(57)【要約】  本発明のポリペプチドは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる牛白血病ウイルス由来であって、（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸を含むポリペプチド、または（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸を含むポリペプチド等である。
2014157595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（ｅ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド
（ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド
（ｇ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（ｈ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す請求項１に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ１）〜（ｈ１）の何れかに示す請求項１に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１８個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド
（ｃ１）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド
（ｄ１）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（ｅ１）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド
（ｆ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド
（ｇ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（ｈ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ１）または（ｂ１）に示す請求項３に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１８個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１番目〜２０番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含む請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸を含む請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸からなる請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２に示すアミノ酸配列における３１番目〜５０番目のアミノ酸からなる請求項１〜４の何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下の（ｃ２）〜（ｈ２）の何れかに示す請求項１または３に記載のポリペプチド：
（ｃ２）配列番号６に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｄ２）配列番号８に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｅ２）配列番号８に示すアミノ酸配列における１３１番目〜１５０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｆ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１４１番目〜１６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｇ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｈ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載のポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が置換もしくは付加されてなる、および／または、末端側に位置する１もしくは２個のアミノ酸が欠失されてなり、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含んでいるベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターが発現可能に導入されている細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含んでいるＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１２に記載のベクターを含んでいる牛白血病の予防または治療のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来の新規なポリペプチドおよびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
地方病性牛白血病は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）というレトロウイルスによって誘発される悪性Ｂリンパ腫である。予防法および根治療法はなく、全世界的に蔓延し、感染率および発症率は増加の一途をたどっている。この病気は長期の潜伏期間（５〜１０年）を経た後に発症し、死に至るため、畜産界に甚大な被害をもたらしている。現在の対処法は、隔離または淘汰によって、拡大を防ぐことである。そのため、ワクチンによる予防法および治療法の確立が急がれる。【０００３】
これまでに、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来のペプチドにおけるＴ細胞エピトープが調べられており、報告がなされている。例えば、非特許文献１には、Ｅｎｖ領域に由来するｇｐ５１のアミノ酸配列の６１〜７８番目がＴ細胞エピトープであることが記載されている。また、非特許文献２には、Ｅｎｖ領域に由来するｇｐ５１のアミノ酸配列の９８〜１１７番目がＴ細胞エピトープであることが記載されている。また、非特許文献３には、Ｇａｇ領域に由来するｐ２４のアミノ酸配列の３１〜５５番目および１４１〜１６５番目がＴ細胞エピトープであることが記載されている。【０００４】
ところで、本発明者らの研究グループは、以前の研究で、ウシの主要組織適合抗原（ＭＨＣ）のクラスＩＩ遺伝子のうち、ＤＲＢ３遺伝子およびその遺伝子産物の構造を明らかにしている（非特許文献４）。さらに、この遺伝子の型によって、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）が引き起こす地方病性牛白血病の発症に対する発症抵抗性および発症感受性が異なることを見出している。【０００５】
また、ヒツジを用いた感染実験において、白血病に対する発症抵抗性のあるヒツジＭＨＣクラスＩＩを有する個体では、Ｔｈ１型細胞性免疫が優勢となっているが、一方、発症感受性のあるヒツジＭＨＣクラスＩＩを有する個体では、Ｔｈ２型液性免疫が優勢となっていることが報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。また、ウシにおいても発症感受性ＭＨＣの型をホモに有する個体は他の個体に比べてプロウイルスロードが高くなっていることが確かめられている（非特許文献７）。そのため、発症感受性ＭＨＣを有する個体では、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対して液性免疫が誘導され、病態進行が起こりやすくなっていると考えられる。また、発症感受性ＭＨＣの型をホモに有する個体は、感染源となる危険性も高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. H. Gatei et al., Journal of Virology, Apr. 1993, p. 1796-1802.
【非特許文献２】I. Callebaut et al., Journal of Virology, Sept. 1993, p. 5321-5327.
【非特許文献３】A. Mager et al., Journal of General Virology (1994), 75, 2223 2231.
【非特許文献４】Y. Aida et al., Biochem Biophys Res Commun 1995, 209(3):981-988.
【非特許文献５】Y. Nagaoka et al., Cancer Res., 1999, 59(4):975-981.
【非特許文献６】S. Konnai et al., Microbiol Immunol 2003, 47(3):223-232.
【非特許文献７】T. Miyasaka et al., Tissue Antigens 2013, 81(2), 71-82.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するワクチンによる予防法および治療法を確立するためには、さらなるＴ細胞エピトープの探索が必要となる。【０００８】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来の新規なポリペプチド等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチドである：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（ｅ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド
（ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド
（ｇ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（ｈ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。【００１０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−０６７６８３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るポリペプチドは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例においてＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行ったＢＬＶのゲノム領域を示す図である。
【図２】実施例１において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングｐ１５ペプチドを示す図である。
【図３】実施例１において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングｐ２４ペプチドを示す図である。
【図４】実施例１において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングｐ１２ペプチドを示す図である。
【図５】実施例１における細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６】実施例１におけるペプチド刺激によるＴｈ１細胞の活性化能の結果を示す図である。
【図７】実施例２において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングｇｐ３０ペプチドを示す図である。
【図８】実施例２において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングｇｐ５１ペプチドを示す図である。
【図９】実施例２における１０アミノ酸オーバーラッピングペプチドの細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図１０】実施例２において作製した１〜３アミノ酸オーバーラッピングペプチドを示す図である。
【図１１】実施例２における１〜３アミノ酸オーバーラッピングペプチドの細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図１２】実施例３において作製した１０アミノ酸オーバーラッピングペプチドを示す図である。
【図１３】実施例３における細胞増殖試験（感受性牛・１回目）の結果を示す図である。
【図１４】実施例３における細胞増殖試験（非感受性牛・１回目）の結果を示す図である。
【図１５】実施例３における細胞増殖試験（感受性牛・２回目）の結果を示す図である。
【図１６】実施例３における細胞増殖試験（非感受性牛・２回目）の結果を示す図である。
【図１７】実施例３における細胞増殖誘導能の濃度依存性（感受性牛）の結果を示す図である。
【図１８】実施例３における細胞増殖誘導能の濃度依存性（非感受性牛）の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔１．本発明に係るポリペプチド〕
本発明に係るポリペプチドは、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）を構成する主要なタンパク質であるＧａｇ領域由来のｐ１２およびｐ１５、Ｅｎｖ領域由来のｇｐ５１およびｇｐ３０、ならびにｐＸ領域由来のｔａｘのペプチドの配列に基づき設計された、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチドである。特にウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、および／またはスイギュウ（Bubalus bubalis）のＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる。好ましくは、ウシおよび／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる。より好ましくは、ウシのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、および役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。なお、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウ以外の動物のＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープにもなり得る。そのような動物としては、例えば、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。
【００１４】
本発明に係るポリペプチドのうち、後述する（ａ）〜（ｆ）は、牛白血病発症に対して感受性を有するＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲＢ３＊１６０１型）をホモにもつ個体の免疫細胞を用いて同定されたエピトープである。したがって、本発明のポリペプチドのうち（ａ）〜（ｆ）は、発症率が高く、感染源となりやすい個体に対する効果が特に期待できる。なお、牛白血病発症に対して感受性を有さない（抵抗性を有する、あるいは何れも有さない）ＭＨＣクラスＩＩをもつ個体に対する効果も期待できる。また、本発明のポリペプチドのうち（ｅ）は、牛白血病発症に対して感受性を有さないＭＨＣクラスＩＩをもつ個体の免疫細胞においてもエピトープとして同定されている。したがって、本発明のポリペプチドのうち（ｅ）は、特に、より幅広いＭＨＣクラスＩＩに対して効果が期待できる。また、本発明のポリペプチドのうち、後述する（ｇ）および（ｈ）は、牛白血病発症に対して感受性を有さないＭＨＣクラスＩＩをもつ個体の免疫細胞を用いて同定されたエピトープである。
【００１５】
「ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる」とは、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩに結合することができ、かつ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させることを指す。「ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる」とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）へ分化させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞に種々のサイトカインを産生させること、ならびに分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞が免疫応答を制御すること等を指し、より好ましくは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞に種々のサイトカインを産生させること、およびその結果として細胞性免疫を活性化すること等を指す。
【００１６】
抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ／単球、およびＢ細胞等が挙げられる。また、Ｔｈ１細胞が産生するサイトカイン（Ｔｈ１サイトカイン）としては、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦ等が挙げられる。Ｔｈ２細胞が産生するサイトカイン（Ｔｈ２サイトカイン）としては、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ-β、およびＩＬ−１３等が挙げられる。Ｔｈ１細胞は、インビボにおいて、上述のサイトカインを産生することによって、細胞性免疫を活性化する。Ｔｈ２細胞は、インビボにおいて、上述のサイトカインを産生することによって、液性免疫を活性化する。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩの型（ハプロタイプ）は特に限定されない。本発明に係るポリペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩの型は、例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する個体のＭＨＣクラスＩＩの型であることが好ましく、ＤＲＢ３＊１６０１型であることがより好ましい場合がある。あるいは、多くの型のＭＨＣクラスＩＩに結合するものであってもよい。例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する型だけでなく、牛白血病発症に対して抵抗性を有する型（例えば、ＤＲＢ３＊０７０１型、ＤＲＢ３＊１４０１１型、およびＤＲＢ３＊１１０１型等）、および／または抵抗性・感受性の何れも有さない型（例えば、ＤＲＢ３＊１５０１型、ＤＲＢ３＊２７０３型、およびＤＲＢ３＊０５０３型等）のＭＨＣクラスＩＩに結合するものであってもよい。なお、上述のＭＨＣクラスＩＩの型の具体的なアミノ酸配列は、http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/bola/align.htmlから入手することができる。
【００１８】
本発明に係るポリペプチドの一例は、以下の（ａ）または（ｂ）に示すものである。
（ａ）（ａ）配列番号１（WRCSLSLGNQ QWMTAYNQEA KFSISIDQIL EAHNQSPFCA KSPRYTLDSV NGYPKIYWPP PQGRRRFGAR A）に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２（VHTPGPKMPG PRQPAPKRPP PGPCYRCLKE GHWARDCPTK ATGPPPGPCP ICKDPSHWKR DCPTLKSKN）に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。
【００１９】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞をより活性化させるという観点では、上記（ａ）に示すポリペプチドは、１５個以上のアミノ酸からなることが好ましく、１８個以上のアミノ酸からなることがより好ましく、２０個以上のアミノ酸からなることがさらに好ましい。また、上記（ａ）〜（ｈ）に示すポリペプチドは、それぞれ、４０個以下のアミノ酸からなることが好ましく、３０個以下のアミノ酸からなることがより好ましい。
【００２０】
また、上記（ａ）に示すポリペプチドは、配列番号３（WMTAYNQEA KFSISIDQIL EAHNQSPFCA K）に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１番目〜２０番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むものが好ましい。なお、配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の１２番目〜４１番目のアミノ酸と同一である。また、配列番号３に示すアミノ酸配列の１１番目〜２０番目のアミノ酸は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２２番目〜３１番目のアミノ酸と同一である。
【００２１】
上記（ａ）に示すポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸（QEA KFSISIDQIL EAHNQSP）を含むことがより好ましい。上記（ａ）に示すポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸からなることがさらに好ましい。なお、配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目番目のアミノ酸は、配列番号１に示すアミノ酸配列の１８番目〜３７番目のアミノ酸と同一である。
【００２２】
上記（ｂ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における３１番目〜５０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２３】
上記（ｃ）に示すポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２４】
上記（ｄ）に示すポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２５】
上記（ｅ）に示すポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列における１３１番目〜１５０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２６】
上記（ｆ）に示すポリペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１４１番目〜１６０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２７】
上記（ｇ）に示すポリペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２８】
上記（ｈ）に示すポリペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００２９】
本発明に係るポリペプチドの特に好ましい一例は、配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２に示すアミノ酸配列における３１番目〜５０番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号６に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号８に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号８に示すアミノ酸配列における１３１番目〜１５０番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１４１番目〜１６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチド、および、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなるポリペプチドである。
【００３０】
また、別の一例では、配列番号２に示すアミノ酸配列における３０番目〜５０番目のアミノ酸からなるポリペプチが好ましい。
【００３１】
なお、本発明に係るポリペプチドの製造方法は特に限定されず、固相合成法等のペプチド化学合成法によって製造してもよいし、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入し当該細胞に大量に産生させてもよいし、または細胞抽出液を用いた無細胞ペプチド合成系によって産生させてもよい。本発明に係るポリペプチドは、比較的短鎖であり、かつ特別な修飾等を行わずともＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるため、ペプチド化学合成法による製造も容易である。
【００３２】
また、本発明に係るポリペプチドは、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる限りにおいて、アミノ酸の置換、付加、および／または欠失が生じていてもよい。ここで許容されるアミノ酸の置換、付加、または欠失とは、具体的には以下に示すものである。
【００３３】
アミノ酸の置換とは、１または２個のアミノ酸の置換であり、好ましくは１個のアミノ酸の置換である。具体的には、例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチドを構成する塩基性アミノ酸を他の塩基性アミノ酸に置換すること、酸性アミノ酸を他の酸性アミノ酸に置換すること、中性アミノ酸を性質の類似する他の中性アミノ酸に置換すること、等が挙げられる。さらに具体的には、例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチドにおいて、以下の（１）〜（６）の何れかの置換が生じていること等が挙げられる。
（１）フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（２）リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（３）アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（４）アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（５）アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（６）セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
【００３４】
アミノ酸の欠失とは、１または２個のアミノ酸の欠失であり、好ましくは１個のアミノ酸の欠失である。より具体的には、例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチドを構成する末端側に位置するアミノ酸を欠失させることを意図する。すなわち、アミノ末端側に位置する１または２個のアミノ酸を欠失させる、カルボキシ末端側に位置する１または２個のアミノ酸を欠失させる、あるいは、アミノ末端側に位置する１個のアミノ酸とカルボキシ末端側に位置する１個のアミノ酸とを欠失させる、ことを意図する。
【００３５】
アミノ酸の付加とは、１または２個のアミノ酸の付加であり、好ましくは１個のアミノ酸の付加である。より具体的には、例えば、上記（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチドを構成する末端側に１または２個のアミノ酸を付加することを意図する。すなわち、アミノ末端側に１または２個のアミノ酸を付加する、カルボキシ末端側に１または２個のアミノ酸を付加する、あるいは、アミノ末端側とカルボキシ末端側とにそれぞれ１個のアミノ酸を付加する、ことを意図する。
【００３６】
上記したアミノ酸の置換、欠失、および／または付加は、公知の方法で行うことができる。公知の方法とは、例えば、Kunkel法等の部位特異的な変異導入法を利用して上記ポリペプチドに所望の変異を導入する方法が挙げられる。あるいは、上記したアミノ酸の置換、欠失、および／または付加をした配列を、ペプチド合成法によって合成することが挙げられる。
【００３７】
〔２．本発明に係るポリヌクレオチド、ベクター〕
（ポリヌクレオチド）
本発明に係るポリヌクレオチドは、上述の本発明に係るポリペプチドをコードしている。当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、一本鎖または二本鎖である。当該ポリヌクレオチドを構成する塩基の配列は、コードすべきポリペプチドのアミノ酸配列に応じて適宜決定すればよい。
【００３８】
配列番号４は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号５は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号１１は、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号１２は、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号１３は、配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号４に示す塩基配列、配列番号５に示す塩基配列、配列番号１１に示す塩基配列、配列番号１２に示す塩基配列、または配列番号１３に示す塩基配列を参照して適宜決定すればよい。
【００３９】
例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列における１８番目〜３７番目のアミノ酸（配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸と同一）からなるポリペプチドは、配列番号４に示す塩基配列における５２番目〜１１１番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号２に示すアミノ酸配列における３１番目〜５０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号５に示す塩基配列における９１番目〜１５０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号６に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１１に示す塩基配列における１２１番目〜１８０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号８に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１２に示す塩基配列における１５４番目〜２１３番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号８に示すアミノ酸配列における１３１番目〜１５０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１２に示す塩基配列における３９１番目〜４５０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１０に示すアミノ酸配列における１４１番目〜１６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１３に示す塩基配列における４２１番目〜４８０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１０に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１３に示す塩基配列における４５１番目〜５１０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１０に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号１３に示す塩基配列における５４１番目〜６００番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４０】
配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３に示される塩基配列に限らず、当業者であれば、コドン表を参照することによって、ポリペプチドのアミノ酸配列を容易に決定できる。
【００４１】
上記ポリヌクレオチドは、細胞中または無細胞合成系での転写および／または翻訳を容易とするため、プロモータ、エンハンサ等の調節領域；開始コドンおよび終止コドン；その他の転写および／または翻訳関連配列；が機能可能に付加されていることが好ましい。さらに、必要に応じて、上記ポリヌクレオチドには、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等の精製用ペプチド配列をコードする配列等が付加されていてもよい。これらの配列が付加された本発明に係るポリヌクレオチドの一例は、後述するベクターに組み込まれた形態のものである。
【００４２】
（ベクター）
本発明に係るベクターは、上述の本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいる。本発明に係るベクターは、本発明に係るポリペプチドを産生するために使用される。本発明に係るベクターは、組換え発現に用いる発現ベクターであってもよいし、細胞抽出液等を用いた無細胞ペプチド合成系に用いるベクターであってもよい。
【００４３】
組換え発現に用いる発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルス等を用いる方法が挙げられるが、特に限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドは比較的短いものであるため、プラスミドを用いる方法が好ましい。
【００４４】
組換え発現に用いる発現ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適当なプロモータ配列等を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んで発現ベクターを構築すればよい。
【００４５】
発現ベクターは、使用される宿主細胞の種類に応じて、少なくとも１つの選択マーカーを含んでいてもよい。このようなマーカーとしては、宿主細胞が原核細胞の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、および蛍光／発光タンパク質をコードする遺伝子等、が挙げられる。
【００４６】
〔３．本発明に係る細胞〕
本発明に係る細胞には、上述の本発明に係るポリヌクレオチドまたは本発明に係るベクターが発現可能に導入されている。
【００４７】
上記の細胞の調製に用いる宿主細胞は、特に限定されないが、例えば、原核細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞から選択される何れかが挙げられる。これら宿主細胞のための適切な培養培地および培養条件は当分野で周知である。
【００４８】
本発明に係る上記ポリヌクレオチド、または上記発現ベクターを宿主細胞等に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、ＰＥＧ法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、およびアグロバクテリウム法（植物細胞に限る）等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００４９】
〔４．本発明に係るポリペプチドの用途の例示〕
（ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤、およびその具体的用途）
本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤の一態様では、本発明に係る少なくとも一種のポリペプチドを有効成分（ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化成分）として含んでいる。本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、必要に応じて、当該ポリペプチドを安定化させる安定化剤、酸化防止剤、および／またはアジュバンド等を含んだ組成物であってもよい。本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化を増強する目的で、本発明に係るポリペプチド以外の他のＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化成分をさらに含んだ組成物であってもよい。
【００５０】
本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、特にウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる。好ましくは、ウシおよび／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる。より好ましくは、ウシのＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる。なお、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウ以外の動物のＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させ得る。そのような動物としては、例えば、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。
【００５１】
本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩに結合し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化することが好ましい。抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩの型（ハプロタイプ）については、上述のとおりである。
【００５２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤の効果としてより具体的には、インビボまたはインビトロにおいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞に種々のサイトカインを産生させること、ならびに分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞が免疫応答を制御すること等が挙げられ、より好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞に種々のサイトカインを産生させること、およびその結果として細胞性免疫を活性化すること等が挙げられる。
【００５３】
本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する個体において特異的に効果を示すものであることが好ましく、ＤＲＢ３＊１６０１型のＭＨＣクラスＩＩを有する個体において特異的に効果を示すものであることがより好ましい場合がある。あるいは、牛白血病発症に対して感受性を有する個体だけでなく、牛白血病発症に対して抵抗性を有する個体（例えば、ＤＲＢ３＊０７０１型、ＤＲＢ３＊１４０１１型、およびＤＲＢ３＊１１０１型等のＭＨＣクラスＩＩを有する個体）、および／または抵抗性・感受性の何れも有さない個体（例えば、ＤＲＢ３＊１５０１型、ＤＲＢ３＊２７０３型、およびＤＲＢ３＊０５０３型等のＭＨＣクラスＩＩを有する個体）においても幅広く効果を示すものであることが好ましい場合がある。
【００５４】
本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤のより具体的な用途は特に限定されないが、例えば、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）への感染を予防するため、牛白血病の発症を抑制するため、牛白血病の進行を遅らせるため、または牛白血病の症状を低減するために用いられ、その形態は例えばワクチンまたは治療薬等の材料であり得る。適用しうる動物個体としては、ウシ、コブウシ、スイギュウ、ヒツジ、およびヤギ等が挙げられる。また、本発明に係るＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、研究用試薬として利用することもできる。
【００５５】
本発明に係るポリペプチド（例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤）をインビボで用いる場合、動物個体に対して、経口投与、静脈内もしくは動脈内への血管内投与、または腸内投与等の手法によって全身投与してもよいし、経皮投与、または舌下投与等の手法によって局所投与してもよい。経口投与の場合、ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤を含んでいる飼料として投与することができる。動物個体は牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染しているものであってもよいし、感染していないものであってもよい。
【００５６】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤の別の態様では、ＤＮＡワクチンまたはベクターワクチンの形態とすることもできる。ＤＮＡワクチンの形態であるＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいる。また、ベクターワクチンの形態であるＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤は、本発明に係るベクターを含んでいる。これらのＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤では、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤が適用された細胞または動物個体において本発明に係るポリペプチドが産生され、上述の効果を発揮する。
【００５７】
（ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法）
本発明はまたＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法を提供する。当該活性化方法は、活性化の対象となるＣＤ４陽性Ｔ細胞に、本発明に係るポリペプチドを接触させることによって、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる。すなわち、当該活性化方法の一態様は、活性化の対象となるＣＤ４陽性Ｔ細胞に、本発明に係るポリペプチドを接触させる工程を含んでいる。「接触」は、インビボで行ってもよいし、インビトロで行ってもよい。対象となる動物としては、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウの他、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。
【００５８】
なお、「ポリペプチドを接触させる」とは、ポリペプチドを直接ＣＤ４陽性Ｔ細胞に接触させること、および、ポリペプチドを抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ／単球、またはＢ細胞等）のＭＨＣクラスＩＩと結合させた状態でＣＤ４陽性Ｔ細胞に接触させることを包含する。なお、「接触」は、ポリペプチドの少なくとも一部におけるものであってもよい。また、「活性化」とは、インビボまたはインビトロにおいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞に種々のサイトカインを産生させること、ならびに分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞が免疫応答を制御すること等を指し、より好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞に種々のサイトカインを産生させること、およびその結果として細胞性免疫を活性化すること等を指す。なお、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化したか否かは、例えば、増殖速度、サイトカインの産生量、または細胞表面に発現している分子の種類等を指標にして判断することができる。
【００５９】
また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化方法の別の態様は、本発明に係るポリペプチドまたはベクターを動物個体に投与する工程を含む、動物個体におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化する方法である。適用しうる動物個体および投与方法は、上述のとおりである。
【００６０】
（牛白血病の予防または治療のための薬剤）
本発明はまた牛白血病の予防または治療のための薬剤を提供する。本発明に係る薬剤は、本発明に係る少なくとも一種のポリペプチドまたはベクターを含んでいる。当該ポリペプチドまたは当該ベクターから発現されるポリペプチドが有効成分として働く。
【００６１】
本発明に係る薬剤は、一実施形態において、治療を目的として、牛白血病に罹患した個体に対して投与される。「治療」の一側面には、牛白血病に関連する少なくとも１つの症状について軽減もしくは緩和すること、進行を遅延すること、および治癒すること等が包含される。また、本発明に係る薬剤は、別の実施形態において、予防を目的として牛白血病に罹患していない個体に対して投与される。「予防」の一側面には、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）への感染を防止すること、および牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染した際の発症を防止すること等が包含される。
【００６２】
本発明に係る薬剤では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化によって、牛白血病の予防または治療が達成される。
【００６３】
（その他の応用）
本発明に係るポリペプチドによるワクチンの開発は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）と類似性の高い成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）に対するワクチンの開発に、有用な情報を与えうる。
【００６４】
〔５．まとめ〕
本願発明者らは、後述の実施例に示すように、発症感受性のＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲＢ３＊１６０１型）をホモに有するウシの免疫細胞を用いて、ＢＬＶのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行った。さらに、発症感受性および発症抵抗性ではないＭＨＣクラスＩＩを有するウシの免疫細胞を用いて、ＢＬＶのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行った。その結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるペプチドを同定した。
【００６５】
本発明はすなわち、以下の（１）〜（１５）を包含する。
【００６６】
（１）以下の（ａ）〜（ｈ）の何れかに示すポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（ｅ）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド
（ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド
（ｇ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（ｈ）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。
【００６７】
（２）  以下の（ａ）または（ｂ）に示す上記（１）に記載のポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド。
【００６８】
（３）  以下の（ａ１）〜（ｈ１）の何れかに示す上記（１）に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１８個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド
（ｃ１）配列番号６に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KNYIHWFHKT QKKPWTFTSG）を含むポリペプチド
（ｄ１）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（ｅ１）配列番号８に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１３１番目〜１５０番目のアミノ酸（VRETIHSVLS LFLLALFLLF）を含むポリペプチド
（ｆ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１４１番目〜１６０番目のアミノ酸（VTHPVLGKVL ILNQMANFSL）を含むポリペプチド
（ｇ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（ｈ１）配列番号１０に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド。
【００６９】
（４）  以下の（ａ１）または（ｂ１）に示す上記（３）に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する１８個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、２２番目〜３１番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、３１番目〜５０番目のアミノ酸（GHWARDCPTK ATGPPPGPCP）を含むポリペプチド。
【００７０】
（５）  配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する１１個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１番目〜２０番目のアミノ酸（FSISIDQIL E）を含む上記（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。
【００７１】
（６）  配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸（QEA KFSISIDQIL EAHNQSP）を含む上記（５）に記載のポリペプチド。
【００７２】
（７）  配列番号３に示すアミノ酸配列における７番目〜２６番目のアミノ酸からなる上記（５）または（６）に記載のポリペプチド。
【００７３】
（８）  配列番号２に示すアミノ酸配列における３１番目〜５０番目のアミノ酸からなる上記（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。
【００７４】
（９）  以下の（ｃ２）〜（ｈ２）の何れかに示す上記（１）または（３）に記載のポリペプチド：
（ｃ２）配列番号６に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｄ２）配列番号８に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｅ２）配列番号８に示すアミノ酸配列における１３１番目〜１５０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｆ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１４１番目〜１６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｇ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｈ２）配列番号１０に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなるポリペプチド。
【００７５】
（１０）  上記（１）から（９）の何れかに記載のポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が置換もしくは付加されてなる、および／または、末端側に位置する１もしくは２個のアミノ酸が欠失されてなり、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチド。
【００７６】
（１１）  上記（１）から（１０）の何れかに記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【００７７】
（１２）  上記（１１）に記載のポリヌクレオチドを含んでいるベクター。
【００７８】
（１３）  上記（１１）に記載のポリヌクレオチド、または上記（１２）に記載のベクターが発現可能に導入されている細胞。
【００７９】
（１４）  上記（１）から（１０）の何れかに記載のポリペプチドを有効成分として含んでいるＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化剤。
【００８０】
（１５）  上記（１）から（１０）の何れかに記載のポリペプチドまたは上記（１２）に記載のベクターを含んでいる牛白血病の予防または治療のための薬剤。
【００８１】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８２】
ＢＬＶを構成する主要なタンパク質のうち、Ｇａｇ領域由来のｐ１５、ｐ２４、ｐ１２およびＥｎｖ由来のｇｐ５１、ｇｐ３０について、計１２１種類のオーバーラッピングペプチドを作製し、ＢＬＶに感染した発症感受性牛由来の細胞をもちいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行った（図１）。【００８３】
〔実施例１：ＢＬＶのＧａｇ領域におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの探索〕
（１０アミノ酸オーバーラッピングペプチドの作製）
ＢＬＶのＧａｇ領域にあるｐ１５、ｐ２４、およびｐ１２のペプチドについて、１０アミノ酸オーバーラッピングペプチド（抗原候補ペプチド）を化学合成し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるペプチドを探索した。抗原候補ペプチドはシグマジェノシス社の受託ペプチド合成によって合成した。【００８４】
ｐ１５のアミノ酸配列は配列番号６に示すとおりである。ｐ２４のアミノ酸配列は配列番号７に示すとおりである。ｐ１２のアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。また、各抗原候補ペプチドのアミノ酸配列は、図２〜４に示すとおりである。すなわち、ｐ１５−１〜ｐ１５−１０は、それぞれ、配列番号６に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１９番目からなる。ｐ２４−１〜ｐ２４−２１は、それぞれ、配列番号７に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目、２０１〜２１５番目からなる。ｐ１２−１〜ｐ１２−６は、それぞれ、配列番号２に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜６９番目からなる。【００８５】
（ＢＬＶ感染感受性牛の選択および細胞の調製）
ＢＬＶ感染牛を、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ（文献：Jimba M et al., BMC veterinary research 2012, 8(1):167.等参照）、ＢＬＶ−ＥＬＩＳＡ（チッソ株式会社）およびＢＬＶプロウイルスのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法（文献：Tajima S et al., J Virol 2003, 77(3):1894-1903.参照）を用いて検索した。【００８６】
複数のＢＬＶ感受性牛（供給元：畜産草地研究所）について、ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）クラスＩＩ ＤＲＢ３遺伝子の遺伝子型を、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３ ＰＣＲ−ＳＢＴ法（文献：Takeshima SN et al., Tissue Antigens 2011.参照）を用いてタイピングした。そのなかから、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１６０１のホモ型であるものを、ＢＬＶ感染感受性牛として実験用に選択した（当該牛を以下「ＰＬ１０」という）。【００８７】
ＰＬ１０から血液１Ｌを採血した。５０ｍＬチューブに１０ｍＬの６０％パーコールを入れ、血液を４０ｍＬずつ重層した。これを、２０００×ｇ、２５分間、室温、ブレーキなしで遠心し、中間層であるリンパ球層を回収した。２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＲＰＭＩで２回洗浄後、１ｍＬ ＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＩＬＡ１１Ａ（anti-bovine CD4 monoclonal antibody, VMRD Inc,）で抗体を反応させた。ＭＡＣＳバッファーで３回洗浄後、MACS mouse-IgG-beads（Miltenyi Biotec）３００μＬ＋ＭＡＣＳバッファー １．２ｍＬで４℃、１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳバッファーで１回洗浄後、３ｍＬ ＭＡＣＳバッファーで平衡化したＬＳカラム（Miltenyi Biotec）に上記細胞を添加し、ＭＡＣＳ用磁石でＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞とを分離した。１０％ ＤＭＳＯ／ＦＣＳに懸濁し、−１５０℃で保存した。ＣＤ４陰性細胞にＸ線照射装置で６０Ｇｙ照射し、細胞増殖を停止させてＡＰＣとした。【００８８】
（細胞増殖試験）
ＣＤ４陽性細胞（０．５×１０６個）、ＣＤ４陰性細胞（０．５×１０６個）、および各種抗原候補ペプチド（１００μｇ／ｍＬ）を混合し、２００μＬを９６ウェルプレートで３日間培養した。また、抗原ペプチドなしのもの（Cont.）、ＧＳＴ融合ペプチドとして大腸菌で発現・精製したｐ１２を混合したもの、およびＧＳＴ融合ペプチドとして大腸菌で発現・精製したｐ１５を混合したものを比較として用いた。培養終了１６時間前に１μCi [3H]-TdR／５０μＬを各ウェルに添加した。培養終了後、培養液ごとに細胞をフィルターに回収した。次いで、蒸留水で８回フィルターを洗浄し、バイアルに回収した。５ｍＬ液シン溶液を添加し、液シンカウンターで細胞数をカウントした。【００８９】
その結果を図５に示す。調べた抗原候補ペプチドのうち、ｐ１２−４およびｐ１５−１が特に細胞増殖が大きかった。【００９０】
（ペプチド刺激によるＴｈ１細胞の活性化能）
細胞増殖が大きかったｐ１２−４およびｐ１５−１について、Ｔｈ１細胞への誘導能を調べた。【００９１】
＜培養上清中のＩＦＮγ濃度の測定＞
ＰＬ１０より採取した血液から、ＰＢＭＣを分離し、次いで抗ウシＣＤ４モノクローナル抗体（ＩＬＡ１１Ａ）を用いて磁気ビーズ法によってＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞とに分画した。６０ＧｙのＸ線照射によって増殖を停止させたＣＤ４陰性細胞を２×１０５個、ＣＤ４陽性細胞を同じく２×１０５個、そして、ｐ１２−４ペプチド抗原（終濃度５０μＭ）またはｐ１５−１ペプチド抗原（終濃度５０μＭ）を４８ウェル培養プレートで混合し、０．５ｍＬとして１週間培養した。また、抗原を添加していないものを比較として用意した。培養上清のウシＩＦＮγ濃度は、ELISA for Bovine Interferon-γキット（MABTECH社,Product Code:3115-1H-20）を用いて測定した。【００９２】
＜ＩＦＮγ産生ＣＤ４陽性細胞数の測定＞
ＰＬ１０より採取した血液から、ＰＢＭＣを分離し、次いで抗ウシＣＤ４モノクローナル抗体（ＩＬＡ１１Ａ）を用いて磁気ビーズ法によってＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞とに分画した。６０ＧｙのＸ線照射によって増殖を停止させたＣＤ４陰性細胞を２×１０５個、ＣＤ４陽性細胞を同じく２×１０５個、そして、ｐ１２−４ペプチド抗原（終濃度５０μＭ）またはｐ１５−１ペプチド抗原（終濃度５０μＭ）を抗ＩＦＮγ固相化ＰＶＤＦフィルタープレート上で混合し、０．２ｍＬとして３６時間培養した。また、抗原を添加していないものを比較として用意した。その後細胞を洗い流し、ビオチン化されたウシＩＦＮγモノクローナル抗体でキャプチャーされたＩＦＮγ抗原と反応させ、続いてアビジンーＨＲＰによってビオチン化抗体にＨＲＰを結合させ、ＴＭＢによって標識して、そのスポット数をカウントすることによって、ＩＦＮγ産生細胞数を測定した。各試薬の反応時間、反応条件、および使用するモノクローナル抗体はELISPOT for Bovine Interferon-γキット（MABTECH社,Product Code:3119-2H）に準じて行った。【００９３】
結果を図６に示す。図６の（ａ）は、培養上清中のＩＦＮγの濃度の結果を示している。また、図６の（ｂ）は、ＩＦＮγ産生ＣＤ４陽性細胞数の結果を示している。この結果から、ｐ１２−４は、ＣＤ４陽性細胞をＴｈ１細胞へ分化させる能力、およびＴｈ１細胞のＩＦＮγ産生を刺激する能力が共に高いことがわかった。【００９４】
〔実施例２：ＢＬＶのＥｎｖ領域におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの探索〕
（１０アミノ酸オーバーラッピングペプチドの作製）
ＢＬＶのＥｎｖ領域にあるｇｐ３０、およびｇｐ５１のペプチドについて、１０アミノ酸オーバーラッピングペプチド（抗原候補ペプチド）を化学合成し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるペプチドを探索した。抗原候補ペプチドはシグマジェノシス社の受託ペプチド合成によって合成した。【００９５】
ｇｐ３０のアミノ酸配列は配列番号８に示すとおりである。ｇｐ５１のアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりである。また、各抗原候補ペプチドのアミノ酸配列は、図７および図８に示すとおりである。すなわち、ｇｐ３０−１〜ｇｐ３０−２０は、それぞれ、配列番号８に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目からなる。また、ｇｐ３０−２１は、配列番号８に示すアミノ酸配列における１９５〜２１０番目のアミノ酸の後ろに配列「RPCP」を付加したものである。ｇｐ５１−１〜ｇｐ５１−２５は、それぞれ、配列番号９に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目、２０１〜２２０番目、２１１〜２３０番目、２２１〜２４０番目、２３１〜２５０番目、２４１〜２６０番目からなる。また、ｇｐ５１−２６は、配列番号９に示すアミノ酸配列における２５１〜２６８番目のアミノ酸の後ろに配列「SD」を付加したものである。また、ｇｐ５１−２７（ｎ）は、配列番号９に示すアミノ酸配列における２６２〜２６８番目のアミノ酸の後ろに配列「SDAPPTRVRRSDS」を付加したものである。【００９６】
（ＢＬＶ感染感受性牛の選択および細胞の調製）
ＢＬＶ感染牛を、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ、ＢＬＶ−ＥＬＩＳＡおよびＢＬＶプロウイルスのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を用いて検索した。【００９７】
複数のＢＬＶ感受性牛について、ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）クラスＩＩ ＤＲＢ３遺伝子の遺伝子型を、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３ ＰＣＲ−ＳＢＴ法を用いてタイピングした。そのなかから、ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１６０１のホモ型であるものを、ＢＬＶ感染感受性牛として実験用に選択した（当該牛を以下「Ｎｓ９２０」という）。【００９８】
Ｎｓ９２０からヘパリン血液１００ｍＬおよびと血清用プレーン管１０ｍＬを採血した。１５ｍＬチューブに４ｍＬの６０％パーコールを入れ、２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＲＰＭＩで２倍に希釈したヘパリン血液を１０ｍＬずつ重層した。これを、１６００×ｇ、２５分間、室温、ブレーキなしで遠心し、中間層であるリンパ球層を回収した。２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＲＰＭＩで２回洗浄後、１ｍＬ ＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬＩＬＡ１１Ａ（anti-bovine CD4 monoclonal antibody, VMRD Inc,）で抗体を反応させた。ＭＡＣＳバッファーで３回洗浄後、MACS mouse-IgG-beads（Miltenyi Biotec）２００μＬ＋ＭＡＣＳバッファー ８００μＬで４℃、１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳバッファーで１回洗浄後、３ｍＬ ＭＡＣＳバッファーで平衡化したＬＳカラム（Miltenyi Biotec）に上記細胞を添加し、ＭＡＣＳ用磁石でＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞とを分離した。１０％ ＤＭＳＯ／ＦＣＳに懸濁し、−１５０℃で保存した。ＣＤ４陰性細胞にＸ線照射装置で６０Ｇｙ照射し、細胞増殖を停止させてＡＰＣとした。【００９９】
（長期培養によるＣＤ４陽性細胞の作製）
まず、ＣＤ４陽性細胞（２×１０６個）、ＣＤ４陰性細胞（２×１０６個）、１ｎｇ／ｍＬ ウシＩＬ−２およびＢＬＶ抗原を混合し、１週間培養した（初期培養）。次いで、細胞を回収してＨＢＳＳで洗浄した後、６ｍＬ 培養液／２５ｃｍフラスコに懸濁し、凍結ＣＤ４陰性細胞（３×１０７個）および１ｎｇ／ｍＬ ウシＩＬ−２を添加して、１２日間培養した（ＢＬＶ抗原なしの休止培養）。次いで、細胞を回収した後、６ｍＬ 培養液／２５ｃｍフラスコに懸濁し、凍結ＣＤ４陰性細胞（１．２×１０７個）および１ｎｇ／ｍＬ ウシＩＬ−２を添加して、２週間培養した（刺激培養）。そして、ＣＤ４陽性細胞を回収した。なお、上述のＢＬＶ抗原は、ＢＬＶを発現するコウモリ由来細胞Ｂａｔ／ＢＬＶを１５ｃｍ ｄｉｓｈで培養した上清を回収し、凍結融解を５回行ってＢＬＶを失活させたもの（Ｂａｔ／ＢＬＶｓｕｐ）を培地に１／２０量で添加した。【０１００】
（細胞増殖試験）
回収した長期培養によるＣＤ４陽性細胞（５×１０４個）、ＣＤ４陰性細胞（２×１０５個）、および各種抗原候補ペプチド（１００μｇ／ｍＬ）を混合し、２００μＬを９６ウェルプレートで３日間培養した。また、既知のＣＤ４エピトープｐｅｐ６１、既知のＣＤ４エピトープｐｅｐ９８、ｐ１２−４を含むペプチド（「ＦＩＴＣ−ｐ１２−４」）またはＢａｔ／ＢＬＶｓｕｐを添加したもの、抗原ペプチドなし（「ＲＰＭＩ」）、ＣＤ４陽性細胞なし（「ＡＰＣのみ」）を比較として用いた。培養終了１６時間前に１μCi [3H]-TdR／５０μＬを各ウェルに添加した。培養終了後、培養液ごとに細胞をフィルターに回収した。次いで、蒸留水で８回フィルターを洗浄し、バイアルに回収した。５ｍＬ液シン溶液を添加し、液シンカウンターで細胞数をカウントした。【０１０１】
その結果を図９に示す。調べた抗原候補ペプチドのうち、ｇｐ５１−２およびｇｐ５１−３が特に細胞増殖が大きかった。また、既知のエピトープ領域を含むｇｐ５１−６およびｇｐ５１−１１も細胞増殖が大きかった。【０１０２】
（ｇｐ５１−２〜ｇｐ５１−６領域の１〜３アミノ酸オーバーラッピングペプチド）
細胞増殖が大きかったｇｐ５１−２〜ｇｐ５１−６領域のポリペプチドについて、１〜３アミノ酸オーバーラッピングペプチド（抗原候補ペプチド）を化学合成し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるペプチドを探索した。抗原候補ペプチドはシグマジェノシス社の受託ペプチド合成によって合成した。各抗原候補ペプチドのアミノ酸配列は、図１０に示すとおりである。【０１０３】
回収した長期培養によるＣＤ４陽性細胞（５×１０４個）、ＣＤ４陰性細胞（２×１０５個）、および各種抗原候補ペプチド（１００μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ）を混合し、２００μＬを９６ウェルプレートで３日間培養した。また、Ｂａｔ／ＢＬＶｓｕｐ、ＣＤ４陰性細胞なし（「ＣＤ４」）、および抗原ペプチドなし（「ｍｅｄｉｕｍ」、「ＮＯａｇ」）を比較として用いた。培養終了１６時間前に１μCi [3H]-TdR／５０μＬを各ウェルに添加した。培養終了後、培養液ごとに細胞をフィルターに回収した。次いで、蒸留水で８回フィルターを洗浄し、バイアルに回収した。５ｍＬ液シン溶液を添加し、液シンカウンターで細胞数をカウントした。【０１０４】
その結果を図１１に示す。調べた抗原候補ペプチドのうち、ｇｐ５１ｐ１２〜ｇｐ５１ｐ２２が特に細胞増殖が大きかった（図１１の（ｂ））。なかでも、ｇｐ５１ｐ１８の細胞増殖が一番大きかった。図１１の（ａ）に、特に細胞増殖が大きかったｇｐ５１ｐ１２〜ｇｐ５１ｐ２２およびその前後の領域のペプチドのアミノ酸配列を示す。【０１０５】
〔実施例３：ＢＬＶのＧａｇ／Ｅｎｖ／ｐＸ領域におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの探索〕
ＢＬＶを構成する主要なタンパク質のうち、Ｇａｇ領域由来のｐ１５、ｐ２４、ｐ１２、Ｅｎｖ領域由来のｇｐ５１、ｇｐ３０、ｐＸ領域由来のｔａｘおよびについて、計１１５種類のオーバーラッピングペプチドを作製し、ＢＬＶに感染した３頭の発症感受性牛およびＢＬＶに感染した２頭の中立牛（発症感受性および発症抵抗性の何れも有さない）由来の細胞を用いて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行った。【０１０６】
（１０アミノ酸オーバーラッピングペプチドの作製）
ＢＬＶのＧａｇ領域にあるｐ１５から１０種類、ｐ２４から２１種類、およびｐ１２から６種類、ＢＬＶのＥｎｖ領域にあるｇｐ３０から２１種類、ｇｐ５１から２７種類、ＢＬＶのｐＸ領域にあるｔａｘから３０種類の１０アミノ酸オーバーラッピングペプチド（抗原候補ペプチド）を化学合成し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなるペプチドを探索した。抗原候補ペプチドはシグマジェノシス社の受託ペプチド合成によって合成した。【０１０７】
ｔａｘのアミノ酸配列は配列番号１０に示すとおりである。また、ｐ１５、ｐ２４、ｐ１２、ｇｐ５１、およびｇｐ３０の抗原候補ペプチドのアミノ酸配列は、図１２に示すとおりである。【０１０８】
すなわち、ｐ１５−Ｎ１〜ｐ１５−Ｎ１０は、それぞれ、配列番号６に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５２〜７１番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１９番目からなる。ｐ２４−Ｎ１〜ｐ２４−Ｎ２１は、それぞれ、配列番号７に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３２〜１５１番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目、２０１〜２１５番目からなる。ｐ１２−Ｎ１〜ｐ１２−Ｎ６は、それぞれ、配列番号２に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜６９番目からなる。【０１０９】
ｇｐ３０−Ｎ１〜ｇｐ３０−Ｎ２１は、それぞれ、配列番号８に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５２〜７１番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１０〜１２９番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目からなる。また、ｇｐ３０−Ｎ２１は、配列番号８に示すアミノ酸配列における１９５〜２１０番目のアミノ酸の後ろに配列「RPCP」を付加したものである。ｇｐ５１−Ｎ１〜ｇｐ５１−Ｎ２６は、それぞれ、配列番号９に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１２〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８１〜１００番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７０〜１８９番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目、２０１〜２２０番目、２１１〜２３０番目、２２１〜２４０番目、２３１〜２５０番目、２４２〜２６１番目、２４９〜２６８番目からなる。また、ｇｐ５１−Ｎ２７は、配列番号９に示すアミノ酸配列における２６２〜２６８番目のアミノ酸の後ろに配列「SDAPPTRVRRSDS」を付加したものである。【０１１０】
ｔａｘ−１〜ｔａｘ−３０は、それぞれ、配列番号１０に示すアミノ酸配列における１〜２０番目、１１〜３０番目、２１〜４０番目、３１〜５０番目、４１〜６０番目、５１〜７０番目、６１〜８０番目、７１〜９０番目、８２〜１０１番目、９１〜１１０番目、１０１〜１２０番目、１１１〜１３０番目、１２１〜１４０番目、１３１〜１５０番目、１４１〜１６０番目、１５１〜１７０番目、１６１〜１８０番目、１７１〜１９０番目、１８１〜２００番目、１９１〜２１０番目、２０１〜２２０番目、２１１〜２３０番目、２２１〜２４０番目、２３１〜２５０番目、２４１〜２６０番目、２５１〜２７０番目、２６１〜２８０番目、２７１〜２９０番目、２８１〜３００番目、２９１〜３１０番目からなる。【０１１１】
（ＢＬＶ感染感受性牛の選択および細胞の調製）
５頭のＢＬＶ未感染黒毛和種牛を用意した。Ｓ２、Ｓ４およびＳ６の３頭はＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがＤＲＢ３＊１６０１／＊１６０１の感受性牛、Ｎ１およびＮ２はＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のアリルがそれぞれＤＲＢ３＊１５０１／＊２７０３、およびＤＲＢ３＊１５０１／＊０５０３の中立牛（非感受性牛）として試験に用いた。【０１１２】
まず、ＢＬＶ感染ホルスタイン種Ｈｏｌ４１６から血液を採取し、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってＢＬＶプロウイルス量を測定した後、４×１０７コピー（感受性牛Ｓ２、Ｓ４、Ｓ６）および３．６×１０７コピー（非感受性牛Ｎ１、Ｎ２）のコピー数のＢＬＶプロウイルスを静脈注射にて接種し、感染させた。感染の成立は、ＢＬＶ−ＥＬＩＳＡ（チッソ株式会社）およびＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを用いて確認した。【０１１３】
Ｓ２、Ｓ４、Ｓ６、Ｎ１およびＮ２から血液１００ｍＬを採血し、２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＲＰＭＩで２倍希釈した。５０ｍＬチューブに１５ｍＬの血球分離溶液LymphoprepTM（ＰＲＯＧＥＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）を入れ、２倍希釈血液を３０〜３５ｍＬずつ重層した。これを、２０００×ｇ、３０分間、室温、ブレーキなしで遠心し、中間層であるリンパ球層を回収した。２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＲＰＭＩで２回〜３回洗浄後、１ｍＬ ＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＩＬＡ１１Ａ（anti-bovine CD4 monoclonal antibody, VMRD Inc,）で抗体を反応させた。ＭＡＣＳバッファーで３回洗浄後、MACS mouse-IgG-beads（Miltenyi Biotec）２００μＬ＋ＭＡＣＳバッファー ０．８ｍＬで４℃、１５分間インキュベートした。ＭＡＣＳバッファーで１回洗浄後、３ｍＬ ＭＡＣＳバッファーで平衡化したＬＳカラム（Miltenyi Biotec）に上記細胞を添加し、ＭＡＣＳ用磁石でＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞とを分離した。ＣＤ４陰性細胞を１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０  １ｍＬに再懸濁し、１μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを添加後、３７℃で１時間培養して増殖を停止させた。続いてＰＢＳで５回洗浄しマイトマイシンＣを完全に除去したのち１０％ ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とした。【０１１４】
（細胞増殖試験）
ＣＤ４陽性細胞（１×１０５個）、ＣＤ４陰性細胞（４×１０５個）、および各種抗原候補ペプチド（最終濃度２０μＭ）を混合し、１００μＬを９６ウェルプレートで１０９時間培養した。また、陰性コントロールとして抗原ペプチドなし（Cont.）、陽性コントロールとしてコンカナバリンＡ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を用いた。１０９時間培養後、細胞増殖／細胞毒性測定用試薬Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）のＣＣＫ試薬を１０μＬ／ウェルで添加し、さらに４時間培養して１１３時間で培養を終了した。終了後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖能とした。【０１１５】
はじめに、５種類ずつの抗原候補ペプチドを混合したペプチドプールを作製し（図１２）、抗原ペプチドのスクリーニングを行った。その結果を図１３および図１４に示す。調べた抗原候補ペプチドのうち、感受性牛Ｓ２ではペプチドプール９および１１が特に細胞増殖が大きかった。感受性牛Ｓ４ではペプチドプール１および１４が特に細胞増殖が大きかった。感受性牛Ｓ６ではペプチドプール９および１１が特に細胞増殖が大きかった。非感受性牛Ｎ１では特に反応の強いペプチドプールは見られなかった。非感受性牛Ｎ２ではペプチドプール３、９、１４および２１で特に細胞増殖が大きかった。【０１１６】
続いて、細胞増殖の大きかったペプチドプールを中心に、ペプチド毎に再度スクリーニングを行った。その結果を図１５および図１６に示す。感受性牛Ｓ２ではペプチドプール９からｇｐ３０−Ｎ６、ペプチドプール１１からｇｐ３０−Ｎ１４、それに追加してｇｐ５１−Ｎ１１およびｔａｘ−１５で細胞増殖が大きかった。感受性牛Ｓ４ではペプチドプール１からｐ１５−Ｎ５、ペプチドプール１４からｇｐ５１−Ｎ９、それに追加してｇｐ３０−Ｎ８およびｇｐ５１−Ｎ８で細胞増殖が大きかった。感受性牛Ｓ６ではペプチドプール９のペプチドの中ではｇｐ３０−Ｎ４で最も細胞増殖が大きく、ペプチドプール１１からはｇｐ３０−Ｎ１４で細胞増殖が大きかった。非感受性牛Ｎ１ではｇｐ３０−Ｎ６およびｔａｘ−１９で細胞増殖が大きかった。非感受性牛Ｎ２ではペプチドプール３からｐ２４−Ｎ５、ペプチドプール９からｇｐ３０−Ｎ６、ペプチドプール１４からｇｐ５１−Ｎ１０、そしてペプチドプール２１からｔａｘ−１６で細胞増殖が大きかった。【０１１７】
最後に、細胞増殖誘導能がみられた抗原候補ペプチドについて、ペプチド濃度を０．２μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、および２０μＭの５点を取って、濃度依存性を確認した。その結果を図１７および図１８に示す。感受性牛Ｓ２のｇｐ３０−Ｎ６、ｇｐ３０−Ｎ１４、ｇｐ５１−Ｎ１１、ｔａｘ−１５、感受性牛Ｓ４のｐ１５−Ｎ５、ｇｐ５１−Ｎ８、ｇｐ５１−Ｎ９、感受性牛Ｓ６のｇｐ３０−Ｎ１４、非感受性牛Ｎ１のｇｐ３０−Ｎ６、ｔａｘ−１９、非感受性牛Ｎ２のｇｐ３０−Ｎ６およびｔａｘ−１６で濃度依存的に細胞増殖能が増加したことから、これらがＣＤ４エピトープとして同定された。一方、Ｓ４のｇｐ３０−Ｎ８、Ｓ６のｇｐ３０−Ｎ４、Ｎ２のｐ２４−Ｎ５およびｇｐ５１−Ｎ１０で濃度依存性が認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明に係るポリペプチド等は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するワクチン製造の材料として利用し得る。【０１１９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
2014157595.tif 000003
【図３】
2014157595.tif 000004
【図４】
2014157595.tif 000005
【図５】
2014157595.tif 000006
【図６】
2014157595.tif 000007
【図７】
2014157595.tif 000008
【図８】
2014157595.tif 000009
【図９】
2014157595.tif 000010
【図１０】
2014157595.tif 000011
【図１１】
2014157595.tif 000012
【図１２】
2014157595.tif 000013
【図１３】
2014157595.tif 000014
【図１４】
2014157595.tif 000015
【図１５】
2014157595.tif 000016
【図１６】
2014157595.tif 000017
【図１７】
2014157595.tif 000018
【図１８】
2014157595.tif 000019
【図１】
2014157595.tif 000020
【配列表】
2014157595000001.app
【国際調査報告】
2014157595.tif 000021
2014157595.tif 000022
2014157595.tif 000023
2014157595.tif 000024