(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも９０％同一である、可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも９０％同一である、可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含み、
前記構築ブロックが、５’末端において少なくとも１つの結合部位と、３’末端において少なくとも１つの結合部位とを含む、ライブラリ。
【請求項２】
第１の構築ブロックの３’末端の結合部位が、第１の構築ブロックの３’末端に結合する第２の構築ブロックの５’末端の結合部位と適合性である、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項３】
前記可変ＴＣＲ  α鎖領域が、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも９５％同一であり、前記可変ＴＣＲ  β鎖領域が、配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも９５％同一である、請求項１または２のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項４】
以下の構築ブロック：
−  前記ＡＶセグメントの３’末端を前記ＡＣセグメントの５’末端に結合させるリンカー配列と、
−  前記ＢＶセグメントの３’末端を前記ＢＣセグメントの５’末端に結合させるリンカー配列と
をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項５】
前記可変ＡＶセグメントが、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、前記可変ＢＶセグメントが、配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする、請求項１から４のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項６】
前記可変ＡＶセグメントが、配列番号８から配列番号５２に記載の配列を有し、前記可変ＢＶセグメントが、配列番号５３から配列番号９９に記載の配列を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項７】
前記ＴＣＲ構築物が、少なくとも１つの骨格ベクターに組み込まれており、前記骨格ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）骨格ベクター、レトロウイルス骨格ベクター、およびレンチウイルス骨格ベクターからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項８】
１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖とをコードするＴＣＲ構築物が、前記骨格ベクターに組み込まれ、１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖とをコードする前記ＴＣＲ構築物において、１つのＴＣＲ  α鎖をコードする配列と１つのＴＣＲ  β鎖とをコードする配列とが、リボソームスキッピングエレメントによって連結されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項９】
前記ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターが、少なくとも１つのＲＮＡ安定化配列を含む、請求項７に記載のライブラリ。
【請求項１０】
前記ＡＶセグメントの３’末端を前記ＡＣセグメントの５’末端に結合させる前記リンカー配列を、ＣＤＲ３Ａ配列およびＡＪ配列に交換すると、機能的ＴＣＲ  α鎖をコードする構築物が得られ、前記ＢＶセグメントの３’末端を前記ＢＣセグメントの５’末端に結合させる前記リンカー配列を、ＣＤＲ３Ｂ配列、ＢＤおよびＢＪ領域に交換すると、機能的ＴＣＲ  β鎖をコードする構築物が得られる、請求項４から９のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項１１】
可変セグメント、リンカー配列、およびＣセグメントを単一のクローニングステップで交換することができる、請求項４から１０のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項１２】
前記可変ＡＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続き、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が続き、前記定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続き、ならびに
前記可変ＢＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続き、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｔＥＩＩ制限部位が続き、前記定常ＢＣセグメントの前にＢｓｐＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く、請求項１から１１のいずれか一項に記載のライブラリ。
【請求項１３】
ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも９０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と
を含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも９０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と
を含む、ライブラリ、および
−  （ｉ）ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉ）ＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖ）ＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システム。
【請求項１４】
（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む、請求項１３に記載の発現システム。
【請求項１５】
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンの集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含む、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  β鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物を含み、ならびに
異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  α鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含む、
ライブラリ。
【請求項１６】
前記細胞クローンがＢＷ−／−細胞株および／または機能的ＴＣＲを欠損するＪｕｒｋａｔ細胞株の細胞クローンである、請求項１５に記載の細胞クローンのライブラリ。
【請求項１７】
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団とを含む、ＴＣＲタンパク質のライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、ＴＣＲ  β鎖とを含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つと、ＴＣＲ  α鎖とを含む、ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリに言及する。さらに、本発明は、ＴＣＲを発現させるための発現システムに関する。
【０００２】
加えて、本発明は、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリに言及する。その上、本発明は、ＴＣＲタンパク質のライブラリに関する。
【背景技術】
【０００３】
それぞれのＴ細胞受容体は、１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖とで構成されるヘテロ二量体タンパク質複合体である。ＴＣＲヘテロ二量体は、ＴＣＲのシグナル伝達装置としての役割を果たす一連の非多型タンパク質からなるＣＤ３複合体と会合してＴ細胞の細胞表面上に発現される。分子レベルで、ＴＣＲ  αおよびβ鎖は、初期Ｔ細胞発達の際に多数の生殖系列コード遺伝子セグメントから無作為にアセンブルされる。Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成と呼ばれるプロセスにおいて、ＴＣＲ  α鎖は、単型の定常（ＡＣ）領域と共に、１つの多型の可変（ＡＶ）および結合（ＡＪ）遺伝子セグメントからアセンブルされる。ＴＣＲ  β鎖の再構成部分は、多様性（ＢＤ）遺伝子セグメントがさらにその間に介在する、１つのＢＶおよびＢＪセグメントからなる。遺伝子セグメント再配列のプロセスの間に、結合領域に隣接する生殖系列コード配列が付随して修飾される。個々のＶ（Ｄ）Ｊセグメント接合部に及ぶ、得られた超可変配列は、ＣＤＲ３領域（相補性決定領域３）として知られ、次いでペプチドがロードされたＭＨＣ分子上のＴＣＲによる特異的エピトープ認識を決定する。
【０００４】
ＣＤ３に会合して発現されるヘテロ二量体タンパク質として、ネイティブＴＣＲは、非常にコンフォメーション依存的構造である。
【０００５】
ＴＣＲ遺伝子移入は、養子細胞治療のための抗原特異的Ｔ細胞を産生するために都合のよい方法である。したがって、治療的ＴＣＲを作製するための有効なツールが必要である。個々のＴＣＲ配列を完全に特徴付けするためには、治療にとって有用な単離ＴＣＲのみを、その遺伝子セグメント組成およびＣＤＲ３領域の正確な配列に関して分析しなければならない。配列情報に基づいて、ＴＣＲを、ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の対応する可変、定常、およびＣＤＲ３領域の組合せによって容易に再設計することができる。したがって、既知の配列のＴＣＲを効率的かつ費用効果がある方法で発現させるために、ＴＣＲ  ＡＣおよびＴＣＲ  ＢＣセグメントの他に、４５個全ての機能的ＴＣＲ  ＡＶセグメントおよび４７個全ての機能的ＴＣＲ  ＢＶセグメントの完全なレパートリーを含むライブラリが必要である。
【０００６】
技術の進歩にもかかわらず、多様な候補ＴＣＲの機能を特徴付けしなければならない場合、完全長のＴＣＲ構築物のＤＮＡ合成はなおも非経済的であると考えなければならない。このように考えると、改善されたＴＣＲ配列が合成された後、Ｃ領域改善の変化に関してそれを遡及的に変更することはできない。異なる立体配置を評価する場合、遺伝子合成には、あらゆる候補ＴＣＲに関して多数の完全なＤＮＡ配列を合成することが必要で、これには高い費用がかかる。
【０００７】
ＴＣＲ発現クローニングに対する、より柔軟で費用効果があるアプローチの必要性に応えるために、本発明者らは、ＴＣＲ配列の迅速な再構築を可能にして、ＴＣＲサブドメインの制限されない交換を可能にするＴＣＲライブラリシステムを開発した。
【０００８】
異なる構築ブロックを有するモジュラーシステムによって、異なるＴＣＲ領域（可変、定常、ＣＤＲ３）を交換することが可能である。このシステムは、それによって異なる特異性を有するＴＣＲを構築することができる。加えて、異なる種を起源とする領域または改変配列を容易に交換することができ、すなわち、ヒト定常領域をマウス定常領域、最少マウス化、またはシステイン改変領域と容易に交換することができる。さらに、ＴＣＲ構築物を、一過性の発現と安定な発現との間で容易に切り替えることができる異なる発現システムに容易に組み込むことができる。
【０００９】
加えて、ＴＣＲの複雑な構造は、異なるＶ領域を識別するために使用することができるエピトープの露出に強く影響を及ぼす。
【００１０】
このことは、ヒトＴＣＲをそのネイティブコンフォメーションで発現する全細胞免疫原を使用するＶ領域のコンフォメーション依存的提示が、免疫のために必要であり、Ｖ領域特異的ｍａｂのスクリーニングにとって必要であることを意味する。
【００１１】
したがって、Ｖ領域に対して特異的であるＴＣＲ特異的抗体を作製するためには、全ての異なる機能的ＴＣＲ可変α鎖およびＴＣＲ可変β鎖をそのネイティブコンフォメーションで含む完全なＴＣＲレパートリーを発現させる有効なツールが必要である。
【００１２】
したがって、このＴＣＲライブラリは、ＴＣＲの効率的な作製ならびにＴＣＲ特異的抗体の作製の両方のために使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の要求に応えるために、本発明の１つの目的は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリを提供することである。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリ、および
−  少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター、および／または
−  少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクター
を含む発現システムを提供することである。
【００１５】
したがって、本発明のもう１つの目的は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンの集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含む、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団とを含む、ＴＣＲタンパク質のライブラリを提供することである。
【００１７】
より正確には、本出願は、第１の態様において、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つと、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つと、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）定常ＢＣセグメントと
を含むライブラリに関する。
【００１８】
詳しくは、本出願は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
−  配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含むライブラリに関する。
【００１９】
ある特定の実施形態において、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントは、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒトまたはその組合せである。
【００２０】
好ましい実施形態において、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントは、マウスまたはヒトである。
【００２１】
他の実施形態において、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントはヒトまたはマウス、好ましくはヒトである。
【００２２】
具体的実施形態において、ＡＣセグメントは、配列番号１、２、または６に記載の配列を有し、ＢＣセグメントは、配列番号３、４、５または７に記載の配列を有する。
【００２３】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶ１〜ＡＶ４５セグメントは、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列を有し、可変ＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列を有する。
【００２４】
典型的に、ＴＣＲ構築物は、少なくとも１つの骨格ベクターに組み込まれている。
【００２５】
ある特定の実施形態において、ＴＣＲ  α鎖をコードするＴＣＲ構築物またはＴＣＲ  β鎖をコードするＴＣＲ構築物はそれぞれ、１つの骨格ベクターに個々に組み込まれている。あるいは、１つのＴＣＲ  α鎖および１つのＴＣＲ  β鎖をコードするＴＣＲ構築物は、骨格ベクターに組み込まれている。
【００２６】
ある特定の実施形態において、１つのＴＣＲ  α鎖および１つのＴＣＲ  β鎖をコードするＴＣＲ構築物において、１つのＴＣＲ  α鎖をコードする配列と１つのＴＣＲ  β鎖をコードする配列は、リボソームスキッピングエレメント、好ましくはＰ２Ａエレメントによって連結されている。
【００２７】
ある特定の実施形態において、骨格ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）骨格ベクター、レトロウイルス骨格ベクター、またはレンチウイルス骨格ベクターからなる群から選択される。好ましくは、骨格は、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、またはレトロウイルス骨格ベクターである。典型的に、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、少なくとも１つのＲＮＡ安定化配列、例えば、ポリアデニンテールを含み、ポリアデニンテールは、少なくとも４０個のアデニン、好ましくは少なくとも１１０個のアデニンを含む。
【００２８】
ベクターは、それぞれのセグメントまたはセグメントの変化形（可変Ｖ、リンカー配列、および定常Ｃセグメント）を、単一ステップ技法で容易に交換することができるように構築される。例えば、リンカー領域を、分析される候補ＴＣＲの任意のＣＤＲ３領域に迅速に交換することができる。それによって、ヒトＴＣＲレパートリーの多様性を利用する非常に柔軟で経済的なアプローチが開発される。その上、マウス定常領域を、その最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒト相対物に迅速に交換することができ、それによって最大の柔軟性を有するＴＣＲ発現クローニング戦略を提供することができる。
【００２９】
これを達成するために、構築ブロックは、５’末端において少なくとも１つの結合部位、および３’末端において少なくとも１つの結合部位を含む。より詳しくは、第１の構築ブロックの３’末端の結合部位は、第１の結合ブロックの３’末端に結合されうる第２の構築ブロックの５’末端の結合部位と適合性である。
【００３０】
モジュラーベクターシステムによって、一過性のトランスフェクションおよび形質導入の両方に関して構築物の容易な作製が可能となり、それによって、レシピエントＴ細胞のゲノムにＴＣＲ構築物を安定に組み込むことができる。
【００３１】
レシピエントＴ細胞のＴＣＲトランスフェクションは、当初のＴ細胞クローンがもはや入手可能でない場合または面倒なＴ細胞培養を回避すべきであるときには常に、候補ＴＣＲのさらなる特徴付けのための簡潔で迅速なアプローチとして使用することができる。さらに、ＴＣＲトランスフェクトＴ細胞は、その一過性の発現により、養子移入したＴ細胞の有害な治療上の副作用を完全に排することができない臨床の状況において、永続的にＴＣＲを遺伝子操作されたレシピエント細胞に対するより安全な代替となる。
【００３２】
その上、レトロウイルス骨格ベクターは、適切なレシピエント細胞におけるＴＣＲトランスジーンの安定な発現を可能にする（Schambach et al., 2000; Hildinger et al., 1999）。レトロウイルスおよび関連するレトロトランスポジション可能なエレメントは、それらが隣接するＤＮＡの再配列を伴うことなく、定義されたコピー数で挿入することができることから、標的細胞にトランスジーンを安定に送達するための独自のツールである。候補ＴＣＲ構築物を含むレシーバープラスミド（ｐＲ）を、ウイルス産生のために使用する。トランスジーンを有するレトロウイルスを次に、標的細胞の形質導入のために利用する。トランスジェニックＴＣＲを永続的に発現する形質導入されたレシピエント細胞は、容易に大量に産生することができ、したがってＴＣＲ特徴付けおよび先進安全性試験ならびに臨床応用にとって適している。
【００３３】
本発明のもう１つの態様は、ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つ、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つ、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含むライブラリ、および
−  （ｉ）ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉ）ＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターからなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖ）ＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターからなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システムに関する。
【００３４】
本発明のある特定の実施形態において、上記の発現システムは、
（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む。
【００３５】
類似の態様において、本発明は、ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つを含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つを含むライブラリ、および
−  （ｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システムに関する。
【００３６】
ある特定の実施形態において、この発現システムは、
（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む。
【００３７】
もう１つの態様において、本発明は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンの集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含むＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  β鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含み、および
異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  α鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含む、
ライブラリを提供する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団とを含む、ＴＣＲタンパク質のライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、ＴＣＲ  β鎖と
を含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つと、ＴＣＲ  α鎖と
を含む、ライブラリに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１Ａ：ＴＣＲ  αおよびβ鎖を含む細胞表面上のＴＣＲ複合体ならびにＣＤ３複合体（ε、γおよびδ鎖）を示す略図である。ＴＣＲは、可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域からなる２つの異なるタンパク質鎖、αおよびβで構成される。ＴＣＲ  αおよびβ鎖の両方の可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含み、中でもＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。図１Ｂ：モジュールで表したレトロウイルスＴＣＲ発現ベクターシステム。ｐＲＡＶｘ（ｐＲＢＶｘ）ベクターシステムは、ｐＭＰ７１骨格（Schambach A, Wodrich H, Hildinger M, Bohne J, Krausslich HG, Baum C., Mol Ther. 2000 Nov; 2(5):435-45.; Hildinger M, Abel KL, Ostertag W, Baum C., J Virol. 1999 May; 73(5):4083-9.）に基づく。それぞれのベクターは、マウス定常α（ｍＣＡ）またはβ定常（ｍＣＢ）領域、ならびに４５個のヒトＡＶまたは４７個のヒトＢＶ領域（ｈＡＶｘおよびｈＢＶｘ）の１つを含む。それぞれのベクターは、ＯＴ−１特異的Ｔ細胞クローンに由来する同一のＣＤＲ３領域を含む。４５ｐＲＡＶｘは、レトロウイルス（ＲＶ）を産生するために連続的に使用される。１つのＡＶ特異的ＲＶを使用して、マウス定常βおよびヒトＢＶ領域を含むＴＲＢＶ鎖をコードする第２のＲＶと共にレシピエントＴ細胞に形質導入する。同様に、選択されたヒトＢＶ領域を発現する細胞を、マウス定常αおよびヒトＡＶ領域を含むＴＲＡＶをコードするｐＲＡＶを一連のｐＲＢＶｘベクターと共に使用して産生する。５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲは、５’および３’レトロウイルス長末端反復を指す。
【図２】形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞株および選択されたクローン上での表面ＴＣＲ発現を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ細胞にレトロウイルスを形質導入して、マウスβ鎖定常領域（ｍＣＢ）の表面発現に関して染色した。ＴＣＲ陽性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーターを使用して直接ソーティングするか、または限界希釈によって手動でサブクローニングした。
【図３】ＴＣＲ細胞ライブラリを示す図である。ａ）完成時のマウスＢＷ−／−ＴＣＲライブラリは、ヒト配列を表すために明るい灰色（勾配）で示す、４５個の異なるヒトＡＶおよび４７個の異なるヒトＢＶ  ＴＣＲ領域を発現する。ＴＣＲの他の全ての領域は、それがマウス起源であることを示すために暗い灰色で示す。マウス細胞ライブラリを免疫のために使用する。ｂ）選択されたＲＶによるレトロウイルス形質導入の際に、細胞を抗ｍＣＢ特異的抗体によって染色した。陽性細胞をソーティングして、ＴＣＲ発現をＢＷ−／−親細胞、形質導入前のレシピエントＢＷ−／−細胞、ソーティング前のＡＶ９形質導入ＢＷ細胞（ＢＷ−ＡＶ９細胞株）、およびソーティングしたＢＷ−ＡＶ９細胞株と比較した。ｃ）完全なＪｕｒｋａｔ  ＴＣＲライブラリは４５個の異なるヒトＡＶおよび４７個の異なるヒトＢＶ  ＴＣＲ領域を発現する。このヒトＪｕｒｋａｔライブラリをスクリーニングに使用する。ｄ）ＴＲＡＶ９可変領域に対して特異的なプライマーおよびＴＲＡＶ１領域に対して特異的な対照プライマーを、形質導入およびソーティングしたＢＷ−ＡＶ９細胞株からのｃＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅のために使用した。次に、増幅されたＤＮＡバンドを切り出して、シークエンシングし、ＡＶ９配列をＩＭＧＴデータベースのＡＶ９配列とのアライメントによって確認した。
【図４】ＢＷ−／−およびＪｕｒｋａｔ−／−細胞を使用した異種間スクリーニングを示す図である。ＢＷ−ＴＣＲ形質導入細胞を免疫に使用したが、これらの細胞は、本明細書において抗ヒトＡＶ１２−２特異的ハイブリドーマ上清ならびに抗ヒトＢＶ１２−３特異的上清に関して示されるように、マウスまたはラットＩｇに非特異的に結合することから、ハイブリドーマスクリーニングのために使用することができなかった。両方のハイブリドーマ上清が、そのＴＣＲ発現によらず、ＢＷ−／−細胞を染色する（ａおよびｂの最初の列）。これに対し、Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞が特異的ＡＶまたはＢＶ  ＴＣＲ鎖を発現する場合に限って、同じ上清がＪｕｒｋａｔ−／−細胞を染色する（ａおよびｂの２列目）。ＴＣＲを発現させるためにＴＣＲ形質導入ＢＷ−／−細胞に、ＣＤ３−ＧＦＰも安定に形質導入した。これは、その中程度のレベルのＧＦＰの原因である。ＴＣＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞における非特異的ＴＣＲ結合と特異的ＴＣＲ結合とを識別するために、安定なＪｕｒｋａｔ−／−細胞クローンに高レベルのＧＦＰを形質導入して発現させ、ハイブリドーマ上清のスクリーニングの際の対照として使用した。ヒストグラムの左上の角の位置は、非常に高いＧＦＰシグナルを示し、これはＢＷ−／−細胞におけるより低レベルのＧＦＰと区別することができる。示されるように、Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ細胞は、ＡＶまたはＢＶ特異的ｍａｂのいずれかを含む上清によって試験したときに非標識のままである（ａおよびｂの２列目）。これは、ＡＶまたはＢＶ特異的ｍａｂを含む上清の存在下で左にシフトしないことによって示される。
【図５】ハイブリドーマクローン１５Ｂ４（図５Ａ）および５Ｈ４（図５Ｂ）を含むプールしたハイブリドーマ上清の一次スクリーニングを示す図である。プールしたハイブリドーマ上清を、４つの異なるＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞および１０％ＧＦＰ発現陰性対照細胞のプールを使用してスクリーニングした。細胞の約４５％がＴＣＲ発現細胞においてａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６４７に向かってシフトすると予想されるが、プールした上清に個々のＢＶ領域に対して特異的なｍａｂが存在する場合には、Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ分画ではシフトしなかった。
【図６】単一のハイブリドーマ上清の二次スクリーニング。単一のプレートのハイブリドーマ上清を、４つの異なるＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞のプールおよび１０％ＧＦＰを発現する陰性対照細胞を使用してスクリーニングした。１５Ｂ４を含む二次スクリーニングを図６Ａに示す。５Ｂ４を含む二次スクリーニングを図６Ｂに示す。
【図７】ヒトＡＢａｂ  ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるＢＶクラスタ発現Ｔ細胞のクラスタＴＣＲ特異的ｍａｂによるｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇の実験設定を示す図である。
【図８】トランスジェニックの設定におけるＴＣＲの誤った対形成を低減させるための異なるＴＣＲ構築物の構造を示す図である。野生型ＴＣＲは、ヒト定常領域（ｈｕＣα、ｈｕＣβ）と、２つのＴＣＲ鎖を２つのシステイン残基（Ｃｙｓ）を介して連結する１つのジスルフィド結合とを含む。Ｃｙｓ突然変異体は、さらなるジスルフィド結合を含み、したがって改変されたＴＣＲ鎖の間の連結を増加させる。マウス化構築物では、安定な表面発現および好ましい対形成を増強するために、ヒト定常領域がマウス定常領域（ｍｕＣα）に交換されている。外因性のマウスセグメントによる起こりうる免疫原性を低減させるために、最小のマウス化構築物は、改善された表面発現および対形成にとって必要な重要なマウスアミノ酸のみを含む。
【図９】モジュール化したベクターシステムを示す図である。図９Ａ：それぞれのセグメントまたはセグメント変種（可変領域、ＣＤＲ３領域を含むリンカー配列、および定常Ｃ領域）ならびに任意のベクター骨格（例えば、レトロ、レンチ、トランスポゾン、−ｉｖｒＲＮＡ）を単一ステップの技法で容易に交換することができるように、ＴＣＲ構築物を構築する。それによって、任意の型のＴＣＲ鎖を、可変領域の交換によって作製することができる。例えばハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドによって導入することができる所望のＣＤＲ３領域の導入によって、特異性を切り替えることができる。その上、セグメントもまた、異なる種のバージョンおよび改変バージョン（ヒト、マウス、システイン操作）の間で切り替えることができる。図９Ｂ：再構成されたＴＲＡＶおよびＴＲＢＶ鎖を、Ｐ２Ａ配列によって分割された全遺伝子と同じベクターに導入することができる。あるいは、ＡＶ−ＣＤＲ３−ＪおよびＢＶ−ＣＤＲ３−Ｊ／Ｄを、ベクター骨格に既に組み込まれているマウスまたはヒト定常領域の直前に導入することができる。
【図１０】マウス定常セグメントを有する例としてのベクターのベクターマップを示す図である。図１０Ａは、ヒトＡＶ１−１、ＯＴ１  ＴＣＲ  α鎖に由来するＣＤＲ３、およびマウスα定常領域で構成されるＴＣＲ  α鎖を有するレトロウイルスベクターの例を示す。このベクターの配列を配列番号２０４に示す。図１０Ｂは、ヒトＢＶ２、ＯＴ１  ＴＣＲ  β鎖に由来するＣＤＲ３、およびマウス定常β領域で構成されるＴＣＲ  β鎖を有するレトロウイルスベクターの例を示す。このベクターの配列を配列番号２０５に記載する。
【図１１】ヒト定常領域を含む例としてのベクターのベクターマップを示す図である。図１１Ａは、ヒトＡＶ１４、Ｔ１．８  ＴＣＲ  α鎖に由来するＣＤＲ３、およびマウスヒト定常領域で構成されるＴＣＲ  α鎖を有するレトロウイルスベクターの例を示す。このベクターの配列を配列番号２０８に記載する。図１１Ｂは、ヒトＢＶ２７、Ｔ１．８  ＴＣＲ  β鎖に由来するＣＤＲ３、およびマウス定常β領域で構成されるＴＣＲ  β鎖を有するレトロウイルスベクターの例を示す。このベクターの配列を配列番号２０９に記載する。
【図１２】単離されたＴＣＲの再設計を示す図である図１２Ａ：単離Ｔ細胞クローンＴ１．８−３−２００の機能分析。Ｔ細胞クローンＴ１．８−３−２００と、ＨＬＡをマッチさせたＮＹ−ＥＳＯ１−Ｘ（シグナルペプチドに融合させたヒトＮＹ−ＥＳＯ１抗原）をロードしたＡＰＣとの同時培養物のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）測定。図１２Ｂ：Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲ  α鎖のＩＭＧＴ配列分析。図１２Ｃ：Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲ  β鎖のＩＭＧＴ配列分析。図１２Ｄ：ＴＣＲ  Ｔ１．８−３−２００のトランスジェニック機能分析。Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲトランスフェクトＰＢＬと、ＨＬＡをマッチさせたＮＹ−ＥＳＯ１−ＸロードＡＰＣとの同時培養物のＩＦＮ−γ測定。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明をその好ましい実施形態の一部に関して詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。
【００４１】
以下に例証によって説明される本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、制限または複数の制限の非存在下で適切に実践することができる。
【００４２】
本発明を、特定の実施形態に関しておよびある特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００４３】
用語「含む」が、本明細書の説明および特許請求の範囲において使用される場合、他の要素を除外しない。本発明の目的に関して、用語「からなる」は、用語「から構成される」の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書において以降、ある群が少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義されるとき、これは同様に、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を開示すると理解すべきである。
【００４４】
本発明の目的に関して、用語「得られた」は、用語「得ることができる」の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書において以降、例えば抗体が特定の起源から得ることができると定義される場合、この起源から得られた抗体も同様に開示すると理解すべきである。
【００４５】
単数の名詞を指す場合に不定冠詞または定冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その」を使用する場合、それ以外であることが具体的に述べられている場合を除き、その名詞の複数形を含む。本発明の文脈における用語「約」または「およそ」は、当業者が、当の特徴の技術的効果をなおも保証すると理解する精度の間隔を指す。用語は典型的に、表記の数値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を示す。
【００４６】
技術用語は、その一般的な意味で使用される。ある特定の用語に特別の意味を伝える場合、用語の定義を、用語が使用される本文においてその後に示す。
【００４７】
本発明の１つの態様は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴ細胞受容体可変α（ＴＣＲ  Ｖα）鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴ細胞受容体可変β（ＴＣＲ  Ｖβ）鎖に結合する抗体またはその結合断片を指す。
【００４８】
本明細書において使用される用語「一部分」、「一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖」、または「一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖」は、全てのＴＣＲ  Ｖα鎖または全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖の群より小さいが、単なる１つの特異的ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖よりは大きい、抗体が結合しているＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖の特異的な群を意味する。
【００４９】
言い換えれば、本発明に従う抗体または結合断片は、１つのＴＣＲ  Ｖα鎖、すなわちＴＣＲ  Ｖα鎖の型、または１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖、すなわちＴＣＲ  Ｖβ鎖の型に結合するのみならず、複数のＴＣＲ  Ｖα鎖、すなわちＴＣＲ  Ｖα鎖の型、またはＴＣＲ  Ｖβ鎖、すなわちＴＣＲ  Ｖβ鎖の型に結合する。
【００５０】
本発明の抗体または結合断片は、全ての機能的ＴＣＲ  Ｖα鎖より小さい一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合するか、または全ての機能的ＴＣＲ  Ｖβ鎖より小さい一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する。言い換えれば、本発明の抗体は、全てのＴＣＲ  Ｖα鎖および／または全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖、特に全ての機能的ＴＣＲ  Ｖα鎖または機能的ＴＣＲ  Ｖβ鎖を認識する汎特異的抗体ではない。
【００５１】
用語「機能的ＴＣＲ  Ｖα鎖」または「機能的ＴＣＲ  Ｖβ鎖」、または「機能的ＴＣＲ可変鎖」は、Ｔ細胞上に発現されるＴＣＲ可変鎖に関連する。このことは、この用語が、偽遺伝子、すなわちフレームシフト突然変異または組換えシグナルの欠損を有する遺伝子などの、発現されないＴＣＲ可変鎖を含まないことを意味する。ＴＣＲ可変鎖が機能的であるか、またはむしろ偽遺伝子であるかの注釈は、例えば、Folch（"The Human T cell Receptor Beta Variable (TRBV) Genes", Folch Geraldibem Lefranc Maire-Paule, Exp Clin Immunogenet 2000;17:42-54）またはSu et al.（Chen Su and Masatoshi Nei, Mol.- Biol. Evol. 2001;18(4):505-513）において見出されうる。これに相応して、用語「機能的ＴＣＲ型」は、Ｔ細胞上に発現されたＴＣＲ可変鎖で構成されるＴＣＲを指す。
【００５２】
１つの実施形態において、抗体またはその結合断片は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する。このため、本発明は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体またはその結合断片を企図する。異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖の多数（例えば、２個の異なるＶβ鎖と比較して２０個の異なるＶβ鎖）に結合する抗体またはその結合断片は、これらの抗体が、例えば異なる患者におけるＴＣＬなどのＴＣＲ関連疾患に関してより広く使用可能でありうることから、一般的に特に重要である。
【００５３】
具体的実施形態において、抗体またはその結合断片は、表１のＴＣＲ  Ｖβ鎖からなる群から選択される３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖からなる一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する。
【００５４】
もう１つの実施形態において、抗体またはその結合断片は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する。このため、本発明は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９  １０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する抗体またはその結合断片を企図する。異なるＴＣＲ  Ｖα鎖の多数（例えば、２個の異なるＶα鎖と比較して２０個の異なるＶα鎖）に結合する抗体またはその結合断片は、これらの抗体が、例えば異なる患者におけるＴＣＬなどのＴＣＲ関連疾患に関してより広く使用可能でありうることから、一般的に特に重要である。
【００５５】
具体的実施形態において、抗体またはその結合断片は、表１のＴＣＲ  Ｖα鎖からなる群から選択される３、４、５、６、７、８、９  １０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖からなる一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する。
【００５６】
【表１】
0006568239.tif 000002
【００５７】
【表２−１】
0006568239.tif 000003
【００５８】
【表２−２】
0006568239.tif 000004
【００５９】
【表２−３】
0006568239.tif 000005
【００６０】
ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列はリーダー配列を含む。成熟の際に、リーダー配列は切断され、このことは、ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の可変領域のタンパク質配列がリーダー配列を含まないことを意味する。したがって、本明細書において開示されるＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の可変領域のアミノ酸配列は、リーダー配列を含まない。
【００６１】
ＴＣＲ  α鎖ＡＶ１−１の可変領域は、ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１（配列番号８）によってコードされ、配列番号１００のアミノ酸配列を有する。
【００６２】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７は、配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする。
【００６３】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７は、配列番号１４５〜配列番号１９９に記載の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする。
【００６４】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７は、配列番号１４５〜配列番号１９９に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする。
【００６５】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列と少なくとも８０％同一である配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列と少なくとも８０％同一である配列を有する。
【００６６】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である配列を有する。
【００６７】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５セグメントは、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列を有する。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖は、２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含み、または一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖は、２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む。
【００６９】
本明細書において使用される用語サブファミリーは、ＶＢ遺伝子の従来の遺伝子注釈を指す。命名法において、各遺伝子は２つの数字によって示される。最初の数字は、遺伝子が属するサブファミリーを表し、２番目の数字は、各サブファミリーにおける遺伝子の発見順序を示す。例えば、可変鎖ＢＶ６−１、ＢＶ６−２、ＢＶ６−４、ＢＶ６−５、ＢＶ６−６、ＢＶ６−８、ＢＶ６−９は、１つのサブファミリーに属する。
【００７０】
このため、ＴＣＲ  Ｖα鎖は、表３に示すように３４のサブファミリーに分類することができる。
【００７１】
【表３】
0006568239.tif 000006
【００７２】
【表４】
0006568239.tif 000007
【００７３】
本発明は、このため、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖は、当然、少なくとも２超、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーにも属しうる。多数の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーからＴＣＲ  Ｖα鎖を認識する抗体または結合断片は、一般的に、これらの抗体が例えば異なる患者におけるＴＣＬなどのＴＣＲ関連疾患にとってより広く使用可能でありうることから、特に重要である。そのような抗体またはその結合断片は、全てが同じサブファミリーに属する異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を認識するＴＣＲ特異的抗体またはその結合断片よりさらに広い応用を有しうる。
【００７４】
本発明は、相応して、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００７５】
本発明は、このため、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００７６】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００７７】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００７８】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも６つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００７９】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも７つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８０】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも８つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８１】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも９つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８２】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも１０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８３】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも１１個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８４】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも１２個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８５】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも１５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８６】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも２０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８７】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８８】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖が、少なくとも３０個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個の異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むことを企図する。
【００８９】
本発明は、このため、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、または少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖は、当然、少なくとも２超、例えば少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーにも属しうる。多数の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーからＴＣＲ  Ｖβ鎖を認識する抗体または結合断片は、一般的に、これらの抗体が例えば異なる患者におけるＴＣＬなどのＴＣＲ関連疾患にとってより広く使用可能でありうることから、特に重要である。そのような抗体またはその結合断片は、全てが同じサブファミリーに属する異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を認識するクラスタＴＣＲ特異的抗体またはその結合断片よりさらに広い応用を有しうる。
【００９０】
本発明は、相応して、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９１】
本発明は、このため、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９２】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９３】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９４】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも６つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９５】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも７つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９６】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも８つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９７】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも９個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９８】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも１０個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【００９９】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも１１個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１００】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも１２個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１０１】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも１５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１０２】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも１８個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１０３】
本発明はまた、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２１個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１０４】
表５は、異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖の群が、クラスタＴＣＲ特異的抗体またはその結合断片によって認識されうることを示す。
【０１０５】
【表５】
0006568239.tif 000008
【０１０６】
本発明はこのため、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表５の行Ｔ−１〜Ｔ−２１に定義される群の１つから選択される少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１０７】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１９に定義される群の１つから選択される少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１０８】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１７に定義される群の１つから選択される少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１０９】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１５に定義される群の１つから選択される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１０】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−２１に定義される群の１つから選択される少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１１】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１９に定義される群の１つから選択される少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１２】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１７に定義される群の１つから選択される少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１３】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１５に定義される群の１つから選択される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１４】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１９に定義される群の１つから選択される少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１５】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１７に定義される群の１つから選択される少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１６】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１５に定義される群の１つから選択される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１７】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１７に定義される群の１つから選択される少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１８】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する表５の行Ｔ−１〜Ｔ−１５に定義される群の１つから選択される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１１９】
表６は、クラスタＴＣＲ特異的抗体またはその結合断片によって認識されるＴＣＲ  Ｖβ鎖が、どの群のサブファミリーに属しうるかを示す。
【０１２０】
【表６】
0006568239.tif 000009
【０１２１】
本発明はこのため、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表６の行Ｆ−１〜Ｆ−２０に定義される少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことを企図する。
【０１２２】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表６の行Ｆ−１〜Ｆ−１８に定義される少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも３つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１２３】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表６の行Ｆ−１〜Ｆ−１５に定義される少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも４つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１２４】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表６の行Ｆ−１〜Ｆ−１３に定義される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１２５】
本発明は、一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖が、表６の行Ｆ−１〜Ｆ−１３に定義される少なくとも５つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個の異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むことをさらに企図する。
【０１２６】
抗体またはその断片が、可変ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合すると述べられている場合、このことは、抗体またはその断片が、前記可変鎖に特異的に結合する、すなわち他の可変鎖より大きい親和性で可変鎖に結合することを意味する。
【０１２７】
例えば、抗体または断片は、抗体または断片の可変領域が結合親和性の測定可能な差のために、類似であるが同一ではない配列の他の公知のポリペプチドと抗原とを識別する検出可能な優先性で同源の抗原を認識して結合する場合、その同源の抗原に対して特異的である。特異的抗体および断片はまた、抗体の可変領域外の配列との相互作用を通して、特に抗体または断片の定常領域の配列との相互作用を通して、他のタンパク質（例えば、ブドウ球菌（S. aureus）プロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用しうると理解される。抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当技術分野で周知であり、日常的に実践される。そのようなアッセイの包括的な考察に関しては、（例えば、4. Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6を参照されたい）。
【０１２８】
本発明の文脈において使用される抗体およびその結合断片は、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはモノクローナルキメラ抗体、ヒト化、またはヒト抗体でありうる。本明細書において記述される全ての実施形態に当てはまる特に好ましい態様は、モノクローナルヒト化抗体またはその結合断片に関する。
【０１２９】
抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスの抗体などの異なるサブタイプの抗体でありうる。ＩｇＧクラスの抗体は特に重要である。
【０１３０】
本明細書において記述される抗体または結合断片は、Ｔ細胞の亜集団を枯渇させることができる。このことは、Ｔ細胞の亜集団のみが枯渇されるが、残りの集団は枯渇後になおも存在することを意味する。
【０１３１】
特に、本明細書において記述される抗体または結合断片は、Ｔ細胞の特異的亜集団を枯渇させることができる。このことは、本発明の抗体が、抗体が結合している少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇させるか、または抗体が結合している少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇させることを意味する。残りのＴ細胞は、抗体が結合している少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を発現しないか、または抗体が結合している少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を発現しない。ＴＣＲ  Ｖα鎖の１つのみならず複数の異なる型またはＴＣＲ  Ｖβの複数の異なる型に結合することによって、Ｔ細胞の大きい集団における異なるＴ細胞を単一の抗体で特異的に枯渇させることができる。
【０１３２】
本明細書において記述される抗体または結合断片のこれらの特性によって、異常なＴ細胞を含むＴ細胞の亜集団を特異的に枯渇させるが、異常なＴ細胞を含まない残りのＴ細胞はインタクトのままとなりうる。したがって、本明細書において記述される抗体または結合断片は、特にＴＣＬなどのＴ細胞関連悪性疾患の治療物質として使用されうる。
【０１３３】
本明細書において記述される抗体または結合断片が、例えば異なるサブファミリーからの一部分のＴＣＲを認識できることを考慮すると、これにより、異常なＴ細胞を伴う異なる悪性疾患を、限定された組の抗体もしくはその結合断片によって、または単一の抗体もしくはその結合断片によって治癒することができる。
【０１３４】
その上、複数の異なるＴ細胞型の異常に関連する状態において、本明細書において記述される抗体または結合断片は、異なるＴ細胞型を一度に標的とすることができ、それぞれの個々のＴ細胞型を個別の特異的抗体または結合断片によって標的とする必要はない。異常なＴ細胞型の組合せに応じて、３から２０の異なるＴ細胞型などの異なる多数のＴ細胞型を含む異常なＴ細胞の集団を枯渇させるためには、例えば１つのみまたは例えば２つもしくは３つの異なる抗体の組合せが必要である。
【０１３５】
その上、本明細書において記述される抗体または結合断片は、治療目的のために使用する場合に、サイトカインストームの形態での炎症促進性サイトカインの放出を誘導しない。
【０１３６】
したがって、本発明は、薬剤として使用するための本明細書において記述される抗体またはその結合断片にも関する。
【０１３７】
特に、本出願は、Ｔ細胞白血病の処置に使用するための本発明に従う抗体またはその結合断片の提供に関する。
【０１３８】
相応して、本出願は、本発明に従う抗体およびその結合断片を投与することによってヒトまたは動物におけるＴ細胞白血病を処置する方法に関する。
【０１３９】
さらに、本出願は、Ｔ細胞白血病の処置のための薬剤の製造における本発明に従う抗体またはその結合断片に関する。
【０１４０】
より特異的な態様に眼を向けると、好ましい実施形態は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む一部分に結合する抗体またはその結合断片に関する。さらにより好ましい実施形態において、上記一部分は、異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖サブファミリーに属する少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む。そのような抗体または結合断片は、抗体が結合している少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇させるために使用されうる。
【０１４１】
そのような抗体またはその結合断片は、例示的な抗体１５Ｂ４の可変重鎖および／または可変軽鎖を含み、可変重鎖および／または可変軽鎖は、例示的な抗体１５Ｂ４の可変重鎖および／または可変軽鎖と少なくとも８０％の配列同一性を有する。１５Ｂ４は、ヒトＢＶ１２に結合するとして実験の章で同定された抗体である。したがって、この配列を使用して、この配列を変化させることによって１５Ｂ４と類似の特性を有する抗体を得ることができる。
【０１４２】
このため、他の企図される例示的な抗体またはその結合断片は、その可変重鎖および／または可変軽鎖内に、例示的な抗体１５Ｂ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みうる。そのような抗体はまた、その可変重鎖および／または可変軽鎖内に、例示的な抗体１５Ｂ４のＣＤＲと少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲを含みうる。
【０１４３】
１５Ｂ４の重鎖は、例えば配列番号２２３によってコードされる。１５Ｂ４の軽鎖は、例えば配列番号２２２によってコードされる。１５Ｂ４の重鎖はこのため、配列番号２２１に記載されるアミノ酸配列を有する。１５Ｂ４の軽鎖はこのため、配列番号２２０に記載されるアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
１５Ｂ４の可変重鎖は、配列番号２１９のアミノ酸配列を有する。１５Ｂ４の可変軽鎖は、配列番号２１８のアミノ酸配列を有する。１５Ｂ４の可変重鎖に関して、ＣＤＲ１は配列番号２１５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号２１６のアミノ酸配列を有し、およびＣＤＲ３は、配列番号２１７のアミノ酸配列を有する。１５Ｂ４の可変軽鎖に関して、ＣＤＲ１は、配列番号２１２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列「ＲＡＳ」を有し、およびＣＤＲ３は、配列番号２１４のアミノ酸配列を有する。
【０１４５】
そのような抗体またはその結合断片は、例示的な抗体５Ｈ４の可変重鎖および／または可変軽鎖を含み、可変重鎖および／または可変軽鎖は、例示的な抗体５Ｈ４の可変重鎖および／または可変軽鎖と少なくとも８０％の配列同一性を有する。５Ｈ４は、ヒトＢＶ１２に結合するとして実験の章で同定された抗体である。したがって、この配列を使用して、この配列を変化させることによって５Ｈ４と類似の特性を有する抗体を得ることができる。
【０１４６】
他の企図される例示的な抗体またはその結合断片は、このためその可変重鎖および／または可変軽鎖内で例示的な抗体５Ｈ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含みうる。そのような抗体はまた、その可変重鎖および／または可変軽鎖内に、例示的な抗体５Ｈ４のＣＤＲと少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲを含みうる。
【０１４７】
５Ｈ４の重鎖は、例えば配列番号２３７によってコードされる。５Ｈ４の軽鎖は、例えば配列番号２３６によってコードされる。このため、５Ｈ４の重鎖は、配列番号２３５のアミノ酸配列を有する。このため、５Ｈ４の軽鎖は、配列番号２３４のアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
５Ｈ４の可変重鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を有する。５Ｈ４の可変軽鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を有する。５Ｈ４の可変重鎖に関して、ＣＤＲ１は配列番号２２９のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号２３０のアミノ酸配列を有し、およびＣＤＲ３は、配列番号２３１のアミノ酸配列を有する。５Ｈ４の可変軽鎖に関して、ＣＤＲ１は、配列番号２２６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列「ＲＡＳ」を有し、およびＣＤＲ３は、配列番号２２８のアミノ酸配列を有する。
【０１４９】
好ましくは、これら全ての実施形態において、配列同一性は、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％または約９９％である。配列同一性は、それぞれの配列の全長にわたって決定されうる。
【０１５０】
２つの配列間の％同一性の決定は、好ましくは、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877の数学的アルゴリズムを使用して行われる。そのようなアルゴリズムは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge）で入手可能なAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol,. 215:403-410（参考文献を参照されたい）のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれている。
【０１５１】
％同一性の決定は、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的なパラメータによって実施される。
【０１５２】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴｎプログラムによって実施される。一般的パラメータに関して、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスを１００に設定し、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックを入れ、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスを１０に設定し、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスを２８に設定してもよい。スコアリングパラメータに関して、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」を１、−２に設定し、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスをリニアに設定してもよい。フィルターおよびマスキングパラメータに関して、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックを入れなくてもよく、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスにチェックを入れなくてもよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックを入れてもよく、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックを入れなくてもよい。
【０１５３】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムによって実施される。一般的パラメータに関して、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスを１００に設定して、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスにチェックを入れ、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスを１０に設定し、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスを「３」に設定してもよい。スコアリングパラメータに関して、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスを「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定して、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスを「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定し、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ」ボックスを「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」に設定してもよい。フィルターおよびマスキングパラメータに関して、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスにチェックを入れなくてもよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスにチェックを入れなくてもよく、および「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスにチェックを入れなくてもよい。
【０１５４】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与するまたは原因である抗体の相補性決定領域または超可変領域のアミノ酸残基を指す。本明細書において記述されるＣＤＲは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33: D593-D597）に従って、（Lefranc et al. Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）に記述されるように定義される。
【０１５５】
軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、特にそのような配列が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において有効であることが示されている場合には、他のヒト抗体に由来するフレームワークおよび定常領域のヒト配列の中に埋もれていることがありうる。この状況では、例えば治療応用のために使用して成功しているヒト化治療抗体のヒト定常およびフレームワーク配列を使用してもよい。軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、好ましくはヒトＩｇＧクラスのそのようなヒト化抗体のフレームワークおよび定常領域に組み込まれる。
【０１５６】
さらに、軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、本質的にフレームワークおよび定常領域に関してヒト配列の中で埋もれている。しかし、特にフレームワーク領域のみならず定常領域は、それらが、例えば抗原結合および／または例えばＡＤＣＣを増強することが知られているマウス抗体において典型的に見出されるアミノ酸を含みうる（例えば、欧州特許出願第０  ４５１  ２１６号明細書を参照されたい）。好ましくは、これらの抗体はＩｇＧクラスの抗体である。
【０１５７】
以下に、非ヒト由来抗体の免疫原性を低減させるために開発された、キメラ化またはヒト化のような複数の方法論を記述する。これらのアプローチはまた、例えば本明細書において後の実験で記述される免疫およびスクリーニングアプローチを使用して同定することができる他の抗体にも適用することができる。それらはこのため、ヒトＢＶ１２ではない他のヒトＶβ鎖を認識する、またはヒトＶα鎖を認識する抗体およびその結合断片にも応用することができる。
【０１５８】
ヒト化の際に、適切な抗体フォールディングまたは抗原認識にとって必須ではない全てのアミノ酸をヒト抗体相対物からのアミノ酸に交換する。従来のＣＤＲ移植、またはコンピューターモデリングおよびバイオインフォマティクス分析を伴うより新規のアプローチを含む、複数のｍａｂヒト化方法が開発されている。ＣＬ  １の重鎖および軽鎖のヒト化は、ＣＤＲ移植法を使用して実施された（例えば、Desmet et al. in Kontermann and Dubel (eds.) Antibody Engineering Vol. 1, p. 341ff; Bernett et al. J. Mol. Biol. (2010) 396, 1474-1490を参照されたい）。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来しうる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列でありうる。ヒト重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、例えば、Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) - Appendix IP A.1P.1-A.1P.37に記載され、ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（http://imgt.cines.fr）を介してアクセス可能である。１５Ｂ４のヒト化ＢＶクラスタｍａｂ  ＩＧＫ鎖配列を、ヒトＩＧＫＶ７−３＊０１（Ｐ）、ＩＧＫＶ３−１１＊０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５＊０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−７＊０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ１＊０１、および配列番号２２４に示されるラット１５Ｂ４  ＩＧＶＫ鎖に基づいて調製することができる。
【０１５９】
１５Ｂ４のヒト化ＢＶクラスタｍａｂ  ＩＧＨ鎖配列は、このため、ヒトＩＧＨＶ１−ｆ＊０、ＩＧＨＶ１−２４＊０１、ＩＧＨＪ６＊０１、ＩＧＨＤ３−１０＊０１および配列番号２２５に示されるラット１５Ｂ４  ＩＧＶＨ鎖に基づいて調製することができる。
【０１６０】
したがって、１５Ｂ４および５Ｈ４は、ヒトＶＢ１２以外のヒトＶβ鎖を認識する抗体またはその結合断片の例として役立つのみならず、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖を認識する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖を認識する抗体またはその結合断片の例としても役立つと理解される。
【０１６１】
したがって、本発明は、上記のＴＣＲ  Ｖα結合抗体および結合断片またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片と同じエピトープまたは同じエピトープの一部に実質的に結合する、ＴＣＲ  Ｖα鎖抗体およびその結合断片、またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片を使用することを企図する。このため、本発明は、１５Ｂ４または５Ｈ４と同じエピトープまたは同じエピトープの一部に実質的に結合するＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片に関する。本発明はまた、１５Ｂ４または５Ｈ４と同じエピトープまたは同じエピトープの一部に実質的に結合する抗体およびその結合断片に関する。
【０１６２】
さらに、本発明は、上記のＴＣＲ  Ｖα鎖抗体およびその結合断片またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片と競合する、ＴＣＲ  Ｖα鎖抗体およびその結合断片またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片を使用することを考慮する。このため、本発明は、１５Ｂ４または５Ｈ４と競合する、ＴＣＲ  Ｖα鎖抗体およびその結合断片またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体およびその結合断片に関する。
【０１６３】
ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖などの抗原の異なる断片を産生して、次にこれらの断片を、抗体またはその結合断片に対する結合に関して試験することによって、エピトープマッピングを行ってもよい。結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）相互作用分析を使用して測定してもよい。同様に、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）のＰｅｐＳｐｏｔ（商標）などの市販のペプチドアレイ、またはプロテオミクスに基づく質量分析法を使用してもよい。特定の抗原またはエピトープに対する結合の競合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。例えば、本発明に従う抗体を標識して、ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に対するその結合に関して試験してもよい。次に、非標識１５Ｂ４（または他の任意のＴＣＲ  Ｖα鎖もしくはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体）を追加して、それが標識抗体の結合に影響を及ぼすか否かを決定するか、または標識抗体の結合をそのような非標識ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖結合抗体の様々な濃度の存在下または非存在下で試験する。そのような標識は、放射活性もしくは蛍光標識または他の種類の検出可能な標識でありうる。
【０１６４】
特定の抗原またはエピトープに対する結合に関する競合は、本発明に従う抗体に関する抗原またはエピトープに対する結合の少なくとも約５０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または約１００％の低減によって決定される。結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器、様々な蛍光検出技術（例えば、蛍光相関分光法、蛍光相互相関、蛍光寿命測定等）、または様々な型のラジオイムノアッセイもしくは標的分子に対する抗体の結合を追跡するために使用される他のアッセイを使用して測定してもよい。
【０１６５】
上記のように、本発明は、クラスタ特異的ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖抗体またはその結合断片を考慮する。完全長の抗体は、定常ドメインおよび可変ドメインを含む。定常領域は、抗体の抗原結合断片に存在する必要はない。
【０１６６】
結合断片は、このため、完全な抗体の抗原結合または可変領域などのインタクト完全長抗体の一部を含みうる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｄおよびＦｖ断片；ダイアボディ、リニア抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；二重特異性、三重特異性、および多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）などの多重特異性抗体断片；ミニボディ；キレート組換え型抗体；トリボディまたはバイボディ；イントラボディ；ナノボディ；小モジュール免疫製剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および抗体断片から形成される他の任意のポリペプチドが含まれる。当業者は、抗体の抗原結合機能が完全長の抗体の断片によって実施されうることを承知している。
【０１６７】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む。Ｆｄは、抗体のシングルアームのＶＨおよびＣＨ１ドメインである。Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインである。
【０１６８】
結合断片はまた、一価もしくは多価、または単量体もしくは多量体（例えば、４量体）のＣＤＲ由来結合ドメインも包含する。
【０１６９】
二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を含み、このため２つの異なる抗原に結合する。１つの実施形態において、二重特異性抗体は、第１の抗原に結合する第１の抗原認識ドメインと、第２の抗原に結合する第２の抗原認識ドメインとを含む。１つの実施形態において、第１の抗原認識ドメインは、本明細書において定義される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖα鎖に結合し、第２の抗原認識領域は、第１の抗原認識ドメインによって認識される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖα鎖として少なくとも１つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含む、本明細書において定義される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する。１つの実施形態において、第１の抗原認識ドメインは、本明細書において定義される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合し、第２の抗原認識領域は、第１の抗原認識ドメインによって認識される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖβ鎖として少なくとも１つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む、本明細書において定義される一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する。
【０１７０】
一部の例において、Ｔ細胞抗原を認識する二重特異性抗体は、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）と呼ばれる。本発明は、任意の特定の二重特異性抗体の使用に限定されるわけではない。むしろ、いかなる二重特異性抗体またはＢｉＴＥも使用することができる。ｓｃＦｖの１つはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は、抗原特異的分子を介して標的とされる抗原に結合する。これによって、Ｔ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムのようなタンパク質を産生することによって、ＭＨＣＩまたは共刺激分子の存在とは無関係に、標的抗原を発現する細胞に対して細胞障害活性を発揮することができる。ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖の例を、本明細書において他所で説明し、その全てが二重特異性抗体によって標的化されうる。１つの実施形態において、二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその断片を含む。
【０１７１】
１つの実施形態において、第１の抗原認識ドメインは、一部分のＴ細胞ＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合し、第２の抗原認識領域は、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する抗原認識領域に結合する。二重特異性抗体を作製する方法は、当業者に公知である。二重特異性抗体は、例えばMilstein et al.（1983; Nature 305:537）に記述されるように、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を使用して組換えによって産生することができる。あるいは、二重特異性抗体は、化学的連結（Brennan et al. (1985)）を使用して調製することができる。二重特異性抗体は、二重特異性抗体断片を含む（例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368.を参照されたい）。
【０１７２】
キメラ抗原受容体ＣＡＲは、二重特異性抗体に由来する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
より詳しくは、本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、例えば、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞上でモノクローナル抗体の特異性を媒介するために使用することができる。本発明の具体的実施形態において、ＣＡＲは、細胞の特異性を、例えばＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に向ける。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に対する結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。ある特定の例において、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を低減するように改変することができる。ある特定の例において、ＣＡＲはＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、および／またはＯＸ４０などのさらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。本発明の抗体または断片の効果を増強するために、ＣＡＲを使用できることは本発明によって企図される。例えば、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴ細胞受容体可変α（ＴＣＲ  Ｖα）鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴ細胞受容体可変β（ＴＣＲ  Ｖβ）鎖に結合する抗体が、Ｔ細胞枯渇活性を示さないかまたはごくわずかしか示さない場合、そのＴ細胞枯渇能を誘発または増強するために、その結合ドメインをＣＡＲに組み込むことができる。同様に、例えば特異的Ｔ細胞の枯渇においてかなり有効である本発明の抗体の活性は、その結合ドメインまたは断片および／またはその変種をＣＡＲに組み込むことによってさらに増強されると想像される。
【０１７３】
ＴＣＲ可変鎖結合抗体およびその結合断片はまた、本明細書において開示される例示的な抗体、結合断片、および配列の変種を包含しうる。変種は、本明細書において開示される例示的な抗体、断片および配列の１つまたは複数と同じまたは実質的に同じエピトープ結合の親和性および特異性を有する、１つまたは複数のアミノ酸配列置換、欠失、および／または付加を含むペプチドおよびポリペプチドを含む。このため、変種は、本明細書において開示される例示的な抗体、断片、および配列に対して１つまたは複数のアミノ酸配列置換、欠失、および／または付加を含むペプチドおよびポリペプチドを含み、そのような置換、欠失、および／または付加は、エピトープ結合の親和性および特異性の実質的な変化を引き起こさない。例えば、抗体または断片の変種は、配列番号２１８、２１９、もしくは２３２、２３３のアミノ酸配列の１つもしくは複数を含む抗体もしくは断片に対する１つもしくは複数の変化に起因しうるか、または変化した抗体もしくは断片は、開始配列と同じまたは実質的に同じエピトープ結合の親和性および特異性を有する。
【０１７４】
本発明の文脈において一般的に言及される限り、抗体またはその結合断片はまた、抗体または抗体の一部と、例えば１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成された、より大きい免疫接着分子の一部でありうる。そのような免疫接着分子の例には、４量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）、ならびに二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058）が含まれる。免疫接着分子を含む抗体および断片は、本明細書において記述される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。好ましい抗原結合部分は、完全なドメインまたは完全なドメインの対である。
【０１７５】
本発明の結合抗体および結合断片はまた、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）を包含しうる。本発明の抗体および結合断片はまた、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖に発現されるが、同じ鎖で２つのドメイン間の対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインにもう１つの鎖の相補的ドメインと対を形成させて、２つの抗原結合部位を作製する二価抗体であるダイアボディを包含する（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, and Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994を参照されたい）。ダイアボディは、二重特異性または単特異性でありうる。
【０１７６】
上記のように、本発明の抗体および結合断片はまた、一本鎖抗体断片（ｓＦｖ）を包含する。ｓｃＦｖは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に作動可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は共にまたは個々に、結合部位を形成する。ｓｃＦｖは、アミノ末端においてＶＨ領域を含み、カルボキシ末端においてＶＬ領域を含みうる。あるいは、ｓｃＦｖはアミノ末端においてＶＬ領域を含み、カルボキシ末端においてＶＨ領域を含みうる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、個別の遺伝子によってコードされるが、それらを組換え法を使用して、合成リンカーによって連結させて、ＶＬおよびＶＨ領域が対を形成して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）を形成する単一のタンパク質鎖として作製することができる。
【０１７７】
ｓｃＦｖは、任意選択でさらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にポリペプチドリンカーを含みうる。そのようなポリペプチドリンカーは、一般的にアミノ酸１〜５０個の間、あるいはアミノ酸３〜１２個の間、あるいはアミノ酸２個を含む。ｓｃＦｖにおいて重鎖および軽鎖を連結するためのリンカーペプチドの例は、アミノ酸５個の配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２３８）を含む。他の例は、リンカーを作製するためにこの配列の１つまたは複数のタンデムリピートを含む（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２３８）の２〜４個のリピートを含むポリペプチド）。
【０１７８】
本発明の抗体および結合断片はまた、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）も包含する。従来の抗体のＨ２Ｌ２構造に対する例外は、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ；Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363: 446; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol. 275: 413）、オオセ（Nuttall et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001）、コモリザメ（Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995; Roux et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804）、およびスポッテドラットフィッシュ（Nguyen, et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," 2002 Immunogenetics 54(1): 39-47）において見出される免疫グロブリンのいくつかのアイソタイプで起こる。これらの抗体は、これらの機能的抗体が重鎖のみの二量体（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と呼ばれる）であるという点において、見かけ上、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成することができる。したがって、本発明の抗体および結合断片の一部の実施形態は、ＴＣＲに特異的に結合する重鎖抗体（ＨＣＡｂ）でありうる。例えば、ＩｇＧのクラスであり、軽鎖を欠く重鎖抗体は、ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマを含むラクダ科の動物によって産生される（Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)）。ＨＣＡｂは、従来のＩｇＧ抗体の約１６０ｋＤａの分子量ではなく約９５ｋＤａの分子量を有する。その結合ドメインは、重鎖可変ドメインのみからなり、しばしば、従来のＶＨとそれらを区別するためにＶＨＨと呼ばれる。Muyldermans et al., J. Mol. Recognit. 12:131-140 (1999)。重鎖抗体の可変ドメインは、時にナノボディと呼ばれる（Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004）。ナノボディライブラリは、Conrath et al.,（Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001）に記述されるように、免疫されたヒトコブラクダからまたは組換え法を使用して作製することができる。
【０１７９】
第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が存在しないことから（スプライスコンセンサスシグナルの喪失によりｍＲＮＡプロセシングの際にスプライシングにより除去される）、可変ドメイン（ＶＨＨ）のすぐ後に、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く（Nguyen et al., Mol. Immunol. 36:515-524 (1999); Woolven et al., Immunogenetics 50:98-101 (1999)）。ラクダのＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ１ドメインを欠如するＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と組換えすることが報告されている（Hamers-Casterman et al., 上記）。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨが、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む定常領域と組換えする従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであるが、ラマのＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠如して、軽鎖を含まない重鎖のみのアイソタイプである。
【０１８０】
ＨＣＡｂは軽鎖を欠くが、それらは抗原結合レパートリーを有する。ＨＣＡｂの遺伝的生成機序は、Nguyen et al. Adv. Immunol 79:261-296 (2001)およびNguyen et al., Immunogenetics 54:39-47 (2002)に論評されている。コモリザメを含むサメは、類似の抗原受容体を含む単一の単量体Ｖドメインを示す。Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31-45 (2001); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11804 (1998)。
【０１８１】
ＶＨＨは、小さいインタクト抗原結合断片（例えば、約１５ｋＤａである断片、１１８〜１３６残基）を含む。ラクダのＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合することが見出されており（Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001）、ＶＨＨの親和性は典型的にナノモル濃度範囲であり、ＦａｂおよびｓｃＦｖ断片の親和性と同等であった。ＶＨＨは、非常に可溶性であり、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片の対応する誘導体より安定である。ＶＨ断片は、可溶型で産生することが比較的難しいが、フレームワーク残基をよりＶＨＨに類似するように変更すると、溶解度の改善および特異的結合を得ることができる（例えば、Reichman et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38を参照されたい）。ＶＨＨは、それらをより親水性にするアミノ酸置換を有し、それがＬ鎖に置換されるまで、フォールディングおよびアセンブリの際に小胞体（ＥＲ）のＨ鎖に通常結合するＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）とのより持続的な相互作用を防止する。ＶＨＨの増加した親水性のために、ＥＲからの分泌が改善する。
【０１８２】
機能的ＶＨＨは、免疫ラクダのＨＣＡｂのタンパク質分解切断によって、組換えＶＨＨが得られる免疫ラクダのＢ細胞からのＶＨＨ遺伝子の直接クローニングによって、またはナイーブもしくは合成ライブラリから得ることができる。所望の抗原特異性を有するＶＨＨはまた、ファージディスプレイ方法論によって得ることができる。ファージディスプレイにおいてＶＨＨを使用することは、機能的抗原結合断片を得るためにクローニングして発現させる必要があるドメインが１つのみですむことから、ＦａｂまたはｓｃＦｖと比較すると、かなり単純でより効率的である。Muyldermans, Biotechnol. 74:277-302 (2001); Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997); and van der Linden et al., J. Biotechnol. 80:261-270 (2000)。ラクダ重鎖を有する抗体を作製する方法はまた。米国特許出願第２００５０１３６０４９号明細書および同第２００５００３７４２１号明細書に記述されている。
【０１８３】
結合抗体およびその結合断片はまた、例えば１つまたは複数の保存的置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の保存的置換）を有する軽鎖または重鎖の前述の具体的に言及したアミノ酸配列のいずれかを包含しうる。保存的置換の候補であるアミノ酸配列の位置を決定することができ、任意の特定のアミノ酸の保存的置換をもたらす合成および天然に存在するアミノ酸を選択することができる。保存的置換を選択するための検討は、任意の特定のアミノ酸置換が行われる状況、側鎖の疎水性もしくは極性、側鎖の一般的なサイズ、および生理的条件下での酸性または塩基性の特性を有する側鎖のｐＫ値を含む。例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、しばしば互いに適切に置換される。当技術分野で公知であるように、これは、３つ全てのアミノ酸が塩基性側鎖を有するためであり、リシンおよびアルギニンの側鎖のｐＫ値は、ヒスチジン（約６）と比較して互いにかなり近い（約１０および１２）。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、しばしば互いに適切に置換されるが、但しグリシンは群の他のメンバーと適切に置換されないことが多い。互いに適切に置換されることが多いアミノ酸の他の群には、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる群、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群、ならびにセリン、トレオニン、および任意選択でチロシンからなる群が含まれるがこれらに限定されるわけではない
【０１８４】
アミノ酸配列に保存的改変を行うことによって、またはコードするヌクレオチドに対応する改変を行うことによって、本明細書において開示される例示的な抗体および断片の特徴と類似の機能的および化学的特徴を有する抗体またはその結合断片を産生することができる。
【０１８５】
本明細書の文脈において言及される結合抗体およびその結合断片は、本明細書において開示される例示的な抗体、断片、および配列の誘導体を包含しうる。誘導体には、化学改変されているポリペプチドもしくはペプチド、またはその変種、断片、もしくは誘導体が含まれる。例には、水溶性ポリマーなどの１つまたは複数のポリマー、Ｎ−結合、またはＯ−結合炭水化物、糖類、リン酸塩、および／または蛍光体などの検出可能な標識などの他のそのような分子の共有結合が含まれる。
【０１８６】
標識物質を、本発明の抗体または抗原に直接または間接的に連結してもよい。間接的連結の一例は、スペーサー部分を使用することによる連結である。さらに、本発明の抗体は、共有または非共有結合によって連結されたさらなるドメインを含みうる。連結は、当技術分野で公知のおよび上記の方法に従って遺伝子融合に基づきうるか、または国際出願国際公開第９４／０４６８６号パンフレットに記述される、例えば化学的架橋によって行うことができる。本発明の抗体を含む融合タンパク質に存在するさらなるドメインを、好ましくはフレキシブルリンカーによって、都合よくは、前記さらなるドメインのＣ末端と本発明の抗体のＮ末端、またはその逆の間の距離に及ぶ十分な長さの複数の親水性のペプチド結合アミノ酸を含むポリペプチドリンカーによって連結してもよい。治療的または診断的に活性な物質を、様々な手段によって本発明の抗体またはその抗原結合断片に連結させることができる。これには、例えばペプチド結合などの共有的方法によって治療的または診断的に活性な物質に連結した本発明の抗体の可変領域を含む一本鎖融合タンパク質が含まれる。さらなる例は、以下の非制限的な例示的な一覧に記載されるものを含む、さらなる分子に共有結合または非共有結合によって連結した抗原結合断片を少なくとも含む分子を含む。Traunecker et al., Int. J. Cancer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52は、ＣＤ３に対するＦｖ領域を可溶性ＣＤ４またはＯＶＣＡおよびＩＬ−７などの他のリガンドに連結した二重特異性試薬ヤヌシンを記述する。同様に、ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に対するＦｖ領域を、例えば抗ＣＤ４０アゴニスト抗体の一部および／または抗ＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体の一部に連結してもよい。同様に、本発明の抗体の可変領域をＦｖ分子に構築して、引用された論文に例証されるリガンドなどの代替リガンドに連結することができる。Higgins et al., J. Infect Disease 166 (1992), 198-202は、ＧＰ１２０のＶ３領域における特異的配列に対する抗体に架橋したＯＫＴ３で構成されるヘテロコンジュゲート抗体を記述した。そのようなヘテロコンジュゲート抗体はまた、本発明の方法の抗体に含まれる可変領域を少なくとも使用して構築することができる。特異的抗体のさらなる例には、Fanger et al., Cancer Treat. Res. 68 (1993), 181-194およびFanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124によって記述される抗体が含まれる。従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートは、当技術分野で広く記述されている。毒素を従来の連結技術によって抗体に連結してもよく、またはタンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として産生することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るために対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素の例は、Byers et al., Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70およびFanger et al., Immunol. Today 12 (1991), 51-54に記述される例である。
【０１８７】
上記の融合タンパク質はさらに、切断可能リンカーまたはプロテアーゼの切断部位を含みうる。これらのスペーサー分子は次に、不溶性または可溶性であり（Diener et al., Science 231 (1986), 148）、標的部位で抗原からの薬物放出を可能にするように選択することができる。
【０１８８】
免疫療法のために本発明の抗体および抗原に連結させることができる治療物質の例は、薬物、放射性同位元素、レクチン、および毒素である。本発明の抗体および抗原にコンジュゲートさせることができる薬物は、古典的にマイトマイシンＣ、ダウノルビシン、およびビンブラスチンなどの薬物と呼ばれる化合物を含む。例えば腫瘍の免疫療法に関して、放射性同位元素をコンジュゲートした本発明の抗体または抗原を使用する場合、ある特定の同位元素は、白血球の分布ならびに安定性および放射などの要因に応じて、他より好ましいことがありうる。
【０１８９】
いくつかのエミッターが他より好ましい場合がある。一般的に、αおよびβ粒子放出放射性同位元素は免疫療法において好ましい。２１２Ｂｉなどのショートレンジで高エネルギーであるエミッターが好ましい。治療目的のために本発明の抗体または抗原に結合させることができる放射性同位元素の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、および１８８Ｒｅである。本発明の抗体または抗原に連結させることができる他の治療物質、ならびにｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ治療プロトコールは公知であるか、または当業者によって容易に確認することができる。
【０１９０】
言及したように、本発明は、一部の実施形態において、抗体およびその結合断片をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、ならびにそのような核酸配列およびベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１９１】
抗体およびその結合断片は、単一の核酸（例えば、抗体の軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸）によって、またはそのそれぞれが抗体もしくは抗体断片の異なる部分をコードする２つもしくはそれ超の個別の核酸によってコードされうる。この点において、本発明は、前述の抗体または結合断片のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸を提供する。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ等でありうる。
【０１９２】
本発明の１つの態様に従って、本発明は、抗体またはその一部の重鎖領域をコードする核酸を提供する。例示的な核酸配列を配列番号２２３および２３７に提供する。本発明はまた、抗体またはその一部の軽鎖可変領域をコードする核酸を提供する。例示的な核酸配列を配列番号２２２および２３６に提供する。
【０１９３】
同様に、本発明の抗体および抗体断片に関して考察したように、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の保存的置換）を含む軽鎖または重鎖の前述のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸も本発明によって包含され、置換を含む抗体または断片は、本開示の例示的な抗体、断片、および配列の１つまたは複数と同じまたは実質的に同じエピトープ結合の親和性および特異性を有する。
【０１９４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントが、当業者に周知である。それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列と、任意選択で転写の終了および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサー、および／または天然に会合するもしくは異種プロモーター領域を含みうる。
【０１９５】
本明細書において記述される核酸は、ベクター、例えば核酸発現ベクターおよび／またはターゲティングベクターに挿入することができる。そのようなベクターは、多様な方法で、例えば細胞またはトランスジェニック動物において抗体または結合断片を発現させるために使用することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸の任意の１つまたは複数を含むベクターを提供する。「ベクター」は、核酸配列を、コードされるポリペプチドの合成が起こりうる適した宿主細胞に運ぶ能力を有する任意の分子または組成物である。典型的に、および好ましくは、ベクターは、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術を使用して、所望の核酸（例えば、本発明の核酸）配列を組み込むように遺伝子操作されている核酸である。望ましくは、ベクターは、ＤＮＡで構成される。しかし、リポソームなどの、核酸を骨格としないベクターも同様に当技術分野で公知であり、本発明に関連して使用することができる。本発明のベクターは、単一の型の核酸（例えば、プラスミド）または非核酸分子（例えば、脂質またはポリマー）に基づくことができる。あるいは、ベクターは、核酸と非核酸（すなわち、「キメラ」ベクター）の組合せでありうる。例えば、核酸を有するプラスミドを、送達ビヒクルとして脂質またはポリマーと共に製剤化することができる。そのようなベクターをそれぞれ、本明細書において「プラスミド−脂質複合体」および「プラスミド−ポリマー」複合体と呼ぶ。本発明の遺伝子移入ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込むことができ、またはエピソームの形態で宿主細胞に存在することができる。
【０１９６】
ベクターは典型的に、ベクターが使用される宿主細胞において機能的となるように選択される（ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるように、宿主細胞機構と適合性である）。抗体またはその結合断片をコードする核酸分子を、原核細胞、酵母、昆虫（バキュロウイルスシステム）および／または真核宿主細胞において増幅／発現させることができる。宿主細胞の選択は、抗体または断片が後に一過性に修飾されるか否か（例えばグリコシル化および／またはリン酸化）に一部依存する。その場合、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。
【０１９７】
発現ベクターは典型的に、以下の成分の１つまたは複数を含む（それらが核酸分子によってまだ提供されていない場合）：プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終止配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能なマーカーエレメント。
【０１９８】
本発明は、一部の態様において、さらに本発明の核酸またはベクターを含む細胞（例えば、単離または精製細胞）を提供する。細胞は、それによってコードされるポリペプチドを産生するために、本発明の核酸またはベクターによって形質転換することができる任意の型の細胞でありうる。細胞は、好ましくは、ヒトなどの哺乳動物の細胞であり、より好ましくは、ハイブリドーマ細胞、胚幹細胞、または受精卵である。胚幹細胞または受精卵は、ヒト胚幹細胞またはヒト受精卵であってはならない。
【０１９９】
宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば大腸菌）または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）でありうる。宿主細胞は、適切な条件で培養すると、抗体または結合断片を発現し、これをその後培養培地から回収するか（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接回収することができる（分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、様々な要因、例えば望ましい発現レベル、活性にとって望ましいまたは必要であるポリペプチド修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化、および生物活性分子へのフォールディングの容易さに依存する。多数の適した宿主細胞が、当技術分野で公知であり、多くはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａから入手可能である。例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞（Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4216-4220 (1980)）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。
【０２００】
本発明の核酸またはベクターを含む細胞を使用して、抗体またはその結合断片、またはその一部（例えば、核酸またはベクターによってコードされる重鎖配列または軽鎖配列）を産生することができる。本発明の核酸またはベクターを細胞に導入後、細胞を、コードされる配列の発現にとって適した条件で培養する。抗体、抗原結合断片、または抗体の一部を細胞から単離することができる。
【０２０１】
本発明のもう１つの態様は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇するため、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇するための、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその結合断片の使用に関する。
【０２０２】
本発明のもう１つの態様は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖を発現するＴ細胞の亜集団をｅｘ  ｖｉｖｏで枯渇するため、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖を発現するＴ細胞の亜集団を枯渇するための、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその結合断片の使用に関する。
【０２０３】
本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するための、本明細書において記述される抗体またはその結合断片に関する。
【０２０４】
具体的実施形態は、Ｔ細胞白血病の処置に使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその結合断片に関する。
【０２０５】
Ｔ細胞白血病細胞であり、したがって、Ｔ細胞白血病の確立されたモデルであるＪｕｒｋａｔ細胞にＣＬ  １が結合することを示す結合データは、本発明に従う抗体または結合断片が、Ｔ細胞白血病を標的としていることを示している。したがって、本発明の抗体または結合断片は、Ｔ細胞白血病などのＴ細胞媒介疾患の処置に使用することができる。
【０２０６】
マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇実験は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞白血病を引き起こす異常なＴ細胞などの特異的Ｔ細胞集団を枯渇させることが実現可能であることを証明するために適している。
【０２０７】
さらに、ＡＤＣＣアッセイは、ＡＤＣＣ、すなわち標的細胞、例えば悪性Ｔ細胞の活発な溶解を誘発する本発明の抗体の能力をモニターする。
【０２０８】
ＴＣＲ可変鎖結合抗体またはその結合断片は、組成物、特に薬学的組成物として製剤化することができる。そのような組成物は、適した担体、例えば薬学的に許容される物質と混合した抗体またはその結合断片の治療または予防有効量を含む。
【０２０９】
本発明の薬学的組成物において使用するための薬学的に許容される物質には、担体、賦形剤、希釈剤、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香料、および希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝液、送達ビヒクル、等張剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、および界面活性剤が含まれる。
【０２１０】
組成物は、液体剤形または凍結乾燥もしくはフリーズドライ剤形でありえ、１つまたは複数の凍結保護剤、賦形剤、界面活性剤、高分子量構造添加剤、および／または増量剤を含みうる（例えば米国特許第６，６８５，９４０号明細書、同第６，５６６，３２９号明細書、および同第６，３７２，７１６号明細書を参照されたい）。
【０２１１】
組成物は、非経口投与に適しうる。例示的な組成物は、当業者が利用可能な任意の経路によって、例えば関節内、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内経路によって動物に注射または注入するために適している。非経口製剤は典型的に、任意選択で薬学的に許容される保存剤を含む、滅菌の発熱物質を含まない等張の水溶液である。
【０２１２】
非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝培地を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、または懸濁剤を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給剤、リンゲルデキストロースに基づく補給剤などの電解質補給剤等を含む。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等などの保存剤および他の添加剤も同様に存在してもよい。一般的に、参照により本明細書に組み込まれている、Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980を参照されたい。
【０２１３】
本明細書において記述される薬学的組成物は、産物の局所濃度（例えば、ボーラス、デポー効果）を提供するおよび／または特定の局所環境での安定性もしくは半減期を増加させるように、制御されたまたは持続的な送達のために製剤化することができる。組成物は、本発明の抗体、結合断片、核酸、またはベクターと、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等などのポリマー化合物の微粒子調製物、ならびに生物分解マトリクス、注射可能ミクロスフェア、マイクロカプセル粒子、マイクロカプセル、生体内分解性粒子ビーズ、リポソームなどの物質の製剤、およびデポー注射として送達することができる活性物質の制御されたまたは持続的放出を提供する埋め込み可能送達装置を含みうる。
【０２１４】
生物分解性および非生物分解性ポリマーマトリクスの両方を使用して本発明の組成物を送達することができ、そのようなポリマーマトリクスは、天然または合成ポリマーを含みうる。生物分解性マトリクスが好ましい。放出が起こる期間は、ポリマーの選択に基づく。典型的に、数時間から３ヶ月〜１２ヶ月間の範囲の期間に及ぶ放出が最も望ましい。
【０２１５】
あるいはまたはさらに、組成物は、本発明の抗体、結合断片、核酸、またはベクターが吸収または封入されている膜、スポンジ、または他の適切な材料を罹患領域に埋め込むことによって局所投与することができる。埋め込み装置を使用する場合、装置を、任意の適した組織または臓器に埋め込むことができ、本発明の抗体、結合断片、核酸、またはベクターは、ボーラス、持続的投与、または持続的注入を使用するカテーテルによって装置から直接送達することができる。
【０２１６】
結合抗体またはその抗体断片を含む薬学的組成物は、例えば乾燥粉末などの吸入のために製剤化することができる。吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための液化プロペラント中で製剤化することができる。なおもう１つの製剤において、溶液を噴霧化してもよい。
【０２１７】
抗体またはその結合断片を含むある特定の製剤を経口投与することができる。このようにして投与される製剤は、錠剤およびカプセル剤などの固体投与剤形の混合において通常使用される担体と共に、または担体を含まずに製剤化することができる。例えば、カプセル剤は、消化管において生物学的利用率が最大で全身到達前分解が最小限である時点で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。選択的結合物質の吸収を促進するさらなる物質を含めることができる。希釈剤、香料、低融点ロウ、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤分解剤、および結合剤も同様に使用することができる。
【０２１８】
少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体または結合断片は、約０．０８ｎＭ〜約０．８ｎＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜約０．６ｎＭのＥＣ５０を有する。
【０２１９】
ここで本発明を、決して制限的に解釈されないいくつかの例を参照して説明する。
【０２２０】
ＡＤＣＣは、抗体依存性細胞障害を指す。抗体が主にＡＤＣＣを媒介することができるか否かを決定するために、ＡＤＣＣを、エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核因子）経路を通して遺伝子転写の活性化をモニターするルシフェラーゼアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。例えば、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）変種、およびホタルルシフェラーゼエフェクター細胞の発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。ＡＤＣＣ  ＭＯＡにおける抗体の生物活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されるルシフェラーゼを通して定量する。
加えて、ＡＤＣＣは、いわゆるＣｒ５１、Ｅｕ、Ｓ３５、およびカルセイン放出アッセイによって測定することができる。その表面上に目的の抗原を表示する標的細胞を、これらの化合物によって標識してもよい。治療抗体の結合後、細胞を洗浄して、ＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞を、抗体標識標的細胞と同時インキュベートして、標的細胞の溶解を、標識の放出によってモニターすることができる。もう１つのアプローチは、いわゆるａＣｅｌｌａ  ＴＯＸ（商標）アッセイを使用する。
【０２２１】
ＣＤＣは、補体依存性細胞障害を指す。抗体が主にＣＤＣを媒介することができるか否かを決定するために、例えばDelobel A et al, Methods Mol Biol. (2013); 988:115-43、またはCurrent Protocols in Immunology, Chapter 13 Complement (Print ISSN: 1934-3671)に記述されるように、ＣＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定してもよい。
【０２２２】
本明細書において使用される「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性食作用は、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞障害性の細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識して、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞性反応を意味する。
【０２２３】
軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、好ましくはヒト由来抗体のフレームワークおよび定常領域の中、すなわち本明細書において記述されるヒト患者から得た抗体に関して決定した配列の中に埋もれている。好ましくは、これらの抗体はＩｇＧクラスの抗体である。
【０２２４】
しかし、軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲはまた、特にそのような配列が抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）において有効であることが示されている場合には、他のヒト抗体に由来するフレームワークおよび定常領域のヒト配列の中に埋もれていてもよい。この状況では、例えば治療応用のために使用して成功しているヒト化治療抗体のヒト定常およびフレームワーク配列を使用してもよい。軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、好ましくはヒトＩｇＧクラスのそのようなヒト化抗体のフレームワークおよび定常領域に組み込まれている。
【０２２５】
さらに、軽鎖および重鎖可変領域の上記のＣＤＲは、フレームワークおよび定常領域に関して本質的にヒト配列の中に埋もれていてもよい。しかし、特にフレームワーク領域のみならず定常領域も、それらが例えば典型的に抗原結合および／または例えばＡＤＣＣを増強することが公知であるマウス抗体において見出されるアミノ酸を含んでもよい（例えば、欧州特許出願第０  ４５１  ２１６号明細書を参照されたい）。好ましくはこれらの抗体は、ＩｇＧクラスの抗体である。
【０２２６】
抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／またはＣＤＣ補体依存性細胞障害および／または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）の食作用を誘発しうる。本出願の具体的実施形態において、抗体はＡＤＣＣを誘発する。
【０２２７】
抗体を作製する方法
本発明のさらなる態様は、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現する非ヒト細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌される抗体を、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現するヒト細胞に接触させることによって、目的の表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に言及する。
【０２２８】
目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しない非ヒト細胞を提供するステップは、非ヒト細胞が、タンパク質の内因性型を産生することが実質的にできないが、目的の細胞表面タンパク質の外因性型を産生することができることを意味する。当業者は、タンパク質の内因性型の発現を阻害する異なる方法を承知している。同様に、自然発生する目的の表面タンパク質の内因性型を発現しない単離細胞株も使用することができる。典型的に非ヒト細胞株において、目的の表面タンパク質の遺伝子座／複数の座は無能力化されている。
【０２２９】
本明細書において使用される用語「少なくとも１つのヒトセグメント」は、タンパク質の少なくとも１つの部分または領域を指す。このことは、完全なヒト細胞表面タンパク質と、完全にヒトではない細胞表面タンパク質の両方が本発明によって想定されることを意味する。したがって、細胞表面タンパク質は、少なくとも１つのヒトセグメントに加えて、もう１つの起源のセグメントを含みうる。例えば、細胞表面タンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインが、マウス起源のドメインであり、細胞外ドメインがヒト起源のドメインでありうる。例えば、ＴＣＲの定常領域は、マウス起源の領域でありうるが、可変ドメインはヒト起源のドメインでありうる。本明細書において使用される用語「セグメント」は、ドメインまたは配列領域などの、しかしこれらに限定されるわけではないタンパク質の一部を指す。
【０２３０】
用語「目的の細胞表面タンパク質」は、細胞表面タンパク質として当業者に公知である任意のタンパク質を指す。本明細書において使用される「細胞表面タンパク質」は、少なくとも１つの部分が細胞外環境に曝露されるタンパク質である。タンパク質は、細胞膜の脂質層に埋め込まれてもよく、または脂質層に組み込まれる分子に結合してもよい。細胞表面タンパク質の例示的な実施形態は、ＴＣＲである。
【０２３１】
目的の細胞表面タンパク質の外因性型は、一過性または永続的に発現させることができる。当業者は、遺伝子を永続的または一過性に発現させる技術に精通している。
【０２３２】
モノクローナル抗体の調製は、公知の方法（C. Milstein, G. Kohler, Nature 256 (1975) 495）に基づいて実施することができる。免疫原として、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現する非ヒト細胞を使用する。
【０２３３】
本明細書において使用される用語「非ヒト細胞株」は、非ヒト動物の免疫にとって適した当業者に公知の任意の非ヒト細胞株を指す。例えば、マウスまたはラット細胞株を使用してもよい。
【０２３４】
免疫することができる非ヒト動物の例は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、フクロウ、サル、ウサギ等である。好ましい実施形態において、ラット、マウス、ウサギ、またはラマを免疫してもよい。より好ましい実施形態において、ラットを免疫してもよい。ラットでは、多数の脾臓細胞、特にマウスと比較して多数の脾臓細胞を得ることができる。
【０２３５】
１つの実施形態において、ステップ（ｂ）において免疫された非ヒト動物は、ステップ（ａ）で提供される非ヒト細胞株とは異なるもう１つの種の動物である。例えば、マウス細胞株によってラットを免疫すると、マウス細胞株によってラットにおいて強い免疫応答が誘発されるという利点を有する。
【０２３６】
特定の実施形態において、免疫される非ヒト動物は、ラットであり、免疫のために使用される非ヒト細胞株はマウス細胞株である。同様に、免疫される非ヒト動物と非ヒト細胞株の他の組合せを使用することができる。
【０２３７】
目的の表面タンパク質に結合する抗体のスクリーニングは、フローサイトメトリーの使用、特にＦＡＣＳによって実施することができる。抗体は、ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌され、これをヒト細胞株に接触させる。免疫のために使用される非ヒト細胞株は、目的の細胞表面タンパク質に対して特異的でない抗体にも結合することから、この細胞株はスクリーニングには使用しない。スクリーニングステップで使用される目的の細胞表面タンパク質を発現するヒト細胞株は、目的のヒト細胞表面タンパク質に対して特異的な抗体が、この細胞株に結合するが、目的のヒト細胞表面タンパク質に対して特異的でない抗体はこのヒト細胞株に実質的に結合しないことから有利である。したがって、スクリーニングステップにおいてヒト細胞株を使用することによって、目的の細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体と、非特異的に結合する抗体とを識別することができる。
【０２３８】
スクリーニング工程をより効率的にするために、複数のプレートの上清をプールして、単一ステップで分析することができる。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ超のウェルの上清をプールすることができる。好ましくは、ウェル４個の上清をプールして一次スクリーニングステップで分析することができる。複数のウェルからプールした上清が抗体の結合を示す場合、単一のウェルの上清を、二次スクリーニングステップで個々に分析してもよい。
【０２３９】
ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現する、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないヒト細胞の混合物に接触させてもよい。
【０２４０】
本明細書において使用される用語「選択マーカー」は、フローサイトメトリー、特にＦＡＣＳにおいて使用することができるマーカーを指しうる。ＦＡＣＳの場合、典型的に蛍光マーカーを使用する。当業者は、ＦＡＣＳにおいて有用である異なる蛍光マーカー、例えば限定されないが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄまたはその誘導体などの、しかしこれらに限定されるわけではない、細胞株において発現される蛍光タンパク質を承知している。一部の実施形態において、第１の定義された割合の細胞と、第２の定義された割合の細胞は、選択マーカーを含みうるが、２つの割合では選択マーカーのレベルが異なり、それによって両方の割合を識別することができる。例えば、選択マーカーは、第１の定義された割合では適度のレベルで存在しうるが、第２の定義された割合では高レベルで存在しうる。
【０２４１】
本発明の１つの態様は、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現するマウス細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供されるマウス細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現する、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップとを含み、
非ヒト動物がマウスまたはラットのいずれかである、方法に言及する。
【０２４２】
本発明の１つの態様は、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現するマウス細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供されるマウス細胞株によってラットを免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫されたラットからハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現する、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的の機能的細胞表面タンパク質を発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に言及する。
【０２４３】
本発明のもう１つの態様は、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現するマウス細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供されたマウス細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、目的の細胞表面タンパク質の内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的の細胞表面タンパク質の外因性型を発現するヒト細胞に接触させることによって、目的の細胞表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップとを含み、
非ヒト動物がマウスまたはラットのいずれかである、
方法に言及する。
【０２４４】
非制限的な例として、ＴＣＲに結合する抗体の作製を示す。
【０２４５】
したがって、１つの実施形態は、目的のＴＣＲに結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的のＴＣＲの内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現する非ヒト細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、目的のＴＣＲの内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するヒト細胞に接触させることによって、目的の表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に関する。
【０２４６】
ステップ（ａ）で提供される細胞株はマウスＢＷ−／−細胞株でありうる。
【０２４７】
用語「ＢＷ−／−細胞株」は、ＡＫＲマウス（Lee NE and Davis MM., J Immunol. 1988 Mar 1; 140(5):1665-75; Letourneur F., Malissen B., Eur J Immunol. 1989;19(12):2269-2274）において自然発症した親ＢＷ５１４７胸腺腫に由来して、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないＢＷ細胞株を指す。ＴＣＲヘテロ二量体の表面発現は、ＣＤ３タンパク質複合体との会合に依存することから、ＢＷ−／−細胞株に、ヒトＣＤ３をＧＦＰと同時発現するように安定に形質導入して（ＢＷ−／−−ＣＤ３−ＧＦＰ；本明細書において単にＢＷ−／−と呼ぶ）、形質導入された細胞を容易に同定できるようにした。ヒトＣＤ３の存在によって、これらの細胞は、細胞表面に任意のヒトまたはマウストランスジェニックＴＣＲを発現することができる。
【０２４８】
ステップ（ｄ）のヒト細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞株でありうる。
【０２４９】
用語「Ｊｕｒｋａｔ−／−」および「Ｊｕｒｋａｔ７６−／−」は、ヒトＶαおよびＶβ鎖を発現しない当初のヒトＴＣＬ株の変種であるヒトＪｕｒｋａｔ７６−／−細胞株を指す（Abraham RT, Weiss A., Nat Rev Immunol. 2004 Apr; 4(4):301-8）。これは、トランスジェニックＴＣＲ表面発現にとって必要な残りの全てのＴＣＲ会合ＣＤ３成分を有する。
【０２５０】
もう１つの実施形態は、目的のＴＣＲに結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するマウスＢＷ−／−細胞株を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌される抗体を、目的のＴＣＲの内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するＪｕｒｋａｔ−／−細胞に接触させることによって、目的の表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に関する。
【０２５１】
さらなる実施形態は、目的のＴＣＲに結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するマウスＢＷ−／−細胞株を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌される抗体を、
（ｉ）目的のＴＣＲを発現する、第１の定義された割合のＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的の機能的ＴＣＲを発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物
を含む、目的のＴＣＲの内因性型を発現しないＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物に接触させることによって、目的のＴＣＲに結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に関する。
【０２５２】
さらなる実施形態は、目的のＴＣＲに結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するマウスＢＷ−／−細胞株を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によってラットを免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のラットからハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌される抗体を、
（ｉ）目的のＴＣＲを発現する、第１の定義された割合のＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的のＴＣＲを発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物、
を含む、目的のＴＣＲの内因性型を発現しないＪｕｒｋａｔ−／−細胞の混合物に接触させることによって、目的のＴＣＲに結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に関する。
【０２５３】
さらなる実施形態は、目的のＴＣＲに結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）目的のＴＣＲの内因性型を発現しないが、少なくとも１つのヒトセグメントを含む目的のＴＣＲの外因性型を発現するマウス細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された細胞株によってラットを免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のラットからハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌される抗体を、
（ｉ）目的のＴＣＲを発現する、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉ）目的のＴＣＲを発現しない、選択マーカーを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、目的のＴＣＲの内因性型を発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、目的の表面タンパク質に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に関する。
【０２５４】
具体的実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）内因性のＴＣＲ  Ｖα鎖または内因性のＴＣＲ  Ｖα鎖のいずれも発現しないが、可変ヒトＴＣＲ  Ｖα鎖および可変ヒトＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む外因性のＴＣＲ  α鎖および外因性のＴＣＲ  β鎖を発現する非ヒト細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供した細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞株によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含まないが、ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖とは異なるＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉｉ）機能的ＴＣＲを含まないが、選択マーカーを含む、第３の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体に関してスクリーニングするステップと
を含む方法に言及する。
【０２５５】
具体的実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＴ細胞受容体可変α（ＴＣＲ  Ｖα）鎖に結合する、または少なくとも１つのＴ細胞受容体可変β（ＴＣＲ  Ｖβ）鎖に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）内因性のＴＣＲ  Ｖα鎖または内因性のＴＣＲ  Ｖα鎖のいずれも発現しないが、可変ヒトＴＣＲ  Ｖα鎖および可変ヒトＴＣＲ  Ｖβ鎖を含む外因性のＴＣＲ  α鎖および外因性のＴＣＲ  β鎖を発現する非ヒト細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供した細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞株によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含まないが、ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖とは異なるＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉｉ）機能的ＴＣＲを含まないが、選択マーカーを含む、第３の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体に関してスクリーニングするステップであって、
非ヒト動物がマウスまたはラットであり、ステップ（ａ）で提供される非ヒト細胞がマウス細胞株である、ステップと
を含む方法に言及する。
【０２５６】
ある特定の実施形態は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を同定するステップであって、
（ｉ）ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合するまたは少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合するとしてステップ（ｄ）で同定された抗体と共にインキュベートするステップ、
（ｉｉ）ＦＡＣＳソーティングによって抗体に結合する細胞に関してスクリーニングするステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の抗体に結合する細胞のＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーを分析するステップ
を含み、
少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではないＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーにより、抗体が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合することが示される、
ステップを含む。
【０２５７】
例えば、本発明の１つの実施形態は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないが、可変ヒトＴＣＲ  Ｖα鎖を含む外因性のＴＣＲ  α鎖および可変ヒトＴＣＲ  β鎖を含む外因性のＴＣＲ  β鎖を発現する非ヒト細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供した細胞株によって非ヒト動物を免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫された非ヒト動物からハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞株によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含まないが、ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖とは異なるＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉｉ）機能的ＴＣＲを含まないが選択マーカーを含む、第３の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体に関してスクリーニングするステップであって、
非ヒト動物がマウスまたはラットであり、ステップ（ａ）で提供される非ヒト細胞がマウス細胞株である、ステップと、
（ｅ）少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を同定するステップであって、
（ｉ）ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合するまたは少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合するとしてステップ（ｄ）で同定された抗体と共にインキュベートするステップ、
（ｉｉ）ＦＡＣＳソーティングによって抗体に結合する細胞に関してスクリーニングするステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の抗体に結合する細胞のＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーを分析するステップ
を含み、
異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではないＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーにより、抗体が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合することが示される、ステップと
を含む方法に言及する。
【０２５８】
本発明のもう１つの実施形態は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を作製する方法であって、
（ａ）内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないが、可変ヒトＴＣＲ  Ｖα鎖を含む外因性のＴＣＲ  α鎖および可変ヒトＴＣＲ  β鎖を含む外因性のＴＣＲ  β鎖を発現するマウス細胞を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供した細胞株によってラットを免疫するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の免疫されたラットからハイブリドーマを作製するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のハイブリドーマによって分泌された抗体を、
（ｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第１の定義された割合のヒト細胞の混合物、
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞株によって発現されたＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含まないが、ステップ（ａ）で提供された非ヒト細胞によって発現されたＴＣＲ鎖とは異なるＴＣＲ鎖を有するＴＣＲを含む、第２の定義された割合のヒト細胞の混合物、および
（ｉｉｉ）機能的ＴＣＲを含まないが選択マーカーを含む、第３の定義された割合のヒト細胞の混合物
を含む、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しないヒト細胞の混合物に接触させることによって、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体に関してスクリーニングするステップであって、
非ヒト動物がマウスまたはラットであり、ステップ（ａ）で提供される非ヒト細胞がマウス細胞株である、ステップと、
（ｅ）少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体を同定するステップであって、
（ｉ）ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖα鎖に結合するまたは少なくとも１つのＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合するとしてステップ（ｄ）で同定された抗体と共にインキュベートするステップ、
（ｉｉ）ＦＡＣＳソーティングによって抗体に結合する細胞に関してスクリーニングするステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の抗体に結合する細胞のＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーを分析するステップ
を含み、
異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではないＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーにより、抗体が、少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖα鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖα鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖα鎖に結合する、または少なくとも２つの異なるＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むが全てのＴＣＲ  Ｖβ鎖を含むわけではない一部分のＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合することが示される、ステップと
を含む方法に言及する。
【０２５９】
ＴＣＲ  Ｖα鎖レパートリーまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖レパートリーの分析は、例えばＰＣＲまたは次世代シークエンシング法によって実施することができる。核酸の配列を同定する方法は当業者に周知である。
【０２６０】
ＴＣＲライブラリ
さらなる態様において、本出願は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型の発現のためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが以下の構築ブロック：
−  可変ＡＶ１〜ＡＶ４５セグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが以下の構築ブロック：
−  可変ＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに関する。
【０２６１】
ある特定の実施形態は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型の発現のためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが以下の構築ブロック：
（ｉ）可変ＡＶ１〜ＡＶ４５セグメントの１つと、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）定常ＡＣセグメントと
を含み、および
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが以下の構築ブロック：
（ｉ）可変ＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントの１つと、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに言及する。
【０２６２】
特に、本出願は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが以下の構築ブロック：
−  配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
−  配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに関する。
【０２６３】
本出願はまた、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個の構築物からなる群から選択される少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個の構築物からなる群から選択される少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５個のＴＣＲ構築物とを含む、機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードするＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードするＴＣＲ構築物のそれぞれが、
−  配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに言及する。
【０２６４】
本出願はまた、
（ｉ）それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、少なくとも１つのＴＣＲ  β鎖とをコードする少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０個のＴＣＲ構築物、または
（ｉｉ）それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つと、少なくとも１つのＴＣＲ  α鎖とをコードする少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５個のＴＣＲ構築物を含む、機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードするＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードする可変ＡＶセグメントの１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードするＴＣＲ構築物のそれぞれが、
−  配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする可変ＢＶセグメントの１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに言及する。
【０２６５】
用語「機能的ＴＣＲ型」は、Ｔ細胞上に発現されるＴＣＲ可変鎖で構成されるＴＣＲを指す。「ＴＣＲ受容体構築物」は、ＴＣＲ  α鎖またはＴＣＲ  β鎖をコードする核酸配列を指す。
【０２６６】
本明細書において使用する用語「構築ブロック」は、可変ＡＶおよびＡＢセグメント、定常ＡＣおよびＢＣセグメント、リンカー配列、および骨格ベクターなどの、ＴＣＲライブラリのエレメントおよびＴＣＲを発現させるための発現システムを指す。
【０２６７】
Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列は、可変ＡＶセグメントと定常ＡＣセグメントとを連結させるために有用であるとして当業者によって考慮される任意の配列でありうる。リンカーは、１つもしくは複数の制限部位などの、しかしこれらに限定されるわけではない組換えにとって有用な配列を含みうるか、またはクローニングを介してＴＣＲ構築物を改変するために有用な配列を含みうる。さらに、リンカーは、（ｉ）１つの可変ＡＶセグメント、（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列、および（ｉｉｉ）定常ＡＣセグメントからなる構築物が機能的ＴＣＲ  α鎖をコードするように、任意のＡＪおよび／またはＣＤＲ３配列を含みうる。具体的実施形態において、リンカー配列は、配列番号１９２に記載の配列と少なくとも９０％同一である、または配列番号１９４に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。より具体的実施形態において、リンカー配列は、配列番号１９２および配列番号１９４に記載の配列を有する。用語「Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列」および用語「ＡＶセグメントの３’末端とＡＣセグメントの５’末端を結合させるリンカー配列」は、本出願において互換的に使用される。
【０２６８】
Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列は、可変ＢＶセグメントと定常ＢＣセグメントとを連結させるために有用であるとして当業者によって考慮される任意の配列でありうる。リンカーは、１つもしくは複数の制限部位を含みうるか、またはクローニングを介してＴＣＲ構築物を改変するために有用な配列を含みうる。さらに、リンカーは、（ｉ）１つの可変ＢＶセグメント、（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列、および（ｉｉｉ）定常ＢＣセグメントからなる構築物が機能的ＴＣＲ  β鎖をコードするように、任意のＢＤ、ＢＪおよび／またはＣＤＲ３配列を含みうる。具体的実施形態において、リンカー配列は、配列番号１９３に記載の配列と少なくとも９０％同一である、または配列番号１９５に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。より具体的実施形態において、リンカー配列は、配列番号１９３および配列番号１９５に記載の配列を有する。用語「Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列」および用語「ＢＶセグメントの３’末端とＢＣセグメントの５’末端を結合させるリンカー配列」は、本出願において互換的に使用される。
【０２６９】
ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントは、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒト、またはその組合せでありうる。
【０２７０】
これらの改変は、ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の対形成を改善しうる。「システイン改変」ＡＣおよびＢＣセグメントは、それぞれのＴＣＲ鎖におけるシステインに対する単一アミノ酸の突然変異をコードして、ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖のＣ領域を接続するさらなるジスルフィド結合の形成が起こる（Cohen, C. J., Li, Y. F., El-Gamil, M., Robbins, P. F., Rosenberg, S. a, & Morgan, R. a. (2007), Cancer Research, 67(8), 3898-903.）。これによって、様々なＴＣＲ対形成が低減し、ＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞の機能性を増強する。したがって、ヒトＴＣＲは、ＴＣＲのより安定な発現に至るマウスＣ領域を備え、このいわゆる「マウス化」によって、これらのハイブリッドＴＣＲの細胞表面発現が野生型（ｗｔ）ヒトＴＣＲと比較して増加し、その結果異なるＴＣＲによって改変されたＴ細胞ではより高い機能的アビディティが得られる（Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. a, & Morgan, R. a. (2006). Cancer Research, 66(17), 8878-86）。あるいは、ＡＣおよびＢＣセグメントは、最少のマウス化でありうる、すなわちヒトＣ領域の全置換と同等のＴＣＲ細胞表面発現を確実にするマウスＴＣＲ  αおよびβ鎖のＣ領域内の重要なアミノ酸が交換されている（Sommermeyer, D., & Uckert, W. (2010); Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 184(11), 6223-31.）。同様に、図８を参照されたい。好ましい実施形態において、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントはマウスまたはヒトである。
【０２７１】
もう１つの実施形態において、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントは、ヒトまたはマウスである。好ましい実施形態において、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントはヒトである。さらにより好ましい実施形態において、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントはマウスであり、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントはヒトである。
【０２７２】
特に、ＴＣＲを、ＴＣＲ特異的抗体の作製などの非治療的使用のために使用する場合、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントはマウスであり、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントがヒトであることが有利である。
【０２７３】
もう１つの好ましい実施形態において、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントはヒトであり、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントはヒトである。
【０２７４】
特に、本明細書において記述されるライブラリによって産生されるＴＣＲを治療のために使用する場合、ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントはヒトであり、可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントはヒトであることが有利である。
【０２７５】
ＴＣＲ構築物の配列を改変してもよく、例えば、限定されるわけではないが、コドン最適化してもよく、または例えばヌクレオチドの交換によってさらなる制限部位を挿入してもよい。好ましい実施形態において、ＴＣＲ構築物の配列を、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現に関してコドン最適化する。あるいは、ＴＣＲ構築物の配列を改変しなくてもよい。
【０２７６】
例えば、配列番号１は、ＤｒａＩＩＩ制限部位をさらに含むことから、ヒト定常α領域をコードする配列番号２のヌクレオチド配列の改変版である。もう１つの例は配列番号４であり、配列番号４は、ＢｓｔＥＩＩ制限部位をさらに含むことから、ヒト定常β領域をコードする配列番号５のヌクレオチド配列の改変版である。
【０２７７】
ＴＣＲ構築物の構築ブロックは、例えば単一のクローニングステップによって容易に交換することができるように構築される。このことは、エレメントが適合性である結合部位を含むこと、すなわち全てのＡＶセグメントが、骨格ベクターの３’末端の結合部位と結合することができる結合部位を５’末端において含むこと、およびさらにＡセグメントに関して特異的なリンカー配列と結合することができる結合部位をその３’末端において含むことを意味する。加えて、全てのＡＣセグメントは、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる結合部位をその５’末端に含み、骨格ベクターの５’末端と結合することができる結合部位をその３’末端にさらに含む。このため、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列は、ＡＶセグメントの３’末端の結合部位と結合することができる結合部位をその５’末端に含み、ＡＣセグメントの５’末端の結合部位と結合することができる結合部位をその３’末端にさらに含む。さらに、全てのＢＶセグメントは、骨格ベクターの３’末端の結合部位と結合することができる結合部位をその５’末端に含み、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる結合部位をその３’末端にさらに含む。加えて、全てのＢＣセグメントは、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列に結合することができる結合部位をその５’末端に含み、骨格ベクターの５’末端に結合することができる結合部位をその３’末端にさらに含む。このため、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列は、ＢＶセグメントの３’末端の結合部位と結合することができる結合部位をその５’末端に含み、ＢＣセグメントの５’末端の結合部位と結合することができる結合部位をその３’末端にさらに含む。要するに、構築ブロックは、５’末端において少なくとも１つの結合部位と、３’末端において少なくとも１つの結合部位とを含む。より詳しくは、第１の構築ブロックの３’末端の結合部位は、第１の構築ブロックの３’末端に結合する第２の構築ブロックの５’末端の結合部位と適合性である。
【０２７８】
本明細書において使用される用語「結合部位」は、制限部位、組換え配列、またはシームレスクローニング技術の相同性領域などの、しかしこれらに限定されるわけではない、ベクターにおいて配列を交換するためにクローニングにとって有用である任意の配列を指す。
【０２７９】
例えば、全てのＡＶセグメントは、骨格ベクターの３’末端の制限部位と結合することができる制限部位を５’末端に含み、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。加えて、全てのＡＣセグメントは、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる制限部位をその５’末端に含み、骨格ベクターの５’末端と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。このため、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列は、ＡＶセグメントの３’末端の制限部位と結合することができる制限部位をその５’末端に含み、ＡＣセグメントの５’末端の制限部位と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。さらに、全てのＢＶセグメントは、骨格ベクターの３’末端の制限部位と結合することができる制限部位をその５’末端に含み、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。加えて、全てのＢＣセグメントは、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と結合することができる制限部位をその５’末端に含み、骨格ベクターの５’末端と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。このため、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列は、ＢＶセグメントの３’末端の制限部位と結合することができる制限部位をその５’末端に含み、ＢＣセグメントの５’末端の制限部位と結合することができる制限部位をその３’末端にさらに含む。
【０２８０】
ある特定の実施形態において、ライブラリは、容易に交換することができるように同じ制限部位をその３’末端およびその５’末端に含む、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒトなどの異なる型のＡＶセグメントを含みうる。したがって、ライブラリは、容易に交換することができるように同じ制限部位をその３’末端およびその５’末端に含む、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒトなどの異なる型のＢＶセグメントを含みうる。
【０２８１】
ある特定の実施形態において、ライブラリは、容易に交換することができるように同じ制限部位をその３’末端およびその５’末端に含む、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒトなどの異なる型のＡＣセグメントを含みうる。したがって、ライブラリは、容易に交換することができるように同じ制限部位をその３’末端およびその５’末端に含む、マウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒトなどの異なる型のＢＣセグメントを含みうる。
【０２８２】
ある特定の実施形態において、可変ＡＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く。
【０２８３】
ある特定の実施形態において、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＤｒａＩＩＩ制限部位が続く。ある特定の実施形態において、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が続く。
【０２８４】
ある特定の実施形態において、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩ制限部位が続く。
【０２８５】
ある特定の実施形態において、定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２８６】
ある特定の実施形態において、定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２８７】
具体的実施形態において、可変ＡＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く。Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前に、ＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が続く。定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２８８】
ある特定の実施形態において、可変ＢＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く。
【０２８９】
ある特定の実施形態において、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列の前に、ＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｔＥＩＩ制限部位が続く。
【０２９０】
ある特定の実施形態において、定常ＢＣセグメントの前にＢｓｐＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩ、ＣｌａＩ、およびＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２９１】
ある特定の実施形態において、定常ＢＣセグメントの前にＢｓｐＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２９２】
具体的実施形態において、可変ＢＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く。Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｔＥＩＩ制限部位が続く。定常ＢＣセグメントの前にＢｓｐＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩ、ＣｌａＩ、およびＥｃｏＲＩ制限部位が続く。
【０２９３】
したがって、可変セグメント、リンカー配列、およびＣセグメントを、単一のクローニングステップで交換することができる。加えて、ＴＣＲ構築物の制限部位および骨格ベクターの独自の設計により、ＴＣＲおよびそのＣＤＲ３領域の可変および定常鎖の効率的な交換が可能となるのみならず、ｉｖｔＲＮＡ産生および／またはウイルストランスフェクションに関するベクター間の容易な切り替えが促進される。
【０２９４】
このため、具体的実施形態は、それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが：
（ｉ）５’末端においてＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位を含み、３’末端においてＦｓｐＩ制限部位を含む、可変ＡＶ１〜ＡＶ４５セグメントの１つと、
（ｉｉ）５’末端においてＦｓｐＩ制限部位を含み、３’末端においてＢｓｐＥＩ制限部位を含む、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）５’末端においてＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位を含み、３‘末端においてＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位を含む、定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが：
（ｉ）５’末端においてＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位を含み、３’末端においてＦｓｐＩ制限部位を含む、可変ＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントの１つと、
（ｉｉ）５’末端においてＦｓｐＩ制限部位を含み、３’末端においてＢｓｔＥＩＩ制限部位を含む、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
（ｉｉｉ）５’末端においてＢｓｐＥＩＩ制限部位を含み、その後に３‘末端においてＭｌｕＩ、ＣｌａＩ、およびＥｃｏＲＩ制限部位を含む、定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリに関する。
【０２９５】
したがって、本明細書において記述されるＴＣＲの発現のための発現システムにおいて、骨格ベクターは、ライブラリ構築物の導入のための適合性の結合部位を含む。具体的実施形態において、本明細書において記述されるＴＣＲの発現のための発現システムにおいて、骨格ベクターは、ライブラリ構築物の導入のための適合性の制限部位を含む。
【０２９６】
例えば、ＡＣセグメントは、配列番号１、２、または６に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ＢＣセグメントは、配列番号３、４、５、または７に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有しうる。特に、ＡＣセグメントは、配列番号１、２、または６に記載の配列を有し、ＢＣセグメントは、配列番号３、４、５または７に記載の配列を有しうる。
【０２９７】
可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５は、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有しうる。特に、可変ＡＶ１〜ＡＶ４５セグメントは、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列を有し、可変ＢＶ１〜ＢＶ４７セグメントは、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列を有しうる。
【０２９８】
ＴＣＲ構築物は、少なくとも１つの骨格ベクターに組み込まれている。
【０２９９】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、連結されているもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子を指すと意図される。１つの型のベクターは「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。もう１つの型のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それが導入される宿主細胞において自立複製することができる（例えば、宿主細胞において機能する複製開始点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入後、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。その上、ある特定の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。骨格ベクターは、インサート配列の複製をもたらすようにインサート配列を組み込むことができる環状または線形の核酸分子でありうる。ベクターは、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"に記載される方法などの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ方法の組合せを使用して産生してもよい。ベクターの代表的な例には、次世代ＳＩＮレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）骨格ベクター、トランスポゾンベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）、アデノウイルス骨格ベクター、レトロウイルス骨格ベクター、レンチウイルス骨格ベクターが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０３００】
ベクターはまた、核酸をクローニングするために使用することができるインサート部位を含みうる。インサート部位は、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型制限酵素などのエンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはニッキング酵素の認識部位でありうる。インサート部位は、相同的組換えのための特異的部位でもありうる。インサート部位は、ベクターの中でインサート部位に限って存在しうる。ある特定の状況において、ベクターから他のインサート部位を除去することが望ましい場合がある。例えば、インサート部位が、制限酵素の認識部位である場合、染色体からそのような他の認識部位を除去することが望ましい場合がある。
【０３０１】
Ｉ型制限酵素の代表的な例には、ＣｆｒＡＩ、Ｅｃｏ３７７Ｉ、Ｅｃｏ３９４Ｉ、Ｅｃｏ５８５Ｉ、Ｅｃｏ６４６Ｉ、Ｅｃｏ７７７Ｉ、Ｅｃｏ８２６Ｉ、Ｅｃｏ８５１Ｉ、Ｅｃｏ９１２Ｉ、ＥｃｏＡＩ、ＥｃｏＢＩ、ＥｃｏＤＩ、ＥｃｏＤＲ２、ＥｃｏＤＲ３、ＥｃｏＤＸＸＩ、ＥｃｏＥＩ、ＥｃｏＫＩ、ＥｃｏｐｒｒＩ、ＥｃｏＲ１２４Ｉ、ＥｃｏＲ１２４ＩＩ、ＥｃｏＲＤ２、ＥｃｏＲＤ３、ＨｉｎｄＩ、ＫｐｎＡＩ、ＫｐｎＢＩ、ＮｇｏＡＶ、ＳｔｙＬＴＩＩＩ、ＳｔｙＳＢＬＩ、ＳｔｙＳＥＡＩ、ＳｔｙＳＧＩ、ＳｔｙＳＪＩ、ＳｔｙＳＫＩ、ＳｔｙＳＰＩ、およびＳｔｙＳＱＩが含まれるがこれらに限定されるわけではない。ＩＩＩ型制限酵素の代表的な例には、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＰＩ、ＨｉｎｆＩＩＩ、およびＳｔｙＬＴＩが含まれるがこれらに限定されるわけではない。ＩＩ型制限酵素の代表的な例には、ＡａｒＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｙＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈａＩＩＩ、ＡｊｕＩ、ＡｌｆＩ、ＡｌｏＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＦＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＢＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＡｓｕＩ、ＡｓｕＩＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖａＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＩ、Ｂａｌｌ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｅｌＩ、ＢｄａＩ、ＢｅｔＩ、ＢｆｉＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｉｎＩ、ＢｍｇＩ、ＢｐｌＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＰＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＳＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＩ、ＢｓｉＹＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１４０７Ｉ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＧＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＬＵ１１Ｉ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｓＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣａｕＩＩ、ＣｄｉＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｆｒＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＮＩＩ、ＣｊｅＰＩ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｓｔＭＩ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＲＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＤｒｄＩＩ、ＤｓａＩ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＥｓｐＩ、ＦａｌＩ、ＦａｕＩ、ＦｉｎＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｎｕＤＩＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＧｄｉＩＩ、ＧｓｕＩ、Ｈａｅｌ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、ＨｇｉＡＩ、ＨｇｉＣＩ、ＨｇｉＥＩＩ、ＨｇｉＪＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１７８ＩＩＩ、Ｈｐｙｌ８８Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭａｅＩ、ＭａｅＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｃｒＩ、ＭｆｅＩ、ＭｊａＩＶ、ＭｌｕＩ、Ｍｍｅｌ、ＭｎｌＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｔＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｐＢＩＩ、ＮｓｐＩ、ＯｌｉＩ、ＰａｃＩ、ＰａｓＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＰｆｌＭＩ、ＰｆｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｍｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｒＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｌｅＡＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｎＤＩ、ＳａｐＩ、ＳａｕＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｄｕＩ、ＳｅｃＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｅＩ、ＳｆｉＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｉｍＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｎａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｌＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２Ｉ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、Ｓｓｅ８６４７Ｉ、ＳｓｍＩ、ＳｓｐＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑＩ、ＴａｑＩＩ、ＴａｔＩ、ＴａｕＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｏＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ４ＣＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＥＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、ＴｓｓＩ、ＴｓｔＩ、ＴｓｕＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、ＵｂａＦ１０Ｉ、ＵｂａＦ９Ｉ、ＵｂａＰＩ、ＶｓｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩＩ、ＸｍａＩＩＩおよびＸｍｎＩが含まれるがこれらに限定されるわけではない。ホーミングエンドヌクレアーゼの代表的な例には、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｆ−ＴｆｌＩ、Ｆ−ＴｆｌＩＩ、Ｆ−ＴｆｌＩＶ（ＨｅｇＡとしても知られる）、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＢａｓＩ、Ｉ−Ｂｍｏｌ、Ｉ−Ｃｅｕｌ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓｐＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏｌＰ、Ｉ−ＰｃｕｌＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｇＩ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｐｂＩＰ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳ３ｂＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−Ｔｓｐ０６１Ｉ、Ｉ−ＴｗｏＩ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰａｂＩ、ＰＩ−ＰａｂＩＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｃａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩおよびＰＩ−ＺｂａＩが含まれるがこれらに限定されるわけではない。可能性がある他の型のエンドヌクレアーゼは、その認識部位の複雑度によって特徴付けられる酵素である。そのような酵素の代表的な例は、ＦｓｅＩである。
【０３０２】
ベクターは、複数のインサート部位を含み、インサート部位は、マルチクローニングサイトの一部として集合しうる。ベクターはまた、同一でありうる１つ超のマルチクローニングサイトを含みうる。
【０３０３】
構築物を、当業者に公知のクローニング技術によって骨格ベクターに組み込んでもよい。これらは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＳ型およびＩＩＧ型制限酵素に基づくクローニングアプローチの使用、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの組換えに基づくクローニングアプローチの使用、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）（ＮＥＢ）、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）システム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）シームレスクローニングなどの相同性に基づくクローニングアプローチの使用を含む。
【０３０４】
特定の実施形態において、骨格は、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターまたはレトロウイルス骨格ベクターである。
【０３０５】
用語「ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター」は、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために使用することができる任意のベクターを指す。本発明において使用することが企図されるｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、Ｔ７、Ｔ３、および／またはｓｐ６プロモーターを含むベクターを含む。そのようなベクターは当業者に周知である。１つの実施形態において、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、Ｔ７および／またはｓｐ６プロモーターを含む。さらにｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、ポリアデニンテールなどの、しかしこれらに限定されるわけではない少なくとも１つのＲＮＡ安定化配列を含みうる。ポリアデニンテールは、少なくとも４０アデニン、少なくとも６０アデニン、少なくとも８０アデニン、少なくとも９０アデニン、少なくとも１００アデニン、少なくとも１１０アデニンを含みうる。
【０３０６】
本明細書において使用される用語「レトロウイルス骨格ベクター」は、真核細胞の宿主ゲノムに所望のＤＮＡ構築物を組み込むために使用することができる任意のベクターを指す。当業者は、そのようなベクターを承知している。本発明において使用するために企図されるベクターの非制限的な例は、ＭＰ７１レトロウイルス骨格ベクター（Schambach A, Wodrich H, Hildinger M, Bohne J, Krausslich HG, Baum C., Mol Ther. 2000 Nov; 2(5):435-45; Hildinger M, Abel KL, Ostertag W, Baum C., J Virol. 1999 May; 73(5):4083-9）である。候補ＤＮＡ構築物を含むレシーバープラスミド（ｐＲ）を、ウイルス産生のために使用する。次に、トランスジーンを有するレトロウイルスを、標的細胞の形質導入のために利用する。トランスジェニックタンパク質を永続的に発現する形質導入された細胞の多数を容易に産生することができる。当業者は、レトロウイルス骨格ベクターが長い末端反復（ＬＴＲ）配列などのエレメントを含みうることを承知している。レトロウイルス骨格ベクターの設計は、当業者に公知であり、関連するテキストおよび文献において記述されている（例えば、"Retroviruses", Coffin JM, et al. eds.; 1997）。
【０３０７】
好ましくは、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列をＣＤＲ３Ａ配列およびＡＪ配列に置換することによって、機能的ＴＣＲ  α鎖をコードする構築物が得られ、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列を、ＣＤＲ３Ｂ配列、ＢＤ、およびＢＪ領域に置換すると、機能的ＴＣＲ  β鎖をコードする構築物が得られる。
【０３０８】
好ましい実施形態において、ＣＤＲ３Ａ配列およびＡＪ配列、ＣＤＲ３配列、ＢＤおよびＢＪ領域は、オリゴヌクレオチドに含まれる。それによって、本明細書において記述されるライブラリは、オリゴヌクレオチドを介したいずれかのＣＤＲ３領域の挿入によって任意の特異性のＴＣＲを効率的に産生することができる。
【０３０９】
ある特定の実施形態において、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９６に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。特定の実施形態において、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９６に記載の配列を有する。他の実施形態において、レトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２００に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。特定の実施形態において、レトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２００に記載の配列を有する。
【０３１０】
好ましくは、１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖とをコードするＴＣＲ構築物において、１つのＴＣＲ  α鎖をコードする配列および１つのＴＣＲ  β鎖をコードする配列は、ベクターから１つ超のタンパク質の発現を可能にするエレメントによって連結されている。そのような例示的なエレメントは、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ（ＩＲＥＳ）またはリボソームスキッピングエレメントを含むがこれらに限定されるわけではない。リボソームスキッピングエレメントは、エレメントに隣接する配列によってコードされるタンパク質の化学量論的産生を可能にする。配列は、新たに挿入されたアミノ酸にリボソームが共有結合するのを防止して、リボソームに翻訳を続けさせ、それによって多価タンパク質の同時翻訳切断が起こる。好ましいリボソームスキッピングエレメントはＰ２Ａエレメントである。
【０３１１】
本発明のもう１つの態様は、ＴＣＲの発現のための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが
（ｉ）可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つ、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含み、４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが
（ｉ）可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つ、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含む、ライブラリ、
−  （ｉ）ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉ）ＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖ）ＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システムに言及する。
【０３１２】
本発明のある特定の実施形態において、上記の発現システムは、
（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む。
【０３１３】
ある特定の実施形態において、ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９７に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ならびに／またはＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９８に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ならびに／またはＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９９に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。特定の実施形態において、ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９７に記載の配列を有し、ならびに／またはＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９８に記載の配列を有し、ならびに／またはＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターは、配列番号１９９に記載の配列を有する。
【０３１４】
他の実施形態において、ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０１に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ならびに／またはＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０２に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ならびに／またはＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０３に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。特定の実施形態において、ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０１に記載の配列を有し、ならびに／またはＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０２に記載の配列を有し、ならびに／またはＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクターは、配列番号２０３に記載の配列を有する。
【０３１５】
本発明のさらなる態様は、ＴＣＲの発現のための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つを含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つを含む、ライブラリ、
−  （ｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システムに言及する。
【０３１６】
１つの実施形態において、この発現システムは、
（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む。
【０３１７】
当業者はまた、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター（ｉ）〜（ｉｉｉ）およびレトロウイルス骨格ベクター（ｉｖ）〜（ｖｉ）を含む上記の発現システムも企図することを理解している。さらに、上記の発現システムは、ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター（ｉ）〜（ｉｉｉ）、レトロウイルス骨格ベクター（ｉｖ）〜（ｖｉ）、およびレンチウイルス骨格ベクター（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）を含みうることは明白である。
【０３１８】
さらなる態様は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローン集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含む、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、本明細書において記述される４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  β鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、本明細書において記述される４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  α鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物と
を含む、ライブラリに関する。
【０３１９】
ある特定の実施形態は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローン集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含む、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  β鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、請求項１に記載の４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  α鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含み、
細胞クローンが内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しない、ライブラリに関する。
【０３２０】
ある特定の実施形態において、細胞クローンはＢＷ−／−細胞株および／またはＪｕｒｋａｔ−／−細胞株の細胞クローンである。
【０３２１】
用語「ＢＷ−／−細胞株」は、ＡＫＲマウスにおいて自然発症し（Lee NE and Davis MM., J Immunol. 1988 Mar 1; 140(5):1665-75; Letourneur F., Malissen B., Eur J Immunol. 1989;19(12):2269-2274）、内因性のＴＣＲ  α鎖または内因性のＴＣＲ  β鎖のいずれも発現しない親ＢＷ５１４７胸腺腫に由来するＢＷ細胞株を指す。ＴＣＲヘテロ二量体の表面発現は、ＣＤ３タンパク質複合体との会合に依存することから、ＢＷ−／−細胞株に、ＧＦＰと共にヒトＣＤ３を同時発現するように安定に形質導入して（ＢＷ−／−−ＣＤ３−ＧＦＰ）（本明細書において以降、単にＢＷ−／−と呼ぶ）、形質導入した細胞を容易に同定できるようにした。ヒトＣＤ３の存在により、これらの細胞は、選択されたＡＶおよびＢＶコードＲＶによる同時形質導入の成功後、細胞表面に任意のヒトまたはマウストランスジェニックＴＣＲを発現することができる。
【０３２２】
用語「Ｊｕｒｋａｔ−／−」および「Ｊｕｒｋａｔ７６−／−」は、ヒトＶαおよびＶβ鎖を発現しない当初のヒトＴＣＬ株の変種であるヒトＪｕｒｋａｔ７６−／−細胞株を指す（Abraham RT, Weiss A., Nat Rev Immunol. 2004 Apr; 4(4):301-8）。これは、選択された適切なＲＶの形質導入後、トランスジェニックＴＣＲ表面発現にとって必要な残りの全てのＴＣＲ関連ＣＤ３成分を有する。
【０３２３】
本発明のさらなる態様は、４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団とを含む、ＴＣＲタンパク質のライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、ＴＣＲ  β鎖とを含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、請求項１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つと、ＴＣＲ  α鎖と
を含む、ライブラリに関する。
【０３２４】
既に記述したように、ＴＣＲライブラリは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体を作製するための動物の免疫のために使用することができる。ＴＣＲライブラリは、汎特異的、クラスタ特異的、モノ特異的抗体を作製するために使用することができる。好ましい実施形態において、ＴＣＲライブラリは、クラスタ特異的抗体を作製するために使用することができる。特に、ライブラリは、抗体産生およびＴＣＲ特異的抗体の選択のための動物の免疫のために使用することができる。
ライブラリは、その応用の必要性に具体的に適合させることができるように構築される。
【０３２５】
特に、ライブラリを、ＴＣＲ特異的抗体の作製のために使用する場合、マウス定常領域、ヒト可変領域、およびリンカー配列を有するＴＣＲをコードするＴＣＲ構築物を使用してもよい。より詳しくは、ライブラリをＴＣＲ特異的抗体の作製のために使用する場合、マウス定常領域、ヒト可変領域、およびマウスリンカー配列を有するＴＣＲをコードするＴＣＲ構築物を使用してもよい。好ましくは、ＴＣＲ構築物は、レトロウイルス骨格ベクターに組み入れられる。ＴＣＲ特異的抗体の作製のために使用することができる例示的なベクターを、図１０に示す。図１０Ａは、ヒトＡＶ１−１領域に対して特異的な抗体を作製するために使用することができるベクターを示す。このベクターの配列を配列番号２０４に示す。ヒトＢＶ２鎖に対して特異的な抗体の作製のために使用することができる例示的なベクターを図１０Ｂに示し、その配列を配列番号２０５に記載する。
【０３２６】
他方、ライブラリを治療的ＴＣＲの構築のために使用する場合、ヒト定常領域およびヒト可変領域を有するＴＣＲをコードするＴＣＲ構築物を使用して、所望の特異性を有するＣＤＲ３をオリゴヌクレオチドによって導入する。
【０３２７】
より詳しくは、治療的ＴＣＲの産生のために、候補ＴＣＲの配列を、クローンＴ１．８に関する「単離ＴＣＲの再設計」の章で詳細に記述されるように同定する。したがって、ＣＤＲ３領域の特異的配列をシークエンシングする。さらに、可変ＴＣＲ  α鎖および可変ＴＣＲ  β鎖型に対して特異的なプライマーを使用するＰＣＲ、またはシークエンシング（説明に関しては、単離Ｔ１．８クローンのＴＣＲ  α鎖をコードする配列を配列番号２１０に記載し、単離クローンＴ１．８のＴＣＲ  β鎖をコードする配列を配列番号２１１に記載する）のいずれかによって、所望のＴＣＲのＴＣＲ  α鎖の可変領域の型およびＴＣＲ  β鎖の可変領域の型を同定する。次に、所望のＴＣＲに関して同定された可変α鎖および可変β鎖に対応するＡＶおよびＢＶセグメントをそれぞれ、定常ＣＡおよびＣＢセグメントと結合させて、この配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用して、リンカー配列を所望のＣＤＲ３配列に交換することによってＴＣＲを再構成する。再設計されたＴＣＲの配列を図１１に示す。再設計されたＴＣＲ  α鎖のベクターマップを図１１Ａに示し、その配列を配列番号２０８に示す。再設計されたＴＣＲ  β鎖のベクターマップを図１１Ｂに示し、その配列を配列番号２０９に示す。
【０３２８】
ＴＣＲライブラリの構築ブロックはまた、ＤＮＡ合成によって作製することもできる。ＤＮＡ合成法は当業者に周知である。
【０３２９】
さらに、本明細書において記述されるライブラリを、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、または細胞ディスプレイスクリーニングなどの、抗体を作製するための合成ディスプレイスクリーニングのために使用することができる。当業者は、ナイーブライブラリ、免疫ライブラリ、および合成ライブラリを含む多様なディスプレイスクリーニング技術を承知している。
【０３３０】
本明細書において記述されるライブラリを、その特徴付けおよび／または治療での使用のために、ＴＣＲを一過性または安定に発現させるために使用することができる。
【０３３１】
本出願のもう１つの態様は、配列番号２４９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲ  α鎖と、配列番号２５０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲ  β鎖とを含むＴＣＲ受容体に言及する。
【０３３２】
ある特定の実施形態は、配列番号２４９のアミノ酸配列を有するＴＣＲ  α鎖と、配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＴＣＲ  β鎖とを含むＴＣＲ受容体に関する。
【０３３３】
さらに、本出願は、ＴＣＲ  α鎖とＴＣＲ  β鎖とを含むＴＣＲ受容体であって、
ＴＣＲ  α鎖が、配列番号２４９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、配列番号２４５の配列を有するＣＤＲ３とを含み、
ＴＣＲ  β鎖が、配列番号２５０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列と、配列番号２４６の配列を有するＣＤＲ３とを含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０３３４】
ある特定の実施形態は、ＴＣＲ  α鎖とＴＣＲ  β鎖とを含むＴＣＲ受容体であって、
ＴＣＲ  α鎖が、配列番号２４９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号２４５の配列を有するＣＤＲ３とを含み；
ＴＣＲ  β鎖が、配列番号２５０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列と、配列番号２４６の配列を有するＣＤＲ３とを含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０３３５】
ある特定の実施形態は、配列番号２４７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲ  α鎖と、配列番号２４８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲ  β鎖とを含む、ＴＣＲ受容体に言及する。
【０３３６】
ある特定の実施形態は、配列番号２４７のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲ  α鎖と、配列番号２４８のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲ  β鎖とを含むＴＣＲ受容体に関する。
【０３３７】
さらに、本出願は、ＴＣＲ  α鎖とＴＣＲ  β鎖とを含む、ＴＣＲ受容体であって、
ＴＣＲ  α鎖が、配列番号２４７と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２４３に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
ＴＣＲ  β鎖が、配列番号２４８と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２４４に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０３３８】
ある特定の実施形態は、ＴＣＲ  α鎖とＴＣＲ  β鎖とを含む、ＴＣＲ受容体であって、
ＴＣＲ  α鎖が、配列番号２４７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２４３に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
ＴＣＲ  β鎖が、配列番号２４８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２４４に記載のヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０３３９】
本出願は、上記のＴＣＲをコードする核酸分子にも関することは当業者に明白である。
【０３４０】
本出願のもう１つの態様は、薬剤として使用するための上記で定義されたＴＣＲに関する。このため、本出願はまた、上記で定義されたＴＣＲと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も企図する。ある特定の実施形態は、ＮＹ−ＥＳＯ１を発現する悪性細胞を含む疾患を処置するために使用するための上記で定義されたＴＣＲに言及する。このため、本出願はまた、がんの処置に使用するために上記で定義されたＴＣＲにも言及する。
【実施例】
【０３４１】
ＴＣＲ特異的免疫原の作製
ＣＤ３に関連して発現されるヘテロ二量体タンパク質として、ネイティブＴＣＲは、非常にコンフォメーション依存的な構造である。この複雑な構造は、異なるＶ領域を識別するために使用することができるエピトープの露出に強く影響を及ぼす。
【０３４２】
第１のステップにおいて、その本来の立体配置でのありとあらゆるＴＣＲ  ＶαおよびＶβ鎖を、レシピエント細胞の表面上に発現させる。これらの細胞は、免疫原および一次スクリーニング細胞として役立つ。細胞免疫原を３つのステップで作製する。第１に、ヒトＴＣＲレパートリーにおける４５個全てのＡＶ遺伝子セグメントおよび４７個全てのＢＶ遺伝子セグメントをコードするベクターライブラリを作製する。次に、ベクターを必要に応じてこのライブラリから選択して、ＴＣＲ陰性細胞株（Ｊｕｒｋａｔ７６−／−）に形質導入するためのレトロウイルス（ＲＶ）を作製し、それによって個々に定義されたＶαＶβヘテロ二量体を有する細胞株を作製する。第３に、これらのＴＣＲトランスジェニック細胞株を、ＴＣＲ表面発現に関するフローサイトメトリーのために選択して、安定な高い表面発現を示す個々のＴ細胞クローンを得る。これらのＴ細胞クローンは、ＰＣＲによるその特異的ＡＶおよびＢＶ領域の増加、バリデーション、および凍結保存後にマスター細胞ライブラリの一部となる。
【０３４３】
ＴＣＲベクターライブラリ
モジュラーＴＣＲベクターライブラリを、ＭＰ７１レトロウイルスベクター骨格を使用して開発した（Schambach, 2000; Hildinger, 1999；図１Ｂ）。完全なＴＣＲベクターライブラリは、それぞれが、４５個の異なるＡＶまたは４７個の異なるＢＶ可変領域の１つを含む、９２個の異なるベクターで構成される。ベクターは、正確なネイティブコンフォメーションで異なるＴＣＲの発現を可能にするように設計した。共通のＣＤＲ３領域を全てのベクターに使用した。これは、オボアルブミンタンパク質に対して特異的であるＯＴ−１マウスＴ細胞クローンに由来した。第２に、ヒト可変領域をそれぞれのマウス定常領域（ｍＣＡまたはｍＣＢ）と結合させた。マウス定常領域は、ヒト定常領域に存在しない複数の荷電アミノ酸を含むことから、ヒトＶαおよびＶβタンパク質鎖の良好な対形成を促進し、それによって、改善された相互のタンパク質相互作用、およびより良好なＴＣＲヘテロ二量体対形成、およびより高い表面発現を可能にする。
【０３４４】
レトロウイルスの産生と細胞の形質導入
個々のｐＲＡＶｘまたはｐＰＢＶｘベクターを使用して、対応するＲＶを作製する。これらのベクターによってコードされるキメラヒト−マウスＴＣＲ鎖が、細胞表面で適切な立体配置でヘテロ二量体を形成する能力を証明する例を図１に示す。本明細書においてＴ細胞株に、ｐＲＡＶｘおよびｐＰＢＶｘレトロウイルスの選択された組合せを形質導入した。トランスジェニックＴＣＲの表面発現を、ｍＣＢに対して特異的なハムスター抗マウス抗体を使用してフローサイトメトリーにおいて評価した。いかなるＴＣＲの表面発現も、α／βヘテロ二量体の完全に正確な形成およびＣＤ３との会合を必要とする。このため、ＴＣＲは、ヘテロ二量体が適切な立体配置でフォールディングして対を形成する場合に限って表面発現を示す。この場合に認められるように、２つのＲＶの同時形質導入後に細胞のおよそ４０％の亜集団が表面ＴＣＲを発現した。個々のクローンの選択後、均一で安定な発現が全てのＴ細胞において見出された。同様に、対応する市販のＶβ特異的ｍａｂが入手可能である他の複数のＴＣＲヘテロ二量体が発現される。これらは、ｍａｂに結合することが見出され、コンフォメーションが、試験したｍａｂによって認識されるエピトープに関してヒトＴ細胞のコンフォメーションと同等であることを証明した（データは示していない）。
【０３４５】
キメラＴＣＲを発現するＴＣＲ細胞ライブラリの開発
２つのＴＣＲ細胞ライブラリを、それぞれのＡＶおよびＢＶレトロウイルスベクターライブラリを使用して開発する。選択されたＲＶのレトロウイルス形質導入後、細胞を、機能的ＴＣＲの発現の検出にとって有用である抗体によって染色して、陽性細胞をソーティングした。マウス定常領域を有するＴＣＲを発現するＴＣＲ細胞ライブラリを作製するために、抗ｍＣＢ特異的抗体を使用した。ヒト定常領域を有するＴＣＲを発現するＴＣＲ細胞ライブラリ作製するために、抗ＣＤ３抗体を使用した。選択されたＡＶまたはＢＶ領域に対して特異的な均一なＴＣＲ発現を有する細胞試薬を効率的に産生するために、形質転換ＴＣＲ陰性Ｔ細胞を使用して細胞ライブラリを作製する。さらに、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無限増殖能を有する。１つの細胞ライブラリを、マウスＴＣＲ陰性細胞（ＢＷ−／−）を使用して開発し、第２のライブラリをＴＣＲ陰性ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を使用して開発する（図３）。
【０３４６】
ＢＷ−／−ＴＣＲ細胞ライブラリを免疫のために使用した。この目的に関して、マウスを、キメラＴＣＲ発現ＢＷ−／−細胞によって免疫した。これは、全細胞免疫原による免疫の際に認められる差を最小限にする。選択されたＶ領域に対するＴＣＲ免疫原性をこのように最小化したにもかかわらず。マウスはなおも、ＢＷ−／−細胞によって発現される他の表面タンパク質に対する抗体を産生することができた。これらは、免疫されたマウスの系統に応じた、同種異系ＭＨＣ分子に対する応答を含んだ。さらに、細胞の形質転換またはウイルスの形質導入に関連するＢＷ−／−細胞によって発現される特定されていない表面タンパク質も同様に、免疫原性エピトープとなった。最後に、ＢＷ−／−細胞は、マウスまたはラットＩｇに非特異的に結合することが見出された。
【０３４７】
一次スクリーニングにおいてＴＣＲ構造に反応しないｍａｂが同定されることを回避するために、対応するＪｕｒｋａｔ−／−ライブラリをスクリーニング（「異種間スクリーニング」）のために使用する。Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞は、ＭＨＣおよび他の細胞表面タンパク質がＢＷ−／−細胞とは異なることから、それらは、ＢＷ−／−細胞免疫原を使用して産生させたこれらの分子に対して特異的なｍａｂに結合しない。さらに、Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞は、マウスまたはラットＩｇの非特異的結合を示さない。
【０３４８】
ヒトＴＣＲ  ＡＶ１２−２およびＢＶ１２−３領域に対する推定の特異性を有する２つの上清による、異種間スクリーニングの一例を図４に示す。認められるように、３つ全てのＢＷ−／−細胞株が、特異的ＴＣＲ発現にかかわらず、非特異的Ｉｇ結合のその特性により、両方の上清に結合する。これに対し、Ｊｕｒｋａｔ−／−ＧＦＰ対照細胞は、両方の上清に関して陰性のままであり、それぞれの上清は、適切なＴＣＲによってＴＣＲを形質導入されたＪｕｒｋａｔ−／−細胞株のみに結合する。
【０３４９】
キメラＴＣＲを発現するマウスＢＷ−／−細胞ライブラリ
マウス細胞ライブラリは、ＡＫＲマウス（Lee NE and Davis MM., J Immunol. 1988 Mar 1; 140(5):1665-75; Letourneur F., Malissen B., Eur J Immunol. 1989;19(12):2269-2274）において自然発症した親ＢＷ５１４７胸腺腫に由来する、ＢＷ−／−細胞株に基づく。上記のように、ＴＣＲヘテロ二量体の表面発現は、ＣＤ３タンパク質複合体との会合に依存する。したがって、ＢＷ−／−細胞株に、ヒトＣＤ３をＧＦＰと共に同時発現するように安定に形質導入して（ＢＷ−／−−ＣＤ３−ＧＦＰ）（本明細書において単にＢＷ−／−と呼ぶ）、形質導入された細胞を容易に同定できるようにした。ヒトＣＤ３の存在によって、これらの細胞は、選択されたＡＶおよびＢＶコードＲＶの同時形質導入の成功後に、細胞表面に任意のヒトまたはマウストランスジェニックＴＣＲを発現することができる。表面発現は、図２に示すように、ヒトＣＤ３に対して特異的な抗体の結合またはマウス定常領域に対する抗体によってモニターすることができる。
【０３５０】
キメラＴＣＲを発現するヒトＪｕｒｋａｔ細胞ライブラリ
ヒトＪｕｒｋａｔ  ＴＣＬを使用して第２の細胞ライブラリを構築する。ヒトＪｕｒｋａｔ７６−／−細胞株（本明細書において以降Ｊｕｒｋａｔ−／−）は、ヒトＶαおよびＶβ鎖を発現しない当初のヒトＴＣＬ株の変種である（Abraham RT, Weiss A., Nat Rev Immunol. 2004 Apr; 4(4):301-8）。この細胞は、選択された適切なＲＶの形質導入後、トランスジェニックＴＣＲ表面発現にとって必要な残りの全てのＴＣＲ会合ＣＤ３成分を有する。陰性対照として、非常に高レベルのＧＦＰを発現するが、ＴＣＲタンパク質を発現しないＪｕｒｋａｔ−／−細胞を作製した。
【０３５１】
ＢＷ−／−およびＪｕｒｋａｔ−／−細胞を使用する異種間スクリーニング
ＢＷ−ＴＣＲ形質導入細胞を免疫のために使用したが、これらの細胞は、抗ヒトＡＶ１２−２特異的ハイブリドーマ上清に関して、ならびに抗ヒトＢＶ１２−３特異的上清に関して本明細書において示したように、マウスまたはラットＩｇに非特異的に結合することから、ハイブリドーマのスクリーニングには使用することができなかった。いずれのハイブリドーマ上清もそのＴＣＲ発現にかかわらず、ＢＷ−／−細胞を染色する（図４、ａおよびｂの最初の列）。これに対し、Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞が特異的ＡＶまたはＢＶ  ＴＣＲ鎖を発現する場合に限って、同じ上清がＪｕｒｋａｔ−／−細胞を染色する（図４、ａおよびｂの２番目の列）。既に言及したように、ＴＣＲ形質導入ＢＷ−／−細胞に、ＴＣＲ発現を可能にするためにＣＤ３−ＧＦＰも安定に形質導入する。これは、その中間のレベルのＧＦＰの原因である。ＴＣＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞上での非特異的ＴＣＲ結合と特異的ＴＣＲ結合とを識別するために、安定に形質導入されたＧＦＰ  Ｊｕｒｋａｔ−／−細胞クローンを確立して、ハイブリドーマ上清スクリーニングの際の対照として使用した。示されるように、Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ細胞はＡＶまたはＢＶ特異的ｍａｂのいずれかを含む上清によって試験した場合に、非標識のままである（図４、ａおよびｂの２番目の列）。
【０３５２】
Ｌｅｗｉｓラットの免疫
Ｌｅｗｉｓラットを、マウス定常領域を組合せとしてまたは単一のＴＣＲとして含むｈＡＶ／ｈＢＶヘテロ二量体を発現するＢＷ−／−細胞によって免疫した。これらのラットの脾臓細胞を回収して、骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８に融合させて２４枚の９６ウェルプレートに播種した。２週間後、全てのプレートを通して、ウェルあたり平均で３個のハイブリドーマクローンが観察され、評価されるおよそ６，９００のハイブリドーマを生じた。
【０３５３】
一次スクリーニング
一次スクリーニングに関して、フローサイトメトリーでのスクリーニングに関して、４枚の９６ウェルプレートからの上清を１つの収集プレートにプールした。これによって、一次フローサイトメトリースクリーニングの試料数は２４枚から６枚の９６ウェルプレートに低減された。
【０３５４】
陽性の上清が一次スクリーニングにおいて、モノ、クラスタ、または汎ＴＣＲ特異性を示すかを識別するために、ｈＡＶ３／ｈＢＶ１２−３を発現する集団（４５％）、Ｊｕｒｋａｔ  ｈＡＶ８−２／ｈＢＶ２４を発現する集団（４５％）、および非ＴＣＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ細胞の１つの集団（１０％）を含む、Ｊｕｒｋａｔ細胞クローンのプールを分析して、非ＴＣＲ特異的ｍａｂを同定した。
【０３５５】
一次異種間スクリーニングの際に、例えばスクリーニングプールのおよそ４０％に結合する異なる抗体クローンのプールした上清が１つ見出された（図５）。このｍａｂは、Ｊｕｒｋａｔ−ＧＦＰ（ＴＣＲ陰性）対照細胞が、結合のいかなるシフトも示さなかったことから、ＴＣＲ関連結合パターンを示す。クローン１５Ｂ４を含む一次スクリーニングの結果を図５Ａに示す。クローン５Ｈ４を含む一次スクリーニングの結果を図５Ｂに示す。
【０３５６】
二次スクリーニング
一次スクリーニング活性の原因である個々のハイブリドーマを同定するために、一次スクリーニングのプールした上清においてＴＣＲ関連結合パターンを有するとして一次スクリーニングにおいて同定された位置の上清を、スクリーニング細胞の同じプールについて個々に試験した。例えば１つの上清が、予想される結合パターンを再現することが見出され、このハイブリドーマクローンを、本明細書において１５Ｂ４として示す（図６Ａ）。例えばもう１つの上清もまた、予想される結合パターンを再現することが見出され、このハイブリドーマクローンを、本明細書において５Ｈ４として示す（図６Ｂ）。これらの実験は、１５Ｂ４ならびに５Ｈ４が、少なくともＢＶ１２−３を認識することを確立する。以下において、１５Ｂ４がクラスタＴＣＲ特異的ｍａｂであることを確立するために使用することができる実験を記述する。
【０３５７】
ＰＢＬソーティング
候補抗体がモノ特異的またはクラスタ特異的であるかを識別するために（すなわち、アミノ酸相同性を共有する多数のＢＶ鎖と反応する）、単一のヒトドナーのＰＢＬを候補ｍａｂによって染色する。細胞の陽性分画をフローサイトメトリーによってソーティングして、完全なヒトＴＣＲ  ＡＶおよびＢＶ  ＰＣＲレパートリー分析を、ソーティングした細胞について実施する。
【０３５８】
ＰＢＬから、ソーティングしたＰＢＬ  ｍＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡを調製する。完全なヒトＴＣＲ  ＡＶおよびＢＶレパートリーを標準的なＰＣＲプロトコール（変性：９４℃で２分間；アニーリング：９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル；伸長：７２℃で１分間）によってそれぞれの特異的ＢＶ鎖に関して特異的なプライマー対を使用して分析する。増幅されたバンドを抽出してシークエンシングする。異なるＴＣＲ  ＶαまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖の複数のアンプリコンを示す試料は、候補抗体が、ＴＣＲ  ＶαまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖のクラスタに対して特異的であることを示している。
【０３５９】
ソーティングした細胞の配列分析
複数のＴＣＲ  ＶαまたはＴＣＲ  Ｖβ鎖に結合する抗体に関して、抗体が特異的であるＢＶ鎖を発現する細胞が、ソーティングされた集団に含まれる。しかし、一部の混入細胞もまたソーティング集団に含まれ、ＰＣＲ法の高い感度により陽性のＰＣＲアンプリコンを生じる。混入によるアンプリコンを除外するために、ＢＶ特異的プライマーによって検出された全てのアンプリコンのバンドをシークエンシングする。配列を分析する際に、クロマトフェログラムならびに増幅されたバンドの密度を考慮に入れた。
【０３６０】
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ＡＤＣＣを、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造元のプロトコールに従って測定する。簡単に説明すると、エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）経路を通しての遺伝子転写の活性化を、エフェクター細胞において発光の読みによって定量されるルシフェラーゼ活性によってモニターする。ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）変種、およびホタルルシフェラーゼエフェクター細胞の発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。ＡＤＣＣ  ＭＯＡにおける抗体の生物活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されたルシフェラーゼを通して定量する。
【０３６１】
ヒト化ＴＣＲマウスモデルにおけるＢＶ１２−３関連ＴＣＲを発現するＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇
ヒトＡＶおよびＢＶ（ｈＡＶ／ｈＢＶ）ＴＣＲ鎖を発現するＡＢａｂマウスを、同定された抗体（５００μｇ）によって処置し、マウス１匹をナイーブ対照として無処置とする。尾出血によって採取したＰＢＬを、処置前（ｄ０）および処置の２、５、７、および９日後に分析して、抗ＣＤ３−ＰＥおよび候補ｍａｂによって染色する（同様に図７を参照されたい）。
【０３６２】
ＴＣＲ可変鎖抗体陽性集団を、マウス抗ラットＩｇＧ二次抗体を使用して検出する。
【０３６３】
抗体によって同定されたＣＤ３＋Ｔ細胞の集団は、実験の時間経過を通してナイーブマウスにおいて安定なままである。これに対し、ＴＣＲ可変鎖抗体結合Ｔ細胞は、ＴＣＲ可変鎖抗体によって処置した２匹の動物において４８時間までに消失する。ＣＤ３＋として表される残りのＴ細胞およびＴＣＲ可変鎖抗体陰性集団は、実験の間同じレベルで安定なままである。
【０３６４】
候補ＴＣＲ  Ｖ鎖ｍａｂのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を詳細に調べるために、候補抗体に対するＴ細胞集団の大きさを、ＴＣＲ  Ｖα鎖またはＴＣＲ  Ｖβ鎖に対して単一特異性である市販のｍａｂを使用して検出されたＴ細胞集団の大きさと比較して評価する。この比較を、ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇試験の前後に行う。実験は、０日目および４８時間後のヒトＴＣＲトランスジェニック（ＡＢａｂ）マウスおよび野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＰＢＬのｍａｂ染色を含む。
【０３６５】
ＢＶ鎖が候補ｍａｂによって標的とされるか否かを決定するために、個々のＢＶ鎖特異的プライマーを使用して、完全なＴＣＲ  ＢＶレパートリー分析を準備した。候補抗体（５００μｇ）によって枯渇させたヒトＴＣＲトランスジェニックマウス（ＡＢａｂ）からのＰＢＬを収集して、個々のＢＶ特異的プライマーを使用して、完全なＢＶレパートリーを決定する。
【０３６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ枯渇の際のサイトカイン測定
ＣＤ３またはＣＤ２８受容体に対して特異的なｍａｂを含むＴ細胞構造を標的とする多くのｍａｂは、免疫応答に関係するＴ細胞から多くのサイトカインの急速な全身性の放出を誘導する。抗原−ＭＨＣ複合体の認識に直接関係せず、ＴＣＲシグナル伝達に関係しないＴＣＲの構造領域を認識するＭａｂは、毒性のサイトカインストームを誘発することなく、望まれない病原性Ｔ細胞の消失に関して実現可能で安全である。
【０３６７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞枯渇の際にマウスにおけるサイトカイン放出を測定するために、ヒトＴＣＲトランスジェニックＡＢａｂマウスの３つの群を２つの対照ｍａｂおよび候補ＴＣＲ可変鎖ｍａｂによって処置する。それぞれのマウスに精製ｍａｂ  ５００μｇを投与する。第１の対照群を、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプのアイソタイプ対照ｍａｂによって処置する。このｍａｂは、エプスタイン−バーウイルス抗原ＥＢＮＡ２を認識する。このｍａｂは、処置したマウスにおいていかなる効果も示してはならない。第２の対照は、ハムスター抗マウスＣＤ３  ｍａｂ（ＩｇＧ１抗マウスＣＤ３ζ、クローン１４５−２Ｃ１１）であり、処置した動物においてサイトカインストームを誘導することが知られている（Hirsch, 1988; Penaranda, 2011）。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの血清中濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用して、ｍａｂ適用の０、２、６、１２、および２４時間後に測定した。
【０３６８】
抗ＥＢＮＡ２  ｍａｂによる処置は、サイトカイン産生に対して効果を示してはならない。これに対し、抗ＣＤ３  ｍａｂによる処置は、適用の約２時間後にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＦＮ−γの放出を誘導すべきである。しかし、候補ｍａｂは、動物の血清中のサイトカインレベルを増加させてはならない。ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの増加したレベルが後の時点（例えば、１２時間）で検出されることがあるが、これは、時間の遅延により標的化Ｔ細胞の食作用を介したマクロファージ活性化をおそらく伴う炎症応答がｉｎ  ｖｉｖｏで起こっている可能性があることを示している。
【０３６９】
アセンブルされたライブラリ
【０３７０】
【表７−１】
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【０３７１】
【表７−２】
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【０３７２】
【表７−３】
0006568239.tif 000012
【０３７３】
それらがマウス定常ＡＣセグメント（配列番号６）の代わりにヒト定常ＡＣセグメント（配列番号１）を含むことを除き、表８において特定されたＴＣＲＡ１〜ＴＣＲＡ４５構築物に対応するＴＣＲＡ１〜ＴＣＲＡ４５構築物を含み、およびそれらがマウス定常ＢＣセグメントの代わりにヒト定常ＢＣセグメント（配列番号４）を含むことを除き、表８において特定されたＴＣＲＢ１〜ＴＣＲＢ４７構築物に対応するＴＣＲＢ１〜ＴＣＲＢ４７構築物をさらに含む、さらなるライブラリを構築する。
【０３７４】
ＴＣＲ構築物ＴＣＲＡ１〜ＴＣＲＡ４５およびＴＣＲＢ１〜ＴＣＲＢ４７は、配列番号１９６のｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターに組み込まれている。
【０３７５】
ＴＣＲ構築物ＴＣＲＡ１〜ＴＣＲＡ４５およびＴＣＲＢ１〜ＴＣＲＢ４７は、配列番号２００のレトロウイルス骨格ベクターに組み込まれている。
【０３７６】
構築物ＴＣＲＡ１およびＴＣＲＢ１２は、ｉｖｔＲＮＡ骨格ＡＣ−Ｐ２Ａ−ＢＣ（配列番号１９９）に組み込まれている。
【０３７７】
構築物ＴＣＲＡ１１およびＴＣＲＢ１２は、レトロウイルス骨格ベクターＡＣ−Ｐ２Ａ−ＢＣ（配列番号２０３）に組み込まれている。
【０３７８】
単離ＴＣＲの再設計
Ｔ細胞クローンＴ１．８−３−２００の機能分析
Ｔ細胞クローンＴ１．８−３−２００とＨＬＡをマッチさせたＮＹ−ＥＳＯ１−Ｘ（シグナルペプチドに融合したヒトＮＹ−ＥＳＯ１抗原）をロードしたＡＰＣとの同時培養により、クローンＴ１．８−３−２００の特異性および機能が証明された（ｎ．ｄ．検出不能；図１２Ａ）。
【０３７９】
当初のＴ細胞クローンＴ１．８−３−２００のＴＣＲ分析
Ｔ細胞クローンＴ１．８−３−２００の再配列したＴＣＲ  ＤＮＡ配列を、５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって増幅した。このために、全ＲＮＡをＴ１．８−３−２００（シグナルペプチドに融合したヒトＮＹ−ＥＳＯ１抗原：ＮＹ−ＥＳＯ１−Ｘを認識する）Ｔ細胞から単離して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。再配列したＴＣＲ  αおよびβ配列を次に、５’ＲＡＣＥ増幅によって増幅した。ＴＯＰＯクローニングを使用して、増幅されたＤＮＡ断片を適切なレシピエントベクターにおいてクローニングして、細菌の形質転換後の個々のＴＣＲ  ＤＮＡ配列を単離した。
【０３８０】
ＤＮＡシークエンシング
単一の細菌コロニーから単離されたベクターのＴＣＲ配列インサートをＤＮＡヌクレオチドシークエンシングによって分析した。
【０３８１】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲαのシークエンシング結果（配列番号２１０）
ａｔｇｔｃａｃｔｔｔｃｔａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇｇｔｃａｃａｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｇｇｃｔａｇｇａｃｃｔｇｇｃａｔｔｇｃｃｃａｇａａｇａｔａａｃｔｃａａａｃｃｃａａｃｃａｇｇａａｔｇｔｔｃｇｔｇｃａｇｇａａａａｇｇａｇｇｃｔｇｔｇａｃｔｃｔｇｇａｃｔｇｃａｃａｔａｔｇａｃａｃｃａｇｔｇａｔｃｃａａｇｔｔａｔｇｇｔｃｔａｔｔｃｔｇｇｔａｃａａｇｃａｇｃｃｃａｇｃａｇｔｇｇｇｇａａａｔｇａｔｔｔｔｔｃｔｔａｔｔｔａｔｃａｇｇｇｇｔｃｔｔａｔｇａｃｃａｇｃａａａａｔｇｃａａｃａｇａａｇｇｔｃｇｃｔａｃｔｃａｔｔｇａａｔｔｔｃｃａｇａａｇｇｃａａｇａａａａｔｃｃｇｃｃａａｃｃｔｔｇｔｃａｔｃｔｃｃｇｃｔｔｃａｃａａｃｔｇｇｇｇｇａｃｔｃａｇｃａａｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｔｇｃａａｔｔｔｃｇａａｃａｃｃｇｇｔａａｃｃａｇｔｔｃｔａｔｔｔｔｇｇｇａｃａｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇａｃｇｇｔｃａｔｔｃｃａａａｔａｔｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃａｇｃｔｇａｇａｇａｃｔｃｔａａａｔｃｃａｇｔｇａｃａａｇｔｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔａｔｔｃａｃｃｇａｔｔｔｔｇａｔｔｃｔｃａａａｃａａａｔｇｔｇｔｃａｃａａａｇｔａａｇｇａｔｔｃｔｇａｔｇｔｇｔａｔａｔｃａｃａｇａｃａａａａｃｔｇｔｇｃｔａｇａｃａｔａｇｔｃａｇｇ
【０３８２】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲβのシークエンシング結果（配列番号２１１）
ａｔｇｇｇｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｃｔｔｇｇｃｔａｔｇｔｇｇｔｃｃｔｔｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｇａｇｃａｇｇｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｃｃａａｇｔｇａｃｃｃａｇａａｃｃｃａａｇａｔａｃｃｔｃａｔｃａｃａｇｔｇａｃｔｇｇａａａｇａａｇｔｔａａｃａｇｔｇａｃｔｔｇｔｔｃｔｃａｇａａｔａｔｇａａｃｃａｔｇａｇｔａｔａｔｇｔｃｃｔｇｇｔａｔｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｇｇｇｃｔｇｇｇｃｔｔａａｇｇｃａｇａｔｃｔａｃｔａｔｔｃａａｔｇａａｔｇｔｔｇａｇｇｔｇａｃｔｇａｔａａｇｇｇａｇａｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｇｇｔａｃａａａｇｔｃｔｃｔｃｇａａａａｇａｇａａｇａｇｇａａｔｔｔｃｃｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｇｇａｇｔｃｇｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｃｃａｇａｃｃｔｃｔｃｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｔｇｃｃａｇｃａａｔａａｃｔｔａｇｃｃｔｃｃｔａｃａａｔｇａｇｃａｇｔｔｃｔｔｃｇｇｇｃｃａｇｇｇａｃａｃｇｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｃｔａｇａｇｇａｃｃｔｇａａａａａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｃｃｃｇａｇｇｔｃｇｃｔｇｔｇｔｔｔｇａｇｃｃａｔｃａｇａａｇｃａｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｃａｃｃｃａａａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇｇｔｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃａｃａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇａｇｃｔｇｇｔｇｇｇｔｇａａｔｇｇｇａａｇｇａｇｇｔｇｃａｃａｇｔｇｇｇｇｔｃａｇｃａｃａｇａｃｃｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｃａａｇａｇｃａｇｃｇｃｔｔ
【０３８３】
ＩＭＧＴ配列分析
ＴＣＲ特異性定義パラメータ（再配列したＴＣＲ  Ｖ−（Ｄ）−Ｊα／βセグメント、ＣＤＲ３領域の配列、およびＣα／β領域を使用した）を、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ検索プラットフォーム（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を使用して、回収されたＤＮＡ配列から分析した。ＴＣＲ  αおよびＴＣＲ  β鎖の結果をそれぞれ、図１２Ｂおよび図１２Ｃに示す。
【０３８４】
同定されたＴ１．８−３−２００  ＴＣＲα  ＣＤＲ３配列：
ＤＮＡ配列：ｇｃａａｔｔｔｃｇａａｃａｃｃｇｇｔａａｃｃａｇｔｔｃｔａｔ（配列番号２４３）
タンパク質配列：AISNTGNQFY（配列番号２４５）
【０３８５】
同定されたＴ１．８−３−２００  ＴＣＲβ  ＣＤＲ３配列：
ＤＮＡ配列：ｇｃｃａｇｃａａｔａａｃｔｔａｇｃｃｔｃｃｔａｃａａｔｇａｇｃａｇｔｔｃ（配列番号２４４）
タンパク質配列：ＡＳＮＮＬＡＳＹＮＥＱ（配列番号２４６）
【０３８６】
ＴＣＲベクターライブラリにおける再構築
ヒト定常領域を有するｐＧＥＭに基づくＴＣＲベクターライブラリからの適切なベクターを使用して、一般的なＣＤＲ３リンカーを、それぞれのＴ１．８−３−２００  ＴＣＲα／β  ＣＤＲ３＋Ｊ領域（制限部位：ＦｓｐＩ×ＢｓｐＥＩ（ＴＣＲ  α鎖：ＡＶ１４ベクター）；ＦｓｐＩ×ＢｓｔＥＩＩ（ＴＣＲ  β鎖、ＢＶ２７ベクター））をコードするアニールしたＤＮＡオリゴヌクレオチドと交換することによって、Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲα／β鎖を再構築した。
【０３８７】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲαオリゴヌクレオチドセンス５’−＞３’（配列番号２３９）
ＧＣＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴ
【０３８８】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲαオリゴヌクレオチドアンチセンス５’−＞３’（配列番号２４０）
ＣＣＧＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧＣ
【０３８９】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲβオリゴヌクレオチドセンス５’−＞３’（配列番号２４１）
ＧＣＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧ
【０３９０】
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲβオリゴヌクレオチドアンチセンス５’−＞３’（配列番号２４２）
ＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＣＧＴＴＣＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＧＣ
【０３９１】
再構築したＴ１．８−３−２００  ＴＣＲαプラスミドの配列を配列番号２０８（ｐＭＰ７１に基づくレトロウイルスベクター）および配列番号２５１（ｉｖｔＲＮＡベクター）に記載する。再構築したＴ１．８−３−２００  ＴＣＲβプラスミドの配列を、配列番号２０９（レトロウイルスベクター）および配列番号２５２（ｐＧＥＭに基づくｉｖｔＲＮＡベクター）に記載する。再構築されたＴＣＲ  α鎖のヌクレオチド配列を配列番号２４７に記載し、対応するアミノ酸配列を配列番号２４９に記載する。再構築されたＴＣＲ  β鎖のヌクレオチド配列を配列番号２４８に記載し、対応するアミノ酸配列を配列番号２５０に記載する。
【０３９２】
ＴＣＲ  Ｔ１．８−３−２００のトランスジェニック機能分析
Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲα／β鎖をコードするＲＮＡを、生成したｐＡＶ／ＢＶ−Ｔ１．８−３−２００−ｉｖｔＲＮＡベクター構築物から産生して、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のトランスフェクションのために使用した。Ｔ１．８−３−２００  ＴＣＲトランスフェクトＰＢＬとＨＬＡをマッチさせたＮＹ−ＥＳＯ１−Ｘ−ロードＡＰＣとの同時培養により、レシピエントＴ細胞における既に定義されたＴ１．８−３−２００  ＴＣＲの特異性および機能の回復が証明された（図１２Ｄ）。
【０３９３】
本出願は以下の実施形態をさらに含む。
【０３９４】
実施形態１：それぞれが４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含む、全ての機能的ＴＣＲ型を発現させるためのライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、以下の構築ブロック：
−  可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つと、
−  定常ＡＣセグメントと
を含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
−  可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つと、
−  定常ＢＣセグメントと
を含む、ライブラリ。
【０３９５】
実施形態２：以下の構築ブロック：
−  Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、
−  Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列と
をさらに含む、実施形態１に記載のライブラリ。
【０３９６】
実施形態３：ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントがマウス、最少マウス化、システイン改変、または野生型ヒト、またはその組合せである、実施形態１または２に記載のライブラリ。
【０３９７】
実施形態４：ＡＣセグメントおよびＢＣセグメントがマウスまたはヒトである、実施形態３に記載のライブラリ。
【０３９８】
実施形態５：可変ＡＶセグメントおよび可変ＢＶセグメントが、ヒト、またはマウス、好ましくはヒトである、実施形態１から４のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０３９９】
実施形態６：ＡＣセグメントが配列番号１、２、または６に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有し、ＢＣセグメントが、配列番号３、４、５または７に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する、実施形態１から５のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４００】
実施形態７：ＡＣセグメントが配列番号１、２、または６に記載の配列を有し、ＢＣセグメントが、配列番号３、４、または７に記載の配列を有する、実施形態１から６のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４０１】
実施形態８：可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５が、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７が、配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列と少なくとも８０％同一である可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする、実施形態１から７のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４０２】
実施形態９：可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５が、配列番号１００〜配列番号１４４に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  α鎖領域をコードし、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７が、配列番号１４５〜配列番号１９１に記載の配列を有する可変ＴＣＲ  β鎖領域をコードする、実施形態１から８のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４０３】
実施形態１０：可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５が、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列と少なくとも８０％同一である配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７セグメントが、配列番号５３〜配列番号９９に記載の配列と少なくとも８０％同一である配列を有する、実施形態１から９のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４０４】
実施形態１１：可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５セグメントが、配列番号８〜配列番号５２に記載の配列を有し、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７セグメントが、配列番５３〜配列番号９９に記載の配列を有する、実施形態１０に記載のライブラリ。
【０４０５】
実施形態１２：ＴＣＲ構築物が、少なくとも１つの骨格ベクターに組み込まれている、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のライブラリ。
【０４０６】
実施形態１３：ＴＣＲ  α鎖をコードするＴＣＲ構築物またはＴＣＲ  β鎖をコードするＴＣＲ構築物がそれぞれ、個々に１つの骨格ベクターに組み込まれ、および／または１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖とをコードするＴＣＲ構築物が骨格ベクターに組み込まれている、実施形態１２に記載のライブラリ。
【０４０７】
実施形態１４：１つのＴＣＲ  α鎖と１つのＴＣＲ  β鎖をコードするＴＣＲ構築物において、１つのＴＣＲ  α鎖をコードする配列と１つのＴＣＲ  β鎖をコードする配列が、リボソームスキッピングエレメントによって連結されている、実施形態１３に記載のライブラリ。
【０４０８】
実施形態１５：１つのＴＣＲ  α鎖をコードする配列と１つのＴＣＲ  β鎖をコードする配列が、Ｐ２Ａエレメントによって連結されている、実施形態１４に記載のライブラリ。
【０４０９】
実施形態１６：少なくとも１つの骨格ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）骨格ベクター、レトロウイルス骨格ベクター、またはレンチウイルス骨格ベクターからなる群から選択される、実施形態１２から１５に記載のライブラリ。
【０４１０】
実施形態１７：少なくとも１つの骨格ベクターがｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターまたはレトロウイルス骨格ベクターである、実施形態１６に記載のライブラリ。
【０４１１】
実施形態１８：ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターがＴ７および／またはｓｐ６プロモーターを含む、実施形態１７に記載のライブラリ。
【０４１２】
実施形態１９：ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクターが、少なくとも１つのＲＮＡ安定化配列を含む、実施形態１７または１８に記載のライブラリ。
【０４１３】
実施形態２０：ＲＮＡ安定化配列がポリアデニンテールである、実施形態１９に記載のライブラリ。
【０４１４】
実施形態２１：ポリアデニンデールが、少なくとも４０個のアデニンを含む、実施形態２０に記載のライブラリ。
【０４１５】
実施形態２２：ポリアデニンテールが少なくとも１１０個のアデニンを含む、実施形態２１に記載のライブラリ。
【０４１６】
実施形態２３：レトロウイルス骨格ベクターが、ＴＣＲ鎖構築物を組み込むための部位に隣接するＬＴＲエレメントを含む、実施形態１７に記載のライブラリ。
【０４１７】
実施形態２４：Ａセグメント対して特異的なリンカー配列を、ＣＤＲ３Ａ配列およびＡＪ配列に交換することによって、機能的ＴＣＲ  α鎖をコードする構築物が得られ、Ｂセグメント対して特異的なリンカー配列を、ＣＤＲ３Ｂ配列、ＢＤ、およびＢＪ領域に交換することによって、機能的ＴＣＲ  β鎖をコードする構築物が得られる、実施形態２から２３に記載のライブラリ。
【０４１８】
実施形態２５：ＴＣＲ構築物の構築ブロックを、単一のクローニングステップで交換することができる、実施形態１から２４のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４１９】
実施形態２６：可変セグメント、リンカー配列、およびＣセグメントを、単一のクローニングステップで交換することができる、実施形態２から２５に記載のライブラリ。
【０４２０】
実施形態２７：ＴＣＲ構築物の構築ブロックが、適合性である結合部位を含む、実施形態１から２６のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４２１】
実施形態２８：ＴＣＲ構築物の構築ブロックが、適合性である制限部位を含む、実施形態１から２７のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４２２】
実施形態２９：可変ＡＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く、実施形態２から２８に記載のライブラリ。
【０４２３】
実施形態３０：Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が続く、実施形態２から２９に記載のライブラリ。
【０４２４】
実施形態３１：Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩ制限部位が続く、実施形態２から３０に記載のライブラリ。
【０４２５】
実施形態３２：定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く、実施形態２から３１に記載のライブラリ。
【０４２６】
実施形態３３：定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く、実施形態２から３２に記載のライブラリ。
【０４２７】
実施形態３４：可変ＢＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続く、実施形態２から３３に記載のライブラリ。
【０４２８】
実施形態３５：Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列の前に、ＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｔＥＩＩ制限部位が続く、実施形態２から３４に記載のライブラリ。
【０４２９】
実施形態３６：定常ＢＣセグメントの前に、ＢｓｔＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く、実施形態２から３５に記載のライブラリ。
【０４３０】
実施形態３７：可変ＡＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続き、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が続き、定常ＡＣセグメントの前にＢｓｐＥＩおよび／またはＤｒａＩＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続き、ならびに可変ＢＶセグメントの前にＮｏｔＩおよび／またはＡｇｅＩ制限部位が存在し、その後にＦｓｐＩ制限部位が続き、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列の前にＦｓｐＩ制限部位が存在し、その後にＢｓｔＥＩＩ制限部位が続き、定常ＢＣセグメントの前にＢｓｐＥＩＩ制限部位が存在し、その後にＭｌｕＩおよび／またはＣｌａＩおよび／またはＥｃｏＲＩ制限部位が続く、実施形態２から３６に記載のライブラリ。
【０４３１】
実施形態３８：ＴＣＲ構築物が、哺乳動物、好ましくはヒト発現のためにコドン最適化される、実施形態１から３７のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４３２】
実施形態３９：ｉｖｔＲＮＡ産生骨格ベクターが、配列番号１９６に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する、実施形態１６から３８に記載のライブラリ。
【０４３３】
実施形態４０：ｉｖｔＲＮＡ産生骨格ベクターが、配列番号１９６に記載の配列を有する、実施形態３９に記載のライブラリ。
【０４３４】
実施形態４１：レトロウイルス骨格ベクターが、配列番号２００に記載の配列と少なくとも９０％同一である配列を有する、実施形態１６から４０のいずれか一つに記載のライブラリ。
【０４３５】
実施形態４２：レトロウイルス骨格ベクターが、配列番号２００に記載の配列を有する、実施形態４１に記載のライブラリ。
【０４３６】
実施形態４３：ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つ、
（ｉｉ）Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、
（ｉ）可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つ、
（ｉｉ）Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列
を含む、ライブラリ、および
（ｉ）ＡＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉ）ＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
（ｉｉｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
（ｉｖ）ＡＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖ）ＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
（ｖｉ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システム。
【０４３７】
実施形態４４：（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む、実施形態４３に記載の発現システム。
【０４３８】
実施形態４５：ＴＣＲを発現させるための発現システムであって、
−  それぞれが４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物と、それぞれが４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物とを含むライブラリであって、
４５個の異なる可変ＴＣＲ  α鎖の１つをコードする４５個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＡＶセグメントＡＶｓｅｇ１〜ＡＶｓｅｇ４５の１つを含み、
４７個の異なる可変ＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物のそれぞれが、可変ＢＶセグメントＢＶｓｅｇ１〜ＢＶｓｅｇ４７の１つを含む、
ライブラリ、および
−  （ｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、
（ｉｉｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター、および／または
−  （ｉｖ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖ）ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター、
（ｖｉ）ＡＣセグメントと、Ａセグメントに対して特異的なリンカー配列と、ＢＣセグメントと、Ｂセグメントに対して特異的なリンカー配列とを含むレトロウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレトロウイルス骨格ベクター
を含む発現システム。
【０４３９】
実施形態４６：（ｖｉｉ）ＡＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｖｉｉｉ）ＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
（ｉｘ）ＡＣおよびＢＣセグメントを含むレンチウイルス骨格ベクター
からなる群から選択される少なくとも１つのレンチウイルス骨格ベクターをさらに含む、実施形態４３から４５に記載の発現システム。
【０４４０】
実施形態４７：ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター（ｉ）から（ｉｉｉ）、およびレトロウイルス骨格ベクター（ｉｖ）から（ｖｉ）を含む、実施形態４３から４６に記載の発現システム。
【０４４１】
実施形態４８：ｉｖｔＲＮＡ骨格ベクター（ｉ）から（ｉｉｉ）、レトロウイルス骨格ベクター（ｉｖ）から（ｖｉ）およびレンチウイルス骨格ベクター（ｖｉｉ）から（ｉｘ）を含む、実施形態４３または４７に記載の発現システム。
【０４４２】
実施形態４９：４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンの集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンの集団とを含む、ＴＣＲを発現する細胞クローンのライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、実施形態１に記載の４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、ＴＣＲ  β鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含み、および
異なるＴＣＲ  β鎖を発現する細胞クローンのそれぞれが、実施形態１に記載の４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つをコードする４７個のＴＣＲ構築物の１つと、ＴＣＲ  α鎖をコードする１つのＴＣＲ構築物とを含む、
ライブラリ。
【０４４３】
実施形態５０：細胞クローンが、ＢＷ−／−細胞株および／または機能的ＴＣＲを欠損するＪｕｒｋａｔ細胞株である、実施形態４９に記載のライブラリ。
【０４４４】
実施形態５１：４５個の異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団と、４７個の異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質の集団とを含む、ＴＣＲタンパク質のライブラリであって、
異なるＴＣＲ  α鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、実施形態１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４５個の異なるＴＣＲ  α鎖の１つと、ＴＣＲ  β鎖とを含み、
異なるＴＣＲ  β鎖を含むＴＣＲタンパク質のそれぞれが、実施形態１に記載のＴＣＲ構築物によってコードされる４７個の異なるＴＣＲ  β鎖の１つと、ＴＣＲ  α鎖とを含む、ライブラリ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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