(57)【要約】【課題】短時間で作製でき、かつ弾性率や膨張圧等の制御された物性を有する低濃度の高分子含有量のゲルを提供することを課題とする。【解決手段】ゲル前駆体クラスターが互いに架橋して３次元網目構造を形成している高分子ゲルの製造方法であって、ａ）臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニットを架橋させて前記ゲル前駆体クラスターを形成する工程、ここで、前記ゲル前駆体クラスターは貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有し；及びｂ）前記ゲル前駆体クラスターを架橋剤により互いに架橋させることによって、３次元網目構造を有するゲルを得る工程、を含むことを特徴とする、該製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル前駆体クラスターが互いに架橋して３次元網目構造を形成している高分子ゲルの製造方法であって、
ａ）臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニットを架橋させて前記ゲル前駆体クラスターを形成する工程、ここで、前記ゲル前駆体クラスターは貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有し；及び
ｂ）前記ゲル前駆体クラスターを架橋剤により互いに架橋させることによって、３次元網目構造を有するゲルを得る工程、
を含むことを特徴とする、該製造方法。
【請求項２】
前記損失弾性率Ｇ”が、１Ｈｚの周波数において０．００５〜５Ｐａの範囲である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ゲル前駆体クラスターが、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ゲル前駆体クラスターが、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ゲルが、５０ｇ／Ｌ以下の高分子含有量である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ゲル前駆体クラスターが、側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ゲル前駆体クラスターが、第１のゲル前駆体クラスターと第２のゲル前駆体クラスターからなり、
前記第１のゲル前駆体クラスターは、第１のポリマーユニットの含有量が第２のポリマーユニットの含有量より多く、
前記第２のゲル前駆体クラスターは、第２のポリマーユニットの含有量が第１のポリマーユニットの含有量より多い、
請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程ｂ）が、１時間以内の反応時間で行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記工程ｂ）における架橋剤が、ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート（ＢＳ２Ｇ）やＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は末端にチオール基を有する合成ペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニットを架橋させて得られるゲル前駆体クラスターであって、
溶媒を含み、
貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有する、
該ゲル前駆体クラスター。
【請求項１３】
前記損失弾性率Ｇ”が、１Ｈｚの周波数において、０．００５〜５Ｐａの範囲である、請求項１２に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１４】
前記ゲル前駆体クラスターが、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する、請求項１２又は１３に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１５】
前記ゲル前駆体クラスターが、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１６】
前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１７】
側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１８】
前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、請求項１７に記載のゲル前駆体クラスター。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、高分子ゲル。
【請求項２０】
ポリマーユニットが互いに架橋することにより３次元網目構造を形成した高分子ゲルであって、
溶媒を含み、
５０ｇ／Ｌ以下の高分子含有量、
１Ｈｚの周波数において１〜１００００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’、及び
１．５〜３．０のフラクタル次元を有する、
ことを特徴とする、該高分子ゲル。
【請求項２１】
１〜１００Ｐａの損失弾性率Ｇ”を有する、請求項２０に記載の高分子ゲル。
【請求項２２】
前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、請求項２０又は２１に記載の高分子ゲル。
【請求項２３】
前記ポリマーユニットが、側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の高分子ゲル。
【請求項２４】
前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、請求項２３に記載の高分子ゲル。
【請求項２５】
水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記高分子ゲルの体積が、ゲル作成時の体積に対して９０〜５００％の体積変化の範囲の膨潤度であり、０．００１〜５ｋＰａの膨潤圧を有する、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の高分子ゲル。
【請求項２６】
前記膨潤度が１００〜２００％の範囲であり、前記膨潤圧が０．１〜２ｋＰａである、請求項２５に記載の高分子ゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な高分子ハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、網状構造を有する高分子ゲルは、その優れた保水能力及び生体適合性等の特性を有することから、人工組織や再生足場用材料等として生体内に埋設する研究が注目されている（非特許文献１）。しかしながら、高分子ゲルは、水中ではゲル内部と外部環境の濃度差から生じる浸透圧や経時変化等による分解によって膨張してしまうため、埋設された周囲の組織に圧迫障害を引き起こすという問題があった。【０００３】
かかる膨張圧は、ゲルを構成する高分子濃度の二乗に比例するため、膨潤による影響は特に高分子濃度が高い場合に顕著となる。膨潤率を下げるために架橋度を上げたとしても、経時変化によって架橋が切断されることになるために、高分子の濃度を下げることが本質的な解決策となる。しかしながら、膨潤による組織障害が生じないレベルまで高分子濃度を低減させてしまうと、従来の高分子ゲルの製造方法では短時間でゲルを作成することは困難であった。また、高分子濃度が低く、ゲル化点近傍の領域でゲルを形成させる場合には、弾性率等の物性が劇的に変化するため、その物性を制御することが困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓａｋａｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、４１、５３７９−５３８４、２００８
【非特許文献２】Ｋｕｒａｋａｚｕら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、４３、３９３５−３９４０、２０１０
【非特許文献２】Ｋａｍａｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４３、８７３−８７５、２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、生体内に埋設した際の膨潤による組織障害の問題を回避し得るゲル及びその製造方法の開発を目的とし、短時間で作製でき、かつ弾性率や膨張圧等の制御された物性を有する低濃度の高分子含有量のゲルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、作為的にゲル化寸前の状態、より詳細には貯蔵弾性率Ｇ’が損失弾性率Ｇ”より小さい状態を有するゲル前駆体クラスターを形成し、その後のゲル化反応における種として用いることによって、当該ゲル前駆体クラスターが非常にゲル化しやすいポリマーユニットとして機能し、短時間で、かつ制御された物性を有する低高分子濃度のゲルを得ることができることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。【０００７】
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）ゲル前駆体クラスターが互いに架橋して３次元網目構造を形成している高分子ゲルの製造方法であって、ａ）臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニットを架橋させて前記ゲル前駆体クラスターを形成する工程、ここで、前記ゲル前駆体クラスターは貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有し；及びｂ）前記ゲル前駆体クラスターを架橋剤により互いに架橋させることによって、３次元網目構造を有するゲルを得る工程、を含むことを特徴とする、該製造方法を提供するものである。【０００８】
また、本発明の製造方法に関する好ましい態様は、
（２）前記損失弾性率Ｇ”が、１Ｈｚの周波数において０．００５〜５Ｐａの範囲である、上記（１）に記載の製造方法；
（３）前記ゲル前駆体クラスターが、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する、上記（１）又は（２）に記載の製造方法；
（４）前記ゲル前駆体クラスターが、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の製造方法；
（５）前記ゲルが、５０ｇ／Ｌ以下の高分子含有量である、上記（１）〜（４）のいずれか１に記載の製造方法；
（６）前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の製造方法；
（７）前ゲル前駆体クラスターが、側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の製造方法；
（８）前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、上記（７）に記載の製造方法； 
（９）前記ゲル前駆体クラスターが、第１のゲル前駆体クラスターと第２のゲル前駆体クラスターからなり、前記第１のゲル前駆体クラスターは、第１のポリマーユニットの含有量が第２のポリマーユニットの含有量より多く、前記第２のゲル前駆体クラスターは、第２のポリマーユニットの含有量が第１のポリマーユニットの含有量より多い、上記（７）又は（８）に記載の製造方法；
（１０）前記工程ｂ）が、１時間以内の反応時間で行われる、上記（１）〜（９）のいずれか１に記載の製造方法；及び
（１１）前記工程ｂ）における架橋剤が、ビス（スルホスクシンイミジル）グルタレート（ＢＳ２Ｇ）やＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は末端にチオール基を有する合成ペプチドである、上記（１）〜（１０）のいずれか１に記載の製造方法
を提供するものである。【０００９】
別の態様において、本発明は、ゲル前駆体クラスターに関し、
（１２）臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニットを架橋させて得られるゲル前駆体クラスターであって、溶媒を含み、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有する、該ゲル前駆体クラスター；
（１３）前記損失弾性率Ｇ”が、１Ｈｚの周波数において、０．００５〜５Ｐａの範囲である、上記（１２）に記載のゲル前駆体クラスター；
（１４）前記ゲル前駆体クラスターが、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する、上記（１２）又は（１３）に記載のゲル前駆体クラスター；
（１５）前記ゲル前駆体クラスターが、１０〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する、上記（１２）〜（１４）のいずれか１に記載のゲル前駆体クラスター；
（１６）前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、上記（１２）〜（１５）のいずれか１に記載のゲル前駆体クラスター；
（１７）側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、上記（１２）〜（１６）のいずれか１に記載のゲル前駆体クラスター；及び
（１８）前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、上記（１７）に記載のゲル前駆体クラスター
を提供するものである。【００１０】
さらなる態様において、本発明は、高分子ゲルに関し、
（１９）上記（１）〜（１１）のいずれか１に記載の製造方法により得られる、高分子ゲル；
（２０）ポリマーユニットが互いに架橋することにより３次元網目構造を形成した高分子ゲルであって、溶媒を含み、５０ｇ／Ｌ以下の高分子含有量、１Ｈｚの周波数において１〜１００００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’、及び１．５〜３．０のフラクタル次元を有する、ことを特徴とする、該高分子ゲル；
（２１）１〜１００Ｐａの損失弾性率Ｇ”を有する、上記（２０）に記載の高分子ゲル；
（２２）前記モノマーユニットがビニル骨格を有するものであり、又は前記ポリマーユニットが、ポリエチレングリコール骨格又はポリビニル骨格を有する、上記（２０）又は（２１）に記載の高分子ゲル；
（２３）前記ポリマーユニットが、側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる、上記（２０）〜（２２）のいずれか１に記載の高分子ゲル；
（２４）前記求核性官能基が、アミノ基、−ＳＨ、及び−ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択され、前記求電子性官能基が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される、上記（２３）に記載の高分子ゲル；
（２５）水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記高分子ゲルの体積が、ゲル作成時の体積に対して９０〜５００％の体積変化の範囲の膨潤度であり、０．００１〜５ｋＰａの膨潤圧を有する、上記（２０）〜（２４）のいずれか１に記載の高分子ゲル；及び
（２６）前記膨潤度が１００〜２００％の範囲であり、前記膨潤圧が０．１〜２ｋＰａである、上記（２５）に記載の高分子ゲル
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、作為的にゲル化寸前の状態で形成させたゲル前駆体クラスターを種として用いてゲル化させることによって、低濃度の高分子含有量のゲルを弾性率や膨潤度等の物性を制御しつつ、短時間で作製することが可能となる。それにより、生体内に埋設した場合等において膨潤による組織障害の問題を回避し得るゲルを提供することができる。かかるゲルは、人工声帯などの生体内の閉鎖腔や半閉鎖腔において適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の製造方法の概要を示す模式図である。
【図２】図２は、一般的なゲル化工程における、弾性率の時間変化を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の製造方法の工程ａ）における、弾性率の時間変化を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の製造方法の工程ｂ）における、弾性率の時間変化を示すグラフである。
【図５】図５は、ゲル前駆体クラスター１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］を用いた本発明の場合（△）と比較例（○）について、ゲル化時間を示すグラフである。
【図６】図４は、ゲル前駆体クラスター２［ＳＨＰＥＧ＋ＭＡＰＥＧ］を用いた本発明の場合（○）と比較例（□）について、ゲル化時間を示すグラフである。
【図７】図７は、ゲル前駆体クラスター１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］のサイズ分布を示すグラフである。
【図８】図８は、ゲル前駆体クラスター１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］のゲル化臨界点における動的粘度特性を測定した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ゲル前駆体クラスター１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］のフラクタル次元を示すグラフである。
【図１０】図１０は、高分子ゲル１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］における弾性率の高分子濃度依存性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、高分子ゲル２［ＳＨＰＥＧ＋ＭＡＰＥＧ］における弾性率の高分子濃度依存性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、半閉鎖空間における高分子ゲル１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］の膨潤の時間変化を示す画像である。
【図１３】図１３は、ハイドロゲル２［ＳＨＰＥＧ＋ＭＡＰＥＧ］について、膨潤圧の時間変化を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１４】
図１は、本発明の製造方法の概要を示す模式図である。第１の工程として、図１ａ）に示すように、最終的に高分子ゲルを構成することとなるモノマーユニットもしくはポリマーユニット（以下、これらを「前駆体ユニット」という。）を、いったんゲル化の寸前の状態で反応させて、未だゲル形成に至らない構造を有する、すなわちゾル状態のポリマークラスターを形成させる。そのうえで、第２の工程として、図１ｂ）に示すように、第２の工程として、適切な架橋剤を添加し、これらクラスター（ゲル前駆体クラスター）どうしをさらに反応させ、互いに３次元的に架橋させることで最終生成物である高分子ゲルを得ることを特徴とするものである。ここで、ゲル前駆体クラスターは、後述のように必ずしも同一組成の単一種である場合に限らず、異なる組成を有する複数のゲル前駆体クラスターを用いることもできる。
【００１５】
本発明は、当該ゲル前駆体クラスターを、いわば最終的なゲルの前駆体或いは中間体として用いるという新規なコンセプトに基づくものである。これにより、低濃度の高分子含有量の場合でも、短時間にゲルを形成させることができ、また、低弾性領域においてもゲルの弾性率を制御できるという従来技術では困難であった手法を見出したものである。ここで、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った分散系をいう。
【００１６】
（１）ゲル前駆体クラスター
本発明において用いられるゲル前駆体クラスターは、上述のように、ゲル化の寸前の状態、すなわち臨界ゲル化濃度未満の条件で前駆体ユニットを反応させることによって得られるゾル状のポリマークラスターである。ここで、「臨界ゲル化濃度と」は、特定の前駆体ユニットの架橋によって３次元構造のゲルを構築する系において、当該ゲル化を達成するために必要な前駆体ユニットの最低濃度を意味し、最低ゲル化濃度とも呼ばれる。本発明において、臨界ゲル化濃度という語には、例えば、２種以上の前駆体ユニットが用いられる系では、それら全体の濃度がゲル化に至る濃度に達しない場合に加えて、１種の前駆体ユニットの濃度だけが低い場合、すなわち各前駆体ユニットの比率が非当量であることによってゲル化を生じさせない場合も含まれる。
【００１７】
当該ゲル前駆体クラスターは、前駆体ユニットが相互に結合ないし架橋した構造を有するものの、未だゲル化に至らない条件で形成されたものであるため、前駆体ユニットにおいて未反応の状態の置換基が存在する。かかる置換基が、ゲル前駆体クラスター間の反応において互いにさらなる架橋を形成することにより３次元網目構造を有する最終的な高分子ゲルが得られることとなる。
【００１８】
当該ゲル前駆体クラスターは、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’＜Ｇ”の関係性を有する。図２に示すように、一般に、ゲル化する以前のポリマーでは損失弾性率Ｇ”の値が貯蔵弾性率Ｇ’より大きく、その後、ゲル化とともに、これらの物性値の大小が逆転してＧ’のほうが大きくなることが知られている。そして、Ｇ’＝Ｇ”となる点が、いわゆるゲル化点である。したがって、ゲル前駆体クラスターがＧ’＜Ｇ”であることは、それがゾル状態であって、未だゲル化に至っていない状態であることを意味する。好ましくは、１Ｈｚの周波数においてＧ’＜Ｇ”＜１００Ｇ’である。
【００１９】
好ましくは、当該ゲル前駆体クラスターのＧ”は、１Ｈｚの周波数において０．００５〜５Ｐａの範囲であり、より好ましくは、０．０１〜１Ｐａ、さらに好ましくは、０．０１〜０．５Ｐａの範囲である。これらの弾性率は、レオメーター等の公知の測定機器を用いて、動的粘弾性測定等の公知の方法で算出することができる。
【００２０】
また、本発明におけるゲル前駆体クラスターは、好ましくは、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する。より好ましくは、１．５〜２．０のフラクタル次元を有する。ここで、フラクタル次元とは、ポリマーユニットによる架橋構造が、どの程度３次元的な構造に近い状態かを表す指標であり、その算出方法は、例えば、（W. Hess, T. A. Vilgis, and H. H. Winter, Macromolecules 21, 2536 (1988)）を参照することができる。具体的には、例えば、ゲル化点における動的粘弾性特性の変化から、動的スケーリング理論を用いて計算することができる。
【００２１】
本発明におけるゲル前駆体クラスターは、好ましくは、１０〜１０００ｎｍ、より好ましくは、５０〜２００ｎｍの直径を有する。また、好ましくは、その分布において、１００ｎｍ程度の直径を有するゲル前駆体クラスターの存在割合が最も多いことが望ましい。
【００２２】
ゲル前駆体クラスターを形成するために用られる前駆体ユニットは、溶液中でのゲル化反応（架橋反応等）によってゲルを形成し得るモノマーもしくはポリマーであれば、当該技術分野において公知のものを最終的なゲルの用途や形状等に応じて用いることができる。より詳細には、ゲル前駆体クラスターから得られる最終的なゲルにおいて、ポリマーが互いに架橋にすることにより網目構造、特に、３次元網目構造を形成し得るポリマーユニットが好ましい。
【００２３】
ゲル前駆体クラスターを形成するために用られるモノマーユニットは、例えば、ビニル骨格を有するものが挙げられる。また、ゲル前駆体クラスターを形成するために用られるポリマーユニットとしては、代表的には、複数のポリエチレングリコール骨格の分岐を有するポリマー種が挙げられ、特に、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有するポリマー種が好ましい。かかる四分岐型のポリエチレングリコール骨格よりなるゲルは、一般に、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルとして知られており、それぞれ末端に活性エステル構造等の求電子性の官能基とアミノ基等の求核性の官能基を有する２種の四分岐高分子間のＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される。Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、これまでの研究から、２００ｎｍ以下のサイズ領域で高分子網目に不均一性がなく、理想的な均一網目構造を有することが報告されている（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４２、Ｎｏ.４、ｐｐ.１３４４−１３５１、２００９）。また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは各高分子溶液の単純な二液混合で簡便にその場で作製可能であり、ゲル調製時のｐＨやイオン強度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。そして、このゲルはＰＥＧを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
【００２４】
ただし、互いに架橋して網目構造ネットワークを形成し得るものであればポリエチレングリコール骨格以外のポリマーも用いることができる。例えば、メチルメタクリレートなどのポリビニル骨格を有するポリマーも用いることができる。
【００２５】
必ずしもこれらに限定されるものではないが、最終的なゲルにおいて、網目構造ネットワークを形成するためには、ゲル前駆体クラスターを形成する前記ポリマーユニットが、側鎖又は末端に1以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと、側鎖又は末端に１以上の求電子性官能基を有する第２のポリマーユニットの２種類のポリマー種を反応させて架橋させる手段が好適である。ここで、求核性官能基と求電子性官能基の合計は、５以上であることが好ましい。これらの官能基は、末端に存在することがさらに好ましい。また、ゲル前駆体クラスターは、第１のポリマーユニットの含有量が第２のポリマーユニットの含有量より多い組成であることもできるし、又は第２のポリマーユニットの含有量が第１のポリマーユニットの含有量より多い組成であることもできる。後述のように、好ましい態様において、このような組成が異なる２種類以上のゲル前駆体クラスターを架橋させて高分子ゲルを得ることができる。
【００２６】
ポリマーユニットに存在する求核性官能基としては、アミノ基、−ＳＨ、又は−ＣＯ２ＰｈＮＯ２(Ｐｈは、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フェニレン基を示す)などを挙げることができ、当業者であれば公知の求核性官能基を適宜用いることができる。好ましくは、求核性官能基は−ＳＨ基である。求核性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求電子性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
【００２７】
ポリマーユニットに存在する求電子性官能基としては、活性エステル基を用いることができる。このような活性エステル基としては、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾイル基、アクリロイル基又はニトロフェニル基などを挙げることができ、当業者であればその他の公知の活性エステル基を適宜用いることができる。好ましくは、求電子性官能基はマレイミジル基である。求電子性官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋結合を形成することとなる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有するゲルを得やすくなる。
【００２８】
末端に求核性官能基を有するポリマーユニットとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にアミノ基を有する下記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【化１】
2016143647.tif 000002
【００２９】
式（Ｉ）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒ１５−、−ＣＯ−Ｒ１５−、−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−、又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示し、ここで、Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。）
【００３０】
ｎ１１〜ｎ１４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ１１〜ｎ１４の値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となる。このため、高強度のゲルを得るためには、同一であることが好ましい。ｎ１１〜ｎ１４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ１１〜ｎ１４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ１１〜ｎ１４は、２５〜２５０の整数値が挙げられ、３５〜１８０が好ましく、５０〜１１５がさらに好ましく、５０〜６０が特に好ましい。そして、その分子量としては、５×１０３〜５×１０４Ｄａが挙げられ、７．５×１０３〜３×１０４Ｄａが好ましく、１×１０４〜２×１０４Ｄａがより好ましい。
【００３１】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１１〜Ｒ１４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ１１〜Ｒ１４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。Ｒ１１〜Ｒ１４は、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒ１５−、−ＣＯ−Ｒ１５−、−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−、又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで、Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
【００３２】
ここで、「Ｃ１−Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１−Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２−Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、−ＣＨ2−、−(ＣＨ2)2−、−(ＣＨ2)3−、−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)3−、−(ＣＨ(ＣＨ3))2−、−(ＣＨ2)2−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)3−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)2−ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)−、−(ＣＨ2)6−、−(ＣＨ２)2−Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2−、及び−(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2−などが挙げられる。
【００３３】
「Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２〜７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２〜５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
【００３４】
一方、末端に求電子性官能基を有するポリマーユニットとして好ましい非限定的な具体例には、例えば、４つのポリエチレングリコール骨格の分岐を有し、末端にＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基を有する下記式（II）で表される化合物が挙げられる。
【化２】
2016143647.tif 000003
【００３５】
上記式（ＩＩ）中、ｎ２１〜ｎ２４は、それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ２１〜ｎ２４の値は近いほど、ゲルは均一な立体構造をとることができ、高強度となるので好ましく、同一である方が好ましい。ｎ２１〜ｎ２４の値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、ｎ２１〜ｎ２４の値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、ｎ２１〜ｎ２４は、５〜３００の整数値が挙げられ、２０〜２５０が好ましく、３０〜１８０がより好ましく、４５〜１１５がさらに好ましく、４５〜５５であればさらに好ましい。本発明の第２の四分岐化合物の分子量としては、５×１０３〜５×１０４Ｄａがあげられ、７．５×１０３〜３×１０４Ｄａが好ましく、１×１０４〜２×１０４Ｄａがより好ましい。
【００３６】
上記式（ＩＩ）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ２１〜Ｒ２４は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（ＩＩ）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒ２５−、−ＣＯ−Ｒ２５−、−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−、−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−、−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−、又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示す。ここで、Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
【００３７】
本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００３８】
また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
【００３９】
上記式（I）及び式（II）のポリマーユニットの場合には、それらがアミド結合によって連結した構造のゲル前駆体クラスターが得られる。なお、後述のように、その場合、最終的に得られるゲルにおいても、各ポリマーユニットがアミド結合によって架橋した構造となる。
【００４０】
（２）ゲル化工程
本発明の製造方法におけるゲル化反応工程の典型的な態様としては、
ａ）臨界ゲル化濃度未満のモノマーユニット又はポリマーユニット（前駆体ユニット）を架橋させてゲル前駆体となるクラスターを形成する工程（図１ａ)
ｂ）前記ゲル前駆体クラスターを架橋剤により互いに架橋させることによって、最終的な目的物である３次元網目構造を有するゲルを得る工程（図１ｂ)、
を含む。
【００４１】
工程ａ）では、上述のとおり、前駆体ユニットの初期濃度を調節することによって、臨界ゲル化濃度未満の条件で前駆体ユニットを反応させ、ゲル化に至らないゾル状態、好ましくは、ゲル化の寸前の構造を有するポリマーのクラスターを形成させる。このクラスターは、いわば最終的なゲルに対する前駆体といえるものであるため、本願においては、当該クラスターを「ゲル前駆体クラスター」という。
【００４２】
前駆体ユニットの初期濃度を臨界ゲル化濃度未満の条件に調節する手法として、例えば、上記のように求核性官能基又は求電子性官能基を有する２種類のポリマーユニットを用いる場合には、それらを当量含むが全体としてゲル化に至るには十分ではない低濃度の条件を用いること、或いは、１種のポリマーユニットの濃度を低濃度として、すなわち非当量とすることによってゲル化を生じさせない条件を用いることができる。
【００４３】
一般に、臨界ゲル化濃度（最低ゲル化濃度）は、用いる前駆体ユニットの種類に依存するが、かかる濃度は当該技術分野において公知であるか、或いは当業者であれば実験的に容易に把握することができる。典型的には、５〜５０ｇ／Ｌであり、下限は重なりあい濃度の１／５程度の濃度である。ここで、重なりあい濃度は、ポリマーユニットが溶液中を充填する濃度であり、その算出方法は、例えば、Polymer Physics（M. Rubinstein, R.Colby著）を参照することができる。具体的には、例えば、希薄溶液の粘度測定より、フローリーフォックスの式を用いて求めることができる。
【００４４】
工程ａ）は、典型的には、２種類の前駆体ユニットを含む溶液を混合することもしくは刺激を与えることによって行うことができる。また、ラジカル開始剤をもちいたモノマーのラジカル重合によっても行うことができる。各溶液の濃度、添加速度、混合速度、混合割合は特に限定されず、当業者であれば適宜調整することができる。また、３種以上の前駆体ユニットを用いる場合でも、同様にして、対応する前駆体ユニットを含む溶液を調製し、それらを適宜混合することができることは明らかであろう。前駆体ユニットを含む溶液の溶媒としては、水、エタノールなどのアルコール類、ＤＭＳＯなどを用いることができる。当該溶液が水溶液である場合には、リン酸緩衝液などの適切なｐＨ緩衝液を用いることができる。
【００４５】
混合する手段としては、例えば、国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号公報に開示されたような二液混合シリンジを用いて行うことができる。混合時の二液の温度は、特に限定されず、前駆体ユニットがそれぞれ溶解され、それぞれの液が流動性を有する状態の温度であればよい。例えば、混合するときの溶液の温度としては、１℃〜１００℃の範囲が挙げられる。二液の温度は異なってもよいが、温度が同じである方が、二液が混合されやすいので好ましい。
【００４６】
次に、工程ｂ）では、工程ａ）で得られたゲル前駆体クラスターどうしをさらに反応させ、互いに３次元的に架橋させることで最終生成物である高分子ゲルが得られる。上述のとおり、ゲル前駆体クラスターは、ゲル化点以前の状態となるよう形成されているため、各前駆体ユニットにおける架橋に用いられる置換基は未反応の状態で残存している。ゲル前駆体クラスター中の当該置換基を他のゲル前駆体クラスターの残存置換基と反応させて、架橋することにより最終的なゲルが形成させることとなるのである。
【００４７】
好ましくは、当該工程ｂ）では、ゲル前駆体クラスターを互いに架橋するための架橋剤を添加することや刺激を与えることができる。そのような架橋剤としては、ポリマーユニット中の架橋基と同じ置換基を有するものを用いることができ、ポリマーユニット自体を架橋剤として用い、追加で添加することもできる。例えば、工程ａ）において、求核性官能基又は求電子性官能基を有する２種類のポリマーユニットを非当量で反応させて、ゲル前駆体クラスターを得た場合には、濃度がより少ないほうの官能基を有する架橋剤を添加することによって、ゲル前駆体クラスター間を架橋することができる。そのような架橋剤としては、ビス（スルホスクシンイミジル）  グルタレート（ＢＳ２Ｇ）やＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、或いは末端にチオール基を有する合成ペプチド等を用いることができる。また、架橋のための刺激としては、例えば光二量化を起こすような官能基（マレイミド基など）に対して、紫外光を照射することができる。
【００４８】
好ましくは、工程ｂ）では、２時間以内の反応時間、好ましくは１時間以内の反応時間で、最終的なゲルを得ることができる。一般に、高分子を低濃度で含むゲルを作製する場合には、反応時間として長時間を要する（系にも依存するが、例えば、高分子含有量が１０ｇ／Ｌ以下の場合に約８時間）の対して、本発明では、はるかに短時間でゲルを作製することができる。
【００４９】
工程ｂ）における他の反応溶液条件等は、工程ａ）と同様である。
【００５０】
（３）高分子ゲル
本発明によって得られる高分子ゲルは、ポリマー含有量が低濃度でありながら、上述のように短い反応時間で得られるとともに、弾性率等の物性を所望の範囲に制御することが可能なものである。図２に示すように、一般的に、ゲル化点付近における弾性率はドラスティックに上昇するため、１０〜１０００Ｐａ等の低弾性率の範囲で特定の値に制御した低弾性率のゲルを得ることは困難であった。これに対し、本発明のゲルは、上記のゲル前駆体クラスターを経由してゲルを作製することで、低弾性領域において制御された弾性率を有するものである。
【００５１】
従って、本発明の高分子ゲルは、ポリマーユニットが互いに架橋することにより３次元網目構造を形成した高分子ゲルであって、低濃度の高分子含有量、低領域の弾性率、及び特定のフラクタル次元を有することを特徴とする。
【００５２】
本発明の高分子ゲルにおける高分子含有量は、５０ｇ／Ｌ以下、好ましくは４０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは、１５〜３０ｇ／Ｌである。
【００５３】
本発明の高分子ゲルは、１〜１００００Ｐａ、好ましくは、１０〜１０００Ｐａの貯蔵弾性率Ｇ’を有する。かかる範囲は、生体における硝子体（数１０Ｐａ）や声帯（数１００Ｐａ）に対応するものである。また、好ましくは、本発明の高分子ゲルは１〜１００Ｐａの損失弾性率Ｇ”を有する。これらの弾性率は、公知の測定機器を用いて、公知の方法で算出することができる。
【００５４】
さらに、本発明の高分子ゲルは、好ましくは、１．５〜２．５のフラクタル次元を有する。より好ましくは、１．５〜２．０のフラクタル次元を有する。当該フラクタル次元は、ゲルにおける架橋構造がどの程度３次元的な構造に近い状態かを表す指標であり、その算出方法は、上述のとおり当該技術分野において公知である。
【００５５】
本発明の高分子ゲルは、水溶液中、３０〜４０℃の範囲における前記高分子ゲルの体積が、ゲル作成時の体積に対して９０〜５００％の体積変化の範囲の膨潤度であり、０．００１〜５ｋＰａの膨潤圧を有する。好ましくは、前記膨潤度が１００〜２００％の範囲であり、膨潤圧が０．１〜２ｋＰａである。膨潤圧が低いことは、ゲルを閉鎖空有においた時の外部に与える圧力が低いことを意味する。つまり、生体内において、時間経過とともに水分を吸収して膨張した場合でも、組織障害性が低いことを意味する。
【００５６】
本発明の高分子ゲルを構成するポリマーユニットは、上述したゲル前駆体クラスターの場合と同様のものを用いることができる。好ましい態様において、ゲル前駆体クラスターが、側鎖又は末端に１以上の求核性官能基を有する第１のポリマーユニットと側鎖又は末端に1以上の求電子性の官能基を有する第２のポリマーユニットからなる場合、当該ゲル前駆体クラスターは、第１のポリマーユニットの含有量が第２のポリマーユニットの含有量より多い組成である第１のゲル前駆体クラスターと、第２のポリマーユニットの含有量が第１のポリマーユニットの含有量より多い組成である第２のゲル前駆体クラスターの２種類のゲル前駆体クラスターを用いることができ、これら組成の異なる２種類のゲル前駆体クラスターが互いに架橋した３次元網目構造の高分子ゲルであることができる。
【００５７】
本発明の高分子ゲルは、その用途に応じて、薄膜状等の種々の形状に加工することができる。そのような加工は、当該技術分野において知られている任意の手法を用いることができる。例えば、薄膜の場合には、例えば、ゲルが完全に固化する前の流動性を有する状態で、ガラス等の平面基板上に塗布する等の手法により薄膜を得ることができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５９】
ポリマーユニットの合成
ＴＡＰＥＧ（テトラアミン−ポリエチレングリコール）とＴＮＰＥＧ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ））を、末端にヒドロキシル基を有するＴＨＰＥＧ（テトラヒドロキシル−ポリエチレングリコール）をそれぞれアミノ化、スクシンイミジル化することによって得た。【００６０】
また、末端に−ＳＨ基を有するＳＨＰＥＧ（テトラチオール−ポリエチレングリコール）及び末端にマレイミジル基を有するＭＡＰＥＧ（テトラマレイミジル−ポリエチレングリコール）は、それぞれ日油株式会社から市販されているものを用いた。分子量はいずれも１０，０００である。【００６１】
以下の実験では、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、日本電子のＪＮＭ−ＥＣＳ４００(４００ＭＨｚ)を用いて解析した。重水素化クロロホルムを溶媒として用い、テトラメチルシランを内部標準とした。分子量はブルカーダルトニクスの質量分析計Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩのリニアポジティブイオンモードを用いて決定した。【００６２】
１．ＴＨＰＥＧの合成：
開始剤のペンタエリスリトール（０．４５７２ｍｍｏｌ、６２．３ｍｇ）をＤＭＳＯ／ＴＨＦ（ｖ／ｖ＝３：２）５０ｍＬの混合溶媒に溶解させ、メタル化剤にカリウムナフレン（０．４１５７ｍｍｏｌ、１．２４ｍｇ）を用い、エチレンオキシド（２００ｍｍｏｌ、１０．０ｍＬ）を加え、約２日間、Ａｒ存在下、６０℃で加熱攪拌した。反応終了後、ジエチルエーテルに再沈殿させ、濾過により沈殿物を取り出した。さらに、ジエチルエーテルで３回洗浄し、得られた白色固体を減圧乾燥することにより、２０ｋのＴＨＰＥＧを得た。【００６３】
２．ＴＡＰＥＧの合成：
ＴＨＰＥＧ（０．１９３５ｍｍｏｌ、３．８７ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ）をベンゼンに溶解させ、凍結乾燥した後、ＴＨＦ６２ｍＬに溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．１９３５ｍｍｏｌ、３．８７ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ）を加えた。別のナスフラスコにＴＨＦ３１ｍＬとメタンスルホニルクロライド（ＭｓＣｌ）（０．１９３５ｍｍｏｌ、３．８７ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ）を加え、氷浴につけた。ＴＨＰＥＧ、ＴＥＡのＴＨＦ溶液にＭｓＣｌのＴＨＦ溶液を約１分間かけて滴下し、３０分間氷浴中で攪拌した後、室温で１時間半攪拌した。反応終了後、ジエチルエーテルに再沈殿させ、濾過により沈殿物を取り出した。さらに、ジエチルエーテルで３回洗浄し、得られた白色固体をナスフラスコに移し、２５％アンモニア水２５０ｍＬを加え、４日間攪拌した。反応終了後、エバポレーターにより溶媒を減圧留去し、水を外液に２、３回透析を行い、凍結乾燥することにより、白色固体のＴＡＰＥＧを得た。作製したＴＡＰＥＧの化学式は式（Ｉａ）に示した。式（Ｉａ）中、ｎ１１〜ｎ１４は、ＴＡＰＥＧの分子量が約１０、０００（１０ｋＤａ）のとき５０〜６０であり、分子量が約２０、０００（２０ｋＤａ）のとき１００〜１１５であった。
【化３】
2016143647.tif 000004
【００６４】
３．ＴＮＰＥＧの合成：
ＴＨＰＥＧ（０．２３９５ｍｍｏｌ、４．７９ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ）をＴＨＦに溶解させ、０．７ｍｏｌ／Ｌグルタル酸／ＴＨＦ溶液（４．７９０ｍｍｏｌ、６．８５ｍＬ、２０ｅｑｕｉｖ）を加え、Ａｒ存在下、６時間攪拌した。反応終了後、２−プロパノールに滴下し、遠心分離機に３回かけた。得られた白色固体は３００ｍＬナスフラスコに移し、エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。残渣をベンゼンに溶解させ、不溶物を濾過によって取り除いた。得られた濾液を凍結乾燥により溶媒を除去することで、末端がカルボキシル基で修飾された白色固体のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得た。このＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．２１６５ｍｍｏｌ、４．３３ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ）をＴＨＦに溶解させ、Ｎ−ハイドロスクシンアミド（２．５８９ｍｍｏｌ、０．２９９ｇ、１２ｅｑｕｉｖ）、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルスクシンアミド（１．７３２ｍｍｏｌ、０．２６９ｍＬ、８．０ｅｑｕｉｖ）を加え、３時間、４０℃で加熱攪拌した。反応終了後、エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。クロロホルムに溶解させ、飽和食塩水で３回抽出し、クロロホルム層を取り出した。さらに、硫酸マグネシウムで脱水、濾過を行った後、エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。得られた残渣のベンゼン凍結乾燥を行い、白色固体のＴＮＰＥＧを得た。作製したＴＮＰＥＧの化学式は式（ＩＩａ）に示した。式（ＩＩａ）中、ｎ２１〜ｎ２４は、ＴＮＰＥＧの分子量が約１０、０００（１０ｋ）のとき４５〜５５であり、分子量が約２０、０００（２０ｋ）のとき９０〜１１５であった。
【化４】
2016143647.tif 000005
【実施例２】
【００６５】
ゲル前駆体クラスターの合成
ゲル化反応における前駆体となるゲル前駆体クラスターを以下のとおり合成した。【００６６】
（１）ゲル前駆体クラスター１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］
まず、実施例１で合成したＴＡＰＥＧ(1.0 x 104 g/mol)及びＴＮＰＥＧ(1.0 x 104 g/mol)をそれぞれ同量の81 ｍＭのリン酸バッファーとクエン酸−リン酸バッファーに溶解させた。このとき、物質量比をTAPEG/TNPEG = 1/0.23、全体のポリマー濃度を60 g/Lとした。得られた２つの溶液を別の容器で混合させ、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。【００６７】
当該工程における貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”の時間変化を図３に示す。反応の終点において、Ｇ’＜Ｇ”の関係性を有しており、未だゲル形成に至らないゾル状態のポリマークラスターであることを示している。【００６８】
（２）ゲル前駆体クラスター２［ＳＨＰＥＧ＋ＭＡＰＥＧ］
ＳＨＰＥＧ及びＭＡＰＥＧを用いて、同様にゲル前駆体クラスター２を合成した。全体のポリマー濃度を60 g/Lとした。この際、ＳＨＰＥＧ：ＭＡＰＥＧが（１−ｒ）：ｒのモル比となるよう、いずれかが過剰に含まれる２種のゲル前駆体クラスターを含む複数のサンプルを調製した。
【実施例３】
【００６９】
高分子ゲルの合成
実施例２で合成したゲル前駆体クラスターを用いて、高分子ゲルを以下のとおり合成した。【００７０】
（１）高分子ゲル１［ＴＡＰＥＧ＋ＴＮＰＥＧ］
実施例２で得られたゲル前駆体クラスター１の溶液を25 g/Lになるように水で希釈した。溶液中の未反応のアミノ基量を算出し、それと等量になるように架橋剤(Bis-(sulfosuccinimidyl) glutarate(BS2G))を添加し、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。【００７１】
当該工程における貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”の時間変化を図４に示す。反応の終点において、Ｇ’＞Ｇ”の関係性を有しており、ゲル前駆体クラスターが架橋することによって高分子ゲルが形成されたことを示している。【００７２】
また、ゲル前駆体クラスターの濃度を変えて、ゲル化を行った場合の反応時間を図５に示す。図５の縦軸はゲル化時間ｔｇｅｌ（秒）、横軸は高分子ゲルにおける高分子含有量ｃ（ｇ／Ｌ）である。図中の△がゲル前駆体クラスターによりゲル化させた本発明の高分子ゲルの実施例であり、○がゲル前駆体クラスターを用いずに従来の手法によりポリマーユニットから直接ゲル化させた比較例である。その結果、ゲル前駆体クラスターによりゲル化させた場合には、短い反応時間で高分子ゲルが得られることが分かる。特に、高分子含有量が８ｇ／Ｌ程度の低濃度の場合では、従来手法の場合には７時間以上のゲル化時間を要するのに対し、本発明のゲル前駆体クラスターを用いた場合には、１．５時間以内でゲル化した。また、それより高濃度の領域では、ゲル前駆体クラスターを用いた場合には、３０分未満のゲル化時間であった。【００７３】
２）高分子ゲル２［ＳＨＰＥＧ＋ＭＡＰＥＧ］
実施例２で得られたゲル前駆体クラスター２を用いて同様に高分子ゲルを作成した。ＳＨＰＥＧが過剰なゲル前駆体クラスター（10 g/L；ｒ＝０．３７）と、ＭＡＰＥＧが過剰なゲル前駆体クラスター（10 g/L；ｒ＝０．６３）をＮａＣｌを含むクエン酸バッファーでそれぞれ６g/Lに希釈し、等量を混合した。図５と同様に、ゲル前駆体クラスターの濃度を変えてゲル化を行った場合の反応時間を図６に示す。図中の○がゲル前駆体クラスターによりゲル化させた本発明の高分子ゲルの実施例であり、□がゲル前駆体クラスターを用いずに従来の手法によりポリマーユニットから直接ゲル化させた比較例である。特に、高分子含有量が７ｇ／Ｌ程度の低濃度の場合では、本発明のゲル前駆体クラスターを用いた場合には、３分でゲル化した。これは、硝子体手術時においてゲル前駆体クラスターを眼内に注入し、ｉｎ  ｖｉｖｏでゲル化させることができることを示している。
【実施例４】
【００７４】
ゲル前駆体クラスターの物性
１．ゲル前駆体クラスターのサイズ
実施例２で合成したゲル前駆体クラスター１のサイズ分布を測定した結果を図７に示す。横軸のＲｈはゲル前駆体クラスターの粒子直径（ｎｍ）、縦軸のＧ（Γ-１）は、特性緩和時間分布関数である。その結果、ゲル前駆体クラスターの粒子直径は、数百ｎｍであり、１００ｎｍ程度のものが最も多いことが分かった。実施例２で合成したゲル前駆体クラスター２についてもほぼ同様の結果が得られた。【００７５】
２．弾性率
溶液中のゲル前駆体クラスター１について、レオメーター（Ｐｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ５０１、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社製）を用いて動的粘弾性測定を行い、貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ”を算出した。その結果、1HzにおけるＧ”は、０．１＜Ｇ”＜１００Paの範囲であり、Ｇ’＜Ｇ”＜１００Ｇ’であった。このことから、上記図３でも示したように、実施例２で得られたゲル前駆体クラスター１は、ゲル化臨界には至っていない構造であることを確認した。実施例２で合成したゲル前駆体クラスター２についてもほぼ同様の結果が得られた。【００７６】
３．フラクタル次元
種々のポリマーユニットの初期濃度を用いた場合の、ゲル化臨界点における動的粘度特性を測定した結果を図８に示す。図８の縦軸は、貯蔵弾性率Ｇ’（図中の○）及び損失弾性率Ｇ”（図中の△）であり、横軸は周波数である。（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、初期濃度の条件である。図８に示すように、初期濃度が低くなるほど、Ｇ’とＧ”の冪乗則が増加した。この結果を用いて、動的スケーリング理論によりゲル前駆体クラスターのフラクタル次元を計算した。その結果を図９に示す。図９の縦軸はフラクタル次元、横軸は初期濃度である。図より、濃度が低くなるほど、フラクタル次元Ｄは理論の予測値（図中の点線）から下方に乖離し、より疎な構造が形成されていることが示唆された。
【実施例５】
【００７７】
高分子ゲルの物性
また、実施例３で得られた高分子ゲル１の弾性率の高分子濃度依存性を測定した。その結果、図１０に示すように、２０ｇ／Ｌの低濃度領域であり、かつ貯蔵弾性率Ｇ’が４００Ｐａより小さい低弾性率領域において、弾性率が高分子含有量に比例することが示された。これは、ゲル前駆体クラスターからゲル化させる手法を用いることによって、低弾性率領域においても、ゲルの弾性率の制御が可能であることを実証するものである。【００７８】
同様に、実施例３で得られた高分子ゲル２の弾性率のポリマー濃度依存性を測定した。結果を図１１に示す。図中の○がゲル前駆体クラスターによりゲル化させた本発明の高分子ゲルの実施例であり、□がゲル前駆体クラスターを用いずに従来の手法によりポリマーユニットから直接ゲル化させた比較例である。いずれの場合も本発明の高分子ゲルのほうが高い弾性率を示し、効果的な３次元網目構造が形成されていることが示唆される。【００７９】
また、疑似的な半閉鎖空間において、実施例３で得られた高分子ゲル１の膨潤の時間変化を観測した。ガラス容器中に高分子ゲルを入れ、リン酸緩衝溶液を加え一晩放置した。その結果、図１２に示すように、溶液中においても体積変化を示さなかった。これは、当該高分子ゲルが半閉鎖空間において非膨潤であり、生体内の閉鎖空間や半閉鎖空間に適用できる可能性を示唆する結果である。【００８０】
さらに、実施例３で得られた高分子ゲル２について、膨潤圧の時間変化を測定した結果を図１３に示す。図中の○がゲル前駆体クラスターによりゲル化させた本発明の高分子ゲルの実施例（ポリマー濃度１０ｇ／Ｌ）であり、□がゲル前駆体クラスターを用いずに従来の手法によりポリマーユニットから直接ゲル化させた比較例（ポリマー濃度１４０ｇ／Ｌ）である。図１３に示すように、比較例では時間経過とともに１２ｋＰａの平衡に至るが、本発明の高分子ゲルでは０．１９ｋＰａ程度で常に一定であった。この結果は、本発明の高分子ゲルが、生体内に適用され長時間経過した場合であっても、長期間安定に用いることが可能であることを示すものである。
【実施例６】
【００８１】
ゲル前駆体クラスターの汎用性
様々な系で四分岐系と同様な手順で低濃度ゲルを作製することで、ゲル前駆体クラスターの汎用性を検討した。【００８２】
［三分岐系］
分子量が共に2.0 x 105のTri-APEG(トリアミン−ポリエチレングリコール)とTri-NPEG(トリ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）)を、それぞれ同量の45 ｍＭのリン酸バッファーとクエン酸−リン酸バッファーに溶解させた。このとき、物質量比をTri-APEG/Tri-NPEG = 1/0.49、全体のポリマー濃度を40 g/Lとした。得られた２つの溶液を別の容器で混合させ、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。得られた溶液を25 g/Lになるように水で希釈した。溶液中の未反応のアミノ基量を算出し、それと等量になるように架橋剤(Bis-(sulfosuccinimidyl) glutarate(BS2G))を添加し、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。最終的には、四分岐系と同様にゲルが得られた。【００８３】
［四分岐/二分岐系］
分子量がそれぞれ2.0 x 105と1.0 x 105のTetra-APEG(トリアミン−ポリエチレングリコール)とLinear-NPEG(リニア−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ）)を、それぞれ同量の42 ｍＭのリン酸バッファーとクエン酸−リン酸バッファーに溶解させた。このとき、物質量比をTri-APEG/Tri-NPEG = 1/1.17、全体のポリマー濃度を40 g/Lとした。得られた２つの溶液を別の容器で混合させ、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。得られた溶液を２５ g/Lになるように水で希釈した。溶液中の未反応のアミノ基量を算出し、それと等量になるように架橋剤(Bis-(sulfosuccinimidyl) glutarate(BS2G))を添加し、自転・公転ミキサーにより脱泡・撹拌した。その後、混合液を素早くファルコンチューブに移し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。最終的には、四分岐系と同様にゲルが得られた。【００８４】
三分岐系および四分岐/二分岐系でも四分岐系と同様の手順でゲルが得られたことから、ゲル前駆体クラスターの汎用性は高いことが分かった。
【実施例７】
【００８５】
マウスへの注入実験
以下の手順により、本発明の高分子ゲルをマウス中に注入した。
１．ゲル前駆体クラスターの調製
Tetra-PEG-maleimide(TMPEG) (1.0 x 104 g/mol) 及びTetra-PEG-thiol(TTPEG) (1.0 x 104 g/mol) の物質量比が下表のようになるように量り取り、それぞれ同量のクエン酸−リン酸バッファー (pH 5.8, 5 mM (NaCl, 149 mM)) に溶解させた。このとき、全体のポリマー濃度を60 g/Lとした。得られた２つの溶液をファルコンチューブで混合し、乾燥を防ぐためにキャップをした上で、室温で12時間静置した。
【表１】
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【００８６】
２．高分子ゲルの調製
高分子ゲルの全量が2 mL、ポリマー濃度がそれぞれ13 g/L（グループ１）、11 g/L（グループ２）になるようにゲル前駆体クラスター溶液を量りとり、シリンジに入れた。また、グループ１及び２について、それぞれの溶液中の未反応のマレイミド基、チオール基量を算出し、それと等量になるように架橋剤 (DL-Dithiothreitol及び1, 8 - Bismaleimidodiethyleneglycol) をそれぞれ量り取った。この架橋剤を、それぞれ高分子ゲルの全量とゲル前駆体クラスターの差分量のクエン酸−リン酸バッファー (pH 5.8, 5 mM (NaCl, 149 mM)) に溶解させ、上記のシリンジとは別のシリンジに入れた。三方便を使用して二つの溶液を混合し、麻酔を打ったマウスの背中に1 mL注入した。また、比較例として、TMPEGのみ (Monomer A) 、TTPEGのみ (Monomer B)を15g/Lになるようにそれぞれクエン酸−リン酸バッファー (pH 5.8, 5 mM (NaCl, 149 mM))に溶解させたものとクエン酸−リン酸バッファー (pH 5.8, 5 mM (NaCl, 149 mM))のみ（対照サンプル）の試料を用意し、麻酔を打ったマウスにそれぞれ1 mL注入した。注入から１週間後にマウスの組織を観察した。【００８７】
その結果、グループ１及び２のいずれも、ゲルの分解や拒絶反応は見られず、注入から1週間後も皮膚下にゲルの存在が認識された。一方、モノマーのみを注入した場合には、毒作用を伴わずに分解した。全てのマウスは、体重変化もなく正常であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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