(57)【要約】  胃癌腹膜播種を予測すること、また、腹膜播種に選択的に作用する医薬のスクリーニング方法、及び医薬を提供する。胃癌腹膜播種転移群で特異的に高発現しているＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を指標とすることにより、術後の腹膜播種転移の予測や、分子標的治療薬をスクリーニングすることができる。さらに、これらｓｉＲＮＡは腹膜播種再発を抑制することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃切除術後の腹膜播種を予測するための検査方法であって、
対象から採取された患者血清、胃切除術における腹腔洗浄液、胃癌組織の少なくともいずれか１つの試料におけるＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量を測定し、
試料中のＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量が所定値より高い場合には、腹膜播種のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の検査方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量の測定方法が、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
請求項２記載の検査方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ発現量の測定方法が定量的ＰＣＲによるものであることを特徴とする検査方法。
【請求項４】
胃切除術後の腹膜播種を診断又は予測するためのキットであって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＳＹＴ８抗体、抗ＳＹＴ１３抗体、抗ＡＮＯＳ１抗体のいずれか１つ以上を含むことを特徴とする検査キット。
【請求項５】
胃切除後の腹膜播種を治療するための分子標的治療薬をスクリーニングする方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現、又は機能の抑制、を指標として物質をスクリーニングすることを特徴とするＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を標的とする分子標的治療薬スクリーニング方法。
【請求項６】
胃癌の腹膜播種を治療もしくは予防するための分子標的治療薬であって、請求項５記載の分子標的治療薬スクリーニング方法によって得られることを特徴とする治療薬。
【請求項７】
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つのｓｉＲＮＡを含む胃切除術後の腹膜播種による転移を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌の予後診断マーカー及びこれを用いて検査する方法に関する。特に、胃癌の予後を左右する腹膜播種転移する胃癌を検査する方法、検査キット及び分子標的治療薬のスクリーニング方法に関する。また、腹膜播種転移を抑制する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は日本、中国、韓国などアジア、南米に多い癌である。日本での部位別がん死亡率を見ると、胃癌の死亡率は、年々減少しているものの男性では肺癌に次ぐ第２位、女性では大腸癌、肺癌に次ぎ、第３位の死亡率となっている（２０１２年統計による。）。癌検診の普及によって早期発見により胃癌による死亡率は減少しているものの進行胃癌は依然として予後不良であり、胃癌罹患率の高い本邦において克服すべき重要な疾患である。【０００３】
胃癌の予後を大きく左右するのは再発転移である。再発胃癌や再発の恐れのある進行胃癌に対しては化学療法が行われる。現在標準レジメンとして用いられているのは、ＤＮＡ合成阻害を作用機序とするＳ−１の投与を基本とする治療法である。進行胃癌は、大規模コホート研究の結果、胃切除術後補助療法としてＳ−１内服を行うことにより治療の効果が認められ、術後のＳ−１内服が標準治療となっている。Ｓ−１は細胞増殖の盛んな癌一般に効果のある薬剤であり、胃癌に特異的に作用するわけではない。化学療法によって高い腫瘍縮小効果を実現できるようになったものの再発胃癌や進行胃癌の完全治癒は困難である。【０００４】
現状では遠隔転移を有する胃癌は一括して扱われ、その治療方針も区別されていない。しかしながら、胃癌の再発転移形式には、腹膜播種転移、血行性転移、リンパ節転移という全く異なる３つの経路が存在する。原発巣から生じた遊離癌細胞が生着・増殖して転移巣を形成するには多段階の過程が必要であり、接着分子、タンパク分解酵素、増殖因子、血管新生因子、ケモカイン等多くの分子が関与していることが報告されている。胃癌においても再発転移の３つの経路は大きく異なることから、転移に関わる分子も異なり、転移した癌細胞の性質も大きく異なるものと考えられている。それにも関わらず、転移巣成立機序の異なる３つの経路を遠隔性転移として同等の治療が行われていることに転移癌の完全治癒の困難さの一因があると考えられている。【０００５】
近年、マイクロアレイや次世代シーケンサーなどによる網羅的な遺伝子解析法により、特異性の高い腫瘍マーカーの同定が行われている。胃癌に関しても再発や腹膜播種転移を予測、検出する方法が開示されている（特許文献１〜３）。【０００６】
また、癌治療においては、副作用の軽減が可能な分子標的治療薬の開発が盛んになっている。分子標的治療薬とは、癌細胞等、病気の細胞の性質を分子レベルでとらえ、表面に発現しているタンパク質や遺伝子を標的として効率よく作用するように作られた薬剤をいう。胃癌に対する分子標的治療薬はまだ数が少なく、ＨＥＲ２陽性胃癌に対するトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）およびラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）のみが国内承認を得ている状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−２３６７２６号公報
【特許文献２】特開２００４−３２１１０２号公報
【特許文献３】特開２００７−２１５４１２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｎｔｅｒｒａｔ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６），  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  Ｖｏｌ．１７６３，  ｐｐ．７３−８１
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｄａ，  Ｍ．，  ＆  Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，  Ｋ．，  （２００１），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  Ｖｏｌ．３５４，  ｐｐ．２４９−２５７
【非特許文献３】Ｊｉａｎ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９），  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｖｏｌ．８，  ｐｐ．３７７０−３７７６．
【非特許文献４】Ｃｈｏｙ．  Ｃ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１４）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２１，  ｐｐ．８５−９９.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、再発、腹膜播種転移のリスクを評価するマーカーが開示されているものの精度がさほど高くなくいまだ実用化されていない。そのため精度高く再発リスクを評価する新規のマーカーの同定が望まれている。特異性の高いマーカーを見出すことができれば、より有効な個別化治療を提供することが可能となる。【００１０】
また、胃癌の分子標的治療薬として、はじめて我が国で承認されたトラスツズマブは進行、再発胃癌の約２０％程度を占めるＨＥＲ２陽性胃癌にのみ有効であるにすぎない。また、次に非切除、再発胃癌の治療に承認されたラムシルマブは、予後延長効果がさほど大きいものとはいえない。そのため遠隔転移を有する、あるいは切除後再発リスクの高い進行胃癌に対する新たな分子標的治療薬の開発が望まれている。【００１１】
本発明は、胃癌の異なる再発転移形式に関わる遺伝子を明らかにし、予後予測を行い得る新規のマーカーを確立し、予後の悪い腹膜播種のリスクを検査する方法及び検査キットを提供することを課題とする。また、該マーカーを指標として分子標的医薬をスクリーニングする方法を開発することを課題とする。さらに、腹膜播種を抑制する治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下に示す検査方法、キット、スクリーニング方法に関する。
（１）胃切除術後の腹膜播種を予測するための検査方法であって、対象から採取された患者血清、胃切除術における腹腔洗浄液、胃癌組織の少なくともいずれか１つの試料におけるＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量を測定し、試料中のＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量が所定値より高い場合には、腹膜播種のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（２）（１）に記載の検査方法であって、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量の測定方法が、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
（３）（２）記載の検査方法であって、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ発現量の測定方法が定量的ＰＣＲによるものであることを特徴とする検査方法。
（４）胃切除術後の腹膜播種を診断又は予測するためのキットであって、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＳＹＴ８抗体、抗ＳＹＴ１３抗体、抗ＡＮＯＳ１抗体のいずれか１つ以上を含むことを特徴とする検査キット。
（５）ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現、又は機能の抑制を指標として物質をスクリーニングすることを特徴とするＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を標的とする分子標的治療薬スクリーニング方法。
（６）胃癌の腹膜播種を治療もしくは予防するための分子標的治療薬であって、（５）記載の分子標的治療薬スクリーニング方法によって得られることを特徴とする治療薬。
（７）ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つのｓｉＲＮＡを含む胃切除術後の腹膜播種による転移を抑制するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、腹膜播種転移が起きる危険性を胃切除術後すぐに予測することができるため、その後の治療に活かすことができる。具体的には腹膜播種転移の危険性の高い患者群には、胃切除術後腹膜播種転移を視野に入れたフォローアップ計画をたて、治療を行うことが可能となる。さらに、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量を指標として医薬をスクリーニングすることが可能となる。したがって、これら分子を標的とする胃癌腹膜播種転移を治療する医薬を開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】胃癌細胞株を用いたＰＣＲアレイの結果を示す図。図１Ａ、ＢはＳＹＴ８発現と相関のある遺伝子、図１Ｃ、ＤはＳＹＴ１３発現と相関のある遺伝子のＰＣＲアレイの結果を示す。
【図２】腹腔洗浄液中の細胞のＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現量を示す図。図２ＡはＳＹＴ８発現量を、図２ＢはＳＹＴ１３発現量を示す。
【図３】免疫組織化学染色法による胃組織中のタンパク質発現の検討結果を示す図。図３Ａ〜ＣはＳＹＴ８、図３Ｄ〜ＦはＳＹＴ１３のタンパク質発現の結果を示す。
【図４】２００例の胃癌切除患者から得た組織中のＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量を胃癌Ｓｔａｇｅ、腹膜播種有無で比較した図。
【図５】胃癌組織中ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種の相関を示す。図５ＡはＲＯＣ曲線による相関度解析結果を示す図。図５Ｂは、根治的胃切除術が施行されたＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例で、後に生じた腹膜播種再発頻度を比較した図。
【図６】腹水検体中のＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示す図。図６ＡはＲＯＣ曲線による相関度解析結果を示す図。図６Ｂは腹膜播種再発とＳＹＴ１３発現の相関を示す図。図６Ｃは腹水検体のＳＹＴ１３発現と術後生存率との関係を示す図。
【図７】２００例の胃癌切除患者から得た組織中のＳＹＴ８  ｍＲＮＡ発現量を胃癌Ｓｔａｇｅ、腹膜播種有無で比較した図。
【図８】胃癌組織中ＳＹＴ８  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種の相関を示す。図８ＡはＲＯＣ曲線による相関度解析結果を示す図。図８Ｂは、根治的胃切除術が施行されたＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例で、後に生じた腹膜播種再発頻度を比較した図。
【図９】ｓｉＲＮＡによるノックダウン実験の結果を示す図。図９Ａ〜ＣはＳＹＴ８発現、図９Ｄ〜ＦはＳＹＴ１３発現を抑制し、増殖能（図９Ａ、Ｄ）、浸潤能（図９Ｂ、Ｅ）、遊走能（図９Ｃ、Ｆ）の解析を行った結果を示す。
【図１０】マウス腹膜播種モデルにＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与を行い処置後の体重減少の解析結果を示す図。
【図１１】マウス腹膜播種モデルにＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与を行い処置開始２週後、４週後の開腹肉眼所見比較を示す図。
【図１２】マウス腹膜播種モデルにＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与を行い処置開始２週後、４週後、６週後のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇの所見比較を示す図。
【図１３】図１２のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇのシグナル値を定量化した図。
【図１４】ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与処置を行ったマウス腹膜播種モデルの生存曲線を示す図。
【図１５】ＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与処置を行ったマウス腹膜播種モデルの生存曲線を示す図。
【図１６】胃癌細胞株を用いたＰＣＲアレイの結果を示す図。図１６Ａ、ＢはＡＮＯＳ１発現と相関のある遺伝子を示す。
【図１７】ＡＮＯＳ１のｓｉＲＮＡによるノックダウン実験の結果を示す図。図１７Ａは増殖能、図１７Ｂは浸潤能、図１７Ｃは遊走能の解析を行った結果を示す。
【図１８】ＡＮＯＳ１の免疫組織化学染色法による胃組織中のタンパク質発現量を示す図。図１８Ａは代表的な免疫組織化学染色像、図１８ＢはＡＮＯＳ１ｍＲＮＡの発現レベルとの相関を示す。
【図１９】ＡＮＯＳ１の発現量と予後、病期との相関を示す図。図１９ＡはＡＮＯＳ１ｍＲＮＡ発現量と予後を、図１９Ｂは病期を、図１９ＣはＡＮＯＳ１タンパク質発現量と予後との相関を示す。
【図２０】血清中のＡＮＯＳ１の発現と病期、予後との相関を示す図。図２０Ａは血清中ＡＮＯＳ１タンパク質量と病期を、図２０ＢはＲＯＣ曲線解析、図２０Ｃは予後との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者は、胃切除術後の症例を経過に応じて分類し、胃癌原発巣組織から得られたｍＲＮＡの分析を行った。その結果、腹膜播種転移する胃癌にＳＹＴ８、ＳＹＴ１３が特異的に高発現していることを明らかにした。また、ＡＮＯＳ１に関しても、ｍＲＮＡ、タンパク質の発現解析を行ったところ、腹膜播種との相関が見られた。したがって、これらの発現量が一定以上である場合に、腹膜播種転移を起こす可能性がある。
【００１６】
ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３はシナプトタグミン（Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ、ＳＹＴ）ファミリーに属する膜タンパク質である。ＳＹＴファミリータンパク質は、シナプス小胞上に存在するカルシウム・リン脂質結合分子として同定され、カルシウムセンサーとして機能することが示唆されている。ヒトでは１７種のアイソフォームの存在が報告され、主として脳組織に分布していることが報告されている。
【００１７】
ＳＹＴ８は、神経細胞、内分泌細胞の他に、膵臓、精子での発現が報告されている（非特許文献１）。また、ＳＹＴ１３は、他のシナプトタグミンとは異なり、カルシウムの有無に関わらず、リン脂質と結合すること、脳以外の種々の組織でも発現していることが報告されている（非特許文献２）。
【００１８】
しかしながら、ＳＹＴ８及びＳＹＴ１３が胃癌腹膜播種転移において高発現していることは、今までに報告がなく、本発明者によって初めて見出されたことである。また、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３だけではなく、いずれのシナプトタグミンファミリー分子に関しても、胃癌や、胃癌腹膜播種転移のみならず、癌細胞において高発現しているとの報告はこれまでにされていない。
【００１９】
ＡＮＯＳ１（Ａｎｏｓｍｉｎ-１）は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）の構成要素である接着性タンパク質である。主として、脳、神経系での発現が認められ、発生の途中にゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）ニューロンの移動を促進することが知られている（非特許文献３、４）。
【００２０】
ＥＣＭや細胞接着性分子は癌細胞の増殖性や、上皮間葉転換（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）のような浸潤性に極めて重要な役割をもつことが知られている。しかしながら、ＡＮＯＳ１の癌における役割は不明の点が多い。例えば、ＡＮＯＳ１の発現は肺癌や卵巣がんの細胞では発現が抑制されていることが知られている（非特許文献３）。一方、ＡＮＯＳ１の発現増強は、脳腫瘍ではインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）シグナルを増強することによって悪性度が増すこと、大腸癌では、転移やアポトーシス誘導剤に対する抵抗性が増すことが知られている（非特許文献３、４）。このように、ＡＮＯＳ１の発現と発癌との関係は、癌種によって多様な結果が得られており、一定の結論を得るにいたってにない。しかしながら、いずれにしても胃癌におけるＡＮＯＳ１の発現に関する報告は今までにはなく、また、いずれの癌腫においても腹膜転移との関連は知られていなかった。
【００２１】
胃切除術における腹腔洗浄液中の細胞や切除胃癌組織の試料中のＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量が有意に所定値よりも高い値であれば、目視では確認できなくとも腹膜播種転移を起こしている潜在的腹膜播種である可能性や、将来的に腹膜播種転移を起こすリスクが高いことが予測される。したがって、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量を定量することによって、腹膜播種に移行するリスクを評価することができる。
【００２２】
また、ＳＹＴ１３／ＳＹＴ８は、胃の原発組織から分泌、あるいは崩壊した腫瘍から血液中に放出され、血液中を循環すると考えられることから、ＥＬＩＳＡ法等によって検出することにより、腹膜播種に移行するリスクを評価することができる。また、本発明者らは、ＡＮＯＳ１に関しては、血清中でのＡＮＯＳ１タンパク質の検出と病期、予後とが相関することを明らかにした。したがって、腹膜播種のリスクを血液検査によって評価することができる。
【００２３】
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１は、いずれもｍＲＮＡやタンパク質を定量することによって、その発現量を定量することができる。ｍＲＮＡは定量的ＰＣＲ法によって、タンパク質は抗ＳＹＴ８抗体、抗ＳＹＴ１３抗体、抗ＡＮＯＳ１抗体を用いて測定すればよい。定量的ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＴ-ＰＣＲ法等、公知の方法を用いることができる。また、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法、免疫組織化学染色法等公知の方法によって定量することができる。ｍＲＮＡ、タンパク質を測定することにより、感度良くＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１発現量を定量し、腹膜播種のリスクを評価することができる。
【００２４】
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量と胃癌腹膜転移再発との間に相関がみられたことから、これら遺伝子を検出可能なＰＣＲプライマーや、タンパク質を検出可能な抗体と検出に必要な試薬を含むキットとすることにより、胃癌切除術後に腹膜転移再発の予後予測を行う検査キットとすることができる。これにより進行胃癌の術後をきめ細かくフォローすることができる。
【００２５】
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１遺伝子の発現量を検査するキットとしては、各遺伝子の発現量を定量可能なＰＣＲプライマーセットの他に、定量に最適な酵素、試薬等を含んだ構成とすることができる。プライマーはＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を定量的に測定することができれば、どのような配列を用いてもよい。また、発現量を正規化するために、ＧＡＰＤＨを増幅するプライマーのようなコントロールプライマーを含めてもよい。
【００２６】
また、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１タンパク質の発現量を検査するキットとしては、タンパク質を検出するための抗体、アプタマー等、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１タンパク質と結合する分子の他に、検出に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００２７】
胃癌腹膜播種転移群の患者において、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１が高発現していることから、これらの発現を抑制する化合物をスクリーニングすることによって、分子標的治療薬を選択することができる。分子標的治療薬の候補は、低分子化合物、天然物等からなるライブラリーから選択すればよい。
【００２８】
さらに、本発明の実施例で使用しているｓｉＲＮＡは、胃癌細胞株の増殖能、浸潤能、遊走能を抑制する。したがって、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を抑制するｓｉＲＮＡは腹膜播種転移を抑制する治療薬として機能し得る。
【００２９】
また、本発明者らがマウス腹膜播種モデルにＳＹＴ１３、ＳＹＴ８のｓｉＲＮＡを腹腔内投与したところ、腹膜播種転移が抑制された。したがって、腹膜播種転移のリスクが高い患者群に、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８のｓｉＲＮＡを投与することによって、腹膜播種転移が抑制されることが期待できる。
【００３０】
また、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１は膜タンパク質あるいは細胞間接着因子であることから、細胞外に表出している部分に対する抗体を用いれば、その機能をマスクし、腹膜播種転移を抑制し得る。これらをスクリーニングすることにより、新たな医薬を創製することが可能となる。
【００３１】
例えば、胃癌腹膜播種より樹立された癌細胞株や胃癌細胞株のうちＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１が高発現している細胞株の培養液にライブラリー化合物を添加して細胞培養を行い、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１発現を抑制するものを選択すればよい。例えば、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を高発現している細胞株としては、胃癌細胞株ＭＫＮ１、及びＭＫＮ４５が挙げられる。ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量は、上述のようにｍＲＮＡやタンパク質を測定することによって定量することができるので、感度よく発現を抑制する物質を選択することができる。
【００３２】
以下、データを踏まえて説明するが、本発明において、「ＳＹＴ８発現」、「ＳＹＴ１３発現」、「ＡＮＯＳ１発現」とは、特に断りのない限り遺伝子及び／又はタンパク質の発現を指す。
【００３３】
（１）ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３と腹膜播種との相関
【実施例１】
【００３４】
≪腹膜播種再発群に特異的に発現する遺伝子の解析≫
これまでに名古屋大学医学部において胃切除術を行った進行胃癌症例を５年以上の長期無再発群、腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群の４群に分け解析を行った。まず、胃癌再発群の約半数を占め、効果的な治療法の確立されていない腹膜播種再発に着目し、腹膜播種再発例において特異的に高発現を示す分子の検出を行うことにした。具体的には、ステージIII胃癌で治癒切除術が施行され、術後補助療法としてＳ−１内服を行った症例を経過に応じて群分けした。５年以上の長期無再発群、腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群の４群に分け、各４例の胃癌原発巣組織から得られたＲＮＡを対象にトランスクリプトーム解析による発現プロファイリングを行った。【００３５】
手術サンプルは、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡは、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、標準プロトコルに従いシーケンス用ライブラリーの調整を行った。【００３６】
次に、次世代シーケンサーＨｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、Ｐａｉｒｅｄ-Ｅｎｄシーケンシングを行い、トランスクリプトーム解析を行った。読み取り塩基長は１００塩基／リード、参考取得リード数は１億リードペア（２億リード）／レーン、参考取得データ量は２０Ｇｂ／レーンでデータの取得を行った。【００３７】
解析はＨｉＳｅｑ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、指定参照配列へのマッピング処理を行い、ＦＰＫＭ（Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads）値に基づく遺伝子ごとの発現量を算出し、検体間比較テーブルを作成することにより行った。【００３８】
５７７５１分子の発現量をトランスクリプトーム解析により網羅的に解析し、腹膜播種再発群において、他の３群と比較して高発現している分子の検出を行った。その結果、２２遺伝子が高発現していることが明らかとなった。その中から、癌組織での発現がこれまでに報告されておらず、遺伝子の機能が報告されている解析可能な遺伝子を選択した。その結果、表１に示すように、ＳＹＴ８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＸＭ＿００５２５３２１６）、ＳＹＴ１３（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＮＭ＿０２０８２６）の発現が腹膜播種再発群において優位に増加していることが認められた。なお、表１は転移が認められた各群と長期無再発群とのシグナル強度比（ｌｏｇ２比）を算出してまとめたものである。【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１に示すように、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３ともに腹膜播種再発群では長期無再発群に対して有意に遺伝子発現が増強していることが認められる。腹膜播種再発した症例では無再発群と比較して、ＳＹＴ８は約８倍、ＳＹＴ１３は約５．６倍の発現増強が認められた。これに対し、他の転移形式である肝転移再発群、リンパ節再発群ではＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現の増強は認められなかった。したがって、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３遺伝子発現量及びタンパク質発現量は胃癌腹膜播種転移のバイオマーカーとして機能する。
【実施例２】
【００４１】
≪細胞株での発現解析≫
胃癌細胞株１１種類と非癌上皮細胞株ＦＨｓ７４についてＰＣＲアレイ解析を行った。Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  （ＥＭＴ）  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  （Ｑｉａｇｅｎ社製)を用いて、１２種の細胞株を対象に８４遺伝子（ＥＭＴ、転写因子、細胞外マトリックス、接着因子、癌関連主要経路に関与する遺伝子）の発現を網羅的に解析した。この結果と各細胞株におけるＳＹＴ８、ＳＹＴ１３との発現度との間で相関性検定を行った。ＳＹＴ８の結果を図１Ａ、Ｂに、ＳＹＴ１３の結果を図１Ｃ、Ｄに示す。【００４２】
ＳＹＴ８の発現は、癌細胞の増殖に関与することが知られているチロシンキナーゼの一つＥＲＢＢ３（ＨＥＲ３）、癌細胞の転移・浸潤において重要なＥＭＴ関連転写因子ＳＮＡＩ３と有意な正の相関関係を有していた。この結果から、ＳＹＴ８が既知の主要な癌関連分子と協調的に発現し、これらとの相互関係から胃癌腹膜播種を促進している可能性が示唆された。【００４３】
ＳＹＴ１３の発現は、細胞増殖に重要な働きを持つシグナル伝達系のＧＳＫ３Ｂ、癌細胞の転移・浸潤において重要なＥＭＴ関連転写因子であるＮＯＴＣＨ１と有意な正の相関関係を有していた。この結果から、ＳＹＴ１３が既知の主要な癌関連分子と協調的に発現し、これらとの相互関係から胃癌腹膜播種を促進している可能性が示唆された。
【実施例３】
【００４４】
≪胃癌組織中のＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現解析と潜在的腹膜播種の相関≫
手術の際に目視では腹膜播種が認められない症例において、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３発現と、潜在的腹膜播種の相関を解析した。【００４５】
腹腔洗浄液中の細胞は、パパニコロウ染色、ギムザ染色を行い、腹膜播種陽性、陰性を診断した。定量的ＰＣＲは下記のプライマー配列を用いて、ＡＢＩ  ＳＴＥＰＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃１０分加熱後、９５℃５秒、６０℃６０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。【００４６】
また、各ＲＮＡの値を正規化するためにコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。用いたＧＡＰＤＨの定量的ＰＣＲプライマーは下記のとおりである。増幅に用いたＰＣＲ条件は、９５℃１０分加熱後、９５℃５秒、６０℃６０秒で４０サイクルである。【００４７】
プライマー配列
ＳＹＴ８  ：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＧＧＴＡＣＧＴＧ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴ（配列番号２）
ＳＹＴ１３：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＣ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号６）【００４８】
胃切除術１０４症例において、手術の際に採取した腹腔洗浄液の病理診断を行い、腹腔洗浄細胞診陰性と判断された６６症例と、陽性であった潜在的腹膜播種３８症例とに分けて、胃癌組織中ＳＹＴ８及びＳＹＴ１３の発現を定量的ＰＣＲで解析した。結果を図２に示す。【００４９】
図２Ａは、ＳＹＴ８のｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で正規化した値を、細胞診陰性症例、陽性症例の各群で箱ひげ図（最小値、第１四分点、中央値、第３四分点、最大値）で表したものである。図２Ｂは、同様にしてＳＹＴ１３の発現量を示したものである。目視では転移が確認されないものの、腹腔洗浄細胞診で癌細胞陽性と判定され、腹膜播種が認められた症例では、有意にＳＹＴ８及びＳＹＴ１３の発現レベルが高かった。【００５０】
患者によるばらつきはあるものの、細胞診陽性群と陰性群を比較するとＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現量は、ともに陽性群で有意に高値であった。至適カットオフ値の設定はさらに多検体での検証が望まれるが、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３発現量を測定することにより腹膜播種再発する胃癌のリスク予測を可能とする。例えば、図２に示すように、細胞診陽性群の中央値を超える陰性患者はＳＹＴ８、ＳＹＴ１３ともに２５％程度であることから、陽性症例の各中央値を基準として腹膜播種再発する胃癌のリスクを予測することができる。ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の測定方法や測定する試料によってもカットオフ値は異なることが予測されることがら、適宜カットオフ値を求めて、腹膜播種再発リスクの高い患者群を選択し、フォローすることが望ましい。
【実施例４】
【００５１】
≪免疫組織化学染色法による胃組織中ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３タンパク質発現の検討≫
ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３ともに６０症例の患者組織を用い検討を行った。抗ＳＹＴ８抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、又は抗ＳＹＴ１３抗体（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用い、ビオチン標識２次抗体キットとしてＨｉｓｔｏｆｉｎｅ  ＳＡＢ‐ＰＯキット（ニチレイ社製）を使用し、ＤＡＢ基質キット（ニチレイ社製）で染色を行った。図３は抗体により染色を行った後、ヘマトキシリン染色を行った像を示している。【００５２】
ＳＹＴ８の胃癌組織中高発現例では、ＳＹＴ８低発現例と比較して有意に腹膜播種を多く認めた（５３％ｖｓ４％，Ｐ＜０．００１）。図３Ａ〜Ｃに代表的な染色結果を示す。図３Ａ、ＢはＳＹＴ８タンパク質発現陽性である腹膜播種陽性例、図３Ｃは、ＳＹＴ８タンパク質発現陰性である腹膜播種陰性例を示す。【００５３】
ＳＹＴ１３の胃癌組織中高発現例では、ＳＹＴ１３低発現例と比較して有意に腹膜播種を多く認めた（２８％ｖｓ０％、Ｐ＜０．００１）。図３Ｄ〜Ｆに代表的な染色結果を示す。図３Ｄ、ＥはＳＹＴ１３タンパク質発現陽性である腹膜播種陽性例、図３Ｆは、ＳＹＴ１３タンパク質発現陰性である腹膜播種陰性例を示す。【００５４】
これらの結果から、胃癌組織中のＳＹＴ８、ＳＹＴ１３タンパク質発現の度合いも腹膜播種の予測、診断に有用であることが示された。【００５５】
以上の結果から、従来行われてきた細胞診だけではなく、胃癌組織の免疫染色、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現も併せて確認することによって、より精密に予後予測を行うことが可能である。次に患者試料を用いて、切除時の胃癌組織のＳＹＴ８、ＳＹＴ１３発現により、腹膜播種が予測可能であるかの検討を行った。まず、ＳＹＴ１３発現について解析した結果を示す。
【実施例５】
【００５６】
≪胃癌切除患者から得た組織中のＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量の比較≫
２００例の胃癌切除患者から得た組織中のｍＲＮＡについて、定量的ＰＣＲ法によりＳＹＴ１３  ｍＲＮＡを測定し、発現量の比較を行った。【００５７】
患者群は、病期によりＳｔａｇｅ  ＩからＩＶまで分類し、Ｓｔａｇｅ  ＩＩからＩＶの患者については、後に腹膜播種再発をきたした症例であるか否かでさらに細分類し、ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量の比較を行った。結果を図４に示す。早期であるＳｔａｇｅ  Ｉ胃癌の組織中では、正常胃粘膜組織同様にＳＹＴ１３発現量は低値であった。治癒的切除の達成されているＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌においては、のちに腹膜播種再発をきたした症例の手術時の胃癌組織中のＳＹＴ１３発現量は、腹膜播種再発を起こさなかった症例と比べて有意に高値であった。手術時にすでに肝転移、腹膜播種、遠隔リンパ節転移などの遠隔転移を有していたＳｔａｇｅ  ＩＶ症例においては、腹膜播種を有した症例は、他の転移を有していた症例と比べて有意に胃癌組織中のＳＹＴ１３発現量が高値であった。このことから、胃癌組織中のＳＹＴ１３発現量を測定することで、その時点の腹膜播種の存在に加えて、将来の腹膜播種再発の危険度を評価できることが示された。【００５８】
上記で解析した２００例の胃癌切除患者から得た胃癌組織中ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種との相関をＲＯＣ曲線により相関度解析を行った。結果を図５Ａに示す。Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ値が０．８１５と、胃癌組織中ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種とは非常に強い相関性を示した。ＳＹＴ１３発現量の至適カットオフ値は０．０５と算出された。【００５９】
次に、図５Ａで得たＳＹＴ１３発現カットオフ値によって患者を２群に分け、根治的胃切除術の施行されたＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例で将来の腹膜播種再発頻度を比較した。Ｓｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例は、胃癌切除時には腹膜播種が認められなかった。カットオフ値で２群に分けた患者での腹膜播種再発発生率を術後月数に対してプロットした（図５Ｂ）。胃癌組織中ＳＹＴ１３発現量が０．０５（カットオフ値）以上の症例群では、より早期に、且つ高頻度に腹膜播種再発をきたしていた。このことは、ＳＹＴ１３発現量が腹膜播種の存在診断、予測の両面において有用なバイオマーカーとなることを示している。
【実施例６】
【００６０】
≪腹水検体中のＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量≫
上記の２００例の胃癌患者とは異なる患者集団１８２例から得た腹水検体中のＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ量を、定量的ＰＣＲ法で測定した。腹水中の細胞から得たｍＲＮＡを用い、ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現量を測定し、腹膜播種への相関をＲＯＣ曲線により解析した（図６Ａ）。Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ値が０．６９８と、ＳＹＴ１３  ｍＲＮＡ発現と腹膜播種再発は強い相関性を示した。ＳＹＴ１３発現量の至適カットオフ値は２．２１×１０−７と算出された。また、図６Ｂに示すように、腹水中ＳＹＴ１３陽性症例では、有意に腹膜播種陽性症例の頻度が高かった。【００６１】
図６Ａで得たカットオフ値によって、患者を２群にわけ、上記で腹水検体を解析した全１８２例の胃癌症例の全生存率を比較した。腹水中ＳＹＴ１３陽性（発現量２．２１×１０−７以上）群は、有意に予後不良であった。このことから、ＳＹＴ１３は、胃組織中だけでなく、患者腹水中の発現量も有望なバイオマーカーとなることが示された。
【実施例７】
【００６２】
≪胃癌切除患者から得た組織中のＳＹＴ８  ｍＲＮＡ発現量の比較≫
次に、胃癌切除患者から得た組織中のＳＹＴ８  ｍＲＮＡの解析結果を示す。２００例の胃癌切除患者から得た組織中のｍＲＮＡについて、実施例５と同様にして定量的ＰＣＲ法によりＳＹＴ８  ｍＲＮＡを測定し、発現量の比較を行った（図７）。【００６３】
早期であるＳｔａｇｅ  Ｉから、遠隔転移を伴うＳｔａｇｅ  ＩＶにわたるまで、腹膜播種を伴わない症例では胃癌組織中のＳＹＴ８発現量は、正常胃粘膜組織同様のレベルであった。治癒的切除の達成されているＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌においては、のちに腹膜播種再発をきたした症例の手術時の胃癌組織中のＳＹＴ８発現量が、腹膜播種再発を起こさなかった症例と比べて有意に高値であった。手術時にすでに肝転移、腹膜播種、遠隔リンパ節転移などの遠隔転移を有していたＳｔａｇｅ  ＩＶ症例においては、腹膜播種を有した症例は、他の転移を有していた症例と比べて有意に胃癌組織中ＳＹＴ８発現量が高値であった。このことから、胃癌組織中の、ＳＹＴ１３同様、ＳＹＴ８発現量を測定することで、その時点の腹膜播種の存在に加えて、将来の腹膜播種再発の危険度を評価することが可能となることが示された。【００６４】
上記で解析した２００例の胃癌切除患者から得た胃癌組織中ＳＹＴ８  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種との相関をＲＯＣ曲線により相関度解析を行った。結果を図８Ａに示す。Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ値が０．７７１と、胃癌組織中ＳＹＴ８  ｍＲＮＡ発現量と腹膜播種とは非常に強い相関性を示した。ＳＹＴ８発現量の至適カットオフ値は０．００５と算出された（図８Ａ）。【００６５】
次に、上記で得たカットオフ値によって患者を２群にわけ、根治的胃切除術の施行されたＳｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例で将来の腹膜播種再発頻度を比較した。Ｓｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ胃癌症例９３例は、胃癌切除時には腹膜播種が認められなかった。カットオフ値で２群に分けた患者での腹膜播種再発発生率を術後月数に対してプロットした（図８Ｂ）。胃癌組織中ＳＹＴ８発現量が０．００５以上の症例群では、より早期に、かつ高頻度に腹膜播種再発をきたしていた。このことから、ＳＹＴ８発現量が腹膜播種の存在診断、予測の両面において有用なバイオマーカーとなることが示された。
【実施例８】
【００６６】
≪ｓｉＲＮＡを用いたノックダウン解析≫
ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の発現と腹膜播種との強い相関がみられたことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の高発現胃癌細胞株（ＭＫＮ１、ＭＫＮ４５）を用いて、各遺伝子の選択的発現阻害（ノックダウン）実験を行い、胃癌細胞の増殖能、浸潤能、遊走能を評価した。ＳＹＴ８のｓｉＲＮＡを用いた結果を図９Ａ〜Ｃに、ＳＹＴ１３のｓｉＲＮＡを用いた結果を図９Ｄ〜Ｆに示す。なお、図９に示すのはＭＫＮ１を用いて得られた結果であるが、ＭＫＮ４５でも同様の結果が得られている。【００６７】
Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いてＭＫＮ１、ＭＫＮ４５細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７２時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養後、増殖能、浸潤能、遊走能の評価を行った。ＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡ、ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ、コントロールｓｉＲＮＡ（Ａｃｃｅｌｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）はいずれもＤｈａｒｍａｃｏｎ社より得た。【００６８】
ｓｉＲＮＡ導入後７２ｈ時間無血清培地で培養した細胞は以下のようにして細胞の増殖能を評価した。ＭＫＮ１、ＭＫＮ４５細胞は各々１×１０４になるよう、９６ウェルプレートに播種し、２％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で９６時間培養後、１０μｌのＰｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ-１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を添加して２４時間後に、吸光度を測定した。【００６９】
結果を図９Ａ（ＳＹＴ８）、図９Ｄ（ＳＹＴ１３）に示す。ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３、いずれもその発現を阻害すると、胃癌細胞は軽度の増殖能抑制を示すことが明らかとなった。【００７０】
細胞の浸潤能は、ｓｉＲＮＡ導入後７２ｈ時間無血清培地で培養した細胞をマトリゲル浸潤アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により評価した。ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＢＤ  Ｓｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、プロトコールにしたがってアッセイを行った。具体的には、ＭＫＮ１、ＭＫＮ４５細胞を１ウェルあたり各々２．５×１０４になるように播種し、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、膜底面の細胞を固定し、ディフクイック（シスメックス社製）で染色して顕微鏡下で観察し細胞数を数えた。顕微鏡観察は２００倍の倍率で行い、ランダムに選択した５つの視野の平均と標準偏差を求めた。【００７１】
顕微鏡画像を図９Ｂ（ＳＹＴ８）、図９Ｅ（ＳＹＴ１３）左に、浸潤能を有する細胞数を右に示す。ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３、いずれもその発現を阻害すると、胃癌細胞は有意に浸潤能の抑制を示すことが明らかとなった。【００７２】
細胞の遊走能は、ｓｉＲＮＡ導入後７２ｈ時間無血清培地で培養した細胞を用い、創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）により評価を行った。ＭＫＮ１、ＭＫＮ４５細胞は各々２×１０４になるように、１２ウェルプレートにｉｂｉｄｉ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｍｅｔｈｏｄ（ｉｂｉｄ社製）を予め定めた幅でｗｏｕｎｄ  ｇａｐを形成して播種し、無血清培地で培養した。播種２４時間後にインサートを除去し、６時間ごとに２００μｍ間隔でｗｏｕｎｄ幅を測定した。測定は、４０倍の倍率の顕微鏡を用い、各ウェル１０か所を測定して平均及び標準偏差を求めた。【００７３】
顕微鏡画像及びｗｏｕｎｄ幅の経時的変化を図９Ｃ（ＳＹＴ８）、図９Ｆ（ＳＹＴ１３）に、示す。ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３、いずれもその発現を阻害すると、胃癌細胞は有意な遊走能の抑制を示すことが明らかとなった。これらの結果によってＳＹＴ８、及びＳＹＴ１３は胃癌細胞の遊走能、浸潤能に関与しており、ＳＹＴ８及び／又はＳＹＴ１３を阻害することで胃癌細胞の転移を抑制できる可能性が示唆された。
【実施例９】
【００７４】
≪マウス腹膜播種モデルを用いた解析≫
培養細胞を用いた結果から、ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３発現が腹膜播種転移の原因となる可能性が示唆された。そこでＳＹＴ８、ＳＹＴ１３発現をｓｉＲＮＡによって抑制し、腹膜播種再発が抑制されるかマウスモデルを用いて解析を行った。【００７５】
免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ  ｎｕ／ｎｕ、オス、１０週齢）に、ルシフェラーゼ遺伝子導入したヒト胃癌細胞株、ＭＫＮ４５細胞を１×１０６個、腹腔内に注入し腹膜播種モデルとした。ＭＫＮ４５細胞を腹腔内に注入後、５０μｇ／５μＬ  ｓｉＲＮＡ溶解液、８０μＬ  ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用トランスフェクション試薬（ＬＥＯ−１０、北海道システム・サイエンス株式会社）、５％ブドウ糖液  ４１５μＬの計５００μＬを週に２回、６週間投与した。ｓｉＲＮＡは、実施例８と同様Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製のものを用いた。コントロール群は５％ブドウ糖液５００μＬを投与した。コントロール群、ｓｉＲＮＡ腹腔内投与群とも、９匹ずつのマウスで実験を行った。【００７６】
細胞注入から２、４、６週後に、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、１５分後に発光量をＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）  Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）で測定し、癌細胞の増殖を解析した。【００７７】
まず、ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ投与のモデル動物の体重に対する効果を示す。図１０は、癌細胞腹腔内導入後のコントロール群とＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ投与群との体重の変化を示す。コントロール群では経時的に癌の進行による体重減少が見られた。一方、ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ投与群では有意に体重が維持された。このことは、腹膜播種の病勢を抑えていたことに加え、ｓｉＲＮＡ投与がマウスに対して有害な副作用を及ぼしていないことを示している。【００７８】
図１１に処置開始２週後、４週後の開腹肉眼所見を示す。矢印で示した白色腹膜結節が、コントロール群で顕著にみられるのに対し、ｓｉＲＮＡ投与群においては明らかに減少していた。図１２に、処置開始２週後、４週後、６週後のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇの所見を示す。図１２に示すマウスの写真は、各週において各群１番目から９番目までの並び順を揃えている。したがって、各群縦に並んでいるマウスは同じ個体である。ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ投与群では、コントロール群に比べてシグナルの経時的増加が抑制されている。特筆すべきことに、処置後４週目にｓｉＲＮＡ投与によって一度シグナルが消失しているマウスも確認された（丸で囲んでいる）。図１３は、図１２のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇのシグナル値を定量化して比較したものである。２週後、４週後、６週後のいずれの時点でも、発光度はｓｉＲＮＡ投与群はコントロール群に比べ有意に低値であった。【００７９】
上記のマウスの生存曲線を図１４に示す。コントロール群に比べ、ＳＹＴ１３  ｓｉＲＮＡ投与によって、有意にマウスの生存期間が延長した。したがって、ＳＹＴ１３は予後予測を診断に用いることができるだけではなく、ｓｉＲＮＡのようにその発現を低下させる薬剤により、腹膜播種再発を抑制することができる。
【実施例１０】
【００８０】
≪マウス腹膜播種モデルを用いた解析≫
実施例９と同様にしてＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡ腹腔内投与の治療効果を検証した。上記と同様のマウス腹膜播種モデルに、ＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡを週に２回、６週間投与した。ｓｉＲＮＡは、実施例８と同様Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製のものを用いた。コントロール群、ｓｉＲＮＡ腹腔内投与群それぞれ９匹ずつのマウスを用いて解析を行った。【００８１】
図１５に生存曲線を示す。ＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡ投与によって、有意にマウスの生存期間が延長している。コントロール群では９５日目にすべてのマウスが死亡したのに対し、ＳＹＴ８  ｓｉＲＮＡ投与群では１０２日経過後でも９匹中５匹のマウスが生存している。
（２）ＡＮＯＳ１と腹膜播種との相関
【実施例１１】
【００８２】
≪腹膜播種の有無とＡＮＯＳ１の発現≫
次に、ＡＮＯＳ１についての解析結果を示す。ＡＮＯＳ１（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＸＭ＿００６１９０１５３．１）のｍＲＮＡ発現と腹膜播種との関係を解析した。上述のように、ＡＮＯＳ１発現は、癌細胞の増殖性や、上皮間葉転換（ＥＭＴ）との関連について示唆されているものの、相反するデータもある。そこで、胃癌におけるＡＮＯＳ１と腹膜播種の相関について解析を行った。【００８３】
２００１年から２０１２年までに名古屋大学医学部において、術前化学療法をせずに胃切除術を行った２３７症例の患者の胃癌部の組織、及び癌部に隣接する非癌部組織の解析を行った。組織サンプルは液体窒素で急速に凍結後、−８０℃で保存して解析を行った。表２にＡＮＯＳ１の発現と、腹膜播種の有無、ＵＩＣＣ（ｔｈｅ  Ｕｎｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）第７版による分類を示す。【００８４】
腹膜播種の判定は、腹腔洗浄液の細胞診を行い、腹膜播種陽性、陰性を判断した。また、２３７症例の患者の胃癌組織中のＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ発現量の平均値を求め、平均値よりも高い発現のものをＡＮＯＳ１高発現、低いものをＡＮＯＳ１低発現としている。ＡＮＯＳ１発現は、定量的ＰＣＲにより解析を行った。定量的ＰＣＲは、下記の配列のＡＮＯＳ１プライマーを用いて、ＡＢＩ  ＳＴＥＰＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃１０分加熱後、９５℃１０秒、６０℃３０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。結果を表２に示す。【００８５】
プライマー配列
ＡＮＯＳ１：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＧ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴＣＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧ（配列番号８）【００８６】
【表２】
2016143697.tif 000004
表２の結果から、ＡＮＯＳ１高発現と腹膜播種陽性が相関していること、さらに、より病期の進行した患者においてＡＮＯＳ１が高発現であることが明らかとなった。
【実施例１２】
【００８７】
≪細胞株での発現解析≫
実施例２と同様にして胃癌細胞株１１種類と非癌上皮細胞株ＦＨｓ７４についてＰＣＲアレイ解析を行った。この結果と各細胞株におけるＡＮＯＳ１との発現度との間で相関性検定を行った。結果を図１６に示す。【００８８】
ＡＮＯＳ１の発現は、細胞の接着に関与することが知られているインテグリンの一つｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＶ（ＩＴＧＡＶ）、癌細胞の転移・浸潤において重要なＥＭＴ関連転写因子ＦＯＸＣ２、成長分化因子ＮＯＤＡＬと有意な正の相関関係を有していた。また、ＥＭＴにおいてしばしば抑制が見られ、多くの胃癌でメチレーションを受けていることが知られているｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２（ＴＦＰＩ２）と負の相関関係を有していた。この結果から、ＡＮＯＳ１が既知の主要な癌関連分子と協調的に発現し、これらとの相互関係から胃癌腹膜播種を促進している可能性が示唆された。
【実施例１３】
【００８９】
≪ｓｉＲＮＡを用いたノックダウン解析≫
実施例８と同様にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＮＯＳ１の高発現胃癌細胞株（ＭＫＮ１、ＭＫＮ４５）を用いて、ＡＮＯＳ１の選択的発現阻害（ノックダウン）実験を行い、胃癌細胞の増殖能、浸潤能、遊走能を評価した。結果を図１７Ａ−Ｃに示す。【００９０】
Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いて各細胞にＡＮＯＳ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を導入し、７２時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養後、増殖能、浸潤能、遊走能の評価を行った。ＡＮＯＳ１発現を阻害すると、胃癌細胞は軽度の増殖能抑制を示し、有意な浸潤能、及び遊走能の抑制を示すことが明らかとなった。
【実施例１４】
【００９１】
≪免疫組織化学染色法による胃組織中ＡＮＯＳ１タンパク質発現の検討≫
実施例３と同様にして、６０症例の患者組織を用いてＡＮＯＳ１タンパク質発現の検討を行った。抗ＡＮＯＳ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた他は実施例３と同様にして免疫組織染色を行った。ＡＮＯＳ１の発現強度を染色無（図１８中  Ｎｏ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、最小限（同  Ｍｉｎｉｍａｌ（＜３０％））、限局性（Ｆｏｃａｌ（３０−７０％））、広範性（Ｄｉｆｕｓｅ（＞７０％））に分類した。代表的な染色像を図１８Ａに示す。ＡＮＯＳ１  ｍＲＮＡ発現レベルと組織染色像との関係を図１８Ｂに示す。ＡＮＯＳ１  ｍＲＮＡ発現レベルは、ｍＲＮＡの発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で正規化した値である。【００９２】
ＡＮＯＳ１との発現強度との相関に関しては、客観性を担保するために、組織標本は解析前にランダムに記号を付し、標本の情報を与えずに２人の観察者に測定を行わせた。各観察者はすべての標本について少なくとも２度測定評価を行い、観察者による差異を最小にするようにした。組織中のＡＮＯＳ１  ｍＲＮＡ発現レベルと免疫組織化学染色法によるＡＮＯＳ１タンパク質発現強度は有意に相関していた。同一症例での胃癌組織中ＡＮＯＳ１  ｍＲＮＡ発現レベルとタンパク質発現強度との相関を解析した結果（図１８Ｂ）では、これらの間に有意な相関を認めており、胃癌組織中のｍＲＮＡ発現解析の結果がタンパク質発現解析にも適応できることが示された。
【実施例１５】
【００９３】
≪組織中のＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ発現量と予後との検討≫
組織中のＡＮＯＳ１の発現量と予後との相関を解析した。表２と同様にして、胃癌組織中のｍＲＮＡのＡＮＯＳ１発現から、ＡＮＯＳ１高発現者、低発現者に分類し、術後からの生存者数をプロットした（図１９Ａ）。ＡＮＯＳ１の高発現者は低発現者に比べ、有意に予後不良であることが明らかである。【００９４】
また、ＵＩＣＣによる病期とＡＮＯＳ１のｍＲＮＡとの関係を示した（図１９Ｂ）。ＡＮＯＳ１の組織中の発現量は、胃癌の病気が進行するにつれて上昇することを示している。さらに、胃癌組織中のＡＮＯＳ１  ｍＲＮＡ発現量の４分位で患者を分類し、術後からの生存者数をプロットした（図１９Ｃ）。ＡＮＯＳ１の発現が多くなるにしたがって生存率が低下しており、このことからもＡＮＯＳ１の組織中発現量を測定することで予後を予測することが可能となることが示唆された。
【実施例１６】
【００９５】
≪患者術前血清中のＡＮＯＳ１タンパク質量と病期、予後の検討≫
６０名の健常者及び１４６名の胃癌患者の血清中のＡＮＯＳ１をＥＬＩＳＡにより解析した。血清サンプルは術前７日以内に採取し、急速に凍結し−８０℃に保存して用いた。血清ＡＮＯＳ１レベルはｈｕｍａｎ  ＡＮＯＳ１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＣＵＳＡＢＩＯ社製）を用いて測定した。【００９６】
血清ＡＮＯＳ１値は健常者より胃癌患者で有意に高値であることに加え、病期が進行するほど上昇していた（図２０Ａ）。ＡＮＯＳ１値のカットオフ値を求めるＲＯＣ曲線解析（図２０Ｂ）より得られたカットオフ値により胃癌患者を２群に分け、予後との相関を解析した。図２０Ｃに示すように、血清ＡＮＯＳ１高値群は有意に予後不良であった。すなわち、患者血清中のＡＮＯＳ１タンパク質量を調べることにより、手術に先立ち患者の病期や予後予測を行うことができることを示している。患者血清中のＡＮＯＳ１測定という侵襲性のより低い方法で病期や予後予測を行うことができることは、患者にとってもメリットが大きい。【００９７】
以上の結果から、ＡＮＯＳ１の発現量と腹膜播種の存在、ひいては患者予後が有意に相関することが明らかとなった。ＡＮＯＳ１量は、胃癌組織中のｍＲＮＡ、タンパク質量、及び血清ＡＮＯＳ１タンパク質量で測定することができることから、術前、あるいは術後すぐに腹膜播種の可能性や予後予測を行うことが可能であり、より細かい治療方針のもと治療を行うことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、手術時に得られる試料中のＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量を、腹膜播種転移が起きるマーカーとして用い、術後のリスクを検査することができる。その結果、より細かい治療方針のもとに患者の治療を行うことが可能となる。さらに、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量を指標として用いてスクリーニングを行うことにより、胃癌腹膜播種転移に選択的に作用する医薬の開発を行うことが可能となる。さらに、ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８のｓｉＲＮＡが腹膜播種モデル動物において、腹膜播種を抑制したことから、これらｓｉＲＮＡが直接腹膜播種再発を抑制できると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年6月29日(2016.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃切除術後の腹膜播種を予測するための検査方法であって、
対象から採取された患者血清、胃切除術における腹腔洗浄液、胃癌組織の少なくともいずれか１つの試料におけるＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量を測定し、
試料中のＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現量が所定値より高い場合には、腹膜播種のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の検査方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量の測定方法が、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
請求項２記載の検査方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１のｍＲＮＡ発現量の測定方法が定量的ＰＣＲによるものであることを特徴とする検査方法。
【請求項４】
胃切除術後の腹膜播種を診断又は予測するためのキットであって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の発現量を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＳＹＴ８抗体、抗ＳＹＴ１３抗体、抗ＡＮＯＳ１抗体のいずれか１つ以上を含むことを特徴とする検査キット。
【請求項５】
胃切除後の腹膜播種を治療するための分子標的治療薬をスクリーニングする方法であって、
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つの発現、又は機能の抑制、を指標として物質をスクリーニングすることを特徴とするＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１を標的とする分子標的治療薬スクリーニング方法。
【請求項６】
胃癌の腹膜播種を治療もしくは予防するための分子標的治療薬であって、請求項５記載の分子標的治療薬スクリーニング方法によって得られることを特徴とする治療薬。
【請求項７】
ＳＹＴ１３、ＳＹＴ８、ＡＮＯＳ１の少なくともいずれか１つのｓｉＲＮＡを含む胃切除術後の腹膜播種による転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項８】
請求項３記載の検査方法であって、
胃癌組織中のｍＲＮＡの発現量が、
ＳＹＴ１３のカットオフ値０．０５、又はＳＹＴ８のカットオフ値０．００５以上のときに、
腹膜播種転移再発のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項９】
請求項２記載の検査方法であって、
血清中のＡＮＯＳ１タンパク質の発現量が、
カットオフ値６００ｐｇ／ｍｌ以上のときに、
患者の腹膜播種転移再発リスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
ＳＹＴ１３、又はＳＹＴ８のｓｉＲＮＡの少なくともいずれか１つを含む胃切除術後の腹膜播種による転移を抑制するための請求項７記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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