(57)【要約】カイコをはじめとする絹糸虫の後部絹糸腺において組換えペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に発現することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及びその遺伝子発現ユニット及びそれを導入した遺伝子組換え絹糸虫の提供を課題とする。  後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチド、及びその下流に連結されたフィブロインの構成成分として分泌されるタンパク質を含まない目的のペプチドをコードするＤＮＡを含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び
該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
を含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項２】
前記シグナルペプチドがセリシン１〜３のいずれか一のシグナルペプチドである、請求項１に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項３】
前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖又はｐ２５である、請求項１又は２に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項４】
（ａ）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、
（ｂ）該転写調節因子の標的プロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
を含む第２サブユニット
から構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項５】
前記シグナルペプチドがセリシン１〜３のいずれか一のシグナルペプチドである、請求項４に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項６】
前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がフィブロインＨ鎖、フィブロインＬ鎖又はｐ２５である、請求項４又は５に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
【請求項９】
前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、請求項８に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
【請求項１０】
前記第１サブユニットを有する系統と前記第２サブユニットを有する系統とを交配して得られる、請求項８又は９に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
【請求項１１】
絹糸虫がカイコ、エリサン又はサクサンである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入して、後部絹糸腺において目的のペプチドを発現する遺伝子組換え絹糸虫の作出方法。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコのような絹糸虫の後部絹糸腺において目的のペプチドを大量に発現することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニット及びそれを有する遺伝子組換え絹糸虫に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の絹糸腺は、大量のタンパク質を短期間に合成できる能力を有している。また、カイコの絹糸腺は大型器官であるため摘出が容易であり、また合成されたタンパク質は絹糸腺内腔に貯蔵されることから回収しやすいという利点もある。そのため、絹糸腺で目的のタンパク質を発現する遺伝子組換えカイコは、タンパク質の大量生産系として有望視されている。
カイコの絹糸腺は、形態学的には図１で示すような左右１対の器官であり、それぞれは、前部絹糸腺、中部絹糸腺、及び後部絹糸腺の３つの領域で構成されている。後部絹糸腺細胞内では、絹糸の繊維成分であるフィブロインを構成する３つの主要なタンパク質、フィブロインＨ鎖（以下、しばしば「Ｆｉｂ  Ｈ」と略称する）、フィブロインＬ鎖（以下、しばしば「Ｆｉｂ  Ｌ」と略称する）、及びｐ２５／ＦＨＸ（以下、「ｐ２５」とする）が発現している。また中部絹糸腺細胞内では絹糸の被覆成分であるゼラチン様タンパク質、セリシンが発現している（図１）。後部絹糸腺細胞内で発現した前記３つのタンパク質は、Ｆｉｂ  Ｈ：Ｆｉｂ  Ｌ：ｐ２５＝６：６：１の比率で複合体（ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｕｎｉｔ；本明細書では、以下「ＳＦＥＵ複合体」と称する。）を形成し、後部絹糸腺内腔中に分泌される。これに対して、セリシンは、発現後に中部絹糸腺内腔中に分泌される。後部絹糸腺内腔中に分泌されたフィブロインは、その後、中部絹糸腺内腔に移行し、セリシンで被覆されて絹糸として吐糸される（図１：非特許文献１）。したがって、カイコ絹糸腺をタンパク質発現系として利用する場合、中部絹糸腺又は後部絹糸腺で特異的に発現する遺伝子発現系を利用すればよい。
カイコ絹糸腺をタンパク質発現系として利用する場合、これまでに中部絹糸腺を用いた組換えタンパク質発現システムとしてＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（非特許文献２）、又はセリシン１プロモーター及びＨｒ３エンハンサーを組み合わせた系による大量発現方法（非特許文献３）が確立している。
一方、後部絹糸腺におけるタンパク質合成能力は、中部絹糸腺のそれの約３倍であることが知られている（非特許文献４）。それ故、生産面から判断すれば、中部絹糸腺よりも後部絹糸腺の方がタンパク質発現系としては、より好ましい。また、後部絹糸腺で生産された組換えタンパク質は、繭糸と共に分泌されるため絹繊維として利用するのにも適している（非特許文献５）。
ところで、これまでの研究からＦｉｂ  Ｈに異常があるカイコの変異系統（Ｎｄ系統）やＦｉｂ  Ｌに異常があるカイコの変異系統（Ｎｄ−ｓ系統及びＮｄ−ｓＤ系統）は、他のフィブロイン構成タンパク質が正常に発現しているにもかかわらず、ほとんど吐糸できないことが知られている（非特許文献６）。また、これらの変異系統の解析から、後部絹糸腺内腔へのＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、及び／又はｐ２５の効率的な分泌には、前記ＳＦＥＵ複合体の形成が重要であることが判明している（非特許文献７及び８）。したがって、前記変異系統が吐糸できない理由は、いずれかの構成タンパク質に異常があるためにＳＦＥＵ複合体を形成できず、その結果、ＦｉｂＨ、ＦｉｂＬ、及びｐ２５のいずれも後部絹糸腺細胞から内腔中へ分泌されないためと考えられている（非特許文献９）。このような知見から、後部絹糸腺細胞内で発現したタンパク質は、ＳＦＥＵ複合体を構成したときにのみ効率的に細胞外に分泌されるというのが当該分野の通説である。したがって、後部絹糸腺をタンパク質発現系として利用するには、後部絹糸腺に特異的な分泌システムを利用するために目的の組換えタンパク質をＳＦＥＵ複合体の一部として発現させる等の工夫をしなければならない。
後部絹糸腺で組換えタンパク質をＳＦＥＵ複合体の一部として発現・分泌させる具体的な方法としては、Ｆｉｂ  Ｈ遺伝子又はＦｉｂ  Ｌ遺伝子のプロモーターの下流にＦｉｂ  Ｈ又はＦｉｂ  Ｌの全部又は一部と組換えタンパク質とを結合した融合タンパク質（キメラタンパク質）として発現させる方法が知られている（図２ａ及びｂ）（非特許文献１０、１１）。そのようなキメラタンパク質は、ＳＦＥＵ複合体の一部として組み込まれるため後部絹糸腺の内腔への分泌は効率的に行われる。しかし、ＳＦＥＵ複合体に組み込まれることによって不溶性となってしまうため、組換えタンパク質を回収するには分泌されたＳＦＥＵ複合体の可溶化処理を行わなければならない。可溶化には強い変性剤による処理が必須であり、さらに、生理活性を発現させるためには、キメラタンパク質中のフィブロイン構成タンパク質部分の切断も必要となる場合がある。そのため後部絹糸腺で発現させた組換えタンパク質は、回収が困難な上に、その活性を失うリスクを伴うという大きな問題があった。
一方、組換えタンパク質を不溶性のＳＦＥＵ複合体の構成成分としてではなく、水溶性タンパク質として後部絹糸腺にて発現・分泌させる方法も知られている。例えば、目的の組換えタンパク質をコードするＤＮＡの上流にｐ２５のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加する方法（図２ｃ）（非特許文献１２）が挙げられる。この方法では目的とするタンパク質は水溶性タンパク質として発現され得るが、発現量及び分泌効率が低いという大きな問題があった（非特許文献１２）。また、後部絹糸腺特異的なタンパク質のシグナルペプチドを用いるのではなく、特許文献１に記載されたタイワンカブトムシのディフェンシンの発現方法のように、目的の組換えタンパク質自身のシグナルペプチドを含む状態で該組換えタンパク質を後部絹糸腺にて可溶化した状態で発現させる方法も試みられている。しかしながら、この方法も前記方法と同様に目的とするタンパク質は発現され得るものの、発現量及び分泌効率が低いという問題があった。
以上の理由より、当該分野では、遺伝子組換えカイコの絹糸腺発現系を用いて、タンパク質を水溶性の状態で簡便にかつ多量に生産する場合には、後部絹糸腺は不適とされてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−９５０６３
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（５１）：４０５１７−４０５２８．
【非特許文献２】Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７．
【非特許文献３】Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（４）：４４９−４６５．
【非特許文献４】Ｍ．Ｍｏｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｓｐｉａｎ  Ｊ．Ｅｎｖ．Ｓｃｉ  ５（２）：６３−７．
【非特許文献５】田村俊樹  他，２００８，農業技術，６３巻第７号：３２０−２３６．
【非特許文献６】Ｇａｍｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．ｓｅｒｉｃ．Ｓｃｉ．Ｊｐｎ，５４，４１２−４１９．
【非特許文献７】Ｔａｋｅｉ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９９：２００５−２０１０．
【非特許文献８】Ｔａｋｅｉ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０５：１７５−１８０．
【非特許文献９】Ｉｎｏｕｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：３５６−３６６．
【非特許文献１０】Ｋｏｊｉｍａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，７１：２９４３−２９５１．
【非特許文献１１】Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１：５２−５６．
【非特許文献１２】Ｒｏｙｅｒ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２．
【発明の概要】
【０００５】
しかしながら、もしも組換えペプチドをフィブロインの構成成分としてではなく、水溶性ペプチドとして後部絹糸腺で簡便にかつ多量に発現及び分泌させることができれば、その高いタンパク質合成能力により遺伝子組換えカイコを用いた有用ペプチドの生産効率を向上させることができ、また、それによって製造コストを低減することも可能となる。
そこで、本発明の目的は、カイコをはじめとする絹糸虫の後部絹糸腺において水溶性組換えペプチドを大量に発現・分泌することのできる後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを開発し、その遺伝子発現ユニット及びそれを導入した遺伝子組換え絹糸虫を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、中部絹糸腺細胞で特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドに外来の水溶性ペプチドを連結したキメラペプチドをコードする遺伝子を後部絹糸腺で発現させたところ、驚くべきことに従来の後部絹糸腺遺伝子発現系と比較して１０〜５０倍もの効率で目的の水溶性ペプチドを発現及び分泌させることができることを見出した。本願発明は、当該新規知見に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡを含む後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（２）前記シグナルペプチドがセリシン１〜３のいずれか一のシグナルペプチドである、（１）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（３）前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ又はｐ２５である、（１）又は（２）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（４）（ａ）後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードする遺伝子を含む第１サブユニットと、（ｂ）該転写調節因子の標的プロモーター、該プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びその下流に連結されたフィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡを含む第２サブユニットから構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（５）前記シグナルペプチドがセリシン１〜３のいずれか一のシグナルペプチドである、（４）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（６）前記後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質がＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ又はｐ２５である、（４）又は（５）に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット。
（７）（１）〜（３）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
（８）（４）〜（６）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫。
（９）前記第１サブユニットと前記第２サブユニットとが異なる染色体上に存在する、（８）に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１０）前記第１サブユニットを有する系統と前記第２サブユニットを有する系統とを交配して得られる、（８）又は（９）に記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１１）絹糸虫がカイコ、エリサン、又はサクサンである、（７）〜（１０）のいずれかに記載の遺伝子組換え絹糸虫。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入して、後部絹糸腺において目的のペプチドを発現する遺伝子組換え絹糸虫の作出方法。
（１３）（７）〜（１１）のいずれかに記載の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチドを製造する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−２８１３３０号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、カイコの絹糸腺及びその各部位で発現するフィブロイン構成タンパク質と絹糸が吐糸されるまでの概念図である。
図２は、従来の後部絹糸腺での組換えタンパク質発現ユニットの構成を示す図である。（ａ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、Ｆｉｂ  ＨのＮ末端領域及びＣ末端領域をそれぞれコードする遺伝子領域の間に目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｘ）を結合してなる融合遺伝子を、Ｆｉｂ  Ｈ遺伝子プロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。（ｂ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、Ｆｉｂ  Ｌの全長をコードする遺伝子領域の下流に目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｘ）を結合してなる融合遺伝子を、Ｆｉｂ  Ｌ遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。（ｃ）この組換えタンパク質の発現ユニットは、ｐ２５のシグナルペプチドをコードする遺伝子領域と目的の組換えタンパク質Ｘをコードする遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｘ）を結合してなる融合遺伝子をｐ２５遺伝子プロモーターの下流に発現可能な状態で結合した構造を有する。なお、（ａ）〜（ｃ）の３’末端側の白箱は、ポリＡシグナルを含む３’ＵＴＲを示す。
図３は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構成例を示す。（ａ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合の構成例である。（ｂ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが２つのサブユニットで構成される場合の第１サブユニットの構成例である。（ｃ）本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが２つのサブユニットで構成される場合の第２サブユニットの構成例である。なお、（ａ）〜（ｃ）の３’末端側の白箱は、ポリＡシグナルを含む３’ＵＴＲを示す。
図４は、実施例１で構築した発現ベクターを示す。（ａ）中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用の第１サブユニットを示す。（ｂ）後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用の第１サブユニットを示す。（ｃ）第２サブユニットを示す。
図５は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコにおける中部絹糸腺及び後部絹糸腺でのＥＧＦＰの発現を示す図である。
図６は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコにおける中部絹糸腺又は後部絹糸腺におけるＥＧＦＰ量を示す図である。
図７は、従来の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット、及び本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットをそれぞれ導入した遺伝子組換えカイコの繭におけるＥＧＦＰの存在を示す図である。
図８において、Ａは、実施例６で用いた第２サブユニットの一つの構造を示す概念図である。Ｂは、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットと、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質セリシン１由来のシグナルペプチド又は後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質ｐ２５由来のシグナルペプチドのいずれかを有する第２サブユニット（それぞれ図４（ｃ）と図８Ａで示す）を導入した遺伝子組換えカイコにおける後部絹糸腺でのＥＧＦＰ量を示す図である。
図９において、Ａは、実施例７で用いた第２サブユニットの構造を示す概念図である。シグナルペプチドは、ブタＩＬ−２由来のものとセリシン１由来のものの２種を構築している。Ｂは実施例７で構築した各後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からブタＩＬ−２を検出したウエスタンブロッティングの結果である。Ｃは実施例７で構築した各中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からブタＩＬ−２を検出したウエスタンブロッティングの結果である。
図１０において、Ａは、実施例８で用いた第２サブユニットの構造を示す概念図である。シグナルペプチドは、ウシＩＦＮ−γ由来のものとセリシン１由来のものの２種を構築している。Ｂは実施例７で構築した各後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からウシＩＦＮ−γを検出したウエスタンブロッティングの結果である。Ｃは実施例７で構築した各中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有するカイコ系統の各絹糸腺の抽出液からウシＩＦＮ−γを検出したウエスタンブロッティングの結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．後部絹糸腺遺伝子発現ユニット
１−１．概要及び定義
本発明の第１の態様は、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットである。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、これを絹糸虫に導入することで、その絹糸虫の後部絹糸腺において、目的とする組換えペプチドをフィブロイン構成成分の一部としてではなく、水溶性ペプチドとして大量に発現及び分泌させることができる。
本明細書において「後部絹糸腺遺伝子発現ユニット」とは、絹糸虫の後部絹糸腺において前記組換えペプチドを大量に発現し、分泌することのできる一組の遺伝子発現システムをいう。
本明細書において「絹糸虫」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。具体的には、鱗翅目、膜翅目、脈翅目、毛翅目等のうち主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。鱗翅目であれば、多量の絹糸を吐糸できるカイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、イボタガ科（Ｂｒａｈｍａｅｉｄａｅ）、オビガ科（Ｅｕｐｔｅｒｏｔｉｄａｅ）、カレハガ科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）、ミノガ科（Ｐｓｙｃｈｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｈｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）等は本明細書の絹糸虫として好ましい。Ｂｏｍｂｙｘ属、Ｓａｍｉａ属、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｓａｔｕｒｎｉａ属、Ａｔｔａｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｉｎｉａ属に属する種、具体的には、カイコ、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ；エリサンＳａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、ヒメヤママユ（Ｓａｔｕｒｎｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オオミズアオ（Ａｃｔｉａｓ  ｇｎｏｍａ）等が好適な例として挙げられる。
「絹糸腺」とは、液状絹を産生し、蓄積し、また分泌する機能を有する唾液腺の変化した管状器官である。絹糸腺は、前記絹糸虫の、主として幼虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の３領域で構成されている。前述のように、後部絹糸腺は、絹糸の繊維成分であるフィブロインを産生及び分泌する。また、中部絹糸腺は、被覆成分であるセリシンを産生及び分泌し、後部絹糸腺より移行してきたフィブロインと共にその内腔に蓄積する。
１−２．構成
１−２−１．エレメントの構成
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡの他、該ペプチドの発現に必要な後部絹糸腺発現プロモーター、及び分泌に必要なシグナルペプチドをコードするＤＮＡ等のエレメント等を包含する。以下、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの各エレメントの構成について具体的に説明をする。
（１）フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドをコードするＤＮＡ
本明細書において「ペプチド」と表記する場合には、２個以上のアミノ酸がアミド結合によって連結した分子をいう。ペプチドは、オリゴペプチド、及びタンパク質のようなポリペプチドを含む。ペプチドは、１遺伝子由来又はその遺伝子断片由来であってもよいし、複数の遺伝子の一部を連結したキメラ遺伝子由来であってもよい。また、ペプチドのアミノ酸長は、特に限定はしない。例えば、アミノ酸残基数が１０〜１０，０００個であってもよい。
本明細書において、「フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチド」とは、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにより大量に発現及び分泌させるべき目的のペプチド（以下、しばしば「目的のペプチド」と略称する）であって、フィブロイン構成タンパク質及びその断片以外のペプチド、及びフィブロイン構成タンパク質の全部又は一部を含まないキメラペプチドをいう。フィブロイン構成タンパク質には、ＳＦＥＵ複合体を構成するＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、又はｐ２５等が該当する。フィブロイン構成タンパク質を含まないペプチドは、ＳＦＥＵ複合体の一部等として発現することはなく、したがって、後部絹糸腺細胞から分泌された後も繭糸の繊維成分の一部となることはない。それ故、目的のペプチドとして、例えば、水溶性ペプチドを本態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットで発現及び分泌させた場合には、該水溶性ペプチドは後部絹糸腺内腔又は繭糸から水、又はタンパク質変性剤を含まない中性の抽出バッファーを用いて容易に分離、回収することができる。このような水溶性ペプチドの例としては、インスリン、カルシトニン、パラトルモン及び成長ホルモンのようなペプチドホルモン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のようなサイトカイン、免疫グロブリン、血清アルブミン、酵素、又はコラーゲン、あるいはそれらの断片（キメラペプチドを含む）が挙げられる。
（２）後部絹糸腺発現プロモーター
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおける後部絹糸腺発現プロモーターは、絹糸虫の後部絹糸腺で作動可能なプロモーターであれば、いずれの遺伝子のプロモーターであってもよい。例えば、後部絹糸腺特異的プロモーターの他、ユビキタスに発現可能な過剰発現型プロモーター、構成的活性型プロモーター若しくは時期特異的活性型プロモーター、又は発現誘導型プロモーター等が挙げられる。好ましくは後部絹糸腺特異的プロモーターである。中でも絹糸虫の後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは好ましく、さらに終齢後期から前蛹期に後部絹糸腺で特異的に活性化する終齢後期後部絹糸腺特異的活性型プロモーターは特に好ましい。具体的には、例えば、フィブロイン構成タンパク質であるＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、又はｐ２５の遺伝子プロモーター（本明細書では、それぞれ「Ｆｉｂ  Ｈプロモーター」、「Ｆｉｂ  Ｌプロモーター」、又は「ｐ２５プロモーター」と称する）が挙げられる。
後部絹糸腺発現プロモーターの由来生物種は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する絹糸虫の細胞内で作動する限り特に限定はしない。特にＦｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、又はｐ２５の各プロモーターを用いる場合には、いずれの絹糸虫由来であってもよい。これらのプロモーターの塩基配列は、絹糸虫間で進化的に非常によく保存されており、後部絹糸腺発現プロモーターの由来する絹糸虫と本願発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する絹糸虫の種類が異なる場合であっても、そのプロモーターは宿主絹糸虫の後部絹糸腺で作動し得るからである（Ｓｅｚｕｔｓｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｙ，７８：１−１０）。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおける後部絹糸腺発現プロモーターとして、好ましくは本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する宿主絹糸虫と分類学上同じ目由来、より好ましくは同じ科由来、さらに好ましくは同じ属由来、最も好ましくは同一種由来のプロモーターである。
Ｆｉｂ  Ｈプロモーターの具体例としては、配列番号１で示される塩基配列を含むカイコ由来のＦｉｂ  Ｈプロモーター、配列番号２で示される塩基配列を含むサクサン由来のＦｉｂ  Ｈプロモーター等が挙げられる。また、Ｆｉｂ  Ｌプロモーターの具体例としては、配列番号３で示される塩基配列を含むカイコ由来のＦｉｂ  Ｌプロモーター、配列番号４で示される塩基配列を含むサクサン由来のＦｉｂ  Ｌプロモーター等が挙げられる。さらに、ｐ２５プロモーターの具体例としては、配列番号５で示される塩基配列を含むカイコ由来のｐ２５プロモーター等が挙げられる。
（３）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（以下「シグナルペプチドＤＮＡ」とする）を含む。このシグナルペプチドは、絹糸腺細胞内で発現した目的のペプチドを絹糸腺内腔内に分泌する上で必要なペプチドである。通常、シグナルペプチドは、分泌性タンパク質のＮ末端側に配置されており、分泌前にシグナルペプチダーゼによって切断除去される。本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットでもシグナルペプチドＤＮＡは、目的のペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に連結されている。したがって、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、シグナルペプチドと目的のペプチドを連結した細胞外分泌性のキメラタンパク質をコードしていることになる（以下、このキメラタンパク質をコードするＤＮＡを「キメラ遺伝子」とする）。
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドＤＮＡは、絹糸虫の中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡであれば、由来する細胞外分泌性タンパク質の種類については特に限定はせず、あらゆるシグナルペプチドＤＮＡを利用することができる。シグナルペプチドのアミノ酸長は、シグナルペプチドとして機能し得る限り、特に限定はしない。通常は、３〜６０アミノ酸の範囲内にあればよい。したがって、シグナルペプチドＤＮＡの塩基長も９〜１８０塩基あればよい。
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドＤＮＡとして好適な例は、セリシン１〜３由来のシグナルペプチドＤＮＡである。セリシン１〜３由来のシグナルペプチドＤＮＡの具体例としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン１シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン２シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号９で示される塩基配列を含むＤＮＡ）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むカイコのセリシン３シグナルペプチドをコードするシグナルペプチドＤＮＡ（例えば、配列番号１１で示される塩基配列を含むＤＮＡ）が挙げられる。
（４）その他のエレメント
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、上記エレメント以外にも、必要に応じて目的のペプチドの発現及び分泌に機能し得るエレメントを含むことができる。例えば、エンハンサー、５’ＵＴＲ、シグナル配列後挿入配列、シグナルペプチダーゼ認識部位、３’ＵＴＲ、ターミネーター、選抜マーカー、インスレーター、及びトランスポゾンの逆位末端反復配列等が挙げられる。
「シグナル配列後挿入配列」は、前記シグナルペプチドと目的のペプチドが連結した細胞外分泌性のキメラペプチドにおいて、シグナルペプチドの切断と分泌を促進するアミノ酸配列をコードする塩基配列で構成される。
「シグナルペプチダーゼ認識部位」は、シグナルペプチダーゼが前記キメラペプチドからシグナルペプチドを認識し、切断するのに必要なアミノ酸配列をコードする塩基配列で構成される。
「ターミネーター」は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する宿主の後部絹糸腺細胞内で、融合タンパク質をコードするＤＮＡの転写を終結できる塩基配列で構成される。
「５’ＵＴＲ」及び「３’ＵＴＲ」は、前記キメラ遺伝子のｍＲＮＡコード領域において、それぞれ開始コドンの上流（５’末端側）及び終止コドンの下流（３’末端側）に配置される塩基配列で構成される。３’ＵＴＲは、ポリＡシグナルを含むことができる。
「選抜マーカー」は、後述する本発明の遺伝子組換え絹糸虫が本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有していることを確認する時のマーカーとして機能し得る。例えば、ＥＧＦＰやＤｓＲｅｄのような蛍光遺伝子を含む複眼の蛍光マーカー３ｘＰ３−ＥＧＦＰや３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ、及びブラストサイジン耐性遺伝子のような薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
「インスレーター」は、その配列に挟まれた遺伝子の転写を、周囲の染色体のクロマチンによる影響を受けずに安定的に制御できる配列である。例えば、ニワトリのｃＨＳ４配列やショウジョウバエのｇｙｐｓｙ配列などが挙げられる。
「トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが相同組換え可能な発現ベクターの場合に含まれ得る。逆位末端反復配列は、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの上流及び下流に配置される。トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓ等を用いることができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９，２７７−２８１；Ｗａｎｇ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９（２）：１４５−５５）。
また、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが、後述する第１サブユニット及び第２サブユニットの２つのユニットで構成される場合には、転写調節因子をコードするＤＮＡ及び該転写調節因子の標的プロモーターを包含する。
本明細書において「転写調節因子をコードするＤＮＡ」とは、第１サブユニットの必須エレメントであって、転写調節因子の遺伝子をいう。本明細書でいう「転写調節因子」とは、後述する標的プロモーターを認識及び／又はそれに結合して、その標的プロモーターを活性化することのできるタンパク質因子をいう。例えば、酵母のガラクトース代謝活性化タンパク質であるＧＡＬ４タンパク質、及びテトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるｔＴＡ及びその変異体等が挙げられる。
本明細書において「転写調節因子の標的プロモーター」とは、第２サブユニットの必須エレメントであって、前記第１サブユニットにコードされた転写調節因子が認識及び／又はそれに結合することよって、その制御下にある遺伝子発現を活性化することのできるプロモーターをいう。前記転写調節因子とその標的プロモーターは、前記転写調節因子とは対応関係にあり、通常、転写調節因子が定まれば、その標的プロモーターも必然的に定まる。例えば、転写調節因子がＧＡＬ４タンパク質の場合には、ＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が使用される。
１−２−２．後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構成
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、例えば、プラスミド若しくはバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）のような自律複製可能な発現ベクター、又は染色体中に相同組換え可能な発現ベクター若しくはそれを宿主のゲノム中に挿入したゲノムの一部であってもよい。発現ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターとすることもできる。
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、（１）１つの遺伝子発現ユニットで構成され、単体で宿主細胞内において機能し得る場合と、（２）２つのサブユニットで構成され、その２つが宿主細胞内に存在してはじめて機能し得る場合がある。以下、それぞれの場合について説明をする。
（１）１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが１つの遺伝子発現ユニットで構成される場合、当該遺伝子発現ユニットは、図３（ａ）で示すような後部絹糸腺発現プロモーター（図３（ａ）ではＦｉｂ  Ｈプロモーターが該当する）、シグナルペプチドＤＮＡ（図３（ａ）ではセリシン１シグナルペプチドＤＮＡが該当する）及び目的のペプチドをコードするＤＮＡ（図３（ａ）ではＥＧＦＰ遺伝子が該当する）を含んでなる遺伝子発現システムを少なくとも１つ含む。
本構成の後部絹糸腺発現プロモーターは、フィブロイン構成タンパク質、例えば、Ｆｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、又はｐ２５をコードする遺伝子のプロモーターのように後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。
本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡ、及びその下流に目的のペプチドをコードするＤＮＡが連結されてなるキメラ遺伝子を含む。シグナルペプチドＤＮＡと目的のペプチドをコードするＤＮＡの間には、シグナル配列後挿入配列及び／又はシグナルペプチダーゼ認識部位を含んでいてもよい。また、シグナルペプチドＤＮＡの上流には５’ＵＴＲを、目的のペプチドをコードするＤＮＡの下流には３’ＵＴＲを含むことができる。目的のペプチドをコードするＤＮＡの下流又は３’ＵＴＲの下流には、さらにターミネーターを配置してもよい。本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、１つの後部絹糸腺発現プロモーター制御下にキメラ遺伝子を１つ含むモノシストロニックな系であってもよいし、キメラ遺伝子を２以上含むポリシストロニックな系であってもよい。
前記キメラ遺伝子は、後部絹糸腺発現プロモーターの下流に機能的に結合されている。本明細書において「後部絹糸腺発現プロモーターの下流に機能的に結合」するとは、後部絹糸腺発現プロモーターの下流で、そのプロモーターによる発現制御を受ける位置にキメラ遺伝子等の遺伝子を配置し、それらを結合することをいう。
（２）２つのサブユニットで構成される場合
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが第１サブユニット及び第２サブユニットで構成される場合、各サブユニットは以下の構成を有する。
第１サブユニットは、図３（ｂ）で示すように、後部絹糸腺発現プロモーター（図３（ｂ）ではＦｉｂ  Ｈプロモーターが該当する）、及び該プロモーターの下流に機能的に結合した転写調節因子をコードするＤＮＡ（図３（ｂ）ではＧＡＬ４遺伝子が該当する）を含んでなる。転写調節因子をコードするＤＮＡの上流には５’ＵＴＲを、またその下流には３’ＵＴＲを含んでいてもよい。
第１サブユニットの後部絹糸腺発現プロモーターは、フィブロイン構成タンパク質、例えば、Ｆｉｂ  Ｈ、Ｆｉｂ  Ｌ、又はｐ２５をコードする遺伝子のプロモーターのように後部絹糸腺で特異的かつ大量に発現するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが好ましい。
第２サブユニットは、図３（ｃ）で示すように、前記第１サブユニットにコードされた転写調節因子の標的プロモーター（図３（ｃ）ではＵＡＳが該当する）、標的プロモーターの下流に機能的に結合した中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドＤＮＡ（図３（ｃ）ではセリシン１シグナルペプチドＤＮＡが該当する）と目的のペプチドをコードするＤＮＡ（図３（ｃ）ではＥＧＦＰ遺伝子が該当する）が連結されてなるキメラ遺伝子を含んでなる。シグナルペプチドＤＮＡと目的のペプチドＤＮＡの間には、シグナル配列後挿入配列及び／又はシグナルペプチダーゼ認識部位を含んでいてもよい。また、キメラ遺伝子の上流には５’ＵＴＲを、その下流には３’ＵＴＲを含んでいてもよい。第２サブユニットは、１つの後部絹糸腺発現プロモーター制御下にキメラ遺伝子を１つ含むモノシストロニックな系であってもよいし、キメラ遺伝子を２以上含むポリシストロニックな系であってもよい。
本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは、第１及び第２のサブユニットの１組で機能する。後部絹糸腺発現プロモーターの活性化により第１サブユニットから発現した転写調節因子が第２サブユニットの標的プロモーターを活性化することによって目的のペプチドを含むキメラペプチドを発現する。第２サブユニットは異なるキメラ遺伝子を含む２以上のサブユニットであってもよい。この場合、第１サブユニットから発現した転写調節因子は、各第２サブユニットの標的プロモーターを活性化することで、それぞれの第２サブユニットにコードされた目的のペプチドを発現することができる。
本構成の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットは第１サブユニットにコードされた転写調節因子を介して第２サブユニットにコードされた目的のペプチドの発現を増幅することができる。したがって、後部絹糸腺発現プロモーターの遺伝子発現能が高くない場合に好適である。また、第２サブユニットにおける目的のペプチドＤＮＡを交換するだけで、第１サブユニットは共通使用が可能であることから、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを構築する上でも、また後述の遺伝子組換え絹糸虫を作出する上でも便利である。
１−３．効果
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、従来当該分野において水溶性ペプチドの生産系としては不適とされてきた絹糸虫の後部絹糸腺で該ペプチドを大量に合成することができる。また、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを用いれば、中部絹糸腺を用いた従来のタンパク質生産系としての遺伝子組換え絹糸虫よりも生産効率の高い遺伝子組換え絹糸虫を作出することが可能となる。
２．遺伝子組換え絹糸虫
２−１．概要
本発明の第２の態様は、遺伝子組換え絹糸虫である。本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有し、後部絹糸腺において目的のペプチドを大量に発現及び分泌できることを特徴とする。
２−２．構成
本発明の「遺伝子組換え絹糸虫」とは、宿主絹糸虫に前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入した絹糸虫又はその後代をいう。宿主絹糸虫は、前述したいずれの絹糸虫であってもよい。飼育方法や人工試料が確立しており、多頭飼育が可能なカイコ、エリサン及びサクサンは、宿主絹糸虫として特に好ましい。
本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを細胞内に一過的に有していてもよいし、ゲノム中に導入された状態等で安定的に有していてもよい。安定的に有することが好ましい。
本発明の遺伝子組換え絹糸虫は、異なる前記第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを２以上有することができる。例えば、遺伝子組換え絹糸虫は、１つの遺伝子発現ユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニットと、２つのサブユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの両方を有することができる。
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットが第１サブユニット及び第２サブユニットの２つのサブユニットで構成され、それぞれが絹糸虫の染色体に挿入されている場合、各サブユニットは同一染色体上に存在していてもよいし、異なる染色体上に存在していてもよい。各サブユニットが異なる染色体上に存在する場合、第１サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換え絹糸虫の系統と第２サブユニットのみを（好ましくはホモ接合体で）有する遺伝子組換え絹糸虫の系統とを交配すれば、Ｆ１で第１サブユニットと第２サブユニットを有する本発明の遺伝子組換え絹糸虫を容易に得ることができる。この場合、前記第１サブユニットのみを有する遺伝子組換え絹糸虫の系統は、様々な第２サブユニットのみを有する遺伝子組換え絹糸虫の系統との交配に使用することができる。一方、第１サブユニット及び第２サブユニットが同一染色体上に存在する場合には、継代過程で組換えのよってそれぞれが分離しないように、サブユニット間の距離が近く、互いに連鎖している方が好ましい。
２−３．効果
本発明の遺伝子組換え絹糸虫によれば、後部絹糸腺発現型の遺伝子組換え絹糸虫を水溶性ペプチドの生産系として利用することができる。
３．遺伝子組換え絹糸虫の作出方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、遺伝子組換え絹糸虫を作出する方法である。本発明は、絹糸虫の後部絹糸腺において目的のペプチドを発現することのできる遺伝子組換え絹糸虫を作出することを特徴とする。
３−２．作出方法
本発明の遺伝子組換え絹糸虫の作出方法は、前記第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを宿主である絹糸虫に導入する方法、又は本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと前記第２サブユニットを異なる染色体上に有する絹糸虫を交配する方法が挙げられる。
前記第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの宿主である絹糸虫への導入は、当該分野で公知の方法によって行えばよい。絹糸虫卵、例えば、カイコ卵に第１態様の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを導入する場合、例えば、Ｔａｍｕｒａらの方法（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）を利用することができる。具体的には、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Ｈａｎｄｌｅｒ  ＡＭ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：７５２０−５）を両端に有する第１態様に記載の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを含む発現ベクターと共に、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを有するヘルパーベクターを絹糸虫の発生初期卵にインジェクションすればよい。ヘルパーベクターとしては、例えば、ｐＨＡ３ＰＩＧが挙げられる。得られた形質転換体は、選抜マーカーに基づいて選抜する。必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、ゲノムに挿入された後部絹糸腺遺伝子発現ユニットのホモ接合体を得てもよい。
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと前記第２サブユニットを異なる染色体上に有する絹糸虫を交配して本発明の遺伝子組換え絹糸虫を作出する場合、それぞれの遺伝子発現ユニットを絹糸虫へ導入する方法は、前記と同様の方法、例えば、Ｔａｍｕｒａらの方法によって行えばよい。それぞれの遺伝子発現ユニットを異なる染色体上に有する遺伝子組換え絹糸虫を交配して２つの遺伝子発現ユニットを有する遺伝子組換え絹糸虫を作出する方法も、当該分野で公知の交配方法によって得ることができる。例えば、それぞれの遺伝子発現ユニットを有する絹糸虫を交配し、Ｆ１個体について２つの遺伝子発現ユニットの選抜マーカーを有する個体を選抜すればよい。必要に応じて兄妹交配又は同系交配を行い、ゲノムに挿入された後部絹糸腺遺伝子発現ユニットのホモ接合体を得てもよい。
４．ペプチドを製造する方法
４−１．概要
本発明の第４の態様は、目的のペプチドを製造する方法に関する。本発明によれば、前記第２態様の遺伝子組換え絹糸虫を用いて目的のペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に製造することができる。
４−２．製造方法
本発明の製造方法は、飼育工程及び回収工程を含む。以下、各工程について説明をする。
（１）飼育工程
「飼育工程」とは、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫を飼育する工程である。遺伝子組換え絹糸虫の飼育方法については、それぞれの絹糸虫について当該分野で公知の技術によって飼育すればよい。例えば、絹糸虫がカイコであれば、「蚕種総論；高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を、またエリサンであれば、「エリサンの人工飼料と飼育法；２０００、野蚕３９  ７−８」を参照するとよい。飼料は、例えば、カイコやクワコであればクワ属（Ｍｏｒｕｓ）の葉、エリサンであればトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）の葉若しくはシンジュ（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）の葉、サクサンであればブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）の葉のような食草樹種の天然葉であってもよいし、シルクメイトＬ４Ｍ若しくは原蚕種１−３齢用（日本農産工業）のような人工飼料であってもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できることを鑑みれば、人工飼料が好ましい。以下、簡単な飼育方法についてカイコを例に挙げて説明する。
掃立ては、適当な頭数（例えば、４〜１０頭）の同系の遺伝子組換え絹糸虫の雌が産卵した卵で行う。孵化した幼虫は、卵台紙から蚕座である防乾紙（パラフィン加工紙）を敷いた容器内に移し、シルクメイト等の人工飼料を防乾紙上に並べて給餌する。餌の交換は、原則として１〜２齢では各１回、３齢では１〜３回行う。古い餌は食べ残しが多い場合には腐敗防止のため除去する。４〜５齢の壮カイコ幼虫時の飼育には、大型容器に移し、容器あたりの頭数を適宜調整する。湿度や容器内の状態により、容器に防乾紙、アクリル、又はメッシュ製のフタをしてもよい。飼育温度は、全齢を通して２５〜２８℃で飼育する。
（２）回収工程
「回収工程」とは、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫の幼虫が後部絹糸腺細胞内で発現し、分泌した後、絹糸腺内腔内に蓄積した目的のペプチドを回収する工程である。
第２態様の遺伝子組換え絹糸虫は、主に幼虫の終齢後期から後部絹糸腺遺伝子発現ユニットに含まれる目的のペプチドをシグナルペプチドとのキメラペプチドとして後部絹糸腺細胞内で発現する。キメラペプチドは、シグナルペプチドの作用によって小胞体へ輸送され、そのシグナルペプチドが小胞体内のペプチダーゼ等の酵素作用によって切断された後、後部絹糸腺内腔へ分泌される。目的のペプチドは、中部絹糸腺に移行、蓄積され、蛹化期に前部絹糸腺からセリシンやフィブロインと共に個体外に分泌、吐糸される。したがって、目的のペプチドの回収方法には、繭から回収する方法、又は終齢後期から前蛹期に虫体から絹糸腺を摘出して直接回収する方法が挙げられる。特に繭から回収する方法は、目的のペプチドを簡便に回収できる点で優れている。
繭から目的のペプチドを回収する方法は、まず、終齢後期の幼虫を上蔟（じょうぞく：幼虫を蔟「まぶし」に移すこと）して、営繭させる。次に、繭から目的のペプチドを抽出する。抽出方法は、特に限定はしない。例えば、水又はタンパク質変性剤を含まない適当な中性の抽出バッファー（例えば、１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０５％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅを含む又は含まないｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．２）中に繭を浸漬するだけで目的のペプチドを回収することができる。抽出効果を高めるため浸漬前に繭を裁断又は粉砕してもよい。抽出温度は、目的のタンパク質の熱変性を防ぐため、０〜１０℃、好ましくは０〜５℃の低温で行う。ただし、目的のペプチドが熱感受性ペプチドでなければ、１０〜４０℃でも行うこともできる。抽出液は、必要に応じて撹拌してもよい。抽出時間は、繭の状態（例えば、未裁断状態か、粉末状態か）、抽出液の量、抽出温度、撹拌の有無等の抽出条件によって異なることから、条件に応じて適宜定めればよい。フィブロイン等の不溶性成分は、抽出液から必要に応じて遠心又は濾過によって除去することができる。
終齢後期〜前踊期の虫体より絹糸腺を摘出して目的のペプチドを回収する方法は、当該分野で公知の方法によって達成することができる。例えば、終齢（５齢）６日目の吐糸直前カイコを氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで絹糸腺を傷つけないように摘出すればよい（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂，１９７０，ｐｐ．２４９−２５５参照）。摘出した絹糸腺を、例えば、前記抽出バッファー中で０〜１０℃、好ましくは０〜５℃の温度下にて緩やかに振盪させて、目的のペプチドをバッファー中に溶出させることができる。目的のペプチドが熱感受性ペプチドでなければ、１０〜４０℃の温度下で行ってもよい。その後、遠心又は濾過によって組織片等の夾雑物を除去し、目的のペプチドを含む上清を回収すればよい。
４−３．効果
本発明のペプチド製造方法によれば、第２態様の遺伝子組換え絹糸虫の幼虫をタンパク質生産系として用いることで、従来の遺伝子組換え絹糸虫を用いた場合と比較して、目的のペプチド、特に水溶性ペプチドを大量に製造し、また容易に回収することが可能である。
以下に本発明の態様について、具体的な実施例を挙げて説明をするが、本実施例は本発明の一概念に過ぎず、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、本実施例では、宿主絹糸虫として、当該分野で最も一般的に利用されているカイコを用いた。
【実施例】
【０００８】
＜実施例１：後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの構築＞
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを含む、各種発現ベクターを構築した。本実施例では、第１及び第２サブユニットで構成される後部絹糸腺遺伝子発現ユニット等の発現ベクターを構築した。
（方法）
１．発現ベクターの構築
（１）中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット：ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（図４（ａ））
対照用の中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットとして、中部絹糸腺で特異的に発現するセリシン１遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子ＧＡＬ４遺伝子、さらにその下流に結合したｈｓｐ７０ｐｏｌｙＡ付加配列を有するｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２を構築した。
セリシン１遺伝子プロモーターは、制限酵素ＡｓｃＩサイトを含む配列番号１２で示すプライマーとＢａｍＨＩサイトを含む配列番号１３で示すプライマーを用いて、配列番号１４で示すセリシン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１０４４０４１）の−６６６から＋４０まで（転写開始点を０位とする。以下同様）のプロモーター領域を、カイコ大造系統のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。得られたプラスミドをＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩで処理し、分離されたＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩ増幅断片をｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ  ７５：８９−９７）のＧＡＬ４遺伝子上流のＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドに、ｐＢａｃＡ３ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ  ７５：８９−９７）からＢｇｌＩＩにより切り出した３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄカセットを選抜マーカーとして挿入し、中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットを構築した。
（２）後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット：ｐＢａｃＦｉｂＨ−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（図４（ｂ））
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットとして、後部絹糸腺で特異的に発現するＦｉｂ  Ｈ遺伝子のプロモーター及びその下流に機能的に結合した転写調節因子ＧＡＬ４遺伝子、さらにその下流に結合したｈｓｐ７０ｐｏｌｙＡ付加配列を有するｐＢａｃＦｉｂＨ１−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２を構築した。
Ｆｉｂ  Ｈ遺伝子プロモーターは、制限酵素ＡｓｃＩサイトを含む配列番号１５で示すプライマーとＢａｍＨＩサイトを含む配列番号１６で示すプライマーを用いて、配列番号１で示すＦｉｂ  Ｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２２６６８８）の−８５８から＋１１の約８７０ｂｐの領域をカイコ大造系統のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。得られたプラスミドをＡｓｃＩ及びＢａｍＨＩで処理し、分離されたＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩ増幅断片をｐＢａｃＡ３ｄＧＡＬ４（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ  ７５：８９−９７）のＧＡＬ４遺伝子上流のＡｓｃＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドに、ｐＢａｃＡ３ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ  ７５：８９−９７）からＢｇｌＩＩにより切り出した３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄカセットを選抜マーカーとして挿入し、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニットを構築した。
（３）第２サブユニット：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図４（ｃ））
中部及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニット兼用の第２サブユニットとして、ＵＡＳ配列の下流にセリシン１遺伝子の分泌シグナル（配列番号６）をコードする塩基配列（配列番号７）と、その３’末端側に付加したクローニング用付加塩基配列（配列番号１７）と目的の水溶性ペプチドＤＮＡとしてのＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１８）を結合し、その下流にセリシン１の３’ＵＴＲ（配列番号１９）を連結したｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
２．発現ベクターの精製
構築した上記各発現ベクターは、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。さらに、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、０．５ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／５ｍＭ  ＫＣｌバッファーに溶解した。
＜実施例２：遺伝子組換えカイコの作出＞
実施例１で構築した各発現ベクターを用いて各種遺伝子組換えカイコを作出した。
（材料と方法）
（１）カイコ系統
農業生物資源研究所で維持されている白眼・白卵・非休眠系統のｗ１−ｐｎｄ系統を宿主系統として用いた。
（２）飼育条件
２５〜２７℃の飼育室で、幼虫の全齢を人工飼料（シルクメイト原種１−３齢Ｓ、日本農産工）で飼育した。人工飼料は２〜３日毎に交換した（Ｕｃｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｓｅｒｉｃｏｌ，７５：８９−９７）。
（３）遺伝子組換えカイコの作出
遺伝子組換えカイコは、Ｔａｍｕｒａらの方法（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）に従って作出した。
実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットを、それぞれ別個にトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，８１−８４）と１：１の割合で混合し、産卵後２〜８時間のカイコ卵にインジェクションした。インジェクション後の卵は、加湿状態、２５℃で孵化するまでインキュベートした。孵化した幼虫を上記の方法で飼育し、兄妹交配を行った。得られた卵を第１サブユニットについては３ｘＰ３  ＤｓＲｅｄ２マーカー、また第２サブユニットについては３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、本発明の遺伝子組換えカイコの第１及び第２サブユニットを有する系統をそれぞれ得た。第１サブユニットと第２サブユニットをそれぞれ有する系統を交配し、一個体に両方の遺伝子発現ユニットを有する系統を上記と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２マーカーによる眼の蛍光の有無で選抜し、中部絹糸腺特異的発現をする遺伝子組換えカイコと本発明の遺伝子組換え絹糸虫である後部絹糸腺特異的発現をする遺伝子組換えカイコをそれぞれ得た。
＜実施例３：絹糸腺における組換えタンパク質の発現＞
（方法）
実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育し、５齢６日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで中部及び後部絹糸腺を傷つけないように摘出した（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂，１９７０，ｐｐ．２４９−２５５参照）。これを固定せずに蛍光顕微鏡（オリンパスＳＺＸ１６、ＧＦＰフィルター）で観察した。
（結果）
図５に結果を示す。中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの絹糸腺は、中部絹糸腺のみで蛍光が観察された。一方、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの絹糸腺は、後部及び中部絹糸腺の両方で蛍光が観察された。この結果は、ＥＧＦＰが後部絹糸腺細胞内で発現した後に、後部絹糸腺内腔に分泌され、その後中部絹糸腺に移行したことを示している。
＜実施例４：絹糸腺における組換えタンパク質の発現量＞
（方法）
実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育し、５齢６日目の吐糸直前に氷上で麻酔にかけ、前述のように背側を切開してピンセットで絹糸腺を傷つけないように摘出した。絹糸腺は、実施例３の結果から、中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコからは中部絹糸腺のみを、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコからは中部絹糸腺及び後部絹糸腺をそれぞれ摘出した。これらをそれぞれ１本当たり１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）／１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０５％アジ化ナトリウムに入れて、室温で２４時間振とうすることによって水溶性タンパク質を抽出した。得られた水溶性タンパク質抽出液を、２，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。上清に含まれる水溶性タンパク質中のＥＧＦＰタンパク質濃度をＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ）で測定した。具体的にはＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓに上清液を１００μＬ添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加して、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＥＩＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色反応を行い、１Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。発色をｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で定量した。リコンビナントＧＦＰタンパク質（タカラバイオ；Ｚ２３７３Ｎ）の系列希釈液（１−４００ｐｇ／μＬ）を用いて標準曲線を作製した。
（結果）
図６に結果を示す。中部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの中部絹糸腺から回収された水溶性タンパク質のＥＧＦＰ発現量は、１頭あたり１０００μｇであったの対して、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの後部絹糸腺及び中部絹糸腺から回収されたＥＧＦＰ発現量は、それぞれ７５０μｇ及び１６００μｇであった。この場合の中部絹糸腺内のＥＧＦＰは、後部絹糸腺で発現したＥＧＦＰが移行したものであるため、後部絹糸腺では２３５０μｇのＥＧＦＰが発現したことになる。この発現量は、図２（ｃ）で示す従来の後部絹糸腺遺伝子発現系の発現量（Ｒｏｙｅｒ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２）と比較して１０〜５０倍多い。
これらの結果は、本発明の遺伝子組換えカイコにおいて後部絹糸腺で発現した組換え水溶性タンパク質であるＥＧＦＰが細胞外に効率的に、かつ中部絹糸腺での発現量よりも高い量で分泌されていることを示している。
＜実施例５：繭中の組換えタンパク質＞
（方法）
実施例２で作出した各遺伝子組換えカイコを実施例２と同様の方法で飼育して営繭させた後、その繭を固定せずに蛍光顕微鏡（オリンパスＳＺＸ１６、ＧＦＰフィルター）で観察した。
（結果）
図７に結果を示す。中部及び後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを有する組換えカイコの繭にはＥＧＦＰが含まれることが確認された。この結果は、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットから発現した水溶性ペプチドであるＥＧＦＰを繭から回収できることを示唆している。
＜実施例６：後部絹糸腺におけるシグナルペプチドの効果＞
後部絹糸腺又は中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドによる後部絹糸腺でのＥＧＦＰの発現及び分泌量について検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
比較用第２サブユニットｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐ２５＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図８Ａ）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチドのみが後部絹糸腺特異的に発現するｐ２５由来のシグナルペプチドとなっている。なお、ｐ２５のシグナルペプチドＤＮＡには、エクソン１からエクソン２の第１アミノ酸までのゲノム配列を用い（配列番号２０）、さらに、ｐ２５のシグナルペプチド中のシトシンをイソロイシンに置換している（配列番号２１）（後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットのシグナルペプチドは、セリシン１由来）。ｐ２５のシグナルペプチドＤＮＡのエクソン−イントロン配列（Ｒｏｙｅｒ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ，１４：４６３−４７２）は、制限酵素ＮｈｅＩサイトを含む配列番号２２で示すプライマーとＢｓｐＨＩサイトを含む配列番号２３で示すプライマーを用いてカイコ大造系統のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（アジレント・テクノロジー）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドをＳｍａＩとＢｓｐＨＩで処理し、分離されたＳｍａＩ−ＢｓｐＨＩ断片をｐＥＧＦＰ＿ＮｃｏＩ＿ＮｈｅＩプラスミド（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７）のＨｉｎｃＩＩ−ＮｃｏＩサイトへ挿入した。得られたプラスミドをＮｈｅＩで部分消化し、約１．３ｋｂのＮｈｅＩ断片を分離した。このＮｈｅＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミド（Ｔａｔｅｍａｔｓｕ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９（３）：４７３−８７）のＢｌｎＩサイトへ挿入し、比較用第２サブユニットｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐ２５＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと第２サブユニットの両方を有する系統は、実施例２で作成した系統を用いた。
一方、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと比較用第２サブユニットの両方を有する系統は、まず、比較用第２サブユニットを有する系統を作成し、その後、第１サブユニットと比較用第２サブユニットのそれぞれ有する系統を交配して、一個体に両方の遺伝子発現ユニットを有する系統を実施例２と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜して得た。比較用第２サブユニットを有する系統を作成する方法及び第１サブユニットと比較用第２サブユニットのそれぞれ有する系統を交配する方法は、実施例２に記載の方法に準じて行った。
（３）飼育条件
実施例２に記載の方法に準じた。
（４）絹糸腺におけるＥＧＦＰの発現量
後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットと、セリシン１のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統又はｐ２５のシグナルペプチドを含む比較第２サブユニットを有する系統におけるＥＧＦＰの発現量を測定した。方法は、実施例４に記載の方法に準じた。
（結果）
図８Ｂに結果を示す。いずれの系統も後部絹糸腺遺伝子発現ユニットの第１サブユニットを有することから、ここで検出されたＥＧＦＰタンパク質は、全て後部絹糸腺で発現したものであり、中部絹糸腺で検出されたＥＧＦＰタンパク質は、後部絹糸腺で発現後に移行したものを示す。したがって、後部絹糸腺で発現したＥＧＦＰタンパク質の実際の発現量は、中部絹糸腺と後部絹糸腺のＥＧＦＰタンパク質量の和となる。
この図で示すように、後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質であるｐ２５由来のシグナルペプチドを含む比較第２サブユニットを有する系統（図８Ｂのｐ２５）のＥＧＦＰタンパク質量に対して、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質セリシン１由来のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統（図８Ｂのセリシン１）のそれは約１０倍もあることが明らかとなった。この結果は、セリシン１由来のシグナルペプチドと結合したＥＧＦＰが後部絹糸腺細胞から効率的に分泌されるのに対し、ｐ２５由来のシグナルペプチドと結合したＥＧＦＰは後部絹糸腺細胞から効率的に分泌されないことを示している。これらの結果から本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットにおけるシグナルペプチドは、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドが適当であることが示された。
また、セリシン１由来のシグナルペプチドを含む第２サブユニットを有する系統では、発現したＥＧＦＰタンパク質の９０％以上が中部絹糸腺に移行していたことから、後部絹糸腺で発現した目的のペプチドがより回収しやすいという利点もある。
＜実施例７：哺乳動物由来のシグナルペプチドと目的のペプチドの影響（１）＞
哺乳動物由来のシグナルペプチド及び／又は目的のペプチドを含む遺伝子発現ユニットによる絹糸腺での目的のペプチドの発現及び分泌量について検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
第１検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図９Ａ：シグナルペプチドがセリシン１の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、目的のペプチドのみがブタのインターロイキン２（ＩＬ−２）由来となっている点で異なる。セリシン１のシグナルペプチドＤＮＡ配列の下流に配列番号２４で示すブタＩＬ−２をコードする遺伝子（ただし、ブタＩＬ−２が本来持つ配列番号２５で示すシグナルペプチドＤＮＡを除く）を連結した断片は、制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号２６で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号２７で示すプライマー、及びセリシン１のシグナルペプチドとＩＬ−２の接続部分の配列を持つプライマー配列番号２８、と配列番号２９を用い、ｐＡｃＰＩＬ２（Ｉｎｕｍａｒｕ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．５：１４６−１４９）とｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第１検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
第２検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図９Ａ：シグナルペプチドがブタＩＬ−２の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチド及び目的のペプチドがいずれもブタＩＬ−２由来となっている点で異なる。ブタＩＬ−２のペプチドをコードするＤＮＡ断片は制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３０で示すプライマーと配列番号３１で示すプライマーを用い、ｐＡｃＰＩＬ２からＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第２検証用第２サブユニットＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｐｏＩＬ２／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
後部又は中部絹糸腺遺伝子発現ユニットのそれぞれの第１サブユニットと、上記第１又は第２検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統は、まず、第１又は第２検証用第２サブユニットＩをそれぞれ有する系統を作成し、その後、第１サブユニットと、各検証用第２サブユニットＩを有する系統を交配して、一個体に第１又は第２のサブユニットを有する系統を実施例２と同様に３ｘＰ３ＥＧＦＰマーカー及び３ｘＰ３ＤｓＲｅｄマーカーによる眼の蛍光の有無で選抜して得た。第１又は第２検証用第２サブユニットＩを有する系統を作成する方法、及び第１サブユニットと、第１又は第２検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統を交配する方法は、実施例２に記載の方法に準じて行った。
また、比較用として、実施例１で構築した中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット（ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２）（図４（ａ））と上記検証用第２サブユニットＩの両方を有する系統も上記と同様に作成した。
（３）飼育条件
実施例２に記載の方法に準じた。
（４）ウエスタンブロッティング
実施例４に記載の方法に準じて、それぞれの系統から中部絹糸腺及び後部絹糸腺を摘出し、各絹糸腺中のタンパク質を抽出した。続いて、絹糸腺抽出液を等量のＥＺアプライ（ＡＥ−１４３０、ＡＴＴＯ）と混合し、９５℃で５分間加温することによりＳＤＳ化した。ＳＤＳ化したサンプルを９ｃｍ×８ｃｍの１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、２０ｍＡ定電流で約９０分間泳動した。ゲルはセミドライ転写装置（ＮＡ−１５１２Ｓ、日本エイドー）を用いて、１２０ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥヘルスケア）に転写した。転写後のメンブレンをＥＺ  ｗａｓｈ（ＡＥ−１４８０、ＡＴＴＯ）で５分間軽く振とうした後、１次抗体（抗ＩＬ−２ウサギ血清、２，０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた。メンブレンをＥＺ  ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、２次抗体（ＮＡ９３４−１００ＵＬ、ＧＥヘルスケア、５０，０００倍希釈）を室温で１時間反応させた。メンブレンをＥＺ  ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア）を５分間反応させ、ＬＡＳ３０００（Ｆｕｊｉフィルム）でシグナルを検出した。
（結果）
図９Ｂ、Ｃに結果を示す。
まず、第１検証用第２サブユニットのセリシン１由来のシグナルペプチドとブタＩＬ−２のキメラ遺伝子を含む遺伝子発現ユニットの場合、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｂ）及び中部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｃ）のいずれも効率よく発現、分泌されることが明らかとなった。特に後部絹糸腺遺伝子発現ユニットでは、非常に多くのブタＩＬ−２が発現、分泌されている。これは、本願発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、目的のペプチドが絹糸虫以外の他生物種由来の水溶性ペプチドであっても中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドとのキメラタンパク質として発現させることによって、目的の水溶性ペプチドを絹糸虫の後部絹糸腺内で大量に製造することができることを示唆している。
一方、シグナルペプチドと目的のペプチドが共にブタＩＬ−２由来の第２検証用第２サブユニットを有する遺伝子発現ユニットの場合、中部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｃ）では効率よく発現、分泌されたが、後部絹糸腺遺伝子発現ユニット（図９Ｂ）では、発現量及び後部絹糸腺から中部絹糸腺への移行共に効率が非常に低かった。この結果は、特許文献１に記載のディフェンシンの結果と矛盾しない。つまり、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質及びフィブロイン構成タンパク質のいずれかに由来するシグナルペプチド以外のシグナルペプチドが結合したタンパク質は、後部絹糸腺細胞からの分泌が抑制されてしまうことが明らかになった。
以上より、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドは、絹糸虫の後部絹糸腺での水溶性ペプチドの大量発現、分泌、及び中部絹糸腺への移行に好適であることが立証された。
＜実施例８：哺乳動物由来のシグナルペプチドと目的のペプチドの影響（２）＞
実施例７とは異なる哺乳動物由来のシグナルペプチド及び／又は目的のペプチドを含む遺伝子発現ユニットを用いて、各絹糸腺での目的のペプチドの発現及び分泌量について再度検証した。
（方法）
（１）発現ベクターの構築
第１検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図１０Ａ：シグナルペプチドがセリシン１の場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、目的のペプチドのみがウシのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）由来となっている点で異なる。セリシン１のシグナルペプチド配列の下流にＩＦＮγ（ＩＦＮγが本来持つシグナルペプチドを除く）をつないだ断片は、制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３２で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３３で示すプライマー、及び、セリシン１のシグナルペプチドとＩＦＮγの接続部分の配列を持つプライマー配列番号３４、と配列番号３５を用い、ｐＢＩＦＮ−γ（Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００１  ＣＹＴＯＫＩＮＥ．１３（１）１８−２４）とｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇＥＧＦＰ／３ｘＰ３ＥＧＦＰからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第１検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｓｅｒ＿ｓｉｇｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
第２検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ（図１０Ａ：シグナルペプチドがウシＩＦＮ−γの場合）を構築した。このサブユニットは、実施例１で構築した後部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第２サブユニットと基本構造は同じであるが、シグナルペプチド及び目的のペプチドがいずれもウシＩＦＮ−γ由来となっている点で異なる。ウシＩＦＮγのアミノ酸をコードするＤＮＡ断片（配列番号３６：ただし、ウシＩＦＮ−γが本来持つ配列番号３７で示すシグナルペプチドＤＮＡを除く）は制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３８で示すプライマーと制限酵素ＢｌｎＩサイトを含む配列番号３９で示すプライマーを用い、ｐＢＩＦＮ−γからＰＣＲで増幅して調製した。増幅断片をｐＺＥｒＯ−２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。得られたプラスミドをＢｌｎＩで処理し、分離されたＢｌｎＩ断片をｐＢａｃ［ＳｅｒＵＡＳ／３ｘＰ３ＥＧＦＰ］プラスミドのＢｌｎＩサイトへ挿入し、第２検証用第２サブユニットＩＩ：ｐＢａｃＳｅｒＵＡＳ−ｂｏＩＦＮγ／３ｘＰ３ＥＧＦＰを構築した。
（２）カイコ系統
後部又は中部絹糸腺遺伝子発現ユニットのそれぞれの第１サブユニットと、上記第１又は第２検証用第２サブユニットＩＩの両方を有する系統は、実施例２及び７に記載の方法に準じて行った。
また、比較用として、実施例１で構築した中部絹糸腺遺伝子発現ユニット用第１サブユニット（ｐＢａｃＳｅｒ−ｐｒｏ  ＧＡＬ４／３ｘＰ３ＤｓＲｅｄ２）（図４（ａ））と上記検証用第２サブユニットＩＩの両方を有する系統も実施例７と同様に作成した。
（３）飼育条件
実施例２に記載の方法に準じた。
（４）ウエスタンブロッティング
実施例４に記載の方法に準じて、それぞれの系統から中部絹糸腺及び後部絹糸腺を摘出し、各絹糸腺中のタンパク質を抽出した。続いて、絹糸腺抽出液を等量のＥＺアプライ（ＡＥ−１４３０、ＡＴＴＯ）と混合し、９５℃で５分間加温することによりＳＤＳ化した。ＳＤＳ化したサンプルを９ｃｍ×８ｃｍの１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて、２０ｍＡ定電流で約９０分間泳動した。ゲルはセミドライ転写装置（ＮＡ−１５１２Ｓ、日本エイドー）を用いて、１２０ｍＡ、６０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（ＲＰＮ３０３Ｆ、ＧＥヘルスケア）に転写した。転写後のメンブレンをＥＺ  ｗａｓｈ（ＡＥ−１４８０、ＡＴＴＯ）で５分間軽く振とうした後、１次抗体（抗ＩＦＮγ抗体：ＡＳ１０１９．２、コスモバイオ、２，０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた。メンブレンをＥＺ  ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、２次抗体（ＮＡ９３４−１００ＵＬ、ＧＥヘルスケア、５０，０００倍希釈）を室温で１時間反応させた。メンブレンをＥＺ  ｗａｓｈで１０分間、３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＲＰＮ２２３２、ＧＥヘルスケア）を５分間反応させ、ＬＡＳ３０００でシグナルを検出した。
（結果）
図１０Ｂ、Ｃに示すように、実施例７とは異なる哺乳動物由来の水溶性タンパク質及びシグナルペプチドに変えた場合でも、結果は実施例７とほとんど同じ傾向を示した。
以上の結果から、中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質由来のシグナルペプチドが結合したキメラタンパク質であれば、水溶性ペプチドであっても後部絹糸腺で抑制されることなく効率的に発現及び分泌されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットによれば、後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを絹糸虫に導入することで、組換えペプチド等の大量発現及び分泌、かつ簡便な回収が可能となる。
本発明の組換え遺伝子絹糸虫によれば、前記組換えペプチドの大量生産系絹糸虫を提供することができる。
本発明の組換え遺伝絹糸虫の作出方法によれば、本発明の後部絹糸腺遺伝子発現ユニットを絹糸虫に導入することで、前記組換えペプチドの大量生産系生物を容易に作出することができる。
本発明の組換えペプチドを製造する方法によれば、水溶性ペプチドを容易に製造することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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