(57)【要約】細胞とともに培地を容器１に供給して細胞培養を行うにあたり、容器１を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、上動させた容器１を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った容器１に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって、容器１の内容液を撹拌する。これにより、細胞に与えるずり応力によるダメージを少なくしつつ、細胞の分布や培地の成分濃度が均一となるように撹拌して良好な培養環境を維持し、また、撹拌によって細胞が内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞の増殖を促進する。
2015133116.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞とともに培地を培養用容器に供給して細胞培養を行う細胞培養方法において、
前記培養用容器を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、
上動させた前記培養用容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記培養用容器に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって、
前記培養用容器の内容液を撹拌することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記培養用容器を上方に移動させながら傾けていくことにより前記培養用容器の内容液を偏らせ、前記培養用容器を初期位置まで戻す際に前記培養用容器の内容液に揺り戻しを生じさせる請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の保持板を有する保持部に前記培養用容器を保持し、
前記回動軸を中心に前記保持板を上方に回動させることにより、前記培養容器を傾けつつ初期位置よりも上方に移動させ、
次いで、前記回動軸を中心に前記保持板を下方に回動させて、前記培養用容器が初期位置に戻る際に前記保持板を前記基台に当接させることによって、前記培養用容器に加える振動を生じさせる請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記保持板を落下により下方に回動させて前記基台で受けることにより、前記培養用容器に加える振動を生じさせる請求項３に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記保持板をフォロワとするカム機構により、前記保持板を上下に回動させる請求項３又は４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
周縁に突起が設けられた回転板と、一端が前記回転板の周縁まで延びるが、他端が前記回転板の周縁に達しない受け板と、前記受け板が基端に設けられた突き上げ部材とを有し、前記回転板が回転すると、前記突起により前記受け板が押し上げられて前記突き上げ部材が上動し、次いで、前記突起が前記受け板から外れると前記突き上げ部材が自重で下動するように構成された駆動機構により、前記保持板を上下に回動させる請求項３又は４に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
可撓性材料を用いて前記培養用容器を形成した請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
細胞とともに培地を培養用容器に供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の保持板を有する保持部と、
前記保持板をフォロワとするカム機構と
を備え、
前記培養用容器が前記保持部に保持されて、
前記カム機構により前記回動軸を中心に前記保持板を上下に繰り返し回動させるとともに、前記保持板が下動して前記基台に当接したときに生じる振動を前記培養用容器に加えることにより前記培養用容器の内容液を撹拌することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
細胞とともに培地を培養用容器に供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、
一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の保持板を有する保持部と、
周縁に突起が設けられた回転板と、一端が前記回転板の周縁まで延びるが、他端が前記回転板の周縁に達しない受け板と、前記受け板が基端に設けられた突き上げ部材とを有し、前記回転板が回転すると、前記突起により前記受け板が押し上げられて前記突き上げ部材が上動し、次いで、前記突起が前記受け板から外れると前記突き上げ部材が自重で下動するように構成された駆動機構と
を備え、
前記培養用容器が前記保持部に保持されて、
前記回転板が一定方向に回転することによって上下動が繰り返される前記突き上げ部材が前記保持板の底面に当接して、前記保持板を上下に繰り返し回動させるとともに、前記保持板が下動して前記基台に当接したときに生じる振動を前記培養用容器に加えることにより前記培養用容器の内容液を撹拌することを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で培養する細胞培養方法、及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められており、種々の細胞培養装置が知られている。例えば、特許文献１には、細胞培養バッグに培地バッグ、培養後の細胞回収バッグ、連結チューブ等を接続して細胞培養を行う細胞培養装置が提案されている。【０００３】
また、この種の細胞培養装置にあっては、細胞の増殖を促進する上で、細胞培養バッグの内容液中の細胞の分布や培地の成分濃度が均一となるように撹拌して良好な培養環境を維持することが望まれることに加え、細胞が内壁に付着したり、過度に凝集したりする等してしまうと細胞の増殖率が低下するという問題がある。【０００４】
このため、特許文献２には、適度に傾斜させた回転板に細胞培養バッグを取り付けて、かかる回転板の回転によって内容液を撹拌するようにした回転培養装置が提案されおり、特許文献３には、Ｘ軸とＹ軸とを中心に上下動可能とされた揺動板に細胞培養バックを取り付けて、かかる揺動板の揺動によって内容液を撹拌するようにした揺動培養装置が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２４８３８２号公報
【特許文献２】実開昭６３−１５５３９９号公報
【特許文献３】特開昭６４−１８４３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２や特許文献３で提案された装置のように、回転や揺動によって細胞培養バッグの内容液を撹拌すると、例えば、図４に示すように、内容液中の細胞Ｃが細胞培養バッグ１００の培養面を長い距離転がり落ちて、ずり応力によるダメージを細胞に与えてしまうことが懸念される。【０００７】
本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、細胞に与えるずり応力によるダメージを少なくしつつ、細胞の分布や培地の成分濃度が均一となるように撹拌して良好な培養環境を維持し、また、撹拌によって細胞が内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞の増殖を促進することができる細胞培養方法、及び細胞培養装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る細胞培養方法は、細胞とともに培地を培養用容器に供給して細胞培養を行う細胞培養方法において、前記培養用容器を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、上動させた前記培養用容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記培養用容器に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって、前記培養用容器の内容液を撹拌する方法としてある。【０００９】
また、本発明に係る細胞培養装置は、細胞とともに培地を培養用容器に供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、一端縁に設けられた回動軸を基台に軸支した平板状の保持板を有する保持部と、前記保持板をフォロワとするカム機構とを備え、前記培養用容器が前記保持部に保持されて、前記カム機構により前記回動軸を中心に前記保持板を上下に繰り返し回動させるとともに、前記保持板が下動して前記基台に当接したときに生じる振動を前記培養用容器に加えることにより前記培養用容器の内容液を撹拌する構成としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞に与えるずり応力によるダメージを少なくしつつ、細胞の分布や培地の成分濃度が均一となるように撹拌して良好な培養環境を維持することができ、さらに、撹拌によって細胞が内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞の増殖を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態の概略を示す説明図である。
【図２】本発明の実施形態の変形例の概略を示す説明図である。
【図３】本発明の実施形態の他の変形例において、保持板を上下に回動させる駆動機構の例を示す説明図である。
【図４】従来技術の概略を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明に係る細胞培養方法、及び細胞培養装置の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
【００１３】
本実施形態にあっては、培養用容器としての容器１に、培養の対象となる細胞（培養細胞）とともに、この細胞を培養するための培地（培養液や培養基を含む）を内容液として供給して細胞培養を行う。
【００１４】
本実施形態において、容器１は、可撓性材料を用いて袋状（バッグ型）に形成してなり、細胞培養を閉鎖系（密閉系）で行うことができるとともに、ＣＯ２インキュベータ内で使用する場合に必要な酸素及び二酸化炭素に対するガス透過性を有している。さらに、容器１は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような容器１としての条件を満たす可撓性材料の具体例としては、ポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴムなどが挙げられる。
【００１５】
特に図示しないが、容器１の形状は、通常、長方形状とされることが多く、細胞や培地を外部から容器１に供給する供給用のチューブと、細胞や培地を容器１から回収する回収用のチューブとが接続される。これらのチューブは、容器１の短辺側の対抗する二辺に１本ずつ接続してもよく、短辺側の一辺又は長辺側の一辺に２本のチューブを接続するようにしてもよい。
【００１６】
なお、容器１に接続されるチューブは２本に限らず、この他にもサンプル取り出し用のチューブ等を接続する場合や、１本のチューブで供給用と回収用とを兼ねる場合もある。また、容器１の形状は、楕円形状、円形状などとする場合もあり、必要に応じて種々の形状とすることができる。
【００１７】
容器１に接続されるチューブの材質としては、適宜使用環境に合わせて選択すれば良いが、ＣＯ２インキュベータ内で使用する場合は、特に、酸素及び二酸化炭素に対するガス透過性に優れるものが望ましい。例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。
【００１８】
本実施形態では、このような容器１を培養用容器として用いて細胞培養を行うにあたり、容器１を初期位置よりも上方に移動させる上動工程と、容器１を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った容器１に振動を加える下動工程とを繰り返すことによって容器１の内容液を撹拌する。
なお、上動工程と下動工程とを繰り返すにあたり、容器１の内容液の撹拌が確実になされるように、必要に応じて下動工程後にインターバルをおいて、所定の時間が経過してから上動工程が繰り返されるようにしてもよい。
【００１９】
このようにすることで、容器１の上下動による内容液の撹拌に加えて、下動工程において容器１に加わる振動によって細胞が内容液中を舞い上がるように拡散する。これにより、容器1の内容液が上下方向にも効率よく攪拌され、細胞が容器１の培養面を転がり落ちる際のずり応力を軽減して、細胞に与えるダメージを少なくしつつ、容器１の内容液中の細胞の分布や培地の成分濃度を均一にして良好な培養環境を維持するとともに、細胞が容器内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞の増殖を促進することができる。さらに、培養する細胞が接着性細胞である場合には、下動工程において容器１に加わる振動により、容器１の培養面からの細胞の剥離を促すことも可能である。
【００２０】
上記のようにして容器１の内容液を撹拌するには、例えば、図１に示すように、一端縁に設けられた回動軸２２を基台４に軸支した平板状の保持板２１を有する保持部２と、保持板２１をフォロワとするカム機構とを備え、容器１が保持部２に保持されて、カム機構により回動軸２２を中心に保持板２１を上下に繰り返し回動させるとともに、保持板２１が下動して基台４に当接したときに生じる振動を容器１に加えることにより容器１の内容液を撹拌する装置を用いるのが好ましい。
【００２１】
このような装置において、上動工程では、保持部２に保持された容器１は、カム機構によって保持板２１が上方に回動するに伴って、初期位置よりも上方に移動しながら傾いていき、これによって可撓性材料を用いて形成された容器１が撓み変形しつつ、その内容液が回動軸２２側に偏るように流動する（図１（ａ）〜（ｅ）参照）。下動工程では、保持板２１は、最大傾斜角度θｍａｘに達した後、下方に回動し、これに伴って容器１は初期位置に戻るが（図１（ｆ），（ｇ）参照）、その際に容器１の内容液に揺り戻しが生じ、これとともに、保持板２１が基台４に当接したときの衝撃によって生じた振動で細胞が内容液中を舞い上がるように拡散し、これによって容器１の内容液が撹拌される。
【００２２】
このようにして容器１の内容液を撹拌するにあたり、細胞に与えるダメージをより少なくして、容器１の内容液をより効率よく撹拌するためには、基台４に水平に支持した保持板２１を緩やかに上方に回動させ、保持板２１が最大傾斜角度θｍａｘに達した後に、保持板２１を落下により下方に回動させて、落下する保持板２１を基台４が受けたときに生じる衝撃によって、容器１に振動が加わるようにするのが好ましい。特に図示しないが、保持板２１が基台４に当接したときの衝撃によって生じた振動を容器１に加えるに際しては、容器１の内容液をより効率よく撹拌する上で容器１に振動を加えるのに好適な位置に応じて、保持板２１に当接する凸部を基台４に設けておくことができる。
【００２３】
また、保持板２１を落下により下方に回動させるには、例えば、輪郭が円弧状の第一カム面３１と、輪郭が直線状の第二カム面３２とを有する板カム３によってカム機構を構成し、カム面３１，３２の曲率、板カム３を回転させる駆動軸３３の位置及び駆動軸３３の回転速度を適宜設定し、第一カム面３１によって保持板２１を上方に回動させ、第二カム面３２に切り替わる際に板カム３が保持板２１から離れるようにすることで（図１（ｆ）参照）、保持板２１が落下により下方に回動させることができる。
【００２４】
なお、前述したように、容器１の形状は、通常、長方形状とされる場合が多く、保持板２１の形状も容器１の形状に合わせて設計するが、保持板２１を長方形状とした場合、回動軸２２を設ける一端縁は、短辺側であっても、長辺側であってもよい。
【００２５】
このような本実施形態は、浮遊系細胞、接着性細胞のいずれを培養する場合にも適用することができる。前述したように、接着性細胞の培養に適用する場合には、容器１の培養面からの細胞の剥離を促すことも可能であり、容器１の内容液に、必要に応じて、トリプシン等のタンパク質分解酵素を添加するなどの所定の処置を施すことにより、接着性細胞を培養面から剥離する手段としても利用することもできる。
【００２６】
以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
【００２７】
例えば、前述した実施形態では、保持板２１の下面に板カム３が当接して保持板２１を上下に回動させる例を示したが、カム機構の具体的な態様はこれに限定されない。例えば、所定の温度に維持された培養室に保持具２とともに容器１を収容して細胞培養を行うにあたり、かかる培養室にカム機構を設置するスペースが確保できないような場合などには、図２に示すように、保持板２１の下面に従節部材２３を設けて、駆動源とともに培養室Ｒの外部に設置した板カム３が当該従節部材２３に当接して、保持板２１を上下に回動させるように構成することもできる。
【００２８】
また、前述した実施形態では、可撓性材料を用いて袋状に形成した容器１を培養用容器として用いた例を示したが、培養用容器は、ブロー成形による一体成型バッグなどでもよい。容器１の上下動に伴って内容液が流動し、撹拌できるものであれば、容器１の具体的な態様は特に限定されない。
【００２９】
また、前述した実施形態では、保持板２１をフォロワとするカム機構により、保持板２１を上下に回動させる例を示したが、保持板２１を上下に回動させる具体的な態様はこれに限定されない。例えば、クランク機構などの他の動力伝達機構を用いてもよく、図３に示す駆動機構により、保持板２１を上下に回動させてもよい。
図３に示す駆動機構は、周縁に突起５ｃが設けられた回転板５ｂと、一端が回転板５ｂの周縁まで延びるが、他端が回転板５ｂの周縁に達しない受け板５ａと、受け板５ａが基端に設けられた突き上げ部材５とを有し、回転板５ｂが回転すると、突起５ｃにより受け板５ａが押し上げられて突き上げ部材５が上動し（図３（ｂ）参照）、次いで、突起５ｃが受け板５ａから外れると突き上げ部材５が自重で下動するように構成されている（図３（ｃ）参照）。このような駆動機構にあっては、回転板５ｂが一定方向に回転することによって上下動が繰り返される突き上げ部材５を保持板２１の底面に当接させて、保持板２１を上下に繰り返し回動させることができる。そして、突き上げ部材５が下動するときには、その自重で落下するようになっており、これに伴って落下する保持板２１が基台４に当接したときに生じる振動を容器１に加えることにより内容液を撹拌することができる。
このような態様にあっても、保持板２１が上下に回動する角速度や保持板２１の最大傾斜角度θｍａｘを適宜設定することで、細胞が容器１の培養面を転がり落ちる際のずり応力を軽減できるとともに、容器１の内容液を効率よく撹拌することができる。
【００３０】
また、前述した実施形態では、保持板２１を落下により下方に回動させて基台４で受けることにより、容器１に加える振動を生じさせる例を示したが、容器１に振動を加える具体的な態様はこれに限定されない。例えば、保持板２１が下方に回動する角速度を適宜調整して、保持板２１が基台４に当接したときに振動が生じるようにするなどしてもよい。
【００３１】
また、前述した実施形態では、一端縁に設けられた回動軸２２を基台４に軸支した平板状の保持板２１を上下に回動させて上動工程と下動工程とを行う例を示したが、上動工程と下動工程とを行う具体的な態様はこれに限定されない。例えば、特に図示しないが、矩形状の保持板の四隅を鉛直方向に配置された軸に遊嵌状に支持させて、当該保持板に培養用容器を保持して適当な動力伝達機構により上動工程と下動工程とを行うようにしてもよい。
【００３２】
また、保持具２は、前述した実施形態で説明した態様に限られず、特願２０１３−２６１１５９や特願２０１３−２６１１６０において、本出願人が先に提案した装置が備える保持具のように、容器１の幅方向中央部を保持する底板と、底板の両側端縁に沿って回動可能に設けられた側板とを有するように構成してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、再生医療や抗体医薬生産において、細胞を培養する技術として好適に利用できる。
【符号の説明】
【００３４】
１          容器（培養用容器）
２          保持部
２１          保持板
２２          回動軸
３          板カム
４          基台
５          突き上げ部材
５ａ          受け板
５ｂ          回転板
５ｃ          突起
【図１】
2015133116.tif 000003
【図２】
2015133116.tif 000004
【図３】
2015133116.tif 000005
【図４】
2015133116.tif 000006
【国際調査報告】
2015133116.tif 000007
2015133116.tif 000008
2015133116.tif 000009
2015133116.tif 000010
2015133116.tif 000011
2015133116.tif 000012