(57)【要約】  本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合能が極めて優れているＦａｂ領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いたＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。特定の位置にアミノ酸置換変異を有するプロテインＧ変異体を利用することによって、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのＦａｂ領域結合性ペプチド。
（１）  プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）、プロテインＧのβ２ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号２）またはプロテインＧのβ２ドメイン変異体由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第２位のアミノ酸残基をＡｒｇに置換する変異および第１５位のアミノ酸残基をＴｙｒまたはＴｒｐに置換する変異から選択される１以上のアミノ酸置換変異が導入されているアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２位および第１５位を除く領域中で１または数個のアミノ酸がさらに欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２位および第１５位から選択される１以上の位置の上記アミノ酸置換変異は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【請求項２】
上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記置換の部位が、第６位、第７位、第１０位、第１３位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３９位、第４０位、第４２位および第４７位から選択される１以上の部位である請求項１に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項３】
上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損および／または付加の部位がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１または２に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項４】
上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９０％以上である請求項１〜３のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項５】
上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１５位のアミノ酸残基がＴｙｒに置換されている請求項１〜４のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とするＦａｂ領域結合性ペプチド多量体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドまたは請求項６に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
【請求項８】
Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項７に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料と接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に対する結合能が極めて優れているＦａｂ領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術も盛んに開発されている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用されるプロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と省略する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。【０００３】
現在上市されている抗体医薬のほとんどは免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）である。また、ＩｇＧを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、ＩｇＧのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献３）。【０００４】
抗体医薬製造における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスではキャプチャリングすることができない。従って、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。【０００５】
ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するタンパク質はすでに複数知られている（非特許文献４）。しかし、そのようなタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスが、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスと同様に、抗体医薬の精製に標準的に産業利用されているという事実はない。【０００６】
例えば、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）は、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Protein-G Sepharose 4 Fast Flow」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合するが、Ｆａｂ領域にも弱いながら結合することが分かっている（非特許文献４，５）。しかし、ＳｐＧのＦａｂ領域への結合力は弱いので、ＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品は、Ｆｃ領域を含まずＦａｂ領域のみを含む断片抗体の保持性能は低いと言える。そこで、ＳｐＧに変異を導入することでＦａｂ領域への結合力を向上する取組みもなされている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６３−５０３０３２号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁
【非特許文献２】Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁
【非特許文献３】Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁
【非特許文献４】Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁
【非特許文献５】Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来、抗体を吸着して精製するためのアフィニティーリガンドとしてはプロテインＡ（ＳｐＡ）が実用化されているが、ＳｐＡはＩｇＧのＦｃ領域にのみ特異的な親和性を示す。しかし近年、抗体の断片を医薬として利用する技術が開発されていることから、ＩｇＧのＦａｂ領域にも親和性を有するリガンドが求められている。Ｆｃ領域のみならずＦａｂ領域に親和性を示すタンパク質としてプロテインＧ（ＳｐＧ）が知られているが、Ｆｃ領域に比べてＦａｂ領域に対する親和性は低い。そこで、特許文献２に記載の発明のとおり、ＳｐＧに変異を導入してＦａｂ領域に対する親和性を高めることも検討されている。しかし、特許文献２に記載の変異型ＳｐＧは、Ｆａｂ領域に対する親和性が変異導入前に比べて２倍程度高いのみであり、例えばＦｃ領域を含まずＦａｂ領域からなる抗体断片を精製するためのリガンドとして十分な親和性を持つものとは言えない。【００１０】
そこで本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合能が極めて優れているＦａｂ領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、および、当該アフィニティー分離マトリックスを用いたＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、驚くべきことに、プロテインＧ（ＳｐＧ）のＩｇＧ結合性ドメインのアミノ酸配列（配列番号１〜３）において、Ｆａｂ領域との相互作用界面から離れている第２位と、Ｆａｂ領域との相互作用界面には比較的近いといえるものの最近接部位ではない第１５位のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換することにより、ＳｐＧ−ＩｇＧ複合体の構造エネルギーが安定化すること、すなわち両者の結合に有利に働くことを見出して、本発明を完成した。【００１２】
その結果として完成した本発明を以下に示す。【００１３】
［１］  下記（１）〜（３）の何れかのＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１４】
（１）  プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）、プロテインＧのβ２ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号２）またはプロテインＧのβ２ドメイン変異体由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第２位のアミノ酸残基をＡｒｇに置換する変異および第１５位のアミノ酸残基をＴｙｒまたはＴｒｐに置換する変異から選択される１以上のアミノ酸置換変異が導入されているアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２位および第１５位を除く領域中で１または数個のアミノ酸がさらに欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；また
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２位および第１５位から選択される１以上の位置の上記アミノ酸置換変異は、（３）においてさらに変異しないものとする）。【００１５】
［２］  上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記置換の部位が、第６位、第７位、第１０位、第１３位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３９位、第４０位、第４２位、および、第４７位から選択される１以上の部位である上記［１］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１６】
［３］  上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損および／または付加の部位がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］または［２］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１７】
［４］  上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９０％以上である上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１８】
［５］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１５位のアミノ酸残基がＴｙｒに置換されている上記［１］〜［４］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１９】
［６］  上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とするＦａｂ領域結合性ペプチド多量体。【００２０】
［７］  上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド、または、上記［６］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。【００２１】
［８］  Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［７］に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料と接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。【００２２】
［９］  上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。【００２３】
［１０］  上記［９］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。【００２４】
［１１］  上記［１０］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して十分に高い親和性を示すので、通常の抗体のみならず、Ｆａｂ領域を有するがＦｃ領域を有さない抗体断片にも親和性を示す。よって、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを不溶性担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスにより、抗体断片医薬の効率的な精製も可能になる。このように、近年、低コストで製造できるなどの理由から抗体断片医薬の開発が盛んであるところ、本発明は、抗体断片医薬の実用化に寄与し得るものとして、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、野生型プロテインＧドメインの発現プラスミドの作製方法を示す図である。
【図２】図２は、変異導入前のプロテインＧドメインおよび本発明に係る変異型プロテインＧドメインの、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＦａｂ領域に対する結合反応曲線チャートである。図２では、各ペプチドの０．１、０．２、０．４、０．８μＭのデータを重ね合わせてある。
【図３】図３は、変異導入前のプロテインＧドメインおよび本発明に係る変異型プロテインＧドメインの、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＦａｂ領域に対する結合反応曲線チャートの重ね合わせである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、下記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）〜（３）のいずれかである。
【００２８】
Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）
プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）、プロテインＧのβ２ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号２）またはプロテインＧのβ２ドメイン変異体由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第２位のアミノ酸残基をＡｒｇに置換する変異および第１５位のアミノ酸残基をＴｙｒまたはＴｒｐに置換する変異から選択される１以上のアミノ酸置換変異が導入されているアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチド；
Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）
上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第２位および第１５位を除く領域中で１または数個のアミノ酸がさらに欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
Ｆａｂ領域結合性ペプチド（３）
上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が上記アミノ酸置換変異導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第２位および第１５位から選択される１以上の位置の上記アミノ酸置換変異は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【００２９】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦａｂ領域に対して高い結合能を示す。
【００３０】
「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００３１】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＳｐＧ−βのＩｇＧへの結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であり、特にＣＨ１への結合が主要である（非特許文献５）。
【００３２】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＦａｂ領域含有タンパク質は、Ｆａｂ領域を含むものであれば、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有する免疫グロブリンＧ分子であってもよいし、免疫グロブリンＧ分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリンＧ分子誘導体は、Ｆａｂ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤が共有結合したＦａｂ断片などを挙げることができる。
【００３３】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。
【００３４】
「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）の細胞壁に由来するタンパク質であり、ほとんどの哺乳類の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域にも弱く結合する。
【００３５】
ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Akerstrom ら，J．Biol．Chem．，1987，28，p．13388-，Fig．5参照）、本発明では、Fahnestockらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Fahnestockら，J．Bacteriol．，1986，167，p．870-）。ＳｐＧ−βのアミノ酸配列は、由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。代表的なアミノ酸配列として、グループＧの連鎖球菌のＧＸ７８０９株由来の２つのβドメインであるβ１とβ２について、β１ドメイン（ＳｐＧ−β１）の第１位のＡｓｐをＴｈｒに置換したアミノ酸配列を配列番号１に、β２ドメイン（ＳｐＧ−β２）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＳｐＧの各βドメインのアミノ酸配列は互いに配列相同性が高く、これらを一括りとしてプロテインＧ−βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ぶ。なお、ＧＸ７８０９株由来のＳｐＧ−β２の第１位はＴｈｒであり、また、文献によっては配列番号１および配列番号２の第２位以降をＳｐＧの各ドメインのアミノ酸配列としているものもあり、配列番号１におけるＳｐＧ−β１に対する上記置換は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドのＦａｂ領域への親和性には影響を与えない。かかる観点から、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）においてＳｐＧ−β１、ＳｐＧ−β２およびＳｐＧ−β２変異体に「由来」するアミノ酸配列とは、各ドメイン自体のアミノ酸配列、または各ドメインのＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性が維持される範囲で変異を加えたアミノ酸配列をいうものとする。
【００３６】
なお、ｐＨ５．４における変性中点温度が、ＳｐＧ−β１で８７．５℃、ＳｐＧ−β２で７９．４℃であることがAlexanderらによって示されている（Alexanderら，Biochemistry，1992，31，p．3597-）。したがって、本発明における好適な形態の１つとして、ペプチドの熱安定性の観点から、ＳｐＧ−β１（配列番号１）を変異導入対象にすることが挙げられる。さらに、熱安定性に優れた変異型ＳｐＧ−β２として、例えば、公知特許文献（特開２００３−８８３８１号公報）に記載のアミノ酸配列（配列番号３）が挙げられる。なお、当該アミノ酸配列は、特開２００３−８８３８１号公報の配列番号８のＣ３６ペプチドのアミノ酸配列に該当し、この配列には、Ｎ末端に大腸菌発現用のＭｅｔ、Ｃ末端に水不溶性担体固定化用のＣｙｓが付与された形になっている。
【００３７】
「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、例えば数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
【００３８】
タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加および／または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。
【００３９】
本発明は、野生型ＳｐＧ−βに変異を導入した配列を有するペプチドに関するが、その変異導入前のアミノ酸配列は、最終的に得られるペプチドが本発明範囲に含まれるものであれば、野生型ＳｐＧ−β１（配列番号１）、野生型ＳｐＧ−β２（配列番号２）および変異型ＳｐＧ−β２（配列番号３）以外のアミノ酸配列であっても適用可能である。例えば、グループＧの連鎖球菌であるＧ１４８株またはＧＸ７８０５株由来のＳｐＧに含まれる３個のＩｇＧ結合性ドメインのＮ末端側から２番目のドメイン（配列番号４）であっても、同様の効果が得られるのは自明である。当該ドメインは、野生型ＳｐＧβ−１（配列番号１）のアミノ酸配列に対し、第６位がＩｌｅからＶａｌに、第７位がＬｅｕからＩｌｅに置換された配列を有し、同等の機能を示し、本発明が適用できるのは明らかである。熱安定性に優れたプロテインＧの変異体も多数知られており、例えば、国際公開第１９９７／０２６９３０号、特開２００３−８８３８１号公報などに記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００４０】
本発明では、置換位置の番号の前に野生型または非変異型のアミノ酸残基を付し、置換位置の番号の後に変異後のアミノ酸残基を付して、アミノ酸を置換する変異を表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと表記する。
【００４１】
本発明は、野生型のＳｐＧのβ１ドメイン（配列番号１）、β２ドメイン（配列番号２）、または変異型β２ドメイン（配列番号３）に対し、特定位置にアミノ酸置換変異を導入することによって、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力がアミノ酸変異導入前よりも高い変異体を創製する技術である。すなわち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が、アミノ酸置換導入前よりも高いという特徴を示す。なお、ここでの比較対照である「変異導入前」とは、本発明に係るアミノ酸置換変異の導入前をいい、上記のとおり熱安定性のため野生型ＳｐＧのβ２ドメインに導入した変異（配列番号３）の前をいうものではない。具体的には、配列番号１〜３のアミノ酸配列の第２位および／または第１５位における変異の導入前をいう。
【００４２】
免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
Ｆａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０〜４０℃の一定温度、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
【００４４】
結合相手の免疫グロブリンＧ分子は、Ｆａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされないが、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンＧ分子を用いるとＦｃ領域への結合も検出されるので断片化し、分離精製したＦａｂフラグメントを用いることが好ましい。親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じ免疫グロブリンＧ分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のタンパク質と変異を導入した後のタンパク質とを比較することで容易に検証することができる。
【００４５】
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明に係る変異体とＦａｂ断片の親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、親和定数（ＫA）が、該変異を導入する前の配列を有するペプチドに比べて２倍以上向上したペプチドを好適に用いることができ、より好ましくは３倍以上、さらにより好ましくは４倍以上、さらにより好ましくは５倍以上、５０倍以下向上したペプチドを好適に用いることができる。
【００４６】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）、プロテインＧのβ２ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号２）またはプロテインＧのβ２ドメイン変異体由来のアミノ酸配列（配列番号３）の第２位または第１５位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。配列番号１〜３のアミノ酸配列において第２位のアミノ酸残基はＴｈｒであり、第１５位のアミノ酸残基はＧｌｕである。本発明における置換変異に関し、第２位のアミノ酸残基に関してはＡｒｇに置換されるのが好ましく、第１５位のアミノ酸残基に関してはＴｙｒまたはＴｒｐに置換されるのが好ましく、Ｔｙｒがより好ましい。
【００４７】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）に関し、「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１または数個」の範囲とは、欠失等を有するＦａｂ領域結合性ペプチドが免疫グロブリンのＦａｂ領域への高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個もしくは２個、または１個程度であることができる。
【００４８】
１または数個のアミノ酸が置換される部位に関しては、上記第２位または第１５位以外であれば、どの部位でも問題ない。例えば、配列番号１〜３の間でアミノ酸の種類が異なる部位である、第６位、第７位、第１９位、第２４位、第２８位、第２９位、第３１位、第３５位、第４０位、第４２位および第４７位が、置換される部位として好ましい。また、立体構造的な観点からは、第１０位、第１３位、第１８位、第１９位、第２１位、第２８位、第３０位、第３１位、第３３位および第３９位が、置換される部位として好ましい。１または数個のアミノ酸が、欠損または付加される部位としては、基本的には、Ｎ末端およびＣ末端が好ましい。
【００４９】
なお、上記の欠損または付加が加わってアミノ酸数が変化した場合であっても、変異導入前におけるアミノ酸残基の位置に対応する変異導入後におけるアミノ酸残基の位置は、変異導入前後のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば容易に検索可能である。このようなアライメント解析の手法は当業者に広く知られている。
【００５０】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（３）に関し、配列同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。上記配列同一性は、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号１の第２位または第１５位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。
【００５１】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）またはＦａｂ領域結合性ペプチド（３）は、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）におけるアミノ酸置換変異の導入からさらに変異を導入することにより、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）におけるアミノ酸置換変異導入前の配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するドメインに比べてＦａｂ領域への結合力が高い。
【００５２】
プロテインＧは、免疫グロブリン結合性ドメインを２個または３個タンデムに並んだ形で含むタンパク質である。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該Ｆａｂ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限は、例えば１０個、好ましくは８個、より好ましくは６個である。これらの多量体は、単一のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００５３】
本発明によって得られる単量体タンパク質の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは１残基以上、２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間、または、β２とβ３の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００５４】
また、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）〜（３）で規定するアミノ酸配列を有するものであればよく、他のペプチドや化合物などが結合していてもよいものとする。すなわち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列において第２位および／または第１５位が変異しているアミノ酸配列を含み、且つ他のアミノ酸配列を有するものであってもよく、或いは他の化合物が結合しているものであってもよい。例えば、本発明の実施形態の１つとして、本発明により得られるＦａｂ領域結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結されたペプチド多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。但し、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列からなることが好ましい。この場合であっても、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、後述するようにリンカー基によって水不溶性担体に固定化されていてもよいし、また、多量体の場合にはリンカー基によりＦａｂ領域結合性ペプチドが連結されていてもよい。
【００５５】
本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＦａｂ領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。
【００５６】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子担体や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類担体を挙げることができる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００５７】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００５８】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００５９】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数１以上１００以下程度のペプチドをリンカー基として加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。上記ペプチドリンカー基のアミノ酸残基数としては、５０以下が好ましく、４０以下または２０以下がより好ましく、１０以下がさらに好ましい。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＦａｂ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦａｂ領域を含むペプチドをアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドの精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドを含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドを吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドはカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドを吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含むペプチドを溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
【００６１】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該洗浄液としては、適当な変性剤や有機溶剤を含む溶液も使用できる。
【００６２】
本発明は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が本発明ペプチドを構成するものであればいかなるものでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含むプラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、および、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００６３】
また、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００６４】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００６５】
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００６６】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
【００６７】
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法に関して、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００６８】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００６９】
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００７０】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
【００７１】
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００７２】
さらに、形質転換体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００７３】
さらに、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現または融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える手法や低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
【００７５】
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより、本発明ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００７６】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００７７】
本願は、２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７９】
以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ドメイン−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型は「ドメイン−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号１で示される野生型ＳｐＧのβ１ドメインは「ＧＢ１−Ｗｉｌｄ」、第２位のＴｈｒをＡｒｇに置換した変異（Ｔ０２Ｒ）を導入したＳｐＧ−β１ドメイン変異体は「ＧＢ１−Ｔ０２Ｒ」と表記する。なお、熱安定性に優れたβ２ドメイン変異体のアミノ酸配列（配列番号３）に関し、本発明の変異を導入する前のアミノ酸配列として取り扱うので、本明細書では当該アミノ酸配列を「ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ」と表記する。【００８０】
２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ０２ＲおよびＥ１５Ｙを導入したＳｐＧ−β１ドメイン変異体は、「ＧＢ１−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ」と表記する。【００８１】
また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｔ０２ＲおよびＥ１５Ｙを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結したタンパク質は、「ＧＢ１−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．２ｄ」と表記する。【００８２】
さらに、例えば、水不溶性基材にタンパク質を固定化するために、Ｃ末端に固定化用官能基を有するＣｙｓ残基（Ｃ）を導入した場合、「ｄ」の後ろに導入したアミノ酸の１文字表記を付与する。例えば、変異Ｔ０２ＲおよびＥ１５Ｙを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結してＣ末端にＣｙｓを付与したタンパク質は、「ＧＢ１−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．２ｄＣ」と表記する。【００８３】
実施例１：  各種ＳｐＧ変異体の調製
（１）  各種ＳｐＧ変異体の発現プラスミドの調製
熱安定性に優れたＳｐＧβ２ドメイン変異体のアミノ酸配列（配列番号３）を、本発明の変異を導入する前の配列（比較例）として、本明細書では便宜上「ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ」として表記する。ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号３）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号５）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２またはｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号６）／ｆ１−２（配列番号７）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号８）／ｆ２−２（配列番号９）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。【００８４】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製，「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製，「3130xl GeneticAnalyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製，「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製，「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。【００８５】
なお、ＧＢ１−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１）、ＧＢ２−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２）、ＧＣ２−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号４）の発現プラスミドも、適切な一本鎖オリゴＤＮＡを利用し、同様の手法にて調製した。各々の発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列を配列番号１０〜１２に示す。【００８６】
各種ＳｐＧ−β２＊１残基変異体をコードするＤＮＡに関しては、調製したＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを鋳型として、配列番号１１〜２０のオリゴヌクレオチドプライマーの中から２種類のプライマーを用いて、クイックチェンジ法を実施し、新たな変異を含む発現プラスミドを取得した。クイックチェンジ法は、ＤＮＡポリメラーゼのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏおよびメチル化ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）切断酵素Ｄｐｎ  Ｉ（ともにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従い実施した。配列番号１３〜１８のオリゴヌクレオチドプライマーの配列、クイックチェンジ法に使われる２種類のプライマーの組み合わせ、および、導入されるアミノ酸変異との関係を表１にまとめた。なお、オリゴヌクレオチドプライマーについては、特記しない限り、全て委託合成にて調製した（シグマジェノシス社）。調製した各種ＳｐＧ−β２＊１残基変異体のコードＤＮＡ配列とアミノ酸配列については配列番号１９〜２４に示し、各々の配列が何に対応するかについて、表１にまとめた。形質転換および塩基配列解析については、上述と同様の手法で実施した。【００８７】
【表１】
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野生型ＳｐＧ−β２に変異を導入したＧＢ２−Ｅ１５Ｗ．１ｄ（配列番号２５）に関しては、ＧＢ２−Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミド（コードＤＮＡ配列が配列番号１１）を鋳型として、配列番号１７および１８のプライマーを用いて、ＧＢ２−Ｅ１５Ｗ．１ｄをコードするＤＮＡ配列（配列番号２６）を有する発現プラスミドを調製した。形質転換および塩基配列解析については、上述と同様の手法で実施した。【００８８】
ＳｐＧ−β２＊２残基変異体であるＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．１ｄ（配列番号２７）に関しては、ＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ．１ｄの発現プラスミド（コードＤＮＡ配列が配列番号１９）を鋳型として、配列番号１５および１６のプライマーを用いたクイックチェンジ法によって、ＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．１ｄをコードするＤＮＡ配列（配列番号２８）を有する発現プラスミドを調製した。形質転換および塩基配列解析については、上述と同様の手法で実施した。【００８９】
（２）  ＳｐＧ変異体の調製
上記（１）で得られた各種ＳｐＧ−β２＊変異体遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。【００９０】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドが生成する。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、変異体の種類によってバンドの位置は違った。【００９１】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例においてＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルとしては、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて濃縮し、溶媒を標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。【００９２】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質は、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳｅｒがＮ末端側に付加された配列を有する。【００９３】
実施例２：  ＳｐＧ変異体のＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性評価
（１）  ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ−Ｆａｂ）の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。ここでは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（一般名「トラスツズマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法を示す。なお、本願明細書中において他のＩｇＧ−Ｆａｂを評価に用いている場合においても、基本的には同様の方法で調製している。【００９４】
具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の場合には、中外製薬社製の「ハーセプチン」）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＫａｎＣａｐＡカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。【００９５】
（２）  ＳｐＧ−β２＊１アミノ酸残基変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＳｐＧ−β２＊変異体の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＳｐＧ−β２＊変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．１、０．２、０．４、０．８μＭに濃度を調整した各々のペプチド溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで４分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，４分間）、および、添加終了後（解離相，４分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、５分間以上ランニング緩衝液を流すことで、残ったセンサーチップ上に残った添加ペプチドを除去したが、測定の合間に必要に応じて、約１０ｍＭ  ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。実験結果データを図２に、解析結果を表２に示す。【００９６】
【表２】
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表２に示した結果の通り、本発明で得られた変異体は、変異導入前と比較して、ＩｇＧ−Ｆａｂへの結合定数が向上していること、すなわちＩｇＧ−Ｆａｂへの結合力が強くなっていることを確認した。解析の結果、ＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ．１ｄ、ＧＢ２＊−Ｅ１５Ｙ．１ｄおよびＧＢ２＊−Ｅ１５Ｗ．１ｄは、変異導入前のＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄに対して４〜５倍の結合定数を示すことが分かった。【００９７】
重要な点として、この変異導入前のＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄは、特許文献２で最も高いＩｇＧ−Ｆａｂ結合を示した変異体と基本的に同じタンパク質である。タンパク質発現・調製系の違いにより、Ｎ末端数残基／Ｃ末端は異なるが、特許文献２に記載の当該タンパク質の結合定数は１．６×１０6［１／Ｍ］（特許文献２の表１に記載の解離定数０．６１×１０-6［Ｍ］の逆数）と、上記表２の結合定数との違いは１．４倍程であり、ほぼ同程度の結合活性を示していると言える。この特許文献２で最も結合活性が高かったＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄよりも、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力が高い変異体が得られ、かつ、変異導入による結合力向上の程度も特許文献２以上であることは、驚くべき結果であったと言える。【００９８】
また、特許文献２では、第１５位をＰｈｅに置換する変異が導入されている。しかし、同じ芳香族アミノ酸であるＴｙｒまたはＴｒｐへの置換変異が、Ｐｈｅへの置換変異では得られなかった高いＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上効果をもたらした点も、予想に反した驚くべき結果であったと言える。第２位についても、公知の結晶構造において、ＳｐＧのＩｇＧ結合性ドメインの第２位の主鎖α炭素はＦａｂ領域との相互作用界面から離れた場所に位置しており、この部位への変異がＦａｂへの結合に大きく影響を与えた点は驚くべき結果であったと言える。【００９９】
（３）  ＳｐＧ−β２変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
野生型のＳｐＧ−β２ドメイン（ＧＢ２−Ｗｉｌｄ．１ｄ）に変異を導入したＧＢ２−Ｅ１５Ｗ．１ｄのＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を（２）と同様の手法によって解析した。但し、実験上の都合により、濃度を０．８μＭに調整したタンパク質溶液を、添加時（結合相，１分間）および添加終了後（解離相，２分間）で観測し、濃度１点でのフィッティング解析を行った。【０１００】
その結果、結合定数ＫAが、１．６×１０6［１／Ｍ］と算出された。変異導入前のＧＢ２−Ｗｉｌｄ．１ｄに相当するタンパク質の結合定数については、０．４×１０6［１／Ｍ］（特許文献２の表１に記載の解離定数２．５７×１０-6［Ｍ］の逆数）との公知情報があり、変異Ｅ１５Ｗを導入した時のＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上効果は、上記（２）のＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄで見られた時と同程度であると推測できる。したがって、類似する様々なプロテインＧのＩｇＧ結合ドメインに対し、本発明の変異導入によるＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上効果は同程度であると考えられる。【０１０１】
（４）  ＳｐＧ−β２＊２残基変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の確認
ＳｐＧ−β２＊２残基変異体であるＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．１ｄ（配列番号２７）のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性は、（２）と同様の手法に従い、結合反応曲線（生データ）によって確認した。濃度を０．８μＭに調整したタンパク質溶液を添加した際の結合反応曲線を、ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ．１ｄのそれぞれの濃度０．８μＭでの結合反応曲線と重ね合わせた図を、図３として示した。【０１０２】
図３に示されているように、同一濃度において、ＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ／Ｅ１５Ｙ．１ｄの結合レスポンスは、ＧＢ２＊−Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＧＢ２＊−Ｔ０２Ｒ．１ｄよりも高いことが確認された。この結果から、本発明によって得られた２種類の変異を同時に導入しても、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上効果が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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