(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有し、
前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、除去標的ＤＮＡの除去方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
前記発現工程の前に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞を得る工程を更に有する、請求項１に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項３】
前記宿主細胞を得る工程は、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと前記領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを前記宿主細胞に導入する工程と、
前記ターゲティングベクターの導入後に、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが前記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第１の選択工程とを含み、
前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記ターゲティングベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有し、
前記第１の選択工程は、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われる、請求項２に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項４】
前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、スクロース致死性遺伝子ＤＮＡである、請求項３に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項５】
前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記発現ベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第３のマーカー遺伝子ＤＮＡとを有し、
前記除去標的ＤＮＡの除去方法は、前記発現工程後に、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として、前記ゲノムＤＮＡ中における前記除去標的ＤＮＡが除去された前記宿主細胞を選択する第２の選択工程を更に有する、請求項１から４のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項６】
前記宿主細胞は、細菌細胞である、請求項１から５のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項７】
前記細菌細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞である、請求項６に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項８】
前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡであり、
前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡは、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡである、請求項６又は７に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【請求項９】
φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子ＤＮＡとを含む領域を有する、ＤＮＡカセットであって、
前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、ＤＮＡカセット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項１０】
前記マーカー遺伝子ＤＮＡが、配列番号３に記載の塩基配列を有する、請求項９に記載のＤＮＡカセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除去標的ＤＮＡの除去方法、ＤＮＡカセット、及び発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、宿主細胞のゲノム中の遺伝子破壊や、遺伝挿入を行う際には、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いて、遺伝子破壊や遺伝子挿入された宿主細胞を選択する手法が用いられてる。
【０００３】
しかしながら、マーカー遺伝子ＤＮＡは、目的の形質転換体を選択した後は不要であり、マーカー遺伝子ＤＮＡが残ることにより、形質転換体の操作の妨げとなる場合がある。そこで、形質転換体を得た後に、このマーカー遺伝子ＤＮＡを取り除くために、部位特異的組換え酵素を用いることが知られている。
【０００４】
部位特異的組換え酵素は、主に、チロシン型インテグラーゼと、セリン型インテグラーゼの２種類に分類される。
【０００５】
チロシン型インテグラーゼは、組換え反応に宿主側の因子を必要とする、必要とする認識配列が長い等の操作性が低いという問題を有する。
【０００６】
これに対し、セリン型インテグラーゼは、反応に宿主側の因子を必要としない、必要とする認識配列が短い等の、操作性において優れた性質を有することが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｕｌ  Ｃ．Ｍ．Ｆｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｗ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｇｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４；４２６（１５）：２７０３−２７１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、セリン型インテグラーゼは、操作性に優れた性質を有する一方で、確実にＤＮＡの除去ができるかが不明であり、セリン型インテグラーゼの操作性に優れた性質を有効に発揮したＤＮＡの除去系は未だに存在しなかった。そのため、ＤＮＡの除去を確実に行うことができ、かつ、操作性に優れた方法が求められていた。
【０００９】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、確実性が高く、かつ、操作性に優れた除去標的ＤＮＡの除去方法、このような除去標的ＤＮＡの除去方法に適したＤＮＡカセット、及び発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、宿主細胞におけるゲノムＤＮＡ中の除去標的ＤＮＡの除去に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を用いることで、確実性が高い除去標的ＤＮＡの除去を可能とし、操作性において優れることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１１】
（１）  φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する、除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１２】
（２）  前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、（１）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００１３】
（３）  前記発現工程の前に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞を得る工程を更に有する、（１）又は（２）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１４】
（４）前記宿主細胞を得る工程は、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと前記領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを前記宿主細胞に導入する工程と、
前記ターゲティングベクターの導入後に、前記宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが前記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第１の選択工程とを含み、
前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記ターゲティングベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有し、
前記第１の選択工程は、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われる、（３）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１５】
（５）前記第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、スクロース致死性遺伝子ＤＮＡである、（４）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１６】
（６）  前記除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡであり、
前記発現ベクターは、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なる第３のマーカー遺伝子ＤＮＡとを有し、
前記除去標的ＤＮＡの除去方法は、前記発現工程後に、前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として、前記ゲノムＤＮＡ中における前記除去標的ＤＮＡが除去された前記宿主細胞を選択する第２の選択工程を更に有する、（１）から（５）のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１７】
（７）  前記宿主細胞は、細菌細胞である、（１）から（６）のいずれかに記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１８】
（８）  前記細菌細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞である、（７）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００１９】
（９）  前記第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡであり、
前記第３のマーカー遺伝子ＤＮＡは、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡである、（７）又は（８）に記載の除去標的ＤＮＡの除去方法。
【００２０】
（１０）  φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子ＤＮＡとを含む領域を有する、ＤＮＡカセットであって、
前記２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、ＤＮＡカセット。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００２１】
（１１）  前記マーカー遺伝子ＤＮＡが、配列番号３に記載の塩基配列を有する、（１０）に記載のＤＮＡカセット。
【００２２】
（１２）  φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡと、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有する発現ベクター。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、確実性が高く、かつ、操作性に優れた除去標的ＤＮＡの除去方法、このような除去標的ＤＮＡの除去方法に適したＤＮＡカセット、及び発現ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ｐＪＰ  ＣＳＫφのプラスミドマップを示す図である。
【図２】ａｔｔＢ及びａｔｔＰのそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。（ａ）は、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。（ｂ）は、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
【図３】ｐＪＰ  ＣＳＫφの塩基配列のうち、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットのアタッチメントサイト周辺の塩基配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例に係るターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘの作製の流れを示す図である。（ａ）は、標的遺伝子Ｘの上流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ａ」）及び下流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ｂ」）が組み込まれる前のｐＪＰ  ＣＳＫφを示し、（ｂ）は、標的遺伝子Ｘの上流域Ａ及び下流域Ｂが組み込まれたターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘを示す。
【図５】ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み替えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株作製の流れを示す図である。（ａ）は、ターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘを示し、（ｂ）は、２回組換え体のゲノムの組換えられた領域周辺を示す。
【図６】本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５のプラスミドマップを示す図である。
【図７】本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５をＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株に形質転換した後に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の塩基配列中の上流側と下流側のプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行った後のＰＣＲ産物についての、電気泳動の画像を示す図である。
【図８】本発明の実施例に係る発現ベクターｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株に形質転換し、宿主細胞中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させ、該部位特異的組換え酵素により、破壊株ゲノム中の除去標的遺伝子ＤＮＡであるカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する流れを示す図である。
【図９】Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノム中の標的遺伝子Ｘの周辺のプライマーペア（標的遺伝子Ｘより上流側に位置する上流域のプライマーと、標的遺伝子Ｘより下流側に位置する下流域のプライマー）によりＰＣＲを行った後のＰＣＲ産物についての、電気泳動の画像を示す図である。（１）は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（２）は、１回組換え体についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（３）は、２回組換え体についてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドであり、（４）は、発現ベクターの形質転換後のＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓについてのＰＣＲ産物の電気泳動後のバンドである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態を説明するが、これらに本発明が限定されるものではない。
【００２６】
＜除去標的ＤＮＡの除去方法＞
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、宿主細胞内において部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有する。本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、これにより、ＤＮＡの除去をより確実に行うことができ、かつ、操作性において優れる。
【００２７】
［発現工程］
本発明における発現工程は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞に、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクターを導入し、宿主細胞内において部位特異的組換え酵素を発現させる工程である。
【００２８】
（部位特異的組換え酵素）
本発明における部位特異的組換え酵素は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素である。φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素は、例えば、配列番号４に記載された塩基配列のＤＮＡによりコードされた部位特異的組換え酵素を用いることができる。ただし、部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡは、これに特に限定されず、例えば、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の機能を損なわない程度に変異・欠失等されたものを用いることができるが、例えば、配列番号４に記載された塩基配列に対して、９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。配列番号４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズできる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００２９】
（認識配列）
本発明における認識配列は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される。
【００３０】
上記認識配列は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識されるものであり、塩基配列が短いものであり、具体的には、１５０ｂｐ以下の長さの塩基配列を有する。認識配列は、１５０ｂｐ以下であれば、特に限定されない。ここで、認識配列が短いと、コドンを揃い、プライマーを設計しやすい等、様々な操作を行いやすいため、短いものが好ましい。他方で、認識配列が短いと、操作性においては優れている一方で、部位特異的組換え酵素により認識しにくくなるため、ＤＮＡの除去効率が低くなることが予想される。しかしながら、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法によると、認識配列が短くしたとしても、確実性の高い除去が行われる。このような観点で、確実性の高い除去を行いつつ、操作性に優れることから、認識配列は短い方が好ましく、より具体的には、５０ｂｐ以下が好ましく、４０ｂｐ以下がより好ましく、３０ｂｐ以下が更に好ましく、２０ｂｐ以下が最も好ましい。
【００３１】
本発明における２つの認識配列の具体例としては、例えば、一方が、配列番号１に記載された配列であり、他方が配列番号２に記載された配列である場合が挙げられる。また、配列番号１の代わりに、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを用いることができる。また、配列番号２の代わりに、配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは、９２％以上、より好ましくは、９５％以上、更に好ましくは、９９％以上）の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。配列番号１又は２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズできる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、更に好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００３２】
特に、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法において、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを用いた場合、上記の配列番号１又は２に記載された塩基配列や、配列番号１又は２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有するＤＮＡを認識配列として用いることで、より確実にＤＮＡの除去が可能となるため、好ましい。
【００３３】
（除去標的ＤＮＡ）
本発明における「除去標的ＤＮＡ」は、宿主細胞内において本発明における部位特異的組換え酵素が発現することで、該部位特異的組換え酵素により、宿主細胞のゲノムＤＮＡから除去されるＤＮＡである。
【００３４】
除去標的ＤＮＡは、特に限定されず、目的や、本発明における各工程における条件に応じて適宜選択することができるが、代表的なものとして、マーカー遺伝子ＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
マーカー遺伝子ＤＮＡは、特に限定されず、目的、検出手段、後述の第２の選択工程等を考慮した上で、従来の公知のものを適宜選択することができる。マーカー遺伝子ＤＮＡとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。
【００３６】
除去標的ＤＮＡは、特に、確実性が高く、操作性に優れることから、配列番号３に記載された塩基配列を有するカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。
【００３７】
（宿主細胞）
本発明の発現工程における宿主細胞は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域（以下、本明細書において、「除去標的領域」ということある。）をゲノムＤＮＡ中に有する。このような宿主細胞であれば、種類は特に限定されないが、例えば、微生物細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。これらのうち、操作性に優れることから、微生物細胞を用いることが好ましい。宿主細胞は、目的に応じて適宜選択することができる。また、宿主細胞の種類に応じて、後述する第１の選択工程や、第２の選択工程の方法（例えば、培養方法、形質転換の方法、マーカー遺伝子の種類等）を、選択することができる。
【００３８】
微生物細胞としては、細菌細胞、酵母、菌類の細胞等が挙げられる。これらのうち、操作性に優れることから、細菌細胞を用いることが好ましい。
【００３９】
細菌細胞としては、特に限定されず、光合成細菌（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ等）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ等）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ等）、Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ属（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ等））、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられるが、これらのうち、光合成細菌は、特に本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に適していることから、好ましい。また、光合成細菌は、特に限定されず、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に適していることから、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属を用いることが好ましい。Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属は、特に限定されないが、認識配列として上記の配列番号１又は２に記載の塩基配列を用いた場合に、より確実にＤＮＡの除去ができることから、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。
【００４０】
酵母細胞は、特に限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等の細胞が上げられる。
【００４１】
植物細胞としては、特に限定されないが、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの菌株Ｃ５８、ＧＶ２２６０、ＬＢＡ４４０４等が挙げられる。
【００４２】
動物細胞としては、特に限定されないが、哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３等）、両生類細胞（アフリカツメガエル卵母細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、Ｓ２、Ｔｎ５等）等が挙げられる。
【００４３】
宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における上記領域は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを有すれものであれば、特に限定されないが、例えば、後述するＤＮＡカセットが好適である。
【００４４】
（発現ベクター）
本発明の発現工程における発現ベクターは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有するものであれば、特に限定されない。なお、「φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクター」とは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素が、宿主細胞内において発現可能に構築されたものであり、宿主細胞内において発現可能となるように、上流側にプロモーター配列を有するものである。プロモーターは、宿主細胞内において発現できるようなものであれば、特に限定されず、宿主の種類に応じて、公知のプロモーターを用いることができる。
【００４５】
発現ベクターの種類は、特に限定されず、宿主細胞や目的に応じて、公知の発現ベクターを用いることができる。例えば、細菌細胞用のベクターとしては、ｐＪＲＤ２１５、ｐＲＬ２５c、ｐＡＣＹＣ等に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡが発現可能に構築されたものを用いることができる。発現ベクターとしては、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いた場合、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡに加え、マーカー遺伝子ＤＮＡとして、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有することが好ましい。このように、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを含むことで、後述の第２の選択工程により発現工程後の宿主細胞を選択する際に、除去標的ＤＮＡの除去が行われた宿主細胞をより確実に選択することができ、すなわち、より確実なＤＮＡの除去が可能である。
【００４６】
（発現ベクターの宿主細胞への導入）
発現ベクターの宿主細胞への導入により、宿主細胞は形質転換される。導入方法は、宿主の種類に応じて、公知の方法を用いることができるが、例えば、接合、エレクトロポレーション法等により、導入することができる。
【００４７】
（φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現）
本発明における発現工程においては、発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内において該部位特異的組換え酵素を発現させる。発現する手段は、特に限定されず、宿主細胞の種類や、発現ベクター内の部位特異的組換え酵素のプロモーターの種類又は発現の機構に応じて、適宜選択される。例えば、ある宿主細胞内において、通常の培養条件で発現できるプロモーターを、発現ベクター内の部位特異的組換え酵素のプロモーターとして用いた場合、そのプロモーターとその宿主細胞を組み合わせて用いることにより、通常の宿主細胞の培養条件で発現させることができる。あるいは、発現誘導剤や、温度変化に応じて発現するプロモータを使用する場合、そのような条件下で培養すれば、部位特異的組換え酵素を発現させることができる。
【００４８】
このような培養の条件は、宿主細胞やプロモーターの条件に応じて、適宜変更されるが、例えば、宿主細胞として、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いた場合、ＰＹＳ培地（例えば、培地組成は、１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のものを用いることができる（ａＢａｓａｌ  Ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、例えば、１ｌあたり、ＥＤＴＡ−３Ｎａ  ４．１２ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．１１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２４．６５ｇ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ２．９４ｇ，ＮａＣｌ  ２３．４ｇ，  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｂ  １０ｍｌ（ｂＴｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、例えば、５００ｍｌあたり、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ５．５８ｇ，  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．４４ｇ，  Ｃｏ（ＮＯ  ３）２・６Ｈ２Ｏ  １．４６ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １．２６ｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．２１ｇ，Ｈ３ＢＯ４  １．５５ｇ，ＥＤＴＡ−３Ｎａ  ２０．６ｇを含むものを用いることができる）を含むものを用いることができる））により、２８〜３３℃で培養することで、発現させることができる。
【００４９】
［発現工程前の宿主細胞を得る工程］
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、発現工程の前に、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域（上述の「除去標的領域」）をゲノムＤＮＡ中に有する宿主細胞を得る工程（以下、本明細書において「宿主細胞を得る工程」ということがある。）を有してもよい。
【００５０】
宿主細胞を得る工程は、特に限定されないが、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを宿主細胞に導入する工程と、ターゲティングベクターの導入後に、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが上記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第１の選択工程とを含むことができる。
【００５１】
（ターゲティングベクターを宿主細胞に導入する工程）
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法において、ターゲティングベクターを宿主細胞に導入することで、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とが組み換えられる。
【００５２】
ターゲティングベクターは、宿主細胞に導入後に、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡと除去標的領域とが組み換え可能に構築されたものであり、除去標的領域を有するものである。ターゲティングベクターは、特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用して、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中の標的遺伝子ＤＮＡと、ターゲティングベクター中の除去標的領域とを組換え可能に構築される。相同組換え可能とするためには、例えば、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中において、標的遺伝子ＤＮＡより上流側に位置する上流域（例えば、８００〜１５００ｂｐ）、及び標的遺伝子ＤＮＡより下流側に位置する下流域（例えば、８００〜１５００ｂｐ）のそれぞれの領域と相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡを、ターゲティングベクター中の除去標的領域より上流側及び下流側にそれぞれ位置するように挿入してターゲティングベクターを構築することができる。
【００５３】
ターゲティングベクター中の除去標的領域は、上述のとおり、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれた除去標的ＤＮＡとを含む領域である。このターゲティングベクター中の除去標的領域に含まれる認識配列と、除去標的ＤＮＡは、それぞれ、上述の「発現工程」で述べたものと同様のものを用いる。特に、「除去標的ＤＮＡ」は、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞を選択するために、マーカー遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。
【００５４】
ターゲティングベクターの作製は、常法により行うことができるが、例えば、以下のような手順で構築することができる。まず、認識配列、及び、除去標的ＤＮＡのそれぞれのＤＮＡ断片を、ＰＣＲや化学合成、アニール等の手段を用いて作製し、その後、制限酵素処理、ライゲーション等を行うことで、除去標的領域を作製する。次いで、この除去標的領域を、ターゲティングベクターの元となるベクター（宿主細胞の種類によるが、例えば、細菌細胞を用いる場合、配列番号５や、配列番号６に記載された塩基配列を有するベクター、あるいは、ｐＪＰ５６０３，ｐＲＬ２７１等）に組み込む。このベクターを相同組換え可能なターゲティングベクターにするために、宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子ＤＮＡの上流域及び下流域をＰＣＲにより増幅し、そのＰＣＲ産物を、常法により（例えば、細菌細胞を用いる場合、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）等を用いることにより）、ターゲティングベクター中の除去標的領域の上流及び下流に組み込むことにより行う。このような方法で、ターゲティングベクターを作製することができる。
【００５５】
上述の、宿主細胞のゲノム中の標的遺伝子ＤＮＡの上流域及び下流域が組み込まれる前の、ターゲティングベクターの元となるベクターに除去標的領域が組み込まれたベクターとしては、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）によるターゲティングベクターの作製に適していることから、除去標的領域として、後述の「ＤＮＡカセット」を含むことが好ましく、特に、除去標的領域のうち、除去標的ＤＮＡとして、配列番号３に記載された塩基配列を有するものが好ましい。このようなベクターの具体例としては、配列番号１５に記載された塩基配列を有するものが挙げられる。
【００５６】
ターゲティングベクターは、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するために、上記除去標的ＤＮＡとは異なる、マーカー遺伝子ＤＮＡを有することが好ましい。本明細書において、「第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ」は、マーカー遺伝子ＤＮＡである「除去標的ＤＮＡ」を指し、「第２のマーカー遺伝子ＤＮＡ」は、ターゲティングベクターが有する、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるマーカー遺伝子ＤＮＡを指す。
【００５７】
第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるものであれば、特に限定されず、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。これらのうち、第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、致死遺伝子を用いることが好ましい。また、致死遺伝子のうち、後述の「第１の選択工程」において、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するために、スクロース致死性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。
【００５８】
第２のマーカー遺伝子ＤＮＡは、ターゲティングベクターの元となるベクターに組み込んでもよく、あらかじめ第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有するベクターを用いてもよく、あるいは、ターゲティングベクターの作製後にこれに組み込んでもよい。
【００５９】
宿主細胞へのターゲティングベクターの導入は、常法により行うことができ、例えば、接合、エレクトロポレーション法等により導入することができる。
【００６０】
（第１の選択工程）
本発明における第１の選択工程は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが除去標的領域に組み換えられた宿主細胞を選択する工程である。
【００６１】
宿主細胞の選択は、マーカー遺伝子ＤＮＡである除去標的ＤＮＡを指標として行うことができる。除去標的ＤＮＡを指標として行う選択は、マーカー遺伝子ＤＮＡの種類に応じで、常法により行うことができる。
【００６２】
宿主細胞の選択は、組換えられた宿主細胞をより確実に選択するためには、上述のとおり、ターゲティングベクターが第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを有し、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ（除去標的ＤＮＡ）及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われることが好ましい。
【００６３】
第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標とする宿主細胞を選択する方法は、特に限定されず、マーカー遺伝子ＤＮＡや宿主細胞の種類に応じて、適宜設定することができるが、例えば、宿主細胞として細菌細胞を用い、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第２のマーカー遺伝子ＤＮＡとして、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡを用いた場合、以下のような手順で行うことができる。この場合において、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を、「第１の薬剤」といい、第２のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を「第２の薬剤」ということがある。
【００６４】
宿主細胞にターゲティングベクターを導入した後、第１の薬剤を含む固形培地で培養し、培地に生えてきたコロニーを得る。次に、得られたコロニーを数回継代して、組換え後のベクターを取り除いた後、いくつかのコロニーを、第１の薬剤と第２の薬剤を含む固形培地に接種して培養する。培養後、固形培地に生えてくるコロニーを選択する。これにより、ゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡが除去標的領域に組み換えられた宿主細胞を選択することができる。
【００６５】
本発明の発現工程前の宿主細胞を得る工程は、得られた宿主細胞が目的とする組み換え体であるか否かを確認する工程を更に有してもよい。確認する方法は、従来の公知の方法を用いることができ、例えば、コロニーＰＣＲ及び電気泳動により確認することができる。
【００６６】
［発現工程後に宿主細胞を選択する第２の選択工程］
本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、発現工程後に、ゲノムＤＮＡ中における除去標的ＤＮＡが除去された宿主細胞を選択する第２の選択工程を更に有してもよい。
【００６７】
第２の選択工程において、除去標的ＤＮＡは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡである。第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、上記の「宿主細胞を得る工程」と同様のものを用いることができる。
【００６８】
第２の選択工程において、発現ベクターは、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを有する。本明細書において、「第３のマーカー遺伝子ＤＮＡ」とは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡと異なるマーカー遺伝子ＤＮＡを指す。なお、「第３のマーカー遺伝子ＤＮＡ」と上述の「第２のマーカー遺伝子ＤＮＡ」とは同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００６９】
第２の選択工程において、発現ベクターは、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡを更に有してもよい。この場合、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡであることが好ましい。これにより、第２の選択工程において、継続して、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡによる薬剤耐性を利用することができる。第２の選択工程において、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡは、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。
【００７０】
第２の選択工程において、宿主細胞の選択は、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行われる。
【００７１】
第１のマーカー遺伝子は、特に限定されないが、上記の「宿主細胞を得る工程」で用いられた「第１のマーカー遺伝子」と同様のものを用いることができる。
【００７２】
第３のマーカー遺伝子は、特に限定されないが、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子、致死遺伝子等のＤＮＡが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光蛋白遺伝子等が挙げられる。発光や呈色反応を触媒する酵素の遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。致死遺伝子としては、各種の宿主細胞の致死遺伝子を使用できるが、スクロース致死性遺伝子、コリシンＥ１遺伝子等が挙げられる。
【００７３】
宿主細胞の選択する方法は、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡを指標として行うことができる。その方法は、特に限定されず、例えば、宿主細胞として細菌細胞を用い、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡ及び第３のマーカー遺伝子ＤＮＡが、薬剤耐性遺伝子ＤＮＡであった場合、発現後の宿主細胞を、第１のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤と、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤の両方を含む固形培地で培養し、生えてきたコロニーを選択することで、選択を行うことができる。このように選択されたコロニーに含まれる宿主細胞は、ゲノム中の除去標的ＤＮＡが除去されたものである。なお、選択後の宿主細胞を、数回継代し、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を含む固形培地と、この薬剤を含まない固形培地とでそれぞれ培養し、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡに関する薬剤を含む固形培地でコロニーが生えてこないことを確認することで、発現ベクターが宿主細胞から取り除かれたことを確認することができる。
【００７４】
特に、宿主細胞が、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞である場合は、第１マーカー遺伝子ＤＮＡとして、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用い、第３のマーカー遺伝子ＤＮＡとしてストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを用いることが好ましい。宿主細胞とマーカー遺伝子ＤＮＡをこのような組み合わせで用いた場合、発現工程後に、カナマイシンとストレプトマイシンとを含む固形培地で培養した後の宿主細胞のコロニーのうち、早く生えてきたもののみをピックアップすることで、より確実に、ゲノム中の除去標的ＤＮＡが除去された宿主細胞を選択することができる。また、発現ベクターを導入することで、カナマイシン耐性遺伝子が当該株のゲノムから除去されるが、この除去と入れ替わりで発現ベクター中のカナマイシン耐性遺伝子が存在するため、第２の選択工程においては継続してカナマイシン耐性を利用でき、かつ、ストレプトマイシン耐性により、発現ベクターの導入株のみを選択することが可能である。
【００７５】
本発明における第２の選択工程は、得られた宿主細胞のゲノムから、除去標的ＤＮＡが除去されたか否かを確認する工程を更に有してもよい。確認する方法は、従来の公知の方法を用いることができ、例えば、コロニーＰＣＲ及び電気泳動により確認することができる。
【００７６】
＜ＤＮＡカセット＞
本発明は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される２つの認識配列と、該２つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子ＤＮＡとを含む領域を有する、ＤＮＡカセットであって、２つの認識配列のうち、一方が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、他方が、以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡである、ＤＮＡカセットを包含する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００７７】
本発明のＤＮＡカセットの用途は、特に限定されず、例えば、宿主細胞の形質転換に用いることができる。宿主細胞への形質転換は、ベクターに組み込み、そのベクターを宿主細胞に形質転換することで行うことができる。特に、本発明のＤＮＡカセットによると、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における除去標的領域として、宿主細胞への形質転換に用いることが好ましい。これにより、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法は、より確実にＤＮＡの除去を行うことができる。本発明のＤＮＡカセットを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における除去標的領域として用いた場合、宿主細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明のＤＮＡカセットは、特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞からのゲノム中のＤＮＡの除去に適している。
【００７８】
マーカー遺伝子ＤＮＡは、特に限定されず、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における第１のマーカー遺伝子と同様のものを用いることができるが、本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に用いた場合、より確実にＤＮＡの除去を行うことができることから、配列番号３に記載の塩基配列を有することで好ましい。
【００７９】
＜発現ベクター＞
本発明は、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡと、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン耐性遺伝子ＤＮＡとを有する発現ベクターを包含する。
【００８０】
本発明の発現ベクターの用途は、特に限定されず、例えば、形質転換に用いることができる。特に、本発明の発現ベクターを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法における発現ベクターとして用いた場合、より確実にＤＮＡの除去を行うことができる。発現ベクターを、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法に用いた場合、宿主細胞は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明の発現ベクターは、特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞からのゲノム中のＤＮＡの除去に適している。
【００８１】
本発明の発現ベクターにおけるφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡは、上述の本発明の除去標的ＤＮＡの除去方法と同様のものを用いることができる。
【実施例】
【００８２】
＜ターゲティングベクターの作製＞
宿主としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを用い、宿主中のゲノムＤＮＡ中における組換え標的遺伝子ＤＮＡの組み換えを行うための、ターゲティングベクターの作製を行った。標的遺伝子ＤＮＡは、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノム中のｐｕｃＢＡ（以下、「標的遺伝子Ｘ」ということがある。）とした。ターゲティングベクターの作製は、まず、ｐＪＰ  ＣＳＫφを作製し、以下に示すとおり手順で行った。
【００８３】
［ｐＪＰ  ＣＳＫφの作製］
図１に、ｐＪＰ  ＣＳＫφのプラスミドマップを示す。このｐＪＰ  ＣＳＫφは、以下の手順で作製した。
【００８４】
（ｐＪＰ  Ｃｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢの作製）
ｐＪＰ  Ｃｍ−ＫＵ（配列番号５）に、ＳａｃＲＢ遺伝子（スクロース致死性遺伝子）ＤＮＡをライゲーションにより組み込み、ｐＪＰ  Ｃｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢ（配列番号６）を作製した。
【００８５】
（ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットの作製）
まず、ＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡを作製した。この際、ＪＰ５６０３プラスミド（ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から入手）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡから、制限酵素サイトＰｓｔＩサイト及びＳｐｈＩサイトを除去したＤＮＡ（以下、「ｐＪＰ５６０３  Ｋｍ−ｍ２」ということがある。）を得た。ＰｓｔＩサイトを除去するために、フォワードプライマーとして配列番号７のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号８のプライマーを用いた。ＳｐｈＩサイトを除去するために、フォワードプライマーとして、配列番号９のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１０のプライマーを用いた。この、制限酵素サイトＰｓｔＩサイト及びＳｐｈＩサイトが除去されたＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、配列番号３に記載されたとおりである。
【００８６】
ｐＪＰ５６０３  Ｋｍ−ｍ２を鋳型とし、フォワードプライマーとして配列番号１１のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を得た後に、ＣｌａＩ、ＰｓｔＩによる制限酵素処理を行った（以下、この制限酵素処理後のＤＮＡ断片を「制限酵素処理ＤＮＡ断片」ということがある。）。
【００８７】
φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の認識配列であるａｔｔＢ（配列番号１）及びａｔｔＰ（配列番号２）のそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片を、オリゴＤＮＡをアニールすることで調製した。調製したそれぞれの付着末端付きのＤＮＡ断片の配列を、図２に示す。図２中、（ａ）は、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示し、（ｂ）は、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。図２中の塩基配列の下線部は、後述する、配列番号１３のプライマー、配列番号１４のプライマーに含まれる配列である。図２に示すように、ａｔｔＢの付着末端付きのＤＮＡ断片は、両端がそれぞれＳａｌＩ及びＣｌａＩに付着できるように設計されている。また、ａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片は、両端がそれぞれＰｓｔＩ及びＳａｃＩに付着できるように設計されている。なお、ａｔｔＢ及びａｔｔＰは、それぞれ、３８ｂｐのφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識される認識配列（アタッチメントサイト）である。
【００８８】
制限酵素処理ＤＮＡ断片と、上記のａｔｔＢ及びａｔｔＰの付着末端付きのＤＮＡ断片についてライゲーションを行った。次いで、ライゲーション産物を鋳型とし、ＰＣＲを行った。フォワードプライマーとして配列番号１３のプライマーを用い、リバースプライマーとして配列番号１４のプライマーを用いた。この操作により、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットを作製した。
【００８９】
（ｐＪＰ  ＣＳＫφの作製）
ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットについて、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩで制限酵素処理を行い、また、ｐＪＰ  Ｃｍ−ＫＵ−ＳａｃＲＢプラスミドのＳａｌＩサイト、ＳｐｈＩサイトに、制限酵素処理後のａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットを挿入し、ｐＪＰ  ＣＳＫφを作製した（図１）。作製したｐＪＰ  ＣＳＫφの塩基配列は、配列番号１５に示されたとおりである。ｐＪＰ  ＣＳＫφの塩基配列のうち、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットのアタッチメントサイト周辺の塩基配列を、図３に示す。
【００９０】
［ターゲティングベクターの作製］
Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムＤＮＡの標的遺伝子Ｘを、相同組換えにより組み替えて破壊株を作製するために、標的遺伝子Ｘより上流側に位置する約１ｋｂｐの上流域、及び、下流側に位置する約１ｋｂｐの下流域のそれぞれの領域をＰＣＲで増幅し、それぞれのＤＮＡ断片を作製した。上流域のＰＣＲには、フォワードプライマーとして配列番号１６のプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１７のプライマーを用いた。下流域のＰＣＲには、フォワードプライマーとして配列番号１８のプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１９のプライマーを用いた。得られた上流域及び下流域のそれぞれのＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）酵素（タカラバイオ株式会社製）を用いて、ｐＪＰ  ＣＳＫφにおけるａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットより上流側と下流側の位置に組み込み、ターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘ（配列番号２０）を作製した。ターゲティングベクターの作製の流れを、図４に示す。図４中、（ａ）は、標的遺伝子Ｘの上流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ａ」）及び下流域約１ｋｂｐ（図４中の「Ｂ」）が組み込まれる前のｐＪＰ  ＣＳＫφを示し、（ｂ）は、標的遺伝子Ｘの上流域Ａ及び下流域Ｂが組み込まれたターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘを示す。図４に示すように、ターゲティングベクターは、ｐＪＰ  ＣＳＫφ中のａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットの上流側及び下流側に、目標遺伝子Ｘの上流域Ａと下流域Ｂとがそれぞれ組み込まれたものである。
【００９１】
＜破壊株の作製＞
ターゲティングベクターを用いて、標的遺伝子Ｘが組換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株の作製を行った。破壊株の選択には、まず、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓにターゲティングベクターを大腸菌Ｓ１７−１λ  ｐｉｒ株を用いた接合により形質転換した後に、カナマイシンを含む固形培地（成分：ＰＹＳ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のもの））で培養し、カナマイシン耐性遺伝子を有する株を選択し、組み換え体（以下、「１回組換え体」ということがある。）を含むコロニーを得た。次に、１回組換え体を含むコロニーを、数回継代した後に、カナマイシンとスクロースを含む固形培地（成分：ＰＹＳ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のもの））で培養し、生えてきたコロニーを選択することで、目的とする組換え体（以下、「２回組換え体」ということがある。）である破壊株を得た。得られた破壊株が、ゲノム中の標的遺伝子ＸとａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットとが組換えられた破壊株であるかを、コロニーＰＣＲにより確認したところ、組換えが正常に行われたことが確認された。図５に、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み替えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株作製の流れを示す。図５中、（ａ）は、ターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘを示し、（ｂ）は、２回組換え体のゲノムの組換えられた領域周辺を示す。図５に示すように、ターゲティングベクターｐＪＰ  ＣＳＫφ△Ｘを用いることで、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型ゲノム中の標的遺伝子Ｘが、ａｔｔＢ−ＫｍＲ−ａｔｔＰカセットと組換えられた。なお、後述の図９の（２）に示すとおり、「１回組換え体」として得たコロニーについて、コロニーＰＣＲ及び電気泳動を行ったところ、実際には、コロニーに「１回組換え体」と「２回組換え体」の両方が含まれることを示すバンドが確認された。
【００９２】
このように、カナマイシン耐性を利用して選択して１回組換え体を得た後に、スクロース致死性とカナマイシン耐性を利用して選択を行うことで、２回組換え体を確実に選択できることが確認された。
【００９３】
＜発現ベクターの作製＞
φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現ベクターの作製を行った。まず、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ（非営利バイオリソースセンター）から入手）にカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターをＮｄｅＩサイト及びＸｂａＩサイトに挿入した。挿入後のプラスミドに対し、ＮｄｅＩサイト及びＢａｍＨＩサイトに、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の遺伝子ＤＮＡ（配列番号４）を組み込み、発現ベクターであるｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５（配列番号２１）を作製した。ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５のプラスミドマップを、図６に示す。ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５は、カナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子ＤＮＡと、ストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性遺伝子ＤＮＡを有する。
【００９４】
＜破壊株からのカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去＞
Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株からカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去を行うために、まず、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の発現ベクターであるｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を有する大腸菌（ＸＬ１  ｂｌｕｅ  ｐＤＰＴ５１）を、接合により破壊株に導入し、培地（成分：ＰＹＳ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のもの））で培養して、破壊株中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させた。次いで、カナマイシンとストレプトマイシンを含むＰＹＳ（成分：（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のもの））のプレート培地（ＰＹＳ  Ｋｍ／Ｓｍプレート）にプレーティングし、早く成長したコロニーを３〜４個選択した。その後、選択したコロニーを、カナマイシンを含むＰＹＳ（成分：（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ，  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  ５ｇ，Ｎａ−Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ５ｇ，Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎａ  １０ｍｌを含み、ｐＨ  ７．０のもの））のプレート培地（ＰＹＳ  Ｋｍプレート）にストリークした。各コロニーのストリークについて更に、それぞれシングルコロニーをピックアップして、コロニーＰＣＲを行い（プライマーは、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素の塩基配列中の上流側と下流側のプライマーを用いた）、発現ベクターをＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓに形質転換したことを確認した。コロニーＰＣＲ後の電気泳動の写真を図７に示す。図７中の（１）〜（５）は、ピックアップしたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのコロニーについてのＰＣＲ後のバンドであり、（Ｃ）は、コントロール（ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５を有する大腸菌ＸＬ１  ｂｌｕｅ  ｐＤＰＴ５１）についてのＰＣＲ後のバンドである。なお、（Ｍ）は、マーカー（λ−ＥｃｏＴ１４Ｉ）である。図７に示すように、部位特異的組換え酵素のＤＮＡのバンドは、（１）〜（５）の全てにおいて確認されたことから、発現ベクターがＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの標的遺伝子Ｘの破壊株に確実に形質転換されたことが確認された。
【００９５】
図８は、発現ベクターを、ゲノム中の標的遺伝子Ｘが組み換えられたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株に形質転換し、宿主細胞中でφＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を発現させ、該部位特異的組換え酵素により、破壊株ゲノム中の除去標的遺伝子ＤＮＡであるカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する流れを示す図である。図８に示すように、発現ベクターが破壊株に形質転換されると、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素が発現して、破壊株ゲノムからカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去する。
【００９６】
上記コロニーＰＣＲと同時に、得られたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムを用いて、ゲノム中の標的遺伝子Ｘの周辺のプライマーペア（標的遺伝子Ｘより上流側に位置する上流域のプライマーと、標的遺伝子Ｘより下流側に位置する下流域のプライマー）によりＰＣＲを行い、バンドのサイズを確認し、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡを除去したことを確認した。また、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型のゲノム、１回組換え体のゲノム、及び２回組換え体のゲノムについても、同様の操作を行った。そのＰＣＲ後の電気泳動の結果を、図９に示す。図９中、（１）は、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの野生型についてのバンドであり、（２）は、１回組換え体についてのバンドであり、（３）は、２回組換え体についてのバンドであり、（４）は、発現ベクターの形質転換後のＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓについてのバンドである。なお、（Ｍ）は、マーカー（λ−ＥｃｏＴ１４Ｉ）である。図９に示すように、（４）の発現ベクターの形質転換後のバンドは、（１）〜（３）より、短いバンドが得られていることは明らかであり、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株から、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡが除去されたことが確認できた。なお、上記（４）のバンドをクローニングし、シークエンス解析を行ったところ、目的とする組換えが生じ、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡが除去されたことを確認できた。
【００９７】
また、上記コロニーＰＣＲによる確認と同時に、ピックアップしたコロニーについて、抗生物質を含まないＰＹＳ培地の培養液にイノキュレートした。そして、上記のとおり、カナマイシン耐性遺伝子が除去されたことを確認できたコロニーの培養液を、抗生物質を含まないＰＹＳプレートにストリークした。このプレートから、シングルコロニー４個程度を更に別のＰＹＳ（抗生物質を含まない）プレートとＰＹＳ  Ｋｍプレートに接種し、レプリカを作成した。そして、ＰＹＳ  Ｋｍプレート側でコロニーが生えてこず、抗生物質を含まないＰＹＳプレートにのみコロニーが生えてくることを確認することで、ｐｈｉＫ３８Ｉｎｔ−ｐＪＲＤ２１５が破壊株から脱離したことを確認した。
【００９８】
以上で述べたとおり、当該破壊株のゲノム上からのカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡの除去と、発現ベクターの脱離を確認することができた。
【００９９】
このように、本発明のＤＮＡの除去方法によると、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を用いることで、高い確実性で、カナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡがゲノムＤＮＡから除去されたＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの破壊株を選択することができた。特に、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓは、若干のストレプトマイシン耐性を有することから、早く成長したコロニーのみを選択したことにより、より確実にＤＮＡの除去が可能となったものと推測される。また、ＤＮＡの除去に用いた、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素により認識されるａｔｔＢ及びａｔｔＰは、３８ｂｐと短いにもかかわらず、上記のとおり、確実性が高いＤＮＡの除去が可能となった。また、認識配列が３８ｂｐと短いため、コドンを揃えやすい、プライマーを設計しやすい等、様々な操作を行いやすい。これらのことから、本発明によると、確実性が高いのみならず、部位特異的組換え酵素の認識配列を短くすることができるため、操作性に優れたＤＮＡの除去が可能となることが示された。
【０１００】
また、認識配列が３８ｂｐのように短いと、宿主細胞中のゲノム中に、組換え部以外に、認識配列を有する可能性が高く、目的とする部分の除去を確実に組替えるのは困難である。しかし、上記２つの認識配列をＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓのゲノムに組み込んで、φＫ３８−１由来の部位特異的組換え酵素を反応させても、予想外なことに、目的とする部分の除去を確実に行うことができた。このことから、本発明のＤＮＡの除去方法において、宿主細胞としてＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓの細胞を用い、認識配列として上記のａｔｔＢ及びａｔｔＰを用いる組合せが、特に適していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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