(57)【要約】  比活性が安定なリコンビナントコラゲナーゼおよび当該リコンビナントを含む細胞分離用酵素剤を提供する。Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼである。得られたリコンビナントコラゲナーゼは、比活性が高く、かつ安定している。
2015133636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、
少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
【請求項２】
前記リンカー領域は、いずれかのアミド結合で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、請求項１記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
【請求項３】
前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることを特徴とする、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
【請求項４】
前記リンカー断片は、前記リンカー領域に含まれる−Ｇ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｙ２−（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
【請求項５】
前記リンカー断片のＣ末端は、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ、−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、または−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒのいずれかであるリコンビナントコラゲナーゼである、請求項２記載のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のリコンビナントコラゲナーゼを含む、細胞分離用酵素剤。
【請求項７】
膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織、骨、軟骨、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織および繊維芽細胞からなる群から選択される１以上の細胞の分離に使用されることを特徴とする、請求項６記載の細胞分離用酵素剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ、および細胞分離用酵素剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓には、消化酵素を十二指腸内へ分泌する外分泌腺と、内分泌腺の膵島とが含まれる。膵臓から、血糖の濃度調節に重要な役割を果たしている膵島を分離および精製し、インスリン依存状態にある１型糖尿病などの患者に移植する療法を、膵島移植という。膵島は点滴の要領で体内に注入できるため低侵襲であり、患者の身体的負担が低い。【０００３】
一方、膵臓の約９割は外分泌腺であり、膵島を分離する技術は難しく、その成功率は極めて低い。現在、細胞分離用の酵素剤として、クロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼＨ（ＣｏｌＨ）とコラゲナーゼＧ（ＣｏｌＧ）というサブタイプを含む混合物が膵臓から膵島を分離するために医療現場で使用されている。しかしながら、膵臓の組織構成は年齢や肥満度により異なるため、膵島分離用の酵素剤と提供された膵臓組織とが適合した場合に膵島分離が成功しているに過ぎない。【０００４】
前記ＣｏｌＨとＣｏｌＧは、複数のドメイン構造を持つマルチドメインタンパク質であり、その活性は、ドメインの組み合わせと相対的な配置に関連する（非特許文献１）。非特許文献１によれば、クロストリジウム属由来コラゲナーゼは、共通して、触媒ドメイン（以下、ＣＤと称する場合がある。）、多発性嚢胞腎様ドメイン（以下、ＰＫＤと称する場合がある。）、コラーゲン結合ドメイン（以下、ＣＢＤと称する場合がある。）の３種を含み、ＣｏｌＨは、１つのＣＤ、２つのＰＫＤ、１つのＣＢＤからなる、ＣＤ−ＰＫＤ−ＰＫＤ−ＣＢＤで示すドメイン構造であり、ＣｏｌＧは、１つのＣＤ、１つのＰＫＤ、２つのＣＢＤからなる、ＣＤ−ＰＫＤ−ＣＢＤ−ＣＢＤで示すドメイン構造である。非特許文献１は、ＣＢＤのＮ末端側にはカルシウムが結合し、カルシウムが外れることでドメインのＮ末端部が構造変化すること、カルシウムはコラーゲンの結合に重要であること、カルシウムがＣｏｌＨの安定化に寄与していることなどを開示する。【０００５】
一方、比活性が高い微生物由来コラゲナーゼとして、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある（非特許文献２）。プレプロ領域、触媒ドメイン、リンカー領域、およびプレペプチダーゼＣ末端ドメイン（以下、ＰＰＣとも称する。）を含む、分子量８４ｋＤａのコラゲナーゼであり、ＢＬＡＳＴ検索の結果、ＣｏｌＨやＣｏｌＧとの相同性が低いことがわかっている。また、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは安価な取得が困難であるという問題に鑑みて、遺伝子工学的手法を用いた当該コラゲナーゼ生産のための技術を構築する方法も提案されている（特許文献１）。当該特許文献１には、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーディング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２を作製する方法、バクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２を用いてブレビバチルス・チョウシネンシス組み換え体を作製し、これによりグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼを製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２６３８８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】大林尚美、村山和隆、”マルチドメインタンパク質コラゲナーゼの分子内コンホメーション変化の解析、生化学、第８５巻、第８号、ｐｐ６９２−６９９、２０１３年
【非特許文献２】Teramura Naoko etc, Cloning of a Novel Collagenase Gene from the Gram-Negative Bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and Its Efficient Expression in Brevibacillus choshinensis, Journal of Bacteriology,June 2011 vol.193 no.12 p.3049-3056.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
膵島移植その他の医療現場では、入手が容易なＣｏｌＨとＣｏｌＧとの混合物が使用されている。しかしながら、ＣｏｌＨとＣｏｌＧとはドメイン構造が相違し、ＣｏｌＨとＣｏｌＧの配合比によって性能が変化するため活性が安定しない。一方、配合比を調整することは容易でなく、膵島分離の成功率を低下させる一因となっている。したがって、混合することなく、活性が安定した細胞分離用酵素剤の開発が希求されている。【０００９】
一方、前記非特許文献１で開示されるグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは比活性が高く、特許文献１では、遺伝子工学を用いたグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの生産法も開示している。しかしながら、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは比活性が変動する場合があった。製造ロットごとに比活性が異なると、異なるロットのものを同じプロトコルで使用することが困難となる。更に、経時的に活性が低下すると、使用量が変動するため細胞収量が変動し、または過度の分解処理を行うことで細胞に負荷を与える場合がある。一方、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメインの詳細は解明されておらず、比活性が低減する原因も不明である。したがって、比活性が安定したグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来する、リコンビナントコラゲナーゼの開発が希求されている。【００１０】
更に、細胞分離の要請は、膵島に限定されるものではない。肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織なども細胞を分離した後に使用されることがある。分離細胞の生着性その他を良好に維持するには、細胞の損傷が少なく生着率が高いことが重要である。したがって、種々の細胞の分離性に優れ、かつ生着率に優れる細胞分離剤の開発が望まれる。【００１１】
膵島移植の成功率は、分離された膵島に残留する酵素量にも依存し、残留酵素量が多いと移植率が低下する。細胞洗浄後に残留酵素が少ないことが好ましいことは他の臓器や細胞でも同様である。したがって、組織を洗浄した後に組織から速やかに分離し、または、洗浄組織に残留した際のコラゲナーゼ活性が低減され、細胞障害を回避しまたは低減できる、新規コラゲナーゼが望まれる。【００１２】
このような状況下、本発明は、コラゲナーゼ活性に優れかつ比活性が安定した、新規なグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供することを目的とする。【００１３】
更に本発明は、このようにして得られた新規グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを用いた細胞分離用酵素剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの遺伝子について詳細に検討したところ、プレプロ領域は分泌シグナル配列であること、ＰＰＣを除去しても高いコラゲナーゼ活性を有すること、ＣＤとＰＰＣとを結ぶリンカー領域配列のＣ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであると、安定したコラーゲン活性を維持できることなどを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち本発明は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、
少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。【００１６】
また本発明は、前記リンカー領域は、いずれかのアミド結合で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。【００１７】
また本発明は、前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。【００１８】
また本発明は、前記リンカー断片が、前記リンカー領域に含まれる−Ｇ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｙ２−（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることを特徴とする、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。【００１９】
また本発明は、前記リンカー断片のＣ末端は、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ、−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、または−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒのいずれかであるリコンビナントコラゲナーゼである、前記グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼを提供するものである。【００２０】
また本発明は、前記リコンビナントコラゲナーゼを含む、細胞分離用酵素剤を提供するものである。【００２１】
また本発明は、膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織、骨、軟骨、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織および繊維芽細胞からなる群から選択される１以上の細胞の分離に使用されることを特徴とする、前記細胞分離用酵素剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、比活性が安定したグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼが提供される。摘出臓器を、このリコンビナントコラゲナーゼを含む細胞分解用酵素剤で培養すると、効率的に細胞を分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのドメイン構造と、リンカー領域の配列、並びにリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをコードするアミノ酸配列を説明する図である。
【図２】実施例１の結果を示す図であり、精製酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す図である。７４ｋＤａは、７４ｋＤａコラゲナーゼ、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、６０ｋＤａはリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ、Ｍはマーカーを示す。
【図３】実施例２において、７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼの精製直後からの比活性の経時変化を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例３において、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを、温度４℃で保存した際の比活性の経時変化を示す図である。
【図５】実施例４の結果を示す図であり、酵素液に含まれるリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度と分解組織量および非分解組織量の変化を示す図である。
【図６】実施例５および比較例１の結果を示す図であり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、またはクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（リベラーゼ）を用いて膵臓消化実験を行い、分解して得た膵島の個数とＩＥＱの結果を示す図である。膵島の個数の結果を図６Ａに、ＩＥＱの結果を図６Ｂに示す。
【図７】実施例５において、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて単離した膵島の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図８】実施例６の結果を示す図であり、膵島を移植したＳＴＺ誘導糖尿病マウスと移植しなかったマウスの血糖値の推移、および摘出した膵島移植腎、組織染色の結果を示す図である。マウスの血糖値の推移の結果を図８Ａに、摘出した膵島移植腎、組織染色の結果を図８Ｂに示す。
【図９】実施例７で分離した肝細胞の位相差顕微鏡写真像を示す図である。
【図１０】実施例８、比較例２の結果を示す図であり、図１０Ａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラーゲン線維に対する結合能を示す結果であり、図１０Ｂはクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（リベラーゼ）のコラーゲン線維に対する結合能を示す結果である。
【図１１】実施例８、比較例２の結果を示す図であり、洗浄したコラーゲン線維が、残留するコラゲナーゼによって経時的に分解された様子を示す図である。
【図１２】実施例１０の結果を示す図であり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型コラーゲンに作用させた後の電気泳動像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の第一は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、コラゲナーゼ触媒ドメインと、リンカー領域配列と、プレペプチダーゼＣ末端ドメインとを含むグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼに由来するリコンビナントコラゲナーゼであって、少なくとも、前記プレペプチダーゼＣ末端ドメインを含まないことを特徴とする、グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼである。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
（１）グリモンティア・ホリセー
コラゲナーゼを産生する微生物としてクロストリジウム属（Chrostridium sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）などが知られているが、本発明で使用するコラゲナーゼは、グリモンティア属（Grimontia sp.）に由来する。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３５６４やＡＴＣＣ  Ｎｏ．３３５６５として入手することができる。
【００２６】
（２）グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ
グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼのアミノ酸配列のドメイン構造を図１Ａに示す。「８４ｋＤａコラゲナーゼ」で示すドメイン構造は、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング配列に対応するドメイン構造である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、アミノ酸番号１〜８７がプレプロ領域、アミノ酸番号８８〜６１５が触媒ドメイン領域（ＣＤ）、アミノ酸番号６１６〜６８７がリンカー領域、アミノ酸番号６８８〜７４９がＰＰＣドメイン領域（ＰＰＣ）である。７６７個のアミノ酸で構成され、分子量は８４ｋＤａである。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの一例として、グリモンティア・ホリセー１７０６Ｂ株のコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、全コーディング領域のＤＮＡ配列を配列番号２に示す。なお、前記プレプロ領域は、分泌シグナル配列であることが判明した。ただし、翻訳のいずれの段階で分泌シグナル配列が離脱するかは明確ではない。本発明では、プレプロ領域を有するコラゲナーゼおよびプレプロ領域を欠失したコラゲナーゼの双方を、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼとする。プレプロ領域を欠失したグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの分子量は７４ｋＤａである。このドメイン構造を、図１Ａに、「７４ｋＤａコラゲナーゼ」として示す。
【００２７】
（３）グリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼ
本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、グリモンティア・ホリセーに由来する。そのドメイン構造は、少なくともＰＰＣを含まないものであればよい。例えば、前記図１Ａの８４ｋＤａコラゲナーゼに示すドメイン構造において、アミノ酸番号６８８以降の配列が欠失され、Ｎ末端からＣ末端に向かって、プレプロ領域、ＣＤ、リンカー領域で構成されるリコンビナントコラゲナーゼである。更にプレプロ領域を欠失し、ＣＤとリンカー領域とからなるリコンビナントコラゲナーゼであってもよい。後記する実施例に示すように、ＰＰＣを欠失しても高いコラゲナーゼ活性を発揮し、かつコラゲナーゼ活性が安定することが判明した。更に、本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、後記実施例に示すように、洗浄後のコラゲナーゼ活性が低減され、細胞障害が低減される。
【００２８】
本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼのリンカー領域は、そのアミノ酸配列の一部を欠失するリンカー断片であってもよい。本発明における「リンカー断片」とは、リンカー領域のいずれかのアミド結合で切断されたものを意味する。例えば、図１Ａの８４ｋＤａコラゲナーゼに示すドメイン構造では、第６１６から６８７のリンカー領域のいずれかのアミド結合で切断されたものとなる。図１Ａの「リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ」は、第６１６から６４６の３１個のアミノ酸からなるリンカー断片を有する例であり、図１Ａの「リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ」は、第６１６から６２４の９個のアミノ酸からなるリンカー断片を有する例である。
【００２９】
前記リンカー断片は、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンであることが好ましい。Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンとなるリコンビナントコラゲナーゼは、後記する実施例に示すように、コラゲナーゼ活性の安定性に優れる。前記リンカー領域は、配列番号１に示すように、−Ｇ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｙ２−（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列を含んでいる。リンカー領域が、前記アミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されると、Ｃ末端から３番目のアミノ酸がグリシンとなる。
【００３０】
便宜のため、図１Ａに示す「８４ｋＤａコラゲナーゼ」のリンカー領域のアミノ酸配列の一部を図１Ｂに示す。「６０ｋＤａ」は「リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼ」のＣ末端を、「６２ｋＤａ」は、「リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ」のＣ末端を示す。リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼのＣ末端は、リンカー領域の−ＧＤＳＧＡＧ−で示される配列のＳとＧとの間が切断されたものであり、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、−ＧＮＴＧＬＰ−で示される配列のＴとＧとの間で切断されたものである。その結果、いずれも、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基がグリシンとなる。なお、前記リンカー領域における前記−Ｇ１Ｘ１Ｙ１Ｇ２Ｘ２Ｙ２−における切断は、図１Ｂに示すように、第６３７と第６３８との間や、第６４２と第６４３との間で切断されたものであってもよい。
【００３１】
本発明のリコンビナントコラゲナーゼのＣ末端は、前記−Ｇ１−Ｘ１−Ｙ１−Ｇ２−Ｘ２−Ｙ２−（式中、Ｇ１とＧ２とはグリシンを示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、それぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示すアミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片であることが好ましい。Ｙ１とＧ２との間で切断されたリンカー断片を有するリコンビナントコラゲナーゼの比活性は、長期間に亘り、安定だからである。したがって、Ｃ末端は、例えば、−ＧＤＳ、−ＧＮＥ、−ＧＥＳ、および−ＧＮＴのいずれかであることが好ましい。図１Ｂに示す配列において、前記アミノ酸配列のＹ１とＧ２との間で切断されると、Ｃ末端は上記配列となる。
【００３２】
前記プレプロ領域およびＰＰＣを欠失し所定のリンカー断片を有し、アミノ酸番号第８８〜第６２４のアミノ酸配列のリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号３に、アミノ酸番号第８８〜第６４６のアミノ酸配列のリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。更に、８４ｋＤａコラゲナーゼからプレプロ領域が欠失されたアミノ酸番号第８８〜第７６７のアミノ酸配列を有するコラゲナーゼを７４ｋＤａコラゲナーゼとし、そのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００３３】
本発明のリコンビナントコラゲナーゼが保存安定性に優れる理由は明確ではない。しかしながら、ＰＰＣを有する７４ｋＤａコラゲナーゼと、ＰＰＣを有しないリコンビナントコラゲナーゼの比活性および安定性を評価したところ、７４ｋＤａコラゲナーゼの方が高い比活性を有することから、ＰＰＣ自体がコラーゲン結合能を有し、ＣＤのコラゲナーゼ活性を補助している可能性がある。本発明のリコンビナントコラゲナーゼは、コラゲナーゼ活性を補助するＰＰＣを欠失することで、コラゲナーゼ活性が安定し、かつ洗浄による組織からの分離性が増加すると推定される。なお、本発明のリコンビナントコラゲナーゼは、ＰＰＣを欠失すれば、リンカー領域を欠失するものであってもよい。
【００３４】
（４）リコンビナントコラゲナーゼの製造方法
本発明のリコンビナントコラゲナーゼを調製する際の形質転換用ＤＮＡとしては、少なくともＣＤに対応するアミノ酸配列をコードするものであり、より好ましくはＣＤとリンカー領域の一部とを含むアミノ酸配列をコードするものである。更に、Ｎ末端側に、プレプロ領域に対応するアミノ酸配列を有するものであってもよい。リンカー領域のＣ末端は、リンカー領域配列に含まれる−Ｇ１Ｘ１Ｙ１Ｇ２Ｘ２Ｙ２−で示される配列のＹ１とＧ２との間で切断されたものを好適に使用することができる。ＰＰＣを含まず、Ｃ末端から３番目がグリシンとなるリコンビナントコラゲナーゼを作製するために使用し得るＤＮＡとしては、下記（Ｉ）で示されるアミノ酸配列をコードするものを使用することできる。
【００３５】
式（Ｉ）：
AVEQCDLSQFQTTSSNQLMAAIRQQGASCVNALFSADTGVQEAAFSSNHMYNVAQYTRTLAQQYAGGGSDELEALYLYLRAGYYAEFYNSNITFLSWVTPAVKGAVDAFVQNAHFYDNGDAHGKVLNEVIITMDSAGLQHAYLDVVTQWLTRWNAQYAEHWYMRNAVNGVFTLLFGGQWNNQYTSLIGEQTALVTALQAFALDRTKVNSPTEFMAANAARELGRLARYTDATIAPKVTEGLTAIFGQYPSYGDGDAIWLGAADTASYYADCSQFNICGFEDALRDAALNQTFICSDTIKIRSQDMSQAQHLAACDKMAYEESFFHTTLETGNQPVADDHNTQLQVNIFNSDTDYGKYAGPIFGIDTNNGGMYLEGNPANVGNIPNFIAYEASYANPDHFVWNLEHEYVHYLDGRFNMYGDFGTPTELVVWWSEGVAEYVSRVNDNPQAIATIQDGSTYTLAQVFDTTYDGFDVDRIYRWGYLAVRFMFERHPDEVQRMLSATRQGRWAEYKAIISGWANQYQSEFAQW-X
ただし、Ｘは、TEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNT、またはTEALAKGDSで示されるポリペプチドである。配列番号３は、ＸがTEALAKGDSである場合のアミノ酸配列であり、配列番号４は、ＸがTEALAKGDSGAGNGEGTGSGNEGGGESGGNTである場合のアミノ酸配列である。なお、上記式で使用されるアルファベットは、以下のアミノ酸を示す。A:アラニン、C:システイン、D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸 F：フェニルアラニン、G：グリシン、H:ヒスチジン、I:イソロイシン、K:リシン、L:ロイシン、M:メチオニン、N:アスパラギン、P:プロリン、Q:グルタミン、R:アルギニン、S:セリン、T:スレオニン、V:バリン、W:トリプトファン、Y:チロシン。
【００３６】
本発明のリコンビナントコラゲナーゼを調製するには、上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを調製し、前記組み換えベクターで形質転換して、コラゲナーゼ活性を有する宿主細胞を調製し、前記宿主細胞を培養してコラゲナーゼ活性を有する遺伝子産物を産生させればよい。このようなリコンビナント蛋白質の製造方法は、遺伝子工学の技術を使用して行うことができる。例えば、グリモンティア・ホリセーのゲノムライブラリーからグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを選択し、そのクローンを鋳型として前記配列番号３や配列番号４をコードするＤＮＡ断片の５’側にＮｃｏ  Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅し、増幅された断片をＮｃｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターなどに挿入して組換プラスミドを調製し、これを用いて例えばブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株などを形質転換し、ブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を作製する。あるいは、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子を含むクローンを鋳型として前記配列番号３や配列番号４をコードするＤＮＡ断片の両端に、挿入する直鎖状発現ベクターの両末端と相同な１５塩基対の配列を付加したＤＮＡ断片を調製および増幅し、当該増幅されたＤＮＡ断片と直鎖状発現ベクターとを混合後、新Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法にてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株などに導入して組換プラスミドおよび組換え体を作製してもよい。このようにして得たブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を培養すれば、培養上清中にグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子産物を産生させることができる。
【００３７】
培養物中から目的物質であるリコンビナントコラゲナーゼを採取及び精製する方法は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。例えば、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、有機溶媒沈澱法、塩析、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。
【００３８】
なお、本発明のグリモンティア・ホリセー由来リコンビナントコラゲナーゼは、予めプレプロ領域を含まないＤＮＡで形質転換された宿主細胞からリコンビナントコラゲナーゼを生産してもよく、プレプロ領域を含むＤＮＡで形質転換された宿主細胞からリコンビナントコラゲナーゼを産生し、翻訳中または翻訳後にプレプロ領域を離脱させてもよい。
【００３９】
（５）細胞分離用酵素剤
本発明の製造方法で得たリコンビナントコラゲナーゼは、従来のコラゲナーゼと同様に使用することができ、例えば細胞分離用酵素剤として使用することができる。摘出臓器から細胞を分離する対象として、膵島、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織、繊維芽細胞などがある。摘出組織に限定されず、コラーゲン培地内で培養した培養細胞の分離にも好適である。特に本発明で得たリコンビナントコラゲナーゼは、比活性が安定性しているため、摘出した膵臓臓器から膵島を単離するための細胞分離用酵素剤として好適に使用することができる。後記する実施例に示すように、洗浄組織に対するコラゲナーゼ活性が低く、細胞損傷が少ない。
【００４０】
本発明で使用する細胞分離用酵素剤には、更にメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼその他の成分を含ませることができる。メタロプロテアーゼとしては、サーモリシン、ディスパーゼ、クロストリジウム・ヒストリチカム由来中性プロテアーゼなどがある。セリンプロテアーゼとしては、トリプシン、エラスターゼなどが、システインプロテアーゼとしてはキモパパインなどがある。
【００４１】
（６）細胞分離方法
摘出した臓器や動物組織に本発明の細胞分離用酵素剤を添加して所定時間培養する。摘出物を上記細胞分離用酵素剤や、更に他の成分を添加した培養液で培養すると、前記摘出組織の細胞外マトリックスや細胞間結合を分離し、細胞を単離することができる。組織から単離された細胞が培養液中に浮遊する場合は、培養液からろ過や遠心などで単離細胞を回収すればよい。
【００４２】
本発明では、摘出臓器として膵臓臓器を使用し、膵島を分離することができる。膵島はコラーゲンによって膵臓内の他の組織と結合しているため、コラゲナーゼで培養することで膵島を他の組織から遊離することができる。例えば、摘出した膵臓臓器の膵管から本発明の細胞分離用酵素剤を注入し、所定時間培養する。培養時間は、使用する組織の状態や細胞分離用酵素剤に含まれるリコンビナントコラゲナーゼ量などによって適宜選択すればよい。膵島は他の組織よりも軽いため、培養後は密度勾配遠心分離法などにより純化することができる。なお、膵島に限定されず、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、副腎、筋肉の他、甲状腺、唾液腺、耳下腺腺房、乳腺組織などの腺組織、骨、軟骨などの骨組織、内皮細胞、上皮細胞、脂肪組織、繊維芽細胞などのいずれの細胞分離にも好適に使用することができる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００４４】
（実施例１）
グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２（受託番号；ＮＩＴＥ  ＢＰ−００７３９：寄託日（原寄託）；２００９年４月２８：寄託機関の名称；独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）：寄託機関のあて名；日本国２９２０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）を鋳型として、配列番号５のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ２０４０ｂｐ）の５’側にＮｃｏ  Ｉサイトを、３’側にＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付加し、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）により増幅した。ＰＣＲ反応には、下記プライマーセットを使用した。プライマーの配列のうち、制限酵素サイトを下線で示す。
Fwd:AAACCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号６）
Rvs: AAAAAGCTTTTACTGACGACACTGGTTAC（配列番号７）
増幅された断片をＮｃｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理して回収した当該ＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＮＹ３２６のクローニングサイトに挿入して、ｐＮＹ３２６−Ｃｏｌ．７４を作製した。この組換えプラスミドでブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株を形質転換して、組換え体を作製した。【００４５】
また、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼの全コーティング領域の遺伝子を含むバクミドｐＣＣ１ＢＡＣ−２（ＮＩＴＥ  ＢＰ−００７３９）を鋳型として、前記配列番号３のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ１６１１ｂｐ）を、下記プライマーセットを使用してＰＣＲ反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状ベクターの両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号８）
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTACTGTCGCCCTTCGCCAGC（配列番号９）【００４６】
また、直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６を、下記プライマーセットを使用してＰＣＲ反応を使って調製した。プライマーの配列のうち、挿入するＤＮＡ断片の両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd: AAGCTTAACAGGATGCGGGG（配列番号１０）
Rvs: AGCGAAAGCCATGGGAGCAA（配列番号１１）【００４７】
上記によって配列番号３のリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（１６１１ｂｐ）と直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６とをモル比２：１で混合後、新Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法にてコンピテントセルに導入するとともにブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３株を形質転換しプラスミドｐＮＹ３２６−Ｃｏｌ．６０および組換え体を作製した。【００４８】
同様にして、以下のプライマーセットを使用して、上記配列番号４のペプチド配列から誘導された当該コラゲナーゼ遺伝子の部分配列（長さ１６７７ｂｐ）を、ＰＣＲ反応を使って単離した。プライマーの配列のうち、直鎖状ベクターの両端の配列と相同な配列を下線で示す。
プライマー：
Fwd:CCCATGGCTTTCGCTGCGGTTGAACAGTGTGATCT（配列番号１２）
Rvs:CATCCTGTTAAGCTTAGGTATTACCACCAGATTCA（配列番号１３）【００４９】
次いで、上記と同様にして直鎖状発現ベクターｐＮＹ３２６を調製し、配列番号４のリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼをコードするＤＮＡ断片（１６７７ｂｐ）を含むプラスミドｐＮＹ３２６−Ｃｏｌ．６２および組換え体を作製した。上記により、３種のブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体を作製した。【００５０】
前記３種のブレビバチルス・チョウシネンシス組換え体をそれぞれ１００ｍｌの２ＳＹＮ培地（２０ｇ／Ｌグルコース、４０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５０μｇ／ｍＬネオマイシン）中で、３０℃、４８時間培養した。グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ遺伝子産物を含む培養液を遠心し、得られた上清を０．２μｍフィルターで濾過滅菌した。次いで、上清をＨＰＬＣシステムにて精製・分画した。ＨＰＬＣシステムは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより行った。各培養上清をカラムに供してコラゲナーゼを吸着させた後、ＮａＣｌ濃度を０．２から１Ｍまで連続的に上げながら、５０ｍＭのビストリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）を流し、コラゲナーゼを分離溶出させた。溶出液を溶出順に４ｍｌずつ採取し、分画した。ついで、限外濾過により３０ｋＤａ以下のものを除去し、０．２ＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２を含む４℃の５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で透析し、精製した７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼを得た。【００５１】
精製酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を図２に示す。７４ｋＤａは、７４ｋＤａコラゲナーゼ、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ、６０ｋＤａはリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼを示す。【００５２】
（実施例２）
実施例１で得た７４ｋＤａコラゲナーゼ、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼの比活性の経時変化を下記方法で測定した。測定結果を図３に示す。７４ｋＤａは、精製直後に１８，０００（Ｕ／ｍｇ）の活性であったが２４時間後には１１，５００（Ｕ／ｍｇ）に低減し、活性が経時的に低下した。これに対し、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼおよびリコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼは、精製直後から２４時間時に至るまで、いずれも１２，０００（Ｕ／ｍｇ）前後で推移し、コラゲナーゼ活性が安定していた。【００５３】
コラゲナーゼの比活性測定：蛍光標識したＩ型コラーゲン（ＦＩＴＣ−コラーゲン）０．０５％、５ｍＭのＣａＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）にコラゲナーゼ０．５μｇを混合して３０℃に加温した。３０分後、ＥＤＴＡを添加して酵素反応を停止した。反応液に等量の７０％のエタノールを含有する５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加して分解物を抽出し、蛍光分光光度計で蛍光強度を測定した。図中１ユニット（Ｕ）はコラーゲン１μｇを３０℃、１分間で分解する活性を意味する。【００５４】
（実施例３）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを、温度４℃で保存した際の比活性の経時変化を評価した。０日目の比活性値を１００％とした時の相対値を図４に示す。図４に示すように、１００日間に亘り、高い比活性を安定に維持することができた。なお、リコンビナント６０ｋＤａコラゲナーゼも同様の安定性を示した。【００５５】
（実施例４）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行った。マウスより膵臓を単離し、ＨＢＳＳバッファー１ｍｌに、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを０．００６２５〜０．２０ｍｇと、サーモリシン（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」の内包品）０．０１２ｍｇとを含む酵素液を膵管より注入し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、目開き１ｍｍメッシュを通過した画分（分解組織）と、メッシュ上に残った画分（非分解組織）のタンパク量を測定した。酵素液に含まれるリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度に依存して、分解組織量が増加し、それに伴い非分解組織量が低減した。結果を図５に示す。図５に示すように、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌで反応はプラトーに達した。【００５６】
（実施例５）
実施例４と同様に、実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて膵臓消化実験を行い、分解して得た膵島の個数を測定し、ＩＥＱ（Ｉｓｌｅｔ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：直径が１５０μｍの膵島を１と規定する、膵島の体積を示す国際単位）を評価した。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの濃度の相違による膵島の個数の結果を図６Ａに、ＩＥＱの結果を図６Ｂに示す。また、単離された膵島の光学顕微鏡写真を図７に示す。【００５７】
（比較例１）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼに代えてクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を使用した以外は、実施例５と同様に操作し、膵島の個数およびＩＥＱを評価した。結果を図６Ａ、図６Ｂに併せて記載する。実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、従来の市販品と同様に、膵臓組織から膵島を分離することができた。【００５８】
（実施例６）
実施例５で得た膵島を、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスの腎皮膜下に移植し、経時的に血糖値を測定した。膵島を移植しなかったコントロール群（ｎ＝３：ＳＴＺ−１、ＳＴＺ−２、ＳＴＺ−３）では、高血糖値を示したのに対し、膵島移植群（ｎ＝５：ＳＴＺ／ｉｓｌｅｔ−１〜ＳＴＺ／ｉｓｌｅｔ−５）では、移植後すぐに血糖値が正常レベルにまで低下した。移植後３９日目に膵島を移植した腎臓を摘出すると、血糖値が再び上昇した。結果を図８Ａに示す。摘出した膵島移植腎とその部分拡大写真を図８Ｂの左端の上下２段に示す。また、摘出した膵島移植腎のヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ染色）を行ったところ腎皮膜下に膵島が確認され、さらには抗インシュリン抗体で膵島が染色された(図８Ｂ）。これらは、実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼにより、膵島機能が保持された膵島が単離できたことを示すものである。【００５９】
（実施例７）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて肝臓消化実験を行った。麻酔したラットの肝臓をＨＢＳＳバッファー潅流下に脱血してカルシウムを除去し、次いで肝臓内にリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼ０．０５ｍｇ／ｍｌとサーモリシン０．０１ｍｇ／ｍｌとを１０分間潅流してカルシウムを添加した後、肝臓を摘出した。摘出肝臓を氷冷し、メスで細切し、ガーゼおよびストレイナーでろ過した。死細胞を除去した後に肝臓細胞を遠心回収した。肝細胞の位相差顕微鏡写真を図９に示す。この肝細胞を７日間培養したところ、生存率は９８％であった。【００６０】
（実施例８）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラーゲン線維への結合能と、洗浄後コラーゲン線維に残留するコラゲナーゼ活性を評価した。
豚皮コラーゲン線維５ｍｇと４００μｌの０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２を含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）とをフィルターを内蔵するスピンカラムに入れ、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心を行い、コラーゲン線維を前記緩衝液で洗浄して全５回の遠心分離を行った。
洗浄液を廃棄し、前記スピンカラムのフィルター上のコラーゲン線維に酵素混合液（リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを０．２ｍｇ／ｍｌ、オボアルブミンを０．２ｍｇ／ｍｌ、オルトフェナントロリンを４ｍＭ、ＮａＣｌを０．２Ｍ、ＣａＣｌ２を５ｍＭ含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））１００μｌを添加し、４℃で３０分静置し、コラーゲン線維にリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを結合させた。
次いで、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行い、前記フィルター上のコラーゲン線維とフィルターを通過した混合液とに分離した。この混合液の一部を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。なお、比較のために豚皮コラーゲン線維を添加せず、上記と同様に処理して得た混合液も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図１０Ａの「混合液／コラーゲン線維「−」、「＋」」で示す。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのバンドは、「＋」で薄く「−」で濃くなった。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、コラーゲン線維と混合すると、コラーゲン線維に結合することが示された。なお、図１０においてＭはマーカーを示す。【００６１】
次いで、スピンカラム内のコラゲナーゼが結合したコラーゲン線維を２ｍｌチューブに回収し、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンペプチド、４ｍＭのオルトフェナントロリンを含むトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、４℃で１０分間静置した後、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心を行い、沈殿物を前記コラーゲンペプチド含有緩衝液で洗浄して全５回の遠心分離を行った。５回の洗浄上清をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図１０Ａの「酵素結合コラーゲン線維のコラーゲンペプチド洗浄上清／１，２，３，４，５」で示す。数値は、上清の洗浄回数を示す。洗浄１回目から５回目に亘りいずれもリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのバンドが薄く、コラーゲン線維に結合したリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、コラーゲンペプチドで洗浄してもコラーゲン線維に残留することが示された。【００６２】
また、遠心分離によって得たコラゲナーゼが結合したコラーゲン線維に、５００μｌの０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、２μｇ／ｍｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含むトリスＨＣｌ緩衝液を添加し、３７℃で静置した。静置開始時、開始後１時間、３時間、５時間、７時間、１７時間、２０時間後に目視にて観察した。２ｍｌチューブの底部に集められたコラーゲン線維の経時変化を図１１に示す。また、静置２０時間後の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０Ａ、「洗浄後線維上清／２０ｈ」に示す。静置２０時間後の上清はコラーゲン分解物のバンドが濃く出現し、コラーゲン線維に結合したコラゲナーゼは、洗浄してもコラーゲン線維に残留し、コラゲナーゼ活性を発揮することが示された。なお、「洗浄後線維上清／２０ｈ」には、コラーゲン分解物のバンドと共に６２ｋＤａのバンドが濃く出現し、コラーゲン分解後に速やかにコラゲナーゼが分離することが示された。【００６３】
（比較例２）
リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼに代えて同量のクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を用いた以外は実施例８と同様に操作した。結果を図１０Ｂおよび図１１に示す。【００６４】
図１０Ｂに示すように、コラーゲン線維が存在する「＋」のカラムではリベラーゼのバンドが薄いためリベラーゼがコラーゲン線維と結合すること、コラゲナーゼ結合コラーゲン線維をコラーゲンペプチドで洗浄した際の洗浄上清は、洗浄１〜５に亘りリベラーゼのバンドが薄く、コラゲナーゼはコラーゲンペプチドで洗浄してもコラーゲン線維に残留すること等は、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼと同じ傾向を示した。【００６５】
一方、図１１に示すように、コラーゲン線維に残留するコラゲナーゼの酵素活性は、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼとリベラーゼとの間に相違が観察された。図１１において、残留酵素のコラゲナーゼ活性が高いほど、コラーゲン線維量が速やかに低減する。コラーゲン線維量が低減する程度は、コンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの方がリベラーゼよりも低い。膵島分離などの処理においては、残留酵素によって細胞障害が生じるため、膵島単離後は、酵素が残留しないことや、残留酵素が存在してもコラゲナーゼ活性が低減されていることが好ましい。図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼとリベラーゼとはコラーゲン線維に結合し、これをコラーゲンペプチドで５回に亘って洗浄しても一部はコラーゲン線維に残存する。しかしながら、残留する酵素の活性は両者間で相違し、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼのコラゲナーゼ活性はリベラーゼよりも低減していた。詳細は不明であるが、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、リベラーゼと相違してコラーゲン線維と結合する「ＣＢＤ」を有しないことが一因と推定される。「ＣＢＤ」が存在しないためコラーゲン線維との結合が緩く、残留酵素によるコラゲナーゼ活性に差が生じた可能性がある。【００６６】
（実施例９）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼおよびクロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）の、蛍光標識したＩ型コラーゲン（以下、ＦＩＴＣ−コラーゲンと称す。）および合成基質Ｎ−（３［２−ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（以下、ＦＡＬＧＰＡと称す。）に対する分解活性を評価した。
ＦＩＴＣ−コラーゲンは、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、３０℃）緩衝液を使用し、ＦＡＬＧＰＡには０．４ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  トリシン（ｐＨ７．５、３０℃）を使用した。ＦＩＴＣ−コラーゲンを基質とする場合には上記コラゲナーゼを０．５μｇ添加し、ＦＡＬＧＰＡを基質とする場合には、リコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼを１．０μｇ、またはリベラーゼＣ／Ｔを２．５μｇ添加した。マイクロプレートリーダーにてＦＡＬＧＰＡを検出および定量し、ＦＡＬＧＰＡ分解活性を評価した。反応系１ｍｌにおいて、１ｍｇの酵素が１分あたり１μｍｏｌｅの前記ペプチドを分解する活性を比活性１Ｕ／ｍｇとし算出し、得られた比活性を表１に示した。リコンビナント６２ｋＤコラゲナーゼは、コラーゲンを分解できるだけでなく、合成基質ＦＡＬＧＰＡに対する分解活性に優れるため、コラーゲンのみならずゼラチン分解性にも優れることが示唆された。【００６７】
【表１】
2015133636.tif 000003
【００６８】
（実施例１０）
実施例１で得たリコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型コラーゲンに対する活性を評価した。０．５ｍｇ／ｍｌの上記コラーゲンに、０．２ＭのＮａＣｌと５ｍＭのＣａＣｌ２とを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１μｇ／ｍｌのコラゲナーゼを添加し、３０℃でインキュベートし、インキュベート開始時、１時間後、３時間後、５時間後にサンプルを分取し、電気泳動で分析した。また、比較のため、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼ（ロシュアプライドサイエンス社製、商品名「リベラーゼＣ／Ｔ」）を用いて同様の操作を行った。結果を図１２に示す。なお、図１２において、６２ｋＤａは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを使用したカラムを、リベラーゼは、クロストリジウム属由来のコラゲナーゼを用いたカラムを示す。
Ｉ型コラーゲンでは、α１（Ｉ）およびα２（Ｉ）の３時間後、５時間後のバンドの消失の程度から、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼの方がリベラーゼよりも迅速にＩ型コラーゲンを分解していると推定された。この傾向は、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型コラーゲンでも同様に観察された。特にＩＶ型およびＶ型コラーゲンは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて３時間、または５時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。ＶＩ型コラーゲンは、リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼを用いて７２時間反応させるとバンドが薄くなるのに対し、リベラーゼではバンドが消失していない。リコンビナント６２ｋＤａコラゲナーゼは、リベラーゼで分解が容易でないコラーゲンも分解できる可能性が示唆された。【００６９】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。【００７０】
本発明は２０１４年３月６日に出願された日本国特願２０１４−０４４２０５号に基づく。本明細書中に日本国特願２０１４−０４４２０５号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、比活性が安定なリコンビナントコラゲナーゼおよび当該リコンビナントコラゲナーゼを含む細胞分離用酵素剤が提供され、有用である。
【受託番号】
【００７２】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−００７３９
【図１】
2015133636.tif 000004
【図２】
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【図３】
2015133636.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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