(57)【要約】本発明は、大腸癌に対するがん薬物療法に対する応答性を予測する方法に関する。より詳細には、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって、被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルを解析し、前記ＤＮＡメチル化レベルに基づき前記被験者のがん薬物療法応答性を判定することを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって、被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルを解析し、前記ＤＮＡメチル化レベルに基づき前記被験者のがん薬物療法応答性を判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１に記載の方法：
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程。
【請求項３】
高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
表７記載又は表８記載の遺伝子群の遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
がん薬物療法が化学療法である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
がん薬物療法が分子標的薬を用いた療法である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分子標的薬が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定できることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット。
【請求項１３】
表８記載の２４遺伝子又はマーカー遺伝子ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、請求項１２記載のプローブセット。
【請求項１４】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
（ａ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット。
【請求項１５】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願〕
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１４−２１２５０３号（２０１４年１０月１７日出願）の明細書に記載された内容を包含する。本発明は、大腸癌に対するがん薬物療法に対する応答性を予測する方法に関する。より詳細には、大腸癌患者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化プロファイルを指標として、大腸癌に対するがん薬物療法に対する感受性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は全悪性腫瘍の中で、罹患者数では、男性で第２位、女性で１位を占める疾患である。死亡者数では第３位（２００４年約４０，０００人）を占め、２０１５年にはさらに増加（約６６，０００人）すると予測される。大腸癌の治療成績を改善させることは、総死亡の３０％を占めるがん死亡数を低下させることに大きく寄与するものと考えられる。【０００３】
現在治癒切除不能な進行性再発大腸癌の化学療法では、イリノテカンベースとオキサリプラチンベースの化学療法がおこなわれているが、その併用における適用順序については、これまで特に検討されていない。【０００４】
一方、分子標的薬、特に抗ＥＧＦＲ抗体薬（セツキシマブ、パニツムマブ）と抗ＶＥＧＦ抗体薬（ベバシズマブ）の導入により、進行・再発大腸癌の治療成績（無増悪生存期間と全生存期間）は着実に向上した。しかし、分子標的薬は高額であり、従来の化学療法薬やその他のがんに用いられる分子標的薬と比べて現時点では費用対効果が劣る。無駄な医療費となる無効患者の副作用回避の視点から、より有効な対象に選択的に治療を適応する必要がある。【０００５】
進行・再発大腸癌の抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する治療感受性を予測するバイオマーカーとしては、２００８年にＫＲＡＳのエクソン２に変異を有する症例では抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療効果の上乗せを認めないことが報告されている。また、近年の臨床研究ではＫＲＡＳのエクソン２に加えエクソン３、４、ＮＲＡＳのエクソン２、３、４に変異を持たないＲＡＳ野生型の症例で、抗ＥＧＦＲ抗体薬の効果がより高くなることが報告されている。その他、治療効果予測因子としてＰＩＫ３ＣＡの変異が有望視されており、また予後予測因子としてのＢＲＡＦ変異がこれまで報告されている。【０００６】
しかしながら、現在広く用いられているバイオマーカーであるＫＲＡＳのエクソン２が野生型である症例において、抗ＥＧＦＲ抗体薬の使用による奏効率の上乗せは３０％程度であり、十分なものとは言えない。上述した他の遺伝子変異を考慮しても、遺伝子変異に基づく解析のみでは真の感受性群を同定することは困難と言える。【０００７】
これに対し、油谷らは、生体試料から抽出したＤＮＡにおけるマーカー遺伝子のメチル化状態を解析し、その結果に基づいて生体試料中のがん細胞の存否または大腸癌患者の予後を判定する方法が報告している（特許文献１）。さらに、八木らは、第１の遺伝子群のメチル化状態に基づいて（ＨＭＥ（高メチル化群）を抽出し、さらに第２の遺伝子群のメチル化状態に基づいてＩＭＥ（中メチル化群）とＬＭＥ（低メチル化群）を抽出することにより、大腸癌患者群を３つのサブタイプに分類すると、ＩＭＥ（ＫＲＡＳ遺伝子変異を含む）の生存期間が最も短いことを報告している（非特許文献１）。【０００８】
石岡らは、大腸癌の選択的治療を可能にするための方法として、大腸癌組織の遺伝子発現量を網羅的に解析し、予め分類された４グループのいずれかに帰属させることによって大腸癌患者の抗ＥＧＦＲ抗体に対する応答性を予測する方法を報告している（特許文献２）。【０００９】
札幌医大のグループは、大腸癌患者においてＬＩＮＥ−１  メチル化レベルとｍｉｃｒｏＲＮＡ−３１の発現レベルが正の相関を示すこと、抗ＥＧＦＲ抗体薬投与例における無憎悪生存期間において、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３１高発現群は低発現群に比べて優位に短いことを報告している（非特許文献２）。【００１０】
また、ＬｅｅらはＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化はがんの生物学的特性に関与し、抗ＥＧＦＲ抗体感受性はＤＮＡのメチル化状態に影響を受けるとの仮説を提案している（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−１８３７２５号
【特許文献２】ＷＯ２０１１／００２０２９
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙａｇｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０  Ｊａｎ  １；１６（１）：２１−３３
【非特許文献２】能正勝彦  大和証券ヘルス財団平成２４年度（第３９回）調査研究助成報告書
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓａｎｇｍｉｎ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３５３３（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｅｔｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ．ａｓｃｏ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１３４３５９−１４４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
進行・再発大腸癌の治療薬として用いられる抗ＥＧＦＲ抗体の投与指針においては、ＫＲＡＳ遺伝子野生型患者のみ本抗体を投与する方法が推奨されているが、野生型患者であっても抗ＥＧＦＲ抗体に抵抗性を示す症例が少なくない。そのため、抗ＥＧＦＲ抗体抵抗性患者に対する高額な本抗体の投与は患者の経済的・身体的負担が大きく、より費用対効果の高い投与指針が望まれる。【００１４】
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、大腸癌のがん薬物療法に対する応答性を高精度で予測し、患者の経済的・身体的負担を低減し、より費用対効果の高い投与指針を提供することにすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明者らは、大腸癌患者組織のＤＮＡメチル化レベルを網羅的に解析した結果、低メチル化群が高メチル化群に比べてがん薬物療法による治療成績が有意に高いことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］  大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって、被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルを解析し、前記ＤＮＡメチル化レベルに基づき前記被験者のがん薬物療法応答性を判定することを特徴とする方法；
［２］  以下の工程を含む上記［１］に記載の方法：
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程；
［３］  高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［４］  表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法、例えば、表８記載の遺伝子群を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［５］  表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［６］  表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、上記［１］又は［２］記載の方法；
［７］  マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる少なくとも１以上を含む、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の方法；
［８］  がん薬物療法が化学療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［９］  がん薬物療法が分子標的薬を用いた治療法である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法；
［１０］  分子標的薬が抗ＥＧＦＲ抗体である、上記［９］に記載の方法；
［１１］  複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定しうる、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］  大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット；
［１３］  マーカー遺伝子が、表８記載の遺伝子群ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１２］記載のプローブセット；
［１４］  大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
（ａ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７記載の遺伝子群又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子、例えば表８記載の遺伝子群すべてについて、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット；
［１５］  マーカー遺伝子が、表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む、上記［１４］記載のキット。【００１６】
これまで、大腸癌や他のいくつかのがんにおいて、ＣＩＭＰに代表されるメチル化プロファイルに基づくｐｈｅｎｏｔｙｐｅ分類が報告されているが、薬剤感受性とメチル化との関連が示された例はなく、既報からメチル化プロファイルと薬剤感受性との関連が存在するかを予想することは容易ではない。すなわち、本発明は、メチル化プロファイルから薬剤感受性が予測可能であることの初の報告である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、メチル化状態の相違に基づき、大腸癌、とくに治癒切除不能進行再発大腸癌における、化学療法の治療選択が可能となる。すなわち、１次治療を開始する際に、現在ではいずれでも良いとされるイリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法のレジメンを、患者の検体由来のＤＮＡメチル化状態に基づき、その適用順序を選択することができる。【００１８】
また、本発明によれば、ＫＲＡＳ野生型であっても抗ＥＧＦＲ抗体薬に抵抗性を示す症例群を抽出することができる。さらには、近年報告のあるＫＲＡＳのエクソン２に加えエクソン３、４、ＮＲＡＳのエクソン２、３、４に変異を持たないＲＡＳ野生型の症例であっても治療抵抗性群に含まれる症例を抽出することができる。すなわち、本発明の方法は、従来の報告では治療感受性群に分類される症例の中から実際は抵抗性である症例を抽出することが可能であり、より精度の高い治療効果予測法であると言える。【００１９】
遺伝子の変異はがんの発生・進行において順次蓄積するものであり、様々な遺伝子変異プロファイルをもつｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが腫瘍内に存在する（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）。大腸癌は腫瘍の発生・進行における遺伝子変異の蓄積傾向が強く、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙに富む腫瘍である点から、遺伝子変異を調べる際には治療経過のいつの時点で、どの部位から、どの程度の範囲で採取した腫瘍からＤＮＡを抽出したかの影響を強く受ける。【００２０】
これに対し、メチル化プロファイルはがん発生初期に決定すると考えられており腫瘍内では比較的均一であると言える。つまり、遺伝子変異による診断に比べ、先述の検体採取条件による結果のばらつきが抑えられることに加え、原発巣切除の際に採取した検体であっても、分子標的薬使用開始時点の腫瘍におけるメチル化プロファイルをより正確に反映していることが期待される。すなわち、本発明の方法は、がんの進行状態や検体の採取条件にかかわらず、がん薬物療法に対する治療効果を正確に判定することができる。【００２１】
また、本発明の方法では、遺伝子発現に基づく従来の方法に比べて、抗ＥＧＦＲ抗体による効果が高い群を濃縮して検出可能であるため、分子標的薬を用いた治療法においても、従来より高精度の判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌４５例の網羅的ＤＮＡメチル化解析（β値分布の標準偏差が０．２５を超える３１６３プローブによる教師なし階層クラスター解析）の結果を示す。
【図２】図２は、大腸癌４５例の抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の（Ａ）無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び（Ｂ）全生存期間（ＯＳ）の高メチル化群と低メチル化群の比較を示す。
【図３】図３は、実施例１の４５例とは異なる、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌５２例の網羅的ＤＮＡメチル化解析（β値分布の標準偏差が０．２５を超える２５７７プローブによる教師なし階層クラスター解析）の結果を示す。
【図４】図４は、大腸癌５２例の抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の（Ａ）無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び（Ｂ）全生存期間（ＯＳ）の高メチル化群と低メチル化群の比較を示す。
【図５】図５は、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を示す：（Ａ）本分類の高メチル化群と低メチル化群の比較、（Ｂ）ＲＡＳ変異群とＲＡＳ野生群の比較。
【図６】図６は、抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）を示す：（Ａ）本分類の高メチル化群と低メチル化群の比較、（Ｂ）ＲＡＳ変異群とＲＡＳ野生群の比較。
【図７】図７は、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の生存曲線を示す：（Ａ）本分類の高メチル化群と低メチル化群の比較、（Ｂ）Ｙａｇｉらの分類に基づく高メチル化群（ＨＭＥ）、中メチル化群（ＩＭＥ）、低メチル化群（ＬＭＥ）の比較を示す。
【図８】図８は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法（実線）、イリノテカンを含む併用療法（破線）行った際の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と、メチル化分類との相関を示す：（Ａ）高メチル化（ＨＭＣＣ）群の１次治療成績、（Ｂ）低メチル化（ＬＭＣＣ）群の１次治療成績。
【図９】図９は、進行再発大腸癌において、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法（実線）、イリノテカンを含む併用療法（破線）行った際の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と、メチル化分類との相関を示す：（Ａ）高メチル化（ＨＭＣＣ）群の２次治療成績、（Ｂ）低メチル化（ＬＭＣＣ）群の２次治療成績。
【図１０】図１０は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチン、２次治療としてイリノテカンを含む併用療法を行った場合（実線）、１次治療としてイリノテカン、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法行った場合（破線）の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と、メチル化分類との相関を示す：（Ａ）高メチル化（ＨＭＣＣ）群の治療成績、（Ｂ）低メチル化（ＬＭＣＣ）群の治療成績。
【図１１】図１１は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチン、２次治療としてイリノテカンを含む併用療法を行った場合（実線）、１次治療としてイリノテカン、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法行った場合（破線）の全生存期間（ＯＳ）と、メチル化分類との相関を示す：（Ａ）高メチル化（ＨＭＣＣ）群の治療成績、（Ｂ）低メチル化（ＬＭＣＣ）群の治療成績。
【図１２】図１２は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法（実線）、イリノテカンを含む併用療法（破線）行った際の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とＣＩＭＰ分類の相関を示す：（Ａ）ＣＩＭＰ陽性群の１次治療成績、（Ｂ）ＣＩＭＰ陰性群の１次治療成績。
【図１３】図１３は、進行再発大腸癌において、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法（実線）、イリノテカンを含む併用療法（破線）行った際の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とＣＩＭＰ分類の相関を示す：（Ａ）ＣＩＭＰ陽性群の２次治療成績、（Ｂ）ＣＩＭＰ陰性群の２次治療成績。
【図１４】図１４は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチン、２次治療としてイリノテカンを含む併用療法を行った場合（実線）、１次治療としてイリノテカン、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法行った場合（破線）の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とＣＩＭＰ分類の相関を示す：（Ａ）ＣＩＭＰ陽性群の１次治療成績、（Ｂ）ＣＩＭＰ陰性群の１次治療成績。
【図１５】図１５は、進行再発大腸癌において、１次治療としてオキサリプラチン、２次治療としてイリノテカンを含む併用療法を行った場合（実線）、１次治療としてイリノテカン、２次治療としてオキサリプラチンを含む併用療法行った場合（破線）の全生存期間（ＯＳ）とＣＩＭＰ分類の相関を示す：（Ａ）ＣＩＭＰ陽性群の１次治療（オキサリプラチン）成績、（Ｂ）ＣＩＭＰ陽性群の２次治療（オキサリプラチン）成績、（Ｃ）ＣＩＭＰ陽性群の１次／２次治療（オキサリプラチン／イリノテカン）成績、（Ｄ）ＣＩＭＰ陰性群の１次治療（オキサリプラチン）成績、（Ｅ）ＣＩＭＰ陰性群の２次治療（オキサリプラチン）成績、（Ｆ）ＣＩＭＰ陰性群の１次／２次治療（オキサリプラチン／イリノテカン）成績。
【図１６】図１６は、２つのコホートにおけるプローブの絞り込みと検証（実施例７）の手順を示す。
【図１７】図１７は、２つのコホート解析で絞り込んだ２４個のマーカー（プローブ）を用いて、解析対象である９７例をＨＭＣＣ群とＬＭＣＣ群に再度分類した結果を示す。図中、列は各症例（合計９７列）を示し、最上段の赤もしくは青は、各症例が、３１４４もしくは２５７７のプローブを用いた最初の解析でＨＭＣＣもしくはＬＭＣＣのいずれに分類されていたかを示す。二段目以降の行（合計２４行）は各プローブを示し、オレンジがメチル化陽性（＝β値０．５以上）、グリーンがメチル化陰性（＝β値０．５未満）と判定されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．定義
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法応答性を判定する方法に関する。以下、本発明及び本明細書中で使用される用語の意味について説明する。
【００２４】
本発明において、「大腸癌」とは、大腸（盲腸、結腸、直腸）に発生するがん腫であって、肛門管に発生するがん腫も含む。「大腸癌患者」は、大腸癌に罹患している対象に加えて、罹患の疑いがあり、がん薬物療法応答性を調べる必要のある対象を含む。
【００２５】
「がん薬物療法」は特に限定されず、例えば、オキサリプラチン、イリノテカン等を用いた化学療法と、抗ＥＧＦＲ抗体等の分子標的薬を用いた治療法の両方が含まれる。
【００２６】
本発明において、「抗ＥＧＦＲ抗体」とは、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）に特異的な抗体又はその免疫学的に活性な断片であって、既に市販されているＩｇＧ１サブクラスのヒト・マウスキメラ抗体であるセツキシマブ、ＩｇＧ２サブクラスの完全ヒト型抗体であるパニツムマブのほか、がんの分子標的薬として有用なすべての抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
【００２７】
転移・再発大腸癌の約８０％程度はＥＧＦＲを発現しており、シグナル伝達の最上流に位置するＥＧＦＲを抗体で阻害することによりがん細胞の増殖が抑制される。しかし、ＥＧＦＲを抗体でブロックしてもシグナル伝達が阻害されない症例がある。例えば、前述のように、増殖シグナル伝達経路の下流にあるＫ−ＲＡＳに変異がある患者では、ＥＧＦＲをブロックしてもシグナル伝達は阻害されないことが知られている。
【００２８】
本発明において、「がん薬物療法に対する応答性」とは、上記したような、がん薬物療法に対する患者の応答性を意味し、がん薬物療法が奏功する場合を「感受性」、奏功しない場合を「抵抗性」と表現する。
【００２９】
本発明で用いられる「検体」は、被験者から単離された被疑病変部位、すなわち大腸癌組織、大腸癌細胞等、大腸癌細胞由来のＤＮＡ（血漿中の腫瘍由来のＤＮＡなど）を含むものであれば特に限定されない。
【００３０】
「ＤＮＡメチル化」は、ＤＮＡを構成するシトシンのピリミジン環の５位炭素原子あるいはアデニンのプリン環の６位窒素原子で起こりうるが、通常哺乳動物成体の体細胞組織ではＣｐＧ部位（シトシンとグアニンが隣り合ったジヌクレオチド部位）で生じる。がんにおいては、ＣｐＧ部位、特にプロモーター領域のＣｐＧアイランドで過剰メチル化が見られることが多いが、低メチル化もまたがんの進展と関連する。
【００３１】
本発明にかかる「ＤＮＡメチル化」とは、ＣｐＧ部位のメチル化に限定されず、例えば、ヒト幹細胞で公知の非ＣｐＧサイトのメチル化領域、公知の正常細胞とがん細胞間で異なるメチル化を示す領域等、非ＣｐＧ部位のメチル化も含む。
【００３２】
本発明にかかる「ＤＮＡメチル化レベル」とは、メチル化の割合（メチル化／メチル化＋非メチル化）であって、例えばβ値によって示される。なお、β値は、以下の式により算出される。
β値＝（メチル検出用プローブの蛍光値の最大値）／（非メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋メチル検出用プローブの蛍光値の最大値＋１００）
【００３３】
ＤＮＡメチル化レベルを測定する「マーカー遺伝子」は特に限定されず、検体中のすべての遺伝子を対象として網羅的に解析してもよいし、特定の遺伝子に限定して解析してもよい。好ましくは、マーカー遺伝子は高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子であり、具体的には、表７に示される１０５３の遺伝子群又は表８に示される２４の遺伝子群から選ばれる。例えば、マーカー遺伝子は遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤで示される７遺伝子、あるいは表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
【００３４】
２．がん薬物療法に対する応答性判定方法
本発明は、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を、前記患者の大腸癌組織又は大腸癌細胞を含む検体におけるＤＮＡメチル化レベルに基づいて判定するものである。
【００３５】
本発明の方法は、例えば、以下の工程を含む。
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程（測定工程）、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程（解析・分類工程）、
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法抵抗性と判定する工程（判定工程）。
【００３６】
２．１  測定工程
（１）ＤＮＡの抽出
まず、被験者から単離した検体よりゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は、当該分野で公知の方法にしたがって実施すればよく、例えば市販のキット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲ  Ｔｉｓｓｕｅ（ＴＡＫＡＲＡ）等）を用いて実施することができる。
【００３７】
（２）ＤＮＡメチル化レベルの測定
ＤＮＡメチル化レベルの測定は、特に限定されず、（Ａ）バイサルファイト処理してシーケンスする解析方法、（Ｂ）メチル化ＤＮＡを断片化、濃縮してメチル化ＤＮＡを解析する方法、（Ｃ）メチル化感受性の制限酵素を利用した解析方法、（Ｄ）メチル化特異的ＰＣＲ法を利用した解析方法等があり、そのいずれを利用してもよい。
【００３８】
好適な一例として、イルミナ社のビーズアレイ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ）を用いた方法を挙げることができる。この方法では、バイサルファイト処理によりＤＮＡ中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）をウラシルに変換することで、メチル化シトシンを非メチル化シトシンを区別する。そして、サイトごとに特異的な、メチル化用プローブ（Ｍタイプ）と非メチル化用プローブ（Ｕタイプ）の２つのビーズに固定化されたプローブをハイブリダイゼーション後、ラベル化ｄｄＮＴＰを使った１塩基伸長反応を行い、この蛍光強度シグナルから、メチル化と非メチル化の割合を計算する。これにより、網羅的なＤＮＡメチル化分析を簡便に行うことができる。
【００３９】
別な一例として、シーケノム社のＭａｓｓＡＲＲＡＹ法を挙げることができる。この方法では、解析したい領域の塩基配列の違いによる質量の違いを利用してＤＮＡメチル化分析を行う。具体的には、ＤＮＡをバイサルファイト処理により非メチル化シトシンをウラシルに変換し（メチル化シトシンはそのまま）、その相補鎖の塩基ＧとＡの質量差からメチル化の有無を解析する。これにより、大量のサンプルを定量的に短時間に解析することができる。
【００４０】
ＤＮＡメチル化レベルは、検体中のすべての遺伝子について測定してもよいが、特定の遺伝子のメチル化レベルを測定することでがん薬物療法の応答性を判定できることを発明者らは見出した。そのような特定の遺伝子としては、高メチル化群と低メチル化群でβ値に有意な差がある遺伝子群から選ばれる４以上の遺伝子であり、具体的には、表７に示される１０５３の遺伝子群又は表８に示される２４の遺伝子群から選ばれる。例えば、マーカー遺伝子は遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤで示される７遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。あるいは、表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
【００４１】
上記マーカー遺伝子のうち４以上の遺伝子、好ましくは４〜７遺伝子、より好ましくは４〜２０、さらに好ましくは４〜１０遺伝子のメチル化レベルを解析することにより、被験者のがん薬物療法に対する応答性を予測することができる。
【００４２】
２．２  解析・分類工程
（１）ＤＮＡメチル化レベルの解析
次いで、前記測定結果を解析し、被験者を高メチル化群または低メチル化群のいずれかに分類する。ＤＮＡメチル化レベルは、例えば前述したβ値等により定量化することができる。このβ値を、全遺伝子あるいは前記した特定の遺伝子について算出・解析することで、被験者が高メチル化群か低メチル化群かに分類することができる。
【００４３】
（２）高メチル化群と低メチル化群の分類
高メチル化群か低メチル化群かの分類は、あらかじめ取得された大腸癌患者の検体におけるＤＮＡメチル化レベルのプロファイルと比較解析することにより行ってもよいし、データの蓄積により経験的に設定された一定のカットオフ値に基づいて分類してもよい。
発明者らは、本願実施例に示すとおり、前述のマーカー遺伝子について、β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類することができることを見出した。この方法によれば、少なくとも４つのマーカー遺伝子のメチル化レベルに基づき、簡便に被験者を高メチル化群か低メチル化群に分類することができる。
【００４４】
２．３  判定工程
上記の分類結果により、被験者が低メチル化群に分類された場合に前記被験者をがん薬物療法感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合にがん薬物療法抵抗性と判定する。
【００４５】
２．４  治療選択への応用
本発明の方法は、メチル化状態の相違に基づき、大腸癌、とくに治癒切除不能進行再発大腸癌における、化学療法の治療選択に応用できる。すなわち、１次治療を開始する際に、現在ではいずれでも良いとされるイリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法のレジメンを、高メチル化群の患者に関してはイリノテカンベースを使うべきと診断でき、また高メチル化群の患者では、イリノテカンベースで化学療法を開始した場合には、２次治療ではオキサリプラチンベースを用いるべきと診断することができる。一方、低メチル化群の患者では、イリノテカンベースとオキザリプラチンベースの化学療法は、いずれを先に行ってもよいと診断することができる。
【００４６】
本発明の方法では、従来の報告では治療感受性群に分類される症例の中から実際は抵抗性である症例を抽出することができ、より精度の高い治療効果の予測が可能となる。また、がんの進行状態や検体の採取条件にかかわらず、化学療法のみならず、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた分子標的薬を用いた治療法についても、治療効果を正確に判定することができる。
【００４７】
また、本発明の方法では、発現アレイに基づく分類に比べ、治療感受性群と治療抵抗性群との間でより低いｐ値を認めており、治療効果が高い群に濃縮することが可能であり、より高精度の判定を行うことができる。
【００４８】
さらに、後述する実施例に示されるとおり、本発明の方法では、独立した２つの症例群において抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、無増悪生存期間（ＰＦＳ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）、全生存期間（ＯＳ：Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）に有意差を持つ２群を抽出することに成功しており、再現性に優れることも示されている。
【００４９】
進行・再発大腸癌の治療薬として用いられる抗ＥＧＦＲ抗体の投与指針においては、ＫＲＡＳ遺伝子野生型患者のみ本抗体を投与する方法が推奨されている。本発明の方法は、従来のｇｅｎｅｔｉｃな方法とは異なるｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃな方法に基づくものであり、現在の投与指針で本抗体感受性に分類される患者群の中から、本抗体抵抗性の患者を抽出することを可能とするという点で、従来の方法とは根本的に異なる。
【００５０】
３．がん薬物療法に対する応答性予測キット・プローブセット
本発明はまた、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセット及びキットを提供する。
【００５１】
本発明のプローブセットは、表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含む。ここで、メチル化の有無とは、バイサルファイトシーケンシングの場合であれば、メチル化部位のシトシンと非メチル化部位のウラシルを検出可能なプローブを意味する。なお、上記マーカー遺伝子は、好ましくは、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む。
【００５２】
本発明のキットは、
（ａ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表７又は表８記載の遺伝子群から選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含む。
なお、上記マーカー遺伝子は、好ましくは、遺伝子シンボルＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる１以上の遺伝子を含む。あるいは、好ましくは、表８記載の染色体番号と位置情報で特定される２４遺伝子から選ばれる遺伝子を含む。
【００５３】
本発明のプローブセットあるいはキットを用いることにより、大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を簡便かつ高精度に予測することができる。
【００５４】
後述する実施例に示されるとおり、発現アレイに基づく方法と本発明の方法は、いずれも網羅的データを用いて教師なし階層クラスター解析を行うことにより、薬剤感受性の異なるサブブループを同定しているが、メチル化解析に基づく本発明の方法では、薬剤感受性が有意に異なる２群を抽出可能である数個のプローブセットを同定することに成功しているという点で、より実用化に即した発明と言える。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５６】
実施例１：大腸癌４５例を用いた網羅的ＤＮＡメチル化解析
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌４５例より外科的に切除された大腸癌腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ検体）を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。なお、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。【００５７】
各プローブについてβ値（メチル化されているプローブ／メチル化されているプロープ＋メチル化されていないプローブ）を算出し、β値の分布の標準偏差が０．２５を超える３，１６３のプローブを用いて教師なし階層クラスター解析を行った（図１）。【００５８】
上記の結果、解析対象症症例はメチル化レベルの高いＨｉｇｈｌｙ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（ＨＭＣＣ）群（１７例）と、メチル化レベルの低いＬｏｗ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（ＬＭＣＣ）群（２８例）の２群に分類された。【００５９】
上記２群（ＨＭＣＣ群とＬＭＣＣ群）間での高ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率を比較した（表１）。抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率に着目した場合、ＬＭＣＣ群では３６％（１０例）であるのに対し、ＨＭＣＣ群では６％（１例）であり、有意にＬＭＣＣ群が高かった（ｐ＝０．０３）。【００６０】
【表１】
2016060278.tif 000002
【００６１】
抗ＥＧＦＲ抗体薬による無増悪生存期間（ＰＦＳ）に着目した場合、ＬＭＣＣ群では中央値が１９７日、ＨＭＣＣ群では中央値が７２日であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ≦０．００１，ＨＲ＝０．２７：図２Ａ）【００６２】
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）の比較では、ＬＭＣＣ群では中央値が２４．９か月、ＨＭＣＣ群では中央値が５．６か月であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ≦０．００１，ＨＲ＝０．１９：図２Ｂ）。【００６３】
以上の結果より、網羅的ＤＮＡメチル化解析により分類された２群間では抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、ＰＦＳ、ＯＳのいずれにおいても有意差を認めており、治療効果予測が可能であることが強く示された。【００６４】
実施例２：独立した大腸癌５２例による検証
実施例１における４５例とは独立した抗ＥＧＦＲ抗体薬使用歴を有する大腸癌５２例を用いてＩｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋによる網羅的ＤＮＡメチル化解析を行った。実施例１と同様に、対象症例はＳａｎｇｅｒ法にてＫＲＡＳエクソン２に変異を認めない症例とした。【００６５】
実施例１と同様に、各プローブについてβ値（メチル化されているプローブ／メチル化されているプローブ＋メチル化されていないプローブ）を算出し、β値の分布の標準偏差が０．２５を超える２，５７７のプローブを用いて教師なし階層クラスター解析を行った（図３）。【００６６】
上記の結果、解析対象症症例はメチル化レベルの高いＨＭＣＣ群１７例と、メチル化レベルの低いＬＭＣＣ群３５例の２群に分類された。【００６７】
上記２群（ＨＭＣＣ群とＬＭＣＣ群）間での高ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率を比較した（表２）。抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率に着目した場合、ＬＭＣＣ群では３４％（１２例）であるのに対し、ＨＭＣＣ群では６％（１例）であり、有意にＬＭＣＣ群が高かった（ｐ＝０．０３）。【００６８】
【表２】
2016060278.tif 000003
【００６９】
抗ＥＧＦＲ抗体薬による無増悪生存期間（ＰＦＳ）に着目した場合、ＬＭＣＣ群では中央値が１９１日、ＨＭＣＣ群では中央値が７０日であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ＝＜０．００１，ＨＲ＝０．２２：図４Ａ）。【００７０】
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）の比較では、ＬＭＣＣ群では中央値が１４．１か月、ＨＭＣＣ群では中央値が９．３か月であり、有意にＬＭＣＣ群で延長していた（ｐ＝０．０３，ＨＲ＝０．３５：図４Ｂ）。【００７１】
以上の結果より、メチル化状態により分類された２群間では抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の奏効率、ＰＦＳ、ＯＳのいずれにおいても有意差を認めており、実施例１で示された網羅的なメチル化状態の、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測因子としての役割が再現された。【００７２】
実施例３：既存のバイオマーカーとの比較
先述の通り、近年ではＫＲＡＳエクソン２に加え、ＫＲＡＳエクソン２，３，４およびＮＲＡＳエクソン２，３，４に変異を有する症例では抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果に乏しいことが報告され、バイオマーカーとして本邦でも臨床応用されつつある。【００７３】
本研究における解析対象９７例のうち、４９例は全エクソン解析を併せて行っていることから、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測に関し、メチル化に基づく本分類と既存のバイオマーカー（上記ＫＲＡＳとＮＲＡＳを併せてＲＡＳ遺伝子型）による分類とで比較を行った（表３）。【００７４】
【表３】
2016060278.tif 000004
【００７５】
初めに抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率について比較を行った。治療抵抗性群であるＨＭＣＣ群とＲＡＳ変異群における奏効率はいずれも７．７％であり、治療感受性群であるＬＭＣＣ群とＲＡＳ野生群の奏効率はいずれも３３．３％であった。以上の結果より、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬による奏効率において、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示すことが示された。【００７６】
続いて、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無憎悪生存期間（ＰＦＳ）について比較を行った（図５）。いずれの分類においても治療感受性群（ＬＭＣＣ群、ＲＡＳ野生群）で有意にＰＦＳが延長していた。ハザード比（ＨＲ）はそれぞれ０．２６（ＬＭＣＣ群ｖｓ．ＨＭＣＣ群）、０．３２（ＲＡＳ野生群ｖｓ．変異群）であった。以上の結果より、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳにおいて、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。【００７７】
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無憎悪生存期間（ＰＦＳ）に影響を与えうる因子を用いて多変量解析を行った（表４）。メチル化状態による本分類とＲＡＳ遺伝子型による分類でｐ値が０．０５を下回ったハザード比（ＨＲ）は本分類とＲＡＳ遺伝子型による分類とで同等であった。以上の結果より、本分類が抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳの独立した規定因子であることが示され、ハザード比はＲＡＳ遺伝子型による分類と同等であることが示された。【００７８】
【表４】
2016060278.tif 000005
【００７９】
抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後の全生存期間（ＯＳ）について比較を行った（図６）。いずれの分類においても治療感受性群（ＬＭＣＣ群、ＲＡＳ野生群）でＯＳが延長する傾向を認めた。ハザード比（ＨＲ）はそれぞれ０．４２（ＬＭＣＣ群ｖｓ．ＨＭＣＣ群）、０．３９（ＲＡＳ野生群ｖｓ．変異群）であった。いずれの分類法でも２群間で有意差は認めなかったが、本分類は抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後のＯＳにおいても、ＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。【００８０】
以上より、抗ＥＧＦＲ抗体薬の奏効率、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳおよび抗ＥＧＦＲ抗体薬初回投与後のＯＳのいずれにおいても本分類はＲＡＳ遺伝子型による分類と同等の関連性を示した。また、多変量解析の結果から、抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時のＰＦＳにおいて本分類はＲＡＳ遺伝子型とは独立した規定因子であることが示された。【００８１】
実施例４：既知のサブタイプ分類との比較
Ｙａｇｉらは７つの遺伝子のメチル化状態を調べることにより、大腸癌を３つのサブタイプに分類（（ＨＭＥ（高メチル化群）、ＩＭＥ（中メチル化群）、ＬＭＥ（低メチル化群））し、ＩＭＥにはＫＲＡＳ変異を有する症例が濃縮されることを示している（前掲：Ｙａｇｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ  １；１６（１）：２１−３３）。また、ＩＭＥかつＫＲＡＳ変異を有する症例は全生存期間が他の症例群に比べ有意に短縮していることを示している。【００８２】
この７つの遺伝子について我々の症例群におけるメチル化状態を評価し、上記論文で述べられている方法に従って３群に分類した。【００８３】
サブタイプ分類に使用される７つの遺伝子のうち６つは、Ｙａｇｉらが解析した領域に含まれるプローブが抽出されたが、残り１つの遺伝子（ＦＢＮ２）は、Ｙａｇｉらが評価した領域に含まれるプローブがデザインされていないため、ＵＣＳＣのブラウザを用いて同じＣｐＧアイランドに含まれるプローブのなかでＹａｇｉらが評価した領域に近いプローブを抽出した。【００８４】
各マーカーにつき複数のプローブが抽出されたため、例えば３つプローブがある場合は過半数（２つ以上）のプローブでメチル化を認める（β値≧０．５）場合にそのマーカーはメチル化陽性であると判断した。【００８５】
上記の結果、実施例１、実施例２を併せた計９７例は、ＨＭＥ（７例）、ＩＭＥ（１６例）、ＬＭＥ（７４例）の３群に分類された（表５）。【００８６】
【表５】
2016060278.tif 000006
【００８７】
抗ＥＧＦＲ抗体薬使用時の無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値はＨＭＥで８５日、ＩＭＥで６７日、ＬＭＥで１６８であり、ＬＭＥはＨＭＥ、ＩＭＥの両群に比べ有意に無増悪生存期間（ＰＦＳ）が延長する結果であった（ｖｓ．ＨＭＥ  ｐ＝０．００４，ｖｓ．ＩＭＥ  ｐ＝１．１４Ｅ−０６，ｖｓ．ＨＭＥ＋ＩＭＥ  ｐ＝３．２１Ｅ−０７：図７Ｂ）。【００８８】
以上の結果より、メチル化プロファイルによる抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測は数個のプローブに絞ることでも十分に可能であることが示され、実用化に向け現在の網羅的解析に基づく診断法から、限定した領域のメチル化を検出するより簡便な診断法に移行することが可能であることが示された。【００８９】
また、ＨＭＥとＩＭＥに含まれた２３例は実施例１と２において全て高メチル化群に含まれる症例であった。【００９０】
本実施例により、本発明の分類法は、既存のメチル化に基づくサブタイプ分類に比較して、多くのメチル化症例を抽出することが可能であり、また既存のサブタイプ分類では抽出されなかった高メチル化症例も抗ＥＧＦＲ抗体薬に抵抗性であることが示された。すなわち、本発明の方法によれば、既存のサブタイプ分類に比べて、抗ＥＧＦＲ抗体薬による治療感受性をより高い確度で予測できる。【００９１】
実施例１と２における薬剤抵抗性群である高メチル化群の症例は合計３４例であり、実施例３で用いた７つの遺伝子に関するマーカーにさらにいくつかのマーカーを追加することにより、ＬＭＥに含まれる薬剤抵抗性症例と考えらえる１１例を抽出することが可能になると考えられた。【００９２】
実施例５：限定されたプローブ数による分類方法の検討
実施例１及び実施例２に含まれる９７例を用いて限定されたプローブ数による分類方法を検討した。実施例１及び２はそれぞれ抽出された３，１６３、２，５７７のプローブを解析に使用し、教師なしクラスター解析により対象症例を分類したものである。各々の実施例で解析に使用されたプローブのうち、１７４４のプローブが両実施例で共通していた。このうち、ＨＭＣＣ群に分類された症例群とＬＭＣＣ群に分類された症例群の間で、β値に差のある１０５３のプローブを抽出した（表７：実施例の最後に記載する）。【００９３】
抽出された１０５３のプローブのうち、４から１０個のプローブをランダムに抽出し、抽出されたプローブのメチル化状態に従って症例をＨＭＣＣ群もしくはＬＭＣＣ群に分類した。各プローブのメチル化判定は、β値が０．５以上であった場合をメチル化陽性と判定し、０．５を下回った場合はメチル化陰性と判定した。【００９４】
解析に用いたプローブのうち、６０％以上のプローブがメチル化陽性であった場合にその症例はＨＭＣＣ群に分類された（例えば、４つのプローブを使用した場合は３個以上、６個のプローブを使用した場合は４個以上でメチル化が陽性であればＨＭＣＣ群と分類する）。【００９５】
上記の方法で分類された結果について、実施例１及び２における各症例の分類結果を正解として感度及び特異度を計算した。すなわち、感度は実施例１及び２でＨＭＣＣ群と判定された合計３４例のうち、本実施例における方法でもＨＭＣＣ群と判定された症例の割合を示す。一方、特異度は実施例１及び２でＬＭＣＣ群と判定された合計６３例のうち、実施例５における方法でもＬＭＣＣ群と判定された症例の割合を示す。【００９６】
抽出するプローブの数を５種類設定した（４個、５個、６個、７個、１０個）。任意のプローブ抽出と症例の分類及び感度特異度の算出を１セットとし、それぞれの条件でこれを５セット繰り返し、その平均値を各条件での感度特異度とした。各条件で算出された感度特異度を表に示す。【００９７】
【表６】
2016060278.tif 000007
各列最上段のＸ＿Ｙ表記は判定条件を示す。ランダムに抽出されたＸ個のプローブのうち、Ｙ個以上がメチル化陽性であることを示す（例：４＿３は、抽出された４個のプローブのうち３個以上がメチル化陽性）。【００９８】
この結果から、今回抽出された１０５３のプローブリストのうち、少なくとも４個のプローブをランダムに抽出することで８３．５％の感度、９３．７％の特異度で症例群を分類可能であることが示された。【００９９】
上記の結果から、表７の１０５３のプローブリストから選ばれる数個のプローブのメチル化状態を評価することで、実用化に十分な感度及び特異度で、より簡便に抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果を予測可能なことが示された。【０１００】
実施例６：進行性再発大腸癌における治療成績とメチル化分類の相関
１）１次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌９４例について、実施例１にしたがって網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３４例）とＬＭＣＣ群（６０例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。【０１０１】
その結果、ＨＭＣＣ群では、オキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図８）。従って、本発明のメチル化分類は進行再発大腸癌の１次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。【０１０２】
２）２次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。【０１０３】
その結果、ＨＭＣＣ群では、イリノテカンを含む併用療法（破線）がオキサリプラチンを含む併用療法（実線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＬＭＣＣ群ではオキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図９）。以上より、本発明のメチル化分類は進行再発大腸癌の２次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。【０１０４】
３）１次、２次治療成績とメチル化分類の相関
進行再発大腸癌８４例について、網羅的メチル化解析を行い、ＨＭＣＣ群（３１例）とＬＭＣＣ群（５３例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績及び全生存期間を比較した。【０１０５】
その結果、ＨＭＣＣ群では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図１０Ａ）。一方、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１０Ｂ）。【０１０６】
また、ＨＭＣＣ群では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも全生存期間が有意に短縮していた（図１１Ａ）。一方、ＬＭＣＣ群では両治療法の間で全生存期間の差を認めなかった（図１１Ｂ）。【０１０７】
以上より、メチル化分類は進行再発大腸癌の１次治療及び２次治療における治療選択のみならず、１次治療、２次治療の順番を選択するためのバイオマーカーとしても有用と考えられた。【０１０８】
実施例７：進行性再発大腸癌における治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
１）１次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌１０８例について、公知の方法にしたがいＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（２４例）とＣＩＭＰ陰性（８４例）に分類し、それぞれの群で１次治療の無増悪生存期間を比較した。【０１０９】
ＣＩＭＰ陽性では、オキサリプラチンを含む併用療法（実線）がイリノテカンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めたが、ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１２）。従って、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の１次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。【０１１０】
２）２次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌７８例について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で２次治療の無増悪生存期間を比較した。【０１１１】
その結果、ＣＩＭＰ陽性では、イリノテカンを含む併用療法（実線）がオキサリプラチンを含む併用療法（破線）に比べ、無増悪生存期間が短い傾向を認めた（図１３Ａ）。一方、ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１３Ｂ）。従って、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の２次治療における治療選択のためのバイオマーカーとして有用と考えられた。【０１１２】
３）１次、２次治療成績とＣＩＭＰ分類の相関
進行再発大腸癌（７８例）について、ＣＩＭＰ解析を行い、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類し、それぞれの群で１次、２次治療におけるオキサリプラチンあるいはイリノテカンを含む併用療法の治療成績を比較した。【０１１３】
その結果、ＣＩＭＰ陽性では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群（実線）が、その逆の順番で行った群（破線）よりも、有意に無増悪生存期間が短かった（図１４Ａ）。ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１４Ｂ）。【０１１４】
進行再発大腸癌において１次治療を行った１０８例、及び２次治療に進んだ７８例について、ＣＩＭＰ解析を行い、それぞれＣＩＭＰ陽性（２４例）とＣＩＭＰ陰性（８４例）、ＣＩＭＰ陽性（１７例）とＣＩＭＰ陰性（６１例）に分類した。【０１１５】
ＣＩＭＰ陽性の症例では、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、２次治療ではイリノテカンを含む併用療法の無増悪生存期間が短い傾向があった（図１５Ａ、Ｃ）。一方、１次から２次治療を継続して解析すると、１次治療にオキサリプラチンを含む併用療法、続く２次治療にイリノテカンを含む併用療法を行った群が、その逆の順番で行った群よりも、有意に無増悪生存期間が短かった（図１５Ｅ）。ＣＩＭＰ陰性群では両治療法の間で無増悪生存期間の差を認めなかった（図１５Ｂ、Ｄ、Ｆ）。【０１１６】
以上より、ＣＩＭＰ分類は進行再発大腸癌の１次治療及び２次治療における治療選択のみならず、１次治療、２次治療の順番を選択するためのバイオマーカーとしても有用と考えられた。【０１１７】
【表７】
2016060278.tif 000008
2016060278.tif 000009
2016060278.tif 000010
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【０１１８】
実施例８：２つのコホートにおけるプローブの絞り込みと検証
実施例１及び２の患者群をそれぞれ第１コホート（Ｃ１）及び第２コホート（Ｃ２）として、以下の手順で、解析に使用するプローブの絞り込みと検証を行った（図１６）。
１）まず、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔというアルゴリズムを用いて、ＨＭＣＣとＬＭＣＣの分類に関する予測モデルを作成した。
２）第１コホート抽出された３，１６３プローブ及び第２コホートで抽出された２，５７７プローブのうち、共通する１７４４のプローブを抽出した。
３）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ  ＦｏｒｅｓｔによりＣ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した。
４）抽出した１７４４のプローブを用いて、Ｒａｎｄｏｍ  ＦｏｒｅｓｔによりＣ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した。
５）上記３）及び４）においてＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓがモデルを作る時の変数の重要性を確認し、０．００２以上で変数を絞り込んだ。
６）上記５）の結果、Ｃ１モデルから１４０プローブ、Ｃ２モデルから１２８プローブが抽出された。
７）上記６）において、共通プローブを抽出すると２４プローブが残った。
８）この２４プローブを用いて３）、４）の予測を行った。
８−１）Ｃ１でモデルを作り、Ｃ２の分類結果を予測した場合は正解率が９８．１％であった（１例のみ正解と異なっていた）。
８−２）Ｃ２でモデルを作り、Ｃ１の分類結果を予測した場合は正解率が１００％であった。【０１１９】
抽出された２４プローブを表８に示す。２４のプローブを用いて、スライドに示した条件を設定し、解析に用いた９７症例を分類しなおした結果を図１７に示す。本分類では、各プローブにおいて、β値が０．５以上である場合にメチル化陽性とした。また、２４のプローブのうち、メチル化陽性のプローブが１６個以上である場合ＨＭＣＣ群、メチル化陽性のプローブが１５個以下の場合ＬＭＣＣ群とした。【０１２０】
【表８】
2016060278.tif 000021
表中、各遺伝子、染色体番号と位置情報で特定される。
例えば、染色体番号が３、位置情報が１５０８０２９９７と記載されている場合は、３番染色体の１５０８０２９９７に存在する特定の１塩基がメチル化されているということを表わす。本分類で述べているメチル化とは、「ヒトゲノム上に存在するある特定の箇所の１塩基がメチル化されている」ことを意味する。【０１２１】
互いのコホートで作成したモデルを用いて、もう一方のコホートを分類した結果、いずれにおいても正解率が９割以上であったことから、各コホートにおける分類の再現性は高く、また両コホートの分類に効いている変数（プローブ）は同様の傾向を示すものから構成されていると考えられた。さらに、互いのコホートで作成したモデルに使用されたプローブのうち、共通する２４個のプローブを用いて再度それぞれのコホートでランダムフォレストを用いてモデルを作成し、もう一方のコホートを分類した結果、１例を除いて全ての症例が正確に分類された。【０１２２】
以上の結果から、抽出された２４プローブを用いることで、３１４４もしくは２５７７のプローブを用いた場合とほぼ同等の精度でＨＭＣＣもしくはＬＭＣＣの分類が可能となることが示された。
すなわち、臨床応用に向けたより簡便な検出系への移行が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の方法は、検体採取条件による結果のばらつきが少なく、原発巣切除の際に採取した検体であっても、治療開始時点の腫瘍におけるメチル化プロファイルと同等の結果が得られる。また、本発明の方法は、併用療法における１次治療及び２次治療の選択のみならず、その適用順序の適否も判定できるため、患者や疾患の状態に応じた最適な治療計画を提供することができる。すなわち、本発明によれば、がん薬物療法に対する応答性を高精度で予測し、患者の経済的・身体的負担を低減し、より費用対効果の高い投与指針を提供することができる。【０１２４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
2016060278.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016060278.tif 000029
【図９】
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【図１０】
2016060278.tif 000031
【図１１】
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【図１２】
2016060278.tif 000033
【図１３】
2016060278.tif 000034
【図１４】
2016060278.tif 000035
【図１５】
2016060278.tif 000036
【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月3日(2016.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌患者の抗ＥＧＦＲ抗体を用いたがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって：
（１）被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のＤＮＡを含む検体中のＤＮＡメチル化レベルを測定する工程、
（２）β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
（３）低メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗ＥＧＦＲ抗体感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗ＥＧＦＲ抗体抵抗性と判定する工程、を含み、
表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤの遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項１、５及び６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定できることを特徴とする、請求項１及び５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット。
【請求項１３】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項１２記載のプローブセット。
【請求項１４】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
（ａ）表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記ＣｐＧ部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
（ｂ）表８記載の２４遺伝子又はＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＬＯＸ、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＥＬＭＯ１、ＨＡＮＤ１、ＩＢＮ２、及びＴＨＢＤから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのＣｐＧ部位を含む領域に結合し、前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット。
【請求項１５】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項１４記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月27日(2017.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌患者の抗EGFR抗体を用いたがん薬物療法に対する応答性を予測する方法であって：
(1)被験者の大腸癌組織、大腸癌細胞、又は大腸癌細胞由来のDNAを含む検体中のDNAメチル化レベルを測定する工程、
(2)β値が０．５以上の遺伝子をメチル化陽性とし、メチル化陽性の遺伝子の割合が６０％以上の場合に当該被験者を高メチル化群に、６０％未満である場合に低メチル化群に分類する工程、及び
(3)低メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗EGFR抗体感受性と判定し、高メチル化群に分類された場合に前記被験者を抗EGFR抗体抵抗性と判定する工程、を含み、
表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる少なくとも４以上のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４〜２０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDの遺伝子群から選ばれる４〜１０のマーカー遺伝子を対象として解析を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
複数のがん薬物療法の適用順序の適否を判定できることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのプローブセットであって、
表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記CpG部位のメチル化の有無を検出可能なプローブを含むプローブセット。
【請求項７】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項６記載のプローブセット。
【請求項８】
大腸癌患者のがん薬物療法に対する応答性を予測するためのキットであって、
(a)表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域と相補的な配列を含み、前記CpG部位のメチル化の有無を検出可能なプローブ、及び
(b)表８記載の２４遺伝子又はCACNA1G、LOX、SLC30A10、ELMO1、HAND1、IBN2、及びTHBDから選ばれる４以上のマーカー遺伝子について、その少なくとも１つのCpG部位を含む領域に結合し、前記CpG領域を含む領域を増幅可能なプライマーペア、を含むキット。
【請求項９】
マーカー遺伝子が表８記載の２４遺伝子である、請求項８記載のキット。
【国際調査報告】
2016060278.tif 000039
2016060278.tif 000040
2016060278.tif 000041
2016060278.tif 000042