(57)【要約】  エタノールを製造するための方法であって、リグノセルロース系バイオマスを含む培地において、酵素を表層提示するように形質転換された酵母を培養して、エタノールを生産する工程を含み、該酵素が、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素である、方法を開示する。本発明によれば、より少ない初期菌体濃度および酵素添加量にて、リグノセルロース系バイオマスから高いエタノール収率を得られるような、エタノールの製造方法を提供され得る。
2015033948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールを製造するための方法であって、
リグノセルロース系バイオマス粒子を含む培地において、酵素を表層提示するように形質転換された酵母を培養し、エタノールを生産する工程を含み、
該酵素が、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素である、方法。
【請求項２】
前記リグノセルロース系バイオマス粒子が２μｍ〜６００μｍの平均粒子径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リグノセルロース系バイオマスが、澱粉をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、スオレニン、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記形質転換酵母が、前記酵素を、該酵素の基質結合部位が細胞に対して外側に配向されるように表層提示されている、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換酵母がキシロース代謝能力を有する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
リグノセルロース系バイオマスを微粉砕処理する工程をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
リグノセルロース系バイオマスを水熱処理する工程をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造方法に関する。より詳細には、微粉砕化したリグノセルロース系バイオマスから酵母による発酵にてエタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食料と競合しないリグノセルロース系バイオマスを原料としたエタノール製造技術開発が盛んに行われている。リグノセルロース系バイオマスは、酵母による発酵のために、通常、糖化酵素（例えばセルラーゼ）での処理により分解され得る。【０００３】
リグノセルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを主要な構成成分とする。さらに、バイオマス中のセルロースは、強固な結晶構造を有する。リグノセルロース系バイオマスを酵素分解するためには、バイオマスに対して酵素が接触および反応し易い状態とするための前処理が不可欠である。【０００４】
リグノセルロース系バイオマスの前処理については、様々な原理を利用した方法が提案され、概ね、物理的処理、化学的処理、および生物的処理に大別される。【０００５】
物理的処理の一例として、微粉砕処理が挙げられる。微粉砕処理は、リグノセルロース系バイオマスをミル等で微粉砕する方法である。微粉砕処理により酵素分解性（糖化性）が向上する理由として、バイオマスの粒径の減少による酵素との接触面積の増加、セルロースの結晶化度および重合度の低下、セルロース分子のミクロフィブリル単位での分離などが挙げられている（非特許文献１）。【０００６】
なかでも、粉砕などの機械的エネルギーを利用して化学反応（結合切断・形成）を起こす方法は、メカノケミカル処理とよばれている。高衝撃かつ省エネルギー化を目的とした粉砕機として、リング型粉砕媒体転動方式を採用したタンデムリングミルが開発されている（非特許文献２）。ボールミルで予備粉砕した後、篩で２００μｍ以下の粒径に分級した杉材をこの装置に供した場合、杉材の平均粒径は、１０〜２０分で約２０μｍに達し、その後６０分まで粉砕を続けることで糖化率が最大値となり得る。このような装置で得られたスギ微粉砕処理物を市販のセルラーゼ製剤によって糖化し、酵母発酵によりエタノールを生産させた例が報告されている（非特許文献３）。【０００７】
一方、リグノセルロースの糖化に関与する様々な酵素を微生物の細胞表層に発現する技術の応用によって、比較的低い酵素添加量においてもリグノセルロース系バイオマスから高いエタノール収率を得られることが示されている。非特許文献４では、エタノール生産において、水熱処理を施した稲わらを原料とし、細胞表層にエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼの３種を発現する組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が、市販のセルラーゼ製剤のみでは分解できないセルロース部位を分解することで、野生酵母と比べて高いエタノール収率を示す点が報告されている。【０００８】
しかしながら、リグノセルロース系バイオマスを原料としてエタノールを製造するためには、酵素による糖化効率を維持または向上させつつ、糖化に要する酵素自体の使用量を低減させることが大きな課題である。微粉砕化したリグノセルロース系バイオマスを用いても使用酵素量が少ない場合には、糖化および発酵収率が著しく減少し得、そして発酵後のスラリー液から酵素を回収する工程も煩雑となり得る。【０００９】
また、エタノール収率を増加させるために、多種類の酵素を高発現させて細胞表層のセルラーゼ活性を高める必要があった。さらに、酵母の細胞表層のセルラーゼ活性がエタノール収率の向上へ有意に作用するために、非常に高い初期菌体濃度が必要であった。このような高い菌体濃度は、エタノール製造コストの増加につながる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】バイオマス分解酵素研究の最前線−セルラーゼ・ヘミセルラーゼを中心として−，第２４章  機械的前処理バイオマスの酵素分解，シーエムシー出版、第１版、２０１３年
【非特許文献２】平成１９年度資源・素材学会春季大会（東京）予稿集，伊藤新ら，バイオエタノール製造用機械的粉砕技術の研究（ＩＩ）（歯車型粉砕媒体利用振動ミル大容量化試験）
【非特許文献３】化学工学会第７７年会，遠田幸生ら，高衝撃粉砕バイオマスの同時糖化発酵特性
【非特許文献４】Y. Matanoら、Bioresource Technology、2012年、第108巻、p.128-133
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は、より少ない初期菌体濃度および酵素添加量にて、リグノセルロース系バイオマスから高いエタノール収率を得られるような、エタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、エタノールを製造するための方法を提供し、この方法は、
リグノセルロース系バイオマス粒子を含む培地において、酵素を表層提示するように形質転換された酵母を培養し、エタノールを生産する工程を含み、
上記酵素は、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素である。【００１３】
１つの実施形態では、上記リグノセルロース系バイオマス粒子は２μｍ〜６００μｍの平均粒子径を有する。【００１４】
１つの実施形態では、上記リグノセルロース系バイオマスは、澱粉をさらに含有する。【００１５】
１つの実施形態では、上記リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、スオレニン、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である。【００１６】
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、上記酵素を、該酵素の基質結合部位が細胞に対して外側に配向されるように表層提示されている。【００１７】
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、キシロース代謝能力を有する。【００１８】
１つの実施形態では、上記方法は、リグノセルロース系バイオマスを微粉砕処理する工程をさらに含む。【００１９】
１つの実施形態では、上記方法は、リグノセルロース系バイオマスを水熱処理する工程をさらに含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、実用的な条件下にて、リグノセルロース系バイオマスから効率的にエタノールを生産することができる方法が提供される。本発明の方法によれば、例えば、初期の酵母菌体濃度を低く設定でき、そしてセルラーゼ添加量を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】稲わらの水熱処理物（ａ）および微粉砕処理物（ｂ）について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１の遺伝子組換え酵母をそれぞれ用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図２】稲わら微粉砕処理物の発酵基質について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株およびＴＪ１４株）および調製例２〜４に示す遺伝子組換え酵母をそれぞれ用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）ネピアグラス、（ｂ）ゴルフ場芝草、（ｃ）ファルカタ材、（ｄおよびｅ）杉材の微粉砕処理物をそれぞれ発酵基質とし、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）稲わらおよび（ｂ）バガスのそれぞれについて水熱処理および微粉砕処理して得られた発酵基質について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図５】バガスの水熱処理および微粉砕処理物について調製例５および６に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図６】１ｍｍに裁断した杉材を粉砕機（ナノメック・リアクター）によって、（ａ）３０分間、（ｂ）４５分間、および（ｃ）６０分間処理した場合の粒度分布を示す。
【図７】粉砕処理時間３０分間、４５分間および６０分間により得られた発酵基質について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図８】粉砕処理時間３０分間、４５分間および６０分間により得られた発酵基質について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図９】バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例７および８に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図１０】バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例９および１０に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図１１】バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例１１に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図１２】籾殻微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）、調製例４、８および１０に示す各遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【図１３】タピオカ澱粉粕微粉砕処理物について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）、調製例１２に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（リグノセルロース系バイオマス）
バイオマスとは、生物資源に由来する糖質材料をいう。例えば、トウモロコシなどから得られるデンプン、サトウキビなどから得られる糖蜜（廃糖蜜）が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスとは、いわゆるリグノセルロース（主にセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの３種類の成分からなる）を含むバイオマスをいう。ここで、セルロースは、β−１，４−グルコシド結合によりグルコピラノース（グルコース）が連なった繊維状高分子であり、加水分解されて得られるグルコースが酵母などの発酵基質として利用される。植物種（特に、木材であるかまたは草本性であるか）、植物の部分（器官、組織）、生育程度などに依存してそれらのセルロース、ヘミセルロースおよびリグニン成分の含有量は変動し得るが、酵素分解によりグルコースを生じ得る限り、いずれの種でも植物の部分や生育の程度に関わらず用いられ得る。
【００２３】
リグノセルロース系バイオマスとしては、コメ、ムギ、トウモロコシ、サトウキビ、木材（例えば、杉材、ファルカタ材、ヒノキ材、ブナ材、ユーカリ材など）、竹、ネピアグラスなどの生物材料の処理に際して生じる廃棄物などが挙げられる。例えば、稲わら、バガス（サトウキビ搾汁後の残渣）、間伐材、廃材、廃草（例えば、ゴルフ場にて廃棄され得る芝草）などが挙げられる。本発明は、リグニンを含むリグノセルロース系バイオマスを原料として用いた場合でも、好適に用いられ得る。本発明において用いることができるリグノセルロース系バイオマスは、このように食糧と競合しない材料であり得る。
【００２４】
リグノセルロース系バイオマスは、上記リグノセルロースに加えて、澱粉をさらに含有するものであってもよい。このようなバイオマスとして、澱粉とリグノセルロース成分の比率はその種類によって異なり得るが、例えば、稲わら、籾殻、コーンファイバー（とうもろこし外皮の繊維）、コーンストーバー（とうもろこし茎葉）、タピオカ澱粉粕（キャッサバ根茎から澱粉を生産する過程で生じる澱粉粕）などが挙げられる。澱粉を含有するリグノセルロース系バイオマスでは、前処理に熱水または他の溶剤を用いると、処理の間にそれらの液の方に澱粉が流れてしまい、材料の損失につながり得る。一方、微粉砕処理では、このような問題を回避し得、さらに、酵素を表層提示する酵母によって、エタノール生産量を増加させ得る。
【００２５】
（表層提示酵母）
宿主酵母としては、グルコースを基質としてエタノール発酵し得る限り、特に限定されない。サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがさらに好ましい。サッカロマイセス・セレビシエの菌株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手可能）、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2010年、第88巻、p.87-94）、およびサッカロマイセス・セレビシエＫＦ−７株（Tingら、Process Biochem.、2006年、第41巻、p.909-914）が挙げられる。
【００２６】
表層提示させる酵素としては、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素が用いられ得る。このような酵素の例としては、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、スオレニン、ラッカーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびプルラナーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である。複数種の酵素を用いる場合、組み合わせる酵素の種類は問わない。酵素遺伝子の組込みコピー数も特に限定されない。
【００２７】
エンドグルカナーゼ（エンドβ１，４−グルカナーゼ）は、狭義にて「セルラーゼ」とも称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして好ましくは１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの低結晶化度または非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。エンドグルカナーゼには複数種あり、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧＩおよびＥＧＩＩ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解するが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの低結晶化度または非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する酵素の一つの例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅い。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）およびセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）と称される。セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨＩＩ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨＩ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の一つの例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。β−グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
フェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸とグリセロールとの間でエステル化反応を生じさせる酵素をいう。フェルラ酸エステラーゼは、リグノセルロース系バイオマス中のリグニンと多糖を繋ぐフェルラ酸を加水分解する作用を示す。この作用によりリグノセルロース系バイオマスの構造が緩む（すなわち、リグノセルロース系バイオマスの構造の一部を分解する）ことにより、セルロース加水分解酵素製剤による糖化を促進することができる。フェルラ酸エステラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）（例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））、およびペニシリニウム属（Penicillium）（例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum））、およびタラモマイセス属（Talaromyces）（例えば、タラモマイセス・フニクロサス（Talaromyces funiculosus））に由来するフェルラ酸エステラーゼが挙げられる。フェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子として、例えば、タラモマイセス・フニクロサス由来遺伝子（ＦａｅＡ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＪ３１２２９６）、アスペルギルス・オリゼ由来遺伝子（ＦａｅＡ：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＯ０９０００１０００２０７）が挙げられる。
【００３１】
澱粉の加水分解のために、酵母は、澱粉加水分解酵素（例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼなど）を発現するものであってもよい。発現様式は、表層提示であってもよく、または分泌であってもよい。発現される酵素は、酵母において、加水分解様式の異なる酵素を組み合わせてもよい。好ましくは、酵母において、少なくとも１つの澱粉加水分解酵素が表層提示される。本発明において用いられる表層提示酵母は、１つの実施形態では、α−アミラーゼを分泌し、かつグルコアミラーゼを表層提示する酵母である。
【００３２】
グルコアミラーゼは、正式名称がグルカン１，４−α−グルコシダーゼといい、１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、エキソ１，４−α−グルコシダーゼ、γ−アミラーゼ、リソソーマルα−グルコシダーゼあるいはアミログルコシダーゼを別名とする。糖鎖の非還元末端のα−１，４−結合をエキソ型に加水分解してブドウ糖１分子を産生する。α−１，６−結合も切断するものも知られている。グルコアミラーゼは、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ０００４９．１）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
α−アミラーゼは、別名を１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、グリコゲナーゼといい、デンプンやグリコーゲンのα−１，４−結合を不規則に切断し、多糖ないしマルトース、オリゴ糖を生み出す酵素である。動物、植物、微生物に広く分布する普遍的な酵素である。α−アミラーゼとしては、例えば、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）由来α−アミラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ０００８２９．１）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
このように、本発明の方法に用いる表層提示酵母は、表層提示以外の様式にて発現されるさらなる遺伝子組換えがなされたものであってもよい。
【００３５】
本発明の方法に用いる表層提示酵母は、キシロース代謝能力を有する酵母であってもよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエを宿主として用いる場合、この酵母は、通常は六炭糖のグルコースを資化可能であるが、五炭糖のキシロースは資化することができない。選抜スクリーニング、変異誘発、遺伝子組換えなどによって、キシロースを資化できるように改変されたサッカロマイセス・セレビシエが用いられ得る。サッカロマイセス・セレビシエは、キシロース資化性遺伝子を有するように形質転換され得る。キシロース資化性遺伝子としては、キシロース代謝系酵素の遺伝子、例えば、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子（例えば、ピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５またはＡ１６１６４）、およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（例えば、ピチア・スチピチス由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２またはＡ１６１６６）、およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来：ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８）が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエは、これらの３つの遺伝子を発現するように遺伝子組換えされ得る。
【００３６】
上記酵素をコードする遺伝子は、例えば、それらの由来生物から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、その構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。
【００３７】
本発明において、酵素を酵母の細胞表層に提示させる方法は、当業者に公知のものが採用され得、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー（特開平１１−２９００７８号公報）、または糖鎖結合ドメイン（国際公開第０２／０８５９３５号）を利用することができる。これらの方法に用いられる細胞表層局在タンパク質としては、例えば、α−またはａ−アグルチニン（酵母の凝集性タンパク質）、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１）、およびアルカリホスファターゼが挙げられる。酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）由来ＴＩＲ１（低温ショックや嫌気状態で誘導される細胞壁マンノプロテイン。Kitagakiら、Eur. J. Biochem.、1997年、249(1)巻、p.343-349）もまた用いられ得る。
【００３８】
ＧＰＩアンカーを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡからなる組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたグルコアミラーゼはＧＰＩアンカー付着認識シグナルを介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合し得る。ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列としては、例えば、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から数えて３２０アミノ酸の配列中に存在するＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が利用され得る。
【００３９】
糖鎖結合ドメインを用いて酵素を細胞表層に提示する方法としては、例えば、酵素を細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）のＮ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側との両方に結合させた融合タンパク質を発現するように調製した組換えＤＮＡを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌された酵素は糖鎖結合ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって、細胞表層に留まり得る。凝集機能ドメインとしては、例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位が挙げられ、代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。
【００４０】
酵母由来ＴＩＲ１を用いる場合、ＴＩＲ１のＣ末端に目的の酵素のＮ末端を結合させた融合タンパク質を発現するように組換えＤＮＡを調製することができる。
【００４１】
組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、特に限定されず、酵素の分泌シグナルであってもよいし、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列であってもよいし、酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列であってもよい。酵素活性に影響を及ぼさなければ、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残っていてもよい。
【００４２】
好ましくは、酵母における酵素の表層提示は、酵素の基質結合部位が細胞に対して外側に配向される。外側への配向は、基質結合部位の位置（例えば、酵素タンパク質のＮ末端側に位置するか、またはＣ末端側に位置するか）に依存して、上述したような表層提示技術を選択し得る。Ｎ末端側に基質結合部位を有する酵素の表層提示は、例えば、該酵素のＣ末端をα−アグルチニンに基づくアンカータンパク質のＮ末端に結合した融合タンパク質を発現するように調製した組換えＤＮＡを用い得る。Ｃ末端側に基質結合部位を有する酵素の表層提示は、例えば、該酵素のＮ末端を酵母由来ＴＩＲ１に基づくアンカータンパク質のＣ末端に結合した融合タンパク質を発現するように調製した組換えＤＮＡを用い得る。
【００４３】
酵素を酵母から分泌させる場合は、例えば、上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡの下流に、目的の酵素をコードする遺伝子を結合させた組換えＤＮＡを酵母に導入することによって行われ得る。酵素を酵母の細胞内発現させる場合は、例えば、分泌シグナル配列との結合や表層提示技術を行うことなく、組換えＤＮＡを調製し、酵母に導入することによって行われ得る。
【００４４】
上記組換えＤＮＡの合成および結合は、例えば、当業者が通常用いる方法により行うことができる。ＤＮＡの結合には、必要に応じて、適宜リンカーを用い得る。
【００４５】
上記組換えＤＮＡは、発現ベクターに組み込まれてもよい。このような発現ベクターは、例えば、プラスミドの形態である。例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有するプラスミドが好適に用いられる。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、および栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に限定されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、およびオロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に限定されない。酵母用の複製遺伝子は必要に応じて選択され得る。
【００４６】
発現ベクターは、目的の酵素をコードする遺伝子を酵母で発現させるために適切なプロモーターおよびターミネーターを有することが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターが挙げられるが、特に限定されない。これらのプロモーターとターミネーターとの間に目的の酵素をコードする遺伝子が挿入される。
【００４７】
酵母に組換えＤＮＡを導入する方法は特に限定されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、およびプロトプラスト法が挙げられる。導入された組換えＤＮＡは、例えば、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
【００４８】
組換えＤＮＡが導入された酵母は、選択マーカーで選択され、発現された酵素の活性を測定することにより選択される。目的の酵素が細胞表層に提示されていることは、例えば、当該酵素に対する抗体を用いて確認することができる。
【００４９】
（エタノールの製造）
本明細書中では、発酵基質を含む培地において酵母を培養し、エタノールを生産する工程を、便宜上、「発酵工程」ともいう。本明細書中における用語「発酵基質」とは、発酵工程の基質をいう。
【００５０】
発酵基質として、リグノセルロース系バイオマス粒子が用いられる。リグノセルロース系バイオマス粒子の平均粒子径は、例えば、２〜６００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍであり、より好ましくは２０〜１００μｍである。さらに、リグノセルロース系バイオマス粒子は、上記平均粒子径に加えて、粒度分布の半値幅（ｄ５０）が好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは、２０μｍ以上１００μｍ以下となるように整粒されたものであることが好ましい。また、リグノセルロース系バイオマス粒子の平均粒子径は、その全ての粒子の５０％が２００μｍ以下でありかつ９０％が６００μｍ以下であり、好ましくは、その全ての粒子の５０％が１００μｍ以下でありかつ９０％が２００μｍ以下であり、より好ましくは、その全ての粒子の５０％が５０μｍ以下でありかつ９０％が１００μｍ以下である。整粒のための方法および手段は特に限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００５１】
リグノセルロース系バイオマス粒子は、例えば、リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理によって調製され得る。
【００５２】
「微粉砕処理」は、リグノセルロース系バイオマスをミル等で微粉砕する方法である。微粉砕処理を行うための粉砕機には多くの種類がある。例えば、ボールミルがよく用いられている。これは容器内にボールを入れて振動や回転により試料を粉砕する装置であり、通常、容器は密閉できる構造となり、乾式条件の他にもガス雰囲気下や湿式条件での処理も可能である。ボールミル粉砕はバッチ処理となるが、連続粉砕が可能な装置としてカッターミル、ハンマーミル、ロールミル、ディスクミルなど粉砕機構の異なる装置も存在する。これら粉砕機に投入する試料には最適な大きさがあるため、試料の形状や大きさに応じて複数の装置で段階的に微細化する方法が効果的である。
【００５３】
例えば、高衝撃かつ省エネルギー化を目的とした粉砕機として、リング型粉砕媒体転動方式を採用したタンデムリングミルが開発されている（非特許文献２）。この装置では、粉砕媒体であるリングが容器内壁に沿って転動することで、遠心力を作用させて材料の微粉砕を行う。例えば、リグノセルロース系バイオマスとして木材（例えば杉材）を用いる場合の微粉砕処理に、好適に用いることができる。
【００５４】
その他の粉砕機としては、ナノメック・リアクター（Simoloyer（登録商標）、Zoz GmbH製、株式会社テクノ・アイより入手可能：ボールをミリング媒体としてローターの高速回転による激しい衝突でバイオマスを粉砕するエネルギーを与える）、ワンダーブレンダー（大阪ケミカル株式会社製）もまた挙げられる。
【００５５】
リグノセルロース系バイオマス粒子は、リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理の前または後に、必要に応じて水熱処理を施してもよい。
【００５６】
「水熱処理」としては、必要に応じて加圧下にて高温の水で処理（例えば、接触、浸漬、蒸煮）することをいう。例えば、リグノセルロース系バイオマスを、必要に応じて裁断または粉砕し、例えば、約２０重量％（乾燥重）の含量となるように水と混合し、この混合物を熱処理する。熱処理は、１２０℃〜３００℃、好ましくは１５０℃〜２８０℃、より好ましくは１８０℃〜２５０℃にて、１５秒間〜１時間行われる。処理温度および時間は用いるバイオマスによって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、熱処理中に加圧してもよい。加圧については、上記範囲内の温度が達成され得る程度の圧力を、装置により自動または手動で設定し得る。
【００５７】
水熱処理の終了後に生じた産物は、適宜冷却および乾燥を施し得る。乾燥方法には特に限定はない。例えば、凍結乾燥、低温乾燥、常温乾燥、高温乾燥などが挙げられ、通風下または減圧下のいずれでもよい。
【００５８】
発酵工程は、発酵基質を含む培地で酵母を培養（好ましくは液体培養）することで行われ得る。発酵工程は、エタノール発酵を行う通常の条件下で行われ得る。
【００５９】
発酵培地には、酵母の生育に必要または望ましい成分がさらに含められ得る。発酵工程の反応時の温度は、用いる酵母に依存し得るが、例えば３０℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃であり得る。発酵ｐＨは、例えば４〜８、好ましくは５〜７である。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、１ppm以下、より好ましくは約０．３ppm以下、よりさらに好ましくは０．１ppm以下であり得る）。
【００６０】
発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分（フェドバッチ）工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。
【００６１】
酵母の投入量（発酵開始時の酵母の菌体濃度）、発酵基質の初期仕込み量および必要に応じて追加の仕込み量および時期、ならびに発酵時間は、基質の種類および状態、発酵培養の容量、発酵エタノールの目的生産量などの要件に依存して適宜決定され得る。発酵開始時の酵母の菌体濃度は、例えば、２ｇ〜２０ｇ湿重量／Ｌ（１×１０７個／ｍＬ〜１×１０８個／ｍＬ）、好ましくは、４ｇ〜１０ｇ湿重量／Ｌ（２×１０７個／ｍＬ〜０．５×１０８個／ｍＬ）である。初期仕込み量は、発酵液（発酵に用いる培地および菌体の合計）に対し例えば、５（w/v）％〜５０（w/v）％、好ましくは１０（w/v）％〜２５（w/v）％である。発酵基質の追加の投入量および時期は、発酵の進行による発酵培地の粘度、エタノール生産量または炭酸ガス発生量などをモニタリングしながら決定してもよい。
【００６２】
本発明のエタノールの製造方法では、セルロースまたは澱粉を加水分解する酵素（例えば、セルラーゼ酵素または澱粉分解酵素、およびその両方）を補助的に用い得る。「セルラーゼ酵素」または「澱粉分解酵素」とは、酵素として単離された任意の形態を含む。例えば、「セルラーゼ酵素」としては、上で説明したようなセルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ）を生産する微生物から単離精製された酵素、およびセルラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。「澱粉分解酵素」としては、上で説明したような澱粉分解酵素（例えば、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナーゼなど）を生産する微生物から単離精製された酵素、および酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。市販の酵素も使用可能である。市販のセルラーゼ酵素としては、例えば、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、アクセルレース（ジェネンコア社製）、メイセラーゼ（Meiji Seikaファルマ社製）が挙げられる。市販の酵素も使用可能である。市販のアミラーゼ酵素としては、例えば、Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、アクセルレース（ジェネンコア社製）、メイセラーゼ（Meiji Seikaファルマ社製）が挙げられる。市販の澱粉分解酵素としては、ネオスピターゼ（液化型α−アミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社製））、グルコチーム（グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社製））、プロモザイム（プルラナーゼ（ノボザイムズ社製）などが挙げられる。例えば、発酵工程前に、発酵基質をセルラーゼ酵素（または必要に応じて澱粉分解酵素あるいはその両方）と適当な条件下にて予めインキュベートしておいてもよい。セルラーゼ酵素の添加量は、例えば、発酵基質重量に対して１〜２０重量％、好ましくは３〜１０重量％であり得る。澱粉分解酵素の添加量は、例えば、発酵基質重量に対して０．０１〜２重量％、好ましくは０．１〜１重量％であり得る。
【００６３】
発酵の進行とともにエタノールの発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
【００６４】
発酵基質と反応させる酵母および必要に応じてセルラーゼ酵素は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
【００６５】
固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられる。固定方法としては、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
【００６６】
担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、５０〜１０００μｍが好ましい。
【００６７】
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは柱状（例えば、立方体状）が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が２〜５０ｍｍ、柱状の場合、２〜５０ｍｍ角が好ましい。
【００６８】
発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７０】
以下に示す実施例で行った各手順について参考例に示す。参考例１〜３、６および７は、リグノセルロース系バイオマスの微粉砕による前処理の手順を示す。参考例４は、稲わらおよびバガスについて行った水熱処理の手順を示す。参考例５は、糖化および発酵の手順を示す。【００７１】
発酵には、酵母サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手）およびＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol., ２０１０年、第８８巻、ｐ．８７−９４）、ならびに調製例１〜１２に示す遺伝子組換え酵母を用いた。【００７２】
なお、本実施例に示す全てのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いて実施した。本実施例に示す全ての酵母の形質転換は、酢酸リチウム法によって実施した。本実施例に示す試薬について、特に記載がなければ、当業者が通常用いる試薬を用いた。【００７３】
（参考例１：リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理１）
１ｍｍに裁断したリグノセルロース系バイオマスを、Φ２５２穴付歯車型粉砕媒体転動方式ミル（非特許文献２）を用いて、粉砕容器径：Φ２８４；振動数１６００ｃｐｍ；振幅：７ｍｍ；および粉砕量：８００ｇにて１００分間粉砕処理した。【００７４】
（参考例２：リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理２）
以下の参考例４に記載のように水熱処理したリグノセルロース系バイオマスを、ワンダーブレンダー（型式：ＷＢ−１、大阪ケミカル株式会社製）を用いて、１分間粉砕処理した。【００７５】
（参考例３：リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理３）
１ｍｍに裁断した杉材を、ナノメック・リアクター（型式：ＣＭ０１、Simoloyer（登録商標）、Zoz GmbH製、株式会社テクノ・アイより入手）を用いて、３０分間、４５分間および６０分間のいずれかにて微粉砕処理した。【００７６】
（参考例４：リグノセルロース系バイオマスの水熱処理）
リグノセルロース系バイオマスを約２０（w/v）％（乾燥重）の含量となるように水と混合し、これを水熱処理装置（三菱重工業株式会社製）に入れ、約１８０℃および約３ＭＰａにて５分間〜２０分間処理した。次いで、固形分を分離し、分離した固形分を発酵基質として用いた。【００７７】
（参考例５：糖化および発酵）
前処理されたリグノセルロース系バイオマス（原料濃度１０％の場合は乾燥重量で５ｇ、２０％の場合は乾燥重量で１０ｇ、３０％の場合は乾燥重量で１５ｇ）を固形分として含む酵素処理液約４８ｍＬ（セルラーゼ製剤Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）をバイオマス乾燥重量に対して５〜１０重量％、ｐＨ６の１Ｍクエン酸バッファー２．５ｍＬ、１０×ＹＰ（酵母エキス１００ｇ／Ｌ，ポリペプトン２００ｇ／Ｌ））を調製した。【００７８】
この酵素処理液を５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて、５０℃にて３５ｒｐｍの回転速度でインキュベートした。【００７９】
酵母について、５ｍＬのＹＰＤ液体培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ，ポリペプトン２０ｇ／Ｌ，グルコース２０ｇ／Ｌ）を含む試験管で種培養を一晩行い、次いで培養液を５００ｍＬのＹＰＤ液体培地を含むフラスコに移し、本培養を２日間行った。この培養液を遠心分離し（３０００ｒｐｍ，４℃，１０分間）、酵母菌体を滅菌蒸留水により２度洗浄後、１００ｇ−湿重量／Ｌの菌体濃度になるように滅菌蒸留水に懸濁した。【００８０】
酵素処理開始から２時間経過後、酵素処理液４８ｍＬを８０ｍＬ容量のねじ口瓶（デュラン社製）に移した。さらに、酵母懸濁液２ｍＬを添加して、菌体濃度を２０ｇ−湿重量／Ｌとした。酵母添加後、３５℃にて発酵を開始した。【００８１】
発酵液（酵母懸濁液が添加された酵素処理液）中に生産されたエタノール濃度を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステム；株式会社日立ハイテクフィールディング、ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ）により経時的に定量した。ＨＰＬＣの分離用カラムにはＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ（信和化工株式会社製，３００ｍｍ（Ｌ）×８ｍｍ（ＩＤ））を用い、移動相には超純水（日本ミリポア株式会社製Ｍｉｌｌｉ−Ｑによる精製水）を用い、そして検出器には屈折率検出器を用いた。ＨＰＬＣの条件は、送液量０．９ｍＬ／分およびカラム温度５０℃とした。【００８２】
（調製例１：セルラーゼ表層提示酵母の調製：ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）を２コピー、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩまたはＣＢＨ２）を１コピーおよびβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を１コピー導入）
まず第１工程として、プラスミドｐＧＫ４０６ＥＧ（国際公開第２０１０／０３２７６２号）をＳｔｕＩで切断して直線状にし、ＮＢＲＣ１４４０／ＵＨＷＬ（国際公開第２０１０／０３２７６２号）に導入してウラシル要求性を持たない株を選択した。【００８３】
次に第２工程として、プラスミドｐＧＫ４０３ＥＧ（国際公開第２０１０／０３２７６２号）をＮｄｅＩで切断して直線状にし、第１工程で選択された株に導入してヒスチジン要求性を持たない株を選択した。【００８４】
さらに第３工程として、プラスミドｐＩＬＧＰ３−ＣＢＨ２（国際公開第２０１０／０３２７６２号）をＨｐａＩで切断して直線状にし、第２工程で選択された株に導入してロイシン要求性を持たない株を選択した。【００８５】
最後に第４工程として、プラスミドｐＩＷＢＧＬ（国際公開第２０１０／０３２７６２号）をＢｓｔ１１０７Ｉで切断して直線状にし、第３工程で選択された株に導入してトリプトファン要求性を持たない株を選択し、これを調製例１のセルラーゼ表層提示酵母とした。【００８６】
なお、第１工程で選択された株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＧＫ４０６ ＥＧ］と、第２工程で選択された株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＧＫ４０６ ＥＧ／ｐＧＫ４０３ ＥＧ］と、第３工程で選択された株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＧＫ４０６ ＥＧ／ｐＧＫ４０３ ＥＧ／ｐＩＬＧＰ３−ＣＢＨ２］と、第４工程で選択された株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＧＫ４０６ ＥＧ／ｐＧＫ４０３ ＥＧ／ｐＩＬＧＰ３−ＣＢＨ２／ｐＩＷＢＧＬ］と、それぞれ命名した。【００８７】
（調製例２：エンドグルカナーゼ表層提示酵母の調製：ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）を細胞表層に発現させた酵母）
上記調製例１において、第２工程で得られた酵母（ＮＢＲＣ１４４０／ｐＧＫ４０６ ＥＧ／ｐＧＫ４０３ ＥＧ）を、調製例２のセルラーゼ表層提示酵母とした。【００８８】
（調製例３：β−グルコシダーゼ表層提示酵母の調製：ＮＢＲＣ１４４０株にβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を細胞表層に発現させた酵母）
まず第１工程として、プラスミドｐＩＷＢＧＬをＮｏｔＩで切断して得られたＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、アスペルギルス・アクレアタス由来ＢＧＬ１遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、ｐＲＳ４０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＮｏｔＩサイトに挿入することでプラスミドｐＲＳ４０６−ＢＧＬを構築した。【００８９】
次に第２工程として、ｐＩＢＧ１３（国際公開第２０１０／０３２７６２号）を鋳型にして、プライマーＳＳ−ＸｂａＩ−Ｆｗ（配列番号１）とプライマーＡＧ−ＸｂａＩ−Ｒｖ（配列番号２）を用いてリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、アスペルギルス・アクレアタス由来ＢＧＬ１遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ鎖をｐＩＬＧＰ３（ＷＯ２０１００３２７６２Ａ１）のＸｂａＩサイトに挿入することでプラスミドｐＩＬＧＰ３−ＢＧＬ１３を構築した。【００９０】
さらに第３工程として、プラスミドｐＩＷＢＧＬをＢｓｔ１１０７Ｉで切断して直線状にし、ＮＢＲＣ１４４０／ＵＨＷＬに導入してトリプトファン要求性を持たない株を選択した。【００９１】
さらに第４工程として、前記第１工程で得られたプラスミドｐＲＳ４０６−ＢＧＬをＮｄｅＩで切断して直線状にし、上記第３工程で選択された株に導入してウラシル要求性を持たない株を選択した。【００９２】
さらに第５工程として、第２工程で得られたプラスミドｐＩＬＧＰ３−ＢＧＬ１３をＨｐａＩで切断して直線状にし、前記第４工程で選択された株に導入してロイシン要求性を持たない株を選択し、これを調製例３のβ−グルコシダーゼ表層提示酵母とした。得られた調製例３のβ−グルコシダーゼ表層提示酵母はＮＢＲＣ１４４０のＢＧＬ−３コピー体になっている。【００９３】
なお、第３工程により得られた株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＩＷＢＧＬ］と、第４工程により得られた株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＩＷＢＧＬ／ｐＲＳ４０６−ＢＧＬ］と、第５工程により得られた株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＩＷＢＧＬ／ｐＲＳ４０６−ＢＧＬ／ｐＩＬＧＰ３−ＢＧＬ１３］と、それぞれ命名した。【００９４】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＳＳ−ＸｂａＩ−Ｆｗ：ｇｃｔｃｔａｇａＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣ（配列番号１）
ＡＧ−ＸｂａＩ−Ｒｖ：ｇｃｔｃｔａｇａＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧ（配列番号２）【００９５】
（調製例４：フェルラ酸エステラーゼ表層提示酵母の調製：ＴＪ１４株にフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母）
遺伝子発現に必要なプロモーターとターミネーター、および酵母表層提示に必要なα-アグルチニン遺伝子を含むプラスミドとしてｐＧＫ４０６ＡＧ（特開２０１１−１４２８７９号公報）を用いた。ＦａｅＡをクローニングするために、タラモマイセス・フニクロサス培養菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列を含むプライマーＳａｌＩ−ｓｓＦａｅＡ−Ｆｗ（配列番号３）と、プライマーＳａｌＩ−ＦａｅＡ−Ｒｖ（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。これにより得られた遺伝子断片をＳａｌＩで消化し、ｐＧＫ４０６ＡＧのＳａｌＩサイトに挿入することでプラスミドｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを構築した。【００９６】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＳａｌＩ−ｓｓＦａｅＡ−Ｆｗ：ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＴＡＴＧＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣ（配列番号３）
ＳａｌＩ−ＦａｅＡ−Ｒｖ：ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡＴＣ（配列番号４）【００９７】
酵母に導入するベクターとして、ｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ株式会社製）を用いた。ｐＡＵＲ１０１のＳｐｈＩサイトに上記で構築したｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧのｐＧＫプロモーター、分泌シグナル配列、ＦａｅＡおよびα−アグルチニンのカセットを挿入するために、ｐＧＫ４０６−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを鋳型にしてプライマーｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｆｗ（配列番号５）とプライマーｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｒｖ（配列番号６）とを用いてＰＣＲを行った。この遺伝子断片をＳｐｈＩで切断したｐＡＵＲ１０１にIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入し、ＦａｅＡ酵母表層提示用プラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを構築した。このｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧをＳｔｕＩで切断後、ＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲ酵母形質転換システム（Clontech Laboratories、Palo Alto、California、USA）を用い、酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）に形質転換し、オーレオバシジンＡ（Aureobasidin A）耐性株を取得し、調製例４のＦａｅＡ表層提示酵母を得た。【００９８】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｆｗ：ＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号５）
ｐＡｕＲ１０１−ＳｐｈＩ−Ｒｖ：ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ（配列番号６）【００９９】
（調製例５：キシロース資化性酵母の調製：ＴＪ１４株にキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）の３種を発現させた酵母「Ｘ３発現酵母」）
プラスミドｐＩＵＸ１Ｘ２ＸＫ（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６  Ｏｃｔ；７２（６）：１１３６−４３）をＰｓｔＩで切断し、ウラシル要求性を付与したＴＪ１４株に形質転換してウラシル要求性を持たない株を選択し、調製例５のキシロース資化性酵母を得た。得られた株をＴＪ１４−ｐＩＵＸ３と命名した。【０１００】
（調製例６：キシロース資化性かつフェルラ酸エステラーゼ表層提示酵母の調製：ＴＪ１４株にキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）の３種を発現させ、かつフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母「Ｘ３発現＋ＦａｅＡ表層提示酵母」）
調製例４で作製したプラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧをＳｔｕＩで切断後、調製例５で作製した酵母ＴＪ１４−ｐＩＵＸ３に形質転換して、オーレオバシジンＡ耐性株を取得し、調製例６のキシロース資化性かつフェルラ酸エステラーゼ表層提示酵母とした。【０１０１】
（調製例７：セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のＮ末端側表層提示酵母の調製：酵母由来α−アグルチニンを用いてＴＪ１４株に表層提示「ＣＢＨＩ−ＡＧ」）
まず第１工程として、ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨＩ（以下ＰＨＣＣＢＨＩ）をＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＢ４６３７３の遺伝子配列を基にして、ＰＨＣＣＢＨＩのシグナル配列を除いた部分をサッカロマイセス・セレビシエの使用コドンに最適化するように人工合成を行った。【０１０２】
次に第２工程として、プライマーＩＦ−ＳＳ−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｆｗ（配列番号７）とプライマーＩＦ−ＡＧ−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｒｖ（配列番号８）を用いて、第１工程で得られたＰＨＣＣＢＨＩの遺伝子断片を増幅した。【０１０３】
さらに第３工程として、プラスミドｐＩＬＧＰ３−ＣＢＨ２（ＷＯ２０１００３２７６２Ａ１）を鋳型にして、プライマーＩＦ−１０１ＳｐｈＩ−ＧＡＰ−Ｆｗ（配列番号９）とプライマーＩＦ−１０１ＳａｃＩ−ＡＧ−Ｒｖ（配列番号１０）を用いて、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域をＰＣＲで増幅した。【０１０４】
さらに第４工程として、第３工程で得られた遺伝子断片を、ＳｐｈＩとＳａｃＩで切断したＰＡＵＲ１０１（タカラバイオ株式会社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入し、プラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ＣＢＨ２を構築した。【０１０５】
さらに第５工程として、第４工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ＣＢＨ２を鋳型にして、プライマーＡＧ−Ｆｗ（配列番号１１）とプライマーＳＳ−Ｒｖ（配列番号１２）を用いてＰＣＲでＣＢＨ２以外を増幅することで、ＣＢＨ２を除去した。【０１０６】
さらに第６工程として、第５工程で得られた線状化遺伝子断片に上記第２工程で得られたＰＨＣＣＢＨＩの遺伝子断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて挿入して、プラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＰＨＣＣＢＨＩ−ＡＧを構築した。【０１０７】
この第６工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＰＨＣＣＢＨＩ−ＡＧをＳｔｕＩで切断後、酵母ＴＪ１４株に形質転換して、オーレオバシジンＡ耐性株を取得し、これを調製例７のセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のＮ末端側表層提示酵母とした。【０１０８】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＩＦ−ＳＳ−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｆｗ：ＴＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＴＣ（配列番号７）
ＩＦ−ＡＧ−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｒｖ：ＡＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＧＴＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧ（配列番号８）
ＩＦ−１０１ＳｐｈＩ−ＧＡＰ−Ｆｗ：ＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号９）
ＩＦ−１０１ＳａｃＩ−ＡＧ−Ｒｖ：ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧ（配列番号１０）
ＡＧ−Ｆｗ： ＡＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣ（配列番号１１）
ＳＳ−Ｒｖ： ＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴ（配列番号１２）【０１０９】
（調製例８：セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のＣ末端側表層提示酵母の調製：酵母由来ＴＩＲ１を用いてＴＪ１４株に表層提示「ＴＩＲ−ＣＢＨＩ」）
まず第１工程として、酵母ＴＪ１４株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＩＦ−ＳＳ−ＴＩＲ１−Ｆｗ（配列番号１３）とプライマーＩＦ−ＴＩＲ１−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｒｖ（配列番号１４）を用いてＰＣＲで増幅し、シグナル配列を含まないＴＩＲ１の遺伝子断片を得た。【０１１０】
次に第２工程として、調製例７の第６工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＰＨＣＣＢＨＩ−ＡＧを鋳型にしてプライマーＴＡＡ−ｄＡＧ−Ｆｗ（配列番号１５）とプライマーＰＨＣＣＢＨＩ−ｄＡＧ−Ｒｖ（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、α−アグルチニン以外の部分を増幅した。その後、得られた遺伝子断片についてＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社）を用いてリン酸化後にセルフライゲーションを行い、これにより、α−アグルチニンが除去されたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＰＨＣＣＢＨＩを構築した。【０１１１】
さらに第３工程として、第２工程で構築したプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＰＨＣＣＢＨＩのリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とＰＨＣＣＢＨＩの間に、第１工程で得られたＴＩＲ１の遺伝子断片を挿入するために、プライマーＰＨＣＣＢＨＩ−Ｆｗ（配列番号１７）とプライマーＳＳ−Ｒｖ（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、線状化した。【０１１２】
さらに第４工程として、第１工程で得られたＴＩＲ１の遺伝子断片と第３工程で得られた遺伝子断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて接続することでプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＴＩＲ１−ＰＨＣＣＢＨＩを構築した。このプラスミドをプライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｆｗ（配列番号１８）とプライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｒｖ（配列番号１９）でＰＣＲを行って線状化した。【０１１３】
最後に、第４工程で得られた遺伝子断片を酵母ＴＪ１４株に形質転換してオーレオバシジンＡ耐性株を取得し、これを調製例８のセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のＣ末端側表層提示酵母とした。【０１１４】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＩＦ−ＳＳ−ＴＩＲ１−Ｆｗ：ＴＴＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＧ（配列番号１３）
ＩＦ−ＴＩＲ１−ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｒｖ：ＣＡＧＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ（配列番号１４）
ＴＡＡ−ｄＡＧ−Ｆｗ：ＴＡＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＴＧＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＡＣ（配列番号１５）
ＰＨＣＣＢＨＩ−ｄＡＧ−Ｒｖ：ＧＴＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧ（配列番号１６）
ＰＨＣＣＢＨＩ−Ｆｗ：ＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＴＣ（配列番号１７）
１０１−ＳｔｕＩ−Ｆｗ：ＣＣＴＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＧ（配列番号１８）
１０１−ＳｔｕＩ−Ｒｖ：ＣＣＴＧＣＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＣ（配列番号１９）【０１１５】
（調製例９：エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＮ末端側表層提示酵母の調製：酵母由来α−アグルチニンを用いてＴＪ１４株に表層提示）
まず第１工程として、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧＩをＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０７９８１の遺伝子配列を基にして、ＥＧＩのシグナル配列を除いた部分をサッカロマイセス・セレビシエの使用コドンに最適化するように人工合成を行った。【０１１６】
次に第２工程として、プライマーＩＦ−ＳＳ−ＥＧＩ−Ｆｗ（配列番号２０）とプライマーＩＦ−ＥＧＩ−ＡＧ−Ｒｖ（配列番号２１）を用いて、第１工程で得られたＥＧＩの遺伝子断片を増幅した。【０１１７】
さらに第３工程として、第２工程で得られたＥＧＩの遺伝子断片と、調製例７の第５工程で得られた線状化遺伝子断片（プラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ＣＢＨ２からＣＢＨ２を除去した線状遺伝子断片）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて接続してプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＥＧＩ−ＡＧを構築した。【０１１８】
最後に第３工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＥＧＩ−ＡＧをＳｔｕＩで切断後、酵母ＴＪ１４株に形質転換し、オーレオバシジンＡ耐性株を取得して、これを調製例９のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＮ末端側表層提示酵母とした。【０１１９】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＩＦ−ＳＳ−ＥＧＩ−Ｆｗ：ＴＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号２０）
ＩＦ−ＥＧＩ−ＡＧ−Ｒｖ：ＡＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＧ（配列番号２１）【０１２０】
（調製例１０：エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＣ末端側表層提示酵母の調製：酵母由来ＴＩＲ１を用いてＴＪ１４株に表層提示）
まず第１工程として、ＴＪ１４のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＩＦ−ＳＳ−ＴＩＲ１−Ｆｗ（配列番号１３）とプライマーＩＦ−ＴＩＲ１−ＥＧＩ−Ｒｖ（配列番号２２）を用いてＰＣＲで増幅することにより、シグナル配列を含まないＴＩＲ１の遺伝子断片を得た。【０１２１】
次に第２工程として、調製例９の第３工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＥＧＩ−ＡＧを鋳型にして、プライマーＴＡＡ−ｄＡＧ−Ｆｗ（配列番号１５）とプライマー  ＥＧＩ−ｄＡＧ−Ｒｖ（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行い、α−アグルチニン以外の部分を増幅した。その後Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社）を用いてリン酸化後にセルフライゲーションを行い、α−アグルチニンが除去されたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＥＧＩを構築した。【０１２２】
さらに第３工程として、第２工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＥＧＩのリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とＰＨＣＣＢＨＩの間にＴＩＲ１を挿入するために、プライマーＥＧＩ−Ｆｗ（配列番号２４）とプライマーＳＳ−Ｒｖ（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、線状化した。【０１２３】
さらに第４工程として、第１工程で得られたＴＩＲ１の遺伝子断片と第３工程で得られた遺伝子断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて接続することでプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＴＩＲ１−ＥＧＩを構築した。【０１２４】
さらに第５工程として、第４工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ＧＰ３−ｓｓＴＩＲ１−ＥＧＩを鋳型として、プライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｆｗ（配列番号１８）とプライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｒｖ（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行って線状化した。【０１２５】
最後に、第５工程で得られた遺伝子断片を酵母ＴＪ１４株に形質転換してオーレオバシジンＡ耐性株を取得して、これを調製例１０のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＣ末端側表層提示酵母とした。【０１２６】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＩＦ−ＴＩＲ１−ＥＧＩ−Ｒｖ：ＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ（配列番号２２）
ＥＧＩ−ｄＡＧ−Ｒｖ：ＴＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＡＴＣＡＴＴＧ（配列番号２３）
ＥＧＩ−Ｆｗ：ＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号２４）【０１２７】
（調製例１１：フェルラ酸エステラーゼのＣ末端側表層提示酵母の調製：酵母由来ＴＩＲ１を用いてＴＪ１４株に表層提示）
まず第１工程として、酵母ＴＪ１４株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、プライマーＩＦ−ＳＳ−ＴＩＲ１−Ｆｗ（配列番号１３）とプライマーＩＦ−ＴＩＲ１−ＦａｅＡ−Ｒｖ（配列番号２５）を用いてＰＣＲで増幅することにより、シグナル配列を含まないＴＩＲ１の遺伝子断片を得た。【０１２８】
次に第２工程として、調製例４で使用したＦａｅＡ酵母表層提示用プラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧを鋳型にして、プライマーＴＡＡ−ｄＡＧ−Ｆｗ（配列番号１５）とプライマーＦａｅＡ−ｄＡＧ−Ｒｖ（配列番号２６）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＦａｅＡ酵母表層提示用プラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡ−ＡＧのα−アグルチニン以外の部分を増幅した。その後Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社）を用いてリン酸化後にセルフライゲーションを行い、α−アグルチニンが除去されたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡを構築した。【０１２９】
さらに第３工程として、第２工程で得られたプラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡのリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とＦａｅＡの間にＴＩＲ１を挿入するために、当該プラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＦａｅＡを鋳型にして、プライマーＦａｅＡ−Ｆｗ（配列番号２７）とプライマーＳＳ−Ｒｖ（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、線状化した。【０１３０】
さらに第４工程として、第１工程で得られたＴＩＲ１の遺伝子断片と、第３工程で得られた遺伝子断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて接続することでプラスミドｐＡＵＲ１０１−ｐＧＫ−ｓｓＴＩＲ１−ＦａｅＡを構築した。このプラスミドをプライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｆｗ（配列番号１８）とプライマー１０１−ＳｔｕＩ−Ｒｖ（配列番号１９）でＰＣＲを行って線状化した。【０１３１】
最後に、酵母ＴＪ１４株に第４工程で得られた遺伝子断片を形質転換し、オーレオバシジンＡ耐性株を取得して、これを調製例１１のフェルラ酸エステラーゼのＣ末端側表層提示酵母とした。【０１３２】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＩＦ−ＴＩＲ１−ＦａｅＡ−Ｒｖ：ＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ（配列番号２５）
ＦａｅＡ−ｄＡＧ−Ｒｖ：ＧＴＧＧＡＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣ（配列番号２６）
ＦａｅＡ−Ｆｗ：ＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＴＡＴＧＧＧＧＣＣＡＡＴＧ（配列番号２７）【０１３３】
（実施例１：稲わら水熱処理物と稲わら微粉砕処理物のエタノール発酵比較）
稲わらの微粉砕処理および水熱処理をそれぞれ参考例１および４に従って行い、発酵基質を得た。これらの処理物をそれぞれ発酵基質とし、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１の遺伝子組換え酵母（ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼを２コピー、セロビオヒドロラーゼを１コピー、β−グルコシダーゼを１コピー導入）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ここで、各稲わら前処理物を発酵液に対する原料濃度を１０（w/v）％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を各前処理物重量の５重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１３４】
図１は、稲わらの水熱処理物（ａ）および微粉砕処理物（ｂ）について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１の遺伝子組換え酵母をそれぞれ用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、野生酵母；および黒丸、調製例１の遺伝子組換え酵母。【０１３５】
図１（ａ）に示すように、稲わら水熱処理物を発酵基質とした場合、セルラーゼを表層提示する酵母を用いても、非特許文献４に記載の１００ｇ−湿重量／Ｌよりも低い初期菌体濃度（２０ｇ−湿重量／Ｌ）ではエタノール収率を高めることはできなかった（表層提示したセルラーゼの糖化促進によるエタノール濃度の増加が見られない）。一方、図１（ｂ）に示すように、稲わら微粉砕処理物を発酵基質とした場合、２０ｇ−湿重量／Ｌのような低い初期菌体濃度であっても細胞表層のセルラーゼが糖化を促進し、野生酵母に比べてエタノール濃度を増加させることができた。【０１３６】
（実施例２：単独の酵素を細胞表層に発現する酵母による稲わら微粉砕処理物のエタノール発酵）
稲わらの微粉砕処理を参考例１に従って行い、発酵基質を得た。得られた発酵基質と、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株およびＴＪ１４株）および調製例２〜４に示す遺伝子組換え酵母（すなわち、ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）を細胞表層に発現させた酵母；ＮＢＲＣ１４４０株にβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を細胞表層に発現させた酵母；およびＴＪ１４株にフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ここで、得られた発酵基質について、発酵液に対する仕込み濃度２０（w/v）％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の５重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１３７】
図２は、稲わら微粉砕処理物の発酵基質について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株およびＴＪ１４株）および調製例２〜４に示す遺伝子組換え酵母をそれぞれ用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＮＢＲＣ１４４０株；黒丸、調製例２の遺伝子組換え酵母；黒三角、調製例３の遺伝子組換え酵母；白菱形、ＴＪ１４株；および黒菱形、調製例４の遺伝子組換え酵母。【０１３８】
図２に示されるように、複数の酵素を表層発現させることなく、単独の酵素を表層発現する酵母（２０ｇ−湿重量／Ｌ）であっても、野生酵母より高いエタノール濃度が得られることが分かった。【０１３９】
（実施例３：多種類のリグノセルロース系バイオマス微粉砕処理物のエタノール発酵）
ネピアグラス、ゴルフ場芝草、ファルカタおよび杉材の微粉砕処理を参考例１に従って行い、それぞれ発酵基質を得た。得られたそれぞれの発酵基質と、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母（ＴＪ１４株にフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ここで、得られた発酵基質を発酵液に対する仕込み濃度２０（w/v）％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の１０重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。杉材の微粉砕処理物については仕込み濃度３０％でも行った。【０１４０】
図３は、（ａ）ネピアグラス、（ｂ）ゴルフ場芝草、（ｃ）ファルカタ材、（ｄおよびｅ）杉材の微粉砕処理物をそれぞれ発酵基質とし、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＴＪ１４株；および黒丸、調製例４の遺伝子組換え酵母。【０１４１】
対象バイオマス中の糖含有量によってエタノール生産量は異なるものの、いずれのバイオマスを用いた場合もＦａｅＡ発現酵母の方が野生酵母（ＴＪ１４株）よりも高いエタノール濃度を示した（図３（ａ）〜３（ｄ））。杉材の発酵液に対する仕込み濃度を２０％から３０％に増加させたところ、図３（ｅ）に示すように、さらに高いエタノール濃度を得ることができた。この場合でもＦａｅＡ発現酵母の方が野生酵母（ＴＪ１４株）よりも高いエタノール濃度を示した。【０１４２】
（実施例４：水熱処理と微粉砕処理との組み合わせのエタノール発酵）
稲わらおよびバガスのそれぞれについて、参考例４に従って水熱処理し、引き続き参考例２に従って微粉砕処理し、各発酵基質を得た。得られたそれぞれの発酵基質と、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母（ＴＪ１４株にフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ここで、得られた各発酵基質を発酵液に対する仕込み濃度２０％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の１０重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１４３】
図４は、（ａ）稲わらおよび（ｂ）バガスのそれぞれについて水熱処理および微粉砕処理して得られた発酵基質について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＴＪ１４株；および黒丸、調製例４の遺伝子組換え酵母。【０１４４】
図４（ａ）に示されるように、ＦａｅＡ表層提示酵母と野生酵母との間には、稲わらの微粉砕処理のみの場合（図２）よりもさらに大きなエタノール生産量の差を得ることができた。また、バガスを用いた場合（図４（ｂ））にも、ＦａｅＡ表層提示酵母と野生酵母の間に、稲わらの場合と同等以上のエタノール生産量の差を確認できた。したがって、水熱処理と微粉砕処理を組み合わせたリグノセルロース系バイオマスについても、酵素を細胞表層に発現する微生物のエタノール発酵に用いることができ、エタノール生産量が顕著に増加することが分かった。【０１４５】
（実施例５：キシロース代謝能力を有する酵素表層提示酵母によるエタノール発酵）
バガスについて、参考例４に従って水熱処理し、引き続き参考例２に従って微粉砕処理し、発酵基質を得た。得られた発酵基質について、調製例５および６に示す遺伝子組換え酵母（それぞれ、Ｘ３発現酵母およびＸ３発現＋ＦａｅＡ表層提示酵母）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ここで、得られた各発酵基質を発酵液に対する仕込み濃度２０（w/v）％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の１０重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１４６】
図５は、バガスの水熱処理および微粉砕処理物について調製例５および６に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノールまたはキシロースの濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、調製例５の遺伝子組換え酵母（Ｘ３発現酵母）の場合の発酵液中のエタノール量；黒丸、調製例６の遺伝子組換え酵母（Ｘ３発現＋ＦａｅＡ表層提示酵母）の場合の発酵液中のエタノール量；白三角、調製例５の遺伝子組換え酵母の場合の発酵液中のキシロース量；および黒三角、調製例６の遺伝子組換え酵母の場合の発酵液中のキシロース量。【０１４７】
図５に示されるように、Ｘ３発現酵母およびＸ３発現＋ＦａｅＡ表層提示酵母のいずれも、キシロースを資化した。さらに、Ｘ３発現＋ＦａｅＡ表層提示酵母の方が、ＦａｅＡ表層提示のないＸ３発現酵母よりも高いエタノール生産量が得られた。【０１４８】
（実施例６：バイオマス微粉砕処理物の粒径が発酵効率に及ぼす影響）
（６−１：バイオマス微粉砕処理物の粒径測定）
杉材の微粉砕処理を参考例３に従って行い、粉砕時間３０分間、４５分間および６０分間の発酵基質を得た。得られたそれぞれの発酵基質について、レーザ回折式粒子径分布測定装置（型式：SALD-2300、株式会社島津製作所製）を用いて粒度分布を測定した。【０１４９】
図６は、１ｍｍに裁断した杉材を粉砕機（ナノメック・リアクター）によって、（ａ）３０分間、（ｂ）４５分間、および（ｃ）６０分間処理した場合の粒度分布を示す。図６の（ａ）から（ｃ）のいずれにおいても、縦軸は相対粒子量（積算／頻度）、そして横軸は粒子径（μｍ）を表す。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の粒度分布における半値幅（ｄ５０）はそれぞれ、６８．４μｍ、５９．４μｍおよび５９．６μｍであった。【０１５０】
粉砕処理時間３０分間では、微粉砕物の５０％が７０μｍ以下、９０％が２３０μｍ以下の粒径であり（図６（ａ））、粉砕処理時間４５分間では５０％が６０μｍ以下、９０％が２２０μｍ以下の粒径であり（図６（ｂ））、さらに粉砕処理時間６０分間では５０％が６０μｍ以下、９０％が１８０μｍ以下の粒径であった（図６（ｃ））。試験した粉砕処理時間の範囲では、３００〜５００μｍの比較的大きな粒径の存在量に違いがみられるものの、平均粒径に大きな影響はみられなかった。粉砕処理時間を変えても微粉砕後のバイオマス中のグルコース含有量はほとんど変わらなかった（表１および２）。【０１５１】
（６−２：フェルラ酸エステラーゼ表層提示酵母による発酵）
６−１で得られたそれぞれの発酵基質（粉砕時間３０分間、４５分間および６０分間）と、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母（ＴＪ１４株にフェルラ酸エステラーゼ（ＦａｅＡ）を細胞表層に発現させた酵母）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った（ＴＪ１４株については、粉砕時間３０分の発酵基質のみ）。ここで、得られた発酵基質を発酵液に対する仕込み濃度２０（w/v）％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の１０重量％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１５２】
図７は、粉砕処理時間３０分間、４５分間および６０分間により得られた発酵基質について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例４に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、粉砕時間３０分の発酵基質＋ＴＪ１４株；黒丸、粉砕時間３０分の発酵基質＋調製例４の遺伝子組換え酵母；黒三角、粉砕時間４５分の発酵基質＋調製例４の遺伝子組換え酵母および；黒菱形、粉砕時間６０分の発酵基質＋調製例４の遺伝子組換え酵母。【０１５３】
図７に示されるように、野生酵母の場合、発酵１８時間以降のエタノール濃度の増加（つまり酵素糖化率の増加）がみられず、ほぼ横ばいであったが、ＦａｅＡ表層提示酵母の場合では、発酵１８時間以降もエタノール濃度の増加が見られた。これは、野生酵母についてバイオマスの糖化に作用する酵素は外部より添加した市販セルラーゼ（CTec2）のみであるのに対し、ＦａｅＡ表層提示酵母の場合では、細胞表層の酵素が発酵後期に至るまでバイオマスの糖化を促進していると考えられた。このことから、外部より添加した発酵液中の酵素はバイオマスに吸着されている或いは吸着が阻害されているために糖化効率が悪く、細胞表層の酵素はバイオマス微粉砕物との接触が維持されるために高い糖化効率を得られると推察される。【０１５４】
さらに、粉砕処理時間に関わらず、ＦａｅＡ表層提示酵母の方が野生酵母より高いエタノール濃度（収率）を得ることができ、粉砕時間ごとの比較では長い粉砕時間の方がより良好な成績となった（表１）。【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
（６−３：セルラーゼ表層提示酵母による発酵）
野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１に示す遺伝子組換え酵母（ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼを２コピー、セロビオヒドロラーゼを１コピー、β−グルコシダーゼを１コピー導入）のそれぞれを用いたこと以外は、６−２と同様にして糖化および発酵を行った。【０１５７】
図８は、粉砕処理時間３０分間、４５分間および６０分間により得られた発酵基質について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）および調製例１に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、粉砕時間３０分の発酵基質＋野生酵母；黒丸、粉砕時間３０分の発酵基質＋調製例１の遺伝子組換え酵母；黒三角、粉砕時間４５分の発酵基質＋調製例１の遺伝子組換え酵母および；黒菱形、粉砕時間６０分の発酵基質＋調製例１の遺伝子組換え酵母。【０１５８】
調製例１の遺伝子組換え酵母（ＮＢＲＣ１４４０株にエンドグルカナーゼを２コピー、セロビオヒドロラーゼを１コピー、β−グルコシダーゼを１コピー導入）でも、調製例４の遺伝子組換え酵母（ＦａｅＡ表層提示酵母）と同様に、粉砕処理時間に関わらず、野生酵母より高いエタノール濃度（収率）を得ることができ、粉砕時間ごとの比較では長い粉砕時間の方がより良好な成績であることを確認した（表２および図８）。【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
（実施例７：表層提示酵素の基質結合部位の配向性がバイオマス微粉砕物のエタノール発酵に及ぼす影響）
（７−１：セロビオヒドロラーゼＩの表層提示）
バガスについて、参考例４に従って水熱処理し、引き続き参考例２に従って微粉砕処理し、発酵基質を得た。得られた発酵基質について、野生酵母（ＴＪ１４株）ならびに調製例７および８に示す遺伝子組換え酵母（それぞれ、セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）のＮ末端側表層提示酵母「ＣＢＨＩ−ＡＧ」およびＣ末端側表層提示酵母「ＴＩＲ−ＣＢＨＩ」）のそれぞれを用いて、参考例５に従って糖化および発酵を行った。ファネロカエテ・クリソスポリウム由来ＣＢＨＩは、Ｃ末端側にセルロース結合部位（ＣＢＤ）を有し、よって、ＣＢＨＩのＮ末端側表層提示酵母は、ＣＢＤが細胞に対して内側に配向した酵母であり、そしてＣ末端側表層提示酵母は、ＣＢＤが細胞に対して外側に配向した酵母である。ここで、得られた発酵基質について、発酵液に対する仕込み濃度２０重量％とし、市販セルラーゼ製剤（Ｃ−Ｔｅｃ２）を微粉砕処理物重量の１０（w/v）％となるようにした。酵母菌体濃度は発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとした。【０１６１】
図９は、バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例７および８に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＴＪ１４株；黒丸、調製例７の遺伝子組換え酵母（「ＣＢＨＩ−ＡＧ」）および；黒三角、調製例８の遺伝子組換え酵母（「ＴＩＲ−ＣＢＨＩ」）。【０１６２】
図９に示されるように、ＣＢＨＩのＣＢＤを細胞に対して内側に配向させた場合（「ＣＢＨＩ−ＡＧ」）、野生酵母より高いエタノール濃度を得られなかったが、ＣＢＤを外側に配向させた場合（「ＴＩＲ−ＣＢＨＩ」）は、野生酵母よりも高いエタノール濃度を得ることができた。【０１６３】
（７−２：エンドグルカナーゼＩの表層提示）
野生酵母（ＴＪ１４株）ならびに調製例９および１０に示す遺伝子組換え酵母（それぞれ、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＮ末端側表層提示酵母およびエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）のＣ末端側表層提示酵母）のそれぞれを用いたこと以外は、７−１と同様にして糖化および発酵を行った。【０１６４】
図１０は、バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例９および１０に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＴＪ１４株；黒丸、調製例９の遺伝子組換え酵母；および黒三角、調製例１０の遺伝子組換え酵母。【０１６５】
図１０に示されるように、このようなＣＢＤを細胞に対して外側に配向させた場合にバイオマス微粉砕処理物から高いエタノール濃度を得られる現象は、ＣＢＨＩと同じくＣ末端側にＣＢＤを有するエンドグルカナーゼＩなど他の酵素でも確認された。すなわち、ＥＧＩのＣＢＤを細胞に対して内側に配向させた場合（調製例９）、野生酵母より高いエタノール濃度を得られなかったが、ＣＢＤを外側に配向させた場合（調製例１０）は、野生酵母よりも高いエタノール濃度を得ることができた。【０１６６】
（７−３：フェルラ酸エステラーゼの表層提示）
野生酵母（ＴＪ１４株）ならびに調製例１１に示す遺伝子組換え酵母（フェルラ酸エステラーゼのＣ末端側表層提示酵母）のそれぞれを用いたこと以外は、７−１と同様にして糖化および発酵を行った。【０１６７】
図１１は、バガスの水熱処理および微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）および調製例１１に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、ＴＪ１４株および黒三角、調製例１１の遺伝子組換え酵母。【０１６８】
図１１に示されるように、基質結合部位がＮ末端側に存在するＦａｅＡ（調製例４および６ではＦａｅＡのＣ末端側をＡＧのＮ末端側と結合して表層提示しているため、ＦａｅＡの基質結合部位は細胞の外側に配向されている）について、ＴＩＲ１のＣ末端側にＦａｅＡのＮ末端側を結合、すなわちＦａｅＡの基質結合部位を細胞の内側に配向した場合（調製例１１）には、野生酵母と比べてエタノール濃度の顕著な増加はみられなかった。【０１６９】
以上のことから、Ｎ末端側またはＣ末端側のいずれに基質結合部位をもつ酵素であっても、基質結合部位を細胞に対して外側に配向させるようにアンカータンパク質と結合して細胞表層提示させることが、バイオマス微粉砕処理物から高いエタノール濃度を得るために重要であると考えられた。【０１７０】
（参考例６：リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理４）
籾殻を、ナノメック・リアクター（型式：ＣＭ０１、Simoloyer（登録商標）、Zoz GmbH製、株式会社テクノ・アイより入手）を用いて、１０分間、微粉砕処理した。【０１７１】
（参考例７：リグノセルロース系バイオマスの微粉砕処理５）
タピオカ澱粉粕を、ナノメック・リアクター（型式：ＣＭ０１、Simoloyer（登録商標）、Zoz GmbH製、株式会社テクノ・アイより入手）を用いて、１０分間、微粉砕処理した。【０１７２】
（実施例８：リグノセルロース加水分解酵素を表層提示する酵母による籾殻微粉砕処理物の同時糖化発酵）
本実施例では、参考例６のバイオマス微粉砕処理物（籾殻）および調製例４、８または１０に示す遺伝子組換え酵母あるいは野生酵母ＴＪ１４株を用いて、糖化および発酵を行った。【０１７３】
糖化および発酵は、バイオマス微粉砕処理物（籾殻）を発酵液に対して仕込み濃度２０（w/v）％とし、市販酵素製剤の添加量を当該微粉砕処理物重量に対してそれぞれ８重量％（Ｃ−Ｔｅｃ２：セルラーゼ）、１重量％（ネオスピターゼ：液化型α−アミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社製））、および１重量％（グルコチーム：グルコアミラーゼ（ナガセケムテックス株式会社製））とし、１Ｍクエン酸バッファーのｐＨを５．０とし、そして酵母菌体濃度を発酵液に対して２０ｇ−湿重量／Ｌとしたこと以外は、参考例５の方法に基づいて行った。【０１７４】
図１２は、籾殻微粉砕処理物について、野生酵母（ＴＪ１４株）、調製例４、８および１０に示す各遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白菱形、ＴＪ１４株；黒丸、調製例４；黒三角、調製例８；黒四角、調製例１０。【０１７５】
図１２に示されるように、原料（籾殻）に含まれる澱粉を糖化するための酵素（アミラーゼおよびグルコアミラーゼ）を添加した場合でも、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に関与する酵素を表層提示する酵母の方が、野生酵母より高いエタノール濃度（収率）を得ることができた。【０１７６】
（調製例１２：アミラーゼ表層提示酵母の調製）
まず第１工程として、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ表層提示プラスミドｐＧＡ１１（Muraiら、Applied and Environmental Microbiology、1997年、第63巻、p.1362-1366）を鋳型にして、プライマーＨｉｎｄIII−ＧＡＰｐ−Ｆｗ（配列番号２８）とプライマーＨｉｎｄIII−ＧＡＰｔ−Ｒｖ（配列番号２９）を用いてＰＣＲで増幅することにより、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片をｐＲＳ４０５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＨｉｎｄIIIサイトに挿入することで、グルコアミラーゼ表層提示プラスミドｐＲＳ４０５−ＧＬＡ−ＡＧを構築した。【０１７７】
次に第２工程として、上記第１工程で得られたプラスミドｐＲＳ４０５−ＧＬＡ−ＡＧをＨｐａＩで切断して直線状にし、ＮＢＲＣ１４４０／ΔＵＨＷＬ（国際公開第２０１０／０３２７６２号）に導入してロイシン要求性を持たない株を選択した。【０１７８】
さらに第３工程として、ストレプトコッカス・ボビス由来α―アミラーゼ分泌かつリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ表層提示プラスミドｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡ（Yamadaら、Enzyme and Microbial Technology、2009年、第44巻、p.344-349）をＳｔｕＩで切断して直線状にし、第２工程で選択された株に導入してウラシル要求性を持たない株を選択し、これを追加調製例１のα−アミラーゼ１コピー分泌、グルコアミラーゼ２コピー表層提示酵母とした。なお、第３工程により得られた株を［ＮＢＲＣ１４４０／ｐＲＳ４０５−ＧＬＡ−ＡＧ／ｐＩＵ−ＧｌｕＲＡＧ−ＳＢＡ］と命名した。グルコアミラーゼの基質結合部位はＮ末端側に存在し、よって、ここで得られた表層提示酵母においては、グルコアミラーゼの基質結合部位が細胞に対して外側に配向されている。【０１７９】
使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
ＨｉｎｄIII−ＧＡＰｐ−Ｆｗ：ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号２８）
ＨｉｎｄIII−ＧＡＰｔ−Ｒｖ：ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＡＴＧＴＣ（配列番号２９）【０１８０】
（実施例９：アミラーゼ表層提示酵母によるタピオカ微粉砕処理物の同時糖化発酵）
本実施例では、参考例７のバイオマス微粉砕処理物（タピオカ澱粉粕）および調製例１２の酵母または対照の野生酵母ＮＢＲＣ１４４０株を用いて、糖化および発酵を行った。【０１８１】
ＹＰＤ液体培地１００ｍＬを含むフラスコ中で酵母菌体を７２時間培養した。７２時間培養後のＹＰＤ液体培地中の酵母菌体濃度は、２０ｇ−湿重量／Ｌに相当する量であった。この酵母培養液７．５ｍＬ、バイオマス微粉砕処理物２．０ｇおよび１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）０．５ｍＬを５０ｍＬ容量のプラスチック製試験管（コーニング社製）に入れ、サーモブロックローテーター（株式会社日伸理化製ＳＮ−０６ＢＮ）を用いた３５℃にて３５ｒｐｍの回転速度でインキュベートした。ここで、５０ｍＬ容試験管内インキュベーション開始時の酵母菌体濃度は、１５ｇ−湿重量／Ｌに相当する量であった。なお、この５０ｍＬ容試験管内のインキュベーションの間、セルラーゼやアミラーゼなどの市販酵素製剤は全く添加しなかった。また、フラスコでのＹＰＤ液体培養で得た酵母培養液には若干のエタノールを含んでいたため、５０ｍＬ容試験管内のインキュベーションの開始直後のエタノール濃度をゼロとして経時変化に関するデータを取得した。【０１８２】
図１３は、タピオカ澱粉粕微粉砕処理物について、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）、調製例１２に示す遺伝子組換え酵母のそれぞれを用いたエタノール発酵の結果を示すグラフである。縦軸は発酵液中のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）、そして横軸は発酵時間（時間）を表す。図中の記号は以下を表す：白丸、野生酵母（ＮＢＲＣ１４４０株）；黒四角、調製例１２。【０１８３】
図１３に示されるように、野生酵母では発酵２４時間以降のエタノール濃度が増加しないのに対し、表層提示酵母では発酵２４時間以降のエタノール濃度が著しく増加し、野生酵母よりも高いエタノール濃度を得られることが分かった。野生酵母では、発酵２４時間までで、バイオマス微粉砕処理物中に存在する、本酵母が発酵可能な糖を消費し尽したのに対し、調製例１２の酵母は、その表層提示グルコアミラーゼおよび分泌α−アミラーゼによりバイオマス微粉砕処理物から発酵可能な糖を作出し、発酵２４時間を経過してもエタノールの生産に寄与し得たと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
エタノール発酵の原料として、微粉砕処理などによるリグノセルロース系バイオマス粒子を用いる場合、原料の高濃度化が可能であること、また、熱履歴が少ないため発酵阻害物質の低減につながる点でも有利である。また、リグノセルロース系バイオマス粒子の調製に用いられ得る微粉砕処理は、特殊な化学物質を使用しない点、処理そのものによる廃棄物の発生が無い点、バイオマスの種類による処理効果の差が比較的少なく広範なバイオマスに適用できる点など多くの利点をもつ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｃ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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