(57)【要約】  持続効果や重症例での効果が期待できるドライアイの処置のために有効な眼科用組成物を提供することを課題とする。消化管において水分調整作用を有する化合物を有効成分とする。消化管において水分調整作用を有する化合物の好ましい例は、ビサコジル、ピコスルファートおよび製薬上許容されるその塩から選択されるいずれかである。本発明の眼科用組成物の有効成分は、対象の眼において、涙液量を増加させることができる。本発明の眼科用組成物の有効成分として、ビサコジルまたはピコスルファートを用いた場合、点眼後、数分から数時間後、例えば3時間後に、涙量の増加が観察されうる。
2014163142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管において水分調整作用を有する化合物を有効成分として含む、眼科用組成物。
【請求項２】
涙量に関連した疾患または状態を処置するための、請求項1に記載の眼科用組成物。
【請求項３】
涙量に関連した疾患または状態が、ドライアイである、請求項2に記載の眼科用組成物。
【請求項４】
点眼液である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の眼科用組成物。
【請求項５】
消化管において水分調整作用を有する化合物が、ビサコジル、ピコスルファートおよび製薬上許容されるその塩から選択されるいずれかである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の眼科用組成物。
【請求項６】
有効成分を0.05〜3％含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の眼科用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管において水分調整作用を有する化合物を有効成分とする、眼科用組成物に関する。より詳細には、ドライアイの処置に有効な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
涙の減少・変化によって、目の表面、角膜、または結膜の健康が損なわれる状態をドライアイという。涙の分泌の減少による涙不足、涙の蒸発の過多による目の乾き、涙の安定性が悪くなることにより、角膜や結膜の表面が荒れ、目の不快感、疲れ等の症状が現れる。【０００３】
原因は複合的であるとも言われている。加齢により、またコンタクトレンズの長時間・長期使用、レーシックなどの目の手術後に、ドライアイを発症する例も報告されている。シェーグレン症候群などの自己免疫疾患や、スティーブンスジョンソン症候群などの病気により涙がほとんどでない重篤なドライアイもある。加えて、コンピュータ、テレビ、携帯電話、タブレット端末の画面を見続ける生活により、まばたきが減少して涙が蒸発しやすくなる。また、空調の効いた室内は、概して乾燥しがちである。さらに涙の分泌は副交感神経に支配されていることから、交感神経優位のストレスの多い状態では分泌が減少すると考えられる。花粉症でおこる目の症状がドライアイと関係があるという報告もある。【０００４】
現在、ドライアイは、浸透圧の等しい人工涙液（有効成分：塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム水和物、ホウ酸）の点眼、ヒアルロン酸液の点眼により処置されているほか、ムチン産生促進作用を有するレバミピドを有効成分とする点眼剤、ジクアホソルナトリウムを有効成分とする点眼剤が用いられている。ジクアホソルナトリウムは、結膜上皮および結膜杯細胞膜上のP2Y2受容体に作用し、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることにより、水分およびムチンの分泌を促進し、眼表面の環境をより正常な状態に近づけ、ドライアイの症状および角結膜上皮障害を改善すると考えられている。【０００５】
一方、ビサコジルは、一般用医薬品では、便秘とそれにともなう頭重、腹部の膨満感、食欲不振（食欲減退）、腸内異常発酵などの不快な症状を改善する目的で、便秘薬に配合されている。ビサコジルは、大腸の副交感神経末端に作用してぜん動を高めるほか、腸粘膜に直接作用して排便反射を刺激し、排便を促進する。ビサコジルと同様に、大腸のぜん動運動亢進作用と水分吸収抑制作用により緩下作用を便秘薬に配合される成分として、ピコスルファートナトリウムが知られている。消化管への作用を目的として、これらを有効成分とする種々の剤形が開発されてきている（例えば、特許文献1および2）。【０００６】
ビサコジルの作用として、大腸粘膜上皮細胞のAQP3の発現量を減少させることにより、腸管側から血管側への水の移動を抑制し、瀉下作用を示している可能性が示唆されており、また、このメカニズムとして、ビサコジルはまず大腸のマクロファージからのCOX2およびPGE2の分泌を亢進させ、次いで、PGE2が大腸粘膜上皮細胞のAQP3の発現を低下させているとの報告がある（非特許文献1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2012-224619
【特許文献２】特開2002-003377
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ikarashi, et al., 2011, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301: G887-G895
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ドライアイの処置のために現在用いられている医薬はいずれも、持続効果や重症例での効果が十分とは考えられない。ドライアイをより有効に処置することのできる手段があれば、望ましいことは言うまでもない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、永年ドライアイの治療方法を鋭意研究してきた。眼の結膜は消化管と同様に水分の分泌・吸収を行っていることから、消化管の水分吸収を抑制する作用のある薬剤を点服薬として投与することについて検討した。その結果、一般に市販されている便秘薬の成分であるビサコジルまたはピコスルファートナトリウムの水溶液をドライアイモデルマウスに点眼したところ、点限後3時間で有意に涙液量を増加させる作用があることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
本発明は、以下を提供する。
[1]  消化管において水分調整作用を有する化合物を有効成分として含む、眼科用組成物。
[2]  涙量に関連した疾患または状態を処置するための、[1]に記載の眼科用組成物。
[3]  涙量に関連した疾患または状態が、ドライアイである、[2]に記載の眼科用組成物。
[4]  点眼液である、[1]〜[3]のいずれか一に記載の眼科用組成物。
[5]  消化管において水分調整作用を有する化合物が、ビサコジル、ピコスルファートおよび製薬上許容されるその塩から選択されるいずれかである、[1]〜[4]のいずれか一に記載の眼科用組成物。
[6]  有効成分を0.05〜3％含有する、[1]〜[5]のいずれか一に記載の眼科用組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】正常マウスに対する0.2%bisacodyl点眼実験。正常マウスでは0.2%bisacodyl点眼3時間後に涙液量増加の傾向を認めた。
【図２】ドライアイモデルマウスに対する0.2%bisacodyl点眼実験。ドライアイモデルマウスでは0.2%bisacodyl点眼3時間後に涙液量の有意な増加を認めた。*: p < 0.05（Wilcoxonの順位和検定）、n=10
【図３】点眼3時間後の涙液変化量（正常マウス）。正常マウスにおいてbisacodyl濃度依存的な涙液量の増加傾向を認めた。正常マウスではplacebo群との有意差は認められなかった。*: p < 0.05（Wilcoxonの順位和検定）、n=10
【図４】点眼3時間後の涙液変化量（ドライアイモデルマウス）。ドライアイモデルマウスにおいてBisacodyl濃度依存的な涙液量の増加を認めた。*: p < 0.05、**: p<0.01（Wilcoxonの符号付き順位検定）、n=10
【図５】相対発現量 (placebo処置対照に対する)。Bisacodyl点眼によりIL-1β、IL-6発現量の増加を認めたがAQP3の減少は認めなかった。*: p < 0.05（Mann-WhitneyのU検定）n=10
【図６】正常マウスに対する0.75%ラキソベロン点眼実験。正常マウスではラキソベロン点眼2〜3時間後に涙液量の増加を認めた。*: p < 0.05（Wilcoxonの符号付き順位検定）、n=22
【図７】Bisacodyl点眼後結膜のプロスタグランジンE2（PGE2）の定量。Bisacodyl点眼により、正常マウスまたはドライアイモデルマウスの両方で、結膜中PGE2の増加を認めた。*: p < 0.05、* *: p < 0.01（WilcoxonのU検定）、n=12（正常マウス）、n=6（ドライアイモデルマウス）
【図８】Bisacodyl点眼後結膜におけるPGE2合成酵素遺伝子の発現。正常マウスに、1% bisacodyl (10% DMSO含む)またはプラセボ(10% DMSO)を点眼した後、点眼1時間後、2時間後、3時間後に結膜を採取した。bisacodyl点眼によりPtgs2 mRNA 発現量の増加を認めた。*: p < 0.05、* *: p < 0.01（WilcoxonのU検定）、n=8
【図９】ドライアイモデル眼に対するbisacodyl点眼の効果。ドライアイモデルマウスに、bisacodylまたはプラセボの1日3回の点眼を1週間行った。点眼開始前1週間と点眼開始直前でBUTに差は認められなかったが、1週間の点眼を行った結果、BUTの延長が認められ、涙液層の安定性が向上した。BUTの延長は点眼終了後1週間を経過した時点においても認められた。*: p < 0.05、* *: p < 0.01（WilcoxonのU検定）、n=8
【図１０】ドライアイモデル眼の角膜フルオレセイン染色の一例。点眼開始前1週間と点眼開始直前では、角膜上皮障害を示す染色部位が、角膜の広い範囲に見られた。一方で、1日3回、1週間の点眼を行った結果、染色範囲は小さくなり、角膜上皮障害が軽減したことが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において数値範囲を「n〜m」を用いて表すときは、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の値nおよびmを含む。
【００１４】
本発明で「眼科用組成物」というときは、特に記載した場合を除き、眼に適用するのに適した形態の医薬組成物をいう。眼科用組成物は、必要に応じ眼に適用するのに適したようにpHおよび／または浸透圧が調整されており、粘性が調節されていてもよく、無菌であり得る。眼科用組成物には、点眼液、眼潅流液、眼軟膏、眼粘弾剤、コンタクトレンズ装着液およびコンタクトレンズケア用剤が含まれる。
【００１５】
本発明は、消化管において水分調整作用を有する化合物を有効成分として含む、眼科用組成物を提供する。本発明の眼科用組成物の有効成分として特に好ましい例は、ビサコジル、ピコスルファートおよび製薬上許容されるその塩である。本発明者らの検討によると、ビサコジル点眼により、正常マウスまたはドライアイモデルマウスの両方で、結膜中PGE2の増加を認めた（本願明細書の実施例の項参照）。これは、結腸粘膜で報告されているビサコジルの作用と同様である。
【００１６】
ビサコジル（bisacodyl、化学名 4,4'-(Pyridin-2-ylmethylene)bis(phenyl acetate）は、下記の構造を有する。
【００１７】
【化１】
2014163142.tif 000003
【００１８】
ピコスルファート（picosulfate、化学名4,4'-(pyridin-2-ylmethylene)bis(phenyl sulfate)）は、市販薬では、下式のピコスルファートナトリウムとして含まれている。
【００１９】
【化２】
2014163142.tif 000004
【００２０】
本発明の眼科用組成物に用いるピコスルファートの塩としては、製薬上許容されるものであれば特に制限されないが、例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩、モノ−、ジ−またはトリ−低級（アルキルまたはヒドロキシアルキル）アンモニウム塩（例えばエタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、トロメタミン塩）、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、アスパラギン酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩およびナフタレンスルホン酸塩を挙げることができる。また、本発明化合物またはその塩についていうときは、無水物または溶媒和物であってよく、溶媒和物には、水和物、メタノール和物、エタノール和物、プロパノール和物、および2-プロパノール和物が含まれる。
【００２１】
本発明の眼科用組成物においては、有効成分は1つであってもよく、複数の組み合わせであってもよい。有効成分の含有量は（複数の有効成分を用いる場合は総量として）、0.0001〜5%、好ましくは0.001〜3%、より好ましくは0.05〜3%、特に好ましくは0.1〜1%程度である。
【００２２】
本発明の眼科用組成物の用量は、当業者であれば適宜設計することができ、例えば点眼液であれば、数時間ごと、または一日に1〜数回、適用することができる。
【００２３】
本発明の眼科用組成物の投与期間は、当業者であれば適宜設計することができ、例えば点眼液であれば、一日に1〜数回の投与を、数日間〜数週間、例えば3日間、7日間、または14日間、継続して用いることができる。
【００２４】
本発明の眼科用組成物は、涙量に関連した疾患または状態を処置するために用いることができる。本発明で「処置」というときは、特に記載した場合を除き、予防および治療を含む。予防は、発症リスクの低減を含む。本発明の眼科用組成物は、特にドライアイの処置のために用いるのに適している。ドライアイとは、一般に、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、眼不快感や視機能異常を伴うものをいうが、本発明においてもこの意味で用いている。
【００２５】
ドライアイの原因や状態は種々あるが、本発明の眼科用組成物は、そのいずれにも好適に用いることができる。例えば、本発明の眼科用組成物は、涙液の基礎分泌が減少しているドライアイ（通常、刺激性分泌は正常である。）であっても、シェーグレン症候群のような重症なドライアイであり、涙液の刺激性分泌も減少している場合であっても、適用することができる。また、蒸散型のドライアイ（パソコンのモニター等を凝視することで瞬きが減少する、老化等の原因により油分が適切に供給されずに目の表面に水分を保てなくなる、乾燥した環境による乾き、アレルギーまたはコンタクトレンズの長期装用で角結膜の表面が傷んでいたり、目の表面が荒れた状態であると涙液が目の表面に定着しにくくなる）であっても、減少型のドライアイであっても、ウェットタイプのドライアイ（主に涙の排出機能が正しく働かない結果、目の表面が刺激を受けやすくなっている状態。）であっても適用することができる。
【００２６】
本発明の眼科用組成物はまた、ドライアイに関連した角膜上皮障害にも有用である。
【００２７】
本発明の眼科用組成物の有効成分は、対象の眼において、涙液量を増加させることができる。本発明の眼科用組成物の有効成分として、ビサコジルまたはピコスルファートを用いた場合、点眼後、数分から数時間後、例えば3時間後に、涙量の増加が観察されうる。従来技術のドライアイの処置のための点眼剤は、持続効果や重症例での効果が十分とは言えなかったが、本発明の眼科用組成物により、持続性および／または重症例における効果が期待できる。持続性に関しては、本発明らの検討によると、ドライアイモデルマウスに、本発明にしたがって処方された眼科用組成物の1日3回の点眼を1週間行ったところ、BUT（涙液層破壊時間）の延長が認められ、涙液層の安定性が向上し、またBUTの延長は点眼終了後1週間を経過した時点においても認められた（本願明細書の実施例の項参照）。
【００２８】
ドライアイであるか否か、並びに本発明の眼科用組成物を適用することによる涙量の増加の有無およびその程度は、公知の検査方法により、確認することができる。公知の検査方法の例としては、スリットランプによる検診、染色検査、シルマーテスト（ろ紙またはフェノールレッド糸を用いる）、BUT測定(涙液層破壊時間測定）、クリアランステスト等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の眼科用組成物には、本発明の効果を損なわない限り、種々の製薬上許容される添加物を配合することができる。
【００３０】
本発明の眼科用組成物には等張化剤を配合することができる。本発明に用いることができる等張化剤の例として、無機塩類、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。無機塩類は、用いるものに拠るが、通常0.001〜5%、好ましくは0.001〜1%、より好ましくは0.005〜0.5%程度で用いられる。
【００３１】
本発明の眼科用組成物は、必要に応じて、生体に許容される範囲内の浸透圧に調整して用いる。浸透圧は、100〜1200mOsm、好ましくは100〜600mOsm、特に好ましくは150〜400mOsm程度であり、生理食塩液に対する浸透圧比は、通常、0.4〜4.1、好ましくは0.3〜2.1、特に好ましくは0.5〜1.4程度である。
【００３２】
本発明の眼科用組成物には、pH調製のための添加剤（緩衝剤）を配合することができる。本発明に用いることができる緩衝剤の例として、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、HEPES緩衝剤、MOPS緩衝剤等が挙げられる。より具体的な例として、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、テトラホウ酸カリウム、メタホウ酸カリウムなど 、リン酸、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、HEPES、MOPSなどの化合物や、これらの群から選ばれる2種以上の化合物の組み合わせ等が挙げられる。
【００３３】
本発明の眼科用組成物は、必要に応じて、生体に適用可能な範囲内のpHに調整して用いる。pHは、例えばpH4.0〜9.0、好ましくは5.0〜8.5、より好ましくは5.5〜8.5である。
【００３４】
本発明の眼科用組成物は、所望の効果を得るために適切な粘度に設定することができる。眼科用組成物の粘度は、眼粘膜に適用した時の差し心地（使用感）、薬物滞留能等に影響を与えることから、適切な粘度を設計し、設計した粘度が長期的に安定に保持されるようにするとよい。適切な粘度とは、例えば20℃における粘度が1.5mPa・s以上であり、典型的には1.5〜300mPa・s、好ましくは、2〜200mPa・s、特に好ましくは5〜100mPa・s、更に好ましくは10〜80mPa・s程度に設計することができる。粘度の調整は、前記緩衝剤、pH調整剤、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）などを用いて行うことができる。
【００３５】
本発明の眼科用組成物に用いることのできる添加剤の他の例としては、溶解補助剤（例えば、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン）、安定剤（例えば、無水亜硫酸ナトリウム）、懸濁化剤・乳化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート80）界面活性剤、保存剤（例えば、パラベン類）、殺菌剤または抗菌剤、香料または清涼化剤、糖類などの各種添加剤を挙げることができる。
【００３６】
本発明の眼科用組成物は、他の有効成分を組み合わせて配合することができる。本発明に用いることができる他の有効成分の例としては、眼科用組成物に通常用いられる充血除去成分、眼筋調節薬成分、抗炎症薬成分または収斂薬成分、抗ヒスタミン薬成分または抗アレルギー薬成分、ビタミン類、アミノ酸、局所麻酔成分、ステロイド成分等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の眼科用組成物は、公知の方法により製造できる。ろ過滅菌処理工程、容器への無菌充填工程等を加えることができる。
【００３８】
本発明の眼科用組成物を点眼液とする場合、適切であれば、有効成分以外の成分は、既存の点眼液に類似した構成とすることができる。いくつかの例を以下に示す。
【００３９】
例1（pH5.0）
ホウ酸  20.0
パラオキシ安息香酸メチル  0.26
パラオキシ安息香酸プロピル  0.14
滅菌精製水  ad 1000.0
【００４０】
例2（pH6.5）
パラオキシ安息香酸メチル  0.26
パラオキシ安息香酸プロピル  0.14
滅菌精製水  ad 1000.0
【００４１】
例4（粘性点眼液とする場合）
メチルセルロース（4000CPS）  0.3
塩化ナトリウム  0.9
塩化ベンゼトニウム  0.02
滅菌精製水  ad 100.0
【００４２】
例5（点眼油とする場合。有効成分は、油に溶解または懸濁させることができる。）
アルミニウムモノステアレート  2g
精製植物油  ad 100g
【００４３】
また本発明の眼科用組成物を点眼液とする場合、適切であれば、用時溶解型の剤形（例えば、溶解液と、溶解液とは別の容器に格納された有効成分とのセット）としてもよい。
【００４４】
以下、本発明を実施例を用いて説明する。
【実施例】
【００４５】
[実験1: Bisacodyl点眼実験]
正常マウスまたはドライアイモデルマウス(涙腺切除)を用いてbisacodyl点眼実験を行った。C57BL/6 12週令のマウス、各5匹（10眼）で実験した。ドライアイモデルマウスは8週齢のメスC57BL/6マウスを4%トリクロロアセトアルデヒド0.2ml腹腔内注射にて麻酔後、外眼角耳側1mmの部位を2mm皮膚切開、涙腺を周囲組織から剥離し、外眼角に開口する涙腺の導管を開口部近傍で切除して涙腺を摘出することにより作成した。本実験では
涙腺切除後4週経過後のものを対象とした。【００４６】
Bisacodyl（Sigma-Aldrich Co. LLC.）をジメチルスルホキサイド（DMSO）に溶解し、10％（w/v）の溶液を調製した。BisacodylのDMSO溶液（10%）20μlを980μlの生理食塩水に加え、0.2% bisacodyl点眼液（2% DMSO含む）を調製した。また、20μlのDMSOを980μlの生理食塩水に加えた溶液をプラセボ点眼液（2% DMSO）とした。【００４７】
0.2% bisacodyl (2% DMSO含む)溶液、またはプラセボ(2% DMSO)を準備し、一回一眼に25μL、5分間隔で3回点眼した。第一日目はプラセボを適用し、第二日目は0.2%bisacodyl点眼液を投与した。点眼前、点眼1時間後、2時間後、3時間後および6時間後の涙液量をフェノールレッド糸（ゾーンクイック（登録商標）昭和薬品化工株式会社、測定時間30秒）により測定した。【００４８】
結果を図1および2に示した。ドライアイマウスでは0.2% bisacodyl点眼3時間後に涙液量の有意な増加を認めた。【００４９】
[実験2: Bisacodyl濃度の検討]
正常マウスまたはドライアイモデルマウスを用いてbisacodylの濃度について検討した。
実験1と同様に、bisacodylのDMSO溶液（10%）を調製し、20μl、50μl、または100μlを、それぞれ980μl、950μl、900μlの生理食塩水に加えて各濃度のbisacodyl点眼液（0.2%、0.5%、1%）を調製した。0.2% bisacodyl (2% DMSO)、0.5% bisacodyl (5% DMSO)、1% bisacodyl (10% DMSO)、またはプラセポ(DMSO) を点眼した。点眼前および点眼3時間後の涙液量をフェノールレッド糸（ゾーンクイック（登録商標）昭和薬品化工株式会社、測定時間30秒）により測定した。【００５０】
正常マウスにおいてbisacodyl濃度依存的な涙液量の増加傾向を認め、placebo群との有意差は認められなかった（図3）。ドライアイモデルマウスにおいてはbisacodyl濃度依存的な涙液量の有意な増加を認めた（図4）。【００５１】
[実験3: 遺伝子発現量の検討]
C57BL/6 12週令の正常マウスに、0.2% bisacodyl (2% DMSO含む)またはプラセボ(2% DMSO)を一回一眼に25μL、5分間隔で3回点眼した後、点眼1時間後、2時間後、3時間後に結膜を採取した。RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（株式会社キアゲン）を用いて結膜から全RNAを抽出、SuperScript（登録商標）VILOTM cDNA Synthesis Kit(Life Technologies Corporation）を用いて逆転写を行い、cDNAを合成した。cDNAを鋳型としてReal-time PCRを行い、AQP1、AQP3、IL-1β、IL-6、TNFαのmRNAを定量した。Real-time PCRによるmRNA定量には、StepOnePlusTM Real-Time PCR System(Life Technologies Corporation）およびTaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ(Life Technologies Corporation）を用いた。解析に使用したTaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイのIDは、Mm00431834#m1（Aqp1）、Mm01208559#m1（AQP3）、Mm00434228#m1（IL-1β）、Mm00446190#m1（IL-6）、Mm00443260#g1（TNFα）である。【００５２】
結果を図5に示した。bisacodyl点眼によりIL-1β、IL-6発現量の増加を認めた。一方、この実験においては、AQP3の減少は認めなかった。【００５３】
[実験4: ピコスルファート点眼実験]
正常マウスを用いてピコスルファート点眼実験を行った。C57BL/6 12週令のマウス、11匹（22眼）を対象とした。【００５４】
0.75% ピコスルファートナトリウム（ラキソベロン）を準備し、一回一眼に25μL、5分間隔で3回点眼した。点眼前、点眼1時間後、2時間後、3時間後および4時間後の涙液量をフェノールレッド糸（ゾーンクイック（登録商標）昭和薬品化工株式会社、測定時間30秒）により測定した。【００５５】
結果を図6に示した。点眼2〜3時間後に涙液量の有意な増加を認めた。【００５６】
[実験5: Bisacodyl点眼後結膜のプロスタグランジンE2（PGE2）の定量]
C57BL/6 12週令の正常マウスまたはドライアイモデルマウス（対線切除後4週）に、1% bisacodyl (10% DMSO含む)またはプラセボ(10% DMSO)を一回一眼に25μL、5分間隔で3回点眼した後、3時間後に結膜を採取した。PGE2の定量にはProstaglandin E2 Parameter Assay Kit (R&D)を用いた。【００５７】
結果を図７に示した。Bisacodyl点眼により、正常マウスまたはドライアイモデルマウスの両方で、結膜中PGE2の増加を認めた。これは、結腸粘膜で報告されているビサコジルの作用と同様であり、PGE2を介したイオンポンプまたはイオンチャネルの調節による水分の吸収阻害または分泌促進がある可能性が期待できる。【００５８】
[実験6: Bisacodyl点眼後結膜におけるPGE2合成酵素（Cyclooxygenase）遺伝子の発現]
C57BL/6 12週令の正常マウスに、1% bisacodyl (10% DMSO含む)またはプラセボ(10% DMSO)を一回一眼に25μL、5分間隔で3回点眼した後、点眼1時間後、2時間後、3時間後に結膜を採取した。RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（株式会社キアゲン）を用いて結膜から全RNAを抽出、SuperScript（登録商標）VILOTMcDNA Synthesis Kit(Life Technologies Corporation）を用いて逆転写を行い、cDNAを合成した。cDNAを鋳型としてReal-time PCRを行い、Ptgs1 (Cyclooxygenase-1, COX-1)、Ptgs2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)のmRNAを定量した。Real-time PCRによるmRNA定量には、StepOnePlusTMReal-Time PCR System(Life Technologies Corporation）およびTaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ(Life Technologies Corporation）を用いた。解析に使用したTaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイのIDは、Mm00477214#m1（Ptgs1）、Mm00478374#m1（Ptgs2）、である。【００５９】
結果を図8に示した。bisacodyl点眼によりPtgs2 mRNA 発現量の増加を認めた。【００６０】
[実験7: ドライアイモデル眼に対するbisacodyl点眼の効果]
C57BL/6 6ヶ月齢のドライアイモデルマウス（涙腺切除後4ヶ月）に、1% bisacodyl (10% DMSO含む)またはプラセボ(10% DMSO)を一回一眼に25μL、1日3回の点眼を1週間行った。涙液層の安定性および角膜上皮障害の程度を評価するため、涙液層破壊時間（BUT）の測定および角膜のフルオレセイン染色を行った。BUT測定と角膜のフルオレセイン染色は点眼開始前1週間、点眼開始直前、点眼終了時、点眼終了後1週目に行った。【００６１】
BUT測定の結果を図9に示した。点眼開始前1週間と点眼開始直前でBUTに差は認められなかった。一方で、1日3回、1週間の点眼を行った結果、BUTの延長が認められ、涙液層の安定性が向上したことが分かった。BUTの延長は点眼終了後1週間を経過した時点においても認められることが分かった。【００６２】
ドライアイモデル眼の角膜フルオレセイン染色の一例を図10に示した。点眼開始前1週間と点眼開始直前では、角膜上皮障害を示す染色部位が、角膜の広い範囲に見られた。一方で、1日3回、1週間の点眼を行った結果、染色範囲は小さくなり、角膜上皮障害が軽減したことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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