(57)【要約】  標的細胞を特異的に吸着しつつ、非特異的な吸着を抑制可能な細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法を提供する。支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備える細胞の分離回収膜及び培養シートを用いる。これにより、標的細胞を特異的に吸着しつつ、非特異的な吸着を抑制可能な細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法を提供することができる。
2015033457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備えることを特徴とする、細胞の分離回収膜。
【請求項２】
前記高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項３】
前記親水性部位は、前記高分子部位に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項４】
前記高分子部位はポリアミノ酸を含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項５】
前記親水性部位は、ポリエチレングリコールを含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項６】
前記細胞吸着部位は、前記標的細胞を抗原とする抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項７】
前記支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項８】
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項９】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備える細胞の分離回収膜を含むことを特徴とする、細胞の培養シート。
【請求項１０】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備える細胞の分離回収膜を具備することを特徴とする、細胞の培養装置。
【請求項１１】
支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する疎水性高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備える細胞の分離回収膜と、
分離回収膜を前記被処理液に接触させる接触装置と、
前記細胞の分離回収膜を加熱又は冷却する加熱冷却装置と、
前記細胞の分離回収膜に吸着した前記標的細胞を回収する細胞回収装置と、を具備する細胞の培養装置を用いて行われ、
前記細胞の分離回収膜を、前記含浸装置によって前記標的細胞を含む被処理液に接触させて、前記被処理液中の標的細胞を前記細胞吸着部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、
前記分離回収膜接触ステップにおいて接触させた細胞の分離回収膜を、前記被処理液外において前記加熱冷却装置により加熱又は冷却する加熱冷却ステップと、
前記加熱冷却ステップにおいて加熱又は冷却された細胞の分離回収膜の表面に膜処理液が供給され、供給された膜処理液を前記細胞回収装置により回収して、前記細胞吸着部位に吸着した前記標的細胞を回収する標的細胞回収ステップと、を含むことを特徴とする、細胞の分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法に関する。【０００２】
近年、医学や生物学、免疫学等の分野において、細胞類の特異的な（選択的な）分離回収技術の必要性が高まっている。例えば、再生医療の分野では、標的細胞がガラスやポリマー等の基板上に特異的に回収される。そして、回収された標的細胞は当該基板上で培養され、その後に標的細胞が基板から剥離されて、分離される。培養された標的細胞を基板から剥離する際には、タンパク質分解酵素であるトリプシンが用いられることが多い。【０００３】
しかしながら、標的細胞を分離回収する工程は煩雑さを伴う。従って、分離回収に時間がかかることがある。特に、土中や水中等における有用細菌の選抜においては、スクリーニングを行って、スクリーニングにより得られた有用細菌の培養が行われることから、特に長時間を要することがある。そこで、短時間で細胞を分離回収する技術が望まれている。【０００４】
また、基板上で培養された細胞を基板から剥離する際、トリプシン等が用いられると、トリプシン等によって、培養された細胞が何らかの影響を受けることがある。そこで、できるだけ酵素や薬品等を用いずに、基板上から分離回収する技術が望まれている。【０００５】
これらの事情に鑑み、特許文献１に記載の技術が知られている。特許文献１には、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマーからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマー膜を備える細胞支持体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１０５５８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の技術においては、標的細胞に特異的に吸着する抗体が、疎水性表面に露出している。そして、この表面に標的細胞を含む溶液を接触させることで、当該溶液中の標的細胞が抗体に特異的に吸着する。抗体に標的細胞が吸着した後、ポリマー膜を水に溶解させて表面を親水性とすることで、標的細胞が抗体から脱離し、標的細胞が溶液から分離回収されるようになっている。【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の細胞支持体の用途によっては、細胞支持体に接触させる溶液には、標的細胞以外の細胞が含まれていることがある。細胞は疎水性を示すため、抗体には標的細胞が吸着するものの、抗体以外の表面部分、即ち疎水性表面の部分には標的細胞以外の細胞が非特異的に吸着することがある。そして、もしこのような非特異的に吸着した細胞を除去しようとすると、例えば非水溶媒等の薬品を用いなければならないことがあり、抗体に吸着している標的細胞に何らかの影響がある可能性がある。【０００９】
本発明はこのような課題を解決するべく行われたものである。本発明が解決すべき課題は、標的細胞を特異的に吸着しつつ、非特異的な吸着を抑制可能な細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決するべく鋭意検討した結果、基板に固定され、抗体に結合させた高分子化合物の側鎖に親水性部位を導入することにより、前記課題を解決できることを見出した。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、標的細胞を特異的に吸着しつつ、非特異的な吸着を抑制可能な細胞の分離回収膜、及びそれを用いた培養シート及び培養装置、並びに細胞の分離回収方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施形態の分離回収膜の斜視図である。
【図２】本実施形態の分離回収膜の作用を説明するための図であり、（ａ）は加熱前の状態、（ｂ）は加熱後の状態を示す図である。
【図３】（ａ）は本実施形態の分離回収膜の変形例を示す図であり、（ｂ）は本実施形態の分離回収膜の別の変形例を示す図である。
【図４】本実施形態の分離回収膜を用いて構成される培養シートの上面図である。
【図５】本実施形態の培養シートの断面図である。
【図６】本実施形態の分離回収膜を用いて構成される培養装置のブロック図である。
【図７】（ａ）は分離回収膜に細胞を吸着させたときの電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は吸着した細胞を回収した後の分離回収膜を撮影した電子顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）の写真を模式的に示した図、（ｄ）は（ｂ）の写真を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（本実施形態）を具体的に挙げて、本発明を具体的に説明する。
【００１４】
［１．細胞の分離回収膜］
〔構成〕
本実施形態の細胞の分離回収膜（以下、適宜、単に「分離回収膜」という）は、支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する疎水性高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備えるものである。まず、これらの構造や機能について説明し、次いで、これらの結合の様子について図面を参照しながら説明する。
【００１５】
（支持体）
分離回収膜に備えられる支持体は、後記する高分子部位等を固定するものである。このような支持体はどのようなものであってもよいが、疎水性高分子部位等を化学的に固定できるものであることが好ましい。具体的には、支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んで構成されていることが好ましい。このような材料を用いることで、高分子部位等を固定するための表面処理が特に容易であり、また、表面処理のために加圧したときの耐久性に優れるという利点がある。
【００１６】
高分子材料としては、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、表面修飾アガロースゲル等が挙げられる。ただし、支持体は、高分子部位等を固定可能であればこれらの材料により構成されている必要は無く、例えば金属の単体、金属酸化物等の金属材料を用いることができる。
【００１７】
支持体表面の形状は、高分子部位等を固定可能であればどのようになっていてもよいが、例えば平坦形状にすることができる。他にも、支持体表面の形状は、ピラー構造や球状構造、多孔形状等とすることもできる。
【００１８】
（高分子部位）
前記支持体に固定される高分子部位は、温度により構造が変化するものである。具体的には、例えば、室温では分子構造が維持されているものの、室温よりも高い所定温度以上では分子構造が崩れるものである。このような構造変化により、詳細は後記するが、高分子部位に結合された細胞吸着部位を後記する親水性部位の中に埋没させることができ、分離回収膜から標的細胞を脱離させ易くなる。
【００１９】
高分子部位の具体的な構造は、温度により構造が変化すれば、特に制限されない。ただし、高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることが好ましい。このような構造を有する高分子部位とすることにより、温度によって当該螺旋構造を掌る水素結合を切断させることができ、構造変化を生じ易くすることができる。また、高分子部位としては、疎水性高分子部位が好ましい。即ち、高分子部位を構成する高分子は、疎水性高分子であることが好ましい。
【００２０】
また、高分子部位は、どのような方法で前記の支持体に固定されていてもよい。例えば、化学的な結合（共有結合等）や物理的な吸着（抗原抗体反応を用いた吸着等）等の方法が挙げられる。
【００２１】
高分子部位の好適な具体例としては、ポリアミノ酸を含むものである。ポリアミノ酸はアミノ酸が二つ以上重合してなるものである。このとき、アミノ酸は、通常は直鎖状に重合することになる。ポリアミノ酸は、分子内で水素結合が生じることにより、螺旋構造を有している。従って、ポリアミノ酸を用いることにより、前記の構造変化を生じさせ易くなるという利点がある。また、ポリアミノ酸は通常直鎖状であるため、高分子部位の配向を制御し易くなる。そのため、支持体上での所望の位置への疎水性部位の固定が容易になる。さらには、後記する細胞吸着部位を高分子部位に結合させ易くなるという利点もある。
【００２２】
ポリアミノ酸は、一種のみのアミノ酸により構成されてもよく（単独重合）、二種以上のアミノ酸が任意の比率及び組み合わせにより構成されてもよい（共重合）。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、特に制限されないが、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、グルタミン、システイン、アラニン、ロイシン等が挙げられる。
【００２３】
なお、ポリアミノ酸の数平均分子量は特に制限されないが、通常は５ｋＤａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上、より好ましくは５０ｋＤａ以上である。この範囲とすることで、ポリアミノ酸を支持体により固定し易くなる。
【００２４】
（細胞吸着部位）
細胞吸着部位は、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能なものである。従って、細胞吸着部位は、分離回収の対象となる標的細胞に応じて適宜決定して用いればよい。中でも、細胞吸着部位として、標的細胞を抗原とする抗体を用いることが好ましい。抗体を用いることで、生体組織である細胞に対して、生物反応である抗原抗体反応を利用することができ、特異的に標的細胞を吸着できるとともに、脱吸着の制御がより容易になる。
【００２５】
また、細胞吸着部位は、前記の高分子部位に結合している。細胞吸着部位と高分子部位とは直接結合していてもよいが、リンカーを介して結合していることが好ましい。リンカーを介して細胞吸着部位を疎水性高分子部位に結合させることにより、より確実に、細胞吸着部位が分離回収膜表面から外側に向かって突出した形態（即ち外表面に露出）とすることができる。これにより、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜を接触させたときに、細胞吸着部位を標的細胞にいっそう特異的に吸着させ易くすることができる。
【００２６】
リンカーとしては、ビオチン−アビジンであることが好ましい。ビオチン−アビジンを用いることにより、細胞吸着部位（例えば抗体）と疎水性高分子部位（例えばポリアミノ酸）とをより容易に結合することができる。具体的には、細胞吸着部位をビオチン化するとともに高分子部位をビオチン化することで、アビジンを介して、細胞吸着部位と高分子とを容易に結合することができる。
【００２７】
さらに、リンカーとしては、プロテインＡやプロテインＧを構成するドメインを用いてもよい。具体的には、プロテインＡやプロテインＧを抗原とし、これらに高分子部位及び細胞吸着部位を結合させるようにしてもよい。これにより、ＩｇＧ（免疫グロブリン）抗体を介して、高分子部位と細胞吸着部位とを結合させることができ、ビオチン−アビジンを用いた場合と同様の効果が得られる。
【００２８】
高分子部位における細胞吸着部位の具体的な結合位置は特に制限されない。ただし、詳細は後記するが、細胞吸着部位をより確実に分離回収膜の外表面に露出させる観点から、高分子部位を構成する高分子の末端に結合されることが好ましい。具体的には、例えば、高分子部位を構成する高分子が直鎖状である場合には直鎖の末端であり、高分子が網目状である場合には網目の末端となる。これらの位置に細胞吸着部位を結合させることで、細胞吸着部位をより確実に分離回収膜の外表面に露出させることができる。
【００２９】
前記のように、細胞吸着部位は、分離回収膜の外表面に露出している。そのため、被処理液を分離回収膜に接触させたときに、細胞吸着部位に対して特異的に標的細胞を結合させて、回収することができる。細胞吸着部位を外表面に露出させる方法は特に制限されず、例えば、前記のように、前記のリンカーを介して細胞吸着部位を高分子部位に吸着させることで、細胞吸着部位を外表面に露出させることができる。また、細胞吸着部位以外の部分の位置（高さ）が、細胞吸着部位の部分の位置（高さ）よりも相対的に低くすることで、リンカーを介さなくても、外表面に露出させることができる。なお、外表面に露出させるためのこれらの方法は一例であり、細胞吸着部位が分離回収膜の外表面に露出していれば、どのような方法を用いてもよく、どのような形態になっていてもよい。
【００３０】
これらの説明のように、細胞吸着部位が外表面に露出しつつ、細胞吸着部位を高分子部位に結合させることで、分離回収膜表面の非特異的な吸着部分を低減することができる。即ち、細胞吸着部位が、高分子部位を覆うように配置されることになるので、高分子部位に由来する非特異的な吸着部分の面積を減少させることができるようになる。
【００３１】
一般に細胞は疎水性の部分に非特異的な吸着を生じやすいため、分離回収膜表面に疎水性の部分が存在すると、当該疎水性の部分に標的細胞以外の細胞が非特異的に吸着し易い。しかし、本実施形態においては、細胞吸着部位が外表面に露出しつつ、高分子部位に結合させているため、細胞吸着部位により標的細胞を特異的に吸着させることができる。しかも、前記のように、疎水性の部分の面積が低減されているため、標的細胞以外の細胞の分離回収膜への非特異的な吸着を抑制することもできる。
【００３２】
（親水性部位）
親水性部位は、分離回収膜の外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触（例えば含浸）させたときに、前記被処理液が接触する部位である。高分子部位及び細胞吸着部位以外の部位に、外表面に露出するように親水性部位が設けられることで、細胞の非特異的な吸着をよりいっそう抑制することができる。
【００３３】
このような親水性部位としては、例えば親水性官能基、具体的には、ヒドロキシル基やカルボキシル基等を有しているものが挙げられる。親水性部位のより具体的な例としては、エチレングリコールやその重合体（ポリエチレングリコール）、リン脂質構造を有する分子、リン酸やその重合体（ポリリン酸）等が挙げられる。中でも、良好な親水性、及び高分子部位への結合のし易さ等の観点から、親水性部位は、エチレングリコールが２つ以上重合したポリエチレングリコールを含むことが好ましい。
【００３４】
また、親水性部位は、前記の高分子部位と独立して設けられていてもよいが、疎水性部位の構造変化をいっそう促す観点から、親水性部位は、高分子部位に結合していることが好ましい。即ち、親水性部位は、前記の高分子部位と一体になっていることが好ましい。親水性部位が疎水性高分子部位に結合していることで、温度変化に伴う高分子部位の構造変化をいっそう促すことができる。ただし、分離回収膜に備えられる全ての親水性部位が高分子部位に結合している必要は無く、適宜アルキル基等を結合することで、高分子部位の温度応答性を制御することができる。
【００３５】
親水性部位の高分子部位への結合位置は特に制限されない。ただし、高分子部位が直鎖状である場合には、高分子部位の側鎖に親水性部位が結合していることが好ましい。これにより、分離回収膜において、高分子部位以外の部位に、親水性部位を容易に配置することができる。そのため、分離回収膜の外表面に、より確実に親水性部位を露出させることができる。
【００３６】
前記のように、高分子部位としてはポリアミノ酸が好ましく、親水性部位としてはポリエチレングリコールを含むことが好ましい。また、親水性部位は、高分子部位に結合していることが好ましい。これらを満たす高分子及び親水性部位として好適な材料としては、例えば、以下の式（１）で表される化合物である。
【化１】
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※式（１）中、ｎ及びｘは、それぞれ独立して、２以上の整数である。
【００３７】
〔作用〕
次に、本実施形態の分離回収膜における構成及び作用について、図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
図１は、本実施形態の分離回収膜１０の斜視図である。分離回収膜１０は、マクロの視点で観察すると、支持体１の表面に薄膜２が形成されている。この薄膜２には、前記の高分子部位や細胞吸着部位、親水性部位等が含まれている。
【００３８】
図２は、本実施形態の分離回収膜１０の作用を説明するための図であり、（ａ）は加熱前の状態、（ｂ）は加熱後の状態を示す図である。本実施形態では、分離回収膜を加熱することで、高分子部位の構造が変化（破壊）されるようになっている。図２（ａ）に示すように、本実施形態においては、薄膜２には、螺旋状の高分子部位２ａと、高分子部位２ａに結合した細胞吸着部位２ｂと、高分子部位２ａに結合した親水性部位２ｃとが含まれている。各高分子部位２ａ（図示の例では３つ）には、それぞれ、細胞吸着部位２ｂが結合されている。また、支持体１の表面において、高分子部位２ａと親水性部位２ｃとが交互に配置されている。即ち、支持体１の表面は、細胞吸着部位２ｂで覆われた高分子部位２ａの部分以外は、親水性部位２ｃにより覆われていることになる。
【００３９】
そして、本実施形態においては、細胞吸着部位２ｂに標的細胞２０が吸着した後（図２（ａ））、分離回収膜１０を加熱することにより高分子部位２ａの構造が変化し、細胞吸着部位２ｂに吸着した標的細胞が脱離するようになっている（図２（ｂ））。なお、図示の例では、便宜上、一つの細胞吸着部位２ｂに一つの標的細胞２０を吸着させているが、二つ以上の標的細胞部位２ｂに一つの標的細胞２０が吸着されるようにしてもよい。
【００４０】
図２（ａ）の状態から図２（ｂ）の状態に変化するときの作用について説明する。加熱前の高分子部位２ａにおいては、螺旋構造が維持されている。また、細胞吸着部位２ｂには、標的細胞２０が吸着している。そして、この状態で分離回収膜１０を加熱すると、熱エネルギにより高分子部位２ａの螺旋構造が破壊されランダム構造に変化し、外表面に露出していた細胞吸着部位２ｂが、親水性部位２ｃの中に埋没する。これにより、細胞吸着部位２ｂと標的細胞２０の吸着が、ランダム構造に変化した疎水性高分子部位２ａの立体障害により、遮断されることになる。さらに、細胞吸着部位２ｂが親水性部位２ｃの中に埋没すると、親水性部位２ｃで覆われた支持体１上に、標的細胞２０が載置されている状態になる。そうすると、疎水性である標的細胞２０は、親水性部位２ｃから容易に回収可能な状態になる。
【００４１】
図２（ａ）の状態から図２（ｂ）の状態に変化する温度としては、例えば高分子部位２ａの構造により制御が可能である。例えば、疎水性高分子部位２ａが長い螺旋構造を有している場合、水素結合の数も多くなるため、それらを切断して構造を変化させるために必要な熱エネルギも大きくなる。そのため、構造変化をさせるための温度も高くなる傾向となる。一方で、含まれる螺旋構造が短い場合には、水素結合の数も少ない。そのため、構造変化をさせるための温度は低くなる傾向となる。さらには、高分子部位２ａに親水性部位２ｃが結合している場合には、親水性部位２ｃの構造によっても制御が可能である。
【００４２】
なお、前記の説明では、所定の温度以上で螺旋構造がランダム構造に変化する構造したが、所定の温度以下ではランダム構造であるが、所定の温度以上では螺旋構造になるようにしてもよい。この場合には冷却により構造変化が生じ、標的細胞２０が回収可能な状態になる。
【００４３】
なお、本実施形態の分離回収膜は、図示の内容や前記の説明の内容に限定されるものではない。例えば、図３（ａ）に示すように、全ての疎水性高分子部位２ａに細胞吸着部位２ｂが結合している必要はなく、一部の疎水性高分子部位２ａにのみ細胞吸着部位２ｂを結合される分離回収膜１０Ａとしてもよい。このようにすることで、被処理液に含まれる標的細胞の数が少ないときでも、効率よく標的細胞を回収することができる。
【００４４】
また、図３（ｂ）に示すように、高分子部位２ａに結合している親水性部位２ｃに加えて、隣接する親水性部位２ｃ間であって支持体１が露出している部位に、別の親水性部位２ｄを設けた分離回収膜１０Ｂとしてもよい。このようにすることで、非特異的な吸着をより確実に防止することができる。
【００４５】
［２．細胞の分離回収膜の製造方法］
次に、本実施形態の分離回収膜の製造方法について説明する。本実施形態の分離回収膜の製造方法は特に制限されないものの、例えば以下の方法により製造することができる。なお、以下の説明では、分離回収膜の製造方法の一例として、親水性部位が高分子部位に結合した分離回収膜を製造する場合を挙げて、図２（ａ）を参照しながら説明する。
【００４６】
まず、親水性部位２ｃを結合させた高分子部位２ａ（任意の方法で調製可能である）が、例えば、スピンコート、ディップ法、気相蒸着法等により、支持体１の表面に固定される。固定の方法としては、可逆反応により高分子部位２ａそのものが脱離しない化学結合が好ましい。具体的には例えば、アミド結合、エステル結合、シラノール結合、マレイミド、チオエステル結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応による化学結合、クリック反応による化学結合、あるいは、用途によっては金−チオール結合、イミン結合等が挙げられる。
【００４７】
ここで、高分子部位２ａの固定に際して、親水性部位２ｃは支持体１に固定されてもよく、固定されなくてもよい。ただし、高分子部位２ａを支持体１に固定すれば、側鎖に結合した親水性部位２ｃは、固定せずとも支持体１の表面に十分に配置することができる。その後、固定されなかった高分子部位２ａは、良溶媒により除去される。
【００４８】
次いで、固定した高分子部位２ａの末端に、化学結合により、細胞吸着部位２ｂが結合される。このとき、細胞吸着部位２ｂは、必ずしも疎水性高分子部位２ａの末端に結合している必要は無い。従って、細胞吸着部位２ｂが、細胞分離膜１０の外表面に露出していれば、高分子部位２ａのどの部分に結合していてもよい。
【００４９】
このようにすることで、親水性部位２ｃを表面に露出させた、分離回収膜を製造することができる。
【００５０】
なお、高分子部位２ａの支持体１への結合は、高分子部位２ａを必要に応じて溶媒に分散させ、例えばスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の各種方法により、支持体１の表面に塗布してもよい。このような方法によっても、支持体１に疎水性高分子部位２ａを配置することができる。
【００５１】
［３．細胞の分離回収膜の用途］
次に、本実施形態の分離回収膜の用途について、図面を参照しながら説明する。本実施形態の分離回収膜は、どのような用途にも適用可能であるが、例えば、細胞の培養シート等のバイオデバイスや、細胞の培養装置等に好適である。以下、本実施形態の分離回収膜の好適な用途として、これら二つを例に挙げて説明する。
【００５２】
［３−１．細胞の培養シート］
図４は、本実施形態の分離回収膜を用いて構成される培養シート５０の上面図である。本実施形態の細胞の培養シート５０（以下、適宜、単に「培養シート５０」という）は、前記の分離回収膜１０と同様の構成を有するものである。細胞培養シート５０は、厚さ０．５μｍのポリスチレンを主成分とする支持体１と、この薄膜に立設され、ポリスチレンを主成分とする複数の柱状微細突起２Ａ（以下、単に「突起２Ａ」という）とを備えている。突起２Ａは円柱状であり、その直径は５００ｎｍ、高さは１μｍである。それぞれの突起２Ａは１μｍの周期（ピッチ）で配列している。また、本実施形態の培養シート５０においては、はじめに円柱状に突起２Ａが形成されたあと十字形状に突起２Ａが除去され、十字形状の隙間５１が形成されている。
【００５３】
突起２Ａは、以下の方法により形成可能である。即ち、まず、ポリスチレンからなる、前記形状を有する土台部分の突起が、インプリント方法により、支持体１上に形成される。そして、この土台表面が、紫外光／オゾン発生装置を用いて表面酸化処理される。最後に、この表面酸化処理された土台に対して、高分子部材等を図２（ａ）等に示したように結合させることにより、標的細胞を吸着可能な突起２Ａを備える培養シート５０が得られる。
【００５４】
培養シート５０は、培養液が入れられたガラスシャーレ等の容器内で培養液に含浸され、培養シート５０上で標的細胞２０（以下、単に「細胞２０」という）の培養が行われる。具体的な培養方法について、図５を参照しながら、培養シート５０の使用方法（細胞の培養方法）について説明する。
【００５５】
図５は、本実施形態の培養シート５０の断面図である。細胞２０は、各突起２Ａ表面の細胞吸着部位２ｂ（図５では図示しない）に吸着（固定）される。なお、図示の例では、複数の突起２Ａ上の細胞吸着部位２ｂに対して、一つの細胞２０が吸着している様子を示している。そして、このように細胞２０が吸着した状態で培地や栄養素等の培養液を供給することで、細胞２０が培養される。なお、培養可能な細胞２０としては特に制限されるものではないが、例えば、皮膚、骨、血液等の細胞（組織）である。
【００５６】
図５に示すように、支持体１と細胞２０とは離間した状態になっている。そのため、細胞２０を培養するための培養液や酸素が、細胞２０の上側と下側との双方から供給される。これにより、細胞２０は効率よく培養可能である。また、細胞２０の培養に伴って排出される老廃物（例えば二酸化炭素）が、細胞２０の上側と下側とから効率よく排出される。
【００５７】
このような培養シート５０を使用することにより、細胞２０は、突起２Ａの上面によってのみ支持されることになる。そのため、従来、ガラスシャーレの底面において培養されていた細胞２０の接触面積を低減することができる。従って、細胞２０を剥離する際の細胞２０への細胞の損傷を大幅に軽減することができる。これにより、細胞２０を移植する際の移植部位への定着率を高めることができる。
【００５８】
また、図５に示すように、突起２Ａにより形成される、細胞２０下方の隙間を通して、細胞２０全体に培養液が流れやすくなる。その結果、細胞２０への栄養素の供給や細胞２０の老廃物の排出を効率よく行うことができ、従来生じていた培養中の細胞２０の死滅を抑制することができる。
【００５９】
なお、突起２Ａは、高分子材料にプラズマ処理等により親水化処理が施されたものであってもよい。また、高分子材料は、培養する細胞（組織）に対して影響の少ない材料を選択することが好ましく、具体的にはポリスチレンを用いているが、これに限られるものではない。例えば、高分子材料としては、ポリメタクリル酸メチル、ポリ乳酸等も好ましい。
【００６０】
さらに、バイオデバイスとしては、前記のものの他にも、例えば医療・診断ツールとして特にμＴＡＳと総称されるものが挙げられる。具体的には、表面に微細加工を施したものや、医療・化学分野向けの検出・合成等の手段に用いられるものも挙げられる。
【００６１】
［３−２．細胞の培養装置］
本実施形態の細胞の培養装置１００（以下、適宜、単に「培養装置１００」という）は、前記の分離回収膜１０を備えるものである。そして、この培養装置１００により、被処理液に含まれる標的細胞の分離回収が行われる。以下、培養装置１００の具体的な装置構成と、培養装置１００を用いた細胞の分離回収方法について説明する。
【００６２】
図６は、本実施形態の分離回収膜を用いて構成される培養装置１００のブロック図である。培養装置１００は、前記の分離回収膜１０と、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜１０を含浸（接触）させる含浸装置１０２ｂ（接触装置）と、分離回収膜１０を加熱する加熱装置１０４（加熱冷却装置）と、分離回収膜１０に吸着した標的細胞を回収する細胞回収装置１０５とを備えるものである。
【００６３】
また、培養装置１００は、これらのほかにも、分離回収膜に非特異的に吸着した細胞を洗浄する洗浄液１００ｂと、標的細胞を培養するための培地試薬１００ｃと、培地試薬１００ａを保管する保冷庫１００ａと、洗浄液１００ｂや培地試薬１００ｃを恒温室１０２に供給する送液システム１０１とを備えている。さらに、培養装置１００には恒温室１０２が備えられ、恒温室１０２内の培養装置１０２ａ内の標的細胞を含む培養液に、分離回収膜１０が含浸されるようになっている。また、培養装置１０２ａ内の雰囲気は、ガス交換装置１０３により、制御されるようになっている。
【００６４】
培養装置１００を用いた、細胞の分離回収方法について説明する。なお、以下の説明においては、細胞を分離回収膜に吸着させて培養した後に回収しているが、培養せず、吸着後にすぐに回収するようにしてもよい。
【００６５】
まず、培養装置１０２ａに、標的細胞を含む被処理液が供給される。その後、含浸装置１０２ｂは、標的細胞を含む被処理液に分離回収膜１０を含浸（接触）させて、被処理液中の標的細胞を分離回収膜に吸着させる（分離回収膜接触ステップ）。その後、分離回収膜１０は洗浄液１００ｂにより洗浄されることで非特異的に吸着した細胞を洗い流し、特異的に吸着した標的細胞が培養される。このようにすることで、標的細胞を効率よく培養することができる。
【００６６】
次いで、含浸装置１０２ｂは、含浸させた分離回収膜１０を被処理液から取り出し、その後、加熱装置１０４により、分離回収膜１０が加熱される（加熱冷却ステップ）。これにより、分離回収膜１０の高分子部位２ａの構造が変化し、特異的に吸着した標的細胞（培養された標的細胞）が容易に剥離可能となる。そして、細胞回収装置１０５は、この状態の分離回収膜１０の表面に対して細胞回収液１０５ａを供給する。これにより、分離回収膜１０の表面から、培養された標的細胞が剥離される。剥離された標的細胞は、細胞塊集装置１０５により回収される。
【００６７】
以上の方法によれば、従来、通常の培地や従来の培養シートを使用するときに生じてきた剥離による細胞への損傷や、回収時に化学薬品の使用を抑えることが可能となる。これにより、標的細胞の回収率の低下を抑制することができる。
【００６８】
なお、前記の例では、加熱により標的細胞が剥離するようにしたが、疎水性高分子部位２ｂ等の構造を変化させることで、冷却により標的細胞が脱離するようにしてもよい。この場合、加熱装置１０４に代えて、分離回収膜１０を冷却する冷却装置を適用すればよい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。【００７０】
〔細胞の分離回収膜の作製と細胞選択率の評価〕
＜実施例１〜３＞
（ＰＥＧ修飾ポリリジンの調製）
まず、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びカルボン酸末端のポリエチレングリコール（前記式（１）においてｘ＝３）を純水に溶解させ、この溶液を４℃に冷却、撹拌しながら、ポリリジン（種々の分子量が混在）を加えた。そして、常温で２時間撹拌し、ポリリジン（高分子部位）の側鎖にポリエチレングリコール（親水性部位）が結合したＰＥＧ修飾ポリリジンを得た。【００７１】
次いで、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて、未反応低分子物を除去し、かつ、５ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（実施例１）、１２ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（実施例２）、２５ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（実施例３）の３種類を分離した。以下、特に指定しない限り、「ポリリジン」との記載は、調製した「ＰＥＧ修飾ポリリジン」を表すものとする。【００７２】
（支持体に対するポリリジンの固定化）
実施例１〜３のポリリジンを、それぞれ、表面にアミノ基処理を施した樹脂プレート（ポリスチレン製の支持体）上に以下の手順に従って共有結合させた。１ｍｏｌ％のポリリジン水溶液に、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加え、各プレートを浸漬した。その後、室温で２時間反応させた。これにより、ポリリジンを結合させた支持体を得た。その後、純水で各プレートを３回洗浄した。【００７３】
（ポリリジンに対するプロテインＡの結合）
実施例１〜３のポリリジンを結合させた３種のプレートを、炭酸緩衝液で希釈した２％グルタルアルデヒドに浸漬し、３７℃で２時間静置した。反応後の各プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そして、濃度０．１ｗｔ％のプロテインＡ水溶液(ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を使用)を調整し、このプロテインＡ溶液に各プレートを浸漬し、プロテインＡをポリリジンに結合させた。【００７４】
（抗体ＣＤ４０の結合）
続いて、以下の手順に従い、各プレートに固定されたプロテインＡ（抗原）に対し、抗体ＣＤ４０を結合させた。抗体ＣＤ４０はチャイニーズハムスター卵巣細胞に特異的に結合可能な抗体である。まず、各プレートを洗浄バッファ（２００μｌ）で３回洗浄した後、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。これにより、プロテインＡにＩｇＧが結合した。その後、４℃に保ちながら洗浄バッファ（２００μｌ）を用いて、各プレートを３回洗浄した。その後、抗体ＣＤ４０の溶液に各プレートを浸漬し、抗体ＣＤ４０をＩｇＧに結合させた。以上の操作により、実施例１〜３の分離回収膜を作製した。【００７５】
（細胞吸着の選択率の評価）
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１対１で含む緩衝水溶液を、実施例１〜３の分離回収膜にそれぞれ４℃で滴下し、インキュベートした。分離回収膜の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、ＣＨＯ細胞が特異的に吸着する。その後、緩衝水溶液で各プレートを３回洗浄することで、非特異的に吸着したＭＳＣを洗い流した。洗い流されたＭＳＣは回収し、フローサイトメータにより、細胞数を確認した。なお、フローサイトメータにおけるＣＨＯ細胞とＭＳＣ細胞との区別は、ＭＳＣ細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１０５抗体で蛍光標識することで行った。【００７６】
次に、緩衝水溶液中で各プレートを３７℃に加熱し、ポリリジンの構造を変化させることにより、特異的に吸着していたＣＨＯ細胞を脱離させた。脱離したＣＨＯ細胞は緩衝水溶液を用いて回収した。そして、回収されたＣＨＯ細胞の細胞数をフローサイトメータで確認した。【００７７】
回収されたＭＳＣの細胞数及びＣＨＯ細胞の細胞数に基づき、以下の式（１）を用いて、細胞の選択率を算出した。
（細胞の選択率）＝（分離回収膜で回収した細胞の数）／（回収前の細胞の数）×１００[％]  ・・・式（１）【００７８】
＜実施例４＞
Ｂ細胞及びＭＳＣを１対１で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は実施例１と同様にして選択率を評価した。なお、分離回収膜の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、Ｂ細胞が特異的に吸着する。【００７９】
＜実施例５＞
血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及びＭＳＣを１対１で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は実施例１と同様にして選択率を評価した。なお、分離回収膜の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、ＣＴＣが特異的に吸着する。【００８０】
＜比較例１＞
「カルボン酸末端のポリエチレングリコール」を用いなかったこと（即ち、親水性部位を含まないこと）、及び、ポリリジン（親水性部位を含まないポリリジン）の数平均分子量を７ｋＤａとしたこと以外は実施例１と同様にして、比較例１の分離回収膜を作製した。そして、この分離回収膜について、実施例１と同様にして選択率の評価を行った。【００８１】
＜評価結果＞
実施例１〜５及び比較例１の選択率を以下の表１に示す。
【表１】
2015033457.tif 000004
【００８２】
表１に示すように、親水性部位を含む分離回収膜（実施例１〜５）においては、数平均分子量（大きさ）や標的細胞の種類によらず、いずれも良好な選択率を示した。従って、親水性部位が細胞分離膜に含まれることにより、細胞の非特異的な吸着が抑制され、標的細胞を効率よく分離回収することができることがわかった。【００８３】
一方で、親水性部位を含まない比較例１においては、数平均分子量や標的細胞の種類は実施例１とほぼ同じであるにも関わらず、選択率は実施例１の約半分であった。従って、親水性部位を含まない分離回収膜を用いると、非特異的な吸着が増加し、選択率が著しく低下することがわかった。【００８４】
また、実施例１の分離回収膜に対して細胞を吸着させた後の表面と、細胞を分離回収（脱離）させた後の表面とについての、電子顕微鏡写真を図７に示す。【００８５】
図７は、（ａ）は分離回収膜に細胞を吸着させたときの電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は吸着した細胞を回収した後の分離回収膜を撮影した電子顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）の写真を模式的に示した図、（ｄ）は（ｂ）の写真を模式的に示した図である。図７（ａ）に示すように、分離回収膜の表面には細胞が吸着しているが、分離回収膜の加熱により、図７（ｂ）に示すように、分離回収膜表面から細胞が完全に脱離していることがわかった。【００８６】
〔細胞の分離回収膜を用いた細胞培養〕
実施例１と同様の方法により、図４及び図５に示す培養シートを作製した。作製した培養シートを、培養液を浸したガラスシャーレに入れ、培養シート上で、正常ヒト表皮角化細胞を培養した。この培養には、クラボウ社製のＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２が培地として使用され、培養温度が３７℃であり、５％の二酸化炭素の流下で行われた。【００８７】
この結果、培養シート上において、表皮角化細胞が正常に付着してシート形状に増殖した。このシート形状の細胞を培養開始の１４日後に剥離することで、損傷の少ないシート状の表皮角化細胞が得られた。
【符号の説明】
【００８８】
１  支持体
２  薄膜
２ａ  高分子部位
２ｂ  細胞吸着部位
２ｃ  親水性部位
５０  培養シート
１００  培養装置
１０２ｂ  含浸装置
１０４  加熱装置
１０５  細胞回収装置
１０５ａ  細胞回収液
【図１】
2015033457.tif 000005
【図２】
2015033457.tif 000006
【図３】
2015033457.tif 000007
【図４】
2015033457.tif 000008
【図５】
2015033457.tif 000009
【図６】
2015033457.tif 000010
【図７】
2015033457.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月10日(2014.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっていることを特徴とする、細胞の分離回収膜。
【請求項２】
前記高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることを特徴とする、請求項１に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項３】
前記親水性部位は、前記高分子部位に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項４】
前記高分子部位はポリアミノ酸を含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項５】
前記親水性部位は、ポリエチレングリコールを含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項６】
前記細胞吸着部位は、前記標的細胞を抗原とする抗体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項７】
前記支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んでいることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞の分離回収膜。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜を含むことを特徴とする、細胞の培養シート。
【請求項１０】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜を具備することを特徴とする、細胞の培養装置。
【請求項１１】
支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する疎水性高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、標的細胞を含む被処理液に接触させたときに前記標的細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、前記細胞吸着部位の位置が、前記支持体に対して、前記親水性部位の位置よりも相対的に高い位置になっている細胞の分離回収膜と、
分離回収膜を前記被処理液に接触させる接触装置と、
前記細胞の分離回収膜を加熱又は冷却する加熱冷却装置と、
前記細胞の分離回収膜に吸着した前記標的細胞を回収する細胞回収装置と、を具備する細胞の培養装置を用いて行われ、
前記細胞の分離回収膜を、前記含浸装置によって前記標的細胞を含む被処理液に接触させて、前記被処理液中の標的細胞を前記細胞吸着部位に吸着させる分離回収膜接触ステップと、
前記分離回収膜接触ステップにおいて接触させた細胞の分離回収膜を、前記被処理液外において前記加熱冷却装置により加熱又は冷却する加熱冷却ステップと、
前記加熱冷却ステップにおいて加熱又は冷却された細胞の分離回収膜の表面に膜処理液が供給され、供給された膜処理液を前記細胞回収装置により回収して、前記細胞吸着部位に吸着した前記標的細胞を回収する標的細胞回収ステップと、を含むことを特徴とする、細胞の分離回収方法。
【国際調査報告】
2015033457.tif 000012
2015033457.tif 000013
2015033457.tif 000014
2015033457.tif 000015