(57)【要約】【課題】排卵機能や卵子自体は一見正常でも、自然交配による妊娠において受胎率および出産率が低いような遺伝的特徴を有する哺乳動物、あるいは環境や加齢などの原因で受胎率および出産率が低下した卵子に対して、受胎率や出産率を向上させるための技術を提供する。【解決手段】低受胎率および低出産率を呈する哺乳動物の受精卵を一度体外にて、特定濃度のグリシン受容体作動物質を含有する培地を用いて体外培養した後、胚を母胎にし、出産させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸を含まない培地、グリシンを含まない他のアミノ酸含有培地、２０種アミノ酸溶液添加培地、及び非必須アミノ酸溶液添加培地のうち、いずれかの培地にグリシン受容体作動物質を添加したことを特徴とする胚培養培地。
【請求項２】
前記グリシン受容体作動物質はグリシン又は／及びβ−アラニンであることを特徴とする請求項１記載の胚培養培地。
【請求項３】
前記添加するグリシン又は／及びβ−アラニンの量が０．０００１ｍＭ〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項２記載の胚培養培地。
【請求項４】
マウスの受精卵を培養するための培地であって、前記添加するグリシンの量が０．１ｍＭ〜２ｍＭであることを特徴とする請求項３記載の胚培養培地。
【請求項５】
ウシの受精卵を培養するための培地であって、前記添加するグリシンの量が１ｍＭ〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項３記載の胚培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然交配でも出産率が低いような動物の、受精卵の体外培養時の発生率の改善に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトやウシ、ブタ、マウスなど哺乳類では、母親の卵巣から排卵された卵子が、卵管膨大部で精子と受精し、受精卵（胚）となって卵管内を子宮側に移動しながら、胚盤胞期と呼ばれるステージまで卵割がすすみ、その後子宮に着床することで新生児への発生・分化を開始する。
ところが、同じ両親に由来する受精卵でも「着床前発生途中で細胞分裂が止まるもの」と「胚盤胞期に到達し着床するもの」があり、卵子や受精卵にも品質（oocyte quality）が存在し、一定以上の品質を持った受精卵のみが子宮に着床することができると考えられている。
この卵子の品質は、母胎の加齢とともに劣化し、やがて発生能を完全に失うと考えられており、「卵子老化（oocyte aging）」と呼ばれ、高齢女性の不妊の原因の一つとして、近年、特に注目されている。【０００３】
実験動物であるマウスでは、代表的な近交系であるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは９０％以上の受精卵が胚盤胞期胚に到達するのに対して、その他の近交系統であるＢＡＬＢ／ｃＡマウス、ＤＢＡ／２Ｊマウスでは胚盤胞達成率は低い。
特に、聴覚欠損や小脳の発達障害を持つＤＢＡ／２系統では受精卵の２０％以下の胚しか胚盤胞期に達しない。
また、排卵される卵子の数はＤＢＡ／２Ｊマウスの方が多いのにも関わらず、実際に自然交配を行った場合の子供の数はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの方が有意に多い（非特許文献１）。
これらマウス近交系統間における表現形の違いは、われわれヒトの個人差に相当すると考えられており、排卵機能や卵子形態などが正常であるにも関わらず、自然交配による妊娠において次世代の子供を授かる確率（受胎率および出産率）が低いような原因不明の不妊症患者の病態モデルとしてＤＢＡ／２Ｊマウスが有用であると考えられている（非特許文献２）。【０００４】
一方、ヒト受精卵のタンパク質を含まない発生培地を提供するためにグリシンを含んだ培地（特許文献１）、L-グルタミンを発生させないための胚発生培地組成として、グリシンを含んだ培地（特許文献２）、グリシンとタウリンは限定培地におけるウシ体外受精卵の胚盤への発育成績を改善する（非特許文献３）などの報告がある。【０００５】
【特許文献１】日本国特表２０１１−５０７５３０号公報
【特許文献２】日本国特開２００１−１７１６０号公報
【非特許文献１】西園啓文、日本胚移植研究会雑誌  第35巻  1号、page 15―18、20    13年
【非特許文献２】小出剛ら、マウス実験の基礎知識、page 148―150、2009年
【非特許文献３】J. Vet.Med. Sci., 60(4), 433-437 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらのような、排卵機能や卵子自体は一見正常でも、自然交配による妊娠において受胎率および出産率が低いような遺伝的特徴を有する哺乳動物、あるいは環境や加齢などの原因で受胎率および出産率が低下した卵子に対して、受胎率や出産率を向上させるための技術は、現在のところほとんど報告されていない。
本発明の目的は、排卵機能や卵子自体は一見正常であっても、自然交配による妊娠において受胎率および出産率が低いような哺乳動物において、高率的に受胎および出産をさせる方法およびそれに用いる胚培養培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、低受胎率および低出産率を呈する哺乳動物の受精卵を一度体外にて培養し、その際に特定濃度のグリシン受容体作動物質を含有する培地を用いて体外培養することにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
具体的には、アミノ酸を含まない培地、グリシンを含まない他のアミノ酸含有培地、２０種アミノ酸溶液添加培地、及び非必須アミノ酸溶液添加培地のうち、いずれかの培地にグリシン受容体作動物質を添加したことを特徴とする。
ここで、グリシン受容体物質とはグリシン受容体に結合し、グリシンに有する作用と同じ又は類似の作用を有する物質をいう。
グリシン受容体作動物質の例としては、例えばアミノメタンスルホン酸，グリシン，Ｄ−アラニン，Ｌ−アラニン，β−アラニン，タウリン，ハイポタウリン，ドデシルベンゼンスルホネート，クロロメチアゾール，イベルメクチン等が挙げられる。
また、本発明においては、グリシン受容体作動物質を単独又は組み合せて用いてもよい。
その中でも好ましくは、グリシン，β−アラニンであり、添加するグリシン又は／及びβ−アラニンの量が０．０００１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲がよい。
例えば、マウスの受精卵を培養するための培地であって、前記添加するグリシンの量が０．１ｍＭ〜２ｍＭであり、ウシの受精卵を培養するための培地であって、前記添加するグリシンの量が１ｍＭ〜５０ｍＭであることを特徴とする。【０００８】
本発明に用いる培地は、哺乳動物の胚培養に用いられる発生培地であれば限定されない。
例えば、ウィッテン培地またはウィッテン修飾培地と呼ばれているものである。【０００９】
ウィッテン培地とは、クレブス-リンガー重炭酸緩衝液［Krebs-Ringer Bicarbonate buffer、組成成分：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、亜リン酸水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ３）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）］に、グルコース（ｇＬｕｃｏｓｅ）とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が添加されたものである。【００１０】
本発明に使用されるウィッテン修飾培地は、ウィッテン培地に乳酸やピルビン酸等の酸成分、グルタミン酸などのアミノ酸、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、ＥＤＴＡ，フェノールレッド、メルカプトエタノール等が適宜添加された培地である。
具体的には、例えば、ＢＭＯＣ２培地、Ｍ１６培地、ＭＴＦ培地、ＣＺＢ培地、ＫＳＭＯ培地、ｍＳＯＦ培地、Ｇ１培地、Ｇ２培地、ＴＹＨ培地、Ｐｅｔｅｒ  ＆  Ｈｏｐｐｅ培地（Biology of Reproduction, 8, 420-426(1973)）およびそれらの修飾培地が挙げられる。【００１１】
本発明の胚培養培地で培養される受精卵は、哺乳動物の受精卵であって、哺乳動物の体内で受精したものであってもよく、体外で受精させたものであってもよい。【００１２】
哺乳動物は、特に限定されないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜動物、マウス、ラット等のげっ歯類が挙げられる。【００１３】
本発明に使用されるグリシンは、タンパク質を分解して得られるものでもよく、化学合成によって得られたのであってもよい。
本発明の胚培養培地におけるグリシンもしくはβ-アラニンまたはその両方の濃度は、マウスで０.０００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、０.１ｍＭ〜２ｍＭ、さらに好ましくは０.５ｍＭ〜１ｍＭである。
また、ウシでは１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の胚培養培地中で培養した受精卵は、胚盤胞へ発生させてから母胎に戻すことで、受胎率および出産率が向上させることができる。
すなわち、低受胎率受精卵の発生率改善した本発明の培地を用いることで、自然交配による妊娠によって次世代の子供を得ることが難しい哺乳動物において、体外で高率的に胚盤胞期胚を作成し、作成された胚盤胞期胚を母胎に戻すことで、受胎率および出産率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施例で説明するが本発明はそれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
自然交配における妊娠で子供を得にくいＤＢＡ／２Ｊマウスの雌マウスに、それぞれ７．５単位のＰＭＳＧおよびｈＣＧホルモンによる過排卵処理を行い、得られた卵子と精子を用いて体外受精を実施した。
体外受精実施２４時間後に、既存の発生培地であるｍＷＭ培地（アークリソース社製）と、１００ｎＭから１ｍＭのグリシンを添加したｍＷＭ培地にそれぞれ受精卵を移し、体外受精から９６時間後に胚盤胞期への発生率を測定した。
体外受精から９６時間後の胚盤胞期への発生率（％）は、下記の数式１で示されるもので、一般的に、この値が高いほど受胎および出産しやすい卵子や胚であると考えられている。【００１７】
【数１】
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それぞれの培地で5回繰り返して実施した平均値を、表１に示す。【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１の通り、１００ｎＭから１ｍＭの濃度でグリシンを添加したｍＷＭ培地で発生させることによって、自然交配における妊娠で子供を得にくいＤＢＡ／２Ｊマウスの受精卵であっても最大２．７倍の効率で、胚盤胞期胚に発生させることができる。
【実施例２】
【００２０】
グリシンの類似物質であり、グリシンと同じくグリシンレセプターの作動薬であるβ−アラニンを、実施例１と同様に、５００μＭ添加したｍＷＭ培地にＤＢＡ／２Ｊマウス受精卵を移し、体外受精から９６時間後に胚盤胞期への発生率を測定した。
５回繰り返して実施した平均値を、表２に示す。【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２の通り、５００μＭの濃度でβ−アラニンを添加したｍＷＭ培地で発生させることによって、自然交配における妊娠で子供を得にくいＤＢＡ／２Ｊマウスの受精卵であっても最大１．９倍の効率で、胚盤胞期胚に発生させることができる。【００２３】
次に２０種アミノ酸溶液の添加培地と無添加培地とを比較した。
ｍＷＭ培地と一般的に使用されている２０種アミノ酸添加培地であるｋＳＯＭ＋ＡＡ培地に、実施例１と同様にＤＢＡ／２Ｊマウスの受精卵を移し、体外受精から９６時間後の胚盤胞期への発生率を測定した。
アミノ酸が添加されていないｍＷＭ培地の発生率は、１９．１９±１２．１２％であり、ｋＳＯＭ＋ＡＡ培地は２３．８９±１６．０１％であった。
このことは、発生率の向上がグリシンが含まれている２０種アミノ酸添加によるものではなく、グリシン単独添加によるものであることが示唆されたことになる。【００２４】
次にグリシン単独の機序を調査した。
ｍＷＭ培地と、これにグリシントランスポーターの阻害剤であるサルコシンを添加した１ｍＭサルコシン添加ｍＷＭ培地に、それぞれＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵（胚盤胞発生率が高いとされるマウス）を実施例１と同様に移し、９６時間後の胚盤胞期への発生率を測定した。
その結果、ｍＷＭ培地の発生率は９０．３２±５．８３％で、１ｍＭサルコシン添加ｍＷＭ培地の発生率は８９．０３±８．９５％であった。
このことは、サルコシンの添加で発生率が低下していないことから、グリシン単独添加の効果は、グリシントランスポーターを介したものではないと推定される。
次に、ｍＷＭ培地とこれにグリシンレセプター阻害剤であるストリキニーネを添加したｍＷＭ＋１ｍＭストリキニーネ培地に、それぞれＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵を移し、実施例１と同様の胚盤胞期への発生率を測定した。
その結果、ｍＷＭ培地の発生率は８６．２３±３．２０％であったのに対して、ｍＷＭ＋１ｍＭストリキニーネ培地の発生率は０．０％となり、胚発生が停止した。
このことは、グリシン単独効果は、グリシンレセプターを介したものであることが推定された。
【実施例３】
【００２５】
黒毛和種及び黒毛和種とホルスタイン種との交雑種の屠体由来卵巣を１４℃で１８〜２０時間保存し、その卵巣から回収した卵子を２２時間体外にて成熟後、体外受精実施した。
体外受精２４時間後に一般的に使用されている発生培地ｍＳＯＦ培地に移した。
表３，４にて試験区「２０ＡＡ」は、ｍＳＯＦ培地に一般的に市販されている、２０種類のアミノ酸（必須アミノ酸＋非必須アミノ酸）が含まれたアミノ酸溶液を１％添加したものである。
表中、「２０ＡＡ＋１０ｍＭグリシン」は、アミノ酸溶液と共に１０ｍＭグリシンになるようにグリシンを添加したものである。
表中、「非必須アミノ酸＋１０ｍＭグリシン」は、一般に市販されている非必須アミノ酸が含まれた非必須アミノ酸溶液を１％添加したものである。
体外受精から７日後の胚盤胞期への発生数と、かっこ書きで示した発生率を表３，４に示す。
胚盤胞の発生率は、分割数に対する胚盤胞の割合を示す。【００２６】
【表３】
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【表４】
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【００２７】
表３の結果からは、ｍＳＯＦ＋２０ＡＡ培地よりも、それに１０ｍＭグリシン添加の培地の方の発生率が２０％以上高い。
表４の結果からは、ｍＳＯＦ＋２０ＡＡ培地に１０ｍＭグリシン添加したものも、ｍＳＯＦ培地に非必須アミノ酸と１０ｍＭグリシン添加したものも、１０ｍＭグリシンの添加により胚盤胞の発生率が３０％以上高い。
このことは、冷蔵保存した品質の劣る卵子由来のウシ体外受精卵でも胚盤胞期への発生率が向上することが明らかになった。
一般的に市販されているアミノ酸溶液や非必須アミノ酸溶液にもグリシンが含まれている。
このようなアミノ酸添加培地や非必須アミノ酸添加培地に対しても、グリシンを単独で添加する効果が認められた。
なお、一般に使用されているｍＳＯＦａａ培地には、グリシンが約７．５ｍｇ／Ｌが含まれており、グリシンのモル質量は約７５ｇ／ｍｏｌであるから、培地におけるグリシンの量は０．１ｍＭ程度である。
ウシでは、品質の悪い卵子や受精卵を作出するような固体から得られた卵子，受精卵でも、１０ｍＭのグリシン添加発生培地で体外培養することで、高確率に胚盤胞を作出することができる。
従って、ウシの場合もアミノ酸溶液の添加よりもグリシン単独の添加効果が認められるものの、１ｍＭ〜５０ｍＭのグリシン、好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭのグリシン添加がよい。
これは、ウシ受精卵ではマウス受精卵よりも浸透圧に対する抵抗性が高く、至適濃度が高いものと推定される。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
自然交配で次世代の子供を得にくいような、ウシやブタなどの産業動物、貴重な遺伝子組換えマウス、あるいは受精卵の発生不良を原因とするような不妊症患者などにおいて、本発明の高濃度グリシン添加発生培地を用いて体外培養したのちに胚を母胎に戻すことで、高率的に次世代の子供を得ることができる。
【国際調査報告】
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