(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）が、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属又はシネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアである、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記シアノバクテリアのアシル−ＡＣＰシンテターゼの機能が喪失している、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
シアノバクテリアに下記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）が、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、請求項７又は８記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記シアノバクテリアが、シネコシスティス（Synechocystis）属又はシネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリアである、請求項７〜９のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記シアノバクテリアのアシル−ＡＣＰシンテターゼの機能が喪失している、請求項７〜１０のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１２】
ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１３】
ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、請求項７〜１１のいずれか１項記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法、及びこれに用いる形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１種であり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
【０００３】
植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−ＡＣＰ（acyl-carrier-protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリアプロテインとからなる複合体）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein  synthase、以下「ＫＡＳ」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、ＫＡＳ  ＩＩＩ、ＫＡＳ  ＩＶ、のそれぞれ機能が異なる４種のＫＡＳが存在することが知られている。このうち、ＫＡＳ  ＩＩＩは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを炭素数４のアシル−ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、及びＫＡＳ  ＩＶが関与する。ＫＡＳ  Ｉは主に炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、ＫＡＳ  ＩＩは主に炭素数１８のステアロイルＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、ＫＡＳ  ＩＶは炭素数６〜１４の中鎖アシル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与するといわれている。ＫＡＳ  ＩＶについては、植物でもあまり知見が得られておらず、クフェア（Cuphea）などの中鎖脂肪酸を蓄積する植物に特有のＫＡＳとされている（特許文献１、及び非特許文献１参照）。
【０００４】
シアノバクテリア（藍色細菌）は真正細菌の一群であり、光合成によって酸素を産生し、ＣＯ２を固定化する能力を有する。シアノバクテリアは、外膜とペプチドグリカンの細胞壁を有し、グラム陰性菌に分類される。しかし、典型的なグラム陰性菌とは分類学上系統的に離れている。シアノバクテリアは、それらが１０数億年前に真核生物に細胞内共生（１次共生）したことが葉緑体の起源であると考えられている。そのため、葉緑体の祖先生物として光合成研究に広く利用されている。また、シアノバクテリアは他の植物と比べて生育が速く、かつ高い光合成能力を有する。さらにシアノバクテリアは形質転換能も有する。
そのためシアノバクテリアは外来ＤＮＡを細胞内に導入することで微生物学的な物質生産に利用可能であることから、バイオ燃料などの物質の生産用宿主として注目されている。
【０００５】
シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、脂肪酸の生産が報告されている（非特許文献２）。しかし、シアノバクテリアの光合成に依存した、大気中の二酸化炭素などを炭素源とした脂肪酸の生産技術は、その生産性が未だ低レベルにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９８／４６７７６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dehesh  K．et  al.，The  Plant  Journal，1998，vol．15(3)，p．383-390
【非特許文献２】Liu  X．et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，2011，vol．108，p．6899-6904
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させる、シアノバクテリアを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた、シアノバクテリアの形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。
本発明者らはまず、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させるために宿主に導入するＫＡＳとして、藻類の１種であるナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類のＫＡＳに着目した。そして、ナンノクロロプシス属の藻類のＫＡＳをシアノバクテリアに導入して形質転換体を作製したところ、形質転換体が生産する中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
本発明は、下記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「ＫＡＳ活性」ともいう）を有するタンパク質
【００１１】
また本発明は、シアノバクテリアに前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性に優れる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書における「脂質」は、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本発明の形質転換体は、下記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子（以下、「ＫＡＳ遺伝子」ともいう）で形質転換されている。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ａ）と機能的に均等なタンパク質）
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属の藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145由来のＫＡＳである。
ＫＡＳは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物と同様、藻類の脂肪酸合成経路も葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ＡＣＰを出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「ＴＥ」ともいう）の作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をＫＡＳが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
【００１６】
本明細書において「ＫＡＳ活性」とは、アセチル−ＡＣＰやアシル−ＡＣＰと、マロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
タンパク質がＫＡＳ活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
【００１７】
ＫＡＳはその基質特異性によってＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、ＫＡＳ  ＩＩＩ、又はＫＡＳ  ＩＶに分類される。ＫＡＳ  ＩＩＩは、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを基質とし、炭素数２から４の伸長反応を触媒する。ＫＡＳ  Ｉは、主に炭素数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰを合成する。ＫＡＳ  ＩＩは、主に炭素数１６から１８の伸長反応を触媒し、炭素数１８のステアロイルＡＣＰを合成する。ＫＡＳ  ＩＶは炭素数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。
前記タンパク質（ａ）は、後述の実施例で示すように、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有する。よって前記タンパク質（ａ）は、ＫＡＳ  ＩＶであると考えられる。ここで「中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性」とは、ＫＡＳが、主に炭素数４〜１２のアシルＡＣＰを基質とし、炭素数１４までの中鎖アシルＡＣＰ合成の伸長反応を触媒することをいう。また本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
ＫＡＳの中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述する中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥを共発現させ、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥ単独を発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、中鎖アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
【００１８】
前記タンパク質（ｂ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列との同一性は７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９１％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【００１９】
前記タンパク質（ｂ）としては、下記タンパク質（ａ１）が挙げられる。
（ａ１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）CCMP526由来のＫＡＳである。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と約９０％の同一性を有する。
また、前記タンパク質（ｂ）として、前記タンパク質（ａ）又は（ａ１）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上１８４個以下、好ましくは１個以上１３８個以下、より好ましくは１個以上９２個以下、さらに好ましくは１個以上４６個以下、特に好ましくは１個以上４２個以下、最も好ましくは１個以上２３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（商品名、タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（商品名、Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（商品名、東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２０】
前記ＫＡＳ遺伝子の一例として、下記ＤＮＡ（ｄ）又は（ｅ）からなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）前記ＤＮＡ（ｄ）の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００２１】
前記ＤＮＡ（ｅ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｄ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がさらに好ましく、７８％以上がよりさらに好ましく、８０％以上がよりさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。また前記ＤＮＡ（ｅ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上５４６個以下、好ましくは１個以上４７８個以下、より好ましくは１個以上４１０個以下、さらに好ましくは１個以上３４２個以下、さらに好ましくは１個以上３０１個以下、さらに好ましくは１個以上２７３個以下、特に好ましくは１個以上１３７個以下、最も好ましくは１個以上６９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００２２】
また前記ＤＮＡ（ｅ）としては、下記ＤＮＡ（ｄ１）が挙げられる。
（ｄ１）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号４の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列と約７７％の同一性を有する。
【００２３】
ＫＡＳ遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ＫＡＳ遺伝子を人工的に合成できる。ＫＡＳ遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータのゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
【００２４】
本発明の形質転換体は、前記ＫＡＳ遺伝子に加えて、ＴＥをコードする遺伝子（以下、「ＴＥ遺伝子」ともいう）を宿主に導入してなるものが好ましい。
ＴＥは、ＫＡＳ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。ＴＥの作用によってＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、宿主にＫＡＳ遺伝子とＴＥ遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるＴＥは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「ＴＥ活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ＴＥ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００２５】
ＴＥは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のＴＥが存在していることが知られている。よってＴＥは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
上述のように、前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）は中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＫＡＳである。よって共導入するＴＥも、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子であることが好ましい。中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。特に、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子を元来有していない宿主を形質転換に用いる場合、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子の共導入が効果的である。
【００２６】
本発明で用いることができるＴＥは、通常のＴＥや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Cuphea calophylla  subsp.  mesostemonのＴＥ（GenBank  ABB71581）；Cinnamomum camphoraのＴＥ（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragransのＴＥ（GenBank  AAB71729及びAAB71730）；Cuphea lanceolataのＴＥ（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookerianaのＴＥ（GenBank  Q39513）；Ulumus americanaのＴＥ(GenBank  AAB71731）；Sorghum bicolorのＴＥ(GenBank  EER87824）；Sorghum bicolorのＴＥ(GenBank  EER88593）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Elaeis guineensisのＴＥ（GenBank  AAD42220）；Desulfovibrio vulgarisのＴＥ（GenBank  ACL08376）；Bacteriodes fragilisのＴＥ（GenBank  CAH09236）；Parabacteriodes distasonisのＴＥ（GenBank  ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicronのＴＥ（GenBank  AAO77182）；Clostridium asparagiformeのＴＥ（GenBank  EEG55387）；Bryanthella formatexigensのＴＥ（GenBank  EET61113）；Geobacillus  sp.のＴＥ（GenBank  EDV77528）；Streptococcus dysgalactiaeのＴＥ（GenBank  BAH81730）；Lactobacillus brevisのＴＥ（GenBank  ABJ63754）；Lactobacillus plantarumのＴＥ（GenBank  CAD63310）；Anaerococcus tetradiusのＴＥ（GenBank  EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorusのＴＥ（GenBank  CAE80300）；Clostridium thermocellumのＴＥ（GenBank  ABN54268）；Arabidopsis thalianaのＴＥ；Bradyrhizobium japonicumのＴＥ；Brassica napusのＴＥ；Cinnamonum camphorumのＴＥ；Capsicum chinenseのＴＥ；Cuphea hookerianaのＴＥ；Cuphea lanceolataのＴＥ；Cuphea palustrisのＴＥ；Coriandrum sativum  Ｌ．のＴＥ；Carthamus tinctoriusのＴＥ；Cuphea wrightiiのＴＥ；Gossypium hirsutumのＴＥ；Garcinia mangostanaのＴＥ；Helianthus annuusのＴＥ；Iris germanicaのＴＥ；Iris tectorumのＴＥ；Triticum aestivumのＴＥ；Ulmus AmericanaのＴＥ；Escherichia coliのＴＥ；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照、配列番号５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６）；Nannochloropsis oculataのＴＥ（配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Umbellularia californicaのＴＥ（GenBank  AAA34215.1、配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Nannochloropsis gaditanaのＴＥ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）；Nannochloropsis granulataのＴＥ（配列番号１３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１４）；Symbiodinium microadriaticumのＴＥ（配列番号１５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１６）、等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつＴＥ活性を有するタンパク質も用いることができる。
前記ＴＥの中でも、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥが好ましく、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、Symbiodinium microadriaticumのＴＥ、これらのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を示すＴＥ活性を有するタンパク質、又はこれらのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつ中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を示すＴＥ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのＴＥ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
【００２７】
ＴＥは、基質となるアシル−ＡＣＰの脂肪酸鎖長及び不飽和度に対して特異性を有する。したがって、導入するＴＥの種類を変えることによって、シアノバクテリアに所望の鎖長や不飽和度の遊離脂肪酸を生産させることができる。
例えば、Umbellularia californica由来のＴＥ（UcTE）は炭素数１２のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にラウリン酸（C12:0）などの炭素数１２の遊離脂肪酸である。また、Cinnamonum camphorum及びCocos nuciferaのＴＥは炭素数１４のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にミリスチン酸（C14:0）などの炭素数１４の遊離脂肪酸である。また、Escherichia coli  K-12株のＴＥは、炭素数１６又は１８のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にパルミチン酸（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、ステアリン酸（C18:0)、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、リノレン酸（C18:3）などの炭素数１６又は１８の遊離脂肪酸である。
【００２８】
本発明においてＴＥ活性は、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にＴＥ遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したＴＥ遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にＴＥ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したＴＥ遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L．et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）に従い各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより確認できる。
【００２９】
本発明の形質転換体は、後述するシアノバクテリアに前記ＫＡＳ遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上するとともに、生産される脂肪酸の総量も有意に向上する。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３０】
本発明の形質転換体の宿主として用いるシアノバクテリアは、クロロフィルを用いた光合成を行う原核生物の一群である。
シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis  sp．）PCC6803のような単細胞性のもの、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー（Anabaena  sp．）PCC7120のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。
生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー（Synechococcus  sp．）CC9311、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーWH8102など、様々な条件に適応した種が見られる。
また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス（Gloeobacter violaceus）PCC7421、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルａでなくクロロフィルｄを主要な（＞９５％）光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）なども挙げられる。
【００３１】
シアノバクテリアでは、光合成により固定された二酸化炭素は多数の酵素反応プロセスを経てアセチル−ＣｏＡへと変換される。脂肪酸合成の最初の段階は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの作用による、アセチル−ＣｏＡとＣＯ2からのマロニル−ＣｏＡの合成である。次に、マロニル−ＣｏＡがマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼの作用によってマロニル−ＡＣＰへと変換される。その後、脂肪酸シンテターゼ（又はアシル−ＡＣＰシンテターゼ）の進行的作用時に、炭素単位２個の連続的付加が起こり、炭素が２個ずつ増加した、アシル−ＡＣＰが合成され、膜脂質等の合成中間体として利用される。
【００３２】
本発明の形質転換体の宿主としては、あらゆる種類のシアノバクテリアを用いることができる。例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属のシアノバクテリアが挙げられる。このうち、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属又はアナベナ属のシアノバクテリアが好ましく、シネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリアがより好ましい。また本発明で用いる宿主としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803、シネコシスティス・エスピーPCC7509、シネコシスティス・エスピーPCC6714、シネココッカス・エロンガタスエスピー（Synechococcus elongatus  sp．）PCC7942、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1、トリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）IMS101、アカリオクロリス・マリアナ（Acaryochloris mariana）MBIC11017、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）WH8501、及びアナベナ・エスピー（Anabaena  sp．）PCC7120がより好ましく、シネコシスティス・エスピーPCC6803及びシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がより好ましく、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がさらに好ましい。
【００３３】
本発明の形質転換体は、前記ＫＡＳ遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記ＫＡＳ遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
前記ＫＡＳ遺伝子に加えて前記ＴＥ遺伝子も導入した形質転換体も、常法により作製できる。
【００３４】
遺伝子発現用プラスミドベクターの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現ベクターとしては、pUC系ベクター（タカラバイオ社製）、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。このうち、pUC系ベクターがより好ましい。
【００３５】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、リボゾームRNAをコードするrrnAオペロン遺伝子のプロモーターが挙げられる。このうち、rrnAオペロン遺伝子のプロモーターがより好ましい。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、及びゲンタマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００３６】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
またシアノバクテリアに導入する異種遺伝子は、シアノバクテリアにおけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon  Usage  Database（www.kazusa.or.jp/codon/）から入手可能である。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。形質転換方法としては、自然形質転換法、エレクトロポレーション法、及び接合法が挙げられる。
【００３７】
本発明の形質転換体に用いる宿主は、アシル−ＡＣＰシンテターゼ（以下、「aas」ともいう）の機能を喪失させたシアノバクテリアであることが好ましい。宿主として、aasの機能を喪失させたシアノバクテリアを用いることで、形質転換体が生産した脂質の分泌能を向上させることができる。
ここで「aas」とは脂肪酸合成に関わる酵素の１種であって、遊離脂肪酸とＡＣＰタンパク質を基質として、ＡＴＰ依存的にチオエステル結合を形成し、アシル−ＡＣＰを産生する機能を有する。シアノバクテリアにおいてaasの機能を喪失させることで脂肪酸の蓄積及び分泌が促進されることが知られている（Plant  Physiology，2010，vol．152(3)，p．1598-1610参照）。
【００３８】
本明細書において「aasの機能を喪失させる」とは、宿主が有するaasのアシル−ＡＣＰ合成機能を喪失させることを意味する。
aasの機能を喪失させるための手段としては、タンパク質の機能の喪失に通常使用される手段から適宜選択することができる。例えば、aasをコードする遺伝子（以下、「aas遺伝子」ともいう）を欠失又は不活性化させる方法、aas遺伝子の転写を阻害する変異を導入する方法、aas遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する方法、aasを特異的に阻害する阻害剤を投与する方法などが挙げられる。前記aas遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、aas遺伝子の塩基配列上の１個以上の塩基に対する突然変異の導入、aas遺伝子の塩基配列に対して別の塩基配列の置換又は挿入、aas遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。aas遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、aas遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別の塩基配列での置換若しくは挿入による当該プロモーターの欠失又は不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、塩基配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射や部位特異的変異導入、相同組換え法、ＳＯＥ（splicing  by  overlap  extension）−ＰＣＲ法などを挙げることができる。転写産物の翻訳を阻害する手段としては、マイクロＲＮＡによるＲＮＡ干渉を挙げることができる。aasの特異的阻害剤としては、aasやその受容体又はリガンドに特異的な抗体が挙げられる。
本発明では、シアノバクテリアのaasの機能を喪失させるために、シアノバクテリアのaas遺伝子を欠失又は不活性化させる方法がより好ましい。なお、シアノバクテリアのaasのアミノ酸配列、aas遺伝子の位置やその塩基配列の情報は、CyanoBase（genome.microbedb.jp/cyanobase/）やNCBIデータベース（[www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/]又は[www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/]）から取得することができる。
【００３９】
前記aasとしては、シネコシスティス・エスピーPCC6803のSlr1609、シネコシスティス・エスピーPCC7509のSyn7509DRAFT_00010940、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942のSynpcc7942_0918、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1のTll1301、トリコデスミウム・エリスラエウムIMS101のTery_1829、アカリオクロリス・マリアナMBIC11017のAM1_5562及びAM1_2147、クロコスファエラ・ワトソニーWH8501のCwat_5663、アナベナ・エスピーPCC7120のAlr3602等が知られている。
また前記aas遺伝子としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803のSlr1609遺伝子（NCBI  Gene  ID：953643）、シネコシスティス・エスピーPCC7509のSyn7509DRAFT_00010940遺伝子（GenBank  ID：ELR87398.1）、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942のSynpcc7942_0918遺伝子（配列番号４６）、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1のTll1301遺伝子、トリコデスミウム・エリスラエウムIMS101のTery_1829遺伝子、アカリオクロリス・マリアナMBIC11017のAM1_5562遺伝子及びAM1_2147遺伝子、クロコスファエラ・ワトソニーWH8501のCwat_5663遺伝子、アナベナ・エスピーPCC7120のAlr3602遺伝子等が知られている。本明細書における「aas遺伝子」には、前記遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上、であり、かつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、１又は数個、通常１個以上１１７０個以下、好ましくは１個以上９７５個以下、より好ましくは１個以上７８０個以下、さらに好ましくは１個以上５８５個以下、特に好ましくは１個以上３９０個以下、最も好ましくは１個以上１９５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を包含する。
【００４０】
シアノバクテリアのaasの機能を喪失させるために、aas遺伝子のコード領域中に異種遺伝子、好ましくは前述のＴＥ遺伝子、を導入することが好ましい。aas遺伝子のコード領域中に前述のＴＥ遺伝子を導入することで、シアノバクテリアのaasの機能の喪失と、ＴＥ発現能の付与を行うことができる。また、aas遺伝子のコード領域中に前述のＴＥ遺伝子を導入することで、ＴＥの作用により生成された遊離脂肪酸を効率的に分泌させることができる。
【００４１】
シアノバクテリアのaasの機能を喪失させる方法としては、例えば、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により両端にaas遺伝子領域のＤＮＡ断片が付加されたＴＥ遺伝子のＤＮＡ断片を構築し、これをベクターに挿入する。そして該ベクターをシアノバクテリアに導入してゲノム上のaas遺伝子領域との相同組換えを起こし、ゲノム上のaas遺伝子の領域にＴＥ遺伝子が導入することで、シアノバクテリアのaasの機能を喪失させることができる。
あるいは、シアノバクテリアのゲノム上における、遺伝子導入を行ってもシアノバクテリアに影響を与えないニュートラルサイトにＴＥ遺伝子を導入してもよい。
【００４２】
本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性が宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から脂質を回収すれば、効率のよく脂質を製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
【００４３】
本発明の形質転換体の培養は、BG-11培地（J．Gen．Microbiol.，1979，vol．111，p．1-61）、Ａ培地（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．，1980，vol．77，p．6052-6056）、ＡＡ培地（Plant  Physiol.，1955，vol．30，p．366-372）など、シアノバクテリアの培養に通常用いられる培地を用いて、液体培養又はその変法により実施することができる。
脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、７〜４５日間、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１４〜２１日間、通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。
【００４４】
形質転換体が生産した脂質を回収する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
また、aasの機能を喪失させた形質転換体を用いた場合、生産された脂質は細胞外に分泌される。よって、脂質を回収するために菌体を破壊する必要がなく、脂質回収後に残った細胞を繰り返し脂質生産に使用することができる。
【００４５】
本発明の製造方法により得られる脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましく、脂肪酸又はそのエステルであることがよりさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、中鎖脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素原子数１２〜１４の飽和脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸若しくはミリスチン酸又はそのエステルが特に好ましい。
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００４６】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、形質転換体、形質転換体の製造方法、及び脂質生産性の向上方法を開示する。
【００４７】
＜１＞下記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９１％以上、最も好ましくは９５％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
【００４８】
＜２＞前記タンパク質（ｂ）が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ａ１）である、前記＜１＞項記載の方法。
＜３＞前記タンパク質（ｂ）が、前記タンパク質（ａ）又は（ａ１）のアミノ酸配列に、１又は数個、例えば１個以上１８４個以下、好ましくは１個以上１３８個以下、より好ましくは１個以上９２個以下、さらに好ましくは１個以上４６個以下、特に好ましくは１個以上４２個以下、最も好ましくは１個以上２３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
＜４＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｄ）又は（ｅ）からなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）前記ＤＮＡ（ｄ）の塩基配列と６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、よりさらに好ましくは７８％以上、よりさらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜５＞前記ＤＮＡ（ｅ）が、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜４＞項記載の方法。
＜６＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
＜７＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）が、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＫＡＳである、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞前記ＴＥが、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Umbellularia californicaのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulata、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜８＞項記載の方法。
＜１０＞前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、より好ましくはシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記シアノバクテリアにおいてaasの機能が喪失している、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記シアノバクテリアにおいてaas遺伝子を欠失又は不活性化させた、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記aas遺伝子が、Slr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子、Alr3602遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上でありかつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、１又は数個、通常１個以上１１７０個以下、好ましくは１個以上９７５個以下、より好ましくは１個以上７８０個以下、さらに好ましくは１個以上５８５個以下、特に好ましくは１個以上３９０個以下、最も好ましくは１個以上１９５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群より選ばれる、より好ましくはSlr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子又はAlr3602遺伝子、である、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１４＞BG-11培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞生産させた脂質を前記基質転換体の細胞外に分泌させる、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
【００４９】
＜１７＞シアノバクテリアに前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体。
＜１８＞シアノバクテリアに前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を導入する、形質転換体の製造方法。
＜１９＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入し、得られた形質転換体の脂質の生産性を向上させる、シアノバクテリアの脂質生産性の向上方法。
【００５０】
＜２０＞前記タンパク質（ｂ）が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ａ１）である、前記＜１７＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２１＞前記タンパク質（ｂ）が、前記タンパク質（ａ）又は（ａ１）のアミノ酸配列に、１又は数個、例えば１個以上１８４個以下、好ましくは１個以上１３８個以下、より好ましくは１個以上９２個以下、さらに好ましくは１個以上４６個以下、特に好ましくは１個以上４２個以下、最も好ましくは１個以上２３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１７＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２２＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｄ）又は（ｅ）からなる遺伝子である、前記＜１７＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２３＞前記ＤＮＡ（ｅ）が、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜２２＞項記載の形質転換体又は方法。
＜２４＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、前記＜１７＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２５＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）が、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＫＡＳである、前記＜１７＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２６＞中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、前記＜１７＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２７＞前記ＴＥが、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Umbellularia californicaのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulata、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜２６＞項記載の形質転換体又は方法。
＜２８＞前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、より好ましくはシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記＜１７＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２９＞前記シアノバクテリアにおいてaasの機能が喪失している、前記＜１７＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３０＞前記シアノバクテリアにおいてaas遺伝子を欠失又は不活性化させた、前記＜２９＞項記載の形質転換体又は方法。
＜３１＞前記aas遺伝子が、Slr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子、Alr3602遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上でありかつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、１又は数個、通常１個以上１１７０個以下、好ましくは１個以上９７５個以下、より好ましくは１個以上７８０個以下、さらに好ましくは１個以上５８５個以下、特に好ましくは１個以上３９０個以下、最も好ましくは１個以上１９５個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ＡＣＰの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群より選ばれる、より好ましくはSlr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子又はAlr3602遺伝子、である、前記＜３０＞項記載の形質転換体又は方法。
＜３２＞生産させた脂質を前記基質転換体の細胞外に分泌させる、前記＜１７＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３３＞ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、前記＜１７＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0006568718.tif 000002
【００５３】
作製例  形質転換体の作製
（１）aas遺伝子の不活性化及びＴＥ遺伝子の導入を行った株の構築
シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株の野生株のゲノムＤＮＡより、表１記載のプライマーpUC118/0918up-F（配列番号２４）及び0918down/pUC118-R（配列番号２５）を用いSynpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を含む断片（2864bp、配列番号４７）を増幅した。増幅した断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ株式会社）のHincIIサイト間にIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を組み込んだpUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを取得した。
【００５４】
pDG1726プラスミド（Guerout-Fleury  et  al.，Gene，1995，vol．167，p．335-336）を鋳型として、表１記載のプライマー0918up/spr-F（配列番号２６）及びspr/0918down-R（配列番号２７）を用いてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子（配列番号１７）断片（以下、「ｓｐ断片」ともいう）を取得した。
【００５５】
次に、前記pUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを鋳型として、表１記載のプライマー0918up-R（配列番号２８）及び0918down-F（配列番号２９）を用いてＰＣＲを行い、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）のコード領域間の927bp領域が削除された直鎖ＤＮＡ断片を取得した。
【００５６】
前記直鎖ＤＮＡ断片と前記ｓｐ断片とをIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて結合し、ｓｐ断片が挿入されたSynpcc7942_0918遺伝子コード領域のＤＮＡ配列を含むpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを得た。
【００５７】
前記pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを鋳型とし、表１記載のプライマー0918up-R（配列番号２８）及びSp-F（配列番号３０）を用いてＰＣＲを行い、pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを線状化した。
また、表１記載のプライマー0918up/PpsbA1-F（配列番号３１）及びPpsbA1/UcTE-R（配列番号３２）を用いてＰＣＲを行い、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来psbA1遺伝子のプロモーター領域断片（配列番号１８）を増幅した。
さらに、Liu  X．et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，2011，vol．108，p．6899-6904に記載されているシネコシスティス・エスピーPCC6803にあわせてコドンを最適化した配列を合成した。合成したcDNAを鋳型とし、これを表１記載のプライマーUcTE-F（配列番号３３）及びUcTE/spr-R（配列番号３４）を用いてＰＣＲを行い、ウンベリラリア・カリフォルニカ由来のＴＥ遺伝子（以下、「UcTE遺伝子」ともいう、配列番号１９）の断片を増幅した。
【００５８】
次いで、前述の、線状化したpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミド、psbA1遺伝子のプロモーター領域断片、及びUcTE遺伝子の断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、Synpcc7942_0918遺伝子のコード領域間に、psbA1遺伝子のプロモーター領域断片、UcTE遺伝子の断片及びｓｐ断片をこの順で挿入された、pUC118-Synpcc7942_0918::PpsbA1-UcTE-spプラスミドを得た。
【００５９】
前記pUC118-Synpcc7942_0918::PpsbA1-UcTE-spプラスミドを用いて、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942野生株を自然形質転換法により形質転換し、スペクチノマイシン耐性により選抜した。このようにして、ゲノム上のaas遺伝子（Synpcc7942_0918遺伝子）コード領域間に、コドンを最適化したUcTE遺伝子を導入することにより、aas遺伝子が不活性化するとともにＴＥ発現能が付与されたΔ0918::UcTE株を取得した。
【００６０】
（２）aas遺伝子の不活性化、ＴＥ遺伝子の導入及びＫＡＳ遺伝子の導入を行った株の構築
シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942の野生株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１記載のpUC118/NS1up-F（配列番号３５）とNS1up/Kmr-R（配列番号３６）のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトＮＳ１領域の上流断片（ＮＳ１ｕｐ断片、配列番号２０）を増幅した。また、前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、表１記載のKmr/NS1down-F（配列番号３７）とNS1down/pUC118-R（配列番号３８）のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトＮＳ１領域の下流断片（ＮＳ１ｄｏｗｎ断片、配列番号２１）を増幅した。さらに、pJH1プラスミド（Trieu-Cuot  P  et  al.，Gene，1983，vol．23，p．331-341）を鋳型として、表１記載のプライマーKmr-F（配列番号３９）及びKmr-R（配列番号４０）を用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性マーカー遺伝子断片（Ｋｍ断片：配列番号２２）を増幅した。
【００６１】
前述の、ＮＳ１ｕｐ断片、ＮＳ１ｄｏｗｎ断片、及びＫｍ断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ社製）のHincIIサイト間にIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、pUC118-NS1::Kmプラスミドを取得した。
【００６２】
前記pUC118-NS1::Kmプラスミドを鋳型とし、表１記載のプライマーNS1up-R（配列番号４１）及びKmr-F（配列番号３９）を用いてＰＣＲを行い、pUC118-NS1::Kmプラスミドを線状化した。
また、表１記載のプライマー0918up/PrrnA-F（配列番号４２）及びPrrnA-R（配列番号４３）を用いてＰＣＲを行い、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来rrnAオペロン遺伝子のプロモーター領域断片（配列番号２３）をＰＣＲ増幅した。
さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のＫＡＳ遺伝子（NoKASIV遺伝子、配列番号２）のｃＤＮＡライブラリーをナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製した。そして作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、表１記載のプライマーPrrnA/NoKASIV-F（配列番号４４）及びNoKASIV/kmr-R（配列番号４５）を用いてＰＣＲを行い、NoKASIV遺伝子断片を増幅した。
【００６３】
次いで、前述の、線状化したpUC118-NS1::Kmプラスミド、rrnAオペロン遺伝子のプロモーター領域断片、及びNoKASIV遺伝子断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942のゲノム中のニュートラルサイトＮＳ１領域間にrrnAオペロン遺伝子のプロモーター領域断片、NoKASIV遺伝子断片、及びＫｍ断片がこの順で挿入された、pUC118-NS1::PrrnA-NoKASIV-Kmプラスミドを得た。
【００６４】
前記pUC118-NS1::PrrnA-NoKASIV-Kmプラスミドを用いて、前記Δ0918::UcTE株を自然形質転換法により形質転換し、カナマイシン耐性により選抜した。このようにして、ゲノム上のＮＳ１領域間にNoKASIV遺伝子発現コンストラクトを導入することでＫＡＳ発現能が付与され、さらにゲノム上のaas遺伝子（Synpcc7942_0918遺伝子）コード領域間にコドンを最適化したUcTE遺伝子を導入することにより、aas遺伝子が不活性化するとともにＴＥ発現能が付与された、ΔNS1::NoKASIVΔ0918::UcTE株を取得した。
【００６５】
試験例  脂質の製造
下記表２に示す組成のBG-11培地25mLを加えた50mL三角フラスコ中で、一定の照明下（60μE・m-2・sec-1）、３０℃にてロータリーシェーカー（120rpm）を用いて、初発菌体濃度をＯＤ730＝０．２に設定し、前記形質転換体の培養を２週間行った。なおBG-11培地には、形質転換体の種類に応じて、スペクチノマイシン及び／又はカナマイシンを20μg/mLの濃度となるよう添加した。
【００６６】
【表２】
0006568718.tif 000003
【００６７】
培養終了後、培養液２５ｍＬにNaH2PO4を１ｇ、及び内部標準としてメタノールに溶解した7-ペンタデカノン（1mg/mL）50μLを添加した。この液にヘキサン10mLを添加し、十分に攪拌し、１０分間静置した。室温、2500rpmで10分間遠心分離を行った後、上層部分をナス型フラスコに採取した。遠心分離した下層にさらにヘキサン5mLを添加して攪拌し、遠心分離を２回行い、減圧濃縮を行うことで乾燥サンプルを得た。
乾燥サンプルに、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）1mLを添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置した。そして、上層のヘキサン層を回収し、脂肪酸メチルエステルを得た。
【００６８】
得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィーは、７８９０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、下記の条件下で解析を実施した。
（解析条件）
キャピラリーカラム：DB-1  MS  30m×200μm×0.25μm（J&W  Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：100:1），圧力14.49psi，104mL/分
注入量１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
【００６９】
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、測定した各ピーク面積を内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行った。
培養1Lあたりに含まれる各脂肪酸の量及びこれらの合計量を算出した。さらに、Δ0918::UcTE株の各脂肪酸量及び総脂肪酸量をそれぞれ１とし、ΔNS1::NoKASIVΔ0918::UcTE株の各脂肪酸量及び総脂肪酸量をそれぞれ相対値で算出した。
その結果を表３に示す。なお表３の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
【００７０】
【表３】
0006568718.tif 000004
【００７１】
表３に示すように、ΔNS1::NoKASIVΔ0918::UcTE株は、Δ0918::UcTE株と比較して、総脂肪酸生産量が１．４３倍増加した。さらに、中鎖脂肪酸であるラウリン酸及びミリスチン酸の生産量も、ΔNS1::NoKASIVΔ0918::UcTE株は、Δ0918::UcTE株と比較して、１．５３倍〜１．６２倍も向上した。
【００７２】
以上のように、シアノバクテリアにＫＡＳ遺伝子を導入することで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させることができる。
【配列表】
0006568718000001.app