(57)【要約】導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程を含むプライミング方法。本発明によれば、細胞懸濁液処理時の有効濾過面積が大きくなり、細胞の回収率や濾過速度を向上させることができ、さらに、閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。
2016067946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程
を含むプライミング方法。
【請求項２】
プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ以上２９ｍｍＨｇ以下である請求項１に記載のプライミング方法。
【請求項３】
前記内圧が陰圧である請求項２に記載のプライミング方法。
【請求項４】
前記線速度が３５ｃｍ／分以上３００ｃｍ／分以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項５】
プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して７０％以上充填する請求項１〜４のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項６】
前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項７】
前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している請求項１〜６のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項８】
中空糸膜の孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項９】
前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる１種以上である請求項１〜８のいずれか１項に記載のプライミング方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
【請求項１１】
前記濾液排出口を少なくとも１つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる請求項１０に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項１２】
細胞懸濁液を線速度５００ｃｍ／分以上２０００ｃｍ／分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する請求項１０または１１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項１３】
細胞懸濁液を濾過速度１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下で濾液出口より導出する請求項１２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸膜を充填した中空糸膜モジュールをプライミングする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外循環の分野における血液浄化や血漿分離、あるいは細胞医療の分野において細胞懸濁液中のタンパクやウイルス、夾雑物を分離、濾過する目的で、中空糸膜を充填した中空糸膜モジュールが幅広く用いられている。体外循環の分野で中空糸膜モジュールを使用する場合、中空糸膜モジュールを通過した血液が直接体内に戻ることから、中空糸膜モジュール内に充填されている空気や気泡を予め完全に除去する必要があり、体外循環を開始する前に生理食塩液などのプライミング液を中空糸膜モジュール内に導入する「プライミング」を行っている（特許文献１）。しかし、中空糸膜モジュール全体にプライミング液を充填するため、プライミング液を中空糸膜の内側と外側、すなわち血液流路側と透析液側の両方から異なる流路で導入しており、流路の切り替えが煩雑で時間のかかる工程になっている。【０００３】
一方、細胞医療の分野で中空糸膜モジュールを使用する場合のプライミング方法については全く考慮されていない（特許文献２）。これは、細胞医療の分野では、体外循環と異なり、中空糸膜モジュールを通過した細胞懸濁液を直接体内に戻さないので、中空糸膜モジュール内の空気や気泡を予め完全に除去する必要がなく、プライミングを行うことについて配慮する必要性が低かったことが考えられる。しかしながら、細胞懸濁液中のタンパクやウイルス、夾雑物を効率的に分離、濾過するためには、中空糸膜の内側と外側がともに濡れている状態で細胞の処理を行う必要があることから、細胞の処理を開始する前に中空糸膜の内側と外側に生理食塩液などのプライミング液を充填し、中空糸膜の有効濾過面積を大きくする「プライミング」のプロセスは、濾過速度の向上や、細胞回収率の向上に寄与することから非常に重要である。さらに、細胞医療用途で中空糸膜モジュールを使用する場合は、血液浄化とは異なり、中空糸膜の外側からプライミング液を導入することは想定しにくいが、中空糸膜にプライミング液を速やかに接触させる観点から、径の大きな口を通じて中空糸膜の外側からプライミング液を導入する場合があった。従って、細胞医療用途においても、中空糸膜の内側から導入したプライミング液を中空糸膜の内側と外側の両方に充填できるプライミング方法が求められているものの、前記のように、従来では全く考慮されておらず、またこれを実現するためには、中空糸膜の外側に大気開放弁を設け、中空糸膜の外側に存在する空気を開放するなど、中空糸膜モジュールの構造を工夫するほかなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２６８７６２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６１８５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記中空糸膜モジュールのプライミング方法における問題点を解決することを課題とする。具体的には、任意の形状の中空糸膜モジュールをプライミングするにあたり、中空糸膜の内側からのみ導入したプライミング液を、中空糸膜の内側と外側の両方に簡便に充填することのできるプライミング方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記プライミング方法を施した中空糸膜モジュールを用いて、細胞懸濁液から細胞濃縮液を短時間で効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中空糸膜モジュールに導入するプライミング液の線速度を特定範囲に設計することで、任意の形状の中空糸膜モジュールをプライミングするにあたり、中空糸膜の内側から導入したプライミング液を、中空糸膜の内側と外側の両方に簡便に充填することのできるプライミング方法を見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法であって、
前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、前記中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填する工程
を含むプライミング方法。
（２）プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ以上２９ｍｍＨｇ以下である前記（１）に記載のプライミング方法。
（３）前記内圧が陰圧である前記（２）に記載のプライミング方法。
（４）前記線速度が３５ｃｍ／分以上３００ｃｍ／分以下である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のプライミング方法。
（５）プライミング液を前記中空糸膜モジュールの容積に対して７０％以上充填する前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライミング方法。
（６）前記中空糸膜の内側にプライミング液を導入する前記（１）〜（５）のいずれかに記載のプライミング方法。
（７）前記導入口および前記導出口が前記中空糸膜の内側を通じて連通している前記（１）〜（６）のいずれかに記載のプライミング方法。
（８）中空糸膜の孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である前記（１）〜（７）のいずれかに記載のプライミング方法。
（９）前記プライミング液が、生理食塩液、輸液、血清または培地からなる群より選ばれる１種以上である前記（１）〜（８）のいずれかに記載のプライミング方法。
（１０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を中空糸膜モジュールの導出入口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法。
（１１）前記濾液排出口を少なくとも１つ以上備えた中空糸膜モジュールを用いる前記（１０）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１２）細胞懸濁液を線速度５００ｃｍ／分以上２０００ｃｍ／分以下で中空糸膜モジュールの導出入口より導入する前記（１０）または（１１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（１３）細胞懸濁液を濾過速度１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下で濾液出口より導出する前記（１２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプライミング方法によれば、細胞処理時の中空糸膜モジュールの有効濾過面積が大きくなり、プライミングが不十分であった場合に生じる細胞回収率の低下を引き起こすことなく、濾過速度を向上させたり、また、濾過速度を下げることなく細胞回収率を向上させることができる。さらに、本発明のプライミング方法では、中空糸膜モジュールの構造を工夫する必要がないので、例えば、中空糸膜の外側に大気開放弁を設けていない中空糸膜モジュールでも好適なプライミングを行うことができる。そして、本発明のプライミング方法で処理した大気開放弁を有さない中空糸膜モジュールでは、閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法の実施形態の一例を示す概略図である。
【図２】本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法の実施形態の別の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明について説明する。
【００１１】
本発明のプライミング方法とは、導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填された中空糸膜モジュールをプライミングする方法である。
【００１２】
本発明で用いる中空糸膜モジュールは、導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填されたタイプのものである。前記中空糸膜モジュールでは、前記導入口（または導出口）から中空糸膜の内側にプライミング液が導入される。プライミング液は、中空糸膜の内側の空間を満たしながら、一部は中空糸膜壁に設けられた微細孔を通過して中空糸膜の外側に排出され、前記容器と前記中空糸膜との間の空間に満たされる。そして、中空糸膜の内側のプライミング液は前記導出口（または導入口）を介して、中空糸膜の外側に排出されたプライミング液は濾液排出口を介して、細胞懸濁液に置き換わるかたちでそれぞれ中空糸膜モジュールから排出される。
【００１３】
また、前記導入口および導出口は前記中空糸膜の内側を通じで連通している。このような構成とすることで、細胞懸濁液などの液体は前記導入口から前記中空糸膜の内側の中空部分を通り、導出口から中空糸膜モジュールの外に導出され、例えば、中空糸膜の内側を細胞懸濁液が通過した際に、液体成分が中空糸膜壁を通じて外側に移行することで、細胞濃縮が実施できる。
【００１４】
なお、プライミング工程において中空糸膜モジュールに導入されるプライミング液の導入口は、次いで行う細胞濃縮工程で導入される細胞懸濁液の導出口になることがあることから、本発明では、濾過するための液体用の出入口の一方の口を「導入口」と示し、他方の口を「導出口」と示す。
ただし、以降の説明では、プライミング液を中空糸膜モジュールに導入するための口を「導入口」、プライミング液を中空糸膜モジュールから導出するための口を「導出口」として説明する。
【００１５】
前記中空糸膜モジュールとしては、前記構成を有するものであればよく特に限定はないが、例えば、図１に示す中空糸膜モジュールＡが挙げられる。中空糸膜モジュールＡを構成する容器１は、胴部２とその両側の頭部３、頭部９からなり、頭部９付近には濾液排出口４が備えられている。この濾液排出口４の位置は頭部９や胴部２の端部に備えられていてもよいし、胴部２の中央部に備えられていてもよい。濾液排出口４の数も特に限定はなく、プライミング後に分離や濾過の用途で中空糸膜モジュールが使用されることを鑑みると、濾液排出口４は１つ以上備えていることが好ましく、濾過速度を高め短時間で分離や濾過を完遂するために、図２に示す中空糸膜モジュールＢのように２つの濾液排出口４、４’またはそれ以上備えていることがより好ましい。また、中空糸膜モジュールに大気開放弁を設ける必要はなく、閉鎖系を維持したままプライミングすることができる。前記中空糸膜モジュールＢでは、濾液排出口４と濾液排出口４’の位置は、中空糸膜モジュールＢの導入口８ａから略同じ距離に設けられているが、別の位置に設けられていてもよい。また、中空糸膜モジュールＢで生じた濾液は、前記濾液排出口４、４’からポンプ１１ｂを駆動させることで廃液容器１３に導入される。
なお、前記中空糸膜モジュールＢは、濾液排出口４’を設け、かつ導出口８ｂ側にポンプ１１ａおよび圧力計１４ａを設けるかわりに、導入口８ａ側の回路１６にポンプ１１ａ’および圧力計１４ａ’を設けた以外は、前記中空糸膜モジュールＡと同じ構成を有する。したがって、中空糸膜モジュールＢの構成について、中空糸膜モジュールＡと共通の構成については、特に必要がない限り説明を省略する。
【００１６】
また、図１では、下側の頭部９に導入口８ａ、上側の頭部３に導出口８ｂが設けられている。導入口８ａとは、中空糸膜の内側にプライミング液を導入する入口のことであり、導出口８ｂとは、プライミング液を中空糸膜の内側より導出する出口のことである。胴部２内部には、装填された中空糸膜の束５と、頭部３の内部に設けられた中空糸膜の束５を胴部２内部に固定するとともに中空糸膜の開口端６を形成している樹脂層部７と、更に頭部９の内部に設けられたこれと同等の構造とを有している。この樹脂層部７および開口端６は、頭部３（或いは頭部９）に被冠された構造となっており、導入口８ａ、導出口８ｂと濾液排出口４とが中空糸膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
【００１７】
なお、図１に示す中空糸膜モジュールＡは、各部分を容器１の胴部２、頭部３、頭部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、容器１の胴部２、頭部３および頭部９が別々のパーツから形成されている場合でも、導入口８ａと導出口８ｂが中空糸膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に導入口８ａおよび導出口８ｂと濾液排出口４とが中空糸膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。
【００１８】
前記中空糸膜モジュールＡは、細胞への細菌の混入を防ぐ観点から、滅菌したものでもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌、電子線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
【００１９】
中空糸膜モジュールの容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。
【００２０】
中空糸膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。
【００２１】
前記中空糸膜モジュールには、中空糸膜を１０〜１０００本程度束ねたものを容器内に充填していることが好ましい。なお、本発明において、中空糸膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、導入口と導出口の間に中空糸膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。さらに、プライミングを行う際の中空糸膜は鉛直方向に配置されていても、水平方向に配置されていても、斜め方向に配置されていてもよいが、有効濾過面積を最大化するためには、中空糸膜が鉛直方向に配置している方がより好ましい。なお、有効濾過面積とは、プライミング後に中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜内側の膜面積のことである。
【００２２】
本発明に用いられる中空糸膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系又はセルロース系の親水性の高分子材料がより好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。
【００２３】
また、中空糸膜の壁に設けられた孔の孔径は０．１μｍ以上１．５μｍ以下が好ましい。前記孔径が０．１μｍ未満であると、プライミングの際に中空糸膜外側に存在する空気がプライミング液によって置換されない、または細胞懸濁液の濃縮時に不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できないため好ましくない。前記孔径が０．１μｍを下回ってくると、孔の大きさは通常分画分子量で表現されるが、例えば５００ｋＤ程度の中空糸膜では、表面張力によりプライミング液が中空糸膜の孔を通過できないため、中空糸膜外側に存在する空気がプライミング液によって置換されない。一方、前記孔径が１．５μｍを超えても、プライミングの工程で特段の問題は生じないが、細胞の大きさに近い孔径が中空糸膜上に存在するため、細胞懸濁液を濃縮する工程において孔への詰まりが生じ、細胞回収率が大きく低下する可能性があるため好ましくない。
前記孔径の上限は、１．５μｍ以下が好ましく、１．２μｍ以下がより好ましく、１．０μｍ以下がさらに好ましい。
前記中空糸膜の孔径は、中空糸膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。
なお、前記中空糸膜の内側に形成される内径については、細胞懸濁液を通液できる大きさがあればよく、特に限定はない。
【００２４】
前記プライミング液としては、生理食塩液、蒸留水、リンゲル液に代表される輸液や、無機塩、糖類、血清、タンパク質を含む液体、緩衝液、血漿、培地等が挙げられる。特に安全性の観点から生理食塩液や輸液を好適に用いることができる。また、血清、血漿、タンパク質を含む液体は、中空糸膜の表面をタンパク質でコーティングすることによって、細胞の中空糸膜への接着が抑制され、細胞回収率の向上が期待できることから、プライミング液として好適に用いることができる。プライミング液は１種類の液体である必要はなく、これらの群から２つ以上の液体を混合して使用することもできる。２つの液体を混合して使用する例としては、アルブミンを添加した生理食塩液や、血清を添加した培地といった組み合わせが挙げられる。
【００２５】
本発明のプライミング方法は、細胞懸濁液を導入する前に、中空糸膜モジュールの導入口または導出口よりプライミング液を線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填するプライミング工程を含むことに特徴があり、これにより細胞処理時の中空糸膜モジュールの有効濾過面積が大きくなり、細胞回収率の低下を引き起こすことなく濾過速度を向上させることが可能となる。
なお、有効濾過面積とは、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜内側の膜面積であり、本発明では、以下の式１：
（有効濾過面積（ｃｍ２））＝π×（中空糸内径（ｃｍ））×（中空糸の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ））×（中空糸本数（本））（式１）
で求めることができる。
【００２６】
前記線速度（ｃｍ／分）とは、単位時間当たりに中空糸膜内側に流入する液量、すなわち流速（ｃｍ３／分＝ｍＬ／分）を中空糸膜の総断面積（ｃｍ２）で除した値である。
本発明のプライミング方法において、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の下限は、３５ｃｍ／分である。また、中空糸膜内側に導入するプライミング液の線速度の上限は、４５０ｃｍ／分であり、好ましくは４２０ｃｍ／分、より好ましくは３００ｃｍ／分である。前記線速度が３５ｃｍ／分未満であると、プライミング工程に時間がかかりすぎることが懸念され、また、４５０ｃｍ／分を超えると、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換される前に中空糸膜の内側がプライミング液により浸潤し、中空糸膜の外側にプライミング液を充填することができなくなる。
【００２７】
なお、ここでいう中空糸膜の総断面積とは、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜の内腔の断面積の合計面積であり、以下の式２：
（総断面積（ｃｍ２））＝（中空糸本数（本））×π×（中空糸内径（ｃｍ））×（中空糸内径（ｃｍ））÷４（式２）
で求めることができる。
若しくは、中空糸内径（ｃｍ）、濾過面積（ｃｍ２）、樹脂層部間の距離（ｃｍ）から、以下の式３：
（総断面積（ｃｍ２））＝[（中空糸内径（ｃｍ）]×[濾過面積（ｃｍ２）]÷[樹脂層部間の距離（ｃｍ）] ÷４（式３）
で求めることができる。
【００２８】
また、前記濾過面積とは、以下の式４：
（濾過面積（ｃｍ２））＝π×（中空糸内径（ｃｍ））×（樹脂層部間の距離（ｃｍ））×（中空糸本数（本））（式４）
により求められた値のことである。
前記樹脂層部間の距離とは、中空糸を中空糸膜モジュール内上下２箇所で固定した樹脂層部の間の距離をさす。
【００２９】
中空糸膜モジュールの容積（ｃｍ３）は、以下の式５：
（中空糸膜モジュールの容積（ｃｍ３））＝（中空糸膜モジュールの総断面積（ｃｍ２））×（中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ））（式５）
により算出される。
【００３０】
前記中空糸膜モジュールの容積は１０ｃｍ３以上５００ｃｍ３以下が好ましい。前記容積が１０ｃｍ３未満では、中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離を十分に確保することができず、その場合は、本発明のプライミング処理を行ってもすぐに中空糸膜内側が完全に濡れてしまい、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換されない。また、前記容積が５００ｃｍ３を超えると、プライミング工程に時間がかかりすぎることが懸念される。前記容積の下限は、２０ｃｍ３がより好ましく、３０ｃｍ３がさらに好ましい。前記容積の上限は、４００ｃｍ３がより好ましく、３００ｃｍ３がさらに好ましい。
【００３１】
本発明のプライミング方法においては、中空糸膜モジュールを構成する容器の前記容積に対してプライミング液が１５％以上充填されている。ここで、前記プライミング液の充填率とは、プライミングを実施した後の前記容器内に充填されている量をいい、具体的には、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）を中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ）で除した値をパーセントで表示することによりプライミング液の充填率（％）を算出することができる。
【００３２】
前記プライミング液の充填率が１５％未満であると、有効濾過面積が小さいため、細胞を含む液体を処理する際に、細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。前記プライミング液の充填率は、４０％以上が好ましく、中でも７０％以上であることで、細胞が中空糸膜に詰まりにくく、その結果細胞回収率がより高くなるためより好ましい。
【００３３】
また、本発明のプライミング方法では、プライミング時の中空糸膜の内圧と外圧の圧力差が７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）以上２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）以下となるように調整することが好ましい。
【００３４】
前記中空糸膜の内圧（ｍｍＨｇまたはＰａ）とは、プライミング時の中空糸膜の内側の圧力の絶対値のことであり、中空糸膜モジュールの導出入口（導出口および／または導入口）付近の空気の圧力測定値の絶対値を参照している。従って、プライミング液の導入口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧測定値（内圧値ともいう）が陽圧になり、反対にプライミング液の導出口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧値が陰圧になる。内圧値は陰圧であることが好ましい。内圧値が陰圧になることで、プライミング液の中空糸膜の内側の導入と、中空糸膜外側の空気のプライミング液への置換とをより効率よく行うことができる。
例えば、図１に示す中空糸膜モジュールＡでは、プライミング液の導出口８ｂ付近に備えられたポンプ１１ａを用いて線速を制御するために、内圧は陰圧になる。このように、内圧が陰圧になることで、プライミング液の中空糸膜の内側の導入と、中空糸膜外側の空気のプライミング液への置換とをより効率よく行うことができる。内圧の下限は８ｍｍＨｇ（１０６７Ｐａ）であることが好ましく、上限は６６ｍｍＨｇ（８７９９Ｐａ）であることが好ましい。
また、図２に示す中空糸膜モジュールＢのようにプライミング液の導入口８ａ付近にポンプ１１ａ’を備えている場合には、前記ポンプ１１ａ’を用いて中空糸膜モジュールＢ内に導入するプライミング液の線速を制御するために、内圧は陽圧になる。
なお、前記内圧の測定方法としては、前記中空糸膜モジュールＡに充填された中空糸膜５の内側に導入されている液体の圧力を測定すればよい。例えば、図１に示すように、プライミング液の導出口８ｂとポンプ１１ａとを接続したチューブの任意の位置に圧力計１４ａを接続して内圧を測定すればよいし、図２に示すように、プライミング液の導入口８ａとポンプ１１ａ’とを接続したチューブの任意の位置に内圧を測定するための圧力計１４ａ’を接続してもよい。
【００３５】
また、前記中空糸膜の外圧（ｍｍＨｇまたはＰａ）とは、プライミング時の中空糸膜の外側の圧力の絶対値のことであり、中空糸膜外側の空間における空気の圧力測定値の絶対値を参照している。プライミング液の導入口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、外圧測定値（外圧値ともいう）が陽圧になり、反対にプライミング液の導出口付近にポンプを配置して線速を制御し、プライミング液を中空糸膜の内側に導入する場合は、外圧値が陰圧になる。外圧の下限は０ｍｍＨｇ（０Ｐａ）であり、上限は４６ｍｍＨｇ（６１３３Ｐａ）であることが好ましい。
なお、前記外圧の測定方法としては、図１、２に示す中空糸膜モジュールＡ、Ｂに充填された中空糸膜５と胴部２との間隙にある液体の圧力を測定すればよく、例えば、図１において胴部２の側面に圧力計接続口１５を設け、この圧力計接続口１５に圧力計１４ｂを接続して測定すればよい。
【００３６】
前記圧力差（ｍｍＨｇまたはＰａ）は、前記内圧測定値から外圧測定値を引いた差の絶対値をさしている。
前記圧力差が７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）未満の場合は、線速が小さすぎてプライミング工程に時間がかかりすぎる。また、前記圧力差が２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）を超えると、線速が大きすぎて、すぐに中空糸膜内側がプライミング液で完全に濡れてしまい、中空糸膜外側の空気がプライミング液に置換されない。
本発明のプライミング方法において、前記圧力差の下限は７ｍｍＨｇ（９３３Ｐａ）が好ましく、また、前記圧力差の上限は２９ｍｍＨｇ（３８６６Ｐａ）が好ましく、２２ｍｍＨｇ（２９３３Ｐａ）がより好ましく、１７ｍｍＨｇ（２２６６Ｐａ）がさらに好ましい。
【００３７】
なお、プライミング液の導入口付近に備えられたポンプを用いて線速を制御し、プライミング液を導入口より中空糸膜の内側に導入する場合は内圧値から外圧値を引いた差が正の値になり、反対にプライミング液の導出口付近に備えられたポンプを用いて線速を制御し、プライミング液を導入口より中空糸膜の内側に導入する場合は、内圧値から外圧値を引いた差が負の値になる。
【００３８】
また、本発明は、前記のようなプライミング方法を中空糸膜モジュールに施した後に、細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口より導入し、細胞を含まない濾液を濾液排出口より排出しながら、細胞懸濁液を濃縮する工程、を含む細胞濃縮液の製造方法に関する。
【００３９】
ここにおける細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、胎児細胞などの希少細胞が例示される。
【００４０】
前記細胞懸濁液は、前記細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理、破砕処理、抽出処理、分解処理または超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理、ろ過処理、酵素処理、分解処理または超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。
【００４１】
また、前記に例示した細胞を生体外で培養した後の細胞懸濁液を使用することができる。細胞を生体外で培養するときの培養液の例としては、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が挙げられる。また、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子を添加した培養液も使用できる。
【００４２】
前記細胞懸濁液を濃縮する工程とは、具体的には、中空糸膜モジュールの導入口または導出口から中空糸膜の内側に流入した細胞懸濁液から、細胞を含まないタンパクや無機塩などの成分が濾液として中空糸膜の外側に濾別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液を導出口または導入口より流出させる工程のことである。また、中空糸膜モジュールの導入口と出口は回路で接続されており、濃縮された細胞濃縮液を、再び中空糸膜の内側に流入させ、細胞成分がさらに濃縮されるように構成される。この濃縮が繰り返されることにより、細胞懸濁液の濃縮が進んで所望の細胞濃度にまで濃縮された細胞濃縮液が生成されることになる。なお、前記細胞濃縮液とは、中空糸膜モジュールを通過することにより濃縮された細胞懸濁液のことを表す。
【００４３】
細胞懸濁液は、プライミング液と同じように導入口から中空糸膜モジュールに導入してもよく、逆にプライミング液の導出口から中空糸膜モジュールに導入することもできる。
【００４４】
前記中空糸膜モジュールに導入するときの細胞懸濁液の線速度は、５００ｃｍ／分より大きく、２０００ｃｍ／分以下であることが好ましい。
前記線速度が５００ｃｍ／分以下であると、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。２０００ｃｍ／分を超えると、細胞へのせん断や圧力によるダメージが大きくなることが懸念される。
前記線速度の下限は５００ｃｍ／分より大きいことが好ましく、８００ｃｍ／分より大きいことがより好ましく、１２００ｃｍ／分より大きいことがさらに好ましい。また、前記線速度の上限は２０００ｃｍ／分であることが好ましく、１８００ｃｍ／分がより好ましく、１５００ｃｍ／分がさらに好ましい。
【００４５】
前記濃縮工程における、細胞懸濁液の濾過速度は（ｍＬ／ｍ２／分）は、１０００ｍＬ／ｍ２／分以上４２５０ｍＬ／ｍ２／分以下であることが好ましい。
前記濾過速度とは、濾液排出口より排出される中空糸膜面積１ｍ２あたりの濾液の流量（ｍＬ／分）を、時間（分）で除した値のことである。
前記濾過速度が１０００ｍＬ／ｍ２／分未満の場合、濃縮処理に時間がかかり効率的でない。４２５０ｍＬ／ｍ２／分を超えると、細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。
また、前記濾過速度の下限は、１０００ｍＬ／ｍ２／分が好ましく、１２５０ｍＬ／ｍ２／分がより好ましく、１５００ｍＬ／ｍ２／分がさらに好ましい。また、前記濾過速度の上限は、４２５０ｍＬ／ｍ２／分が好ましく、４０００ｍＬ／ｍ２／分がより好ましく、３７５０ｍＬ／ｍ２／分がさらに好ましい。
中でも、前記細胞懸濁液の濾過速度は、１５００ｍＬ／ｍ２／分以上３７５０ｍＬ／ｍ２／分以下であることで短時間かつ回収効率の高い濃縮処理が可能となるため好ましい。
【００４６】
なお、前記濾過速度を求める際の中空糸膜面積は、中空糸膜の外側が液体で浸潤しているかどうかに関わらず、中空糸膜モジュールに充填された中空糸膜全体の膜面積のことをさしており、
（膜面積（ｍ２））＝（中空糸の内径（ｍ））×π×（樹脂層部間の距離（ｍ））×（中空糸本数（本））
により算出される。
【００４７】
前記膜面積としては、０．０５ｍ２以上０．２０ｍ２以下が好ましい。前記膜面積が０．２０ｍ２を超えると細胞懸濁液が中空糸膜内に残存する液量が多くなり回収率が低下することが懸念され、また、０．０５ｍ２未満では、濾過流量が十分でなく短時間で処理ができない、もしくは細胞が中空糸膜に詰まりやすく、細胞回収率の低下を引き起こすことが懸念される。前記膜面積の下限は０．０５ｍ２が好ましく、０．０７ｍ２がより好ましく、０．０９ｍ２がさらに好ましい。前記膜面積の上限は０．２０ｍ２が好ましく、０，１８ｍ２がより好ましく、０．１６ｍ２がさらに好ましい。
【００４８】
以下、本発明のプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法を、図１を使用して例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更することができる。
【００４９】
まず、中空糸膜モジュールＡの導入口８ａおよび導出口８ｂにチューブ等を取り付ける。導入口８ａおよび導出口８ｂに取り付けたチューブの端はプライミング液が入ったバッグなどの貯留容器１０に連結し、前記貯留容器１０と中空糸膜モジュールＡとの間でプライミング液などの液体が循環できるように回路１６を形成する。さらに取り付けたチューブ内を、プライミング液などの液体が循環できるように、ポンプ１１ａをこのチューブに介在させてもよい。また、濾液排出口４はプライミング工程が終わるまで二方活栓１２で閉じた状態にしておく。中空糸膜モジュールＡおよびチューブ等の全体の取り付けは、クリーンベンチ等の無菌的な環境下で行われることが好ましい。
【００５０】
次に、ポンプ１１ａを図１に示す回路１６からみて反時計周りに動かしてプライミング液を中空糸膜モジュールＡの下方にある導入口８ａから中空糸膜内側に充填する。前記ポンプ１１ａの駆動速度は、プライミング液の線速度が３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下になるように調整し、前記中空糸膜モジュールＡの容積に対して１５％以上になるまでプライミング液が充填されていることを確認してからポンプ１１ａを止めてプライミングを終了する。
【００５１】
次に、プライミングが終了したら、前記貯留容器１０内のプライミング液を細胞懸濁液に交換し、濾液排出口４と廃液容器１３とを連結しているチューブにある二方活栓１２を開放し、ポンプ１１ａを図１に示す回路１６からみて時計周りに動かして細胞懸濁液の濃縮工程を開始する。
このとき、濾液排出口４側の流路を狭くするなどして中空糸膜に圧力をかけながら濾過することもできるし、濾過側のチューブにポンプなどの機械１１ｂを設置して圧力をかけながら濾過を行ってもよく、一般的な中空糸膜モジュールで用いられる各種濾過方法を併用することができる。
【００５２】
また、前記濃縮工程後に、細胞濃縮液を回収する方法としては、例えば、前記導入口８ａと貯留容器１０とを接続する回路１６の適当な場所に分岐部として三方活栓１７を設け、この分岐部の三方活栓１７に回収容器１８を接続し、前記ポンプ１１ａを駆動しながら、中空糸膜モジュールＡ、貯留容器１０および回路１６内の細胞濃縮液を前記回収容器１８に導入する方法が挙げられるが、特に限定はない。
【００５３】
以上のようにして、閉鎖環境を維持して得られる細胞濃縮液には細菌などの混入がないことから、そのまま各種疾患の治療用途に提供することができる。
例えば、前記製造方法で得られる細胞濃縮液をヒトや非ヒト動物に投与する各種疾患の治療方法に関する。
【００５４】
前記治療方法としては、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞などの免疫細胞を使用したがんに対する免疫細胞療法、間葉系幹細胞などの多分化能を有する生体幹細胞を使用した、骨、関節、血管、臓器などの組織再生に対する細胞移植治療法、間葉系幹細胞を使用したＧＶＨＤ治療法が挙げられる。これらの治療に用いられる細胞は、iＰＳ細胞、ＥＳ細胞より誘導した細胞や、各種遺伝子を導入した細胞を使用することもできる。さらに、前記製造方法で得られる細胞濃縮液は、細胞濃縮液に新鮮な培地を加え、再び培養を行う培地交換の用途としても好適に使用することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。
細胞回収率（％）とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。
細胞数（個）は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス製、商品名「Ｋ−４５００」）により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量（ｍＬ）と細胞濃度（個／ｍＬ）の値の積で算出することができる。
細胞回収率（％）は７０％以上であることが好ましく、８５％以上がさらに好ましい。８５％未満になると、細胞治療用途として患者に投与する際に必要な細胞数を確保できない可能性がある。さらに７０％未満になると、細胞損失が大きすぎて細胞処理用途としての使用に適さないと判断される可能性が高い。【００５６】
また、ここで細胞生存率比とは、回収容器１８に回収した細胞懸濁液中の細胞生存率を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞生存率で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど細胞に与えるダメージが少ないことを示す。細胞生存率は{細胞生存率（％）＝１００−死細胞率（％）}により算出される。【００５７】
死細胞率（％）は、細胞濃度が１ｍLあたり１０の６乗個になるよう調製した各細胞懸濁液１００μLに対し、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅ（ＢＤ製）を１０μＬ加え１０分間室温暗所で静置させた後、フローサイトメーター（ＢＤ製、商品名「ＦＡＣＳＣａｎｔｏ」）に取り込み、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅの陽性率（％）として測定することができる。【００５８】
本発明において細胞生存率比は、９５％以上であることが好ましく、９６％以上がさらに好ましい。９５％未満の場合は、細胞濃縮工程において細胞が大きくダメージを受けており、例えば細胞治療用途として患者に投与したときに、細胞が正常に機能せず、治療効果を発揮しない可能性がある。【００５９】
実施例に使用する細胞懸濁液は、培養したＪｕｒｋａｔ細胞を含有する細胞懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）１５００ｍＬとした。【００６０】
各実験例におけるプライミング方法および細胞濃縮液の製造方法は、図１に示すように、中空糸膜モジュールＡ、貯留容器１０および廃液容器１３をチューブで接続した装置を用いて行った。前記中空糸膜モジュールＡとしては、下方にある頭部９の底面に導入口８ａ、その付近の胴部２側面に濾液排出口４が設けられており、前記中空糸膜モジュールＡの上方にある頭部３の天面に導出口８ｂ、その付近の胴部２側面に圧力計接続口１５が設けられているものを用いた。
また、各実施例に記載した中空糸膜モジュールＡの導入口８ａ、および導出口８ｂにそれぞれ塩化ビニルチューブをつなげた。導入口８ａおよび導出口８ｂにつなげた塩化ビニルチューブのそれぞれの他方端は生理食塩液が貯留されたプラスチック製の貯留容器１０に接続し、貯留容器１０中の生理食塩液が中空糸膜モジュールＡと貯留容器１０との間を、チューブを介して循環できるように回路１６を形成した。
導出口８ｂ側の塩化ビニルチューブにはポンプ１１ａおよび内圧圧力計１４ａを設置し、生理食塩液が後述の実施例に記載した流速で流れるように設定した。
中空糸膜モジュールＡの濾液排出口４にはチューブおよび二方活栓１２を取り付け、チューブの端を廃液容器１３と接続し、さらに前記チューブにはポンプ１１ｂを設置して、濾液が後述の実施例に記載した流速で排出されるように設定し、二方活栓１２を閉じた。
また、前記圧力計接続口１５には外圧圧力計１４ｂを取り付けた。
また、貯留容器１０と中空糸膜モジュールＡの導入口８ａとを接続しているチューブに三方活栓１７を取り付け、さらに、この三方活栓１７にチューブを介してプラスチック製の回収容器１８を接続した。【００６１】
次に、ポンプ１１ａを駆動して、導入口８ａから中空糸膜モジュールＡ内に生理食塩液を充填し、このときの外圧圧力計１４ｂと内圧圧力計１４ａの値（ｍｍＨｇ）、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）をそれぞれ記録した。
なお、外圧圧力計１４ｂの値を中空糸膜の「外圧」とし、内圧圧力計１４ａの値を中空糸膜の「内圧」とした。
また、中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている部分の中空糸膜の長さ（ｃｍ）を中空糸膜モジュール両端の樹脂層部間の距離（ｃｍ）で除した値をパーセントで表示することによりプライミング液の充填効率（％）を算出した。【００６２】
続いて、二方活栓１２を開け、生理食塩液が貯留された貯留容器１０を細胞懸濁液が貯留された別の貯留容器１０に無菌的に交換し、ポンプ１１ａの流速について後述の実施例に記載した流速になるよう設定し、通液方向はプライミング液の通液方向と逆方向になるようにした。
すなわち、導出口８ｂより細胞懸濁液を中空糸膜モジュールＡに導入し、前記貯留容器１０との間で細胞懸濁液を循環させながら濾液を濾液排出口４より排出した。
濾液の容量が一定量（７０ｍＬ〜８０ｍＬ）になるまで濃縮した後、二方活栓１２を閉じ、チューブ、中空糸型分離膜５内の細胞濃縮液をポンプ１１ａにより流量７５ｍＬ／分で導入口８ａから押し出して導入口８ａと貯留容器１０との間にある回路１６から分岐した回収容器１８に回収した。【００６３】
細胞懸濁液の通液開始から回収終了までに要した時間をストップウォッチで計測し、処理時間を測定した。最後に回収容器１８中の細胞濃縮液の細胞数を測定し、細胞回収率および生存率比を算出した。以下に実施例を示す。【００６４】
（実施例１）  
側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径４．５ｃｍ、高さ２４ｃｍの円筒型容器１に、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製の中空糸膜〔商品名：ＭＦＣ−Ｋ１、中空糸内径５７０μｍ、孔径０．２μｍ、東洋紡社製〕３００本を充填し、この中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内部に固定した。
このときの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであった。次に、円筒型容器１の両端面に導入口８ａ、導出口８ｂが設けられた頭部（３、９）を取り付け、中空糸膜モジュールＡとした。【００６５】
作製した中空糸膜モジュールＡの濾過面積は０．１８ｍ２、総断面積は前記式２を用いて０．７７ｃｍ２と算出した。プライミング条件は、導出口の流量が２７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。
このとき、内圧値は−８ｍｍＨｇ、外圧値は−１ｍｍＨｇ、圧力差の絶対値は７ｍｍＨｇであった。【００６６】
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうちプライミング終了時に中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の垂直方向の長さは２１ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率（モジュール両端の樹脂層部７間の距離に対する中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さの割合）は、９１％と算出された。【００６７】
濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６２秒、細胞回収率は８６％、生存率比は９７％であった。【００６８】
（実施例２）
実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２３０ｍＬ／分（線速度３００ｃｍ／分）とした。
このとき、内圧値は−３２ｍｍＨｇ、外圧値は−１５ｍｍＨｇ、圧力差は１７ｍｍＨｇであった。
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１７ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、７４％と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６４秒、細胞回収率は８５％、生存率比は９６％であった。【００６９】
（実施例３）
実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が３２２ｍＬ／分（線速度４２０ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−３４ｍｍＨｇ、外圧値は−１２ｍｍＨｇ、圧力差は２２ｍｍＨｇであった。
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１０ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、４４％と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６５秒、細胞回収率は７３％、生存率比は９７％であった。【００７０】
（実施例４）
実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が３４４ｍＬ／分（線速度４５０ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−３６ｍｍＨｇ、外圧値は−７ｍｍＨｇ、圧力差は２９ｍｍＨｇであった。
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは４ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、１７％と算出された。
濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。その結果、処理時間は３６３秒、細胞回収率は７０％、生存率比は９５％であった。【００７１】
（実施例５）
実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いて、実施例１と同じ条件でプライミングを実施した。
濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が６００ｍＬ／分（線速度７８４ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は２４２２ｍＬ／ｍ２／分とした。
その結果、処理時間は２９７秒、細胞回収率は７６％、生存率比は９８％であった。【００７２】
（実施例６）
混合セルロースエステル（ＭＥ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６−Ｍ２０Ｕ−０６−Ｎ、中空糸内径６００μｍ、孔径０．２μｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３３５ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の両端を樹脂層部７で固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。
このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７７ｃｍ２と算出した。
プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−５５ｍｍＨｇ、外圧値は−４６ｍｍＨｇ、圧力差は９ｍｍＨｇであった。また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の垂直方向の長さは６２ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、９５％と算出された。【００７３】
（実施例７）    
混合セルロースエステル（ＭＥ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６−Ｍ１０Ｕ−０６−Ｎ、中空糸内径６００μｍ、孔径０．１μｍ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３３５ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内部に固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。
このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７７ｃｍ２と算出した。
プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.７ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−６６ｍｍＨｇ、外圧値は−４６ｍｍＨｇ、圧力差は２０ｍｍＨｇであった。また、中空糸膜モジュール両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは４６ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、７１％と算出された。【００７４】
（比較例１）
実施例１と同様の中空糸膜モジュールＡを用いた。プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が４５９ｍＬ／分（線速度６００ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−５８ｍｍＨｇ、外圧値は−２８ｍｍＨｇ、圧力差は３０ｍｍＨｇであった。
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は２３ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは１ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、４％と算出された。濃縮条件は、プライミング液導出口８ｂ付近の流量が４５０ｍＬ／分（線速度５８８ｃｍ／分）、濾液排出口４より排出される濾過速度は１８２３ｍＬ／ｍ２／分とした。
その結果、処理時間は３６４秒、細胞回収率は６５％、生存率比は９５％であった。【００７５】
（比較例２）    
ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）製の中空糸膜〔商品名：Ｄ０６−Ｅ５００−０５−Ｎ、中空糸内径５００μｍ、分画５００ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製〕が、側面端部に濾液排出口４および圧力計接続口１５を備えた直径６．９８ｍｍ、高さ６８ｃｍの円筒型容器１に濾過面積が３７０ｃｍ２になるよう充填され、中空糸膜の束５の両端を樹脂層部７で容器１内に固定された中空糸膜モジュールＡを使用した。このときの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであった。これらの値を前記式３に代入することにより、中空糸膜の総断面積を０．０７１ｃｍ２と算出した。
プライミング条件は、導出口８ｂ付近の流量が２.１ｍＬ／分（線速度３５ｃｍ／分）とした。このとき、内圧値は−５５ｍｍＨｇ、外圧値は８９ｍｍＨｇ、圧力差は１４４ｍｍＨｇであった。
また、中空糸膜モジュールＡの両端の樹脂層部７間の距離は６５ｃｍであり、そのうち中空糸膜の外側がプライミング液に浸っている中空糸膜の長さは０ｃｍであった。
従って、プライミング液の充填効率は、０％と算出された。【００７６】
実施例１〜５および比較例１、２の中空糸膜モジュールの条件、プライミング条件、濃縮条件および性能を表１に示す。なお、実施例６、７および比較例２ではプライミングのみを行い、細胞濃縮は行わなかった。【００７７】
【表１】
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【００７８】
表１に示す結果から、実施例１〜５では、プライミング液を中空糸膜モジュールに線速度３５ｃｍ／分以上４５０ｃｍ／分以下で、中空糸膜モジュールの容積に対して１５％以上充填するプライミング方法とすることにより、比較例１に比べて有意に高い細胞回収率および生存率比で細胞濃縮液を製造できることは明らかである。また、実施例１〜５のように、プライミング時の線速度を濃縮時の線速度よりも低く調整することで、中空糸膜の内側と外側の両方にプライミング液を簡便に充填でき、続く細胞懸濁液処理工程において有効濾過面積が大きくなり、細胞の回収率や濾過速度を向上させることができる。さらに、実施例１〜５では閉鎖環境を維持したまま細胞処理を完遂できるため、得られた細胞は治療用途として提供することができる。【００７９】
また、表１に示す実施例３と実施例５との結果から、プライミング時の線速を下げ、細胞処理時の有効濾過面積を大きくすることにより、細胞回収率の低下を引き起こすことなく濾過速度を向上させることができ、これにより細胞懸濁液の処理時間の短縮が期待される。【００８０】
表１に示す実施例１および実施例６は、中空糸膜の材料としてポリスルホン系、およびセルロース系の高分子材料がより好ましく用いられることを示している。また、実施例１と実施例７と比較例２との結果から、プライミングを行う場合、中空糸膜の壁に設ける孔径は０．１μｍ以上が好ましいことを示している。
【符号の説明】
【００８１】
Ａ、Ｂ.中空糸膜モジュール
１．容器
２．胴部
３．頭部
４、４’．濾液排出口
５．中空糸膜の束
６．開口端
７．樹脂層部
８ａ．導入口
８ｂ．導出口
９．頭部
１０．貯留容器
１１ａ、１１ａ’．ポンプ
１１ｂ．ポンプ
１２．二方活栓
１３．廃液容器
１４ａ、１４ａ’．内圧圧力計
１４ｂ．外圧圧力計
１５．圧力計接続口
１６．回路
１７．三方活栓
１８．回収容器
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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