(57)【要約】  癌細胞に対して正常な細胞への分化を誘導できるように、エピジェネティックな作用の予想される成分を含有するミトコンドリア活性化剤とし、またはミトコンドリアを活性化する作用のある新規な組成の細胞分化誘導剤とする。ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールとグリセリンの混合成分を有効成分として０．０３〜３００μｇ／mL含有するミトコンドリア活性化剤とする。ＤＮＡメチル化を促進し、白血病細胞などの癌細胞の休止遺伝子を活性化して正常な細胞周期による細胞の正常分裂を促し、ミトコンドリアの機能を活性化させて細胞の分化を中止させることなく継続的に正常な細胞に分化誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤。
【請求項２】
上記有効成分の濃度が、０．０３〜３００μｇ／mLである請求項１に記載のミトコンドリア活性化剤。
【請求項３】
ケンフェロールとグリセリンの配合割合が、質量比で９９．５：０．５〜０．５：９９．５の範囲である請求項１または２に記載のミトコンドリア活性化剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のミトコンドリア活性化剤からなり、急性前骨髄性白血病細胞に対するミトコンドリア活性化剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のミトコンドリア活性化剤を有効成分とする急性前骨髄性白血病細胞に対する細胞分化誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ミトコンドリアの生理活性や細胞中の存在量を高めることにより、細胞の正常な分裂および分化を促進し、白血病細胞などに対し正常な細胞への分化を誘導することが可能なミトコンドリア活性化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ミトコンドリアは、細胞の機能を活性化させ、特に筋肉細胞ではエネルギー消費を亢進させるので、その機能の活性化剤としてベンゾイミダゾール誘導体などが知られており、これには肥満、糖尿病を予防するなどの効果があることが知られている（下記特許文献１）。【０００３】
このようなミトコンドリア活性化剤は、ミトコンドリアを含んでいる細胞に対し、正常な分裂および分化を促進するための役割があることはあまり知られていない。【０００４】
たとえば急性前骨髄球性白血病の発症の機序として、顆粒球細胞などに分化抑制が起こり、分化抑制された細胞のミトコンドリア活性は低いことが認められるが、分化抑制とミトコンドリア活性の関係についての因果関係についてはよく知られていない。【０００５】
ところで、一般によく知られたフラボノールを含有する果実等抽出物を原料とする癌増殖抑制剤があり、たとえばケルセチン、ケンフェロールなどの成分を含む癌増殖抑制剤が知られている（下記特許文献２）【０００６】
また、マメ科の植物に含まれるポリフェノールの一種として知られているケンフェロールについて、これを水相画分から抽出して精製し、機能性食品や化粧品、試薬、医薬品に用いることができることが知られている（下記特許文献３）。【０００７】
また、本願の発明者らによって発見され、白血病や皮膚癌などの癌細胞に対して分化誘導活性を示す天然成分由来の細胞分化誘導剤が開示されており、杉、檜または松の樹木粉砕物に水を添加し、煮熟したものを濾過して樹脂分および固形物を除去した各熱水抽出物と、オオバコ水を添加し、これを煮熟したものを濾過した熱水抽出物を用い、各熱水抽出物の含有割合を調整した水溶性混合抽出物の乾燥物のエチルアルコール可溶性成分を有効成分として含有する白血病細胞に対する細胞分化誘導剤が公報に記載されている（下記特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−６７６２９号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５７２４号公報
【特許文献３】特開２００７−２８４３６９号公報
【特許文献４】特許第４７１７３６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上記した従来の癌増殖抑制剤や細胞分化誘導剤は、天然物由来の抽出物であっても、これに含まれている多種類の不特定な成分を有効成分としたものにすぎず、有効な特定成分は限定されていないので、より効率よく所期した作用が奏されるように癌細胞の増殖抑制作用の確実性を高めるために有効成分を特定する必要があった。【００１０】
また、ケンフェロールは、フラボノイドの一種としてフリーラジカルを消去する作用を通じて癌増殖抑制効果のあることは知られているが、特に細胞分化誘導性のある有効成分としては解明されていない。【００１１】
また、急性前白血病の治療薬の有効成分として、ビタミンＡの誘導体であるレチノイン酸が知られているが、白血病細胞に投与すると、骨髄球の分化過程において好中球に分化させる割合があまり高くなく、好中球よりも貧食作用の弱い単球に分化する割合が多いので、癌細胞を貧食させて抗癌性を発揮する効果が充分に発揮されていないという問題点がある。【００１２】
そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決して果実等に含まれる天然物由来の成分のうち、特にヒトなどの癌細胞に対して正常な細胞への分化を誘導できるように、エピジェネティックな作用の予想される成分を含有するミトコンドリア活性化剤とし、またはミトコンドリアを活性化する作用のある新規な組成の細胞分化誘導剤とすることである。【００１３】
また、細胞分化誘導性の有効成分をヒト白血病細胞に投与した際に、骨髄球の分化過程において好中球に分化させる割合を高くすると共に、好中球より貧食作用の弱い単球に分化する割合を低くして、効率よく癌細胞を貧食させて抗癌性を発揮する効能を充分に高められる細胞分化誘導剤とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、この発明においては、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤としたのである。【００１５】
上記したように構成されるこの発明のミトコンドリア活性化剤は、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分として含有することにより、ヒト白血病細胞等のミトコンドリアのＤＮＡ中のシトシンにメチル基を転移させ、５−メチルシトシンに変化させるという、いわゆるＤＮＡメチル化を促進するエピジェネティックな作用がある。【００１６】
因みに、上記のＤＮＡメチル化は正常な発生に必須であり、遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、反復因子の抑制、発癌など多くの鍵段階と関係している。【００１７】
このような作用によって、白血病細胞などの癌細胞の休止遺伝子を活性化して正常な細胞周期による細胞の正常分裂を促し、すなわち、この発明のミトコンドリア活性化剤は、ミトコンドリアの機能を活性化させて細胞の分化を中止させることなく継続的に正常な細胞に分化誘導することができる。【００１８】
そして、上記した作用が充分に奏されるように、上記有効成分の濃度が、０．０３〜３００μｇ／mLである上記のミトコンドリア活性化剤とすることが好ましい。
なぜなら、０．０３μｇ／mL（＝３０ｎｇ／mL）未満の低濃度では、ミトコンドリアの活性や増殖性は、抑制されてしまい、また３００μｇ／mLを超える高濃度では、それ以上の格段の効果が望めず、効率性の点で実用的でないからである。【００１９】
また、この発明においてケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分とする場合、ケンフェロールとグリセリンの配合割合が、質量比で９９．５：０．５〜０．５：９９．５の範囲であるように配合されたミトコンドリア活性化剤とすることが好ましい。【００２０】
ケンフェロールおよびグリセリンの併用時におけるグリセリンの配合割合が、０．５質量％未満の少量の場合は、ミトコンドリアの活性や増殖性は安定しない場合があるので好ましくない。また、ケンフェロールおよびグリセリンの併用時におけるグリセリンの配合割合が、９９．５質量％を超える多量の場合は、ミトコンドリアの活性や増殖性の効果は認められるものの、残分としてのケンフェロールの有効成分量をミトコンドリア活性化剤の使用目的に応じて適切に調整する必要がある。【００２１】
特に好ましい上記したミトコンドリア活性化剤の用途としては、急性前骨髄性白血病細胞に対するミトコンドリア活性化剤である。また、上記のミトコンドリア活性化剤を有効成分とする急性前骨髄性白血病細胞に対する細胞分化誘導剤とすることもできる。
【発明の効果】
【００２２】
この発明は、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤としたので、特にヒトなどの癌細胞に対して正常な細胞への分化を誘導できるように、エピジェネティックな作用の予想される成分を含有するミトコンドリア活性化剤とし、またはミトコンドリアを活性化する作用のある新規な組成の細胞分化誘導剤となる利点がある。【００２３】
また、この発明のミトコンドリア活性化剤を有効成分とする急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）に対する細胞分化誘導剤は、骨髄球の分化過程において好中球に分化させる割合が顕著に高く、好中球より貧食作用の弱い単球に分化する割合が低いため、効率よく癌細胞を貧食する好中球の割合を高めて抗癌性を発揮する利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ミトコンドリアの活性化について細胞毒性試験の結果を示し、有効成分（ケンフェロール、ケンフェロールとグリセリン）の添加量と吸光度（生細胞数）との関係を示す図表
【図２】培養期間５日間または１０日間におけるケンフェロールの添加量と死細胞率との関係を示す図表
【図３】培養期間５日間での好中球への分化誘導性を示し、各種試薬（エチルアルコール、ビタミンＤ３、レチノイン酸）または有効成分（ケンフェロールおよびグリセリン、ケンフェロール）の添加量とＮＢＴ染色細胞率との関係を示す図表
【図４】培養期間１０日間での好中球への分化誘導性を示し、各種試薬（エチルアルコール、ビタミンＤ３、レチノイン酸）または有効成分（ケンフェロールおよびグリセリン、ケンフェロール）の添加量とＮＢＴ染色細胞率との関係を示す図表
【図５】培養期間５日間での単球への分化誘導性を示し、各種試薬（エチルアルコール、ビタミンＤ３、レチノイン酸）または有効成分（ケンフェロールおよびグリセリン、ケンフェロール）の添加量とエステラーゼ染色細胞率との関係を示す図表
【図６】培養期間１０日間での単球への分化誘導性を示し、各種試薬（エチルアルコール、ビタミンＤ３、レチノイン酸）または有効成分（ケンフェロールおよびグリセリン、ケンフェロール）の添加量とエステラーゼ染色細胞率との関係を示す図表
【図７】培養期間１０日間での分化誘導性を示し、各種試薬（エチルアルコール、ビタミンＤ３、レチノイン酸）またはケンフェロールの添加量に対する分化細胞の割合またはメチル化ＤＮＡ量の関係を示す図表
【図８】トリパンブルー染色法による生細胞数の測定試験結果を示す図表
【図９】ミトコンドリア活性測定試験結果（最高反応速度）を示す図表
【図１０】ミトコンドリア活性測定試験結果（ユニット値）を示す図表
【発明を実施するための形態】
【００２５】
この発明のミトコンドリア活性化剤は、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分として含有するものであり、ヒト白血病細胞等のミトコンドリアのＤＮＡ中のシトシンにメチル基を転移させ、５−メチルシトシンに変化させるという、エピジェネティックなＤＮＡメチル化作用を奏するものである。
【００２６】
すなわち、この発明の細胞分化誘導剤は、癌細胞などの未分化な細胞に対し、細胞の分化を誘導する作用があり、例えば急性前骨髄性白血病や、大腸がん、前立腺がん、糖尿病性腎症などのＤＮＡのメチル化やヒストンの脱アセチル化等に関する異常により発現する疾患に関わる細胞の分化を正常に誘導することができる可能性を有する細胞分化誘導剤である。
【００２７】
この発明に用いるケンフェロールは、下記の化１の式で示される分子式Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６で分子量２８６．２４の天然フラボノールの一種であり、天然の由来のものは、３位または３位、７位に糖が結合した配糖体として、ゲンノショウコやエジス草の葉、キャベツ、豆類、トマトなどに含有されている。
【００２８】
【化１】
2014171333.tif 000002
【００２９】
また、白血病や皮膚癌などの癌細胞に対して分化誘導活性を示す天然成分由来の細胞分化誘導剤（特許文献４参照）についてもケンフェロールおよびグリセリンが含有されていることが判明している。この天然由来成分は、杉、檜または松の樹木粉砕物に水を添加し、煮熟したものを濾過して樹脂分および固形物を除去した各熱水抽出物と、オオバコに水を添加し、これを煮熟したものを濾過した熱水抽出物を用い、各熱水抽出物の含有割合を調整した水溶性混合抽出物の乾燥物のエチルアルコール可溶性成分中に含有されている。
【００３０】
この発明に用いるグリセリンは、示性式Ｃ３Ｈ５（ＯＨ）３または分子式Ｃ３Ｈ８Ｏ３で表される３価のアルコールであるが、製剤の態様に応じてジグリセリンなどのオリゴグリセリンやポリグリセリンを単独または混合して用いることもできる。
【００３１】
この発明のミトコンドリア活性化剤またはこれを有効成分とする急性前骨髄性白血病細胞に対する細胞分化誘導剤の有効成分についての安全性については、前記したような野菜などの食品に含まれている安全性の高いものであり、またグリセリンの安全性については周知である。
【００３２】
投与剤型としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤などの経口製剤、注射製剤および外用剤が挙げられる。製剤化の際には、通常の製剤担体を用いて常法により製造することができる。
【００３３】
すなわち経口製剤を製造するには、有効成分と賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により上記剤形に製剤する。
【００３４】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などがあり、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチル（エチル）セルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどがあり、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン、結晶セルロース、炭酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等があり、錠剤・顆粒剤には糖衣、その他必要に応じてコーティングしてもよい。
【００３５】
また注射用製剤を製造するには、有効成分にｐＨ調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤などを加えて、常法により製剤化する。
【００３６】
外用剤を製造する際の方法は限定されず、常法により製造すればよく、すなわち基剤原料として、例えば動植物油、エステル油、ワックス類、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、粘土鉱物類、精製水などの原料が挙げられ、さらに必要に応じ、pH調整剤、抗酸化剤、キレート剤などを添加することができる。
【００３７】
また必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。なお上記基剤原料の添加量は、通常外用剤の製造にあたり設定される濃度になる量である。
【００３８】
この発明における有効成分の臨床投与量は、症状、重症度、年齢、合併症などによって異なり限定されず、また化合物の種類・投与経路などによっても異なるが、癌細胞などに対する有効成分の濃度が、０．０３〜３００μｇ／mLであり、好ましくは３０〜３００μｇ／mLである。
【実施例】
【００３９】
有効成分として、ケンフェロールを有効成分とする実施例１、またはケンフェロール１質量部に対してグリセリンを９質量部配合した実施例２のミトコンドリア活性化剤を、それぞれ蒸留水（ＳＤＷ）を基材として所定濃度配合して調製した。
すなわち、図１〜７中に示すように、それらの配合量は、３．２×１０−４質量％、１．０×１０−３質量％、３．２×１０−３質量％、０．０１質量％、０．０３２質量％、０．１質量％（３０ｎｇ／mL）、０．３２質量％、１質量％、３．２質量％、１０質量％（＝３００μｇ／mL）とした。【００４０】
このミトコンドリア活性化剤（実施例１、２）に対し、以下の方法で培養された細胞に対し、細胞毒性試験（ミトコンドリア活性量［生細胞数の測定］）、細胞分化誘導試験、エステラーゼ染色試験、ＮＢＴ還元染色試験を行ない、これらの結果を図１〜７に示した。【００４１】
これらの試験方法の詳細を以下に示す。
１）細胞の培養条件
ＨＬ６０細胞は試験培地（ＲＰＭＩ  １６４０培地、１０％ＦＢＳ、抗生物質無添加）を使用し、ＣＯ：インキュベータ（５％Ｃｑ、３７℃）内で対数増殖期に達するまで培養した。【００４２】
２）細胞毒性試験（培養細胞を用いて、毒性を細胞の生死、すなわち生存率もしくは死亡率により評価した）
ＨＬ６Ｏ細胞を９６ウェルプレートに５×１０４cells/mLの濃度で０．１mLを各ウェルに播種、同時に被験物質（７段階希釈：１０％より１０倍希釈系列：被験物質はあらかじめ濾過減菌して使用する）を添加した。培養３日後、細胞浮遊培養液に生細胞測定試薬ＳＦを添加（最終１０％）し、生細胞数を測定した。ｎ＝３で行って細胞の増殖性（viability）を生細胞数測定試薬ＳＦ(WST-8）で吸光度を測定した。【００４３】
３）細胞分化誘導試験
ＨＬ６０細胞を５×１０４ce11s／mL濃度で１mLを６ウェルプレート各ウェルに播種し、播種と同時に被験物質５段階濃度（１０％より１０倍希釈系列）を添加した。プレートを５％Ｃｑ、３７℃下で５日間、１０日間培養した。各ウェルの細胞浮遊液を遠心により回収し、回収した細胞について細胞数、ＮＢＴ還元能およびエステラーゼ活性の測定を行なった。さらにカラッチへマトキシリン染色にて各細胞の核型の変化を観察した。それぞれの染色細胞の割合を測定し、分化誘導性を評価した。試験数ｎ＝５で行ない、陰性対照として無添加、０．１％エチルアルコール（陽性対照の溶媒対照）、陽性対照としてレチノイン酸（エチルアルコール溶解、終濃度1μＭ）、活性型ビタミンＤ３（エチルアルコール溶解、終濃度１０ｎＭ）を用いた。各染色法の詳細を以下に示す。【００４４】
３−１）エステラーゼ染色・カラッチヘマトキシリン染色
エステラーゼ染色用エステラーゼ染色キット（武藤化学社製）を用いて以下のように行なった。回収した細胞を１×１０6cells/mLの濃度になるようにＰＢＳで調製した。細胞溶液をスライドグラス上に薄く広げ、１０分間静置した。次いで冷蔵庫内で固定液を細胞上に滴下し、３０秒間静置し、流水で３０秒間水洗した。次に標本にエステラーゼ反応液を滴下し、３７℃（湿潤室にて）、３０分間静置し、流水で３０秒間水洗した。その後、カラッチへマトキシリン溶液を滴下し、室温で１０分間静置し、流水で５分間水洗した。乾燥後、５０％グリセリン溶液を滴下後、カバーグラスを封入し、顕微鏡下で赤褐色・青色に染色された細胞を計測した。【００４５】
３−２）ＮＢＴ還元染色
回収した細胞を１×１０6cells/mLの濃度になるようにＲＰＭＩｌ６４０培地（SIGMA,R8758血清無添加）で調製し、等量のＮＢＴ溶液（ＰＢＳに０．２％ＮＢＴ,２０％ＦＢＳを添加し、濾過後に使用する）を加えた。終濃度６μＭになるようにＴＰＡを添加し、撹伴後、３７℃、３０分間静置し、１０００rpm、５分間遠心し、上清を除去した。次いで、細胞をＰＢＳに再懸濁し、スライドグラス上に塗布し、顕微緯下で青色に染色された細胞を計測した。【００４６】
以上の試験結果を図１〜７に示した。
図１は、ケンフェロール、またはケンフェロールにグリセリンを加えた混合物の諸種濃度のミトコンドリア活性を調べた図であり、ケンフェロールにグリセリンを加えた群は３．２×１０−４％から０．０３２％まで増加傾向を示し、その後１０％（３００μｇ）まで増加を認めなかった。【００４７】
しかし、各種濃度のケンフェロール群３．２×１０−４％から０．０３２％までミトコンドリア活性は抑制され、０．１％（３０ｎｇ／mL＝０．０３μｇ／mL）から１０％（３００μｇ／mL）まで増加を認めた。【００４８】
図２のトリパンブルー染色での死細胞数は５日間培養で、２％から４％で濃度による差は認められなかった。このことから、ミトコンドリアの活性化はケンフェロール単独で用いること良いことがわかる。【００４９】
図３、４の５日間と１０日間の培養では好中球への分化誘導試験（ＮＢＴ染色陽性）では、濃度依存的にケンフェロール・グリセリンが増加していた。このことはケンフェロールにミトコンドリア活性作用と分化誘導作用があり、ケンフェロール・グリセリンは分化誘導作用が良好であることがわかる。【００５０】
また、図３に示すように、培養５日間のケンフェロール群とケンフェロール・グリセリン群は、濃度依存的に分化率は向上し、そして３００μｇのケンフェロール・グリセリンは３００μｇのケンフェロールの２倍強の分化率を示した。【００５１】
図４に示すように、培養１０日間のＮＢＴ染色細胞率をみると、培養１０日目ではケンフェロール群の分化率は低下し、３００μｇケンフェロールでも３％であった。これと比較しケンフェロール・グリセリン群は、３０ｎｇで４％、０．００１％で８％、０．１％で７％、１％で９％、１０％で１４％と分化率は向上していた。レチノイン酸添加も６８％、活性型ビタミンＤ３は４％と分化率は半減していた。【００５２】
これらのことから、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分とすることにより、濃度依存的、かつ培養期間５から１０日で経時的に好中球などの顆粒球の数は、有意に増加していることがわかる。【００５３】
次に、図５、６に示した単球への分化を示すエステラーゼ染色では、両者に濃度と培養期間に対する有意差は無かった。レチノイン酸では、５日培養で２％、１０日培養では１４％と分化が見られ、ケンフェロール・グリセリンは、このような傾向が無かった。【００５４】
これにより、分化するポイントは、レチノイン酸より前の段階でオンすると考えられる。すなわち、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分とし、ヒト白血病細胞に投与すると、骨髄球の分化過程において好中球に分化させる割合が高く、一方、好中球より貧食作用の弱い単球に分化する割合は低くなっていた。【００５５】
したがって、ケンフェロールの単独成分、またはケンフェロールおよびグリセリンを併用した混合成分を有効成分とすれば、効率よく癌細胞を貧食させて抗癌性を発揮する効能を充分に高められる細胞分化誘導剤になることがわかる。【００５６】
図７に示すように、諸種濃度のケンフェロールを添加すると、ＨＬ６０細胞が０．００１％でＤＮＡメチル化量は増加し１０％（３００μｇ／mL）でメチル化量は低下していた。【００５７】
これらの結果から、分化誘導剤のレチノイン酸と比較し、ケンフェロールは、分化誘導に優れた脱メチル化とアポトーシス剤として用いることができ、細胞内のメチル化酵素が低下している細胞の老化予防すなわち前ガン状態にある細胞やメチル化細胞が多い脂肪細胞の分化誘導剤（代謝改善剤）として新抗老化剤として使用も可能であると認められた。【００５８】
［実施例３、４］
ケンフェロール１質量部に対してグリセリン２００質量部配合した混合物を実施例３として調製し、またケンフェロール含有の植物からエチルアルコールおよびアセトニトリルで抽出された成分からなり、ケンフェロール３．０×１０−４質量％、グリセリン９９．９９９７質量％からなる組成物を実施例４とした。【００５９】
これら実施例３、４を被験物質として、以下のように「生細胞数測定及びミトコンドリア活性測定試験」を行なって検証し、ミトコンドリア活性化剤の作用について、ＨＬ６０細胞を分化し細胞数を増やしてミトコンドリアを量的に増加させてアポトーシスを起こすのか、またはＨＬ６０細胞の分化を誘導する際に、細胞数を増加させることなく個々の細胞内のミトコンドリアの機能を活性化してアポトーシスを起こすのかについて調べた。【００６０】
［生細胞数測定及びミトコンドリア活性測定試験］
ＨＬ６０細胞を１×１０７cells/フラスコ含む５mLをＴ２５フラスコに播種し、この播種と同時に各被験物質（エチルアルコール、レチノイン酸、ジメチルスルホキシド、ロテノン、ＳＤＷ、実施例３、４）を添加した。【００６１】
この添加の際に、実施例３は濾過滅菌後、培地に添加した。実施例４では、１０mLを６０℃で加温し、溶媒を全て蒸発させ、新たに１０mLの滅菌水を添加して溶解し、その後、濾過滅菌処理してから培地に添加した。また、レチノイン酸は１００mM濃度としてエチルアルコールに溶解した濃縮溶液とし、ロテノンは１００ｍＭ濃度としてＤＭＳＯに溶解した濃縮溶液として添加した。【００６２】
なお、実施例３、４は終濃度１０％で培地に溶解していることから陰性対照（溶媒対照）は１０％ＳＤＷ（滅菌蒸留水）であり、また陽性対照のレチノイン酸、ロテノンに対する溶媒対照はそれぞれ１．０×１０−４％エチルアルコール、１．０×１０−５％ＤＭＳＯとした。【００６３】
生細胞の培養条件は、フラスコを５％ＣＯ２、３７℃下で５日間の培養とし、各ウェルの細胞浮遊液を回収し、トリパンブルー染色法による生細胞数測定、ミトコンドリア活性（シトクロームＣオキシダーゼ活性）測定の各アッセイを試験数を５として行なった。測定法は以下の通りである。 【００６４】
＜トリパンブルー染色による生細胞数測定＞ 
細胞浮遊培養液５０μLに５０μLのトリパンブルー溶液を添加し、数分反応後に血球計算版にて顕微鏡下で未染色細胞、染色細胞をカウントした。全細胞数における死細胞（染色細胞）を求め、生細胞数（cells/mL）および死細胞率（％）を算出し、結果を図８に示した。 【００６５】
＜ミトコンドリアの活性測定＞
１．ミトコンドリア画分の抽出 
ミトコンドリア画分の抽出にはMitochondria Isolation Kit for Tissue and cultured cells (BioChain社製)を使用し、その手順書に従って以下のように抽出した。【００６６】
(1)培養終了後の浮遊細胞を600×g、５分、４℃にて遠心し、沈殿した細胞に冷やした１×PBSを細胞液と等量添加して洗浄した。再び600×g、５分、４℃にて遠心分離して細胞を回収した。【００６７】
(2)得られた沈殿（細胞）に、１mLのMitochondria isolation bufferを添加し、懸濁した。懸濁液をホモジナイザー用のチューブに移し３０〜４０回（ストローク）ホモジナイザーにより細胞を破砕した。破砕は氷上にて行なった。【００６８】
(3)破砕液を２mLのチューブに移し、600×g、１０分、４℃にて遠心分離し、沈殿（未破砕細胞）を除去し、上清を回収した。【００６９】
(4)上清を１２０００×g、１５分、４℃にて遠心し、沈殿したミトコンドリアに１００μLのLysis Bufferを添加し、懸濁し、ミトコンドリアタンパク質を溶出した。ミトコンドリア溶解液のタンパク質濃度をBCA法にて測定し0.1mg/mLタンパク質濃度となるように調製した。 【００７０】
２．ミトコンドリアの活性（シトクロームCオキシダーゼ活性）の測定 
上記のように抽出したミトコンドリア溶解液中のミトコンドリアの活性（シトクロームCオキシダーゼ活性）は、ミトコンドリア  アッセイ  キット (BioChain社製)を用い、その手順書に従って以下のように算出した。【００７１】
(1) キュベットに以下の反応液（合計1000μL）を調製した。
１×Enzyme assay buffer                        850μL 
1×Enzyme Dilution buffer                       50μL 
Ferrocytochrome C substrate solution            50μL 
サンプル（ミトコンドリア溶解液）                50μL 【００７２】
(2) 上記反応液を調製するとき、サンプル（ミトコンドリア溶解液）を添加後、直ちにピペッティングにより攪拌して吸光度計にセットし、吸光度（550nm）にてセット後15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 180秒後の吸光度を測定した。【００７３】
(3) 得られた吸光度から時間/吸光度の反応曲線を作成し、最高反応速度（ABS/min)を求めた。測定に使用したミトコンドリア溶出液のタンパク質量から比活性（ABS/min/mgprotein）を算出し、結果を図９に示した。 【００７４】
(4) ユニット値の算出 
ユニット値は、キットの手順書に記載の式に従って、以下のように算出した。
なお、式中のdilution=2, Vol:0.05とし、結果を図１０に示した。 
Unit/mL =(Δk×60×dilution×1)/ Vol (sample)×In21.84 【００７５】
３．有意差検定
比較試験区間では有意差検定を行った。検定はStudent T-testとして行ないP < 0.05（帰無仮説が5％未満）のものを有意差ありと判断し、図中にP < 0.05、P < 0.01、P < 0.001の３段階で示した。 【００７６】
通常、細胞で産生されるNADHおよびNADPHは、主にミトコンドリアで産生され、また生細胞数とミトコンドリア量とは比例関係にある。ミトコンドリア電子伝達系複合体Ｉの阻害剤として陽性対照であるロテノン添加区では、トリパンブルー染色法で溶媒対照の約半分に生細胞数が減少していた。【００７７】
図８の結果からも明らかなように、トリパンブルー染色による生細胞数測定では実施例３、４の処理区において有意な上昇は認められなかった。
したがって、実施例３、４の処理区においては、生細胞数の増加による見かけ上のミトコンドリア活性の増加はなかったと考えた。【００７８】
一方、図９、１０の結果からも明らかなように、ミトコンドリア活性測定では実施例３、４の処理区では溶媒対照の約１３０％（実施例３）、１１８％（実施例４）の活性上昇を示した。そして、ミトコンドリア活性において分化誘導剤であるレチノイン酸処理区と被験物質処理区との間でいずれも有意差が認められた。【００７９】
また、被験物質処理前細胞（Day0）と被験物質処理区とのミトコンドリア活性を比較した場合、この活性は、被験物質処理において有意に上昇していると認められた。【００８０】
そして、溶媒対照である１０％ＳＤＷ処理区が、被験物質処理前細胞より僅かに上昇していることから、溶媒による活性への影響を考慮する必要があるもののこの影響は軽微であり、明らかに被験物質処理によりミトコンドリア活性が上昇していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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