(57)【要約】  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の有効なワクチンや診断ツールを開発するための組換えタンパク質を提供することを課題とする。  Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のメジャーエピトープ領域にＨＣＶ  Ｅ２のエピトープを挿入した組換えタンパク質を作製し、免疫原性の高い組換えタンパク質を得ることに成功した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のアミノ酸配列番号１２９〜１４１のアミノ酸配列を含む１３〜１５アミノ酸を除去し、代わりにＨＣＶ  Ｅ２エピトープを含む同数のアミノ酸配列を組み込んだことを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えタンパク質において、
前記ＨＣＶ  Ｅ２エピトープがＥ２タンパク質のアミノ酸配列番号４０９〜４２３又は配列番号５２３〜５３７のいずれか一つの領域であることを特徴とする組換えタンパク質。
【請求項３】
ＨＣＶを予防するためのワクチンであって、
請求項１又は２記載の組換えタンパク質を抗原とすることを特徴とするワクチン。
【請求項４】
ＨＣＶのエンベロープタンパク質を認識する抗体であって、
請求項１又は２記載の組換えタンパク質を抗原として得ることを特徴とする抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスによる感染に対応する予防的／及び治療的免疫応答、診断に使用可能な組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリアは全世界で１億７０００万人、すなわち全人口の３％がキャリアであると言われており、わが国のキャリア数は１５０万〜２００万人と推定されている。ＨＣＶに感染すると、免疫力の正常な健康成人への感染であっても、急性の経過で治癒するものは約３０％であり、残りは慢性感染へ移行すると言われている。ＨＣＶによる慢性肝炎では炎症が持続することにより肝線維化が誘発され、肝硬変、肝癌へと進展する。【０００３】
慢性Ｃ型肝炎は感染から１０年〜２０年を経て肝硬変へと進展して、やがて高率に原発性肝癌を発症する。わが国では毎年２万数千人がＨＣＶによる原発性肝癌によって死亡しており、これは原発性肝癌の約８０％に該当する。【０００４】
また、わが国では慢性肝炎、肝硬変、肝癌患者の７５％がＨＣＶ感染者であるとも言われており、ＨＣＶの診断、治療、予防は重要な問題となっている。【０００５】
ＨＣＶはフラビウイルス科（Flaviviridae）に属するＲＮＡウイルスであり、カプシド、Ｅ１、Ｅ２の２つのエンベロープタンパク質、ｐ７の４つの構造タンパク質、及び６つの非構造タンパク質からなっている。【０００６】
ＨＣＶはＲＮＡウイルスであり変異しやすく、特にエンベロープタンパク質のアミノ末端には超可変領域（Hypervariable Region : HVR）と呼ばれる領域が存在する。この領域はアミノ酸変異が多く、中和抗体からのエスケープ機序に関与していると考えられている。ＨＣＶが変異しやすいＲＮＡウイルスであることが、慢性化の要因でもあり、また、有効なワクチン開発の大きな障害となっている。【０００７】
また、ＨＣＶには１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂなど１０種類以上のジェノタイプが存在することが知られている。ジェノタイプにより、ウイルスの感染性、インターフェロン等の治療への感受性が異なり、治療効果が異なることが知られている。中和抗体に関しても、ジェノタイプ間で異なるアミノ酸配列の領域を認識する中和抗体は他のジェノタイプのウイルスの重感染を防ぐことができない。多くのジェノタイプが存在することもワクチン開発の障害となっている。【０００８】
ＨＣＶは、感染初期では検出が難しく、診断が困難な時期があることや、上述のようにウイルスの遺伝子型によって治療効果が異なることから、いかに精度、感度の高い診断を行うかが問題となっている。また、予防の面では、エスケープ機序や多くのジェノタイプが存在するために有効なワクチンはまだ開発されておらず、積極的な予防法がないことが大きな問題となっている。【０００９】
一方、ＨＣＶと並んでヒトに肝炎、肝癌を誘発するウイルスとして、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）がある。ＨＢＶもＨＣＶ同様、慢性肝炎、肝硬変、肝癌を誘発するウイルスであることが明らかにされている。ＨＢＶはヘパドナウイルス科のＤＮＡウイルスであり、その複製機構や免疫応答はＨＣＶとは全く異なるものである。【００１０】
ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃ）は、自己集合して球状のコア粒子を形成する。このコア粒子は非常に免疫原性が高いことが知られている。このＨＢｃタンパク質のアミノ酸残基７５〜８０付近に所望のエピトープを挿入するか、ＨＢｃ抗原タンパク質の末端に所望のエピトープを連結することにより得られる融合ポリペプチドは自己集合によりコア粒子を形成する。形成された粒子の表面には、挿入、あるいは連結したエピトープが提示される。この組換え抗原を用いると、エピトープが免疫系に認識されやすくなり、抗体産生を効率的に誘導することができる（非特許文献１）。【００１１】
そこでＨＢｃ抗原タンパク質をワクチンのプラットフォームとして利用し、免疫系に認識されにくい抗原に対する抗体産生を誘導する試みが今までになされている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第３２２８７３７号公報
【特許文献２】特開平６−２７９５００号公報
【特許文献３】国際公開第２０１２／１４１２８０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Clarke, B.E. et al., (1987), Nature, Vol.330, pp.381-384
【非特許文献２】Perotti et al., (2008), J.Virology, Vol.82, No.2, pp.1047-1052
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＨＣＶワクチンを開発する試みは、ＨＣＶウイルスが発見された１９８９年以来続いているもののいまだ有効なワクチンは開発されていない。したがって、ＨＣＶの積極的な予防法は現在のところないため、ワクチンの開発が望まれている。【００１５】
また、変異やジェノタイプによらず、あらゆるＨＣＶに対応して感度良く検出可能な抗原タンパク質の開発も望まれている。有効な抗原タンパク質があれば、ヒトにＨＣＶウイルスが感染し、抗体が産生していれば患者血清中の抗体を検出することも可能である。また、ウサギやヤギ等の動物に抗原タンパク質を免疫して抗体を産生させ、患者血液中のウイルス抗原を検出する抗体試薬を作成し、患者のウイルス感染を検出することも可能となる。【００１６】
本発明は、ＨＣＶの有効なワクチンや診断ツールを開発するための組換えタンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の組換えタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のアミノ酸配列番号１２９〜１４１のアミノ酸配列を含む１３〜１５アミノ酸を除去し、代わりにＨＣＶ  Ｅ２エピトープを含む同数のアミノ酸配列を組み込んだことを特徴とする。【００１８】
本発明者らも、非特許文献１の方法と同様に、ＨＢＶのコアタンパク質（ＨＢｃ）をプラットフォームとして用いている。しかしながら、これまでのＨＢｃタンパク質をワクチン等、抗体産生を誘導する際のプラットフォームとして用いる場合とは異なり、ＨＢｃのアミノ酸配列８０付近ではなく、配列番号１２９〜１４１のアミノ酸配列を含む１３〜１５アミノ酸を除去し当該領域に、同数のアミノ酸からなるＨＣＶのＥ２エピトープを挿入した。ＨＢｃのアミノ酸配列１２９〜１４１付近は、抗原性が高い。当該領域を除去することにより、ＨＢｃの抗原性を抑えて、ＨＣＶ  Ｅ２エピトープに高い抗原性を備えた組換えタンパク質を産生することができる。【００１９】
さらに、本発明はＨＣＶ  Ｅ２エピトープがＥ２タンパク質のアミノ酸配列番号４０９〜４２３又は配列番号５２３〜５３７のいずれか一つの領域であることを特徴とする。【００２０】
ＨＣＶのこの領域は、エンベロープタンパク質の中でも、保存性が高く、ＨＣＶの遺伝子型によらず保存されている。また、ウサギを使った実験で抗体が産生することを確認した。したがって、遺伝子変異があまり起こらないことからワクチンや診断に用いるのには適した配列である。【００２１】
本発明は、ＨＣＶを予防するためのワクチンであって、前記組換えタンパク質を抗原とすることを特徴とする。【００２２】
本発明の抗原はＨＣＶのエンベロープタンパク質と反応する抗体を産生することが確認されたことから、有効なワクチンとして機能すると考えられる。【００２３】
本発明は、ＨＣＶのエンベロープタンパク質を認識する抗体であって、前記組換えタンパク質を抗原として得ることを特徴とする。【００２４】
本発明の抗原を用いて抗体を得ることによって、ＨＣＶエンベロープの保存されたアミノ酸領域を認識する抗体を得ることができる。そのため、診断、治療に有用な抗体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】作製した組換えタンパク質を模式的に示す図。
【図２】キメラタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ウェスタンブロット解析を示す図。
【図３】ＥＬＩＳＡによりキメラタンパク質のＨＣＶ  Ｅ２ペプチドに対する免疫原性を確認した図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＨＢｃをプラットフォームとして用い組換え体を作製するものである。従来ペプチドを挿入していた部位は、ＨＢｃのアミノ酸残基７５〜８０の領域であったが、本発明では１２９〜１４１番目のアミノ酸の領域に挿入した。ＨＢｃの１２９〜１４１番目のアミノ酸領域は抗原性が高いことが知られている。挿入するペプチドの物理的性質にもよるが、当該領域を除去し代わりに所望のペプチドを挿入することにより、挿入したペプチドがＨＢｃ分子表面に提示され、エピトープとして認識されることが期待される。ＨＣＶのＥ２のエピトープとしては、遺伝子型によらず保存されている３箇所を選び、挿入した（図１）。
【００２７】
ＨＢｃの１２９〜１４１番目のアミノ酸は、メジャーエピトープである１３４〜１４０、１３８〜１５４番目のアミノ酸領域の両者に跨っている。そのため、本発明の組換えタンパク質を用いた場合には、ＨＢｃに対する抗体ができにくいものと考えられる。したがって、この領域にＨＣＶペプチドを挿入した場合には、ＨＢｃの当該領域に対する抗体が産生されず、ＨＣＶのエンベロープを認識する抗体が産生されることが期待される。
【００２８】
［実施例］
１．組換えタンパク質発現プラスミドの構築
ＨＢｃ抗原を発現するプラスミドｐＧＨＢｃを作製した。ｐＧｄ１のＮｃｏＩ/ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＨＢｃを挿入したｐＧＨＢｃを得た。
【００２９】
次に、ＰＣＲを用い、定法によりＨＢｃの１２９〜１４１、又は１２８〜１４２番目までの１３又は１５アミノ酸を除去し、代わりにＨＣＶ  Ｅ２のエピトープ候補領域を挿入した。
【００３０】
Ｅ２エピトープは全てのジェノタイプのＨＣＶで保存性が高く、かつヒトの中和抗体と反応性のある領域として非特許文献２に報告されている下線で示した下記（１）〜（３）の箇所を含む領域を選定した。
（１）アミノ酸配列番号４０９−４２３
ＱＲＩＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮ
（２）アミノ酸配列番号４３４−４４６
ＱＴＧＦＬＡＡＬＦＹＡＨＲ
（３）アミノ酸配列番号５２３−５３７
ＬＧＮＰＴＹＳＷＧＥＮＤＴＤＶ
なお、アミノ酸の配列番号は、ポリプロテインによるＨＣＶコアタンパク質のＮ末端を１として表したときの番号を示す。また、配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＦ１３９５９４．２をもとにしている。
【００３１】
当初ＨＣＶ  ４３３〜４４７番目のアミノ酸をＨＢｃの１２８〜１４２番目のアミノ酸の代わりに挿入し、タンパク質精製を試みた。しかしながら、ＲＮＡ発現は確認されたもののタンパク質の発現が見られなかったため、ＨＢｃの１２８番目と１４２番目のアミノ酸をそのまま残し、ＨＣＶ  Ｅ２ペプチドは４３４〜４４６番目までの１３アミノ酸を組換えて用いた（図１参照）。
【００３２】
以下、ＨＢｃの１２８〜１４２番目までの１５アミノ酸を除去し、代わりにＨＣＶ  Ｅ２の４０９−４２３アミノ酸領域、あるいは５２３−５３７アミノ酸領域を組み込んだキメラタンパク質を夫々ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４０９−４２３）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ５２３−５３７）、ＨＢｃの１２９〜１４１番目までの１３アミノ酸を除去し、代わりにＨＣＶ  Ｅ２の４３４−４４６アミノ酸領域を組み込んだキメラタンパク質をＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４３４−４４６）と称する。
【００３３】
２．ＨＢｃ-Ｅ２キメラタンパク質の発現と精製
作製したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換し、ＨＢｃ-Ｅ２キメラタンパク質を発現させる。キメラタンパク質は大腸菌の封入体画分を精製することによって得た。
【００３４】
具体的には、ＬＢ培地中で２４時間大腸菌を培養し、遠心分離後、ＴＥ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ  ７．５），  １０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、氷中で超音波破砕機により３０分間破砕した。ＰＭＳＦ（phenylmethylsulfonyl fluoride）を終濃度１ｍＭになるように添加し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ, ４℃、１５分）により上清を捨て沈殿を回収する。得られた沈殿はＴＥで懸濁し、超音波破砕機により氷中で４分間処理する。遠心分離による洗浄を２度繰り返し、封入体画分を得る。
【００３５】
得られた封入体画分は、８Ｍ尿素溶液（８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、４℃で一晩静置する。
【００３６】
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ, ４℃、１５分）を行い、上清を回収後、孔径０．８μｍフィルターで濾過し、８Ｍ尿素溶液で平衡化したＳ−３００ゲル濾過カラムでタンパク質を分離精製する。
【００３７】
得られたタンパク質画分は限外濾過を用いて濃縮後、ＳＤＳ、ＤＴＴを夫々終濃度１％、１００ｍＭになるように加え、５分間煮沸する。煮沸後、室温に戻るまで静置し、孔径０．８μｍのフィルターで濾過する。
【００３８】
濾過後のタンパク質は予め８Ｍ尿素溶液に１％ＳＤＳを加えた溶液で平衡化したＳ−３００ゲル濾過カラムで分離精製する。得られたタンパク質画分は尿素を段階的に減らして透析を行い、最終的にＴＥに溶解したキメラタンパク質溶液を得た。透析終了後孔径０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、最終精製品とした。
【００３９】
図２Ａは精製した組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルー染色したものである。図中の各レーンの表示は、以下のものを表す。マーカーはタンパク質のサイズマーカー、ＨＢｃは精製したＨＢｃタンパク質、４０９、４３４、５２３は夫々ＨＣＶ  Ｅ２キメラタンパク質のＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４０９−４２３）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４３４−４４６）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ５２３−５３７）を示す。また、矢印は、配列より推定されるキメラタンパク質の分子量を示す。
【００４０】
図２Ａに示すように、組換えタンパク質を泳動した各レーンでは、主要なバンドとしてキメラタンパク質の存在が確認される。
【００４１】
さらに、ウェスタンブロット法により、キメラタンパク質が発現していることを確認した。一次抗体としてＨＢｃの２〜１０番目のアミノ酸配列を認識するマウスモノクローナル抗体、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウス抗体を用い、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法により発色させた（図２Ｂ）。
【００４２】
図２Ｂ中、４０９、４３４、５２３は、ＨＣＶ  Ｅ２キメラタンパク質であるＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４０９−４２３）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４３４−４４６）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ５２３−５３７）を示す。いずれのキメラタンパク質も抗ＨＢｃ抗体との反応性を有している。したがって、ＨＢｃのプラットフォームにＨＣＶ  Ｅ２タンパク質が組み込まれたキメラタンパク質が発現していることが示されている。
【００４３】
３．免疫原性の確認
上記で発現精製した３種の精製抗原をウサギ（各２匹）に免疫し、抗血清を採取した。抗原溶液は、アジュバントと等量混合し、エマルジョンの状態でウサギの背部皮下に投与した。なお、初回免疫にはフロイント完全アジュバントを用い、２回目以降の免疫にはフロイント不完全アジュバントを用いた。
【００４４】
投与週は０、２、４、６週、初回免疫０．６ｍｇ／匹、２回目以降は０．３ｍｇ／匹で行った。抗体価は、ＢＳＡに結合させた合成ペプチドを抗原として用い、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００４５】
ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４３４−４４６）を免疫したウサギでは、抗原に対する反応は見られなかったが、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４０９−４２３）、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ５２３−５３７）では、抗体が産生していることが確認された。ＥＬＩＳＡによる抗体産生確認の結果を図３に示す。図中、４０９は、キメラタンパク質ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４０９−４２３）を、５２３はＨＢｃ−Ｅ２（ａａ５２３−５３７）を免疫したウサギの抗体価を示す。
【００４６】
なお、ＨＢｃ−Ｅ２（ａａ４３４−４４６）に抗原性が見られなかった理由としては、ＨＣＶ  Ｅ２の４３４−４４６アミノ酸の合成ペプチドが不溶性であり、ＨＢｃとのキメラタンパク質とした場合にも、ＨＣＶペプチド領域がキメラタンパク質表面に表出せず、抗原性を持たなかった可能性が考えられる。
【００４７】
あるいは、ＨＣＶ  Ｅ２の４３４−４４６アミノ酸領域が、コンフォメーショナルエピトープであり、キメラタンパク質の環境では立体構造がうまく形成さなかった可能性や、ＨＣＶ  Ｅ２の４３４−４４６アミノ酸領域によって、ＨＢｃの粒子形成が妨げられた可能性が挙げられる。
【００４８】
本発明は、ＨＣＶ  Ｅ２の４０９−４２３番目のアミノ酸、及び５２３−５３７番目のアミノ酸配列をＨＢｃタンパク質のメジャーエピトープの部分と組み換えたキメラタンパク質が免疫原性を有することを初めて示したものである。条件を検討し、ＨＣＶ  Ｅ２ペプチドを提示したＨＢｃ粒子を作成することができれば、さらに免疫原性の高い抗原とすることができる。
【００４９】
以上、示したように、ＨＣＶ  Ｅ２ペプチドとして、中和抗体として作用し得るアミノ酸配列４０９−４２３、５２３−５３７番目は、ＨＢｃとのキメラタンパク質として高い免疫原性を示す。
【００５０】
したがって、この抗原を用いてヒトに免疫することにより、ＨＣＶの中和抗体を産生し得ることから、ワクチンとしての利用が期待できる。また、本発明の組換え抗原を用いれば、すべてのＨＣＶに対して反応する抗体を得ることができることから、汎用性の高い診断ツールを得ることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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