(57)【要約】  ＭＭＰ−１産生の抑制剤を提供することを目的とする。  アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュからなる群から選択される１又は２以上の植物抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１産生抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュからなる群から選択される１又は２以上の植物抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項２】
前記植物抽出物が溶媒を用いて抽出された植物抽出物である、請求項１に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項３】
前記溶媒がアルコールを含む溶媒である、請求項２に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項４】
前記ＭＭＰ−１の産生が開始される前又は開始された後に適用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項５】
前記ＭＭＰ−１が皮膚を構成する細胞により産生される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項６】
前記細胞が真皮線維芽細胞である、請求項５に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項７】
前記ＭＭＰ−１の産生が紫外線への曝露又は炎症に起因する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項８】
前記紫外線がＵＶＢである、請求項７に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項９】
表皮に適用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１０】
皮下に適用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１１】
皮膚の老化を予防又は改善するために用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１２】
前記皮膚の老化がシワ又はたるみである、請求項１１に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤を含む皮膚外用剤。
【請求項１４】
皮膚外用剤の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生阻害剤の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤又は請求項１４に記載の皮膚外用剤を適用することを含んでなる、皮膚の非医療的な処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ産生抑制剤及び当該抑制剤を含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は外側から角層、表皮、基底膜、及び真皮より構成されている。真皮は、細胞成分と、これらの細胞が産生する細胞外マトリックスと呼ばれる巨大分子の網目構造によって満たされている。細胞成分として、線維芽細胞、マクロファージ、肥満細胞、血管や神経の構成細胞の存在が知られており、細胞外マトリックスとして、コラーゲンやエラスチン等の線維性タンパク質、及びヒアルロン酸やプロテオグリカン等の多糖類などの存在が知られている。細胞外マトリックスとしてのコラーゲン線維は、真皮の乾燥重量の約７０％を占めると言われており、皮膚のハリや弾力の維持に重要な役割を担っている。コラーゲン分子には２０種類のサブタイプが存在するが、真皮に存在するコラーゲン線維の大部分はＩ型コラーゲンである。【０００３】
マトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix Metalloproteinase：以下、「ＭＭＰ」とする。）は、細胞外マトリックスの分解代謝に関与するタンパク質分解酵素である。ＭＭＰは、分子構造や基質特異性などの観点から、いくつかのサブタイプに分類されている。例えば、ＭＭＰ−１はＩ型コラーゲンの３重螺旋構造を分解し、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９は基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンやゼラチンを分解する。ＭＭＰは真皮細胞外マトリックスの代謝をコントロールしているだけでなく、細胞の湿潤やサイトカイン等の生理活性分子の活性化にも深く関与しており、種々の疾患との関連性が報告されている。とりわけ皮膚においては、紫外線曝露や様々な炎症によりＭＭＰが過剰に産生され、当該ＭＭＰがコラーゲンやエラスチンを分解・変性し、皮膚のシワやたるみの原因になることが明らかになっている。【０００４】
これらの背景のもと、ＭＭＰの制御という観点から様々な検討が行われており、ＭＭＰの活性を阻害する植物抽出物などが多く報告されている（特許文献１及び２）。さらに、酵素の産生そのものを抑制し、ＭＭＰの作用を根本的に抑制することを意図した、酵母培養液を有効成分とするＭＭＰ−１産生抑制剤（特許文献３）、スルフヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有する化合物を有効成分とするＭＭＰ−１産生抑制剤（特許文献４）などが報告されている。一方、近年、脂質や糖代謝を維持する遺伝子群の発現制御を担う核内受容体であるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（Peroxisome Proliferator-activated receptor、以下、「ＰＰＡＲ」とする。）のサブタイプの１つであるＰＰＡＲδのアゴニストが、線維芽細胞においてＵＶＢ曝露によるＭＭＰ−１の産生を抑制することが示唆されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１９６５２６号公報
【特許文献２】特開平７−２９１８７３号公報
【特許文献３】特開２００９−２４６３８号公報
【特許文献４】特開２００２−４７１７８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】SA Ham et al: Journal of Investigative Dermatology 133, 2593-2600 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、「ＵＶＢまでの短波長紫外線は真皮までほとんど透過しないため、真皮へ影響する紫外線は主にＵＶＡである」（今川孝太郎他、「光が皮膚に与える影響」、日レ医誌（ＪＪＳＬＳＭ）第３２巻第４号（２０１２）、第４４８頁２２〜２４行）と記載されているように、通常の環境下において、皮膚が紫外線に曝露されたとしても、ＵＶＡを除くそのほとんどは真皮に到達することができないと考えられている。したがって、通常の環境下での真皮線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生は、真皮線維芽細胞に対するＵＶＡの直接的な作用か、又はＵＶＢに曝露された皮膚細胞により産生される炎症性サイトカインや活性酸素種（ＲＯＳ）を介した間接的な作用によるものと考えられている。非特許文献１は、真皮由来の線維芽細胞にＵＶＢを直接照射するものであり、皮膚がＵＶＢに曝露される環境とは異なる。即ち、ＰＰＡＲδのリガンド剤が、通常の環境下で起こり得るＭＭＰ−１の産生を抑制することは、知られていない。本発明は、ＭＭＰ−１産生の抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の事情の下、本願の発明者らは、様々な素材を探索し、ＭＭＰ−１産生を抑制する活性を見出すことに着手した。その結果、特定の植物より調製した植物抽出物が、ＭＭＰ−１産生を効果的に抑制することが判明した。かかる知見に基づいて、本発明を完成させた。【０００９】
本発明は、以下を提供する。
（１）アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュからなる群から選択される１又は２以上の植物抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１産生抑制剤。
（２）前記植物抽出物が溶媒を用いて抽出された植物抽出物である、（１）に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（３）前記溶媒がアルコールを含む溶媒である、（２）に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（４）前記ＭＭＰ−１の産生が開始される前又は開始された後に適用する、（１）〜（３）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（５）前記ＭＭＰ−１が皮膚を構成する細胞により産生される、（１）〜（４）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（６）前記細胞が真皮線維芽細胞である、（５）に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（７）前記ＭＭＰ−１の産生が紫外線への曝露又は炎症に起因する、（１）〜（６）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（８）前記紫外線がＵＶＢである、（７）に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（９）表皮に適用する、（１）〜（８）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（１０）皮下に適用する、（１）〜（８）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（１１）皮膚の老化を予防又は改善するために用いられる、（１）〜（１０）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（１２）前記皮膚の老化がシワ又はたるみである、（１１）に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
（１３）（１）〜（９）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤を含む皮膚外用剤。
（１４）皮膚外用剤の製造における、（１）〜（９）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生阻害剤の使用。
（１５）（１）〜（１２）のいずれかに記載のＭＭＰ−１産生抑制剤又は（１３）に記載の皮膚外用剤を適用することを含んでなる、皮膚の非医療的な処置方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アシュワガンダ、トケイソウ、ハリエンジュという特定の植物より得られる抽出物を用いることにより、ＭＭＰ−１産生を顕著に抑制することが可能となる。このような抑制効果は、本願の発明者により見い出された、紫外線曝露や炎症のような通常の環境下でのＭＭＰ−１産生の誘導に対しても効果的に作用した。本発明によれば、ＭＭＰ−１産生に起因する真皮の細胞外マトリックス、特にコラーゲンの分解が抑制され、優れた老化防止効果が発揮される。即ち、老化防止効果に優れた皮膚外用剤が提供される。これに他の薬剤、例えば美白剤や抗酸化剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、保湿剤、紫外線防止剤等を組み合わせることにより、更に高い老化防止効果が期待できる。上記のような優れた効果は、先行技術から予測することはできない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＵＶＢを照射された表皮角化細胞によるＩＬ−１βの産生を示す。コンフルエントのヒト表皮角化細胞にＵＶＢを０〜６０秒照射し、２４時間後（◆）及び７２時間後（■）の培地中のＩＬ−１βの濃度を定量した。
【図２】図２は、ＩＬ−βの存在下における真皮線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生を示す。コンフルエントのヒト真皮線維芽細胞をＩＬ−１βで２４時間処理し、培地中のｐｒｏＭＭＰ−１を定量し、ＭＭＰ−１の産生量とした。
【図３】図３は、過酸化水素により誘導される活性酸素種（ＲＯＳ）の産生抑制に対する植物抽出物の効果を示す。ＡＧ：アシュワガンダの抽出物、ＰＦ：トケイソウの抽出物、ＮＡＣ：Ｎ−アセチルシステイン。**：Ｐ＜０．０１対コントロール、＃：Ｐ＜０．０５対過酸化水素のみ添加、＃＃：Ｐ＜０．０１対過酸化水素のみ添加。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜ＭＭＰ−１産生抑制剤＞
本発明は、植物抽出物を有効成分として含有する、ＭＭＰ−１産生抑制剤を提供する。
【００１３】
本発明において、植物抽出物とは、ＭＭＰ−１の産生を抑制することのできる植物由来の抽出物を意味する。当該植物抽出物の原料となる植物は、様々な植物を対象とするスクリーニングにより見いだされた、アシュワガンダ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）、トケイソウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）、及びハリエンジュ（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓeｕｄｏａｃａｓｉａ）からなる群から選択される１種又は２種以上とすることができる。以下、各植物について説明する。
【００１４】
アシュワガンダは、ナス科の植物であり、その葉や根はインドの伝統医療アーユルヴェーダで長寿の薬サラヤンとして古くから用いられている。本発明において、好ましくは根を用いることができる。トケイソウは、トケイソウ科の植物であり、その地上部はパッションフラワーといわれ、ヨーロッパでは神経不安や不眠症などに用いられるハーブである。本発明において好ましくは地上部を用いることができる。ハリエンジュは、ニセアカシアとも呼ばれるマメ科の植物であり、本発明においては好ましくは花を用いる。
【００１５】
本発明で使用する植物抽出物の原料として用いる植物は、各植物について上記で説明した部位を用いることが好ましいが、これに制限されるものでなく、蕾、花、果実、果皮、種子、葉、枝、幹、樹皮、根、根皮、地上部、全草など全ての部位を使用することができる。また、上述の好ましい部位に加えて、上記の全ての内容から選択される１種又は２種以上を併せて用いてもよい。
【００１６】
原料となる植物体は、生又は乾燥したものを用いることができ、必要により、粉砕、細切、粉末化等の加工をして用いることができる。また生薬として入手可能なものはそれを用いてもよい。
【００１７】
植物抽出物は、原料となる植物から溶媒を用いて直接抽出することで得ることができる。当該抽出溶媒としては、特に限定されないが、水、アルコール、液状多価アルコール（例えば１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（例えばアセトン、メチルエチルケトン）、エステル類（例えば酢酸エチル、酢酸ブチル等）などが挙げられる。ここで、アルコールとして、炭素数が１〜４の低級アルコールが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等を例示することができる。これらの抽出溶媒は、単独で用いることができるし、２種以上を混合して用いることもできる。また、本発明において用いる溶媒には、得られる植物抽出物の抽出効率やＭＭＰ−１産生抑制作用が大きく損なわれない限り、任意の他の成分を含んでいてもよい。
【００１８】
溶媒による植物抽出物の調製の一態様として、原料となる植物をアルコールを含む溶媒で処理することにより、植物抽出物を得ることが挙げられる。アルコールの濃度は、得られる植物抽出物がＭＭＰ−１産生を抑制する効果を有する限り、特に制限されない。抽出溶媒中におけるアルコールの濃度は、約１０〜１００容量％、好ましくは約１０〜７０容量％である。アルコールを含む溶媒としては、アルコール水溶液を好適に用いることができる。本発明においては、安全性の観点から、アルコールとしてエタノールを用いることが好ましい。
【００１９】
原料植物の抽出方法は、特に限定されるものではないが、公知の手段に従い、所望に応じて適宜設定することができる。例えば、溶媒中に原料植物を浸漬すること等によって溶媒を原料植物と接触させ、必要に応じ、静置保存、攪拌、又は加熱還流してもよい。抽出温度は、特に制限されるものではなく、溶媒の温度に応じて適宜設定すればよいが、操作上の観点から、溶媒の沸点以下とすることができる。また、必要に応じて、加圧や減圧等の条件を設定することもできる。
【００２０】
抽出時間は、用いる植物原料の種類や抽出溶媒の種類及び使用量等により適宜設定すればよい。その使用量は、通常、原料植物１重量部に対して１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍、さらに好ましくは1〜１０倍とすることができ、抽出時間は、通常、約１０分〜１ヶ月程度、好ましくは１０分〜７日程度とすることができる。また、溶媒として熱水を用いる場合、その使用量は、通常、原料１重量部に対して１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍、さらに好ましくは1〜１０倍とすることができ、抽出時間は、通常、約１０分〜７日程度、好ましくは１０分〜１日程度、さらに好ましくは１０分〜１時間程度とすることができる。
【００２１】
本発明の植物抽出物は、上記の抽出操作の後、抽出残渣を分離して抽出液の形態とする。この分離手段としては、公知の方法を用いることができ、例えば濾過、遠心分離などを用いることができる。本発明においては、上記抽出液のまま使用してもよい。或いは、ＭＭＰ−１産生抑制作用の調整、輸送の簡便性、又は保存の簡便性等の様々な観点から、必要に応じて、前記抽出液の濃縮物又は乾燥物（濃縮乾固物）を得、これを使用してもよい。濃縮は常圧又は減圧下で行うことができ、得られる濃縮液の容積を、濃縮前の抽出液の容積の約１０〜５０容量％、好ましくは約１０〜３０容量％に調整してもよい。乾固物は、抽出液を減圧下で乾燥させ、溶媒を除去することによって得ることができる。
【００２２】
また、植物抽出物は、上記した溶媒を用いる方法以外の方法によって調製することもできる。例えば、水蒸気蒸留や、超臨界抽出技術を用いた二酸化炭素抽出、さらには圧搾処理を施した後に得られる圧搾液（搾汁）および／又は残渣に溶媒を加えて抽出することで得られるもの、前記の圧搾液そのものも、本発明の植物抽出物の定義に含まれる。また、本発明の植物抽出物は、必要に応じ、カラムクロマトグラフィー等でその活性成分を分画精製してもよい。
【００２３】
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、ＭＭＰ−１が産生されるいずれの対象に適用することができ、それによりＭＭＰ−１の産生を抑制する。ここで、ＭＭＰ−１産生抑制とは、ＭＭＰ−１の産生を完全に抑制することに限定されるものではなく、ＭＭＰ−１の過剰産生を抑制するなどのＭＭＰ−１産生の部分的な抑制で足りるものとする。本明細書において「対象」とは、哺乳動物を意味し、好ましくはヒトである。
【００２４】
ＭＭＰ−１が産生される組織は、限定されないが、皮膚を例示することができる。よって、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、皮膚におけるＭＭＰ−１の産生の抑制に適用することができる。そして、皮膚は、角層、表皮、基底膜、及び真皮から構成されるが、ＭＭＰ−１は主として真皮において産生される。よって、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、真皮におけるＭＭＰ−１の産生を抑制するために適用することができる。更に、真皮におけるＭＭＰ−１の産生は、真皮に存在する細胞により行われる。よって、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、真皮に存在する細胞によるＭＭＰ−１の産生を抑制するために適用することができる。また、真皮においてＭＭＰ−１を産生する細胞は主として線維芽細胞である。よって、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、真皮に存在する線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生を抑制するために適用することができる。
【００２５】
皮膚において、ＭＭＰ−１は定常的に産生され、真皮の代謝制御に関与している。一方、ＭＭＰ−１は、刺激によって過剰に産生され、様々な疾患に関与することも知られている。ここで、刺激とは、皮膚に関して例示するとすれば、紫外線及び炎症等が挙げられる。よって、本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、皮膚の紫外線曝露又は皮膚の炎症により誘導される、真皮におけるＭＭＰ−１産生を抑制するために適用することができる。ここで、紫外線として、波長の異なるＵＶＡとＵＶＢの存在が知られている。ＵＶＡは表皮を通過して真皮にまで到達し、真皮の線維芽細胞に作用してＭＭＰ−１の産生を誘導すると考えられている。一方、ＵＶＢは、真皮にほとんど到達しないため、真皮の線維芽細胞に直接作用してＭＭＰ−１産生を誘導することはできないと考えられている。即ち、皮膚がＵＶＢに曝露されることにより、真皮でのＭＭＰ−１の産生が誘導されるとすれば、更なる別の因子が関与していることが示唆される。本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、皮膚のＵＶＢへの曝露により誘導される、真皮におけるＭＭＰ−１産生を抑制するために好ましく適用することができる。
【００２６】
ＵＶＢ曝露によるＭＭＰ−１産生への影響は、非特許文献１に報告されている。当該報告では、ＵＶＢを真皮の線維芽細胞に直接照射した検討がなされている。しかし、上記で説明したように、ＵＶＢを皮膚に照射したとしても、ＵＶＢは真皮へはほとんど到達しないため、非特許文献１の報告は通常の環境下において皮膚がＵＶＢに曝露される条件を反映しているとはいえない。一方、本願の発明者は、ＵＶＢ曝露により皮膚の表皮細胞（例えば、表皮角化細胞）がＩＬ−１β及びＲＯＳを産生することを見出した。更に、外因性のＩＬ−１βが、真皮の線維芽細胞によるＭＭＰ−１産生を刺激することも見出した。また、皮膚においてＲＯＳが発生すると、ＭＭＰ−１の産生を誘導するシグナルカスケード（ＭＡＰＫ）が活性化されることが知られている（Hyeon Ho Kim et al, Journal of Lipid Research 46, 1712-1720（2005）)。これらの事項から、皮膚がＵＶＢに曝露された場合、表皮細胞によりＩＬ−１β及び／又はＲＯＳが産生され、当該ＩＬ−１β及び／又はＲＯＳが真皮の線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生を誘導することが示唆された。よって、本願のＭＭＰ−１産生抑制剤は、皮膚のＵＶＢ曝露により産生されるＩＬ−１β及び／又はＲＯＳが媒介する真皮でのＭＭＰ−１産生を抑制するために適用することができる。そして、当該ＩＬ−１β及び／又はＲＯＳは表皮細胞により産生されたものであり、当該表皮細胞として表皮角化細胞が例示される。
【００２７】
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を適用する時期は特に制限されない。例えば、ＭＭＰ−１の産生が開始される前に本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を適用すれば、ＭＭＰ−１の産生を予防的に抑制することができる。別の例として、ＭＭＰ−１の産生が開始された後に本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を適用すれば、ＭＭＰ−１産生の程度を抑えることができる。このようなＭＭＰ−１の産生抑制作用によって、コラーゲン、特にＩ型コラーゲンの分解を防ぐことができる。
【００２８】
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤の適用は、ＭＭＰ−１の産生抑制効果が発揮される態様であれば、いずれの方法で行ってもよい。好ましくは、例えば、当該抑制剤を、塗布、貼付け、又は噴霧すること等により適用することができる。別の好ましい例として、当該抑制剤を皮下に注入することにより適用することもできる。しかし、これらの例に限定されるものではない。当該抑制剤の適用量は、ＭＭＰ−１の産生を抑制するために有効な量であればよい。当該抑制剤の適用は、１日１回としてもよいし、数回に分けてもよい。また、適用期間は１日又はそれ以上の日数とすることができる。当業者は、当該抑制剤を適用する対象（例えば、ヒト）の状態（年齢、性別、症状など）、及びその他の事情を考慮し、当該抑制剤の適切な適用量、適用回数、及び適用期間を決定することができる。
【００２９】
本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、限定されないが、皮膚の老化の予防又は改善に適用することができる。ＭＭＰ−１は、皮膚のＩ型コラーゲンの分解を介して、細胞外マトリックスの分解又は変性に関与する。皮膚の細胞外マトリックスの分解又は変性は、皮膚のシワやたるみの原因となる。本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤は、ＭＭＰ−１の産生を抑制することができるため、例えば、皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善に適用することができる。
【００３０】
＜皮膚外用剤＞
本発明によれば、上記で説明したＭＭＰ−１産生抑制剤を含有する皮膚外用剤が提供される。当該皮膚外用剤は、限定されないが、皮膚の老化の予防又は改善、並びに皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善に適用することができる。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤の適用は、ＭＭＰ−１の産生抑制効果が発揮される態様であれば、いずれの方法で行ってもよい。好ましくは、例えば、当該皮膚外用剤を、皮膚に塗布、貼付け、又は噴霧すること等により適用することができる。別の好ましい例として、当該皮膚外用剤を皮下に注入することにより適用することもできる。しかし、これらの例に限定されるものではない。当該皮膚外用剤の適用量は、ＭＭＰ−１の産生を抑制するために有効な量であればよい。当該皮膚外用剤の適用は、１日１回としてもよいし、数回に分けてもよい。また、適用期間は１日又はそれ以上の日数としてもよい。当業者は、当該皮膚外用剤を適用する対象（例えば、ヒト）の状態（年齢、性別、症状など）、及びその他の事情を考慮し、当該皮膚外用剤の適切な適用量、適用回数、及び適用期間を決定することができる。
【００３２】
本発明の皮膚外用剤は、許容される基材を更に含んでもよい。ここで、許容される基材としては、ヒトや動物に対する使用が許容されている成分を好ましい例として挙げることができる。当該基材は、ＭＭＰ−１産生抑制作用を著しく損なわないものであればよく、例えば、ビタミンＥ及びビタミンＣ等のビタミン類、水、アルコール、糖類、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤、乳化剤、緊張化剤(等張化剤)、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、吸収促進剤、安定化剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤、香料、凝固剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、エキス粉末、生薬、各種粉黛、キレート剤、無機塩、油剤、界面活性剤、血行促進剤、抗菌・殺菌剤、各種動植物・微生物抽出物等が挙げられる。これらの基材から、意図する使用態様に適切なものを選択し、使用することができる。例えば、本発明の皮膚外用剤を化粧料とする場合、上記の基材から化粧料や医薬部外品において使用可能なものを選択し、配合することができる。例えば、本発明の皮膚外用剤を医薬品とする場合、上記の基材から外用医薬品において使用可能なものを選択し、配合することができる。
【００３３】
本発明の皮膚外用剤は、意図する使用態様に則して適切な形態とすることができる。例えば、当該皮膚外用剤を化粧料として用いる場合、乳液、クリーム、化粧水、パック、フィルム、洗浄料、ファンデーション、軟膏、エアゾール等の形態にすることができる。別の例として、本発明の皮膚外用剤を医薬品として用いる場合、乳液、クリーム、水溶液、貼付け剤、フィルム、洗浄料、軟膏、エアゾール等の形態にすることができる。
【００３４】
本発明の皮膚外用剤は、ＭＭＰ−１の産生を抑制する作用を有する追加の成分と組み合わせて用いてもよい。当該追加の成分としては、例えば、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、保湿剤、紫外線防止剤等が挙げられる。ここで、組み合わせて用いるとは、当該追加の成分を本発明の皮膚外用剤に配合することだけでなく、当該追加の成分を本発明の皮膚外用剤と別の構成とし、本発明の皮膚外用剤を適用する前、後、又は同時に当該追加の成分を適用することも含む。
【００３５】
＜その他＞
本発明は、ＭＭＰ−１産生抑制剤の製造における、植物抽出物の使用を提供する。本発明は、皮膚外用剤の製造における、ＭＭＰ−１産生抑制剤の使用を更に提供する。本発明は、また、必要とする対象の皮膚に本発明のＭＭＰ−１産生抑制剤を適用することを含んでなる、非医療的な皮膚の処置方法を提供する。ここで、当該ＭＭＰ−１産生抑制剤、植物抽出物、皮膚外用剤、及び対象の態様については、上述した通りである。そして、本明細書でいう「非医療的」とは、病気や疾患の治療等の医療的な処置を目的とするものではなく、外観上の老化、例えば、シワやたるみなどを予防又は改善することにより、皮膚の外観を美しくしたり、美しさを保つなどの化粧上又は美容上の処置を意図する。
【実施例】
【００３６】
本実施例において、具体例を挙げて本発明を更に説明する。本実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。【００３７】
［試験例１］ＵＶＢ照射による表皮角化細胞によるＩＬ−１βの産生
成人由来正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ−ＡＤ、クラボウ株式会社より購入）を用いて、ＵＶＢによる表皮角化細胞でのＩＬ−１βの産生について評価した。３５ｍｍの培養ディッシュに細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。０．１３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを０〜６０秒間細胞に照射した。ＵＶＢ照射後２４時間及び７２時間の培地から培養上清を回収し、培地中に分泌されたＩＬ−１βを定量した。ＩＬ−１β定量ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付された説明書に従って、ＩＬ−１βの定量を行った（図１）。【００３８】
表皮角化細胞によるＩＬ−１βの産生量は、ＵＶＢの照射時間が長くなるにつれて、増加することが示された。特に、ＵＶＢの照射時間が２０秒を超えた場合、ＩＬ−１βの産生量が増加することが明確になった。このような傾向は、ＵＶＢ照射後２４時間及び７２時間のいずれにおいても観察された。また、ＵＶＢ照射後７２時間において、より多くのＩＬ−１βが蓄積していることが示された。【００３９】
［試験例２］ＩＬ−βによる真皮線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生
新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ、クラボウ株式会社より購入）を真皮線維芽細胞として用いて、ＭＭＰ−１の産生量を指標に検討を行った。２４ウェルプレートに真皮線維芽細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。ＩＬ−１βを最終濃度で０、３０、１００、３００、１０００ｐｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、２４時間培養した。培養後、培養上清を回収し、培地中に分泌されたｐｒｏＭＭＰ−１を定量した。定量ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付された説明書に従って、ｐｒｏＭＭＰ−１の定量を行い（図２）、ＭＭＰ−１の産生量とした。【００４０】
この結果より、ＩＬ−１βの存在により、真皮線維芽細胞においてＭＭＰ−１が産生することが示された。ＭＭＰ−１の産生量は、ＩＬ−１βの濃度に伴って増加した。この結果と試験例１の結果を併せて考えると、皮膚がＵＶＢに曝露されると、表皮角化細胞によりＩＬ−１βが産生され、当該ＩＬ−１βが真皮線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生を誘導し、当該ＭＭＰ−１がコラーゲンを分解するという一連のプロセスが示唆される。【００４１】
［調製例１］植物由来の抽出物の調製
様々な植物を対象とするスクリーニングにより選択した８種の植物をエタノール抽出し、抽出物を得た。アシュワガンダ、トケイソウ、ハリエンジュ、サクナ、ギョリュウモドキ、アニス、セキガイチャ、及びセイヨウニワトコの破砕物それぞれを、重量の１０（ｗ／ｖ）倍量の７０容量％エタノールに浸し、室温下、１日１回攪拌操作を加えて７日間抽出した。その後、濾過により残渣を除去し、抽出液を得た。当該抽出液を濃縮後、凍結乾燥することにより各植物のエタノール抽出物を得た。当該植物抽出物を本実施例で用いた。【００４２】
［試験例３］ＭＭＰ−１産生抑制効果
ＭＭＰ−１産生の抑制における植物由来の抽出物の効果について検討した。ＰＰＡＲδリガンド剤をポジティブコントロールとして、同様に検討した。新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＮＢ、クラボウ株式会社より購入）を真皮線維芽細胞として用いて、ＭＭＰ−１の産生量を指標として検討を行った。【００４３】
２４ウェルプレートに真皮線維芽細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。その後、以下の成分を添加した：
・ＤＭＳＯに溶解されたＰＰＡＲδリガンド剤ＧＷ５０１５１６（ＥｎｚｏＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、
・ＤＭＳＯに溶解された８種の植物それぞれより調製した植物抽出物（調製例１を参照）、又は
・添加なし（ＤＭＳＯ溶液のみ）。
添加した成分の培養液中の濃度は、ＧＷ５０１５１６に関しては２５ｎＭ、植物抽出物に関しては１０μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯに関しては０．１％とした。２４時間培養した後、ＩＬ−１βを最終濃度１００ｐｇ／ｍＬで培地に添加した。ここで、ＤＭＳＯ溶液のみを添加したウェルの一部にはＩＬ−１βを添加しないものとし、これをコントロールとした。４８時間培養後、培養上清を回収し、培地中に分泌されたｐｒｏＭＭＰ−１を定量し、ＭＭＰ−１の産生量とした。ｐｒｏＭＭＰ−１の定量は、定量ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、添付された説明書に従って行った。定量結果は、コントロールについてのＭＭＰ−１の産生量を１００％とする相対値（％）として示した（表１）。【００４４】
【表１】
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【００４５】
真皮線維芽細胞にＩＬ−１βのみを添加すると、ＭＭＰ−１の産生量は、およそ２２０％（コントロールの２．２倍）となった。そして、ＩＬ−１βを添加する前にＧＷ５０１５１６で細胞を処理した場合、ＭＭＰ−１の産生量は、１６５．２±６．８％となった。このことから、ＩＬ−１βによるＭＭＰ−１の産生が、ＧＷ５０１５１６により抑制されることが確認された。【００４６】
一方、本試験に供した８種類の植物由来の抽出物のうち、サクナ、ギョリュウモドキ、アニス、セキガイチャ、及びセイヨウニワトコより調製した５種類の植物抽出物で細胞を処理した場合、ＩＬ−１βのみを添加したものに比べて、ＭＭＰ−１の産生量は却って高くなることが示された。これに対して、アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュから調製した３種類の植物抽出物で細胞を処理した場合、ＩＬ−１βによるＭＭＰ−１の産生が強く抑制された。これら３種類の植物抽出物で処理した場合のＭＭＰ−１の産生量はそれぞれ、１４７．１±１．５％、２００．２±１．３％、及び２０５．６±１．８％であり、ＩＬ−１βのみを添加したものに比べて大幅に抑制された。とりわけ、アシュワガンダより調製した植物抽出物によるＭＭＰ−１産生の抑制効果は、ＧＷ５０１５１６による効果をも上回ることが確認された。試験に供した植物抽出物の中で、アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュから調製した３種類の植物抽出物のみがＭＭＰ−１の産生を強く抑制することは、全くの予想外であった。【００４７】
［試験例４］植物抽出物によるＭＭＰ−１産生抑制効果
試験例３において、ＭＭＰ−１産生を抑制することが確認された３種類の植物抽出物について、更に検討した。【００４８】
これらの植物抽出物の培地中の濃度を２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬとする以外は、試験例３と同様の条件で試験した。ＭＭＰ−１の産生量は、コントロールについてのＭＭＰ−１の産生量を１００％とする相対値（％）として示した（表２）。【００４９】
【表２】
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【００５０】
真皮線維芽細胞にＩＬ−１βのみを添加すると、ＭＭＰ−１の産生量は、およそ４４６％（コントロールの４．５倍に増加）となった。そして、本試験に供した３種類の植物抽出物はいずれも、試験した全ての濃度において、ＭＭＰ−１の産生を顕著に抑制した。これらの結果から、アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュより調製される植物抽出物は、優れたＭＭＰ−１産生抑制効果を有することが示された。【００５１】
以上より、通常の環境下で紫外線に曝露された皮膚において、ＵＶＢに曝露された皮膚細胞により産生される炎症性サイトカインを介する真皮線維芽細胞によるＭＭＰ−１の産生は、本発明により効果的に抑制されることが判明した。【００５２】
［試験例５］過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）により誘導される活性酸素種（ＲＯＳ）の産生抑制に対する植物抽出物の効果
ヒトの皮膚をＵＶＢに曝露すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が発生することが知られている（Hyeon Ho Kim et al, Journal of Lipid Research 46, 1712-1720（2005）)。本試験においては、過酸化水素の刺激による活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、及び植物抽出物によるＲＯＳの産生抑制について検討を行った。【００５３】
２４ウェルプレートに真皮線維芽細胞を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にてコンフルエントになるまで培養した。
その後、以下の成分を添加した：
・ＤＭＳＯに溶解された抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ナカライテスク社製）、
・ＤＭＳＯに溶解されたＰＰＡＲδリガンド剤ＧＷ５０１５１６（ＥｎｚｏＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、
・ＤＭＳＯに溶解された植物抽出物（調製例１を参照）、又は
・添加なし（ＤＭＳＯ溶液のみ）。
添加した成分の培養液中の濃度は、Ｎ−アセチルシステインに関しては３０μＭ及び３００μＭ、ＧＷ５０１５１６に関しては２５ｎＭ、植物抽出物に関しては１０μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬとし、ＤＭＳＯに関しては０．１％とした。２４時間培養した後、新しい培地に交換し、過酸化水素を最終濃度１０μＭで培地に添加し、１０分後の細胞内の活性酸素種レベルを定量し、ＲＯＳ産生量とした。ＲＯＳの定量は、ＤＣＦＤＡアッセイキット（Ａｂｃａｍ社製）を添付された説明書に従って使用することにより行った。ＤＭＳＯ溶液のみを添加したウェルの一部にはＨ２Ｏ２を添加しないものとし、これをコントロールとした。定量結果は、コントロールについてのＲＯＳ産生量を１００％とする相対値（％）として示した（図３）。【００５４】
成分を添加せず、過酸化水素を添加した細胞とコントロールの結果から、過酸化水素で細胞を刺激することによって、ＲＯＳの産生が誘導されることが確認された。そして、成分を添加せず、過酸化水素を添加した細胞についての結果と比較することにより、次の事項が示された：
・アシュワガンダの抽出物及びトケイソウの抽出物により、ＲＯＳの産生が抑制された。いずれの抽出物も、２０μｇ／ｍｌの添加により、ＲＯＳの産生を有意に抑制した；
・抗酸化剤として知られるＮ−アセチルシステインによっても、ＲＯＳの産生が抑制された。３００μＭの添加量において、ＲＯＳの産生を有意に抑制した。なお、ＧＷ５０１５１６は、ＲＯＳの産生抑制効果を示さなかった。【００５５】
以上より、アシュワガンダの抽出物及びトケイソウの抽出物は、過酸化水素の刺激により誘導されるＲＯＳの産生を抑制することが明らかとなった。その効果は、抗酸化剤として知られるＮ−アセチルシステインの効果に匹敵する又はそれ以上である。【００５６】
Hyeon Ho Kimら（Journal of Lipid Research 46, 1712-1720（2005））には、ヒトの皮膚が紫外線に曝露されると、過酸化水素が迅速かつ有意に産生されること、そして上昇したＲＯＳがシグナルカスケード（ＭＡＰＫ）の活性化に関与し、結果としてＭＭＰ−１の産生を誘導することが示唆されている。ここでは、更に、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤がＲＯＳを捕捉し、当該カスケードの活性化に干渉することにより、ＭＭＰ−１の産生を抑制する可能性も教示されている。これらの事項を上記の結果と併せて考えると、アシュワガンダ及びトケイソウは、過酸化水素により誘導されるＲＯＳの産生を抑制することによっても、ＭＭＰ−１の産生を抑制することが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月1日(2017.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシュワガンダ、トケイソウ、及びハリエンジュからなる群から選択される１又は２以上の植物抽出物を有効成分として含有するＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項２】
前記植物抽出物が溶媒を用いて抽出された植物抽出物である、請求項１に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項３】
前記溶媒がアルコールを含む溶媒である、請求項２に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項４】
前記ＭＭＰ−１の産生が開始される前又は開始された後に適用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項５】
前記ＭＭＰ−１が皮膚を構成する細胞により産生される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項６】
前記細胞が真皮線維芽細胞である、請求項５に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項７】
前記ＭＭＰ−１の産生が紫外線への曝露又は炎症に起因する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項８】
前記紫外線がＵＶＢである、請求項７に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項９】
表皮に適用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１０】
皮下に適用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１１】
皮膚の老化を予防又は改善するために用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１２】
前記皮膚の老化がシワ又はたるみである、請求項１１に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤を含む皮膚外用剤。
【請求項１４】
皮膚外用剤の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生阻害剤の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＭＭＰ−１産生抑制剤又は請求項１３に記載の皮膚外用剤を適用することを含んでなる、皮膚の非医療的な処置方法。
【国際調査報告】
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