(57)【要約】【課題】  ニストースの生成を抑制してケストースを効率よく生成することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼを提供する。【解決手段】  下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、以下のｉ）および／またはｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；ｉ）Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）をグリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、ｉｉ）Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、（ｂ）（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、以下のｉ）および／またはｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）をグリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
（ｂ）（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡまたは請求項４に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、請求項５に記載の形質転換体または請求項５に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有するケストースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼに関し、特に、ニストースの生成を抑制して、効率的にケストースを生成することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法およびそれらを用いたケストースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して、加水分解する酵素である。β−フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解活性に加えて、加水分解によって生じたフルクトースを基質に転移させるフルクトース転移活性を有するものも存在する。そのようなβ−フルクトフラノシダーゼによれば、スクロースを基質として、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖であるケストースを生成することができる。【０００３】
ケストースの中でも１−ケストースは、スクロース（砂糖）と似た甘味質であり、砂糖の三分の一程度の甘さを生じる一方で、砂糖の約半分のカロリーであること、摂取しても血糖値を上昇させにくいこと、アレルギー抑制機能を奏すること（特許文献１）などから、有用なオリゴ糖であることが知られている。１−ケストースを生成するβ−フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼおよびそのアミノ酸配列にアミノ酸変異を導入した変異体のβ−フルクトフラノシダーゼが開示されている（特許文献２および特許文献３）。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１６２１４７号公報
【特許文献２】特許第３６２８３３６号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０８５４４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
スクロースを基質とし、β−フルクトフラノシダーゼを用いてケストースを製造する際には、通常、副生成物として４糖のニストースが生成する。後述する実施例１（１）に示すように、糖液中に一定の割合以上で存在するニストースは、晶析工程でのケストースの結晶化を阻害する。また、後述する実施例１（２）に示すように、ニストースはクロマトグラフィーにおいてケストースとの分離が困難であり、クロマトグラフィーによる分離精製工程を経ても、その含有割合を低減させることが困難である。これらのことから、ケストース結晶を効率的に製造するためには、β−フルクトフラノシダーゼによる酵素反応の反応液において、ケストースの生成量ないしケストースの含有割合を向上させるとともに、ニストースの含有割合を十分に低減させることが必要である。したがって、ニストースの生成を抑制しつつケストースを効率的に生成することができるβ−フルクトフラノシダーゼが求められている。【０００６】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ニストースの生成を抑制しつつ効率的にケストースを生成することができる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＮＢＲＣ ４３０８（以下、「Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ」と略記する。）由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２；全長６２８アミノ酸）に対して、アミノ末端（Ｎ末端）から８５番目のグリシン（Ｇ）を、グリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、または、Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）もしくはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつ効率的にケストースを生成できることを見出し、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。【０００８】
（１）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列（全長６２８アミノ酸）に対して、以下のｉ）および／またはｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）をグリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
（ｂ）（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。【０００９】
（２）本発明に係るポリペプチドは、（１）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。【００１０】
（３）本発明に係るＤＮＡは、（１）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードする。【００１１】
（４）本発明に係る組換えベクターは、（３）に記載のＤＮＡを含む。【００１２】
（５）本発明に係る形質転換体は、（３）に記載のＤＮＡまたは（４）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。【００１３】
（６）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法は、（５）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。【００１４】
（７）本発明に係るケストースの製造方法は、（１）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼ、（５）に記載の形質転換体または（５）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼや本発明に係る形質転換体、本発明に係るケストースの製造方法によれば、ニストースの生成を抑制してケストースを効率よく製造することができる。また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法によれば、ニストースが生成する割合を抑えてケストースを効率よく生成する改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法について詳細に説明する。
【００１７】
本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいう。
【００１８】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列（全長６２８アミノ酸）に対して、以下のｉ）および／またはｉｉ）のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
ｉ）Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）をグリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、
ｉｉ）Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
（ｂ）（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１９】
ここで、「タンパク質構成アミノ酸」とは、下記の表１に掲げるものをいう（生化学事典第４版；東京化学同人社発行、第５７頁、２００７年１２月）。これらのうち、本発明に係る「グリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸」として、好ましくは芳香族アミノ酸、複素環式アミノ酸、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸を、より好ましくはトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）グルタミン酸（Ｅ）およびアルギニン（Ｒ）を挙げることができる。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
上記（ｂ）は、（ａ）と配列同一性が高く、（ａ）において導入されたアミノ酸変異に相当するアミノ酸変異を有し、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列である。
ここで、（ａ）と（ｂ）との同一性の値としては、例えば、８０〜８５％以上、８５〜９０％以上、９０〜９５％以上などを挙げることができる。
すなわち、（ｂ）は、例えば、「（ａ）との同一性の値が８０〜９０％未満とならない範囲で、（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列」からなる。
したがって、（ｂ）の「欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸」の個数として、具体的には、例えば、１〜１２５個（（ａ）との同一性が８０％以上）、１〜１１３個（（ａ）との同一性が８２％以上）、１〜１００個（（ａ）との同一性が８４％以上）、１〜８７個（（ａ）との同一性が８６％以上）、１〜７５個（（ａ）との同一性が８８％以上）、１〜６２個（（ａ）との同一性が９０％以上）、１〜５０個（（ａ）との同一性が９２％以上）、１〜３７個（（ａ）との同一性が９４％以上）、１〜２５個（（ａ）との同一性が９６％以上）、１〜１２個（（ａ）との同一性が９８％以上）などを挙げることができる。
【００２２】
ここで、アミノ酸配列の同一性は、常法に従って確認することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて確認することができる。なお、「同一性」とは一致性を指し、「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」と交換可能に用いられる。
【００２３】
本発明において、あるタンパク質がβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例３（１）に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で培養した後、その反応液の含有物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより確認する。その結果、グルコースやフルクトースなどのβ−フルクトフラノシダーゼの加水分解活性により生じた物質や、ケストースやニストースなどのβ−フルクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性により生じた物質の存在が確認されれば、当該タンパク質はβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有すると判断することができる。
【００２４】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法では、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
【００２５】
また、遺伝子組換え技術による方法では、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例２に示すように、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β−フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
【００２６】
ここで、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、その塩基配列情報に基づいて、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。
【００２７】
例えば、アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例２に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β−フルクトフラノシダーゼまたは当該アミノ酸変異を導入していない改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、当該アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２８】
また、上記（ｂ）の、「（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列」からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加した箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、（ａ）をコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、（ａ）において、当該アミノ酸を欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２９】
また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００３０】
本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端および／またはカルボキシル末端（Ｃ末端）に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。
【００３１】
次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００３２】
また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００３３】
本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β−フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。
【００３４】
また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００３５】
本発明に係る形質転換体は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入するには、相同組換え法などを用いることができる。
【００３６】
次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供する。本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法は、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。なお、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００３７】
本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程において、改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する方法は、形質転換体の態様などに応じて適宜選択することができる。具体的には、形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得してもよく、培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製して取得してもよい。
【００３８】
形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得する方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の細胞表面あるいは細胞内部に発現されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して形質転換体を回収し、これをそのまま改良型βフルクトフラノシダーゼとして取得する方法や、回収した形質転換体を破砕して、これを改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得する方法を挙げることができる。
【００３９】
培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製する方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の外部に分泌されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して培養上清を回収することにより改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製することができる。また、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の内部に発現される場合は、培養物を遠心分離に供して沈殿させた形質転換体を回収し、これを、緩衝液中に懸濁、凍結融解、超音波処理または磨砕するなどして形質転換体を破砕した後、遠心分離に供して上清を回収することにより改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製することができる。その他、精製する方法としては、培養物を熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などに供する方法を挙げることができる。
【００４０】
最後に、本発明は、ケストースの製造方法を提供する。本発明に係るケストースの製造方法は、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。なお、本発明に係るケストースの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４１】
なお、ケストースは、通常、スクロースにフルクトースが結合して生成し、フルクトースが結合する位置により、１−ケストース、６−ケストースおよびネオケストースの３種類が生じうる。すなわち、１−ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成し、６−ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→６）結合して生成し、ネオケストースはフルクトースがスクロース中のグルコース単位にβ（２→６）結合して生成する。また、ニストースは、フルクトースが１−ケストース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成する４糖である。
【００４２】
本発明における「ケストース」とは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖を意味し、１−ケストース、６−ケストースおよびネオケストースを包含する。
【００４３】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪培養する方法を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
【００４５】
本発明に係るケストースの製造方法には、本発明に係るケストースの製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、クロマトグラフィーによるケストースの分離工程や煎糖などの結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
【００４６】
以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法、ケストースの製造方法およびケストースの製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１＞ニストース含有割合の影響の検討
（１）結晶化試験
水溶液に含まれる糖におけるニストースの含有割合（（ｗ／ｗ）％；以下、「ニストース含有割合」という）が５％程度および１０％程度である原料糖液を用いてケストースの結晶を製造し、ケストースの回収率および結晶サイズの確認を行うことにより、ケストースの結晶製造時におけるニストース含有割合の影響を検討した。具体的な手順を以下に示す。【００４８】
まず、水溶液に含まれる糖におけるケストースの含有割合（（ｗ／ｗ）％；以下、「ケストース含有割合」という）が８０％以上、かつ糖濃度が６０（ｗ／ｗ）％程度になるように、ケストース結晶およびフラクトオリゴ糖粉末（メイオリゴＰ；明治フードマテリア社）を水に溶解し、Ｎｏ．１〜４とした。ここで、Ｎｏ．１および２はニストース含有割合が５．２％、Ｎｏ．３および４はニストース含有割合が１０％となるように調製した。その後、ロータリーエバポレータを用いて濃縮し、これを原料糖液とした。一方、ケストース結晶をすりつぶし、メッシュふるいを通過させて粒度を揃えたものをシードとした。【００４９】
１Ｌ容量のナスフラスコに、糖の固形分換算で４００ｇに相当する量の原料糖液を入れ、真空度２９３ｈＰａ（２２０ｍｍＨｇ）で減圧濃縮した。糖液の温度が７８℃に到達した時点でシードを加えて起晶させ、結晶化を行った。シードは、Ｎｏ．１および３には２．５ｐｐｍ、Ｎｏ．２には１．２ｐｐｍ、Ｎｏ．４には１．１ｐｐｍとなるよう加えた。結晶化の途中で、糖の固形分換算で２００ｇに相当する量の原料糖液を、６０℃に加温しながらナスフラスコ内へ供給した。その後、糖液のＢｒｉｘ値および重量を測定した後、小型遠心分離機（Ｈ−１１２；コクサン社）に供して結晶を回収した。回収した結晶は、８０℃に設定した乾燥器に１時間程度静置して乾燥させた。【００５０】
乾燥後の結晶の重量を測定し、次式１により、結晶化によるケストースの回収率を算出した。  
式１；ケストースの回収率＝｛結晶重量／（小型遠心分離機に供した糖液の重量×糖液のＢｒｉｘ値／１００）｝×１００
また、顕微鏡を用いて結晶サイズを観察した。また、結晶および原料糖液を下記の条件により高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、各糖（単糖；フルクトース、単糖；グルコース、２糖；スクロース、３糖；ケストース、４糖；ニストース、およびその他の糖）の含有割合を確認した。各糖の含有割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。その結果を表２に示す。なお、表１中、「−」は測定不可であったことを示す。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ)  ２本
移動相；水
流速  ；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度  ；５０℃
検出  ；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率）【００５１】
【表２】
2016143873.tif 000003
【００５２】
表２に示すように、ケストースの回収率は、Ｎｏ．１および２では、それぞれ４０％および４５％であったのに対して、Ｎｏ．３では１５％であった。また、結晶サイズは、Ｎｏ．１および２ではいずれも結晶サイズが大きかったのに対して、Ｎｏ．３では結晶サイズが小さかった。さらに、Ｎｏ．４では生成した結晶が小さく、結晶が回収できなかった。また、シードの添加量を２．５ｐｐｍとした場合の結晶化に要した時間は、Ｎｏ．１では８時間であったのに対して、Ｎｏ．３では２３時間であった。【００５３】
すなわち、原料糖液におけるニストース含有割合が５．２％である場合は、ケストースの回収率が高く、結晶のサイズも大きく、結晶を得るために要する時間も短いのに対して、原料糖液におけるニストース含有割合が１０％である場合は、ケストースの回収率が低く、結晶のサイズが小さく、結晶を得るために要した時間が長いことが明らかになった。これらの結果から、ケストースの結晶を効率的に製造するためには、原料糖液におけるニストース含有割合は１０％より小さいことが望ましいことが明らかになった。【００５４】
（２）クロマトグラフィーを用いたケストース分離試験
スクロースを基質としてβ−フルクトフラノシダーゼによる酵素反応を行い、種々の割合でニストース、ケストース、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む反応液を得て、Ｎｏ．１〜８とした。これらについて、結晶製造に足る程度までケストース含有割合を高める（ケストース含有割合（ケストース純度）が約８０％程度）ために、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに供してケストースの分離精製を行い、ケストース高純度液を得た。なお、クロマトグラフィーの条件はＮｏ．１〜８のサンプル間で、同一条件とした。反応液およびケストース高純度液における各糖の含有割合を表３に示す。【００５５】
【表３】
2016143873.tif 000004
【００５６】
表３に示すように、ケストース含有割合は、反応液では、Ｎｏ１〜８でそれぞれ、４５．１％、４５．８％、５２．９％、５３．７％、５２．８％、４６．０％、４５．８％および４８．４％であったのに対して、ケストース高純度液では、Ｎｏ１〜８でそれぞれ、７６．６％、７８．１％、８６．４％、８８．３％、８８．０％、７８．７％、７９．２％および７８．６％であった。すなわち、Ｎｏ．１〜８のいずれにおいても、ケストース高純度液では、結晶製造に足る程度（約８０％程度）までケストース含有割合が高くなった。【００５７】
一方、ニストース含有割合は、反応液では、Ｎｏ１〜８でそれぞれ、１１．６％、１０．６％、６．０％、４．７％、４．７％、１０．２％、９．７％および１１．３％であったのに対して、ケストース高純度液では、Ｎｏ１〜８でそれぞれ、１８．６％、１７．０％、９．２％、７．３％、７．４％、１６．４％、１５．８％および１７．３％であった。すなわち、Ｎｏ．１〜８のいずれにおいても、ケストース高純度液では、反応液と比較してニストース含有割合が１．５倍程度に高くなった。具体的には、ニストース含有割合は、反応液で５％程度の場合（Ｎｏ．３、４および５）は、ケストース高純度液でも１０％未満に収まったが、反応液で１０％程度の場合（Ｎｏ．１、２、６、７および８）は、ケストース高純度液では、１５％以上となった。これは、クロマトグラフィーにおいて、ニストースとケストースの分離が困難であるためと考えられる。【００５８】
この本実施例１（２）の結果と上述の本実施例１（１）の結果とから、ケストースの結晶を効率的に製造するためには、β−フルクトフラノシダーゼによる酵素反応後の反応液におけるニストース含有割合は５％程度に抑える必要があることが明らかになった。【００５９】
＜実施例２＞ 改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）を、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアルギニン（Ｒ）に置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｇ８５Ｗ」「Ｇ８５Ｆ」「Ｇ８５Ｙ」「Ｇ８５Ｄ」「Ｇ８５Ｅ」「Ｇ８５Ｒ」と略記する。）、および、Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）を、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、グリシン（Ｇ）またはトリプトファン（Ｗ）に置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｈ３１０Ｋ」「Ｈ３１０Ｄ」「Ｈ３１０Ｒ」「Ｈ３１０Ｙ」「Ｈ３１０Ｇ」「Ｈ３１０Ｗ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる一重変異体および二重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これらを改良型β−フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。【００６０】
（１）野生型β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の取得および発現系の構築
［１−１］ＤＮＡの取得
Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＡ８８１０１．１）をコードするＤＮＡをジェンスクリプト社に依頼して人工合成して取得した。Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号１に、それにコードされるＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に、それぞれ示す。なお、配列番号２において、シグナル配列は１〜２４番目に相当する。【００６１】
［１−２］β−フルクトフラノシダーゼ発現系の構築
下記の条件でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡアンカータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片とした。また、ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片について、常法に従ってシークエンスを行い、その塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、それにコードされるＰｇｓＡアンカータンパク質のアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。【００６２】
《ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号５）
リバースプライマー（下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）【００６３】
また、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（以下、「ｐＣＤＦプラスミド」と略記する；Ｍｅｒｃｋ社）を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＣＤＦプラスミド断片を得た。続いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いｐＣＤＦプラスミド断片とＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片とをライゲーションし、ｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ組換えベクターを構築した。【００６４】
次に、シグナル配列を除去するようにプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをｋａｗａｃｈｉｉ−ＤＮＡ断片とした。
《Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
本鋳型；実施例２（１）［１−１］のＡ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号７）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）【００６５】
また、下記の条件でｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片とした。
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたｐＣＤＦプラスミド由来のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー；５’−ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）【００６６】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いｋａｗａｃｈｉｉ−ＤＮＡ断片およびｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片を連結し、これをｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクターとした。【００６７】
（２）改良型β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の作成
［２−１］一重変異体
本実施例２（１）［１−２］のｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクターを鋳型とし、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ（東洋紡社）をＰＣＲ用酵素として用いて、下記のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行うことにより、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含んだＤＮＡ断片を増幅した。【００６８】
《改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
「Ｇ８５Ｗ」
フォワードプライマー；５’−ＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１２）
「Ｇ８５Ｆ」
フォワードプライマー；５’−ＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１４）
「Ｇ８５Ｙ」
フォワードプライマー；５’−ＴＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１６）
「Ｇ８５Ｄ」
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１７）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１８）
「Ｇ８５Ｅ」
フォワードプライマー；５’−ＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１９）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号２０）
「Ｇ８５Ｒ」
フォワードプライマー；５’−ＣＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号２１）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号２２）
「Ｈ３１０Ｋ」
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２３）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号２４）
「Ｈ３１０Ｄ」
フォワードプライマー；５’−ＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２５）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号２６）
「Ｈ３１０Ｙ」
フォワードプライマー；５’−ＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２７）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号２８）
「Ｈ３１０Ｒ」
フォワードプライマー；５’−ＣＧＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号２９）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号３０）
「Ｈ３１０Ｇ」
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号３１）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号３２）
「Ｈ３１０Ｗ」
フォワードプライマー；５’−ＴＧＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡ  ＧＴＣ−３’（配列番号３３）
リバースプライマー；５’−ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ−３’（配列番号３４）【００６９】
続いて、ＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出し、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフライゲーションを行い、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成した。「Ｇ８５Ｗ」、「Ｇ８５Ｆ」、「Ｇ８５Ｙ」、「Ｇ８５Ｄ」、「Ｇ８５Ｅ」、「Ｇ８５Ｒ」、「Ｈ３１０Ｋ」、「Ｈ３１０Ｄ」、「Ｈ３１０Ｙ」、「Ｈ３１０Ｒ」、「Ｈ３１０Ｇ」および「Ｈ３１０Ｗ」を導入した改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを、それぞれｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｆ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｅ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｒ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｒ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｇ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｗ）組換えベクターとした。【００７０】
［２−２］２重変異体
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、「Ｇ８５Ｗ」および「Ｈ３１０Ｋ」を導入したアミノ酸配列からなる二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。
《改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例２（２）［２−１］のｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクター 
フォワードプライマー；ＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ（東洋紡社）【００７１】
続いて、本実施例２（２）［２−１］に記載の方法により、ＰＣＲ産物の精製およびセルフライゲーションを行い、二重変異体の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ／Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターとした。【００７２】
（３）形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例２（１）［１−２］、（２）［２−１］および（２）［２−２］の各組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル（ニッポンジーン社）に導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のコロニーをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、このうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪培養して、培養物を得た。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。【００７３】
Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水  ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース  ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、２．５Ｍ  ＭｇＣｌ２  ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩）。
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水  ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１  ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２  ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３  １００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩）。【００７４】
＜実施例３＞改良型β−フルクトフラノシダーゼの活性確認
（１）β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応
３０（ｗ／ｗ）％のスクロースを含む０．０４Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、これを３０％スクロース溶液とした。実施例２（３）の組換え大腸菌の培養物０．５ｍＬを遠心分離に供して集菌し、湿重量（湿菌体重量）を測定した。ここに、３０％スクロース溶液３５０μＬを加えて懸濁した後、３０℃、２００ｒｐｍで一定時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、これを反応液とした。酵素反応の時間は、３、９、３２および４８時間とした。【００７５】
（２）酵素反応生成物の確認
続いて、反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを実施例１（１）に記載の条件でＨＰＬＣに供して、反応液に含まれる各糖の含有割合を確認した。また、反応液に含まれるケストースおよびニストースの量を、酵素反応開始時の反応液に含まれていたスクロースの質量にケストースおよびニストースのそれぞれの含有割合を乗じて算出し、湿菌体重量で除した値で表した。その結果を表４に示す。なお、表４中、「−」は検出限界以下であったことを示す。【００７６】
【表４】
2016143873.tif 000005
【００７７】
表４の上から１段目に示すように、酵素反応が３時間の場合において、湿菌体重量あたりのケストースの量は、ｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液（コントロール）では０．９２ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｆ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｅ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではそれぞれ、９．６２ｍｇ、２．６４ｍｇ、１．８０ｍｇ、１．８４ｍｇ、３．４３ｍｇおよび２．７６ｍｇであった。また、湿菌体重量あたりのニストースの量は、コントロールでは１．２６ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｆ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｅ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではそれぞれ、０．８５ｍｇ、０．２３ｍｇ、０．５７ｍｇ、０．２９ｍｇ、０．４６ｍｇおよび０．７９ｍｇであった。また、ニストース含有割合は、コントロールでは２９．６４％であったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｆ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｅ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではそれぞれ、４．５１％、３．４６％、１３．３６％、７．３６％、６．６５％および１２．７８％であった。【００７８】
すなわち、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｆ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｅ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液のいずれにおいても、コントロールと比較して、ケストースの量およびケストース含有割合が増加し、かつ、ニストースの量およびニストース含有割合が顕著に減少した。【００７９】
次に、表４の上から２段目に示すように、酵素反応が９時間の場合において、湿菌体重量あたりのケストースの量は、コントロールでは２．５９ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｒ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｇ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌ではそれぞれ、５．５０ｍｇ、０．０３ｍｇ、７．３５ｍｇ、１．２０ｍｇ、０．２６ｍｇおよび０．４２ｍｇであった。また、湿菌体重量あたりのニストースの量は、コントロールでは０．１５ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｒ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｇ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌ではそれぞれ、０．３７ｍｇ、検出限界以下、０．９５ｍｇ、０．０１ｍｇ、検出限界以下および０．００３ｍｇであった。また、ニストース含有割合は、コントロールでは１．２３％であったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｄ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｒ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクター、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｇ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌ではそれぞれ、２．７６％、検出限界以下、４．９６％、０．１１％、検出限界以下および０．０２％であった。【００８０】
すなわち、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液において、コントロールと比較してケストースの量およびケストース含有割合が増加し、かつ、ケストースの結晶の効率的製造に必要な程度（５％以下）にニストース含有割合が低かった。【００８１】
次に、表４の上から３段目に示すように、酵素反応が４８時間の場合において、湿菌体重量あたりのケストースの量は、コントロールでは１．９９ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では３．８６ｍｇであった。また、湿菌体重量あたりのニストースの量は、コントロールでは３．８９ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では０．１６ｍｇであった。また、ニストース含有割合は、コントロールでは３１．５０％であったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では１．３６％であった。【００８２】
すなわち、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｙ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液において、コントロールと比較してケストースの量およびケストース含有割合が増加し、かつ、ニストースの量およびニストース含有割合が顕著に減少した。【００８３】
最後に、表４の最下段に示すように、酵素反応が３２時間の場合において、湿菌体重量あたりのケストースの量は、コントロールでは０．８２ｍｇ、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では１．３０ｍｇ、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では５．７９ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ／Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では６．４６ｍｇであった。また、湿菌体重量あたりのニストースの量は、コントロールでは１．０８ｍｇ、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では１．２９ｍｇ、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では１．９２ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ／Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では０．４０ｍｇであった。また、ニストース含有割合は、コントロールでは３１．７８％、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では２５．１４％、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では１５．３８％であったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ／Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌では３．４３％であった。【００８４】
すなわち、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ／Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液において、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｈ３１０Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ならびにコントロールと比較して、ケストースの量およびケストース含有割合が増加し、かつ、ニストースの量およびニストース含有割合が顕著に減少した。この結果から、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｇ８５ＷとＨ３１０Ｋとを組み合わせた二重変異を導入することにより、それぞれの一重変異を導入した場合と比較して、よりニストースの生成を抑制しつつ、ケストースを効率的に生成できることが明らかになった。【００８５】
以上の表４の結果から、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）をグリシン（Ｇ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異、または、Ｎ末端から３１０番目のヒスチジン（Ｈ）をリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）もしくはチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつ、ケストースを効率的に生成できることが明らかになった。【００８６】
＜実施例４＞Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと相同なβ−フルクトフラノシダーゼにおける改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成と活性確認
（１）改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
［１−１］アラインメント
Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと６８％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼとして下記（ア）を、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと６０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼとして下記（イ）を、それぞれ抽出した。
（ア）６８％の同一性：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０(以下「Ａ．ｏｒｙｚａｅ」と略記する。)のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＸＰ＿００３１９０５５８）
（イ）６０％の同一性：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＮＩＨ２６２４（以下「Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＸＰ＿００１２１４１７４）【００８７】
次に、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）について、（ア）および（イ）に対してＣｌｕｓｔａｌＷ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）でアラインメントを行った。その結果、Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末端から８５番目のグリシン（Ｇ）は、（ア）および（イ）では、Ｎ末端から７８番目のグリシン（Ｇ）に相当することが明らかになった。【００８８】
そこで、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列およびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から７８番目のグリシン（Ｇ）をトリプトファン（Ｗ）に置換するアミノ酸変異（以下、「Ｇ７８Ｗ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる一重変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これらを改良型β−フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下の本実施例３（１）［１−２］および［１−３］に示す。【００８９】
［１−２］野生型β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の取得
Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓのゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型として下記の条件によりＰＣＲを行い、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡおよびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。なお、鋳型において、β−フルクトフラノシダーゼをコードする領域にイントロンが存在しており、これを除くためにＰＣＲは２回に分けて行った。このＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、それぞれＡ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−１、２およびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−１、２とした。【００９０】
また、常法に従いシークエンスを行って全長の塩基配列を確認した。Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３５に、それにコードされるＡ．ｏｒｙｚａｅ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号３６に、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３７に、それにコードされるＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号３８に、それぞれ示す。【００９１】
《Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−１を増幅するＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＴＧＣＣＴ−３’（配列番号３９）
リバースプライマー；５’−ＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号４０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
《Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−２を増幅するＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＡＧＴＡＣＴＴＧＧＧＣＴＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧ−３’（配列番号４１）
リバースプライマー；５’−ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号４２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−１を増幅するＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号４３）
リバースプライマー；５’−ＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＧＡＡ−３’（配列番号４４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−２を増幅するＰＣＲの条件》
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＡＴＴＡＧ−３’（配列番号４５）
リバースプライマー；５’−ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号４６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）【００９２】
続いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−１および２、ならびにＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−１および２をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてそれぞれ連結し、前者をＡ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−３とし、後者をＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−３とした。次に、シグナル配列を除去するようにプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡおよびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物を、それぞれＡ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−４およびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−４とした。【００９３】
《Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−４を増幅するＰＣＲの条件》
鋳型；Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−３
フォワードプライマー５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧ−３’（配列番号４７）
リバースプライマー５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡ−３’（配列番号４８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−４を増幅するＰＣＲの条件》
鋳型；Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−３
フォワードプライマー５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＴ−３’（配列番号４９）
リバースプライマー５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧ−３’（配列番号５０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）【００９４】
次に、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡを挿入したｐＣＤＦプラスミドのＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片とした。
《ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡを挿入したｐＣＤＦプラスミドのＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例２（１）［１−１］のｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’（配列番号５１）
リバースプライマー；５’−ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号５２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）【００９５】
続いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅ野生型ＤＮＡ断片−４およびｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片、ならびにＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ野生型ＤＮＡ断片−４およびｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ−ＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてそれぞれ連結することにより組換えベクターを得て、前者をｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクターとし、後者をｔｅｒｒｅｕｓ（野生型）組換えベクターとした。【００９６】
［１−３］改良型β−フルクトフラノシダーゼ遺伝子の作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含んだＤＮＡ断片を増幅した。
《Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例４（１）［１−２］のｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＡＣ−３’（配列番号５３）
リバースプライマー；５’−ＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号５４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；本実施例４（１）［１−２］のｔｅｒｒｅｕｓ(野生型)組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号５５）
リバースプライマー；５’−ＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴＧ−３’（配列番号５６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）【００９７】
続いて、実施例２（２）［２−１］に記載の方法により、ＤＮＡ断片の精製およびセルフライゲーションを行い、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡおよびＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ由来の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡがそれぞれ挿入された組換えベクターを作成し、前者をｏｒｙｚａｅ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクター、後者をｔｅｒｒｅｕｓ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターとした。【００９８】
［１−４］形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例４（１）［１−２］および［１−３］の各組換えベクターについて、実施例２（３）に記載の方法により形質転換および形質転換体の培養と回収を行い、組換え大腸菌を得た。【００９９】
（２）活性確認
本実施例４（１）［１−４］の組換え大腸菌を用いて、実施例３（１）および（２）に記載の方法によりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応および酵素反応生成物の確認を行った。ただし、酵素反応の時間は３時間とした。その結果を表５に示す。なお、表５には、比較のために、表４に示す結果のうちｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクターおよびｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌における結果を併せて示す。表５中、「−」は検出限界以下であったことを示す。【０１００】
【表５】
2016143873.tif 000006
【０１０１】
表５に示すように、湿菌体重量あたりのケストースの量は、ｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ０．９２ｍｇ、０．８７ｍｇおよび０．９９ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ９．６２ｍｇ、２．８４ｍｇおよび２．９６ｍｇであった。また、湿菌体重量あたりのニストースの量は、ｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ１．２６ｍｇ、１．６６ｍｇおよび１．１７ｍｇであったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ０．８５ｍｇ、１．５６ｍｇおよび１．６２ｍｇであった。また、ニストース含有割合は、ｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ２９．６４％、３１．６８％および１５．４２％であったのに対して、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクター、ｏｒｙｚａｅ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ４．５１％、２０．８６％および１６．９１％であった。【０１０２】
すなわち、ｋａｗａｃｈｉｉ（Ｇ８５Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、ｋａｗａｃｈｉｉ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較してケストースの量が増加し、ニストースの量が減少し、かつ、ニストース含有割合が顕著に減少したのに対して、ｏｒｙｚａｅ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（Ｇ７８Ｗ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、ｏｒｙｚａｅ（野生型）組換えベクターおよびｔｅｒｒｅｕｓ（野生型）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較して、ケストースの量が増加したもののニストースの量およびニストース含有割合の顕著な減少は認められず、特に、ニストース含有割合はケストースの結晶の効率的製造に必要な程度（５％以下）よりも高い値となった。【０１０３】
この結果から、ニストースの生成を抑制しつつ、ケストースを効率的に生成できるβ−フルクトフラノシダーを得るためには、Ａ．Ｋａｗａｃｈｉｉ由来の野生型β−フルクトフラノシダーゼ（配列番号２）に対してアミノ酸変異を導入する必要があることが明らかになった。
【配列表】
2016143873000001.app
【国際調査報告】
2016143873.tif 000007
2016143873.tif 000008