(57)【要約】  被験者由来の試料中に存在する（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、または（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法、および、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定する工程、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する工程を含むことを特徴とする自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の（１）または（２）を検出することを特徴とする判定方法。
（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体
（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞
【請求項２】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
被験者が、抗ＣＣＰ抗体陰性であることを特徴とする請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、またはリボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする使用。
【請求項５】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項７】
自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項８】
前記Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該Ｔ細胞の増殖、または該Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する５アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
【請求項１２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする請求項１１に記載のフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性関節炎の判定方法および自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞活性化抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、全身の関節を中心に慢性炎症や組織破壊を引き起こす自己免疫性疾患で、全人口の約１％が罹患する。関節リウマチにおいては、獲得免疫細胞（Ｔ細胞やＢ細胞）による病的な自己免疫反応と、炎症性サイトカインによる慢性炎症が、病態の２つの柱である。炎症性サイトカインについては近年、抗サイトカイン療法によって良好なコントロールが得られるようになった。しかし、そのような場合でも病的な自己免疫反応は是正できていないために、抗サイトカイン療法中止後の疾患の再燃が大きな問題となっている。関節リウマチで起こっている病的な自己免疫反応の中心的な担い手として、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が重要であることが指摘されてきたが、疾患惹起性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の認識する自己抗原は長らく不明であった。そして、そのことが自己免疫反応の抗原特異的なコントロールや、疾患惹起性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の解析を妨げていた。【０００３】
これまでに、自己免疫性関節炎を引き起こすＴ細胞が認識する自己抗原は、特殊な免疫を行う必要のある自己免疫性関節炎の系、あるいはＢ細胞や自己抗体が必須の自己免疫性関節炎の系でのみ知られていた。例えば、ＤＢＡ／１系統のマウスに、ＩＩ型コラーゲン１００ｍｇをＣＦＡ（コンプリートフロインドアジュバント）と共に皮下投与し、さらに２０日後にＩＩ型コラーゲン１００ｍｇをＩＦＡ（インコンプリートフロインドアジュバント）と共に皮下投与すると関節炎を発症させることができることが報告されている（ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、非特許文献１参照）この系ではＣＤ４陽性Ｔ細胞が必要なことは分かっているが、免疫の結果体内に産生されるＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体も関節炎を起こすことができることが知られており、ＩＩ型コラーゲン特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、自己抗体非存在下で関節炎を起こすことができるかどうかははっきりしていない。【０００４】
また、加齢に伴って自己免疫疾患を自然発症するＫ／ＢｘＮマウスでは、糖代謝酵素ＧＰＩが標的自己抗原であることが知られている（非特許文献２、３参照）この系では、自己反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化の結果ＧＰＩに対する自己抗体が産生され、その自己抗体が関節炎を引き起こすことが分かっている。ただし、この系においても、自己反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は自己抗体の非存在下で関節炎を引き起こすことができない。【０００５】
関節リウマチ等の自己免疫性関節炎については未だ不明な点が多く、自己免疫性関節炎を惹起する新規な自己抗原を見出すことは重要な課題である。なかでも、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原はこれまでに報告されておらず、このような自己抗原を見出すことができれば、自己免疫性関節炎のメカニズム解析および治療法の開発に繋がることが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Courtenay JS, Dallman MJ, Dayan AD, Martin A, Mosedale B. Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature 1980;283:666‐8
【非特許文献２】論文名Kouskoff, V. et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811-822 (1996).
【非特許文献３】論文名Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C. & Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science 286, 1732-1735 (1999).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性かつ自己抗体非依存性に引き起こされる自己免疫性関節炎の自己抗原を見出すことを課題とする。さらに、そのような自己抗原を用いて自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供すること、およびそのような自己抗原と反応してＴ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法であって、被験者由来の試料中に存在する以下の（１）または（２）を検出することを特徴とする判定方法。
（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体
（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞
［２］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［１］に記載の判定方法。
［３］被験者が、抗ＣＣＰ抗体陰性であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の判定方法。
［４］自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定するためのリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントの使用であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いてリボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、またはリボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することを特徴とする使用。
［５］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［４］に記載の使用。
［６］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする前記［４］に記載の使用。
［７］自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にリボソームタンパク質Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
［８］前記Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、該Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカイン、該Ｔ細胞の増殖、または該Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定することを特徴とする前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］リボソームタンパク質Ｌ２３ａが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［７］または［８］に記載のスクリーニング方法。
［１０］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする前記［７］または［８］に記載のスクリーニング方法。
［１１］リボソームタンパク質Ｌ２３ａのフラグメントであって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくとも連続する５アミノ酸残基を含むことを特徴とするフラグメント。
［１２］配列番号１で示されるアミノ酸配列の第７１位〜第９０位を含むことを特徴とする前記［１１］に記載のフラグメント。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供することができる。また、Ｔ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供することができる。また、これらの方法や自己免疫性関節炎の研究に好適に用いることができるタンパク質断片を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】関節炎を発症したレトロジェニックマウスの写真である。
【図２】関節炎惹起性Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】リボソームタンパク質Ｌ２３ａによる関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の活性化を検討した結果を示す図である。
【図４】リボソームタンパク質Ｌ２３ａの抗原フラグメントを同定した結果を示す図である。
【図５】関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウスの血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。
【図６】関節リウマチ患者の血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。
【図７】関節リウマチ患者の関節液中にリボソームタンパク質Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を検出した結果を示す図である。
【図８】抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者の血清中に抗リボソームタンパク質Ｌ２３ａ抗体を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、関節リウマチに酷似した自己免疫性関節炎を引き起こすＳＫＧマウスを樹立し（特許第3467520号）、解析を進めてきた。ＳＫＧマウスは、Ｔ細胞シグナル伝達因子ＺＡＰ７０の点突然変異を持ち、そのために胸腺でのＴ細胞の選択異常が起こり、関節炎を起こす自己反応性Ｔ細胞が末梢に出現して関節炎を引き起こす（Sakaguchi, N. et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature 426, 454-460, doi:10.1038/nature02119 (2003) 、Hirota, K. et al. T cell self-reactivity forms a cytokine milieu for spontaneous development of IL-17+ Th cells that cause autoimmune arthritis. The Journal of experimental medicine 204, 41-47, doi:10.1084/jem.20062259 (2007)）。ＳＫＧマウスの関節炎は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存的である。すなわち、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を免疫不全マウスへ移入することで、レシピエントマウスは関節炎を発症する。
本発明者らは、後段の実施例に示すように、ＳＫＧマウスを用いて自己抗体非依存的に関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞を見出し、当該ＣＤ４陽性Ｔ細胞の認識抗原を探索した結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞依存性の自己免疫性関節炎を惹起する自己抗原としてリボソームタンパク質Ｌ２３ａを同定した。さらにこの自己抗原について研究を進めた結果、本願発明を完成させた。
【００１２】
〔自己免疫性関節炎の判定方法〕
本発明は、自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定する方法を提供する。本発明の判定方法は、被験者由来の試料中に存在する（１）リボソームタンパク質Ｌ２３ａに対する抗体、または（２）リボソームタンパク質Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出することにより行うことができる。
本発明の判定対象である自己免疫性関節炎は、自己抗体または自己反応性Ｔ細胞によって発症する関節炎であればどのような関節炎でもよい。例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、膠原病関連関節炎などが挙げられる。好ましくは関節リウマチである。
被験者は特に限定されないが、関節炎を発症している者または関節炎の発症が疑われる者が好ましい。関節炎の発症が疑われる者としては、関節炎の自覚症状が認められる者が挙げられる。また、被験者は抗ＣＣＰ抗体陰性であることが好ましい。具体的には、関節炎を発症しているが抗ＣＣＰ抗体陰性の被験者、または関節炎の発症が疑われるが抗ＣＣＰ抗体陰性の被験者であることが好ましい。
【００１３】
被験者由来の試料としては、抗体またはＴ細胞が含まれる試料であれば特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類を好適に用いることができる。
リボソームタンパク質Ｌ２３ａ（以下「Ｌ２３ａ」と記す）に対する抗体は、Ｌ２３ａに特異的に結合する抗体であればよい。Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、Ｌ２３ａと特異的に反応して活性化されるＣＤ４陽性Ｔ細胞であればよい。
【００１４】
Ｌ２３ａに対する抗体の検出およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出には、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントを用いることができる。用いるＬ２３ａの由来は特に限定されないが、哺乳動物のＬ２３ａが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。哺乳動物のＬ２３ａはよく保存されており、少なくともヒト、アカゲザル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスのＬ２３ａのアミノ酸配列は同一である、（配列番号１）。各種動物のＬ２３ａのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
Ｌ２３ａのフラグメントは、Ｌ２３ａの一部からなるものであれば特に限定されないが、哺乳動物のＬ２３ａの一部からなるものであることが好ましく、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＬ２３ａの一部であることがより好ましい。Ｌ２３ａのフラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、５残基以上であることが好ましい。上限は特に限定されないが、約１４０残基以下が好ましく、約１２０残基以下がより好ましく、約１００残基以下がさらに好ましく、約８０残基以下がさらに好ましく、約６０残基以下がさらに好ましく、約４０残基以下がさらに好ましく、約２０残基以下が特に好ましい。
また、Ｌ２３ａのフラグメントは、Ｌ２３ａのアミノ酸配列（配列番号１）の第７１位〜第９０位のアミノ酸配列（LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号３）を含むフラグメントであることが好ましく、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるフラグメントである。
【００１７】
Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントをコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。また、Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することができる。また、Ｌ２３ａおよびＬ２３ａのフラグメントは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。
【００１８】
Ｌ２３ａに対する抗体の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に結合する抗体を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いてＬ２３ａに対する抗体の検出を行う場合、Ｌ２３ａまたはそのフラグメントをプレートに固相化し、被験者由来に血清を添加して反応させ、適当な二次抗体を用いて検出することができる。
【００１９】
Ｌ２３ａに対する抗体が陽性であることの判断基準は、例えば、関節炎に関して正常な個体（例えば、関節炎の自覚症状のないヒト）を対照とし、対照のＬ２３ａに対する抗体量に基づいて定めることができる。例えば、被験者のＬ２３ａに対する抗体を検出するための方法と同じ方法を用いて、複数の対照のＬ２３ａに対する抗体量を測定し、平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出し、対照の平均値＋３ＳＤを基準値として、それ以下を正常、それを超えるものを陽性と判定する方法が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。対照の抗体量を背景データとして蓄積し、蓄積データを用いて基準値を算出することもできる。
【００２０】
Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出方法は特に限定されず、抗原と特異的に反応するＴ細胞を検出するための公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、Ｌ２３ａと反応することにより炎症性サイトカインを分泌する細胞を検出する方法、Ｌ２３ａ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖を検出する方法、活性化表面マーカー（ＣＤ１５４など）を検出する方法などを好適に用いることができる。具体的には、例えば、被験者の血液から公知の方法でＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、得られた細胞をＬ２３ａまたはそのフラグメントと接触させ、炎症性サイトカインを分泌する細胞をフローサイトメーターで検出する方法などが挙げられる。炎症性サイトカインとしては、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６，ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ１７、ＩＬ−１８などが挙げられる。
【００２１】
Ｌ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞が検出された場合に、当該被験者はＬ２３ａ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞が陽性であると判断できる。
【００２２】
Ｌ２３ａに対する抗体およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の少なくとも一方が陽性と判断された場合、被験者は自己免疫性関節炎の発症している、または自己免疫性関節炎を発症する見込みがあると判定することができる。自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できることにより、より早期の効果的な治療介入、あるいはより慎重な経過観察による疾患発症の判定が可能となる。
さらに、抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者血清の過半数にＬ２３ａに対する抗体が検出されたことから（実施例参照）、本発明の判定方法は、関節炎を発症しているが抗ＣＣＰ抗体陰性の者または関節炎の発症が疑われるが抗ＣＣＰ抗体陰性の者を対象とすることができ、これらの被験者における自己免疫性関節炎の発症または発症の見込みを判定できる点で、非常に有用である。
【００２３】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、該Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程、該Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程、該Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法を適用する被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
Ｌ２３ａと反応するＴ細胞（以下「Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞」と記す）は、自己免疫性関節炎患者から、上記のＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出方法に準じて採取することができる。また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞は、Ｌ２３ａを特異的に認識するＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体を発現していないＴ細胞株（例えば５ＫＣ−７３．８．２０）に導入することにより、作製することができる（実施例参照）。
【００２５】
Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に被験物質を接触させる工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に被験物質を接触させる方法は、細胞と被験物質とが接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地に被験物質を添加する方法、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地を被験物質を含有する培地と交換する方法などが挙げられる。なお、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる方法も特に限定されず、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地にＬ２３ａまたはそのフラグメントを添加する方法、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞を培養している培地をＬ２３ａまたはそのフラグメントを含有する培地と交換する方法などが挙げられる。
【００２６】
Ｌ２３ａと反応するＴ細胞に被験物質を接触させる工程、および、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させる工程は、どちらを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。すなわち、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対して被験物質を接触させた後にＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させてもよく、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対してＬ２３ａまたはそのフラグメントを接触させた後に被験物質を接触させてもよく、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞に対して被験物質とＬ２３ａまたはそのフラグメントを同時に接触させてもよい。
【００２７】
Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、測定対象は、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態の指標となるものであれば特に限定されない。例えば、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインの測定、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖の測定、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーの測定などを好適に用いることができる。
【００２８】
測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインである場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞から分泌される炎症性サイトカインを測定すればよい。測定対象の炎症性サイトカインは特に限定されず、上記に例示した公知の炎症性サイトカイン中から一種または二種以上を適宜選択すればよい。炎症性サイトカインの測定方法も特に限定されず、測定対象の炎症性サイトカインを測定できる公知の方法（例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など）から適宜選択すればよい。
【００２９】
また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な炎症性サイトカイン分泌量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における炎症性サイトカイン分泌量と比較して、被験物質を接触させた場合に炎症性サイトカイン分泌量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が炎症性サイトカイン分泌量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の炎症性サイトカイン分泌量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
【００３０】
測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖である場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖を測定すればよい。Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の増殖を測定する方法は特に限定されず、公知の細胞増殖測定方法のなかから適宜選択して用いることができる。例えば、トリチウム化チミジンの取り込み測定によるもの、ＣＦＳＥラベルによる分裂の検出などを挙げることができる。
【００３１】
また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な細胞増殖量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における細胞増殖量と比較して、被験物質を接触させた場合に細胞増殖量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が細胞増殖量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の細胞増殖量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
【００３２】
測定対象がＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーである場合、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化状態を測定する工程において、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化表面マーカーを測定すればよい。対象となる活性化表面マーカーは特に限定されず、例えばＣＤ１５４などが挙げられる。表面マーカーを測定する方法は特に限定されず、細胞表面マーカーを測定できる公知の方法（例えば、フローサイトメーターを用いる方法など）から適宜選択すればよい。
【００３３】
また、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の被験物質依存的な活性化状態の変化を分析する工程では、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析すればよい。本工程において、被験物質依存的な活性化表面マーカー量の変化を分析する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群における活性化表面マーカー量と比較して、被験物質を接触させた場合に活性化表面マーカー量が減少していれば、当該被験物質を自己免疫性関節炎惹起性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質として選択することができる。被験物質が活性化表面マーカー量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞の活性化表面マーカー量と比較して５０％以下にさせる被験物質が好ましく、２５％以下にさせる被験物質がより好ましい。
【００３４】
〔スクリーニングにより得られた物質を含有する医薬〕
上記、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、自己免疫性関節炎の予防または治療薬の有効成分として有用である。したがって、本発明には、Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質を有効成分とする自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬が含まれる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を、自己免疫性関節炎の予防または治療用医薬の有効成分として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記Ｌ２３ａ反応性Ｔ細胞の活性化を抑制する物質またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＳＩＫ３の発現または機能を抑制する物質またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００３６】
〔フラグメントの利用〕
本発明は、Ｌ２３ａのフラグメントを提供する。本発明のフラグメントは、上記本発明の判定方法において、Ｌ２３ａに対する抗体の検出およびＬ２３ａと反応するＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出に用いることができる。また、本発明のフラグメントは、自己抗体非依存的に関節炎を惹起するＣＤ４陽性Ｔ細胞の解析、自己抗体非依存的に関節炎のメカニズム解析等の基礎研究に用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３８】
〔関節炎を引き起こすＴ細胞のＴ細胞受容体のクローニング〕
制御性Ｔ細胞の特異的転写因子であるＦｏｘｐ３とＥＧＦＰとの融合蛋白質をコードする融合遺伝子をノックインしたｅｆｏｘマウスを作製した。ｅｆｏｘマウスは、制御性Ｔ細胞をＥＧＦＰのシグナルによって簡便に検出することができる。このｅｆｏｘマウスと、自己免疫性関節炎モデルマウスであるＳＫＧマウスとを掛け合わせて、ｅｆｏｘＳＫＧマウスを作製し、ＳＰＦ環境下で飼育した。ｅｆｏｘＳＫＧマウスは、約３か月間飼育後に関節炎を自然発症した。【００３９】
関節炎を発症したｅｆｏｘＳＫＧマウスの関節局所から、エフェクターＣＤ４陽性Ｔ細胞を分取した。具体的には、足関節から滑膜組織を分離して、Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＭ（ロシュ）含有ＲＰＭＩ１６４０にて３７℃１時間分解させた。その組織をナイロンメッシュに通し、単細胞浮遊液を調製した。Ｍｏｆｌｏ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒサイクロン装置を用いて、ＧＦＰ陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を９６ウェルＰＣＲプレート上に単一細胞分取した。そのプレートは使用まで−８０℃で保存した。【００４０】
分取したＧＦＰ陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の単一細胞からＴ細胞受容体をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法でクローニングした。具体的には、５μＬ／ウェルのリアクションミックス［100 mg/ mLゼラチン、0.1 % Triton X-100、4U/ mL RNAsin、125ng OligodT （プロメガ）、0.5mM dNTPs、5U/ mL Multiscribe RT enzyme、1xRT Buffer（High Throughput cDNA kit、アプライドバイオシステムズ）］を添加し、２５℃１０分間、３７℃２時間、８５℃５分間反応させて、逆転写を行った。反応液のうち２μＬずつをＴ細胞受容体α鎖、β鎖遺伝子の増幅に用いた。９５℃１分後、９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃３０秒を５サイクル、９５℃３０秒、５８℃１分、７２℃３０秒を３０サイクルの後、７２℃５分を行った後、より内側のプライマーを使用して同様のＰＣＲをもう一度行った。このクローニングしたＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体発現用レトロウイルスベクター（Lennon, G. P. et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity 31, 643-653, doi:10.1016/j.immuni.2009.07.008 (2009)）へサブクローニングした。α鎖はＭｆｅＩおよびＳｔｕＩ制限酵素認識部位、β鎖はＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素認識部位を用いてサブクローニングした。約１５０個の単一細胞から、それぞれＴ細胞受容体遺伝子をクローニングした。【００４１】
作製したレトロウイルスベクターを用いて、レトロジェニックマウスを作製した。このベクタープラスミドを、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞株へＦｕｇｅｎｅ ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ロシュ）を用いて遺伝子導入した。４８時間後、７２時間後にレトロウイルスを含んだ上清を回収して、０．４５μｍフィルターに通してゴミを取り除いた。
Ｔ細胞、Ｂ細胞を欠損し、ＳＫＧ変異を有するＲＡＧ２ノックアウトマウス（ＳＫＧマウスとＲＡＧ２ノックアウトマウスを掛け合わせて作製）へ１５０ｍｇ／ｋｇの５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌを腹腔内投与した。４日後に骨髄細胞を回収して、赤血球細胞を除いた。その後、ＩＬ−３（20ng/mL）、ＩＬ−６（40ng/mL）、ＳＣＦ（50ng/mL）（ペプロテック）の存在下で、２０％牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、２−ＭＥ添加ＤＭＥＭ溶液で骨髄細胞を２×１０６個／ｍＬの濃度で培養した。培養２日目、３日目に、前記レトロウイルス含有上清にＩＬ−３（20ng/mL）、ＩＬ−６（40ng/mL）、ＳＣＦ（50ng/mL）およびポリブレン（4μg/mL）を添加した培地に交換した後、７００ｇ、３２℃、９０分間遠心することにより、レトロウイルスを骨髄細胞へ感染させた。培養４日目に、その骨髄細胞を、６００ｒａｄ放射線照射したＲＡＧ２ノックアウトマウスへ静脈内注射した。１種類のレトロウイルスをそれぞれ感染させたレトロジェニックマウスを約３０種作製した。【００４２】
作製されたレトロジェニックマウスは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体として、レトロウイルスベクターによって導入、発現された単一ペアのＴ細胞受容体のみを発現する。各レトロジェニックマウスが関節炎を発症するかどうかを観察することにより、そのレトロジェニックマウスの持つＴ細胞受容体が関節炎惹起能を持つかどうかを検証することができる。
作製したレトロジェニックマウスをＳＰＦ環境下で飼育し、関節炎を自然発症する個体を見出した。関節炎を発症したマウスの写真を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。さらに、当該マウスに感染させたレトロウイルスを解析し、関節炎惹起性Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列を特定した（図２参照）。図２中「14D-3/DV8*03」、「40*01」、「10*01」および「2-1*01」と示された配列は、例えばデータベースＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢ（http://www.imgt.org/ligmdb/）から取得することができる。【００４３】
〔関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原の同定〕
上記により見出した関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原の候補の絞り込みを以下のように行った。
まず、関節炎を起こすことを確認した上記のＴ細胞受容体遺伝子を、Ｔ細胞受容体を発現していない、Ｔ細胞株５ＫＣ−７３．８．２０へ、上記のレトロウイルスベクター含有上清を用いて同じ方法で遺伝子導入した。この細胞株は、Ｔ細胞受容体からの刺激によってＩＬ−２を産生することが知られている。次に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞から、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニー社）により、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＭＡＣＳシステムで濃縮、回収し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製した。
他方、関節炎を発症したＳＫＧマウス関節滑膜細胞の細胞破砕液を調製し、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ法を用いて各バンドに分離し、各バンドを切り出してそれぞれに含まれるタンパク質を抽出した。【００４４】
上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株（５×１０４個／ウェル）と上記抗原提示細胞（５×１０４個／ウェル）を、９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、上記各バンドから抽出したタンパク質を加えて共培養した。２４時間培養後、上清中のＩＬ−２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。ＩＬ−２濃度が有意に上昇したバンドを候補バンドとして選択した。
候補バンドからの抽出タンパク質を質量分析に供し、その結果から複数の候補タンパク質を絞り込んだ。【００４５】
候補タンパク質について、それぞれ組み換えタンパク質を作製し、上記のＴ細胞株と抗原提示細胞の共培養系に添加して、関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原であるか否かをＩＬ−２濃度の上昇を指標に確認した。その結果、Ｌ２３ａ（60S ribosomal protein L23a）を添加したときに、ＩＬ−２濃度が上昇することを見出した。【００４６】
〔Ｌ２３ａによる関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の活性化〕
ヒトＬ２３ａをコードするＤＮＡ（配列番号２、ACCESSION:NM_000984）のコード領域を発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ１へ挿入した。この発現ベクターを大腸菌に導入し、ＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧ存在下、２５℃で５時間培養することによりタンパク質の発現を誘導した。その後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳを用いて細菌を溶解し、ソニケーションによりタンパク質を溶解させた。得られたタンパク質を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ ｂｅａｄｓで精製し、組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａを得た。コントロールとして用いるＧＳＴの組み換えタンパク質は遺伝子導入していないｐＧＥＸ−６Ｐ１ベクターから同様の方法で作製した。【００４７】
上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株、上記の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａ、組み換えＧＳＴおよびマウス骨髄腫細胞（Ｂ細胞）株Ｐ３Ｕ１の細胞破砕液（ポジティブコントロール）を用い、以下の表１の試験群を設けた。各細胞を９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、試験物質を添加した培地を加えて２４時間培養後、上清中のＩＬ−２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。なお、本発明者は、本実験に先立って、今回クローニングした関節炎惹起性Ｔ細胞受容体がＰ３Ｕ１細胞破砕液に反応することを確認していたため、Ｐ３Ｕ１細胞破砕液をポジティブコントロールとして使用した。細胞破砕液は以下のように調製した。すなわち、１×１０７個の細胞を１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、液体窒素で凍結後融解した。続いて、ソニケーション３０秒を３回繰り返し、１５０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、上清を細胞破砕液として使用した。
結果を図３に示した。図３から明らかなように、ＧＳＴ−Ｌ２３ａは濃度依存的に関節炎惹起性Ｔ細胞受容体を活性化することが示された。【００４８】
【表２】
2015016096.tif 000004
【００４９】
〔Ｌ２３ａの抗原フラグメントの同定〕
Ｌ２３ａのアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、約２０アミノ酸残基からなる各種ペプチドを定法に従い合成した。上記のＴ細胞受容体遺伝子を導入したＴ細胞株、上記の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、合成した各種のペプチドおよび上記組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａ（Ｌ２３ａ全長）を用いて、上記と同様に、各細胞を９６ウェルラウンドボトムプレートに播種し、ペプチドまたはＧＳＴ−Ｌ２３ａを添加した培地を加えて２４時間培養後、上清中のＩＬ−２濃度を、ＥＬＩＳＡ（ebioscience）を用いて測定した。なお、ペプチドの濃度は５０μｇ／ｍＬ、ＧＳＴ−Ｌ２３ａの濃度は１００μｇ／ｍＬとした。
図４に結果を示した。図４から明らかなように、Ｌ２３ａ７１−９０が顕著にＩＬ−２濃度を上昇させた。一方、Ｌ２３ａ６−２５はＩＬ−２濃度を上昇させなかった。図に示していないが、Ｌ２３ａ７１−９０以外のペプチドは、いずれもＬ２３ａ６−２５と同様の結果であった。この結果から、Ｌ２３ａの第７１位〜第９０位のアミノ酸配列（LDHYAIIKFPLTTESAMKKI、配列番号３）からなるフラグメントが関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原であることが明らかとなった。【００５０】
〔関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウス血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
関節炎を発症したレトロジェニックマウス（Ｌ２３ａを認識する関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウス）から採血し、血清を得た。
Ｐ３Ｕ１細胞破砕液、組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａまたは組み換えＧＳＴ−ヒストン１．２を２ＭＥ含有サンプルバッファーに添加し、９５℃で５分間加熱した。１５％のポリアクリルアミドゲルを用いて２０ｍＡ７５分間電気泳動し、その後９０Ｖで３０分間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Millipore）に転写した。転写した膜に２００倍希釈した血清を反応させ、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１抗体を２０００倍希釈で反応させた。洗浄後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて発色させ、ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉを用いて検出した。
なお、ヒストンＨ１．２は、今回クローニングした関節炎惹起性Ｔ細胞受容体の認識抗原候補に含まれていたが、反応性がないことが確認されたタンパク質であり、マウスヒストンＨ１．２をコードするＤＮＡ（ACCESSION:NM_015786）のコード領域を発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ１へ挿入し、ＧＳＴ−Ｌ２３ａと同様の方法でＧＳＴタグを付加した組み換えタンパク質として調製した。【００５１】
結果を図５に示した。図５中、左側の矢印はＧＳＴ−Ｌ２３ａのバンドの位置を表し、右側の矢印は血清中の抗体が結合したＰ３Ｕ１細胞破砕液中のタンパク質の位置を表す。ＧＳＴ−ヒストン１．２に結合する抗体が存在しなかったことから、Ｌ２３ａを認識する関節炎惹起性Ｔ細胞受容体発現レトロジェニックマウスの血清中に、Ｌ２３ａを認識する抗体が多量に存在することが明らかとなった。【００５２】
〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
関節リウマチ患者３７４例、関節リウマチに罹患していない正常人８０例から血液を採取し、血清を得た。
組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａまたは組み換えＧＳＴをＰＢＳに溶解し、２００ｎｇ／ｍＬの溶液を調製した。ＥＬＩＳＡ用ポリソーププレート（商品名、Nunc）のウェルにそれぞれ添加して、４℃で１６時間吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間ブロッキングした。その後同様に５回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５００倍に希釈した血清を１００μＬずつ各ウェルに添加した。室温で２時間放置し、５回洗浄した後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで４０００倍に希釈したもの）を添加し１時間室温で放置した。５回洗浄した後、ＴＭＢを加えて１５分後にＯＤ４５０ｎｍの値を測定した。ＧＳＴ−Ｌ２３ａのＯＤ値からＧＳＴのＯＤ値を引いた値をＬ２３ａに対する抗体のＯＤ値とした。【００５３】
結果を図６に示した。図中Ｃｏｎｔｒｏｌは正常人、ＲＡは関節リウマチ患者を表す。単位（Ｕ／ｍＬ）は、１例の陽性の血清を基準に任意に設定したものである。正常人の平均値の＋３ＳＤ以下（図中の破線以下）を正常値と判定し、それを超えるものを陽性と判定した。図６に示したように、正常人は８０例中１例のみが陽性であったが、関節リウマチ患者は３７４例中６４例が陽性であった。ｔ検定でｐ値が０．００１２と有意差を持っていた。【００５４】
〔関節リウマチ患者の関節液中のＬ２３ａ反応性Ｔ細胞の検出〕
関節リウマチ患者１名から関節液を採取した。健常人１名から血液を採取した。それぞれ関節液および血液から単核球を分離した。具体的には、関節液または血液にフィコールを加え、２２００ｒｐｍで２０分間遠心して単核球を分離、回収した。得られた単核球を１×１０６個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、培地に組み換えＧＳＴまたは組み換えＧＳＴ−Ｌ２３ａを１００μｇ/ｍＬ添加して、２４時間培養した。培養終了６時間前にＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを１μｇ／ｍＬとなるように加え、サイトカインの分泌を止めた。細胞を回収後、一般的なサイトカイン染色法によりＩＬ−１７ＡおよびＩＦＮ−γを染色し、フローサイトメーターで検出した。【００５５】
結果を図７に示した。関節リウマチ患者の関節液中にはＧＳＴ−Ｌ２３ａに反応して炎症性サイトカインであるＩＬ−１７ＡやＩＦＮ−γを分泌する細胞が検出された（右下）。一方、健常人の血液中にはＧＳＴ−Ｌ２３ａに反応して炎症性サイトカインを分泌する細胞は検出されなかった。【００５６】
〔抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕
抗ＣＣＰ抗体（抗環状シトルリン化ペプチド抗体）は、関節リウマチ患者において陽性率が９０％を超え、非常に感度の高い関節リウマチの診断マーカーとして広く用いられている。しかし、約１０％の関節リウマチ患者では陰性であることが知られている。
そこで、抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者５９例から血液を採取して血清を得、上記〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕に記載の方法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて、血清中の抗Ｌ２３ａ抗体を測定した。【００５７】
結果を図８に示した。正常値の上限は上記〔関節リウマチ患者血清における抗Ｌ２３ａ抗体の検出〕において設定した数値を採用した。図８に示したように、５９例中３２例（５４％）が陽性であった。抗ＣＣＰ抗体陰性の関節リウマチ患者の過半数において抗Ｌ２３ａ抗体が検出されたことから、本発明の判定方法の有用性が示された。【００５８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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