(57)【要約】  本発明は、被検出物質を高感度に検出することができる、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する表面プラズモン増強蛍光分析装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光をチップの回折格子に照射する光源と、回折格子上の蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。
2015155799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、
前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、
前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、
を有する、表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項２】
前記光検出部による検出値を処理する処理部をさらに有し、
前記偏光子は、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出し、
前記光検出部は、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
前記処理部は、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項３】
前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項４】
被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、
回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する第１の工程と、
前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する第２の工程と、
前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す第３の工程と、
前記直線偏光の光を検出する第４の工程と、
を含む、表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【請求項５】
前記第４の工程で得られた検出値を処理する第５の工程をさらに含み、
前記第３の工程では、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出し、
前記第４の工程では、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
前記第５の工程では、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
請求項４に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【請求項６】
前記第２の工程では、前記回折格子に励起光を継続して照射し、
前記第３の工程では、前記直線偏光の光を継続して取り出し、
前記第４の工程では、前記直線偏光の光を継続して検出する、
請求項４に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【請求項７】
前記第４の工程で得られた検出値を処理する第５の工程をさらに含み、
前記第３の工程では、前記蛍光物質から放出された蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光および前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を継続して同時または異時に取り出し、
前記第４の工程では、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ継続して検出し、
前記第５の工程では、前記第１の光の検出値と前記第２の光の検出値との差分値を算出する、
請求項６に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【請求項８】
前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
請求項５または請求項７に記載の表面プラズモン増強蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して検体に含まれる被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。【０００３】
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射すると、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じることを利用する。被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。【０００４】
ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ−ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ−ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、ＰＣ−ＳＰＦＳは、測定装置の小型化の点で課題を有している。【０００５】
これに対し、ＧＣ−ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（特許文献１および非特許文献１参照）。ＧＣ−ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１５８３６９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Keiko Tawa, Hironobu Hori, Kenji Kintaka, Kazuyuki Kiyosue, Yoshiro Tatsu, and Junji Nishii, "Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance", Optics Express, Vol. 16, pp. 9781-9790.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、ＧＣ−ＳＰＦＳは、ＰＣ−ＳＰＦＳに比べて測定装置を小型化できるという利点を有するが、ＧＣ−ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ−ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法には、検出感度に改善の余地がある。【０００９】
本発明の目的は、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法であって、被検出物質をより高感度に検出することができる測定装置および測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置は、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを装着され、励起光を前記回折格子に照射することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、増強された電場により前記蛍光物質を励起して蛍光を放出させるために、前記励起光を前記回折格子に照射する光源と、前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す偏光子と、前記偏光子により取り出された前記直線偏光の光を検出する光検出部と、を有する。【００１１】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン増強蛍光測定方法であって、回折格子を形成された金属膜と、前記回折格子に固定化された捕捉体と、前記捕捉体に結合した、蛍光物質で標識された被検出物質とを有するチップを準備する第１の工程と、前記回折格子において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記回折格子に励起光を照射する第２の工程と、前記蛍光物質から放出された蛍光から直線偏光の光を取り出す第３の工程と、前記直線偏光の光を検出する第４の工程と、を含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、被検出物質をより高感度に検出することができる。また、本発明によれば、被検出物質をリアルタイムで検出することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施の形態１，２に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下「ＳＰＦＳ装置」という）の構成を示す模式図である。
【図２】図２Ａ，Ｂは、回折格子の斜視図である。
【図３】図３Ａは、実施の形態１，２に係るチップの第１の態様を模式的に示す図であり、図３Ｂは、実施の形態１，２に係るチップの第２の態様を模式的に示す図である。
【図４】図４は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。
【図５】図５Ａ，Ｂは、蛍光強度の測定手順を示す模式図である。
【図６】図６は、差分値（シグナル値）を説明するためのグラフである。
【図７】図７は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。
【図８】図８Ａ，Ｂは、蛍光強度をリアルタイムで測定したときの結果の例を示すグラフである。
【図９】図９は、実施の形態１，２に係るＳＰＦＳ装置の他の例の構成を示す模式図である。
【図１０】図１０Ａ，Ｂは、参考実験の手順を示す模式図である。
【図１１】図１１は、参考実験の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。
【００１６】
図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０および制御部１３０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（不図示）にチップ２００を装着した状態で使用される。そこで、チップ２００について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。
【００１７】
チップ２００は、基板２１０と、基板２１０の上に形成された金属膜２２０とを有する。金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。回折格子２３０には捕捉体（例えば１次抗体）が固定化されており、回折格子２３０の表面は、捕捉体と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。なお、図１では、捕捉体および被検出物質を省略している。
【００１８】
基板２１０は、金属膜２２０の支持部材である。基板２１０の材料は、金属膜２２０を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板２１０の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料、ポリメタクリル酸メチルやポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。
【００１９】
金属膜２２０は、基板２１０上に配置されている。前述のとおり、金属膜２２０には、回折格子２３０が形成されている。金属膜２２０に光を照射すると、金属膜２２０中に生じる表面プラズモンと、回折格子２３０により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴が生じる。金属膜２２０の材料は、表面プラズモンを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜２２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜２２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜２２０の厚みは、特に限定されない。金属膜２２０の厚みは、例えば３０〜５００ｎｍであり、好ましくは１００〜３００ｎｍである。
【００２０】
回折格子２３０は、金属膜２２０に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子２３０の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２３０は、図２Ａに示されるように１次元回折格子であってもよいし、図２Ｂに示されるように２次元回折格子であってもよい。図２Ａに示される１次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図２Ｂに示される２次元回折格子では、金属膜２２０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２３０の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。図２Ａ，Ｂに示される例では、後述する励起光αの光軸は、ｘｚ平面に平行である。
【００２１】
回折格子２３０の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板２１０の上に金属膜２２０を形成した後、金属膜２２０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板２１０の上に、金属膜２２０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２３０を含む金属膜２２０を形成することができる。
【００２２】
回折格子２３０（反応場）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する。本実施の形態では、回折格子２３０の表面に、捕捉体が略均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。
【００２３】
捕捉体の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子２３０の上に、捕捉体を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子２３０に固定化し、この高分子に捕捉体を結合させてもよい。
【００２４】
図１に示されるように、励起光αは、所定の入射角θ１で金属膜２２０（回折格子２３０）に照射される。照射領域では、金属膜２２０で生じた表面プラズモンと、回折格子２３０により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＧＣ−ＳＰＦＳでは、ＰＣ−ＳＰＦＳと異なり、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。たとえば、蛍光βの出射角θ２は、２θ１で近似される。なお、励起光αの反射光γは、ほとんど生じない。
【００２５】
回折格子２３０は、使用時には、反応や洗浄などの操作のために緩衝液などの液体に接触する。したがって、通常は、回折格子２３０は、液体を収容可能な空間に配置される。たとえば、回折格子２３０は、図３Ａに示されるように、液体を収容するウェルの内表面（例えば底面）に配置されてもよいし、図３Ｂに示されるように、液体を連続して供給されうる流路（フローセル）の内表面（例えば底面）に配置されてもよい。図３Ａに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、バルクと金属膜２２０表面との間の物質移動解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）や、増強電場空間スケール（ｚ軸方向）の測定などにも好適である。図３Ｂに示されるチップ２００は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、金属膜２２０表面に固定化された分子（捕捉体）に対する、別の分子（被検出物質）の反応定数解析（リアルタイム測定；実施の形態２参照）などにも好適である。
【００２６】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００２７】
励起光照射ユニット１１０は、波長および光量が一定の励起光αを、チップ２００の金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。このとき、励起光照射ユニット１１０は、金属膜２２０中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子２３０で生じるように、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光を金属膜２２０（回折格子２３０）に照射する。励起光αの光軸は、回折格子２３０における周期的構造の配列方向（図２Ａ，Ｂにおけるｘ軸方向）に沿う。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に平行な軸をｙ軸とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜２２０の表面に垂直な軸をｚ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｚ平面に平行である（図１参照）。励起光αは、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光であることから、励起光αの電界の振動方向は、励起光αの光軸および金属膜２２０の表面に対する法線を含むｘｚ平面に平行である。
【００２８】
励起光照射ユニット１１０は、少なくとも光源１１２を有する。励起光照射ユニット１１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。
【００２９】
光源１１２は、チップ２００の回折格子２３０に向けて励起光αを出射する。本実施の形態では、光源１１２は、レーザーダイオードである。なお、光源１１２の種類は、特に限定されず、レーザーダイオードでなくてもよい。光源１１２の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
【００３０】
コリメートレンズ（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αをコリメートする。レーザーダイオード（光源１１２）から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、金属膜２２０表面における照射スポットの形状が略円形となるように、レーザーダイオードは所定の姿勢で保持される。照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。
【００３１】
励起光フィルター（図示省略）は、光源１１２とチップ２００との間に配置され、光源１１２から出射された励起光αを整波する。励起光フィルターは、例えば、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターを含む。レーザーダイオード（光源１１２）からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、レーザーダイオード（光源１１２）からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルターは、金属膜２２０にｐ偏光の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
【００３２】
金属膜２２０に対する励起光αの入射角θ１（図１参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角θ１は、回折格子２３０のピッチや励起光αの波長、金属膜２２０を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。なお、回折格子のピッチとしては、例えば４００ｎｍ程度であることが好ましい。励起光αの最適な入射角θ１は、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで入射角θ１を調整する第１角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を中心として、励起光照射ユニット１１０またはチップ２００を回転させればよい。
【００３３】
蛍光検出ユニット１２０は、励起光照射ユニット１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜２２０との交点を通り、かつ金属膜２２０の表面に対して垂直な直線を挟むように配置されている。蛍光検出ユニット１２０は、回折格子２３０（反応場）上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する。
【００３４】
蛍光検出ユニット１２０は、少なくとも偏光子１２２および光検出部１２４を有する。蛍光検出ユニット１２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。
【００３５】
偏光子１２２は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置され、蛍光物質から放出された蛍光βから直線偏光の光を取り出す。本実施の形態では、偏光子１２２は、偏光板である。偏光子１２２は、金属膜２２０から光検出部１２４に向かう蛍光βの進行方向に垂直な平面内で回転できるように保持されている。
【００３６】
偏光子１２２は、蛍光βから、金属膜２２０の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光、および前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光を同時または異時に取り出す。好ましくは、偏光子１２２は、蛍光βから、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０°のｐ偏光の光を第１の光として取り出し、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が９０°のｓ偏光の光を第２の光として同時または異時に取り出す。本実施の形態では、偏光子（偏光板）１２２を回転させることで、第１の光（例えばｐ偏光の光）と第２の光（例えばｓ偏光の光）とを異時に取り出す。この後説明するように、第１の光は、検出対象のシグナル成分およびノイズ成分を含む光であり、第２の光は、主としてノイズ成分からなる光である。
【００３７】
なお、偏光子１２２の種類は、所定の偏光方向の直線偏光の光を取り出すことができれば特に限定されず、偏光板でなくてもよい。偏光子１２２の例には、偏光プリズム、液晶フィルター、その他の偏光フィルターが含まれる。
【００３８】
光検出部１２４は、偏光子１２２により取り出された直線偏光の光を検出して、金属膜２２０上の蛍光像を検出する。偏光子１２２が、蛍光βから第１の光および第２の光を同時または異時に取り出した場合は、光検出部１２４は、第１の光および第２の光をそれぞれ検出する。たとえば、光検出部１２４は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光検出部１２４は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサなどであってもよい。
【００３９】
集光レンズ群（図示省略）は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜２２０上の蛍光像を光検出部１２４の受光面上に結像させる。
【００４０】
蛍光フィルター（図示省略）は、チップ２００と光検出部１２４との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、光検出部１２４に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、光検出部１２４に到達する光の光量を調整したりする。
【００４１】
前述のとおり、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、蛍光βは、回折格子２３０（反応場）から特定の方向に指向性を持って出射される。したがって、金属膜２２０表面の法線に対する蛍光検出ユニット１２０の光軸の角度は、蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。したがって、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出ユニット１２０の光軸とチップ２００とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニット１２０の光軸の角度を調整する第２角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２角度調整部は、蛍光検出ユニット１２０の光軸と金属膜２２０との交点を中心として、蛍光検出ユニット１２０またはチップ２００を回転させればよい。
【００４２】
制御部１３０は、励起光照射ユニット１１０（光源１１２）、蛍光検出ユニット１２０（偏光子１２２および光検出部１２４）、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１２０の角度調整部（第１角度調整部および第２角度調整部）の動作を制御する。また、制御部１３０は、光検出部１２４からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。制御部１３０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。
【００４３】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
【００４４】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、チップ２００を準備して、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置にチップ２００を設置する。また、チップ２００の金属膜２２０上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜２２０上を洗浄して保湿剤を除去する。
【００４５】
次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００４６】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜２２０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。この後説明するように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。しかしながら、蛍光物質で標識した後は、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。
【００４７】
なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜２２０上に提供してもよい。また、金属膜２２０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００４８】
次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えばｐ偏光の光）の強度を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、図５Ａに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第１の光（図ではｐ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
【００４９】
この後の参考実験で示すように、ＧＣ−ＳＰＦＳでは、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、金属膜２２０の表面に対するｐ偏光の光または、偏光角度が前記ｐ偏光の光に近い光である。したがって、シグナル成分は、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。一方で、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）は、ランダム偏光の光である。したがって、ノイズ成分の一部（シグナル成分と偏光角度が同じ光）も、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｐ）は、シグナル成分およびノイズ成分を含む。
【００５０】
次いで、励起光αを金属膜２２０に照射して、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えばｓ偏光の光）の強度を測定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を検出させる。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第２の光（図ではｓ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
【００５１】
前の工程で説明したように、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）は、ランダム偏光の光である。したがって、ノイズ成分の一部は、この工程においても偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｓ）は、主としてノイズ成分からなる。
【００５２】
なお、第１の光の測定（工程Ｓ４０）と第２の光の測定（工程Ｓ５０）の順番は、これに限定されない。たとえば、第２の光の強度を測定した後に、第１の光の強度を測定してもよい。
【００５３】
最後に、制御部（処理部）１３０は、光検出部１２４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ６０）。具体的には、図６に示されるように、制御部（処理部）１３０は、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。前述のとおり、出力Ｏｐは、主としてシグナル成分およびノイズ成分からなり、出力Ｏｓは、主としてノイズ成分からなることから、これらの差分値を算出することで、ノイズ成分を除去したシグナル値を得ることができる。
【００５４】
以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
【００５５】
以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、シグナル成分とノイズ成分の偏光特性の違いを利用してシグナル成分のみを検出することができるため、従来のＳＰＦＳ装置に比べてより高感度に被検出物質を検出することができる。
【００５６】
また、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。
【００５７】
なお、上記実施の形態では、金属膜２２０側から励起光αをチップ２００に照射する例について説明したが、基板２１０側から励起光αをチップ２００に照射してもよい。
【００５８】
［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置１００’は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同じ構成であり、リアルタイム測定を行う点で実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、ＳＰＦＳ装置の構成については説明を省略し、動作手順についてのみ説明する。
【００５９】
本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００’は、回折格子２３０に励起光αを継続して照射し、蛍光物質から放出された蛍光βから直線偏光の光を継続して取り出し、かつ前記直線偏光の光を継続して検出する。ここで「継続」とは、連続して動作を行うことだけでなく、断続的に動作を行うことも含む。したがって、「励起光を継続して照射する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で励起光αを照射することを意味する。「直線偏光の光を継続して取り出す」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で蛍光βから直線偏光の光を継続して取り出すことを意味する。「直線偏光の光を継続して検出する」とは、被検出物質の経時的な変化を検出可能な適当な時間および頻度で蛍光βから直線偏光の光を検出することを意味する。
【００６０】
たとえば、励起光αの継続的な照射は、励起光αを連続して照射することであってもよいし、励起光αを断続的に照射することであってもよい。蛍光物質の退色を防ぐ観点からは、励起光αの継続的な照射は、励起光αの断続的な照射であることが好ましい。この場合、励起光αの照射間隔は、一定であってもよいし、不定（任意）であってもよい。また、励起光αの照射間隔は、例えばプログラムによる自動算出のような、一定の条件に基づいて自動的に決められてもよいし、予備実験などによって経験的に決められてもよいし、ユーザによって任意に決められてもよい。
【００６１】
励起光の照射間隔は、蛍光強度の検出結果に応じて決められてもよい。たとえば、蛍光強度の検出値が小さい場合には、励起光の照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値が大きい場合には、励起光の照射間隔をより長くしてもよい。また、蛍光強度の検出値の経時的な変化が大きい場合には、励起光の照射間隔をより短くし、蛍光強度の検出値の経時的な変化が小さい場合には、励起光の照射の間隔をより長くしてもよい。このような励起光の照射間隔の調整は、例えば、蛍光強度の検出値に係る閾値を適宜に設定し、蛍光強度の検出値に基づくフィードバック制御によって行うことが可能である。このような励起光の照射間隔の調整は、被検出物質に係る経時的な変化をより精密に観測する観点から好ましい。
【００６２】
直線偏光の光の継続的な取り出しのタイミング、および直線偏光の光の継続的な検出のタイミングについても同様である。
【００６３】
図７は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置１００’の動作手順の一例を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜２２０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。
【００６４】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、チップ２００を準備して、ＳＰＦＳ装置１００’の所定の位置にチップ２００を設置する。実施の形態１と同様に、必要に応じて金属膜２２０上を洗浄する。
【００６５】
次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ１２０）。具体的には、金属膜２２０上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。この後、金属膜２２０上を緩衝液などで洗浄して、１次抗体に結合しなかった物質を除去する。
【００６６】
次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ１３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜２２０上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。実施の形態１と同様に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００’では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質を測定することができる。
【００６７】
なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜２２０上に提供してもよい。また、金属膜２２０上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。
【００６８】
次いで、励起光αを金属膜２２０に照射しつつ、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えばｐ偏光の光）の強度を測定し（工程Ｓ１４０）、励起光αを金属膜２２０に照射しつつ、蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えばｓ偏光の光）の強度を測定し（工程Ｓ１５０）、そして、第１の光の強度の測定と第２の光の強度の測定とを所定の回数だけ繰り返す（工程Ｓ１６０）。これにより、第１の光の強度の測定と第２の光の強度の測定が交互に複数回繰り返され、第１の光の強度の測定値と第２の光の強度の測定値とが、それぞれ継続して（断続的に）得られる。
【００６９】
具体的には、工程Ｓ１４０では、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを連続して、または所定の間隔で断続的に（すなわち「継続して」）出射させる。「所定の間隔」とは、例えば、後述する偏光子１２２の回転角度の変更（調整）の間隔である。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を継続して検出させる。蛍光βの強度の継続的な検出のタイミングは、励起光αの経時的な照射のタイミングと同期していてもよいし、異なっていてもよい。このとき、図５Ａに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第１の光（図ではｐ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｐ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
【００７０】
実施の形態１の工程Ｓ４０で説明したように、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光β（シグナル成分）は、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。一方で、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）の一部（シグナル成分と偏光角度が同じ光）も、偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｐ）は、シグナル成分およびノイズ成分を含む。
【００７１】
工程Ｓ１５０では、制御部１３０は、光源１１２に励起光αを依然として継続して出射させる。同時に、制御部１３０は、光検出部１２４に金属膜２２０からの蛍光βの強度を継続して検出させる。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１３０は、蛍光βに含まれる第２の光（図ではｓ偏光の光）のみが透過できるように、偏光子１２２の回転角度を調整する。光検出部１２４は、測定結果（出力Ｏｓ）を制御部（処理部）１３０に出力する。
【００７２】
実施の形態１の工程Ｓ５０で説明したように、金属膜２２０上に浮遊している蛍光物質から放出される蛍光β（ノイズ成分）の一部は、この工程においても偏光子１２２を透過して光検出部１２４に到達する。結果として、この工程の測定結果（出力Ｏｓ）は、主としてノイズ成分からなる。
【００７３】
なお、第１の光の測定（工程Ｓ１４０）と第２の光の測定（工程Ｓ１５０）の順番は、これに限定されない。たとえば、第２の光の強度を測定した後に、第１の光の強度を測定してもよい。
【００７４】
工程Ｓ１６０では、例えば、制御部１３０は、第２の光の測定回数（ｓ偏光測定回数Ｃｓ）を数え、Ｃｓが設定値（例えばＮ回）に達していない場合には、偏光子１２２の回転角度を第１の光を検出するための角度に再び調整し、工程Ｓ１４０に戻って第１の光の強度を測定する。
【００７５】
前記ＣｓがＮ回に達した場合、制御部（処理部）１３０は、光検出部１２４からの出力信号（出力ＯｐおよびＯｓ）を解析して、被検出物質の存在または被検出物質の量を分析する（工程Ｓ１７０）。
【００７６】
具体的には、図６に示されるように、制御部（処理部）１３０は、工程Ｓ１４０で測定された第１の光の強度およびその直後の工程Ｓ１５０で測定された第２の光の強度の各セットについて、出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値を算出してシグナル値を得る。したがって、第１の光の強度および第２の光の強度を継続して測定すると、第１の光の強度の検出値と第２の光の強度の検出値とのセットごとにシグナル値が算出される。すなわち、経時的に変化するシグナル値が算出される。また、工程Ｓ１４０〜Ｓ１６０と工程Ｓ１７０とを並行して行うことで、経時的に変化するシグナル値をリアルタイムで算出することも可能である。
【００７７】
図８Ａは、一般的な濃度（例えば数１００ｐＭ〜１μＭ）で蛍光物質を含む蛍光標識液が金属膜２２０上に提供されたときの、シグナル成分の蛍光強度とシグナル成分の蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。図８Ｂは、低濃度（例えば１００ｆＭ〜数１００ｐＭ）で蛍光物質を含む蛍光標識液が金属膜２２０上に提供されたときの、シグナル成分の蛍光強度とシグナル成分の蛍光強度の経時的な変化を示すグラフである。これらの実験では、蛍光標識液（遊離の２次抗体）が金属膜２２０上に存在する状態で、第１の光および第２の光の強度を測定している。これらのグラフにおいて、黒丸（●）は、ノイズ成分の蛍光強度（出力Ｏｓ）を表し、黒三角（▲）は、シグナル成分の蛍光強度（出力Ｏｐと出力Ｏｓとの差分値）を表す。
【００７８】
これらのグラフから、蛍光標識のために供給される蛍光物質の濃度の高低に関わらず、シグナル成分の蛍光強度の経時的変化を測定できることがわかる。これらの測定値は、カイネティクス解析によって即座に経時的変化の挙動を示す曲線として表示されうる。
【００７９】
以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量をリアルタイムで測定することができる。
【００８０】
以上のように、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００’は、シグナル成分とノイズ成分の偏光特性の違いを利用してシグナル成分のみをリアルタイムで検出することができるため、従来のＳＰＦＳ装置と同等の高感度で被検出物質をリアルタイムで測定することができる。
【００８１】
また、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００’は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ１３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の測定を行うことができる。
【００８２】
したがって、本実施の形態に係る測定方法では、レクチンなどの、アフィニティーが弱く、通常のサンドイッチアッセイでは検出が難しい物質も検出することができる。また、血清などの夾雑物が多い検体を用いる場合でも、回折格子２３０上に捕捉された被検出物質に由来する蛍光の強度を、夾雑物に由来する蛍光の強度から区別することが可能であるので、高精度の測定でありながら、夾雑物によるノイズの影響が実質的には反映されない測定結果が得られる。
【００８３】
したがって、本実施の形態に係る測定方法によれば、新規の生体物質の生合成による粗生成物や、臨床検査で採取された原サンプルなどの未精製のサンプル中の被検出物質を高い精度で経時的に、そして簡易に測定することが可能である。
【００８４】
なお、図１に示されるＳＰＦＳ装置１００（１００’）の代わりに、図９に示されるＳＰＦＳ装置３００を用いてもよい。図９に示されるように、ＳＰＦＳ装置３００は、ハーフミラー３２１、偏光子３２２および光検出部３２４をさらに有する点を除き、ＳＰＦＳ装置１００と同様に構成されている。
【００８５】
ハーフミラー３２１は、回折格子２３０と偏光子１２２との間において蛍光βの光路上に配置されている。光検出器３２４は、ハーフミラー３２１で反射した蛍光βの光路（反射光路）上に配置されており、偏光子３２２は、ハーフミラー３２１と光検出器３２４との間において反射光路上に配置されている。偏光子１２２の回転角度は、第１の光（例えばｐ偏光の光）を通すように調整（あるいは固定）されており、偏光子３２２の回転角度は、第２の光（例えばｓ偏光の光）を通すように調整（あるいは固定）されている。なお、ハーフミラー３２１、偏光子１２２および偏光子３２２の代わりに、偏光ビームスプリッターを使用してもよい。
【００８６】
光検出器１２４，３２４は、いずれも、第１の光の強度および第２の光の強度を連続して検出する。したがって、光源１１２が励起光αを連続して照射した場合、光検出器１２４，３２４は、それぞれ第１の光の強度および第２の光の強度を連続して検出する。蛍光βの過度の退色を予防する観点から、光源１１２が所定の間隔で断続的に励起光αを照射した場合、光検出器１２４は第１の光の強度を断続的に検出し、光検出器３２４は第２の光の強度を断続的に検出する。すなわち、第１の光の強度および第２の光の強度は、いずれも励起光αの照射間隔と同じ間隔で同時に検出される。
【００８７】
光検出器１２４からの出力Ｏｐおよび光検出器３２４からの出力Ｏｓから、図８Ａおよび図８Ｂと同様のグラフが作成されうる。
【００８８】
ＳＰＦＳ装置１００（１００’）は、偏光子１２２および光検出器１２４をそれぞれ一つずつしか有さないので、装置の小型化に有利であるが、ＳＰＦＳ装置３００は、第１の光と第２の光の両方を同時に測定可能であるので、より高い時間分解能でのリアルタイムのＳＰＦＳ測定に有利である。
【００８９】
［参考実験］
本実験では、ＧＣ−ＳＰＦＳを利用する測定装置および測定方法において、金属膜上で励起された蛍光物質から放出された蛍光（被検出物質の存在または量を示すシグナル成分）と、液体中に浮遊している蛍光物質から放出された蛍光（ノイズ成分）の偏光特性を調べた結果を示す。
【００９０】
まず、図１０Ａに示されるように、金属膜の回折格子２３０上に、図中白色の星で示される第１の蛍光物質（アロフィコシアニン、吸収波長：６５０ｎｍ、蛍光波長６６１ｎｍ）を固定化した。第１の蛍光物質は、ＧＣ−ＳＰＦＳにおける被検出物質を標識する蛍光物質を模擬している。この状態で、回折格子２３０に励起光α（波長６４０ｎｍ）を所定の入射角で照射し、偏光子（偏光板）１２２を回転させながら、光検出部１２４で蛍光βの強度を測定した。なお、図１０Ａでは、回折格子２３０上に存在する緩衝液を省略している。
【００９１】
次いで、図１０Ｂに示されるように、金属膜の回折格子２３０上に、図中黒色の星で示される第２の蛍光物質（AlexaFluor 647、吸収波長：６４７ｎｍ、蛍光波長６６５ｎｍ）を含む緩衝液を提供した。第２の蛍光物質は、ＧＣ−ＳＰＦＳにおいてノイズ源となる、金属膜上に浮遊している蛍光物質を模擬している。この状態で、回折格子２３０に励起光α（波長６４０ｎｍ）を前回と同一の入射角で照射し、偏光子（偏光板）１２２を回転させながら、光検出部１２４で蛍光βの強度を測定した。なお、図１０Ｂでも、第２の蛍光物質を除き、回折格子２３０上に存在する緩衝液を省略している。また、蛍光物質の実際の粒子サイズとしては、一般的には数ｎｍ程度である。
【００９２】
図１１は、蛍光強度の測定結果を示すグラフである。一点鎖線は、第１の蛍光物質のみが存在する場合（図１０Ａ参照）における、偏光子の回転角度と蛍光強度との関係を示す曲線である。破線は、第１の蛍光物質に加えて第２の蛍光物質も存在する場合（図１０Ｂ参照）における、偏光子の回転角度と蛍光強度との関係を示す曲線である。実線は、偏光子の回転角度とこれら２つの測定値の差分値との関係を示す曲線である。なお、偏光子の回転角度は、金属膜２２０の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面に対する角度である。たとえば、偏光子の回転角度が０°の場合は、ｐ偏光の光が検出されており、偏光子の回転角度が±９０°の場合は、ｓ偏光の光が検出されている。
【００９３】
まず、一点鎖線について見てみると、第１の蛍光物質に由来する蛍光（シグナル成分）は、主としてｐ偏光であることがわかる。次に、破線について見てみると、第２の蛍光物質が浮遊している場合は、偏光子の回転角度に関係なく蛍光強度が一律に上昇していることがわかる。これは、第２の蛍光物質に由来する蛍光（ノイズ成分）が加わったためと考えられる。そこで、これらの差分値を示す実線について見てみると、第２の蛍光物質に由来する蛍光（ノイズ成分）は、ランダム偏光であることがわかる。
【００９４】
したがって、シグナル成分以外のノイズ成分が蛍光に含まれる場合であっても、図１１に示されるように、ｐ偏光成分の検出結果からｓ偏光成分の検出結果を引くことで、ノイズ成分をほとんど含まないシグナル成分の値を算出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。【００９６】
また、本発明に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定方法は、蛍光標識液などを提供した後に金属膜表面を洗浄しなくても、被検出物質を高い信頼性でリアルタイムに測定することもできる。よって、測定時間の短縮化が図られるだけでなく、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
【符号の説明】
【００９７】
１００，１００’，３００  表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０  励起光照射ユニット
１１２  光源
１２０  蛍光検出ユニット
１２２，３２２  偏光子
１２４，３２４  光検出部
１３０  制御部（処理部）
２００  チップ
２１０  基板
２２０  金属膜
２３０  回折格子
３２１  ハーフミラー
α  励起光
β  蛍光
γ  反射光
【図１】
2015155799.tif 000003
【図２】
2015155799.tif 000004
【図３】
2015155799.tif 000005
【図４】
2015155799.tif 000006
【図５】
2015155799.tif 000007
【図６】
2015155799.tif 000008
【図７】
2015155799.tif 000009
【図８】
2015155799.tif 000010
【図９】
2015155799.tif 000011
【図１０】
2015155799.tif 000012
【図１１】
2015155799.tif 000013
【国際調査報告】
2015155799.tif 000014
2015155799.tif 000015
2015155799.tif 000016
2015155799.tif 000017