(57)【要約】  生体分子と反応する機能性分子により表面修飾した場合に、凝集を起こさない安定した金属ナノ構造体を提供する。少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ構造体を３０〜９０％被覆し、さらに１種以上の生物学的機能性分子によって金属ナノ構造体を被覆する。
2015056766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多機能金属ナノ構造体であって、
金属ナノ構造体表面の３０〜９０％を被覆する少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子と、
末端にアミノ酸を有する少なくとも１種以上の生物学的機能性分子とにより金属ナノ構造体表面が被覆されていることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項２】
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記コロイド安定化機能性分子が下記一般式（１）
【化１】
2015056766.tif 000004
（式中ｎは１以上の整数を表す）
で表される化合物を含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項３】
請求項２記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記一般式（１）の化合物がポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項４】
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記コロイド安定化機能性分子の少なくとも１つの末端にチオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基を有することを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項５】
請求項４に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記コロイド安定化機能性分子の一端が、チオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基であり、
他端は、メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項６】
請求項１に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記金属ナノ構造体が金属ナノ粒子であって、
該金属ナノ粒子が、貴金属ナノ粒子又は貴金属を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項７】
請求項６に記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子、又は金を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項８】
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体であって、
前記生物学的機能性分子がペプチドを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体。
【請求項９】
多機能金属ナノ構造体を液体中に分散した分散液であって、
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする分散液。
【請求項１０】
多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品であって、
請求項９記載の分散液を凍結することを特徴とする多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品。
【請求項１１】
多機能金属ナノ構造体を含む診断用及び／又は治療用組成物であって、
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする診断用及び／又は治療用組成物。
【請求項１２】
多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
水あるいは電解液中に分散された金属ナノ構造体を用意する工程と、
物理量により金属ナノ構造体の表面被覆量を測定し、金属ナノ構造体表面の３０〜９０％をコロイド安定化機能性分子によって被覆する工程と、
一種以上の生物学的機能性分子によって、金属ナノ構造体表面を被覆する工程とを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
前記金属ナノ構造体が水あるいは電解液中に分散された分散液の電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
一種以上の前記生物学的機能性分子がＮ種類（Ｎは整数を表す。）の生物学的機能性分子である場合において、
各工程において前記金属ナノ構造体の表面被覆量を物理量よって調節し、
前記生物学的機能性分子として、第１番目の生物学的機能性分子から第（Ｎ−１）番目の生物学的機能性分子まで、順番に各々有効表面積の全てを占有しないように部分的に被覆する各工程と、
Ｎ番目の生物学的機能性分子によって、前記金属ナノ構造体表面の有効領域が飽和状態になるまで表面被覆することを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
各工程の後に前記金属ナノ構造体に結合しない余剰分子を除去する工程を含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の多機能金属ナノ構造体の製造方法であって、
余剰分子を除去する工程が遠心分離又は透析であることを特徴とする多機能金属ナノ構造体の製造方法。
【請求項１７】
請求項１記載の多機能金属ナノ構造体を製造するためのキットであって、
少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子により部分的に被覆された金属ナノ構造体と、
生物学的機能性分子を被覆するための緩衝液とを含むことを特徴とする多機能金属ナノ構造体を製造するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病気の診断や治療に用いる医療用の多機能金属ナノ構造体に関する。すなわち、金属ナノ構造体の表面を複数の機能性分子で被覆し、安定したコロイド分散液を作製するための方法、及び該方法による多機能金属ナノ構造体、及び該多機能金属ナノ構造体を含む製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属ナノ粒子やロッド等の金属ナノ構造体を用いたいわゆるナノテクノロジーは、近年、研究・産業分野で重要な技術となっている。特に、医療、診断分野で、金属ナノ構造体の表面に、ペプチドや核酸等の生体分子、生体適合性のあるポリマー、蛍光分子のような機能性分子を結合させて、疾患の検出等に利用されてきている。【０００３】
特に金属成分として金を用いる金ナノ構造体は、金が物質として安定しており、毒性が低いことから、幅広く展開されてきている。金ナノ構造体の光学的性質を利用した比色センサや、表面プラズモン共鳴を利用したセンサは、例えば家庭用妊娠検査キット等、様々な検査で用いられている。【０００４】
また、金属ナノ構造体は、表面を特定の分子でコーティングし、暗視野顕微鏡や、電子顕微鏡用のプローブとしても用いられている。さらには、金ナノ構造体の表面にがん細胞等、特定の細胞を認識する標的分子と治療薬とをコーティングし、治療用キャリヤーとして用いることが試みられている。【０００５】
通常、これらの金属ナノ構造体の表面の機能化は、核となる金属ナノ構造体が水などの液体媒質中に分散されたコロイド溶液に、機能性分子を混合し、自発的あるいはｐＨ変化や温度変化などの外的刺激によって起こる、金属ナノ粒子-機能性分子間の結合反応を利用して修飾する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２２５０２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】G. Luo et al.,International Journal of Pharmaceutics, 2010,Vol. 385, p.150-156,
【非特許文献２】G. F. Paciotti et al., Drug Delivery, 2004, Vol.11, p.169-183
【非特許文献３】K. A. Kelly et al., PLOS Medicine, 2008, Vol.5, Issue 4, e45
【非特許文献４】S. J. Shin, et al., PNAS, 2013, Vol.110, No.48, p.19414-19419
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、金属ナノ構造体を機能化する際に、金属ナノ構造体のコロイド溶液と、生体分子と反応性を有する機能性分子を混合すると、コロイド状態の不安定化を引き起こし、金属ナノ構造体の凝集を誘発することがある。一度ナノ構造体の凝集が起こると再分散させることは難しい。特に、分子量がおよそ３０００以下のペプチドのような荷電性官能基を有する分子の場合に凝集が頻発する。そのため、バイオ、医療用途での利用が困難であるという問題が生じていた。【０００９】
上記問題を回避するために、以下のアプローチがある。第１の方法は、最初にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生体適合性のある高分子の一端をナノ構造体の表面に結合させ、ナノ構造体全体を表面修飾する。高分子による立体障害によって粒子間反発が起きるため、コロイドが安定化し凝集が抑制される。【００１０】
高分子で表面修飾後、高分子の他端に目的の機能化分子を化学反応により結合させる。すなわち、ナノ構造体に高分子を介して目的の機能化分子を高分子の外層に結合させる方法である（非特許文献１）。【００１１】
しかし、外側に層を重ねていくことで表面修飾後のナノ構造体全体のサイズが大きくなってしまう問題や、機能化分子を化学結合で結合させることから、あらかじめ高分子と機能化分子双方に結合させるための官能基を導入しておく必要がある。そのため、これらの分子の合成自体が複雑化し、コストがかかってしまうという問題があった。【００１２】
第２の方法は、表面修飾する特定のタンパク質、あるいはペプチドに合わせて、コロイド溶液のｐＨを調整し、その特定のｐＨ下で表面修飾を行う方法である（非特許文献２）。【００１３】
しかしながら、この方法では、タンパク質あるいはペプチドに固有の最適ｐＨに合わせて反応を行う必要がある。そのため、個々のタンパク質あるいはペプチドに応じて、最適ｐＨを求めなければならない。したがって、一般化した表面修飾方法を確立することができず、タンパク質、ペプチドごとにｐＨを最適化するための時間が必要となる。【００１４】
また、特許文献１には、表面被覆率を調節して機能性分子を修飾する方法、及び修飾することによって得られる安定化コロイドナノ粒子が開示されている。生物学的又は医療用途への応用の示唆はあるが、金ナノ粒子表面にポリエチレングリコールを結合させた安定化コロイド粒子が開示されているだけであり、ペプチド、アプタマー等、生体分子に特異的に結合する分子によって修飾した応用技術に関する記載はない。【００１５】
したがって、特許文献１に記載されているコロイド粒子は、安定化コロイドナノ粒子ではあるものの、ペプチド、アプタマー等を結合させ、治療、診断用途に用いるための最適化がなされているわけではない。【００１６】
治療、診断目的で特定のタンパク質等の生体分子を検出するためには、感度と精度が求められる。そのためには、高密度でペプチド、アプタマー等生体分子と結合する機能性分子で金属ナノ構造体を修飾する必要がある。また、生体分子は多様であるため、これと結合する機能性分子も多様である。多様な生体分子に適用し、治療、診断用に使用するためには表面修飾法をさらに最適化する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の多機能金属ナノ構造体は、金属ナノ構造体表面の３０〜９０％を被覆する少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子と、末端にアミノ酸を有する少なくとも１種以上の生物学的機能性分子とにより金属ナノ構造体表面が被覆されていることを特徴とする。【００１８】
コロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ構造体が凝集することを抑制し、生体内の分子と反応性を有する生物学的機能性分子によって、標的分子と結合し、診断・治療用の素材として応用できるからである。【００１９】
ここで、コロイド安定化機能性分子によって、金属ナノ粒子表面の全領域が被覆されているのではなく、部分的に被覆されていることが重要である。コロイド安定化機能性分子によって、被覆されていることによって、水溶液中での分散性を確保するとともに、部分的な被覆であることから、コロイド安定化機能性分子の間隙部分に生物学的機能性分子が結合することができる。【００２０】
コロイド安定化機能性分子の被覆率が３０％未満であると、金属ナノ構造体の凝集が起こりやすく、安定したコロイドとして得ることができない。また、コロイド安定化機能性分子の被覆率が９０％を超えると生物学的機能性分子が被覆する領域が少なくなるため、生体分子との反応性が低下する。【００２１】
末端にアミノ酸を有する生物学的機能性分子としては、抗体をはじめ、特定の分子に結合する合成ペプチド、ペプチドホルモン等様々なペプチドが含まれる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や核酸にリンカーを結合させた分子が含まれ、リンカーはアミノ基を含む化合物であれば特に限定されない。これら分子を生物学的機能性分子として多機能金属ナノ構造体に結合させることにより、診断・治療、研究分野等、幅広い応用が期待できる。【００２２】
また、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記コロイド安定化機能性分子が下記一般式（１）
【化１】
2015056766.tif 000003
（式中ｎは１以上の整数を表す。）
で表される化合物を含むことを特徴とする。【００２３】
上記化合物を含むことにより、金属ナノ構造体がコロイドとして安定化するからである。【００２４】
さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記一般式（１）の化合物がポリエチレングリコール又はその誘導体であることを特徴とする。【００２５】
ポリエチレングリコールは生体適合性が良いことから、がん細胞等特定の標的に対する治療薬を結合させて、生体に投与することが可能となる。【００２６】
本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子の少なくとも１つの末端にチオール基又はジスルフィド基を有することを特徴とする。【００２７】
コロイド安定化機能性分子の一端をチオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基とすることにより、金属基材と容易に結合する。したがって、確実にコロイド安定化機能性分子で金属ナノ構造体を被覆することが可能となる。【００２８】
また、本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子の一端に、チオール（‐ＳＨ）又はジスルフィド（‐Ｓ‐Ｓ‐）を有する官能基を備え、他端は、メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基の少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする。【００２９】
メトキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アシル基、アゾ基、カルボニル基のいずれか１つを含むことにより、生物学的機能性分子であるペプチドがコロイド安定化機能性分子とも結合可能となる。そのため生物学的機能性分子が結合可能な表面領域が拡大する。【００３０】
さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体は、金属ナノ粒子であって、貴金属ナノ粒子又は貴金属を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする。【００３１】
金属ナノ構造体が、白金等の貴金属ナノ粒子、又は貴金属を含む合金であれば、放射線に対する散乱係数が大きいので、Ｘ線、粒子線等の造影剤として用いることができる。【００３２】
さらにまた、本発明の多機能金属ナノ構造体は、前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子、又は金を含む合金ナノ粒子であることを特徴とする。【００３３】
貴金属の中でも金は安定であり、担体としてすでに診断・治療に用いられており、すでに幅広い用途が確立しているからである。また、生物学的機能性分子によってがん細胞のような標的細胞に集積させ、電磁波により熱を生成させることによって、該標的細胞を死滅させることが可能となる。【００３４】
本発明の多機能金属ナノ構造体は、生物学的機能性分子が少なくともペプチドを含むことを特徴とする。【００３５】
標的分子に結合する分子量２００以上１００００以下のペプチドは、効率良く金属ナノ構造体を被覆することができる。そのため、感度良く標的分子を検出することが可能であり、また、治療に用いる場合にも、高い効果を得ることが期待できる。【００３６】
さらに、本発明は、前記多機能金属ナノ構造体を液体中に分散した分散液であることを特徴とする。【００３７】
本発明の多機能金属ナノ構造体は、コロイド安定化機能性分子で表面を被覆しているために、非常に安定して液体中に分散する。したがって、非常に扱いやすい。また、生物学的機能性分子を結合していることから、診断・治療の現場において、すぐに使用する形態で提供できる。【００３８】
さらに、本発明は、前記多機能金属ナノ構造体を含む凍結乾燥品であって、前記分散液を凍結することを特徴とする。【００３９】
凍結乾燥品とすることによって、長期保存と輸送安定性の確保が可能となり、ペプチド等の生物学的機能性分子が結合した状態であっても、安定した製品として供給可能となる。【００４０】
また、本発明の診断用及び／又は治療用組成物は、前記多機能金属ナノ構造体を含むことを特徴とする。【００４１】
本発明の多機能金属ナノ構造体は、生物学的機能性分子が結合している金属ナノ構造体であることから、所望の器官、患部等に集積させることが可能であり、造影剤や、温熱療法にも用いることができる。また、蛍光色素等の色素を結合させることによって、がん細胞等の検出を行う、いわゆるイメージング剤として使用することができる。【００４２】
さらに、抗がん剤のキャリヤーとしても用いることができる。すなわち、生物学的機能性分子の他に、抗がん剤や細胞増殖抑制剤を結合させた多機能金属ナノ構造体とすることによって、標的細胞に集積させることができ、副作用の少ない治療を行うことが可能となる。【００４３】
本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、水あるいは電解液中に分散された金属ナノ構造体を用意する工程と、物理量により金属ナノ構造体の表面被覆量を測定し、金属ナノ構造体表面の３０〜９０％をコロイド安定化機能性分子によって被覆する工程と、一種以上の生物学的機能性分子によって、金属ナノ構造体表面を被覆する工程とを含むことを特徴とする。【００４４】
金属ナノ構造体の表面被覆量は物理量を測定することによってモニターすることが可能である。したがって、最初にコロイド安定化機能性分子による被覆率を調節して被覆し、次に、生物学的機能性分子を同様に被覆率をモニターしながら被覆することができる。そのためコロイド安定化機能性分子と生物学的機能性分子とを最適比率で被覆することが可能である。【００４５】
また、予め所定の被覆条件によって、金属ナノ構造体表面の被覆率を求めておき、それに基づいてコロイド安定化機能性分子を被覆することもできる。特に、ＰＥＧ等特定のコロイド安定化機能性分子を用いる場合には、条件を決めて被覆することにより、再現性良く所望の被覆率で金属ナノ構造体表面を被覆することができる。【００４６】
本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、前記金属ナノ構造体が水あるいは電解液中に分散された分散液の電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることを特徴とする。【００４７】
不純物イオンは、表面被覆工程における金ナノ粒子の表面活性を悪くする可能性があるためである。【００４８】
本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、一種以上の前記生物学的機能性分子がＮ種類（Ｎは整数を表す。）の生物学的機能性分子である場合において、各工程において前記金属ナノ構造体の表面被覆量を物理量によって調節し、前記生物学的機能性分子として、第１番目の生物学的機能性分子から第（Ｎ−１）番目の生物学的機能性分子まで、順番に各々有効表面積の全てを占有しないように部分的に被覆する各工程と、Ｎ番目の生物学的機能性分子によって、前記金属ナノ構造体表面の有効領域が飽和状態になるまで表面被覆することを特徴とする。【００４９】
本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法によれば、複数の生物学的機能性分子を結合させる場合であっても、その被覆量を調節しながら被覆することができるため、各々最適比率で被覆することが可能である。【００５０】
また、本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、各工程の後に金属ナノ構造体に結合しない余剰分子を除去する工程を含むことを特徴とする。【００５１】
余剰分子の除去工程を含むことにより、より正確に金属ナノ構造体表面の被覆率を測定することが可能である。【００５２】
本発明の多機能金属ナノ構造体の製造方法は、余剰分子を除去する工程が遠心分離又は透析であることを特徴とする。【００５３】
余剰分子を遠心分離により除去することにより、簡便に余剰分子の除去を行うことができる。また、透析による余剰分子の除去を行うことにより、造影剤や治療薬として安全に投与可能な薬剤を製造することができる。【００５４】
さらに、本発明の多機能金属ナノ構造体を製造するためのキットは、少なくとも１種以上のコロイド安定化機能性分子により部分的に被覆された金属ナノ構造体と、生物学的機能性分子を被覆するための緩衝液とを含むことを特徴とする。【００５５】
コロイド安定化機能性分子を部分的に被覆し、研究者が所望の生物学的機能性分子を適宜被覆できるようにすることによって、各自の研究目的、あるいは、診断目的に沿った試薬を調整することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の多機能金属ナノ構造体を模式的に示す。
【図２】異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の混合溶液での流体力学的粒子半径の増加量を示す。
【図３Ａ】異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比による金ナノ粒子表面の修飾率を示す。
【図３Ｂ】ＰＥＧにより被覆された金ナノ粒子の凝集が抑制されることを示す。
【図４】ＥｐＣＡＭペプチドで修飾した多機能金ナノ粒子による細胞染色像。
【図５】プレクチン結合ペプチドで修飾した多機能金ナノ粒子による細胞染色像。
【図６】蛍光標識多機能金ナノ粒子の蛍光強度を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明のコロイド安定化機能性分子としては、コロイド粒子が凝集することを防止する効果を備えている分子であればどのようなものを使用してもよい。
【００５８】
高分子により表面を被覆すると、被覆した分子による立体的障害により、粒子同士が一定の距離より近づきにくくなるため、凝集しにくくなる。したがって、金属表面を被覆可能な高分子であれば、どのようなものを使用してもよい。
【００５９】
例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリサッカライド、ポリデシルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ(poly(lactic-co-glycolic acid))、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、高分子炭化水素、及びこれらの誘導体や共重合体が挙げられる。また、デンドリマー、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、抗体、アルブミンなどのタンパク質も挙げられる。
【００６０】
一般にアプタマーやタンパク質は凝集を引き起こす分子になるが、特定のアプタマーやタンパク質によっては凝集を引き起こさず、立体的障害のみを誘導することから、コロイド安定化機能性分子として作用し得るものも存在する。
【００６１】
さらに、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate）、ＬＤＳ (Lithium Dodecyl Sulfate)、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ１００、コール酸類等の界面活性剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等を用いてもよい。
【００６２】
生物学的機能性分子を被覆するために、コロイド安定化機能性分子は、図１に模式的に示すように、金属ナノ粒子表面が部分的に被覆されるように量を調節して被覆することが重要である。
【００６３】
図１に示すように、コロイド安定化機能性分子（図１ではＰＥＧの例を示している。）によって完全に表面被覆されると、コロイドとしては安定化する。しかしながら、生物学的機能性分子（図１ではペプチドの例を示している。）がコロイド安定化機能性分子の間隙に入り込む余地がなく、ペプチド等の生物学的機能性分子の結合が妨げられる。したがって、部分的にコロイド安定化機能性分子によって被覆されていることが、コロイドの安定化、生物学的機能性分子の結合の２つを達成するためには重要である。
【００６４】
本明細書では、「結合」とは、共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合等、あらゆる結合形式が含まれる。
【００６５】
また、本発明で好適に用いられるＰＥＧについては、第２の機能性分子として結合させる生物学的機能性分子の分子量にもよるが、分子量５００〜１０００００程度のものが好ましい。
【００６６】
また、本発明の生物学的機能性分子としては、生体分子と反応性を有する分子であれば、どのようなものを用いてもよい。例えば、抗体、アプタマーのような特定の分子に特異的に結合する核酸やペプチドを用いることができる。核酸の場合には、上述のようにアミノ基を有するリンカーを付加すればよい。
【００６７】
また、ペプチドの場合、分子量が２００以上１００００以下の範囲であれば、効率良く金属ナノ構造体に結合することが期待できる。しかし、分子量が２００以上１００００以下のペプチドに限定するものではなく、分子量が１０００００を超える抗体をはじめ、様々な分子を想定することができる。特定の分子に結合する合成ペプチドや、ペプチドホルモン等様々なペプチドおよびそれらの誘導体も、前記生物学的機能性分子として挙げることができる。
【００６８】
また、複数の生物学的機能性分子を結合させることで、診断・治療用途での様々な応用が考えられる。例えば、標的に結合させるための抗体やアプタマーとともに、蛍光剤や色素等を結合させた多機能金属ナノ構造体は、内視鏡を用いた診断・治療に威力を発揮する。また、標的分子とともに、抗がん剤等の化合物等を結合させることにより特定の細胞を標的とした治療も可能となる。
【００６９】
診断・治療用途に用いる場合には、例えば、がん幹細胞表面マーカーであるＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule）に親和性のあるペプチドを生物学的機能性分子として、コロイド安定化機能性分子を結合させた金属ナノ構造体に結合させる。この多機能金属ナノ構造体を生体内に投与すると、がん病巣部位に当該多機能金属ナノ構造体が結合する。これによって、Ｘ線検査などの画像診断装置でがん病巣部位が金ナノコロイドで描出され、診断が可能となる。
【００７０】
また、近年利用増加が著しい内視鏡手術においては、胃の粘膜がんに対して、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＤ）や内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）が第一選択となっている。また、大腸のポリープに対しても内視鏡的切除術（ポリペクトミー）が一般的治療として広く行われている。これらの診断または治療の際に、当該多機能金属ナノ構造体にさらに蛍光色素を結合させ、内視鏡下で術野領域に広く投与して蛍光励起レーザーを照射すると、がん病巣部位を蛍光部位として認知できるようになり、手術切除部位を特定することができる。
【００７１】
さらに、治療を目的とした利用方法として、当該多機能金属ナノ構造体を投与後に、マイクロ波や光などの電磁波、超音波など、何らかの外的物理エネルギーを注入することによって金属ナノ構造体を励起し、患部に局所的に熱をかける方法がある。エネルギー励起としては、電子遷移、格子振動、ナノ構造体の振動・回転など運動に関するエネルギー等、当該ナノ構造体に固有なエネルギー準位であれば、あらゆるエネルギー準位、またそれらの組み合わせを利用することができる。例えば、金ナノ粒子の場合、局在化した電子の集団振動モードに起因するプラズモン共鳴を有するので、この共鳴エネルギーに対応する波長のレーザー光などを照射することで、金ナノ粒子を選択的にエネルギー励起する。その結果、電子‐格子相互作用、格子‐格子相互作用を通じて変換された熱エネルギーによって金ナノ粒子周辺は高温となる。４２°Ｃ以上ではがん細胞は死滅することから、いわゆるがんの温熱療法に利用することができる。
【００７２】
あるいは、さらに抗がん剤を結合させ、がん幹細胞を標的としたドラッグデリバリーシステムとしてがん治療に用いることもできる。この場合、がん組織の新生血管は、一般に毛細血管に比べて脆弱で物質透過性が高いことから、当該多機能金属ナノ構造体はがん組織に集積されやすい。また、金属ナノ構造体に結合させた抗がん剤は、一定の質量を有し、タンパク質相互作用が少なくなるために、標的部位以外の細胞や組織と反応することや体内に広く拡散することが抑えられる。そのため標的部位への集積が行われることから、結果として副作用や薬効の希釈が抑制される効果も期待できる。当該多機能金属ナノ構造体が細胞内に取り込まれた後、細胞内に薬剤を放出させるためには、薬剤を金属ナノ構造体に結合させるリンカーに、カテプシンなどの細胞内プロテアーゼで切断されるアミノ酸配列を含むリンカーを用いることにより可能となる。
【００７３】
また、がんの診断・治療に使用する場合、がん組織の新生血管の物質透過性は正常血管のそれより大きいことから、金属ナノ構造体のサイズを調整することにより、正常組織へのデリバリーよりもがん組織へのデリバリーの方を多くすることができ、結果として副作用が少なく、有効性が大きい手法を開発することができる。
【００７４】
ＥｐＣＡＭ以外にも、ＨＥＲ２ (human EGFR-related 2)、ＭＵＣ１(mucin core protein 1)、ＦＧＦＲ２ (fibroblast growth factor receptor 2)、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ１３３、ＣＤ８１、ＶＥＧＦＲ (vascular endothelial growth factor receptor)、ＩＧＦ−１Ｒ (Insulin-like growth factor 1 receptor)、ＥＧＦＲ(Epidermal growth factor receptor)、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１１受容体、ＩＬ−４受容体、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor）受容体、ケモカイン受容体、Ｅ−カドヘリン、インテグリン、Claudin、Ｆｚｄ１０、プレクチン（Plectin）、ＴＡＧ−７２、Prestin、Clusterin、Nestin、Slectin、Tenascin C、Vimentin等の分子は特定のがん細胞、あるいはがん幹細胞で発現することが知られている。したがって、これら分子に結合する抗体、アプタマー等を本発明の金属ナノ構造体に結合させることによって、診断、治療に有用に用いることができる。
【００７５】
さらに核酸医薬領域においては、細胞内に特定の核酸を送達する技術が必要であり、このデリバリーシステムのキャリヤーとしても利用することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡのほか、アンチセンス核酸やデコイ核酸などの核酸分子を、リンカーによって本発明の金属ナノ構造体に結合させ、細胞内に送達することによって、診断、治療に有用に用いることができる。
【００７６】
また、生物学的機能性分子の末端にアミノ酸が存在することにより、安定して金属ナノ構造体に結合することができるが、当該アミノ酸がチオール基を有すること、すなわちシステインである必要はない。
【００７７】
本発明の多機能金属ナノ構造体を利用する場合の製剤化としては、分散液として、又は凍結乾燥品として提供することができる。分散液の形態であれば、すぐに使用することが可能であるし、凍結乾燥品であれば、長期保存が可能となる。
【００７８】
さらに、コロイド安定化機能性分子によって部分的に被覆された金属ナノ構造体と、生物学的機能性分子を結合させるための緩衝液を含むキットを提供する。部分的にコロイド安定化機能性分子によって被覆された金属ナノ構造体を用いることによって、使用者が所望の生物学的機能性分子を結合させて用いることが可能となる。本発明を実施例を交えながら以下詳細に説明する。
【実施例】
【００７９】
［実施例１］金属ナノ粒子の表面被覆
（１）第１の機能性分子、コロイド安定化機能性分子による部分的金属ナノ粒子の表面被覆
多機能金属ナノ構造体の核となる金属ナノ粒子のコロイド溶液として、液中レーザーアブレーションで作製された約１５ｎｍの金ナノ粒子のコロイド液、i-colloid Au15（米国IMRA America社製）を用意し、前駆体として用いた。金ナノ粒子の濃度は約２．８ｎＭである。【００８０】
コロイドに含まれる総電解質の濃度としては、不純物イオンが少ない方が好ましく、電気伝導度が２５μＳ／ｃｍ程度以下であることが望ましい。一般的に広く使われているクエン酸還元法などで作られた化学合成製の金ナノ粒子コロイド溶液は、反応副産物等の不純物イオンを多く含むため、その電気伝導度は２００μＳ／ｃｍから３００μＳ／ｃｍあるいはそれ以上である。これらの不純物イオンは、以下の表面被覆工程における金ナノ粒子の表面活性を悪くする可能性があるだけでなく、多量の不純物イオン（電解質）の存在により、コロイド粒子間に働く静電反発力の起源である電気二重層の層厚が薄くなり、結果、分子表面被覆工程で粒子凝集等の問題を招く可能性もある。【００８１】
第１の機能性分子であるコロイド安定化機能性分子としては、ここでは分子量約５０００のチオール化メトキシポリエチレングリコール、具体的にはｍＰＥＧ-ＳＨ、５ｋ（Creative PEGWorks社製）を脱イオン水に溶解して用いた。【００８２】
まず、コロイド安定化機能性分子、すなわちＰＥＧによって、金属ナノ粒子を部分的に表面被覆するために好適なＰＥＧと金ナノ粒子の混合する割合を求める。【００８３】
金ナノ粒子とＰＥＧとの比率を少しずつ変えた混合液を用意し、良く混和した後２４時間静置する。金ナノ粒子表面上にチオール-金の化学結合が形成されることによって、ＰＥＧが金に結合する。【００８４】
金属ナノ粒子の表面をＰＥＧが占有する割合は、動的散乱粒子サイズ測定（ＤＬＳ）における流体力学的粒径変化によって見積もった。具体的にはZetasizer NanoZS（英国Malvern社製）を用いて粒子径を測定し、半径増加量が漸近的に近づいていく値を占有率が１００％の飽和状態であると仮定する。この漸近線に近付いていく割合をナノ構造体表面の被覆率と定義する。【００８５】
図２にＤＬＳで測定した、異なるＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の混合溶液での流体力学的粒子半径の増加を示す。金ナノ粒子に対するＰＥＧの増加とともに、流体力学的粒子半径の増加量は漸近的に１０ｎｍに近付いていくことから、半径増加量１０ｎｍ近傍が占有率１００％に近い飽和領域であると認められる（図２右縦軸で示す。）。図２のグラフにおいて、急激に流体力学的粒子半径が増加を示すＰＥＧ分子数に対する金ナノ粒子数の比の値が６００以下の領域、例えば図２中、矢印で示した１００／１、２００／１、３００／１の点においては、図１に示すＰＥＧによる部分的表面被覆の状態が実現されている。【００８６】
ＰＥＧ分子等のコロイド安定化機能性分子が結合した金属ナノ構造体が、凝集せずに安定して分散体として存在するためには、コロイド安定化機能性分子によって金属表面を約３０％以上被覆することが必要だと考えられる。別の実験では、上記の異なる比率（１００／１、２００／１、３００／１）でｍＰＥＧ-ＳＨ、５ｋを部分被覆したコロイドに対し、例えば、ＲＡＤペプチドの溶液を混ぜた場合、被覆率約３０％に対応する比の値１００／１のコロイドで、粒子凝集による変色が確認されたことから、コロイド粒子の表面を約３０％以上被覆することが必要だと考えられる。【００８７】
次に、コロイド安定化機能性分子の被覆によって、ナノ構造体の凝集がおこりにくくなることを確認した。ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値を１０／１（ＰＥＧ量１０倍）から７５０／１（ＰＥＧ量７５０倍）まで変えて、上記と同様にして金ナノ粒子をＰＥＧで被覆した。図３Ａに示すようにＰＥＧ分子数が金ナノ粒子数に比べ８０倍のときに、約３８％の表面修飾率、２００倍のときに約７４％の表面修飾率であった。【００８８】
ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比を変えて、表面を被覆した金ナノ粒子を次に生理的な塩濃度に近い１０％ＮａＣｌ中に懸濁し、金ナノ粒子の凝集を吸光度で測定した（図３Ｂ）。ＰＥＧ分子数が金ナノ粒子数に比べ８０倍以上で被覆した場合には、金ナノ粒子の凝集が抑えられることが明らかとなった。したがって、金属ナノ構造体の表面が４０％以上被覆されていれば、凝集が抑制された金属ナノ構造体を得ることができる。【００８９】
（２）第２の機能性分子、生物学的機能性分子による金属ナノ粒子の表面被覆
次に、第２の機能性分子である生物学的機能性分子として、ペプチドを結合させた例を示す。ペプチドとしては、アミノ末端に蛍光分子フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を結合させたＥｐＣＡＭ結合ペプチド、ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳＧＧＫ（配列番号１、以下、ＥＰ１１４という。）を用いた。なお、ＥｐＣＡＭはがん細胞でその細胞表面に発現していることが認められている抗原である。【００９０】
コロイド安定化機能性分子であるＰＥＧによって、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１、２００／１、３００／１で部分的に被覆された金ナノ粒子を用意した。次に、混合溶液中の最終的な金ナノ粒子数に対するＥＰ１１４ペプチド数が２０００になるように濃度を調整したＥＰ１１４ペプチド溶液を、ＰＥＧ／金ナノ粒子混合液に加え混合する。余剰の生物学的機能性分子を加えることによって、コロイド安定化機能性分子によって部分的に被覆されている金ナノ粒子の被覆されていない部分を被覆することが可能となる。【００９１】
混合後、１２〜２４時間程度静置することによって、ペプチドをＰＥＧ／金ナノ粒子に結合させることができる。【００９２】
金属ナノ粒子の被覆完了後、遠心分離、透析などの定法を用いて、余剰の機能性分子を除去することができる。【００９３】
ここでは、ペプチドＥＰ１１４によって被覆後、各混合液を遠心分離用チューブに入れ、１６，０００ｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上清を除去後脱イオン水を加え、再度遠心により洗浄後、細胞用培地を加えた。これにより、細胞用培地中に分散されたＥＰ１１４／ＰＥＧ／金ナノ粒子複合体を得た。【００９４】
最終的にどのような溶液中に分散するかは、多機能金属ナノ構造体をどのような目的で使用するかによって、使用者が適宜選択することができるのは言うまでもない。【００９５】
［実施例２］ＥｐＣＡＭ結合ペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体を用いた細胞染色
大腸癌細胞株、ＨＴ２９を用い、細胞への取り込み実験を行った。まず、９６穴タイプのスフェロイド用培養プレート、ＥＺ−ＳｐｈｅｒｅＴＭ（旭硝子株式会社製）を使用して、ＨＴ２９細胞のスフェロイドを形成させた。【００９６】
具体的には、ＨＴ２９、４ｘ１０５細胞を３ｍｌのＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 1:1 Mixture, GIBCO社製）に２０ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ(Miltenyi Biotec社製)、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ−２(Miltenyi Biotec社製)、１／５０量のB-27 supplement×50(GIBCO社製)、１／１００量のPenicillin-Streptomycin Solution×100(和光純薬工業株式会社製)を加えた培地中に懸濁し、懸濁液を各ウェル２００μｌに分注し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７２時間培養した。その後、スフェロイドを含まない、上澄部分１５０μｌを除去し、下部に沈殿している５０μｌ中のスフェロイドに、ＥｐＣＡＭ結合ペプチド（ＥＰ１１４ペプチド、アミノ酸配列は、配列番号１に示す。）、ＥｐＣＡＭに結合しないペプチド（ＥＰ１１４コントロールペプチド、アミノ酸配列は、配列番号２に示す。）により被覆した多機能金属ナノ構造体溶液５０μｌを加え、３７℃で１時間反応した。【００９７】
その後、一部（約２０μｌ）のスフェロイドと金粒子ペプチド複合体をガラスボトムディッシュ（D110300, 松浪硝子工業株式会社製）の上にのせ、倒立型共焦点レーザー顕微鏡(FLUOVIEW FV1000IX81タイプ、オリンパス株式会社製)を使用して、４０倍の対物レンズで４８８ｎｍのレーザーを照射し、Ａｌｅｘａ４８８用のフィルターを用いて観察した。【００９８】
用いたＥｐＣＡＭ結合ペプチド、あるいはコントロールペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体は、実施例１で述べた方法に従い、多機能金属ナノ粒子を作成して用いた。すなわち、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１、２００／１、３００／１で、金ナノ粒子を部分的に被覆した後に、各ペプチド数が金ナノ粒子数に対して２０００になるように混合し、多機能金属ナノ粒子を作成した。【００９９】
図４に示すように、細胞表面のＥｐＣＡＭに多機能金属ナノ粒子が結合し、染色されているのが確認された。ＥｐＣＡＭ結合ペプチドを生物学的機能性分子として用いた場合には、蛍光顕微鏡検出においては、ＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が１００／１（ｂ、ｆ）、２００／１（ｃ、ｇ）、３００／１（ｄ、ｈ）のいずれの場合であっても、同等に検出することができる。なお、図４a、ｅはペプチドを被覆した金ナノ粒子の代わりに、ペプチド単独で細胞と反応させた結果を示している。【０１００】
上記示したように、ＥｐＣＡＭのようにがん細胞で発現している表面抗原に結合するペプチドや抗体を生物学的機能性分子として金属ナノ構造体を被覆することにより、特異的に染色することが可能となる。【０１０１】
［実施例３］プレクチン結合ペプチドにより被覆した多機能金属ナノ構造体を用いた細胞染色
プレクチンは膵管がんのバイオマーカーとして近年報告され、プレクチンに結合するペプチドによって、その局在の検出が行われている（非特許文献３、４）。そこで、プレクチン結合ペプチドを用いて、ペプチドで表面修飾されている金ナノ粒子の結合評価実験を行った。【０１０２】
金ナノ粒子のコロイド液、i-colloid Au15（米国IMRA America社製）とＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨ(NANOCOS社製)をＰＥＧ分子数と金ナノ粒子数の比の値が２００／１になるようにして被覆した。修飾率は約５０％であった。【０１０３】
次に、Ｃ末をアミド化したプレクチン結合ペプチドをペプチド数と金ナノ粒子数の比の値が６００／１になるように調整して被覆した。なお、プレクチン結合ペプチドは、下記のアミノ酸配列のリンカーを付与したものとしていないものの２種類を用意した。【０１０４】
プレクチン結合ペプチド配列
リンカーあり：ＫＴＬＬＰＴＰＧＧＣ（配列番号３）
リンカーなし：ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号４）
上記の比率でペプチドを被覆することにより、ＰＥＧによって被覆されていなかった約５０％の部分が被覆され、金ナノ粒子の表面はほとんど被覆された状態となる。【０１０５】
プレクチンが細胞表面に局在するとされるＭＩＡＰａＣａ２を用いて、プレクチン結合ペプチドで修飾された金ナノ粒子の結合評価実験を行った。【０１０６】
Bio Coat Poly-D-Lisine 8-well スライド（ベクトン・ディッキンソン社製）にＭＩＡＰａＣａ２を２．５×１０４細胞／ｗｅｌｌの濃度で播種し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件化で培養した。【０１０７】
２００μｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、室温で１０分間固定したのち、２５０μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ/ＰＢＳという。）で２回洗浄した。さらに、１％ＢＳＡ/ＰＢＳ中に室温で１時間静置することによりブロッキングし、２０ｎＭのプレクチン結合ペプチドにより修飾した金ナノ粒子を２００μｌ添加し、３時間静置した後、２５０μｌの１％ＢＳＡ/ＰＢＳで２回洗浄を行い、Prolong gold antifade reagent with DAPI special packaging（Invitrogen社製）を用いて封入した。検体は、ＨＲＡナノイメージングアダプター（CytoVIVA社製）を設置した暗視野顕微鏡（DMLP Polarizing microscope, LEICA社製）を用いて観察した。結果を図５に示す。【０１０８】
図５（ａ）はＰＥＧで被覆した金ナノ粒子のみ、（ｂ）はリンカー付きプレクチン結合ペプチドで被覆した金ナノ粒子、（ｃ）はリンカーなしプレクチン結合ペプチドで被覆した金ナノ粒子を用いた結果を示す。これら顕微鏡写真より明らかなように、プレクチン結合ペプチドで修飾していない金ナノ粒子（ａ）に比べ、ペプチドで修飾した金ナノ粒子（ｂ）、（ｃ）では金ナノ粒子による散乱光シグナルが細胞表面に観察される。また、矢印で示したように、細胞間に強いシグナルが観察されるが、プレクチンは細胞外に放出されることが報告されており、細胞外のプレクチンを検出しているものと考えられる。【０１０９】
［実施例４］
本発明によって修飾した金属ナノ構造体のフローサイトメトリーへの適用についても検討を行った。金ナノ粒子のみ、金ナノ粒子にＰＥＧを被覆したもの、実施例３で用いた金ナノ粒子をＦＩＴＣが結合しているＰＥＧ、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆したもの、これにさらにペプチドを結合させたものを用いて蛍光強度を測定した。【０１１０】
サンプルをＯＤ５２０＝１になるように精製水で希釈し、分光蛍光光度計  FP-6500（日本分光株式会社製）を用い、測定条件＝Response：1 sec, Band width(Ex)：５ｎｍ, Band width(Em)：５ｎｍ, Sensitivity：mediumで蛍光を測定した。励起波長は４９５ｎｍで、測定蛍光波長は５１９ｎｍに設定した。【０１１１】
図６に示すように、ブランク（精製水）（１）、ＦＩＴＣが結合していないＰＥＧで被覆したもの（２）では、ほとんど蛍光が観察されないのに対し、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆したもの（３）、ＦＩＴＣ-ＰＥＧ-ＳＨで被覆し、さらにペプチドで被覆したもの（４）は有意に蛍光強度の増強が観察された。【０１１２】
コロイド安定化機能性分子として、ＦＩＴＣが結合しているＰＥＧを用いることによって、どのような生物学的機能性分子で修飾しても蛍光観察を行うことが可能となる。すなわち、用いるペプチド、アプタマー等の生物学的機能性分子毎に標識することなく、コロイド安定化機能性分子が蛍光色素等で標識されているものを用いることによって、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡を用いた検出が可能となる。【０１１３】
また、上記実施例３で示したように、金ナノ粒子による散乱光を観察できることから、暗視野顕微鏡等、散乱光を検出する検出器を用いても結合を確認することができる。【０１１４】
本発明の方法は、上記示してきたようなＥｐＣＡＭやプレクチンだけではなく、生物学的機能性分子として、細胞表面上に発現しているタンパク質等を任意に選択することによって、がん細胞のみならず、様々な細胞を標的として診断、治療に使用することが可能である。【０１１５】
以上、示してきたように、本発明の多機能金属ナノ構造体は、研究、診断、治療目的に任意の抗体、アプタマー等を結合させることによって、多様な用途に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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