(57)【要約】  セルロースを簡便かつ廉価に製造する方法を提供する。  プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有するセルロース製造用ベクターを使用する。そして、前記セルロース製造用ベクターを導入した形質転換体を培養し、前記ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現させることによって、前記形質転換体によりセルロースを生合成できる。
2014104310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする、セルロース製造用ベクター。
【請求項２】
前記上流配列の長さが、１３〜１００塩基長である、請求項１記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項３】
前記上流配列が、前記５’側遺伝子の開始コドンに連結している、請求項１または２記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項４】
前記上流配列が、前記５’側遺伝子の由来生物において、前記５’遺伝子の開始コドンに連結する上流配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項５】
前記上流配列が、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはその部分配列を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項６】
前記上流配列が、配列番号１６の塩基配列（GGACGAGCTATT）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項７】
前記配列番号１６の塩基配列が、前記上流配列における３’領域の配列であり、その３’末端が、前記５’側遺伝子の開始コドンと連結している、請求項６記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターと前記開始コドンとの間の長さが、１３〜１００塩基長である、請求項１から７のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項９】
前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子を、上流側から、この順序で有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１０】
さらに、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子の少なくとも一方を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１１】
前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子が、酢酸菌由来である。請求項１から１０のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１２】
前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター属である、請求項１１記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１３】
前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター・キシリナスである、請求項１２記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１４】
前記プロモーターが、ｐＱＥベクターのプロモーターである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１５】
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーターである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。
【請求項１７】
さらに、ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを含む、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記ｄｇｃ遺伝子が、サーモトーガ・マリティマ由来である、請求項１６または１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
前記形質転換体が、大腸菌である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする、セルロースの製造方法。
【請求項２１】
前記セルロースが、セルロースＩまたはセルロースIIである、請求項２０に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする、セルロース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、様々な産業における有用な原材料として、長年利用されている。セルロースは、グルコースが重合した直鎖の高分子であり、その分子鎖の凝集形態によって、Ｉ型およびII型等の結晶構造に分類できる。天然セルロースは、Ｉ型の結晶構造を有するセルロースＩと呼ばれ、一般に、紙および衣服の材料として使用されている。また、再生セルロースは、II型の結晶構造を有するセルロースIIと呼ばれ、独特の風合いおよび高親水性を有することから、付加価値が高く、一般に、セロファンおよびレーヨンの材料として使用されている。しかし、天然セルロースは、通常、天然木材から得られるパルプを原料とするため、森林等の天然資源の保存の観点から、パルプ原料を使用しない方法の開発が求められている。さらに、再生セルロースは、前記天然セルロースを高濃度のアルカリ溶液に浸漬して製造されるため、環境への負荷およびコストが高いという問題もある。【０００３】
一方、遺伝子工学の発展に伴い、セルロースの製造方法として、前述のような天然物からの調製ではなく、組換え技術によって、微生物にセルロースを合成させる方法が研究されている。具体例として、例えば、酢酸菌のセルロース合成酵素遺伝子ｂｃｓＡＢをシアノバクテリアに導入し、その形質転換体によってセルロースを製造する方法が、報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法では、前記遺伝子をシアノバクテリアのゲノムＤＮＡに導入するため、手間と時間を要し、収量が低いという問題もある。したがって、セルロースを簡便かつ廉価に製造する方法の提供が、強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Transgenic  expression  of  Gluconacetobacter  xylinus  strain  ATCC  53582  cellulose  synthase  genes  in  the  cyanobacterium  Synechococcus  leopoliensis  strain  UTCC  100”，  Cellulose  15，  691−701(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、様々な物性を持つセルロースを簡便かつ廉価に製造する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のセルロース製造用ベクターは、プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする。【０００７】
本発明の形質転換体は、前記本発明のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする。【０００８】
本発明のセルロースの製造方法は、前記本発明のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のセルロースは、前記本発明のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記本発明のセルロース製造用ベクターを宿主に導入した形質転換体において、前記セルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現することによって、簡便にセルロースを製造できる。また、前記形質転換体の生合成によってセルロースを製造できるため、従来のように、パルプを原料として使用する必要がなく、天然原料の使用による環境への負荷も回避できる。したがって、本発明は、セルロースを原料とする様々な産業に有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、ＣｅｓＡＢＣＤ遺伝子の発現系構成を示す概略図である。
【図２】実施例１において、ＣｅｓＡＢ発現系の構築の手順を示す図である。
【図３】実施例１において、ｄｇｃ発現系の構築の手順を示す図である。
【図４】実施例１において、サンプルの負染色観察の結果を示す写真である。
【図５】実施例１において、サンプルの電子回折の結果を示す写真である。
【図６】実施例１において、サンプルの赤外スペクトルを示すグラフである。
【図７】実施例３において、サンプルの負染色観察の結果を示す写真である。
【図８】実施例４において、Ｃｅｓ発現系の上流配列およびスペーサー配列の長さを示す図である。
【図９】実施例４において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】実施例５において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）セルロース製造用ベクター
本発明のセルロース製造用ベクターは、前述のように、プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする。以下、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の遺伝子を、５’側遺伝子、下流側の遺伝子を、３’側遺伝子ともいう。
【００１３】
前記上流配列の長さは、下限が、例えば、１３塩基長であり、好ましくは１６塩基長であり、より好ましくは２１塩基長であり、上限が、例えば、１００塩基長であり、好ましくは７０塩基長であり、より好ましくは２４塩基長であり、その範囲は、例えば、１３〜１００塩基長であり、好ましくは１３〜７０塩基長であり、より好ましくは１３〜２４塩基長である。なお、本発明において、数値範囲の記載は、その範囲内に含まれる値の開示も意味する。すなわち、例えば、１〜３個の記載は、１個、２個および３個の開示を意味する。
【００１４】
前記上流配列は、例えば、前記５’側遺伝子の開始コドンに、直接的に連結してもよいし、スペーサー配列を介して間接的に連結してもよく、好ましくは前者である。また、前記上流配列は、例えば、前記プロモーターの３’末端に、直接的に連結してもよいし、スペーサー配列を介して間接的に連結してもよい。
【００１５】
前記上流配列は、前述のように、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流の配列であればよく、特に制限されない。前記上流配列は、例えば、前記５’側遺伝子の由来生物において、前記５’遺伝子の開始コドンに連結する上流配列であり、具体的には、前記開始コドンに直接連結する上流配列であることが好ましい。
【００１６】
前記上流配列は、例えば、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子の発現に関与する機能的な配列を含んでもよい。具体例として、前記上流配列は、例えば、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはその部分配列を有する配列があげられる。前記上流配列は、例えば、ＲＢＳのみからなる配列でもよいし、ＲＢＳを含む配列でもよいし、前記部分配列のみからなる配列でもよいし、前記部分配列を含む配列でもよい。
【００１７】
前記ＲＢＳの部分配列は、例えば、配列番号１６の塩基配列（GGACGAGCTATT）があげられる。前記上流配列は、例えば、配列番号１６の塩基配列からなる配列でもよいし、前記塩基配列を含む配列でもよい。
【００１８】
前記上流配列が、例えば、配列番号１６の塩基配列を含む場合、前記塩基配列は、前記上流配列における３’領域の配列であることが好ましく、この場合、前記上流配列は、例えば、前記塩基配列の３’末端が、前記５’側遺伝子の開始コドンと連結していることが好ましい。
【００１９】
前記プロモーターと前記開始コドンとの間の長さは、特に制限されない。前記長さの下限は、例えば、１３塩基長であり、好ましくは２７塩基長であり、より好ましくは２９塩基長であり、前記長さの上限は、例えば、１００塩基長であり、好ましくは８６塩基長、より好ましくは７０塩基長であり、さらに好ましくは３０塩基長であり、前記長さの範囲は、例えば、１３〜１００塩基長であり、好ましくは１３〜８６塩基長であり、より好ましくは１３〜８６塩基長であり、さらに好ましくは２７〜８６塩基長または２９〜８６塩基長である。
【００２０】
前記プロモーターと前記開始コドンとの間に前記スペーサー配列を有する場合、前記スペーサー配列の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１塩基長であり、好ましくは６塩基長であり、上限は、例えば、１００塩基長であり、好ましくは１６塩基長であり、その範囲は、例えば、１〜１００塩基長であり、好ましくは６〜１６塩基長ある。前記プロモーターと前記上流配列との間に前記スペーサー配列を有する場合、前記スペーサー配列の長さは、例えば、このような範囲があげられる。
【００２１】
本発明において、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子の順序は、特に制限されない。本発明のセルロース製造用ベクターは、前記両遺伝子を、例えば、上流側から、以下の順序で有してもよい。［Ａ］は、ＣｅｓＡ遺伝子を示し、［Ｂ］は、ＣｅｓＢ遺伝子を示す（以下、同様）。
［Ａ］−［Ｂ］
［Ｂ］−［Ａ］
本発明は、中でも、［Ａ］−［Ｂ］すなわち、上流から、ＣｅｓＡ遺伝子−ＣｅｓＢ遺伝子の順で有することが好ましい。前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子は、例えば、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。本発明は、例えば、上流に位置する前記プロモーターによって両遺伝子の発現が共に制御されるように、機能的に連結されていることが好ましく、具体例として、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子が一つのオペロンを形成してもよい。
【００２２】
本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子の少なくとも一方を有してもよく、具体的には、両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。本発明のセルロース製造用ベクターは、前記各遺伝子を、例えば、上流から、以下の順序で有してもよい。［Ｃ］は、ＣｅｓＣ遺伝子を示し、［Ｄ］は、ＣｅｓＤ遺伝子を示す（以下、同様）。
［Ａ］−［Ｂ］−［Ｃ］
［Ａ］−［Ｂ］−［Ｃ］−［Ｄ］
［Ａ］−［Ｂ］−［Ｄ］
［Ａ］−［Ｂ］−［Ｄ］−［Ｃ］
［Ｂ］−［Ａ］−［Ｃ］
［Ｂ］−［Ａ］−［Ｃ］−［Ｄ］
［Ｂ］−［Ａ］−［Ｄ］
［Ｂ］−［Ａ］−［Ｄ］−［Ｃ］
前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、例えば、隣接する遺伝子がそれぞれ、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。本発明は、例えば、上流に位置する前記プロモーターによって各遺伝子の発現が共に制御されるように、機能的に連結されていることが好ましく、具体例として、各遺伝子が一つのオペロンを形成してもよい。
【００２３】
前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、セルロース合成酵素遺伝子として公知の遺伝子であり、例えば、酢酸菌等の細菌において、これらの遺伝子が一つのオペロンを形成していることが知られている。前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、以下、Ｃｅｓ系遺伝子ともいう。
【００２４】
本発明において、前記Ｃｅｓ系遺伝子の由来は、何ら制限されない。前記Ｃｅｓ系遺伝子は、例えば、全て同じ由来でもよいし、全てまたは一部が異なる由来であってもよい。前記由来は、例えば、細菌等の生物があげられ、前記細菌は、例えば、酢酸菌、サルモネラ菌、植物病原菌、植物共生菌、光合成細菌等があげられる。前記酢酸菌は、例えば、アセトバクター属、アシディフィリウム属、アシディスフェラ属、アシドセラ属、アシドモナス属、アサイア属、クラウロコッカス属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、コザキア属、ムリコッカス属、パラクラウロコッカス属、ロドピラ属、ロゼオコッカス属、ルブリテピダ属、ステラ属、テイココッカス属またはザヴァルジニア属等があげられ、好ましくは、前記グルコンアセトバクター属である。前記グルコンアセトバクター属に属する酢酸菌は、特に制限されず、例えば、グルコンアセトバクター・キシリナス等があげられる。
【００２５】
前記Ｃｅｓ系遺伝子は、例えば、遺伝子工学的手法により調製してもよいし、化学的手法により調製してもよい。前者の場合、例えば、前記由来生物からクローニングしてもよいし、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法により調製してもよい。後者の場合、化学的に合成してもよい。前記調製は、例えば、前記各Ｃｅｓ系遺伝子の塩基配列情報、または各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、行うことができる。また、前記Ｃｅｓ系遺伝子として、例えば、公知のＣｅｓ系遺伝子の塩基配列において、コードするタンパク質が同等の機能を維持する範囲で改変された塩基配列からなるポリヌクレオチドも使用できる。
【００２６】
具体例として、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子のオペロンの塩基配列、前記各遺伝子の塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す。本発明において、前記Ｃｅｓ系遺伝子は、これらの配列に制限されない。
【００２７】
Ｃｅｓ遺伝子オペロン（配列番号１、Ｆｒｏｍ−７０）
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【００２８】
ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２、前記オペロンにおける７１−２３３５番目）
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ＣｅｓＡタンパク質（配列番号３）
MSEVQSPVPTESRLGRISNKILSLRGASYIVGALGLCALIAATTVTLNNNEQLIVAAVCVVIFFVVGRGKSRRTQIFLEVLSALVSLRYLTWRLTETLDFNTWIQGILGVILLMAELYALYMLFLSYFQTIQPLHRAPLPLPDNVDDWPTVDIFIPTYDEQLSIVRLTVLGALGIDWPPDKVNVYILDDGVRPEFEQFAKDCGALYIGRVDSAHAKAGNLNHAIKRTSGDYILILDCDHIPTRAFLQIAMGWMVADRKIALMQTPHHFYSPDPFQRNLAVGYRTPPEGNLFYGVIQDGNDFWDATFFCGSCAILRREAIESIGGFAVETVTEDAHTALRMQRRGWSTAYLRIPVASGLATERLTTHIGQRMRWARGMIQIFRVDNPMLGRGLKLGQRLCYLSAMTSFFFAIPRVIFLASPLAFLFAGQNIIAAAPLAVAAYALPHMFHSIATAAKVNKGWRYSFWSEVYETTMALFLVRVTIVTLLFPSKGKFNVTEKGGVLEEEEFDLGATYPNIIFATIMMGGLLIGLFELIVRFNQLDVIARNAYLLNCAWALISLIILFAAIAVGRETKQVRYNHRVEAHIPVTVYDAPAEGQPHTYYNATHGMTQDVSMGGVAVHIPLPDVTTGPVKKRIHAVLDGEEIDIPATMLRCTNGKAVFTWDNNDLDTERDIVRFVFGRADAWLQWNNYEDDRPLRSLWSLLLSIKALFRKKGKIMANSRPKKKPLALPVERREPTTIHSGQTQEGKISRAAS
【００２９】
ＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４、前記オペロンにおける２３３７−４７４５番目）
atgaaaatggtgtccctgatcgcgctgctggtctttgcaacgggggcacaggctgcgcctgttgcttccaaggcgccagctccgcagcccgcaggttcagacctgccacctctccctgccgcaccgccgcaggctgctccgcccgcagccgcgagtgccgccccgcccgccacaaccccggcggcggatgcctcagcagccagcgcggctgatgcggtcgtggacaatgccgagaacgccatcgccgggtctgacgtggcgacggtgcatacatattccctcagggaacttggtgcgcagagtgccctcaaaatgcagggcgctgctacgctgcagggcctgcagttcggtattccggccgaccagctcgtgacttcggcgcggcttgtcgtgtcgggtgcgatgtcgcccagcctccagcctgacaccagcgcggtcacgatcacgctgaacgaacagttcatcggcacgctgcggcctgaccccacacaccctacatttgggccgctctcgtttgatatcaaccccatcttcttcatcagtggcaaccggctgaatttcagcttcgcttcaagctcgaagggctgcacggaccccagcaacgggttgctctgggccagcgtgtccgaacattccgagctgcagatcaccaccatcccgcttcccccgcatcgccagctgtcgcgtctgccccagccgttcttcgacaagaacgtaaagcagaagatcgtcattccgttcgttctcgcacagacatttgatcccgaagtgctgaaggcgacgggcatcctggcatcgtggttcggccagcagaccgattaccgtggcgtcaccttcccggtcttctccaccattccgcaaacgggcaacgccgttgttgtcggcgtggctgacgagctgccttccgccctcgggcgccaggcggtcagtggccccacgcttatggaagtggccaatccatccgaccccaacggcacgatcctgctcgtaaccgggcgcgaccgtgatgaagtcatcaccgcgagcaagggcatcggttttggttcgagcaccctgccgacagccaaccgcatggacgtggcgccgatcgaggtcggggcccgcgtggcgaatgacgcgccctccttcattccgaccaaccgcccggtccgcctgggcgaactggtgccagacagcgccctgcaggctgaaggttacgcccctggcgcgctggcggtgccattccgtgtctcgcctgacctgtatacgtggcgcgatcggccgtacaagctgaacgtccgtttccgcgcgccgccggggccgatcgtggatgtgtcgcgctcgtcgctcaatgtaggcatcaacgatacctatctcgaggcctatccgctgcgtgagccggattcaccgctggaccagctcctgcatggggtgggccttggccatcgtaataatgacagcgtgcagcagcacaccatgcccatcccgacctaccgggtctttggccagaaccagctgctgttctatttcgagatggcggcgatggtcgagccgggctgcaaacccggcccgagcacgttccatatgggcattgatcccaattcgacgatcgatctgtccaactcctatcacatcacccagatgcccaacctcgccttcatggccagtgcgggctttccgttcaccacctatgccgacctgtcgcgctcggccgtggtgctgcccgaacaccccaatggcatgattgtcagcgcctatctcgacctcatgggcttcatgggggcgacgacatggtatccggtgtctggcgttgatgtggtctccagcgaccatgtgaatgacgtggcggaccggaacctgattgtcctgtccacgctggccaatagcggtgatgtttcgcagctgctgagcaattcggcctatcagatttccgatgggcggctgcacatggccctgcgttcgacgctgagcggcgtgtggaaccttttccaggatcccatgtcggccatcaacagcacggccccgaccgatgtcgagagcacgctgaccggtggcgtggccgcgatggtcgaggcggaatcgccgctggcatcgggtcggaccgttctcgcgctgctttcgggtgacgggcaggggctcaacaaccttgtgcagatcctggcgcagcggaaaaaccaggccaagatccagggtgatctggtgctggcacatggggatgacctgacctcctaccgcagctcgccgctgtatacggttggcaccgtgccgctgtggctcaagcctgactggtatatgcacaaccatcccagccgcgtggtcgtggttggcctgttcggttgccttctggtggtggctgtcctgatgcgcgccctgaccaagcatgctctgcgccgccgtcgggagttgcaggaagaaaggcagagaacgtga
ＣｅｓＢタンパク質（配列番号５）
MKMVSLIALLVFATGAQAAPVASKAPAPQPAGSDLPPLPAAPPQAAPPAAASAAPPATTPAADASAASAADAVVDNAENAIAGSDVATVHTYSLRELGAQSALKMQGAATLQGLQFGIPADQLVTSARLVVSGAMSPSLQPDTSAVTITLNEQFIGTLRPDPTHPTFGPLSFDINPIFFISGNRLNFSFASSSKGCTDPSNGLLWASVSEHSELQITTIPLPPHRQLSRLPQPFFDKNVKQKIVIPFVLAQTFDPEVLKATGILASWFGQQTDYRGVTFPVFSTIPQTGNAVVVGVADELPSALGRQAVSGPTLMEVANPSDPNGTILLVTGRDRDEVITASKGIGFGSSTLPTANRMDVAPIEVGARVANDAPSFIPTNRPVRLGELVPDSALQAEGYAPGALAVPFRVSPDLYTWRDRPYKLNVRFRAPPGPIVDVSRSSLNVGINDTYLEAYPLREPDSPLDQLLHGVGLGHRNNDSVQQHTMPIPTYRVFGQNQLLFYFEMAAMVEPGCKPGPSTFHMGIDPNSTIDLSNSYHITQMPNLAFMASAGFPFTTYADLSRSAVVLPEHPNGMIVSAYLDLMGFMGATTWYPVSGVDVVSSDHVNDVADRNLIVLSTLANSGDVSQLLSNSAYQISDGRLHMALRSTLSGVWNLFQDPMSAINSTAPTDVESTLTGGVAAMVEAESPLASGRTVLALLSGDGQGLNNLVQILAQRKNQAKIQGDLVLAHGDDLTSYRSSPLYTVGTVPLWLKPDWYMHNHPSRVVVVGLFGCLLVVAVLMRALTKHALRRRRELQEERQRT
【００３０】
ＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６、前記オペロンにおける４７４８−８７２８番目）
atgaacaggcgatacgccctttcgctttctggtgccctgctggccagcagttgcatgacggtgctggtggcggttcctgttgcgcgggcgcagcaggcttccactgccgtgacttccacagccgcgagtccggctgcggccccacggcagatcctgttgcagcaggcacgcttctggcttcagcagcagcaatatgacaatgcccgccaggccctgcagaatgcgcagcgcatcgcccccgatgcccctgacgtgctggaagtggagggtgaataccaggcggccgttggcaaccgcgaagccgctgccgataccctgcgccacctgcagcaggtggccccggccagcacggcggtcagcaacctgagcgatctgctcagcgagcgggccatttcccaaagcgacctgtcacagatccgttcgctggcgggttcgggccagaacgcgcaggcggtggcggggtaccagaagctgttccacggtggcaagccgccccgttcgcttgcggtggaatactaccagaccatggcgggcgtgccgacccagtgggaccaggcgcgcgcggggctggccgggatcgttgcgtccaacccgcagaattaccgcgcccagctcgcctttgcccaggccctgacctataatacctcgacccgcatggaaggcctgacccggctcaaggatctgcaatccttccagagtcaggccccggtcgaagctgccgccgcgacgcagtcctatcgccagaccctgagctggctgccggtcaatcccgatacgcagcccctcatggagcagtggctttccgcccaccccaatgatgccgcgctgcgcgaacacatgcttcacccccccggcggcccgccggacaaggcggggcttgcgcggcaggccggttaccagcagctcaacgcgggccgtctttccgctgccgaacagtccttccagtcggcgttgcagatcaactcccatgatgctgattcactgggtggcatgggcctcgtgagcatgcggcagggcgataccgccgaggcgcaccgctattttgaagaggcgatggccgccgaccccaagactgccgatcgctggcgcccggcgcttgcgggcatggcggtcagcggggactatgccgccgttcgccagttgattgccgcccatcagtataccgaggccaagcagaagcttgccacgctggcccgccagcccgggcagtacaccggcgcgaccctcatgctggccgacctgcagcgctcgaccgggcaggttgccgccgccgagcaggaatatcgtggcatcctgtcgcgtgagcccaataaccagctggcccttatggggctggcgcgggtggacatggcgcagggcaacacggcggaagcacgccagctcctgtcgcgtgtgagcccgcaatatgccagccaggtcggggaaatcgaggtttccggccttatggcggcagcgtcgcagacatcggattcagcgcgcaaggtttccatcctgcgcgaagcgatggcccaggccccgcgtgacccgtgggtgcgcatcaaccttgccaatgcgctgcagcagcagggcgatgtggctgaagccgggcgcgtgatgcagcccatcctggccaatcctgtcaccgcgcaggaccgccaggccggtatcctgtatacctatggcagtggcaatgatgcgatgacccgccagcttctggccggtctgtcgcccgcggattattcccccgcgatccgttccattgccgaggaaatggaaatcaagcaggacctggccagccgcctgtcgatggtatccaacccggtgccgctgatccgcgaggccctttcccagcctgatccgaccggcgcgcgtggcgtggcggtggccgacctgttccgccagcgtggcgacatggtgcatgcgcgcatggcgctgcgtatcgcctcgacgcgcaccatcgacctttcgcccgaccagcgcctgtcctacgccaccgaatacatgaagatcagcaacccggtggcagccgcacgcctgctggccccgctgggggatggcacgggttcgggcgcgggcaatgcgctgctgcccgagcagatgcagacattgcagcaactgcgcatgggcatctcggtggcgcagtccgatctgctcaaccagcgtggcgatcaggcgcaggcctacgatcatctggcgcccgccctgcaggccgacccggaggcgacatcgcccaagctggcgctcgcgcggctgtataacggccacggcaagccgggcaaggcgctcgagatcgaccttgcggtgctgcgccacaacccgcaggatcttgatgcgcggcaggcggcggtgcaggcggcggtcaacagcaaccacaacagtcttgccacccgtctcgcgatggatggcgtgcaggaaagcccgatggatgcccgcgcctggctggccatggccgtagctgaccaggccgatggccatggtcagcgcaccatcgaggacctgcgccgcgcctatgacctgcgcctgcagcaggtcgagggcacgcgggccgcgtctggtccggtcggggcgcaggaagaagcgcttgccccgccatcgaccaacccgttccagtcgcgtggctacgggcatcaggtggaactgggcgcgccggtgaccggtggctcctacagtgccgaggcggcatcgcccgatacgtcggaccagatgctctcctccattgctggccagatccacacgctgcgtgaaaaccttgcaccctccattgatggtgggctgggcttccggtcgcgttcgggcgagcatggcatgggccgcctgacggaagcgaacattcccatcgtgggccgcctgccgctgcaggccggtgcttccgccctgaccttctcgatcacgccaaccatgatctggtcgggccagctcaacacaggctccgtctatgatgtgccgcgttatggcacgttcatggcaacgcaggctgccaaccagtgcgcgggccacagttcgtgtggcgggcttgatttcctgagcgccaaccatacccagcgcatcgcggctggtgcaggcgaggccgggtttgcgccggatgtgcagttcggcaatagctgggtgcgcgctgatgtcggcgcctcgcccatcggcttccccattaccaacgtgctgggcggggtcgagttctcgccgcgcgtggggccggtcacgttccgtgtcagcgccgagcgccggtcgatcaccaacagcgtgctgtcctatggtggcctgcgtgatccgaactacaacagcgaggtcggtcgttacgcgcgtcaggtctatggtcatgacctgaccaagcagtggggtagcgaatggggtggggtggtgaccaaccacttccacggtcaggtcgaggcgacgctgggcaacaccatcctgtatggtggtggcggctacgcgatccagaccggcaagaacgtgcagcgcaacagcgagcgcgaagccggcatcggcgccaatacgctggtgtggcataacgccaacatgctggtgcgcattggcgtgagcctgacctatttcggttatgcccataacgaggatttctatacctatgggcagggcggctacttctcgccgcagtcctattatgcggcaaccgtgccggtgcgttatgcgggccagcacaagcggctggactgggatgtgacgggtagcgtgggctaccaggtgttccatgaacacgcggcgcccttcttccccacgtcatcgctgctgcagtccggtgccaattacgttgcatcgaactttgtgcagaatgccctgccaacggattatctgtcgcaggaaacggtgaacagcgcctactatcccggggatagtattgctggtcttacgggcggctttaatgctagggtgggctatcgctttacacgcaatgttcgtcttgatctctcggggcgctatcagaaggccggtaactggactgaaagcggcgccatgatttccgcacactatcttattatggaccagtaa
ＣｅｓＣタンパク質（配列番号７）
MNRRYALSLSGALLASSCMTVLVAVPVARAQQASTAVTSTAASPAAAPRQILLQQARFWLQQQQYDNARQALQNAQRIAPDAPDVLEVEGEYQAAVGNREAAADTLRHLQQVAPASTAVSNLSDLLSERAISQSDLSQIRSLAGSGQNAQAVAGYQKLFHGGKPPRSLAVEYYQTMAGVPTQWDQARAGLAGIVASNPQNYRAQLAFAQALTYNTSTRMEGLTRLKDLQSFQSQAPVEAAAATQSYRQTLSWLPVNPDTQPLMEQWLSAHPNDAALREHMLHPPGGPPDKAGLARQAGYQQLNAGRLSAAEQSFQSALQINSHDADSLGGMGLVSMRQGDTAEAHRYFEEAMAADPKTADRWRPALAGMAVSGDYAAVRQLIAAHQYTEAKQKLATLARQPGQYTGATLMLADLQRSTGQVAAAEQEYRGILSREPNNQLALMGLARVDMAQGNTAEARQLLSRVSPQYASQVGEIEVSGLMAAASQTSDSARKVSILREAMAQAPRDPWVRINLANALQQQGDVAEAGRVMQPILANPVTAQDRQAGILYTYGSGNDAMTRQLLAGLSPADYSPAIRSIAEEMEIKQDLASRLSMVSNPVPLIREALSQPDPTGARGVAVADLFRQRGDMVHARMALRIASTRTIDLSPDQRLSYATEYMKISNPVAAARLLAPLGDGTGSGAGNALLPEQMQTLQQLRMGISVAQSDLLNQRGDQAQAYDHLAPALQADPEATSPKLALARLYNGHGKPGKALEIDLAVLRHNPQDLDARQAAVQAAVNSNHNSLATRLAMDGVQESPMDARAWLAMAVADQADGHGQRTIEDLRRAYDLRLQQVEGTRAASGPVGAQEEALAPPSTNPFQSRGYGHQVELGAPVTGGSYSAEAASPDTSDQMLSSIAGQIHTLRENLAPSIDGGLGFRSRSGEHGMGRLTEANIPIVGRLPLQAGASALTFSITPTMIWSGQLNTGSVYDVPRYGTFMATQAANQCAGHSSCGGLDFLSANHTQRIAAGAGEAGFAPDVQFGNSWVRADVGASPIGFPITNVLGGVEFSPRVGPVTFRVSAERRSITNSVLSYGGLRDPNYNSEVGRYARQVYGHDLTKQWGSEWGGVVTNHFHGQVEATLGNTILYGGGGYAIQTGKNVQRNSEREAGIGANTLVWHNANMLVRIGVSLTYFGYAHNEDFYTYGQGGYFSPQSYYAATVPVRYAGQHKRLDWDVTGSVGYQVFHEHAAPFFPTSSLLQSGANYVASNFVQNALPTDYLSQETVNSAYYPGDSIAGLTGGFNARVGYRFTRNVRLDLSGRYQKAGNWTESGAMISAHYLIMDQ
【００３１】
ＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８、前記オペロンにおける８７２８−９１９８番目）
atgacaactttgaacgcaaaaccggacttttcgcttttcctgcaggcactgtcctgggagatcgatgatcaggccgggatcgaggtcaggaatgacctgttgcgcgaggtcggccggggtatggctggtcgtttccagccgccgctgtgcaacaccatccaccagctccagatcgagctgaacgccctgctggccatgatcaactggggctacgtaaagctggacctgctggcggaagaacaggccatgcgcatcgtgcatgaagacctgccgcaggtgggcagcgcgggcgaacccgccggcacatggcttgccccggtgctggaagggctttatggccgctggatcacgtcgcagcccggcgccttcggtgattatgtcgtgacgcgtgatatcgacgcggaagacctgaactcggtcccggcccagacggtcatcctgtacatgcgcacccgcagcgccgcgacctga
ＣｅｓＤタンパク質（配列番号９）
MTTLNAKPDFSLFLQALSWEIDDQAGIEVRNDLLREVGRGMAGRFQPPLCNTIHQLQIELNALLAMINWGYVKLDLLAEEQAMRIVHEDLPQVGSAGEPAGTWLAPVLEGLYGRWITSQPGAFGDYVVTRDIDAEDLNSVPAQTVILYMRTRSAAT
【００３２】
本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記条件を満たすように、前記Ｃｅｓ系遺伝子を挿入することで作製できる。本発明のセルロース製造用ベクターにおいて、前記プロモーターは、例えば、前記基本ベクターが有するプロモーターでもよいし、別途、前記基本ベクターに挿入したプロモーターでもよい。前者の場合、例えば、前記基本ベクターに対して、プロモーターの下流側に、前記上流配列および前記Ｃｅｓ系遺伝子を挿入してもよい。
【００３３】
前記プロモーターは、例えば、本発明のセルロース製造用ベクターを導入する宿主内で機能すればよく、その組合せは特に制限されない。前記プロモーターは、例えば、Ｔ５プロモーター（ＰＴ５）、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＴＤＨ３ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＧＡＬ１ｐ＝ＧＡＬ１０ｐ、ＡＤＨ２ｐ、ＰＨＯ５ｐ、ＣＵＰ１ｐ、ＭＦα１ｐ等があげられる。また、高発現プロモーターは、ＴＤＨ３ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＰＧＩ１ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＡＤＨ１ｐ等があげられる。
【００３４】
前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等があげられる。前記大腸菌由来のプラスミドは、例えば、ｐＱＥ系（ｐＱＥ−８０Ｌ、ｐＱＥ−６０およびｐＱＥ−３０Ｌ等）、ｐＥＸ系、ｐＢＲ系（ｐＢＲ３２２等）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９等）、ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ、ｐＦＬＡＧ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴベクターおよびｐＣｏｌｄベクター等があげられる。前記酵母由来のプラスミドは、例えば、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）等があげられる。前記ＹＥｐ型ベクターは、例えば、ＹＥｐ２４(J．  R．  Broach  et  al．，  Experimental  Manipulation  of  Gene  Expression，  Academic  Press，  New  York，  83，  1983)、前記ＹＣｐ型ベクターは、例えば、ＹＣｐ５０(M．  D．  Rose  et  al．，  Gene，  60，  237，  1987)、前記ＹＩｐ型ベクターは、例えば、ＹＩｐ５(K．  Struhl  et  al．，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA，  76，  1035，  1979)、等が報告されている。この他にも、例えば、ｐＹＥ２２ｍ（Biosci．  Biotech．  Biochem．，  59，  1221−1228，  1995）、ＹＩｐ１(X70480）等があげられる。前記基本ベクターは、中でも、前記大腸菌由来のプラスミドが好ましく、より好ましくは前記ｐＱＥ系プラスミドであり、さらに好ましくはｐＱＥ−８０Ｌである。
【００３５】
本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、前記Ｃｅｓ系遺伝子の発現を調節する調節配列を有してもよい。前記調節配列は、本発明のセルロース製造用ベクターを導入する宿主内で機能すればよく、例えば、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を他の調節配列に置き換えてもよい。本発明のセルロース製造用ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されず、前記Ｃｅｓ系遺伝子の発現を機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて行うことができる。
【００３６】
本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性等の耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。前記栄養要求性マーカーは、例えば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子等があげられる。前記薬剤耐性マーカーは、例えば、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネティシン耐性等のマーカーがあげられる。この他にも、例えば、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin  et  al．，  Proc．  Natl．  Acad．  Sci．  USA，  81，  337  1984）、セルレニン耐性遺伝子として、ｆａｓ２ｍ遺伝子（猪腰淳嗣ら，  生化学，  64，  660，  1992）、ＰＤＲ４遺伝子（Hussain  et  al．，  gene，  101，  149，  1991）等が利用可能である。
【００３７】
（２）形質転換体
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記Ｃｅｓ系遺伝子が発現可能なように、本発明のセルロース製造用ベクターが導入されていればよく、その他の構成は、特に制限されない。
【００３８】
本発明の形質転換体は、前記本発明のセルロース製造用ベクターを、前記ｄｇｃ遺伝子と共に発現させることによって、簡便にセルロースを製造できる。そこで、本発明の形質転換体は、さらに、ｄｇｃ遺伝子を有することが好ましく、具体的には、さらに、前記ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを含むことが好ましい。前記ｄｇｃ遺伝子は、例えば、前記本発明のセルロース製造用ベクターが有してもよいが、前記本発明のセルロース製造用ベクターとは別個独立したベクターが有することが好ましい。前記ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを、以下、ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターともいう。
【００３９】
前記ｄｇｃ遺伝子は、cyclic−di−guanylmonophosphate（ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）合成酵素遺伝子として公知の遺伝子である。本発明において、前記ｄｇｃ遺伝子の由来となる生物は、特に制限されない。前記生物は、例えば、古細菌および真正細菌、これらのいずれかに属する好熱菌等があげられる。前記真正細菌は、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、コレラ菌等があげられる。前記好熱菌は、特に制限されず、例えば、パイロコッカス属、メタノパイラス属、サーモコッカス属、サーモトーガ属、パイロロバス属、ブルカニサエタ属、ハロアキューラ属、メタノセラ属、またはサーマス属等があげられ、好ましくは、前記サーモトーガ属である。前記サーモトーガ属に属する好熱菌は、特に制限されず、例えば、サーモトーガ・マリティマ等があげられる。
【００４０】
具体例として、前記ｄｇｃ遺伝子の塩基配列およびこれらがコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１０〜１５に示す。本発明において、前記ｄｇｃ遺伝子は、この配列に限定されない。以下に示すＳｏＤＧＣは、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ合成酵素であり、ｔＤＧＣは、サーモトーガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のｃ−ｄｉ−ＧＭＰ合成酵素であり、ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａは、Ｎ末の１−８１番目のアミノ酸を欠損し、Ｒ１５８Ａの点変異を持ったｔＤＧＣである。
【００４１】
ＳｏＤＧＣ遺伝子（配列番号１０）
atgtcacgagatttattacaaaccgctgccttgaatcttaaaaaagcggttcccttaatgctcaaacatcagatccccacgactcccattaattatgccctttggtatacctatgtgggtgaacaaaatctggcattaaatgcacagctcgataccgttatcgcacattacaatacttgcccacccgtgagcagtgagctgttgtatcgccaatatgtggccgatcccgttgaacttaatgtgcgcgatatgcgcctcaatctcgaggcgatggccacagagttatcgcaatcgattaaggacactagccttgatacaaccgagtttcaaacctgtatcaatagcaatttttccaaacttaatggcatagaagaaggtgctctcagtgtcgagcaagtgctagatttagttcgcaatttagtgaaggagtctgacaatattcgttcgagcactgagtttttgaccacacagttgcaaaaagcccagacagagatcgatgcgctaaaacaaaagctcgaaaaaacagaaaaagatgtgctttatgatgcccttacaggctgtttaaaccgccgcgcctttgatgcagatatcgctggcatgatagcgcaggctccggaagggacctgcctaatcttagtcgatatcgatcattttaaagcctttaatgataactatggccaccaactgggcgatcaagtcctaaaggctgtggccaaacgcctacaggaagcatgccgagatggcagcaaactatatcgttttggcggtgaagaatttgcgattatcgtgcccaagagccaactgcggatcacaaggcaattggctgaggctatgcgccgcgggcttgaaaaactgtgcctaaaagaccgacgtaaagaccaacttgttgataatattaccgcttcttttggtgttgcccaatggcaagaaaggcaatctgttgtgcagctgatagagaaaacagataagctgctttacgaagctaaacgcctaggccgtaatcgggttatgccgataaacaactaa
ＳｏＤＧＣタンパク質（配列番号１１）
MSRDLLQTAALNLKKAVPLMLKHQIPTTPINYALWYTYVGEQNLALNAQLDTVIAHYNTCPPVSSELLYRQYVADPVELNVRDMRLNLEAMATELSQSIKDTSLDTTEFQTCINSNFSKLNGIEEGALSVEQVLDLVRNLVKESDNIRSSTEFLTTQLQKAQTEIDALKQKLEKTEKDVLYDALTGCLNRRAFDADIAGMIAQAPEGTCLILVDIDHFKAFNDNYGHQLGDQVLKAVAKRLQEACRDGSKLYRFGGEEFAIIVPKSQLRITRQLAEAMRRGLEKLCLKDRRKDQLVDNITASFGVAQWQERQSVVQLIEKTDKLLYEAKRLGRNRVMPINN
【００４２】
ｔＤＧＣ遺伝子（配列番号１２）
gtgaaagtttccgggggggaagttcctccctttttcaaggaggggtttttctttacttcagaggaactgactcatcttatcaatgtatgtagtagcacatctgcaattatctcagtattgaaagacagtaagtatagaaggtctttggtcttatatctaaaaaggcctttgagcaaagatgctcttcttttgattcagactctgctaactacccttgaaagggaagatctttcgtttggtgtaaaagaactggaatacatggcctatcacgatccactgacagggcttccaaacaggcgttatttctttgaactgggaaacagatatctggacttagcaaagcgcgagggaaaaaaggtattcgttcttttcgtagatcttgctgggtttaaggcgataaatgacacatacggccatctgtcaggtgatgaggtattgaagacagtttcaaaaaggattctggacagggttagaagaagcgatgtggtggctcgatacggcggtgatgagtttaccattctcctctacgatatgaaagaagagtatctgaaatccctcctggaaaggattctttccaccttcagagaacccgtcagagtggaaaataaacacttatctgtcacaccgaacataggagttgccagattccctgaagatggggaaaatcttgaagaacttctgaaagtagcggatatgaggatgtacaaagcaaaggaaatgaaagtgccttatttcagtctctcataa
ｔＤＧＣタンパク質（配列番号１３）
MKVSGGEVPPFFKEGFFFTSEELTHLINVCSSTSAIISVLKDSKYRRSLVLYLKRPLSKDALLLIQTLLTTLEREDLSFGVKELEYMAYHDPLTGLPNRRYFFELGNRYLDLAKREGKKVFVLFVDLAGFKAINDTYGHLSGDEVLKTVSKRILDRVRRSDVVARYGGDEFTILLYDMKEEYLKSLLERILSTFREPVRVENKHLSVTPNIGVARFPEDGENLEELLKVADMRMYKAKEMKVPYFSLS
【００４３】
ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａ−遺伝子（配列番号１４）
aaagaactggaatacatggcctatcacgatccactgacagggcttccaaacaggcgttatttctttgaactgggaaacagatatctggacttagcaaagcgcgagggaaaaaaggtattcgttcttttcgtagatcttgctgggtttaaggcgataaatgacacatacggccatctgtcaggtgatgaggtattgaagacagtttcaaaaaggattctggacagggttgcaagaagcgatgtggtggctcgatacggcggtgatgagtttaccattctcctctacgatatgaaagaagagtatctgaaatccctcctggaaaggattctttccaccttcagagaacccgtcagagtggaaaataaacacttatctgtcacaccgaacataggagttgccagattccctgaagatggggaaaatcttgaagaacttctgaaagtagcggatatgaggatgtacaaagcaaaggaaatgaaagtgccttatttcagtctctcataa
ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａ−タンパク質（配列番号１５）
KELEYMAYHDPLTGLPNRRYFFELGNRYLDLAKREGKKVFVLFVDLAGFKAINDTYGHLSGDEVLKTVSKRILDRVARSDVVARYGGDEFTILLYDMKEEYLKSLLERILSTFREPVRVENKHLSVTPNIGVARFPEDGENLEELLKVADMRMYKAKEMKVPYFSLS
【００４４】
本発明の形質転換体は、例えば、宿主に、本発明のセルロース製造用ベクターを導入することによって得られる。また、本発明の形質転換体は、例えば、さらに、前記ｄｇｃ遺伝子、具体的には、前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターを導入することによって得られる。前記本発明のセルロース製造用ベクターと前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターの導入の順序は、特に制限されず、いずれが先でもよいし、同時であってもよい。
【００４５】
前記宿主は、特に制限されず、適宜選択できる。前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはこれらの培養細胞等があげられる。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等があげられる。前記宿主は、好ましくは大腸菌である。
【００４６】
本発明において、前記宿主にベクターまたは遺伝子を導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
【００４７】
前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
【００４８】
本発明において、前記ベクターが前記宿主に導入されたか否かを確認する方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。公知の方法としては、例えば、前記ベクターが有する前記各選択マーカーを利用する方法、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等があげられる。
【００４９】
（３）セルロースの製造方法
本発明のセルロースの製造方法は、前述のように、本発明のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を、培養する工程を含むことを特徴とする。本発明は、本発明の形質転換体を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明によれば、例えば、特別な基質を使用することなく、簡便にセルロースを合成することができる。
【００５０】
本発明において、製造する前記セルロースは、特に制限されず、例えば、セルロースＩ、セルロースIIおよびセルロースIII等があげられ、好ましくはセルロースIIである。
【００５１】
本発明において、前記形質転換体は、前述した本発明の形質転換体が使用でき、具体的には、前記本発明のセルロース製造用ベクターと前記ｄｇｃ遺伝子とを有する形質転換体があげられる。前記形質転換体において、前記ｄｇｃ遺伝子は、前述のように、前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターとして導入されてもよい。
【００５２】
前記培養工程において、前記培地の種類は、特に制限されず、前記形質転換体の宿主等に応じて、適宜選択できる。前記宿主が大腸菌の場合、例えば、ＬＢ、２ｘＹＴ、ＴＢ等の培地があげられる。また、本発明の形質転換体は、例えば、グルコース等の基質を、外来基質として添加しない条件においてもセルロースを合成できる。
【００５３】
また、前記培養工程において、前記培地の原料として、バイオマスを使用することもできる。
【００５４】
前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、前記宿主に応じて、適宜選択できる。前記宿主が大腸菌の場合、例えば、大腸菌培養時の公知の条件が採用できる。培養温度は、例えば、４〜４０℃であり、好ましくは４〜３０℃である。培養時間は、特に制限されず、例えば、２〜２４時間であり、好ましくは５〜１２時間である。
【００５５】
本発明のセルロースの製造方法は、さらに、前記培養工程により得られた培養物からセルロースを抽出する抽出工程を含んでもよい。前記抽出工程は、例えば、固体画分と液体画分との分離工程、前記固体画分または前記液体画分からのセルロースの精製工程等を含んでもよい。前記本発明の形質転換体の培養により合成されるセルロースが、例えば、不溶性の場合、前記精製工程において、前記固体画分を用いてセルロースを精製することが好ましく、水溶性の場合、前記精製工程において、前記液体画分を用いてセルロースを精製することが好ましい。また、合成されたセルロースは、例えば、菌体外に放出されるが、菌体内に保持されたセルロースは、前記固体画分に含まれる培養後の前記形質転換体を破壊して、回収および精製してもよい。
【００５６】
前記分離工程は、例えば、遠心分離、ろ過等により行うことができる。前記精製工程は、例えば、前記分離工程において回収した固体画分を、酸処理する工程があげられる。また、前記精製工程は、例えば、前記酸処理後の個体画分を、さらにアルカリ処理する工程を含んでもよい。
【００５７】
また、例えば、本発明は、前記セルロース製造用ベクターの利用により、例えば、著しく疎水性の高いセルロース等、従来とは全く異なる性質を持つセルロースの生産を可能とするプラットフォームとして、利用することも期待できる。
【００５８】
（４）セルロース
本発明のセルロースは、前述のように、本発明のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする。本発明のセルロースは、本発明のセルロースの製造方法により得られることが特徴であり、その他の構成は、特に制限されない。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。【００６０】
［実施例１］
（１）ＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子のサブクローニング
理研ＢＲＣより、グルコンアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）  ＪＣＭ９７３０株を入手した。前記株は、そのセルロース合成酵素遺伝子群の配列が同定されているＢＰＲ２００１株に相当する（Nakai  T．；  Moriya  A．；  Tonouchi  N．；  Tsuchida  T．；  Yoshinaga  F．；  Horinouchi  S．；  Sone  Y．；  Mori  H．；  Sakai  F．；  Hayashi  T．，  "Control  of  expression  by  the  cellulose  synthase  (bcsA)  promoter  region  from  Acetobacter  xylinum  BPR  2001"  Gene  213，  93−100  (1998)）。【００６１】
前記株をＳＨ培地（Schramm  M．；  Hestrin  S．，  "Factors  affecting  production  of  cellulose  at  the  air/liquid  interface  of  a  culture  of  Acetobacter  xylinum"  J．  Gen．  Microbiol．  11，  123−129  (1954)）で培養し、得られた菌体より、市販キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ社製）を使ってゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、キットを用いたＰＣＲにより、目的遺伝子を増幅した。前記キットは、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラ）またはＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ（タカラ）を使用した。そして、得られた増幅産物を、ＴＡ−ライゲーションによりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。前記キットとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬを使用した場合、Ｔａｑ（タカラ）によるＡ−ｔａｉｌｉｎｇ後に、ＴＡ−ライゲーションを行った。【００６２】
前記ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
＃ａ１（配列番号１７）
5'-ATATAAGGACGAGCTATTGATGTCAGAGGTTCAGTCGCCAGTACCC-3'
＃ａ２（配列番号１８）
5'-ATAGGATCCCGAGGCCGCACGGCTGATCTTTCC-3'
＃ａ３（配列番号１９）
5'-ATGAGCTCATGTCAGAGGTTCAGTCG-3'
＃ａ４（配列番号２０）
5'-GGATCCCAGGGCGATCTTGCGGTCAGC-3'
＃ａ５（配列番号２１）
5'-GCTAGCCACCATGTCAGAGGTTCAGTCG-3'
＃ａ６（配列番号２２）
5'-GGTACCTCATCACGAGGCCGCACGGCTGATCTT-3'
＃ａ７（配列番号２３）
5'-ACCGGTTGAGCGCAGGGAGCC-3'
＃ａ８（配列番号２４）
5'-CATATGGAACGTGCTCGGGCC-3'
＃ａ９（配列番号２５）
5'-GCCACCATGGCAATGGTGTCCCTGATCG-3'
＃ａ１０（配列番号２６）
5'-CATATGGAACGTGCTCGG-3'
＃ａ１１（配列番号２７）
5'-CTCGAGGCCTATCCGCTGCGT-3'
＃ａ１２（配列番号２８）
5'-AGATCTCGTTCTCTGCCTTTCTTCCTG-3'
＃ａ１３（配列番号２９）
5'-GGTACCTCACGTTCTCTGCCTTTCTTC-3'
＃ａ１４（配列番号３０）
5'-ATGGATCCCTTGCGCGCTGAATCCGATG-3'
＃ａ１５（配列番号３１）
5'-GCCACCATGGCAAGGCGATACGCCCTTTC-3'
＃ａ１６（配列番号３２）
5'-GGTGCGCGTCGAGGCGATAC-3'
＃ａ１７（配列番号３３）
5'-CATATGGGTTACCAGCAGCTCAACG-3'
＃ａ１８（配列番号３４）
5'-AAGGATCCCGTGCCATAACGCGGCACATC-3'
＃ａ１９（配列番号３５）
5'-AAGGATCCCAGGCCGACCCGGAGGCGAC-3'
＃ａ２０（配列番号３６）
5'-GGATCCCTGGTCCATAATAAGATAG-3'
＃ａ２１（配列番号３７）
5'-ATGAGCTCCCGGTCGCGGCGCTGCGGGTG-3'
＃ａ２２（配列番号３８）
5'-ATAACCATGGCAACTTTGAACGCAAAAC-3'
＃ａ２３（配列番号３９）
5'-ATAAGCTTCAGGTCGCGGCGCTGCGGGTG-3'
＃ａ２４（配列番号４０）
5'-AAGCTTAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGGCGCTGCG-3'
＃ａ２５（配列番号４１）
5'-ATAAAAGCTTACTGGTCCATAATAAGATAG-3'【００６３】
ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したサブクローニングベクターとの関係を、下記表１に示す。ベクター＃ａ１３は、ベクター＃ａ１０およびベクター＃ａ１２由来の断片を、ベクター＃ａ８にライゲーションすることによって作製した。また、図１に、各ベクターに導入したグルコンアセトバクター・キシリナスＪＣＭ９７３０由来のＣｅｓＡＢＣＤ遺伝子の領域を示す。【００６４】
【表１】
2014104310.tif 000003
【００６５】
目的遺伝子のＤＮＡ配列を確認し、上記のサブクローニングベクターから、制限酵素処理により前記ＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーション反応で発現ベクターへ挿入した。ついで、制限処理後にアガロースゲル電気泳動を行い、ゲルをＭｕｐｉｄ  Ｂｌｕｅ（アドバンス）で染色し、目的の大きさのバンドを切りだし、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることで、目的遺伝子のＤＮＡ断片を単離した。得られたＤＮＡ断片のライゲーション反応は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（タカラ）あるいはＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＬＯＮＧ（タカラ）を用いて行った。【００６６】
（２）Ｃｅｓ発現系の構築
（２−１）ＣｅｓＡ発現系の構築
ｐＱＥ−８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ）をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで処理し、これに、ベクター＃ａ２のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）と、ベクター＃ａ３のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片（約１７００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）が導入され、Ｎ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６タグ）の付いたＣｅｓＡを発現するＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃２０を作製した。【００６７】
（２−２）ＣｅｓＢ発現系の構築
ｐＱＥ−６０をＮｃｏＩおよびＢｇｌIIで処理し、これに、ベクター＃ａ５のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片（約１３５０ｂｐ）と、ベクター＃ａ６のＸｈｏＩ−ＢｇｌII断片（約１０５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）が導入され、Ｃ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＢを発現するＣｅｓＢ発現系ＥＶ＃３２を作製した。【００６８】
（２−３）ＣｅｓＣ発現系の構築
ｐＱＥ−６０をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、これに、ベクター＃ａ９のＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ断片（約５００ｂｐ）と、ベクター＃ａ１０のＫｐｎＩ−ＡｇｅＩ断片（約２２００ｂｐ）と、ベクター＃１１のＡｇｅＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１３５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）が導入され、ＣｅｓＣを発現するＣｅｓＣ発現系ＥＶ＃５９を作製した。【００６９】
（２−４）ＣｅｓＡＢ発現系の構築
ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系の構築の手順を、図２に示す。ＥＶ＃２０をＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで処理し、これに、ベクター＃ａ４のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ断片（約１４００ｂｐ）と、ベクター＃ａ７のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片（約１０５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃２１を作製した。【００７０】
ＥＶ＃２１をＥｃｏＲＩで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）をアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理し、これに、ベクター＃ａ１のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を作製した。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とが導入され、ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を作製した。なお、断片の挿入方向の確認は、ＰＣＲにより行った。【００７１】
ＥＶ＃５１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ＥＶ＃３２のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片（約５００ｂｐ）をライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とが導入され、ＣｅｓＡおよびＣ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３を作製した。【００７２】
ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３において、ＣｅｓＡ遺伝子は、ＣｅｓＢ遺伝子の上流側に位置し、ｐＱＥ−８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列を以下に示す。下記配列において、５’側の下線部が前記プロモーターの領域であり、下線を付していない領域が、ＥｃｏＲＩサイトおよびサブクローニングベクター＃ａ１より持ち込まれたｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ由来の配列であり、四角で囲んだ領域が、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子の開始コドン上流の上流配列（１３塩基長）であり、３’側の下線部がＣｅｓＡ遺伝子の開始コドンである。【００７３】
【表２】
2014104310.tif 000004
【００７４】
（２−５）ＣｅｓＡＢＣ発現系の構築
ベクター＃ａ８をＸｍａＩおよびＳｐｅＩで処理し、これに、ベクター＃ａ１０のＸｍａＩ−ＡｇｅＩ断片（約１６００ｂｐ）と、ベクター＃１２のＡｇｅＩ−ＳｐｅＩ断片（約１８００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ベクター＃ａ１３を作製した。ベクター＃ａ１３は、ＣｅｓＢの３’側領域から、ＣｅｓＣ全長およびＣｅｓＤの３’末端までを含む。ついで、ＥＶ＃５３をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ベクター＃ａ１３のＢａｍＨＩ−ＳａｃII断片（約２１５０ｂｐ）と、ＥＶ＃５９のＳａｃII−ＨｉｎｄIII断片（約２３００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢおよびＣ末端にＨｉｓタグを付けたＣｅｓＣを発現するＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３を作製した。【００７５】
また、ベクターａ＃１３のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＩ断片に代えて、ベクターａ＃１３のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（約２７００ｂｐ）、ＥＶ＃５９のＳａｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に代えてベクターａ＃１６のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１７００ｂｐ）を使用した以外は、同様にして、ライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とが導入され、Ｈｉｓタグが付されないＣｅｓＡ、ＣｅｓＢおよびＣｅｓＣを発現するＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃１００を作製した。【００７６】
ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３において、上流側からＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子およびＣｅｓＣ遺伝子が配置され、ｐＱＥ−８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列は、前記ＥＶ＃５３と同様である。【００７７】
（２−６）ＣｅｓＡＢＣＤ発現系の構築
ＥＶ＃５３をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ベクター＃ａ１３のＢａｍＨＩ−ＳａｃII断片（約２４００ｂｐ）と、ベクター＃ａ１３のＳａｃII−ＥａｇＩ断片（約２１５０ｂｐ）と、ベクター＃ａ１４のＥａｇＩ−ＨｉｎｄIII断片（約４００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢ、ＣｅｓＣおよびＣｅｓＤを発現するＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃７９を作製した。【００７８】
また、前記ベクター＃ａ１４に代えて、ベクター＃ａ１５を使用した以外は、同様にして、ライゲーションを行った。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢ、ＣｅｓＣおよびＣ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＤを発現するＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃８０を作製した。【００７９】
ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３および＃８０において、上流側からＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子が配置され、ｐＱＥ−８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列は、前記ＥＶ＃５３と同様である。【００８０】
（３）ｄｇｃ遺伝子のクローニング
ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ，  Ｊａｐａｎ）よりサーモトーガ・マリティマ（Thermotoga maritime）  ＭＳＢ８（ＮＢＲＣ  １００８２６）を入手した。前記菌体の水懸濁液をテンプレートとして、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＰＣＲにより、ＤＧＣ（Ｄｉｇｕａｎｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ）をコードするｄｇｃ遺伝子を増幅した。前記ｄｇｃ遺伝子は、アクセッション番号ＴＭ１７８８（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８９７７４２）（Rao  F．；  Pasunooti  S．；  Ng  Y．；  Zhuo  W．；  Lim  L．；  Liu  A．W．；  Liang  Z．−．，  "Enzymatic  synthesis  of  c−di−GMP  using  a  thermophilic  diguanylate  cyclase"  Anal．  Biochem．  389，  138−142  (2009)）に登録されている。そして、得られた増幅産物を、ＴＡ−ｌｉｇａｔｉｏｎによりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターに挿入し、ベクター＃ｂ１を作製した。さらに、ベクター＃ｂ１をテンプレートとして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルによるＰＣＲ（タカラ，  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬを使用）により、点変異Ｒ１５８Ａを導入し、ｄｇｃ遺伝子（配列番号１４）を導入したベクター＃ｂ２を作製した。【００８１】
前記ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
＃ｂ１（配列番号４３）
5'-GCTAGCAAAGAACTGGAATACATGG-3'
＃ｂ２（配列番号４４）
5'-GAATTCTTATGAGAGACTGAAATAAGGC-3'
＃ｂ３（配列番号４５）
5'-CTGGACAGGGTTGCAAGAAGCGATGTGG-3'
＃ｂ４（配列番号４６）
5'-CCACATCGCTTCTTGCAACCCTGTCCAG-3'【００８２】
ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したベクターとの関係を、下記表３に示す。
【表３】
2014104310.tif 000005
【００８３】
（４）ｄｇｃ発現系の構築
ＤＧＣを発現するｄｇｃ発現系の構築の手順を、図３に示す。ベクター＃ｂ２をテンプレートとし、下記プライマーと前記プライマー＃ｂ２とを使用して、ＰＣＲ（タカラ，  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬを使用）を行った。得られた増幅産物を、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローニング反応で挿入し、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ｔＤＧＣを作製した。
プライマー（配列番号４７）
5’-CACCAAAGAACTGGAATACATGG-3’【００８４】
前記ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ＴＯＰＯに、以下に示す２つのオリゴヌクレオチドをＴＯＰＯ反応で挿入し、ｐＢＡＤ２０２／Ｒを得た。そして、ＢＢＲＰ（ＮＩＧ，  Ｊａｐａｎ）より分譲されたｐＢＡＤ３３を、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片に、ｐＢＡＤ２０２／ＲのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄIII断片（約６００ｂｐ）を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１を用いてライゲーションした。これによって、ｐＢＡＤ３３／２０２Ｒを作製した。
オリゴヌクレオチド
5’-CACCGAATTCGTCGACGGTACCGCTAGC-3’（配列番号４８）
5’-GCTAGCGGTACCGTCGACGAATTC-3’（配列番号４９）【００８５】
前記ｐＢＡＤ３３／２０２ＲをＭｌｕＩおよびＳａｃＩで処理し、得られたベクター断片に、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ−ｔＤＧＣのＭｌｕＩ−ＳａｃＩ断片（約１１００ｂｐ）を、タカラ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１を用いてライゲーションした。これによって、ｄｇｃ遺伝子（配列番号１４）が導入され、ＤＧＣを発現するｐＢＡＤ３３／２０２−ｔＤＧＣを作製した。【００８６】
（５）セルロース合成
得られたＣｅｓ発現系ベクター（ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３、ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３またはＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃８０）と、ｄｇｃ発現系ベクター（ｐＢＡＤ３３／２０２−ｔＤＧＣ）とを、ルビジウム法によって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に導入して、前記両発現系ベクターを共発現する形質転換体を製造した。【００８７】
そして、各形質転換体を、０．２％  Ｌ−アラビノースおよび０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む２×ＹＴ培地（ｐＨ７）培地を、温度２８℃の条件下、５時間培養した。【００８８】
得られた培養液について、以下のような処理を施し、サンプルを調製し、後述するセルロース分析を行った。まず、前記培養液を、７，５００ｇの条件で遠心分離にかけ、菌体を含む沈殿を回収した。前記沈殿を水に懸濁させた後、この懸濁液に対して、体積比が酢酸８：硝酸１の混合液を、４倍体積量加え、１００℃で３０分処理した。この処理液を遠心分離にかけ、沈殿を回収し、遠心後の上清が中性になるまで、前記沈殿の洗浄を行った。【００８９】
セルロース分析は、前記サンプルについて、透過型電子顕微鏡（正式名称  ＪＥＭ−２０００ＥＸＩＩ）を用いた２％酢酸ウランによる負染色観察および電子回折像撮影、およびＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いた赤外スペクトルの測定により行った。前記赤外スペクトルの測定は、I型のセルロースおよびII型のセルロースの標準品と共に解析を行った。これらの結果から代表して、Ｃｅｓ発現系ベクターとしてＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３を導入した形質転換体から得られたサンプルの結果を、図４、図５および図６に示す。【００９０】
図４は、負染色観察の結果であり、（Ａ）が、低倍観察の結果であり、（Ｂ）が、高倍観察の結果である。（Ａ）において、スケールバーは１０μｍを示し、（Ｂ）において、スケールバーは、１００ｎｍを示す。また、図５は、電子回折パターンの写真であり、図６は、赤外スペクトルであり、Ｎａｔｉｖｅ  ＢＣはセルロースＩ型の標準サンプル、Ｍｅｒｃｅｒｉｚｅｄ  ＢＣはセルロースII型の標準サンプル、ＥＣ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄは実施例のサンプルの結果を示す。図４において、大きさが１０〜２０ｎｍの凝集体が確認された。また、図５において、セルロースII結晶に特徴的な１１０と０２０の回折リングが確認された。さらに、図６に示すように、前記サンプル（ＥＣ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）は、II型のセルロース（Ｍｅｒｃｅｒｉｚｅｄ  ＢＣ）と同じパターンが確認された。これらの結果から、前記サンプルにII型のセルロースが含まれること、すなわち、前記形質転換体の培養によってII型のセルロースが生合成されたことが確認された。なお、その他のＣｅｓ発現系ベクターを導入した形質転換体から得られたサンプルについても、同様の結果であった。また、Ｃｅｓ系遺伝子を挿入した発現ベクターが、本発明の条件を満たさない場合、タンパク質の発現がほとんど確認できなかったことから、セルロース合成は行えないこともわかった。【００９１】
［実施例２］
本実施例では、前記ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体が、セルロースを発現していることを確認した。【００９２】
前記実施例１と同様にして、Ｃｅｓ発現系ベクター（ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１）と、前記ｄｇｃ発現系ベクター（ｐＢＡＤ３３／２０２−ｔＤＧＣ）とを導入した形質転換体を製造した。【００９３】
前記形質転換体を、２×ＹＴ培地（ｐＨ７）培地を用いて、温度２８℃の条件下で培養した。つぎに、０．２％  Ｌ−アラビノースおよび０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＰＴＧとなるようＬ−アラビノースおよびＩＰＴＧを添加し、さらに、温度２８℃の条件下で６−７時間培養した。前記培養後、５０００ｇで菌体を含む沈殿を回収した。そして、前記菌体を含む沈殿に、体積比が酢酸８：硝酸１の混合液を加え、１００℃で３０分処理した。この処理液を遠心分離にかけ、セルロースの沈殿を回収し、遠心後の上清が中性になるまで、前記セルロースの沈殿の洗浄を行った。前記洗浄後、前記セルロースの沈殿を凍結乾燥し、セルロースの有無を目視で確認した。【００９４】
また、コントロール１は、前記ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１に代えて、前記ＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃９８を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記ｄｇｃ発現系ベクターのみを用いた以外は同様にして、セルロースの有無を目視で確認した。なお、前記ＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃９８は、ＥＶ＃２０をＥｃｏＲＩで処理し、これに、ベクターａ＃０１のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をライゲーションし、作製した。【００９５】
ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体由来のサンプルでは、セルロースが確認できたのに対し、コントロール１およびコントロール２では、セルロースが確認できなかった。これらの結果から、セルロースの合成には、ＣｅｓＡＢ発現系がセルロースの合成に重要であることがわかった。【００９６】
［実施例３］
本実施例では、前記ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体の培養液をセルラーゼ処理し、セルロースが合成されていることを確認した。【００９７】
前記実施例１と同様にして、形質転換体の培養液を製造した。つぎに、前記培養液をサンプルとして、カーボン膜を張ったニッケルグリッドにマウントした。前記マウント後のニッケルグリッドをＴＢＳ（Tris  buffered  Saline）および水で洗浄し、５分間乾燥させた。さらに、０．５％セルラーゼ（商品名：Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社）を含む緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ５．６）に、前記ニッケルグリッドを浮かべ、４５−５０℃で１時間処理した。そして、前記処理後のニッケルグリッドを水で洗浄し、前記実施例１と同様にして、２％酢酸ウランによる負染色観察を行った。また、同じサンプルについて、前記セルラーゼを含む緩衝液に代えて、セルラーゼを含まない前記緩衝液を用いた以外は、同様にして負染色観察を行った。【００９８】
これらの結果を図７に示す。図７は、負染色観察の結果である。図７において、上段は、セルラーゼ未処理のサンプルの結果であり、下段は、セルラーゼ処理したサンプルの結果であり、左段は、低倍観察の結果であり、右段が、高倍観察の結果である。左段の写真において、スケールバーは、２０００ｎｍを示し、右段の写真において、スケールバーは、２００ｎｍを示す。図７において、上段の写真に示すように、セルラーゼ未処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察され、他方、下段の写真に示すように、セルラーゼ処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察されなかった。これらの結果から、前記形質転換体の培養によって、セルロースが合成されていることがわかった。【００９９】
［実施例４］
本実施例では、上流配列の塩基長およびスペーサー配列の塩基長が異なるＣｅｓＡＢ発現系を作製し、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の発現に上流配列が必要であることを確認した。【０１００】
（１）Ｃｅｓ発現系の構築
本実施例で用いたＣｅｓ発現系を図８に示す。図８に示すように、コントロール発現系ＥＶ＃４３は、上流配列を有さない比較例の発現ベクターであり、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９−ＥＶ＃５２は、上流配列を有する実施例の発現ベクターである。コントロール発現系ＥＶ＃４３およびＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９−ＥＶ＃５２の上流配列の長さは、それぞれ、０、２１、２４、１３、７０塩基長であり、スペーサー配列の長さは、それぞれ、２７、６、６、１６、１６塩基長であり、プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子（開始コドン）との間の長さは、それぞれ、２７、２７、３０、２９および８６塩基長である。本実施例では、コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０およびＥＶ＃５２を作製した。また、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１は、実施例１のＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を用いた。【０１０１】
前記プライマー＃ａ４および下記のプライマー＃ａ２６−２９を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙにライゲーションし、ベクター＃ａ１７−＃ａ２０を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
＃ａ２６（配列番号５０）
5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTACATATGTCAGAGGTTCAGTCGCCAGTA-3'
＃ａ２７（配列番号５１）
5'-GAATTCTTATTATCGGACGAGCTATTGATG-3'
＃ａ２８（配列番号５２）
5'-GAATTCTATTTATTATCGGACGAGCTATTGATG-3'
＃ａ２９（配列番号５３）
5'-ATGCGTCTGACGGTTTTCTTTTGAATATAT-3'【０１０２】
また、ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したサブクローニングベクターとの関係を、下記表４に示す。【０１０３】
【表４】
2014104310.tif 000006
【０１０４】
ベクター＃ａ１のＥｃｏＲＩ断片に代えて、ベクター＃ａ１７−＃ａ２０のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をそれぞれ用いた以外は、前記実施例１（２−４）と同様にして、コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、５０および５２を作製した。【０１０５】
コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、実施例１のＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２において、ＣｅｓＡ遺伝子は、ＣｅｓＢ遺伝子の上流側に位置し、ｐＱＥ−８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、それぞれ２７、２７、３０、２９および８６塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列を以下に示す。下記配列において、５’側の下線部が前記プロモーターの領域であり、下線を付していない領域が、ｐＱＥ−８０Ｌベクター、ＥｃｏＲＩサイト、またはＥｃｏＲＩサイトおよびサブクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙより持ち込まれたｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ由来の配列であり、四角で囲んだ領域が、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子の開始コドン上流の上流配列（それぞれ、０、２１、２４、１３および７０塩基長）であり、３’側の下線部がＣｅｓＡ遺伝子の開始コドンである。【０１０６】
【表５】
2014104310.tif 000007
【０１０７】
（２）ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の発現の確認
Ｃｅｓ発現系ベクター（コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）をそれぞれ用いた以外は、前記実施例１（５）と同様にして、形質転換体を作製した。そして、各形質転換体を、２×ＹＴ培地培地を用いて、温度２８℃の条件下で培養した。さらに、０．５ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧを添加し、温度２８℃の条件下で５時間培養した。【０１０８】
培養した形質転換体を集菌し、ライシスバッファー（１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８），５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，０．０２％  ＮａＮ３，５０  μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）に懸濁し、さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、終濃度５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％グリセリン、０．５％  ＳＤＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを作製し、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。前記電気泳動後、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質は、それぞれ、参考文献１に記載のポリクローナル抗ＣｅｓＡ抗体およびポリクローナル抗ＣｅｓＢ抗体を用いて検出した。また、ネガティブコントロールは、ＩＰＴＧ添加前に各形質転換体を回収した以外は同様にして、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質を検出した。
参考文献１：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４６，２７６０−２７６８  （２０１１）【０１０９】
これらの結果を図９に示す。図９は、ウエスタンブロッティングの写真であり、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。また、図９において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、写真の上側は、形質転換に用いた発現ベクターおよびサンプルの種類を示す。【０１１０】
図９に示すように、ネガティブコントロール（発現誘導前）では、いずれも、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。そして、図９に示すように、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）では、８５ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。しかし、上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３は、１００ｋＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これは、後述するように、ＣｅｓＢタンパク質が、正しいフォールディングを形成できなかったことによる。なお、図示していないが、ネガティブコントロールでは、いずれも、ＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。また、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）および上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３では、いずれも７０ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、プロモーターと５’側遺伝子の開始コドンとの間に、５’側遺伝子の前記上流配列を有することで、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することがわかった。また、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することで、セルロースが合成されることから、セルロース合成には、前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であるといえる。【０１１１】
［実施例５］
本実施例では、ＣｅｓＢ発現系、コントロール発現系およびＣｅｓＡＢ発現系を用い、正常なＣｅｓＢタンパク質の発現には、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の共発現および前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であることを確認した。【０１１２】
Ｃｅｓ発現系ベクターとして、ＣｅｓＡＢ発現系＃５１のみを用い、０．２ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧを添加した以外は、前記実施例４（２）と同様にしてサンプル（−βＭＥサンプル）を調製した。また、前記サンプルに、１％となるようにβメルカプトエタノール添加し、ジスルフィド結合を還元した＋βＭＥサンプルを調製した。そして、前記実施例４（２）と同様にして、ＣｅｓＢタンパク質の発現を検出した。また、コントロール１は、形質転換体に代えて、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質を発現する酢酸菌を用い、コントロール２は、前記ＣｅｓＡＢ発現系＃５１に代えて、ＣｅｓＢ発現系＃３２を用い、コントロール３は、前記ＣｅｓＡＢ発現系＃５１に代えて、コントロール発現系ＥＶ＃４３を用い、それ以外は同様にして、−βＭＥサンプルおよび＋βＭＥサンプルを調製し、各サンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を検出した。【０１１３】
これらの結果を図１０に示す。図１０は、ウエスタンブロッティングの写真であり、（Ａ）は、−βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真であり、（Ｂ）は、＋βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、酢酸菌、ＣｅｓＢ発現系＃３２、コントロール発現系ＥＶ＃４３、ＣｅｓＡＢ発現系＃５１の結果を示す。【０１１４】
図１０（Ａ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の−βＭＥサンプルでは、１００ＫＤａ付近に正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の−βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。また、（Ｂ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の＋βＭＥサンプルでは、８５ＫＤａ付近にジスルフィド結合が還元されたＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の＋βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３で観察されたＣｅｓＢタンパク質は、ミスフォールディングしたＣｅｓＢタンパク質であることがわかった。また、以上の結果から、正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現には、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の共発現および前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であることがわかった。【０１１５】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０１１６】
この出願は、２０１２年１２月２８日に出願された日本出願特願２０１２−２８８３３５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
以上のように、本発明によれば、前記本発明のセルロース製造用ベクターを宿主に導入した形質転換体において、前記セルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現することによって、簡便にセルロースを製造できる。また、前記形質転換体の生合成によってセルロースを製造できるため、従来のように、パルプを原料として使用する必要がなく、天然原料の使用による環境への負荷も回避できる。したがって、本発明は、セルロースを原料とする様々な産業に有用な技術といえる。
【図１】
2014104310.tif 000008
【図６】
2014104310.tif 000009
【図８】
2014104310.tif 000010
【図２】
2014104310.tif 000011
【図３】
2014104310.tif 000012
【図４】
2014104310.tif 000013
【図５】
2014104310.tif 000014
【図７】
2014104310.tif 000015
【図９】
2014104310.tif 000016
【図１０】
2014104310.tif 000017
【配列表】
2014104310000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月13日(2014.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有し、
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーターおよびＢＡＤプロモーターの少なくとも一方であり、
前記上流配列の長さが、１３〜１００塩基長であることを特徴とする、セルロース製造用ベクター。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記上流配列が、前記５’側遺伝子の開始コドンに連結している、請求項１記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項４】
前記上流配列が、前記５’側遺伝子の由来生物において、前記５’遺伝子の開始コドンに連結する上流配列である、請求項１または３に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項５】
前記上流配列が、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはその部分配列を有する、請求項１、３および４のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項６】
前記上流配列が、配列番号１６の塩基配列（ＧＧＡＣＧＡＧＣＴＡＴＴ）を含む、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項７】
前記配列番号１６の塩基配列が、前記上流配列における３’領域の配列であり、その３’末端が、前記５’側遺伝子の開始コドンと連結している、請求項６記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターと前記開始コドンとの間の長さが、１３〜１００塩基長である、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項９】
前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子を、上流側から、この順序で有する、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１０】
さらに、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子の少なくとも一方を有する、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１１】
前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子が、酢酸菌由来である。請求項１および３〜１０のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１２】
前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター属である、請求項１１記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１３】
前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター・キシリナスである、請求項１２記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーターである、請求項１および３〜１３のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
【請求項１６】
形質転換体であって、
前記形質転換体が、請求項１、３〜１３および１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターを含み、
前記形質転換体が、大腸菌、バシラス・スブチリスまたは酵母であることを特徴とする、形質転換体。
【請求項１７】
さらに、ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを含む、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記ｄｇｃ遺伝子が、サーモトーガ・マリティマ由来である、請求項１６または１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】
前記形質転換体が、大腸菌である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項１、３〜１３および１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を培養する工程を含み、
前記形質転換体が、大腸菌、バシラス・スブチリスまたは酵母であることを特徴とする、セルロースの製造方法。
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
請求項２０記載のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする、セルロース。
【請求項２３】
形質転換体であって、
前記形質転換体が、セルロース製造用ベクターを含み、
前記セルロース製造用ベクターが、プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有し、
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーターであり、
前記上流配列の長さが、１３〜１００塩基長であり、
前記形質転換体が大腸菌であることを特徴とする、形質転換体。
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月15日(2015.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】実施例１において、ＣｅｓＡＢＣＤ遺伝子の発現系構成を示す概略図である。
【図２】実施例１において、ＣｅｓＡＢ発現系の構築の手順を示す図である。
【図３】実施例１において、ｄｇｃ発現系の構築の手順を示す図である。
【図４】実施例１において、サンプルの負染色観察の結果を示す写真である。
【図５】実施例１において、サンプルの電子回折の結果を示す写真である。
【図６】実施例１において、サンプルの赤外スペクトルを示すグラフである。
【図７】実施例４において、Ｃｅｓ発現系の上流配列およびスペーサー配列の長さを示す図である。
【図８】実施例４において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】実施例５において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
セルラーゼ未処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察され、他方、セルラーゼ処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察されなかった。これらの結果から、前記形質転換体の培養によって、セルロースが合成されていることがわかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
（１）Ｃｅｓ発現系の構築
本実施例で用いたＣｅｓ発現系を図７に示す。図７に示すように、コントロール発現系ＥＶ＃４３は、上流配列を有さない比較例の発現ベクターであり、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９−ＥＶ＃５２は、上流配列を有する実施例の発現ベクターである。コントロール発現系ＥＶ＃４３およびＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９−ＥＶ＃５２の上流配列の長さは、それぞれ、０、２１、２４、１３、７０塩基長であり、スペーサー配列の長さは、それぞれ、２７、６、６、１６、１６塩基長であり、プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子（開始コドン）との間の長さは、それぞれ、２７、２７、３０、２９および８６塩基長である。本実施例では、コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０およびＥＶ＃５２を作製した。また、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１は、実施例１のＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を用いた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
これらの結果を図８に示す。図８は、ウエスタンブロッティングの写真であり、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。また、図８において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、写真の上側は、形質転換に用いた発現ベクターおよびサンプルの種類を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
図８に示すように、ネガティブコントロール（発現誘導前）では、いずれも、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。そして、図８に示すように、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）では、８５ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。しかし、上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３は、１００ｋＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これは、後述するように、ＣｅｓＢタンパク質が、正しいフォールディングを形成できなかったことによる。なお、図示していないが、ネガティブコントロールでは、いずれも、ＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。また、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）および上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３では、いずれも７０ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、プロモーターと５’側遺伝子の開始コドンとの間に、５’側遺伝子の前記上流配列を有することで、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することがわかった。また、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することで、セルロースが合成されることから、セルロース合成には、前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であるといえる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
これらの結果を図９に示す。図９は、ウエスタンブロッティングの写真であり、（Ａ）は、−βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真であり、（Ｂ）は、＋βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。図９（Ａ）および（Ｂ）において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、酢酸菌、ＣｅｓＢ発現系＃３２、コントロール発現系ＥＶ＃４３、ＣｅｓＡＢ発現系＃５１の結果を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
図９（Ａ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の−βＭＥサンプルでは、１００ＫＤａ付近に正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の−βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。また、（Ｂ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の＋βＭＥサンプルでは、８５ＫＤａ付近にジスルフィド結合が還元されたＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の＋βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３で観察されたＣｅｓＢタンパク質は、ミスフォールディングしたＣｅｓＢタンパク質であることがわかった。また、以上の結果から、正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現には、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の共発現および前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であることがわかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014104310.tif 000018
【図６】
2014104310.tif 000019
【図７】
2014104310.tif 000020
【図２】
2014104310.tif 000021
【図３】
2014104310.tif 000022
【図４】
2014104310.tif 000023
【図５】
2014104310.tif 000024
【図８】
2014104310.tif 000025
【図９】
2014104310.tif 000026
【国際調査報告】
2014104310.tif 000027
2014104310.tif 000028
2014104310.tif 000029
2014104310.tif 000030