(57)【要約】【課題】蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を捕捉する蛍光検出方法およびその検出用試料セルにおいて、捕捉する被検出物質の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する。【解決手段】蛍光標識（Ｆ）と特異的に結合する抗原（Ａ）を含有する試料液（Ｓ）を試料液流路（１１３）に流下させる。抗原（Ａ）および蛍光標識（Ｆ）を含有しない混相液（Ｇ）を混相液流路（１１４）に流下させる。試料液（Ｓ）および混相液（Ｇ）を試料液流路（１１３）および混相液流路（１１４）のいずれの幅よりも狭い二相流流路（１１５）に導き、二相流流路（１１５）において、試料液（Ｓ）と混相液（Ｇ）との二相流を発生せしめ、試料液（Ｓ）を側壁（１１５ａ）に沿って流下させる。側壁（１１５ａ）に設けられた検出部（２００）に蛍光標識（Ｆ）と特異的に結合した抗原（Ａ）を捕捉させ、検出部（２００）に励起光（Ｌ）を照射して蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて抗原（Ａ）の存在量を検出する。【選択図】図４
2016047027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質と特異的に結合する蛍光標識を用意し、
前記被検出物質および前記蛍光標識を含有する試料液を試料液流路に流下させ、
前記被検出物質および前記蛍光標識を含有しない混相液を混相液流路に流下させ、
前記試料液流路より流下された前記試料液および前記混相液流路より流下された前記混相液を、前記試料液流路および前記混相液流路よりも幅の狭い二相流流路に導き、前記二相流流路において、前記試料液と前記混相液との二相流を発生せしめ、前記試料液を前記二相流流路の一側壁に沿って流下させ、
前記一側壁に設けた検出部に前記蛍光標識と特異的に結合した前記被検出物質を捕捉させ、
前記検出部に励起光を照射し、
前記励起光の照射により前記蛍光標識が発する蛍光を検出し、
前記検出した蛍光の量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法。
【請求項２】
前記混相液流路として、前記試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いる請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記励起光を照射する工程において、前記励起光の照射により前記検出部からエバネッセント光を染み出させ、前記エバネッセント光により前記蛍光標識が前記蛍光を発する請求項１または２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記検出部が金属膜を備え、
前記励起光を照射する工程が、前記金属膜に対して、全反射以上の入射角で前記励起光を照射することより、前記金属膜上に電場を増強する表面プラズモンを発生させる請求項３に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記蛍光標識として、前記励起光および前記蛍光を透過する透光性誘電体材料中に蛍光色素分子を内包してなる蛍光ビーズを用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記蛍光ビーズが親水性を有するものであり、前記混相液に１．８パーセント以上の濃度を有する生理食塩水を用いる請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記蛍光ビーズが親水性を有するものであり、前記混相液として有機溶媒を用いる請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記蛍光ビーズを酸性または塩基性の官能基で表面修飾し、前記試料液のｐＨを前記官能基が電離分解できる値とし、前記混相液のｐＨを前記官能基が電離分解できない値とする請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記混相液に蛍光色素を有さないビーズを含有させ、前記混相液の単位体積当たりの前記ビーズの数を前記試料液の単位体積当たりの前記蛍光ビーズの数よりも多くする請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに１項に記載の蛍光検出方法に使用される検出用試料セルであって、
前記試料液を流下させる試料液流路と、
前記混相液を流下させる混相液流路と、
前記試料流路の下流端と前記混相液流路の下流端とに連通し且つ前記試料液流路および前記検出液流路のいずれの幅よりも狭い幅を有する二相流流路と、
前記蛍光標識と特異的に結合した前記被検出物質を捕捉する、前記二相流流路の側壁の一部に設けられた検出部とを備えた検出用試料セル。
【請求項１１】
前記混相液流路の幅が前記試料液流路の幅以上である請求項１０に記載の検出用試料セル。
【請求項１２】
前記二相流流路の幅が５μｍ以上１００μｍ未満の範囲である請求項１０または１１に記載の検出用試料セル。
【請求項１３】
前記試料液流路の下流端と、前記混相液流路の下流端と、前記二相流流路の上流端とが互いに連通する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の検出用試料セル。
【請求項１４】
前記試料液流路と前記二相流流路とのなす角度が、前記混相液流路と前記二相流流路とのなす角度に等しい請求項１３に記載の検出用試料セル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光検出方法および検出用試料セルに関する。より詳しくは、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質をマイクロ流路に流下させ、マイクロ流路に設けた検出部に捕捉させ、励起光を照射して蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法および検出用試料セルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病室や家庭等での検査を可能にするＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）検査が注目を集めている。このＰＯＣＴ検査を実現するため、マイクロ流路を備えた検出用試料セルを用いた生化学検査の研究が盛んに行われている。【０００３】
マイクロ流路を利用する生化学検査としては蛍光法が広く用いられている。蛍光法は、特定波長の光に励起されて蛍光を発する蛍光標識、および蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を含有する試料液をマイクロ流路に流下させ、マイクロ流路の一部に設けられた固体表面（固相）である検出部に捕捉させる。そして、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を捕捉した検出部に向けて励起光を照射し、蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する方法である。【０００４】
蛍光法には、感度の向上を図るため、検出部の表面から染み出すエバネッセント波を利用するエバネッセント蛍光法や、エバネッセント蛍光法の感度をさらに向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強を利用した表面プラズモン増強蛍光法等が知られている。【０００５】
また、感度の向上を図るには、検出部に捕捉される被検出物質の量を増加させることも重要である。図７Ａや図７Ｂに示されるような、検出部の表面に直交する方向に試料液を送液する技術（特許文献１）や、図８に示されるような、試料液を検出部上で往復させる送液技術（特許文献２）が提案されている。【０００６】
また、反応物質が固定された反応流路と、試料液を反応流路に導く試料注入流路と、試料液以外の流体を反応流路に導く他の流路を設け、反応流路内において、試料液以外の流体により試料液を反応物質側の一壁面に沿って流下させる技術（特許文献３）も提案されている。【０００７】
しかしながら、マイクロ流路内を流下する蛍光粒子は、図９に示すように、中央部分に偏って流下する傾向がある（非特許文献１）。したがって、蛍光粒子が検出部近傍を通過するように流下させることが望まれるが、技術的には確立されていない。なお、マイクロ流路を用いた微粒子を分離分級する手法については提案されている（非特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−２５７２６６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１１／０２７８５１号
【特許文献３】特開２００８−２０３１５８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】D.Ross et al., Anal. Chem. 2001, 73, 2509
【非特許文献２】山田真澄、関実  混相流  １９巻２号（２００５）pp.102-107  「マイクロフルイディクスを利用した微粒子の連続分離・分級」
【非特許文献３】山田真澄、関実  真空  Vol.49 No.7, 2006 pp.404-408  「マイクロ流路を用いた粒子の分級」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
蛍光標識と特異的に結合する被検出物質を検出部に捕捉させるには、被検出物質を検出部の表面から１００ｎｍ程度の領域まで近接させる必要がある。図１０はマイクロ流路を流下する試料液の送液を示す模式図である。【００１１】
しかしながら、被検出物質（抗原）は、図１０からも明らかなように、マイクロ流路内の中央付近に偏って流下され、大半の被検出物質は検出部の近傍の領域を通過しない。したがって、分散により検出部近傍に到達する被検出物の量は、試料液内の全被検出物質に対して、０．００１パーセント程度に過ぎない。すなわち殆どの被検出物質が検出部に捕捉されず、高感度な検出が困難となる虞がある。【００１２】
また、マイクロ流路の幅は、製造上の観点より、上記近傍領域より１０００倍程広い１００μｍ程度となり、中央付近に位置する被検出物質が、分散により検出部近傍に到達するには時間が掛かり、短時間での検出が困難となる虞もある。【００１３】
層流として流下する試料液に対しては、特許文献１および２のような、単に試料液を検出部に向けて送液する技術や、特許文献３のような、他の流体を用いて試料液を所望の方向に導く技術では、被検出物を短時間で検出部付近に移動させることは困難である。また、非特許文献１〜３には、蛍光法において、検出部に捕捉される被検出物質を増加させることについては何ら提言もされていない。【００１４】
本発明は、上記事情に鑑み、検出部に捕捉される、蛍光標識と特異的に結合した被検出物の量を増加させ、高感度且つ検出時間の短縮を実現する蛍光検出法および検出用試料セルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するため、本発明に係る蛍光検出方法は、被検出物質と特異的に結合する蛍光標識を用意し、被検出物質および蛍光標識を含有する試料液を試料液流路に流下させ、被検出物質および蛍光標識を含有しない混相液を混相液流路に流下させ、試料液流路より流下された試料液および混相液流路より流下された混相液を、試料液流路および混相液流路よりも幅の狭い二相流流路に導き、二相流流路において、試料液と混相液との二相流を発生せしめ、試料液を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、一側壁に設けた検出部に蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉させ、検出部に励起光を照射し、照射により蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて被検出物質の存在量を検出する。【００１６】
また、上記「照射により蛍光標識が発する蛍光」とは、励起光の照射により直接若しくは間接的に蛍光標識が励起されて発生する蛍光を意味する。また、上記「被検出物質の存在量を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み、その存在量を定量的に検出する意味である。【００１７】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、混相液流路として、試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いることが望ましい。【００１８】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、励起光の照射により検出部からエバネッセント光を染み出させ、エバネッセント光により蛍光標識が蛍光を発生させることが望ましい。【００１９】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、検出部が金属膜を備え、金属膜に対して、全反射以上の入射角で励起光を照射することより、金属膜上に電場を増強する表面プラズモンを発生させることが望ましい。【００２０】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光標識として、励起光および蛍光を透過する透光性誘電体材料中に蛍光色素分子を内包してなる蛍光ビーズを用いることが望ましい。【００２１】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズが親水性を有するものであり、混相液が１．８パーセント以上の濃度を有する生理食塩水であることが望ましい。ここで、「濃度」とは塩化ナトリウムの含有濃度を意味する。【００２２】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズが親水性を有するものであり、混相液として有機溶媒を用いることが望ましい。【００２３】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、蛍光ビーズを酸性または塩基性の官能基で表面修飾し、試料液のｐＨを官能基が電離分解できる値とし、混相液のｐＨを官能基が電離分解できない値とすることが望ましい。【００２４】
また、本発明に係る蛍光検出方法において、混相液に蛍光色素を有さないビーズを含有させ、混相液の単位体積当たりの蛍光ビーズの数を試料液の単位体積当たりの蛍光ビーズの数よりも多くすることが望ましい。【００２５】
また、本発明に係る検出用試料セルは、本発明に係る蛍光検出方法に使用される検出用試料セルであって、試料液を流下させる試料液流路と、混相液を流下させる混相液流路と、試料流路の下流端および混相液流路の下流端に連通し且つ試料液流路および検出液流路のいずれの幅よりも狭い幅を有する二相流流路と、蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉する、二相流流路の側壁の一部に設けられた検出部とを備えるものであってもよい。【００２６】
また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、混相液流路の幅が試料液流路の幅以上であることが望ましい。【００２７】
また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、二相流流路の幅が５μｍ以上１００μｍ未満の範囲であることが望ましい。【００２８】
また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、試料液流路の下流端と、混相液流路の下流端と、二相流流路の上流端とが互いに連通するものが望ましい。【００２９】
また、本発明に係る検出用試料セルにおいて、試料液流路と二相流流路とのなす角度が、混相液流路と二相流流路とのなす角度と等しいことが望ましい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の蛍光検出方法によれば、二相流流路において、試料液と混相液との二相流を発生せしめ、試料液を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、一側壁に設けた検出部に蛍光標識と特異的に結合した被検出物質を捕捉させ、検出部に励起光を照射し、照射により蛍光標識が発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて被検出物質の存在量を検出するため、蛍光標識と特異的に結合する被検出物質が検出部側の側壁に沿って検出部近傍を流下され、検出部に捕捉される量が増加して高感度且つ検出時間の短縮を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】蛍光検出装置の模式図
【図２】蛍光検出装置のブロック図
【図３】マイクロ流路内の模式図
【図４】マイクロ流路の部分拡大図
【図５Ａ】通常の検出用試料セルを用いた検出画像（その１）
【図５Ｂ】通常の検出用試料セルを用いた検出画像（その２）
【図６Ａ】二相流流路を有する検出用試料セルを用いた検出画像（その１）
【図６Ｂ】二相流流路を有する検出用試料セルを用いた検出画像（その２）
【図７Ａ】従来技術による試料液の送液を示す図（その１）
【図７Ｂ】従来技術による試料液の送液を示す図（その２）
【図８】従来技術による試料液の送液を示す図（その３）
【図９】マイクロ流路内を流下する蛍光粒子の画像
【図１０】マイクロ流路内を流下する試料液の送液を示す模式図
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、図面を参照して本発明の一実施形態を詳細に説明する。本実施形態は、被検出物質としての抗原Ａを検出する方法である。図１は本発明の実施形態に用いられる蛍光検出装置１の模式図である。図２は蛍光検出装置１のブロック図である。蛍光検出装置１は、一例として表面プラズモン増強蛍光法を利用した装置とする。
【００３３】
蛍光検出装置１には、抗原Ａを含有する検体液を収容する検体容器ＫＢ、抗原Ａを捕捉する検出用試料セル１００およびノズルチップＮＣが装着される。検体液は、例えば血清、血漿、尿等であり、抗原Ａとしては、例えばｈＣＧが挙げられる。
【００３４】
蛍光検出装置１は、ノズルチップＮＣ等を駆動させる検体処理部１１、検出用試料セル１００に励起光を照射する光照射部１２、励起光の照射により発生した蛍光を検出する蛍光検出部１３、検出した蛍光数を計測して抗原Ａの存在量を分析するデータ分析部１４を備えている。
【００３５】
検出用試料セル１００は、マイクロ流路１１０が形成された基材１００ａ、蛍光標識Ｆを含有する試薬を収容する試薬セル１２０、混相液Ｇを収容する混相液セル１３０、試料液Ｓを注入する注入ウェル１４０、混相液Ｇを注入する注入ウェル１５０、試料液Ｓおよび混相液Ｇを排出する排出ウェル１６０が形成された蓋材１００ｂ、マイクロ流路１１０の一部に設けられた、抗原Ａを捕捉する検出部２００を備えている。
【００３６】
基材１００ａには、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることが望ましい。
【００３７】
蛍光標識Ｆは、抗原Ａと特異的に結合し、励起光が照射されると蛍光を発するものである。また、混相液Ｇは抗原Ａおよび蛍光標識Ｆを含有しない溶液である。試料液Ｓが体液由来、例えば血清、血漿、尿、鼻水の場合、混相液Ｇとしては、生理食塩水の通常の濃度（０．９パーセント程度）の２倍以上（１．８パーセント以上）の濃度を有する生理食塩水が挙げられ、具体的にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることが望ましい。
【００３８】
マイクロ流路１１０には、検体処理部１１により試料液Ｓおよび混相液Ｇが流下される。試料液Ｓは、ノズルチップＮＣが検体容器ＫＢより検体液を抽出し、試薬セル１２０内で混合・撹拌して作製される。試料液Ｓは、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａ、未結合状態の抗原Ａおよび蛍光標識Ｆを含有する。
【００３９】
図３は、マイクロ流路１１０内の検出部２００近傍の模式図である。検出部２００は、マイクロ流路の内壁の一部に成膜された金属膜２０１と、金属膜２０１に固定された一次抗体Ｂとから構成される。検出部２００は、抗原抗体反応によって抗原Ａに一次抗体Ｂが特異的に結合することにより、抗原Ａを捕捉する。
【００４０】
一次抗体Ｂは、抗原Ａの種類に応じて適宜調整可能である。例えばｈＣＧである抗原Ａに対しては、抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ 5008 ＳＰ−５，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いることができる。そして、一次抗体Ｂは、末端をカルボキシル基化してアミノカップリング法を施すことにより、金属膜２０１上に固定される。
【００４１】
蛍光標識Ｆは、蛍光ビーズＦＢと蛍光ビーズＦＢに固定された二次抗体Ｃとで構成される。二次抗体Ｃも抗原抗体反応により抗原Ａと特異的に結合するものである。検出部２００は、蛍光ビーズＦＢに固定された二次抗体Ｃと特異的に結合した抗原Ａを一次抗体Ｂと特異的に結合させて捕捉する（サンドイッチ方式）。
【００４２】
蛍光ビーズＦＢは、蛍光色素分子を、この蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料で内包するビーズであることが望ましい。具体的に、蛍光ビーズＦＢは、ポリスチレン粒子を調液したポリスチレン溶液、蛍光色素の蛍光色素溶液をそれぞれ作製し、混合・エバポレートしながら含浸させた後、遠心分離を施して作製される。
【００４３】
作製された蛍光ビーズＦＢの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一であり、且つ各蛍光ビーズＦＢの粒径は均一である。蛍光ビーズＦＢの粒径は、１μｍ以上５μｍ未満が望ましく、１μｍ以上３μｍ未満がより望ましい。蛍光ビーズＦＢとして、例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製の粒径が１μｍ、励起波長が６６０ｎｍ、蛍光波長が６９０ｎｍのビーズを用いることができる。
【００４４】
二次抗体Ｃも抗原Ａに応じて適宜調整可能である。例えばｈＣＧである抗原Ａに対しては、抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ 6601 ＳＰＲ−５，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いることができる。二次抗体Ｃは、蛍光ビーズＦＢをカルボキシル基で表面修飾し、二次抗体Ｃの末端をアミノ基化してアミノカップリング法を施すことにより、蛍光ビーズＦＢに固定される。
【００４５】
検出部２００が、蛍光ビーズＦＢが固定された二次抗体Ｃと特異的に結合した抗原Ａを捕捉した後、光照射部１２が、検出部２００の裏面側より励起光Ｌを全反射条件となる入射角度でプリズムを介して金属膜２０１に照射する。
【００４６】
励起光Ｌが照射されると、金属膜２０１上にエバネッセント波Ｅが滲み出す。このエバネッセント波Ｅと金属膜２０１の自由電子との速度が等しくなると、金属膜２０１上にプラズモン共鳴が励起され、光の吸収・表面プラズモン増強電場が発生する。そして、エバネッセント波Ｅにより蛍光ビーズＦＢが励起されて増強された蛍光を発する。なお、表面プラズモン増強電場は、金属膜２０１の表面より約２００ｎｍ程度の範囲で発生する。
【００４７】
蛍光ビーズＦＢが蛍光を発すると、蛍光検出部１３が、蛍光を蛍光信号として検出する。蛍光検出部１３としては、例えばフォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等を用いることができる。また、蛍光検出部１３は、励起光を遮断する不図示のフィルタを用いて、蛍光信号のみを検出する。
【００４８】
蛍光検出部１３が蛍光信号を検出すると、データ分析部１４が、蛍光信号に基づいた検出画像を作成し、検出画像内の所定面積当たりの蛍光量を計測して抗原Ａの存在数を分析する。
【００４９】
データ分析部１４は、試料液Ｓおよび混相液Ｇを流下させ、所定時間（例えば１分〜２０分）経過した後に、抗原Ａの存在数を分析してもよいし、試料液Ｓおよび混相液Ｇを流下させつつ、蛍光信号を一定間隔（例えば５分間）サンプリングすることにより、蛍光強度の時間変化率に基づいて抗原Ａの存在数を分析してもよい（レート法）。
【００５０】
検出用試料セル１００のマイクロ流路１１０の構造およびその作用について説明する。図４はマイクロ流路１１０の部分拡大図を示す図である。
【００５１】
マイクロ流路１１０は、注入ウェル１４０（図１参照）と連通して試料液Ｓを流下させる試料液流路１１３、注入ウェル１５０（図１参照）と連通して混相液Ｇを流下させる混相液流路１１４、試料液流路１１３の下流端および混相液流路１１４の下流端に連通する二相流流路１１５、二相流流路１１５の下流端および排出ウェル１６０（図１参照）に連通する排出流路１１６から構成される。
【００５２】
試料液流路１１３と二相流流路１１５とは角度θ１をなして連通し、混相液流路１１４と二相流流路１１５とは角度θ２をなして連通している。また、試料液流路１１３の下流端、混相液流路１１４の下流端、二相流流路１１５の上流端は互いに連通している。試料液流路１１３、混相液流路１１４および二相流流路１１５はそれぞれ一定幅の流路であるが、二相流流路１１５の幅ｄ３は、試料液流路１１３の幅ｄ１および混相液流路１１４の幅ｄ２のいずれよりも狭くなっている。
【００５３】
また、排出流路１１６は、角度θ３をなして下流方向に向けて幅が拡大する拡幅部１１６ａと拡幅部１１６ａに連通する定幅部１１６ｂとを有している。このように、試料液流路１１３、混相液流路１１４、二相流流路１１５および排出流路１１６は、いわゆるピンチド流路構造を構成するものである。
【００５４】
また、検出部２００は、二相流流路１１５の、試料液流路１１３側の側壁１１５ａの一部に設けられている。検体処理部１１が、試料液Ｓを注入ウェル１４０、混相液Ｇを注入ウェル１５０にそれぞれ注入して排出ウェル１６０に負圧を掛けることにより、試料液Ｓおよび混相液Ｇが同一の流速で試料液流路１１３および混相液流路１１４をそれぞれ流下し、二相流流路１１５に同時に導かれる。
【００５５】
そして、二相流流路１１５に導かれた試料液Ｓおよび混相液Ｇは、ピンチド流路構造の作用により、二相流流路１１５において、試料液Ｓが側壁１１５ａ側に、混相液Ｇが反対側の側壁１１５ｂ側にそれぞれ沿って二相流として流下する。
【００５６】
試料液Ｓに含有される、抗原Ａ、蛍光標識Ｆおよび蛍光標識と特異的に結合した抗原Ａは、試料液流路１１３においては、層流により中央部分に偏って流下されるが、二相流流路１１５に導かれると、いわゆるピンチドフローフラクショネーション法の原理により、抗原Ａ、蛍光標識Ｆおよび蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａは、側壁１１５ａに押し付けられながら流下される。
【００５７】
したがって、試料液Ｓ内の蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａが、金属膜２０１の近傍を通過することになり、検出部２００に捕捉される抗原Ａの量を増加させることができる。なお、検出部２００に未結合の抗原Ａが捕捉された後に、側壁１１５ａに沿って流下された未結合の蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａの量も増加する。
【００５８】
検出部２００に捕捉されなかった蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａ、未結合の抗原Ａおよび蛍光標識Ｆは排出流路１１６に導かれる。排出流路１１６においては、その大きさに応じて、未結合の蛍光標識Ｆおよび蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａからなるグループと未結合の抗原Ａからなるグループとが、互いに異なる流下方向で流下され、排出ウェル１６０より排出される。
【００５９】
また、二相流流路１１５に導く混相液Ｇの流量は、二相流流路１１５に導く試料液Ｓの量よりも多くすることが望ましい。これにより、二相流流路１１５において、試料液Ｓの幅が混相液Ｇの幅よりも狭くなり、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａが検出部２００に近接する確率が高くなり、検出部２００に捕捉される抗原Ａの量を増加させることができる。具体的には、混相液流路１１４の幅ｄ２を試料液流路１１３の幅ｄ１よりも広くすることが望ましい。なお、混相液流路１１４および二相流流路１１５内の全体で層流となるために試料液Ｓおよび混相液Ｇの流量を調整することが望ましい。具体的には、ハーゲン・ポアズイユ流れ（Hagen-Poiseuille flow）の式を用いて流速分布より各流量を算出することができる。
【００６０】
また、二相流流路１１５において、試料液Ｓと混相液Ｇとからなる二相流が発生し易くするため、試料液流路１１３と二相流流路１１５とのなす角度θ１と混相液流路１１４と二相流流路１１５とのなす角度θ２とは等しいことが望ましい。また、角度θ１および角度θ２は１１０〜１６０度の範囲であることが望ましい。また、拡幅部１１６ａの角度θ３は９０度〜１３０度の範囲であることが望ましい。
【００６１】
また、二相流流路１１５の幅ｄ３は、５μｍ以上１００μｍ未満の範囲とすることが望ましく、５μｍ以上１０μｍ未満とすることがより望ましい。また、試料液流路１１３の幅ｄ１および混相液流路１１４の幅ｄ２は、１０μｍ以上２０００μｍ未満とすることが望ましい。なお、試料液流路１１３、混相液流路１１４、二相流流路１１５および排出流路１１６は、それぞれ均一な深さを有し、その深さは互いに等しいものである。
【００６２】
本実施形態の優位性について詳細に説明する。最初に、二相流路構造を有さないマイクロ流路が形成された通常の検出用試料セルを用いた分析結果を説明する。図５Ａは、抗原Ａのモル濃度が９０ｐＭの試料液Ｓを通常の検出用試料セルに１５分間流下させた後の検出画像を示す。図５Ｂは、抗原Ａのモル濃度が０ｐＭの試料液Ｓを上記通常流路の検出用試料セルに１５分間流下させた後の検出画像を示す。
【００６３】
蛍光顕微鏡を用いて計測された蛍光数は、図５Ａにおいては単位面積（１ｍｍ２）当たり６３個程度であった。図５Ｂの検出画像は抗原Ａの存在量と相関する蛍光数を示す信号としての画像である。図５Ｂにおいては単位面積（１ｍｍ２）当たり２５個程度であった。図５Ｂの検出画像は、金属膜２０１に非特異的に吸着した蛍光標識Ｆが発する蛍光数を示すものであり、ノイズを示す画像である。試料液Ｓの量は１００μＬ程度である。
【００６４】
次に、本実施形態の検出用試料セル１００を用いた分析結果を説明する。図６Ａは、抗原Ａのモル濃度が９０ｐＭの試料液Ｓおよび混相液Ｇを検出用試料セル１００に２分間流下させた後の検出画像である。図６Ｂは、抗原Ａのモル濃度が０ｐＭの試料液Ｓおよび混相液Ｇを検出用試料セル１００に２分間流下させた後の検出画像を示す。二相流流路１１５内の試料液Ｓの量は１００μＬ程度であり、混相液Ｇの量は３０００μＬ程度である。
【００６５】
計測された蛍光数は、図６Ａにおいては単位面積（１ｍｍ２）当たり８１２５個程度、図６Ｂにおいては単位面積（１ｍｍ２）当たり１５６個程度であった。したがって、通常の検出用試料セルを用いた場合のＳ／Ｎ比が６３／２５となるのに対し、検出用試料セル１００を用いた場合のＳ／Ｎ比は、８１２５／１５６となり、通常流路を用いた場合と比較して２０倍程度の感度の向上を実現した。
【００６６】
また、検出用試料セル１００を用いた場合、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａが側壁１１５ａに沿って流下されるため、通常流路を用いた場合のように、抗原Ａが金属膜２０１の近傍まで分散されるのを待機する必要がない。したがって、試料液Ｓの流速を高速化させることが可能であり、試料液Ｓおよび混相液Ｇを２分間流下させた後に検出画像を得ることができ、検出時間の短縮も実現した。なお、検出用試料セル１００を用いた方法において、通常流路を用いた方法と同様に、試料液Ｓおよび混相液Ｇを１５分間流下させた後の画像では、通常流路の場合よりも１００倍を超えるＳ／Ｎが確認された。
【００６７】
ここで、二相流流路１１５において、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａが混相液Ｇに分散することを抑制することも、検出部２００に捕捉される確率を向上させるものである。以下に、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａが混相液Ｇに分散することを抑制できる本実施形態の第一〜第三の変形例を説明する。
【００６８】
第一の変形例は、混相液Ｇ内に蛍光色素を有さないポリスチレンビーズを含有させる方法である。そして、第一の変形例では、混相液Ｇ内の単位体積当たりのポリスチレンビーズの数を試料液内の単位体積当たりの蛍光ビーズＦＢの数よりも多くする。
【００６９】
これにより、混相液Ｇのビーズの濃度、すなわち単位体積当たりに含有するビーズ濃度が、試料液Ｓのビーズ濃度よりも高くなる。したがって、試料液Ｓと混相液Ｇとのビーズの濃度の差により、蛍光ビーズＦＢが高濃度の混相液Ｇに分散され難くなり、その結果として、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａの混相液Ｇへの分散も抑制される。
【００７０】
なお、第一の変形例では、混相液Ｇ内の蛍光色素を有さないポリスチレンビーズが、照射された励起光Ｌを散乱させてしまうため、データ分析部１４は、前述のレート法よりも、試料液Ｓおよび混相液Ｇを所定時間経過した後に分析する方が望ましい。
【００７１】
第二の変形例を説明する。第二の変形例は混相液Ｇとして有機溶媒を用いる方法である。蛍光ビーズＦＢは、前述の通り、官能基により表面修飾されている。官能基は、試料液Ｓ内でイオン化するため、蛍光ビーズＦＢの親水性を高くする。
【００７２】
本実施形態では、前述の通り、酸性官能基であるカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を用いており、このカルボキシル基は試料液Ｓ内ではＣＯＯ−にイオン化した状態となる。勿論、酸性官能基としてスルホン酸基等を用いても同様にイオン化した状態となる。
【００７３】
また、蛍光ビーズＦＢを塩基性官能基で表面修飾した場合も蛍光ビーズＦＢの親水性を高くする。例えばアミノ基（−ＮＨ２）を用いると、試料液Ｓ内でＮＨ３＋にイオン化した状態となる。勿論、塩基性官能基として４級アンモニウム基等を用いても同様にイオン化した状態となる。
【００７４】
したがって、混相液Ｇとして有機溶媒を用いると、蛍光ビーズＦＢにとって混相液Ｇは疎水的となり、その結果として、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａの混相液Ｇへの分散が抑制される。具体的に、有機溶媒としてエタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いることができる。
【００７５】
第三の変形例を説明する。第三の変形例は官能基の種類に応じて混相液ＧのｐＨを調整する方法である。前述の通り、蛍光ビーズＦＢに官能基で表面修飾されると、試料液Ｓ内で官能基がイオン化した状態となる。そして、酸性官能基を用いると、蛍光ビーズＦＢはマイナスに帯電され、塩基性官能基を用いると、蛍光ビーズＦＢはプラスに帯電される。なお、試料液ＳのｐＨは、官能基のイオン化を施す程度の値であり、具体的にｐＨは７.４程度である。
【００７６】
第三の変形例では、混相液ＧのｐＨ値を官能基がイオン化されないｐＨとする。具体的に、蛍光ビーズＦＢが酸性官能基で表面修飾される場合は、混相液ＧのｐＨを試料液ＳのｐＨよりも小さくし、蛍光ビーズＦＢが塩基性官能基で表面修飾される場合は、混相液ＧのｐＨを試料液のｐＨよりも大きくする。
【００７７】
これにより、混相液Ｇの電荷濃度が試料液Ｓの電荷濃度より高くなる。したがって、試料液Ｓと混相液Ｇとの電荷濃度の差により、混相液Ｇ内では官能基が電荷分離し辛くなり、その結果として、蛍光標識Ｆと特異的に結合した抗原Ａの混相液Ｇへの分散が抑制される。具体的に、蛍光ビーズＦＢが、酸性官能基で修飾される場合は混相液のｐＨを４未満にし、塩基性官能基で修飾される場合は混相液のｐＨが１０を超えるようにすることが望ましい。
【００７８】
以上、本発明の好ましい実施の形態およびその変形例を説明したが、本発明は、これらの実施形態およびその変形例に限定されるものではない。すなわち本発明は、検出部に捕捉される抗原Ａの量を増加させて、蛍光法の高感度を実現するものであるから、表面プラズモン増強蛍光法以外に、エバネッセント蛍光法、光導波路を用いた蛍光検出法、種々の蛍光検出方法に適用させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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