(57)【要約】本発明は、組換え蛋白質の分泌生産量を向上し、より安価に組換え蛋白質を調製することが可能であり、工業化規模にスケールアップ可能なブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法を提供する。本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を、前記ブレビバチルス属細菌の対数増殖期初期以降から弱アルカリ性条件で培養する工程を含む、組換え蛋白質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を、前記ブレビバチルス属細菌の対数増殖期初期以降から弱アルカリ性条件で培養する工程を含む、組換え蛋白質の製造方法。
【請求項２】
弱アルカリ性条件がｐＨ７．５以上８．１以下である、請求項１に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項３】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌がブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）である、請求項１または２に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項４】
組換え蛋白質が抗体結合性蛋白質である、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項５】
抗体結合性蛋白質がプロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメイン、またはｂｅｔａ−３ドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体である、請求項４に記載の組換え蛋白質の製造方法。
【請求項６】
グルコースを含む培地を使用する、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えブレビバチルス属細菌を使用した、組換え蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え微生物を培養することにより、微生物、動物又は植物等由来の様々な有用蛋白質が工業的規模で製造されている。遺伝子組換え微生物の宿主としては様々な種類の微生物が利用されているが、その中でブレビバチルス属細菌は目的蛋白質を細胞外に分泌発現させることが可能であり、種々の異種蛋白質の製造に用いられている（非特許文献１）。菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上および培養時の菌体の高密度化のために種々の培養条件の検討が行われている（特許文献１）。【０００３】
一般に、微生物にはそれぞれ生育に適したｐＨの範囲が存在する。特に組換え蛋白質を生産する場合、宿主となる微生物にとって好適なｐＨ範囲で培養を行うことは一般的である。例えば、有用蛋白質の生産を目的とした遺伝子組換え大腸菌の培養においては、培養中の培地のｐＨを６．８〜７．２に設定することが多く行われている。ブレビバチルス属細菌ではｐＨを７．０に設定することが多く行われている。【０００４】
ところで、遺伝子組換え技術を用いて生産される蛋白質医薬品のうち、抗体医薬品は急速にその需要を拡大している。抗体医薬品は、約１５０ｋＤａの糖蛋白質として、主にＣＨＯ培養細胞を用いて生産される。【０００５】
抗体医薬品の製造には、一般に抗体結合能を有するアフィニティークロマトグラフィーが使用されており、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどの蛋白質を適当な樹脂に固定化して得られる抗体精製用担体による、クロマトグラフィーが最も多く使用されている。抗体結合能を有するリガンドとしては、プロテインＡが特に多く使用されている。【０００６】
蛋白質をリガンドとするアフィニティー担体は、医薬品製造用資材として高い品質が求められる。蛋白質からなるリガンド自体も蛋白質医薬品と同等レベルの品質を要求され、生産コストが高いので、アフィニティー担体を安価に供給できない状況となっている。抗体医薬品の製造コストのうち、アフィニティー担体の生産コストが占める割合は大きく、抗体医薬品の製造コスト低減に大きな足かせとなっている。よって、蛋白質からなるリガンドを高品質で安価に調達する方法が望まれている。【０００７】
本発明者らは、これまでに、プロテインＡの部分配列を安定的かつ大量に生産するために、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い、プロテインＡの部分配列を効率良く大量に分泌発現し、培養液中に安定的に蓄積させ、容易に高純度で分離回収できる方法を見いだしている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第１０／００１９６０号
【特許文献２】国際公開第０６／００４０６７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】『蛋白質  核酸  酵素』 Ｆｅｂ；３７（３  Ｓｕｐｐｌ）：２５８−６８（１９９２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ブレビバチルス属細菌を用いて組換え蛋白質を製造する際に、組換え蛋白質の分泌生産量を向上し、より安価に組換え蛋白質を調製することが可能であり、工業化規模にスケールアップ可能な、組換え蛋白質の生産方法を提供することである。また、本発明の課題は、特許文献１のように炭素源を変更することなく、グルコースを炭素源として使用しながら生産性を改善できる、組換え蛋白質の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、対数増殖期に入って以降、菌体にとって好適なｐＨから外れた弱アルカリ性のｐＨ範囲で培養することで組換え蛋白質の分泌生産量が向上できることを見いだし、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を、前記ブレビバチルス属細菌の対数増殖期初期以降から弱アルカリ性条件で培養する工程を含む、組換え蛋白質の製造方法に関する。【００１３】
弱アルカリ性条件がｐＨ７．５以上８．１以下であることが好ましい。【００１４】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌がブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）であることが好ましい。【００１５】
組換え蛋白質が抗体結合性蛋白質であることが好ましい。【００１６】
抗体結合性蛋白質がプロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメイン、またはｂｅｔａ−３ドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体であることが好ましい。【００１７】
グルコースを含む培地を使用することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、組換えブレビバチルス属細菌を用いた組換え蛋白質の製造において、組換え蛋白質の分泌生産量が向上し、微生物にとって好適なｐＨ範囲（７．０〜７．２）で培養を行う場合と比べ、組換え蛋白質の生産性向上を達成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、組換え蛋白質をコードする遺伝子を有するブレビバチルス属細菌を、前記ブレビバチルス属細菌の対数増殖期初期以降から弱アルカリ性条件で培養する工程を含む、組換え蛋白質の製造方法に関する。
【００２０】
組換え蛋白質としては、例えば抗体結合性蛋白質、抗体、酵素、生理活性蛋白質が挙げられる。
【００２１】
抗体結合性蛋白質は、抗体の抗原認識部位以外の部分（例えば、Ｆｃ部分）と結合可能な蛋白質である。抗体の抗原認識部位以外の部分と結合し得る蛋白質であれば、その構造は特に限定されない。このような蛋白質としては、例えば、プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、またはＣドメイン、プロテインＧのｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメイン、またはｂｅｔａ−３ドメイン、プロテインＬのＢドメイン、もしくはそれらの連結体または機能的変異体が挙げられる。
【００２２】
プロテインＡとは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約４２，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は７つの機能ドメイン（アミノ末端からシグナル配列Ｓ、イムノグロブリン結合ドメインＥ、イムノグロブリン結合ドメインＤ、イムノグロブリン結合ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢ、イムノグロブリン結合ドメインＣ、スタフィロコッカス・アウレウス細菌細胞壁結合ドメインＸ）から構成されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３，８０：６９７−７０１、Ｇｅｎｅ，１９８７，５８：２８３−２９５、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２５９：１６９５−１７０２）。
【００２３】
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、ｐＨ、スタフィロコッカス・アウレウス菌株種（Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８７，５５：８４３−８４７）、またイムノグロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）などの多くの因子に依存することが知られ、特にイムノグロブリンのクラスではヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ，マウスＩｇＧ３のＦｃ部分と強い結合を示す。
【００２４】
プロテインＡのＥドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメインとしては、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が一例として挙げられる。
【００２５】
プロテインＧは、ストレプトコッカス属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）によって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、哺乳動物のＩｇＧのＦｃ部分と結合活性を示す。この結合活性は、プロテインＧのｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメイン、およびｂｅｔａ−３ドメインよりもたらされる。
【００２６】
プロテインＧのｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメイン、およびｂｅｔａ−３ドメインとしては、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が一例として挙げられる。
【００２７】
プロテインＬとは、ペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）によって生産される蛋白質の１種であり、約７９，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は６つの機能ドメイン（アミノ末端から、シグナル配列ＳＳ、アミノ末端ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢの５回繰り返し、機能不明ドメインＣの２回繰り返し、細胞壁貫通ドメインＷ、細胞膜貫通ドメインＭ）から構成されている。
【００２８】
このプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインはイムノグロブリンのκ軽鎖と結合を示す。（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４：１９７４０−１９７４６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：１２８２０−１２８２５）。
【００２９】
プロテインＬのＢドメインとしては、配列番号９〜１３に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が一例として挙げられる。
【００３０】
抗体結合性蛋白質の機能的変異体は、抗体結合性蛋白質の変異体のうち、抗体に結合する活性を有する蛋白質である。抗体結合性蛋白質の機能的変異体と、配列番号５に示すプロテインＡのＣドメインとの配列同一性は、６０％以上であることが好ましく、６５％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、７５％以上であることがさらにより好ましく、８０％以上であることがさらにより好ましく、８５％以上であることがさらにより好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
【００３１】
抗体結合性蛋白質の連結体は、抗体結合性蛋白質を直列に連結して得られる蛋白質である。異なる抗体結合性蛋白質を連結してもよく、同じ抗体結合性蛋白質を連結してもよい。連結される抗体結合性蛋白質の数としては、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個が挙げられる。連結体としては、プロテインＡのＣドメインの機能的変異体５個を含む、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が一例として挙げられる。
【００３２】
抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの完全長抗体、およびそれらの抗原結合部位からなる部分断片化抗体などが挙げられる。
【００３３】
酵素としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、アシラーゼ、アミダーゼ、ヒダントイナーゼ、ヒダントインラセマーゼ、デカルバミラーゼ、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、Ｄ−スクシニラーゼ、Ｌ−スクシニラーゼ、カルバミルアミノ酸ラセマーゼ、アミノ酸アミドラセマーゼ、アミノペプチダーゼなどが挙げられる。
【００３４】
生理活性蛋白質は、医薬活性成分として用いられる蛋白質であり、例えばインシュリン、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、成長ホルモン、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、造血因子、酵素、およびそれらの受容体蛋白質などが挙げられる。
【００３５】
組換え蛋白質をコードする遺伝子は、組換え蛋白質をコードする塩基配列を有していれば特に限定されない。前記遺伝子を含むＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法で取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８４．１２：４３５９）、ＤＮＡライブラリーからも取得できる。当該ＤＮＡにおいて、コドンが縮重コドンで置換されていてもよい。
【００３６】
ブレビバチルス属細菌で組換え蛋白質を発現させるために、発現ベクターを使用できる。発現ベクターは、組換え蛋白質をコードする遺伝子を含む。当該遺伝子を発現させるプロモーターとして、ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを使用できる。
【００３７】
当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでもよいが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌に由来し、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましい。ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰ（Ｅｂｉｓｕ．Ｓら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０．１７２：１３１２−１３２０）をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。具体例として、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ５プロモーター領域や、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域が挙げられる。
【００３８】
発現ベクターは、前記プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列及びシグナル配列をさらに含むことが好ましい。シャインダルガノ配列は、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なシャインダルガノ配列が好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰをコードする遺伝子の上流に存在するシャインダルガノ配列がより好ましい。発現ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでもよい。
【００３９】
発現ベクターは、シャインダルガノ配列の下流に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでいても良い。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ブレビバチルス・ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性はない。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等の細菌由来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）、同蛋白質であるｏｕｔｅｒ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＷＰ）または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰの分泌シグナルペプチドがより好ましい。また従来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものも使用できる。
【００４０】
分泌シグナルペプチドの具体例としては、ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ）のシグナルペプチド、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡｌａをＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａの下線部のように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加または消失させた分泌シグナルペプチドも使用できる。また従来からブレビバチルス属の分泌蛋白質において使われている分泌シグナルペプチドも使用できる。
【００４１】
さらに該プロテインＡが本来有するシグナルペプチド、すなわち、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａも使用できる。
【００４２】
上記のプロモーター、ＳＤ配列、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、ブレビバチルス属細菌から得ることができる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭＢＰ−４５７３）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。
【００４３】
発現ベクターにおいては、前記プロモーター、前記シャインダルガノ配列、前記シグナルペプチド配列、および組換え蛋白質をコードする遺伝子が、ブレビバチルス属細菌内において作動可能に連結されていることが好ましい。
【００４４】
発現ベクターは、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、またはｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８７．１２３９−１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７．６１：６６９−６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５−８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８−４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ｓｈｉｇａ．Ｙ．ら．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２．５８：５２５−５３１．）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｉｓｈｉｈａｒａ．Ｔら、１９９５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７７：７４５−７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８−３６３）、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）が挙げられる。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャインダルガノ配列と目的蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを含んだ発現ベクター、または、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いてもよい。
【００４５】
組換え蛋白質は、ブレビバチルス属細菌において分泌させる方法、または分泌させない方法のいずれで生産されてもよいが、分離精製が容易であることから、培養液中へ分泌させる方法が好ましい。
【００４６】
組換え蛋白質を培養液中へ分泌させるためには、組換え蛋白質をコードする遺伝子の上流にブレビバチルス属細菌で機能するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加または連結するのが好ましい。
【００４７】
形質転換体を得るために用いる宿主細胞としては、任意のブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属細菌としては、特に限定されないが、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロポラス、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー等が挙げられる。
【００４８】
好ましくは、ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（Ｔａｋａｒａ社製）からなる群より選択される。より好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ、およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓからなる群より選択される。
【００４９】
ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ（ＪＣＭ８９７０）は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３０５−００７４茨城県つくば市高野台３−１−１）より入手することができる。
【００５０】
組換え蛋白質の生産量や品質を改善するために、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用してもよい。変異株として、例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報）、ヒト唾液アミラーゼ高生産株であるブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ら．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９０．３４：２９７−３０２）が挙げられる。前述した変異株から、さらに組換え蛋白質の生産量や品質が優れるブレビバチルス属細菌を取得して、組換え蛋白質の生産に用いることも可能である。
【００５１】
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および／またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶性化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）および／またはＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報）である。
【００５２】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。
【００５３】
本発明による組換え蛋白質、好ましくはプロテインＡまたはその部分的配列からなる蛋白質の発現の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン蛋白質、ジスルフィド結合酸化還元酵素、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。具体的に挙げれば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフィド結合に関与し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの類縁と考えられている大腸菌のＤｓｂＡ（Ｂａｒｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．Ａ．ら．Ｃｅｌｌ．１９９１．６７：５８２−５８９、Ｋａｍｉｔａｎｉ．Ｓら．ＥＭＢＯ．Ｊ．１９９２．１１：５７−６２．）および／または、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正確なジスルフィド結合に関与している酵素ＰＤＩ（特願２００１−５６７３６７号公報）、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ，Ｖ，Ｐ．ら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９３．８：７２７−７３７）、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向上させることもできる。
【００５４】
組換え蛋白質をコードする遺伝子による、ブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のＴａｋａｈａｈｉらの方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ．Ｗら．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３．１５６：１１３０−１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ｔａｋａｇｉ．Ｈ．ら．１９８９．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，５３：３０９９−３１００）、またはＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｏｋａｍｏｔｏ．Ａ．ら  １９９７．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：２０２−２０３）により行うことができる。
【００５５】
ブレビバチルス属細菌の培養に用いる培地は、組換え蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に限定されない。具体的にはグルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。グルコースを炭素源として含むことが好ましい。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類を添加してもよい。
【００５６】
また、大豆油、ラード油、界面活性剤等の消泡効果のある、または、細胞膜の物質透過性を変化させ、菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上が期待される化合物を添加してもよい。界面活性剤の使用は、本発明の効果を増強する場合があり、好ましい。界面活性剤としては、ブレビバチルス属細菌の生育および／または組換え蛋白質生産に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されず、例えばポリオキシアルキレングリコール系の界面活性剤が挙げられる。
【００５７】
栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加してもよい。ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質を添加してもよい。
【００５８】
菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解や低分子化を抑えるために、公知のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。プロテアーゼ阻害剤として、例えばＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）などが挙げられる。
【００５９】
培養は、通気攪拌条件で行う好気的培養、または通気を遮断した嫌気的培養が挙げられ、好気的培養が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法も使用できる。
【００６０】
本発明の組換え蛋白質の製造方法は、ブレビバチルス属細菌の対数増殖期初期以降から弱アルカリ性条件で培養する工程を含む。新しい培養基にブレビバチルス属細菌を接種することにより培養を開始すると、培養初期の一定期間は菌の増殖が認められず、この期間が誘導期である。誘導期は、菌体濃度の指標として６００ｎｍの波長で測定される培地の吸光度（ＯＤ６００値）が５未満までの状態である。誘導期にはｐＨをブレビバチルス属細菌が生育可能な任意のｐＨとすることができる。
【００６１】
対数増殖期とは一般的には、ある系に含まれるすべての細胞が一定の間隔で細胞分裂して増殖し、系全体に含まれる細胞の総数がそれぞれ２倍ずつになるため、時間軸に対して、細胞数の対数が直線となる時期のことである。本発明において、対数増殖期初期は、菌体濃度の指標であるＯＤ６００値が５以上であり、かつ菌体が増殖している期間を指す。
【００６２】
通常、ブレビバチルス属細菌を培養すると、誘導期には培地のｐＨがアルカリ性になる傾向があり、対数増殖期初期以降には酸性になる傾向がある。誘導期から対数増殖期初期にかけて、生育が阻害されるほどの過度なｐＨの上昇を抑えるために、酸の添加によりｐＨの上限制御を行う必要がある。さらに本発明の製造方法では、対数増殖期初期以降に、低下する培地のｐＨを制御して弱アルカリ性状態を維持する。ｐＨを制御するために用いるｐＨ調整剤としては、無機酸、有機酸、アルカリが挙げられ、無機酸、アルカリが好ましい。無機酸としては、硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などが挙げられる。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニアなどが挙げられる。
【００６３】
培養液のｐＨを弱アルカリ性に維持するための制御を開始する時期は、上記のように培養開始後ｐＨが上昇し弱アルカリ性域に達して以降であり、好ましくは対数増殖期初期以降であるＯＤ６００値が５以上の時期であり、より好ましくはＯＤ６００値が５以上６０以下の時期であり、さらに好ましくはＯＤ６００値が１０以上５０以下の時期であり、さらにより好ましくはＯＤ６００値が１０以上４５以下の時期であり、特に好ましくはＯＤ６００値が１０以上４０以下の時期である。
【００６４】
弱アルカリ性条件としては、培地のｐＨが好ましくはｐＨ７．５以上８．１以下であり、より好ましくはｐＨ７．６以上８．１以下であり、さらに好ましくはｐＨ７．７以上８．１以下である。
【００６５】
培養液のｐＨを弱アルカリ性で制御する期間は、対数増殖期初期以降の培養期間の４０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましい。
【００６６】
生産された組換え蛋白質は、菌体外、すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、組換え蛋白質は培養上清中から回収し精製できる。また菌体内、及び菌体表層に存在する組換え蛋白質も、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリ処理、ＳＤＳ処理などの公知の方法により菌を破砕して、回収できる。培養上清や菌体から回収された蛋白質は、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトンなどを用いた濃縮、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、組換え蛋白質が有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて精製できる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。【００６８】
（実施例１）
配列番号１５に示す塩基配列を有し、プロテインＡをコードする遺伝子を含むＤＮＡを全合成した。ＤＮＡの全合成は、タカラバイオ（株）に依頼した。納品されたＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（共にタカラバイオ社製）で切断してプロテインＡ遺伝子を分画精製し、同じくＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断したブレビバチルス用発現ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）と混合後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたライゲーションを行い、得られたプラスミドを、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社製）にエレクトロポレーション法により電気導入することで、プロテインＡを発現するブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）を作製した。【００６９】
（比較例１）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）の培養
実施例１にて得られたブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）を、Ａ培地（ペプトン１．５％、酵母エキス０．８％、グルコース２．０％、リン酸塩０．３８％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０４％、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００４％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００４％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００４％、ｐＨ７．２、培養開始後６時間目からグルコースを３．８％分連続添加）で好気的条件下で３０℃で培養した。培地のｐＨは、培養開始から培養終了までｐＨ７．０〜７．２の範囲となるように制御した。【００７０】
培養開始から６３時間後に培養液を採取し、遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７１】
（比較例２）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜８．０の範囲となるように制御し、培養を開始してから１６時間後以降はｐＨ７．４となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから１６時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は１６であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７２】
（実施例２）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜７．６の範囲となるように制御し、培養を開始してから２３時間後以降はｐＨ７．９となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから２３時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は４０であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７３】
（実施例３）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜８．０の範囲となるように制御し、培養を開始してから１６時間後以降はｐＨ７．６となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから１６時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は１６であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７４】
（実施例４）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜８．０の範囲となるように制御し、培養を開始してから１６時間後以降はｐＨ７．８となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから１６時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は１７であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７５】
（実施例５）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜８．０の範囲となるように制御し、培養を開始してから１６時間後以降はｐＨ７．９となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから１６時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は１７であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７６】
（実施例６）ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３（ｐＮＣＭＯ２Ｓｐａ３）のｐＨシフト培養
培地のｐＨを、誘導期はｐＨ７．２〜８．０の範囲となるように制御し、培養を開始してから１６時間後以降はｐＨ８．０となるように制御した以外は、比較例１と同じ条件で培養した。なお、培養を開始してから１６時間後の培地の、分光光度計を用いて測定した６００ｎｍにおける濁度は１４であった。比較例１と同じ方法で培養上清中の組換えプロテインＡ濃度を測定した。測定結果を表１に示す。【００７７】
【表１】
2015190458.tif 000002
【配列表】
2015190458000001.app
【国際調査報告】
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2015190458.tif 000004
2015190458.tif 000005
2015190458.tif 000006