(57)【要約】  子宮体がんであってリンパ節転移性のものと非転移のものとを、分子レベルで判別する手法の提供。  子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、  該転写開始領域が、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記評価方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する少なくとも１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記評価方法。
【請求項２】
配列番号１〜２７７で示される塩基配列が、配列番号２０８、配列番号２６４、配列番号２３７、配列番号２７０、配列番号５７、配列番号２７４、配列番号１０８及び配列番号１８２で示される塩基配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１〜２７７で示される塩基配列が、下記１）〜４３４）の配列番号で示される塩基配列の組み合わせである、請求項１記載の方法。
【表１】
2015105190.tif 000022
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【請求項４】
さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを対照レベルと比較する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記ＤＮＡの発現産物の発現レベルを閾値レベルと比較する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
発現産物の発現レベルの測定が、転写産物の量又は翻訳産物の量を測定することによって行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する請求項１〜６のいずれか１項記載の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価するための検査用キット。
【請求項８】
転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価するためのマーカーとしての使用であって、該ＤＮＡが配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記発現産物の使用。
【請求項９】
子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、ＴＡＣＣ２のＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願及び参照による援用）
本出願は、２０１４年１月１０日に出願した日本国特願２０１４−００３１９１の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書において参照として援用される。
また、本明細書に引用される全ての文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを認めるものと解釈されてはならない。【０００２】
本発明は、子宮体がんであってリンパ節転移性のものと非転移性のものとを分子レベルで判別する手法に関する。
【背景技術】
【０００３】
早期子宮体がん（高分化型腺がん）症例において、リンパ節転移の有無の違いは、原発巣のがんにおける転写の異常によってもたらされていると考えられる。子宮体がんtype１の高分化型腺がんにおいて、筋層浸潤が無い早期がんであるにも関わらず、リンパ節転移陽性症例が散見することがあるが、ほとんどの子宮体部高分化型腺がんは筋層浸潤を認めてもリンパ節転移陰性で、にもかかわらず不要なリンパ節郭清が行われているのが現状である。【０００４】
従来、子宮体がんにおけるリンパ節転移能を調べるには、実際にリンパ節郭清を行い、摘出したリンパ節に転移したがん組織があるかどうかを病理学的に確認することによりのみ行われており、リンパ節郭清を行わずにリンパ節転移性の子宮体がんであるか否かを判別する手段はこれまでに全く知られていない。【０００５】
一方、近年、遺伝子の発現状態の比較によって、ある状態にある細胞で発現している遺伝子を網羅的に解析し、その種類や発現レベルを細胞間で比較する、遺伝子の発現解析(expression analysis)のための手法が開発されている。例えば、転写開始部位の遺伝子の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析するＲＮＡ−ｓｅｑ（非特許文献１）やＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression：非特許文献２）等が知られている。このうち、ＣＡＧＥ法は、ｍＲＮＡ等の長いキャップ付ＲＮＡを選択し、その５’末端を無作為かつ大量に配列決定することで転写開始点の活性を網羅的に定量化できるという特徴を有する。【０００６】
しかしながら、ヒトゲノムにおける転写開始領域の発現レベルと特定の疾患との関係についてはこれまでに全く報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63
【非特許文献２】Genome Res. 2011 Jul;21(7):1150-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、子宮体がんであってリンパ節転移性のものと非転移性のものとを、分子レベルで判別する手法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、子宮体がん患者から採取した、リンパ節転移があるがん組織とリンパ節転移がないがん組織からＲＮＡを抽出し、ＣＡＧＥ解析法を用いて転写開始領域（Transcript Start Site；ＴＳＳ）付近の発現状態をシーケンス情報として網羅的に解析した結果、特定の転写開始領域を含むＤＮＡの発現レベルが両者の間で有意に異なり、これを指標として、リンパ節転移性の子宮体がんと非転移の子宮体がんを判別できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価する方法であって、該ＤＮＡが配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記評価方法。
２）前記ＤＮＡの転写産物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は前記ＤＮＡの翻訳産物を認識する抗体を含有する上記１）の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価するための検査用キット。
３）転写開始領域を含むＤＮＡの１種又は２種以上の発現産物の、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価するためのマーカーとしての使用であって、該ＤＮＡが配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡであり、
該転写開始領域が、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の１番目の塩基と３’末端から１０１番目の塩基によって両端が規定される領域である、前記発現産物の使用。
４）子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、ＴＡＣＣ２のＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リンパ節転移の可能性が皆無である子宮体がん検体を選択でき、これによって、不要なリンパ節郭清の回避を含めた手術方式に関する方針の示唆が得られる。リンパ節郭清を回避できれば、手術時間の短縮、手術侵襲の軽減、術後のリンパ浮腫などを防ぐことができる。また、本発明を用いることで、子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能、トレーニングを積んだ臨床検査技師のような専門家の主観によらなくても、同程度あるいはそれ以上の分類を客観的に行うことが可能になり、患者検体の採取から解析まで患者の傍らで医療従事者が行う検査（POCT：Point of Care Testing）にも好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】免疫組織化学像。（左図）転移あり、濃い茶色：ＴＡＣＣ２発現細胞、倍率：４００倍、（右図）転移なし、倍率：４００倍
【図２】ＴＡＣＣ２のＲＮＡ発現量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、子宮体がんとは、子宮癌のうち子宮体部に発生する癌を意味する。子宮体がんは子宮腔側の上皮組織である子宮内膜に発生し、子宮内膜がんと同義である。子宮体がんは、がんの大きさ、広がり、浸潤や転移の状況から、日産婦臨床進行期分類（２０１１年）によれば進行期がＩ〜ＩＶに分類されている。本発明において、評価の対象となる子宮体がんとしては、進行期によって特に制限されるものではないが、類内膜腺がんの高分化型腺がんであるのが好ましい。
【００１４】
本発明において、子宮体がんにおけるリンパ節転移とは、子宮体がんが、骨盤内や大動脈周囲等のリンパ節において増殖することを意味する。
【００１５】
本発明においてリンパ節転移の評価とは、子宮体がんのリンパ節への転移の有無を評価又は測定することを意味し、リンパ節転移能（リンパ節転移性）の評価とは、子宮体がんがリンパ節へ転移して増殖する能力を有するか否かを評価又は測定することを意味する。
【００１６】
本発明において用いられる生体試料は、評価対象となる子宮体がん患者から分離された術前或いは術中の子宮体がん組織である。当該生体試料は、測定に供するために適宜調製・処理される。例えば試料を核酸レベルでの測定に供する場合はＲＮＡ抽出液が調製され、試料をタンパク質レベルでの測定に供する場合はタンパク質抽出液が調製される。
生体試料からＲＮＡを抽出する方法は、公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、ライフテクノロジーズ社製Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅキット、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ、同社製ＲＮｅａｓｙが例示できるが、これらのうちキアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙキットが好適に用いられる。
【００１７】
本明細書において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。また、「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。従って、ＤＮＡには、２本鎖のゲノムＤＮＡ、１本鎖のｃＤＮＡや該ＤＮＡと相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ等が包含される。また、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００１８】
本発明において、配列番号１〜２７７で示される塩基配列からなるＤＮＡ（転写開始領域とその下流に連続する１００塩基からなるヒトゲノムＤＮＡ）の転写産物は、実施例で示すとおり、子宮体がんのうちリンパ節転移がない検体とリンパ節転移がある検体について、ＣＡＧＥ（Cap Analysis Gene Expression）解析法を用いて、ゲノム上の転写開始領域を含む下流１００ベース以上のＤＮＡの発現状態を網羅的に解析した結果、リンパ節転移性の子宮体がんと非転移の子宮体がんで、その発現レベル（転写活性）に有意な差異が認められたものである。具体的には、ＲＮＡの転写活性について、「リンパ節転移あり」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「リンパ節転移なし」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用い、閾値としてＦＤＲ（false discovery rate）５％を設定し、抽出されたものである。
したがって、配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、転写開始領域の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に連続する１塩基以上からなるＤＮＡ（以下、「配列番号１〜２７７における転写開始点を含むＤＮＡ」と称する）の（又はそれによってコードされる）発現産物（「本発明の発現産物」と云う）は、リンパ節転移性の子宮体がんと非転移性の子宮体がんを判別するためのバイオマーカーとなり得る。尚、配列番号１〜２７５における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、リンパ節転移がある場合に発現レベルが上がるマーカーであり、配列番号２７６〜２７７における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物はリンパ節転移がある場合に発現レベルが下がるマーカーである。
【００１９】
本発明において、「転写開始領域」は、転写開始点を含む領域をいう。特定のプロモーターからの転写開始点は単一の塩基に限定されず、ゲノム上のプロモーターの下流の複数の位置に存在する塩基であり得る。これらの複数の転写開始点を含む領域を本明細書において転写開始領域と称する。より詳細には、転写開始領域は、複数の転写開始点のうち最も５’側に位置する転写開始点と最も３’側に位置する転写開始点との間の領域である。配列番号１〜２７７で示される塩基配列の各々において転写開始領域は１位（５’末端）の塩基と３’末端から１０１番目の塩基とによって両端が規定される領域に相当する５’末端を形成する塩基領域である。換言すると、配列番号１〜２７７で示される塩基配列の各々には、転写開始領域と、転写開始領域中の最も３’側に位置する転写開始点に続く１００個の塩基が示されている。本明細書においては、斯かる転写開始領域を「配列番号１〜２７７において示される転写開始領域」とも称する。
配列番号１〜２７７において示される転写開始領域のゲノム上の位置、及びそれに関連する遺伝子情報等は後記表１−１〜表１−１２に示すとおりである。
【００２０】
本発明において、発現産物の発現レベルが測定されるＤＮＡは、配列番号１〜２７７で示される塩基配列における、上記転写開始領域中の任意の位置（転写開始点）の塩基とその下流に続く１塩基以上の塩基配列からなるＤＮＡである。
ここで、下流に続く塩基配列の塩基数は、発現産物を特定できる数であればよい。当該塩基数としては、例えば１塩基以上、５塩基以上、１０塩基以上、１５塩基以上、２０塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上、５０塩基以上が挙げられる。また、当該塩基数としては、例えば１０塩基以下、１５塩基以下、２０塩基以下、２５塩基以下、３０塩基以下、４０塩基以下、５０塩基以下、１００塩基以下が挙げられる。
下流側の塩基は、ＣＡＧＥ法による測定の場合には特に必要ないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによる測定の際にはその精度を担保するために下流１００塩基程度までの何れかの部分を対象とすることができ、転写開始領域とその下流１００塩基からなるＤＮＡのうち、少なくとも２０塩基以上の長さのものであればゲノム全体を対象にした実験系であっても特定できる確率が高い。
【００２１】
また、当該ＤＮＡには、その発現産物がリンパ節転移性の子宮体がんと非転移性の子宮体がんを判別するためのバイオマーカーとなり得る限り、当該ＤＮＡの塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡも包含される。ここで、実質的に同一の塩基配列とは、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLASTを用い、期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３の条件にて検索をした場合、配列番号１〜２２７に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性があることを意味する。
【００２２】
斯かる本発明の発現産物は、１種又は２種以上を組み合わせてその発現レベルを把握することにより、リンパ節転移性の子宮体がんと非転移性の子宮体がんの判別が可能であるが、このうち、配列番号２０８、配列番号２６４、配列番号２３７、配列番号２７０、配列番号５７、配列番号２７４、配列番号１０８、配列番号１８２における転写開始点を含むＤＮＡの発現産物は、表２に示す閾値を設定した場合に、特異度１００％・感度１００％で分類できるものである。すなわち、これらは、其々一つの発現レベルのみを以って確実な判別が可能なものである。
【００２３】
また、複数の発現産物を組み合わせてその発現レベルを確認する場合、その数、組み合わせの内容は適宜選択できるが、少なくとも２つのＤＮＡの発現産物を用いる場合の好適な組み合わせ（４３４組）を後記表３に示した。斯かる組み合わせは、上記２７７個の転写開始領域から選択した２個のすべての組み合わせについて、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関するリンパ節転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものを抽出したものである。尚、更なる精度向上を目的として、これらを適宜２セット若しくは３セット以上を組み合わせて用いることができる。また、斯かる２つのＤＮＡの発現産物の組み合わせに加えて、配列番号１〜２７７における転写開始点を含むＤＮＡのうち、表３−１〜表３−６に示された以外のＤＮＡの発現産物と組み合わせてもよく、更には本発明の評価に寄与し得る範囲でそれ以外の任意の塩基配列からなるＤＮＡの発現産物を組み合わせてもよい。
【００２４】
本発明の発現産物としては、当該ＤＮＡから発現される転写産物及び翻訳産物が挙げられる。転写産物としては、具体的には、当該ＤＮＡから転写されて生じるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。また、翻訳産物としては、具体的には、当該ＲＮＡによってコードされるタンパク質が挙げられる。例えば、表２で示した転写開始点を含むＤＮＡの発現産物のうち、配列番号２６４における転写開始点を含むＤＮＡから発現されるタンパク質は、「ＴＡＣＣ２」（Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 2；UniProtKB/Swiss-Prot: TACC2_HUMAN, O95359）として同定されている。
【００２５】
発現産物の測定又は検出の対象には、そのＲＮＡから人工的に合成されたｃＤＮＡ、そのＲＮＡをエンコードするＤＮＡ、そのＲＮＡにコードされるタンパク質、該タンパク質と相互作用をする分子、そのＲＮＡと相互作用する分子、又はそのＤＮＡと相互作用する分子等も包含される。ここで、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質と相互作用する分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸、及びこれらのリン酸化物、アルキル化物、糖付加物等、及び上記いずれかの複合体が挙げられる。
また、発現レベルとは、当該発現産物の発現量や活性を包括的に意味する。
【００２６】
発現レベルを測定する方法は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを対象とする場合、これらにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、ＬＡＭＰ法等に代表される核酸増幅法、これらにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション等）、塩基配列を決定する方法、又はこれらを組み合わせた方法から選ぶことができる。
【００２７】
ここで、測定に用いられるプローブ又はプライマー、すなわち、本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該ＲＮＡ又はそれに由来する核酸を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、配列番号１〜２７７で示される塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法において、実質的に本発明の発現産物（転写産物）又はそれに由来する核酸のみを検出できること、また例えばＲＴ−ＰＣＲ法において、実質的に当該核酸のみが生成される如く、当該検出物又は生成物が当該転写産物又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、配列番号１〜２７７で示される塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、配列番号１〜２７７で示される塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
【００２８】
例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション法を利用する場合は、まずプローブＤＮＡを放射性同位元素、蛍光物質等で標識し、次いで、得られた標識ＤＮＡを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした生体試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識ＤＮＡとＲＮＡとの二重鎖を、標識物に由来するシグナルを検出、測定する方法を用いることができる。
【００２９】
また、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、まず生体試料由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的の本発明の発現産物（この場合、転写産物）が増幅できるように調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。増幅された二本鎖ＤＮＡの検出には、予めＲＩ、蛍光物質等で標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法等を用いることができる。
【００３０】
また、ＤＮＡマイクロアレイを用いて検体中のｍＲＮＡの発現量を測定する場合は、支持体に本発明の発現産物（この場合、転写産物）由来の核酸（ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）の少なくとも１種を固定化したアレイを用い、ｍＲＮＡから調製した標識化ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをマイクロアレイ上に結合させ、マイクロアレイ上の標識を検出することによって、ｍＲＮＡ発現量を測定することができる。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下に特異的（すなわち、実質的に目的の核酸のみに）にハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、本発明の発現産物（転写産物）の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも１５〜２５塩基からなる核酸が挙げられる。
ここでストリンジェントな条件は、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の洗浄条件を挙げることができ、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)などに記載されている。
【００３１】
また、塩基配列を決定する方法としては、ＣＡＧＥ法、ＴＳＳ−ｓｅｑ法、ＲＮＡ−ｓｅｑ法、ＤＧＥ法、ＳＡＧＥ法等が挙げられるが、ＣＡＧＥ法が好適である。
ＣＡＧＥ法を用いて、発現レベルを測定する場合、後記実施例に記載した方法に準じて実施することができる。
【００３２】
また、配列番号１〜２７７における転写開始点を含むＤＮＡからコードされるタンパク質（翻訳産物）、当該タンパク質と相互作用する分子、ＲＮＡと相互作用する分子、又はＤＮＡと相互作用する分子を測定する場合は、プロテインチップ解析、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）、１−ハイブリッド法（PNAS 100, 12271-12276(2003)）や２−ハイブリッド法（Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998)）のような方法を用いることができ、対象に応じて適宜選択できる。
例えば、測定対象としてタンパク質が用いられる場合は、本発明の発現産物（この場合、翻訳産物）に対する抗体を生体試料と接触させ、当該抗体に結合した試料中のポリペプチドを検出し、そのレベルを測定することによって実施される。例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
尚、上記翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体は、公知の方法に従って製造することができる。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該タンパク質の部分ポリペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。
一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌等で発現し精製したタンパク質又は該タンパク質の部分ポリペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞から得ることができる。また、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイを用いて作製してもよい（Griffiths, A.D.; Duncan, A.R., Current Opinion in Biotechnology, Volume 9, Number 1, February 1998 , pp. 102-108(7)）。
また、免疫組織化学分析法を行う場合には、患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用するのが好ましい。二次抗体としては、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素標識抗体を用いることができるが、ＡＢＣ法やＬＳＡＢ法等の三段階法、またＤＡＫＯ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ検出システム等を用いて高感度な検出を行うのが好ましい。
【００３３】
斯くして、子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中の本発明の発現産物の発現レベルが測定され、当該発現レベルに基づいて、リンパ節転移又はリンパ節転移能の有無が評価される。具体的には、検出された本発明の発現産物の発現レベルを対照レベルと比較することによって評価される。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織若しくは子宮体がん患者から分離された正常組織における当該発現産物の発現レベル、又は子宮体がんを発症していない健常人群における当該発現産物の発現レベルが挙げられる。
例えば、対象患者のがん組織の当該発現産物の発現レベルが、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い（又は低い）場合には、当該患者の子宮体がんはリンパ節転移がない又はリンパ節転移能が低いと評価できる。
【００３４】
また、本発明における子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能の評価は、本発明の発現産物の発現レベルの上昇／減少により行うこともできる。この場合は、対照レベルとして、例えば正常組織、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織或いは健常人の組織由来の当該発現産物の発現レベルに基いて、標準値（閾値レベル）を設定し、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルを標準値と比較する（例えば±２Ｓ．Ｄ．の範囲を許容範囲とする）ことにより行うことができる。例えば、患者由来の生体試料における当該発現産物の発現レベルが閾値レベルより高い又は低い場合に、当該患者の子宮体がんはリンパ節転移がない又はリンパ節転移能が低いと評価できる。
【００３５】
本発明の方法に従い、必要に応じて他の方法（CT,MRIやPET-CTなど）との組み合わせで、提供された情報に基づいて、リンパ節転移の可能性又はリンパ節転移能が判断される。リンパ節生検やリンパ節郭清を行う基準は医師の判断に委ねられるが、リンパ節転移の可能性がある又はリンパ節転移能が高いと判断された場合には、例えばリンパ節郭清を行うことができる。一方、リンパ節転移の可能性がない又はリンパ節転移能が低いと判断された場合には、リンパ節郭清を行う必要はないと考えられる。
【００３６】
本発明の子宮体がんのリンパ節転移又はリンパ節転移能を評価するための検査用キットは、患者から分離した生体試料における本発明の発現産物の発現レベルを測定するための検査試薬を含有するものである。具体的には、本発明の発現産物（転写産物）等と特異的に結合（ハイブリダイズ）するオリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅、ハイブリダイゼーションのための試薬、或いは、本発明の発現産物（翻訳産物）を認識する抗体を含む免疫学的測定のための試薬等が挙げられる。当該キットに包含されるオリゴヌクレオチド、抗体等は、上述したとおり公知の方法により得ることができる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００３７】
実施例１  リンパ節転移性の子宮体がんと非転移の子宮体がんの判別を可能にする転写開始領域の抽出と検証
（１）検体試料の入手
術前に包括的同意を頂いた患者の手術摘出検体で、子宮筋層浸潤が１／２以下の子宮体がん（高分化型腺癌）の子宮内膜癌部を５mm各採取した。使用したサンプルは、転写開始領域抽出用サンプルとして１０検体（うち、リンパ節転移ありが３検体、リンパ節転移なしが７検体）、検証用サンプルとして５検体（うち、リンパ節転移ありが２検体、リンパ節転移なしが３検体）である。【００３８】
（２）試料の保存・調製
摘出された組織片は、適宜冷凍処理されて−８０℃で保存した。保存組織片は、２ｍＬマイクロチューブに組織片を５０ｍｇ以下になるように入れてキアゲン社製ＱＩＡｚｏｌを添加して、ジルコニアビーズを１個入れて密閉し、キアゲン社製ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いて浸透処理により破砕した。【００３９】
（３）ＲＮＡの調製
破砕・抽出処理を行った試料は、キアゲン社製ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔにより、添付されたプロトコルに従ってＲＮＡ調製を行った。調製後のＲＮＡは、分光高度計による紫外吸収（２３０、２６０、２８０ｎｍ）を測定して、２６０／２３０、２６０／２８０比を算出し、そのＲＮＡの質を検定した。また、アジレント社製ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ｎａｎｏ  ｃｈｉｐにより電気泳動を行い、ＲＮＡ分解度を示すＲＩＮ値を算出して、ＲＮＡの分解度合いを検定した。【００４０】
（４）ＣＡＧＥライブラリー調製
精製ＲＮＡを５μｇ用意し、非増幅非タグ化ＣＡＧＥ法（「細胞工学別冊  次世代シークエンサー目的別アドバンストメソッド」、菅野純夫、鈴木穣監修、学研メディカル秀潤社、2012年09月19日発行）内、第３章３、“網羅的プロモーター解析（イルミナシーケンサーを用いた非増幅ＣＡＧＥ法）”参照）により、ＣＡＧＥライブラリーを調製した。具体的には、精製ＲＮＡを逆転写反応に供して精製後、過ヨウ素酸ナトリウムによりリボースのジオールを参加してアルデヒド化し、ビオチンヒドラジドを添加してアルデヒド基にビオチンを付加した。ＲＮａｓｅＩにより一本鎖ＲＮＡ部分を消化・精製後、アビジン磁気ビーズによりビオチン化されたＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖のみをビーズ表面に結合させ、ＲＮａｓｅＨ消化及び熱処理によりｃＤＮＡを遊離させて回収した。回収したｃＤＮＡの両端にシーケンスに必要なアダプターを連結させた後、イルミナ社製ＨｉＳｅｑ２５００によりシーケンスを行った。なお、本工程において精製・緩衝液置換等に用いるＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター社製）の標準的な条件では、二本鎖の場合で１００塩基以上の長さの核酸が回収される条件であり、これを採用した本工程により生産されるＣＡＧＥライブラリーは１００塩基以上の鎖長をもつ二本鎖ＤＮＡからなる。【００４１】
（５）ＲＮＡ発現解析
ｉ）リファレンス転写開始領域の準備
ヒトの初代培養細胞や細胞株、さらに組織等を含め合計約１０００ものヒトサンプルについて転写開始点の活性がゲノムワイドに測定されたプロファイルするプロジェクトである「ＦＡＮＴＯＭ５」（論文投稿中）において同定された転写開始領域のうち、ヒトリファレンスゲノムｈｇ１９上に定義された約１８万の転写開始領域をリファレンス転写開始領域とした。【００４２】
ｉｉ）転写活性の定量
シーケンシングにより得られたリードとヒトのリファレンスゲノム(hg19)のアラインメントをbwa(Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60)を用いて行った。マッピングクオリティが20以上、かつアラインメントの開始位置が、リファレンス転写開始領域内に位置するようなアラインメントだけを選択し、各転写開始領域ごとのリード数を数え上げた。各ライブラリーの総リード数と、RLE(Genome Biol. 2010;11(10):R106)法により推定されたライブラリサイズを用いて、カウントを100万あたりのリード数(counts per million)に変換する。【００４３】
（６）結果
（Ａ）活性の異なる転写開始領域の抽出
上記で定量された、転写開始領域抽出用各サンプルでの転写活性について、「リンパ節転移あり」から得られた臨床検体由来プロファイル群、「リンパ節転移なし」から得られた臨床検体由来プロファイル群の間における差分解析をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｅｄｇｅＲパッケージ（Bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40）を用いて行った。すなわち、二群間で発現量の平均が異なるかどうか（発現量の平均が等しいことを帰無仮説とし、この帰無仮説が真であることを仮定した場合、測定結果が偶然に起きる確率を計算する）を統計的に検定するものである。閾値としてＦＤＲ（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）５％を設定したところ、これよりも小さな転写開始領域を含むＤＮＡを２７７個同定した（表１−１〜表１−１２）。この基準は、該当する閾値により抽出される候補のうち９５％は真に発現差があると統計的に推定されたものであり、通常広く使われるＰ値(発現差が無いことを仮定した場合に偶然起きる確率)を５％とする場合よりも厳しい基準である。【００４４】
【表１−１】
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【００４５】
【表１−２】
2015105190.tif 000003
【００４６】
【表１−３】
2015105190.tif 000004
【００４７】
【表１−４】
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【００４８】
【表１−５】
2015105190.tif 000006
【００４９】
【表１−６】
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【００５０】
【表１−７】
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【００５１】
【表１−８】
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【００５２】
【表１−９】
2015105190.tif 000010
【００５３】
【表１−１０】
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【００５４】
【表１−１１】
2015105190.tif 000012
【００５５】
【表１−１２】
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【００５６】
（Ｂ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（１）
上記（Ａ）で同定された転写開始領域のうち、一つの発現レベルのみを用いてリンパ節転移の有無を分類できるかどうかを考える。それぞれについて、何らかの閾値を設定することで、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できることを確認した。表２に、その閾値の例を示す（ある群における最大値の方が、その他の群における最小値よりも小さい場合、これらの平均を表２に示している）。【００５７】
【表２】
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【００５８】
（Ｃ）高精度の予測を行う転写開始領域の選択（２）
上記で同定された２７７個の転写開始領域の発現レベルのうち、複数を用いてリンパ節転移の有無を分類できるかどうかを考える。例としてここでは、一般化線形モデルの一種であるロジスティック回帰モデルを構成することを考える。これは、リンパ節転移の有無を示す従属変数（Ｙ）を、転写開始領域の発現レベルである説明変数（Ｘｉ、上記ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎの対数をとったもの）で確率的に予測することを考える場合、最もシンプルなモデルの一つである。【００５９】
上記２７７個の転写開始領域から選択した二個のすべての組み合わせ（３８，２２６組）について、これらの発現レベルを説明変数とし、転写開始領域抽出用サンプルに関するリンパ節転移の有無を推定するロジスティック回帰モデルの構築を行い、転写開始領域抽出用サンプル、検証用サンプル共に特異度１００％・感度１００％で分類できるものを選択した（表３−１〜表３−６）。
ここでは、機械学習器の中でも最も単純なものの一つであるロジスティック回帰モデルを採用しているが、当該ＴＳＳの発現を測定する方法や、他の遺伝子等の発現レベルや遺伝子型との組み合わせ等によって、他の数理モデルを適切に利用することで、より頑健な予測が可能になる。【００６０】
【表３−１】
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【００６１】
【表３−２】
2015105190.tif 000016
【００６２】
【表３−３】
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【００６３】
【表３−４】
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【００６４】
【表３−５】
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【００６５】
【表３−６】
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【００６６】
実施例２
実施例１で用いた検体とは別の手術摘出検体２３検体（リンパ節転移あり９検体、リンパ節転移なし１４検体）を用いて、実施例１と同様に、ＣＡＧＥライブラリーを調製してリンパ節転移ありの群とリンパ節転移なしの群で活性の異なる転写開始領域を抽出した。その結果、配列番号３５、３６、６３、７３、１４０、１６１、１８９、１９３、２０５及び２１９で示される転写開始領域の転写活性レベルが、転移あり／なしの群の間で優位に異なることが確認された（表４）。【００６７】
【表４】
2015105190.tif 000021
【００６８】
実施例３  ＴＡＣＣ２をマーカーとして用いたリンパ節転移性の子宮体がんと非転移の子宮体がんの判別
（１）検体
術前に包括的同意を頂いた患者の手術摘出検体（子宮筋層浸潤が１／２以下の子宮体がん（高分化型腺癌）の子宮内膜癌部を５mm各採取）で、リンパ節転移あり又はリンパ節転移なしと診断がなされている検体を使用した。【００６９】
（２）免疫化学染色によるタンパク質の検出
患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料とした。次いで切片試料を、熱処理（121℃、10分）して抗原を賦活化した。次いで、抗ＴＡＣＣ２抗体（EMD Millipore社、「Polyclonal Rabbit anti-TACC2 antibody」）（一次抗体、濃度0.5μg／ｍL）を一晩（4℃）反応させた。緩衝液にて十分に洗浄後、二次抗体としてAnti-Rabbit Immunoglobulins (DAKO #E432)を用い、30分間（20℃）反応させた。緩衝液にて十分に洗浄後、標識試薬Peroxidase-conjugated streptavidin (DAKO #P0397)を用い、30分間（20℃）反応させた（ABC法）。緩衝液にて十分に洗浄後、ＤＡＢを用いて発色させた。その標本を光学顕微鏡下で陽性・陰性を観察した。その一例を図１に示す。
その結果、リンパ節転移あり／なしの間で染色パターンが異なり、ＴＡＣＣ２をマーカーとして両者を区別可能であることが確認された。【００７０】
（３）ｑＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＲＮＡ量の測定
検体組織からＲＮＡ抽出キット（QIAGEN、RAase Plus Mini Kit (#74134)）を用いて全ＲＮＡ抽出した。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応は、TAKARA、PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(#6210A)により行った。リアルタイムＰＣＲは、ABI、Fast SYBR Green Master Mix (#4385612)を用い、以下に示すプライマーを用いて、ABI 7500 Fast Real Time PCR Systemで実施した。
Primer F: CCAgTTgCTgAAgggCAgAA（配列番号２７８）
Primer R: gCggACCTTggAgTCTgAg（配列番号２７９）
尚、ＴＡＣＣ２遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、ＳＵＤＳ４で補正し、対照に対する相対変化量として算出した。結果を図２に示す。
図２より、このプライマーを用いて行ったリアルタイムＰＣＲでは、リンパ節転移あり／なしの間ではＴＡＣＣ２の発現レベルが異なり、ＴＡＣＣ２をマーカーとして両者を区別することは可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、術前又は術中に採取した子宮内膜の原発巣を調べることで、子宮体がんのリンパ節転移有無の判断や発生の予測を、客観的に行うことができる。これにより、不要なリンパ節郭清の回避でき、術後リンパ浮腫などの合併症を減らすことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015105190.tif 000031
2015105190.tif 000032
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