(57)【要約】本発明が解決すべき課題は、ＴＡＣＥ機能の高い阻害能を有する抗体を提供することである。本発明は、VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ又はMAKSYPNEEKDAWで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ又はMAKSYPNEEKDAWで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体。
【請求項２】
YPIAVSGDで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQで表されるアミノ酸配列のうち少なくとも７つの連続するアミノ酸からなるペプチド、又はMAKSYPNEEKDAWで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、ＴＡＣＥペプチドエピトープ。
【請求項５】
アミノ酸配列YPIAVSG又はPIAVSGDを含む、請求項４に記載のＴＡＣＥペプチドエピトープ。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬。
【請求項８】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の治療又は予防薬。
【請求項９】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与する工程を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１０】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬を製造するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月２８日に出願された、日本国特許出願第2013-069544号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、ＴＡＣＥペプチドエピトープ、抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体及び当該抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００３】
歯周病は加齢とともに罹患率が上昇する生活習慣病の一つであり、歯周病原菌感染によって過度の免疫反応が歯周組織で惹起されることで発症する。重度の歯周病では歯槽骨骨破壊により歯の支持組織が失われ咀嚼障害が生じ、著しくQOLが低下する。この骨破壊は破骨細胞による過剰な骨吸収促進によって生じることが知られており、破骨細胞形成と活性化への必須因子であるRANKL(非特許文献１)が歯周病の歯周組織においてmRNAレベルならびにタンパク質レベルで発現が上昇している事も報告されている(非特許文献２及び３)。また歯周病においてどのような細胞がRANKLを発現しているかについては、歯肉組織に浸潤したリンパ球(B細胞やT細胞)がこの上昇したRANKLの主要源になっていることも報告されている（非特許文献２）。【０００４】
歯周病の進行ステップを簡単に説明すると、歯と歯茎の境目の溝(歯周ポケット)にプラークが沈着し、そのプラークの大部分を構成する細菌やそれらの産生物が歯周ポケットから歯肉上皮を通過、歯肉組織内に侵入し、侵入した細菌・産生物が免疫系細胞を刺激し、リンパ球の浸潤、浸潤リンパ球の活性化が引き起こされる。このように、侵入した細菌・産生物に引き寄せられることで歯肉内の毛細血管から遊走したリンパ球は、歯周ポケット近く、つまり歯槽骨から遠く離れた上皮近くに集積することとなる(非特許文献４)
破骨細胞形成と活性化への必須因子であるRANKL（RANKリガンド）は、破骨細胞形成を支持するリンパ球などの免疫系細胞や、骨芽細胞などの間質細胞に、通常膜結合型タンパク質として合成される(非特許文献１)。そのため、これら破骨細胞形成支持細胞と、破骨細胞前駆細胞・破骨細胞との直接的な細胞間接触が、RANKLシクナル伝達に必須であるとされている(非特許文献５)。膜結合型RANKLは細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインの3領域で構成され、破骨細胞分化因子としての機能へは、細胞外ドメインの特定領域のみが必要である。【０００５】
ところが、歯周病歯肉組織を考えた場合、前述の通りRANKL発現細胞(浸潤した活性化リンパ球)と、歯槽骨表面に存在し実際に骨吸収を行っている破骨細胞との問には数100マイクロメートルの距離があり(非特許文献７)、破骨細胞形成支持細胞(浸潤した活性化リンパ球)と破骨細胞が細胞間接触でRANKLシグナルを伝達しているとは考えにくい。この現象の乖離への説明として、膜結合型RANKLから遊離型RANKLへの酵素的な切断による変換(shedding)について報告がなされている(非特許文献４、６〜８)。RANKLの破骨細胞分化因子としての機能は、細胞外ドメインの特定領域のみが必要であり(非特許文献９)、その領域(soluble RANKL domain)と膜貫通ドメインとの間の特定アミノ酸配列を切断できる酵素であれば、RANKLの破骨細胞分化促進機能を保ったまま、膜結合型から遊離型RANKLへ変換することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yasuda H,  ShimaN,  Nakagawa N,  Yamaguchi K,  Kinosaki M,  Mochizuki S,  TomoyasuA, Yano K,  Goto M,  Murakami A,  Tsuda E,  Morinaga T,  Higashio K,  UdagawaN,  Takahashi N, Suda T. 1998 0steoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(7):3597-602.
【非特許文献２】Kawai T, Matsuyama T, Hosokawa Y, Makihira S, Seki M, Karimbux NY, GoncalvesRB, Valverde P, Dibart S, Li YP, Miranda LA, Ernst CW, Izumi Y, Taubman MA. 2006 B and T Lymphocytes Are the Primary Sources of RANKL in the Bone Resorptive Lesion of PeriodontaI Disease. Am J Pathol 169:987-998
【非特許文献３】Teng YT, Nguyen H, Gao X, Kong YY, Gorczynski RM, Singh B, Ellen RP, Pennlnger JM. 2000 Functional humanT-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. J Clin Invest. 106(6):R59-67
【非特許文献４】Shibutani T, Murahashi Y, Tsukada E, Iwayama Y, Heersche ]N. 1997 Experimentally induced periodontitis in beagle dogs causes rapid increases in osteoclastic resorption of alveola bone. J Periodontol. 68(4):385-91
【非特許文献５】Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Goto M, Mochizuki SI, Tsuda E,  Morinaga T, Udagawa N, Takahashi N, Suda T, Higashio K. 1999 A novel molecular mechanism modulating osteoclast differentiation and function. Bone.25(1):109-113
【非特許文献６】Lum L, Wong BR, Josien R, Becherer JD, Erdjument-Bromage H, Schloendorff J, Tempst P, Choi Y, Blobel CP. 1999 Evidence for a role of a tumor necrosis factor-alpha(TNF-alpha)-converting enzyme-like protease in shedding of TRANCE, a TNF family member involved in osteoclastogenesis and dendritic cell survival. J. Biol. Chem. 274:13613-13618
【非特許文献７】Lynch CC, Hikosaka A, Acuff HB, Martin MD, Kawai N, Singh RK, Vargo-Gogola TC, Begtrup JL, Peterson TE, Fingleton B, Shirai T, Matrisian LM, Futakuchi M. 2005 MMP-7 promotes prostate cancer-induced osteolysis via the solubilization of RANKL. Cancer Cell. 7(5):485-496
【非特許文献８】Hikita A, Yana I, Wakeyama H, Nakamura M, Kadono Y, Oshima Y, Nakamura K, Seiki M. Tanaka S. 2006 Negative regulation of osteoclastogenesis by ectodomain shedding of receptor activator of NF-kappaB ligand. J Biol Chem. 281(48):36846-55
【非特許文献９】Mizuno A, Kanno T, Hoshi M. Shibata O, Yano K, Fujise N, Kinosaki M, Yamaguchi K, Tsuda E, Murakami A, Yasuda H, Higashio K. 2002 Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (SODF) exhibit severe osteoporosis. J Bone Miner Metab. 2002;20(6):337-44.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＴＡＣＥ機能の高い阻害能を有する抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、このRANKL sheddaseとして報告されている酵素のうち、活性化リンパ球でRT-PCRによるmRNA発現ならびにフローサイトメトリーを用いてタンパク質レベルでの発現を観察したところ、MMp-7、MMP114、ADAM-10、ADAM-17(TACE:TNF-αconvertingenzyme)の4酵素までRANKL sheddaseを絞り込むことができた。そして、本発明者は、これらのRANKL sheddaseのうちTACEが重要な役割を果たすことを見出した。さらに本発明者は、鋭意研究した結果、ＩｇＧ抗ヒトTACE中和抗体を作製するに当り、TACEのアミノ酸配列のうち、特定の部分を抗原として用いることでＴＡＣＥ機能の阻害能を有する抗体が作製可能であることを見出した。【０００９】
従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ又はMAKSYPNEEKDAWで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体。【００１０】
項２．YPIAVSGDで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する、項１に記載の抗体。【００１１】
項３．モノクローナル抗体である、項１又は２に記載の抗体。【００１２】
項４．VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQで表されるアミノ酸配列のうち少なくとも７つの連続するアミノ酸からなるペプチド、又はMAKSYPNEEKDAWで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、ＴＡＣＥペプチドエピトープ。【００１３】
項５．アミノ酸配列YPIAVSG又はPIAVSGDを含む、項４に記載のＴＡＣＥペプチドエピトープ。【００１４】
項６．項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。【００１５】
項７．有効量の項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬。【００１６】
項８．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、項７に記載の治療又は予防薬。【００１７】
項９．有効量の項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与する工程を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防する方法。【００１８】
項１０．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、項９に記載の方法。【００１９】
項１１．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防するための項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。【００２０】
項１２．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、項１１に記載の抗体。【００２１】
項１３．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬を製造するための項１〜３のいずれか一項に記載の抗体の使用。【００２２】
項１４．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、項１３に記載の使用。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る抗体は、非常に高いＴＡＣＥ機能の阻害能を有する。従って、本発明に係る抗体は、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達を阻害し、当該シグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１におけるアフィニティー精製ポリクローナル抗体のTACE阻害能比較の結果を示す。
【図２】実施例１におけるアフィニティー精製ポリクローナル抗体と低分子阻害剤TAPI-2のTACE阻害能比較の結果を示す。
【図３】実施例２におけるモノクローナル抗体C6-30、C6-62と低分子阻害剤TAPI-2のTACE阻害能比較の結果を示す。
【図４】実施例３における各試験の結果を示す。
【図５】実施例４における活性化T細胞からの破骨細胞分化促進サイトカインの測定結果を示す。図５（上）は、刺激後２時間の培養上清について市販のELISAキットを用いてTNF-αの測定を行った結果を示す。図５（下）は刺激後３日目の培養上清について市販のELISAキットを用いてsRANKLの測定を行った結果を示す。
【図６】ＴＡＣＥのアミノ酸配列を示す。
【図７】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−１の位置を示す。
【図８】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−２の位置を示す。
【図９】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−３の位置を示す。
【図１０】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−４の位置を示す。
【図１１】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−５の位置を示す。
【図１２】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−６の位置を示す。
【図１３】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−７の位置を示す。
【図１４】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−８の位置を示す。
【図１５】ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−９の位置を示す。
【図１６】実施例５におけるin vivoでの骨破壊に対するモノクロ抗体の阻止効果を示す。  *:p < 0.05、NS:群間に有為差なし
【発明を実施するための形態】
【００２５】
抗体
本発明の抗体が標的とするＴＡＣＥ (TNF-α converting enzyme, ADAM-17)は特定のアミノ酸配列(VGPQRJFSGAPAMME)を認識し切断する、70kDa(824アミノ酸残基)の酵素であり、ADAMファミリーに属する。ヒトＴＡＣＥのアミノ酸配列を図６に示す（配列番号１０）
。T細胞やB細胞など様々な細胞での発現が報告されている。またTACEは、膜結合型の酵素であり、細胞外ドメイン(215-671)、膜貫通ドメイン(672-692)及び細胞内ドメイン(693-824)の3領域で構成されており、酵素機能を発揮するcatalytic domain(223-474)は細胞外ドメインに存在する(Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, Peschon JJ, Slack JL, Wolfson MF, CastnerBJ, Stocking KL, Reddy P, Srinivasan S, Nelson N, Boiani N, Schooley KA, Gerhart M, Davis R, Fitzner JN, Johnson RS, Paxton RJ, March CJ, Cerretti DP. 1997 A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature. 385(6618):729-33.  ；  Moss ML, Jin SL, MiIIa ME, Bickett DM. Burkhart W, Carter HL, Chen WJ, Clay WC. Didsbury JR, Hassler D, Hoffman CR, Kost TA, Lambert MH, Leesnitzer MA, McCauley P, McGreehan G, Mitchell J, Moyer M, Pahel G Rocque W, Overton LK, Schoenen F, Seaton T, Su JL, Becherer JD, et al. 1997 Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumour-necrosis factor-alpha. Nature. 385(6618):73316)。また、種を越えてアミノ酸配列の高い相同性が維持されており、ヒト−ラット・ヒト−マウス間では95%、ヒト−ウサギ間でも87%配列が一致している。
【００２６】
本発明に係る抗体は、ＴＡＣＥのアミノ酸配列のうち、VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ（配列番号９）又はMAKSYPNEEKDAW（配列番号４）で表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する。本発明に係る抗体のうち、VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ（配列番号９）で表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合するものが好ましく、当該アミノ酸領域のうち、YPIAVSGD（配列番号１２）で表されるアミノ酸領域に特異的に結合するものがより好ましい。
【００２７】
本発明に係る抗体が上記に示すＴＡＣＥ由来のアミノ酸配列の領域に特異的に結合することは、公知の方法で可視化することができる。例えば、試験管内の試料を対象とするイムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、免疫電気泳動法（例えばウェスタンブロット法）、および組織または細胞を対象とする免疫組織化学などが例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。可視化にあたっては、本発明の抗体が蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチアネート）、放射性同位体（例えば、ヨウ素１２５）、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシターゼ）、その他のタンパク質（例えば、アビジン）などの分子によって標識化されていてもよい。あるいは、本発明の抗体を特異的に認識する二次抗体を用いてもよい。
【００２８】
本発明の抗体は、上記に示すＴＡＣＥ由来のアミノ酸配列の領域と特異的に結合できる限りその免疫グロブリンクラスについては限定されるものではなく、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹなどが挙げられる。さらに、そのサブクラスも制限されない。好ましくは、ＩｇＧである。
【００２９】
本発明の抗体は、抗体を産生しうる哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ）または鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ）由来である。
【００３０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。さらには、モノクローナル抗体のうち、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。ここで、キメラ抗体およびヒト化抗体とは、免疫グロブリンタンパク質のうち、抗原と結合可能な部位以外がヒト由来である抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト由来の抗体、または完全なヒト由来の免疫グロブリン遺伝子を有するヒト抗体産生マウス由来である抗体を指す。キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体は、ヒトにおける免疫原性が低く、抗体を医療製剤などに用いるに当たって有用である。従って、本発明の抗体を医療製剤などに用いる場合にあっては、モノクローナル抗体が好ましく、ヒト化抗体またはヒト抗体が特に好ましい。
【００３１】
本発明の抗体は、免疫グロブリンタンパク質全長であっても、抗原と結合可能な部位を含むそれらの断片（フラグメント）であってもよい。また、抗体を含む組成物、例えば抗血清などであってもよい。
【００３２】
本発明の抗体は、抗原を免疫動物に投与することで作製することができる。抗原としては、後述する本発明のＴＡＣＥペプチドエピトープを用いることができる。抗原を免疫動物に投与する場合にあっては、ペプチドは分子量が小さく、免疫応答を十分に起こせない場合があるため、ペプチドを適当なタンパク質（例えば、アルブミン、サイログロブリンヘモシアニン等）に結合させて抗原として用いてもよい。
【００３３】
あるいは、多様な抗体またはその断片を産出しうる細胞またはファージなどのライブラリから、抗原と結合する抗体またはその断片を産出するものを探索することで、本発明の抗体を入手することもできる。この場合、抗原としては、後述する本発明のＴＡＣＥペプチドエピトープを用いることができる。
【００３４】
抗原として用いるペプチドの入手方法は、特に制限されず公知の方法によることができ、例えば天然由来、化学合成、無細胞系合成、組換えペプチドであってもよい。
【００３５】
一般的な抗体の作製方法については、例えば、Harlowらの「Using Antibodies : A laboratory manual」(Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」などに記載されている。以下、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびヒト化抗体の各抗体の作製方法について簡単に説明する。
【００３６】
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、免疫動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ）を通常の方法により免疫し、血清を調製し、抗血清から抗体を精製することにより得ることができる。免疫は、例えば、免疫原溶液を等量のフロイントの完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳化混合したものを接種（初回免疫）し、以後２〜４週間の間隔で数回免疫することによって行うことができる。抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー等により行うことができる。
【００３７】
（２）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製し、当該ハイブリドーマが産生した抗体を精製することで作製できる。または、ファージディスプレイ法、すなわち、多様な抗体または抗体断片を発現するファージライブラリより、抗原に対して特異的に結合する抗体または抗体断片を探索する方法によって作製することもできる。
【００３８】
ハイブリドーマを分離する方法は、自体公知であり（例えば、Kohlerら, Nature, 256: 495 (1975)など）、例えば、以下の方法により得ることができる。最終免疫して数日後の免疫動物（例えば、マウス）から脾臓を無菌的に摘出し、脾臓から脾臓細胞を調製する。脾臓細胞は、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とともに、細胞融合工程に用いる。ミエローマ細胞としては例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などを使用することができ、細胞融合の方法としては、例えばＰＥＧ等の融合促進剤を含む培地中で、脾臓細胞とミエローマ細胞とを、常法の混合比率（約１／５〜１／１０程度の割合）で混合することにより行うことができる。融合後、選択用培地（例えば、ＨＡＴ培地）を用いて、ハイブリドーマのみを増殖させる。それらの内、培養上清中に目的のモノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマは、例えば、培養上清とＴＡＣＥペプチドエピトープとの反応性を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングすることによって確認し、選択することができる。
【００３９】
ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、これを培養することにより、容易に調製することができる。培養は適切な培地中（例えば、１０％ウシ胎児血清を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））で、あるいは生体内（例えば、マウスの腹腔中）で行うことができる。培養上清、あるいは腹水などを出発材料として、抗体を精製することもできる。抗体の精製には、タンパク質の精製に一般的な方法、例えば硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡもしくはプロテインＧ結合ポリマー等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、または透析等の方法を適宜組み合わせて用いることができる。
【００４０】
ファージディスプレイ法も自体公知であるが（例えば、Clacksonら, Nature 352:624-8(1991)等）、以下に簡単に説明する。あらかじめ作製した多様な抗体の抗原認識部位を提示するファージライブラリから、ＴＡＣＥペプチドエピトープと結合する抗原認識部位を提示するファージを選択する。選択されたファージが提示する抗原認識部位をそのまま用いても良いし、遺伝子工学的手法によって完全長の抗体を産出可能なＣＨＯ細胞などに組み込むことで、完全長の抗体を得ることもできる。
【００４１】
（３）ヒト化抗体、ヒト抗体
ヒト化抗体とは、抗体タンパク質のうち、抗原認識のために必要最小限な領域（相補性決定領域、complementarity-determining region:ＣＤＲ）以外がヒト由来のものである。ヒト化抗体の製造方法は、例えば、ＥＰ０２３９４００、ＵＳ５５８５０８９号などに記載され公知である。
【００４２】
ヒト抗体は、完全なヒト由来の免疫グロブリン遺伝子を有するヒト抗体産生マウスから得ることができる。ヒト抗体産生マウスについては、ＷＯ９７／０７６７１などに記載され公知である。
【００４３】
本発明の抗体は、非常に高いTACE活性中和能を有する。ＴＡＣＥはRANK−RANKLシグナル伝達に重要な役割を果たしているため、本発明の抗体は、RANK−RANKLシグナル伝達に起因する疾患の治療、予防などに有用である。
【００４４】
エピトープ
本発明は、VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ（配列番号９）で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも７つの連続するアミノ酸からなるペプチド、又はMAKSYPNEEKDAW（配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、ＴＡＣＥペプチドエピトープを提供する。
【００４５】
これらのＴＡＣＥペプチドエピトープのうち、配列番号９で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも７つの連続するアミノ酸からなるペプチドが好ましい。当該ＴＡＣＥペプチドエピトープは、好ましくは、２０個以下のアミノ酸からなることが好ましく、１５個以下のアミノ酸からなることがより好ましく、１０個以下のアミノ酸からなることがさらに好ましく、９個以下のアミノ酸からなることがさらに好ましい。また、本発明のエピトープは、アミノ酸配列YPIAVSG（配列番号１９）又はPIAVSGD（配列番号２０）を含むことが好ましい。好ましいペプチドエピトープとしては、例えば、VMYPIAVSGDHE（配列番号２１）、MYPIAVSGDHE（配列番号２２）、VMYPIAVSGDH（配列番号２３）、YPIAVSGDHE（配列番号２４）、VMYPIAVSGD（配列番号２５）、MYPIAVSGDH（配列番号２６）、YPIAVSGDH（配列番号２７）、MYPIAVSGD（配列番号２８）、PIAVSGDHE（配列番号２９）、VMYPIAVSG（配列番号３０）、PIAVSGDH（配列番号３１）、MYPIAVSG（配列番号３２）、YPIAVSGD（配列番号３３）、YPIAVSG（配列番号３４）、PIAVSGD（配列番号３５）等が挙げられ、YPIAVSGDHE（配列番号２４）、VMYPIAVSGD（配列番号２５、MYPIAVSGDH（配列番号２６）、YPIAVSGDH（配列番号２７）、MYPIAVSGD（配列番号２８）、YPIAVSGD（配列番号１２）等がより好ましく、YPIAVSGD（配列番号１２）が最も好ましい。
【００４６】
本発明のペプチドエピトープは、ＴＡＣＥ機能の阻害能を有する抗体を調製するために用いることができる。本発明のペプチドエピトープを抗原として用いる場合には、前述のように、適当なタンパク質に結合させて抗原として用いてもよい。
【００４７】
ハイブリドーマ
本発明は、抗体を産生するハイブリドーマも提供する。ハイブリドーマの製造方法は、本願実施例の方法、抗体について前述した方法等、自体公知の方法に準じて行うことができる。
【００４８】
治療又は予防薬
本発明は、前述の抗体を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬を提供する。
【００４９】
本発明のＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬は、当該抗体に薬学的に許容される各種担体（ 賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる）と配合した製剤であってもよい。上記製剤は慣用の添加剤を含んでいてよい。
【００５０】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。好ましい製剤形態としては、例えば、局所注射剤、歯肉粘膜への塗布剤、含嗽剤等が挙げられる。
【００５１】
製剤中の本発明の抗体の含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリペプチドの１日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。
【００５２】
本発明の治療又は予防剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【００５３】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患としては、特に限定されないが、例えば、歯周病、関節リウマチ（慢性関節リウマチ）、変形性関節炎、転移性骨腫瘍等が挙げられる。
【００５４】
歯周病とＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達との関連性は前述した通りである。また、正常と比較して進行状態にある歯周病でTACEの発現が上昇していることが報告されている（J Dent Res. 2008 Mar;87(3):273-7. Tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (TACE) levels in periodontal diseases. Bostanci N, Emingil G, Afacan B, Han B, Ilgenli T, Atilla G, Hughes FJ, Belibasakis GN.）。
【００５５】
また、慢性関節リウマチ及び変形性関節炎での骨破壊病態と歯周病における病態の類似性が指摘されており（Inflamm Res. 2004 Nov;53(11):596-600. Bone lysis and inflammation. Haynes DR.）、慢性関節リウマチにおいて、活性化リンパ球がRANKLを発現しRANKLやTNF-alphaが関節破壊に重要な役割を果たしていること（Bone. 2002 Feb;30(2):340-6. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis. Romas E, Gillespie MT, Martin TJ.）や、慢性関節リウマチにおいてTACEがTNF-alpha産生に重要な役割を果たしていること（J Rheumatol. 2001 Aug;28(8):1756-63. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) converting enzyme contributes to production of TNF-alpha in synovial tissues from patients with rheumatoid arthritis. Ohta S, Harigai M, Tanaka M, Kawaguchi Y, Sugiura T, Takagi K, Fukasawa C, Hara M, Kamatani N.）が報告されている。さらに変形性関節炎でTNF-alphaの発現や（Osteoarthritis Cartilage. 1999 Jul;7(4):392-4. Regulation of tumor necrosis factor-alpha and tumor necrosis factor converting enzyme in human osteoarthritis. Amin AR.）、TACEの発現が上昇していること（J Immunol. 1998 May 1;160(9):4570-9. TNF-alpha convertase enzyme from human arthritis-affected cartilage: isolation of cDNA by differential display, expression of the active enzyme, and regulation of TNF-alpha. Patel IR, Attur MG, Patel RN, Stuchin SA, Abagyan RA, Abramson SB, Amin AR.）が報告されており、TACEが破骨細胞分化促進サイトカインRANKLとTNF-alphaの遊離・活性化に重要な役割を果たしていることが推察される。そのため現在までにTACE阻害剤の慢性関節リウマチへの応用が試みられている（Bioorg Med Chem. 2009 Jan 15;17(2):444-59. doi: 10.1016/j.bmc.2008.11.067. Epub 2008 Dec 3. Current perspective of TACE inhibitors: a review. DasGupta S, Murumkar PR, Giridhar R, Yadav MR.）。
【００５６】
また、腫瘍の骨転移の阻害に関しては、1) TACEが様々な腫瘍で発現が上昇していること(Eur J Cell Biol. 2011;90(6-7) :527-35, Curr Pharm Des. 2009;15(20):2319-35, Semin Cell Dev Biol. 2009;20(2):164-74)、2）インターフェロンガンマ（IFNG）は破骨細胞分化因子RANKLの細胞内シグナルを干渉することで破骨細胞分化を阻止する能力を有することが報告されている(Nature 2000,408(6812):600-5.)。また、本発明者は、TACEがIFNGを分解できることを見出している。また、腫瘍細胞がRANKLを発現し、破骨細胞分化・活性化を促進させそれによって骨転移をおこなうことも知られている。以上から腫瘍細胞が発現を上昇させているTACEによって、腫瘍周囲免疫系細胞から産生されるIFNGを分解し、ホストのIFNGによる抗腫瘍免疫の低下や破骨細胞分化活性化をより増強させることにより、さらに破骨細胞分化・活性化を促進させることで腫瘍細胞の骨転移を増強していることが考えられる。また、腫瘍でTACE発現が上昇することも報告されている（Eur J Cell Biol. 2011;90(6-7):527-35, Curr Pharm Des. 2009;15(20):2319-35,及びSemin Cell Dev Biol. 2009;20(2):164-74）。よって腫瘍細胞の発現するTACEを阻害することで、IFNG分解を阻止し、それによってホストの抗腫瘍免疫の低下や破骨細胞分化活性化を抑制できることが考えられる。
【００５７】
診断剤
前述のTACEの発現と病態の進行が相関しているため、本発明の抗体を用いて病理組織標本や血清サンプル・組織液サンプルなどでTACEの増加を検出することで病態の進行を予測することができる。従って、本発明は、前述の抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体を含有する、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の診断剤（例えば、体外診断剤）を提供する。前述のＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患に罹患していることが疑われる患者の血清等の被験試料中にヒトＴＡＣＥタンパク質が検出されれば（例えば、ヒトＴＡＣＥタンパク質があらかじめ設定した閾値以上であった場合等）、当該疾患に罹患している、またはその疾患が進行期にあると診断することができる。ヒトＴＡＣＥタンパク質の検出方法としては、ＥＬＩＳＡ等、自体公知の方法を適宜使用することができる。
【実施例】
【００５８】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００５９】
本実施例においては、下記の動物、細胞、試薬等を使用した：
動物
6週齢雄性BALB/C マウス（総数18匹）は日本SLC（浜松）から購入し実験に用いた。本実験プロトコールは東北大学動物実験指針を遵守して計画し、実験開始前に学内委員会の承認を得た上で実験を遂行した。【００６０】
細胞
マウスT細胞セルラインEL4-TK
マウスT細胞リンパ腫から樹立されたEL4-TKを東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから提供を受けて用いた。
（http://www2.idac.tohoku.ac.jp/dep/ccr/TKGdate/TKGvo101/0192.html）
マウスミエローマセルラインSP-2
マウスミエローマセルラインSP-2は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから提供を受けて用いた。
（http://www2.idac.tohoku.ac.jp/dep/ccr/TKGdate/TKGvo102/0248.html）
試薬
リコンビナントヒトTACE（930-ADB-010）、蛍光ペプチド基質（ES010)はR&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)から購入し実験に用いた。抗マウスTNF-alpha ELISAキット(430902)はBioLegend, Inc. (San Diego, CA) から購入し実験に用いた。抗げっ歯類sRANKL ELISAキット（900-K233）はPeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ) から購入し実験に用いた。
HRP標識抗マウスIgG抗体（710-1332）はRockland Immunochemicals Inc. (Gilbertsville, PA) から購入し実験に用いた。TMB(860336)はSigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO) から購入し実験に用いた。TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドはライフテクノロジーズジャパン（東京）へ依頼し合成した。以下合成したTACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドの配列を示す。【００６１】
【表１】
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【００６２】
細胞培養
各細胞は他にことわりが無い限り10%FBS（HyClone：サーモサイエンス、Rockford, IL）、ペニシリン・ストレプトマイシン含有α-MEMを培養液として用いた。また37℃、5%CO2下で培養を行った。【００６３】
実施例１
マウスへのペプチド免疫
合成したTACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチド9種をそれぞれHemocyanin, from Keyhole Limpet (KLH：和光純薬、東京、日本)へDisuccinimidyl suberate(DSS: サーモサイエンス、Rockford, IL)を用いて架橋した。KLH結合ポリペプチドを通法に従いフロイドのアジュバントとともに皮下組織に注射した。２週毎に追加免疫を行った。免疫直前ならびに追加免疫時に採血を行い、血清中の抗体力価をELISAを用いた下記方法にて測定した。【００６４】
血清中の抗体力価測定
TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドまたはリコンビナントヒトTACE（R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)）をコートしたELISA plateをブロックエース（DSファーマバイオメディカル、大阪、日本）で非特異結合部位をマスク後に1000倍希釈した血清サンプルを各ウェル100マイクロL添加した。ウェルを洗浄後、検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体（Rockland Immunochemicals Inc. 、Gilbertsville、PA)を反応させ、さらにウェルを洗浄後にHRPの反応基質としてTMB(Sigma-Aldrich Co. LLC. 、St. Louis、MO)を用いて650nmの吸光度を測定し各抗原へ結合した血清IgG量を相対評価した。【００６５】
ポリクローナル抗体のマウス血清からのアフィニティー精製
十分に血清抗体価が上昇したところで血液を5ml程度貯蔵し、Ab-Rapid（プロテノバ、高松、日本）を推奨プロトコールに準じてIgGを精製した。その後、各ポリペプチドをNHS-Activated アガロースゲル（サーモサイエンス、Rockford, IL）へクロスリンクしたアガロースゲルカラムを用いて、精製したIgG中の各TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドに特異的に結合するIgGをアフィニティー精製した。精製後、ビバスピン500 遠心濾過ユニット(MWCO 10kDa；Sartorius AG、Goettingen、Germany)を用いてPhosphate buffered Saline (PBS)へ溶媒を置換した。【００６６】
精製したIgG濃度測定
あらかじめ濃度が既知のノーマルマウスIgG希釈系列ならびにサンプルIgGをELISAプレートへコートし、ブロックエースで非特異結合部位をマスク後に検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を反応させ、さらにウェルを洗浄後にHRPの反応基質としてTMBを用いて650nmの吸光度を測定した。ノーマルマウスIgG希釈系列のIgG濃度-吸光度標準曲線を用いて、サンプルの吸光度からサンプルのIgG濃度を計測し、各抗体溶液の濃度を一定とした。【００６７】
TACE活性阻害測定
リコンビナントヒトTACE (R&D Systems, Inc. 、Minneapolis、MN) 0.4 μmol（ポリクローナル抗体の阻害能測定時）あるいは4μmol（モノクローナル抗体の阻害能測定時）を、100μLの反応液（2.5 microM 塩化亜鉛、0.005% Brij35含有PBS）に希釈し、低分子阻害剤TAPI-2 (Santa Cruz, Inc.、Santa Cruz、CA)または精製した抗体を添加し、蛍光ペプチド基質（R&D Systems, Inc. 、Minneapolis、MN) 0.5nmolを添加した後に、TACEによって蛍光ペプチド基質が切断されることで生ずる蛍光を励起光320nm、蛍光405nmの設定でSpectraMax M2e蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス ジャパン株式会社、東京）を用いて測定し、その蛍光値からTACE酵素活性阻害を比較した。結果は以下の通り。【００６８】
各アフィニティー精製ポリクローナル抗体のTACE阻害能比較
得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体のTACE中和能を評価すべく、リコンビナントヒトTACEと蛍光標識TACE基質ならびにそれぞれ等量のアフィニティー精製ポリクローナル抗体を用いて、TACE活性の測定を行った。【００６９】
具体的には、リコンビナントヒトTACEとアフィニティー精製抗体を30分反応後、蛍光標識TACE基質を反応系に添加し、蛍光プレートリーダーで蛍光標識TACE基質分解に伴う蛍光の上昇を観察した。結果を図１に示す。グラフは数値が高いほどその精製抗体がTACE酵素活性阻害能が低く、グラフの数値が低いほどTACE酵素活性阻害能が高いことを示す。
データは平均値ならびにSDバーを示す。
*: 群間にp< 0.05 で有意差があることを示す。【００７０】
図１に示すように、そのままのTACE活性を100%、完全なTACE活性阻害が得られた場合を0%とすると、酵素活性中心を含むポリペプチド７を免疫することで得られた精製抗体を作用させた場合はそれほど高い中和能は示さなかった(82.1%)。得られた精製抗体のうち、酵素活性中心に3次元的に近接する部位のポリペプチド９を免疫した動物から得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体が最も高いTACE活性中和能を示した(42.5%)（図７〜１５に、ＴＡＣＥの３次元構造及びＰｅｐｔｉｄｅ−１〜Ｐｅｐｔｉｄｅ−９の位置を示す）。しかしながらポリペプチド９と同様に３次元的に酵素活性中心に近接する部位のポリペプチド５を免疫することで得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体はほとんど中和能を示さなかった(94.1%)。酵素活性中心から3次元的に遠い部位であるポリペプチド４を免疫することで得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体はポリペプチド９に次ぐ高いTACE活性中和能を示した(46.6%)。【００７１】
アフィニティー精製ポリクローナル抗体と低分子阻害剤TAPI-2のTACE阻害能比較
ポリペプチド９から得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体が、TACE低分子阻害剤(TAPI-2)と比較してどの程度中和活性を有しているかを明らかとすべく、濃度-反応曲線をそれぞれ作成し、中和活性の評価を行った。比較は、リコンビナントヒトTACE活性を50%中和するのに必要な抗体あるいは阻害剤のモル濃度ND50を比較することで行った。【００７２】
具体的には、ヒトリコンビナントTACEとアフィニティー精製抗体またはTACE低分子阻害剤(TAPI-2)を30分反応後、蛍光標識TACE基質を反応系に添加し、蛍光プレートリーダーで蛍光標識TACE基質分解に伴う蛍光の上昇を観察した。【００７３】
抗体・低分子阻害剤ともに５倍希釈系を５点作製し、TACE酵素活性阻害能を評価した。結果を図２に示す。赤い横線はTACE活性50%阻害を示し、各グラフとの交点がND50を示す。グラフの曲線が左にあればあるほど低濃度で高い中和能を有することを示す。TAPI-2（3500nM）と比較して今回得られたアフィニティー精製ポリクローナル抗体（0.02nM）は、６桁低いND50値を示した。【００７４】
実施例２
ハイブリドーマ作製
TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチド最終免疫日から4日後に免疫したマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。脾細胞懸濁液を調整後、赤血球を0.75% 塩化アンモニウム含有0.017M トリス緩衝液（pH = 7.65）を用いて溶血し、PBS洗浄後に無血清培地に懸濁し細胞懸濁液を調製した。細胞融合試薬GenomOne-CF（石原産業、大阪）を推奨プロトコールに準じて用いて、脾細胞とマウスミエローマSP-2細胞を融合させた。96ウェルプレートへ播種し、細胞融合の翌日にHTメディアサプリメント Hyb Max（Sigma-Aldrich Co. LLC. 、St. Louis、MO）含有培地で培養を開始した。【００７５】
ハイブリドーマの選択
ハイブリドーマのコロニー形成が確認された段階で培養上清を回収しELISAプレートを用いて各クローンの産生するIgGの反応性を確認した。抗原としてTACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチド、KLH結合TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチド、KLH、リコンビナントヒトTACEを用いた。この中でKLH結合ポリペプチドコートプレートで高値を示すクローンを1次選択し、その中でKLHコートプレートで高値を示すクローンを除外した。次にそれら選択されたクローンの中からTACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチド、リコンビナントヒトTACEコートプレートで高値を示すクローンを選択し、等量の精製モノクローナルIgG抗体を用いてTACE酵素活性阻害試験を行った。【００７６】
モノクローナル抗体C6-30、C6-62と低分子阻害剤TAPI-2のTACE阻害能比較
ポリペプチド９から得られたモノクローナル抗体が、TACE低分子阻害剤(TAPI-2)と比較してどの程度中和活性を有しているかを明らかとすべく、濃度-反応曲線をそれぞれ作成し、中和活性の評価を行った。比較は、リコンビナントヒトTACE活性を50%中和するのに必要な抗体あるいは阻害剤のモル濃度ND50を比較することで行った。【００７７】
具体的には、モノクローナル抗体を用いる以外、前記実施例１の「アフィニティー精製ポリクローナル抗体と低分子阻害剤TAPI-2のTACE阻害能比較」と同様にして測定を行った。【００７８】
結果を図３に示す。TAPI-2 (385252 pM) と比較してモノクローナル抗体C6-30 (2094 pM)、C6-62 (728 pM)ともに3桁低いND50値を示し、非常に高いTACE活性阻害能を有していた。【００７９】
実施例３
エピトープマッピング
TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドNo.９（VMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQ）のうち、N末端から８アミノ酸残基のより短いペプチドを２アミノ酸残基ずつずらして計８種類、医学生物学研究所に依頼して合成した。以下合成依頼したエピトープマッピング用ペプチドの配列を示す。各ペプチドのHPLCによる実測純度は、94.6〜99.8%であった。【００８０】
【表２】
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【００８１】
精製モノクローナル抗体に各ペプチド9A〜9Hをそれぞれ添加したサンプルを準備し、それらをリコンビナントヒトTACEをコート、BlockAceブロッキングしたELISAプレートの各ウェルへ添加し、インキュベートした。その後検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を反応させ、さらにウェルを洗浄後にHRPの反応基質としてTMBを用いて650nmの吸光度を測定した。各ペプチド9A〜9Hを精製モノクローナル抗体に添加することで精製モノクローナル抗体がエピトープであるペプチドに結合し、リコンビナントヒトTACEに結合できなくなる性質を利用し、本検出系で数値が低くなった添加ペプチドが精製モノクローナル抗体のエピトープ配列であることを示している。具体的には以下の通り：【００８２】
モノクローナル抗体C6-30、C6-62のエピトープマッピング
TACE細胞外ドメイン短鎖ポリペプチドNo.９は23アミノ酸残基であり、この23アミノ酸残基のなかでエピトープ領域をさらに絞り込むことを目的として8アミノ酸残基長でN末端から2アミノ酸残基づつずらしたペプチドを８種類合成し、得られたモノクローナル抗体がどのペプチドと強く結合するかを調べることでモノクローナル抗体のエピトープ配列同定を行った。【００８３】
はじめに、8アミノ酸残基長ペプチドがELISAプレートに十分結合しないことを懸念し、あらかじめ等量の8アミノ酸残基長ペプチドをモノクローナル抗体溶液中にそれぞれ添加して反応させた後に、そのペプチドと反応させた抗体溶液をリコンビナントヒトTACEをコートしたELISAプレートへ添加し、モノクローナル抗体のリコンビナントヒトTACEへの結合量が減少するペプチドをエピトープ配列とする方法でエピトープの同定を行った。【００８４】
より具体的には、精製モノクローナル抗体に各ペプチド9A〜9Hをそれぞれ添加したサンプルを準備し、それらをリコンビナントヒトTACEをコート、BlockAceブロッキングしたELISAプレートの各ウェルへ添加し、インキュベートした。その後検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を反応させ、さらにウェルを洗浄後にHRPの反応基質としてTMBを用いて650nmの吸光度を測定した。データを図４の上のグラフに示す。
図中、＊は p < 0.05でモノクローナル抗体にPBSを添加したサンプルに対して有意差あり、を示す。
ペプチド９Bを添加したモノクローナル抗体サンプルで著しい数値の減少が観察されたことから、ペプチド９Bが得られたモノクローナル抗体のエピトープであることが示唆された。尚、データはモノクローナル抗体C6-30の結果を示しているが、C6-62でも同様の結果が得られた（Data not shown）。【００８５】
また、精製モノクローナル抗体エピトープ配列の別な検出方法として、精製モノクローナル抗体の各ペプチド9A〜9Hへの反応性を直接的に観察すべく、各ペプチド9A〜9HをELISAプレートにコートし、BlockAceブロッキング後に精製モノクローナルIgGサンプルを各ウェルに添加・インキュベート後、検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を反応させ、HRPの反応基質としてTMBを用いて650nmの吸光度を測定した。本検出系で数値が高くなったウェルをコートしたペプチドが精製モノクローナル抗体のエピトープ配列であることを示している。【００８６】
具体的には、精製モノクローナル抗体の各ペプチド9A〜9Hへの反応性を直接的に観察すべく、各ペプチド9A〜9HをELISAプレートにコートし、BlockAceブロッキング後に精製モノクローナルIgGサンプルを各ウェルに添加・インキュベート後、検出抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体を反応させ、HRPの反応基質としてTMBを用いて650nmの吸光度を測定した。本検出系で数値が高くなったウェルをコートしたペプチドが精製モノクローナル抗体のエピトープ配列であることを示している。結果を図４  上から２つめのグラフに示す。
図中、＊は、p < 0.05 でノンコートウェルに対して有意差あり、を示す。【００８７】
ペプチドをコートしないウェルに比較してペプチド9Bをコートしたウェルにおいてのみ高い吸光度が観察されたことから、得られたモノクローナル抗体はペプチド9Bにのみ結合していることが示された。尚、データはモノクローナル抗体C6-30の結果を示しているが、C6-62でも同様の結果が得られた（Data not shown）。【００８８】
以上のことから、得られたモノクローナル抗体のエピトープ配列は“YPIAVSGD”であることが示された。【００８９】
実施例４
細胞培養系における精製モノクローナル抗体のTACE中和能試験
次に得られたモノクローナル抗体C6-62が細胞培養系においても所定のTACE阻害効果を示すかどうかを、活性化マウスT細胞からのTACEによる破骨細胞分化促進サイトカイン遊離を測定することで確認した。【００９０】
具体的には、マウスT細胞セルラインEL4-TK細胞懸濁液（8×104 cells/ml、1ml）を24ウェルプレートへ播種した。精製モノクローナル抗体または正常マウスIgGを終濃度0.32 μg/mlとなるように添加し30分間反応後、刺激群ではPhorbol-12-Myristate-13-Acetate (PMA) (終濃度25ng/ml；LC Laboratories、Woburn、MA)とIonomycin（終濃度500 ng/ml；Enzo Life Sciences, Inc.、Farmingdale、NY）を培養系に添加し細胞を刺激した。２時間後に培養液中のTNF-α測定用に培養液を回収した。また培養液中のsRANKL測定用に、刺激開始3日後に培養液を回収した。下記の方法により、TNF-α、sRANKL濃度を測定、評価した。【００９１】
刺激された細胞からのマウス破骨細胞分化促進因子遊離量の測定
培養液中のマウスTNF-α、sRANKL濃度は、抗マウスTNF-alpha ELISAキット(BioLegend, Inc. 、San Diego、CA) ならびに抗げっ歯類sRANKL ELISAキット（PeproTech, Inc. 、Rocky Hill、NJ)を推奨プロトコール通り用いて測定した。【００９２】
統計学的有意差の検定
実験は各サンプルを三回計測する実験を３度繰り返し、同様な結果を得られていることを確認している。それら実験データの統計学的有意差検定施行は、Tukeyの多重比較法を用いて行い、有意水準5%以下を有意差ありと見なした。【００９３】
結果を図５に示す。図中、＊は、p < 0.05でコントロールと刺激群間で有意差あり、を示す。マウスT細胞セルラインEL4TKはPMAとIonomycinの組み合わせによる刺激でTNF-αと遊離型RANKL（soluble RANKL: sRANKL）を培養上清中に遊離した。モノクローナル抗体C6-62を培養系に添加した状態で細胞を刺激した場合には、培養上清中のTNF-α・sRANKLともに著しく減少し、モノクローナル抗体C6-62が細胞培養系においてもTACEの活性を阻害し、活性化T細胞からの破骨細胞分化促進サイトカイン遊離を阻止できることが示された。【００９４】
実施例５
動物実験
８週齢の雌性C57BL6マウスを対照群6匹、実験的歯周病群6匹、実験的歯周病+抗体投与群6匹に分けて実験に用いた。
実験的歯周病群及び実験的歯周病+抗体投与群については、Kimuraらの方法に準じ(J Periodontol. 2000 Jul;71(7):1167-73.)、実験開始日にマウス上顎第一・二臼歯間に6-0絹糸を挿入することで骨破壊を惹起した。骨破壊に対して樹立した抗TACEモノクローナル抗体がどの程度抑制効果を示すかを探索すべく、対照群・実験的歯周病群では上顎第一・二臼歯間の口蓋側歯間乳頭歯肉にPBSを、実験的歯周病+抗体投与群では抗TACEモノクローナル抗体（C6-62）をそれぞれ2マイクロLを実験開始日に（実験的歯周病群及び実験的歯周病+抗体投与群においては、上記絹糸を挿入した後５分以内に）局所注射した。各群のマウスを実験開始5日目に屠殺、マイクロCTを撮影し骨破壊の程度を評価した。【００９５】
マイクロCTによる骨破壊評価
屠殺後の各マウス頭蓋サンプルを１晩ホルムアルデヒド浸積固定後、ScanXmate-E090(コムスキャンテクノ社）にてマイクロCT像を撮影した。撮影したマイクロCT像はConeCTexpress(コムスキャンテクノ社）にて再構築しDICOMファイル化した後、３次元レンダリング処理をPluto(http://pluto.newves.org/trac)を用いて行い３次元像上で第一臼歯遠心口蓋根の歯槽骨破壊の程度をセメントエナメルジャンクションから歯槽骨表層までの距離を算出することで比較検討した。【００９６】
統計処理
他群間比較はTukeyテスト（MEPHAS; http://www.gen-info.osaka-u.ac.jp/testdocs/tomocom/tukey-e.html）を用いて有為差の検定を行った。p < 0.05 を有為差ありと判定した。結果を図１６に示す。具体的には、各グループの代表的な3次元レンダリング処理像を図１６左に示す。白線はセメントエナメルジャンクションから歯槽骨表層までの距離を示す。セメントエナメルジャンクションから歯槽骨表層までの距離についてのグループ間比較として、対照群における平均距離を0%、実験的歯周病群における平均距離を100％とした場合の実験的歯周病+抗体投与群の平均距離を%へ換算し、図１６右に示す。100％に近いほど骨破壊量が多く、0%に近いほど骨破壊が阻止されていることを示す。図１６から明らかなように、本実施例で用いたモノクローナル抗体が骨破壊を阻止したことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明に係る抗体は、非常に高いＴＡＣＥ機能の阻害能を有し、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達を阻害する。ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患は多岐にわたっているため、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月16日(2015.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＭＹＰＩＡＶＳＧＤＨＥＮＮＫＭＦＳＮＣＳＫＱ又はＭＡＫＳＹＰＮＥＥＫＤＡＷで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する抗ヒトＴＡＣＥタンパク質抗体。
【請求項２】
ＹＰＩＡＶＳＧＤで表されるアミノ酸配列の領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＶＭＹＰＩＡＶＳＧＤＨＥＮＮＫＭＦＳＮＣＳＫＱで表されるアミノ酸配列のうち少なくとも７つの連続するアミノ酸からなるペプチド、又はＭＡＫＳＹＰＮＥＥＫＤＡＷで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、ＴＡＣＥペプチドエピトープ。
【請求項５】
アミノ酸配列ＹＰＩＡＶＳＧＤを含む、請求項４に記載のＴＡＣＥペプチドエピトープ。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬。
【請求項８】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の治療又は予防薬。
【請求項９】
有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与する工程を含む、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１０】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項９に記載の方法
【請求項１１】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患を治療又は予防するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、間節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患の治療又は予防薬を製造するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達に起因する疾患が、歯周病、関節リウマチ及び転移性骨腫瘍からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１３に記載の使用。
【国際調査報告】
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