(57)【要約】  １）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備することを特徴とする神経再生用移植材料。２）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液に浸漬させて、前記コラーゲンに前記コラーゲン結合部位含有成長因子を結合させる工程を有する神経再生用移植材料の製造方法。３）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材、及び受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子、を備えたことを特徴とする神経再生用移植材料製造用キット。
2016060252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備する神経再生用移植材料。
【請求項２】
前記コラーゲンに、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子が結合してなる請求項１に記載の神経再生用移植材料。
【請求項３】
中空の筒体形状を有し、該筒体の内面の少なくとも一部が前記コラーゲン基材により構成された請求項１又は２に記載の神経再生用移植材料。
【請求項４】
前記コラーゲンが、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有する請求項３に記載の神経再生用移植材料。
【請求項５】
前記コラーゲン結合部位含有成長因子は、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、
前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである請求項２〜４のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項６】
前記成長因子受容体アゴニストペプチド部は、塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項７】
前記コラーゲン基材は、複数のコラーゲン基材層からなる請求項１〜６のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項８】
前記コラーゲン基材の厚みが、５０μｍ以上、２００μｍ以下である請求項１〜７のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項９】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液に浸漬させて、前記コラーゲンに前記コラーゲン結合部位含有成長因子を結合させる工程を有する神経再生用移植材料の製造方法。
【請求項１０】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材、
及び受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子、
を備えた神経再生用移植材料製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経再生用移植材料、神経再生用移植材料の製造方法、及び神経再生用移植材料製造用キットに関する。
本願は、２０１４年１０月１６日に、日本に出願された特願２０１４−２１２０８５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
交通外傷や腫瘍切除に伴う神経損傷に対し、健常な神経組織を移植する自家神経移植術が行われている。しかし、ドナーとして用いることのできる神経組織の長さや径に限度があることやドナー採取部位の損傷が問題となっている。近年、生体材料からなる人工神経が開発されているが、十分な成績は得られていない。
一方、神経損傷の自己修復を促進させる試みも従来行われてきた。特許文献１には、コラーゲンを神経再生の足場として使用する神経再生誘導管が開示されている。特許文献２及び３には生分解性ポリマー繊維から編成された管状体にコラーゲンが塗布、充填等されてなる神経再生誘導管が開示されている。【０００３】
また近年、生体移植材料として利用可能な、配向性を有するコラーゲンの開発が行われてきた（特許文献４及び特許文献５）。特許文献５においては、配向性を有するコラーゲンの生体適合材料への利用として、骨芽細胞又は間葉系幹細胞を播種することにより、コラーゲンの配向性の方向と略一致した配向性を有するアパタイトを、前記コラーゲンの表面及び／又は内部に生成・固定させたコラーゲン／アパタイト配向性材料の製造方法が開示されている。これは、骨組織に類似した特徴を有する生体適合性材料を提供するものである。
神経欠損は時間経過とともに重度の機能障害をもたらし、患者の生活の質を著しく低下させることに加え、長期にわたる治療は患者の社会復帰遅延、医療費増加に直結する。したがって、例えば、より早期に神経損傷を回復させることのできる技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４５７２９９６号公報
【特許文献２】特許第４５９６３３５号公報
【特許文献３】特許第４６４０５３３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／１１４７０７号
【特許文献５】特開２０１２−６５７４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、効率的に神経再生を可能にする神経再生用移植材料の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、従来神経再生用として用いられることの無かった配向性を有するコラーゲン線維を含むコラーゲン基材を、神経再生用移植材料に備えることで、効率的な神経損傷部位の再生を実現可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。【０００７】
（１）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備する神経再生用移植材料。
（２）前記コラーゲンに、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子が結合してなる前記（１）に記載の神経再生用移植材料。
（３）中空の筒体形状を有し、該筒体の内面の少なくとも一部が前記コラーゲン基材により構成された前記（１）又は（２）に記載の神経再生用移植材料。
（４）前記コラーゲンが、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有する前記（３）に記載の神経再生用移植材料。
（５）前記コラーゲン結合部位含有成長因子は、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、
前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである前記（２）〜（４）のいずれか一つに記載の神経再生用移植材料。
（６）前記成長因子受容体アゴニストペプチド部は、塩基性線維芽細胞増殖因子である、前記（２）〜（５）のいずれか一つに記載の神経再生用移植材料。
（７）前記コラーゲン基材は、複数のコラーゲン基材層からなる前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の神経再生用移植材料。
（８）前記コラーゲン基材の厚みが、５０μｍ以上、２００μｍ以下である前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の神経再生用移植材料。
（９）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液に浸漬させて、前記コラーゲンに前記コラーゲン結合部位含有成長因子を結合させる工程を有する神経再生用移植材料の製造方法。
（１０）配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材、
及び受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子、
を備えた神経再生用移植材料製造用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、神経再生効率に優れた神経再生用移植材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例において作製した配向性コラーゲンチューブＡの外観を写した写真である。
【図２】（ａ）移植から１２週経過後の配向性コラーゲンチューブ移植部分の肉眼所見（写真）である。（ｂ）移植から１２週経過後の配向性コラーゲンチューブ移植部分のＨＥ染色像である。（ｃ）図２（ｂ）に示すＨＥ染色像枠内の拡大画像である。
【図３】神経節細胞のＦＡＳＴ Ｂｌｕｅ標識像である。
【図４】配向性コラーゲンチューブ移植後のラットに対する運動機能の評価結果を示すグラフである。
【図５】溶液中に添加したｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質量と、配向性コラーゲンチューブへ結合したｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質量の関係を示すグラフである。
【図６】配向性コラーゲンチューブ移植後のラットに対するｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔによる行動学的評価結果を示すグラフである。
【図７】コラーゲンチューブ移植部分に再生した神経のトルイジンブルー染色像である。
【図８】ＣＢＤを有する細菌性コラゲナーゼの分子系統樹、及びそれらのドメインを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪神経再生用移植材料≫
＜コラーゲン基材＞
本発明の神経再生用移植材料は、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備するものである。
【００１１】
配向性を有するコラーゲンとは、単体のコラーゲンゲル、乾燥コラーゲンゲルなどの線維状コラーゲンの走行方向がある方位に揃っているコラーゲンを意味する。配向性を有するコラーゲンが、金属、セラミックス、高分子材料、又は生体材料からなる基板にコートされている場合（コラーゲン基板ともいう。）には、配向性を有するコラーゲンとは、各種形状に加工された金属、セラミックス、高分子材料、又は生体材料等の基板にコートされたコラーゲンゲル、乾燥コラーゲンゲルなどにおける線維状コラーゲンの走行方向がある方位に揃っているコラーゲンを意味する。
線維状コラーゲンの走行方向がある方位に揃っているとは、コラーゲン基材において、ある方位へ走行する線維状コラーゲンの割合が、別の方位へ走行する線維状コラーゲンの割合よりも高い状態をいう。
なお、線維状コラーゲンの「走行方向」と、配向性の方向、方位、配向、配向性、配向性の向きとは、同じ意味で用いている。
【００１２】
配向性を有するコラーゲンゲルを準備する方法は、常法により特に限定されない。例えば、ミリメーターオーダー以上のコラーゲンゲルに配向性を与えるには、コラーゲン溶液をゲル化する過程でコラーゲン溶液に一定方向の流れを与える方法が提案されているが、他の方法としてもよい。他の方法としては、コラーゲン線維が形成される過程において強力な磁場を印加する方法、コラーゲンゲルをスピンコートする方法、コラーゲンゲルを一定方向にメカニカルに（物理的に）延伸する方法などを挙げることができる。
【００１３】
コラーゲン線維が形成される過程において強力な磁場を印加する方法により、配向性を有するコラーゲンゲル断片を準備する場合、磁場に対してコラーゲン線維は垂直に配列するので、磁場を同じ方向からかけ続けると２次元の配列になり、回転磁場を与えると１軸配向となる。このような配向を有するコラーゲンゲルを、出発材料として用いたい場合に磁場を用いた方法を使用可能である。但し、磁場であれば、基本的には均一な配列をもったもののみ作製が可能で、マクロ形状も限定される傾向にある。これに対して、コラーゲン溶液をゲル化する過程でコラーゲン溶液に一定方向の流れを与える方法によって、配向性を有するコラーゲンゲルを準備する場合には、液体の流れを利用するためシート状の形状を含む様々な形状やそれを積層させることで、３次元的に配向性の異なるコラーゲンを作製可能である。
【００１４】
このような方法においては、配向性コラーゲン（コラーゲン単体）は、コラーゲン溶液の流れを利用してコラーゲンゲルとして固めるプロセスで配向性を与えることによって得ることができる。これにより、ストリング形状、幅の広いリボン形状等、各種形状（線、面、立体）の配向性コラーゲンゲル又はコラーゲンゲル断片の作製が可能である。また、その際に、流れの速度を制御することで、配向性の程度を制御することも可能である。そのため、同一コラーゲンゲル内においても、配向性の方向、配向性の程度を制御して分布をもたせることは可能である。
【００１５】
例えば、コラーゲン溶液をゲル化する過程でコラーゲン溶液に一定方向の流れを与える方法において説明すると、コラーゲン溶液の濃度は、得られるコラーゲン又はコラーゲン基板が十分な機械的強度を有するためには10mg/ml以上が好ましいが、3mg/ml程度以上のものであってもよい。コラーゲンの由来は問わない。また、由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。例えば、ラット尾、豚皮、牛皮、ダチョウ、魚などの動物等から抽出したものを使用できる。すなわち、哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンを使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。また動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。また、抗原性を抑えるために酵素処理したアテロコラーゲンを用いることができる。また、コラーゲンとしては酸可溶性コラーゲン、中性塩可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）等の未修飾可溶性コラーゲン、サクシニル化、フタル化等のアシル化、メチル化等のエステル化、アルカリ可溶化の脱アミド化等の化学修飾コラーゲン、さらにテンドンコラーゲン等不溶性のコラーゲンを用いることが出来る。さらにコラーゲン溶液に化学架橋剤、薬剤、酸素等の気泡を導入することもできる。導入方法は常法により特に限定されない。
【００１６】
得られたコラーゲンの配向性の方位、配向性の程度は、例えば、ラマン分光顕微鏡によって定量的に評価が可能である。ラマン分光とは、分子に当たって散乱される光が分子の振動によって周波数変調を受けた成分を含むことを分光器によって調べることであり、分析対象の組成や結晶構造の情報を得ることができ、コラーゲンの配向性についても分析が可能となる。
【００１７】
本発明の神経再生用移植材料は、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備しているため、コラーゲンの配向性に沿った神経細胞及び神経組織の再生を促すことができる。このときコラーゲン基材は、神経細胞の足場としての役割を果たすことができると考えられる。神経再生では空間的な配置の再生も重要となるため、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材の利用は、大変有用である。神経損傷の修復を行う場合、例えば、神経の切断部位に神経再生用移植材料を配置し、本来の神経が通っていた方向とコラーゲンの配向とを合わせることで、より効率的に神経の再生を実現できる。
【００１８】
（形状）
本発明の神経再生用移植材料の形状は特に制限されず、リボン、シート、チューブ、スポンジ、グレイン（粒）、ロッド、リング、スパイラル、スプリング（バネ）、ディスク、ドーム又はブロック等の形状を有し得る。
【００１９】
上記に挙げた形状の作製にあたっては、例えば、まずストリング形状のものからシート状のコラーゲン材料（断片）を作製し、当該コラーゲン材料をさらに加工して種々の最終形状の3次元コラーゲン材料を作製することができる。３次元コラーゲン材料の作製は、国際公開第２０１２／１１４７０７号に挙げられた方法を採択するこができる。
【００２０】
本発明の神経再生用移植材料は、上記に例示した形状のなかでも、中空の筒体形状（チューブ形状）を有することが好ましい。さらには、該筒体の内面の少なくとも一部又は全部が前記コラーゲン基材により構成されたものであることが好ましい。また、該筒体の内表面の少なくとも一部又は全部が前記コラーゲン基材により構成されたものであることが好ましい。筒体形状を有する神経再生用移植材料では、その筒体内部に神経再生させることができる。筒体は周囲の組織が筒体内部へと侵入することを防ぎ、同時に筒体内部では神経を保持できるので、より効率的に神経を再生させることができる。
【００２１】
神経再生用移植材料が中空の筒体形状を有している場合、前記コラーゲンが、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有することが好ましい。筒体の両端の開口部を結ぶ方向は、例えば神経の欠損部分に筒体の神経再生用移植材料を挿入したときに、欠損した神経の末端同士を結ぶ方向となるため、より効率的に神経の再生を実現することができる。
【００２２】
神経再生用移植材料が中空の筒体形状を有している場合とは、コラーゲン基材自体が筒体形状を有している場合が挙げられる。この場合、該コラーゲン基材は継ぎ目のないシームレスチューブであることが好ましい。継ぎ目とは、板状のコラーゲン基材の端を接続して筒体形状とする際に形成される、端同士の結合部である。シームレスチューブでは、チューブ内面で細胞成長がよりスムースとなるため好ましい。
【００２３】
本発明の神経再生用移植材料は、生分解性材料からなり、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備するものであることがより好ましい。生分解性材料からなる神経再生用移植材料は、神経の再生が達成された後に、移植先の生体内で分解されるので、移植後の被移植者の負担を軽減できる。
【００２４】
また、本発明の神経再生用移植材料が備える前記コラーゲン基材は、複数のコラーゲン基材層からなるものであってもよい。コラーゲン基材の重層化により、コラーゲン基材の厚み、強度等の物性を、容易に調整可能である。したがって、他の支持体を用いることなく、生分解性であるコラーゲン基材の調整のみで神経再生用移植材料の物性を調整可能である。
【００２５】
例えば、神経再生用移植材料の一実施形態として、中空の筒体形状を有し、該筒体の内面の少なくとも一部が前記コラーゲン基材により構成され、前記コラーゲンが前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有し、前記コラーゲン基材が複数のコラーゲン基材層からなるものを例示できる。このとき、筒体の最内面のコラーゲン基材層のコラーゲンは、筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有していることが好ましい。最内面のコラーゲン基材層以外の層のコラーゲンは、配向性を有していてもよいし、有していなくてもよい。最内面のコラーゲン基材層以外の層のコラーゲンが配向性を有している場合、最内面のコラーゲン基材層以外の層のコラーゲンの配向性の向きは特に制限されない。しかし、最内面の層が生分解され、最内面のコラーゲン基材層以外の層が筒体の内面に露出することを考慮した場合には、最内面のコラーゲン基材層以外の層のコラーゲンも、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有していることが好ましい。一方、縫合性など強度を高めることを考慮した場合、最内面のコラーゲン基材層以外の層のコラーゲンは、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向以外の方向に配向性を有していることが好ましい。
【００２６】
このように、コラーゲン基材を重層化させることで、神経再生用移植材料の機能性をより高めることができる。
【００２７】
コラーゲン基材の厚みは、５０μｍ以上であることが好ましく、７０μｍ以上であることがより好ましい。
コラーゲン基材の厚みは、２００μｍ以下であることが好ましく、１７０μｍ以下であることがより好ましく、１３０μｍ以下であることがさらに好ましい。
コラーゲン基材の厚みは、５０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましく、７０μｍ以上１７０μｍ以下であることがより好ましく、７０μｍ以上１３０μｍ以下であることがさらに好ましい。通常、５０μｍ以上の厚みであると、移植操作が容易となり好都合である。また、通常２００μｍ以下の厚みであると、生分解に要する時間が長すぎることなく生体への負担が軽減されるため好ましい。
コラーゲン基材の厚みは、乾燥状態コラーゲン基材の無作為に選択した１０か所程度の厚みを測定し、その平均値として求めることができる。
コラーゲン基材が重層化している場合、コラーゲン基材の厚みとは、重層化した層全体の厚みを指す。コラーゲン基材が重層化している場合、単層の厚みを、目安として１０〜１５ μｍ程度とすることを例示できる。
【００２８】
本発明においては、コラーゲン基材は、乾燥状態での提供を基本とするが、乾燥状態にあるコラーゲン基材をＰＢＳ等に浸漬することによりゲル状の状態でも提供可能である。
本明細書中、乾燥状態のコラーゲン基材とは、水分含量が０〜３０質量％のコラーゲン基材をいう。水分含量は、常圧加熱乾燥法により求めることができる。
通常、乾燥するとコラーゲン基材の組織が一部破壊除去される可能性はあるが、保存性（形状維持が容易、またゲルのままでは水分を含んでいるので腐敗しやすい）、輸送性（ゲルだと水分を含んでいるので壊れやすい、容器にひっついて剥がす時に変形する等）の観点から乾燥材料のほうが扱いやすいといえる。 
本発明において、乾燥状態のコラーゲン基材は、実際に使用する時にＰＢＳ、培養液でゲルに戻して使用することが可能である。本発明において、乾燥状態のコラーゲン基材は、乾燥させることにより、ゲルの水分が抜けて、コラーゲン線維組織が緻密になり、再度ＰＢＳ、培養液でゲルに戻しても、元の体積よりも小さく、結果として組織の緻密さが残され、強度において、そして配向性において、製作時のゲルより優れることが多いといえる。 
このように本発明においては、特徴として、乾燥状態でコラーゲン基材を提供することも可能である一方、ＰＢＳ、培養液でゲルに戻してから提供することも可能である。
【００２９】
＜コラーゲン結合部位含有成長因子＞
本発明の神経再生用移植材料は、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備し、前記コラーゲンに、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子（Collagen-binding Growth factor;以下「ＣＢ−ＧＦ」とも称する。）が結合してなる「成長因子アンカーリング型神経再生用移植材料」であってもよい。
成長因子アンカーリング型神経再生用移植材料は、前記コラーゲン基材の有する神経再生作用に加え成長因子による相乗的な神経再生作用を期待することができる。しかも、成長因子は、コラーゲン基材のコラーゲン線維に結合しているため移植部に長く留まり、継続的な神経再生を促すことができる。
【００３０】
ここで、コラーゲン基材に結合させるＣＢ−ＧＦの量に限定はないが、コラーゲン基材１ｍｇ（乾燥重量）にＣＢ−ＧＦを０．０１〜１ナノモル、好ましくは０．１〜１ナノモル、より好ましくは０．５〜１ナノモル結合したものであることが好ましい。１ナノモル以下で前記ＣＢ−ＧＦが結合すると、神経再生の増加率が好ましく、一方、０．０１ナノモル以上で前記ＣＢ−ＧＦが結合すると、より効果的に神経再生効果が発揮される。
【００３１】
（ＣＢ−ＧＦ）
ＣＢ−ＧＦは、成長因子受容体のアゴニストペプチド部（以下、「ＧＦ部」とも称する。）とコラーゲン結合性ペプチド部（以下、「ＣＢ部」とも称する。）とを含むものであればその構造や製造方法に特に制限はなく、両ペプチド部が化学的に結合されたものであってもよく、ＧＦ部とＣＢ部とを含む融合タンパクであってもよい。この際、たとえば、ＣＢ部が、直接またはポリペプチド断片からなるリンカー部を介して、ＧＦ部に連結されるものであってもよい。更に、ＧＦ部とＣＢ部という二つのポリペプチドを、アミノ基を介してジスクシンイミドイルグルタレートやグルタルアルデヒドを含む試薬により架橋結合するものであってもよい。また、一つのポリペプチドをスクシンイミドイル−４−ヒドラジノニコチネート  アセトンヒドラゾンにより、もう一方のポリペプチドをスクシンイミドイル−４−フォルミル  ベンゾエートにより誘導化した後に、二つの誘導化されたポリペプチドを混合し、アミノ基を介して架橋結合してもよい。なお、上記以外にＧＦ部とＣＢ部とを結合するために、ポリペプチド以外の架橋剤その他の化合物でこれらを連結してもよい。
【００３２】
（コラーゲン結合性ペプチド部）
ＣＢ−ＧＦを構成する「コラーゲン結合性ペプチド部」は、コラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子受容体アゴニストペプチド部を結合させるための結合部として機能する部位である。前記したように、成長因子は神経再生作用を示すが、静脈注射などによって全身投与すると局所残存率が低く、持続的な神経再生作用を期待することができない場合がある。
しかしながら、ＣＢ−ＧＦを使用すれば、ＣＢ−ＧＦに含まれるＣＢ部を介して架橋剤その他の化学的成分を使用せずにコラーゲン基材のコラーゲン線維にＧＦ部を結合させることができる。成長因子アンカーリング型神経再生用移植材料は後述のように製造が容易であり、かつ架橋剤を使用しないため安全性に優れる。
【００３３】
なお、「ＣＢ部」とは、コラーゲン線維の少なくとも一部と結合するものを広く対象とすることができる。コラーゲン線維と結合するポリペプチドとしては、例えば、コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位などを例示することができる。コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位の構造遺伝子の例としては、配列番号１に示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ（以下、「ＣｏｌＨ」と称する場合がある。）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１）の３００１番目〜３３６６番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片がある。このＤＮＡ断片は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＢＡＡ０６２５１で特定されるアミノ酸配列をコードするものであり、図８に示すように、ＣＤで示される触媒部位と、ＣＢＤで示されるコラーゲン結合部位とを含む。配列番号１の塩基配列に併記するアミノ酸配列の９０１番目〜１０２１番目のアミノ酸配列がＣＢＤに該当する。同様に、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＢＡＡ７７４５３で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ（以下、「ＣｏｌＧ」と称する場合がある。）、同アクセッション番号ＢＡＣ５７５３２で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５３５で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍコラゲナーゼ，同Ａ３６８６６で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５４５で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５４１で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５５０で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉコラゲナーゼ、同ＡＡＯ３７４５６で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉコラゲナーゼ，同ＹＰ＿００１２５４１２２で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５３８で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３３２６２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿９７９８３６で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３３２６２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿９７９８３６で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４５８５４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ，同ＹＰ＿０３７６０８で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３２９０２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４５５９０で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３０３７３で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＹＰ＿０３４８１４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４３０９０で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ、同ＮＰ＿９７６９４２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ、その他の��菌性コラゲナーゼに由来するコラーゲン結合性ペプチド部も同様に使用することができる。なお、「ＣＢ部」は、コラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度に結合できればよく、従って、コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位の全てのアミノ酸配列を含む必要はない。例えば、前記コラーゲン結合性ペプチド部は、上記構造遺伝子のコードするアミノ酸配列におけるＣＢＤを構成する塩基配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の相同性を有し、且つコラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度に結合できるものを好適に使用することができる。また例えば、前記コラーゲン結合性ペプチド部は、上記構造遺伝子のコードするアミノ酸配列におけるＣＢＤを構成するアミノ酸配列と８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の相同性を有し、且つコラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度に結合できるものを好適に使用することができる。結合方法は問わず、例えば、コラーゲン基材の表面から露出するコラーゲン線維の一部と親和性を有して結合するものであってもよい。配列同士の相同性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ  （Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて算出可能である。
【００３４】
（成長因子受容体アゴニストペプチド部）
ＣＢ−ＧＦを構成するＧＦ部は、コラーゲン基材のコラーゲン線維に結合して成長因子などの機能を発揮する部位である。成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などがあり、このような作用を発揮しうる成長因子受容体アゴニストを広く使用することができる。その他、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの因子は、神経修復作用を示し、欠損部に適用すると神経再生を促進する。
【００３５】
このような成長因子受容体アゴニストの構造遺伝子として、特に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を使用することが好ましい。このような塩基性線維芽細胞増殖因子としては、配列番号２に示すＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３５番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片がある。また、上皮成長因子の構造遺伝子として、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  のｐｒｅｐｒｏＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ０４８４２）のｃＤＮＡもある。
【００３６】
本発明では、ＧＦ部として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を好適に使用することができる。塩基性線維芽細胞増殖因子は神経再生能に優れており、ＣＢ−ＧＦを構成する成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子が結合したもの（以下、「ＣＢ−ｂＦＧＦ」と称する。）をコラーゲン基材に結合すると、早期に神経を修復できるからである。なお、塩基性線維芽細胞増殖因子に代えて上皮成長因子（ＥＧＦ）を結合したＣＢ−ＧＦをＣＢ−ＥＧＦと称する。
【００３７】
上記のＣＢ−ｂＦＧＦの一実施形態としては、前記ＣＢが以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるポリペプチドであり、前記ｂＧＦＧが以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選ばれるポリペプチドであるものが例示できる。
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の２５５番目〜３７５番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の２５５番目〜３７５番目のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、コラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度の結合性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の２５５番目〜３７５番目のアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、コラーゲン基材のコラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度の結合性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の３番目〜１５７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の３番目〜１５７のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、神経修復作用を有するポリペプチド
（ｆ）配列番号５で表されるアミノ酸配列の３番目〜１５７のアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、神経修復作用を有するポリペプチド
【００３８】
（ｂ）、（ｅ）のアミノ酸配列において、「１〜数個」の塩基とは、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、又は１〜３個であってもよい。
（ｃ）、（ｆ）のアミノ酸配列において、アミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であり、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であってもよい。
アミノ酸配列同士の配列同一性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ  （Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて算出可能である。
【００３９】
（リンカー部）
ＣＢ−ＧＦは、ＣＢ部とＧＦ部とをリンカー部によって連結するものであってもよい。
リンカー部を挿入することでＣＢ部とＧＦ部とを所定間隔に隔離することにより、各部位の機能を独立して十分に発揮させることができる。この結果、リンカー部を挿入することでリンカー部を有しないＣＢ−ＧＦを使用する場合よりも強くコラーゲン線維に結合させることができる。 
このようなリンカー部としては、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等のアミノ酸からなる特定の三次元構造を持たないペプチド断片が例示できる。また、このようなリンカー部として、前記ＣｏｌＨに由来するアミノ酸配列を好適に使用することができる。より具体的には、ＣｏｌＨの多発性嚢胞腎Ｉ（Polycystic kidney disease I；以下、「ＰＫＤ」と称する。）ドメインを好適に使用することができる。その他、他の細菌コラゲナーゼに由来するＰＫＤもリンカー部として好適に使用することができる。ＰＫＤの共存によりＣＢＤのコラーゲン結合性が強化されるからである。このような細菌コラゲナーゼに由来するリンカー部は、図８のＰＫＤとして記載されている。なお、このようなリンカー部は、生体循環液に含まれるペプチド水解酵素などに対する抵抗性を有することが好ましく、これによってＧＦ部の局所残存性を高め、継続的な神経再生を可能とすることができる。
【００４０】
≪神経再生用移植材料の製造方法≫
本発明の神経再生用移植材料の製造方法は、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子（ＣＢ−ＧＦ）を含有する溶液に浸漬させて、前記コラーゲンに前記コラーゲン結合部位含有成長因子を結合させる工程を有する。
例えば、リン酸緩衝液に配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材とＣＢ−ＧＦとを所定量添加し、温度０〜１０℃で６０秒から６０分、好ましくは５から３０分、より好ましくは１５から３０分撹拌し、または静置することでコラーゲン基材にＣＢ−ＧＦを結合することができる。
【００４１】
本発明で使用され得るＣＢ−ＧＦを構成するＧＦ部とＣＢ部とは、共にペプチドであるため融合タンパクとして調製することができる。ＣＢ−ＧＦとして、成長因子受容体アゴニストが塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）であり、リンカー部およびＣＢ部がＣｏｌＨに由来するＰＫＤ−ＣＢＤである場合のＣＢ−ＧＦをｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤと称すれば、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤの製造方法は、文献（Nishi N. et al.: Proc Natl Acad Sci USA vol. 95, pages 7018 - 7023, 1998）に開示されている。これにより、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤを製造することができる。また、ＧＦ部として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を使用し、ＣＢ部としてＣｏｌＧに由来するＣＢＤを使用することで、これらが融合したｂＦＧＦ−ＣＢＤを製造することもできる。また、ｂＦＧＦの遺伝子配列に代えて上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の遺伝子配列を使用することで、上記と同様にしてＣＢ−ＥＧＦを製造することができる。更に、他の成長因子受容体アゴニストをコードする遺伝子配列を使用することで、ＣＢに他の成長因子受容体アゴニストが結合したＣＢ−ＧＦを製造することができる。なお、前記したように架橋剤によってＣＢ部とＧＦ部とを架橋結合させてもよい。 
【００４２】
≪神経再生用移植材料製造用キット≫
本発明の神経再生用移植材料製造用キットは、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材、及び受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子（ＣＢ−ＧＦ）を備える。
【００４３】
神経再生用移植材料としては、上述の≪神経再生用移植材料≫において説明したものが例示できる。前記ＣＢ−ＧＦは、ＣＢ−ＧＦを含むＣＢ−ＧＦ溶液の形態であってもよい。ＣＢ−ＧＦ溶液としては、ＣＢ−ＧＦを緩衝液中に０．５〜２.０ｍｇ／ｍｌの範囲で溶解した溶液を例示できる。
緩衝液としては、ｐＨ７．０〜８.０のリン酸緩衝液や、トリス緩衝液、生理食塩液を例示することができる。本発明のキットでは、成長因子アンカーリング型神経再生用移植材料の製造に必要なものがセットされているため、移植時にコラーゲン基材にＣＢ−ＧＦ溶液を加えるだけで簡便に成長因子アンカーリング型神経再生用移植材料を調製することができる。
【００４４】
≪神経再生方法など≫
上述の≪神経再生用移植材料≫において説明した本発明の神経再生用移植材料は、神経再生のために使用可能である。また、当該神経再生用移植材料を治療対象部位に移植することは、神経再生方法として実施することができる。
【００４５】
一実施形態において本発明は、神経再生のための、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備する移植材料を提供する。
一実施形態において本発明は、神経再生のための、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備する移植材料の使用を提供する。
一実施形態において本発明は、治療を必要とする患者又は畜患に、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備する移植材料を移植することを含む、神経再生方法を提供する。
【００４６】
移植の例としては、神経欠損部位を補填する、神経欠損部位を架橋する、神経欠損部位を被覆する、神経損傷部位を補填する、神経損傷部位を架橋する、神経損傷部位を被覆する等の方法が挙げられる。例えば、神経欠損領域長とほぼ等しい長さを有する神経再生用移植材料を、患者又は畜患の神経欠損部位へ移植することが挙げられる。
適用される神経の種類は特に制限されず、中枢神経、末梢神経、運動神経、知覚神経等のいずれに対しても適用可能である。
【００４７】
神経再生とは、細胞の増加、分化、成熟等の神経の修復又は神経の発生過程で生じる様々な現象のうち少なくとも一つを示していればよい。また、その結果として、神経再生とは、本来の神経の機能が完全又は部分的に回復する現象を含むことが好ましい。
効率的な神経再生が達成されたかどうかは、公知の方法により確認可能である。例えば、神経損傷があり移植材料が移植された患者又は畜患と、神経損傷があり移植材料が移植されていない患者又は畜患とを比較して、移植材料が移植された患者又は畜患のほうで、損傷した神経の機能の回復の程度が高い場合、効率的な神経再生が達成されたと判断できる。神経の機能の回復は、後述の実施例に示すように、刺激への反応や運動機能の回復を指標に評価できる。
【００４８】
神経再生は、欠損が生じた神経由来の細胞であって、治療対象部位にもともと存在する細胞（内在性の細胞）によるものであってもよいし、例えば神経再生用移植材料とともに移植された細胞（外来性の細胞）によるものであってもよい。これらの細胞としては、神経細胞、神経前駆細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等を挙げることができる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５０】
［配向性コラーゲンチューブの製造］
先ず、特許文献４に開示の方法に沿って、配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材からなり、以下に示す特性を有する配向性コラーゲンチューブＡを製造した。【００５１】
原材料コラーゲン： Porcine Skin Collagen type-I （製造元：nippi、仕様：Pepsin solubilized, 10mg/mL, 20mM acetic acid, 0.8μm filtered）
コラーゲン基材形状：筒体形状、７層重ね、筒内シームレス、
コラーゲン基材厚み：約１５μｍ（１層分、乾燥状態）、約１０５μｍ（７層分、乾燥状態）
内径：１ｍｍ、
コラーゲン配向性：長軸方向（１〜７層）、
コラーゲン量（７層分、乾燥状態）：約２５ｍｇ／ｃｍ２【００５２】
コラーゲンチューブＡの具体的な製造方法は以下のとおりである。
まず、ストリング形状の配向性コラーゲンゲルを準備した。コラーゲンゲルは濃度10mg/mLの豚皮由来Ｉ型コラーゲン溶液（nippi社製）を、内径0.38mmのノズルを介して38℃、pH7.4、１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（１０×PBS）が入った皿容器に押し出しながら、ノズルをスライドすることにより、直径1mm程度、長さ200mm程度のストリング形状のコラーゲンゲルを得た。
得られたコラーゲンゲルの配向性については、ラマン分光顕微鏡（フォトンデザイン社）により解析した。その際、連続発振アルゴンイオンレーザー  Stabilite  2017（スペクトラフィジックス社）により励起波長を514.5nm とし、分光器はHR-320（Jovin  Yvon社）、検出器はLN/CCD-1100-PB/UV  AR/1  （Roper  scientific社）を用いた。解析により、コラーゲンゲル長軸方向にコラーゲン線維が配向していることがわかった。
作製したストリング形状の配向性コラーゲンゲルを、心棒上に軸方向に配列させ、その後乾燥させることによってチューブ形状の乾燥配向性コラーゲン材料を得た。さらに、チューブ形状の乾燥配向性コラーゲン材料上に、作製したストリング形状の配向性コラーゲンゲルを配列させることを繰り返し、７層とした。その後、心棒を取り除き、乾燥状態の配向性コラーゲンチューブＡを得た（図１）。【００５３】
上記コラーゲンチューブＡは７層のコラーゲン基材を有するものであった。コラーゲン基材を３層とし、それ以外の条件は同様にして、３層のコラーゲン基材を有するコラーゲンチューブＡ´を製造した。コラーゲンチューブＡ´は以下に示す特性を有する。【００５４】
コラーゲン基材形状：筒体形状、３層重ね、筒内シームレス、
コラーゲン基材厚み：約１５μｍ（１層分、乾燥状態）、約４５μｍ（３層分、乾燥状態）、
コラーゲン量（３層分、乾燥状態）：約１１ｍｇ／ｃｍ２
（原材料コラーゲン、内径、コラーゲン配向性（１〜３層）は、上記コラーゲンチューブＡと同じである。）【００５５】
［ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の製造］
国際公開２０１２／１５７３３９号に開示の方法に沿って、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を製造した。
ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の具体的な製造方法は以下のとおりである。【００５６】
まず、配列番号１に示すＣｏ１Ｈ遺伝子の２７１９番目〜３３９１番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＰＫＤ−ＣＢＤ遺伝子）を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミド（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のＳｍａＩ部位に、常法を用いて挿入した。他方、配列番号２に示すＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、５´末端側にＢｇｌＩＩ部位を有し、３´末端側に１ヌクレオチド（塩基Ｇ）およびＥｃｏＲＩ部位を有するように、ＰＣＲ法により増幅した。増幅したＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、前記ＤＮＡ断片（ＰＫＤ−ＣＢＤ遺伝子）を挿入した前記プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、常法を用いて挿入し、発現プラスミドを調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号３）をコードするリーディングフレーム（配列番号４）を有している。前記ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、前記ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号６に示す。配列番号５に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、ＧＳＴタグ切断用酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部である。エレクトロポレーション法を用いて、前記発現プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  
ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、形質転換体を作製した。【００５７】
前記形質転換体を、５０ｍＬの５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ−Ｇ培地中で、一晩、前培養した。得られた前培養液１０ｍＬを前記培地５００ｍＬに加え、この菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が約０．７になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた菌液に、０．１Ｍ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）溶液５ｍＬを添加し、２５℃で５時間培養した。さらに、０．１Ｍ  フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）２−プロパノール溶液５ｍＬを添加後、前記菌液を６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、形質転換体を回収した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ  ７．５ｍＬに、前記形質転換体を懸濁し、フレンチ・プレスにより細胞を破壊した。この懸濁液１９容量に対して、２０％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １容量を加え、４℃で３０分間撹拌した。得られた菌液を、１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。この上清を、さらに１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。この上清を、清澄溶菌液とした。グルタチオン−セファロースビーズ  ２ｍＬに前記清澄溶菌液を添加し、４℃で１時間撹拌した。前記ビーズを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  １２ｍＬを用いて５回洗浄後、少量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌに懸濁してカラムに充填し、溶出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭグルタチオン）を用いて、前記ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を溶出した。この融合タンパク質１ｍｇあたり、５ｕｎｉｔのトロンビンを添加して、２５℃で１０時間反応させた。得られた反応液を、ヘパリン−セファロースビーズ  １ｍＬに添加し、４℃で３時間撹拌してｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を本ビーズに結合させた。上清を静かに捨て５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  １２ｍＬを用いて３回洗浄した。このビーズをカラムに充填し、０．５〜２Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）計１０ｍＬを用いてタンパク質を溶出し、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号５）を得た。【００５８】
［移植試験１−１］
生後７週齡のWistar ラットの坐骨神経を５ｍｍ欠損させた。欠損部に長さ５ｍｍの配向性コラーゲンチューブＡを移植し、架橋した。移植から１２週経過後の移植部位の様子を図２に示す。配向性コラーゲンチューブＡ内に神経再生が認められた（図２）。【００５９】
ラットに逆行性神経トレーサー（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ）を投与し、神経再生後のＬ５後根神経節細胞を観察した。結果を図３に示す。Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅで標識されたＬ５後根神経節細胞が観察され（図中矢印）、再生後の神経が機能的であることが示された。【００６０】
［移植試験１−２］
コラーゲンチューブＡの代わりに上記コラーゲンチューブＡ´を用いて移植を行った以外は、上記［移植試験１−１］と同様にして、移植試験を行った。
コラーゲンチューブＡ´を用いた場合、移植作業中にコラーゲンチューブのコラーゲン基材が裂けてしまう場合があった。移植後、コラーゲンチューブＡ´内での神経再生は認められた。
したがって、コラーゲンチューブＡは、移植作業効率及び神経再生の効率化の点で、コラーゲンチューブＡ´よりも優れていた。【００６１】
［移植試験２］
まず、上述のようにして、前記配向性コラーゲンチューブＡを製造した。
生後７週齡のＷｉｓｔａｒラット１６匹を実験に供した。通常自然治癒が認められない程度の欠損である坐骨神経１５ｍｍ欠損作製した群（欠損群）、配向性コラーゲンチューブＡをリン酸緩衝液に浸漬後、坐骨神経１５ｍｍ欠損部に移植し、欠損部を長さ１５ｍｍのコラーゲンチューブで架橋した群（ＰＢＳ群）（ｎ＝８）。移植後、１，４，８週で  ラット歩行解析装置（ＣａｔＷａｌｋ）を用いて足底のプリント幅、プリント長を測定した。欠損前の値を１とし、評価結果を図４に示す。【００６２】
図４を参照すると、プリント幅は欠損群に比べ、ＰＢＳ群では有意にプリント幅が広かった。また、プリント長も欠損群に比べＰＢＳ群で有意に高く、欠損前と同等のプリント長を示した。
これらの結果から、ＰＢＳ群では欠損群に比べて、運動機能の回復の程度が、優れていることが明らかとなった。このことから、配向性コラーゲンチューブＡが非常に優れた神経再生効果を有することが明らかとなった。【００６３】
［成長因子アンカーリング型配向性コラーゲンチューブの製造・ＣＢ−ＧＦ結合試験］
リン酸緩衝液中にｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をそれぞれ１．２５ ｍｇ／ｍｌ、２．５ ｍｇ／ｍｌ、５ ｍｇ／ｍｌ、１０ ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を用意し、上記の配向性コラーゲンチューブを溶液中に添加した。
配向性コラーゲンチューブへのｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合量は、溶液中上清中のｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質量から、以下のように求めた。
結合量 ＝ 添加量 − 溶液上清中のｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質量【００６４】
結合試験の結果を図５に示す。図５のグラフは、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の添加量と、配向性コラーゲンチューブへのｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合量の関係を示している。１０μｇのｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を添加した場合、そのうちの約9μgが結合していた。図５のグラフから、他の添加量の場合でも約９０％のタンパク質結合率を達成できたことが読み取れる。以上のことから、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を配向性コラーゲンチューブにｂＦＧＦを高効率でアンカーリングさせ、成長因子アンカーリング型配向性コラーゲンチューブが得られたことが示された。【００６５】
［移植試験３］
まず、上述のようにして、前記配向性コラーゲンチューブＡをｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ溶液１０ｍｇ／ｍｌに浸漬させ、成長因子アンカーリング型配向性コラーゲンチューブ（配向性コラーゲンチューブＢ）を製造した。
生後７週齡のWistarラット８匹を実験に供した。ラットは、前記配向性コラーゲンチューブＡをリン酸緩衝液に浸漬後移植した群（ＰＢＳ群）、成長因子アンカーリング型の前記配向性コラーゲンチューブＢを移植した群（ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群）の２群に分けた。通常自然治癒が認められない程度の欠損である坐骨神経１５ｍｍ欠損を各群のラットに対して作製後、欠損部を長さ１５mmの上記の各コラーゲンチューブでそれぞれ架橋した。【００６６】
移植から２週間経過後より ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔによる行動学的評価を行い、感覚神経の回復を評価した。行動学的評価では、０．００８〜３００ｇの足裏刺激に対して反応したラットの割合と、ラットが反応した閾値の平均値を求めた。評価は移植から２週間経過後、３週間経過後、４週間経過後、５週間経過後、６週間経過後の各時点で行った。評価結果を表１及び図６に示す。【００６７】
【表１】
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【００６８】
表１は、ラットの感覚神経の回復率（回復個体数／評価対象個体数）を示す。回復の評価は、３００ｇの足裏刺激への反応の有無で評価した。ＰＢＳ群及び、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群の両群で感覚神経の回復が認められた。したがって、配向性コラーゲンチューブＡ、配向性コラーゲンチューブＢの両チューブで、本来自然治癒が困難な程度の神経欠損を再生可能であることが示された。【００６９】
ＰＢＳ群では、移植から３週経過時点で全例（４例中４例）感覚神経の回復が認められたのに対して、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群では移植から２週経過時点で全例感覚神経の回復を認めた。このことから、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群ではＰＢＳ群に比べて、早期に感覚神経の再生が認められたことが明らかとなった。【００７０】
図６を参照すると、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群はＰＢＳ群に比べ低い刺激（圧）で反応していることがわかる。
また、再生した神経の様子を図７に示す。図７は、コラーゲンチューブ移植から８週経過時点での、再生した神経のトルイジンブルー染色像である。ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群ではＰＢＳ群に比べて、より多くの髄鞘が形成されていた。
これらの結果から、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ群ではＰＢＳ群に比べて、再生した神経の回復の質が、機能的にも組織学的にも、より優れていることが明らかとなった。【００７１】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、効率的な神経再生を可能にする神経再生用移植材料を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月16日(2016.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を具備し、
前記コラーゲンに、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子が結合され、
前記コラーゲン結合部位含有成長因子は、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、
前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである神経再生用移植材料。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
中空の筒体形状を有し、該筒体の内面の少なくとも一部が前記コラーゲン基材により構成された請求項１に記載の神経再生用移植材料。
【請求項４】
前記コラーゲン基材が筒体形状を有し、該コラーゲン基材は継ぎ目のないシームレスチューブである、請求項３に記載の神経再生用移植材料。
【請求項５】
前記コラーゲンが、前記筒体の両端の開口部を結ぶ方向に配向性を有する請求項３に記載の神経再生用移植材料。
【請求項６】
前記成長因子受容体アゴニストペプチド部は、塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項７】
前記コラーゲン基材は、複数のコラーゲン基材層からなる請求項１〜６のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項８】
前記コラーゲン基材の厚みが、５０μｍ以上、２００μｍ以下である請求項１〜７のいずれか一項に記載の神経再生用移植材料。
【請求項９】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材を、受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液に浸漬させて、前記コラーゲンに前記コラーゲン結合部位含有成長因子を結合させる工程を有する神経再生用移植材料の製造方法。
【請求項１０】
配向性を有するコラーゲンを含むコラーゲン基材、
及び受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子、
を備えた神経再生用移植材料製造用キット。
【国際調査報告】
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