(57)【要約】  本発明は、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いて、尿中ポドサイトを光学顕微鏡により検出する方法に関するものであり、より詳細には以下の（１）〜（３）の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法に関する。（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程、（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程、および、（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
2014104019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法：
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
【請求項２】
前記不溶性担体がポリスチレンラテックス粒子である、請求項１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
【請求項３】
ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体が、抗ポドカリキシン抗体である、請求項１または２に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
【請求項４】
ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害の可能性があると判定される、請求項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
【請求項５】
尿検体が、尿沈渣である、請求項１〜４のいずれか１に記載の尿中のポドサイトを検出する方法。
【請求項６】
以下の試薬を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法に用いられる、尿中ポドサイトを検出するための試薬キット：
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を含む試薬；
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いて、尿中ポドサイトを光学顕微鏡により検出する方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2012-282394号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
透析や移植を必要とするend-Stage kidney disease（ESKD）患者は世界中で増え続けている。1990〜2000年の10年間でESKD患者は43万人から106.5万人に増加したが、2008年には少なくとも165万人程度に増加している。2011年には日本の維持透析患者数は約30万人となり、人口100万人当たりの患者数は2126人であり、その数は世界第2位である。慢性腎臓病（CKD）は世界中で増え続けるESKDの予備軍であり、米国の2000年のCKD患者数は成人人口の13.07%（2561万人）と推測されている。日本の2005年のCKD患者数は成人人口の12.9%（1330万人）である。また、CKDは心血管疾患（CVD）の危険因子であり、欧米のCKDにおいては、透析導入される患者数よりもCVDにより死亡する患者の方が多数であり、日本においてもCKDはCVDの危険因子である（非特許文献１）。よってCKD患者に対して、それぞれの進行過程に合った適切な治療を行うことができれば、透析導入数やCVDで死亡する人数を大幅に減らすことが可能であると考えられる。【０００４】
ポドカリキシンは、腎糸球体を構成するタコ足細胞（ポドサイト）の表面に存在し、濾過機能を担っている糖タンパク質である。ポドサイトは糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割を持つ。ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味を持つことから（非特許文献２）、尿中に排出されるポドカリキシンを検出することにより、腎障害の検査が行われている。例えば、尿中ポドカリキシンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１）。【０００５】
ポドサイトの尿中への脱落は分節状糸球体硬化病変の最初の引き金となることが明らかにされてきている。また小児のIgA腎症や巣状糸球体硬化症などの糸球体疾患の患者においては、尿中にポドサイトが脱落していることが報告されている。したがって、尿中のポドサイト数が糸球体疾患において重症度の指標になるとされている（非特許文献３）。正常人においてはポドサイトが尿中へ脱落することはない。このため、尿中でポドサイトが検出された場合は、その患者は腎疾患であると判断され、即治療が必要となる。【０００６】
現在、尿中ポドサイトの検出は蛍光抗体法で行われている。しかし、蛍光抗体法は操作が煩雑で時間がかかり、かつ蛍光顕微鏡を必要とするため実施できる施設は限られているのが現状である。【０００７】
不溶性担体、例えばラテックス粒子を抗体に結合させたものを用いて、抗原を検出する方法として、ラテックス凝集法が一般的に知られており、種々の検出キットが市販されている。ラテックス凝集法は、抗原存在下で抗体結合ラテックス粒子を凝集させ、この凝集を吸光度等で観察することにより抗原を検出する。ラテックス凝集法は、ポドサイトの表面に存在する抗原タンパク質以外に、尿中に浮遊するベジクル様抗原タンパク質をも検出してしまうため、ポドサイトの検出に適用することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０３７０９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】日本腎臓学会編  CKD診療ガイドライン2012、p.5, 7
【非特許文献２】Hara et al., Nephron69: 397-403 (1995)
【非特許文献３】松田  昭彦  埼玉医科大学雑誌  第28巻  第3号  平成13年7月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来の方法より簡便に尿中ポドサイトを検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いることにより、尿中ポドサイトを光学顕微鏡で検出し得ることに着目し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、尿中ポドサイトを検出する方法：
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
２．前記不溶性担体がポリスチレンラテックス粒子である、前項１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
３．ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体が、抗ポドカリキシン抗体である、前項１または２に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
４．ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害の可能性があると判定される、前項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法。
５．尿検体が、尿沈渣である、前項１〜４のいずれか１に記載の尿中のポドサイトを検出する方法。
６．以下の試薬を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の尿中ポドサイトを検出する方法に用いられる、尿中ポドサイトを検出するための試薬キット：
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイト特異的に細胞表面に発現するタンパク質を特異的に認識する抗体を含む試薬；
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の検出方法は光学顕微鏡を用いて尿中ポドサイトを検出することが可能であるため、従来の蛍光顕微鏡を用いた検出方法に比較して、簡便に尿中ポドサイトを検出することが可能であり、より多くの施設で尿中ポドサイトの検出を行うことができる。また本発明の方法によれば、尿中に含まれるベジクル様ポドカリキシンと、ポドサイトを区別することが可能であるため、偽陽性を排除することが可能である。また本発明の検出方法は、従来の蛍光顕微鏡を用いた検出方法の約1/3量の尿検体で、ポドサイトを観察することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ポドサイトを、従来の蛍光抗体法により蛍光顕微鏡を用いて観察した画像（図１ａ）と、本発明の方法により光学顕微鏡を用いて観察した画像（図１ｂ）を比較して示す図である。（実施例１）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下の工程を含む尿中ポドサイトを検出する方法を対象とする。
（１）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体（以下単に「不溶性担体の結合した抗体」と称することもある）を準備する工程；
（２）不溶性担体の結合した抗体を、被験者の尿検体に接触させる工程；
（３）不溶性担体の結合した抗体と接触させた尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する工程。
【００１６】
ポドサイト（タコ足細胞）は、腎臓の糸球体上皮細胞であり、高度に最終分化し、分裂能を持たない細胞と考えられている。ポドサイトは糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつため、ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味を持つ。例えば、糸球体疾患患者においては尿中にポドサイトが脱落していることがわかっており、正常人においてはポドサイトが尿中に脱落することはない。したがって、尿中のポドサイトの有無を確認することにより、腎疾患を検出することが可能であり、尿中のポドサイト数は腎疾患の重症度の指標になると考えられる。
【００１７】
本発明は、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を用いる。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質は、尿中においてポドサイトの表面のみに存在するのではなく、ポドサイトに結合せず、尿中に浮遊している場合もある。前記抗体は、ポドサイトの表面に存在するタンパク質と尿中に浮遊しているタンパク質の両方を認識するが、光学顕微鏡を用いて検出することによりこれらを区別し、偽陽性を排除することができる。例えばポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質がポドカリキシンの場合、尿中に排泄されているポドカリキシン関連物質としては、ポドサイトとベジクル様ポドカリキシンが存在する。本発明において、ポドサイトとベジクル様ポドカリキシンを認識する抗ポドカリキシン抗体を使用した場合、光学顕微鏡の像を観察することによりこれらの２つの区別が可能となる。大きさ（直径）が10〜30μm（リンパ球、好中球の約２倍）であって、不溶性担体の結合した抗体がリング状に結合した細胞が顕微鏡像にて認められた場合、ポドサイト陽性と判断することができる。
【００１８】
本発明において用いられる抗体は、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体であれば、いかなるものであってもよい。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質とは、ポドサイト以外の尿中に存在し得る細胞の表面には発現しておらず、ポドサイトの表面のみに発現しているタンパク質を意味する。かかるタンパク質としては、例えば、ポドカリキシン、GLEPP-1（glomerular epithelial protein-1）等が例示される。
【００１９】
上記ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体は、当該タンパク質の細胞外領域を認識する抗体を用いる必要がある。細胞外領域を認識する抗体は、タンパク質を可溶化する処理を行わずに当該タンパク質を認識し得、ポドサイトを破壊せずに、反応させることが可能である。ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体のうち、本発明においては、ポドカリキシンを認識する抗ポドカリキシン抗体を使用することが好ましい。抗ポドカリキシン抗体は、ポドサイトの表面に発現しているポドカリキシンを認識しうる抗体であれば、いかなるものであってもよい。本発明において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されない。本発明においては、細胞外領域（糖領域を含む）を認識する抗ポドカリシキン抗体を使用する必要がある。また、本発明における抗ポドカリキシン抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。
【００２０】
ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体に結合した不溶性担体としては、本発明の目的を達成し得るものであれば、公知のものを含めて、いかなるものも使用可能である。例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコン樹脂、シリコンラバー等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が例示される。これら不溶性担体は、微粒子、ラテックス粒子等の形態で使用することが可能である。
【００２１】
本発明に用いられる不溶性担体としては、ラテックス粒子を用いることが好適である。ラテックス粒子は人工担体であり、目的に応じて担体表面を化学的に処理し易いこと、また非特異反応が起こりにくいこと等の利点がある。ラテックス粒子の材質は特に限定されないが、例えばポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、アクリル酸系ラテックス等が挙げられる。これらラテックス粒子のうち、乳化剤を用いない乳化重合によって得られる、ポリスチレンラテックス粒子等を用いることが好ましい。ポリスチレンラテックス粒子等は表面の疎水性が強いため、タンパク質もしくはペプチドを吸着するのに適しており、且つ表面の負電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも溶液中で安定に分散するという性質を有しているためである。また、種々の変性ラテックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等も必要に応じて使用できることは言うまでもない。
【００２２】
本発明に用いられるラテックス粒子としては、公知のものを使用可能であるが、ラテックス粒子の平均粒径が小さいもの、即ち、単位重量あたりの表面積が大きいものが、抗体に効率良く結合させることができるので好ましい。ラテックス粒子の平均粒径としては、具体的には、通常0.4μｍ以上1.5μｍ以下、好ましくは0.4μｍ以上1.0μｍ以下である。ラテックス粒子の平均粒径が1.5μｍを超えると、ポドサイトに結合する抗体結合ラテックス数が少なくなるため検出が困難になる可能性がある。なお平均粒径は、電子顕微鏡写真や粒度分布測定装置による一般的な方法で求めることができるものである。ラテックス粒子は、着色された着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。
【００２３】
また、ラテックス粒子の粒径の差は小さい方が好ましい。具体的には、最小値と最大値の差が最小値を基準にして10%以内であることが好ましい。ラテックス粒子の表面の電荷密度は最も小さなものと大きなものの差が最も小さなものを基準にして10%以内であることが好ましい。
【００２４】
不溶性担体を、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体に結合する方法は、特に限定されず、従来公知の方法により、物理的及び／又は化学的結合により両者を結合する方法等が挙げられる。
【００２５】
不溶性担体の結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体は、適当な溶媒中に0.025〜1%（重量%）で分散もしくは懸濁させて、試薬として調製したものを用いることが好ましい。溶媒は本発明の目的に沿うものであればいかなるものであってもよいが、緩衝液を用いることが好適である。緩衝液は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記緩衝液のpHは特に限定されないが、好ましい下限は5.5、好ましい上限は8.5、より好ましい下限は6.5である。
【００２６】
本発明の検出方法において、ポドサイトが検出される尿検体は、いかなる被験者から得られたものであってもよい。また被験者からの尿の採取方法は問わないが、早朝尿もしくは随時尿を採取することが好ましい。本発明の検出方法に必要な尿の量は5〜20mL程度であり、従来の蛍光抗体法に必要な尿量と比較して少量である。本発明の検出方法は、従来の一般的な尿検査と同時に行われてもよいし、腎疾患の疑いのある被験者や、腎疾患と診断された患者について別途尿を採取して行われてもよい。
【００２７】
本発明においてポドサイトが検出される尿検体は、被験者から得られた尿を処理して得られるものであり、好ましくは尿沈渣である。尿の処理は、処理液を添加して混合することにより行うことができる。処理液は、尿のpH調整、尿沈渣のマスキングが可能なものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、本発明の目的に沿うものであればいかなるものであってもよい。処理液としては、より具体的には、2M TES-NaOHに0.2M EDTAを含む溶液（pH7.0）や、かかる溶液を希釈した溶液が例示される。尿沈渣は公知の手法により調製することができるが、例えば上記処理液を尿に混合し、遠心分離して上清を除去して、ペレットを得ることにより、調製することができる。
【００２８】
不溶性担体の結合したポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を、被験者の尿検体に接触させると、抗原抗体反応により不溶性担体の結合した抗体がポドサイトに集積し、不溶性担体が標識としての機能を発揮して、ポドサイトを可視化する。不溶性担体の結合した抗体を被験者の尿検体に接触させる方法は、特に限定されず、公知の免疫染色の手法と同様の手法により行えばよい。通常、検体と不溶性担体の結合した抗体とを混合し、一定時間静置もしくは振盪させることにより、十分に反応させることが可能である。反応後の尿検体中には、抗原抗体反応をしていない不溶性担体の結合した抗体が含まれるが、尿検体中からこれらの抗原抗体反応をしていない不溶性担体の結合した抗体を除去する必要はない。
【００２９】
不溶性担体の結合した抗体と接触させた前記の尿検体を、光学顕微鏡により観察し、ポドサイトを計測する。光学顕微鏡による観察は、通常と同様に、観察対象である尿検体をスライドグラスに載せて、観察を行えばよい。
【００３０】
光学顕微鏡で観察し、ポドサイトが確認された場合は、腎疾患であると判定される。好ましくは、ポドサイトの計測数が１個/mL以上である場合に、腎障害（腎疾患）の可能性があると判定される。本明細書において腎障害と腎疾患は同義に用いられ、腎障害または腎疾患は、腎炎などの腎臓病に加えて、糖尿病、膠原病などの他の疾患に伴って引き起こされる、腎機能が低下した状態を含む。本発明の検出方法では、検出されたポドサイト数により、腎疾患の重症度を判定することも可能である。検出されたポドサイト数が多くなるにつれて、腎疾患が重篤であると判定することができる。よって、本発明の検出方法は、腎疾患患者について、腎疾患の進行をモニタリングすることを目的として、行われてもよい。
【００３１】
本発明の検出方法は、腎疾患の判定に用いることが可能であるが、好ましくは糸球体に異常の認められる糸球体疾患の判定に用いられる。糸球体疾患としては、急性（糸球体）腎炎、糖尿病性腎症、IgA腎症、ネフローゼ症候群、慢性糸球体腎炎、膜性腎症、ANCA関連腎炎、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）、紫斑病性腎炎、間質性腎炎、半月体形成性腎炎、巣状糸球体硬化症、腎硬化症、急性腎不全、慢性腎不全、腎アミロイドーシス、強皮症腎、シェーグレン症候群による間質性腎炎、薬剤性腎症等が例示される。
【００３２】
本発明は、以下の試薬を含む尿中ポドサイトを検出するための試薬キットをも包含する。
（ａ）不溶性担体が結合した、ポドサイトの表面に特異的に発現するタンパク質を認識する抗体を含む試薬。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具のうち、少なくとも１つ。
（ｂ）光学顕微鏡での細胞観察に用いられる試薬および器具としては、尿の処理に用いられる処理液、スライドグラス、ポジティブコントロール、ポドサイト観察例、採尿スピッツ等が例示される。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００３４】
（実施例１）蛍光抗体法と本発明の方法の、尿中ポドサイト検出手順の比較【００３５】
１．蛍光抗体法
下記の手順により、蛍光抗体法を行った。
（１）早朝新鮮尿30mLを、尿細胞保存液20mLの入っているウリキープ5D（武藤化学株式会社）に保存した。（所要時間1〜2分間）
（２）スライドグラス上に、サイトスピンにてオートスメアサンプルを作製した（所要時間10分間）。
（３）作製したオートスメアサンプルを風乾させた（所要時間1〜2時間）。
（４）風乾させたサンプルと抗ポドカリキシン抗体とを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）。
（５）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（６）スライドグラス上のサンプルと、FITC標識抗マウスIgGとを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）
（７）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（８）蛍光顕微鏡を用いて、スライドグラス上のサンプルを100倍で検鏡した。【００３６】
２．本発明の不溶性担体の結合した担体を用いた方法
（ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体の作製）
TechNote 205, Rev.003, Active: 30/Mar/02 "Covalent Coupling", Bangs Laboratories Inc.を参照して、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を作製した。【００３７】
（ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を用いた検出方法）
下記の手順により、上記ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体を用いた検出方法を行った。
（１）早朝新鮮尿9mLを、2M TES-NaOHに0.2M EDTAを含む溶液（pH7.0）1mLと混合した。（所要時間1〜2分間）
（２）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットを得た。（所要時間7〜8分間）
（３）ペレットに、蒸留水を7.5mL添加して混合し、その後直ぐに400mM TES-NaOHに40mM EDTAに含む溶液（pH7.0）7.5mLを添加した。（所要時間1〜2分間）
なお蒸留水を加える理由は、尿沈渣中の赤血球を溶血させるためである。
（４）混合した試料を、遠心分離（1710g×5分間）後、上清を除去し、ペレットとして尿沈渣を得た。（所要時間7〜8分間）
（５）尿沈渣に、ラテックス粒子結合抗ポドカリキシン抗体45μL（ラテックス粒子濃度が0.1%（重量%））を添加して、室温で90分間振盪させて反応させた（所要時間90分間）。
（６）反応後のサンプルをスライドグラスに載せて、光学顕微鏡により100倍で検鏡した。【００３８】
蛍光抗体法と本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法の手順を比較すると、蛍光抗体法は最短でも3時間10分間の時間を必要とするが、本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法では、抗体との反応終了までが、1時間50分間と短縮されていた。【００３９】
急性腎炎患者の尿を使用して、本実施例の蛍光抗体法と本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法によりポドサイトを可視化した画像を、図１に示す。本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法によれば、蛍光抗体法と同程度の明瞭さで、ポドサイトを検出することが可能であることがわかった。また本発明の不溶性担体の結合した抗体を用いた方法は、蛍光抗体法の約1/3量の尿検体で、ポドサイトを観察することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
上記説明したとおり、尿中ポドサイトを不溶性担体の結合した抗体を用いて光学顕微鏡で検出することにより、これまで尿中ポドサイト検査が実施できなかった施設でも容易に実施できるようになり、腎障害の検査の実施が可能となる。腎障害の検査が実施可能な施設が増えることにより、適切な診断が行われ、適切な治療を選択できることから、患者にとって有益である。
【図１】
2014104019.tif 000003
【国際調査報告】
2014104019.tif 000004
2014104019.tif 000005
2014104019.tif 000006
2014104019.tif 000007