(57)【要約】  バイオマーカー等の生体物質量を高感度で測定するための担体、担体の製造方法、測定方法の提供。  スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を表面に有することを特徴とする担体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を表面に有することを特徴とする担体。
【請求項２】
前記重合体がスルフィニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体である、請求項１に記載の担体。
【請求項３】
前記重合体がさらに疎水性繰り返し単位を有する、請求項１又は２に記載の担体。
【請求項４】
さらにリガンドを担持させた、請求項１〜３いずれか１つに記載の担体。
【請求項５】
磁性体を含む磁性粒子を有する、請求項１〜４いずれか１つに記載の担体。
【請求項６】
担体にスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を接触させることを特徴とする、前記担体の製造方法。
【請求項７】
測定対象物質を担体へ捕捉させる工程を含み、
前記担体が、請求項４又は５に記載の担体であることを特徴とする
生体物質の免疫学的測定方法。
【請求項８】
さらに前記担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程を含む、請求項７に記載の免疫学的測定方法。
【請求項９】
さらに前記担体に捕捉された対象物質量を測定する工程を含む、請求項７又は８に記載の免疫学的測定方法。
【請求項１０】
同一反応容器中で、測定対象物質を磁性粒子へ捕捉させる反応工程と、前記磁性粒子を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、磁性粒子に捕捉された対象物質を測定する測定工程を行う、生体物質の免疫学的測定方法であって、反応容器内にスルフィニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体を含有する溶液及び前記磁性粒子を投入し、捕捉反応を行うことを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合体を表面に有する担体、当該担体の製造方法、及び、免疫反応を用いてバイオマーカー等の生体物質を高感度で測定する生体物質の免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血清、血漿、尿などの各種生体試料中に含まれている微量物質の測定には、放射免疫測定法（ＲＩＡ）や酵素免疫測定法（ＥＩＡ）などの免疫測定法が採用されている。この際に、不溶性担体として、抗原又は抗体を結合した磁性粒子を用いることがある。【０００３】
しかしながら、不均一相での免疫測定法には、測定試料中に含まれている成分に起因する干渉物質によって引き起こされる、抗原と抗体の特異的な反応に依らない所謂“非特異吸着”に起因するブランク値の上昇という問題がある。また、抗原抗体間の反応から検出反応までの工程を、マイクロタイタープレートのような一つの反応容器で行う場合に、容器の汚染が、著しいブランク値の上昇や測定精度の低下を起こすという問題があった。【０００４】
従来、非特異吸着や容器の汚染を減少させるため、反応系にアルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質を添加する方法や、界面活性剤を添加する方法（特許文献１〜３）等が報告されている。しかしながら、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があり、一方、界面活性剤の使用では、ある程度の効果はあげられているが、未だ十分なものとは云えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−１８７８６２号公報
【特許文献２】特開昭６０−５３８４６号公報
【特許文献３】特開昭６１−２６０１６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、バイオマーカー等の生体物質量を高感度で測定するための担体、担体の製造方法、測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体で処理された担体を用いることより非特異吸着を抑制し、生体物質を高感度で測定できることを見出した。      【０００８】
すなわち、本発明は以下の＜１＞〜＜１０＞に係るものである。
＜１＞スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を表面に有することを特徴とする担体。
＜２＞前記重合体がスルフィニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体である、＜１＞に記載の担体。
＜３＞前記重合体がさらに疎水性繰り返し単位を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。
＜４＞さらにリガンドを担持させた、＜１＞〜＜３＞いずれか１つに記載の担体。
＜５＞磁性体を含む磁性粒子を有する、＜１＞〜＜４＞いずれか１つに記載の担体。
＜６＞担体にスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を接触させることを特徴とする、前記担体の製造方法。
＜７＞測定対象物質を担体へ捕捉させる工程を含み、前記担体が、＜４＞又は＜５＞に記載の担体であることを特徴とする生体物質の免疫学的測定方法。
＜８＞さらに前記担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程を含む、＜７＞に記載の免疫学的測定方法。
＜９＞さらに前記担体に捕捉された対象物質量を測定する工程を含む、＜７＞又は＜８＞に記載の免疫学的測定方法。
＜１０＞同一反応容器中で、測定対象物質を磁性粒子へ捕捉させる反応工程と、前記磁性粒子を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、磁性粒子に捕捉された対象物質を測定する測定工程を行う、生体物質の免疫学的測定方法であって、反応容器内にスルフィニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体を含有する溶液及び前記磁性粒子を投入し、捕捉反応を行うことを特徴とする測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、不均一相における免疫測定法において、干渉物質に起因する非特異的吸着を減少させることができる。これにより、バックグラウンドを下げることができる。そのため生体物質又はこれを含む血液献体などの生体試料を希釈せずに測定することができる。また、同時に免疫反応が効率良く行われることから、低値における測定精度が向上し、分析時間が短縮する。また、重合体による磁性粒子などの担体の処理を反応容器中で行う方法によれば、同時に免疫反応の際の反応容器の汚染も防止できることから、前記の効果はさらに向上する。また、本発明の方法は、固相担体として磁性粒子を用いることが好ましく、その場合には検体の濃縮や洗浄が容易であり、また、多数検体を短時間で測定可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の担体は、スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を表面に有することを特徴とする。
【００１１】
［スルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体］
以下、スルフィニル基を有する繰り返し単位を「繰り返し単位（Ａ）」、当該繰り返し単位を有する重合体を単に「重合体」とも称する。
繰り返し単位（Ａ）としては、スルフィニル基を有する繰り返し単位であれば主鎖にスルフィニル基を有するものであっても、スルフィニル基を側鎖に有するものであってもよく、スルフィニル基を側鎖に有するものが好ましい。
また、繰り返し単位（Ａ）としては、親水性を示すものが好ましい。ここで、本明細書において、親水性とは、水との親和力が強い性質を持つことを意味する。具体的には１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１万〜１０万程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する場合にはその繰り返し単位は親水性である。
また、上記繰り返し単位（Ａ）としては、親水疎水の尺度を示すＨｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ(ＨＬＢ値)が１０以上のものが好ましい。高い親水性を得る場合には、ＨＬＢ値は１５以上がより好ましく、２０〜４０がさらに好ましい。
また、本明細書において、ＨＬＢ値は、化合物の有機性の値と無機性の値の比率から算出されるもの（小田式）を意味し、「Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ  Ｄｉａｇｒａｍ」[１９９８年、ＮＩＨＯＮ  ＥＭＵＬＳＩＯＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ]に記載の計算方法により算出できる。例えば、後述する製造例１に記載のＮ−１−１の共重合体に含まれる親水性繰り返し単位のＨＬＢ値は、（１００×３＋６０×１＋１４０×１）／（２０×１０＋４０×１−１０×３）×１０＝２３．８である。
【００１２】
また、繰り返し単位（Ａ）は特に限定されないが、非特異吸着防止の観点からノニオン性のものが好ましい。
また、繰り返し単位（Ａ）は、スルフィニル基の他に、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等の親水性基を有していてもよい。また、斯かる親水性基の位置および個数は任意であるが、その位置は好ましくは重合体の側鎖である。一方、スルフィニル基以外の親水性基の個数としては、適度な親水性を得る観点から、繰り返し単位１個中に、０〜１２個が好ましく、０〜１０個がより好ましく、０〜５個がさらに好ましく、０〜３個がさらに好ましく、１〜３個がさらに好ましく、２または３個が特に好ましい。また、上記親水性基の中でも、適度な親水性を得る観点から、ヒドロキシ基が好ましい。なお、本発明の効果が失われない範囲で、重合体に含まれる複数のスルフィニル基の一部がスルフィド基やスルホニル基となっていてもよい。
【００１３】
また、上記繰り返し単位（Ａ）の好適な具体例としては、下記式（１）で表される構造を側鎖中に少なくとも１つ含む繰り返し単位が挙げられる。式（１）で表される構造を側鎖中に有する繰り返し単位となるポリマー種としては公知のものを用いることができ、中でも（メタ）アクリレート系のポリマー種、（メタ）アクリルアミド系のポリマー種、スチレン系のポリマー種等が好ましい。より具体的には、下記式（２）で表される繰り返し単位が挙げられる。
【００１４】
【化１】
2014126111.tif 000002
【００１５】
〔式（１）中、Ｒ3は、直接結合または炭素数１〜２４の２価の有機基を示し、Ｒ4は、炭素数１〜１０の有機基を示す。〕
【００１６】
【化２】
2014126111.tif 000003
【００１７】
〔式（２）中、Ｒ1は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ2は、基−Ｏ−、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ5−、基＊−ＮＲ5−（Ｃ＝Ｏ）−（Ｒ5は、水素原子または炭素数１〜１０の有機基を示し、＊は、式（２）中のＲ1が結合している炭素原子と結合する位置を示す）またはフェニレン基を示し、Ｒ3およびＲ4は前記と同義である。〕
ここで、式（１）および（２）中の各記号について詳細に説明する。
【００１８】
Ｒ1は、水素原子またはメチル基を示すが、メチル基が好ましい。
【００１９】
また、Ｒ2は、基−Ｏ−、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ5−、基＊−ＮＲ5−（Ｃ＝Ｏ）−またはフェニレン基を示す。斯かるフェニレン基としては、１，２−フェニレン基、１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基が挙げられる。
【００２０】
また、上記Ｒ5で示される有機基の炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜６である。上記有機基としては、炭化水素基が挙げられる。斯かる炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基および芳香族炭化水素基を包含する概念である。
【００２１】
上記Ｒ5における脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等のアルキル基が挙げられる。
また、上記脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。上記単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
また、上記芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基が挙げられる。
【００２２】
上述のようなＲ2の中でも、非特異吸着抑制効果の観点から、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、フェニレン基が好ましく、基＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−が特に好ましい。
【００２３】
Ｒ3は、直接結合または炭素数１〜２４の２価の有機基を示す。斯かる直接結合としては、単結合が挙げられる。
【００２４】
斯様なＲ3の中でも、炭素数１〜２４の２価の有機基が好ましい。斯かる２価の有機基の炭素数は、好ましくは２〜１８であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは２〜９であり、特に好ましくは３〜６である。
【００２５】
上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられる。２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、直鎖状でも分岐状でもよい。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基等のアルカンジイル基が挙げられる。
【００２６】
また、上記２価の炭化水素基は、置換基を有していてもよく、炭素−炭素結合間にエーテル結合を含んでいてもよい。
上記２価の炭化水素基が有していてもよい置換基としては、前記親水性基が挙げられる。該置換基の個数は、好ましくは１〜５であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１または２である。
また、上記２価の炭化水素基が含んでいてもよいエーテル結合の個数としては、０〜５が好ましく、０〜３がより好ましい。
【００２７】
また、２価の有機基の好適な具体例としては、下記式（３）で表される連結基、炭素数１〜２４のアルカンジイル基が挙げられ、より好ましくは式（３）で表される連結基である。
【００２８】
【化３】
2014126111.tif 000004
【００２９】
〔式（３）中、Ｒ6は、単結合、基−Ｒ8−Ｏ−（Ｒ8は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示す）または下記式（４）で表される連結基を示し、Ｒ7は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、ｎは１または２を示し、＊＊は、式（１）、（２）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
【００３０】
【化４】
2014126111.tif 000005
【００３１】
〔式（４）中、Ｒ9は、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、Ｒ10は、炭素数２または３のアルカンジイル基を示し、ｍ1は１または２を示し、ｍ2は１〜３の整数を示す。〕
【００３２】
上記Ｒ6としては、単結合、基−Ｒ8−Ｏ−が好ましく、単結合が特に好ましい。
【００３３】
また、上記Ｒ7、Ｒ8およびＲ9で示されるアルカンジイル基の炭素数は１〜４であるが、１または２が好ましい。
また、上記アルカンジイル基は直鎖状でも分岐でもよく、前述のアルカンジイル基と同様のものが挙げられる。
【００３４】
また、上記Ｒ10で示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２である。また、該アルカンジイル基としては、Ｒ7で示されるものと同様のものが挙げられる。なお、ｍ2が２または３の場合、ｍ2個のＲ10は同一であっても異なっていてもよい。
また、ｎおよびｍ1としては１が好ましく、ｍ2としては１または２が好ましい。
【００３５】
また、Ｒ4は、炭素数１〜１０の有機基を示す。斯かる有機基としては、Ｒ5で示されるものと同様のものが挙げられる。また、Ｒ4が炭化水素基である場合、斯かる炭化水素基は置換基を有していてもよく、該置換基およびその個数としては、前記２価の炭化水素基が有していてもよいものと同様のものが挙げられる。また、親水性の観点から、Ｒ4としては、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の環構造を含まないものが好ましい。
【００３６】
上述のようなＲ4の好適な具体例としては、前記親水性基を有する炭素数１〜１０の有機基が挙げられ、より好ましくは下記式（５）で表される１価の基、炭素数１〜１０のアルキル基であり、さらに好ましくは式（５）で表される１価の基である。
【００３７】
【化５】
2014126111.tif 000006
【００３８】
〔式（５）中、ｋ1は、１〜４の整数を示し、ｋ2は、０〜４の整数を示し、＊＊＊は、式（１）、（２）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
【００３９】
式（５）中、ｋ1としては、１または２が好ましい。また、ｋ2としては、０〜２の整数が好ましく、０または１がより好ましい。
【００４０】
また、繰り返し単位（Ａ）の合計含有量の下限としては、水溶性の付与、非特異吸着抑制効果の観点から、全繰り返し単位中、１０モル％以上が好ましく、４０モル％以上がより好ましい。特に、本発明の重合体が後述する繰り返し単位（Ｂ）としてスチレン類から誘導される繰り返し単位を含む場合、繰り返し単位（Ａ）の合計含有量の下限は、より好ましくは５０モル％以上であり、さらに好ましくは６０モル％以上であり、さらに好ましくは６５モル％以上である。
一方、上限としては、水溶性の付与、基材との吸着の観点から、全繰り返し単位中、９９モル％以下が好ましく、９０モル％以下がより好ましく、８５モル％以下が特に好ましい。特に、本発明の重合体が後述する繰り返し単位（Ｂ）としてスチレン類から誘導される繰り返し単位を含む場合、繰り返し単位（Ａ）の合計含有量の上限は、より好ましくは８０モル％以下であり、さらに好ましくは７０モル％以下である。
また、質量％としての繰り返し単位（Ａ）の合計含有量の下限としては、水溶性の付与、非特異吸着抑制効果の観点から、全繰り返し単位中、２０質量％以上が好ましく、３５質量％以上がより好ましく、５０質量％以上がさらに好ましく、６０質量％以上がさらに好ましく、７０質量％以上が特に好ましい。特に、本発明の重合体が後述する繰り返し単位（Ｂ）としてスチレン類から誘導される繰り返し単位を含む場合、繰り返し単位（Ａ）の合計含有量の下限は、より好ましくは７５質量％以上であり、さらに好ましくは８０質量％以上である。
一方、上限としては、水溶性の付与、基材との吸着の観点から、全繰り返し単位中、９９質量％以下が好ましく、９８質量％以下がより好ましく、９５質量％以下がさらに好ましく、９０質量％以下が特に好ましい。
なお、繰り返し単位（Ａ）の含有量は13Ｃ−ＮＭＲ等により測定可能である。
【００４１】
また、本発明の重合体としては、さらに疎水性繰り返し単位（以下、繰り返し単位（Ｂ）とも称する）を有するものが好ましい。ここで、疎水性とは、水との親和性が低い性質を持つことを意味する。具体的には、１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１万〜１０万程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して溶解する量が１ｇ未満である場合にはその繰り返し単位は疎水性である。
また、上記繰り返し単位（Ｂ）のＨＬＢ値としては、高い疎水性を得る場合には、２０未満が好ましく、１５未満がより好ましく、０．１以上１０未満がさらに好ましい。
【００４２】
繰り返し単位（Ｂ）としては、疎水性を示す公知のものが挙げられ、特に限定されないが、スチレン類、（メタ）アクリレート類および（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上の単量体から誘導されるものが好ましい。
【００４３】
上記スチレン類から誘導される繰り返し単位としては、下記式（６）で表される繰り返し単位が好ましい。
【００４４】
【化６】
2014126111.tif 000007
【００４５】
〔式（６）中、Ｒ11は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ12は、炭素数１〜１０の有機基を示し、ｐは０〜５の整数を示す。〕
【００４６】
式（６）中、Ｒ12で示される有機基としては、Ｒ5で示されるものと同様のものが挙げられるが、その炭素数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３である。また、親水性基がないものが好ましい。なお、斯かる有機基は、炭素数１〜３のアルコキシ基等が置換していてもよい。また、ｐが２〜５の整数の場合、ｐ個のＲ12は同一であっても異なっていてもよい。
【００４７】
また、ｐは０〜５の整数を示すが、０〜３が好ましく、０がより好ましい。
【００４８】
スチレン類から誘導される繰り返し単位の具体例としては、スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、４−エチルスチレン、４−イソプロピルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、α―メチルスチレン等に由来する繰り返し単位が挙げられる。
【００４９】
また、上記（メタ）アクリレート類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等の（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキル；（メタ）アクリル酸シクロヘキシル等の（メタ）アクリル酸Ｃ6-10シクロアルキル；（メタ）アクリル酸１−メトキシエチル、（メタ）アクリル酸２−メトキシエチル等の（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルコキシＣ1-10アルキル；（メタ）アクリル酸１−アダマンチル、（メタ）アクリル酸１−メチル−（１−アダマンチルエチル）、（メタ）アクリル酸トリシクロ[５．２．１．０2,6]デカン−８−イル等の炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。また、これら（メタ）アクリレート類において、上記Ｃ1-10アルキル基としてはＣ1-8アルキル基が好ましく、上記Ｃ6-10シクロアルキル基としてはＣ6-8シクロアルキル基が好ましく、上記Ｃ1-10アルコキシ基としてはＣ1-6アルコキシ基が好ましく、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基としては、炭素数８〜１２の橋かけ環炭化水素基が好ましい。
また、（メタ）アクリレート類として、末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するポリスチレンのマクロモノマー、末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するポリメチル（メタ）アクリレートのマクロモノマー（東亜合成株式会社製  マクロモノマーＡＡ−６等）、末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するポリブチル（メタ）アクリレートのマクロモノマー（東亜合成株式会社製  マクロモノマーＡＢ−６等）、末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するポリジメチルシロキサンのマクロモノマー（信越化学工業株式会社製  変性シリコーンオイルＸ−２２−２４７５等）等の末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するマクロモノマーを使用してもよい。これらマクロモノマーを使用することによりグラフト共重合体が得られる。
また、上記（メタ）アクリレート類の中でも、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルコキシＣ1-10アルキル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキル、末端に（メタ）アクリロイルオキシ基を有するマクロモノマーが好ましく、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルコキシＣ1-10アルキル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルがより好ましく、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルがさらに好ましく、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルが特に好ましい。
【００５０】
また、上記（メタ）アクリルアミド類としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジＣ1-10アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド等のＮ−Ｃ1-10アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−（１，１−ジメチル−２−アセチルエチル）（メタ）アクリルアミド等のＮ−Ｃ1-10アルカノイルＣ1-10アルキル（メタ）アクリルアミドの他、（メタ）アクリロイルピペリジン等が挙げられる。また、これら（メタ）アクリルアミド類において、上記Ｃ1-10アルキル基としては、Ｃ3-10アルキル基が好ましく、上記Ｃ1-10アルカノイル基としては、Ｃ1-6アルカノイル基が好ましい。
【００５１】
また、繰り返し単位（Ｂ）の合計含有量の下限としては、基材との吸着の観点から、全繰り返し単位中、１モル％以上が好ましく、１０モル％以上がより好ましく、１５モル％以上がさらに好ましい。特に、繰り返し単位（Ｂ）がスチレン類から誘導される繰り返し単位である場合、繰り返し単位（Ｂ）の合計含有量の下限は、より好ましくは２０モル％以上であり、さらに好ましくは３０モル％以上である。
一方、上限としては、水溶性の付与、非特異吸着抑制の観点から、全繰り返し単位中、９０モル％以下が好ましく、８０モル％以下がより好ましく、７０モル％以下がさらに好ましく、６０モル％以下がさらに好ましい。特に、繰り返し単位（Ｂ）がスチレン類から誘導される繰り返し単位である場合、繰り返し単位（Ｂ）の合計含有量の上限は、より好ましくは５０モル％以下であり、さらに好ましくは４０モル％以下であり、さらに好ましくは３５モル％以下である。
また、質量％としての繰り返し単位（Ｂ）の合計含有量の下限としては、基材との吸着の観点から、全繰り返し単位中、１質量％以上が好ましく、２質量％以上がより好ましく、３質量％以上がさらに好ましく、５質量％以上がさらに好ましく、１０質量％以上が特に好ましい。
一方、上限としては、水溶性の付与、非特異吸着抑制の観点から、全繰り返し単位中、８０質量％以下が好ましく、６５質量％以下がより好ましく、５０質量％以下がさらに好ましく、４０質量％以下がさらに好ましく、３０質量％以下が特に好ましい。特に、繰り返し単位（Ｂ）がスチレン類から誘導される繰り返し単位である場合、繰り返し単位（Ｂ）の合計含有量の上限は、より好ましくは２０質量％以下であり、さらに好ましくは１８質量％以下である。
なお、繰り返し単位（Ｂ）の含有量は、繰り返し単位（Ａ）の含有量と同様にして測定すればよい。
【００５２】
また、重合体に含まれる繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とのモル比〔（Ａ）：（Ｂ）〕としては、非特異吸着抑制効果の観点から、１０：３０〜９９：１が好ましく、１０：２０〜９９：１がより好ましい。特に、繰り返し単位（Ｂ）がスチレン類から誘導される繰り返し単位である場合、１０：１５〜５０：１がさらに好ましく、１０：１０〜１０：１がさらに好ましく、１０：８〜１０：３が特に好ましい。
また、上記繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）との質量比＜（Ａ）：（Ｂ）＞としては、非特異吸着抑制効果の観点から、４０：６０〜９９：１が好ましく、５５：４５〜９９：１がより好ましく、６０：４０〜９９：１がさらに好ましい。特に、繰り返し単位（Ｂ）がスチレン類から誘導される繰り返し単位である場合、７０：３０〜９８：２がさらに好ましく、７５：２５〜９０：１０が特に好ましい。
【００５３】
また、上記親水性繰り返し単位（Ａ）及び疎水性繰り返し単位（Ｂ）の組み合わせとしては、非特異吸着抑制効果の観点から、
（Ａ）式（２）で表される親水性繰り返し単位：６０〜９９質量％
（Ｂ）スチレン類、（メタ）アクリレート類および（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上の単量体から誘導される疎水性繰り返し単位：１〜４０質量％の組み合わせが好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が０〜３個である親水性繰り返し単位：６０〜９９質量％
（Ｂ）スチレン類、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルコキシＣ1-10アルキル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルおよび（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上の単量体から誘導される疎水性繰り返し単位：１〜４０質量％の組み合わせがより好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が１〜３個である親水性繰り返し単位：６０〜９９質量％
（Ｂ）スチレン類、炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルおよび（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上の単量体から誘導される疎水性繰り返し単位：１〜４０質量％の組み合わせがさらに好ましく、
（Ａ）式（２）で表され、式（２）中の側鎖部のヒドロキシ基の数が１〜３個であり、且つ式（２）中のＲ2が基＊−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−である親水性繰り返し単位：７０〜９９質量％
（Ｂ）スチレン類、（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキルおよび（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上の単量体から誘導される疎水性繰り返し単位：１〜３０質量％の組み合わせが特に好ましい。
【００５４】
また、本発明の重合体は、前記繰り返し単位（Ａ）以外の親水性繰り返し単位（Ｃ）を有していてもよい。斯様な親水性繰り返し単位（Ｃ）としては、アニオン性の単量体（アニオン性モノマー）、カチオン性の単量体（カチオン性モノマー）、またはノニオン性の単量体（ノニオン性モノマー）から誘導されるものが挙げられ、これらを１種または２種以上含んでいてもよい。
【００５５】
上記アニオン性モノマーとしては、ビニル安息香酸、（メタ）アクリル酸等の不飽和カルボン酸モノマー；スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、イソプレンスルホン酸等の不飽和スルホン酸モノマーが挙げられる。不飽和スルホン酸モノマーを用いれば、免疫診断薬の希釈液として用いた場合の非特異検体のシグナル抑制効果を向上させることができる。
【００５６】
また、カチオン性モノマーとしては、アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド塩化メチル４級塩等の１〜４級アミノ基と不飽和結合を有するものが挙げられる。
【００５７】
また、ノニオン性モノマーとしては、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリセリル、（メタ）アクリル酸ポリオキシエチレン等のヒドロキシ基を有する不飽和カルボン酸エステルモノマー；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド等のヒドロキシ基を有する（メタ）アクリルアミドモノマーが挙げられる。
【００５８】
上記繰り返し単位（Ｃ）の合計含有量としては、全繰り返し単位中、０〜４９モル％が好ましく、０〜２０モル％がより好ましく、０〜１０モル％がさらに好ましく、０〜１モル％が特に好ましい。また、質量％として０〜４９質量％が好ましく、０〜２０質量％がより好ましく、０〜１０質量％がさらに好ましく、０〜１質量％が特に好ましい。
【００５９】
また、本発明の重合体が共重合体である場合、その繰り返し単位の配列の態様は特に限定されず、共重合体は、ブロック共重合体、グラフト共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
また、本発明の重合体の両末端としては、水素原子、アルキル基、ヒドロキシ基、ＲＡＦＴ剤残基が好ましい。
また、本発明の重合体の数平均分子量（Ｍn）としては、５０００〜１００万が好ましく、７０００〜２０万がより好ましく、１万〜１５万が特に好ましい。数平均分子量を５０００以上とすることにより、非特異吸着抑制効果が向上し、一方、１００万以下とすることにより、コーティング性やハンドリング性が向上する。
また、分子量分布（Ｍw／Ｍn）としては、１．０〜５．０が好ましく、１．０〜４．０がより好ましく、１．０〜３．０がさらに好ましく、１．５〜２．５が特に好ましい。
なお、上記数平均分子量および分子量分布は、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【００６０】
また、本発明の重合体としては、非特異吸着抑制効果の観点から、水溶性のものが好ましい。ここで、本明細書において、水溶性とは、１質量％のポリマー固形分となるように重合体を水（２５℃）に添加・混合したときに、目視で透明となることをいう。
また、本発明の重合体としては、ノニオン性のものが好ましい。
【００６１】
また、本発明の重合体としては、水溶性の付与、非特異吸着抑制効果の観点から、ＨＬＢ値が１０〜２２の範囲であるものが好ましい。
【００６２】
次に、本発明の重合体の製造方法について説明する。
本発明の重合体は、（１）公知の重合体の側鎖中にスルフィド基を導入し、斯かるスルフィド基をスルフィニル基に変換すること、（２）重合させたときに側鎖となる部分にスルフィド基を有するモノマーを、重合または他のモノマーと共重合させ、得られた（共）重合体のスルフィド基をスルフィニル基に変換すること、（３）或いは重合させたときに側鎖となる部分にスルフィニル基を有するモノマーを、重合または他のモノマーと共重合させること等により製造できる。
上記製造方法を、下記共重合体（Ｎ−１）の製造方法を例に挙げて具体的に説明する。
すなわち、工程１−Ａ−１および工程１−Ａ−２により、或いは工程１−Ｂまたは工程１−Ｃにより、共重合体（Ｓ−１）を得、これを用いて共重合体（Ｇ−１）を経て共重合体（Ｎ−１）を得る。
【００６３】
【化７】
2014126111.tif 000008
【００６４】
【化８】
2014126111.tif 000009
【００６５】
（式中の各記号は前記と同義である。）
【００６６】
＜工程１−Ａ−１＞
工程１−Ａ−１は、化合物（Ａ−１−１）と化合物（Ｂ−１）とを重合開始剤の存在下で重合させ、共重合体（Ｍ−１）を得る工程である。
化合物（Ａ−１−１）としては、例えば、（メタ）アクリル酸等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、化合物（Ｂ−１）としては、前記スチレン類が挙げられ、その合計使用量としては、化合物（Ａ−１−１）に対し、０．００１〜１．５モル当量が好ましく、０．００５〜０．８モル当量がより好ましく、０．０２〜０．８モル当量がさらに好ましく、０．３〜０．８モル当量が特に好ましい。
【００６７】
また、上記重合開始剤としては、例えば、２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）、ジメチル２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオネート）、２，２'−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ系開始剤；ジ(３，５，５−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド、過酸化ベンゾイル等の過酸化物が挙げられ、これら重合開始剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
重合開始剤の合計使用量は、化合物（Ａ−１−１）に対し、通常０．０００２〜０．２質量倍程度である。
【００６８】
また、工程１−Ａ−１には溶媒、連鎖移動剤を使用してもよい。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル、γ−ブチロラクトン等のエステル系溶媒；トルエン、ベンゼン等の芳香族系溶媒；１、４−ジオキサン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これら溶媒の合計使用量は、化合物（Ａ−１−１）に対し、通常０．５〜１５質量倍程度である。
また、上記連鎖移動剤としては、メルカプトエタノール、チオグリセロール、ｔｅｒｔ−ドデシルメルカプタン等が挙げられる。
【００６９】
また、工程１−Ａ−１の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常０〜１２０℃程度である。
【００７０】
＜工程１−Ａ−２＞
工程１−Ａ−２は、工程１−Ａ−１で得た共重合体（Ｍ−１）の−Ｒ2を、化合物（Ｃ−１）のグリシジル基またはオキセタニル基に対し開環付加させ、共重合体（Ｓ−１）を得る工程である。
工程１−Ａ−２で用いる化合物（Ｃ−１）としては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等が挙げられ、その合計使用量としては、共重合体（Ｍ−１）中の化合物（Ａ−１−１）から誘導される繰り返し単位に対し、１．５〜１０モル当量が好ましく、２〜５モル当量がより好ましい。
【００７１】
また、工程１−Ａ−２は、触媒存在下で行うのが好ましい。触媒としては、テトラブチルアンモニウムブロマイド等の四級アンモニウム塩；テトラブチルホスホニウムブロマイド、テトラブチルホスホニウムクロライド等の四級ホスホニウム塩が挙げられ、これら触媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記触媒の合計使用量は、共重合体（Ｍ−１）中の化合物（Ａ−１−１）から誘導される繰り返し単位に対し、通常０．０１〜０．２モル当量程度である。
また、工程１−Ａ−２で好適に使用される溶媒としては、工程１−Ａ−１と同様のものが挙げられる。
【００７２】
また、工程１−Ａ−２の反応時間は特に限定されないが、通常１〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常４０〜２００℃程度である。
【００７３】
＜工程１−Ｂおよび工程１−Ｃ＞
工程１−Ｂおよび工程１−Ｃは、化合物（Ａ−１−２）または化合物（Ａ−１−３）と、化合物（Ｂ−１）とを重合開始剤の存在下で重合させ、共重合体（Ｓ−１）を得る工程である。
化合物（Ａ−１−２）としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、オキセタニル（メタ）アクリレートが挙げられ、化合物（Ａ−１−３）としては、ビニルベンジルグリシジルエーテル、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等が挙げられる。なお、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
工程１−Ｂおよび工程１−Ｃは、上記工程１−Ａ−１と同様にして行えばよい。
なお、上記工程１−Ａ−１、１−Ａ−２、工程１−Ｂ、工程１−Ｃに先立ち、単量体のうち一方にＲＡＦＴ剤を反応させておくことによりブロック共重合体を合成できる。ＲＡＦＴ剤としては、トリチオ炭酸ドデシルシアノメチルや、２−メチル−２−［（ドデシルスルファニルチオカーバーボニル）スルファニル］プロパン酸、２−シアノ−２−プロピルドデシルトリチオカーボネート等が挙げられる。これらＲＡＦＴ剤の使用量は、上記単量体に対し、通常０．００００１〜０．１質量倍等量である。
また、化合物（Ｂ−１）は、前述の繰り返し単位（Ｂ）を誘導する化合物に変更して共重合させることもでき、斯かる化合物としてマクロモノマーを使用することでグラフト共重合体を合成できる。
【００７４】
＜工程２＞
工程２は、工程１−Ａ−２、工程１−Ｂまたは工程１−Ｃで得た共重合体（Ｓ−１）のグリシジル基またはオキセタニル基に対し、−ＳＲ4を開環付加させ、共重合体（Ｇ−１）を得る工程である。
工程２で用いるＲ4ＳＨで表される化合物としては、チオグリセロール、メルカプトエタノールが挙げられるが、親水性向上の観点から、チオグリセロールが好ましい。
上記化合物の合計使用量は、化合物（Ａ−１−１）、（Ａ−１−２）または（Ａ−１−３）から誘導される繰り返し単位に対し、通常０．１〜２０モル当量であり、好ましくは１〜１０モル当量である。
【００７５】
また、工程２は、触媒存在下で行うのが好ましい。触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン等の塩基性触媒が挙げられ、これら触媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記触媒の合計使用量は、化合物（Ａ−１−１）、（Ａ−１−２）または（Ａ−１−３）から誘導される繰り返し単位に対し、通常０．０１〜３２モル当量である。
【００７６】
また、工程２は、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、工程１で使用できる溶媒の他、エタノール、メタノール等のアルコール系溶媒、またはこれらの混合溶媒が挙げられ、その合計使用量は、共重合体（Ｓ−１）に対し、通常０．５〜２０質量倍程度である。
【００７７】
また、工程２の反応時間は特に限定されないが、通常１〜８時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常４０〜１００℃程度である。
【００７８】
なお、工程２を工程１−Ｂまたは工程１−Ｃの前に実施し、その後工程１−Ｂまたは工程１−Ｃの重合を実施してもよい。
【００７９】
＜工程３＞
工程３は、酸化剤を用いて、工程２で得た共重合体（Ｇ−１）のスルフィド基をスルフィニル基に変換し、共重合体（Ｎ−１）を得る工程である。なお、本発明の効果が失われない範囲で、共重合体中に含まれる複数のスルフィニル基の一部がスルフィド基やスルホニル基となってもよい。
【００８０】
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の使用量は、化合物（Ａ−１−１）、（Ａ−１−２）または（Ａ−１−３）から誘導される繰り返し単位に対し、通常１．０〜１０．０モル当量程度であるが、好ましくは１．０〜２．０モル当量である。
【００８１】
工程３は、溶媒存在下で行うのが好ましい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できるが、水、アルコール系溶媒が好ましい。
上記溶媒の合計使用量は、共重合体（Ｇ−１）に対し、通常１〜２０質量倍程度であるが、好ましくは１〜１５質量倍である。
【００８２】
また、工程３の反応時間は特に限定されないが、通常１〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２５〜７０℃程度である。
【００８３】
なお、前記各工程において、各反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
【００８４】
重合体は、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶剤、水とアルコールとの混合物等の溶剤に溶解した重合体溶液として使用される。斯かる重合体溶液における重合体の含有量は、溶剤１００質量部に対し、０．００１〜１５質量部が好ましく、０．０１〜１０質量部がより好ましい。
【００８５】
［担体］
本発明において使用される担体としては、免疫測定に使用でき、水系媒体中において安定な不溶性の担体であればよく、形状は特に限定されない。例えば、磁性体そのものなどの粉体、磁性体を樹脂中に含有する磁性粒子等の粒子、網目状、不織布等のフィルター、フィルム状、繊維状等が挙げられる。少量の検体から高感度にバイオマーカーを検出する場合には、分離、洗浄の容易さの観点から磁性体、又は、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、公知のものを用いることができ、特に限定されない。
【００８６】
［磁性粒子］
磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだ疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられるが、好適には、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＭｎＦｅ2Ｏ4（Ｍｎ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表現されるフェライト、Ｆｅ3Ｏ4で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ2Ｏ3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ2Ｏ3およびＦｅ3Ｏ4のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００８７】
また、疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーとしては、単官能性モノマーとして、例えばスチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。また、架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００８８】
第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり２０質量％以上のグリシジル基含有モノマーを含むものである。第１モノマー部に所定量のグリシジル基含有モノマーを含む第２モノマー部を重合することにより、２以上のグリシジル基を有する第２ポリマー層を得ることができる。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等を例示できる。
第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより、導入される極性基としては、抗原又は抗体と反応可能な官能基であることが好ましく、例えば、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、および活性エステル基から選択される少なくとも１つであることが好ましい。例えば、得られた磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基および２，３−ヒドロキシプロピル基を有する場合、抗原又は抗体との結合性が良好である。
【００８９】
［重合体を表面に有する担体の製造方法］
本発明のスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を表面に有する担体は、上記担体がスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体で処理されてなるものであり、担体を当該重合体と接触させることにより製造できる。
免疫測定に用いられる担体には測定対象物質に特異的に結合し得るリガンド、例えば抗体又は抗原が担持されるが、重合体による接触は、当該リガンドの担持の前でも後でもよい。
【００９０】
尚、担体へのリガンドの担持は、例えば、測定対象物質が抗原である場合にはそれと特異的に結合し得る抗体が担持されるが、斯かる抗体としては、好ましくはＩｇＧが用いられるが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの低分子化したものを用いてもよい。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメントを用いてもよい。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも適用できる。
【００９１】
リガンドを担体へ固定化する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に担持させる方法などが用いられる。物理的吸着法としては、担体にリガンドを直接固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定化する方法などが挙げられる。
【００９２】
化学的に担持させる方法としては、担体表面に存在するアミノ基、カルボキシ基、メルカプト基、ヒドロキシ基、アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾することにより抗体、抗原等のリガンド分子と結合させることができる官能基を利用して、直接担体上に固定化する方法、担体と抗体、抗原等のリガンド分子との間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に抗体、抗原等のリガンドを結合させた後、そのタンパク質を担体に化学結合させる方法などが挙げられる。
【００９３】
斯かる担体に対する重合体による処理は、重合体を担体の表面に所定時間接触させることができればその手段は限定されないが、例えば、担体を重合体、又は、重合体溶液中に浸漬することで行われる。より詳細には、下記（１）、（２）の通りである。
（１）重合体を含有する溶液に担体を接触させ、分散媒を残したまま溶液中で重合体を担体表面に物理吸着させ、その後、余剰の重合体ごと溶液を除去する方法
（２）重合体を含有する溶液に担体を接触させた後、溶媒を除去し、重合体の乾燥膜を担体表面に形成させる方法
例えば重合体溶液中に磁性粒子を分散させた後、磁力により磁性粒子を集めて上澄み液を除去し、再度磁性粒子を水や緩衝液により再分散させる等の方法で行えばよい。重合体の使用量は、担体１００質量部に対し、０．０１〜１０００質量部使用するのが好ましく、０．１〜５００質量部使用するのがより好ましい。
浸漬は、好ましくは１〜６０分程度、より好ましくは２〜１０分程度、分散し、撹拌することにより行われる。
【００９４】
リガンドが担持された担体を重合体処理する場合は、免疫反応とは別に予め行っておいても良く、また免疫測定を行う反応容器中で行うことも可能である。免疫測定を行う反応容器中で重合体処理を行う場合は、捕捉反応を行う前に重合体を磁性粒子の表面に所定時間接触させることが好ましい。この場合、重合体の使用量は、反応系中、０．０１〜２．００質量％とするのが好ましく、０．１〜０．５質量％とするのがより好ましい。
重合体による処理を反応容器中で行った場合、磁性粒子表面が重合体で処理されるのみならず、反応容器も表面処理され、免疫反応の際の反応容器の汚染を防止でき、干渉物質による非特異的な妨害をより効果的に減少させることができる。
【００９５】
本発明の生体物質の免疫学的測定方法は、測定対象物質を担体へ捕捉させる工程（以下、反応工程ともいう。）を含み、前記担体が、上述した重合体で処理され、その表面に重合体を有する状態であることを特徴とする。さらに前記担体を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程（以下、洗浄工程ともいう。）や、前記担体に捕捉された対象物質量を測定する工程（以下、測定工程ともいう。）を含むことが好ましい。ここで、担体は、捕捉反応の際に、重合体で処理された状態であればよく、予め重合体で処理された担体を用いること、或いは重合体による処理と共に捕捉反応を行うことの何れでもよい。
【００９６】
重合体を表面に有する担体として磁性粒子を用いた場合は、以下の工程を含む態様が好ましい。
（１）同一反応容器中で、測定対象物質を磁性粒子へ捕捉させる反応工程と、前記磁性粒子を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、磁性粒子に捕捉された対象物質を測定する測定工程を行う、生体物質の免疫学的測定方法であって、前記磁性粒子としてスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体で処理された粒子を用いることを特徴とする測定方法。
（２）同一反応容器中で、測定対象物質を磁性粒子へ捕捉させる反応工程と、前記磁性粒子を含む反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う洗浄工程と、磁性粒子に捕捉された対象物質を測定する測定工程を行う、生体物質の免疫学的測定方法であって、反応容器内にスルフィニル基を有する繰り返し単位を有する重合体を含有する溶液を注入し、次いで前記磁性粒子を添加し、捕捉反応を行うことを特徴とする測定方法。
【００９７】
以下、担体が磁性粒子である場合を例に挙げて各反応工程を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜反応工程＞
磁性粒子を、測定対象物質と反応させることにより、磁性粒子上に固定化されたリガンド、好適には測定対象物質と特異的に結合する抗体又は抗原を介して、該測定対象物質を磁性粒子へ捕捉させる。尚、当該反応系には、測定対象物質に特異的に結合し得る標識された抗体が共存していてもよい。
【００９８】
反応は、通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８程度で行われるが、特に限定されるものではない。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が例示されるが、これらに限られない。
また、反応は、通常室温〜４２℃で、５〜６０分間行われる。
【００９９】
上記反応の反応系には、必要に応じて、塩類や、アルブミン等のタンパク質、界面活性剤等を添加することができる。
また、磁性粒子に対する重合体による処理を反応容器中で行う場合は、当該重合体が存在した状態のまま捕捉反応を行うことが可能である。
尚、磁性粒子の重合体による処理を予め行なっておく場合は、適当な容器中で、重合体溶液と磁性粒子を含む溶液を１〜６０分程度、好ましくは２〜１０分程度分散し、撹拌した後、磁性粒子を回収し、上記の反応・測定工程に付せばよい。
【０１００】
＜洗浄工程＞
前記捕捉反応終了後、測定対象物質を捕捉した磁性粒子を含む反応系を洗浄して、未反応の成分や未反応の標識物質等を除去するＢ／Ｆ分離を行う。
未反応の物質を磁性粒子から洗浄・分離除去する方法としては、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて適当な洗浄液（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００含有ＴＢＳ（２０ｍＭのトリスバッファー  ０．９％  Ｓａｌｉｎｅ，  ｐＨ７．４）等）を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行われる。
【０１０１】
＜測定工程＞
前記洗浄工程の後、磁性粒子に捕捉された測定対象物質を測定する。測定は、公知の免疫測定法、すなわち、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等により行なうことができる。例えば、標識物質が化学発光物質または蛍光色素であれば、標識物質が発する発光または蛍光を、標識物質が酵素であれば、この酵素活性を測定することにより、測定対象物質を測定することができる。また、標識物質がラジオアイソトープ（放射性同位体）である場合には、標識物質の放射活性を測定すればよい。
【０１０２】
また、測定法は、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等、何れの手法であってもよいが、感度、特異性等の点から、サンドイッチ法を用いるのが好ましい。
サンドイッチ法に基づいて測定する場合は、測定対象物質に特異的に結合し得る標識された抗体（二次抗体）が添加され、測定対象物質を介して磁性粒子に固定化された二次抗体の標識体に応じて測定が行われる。
【０１０３】
二次抗体の標識は、放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、金コロイド、ラテックス、フェライト粒子等で直接標識すればよいが、上述したように、安全性が高く、良好な測定結果が期待できる点から酵素標識するのが好ましい。好適な標識酵素としては、安定性に優れ、酵素活性が測定しやすいペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【０１０４】
結合された二次抗体の検出又は定量は、任意の公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素、発光体、蛍光体等で標識された二次抗体自体を、直接検出または測定することも可能であるし、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この三次抗体を種々の方法により標識しておき、三次抗体の標識を検出又は定量することもできる。
好適な検出法としては、上述のとおり、酵素標識された二次抗体に対して、当該その酵素に特異的な基質（発色基質、蛍光基質、化学発光基質）を反応させ、発色、蛍光、発光等を生じさせてそのシグナルを測定機器で検出する方法が挙げられ、特に高感度検出が可能な化学発光基質を用いる方法が好ましい。
【０１０５】
以下に、磁性粒子の重合体による処理を反応容器中で行う場合の測定法について説明する。
重合体と磁性粒子の接触は何れの手順でも良いが、反応容器表面及び磁性粒子表面を共に効果的に処理するべく、通常重合体溶液を反応容器に注入して重合体と反応容器表面を十分に接触させた後、測定対象物質に特異的に結合し得る抗体又は抗原を担持させた磁性粒子を添加するのが好ましい。重合体と磁性粒子の接触は、１〜６０分間、好ましくは２〜１０分間程度放置することにより行うのが好ましい。
例えば、測定手段として、サンドイッチ法を用いる場合、以下に示す１ステップ法又は２ステップ法が採用できる。
＜１ステップ法＞
ａ）反応容器に重合体溶液を注入し、次いでリガンド（好適には、測定対象物質に特異的に結合し得る抗体又は抗原）を担持させた磁性粒子を含む溶液を添加し、続いて、測定対象物質及び測定対象物質に特異的に結合し得る標識された抗体を添加して反応させる工程
ｂ）工程ａ）終了後、反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程
ｃ）磁性粒子に捕捉された目的物質を測定する工程
【０１０６】
＜２ステップ法＞
ｄ）反応容器に重合体溶液を注入し、次いでリガンド（好適には、測定対象物質に特異的に結合し得る抗体又は抗原）を担持させた磁性粒子を含む溶液を添加し、続いて、測定対象物質を添加して反応させる工程
ｅ）工程ａ）終了後、反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程
ｆ）測定対象物質に特異的に結合し得る標識された抗体を添加して反応させる工程
ｇ）工程ｆ）終了後、反応系を洗浄してＢ／Ｆ分離を行う工程
ｈ）磁性粒子に捕捉された目的物質を測定する工程
【０１０７】
本発明において用いられる反応容器としては、交換することなく免疫反応の全工程を通して使用できるものであれば限定されない。例えば、ガラス又はプラスチック製のチューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、マイクロタイタープレート、専用に設計され、洗浄しながら繰り返し使用する全自動ＥＩＡ測定装置用の反応管などが挙げられる。
【０１０８】
［測定対象物質及び試料］
上記免疫学的測定方法において、測定対象となる物質は、生体試料中に存在する特定物質（生体物質と云う）であり、例えばタンパク質、ペプチド、糖質、脂質等が挙げられる。具体的には、例えば、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体等のウイルス関連の抗原又は抗体；抗マイコプラズマ抗体、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、レジオネラ菌、キャンピロバクター、ヘリコバクターピロリ、ＭＲＳＡ等の細菌関連の抗原又は抗体；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リウマトイド因子等の炎症マーカー；α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＰＳＡ等の腫瘍マーカー；ホルモン；アレルゲン、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体等のアレルギー関連の抗原又は抗体等を例示することができる。
【０１０９】
尚、生体試料としては特に限定されないが、例えば、血清、血漿、血液、髄液等の各種体液や尿等の排泄物、便等の希釈物から固形分を除去したもの、各種組織の抽出液等が挙げられる。
【実施例】
【０１１０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
＜分子量測定＞
重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、東ソー（株）製  ＴＳＫｇｅｌ  α−Ｍカラムを用い、流量：０．５ミリリットル／分、溶出溶媒：ＮＭＰ溶媒（Ｈ3ＰＯ4：０．０１６Ｍ、ＬｉＢｒ：０．０３０Ｍ）、カラム温度：４０℃の分析条件で、ポリスチレンを標準とするゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。【０１１１】
＜ＮＭＲスペクトル＞
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、溶媒および内部標準物質としてｄ6−ＤＭＳＯを用いて、ＢＲＵＫＥＲ製モデルＡＶＡＮＣＥ５００（５００ＭＨｚ）により測定した。【０１１２】
製造例１  共重合体（Ｎ−１−１）の合成
以下の合成経路に従い、共重合体（Ｎ−１−１）を得た。【０１１３】
【化９】
2014126111.tif 000010
【０１１４】
グリシジルメタクリレート６．７９質量部およびスチレン２．２７質量部と、重合開始剤として２，２'−アゾビス（イソブチロニトリル）０．２７２質量部と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１８．９質量部とを混合しフラスコに入れた。これに窒素を吹き込み、７０℃まで昇温し、６時間重合させ、その後室温に冷却した。この溶液をメタノールによる再沈殿で精製し、減圧乾燥することで共重合体（Ｓ−１−１）を得た。
得られた共重合体（Ｓ−１−１）において、グリシジルメタクリレートから誘導された繰り返し単位の含有量は６７モル％であり、スチレンから誘導された繰り返し単位の含有量は３３モル％であった。なお、これら含有量は13Ｃ−ＮＭＲにより測定した。【０１１５】
次いで、得られた共重合体（Ｓ−１−１）１質量部およびチオグリセロール４．４７質量部と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド９．４５質量部とを混合してフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら６０℃まで昇温し、触媒としてトリエチルアミン１６．７質量部を添加した後４時間反応させ、その後室温に冷却した。この溶液を水による再沈殿で精製し、凍結乾燥することで共重合体（Ｇ−１−１）を得た。【０１１６】
次いで、得られた共重合体（Ｇ−１−１）０．１質量部を０．８４４質量部の水に分散させ、フラスコへ入れた。これに、３０％過酸化水素水溶液を０．０５６質量部添加し、室温で１８時間反応させた。得られた水溶液を透析することで、共重合体（Ｎ−１−１）を得た（収率：２７％）。この共重合体（Ｎ−１−１）と水を混合し、濃度を１質量％に調整したところ、共重合体（Ｎ−１−１）は水に溶解していた。
また、得られた共重合体（Ｎ−１−１）の数平均分子量は２３３００であり、分子量分布は２．１７であった。
共重合体（Ｎ−１−１）の構造は13Ｃ−ＮＭＲより確認した。
また、Ｎ−１−１のＨＬＢ値は１７．６であった。【０１１７】
製造例２  磁性粒子の作製
２．１  核粒子の作製
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（（株）日油製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、以下、「パーロイル」という。）２質量部を１質量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒子径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部および水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間撹拌した。別の容器でメチルメタクリレート（以下、「ＭＭＡ」という。）９５質量部およびトリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）５質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部に乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間撹拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これを核粒子Ａ−１とする。粒子径は１．５μｍであった。なお、粒子径は（株）島津製作所製レーザ回折式粒度分布測定機ＳＡＬＤ−２０００で測定した体積平均粒子径を意味し、以下特に断りのない限り同様とする。【０１１８】
２．２  母粒子の作製（磁性体層の形成）
油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。【０１１９】
次いで、上記核粒子Ａ−１を１５質量部および上記疎水化された超常磁性微粒子２０質量部をミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、超常磁性微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子Ａ−２（粒子径：１．７μｍ）を得た。【０１２０】
２．３  母粒子への第１、第２ポリマー層の形成
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液３７５質量部を１Ｌセパラブルフラスコに投入し、次いで、母粒子Ａ−２  １５質量部を投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液１００質量部に、ＭＭＡ１８質量部、ＴＭＰ２質量部、およびパーロイル０．４質量部を入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した（以上、第１ポリマー層の形成）。【０１２１】
滴下終了後、６０℃に保持して１時間撹拌した後、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５質量％水溶液７５質量部に、グリシジルメタクリレート１０．５質量部、ＴＭＰ１．５質量部、およびパーロイル０．３質量部を入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記１Ｌセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温し、さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた（以上、第２ポリマー層の形成）。【０１２２】
次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有する第２ポリマー層が形成された磁性粒子Ａ−３（体積平均粒子径：２．７μｍ）を得た。【０１２３】
磁性粒子Ａ−３の水分散液から磁気分離によって単離した粒子１．０質量部に、１質量％硫酸水溶液１０質量部を加え、間接超音波を２０分間照射して分散させ、次いで、６０℃で５時間撹拌した（グリシジル基の加水分解）。【０１２４】
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返し、さらに乾燥させた。得られた乾燥粒子１．０質量部を１０ｍｌのピリジンで洗浄してから５ｍｌのピリジンに分散させた後、２５ｍｌのピリジンに３質量部の無水コハク酸を溶解した溶液を加え、６０℃で２時間撹拌した（カルボキシ基の導入）。反応後、磁気を用いて前記粒子を分離し、アセトンで３回、続いて０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で３回、さらに蒸留水で４回洗浄してから蒸留水に分散させて、１．０質量部のカルボキシ基導入磁性粒子Ｃａ−１を含む１０質量％分散液を得た。【０１２５】
製造例３  抗体結合磁性粒子の作製
製造例２で得られたカルボキシ基導入磁性粒子Ｃａ−１を含む分散液を磁気分離して上清を除き、０．１  Ｍ  ＭＥＳ  （ｐＨ５．５）で２回洗浄した。磁気分離して上清を除き、０．１  Ｍ  ＭＥＳ  （ｐＨ５．５）および抗体溶液（抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）抗体）を粒子１ｍｇあたり抗体１０μｇとなるように加え、さらにＥＤＣ（１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）、３ｍｇ／ｍＬ）を粒子１ｍｇあたり１００μｇとなるように加えて２５℃で２時間転倒混和した。反応終了後、磁気分離して上清を除き、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２回洗浄した。ついで、磁気分離して上清を除き、５０ｍＭのトリスバッファーにバッファーを置換し、さらに磁気分離して上清を除き、ＢＳＡ含有バッファー（５０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．５、１重量％ＢＳＡ）に懸濁し、抗体結合粒子分散液（磁性粒子濃度０．０５重量％）とした。【０１２６】
実施例１
製造例１で得られた共重合体（Ｎ−１−１）をＴＢＳバッファー（５０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．５）に溶解した溶液（２質量％）２５μＬを９６ｗｅｌｌ白色プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルへ分注し、次いで製造例３で調製した抗体結合磁性粒子をＢＳＡ含有バッファーに分散させた分散液２５μＬを分注し、続いでサンプル（ヒト血清または標準溶液（ＰＳＡ抗原含有液：０〜２５ｎｇ／ｍＬ）２５μＬ、さらにＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗ＰＳＡ抗体液）２５μＬを順次分注し、２５℃で２０分間反応させた。磁気分離にて粒子を分離した後、９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャー（テカンジャパン社製、Ｈｙｄｒｏ  Ｆｌｅｘ）を用い、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄を行った後、ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）を添加し、２５℃、５分間反応させ、発光強度を測定（ＡＲＶＯ  Ｘ５  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製））した。
尚、共重合体溶液をバッファー（ＴＢＳバッファー）に換え、同様に操作した結果を比較例とした。【０１２７】
（１）Ｓ／Ｎ
標準溶液の発光強度をシグナル、ブランクの発光強度をノイズとして、Ｓ／Ｎ比を算出し、共重合体の有無によるＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ比）を比較した。【０１２８】
【表１】
2014126111.tif 000011
【０１２９】
共重合体を含有しない条件と比較して、含有する条件ではＳ／Ｎが約２倍となり、非特異的な反応に対するブロッキング効果が認められた。【０１３０】
（２）感度
上記の方法でＳ／Ｎを算出し、Ｓ／Ｎ＝２となる抗原濃度を感度とした。すなわちＳ／Ｎ＝２となるときの抗原濃度が低いほど高感度となる。抗原溶液を測定した際のＳ／Ｎ＝２を感度とすると、２．２ｐｇ／ｍＬとなった。
下記の測定結果から１０ｐｇ／ｍＬのＳ／Ｎを計算すると１３７／２５＝５．５となる。一方、抗原濃度が０ｐｇ／ｍＬの際にはＳ／Ｎは１となる。これらの値からＳ／Ｎ＝２の際の抗原濃度を算出すると２．２ｐｇ／ｍＬとなる。【０１３１】
【表２】
2014126111.tif 000012
【０１３２】
（３）ＥＬＩＳＡ法との比較
血清試料（検体Ａ〜Ｅ）について、実施例１の方法と以下に示すＥＬＩＳＡ法でＰＳＡ抗原を測定し、測定感度を比較した。
＜ＥＬＩＳＡ法＞
ＮＵＮＣ社製ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ）にＰＳＡ抗体を２μｇ／ｍＬの濃度にＰＢＳで希釈し、５０μＬウェルずつ入れ、４℃で一晩放置し吸着させた。次にブロッキングバッファー（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｍＭのＰＢＳ  ｐＨ７．４）を２００μｌ／ウェル入れ、３７℃で５時間放置しブロッキングした。
Ｂｉｏｔｉｎ標識ＰＳＡ抗体は標識抗体希釈緩衝液（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、ｉｎ  ５０ｍＭＰＢＳ  ｐＨ  ７．４）で１μｇ／ｍＬに調製し使用した。ＨＲＰ標識アビジン（シグマ社製）は緩衝液（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、ｉｎ  ５０ｍＭＰＢＳ  ｐＨ  ７．４）で２０００倍希釈した。
上記ＥＬＩＳＡプレートをトリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３回洗浄後、検体希釈緩衝液（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、ｉｎ  ５０ｍＭＰＢＳ  ｐＨ  ７．４）で５倍希釈した血清、及びスタンダードを１００μｌずつ各ウェルに入れ、３７℃で１時間反応させた。トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３回洗浄後、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗体を１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間反応させた。トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で充分洗浄し、基質としてＴＭＢ溶液（和光純薬社製）を１００μｌ／ウェル入れ、１０分後に１Ｎ  ＨＣｌを１００μｌ／ウェル加え、４５０ｎｍの波長を測定した。
＜結果＞
ＰＳＡを約４３０ｐｇ／ｍＬ含む血清検体Ａについては、実施例１の測定方法でもＥＬＩＳＡ法でも抗原濃度を定量できた。一方、４３０ｐｇ／ｍＬより少ない抗原を含む検体Ｂ〜Ｅについては、ＥＬＩＳＡ法では抗原濃度を測定することができなかったが、実施例１の測定方法によれば、ＥＬＩＳＡ法の検出限界以下であった血清検体Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについても測定可能となり、本測定方法が高感度であることが確認された。【０１３３】
【表３】
2014126111.tif 000013
【０１３４】
実施例２
製造例１で得られた共重合体（Ｎ−１−１）をＴＢＳバッファー（５０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．５）に溶解した溶液（２質量％）２５μＬを９６ｗｅｌｌ白色プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウェルへ分注し、次いで製造例３で調製した抗体結合磁性粒子をＢＳＡ含有バッファーに分散させた分散液２５μＬを分注し、続いでサンプル（ヒト血清または標準溶液（ＰＳＡ抗原含有液：０〜２５ｎｇ／ｍＬ）２５μＬを順次分注し、２５℃で２０分間反応させた。
磁気分離にて粒子を分離した後、９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャー（テカンジャパン社製、Ｈｙｄｒｏ  Ｆｌｅｘ）を用い、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄を行った後、標識体液（ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体液）５０μＬを分注し、２５℃で２０分間反応させた。磁気分離にて粒子を分離した後、９６ｗｅｌｌプレート用ウォッシャー（テカンジャパン社製、Ｈｙｄｒｏ  Ｆｌｅｘ）を用い、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄を行った後、ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）を添加し、２５℃、５分間反応させ、発光強度を測定（ＡＲＶＯ  Ｘ５  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社））した。
尚、共重合体溶液をバッファー（ＴＢＳバッファー）に換え、同様に操作した結果を比較例とした。【０１３５】
【表４】
2014126111.tif 000014
【０１３６】
実施例３
カルボキシ基を有する上記磁性粒子を磁気分離して上清を除き、ＴＢＳバッファー（５０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．５）で希釈した共重合体（Ｎ−１−１）希釈液（０．３％、１．５％）で２回洗浄した。磁気分離して上清を除き、粒子濃度が０．０２５％になるように０．３または１．５％にＴＢＳバッファーで希釈した共重合体（Ｎ−１−１）希釈液に分散し、２５℃で一晩反応させた。
ブロッキング処理が施された９６ウェルプレートのウェルを共重合体（Ｎ−１−１）で処理した０．０２５％粒子液を５０μＬ  ／ｗｅｌｌ分注し、磁気分離して上清を除き、トリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５回洗浄した。ついでＴＢＳに希釈された５０μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体希釈液を５０μＬ  ／ｗｅｌｌ分注し２５℃で２０分間振とうしながら反応させた。磁気分離して上清を除き、各ウェルをトリスバッファー／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５回洗浄して上清を除いた後、ＨＲＰ用化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌR  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、サーモ社）を５０μＬ  ／ｗｅｌｌ分注し、５分後に化学発光量を測定し、この吸光度から検量線法により抗体吸着量を算出した。尚、共重合体（Ｎ−１−１）を含まないＴＢＳを加えて同様に反応させたものをコントロールとした。結果を表５に示す。【０１３７】
【表５】
2014126111.tif 000015
【０１３８】
これより、共重合体（Ｎ−１−１）には、磁性粒子上への非特異的吸着を抑制する効果があることが確認された。
【国際調査報告】
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