化前と異なる位置に集光され、CCDカメラの受光面においても発生したCARS光が異なる位置に入射される。ここでガルバノミラーの角度走査方向を、CCDカメラの受光面においてCARS光の位置が図２の縦方向（分光される方向と垂直な方向）に変化するように設定する。この場合、CARS光のビーム203が垂直方向に移動するが、上述のようにデータ取得時には垂直方向に積算されたデータが出力されるため、ビームの位置が変化しても出力信号には影響がない。他の軸はXYZステージ12を用いて走査する。この動作はMEMSミラーなどの他のスキャンミラーを用いても同様である。これらのスキャンミラーは通常、XYZステージなどに比べると高速に動作するため、これらを適用することにより、より高速な測定が可能である。【００３７】
また、本実施例で分光器は励起光・ストークス光の試料への入射側と反対側に配置されているが、同じ側に配置し、試料からの後方散乱光を対物レンズ106で平行光として分光器で検出してもよい。この場合、図６の模式図に示すように、励起光・ストークス光とＣＡＲＳ光が同軸となるため、ビームスプリッタ３０１などを用いてＣＡＲＳ光を励起光・ストークス光と分離する必要がある。【００３８】
本実施例では検出器としてＣＣＤカメラを想定したが、検出器はこの限りではなく、ＣＯＭＳカメラや１次元の検出器アレイであるラインセンサを用いた場合も同様の効果を得ることができる。【００３９】
本実施例は試料の位置ごとに異なるスペクトルを出力してイメージングが可能なものとなっているが、試料の１点あるいは複数点のスペクトルを分析する分光分析手段にも同一の方法が適用できることは言うまでもない。【００４０】
また、フォトニック結晶ファイバ103はスーパーコンティニューム光源を発生する別の光導波路で代用することが可能であり、例えばテーパファイバや、コア形の比較的小さなシングルモードファイバを用いてもよいし、必ずしもファイバの形態である必要すらなく、基板上に実装されたモードフィールド径10um以下程度の光導波路を用いてもよい。【００４１】
本実施例のパルスレーザ光源はスーパーコンティニューム光を十分に発生させるだけのパルスエネルギーをもつ必要がある。このために要求される仕様としては、パルス幅５ns以内、ピークパワー1kW以上、平均出力10mW以上のものが望ましい。このような条件を満たすレーザとして、モード同期チタンサファイアレーザなどが挙げられる。【００４２】
本実施例のロングパスフィルタは、スーパーコンティニューム光のうち短パルスレーザ光源の波長より短い波長の成分が遮断し、CARS光の検出の際のバックグラウンドレベルを十分に低減する目的で挿入されている。従って遮断する帯域における遮断の程度は、スーパーコンティニューム光のうち短パルスレーザ光源の波長より短い波長の成分が、分光器で検出される際にCARS光よりも同程度以下のレベルであるよう設定されていることが望ましい。本実施例ではOD６（すなわち減衰率10^-6）のフィルタで十分であることが確認されているが、信号量に応じて適切にする必要がある。【００４３】
本実施例のロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ等の光学フィルタは、誘電体多層膜で構成したバルク状のフィルタを想定したが、形態はこの限りではなく、例えばファイバブラッググレーティングのようなファイバ状のフィルタを用いてもよいし、回折格子やプリズムペア等により空間的に異なる波長成分を分離して、不要成分をナイフエッジ等で遮断する方法（非特許文献１にこのような構成が見られる）を用いても構わない。
【実施例２】
【００４４】
本実施例は、光源にフェムト秒レーザを用いる実施形態である。本実施例の構成は図１と基本的に同一であり、違いはレーザ光源がフェムト秒レーザである点と、ロングパスフィルタ106が特殊なバンドパスフィルタに置き換わっている点である。（なお、ここでフェムト秒レーザとは、パルス幅が５００ｆｓ以内であるものを指す。）このバンドパスフィルタは図７に示すような透過率特性を有しており、励起光の一部の狭いスペクトル成分と、スーパーコンティニューム光のうち励起光よりも波長の長い成分を透過する。励起光のスペクトル幅が広い場合、CARS光のスペクトルの波長分解能が低下する。このため本実施例のフィルタにより励起光のスペクトルを狭め、十分な波長分解能を確保している。本実施例ではフェムト秒レーザを使用することにより効率的にスーパーコンティニューム光を生成することができ、フォトニック結晶ファイバを短くすることができて構成の簡素化、低コスト化が可能である。
【実施例３】
【００４５】
本実施例は、試料から発生するCARS光をヘテロダイン検出する実施形態である。本実施例は実施例２と比べ、バンドパスフィルタの透過特性のみが異なる。本実施例のバンドパスフィルタの透過特性は、図８に示すように、実施例２のフィルタの透過帯域に加え、スーパーコンティニューム光の励起光より波長が短い成分にもわずかな透過率を有する。この成分は試料からのCARS光と干渉し、この干渉した光が分光器で検出される。このように被検出光を別の光（ローカルオシレータと呼ぶ）と干渉させて検出する方式はヘテロダイン検出と呼ばれ、信号レベルの増幅などの効果がある。（例えばCARS顕微鏡においては非特許文献４などに例が示されている。）ヘテロダイン検出においてはローカルオシレータと被検出光（本実施例では試料から発生するCARS光）の光軸を正確に一致させる必要があるが、本実施例ではローカルオシレータ、励起光、ストークス光が常に同軸の構成となっており、安定的に信号を取得することが可能である。
【実施例４】
【００４６】
本実施例は、本発明の光学分析装置を単一細胞解析に適用した生体分子解析装置の実施例であり、細胞解析の一つの形態としてＣＡＲＳスペクトルを取得する実施例である。【００４７】
図９、図１０は、本実施例に係る生体分子解析装置の構成例を示す模式図である。図９は本装置の光学系部分を示した概略図であり、図１０は生体分子採取システムの構成例を示す試料の周辺の詳細図である。図１０には遺伝子発現解析を行うために試料である細胞のｍＲＮＡを捕捉する生体分子採取システム２が含まれている。光学系部分及び生体分子採取システムはコンピュータ１１により制御され、またデータの取得が行われる。【００４８】
（光学系部分の説明）
図９に示した装置の光学系部分は、構成に加え、微分観察系と、細胞破壊用レーザ５（波長３５５ｎｍ、平均出力２Ｗ、繰り返し周波数５ｋＨｚのパルスレーザ）及びドライバ６０２、レーザ５からの出射光を励起光、ストークス光と同軸にするためのダイクロイックミラー６０３を備える。光学系部分には、（１）微分干渉顕微鏡像の取得、（２）ＣＡＲＳスペクトルの取得、（３）細胞の破壊、の３つの機能が含まれる。それぞれについて以下に説明する。（１）について、まず照明４０１（ハロゲンランプ）からの照明光を、ウォラストンプリズム４０２を通過させてからダイクロイックミラー４０３で反射させてコンデンサレンズ１１１によって試料１１０に集光し、試料１１０の微分干渉像を対物レンズ106、ダイクロイックミラー４０４、ウォラストンプリズム４０５、ポラライザ４０６、結像レンズ４０７を用いてＣＣＤカメラ４０８等の撮像装置上に結像させて試料のイメージを取得する。この構成はよく知られた微分干渉顕微鏡のそれと同一である。なお、ダイクロイックミラー４０３，４０４は照明４０１の可視光域の波長（４００−７００ｎｍ）は反射し、励起光、ストークス光、ＣＡＲＳ光（いずれも７００ｎｍ以上の近赤外域の波長を有する）は透過するように設計されており、ＣＡＲＳ信号の生成、検出には影響を及ぼさない。（２）の機能については実施例１で述べたとおりである。（３）の機能は、細胞破壊用レーザ５からの出射光を対物レンズ106により観測対象の細胞に集光し、細胞を破壊して細胞内部のｍＲＮＡ等の生体分子を外部に放出させる機能である。放出されたｍＲＮＡは、後述するように生体分子採取システム２により捕捉・解析される。【００４９】
（生体分子採取システムの説明）
図１０に示す生体分子採取システム２は、細胞から放出されたｍＲＮＡ等の生体分子を捕捉するための領域が配列したアレイデバイスを備える。例えば、単一細胞ごとにアレイデバイスの複数の領域にｍＲＮＡを捕捉し、アレイデバイスにおいて逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。本実施例では、アレイデバイスは、多数の貫通孔が面に垂直に形成された透明な多孔質メンブレンから構築され、以下、これを細孔アレイシート３０と呼ぶ。また、細孔アレイシート３０にｃＤＮＡライブラリーが形成されたものをｃＤＮＡライブラリー細孔アレイシートと呼ぶ。【００５０】
本実施例においては、細孔アレイシート３０として、直径０．２μｍの貫通孔が陽極酸化によって多数形成された、厚さ８０μｍ、大きさ２ｍｍ×２ｍｍの酸化アルミニウム製多孔質メンブレンを用いている。細孔アレイシート３０には、生体分子を捕捉する領域同士を分離するため分離壁３１を形成することができる。この分離壁３１は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、半導体プロセスにより形成することができ、厚さは８０μｍ程度で細孔アレイシート３０に密着させることができる。【００５１】
図１１は、細孔アレイシート３０の上面図である。細孔アレイシート３０（大きさ２ｍｍ×２ｍｍ、厚さ８０μｍ）には、多数の生体分子、例えばｍＲＮＡを捕捉するための領域３００が形成される。領域３００のサイズは、ここでは、一辺を１００μｍとし、間隔を８０μｍとしている（１８０μｍ周期で配置）。領域３００のサイズは、捕捉対象とする生体分子の量や面内での拡散しやすさ（分子の大きさ）に応じて１μｍ程度から１０ｍｍ程度まで自由に設計することが可能である。【００５２】
アレイデバイスとしては、アルミニウムを陽極酸化することによって形成した多孔質メンブレンからなる細孔アレイシート３０の他、シリコン等の材料を陽極酸化することによって多数の貫通孔を形成したものを用いても良い。さらに、半導体プロセスを用いて、シリコン酸化物やシリコン窒化物薄膜に多数の貫通孔を設けることによって、アレイデバイスを構築しても良い。【００５３】
図１０に示すように、細胞から放出される生体分子を、電気泳動によって細孔アレイシート３０における特定の領域まで導く手段として、ループ状の白金電極３２をシールド線３３の先端に接合している。白金電極３２の線材の直径は３０μｍであり、線材を２つ折にして、リード線接合部分を捻って一本化した後、ループ側を直径１００μｍの円形に加工する。このような電極を２つ作製し、細孔アレイシート３０を挟むように配置し、電源３５によって直流１．５Ｖを印加する。放出されるｍＲＮＡ３６は負の電荷を持つので、上側の白金電極３２を正極とする。ただし、銀−塩化銀の参照電極３９を設けて、下側の白金電極３２に０．２Ｖを印加する。このような操作によって、生体分子を捕捉する領域３００の内部にｍＲＮＡ３６を電気泳動によって誘導することができる。また、生体分子の捕捉効率をより向上するために、横方向の電気泳動によるｍＲＮＡの濃縮を実現するため、上側の白金電極３２のループの直径を５０μｍにしても良い。この場合、線材の直径は１０μｍとする。【００５４】
（動作フローの説明）
次に、本実施例に係る生体分子解析装置の動作フローについて説明する。図１２にフローチャートの一例を示す。【００５５】
最初に接着系培養細胞２１，２２，２３からなる試料をシャーレ２０に載せる。この実施例では測定対象が培養細胞であるから、シャーレ２０を使って事前に培養し、測定対象の細胞が底面に接着するようにする。試料が凍結切片の場合には、これをシャーレ２０の上に載せる。あるいは、複数の細胞をゲル中に３次元的に配置したものを試料としても良い。次に、顕微鏡システムを用いて、対象となる細胞群の微分干渉像を取得し、生体分子を採取、測定する対象細胞をユーザが決定する。次に、コンピュータ１１は、ユーザから測定対象とする細胞又は細胞の部分に関する情報の入力を受ける。一般に、ユーザは複数の細胞を測定対象とする場合が多い。その場合には、生体分子を捕捉する細胞の順序をコンピュータ１１が決定し、まず、１番最初に対象となった細胞が視野の中心に配置されるようにＸＹＺステージ１２を駆動する。ここで、実施例１に述べた方法により視野の中心に配置された細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、取得スペクトルから実施例１に述べる方法により得られた定量値データをコンピュータ１１に保存する。【００５６】
次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を用いて、ＣＡＲＳスペクトルを取得した細胞の近傍（図1０の例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，１）番地の領域３００）を接近させる。本実施例では細孔アレイシート３０の下面とシャーレ２０との間の距離を３００μｍに設定しているが、この距離は、採取する生体分子の種類や、電極構造によって変化させることができる。例えば、１μｍから１０ｍｍ程度が好適である。ＸＹＺステージ３４による細孔アレイシート３０の移動は、コンピュータ１１が事前のプログラムに従って自動的に行う。移動の完了をコンピュータ１１が確認した後、電気泳動用の白金電極３２に電圧を印加すると同時に、測定対象とする細胞の細胞膜を破壊するために、細胞破壊用レーザ光源５からのレーザ光を細胞に照射する。ここで照射時間は、例えば１０秒とし、電気泳動駆動時間は６０秒とすることができる。【００５７】
一つの細胞の破壊とその細胞中の生体分子の捕捉が終了した後、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ１２を駆動して登録された２番目の対象細胞を視野の中心に位置づける。その後、２番目の細胞のＣＡＲＳスペクトルを取得し、コンピュータ１１にデータを保存する。次に、コンピュータ１１は、ＸＹＺステージ３４を駆動して２番目の対象細胞の近傍（図1０の構成例では細胞の直上）に細孔アレイシート３０の特定の領域（例えば、（１，２）番地の領域３００）を接近させる。そして、コンピュータ１１に登録された２番目の細胞へ細胞破壊用レーザ５からのレーザ光を照射する。このとき、前記と同様に、同時に白金電極３２に電圧を印加する。その後、順次指定された細胞に対し、上記のＣＡＲＳスペクトル取得を行い、細胞を破壊して、その細胞中の生体分子を細孔アレイシート３０の特定の領域３００に捕捉した後、捕捉した生体分子を測定するための処理を実行する。最後に、微分干渉像における破壊された細胞に相当する部分と、細孔アレイシート３０における生体分子を捕捉した領域３００、取得したＣＡＲＳスペクトルとそこから取得した定量値を対応付けて、ユーザに提示する。【００５８】
ここでは破壊する細胞を１細胞としたが、より粗い分解能のデータを取得したい場合は、アレイデバイス上の一つの領域３００に対して、複数の細胞を破壊したときに放出され、電気泳動されるｍＲＮＡを捕捉しても良い。その際の破壊は複数の細胞を同時に破壊しても良いし、アレイデバイスを動かさずに１細胞ずつ順次破壊しても良い。また、本実施例ではＣＡＲＳスペクトルの取得と生体分子の捕捉を異なる細胞に対して順次行うフローとしたが、例えば試料の微分干渉像の取得後、対象となる細胞のＣＡＲＳスペクトルを全て測定したのち、各細胞を順次破壊して生体分子を補足する、というフローであっても構わない。【００５９】
本実施例により、個々の細胞に対してＣＡＲＳスペクトルと遺伝子発現データを取得することができる。この機能を利用して、細胞の動的特性を高い精度で確認することが可能となる。このような解析を実行するためのフローチャートを図１３に示す。【００６０】
まず、ＣＡＲＳスペクトルを取得する。取得したＣＡＲＳスペクトルと細胞の詳細な状態との対応を確認したいと考えた時点で、ユーザが選択した細胞について細胞を破壊し、その細胞内の生体分子をアレイデバイス上に捕捉して、その量を計測する。この生体分子の定量によって詳細な細胞の状態や種類を同定し、ＣＡＲＳスペクトルとの対応をとることによって、ＣＡＲＳスペクトルと細胞の状態や種類との対応付けを高精度に行うことが可能となる。ＣＡＲＳスペクトルは、通常単一細胞の解析に用いられる蛍光共焦点顕微鏡に比べてラマンスペクトルを取得可能であるという点で測定対象の化学種に対してより多くの情報を得ることが可能であり、このような高精度な解析が可能となる。【００６１】
次に、細胞の分類をＣＡＲＳスペクトルで行うための方法について示す。ＣＡＲＳスペクトルとそこから得られる定量値を取得後、例えば１８０個の細胞の２０個の遺伝子発現解析を行って、主因子分析を行い、上位２つの主因子についてプロットした図を図１４に示す。図中のＰＣはprincipal componentの略であり、ＰＣ１が第一の主因子、ＰＣ２が第２の主因子を指す。個々の点は１つの細胞の遺伝子発現データに対応する。多くの場合に細胞の状態や種類に対応して複数のクラスター（この例では６個のクラスター）に分かれる。図１４において、一つ一つの点は細胞に対応するので、どの細胞がどのような種類の細胞であるかをＣＡＲＳスペクトルだけでは判定できなくても、遺伝子発現解析データに基づいて対応させることができる。この対応付けをメモリに保存しておくことで、どのようなＣＡＲＳスペクトル、定量値が得られたときにどのような細胞の状態や種類になるかを判定させるような機械学習をコンピュータシステムにさせることができ、学習が完了した後はＣＡＲＳスペクトルと定量値の取得のみで細胞の状態や種類の分類が可能となる。【００６２】
なお、この例では、細胞の遺伝子発現に基づくクラスタリングに主因子分析を用いたが、階層的クラスタリングやk-means法等様々の方法を適用することができる。また、機械学習の方法としては、サポートベクタマシン等、データマイニングに用いられる様々な方法が知られており、それらのいずれを用いても良い。【００６３】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、構成が簡易で安定的に動作する分析装置を提供することが可能となり、医療や製薬分野における研究開発を加速することができる。
【符号の説明】
【００６５】
２：生体分子採取システム、５：細胞破壊用レーザ、１１：コンピュータ、２１，２２，２３：接着系培養細胞、３０：細孔アレイシート、３２：白金電極、１０１：短パルスレーザ光源、１０３：フォトニック結晶ファイバ、１０５：ロングパスフィルタ、１０６：対物レンズ、１０７：試料、１１０：分光器、１１１：分光部、１１２：検出部、２０１：ＣＣＤカメラ受光部、４０１：照明、４０７：結像レンズ、４０８：ＣＣＤカメラ、５０１：ガルバノミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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