(57)【要約】  本発明は、ヒト特定分子に対する分子標的物質又は標的薬の特性や薬理作用や安全性を適切に評価することが可能なトランスジェニック非ヒト動物ならびにその作製方法を提供することを目的とする。  ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が導入され、かつ該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が導入され、かつ該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂからなる群から選択される一以上を含む、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
ヒト特定分子をコードする遺伝子が、該遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターを、宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）にて得られた仮親動物から出生した産仔から、ヒトの特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を選別する工程、
を含む、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
【請求項６】
ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂからなる群から選択される一以上を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターが、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）において、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、染色体ＤＮＡに組み込まれている産仔を選別する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物と同種の他の疾患モデル動物とを交配して得られた、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する疾患モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該疾患モデル非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項１２】
被験物質が、ヒト由来ガンマ鎖Ｆｃ領域のペプチド配列の一部、または全部を有する抗体である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験物質の特性が、ヒト特定分子に対する機能阻害能力、ヒト特定分子に対する結合能力、ヒト特定分子を発現する細胞、組織もしくは器官に対する障害能力、生体内分布、薬効、又は安全性である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの受容体、調節因子、抗原等のヒト特定分子とヒトＦｃγ受容体ファミリーとを発現するトランスジェニック非ヒト動物、ならびに当該トランスジェニック非ヒト動物を用いた、ヒト特定分子と結合する分子標的物質（例えば、ヒトキメラ抗体やヒト化抗体等）の特性や安全性、及び治療効果を実験動物（マウスやラットやウサギ等）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学技術や抗体工学技術の近年の輝かしい進歩は、抗体医薬品に代表されるヒト分子に対する標的薬の作製を可能にした。しかし、ヒト分子に対する標的薬の薬理作用や安全性を非臨床の動物試験で評価しようとした場合、標的分子であるヒト抗原を持たない非ヒト動物（例えばマウス、ラット、ウサギなど）にヒト分子を標的とする抗体等の分子標的薬を投与しても投与した分子標的薬と反応するヒト抗原がないため適切な評価を行うことはできない。したがって、ヒトキメラ抗体やヒト化抗体等の分子標的薬の開発においては、その安全性や治療効果をあらかじめｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験で評価する手段（非臨床試験の手段）が求められている。【０００３】
ヒトゲノムの解読が完了した今日では、抗原となるヒト分子のゲノム情報やゲノム断片等のバイオリソースが容易に入手でき、分子標的薬の代表である抗体医薬品は数百のレベルで開発がなされ熾烈な競争が繰り広げられている。現行の抗体医薬品の原料であるモノクローナル抗体は、抗原（標的分子）に対する特異性が高く、生体内の安定性も高く、毒性が低く、生産方法も共通性があり比較的容易である。また、特異性および結合活性の優れた抗体を一度得たら、多様な修飾を行って活性を増強できる。しかし、その臨床効果は必ずしも充分でなく、投与量も多いため高額な薬剤費を要するという課題がある。この原因に、ヒトの抗原に対する抗体の機能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる適切な動物モデルがなく、病態モデルを用いた非臨床試験による薬剤の評価ができていないことがあげられる。この問題を解決するためには、抗体に代表される分子標的薬の機能をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するための動物モデルの作製が欠かせず適切な動物モデルを用いた評価法が求められている。【０００４】
厚生労働省医薬品食品局の通達「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」について（平成２４年３月２３日薬食審査発０３２３第１号）（非特許文献１）の第１部３．非臨床安全性試験３．３動物種／モデルの選択によれば、「モノクローナル抗体の試験のための適切な動物種は、意図するエピトープを発現し、ヒト組織の場合と類似した組織交差反応性を示すような動物種である。」とあり、「適切な動物種が存在しない場合、ヒト型受容体を発現させたトランスジェニック動物あるいはその動物にとって相同タンパク質等を用いることを検討すべきである。」ことが記載され、トランスジェニック動物を利用する考えが示されている。さらに、「ヒト型受容体を発現したトランスジェニック動物モデルを使用して得られた情報は最も有効なものとなる。」とも述べている。一方、後者のヒト抗原に類似した相同なタンパク質（抗原ホモログ）をもつアカゲザル等の非ヒト霊長類を用いる評価方法を利用する考えも示されるが、非ヒト霊長類を使用する試験は、倫理及び／又は福祉的な観点から動物実験は非常に制限されることに加え、非常に高価で容易に採用できるものではない。そのため、これに変わるトランスジェニック動物を用いた評価方法が求められている。【０００５】
このため、抗体医薬の開発に利用することを目的に、モノクローナル抗体が認識するヒトの抗原や受容体等をマウスで発現させたトランスジェニックマウスの作製が多数報告されている。一方、小型のプラスミドタイプの発現ベクターを利用して遺伝子導入した場合は、導入した遺伝子の所望する発現量や導入した遺伝子本来の精密な発現制御を、作出したトランスジェニックマウスで再現することは難しい。そこで、ヒト抗原やヒト受容体等をコードする遺伝子と共に、その遺伝子の発現制御配列とを一緒に含むヒトゲノム由来の巨大なＤＮＡ断片を発現ベクター（ＢＡＣ発現ベクター）として使用して受精卵に導入して作製したトランスジェニックマウス等が報告されており、当該手法によりヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニックマウスが作製されている（特許文献１、非特許文献２）。このトランスジェニックマウスは、血液、骨髄、脾臓、リンパ節及びパイエル板の成熟、プレＢ及び未成熟細胞上にＣＤ２０を発現し、これらの細胞上のヒトＣＤ２０の発現レベルはヒト細胞上のＣＤ２０の発現レベルの約４０％であった（特許文献１）。また、トランスジェニックマウスの脾臓やＢ細胞上のヒトＣＤ２０の発現レベルはヒトでの発現レベルに比べて〜７倍低いものであった（非特許文献２）。また、ヒトの免疫系を再現する非ヒト動物として、ヒトＣＤ１６とそのアクセサリー分子を共発現させるようにゲノム改変したノックインマウスが報告されている（特許文献２）。このようにして作製されたヒト抗原を発現するトランスジェニックマウスを用いてヒト抗原に対する抗体がｉｎ  ｖｉｖｏでも薬理活性を示すことが報告された（非特許文献２、非特許文献３）。【０００６】
しかしながら、上記のヒト抗原を発現するトランスジェニックマウスを用いて抗体医薬品のｉｎ  ｖｉｖｏ評価を行った際に、臨床投与量をはるかに超えた投与量が必要とされる場合があり評価の妥当性に問題を生じることがあった（非特許文献２、および非特許文献４）。【０００７】
以上のとおり、抗体医薬を始めとする分子標的薬の開発では、薬剤の機能や有効性や安全性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる適切な動物モデルがなく、病態モデルを用いた非臨床試験の手段もないため、動物モデルを用いて薬剤の適切な評価を行うことが可能な新たな手法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００６−５１７０９６号公報
【特許文献２】特開２００８−１５４４６８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価」について、薬食審査発０３２３第１号  平成２４年３月２３日
【非特許文献２】Ａｈｕｊａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３３５１−３３６１．
【非特許文献３】Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１２：４１７０−４１７７．
【非特許文献４】Ｈｕａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＮＡＳ  １０７：４６５８−４６６３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒト特定分子に対する分子標的物質又は標的薬の特性や薬理作用や安全性を適切に評価することが可能なトランスジェニック非ヒト動物ならびにその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ヒト特定分子をコードする遺伝子とヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を、宿主となるマウスやラットやウサギ等の非ヒト動物に導入し、ヒト特定分子およびヒトＦｃγ受容体ファミリーを発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製し、当該トランスジェニック非ヒト動物を利用することによって、ヒト特定分子に対する分子標的物質又は標的薬の特性や薬理作用、ならびに安全性等を、本来のヒト生体内に近い環境下にて評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を含む。
［１］  ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が導入され、かつ該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
［２］  ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂからなる群から選択される一以上を含む、［１］のトランスジェニック非ヒト動物。
［３］  ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、［１］又は［２］のトランスジェニック非ヒト動物。
［４］  ヒト特定分子をコードする遺伝子が、該遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現される、［１］〜［３］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物。
［５］  以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターを、宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）にて得られた仮親動物から出生した産仔から、ヒトの特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を選別する工程、
を含む、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
［６］  ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂからなる群から選択される一以上を含む、［５］の方法。
［７］  ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、［５］又は［６］の方法。
［８］  ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターが、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含む、［５］〜［７］のいずれかの方法。
［９］  工程（ｂ）において、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、染色体ＤＮＡに組み込まれている産仔を選別する、［５］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］  ［１］〜［４］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
［１１］  ［１］〜［４］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物と同種の他の疾患モデル動物とを交配して得られた、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する疾患モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該疾患モデル非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
［１２］  被験物質が、ヒト由来ガンマ鎖Ｆｃ領域のペプチド配列の一部、または全部を有する抗体である、［１０］又は［１１］の方法。
［１３］  被験物質の特性が、ヒト特定分子に対する機能阻害能力、ヒト特定分子に対する結合能力、ヒト特定分子を発現する細胞、組織もしくは器官に対する障害能力、生体内分布、薬効、又は安全性である、［１０］〜［１２］のいずれかの方法。【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-093445号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ヒト特定分子に対する分子標的物質又は標的薬の特性や薬理作用、ならびに安全性等をより高感度に、かつ適切に評価することが可能なトランスジェニック非ヒト動物ならびにその作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターを含むＢＡＣ発現ベクターの模式図を示す。
【図２】図２はマウスＣＤ２０遺伝子座を含むＢＡＣクローンの模式図を示す。
【図３】図３はヒトＣＤ２０遺伝子座を含むＢＡＣクローンの模式図を示す。
【図４】図４はヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの構築方法を示す模式図を示す。
【図５】図５はＢａｌｂ／ｃマウスより得られた、ＣＤ２０ヒト抗原マウス（ｈｕＣＤ２０／ｈｕＦｃγＲ）、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ２０／−）の各系統における、ヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞（上段）及びヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現性のＮＫ細胞（下段）の検出結果を示す。上段の各パネルにおいて縦軸はＰＥ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０を示し、横軸はＦＩＴＣ−ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（Ｂ細胞）を示し、下段の各パネルにおいて縦軸はＰＥ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１６（ＦＣγＲ）を示し、横軸はＦＩＴＣ−ｐａｎｋＮＫ（ＮＫ細胞）を示す。各抗原を示す各細胞は円で囲まれた領域に検出されている。
【図６】図６はＣ５７ｂｌ／６ＪＪｃｌマウスより得られた、ＣＤ２０ヒト抗原マウス（ｈｕＣＤ２０／ｈｕＦｃγＲ）、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ２０／−）の各系統における、ヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞（上段）及びヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現性のＮＫ細胞（下段）の検出結果を示す。上段の各パネルにおいて縦軸はＰＥ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０を示し、横軸はＦＩＴＣ−ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（Ｂ細胞）を示し、下段の各パネルにおいて縦軸はＰＥ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ１６（ＦＣγＲ）を示し、横軸はＦＩＴＣ−ｐａｎｋＮＫ（ＮＫ細胞）を示す。各抗原を示す各細胞は円で囲まれた領域に検出されている。
【図７】図７は治療用の各種抗ＣＤ２０抗体医薬を投与されたＣＤ２０ヒト抗原マウスにおける脾臓Ｂリンパ球数の測定結果を示す。
【図８】図８は治療用の各種抗ＣＤ２０抗体医薬を投与されたＣＤ２０ヒト抗原マウスにおける脾臓Ｂリンパ球数の経時的な測定結果を示す。
【図９】図９は治療用の各種抗ＣＤ２０抗体医薬を投与された、（Ａ）ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウス（１０＿８系統（ｈｕＣＤ２０＋／ｈｕＦｃγＲ−））および（Ｂ）ＣＤ２０ヒト抗原マウス（９＿６系統（ｈｕＣＤ２０＋／ｈｕＦｃγＲ＋））における脾臓Ｂリンパ球数の測定結果を示す。各グラフは、コントロール群における脾臓Ｂリンパ球数の値を１００％とする相対値にて示す。
【図１０】図１０はＣＤ２０ヒト抗原マウスと遺伝子改変原発性胆汁性肝硬変モデルマウスとを交配して得られたＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスに治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与した後の、末梢血液中のＢリンパ球数の経時的な測定結果を示す。
【図１１】図１１は治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与された、前記ＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスの肝臓に浸潤した、（Ａ）総リンパ球数、（Ｂ）ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞数、及び（Ｃ）ＣＤ４４高発現ＣＤ８陽性活性化細胞傷害性Ｔ細胞数、の測定結果を示す。
【図１２】図１２は治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与された、前記ＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスの肝臓における実質域炎症の（Ａ）悪化度、（Ｂ）悪化頻度、及び（Ｃ）悪化スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．トランスジェニック非ヒト動物
本発明において「ヒト特定分子」とは、ヒト細胞にて発現されるタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの変異体が挙げられる。好ましくは、ヒト特定分子とは分子標的薬（例えば抗体医薬）等の標的となり得る任意のヒト抗原分子である。さらに好ましくはヒト特定分子とはヒトの疾患や疾患症状に関与する、すなわち、疾患や疾患症状の素因となり得るものである。ここで「変異体」とは、元のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ元のタンパク質又はポリペプチドの活性もしくは機能を保持するタンパク質又はポリペプチド、あるいは、元のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列とその一部又は全体が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の配列同一性を有し、かつ元のタンパク質又はポリペプチドの活性もしくは機能を保持するタンパク質又はポリペプチドを意味する。アミノ酸配列の配列同一性は公知のアミノ酸配列の比較方法によって求めることができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施することができる。
【００１７】
好ましくは本発明において「ヒト特定分子」とはヒトＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）、ＣＤ３、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＧＦ−ＩＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２：ＨＥＲ２）、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ３２６、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４：ＣＴＬＡ４）、ＧＭ−２、細胞間接着分子（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １：ＩＣＡＭ１）、癌抗原１２５（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  １２５：ＣＡ１２５）、ＣＤ５２、細胞死受容体１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１；ＰＤ−１）、Ｂ細胞活性化因子（Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＡＦＦ）、ＣＣケモカイン受容体４（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ４：ＣＣＲ４）、血管内皮細胞増殖因子受容体３（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３：ＶＥＧＦＲ−３）、ＣＤ２４８、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  １０：ＣＸＣＬ１０）、ＣＣモチーフケモカイン２（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ２：ＣＣＬ２）、インターロイキン６受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＬ−６Ｒ）、ＧＤ２、Ｄｅｌｔａ様リガンド４（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ４：ＤＬＬ４）、ＣＣケモカイン受容体５（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ５：ＣＣＲ５）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ７２：ＴＡＧ−７２）、ＣＤ３８、細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １：ＰＤ−Ｌ１）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチンドメイン３（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕｃｉｎ−３：ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３：ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞-Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＩＴＩＭ  ｄｏｍａｉｎ：ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ３３、ＣＤ１３７、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２：ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５等が挙げられ、特に好ましくはヒトＣＤ２０である。
【００１８】
本発明において「ヒトＦｃγ受容体ファミリー」とは、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等の所謂、ヒトエフェクター細胞と呼ばれる細胞にて発現される一連のヒトＦｃγ受容体を意味する。ヒトＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂの５つのファミリーから成り、このうちＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂは活性化型Ｆｃγ受容体と呼ばれ、抗原とＩｇＧ抗体との結合体（ＩｇＧ免疫複合体）と結合してエフェクター細胞を活性化する。一方、ＦｃγＲＩＩｂは抑制型Ｆｃγ受容体と呼ばれ、ＩｇＧ免疫複合体と結合してエフェクター細胞の活性を抑制する。本発明において「ヒトＦｃγ受容体ファミリー」には、上記ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ならびにＦｃγＲＩＩｂからなる群から選択される一又は複数（例えば、２個、３個、４個）が含まれるが、好ましくはＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ならびにＦｃγＲＩＩｂが含まれる。これらのＦｃγ受容体をコードする遺伝子群はヒト１番染色体の１ｑ２３にクラスターを形成して存在する。また、本発明において「ヒトＦｃγ受容体ファミリー」にはその変異体が含まれる。ここで「変異体」とは、ヒトＦｃγ受容体ファミリーに含まれる一又は複数（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個）のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ元のタンパク質又はポリペプチドの活性又は機能を保持するタンパク質又はポリペプチド、あるいは、元のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列とその一部又は全体が８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の配列同一性を有し、かつ元のタンパク質又はポリペプチドの活性又は機能を保持するタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００１９】
本発明において、ヒト特定分子およびヒトＦｃγ受容体ファミリーのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに開示されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＢＣ００２８０７として登録されており、ヒトＦｃγ受容体ファミリーは、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ならびにＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列がＧｅｎＢａｎｋにＢＣ０１９９３１、ＢＣ０１７８６５、ＢＣ１３７３９７、ＢＣ１２８５６２、及びＢＣ０３１９９２としてそれぞれ登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。
【００２０】
本発明において「非ヒト動物」とは、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられる。好ましくは、遺伝子工学的な技術基盤の整備がなされて容易に利用できるマウスやラットである。例えば、本発明において、非ヒト動物がマウスである場合はＣ５７ＢＬ／６やＢＡＬＢ／ｃを、非ヒト動物がラットである場合はウィスターやスプラーク・ダウリーなどを使用することができる。
【００２１】
本発明において「非ヒト動物のホモログ遺伝子」とは、ヒト特定分子又はヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子と進化的な起源を同じくする非ヒト動物が有する遺伝子であり、当該ヒト特定分子又はヒトＦｃγ受容体ファミリーと構造や機能が同じ又は類似するタンパク質をコードする非ヒト動物の遺伝子を意味する。一般的に、ヒト遺伝子とその非ヒト動物のホモログ遺伝子とは高い配列同一性、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する。例えば、ヒトＣＤ２０のマウスのホモログ遺伝子は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋにＢＣ０２８３２２として登録されており、またヒトＦｃγ受容体ファミリーのマウスのホモログ遺伝子は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋにＢＣ０３８０７０、およびＢＣ０２７３１０として登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。
【００２２】
本発明において「トランスジェニック非ヒト動物」には、下記手法により作製されたトランスジェニック非ヒト動物及びその系統だけでなく、その子孫、ならびにそれらの一部が含まれる。ここで「子孫」とは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物及びその系統と交配して得られた非ヒト動物であって、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有し、かつ当該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び当該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する非ヒト動物を意味する。また「一部」とは本発明のトランスジェニック非ヒト動物及びその系統ならびにそれらの子孫に由来する器官、組織、細胞を意味する。
【００２３】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当該分野で通常用いられているＢＡＣトランスジェニック非ヒト動物の標準的な作出方法により製造することができる。すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、概ね下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法により作製できる。
（ａ）ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターを、宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｂ）工程（ａ）にて得られた仮親動物から出生した子孫から、ヒトの特定分子をコードする遺伝子ならびにヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を選別する工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）にて選別したトランスジェニック非ヒト動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。
【００２４】
以下、各工程について説明する。
【００２５】
前記工程（ａ）において、ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣ、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子含むＢＡＣとは、ヒト特定分子をコードするＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードするＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含む大腸菌人工染色体（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：ＢＡＣ）であり、各ＢＡＣにはヒト特定分子をコードするＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードするＤＮＡ又はゲノムＤＮＡと共に、その転写、翻訳、安定性に影響を与える配列（５’フランキング領域、及び／又は、３’フランキング領域）を含む。
【００２６】
ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣ、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を含むＢＡＣは、公知のヒトゲノムデータベース（例えば、カリフォルニア大学サンタクララ校が公開するデータベース）を検索し、所定の遺伝子が含まれるヒトＢＡＣクローンを選択・利用することができる。ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣは、異なるヒト特定分子をコードする遺伝子をそれぞれ含む複数のヒトＢＡＣクローンを用いても良い。
【００２７】
本発明においては、得られた各ヒトＢＡＣクローンをＢＡＣ発現ベクターとして使用することができるが、好ましくは宿主となる非ヒト動物のホモログ遺伝子を含むＢＡＣクローンにおける当該ホモログ遺伝子をヒトＢＡＣクローンの所定の遺伝子で置換することにより作製された発現ベクター（以下、「組換えＢＡＣ発現ベクター」と記載する）を利用する。当該組換えＢＡＣ発現ベクターを介して非ヒト動物に導入されたヒトＢＡＣクローン由来のヒト遺伝子は、非ヒト動物内において、当該ホモログ遺伝子の発現制御機構にしたがって発現され得る。非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現は、対応するヒト遺伝子のヒト生体内における発現と対応関係がみられ（すなわち、対応するヒト遺伝子がヒト生体内で発現する部位（器官や組織）は、非ヒト動物生体内でそのホモログ遺伝子が発現する部位（器官や組織）に対応する）、したがって、導入されたヒト遺伝子はホモログ遺伝子の発現制御機構の制御の下、非ヒト動物において本来のヒト生体内に近い環境下（器官や組織）において発現され得る。
【００２８】
組換えＢＡＣ発現ベクターの作製に際して、非ヒト動物のホモログ遺伝子を含むＢＡＣクローンは、公知のヒトゲノムデータベース（例えば、カリフォルニア大学サンタクララ校が公開するデータベース）を検索し、所定のホモログ遺伝子が含まれる非ヒト動物のＢＡＣクローンを選択・利用することができる。宿主となる非ヒト動物において該当するホモログ遺伝子のゲノム配列を含むＢＡＣクローンが複数存在している場合は、５’フランキング領域、及び／又は、３’フランキング領域を長くカバーしているＢＡＣクローンを選ぶことにより、最終的なトランスジェニック非ヒト動物において、導入したヒト遺伝子のより正確な発現を実現することができ好ましい。
【００２９】
ヒトＢＡＣクローンの所定の遺伝子と、対応する非ヒト動物のホモログ遺伝子との置換は、非ヒト動物のＢＡＣにおいて当該ホモログ遺伝子の開始コドンから停止コドンをコードする領域を正確に除去して、そこにヒトＢＡＣクローンの所定の遺伝子の開始コドンから停止コドンをコードする領域を挿入することにより行うことができる。組換えＢＡＣ発現ベクターの作製は、例えば、欠損型ラムダプロファージを使用したＲｅｄ  ｓｙｓｔｅｍによるＢＡＣ相同組み換え方法を利用することができる。組換えＢＡＣ発現ベクターを作製する上で、組換えの過程で挿入される大腸菌由来の抗生剤耐性遺伝子などを痕跡なく除去することが好ましい。
【００３０】
本発明においては、少なくともヒト特定分子をコードする遺伝子は、組換えＢＡＣ発現ベクターの形態であることが好ましい。
【００３１】
ＢＡＣ発現ベクター（及び組換えＢＡＣ発現ベクター）は精製された形態であることが好ましい。ＢＡＣ発現ベクターの精製は、例えば、核酸を精製するための一般的な手法を用いて行うことができ、例えば、適当な制限酵素により直鎖化したＢＡＣ発現ベクターをパルスフィールド電気泳動によって分離させ、電気溶出でＢＡＣ発現ベクターを精製することができる。
【００３２】
各ＢＡＣ発現ベクターを宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入する方法は、例えば、交配後間もない雌の卵管を洗浄して前核期受精卵を採取し、精子または卵子由来の前核、好ましくは雄性前核にマイクロインジェクション法によりＢＡＣ発現ベクターを直接注入する方法（いわゆる、マイクロインジェクション法）により行うことができる。各ＢＡＣ発現ベクターは同時に注入されてもよいし、逐次注入されてもよい。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
【００３３】
前記工程（ｂ）において、工程（ａ）で受精卵を移植した動物が産んだ子孫からのトランスジェニック非ヒト動物の選別は、ヒト特定分子をコードする遺伝子およびヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、得られた産仔の染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かを検出することにより行うことができる。当該検出は常法にしたがって行うことができ、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンブロット法またはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによって行うことができる。
【００３４】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で選別したトランスジェニック非ヒト動物（ファウンダー）から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、ヒトの特定分子をコードする遺伝子が組み込まれた動物と、野生型動物（マウスのＣ５７ＢＬ／６やＢＡＬＢ／ｃ、あるいは、ラットのウィスター、スプラーク・ダウリーなど）との戻し交配をする方法があげられる。
【００３５】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、同種野生型動物と異なり、ヒト特定分子と相互作用するあらゆる高分子、低分子化合物を投与して、生物反応を評価できる動物であり、分子標的医薬の薬効評価、安全性評価を始めとする分子標的治療の伸展に大きく貢献しうるモデル動物となり得る。近年、抗体医薬の薬理活性の発揮にはエフェクター活性が重要視されており、当該活性を含めた分子標的医薬の薬効評価及び安全性評価等が求められている。一方、従来公知のヒト抗原を発現するトランスジェニックマウス（Ａｈｕｊａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｈｕａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０、上掲）はヒトＦｃγ受容体を持っていないことから、投与された抗体医薬はそのエフェクター活性を十分に発揮することができず、その薬効評価及び安全性評価等において妥当性を欠く場合がある。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトＦｃγ受容体ファミリーを有することによりエフェクター活性も含めた生物反応を再現することが可能であり、投与された抗体医薬を本来のヒト生体内に近い環境下にて評価することを可能とする。
【００３６】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製は、マイクロインジェクション法を用いて行うことができ、従来公知のトランスジェニック非ヒト動物の作製において一般的に用いられる遺伝子ターゲティング法の様な煩雑な操作を必要としない。このため、非常に簡便かつ迅速に目的のトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【００３７】
さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、同種の他の疾患モデル動物と交配して、ヒト特定分子およびヒトＦｃγ受容体ファミリーを発現する、疾患モデル非ヒト動物を得ることができる。「他の疾患モデル動物」としては、例えば、Ｉ型糖尿病、自己免疫疾患（関節リウマチ、ループス腎炎、全身性エリトマトーデスなど）等の公知のモデル動物（例えばＮＯＤマウス（Ｉ型糖尿病モデルマウス））が挙げられる。
【００３８】
そして、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製に際して、ヒト特定分子のアミノ酸配列にアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異を加えた遺伝子（変異型）を利用することにより、変異型のヒト特定分子を発現させることも可能である。このことから、分子標的医薬に対して高感受性または耐性に関するヒト特定分子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作出することも可能である。たとえば、分子標的医薬に対して耐性に関する、ヒト特定分子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＤＤＲ２等）の変異型を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作出すれば、当該トランスジェニック非ヒト動物を利用することにより、その耐性を有するモデル非ヒト動物に対しても感受性を示す分子標的医薬の創製に利用することができる。本発明においては、このような変異型のヒト特定分子をヒトＦｃγ受容体ファミリーと共に発現するトランスジェニック非ヒト動物も提供することができる。
【００３９】
２．スクリーニング／評価方法
（２−１）特性評価方法
本発明は、下記工程を含む被験物質の特性評価方法を提供する。
（ａ）上記本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した前記トランスジェニック非ヒト動物の生体内における被験物質の特性を評価する工程。
【００４０】
前記（ａ）において、被験物質としては、いかなる分子標的物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ヒト特定分子に対する抗体、アプタマー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、または微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分、あるいはこれらの化合物の２種以上の混合物などがあげられ、また、被験物質にはこれらの一又は複数の成分を有効成分とする薬剤も含めることができる。例えば、本発明において被験物質として、抗体を好適に利用することができる。抗体はポリクローナル抗体やモノクローナル抗体であってもよく、また、ヒトキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。
【００４１】
前記被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内等の全身投与、あるいは標的細胞付近への局所投与等があげられる。
【００４２】
前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。
【００４３】
前記工程（ｂ）において、被験物質の特性としては例えば、ヒトの特定分子に対する結合能力、ヒトの特定分子に対する機能阻害能力、ヒトの特定分子を発現する細胞、組織もしくは器官に対する障害能力、生体内分布などが挙げられる。
【００４４】
特性の評価方法としては、タンパク質又は核酸の定量に用いられる一般的な手法を用いることができ、例えば、被験物質投与前後の本発明のトランスジェニック非ヒト動物における所定の器官、又は組織を採取して、当該器官、又は組織におけるヒト特定分子もしくはそれをコードする遺伝子、又は当該ヒト特定分子が関与するシグナルカスケードの下流に存在する分子もしくはそれをコードする遺伝子の発現量や被験物質の含有量をフローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等を用いて定量し、被験物質投与前後における当該発現量や含有量の変化を分析する方法が挙げられる。また、これらの発現量や含有量の変化を分析することに加えて、又は代えて、ＥＬＩＳＡ法でヒト特定分子に対する抗体の力価を定量する方法や、免疫沈降にてヒト特定分子のリン酸化の増強又は抑制や下流シグナルの増強又は抑制をタンパク質レベルで分析する方法等が挙げられる。
【００４５】
（２−２）スクリーニング方法
本発明は、下記工程を含む疾患の治療候補物質のスクリーニング／評価方法を提供する。
（ａ）上記本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した前記トランスジェニック非ヒト動物における疾患部の程度と、被験物質を投与しない対照における疾患部の程度とを比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、より望ましい薬効を持つ又は持つと予想される被験物質を選択する、あるいは、被験物質の薬効／安全性を評価する、工程。
【００４６】
前記（ａ）において、被験物質及びその投与方法は、上記特性評価方法に記載されたものと同様である。
【００４７】
前記工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物における疾患部の程度を調べる方法としては、上記特性評価方法に記載された分析方法を用いることができる。被験物質を投与しない対照動物についても同様に調べることができる。
【００４８】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、ヒト特定分子の機能や活性を増強又は阻害する被験物質を選択する、あるいは、被験物質の薬効／安全性を評価する。選択／評価する基準は、被験物質を投与していない対照動物の結果を指標にすればよい。
【００４９】
このようにして評価又は選択された被験物質は、ヒト特定分子の機能や活性の増強又は抑制に起因する疾患を改善させる作用を有するものであり、当該疾患の治療候補薬となりうる。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、下記工程を含む自己免疫疾患の治療候補物質のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）ヒトＦｃγ受容体ファミリーおよびヒト特定分子としてヒトＣＤ２０を発現する上記本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質であるヒトＣＤ２０を標的とする抗体を投与する工程、
（ｂ）前記抗体を投与した前記トランスジェニック非ヒト動物における、ヒトＣＤ２０を発現するリンパ球を採取してフローサイトメトリーで評価する、及び／又は、血清を採取してＥＬＩＳＡ法で自己抗体の力価を定量する、及び／又は、ウェスタンブロット、免疫沈降にてヒト抗原のリン酸化抑制や下流シグナルの抑制をタンパク質レベルで確認し、抗体を投与しない対照における結果と比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、リンパ球の活性化を抑制し、自己抗体の産生を抑制し得る抗体を自己免疫疾患の治療候補物質として選択する工程。
【００５１】
また、より具体的には、本発明は、下記工程を含む、公知の分子標的医薬に対して耐性を有する疾患の治療候補物質のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）公知の分子標的医薬（ゲフィチニブ、エルロチニブ、セルメチニブ、アファチニブ、ネラチニブ、ベムラフェニブ、ダサチニブ、イマチニブ等）に対する耐性に関与する、ヒト特定分子（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＨＥＲ２、ＢＲＡＦ、ＤＤＲ２等）の変異型およびヒトＦｃγ受容体ファミリーを発現するトランスジェニック非ヒト動物に被験物質及び当該分子標的医薬を投与する工程、
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における変異型ヒトの特定分子を発現する器官又は組織を採取して、そこに発現する変異型ヒトの特定分子もしくはそれをコードする遺伝子、あるいは当該ヒト特定分子が関与するシグナルカスケードの下流に存在する分子又はそれをコードする遺伝子の発現量を遺伝子レベル及び／又はタンパク質レベルで定量するか、当該ヒト特定分子に対する抗体の力価を定量し、被験物質を投与しない対照における定量結果と比較する工程、ならびに
（ｃ）前記比較結果に基づいて、分子標的医薬に対する感受性を増強し得る被験物質を前記疾患の治療候補物質として選択する工程。
【００５２】
このようにして選択された被験物質は、前記変異型のヒト特定分子の機能や活性の増強又は抑制に起因する疾患を改善させる作用を有するものであり、公知の分子標的医薬に対して耐性を有する疾患の治療候補物質となりうる。
【００５３】
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら制限されるものでない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターを含むＢＡＣの選択
ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０１９９３１、ＢＣ０３１９９２、ＢＣ１３７３９７、ＢＣ０１７８６５及びＢＣ１２８５６２）をもとにしてＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを利用してヒトゲノム配列を検索し、これらすべてのヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子クラスターが包含されるＢＡＣクローンを探索した。その結果、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ遺伝子の全てのゲノムＤＮＡ配列が含まれている１７９．６ｋｂのサイズのＲＰ１１−９２５Ｄ６を同定、入手し（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｓ  Ｃｏ．）、これをヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターとした（図１）。【００５５】
実施例２：ヒトＣＤ２０、およびマウスＣＤ２０遺伝子のゲノム配列を含むＢＡＣの選択
マウスＣＤ２０遺伝子のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０２８３２２）をもとにしてＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを利用してマウスゲノムＤＮＡ配列を検索したところ、マウスＣＤ２０遺伝子は１９番染色体の１９８．１９ｃＭ領域に存在することがわかった。マウスＣＤ２０遺伝子のｃＤＮＡ配列とマウスゲノム配列を並べたところ、マウスＣＤ２０遺伝子のコード領域も１５ｋｂにわたるゲノム配列に７個のエキソンでコードしていることが明らかになった。【００５６】
次に、マウスＣＤ２０遺伝子座をコードするＢＡＣクローンを探索したところ、マウスＣＤ２０遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列とともに、５’上流の１１１ｋｂのゲノム配列、および３’下流の８３ｋｂのゲノム配列を含む、１９番染色体の２０９．９ｋｂがカバーされているＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１１７Ｈ１９（図２）を同定・入手した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｓ  Ｃｏ．）。以上の遺伝子情報から、この２０９．９ｋｂのＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１１７Ｈ１９にはＣＤ２０遺伝子をドライブする全ての発現制御配列が含んでいると考えることができる。このクローンを利用してヒトＣＤ２０遺伝子の発現ベクターを構築することが合理的であると判断した。【００５７】
一方、ヒトＣＤ２０遺伝子のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ００２８０７）をもとにしてＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを利用してヒトゲノムＤＮＡ配列を検索したところ、ヒトＣＤ２０遺伝子は１１番染色体の１１ｑ１２領域に存在することがわかった。ヒトＣＤ２０遺伝子のｃＤＮＡ配列とヒトゲノム配列を並べたところ、ヒトＣＤ２０遺伝子のコード領域は１４ｋｂにわたるゲノム配列に８個のエキソンでコードしていることが明らかになった。次に、ヒトＣＤ２０遺伝子座をコードするＢＡＣクローンを探索したところ、ヒトＣＤ２０遺伝子座の全てのゲノムＤＮＡ配列を含んでいる１７４．６ｋｂのサイズのＢＡＣクローンであるＲＰ１１−７９２Ｈ２（図３）を同定・入手した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｓ  Ｃｏ．）。【００５８】
実施例３：ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの構築
ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの構築に際して、以下に示すヒトＣＤ２０遺伝子のヒトＣＤ２０遺伝子のイントロン４の配列、ヒトＣＤ２０遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのヒトＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列の両端の配列、およびマウスＢＡＣクローンのＣＤ２０遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのマウスＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列３’側末端、５’側末端を大腸菌内での能動型相同組み換え反応のためのキー配列とした。
2016175285.tif 000002
【００５９】
ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの構築方法の模式図を図４に示す。以下、図４の各図面に基づいて説明する。【００６０】
図４（Ａ）：ヒトＢＡＣクローン（ｈｕｍａｎ  ｃｄ２０  Ｗｔ  ＢＡＣ）のヒトＣＤ２０遺伝子のイントロン４にポジティブ／ネガティブセレクションマーカーカセットを挿入するために、ＣＤ２０−Ｈ３配列、Ｒｐｓｌ−ｋａｎ、およびＣＤ２０−Ｈ４配列をタンデムにつないだＤＮＡフラグメントを、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより構築した（ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＢＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）。Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍの能力を有した大腸菌株に、ヒトＣＤ２０遺伝子座を含むヒトＢＡＣクローン（ｈｕｍａｎ  ｃｄ２０  Ｗｔ  ＢＡＣ）とｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＢＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ  ｓｙｓｔｅｍを誘導し、クロラムフェニコール耐性、かつカナマイシン耐性のコロニーをピックアップすることにより、ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＢＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔをＣＤ２０遺伝子座のヒトＣＤ２０遺伝子のイントロン４に挿入した組み換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ  Ｉｎｔｅｒ．１）。【００６１】
図４（Ｂ）：次いで、得られたｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ  Ｉｎｔｅｒ．１から、Ｒｐｓｌ−ｋａｎカセットを挿入したヒトＣＤ２０遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターにサブクローニングするため、ＣＤ２０−Ｈ２−ＣＤ２０−Ｈ６−ＳａｃＢ−ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣＤ２０−Ｈ５−ＣＤ２０−Ｈ１をタンデムにつないだＤＮＡカセットを構築した（ＣＤ２０プレトランスファープラスミド）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍの能力を有する大腸菌株に、ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ  Ｉｎｔｅｒ．１とともに、直鎖化したＣＤ２０プレトランスファープラスミドを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ  ｓｙｓｔｅｍを誘導してアンピシリンおよびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、Ｒｐｓｌ−ｋａｎカセットを挿入したヒトＣＤ２０遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を持つプラスミドをスクリーニングした（ヒトＣＤ２０トランスファープラスミド）。次に、制限酵素反応により、このヒトＣＤ２０トランスファープラスミドから、マウスゲノム配列に由来するＣＤ２０−Ｈ５配列とＣＤ２０−Ｈ６配列を両端に持ち、Ｒｐｓｌ−ｋａｎカセットを挿入したヒトＣＤ２０遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターから切り出した（ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０トランスファーフラグメント）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍの能力を有する大腸菌株に、マウスＣＤ２０をコードするＢＡＣクローン（ｍｏｕｓｅ  ｃｄ２０  Ｗｔ  ＢＡＣ）とともに、ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０トランスファーフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ  ｓｙｓｔｅｍを誘導してクロラムフェニコール、およびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＣＤ２０遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのマウスＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＣＤ２０トランスファーフラグメントの翻訳開始コドンから停止コドンまでのヒトＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＣＤ２０／ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ  Ｉｎｔｅｒ．２）。【００６２】
図４（Ｃ）：最後に、ヒトＣＤ２０遺伝子座のヒトＣＤ２０遺伝子のイントロン４配列をＰＣＲで増幅し、ネガティブセレクションによりヒトＣＤ２０遺伝子のヒトＣＤ２０遺伝子のイントロン４に挿入したＲｐｓｌ−ｋａｎを除去するためのＤＮＡ配列とした（ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  Ｒｅｐａｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍの能力を有する大腸菌株にｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ  Ｉｎｔｅｒ．２とともに、ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  Ｒｅｐａｉｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ  ｓｙｓｔｅｍを誘導してクロラムフェニコール、およびストレプトマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＣＤ２０遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのマウスＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＣＤ２０遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのヒトＣＤ２０遺伝子ゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＣＤ２０／ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣクローンの構築を行なった（ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  ＣＤ２０  ＲｅｃＢＡＣ）。シークエンス解析により、Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍで接合したゲノムＤＮＡ配列を確認した。【００６３】
得られたＢＡＣクローンを、ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターとした。【００６４】
実施例４：ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの精製
ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターによりそれぞれ形質転換した大腸菌（ＤＨ１０Ｂ株）を、それぞれクロラムフェニコールを含むＬＢアガー培地上でクローニングし、そのシングルコロニーをピックアップして液体培地で一昼夜振盪培養した。一部改変した阿部らの方法（ＥｘｐＡｎｉｍ．２００４５３（４）：３１１−２０．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＢＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ  ｌｏｃｕｓ．Ａｂｅ  Ｋ，Ｈａｚａｍａ  Ｍ，Ｋａｔｏｈ  Ｈ，Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｍ．）に従い、ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターをそれぞれ、プラスミド抽出キット（マッキリーナーゲル社、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＢＡＣ  １００キット）を用いて精製し、ＰＩ−ＳｃｅＩを加えて３７℃、１６時間反応させて直鎖化した。次いで、直鎖化したヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターをそれぞれ、１％ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロースゲル（タカラバイオ）にアプライし、パルスフィールド電気泳動装置（バイオラッド、ＣＨＥＦＤＲ−ＩＩ）により、６ｖ／ｃｍ、０．１−４０ｓｅｃ、１５ｈｒ、１４℃の条件で電気泳動を行った。サンプルの一部をガイドマーカーとしてＵＶトランスイルミネーターにより可視化することによって、アガロースゲル中に分離した直鎖化したヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターをＵＶ照射することなく、カミソリで切り出した。得られた長鎖ＤＮＡ断片を電気溶出法によりアガロースゲルから抽出し、マイクロインジェクション用に調製したＴＥバッファーで、４℃、２時間透析した。精製したＤＮＡ断片をパルスフィールド電気泳動にアプライして、長鎖ＤＮＡ断片が分断することなく高度に精製されていることを確認した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（旭テクノグラス社）によりそのＤＮＡ濃度を決定した。このＤＮＡ断片の溶液を０．５ｎｇ／μｌになるように希釈し、トランスジェニックマウス作出用のヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの溶液をそれぞれ、調製した。【００６５】
実施例５：ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの受精卵への導入と遺伝子導入受精卵の仮親動物への移植
雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールスリバー社）、および雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（日本クレア社）に妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ：あすか製薬株式会社）５ＩＵを腹腔内に注射し、その４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ：あすか製薬株式会社）５ＩＵを腹腔内に注射して、過剰排卵を誘起した。これらの雌性マウスと同系統の雄性マウスと交配した後、前核期胚を採取した。ＰＭＳＧおよびｈＣＧ投与により過排卵誘起して交配した結果、Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ雌性マウスからそれぞれ、２０２９個、および６４２個の前核期胚を採取することができた。【００６６】
精製したヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターの溶液を等量混合し、マイクロマニュピレーターを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスの前核期胚の雄性核にそれぞれ、直接注入した。マイクロインジェクションを受けたマウス受精卵を顕微鏡下で観察したところ、注入操作によるダメージで死滅した受精卵はわずかで、それぞれ、１６８２個、および６０３個の受精卵はマイクロインジェクションを受けた後も安定な状態を保っていた。これらのダメージなく発現ベクターを注入できた受精卵を偽妊娠マウスに移植することができた。【００６７】
ヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクターを注入したＢａｌｂ／ｃマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスの受精卵を移植した仮親マウスから約３週間の妊娠期間を経た後に、それぞれ、１０４頭、および１０９頭の産子を得ることができた。ヒトＦｃγ受容体ファミリーおよびヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニックマウス（以下、「ＣＤ２０ヒト抗原マウス」と記載する）のファウンダー候補個体を４週齢で離乳し、個体識別のための耳標をつけた後に、尾部組織を生検して解析に供するまで−８０℃に保管した。【００６８】
実施例６：ＣＤ２０ヒト抗原マウスの選別
−８０℃で保存したＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダー候補個体の尾部組織を室温で融解し、以下に示すサザンブロットハイブリダイゼーション法によりＣＤ２０ヒト抗原マウスの選別を行った。すなわち、１％ＳＤＳ（和光純薬）、１ｍｇ／ｍｌアクチナーゼＥ（科研製薬）および０．１５ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（メルク）を含むライシスバッファーを加え、５５℃で１６時間振盪して組織を可溶化した。フェノール抽出、およびフェノール／クロロフォルム抽出を行って、組織から可溶化したゲノムＤＮＡに結合するタンパク質を除去した。ゲノムＤＮＡに混在するＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ａ（シグマ）により分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムＤＮＡを析出した。析出したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄して風乾した後、５０μｌのＴＥに再溶解した。各検体から調製したゲノムＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を吸光法により決定し、各検体のＤＮＡ濃度の値からＤＮＡ５μｇに相当するゲノムＤＮＡ溶液の容量を算出した。マイクロインジェクションに使用したＢＡＣ発現ベクターを１、３、１０、および３０コピーになるように希釈し、別途調製したコントロールマウスのゲノムＤＮＡ５μｇを加えて、サザン解析の陽性コントロールＤＮＡを調製した。一方、コントロールマウスのゲノムＤＮＡ５μｇをサザン解析の陰性コントロールＤＮＡとした。各検体から調製したゲノムＤＮＡ、陽性コントロールＤＮＡ、および陰性コントロールＤＮＡに制限酵素ＸｂａＩ、またはＨｉｎｃＩＩを加えて、３７℃、１６時間の反応を行った。生成したゲノムＤＮＡ断片をイソプロパノール沈澱により析出し、７０％エタノールで洗浄して風乾した後、ＴＥに再溶解した。これらのゲノムＤＮＡのＸｂａＩ、またはＨｉｎｃＩＩ断片を１．２％のアガロースゲルにアプライして電気泳動し、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡ断片をＵＶトランスイルミネーターにより可視化し、スケールとともに写真撮影した。このアガロースゲルを０．２５Ｎ塩酸に浸して１０分間緩やかに振盪した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに浸してさらに１０分間緩やかに振盪した。０．４Ｎ水酸化ナトリウムを用いたキャピラリー法により、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡのＸｂａＩ、またはＨｉｎｃＩＩ断片をそれぞれ、室温で１６時間、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ；ＧＥＨ）にトランスファーした。ゲノムＤＮＡのＸｂａＩ、またはＨｉｎｃＩＩ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンを２ＸＳＳＣに浸して１０分間緩やかに振盪した後に風乾し、ハイブリダイゼーションに用いるまで室温で保存した。ＤＮＡラベル化キット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＧＥＨ）を用いて、ランダムプライム法によりヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターからサブクローニングしたヒトＣＤ２０プローブ用フラグメント、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターからサブクローニングしたＦｃγＲＩＩＩａプローブ用フラグメントをそれぞれ、［３２Ｐ］ラベルした。セファデックススピンカラム（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ；ＧＥＨ）を用いて［３２Ｐ］ラベル化したフラグメントを���製し、それぞれ、［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および、［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブとした。ゲノムＤＮＡのＸｂａＩ、またはＨｉｎｃＩＩ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッファーに入れて、６５℃で１時間プレインキュベートした。その後、９５℃、５分間加熱し、直後に５分間氷冷し、変性した［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および、［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブをそれぞれ、ＸｂａＩ、およびＨｉｎｃＩＩ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンに加えて、６５℃で４時間インキュベートした。インキュベーション終了後にナイロンメンブレンを取り出し、０．１％ＳＤＳ、０．５ＸＳＳＣを用いて６５℃で約１５分間洗浄した。サーベイメーターでメンブレンに結合したプローブに由来する放射活性をモニターし、放射活性がほぼ一定になるまでこの洗浄を繰り返した。洗浄したメンブレンをサランラップ（登録商標）で覆い、暗室内でＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ  ＭＳ；コダック）を重ねてオートラジオグラフィーカセットに入れた。４℃で１週間感光した後にＸ線フィルムを現像した。ヒトＣＤ２０遺伝子の組換えＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターに由来する特異的なシグナルをオートラジオグラフィーで検出した。【００６９】
その結果、［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブとのハイブリダイゼーションにより、全ての陽性コントロールであるヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターの断片から発現ベクターに由来する特異的なシグナルを検出することができた。また、全ての陽性コントロールから発現ベクター由来のハイブリダイゼーションシグナルを検出できたことから、［３２Ｐ］ラベル化プローブを用いたサザン解析により、宿主ゲノムにインテグレートされた１コピー以上の発現ベクターを検出できることがわかった。【００７０】
さらに、ＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダー候補となる産子から抽出したゲノムＤＮＡ断片と［３２Ｐ］ラベル化プローブのハイブリダイゼーションにより、［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブとのハイブリダイゼーションによる両方に特異的なシグナルをもたらす個体をＣＤ２０ヒト抗原マウス、ファウンダー個体として同定した。その結果、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターおよびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターが、両方導入されたＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーを合計１５頭同定することができた。【００７１】
各検体のシグナルの強度を陽性コントロールＤＮＡのシグナルの強度と比較して、ゲノムに導入した発現ベクターのコピー数を概算した。その結果、これらのＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーに導入した発現ベクターのコピー数は、１コピーから３０コピーであった。これらのＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーとは別に、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスのファウンダー、およびヒトＦｃγ受容体遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスのファウンダーも、それぞれ得られた。【００７２】
実施例７：ＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーからの系統樹立
３コピー以上のヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクター、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターが導入されたＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダー雄性個体を繁殖期まで育成させ、以下に示す体外受精法により系統樹立を行った。すなわち、雄性個体から精巣上体を摘出して尾部より体外受精に供する精子を回収し、ＴＹＨ溶液にて２時間の前培養を行った。３〜４週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスにＰＭＳＧを５ＩＵを腹腔内に注射し、その４８時間後にｈＣＧ  ５ＩＵを腹腔内に注射して、過剰排卵を誘起した。過剰排卵を誘起した雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス、およびＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスを、ｈＣＧ投与の１６−１８時間後に頸椎脱臼にて安楽死させ、卵管を摘出してその卵管膨大部より未受精卵を回収し、ＨＴＦ溶液に加えた。前培養したＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダー由来の精子の一部を、未受精卵を含むＨＴＦ溶液に添加して４−６時間媒性し、その後ｍＷＭ溶液内に移してさらに２４時間体外培養を行って、Ｆ１個体の後代の受精卵を得た。体外受精により得たこれらの受精卵の中で、２細胞期に達した胚のみを回収し、偽妊娠誘起した受胚雌マウスの卵管に２０個程度ずつ移植して、ＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーからの系統樹立に供した。自然分娩により得た産子を、離乳まで保育した。これらのＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ１個体を４週齢で離乳させ、個体識別のための耳標をつけた後に、尾部組織を生検して解析に供するまで−８０℃に保管した。【００７３】
−８０℃で保存しておいたＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ１個体の尾部組織を室温で融解させ、上記と同様の［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション法により、ＣＤ２０ヒト抗原マウスの雄性Ｆ１個体を同定した。【００７４】
その結果、系統化に供したＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダーのうち、４頭のファウンダーからトランスジーンを伝達した複数のＦ１個体を得ることができた。このファウンダーマウスの系統化効率から、これらの発現ベクターが胎児の発生や発育に重大な影響を及ぼすものではないことが示された。ＣＤ２０ヒト抗原マウスのファウンダー以外に、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスのファウンダー２頭、およびヒトＦｃγ受容体ファミリーの遺伝子クラスターＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスのファウンダー１頭も、それぞれファウンダーからトランスジーンを伝達した複数のＦ１個体を得ることができた。【００７５】
実施例８：ＣＤ２０ヒト抗原マウスにおけるヒト抗原の発現解析
系統化に成功したＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ１個体を頚椎脱臼により安楽死させ、全身に消毒用エタノールをかけて腹部を解剖用ハサミで切開して脾臓を摘出した。メディウムを入れて氷冷したプラスチックシャーレ中に摘出した脾臓を入れ、ピンセットでほぐしてピペッティング、濾過した後にトリス緩衝塩化アンモニウム溶液に再懸濁させて、赤血球を除去した。調製した脾臓細胞浮遊液の生細胞数を計数した。脾臓細胞に存在するマウスのＣＤ１６、およびＣＤ３２と蛍光ラベル化ＩｇＧの非特異的結合をブロックするために、１×１０６個の脾細胞を含む浮遊液の入ったエッペンドルフチューブに抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（日本ベクトン・ディッキンソン）を加え、４℃、３０分間インキュベートした。遠心分離で上清を除いて再懸濁させた後に、ＰＥラベル化抗体、ＦＩＴＣラベル化抗体（日本ベクトン・ディッキンソン）を加えて４℃、３０分間インキュベートした。遠心分離・再懸濁させて洗浄した後に７−ＡＡＤ核染色液を加え、室温、暗所で１０分間インキュベーションして、死細胞を染色した。このように染色した細胞浮遊液をフローサイトメーターによって分析し、多重染色によるドットプロットを出力してＣＤ２０ヒト抗原マウスにおけるヒト抗原の発現解析を行った。【００７６】
その結果、陰性コントロール（野生型）のマウスはＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体による染色で二重陽性となる細胞が見出されなかったのに対して、系統化に成功したＣＤ２０ヒト抗原マウスの４系統全てが、ＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体による染色で二重陽性となるヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞を高い比率で有していることが明らかになった。加えて、系統化に成功したヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスの３系統のうち２系統がＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体による染色で二重陽性となるヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞を高い比率で有していることも明らかになった。【００７７】
また、系統化に成功したＣＤ２０ヒト抗原マウスの４系統のうち２系統がヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞を高い比率で有し、かつヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現性のＮＫ細胞を有していることが明らかになった（図５、図６）。これらの２系統（Ｂａｌｂ／ｃ−９＿６系統、およびＣ５７ＢＬ／６−１＿２系統）を、ＣＤ２０ヒト抗原マウスとして樹立した。【００７８】
ヒストグラム解析により、Ｂａｌｂ／ｃ−９＿６系統の脾細胞中のＢ細胞分画、マクロファージ細胞分画、およびＮＫ細胞分画における、ヒトＣＤ２０発現性のＢ細胞、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現性のＮＫ細胞、およびヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現性のＮＫ細胞の比率を調べたところ、それぞれ、４４％、６５％、および２１％であることが確認された。この結果から、Ｂａｌｂ／ｃ−９＿６系統にはヒトＣＤ２０抗原、およびヒトＦｃγＲＩＩＩａ抗原が組織特異的に発現していることが示され、以降のバイオアッセイにＢａｌｂ／ｃ−９＿６系統を利用した。【００７９】
実施例９：ＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用した治療用抗ＣＤ２０抗体医薬のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ＣＤ２０ヒト抗原マウス、Ｂａｌｂ／ｃ−９＿６系統、雄性Ｆ１個体を繁殖期まで育成させ、上記と同様の方法で、ＣＤ２０ヒト抗原マウス、雄性Ｆ１個体と雌性野生型Ｂａｌｂ／ｃ系統マウスとの体外受精によりＦ２世代の受精卵を得た。これらの受精卵の中で２細胞期に達した胚のみを回収し、４００個程度の胚を偽妊娠誘起した受胚雌マウスの卵管に２０個程度ずつ移植した。自然分娩で産まれるＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を４週令で離乳させ、上記の［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション法によりＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を選別した。これらのＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体に治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与し、脾臓Ｂリンパ球除去作用を比較した。【００８０】
（１）抗ＣＤ２０抗体医薬投与による脾臓Ｂリンパ球除去作用の用量依存性の確認
ＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を各実験群に割り付け、それぞれＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、および陰性対照ＩｇＧ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）を投与し、脾臓Ｂリンパ球の除去作用の用量依存性を調べた。各実験群のＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体に、５０μｇおよび２５０μｇのＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂを、そして２５０μｇのＩｎｆｌｉｘｉｍａｂを、それぞれ腹腔内に単回投与した。抗体を投与した日をｄａｙ０として、ｄａｙ７に頚椎脱臼により各実験群のＣＤ２０ヒト抗原マウスを安楽死させ、その脾臓を摘出した。上記と同様の方法で、ＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体により免疫染色した脾臓細胞をフローサイトメーターによって分析し、そのドットプロットから治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与されたＣＤ２０ヒト抗原マウスにおける脾臓Ｂリンパ球数を評価した。【００８１】
その結果、２５０μｇのＩｎｆｌｉｘｉｍａｂ投与群では脾臓Ｂリンパ球数に変化は見られなかったが、２５０μｇのＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂ投与群では脾臓Ｂリンパ球数が著しく減少していた。【００８２】
５０μｇおよび２５０μｇのＲｉｔｕｘｉｍａｂ投与群を比較すると、投与したＲｉｔｕｘｉｍａｂの用量依存的に脾臓Ｂリンパ球数が減少していた。さらに、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂよりも生物活性がより強力な第２世代抗体であるＢＭ−ｃａ投与群、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂ投与群では、５０μｇの低用量の抗体投与で既に最大限に脾臓Ｂリンパ球数が減少していた（図７）。【００８３】
（２）抗ＣＤ２０抗体医薬投与によるＢ細胞除去作用の時間的変化の確認
ＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を各実験群に割り付け、それぞれＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、およびＩｎｆｌｉｘｉｍａｂを投与し、脾臓Ｂリンパ球の除去作用の時間的変化を調べた。各実験群のＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体に、２５０μｇのＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、およびＩｎｆｌｉｘｉｍａｂを、それぞれ腹腔内に単回投与した。抗体を投与した日をｄａｙ０として、ｄａｙ２、ｄａｙ７、ｄａｙ１４、ｄａｙ２１に頚椎脱臼により各実験群のＣＤ２０ヒト抗原マウスを安楽死させ、その脾臓を摘出した。上記と同様の方法で、ＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体により免疫染色した脾臓細胞をフローサイトメーターによって分析し、そのドットプロットから治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与されたＣＤ２０ヒト抗原マウスにおけるＢ細胞数を評価した。【００８４】
その結果、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ投与群では脾臓Ｂリンパ球数に顕著な減少は見られなかった。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂ投与群ではｄａｙ２ではあまり顕著な変化は認められなかったが、ｄａｙ７、１４では脾臓Ｂリンパ球数が著しく減少し、ｄａｙ２１ではほぼ回復していた。一方、ＢＭ−ｃａ投与群ではｄａｙ２で既に脾臓Ｂリンパ球数の減少がほぼ最大限に到達するとともにｄａｙ７まで効果が持続し、その後徐々に回復した（図８）。【００８５】
以上の結果から、ＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより、治療用抗ＣＤ２０抗体医薬のｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を、投与用量および時間経過を正確に反映させた薬力学的データとして評価できることが示された。さらに、腫瘍細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験から、ＢＭ−ｃａはＲｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂにはない強力な直接細胞傷害活性を持つことが報告されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．ら、ＣＡＮＣＥＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，２：１３０−１４３（２０１３））。また、再発、再燃した低悪性度Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫患者を対象とした臨床第１相試験では、ＢＭ−ｃａは現在の標準治療になっているＲｉｔｕｘｉｍａｂの投与期間に比べて、半分の投与期間でＲｉｔｕｘｉｍａｂと同様の抗腫瘍効果をもたらすことが明らかになっている（Ｔｏｂｉｎａｉ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３１，２０１３（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ８５５１））。臨床第１相試験でＢＭ−ｃａが抗腫瘍効果を示した最低投与用量は１０ｍｇ／ｋｇであり、これはＢＭ−ｃａをマウスに２５０μｇ投与した用量にほぼ相当する。このＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、およびＯｆａｔｕｍｕｍａｂと比べてＢＭ−ｃａは極めて短時間、もしくは低用量で、Ｂ細胞除去作用を発揮した。これらの知見と合わせてこの結果を評価すると、ＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを行えば、抗ＣＤ２０抗体医薬の生物学的特徴を反映した薬理効果を観察することできるため、臨床試験における投与用量を推定するために非常に質の高い情報が得られることが示された。【００８６】
実施例１０：ＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおけるヒトＦｃγ受容体ファミリーの効果
ＣＤ２０ヒト抗原マウス、およびヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスに、それぞれＢＭ−ｃａ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂを投与して、抗ＣＤ２０抗体医薬投与による脾臓Ｂリンパ球の除去作用に対するヒトＦｃγ受容体ファミリーを発現したヒト型エフェクター細胞の効果を調べた。【００８７】
ＣＤ２０ヒト抗原マウス（Ｂａｌｂ／ｃ−９＿６系統）のＦ２個体、および、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウス（Ｂａｌｂ／ｃ−１０＿８系統）のＦ１個体に、２５０μｇのＢＭ−ｃａ、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂを、それぞれ腹腔内に単回投与した。抗体を投与した日をｄａｙ０として、ｄａｙ７に頚椎脱臼により各実験群のマウスを安楽死させ、その脾臓を摘出した。上記と同様の方法で、ＦＩＴＣ−抗マウスＢ２２０抗体とＰＥ−抗ヒトＣＤ２０抗体により免疫染色した脾臓細胞をフローサイトメーターによって分析し、そのドットプロットから治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与された各実験群のマウスにおける脾臓Ｂリンパ球を評価した。【００８８】
その結果、ＣＤ２０ヒト抗原マウスにＲｉｔｕｘｉｍａｂを投与した群では、コントロール群に比べて平均脾臓Ｂリンパ球数が４５．５％にまで減少していたが（図９（Ｂ））、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスにＲｉｔｕｘｉｍａｂを投与した群では、平均脾臓Ｂリンパ球数の減少はコントロール群に比べて７５．９％に留まっていた（図９（Ａ））。【００８９】
この結果から、ＣＤ２０ヒト抗原マウスにヒトＦｃγ受容体を発現したヒト型エフェクター細胞が存在することにより、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるエフェクター細胞の活性化を介したＡＤＣＣ活性による脾臓Ｂリンパ球の除去作用を顕著に検出できていることが示された。【００９０】
ＣＤ２０ヒト抗原マウスにＢＭ−ｃａを投与した場合も、コントロール群に比べて投与群の平均脾臓Ｂリンパ球数は３４．０％にまで減少していたが（図９（Ｂ））、一方、ヒトＣＤ２０組換えＢＡＣ発現ベクターのみが導入されたトランスジェニックマウスにＢＭ−ｃａを投与した場合、投与群の平均脾臓Ｂリンパ球数の減少はコントロール群に比べて４６．０％に達した（図９（Ａ））。この結果から、ＢＭ−ｃａはその強力な直接細胞傷害活性により、ＣＤ２０ヒト抗原マウスのエフェクター細胞の活性化を誘導する前に既に脾臓Ｂリンパ球を除去する作用を有することが示された。【００９１】
実施例１１：ＣＤ２０ヒト抗原マウスを利用した治療用抗ＣＤ２０抗体医薬の疾患モデルマウスに対する薬理薬効試験
ＣＤ２０ヒト抗原マウス、Ｃ５７ＢＬ／６−１＿２系統、雄性Ｆ１個体を繁殖期まで育成させ、上記と同様の方法で、ＣＤ２０ヒト抗原マウス、雄性Ｆ１個体と雌性野生型Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスとの体外受精によりＦ２世代の受精卵を得た。これらの受精卵の中で２細胞期に達した胚のみを回収し、４００個程度の胚を偽妊娠誘起した受胚雌マウスの卵管に２０個程度ずつ移植した。自然分娩で産まれるＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を４週令で離乳させ、上記の［３２Ｐ］ラベル化ヒトＣＤ２０プローブ、および［３２Ｐ］ラベル化ヒトＦｃγＲＩＩＩａプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション法によりＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体を選別した。【００９２】
これらのＣＤ２０ヒト抗原マウスのＦ２個体に得られたＣＤ２０ヒト抗原マウスと遺伝子改変原発性胆汁性肝硬変モデルマウス（疾患モデルマウス）を順次交配させ、生まれたマウスを４週令で離乳させ、ＰＣＲによりＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスを選別した。これらのマウスのうち雌性個体、合計２０頭程度を選別し、抗ＣＤ２０抗体医薬であるＢＭ−ｃａ投与による肝臓炎症の抑制作用を確認する薬効薬理試験に供した。【００９３】
選別された雌性ＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスを各実験群に割り付け、２５０μｇの治療用抗ＣＤ２０抗体医薬ＢＭ−ｃａ、および溶媒（ＰＢＳ）を、それぞれ腹腔内に週１回、１６週間に渡って反復投与した。治療用抗ＣＤ２０抗体医薬の投与中に２週間に１回、血液を採取して、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ１９抗体とＰＥ−抗マウスＣＤ４抗体により免疫染色した末梢血液中のリンパ比率をフローサイトメーターによって分析し、そのドットプロットから治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与されたＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスにおける末梢血液中Ｂリンパ球数を評価した。【００９４】
最後に治療用抗ＣＤ２０抗体医薬、および溶媒を投与した日をｄａｙ０として、ｄａｙ７に全てのＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスを安楽死させ、肝臓を摘出した。摘出した肝臓組織の一部を１０％中性緩衝ホルマリン液で固定してパラフィンブロックを作成し、切片にヘマトキシリン・エオジン染色を行い、肝臓炎症の病理組織学的評価を行い、門脈域および実質細胞域の炎症スコアリングを行った。さらに、摘出した肝臓組織の一部をすりつぶして懸濁させ、フローサイトメーターにより肝臓内に浸潤した単核球数、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数、および、ＣＤ４４高ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を評価した。コントロールには溶媒のみを同様に投与して、各細胞数を同様に評価した。【００９５】
その結果、治療用抗ＣＤ２０抗体医薬投与群では、投与開始直後からＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスの末梢血液中におけるＢリンパ球の比率が著しく減少し、投与期間中に渡り当該比率は低いレベルを維持していた（図１０）。【００９６】
また、１６週間の治療用抗ＣＤ２０抗体医薬投与の後に、ＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスの肝臓に浸潤したリンパ球数を測定したところ、治療用抗ＣＤ２０抗体医薬投与により、原発性胆汁性肝硬変を発症したマウスの肝臓に浸潤した総リンパ球数、およびＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞数が有意に減少し、特にＣＤ４４高発現ＣＤ８陽性活性化細胞傷害性Ｔ細胞数が著しく減少した（図１１）。そして肝臓組織の病理組織学的評価を行ったところ、この肝臓に浸潤した細胞傷害性Ｔ細胞数の減少を反映して、治療用抗ＣＤ２０抗体医薬投与により、ＣＤ２０ヒト抗原・疾患モデルマウスの肝臓の実質域炎症の悪化度、悪化頻度が、それぞれ有意に改善した（図１２）。【００９７】
以上の結果から、本発明に係るＣＤ２０ヒト抗原マウスは、治療用抗ＣＤ２０抗体医薬を投与して疾患モデルマウスに対する治療効果を確認する薬効薬理試験に利用できることが確認された。本発明に係るＣＤ２０ヒト抗原マウスは、従来の抗体医薬より効果の優れたバイオベター抗体医薬の開発や、臨床試験導入を促進することが期待されるとともに、既に臨床で使用されている抗体医薬の新規適用を検討するドラッグリポジショニングの分野においても利用可能な有益なツールとなり得る。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、ヒト特定分子に対する分子標的物質又は標的薬の特性や薬理作用、ならびに安全性等をより高感度に、かつ適切に評価することが可能なトランスジェニック非ヒト動物を提供することができ、これは分子標的物質や標的薬を含む新規薬剤の開発に大いに貢献することが期待される。【００９９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2016175285.tif 000003
【図２】
2016175285.tif 000004
【図３】
2016175285.tif 000005
【図４】
2016175285.tif 000006
【図５】
2016175285.tif 000007
【図６】
2016175285.tif 000008
【図７】
2016175285.tif 000009
【図８】
2016175285.tif 000010
【図９】
2016175285.tif 000011
【図１０】
2016175285.tif 000012
【図１１】
2016175285.tif 000013
【図１２】
2016175285.tif 000014
【配列表】
2016175285000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月17日(2017.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれ、かつ該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物であって、
該ヒト特定分子をコードする遺伝子が３コピー以上組み込まれており、
該ヒト特定分子をコードする遺伝子が、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現されており、該ヒト特定分子をコードする遺伝子ならびに該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構が、該トランスジェニック非ヒト動物の製造時に受精卵に導入されたＢＡＣ発現ベクターに由来し、該ＢＡＣ発現ベクターが、該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子及びその発現制御機構を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含み、かつ、
ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂを含み、
該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現されており、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子ならびに該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構が、該トランスジェニック非ヒト動物の製造時に受精卵に導入されたＢＡＣ発現ベクターに由来し、該ＢＡＣ発現ベクターが、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下に連結されてなるＢＡＣを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターおよび、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂを含むヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下に連結されてなるＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターを、宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程であって、該ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターが、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子及びその発現制御機構を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含む、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）にて得られた仮親動物から出生した産仔から、ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子、及び３コピー以上のヒトの特定分子をコードする遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれているトランスジェニック非ヒト動物を選別する工程、
を含む、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
請求項１又は３に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項１１】
請求項１又は３に記載のトランスジェニック非ヒト動物と同種の他の疾患モデル動物とを交配して得られた、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する疾患モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該疾患モデル非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項１２】
被験物質が、ヒト由来ガンマ鎖Ｆｃ領域のペプチド配列の一部、または全部を有する抗体である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験物質の特性が、ヒト特定分子に対する機能阻害能力、ヒト特定分子に対する結合能力、ヒト特定分子を発現する細胞、組織もしくは器官に対する障害能力、生体内分布、薬効、又は安全性である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月20日(2017.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれ、かつ該ヒト特定分子をコードする遺伝子及び該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック非ヒト動物であって、
該ヒト特定分子をコードする遺伝子が、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現されており、該ヒト特定分子をコードする遺伝子ならびに該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子の発現制御機構が、該トランスジェニック非ヒト動物の製造時に受精卵に導入されたＢＡＣ発現ベクターに由来し、該ＢＡＣ発現ベクターが、該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子及びその発現制御機構を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含み、かつ、
ヒトＦｃγ受容体ファミリーが、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂを含み、
該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下にて発現されており、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子ならびに該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構が、該トランスジェニック非ヒト動物の製造時に受精卵に導入されたＢＡＣ発現ベクターに由来し、該ＢＡＣ発現ベクターが、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下に連結されてなるＢＡＣを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
ヒト特定分子をコードする遺伝子が、３コピー以上組み込まれている、請求項１又は２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターおよび、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩｃ、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、及びヒトＦｃγＲＩＩＩｂを含むヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子が、該ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子の発現制御機構の制御下に連結されてなるＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターを、宿主となる非ヒト動物の受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程であって、該ヒト特定分子をコードする遺伝子を含むＢＡＣを含むＢＡＣ発現ベクターが、該ヒト特定分子をコードする遺伝子の非ヒト動物におけるホモログ遺伝子及びその発現制御機構を含むＢＡＣにおいて、該ホモログ遺伝子が該ヒト特定分子をコードする遺伝子に置換されてなるＢＡＣを含む、工程；ならびに
（ｂ）工程（ａ）にて得られた仮親動物から出生した産仔から、ヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子及びヒト特定分子をコードする遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれているトランスジェニック非ヒト動物を選別する工程、
を含む、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法。
【請求項５】
ヒト特定分子がヒトＣＤ２０、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＣＤ３、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３２６、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ４、ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ２２、ヒトＣＤ３０、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＧＭ−２、ヒトＩＣＡＭ１、ヒトＣＡ１２５、ヒトＣＤ５２、ヒトＰＤ−１、ヒトＢＡＦＦ、ヒトＣＣＲ４、ヒトＶＥＧＦＲ−３、ヒトＣＤ２４８、ヒトＣＸＣＬ１０、ヒトＣＣＬ２、ヒトＩＬ−６Ｒ、ヒトＧＤ２、ヒトＤＬＬ４、ヒトＣＣＲ５、ヒトＴＡＧ−７２、ヒトＣＤ３８、ヒトＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１３７、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＣＤ２、ヒトＢ７−Ｈ３、ヒトＢ７−Ｈ４、及びヒトＢ７−Ｈ５からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒト特定分子をコードする遺伝子が、３コピー以上組み込まれている、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、該トランスジェニック非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物と同種の他の疾患モデル動物とを交配して得られた、ヒト特定分子をコードする遺伝子及びヒトＦｃγ受容体ファミリーをコードする遺伝子を発現する疾患モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、該疾患モデル非ヒト動物の生体内における該被験物質の特性を評価することを含む、該被験物質の特性評価方法。
【請求項９】
被験物質が、ヒト由来ガンマ鎖Ｆｃ領域のペプチド配列の一部、または全部を有する抗体である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質の特性が、ヒト特定分子に対する機能阻害能力、ヒト特定分子に対する結合能力、ヒト特定分子を発現する細胞、組織もしくは器官に対する障害能力、生体内分布、薬効、又は安全性である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2016175285.tif 000015
2016175285.tif 000016
2016175285.tif 000017
2016175285.tif 000018