(57)【要約】  本発明は、プルランの新たな利用方法が提供するものであり、例えば、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲル、タンパク質がプルランと架橋しているプルランゲル、プルランゲルの乾燥物、薬学的組成物、タンパク質検出キット等、ならびにそれらの製造方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプルランが架橋されてなるプルランゲル。
【請求項２】
上記複数のプルランは、下記一般式（１）で表される構造によって架橋されている、請求項１に記載のプルランゲル。
【化１】
2015133439.tif 000009
（式（１）において、複数ある＊のうちの少なくとも２つはプルランとの架橋点である）
【請求項３】
さらに、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されている、請求項１または２に記載のプルランゲル。
【請求項４】
上記タンパク質は、抗体、抗原、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、もしくはホルモン、またはこれらの何れかの機能的フラグメントである、請求項３に記載のプルランゲル。
【請求項５】
薬剤が含浸されている、請求項１または２に記載のプルランゲル。
【請求項６】
平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載のプルランゲル。
【請求項７】
プルラン以外の多糖類を含んでいる、請求項１〜６の何れか１項に記載のプルランゲル。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載のプルランゲルを乾燥させた、プルランゲル乾燥物。
【請求項９】
複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法。
【化２】
2015133439.tif 000010
（式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である）
【請求項１０】
複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法。
【化３】
2015133439.tif 000011
（式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である）
【請求項１１】
複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、
乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、
上記水溶液および上記水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる、プルランゲル製造方法。
【化４】
2015133439.tif 000012
（式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である）
【請求項１２】
上記架橋剤は塩化シアヌルである、請求項９〜１１の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法。
【請求項１３】
上記水溶液は、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０である、請求項９〜１２の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法。
【請求項１４】
−２０℃〜３７℃で架橋を行う、請求項９〜１３の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法。
【請求項１５】
上記プルランゲルはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がさらに架橋されており、
上記水溶液は当該タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をさらに含んでいる、請求項９〜１４の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法。
【請求項１６】
請求項９〜１５の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法によって製造された、プルランゲル。
【請求項１７】
薬剤の徐放性を有する薬学的組成物の製造方法であって、
請求項９〜１４の何れか１項に記載のプルランゲル製造方法によって作製されたプルランゲルを乾燥させる工程と、
乾燥させたプルランゲルを、上記薬剤を含む液体に浸漬する工程とを含む、薬学的組成物製造方法。
【請求項１８】
上記プルランゲルは、乾燥前の平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍである、請求項１７に記載の薬学的組成物製造方法。
【請求項１９】
請求項３または４に記載のプルランゲルまたはその乾燥物を備える、タンパク質検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プルランゲルならびにその製造方法および利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プルランは、グルコース３分子がα−１，４結合したマルトトリオースがα−１，６結合で繋がった水溶性の多糖類であり、現在、食品添加剤および医薬品補助剤として広く使われている。【０００３】
例えば、特許文献１には、薬物の肝臓へのターゲティングを目的とした、薬物と水溶性多糖プルランとからなる水溶性の結合体製剤が記載されている。この結合体製剤は、プルランと塩化シアヌルとを反応させ、次いでシアヌル化プルランと薬物とを化学結合させることによって製造される。【０００４】
また、非特許文献１には、疎水性のコレステロールおよびカチオン性官能基を付加したプルランのナノゲルが記載されている。このナノゲルは、疎水性であるコレステロールが水性溶媒中で互いに集まる性質を利用して、親水性であるプルランを集合させて作製したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開平９−１２４５１２号公報（１９９７年５月１３日公開）」
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Nochi et al., Nature Materials, 9: 572-578, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のようにプルランの様々な利用方法が研究されてきたが、プルランの水溶性の性質をもっぱら利用するものであった。プルランの新たな利用方法を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るプルランゲルは、複数のプルランが架橋されてなる。【０００９】
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。【００１０】
【化１】
2015133439.tif 000002
【００１１】
（式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である）
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。【００１２】
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、上記水溶液および上記水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる、プルランゲル製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、プルランの新たな利用方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例において、粉砕したプルランゲルおよびその粒子径を示す図である。
【図２】実施例において、ラット血清中のＤｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＧ抗体の推移を示す図である。
【図３】実施例において、プルランマイクロゲルおよび各処理後の結果を示す図である。
【図４】実施例において、プルランゲルフィルムを示す図である。
【図５】実施例において、各プルランゲルフィルムのタンパク質徐放性を示す図である。
【図６】実施例において、プルランマイクロゲルの粒子径を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
〔プルランゲルおよび製造方法〕
（プルランゲル）
本発明に係るプルランゲルは、複数のプルランが架橋されてなる。プルランは、グルコース３分子がα−１，４結合したマルトトリオースがα−１，６結合で繋がった多糖類である。本発明に係るプルランゲルを構成するプルランの平均分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すればよいが、例えば、２０ｋＤａ〜１６００ｋＤａであり得る。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上かつＢ以下」を意味する。
【００１６】
【化２】
2015133439.tif 000003
【００１７】
また、本発明に係るプルランゲルの一実施形態において、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されていてもよい。
【００１８】
本発明に係るプルランゲルおいて、複数のプルランが架橋されている架橋部分の構造は特に限定されないが、例えば、複数のプルランは下記一般式（１）で表される構造によって架橋されている。
【００１９】
【化３】
2015133439.tif 000004
【００２０】
式（１）において、複数ある＊のうちの少なくとも２つはプルランとの架橋点である。
【００２１】
一実施形態において、プルランゲルはプルランのみが架橋されてなり、その場合、プルランとの架橋点でない＊はヒドロキシ基である。具体的には、複数ある＊のうちの２つはプルランとの架橋点であり、それ以外の＊はヒドロキシ基であるか、あるいは、複数ある＊のうちの３つともプルランとの架橋点である架橋構造を含んでいる。すなわち、プルランゲルは、２分子以上、好ましくは３分子以上のプルランが１つの架橋構造で架橋されている構造を含んでいる。なお、プルランゲル中には、複数ある＊のうちの１つのみがプルランと結合している、すなわち架橋を構成していない、上記一般式（１）で表される構造が含まれていてもよい。
【００２２】
別の実施形態において、さらにタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されていてもよい。タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されている架橋部分の構造は特に限定されないが、例えば、上記一般式（１）で表される構造によって架橋されている。その場合、プルランとの架橋点でない＊は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸との架橋点である。すなわち、プルランゲルは、複数ある＊のうちの２つはプルランとの架橋点であり、かつ、それ以外の＊はタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸との架橋点である架橋構造を含んでいる。
【００２３】
本発明に係るプルランゲルでは、このような架橋構造が多数ある。そのため、一実施形態において、多数のプルランが多数の架橋構造を介して網目状に構成されている。なお、プルラン同士は直接結合していない。プルランは、ランダムな位置のヒドロキシ基で架橋されていると考えられる。そのため、プルランは、１分子中に、複数の架橋点を有していてもよい。また、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が架橋されている場合、当該タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸はプルランゲルの内部および表面に存在し得る。
【００２４】
１つのプルランゲルに含まれる多数の架橋構造において、架橋の様式は１種類である必要はなく、例えば、タンパク質が架橋しているプルランゲルにおいて、多数の架橋構造の少なくとも一部にタンパク質が結合していればよい。すなわち、一実施形態において、複数の架橋構造のうちの一部では、複数の＊のうちの２つがプルランとの架橋点であり、それ以外の＊がタンパク質との架橋点であり、複数ある架橋構造のうちの別の一部では、複数の＊のうちの２つがプルランとの架橋点であり、それ以外の＊がヒドロキシ基である。また、プルランゲルは、上記の架橋構造の他に、２つのタンパク質と１つのプルランが結合した（すなわち、１つの＊がプルランとの架橋点であり、２つの＊がタンパク質との架橋点である）架橋構造を含んでいてもよい。また、上記の架橋構造の他に、１つのタンパク質と１つのプルランが結合した（すなわち、１つの＊がプルランとの架橋点であり、１つの＊がタンパク質との架橋点であり、１つの＊がヒドロキシ基である）架橋構造を含んでいてもよい。
【００２５】
タンパク質またはペプチドが架橋されている場合、当該タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、側鎖にヒドロキシ基を有するアミノ酸（セリン、チロシンおよびスレオニン等）の当該ヒドロキシ基で架橋されていると考えられる。また、側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸等）の当該カルボキシ基でも架橋され得る。ただし、これらのアミノ酸に限定されるわけではない。
【００２６】
プルランゲルに架橋されるタンパク質としては、例えば、抗体、抗原、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、およびホルモン、ならびにこれらの機能的フラグメント等が挙げられる。タンパク質は、天然タンパク質であってもよいし、非天然タンパク質であってもよい。このようなタンパク質が架橋されたプルランゲルは、例えば、後述するタンパク質検出キットとして利用することができる。
【００２７】
本明細書において「ペプチド」は、２以上のアミノ酸がペプチド結合でつながった化合物を指す。「ペプチド」には、オリゴペプチドおよびポリペプチドも包含される。
【００２８】
プルランゲルに架橋されるペプチドとしては、例えば、上記タンパク質の機能的フラグメント以外のフラグメントが挙げられる。このようなペプチドが架橋されたプルランゲルも、例えば、後述するタンパク質検出キットとして利用することができる。
【００２９】
プルランゲルに架橋されるアミノ酸は、天然型アミノ酸であってもよいし、非天然型アミノ酸であってもよい。当該アミノ酸として好ましくは、ヒドロキシ基を有するアミノ酸である。ヒドロキシ基を有するアミノ酸としては、例えば、セリン、チロシン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、およびそれらの誘導体が挙げられる。なお、アミノ酸のカルボキシ基においても架橋され得る。
【００３０】
本発明に係るプルランゲルは、ハイドロゲルであってもよいし、オルガノゲルであってもよい。オルガノゲルにおける有機溶剤としては、メタノール、エタノール、アセトンまたはクロロフォルム等が挙げられる。後述の実施例で示すように、本発明に係るプルランゲルは、水だけでなく、メタノール等の有機溶剤に対しても安定性を有している。
【００３１】
プルランゲルの大きさおよび形状は特に限定されず、使用目的に応じて適宜設定すればよい。形状としては、例えば、球形、直方体、およびシート状等が挙げられる。大きさは、例えば、数十ｃｍ角の大きさであってもよいし、μｍオーダーの大きさ（プルランマイクロゲル）であってもよい。さらに、ｎｍオーダーの大きさ（プルランナノゲル）であってもよい。また、厚さが１μｍ〜３ｍｍのシートであってもよい。一実施形態において、平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍである粒子とすることが好ましい。なお、「平均粒径」は、レーザー回折・散乱法による測定方法を用いて、体積換算の平均粒径として算出することができる。
【００３２】
本発明のプルランマイクロゲルおよびプルランナノゲルは、通針性を有する大きさであり得、注射によって生体へ投与することが可能である。後述の実施例で示すように、プルランゲルは皮下投与時の刺激および炎症反応を示さず、安全に生体へ投与し得る。
【００３３】
本発明のプルランゲル（有色の液体または有色の薬剤等を含浸していない場合）の色は、製造の条件によって異なるが、透明〜白色であり、好ましくは透明である。また、本発明のプルランゲルは、好ましくは、色が均一である。
【００３４】
また、本発明に係るプルランゲルは、薬剤が含浸されていてもよい。薬剤としては、医療用薬剤、実験用薬剤、およびワクチン等が挙げられ、例えば、上述のタンパク質およびペプチドの他、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）等の生体分子およびその以外の化学物質が挙げられる。薬剤が含浸されているプルランゲルでは、薬剤はプルランと架橋されておらず、プルランゲルが保持する液体（水または有機溶剤）に溶解または懸濁されている。薬剤が含浸されているプルランゲルは、徐放性を有する材料として利用することもでき、例えば、アジュバント、創傷被覆剤、および癒着防止剤等として、医療分野で好適に用いることができる。
【００３５】
本発明に係るプルランゲルは、オートクレーブ（１２１℃、２０分）に供しても、形状を維持し得る。したがって、本発明に係るプルランゲルを、例えば、生体等に適用する場合、あるいは実験等に用いる場合に、オートクレーブによる滅菌を行うことができる。オートクレーブに供する場合には、プルランゲルを水に浸漬した状態で行うことが好ましい。また、本発明のプルランゲルは、凍結・解凍させても、形状を維持することができる。したがって、冷凍保存も可能である。
【００３６】
また、本発明に係るプルランゲルは、後述する製造方法で用いる塩化シアヌル等の有毒な物質を実質的に含んでいない。また、架橋構造自体は、生体への毒性がほとんどない。そのため、本発明に係るプルランゲルは、生体へ安全に適用することができる。
【００３７】
本発明に係るプルランゲルは、プルラン以外の多糖類を含んでいるハイブリッドゲルであってもよい。当該多糖類は、プルランに架橋されているのではなく、プルランゲルを構成するプルランの網目構造に絡まることでプルランゲルの一部となっている。タンパク質が架橋されたプルランゲルでは、当該多糖類はタンパク質にも絡まっていてもよい。当該多糖類は、プルランゲルの内部および／または外部に存在し得る。複数の分子の多糖類が、複数の分子のプルランに絡まることにより、プルランゲル中でプルランと当該多糖類とが網目状に張り巡らされた構造であり得る。当該多糖類としては、例えば、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、デキストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、β−シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、アラビアガム、キトサン、およびトレハロース、ならびにこれらの誘導体等が挙げられる。当該多糖類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。このようなハイブリッドゲルでは、多糖類単独ではゲル化しないものをプルランと組み合わせることによりゲル化できるという利点がある。例えば、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンとのハイブリッドゲルでは、高いアジュバント効果が期待される。また、例えば皮下に注射したプルランゲルは分解しづらいが、これら多糖類と組み合わせることによって分解し易くすることもできる。さらに、β−シクロデキストリンとのハイブリッドゲルでは、低分子化合物を含浸させた場合に徐放性を有し得る。
【００３８】
また、本発明に係るプルランゲルは、内部に任意の物体を保持していてもよい。当該物体としては、例えば、磁性体等が挙げられる。このようなプルランゲルでは、当該物体の性質を利用した様々な用途に用いられ得る。例えば、磁性体を内部に保持している場合、タンパク質のアフィニティ精製等の使用方法がある。
【００３９】
（製造方法）
＜製造方法１＞
プルランゲルの製造方法の一実施形態では、プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む。
【００４０】
【化４】
2015133439.tif 000005
【００４１】
式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である。架橋剤は、Ｒ１〜Ｒ３の何れもが塩素原子である塩化シアヌル（下記一般式（３））であることが好ましい。
【００４２】
【化５】
2015133439.tif 000006
【００４３】
水溶液に含まれるプルランの濃度は、特に限定されないが、例えば、２％（ｗ／ｖ）〜１５％（ｗ／ｖ）とすることができる。水溶液に含まれるプルランの濃度によって、プルランゲルの硬さを調節することができ、プルランの濃度が高いほどプルランゲルは硬くなる。また、水溶液に含まれる架橋剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）〜０．３％（ｗ／ｖ）とすることができる。水溶液に含まれる架橋剤の濃度によって、プルランゲルの硬さを調節することができ、架橋剤の濃度が高いほどプルランゲルは硬くなる。プルランおよび架橋剤は、市販のものを用いることができる。
【００４４】
水溶液のｐＨは、５．０〜１０．０であることが好ましく、５．０〜８．０であることがより好ましく、６．０〜８．０であることがさらに好ましく、６．５〜７．５であることがよりさらに好ましく、ｐＨ７．０であることが特に好ましい。ｐＨが高すぎる場合、硬さの異なる部分を有する不均一な白濁したゲルとなってしまう。また、水酸化ナトリウムを用いる場合には、プルランが化学反応を起こして数分で黄〜黄褐色に発色（着色）する（後述の参考例も参照）。これは、プルラン自体の構造が変化しているためと考えられる。そのため、水酸化ナトリウムを用いて本発明のプルランゲルを製造することはできない。
【００４５】
撹拌する際の温度は、０℃〜４５℃であることが好ましく、０℃〜３７℃であることがより好ましい。撹拌する速度は、例えば１０ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍとすることができ、好ましくは１００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍである。撹拌する時間は、例えば１分〜５時間とすることができ、好ましくは５分〜３時間である。撹拌する時間が短時間であっても、後述の架橋を行う工程において、プルランゲルを作製することができる。
【００４６】
上記水溶液は、プルランおよび架橋剤の他に、例えば、ｐＨを調製するための重曹（炭酸水素ナトリウム）または炭酸ナトリウム等のｐＨ調整剤、および架橋剤を溶解させるためのアセトン等の有機溶剤等を含んでいてもよい。
【００４７】
一実施形態では、有機溶剤に溶解した架橋剤をプルラン水溶液に添加し、得られた水溶液を撹拌する。別の実施形態では、粉末の架橋剤をプルラン水溶液に添加し、得られた水溶液を撹拌する。
【００４８】
撹拌により、水への溶解度が低い架橋剤（塩化シアヌル等）を溶解させることができ、また、プルランおよび架橋剤を溶液中で均一に存在させることができる。
【００４９】
撹拌後で架橋前に、この水溶液を所望の大きさおよび形状の型に入れて成型する工程を行ってもよい。
【００５０】
架橋を行う際の温度は、例えば−２０℃〜４５℃とすることができ、−２０℃〜３７℃であることが好ましく、０℃〜３７℃であることがより好ましく、０℃〜３０℃であることがさらに好ましい。架橋を行う時間は、水溶液を含む容器または型の大きさ等に応じて適宜設定すればよいが、例えば３０分〜１８時間とすることができ、好ましくは３０分〜５時間であり、より好ましくは１時間〜４時間である。
【００５１】
架橋剤として塩化シアヌルを用いる場合、水中で塩素原子が遊離し、プルランが結合しなかった位置ではヒドロキシ基になると考えられる。
【００５２】
このようにして得られたプルランゲルは、所望の大きさおよび形状に切断または粉砕してもよい。プルランゲルの粉砕は、粉砕機、ホモミキサー、ワーリングブレンダー、または乳鉢等を用いて行うことができ、μｍオーダー、場合によってはｎｍオーダーにまで粉砕することもできる。また、得られたプルランゲルを乾燥してから粉砕することもできる。
【００５３】
また、プルランゲルに付着した架橋剤およびプルランを洗浄する工程をさらに含んでいてもよい。洗浄する工程は、例えば、水を用いて行うことができる。
【００５４】
＜製造方法２＞
プルランゲルの製造方法の別の実施形態では、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む。この製造方法は、特に、球状のプルランマイクロゲルおよびプルランナノゲルを製造する場合に好ましい。
【００５５】
プルランと架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程については、上述のとおりであるが、水溶液に含まれるプルランの濃度は、４％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【００５６】
架橋を行う工程の前に、上記水溶液を静置する工程を含んでいてもよい。静置する時間は、例えば、１分〜６０分とすることができる。静置する際の温度は、例えば、４℃〜３７℃とすることができる。水溶液が僅かに糸を引く状態まで行うことが好ましい。
【００５７】
架橋を行う工程で用いる水不溶性の液体としては、常温で液体のものが好ましく、ヒマワリ油、オリーブオイル、パナセート８１０（登録商標）、および大豆油等のオイル；ヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、および酢酸エチル等の炭化水素等が挙げられるが、これらに限定されない。オイルの粘度は特に限定されないが、例えば、一般的な植物油の範囲のものを用いることができる。水不溶性の液体の粘度が高いほどプルランゲルの平均粒径が小さくなる。粒径維持の観点からは、高粘度のオイルが好ましい。
【００５８】
水不溶性の液体に対する水溶液の量は、１体積％〜５０体積％であることが好ましく、１体積％〜２０体積％であることがより好ましく、１体積％〜１０体積％であることがさらに好ましい。架橋を行う際の撹拌速度は、特に限定されず、製造したいプルランゲルの大きさに応じて適宜設定すればよいが、例えば、１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍとすることができ、５００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍであることが好ましい。撹拌速度が速いほど、プルランゲルの平均粒径が小さくなる。架橋を行う際の温度は、−２０℃〜４５℃であることが好ましく、−２０℃〜３７℃であることがより好ましく、０℃〜３０℃であることがさらに好ましい。撹拌する時間は、例えば３０分〜５時間とすることができ、好ましくは１時間〜４時間である。
【００５９】
撹拌せずに静置すると一旦分散したプルラン同士が吸着し合い球状ゲルは生成されないが、この製造方法では、プルランと架橋剤とを含む水溶液の小さな液滴が水不溶性の液体中に生成し、撹拌することによって分散したままこの液滴の中で架橋が進行する。そのため、より小さな球状のプルランゲル（プルランマイクロゲルまたはプルランナノゲル）が製造される。
【００６０】
製造したプルランゲルを水不溶性の液体から回収する方法は特に限定されないが、回収前に水を加えることが好ましい。これにより、プルランゲルが水中に浮遊し、プルランゲル同士の吸着を抑えることができる。
【００６１】
回収後に、プルランゲルを静置し、さらに架橋を進行させてもよい。
【００６２】
＜製造方法３＞
プルランゲルの製造方法のさらに別の実施形態では、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、当該水溶液および当該水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる。この製造方法は、特に、球状のプルランマイクロゲルおよびプルランナノゲルを製造する場合に好ましい。
【００６３】
プルランと架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程については、上述のとおりであるが、水溶液に含まれるプルランの濃度は、４％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【００６４】
乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ＤＫＳ  ＮＬ−１５、およびＤＫＳ  ＮＬ−５０等の界面活性剤等が挙げられる。乳化剤は、プルランと架橋剤とを含む水溶液に含まれていてもよいし、水不溶性の液体に含まれていてもよいし、その両方に含まれていてもよい。水溶液または水不溶性の液体に含まれる乳化剤の濃度は、特に限定されず、油中水滴（Ｗ／Ｏ型）エマルションを形成する濃度範囲であればよい。そのような濃度範囲は、水溶液と水不溶性の液体との成分比および温度等に基づいて、当業者は適宜決定することができる。
【００６５】
架橋を行う工程の前に、上記水溶液を静置する工程を含んでいてもよい。静置する時間は、例えば、１０分〜３０分とすることができる。静置する際の温度は、５℃以下であることが好ましい。５℃以下の温度とすることで、架橋反応の進行を遅らせ、粘度の上昇を程よく調節することが容易となり、乳化しやすくなる。
【００６６】
架橋を行う工程で用いる水不溶性の液体の種類については、製造方法２と同様である。
【００６７】
水不溶性の液体に対する水溶液の量は、例えば、１体積％〜３０体積％とすることができる。乳化する際の撹拌速度は特に限定されず、乳化を達成しうる範囲内で適宜設定すればよいが、例えば、１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍとすることができる。撹拌速度が速いほど、均一な乳化液が得られる。乳化を行う際の温度は、例えば、０℃〜３０℃とすることができる。撹拌する時間は、例えば、１分〜１０分とすることができる。架橋を行う際の温度は、例えば、０℃〜３０℃とすることができる。架橋を行う際は静置する。
【００６８】
乳化せずに静置すると一旦分散したプルラン同士が吸着し合い球状ゲルは生成されないが、この製造方法では、プルランと架橋剤とを含む水溶液の小さな液滴が水不溶性の液体中に生成し、乳化剤で乳化することによって安定的に分散したままこの液滴の中で架橋が進行する。そのため、より小さな球状のプルランゲル（プルランマイクロゲルまたはプルランナノゲル）が製造される。遠心分離により所望の粒径を有するものを選択してもよい。
【００６９】
製造したプルランゲルを水不溶性の液体から回収する方法は特に限定されないが、回収前に水を加えることが好ましい。これにより、プルランゲルが水中に浮遊し、プルランゲル同士の吸着を抑えることができる。
【００７０】
回収後に、プルランゲルを静置し、さらに架橋を進行させてもよい。また、プルランゲルをＷ／Ｏ系で分散し、遠心分離回収を繰り返して、乳化剤を除去してもよい。
【００７１】
＜製造方法４＞
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がさらに架橋されているプルランゲルを製造する場合、上記水溶液はタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をさらに含んでいる。したがって、プルランゲルの製造方法の別の実施形態では、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む。さらに別の実施形態では、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む。またさらに別の実施形態では、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、当該水溶液および当該水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる。
【００７２】
具体的な説明は、それぞれ、製造方法１、製造方法２、および製造方法３と同様である。
【００７３】
水溶液におけるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の濃度は、プルランゲルに架橋させたい量に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬとすることができる。
【００７４】
＜製造方法５＞
オルガノゲルを製造する場合は、上述の製造方法で得られたプルランゲルを乾燥させる工程と当該乾燥させたプルランゲルを有機溶剤に浸漬する工程とをさらに含む。
【００７５】
有機溶剤の種類は上述のとおりである。乾燥温度は、例えば、４℃〜４０℃とすることができる。乾燥時間は、プルランゲルの大きさおよび厚さ等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、３０分間〜５時間とすることができる。乾燥は大気圧下で行ってもよいし、減圧または真空下で行ってもよい。浸漬時間は、ゲルの厚さ等に応じて適否設定すればよいが、例えば、１分間〜５時間とすることができる。
【００７６】
＜製造方法６＞
プルラン以外の多糖類を含んでいるプルランゲル（ハイブリッドゲル）を製造する場合、上記水溶液に当該多糖類を含ませればよい。多糖類の種類は上述のとおりである。当該多糖類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。水溶液中の当該多糖類の濃度は特に限定されないが、例えば、１％〜１０％（ｗ／ｖ）（２種類以上の場合には合計した濃度）とすることができる。
【００７７】
＜製造方法７＞
内部に任意の物体を保持させたプルランゲルを製造する場合、例えば、上記水溶液に当該物体を含ませればよい。
【００７８】
なお、プルランゲルの製造方法として挙げた製造方法１〜７は適宜組み合わせることができる。例えば、内部に任意の物体を保持しており、かつタンパク質を架橋したプルランマイクロゲルを製造することもできる。
【００７９】
本発明に係る製造方法では、加熱が不要であり、常温以下の温度であっても行うことができる。さらに、本発明に係る製造方法では、中性付近で架橋を行うことができる。そのため、簡便である上、タンパク質を変性させずに製造することができる。他の多糖類（例えば、アガロース等）のハイドロゲルの公知の製造方法では、加熱したり、ｐＨをアルカリ側にしたりする必要があるが、これに対して本発明のプルランゲルの製造方法では、加熱不要でかつ中性付近で製造することができるという点で非常に優れている。
【００８０】
〔プルランゲル乾燥物およびその製造方法〕
（プルランゲル乾燥物）
本発明に係るプルランゲル乾燥物は、上述のプルランゲルを乾燥させた乾燥物である。プルランゲル乾燥物の大きさおよび形状は特に限定されず、使用目的に応じて適宜設定すればよい。乾燥させるプルランゲルは、タンパク質等が架橋されたプルランゲル、または薬剤が含浸されたプルランゲルであってもよい。プルランゲル乾燥物は、水等の液体に浸漬すると、当該液体を吸い、元のプルランゲルに戻る。
【００８１】
プルランゲル乾燥物の一実施形態は、プルランマイクロゲルまたはプルランナノゲルの乾燥物である。例えば、後述する薬剤の徐放性を有する薬学的組成物として用いるプルランマイクロゲルまたはプルランナノゲルを乾燥させたものである。乾燥物はゲルよりも保存性が高いため、例えば、薬剤を含むプルランマイクロゲルまたはプルランナノゲルを製剤として使用する場合に、乾燥物として好適に保存することができる。
【００８２】
プルランゲル乾燥物の別の実施形態は、厚さが例えば１μｍ〜５００μｍのフィルムである。プルランに水を加えて加熱加圧成形した公知のプルランフィルムは水に可溶であるが、本発明に係るプルランゲルフィルムは水に不溶であり、水に浸漬するとシート状のゲルになる。そのため、タンパク質が架橋されたプルランゲルのフィルムでは、抗体または抗原等を反応させて洗浄することが可能であり、タンパク質の検出に好適に利用することができる。
【００８３】
また、プルランゲル乾燥物を、所望の薬剤（例えばタンパク質）が溶解または分散している液体に浸漬すると、当該薬剤を含む液体がプルランゲル乾燥物の内部まで浸透し、ゲルになる。このゲルでは、浸透した薬剤が保持され、すぐには溶出しない。そのため、徐放性のゲルとして利用することができる。したがって、プルランゲル乾燥物は、徐放性のゲルを製造するための材料として用いることができる。
【００８４】
タンパク質が架橋されたプルランゲル乾燥物では、吸水してもタンパク質が溶出しない。そのため、タンパク質の検出等に好適に用いることができる。
【００８５】
（製造方法）
プルランゲル乾燥物の製造方法の一実施形態では、上述の種々の形態のプルランゲルを乾燥させる工程を含む。
【００８６】
乾燥温度は、特に限定されないが、例えば、２０℃〜１００℃とすることができる。乾燥時間は、プルランゲルの大きさおよび厚さ等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１秒〜１０日とすることができる。乾燥は大気圧下で行ってもよいし、減圧または真空下で行ってもよい。あるいは、凍結乾燥を行ってもよく、例えば、−１５℃以下、好ましくは−５０℃以下で行えばよい。
【００８７】
〔薬学的組成物およびその製造方法〕
（薬学的組成物）
本発明に係るプルランゲルは、薬剤の徐放性を有する薬学的組成物として利用することができる（実施例を参照）。また、本発明に係るプルランゲルは、アジュバント効果を有する薬学的組成物として利用することができる（実施例を参照）。
【００８８】
薬学的組成物は、生体の皮膚に接触させて使用するものであてもよいし、生体内に投与して使用するものであってもよい。徐放性を有するゲルとしてゼラチンハイドロゲル（メドジェル（登録商標））が公知であるが、牛骨から生成したゼラチンを用いているため、ＢＳＥ等の残留の虞がある。一方、本願のプルランゲルは、そのような虞がないため、安全に生体へ適用できる。
【００８９】
一実施形態において、薬学的組成物は、薬剤が含浸されたｎｍ〜μｍオーダー（あるいは１ｍｍ程度まで）のプルランゲルである。このような薬学的組成物は、生体内への好適に投与することができる。好ましい一例は、平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍのプルラゲルである。別の好ましい一例は、薬剤が含浸された平均粒径が５μｍ〜２００μｍのプルランゲルである。この平均粒径を有するプルランゲルは、皮下投与した際に投与部位に留まるため、局所的に薬剤を効かせることができる。また、本発明に係るプルランゲルは、実施例に示すように、アジュバントとして働く。したがって、薬学的組成物は、薬剤の徐放性を有し、かつ、アジュバント効果を有する組成物であり得る。薬学的組成物は、例えば、ワクチン等として製剤化され得る。
【００９０】
別の実施形態において、薬学的組成物は、薬剤が含浸されたｍｍ〜ｃｍオーダーのプルランゲルである。このような薬学的組成物は、生体の皮膚へ好適に適用され、例えば、創傷被覆材として利用可能である。
【００９１】
さらに別の実施形態において、薬学的組成物は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が架橋されたプルランゲルである。このような薬学的組成物は、タンパク質等が溶出せずに留まり、マクロファージおよび樹状細胞に貪食されて、アジュバント効果を有すると考えられる。また、このような薬学的組成物に徐放性を持たせるために、当該プルランゲルを、体内で分解されやすい他の多糖類とのハイブリッドゲルとすることもできる。
【００９２】
また、薬学的組成物は、樹状細胞および／またはＮＫＴ細胞を刺激して活性化する物質が結合または含浸されていてもよい。樹状細胞を活性化する物質としては、例えば、Toll様受容体のリガンドが挙げられる。また、ＮＫＴ細胞を活性化する物質としては、例えば、α−ガラクトシルセラミド（α−GalCer）が挙げられる。
【００９３】
（製造方法）
薬学的組成物の製造方法の一実施形態では、上述の製造方法によって製造された種々の形態のプルランゲルを乾燥させる工程と、乾燥させたプルランゲルを、上述の薬剤を含む液体に浸漬する工程とを含む。
【００９４】
ｎｍ〜μｍオーダーのプルランゲルの方法は、上述のようにプルランゲルを水不溶性の液体中で製造してもよいし、水溶液の状態で製造したプルランゲルを粉砕化したものであってもよい。均一性の観点からはプルランゲルを水不溶性の液体中で製造することが好ましい。乾燥させる工程の具体的の方法は上述のとおりである。浸漬する工程における浸漬時間は、プルランゲルの大きさ等に応じて適否設定すればよいが、例えば、１分間〜１０分間とすることができる。また、溶液に含まれる薬剤の濃度は特に限定されないが、例えば、１０μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ/ｍＬとすることができる。なお、乾燥前のプルランゲルの大きさと浸漬後の大きさとは、ほとんど同じであるため、乾燥前の平均粒径を所望の平均粒径に合わせておけば、当該所望の平均粒径を有する、薬剤が含浸されたプルランゲルを得ることができる。そのため、例えば、乾燥前の平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍのプルラゲルを用いれば、薬剤が含浸された平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍのプルラゲルを得ることができる。
【００９５】
また、タンパク質が架橋されたプルランゲルを薬学的組成物として利用する場合、プルランゲルは、上述のタンパク質が架橋された製造方法によって製造すればよい。
【００９６】
〔タンパク質検出キット〕
本発明に係るタンパク質検出キットは、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が上記一般式（１）で表される構造によってプルランに架橋されているプルランゲルまたはその乾燥物を備える。
【００９７】
上記タンパク質としては、抗体、抗原、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、およびホルモン、ならびにこれらの機能的フラグメント等が挙げられる。
【００９８】
タンパク質検出キットによって検出されるタンパク質は、プルランゲルに含まれるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と相互作用するタンパク質である。例えば、抗体を含むプルランゲルでは、当該抗体が結合可能な抗原が検出できる。一方、抗原を含むプルランゲルでは、当該抗原が結合可能な抗体が検出できる。このような組み合わせとしては、抗体−抗原の他に、受容体−受容体に対するリガンド、および酵素−酵素に対するリガンド等が挙げられる。
【００９９】
検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、およびイムノクロマト法等が挙げられる。
【０１００】
本発明に係るプルランゲルは、実施例に示すように、有機溶剤および酸・アルカリ溶液に対して一定の安定性を有している。そのため、タンパク質の検出における種々の操作に耐えることができる。
【０１０１】
本発明に係るタンパク質検出キットは、さらに、必要に応じて、プルランゲルに架橋しているタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が捕捉したタンパク質を免疫学的に検出するための各種試薬（二次抗体、レポーター分子、およびバッファー等）および器具（プレートおよびピペット等）、タンパク質検出キットの使用説明書等のうちの少なくとも１つを備えていてもよい。
【０１０２】
〔その他〕
本発明のプルランゲルフィルムは、食品分野で利用することもできる。例えば、本発明のプルランゲルフィルムは透明で光沢があるため、食品の光沢剤として利用することができ、食品の表面にコーティングすることにより、食品の艶出しを行うことができる。プルランゲルフィルムは可食性を有しているため、そのまま食品とともに食べることができる。また、本発明のプルランゲルフィルムは食品を包むためのフィルムとして利用することもできる。本発明のプルランゲルフィルムは、酸素の透過率が低いため、食品の酸化を防ぎ、品質の劣化を低減する。さらに、本発明のプルランゲルフィルムは、表面に印刷することが可能であり、幅広い印刷インクを用いることができる。また、色素等をプルランゲルに含浸させて乾燥させることによって、着色したプルランゲルフィルムを作製することもできる。また、プルランゲルフィルムの表面に様々な物質を貼り付けることができる。
【０１０３】
〔まとめ〕
本発明に係るプルランゲルは、複数のプルランが架橋されてなる。
【０１０４】
本発明に係るプルランゲルにおいて、上記複数のプルランは、下記一般式（１）で表される構造によって架橋されていることが好ましい。
【０１０５】
【化６】
2015133439.tif 000007
【０１０６】
（式（１）において、複数ある＊のうちの少なくとも２つはプルランとの架橋点である）
本発明に係るプルランゲルにおいて、さらにタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されていてもよい。
【０１０７】
本発明に係るプルランゲルにおいて、上記タンパク質は、抗体、抗原、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、もしくはホルモン、またはこれらの何れかの機能的フラグメントであってもよい。
【０１０８】
本発明に係るプルランゲルは、薬剤が含浸されていてもよい。
【０１０９】
本発明に係るプルランゲルは、平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍであってもよい。
【０１１０】
本発明に係るプルランゲルは、プルラン以外の多糖類を含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明はまた、上記プルランゲルを乾燥させたプルランゲル乾燥物を提供する。
【０１１２】
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと下記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。
【０１１３】
【化７】
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【０１１４】
（式（２）において、複数あるＲ１〜Ｒ３はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である）
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であってプルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。
【０１１５】
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと上記一般式（２）で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、上記水溶液および上記水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる、プルランゲル製造方法を提供する。
【０１１６】
本発明に係るプルランゲル製造方法において、上記架橋剤は塩化シアヌルであることが好ましい。
【０１１７】
本発明に係るプルランゲル製造方法において、上記水溶液は、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０であることが好ましい。
【０１１８】
本発明に係るプルランゲル製造方法は、−２０℃〜３７℃で架橋を行うことが好ましい。
【０１１９】
本発明に係るプルランゲル製造方法において、上記プルランゲルはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がさらに架橋されており、上記水溶液は当該タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をさらに含んでいてもよい。
【０１２０】
本発明はまた、上記プルランゲル製造方法によって製造されたプルランゲルを提供する。
【０１２１】
本発明はまた、薬剤の徐放性を有する薬学的組成物の製造方法であって、上記のタンパク質を含まないプルランゲルの製造方法によって作製されたプルランゲルを乾燥させる工程と、乾燥させたプルランゲルを、上記薬剤を含む液体に浸漬する工程とを含む、薬学的組成物製造方法を提供する。
【０１２２】
本発明に係る薬学的組成物製造方法において、上記プルランゲルは、乾燥前の平均粒径が５０ｎｍ〜１ｍｍであってもよい。
【０１２３】
本発明はまた、さらにタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されているプルランゲルまたはその乾燥物を備える、タンパク質検出キットを提供する。
【０１２４】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１２５】
〔実施例１：プルランゲルの作製−１〕
１００ｍＬの水に、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（６ｇ，林原社製）を加え、さらに５％重曹水溶液（２ｍＬ，和光純薬社製）を加えてｐＨを７に調整した。ここに塩化シアヌル（０．２ｇ，関東化学社製）のアセトン（２ｍＬ，和光純薬社製）溶液を加えた。塩化シアヌルのアセトン溶液を添加するとｐＨが徐々に低下したため、ｐＨ７を維持するよう５％重曹液を適宜添加した。次いで、氷中（０〜１℃）において３時間、約３００ｒｐｍの速度でこの水溶液を撹拌した。その後、撹拌を停止し、５０ｍＬチューブに水溶液を１５ｍＬずつ５本に入れ、それぞれ、３７℃、２５℃、４℃、氷中（０〜１℃）および−２０℃において１８時間静置したところ、プルランゲルを作製することができた（−２０℃に置いたものは凍結していたので、室温で自然解凍しゲル化を確認した）。【０１２６】
また、プルランの量を４ｇ、１０ｇおよび１５ｇにした場合にも、同様にプルランゲルを作製することができた。プルランの濃度が高いほど、プルランゲルは硬かった。塩化シアヌルの量を０．１ｇおよび０．３ｇにした場合にも、同様にプルランゲルを作製することができた。塩化シアヌルの濃度が高いほど、プルランゲルは硬かった。【０１２７】
また、プルランの量２ｇで、−２０℃で静置した場合にも、プルランゲルを作製することができた。【０１２８】
〔実施例２：プルランゲルの作製−２〕
常温の水１００ｍＬに、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（１０ｇ，林原社製）を加え溶解した。ここに塩化シアヌル（０．２ｇ，関東化学社製）を加えて約５分間撹拌した。この水溶液を１５ｍＬずつ５０ｍＬチューブ５本に入れ、それぞれｐＨを３．５、５．０、７．０、８．０、および１０．０に調整した。ｐＨは、調整前でｐＨ３．５であり、ｐＨ５．０、７．０および８．０は５％重曹水溶液で調整し、５％重曹水溶液のｐＨが８．３であったため、ｐＨ１０．０の条件のものは、５％炭酸ナトリウム水溶液で調整した。【０１２９】
これらの水溶液をさらに５分間撹拌した後、２５℃で１８時間静置したところ、ｐＨ３．５ではゲル化しておらず、ｐＨ５．０、７．０、および８．０では透明で均一なゲルとなっており、ｐＨ１０．０のものはｐＨ調整時から部分的にゲル化が見られ一部白濁した不均一なゲルとなった。【０１３０】
〔実施例３：プルランゲルの作製−３〕
１００ｍＬの水に、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（１０ｇ，林原社製）を加え、さらに５％重曹水溶液（６ｍＬ）を加え、ここに塩化シアヌル（０．２ｇ，ナカライテスク社製）の粉末を加えた。１分間撹拌した後、ｐＨが７．０となるよう５％重曹水溶液を適量加えた。次いで、常温（約２２℃）において５〜１０分間、５００ｒｐｍの速度でこの水溶液を撹拌した。その後、撹拌を停止し、４℃において１８時間静置したところ、プルランゲルを作製することができた。必要に応じ、このプルランゲルをグリシン溶液（５％，味の素社製）に２４時間浸漬し残存活性基をマスキングした。【０１３１】
〔実施例４：タンパク質を架橋したプルランゲルの作製〕
２０ｍＬの水に、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（２ｇ，林原社製）、塩化シアヌル（４０ｍｇ，ナカライテスク社製）、タンパク質を加えた。用いたタンパク質は、組み換えＤｅｒ  ｆ  ２（２０ｍｇ，自社製）、ネコＨＧＦ（２０ｍｇ，自社製）、ネコＩＦＮ（１０ｍｇ，自社製）、およびＢＳＡ（２０ｍｇ，和光純薬社製）である。実施例１と同様の方法で撹拌し、４℃で静置することにより、タンパク質を架橋したプルランゲルを作製することができた。【０１３２】
次いで、Ｄｅｒ  ｆ  ２を架橋したプルランゲルについて、Ｄｅｒ  ｆ  ２の抗原活性を確認した。方法としては、まず、プルランゲルを３回遠心洗浄し、５％スキムミルクを用いて、室温で２時間振盪し、ブロッキングした。次いで、プルランゲルを３回遠心洗浄し、ＨＲＰ標識−抗Ｄｅｒ  ｆ  ２抗体を入れ、室温で２時間振盪した。その後、プルランゲルを３回遠心洗浄し、ＯＰＤ基質液を入れ、５分間静置した。対照として、タンパク質を架橋していないプルランゲルに同様の操作を行った。その結果、Ｄｅｒ  ｆ  ２を架橋したプルランゲルのみ発色し、ゲル内で抗原活性を保持していることが確認された。【０１３３】
〔実施例５：プルランゲルの粉砕〕
ネコＨＧＦを架橋したプルランゲルを、４℃の条件下および−２０℃の凍結条件下で静置して作製した。これらのプルランゲルをホモミキサー（プライミクス社製，型番ＨＯＭＯＭＩＸＥＲ  ＭＡＲＫII  Ｍｏｄｅｌ２．５）を用いて、最大回転数で１分間の条件で粉砕した。４℃条件のプルランゲルの粉砕後の顕微鏡画像を図１の（ａ）に示す。−２０℃条件のプルランゲルの粉砕後の顕微鏡画像を図１の（ｂ）に示す。【０１３４】
それぞれの粉砕ゲルの平均粒径（堀場製作所社製，型番ＬＡ−９５０Ｖ２）を用いて測定したところ、４℃条件のプルランゲルでは７０μｍ、−２０℃条件のプルランゲルでは２００μｍであった（図１の（ｃ））。なお、粉砕装置を変更することにより、さらなる微粒子化が可能である。【０１３５】
また、それぞれの粉砕ゲルを２３Ｇおよび２５Ｇの注射針に通したところ、詰まることなく通すことができた。【０１３６】
また、それぞれの粉砕ゲルをＣＣＢ染色したところ、粉砕ゲルは染色されていることが確認され、粉砕を行ってもタンパク質が漏れ出ないことが確認された。【０１３７】
〔実施例６：プルランゲルの凍結・解凍〕
実施例１と同様の方法において４℃で静置して作製したプルランゲルを、−２０℃で凍結させた。７日後、解凍を行ったところ、元のプルランゲルに戻った。【０１３８】
〔実施例７：プルランゲル乾燥物の作製〕
実施例１と同様の方法において４℃で静置して作製したプルランゲルを、３ｍＬバイアル瓶に１ｍＬ入れ、凍結乾燥装置（東京理化器械社製，型番FDU-2100＋DRC-1100）の自動運転条件下で凍結乾燥し、プルランゲル乾燥物を作製した。【０１３９】
〔実施例８：タンパク質含浸プルランゲルの作製〕
実施例１と同様の方法において４℃で静置して作製したプルランゲルを、実施例７の条件下で凍結乾燥し、プルランゲル乾燥物を作製した。この乾燥物に、組み換えＤｅｒ  ｆ  ２（１ｍｇ）を含む水１ｍＬを加え、２５℃で５分間静置した。その結果、乾燥物内部まで浸水し、外観は凍結乾燥前のゲルに戻り、タンパク質含浸プルランゲルが作製できた。【０１４０】
〔実施例９：プルランゲルを用いた抗体産生能の確認〕
（投与試料の作製）
Ｄｅｒ  ｆ  ２−プルラン結合体（Ｄｅｒ  ｆ  ２−Ｐ結合体）：１００ｍＬの水に、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（２ｇ，林原社製）を加え、さらに５％重曹水溶液（２ｍＬ，和光純薬社製）を加えて溶解した。ここに塩化シアヌル（１２５ｍｇ，関東化学社製）のアセトン（２ｍＬ，和光純薬社製）溶液を加えた。塩化シアヌルのアセトン溶液を添加するとｐＨが徐々に低下したため、ｐＨ７を維持するよう５％重曹液を適宜添加した。次いで、氷中（０〜１℃）において３時間、約３００ｒｐｍの速度でこの水溶液を撹拌した。また、この水溶液に組み換えＤｅｒ  ｆ  ２を１００ｍｇ添加した。その後、３７℃で１８時間撹拌し続けた。この溶液にグリシン（５ｇ，味の素社製）を加えて３７℃で２時間撹拌し、残存活性基をマスキングした。この溶液からカラムクロマトグラフィーおよび限外ろ過膜を用いて、未反応のＤｅｒ  ｆ  ２、プルラン、塩化シアヌル等の試薬類を除去し、ＰＢＳにバッファー交換してＤｅｒ  ｆ  ２−プルラン結合体サンプルとした。このＤｅｒ  ｆ  ２−プルラン結合体は、プルラン同士は結合しておらず、ＰＢＳ中にプルラン誘導体として溶解している。【０１４１】
Ｄｅｒ  ｆ  ２含浸ゲルおよびＤｅｒ  ｆ  ２＋ゲル混合：実施例３の方法で作製したプルランゲルを実施例５の方法によって粉砕し、これをＰＢＳで３回遠心洗浄後、ゲル外の水分を除去した。このゲル１ｍＬに組み換えＤｅｒ  ｆ  ２（５００μｇ）を添加し撹拌後３時間静置したものをＤｅｒ  ｆ  ２含浸ゲルサンプルとし、Ｄｅｒ  ｆ  ２（５００μｇ）を投与直前に添加し撹拌したものをＤｅｒ  ｆ  ２＋ゲル混合サンプルとした。【０１４２】
Ｄｅｒ  ｆ  ２単独：組み換えＤｅｒ  ｆ  ２をＰＢＳに５００μｇ／ｍＬの濃度で添加したもの１ｍＬをＤｅｒ  ｆ  ２単独サンプルとした。【０１４３】
（投与）
これらのサンプルを、各群ラット２匹に頸部皮下投与（２回：開始時および７日後）した。定期的（開始時、７日後、１４日後、２１日後、および２８日後）に採血して、血清中のＤｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＧの推移をＥＬＩＳＡ法により吸光度の値で比較した。【０１４４】
その結果、Ｄｅｒ  ｆ  ２単独投与群では血清中のＤｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＧに変化が見られなかったのに対し、Ｄｅｒ  ｆ  ２含浸ゲル投与群およびＤｅｒ  ｆ  ２＋ゲル混合投与群では、Ｄｅｒ  ｆ  ２−プルラン結合体投与群と同等に血清中Ｄｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＧが上昇した。Ｄｅｒ  ｆ  ２単独投与では抗体が産生されずにＤｅｒ  ｆ  ２−プルラン結合体投与で抗体が産生されることは既知の現象であり、本試験でＤｅｒ  ｆ  ２をプルランゲルに含浸および投与直前に混合し投与しただけで抗体が産生されることは新発見であった。また、一般的なアジュバントは投与時の刺激および投与後の炎症が見られるが、プルランゲルはラットへの投与時も刺激がなく、また、投与後の炎症も確認されなかった。【０１４５】
〔実施例１０：プルランマイクロゲルの作製−１〕
Ｗ／Ｏ分散によるプルランのマイクロゲル化を検討した。実施例３の方法で操作し、１０分間撹拌後に１８時間静置するところを静置時間１０分間とし、架橋反応がある程度進行し溶液が僅かに糸を引く状態であることを確認した後、この液を１ｍＬから１０ｍＬの範囲で５０ｍＬのオイル（オリーブオイル、パナセート８１０、またはヒマワリ油）に滴下して、１００ｒｐｍから１，０００ｒｐｍの範囲、および３０分から３時間の範囲で撹拌して分散させ、マイクロサイズの球状ゲルの作製を検討した。【０１４６】
その結果、何れのオイルでも球状のプルランゲルを作製することができた。なかでも粘度が最も高いひまわり油が好ましく、撹拌時の回転数は早い方が粒子径の小さいゲルになる傾向が見られ、５００ｒｐｍから１，０００ｒｐｍであることがより好ましかった。オイルに分散させる水溶液の量が多いと分散した粒子が撹拌中に吸着し合う現象が見られ、２体積％から１０体積％がより好ましかった。また、球状のゲルをオイルの中から回収しようと撹拌を止めたところ、球状のゲル同士が吸着し塊状になった。これは、架橋反応が完了していないためと考えられるが、回収前にオイルの半量程度の水を加えてから撹拌を止めると吸着が防止できた。【０１４７】
プルラン（２ｇ）を水（２０ｍＬ）に溶解させ、５％重曹水溶液（１．５ｍＬ）を加え１分間撹拌した後、塩化シアヌル（４０ｍｇ）を加えて１０分間（約５００ｒｐｍ）撹拌して１０分間静置した。この液（２ｍＬ）をひまわり油（５０ｍＬ）に分散させ、１時間撹拌し、水（２５ｍＬ）を加え５分経過後に撹拌を止め、水層にある球状のプルランマイクロゲルを回収した。これを４℃で１８時間静置して架橋反応を完了させた後、水で遠心洗浄（１０分振盪後，２，０００ｒｐｍ，５分×３回）した。このゲル粒子に等量の水を加え冷凍（−２０℃，３日間）して解凍（２５℃，自然解凍）したところ、ゲル粒子は球状を保っていた。次にゲル粒子に等量の水を加えオートクレーブ処理（１２１℃，２０分間）したところ、ゲル粒子は球状を保っていた。【０１４８】
同様の方法でタンパク質（ＢＳＡ）を架橋させた球状のプルランマイクロゲルを作製したところ、タンパク質を架橋させていないプルランマイクロゲルと同様の結果であった（図３の（ａ）〜（ｃ））。なお、図３に記載の粒子径は、光学顕微鏡に付いているスケールを用いて目測で測定したものである。【０１４９】
これらのゲル粒子をＣＢＢ染色したところ、タンパク質を架橋させた球状のプルランマイクロゲルのみ染色された。【０１５０】
〔実施例１１：プルランゲルフィルムの作製−１〕
実施例３の方法で操作し、１０分間撹拌後に１８時間静置するところを静置時間３０分間とし、架橋反応がある程度進行し溶液が糸を引く状態であることを確認した後、ポリプロピレン製の板上に薄く伸ばした。これを２５℃で４８時間静置して自然乾燥し、プルランゲルフィルムを作製した。これと同時にＢＳＡ（２０ｍｇ，和光純薬社製）を添加し、タンパク質を架橋させたプルランゲルも同様の操作で作製した。もう一つの形態として、タンパク質を架橋させていないプルランゲルフィルムをＢＳＡ液（１ｍｇ／ｍＬ）に１０分間浸漬した後１０分間水洗した、タンパク質含浸プルランゲルフィルムを作製した。また、比較として、プルラン（林原社製）を水に溶解してポリプロピレン製の板上に薄く伸ばし、これを２５℃で４８時間静置して自然乾燥して、プルランフィルムを作製した。【０１５１】
プルランゲルフィルムは、プルランフィルムと比較して、溶液に粘性があり、薄くかつ綺麗に伸ばすことができるため、外観が良好なフィルムを作製することができることがわかった（図４の（ａ））。また、プルランゲルフィルムを水に浸漬したところ、吸水してシート状のプルランゲルとなった（図４の（ｂ））。このプルランゲルを顕微鏡で観察したところ、厚みが均一であることがわかった（図４の（ｃ））。【０１５２】
上記３種類のプルランゲルフィルムをＣＢＢ染色液に浸漬したところ、タンパク質を架橋させたプルランゲルフィルム、およびタンパク質含浸プルランゲルフィルムは染色されたことから、これらのフィルムではタンパク質を含んでいる（タンパク質含浸プルランゲルフィルムでは、ゲルマトリックス内にＢＳＡタンパク質が入り込んだ）ことが確認された（図５の（ａ））。また、これら３種類のプルランゲルフィルムを水中で７日間振盪したところ、タンパク質を架橋させたプルランゲルフィルムは全く変化がなく、タンパク質含浸プルランゲルフィルムは徐々に脱色されていった。一方、プルランゲルフィルムは最初から染色されていないので変化はなかったが、７日間水中で振盪しても市販のプルランフィルムのように溶解することはなかった。これらの結果から、タンパク質を架橋させたプルランゲルフィルム中のタンパク質は化学的に結合しているため溶出せず、タンパク質含浸プルランゲルフィルム中のタンパク質は徐々に溶出され、徐放性があることがわかった（図５の（ｂ））。【０１５３】
プルランゲルフィルムを、メタノール、１Ｍ硫酸水溶液、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し薬品耐性を確認したところ、１Ｍ硫酸水溶液に浸漬したものは、徐々膨張し３日後に崩壊したが、メタノールおよび１Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬したものは１４日経過しても特に変化は見られなかった。【０１５４】
〔実施例１２：プルランゲルフィルムの作製−２〕
水（９０ｍＬ）にプルラン（１０ｇ，林原社製）および重曹（４００ｍｇ）を加えて完全に溶解させた。氷中にて５℃以下まで冷却後、塩化シアヌル（２００ｍｇ，関東化学社製）のアセトン（２ｍＬ）溶液を加え、均一溶液となるまで５℃以下で攪拌し、プルラン１０％−塩化シアヌル２％のワニスを調製した。これをゲル化前にルミラーフィルム（Ｔ６０，膜厚１００μｍ，東レ社製）上にバーコーター（＃８０）で展開し、一昼夜常温常圧で乾燥させた。得られたプルランゲルフィルム（膜厚１６μｍ）を剥離して、酸素透過率測定に供した。酸素透過率測定は、測定器：ＯＸ−ＴＲＡＮ２／２１（ＭＯＣＯＮ社製）を用いて行い、測定条件は２３℃，５０％ＲＨとした。【０１５５】
その結果、プルランゲルフィルムの酸素透過係数（cm3・mm/m2・day・atm）は、０．０４５であった。一方、比較として作製したプルランフィルムの酸素透過係数（cm3・mm/m2・day・atm）は、０．０７０であった。【０１５６】
〔実施例１３：ハイブリッドゲルの作製−１〕
２０ｍＬの水に、平均分子量２００ｋＤａのプルラン（２ｇ，林原社製）、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（１ｇ，和光純薬社製）および５％重曹（和光純薬社製）水溶液を１．５ｍＬ加え１分間（約５００ｒｐｍ）撹拌した。そこに塩化シアヌル（４０ｍｇ，ナカライテスク社製）を加え、約１０分間（５００ｒｐｍ）撹拌した後、２５℃で１８時間静置したところ溶液部分全てがゲル化し一つの塊になった。【０１５７】
〔実施例１４：ハイブリッドゲルの作製−２〕
２３ｍＬの水に、プルラン（１．４０ｇ，林原社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（０．６０ｇ，和光純薬社製）および重曹（１００ｍｇ）を加えて完全に溶解した。次いで、そこに塩化シアヌル（５０ｍｇ，関東化学社製）のアセトン（１ｍＬ）溶液を加え、１分間（３００ｒｐｍ）撹拌した後、室温で一昼夜静置してゲル化させた。水（１０ｍＬ）を加えてゲルをポリトロンホモジナイザーで破砕（１３，０００ｒｐｍ）した後、エタノール４００ｍＬに注ぎ、ろ過および真空乾燥（５０℃）した。次いで、ラボミルサープラスで粉砕し、粉末状のプルラン−デキストラン硫酸ナトリウムハイブリッドゲル（１．７２ｇ）を得た。【０１５８】
〔実施例１５：ハイブリッドゲルの作製−３〕
キトサン１０（７５０ｍｇ，和光純薬社製）を水（１５ｍＬ）に分散させ、１Ｍ塩酸（２．９ｍＬ）を加えて完全に溶解させた後、重曹溶液でｐＨ６．０に調整した。そこにプルラン（５００ｍｇ，林原社製）および水を加えて液量２５ｍＬとした後、塩化シアヌル（３１ｍｇ，関東化学社製）のアセトン（０．５ｍＬ）溶液を加え、１分間（３００ｒｐｍ）撹拌した後、室温で一昼夜静置してゲル化させた。ゲルをスパチュラで破砕した後、エタノール（３００ｍＬ）に注ぎ、ろ過および真空乾燥（５０℃）した。次いで、ラボミルサープラスで粉砕し、粉末状のプルラン−キトサンハイブリッドゲル（１．００ｇ）を得た。【０１５９】
〔実施例１６：プルランマイクロゲルの作製−２〕
実施例１２と同様の方法でプルラン８％−塩化シアヌル２．５％の前駆体溶液（５ｍＬ）を調製し、そこにラウリル硫酸ナトリウム（２５０ｍｇ）を加えて穏やかに攪拌した。これとは別にＤＫＳ  ＮＬ−１５（２．８２ｇ，第一工業製薬製）およびＤＫＳ  ＮＬ−５０（０．７１ｇ，第一工業製薬製）のヘキサン（３０ｍＬ）混合液を調製した後、上記水溶液を加えて、ボルテックスで激しく攪拌し乳化させた。室温で一晩静置した後、ゲル沈殿を遠心分離回収し、ヘキサン／水＝１／１混合液で分散および遠心分離回収を繰り返して乳化剤を除去した。最後に水分散させ２００×ｇで沈殿する巨大粒子を除去してプルランマイクロゲルを得た。プルランマイクロゲルの粒子径を測定した（ＬＡ−９５０Ｖ２，堀場製作所製）結果、８．６μｍ（体積基準９０％径）であった（図６）。【０１６０】
〔参考例１：プルラン以外の多糖類でのゲル化実験〕
プルラン以外の多糖類でゲルを作製することが可能か実験した。プルラン以外の多糖類として、常温で水に溶解するものを用いた。用いた多糖類は、デキストラン４０，０００、デキストラン２００，０００、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、およびアラビアガム、の１１種類である。これら各２ｇを水２０ｍＬに加え撹拌し溶解した。一部溶解しなかったものについては、溶解するまで水を加えそこから２０ｍＬ採取した。【０１６１】
それぞれの水溶液に５％重曹水溶液を１．５ｍＬ加え、塩化シアヌル４０ｍｇを加えて１分間撹拌後、ｐＨが７以上であることを確認した。さらに１０分間、約５００ｒｐｍで撹拌した後、２５℃で１８時間静置後ゲル化しているか確認したところ何れもゲル化しなかった。【０１６２】
〔参考例２：水酸化ナトリウム溶液を用いたゲル化−１〕
水酸化ナトリウム水溶液（０．１Ｍ、０．５Ｍ）２０ｍＬにそれぞれプルラン（２ｇ，林原社製）を溶解したところ、発色（淡黄色〜黄褐色）が見られた。その水溶液のｐＨを測定したところ０．１ＭがｐＨ１２．６であり、０．５ＭがｐＨ１３．５であった。それぞれの水溶液に塩化シアヌル（６０ｍｇ，ナカライテスク社製）のアセトン（４００ｍＬ，和光純薬社製）溶液を加えたところ、塩化シアヌルのアセトン溶液を滴下した部分が直ちにゲル化し、撹拌しても均一にはならず、１８時間静置後に確認したところ、ムラがある一部白濁したゲルとなった。このように、水酸化ナトリウムを用いる場合には、プルラン自体が何らかの化学反応を起こし、構造が変化している可能性が示唆された。【０１６３】
〔参考例３：水酸化ナトリウム溶液を用いたゲル化−２〕
水酸化ナトリウム水溶液（０．１Ｍ、０．５Ｍ）２０ｍＬにそれぞれプルラン（２ｇ，林原社製）を溶解したところ、発色（淡黄色〜黄褐色）が見られた。対照として、本発明で用いる重曹についても同時に実施した。重曹水溶液（０．５Ｍ）２０ｍＬにプルラン（２ｇ，林原社製）を溶解したところ、無色透明で水酸化ナトリウムを用いた時とは異なり発色しなかった。これら水溶液のｐＨを測定したところ、水酸化ナトリウムの方は、０．１ＭがｐＨ１２．２、０．５ＭがｐＨ１３．２であり、重曹の方はｐＨ８．４であった。それぞれの水溶液に粉末の塩化シアヌル（６０ｍｇ，ナカライテスク社製）を加え１０分間撹拌したところ、重曹を用いたものは塩化シアヌルが均一に分散して溶解したが、水酸化ナトリウムを用いたものは、粉末の塩化シアヌルの周りがゲル化しダマ状になり溶け残った。その影響からか１８時間静置後、０．１Ｍはゲル化しなかった。０．５Ｍはゲル化したが、色のついたゲルとなった。一方の重曹を用いたものは、無色透明なゲルとなった。水酸化ナトリウム水溶液にプルランを溶解して作製したゲルは、重曹を用いた本発明のゲルとは外観上異なるものとなった。そのため、ゲルの化学構造も異なっていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明のプルランゲルは、医療分野および研究分野等における材料として利用することができる。また、食品分野においても利用することができる。
【図２】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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