(57)【要約】水を完全に除去することにより変性するタンパク質や親水性が高いタンパク質に対して、タンパク質の放射線照射を行った際に発生するタンパク質の分解・変性などの変化を抑制するタンパク質組成物の製造方法を提供することを目的とする。本発明のタンパク質組成物の製造方法は、タンパク質（Ａ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）とアミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有するタンパク質組成物の製造方法であって、前記タンパク質組成物の製造方法は、滅菌前タンパク質組成物を放射線により滅菌する滅菌工程を含み、前記滅菌前タンパク質組成物は、前記タンパク質（Ａ）と、前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、前記滅菌前タンパク質組成物中の水分含有量が、前記滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であり、前記滅菌前タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、前記滅菌前タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、前記タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質（Ａ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）とアミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有するタンパク質組成物の製造方法であって、
前記タンパク質組成物の製造方法は、滅菌前タンパク質組成物を放射線により滅菌する滅菌工程を含み、
前記滅菌前タンパク質組成物は、前記タンパク質（Ａ）と、前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、
前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、
前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、
前記滅菌前タンパク質組成物中の水分含有量が、前記滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であり、
前記滅菌前タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、
前記滅菌前タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、前記タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であることを特徴とするタンパク質組成物の製造方法。
【請求項２】
滅菌前タンパク質組成物中において、前記タンパク質（Ａ）中の官能基は、アミノ酸の側鎖に位置し、
前記タンパク質（Ａ）中のアミノ酸の側鎖に位置する官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは第１の水素結合により結合することができ、
前記第１の水素結合の距離が、１．３〜１．９Åである請求項１に記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項３】
滅菌前タンパク質組成物中において、前記タンパク質（Ａ）中の官能基は、前記タンパク質（Ａ）のペプチド結合中のアミド基であり、
前記タンパク質（Ａ）のペプチド結合中のアミド基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とは、第２の水素結合により結合されており、
前記第２の水素結合の距離が、１．３〜１．９Åである請求項１又は２に記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸組成が、前記タンパク質（Ａ）の総アミノ酸数に基づいて、プロリン（Ｐ）の個数の割合が１〜５０％であり、セリン（Ｓ）の個数の割合が１〜５０％であり、バリン（Ｖ）の個数の割合が１〜５０％である請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）が繰り返し配列（Ｘ）を含む請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項６】
前記繰り返し配列（Ｘ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＰＧＶＧＶ配列（４）、ＶＰＧＶＧ配列（５）、ＧＶＰＧＶ配列（６）、ＶＧＶＰＧ配列（７）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列、ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（８）、ＧＡＡ配列、ＶＡＡＧＹ配列（９）、ＧＡＧＡＧＡＳ配列（１０）、ＬＧＰＬＧＰ配列（１１）、ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１２）、ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＧＤＰＧＰＰ配列（１３）、ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ配列（１４）、ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ配列（１５）、ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ配列（１６）、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）及びＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（ａ１）を含む請求項５に記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項７】
前記繰り返し配列（Ｘ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）を２〜２００個繰り返されたアミノ酸配列を含む請求項５又は６に記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項８】
前記繰り返し配列（Ｘ）が、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＰＧＶＧＶ配列（４）、ＶＰＧＶＧ配列（５）、ＧＶＰＧＶ配列（６）、ＶＧＶＰＧ配列（７）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（８）のうちいずれか１種であるアミノ酸配列（ａ２）が２〜２００個繰り返された配列（Ｙ）及び／又は前記配列（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換された配列（Ｙ１）を含む請求項５〜７のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質（Ａ）の１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と前記アミノ酸配列（ａ２）及び下記アミノ酸配列（ａ２’）の合計の数との比率［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数：アミノ酸配列（ａ２）及び（ａ２’）の数の合計］が、［１：２］〜［１：２０］である請求項８に記載のタンパク質組成物の製造方法。
アミノ酸配列（ａ２’）：アミノ酸配列（ａ２）の１〜５個のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記繰り返し配列（Ｘ）が、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）及びＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）のうちいずれか１種であるアミノ酸配列（ａ３）が１〜５０繰り返された配列（Ｙ２）を含む請求項５〜９のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）の構造が酸素含有共役構造及び窒素含有共役構造からなる群から選ばれる１種以上である請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）のジフェニルピクリルヒドラジルラジカルに対するラジカル捕捉能が、０．０１〜９０ｍｇ  Ｔｒｏｌｏｘ  ｅｑ／ｍｇである請求項１〜１２のいずれかに記載のタンパク質組成物の製造方法。
【請求項１４】
タンパク質（Ａ）を含有するタンパク質組成物であって、
前記タンパク質組成物は、さらにラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、アミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、
前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、
前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、
前記タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、
前記タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であり、
放射線滅菌されていることを特徴とするタンパク質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質組成物の製造方法及びタンパク質組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療用途や生化学用途で用いられるタンパク質は滅菌される必要がある。滅菌はエチレンオキシドガス滅菌、ろ過滅菌、放射線滅菌によって行われているが、滅菌後の毒性残留物（エチレンオキシドガス）がないことやコスト、バリデーションの観点から放射線滅菌が優れている。【０００３】
タンパク質は放射線滅菌すると、分解、変性等の変化が生じるという欠点がある。タンパク質の変化は、放射線により発生する活性ラジカル（ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル）がタンパク質と反応する事により引き起こされる。【０００４】
従来、活性ラジカルによるタンパク質の変化を抑えるために、放射線照射を冷却状態で行う方法、放射線照射系から水を取り除く方法、活性ラジカルに対するラジカル捕捉剤を添加する方法が取られている（特許文献１、２）。【０００５】
しかし、放射線照射を冷却状態で行う方法は効果が低く、冷却するための製造コストが高い。また、水を完全に除去することにより変性するタンパク質や親水性が高いタンパク質を滅菌する際には、放射線照射系から水を取り除くことが難しい。さらに、活性ラジカルによるタンパク質の変化を防ぐためにラジカル捕捉剤を用いる場合、ラジカル捕捉剤を多量に添加する必要があり、タンパク質が持つ生理学的、物理化学的機能を損なうという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５２７２１０号公報
【特許文献２】特表２０１０−５１４７４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、水を完全に除去することにより変性するタンパク質や親水性が高いタンパク質に対して、放射線照射を行った際に発生するタンパク質の分解・変性などの変化を抑えることを可能にするタンパク質組成物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。すなわち、タンパク質（Ａ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）とアミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有するタンパク質組成物の製造方法であって、前記タンパク質組成物の製造方法は、滅菌前タンパク質組成物を放射線により滅菌する滅菌工程を含み、前記滅菌前タンパク質組成物は、前記タンパク質（Ａ）と、前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、前記滅菌前タンパク質組成物中の水分含有量が、前記滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であり、前記滅菌前タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１であり、前記滅菌前タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計モル数と、前記タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５であることを特徴とするタンパク質組成物の製造方法；タンパク質（Ａ）を含有するタンパク質組成物であって、前記タンパク質組成物は、さらにラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、アミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、前記タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、前記タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であり、放射線滅菌されていることを特徴とするタンパク質組成物である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法は水を完全に除去することにより変性するタンパク質や親水性が高いタンパク質に対して、放射線照射を行った際に発生するラジカルを効果的に捕捉することによりラジカル捕捉剤（ＲＳ）の添加量を抑え、得られたタンパク質組成物は放射線照射前の生理学的、物理化学的機能を保持するという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、使用する滅菌前タンパク質組成物は、タンパク質（Ａ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）とアミノ酸、ペプチド及びタンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有する。
なお、本発明のタンパク質組成物の製造方法における「滅菌前タンパク質組成物」とは、本発明のタンパク質組成物の製造方法の滅菌工程前のタンパク質（Ａ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）を含むタンパク質組成物を意味する。
【００１１】
タンパク質（Ａ）としては、動物由来タンパク質、植物由来タンパク質、微生物由来タンパク質、組換えタンパク質等が挙げられる。
動物由来タンパク質としては、タンパク質製剤、酵素、抗体、凝固因子、細胞外基質等が挙げられる。
植物由来タンパク質としては、酵素、細胞外基質等が挙げられる。
微生物由来タンパク質としては、酵素、細胞外基質等が挙げられる。
組換えタンパク質としては、タンパク質製剤、ワクチン等が挙げられる。
【００１２】
タンパク質製剤としては、インターフェロンα、インターフェロン１３、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ΤΡΑ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Α型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
【００１３】
酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素及び脱離酵素等が挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ダルコアミラーゼ等が挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼ等が挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ等が挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼ等が挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼ等が挙げられる。
【００１４】
抗体としては、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ等が挙げられる。
【００１５】
凝固因子としては、フィブリノーゲン、フィブリン、プロトロンビン、トロンビン、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子及び第ＸＩＩＩ因子等が挙げられる。
【００１６】
細胞外基質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン等が挙げられる。
【００１７】
タンパク質（Ａ）は、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有する。
このうち、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）との水素結合間距離の観点から、ヒドロキシル基、アミド基及びアミノ基、カルボキシル基が好ましい。
【００１８】
スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有するタンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中に前記官能基を有するアミノ酸を含んでいることが好ましい。
スルフィド基を含むアミノ酸としては、メチオニン及びシステイン等が挙げられる。
アミド基としては、タンパク質に含まれるアミノ酸同士のペプチド結合部位等が挙げられる。
ヒドロキシル基を含むアミノ酸としては、セリン、トレオニン及びチロシン等が挙げられる。
アミノ基を含むアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びトリプトファン等が挙げられる。
カルボキシル基を含むアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸等が挙げられる。
【００１９】
タンパク質（Ａ）としては、タンパク質（Ａ）の安定性の観点から、メチオニン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含むタンパク質（Ａ）が好ましく、メチオニン、セリン、トレオニン、チロシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含むタンパク質（Ａ）がさらに好ましい。
【００２０】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質（Ａ）は、タンパク質の安定性の観点から、繰り返し配列（Ｘ）を含むことが好ましい。
【００２１】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、繰り返し配列（Ｘ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＰＧＶＧＶ配列（４）、ＶＰＧＶＧ配列（５）、ＧＶＰＧＶ配列（６）、ＶＧＶＰＧ配列（７）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列、ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（８）、ＧＡＡ配列、ＶＡＡＧＹ配列（９）、ＧＡＧＡＧＡＳ配列（１０）、ＬＧＰＬＧＰ配列（１１）、ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（１２）、ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＧＤＰＧＰＰ配列（１３）、ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ配列（１４）、ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ配列（１５）、ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ配列（１６）、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）及びＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（ａ１）を含むことが好ましい。繰り返し配列（Ｘ）は、１種のアミノ酸配列（ａ１）を含んでいてもよく、２種類以上のアミノ酸配列（ａ１）を含んでいてもよい。
これらのうち、タンパク質の安定性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、ＧＡＡ配列、ＶＡＡＧＹ配列（９）及びＧＡＧＡＧＡＳ配列（１０）が好ましい。
【００２２】
本発明のタンパク質組成物の製造方法では、繰り返し配列（Ｘ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）をタンパク質の安定性の観点から、好ましくは２〜２００個有し、さらに好ましくは１５〜１５０個有し、特に好ましくは３０〜１２０個有する。
【００２３】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質の安定性の観点から、繰り返し配列（Ｘ）は、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＰＧＶＧＶ配列（４）、ＶＰＧＶＧ配列（５）、ＧＶＰＧＶ配列（６）、ＶＧＶＰＧ配列（７）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（８）のうちいずれか１種であるアミノ酸配列（ａ２）が２〜２００個繰り返された配列（Ｙ）及び／又は配列（Ｙ）中の１〜１００個のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換された配列（Ｙ１）を含むことが好ましい。
これらのうち、配列（Ｙ）は、タンパク質の安定性の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（３）、ＰＧＶＧＶ配列（４）、ＶＰＧＶＧ配列（５）、ＧＶＰＧＶ配列（６）及びＶＧＶＰＧ配列（７）が２〜２００個繰り返された配列であることが好ましい。
また、繰り返し配列（Ｘ）は１種の配列（Ｙ）又は配列（Ｙ１）を含んでいてもよく、２種以上の配列（Ｙ）及び／又は配列（Ｙ１）を含んでいてもよい。
【００２４】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質（Ａ）の１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数とアミノ酸配列（ａ２）及び下記アミノ酸配列（ａ２’）の合計の数との比率［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数：アミノ酸配列（ａ２）及び（ａ２’）の数の合計］は、タンパク質の安定性の観点から、好ましくは［１：２］〜［１：２０］であり、さらに好ましくは［１：１０］〜［１：５］である。
アミノ酸配列（ａ２’）：アミノ酸配列（ａ２）の１〜５個のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【００２５】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質の生理活性の観点から、繰り返し配列（Ｘ）は、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）及びＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）のうちいずれか１種であるアミノ酸配列（ａ３）が１〜５０個繰り返された配列（Ｙ２）を含むことが好ましい。
また、繰り返し配列（Ｘ）は１種の配列（Ｙ２）を含んでいてもよく、２種以上の配列（Ｙ２）を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質（Ａ）は、繰り返し配列（Ｘ）の前後、及び間にアミノ酸を有してもよく、繰り返し配列（Ｘ）の前後及び間のアミノ酸の数は、タンパク質（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、好ましくは１〜１００個であり、さらに好ましくは５〜４０個であり、特に好ましくは１０〜３５個である。
繰り返し配列（Ｘ）の前後及び間のアミノ酸の例としては、βガラクトシダーゼ由来の配列や精製タグ（６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグ等）が挙げられる。
【００２７】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）繰り返し配列（Ｘ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）と配列（Ｙ１）からなるタンパク質
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１９）を１２個有し、ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続した繰り返し配列（Ｙ−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（２０）（Ｙ１−１）を１３個有し、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）を１個有し、これらが（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３［（ＧＡＧＡＧＳ）４（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３］１２（ＧＡＧＡＧＳ）２となるように化学結合してなる分子質量が約７０ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）；
（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（２０）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）をそれぞれ１７個有し、これらが［（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３（ＧＡＧＡＧＳ）２］１７となるように化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）；
（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）を１６個有し、ＧＶＧＶＰ配列（３）が１６個連続した繰り返し配列（Ｙ−２）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２４）を８個有し、これらが［（ＧＡＧＡＧＳ）２（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１（ＧＡＧＡＧＳ）２］８となるように化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ）；
（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）を６個有し、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２４）を６個有し、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１９）を６個有し、これらが［（ＧＡＧＡＧＳ）２（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１（ＧＡＧＡＧＳ）４］６となるように化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２６）のタンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ）等である。
これらのうち、タンパク質の安定性の観点から、タンパク質（Ａ）は、ＳＥＬＰ０Ｋ及びＳＥＬＰ８Ｋが好ましく、更にＳＥＬＰ８Ｋが好ましい。
（２）繰り返し配列（Ｘ）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）と配列（Ｙ２）とからなるタンパク質
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２７）を１個有し、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）を１個有し、ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）１個とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が９個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）とが１２個結合した配列［（ＧＡＧＡＧＳ）９（ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ）］１２配列（２９）を１個有し、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）を１個有し、これらが（ＧＡＧＡＧＳ）６（ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ）［（ＧＡＧＡＧＳ）９（ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ）］１２（ＧＡＧＡＧＳ）２となるように化学結合してなる分子質量が約７３ｋＤａの配列（３０）のタンパク質（プロネクチンＦ）；
（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２７）を１個有し、ＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）を１個有し、（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）とＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（１８）が１２個結合した配列［（ＧＡＧＡＧＳ）９（ＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ）］１２配列（３１）を１個有し、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（２１）を１個有し、これらが（ＧＡＧＡＧＳ）６（ＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ）［（ＧＡＧＡＧＳ）９（ＧＡＡＰＧＡＳＩＫＶＡＶＳＡＧＰＳＡＧＹ）］１２（ＧＡＧＡＧＳ）２となるように化学結合した構造を有する分子質量が約７６ｋＤａの配列（３２）のタンパク質（プロネクチンＬ）等である。
【００２８】
タンパク質（Ａ）のアミノ酸組成が、タンパク質（Ａ）の安定性の観点から、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列の総数に基づいて、プロリン（Ｐ）の個数の割合が１〜５０％であり、セリン（Ｓ）の個数の割合が１〜５０％であり、バリン（Ｖ）の個数の割合が１〜５０％であることが好ましい。さらに好ましくはプロリン（Ｐ）が１〜２０％であり、セリン（Ｓ）が１〜２０％であり、バリン（Ｖ）が１〜３０％である。
【００２９】
タンパク質組成物中のタンパク質（Ａ）の含有率は、タンパク質（Ａ）の溶解性の観点から、タンパク質組成物の重量に基づいて、好ましくは５０重量％以下であり、さらに好ましくは１０重量％以下である。
【００３０】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質（Ａ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子質量が好ましくは１５〜２００ｋＤａである。
なお、タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【００３１】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質（Ａ）の安定性の観点から、タンパク質組成物中のラジカル捕捉剤（ＲＳ）としては、酸素含有共役構造及び窒素含有共役構造からなる群から選ばれる１種以上であることが好ましい。
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）のジフェニルピクリルヒドラジルラジカル（ＤＰＰＨラジカル）に対するラジカル捕捉能は、０．０１〜９０ｍｇ  Ｔｒｏｌｏｘ  ｅｑ／ｍｇであることが好ましい。
なお、ＤＰＰＨラジカル捕捉能は［「食品機能性評価マニュアル集第ＩＩ集」ＤＰＰＨラジカル消去活性評価法、沖智之、（２００８）ｐ．７１−７８］に記載の方法で行われ、Ｔｒｏｌｏｘ相当値として評価できる。
また、ペルオキシラジカル、ヒドロキシラジカル、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）ラジカル、酸素ラジカル、アルキルラジカルに対するラジカル捕捉能を、スーパーオキシドジスムターゼ法（ＳＯＤ法）、ＡＢＴＳラジカル捕捉能測定法、Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉ  Ｏｘｉｄａｎｔ（ＰＡＯ）抗酸化能測定法、ＥＰＲスピントラップ法等を用いて測定し、ラジカル捕捉能を０．０１ｍｇ  Ｔｒｏｌｏｘ  ｅｑ／ｍｇ以上に設定することができる。
【００３２】
ラジカル捕捉剤（ＲＳ）としては、例えば、有機酸（アスコルビン酸、エリソルビン酸、尿酸、没食子酸、グルタチオン、フェノール酸、エラグ酸、クロロゲン酸等）、グルタチオン、エダラボン、ポリフェノール（フラボノイド、フェノール酸、エラグ酸、リグナン、クルクミン、クマリン等）及び、フェノール系化合物（バニリン、ピロガロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール等）が挙げられる。
このうち、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）としては、タンパク質（Ａ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）との相溶性、ラジカル捕捉能及び安全性の観点から、アスコルビン酸、エダラボン、バニリン、没食子酸、グルタチオン及びクロロゲン酸が好ましく、アスコルビン酸及びエダラボンがさらに好ましい。
【００３３】
滅菌前タンパク質組成物中のラジカル捕捉剤（ＲＳ）の含有率は、溶解性の観点から、滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、好ましくは４０重量％以下であり、さらに好ましくは３０重量％以下である。
【００３４】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有する。
このうち、タンパク質（Ａ）との水素結合距離の観点から、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、カルボキシル基、ヒドロキシル基及びアミノ基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有することが好ましい。
【００３５】
水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）としては、例えば、アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンとその誘導体）、ペプチド（アスパルテーム、バソプレシン、グルカゴン及びセレクチン等）が挙げられる。
このうち、タンパク質（Ａ）と水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）との相溶性および水素結合距離の観点から、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、トリプトファン、チロシン又はヒスチジンであることが好ましく、トリプトファンであることがさらに好ましい。
【００３６】
滅菌前タンパク質組成物中の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の含有率は、溶解性の観点から、滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、好ましくは２５重量％以下であり、さらに好ましくは１０重量％以下である。
【００３７】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、滅菌前タンパク質組成物中の水分含有量が、滅菌前タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であり、タンパク質の安定性の観点から、好ましくは０．０１〜３０重量％、より好ましくは０．０１〜１５重量％の水分を含む。
なお、本発明のタンパク質組成物の製造方法において、滅菌前タンパク質組成物は、滅菌工程前に乾燥してもよい。
滅菌前タンパク質組成物の乾燥方法としては、凍結乾燥、加熱乾燥等が挙げられる。
【００３８】
滅菌前タンパク質組成物中の水分は下記により測定することができる。
＜滅菌前タンパク質組成物中の水分の測定方法＞
滅菌前タンパク質組成物をガラスバイアルに、５０〜１００ｍｇ計り取る。秤量した量（Ｗｓ０）、ガラスバイアルの重さ（Ｗｂ０）を記録する。乾燥機を１００℃にセットし、１００℃になったら滅菌前タンパク質組成物の入ったガラスバイアルをいれる。（ガラスバイアルはふたを外しておく。）２時間後、滅菌前タンパク質組成物の入ったガラスバイアルを乾燥機から取り出し、デシケーター内で室温まで放冷させる。放冷後、ガラスバイアルのふたをし、重量（Ｗ）を測定する。そして、以下の式（１）に基づいて、滅菌前タンパク質組成物中の水分含量を算出する。
（Ｗｓ０＋Ｗｂ０−Ｗ）／Ｗｓ０×１００＝滅菌前タンパク質組成物中の水分含量（重量％）・・・（１）
【００３９】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、滅菌前タンパク質組成物中のラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］は０．０１〜１．０であり、タンパク質（Ａ）の生理学的、物理化学的機能を保持する観点から、好ましくは０．０１〜０．１であり、さらに好ましくは０．０１〜０．０５である。
【００４０】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、タンパク質組成物中の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計のモル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であり、タンパク質の性能保護の観点から、好ましくは０．０１〜０．５０であり、より好ましくは０．０１〜０．１０であり、さらに好ましくは０．０１〜０．０５である。
このモル比が、１．０を超える場合、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）によるデメリット（生理学的・物理化学的機能の変化、ｐＨ環境の変化、コスト増大、炎症及び発ガン等）が大きくなる。
このモル比が、０．０１未満の場合タンパク質（Ａ）の変性が大きくなる。
なお、上記モル比の計算に用いられる「タンパク質（Ａ）中の官能基」とは、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基と水素結合するタンパク質（Ａ）中の官能基のことを意味する。また、上記モル比の計算に用いられる「水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基」とは、タンパク質（Ａ）中の官能基と水素結合する水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基のことを意味する。
【００４１】
本発明のタンパク質組成物の製造方法では、上記の通り、タンパク質（Ａ）はスルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有している。
また、本発明のタンパク質組成物の製造方法では、タンパク質（Ａ）中の官能基と、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができる。
特に、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基は、タンパク質（Ａ）が放射線照射された際に、変性しやすいタンパク質（Ａ）のアミノ酸の官能基と水素結合できることが好ましい。滅菌前タンパク質組成物が、このような水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）を含むと、滅菌工程において、タンパク質（Ａ）が変性することを防ぎやすくなる。
放射線照射された際に変性しやすいタンパク質（Ａ）のアミノ酸としては、例えば、セリンやアスパラギン酸が挙げられる。
【００４２】
タンパク質（Ａ）中の官能基は、タンパク質（Ａ）のアミノ酸の側鎖に位置していてもよい。
これらの官能基がアミノ酸の側鎖に位置する場合、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸の側鎖に位置する官能基と、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは第１の水素結合により結合することができ、第１の水素結合の距離は、ラジカル捕捉性の観点から、好ましくは１．３〜１．９Åであり、さらに好ましくは１．７〜１．８Åである。
【００４３】
また、タンパク質（Ａ）中の官能基のうちアミド基は、タンパク質（Ａ）のペプチド結合中にも位置する。
タンパク質（Ａ）のペプチド結合中のアミド基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とは、第２の水素結合により結合することができ、第２の水素結合の距離は、ラジカル捕捉性の観点から、好ましくは１．３〜１．９Åであり、さらに好ましくは１．７〜１．８Åである。
なお、水素結合の距離はシミュレーションソフト（Ｇａｕｓｓｉａｎ：Ｇａｕｓｓｉａｎ社製）を用いて算出される。
【００４４】
シミュレーションソフト（Ｇａｕｓｓｉａｎ）により、水素結合間距離を算出する際には、タンパク質（Ａ）に含まれる所定の官能基を有する化合物のモデル化合物として、所定の官能基を有するアミノ酸を選択する。そして、当該アミノ酸の官能基と、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基との水素結合の距離を算出することにより求めることができる。
なお、当該アミノ酸の官能基と、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基との水素結合の距離とは、これらの間でエネルギー的に最小になるよう最適化された、水素結合の距離のことをいう。
【００４５】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、第１の水素結合の距離が、１．３〜１．９Åであり、第２の水素結合の距離が、１．３〜１．９Åである場合、これらの距離は、通常の水素結合間距離（２．４〜３．３Å）より短いことになる。
そのため、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が滅菌前タンパク質組成物に含まれると、滅菌工程において、タンパク質（Ａ）が放射線により変性することを抑制することができる。これは、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が水素結合を介して、タンパク質（Ａ）からラジカル捕捉剤（ＲＳ）へのラジカルの移動を促進する役割を果たしたためと考えられる。この相乗効果により、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）のみで変性を抑えようとした場合に比べて、極端に添加量（１００分の１程度）を抑えることができる。そのため、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）を大量に滅菌前タンパク質組成物に加えることにより発生するデメリット（生理学的・物理化学的機能の変化、ｐＨ環境の変化、コスト増大、製造されるタンパク質が原因となる炎症、製造されるタンパク質の発ガン性等）が抑えられる。
【００４６】
また、本発明のタンパク質組成物の製造方法では、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、タンパク質（Ａ）と水素結合のみで結合することが好ましい。
水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の代わりに、タンパク質（Ａ）と共有結合を形成する化合物を用いても、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）と同等の機能（タンパク質（Ａ）からラジカル捕捉剤（ＲＳ）へのラジカルの移動を促進する役割）を発揮することが可能であるが、このように共有結合が形成されると、タンパク質（Ａ）の物理学的機能、生理学的機能が変化してしまう。これに対して、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）がタンパク質（Ａ）と共有結合をせず、水素結合のみで結合すると、上記のようなデメリット（生理学的・物理化学的機能の変化、安全性の変化等）が発生することがない。
【００４７】
タンパク質（Ａ）中のスルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基と水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基との水素結合間距離の調整方法として、例えば、タンパク質（Ａ）中のヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基と水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基との水素結合間距離が、１．３〜１．９Åの数値範囲に含まれるように、官能基、タンパク質及び水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）を種々選択する。
すなわち、本発明のタンパク質組成物の製造方法では、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、タンパク質（Ａ）の種類等に応じて選択することが好ましい。
【００４８】
また、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）は、例えば、以下のスクリーニング（１）やスクリーニング（２）等の方法でスクリーニングしてもよい。
【００４９】
＜スクリーニング（１）＞
まず、タンパク質（Ａ）に放射線照射し、タンパク質（Ａ）を滅菌する。その後、放射線照射後のタンパク質（Ａ）において変性が発生したアミノ酸（α）を特定する。そして、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸の側鎖に位置する官能基を有する化合物のモデル化合物として、変性が生じる前のアミノ酸（α）を用い、上記シミュレーションソフト等を用いて、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングしてもよい。
なお、変性したアミノ酸（α）の分析は、ＬＣ−ＭＳＭＳを用いることにより特定することができる。ＬＣ−ＭＳＭＳによる分析の条件は、後述するＬＣ−ＭＳＭＳを用いてタンパク質（Ａ）の変異率を算出する際の「ＬＣ−ＭＳＭＳによる測定」の条件と同じ条件であることが好ましい。
本方法により、第１の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングすることができる。
【００５０】
＜スクリーニング（２）＞
タンパク質（Ａ）のペプチド結合中のアミド基を有する化合物のモデル化合物として、アラニルアラニンを用い、上記シミュレーションソフト等を用いて、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングしてもよい。
本方法により、第２の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングすることができる。
【００５１】
本発明のタンパク質組成物の製造方法において、滅菌前タンパク質組成物中には、タンパク質（Ａ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）以外の任意の添加剤を含んでいても良い。
任意の添加物としては、抗酸化剤、防腐剤、安定化剤、可溶化剤、緩衝液成分等が挙げられる。
【００５２】
本発明のタンパク質組成物の製造方法は、滅菌前タンパク質組成物を放射線により滅菌する滅菌工程を含む。
また、本発明のタンパク質組成物の製造方法では、滅菌工程の前に、以下のように、滅菌前タンパク質組成物を準備する滅菌前タンパク質組成物準備工程や、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥する凍結乾燥工程や、滅菌前タンパク質組成物をパッキングするパッキング工程を行ってもよい。
【００５３】
（滅菌前タンパク質組成物準備工程）
滅菌前タンパク質組成物の作製方法として、例えば、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とラジカル捕捉剤（ＲＳ）とタンパク質（Ａ）を室温で水に溶解させる方法が挙げられる。水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、水の滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃、２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【００５４】
（凍結乾燥工程）
滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥させる方法として−３０〜−３５℃程度まで温度を下げて、凍結した後に、減圧し、真空状態とし、温度を−１０〜−２０℃程度（平衡水蒸気圧が設定真空度以上となる温度）まで上げ、水を昇華させる方法等が挙げられる。
一例として、設備条件を以下に挙げる。
設備：凍結乾燥機ＦＤ−１０ＢＭ（日本テクノサービス株式会社製）
凍結条件：−３０℃（１５ｈ）
一次乾燥条件：−１０℃（７２ｈ）
二次乾燥条件：１０℃（７２ｈ）
真空度：１Ｐａ〜１０Ｐａ
【００５５】
（パッキング工程）
本発明のタンパク質組成物の製造方法では、滅菌工程前に、滅菌前タンパク質組成物を外部と遮断するために、滅菌前タンパク質組成物のパッキングをしてもよい。
パッキングの方法としては、真空パック法が挙げられる。
【００５６】
（滅菌工程）
本発明のタンパク質組成物の製造方法の滅菌工程において、滅菌前タンパク質組成物を放射線により滅菌する方法として、以下の条件でγ線滅菌、電子線滅菌等する方法が挙げられる。
照射施設：日本電子照射サービス株式会社
照射線量：２５〜２７ｋＧｙ
照射時環境温度：−１０〜１０℃
また、本発明のタンパク質組成物の製造方法の滅菌工程では、ＪＩＳ  Ｔ  ０８０６−２：２０１０又はＩＳＯ１１１３７−２：２００６に従いＳＡＬ１０−６が達成されるように滅菌することが好ましい。
また、本発明のタンパク質組成物の製造方法において、滅菌工程は１回だけ行ってもよく、複数回行ってもよい。
【００５７】
本発明のタンパク質組成物の製造方法によりタンパク質組成物を製造することにより、製造されたタンパク質組成物の変性率、特に、下記方法で測定される「ＨＰＬＣ測定により算出される変性率」及び「ＬＣ−ＭＳＭＳ測定により算出されるタンパク質組成物の変性率」を低くすることができる。
【００５８】
本明細書において、製造されたタンパク質組成物のＨＰＬＣ測定により算出された変性率とは、滅菌前タンパク質組成物及び製造されたタンパク質組成物を以下の条件でＨＰＬＣ測定を行い、滅菌前タンパク質組成物のピーク高さをＭとし、製造されたタンパク質組成物のピーク高さをＮとした際に、以下の式（２）から算出される数値を意味する。
変性率（％）＝［１−（Ｎ／Ｍ）］×１００・・・（２）
【００５９】
（ＨＰＬＣによる測定）
タンパク質（Ａ）が１ｍｇとなるように滅菌前タンパク質組成物又は製造されたタンパク質組成物中を純水１ｍＬに溶解し、０．４５μｍフィルターを通し測定用試料とする。
当該測定用試料をＨＰＬＣ（島津社製）で以下の条件により測定する。
カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４
移動層：
Ａ：９９．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
Ｂ：３４重量％アセトニトリル＋６５．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
Ｃ：８０重量％アセトニトリル＋１９．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
モード：曲線グラジエントモード（Ａ／Ｂ＝８６／１４  ｔｏ  Ａ／Ｂ＝２０／８０  ｔｏ  Ｃ＝１００）
測定波長：２１４ｎｍ
【００６０】
通常、タンパク質組成物が放射線により滅菌されると、タンパク質組成物に含まれるタンパク質は親水化する。そのため、放射線により滅菌されたタンパク質組成物のＨＰＬＣ分析のピークは、ブロードになり、低くなる。逆に、変性が生じたタンパク質の割合が少なければ、ＨＰＬＣ分析のピークは、シャープになり、低くなりにくい。
【００６１】
本明細書において、製造されたタンパク質組成物のＬＣ−ＭＳＭＳ測定により算出された変性率とは、滅菌前タンパク質組成物及び製造されたタンパク質組成物を以下の条件でＬＣ−ＭＳＭＳ測定を行い、滅菌前タンパク質組成物の各アミノ酸濃度をＯｎとし、製造されたタンパク質組成物の各アミノ酸濃度をＰｎとし、測定したアミノ酸の種類の数をＱとした際に、以下の式（３）から算出される数値を意味する。
変性率（％）＝１／Ｑ×Σ［１−（Ｐｎ／Ｏｎ）］×１００・・・（３）
【００６２】
（ＬＣ−ＭＳＭＳによる測定）
タンパク質（Ａ）が１ｍｇとなるように滅菌前タンパク質組成物又は製造されたタンパク質組成物中を６Ｎ  塩酸２００μＬに加え脱気する。泡が発生しなくなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行う。加水分解後、８００μＬになるように純水で希釈する。希釈した溶液を、０．４５μｍのフィルターを通し測定用試料とする。
当該測定用試料をＬＣ−ＭＳＭＳ（島津社製）で以下の条件により測定する。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（ジーエルサイエンス製）
移動相：
Ａ：０．０５Ｍトリフルオロ酢酸水溶液
Ｂ：メタノール
Ａ／Ｂ＝９５／５（Ｖ／Ｖ）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン源：ＥＳＩ（＋）
測定モード：ＭＲＭ（ＭＳＭＳ）
標準試料（アミノ酸混合標準液  Ｈ型）から得られる溶出時間と分子量により、アミノ酸組成を決定する。
【００６３】
本発明のタンパク質組成物の製造方法は、医療用途や生化学用途で用いられるタンパク質組成物を製造する方法であって、放射線滅菌による、タンパク質の分解、変性等の変化を防止するために使用される。
【００６４】
本発明のタンパク質組成物の製造方法により製造されたタンパク質組成物は、本発明のタンパク質組成物でもある。
すなわち、本発明のタンパク質組成物は、タンパク質（Ａ）を含有するタンパク質組成物であって、前記タンパク質組成物は、さらにラジカル捕捉剤（ＲＳ）と、アミノ酸、ペプチド及び前記タンパク質（Ａ）以外のタンパク質からなる群から選ばれる１種以上である水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）とを含有し、前記タンパク質（Ａ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）が、スルフィド基、アミド基、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の官能基を有し、前記タンパク質（Ａ）中の官能基と、前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基とは、水素結合により結合することができ、前記タンパク質組成物中の前記ラジカル捕捉剤（ＲＳ）と前記タンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、前記タンパク質組成物中の前記水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であり、放射線滅菌されていることを特徴とする。
【００６５】
本発明のタンパク質組成物では、タンパク質組成物中のラジカル捕捉剤（ＲＳ）とタンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であり、０．０１〜０．１であることが好ましく、０．０１〜０．０５であることがより好ましい。
上記の通り、本発明のタンパク質組成物は、放射線による滅菌をされて製造される。タンパク質組成物中のラジカル捕捉剤（ＲＳ）とタンパク質（Ａ）との重量比［ラジカル捕捉剤（ＲＳ）／タンパク質（Ａ）］が０．０１〜１．０であると、放射線による滅菌により、タンパク質（Ａ）の変性体が生じにくくなり、タンパク質（Ａ）の生理学的、物理化学的機能を保持しやすくなる。
【００６６】
本発明のタンパク質組成物では、タンパク質組成物中の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であり、０．０１〜０．１０であることが好ましく、０．０１〜０．０５であることがより好ましい。
上記の通り、本発明のタンパク質組成物は、放射線による滅菌をされて製造される。
タンパク質組成物中の水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）の官能基の合計モル数と、タンパク質（Ａ）中の官能基の合計モル数とのモル比［水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）中の官能基の合計のモル数／タンパク質（Ａ）中の官能基の合計のモル数］が、０．０１〜０．５０であると、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）によるデメリット（生理学的・物理化学的機能の変化、ｐＨ環境の変化、コスト増大、炎症及び発ガン等）が小さくなる。また、放射線による滅菌により、タンパク質（Ａ）の変性体が生じにくくなり、タンパク質（Ａ）の生理学的、物理化学的機能を保持しやすくなる。
【００６７】
本発明のタンパク質組成物は、放射線滅菌されている。
従って、本発明のタンパク質組成物を医療用途や生化学的用途に用いた場合、コンタミネーションを好適に防ぐことができる。
また、本発明のタンパク質組成物は、２５〜２７ｋＧｙで放射線滅菌されていることが好ましい。
なお、本発明のタンパク質組成物は、ＪＩＳ  Ｔ  ０８０６−２：２０１０又はＩＳＯ１１１３７−２：２００６に従い、ＳＡＬ１０−６が達成されるように滅菌されていることがより好ましい。このように滅菌されている場合、本発明のタンパク質組成物は医薬品としても使用することができる。
【００６８】
本発明のタンパク質組成物では、タンパク質組成物中の水分含有量が、タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であることが好ましく、０．０１〜３０重量％であることがより好ましく、０．０１〜１５重量％であることがさらに好ましい。
タンパク質組成物中の水分含有量が、タンパク質組成物の重量に基づいて、０〜３０重量％であると、タンパク質組成物に含まれるタンパク質（Ａ）の安定性が向上する。
【００６９】
本発明のタンパク質組成物は、パッキングされていることが好ましく、真空パックされていることがより好ましい。
タンパク質組成物がパッキングされていると、外部と遮断されるため、コンタミネーションが生じにくくなる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７１】
（ラジカル捕捉剤（ＲＳ）の準備）
表１に示す各種ラジカル捕捉剤（ＲＳ）を準備した。各ラジカル捕捉剤のラジカル捕捉能及びラジカル捕捉剤の構造を表１に示す。【００７２】
【表１】
2016143828.tif 000002
【００７３】
（水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）のスクリーニング）
まず、タンパク質（Ａ）として、ＳＥＬＰ８Ｋ（配列（２２））、プロネクチンＦ（配列（３０））、プロネクチンＬ（配列（３２））、ＨＲＰ結合ラビット抗体（配列（３３））、グルコースオキシダーゼ（配列（３４））及びウシ血清アルブミン（配列（３５））の各水溶液を凍結乾燥し、乾燥後、窒素雰囲気下で真空パックした。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射した。
その後、電子線照射前のタンパク質（Ａ）及び電子線照射後のタンパク質（Ａ）のアミノ酸組成を以下の方法で測定し、電子線照射により変性したアミノ酸を特定した。【００７４】
＜評価：アミノ酸分析＞
タンパク質１ｍｇを６Ｎ  塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなくなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。加水分解後、８００μＬになるように純水で希釈した。希釈した溶液を、０．４５μｍのフィルターを通し測定用試料とし、結果を表３に示した。
ＬＣ−ＭＳＭＳ（島津社製）で以下の条件により分析した。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（ジーエルサイエンス製）
移動相：
Ａ：０．０５Ｍトリフルオロ酢酸水溶液
Ｂ：メタノール
Ａ／Ｂ＝９５／５（Ｖ／Ｖ）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン源：ＥＳＩ（＋）
測定モード：ＭＲＭ（ＭＳＭＳ）
標準試料（アミノ酸混合標準液  Ｈ型）から得られる溶出時間と分子量により、アミノ酸組成を決定した。【００７５】
電子線照射によって変性したタンパク質（Ａ）中のアミノ酸は、セリンであった。【００７６】
次に、シミュレーションソフト（Ｇａｕｓｓｉａｎ）を用いて、セリンの側鎖のヒドロキシル基と水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングした。
また、アラニルアラニンのペプチド結合中のアミド基と水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）をスクリーニングした。
その結果、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）として、トリプトファン、チロシン及びヒスチジンをスクリーニングすることができた。
セリンの側鎖のヒドロキシル基と、トリプトファンの側鎖のカルボキシル基、チロシンの側鎖のヒドロキシル基又はヒスチジンの側鎖のカルボキシル基とは水素結合（第１の水素結合）をすると考えられる。第１の水素結合の距離（Å）を表２に示す。
アラニルアラニンのペプチド結合中のアミド基と、トリプトファンの側鎖のカルボキシル基、チロシンの側鎖のヒドロキシル基又はヒスチジンの側鎖のカルボキシル基とは水素結合（第２の水素結合）をすると考えられる。第２の水素結合の距離（Å）を表２に示す。【００７７】
【表２】
2016143828.tif 000003
【００７８】
＜実施例１〜３２＞
・ＳＥＬＰ８Ｋを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてＳＥＬＰ８Ｋを用い、表３に記載した重量比及びモル比となるようにＳＥＬＰ８Ｋ、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水を混合し、ＳＥＬＰ８Ｋが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は８重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、実施例１〜３２に係るタンパク質組成物を製造した。【００７９】
＜実施例３３〜６５＞
・プロネクチンＦを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてプロネクチンＦを用い、表４に記載した重量比及びモル比となるようにプロネクチンＦ、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水を混合し、プロネクチンＦが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質の水分含有量は５重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、実施例３３〜６５に係るタンパク質組成物を製造した。【００８０】
＜実施例６６〜９７＞
・プロネクチンＬを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてプロネクチンＬを用い、表５に記載した重量比及びモル比となるようにプロネクチンＬ、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水を混合し、プロネクチンＬが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前のタンパク質の水分含有量は４重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、実施例６６〜９７に係るタンパク質組成物を製造した。【００８１】
＜実施例９８＞
・ＨＲＰ結合ラビット抗体を含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）として、ＨＲＰ結合ラビット抗体を用い、表６に記載の重量比及びモル比に従って、ＨＲＰ結合ラビット抗体、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水混合し、ＨＲＰ結合ラビット抗体が０．１重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前のタンパク質組成物の水分含有量は７重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し実施例９８に係るタンパク質組成物を製造した。【００８２】
＜実施例９９＞
・グルコースオキシダーゼを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてグルコースオキシダーゼを用い、表６に記載した重量比及びモル比となるようにグルコースオキシダーゼ、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水を混合し、グルコースオキシダーゼが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は６重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、実施例９９に係るタンパク質組成物を製造した。【００８３】
＜実施例１００＞
・ウシ血清アルブミンを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてウシ血清アルブミンを用い、表６に記載した重量比及びモル比となるようにウシ血清アルブミン、水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）、ラジカル捕捉剤（ＲＳ）及び水を混合し、ウシ血清アルブミンが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は５重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、実施例１００に係るタンパク質組成物を製造した。【００８４】
＜比較例１＞
・ＳＥＬＰ８Ｋを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてＳＥＬＰ８Ｋを用い、ＳＥＬＰ８Ｋ及び水を混合し、ＳＥＬＰ８Ｋが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は８重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例１に係るタンパク質組成物を製造した。【００８５】
＜比較例２＞
・プロネクチンＦを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてプロネクチンＦを用い、プロネクチンＦ及び水を混合し、プロネクチンＦが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質の水分含有量は５重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例２に係るタンパク質組成物を製造した。【００８６】
＜比較例３＞
・プロネクチンＬを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてプロネクチンＬを用い、プロネクチンＬ及び水を混合し、プロネクチンＬが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前のタンパク質の水分含有量は４重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例３に係るタンパク質組成物を製造した。【００８７】
＜比較例４＞
・ＨＲＰ結合ラビット抗体を含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）として、ＨＲＰ結合ラビット抗体を用い、ＨＲＰ結合ラビット抗体及び水混合し、ＨＲＰ結合ラビット抗体が０．１重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前のタンパク質組成物の水分含有量は７重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例４に係るタンパク質組成物を製造した。【００８８】
＜比較例５＞
・グルコースオキシダーゼを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてグルコースオキシダーゼを用い、グルコースオキシダーゼ及び水を混合し、グルコースオキシダーゼが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は６重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例５に係るタンパク質組成物を製造した。【００８９】
＜比較例６＞
・ウシ血清アルブミンを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
タンパク質（Ａ）としてウシ血清アルブミンを用い、ウシ血清アルブミン及び水を混合し、ウシ血清アルブミンが２．４重量％含まれる滅菌前タンパク質組成物の水溶液を作製した。
その後、滅菌前タンパク質組成物を凍結乾燥し、窒素雰囲気下で真空パックした。滅菌前タンパク質組成物の水分含有量は５重量％であった。真空パックしたものを、−２０℃、２５ｋＧｙの条件で、電子線を照射し、比較例６に係るタンパク質組成物を製造した。【００９０】
＜比較例７＞
・ＳＥＬＰ８Ｋを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例１と同様にして、比較例７に係るタンパク質組成物を製造した。【００９１】
＜比較例８＞
・プロネクチンＦを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例２と同様にして、比較例８に係るタンパク質組成物を製造した。【００９２】
＜比較例９＞
・プロネクチンＬを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例３と同様にして、比較例９に係るタンパク質組成物を製造した。【００９３】
＜比較例１０＞
・ＨＲＰ結合ラビット抗体を含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例４と同様にして、比較例１０に係るタンパク質組成物を製造した。【００９４】
＜比較例１１＞
・グルコースオキシダーゼを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例５と同様にして、比較例１１に係るタンパク質組成物を製造した。【００９５】
＜比較例１２＞
・ウシ血清アルブミンを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例６と同様にして、比較例１２に係るタンパク質組成物を製造した。【００９６】
＜比較例１３＞
・ＳＥＬＰ８Ｋを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例１と同様にして、比較例１３に係るタンパク質組成物を製造した。【００９７】
＜比較例１４＞
・プロネクチンＦを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例２と同様にして、比較例１４に係るタンパク質組成物を製造した。【００９８】
＜比較例１５＞
・プロネクチンＬを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
ラジカル捕捉剤としてアスコルビン酸を表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例３と同様にして、比較例１５に係るタンパク質組成物を製造した。【００９９】
＜比較例１６＞
・ＳＥＬＰ８Ｋを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）としてトリプトファンを表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例１と同様にして、比較例１６に係るタンパク質組成物を製造した。【０１００】
＜比較例１７＞
・プロネクチンＦを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）としてトリプトファンを表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例２と同様にして、比較例１７に係るタンパク質組成物を製造した。【０１０１】
＜比較例１８＞
・プロネクチンＬを含むタンパク質組成物の放射線による滅菌
水素結合を形成しうる化合物（ＨＣ）としてトリプトファンを表７に示す割合で加えたこと以外は、比較例３と同様にして、比較例１８に係るタンパク質組成物を製造した。【０１０２】
＜ＨＰＬＣ測定により算出された変性率の評価＞
（ＨＰＬＣによる測定）
タンパク質（Ａ）が１ｍｇとなるように、各実施例のタンパク質組成物を製造する際に作製した滅菌前タンパク質組成物、及び、各実施例に係るタンパク質組成物を純水１ｍＬに溶解し、０．４５μｍフィルターを通し測定用試料とした。同様に、各比較例のタンパク質組成物を製造する際に作製した滅菌前タンパク質組成物、及び、各比較例に係るタンパク質組成物の測定用試料を作製した。
当該測定用試料につきＨＰＬＣ（島津社製）で以下の条件により測定した。
カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４
移動層：
Ａ：９９．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
Ｂ：３４重量％アセトニトリル＋６５．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
Ｃ：８０重量％アセトニトリル＋１９．８５重量％水＋０．１５重量％トリクロロ酢酸
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
モード：曲線グラジエントモード（Ａ／Ｂ＝８６／１４  ｔｏ  Ａ／Ｂ＝２０／８０  ｔｏ  Ｃ＝１００）
測定波長：２１４ｎｍ【０１０３】
（ＨＰＬＣ測定により算出された変性率の算出）
上記条件により測定された、滅菌前タンパク質組成物のピーク高さをＭとし、製造されたタンパク質組成物のピーク高さをＮとし、以下の式（１）からＨＰＬＣ測定により算出された変性率を得た。結果を表３〜７に示す。
変性率（％）＝｛１−（Ｎ／Ｍ）｝×１００・・・（１）【０１０４】
＜ＬＣ−ＭＳＭＳ測定により算出された変性率の評価＞
（ＬＣ−ＭＳＭＳによる測定）
タンパク質（Ａ）が１ｍｇとなるように、各実施例のタンパク質組成物を製造する際に作製した滅菌前タンパク質組成物、及び、各実施例に係るタンパク質組成物を６Ｎ  塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなくなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。加水分解後、８００μＬになるように純水で希釈した。希釈した溶液を、０．４５μｍのフィルターを通し測定用試料とした。同様に、各比較例のタンパク質組成物を製造する際に作製した滅菌前タンパク質組成物、及び、各比較例に係るタンパク質組成物の測定用試料を作製した。
当該測定用試料をＬＣ−ＭＳＭＳ（島津社製）で以下の条件により分析した。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（ジーエルサイエンス製）
移動相：
Ａ：０．０５Ｍトリフルオロ酢酸水溶液
Ｂ：メタノール
Ａ／Ｂ＝９５／５（Ｖ／Ｖ）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
イオン源：ＥＳＩ（＋）
測定モード：ＭＲＭ（ＭＳＭＳ）
標準試料（アミノ酸混合標準液  Ｈ型）から得られる溶出時間と分子量により、アミノ酸組成を決定した。【０１０５】
（ＬＣ−ＭＳＭＳ測定により算出された変性率の算出）
上記条件により測定された、滅菌前タンパク質組成物の各アミノ酸濃度をＯｎとし、製造されたタンパク質組成物の各アミノ酸濃度をＰｎとし、測定したアミノ酸の種類の数をＱとし、以下の式（２）からＬＣ−ＭＳＭＳ測定により算出された変性率を得た。結果を表３〜７に示す。
変性率（％）＝１／Ｑ×Σ［１−（Ｐｎ／Ｏｎ）］×１００・・・（２）【０１０６】
【表３】
2016143828.tif 000004
【０１０７】
【表４】
2016143828.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2016143828.tif 000006
【０１０９】
【表６】
2016143828.tif 000007
【０１１０】
【表７】
2016143828.tif 000008
【０１１１】
表３〜７の結果から、本発明の製造方法により得られたタンパク質組成物は、比較例１〜１８に係るタンパク質組成物と比較して、タンパク質（Ａ）の変性率が低いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のタンパク質組成物の製造方法は、タンパク質組成物を放射線滅菌する場合に、タンパク質の生理学的及び物理化学的機能の保持に優れている。したがって、タンパク質組成物の製造方法として有効である。
【配列表】
2016143828000001.app
【国際調査報告】
2016143828.tif 000009
2016143828.tif 000010
2016143828.tif 000011
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