(57)【要約】  コリモナス（Collimonas）属細菌を長期に保存するのに適した新規な培養方法及び保存方法を提供すること  米ぬか培地及び／又はおから培地を含む培地にてコリモナス属細菌を密封状態で培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。  当該培養したコリモナス属細菌を常温下で保存することを特徴とするコリモナス属細菌の保存方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米ぬか培地及び／又はおから培地を含む培地にてコリモナス属細菌を密封状態で培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。
【請求項２】
前記米ぬか培地及び／又はおから培地を含む培地に、添加剤として緑色凝灰岩を添加する
ことを特徴とする請求項１記載のコリモナス属細菌の培養方法。
【請求項３】
緑色凝灰岩を含む培地にてコリモナス属細菌を培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。
【請求項４】
請求項３において、前記緑色凝灰岩の重量と培養液の水分量との比率を７：３に調整してコリモナス属細菌を培養する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法。
【請求項５】
請求項1乃至４何れか一項において、培養後のコリモナス属細菌を常温下で保存する
ことを特徴とするコリモナス属細菌の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、微生物の培養方法に関し、特に、コリモナス属細菌の長期保存に適した培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリモナス（Collimonas）属細菌は、植物性病原菌の増殖を抑制する微生物として知られており、様々な研究が行われている。コリモナス（Collimonas）属細菌による植物性病原菌の増殖を抑制する作用が明らかになれば、当該細菌の微生物農薬への実用が期待できる。【０００３】
微生物農薬に含有される微生物には、各微生物が備える作用を発揮させるため、高い保存性が望まれている。【０００４】
微生物の保存には凍結保存乾燥方法や、特許文献１に提案されている凍結保存乾燥方法を利用した保存方法等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２４３７８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者らは、上述した従来知られている微生物の保存方法以外にも長期に保存可能な微生物の保存方法を得るため鋭意研究を重ねた。【０００７】
その結果、ある培地条件下で、又は前培養後、添加剤として緑色凝灰岩である十和田石を添加することで、コリモナス（Collimonas）属細菌を１年近くにわたり保存させることに成功した。【０００８】
そこで、この発明は、コリモナス（Collimonas）属細菌を長期に保存するのに適した新規な培養方法及び保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、以下の発明を提案する。【００１０】
請求項１の発明は、
米ぬか培地及び／又はおから培地を含む培地にてコリモナス属細菌を密封状態で培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。【００１１】
請求項２の発明は、
前記米ぬか培地及び／又はおから培地を含む培地に、添加剤として緑色凝灰岩を添加することを特徴とする請求項１記載のコリモナス属細菌の培養方法である。【００１２】
請求項３の発明は、
緑色凝灰岩を含む培地にてコリモナス属細菌を培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。【００１３】
請求項４の発明は、
請求項３において、前記緑色凝灰岩の重量と培養液の水分量との比率を７：３に調整してコリモナス属細菌を培養することを特徴とするコリモナス属細菌の培養方法である。【００１４】
請求項５の発明は、
請求項1乃至４何れか一項において、培養後のコリモナス属細菌を常温下で保存することを特徴とするコリモナス属細菌の保存方法である。
【発明の効果】
【００１５】
この発明によれば、コリモナス（Collimonas）属細菌を長期に保存するのに適した新規な培養方法及び保存方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）米ぬか・おから培地におけるＤ−２５株の生菌数算定結果を表す図、（ｂ）おから培地におけるＤ−２５株の生菌数算定結果を表す図、（ｃ）米ぬか培地におけるＤ−２５株の生菌数算定結果を表す図である。
【図２】十和田石粉末にＤ−２５株を植菌した状態を表すであって、左から、０．９ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌したもの、０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、２００μＬの減菌水を加えたもの、０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、４００μＬの減菌水を加えたものである。
【図３】図２図示の状態から４日間培養後のＤ−２５株の生育状態を表す図であって、（ａ）０．９ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌したもの、（ｂ）０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、２００μＬの減菌水を加えたもの、（ｃ）０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、４００μＬの減菌水を加えたものである。
【図４】十和田石を含む培地にＤ−２５株を植菌して培養後、真空乾燥処理後のＤ−２５株の生育状態を表す図であって、（ａ）０．９ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌したもの、（ｂ）０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、２００μＬの減菌水を加えたもの、（ｃ）０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、４００μＬの減菌水を加えたものである。
【図５】十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液及び減菌水を含む水分の水分量との比を７：３、５：５と調製したサンプルを作製し、それぞれのＤ−２５株の生菌数を算定したグラフである。
【図６】十和田石粉末にＤ−２５株を植菌した状態を表すであって、左から、０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を２００μＬ添加したもの、０．６ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を３００μＬ添加したもの、０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の菌液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を４００μＬ添加したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
この実施形態で使用する微生物は、コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）に属する微生物とした。コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）に属する微生物としては、Ｄ−２５株、Ｃａｌ２株、Ｃａｌ３１株が挙げられる。これらのうち、Ｄ−２５株の菌学的性質は表１〜表３の通りである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００１９】
表１〜表３に記載の菌額的性質を有するＤ−２５株をコリモナス（Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２３年６月９日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４として寄託されている。
【００２０】
この実施形態で使用される添加剤としての十和田石は、秋田県大館市比内町で採掘される緑色凝灰岩で、正式名称は「石英安山岩質浮石質凝灰岩」といい、「グリーンタフ」という名称で知られている。
【００２１】
十和田石は、鉱物組成として、石英や曹長石や緑泥石などを含む複合鉱石でありミネラルを多く含む特徴を持つ。また、十和田石は多孔質であることから物質の吸着・放出などの働きをもち、農業肥料としても利用されている。十和田石の主な組成を表４に示す。
【表４】
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【実施例１】
【００２２】
コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）Ｄ−２５株（以下「Ｄ−２５株」という）の米ぬか・おから培地およびＲ２Ａ培地におけるグリセリン、十和田石添加によるＤ−２５株の保存を試みた。【００２３】
前培養における培地をＲ２Ａ培地とし、本培養における培地を米ぬか・おから培地、Ｒ２Ａ培地とし、本培養における培地への添加材として、グリセリン、十和田石とした。Ｒ２Ａ培地の組成は以下の通りである。【００２４】
（Ｒ２Ａ培地組成（１Ｌ当たりの含有量））
ペプトン：０．５ｇ
酵母エキス：０．５ｇ
カザミノ酸：０．５ｇ
グルコース：０．５ｇ
可溶性デンプン：０．５ｇ
ピルビン酸Ｎａ ：０．５ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4：０．３ｇ
ＭｇＳＯ4：０．０５ｇ【００２５】
（実験方法）
Ｒ２Ａ培地２ｍＬにＤ−２５株を爪楊枝で植菌し、２日間、２４℃、２００ ｒｐｍで前培養をし、生菌数算定を行った。【００２６】
前培養後、Ｒ２Ａ培地１０ｍＬ、米ぬか・おから培地１０ｍＬ（米ぬか、おから各１％（ｗ／ｖ））それぞれにＤ−２５株を２％植菌し、６日間、２４℃、２００ ｒｐｍで本培養を行った。【００２７】
培養６日目のＲ２Ａ培地、米ぬか・おから培地各菌液１０００μＬを１．５ ｍＬサンプルチューブに分注し、５０００ ｒｐｍ、３分間遠心分離を行い、上清を捨て、菌体を得た。【００２８】
各菌体のみのサンプルチューブを４本準備し、当該４本のサンプルチューブそれぞれに、グリセリン濃度０％（滅菌蒸留水のみ）、１０％（Ｗ／Ｗ）、３０％（Ｗ／Ｗ）、５０％（Ｗ／Ｗ） 水溶液を１ｍＬ加え、パラフィルムで密閉後、２４℃で静置した。【００２９】
また、前記培養６日目のＲ２Ａ培地、米ぬか・おから培地各菌液からの菌体を得て、別に各菌体のみのサンプルチューブを２本準備し、当該２本のサンプルチューブそれぞれに、滅菌水２００μＬを加え、さらに滅菌処理した十和田石を０．５ｇ、１．０ｇを加え、よくボルテックスにかけパラフィルムで開封口をしっかり巻き２４℃で静置した。【００３０】
前記Ｒ２Ａ培地、米ぬか・おから培地で本培養をしたサンプルは、０日目、２日目、４日目、６日目の生菌数算定を行った。前記グリセリンを加えたサンプルは、３日目、６日目の生菌数算定を行った。前記十和田石を加えたサンプルは６日目の生菌数算定を行った。【００３１】
（結果）
Ｒ２Ａ培地で前培養を行ったＤ−２５株について、培養２日目の生菌数は、５．６７×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。表５〜表７それぞれに、前記Ｒ２Ａ培地、米ぬか・おから培地で本培養をしたサンプル、前記グリセリンを加えたサンプル、前記十和田石を加えたサンプルにおけるＤ−２５株の生菌数算定結果を示す。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００３２】
（考察）
米ぬか・おから培地とＲ２Ａ培地でＤ−２５株を培養したものを比較すると、全体的に米ぬか・おから培地における増殖が良く、生菌数も長期間維持できている（表５）。更に、常温下で、８ヶ月経過後も１０８ｃｆｕ／ｍｌを維持している。これは、米ぬか・おから培地において、遠心分離をした際に培地成分の持込（沈殿として米ぬか・おからの一部が沈殿する）が多いため、生菌数を長く維持できたと考えられる。【００３３】
コリモナス（Collimonas）属細菌は、貧栄養環境で増殖をする微生物、例えば、Ｒ２Ａ培地において増殖し、栄養分が多い培地では増殖し難い微生物として知られている。また、その保存に関しては、４℃以下の低温での保管が公知となっている。【００３４】
上述のＤ−２５株の生菌数算定結果より、上述したＲ２Ａ培地に比べ栄養分が多い米ぬか、おから培地でも増殖することが確認され、尚且つ、密封条件であれば、常温下で8ヶ月間に渡って、その菌数を維持することが確認できた。【００３５】
更に、密閉できる容器に、滅菌処理した十和田石を入れ、Ｄ−２５株を添加し、少量の水を加えれば、見た目としては粉末状で保存することができると考えられる（表７）。この方法であれば、真空乾燥や凍結乾燥による菌体の死滅を防ぐことができる。
【実施例２】
【００３６】
Ｄ−２５株の米ぬか培地もしくはおから培地、又は米ぬか・おから培地におけるＤ−２５株の保存を試みた。前培養における培地は実施例１に記載のＲ２Ａ培地と同様である。【００３７】
（実験方法）
Ｒ２Ａ培地２ｍＬにＤ−２５株を爪楊枝で植菌し、２日間、２４℃、２００ ｒｐｍで前培養を行った。前培養後、培養液を６０００ ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を取り除き、等量の生理食塩水を加え、これを植菌用の菌液とした。【００３８】
フラスコに１００ｍＬのおから・米ぬか培地（各１％（ｗ／ｖ））、おから培地（１％（ｗ／ｖ））、米ぬか培地（１％（ｗ／ｖ））を作製し、先ほど作製した菌液１００μＬを加え植菌した。植菌後６日間、２４℃、２００ ｒｐｍで振とう培養し、生菌数算定を行った。【００３９】
その後、フラスコからボトルに培養液を移し変え、静地培養を行った。生菌数算定は、最初の4週間は1週間ごとに、その後は1ヶ月ごとに生菌数算定を行った。前記３種の培養液におけるＤ−２５株の生菌数算定結果を図１に示す。【００４０】
（結果及び考察）
おから・米ぬか培地では６日目に１０１０ｃｆｕ／ｍｌまで増殖し（図１（ａ））、おから培地、米ぬか培地ではそれぞれ１０９ｃｆｕ／ｍｌまで増殖した（図１（ｂ）、（ｃ））。【００４１】
ボトルに移して１週間後、それぞれの培地で１０２ｃｆｕ／ｍｌ減少した（図１）。空気が遮断されたことと静地培養が影響したと考えられる。【００４２】
ボトルに移した後、おから・米ぬか培地では２週間で生菌数が１０倍になり、その後２ヵ月後まで１０８ｃｆｕ／ｍｌを保持した（図１（ａ））。【００４３】
おから培地では２週間後生菌数が１／１０になり、３週間後に再び１０倍に増えた。その後は１０７ｃｆｕ／ｍｌを保持した（図１（ｂ））。【００４４】
米ぬか培地では３週間後に１／１０になり、その後１０６ｃｆｕ／ｍｌを保持した。【００４５】
この実施例でも米ぬか、おから培地でＤ−２５株が増殖することが確認され、生菌数も一定数を保持することが確認された。
【実施例３】
【００４６】
Ｄ−２５株、コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）Ｃａｌ２株（以下「Ｃａｌ２株」という）、コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）Ｃａｌ３１株（以下「Ｃａｌ３１株」という）それぞれの米ぬか・おから培地における菌株の保存を試みた。前培養における培地は実施例１に記載のＲ２Ａ培地と同様である。【００４７】
（実験方法）
Ｒ２Ａ培地、４℃で保存していたＤ−２５株、Ｃａｌ２株、Ｃａｌ３１株それぞれを新しいＲ２Ａ液体培地に植菌し、２４℃で２日間前培養を行った。【００４８】
前培養後、米ぬか及びおからを各１％添加した培地を２０ｍＬ作製し、前培養液を２００μＬ植菌した（１％植菌）。植菌後、２４℃、３日間、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。【００４９】
培養後、生菌数算定を行いＣａｌ２株、Ｃａｌ３１株についてＤ−２５株と同様の生育を示すかを確認した。【００５０】
（結果）
Ｒ２Ａ培地で前培養を行ったＣａｌ２株、Ｃａｌ３１株、Ｄ−２５株について、前培養後の生菌数はそれぞれ以下の通りであった。  
Ｄ−２５株 : ４．３×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ
Ｃａｌ２株：１．８×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ
Ｃａｌ３１株 : ５．３×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ
表８に、Ｃａｌ２株、Ｃａｌ３１株、Ｄ−２５株の生菌数算定結果を示す。
【表８】
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【００５１】
Ｃａｌ２株、Ｃａｌ３１株について、どちらも米ぬか・おから培地で３日間培養すると１０９ｃｆｕ／ｍｌまで生育することが分かった。Ｄ−２５株についてもＣａｌ２株、Ｃａｌ３１株に比べてやや高い生菌数を示した。【００５２】
本実施例により、コリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）に属する菌株が米ぬか、おから培地で増殖すること及び生菌数も一定数を保持することが可能であると示唆された。【００５３】
[参考例１]
＜Ｄ−２５株を使用した微生物製剤の作製＞
実施例３において米ぬか・おから培地で培養したＤ−２５株の培養液を用いて、微生物製剤作製のための実験を行った。【００５４】
Ｄ−２５株を固定するための担体として、十和田石を粉末状に処理したものを使用した。【００５５】
（実験方法）
実施例３で作製した米ぬか・おから培地によるＤ−２５株の培養液を２ｍＬ 遠心チューブ（１５ｍＬ容）に分注した。生菌数は１．５×１０１０ ｃｆｕ／２ｍＬであった。【００５６】
乾熱滅菌処理を行った十和田石粉末を用意し、その５ｇ をＤ−２５株の培養液が入った前記遠心チューブに添加し、マザーズ小型リアクターで攪拌した。攪拌は上下の取り付け位置を換え、１分間を計３回行った。攪拌中、十和田石の粒径の大きな塊がいくつかできたが、白金耳でつぶすことにより処理を行った。【００５７】
作製した製剤を０．２ｇ 秤量し、滅菌水を１ｍＬ加え、これを用いてＤ−２５株の生菌数算定を行った。【００５８】
（結果）
十和田石を添加したＤ−２５株の生菌数は５．５×１０７ｃｆｕ／ｇとなり、１０７ｃｆｕ／ｇ程の微生物製剤を作製することができた。生菌数が低下してしまった要因としては、攪拌が激しすぎたことが挙げられる。しかしコリモナス  スピーシーズ（Collimonas  sp.）は菌量を短時間で多量に確保できるので、初期の投入量を増やすことでカバーできると考えられる。
【実施例４】
【００５９】
実施例１において、Ｄ−２５株の培養液に十和田石を添加すると、Ｄ−２５株を粉状で保存することが可能であると考えられたため、本実施例でコリモナス（Collimonas）属細菌の生育に適した十和田石粉末と水分含量の検討を行った。【００６０】
本実施例で使用するコリモナス（Collimonas）属細菌をＤ−２５株とし、Ｄ−２５株を固定するための担体として、十和田石を１μｍ〜８０μｍの粉末状に処理したものを使用した。【００６１】
（実験方法）
十和田石の粉末を０．９ｇ、 ０．７ｇ、 ０．５ｇ 秤量し、試験管に分注後、乾熱滅菌器にて滅菌処理を行った。【００６２】
あらかじめ、Ｒ２Ａ培地から１／１０ＴＳＢ培地に植菌し、前培養を行っていたコリモナスＤ−２５の前培養液を作製し、０．９ｇの十和田石粉末に前記前培養液を１００μＬ植菌したもの（サンプル１）、０．７ｇの十和田石粉末に前記前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水２００μＬ加えたもの（サンプル２）、０．５ｇの十和田石粉末に前記前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水４００μＬ加えたもの（サンプル３）を準備した。植菌後、室温で培養した。その状態を表したものを図２に示す。前培養したＤ−２５株の生菌数は７．０×１０５ ｃｆｕ／ｍＬ であった。【００６３】
４日間の培養後、生菌数を測定するため、各サンプルに滅菌水を３ｍＬ加え、ボルテックスで３０秒間攪拌した。攪拌後、１０分間静置し、十和田石粉末を沈殿させた後上清を用いてＤ−２５株の生菌数の算定を行った。【００６４】
（結果）
表９にＤ−２５株の生菌数算定結果を表す。なお、生菌数は、３ｍＬの滅菌水を加えた時の値を示す。また、算定時のＤ−２５株の状態を図３に表す。
【表９】
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【００６５】
サンプル１については、Ｄ−２５株の生育が見られなかった。図３（ａ）中白く見えるものは、十和田石の粉末だと思われる。【００６６】
サンプル２及びサンプル３については、Ｄ−２５株の生育が確認された。特に、サンプル３では、１０４ｃｆｕ／ｍＬまで生菌が確認された。
【実施例５】
【００６７】
実施例４において、十和田石粉末にＤ−２５株を植菌し、減菌水を加えるとＤ−２５株の生育が確認できたので、本実施例では、Ｄ−２５株の生育に適した十和田石と水分含有量の重量比を確認する実験を行った。【００６８】
（実験方法１）
十和田石を含む培地でＤ−２５株を一週間培養後、真空乾燥を３日間行い（減圧処理は１回、３０秒程度）水分を除去した。乾燥後、滅菌水を３ｍＬ加え懸濁し、懸濁液中の生菌数を算定した。【００６９】
＜作製したサンプル＞
０．９ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌したもの
０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水２００μＬ加えたもの
０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水４００μＬ加えたもの【００７０】
（結果）
生菌数算定の結果、どのサンプルでも、図４図示のようにＤ−２５株の生育を確認することはできなかったので、死滅したと考えられる。【００７１】
（実験方法２）
十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液及び減菌水を含む水分の水分量との比を７：３、５：５に調整したサンプルを作製し、それぞれのＤ−２５株の生菌数を算定した。【００７２】
（結果）
図５図示のように、一週間以上の生存が認められ、１０６ｃｆｕ／ｍＬ程度の生菌数が保持されていることが確認された。【００７３】
（実験方法３）
上述した実験方法１において、Ｄ−２５株の培養後、真空乾燥処理を行うとコリモナスが死滅するため、滅菌水の代わりにＴＳＢ及びグリセリン３％を添加し培養を試みた。なお、Ｄ−２５株の前培養液の生菌数は２．６×１０７ｃｆｕ／ｍＬであった。【００７４】
作製したサンプルにて４日間培養後、滅菌水を３ｍＬ加え懸濁液とし、生菌数算定を行った。【００７５】
＜作製したサンプル＞
サンプル１：０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を２００μＬ添加したもの
（十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液を含む水分の水分量との比が７：３）
サンプル２：０．６ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を３００μＬ添加したもの
（十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液を含む水分の水分量との比が６：４）
サンプル３：０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、ＴＳＢ及びグリセリン３％を４００μＬ添加したもの
（十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液を含む水分の水分量との比が５：５）【００７６】
（結果）
生菌数算定の結果を表１０に表す。
【表１０】
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【００７７】
図５図示されているように、０．５ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水４００μＬ加えたものでは、１０８ｃｆｕ／ｍＬ程の生菌数が得られているため、本実施例におけるサンプル１ではこれと同等の結果が得られている。【００７８】
本実施例により、十和田石だけでなく、ＴＳＢ培地（菌液分若干希釈されている）と十和田石でもＤ−２５株の培養ができることが確認された。【００７９】
また、十和田石の重量とＤ−２５株の前培養液を含む水分の水分量との比が７：３の場合、Ｄ−２５株の培養を促進させることができ、長期の保存が可能であることが示唆された。【００８０】
[参考例]
実施例４及び５において、十和田石粉末にＤ−２５株を植菌し、減菌水を加えるとＤ−２５株の生育が確認できたので、参考例として、十和田石粉末、Ｄ−２５株の条件を変えてＤ−２５株の生育状態を確認すると共に、コリモナス（Collimonas）属細菌の植物病原菌に対する抑制効果を観察する実験を行った。【００８１】
＜作製したサンプル＞
サンプル１：０．７ｇの十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水を２００μＬ添加したもの
サンプル２：Ｄ−２５株の前培養液１００μＬに、減菌水を９００μＬ添加したもの
サンプル３：０．７ｇの減菌処理していない十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水を３００μＬ添加したもの
サンプル４：０．７ｇの減菌処理した十和田石粉末にＤ−２５株の前培養液を１００μＬ植菌し、減菌水を３００μＬ添加したもの【００８２】
（実験方法）
コリモナスＤ−２５株を１／１０ＴＳＢ培地で４日間、２４℃で振とう前培養を行った。前培養後の生菌数は２．６×１０７ｃｆｕ／ｍＬであった。【００８３】
各サンプルを作製後、室温で２日間静置培養し、各サンプルに滅菌水を３ｍＬ添加してボルテックスを用いて攪拌した。攪拌した培養液のＤ−２５について、１／１０ＴＳＡ培地を用いて生菌数算定を行った。【００８４】
また、各サンプルに係る培養液を１０μＬＴＳＡおよび１／１０ ＴＳＡ培地に植菌し、同時にリゾクトニアの寒天切片を植菌した。培養は、室温で行いＤ−２５株のリゾクトニアに対して抑制するか観察を行った。【００８５】
（結果）
（１）生菌数算定結果
生菌数算定の結果を表１１に表す。
【表１１】
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【００８６】
サンプル２でも増殖が認められることから、十和田石からの栄養分の溶出よりも、前培養の１／１０ＴＳＢの持ちこみの栄養分による増殖と考える方が適当であると思われる。【００８７】
（２）植物病原菌に対する抑制効果
十和田石でＤ−２５を培養し植物病原菌に対する抑制効果を確認すると、Ｄ−２５のみに比べ阻止円の形成がよりはっきりとしていた。【００８８】
また、十和田石を滅菌処理せず抑制効果の実験を行なうと、かなり大きな阻止円を形成した。【００８９】
前者については、十和田石を添加すると十和田石のミネラルなどの影響によって微生物の増殖およびキチナーゼなどの食菌作用を強化するような遺伝子の発現が行われていると推測される。【００９０】
後者については、目視で確認しても数種類のバクテリアとカビが十和田石には常在しており、阻止円の境界は菌糸生長の阻害のようなものが確認されているため、抗菌活性が強い微生物の存在が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
この発明によれば、コリモナス（Collimonas）属細菌を長期にわたり保存することが可能なので、当該細菌を微生物農薬として利用することができる。【００９２】
また、緑色凝灰岩を担体とすることも可能なので、植物種子のコーティング材として利用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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