(57)【要約】  本発明は、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状についての安全でかつ優れた治療薬、及び安全でかつ優れたＡＳＣの機能阻害薬を提供する。  １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の機能阻害薬。
2015016178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の機能阻害薬。
【請求項２】
ＡＳＣの機能が、カスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成能である、請求項１に記載の阻害薬。
【請求項３】
複合体がインフラマソームである、請求項２に記載の阻害薬。
【請求項４】
インフラマソームが関与する経路における、プロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を阻害する、請求項３に記載の阻害薬。
【請求項５】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状の治療薬。
【請求項６】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＡＳＣとカスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成が関与する疾患又は症状である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項７】
複合体がインフラマソームである、請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、カスパーゼ１が関与する疾患又は症状である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項９】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８が関与する疾患又は症状である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１０】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１１】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、慢性関節リウマチである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１２】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、アルツハイマー病である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１３】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、クライオピリン関連周期熱症候群である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１４】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、家族性地中海熱である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１５】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＰＡＰＡ症候群である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１６】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、Ｍａｊｅｅｄ症候群である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１７】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、高ＩｇＤ症候群である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１８】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、反復性胞状奇胎である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項１９】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＤＩＲＡである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項２０】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炭疽菌感染症である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項２１】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、急性呼吸促拍症候群である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項２２】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炎症性細胞死である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【請求項２３】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、石綿肺である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分として含有する、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の機能阻害薬及びＡＳＣが関与する疾患又は症状の治療薬に関する。本発明はまた、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分として含有する、インフラマソーム経路阻害薬及びインフラマソーム経路が関与する疾患又は症状の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下、１，５−ＡＦという）は、ある種の子嚢菌や紅藻由来の酵素であるα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることで生産することができる。１，５−ＡＦは、その分子間内に二重結合を有しており、他の単糖類と比較して反応性に富む糖である。【０００３】
１，５−ＡＦは食品に安全に添加される抗酸化剤等としての用途が開示されている（特許文献１及び２参照）。また、この単糖は抗生物質ピロンミクロテシンの前駆体でもある（特許文献３参照）。【０００４】
また１，５−ＡＦは、最近では、抗う蝕作用、血小板凝集抑制作用、グリコーゲン分解酵素阻害、アディポネクチンの産生増強、抗腫瘍作用等についても報告されており（特許文献４−１１参照）、１，５−ＡＦは健康食品あるいは医薬品等の様々な分野でもその多機能性を利用した展開が期待される糖質である。【０００５】
「炎症（inflammation）」はヒトの感染症や外傷の基盤をなす病態であるため、臨床医学のみならず、基礎医学、生物学の分野においても重要な分野である。この炎症は症候−病理形態学的特徴から、「紅腫熱疼」として把握されてきた。すなわち炎症巣は、熱を帯びて紅く腫れ、かつ痛むという特徴を有しており、この病態像は長らく中核をなすコンセプトであり、いわば「古典的炎症像」とでも言うべき概念である。しかしこの十数年の研究でサイトカインと称される細胞間のメディエーター類、そしてそれらの受容体が発見され、一挙に炎症の研究は細胞間のネットワークと細胞内のシグナル、遺伝子発現の解明の研究へとシフトしていった。その輝かしい成果で、ブルース・ボイトラー、ジュール・ホフマン、ラルフ・スタインマン各博士らが２０１１年にノーベル賞に輝いたことからも窺い知ることができるように、まさにこの分野は現在オンゴーイングの領域であるといえる。この３氏の研究により、炎症が免疫と密接にリンクしていること、そして細胞−受容体とその下流のシグナルにより、免疫は自然免疫と獲得免疫に２大分類されること等の概念が確立された。これは古典的炎症像を塗り替える、いわば「近代的炎症像」とも言うべき炎症像である。これらの進歩は治療医学に関してもサイトカイン介入療法（抗サイトカイン、又はその受容体のブロッカー、又は抗体）へと発展していった。このうち抗体を用いる療法は「生物学的製剤」と言われ、慢性関節リウマチ等の疾患の治療においては進歩を遂げている。しかしこの生物学的製剤は全ての炎症に対して奏功するわけではなく一部の疾患に限られている。さらに、生物学的製剤が奏功する場合であっても、副作用及びコスト等の多くの問題があることが判明しつつある。【０００６】
一方、上述のサイトカイン類とその受容体からのシグナルは肥満や糖尿病、動脈硬化、高血圧、さらには加齢等によっても微量ではあるが慢性持続的に作動していることが判明し、「自然炎症」なる概念が登場してきつつある（図１）。このような概念の進化の背景には、ＰＡＭＰｓ（Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ：病原微生物由来の分子、あるいはその断片)、ＤＡＭＰｓ(Ｄａｍａｇｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ：障害を受けた、あるいは病態下で生成された自己の細胞や蛋白、あるいは組織由来の分子等)を認識するＰＲＲｓ（Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）が発見・同定されたこと、そしてそれからのシグナル伝達とそれによって活性化される細胞内マシナリー；ＮＦ-κＢとインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）が明らかになってきたことが挙げられる（図２）。【０００７】
ここに至り、炎症の研究は一挙に細胞内シグナル伝達と細胞内マシナリー、特にインフラマソームの活性化と、その下流に移ってきつつある。従って今後、炎症とその治療の研究は、一斉に細胞内にシフトすることが予想され、事実その兆しは見えつつある。【０００８】
上記細胞内炎症発現のプロセスは図２、３−１に示すように、数千個にも上ると考えられ始めたＰＡＭＰｓ、ＤＡＭＰｓが生体内の細胞にあまねく発現している細胞表面、あるいは細胞内のＰＲＲｓによって認識されてシグナルは細胞内に伝達され、一つはＮＦ-κＢへ、あと一つはインフラマソームに収束することが判明してきた。すなわち「情報の収束」である。そして最終的にはＮＦ-κＢとインフラマソームからの情報はさらにプロカスパーゼ１（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ １）のカスパーゼ１への活性化という一点に集中される。すなわち細胞内で炎症発現のためのシグナルのカスケード（瀑状型）反応を構築していると言い得る。【０００９】
カスパーゼ１の生成により、ｐｒｏ−ＩＬ−１８、ｐｒｏ−ＩＬ−１βの成熟化とＩＬ−１８、ＩＬ−１βの細胞外への放出、それによる免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球等）の「呼び寄せ（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ)」が開始され、当該部位に炎症巣が形成されることになる。この点で重要な点は先ず、ＮＦ−κＢの活性化で、ｐｒｏ−ＩＬ−１βとｐｒｏ−ＩＬ−１８（いずれも前駆体）が細胞内に産生・蓄積され、次に活性化インフラマソームがプロカスパーゼ１をカスパーゼ１に活性化してはじめて、活性を持ったカスパーゼがそれぞれ、ｐｒｏ−ＩＬ−１８とｐｒｏ−ＩＬ−βを、成熟型の活性化ＩＬ−１８，ＩＬ−１βに活性化して、細胞外に放出するということである（図３−１）。【００１０】
インフラマソームは、図３−２に示すような７量体を形成することによりカスパーゼ１を活性化すると考えられている。具体的には、ＣＡＲＤには重合する性質があり、そのためカスパーゼ１（ＣＡＲＤ・ｐ２０／ｐ１６）とＡＳＣ（ＰＹＤ・ＣＡＲＤ）とがＣＡＲＤを介して結合し、これにＮＬＲ（ＰＹＤ／ＮＡＣＨＴ）がＰＹＤを介して結合して７量体を形成する。【００１１】
このＡＳＣは、本来、サイトゾルに存在し、トリトンＸ−１００（フェニルポリエチレングリコール型のノンイオン界面活性剤）を含む緩衝液に可溶な蛋白質であるが、レチノイン酸や抗癌剤等のアポトーシス誘発剤によって誘発されるアポトーシスに伴い、トリトンＸ−１００を含む緩衝液に不溶化し、凝集を起こす。ＡＳＣがアポトーシスに伴ってトリトンＸ−１００を含む緩衝液に対して溶性から不溶性に変化する原因は、コンフォメーションの変化によるものと考えられる。また、ＡＳＣは、自らアポトーシスを誘発する作用はないが、他の因子によって誘発されるアポトーシスを促進する作用を有する（特許文献１２参照）。【００１２】
ＮＦ-κＢとインフラマソームは上皮系細胞、神経細胞等、免疫細胞以外の細胞や、免疫担当細胞、すなわちリンパ球細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）がレジデントしていない組織や臓器の細胞群にもあまねく発現しているが、これらの非骨髄（ｎｏｎ-ｍｙｅｌｏｉｄ）系細胞も当然、生体内外からの侵襲に会うので、生体防御的応答が要求される。この際に、ｎｏｎ-ｍｙｅｌｏｉｄ組織はＰＡＭＰｓやＤＡＭＰｓの情報をキャッチして、免疫細胞の遊走因子であるＩＬ−１８、ＩＬ−１βを産生・放出して、ｍｙｅｌｏｉｄ系細胞を集簇させることで、その部位に免疫反応を遂行しうる生体防御のためのリンパ球等から成るいわば擬似リンパ節を構築するものと考えられる。【００１３】
非特許文献１及び２には以下の事項が記載されている。自然免疫や獲得免疫に関る細胞群（マクロファージや樹状細胞等）は細胞表面にＴｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプター（ＴＬＲｓ）を発現しており、これらの受容体にＤＡＭＰｓやＰＡＭＰｓが結合すると、これらの細胞は活性化され、種々のシグナルが伝達されるが、これらは合流し、１つはインフラマソームと称される蛋白複合体に収束する。この複合体はＮｏｄ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＬＲ）、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｃａｓｐａｓｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ（ＡＳＣ）、プロカスパーゼ１から構成される。ＮＬＲにＴＲＬｓ同様、ＤＡＭＰｓやＰＡＭＰｓが結合することにより、インフラマソームが活性化される。【００１４】
炎症性サイトカインであるＩＬ−１βの分泌には少なくとも２つのステップが必要である。１つはＴＬＲｓからの刺激（シグナル１）で、これによりｐｒｏ−ＩＬ−１β（ＩＬ−１βの前駆体）が細胞質内で作られる。次に、インフラマソームの活性化（シグナル２）からのシグナルでプロカスパーゼ１がカスパーゼ１に活性化され、これによりカスパーゼ１がｐｒｏ−ＩＬ−１βを切断し、活性化ＩＬ−１βが細胞外に分泌され、感染局所への免疫担当症細胞の遊走等、さまざまな免疫応答に関与する。また、ＩＬ−１８も同様のメカニズムで分泌される（非特許文献１及び２参照）。ここで最近の知見で重要な点はカスパーゼの活性化は、ＩＬ−１βとＩＬ−１８の生成と細胞外放出を惹起するのみでなく、細胞ＤＮＡの断片化、ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓと呼ばれる細胞の膨化と細胞死（炎症性ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を引き起こすということである（図４）。【００１５】
クライオピリン関連周期熱症候群（ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ＣＡＰＳ）は、インフラマソームの主要成分であるＮＬＲＰ３遺伝子に変異が生じ、インフラマソームが活性化した状態が続き、ＩＬ−１βの過剰産生が起こる。同様に家族性地中海熱、Ｐｙｏｇｅｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈ ｐｙｏｄｅｒｍａ ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ ａｎｄ ａｃｎｅ（ＰＡＰＡ）症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、高ＩｇＤ症候群、反復性胞状奇胎、ＤＩＲＡにおいてもインフラマソームが活性化した状態が続き、ＩＬ−１βの過剰産生が起こることが知られている（非特許文献１及び２参照）。これらの疾患に対してＩＬ−１βの阻害薬であるアナキンラ、リロナセプト、カナキヌマブが臨床で使用されているが、すべての患者に対して効果があるわけではない（非特許文献３参照）。その上、これらのＩＬ−１βの阻害薬アナキンラ、リロナセプト、カナキヌマブは、当然のことながらＩＬ−１８を阻害し得ない。【００１６】
上記した疾患は、遺伝子性のものであるが、内因性の因子であるＤＡＭＰｓや外来性ＰＡＭＰｓによるインフラマソームの活性化を経てプロカスパーゼ１活性化が関係する病気として痛風、アルツハイマー病、２型糖尿病、そしてこれらの病態における急性増悪や急性転化が知られており（非特許文献２）、これらの病気も現状の治療法ではコントロールが効かないことが知られている。【００１７】
このように、インフラマソームからカスパーゼ１の生成が炎症の発現に決定的に重要であることが判明してきたので、現在、インフラマソーム阻害剤やカスパーゼ阻害剤は世界中でいっせいに研究開始されている。そして、確実に症状を抑制でき、かつ、安全で長期に使用し得る薬剤の開発が目指されている。一方ＡＳＣが自然免疫系の活性化、癌の抑制、自然炎症疾患の抑制等に寄与する蛋白質であることも明らかになってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特表平９−５０５９８８号公報
【特許文献２】特表２００１−８９３７７号公報
【特許文献３】仏国特許出願公開第２６１７５０２号
【特許文献４】特開２００４−１２３６０４号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１０／０８２６６１
【特許文献６】ＷＯ２００４／０４５６２８
【特許文献７】特開２０１２−１５１５号公報
【特許文献８】特開２００７−３０１４６号公報
【特許文献９】特開２００７−９１６４４号公報
【特許文献１０】特開２００６−３０６８１４号公報
【特許文献１１】特開２００５−１５４４２５号公報
【特許文献１２】特開２００１−２７５６８１号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】斎藤潤，日本臨床免疫学会会誌，Ｖｏｌ．３４，（２０１１），２０−２８
【非特許文献２】増本純也，日本臨床免疫学会会誌，Ｖｏｌ．３４，（２０１１），３４６−３５４
【非特許文献３】Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｃａｏｒｓｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２，（２０１２）８１−８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって本発明は、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状についての安全でかつ優れた治療薬、及び安全でかつ優れたＡＳＣの機能阻害薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、生体内糖代謝産物である１，５−ＡＦがＡＳＣを標的蛋白とすることを見出し、本発明に到達した。さらに本発明者らは、１，５−ＡＦがインフラマソーム経路を阻害することを見出した。これまでインフラマソーム経路の阻害系は見出されていなかった。つまり、インフラマソーム経路を阻害する化合物として初めて見出されたのが、１，５−ＡＦである。【００２２】
本発明は以下の発明を包含する。【００２３】
（１）１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の機能阻害薬。【００２４】
（２）ＡＳＣの機能が、カスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成能である、上記（１）に記載の阻害薬。【００２５】
（３）複合体がインフラマソームである、上記（２）に記載の阻害薬。【００２６】
（４）インフラマソームが関与する経路における、プロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を阻害する、上記（３）に記載の阻害薬。【００２７】
（５）１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状の治療薬。【００２８】
（６）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＡＳＣとカスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成が関与する疾患又は症状である、上記（５）に記載の治療薬。【００２９】
（７）複合体がインフラマソームである、上記（６）に記載の治療薬。【００３０】
（８）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、カスパーゼ１が関与する疾患又は症状である、上記（５）〜（７）のいずれかに記載の治療薬。【００３１】
（９）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８が関与する疾患又は症状である、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の治療薬。【００３２】
（１０）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳである、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３３】
（１１）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、慢性関節リウマチである、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３４】
（１２）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、アルツハイマー病である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３５】
（１３）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、クライオピリン関連周期熱症候群である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３６】
（１４）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、家族性地中海熱である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３７】
（１５）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＰＡＰＡ症候群である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３８】
（１６）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、Ｍａｊｅｅｄ症候群である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００３９】
（１７）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、高ＩｇＤ症候群である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４０】
（１８）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、反復性胞状奇胎である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４１】
（１９）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＤＩＲＡである、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４２】
（２０）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炭疽菌感染症である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４３】
（２１）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、急性呼吸促拍症候群である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４４】
（２２）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炎症性細胞死である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４５】
（２３）ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、石綿肺である、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の治療薬。【００４６】
本発明者らは、１，５-ＡＦの標的蛋白質がＡＳＣであることを見出した。さらに本発明者らは、特に生体細胞には細胞内炎症カスケードを制御するための装置があり、それが１，５-ＡＦ経路であることを見出した。１，５-ＡＦは生体内分子であり、副作用も無いことから、炎症制御の大きな武器になるもと期待される。また、ＩＬ−１βの阻害薬アナキンラ、リロナセプト、カナキヌマブはいずれも蛋白質であり、製造コストが高いが、１，５−ＡＦはこれらの蛋白質製剤に比べると格段に安いコストで製造できるため、本発明の薬剤はこれらと比較して経済的にも有利である。【００４７】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状、特にインフラマソーム経路が関与する疾患又は症状、具体的には活性化プロカスパーゼ１が関与した自己炎症性疾患が起こっている哺乳動物個体に本発明の薬剤を適当量しかるべき方法で投与することにより、自然免疫の中心的役割を果たすＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８生成を有意に抑え、自然免疫の過剰により発症する疾患群の発生を抑制することが可能となる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の薬剤によれば、ＡＳＣが関与する疾患又は症状を緩和、抑制することが可能となる。また本発明の薬剤によれば、インフラマソーム経路が関与する疾患又は症状、特には活性型カスパーゼ１が関与する疾患又は症状を予防及び／又は治療し、活性化した自然免疫を有意に緩和、抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、自然炎症と疾患との関係を説明する図である。
【図２】図２は、ＰＡＭＰｓ及びＤＡＭＰｓによるＮＦ−κＢ及びインフラマソームの活性化を説明する図である。
【図３−１】図３−１は、インフラマソーム経路活性化を経てプロカスパーゼ１が活性化される経路を説明する図である。
【図３−２】図３−２は、インフラマソーム多重蛋白質複合体の形態を説明する図である。
【図４】図４は、プロカスパーゼ１が、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８の産生・放出のみならず、ＤＮＡの断片化、ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓと呼ばれるプログラム化された細胞死をも引き起こすことを示した図である。
【図５】図５はマウス由来骨髄マクロファージにおけるＩＬ−１β生成に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。グラフ右は添加した物質で、括弧内は活性化されるＮＬＲを示す。
【図６】図６は、マウス由来骨髄マクロファージにおけるＩＬ−１β生成に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。グラフ右は添加した物質で、括弧内は活性化されるＮＬＲを示す。
【図７】図７は、マウス由来骨髄マクロファージにおけるＩＬ−１８生成に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。グラフ右は添加した物質で、括弧内は活性化されるＮＬＲを示す。
【図８】図８は、マウス由来骨髄マクロファージにおけるＩＬ−１８生成に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。グラフ右は添加した物質で、括弧内は活性化されるＮＬＲを示す。
【図９】図９は、アラム又は尿酸塩によるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ニゲリシン及びＡＴＰによるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＡＴＰによるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１２】図１２は、炭疽菌毒素によるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１３】図１３は、フラジェリンによるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１４】図１４は、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）によるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１５】図１５は、１，５−ＡＦがプロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を抑制することを示す図である。
【図１６】図１６は、ロテノンによるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図１７】図１７は、マウスＡＬＩモデルの肺組織像及び細胞数を示す図である。
【図１８】図１８は、ＳＩＲＳモデルに１，５−ＡＦを投与した後の時間と生存率との関係を示す図である。
【図１９】図１９は、１，５−ＡＦの標的蛋白質がＡＳＣであることを示す図である。
【図２０】図２０ａ及びｂは、石綿肺のモデル実験におけるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図２１】図２１は、炭疽菌毒素によるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【図２２】図２２は、ヒト末梢血を用いて行った、ＡＴＰによるインフラマソーム活性化に対する１，５−ＡＦの抑制効果の試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の薬剤に使用される１，５−ＡＦは、既に公知の方法、例えば、上記特許文献１に記載の方法によって調製可能である。
【００５１】
本発明の薬剤は、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）の機能、特には、カスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成能を阻害する。ここでＡＳＣが「複合体形成能」を有するとは、ＡＳＣがアダプター蛋白質として機能することを示す。特には複合体がインフラマソームである場合、本発明の薬剤は、インフラマソーム経路を阻害し、特にはプロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を抑制することができる。ここで、インフラマソーム経路とはインフラマソームを介して行われる一連のシグナル伝達経路を示す（図３−１）。インフラマソームは、ＡＳＣがカスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体と７量体の複合体を形成することによりカスパーゼ１を活性化すると考えられている（図３−２）。
【００５２】
また、本発明の薬剤は、ＡＳＣが関与する疾患又は症状、特には、ＡＳＣとカスパーゼ１及びＮＯＤ様受容体との複合体形成が関与する疾患又は症状の治療薬である。特には複合体がインフラマソームである場合、本発明の薬剤は、インフラマソームが活性化した自己炎症性疾患の予防若しくは治療を目的として使用することができる。この場合インフラマソーム活性化、特にはカスパーセ１活性化に伴う自己炎症性疾患の自然免疫を抑えることによりその症状を抑えるものであり、よって、これらの疾患の予防若しくは治療を目的として使用することが可能である。
【００５３】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状としては、例えば癌、免疫抑制性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染症、神経変性疾患、内分泌疾患、炎症性疾患、臓器移植障害及び放射線障害等が挙げられる。
【００５４】
さらに、上記疾患又は症状としては、インフラマソーム経路が関与する疾患又は症状、特には、インフラマソームを介して行われる一連のシグナル伝達により引き起こされる疾患又は症状が挙げられる。インフラマソーム経路が関与する疾患又は症状としては、活性化プロカスパーゼ１が関与した疾患又は症状が挙げられる。また、インフラマソーム経路が関与する疾患又は症状としては、自己炎症性疾患、特にはＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１８の生成により引き起こされる疾患が挙げられる。具体的には、インフラマソーム経路が関与する疾患としては、例えば、クライオピリン関連周期熱症候群、家族性地中海熱、ＰＡＰＡ症候群（Ｐｙｏｇｅｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈ ｐｙｏｄｅｒｍａ ｇａｎｇｒｅｎｏｓｕｍ ａｎｄ ａｃｎｅ）症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、高ＩｇＤ症候群、反復性胞状奇胎、ＤＩＲＡ（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、痛風、アルツハイマー病、２型糖尿病、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、炭疽菌感染症、急性肺障害（Ａｃｕｔｅ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ）、急性呼吸促拍症候群（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、石綿肺及び若年性特発性関節炎等が挙げられる。
【００５５】
全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳには、外傷、熱傷、膵炎、侵襲の強い術後等感染を伴わない様々な原因によるものと、細菌、真菌、寄生虫、ウイルス等による感染を伴うものがあり、特に感染に起因するＳＩＲＳとして敗血症（sepsis）を挙げることができる。敗血症は、炎症性サイトカインによる全身の反応性炎症ＳＩＲＳの病態に加えて、血管内凝固障害（出血や血栓等）、尿量減少、血圧低下等の全身の臓器障害が顕著に出現した病態である。つまり、いずれもインフラマソームの活性化に起因する病態であるが、ＳＩＲＳは主として全身の炎症性病態、インフラマソームの活性化に主眼を置いた概念であり、一方敗血症はインフラマソームの活性化に引き続き、血液凝固系の障害や循環障害等によって多臓器障害等を合併している病態であるといえる。
【００５６】
さらには、インフラマソーム経路が関与する症状としては、炎症性細胞死（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）及びＤＮＡの断片化に伴う症状が挙げられる。
【００５７】
本発明の薬剤は、その剤形に応じてそれ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、その投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合等を考慮して適宜決定することができる。投与方法としては、速やかに体内、あるいは病巣局所に１，５−ＡＦを送達することができる限り特に制限されないが、例えば、経口投与、注射や点滴、経気管支等の方法、あるいは貼付、塗布を挙げることができる。
【００５８】
本発明の一実施形態において、本発明の薬剤の投与量は、その剤形、投与方法、又は予防若しくは治療しようとする症状により異なるが、例えば、体重１ｋｇあたりの投与量として有効成分（１，５−ＡＦ）換算で１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇとすることができ、１日１回又は数回、あるいは持続点滴等、さらには数日毎に１回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。また肺障害が強い場合には経気道投与等の方法も考えられる。
【００５９】
本発明の一実施形態において、本発明の薬剤の投与量は、その剤形、投与方法、又は予防若しくは治療しようとする症状により異なるが、例えば、体重１ｋｇあたりの投与量として有効成分（１，５−ＡＦ）換算で０．００１μｇ〜１００００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜５，０００ｍｇとすることができ、１日１回又は数回、あるいは数日毎に１回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。
【００６０】
本発明は、本発明の薬剤を含む製剤にも関する。本発明の製剤の形態としては、例えば、点滴、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、経皮吸収剤、クリーム、ペースト、ゲル、スプレー等が挙げられるが、特に制限されない。また本発明の薬剤を含む製剤は、さらに必要な成分、例えば、製剤担体や賦形剤、安定剤等を含有することもできる。
【００６１】
さらに、本発明の効果を奏する限り、本発明の製剤は、他の薬剤あるいはその他の薬理成分あるいはブドウ糖等の栄養成分を含むことも可能である。上述したように、例えば１，５−ＡＦは抗炎症作用を有し、さらに炎症性細胞死をも強く抑制する。よって、特に敗血症の治療においては、１，５−ＡＦを、凝固を抑制する抗凝固剤（例えば、遺伝子組換えトロンボモジュリン、商品名リコモジュリン等）と併用することにより、複合した病態を軽減することができる。
【００６２】
また本発明の薬剤は、医薬品用途に限られるものではなく、医薬部外品、化粧品、食品、飲料、飼料等に配合することも可能である。例えば、１，５−ＡＦを食品に添加して、各種疾患における症状の予防あるいは治療を目的とした機能性食品のような形態をとることもできる。
【００６３】
本発明の薬剤を含む製剤は、皮膚症状の治療を目的とする医薬部外品あるいは化粧品等の形態をとることも可能である。
【００６４】
本発明の薬剤は、人間以外の哺乳動物にも投与することができる。その場合、哺乳動物に対し、１，５−ＡＦを適量投与することによって治療を行うことができる。
【００６５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
[１]１，５−ＡＦは、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４及びＡＩＭ２が関連する全てのインフラマソーム経路を介したプロカスパーゼ１の活性化を抑制した
［実施例１］
インフラマソームの構成成分であるＮＬＲは、細胞内の病原体等を認識するパターン認識受容体であり、これにＤＡＭＰｓやＰＡＭＰｓが結合することによりインフラマソームが活性化される。ＮＬＲは多くのものが知られているが、本実施例においてはＮＬＲの代表としてＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４、ＡＩＭ２を活性化する薬剤を用いて実験を行った。各ＮＬＲを活性化するものとして以下の薬剤を用いた：
ＮＬＲＰ１  Ａｎｔｈｒａｘ ＰＡとＬＦ（ＡＮＴ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ社）
ＮＬＲＰ３  ＡＴＰ、ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ（ＮＩＧ）、尿酸塩（ＭＳＵ）、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｊｕｖａｎｔ（ＡＬＵ）
ＮＬＲＣ４  フラジェリンＦＬＡ
ＡＩＭ２  ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）（ＰＯＬ）（Ｓｉｇｍａ社）、リポフェクタミン２０００（ＬＩＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。【００６７】
本実施例において、Ｎａｋａｈｉｒａ，Ｋらの方法（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２ （２０１１）２２２−３０）に従ってマウス由来骨髄マクロファージを作製した。Ｃ５７／ＢＬ６の雄性マウスの大腿骨及び脛骨より、骨髄幹細胞を抽出し、Ｌ９２９細胞より抽出した培養上清液（Ｍ−ＣＳＦを含む）を２５％含むＤＭＥＭ液体培地（１０％ＦＢＳ及び２％ペニシリンストレプトマイシン含有）中で６日間培養し、マクロファージへと分化させた。６日間経過後に、マウス由来骨髄マクロファージを回収し、細胞数を調節し、各デッシュにまきなおし、オーバーナイトで接着させた後に、ＬＰＳ、及びインフラマソームを誘導する薬剤を添加した。【００６８】
最初に、ＴＬＲｓからの刺激（シグナル１）でｐｒｏ−ＩＬ−１β（ＩＬ−１βの前駆体）及びｐｒｏ−ＩＬ−１８（ＩＬ−１８の前駆体）を細胞質内で作らせる目的で、ＬＰＳの添加を行った。ＬＰＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＵｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＰＳを使用し、１００ｎｇ／ｍｌ濃度で４時間刺激を行った。【００６９】
その後、１，５−ＡＦを３０分間インキュベートし、さらにインフラマソームを誘導する薬剤を添加した。【００７０】
ＮＬＲＰ１を活性化する場合は、Ａｎｔｈｒａｘ ＰＡとＬＦ（ＡＮＴ）を５ μｇ／ｍｌずつ入れ６時間インキュベートして誘導した。ＮＬＲＰ３の場合は、ＡＴＰ ５ｍＭで１時間、ニゲリシン（Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ：ＮＩＧ） ５μＭで１時間、Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ Ａｊｕｖａｎｔ（ＡＬＵ） ２００μｇ／ｍｌで６時間、尿酸塩（ＭＳＵ） １５０μｇ／ｍｌで６時間インキュベートして誘導した。ＮＬＲＣ４の場合は、フラジェリン（ＦＬＡ）２．５μｇ／ｍｌで６時間インキュベートして誘導した。ＡＩＭ２の場合は、リポフェクタミン２０００（ＬＩＰ）を使用し、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）（ＰＯＬ）をトランスフェクションさせることで誘導した。ＩＬ−１βやＩＬ−１８の定量はＲ＆Ｄ社のＥＬＩＳＡキットを用いて行った。【００７１】
実施例１の結果を図５−８に示す。図５−８より、１，５−ＡＦは、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４及びＡＩＭ２が関連する全てのインフラマソーム経路を介したプロカスパーゼ１の活性化によるＩＬ−１β、ＩＬ−１８の生成を抑制したことがわかる。図５−８に示す結果について以下に説明する。【００７２】
ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージのメディウム中にＡＴＰ、ニゲリシン、尿酸塩又はアラムを添加することによりＮＬＲＰ３インフラマソーム経路を活性化した。ＬＰＳでインキュベートした骨髄マクロファージに対して、サルモネラ菌の菌体成分を抽出したフラジェリン（ＦＬＡ）を添加することによりＮＬＲＣ４インフラマソーム経路を活性化した。ＬＰＳでインキュベートした骨髄マクロファージに対して、ＤＮＡを抽出したｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）（ＰＯＬ）を、リポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクションすることによりＡＩＭ−２インフラマソーム経路を活性化した。【００７３】
アラム（ＡＬＵ）又は尿酸塩(ＭＳＵ)は、ＮＬＲＰ３経路を活性化する代表的な分子である。ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージにアラム又は尿酸塩を加えるとＮＬＲＰ３インフラマソームが活性化された（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, ２０１３ Ｍａｙ；１４（５）：４５４−６０）。これに対し、１，５−ＡＦが存在する場合には、アラム又は尿酸塩によるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は抑制された（図９も参照）。【００７４】
細菌毒素の一種であるニゲリシン（ＮＩＧ）はＮＬＲＰｓを活性化し、カスパーゼ１を介してＩＬ−１β及びＩＬ−１８を再生、放出させて、炎症を引き起こす。ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージにニゲリシンを加えるとインフラマソームが活性化された。これに対し、１，５−ＡＦが存在する場合には、ニゲリシンによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生、放出は強く抑制された（図１０も参照）。【００７５】
ＡＴＰはＮＬＲＰ３経路でインフラマソームを活性化する。ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージにＡＴＰを加えるとインフラマソームが活性化された。これに対し、１，５−ＡＦが存在する場合には、ＡＴＰによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生、放出は抑制された（図１１も参照）。また、アンヒドログルコース（ＡＧ）及びフルクトースと比較して、１，５−ＡＦはＡＴＰによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生、放出を濃度依存性に抑制した（図１１参照）。【００７６】
炭疽菌毒素（ａｎｔｈｏｒａｘ ｔｏｘｉｎ：ＡＮＴ）はＮＬＲＰ１経路でインフラマソームを活性化する。炭疽菌毒素は強い肺障害を起こし、バイオテロに使用される危険性からその対策が急がれている。ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージに炭疽菌毒素を加えるとＮＬＲＰ１インフラマソームが活性化された。これに対し、１，５−ＡＦが存在する場合には、炭疽菌毒素よるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生、放出は強く抑制された（図１２も参照）。【００７７】
フラジェリン（ＦＬＡ）はＮＬＲＰ４を活性化し、カスパーゼ１を介してＩＬ−１β及びＩＬ−１８を再生、放出させて、炎症を引き起こす。フラジェリン（ＦＬＡ）は、鞭毛を有する細菌（ピロリ菌等）の鞭毛の構成タンパク質の一種で、樹状細胞等に発現しているトール様受容体５（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）を介して炎症を惹起する。ＬＰＳで刺激した骨髄マクロファージにフラジェリンを加えるとインフラマソームが活性化された。これに対し、１，５−ＡＦが存在する場合には、フラジェリンによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１β及びＩＬ−１８の産生、放出は強く抑制された（図１３も参照）。【００７８】
宿主の２重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）はＡＩＭ２／ＡＳＣ経由でカスパーゼを活性化して、ＩＬ−１β及びＩＬ−１８を産生放出し、炎症を引き起こすことが判明している。ｄｓＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）（ＰＯＬ）で骨髄マクロファージを刺激した。１，５−ＡＦが存在する場合には、コントロールに比べ、１，５−ＡＦを添加した群の培養上清中のＩＬ−１βの産生は顕著に抑制されており、１，５−ＡＦがＡＩＭ２／ＡＳＣ経路からのインフラマソーム活性化を抑制していることが実証された（図１４も参照）。【００７９】
[２]（ｉ）ＬＰＳとＡＴＰの両方の刺激があったもののみプロカスパーゼ−１のカスパーゼ１への活性化とＩＬ−１β前駆体（ｐｒｏＩＬ−１β）のＩＬ−１βへの成熟化、細胞外への分泌が起きた
（ｉｉ）１，５−ＡＦはインフラマソームの活性化を介したプロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化を抑制した
［実施例２］
実施例１同様に、本実験はＮａｋａｈｉｒａ，Ｋらの方法（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２ （２０１１）２２２−３０）に従ってマウス由来骨髄マクロファージを作製し、実験を行った。Ｃ５７／ＢＬ６の雄性マウスの大腿骨及び脛骨より、骨髄幹細胞を抽出し、Ｌ９２９細胞より抽出した培養上清液（Ｍ−ＣＳＦを含む）を２５％含むＤＭＥＭ液体培地（１０％ＦＢＳ及び２％ペニシリンストレプトマイシン含有）中で６日間培養し、マクロファージへと分化させた。６日間経過後に、マウス由来骨髄マクロファージを回収し、細胞数を調節し、各デッシュにまきなおし、オーバーナイトで接着させた後に、ＬＰＳ、及びインフラマソームを誘導する薬剤を添加した。【００８０】
最初に、ＴＬＲｓからの刺激（シグナル１）でｐｒｏ−ＩＬ−１β（ＩＬ−１βの前駆体）を細胞質内で作らせる目的で、ＬＰＳの添加を行った。ＬＰＳは、ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ社のＵｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＰＳを使用し、１００ｎｇ／ｍｌ濃度で４時間刺激を行った。【００８１】
その後、１，５−ＡＦを３０分間インキュベートし、さらにインフラマソームを誘導する薬剤を添加した。ＮＬＲＰ３の場合は、ＡＴＰ ５ｍＭで時間インキュベートし誘導した。各サンプルの細胞と上清各分を電気泳動にかけ、カテプシンＢ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、ｓｃ−１３９８５）、ＡＳＣ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、ｓｃ−２２５１４−Ｒ）、カスパーゼ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、ｓｃ−５１４）、ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社、５１２９−１００）、β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ１９７８）を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。【００８２】
実施例２の結果を図１５に示す。図１５より、ＬＰＳとＡＴＰの両方の刺激があったもののみプロカスパーゼ−１のカスパーゼ１への活性化とＩＬ−１β前駆体（ｐｒｏＩＬ−１β）のＩＬ−１βへの成熟化、細胞外への分泌が起きたことがわかる。そして、１，５−ＡＦはインフラマソームの活性化を介したプロカスパーゼ１からカスパーゼ１への活性化を抑制することが明らかとなった。【００８３】
[３]１，５−ＡＦは実験的アルツハイマー病やパーキンソン病に使われる神経障害因子であるロテノンによるインフラマソーム活性化を抑制した
[実施例３]
ワイルドタイプマウスより腹腔マクロファージを抽出し、これにＬＰＳを添加してプライミングした後に、インフラマソームを誘導する薬剤としてロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎ）を添加（１時間）して上清中のＩＬ−１βの定量をＥＬＩＳＡキットを用いて行った。ロテノンは、ミトコンドリア障害因子であり、実験的アルツハイマー病やパーキンソン病に使われる神経障害因子である。ミトコンドリアが障害されると、障害ミトコンドリアから大量のＡＴＰが放出されて、インフラマソームが活性化されて炎症が惹起されることが知られている。神経系の場合にはこのことがアルツハイマー病やパーキンソン病の原因となることがわかっている。【００８４】
１，５−ＡＦは、ロテノンによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１βの産生、放出を抑制した（図１６）。【００８５】
[４]１，５−ＡＦをＡＬＩの代表的モデルに腹腔内投与すると顕著に肺組織像と気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞浸潤が抑制された
[実施例４]
Ｃ５７／ＢＬ６ワイルドマウスにＬＰＳを経気管投与してＡＬＩモデルを作製した。ＬＰＳ(エンドトキシン)を経気管投与すると激しい肺障害が惹起され、これはＡＬＩの代表的モデルとされている（Ｇｕｓｔａｖｏ Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ. “Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ”, Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５： Ｌ３７９−Ｌ３９９， ２００８）。急性肺障害(ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ, ＡＬＩ)や急性呼吸促拍症候群(ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ, ＡＲＤＳ)はインフラマソーム活性化に伴う代表的な疾患である。【００８６】
作製したマウス（ＡＬＩモデル）に１，５−ＡＦを腹腔内投与すると顕著に肺組織像と気管支肺胞洗浄液中の炎症性細胞浸潤が抑制された（図１７）。【００８７】
[５]１，５−ＡＦをＳＩＲＳモデルに投与すると顕著に生存率が改善された
[実施例５]
Ｃ５７／ＢＬ６ワイルドタイプマウスにＬＰＳを腹腔内投与してＳＩＲＳモデルを作製した。全身性にインフラマソームが活性化されるとＩＬ−１β等の炎症性サイトカインが全身を循環しＳＩＲＳを引きおこし、臨床上も重要な病態となっている。【００８８】
作製したマウス（ＳＩＲＳモデル）に治療群として１，５−ＡＦを１００ｍｇ／ｋｇ、ＬＰＳ投与２、６、１２、２４時間後に投与し、５日間観察したところ、顕著に生存率が改善された（図１８）。【００８９】
[６]１，５−ＡＦはプロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を抑制して炎症性細胞死を抑制した
[実施例６]
プロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化は、単にｐｒｏ−ＩＬ−１βとｐｒｏ−ＩＬ−１８のＩＬ−１β、ＩＬ−１８への活性化で免疫担当細胞を病巣部へリクルートするのみでなく、プログラム化された炎症性細胞死（ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ）をも引き起こす。これらは新しい炎症の概念である。本発明者らは、１，５−ＡＦがプロカスパーゼ１のカスパーゼ１への活性化を抑制して、炎症性細胞死を抑制することを検証した。【００９０】
マウス骨髄細胞をＬＰＳで４時間インキュベーションしてプライミングし、次に１，５−ＡＦと３０分間インキュベーションした後に、完全に１，５−ＡＦを洗い去り、次にニゲリシン（５μＭ）で１時間インキュベーションして、炎症性細胞死を検討した。【００９１】
３つのサンプルについての結果を表１に示す。ＬＰＳとニゲリシンを加えたものは、炎症性細胞死が誘導されて、生細胞数はＬＰＳ単独に比べ、約１／６に減少していたが、１，５―ＡＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した場合、炎症性細胞死した細胞数は約１／３程度に収まり、細胞死は抑制され、生細胞数は５０％近くまで増加した。すなわち１，５−ＡＦによりニゲリシンによる炎症性細胞死は抑制された。
【表１】
2015016178.tif 000003
【００９２】
[７]１，５−ＡＦはアポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）を標的とする
［実施例７］
ＡＳＣを発現させたＨＥＫ細胞をエンドトキシン刺激し（第１刺激）、次にｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）を加えた（第２刺激）場合、図１９の列５のようにＡＳＣモノマーは、ダイマー、トリマー及びテトラマーを形成した。しかしながら、１，５−ＡＦの存在下では、このようなＡＳＣモノマーの重合体は観察されなかった（図１９の６列参照）。つまり、１，５−ＡＦはＡＳＣの重合を抑制していることが示唆された。結果として１，５−ＡＦは図３−２に示されるＡＳＣ重合阻害を介してカスパーゼ１の生成を阻害して、結果的にＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１８の産生を抑制しているものといえる。【００９３】
[８]１，５−ＡＦは、シリカによるインフラマソーム活性化を抑制した
［実施例８］
マウス骨髄単核球を培養し、シリカ(珪酸マグネシウム：５０μｇ/ｍｌ)による刺激した後、１，５-ＡＦ（５μｇ/ｍｌ）を添加して１時間後、ＩＬ−１８の濃度を測定した（図２０ａ）。同様に、各濃度のシリカで骨髄単核球を刺激した後、５時間後に１，５−ＡＦ（２〜１０ｍｇ/ｍｌ）加え、ＩＬ−１βの濃度を測定した（図２０ｂ）。【００９４】
１，５−ＡＦは、シリカによるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１８、ＩＬ−１βの産生、放出を抑制した（図２０）。【００９５】
石綿肺のモデル実験において、炎症を抑制し、石綿肺防止剤として利用できることが分かった。【００９６】
[９]１，５−ＡＦは、炭疽菌毒素によるインフラマソーム活性化ＩＬ−１βの産生、放出を抑制した
［実施例９］
マウス骨髄単核球を炭疽菌毒素（ａｎｔｈｏｒａｘ ｔｏｘｉｎ：１ｍｇ/ｍｌ）又はアラム（５０μｇ/ｍｌ）で４時間培養刺激した後、１，５−ＡＦ（５ｍｇ/ｍｌ）を添加して、２時間後のＩＬ−１βの濃度を測定した（図２１）。アラムはポジティブコントロールとして使用した。【００９７】
１，５−ＡＦは、炭疽菌毒素によるインフラマソーム活性化、すなわちＩＬ−１βの産生、放出を抑制した（図２１）。【００９８】
炭疽菌によるバイオテロへの防御剤として利用できることが分かった。【００９９】
[１０]１，５−ＡＦは、ＬＰＳ＋シリカ又はＡＴＰで刺激したヒト末梢血単核細胞に対してもＩＬ−１βの放出を抑制する効果を有する
［実施例１０］
ヒト末梢血を採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に当たり０．１ｘ１０６個/ウェルずつまいて、実験に用いた。ＬＰＳ ５００ｎｇ／ｍｌで３時間プライミング処理した。１，５−ＡＦ（２〜１０ｍｇ/ｍｌ）を加え、３０分インキュベートした後にシリカ（２５０μｇ／ｍｌ）で２時間刺激した後、上清を回収した。【０１００】
［実施例１１］
ヒト末梢血を採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＰＢＭＣを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に当たり０．１ｘ１０６個/ウェルずつまいて実験に用いた。ＬＰＳ ５００ｎｇ／ｍｌで３時間プライミング処理した。１，５−ＡＦ（２〜１０ｍｇ/ｍｌ）を加え、３０分インキュベートした後にＡＴＰ（２〜５ｍＭ）で1時間刺激した後、上清を回収した。【０１０１】
１，５−ＡＦは、ＬＰＳ＋ＡＴＰで刺激したヒト末梢血単核細胞に対してもＩＬ−１βの放出を抑制する効果を有することが分かった（図２２）。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本願の薬剤は、現在の生物学的製剤（抗体）に代わるアポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）制御剤として使用することができる。【０１０３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2015016178.tif 000004
【図２】
2015016178.tif 000005
【図３−１】
2015016178.tif 000006
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月28日(2015.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状の治療薬であって、
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳ、アルツハイマー病、クライオピリン関連周期熱症候群、家族性地中海熱、ＰＡＰＡ症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、高ＩｇＤ症候群、反復性胞状奇胎、ＤＩＲＡ、炭疽菌感染症、急性呼吸促拍症候群、炎症性細胞死及び石綿肺から選択される少なくとも１種である、上記治療薬。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、全身性炎症性反応症候群ＳＩＲＳである、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１１】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを有効成分とする、アポトーシス関連スペック様カード蛋白質（ＡＳＣ）が関与する疾患又は症状の治療薬であって、
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、慢性関節リウマチである、上記治療薬。
【請求項１２】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、アルツハイマー病である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１３】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、クライオピリン関連周期熱症候群である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１４】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、家族性地中海熱である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１５】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＰＡＰＡ症候群である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１６】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、Ｍａｊｅｅｄ症候群である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１７】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、高ＩｇＤ症候群である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１８】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、反復性胞状奇胎である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項１９】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、ＤＩＲＡである、請求項５に記載の治療薬。
【請求項２０】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炭疽菌感染症である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項２１】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、急性呼吸促拍症候群である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項２２】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、炎症性細胞死である、請求項５に記載の治療薬。
【請求項２３】
ＡＳＣが関与する疾患又は症状が、石綿肺である、請求項５に記載の治療薬。
【国際調査報告】
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