(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲに交差反応せず、配列番号１で表されるＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）のアミノ酸配列中１〜１３番目のアミノ酸領域に特異的に結合する抗体であって、
前記抗体が、
配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３２〜３５の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３３の配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３４の配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３５の配列を含む軽鎖可変領域
を含む、前記抗体。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸領域に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号３６〜３９からなる群から選択された一つ以上の重鎖可変領域をコードする配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号４０〜４３からなる群から選択された一つ以上の軽鎖可変領域をコードする配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項４に記載の核酸または請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養して抗体を発現させる工程を含む請求項１に記載の抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）に特異的に結合する抗体、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、前記抗体の製造方法及び前記抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥｒｂＢ−１；ＨＥＲ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）は、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ大学のＳｔａｎｌｅｙ  Ｃｏｈｅｎによって発見された細胞表面に発現するＥｒｂＢ系列のチロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）であって、この受容体の過発現または活性化変異は、暗化作用をする（Ｚｈａｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＥＧＦＲ系列の受容体（ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１），ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２），Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）ａｎｄ  Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４））は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αなどのリガンドに反応して（Ｈｅｒ２の場合は知られたリガンドなし）同型（ｈｏｍｏ）または異型（ｈｅｔｅｒｏ）の二量体を作って活性化信号を細胞内に伝達する。
【０００３】
二量体形成により図面のような自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４）を介してＭＡＰＫ、ＡｋｔまたはＪＮＫを経由する信号を伝達して、細胞周期や、細胞増殖を活性化する（Ｏｄａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＥＧＦＲの各ドメインとリン酸化部位は、図１に図示されたとおりである。
【０００４】
このような、腫瘍関連ＥＧＦＲの活性化を抑制するための様々な治療療法が登場して現在の強力な坑癌効果を示しており、治療療法に伴う副作用、耐性など短所を補完するために、新しい形態のＥＧＦＲ拮抗剤が開発されている。現在開発進行中であるＥＧＦＲ拮抗剤に対する具体的な内容は図２に記載されたとおりである。
【０００５】
ＥＧＦＲの過量発現及び突然変異は、肺癌、肛門癌、脳腫瘍（ＧＢＭ，ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）等において様々な形態で現れるが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異の場合、脳腫瘍でたびたび発見されて、手術、放射能療法、化学療法を介して治療後良くない予後を反映する（Ｋｕａｎ  ＣＴ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。組み換え形態のＥＧＦＲ突然変異体は、特定エクソン（ｅｘｏｎ）の削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）や重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有している。ＥＧＦＲと組み換え形態のＥＧＦＲ突然変異体は、図３に示されたとおりである。
【０００６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、２番から７番までのエクソン内のアミノ酸が欠乏している最も多く現れる配列番号１のＥＧＦＲ変異体であり、末期脳腫瘍患者から５０％以上が発現される。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲｗｔのアミノ酸配列中２６７アミノ酸を欠乏していて、１番と８番エクソンが結合されて新しいアミノ酸であるグリシンが生成されて、細胞内ドメインのリン酸化を誘導して持続的な活性を示して暗化過程に寄与するようになる（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。もちろん、他の形態のＥＧＦＲもターゲッティングが可能であるが、現在はＥＧＦＲｖＩＩＩが坑癌標的として最も適したＥＧＦＲ変異体と考えられ、多くの研究開発が進行中である。
【０００７】
特に、脳腫瘍でＥＧＦＲｖＩＩＩの主にＰＩ３ＫとＡＫＴを経由する主な信号伝達経路によって細胞信号を伝達して、非主流経路でＳｔａｔ−３、ＡＰ−１またはＭＡＰＫの活性化を介して、癌細胞の増殖、細胞死滅に対する抵抗性、新生血管形成、癌細胞の浸透増加、癌幹細胞形成などに寄与する（Ｇａｎ  ＨＫ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。近年の研究では、ＥＧＦＲｖＩＩＩがｍＴＯＲＣ２を経由してＮＦ−κＢを活性化して暗化作用に重要な役割を担うとの報告がある（Ｂｏｎａｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＥＧＦＲｖＩＩＩの活性化に伴う信号伝達経路は、図４に示されたとおりである。
【０００８】
また、ＥＧＦＲｖＩＩＩによってｃ−Ｍｅｔリン酸化に続く活性化が誘導されるため（Ｈｕａｎｇ  ＰＨ．ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ阻害剤と共にｃ−Ｍｅｔ阻害剤を併合して患者に適用投与する場合、ＥＧＦＲｖＩＩＩを高発現する患者の化学療法に対する抵抗性を軽減させると共に効能を向上させることができると判断される。
【０００９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは脳腫瘍で通常ＥＧＦＲ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ（ＷＴ）と同時に発現して（Ｅｋｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ自体はＥＧＦＲ遺伝子が増幅された腫瘍で発現するため（Ｂｉｅｒｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、個々の癌細胞は、ＥＧＦＲｗｔ増幅とＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を同時に行って相互作用をすると考えられていた。
【００１０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、脳腫瘍で比較的高い頻度で発現するが、他の癌腫ではさらなる研究が必要である。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように形質転換された脳腫瘍細胞株を利用した近年の研究では、ＥＧＦＲｖＩＩＩとＥＧＦＲｗｔを使用するネットワークが確かに相互間活性化する可能性があることが明らかにされた（Ｓｈｉａ  Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１２）。このようなＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲｗｔ間の相互作用は、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）モデル、ＧＢＭスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｌｉｎｅｓ）やその他の別の細胞株を介して自然に発現するＥＧＦＲｖＩＩＩを利用して再度確認する必要がある。
【００１１】
ＥＧＦＲが、ＥＧＦＲｖＩＩＩをリン酸化してＳＴＡＴ３／５活性化経路を主導して、脳腫瘍の進行に大きい影響を与えるとの報告もあって（Ｆａｎ  ＱＷ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ二量体形成が信号伝達の活性化に大きい影響を与えるが、ＥＧＦＲｗｔの発現が増加するほどＥＧＦＲｖＩＩＩのリン酸化と活性化を増大させるため、ＥＧＦＲｗｔの二量体形性を行うアーム（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｒｍ）とキナーゼ活性が、ＥＧＦＲｖＩＩＩの活性化に寄与すると考えられ、同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）モデルでＥＧＦＲｗｔまたはＨＢ−ＥＧＦの発現を抑制した時、ＥＧＦＲｖＩＩＩによって誘導された暗化を抑制するとの結果（Ｌｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４）から、ＥＧＦＲｗｔを取り囲んでいる活性化経路が、ＥＧＦＲｖＩＩＩの活性化を経由した腫瘍形成に大変重要な役割をしていると言える。
【００１２】
現在、ＥＧＦＲｖＩＩＩをターゲットして開発されている（脳）腫瘍治療剤は、五つの範疇に分けることができる。一番目は、従来のＥＧＦＲ治療剤を利用して、ＥＧＦＲｗｔ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの内部信号伝達を防ぐ方法、二番目は、ＡＢＴ−８０６（ｍＡｂ８０６、アボット）のようにＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩを同時にターゲッティングする抗体を利用して外部信号伝達と受容体間の相互作用を抑制する方法、三番目は、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）で開発中のＡＭＧ−５９５で見られるように、ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をＡＤＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形態で開発中のものがあって、四番目は、ＣＡＲ−Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔ  ｃｅｌｌ）形態で細胞免疫治療剤として使用することができる。五番目は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的な１４個のアミノ酸配列をＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に接合して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ坑癌ワクチンで投与する方法である。ＥＧＦＲではなく、ＥＧＦＲｖＩＩＩだけをターゲッティングする坑癌治療剤は、現在商品化された例がなく、図６に示したとおり臨床開発に当たり最も先頭にあるものがセルデクス（Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）で開発中のＥＧＦＲｖＩＩＩワクチンＣＤＸ−１１０である。
【００１３】
このような技術的背景下、本出願の発明者等は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する新規抗体を製造した。特に、ＥＧＦＲｗｔに交差反応（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ）を行わず、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するように製作して、ＥＧＦＲｗｔには結合せずＥＧＦＲｖＩＩＩにだけ結合する新規抗体を製造する可能性があることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する新規抗体、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、前記抗体の製造方法及び前記抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用医薬組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、野生型ＥＧＦＲに交差反応（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ）せず、配列番号１で表されるＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）のアミノ酸配列中１〜１３番目アミノ酸領域に特異的に結合する抗体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記抗体をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
本発明はまた、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明はまた、前記宿主細胞を培養して抗体を発現させる工程を含む抗体の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記抗体を薬学的に有効な量で必要な個体に投与する癌または腫瘍治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＥＧＦＲの各ドメインとリン酸化部位を示したものである。
【図２】ＥＧＦＲ受容体をターゲッティングする公示の拮抗体の開発進行状況を示したものである。
【図３】ＥＧＦＲと組み換え形態のＥＧＦＲ突然変異体の構造を示した模式図である。
【図４】ＥＧＦＲｖＩＩＩの活性化に伴う信号伝達の流れを示す模式図である。
【図５】www.clinicaltrials.govから入手された、臨床開発中のＥＧＦＲｖＩＩＩターゲッティング治療剤候補リストを示したものである。
【図６Ａ】ＣＨＯＫ１−ＥＧＦＲｖＩＩＩ単一細胞株の受容体発現を示すウエスタンブロット結果を示したものである。
【図６Ｂ】Ｕ８７ｍｇ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ単一細胞株の受容体発現を示すウエスタンブロット結果を示したものである。
【図７】ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を選別するために使用されたＥＧＦＲｖＩＩＩ特異配列を含むｐｅｐｔｉｄｅに対するビーズパンニングモノファージであってＥＬＩＳＡ結果を示したものである。
【図８】ｂｅａｄ  ｐａｎｎｉｎｇによって選別された単一ファージ−抗体の抗原特異的結合能を確認するウエスタンブロット結果を示したものである。
【図９Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇバッファーに処理して取得したＩｇＧを確認する結果である。
【図９Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してｒｅｄｕｃｉｎｇバッファーに処理して取得したＩｇＧを確認する結果である。
【図１０】ＥＬＩＳＡを利用してヒトＩｇＧクローンの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｐｅｐｔｉｄｅ結合を確認したものである。
【図１１】フローサイトメトリーを利用してヒトＩｇＧクローンのＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株に対する結合特異性を示したものである。
【図１２】抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩフローサイトメトリーでヒトＩｇＧの濃度低下が及ぼす結合能を確認した結果を示したものである。
【図１３】ヒトＩｇＧの軽鎖変化に応じた結合能をＥＬＩＳＡで確認した結果を示したものである。
【図１４】ヒトＩｇＧの軽鎖変化に応じた結合能をフローサイトメトリーで確認した結果を示したものである。
【図１５Ａ】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩヒトＩｇＧの内在化をＵ８７  ＭＧ  １３を利用してフローサイトメトリーで確認した結果を示したものである。
【図１５Ｂ】抗ＥＧＦＲｖＩＩＩヒトＩｇＧの内在化をＣＨＯＫ１  ２２−２を利用してフローサイトメトリーで確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一観点において、本発明は、野生型ＥＧＦＲに交差反応せず、配列番号１で表されるＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ）のアミノ酸配列中１〜１３番目アミノ酸領域に特異的に結合する抗体に関する。各構成に対する具体的説明は下記のとおりである。
【００１９】
抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩ
前記で議論したとおり、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインで２６７アミノ酸が接合部でグリシンの単一アミノ酸置換と共に欠失されているＥＧＦＲの欠失突然変異体で、配列番号１で表される配列を有する。
【００２０】
本出願の発明者等は、野生型ＥＧＦＲに交差反応せずにＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体を製作しようと、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド特異配列１３ｍｅｒを含むペプチドを抗原で使用して抗体を製作した。本発明に係る抗体は、具体的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド特異配列１３ｍｅｒ、４ｍｅｒのリンカー及びビオチンが含まれた配列番号２ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣＳＧＧＫＮ（Ｎはビオチン）で表される配列に特異的に結合することができる。同時に、非特異的結合を遮断するためのｎｅｇａｔｉｖｅ抗原としてＴＴＡＣＣＤＲＩＩ、例えば配列番号３  ＮＥＩＮＰＧＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（Ｎはビオチン）で表される配列を有するペプチドを利用した。これにより、野生型ＥＧＦＲに交差反応しないながらも、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体を製作した。
【００２１】
抗体
本明細書で使われる用語「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子として、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、多クローン性抗体および単クローン性抗体と、全長抗体および抗体断片を全て含んでもよい。また、前記抗体はキメラ性抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）および二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性分子、（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ、トリアボデ及びテトラボディを含んでもよい。
【００２２】
：全長抗体は、２つの全体の長さの軽鎖および２つの全体の長さの重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全長抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。前記抗体断片は、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。
【００２３】
Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。
【００２４】
前記Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体断片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術（例えば、抗体の重鎖またはこれの可変領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖またはこれの可変領域をコードするＤＮＡを鋳型にして、プライマー対を利用してＰＣＲ法によって増幅させて、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡと両末端がそれぞれ重鎖またはこれの可変領域及び軽鎖またはこれの可変領域と連結されるようにするプライマー対を組み合わせて増幅）を介して製作することができる。
【００２５】
免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を持ち、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域と可変領域（前記部位は、ドメインとしても知られている）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」と称する）と呼ばれる３つの多変可能な領域と４つの構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始まって順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれて、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別することができる。
【００２６】
本明細書で使用する「単クローン抗体」とは、実質的に同じ抗体集団から収得した単一分子組成の抗体分子を意味し、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示すことができる。
本明細書で使用する「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されているものを意味する。ヒト抗体は、通常ヒトの疾病の治療に使用されるが、ｉ）ヒト免疫体系とより良好に相互作用して、例えば補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）または抗体−依存性細胞性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）によって目的細胞をより効率的に破壊させることができる点、ｉｉ）ヒト免疫体系が前記抗体を外来のものと認識しない点、及びｉｉｉ）さらに少ない量、より少ない頻度の薬物を投与した時にもヒト循環系内半減期が天然発生抗体と類似する点が長所である。
【００２７】
これを考慮して、本発明に係る抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する単クローン抗体で、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する優秀な親和度及び特異度を示すことができるだけでなく、ヒト由来であるため、低い免疫原性を示すため、癌または腫瘍のような疾病の治療に適する。
【００２８】
本明細書で使用される用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体」とは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合してＥＧＦＲｖＩＩＩの生物学的活性の抑制を招く抗体を意味して、抗−ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と混用して使用することができる。この時、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＫＤは、例えば、１０−８以下、好ましくは１０−９以下、さらに好ましくは１０−１０以下である。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ＥＧＦＲに交差反応しない」とは、野生型ＥＧＦＲに結合する抗体及びＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体が、各抗原に対して交差反応性を示さないことを意味することができる。この時、前記ＥＧＦＲに交差反応しない抗体は、例えば野生型ＥＧＦＲに対する抗体のＫＤが、例えば、１０−５以上、好ましくは１０−４以上、さらに好ましくは１０−３以上であり、実質的に前記ＥＧＦＲに交差反応しない抗体は、制限されない形態の標準結合分析で野生型ＥＧＦＲに結合する抗体を検出することができない抗体を意味することができる。
【００３０】
一実施例で、本発明に係る抗体は、例えば、実施例１に詳細に記述されたとおり、ＥＧＦＲに交差反応せず、配列番号１で表されるＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列中１〜１３番目アミノ酸領域に特異的に結合するように構造的に特性化されて分離した単クローンヒト抗体ＰＡ４３０、ＰＤ２７、ＰＤ５２及びＰＤ１０であってもよい。各抗体の重鎖ＣＤＲ、軽鎖ＣＤＲに対するアミノ酸配列は、下記の表１及び２に記載されたとおりである。
【００３１】
【表１】
0006616833.tif 000002
【００３２】
【表２】
0006616833.tif 000003
【００３３】
本発明に係る抗体は、例えば表１及び２に記述されたＶＨＣＤＲ１、２及び３配列とＶＬＣＤＲ１、２及び３配列は、構造的に類似するＶＨ及びＶＬ配列が混合されてＶＨ／ＶＬ対のＣＤＲ１、２及び３に配置されて形成されて、例えば下記の重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい：
配列番号４〜７からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
配列番号８〜１１からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号１２〜１５からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３。
【００３４】
また、本発明に係る抗体は、下記の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよい：
配列番号１６〜１９からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
配列番号２０〜２３からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
配列番号２４〜２７からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３。
【００３５】
一実施例で、本発明に係る抗体は、具体的に、下記の表３に記載されたような重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列またはこれと相同性を有する配列を含むことができる：
【００３６】
【表３】
0006616833.tif 000004
【００３７】
本発明に係る抗体は、例えば下記の配列番号２８〜３１からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。前記抗体は、配列番号２８〜３１からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性、より好ましくは１００％以上の相同性、すなわち、配列番号２９〜３２の配列を重鎖可変領域として含んでもよい。
【００３８】
また、本発明に係る抗体は、例えば下記の配列番号３２〜３５からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。前記抗体は、配列番号３２〜３５からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性、より好ましくは１００％以上の相同性、すなわち、配列番号３３〜３６の配列を重鎖可変領域として含んでもよい。
【００３９】
具体的には、本発明に係る抗体は、下記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでもよく、表３に記載されたＶＨおよびＶＬ配列は、構造的に類似なＶＨおよびＶＬ配列が混合されて、ＶＨ／ＶＬ対をなして制限せず配置されて形成されてもよい：
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号３２〜３５からなる群から選択された配列の軽鎖可変領域；
配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３２〜３５からなる群から選択された配列の軽鎖可変領域；
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３２〜３５からなる群から選択された配列の軽鎖可変領域；及び
配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３２〜３５からなる群から選択された配列の軽鎖可変領域。
【００４０】
特に、本発明に係る抗体は、下記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでもよい：
配列番号２８の重鎖可変領域および配列番号３２の軽鎖可変領域；
配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３３の軽鎖可変領域；
配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；及び
配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域。
【００４１】
他の観点において、本発明は、前記抗体をコードする核酸に関する。本明細書で使用される「核酸」とは、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在したり、または、部分的に精製された形態または、実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当業界に広く知られたその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分またはその他汚染物質、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から精製されて出る場合「単離」されるか、「実質的に純粋になる」ものである。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくでもよい。
【００４２】
一実施例で、本発明に係る核酸は、表４に記載されたＶＨ配列およびＶＬ配列をコードするもので、配列番号３６〜３９からなる群から選択された一つ以上の重鎖可変領域をコードする配列と９５％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む及び／または配列番号４０〜４３からなる群から選択された一つ以上の軽鎖可変領域をコードする配列と９５％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。前記抗体は、配列番号３６〜３９及び／または列番号４０〜４３からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸配列と９５％以上の相同性、好ましくは９８％以上の相同性、より好ましくは１００％以上の相同性を有してもよい。
【００４３】
【表４】
0006616833.tif 000005
0006616833.tif 000006
【００４４】
本発明は、前記抗体に毒素、薬物などが接合された接合体を含むことができる。前記毒素または薬物は、目的に応じて任意の化合物を含むことができる。前記毒素の例示としては、テュオカマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンまたはアウリスタチンであり、前記化合物は公示の坑癌または抗腫瘍化合物、例えば、タキソール、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン等、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）等であり得る。前記接合体は、当業界で利用可能なリンカー利用技術を使用して製造されることができる。
【００４５】
また、本発明は、前記抗体以外にも、前記抗体と他の抗原結合部位に結合するペプチド、タンパク質または抗体が結合されて、二つ以上の異なる結合部位を含む二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合分子を含むことができる。前記二重特異性結合分子は、当業界に公示された方法を使用して結合特異的部分を連結することによって製造することができる。また、抗体が連結される場合、重鎖のＣ末端領域でｓｕｌｆ−ｈｙｄｒｙｌ  ｌｉｎｋを介して連結されることができる。場合により、同じベクターでコードされて同じ宿主細胞で発現して組み合わさるようにすることができる。
【００４６】
抗体の製造方法
また他の観点において、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。抗体またはその抗体断片の発現のために、部分的であるか全長である軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または目的抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）で収得することができて、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に作動するように結合されて発現ベクター内に挿入されることができる。
【００４７】
本明細書で使用される「作動するように結合」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図的機能をするように抗体遺伝子がベクター内にライゲーションされることを意味することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞と相溶性があるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクター内に挿入されるか、二つの遺伝子共に同じ発現ベクター内に挿入される。抗体は標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合、平滑（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）で発現ベクター内に挿入される。場合により、前記組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にする信号ペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、信号ペプチドがフレームに合うように抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合されるようにベクター内にクローニングできる。信号ペプチドは、免疫グロブリンと信号ペプチドまたは、異種性信号ペプチド（すなわち、免疫グロブリンの他タンパク質由来の信号ペプチド）であり得る。また、前記組み換え発現ベクターは、宿主細胞で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、インハンサー及びその他発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。当業者は、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現水準などのような因子に応じて調節配列を異なるように選択して、発現ベクターのデザインが変わる可能性があることを認識することができる。
【００４８】
本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を含むことができる。前記核酸または前記ベクターは、トランスフェクションされる。「トランスフェクション」させるために、原核または真核宿主細胞内に外因性ＤＮＡを導入するには通常使用される様々な技術、例えば電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを使用することができる。本発明に係る抗体は、哺乳類細胞への適用の可能性を考慮して、真核細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞で発現することができる。前記抗体の発現に適した哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲ選抜可能なマーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞またはＳＰ２細胞などを例示することができる。
【００４９】
また他の観点において、本発明は、宿主細胞を培養して抗体を発現させる工程を含む抗体の製造方法に関する。前記抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが、哺乳類宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞で抗体が発現するようにするのに十分な期間の間、または、さらに好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内に抗体が分泌されるようにするのに十分な期間の間宿主細胞を培養することによって製造されることができる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩを使用してバイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）する工程を含んで抗体を製造することもできる。
【００５０】
場合により、発現した抗体は、宿主細胞から分離して均一に精製することができる。前記抗体の分離または精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって実行されることができる。前記クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを含む親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疏水性クロマトグラフィーを含むことができる。前記クロマトグラフィー以外に、追加でろ過、超ろ過、塩析、透析などを組み合わせることによって抗体を分離、精製することができる。
【００５１】
医薬組成物
また他の観点において、本発明は、抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用医薬組成物に関する。
本明細書で使用される「癌または腫瘍」とは、本発明の抗体によって治療できる癌または腫瘍の種類であれば特に制限されないが、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩの過発現による乳癌、肺癌または肛門癌であり、脳腫瘍、例えば元発性脳腫瘍（すなわち、脳で発生）及び続発性または、転移性脳腫瘍であり得る。
【００５２】
場合により、本発明に係る抗体は、その他抗癌剤と併用（すなわち、坑癌治療前、治療の間または治療後）して投与できる。当業者に公示された任意の一つ以上の化学療法薬物、例えばアルキル化剤、例えばカルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、及びシクロホスファミド；抗代謝物質、例えばフルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メソトレキセート及びヒドロキシウレア；天然生成物、例えば植物アルカロイドまたは抗生剤、例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタキソール（パクリタキセル）または関連化合物、例えば、タキソテレ（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））；脳腫瘍治療に治療剤、例えば、テモゾロミドまたはカルムスチン含有ギリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））ウェハー；及びその他薬物、例えばイリノテカン及びグリベックなどと併用して投与されることができる。その他にも、その他生物学的薬剤、例えばモノクローナル抗体、例えばＨＥＲ２抗原に対するハーセプチン（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）、ＶＥＧＦに対するアバスチン（ＡｖａｓｔｉｎＴＭ）、ＥＧＦ受容体に対する抗体、例えばアービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、その他ＥＧＦ受容体拮抗薬物を含んでもよい。
【００５３】
前記医薬的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んで製剤化されることができる。前記「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水き、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００５４】
前記医薬的組成物は、経口または非経口の種々に剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれてもよい。
【００５５】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が用いられる。
【００５６】
前記医薬的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤と坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。また、前記医薬的組成物は、単一または多重投与してもよい。この時、組成物は液剤、散剤、エアゾール、カプセル剤、腸溶剤またはカプセル剤または座薬の形態で投与することができる。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これらに制限されない。しかし経口投与時、ペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、医薬的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。
【００５７】
前記組成物は、治療的に有効な量で投与することができ、「治療的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味してもよい。有効容量レベルは、個体の種類および疾患の重症度、患者の年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、使用された本発明組成物の投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と同時使用される薬物を含んだ要素およびその他医学分野に良く知られた要素により定められる。前記組成物は、通常０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば１、２、３または４ｍｇ／ｋｇで投与されるか、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５または２０ｍｇ／ｋｇの高容量で投与されることができる。固定された単位容量で、例えば５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇで提供されることができる。癌または腫瘍の退行を惹起させたり、より好ましくは腫瘍を除去するために、１〜８回の投与（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）で投与されるか、１０、２０またはそれ以上で投与されることができる。抗体の半減期を基に、１週間に２回、毎週、隔週、毎月またはその他間隔で１週、２週、４週、８週、３〜６ヶ月またはそれ以上の間投与されることができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００５９】
実施例１：ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株の確立
ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限酵素サイトを含むＥＧＦＲｖＩＩＩの遺伝子をＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号１）を利用して取得してＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限酵素を利用して切断した。切断された鋳型ＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限酵素に切断された発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＲｖＩＩＩを組み合わせた。ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＤＨ５α大腸菌細胞にトランスフォーメーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）してアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抵抗性がある菌株を選別した。ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ制限酵素によって切断されてＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子の挿入の有無を確認した。
【００６０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株を製作するために製造されたｐｃＤＮＡ３．１−ＥＧＦＲｖＩＩＩベクターをＣＨＯＫ１、Ｕ８７ＭＧ、Ａ４３１に対してリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を利用してトランスフェクションさせて、細胞は１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭで４８時間培養した。培養された細胞は１：１０希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して１０％ＦＢＳ  １０００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８が添加されたＤＭＥＭまたはＲＰＭＩで培養された後、コロニー化される細胞を選択して６−ｗｅｌｌで増殖した。１２日間増殖した各細胞を溶解させて電気泳動後ウエスタンブロットを行う時、抗−ＥＧＦＲ抗体と抗−ヒトＩｇＧ  ＨＲＰで処理してＥＣ基質で反応した（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００６１】
実施例２：バイオパンニング
抗原として使用されるＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅは、特異配列１３ｍｅｒとｌｉｎｋｅｒとして使用される４ｍｅｒ及びビオチンが含まれるように合成（配列番号２）した。非特異的結合を遮断するためのｎｅｇａｔｉｖｅ抗原として、ビオチン−ＴＴＡＣＣＤＲＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅも合成（配列番号３）した。各ｐｅｐｔｉｄｅは、Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ＵＳＡ）ｂｅａｄを利用して５ｕｌ当たり７．８ｎｇのｐｅｐｔｉｄｅが接合されるように製造した。
【００６２】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ｂｅａｄに接合させたＴＴＡＣＣＤＲＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅに予め２５℃  ３０分間反応して非特異的ファージ抗体が結合されるように誘導した。その後、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂａｒを利用してｂｅａｄに結合されたＴＴＡＣＣＤＲＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅを取って、上澄み液だけ別に取った。上澄み液は再びｂｅａｄに接合させたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅに添加して２５℃  ２時間反応して抗体ファージの結合が起きるように反応した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂａｒを利用してｂｅａｄに結合されたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅを取って、ファージ上澄み液は除去した。Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂａｒに引かれたＢｅａｄ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅは、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回繰り返し洗浄して最後にＰＢＳを利用して１回洗浄した。１００ｕｌの１００ｍＭトリエチルアミン溶液を１０分間反応させて抗原に結合されたファージが湧出されるようにして、湧出されたファージは５０ｕｌの１ＭトリスｐＨ７．５によって中和させた。
【００６３】
中和されたファージ湧出液は、１０ｍｌのミッドログ（ｍｉｄ−ｌｏｇ）器ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞株に添加されて３７℃で３０分間反応して感染するように誘導した。感染したＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌細胞株は、１％ｇｌｕｃｏｓｅが含まれた２ｘＹＴ／Ｃプレートにスプレディングして３０℃１６時間培養した。１次パンニングと２次、３次パンニングは同じ方法で進行した。
【００６４】
実施例３：ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するファージ抗体の選別
完了したパンニングから無作為でＥ．ｃｏｌｉクローンを選別して５００ｕｌ  ２ｘＹＴ／Ｃの培地を添加して９６ｗｅｌｌプレートで３７℃３００ｒｐｍでミッドログ（ｍｉｄ−ｌｏｇ）器で培養させた後、Ｍ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ）を添加した後、３７℃３０分間ファージの感染を誘導した。感染したＥ．ｃｏｌｉクローンは、３０℃３０ｒｐｍの条件で１５時間培養されてファージ−抗体が湧出されるように準備した。培養されたＥ．ｃｏｌｉクローンの細胞は６０００ｒｐｍ１０分間遠心分離して細胞は除去して上澄み液だけ取得した。
【００６５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＴＡＣＣＤＲＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＢＳＡを１μｇ／ｍｌでＭａｘｉｓｏｒｂ  ９６ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にコートして、室温で１時間３％脱脂牛乳／ＰＢＳで先に遮断させた後、取得された上澄み液を接種して１時間室温で反応させた。前記ＥＬＩＳＡプレートはＰＢＳＴ  ０．０５％で３回洗浄後、抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）抗体（ＧＥ）を１：３００  ＰＢＳＴ  ０．０５％に希釈して１時間、ＴＭＢ基質（ＢＤ，ＵＳＡ）を１０分処理して発色させた後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を処理して反応を中止させた。発色されたＥＬＩＳＡはＳｕｎｒｉｓｅ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）器を利用して４５０ｎｍ〜６５０ｎｍで吸光度を測定した（図７）。
【００６６】
実施例４：ウエスタンブロット
ファージ−抗体によってＥＧＦＲｖＩＩＩ結合能をＣＨＯＫ１−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞溶解物を利用したウエスタンブロットで観察した。
実施例１で製造されたＣＨＯＫ１−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株であるＣＨＯＫ１  ２２−２とこれに対する母細胞であるＣＨＯＫ１及びＥＧＦＲ  ｗｉｌｄｔｙｐｅを発現するＡ４３１をＰＢＳで洗浄して、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ３、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｕＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１．５ｕＭ  ｐｅｐｓｔｅｉｎ、１０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎの湧出バッファーを利用して溶解させた。６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで各細胞の溶解物を１５μｇずつ分離した後、ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅでタンパク質を転移させた。３％脱脂牛乳ＴＢＳＴで１時間ブロック（ｂｌｏｃｋ）した後、５×１０１０ｐｆｕのＰＡ４３０ファージ、ＰＤ５４ファージを処理して１時間、その次に抗−Ｍ１３−ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）抗体（ＧＥ）を１：２４０００  ＴＢＳＴに希釈して１時間、ＥＣＬ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）基質を利用して発色させた後、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｆｃイメージングシステム（Ｌｉｃｏｒ，ＵＳＡ）でブロットを確認した。
【００６７】
その結果を図８に示しているが、図８を参照すると、ＰＡ４３０ファージとＰＤ５４ファージはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞株だけで結合することが分かった。
【００６８】
実施例５：ＩｇＧ発現及び精製
ＩｇＧ形態への転換は、ファージ−抗体の可変重鎖を含むｓｆｉＩ制限酵素で二重切断して断片を取得して、重鎖領域を含むベクターであるｐＩｇＧＨＤ−６Ａ６ＨｖｙにｓｆｉＩ制限酵素を二重切断して断片とライゲーションした。ファージ−抗体の可変軽鎖を含むＢｓｔＸＩ制限酵素で二重切断して断片を取得して、軽鎖領域を含むベクターであるｐＩｇＧＬＤ−６Ａ６Ｌｇｔに同様に断片とライゲーションした（上記方法は韓国特許出願公開第２００８−０１０９４１７号参照）。
【００６９】
ＩｇＧの発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ細胞培養ディッシュ当たり８×１０６細胞を接種して３７℃  ＣＯ２５％培養器で２４時間放置するようにして、細胞の付着及び密度が８０〜９０％になるよう培養した。製作されたＩｇＧの重鎖発現ベクター１０μｇと軽鎖発現ベクター１０μｇ、計２０μｇのベクターは１：３（ＤＮＡ：ＰＥＩ）μｇの割合でＰＥＩと混合して１５分間反応して複合体が形成されるようにした。培養された細胞にＤＮＡ  ＰＥＩ複合体を添加して１０時間反応した後、ＤＭＥＭで１回洗浄後Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）に１０％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）が添加された培地１０ｍｌを添加して４８時間放置してＩｇＧが発現した上澄み液を取るようにした。
【００７０】
取得された上澄み液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．０で平衡化させたｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）に注入して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０の溶液で洗浄した後、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）溶液で湧出して１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和するアフィニティークロマトグラフィーを実施した。湧出されたタンパク質はＭＷＣＯ  １０，０００  ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ＵＳＡ）にパッキングして、ＰＢＳ透析して溶液を取り替えた。
【００７１】
その結果を図９Ａ及び９Ｂに図示した。図９Ａ及び９Ｂを参照すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して各抗体をＮｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇまたはＲｅｄｕｃｉｎｇ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に処理してＮｕｐａｇｅ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）にＬｏａｄｉｎｇした時５０ｋＤＡの重鎖及び２５ｋＤａの軽鎖を含み１５０ｋＤａに準ずるＩｇＧを取得した。
【００７２】
実施例６：ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するＩｇＧの選別
ＩｇＧに転換されたクローンの抗原特異的結合力を確認するために、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅとＴＴＡＣＣＤＲＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ、ＢＳＡをそれぞれ１μｇ／ｍｌ  ９６ｗｅｌｌプレートに３７℃で２時間反応させてコートした。以後３％脱脂牛乳／ＰＢＳＴ０．０５％でコートされなかった部分を遮断させた後、１μｇ／ｍｌのＩｇＧをプレートに添加して３７℃で１時間反応して抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を１：３０００希釈して１時間反応した。次に、ＴＭＢ基質（ＢＤ，ＵＳＡ）を１０分処理して発色させた後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を処理して反応を中止させた。発色されたＥＬＩＳＡは、Ｓｕｎｒｉｓｅ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）器を利用して４５０ｎｍ〜６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７３】
その結果を図１０に示しているが、図１０を参照すると、ＰＡ４３０、ＰＤ２７、ＰＤ５２、ＰＤ１０は、非特異的結合なしに、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅだけで特異的な結合能があることを示した。
【００７４】
このような結果を基に前記の抗体４種を対象にＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株で結合力を維持するか否かを確認しようと、蛍光染色フローサイトメトリーを実施した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株であるＣＨＯＫ１  ２２−２とこれに対する母細胞であるＣＨＯＫ１、そしてＥＧＦＲ  ｗｉｌｄｔｙｐｅを発現するＡ４３１をその対象にした。各細胞は、１×１０６の細胞数で取得して、２％ＦＢＳが添加されたＰＢＳに各抗体を１μｇ／ｍｌで希釈して細胞に添加して４℃  １時間反応して、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（Ｂｅｔｈｙｌ，ＵＳＡ）を１：２００希釈して４℃  ４５分間反応させて蛍光染色した。各サンプルは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ，ＵＳＡ）機器を利用してサンプル当たり１×１０４個の細胞を測定した。
【００７５】
その結果を図１１に示した。図１１を参照すると、ＰＡ４３１、ＰＤ２７、ＰＤ１０は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株であるＣＨＯＫ１  ２２−２に結合能を示して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ非発現細胞株であるＣＨＯＫ１とＡ４３１では結合能がないことが示された。また、ＥＧＦＲ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅを発現する細胞であるＡ４３１でも結合されないことが示された。
【００７６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株に結合能を示す抗体３種が、抗体濃度の低下によって及ぼす結合特性を確認するために、下記のように実施した。抗体の濃度は１０００ｎｇ／ｍｌから始まって２倍ずつ順次希釈して３１ｎｇ／ｍｌまで準備した。蛍光染色フローサイトメトリーは、前記に列挙された順で同様に実施した。
【００７７】
その結果を図１２に示しているが、図１２を参照すると、ＰＡ４３０は、ＰＤ２７とＰＤ１０に比べて同じ濃度のＩｇＧを処理するにもかかわらず高結合能を示すことが観察された。
【００７８】
実施例７：親和度増進のための軽鎖の変更
ＰＡ４３０の抗原特異的親和度増進のために、軽鎖を変更した。ＰＡ４３０とＰＤ５２、ＰＤ２７の可変軽鎖のＣＤＲを調べると、抗原特異的親和度が高かったＰＡ４３０の可変軽鎖の配列と類似することを確認することができる（表１〜３参照）。このような点を利用して、ＰＡ４３０の本来軽鎖の他にＰＤ５２、ＰＤ２７、ＰＤ１０の軽鎖ベクターをＰＡ４３０の重鎖ベクターと混合してトランスフェクションしてＩｇＧを産生して、これは実施例５と同様である。
【００７９】
産生及び同定された４３０Ｈ１０Ｌ、４３０Ｈ５２Ｌ、４３０Ｈ２７Ｌを実施例６のＥＬＩＳＡと同様に実施した時、抗原特異的結合能が維持されたことを確認した（図１３）。
【００８０】
ＰＡ４３０と４３０Ｈ５２Ｌ、４３０Ｈ２７Ｌ、ＰＤ１０  ＩｇＧを対象に実施例６の蛍光染色フローサイトメトリーを同様に実施して、Ｕ８７ｍｇ細胞をベースにＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株で製作されたＵ８７  ＭＧ  １３細胞株、Ａ４３１細胞をベースにＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株で製作されたＡ４３１  １６−３細胞株を追加して実施した時、４３０Ｈ５２Ｌ、４３０Ｈ２７Ｌは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異細胞株でも結合能が維持されることを確認した。また、４３０Ｈ５２Ｌは、原形軽鎖を有するＰＡ４３０に比べて同じ濃度を処理するにもかかわらず結合シグナルが優秀であることが観察された（図１４）。
【００８１】
実施例８：蛍光染色フローサイトメトリーを利用した抗体内在化分析
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的結合能を示す４３０Ｈ５２Ｌ抗体を利用して、抗体−ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合による内在化が行われるか否かを確認しようと蛍光染色フローサイトメトリーを実施した。
【００８２】
Ｕ８７  ＭＧ  １３細胞とＣＨＯＫ１  ２２−２細胞を対象に２×１０６細胞をＴｒｙｐｓｉｎ  ＥＤＴＡ処理して取得した後、細胞の活性を阻害させるために、４℃で３０分間ｃｏｏｌｉｎｇした。ＤＭＥＭ培地に４３０Ｈ５２Ｌ  １μｇ／ｍｌを希釈して細胞に処理して４℃で３０分間抗体抗原結合を誘導した。２次抗体だけ処理されるサンプルは、ＤＭＥＭだけを処理した。次に１３００ｒｐｍ  ３分間遠心分離後、残りの抗体が除去されるように細胞をＰＢＳで洗浄してＤＭＥＭ培地を添加して４℃反応するサンプル、３７℃  １５分、３７℃  ３０分、３７℃  ６０分ＣＯ２  ５％インキュベーティングサンプルで反応させた。遠心分離して４℃  ＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．２を１０分間３回繰り返し処理して細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩに結合されている抗体を人為除去させた。遠心分離してＰＢＳ洗浄後４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＵＳＢ，ＵＳＡ）で１０分４℃固定化作業をした。各サンプルは、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−１００（ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）ＰＢＳ溶液を４℃  １０分反応して透過できるように作るか、２％ＦＢＳ  ＰＢＳ溶液を処理して透過が起きないようにした。遠心分離してＰＢＳ洗浄後２％ＦＢＳ  ＰＢＳを処理してブロッキングしたし抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（ｂｅｔｈｙｌ，ＵＳＡ）を１：４００処理して染色した。各サンプルは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ，ＵＳＡ）機器を利用してサンプル当たり１×１０４個の細胞を測定した。
【００８３】
その結果を図１５Ａ及び１５Ｂにそれぞれ示した。図１５Ａ及び１５Ｂを参照すると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株であるＵ８７  ＭＧ  １３やＣＨＯＫ１  ２２−２細胞に４３０Ｈ５２Ｌ抗体を処理して温度及び時間別反応を経て細胞透過（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）を利用して蛍光染色をした時、４℃に比べて３７℃での時間が増加することにより、シグナルが増加することが観察された。対照群の意味で細胞透過を経ず（Ｎｏｎ−ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ）蛍光染色をした時、温度及び時間の増加によるシグナルの増加はなかった。これは、４３０Ｈ５２Ｌ  ＩｇＧがＥＧＦＲｖＩＩＩに結合されて３７℃の条件で時間の増加により内在化が増加したことを蛍光シグナルで証明したものである。
【００８４】
本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体は、野生型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｗｔ）には結合せずＥＧＦＲｖＩＩＩにだけ結合する新規抗体で、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞で優秀な結合能を示して、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が起きることが確認されたため、ＥＧＦＲｖＩＩＩをターゲットとする有効な拮抗剤として作用することができる。これを基に、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現によって誘導される疾病の治療に有用に使用できる。
【００８５】
本発明が属する技術分野に通常の知識を持った者であれば前記内容を基に本発明の範囲内に様々な応用及び変形を行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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