(57)【要約】  本発明の目的は、固相合成された疎水性ペプチドを親水性ユニットで親水化してＨＰＬＣ精製するに際し、Ｎ末端のアミノ酸残基の種類によらず全ての疎水性ペプチドを精製対象にでき、且つこの疎水性ペプチドの種類に応じて親水性ユニットを臨機応変に選択できる汎用性に優れた製造方法を提供する事にある。  本発明は、担体と、この担体にＣ末端側で結合する第１ペプチド鎖とから構成される担体付き粗製ペプチドから精製ペプチドを得る方法であって、担体付粗製ペプチドのアミノ基にリンカーと親水性ユニットとをこの順で段階的に又は一段階で導入して担体フリーの親水化ペプチド体を得る親水化工程Ａと、担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合する前から親水化ペプチド体を得るまでのいずれかの段階で、或いは担体付き親水化ペプチド体を得た後で、第１ペプチド鎖と担体との間の結合を切断するための担体切除工程Ｂと、親水化工程Ａ及び担体切除工程Ｂによって得られる担体フリーの親水化ペプチド体を水に溶解して液体クロマトグラフィーで処理するクロマト精製工程と、クロマト精製された担体フリーの親水化ペプチド体に含まれるリンカー−第１ペプチド鎖間の結合を化学処理により切断するリンカー切除工程と、を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体と、この担体にＣ末端側で結合する第１ペプチド鎖とから構成される担体付き粗製ペプチドから精製ペプチドを得る方法であって、
担体付き粗製ペプチドのアミノ基にリンカーと親水性ユニットとをこの順で段階的に又は一段階で導入して担体フリーの親水化ペプチド体を得る親水化工程Ａと、
担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合する前から親水化ペプチド体を得るまでのいずれかの段階で、或いは担体付き親水化ペプチド体を得た後で、第１ペプチド鎖と担体との間の結合を切断するための担体切除工程Ｂと、
親水化工程Ａ及び担体切除工程Ｂによって得られる担体フリーの親水化ペプチド体を液体クロマトグラフィーで処理するクロマト精製工程と、
クロマト精製された担体フリーの親水化ペプチド体に含まれるリンカー−第１ペプチド鎖間の結合を、化学処理により切断するリンカー切除工程と、を有することを特徴とする精製ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記リンカー切除工程を、接触還元又は酸により行う請求項１に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記リンカー切除工程を、酸とルイス酸を含む混合溶液を使用して行う請求項２に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記リンカー切除工程を、ＴＦＡとルイス酸を含む混合溶液を使用して行う請求項３に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記リンカー切除工程を、ＴＦＡ、ＴＭＳＯＴｆ及びチオアニソールを含む混合溶液を使用して行う請求項４に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記リンカー切除工程を、ｐＫａ−２以下の酸を使用して行う請求項２に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記リンカー切除工程を、金属担持触媒を使用して行う請求項２に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項８】
前記親水性ユニットが、親水性ペプチド、ポリエーテル、またはポリアミンである請求項１〜７のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記親水化工程Ａが、粗製ペプチドのアミノ基にリンカーを結合させるリンカー結合工程と、得られるリンカー結合体のリンカー部位に親水性ユニットを結合する親水性ユニット結合工程とから構成され、
前記親水性ユニット結合工程では、
Ｆｍｏｃ固相合成法によって複数のアミノ酸を段階的にリンカー部位に結合させるか、
予め調製された親水性ペプチド鎖をリンカー部位に結合させるか、
予め調製されたポリエーテルをリンカー部位に結合させるか、或いは
予め調製されたポリアミンをリンカー部位に結合させる請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記親水化工程Ａによって担体付き親水化ペプチド体を得た後に、担体切除工程Ｂを実施する請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１１】
リンカー切除工程後に水又は含水溶媒で洗浄する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
Ｆｍｏｃ固相合成法によって担体に複数のアミノ酸を順に結合させて前記担体付き粗製ペプチドを形成する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１３】
前記リンカーが、ベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成することによって第１ペプチド鎖と結合している請求項１〜１２のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１４】
前記リンカーが、粗製ペプチドとベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成可能な第１基と、親水性ユニットと化学結合可能な第２基とを有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１５】
前記親水性ユニットのｌｏｇＰ（式中、Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が、−１以下である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１６】
前記親水性ユニットが、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジンから選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を２残基以上含有する親水性ペプチド鎖である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１７】
前記親水性ユニットが、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を２残基以上含有する親水性ペプチド鎖である請求項１〜１６のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１８】
前記親水性ペプチド鎖のアミノ酸残基の数が、２以上３５以下である請求項８〜１７のいずれか１項に記載の精製ペプチドの製造方法。
【請求項１９】
１級又は２級アミンとベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成可能な第１基と、親水性ユニットと化学結合可能な第２基とを有することを特徴とするリンカー。
【請求項２０】
下記式（１）で表されることを特徴とするリンカー。
【化１】
2016047794.tif 000033
（式（１）中、Ｒ1は保護された１級アミノ基を有する有機基であり、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｚは下記式（ａ）：
【化２】
2016047794.tif 000034
（式（ａ）中、Ｘは脱離基、＊は化合物（１）のベンゼン環との結合部位を示す）で表されるカーボネート基、ホルミル基又はハロゲン化メチル基である。）
【請求項２１】
下記式（２）、下記式（４）又は（６）で表されることを特徴とするリンカー。
【化３】
2016047794.tif 000035
（式（２）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｘは−ＯＲx（式中Ｒxは、複素環式イミド基である）であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である。）
【化４】
2016047794.tif 000036
（式（４）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である。）
【化５】
2016047794.tif 000037
（式（６）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｘ3はハロゲン原子である。）
【請求項２２】
下記式（３ａ）で表されることを特徴とするリンカー。
【化６】
2016047794.tif 000038
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体が結合している粗製ペプチドを、簡便に精製して精製ペプチドを製造する方法、及び当該精製ペプチドの製造方法に適したリンカーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド及びタンパク質を化学合成する手法としては、代表的なものとして、ポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として利用し、そこへアミノ酸の縮合反応と末端保護基の脱保護を繰り返すことによってペプチド鎖を順に伸長していく固相合成法と、液相中でアミノ酸の縮合反応と末端保護基の脱保護を繰り返すことによってペプチド鎖を伸長していく液相合成法が知られている。中でも固相合成法は、生成ペプチド鎖に高分子ゲルが結合して不溶化しているため、濾過などによって原料試薬などの可溶性不純物の除去や、粗精製が容易である。そして高分子ゲルを外す事で得られるペプチドは、それが親水性の場合には、逆相ＨＰＬＣなどでさらに精製できる。しかしながら、生成したペプチドが疎水性の場合、逆相ＨＰＬＣで精製ができず、高純度化が困難であるといった問題が生じていた。【０００３】
固相合成した疎水性ペプチドの精製技術として、疎水性ペプチドから固相担体を切断除去する一方で親水性ペプチドを結合させ、疎水性ペプチドを一旦親水化してＨＰＬＣ精製を実施した後、当該親水性ペプチドを切断除去して高純度の疎水性ペプチドを取得する方法が知られている。例えば、特許文献１にはバイオ技術を適用することで、疎水性ペプチドに親水性ペプチドを結合する技術が記載されている。しかし、バイオ技術による場合には、目的疎水性ペプチドの配列によってその製造効率が大きく左右され、大量生産が困難な場合もあり、技術の汎用性に乏しいといった課題がある。【０００４】
疎水性ペプチドに親水性アミノ酸を連続的に結合して親水化し、ＨＰＬＣ精製する技術としては、前記バイオ技術を用いたペプチド製造法の他、Ｂｏｃ固相合成法を利用した技術（非特許文献１）、Ｆｍｏｃ固相合成法を利用した技術（非特許文献２〜５など）が知られている。これらの化学的手法を採用してペプチドを形成する場合には、アミノ酸の保護基の脱保護とペプチド合成とを連続的に繰り返すため、疎水性ペプチドと固相担体との間の結合がアミノ酸脱保護反応条件で切断されない必要がある。例えば、Ｂｏｃ固相合成法では、強酸であるＴＦＡでアミノ酸の保護基を脱保護するため、疎水性ペプチドと固相担体との間の結合は耐強酸性を有している。この疎水性ペプチドと固相担体の結合の切断にはＨＦを使用するのが一般的である。しかし、ＨＦは危険かつ有害であり、特殊な製造装置が必要になってしまう。【０００５】
Ｆｍｏｃ固相合成法では、塩基性条件で脱保護が可能なため、固相担体との結合手段の自由度が高い。例えば非特許文献２や３では、Ｆｍｏｃ固相合成法で固相担体上に親水性ペプチドを合成し、次いでそのＮ末端側に４−ヒドロキシメチル安息香酸をリンカーとして結合し、さらにＦｍｏｃ固相合成法で疎水性ペプチドを合成する方法が開示されている。この方法では、固相担体とペプチド鎖との切断が容易であり、またリンカーの水酸基側（疎水性ペプチド結合側）の切断も容易である。しかし、この方法では目的ペプチド（疎水性ペプチド）のアミノ酸配列に合わせて親水性ペプチドを適宜変更する事が困難となり、処方の汎用性に欠ける。またリンカーの水酸基側から親水性ペプチドを除去する際には、強塩基条件を必要とする。そのため、アスパルチミド化を初めとした副反応による純度低下のおそれがあり、得られる疎水性ペプチドのＣ末端側の形態がカルボン酸のみに限られるという問題もある。【０００６】
非特許文献４及び５の方法は、同じＦｍｏｃ固相合成法でありながら、固相合成法で先に疎水性ペプチド（目的ペプチド）を合成可能である点で前記非特許文献２や３の方法よりも優れている。この方法は、親水性ペプチドとフェニレン型化合物をＮ末端に有するアミノ酸を合成してから、疎水性ペプチドの配列を完成させる必要がある。このため、疎水性ペプチドごとに親水性ペプチドとフェニレン型化合物をＮ末端に有するアミノ酸が必要となるため煩雑なプロセスと言える。また、最終的に得られる疎水性ペプチドは、Ｎ末端側をシステインやメチオニンにすることができず、汎用性に欠ける。更に、この方法では目的ペプチド（疎水性ペプチド）のアミノ酸配列に合わせて親水性ペプチドを適宜変更することが困難であり、この点においても処方の汎用性に欠ける。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平０７−１０２０００号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ、Ｄ．Ｒ．ら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９９、５５、６６２３．
【非特許文献２】Ｈｏｓｓａｉｎ、Ｍ．Ａら著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｔｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．２００９、２０、１３９０．
【非特許文献３】Ｃｈｏｍａ、Ｃ．Ｔ．ら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９８、３９、２４１７．
【非特許文献４】Ｖｏｒｈｅｒｒ、Ｔ．著、Ｃｈｉｍｉｃａ  Ｏｇｇｉ  ２００７、２５、２２．
【非特許文献５】Ｄｉｃｋ、Ｆら著、Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．２９ｔｈ、Ｇｄａｎｓｋ  ２００６、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｔｈ００９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って本発明の目的は、固相合成された疎水性ペプチドを親水性ユニットで親水化してＨＰＬＣ精製するに際し、Ｎ末端のアミノ酸残基の種類によらず全ての疎水性ペプチドを精製対象にでき、且つ疎水性ペプチドのＣ末端側の形態はカルボン酸に限定されず、さらに疎水性ペプチドの種類に応じて親水性ユニットを臨機応変に選択でき、さらに汎用性に優れた製造方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決するために、鋭意検討した結果、まず固相合成した目的ペプチドに、後からリンカーと親水性ユニットとを導入することとして、親水性ユニットを臨機応変に選択できる様にした。これにより、Ｃ末端側の形態はカルボン酸に限定されずに、親水化できるようになった。そしてリンカーと親水性ユニットを導入するに際して、目的ペプチドとリンカーとの結合を化学処理により切断できる様にしておけば、この結合は目的ペプチドのＮ末端アミノ酸の種類によらず形成可能であって目的ペプチドの種類を広げることが可能である事、及びこうした結合はアミノ酸保護基の脱保護条件（Ｆｍｏｃ脱保護条件であるピペリジン条件など）や固相担体からの切り出し（ＴＦＡ条件など）に対する耐性を有しており、ＨＰＬＣ精製の為の担体フリーの親水化ペプチド体（目的ペプチドとリンカーと親水性ユニットとの結合体）の製造が可能であり、かつその精製後には親水性ユニットおよびリンカーを簡便に切断除去することも可能である事を見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち本発明は、
［１］担体と、この担体にＣ末端側で結合する第１ペプチド鎖とから構成される担体付き粗製ペプチドから精製ペプチドを得る方法であって、
担体付粗製ペプチドのアミノ基にリンカーと親水性ユニットとをこの順で段階的に又は一段階で導入して担体フリーの親水化ペプチド体を得る親水化工程Ａと、
担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合する前から親水化ペプチド体を得るまでのいずれかの段階で、或いは担体付き親水化ペプチド体を得た後で、第１ペプチド鎖と担体との間の結合を切断するための担体切除工程Ｂと、
親水化工程Ａ及び担体切除工程Ｂによって得られる担体フリーの親水化ペプチド体を液体クロマトグラフィーで処理するクロマト精製工程と、
クロマト精製された担体フリーの親水化ペプチド体に含まれるリンカー−第１ペプチド鎖間の結合を、化学処理により切断するリンカー切除工程と、を有することを特徴とする。
［２］前記リンカー切除工程を、接触還元又は酸により行う［１］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［３］前記リンカー切除工程を、酸とルイス酸を含む混合溶液を使用して行う［２］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［４］前記リンカー切除工程を、ＴＦＡとルイス酸を含む混合溶液を使用して行う［３］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［５］前記リンカー切除工程を、ＴＦＡ、ＴＭＳＯＴｆ及びチオアニソールを含む混合溶液を使用して行う［４］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［６］前記リンカー切除工程を、ｐＫａ−２以下の酸を使用して行う［２］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［７］前記リンカー切除工程を、金属担持触媒を使用して行う［２］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［８］前記親水性ユニットが、親水性ペプチド、ポリエーテル、またはポリアミンである［１］〜［７］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［９］前記親水化工程Ａが、粗製ペプチドのアミノ基にリンカーを結合させるリンカー結合工程と、得られるリンカー結合体のリンカー部位に親水性ユニットを結合する親水性ユニット結合工程とから構成され、
前記親水性ユニット結合工程では、
Ｆｍｏｃ固相合成法によって複数のアミノ酸を段階的にリンカー部位に結合させるか、
予め調製された親水性ペプチド鎖をリンカー部位に結合させるか、
予め調製されたポリエーテルをリンカー部位に結合させるか、或いは
予め調製されたポリアミンをリンカー部位に結合させる［１］〜［８］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１０］前記親水化工程Ａによって担体付き親水化ペプチド体を得た後に、担体切除工程Ｂを実施する［１］〜［９］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１１］リンカー切除工程後に水又は含水溶媒で洗浄する［１］〜［１０］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１２］Ｆｍｏｃ固相合成法によって担体に複数のアミノ酸を順に結合させて前記担体付き粗製ペプチドを形成する［１］〜［１１］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１３］前記リンカーが、ベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成することによって第１ペプチド鎖と結合している［１］〜［１２］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１４］前記リンカーが、粗製ペプチドとベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成可能な第１基と、親水性ユニットと化学結合可能な第２基とを有する［１］〜［１３］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１５］前記親水性ユニットのｌｏｇＰ（式中、Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が、−１以下である［１］〜［１４］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１６］前記親水性ユニットが、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジンから選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を２残基以上含有する親水性ペプチド鎖である［１］〜［１５］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１７］前記親水性ユニットが、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を２残基以上含有する親水性ペプチド鎖である［１］〜［１６］のいずれかに記載の精製ペプチドの製造方法。
［１８］前記親水性ペプチド鎖のアミノ酸残基の数が、２以上３５以下である［８］〜［１７］に記載の精製ペプチドの製造方法。
［１９］１級又は２級アミンとベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成可能な第１基と、親水性ユニットと化学結合可能な第２基とを有することを特徴とするリンカー。
［２０］下記式（１）で表されることを特徴とするリンカー。【００１２】
【化１】
2016047794.tif 000002
（式（１）中、Ｒ1は保護された１級アミノ基を有する有機基であり、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｚは下記式（ａ）：【００１３】
【化２】
2016047794.tif 000003
（式（ａ）中、Ｘは脱離基、＊は化合物（１）のベンゼン環との結合部位を示す）で表されるカーボネート基、ホルミル基又はハロゲン化メチル基である。）
［２１］下記式（２）、下記式（４）又は（６）で表されることを特徴とするリンカー。【００１４】
【化３】
2016047794.tif 000004
（式（２）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｘは−ＯＲx（式中Ｒxは、複素環式イミド基である）であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である。）【００１５】
【化４】
2016047794.tif 000005
（式（４）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である。）【００１６】
【化５】
2016047794.tif 000006
（式（６）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｘ3はハロゲン原子である。）
［２２］下記式（３ａ）で表されることを特徴とするリンカー。【００１７】
【化６】
2016047794.tif 000007
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、目的ペプチドに、後からリンカーと親水性ユニットとをこの順で導入することとし、目的ペプチドとリンカーとの結合を、化学処理により切断できる様に調整しているため、目的ペプチドの形態及び配列が限定されることがない。そのため、目的ペプチドの種類を広げることが可能となり、精製後の親水性ユニットの切断も簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１で得られた親水化ペプチド体（粗生成物）のＨＰＬＣ分析結果である。
【図２】実施例１で得られた親水化ペプチド体（粗生成物）の質量分析結果である。
【図３】実施例１で得られた親水化ペプチド体（精製後）のＨＰＬＣ分析結果である。
【図４】実施例１で得られた親水化ペプチド体（精製後）の質量分析結果である。
【図５】実施例１で得られた高純度の疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶのＨＰＬＣ分析結果である。
【図６】実施例１で得られた高純度の疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶの質量分析結果である。
【図７】実施例４で得られた親水化ペプチド体（粗生成物）のＨＰＬＣ分析結果である。
【図８】実施例４で得られた親水化ペプチド体（粗生成物）の質量分析結果である。
【図９】実施例４で得られた親水化ペプチド体（精製後）のＨＰＬＣ分析結果である。
【図１０】実施例４で得られた親水化ペプチド体（精製後）の質量分析結果である。
【図１１】実施例４で得られた高純度の疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶのＨＰＬＣ分析結果である。
【図１２】実施例４で得られた高純度の疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶの質量分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜精製ペプチドの製造方法＞
下記に示すスキームＩは、本発明の製造プロセスの概略を示すものである。以下、適宜、このスキームを参照しながら本発明を詳細に説明する。
【００２１】
【化７】
2016047794.tif 000008
【００２２】
本発明に係る精製ペプチドの製造方法は、担体と、この担体にＣ末端側で結合する第１ペプチド鎖とから構成される担体付き粗製ペプチドを精製対象（ターゲット）とする。そしてこの精製対象を順に処理していき、最終的に精製されたフリーの第１ペプチド鎖（精製ペプチド）を得る事を目的とする。
【００２３】
この精製対象（担体付き粗製ペプチド）から目的物（第１ペプチド鎖）への処理手順は、粗製ペプチド（スキームＩ中、担体付き粗製ペプチドまたは担体フリーの粗製ペプチドのどちらか）のアミノ基にリンカーと親水性ユニットとをこの順で段階的に又は一段階で導入して親水化ペプチド体（スキームＩ中、担体付き親水化ペプチド体または担体フリーの親水化ペプチド体のどちらか）を得る親水化工程Ａ（スキームＩ中、工程Ａ１ａ及びＡ１ｂ、又はＡ２−I）と、
担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合する前から親水化ペプチド体を得るまでのいずれかの段階で、或いは担体付き親水化ペプチド体を得た後で、第１ペプチド鎖と担体との間の結合を切断するための担体切除工程Ｂ（スキームＩ中、工程Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３のいずれか）と、
親水化工程Ａ及び担体切除工程Ｂによって得られる担体フリーの親水化ペプチド体を水に溶解して液体クロマトグラフィーで処理するクロマト精製工程と、
クロマト精製された担体フリーの親水化ペプチド体に含まれるリンカー−第１ペプチド鎖間の結合を、化学処理により切断するリンカー切除工程と、を有することを特徴とする。
【００２４】
この方法では、先に第１ペプチド鎖（目的ペプチド鎖）を担体上に形成し、後から親水性ユニットを結合させている為、親水性ユニットを臨機応変に選択でき、プロセス設計の自由度を高めることができる。加えて本発明によれば、親水化工程Ａで親水性ユニットを第１ペプチド鎖に結合し、且つ、切除工程Ｂ１〜Ｂ３で担体を除去している為、第１ペプチド鎖を親水化でき、クロマト精製が可能になる。特に本発明の方法では、リンカーと第１ペプチド鎖との間が、化学処理により切断可能な結合になっており、こういった結合は、アミノ酸保護基除去条件に対する耐久性を有している為、例えば親水性ユニットをＦｍｏｃ合成法で形成する事が可能となる。加えて固相担体の切断除去条件（ＴＦＡ条件など）に対する耐久性も有している為、親水性ユニットを導入した後でも（勿論、親水性ユニットを導入する前でも）固相担体を除去でき、設計の自由度が極めて高くなる。さらにはこの結合は、第１ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸の種類によらず形成可能なため、第１ペプチド鎖（目的ペプチド）の汎用性を高めることが可能である。そしてクロマト精製終了後には、上述した様に、化学処理により親水性ユニットをリンカーごと切断除去できるため、その切断除去の為の特別な設備が不要であり、簡便に精製第１ペプチド鎖（精製ペプチド）を製造できる。以下、工程の順を追って、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
１．担体付き粗製ペプチドの製造工程
まず、精製対象である担体付き粗製ペプチドの製造工程から説明する。「担体付き粗製ペプチド」とは、担体と、この担体にＣ末端側で結合する第１ペプチド鎖とから構成される担体と第１ペプチド鎖の結合体をいう。そして「第１ペプチド鎖」とは、二個以上のアミノ酸がアミノ基とカルボキシル基との間でペプチド結合を形成して重合してできた化合物をいい、本発明ではこの第１ペプチド鎖を精製することを目的とする。なお、本明細書において単に「粗製ペプチド」は、担体付きの粗製ペプチドと、担体フリーの粗製ペプチドの両方を含む概念である。担体付き粗製ペプチドの製造工程は本発明に必須ではなく、他のプロセスを経て得られる粗製ペプチドも本発明の精製方法を適用可能であるが、下記工程を経て担体付き粗製ペプチドを製造するのが簡便である。下記担体付き粗製ペプチドの製造工程では、担体のＮ末端側に複数のアミノ酸を順に結合していく固相ペプチド合成を行う。
【００２６】
前記アミノ酸とは、塩基性のアミノ基（−ＮＨ2）と酸性のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）をそれぞれ少なくとも１個以上有する化合物である。本発明において前記アミノ酸は特に限定されるものではないが、好ましくは、例えば、グリシン、アラニン、３，３，３−トリフルオロアラニン、２−アミノブタン酸、２−アミノ−２−メチルブタン酸、ノルバリン、５，５，５−トリフルオロノルバリン、バリン、２−アミノ−４−ペンテン酸、２−アミノ−２−メチルペンテン酸、プロパルギルグリシン、２−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、２−アミノ−４−フルオロ−４−メチルペンタン酸、４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、セリン、Ｏ−メチルセリン、Ｏ−アリルセリン、トレオニン、ホモセリン、システイン、２−メチルシステイン、メチオニン、ペニシラミン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、グルタミン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、チロシン、トリプトファン、リジン、（１Ｒ，２Ｓ）−１−アミノ−２−ビニル−シクロプロパン酸、（１Ｒ，２Ｓ）−１−アミノ−２−エチル−シクロプロパン酸、サルコシン、フェニルアラニン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニン等のα−アミノ酸；アジリジンカルボン酸、アゼチジンカルボン酸、プロリン、１−メチルプロリン、２−メチルプロリン、２−エチルプロリン、３−メチルプロリン、４−メチルプロリン、５−メチルプロリン、４−メチレンプロリン、４−ヒドロキシプロリン、４−フルオロプロリン、ピペコリン酸、ニペコチン酸、イソニペコチン酸等の環状アミノ酸；β−アラニン、イソセリン、３−アミノブタン酸、３−アミノペンタン酸、β−ロイシン等のβ−アミノ酸；４−アミノブタン酸、４−アミノ−３−メチルプロピオン酸、４−アミノ−３−プロピルブタン酸、４−アミノ−３−イソプロピルブタン酸、４−アミノ−２−ヒドロキシブタン酸等のγ−アミノ酸が挙げられる。好ましいアミノ酸は、天然アミノ酸、α−アミノ酸などであり、天然α−アミノ酸である、本発明において、アミノ酸１分子におけるアミノ基及びカルボキシル基の数は特に限定されるものではなく、例えば、１つでもよく、複数でもよい。またアミノ酸１分子あたりのアミノ基とカルボキシル基の数は同じであっても良いし、異なっていてもよい。
【００２７】
前記第１ペプチド鎖の水に対する溶解性は、ＧＲＡＶＹ（ｇｒａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）スコアにより評価するものとする。ＧＲＡＶＹスコアとは、タンパク質中の全アミノ酸の平均ハイドロパシースコアを意味する。ＧＲＡＶＹスコアはＫｙｔｅらの方法（Ｊ．Ｋｙｔｅ，ＲＦ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １５２（１９８２）１０５）に従って計算でき、一般に、スコアが正のペプチドは疎水性、負のものは親水性の傾向にある。本発明によれば、従来精製が困難であった疎水性ペプチドの精製も可能となる。このような疎水性ペプチドとは、上記ＧＲＡＶＹスコアで、−０．５以上が好ましく、より好ましくは０以上であり、更に好ましくは０．５以上である。上限は特に限定されないものの、一般的には１０以下であり、５以下であってもよい。
【００２８】
また本発明によれば、従来は合成が困難であったシステイン、メチオニン等の含硫アミノ酸を含む第１ペプチド鎖であっても精製が可能なため、本発明は含硫アミノ酸を含むペプチドの精製にも有用である。
【００２９】
前記第１ペプチド鎖のアミノ酸残基の数は、例えば、２以上が好ましく、より好ましくは４以上であり、更に好ましくは６以上である。上限は特に限定されないが、例えば、２００以下が好ましく、より好ましくは１５０以下であり、更に好ましくは１００以下である。
【００３０】
担体付き粗製ペプチドの製造工程では前記第１ペプチド鎖をペプチド固相合成法により製造する。ペプチド固相合成法とは、ポリスチレン等の水不溶性固相担体に、当該担体に直接結合しているリンカーを介してアミノ酸のＣ末端を順に結合させてペプチドを逐次伸長させる手法である。所望の配列が完成した後には、生成したペプチド鎖を担体から切断することで所望のペプチドを製造することができる。本合成法によれば、アミノ酸の配列に依存することなく広範囲のペプチドを合成できるため、全自動化も容易である。
【００３１】
担体に複数のアミノ酸を順に結合させて前記担体付き粗製ペプチドを合成する方法としては、Ｎ末端の保護基としてＦｍｏｃ基を用いるＦｍｏｃ固相合成法が好ましい。一般に、Ｆｍｏｃ固相合成法では、アミド系溶媒（ＤＭＦなど）とアミン系塩基（特にピペリジン）などの塩基性条件下で脱保護を行い、酸性条件（ＴＦＡなど）により担体から生成ペプチドを切り出し可能である。
【００３２】
Ｆｍｏｃ固相合成で用いるアミノ酸は、Ｎ末端が保護された一般的なアミノ酸を用いることができる。ペプチドの主鎖若しくは側鎖にリンカーを結合させる場合は、保護基として、ピペリジンやＴＦＡを用いない条件で脱保護可能な基を有するアミノ酸を用いることもできる。また、第１ペプチド鎖形成後に任意のアミノ酸残基に保護基を導入してもよい。
【００３３】
Ｆｍｏｃ固相合成法によってペプチド合成する場合、Ｎ末端がＦｍｏｃ保護され、且つ、カルボン酸基が活性化されたアミノ酸を、ペプチドのＮ末端と反応させて新たなペプチド結合を形成し、次いでＦｍｏｃ保護基を脱保護して新たなＮ末端を出現させ、これにＮ末端がＦｍｏｃ保護されかつカルボン酸基が前記手法によって活性化された次のアミノ酸を反応させ、以下、同様の手順を繰り返すことでペプチド鎖を合成する。
【００３４】
前記水不溶性固相担体は特に限定されるものではなく、ペプチド固相合成法に広く用いられる、例えば、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ  ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＮｏｖａＧｅｌ、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ  ｒｅｓｉｎ、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＡ  ｒｅｓｉｎ、ＴｅｎｔａＧｅｌ  ｒｅｓｉｎ、Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ、ＨＭＰ−ＮｏｖａＧｅｌ、ＨＭＰＡ−ＮｏｖａＧｅｌ、２−Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ  ｒｅｓｉｎ、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｒｅｓｉｎ、ＨＭＰＢ−ＡＭ、Ｓｉｅｂｅｒ  Ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ  Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｅｓｉｎ、４−｛４−Ｆｏｒｍｙｌ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔｙｒｙｌ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、４−Ｓｕｌｆａｍｙｌｂｕｔｙｒｙｌ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、４−Ｓｕｌｆａｍｙｌｂｕｔｙｒｙｌ  ＡＭ  ＰＥＧＡ、４−Ｆｍｏｃ−ｈｙｄｒｏｚｉｎｏｂｅｎｚｏｙｌ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、ＨＭＢＡ−ＡＭ  ｒｅｓｉｎ、ＨＭＢＡ−ＮｏｖａＧｅｌ、ＤＨＰ  ＨＭ等の各種担体を使用するとよい。固相担体は、固相合成の起点となるアミノ基を表面に有しているのが好ましく、このアミノ基は保護されていてもよい。固相担体の表面にアミノ基が存在すれば、前記第１ペプチド鎖と担体とが、アミド基を介して結合し得る。
【００３５】
ペプチドの合成では、アミノ酸のカルボキシル基を種々の活性エステル法や１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）等のトリアゾール類；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＣＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロボラート（ＴＳＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）等のフルオロリン酸塩類；１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド類；プロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）；等に代表されるカップリング試薬により活性化して、これをペプチドのＮ末端のアミノ基と反応させることによりペプチド結合を形成してもよい。
【００３６】
Ｆｍｏｃ固相合成法で担体付き粗製ペプチドを合成した後は、該担体付き粗製ペプチドは、必要に応じて濾過し、かつ適当な有機溶媒（例えば、ＤＭＦや塩化メチレンなど）で洗浄してもよい。こうした濾過・洗浄を行う事によって、溶解性の不純物(原料など）を簡便に除去でき、担体付き粗製ペプチドの純度を高めることができる。なお本濾過・洗浄工程は、以下の工程でも、担体を切断除去する前であれば、適宜実施できる。
【００３７】
２．親水化工程
親水化工程は、本発明での最初の工程であり、前記粗製ペプチド（担体付き粗製ペプチドまたは担体フリーの粗製ペプチドのどちらか）のアミノ基にリンカーと親水性ユニットとをこの順で段階的に又は一段階で導入して親水化ペプチド体（担体付き親水化ペプチド体または担体フリーの親水化ペプチド体のどちらか）を得ることを特徴とする。
【００３８】
親水化工程で使用する粗製ペプチドは、種々のプロセスを経て得られたものを使用できるが、簡便であることから、前記工程で製造した担体付き粗製ペプチドを使用するとよい。前記工程で製造した担体付き粗製ペプチドに、リンカーと親水性ユニットを導入する方法は特に限定されるものではなく、担体付き粗製ペプチドのアミノ基にリンカーを結合させるリンカー結合工程（スキームＩ中、Ａ１ａ）と、得られる担体付きリンカー結合体のリンカー部位に親水性ユニットを結合する親水性ユニット結合工程（スキームＩ中、Ａ１ｂ）とから構成されてもよいし、親水性ユニットとリンカーを予め複合したもの（複合体）を、担体付き粗製ペプチドのアミノ基に結合する親水性ユニットリンカー複合体結合工程（スキームＩ中、Ａ２−Ｉ）を実施してもよい。
【００３９】
また親水化工程では、担体フリーの粗製ペプチドを使用することも可能である。この担体フリーの粗製ペプチドにリンカーを結合させるリンカー結合工程（スキームＩ中、Ａ１ｃ）、親水性ユニット結合工程（スキームＩ中、Ａ１ｄ）、親水性ユニットリンカー複合体結合工程（スキームＩ中、Ａ２−ＩＩ）は、Ａ１ａ〜Ａ１ｂ、Ａ２−Ｉと同様に実施することができる。
【００４０】
前記リンカーの結合位置は、少なくとも１個以上の水素原子と結合している粗製ペプチド中のアミノ基であれば、第１ペプチド鎖の末端、側鎖のいずれでもよい。
【００４１】
＜リンカー結合工程Ａ１ａ＞
本発明において「リンカー」とは、第１ペプチド鎖（例えば、アミノ基）と結合可能な第１の結合基と、更に後述する親水性ユニットと結合可能な第２の結合基とを有しており、結合後は第１ペプチド鎖と親水性ユニットと結合した状態で第１ペプチド鎖と親水性ユニットの間に存在し得る化合物をいう。本明細書では、このリンカー結合工程で得られる生成物を「リンカー結合体」と称し、担体が結合しているものを特に「担体付きリンカー結合体」と、担体が除去されているものを特に「担体フリーのリンカー結合体」と称することとする。そして本発明では、後述するように、担体付きの粗製ペプチドにリンカーを結合した後、このリンカーにペプチド合成によってアミノ酸を連結していき、親水性ユニットを調製する場合がある。そのため、リンカーと第１ペプチド鎖間の結合が、ペプチド合成条件（特にアミノ酸の脱保護条件）で切断されない必要があり、例えば、Ｆｍｏｃ合成法による場合には脱Ｆｍｏｃ条件である塩基性条件への耐久性が求められる。また、このリンカーと第１ペプチド鎖間の結合には、担体から第１ペプチド鎖を切り出すときの試薬（例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法の場合にはＴＦＡなどの酸性条件）に対する耐性が求められる。第１ペプチド鎖と担体とを切断する時にリンカーと第１ペプチド鎖間の結合が切断されないようにして、親水性ユニットを結合可能にする為である。
【００４２】
これらの要求特性を満足するため前記リンカーの第１ペプチド鎖側の前記第１の基は、少なくとも１個以上の水素原子を有する１級又は２級アミン（例えば、第１ペプチド鎖のアミノ基）とベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成可能な第１基を有する。この様な第１基は、第１ペプチド鎖のＮ末端などとリンカーとを結合できるだけでなく、酸性又は塩基性条件下での耐性を有している。一方、リンカーの親水性ユニット側の第２基は、親水性ユニットと化学結合可能な基である。
【００４３】
こうした第１基及び第２基を有する好ましいリンカーとしては、例えば、下記式（１）：
【００４４】
【化８】
2016047794.tif 000009
【００４５】
（式（１）中、Ｒ1は保護された１級アミノ基を有する有機基であり、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｚは下記式（ａ）：
【００４６】
【化９】
2016047794.tif 000010
【００４７】
（式（ａ）中、Ｘは脱離基、＊は化合物（１）のベンゼン環との結合部位を示す）で表されるカーボネート基、ホルミル基又はハロゲン化メチル基である）で表される化合物が挙げられる。前記式（ａ）における脱離基Ｘは、特に限られるものではないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；−ＯＲx  …（９）（式中Ｒxは、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい）で表される有機基；である。
【００４８】
前記脂肪族炭化水素基は、炭素数が１〜２０のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−オクタデシル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基等のアルケニル基；エチニル基、プロパルギル基のようなアルキニル基等；が挙げられる。
【００４９】
また前記脂環式炭化水素基は、炭素数が３〜２０のものが好ましく、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基、ノルボルニル基、アダマンチル基のようなシクロアルキル基；シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基のようなシクロアルキルアルキル基；等が挙げられる。
【００５０】
前記芳香族炭化水素基は、炭素数が６〜２０のものが好ましく、具体的には、フェニル基、ナフチル基、インデニル基等のアリール基；ベンジル基、４−フェニルブチル基等のアラルキル基；等が挙げられる。
【００５１】
更に前記複素環基は、前記脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基において、環を構成する炭素の一部が、窒素、酸素、硫黄等の炭素以外の原子で置換されたものであり、炭素数が３〜２０のものが好ましい。複素環基としてより好ましくは、含窒素複素環基において、少なくとも１個のイミド基を有する含窒素複素環式イミド基である。このような含窒素複素環式イミド基としては、例えば、下記に例示するような飽和又は不飽和の含窒素複素環式イミド基が挙げられる。
【００５２】
【化１０】
2016047794.tif 000011
【００５３】
このような複素環式イミド基としては、例えば、スクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基等が特に好ましく例示できる。
【００５４】
脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基は、置換基を有していてもよく、かかる置換基の例としては、アルキル基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；アミノ基；ヒドロキシ基；ニトロ基；等が挙げられる。
【００５５】
このような−ＯＲxとしては、例えば、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、Ｎ−マレイミジルオキシ基、Ｎ−フタルイミジルオキシ、ｐ−ニトロフェニルオキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられ、中でも好ましくはＮ−スクシンイミジルオキシ基である。
【００５６】
このような構造により、リンカーは、ベンジルオキシカルボニルアミノ基またはベンジルアミノ基を形成することによって第１ペプチド鎖と結合することが可能となる。以下、本明細書では、これらの化合物をＺ基の構造に応じて、カーボネート型リンカー、アルデヒド型リンカー又はハロゲン型リンカーと称す。
【００５７】
前記式（１）において、Ｒ1は保護された１級アミノ基を有する有機基である。このような置換基としては、有機基の末端に保護された１級アミノ基が存在する限り特に限定されるものではないが、例えば、下記式（ｂ）：
【００５８】
【化１１】
2016047794.tif 000012
【００５９】
（式（ｂ）中、Ｒ3は二価の炭化水素基であり、Ａは−ＣＨ2−、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＨ−から選ばれる一つの置換基であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、＊は化合物（１）のベンゼン環との結合部位を示す）で表される保護された１級アミノ基を有する有機基が好ましい。
【００６０】
前記式（ｂ）において、Ｒ3は二価の炭化水素基であり、より好ましくは二価の脂肪族炭化水素基であり、前記二価の脂肪族炭化水素基としては、飽和、不飽和のいずれであってもよいが、特に好ましくはアルキレン基であり、炭素数１〜１０のアルキレン基が好ましく、より好ましくは炭素数２〜５のアルキレン基である。好ましいアルキレン基を例示すると、例えば、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ2）ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）ＣＨ2−、−Ｃ（ＣＨ2）2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、等が挙げられ、中でも−ＣＨ2ＣＨ2−（エチレン基）、−ＣＨ（ＣＨ2）ＣＨ2−（プロピレン基）又は−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−（トリメチレン基）が好ましく、最も−ＣＨ2ＣＨ2−（エチレン基）が好ましい。
【００６１】
前記式（ｂ）において、Ａは−ＣＨ2−、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＨ−から選ばれる一つの置換基であり、中でも−Ｏ−又は−Ｓ−が好ましく、より好ましくは−Ｏ−である。
【００６２】
前記式（ｂ）において、Ｐｒｏはアミノ保護基であれば特に限定されず、アシル系、カルバメート系、イミド系、スルホンアミド系等が挙げられるが、中でもアセチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（−Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（−Ｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（−Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（−Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（−Ａｌｌｏｃ）等のカルバメート系保護基が好ましい。特に、前記第１ペプチド鎖中のアミノ基を基点としてその後の反応を進行できることから、前記Ｐｒｏは、第１ペプチド鎖中のアミノ保護基と同じものが好ましく、より好ましくは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（−Ｆｍｏｃ）である。
【００６３】
前記式（ｂ）において、Ｒ2は電子求引性基であり、より好ましくはハロゲン、シアノ基、ニトロ基、スルホ基、アルキルオキシカルボニル基及びアシル基から選ばれる少なくとも一種の置換基である。
【００６４】
前記ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられ、これらの中でも塩素が特に好ましい。
【００６５】
前記アルキルオキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ヘプチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、デシルオキシカルボニル基、オクタデシルオキシカルボニル基、及び、トリフルオロメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００６６】
前記アシル基としては、例えば、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、１−ナフトイル基、２−ナフトイル基等が挙げられる。これらの中でも、炭素数２〜１５のアシル基が好ましく、炭素数２〜１０のものがより好ましい。
【００６７】
前記式（１）において、ｎは０〜４の整数であり、より好ましくは１、２、３であり、更に好ましくは２である。ｎが２以上のとき、複数のＲ2は、同種であっても異種であってもよい。
【００６８】
Ｒ1とＲ2のベンゼン環との結合位置は特に限定されるものではない。Ｒ1の結合位置は、カーボネート基からみて２〜６位のいずれでもよく、更に好ましくは２位、３位、４位、５位であり、より好ましくは２位又は４位であり、特に好ましくは４位である。またＲ2が結合する場合の結合位置は２〜６位のいずれでもよく、より好ましい態様としては、少なくともベンゼン環の３位及び５位にＲ2が結合しているとよい。
【００６９】
上述したリンカーにおいて、前記カーボネート型リンカーは、例えば、下記式（２）：
【００７０】
【化１２】
2016047794.tif 000013
【００７１】
［式（２）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｘは−ＯＲx（式中Ｒxは、複素環式イミド基である）であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である］で表される化合物が好ましい。好ましいＸはＮ−スクシンイミジルオキシ基であり、好ましいＲ2、ｎ、Ｐｒｏ、Ｒ3は式（１）と同様である。中でも最も好ましいカーボネート型リンカーとしては、例えば、下記式（３ａ）〜（３ｅ）：
【００７２】
【化１３】
2016047794.tif 000014
【００７３】
【化１４】
2016047794.tif 000015
【００７４】
【化１５】
2016047794.tif 000016
【００７５】
【化１６】
2016047794.tif 000017
【００７６】
【化１７】
2016047794.tif 000018
で表される化合物である。
【００７７】
またアルデヒド型リンカーは、例えば、下記式（４）：
【００７８】
【化１８】
2016047794.tif 000019
【００７９】
（式（４）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基である）で表される化合物が好ましい。好ましいＲ2、ｎ、Ｐｒｏ、Ｒ3は式（１）と同様である。中でも最も好ましいアルデヒド型リンカーは、下記式（５）：
【００８０】
【化１９】
2016047794.tif 000020
で表される化合物である。
【００８１】
更に、ハロゲン型リンカーは、例えば、下記式（６）：
【００８２】
【化２０】
2016047794.tif 000021
【００８３】
（式（６）中、Ｒ2は電子求引性基であり、ｎは０〜４の整数であり、Ｐｒｏはアミノ保護基であり、Ｒ3は炭素数１〜１０のアルキレン基であり、Ｘ3はハロゲン原子である。）
【００８４】
本発明に係る各種リンカーの製造方法は特に限定されるものではないが、カーボネート型リンカー又はアルデヒド型リンカーの製造方法は、それぞれ、少なくとも下記式（７）：
【００８５】
【化２１】
2016047794.tif 000022
【００８６】
（式（７）中、Ｒ1、Ｒ2、ｎは前記に同じ）で表されるベンジルアルコール誘導体のヒドロキシメチル基を、カーボネート化、酸化、又はハロゲン化する工程を含む。
【００８７】
前記式（７）で表されるベンジルアルコール誘導体のヒドロキシメチル基をカーボネート化する反応では、塩基存在下において、前記式（７）で表されるベンジルアルコール誘導体と、下記式（８）：
【００８８】
【化２２】
2016047794.tif 000023
【００８９】
（式（８）中、Ｘ1、Ｘ2は、それぞれ脱離基である）で表される化合物を反応させることを特徴とする。
【００９０】
式（８）中、Ｘ1、Ｘ2の脱離基は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；−ＯＲx  …（９）（式中Ｒxは、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基を表し、これらの基は置換基を有していてもよい）で表される有機基である。
【００９１】
前記脂肪族炭化水素基は、炭素数が１〜２０のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−オクタデシル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基等のアルケニル基；エチニル基、プロパルギル基のようなアルキニル基等；が挙げられる。
【００９２】
また前記脂環式炭化水素基は、炭素数が３〜２０のものが好ましく、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基、ノルボルニル基、アダマンチル基のようなシクロアルキル基；シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基のようなシクロアルキルアルキル基；等が挙げられる。
【００９３】
前記芳香族炭化水素基は、炭素数が６〜２０のものが好ましく、具体的には、フェニル基、ナフチル基、インデニル基等のアリール基；ベンジル基、４−フェニルブチル基等のアラルキル基；等が挙げられる。
【００９４】
更に前記複素環基は、前記脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基において、環を構成する炭素の一部が、窒素、酸素、硫黄等の炭素以外の原子で置換されたものであり、炭素数が３〜２０のものが好ましい。複素環基としてより好ましくは、含窒素複素環基において、少なくとも１個のイミド基を有する含窒素複素環式イミド基である。このような含窒素複素環式イミド基としては、例えば、下記に例示するような飽和又は不飽和の含窒素複素環式イミド基が挙げられる。
【００９５】
【化２３】
2016047794.tif 000024
【００９６】
このような複素環式イミド基としては、例えば、スクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基等が特に好ましく例示できる。
【００９７】
脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は複素環基は、置換基を有していてもよく、かかる置換基の例としては、アルキル基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子；アミノ基；ヒドロキシ基；ニトロ基；等が挙げられる。
【００９８】
このような−ＯＲxとしては、例えば、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、Ｎ−マレイミジルオキシ基、Ｎ−フタルイミジルオキシ基、ｐ−ニトロフェニルオキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００９９】
式（８）においてＸ1、Ｘ2は同一であってもよく、相違していてもよい。好ましい化合物（８）は、例えば、炭酸誘導体（例えば、炭酸ジＮ−スクシンイミジル等）、クロロホルメート化合物（例えば、Ｎ−スクシンイミジルクロロホルメート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート）等である。
【０１００】
カーボネート化反応における前記式（８）で表されるカーボネート基を有する化合物の使用量は、前記式（７）で表されるベンジルアルコール誘導体１ｍｏｌに対し、０．５倍ｍｏｌ以上が好ましく、より好ましくは０．８倍ｍｏｌ以上であり、更に好ましくは１倍ｍｏｌ以上であり、３倍ｍｏｌ以下が好ましく、より好ましくは２．５倍ｍｏｌ以下であり、更に好ましくは２倍ｍｏｌ以下である。
【０１０１】
前記塩基は特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミン、トリｎ−ブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン等の第３級アミン類；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム等の金属水酸化物；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の金属炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の金属炭酸水素塩；リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の金属アルコキシドが挙げられる。中でも、第３級アミン類が好ましく、より好ましくはピリジン又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンである。これらの塩基は、１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【０１０２】
前記式（７）で表されるベンジルアルコール誘導体のヒドロキシメチル基を酸化する反応では、酸化剤を作用させて前記式（７）で表されるベンジルアルコール誘導体を酸化することを特徴とする。
【０１０３】
前記酸化剤は特に限定されるものではないが、例えば、塩素酸カリウム、塩素酸ナトリウム、塩素酸アンモニウム、塩素酸バリウム、塩素酸カルシウム等の塩素酸塩；過塩素酸カリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸アンモニウム等の過塩素酸塩；過酸化カリウム、過酸化ナトリウム、過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過酸化バリウム等の無機過酸化物；亜塩素酸カリウム、亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸銅等の亜塩素酸塩；臭素酸カリウム、臭素酸ナトリウム、臭素酸マグネシウム等の臭素酸塩；硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸バリウム、硝酸銀等の硝酸塩；ヨウ素酸カリウム、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ素酸カルシウム等のヨウ素酸塩；過マンガン酸カリウム、過マンガン酸アンモニウム等の過マンガン酸塩；重クロム酸ナトリウム、重クロム酸アンモニウム等の重クロム酸塩；過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸等の過ヨウ素酸塩；二酸化マンガン；三酸化クロム、無水クロム酸、クロム酸、二クロム酸等のクロム酸塩；二酸化鉛、亜硝酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキソニ硫酸カリウム、ペルオキソニ硫酸ナトリウム、ペルオキソニ硫酸アンモニウム、ペルオキソほう酸カリウム、ペルオキソほう酸アンモニウム、オゾン、過塩素酸、酸化タングステン、又は過酸化水素等が挙げられる。中でも入手が容易なことから、二酸化マンガンが好ましい。これらの酸化剤は、１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【０１０４】
リンカー結合工程では、各リンカーの特性に応じて反応条件を調整する必要がある。以下、本発明で代表的に用いられるカーボネート型リンカー、アルデヒド型リンカーにそれぞれ分けて反応条件を説明する。
【０１０５】
＜＜カーボネート型リンカーの場合＞＞
カーボネート型リンカーを用いたときのリンカー結合工程について説明する。カーボネート型リンカーを用いるとき、リンカー結合体は、カーボネート型リンカーと粗製ペプチドを混合し、ベンジルオキシカルボニルアミノ基を形成することにより、リンカーを、第１ペプチド鎖のアミノ基と結合することにより形成される。
【０１０６】
この反応において、カーボネート型リンカーの使用量は、粗製ペプチド１ｍｏｌに対し、０．５倍ｍｏｌ以上であることが好ましく、より好ましくは１倍ｍｏｌ以上であり、更に好ましくは２倍ｍｏｌ以上であり、２０倍ｍｏｌ以下が好ましく、より好ましくは１０倍ｍｏｌ以下である。
【０１０７】
カーボネート型リンカーと粗製ペプチドとの反応は、溶媒存在下で実施することが好ましく、反応溶媒としては、例えば、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジブチルエーテル、ジオキサン、ジグライム等のエーテル系溶媒；プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等の変性エーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン系溶媒；等の有機溶媒や、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；等の水性溶媒を用いることができる。これらの反応溶媒は１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。中でも、アミド類が好ましく、より好ましくはジメチルホルムアミドである。
【０１０８】
前記反応溶媒の使用量としては、粗製ペプチドに対し、好ましくは５０倍重量以下、更に好ましくは２０倍重量以下であり、下限は特に限定されないが２倍重量以上が好ましい。
【０１０９】
更に、本反応においては、反応加速を目的として、例えば、トリエチルアミン、トリｎ−ブチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−メチルピペリジン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン、１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン等の第３級アミン類を反応促進剤として共存させるとよい。
【０１１０】
反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、０℃以上が好ましく、より好ましくは１０℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上であり、１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以下である。
【０１１１】
反応時間も特に限定されず、１時間以上が好ましく、より好ましくは２時間以上であり、１００時間以下が好ましく、より好ましくは５０時間以下である。
【０１１２】
反応終了後は、得られたリンカー結合体を洗浄し、不要な成分を除去するとよい。洗浄用の溶媒としては、反応溶媒の欄で詳述した各種溶媒を使用することができる。
【０１１３】
＜＜アルデヒド型リンカーの場合＞＞
アルデヒド型リンカーを用いたときのリンカー結合工程について説明する。アルデヒド型リンカーを用いるとき、リンカー結合体は、前記アルデヒド型リンカーと前記粗製ペプチドを脱水縮合させて、イミノ基を介して前記アルデヒド型リンカーが前記粗製ペプチドに結合したイミン化樹脂を製造し、得られた前記イミン化樹脂に還元剤を作用させてイミノ基を還元し、前記リンカーを、ベンジルアミノ基を形成することにより第１ペプチド鎖のアミノ基と結合することで製造できる。
【０１１４】
前記アルデヒド型リンカーと前記粗製ペプチドの脱水縮合反応は、アルデヒド型リンカーと粗製ペプチドを混合することにより行う。前記イミン化樹脂の製造にあたり、アルデヒド型リンカーの使用量は、粗製ペプチド１ｍｏｌに対し、１倍ｍｏｌ以上であることが好ましく、より好ましくは３倍ｍｏｌ以上であり、更に好ましくは５倍ｍｏｌ以上であり、５０倍ｍｏｌ以下が好ましく、より好ましくは３０倍ｍｏｌ以下であり、更に好ましくは２０倍ｍｏｌ以下である。
【０１１５】
アルデヒド型リンカーと粗製ペプチドとの反応は、溶媒存在下で実施することが好ましく、反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒；ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジブチルエーテル、ジグライム等のエーテル系溶媒；プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等の変性エーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン系溶媒；シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等の環状炭化水素溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、イソドデカン等の鎖状炭化水素溶媒；等の有機溶媒や、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；等の水性溶媒を用いることができる。これらの反応溶媒は１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。中でも、ハロゲン系溶媒が好ましく、より好ましくはジクロロメタンである。
【０１１６】
前記反応溶媒の使用量としては、粗製ペプチドに対し、好ましくは１００倍重量以下、更に好ましくは５０倍重量以下であり、下限は特に限定されないが２倍重量以上が好ましい。
【０１１７】
また脱水縮合反応では適宜脱水剤を使用するとよい。前記脱水剤としては、例えば、オルトギ酸トリメチル、オルトギ酸トリエチル、オルトギ酸トリプロピル等のオルトギ酸エステル類；オルト酢酸トリメチル、オルト酢酸トリエチル、オルト酢酸トリプロピル等のオルト酢酸エステル類；オルトプロピオン酸トリメチル、オルトプロピオン酸トリエチル、オルトプロピオン酸トリプロピル等のオルトプロピオン酸エステル類；等に代表されるオルト酸エステル類、ジメトキシメタン、１，１−ジメトキシエタン、１，１−ジメトキシプロパン、ジエトキシエタン、１，１−ジエトキシエタン、１，１−ジエトキシプロパン等に代表されるアセタール類、１−メトキシ−１−エタノール、１−メトキシ−１−プロパノール、１−メトキシ−１−ブタノール、１−エトキシ−１−エタノール、１−エトキシ−１−プロパノール、１−エトキシ−１−ブタノール等に代表されるヘミアセタール類が好ましい。中でも、オルトギ酸エステル類が好ましく、より好ましくはオルトギ酸トリメチルである。
【０１１８】
前記脱水剤を使用する場合には、脱水剤の使用量は、粗製ペプチドに対し、好ましくは１００倍重量以下、更に好ましくは５０倍重量以下であり、下限は特に限定されないが１倍重量以上が好ましい。
【０１１９】
反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、０℃以上が好ましく、より好ましくは１０℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上であり、１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以下であり、更に好ましくは６０℃以下である。
【０１２０】
反応時間も特に限定されず、１時間以上が好ましく、より好ましくは１２時間以上であり、２０日以下が好ましく、より好ましくは１５日以下である。
【０１２１】
反応終了後は、得られたリンカー結合体を洗浄し、不要な成分を除去するとよい。洗浄用の溶媒としては、反応溶媒の欄で詳述した各種溶媒を使用することができる。
【０１２２】
前記イミン化樹脂の還元反応において、還元剤としては、例えば、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム等のアルミニウム水素化物類；水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム等の水素化ホウ素アルカリ金属や水素化ホウ素カルシウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素カリウム等の水素化ホウ素化合物；水素化トリブチルスズ；ボラン等が挙げられ、化学選択性の観点から、中でも水素化ホウ素化合物が好ましく、より好ましくはシアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
【０１２３】
前記還元剤の使用量としては、前記イミン化樹脂１質量部に対して、０．１質量部以上が好ましく、より好ましくは０．３質量部以上であり、更に好ましくは０．６質量部以上であり、３質量部以下が好ましく、より好ましくは２．５質量部以下であり、更に好ましくは２質量部以下である。
【０１２４】
イミン化樹脂の還元反応は、溶媒存在下で実施することが好ましく、反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒；ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジブチルエーテル、ジグライム等のエーテル系溶媒；プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等の変性エーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸系溶媒；クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン系溶媒；シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等の環状炭化水素溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、イソドデカン等の鎖状炭化水素溶媒；等の有機溶媒や、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；等の水性溶媒を用いることができる。これらの反応溶媒は１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。アルコール類や、カルボン酸系溶媒を使用すると、反応速度が早まることも期待できる。本発明では、中でもアルコール系溶媒、カルボン酸系溶媒、アミド類が好ましい。
【０１２５】
前記反応溶媒の使用量としては、イミン化樹脂に対し、好ましくは１００倍重量以下、更に好ましくは５０倍重量以下であり、下限は特に限定されないが５倍重量以上が好ましい。
【０１２６】
反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、０℃以上が好ましく、より好ましくは１０℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上であり、１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以下であり、更に好ましくは６０℃以下である。
【０１２７】
反応時間も特に限定されず、１時間以上が好ましく、より好ましくは１０時間以上であり、５０時間以下が好ましく、より好ましくは３０時間以下である。
【０１２８】
反応終了後は、得られたリンカー結合体を洗浄し、不要な成分を除去するとよい。洗浄用の溶媒としては、反応溶媒の欄で詳述した各種溶媒を使用することができる。
【０１２９】
得られたリンカー結合体は、リンカーと粗製ペプチドが−ＣＨ2−ＮＨ−を介して結合されている。しかし−ＮＨ−中の水素原子は反応性が高く、後の反応に影響を及ぼす虞があるため、必要に応じて、還元反応後のリンカー結合体（還元体樹脂と称する）のＮ保護反応を行うことが好ましい。アミノ基の保護基としては、カルバメート系、イミド系、スルホンアミド系等が挙げられるが、中でもｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（−Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（−Ｚ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（−Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（−Ｔｒｏｃ）、アリルオキシカルボニル基（−Ａｌｌｏｃ）等のカルバメート系保護基が好ましい。アルデヒド型リンカー中のアミノ保護基がＦｍｏｃのときは、このＦｍｏｃの脱保護条件に影響されないよう、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（−Ｂｏｃ）を選択するとよい。
【０１３０】
保護基の導入においては、塩基性条件下で、還元反応後の反応液に各保護基に対応する保護試剤を添加することにより行うことができる。前記保護試剤としては、例えば、塩化メトキシカルボニル、塩化エトキシカルボニル、塩化イソプロポキシカルボニル、塩化アリルオキシカルボニル、塩化ベンジルオキシカルボニル、塩化フェニルオキシカルボニル等の塩化物、または二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチル等の無水物等のカルバメート化剤等が挙げられる。
【０１３１】
前記保護試剤の使用量は、還元体樹脂１ｍｏｌに対して、１〜３０倍ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１０〜２５倍ｍｏｌである。
【０１３２】
また前記保護の際には、副生する酸を中和して反応を加速する目的で、更に塩基を添加してもよい。塩基としては、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の金属炭酸塩；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素セシウムなどの金属炭酸水素塩；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の金属水酸化物；トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、エチルジイソプロピルアミン、ピリジン等の３級アミン類を挙げることができる。好ましくは３級アミン類であり、更に好ましくはＮ−メチルモルホリンである。
【０１３３】
前記塩基の使用量は、還元体樹脂１ｍｏｌに対して、０．５〜２０倍ｍｏｌが好ましく、より好ましくは３〜１５倍ｍｏｌである。
【０１３４】
Ｎ保護反応は溶媒存在下で実施してもよい。前記反応溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、例えば、水；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等のエステル系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒を用いることができる。好ましくは、水；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等のエステル系溶媒；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；であり、更に好ましくはＤＭＦである。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。
【０１３５】
溶媒の使用量としては、多すぎるとコストや後処理の点で好ましくないため、還元体樹脂に対して、５０倍重量以下が好ましく、より好ましくは３０倍重量以下である。
【０１３６】
反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、短時間で反応を終了でき、且つ、副反応を抑制する目的で、−１０℃以上が好ましく、より好ましくは０℃以上であり、９０℃以下が好ましく、より好ましくは５０℃以下である。
【０１３７】
反応時間も特に限定されず、１時間以上が好ましく、より好ましくは３時間以上であり、１００時間以下が好ましく、より好ましくは５０時間以下である。
【０１３８】
＜親水性ユニット結合工程Ａ１ｂ＞
親水性ユニット結合工程では、以上のようにして得られるリンカー結合体に、親水性ユニットを結合する。この「親水性ユニット」とは、前記リンカー結合体（第１ペプチドとリンカーの結合体）のリンカー部位に結合し得る単位であって、リンカー結合体に親水性を付与できる単位をいい、例えば、親水性ユニット自身が、ｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値で−１以下の親水性を有するものである。このような親水性ユニットを、リンカーを介して第１ペプチド鎖に結合させることによって、担体を切断除去した時に、第１ペプチド鎖を親水化でき、第１ペプチド鎖のクロマト精製が可能になる。なお本明細書では、この親水性ユニット結合工程で得られる生成物、すなわち第１ペプチド、リンカー及び親水性ユニットの三成分を含む連結体を、「親水化ペプチド体」と称し、担体が結合しているものを特に「担体付き親水化ペプチド体」と、担体が除去されているものを特に「担体フリーの親水化ペプチド体」と称することとする。
【０１３９】
ｌｏｇＰ値とは、化合物の疎水性のパラメータであり、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐは以下のように求められる。まず、化合物（本発明では、親水性ユニット）をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｆｌａｓｋｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。そののち２０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物の各濃度を分光学的またはＧＬＣなどの種々の方法で測定することにより次式から求められる。
Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ：水層中の化合物濃度
【０１４０】
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ  ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ  ＡＮＤＴＨＥＩＲ  ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。
【０１４１】
ｌｏｇＰ値は上記の方法で求めてもよいが、本発明では原則としてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ製のＡＣＤ／ＬｏｇＰ  ＤＢ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １００  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０１により温度２５℃条件下で算出される値を用いる。
【０１４２】
親水性ユニットとして有効な構造の探索にあたり、種々のｌｏｇＰ値を有する化合物を検討した結果、親水化ユニットのｌｏｇＰ値が、例えば、−１以下であれば、粗製ペプチドの親水化に有効であることがわかった。更にｌｏｇＰ値が−１を超えると、十分な親水性が発揮されないため、担体フリーの親水化ペプチド体の精製効率が低くなる虞がある。ｌｏｇＰ値は、より好ましくは−１．２以下であり、更に好ましくは−１．５以下である。またｌｏｇＰ値の下限は特に限定されないが、例えば、−１０以上が好ましい。
【０１４３】
このようなｌｏｇＰ値を有する親水性ユニットとしては、例えば、親水性ペプチド鎖、親水性ポリエーテル又は親水性ポリアミン等が挙げられる。親水性ペプチド鎖は、リンカー結合体に順次アミノ酸を連結していくことで調製してもよく、この場合、Ｆｍｏｃ固相合成法によって調製することが望ましい。また親水性ペプチド鎖は、別途、予め調製しておいたものをリンカー結合体に連結してもよい。
【０１４４】
従って、親水性ユニット結合工程の好ましい態様では、次の工程により親水性ユニットをリンカー部位に結合させるとよい。
（１）Ｆｍｏｃ固相合成法によって複数のアミノ酸を段階的にリンカー部位に結合させる；
（２）予め調製された親水性ペプチド鎖をリンカー部位に結合させる；
（３）予め調製されたポリエーテルをリンカー部位に結合させる；
（４）予め調製されたポリアミンをリンカー部位に結合させる。
以下では上記の各工程について説明する。
【０１４５】
（１）Ｆｍｏｃ固相合成法による親水化ペプチド体の形成
本方法において親水性ペプチドは、前記工程で得られたリンカー結合体のアミノ基に、Ｆｍｏｃ固相合成法で逐次的にペプチドを形成することにより得られる。本方法のように逐次的に親水性ペプチドを形成すれば、１サイクル終了毎に形成される親水化ペプチド体の性質（例えば、親水性等）を検証できるため、余分に試剤を消費することがなく好ましい。Ｆｍｏｃ固相合成法の具体的な手順は特に限定されず、例えば、上述の担体付き粗製ペプチドの製造工程の場合と同様に手順であってもよい。いずれにしても、塩基性存在下でＦｍｏｃの脱保護を行い、アミノ酸又はペプチドを脱水縮合して主鎖を伸長する、というサイクルを所望の親水性ペプチド鎖が得られるまで続けるとよい。
【０１４６】
前記親水性ペプチドを構成するアミノ酸は特に限定されるものではなく、第１ペプチド鎖の欄で詳述した各種アミノ酸を用いることができる。親水性ペプチドには、これらのアミノ酸の中から、異種のアミノ酸を組み合わせて使用してもよく、同種のアミノ酸を単独で用いてもよい。本発明では、前記親水性ペプチドの親水性を高めるため、前記親水性ペプチドは、例えば、塩基性の側鎖を有するアミノ酸由来の単位を有していることが好ましく、具体的に前記親水性ペプチド鎖は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジンから選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を、全アミノ酸残基中、２残基以上含有することが好ましく、より好ましくは４残基以上であり、上限は特に限定されないが、３５残基以下が好ましく、より好ましくは２０残基以下であり、更に好ましくは１０残基以下である。同様の理由により、前記親水性ペプチドは、例えば、酸性の側鎖を有するアミノ酸由来の残基を有していることが好ましく、具体的に前記親水性ペプチド鎖は、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される少なくとも１種以上のアミノ酸残基を、全アミノ酸残基中、２残基以上含有することが望ましく、より好ましくは４残基以上であり、上限は特に限定されないが、３５残基以下が好ましく、より好ましくは２０残基以下であり、更に好ましくは１０残基以下である。
【０１４７】
前記親水性ペプチド鎖のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、例えば２以上であり、より好ましくは３以上であり、更に好ましくは４以上であり、３５以下が好ましく、２０以下であってもよく、１０以下であってもよい。親水性ペプチドを構成するアミノ酸残基の数が増えると、リンカー結合体と親水性ペプチド鎖の結合体（親水化ペプチド体）における親水性ペプチド鎖の親水化への寄与率が高まるため、前記親水化ペプチド体の特性をコントロールし易くなる。
【０１４８】
（２）予め調製された親水性ペプチド鎖による親水化ペプチド体の形成
前記親水性ペプチド鎖をリンカー結合体と結合する前に、予め、液相合成法や固相合成法により所望の親水性ペプチド鎖を製造し、得られた親水性ペプチド鎖をリンカーに結合してもよい。
【０１４９】
（３）予め調製されたポリエーテルによる親水化ペプチド体の形成
親水性ユニットは、ポリペプチドに限られず、ポリエーテルまたはポリアミンであってもよい。前記親水性ポリエーテルは、特に限定されるものではなく、例えば、−Ｒy−Ｏ−で表される反復単位を主鎖骨格に有する化合物である。Ｒyとしては、例えば−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）ＣＨ2−、−Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2−、−（ＣＨ2）4−等が挙げられ、中でも、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−が好ましい。親水性ポリエーテルは、これらの反復単位のうち１種の反復単位からなる単独重合体であってもよく、共重合体であってもよい。
【０１５０】
−Ｒy−Ｏ−で表される反復単位の数は、例えば、１〜２００が好ましく、より好ましくは５０〜１５０である。
【０１５１】
親水性ポリエーテルは、−Ｒy−Ｏ−で表される反復単位を、親水性ポリエーテル中、５０重量％以上、更に好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上含むことが好ましい。
【０１５２】
親水性ポリエーテルは、ゲル・パーミエイション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）におけるポリスチレン換算での数平均分子量が、例えば、１０００〜１００，０００程度であることが好ましい。
【０１５３】
（４）予め調製されたポリアミンによる親水化ペプチド体の形成
前記ポリアミンは、特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基が少なくとも２個以上結合した脂肪族炭化水素が挙げられ、前記脂肪族炭化水素としては、飽和（鎖状又は環状）又は不飽和のいずれであってもよい。ポリアミンの窒素原子に結合している水素原子は、置換又は無置換のいずれであってもよいが、親水性を高めるため、無置換であることが好ましい。
【０１５４】
このようなポリアミンを具体的に例示すると、例えば、ジエチレントリアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、スペルミジン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、４−（アミノメチル）−１，８−オクタンジアミン、トリエチレンテトラミン、１，４，７，１１−テトラアザウンデカン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、スペルミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン等の鎖状脂肪族ポリアミン；１，４，７−トリアザシクロノナン、１，５，９−トリアザシクロドデカン、サイクレン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、ヘキササイクレン、３，３’−ジアミノベンジジン、１，２，４，５−ベンゼンテトラミン等の環状脂肪族ポリアミン；が挙げられる。
【０１５５】
＜親水性ユニットリンカー複合体結合工程Ａ２＞
粗製ペプチドにリンカーと親水性ユニットを結合して親水化ペプチド体を得るには、親水性ユニットとリンカーが予め一つの化合物として結合している親水性ユニットリンカー複合体を粗製ペプチドのアミノ基に導入してもよい。予め複合体を調製しておくことで、粗製ペプチドから親水性ペプチド体の製造プロセスを短縮でき、プロセス全体の効率を高めることができる。
【０１５６】
複合体における親水性ユニット及びリンカーは、前記リンカー結合工程Ａ１ａや親水性ユニット結合工程Ａ１ｂと同様のものを使用できる。その複合体の調製法としては、親水性ユニット結合工程Ａ１ｂと同様の方法が採用でき、複合体を粗製ペプチドに結合する場合には、前記リンカー結合工程Ａ１ａと同様の方法が採用できる。
【０１５７】
なお親水性ユニットリンカー複合体を粗製ペプチドに結合した後、必要に応じて、さらに親水性ユニット側のアミノ酸を伸長してもよい。例えば、親水性ユニットリンカー複合体として有限種のものを基本ユニットとして準備しておき、この基本ユニットを粗製ペプチドに結合した後、粗製ペプチドの特性に応じてアミノ酸を伸長するなどすれば、基本ユニットとして準備しておく親水性ユニットリンカー複合体の種類を減らすことができ、簡便である。
【０１５８】
またＡ２−ＩＩも、Ａ２−Ｉと同様の方法で実施するとよい。
【０１５９】
３．担体切除工程
担体切除工程とは、担体と第１ペプチド鎖を切り離す工程をいう。第１ペプチド鎖にリンカー及び親水性ユニットを結合する一方で、担体を切除する事によって、第１ペプチド鎖を親水化できる。なおリンカー及び親水性ユニットが結合し、担体が切除された第１ペプチド鎖を、本明細書では、担体フリー親水化ペプチド体と称する。
【０１６０】
この担体切除工程は、後述するクロマト精製工程の前であれば、いずれの段階で実施されてもよいが、例えば、担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合する前から親水化ペプチド体を得るまでのいずれかの段階で、或いは担体付き親水化ペプチド体を得た後で、第１ペプチド鎖と担体との間の結合を切断するとよい。具体的には、第１ペプチド鎖と担体とからなる担体付き粗製ペプチドから担体を切除してもよく（スキームＩの担体切除工程Ｂ１参照）、担体付き粗製ペプチドにリンカーを結合した担体付きリンカー結合体から担体を切除してもよく（スキームＩの担体切除工程Ｂ２参照）、担体付き粗製ペプチドにリンカーと親水性ユニットを結合した担体付き親水化ペプチド体から担体を切除してもよい（スキームＩの担体切除工程Ｂ３参照）。担体付き粗製ペプチドから担体を切除した場合でも（担体切除工程Ｂ１）、得られる担体フリー粗製ペプチドから、リンカー結合工程Ａ１ａを上記と同様に実施して担体フリーのリンカー結合体を得ることができ（スキームＩのＡ１ｃ）、また担体フリーの粗製ペプチドから、親水性ユニットリンカー複合体結合工程Ａ２を実施して、担体フリーの親水化ペプチド体を得ることができる。また担体切除工程Ｂ２を実施することによって、又は、担体フリーの粗製ペプチドをリンカー結合工程Ａ１ａで処理することによって得られる担体フリーのリンカー結合体からは、上記と同様にして親水性ユニット結合工程Ａ１ｂを実施する事により、担体フリーの親水化ペプチド体を得ることができる（スキームＩのＡ１ｄ）。なお本発明では、前記親水化工程によって親水化ペプチド体を得た後に、担体切除工程（つまりスキームＩの担体切除工程Ｂ３）を実施することが好ましい。
【０１６１】
これら担体切除工程Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３では、前記第１ペプチド鎖と前記担体とを繋ぐアミド結合またはエステル結合を加水分解する。担体から第１ペプチド鎖を切り出す際には、固相合成法で広く採用されている操作を実施するとよい。例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法で第１ペプチド鎖や親水性ユニットを形成している場合には、切断用の試薬で処理して担体から第１ペプチド鎖を切り出すとよい。
【０１６２】
前記切断用試薬は、一般的な担体からの切り出し条件に用いられる試薬を用いることができる。切断用試薬は、水溶液として用いる場合、この試薬１００％に占める前記切断用試薬の濃度は、容積比で４０％以上が好ましく、より好ましくは５０％以上であり、１００％以下が好ましいが、９７％以下であっても問題ない。
【０１６３】
また前記切断用試薬は、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）を含んでいてもよい。試薬１００％に占めるＴＩＳの濃度は容積比で１％以上が好ましく、より好ましくは１．５％以上であり、２０％以下が好ましく、より好ましくは１０％以下である。
【０１６４】
切断工程は無溶媒下（上記試薬から混入する溶媒は許容される）で実施してもよく、必要に応じて溶媒存在下で実施してもよい。この溶媒としては、水、有機溶媒水性溶媒などが挙げられ、有機溶媒には、例えば、四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン系溶媒等が含まれ、水性溶媒には、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトン、ジオキサン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；等が含まれる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。
【０１６５】
処理温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、０℃以上が好ましく、より好ましくは１０℃以上であり、１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以下であり、更に好ましくは６０℃以下である。
【０１６６】
また処理時間は、例えば、０．５時間以上が好ましく、より好ましくは１時間以上であり、更に好ましくは１．５時間以上であり、２０時間以下が好ましく、より好ましくは１０時間以下である。
【０１６７】
反応後の後処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行うとよい。具体的には、切断した担体を濾過等によって分離し、必要に応じて濃縮、洗浄した後、有機溶媒を加えて析出させ固体を取得する操作等の一般的な精製手法により、さらに純度を高めてもよい。
【０１６８】
第１ペプチドの側鎖の保護基は、担体切除工程での処理により、脱保護されてもよいし、されなくてもよい。担体切除工程での処理により、第１ペプチドの側鎖に結合する保護基も脱保護できれば、側鎖の脱保護工程を省略できるため簡便である。また担体切除工程で第１ペプチドの側鎖を脱保護しない場合には、別途、第１ペプチド鎖の側鎖の脱保護を実施するとよい。第１ペプチド鎖の側鎖に結合している保護基は、親水性ユニット導入前又は導入後のいずれの段階で脱保護してもよい。また側鎖の脱保護は、保護基に応じて、一般的な方法により実施することができる。
【０１６９】
４．クロマト精製工程
上記のようにしてリンカー親水性ユニットを結合し、担体を切除した第１ペプチド鎖（担体フリー親水化ペプチド体）は、親水性を有するため、クロマト精製が可能である。そこでクロマト精製工程では、親水化工程及び担体切除工程によって得られる担体フリーの親水化ペプチド体を液体クロマトグラフィーで処理する。このとき、親水化ペプチド体を水に溶解しておくことが好ましい。
【０１７０】
クロマト精製に使用するカラム及び溶離液は、精製する担体フリー親水化ペプチド体の種類や、分離する不純物に応じて適宜選択できる。カラムの充填剤は特に限定されず、公知の充填剤を広く使用できるが、代表的なものとしては、例えば、シリカゲル、オクタデシル基結合シリカゲル、オクチル基結合シリカゲル、ブチル基結合シリカゲル、トリメチルシリル基結合シリカゲル、フロリジール、アルミナ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイト、スチレン・ビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレート、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリビニルアルコール、イオン交換樹脂、活性炭等が好ましく例示される。これら充填剤をパックしたカラムは、単独でもよく、２種以上を組み合わせてもよい。
【０１７１】
また溶離液は、使用するカラムや精製対象目的物並びに除去対象不純物に応じて適宜調製できるが、例えば、水と親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトン、ジオキサン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；など）を適宜組み合わせた混合溶液が使用される。この混合溶液は、適当な酸（例えば、ＴＦＡ、蟻酸、酢酸等）を溶解させてもよい。
【０１７２】
クロマト精製工程は、必要に応じて２回以上実施してもよく、カラム（充填剤）及び／又は溶離液は、毎回、変更してもよい。
【０１７３】
５．リンカー切除工程
リンカー切除工程では、クロマト精製された担体フリーの親水化ペプチド体に含まれるリンカー−第１ペプチド鎖間の結合を、化学処理により切断する。前記化学処理としては、例えば、接触還元又は酸による処理等が挙げられる。
【０１７４】
＜接触還元反応によるリンカーの切断＞
接触還元反応によるリンカーの切断は、溶媒存在下で実施されることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｎ−ペンタノール等のアルコール系溶媒；酢酸、蟻酸、プロピオン酸などのカルボン酸系溶媒；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル等のエステル系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；アセトン、２−ブタノン、３−メチル−２−ブタノン、２−ペンタノン、４−メチル−２−ペンタノン、２−ヘキサノンなどのケトン系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン等のアミド類；アセトニトリル等のニトリル類；が挙げられ、これらの溶媒は１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。中でも、炭素数３〜８のアルコール系溶媒を、溶媒１００重量％中、１０〜１００重量％、より好ましくは３０〜１００重量％含むことが好ましい。
【０１７５】
接触還元反応に用いる前記溶媒の使用量は特に限定されないが、例えば、親水化ペプチド体に対する重量比率として、２倍量以上が好ましく、より好ましくは５倍量以上であり、５００倍量以下が好ましく、より好ましくは４００倍量以下である。
【０１７６】
接触還元反応の水素源としては、例えば、水素ガスや、蟻酸又はその塩を用いることが可能であるが、経済性の観点から水素ガスを用いることが好ましい。水素ガスを用いる場合、通常、水素圧は大気圧（１．０１３×１０5Ｐａ）〜０．５ＭＰａの範囲に調整して行うことが好ましい。
【０１７７】
接触還元反応用の触媒としては、例えば、白金、パラジウム等を含有する触媒を用いることができるが、中でもパラジウムを含有する触媒が好ましく、特に活性炭に担持させたパラジウム触媒等の金属担持触媒が好ましい。
【０１７８】
接触還元反応は、溶媒及び水素源の存在下、親水化ペプチド体と触媒との混合物を反応させることにより実施するとよい。反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、０℃以上が好ましく、より好ましくは１５℃以上であり、更に好ましくは３０℃以上であり、７０℃以下が好ましく、より好ましくは６０℃以下である。また反応時間は制限されるものではないが、例えば、１時間以上が好ましく、より好ましくは３時間以上であり、更に好ましくは５時間以上であり、５０時間以下が好ましく、より好ましくは３０時間以下である。
【０１７９】
接触還元反応終了後、リンカーが除去された第１ペプチド鎖は、通常行われる後処理、例えば、濃縮、有機溶媒への溶解、濾過、洗浄、析出等の操作により単離精製することができる。
【０１８０】
＜酸によるリンカーの切断＞
本工程で使用する酸としては、例えば、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）などのハロゲン化カルボン酸類；臭化水素酸、塩酸、硫酸等の鉱酸；ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、フルオロスルホン酸等のスルホン酸類等が挙げられる。好ましくは、ｐＫａ０以下の酸であり、さらに好ましくはｐＫａ−２以下の酸であり、下限は特に限定されないが、一般的にはｐＫａ−２０以上であり、好ましくはｐＫａ−１８以上である。これらの酸は、１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。酸の使用量は、親水化ペプチド体に対し、重量比で、１０倍量以上が好ましく、より好ましくは２０倍量以上であり、１００倍量以下が好ましく、より好ましくは８０倍量以下である。
【０１８１】
酸によるリンカーの切断反応は、溶媒存在下で実施してもよい。前記溶媒としては、例えば、酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸系溶媒；水等が挙げられる。これらの溶媒は、１種のみを単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。前記溶媒の使用量は、親水化ペプチド体に対し、重量比で、１倍量以上が好ましく、より好ましくは２倍量以上であり、１００倍量以下が好ましく、より好ましくは５０倍量以下である。
【０１８２】
このような溶媒としては、ＴＦＡを必須に含む溶媒が好ましく、より好ましくはＴＦＡとＴＦＡ以外の鉱酸の両方を含む混合溶液、又は、ＴＦＡとルイス酸を含む混合溶液である。ＴＦＡとＴＦＡ以外の鉱酸の両方を含む混合溶液としては、例えば、ＨＢｒ（濃度は好ましくは１５〜４０％）、酢酸、チオアニソール及びＴＦＡを含む混合溶液が好ましい。また、ＴＦＡとルイス酸を含む混合溶液としては、例えば、ＴＦＡ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）、及びチオアニソールを含む混合溶液や、ＴＦＡ、ＴＭＳＯＴｆ、及びメタクレゾールを含む混合溶液等が挙げられる。実用性の観点から、ＴＦＡとルイス酸を含む混合溶液がより好ましく用いられる。
【０１８３】
更に酸によるリンカーの切断反応では、酸にトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）、臭化トリメチルシリル（ＴＭＳＢｒ）、ヨウ化トリメチルシリル（ＴＭＳＩ）、ＢＦ3ジエチルエーテル錯体、Ｃｐ2ＨｆＣｌ2−ＡｇＣｌＯ4等のルイス酸を反応促進剤として含む混合溶液を使用することもできる。前記反応促進剤の使用量は、親水化ペプチド体に対し、重量比で、１倍量以上が好ましく、より好ましくは５倍量以上であり、１００倍量以下が好ましく、より好ましくは５０倍量以下である。
【０１８４】
酸によるリンカーの切断反応では、反応を加速する目的で添加剤を加えてもよい。前記添加剤としては、例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、アニソール、チオアニソール、ジフェニルスルフィド、ジメチルスルフィドが挙げられる。これらの添加剤は、１種のみでもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１８５】
反応温度は用いる溶媒の沸点以下であれば特に限定されず、例えば、−３５℃以上が好ましく、より好ましくは−２０℃以上であり、更に好ましくは−１０℃以上であり、１００℃以下が好ましく、より好ましくは８０℃以下であり、更に好ましくは６０℃以下である。
【０１８６】
反応時間も特に限定されず、０．１時間以上が好ましく、より好ましくは１時間以上であり、更に好ましくは２時間以上であり、５０時間以下が好ましく、より好ましくは３０時間以下であり、更に好ましくは２０時間以下である。
【０１８７】
酸による反応終了後、リンカーが除去された第１ペプチド鎖は、通常行われる後処理、例えば、一般的な有機溶媒を加えてペプチドを析出させ取得する操作等に付すことにより単離精製することができる。
【０１８８】
６．洗浄工程
前記工程で得られた疎水性ペプチドを更に精製するために、親水性ユニットとリンカーの結合体を洗浄して除去する洗浄工程を実施してもよい。本工程では、リンカー切除工程によって得られる担体フリーかつリンカーフリーの第１ペプチド鎖を、助剤を含有していてもよい水又は含水溶媒で洗浄する。
【０１８９】
前記含水溶媒は、例えば、水と親水性溶媒との混合物であり、この親水性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類；エチレングリコール、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトン、ジオキサン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；等の水性溶媒が挙げられる。これら水又は含水溶媒は、必要に応じて、中和剤、緩衝剤等の助剤を含有していてもよい。前記中和剤としては、例えば、重曹、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、消石灰等の無機塩基化合物が挙げられる。また前記緩衝剤としては、例えば、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、リン酸２水素カリウムなどのリン塩又はカルボン酸塩等が例示できる。
【０１９０】
洗浄操作は必要に応じて２回以上実施してもよく、洗浄に用いる水又は含水溶媒は、毎回変更してもよい。洗浄操作後の精製ペプチドを、乾燥させ、残渣を除去して、製品とするとよい。
【０１９１】
以上のように、担体付き粗製ペプチドを親水化工程Ａと担体切除工程Ｂで処理し、次いでクロマト精製工程及びリンカー切除工程で処理することで、ペプチドを高度にかつ簡便に精製することが可能となる。しかも本発明は、ペプチドの種類を問わないため、汎用性に優れており、各種ペプチドを簡便に精製する用途に適している。
【０１９２】
本願は、２０１４年９月２６日に出願された米国特許出願第６２／０５５，９９１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１４年９月２６日に出願された米国特許出願第６２／０５５，９９１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【０１９３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【０１９４】
本願実施例で使用した装置は以下の通りである。
・自動ペプチド合成装置：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ製Ｓｙｍｐｈｏｎｙ
・ＮＭＲ：日本電子社製「ＪＭＴＣ−５００」
・質量分析装置：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｒｔｏｎｉｃｓ社製「ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ」を使用し、マトリックスにはｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄを用いた。
・ＨＰＬＣ分析装置；島津製作所社製「ＳＰＤ−１０Ａｖｐ」「ＬＣ−１０ＡＤｖｐ」「ＳＣＬ−１０Ａｖｐ」「ＤＧＵ−１２Ａ」「ＣＴＯ−１０ＡＳｖｐ」「Ｃ−Ｒ８Ａ」
・ＨＰＬＣ精製装置；ＸＸＶａｒｉａｎ製「ＰｒｏＳｔａｒ（分取クロマト装置）」およびＲａｉｎｉｎｇ製「ＤＹＮＡＭＡＸ  ＡｂｓｏｒｂａｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ｕｖ−Ｄ  ＩＩ（ＵＶ検出装置分取クロマト装置）」【０１９５】
合成例１  ４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ａ）【０１９６】
【化２４】
2016047794.tif 000025
【０１９７】
４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（純度９８．３％、２００ｍｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４ｍＬ）に溶解した。ここに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（１６５ｍｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍＬ）溶液と、ピリジン（５１．８μＬ、０．６４３ｍｍｏｌ）を順に加えた。２５℃で３時間撹拌後、濃縮を行った。残渣に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて溶解し、１０％重曹水（２５ｍＬで３回）、Ｈ2Ｏ（２５ｍＬで２回）、飽和食塩水（２５ｍＬで１回）で順に洗浄を行った。有機層は硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過と濃縮を行い、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の白色固体を取得した（２７６．７ｍｇ、定量的収率）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．７７（ｄ，３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｄ，３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄｄ，３ＪＨＨ＝１５．０ａｎｄ７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｔ，３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），５．５１（ｂｓ，１Ｈ），５．２１（ｓ，２Ｈ），４．４１（ｄ，３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｔ，３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２０−４．１６（ｍ，２Ｈ），３．６８−３．６５（ｍ，２Ｈ）【０１９８】
合成例２  ４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−１−ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚｅｎｅ（５）【０１９９】
【化２５】
2016047794.tif 000026
【０２００】
４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（１．００ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（３０ｍＬ）溶液に、二酸化マンガン（４．４７ｇ、５１．４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３５時間撹拌した。セライト濾過を行い、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン／塩化メチレン＝１／１／１）精製により、アルデヒド型リンカー（５）を０．９２ｇの白色固体として取得した（２．３７ｍｍｏｌ、収率９２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ９．９０（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，３ＪＨＨ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３９（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，３ＪＨＨ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．１９（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｄ，３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｔ，３ＪＨＨ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１０（ｍ，２Ｈ），３．６６−３．６３（ｍ，２Ｈ）【０２０１】
合成例３  ２−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｄ）【０２０２】
【化２６】
2016047794.tif 000027
【０２０３】
２−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（４５８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍＬ）溶液に対し、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３８４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２８ｍＬ）溶液を加え、均一な溶液とした。ここにピリジン（０．１２１ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を１分間かけて滴下し、その後２５℃で１１時間撹拌した。溶媒の減圧留去を行い、残渣にＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加えた。飽和重曹水（５０ｍＬで３回）と水（５０ｍＬで４回）と飽和食塩水（５０ｍＬで１回）で順に洗浄し、得られたＥｔＯＡｃ層のＭｇＳＯ4による乾燥と濾過、減圧濃縮を行い、２−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅを白色固体として取得した（純度９４．７％；６１５ｍｇ、０．９７２ｍｍｏｌ、収率９７％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ７．７７（ｄ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６３（ｄ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５（ｄ、４ＪＨＨ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０（ｔ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３３−７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．３２（ｄ、４ＪＨＨ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．５７（ｔ、３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３２（ｓ、２Ｈ）、４．４０（ｄ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．２５（ｔ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１２（ｔ、３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．６６（ｄｔ、３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚａｎｄ５．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．７９（ｓ、４Ｈ）【０２０４】
合成例４  ４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｂ）
【化２７】
2016047794.tif 000028
【０２０５】
４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（５４７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍＬ）溶液に対し、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（３８４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２８ｍＬ）溶液を加え、均一な溶液とした。ここにピリジン（０．１２１ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を１分間かけて滴下し、その後２５℃で１１時間撹拌した。溶媒の減圧留去を行い、残渣にＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加えた。飽和重曹水（５０ｍＬで３回）と水（５０ｍＬで４回）と飽和食塩水（５０ｍＬで１回）で順に洗浄し、得られたＥｔＯＡｃ層のＭｇＳＯ４による乾燥と濾過、減圧濃縮を行い、白色固体を取得した（純度９３．２％；６７４ｍｇ、０．９１３ｍｍｏｌ、収率９１％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ７．７７（ｄ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６２（ｄ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．５７（ｓ、２Ｈ）、７．４１（ｔ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３２（ｔ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．５２（ｔ、３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｓ、２Ｈ）、４．４２（ｄ、３ＪＨＨ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２５（ｔ、３ＪＨＨ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１３（ｔ、３ＪＨＨ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．６９−３．６６（ｍ、２Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）【０２０６】
合成例５  ４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｃ）【０２０７】
【化２８】
2016047794.tif 000029
【０２０８】
４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（純度９４．５％；０．６３ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍＬ）溶液に対し、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（５３０ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２８ｍＬ）溶液を加え、均一な溶液とした。ここにピリジン（０．１６７ｍＬ、２．０７ｍｍｏｌ）を１分間かけて滴下し、その後２５℃で４時間撹拌した。溶媒の減圧留去を行い、残渣にＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加えた。飽和重曹水（５０ｍＬで３回）と水（５０ｍＬで４回）と飽和食塩水（５０ｍＬで１回）で順に洗浄し、得られたＥｔＯＡｃ層のＭｇＳＯ4による乾燥と濾過、減圧濃縮を行い、４−（２−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｃ）を白色固体として取得した（純度９２．９％；７９４ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、収率９３％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ７．９７（ｄ、４ＪＨＨ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４（ｄ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６２−７．５９（ｍ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８（ｔ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２９（ｔ、３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１（ｄ、３ＪＨＨ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．４８（ｔ、３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．２９（ｓ、２Ｈ）、４．３８（ｄ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．２３−４．１９（ｍ、３Ｈ）、３．６９−３．６６（ｍ、２Ｈ）、２．８４（ｓ、４Ｈ）【０２０９】
合成例６  ４−（６−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｈｅｘｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｅ）【０２１０】
【化２９】
2016047794.tif 000030
【０２１１】
４−（６−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｈｅｘｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌａｌｃｏｈｏｌ（３６０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）溶液に、炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２６９ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液を添加し、さらにピリジン（８３ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１ｍＬ）溶液を滴下し、その後２５℃で４時間撹拌した。溶媒の減圧留去を行い、残渣にＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加えた。飽和重曹水（１０ｍＬで３回）と水（１０ｍＬで１回）と飽和食塩水（１０ｍＬで１回）で順に洗浄し、得られたＥｔＯＡｃ層を硫酸マグネシウムで乾燥した後に硫酸マグネシウムを濾別し、濾液を減圧濃縮して４−（６−Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ）ｈｅｘｏｘｙ−３，５−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｚｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（３ｅ）を粘性の高い白色固体として取得した（３８３ｍｇ、収率９６％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：δ７．７７（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４（ｓ、２Ｈ）、７．３２（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．７（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、４．４０（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、４．２３−４．２０（ｍ、１Ｈ）、４．０３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．２５−３．１８（ｍ，２Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、１．８８−１．８０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．４７−１．３８（ｍ、２Ｈ）。【０２１２】
実施例１
＜担体付き粗製ペプチドの製造：Ｒｉｎｋアミド樹脂担持９残基疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶ（ＧＲＡＶＹスコア：２．３１）＞
Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ固相合成法により、０．４１ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ樹脂、及びカップリング試薬としてＯ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＣＴＵ）を用いて、自動ペプチド合成装置により標記の担体付き粗製ペプチドを合成した。【０２１３】
＜リンカー結合工程（Ｒｉｎｋアミド樹脂担持９残基疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（０．７ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（７３．７ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を、Ｒｉｎｋアミド樹脂担持９残基疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ、１００ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で１４時間振蕩した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を１２２ｍｇ取得した。【０２１４】
得られたリンカー結合体は、以下のスキームによって高純度の疎水性ペプチドとした。【０２１５】
【化３０】
2016047794.tif 000031
【０２１６】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（６１６ｍｇ）をＤＭＦ（３ｍＬ）で２回洗浄し、さらにＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）で１回洗浄した後減圧下で過剰の溶媒を除去した。ここに２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を加え２５℃で２０分間振盪した後、濾過を行い、脱Ｆｍｏｃ反応を実施した。このピペリジン処理操作は合計４回繰り返し、最後ＤＭＦ（３ｍＬ）で洗浄した。脱Ｆｍｏｃ後の担体付きリンカー結合体１ｍｏｌに対し、Ｆｍｏｃアミノ酸：ＨＯＢｔ：ＨＢＴＵ：ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）＝３ｍｏｌ：３ｍｏｌ：６ｍｏｌの比率で仕込まれたＤＭＦ（３ｍＬ）溶液を加え、２５℃で２０分間撹拌した後、濾過を行い、Ｆｍｏｃアミノ酸をカップリングさせた。このカップリング操作は合計３回繰り返した。ニンヒドリン試薬の呈色反応により未反応のアミノ基が存在しないことを確認してから、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液による脱Ｆｍｏｃ反応、カップリング操作を所望の配列が得られるまで繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙからなる１１残基のペプチド鎖を連結した担体付き親水化ペプチド体を９６３ｍｇ取得した。【０２１７】
＜担体切除工程＞
担体付き親水化ペプチド体（２００ｍｇ）に、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）：Ｈ2Ｏ＝９５：２．５：２．５（容積比、２ｍＬ）の混合溶液を加え、２５℃で２時間振蕩した。担体の濾別を行い、残渣はＴＦＡ（１ｍＬ）で洗浄した。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物７１ｍｇの白色固体として取得した。
取得した親水化ペプチド体について、ＨＰＬＣ分析及び質量分析を行った。結果を以下に示し、得られたチャートを、図１、２に示す。【０２１８】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（粗生成物）＞
ＨＰＬＣ  カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＢＩＯ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ１８−５、２５ｃｍＸ４．６ｍｍ、５μｍ
流速：１ｍＬ／ｍＬ
カラム温度：４０℃
波長：２２０ｎｍ
溶離液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝０→１００（０−２０分）、１００（２０−３４．５分）、１００→０（３４．５−３５分）、０（３５−３９．９分）
保持時間：  １３．７分
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ２１０１．９１７  （計算値：２１０１．１４）【０２１９】
＜クロマト精製工程＞
以下の条件に基づき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による担体フリーの親水化ペプチド体の精製を行った。実施条件、結果を示す。また得られたチャートを図３、４に示す。
ＨＰＬＣ精製条件
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ
溶離液：０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％アセトニトリル溶液＝８５／１５→５０／５０（７０ｍｉｎ）
流速：２０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２５ｎｍ【０２２０】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（精製物）＞
ＨＰＬＣカラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２２５ｎｍ
溶離液：０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％アセトニトリル溶液＝９５／５→４０／６０（８ｍｉｎ）
保持時間：４．８ｍｉｎ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ２１０３．６（計算値２１０１．１４）【０２２１】
＜リンカー切除工程（接触還元反応によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（１０ｍｇ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（１０％  ｗａｔｅｒ  ｗｅｔ；３０ｍｇ）を加えた。容器内の水素ガス置換を行い、１気圧の水素雰囲気下とした。混合物を５０℃で１５時間撹拌後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にトリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ）を加え濾過を行った。固体はＴＦＡ（１ｍＬ）で洗浄し、濾液と洗浄液を混合しヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、１１．８ｍｇの白色粉末を取得した。【０２２２】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、１０％炭酸水素ナトリウム１．０ｍＬとアセトニトリル／Ｈ2Ｏ＝１／１（容積比）１．０ｍＬで順に洗浄操作を実施した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶ５．０ｍｇを白色粉末として取得した。得られた疎水性ペプチドのＨＰＬＣ分析結果、及び質量分析結果を図５、６に示す。【０２２３】
実施例２
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持アミロイドβ（１７〜４０断片）ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
Ｆｍｏｃ／Ｂｏｃ固相合成法により、０．４１ｍｍｏｌ／ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂、及びカップリング試薬としてＯ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＣＴＵ）を用いて、自動ペプチド合成装置により標記の担体付き粗製ペプチドを合成した。【０２２４】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持アミロイドβ（１７〜４０断片）への活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（１４４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持アミロイドβ（１７〜４０断片）（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、８００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振蕩した。次いで、担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を８４６ｍｇ取得した。【０２２５】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（８４６ｍｇ）に対し、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリング操作を繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙからなる合計１１個のアミノ酸からなるペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド２を９９２ｍｇ取得した。【０２２６】
＜担体切除工程（配列にＳ原子を含む場合）＞
担体付き親水化ペプチド体（４００ｍｇ）に、ＴＦＡ：ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ：Ｈ2Ｏ＝９０：５：３：５（容積比）の混合溶液を３ｍＬ加え、２５℃で２時間振蕩した。樹脂の濾別を行い、ＴＦＡで残渣を洗浄した。濾液と洗浄液を混合しヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物１３３ｍｇを取得した。
取得した親水化ペプチド体について、ＨＰＬＣ分析及び質量分析を行った。結果を以下に示す。【０２２７】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（粗生成物）＞
ＨＰＬＣ  カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＢＩＯ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ１８−５、２５ｃｍＸ４．６ｍｍ、５μｍ
流速：１ｍＬ／ｍＬ
カラム温度：４０℃
波長：２２０ｎｍ
溶離液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝０→１００（０−２０分）、１００（２０−３４．５分）、１００→０（３４．５−３５分）、０（３５−３９．９分）
保持時間：  １５．７分
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３６３５．８７２  （計算値：３６３５．８８７）【０２２８】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。【０２２９】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：ｍ−ｃｒｅｓｏｌ：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物１０．１ｍｇを取得した。【０２３０】
実施例３
＜担体付きリンカー結合工程（Ｒｉｎｋアミド樹脂担持９残基疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶへのアルデヒド型リンカー（５）の連結）（ＧＲＡＶＹスコア：２．３１）＞
Ｒｉｎｋアミド樹脂担持９残基疎水性ペプチドＧＩＬＴＶＳＶＡＶ（０．４１ｍｍｏｌ／ｇ；１５０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、アルデヒド型リンカー（５）（２４０ｍｇ、０．６１５ｍｍｏｌ）、及び塩化メチレン／オルトギ酸トリメチル混合溶液（容積比２／１；３．０ｍＬ）を混合し、２５℃で１３日間振蕩した。濾過した後、塩化メチレン（５ｍＬ）で洗浄し、減圧乾燥して１５５．９ｍｇのイミン化樹脂を取得した。
得られたイミン化樹脂２６ｍｇにＮａＢＨ3ＣＮ（３２．０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）とＤＭＦ／酢酸／メタノール混合溶液（９／９／２．６ｍＬ）を加え、２５℃で２４時間振蕩した。濾過、ＤＭＦ（３ｍＬ）と塩化メチレン（３ｍＬ）による洗浄により還元体樹脂２８ｍｇを取得した。
得られた還元体樹脂（１８３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）に、二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチル（１６４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（８３μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を混合し、２５℃で１９時間振蕩した。濾過、ＤＭＦ（３ｍＬ）による洗浄後、樹脂に再び二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチル（１６４ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（８３μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を加えて、２５℃で２３時間振蕩した。濾過、ＤＭＦ（３ｍＬ）と塩化メチレン（３ｍＬ）による洗浄、減圧乾燥により、アルデヒド型リンカー（５）が連結した担体付きリンカー結合体を２０９ｍｇ取得した。【０２３１】
得られた担体付きリンカー結合体は、以下のスキームによって高純度の疎水性ペプチドとした。【０２３２】
【化３１】
2016047794.tif 000032
【０２３３】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（４００ｍｇ）に対し、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリング操作を繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｇｌｙからなる合計１１個のアミノ酸からなるペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド体を４７２ｍｇ取得した。【０２３４】
＜担体切除工程＞
実施例１と同様の方法により、親水化ペプチド体（２００ｍｇ）から担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物（７８ｍｇ）を取得した。取得した親水化ペプチド体について、ＨＰＬＣ分析及び質量分析を行った。【０２３５】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（粗生成物）＞
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  １９８９．３３０  （計算値：１９８９．２３０）【０２３６】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。【０２３７】
実施例４
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２３８】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（１４４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、８００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を８４６ｍｇ取得した。【０２３９】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（８４６ｍｇ）をＤＭＦ（３ｍＬで２回）とＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬで１回）で順に洗浄し、減圧下で過剰の溶媒を除去した。ここに２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を加え２５℃で２０分間振盪し、その後ろ過することによりＦｍｏｃ基の脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド体を８６０ｍｇ取得した。【０２４０】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（１．２４ｇ、０．０９５４ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、５ｍＬ）の混合溶液を加え、２５℃で２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄した。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物１９６ｍｇを取得した。
取得した親水化ペプチド体について、ＨＰＬＣ分析及び質量分析を行った。結果を以下に示し、得られたチャートを、図７、８に示す。【０２４１】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（粗生成物）＞
ＨＰＬＣ  カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＢＩＯ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ  Ｃ１８−５、２５ｃｍＸ４．６ｍｍ、５μｍ
流速：１ｍＬ／ｍＬ
カラム温度：４０℃
波長：２２０ｎｍ
溶離液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝０→１００（０−２０分）、１００（２０−３４．５分）、１００→０（３４．５−３５分）、０（３５−３９．９分）
保持時間：  １３．７分
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３０３８．０２７（計算値：３０３７．５６８）【０２４２】
＜クロマト精製工程＞
以下の条件に基づき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による担体フリーの親水化ペプチド体の精製を行った。実施条件、結果を示す。また得られたチャートを図９、１０に示す。
ＨＰＬＣ精製条件
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ
溶離液：０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％アセトニトリル溶液＝８５／１５→５０／５０（７０ｍｉｎ）
流速：２０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２５ｎｍ【０２４３】
＜担体フリーの親水化ペプチド体（精製物）＞
ＨＰＬＣカラム：ＳＵＰＥＬＣＯ  Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出波長：２２５ｎｍ
溶離液：０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％アセトニトリル溶液＝８５／１５→２５／７５（２０ｍｉｎ）
保持時間：１４．５ｍｉｎ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３０３９（計算値３０３７．５６８）【０２４４】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（２０ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を４．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物２２ｍｇを取得した。【０２４５】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを白色粉末として１２ｍｇ取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９５．１（計算値２３９２．２８７）であった。得られた疎水性ペプチドのＨＰＬＣ分析結果、及び質量分析結果を図１１、１２に示す。【０２４６】
実施例５
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２４７】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（１４４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、８００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を８４６ｍｇ取得した。【０２４８】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（１．６０ｇ）をＤＭＦ（３ｍＬで２回）とＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬで１回）で順に洗浄し、減圧下で過剰の溶媒を除去した。ここに２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を加え２５℃で２０分間振盪し、その後ろ過することによりＦｍｏｃ基の脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）からなる６残基のペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド７を２．１１ｇ取得した。【０２４９】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（１．２４ｇ、０．０９５４ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、５ｍＬ）の混合溶液を加え、２５℃で２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄した。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物１９６ｍｇを取得した。【０２５０】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３５９０．６８６（計算値３５８９．８９７）【０２５１】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（２０ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を４．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物２２ｍｇを取得した。【０２５２】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを１２．０ｍｇ、白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９２．６８３（計算値２３９２．２８７）であった。【０２５３】
実施例６
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２５４】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（１４４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、８００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を８４６ｍｇ取得した。【０２５５】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体（１．６０ｇ）をＤＭＦ（３ｍＬで２回）とＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬで１回）で順に洗浄し、減圧下で過剰の溶媒を除去した。ここに２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を加え２５℃で２０分間振盪し、その後ろ過することによりＦｍｏｃ基の脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）、（Ｆｍｏｃ）Ａｓｐ（ｔＢｕ）からなる６残基のペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド体を１．９８ｇ取得した。【０２５６】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（１．２４ｇ、０．０９５４ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、５ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄した。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物１９６ｍｇを取得した。【０２５７】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３３４３．３０４（計算値３３４３．４５２）【０２５８】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（２０ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を４．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物２２ｍｇを取得した。【０２５９】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを１２．０ｍｇ、白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９３．２１０（計算値２３９２．２８７）であった。【０２６０】
実施例７
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２６１】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ｄ）の連結）＞
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ｄ）（３９ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、３００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ｄ）が連結した担体付きリンカー結合体を取得した。【０２６２】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体に対し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を加え２０分間振盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結し、担体付き親水化ペプチド体を取得した。【０２６３】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（５０ｍｇ、０．０００３１１ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、１ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄を行った。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物１９６ｍｇを取得した。【０２６４】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３０３７．８１２（計算値３０３７．５６８）【０２６５】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物６．９ｍｇを取得した。【０２６６】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチド（６．９ｍｇ）を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを３．０ｍｇ、白色粉末として（３．０ｍｇ）取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９２．９３９（計算値２３９２．２８７）であった。【０２６７】
実施例８
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２６８】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ｂ）の連結）＞
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ｂ）（４６ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、３００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ｂ）が連結した担体付きリンカー結合体を取得した。【０２６９】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体に対し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を加え２０分間振盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結した。【０２７０】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（４４ｍｇ、０．００４１０ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、１ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄を行った。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物６．０ｍｇを取得した。【０２７１】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３１２５．９４６（計算値３１２５．４７４）【０２７２】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物７．５ｍｇを取得した。【０２７３】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを１３．０ｍｇ、白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９２．１６８（計算値２３９２．２８７）であった。【０２７４】
実施例９
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２７５】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ｃ）の連結）＞
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ｃ）（３９ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、３００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ｃ）が連結した担体付きリンカー結合体を取得した。【０２７６】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体に対し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を加え２０分間振盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結した。【０２７７】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（４４ｍｇ、０．００４１０ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、１ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄を行った。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物８．２ｍｇを取得した。【０２７８】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３０１４．５５０（計算値３０１４．６３８）【０２７９】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物７．０ｍｇを取得した。【０２８０】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを１３．０ｍｇ、白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９６．０９９（計算値２３９２．２８７）であった。【０２８１】
実施例１０
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＨＭＰ  ＮｏｖａＧＥＬ樹脂担持１２残基疎水性ペプチドＣＥＷＮＳＡＨＦＩＡＹＫ（ＧＲＡＶＹスコア：−０．３１）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる１２残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＨＭＰ  ＮｏｖａＧＥＬ樹脂）を取得した。【０２８２】
＜リンカー結合工程（ＨＭＰ  ＮｏｖａＧＥＬ樹脂担持１２残基疎水性ペプチドＣＥＷＮＳＡＨＦＩＡＹＫへの活性化カーボネート型リンカー（３ａ）の連結）＞
ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ａ）（１７９ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、ＨＭＰ  ＮｏｖａＧＥＬ樹脂担持１２残基疎水性ペプチドＣＥＷＮＳＡＨＦＩＡＹＫ（０．２７ｍｍｏｌ／ｇ、５００ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ａ）が連結した担体付きリンカー結合体を取得した。【０２８３】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体に対し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（３ｍＬ）を加え２０分間振盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結した。【０２８４】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（５０ｍｇ、０．００８８ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、１ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄を行った。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物８．２ｍｇを取得した。【０２８５】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ２０２８．５５９（計算値２０２７．８６４）【０２８６】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物６．９ｍｇを取得した。【０２８７】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＡｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（３．０ｍｇ）を白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値１５１０．９５１（計算値１５１０．６７８）であった。【０２８８】
実施例１１
＜担体付き粗製ペプチドの製造：ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（ＧＲＡＶＹスコア：１．６３）＞
自動ペプチド合成機を使用したＦｍｏｃ固相合成法により、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌからなる２４残基ペプチドを担持した固相樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂）を取得した。【０２８９】
＜リンカー結合工程（ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶへの活性化カーボネート型リンカー（３ｅ）の連結）＞
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した活性化カーボネート型リンカー（３ｅ）（５５ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を、ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂担持２４残基疎水性ペプチドＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（０．１５ｍｍｏｌ／ｇ、３００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）と混合し、２５℃で２時間振盪した。次いで濾過を行い、得られた担体付きリンカー結合体をＤＭＦ（１０ｍＬ）と塩化メチレン（１０ｍＬ）で洗浄することにより、活性化カーボネート型リンカー（３ｅ）が連結した担体付きリンカー結合体を取得した。【０２９０】
＜親水性ユニット結合工程＞
担体付きリンカー結合体に対し、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を加え２０分間振盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行った。このピペリジン処理操作は合計４回行った。ＤＭＦでの洗浄後、実施例１と同様のＦｍｏｃ固相合成法により、Ｆｍｏｃ基の脱保護とＦｍｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返した。これにより、リンカー分子に、順に（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）からなる３残基のペプチド鎖を連結した。【０２９１】
＜担体切除工程＞
よく乾燥させた担体付き親水化ペプチド体（４４ｍｇ、０．００４１０ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ：フェノール：水：チオアニソール：３，６−ｄｉｏｘａ−１，８−ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ＝８０：８：５：５：２（容積比、１ｍＬ）の混合溶液を加え、２時間振蕩した。担体の濾別を行い、固体はＴＦＡで洗浄を行った。濾液と洗浄液を混合し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて激しく振盪した後、静置して二相に分離させた。ヘキサン層（上層）を除去し、残ったＴＦＡ層にジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回洗浄した。減圧下でジエチルエーテルを留去することにより、担体フリーの親水化ペプチド体の粗生成物８．２ｍｇを取得した。【０２９２】
＜クロマト精製工程＞
クロマト精製工程は、実施例１と同様の方法により行うとよい。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：  （Ｍ＋Ｈ＋）  ｍ／ｚ  ＝  ３０１４．５５０（計算値３０１４．６３８）【０２９３】
＜リンカー切除工程（酸性条件によるリンカーの切断）＞
担体フリーの親水化ペプチド体（５ｍｇ）に対し、ＴＦＡ：チオアニソール：ＴＭＳＯＴｆ＝６８：１２：２０（容積比）からなる混合溶液を１．０ｍＬ加え、０℃で４時間撹拌した。ＴＦＡ層にジエチルエーテル（４ｍＬ）を加えると、固体が析出した。遠心分離後、上澄みの除去を行い、固体はジエチルエーテルでさらに３回の洗浄操作を実施した。減圧下ジエチルエーテルを留去することにより、粗生成物７．０ｍｇを取得した。【０２９４】
＜疎水性ペプチドの取得（可溶化部位の除去）＞
前工程で得られたリンカー切断後の疎水性ペプチドを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬで２回洗浄し、さらに水１ｍＬで２回洗浄した。残渣を真空乾燥することにより、疎水性ペプチドＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌを１３．０ｍｇ、白色粉末として取得した。
上記疎水性ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を実施した。結果は、測定値２３９６．０９９（計算値２３９２．２８７）であった。
【図１】
2016047794.tif 000039
【図２】
2016047794.tif 000040
【図３】
2016047794.tif 000041
【図４】
2016047794.tif 000042
【図５】
2016047794.tif 000043
【図６】
2016047794.tif 000044
【図７】
2016047794.tif 000045
【図８】
2016047794.tif 000046
【図９】
2016047794.tif 000047
【図１０】
2016047794.tif 000048
【図１１】
2016047794.tif 000049
【図１２】
2016047794.tif 000050
【配列表】
2016047794000001.app
【国際調査報告】
2016047794.tif 000051
2016047794.tif 000052
2016047794.tif 000053
2016047794.tif 000054