(57)【要約】  光化学的に切断可能なヌクレオチドによるシーケンス反応に用いる核酸分析用フローセルにおいて、光切断反応の反応効率を高めるとともに、蛍光検出時のノイズを低減することで、配列決定の正確性を高め、ランニング時間を短くし、取込み塩基長を長くする。本発明の核酸分析用フローセルは、流路内物質の化学構造を変化させる第一の光を反射する光学フィルタ102を備えた第一の基板101と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシート103と、第一の光を透過する第二の基板105を貼合わせたものである。
2015015913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内物質の化学構造を変化させる第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセル。
【請求項２】
上記光学フィルタは、流路内物質を励起する第二の光および、流路内物質から放射される第三の光を透過する、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項３】
上記光学フィルタが第一の基板上に流路と接するようにパターニングされている、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項４】
上記第二の基板が流路内物質の化学構造を変化させる第一の光は透過し、第一の光より短い波長を持つ第四の光を反射する近紫外線カットフィルタを備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項５】
上記の第二の基板が第一の光と第二の光の反射を防止する反射防止膜を備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項６】
第一の光の波長は、450nm以下である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項７】
第一の光の波長は、320nm以上である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項８】
第二の光の波長は、450nm以上である請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項９】
第三の光の波長は、480nm以上である請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項１０】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
第一の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝の底面には流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１１】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
第二の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝と対向する第一の基板面には流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１２】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
基板間にはシートが配置されており、
シートには複数の流路溝を有し、これらの流路溝の第一の基板側の底面には流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１３】
上記光学フィルタは、流路内物質を励起する第二の光は透過し、流路内物質から放射される第三の光も透過する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の核酸分析用フローセル。
【請求項１４】
核酸を分析する核酸分析装置であって、
流路内物質の化学構造を変化させる第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセル
前記核酸分析用フローセルを保持するホルダユニット、
前記核酸分析用フローセル内の試料を観察する検出ユニット、
前記核酸分析用フローセルに流路内物質の構造を変化させる第一の光を照射する光源、  前記核酸分析用フローセルに試薬を送液する送液ユニット、を備えた核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析用フローセル、及び核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が実用化されてきている。【０００３】
従来から用いられてきた電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。【０００４】
これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されてきている。【０００５】
非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。【０００６】
また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付きプライマを取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。【０００７】
さらに、非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄や，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。【０００８】
以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。【０００９】
特許文献１に、パラレルで数多くの配列情報を決定する方法の詳細が開示されている。シーケンス反応は内部に流路を持つフロ−セルの中で行われる。流路表面はアクリルアミドでコーティングされ、アクリルアミド上にフォワ−ドプライマとリバースプライマがグラフト化される。測定対象である複数種類のテンプレート含む溶液をフローセル内に導入した後、フローセルに温度サイクルをかけて基板上増幅反応を行い、基板上にテンプレートと同じ配列を持つ複数のコロニーを形成する。一つのコロニーは増幅された複数のコピーテンプレートの集合体であり、コピーテンプレートは測定対象テンプレートと同じ配列、または相補的な配列を持つ。増幅後、コロニー内のテンプレートにシーケシングプライマをハイブリダイゼーションさせてシーケンス反応を行う。シーケンス反応には、WO2004／018493に開示されているヌクレオチドを用いる。ヌクレオチドは、切断可能なリンカー介した蛍光分子と糖の3,位の酸素に脱離基を持つ。シーケンス反応では4種類の塩基A，T，C，Gに由来する4種類のヌクレオチドが用いられる。4種類のヌクレオチドはそれぞれ異なる蛍光色素でラベル化される。フローセル内にポリメラーゼと4種類のヌクレオチドを含む溶液を注入し、シーケンスプライマにヌクレオチドを取込ませる。その後、蛍光が取込まれたシーケンスプライマを蛍光検出する。この時、テンプレート配列と相補な配列を形成するようにヌクレオチドが取込まれるため、取込まれたヌクレオチドの蛍光を検出することで、測定対象であるテンプレートの塩基配列を決定することができる。蛍光検出後は、分子内リンカーを化学的に切断して蛍光分子を除去する。ヌクレオチド取込み、蛍光検出、蛍光分子除去のサイクルを繰り返してテンプレートの塩基配列を決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第US2012/208194号明細書
【特許文献２】国際特許WO2004／018493
【特許文献３】米国特許第US7897737B1号明細書
【特許文献４】米国特許第US8039817B1号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第US2009/208194号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nature 2005， vol． 437， pp．376−380．
【非特許文献２】Science 2005， vol． 309， pp．1728−1732
【非特許文献３】Science 2008， vol． 320， pp． 106−109．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献1や特許文献２に記載の方法は、テンプレートの塩基配列に関係ない誤ったヌクレオチドが一定の割合で取込まれるため、配列決定の正確性が低い課題がある。また、テンプレートの塩基長が長くなるにつれて、一つのコロニーの中で誤ったヌクレオチドを取込むテンプレートの割合が高くなり、正しい蛍光信号が低減する。結果として、取込み塩基長を長くできない課題がある。一般に、配列決定プロセスでは、短くバラバラにされたテンプレートの塩基配列を決定した後、バラバラの配列をコンピュータ上でアライメントするが、取込み塩基長が短いと、アライメントの精度が低下したり、アライメント時間が長くなったりする課題も生じる。また、一般に、化学的な切断は反応時間が長いため、1回のラン当たりに必要なランニング時間が長い課題もある。【００１３】
特許文献3にヌクレオチド取込みの正確性を高め、切断反応時間を短くできるヌクレオチドが開示されている。ヌクレオチド内の糖の3,位酸素の脱離基をなくすことでポリメラーゼ酵素とヌクレオチドの親和性を高めて取込み時の正確性を高めている。また、光化学的に切断可能な分子内リンカーを導入し切断時間も短くしている。一方で、特許文献3のヌクレオチドはフロ−セル内での光化学的な切断反応の反応効率自体がまだまだ低く、取込み塩基長が十分に長くならない課題がある。シーケンス反応では反応を複数サイクル行うため、わずかな反応効率の差が、サイクル数が増えた取込み時の蛍光信号に大きな影響を与える。例えば、1サイクルの反応効率が99％の時、250サイクル後の蛍光強度は、1サイクル時の蛍光強度を100％とした場合で0.99250×100＝8.1（%）となる。一方、98％では0.98250×100＝0.6（%）となり、わずか1%の反応効率の差が8.1−0.6＝7.5（%）の蛍光強度の差となる。光化学的な切断反応の反応効率を高める手段として、光強度を強くする方法もあるが、光強度が強すぎると溶存酸素などによるラジカルが発生し、ラジカルによるテンプレートの2量化反応などの副反応が生じて、プライマに取込まれるヌクレオチドの量が減少する課題が生じる。特許文献4に示される様な流路の上下両面を検出するような場合、一般には光化学反応の光源に近い面の光強度が遠い面の光強度よりも強く、遠い面の光強度を強くするために光源の光強度を強くすると、近い面の光強度が必要以上に強くなって、先の副反応が生じる。【００１４】
本発明は、光化学的に切断可能なヌクレオチドによるシーケンス反応に用いる核酸分析用フローセルにおいて、切断反応の反応効率を高めるフローセルを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の核酸分析用フローセルは、流路内物質の化学構造を変化させる第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせたものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、光化学的に切断可能なヌクレオチドによるシーケンス反応に用いる核酸分析用フローセルにおいて、光切断反応の反応効率を高めるとともに、蛍光検出時のノイズを低減することができる。これにより、配列決定の正確性を高め、ランニング時間を短く、取込み塩基長を長くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図２】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図３】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図４】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図５】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図７】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図８】本発明の核酸分析用フローセル製造方法の一例を説明するための図である
【図９】本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。
【図１０】本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。
【図１１】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図１２】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の発明者は、鋭意研究の結果、ヌクレオチド取込み正確性が高く、切断時間が短く、切断効率も高いシーケンス反応を実現できる核酸分析用フローセルを完成させた。
【００１９】
本発明は、流路内物質の化学構造を変化させる第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセルである。第二の基板を透過した第一の光が光学フィルタで反射することで、第二の基板上、または、第二の基板と第一の基板の光学フィルタ上の分子内リンカーを持つ化合物に対して、第一の光が複数方向から効率良く照射できるため、光化学反応の効率を高めることができる。高い光化学反応の効率は、塩基配列決定の正確性を高め、取込み塩基長を長くし、ランニング時間を短くすることができる。
【００２０】
また、本発明は、光学フィルタが、流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光は反射し、流路内物質を励起する第二の光は透過し、流路内物質から放射される第三の光も透過することを特徴とする。光化学反応の効率を高めると同時に、蛍光検出のための励起光と第二の基板、及び光学フィルタ上のノイズ蛍光分子からの蛍光をフローセルの外に透過させることで、検出対象コロニー以外の蛍光分子に由来するノイズを低減することができる。ノイズ蛍光分子とは、第二の基板上コロニー検出時では、第二の基板上のコロニー以外の領域に付着した蛍光分子以外に、流路内にキャリーオーバーした蛍光分子や第一の基板光学フィルタ上の蛍光分子などがある。第一の基板光学フィルタ上のコロニー検出時では、同じく、光学フィルム上以外に、流路内のキャリーオーバーした分子や第二の基板上の分子などがある。
【００２１】
また、本発明は、光学フィルタがパターニングされ、パターニングされた光学フィルタが第一の基板の流路と接する面に存在することを特徴とする。一般に、光学フィルタは蒸着法などの方法を用いて成膜された無機酸化物や金属酸化物の薄膜を多層化したものであり、通常のガラスより平坦性が高いため、PDMS（Polyimethylsiloxane）や感圧性両面接着テープなどの中抜きシートとの接着力が低く、フロ−セルの耐圧が低い課題がある。光学フィルタをパターニングすることで、中抜きシートは高い接着力が得られるガラスなどの第一の基板と直接接触する構造となるため、フロ−セルの耐圧を高めることができる。
【００２２】
また、本発明は、第二の基板が流路内物質の化学構造を変化させる第一の光は透過し、第一の光より短い波長を持つ第四の光を反射する近紫外線カットフィルタを備えることを特徴とする。一般に、DNAは波長320nm以下の光を吸収し一部が二量化して、シーケンス反応の反応効率を低下させる。また、波長184.9nmの近紫外線はオゾンを生成し、生成したオゾンは波長253.7nmの紫外線で分解されて強い酸化力を持つO原子を生じることが知られている。これらオゾンやO原子は、シーケンス反応で用いられるポリメラーゼやヌクレオチド、テンプレートを酸化分解するため、シーケンス反応の反応効率を低下させる。本発明の近紫外線カットフィルタは、これらの近紫外線の流路内への透過を防ぐ。
【００２３】
また、本発明は、第二の基板が第一の光と第二の光の反射を防止する反射防止膜を持つことを特徴とする。一般にガラス表面では10％未満の光が反射することが知られている。本発明の反射防止膜は、第一の光や第二の光の基板表面での反射を防ぎ、流路に入る第一の光や第二の光の光強度の低下を最小化する。
【００２４】
また、本発明は、第一の基板と第二の基板、または第一の基板と第二の基板と溝ありシートを貼合わせた核酸分析用フローセルにおいて、流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光が第二の基板を透過し、流路を挟んだ第二の基板に対向する流路底面に、第一の光を反射する光学フィルタを持つことを特徴とする。図7の（a）〜（c）に示す様な中抜きシートがない構造においても、先に記載の同様のメカニズムで同様の効果を得ることができる。
【００２５】
また、本発明は、第一の基板と第二の基板、または第一の基板と第二の基板と溝ありシートを貼合わせた核酸分析用フローセルにおいて、光学フィルタが、流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光は反射し、流路内物質を励起する第二の光は透過し、流路内物質から放射される第三の光も透過することを特徴とする。先と同様、図7の(a)〜(c)に示す様な中抜きシートがない構造においても、先に記載の同様のメカニズムで同様の効果を得ることができる。
【００２６】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
【００２７】
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【実施例１】
【００２８】
図１に本発明の核酸分析用フローセルの例を示す。【００２９】
本発明の核酸分析用フローセルは、光学フィルタ102を持つ第一の基板101と流路を形成するための中空部104を持つ中抜きシート103と第二の基板105を貼り合わせた構造である。第一の基板上の光学フィルタ102と中抜きシート103と第二の基板105で囲まれた空間が流路となる。第二の基板に開けられた穴が流路に液を注入するための注入口106や排出口107となる。図1の核酸分析用フローセルの一例は、第二の基板に穴がある例であるが、第一の基板に穴がありこれが注入口や排出口となっても良い。【００３０】
図１０に本発明の核酸分析用フローセル1010を核酸分析装置に設置した場合の構成を示す。光源1019は測定対象である流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光1020を発する。検出ユニット1017は、流路内物質を励起するための第二の光1021を発し、励起された流路内物質から放射される第三の光1022を検出する。図１０の一例では、測定対象の流路内物質はビーズ担体1023の表面に複数分子存在する。ホルダユニット1011は核酸分析用フローセル1010を保持する。光源1019より発せられた第一の光1020は、第一の基板1020を通過した後、ビーズ担体1023上の流路内物質を照射する。ビーズ担体1023を透過した一部の第一の光1020が光学フィルタ1002で反射し、反射した第一の光1020がビーズ担体1023を下面から照射することでビーズ担体1023の下側に存在する流路内物質の光反応の反応効率を高める。第二の基板1005を通過した第二の光1021は、ビーズ担体1023上の流路内物質を励起した後、ビーズ担体1023を通過した第二の光1021は光学フィルタ1002を透過し、流路1004の外部に出ていく。シーケンス反応で測定対象となる流路内物質とは、分子内に光切断可能なリンカー介した蛍光分子を持つヌクレオチドである。シーケンス反応の概要は、核酸分析用フローセル1010の外部でビーズ担体1023上に増幅テンプレートを導入した後、増幅テンプレートを持つビーズ担体1023を流路と接する第二の基板上に固定した後、増幅テンプレートにシーケンスプライマをハイブリザイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後にヌクレオチドと酵素含む水溶液を流路1004内に供給して、プライマにヌクレオチドを取込ませた後、流路1004内を洗浄し未反応ヌクレオチドを除去する。未反応ヌクレオチド除去後、取込まれたヌクレオチドに第一の光1020を照射して光切断反応を行った後、流路1004内を洗浄する。この時、流路内洗浄で除去できずに残留したヌクレオチドが蛍光検出時のノイズとなる。同じく、残留した光切断後の蛍光色素もノイズとなる。ヌクレオチドや光切断後の蛍光色素は、ビーズ担体1023の表面、流路1004と接する第二の基板1005表面、流路1004と接する光学フィルタ1002上に残留する。本発明の光学フィルタは、第二の光1021を流路の外に出すので、残留したヌクレオチドや光切断後の蛍光色素に由来するノイズを低減することができる。一方、光学フィルタ1002は第二の光1021に励起されて生じた第三の光1022も流路1004の外部に出す。図10は流路の上面にのみビーズ担体1023が固定された例を示したが、ビーズ担体1023が光学フィルタ1002上にも固定された例では、流路上面検出時には流路下面のビーズ担体1023からの第三の光1022や流路内に残留したヌクレオチドや光切断後の蛍光色素からの第三の光1022がノイズとなるが、本発明の光学フィルタ1002はこれら第三の光1022を流路1004の外に出すのでノイズを低減することができる。この時、ホルダユニット上に第二の光や第三の光を吸収可能な有機物を塗布することで、一度、流路1004より外に出た第二の光や第三の光がホルダユニット表面で反射して、再度流路1004内に戻るのを防ぎ、ノイズをさらに低減する。【００３１】
第一の光の波長は、分子内に光切断可能なリンカー介した蛍光分子を持つヌクレオチドのリンカーを切断できれば特に制限はないが、特許文献3に記載されるヌクレオチドを切断でき、且つ、一般的な蛍光分子を励起する第二の波長と重ならない波長として、450nm以下は望ましい。また、ラジカル発生によるDNAの二量化を防げる波長として、320nmよりも大きい波長が望ましい。【００３２】
第二の光の波長は、蛍光分子を励起できれば特に制限ないが、シーケンス反応では4種類の蛍光色素を同時に用いて検出する必要があるため、4色色素間の発光波長の重なりを少なくできる色素の選定が容易な、450nm以上の波長が望ましい。第三の光の波長も特に制限はないが、第二の光の波長と同様に、4色色素間の発光波長の重なりを少なくできる色素の選定が容易な、480nm以上の波長が望ましい。第二の光の波長450nm以上と、第三の光の波長480nm以上と、4色色素間の発光波長の重なりを少なくできる色素の組合わせとしては、第一群がAlexa Fluor488、FAM、FITC、Oregon Green488、第二群がAlexa Fluor532、BODIPY TMR-X、Cy3、HEX、JOE、第三群がAlexa Fluor594、Texas Red-X、第四群がBODIPY 650／665、Cy5のそれぞれの群から一つの色素を選び、組み合わせれば良い。【００３３】
本発明で用いられる第一の基板101の材質に特に制限はないが、ガラス，サファイア，シリコンなどの無機材料、アルミ、銅などの金属、及びステンレスなどの合金、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シクロオレフィン樹脂などの樹脂材料を用いることができる。一方、シーケンス反応で用いる場合、第一の基板1001が接するホルダユニット1011は温調機能を有するため、熱伝導性が高い、ガラス、シリコン、ステンレスや、カーボンファイバや無機フィーラを配合した高熱伝導性の樹脂材料などが望ましい。熱伝導性は低下させずに、貼り合わせ後フローセルの強度が得られる厚さとして、0.1mm以上100mm以下が望ましい。【００３４】
第二の基板102の材質としては、光を透過すれば特に制限なく、ガラス、サファイア、石英などの無機材料、アクリル樹脂やシクレオレフィン樹脂などの樹脂材料を用いることができる。厚さは、検出ユニット1017に搭載される対物レンズの仕様に合わせて、0.1mm以上10mm以下が望ましい。【００３５】
中抜きシート203の材質に特に制限はないが、熱硬化性、光硬化性などのエポキシ接着剤、アクリル接着剤などを用いることができる。また、アクリル樹脂をベースとした両面テープなどを用いても良い。より好ましい材料として、ガラス、石英、サファイア、又は透明樹脂との接着強度が高いポリジメチルシロキサンを挙げることができる。スペーサ厚さに特に制限はないが、厚さが薄いほど流路内容量を低減することができ、使用する試薬量を少なくすることができる。スペーサ506は厚さ1mm以下が望ましい。【００３６】
光学フィルタ104は、SiO2、TiO2、Ta2O2、Nb2O3などの誘電体多層膜を任意に10層から40層程度重ねて作られ、所望の波長の光を反射し,その他の波長の光を透過させることができる。図11に本発明に適した、波長400nm未満の第一の光は反射し、波長400nm以上の第二の光と第三の光を透過する光学フィルタの光学特性を示す。また、図１、図３〜図７に示すように、光学フィルタを第一の基板の上面に備える構造とすることで、ホルダユニット1011に核酸分析用フローセル1001設置時に、光学フィルタ1002とホルダユニット1011が直接接することを防ぐことができ、光学フィルタのキズ発生を防ぐことができる。また、光学フィルタの最表面をSiO2とすることで、Al2O3、TiO2などの多層膜構成材量がシーケンス反応で用いる塩素イオン含むバッファに接することを防ぎ、これらの酸化膜の腐食を防止することができる。【００３７】
図２から図７に本発明の核酸分析用フローセルの更なる構成を示す。図２は光学フィルタ202が第一の基板201の下面に備えたものであり、図３はパターニングされた光学フィルタ302が第一の基板上に流路と接する様に存在することを特徴とする。一般に、光学フィルタは通常のガラスより平坦性が高いため、PDMS（Polyimethylsiloxane）や感圧性両面接着テープなどの中抜きシートとの接着力が低く、フロ−セルの耐圧が低い課題がある。図２や図３の核酸分析用フローセルは、中抜きシートが高い接着力が得られるガラスなどの第一の基板と直接接触する構造となるため、フロ−セルの耐圧を高めることができる。図４、または図５の核酸分析用フローセルは、波長320nm以下の近紫外線を反射する近紫外線フィルタを第二の基板上に備える。近紫外フィルタは、流路内への近紫外線の進入を防ぐ。一般に、DNAは波長320nm以下の光を吸収し一部が二量化して、シーケンス反応の反応効率を低下させる。また、波長184.9nmの近紫外線はオゾンを生成し、生成したオゾンは波長253.7nmの紫外線で分解されて強い酸化力を持つO原子を生じることが知られている。これらオゾンやO原子は、シーケンス反応で用いられるポリメラーゼやヌクレオチド、テンプレートを酸化分解するため、シーケンス反応の反応効率を低下させる。図４、または図５の核酸分析用フローセルは、近紫外線によるシーケンス反応の反応効率の低下を防ぐ。図６の核酸分析用フローセルは、第二の基板605上に反射防止膜609を備える。反射防止膜609は、第一の光1020や第二の光1021が第二の基板上面で反射するのを防ぎ、流路604に進入する第一の光1020や第二の光1021の光強度の低下を最小化する。通常、波長400nmから800nmの可視光は、ガラス表面で10％未満の光が反射することが知られている。図12に本発明の反射防止膜の光学特性を示すが、反射率を2％以下とすることができる。この様な反射防止膜は、Al、MgF2、SiO2とAl2O3の多層膜などで形成することができる。図７の核酸分析用フローセルは、第一の基板と第二の基板、または第一の基板と第二の基板と溝ありシート720を貼合わせた核酸分析用フローセルにおいて、流路内物質の化学構造を変化させるための第一の光が第二の基板を透過し、流路を挟んだ第二の基板に対向する流路底面に、第一の光を反射する光学フィルタを持つことを特徴とする。図7の(a)〜(c)に示す様な中抜きシートがない構造においても、同様の効果を得ることができる。この様なフローセルは、第二の基板にガラスやエッチングされたガラス、溝ありシートにエッチングされたシリコンやPDMS、第一の基板にガラスやシリコンを用いることで作製することができる。【００３８】
本発明の核酸分析用フローセルの製造方法の一例を図８を用いて説明する。離型可能な保護フィルムを持つ保護フィルム付シート821を型抜きプレス加工やレーザ加工などを用いて内部を中抜きし、流路を形成する中空部804を形成する。次に、第一の基板801上に蒸着法などを用いて光学フィルム802を形成する。先の保護フィルム付シート821から保護フィルム822を剥離した後、保護フィルム822を剥離した保護フィルム付シートと光学フィルム802を有する第一の基板801を貼り合せる。光学フィルム802と中抜きシート803の接着力を高めるために、貼り合わせ前に光学フィルム802の表面、及び中抜きシートの表面を、エキシマ、酸素プラズマ、又は大気圧プラズマに暴露しても良い。また、貼り合わせ後に加熱処理を行って接着性を高めても良い。次に、残っている保護フィルム822を除去した後、第二の基板805と貼り合わせる。第二の基板805と中抜きシート803の接着力を高めるために、先のエキシマ、酸素プラズマ、又は大気圧プラズマへの暴露や加熱処理を行っても良い。【００３９】
このようにして作製した核酸分析用フローセルを、核酸分析装置にセットし核酸分析を行う。本発明は、本発明の核酸分析用フローセルをセットして核酸反応を行うための核酸分析装置も包含する。本発明の核酸分析装置は、少なくとも、前記核酸分析用フローセルを保持するホルダユニット、前記核酸分析用フローセル内の試料を観察する検出ユニット、前記核酸分析用フローセルに流路内物質の構造を変化させる第一の光を照射する光源、前記核酸分析用フローセルに試薬を送液する送液ユニットを含む。【００４０】
本発明の核酸分析装置の一例を図９を用いて説明する。核酸分析装置は、本発明の核酸分析用フローセル910；、核酸分析用フローセル910を固定し、なおかつ核酸分析用フローセル910の温度を調整することができるホルダユニット911；、核酸分析用フローセル910とホルダユニット911を移動させるステージユニット912；、複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器913；、試薬容器913に収容された試薬を吸引し核酸分析用フローセル910に注入するための駆動源である送液ユニット914；、試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器913や核酸分析用フローセル910にアクセスするノズル915；、ノズル915を搬送させるノズル搬送ユニット916；、核酸分析用フローセル910に固定された試料を観察するための検出ユニット917；、流路内物質の構造を変化させる第一の光を発する光源919及び廃液を収容する廃液容器918等を有する。検出ユニット917は、例えば、蛍光検出装置からなり、ステージユニット上の核酸分析用フローセル910に励起光を照射し、発生した蛍光を検出することができる。【００４１】
本発明の核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象の核酸試料を保持した核酸分析用フローセル910をホルダユニット911に設置する。次に、ノズル916が試薬容器913にアクセスし、試薬を送液ユニット914を用いて吸引する。ノズル915は、ノズル搬送ユニット916により核酸分析用フローセル910上面に搬送され、核酸分析用フローセル910に試薬を注入する。その後、ホルダユニット911が、核酸分析用フローセル910の流路内に含まれた溶液を温度調整し、シーケンス反応を制御する。反応した核酸試料を観察するために、核酸分析用フローセル910をステージユニット912にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料の蛍光を検出する。この際、好ましくは、核酸試料又は核酸試料を表面に有する担体が固定された側の基板を通して励起光を当て、蛍光を検出すればよい。核酸分析用フローセル910を微小に動かし同様の方法による検出複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器913に収容された洗浄水を送液ユニット914により吸引し、核酸分析用フローセル910へ注入することで、核酸分析用フローセル910の流路内を洗浄する。次に、別の試薬を注入した後、核酸試料に取込まれた流路内物質に第一の光を照射し、次サイクルの反応が進むように流路内物質の構造を変化させる。その後、同様に、核酸分析用フローセル910内の流路内の洗浄を行う。試薬の注入、温度制御によるシーケンス反応、蛍光検出、流路内の洗浄、第一の光照射、流路内の洗浄からなるサイクルを複数回繰り返すことで、核酸試料を読み取ることが出来る。核酸分析装置は、コンピュータにより制御され、上記動作を自動的に行うことができる。
【実施例２】
【００４２】
本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法はScience 2005，vol. 309，pp．1728-1732（非特許文献2）に開示されている方法に準じる。【００４３】
（１）ライブラリー作製
測定対象の流路内物質をDneasy Tissue kit（QIAGEN社）を用いて精製した後、核酸試料を断片化した。断片化DNAに対して、End-it DNA End Repair kit（EpiCentre社）を用いてテンプレートDNAの両端にタグ配列を付加した。タグ配列が付加したテンプレートを精製した後、スペーサ配列が付加されたテンプレートをエキソヌクレアーゼで処理して、RCA（Rolling Circle Amplification）用のテンプレートを作製した。得られたテンプレートに対して、ランダムヘキサマーを用いたRCAを行いテンプレートを増幅した。増幅産物をMicrocon-30（Millipore社）で精製した後、制限酵素で断片化した。断片化された産物に対してゲル精製を行い、70塩基長のタグライブラリーを抽出した。抽出されたタグライブラリーに対してプライマをライゲーションした後PCR増幅を行いライブラリーを作製した。【００４４】
（２）エマルジョンPCR
Light mineral oil(Sigma社)からなるオイル溶液にPCR溶液、MyOne（商標）、paramagnetic streptavidin磁気ビーズ（Dynal社）、及びライブラリー溶液を加えてエマルジョンPCRを行った。増幅溶液に対して、界面活性剤を含む溶液を加えて高速遠心を行った後、マグネットを用いて溶媒置換を行い、表面に数多くの増幅産物を持つ測定用のDNAを表面に有する付きビーズ水溶液を作製した。【００４５】
（３）核酸分析用フローセルへのDNAを表面に有するビーズの固定
4.2×107個のビーズを19.2μlの10mMのドデシル硫酸ナトリウムを含むTEバッファーに分散した後、ビーズ分散溶液を核酸分析用フローセル内に注入した。恒温槽内で流路内のビーズ懸濁液を乾燥した後、6％アクリルアミド水溶液を流路内に注入しビーズを固定した。本実施例ではアクリルアミドを用いてビーズを固定したが、特許文献5に開示されている様な、シランやポリリジン、ビオチンとストレプトアビジンの結合などを使って固定しても良い。【００４６】
（４）核酸分析
特許文献3に開示されているヌクレオチドを用いて核酸分析を行った。本発明の核酸分析装置に前項のビーズが固定された核酸分析用フローセルを設置した。プライマを含む水溶液をノズル915を介して核酸分析用フローセル910に注入した。ホルダユニット911を用いて核酸分析用フローセル910内の水溶液を57℃に加熱した後、4℃に保持した。先のヌクレオチドとDNAポリメラーゼを含む水溶液を注入した後、60℃で5分間保持し伸長反応を行った。バッファーで核酸分析用フローセル910内の流路を洗浄し、未反応のヌクレオチドを除去した。核酸分析用フローセル910をステージユニット912にて移動させた後、検出ユニット917にて励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料付きビーズに導入された蛍光を検出した。検出後、50mMのアジ化ナトリウム水溶液を注入した後、波長365nmのUV光を0.7W/cm2で4分間照射し蛍光色素を切断した。その後、フローセル内をバッファで洗浄した。先の伸長反応、蛍光検出、蛍光色素の切断を繰り返し、核酸の塩基配列を決定した。
【実施例３】
【００４７】
実施例1の（２）エマルジョンPCR、（３）核酸分析用フローセルへのDNAを表面に有するビーズの固定、の代わりに、特許文献1に開示されているテンプレート準備方法を用いた。基板上に形成されたコロニーに対するシーケンス反応を行った。【００４８】
（１）ライブラリー作製
実施例１と同様に行った。【００４９】
（２）核酸分析用フローセル内流路へのアクリルアミドコーティング
2％アクリルアミド水溶液10mlに、100mg/mlのBRAPAを溶かしたDMF溶液165μl、TEMED11.5μl、50mg/mlの過硫酸カリウム100μlを混合した後、混合溶液を流路内に注入した。核酸分析用フローセルを室温で1時間30分保持した後、流路内を水で洗浄した。【００５０】
（３）アクリルアミド上へのプライマーのグラフト化
0.5μMのフォワードプライマー、0.5μMのリバースプライマーを含む水溶液を流量60μl／秒で流路内に75秒流した後、核酸分析用フローセルを50℃で1時間保持した。保持後に、5×SSCバッファで流路内を洗浄した。【００５１】
（４）核酸分析用内フローセル内でのコロニー形成
（５）ライブラリー作製で得られたライブラリを核酸分析用フローセル内に注入し、増幅反応を行いコロニーを形成した。【００５２】
（６）核酸分析
実施例1の方法に従い、核酸の塩基配列を決定した。
【実施例４】
【００５３】
実施例１のアジ化ナトリウム水溶液にマイクロガラスビーズ（品名：EMB−10、ポッターズ・バロディーニ株式会社製）を加えた。マイクロガラスビーズの平均粒径は5μmであった。マイクロガラスビーズは流路内に進入したUV光を乱反射させることができ、蛍光色素を切断する効率をさらに高めることができた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の核酸分析用フローセル又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を行うことができ、DNAシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。
【符号の説明】
【００５５】
101,201,301,401,501,601,701(a),701(b),701(c),801  第一の基板
102,202,302,402,502,602,702(a),702(b),702(c),802  光学フィルタ
103,203,303,403,503,603  中抜きシート
104,204,304,404,504,604,704(a),704(b),704(c),804  中空部（または、流路）
105,205,305,405,505,605,705(a),705(b),705(c)  第二の基板
106,206,306,406  注入口
107,207,307,407  排出口
408,508,608  近紫外線カットフィルタ
609  反射防止膜
720  溝ありシート
821  保護フィルム付シート
822  保護フィルム
910  核酸分析用フローセル
911  ホルダユニット
912  ステージユニット
913  試薬容器
914  送液ユニット
915  ノズル
916  ノズル搬送ユニット
917  検出ユニット
918  廃液容器
919  光源
1020  第一の光
1021  第二の光
1022  第三の光
1023  ビーズ担体
1024  第四の光
【図１】
2015015913.tif 000003
【図２】
2015015913.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015015913.tif 000009
【図８】
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【図９】
2015015913.tif 000011
【図１０】
2015015913.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2015015913.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月28日(2014.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行う第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセルであって、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記流路内に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過する、核酸分析用フローセル。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
上記光学フィルタが第一の基板上に流路と接するようにパターニングされている、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項４】
上記第二の基板が流路内物質の化学構造を変化させる第一の光は透過し、第一の光より短い波長を持つ第四の光を反射する近紫外線カットフィルタを備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項５】
上記の第二の基板が第一の光と第二の光の反射を防止する反射防止膜を備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項６】
第一の光の波長は、４５０ｎｍ以下である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項７】
第一の光の波長は、３２０ｎｍ以上である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項８】
第二の光の波長は、４５０ｎｍ以上である請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項９】
第三の光の波長は、４８０ｎｍ以上である請求項１に記載の核酸分析フローセル。
【請求項１０】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記流路内に複数固定され、
第一の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝の底面には蛍光分子を持つヌクレオチドの光切断反応を行うための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過し、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１１】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記流路内に複数固定され、
第二の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝と対向する第一の基板面には蛍光分子を持つヌクレオチドの光切断反応を行うための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過し、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１２】
第三の光の波長は、４８０ｎｍ以上である請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
核酸を分析する核酸分析装置であって、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行う第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセル、
前記核酸分析用フローセルを保持するホルダユニット、
前記核酸分析用フローセル内の試料を観察する検出ユニット、
前記核酸分析用フローセルに流路内物質の構造を変化させる第一の光を照射する光源、
前記核酸分析用フローセルに試薬を送液する送液ユニット、を備え、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記流路内に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過する、核酸分析装置。
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月15日(2016.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行う第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセルであって、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記第二の基板上に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過する、核酸分析用フローセル。
【請求項２】
上記光学フィルタが第一の基板上に流路と接するようにパターニングされている、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項３】
上記第二の基板が流路内物質の化学構造を変化させる第一の光は透過し、第一の光より短い波長を持つ第四の光を反射する近紫外線カットフィルタを備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項４】
上記の第二の基板が第一の光と第二の光の反射を防止する反射防止膜を備えた、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項５】
第一の光の波長は、450nm以下である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項６】
第一の光の波長は、320nm以上である、請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項７】
第二の光の波長は、450nm以上である請求項１に記載の核酸分析用フローセル。
【請求項８】
第三の光の波長は、480nm以上である請求項１に記載の核酸分析フローセル。
【請求項９】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
第一の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝の底面には分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行うための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過し、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記第二の基板上に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１０】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
第二の基板側には複数の流路溝を有し、さらに、当該流路溝と対向する第一の基板面には分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行うための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過し、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記第二の基板上に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１１】
第一の基板と、第二の基板とを貼合わせて成る核酸分析用フローセルにおいて、
基板間にはシートが配置されており、
シートには複数の流路溝を有し、これらの流路溝の第一の基板側の底面には分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行うための第一の光を反射する光学フィルタを備え、第二の基板は第一の光を透過し、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記第二の基板上に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過することを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１２】
核酸を分析する核酸分析装置であって、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドに対して光切断反応を行う第一の光を反射する光学フィルタを備えた第一の基板と、流路を形成するための中空部を持つ中抜きシートと、第一の光を透過する第二の基板を貼合わせた核酸分析用フローセル、
前記核酸分析用フローセルを保持するホルダユニット、
前記核酸分析用フローセル内の試料を観察する検出ユニット、
前記核酸分析用フローセルに流路内物質の構造を変化させる第一の光を照射する光源、
前記核酸分析用フローセルに試薬を送液する送液ユニット、を備え、
分子内に光切断可能なリンカーを介した蛍光分子を持つヌクレオチドが表面に複数分子存在するビーズ担体が前記第二の基板上に複数固定され、
上記光学フィルタは、前記蛍光分子を励起する第二の光および、前記蛍光分子から放射される第三の光を透過する、核酸分析装置。
【国際調査報告】
2015015913.tif 000015
2015015913.tif 000016
2015015913.tif 000017
2015015913.tif 000018