(57)【要約】高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができ、高い細胞増殖効率を得ることの可能な動物細胞用培養液を提供する。動物細胞の呼吸において行われるＴＣＡ回路（tricarboxylic  acid  cycle）の代謝活性を高めるための動物細胞用培養液であって、ＴＣＡ回路を構成する要素であるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で有効成分として含有する動物細胞用培養液とする。
2015155975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の呼吸において行われるＴＣＡ回路（tricarboxylic  acid  cycle）の代謝活性を高めるための動物細胞用培養液であって、ＴＣＡ回路を構成する要素であるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で有効成分として含有することを特徴とする動物細胞用培養液。
【請求項２】
前記スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸が、イソロイシン、バリン、及びメチオニンであることを特徴とする請求項１記載の動物細胞用培養液。
【請求項３】
前記動物細胞が、ヒト由来リンパ球であることを特徴とする請求項１又は２記載の動物細胞用培養液。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の動物細胞用培養液をガス透過性容器に充填したことを特徴とする培養容器。
【請求項５】
前記ガス透過性容器の酸素透過度が６０００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上であることを特徴とする請求項４記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養技術に関し、特に動物細胞の増殖効率を向上させるための動物細胞用培養液、及び培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムからなる培養容器に細胞と培養液を封入して、細胞を閉鎖系で大量培養することが行われている。【０００３】
本出願人は、このような細胞培養において優れた細胞増殖効率を得るために、高ガス透過性を有する多層フィルムを開発し、これを用いた高ガス透過性培養容器を既に完成させている（特許文献１参照）。この高ガス透過性培養容器を用いて細胞培養を行えば、細胞の呼吸に必要なガス交換が効率的に行われると考えられ、細胞増殖効率が大きく向上するものと期待されていた。【０００４】
そこで、本出願人は、図１に示す、高ガス透過性培養容器である培養容器Ａ（酸素透過度９３００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）と、従来のガス透過性フィルムからなる通常の培養容器Ｂ（酸素透過度５２００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）とを用いて、ヒトのリンパ球を増殖させるための細胞培養を行った（後述する比較例１，２に対応）。その結果、図２に示すように、培養容器Ａと培養容器Ｂとで、細胞増殖効率がほとんど変わらないことを示すデータが得られた。
その理由は定かではなかったが、細胞培養において高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができるだけの酸素呼吸が行われていないのではないかということが推測された。また、十分な酸素呼吸が行われていない理由として、培養に用いた培養液に酸素呼吸に必要な栄養素が足りていないのではないかということが考えられた。【０００５】
ここで、細胞は増殖の際に、呼吸により産生したエネルギーを利用しているが、この呼吸には、解糖系と酸化的リン酸化があり、これらによってＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の生産が行われている。
解糖系は嫌気的代謝であり、グルコースをピルビン酸に変換する過程で、グルコース１分子毎に２ＡＴＰを生産し、ピルビン酸から乳酸が生成する。乳酸が生成すると培養液のｐＨが下がるため、増殖効率は低下する。
酸化的リン酸化は好気的（酸素を利用する）代謝であり、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換してＴＣＡ回路（tricarboxylic  acid  cycle）に供給し、乳酸は生成せず、ＴＣＡ回路で産生されたＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（nicotinamide  adenine  dinucleotide））などを電子伝達系に供給して、グルコース１分子毎に３８ＡＴＰを生産する。このように好気的環境下では酸化的リン酸化が行われることによってエネルギー生産効率が向上するため、グルコースの消費量は減少する。【０００６】
ところが、好気呼吸を行う細胞であっても、あえて酸素を使用しない場合がある。例えば、癌細胞は、好気的環境下においても酸化的リン酸化ではなく、解糖系によってＡＴＰを生産する。これは、癌細胞では分裂が旺盛に行われるため、エネルギー生産に有利な酸化的リン酸化よりも、核酸やＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（nicotinamide  adenine  dinucleotide  phosphate））の生産に有利な解糖系（ペントース-リン酸経路を含む）をあえて使っていると考えられている。【０００７】
前述したリンパ球の培養では、乳酸が多く産生されていたことから、解糖系が積極的に使用され、高ガス透過性培養容器の性能を十分に生かすことができるだけの酸化的リン酸化が行われなかったのではないかと推測された。
しかしながら、高ガス透過性培養容器の性能を十分に生かすことができるだけの酸化的リン酸化が行われれば、期待通りに細胞の増殖効率が向上するか否かは、定かではなかった。また、どのようにすれば、細胞の呼吸における酸化的リン酸化の割合を高めることができるのかも不明であった。【０００８】
このような細胞の呼吸における酸化的リン酸化の割合を高めることに関連する記載のある先行技術文献として、特許文献２及び特許文献３を挙げることができる。
特許文献２には、哺乳類細胞の増殖時のグルコース消費、乳酸塩形成を減少させる方法が開示されている。具体的には、１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸又はクエン酸塩の存在下で、血清不含培地において培養が行われる哺乳類細胞の培養によりタンパク質を産生する方法が開示されている。この方法によれば、細胞の増殖時のグルコース消費と乳酸塩形成を減少できるため、細胞の呼吸における酸化的リン酸化の割合は高まっていると考えられる。
また、特許文献３には、血清を用いずに限られたアミノ酸の添加のみで細胞増殖を改善するための無血清培養用培地であって、アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸，イソロイシン，ロイシン，リジン，セリン，スレオニン，バリンを添加したものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５１９１９７０号公報
【特許文献２】特許第５３４４０９４号公報
【特許文献３】特開２００４−２７５０４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これらの特許文献に記載の技術では、高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させて、細胞の増殖効率を大きく向上させることは困難であった。
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、培養液にＴＣＡ回路を構成する要素であるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で有効成分として含有させることで、細胞の呼吸におけるＴＣＡ回路の代謝活性を向上させ、酸化的リン酸化の割合を高め得ることを見いだした。そして、この培養液を充填した高ガス透過性培養容器を用いて細胞培養を行った場合に、通常のガス透過性培養容器を用いた場合に比較して、細胞増殖効率を顕著に向上させることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができ、高い細胞増殖効率を得ることの可能な動物細胞用培養液、及び培養容器の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明の動物細胞用培養液は、動物細胞の呼吸において行われるＴＣＡ回路（tricarboxylic  acid  cycle）の代謝活性を高めるための動物細胞用培養液であって、ＴＣＡ回路を構成する要素であるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で有効成分として含有する構成としてある。
また、本発明の培養容器は、本発明の動物細胞用培養液をガス透過性容器に充填した構成としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができ、高い細胞増殖効率を得ることの可能な動物細胞用培養液、及び培養容器を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器の酸素透過度を表すグラフを示す図である。
【図２】高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器に従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填して細胞培養を行った結果を示す図である。
【図３】細胞の呼吸において行われるＴＣＡ回路を説明するための図である。
【図４】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液のアミノ酸組成を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養による培養細胞数の比較結果を表す折れ線グラフを示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養による培養細胞数の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養によるグルコース消費率の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養による乳酸産生率の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係る各動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液のアミノ酸組成を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る各種動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器を用いた細胞培養による細胞増殖率の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【図１１】二種類の高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器の酸素透過度を表すグラフを示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に係る各種動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した二種類の高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養による細胞増殖率の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液等のアミノ酸組成を示す図である。
【図１４】本発明の実施形態に係る各動物細胞用培養液の組成を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態に係る各種動物細胞用培養液と従来の動物細胞用培養液をそれぞれ充填した高ガス透過性培養容器を用いた細胞培養による細胞増殖率の比較結果を表す棒グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の動物細胞用培養液の一実施形態について、詳細に説明する。
本実施形態に係る動物細胞用培養液は、動物細胞の呼吸において行われるＴＣＡ回路の代謝活性を高めるための動物細胞用培養液であって、必須アミノ酸を、６．０ｍｍｏｌ／Ｌ〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で有効成分として含有する。
本実施形態における必須アミノ酸は、完全必須アミノ酸と準必須アミノ酸を含む１２種類のアミノ酸を意味し、具体的には、システイン、トレオニン、トリプトファン、ロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、及びフェニルアラニンである。本実施形態に係る動物細胞用培養液には、これら全ての必須アミノ酸が含まれる。
【００１５】
動物細胞用培養液における必須アミノ酸の含有量が多いほど、細胞増殖効率が向上するわけではない。すなわち、アミノ酸が代謝される際に窒素系老廃物としてアンモニアが発生するため、これが培養液に蓄積すると、培養液のｐＨが上昇して培養環境が悪化し、細胞の増殖が阻害されるためである。それゆえに、動物細胞用培養液を作成するにあたっては、アミノ酸の総含有量は低く抑えた方が良い。
このような観点から細胞増殖効率を好適に向上させるため、本実施形態の動物細胞用培養液における必須アミノ酸の含有割合を、６．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１３ｍｍｏｌ／Ｌとすることがより好ましく、６．９ｍｍｏｌ／Ｌ〜１１ｍｍｏｌ／Ｌとすることがさらに好ましい。
【００１６】
細胞の呼吸におけるＴＣＡ回路は、図３に示すように、その構成分子として、スクシニルＣｏＡ（ＳｕｃｃｉｎｙｌＣｏＡ）、α-ケトグルタル酸、ピルビン酸などのカルボン酸を有している。
本実施形態に係る動物細胞用培養液によれば、必須アミノ酸を上記の濃度範囲で含有することにより、従来の動物細胞用培養液に比べて、ＴＣＡ回路の構成分子であるカルボン酸に代謝される炭素源の供給量を増加させ、細胞の呼吸における酸化的リン酸化を活性化させることが可能になっている。
そして、これによって、本実施形態に係る動物細胞用培養液は、細胞の酸素需要を増加させ、ガス透過性培養容器の性能に見合った細胞増殖効率を実現できるものとなっている。
【００１７】
本実施形態に係る動物細胞用培養液に含有される必須アミノ酸において、ＴＣＡ回路の構成分子であるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含有させることが好ましく、２．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌとすることがより好ましく、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌとすることがさらに好ましい。
本実施形態に係る動物細胞用培養液に、スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸をこのような濃度範囲で含有させることによって、細胞増殖効率を特に向上させることが可能となる。
【００１８】
スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸としては、イソロイシン、バリン、及びメチオニンの少なくともいずれかを用いることが好ましく、これらの全てを用いることがより好ましい。
【００１９】
本実施形態に係る動物細胞用培養液に含有される必須アミノ酸において、ＴＣＡ回路の構成分子であるα-ケトグルタル酸に代謝されるアミノ酸の含有量を増加させることによって、細胞増殖効率を向上させることも可能である。
α-ケトグルタル酸に代謝されるアミノ酸としては、アルギニン、及びヒスチジンの少なくともいずれかを用いることが好ましく、これらの全てを用いることがより好ましい。
【００２０】
本実施形態に係る動物細胞用培養液に含有される必須アミノ酸において、ＴＣＡ回路の構成分子であるピルビン酸に代謝されるアミノ酸の含有量を増加させることによって、細胞増殖効率を向上させることも可能である。
ピルビン酸に代謝されるアミノ酸としては、システイン、トレオニン、及びトリプトファンの少なくともいずれかを用いることが好ましく、これらの全てを用いることがより好ましい。
【００２１】
ここで、本実施形態に係る動物細胞用培養液にスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸を上記の濃度範囲で含有させることにより、細胞増殖効率を特に向上させることができる理由は定かではないが、ＴＣＡ回路におけるスクシニルＣｏＡに至る反応の進みにくいことが原因の一つと考えられる。
すなわち、ＴＣＡ回路の調節酵素であるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（イソクエン酸をα-ケトグルタル酸に変換）と、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-ケトグルタル酸をスクシニルＣｏＡに変換）という代謝を調節する酵素が直前に２つあることから、スクシニルＣｏＡに至る反応は進みにくい。当該動物細胞用培養液によれば、スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸が多量に供給されるため、ＴＣＡ回路における滞り易い部分の反応が進み易くなり、細胞増殖効率を特に向上できたと考えられる。
また、スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸が、ＴＣＡ回路を経て合成される物質の炭素源として供給されることも原因の一つと考えられる。特に、これらのアミノ酸は、スクシニルＣｏＡに代謝された後、アミノレブリン酸合成に用いられると考えられる。アミノレブリン酸はポルフィリン合成を経てヘムに変換され、電子伝達系に必要なシトクロムｃなどの合成に利用される。電子伝達系はＴＣＡ回路で発生したＮＡＤＨを消費し、ＡＴＰを生産する代謝経路であるため、シトクロムの合成が強化されることによって、より迅速にエネルギーが生産されることになる。さらに、過剰なＮＡＤＨはＴＣＡ回路を阻害するため、電子伝達系強化によりＮＡＤＨが消費されることで、ＴＣＡ回路全体が淀みなく流ようになると考えられる。
【００２２】
このような観点から、本実施形態に係る動物細胞用培養液において、ＴＣＡ回路にスクシニルＣｏＡを供給可能なその他の各種栄養素を含有させることにより、細胞増殖効率を向上させることも好ましい。
このような栄養素として、例えば上述したα-ケトグルタル酸を供給するアミノ酸を挙げることができ、アルギニン、及びヒスチジンの他、グルタミン、グルタミン酸、プロリン等を挙げることができる。
また、このような栄養素として、奇数炭素脂肪酸とそれを含む脂質（トリグリセリド、リン脂質）、エステルを挙げることもできる。奇数炭素脂肪酸は炭素鎖が奇数個の脂肪酸をさし、プロピオン酸、ペラルゴン酸等を挙げることができる。
【００２３】
本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いて培養する動物細胞は、特に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞(ＥＳ細胞)、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮細胞、筋細胞、心筋細胞、骨芽細胞、膵島β（ベータ）細胞等を挙げることができる。本実施形態に係る動物細胞用培養液によれば、特に、ヒト由来リンパ球などのリンパ球細胞や、モノクローナル抗体などを産生するハイブリドーマ等を好適に増殖させることが可能である。
【００２４】
本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いて行う細胞培養は、流加培養、バッチ培養、及び連続培養のいずれにも適用することが可能である。
【００２５】
本実施形態に係る培養容器は、本実施形態に係る動物細胞用培養液をガス透過性容器に充填したことを特徴とする。
特に、本実施形態に係る動物細胞用培養液を高ガス透過性培養容器に充填して細胞培養を行うことによって、細胞培養効率を顕著に向上させることが可能である。
このような高ガス透過性培養容器の酸素透過度としては、６０００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上とすることが好ましく、７５００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上とすることがより好ましく、９０００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上とすることがさらに好ましい。
【００２６】
以上説明したように、本実施形態に係る動物細胞用培養液及び培養容器によれば、所定の濃度の必須アミノ酸によりＴＣＡ回路を活性化させて細胞の酸素需要を増加させることができ、ガス透過性培養容器の性能を十分に生かすことができる結果、そのガス透過性に見合った高い細胞増殖効率を得ることが可能となる。特に、本実施形態に係る動物細胞用培養液は、高ガス透過性培養容器に充填して用いられた場合に、その効果をより大きく発揮でき、優れた細胞増殖効率を実現することが可能である。
また、ＴＣＡ回路を活性化させることによって、代謝老廃物（乳酸）の産生を抑制することができ、糖（グルコース）の消費も抑制することが可能である。
さらに、代謝老廃物の産生と糖の消費を抑制できる結果、培養に必要な培養液の量を低減することも可能である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施形態に係る動物細胞用培養液及び培養容器の効果を確認するために行った実験について、図４〜図１２を参照して説明する。【００２８】
［実験１］
本実施形態に係る動物細胞用培養液を充填した高ガス透過性培養容器を用いた細胞培養（実施例１）と、本実施形態に係る動物細胞用培養液を充填した通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養（実施例２）と、従来の動物細胞用培養液を充填した高ガス透過性培養容器を用いた細胞培養（比較例１）と、従来の動物細胞用培養液を充填した通常のガス透過性培養容器を用いた細胞培養（比較例２）とを、それぞれ以下の条件で行った。【００２９】
（１）動物細胞用培養液
まず、従来の動物細胞用培養液として、ＡＬｙＳ培地（ALyS505N-7，株式会社細胞科学研究所製）を使用した。そのアミノ酸組成を図４における「ＡＬｙＳ」の欄に示す。ＡＬｙＳ培地における必須アミノ酸の濃度は、６．０５ｍｍｏｌ／Ｌであり、スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸の濃度は１．８ｍｍｏｌ／Ｌであった。
次に、本実施形態に係る動物細胞用培養液として、ＡＬｙＳ培地に必須アミノ酸１２種類を所定の濃度となるように添加したものを使用した。そのアミノ酸組成を図４における「＋必須アミノ酸」の欄に示す（以下、本実施形態に係る動物細胞用培養液を、＋必須アミノ酸と称する場合がある）。＋必須アミノ酸における必須アミノ酸の濃度は、９．５１ｍｍｏｌ／Ｌであり、スクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸の濃度は２．７ｍｍｏｌ／Ｌであった。【００３０】
（２）培養容器
高ガス透過性培養容器として、図１に記載の高ガス培養容器Ａ（酸素透過度９３００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）を使用した。高ガス培養容器ＡはＬＬＤＰＥ（直鎖状低密度ポリエチレン）製でサイズは２００ｍｍ×２００ｍｍであった。
また、通常のガス透過性培養容器として、同図に記載の培養容器Ｂ（酸素透過度５２００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）を使用した。培養容器ＢはＥＶＡ（エチレン−酢酸ビニル共重合樹脂）製でサイズは２００ｍｍ×２００ｍｍであった。【００３１】
（３）実験方法
まず、細胞の増殖培養に先立って、細胞の活性化培養を行った。具体的には、ポリスチレン製ディッシュに抗ＣＤ３抗体を固相化し、培養液としてＡＬｙＳ培地に血清を添加したもの（ALyS505N-7+血清10%）を用いた。ヒト末梢血単核球細胞（hPBMC，Cell  Applications.Inc製）２９６×１０４ｃｅｌｌｓを前記培養液と共に前記ディッシュに播種した。そして、３７℃、５％ＣＯ２濃度で、３日間インキュベータで培養した。【００３２】
次に、活性化された細胞の増殖培養を行った。具体的には、各実施例及び比較例毎に、それぞれ前述した培養容器に活性化された細胞と動物細胞用培養液５００ｍｌを注入して、３７℃、５％ＣＯ２濃度で、１１日間インキュベータで培養した。
そして、活性化を含めた培養開始から７２．５時間後、１４５．５時間後、２３８．５時間後、及び３３６．５時間後に、細胞数を計数した。細胞数の計数は、血球計算板を用いて行った。
また、培養開始時と培養期間終了時（３３６．５時間後）に、グルコース濃度及び乳酸濃度を測定した。グルコース濃度の測定は、ｉＳＴＡＴ  ＣＧ８＋（扶桑薬品工業株式会社製）を、乳酸濃度の測定はｉＳＴＡＴ  ＣＧ４＋（扶桑薬品工業株式会社製）を用いて行った。そして、単位細胞増殖（１０８cells）当たりのグルコース消費量（mg）及び乳酸産生量（mg）を算出することにより、グルコース消費率及び乳酸産生率を算出した。【００３３】
（４）実験結果
図５に示すように、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋必須アミノ酸）を用いた場合、高ガス透過性培養容器（高ガス培養容器Ａ）で培養された細胞数（実施例１）は、通常のガス透過性培養容器（培養容器Ｂ）で培養された細胞数（実施例２）よりも大きく増加していることがわかる。
すなわち、従来の動物細胞用培養液（ＡＬｙＳ）を用いた場合は、高ガス透過性培養容器で培養された細胞数（比較例１）と、通常のガス透過性培養容器で培養された細胞数（比較例２）とにほとんど変わりがなかったが、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いることによって、高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができ、細胞の増殖効率をより向上できたことがわかる。【００３４】
図６は、各実施例及び比較例の培養期間終了時の培養細胞数を比較した棒グラフである。本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いた場合、高ガス透過性培養容器で培養された細胞数（実施例１：１４１,６００×１０４）は、通常のガス透過性培養容器で培養された細胞数（実施例２：１１１,８００×１０４）に比べて、３０％近く多くなっている。
また、この通常のガス透過性培養容器で培養された細胞数（実施例２）は、従来の動物細胞用培養液を用いた場合の通常のガス透過性培養容器で培養された細胞数（比較例２：９１,３００×１０４）に比べて、２０％以上多くなっている。
すなわち、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いることによって、通常のガス透過性培養容器による細胞増殖効率を向上でき、高ガス透過性培養容器による細胞増殖効率を一層向上できたことがわかる。【００３５】
また、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いた場合の高ガス透過性培養容器で培養された細胞数（実施例１）は、従来の動物細胞用培養液を用いた場合の高ガス透過性培養容器で培養された細胞数（比較例１：８６,３００×１０４）に比べて、６０％以上多くなっている。
したがって、本実施形態に係る動物細胞用培養液によれば、高ガス透過性培養容器の性能を十分に発揮させることができ、細胞増殖効率を顕著に増加させることができたことがわかる。【００３６】
ここで、細胞の増殖は、培養容器のガス透過度と細胞の呼吸活性（酸素利用能）の低い方に制されることになる。
従来の動物細胞用培養液を用いた場合、細胞の呼吸活性が、高ガス透過性培養容器及び通常のガス透過性培養容器の両方のガス透過度を下回っており、そのために比較例１と比較例２で差がほとんど生じなかったと考えられる。
一方、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いた場合、細胞の呼吸活性が高められてガス透過度を上回った結果、実施例１と実施例２で細胞増殖効率が向上したと考えられる。【００３７】
また、通常のガス透過性培養容器については、従来の動物細胞用培養液を用いた場合には、低い呼吸活性が細胞増殖効率の制限要因であったのが、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いることにより、細胞の呼吸活性が高められて培養容器のガス透過度が細胞増殖効率の制限要因に変わり、その差分が、比較例２から実施例２への細胞増殖効率の向上として現れたと考えられる。【００３８】
また、図７は、各実施例及び比較例の培養期間終了時の細胞増殖分あたりのグルコース消費量（Ｇｌｃ消費量（mg）／細胞増殖分（１０８cells），グルコース消費率）を比較した棒グラフである。
本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋必須アミノ酸）を用いた場合、高ガス透過性培養容器での細胞培養によるグルコース消費率（実施例１）は、通常のガス透過性培養容器での細胞培養によるグルコース消費率（実施例２）に比べて、２０％近く小さくなっている。また、実施例１のグルコース消費率は、従来の動物細胞用培養液（ＡＬｙＳ）を用いた場合の高ガス透過性培養容器での細胞培養によるグルコース消費率（比較例１）に比べて、２０％以上小さくなっている。
すなわち、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いることによって、グルコースの消費が抑制されていることから、細胞の呼吸における酸化的リン酸化が活性化され、細胞培養における酸素需要が上昇したことがわかる。【００３９】
また、図８は、各実施例及び比較例の培養期間終了時の細胞増殖分あたりの乳酸生産量（Ｌａｃ産生量（mg）／細胞増殖分（１０８cells），乳酸産生率）を比較した棒グラフである。
本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋必須アミノ酸）を用いた場合、高ガス透過性培養容器での細胞培養による乳酸産生率（実施例１）は、通常のガス透過性培養容器での細胞培養による乳酸産生率（実施例２）に比べて、２０％近く小さくなっている。また、実施例１の乳酸産生率は、従来の動物細胞用培養液（ＡＬｙＳ）を用いた場合の高ガス透過性培養容器での細胞培養による乳酸産生率（比較例１）に比べて、３０％以上小さくなっている。
すなわち、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いることによって、乳酸の産生が抑制されていることから、細胞の呼吸における酸化的リン酸化が活性化され、細胞培養における酸素需要が上昇したことがわかる。【００４０】
［実験２］
本実施形態に係る動物細胞用培養液に含有される必須アミノ酸において、ＴＣＡ回路の構成分子に代謝される所定のアミノ酸の含有量を増加させた場合の細胞増殖効率を確認するための実験を以下の条件で行った。【００４１】
（１）動物細胞用培養液
従来の動物細胞用培養液として、実験１と同様のＡＬｙＳ培地を使用した（比較例３）。
本実施形態に係る動物細胞用培養液として、ＡＬｙＳ培地に必須アミノ酸１２種類を実験１と同様に添加したもの（＋必須アミノ酸，実施例３）と、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸である（イソロイシン、バリン、メチオニン）を添加したもの（以下、＋スクシニルＣｏＡと称する場合がある，実施例４）と、ＡＬｙＳ培地にα-ケトグルタル酸に代謝される必須アミノ酸である（アルギニン、ヒスチジン）を添加したもの（以下、＋α-ケトグルタル酸と称する場合がある，実施例５）と、ＡＬｙＳ培地にピルビン酸に代謝される必須アミノ酸である（システイン、トレオニン、トリプトファン）を添加したもの（以下、＋ピルビン酸と称する場合がある，実施例６）を使用した。【００４２】
本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）のアミノ酸組成を図９における「＋スクシニルＣｏＡ」の欄に示す。
＋スクシニルＣｏＡは、＋必須アミノ酸における添加量と同量のイソロイシン、バリン、メチオニンをＡＬｙＳ培地に添加して作成した。
また、＋α-ケトグルタル酸と＋ピルビン酸についても、それぞれ添加するアミノ酸を、＋必須アミノ酸における添加量と同量でＡＬｙＳ培地に添加して作成した。【００４３】
（２）培養容器
高ガス透過性培養容器として、図１に記載の高ガス培養容器Ａ（酸素透過度９３００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）を使用した。【００４４】
（３）実験方法
実験１と同様にして、ヒト末梢血単核球細胞（hPBMC，Cell  Applications.Inc製）を活性化した後、増殖培養を行った。ただし、実験１とは異なるロットの細胞のため、細胞の呼吸活性（酸素利用能）は実験１とは異なる。
そして、培養期間終了時の細胞数を計数し、培養期間開始時の細胞数に対する増殖率を算出した。【００４５】
（４）実験結果
図１０に示すように、比較例３の増殖率は３４６．５倍であった。また、＋必須アミノ酸の増殖率は３８３．６倍（実施例３）、＋スクシニルＣｏＡの増殖率は４１０．８倍（実施例４）、＋α-ケトグルタル酸の増殖率は３７５．１倍（実施例５）、＋ピルビン酸の増殖率は３６４．５倍（実施例６）であった。
すなわち、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いた場合の細胞増殖率の、比較例３に対する上昇率は、＋必須アミノ酸では１０．７％（実施例３）、＋スクシニルＣｏＡでは１８．６％（実施例４）、＋α-ケトグルタル酸では８．３％（実施例５）、＋ピルビン酸では５．２％（実施例６）であった。
このことから、従来の動物細胞用培養液に対して、必須アミノ酸のうち、上記所定のアミノ酸のみを添加した場合でも、細胞増殖効率を向上できることがわかった。【００４６】
特に、イソロイシン、バリン、及びメチオニンを添加した＋スクシニルＣｏＡによる細胞増殖効率の上昇率は、＋必須アミノ酸よりも７０％以上大きくなっている。
したがって、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）によれば、細胞増殖効率を顕著に上昇できることがわかった。【００４７】
［実験３］
本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）による細胞増殖効率の向上効果を確認するための実験を以下の条件で行った。【００４８】
（１）動物細胞用培養液
従来の動物細胞用培養液として、実験１と同様のＡＬｙＳ培地を使用した（比較例４〜６）。
本実施形態に係る動物細胞用培養液として、ＡＬｙＳ培地に必須アミノ酸１２種類を実験１と同様に添加したもの（＋必須アミノ酸，実施例７〜９）と、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸であるイソロイシン、バリン、メチオニンを実験１と同様に添加したもの（＋スクシニルＣｏＡ，実施例１０〜１２）と、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸であるイソロイシン、バリン、メチオニンを実験１の２倍量添加したもの（以下、＋スクシニルＣｏＡ×２と称する場合がある，実施例１３〜１５）を使用した。【００４９】
（２）培養容器
実験３で用いた培養容器を図１１に示す。
高ガス透過性培養容器（高ガス培養容器Ａ）は、図１に記載のものと同様のもの（酸素透過度９３００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）であり、通常のガス透過性培養容器（培養容器Ｂ）も、図１に記載のものと同様のもの（酸素透過度５２００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）である。
さらに、高ガス透過性培養容器（高ガス培養容器Ｃ）として、酸素透過度７２３０ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍのものを使用した。高ガス培養容器ＣはＬＬＤＰＥ（直鎖状低密度ポリエチレン）製、サイズは２００ｍｍ×２００ｍｍであった。【００５０】
（３）実験方法
実験１と同様にして、ヒト末梢血単核球細胞（hPBMC，Cell  Applications.Inc製）を活性化した後、増殖培養を行った。ただし、実験１とは異なるロットの細胞のため、細胞の呼吸活性（酸素利用能）は実験１とは異なる。また、培養期間は、１４日間（３３６時間）とした。
そして、培養期間終了時の細胞数を計数し、培養期間開始時の細胞数に対する増殖率を算出した。【００５１】
（４）実験結果
図１２に示すように、従来の動物細胞用培養液を用いた場合、細胞増殖率は、高ガス透過性培養容器（高ガス培養容器Ａ）、通常のガス透過性培養容器（培養容器Ｂ）、及び高ガス透過性培養容器（高ガス培養容器Ｃ）毎に、それぞれ８８０．６倍（比較例４）、７９０．７倍（比較例５）、８５３．３倍（比較例６）であった。
また、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋必須アミノ酸）を用いた場合、細胞増殖率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ９１０．７倍（実施例７）、８０６．４倍（実施例８）、８９３．７倍（実施例９）であった。
したがって、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋必須アミノ酸）を用いた場合の細胞増殖率の、従来の動物細胞用培養液を用いた場合に対する上昇率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ３．４％（実施例７）、２．０％（実施例８）、４．７％（実施例９）であった。【００５２】
また、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）を用いた場合、細胞増殖率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ９１７．３倍（実施例１０）、７７３．７倍（実施例１１）、８９９．２倍（実施例１２）であった。
したがって、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）を用いた場合の細胞増殖率の、従来の動物細胞用培養液を用いた場合に対する上昇率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ４．２％（実施例１０）、−２．２％（実施例１１）、５．４％（実施例１２）であった。【００５３】
また、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ×２）を用いた場合、細胞増殖率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ９５７．７倍（実施例１３）、７８８．５倍（実施例１４）、８５７．７倍（実施例１５）であった。
したがって、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ×２）を用いた場合の細胞増殖率の、従来の動物細胞用培養液を用いた場合に対する上昇率は、高ガス培養容器Ａ、培養容器Ｂ、及び高ガス培養容器Ｃ毎に、それぞれ８．７％（実施例１３）、−０．３％（実施例１４）、０．５％（実施例１５）であった。【００５４】
ここで、前述したように、細胞の増殖は、培養容器のガス透過度と細胞の呼吸活性（酸素利用能）の低い方に制されることとなり、細胞の呼吸活性の個体差の影響を強く受けるところ、実験３において使用した細胞は、従来の動物細胞用培養液を用いた場合に、呼吸活性が培養容器Ｂのガス透過度を上回っていたと考えられる。
このため、培養容器Ｂによる細胞培養（実施例８，１１，１４）では、培養容器Ｂのガス透過度が細胞増殖効率の制限要因となり、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いても細胞の呼吸活性をそれ以上高められなかったと考えられる。
これに対して、高ガス培養容器Ａと高ガス培養容器Ｃでは、細胞の呼吸活性に比べて、ガス透過度に余力があり、細胞の呼吸活性をより高めることができた結果、細胞増殖効率を向上できたと考えられる。
すなわち、高ガス培養容器Ａによる細胞培養（実施例７，１０，１３）、及び高ガス培養容器Ｃによる細胞培養（実施例９，１２，１５）では、ガス透過度が細胞の呼吸活性を上回っていたために、その差分が細胞増殖効率の向上として現れたと考えられる。【００５５】
［実験４］
本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）による細胞増殖効率の向上効果を確認するための実験を、さらに以下の条件で行った。【００５６】
（１）動物細胞用培養液
従来の動物細胞用培養液として、図１３に示すＡＬｙＳ培地を使用した（スクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸濃度１．８ｍｍｏｌ／Ｌ，比較例７）。このＡＬｙＳ培地は、実験１で用いたものと同様である。
また、本実施形態に係る動物細胞用培養液として、図１４に示すように、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸であるイソロイシン、バリン、メチオニンを実験１と同様に添加したもの（＋スクシニルＣｏＡ×１，スクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸濃度２．７ｍｍｏｌ／Ｌ，実施例１６）と、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸であるイソロイシン、バリン、メチオニンを実験１６の追加量の２倍量添加したもの（以下、＋スクシニルＣｏＡ×２，スクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸濃度３．６ｍｍｏｌ／Ｌ，実施例１７）と、ＡＬｙＳ培地にスクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸であるイソロイシン、バリン、メチオニンを実験１６の追加量の４倍量添加したもの（以下、＋スクシニルＣｏＡ×４，スクシニルＣｏＡに代謝される必須アミノ酸濃度５．４ｍｍｏｌ／Ｌ，実施例１８）を使用した。【００５７】
（２）培養容器
培養容器には、高ガス透過性培養容器として、図１に記載の高ガス培養容器Ａ（酸素透過度９３００ｍｌ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）を使用した。【００５８】
（３）実験方法
実験１と同様にして、ヒト末梢血単核球細胞（hPBMC，タカラバイオ株式会社製）を活性化した後、増殖培養を行った。ただし、実験１とは異なるロットの細胞のため、細胞の呼吸活性（酸素利用能）は実験１とは異なる。また、培養期間は、１２日間（活性化培養を３日、増幅培養を９日、合計２８４時間）とした。
そして、培養期間終了時の細胞数を計数し、培養期間開始時の細胞数に対する増殖率を算出した。【００５９】
（４）実験結果
図１５に示すように、比較例７の増殖率は６２６．７倍であった。また、＋スクシニルＣｏＡ×１の増殖率は６５８．１倍（実施例１６）、＋スクシニルＣｏＡ×２の増殖率は６４７．１倍（実施例１７）、＋スクシニルＣｏＡ×４の増殖率は６３４．８倍（実施例１８）であった。
すなわち、本実施形態に係る動物細胞用培養液を用いた場合の細胞増殖率の、比較例７に対する上昇率は、＋スクシニルＣｏＡ×１では５．０％（実施例１６）、＋スクシニルＣｏＡ×２では３．３％（実施例１７）、＋スクシニルＣｏＡ×４では１．３％（実施例１８）であった。
このことから、本実施形態に係る動物細胞用培養液（＋スクシニルＣｏＡ）によれば、細胞増殖効率を向上できることが再度確認された。【００６０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態に係る動物細胞用培養液におけるスクシニルＣｏＡに代謝されるアミノ酸の配合割合を実施例とは異なるものとしたり、あるいはスクシニルＣｏＡに代謝されるその他の成分を添加したりするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、閉鎖系の培養容器を用いて、細胞を大量に生産する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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