(57)【要約】  十分に高い細胞性免疫を誘導できる新規なワクチンが開示されている。本発明のワクチンは、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域とスペーサー配列が少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分とする。スペーサー配列は、例えば、前記抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列である。
2015002134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチン。
(1)  前記MHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)  (1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
【請求項２】
抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチン。
(1)  前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープと、高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされ、かつ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように塩基配列を設計した時に、当該残りの読み枠で該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)  (1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
【請求項３】
前記MHCクラスIエピトープ領域と前記MHCクラスIIエピトープ領域が同一の抗原タンパク質に由来する、請求項１又は２記載のワクチン。
【請求項４】
前記(2)の配列は、(1)のアミノ酸配列のうちの数個の残基からなる領域が、MHCクラスIIエピトープ領域又は高次構造安定化領域の一部に由来するアミノ酸配列に置換した配列である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記高次構造安定化領域が、αへリックス形成性領域及びβシート形成性領域から選択される少なくとも１つである、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記(1)の配列は、１つの読み枠に前記MHCクラスIエピトープ領域がコードされ、他の１つの読み枠に前記MHCクラスIIエピトープ領域がコードされ、さらに他の１つの読み枠に少なくとも１つのαへリックス形成性領域がコードされるように前記塩基配列を設計した時に、MHCクラスIエピトープ領域をコードする読み枠内でMHCクラスIエピトープ領域に隣接して生じるアミノ酸配列である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、N末端側領域及びC末端側領域の少なくともいずれか一方に前記MHCクラスIIエピトープ領域を含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
前記抗原タンパク質が、腫瘍抗原、がん幹細胞抗原、ウイルス抗原、又は寄生虫抗原である請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
前記抗原タンパク質が、WT1、サバイビン、サバイビン-B2、MAGE-A3、MEGE-A4、チロシナーゼ、gp100、Melan-A、TRP-2、SNRPD1、CDK4、NY-ESO-1、HER2、MUC-1、CD20、又はp53である請求項１ないし７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの等電点が6.0〜8.6である請求項１ないし９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
トール様受容体経路を活性化するアジュバントと組み合わせて用いられる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞性免疫を効果的に誘導できるワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エピトープペプチド（MHCクラスI、クラスII分子に提示される最小ペプチド配列）を用いた腫瘍免疫療法が注目されている。エピトープペプチドワクチンは、エピトープペプチドをモンタナイドなどのオイルエマルジョンに懸濁し投与される。この免疫方法では、大量のエピトープペプチドが抗原提示細胞の空のMHC分子へ結合するか、あるいは、MHC分子に既に結合しているペプチドとの競合によりペプチドの置換が起こることで、その機能を発揮すると考えられている（非特許文献１〜４）。しかし、この方法は、樹状細胞などによる本来の抗原処理過程を経ておらず、効率よく抗原提示されていない可能性がある。さらに、最近、エピトープペプチドワクチンに必須なオイルアジュバントが、ワクチン接種部位におこる炎症のため、腫瘍を攻撃するはずの細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、腫瘍部位ではなく、ワクチン接種部位に局在されるようになり、抗腫瘍効果を効率的に発揮できないとの報告がなされた（非特許文献５）。従って、ひとつには、オイルアジュバントを用いることなく安定的に免疫原性を発揮できるペプチドワクチンの開発が期待されている。【０００３】
一方、全長タンパク質を免疫源に用いると、樹状細胞などの抗原提示細胞に処理されるが、タンパク質分子あたりの抗原エピトープ数は少なくなり、MHC分子に提示されるペプチドも、エピトープペプチド免疫よりも少なくなると考えられる。【０００４】
また、ワクチンとして投与される抗原は、体内では、外来抗原として認識され、抗原提示細胞に取り込まれ、MHCクラスII分子に提示され、液性免疫を誘導する傾向がある。エイズ、マラリア、悪性腫瘍などの疾患に対しては、細胞性免疫の誘導が重要である。これらの疾患では、その特異抗原が抗体で認識される細胞表面に発現するわけではないので、液性免疫ではこれらの疾患に対応できない。これらの疾患に特異的な抗原は、内因性抗原として細胞内でプロセシングを受け、MHCクラスI分子に提示されるため、細胞性免疫でないと効果を発揮することができない。従って、この様な疾患に対する免疫療法に対しては、タンパク質を抗原にする場合に、液性免疫よりも細胞性免疫を誘導できるシステムの開発が期待されている。【０００５】
樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞には、外来抗原に対しても細胞性免疫を誘導できるメカニズムがあることが知られている。これはクロスプレゼンテーションと呼ばれるシステムで、外来抗原として抗原提示細胞に取りこまれた抗原が、プロテアソームにより分解を受け、MHCクラスI分子に提示される現象である。しかし、どのような抗原がクロスプレゼンテーションを受けやすいのか、また、その詳細なメカニズムも未だ不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yamada A, et al.Cancer Sci. 2013 Jan;104(1):15-21. doi: 10.1111/cas.12050. Epub 2012 Dec 4.Next-generation peptide vaccines for advanced cancer.
【非特許文献２】Khazaie K, et al. Curr Opin Oncol. 2009 Nov;21(6):524-30. doi: 10.1097/CCO.0b013e328331a78e.Current developments with peptide-based human tumor vaccines.
【非特許文献３】Perez SA, et al. Cancer. 2010 May 1;116(9):2071-80. doi: 10.1002/cncr.24988.A new era in anticancer peptide vaccines.
【非特許文献４】Slingluff CL Jr.Cancer J. 2011 Sep-Oct;17(5):343-50. doi: 10.1097/PPO.0b013e318233e5b2.The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination?
【非特許文献５】Hailemichael Y, et al. Nat Med. 2013 Apr;19(4):465-72. doi: 10.1038/nm.3105. Epub 2013 Mar 3.Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8+ T cell sequestration, dysfunction and deletion.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、十分に高い細胞性免疫を誘導できる新規なワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ワクチンによる高い治療効果を期待するならば、クロスプレゼンテーションを誘導できるペプチドワクチンがより好ましいと考えられる。本願発明者らは、ペプチドワクチンの高次構造を改良した人工タンパク質を用いれば、エピトープペプチド等の短いポリペプチドや全長タンパク質等のサイズの大きいポリペプチドを用いる従来の免疫法の欠点を解消することができると考えた。そこで、芝清隆らが開発したMolCraft法を用いた人工タンパク質創製技術を用いて鋭意研究の結果、細胞性免疫を強力に誘導できる人工タンパク質抗原に重要な構造を特定することに成功し、本願発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチンを提供する。
(1)  前記MHCクラスIエピトープ領域と、前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)  (1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。【００１０】
また、本発明は、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、下記(1)及び(2)のいずれかであるスペーサー配列とが少なくとも３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含有するワクチンを提供する。
(1)  前記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープと、高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされ、かつ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように塩基配列を設計した時に、当該残りの読み枠で該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として生じる配列。
(2)  (1)のアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換した配列。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、細胞性免疫の誘導能に優れたペプチドワクチンが提供される。本発明のペプチドワクチンは、MHCクラスIとMHCクラスIIのクロスプレゼンテーション能を有して十分に高い免疫誘導能を有する。また、オイルアジュバントの使用量を低減ないしは不使用としても、もとの抗原タンパク質よりも遥かに強く、例えば１００倍以上強く細胞性免疫を誘導することができる。本発明の技術によれば、免疫原性の弱いペプチドエピトープを用いた場合でも、高い免疫誘導能を有するワクチンを提供可能になる。マラリア、エイズ、腫瘍等の疾患の治療及び予防には細胞性免疫の誘導が必要とされるが、本発明によれば、そのような疾患の治療及び予防に有効なワクチンを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マイクロ遺伝子及び人工タンパク質の構築について説明した図である。(a)天然抗原オボアルブミン（OVA)のアミノ酸配列である。(b)実施例でデザインしたマイクロ遺伝子である。(c)人工タンパク質構築のスキームと、様々なモチーフ及び人工タンパク質の模式図である。(d)各人工タンパク質及びOVAのin vitroの抗原提示能を比較した結果である。人工タンパク質のSDS-PAGE像も図中に示した。
【図２】マイクロ遺伝子#2101の設計から人工タンパク質遺伝子の構築までの流れを説明した図である。
【図３】人工タンパク質のアミノ酸配列である。
【図４】人工タンパク質のアミノ酸配列である。
【図５】人工タンパク質F37Aについて、抗原提示能を解析した結果である。(a)F37Aのアミノ酸配列と、他の人工タンパク質の配列を模式的に示した図である。(b)抗原提示能をin vitroでのIL-2生産量により評価した結果である。(c)F37Aに含まれるOVAのMHCクラスIエピトープモチーフをWT1のMHCクラスIエピトープモチーフで置き換えて作製した変異体の構造を説明する図（左）、及び各変異体の抗原提示能をIL-2生産量により評価した結果のグラフ（右）である。(d)クロスプレゼンテーションアッセイの結果である。
【図６】人工タンパク質及びWT1のMHCクラスIエピトープモチーフで置き換えた変異体のアミノ酸配列である。
【図７】円偏光二色性解析（CD）により人工タンパク質の二次構造を調べた結果である。
【図８】Strider 1.4f7ソフトを使用して人工タンパク質のHydropathy(Kite-Doolittle)疎水性解析を行なった結果である。
【図９】Strider 1.4f7ソフトを使用して両親媒性(Amphipathicity)解析を行なった結果である。
【図１０】F37Aで２０時間刺激した後のCD11c＋生細胞表面におけるCD80及びCD86の発現量をフローサイトメトリーにより測定した結果である。
【図１１】F37Aで免疫したマウス体内での抗原特異的CTL誘導を調べた結果である。(a)免疫したマウスから採取した脾臓細胞を用いて細胞障害性アッセイを行なった結果である。(b)免疫したマウスに腫瘍細胞を移植し、腫瘍の増殖を観察した結果である。(c)免疫したマウス体内で抗OVA抗体が生じているか否かを調べた結果である。
【図１２】F37Aの抗原性について、クラスIエピトープ及びクラスIIエピトープの関与を検討した結果である。(a)F37A、F36C及びMT825のアミノ酸配列である。(b)MPLアジュバントと共にマウスを免疫し、51Cr放出アッセイによりCTL活性を調べた結果である。(c)テトラマーアッセイの結果である。(d)免疫したマウスに腫瘍細胞を移植し、腫瘍の増殖を観察した結果である。(e)腫瘍細胞を移植した免疫マウスの各個体における腫瘍増殖を示したグラフである。
【図１３】F37AとC131Bの構造の模式図を示す。(A) 抗原提示細胞DC2.4細胞を、阻害剤無処理で、又はcytochalasin B(ファゴサイトーシス阻害剤)、DMA（ピノサイトーシス阻害剤）若しくはPoly-I（スカベンジャーレセプターA阻害剤）で処理した後、抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養した。培養後の各細胞をサンプルとし、抗His-tag抗体および抗OVA抗体を用いたウエスタンブロットにより、抗原提示細胞への抗原の取込量を測定した（レーン１：無処理コントロール、レーン２：cytochalasin B処理、レーン３：DMA処理、レーン４：Poly-I処理）。細胞に取り込まれた抗原のバンド強度をデンシトメトリーで測定し、βアクチンを基準にして定量してグラフ化した。(B) 抗原提示細胞DC2.4細胞を、阻害剤無処理で、又はcytochalasin B、DMA若しくはPoly-Iで処理し、抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養した。その後、OVA特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞（RF33.70細胞）を添加し、共培養した。培養上清中のIL-2産生量を測定する事により、OVA特異的抗原提示能を評価した。
【図１４】(A) 既知量（100ng, 50ng, 10ng, 5ng）のF37A抗原及びC131B抗原をそれぞれ電気泳動し、抗His-tag抗体を用いたWB（ウエスタンブロット）を行い、オートラジオグラフィーで抗原を検出した結果である。デンシトメトリーでバンド強度を測定し、抗原濃度とバンド強度から、検量線を作製した（検量線図は省略）。(B) 抗原提示細胞DC2.4細胞に抗原（F37A又はC131B）を添加して培養した。抗His-tag抗体および抗OVA抗体を用いたウエスタンブロットにより、抗原提示細胞への抗原の取込量を測定した。Ａで求めた検量線から、抗原提示細胞へのF37A抗原及びC131B抗原の取込量を半定量した。F37AとC131Bの取込実験は２サンプルずつ行なった。F37Aの取込量は6ngと5ngであった。C131Bの取込量は29ngと22ngであった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で有効成分として用いるポリペプチドは、天然には存在しない人工のタンパク質である。この有効成分ポリペプチドは、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ領域と、本明細書において定義される通りのスペーサー配列とが、少なくとも３回交互に繰り返して連結されたタンデムリピート構造を含むことを特徴とする。クラスIエピトープ領域とスペーサー配列とが少なくとも３回反復した構造を有することで、対象とする抗原タンパク質に対する細胞性免疫を強く誘導することができる。ポリペプチドを有効成分とするペプチドワクチンでは、通常、生体に十分な免疫を誘導するために一定量のアルミニウムアジュバントやオイルアジュバントの使用が必須的であるが、本発明のペプチドワクチンは、アルミニウムアジュバントやオイルアジュバントの使用量を低減化して副作用を軽減し、あるいはこのようなアジュバントを使用することなく、十分に高い免疫誘導能を発揮することができる。
【００１４】
「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ」及び「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ」には、天然の抗原タンパク質中に見出される当該エピトープのアミノ酸配列と同一のもののみならず、天然のエピトープ配列の少数の残基に改変を加えた配列からなるエピトープも包含される。天然のMHCクラスIエピトープやクラスIIエピトープの配列を改変することで、MHCクラスI又はクラスII分子への結合性などのエピトープの機能を高めることができることが知られている。例えば、腫瘍抗原WT1のMHCクラスIエピトープCMTWNQMNLの２つ目のMをYに置換することで、MHCクラスI分子への結合性が高まることが知られている（Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620）。このような改変されたMHCクラスI及びクラスIIエピトープも「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープ」及び「抗原タンパク質に由来するMHCクラスIIエピトープ」に包含される。
【００１５】
タンデムリピート構造は、MHCクラスIエピトープ領域及びスペーサー配列からなる構造を１単位とし、これが少なくとも３単位連結した構造である。反復回数の上限は特に限定されないが、ワクチンの製造コスト等の観点から有効成分ポリペプチドのサイズは５００残基程度以下が好ましく、また、後述するMPR法によりマイクロ遺伝子の重合を行なって有効成分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得る場合には、MPR法におけるマイクロ遺伝子重合体のサイズの一般的な上限より、コードされるポリペプチドのサイズが通常３００残基程度以下となるため、タンデムリピート構造の反復回数は通常概ね１０回以下である。
【００１６】
タンデムリピート構造内では、一部のモチーフ連結部位に数個以内、好ましくは５個以内、より好ましくは３個以内の残基が挿入されていてもよく、あるいは、一部のモチーフ連結部位で数個以内、好ましくは５個以内、より好ましくは３個以内の残基が欠失していてもよい。このようなモチーフ連結部位における残基の不一致は、MPRという手法の性質上必然的に生じることである。MHCクラスIエピトープ領域は、後述の通り、最小エピトープ配列の末端にもとの抗原タンパク質に由来する少数の隣接残基を含み得るが、タンデムリピート構造内では最小エピトープ配列が維持されていればよいので、クラスIエピトープ領域に含まれ得る最小エピトープ配列以外の残基は、一部のリピート単位において欠失していても差し支えない。
【００１７】
また、タンデムリピート構造内では、全てのスペーサー配列モチーフが完全に一致していなくてもよく、数個以内、好ましくは６個以内の残基が相違するスペーサー配列モチーフがタンデムリピート構造内の一部に含まれていてよい。MPR法によりマイクロ遺伝子を重合して調製した人工タンパク質ライブラリーから有効成分ポリペプチドを取得する場合には、重合反応の過程でランダムに読み枠がずれて重合され、マイクロ遺伝子がそもそも規定していたモチーフ配列とは一致しないモチーフ配列が生じることがしばしばある。本発明におけるスペーサー配列は、そのようにして生じた、他のリピート単位中に見られるスペーサー配列とは一部の残基（好ましくは６個以内の残基）が相違する配列からなるものであってもよい。
【００１８】
本発明で用いるスペーサー配列は、抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープ領域と、上記抗原タンパク質と同一又は異なる抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域と、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが、単一の塩基配列の異なる読み枠でコードされるように塩基配列を設計した時に、該塩基配列が必然的にコードするアミノ酸配列として、好ましくはクラスIエピトープ領域と同じ読み枠内でクラスIエピトープ領域に隣接して生じる配列である。このような、読み枠を異にして複数のモチーフをコードし、いずれの読み枠にも終止コドンが生じないように設計された塩基配列は、多機能塩基配列ないしはマイクロ遺伝子と呼ばれることがある。３つの読み枠のうちの２つの枠でコードされるアミノ酸配列が決定した場合、残る１枠のアミノ酸配列は自動的に定まる。
【００１９】
あるいは、本発明で用いるスペーサー配列は、上記した自動的に定まるアミノ酸配列において、数個のアミノ酸残基からなる領域が置換した配列を有する。より具体的には、該スペーサー配列は、数個のアミノ酸残基からなる領域が、他の読み枠でコードされるMHCクラスIIエピトープ領域又は高次構造安定化領域の一部に由来するアミノ酸配列に置換した配列であり得る。MPR法により調製したマイクロ遺伝子重合体からポリペプチドを調製する場合、マイクロ遺伝子の連結部位においてポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性により塩基の挿入及び欠失がランダムに生じ、その結果、ある１つのモチーフ配列が部分的に別の読み枠のモチーフ配列に由来するアミノ酸配列に置換したモチーフ配列が生じることがしばしばある。下記実施例では、人工タンパク質F182Aのタンデムリピート構造中にそのような部分的に置換したスペーサー配列が混在している。もっとも、タンデムリピート構造中のスペーサー配列の全てがそのような置換が生じていない配列である方が、ポリペプチドの細胞性免疫の誘導能が高い場合がある。
【００２０】
MHCクラスIエピトープとMHCクラスIIエピトープは、同一の抗原タンパク質に由来するものでもよいし、異なる抗原タンパク質に由来するものでもよい。典型的には、MHCクラスIエピトープ及びMHCクラスIIエピトープは、同一抗原由来であり得る。複数のMHCクラスII分子に結合できるエピトープ配列が公知であり（例えば、PADREエピトープと呼ばれるパンHLA-DR結合性エピトープ等。Hum Immunol. 2012 January ; 73(1): 1-10.、及びMolecular Therapy vol. 15 no. 6, 1211-1219 june 2007等を参照。）、異なる抗原タンパク質に由来するクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープを用いる場合には、そのような複数のMHCクラスII分子に結合できるエピトープを使用してもよい。配列表の配列番号６１、６２に示す配列は、PADREエピトープを用いた有効成分ポリペプチドの具体例である（下記表１−２参照）。
【００２１】
本発明においては、３つの読み枠に終止コドンが含まれることなく合計６つのモチーフがコードされるように多機能塩基配列をデザインすればよい（図２参照）。６つのモチーフのうち、１つがMHCクラスIエピトープ領域であり、１つがMHCクラスIIエピトープ領域であり、２つが高次構造安定化領域である。このような場合、通常は、MHCクラスIエピトープ領域をコードする多機能塩基配列(I)、及びMHCクラスIIエピトープ領域をコードする多機能塩基配列(II)をそれぞれ設計した後、２つの多機能塩基配列を読み枠を調整しながら連結することにより、クラスIエピトープと、クラスIIエピトープと、少なくとも１つの高次構造安定化領域とが異なる読み枠でコードされる１つの多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）が設計される。多機能塩基配列において、2つの読み枠のアミノ酸配列が定められ、残りの読み枠で終止コドンが生じないように設計した場合、当該残りの読み枠でコードされるアミノ酸配列は自動的に決定される。従って、多機能遺伝子(I)においてクラスIエピトープに対し１つの、そして多機能遺伝子(II)においてクラスIIエピトープに対し１つの、自動的に決定される配列モチーフが得られる。結合後のマイクロ遺伝子配列において、２つの高次構造安定化領域モチーフは、同一の読み枠にくることもあるし、別々の読み枠にくることもあるが、クラスIエピトープとクラスIIエピトープが同じ読み枠にこないように設計するため、自動的に決定される配列モチーフが同一の読み枠にコードされることはない。このようにして得られた、自動的に決定されるないしは必然的に生じる配列のモチーフのうち、クラスIIエピトープに対して生じ、マイクロ遺伝子上ではクラスIエピトープと同一の読み枠内でクラスIエピトープ領域に隣接して生じる配列モチーフが、タンデムリピート構造のスペーサー配列として用いられる。
【００２２】
「高次構造安定化領域」とは、多機能塩基配列を重合させて得られた核酸重合体からポリペプチドを発現させたとき、該ポリペプチドが安定した高次構造をとることを可能にする配列を有する領域である。ポリペプチドの高次構造は、αへリックス構造、βシート構造、分子内疎水結合の形成等により安定化する。高次構造安定化領域の具体例としては、αへリックス形成性領域（αへリックス構造を形成しやすいアミノ酸配列の領域）、βシート形成性領域（βシート構造を形成しやすいアミノ酸配列の領域）、疎水結合形成性領域（疎水性側鎖を有するアミノ酸残基に富み、分子内疎水結合を形成しやすい領域）等を挙げることができる。これらの構造をとることでタンパク質の高次構造が安定化することが知られている。好ましくは、高次構造安定化領域は、αへリックス形成性領域及びβシート形成性領域から選択される少なくとも１つであり、より好ましくはαへリックス形成性領域である。アミノ酸残基には、αへリックスを形成しやすい残基や、βシートを形成しやすい残基があることが知られており、そのような残基によってαへリックス形成性領域やβシート形成性領域を構成することができる。
【００２３】
好ましくは、３つの読み枠のうちの１つの読み枠にMHCクラスIエピトープ領域がコードされ、他の１つの読み枠にMHCクラスIIエピトープ領域がコードされ、さらに他の１つの読み枠に少なくとも１つのαへリックス形成性領域がコードされるように多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）が設計される。上述した通り、スペーサー配列は、MHCクラスIエピトープ領域をコードする読み枠内でMHCクラスIエピトープ領域に隣接して生じるアミノ酸配列モチーフである。例えば、第１枠にMHCクラスIエピトープ領域が、第２枠（第１枠から読み枠が３’方向に１つシフトした枠）にMHCクラスIIエピトープ領域が、第３枠（第１枠から読み枠が３’方向に２つシフトした枠）に１つ又は２つのαへリックス形成性領域がコードされ、第１枠に生じるアミノ酸配列をスペーサー配列として用いることができる。
【００２４】
一般に、抗原タンパク質が有するMHCクラスIエピトープは５〜１２残基程度、典型的には８〜１０残基程度のサイズである。MHCクラスIIエピトープに関しては、長さがあまり限定されていないことが知られているが、概ね１３〜３０残基程度のサイズであり、本発明におけるクラスIIエピトープ領域モチーフとしては、１３〜２３残基程度のサイズのクラスIIエピトープを好ましく用いることができる。従って、例えば第１読み枠にクラスIエピトープを、第２読み枠にクラスIIエピトープを、第３読み枠に少なくとも１つの高次構造安定化領域をコードするように設計する場合、多機能塩基配列のサイズは通常30bp〜90bp程度となり、得られるスペーサー配列のサイズは概ね10〜30残基程度となる。
【００２５】
「MHCクラスIエピトープ領域」には、抗原タンパク質に由来するMHCクラスIエピトープの最小単位の他、もとの抗原タンパク質のアミノ酸配列中で当該エピトープの前後に隣接している各数個（例えば１個〜３個）の残基も含まれ得る。通常、もとの抗原タンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸残基を、MHCクラスIエピトープ最小配列のN末に少なくとも２残基、C末に少なくとも１残基付け加え、これをMHCクラスIエピトープ領域モチーフとして用いることが好ましい。具体的には、例えば・・・abcdXXXXXXXXefgh・・・という抗原タンパク質配列において、クラスIエピトープがXXXXXXXXである場合、Ｎ末側cdとC末側eを付け加えたcdXXXXXXXXeをMHCクラスIエピトープ領域モチーフとして用いることができる。エピトープのC末側はプロテアソームで切断され、比較的配列特異性がない一方、N末側の切断は配列特異的なアミノペプチダーゼにより行なわれることが知られている。上記のようにして、もとの抗原タンパク質におけるエピトープ前後の構造も有効成分ポリペプチド分子内で維持させることにより、抗原提示をより効率よく生じさせ、細胞性免疫の誘導能をさらに高めることができる。MHCクラスIIエピトープ領域についても同様である。
【００２６】
様々な抗原タンパク質について、MHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープの配列が同定され、公知となっている。また、アミノ酸配列情報からエピトープを予測するアルゴリズムが公知であるので（例えば、SYFPEITHI algorithm software (www.syfpeithi.de)など）、任意の抗原タンパク質についてそのようなアルゴリズムを用いてMHC分子に結合するエピトープを予測し、MHCクラスI及びクラスIIエピトープとして用いてもよい。また、上述した通り、天然のMHCクラスI及びクラスIIエピトープの配列を一部改変することで当該エピトープの機能（例えばMHCクラスI分子又はクラスII分子への結合性）を高めることができることも知られており、本発明ではそのような改変型のエピトープ配列を用いることもできる。
【００２７】
上記のようにして、あるMHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープに対して得られるスペーサー配列は、親水性アミノ酸（R、N、D、E、Q、G、H、K、P、S、T、Yなど）を多く含み、親水性の特徴を有したものであり得る。スペーサー配列として親水性であるか否かは、Strider 1.4f7ソフトを用いたHydropathy(Kite-Doolittle)解析により調べることができる。
【００２８】
また、タンデムリピート構造部分の両親媒性は、0.0〜0.4であり得る。両親媒性解析は、Strider 1.4f7ソフトを使用して実施することができる。
【００２９】
有効成分として用いる、上記したタンデムリピート構造を含むポリペプチドは、N末端側領域及びC末端側領域の少なくともいずれか一方に、同じ抗原タンパク質由来のMHCクラスIIエピトープ領域を含んだものであってよい。これにより、ワクチンの細胞性免疫誘導能をさらに高めることができる。
【００３０】
また、有効成分ポリペプチドには、上記定義の通りの高次構造安定化領域が含まれていてよい。αへリックス構造やβシート構造などの高次構造を安定化する領域を含んでいることで、ポリペプチドの安定性が増し、大腸菌等の宿主細胞内での生産効率が向上し得る。
【００３１】
さらにまた、有効成分ポリペプチドは、ポリペプチドの製造の便宜等のため、ヒスチジンタグ等のタグ配列を含んでいてよい。
【００３２】
有効成分ポリペプチドは、等電点(pI)が6.0〜8.6であり得る。ポリペプチドの等電点をこのような中性付近に調整するため、有効成分ポリペプチドには、必要に応じて適宜DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKL（triple FLAG tag配列）やDEDEDED等の配列を導入してよい。このような配列が導入された有効成分ポリペプチドの具体例が配列表の配列番号５７〜６０に記載されている（下記表１−１参照）。
【００３３】
多機能塩基配列を設計する方法は公知である。例えば、K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153に記載されているCyberGeneソフトウェアを用いることができる。より具体的には、特許第4007477号、第4911857号及び第4989600号等に記載されている設計方法で設計することができる。本発明ではいずれの方法を用いてもよい。
【００３４】
特許第4007477号は、第１の機能をもつ与えられたペプチド配列（本願でいえばMHCクラスIエピトープペプチド配列及びクラスIIエピトープペプチド配列）を初期値として設定し、そこから遺伝暗号表をもとに１塩基ずつ塩基配列に逆翻訳して、そのペプチド配列をコードすることが可能な全ての塩基配列を計算機内に生成し、次にこの生成した全ての塩基配列がコードする第１のペプチド配列とは別の読み枠でのペプチド配列集団を計算機内に書き出し、最後にこのペプチド配列集団の中から第２、第３の機能をもつペプチドを選び出す、といったプロセスを経てデザインする方法である。この方法では、多機能塩基配列にコードさせるタンパク質を２０種のアミノ酸の連結産物として分析を行なう。
【００３５】
第4911857号及び第4989600号に記載されている設計方法は、特許第4007477号に記載の設計方法の改良法である。この方法では、多機能塩基配列にコードさせるタンパク質を、２０種のアミノ酸の連結産物としてではなく、２〜８残基程度のごく短いペプチド配列の重複連結産物と捉えて分析を行なう。ジペプチドをコードする塩基配列は６塩基であるが、この６塩基には既に第２、第３の読み枠の翻訳産物の情報が内包されている。従って、２〜８残基程度の短いペプチド配列の重複連結産物として分析・計算を行なうことにより、第２枠、第３枠で途中に終止コドンが入ってしまう塩基配列を予め除外して計算処理を実行することができる。これにより、２０種のアミノ酸の連結産物として分析を行なう方法と比較して、計算時間の大幅な短縮とメモリサイズの大幅な軽減が可能となる。
【００３６】
下記実施例では、CyberGeneソフトウェアを用いて多機能塩基配列（マイクロ遺伝子）を設計し、公知のマイクロ遺伝子重合法（microgenepolymerization reaction; MPR、芝清隆ら、PNAS vol.94, pp.3805-3810, 1997）によりマイクロ遺伝子重合体（人工タンパク質遺伝子）の集団を構築し、これらの重合体からタンパク質を発現させて抗原提示能が高いタンパク質を取得している（図１、２）。このような手法は、MolCraft（登録商標）法として知られており（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）、同手法により様々な人工タンパク質が合成されている（例えば、Saito et al., Chemistry & Biology, Vol. 11, 765-773, 2004; Saito et al., Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 6, e38; Kokubun et al., Biomacromolecules 2008, 9, 3098-3105等）。MolCraft（登録商標）法を用いれば、様々な抗原タンパク質を対象に、本発明のワクチンに用いるポリペプチド配列を取得することができる。
【００３７】
WT1タンパク質由来のMHCクラスI及びクラスIIエピトープ配列を用いて本発明による抗がんワクチンを製造する方法を以下に説明する。
【００３８】
WT1タンパク質（配列番号２３）では、MHCクラスIエピトープとして、CMTWNQMNL（配列番号２３の303番〜311番残基）及びRMFPNAPYL（配列番号２３の194番〜202番残基）、並びにこれらの改変配列（例えばCMTWNQMNLの２つ目のMをYに置換した配列、Cancer Immunol Immunother (2002) 51: 614-620）を使用することができる。ここではRMFPNAPYLを用いるものとして説明する。RMFPNAPYLは、もとのWT1タンパク質において前後に隣接するアミノ酸残基をいくつか付加して（例えば、N末側に隣接するQA、及びC末側に隣接するPを各末端に付加して）多機能塩基配列の設計に用いることとする。MHCクラスIIエピトープとしては、PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG（配列番号２３の396番〜417番残基）を使用することができる。手順を大まかに説明すると、まず、クラスIエピトープをコードする多機能塩基配列と、クラスIIエピトープをコードする多機能塩基配列とを、それぞれ別々に設計し、得られた２つの多機能塩基配列を融合させてマイクロ遺伝子を設計した上で、このマイクロ遺伝子の配列に基づいてMPRプライマーを設計し、MPR法によるマイクロ遺伝子重合反応を実施する。
【００３９】
まず、計算機内で、QARMFPNAPYLP及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを初期値（第１配列）としてそれぞれ設定し、そこから遺伝暗号表をもとに１残基ずつ塩基配列に逆翻訳して、そのペプチド配列をコードすることが可能な全ての塩基配列を計算機内に生成する。次いで、QARMFPNAPYLPをコードする塩基配列及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGをコードする塩基配列の中から、別の読み枠に高次構造安定化領域をコードする配列をそれぞれ選び出す（第２配列）。CyberGeneソフトウェアを用いる場合、第１配列としてQARMFPNAPYLP及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを入力すると、それぞれに対して、αへリックス構造やβシート構造を取りやすい配列候補が多数記述されるので、安定した構造を取りやすい配列を第２配列として選びだせばよい。第１配列のモチーフを単純に逆翻訳すると、そのDNA配列の組み合わせはそれぞれ膨大な数になるが、CyberGeneプログラムは、複数の読み枠に同一のモチーフ配列が生じるケースやいずれかの読み枠内に終止コドンが生じるケースが排除されるように設計されているので、入力したモチーフ配列から得られる多機能塩基配列候補は理論上の組み合わせ数よりも遥かに少ない数となる。第１配列及び第２配列を指定することにより、第３配列は自動的に決定される。１つの読み枠にエピトープモチーフを、他の読み枠のいずれかに高次構造安定化モチーフをコードする多機能塩基配列が数百以上出力されるが、各々の構造の形成しやすさでランク付けされるので、上位１０種程度の配列を選別する。
【００４０】
以上のようにして得られた、QARMFPNAPYLPを第１枠にコードする多機能塩基配列(I)及びPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGを第１枠にコードする多機能塩基配列(II)を結合することにより、WT1のMHCクラスIエピトープ、クラスIIエピトープ、及び少なくとも１つの高次構造安定化領域を異なる読み枠にコードするマイクロ遺伝子配列が得られる。フレームをずらして結合しても終止コドンが生じないような配列を候補の配列の中から選択し、配列を調整する。この際、MHCクラスIモチーフQARMFPNAPYLPとMHCクラスIIモチーフPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGが同一の読み枠にこないように、結合部位を適宜調節する。自動的に決定された、機能が付与されていない第３配列は、クラスIモチーフQARMFPNAPYLP及びクラスIIモチーフPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGに対してそれぞれ発生する。MHCクラスIモチーフとMHCクラスIIモチーフが同一の読み枠にこないように調整して多機能塩基配列(I)及び(II)を結合した結果、クラスIIモチーフに対して発生した第３配列は、MHCクラスIモチーフと同一の読み枠内にくることになる。従って、本発明におけるスペーサー配列とは、MHCクラスIIエピトープ領域（ポリペプチドに採用するクラスIエピトープと同じ抗原に由来するエピトープ）と高次構造安定化領域とが異なる読み枠でコードされるように多機能塩基配列を設計したときに、残る１つの読み枠でコードされるアミノ酸配列として生じる配列と理解することもできる。
【００４１】
以上の工程により、本発明で有効成分として用いるポリペプチドのスペーサー配列を得ることができる。このスペーサー配列をMHCクラスIモチーフQARMFPNAPYLPと連結させて、タンデムリピート構造を構築し、有効成分ポリペプチドを設計してもよい。あるいは、MPR法によりフレームシフトをランダムに生じさせつつマイクロ遺伝子を重合させ、得られた重合体（人工タンパク質遺伝子）からタンパク質を発現させて、クラスIエピトープとスペーサー配列がタンデムに３回以上連結した構造を含むタンパク質を選び出し、細胞性免疫の誘導能を確認してもよい。
【００４２】
MPR法において用いるMPRプライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーが互いの３’末端領域で数塩基（通常は８塩基前後）の相補的な塩基対を形成するようにデザインする。ただし、３’末端部の一塩基にはミスマッチを設ける。このMPRプライマーを用いた重合反応では、プライマーが各々の３’側領域の一部でアニールすることで、ポリメラーゼ反応により一本鎖部分に対して相補鎖が合成される。MPR法においては、プライマー自体がテンプレートも兼ねている。各MPRプライマーの使用濃度は40 nM〜2000 nM程度でよい。サーマルサイクラーを用いて２ステップの反応サイクルを実施することにより、マイクロ遺伝子がタンデムに結合したマイクロ遺伝子重合体が合成される。ポリメラーゼは、3'→5'エクソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いる。重合反応の過程で、マイクロ遺伝子同士の結合部分には揺らぎが生じ、塩基の欠失や挿入がランダムに起こる。これにより読み枠のずれが生じるので、コードされるポリペプチド配列が様々な数、様々な組み合わせで出現する人工遺伝子のライブラリーが創製されることになる。
【００４３】
得られた遺伝子は、周知の常法により適当なタンパク質発現ベクターに組み込み、タンパク質を発現させることで、人工タンパク質ライブラリーが得られる。Hisタグ付きタンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌や昆虫細胞等の適当な宿主細胞に導入し、Hisタグを利用して常法により発現タンパク質を精製すればよい。宿主細胞内での発現効率には人工遺伝子毎にばらつきがあるので、タンパク質精製量も評価して人工タンパク質ライブラリーを作製する。
【００４４】
人工遺伝子から発現した人工タンパク質についての抗原提示能の評価や細胞性免疫の誘導能の評価は、常法により実施することができる。クラスIエピトープモチーフと、多機能塩基配列の設計により得られたスペーサー配列とがタンデムに３回以上連結した構造を有する人工タンパク質をコードする人工遺伝子を選び出し、抗原提示能や免疫誘導能の評価を行なってよい。
【００４５】
抗原提示能の評価では、例えば、得られた人工タンパク質を抗原提示細胞に添加し、目的のエピトープがMHCクラスI分子やクラスII分子に提示されることを、エピトープ特異的CD8+Ｔ細胞等を用いてin vitroで測定すればよい。エピトープ特異的CD8+Ｔ細胞を用いてクラスIエピトープの提示能を評価する方法では、クラスIエピトープ特異的なT細胞レセプター（TCR）を持つCD8+Ｔ細胞と、人工タンパク質を添加した抗原提示細胞を共培養する。人工タンパク質が取り込まれ、プロセシングを受け、MHCクラスI分子にエピトープが提示されると、CD8+Ｔ細胞がTCRを介してこれを認識し、抗原特異的にIL-2を産生する。このIL-2の産生量が高い人工タンパク質を選別することで、クロスプレゼンテーションを介して抗原提示する人工タンパク質をスクリーニングすることができる。
【００４６】
In vitroの抗原提示能、タンパク質精製量などを考慮しながら、in vivoでのCD8+細胞障害性T細胞の誘導能（細胞性免疫の誘導能）の高い人工タンパク質を常法により選別することができる。例えば、候補の人工タンパク質を100μg程度ずつ、アジュバントMPL（monophosphoryl lipid A）20μgとともに、マウス等の動物（ヒトを除く）の皮内、皮下または腹腔などに、少なくとも１回、望ましくは２週間隔で３回程度投与し、動物を免疫する。免疫後、脾臓細胞を取り出し、エピトープ特異的TCRを持つCD8+T細胞を検出するためのテトラマー試薬を用いて、フローサイトメトリーによりテトラマーアッセイを行ない、CD8+細胞障害性Ｔ細胞の誘導能を評価すればよい。また、抗原タンパク質を発現するように組み換えられた腫瘍細胞E.G7と、その親株であるEL-4細胞を用いた機能的細胞障害性アッセイを行い、細胞障害性の強い人工タンパク質を選別することもできる。さらにまた、抗原タンパク質を発現するE.G7細胞を免疫動物に接種し、腫瘍増殖が抑制される人工タンパク質を選別することも可能である。
【００４７】
上記の通りの手順でMolCraft法を実施し、任意の抗原タンパク質由来のMHCクラスIエピトープと本発明の定義に従うスペーサー配列とが３回以上連結したタンデムリピート構造を含む、ワクチンの有効成分として用いるポリペプチドの好ましい例を得ることができる。一旦、ポリペプチドのアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチド（人工遺伝子）の塩基配列が特定されれば、当該分野で周知の常法によりポリペプチドを製造することができる。例えば、適当な発現ベクターにポリヌクレオチドを組み込んで大腸菌や昆虫細胞等の宿主細胞内で発現させ、ポリペプチドを回収、精製すればよい。ポリヌクレオチド自体は、MolCraft法におけるMPR工程で得られた人工遺伝子を鋳型としてPCRにより増幅して得ることができるし、あるいは、配列が特定されたポリヌクレオチドは、化学合成により調製することも可能である。大腸菌細胞内で発現させたポリペプチドは、Triton X-114法などの手法によりエンドトキシンを除去すれば、医薬の有効成分として使用することができる。あるいはまた、配列が特定されたポリペプチド自体も、例えばFmoc法やtBoc法等の常法により化学合成が可能である。化学合成で得られたポリぺプチドは、そのままあるいは酵素学的に結合して長鎖のポリぺプチドにしたうえ、リフォールディングさせて本発明の求める高次構造を有する形態にして用いることができる。
【００４８】
本発明のワクチンは、様々な抗原タンパク質に対して製造することができる。腫瘍抗原及びがん幹細胞抗原に対するワクチンは抗がんワクチン（がんの治療又は予防剤）として、病原体や寄生虫の抗原に対するワクチンは感染症の予防又は治療用のワクチンとして提供できる。予防及び治療に細胞性免疫が重要な役割を担う疾患に対して本発明を好ましく適用することができる。腫瘍抗原の具体例としては、例えば、WT1、サバイビン、サバイビン-B2、MAGE-A3、MEGE-A4、チロシナーゼ、gp100、Melan-A、TRP-2、SNRPD1、CDK4、NY-ESO-1、HER2、MUC-1、CD20、p53などを挙げることができる。がん幹細胞抗原としては、CD44, CD133、LGR5, Dclk1などを挙げることができる。ウイルス抗原としては、肝炎ウイルス（HBV、HCV等）、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等のウイルスの構成タンパク質を挙げることができる。寄生虫抗原としては、マラリア原虫タンパク質等を挙げることができる。これらの抗原のMHCクラスIエピトープ及びクラスIIエピトープをモチーフとして用いて、本発明のワクチンを設計、製造することができる。
【００４９】
本発明のワクチンペプチドの具体例として、腫瘍抗原タンパク質に対して設計したポリペプチドのアミノ酸配列の一例を下記表１−１〜表１−３に示す。
【００５０】
【表１−１】
2015002134.tif 000003
【００５１】
【表１−２】
2015002134.tif 000004
【００５２】
【表１−３】
2015002134.tif 000005
【００５３】
本発明のワクチンの生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、対象とする疾患の状態、症状、投与対象となる動物の年齢、体重等に応じて適宜選択されるが、通常、対象の動物に対し１日当りの有効量として0.1μg〜500mg、例えば1μg〜100mgであり得る。１回又は数回に分けて投与することができ、例えば、数回に分け、数日ないし数月おきに投与してもよい。
【００５４】
ワクチンの剤形は特に限定されず、ポリペプチドのみからなっていてもよいし、各投与経路に適した、薬剤的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤してもよい。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知である。製剤形態の具体例を挙げると、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、並びに吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。
【００５５】
従来のペプチドワクチンでは、生体内で十分な免疫を誘導するため、一定量のオイルアジュバントやアルミニウムアジュバントを組み合わせて投与することが必須的である。これらのアジュバントで現在臨床で利用されているものとして、Alum（アルミニウム塩）、MF59（オイルエマルジョン）、モンタナイド（Montanide ISA 51VGなど、オイルエマルジョン）等がある。オイルアジュバント及びアルミニウムアジュバントは、抗原の分解抑制、組織破壊による炎症性細胞の誘導、抗原提示細胞の成熟化などを介して免疫を補助すると考えられている。しかしながら、これらのアジュバントにより皮膚の炎症反応（しこり）が生じることが問題となっており、さらに、誘導されたCTLがアジュバント接種部位に集積してしまい、腫瘍の増殖抑制が効果的に生じないという問題も指摘されている。本発明のワクチンは、このような問題を有するオイルアジュバントやアルミニウムアジュバントの使用量を低減化して副作用を軽減し、あるいはそのようなアジュバントを用いることなく、細胞性免疫を強く誘導することができる。なお、下記実施例でOVAを用いて調製した人工タンパク質は、TLR（Toll-like Receptor; トール様受容体）経路刺激による副刺激分子（CD80、CD86等）の発現を増強しないので、そのような場合にはTLRリガンド等のTLR経路を刺激するアジュバントを組み合わせて用いてもよい。「組み合わせて用いる」とは、ワクチンとアジュバントが同時に対象に投与されるか、又は連続的に対象に投与されることをいう。同時に投与される場合、ワクチンは、アジュバントをさらに含有するように製剤されていてもよい。また、TLRのリガンド機能を模倣するペプチド配列が一部同定されており、例えば、TLR-4のリガンド機能を模倣するペプチド配列として、APPHALS、QEINSSY等が知られている（PLoS ONE, February 2012, Volume 7, Issue 2, e30839）。そのようなペプチド配列を有効成分ポリペプチドの配列に導入することによって、ポリペプチドにアジュバント機能を併せ持たせてもよい。このように、アジュバント機能を有するペプチド配列を有効成分ポリペプチドに導入した態様も、アジュバントを「組み合わせて用いる」態様に包含される。TLR経路を刺激するアジュバントで臨床使用されているものとして、MPLを挙げることができる。
【００５６】
本発明のワクチンは、上記した人工のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で当該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分とするワクチンであってもよい。このような形態のワクチンは遺伝子ワクチンとも呼ばれる。ポリヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよいが、好ましくはDNAである。遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記した人工のポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００５７】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、例えば1μg〜10mg程度である。
【００５８】
遺伝子ワクチンの使用方法として、遺伝子ワクチンを直接体内に導入するin vivo法と、対象動物からある種の細胞を採取し、体外で遺伝子を該細胞に導入して再度体内に戻すex vivo法が知られている（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５；月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８；実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号など）。in vivo方法がより好ましい。
【００５９】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００６０】
本発明のワクチンは、他の医薬品と組み合わせて用いることができる。例えば、腫瘍抗原に対して設計された本発明のワクチンは、他の抗がん剤と組み合わせて用いることができる。
【００６１】
現在、腫瘍免疫療法において、免疫チェックポイント阻害剤(immune checkpoint inhibitor)が注目されている（Nature Reviews Cancer 12, 252-264 (April 2012)）。生体には、過剰な免疫反応を抑制制御するためのシステムが存在する。これまでに、抗原提示細胞(APC)に発現する分子とT細胞に発現する分子、例えば、PD-L1とPD-1、CD80とCTLA4、MHC class IあるいはMHC class II とKIRあるいはLAG3、GLA9とTIM3などが同定されており、その相互作用により、T細胞に負のシグナルを伝え、T細胞反応を阻害する。このメカニズムは免疫チェックポイントと呼ばれている。
【００６２】
免疫チェックポイントの阻害機能を持つ、ヒト化抗CTAL-4抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体（免疫チェックポイント阻害剤）の投与は、メラノーマや肺がんで、劇的な治療効果を示す（Clin Cancer Res. 2013 Oct 1;19(19):5300-9.）。また、同時に、自己に対する免疫トレランスが破綻する事から、重度の自己免疫疾患になる事も報告されている。この事実は、がん患者には、本来、がん細胞を攻撃する腫瘍免疫が成立している事を示しており、がん細胞によるPD-L1の発現や、様々なサイトカインの産生による、免疫チェックポイントの負の制御により、腫瘍免疫が抑制されるシステムが働いており、その結果、腫瘍細胞の増殖を押さえ込めなくなり、がんが進行する事を示唆している。即ち、担がん状態の患者は、腫瘍免疫を抑制するようなブレーキがかかっている状態にある。免疫チェックポイント阻害剤の投与は、この腫瘍免疫に対するブレーキを外してやる事に繋がり、本来、患者が有する、がん細胞を攻撃する腫瘍免疫が機能するようになり、抗腫瘍効果が発揮されると考えられる。これまでに、担がん患者に本来備わっている腫瘍免疫が、がんの発生防御に機能している実際的な根拠が得られていなかったが、免疫チェックポイントの科学的理解と、特異的阻害剤の劇的な治療効果により、今後、腫瘍免疫療法は大きく変貌を遂げると思われる。
【００６３】
免疫チェックポイント阻害剤は、がんで過剰発現している抗原や、driver mutation（がん細胞の増殖に寄与する変異で、がん細胞に蓄積するようなアミノ酸置換、遺伝子融合、欠失、挿入等の変異）を起こした、いわゆるがん抗原に対して免疫を発揮するよりも、むしろ、passenger mutationと言われるアミノ酸置換をおこすような変異が起きているが、タンパク質の機能に影響を与えないため、必ずしもがん細胞に蓄積しないような変異タンパク質に対して免疫を発揮するという事が想定される。即ち、免疫チェックポイント阻害剤により誘導される、腫瘍免疫の標的となる抗原は、個人により大きく異なると考えられる。免疫チェックポイント阻害剤は、強力な抗腫瘍免疫を誘導するが、すべての患者に有効であるわけでなく、また、がん種による差も報告されている。
【００６４】
これらの事を考え合わせると、免疫チェックポイント阻害剤で、担がん患者の免疫抑制状態を制御しつつ、本発明による人工タンパク質ワクチンで腫瘍抗原に対する免疫を誘導する、すなわち、免疫チェックポイント阻害剤と本発明による人工タンパク質ワクチンを組み合わせて使用する事によって、強力な腫瘍免疫誘導に繋がり、より一層強力な抗腫瘍効果を得ることができる可能性が示唆される。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００６６】
１．人工タンパク質を創製するためのマイクロ遺伝子の設計
天然抗原OVA（配列番号２４）から、OVA-I：●(OVA MHCクラスIエピトープ, OVA258-265, SIINFEKL)とOVA-II：■(OVA MHCクラスIIエピトープ, OVA324-340, ISQAVHAAHAEINEAGR) を選択した（図１a）。【００６７】
第一配列にMHCクラスIエピトープOVA-I、第二配列にMHCクラスIIエピトープOVA-IIがコードされるマイクロ遺伝子#2101及び#6101を、芝清隆らが開発したCyberGeneソフトウェア（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）を用いて設計した（図１b）。この設計の工程を図２の1)〜5)に示した。天然抗原OVAにおいてMHCクラスIエピトープ（SIINFEKL）のN末に隣接する２アミノ酸は、細胞内でのアミノペプチダーゼによる分解に影響を与えることが知られているので、OVA-IのN末にOVA全長抗原由来の２アミノ酸LEを付加した。さらに、N末の1アミノ酸も、OVA全長抗原由来のTを保存した形（LESIINFEKLT）で選択し、マイクロ遺伝子設計のためのモチーフとして使用した。【００６８】
まず、OVA-IモチーフLESIINFEKLTをコードする多機能塩基配列(I)と、OVA-IIモチーフISQAVHAAHAEINEAGRをコードする多機能塩基配列(II)とをCyberGeneを用いて別々に設計した。OVA-Iモチーフ及びOVA-IIモチーフから、逆翻訳して可能なコドンを書きだすと、DNA配列の組み合わせはそれぞれ248,832通り及び169,869,312通りであるが、CyberGeneにより、いずれかの読み枠内で終止コドンが生じるDNA配列等は排除された。第一配列としてOVA-Iモチーフ及びOVA-IIモチーフを指定し、第２配列にαへリックス構造やβシート構造をとりやすいアミノ酸配列を指定すると、それぞれ遺伝子配列が数百以上指定されるので、各々の構造の安定性が高い上位の配列を選別した。その結果得られた多機能塩基配列(I)及び(II)の一例を図２の4)に示す。【００６９】
得られた多機能塩基配列(I)及び(II)を結合し、マイクロ遺伝子#2101（配列番号１１）及び#6101（配列番号１５）を設計した。#2101が３つの読み枠でコードするアミノ酸配列を配列番号１２〜１４に示す。第１枠（配列番号１２）にはMHCクラスIエピトープが、第２枠（配列番号１３）にはMHCクラスIIエピトープが、第３枠（配列番号１４）には２つのαへリックスモチーフがコードされている。また、#6101が３つの読み枠でコードするアミノ酸配列を配列番号１６〜１８に示す。第１枠（配列番号１６）にはMHCクラスIエピトープが、第２枠（配列番号１７）にはMHCクラスIIエピトープ及びβシートモチーフが、第３枠（配列番号１８）にはαへリックスモチーフがコードされている。【００７０】
２．MolCraft法を用いた人工タンパク質ライブラリーの創製
芝清隆らが開発したMolCraft法（K. Shiba, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 28 (2004) 145-153）を用い、OVAのMHCクラスI、クラスIIエピトープ、αヘリックスなどのタンパク質安定化配列、CyberGeneにより自動的に定められた配列などのペプチドモチーフ配列（表２）が組み合わせ的に結合した人工タンパク質遺伝子を合成した。#2101のMPR法（芝清隆ら、PNAS vol.94, pp.3805-3810, 1997）による人工タンパク質遺伝子の合成工程の概略を図２の6)〜9)に示す。【００７１】
#2101の重合反応には2101-Sプライマー（CTCGAGAGTATCATCAACTTCGAGAAGCTTACCGATTTCTCAGGCT、配列番号１９）及び2101-ASプライマー（GCGGCCAGCCTCGTTGATCTCTGCATGAGCTGCATGAACTGCCTGAGAT、配列番号２０）を、#6101の重合反応には6101-Sプライマー（CTCGAAAGTATTATCAATTTCGAAAAACTCACCGATTTCTCAGGCT、配列番号２１）及び6101-ASプライマー（2101-ASと配列同一）を用いた。重合反応液は、3'→5'エクソヌクレアーゼ活性を有するVent DNA polymerases（2 units／μL、NEW ENGLAND BioLabs）を2.6μL、10×ThermoPol Reaction Buffer (NEW ENGLAND BioLabs, 1×ThermoPol Reaction Buffer：トリス塩酸pH8.8、10mM 塩化カリウム、10mM 硫酸アンモニウム、2mM 硫酸マグネシウム、0.1％トライトンX-100)を5μL、350μMdNTP、MPRプライマーS、AS各400 nM（各20 pmol使用）の組成で全量50μLで調製した。サーマルサイクラーを用いた重合反応の条件は、９４℃１０分→６０℃１０分→（９４℃１０秒→６０℃１分を３０サイクル）→６０℃７分→４℃∞とした。【００７２】
上記の通りにして人工タンパク質遺伝子１３４種類を合成し、それぞれ発現ベクターにクローニングした。６２種類の遺伝子に関して、大腸菌でのタンパク質発現をチェックした結果、４０種類の遺伝子でタンパク質の発現を確認した。【００７３】
【表２】
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【００７４】
３．In vitro抗原提示機能アッセイ
これらの人工タンパク質ライブラリーの中から、始めに８種類の人工タンパク質（図１c中に示したF138A, G142A, G142C, F182A, F58B, F58C, F112A, F112C）を選択し、in vitro抗原提示能アッセイを行った。人工タンパク質のアミノ酸配列を図３、４及び配列番号２６〜４３に示した。【００７５】
人工タンパク質を抗原提示細胞（DC2.4樹状細胞株）に添加し、OVA特異的エピトープを認識するT細胞(RF33.70)と共培養し、IL-2産生能を測定し、抗原提示能を評価した。【００７６】
その結果、10μg/mlの濃度でクローンF182A（配列番号２６）のみがIL-2を産生し、抗原提示能を示した（図１d）。タンパク質の大きさと純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した（図１d）。天然OVAでは、10μg/ml濃度では抗原提示能は認められなかった。また、骨髄由来の樹状細胞を用いた実験においても同様な結果が得られ、８種類の人工タンパク質のうちF182AのみがIL-2を産生し、抗原提示能を示した（データ省略）。このことから、F182A人工タンパク質は細胞性免疫を誘導する能力があることがわかった。【００７７】
４．抗原提示能を示す人工抗原とその特徴的アミノ酸配列
４−１．F37A人工タンパク質は天然OVAよりも１００倍強力に抗原提示する
次に、ライブラリーの中から、F182Aと似た構造を持つ人工タンパク質を含め、さらに8種類の人工タンパク質を選択し、in vitroで抗原提示能を評価した。10μg/mlの抗原濃度で、F182Aに加えて、F37A（配列番号４４）とF36C（配列番号３１）が抗原提示能を示した。抗原提示能を示したF182A、F37A、F36Cはいずれも共通の配列パターンを持っていた。即ち、●▽●▽●▽（▽は一部又は全部が(▽/▼)でもよい）の配列である。これは、LESIINFEKLTDFSGSSCSSCRDQRGWP（●▽、配列番号２２）又はLESIINFEKLTDLRQFTCRDQRGWP（●(▽/▼)、配列番号５３）の配列が３回タンデムに結合している構造である。以下、▽の一部又は全部が(▽/▼)であるものも含めて「●▽●▽●▽」と表現する。【００７８】
天然のOVAは1000μg/mlまで濃度を上げないと抗原提示能を示さなかった。このことから、F182A、F37A、F36Cは、OVAよりも１００倍高い抗原提示能を持つ事が明らかとなった。【００７９】
４−２．F37Aの特徴的な配列パターンが抗原提示能に機能する
抗原提示を示した人工タンパク質に共通の配列●▽●▽●▽が、抗原提示に重要であることを明らかにするために、F37Aの配列のOVA-I配列（●）をWT1（Wilms tumor 1）のMHCクラスIエピトープ配列（RMFPNAPYL、配列番号２３の194番〜202番残基）に、ひとつひとつ置換した変異体を作製した（図５c）。W▽の配列を配列番号２５に示す。人工タンパク質のアミノ酸配列を図６及び配列番号４４〜５２に示した。【００８０】
これらの抗原提示能を調べたが、ひとつでもOVA-I配列がWT1配列に置き換わることで、OVA特異的エピトープを認識するT細胞(RF33.70)と共培養した抗原提示細胞における人工タンパク質の抗原提示能は消失した。F37AE2は、F37AのＣ末の３アミノ酸が異なる５アミノ酸に変更されただけの人工タンパク質であり、●▽●▽●▽はそのまま含んでいたが、これは、抗原の濃度依存性にIL-2の産生能が増加していた。これらの結果から、天然OVAタンパク質よりも強い抗原提示能を持つ人工タンパク質は、特徴的な●▽●▽●▽の配列を介して機能し、外来抗原でありながら高率にエピトープペプチドをMHCクラスI分子に提示できることが明らかとなった。【００８１】
F37Aは大腸菌内でのタンパク質産生能が安定的に高いこと、また、抗原提示能が３つの中で最も高いことから、以下の実験はF37Aを用いて行った。【００８２】
４−３．円偏光二色性解析（CD）（図７）
天然OVAやαヘリックス構造を多く含む人工タンパク質(F182C,F37C,F36B)は典型的なαヘリックス構造を示すグラフパターンを示した。一方、F36AやF182Bはランダムコイルを特徴とするグラフパターンを示した。【００８３】
抗原性を示した、F182A, F37C, F36Cは、共通の特徴的なグラフパターンを示し、天然のOVAタンパク質が示すグラフパターンとは明らかに異なるが、少なくともαヘリックス構造を有していると考えられる二次構造を形成していることが明らかとなった。このような二次構造が抗原性の発揮に影響していることが示唆された。【００８４】
表３に、実験に使用した人工タンパク質の生化学的特徴、OVA-I：●とOVA-II：■エピトープ配列の保有数、in vitroの抗原性の有り無しをまとめた。【００８５】
【表３】
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【００８６】
G142A（配列番号３５）はMHCクラスIエピトープを4個、MHCクラスIIエピトープを2個持つが、抗原性を示さなかった。このことから、必ずしも、タンパク質中のMHCクラスIエピトープの数が多いことが抗原性の誘導に寄与しているのではないということが示唆された。【００８７】
F138AやG142Aのように、●▽の配列が2回繰り返しているタンパク質は抗原性を示さなかった。抗原性を示したタンパク質は、すべて、特徴的な●▽●▽●▽を含んでいた。従って、特徴的な●▽●▽●▽に見られる●▽の配列が3回以上繰り返す構造が抗原性の誘導に重要であることが示唆された。【００８８】
▽の配列（DFSGSSCSSCRDQRGWP、配列番号８）は、芝清隆らに開発されたCyberGeneソフトウェアを使用し、MHCクラスII配列を第１配列に、αヘリックス構造をとる配列を第２配列に規定した場合に得られる、第３配列としてCyberGeneソフトウェアのアルゴリズムにより提案される配列である。【００８９】
また、抗原性を示したタンパク質の等電点は6.0以上から8.6以下で、いずれも中性付近に等電点を持つことがわかった。このことから、抗原性には、人工タンパク質の等電点が中性であることが重要であることが示唆された。【００９０】
さらに、Strider 1.4f7ソフトを使用し、windowを９として、Hydropathy(Kite-Doolittle)疎水性解析を行った。その結果、MHCクラスI配列の下流にくる▽の配列（DFSGSSCSSCRDQRGWP、配列番号８）が親水性アミノ酸（R、N、D、E、Q、G、H、K、P、S、T、Yなど）を多く含み、親水性の特徴を示していることが示された（図８）。このことから、MHCクラスIが3回繰り返すMHCクラスI配列の下流にくる配列は親水性を示すことが重要であることが示唆された。【００９１】
さらに、Strider 1.4f7ソフトを使用し、windowを９として、タンパク質の両親媒性(Amphipathicity)解析を行った。その結果、特徴的な●▽●▽●▽配列の領域は、両親媒性が0.0から0.4の数値の間にあった（図９）。このような両親媒性が極端に逸脱しない構造が抗原性を示すうえで重要な特徴であることが示唆された。【００９２】
５．F37A人工タンパク質はクロスプレゼンテーションを介して抗原提示する
人工タンパク質が、抗原提示細胞に取り込まれ、クロスプレゼンテーションを介して、エピトープを抗原提示していることを確認するために、クロスプレゼンテーションに関与するプロテアソームの阻害剤、PiroximicinとMG132で処理して、細胞性免疫誘導能を評価した。その結果、F182AとF37Aの細胞性免疫誘導能が抑制された（図５d）。さらに、クロスプレゼンテーションを促進する効果のあるリソソーム阻害剤(Chloroquin)で処理したところ、F182AとF37Aの細胞性免疫誘導能が増強した。【００９３】
これらの知見から、F182AとF37Aは、外来抗原として、抗原提示細胞に取り込まれ、プロテアソームによる分解を受け、MHCクラスI分子にペプチドエピトープを提示する、いわゆるクロスプレゼンテーションを介して、抗原提示していることが確認された。【００９４】
６．F37Aは樹状細胞の成熟を介して抗原提示能を発揮していない
抗原提示細胞が免疫を誘導するためには、MHC分子への抗原提示に加えて、補助刺激分子（CD80やCD86）の発現、即ち、抗原提示細胞の成熟化が必要であることが知られている。そこで、マウス骨髄単球細胞からGM-CSFを用いて誘導したBMDC骨髄由来樹状細胞にF37Aを添加し、成熟マーカーであるCD80とCD86の発現を調べた。【００９５】
結果を図１０に示す。F37AはCD80やCD86の発現に影響を与えなかった。従って、F37Aは、抗原提示細胞の成熟に影響を与えて抗原提示を示しているのではないことが示唆された。なお、人工タンパク質及びOVAからは、triton X-114を用いて、大腸菌由来や環境由来のLPSは除去しており、サンプル中のLPSの濃度は0.5 EU/mg以下であることを確認している。【００９６】
７．F37A人工タンパク質はIn vivoで細胞性免疫を強力に誘導する
次に、抗原をC57Bl/6マウスの皮内に100μg/匹、２週間間隔で３回投与し、免疫した。検討群として、OVA-Iペプチド群 (OVA MHCクラスIエピトープ, OVA257-264, SIINFEKLを投与)、天然OVAタンパク質群、F37A人工タンパク質群を設定した。また、アジュバントとして、MPL(monophosphoryl lipid A)とフロイントアジュバントCFA（コンプリートアジュバント(結核菌死菌添加)１回、インコンプリートアジュバント２回）を用いて免疫を行った。【００９７】
免疫マウスから脾臓細胞を取り出し、IL-2 (10ng/ml)と100GyＸ線照射し不活化したEG7-OVA細胞(OVAを発現する腫瘍細胞)を混合培養し、in vitro stimulationを行った。その後、機能的OVA特異的Ｔ細胞を検出するため、EL-4（OVAを発現していない細胞、E.G7-OVAの親細胞）とEG7-OVA細胞（OVAを発現する細胞）を標的としCromium51 releasing assay（細胞障害性アッセイ）を行った。【００９８】
細胞障害性アッセイの結果を図１１aに示す。アジュバントを使用しないと、OVA-Iペプチド、天然OVAタンパク質、F37A、いずれの免疫群でもOVA特異的細胞障害性Ｔ細胞CTLは検出されなかった（図１１a、上段）。【００９９】
アジュバントとして、MPLと抗原を同時に投与すると、F37A群で、OVA-Iペプチド群及びOVA群よりも有意に強いＣＴＬ誘導が認められた（図１１a、中段）。このように、F37Aは、フロイントのオイルアジュバントを用いないでも、細胞性免疫を誘導できることが確認された。【０１００】
また、CFAをアジュバントとして用いると、OVA-Iペプチド群及びOVA群でもCTL誘導が認められた。また、F37A群のCTL誘導能は、OVA-Iペプチド群及びOAV群よりも高い傾向が見られた（図１１a、下段）。【０１０１】
これらの結果は、in vivoにおいても、F37Aが天然OVAタンパク質よりも強力にCTLを誘導できることを示している。【０１０２】
８．F37Aの腫瘍増殖抑制効果
次に、OVA発現腫瘍に対する腫瘍抑制効果を検証した。マウスを上記と同じように免疫し、腫瘍細胞EG7-OVA(2x106個)をマウスの背中に皮下投与した。その後、１週間ごとに腫瘍径を測定した。その結果、アジュバントを用いない群で、腫瘍細胞接種後３週の腫瘍径に群間で差は認められなかった。しかし、MPLをアジュバントとして用いると、OVA免疫群とF37A免疫群で有意な腫瘍の増殖抑制効果が認められた（図１１b）。F37Aは、フロイントのオイルアジュバントを用いないでも、細胞性免疫を誘導し、その細胞性免疫が機能できることが確認された。【０１０３】
さらに、CFAアジュバント使用群では、F37A免疫群で有意な腫瘍の増殖抑制が認められた。【０１０４】
これらの結果は、F37A免疫により誘導されるCTLが、OVAを発現する腫瘍細胞を障害できる機能的なCTLであることを示している。【０１０５】
９．F37Aは細胞性免疫誘導能だけでなく、液性免疫誘導も発揮する
免疫マウスから血清を採取し、抗OVA抗体ができているか否かを、OVAを抗原としたELISA法により調べた（図１１c）。【０１０６】
OVA-Iペプチドで免疫した群は、アジュバントの有無に関わらず、抗OVA抗体の産生は認められなかった。【０１０７】
一方、F37A免疫群では、アジュバントMPLおよびCFAの使用で、抗OVA抗体の産生が認められた。しかし、その産生量は、OVAタンパク質免疫群よりも明らかに低かった。【０１０８】
CTL誘導能、抗体産生能の結果から、天然OVAタンパク質は、細胞性免疫と液性免疫の両方を誘導する能力があるが、液性免疫が誘導されやすい傾向にあることがわかった。【０１０９】
一方、F37Aは、細胞性免疫と液性免疫の両方を誘導できるが、液性免疫よりも細胞性免疫を強く誘導する傾向にあることが明らかとなった。【０１１０】
１０．F37AのMHCクラスIIエピトープはOVA特異的CTL誘導に必須ではなく、細胞性免疫誘導にはMHCクラスIエピトープが機能している
F37AのOVA特異的CTL誘導にMHCクラスIIエピトープ配列OVA-IIが関与しているかどうか調べるために、MHCクラスIIエピトープを持たないF36C人工タンパク質でマウスを免疫した。また、F37Aに存在するMHCクラスIエピトープ配列OVA-Iが細胞性免疫誘導に機能していることを明らかにするために、３つのOVA-IをすべてWT1 MHCクラスIエピトープに置換したMT825人工タンパク質を用いてマウスを免疫した。免疫は、抗原100μgを用い、アジュバントMPL(20μg/匹)と同時に２週間隔で３回腹腔内に投与した（図１２a）。【０１１１】
１１．F37Aと同じ特徴的な配列パターン(●▽●▽●▽)を持ち、MHCクラスIIエピトープ配列を持たないF36CはCTLを誘導できる
免疫したマウスのCTLアッセイの結果、F37Aの免疫群は、MT825免疫群およびOVA免疫群に比べて有意にCTLを誘導した（図１２b）。また、F37Aと同じ特徴的な配列パターン(●▽●▽●▽)を持ち、MHCクラスIIエピトープ配列を持たないF36CにもCTLを誘導する傾向が見られた。OVA-Iを一つも持たないMT825は全くCTLを誘導することはなかった。これらの結果から、OVA特異的CTLの誘導には、必ずしもMHCクラスIIエピトープ配列は必要ではないことが示唆された。【０１１２】
１２．F37AのOVA特異的CTL誘導にはOVA-I配列が機能する
MT825にCTL誘導能が見られないことから、OVA特異的CTL誘導には、F37AのOVA-I (OVA MHCクラスIエピトープ, SIINFEKL)配列が必須であることが明らかになった。【０１１３】
１３．F37AはOVA特異的CTLを強力に誘導する（テトラマーアッセイ）
免疫したマウスに、OVA-Iペプチド（SIINFEKL）特異的なCD8陽性Ｔ細胞が存在することを、OVA-I配列特異的なテトラマー試薬を用いて測定した。テトラマー試薬は、MHCクラスI分子にエピトープペプチドOVA-Iが結合した4量体であり、Ｔ細胞のOVA-I特異的なT細胞レセプター（TCR）を発現する細胞を定量することが可能である。【０１１４】
テトラマーアッセイの結果を図１２cに示す。F37AはMT825免疫群に比べて有意にテトラマー陽性細胞を誘導した。また、OVAとF36Cもテトラマーを誘導する傾向があった。【０１１５】
これらの結果から、先に示したOVA腫瘍細胞を障害するCTLは、F37AのOVA-I配列特異的なテトラマー陽性CD8細胞であることが示唆された。【０１１６】
１４．F37AとF36Cには腫瘍の増殖を抑制する能力がある
上記の通り免疫したマウスに、EG7-OVA(2x106個)接種し、腫瘍の腫瘍径を測定した。腫瘍接種後３週では、F37AとF36C免疫群で有意に腫瘍増殖の抑制が認められた（図１２d）。個々のマウスの腫瘍増殖は図１２eに示した。OVA免疫群でも腫瘍増殖の抑制傾向が見られた。【０１１７】
マウスの生存曲線を比較した結果、OVA免疫群、F37A免疫群、F36C免疫群で生存の延長が見られた。その中でも、F37Aが最も生存延長効果が強かった（図１２d、下段右端）。【０１１８】
これらの結果から、F37Aは、in vivoにおいて、腫瘍の増殖を天然OVAタンパク質よりも強く抑制できることが明らかとなった。【０１１９】
MHCクラスII配列をもたないF36Cにおいても腫瘍増殖抑制が認められるが、MHCクラスII配列をもつF37Aの方が腫瘍抑制能が強いことが示されたことから、インダクションフェーズ（ＣＴＬの誘導）には必ずしもMHCクラスII配列は必要はないが、エフェクターフェーズ（免疫が機能し、腫瘍を攻撃する際）にはMHCクラスIとMHCクラスII配列の両方をもつ抗原の方がより強い効果を発揮することが示唆された。【０１２０】
MHCクラスI配列とCyberGeneに規定されるスペーサー配列が結合した配列が3回タンデムに結合し、かつ、N末とC末にMHCクラスIIエピトープを持つ構造を有するF37Aが、in vitroおよびin vivoにおいて最も強く細胞性免疫を誘導し、腫瘍の増殖を抑制したことから、F37Aは細胞性免疫を強力に誘導するワクチンの抗原として機能する特徴的な構造を我々に提示していると考えられる。【０１２１】
１５．F37Aの抗原提示メカニズムの解析
外来抗原が抗原提示細胞に取りこまれ、MHC class I分子に抗原エピトープを提示するクロスプレゼンテーションの細胞内経路は、未だ不明な点が多い。クロスプレゼンテーションを介して強力に細胞性免疫を誘導できるF37Aがどのようなメカニズムで抗原提示するかを調べた。【０１２２】
抗原提示能を示すF37A（配列番号４４）は、MHC class Iエピトープ3個とclass IIエピトープ２個を含み、class Iエピトープとスペーサー配列が３回交互に繰り返し連結したタンデムリピート構造を含む。一方、C131B（配列番号６４）は、MHC class Iエピトープ3個とclass IIエピトープ3個を含むが、F37Aと分子コンテクスト（エピトープの配列順序の組み合わせ等）が異なり、上記のタンデムリピート構造を含まず、抗原提示能を示さない(図１３Ａ)。【０１２３】
まず、F37AとC131Bの、抗原提示細胞への取込を調べた。その結果、F37Aは、C131Bよりも抗原提示細胞への取込量が低かった（図１４A、１４B）。C131Bの取込量は、F37Aよりも多い傾向が見られたが、図１３で示すように、C131Bは全く抗原提示能を示さなかった。以上より、F37Aの抗原提示細胞への取込量は、F37Aの抗原提示機能に関与していない事が示唆された。【０１２４】
次に、F37Aの抗原提示細胞への取込方式が抗原提示能の増強に関与している事を調べた。【０１２５】
クロスプレゼンテーションにおける抗原の取込には、マクロピノサイトーシス、非特異的ファゴサイトーシス、レセプター介したファゴサイトーシスなどが報告されている。天然抗原であるOVAは、抗原提示細胞のマンノースレセプターを介して取りこまれる（Burgdorf S, Kautz A, Bohnert V, Knolle PA, Kurts C (2007) Distinct pathways of antigenuptake and intracellular routing in CD4 and CD8 T cell activation. Science 316: 612-616.）。【０１２６】
F37Aは大腸菌で作製しており、糖修飾されていない。従って、天然抗原OVAとは異なり、マンノースレセプターを介するパスウェイ以外のメカニズムで抗原提示細胞に取りこまれていると考えられる。【０１２７】
抗原提示細胞（DC2.4細胞）をcytochalasin B（ファゴサイトーシス阻害剤）、5-(N,N-ジメチル)アミロリド（DMA、ピノサイトーシス阻害剤）、Poly-I（class Aスカベンジャーレセプター（SRA）阻害剤）であらかじめ処理した後、各処理細胞及び無処理細胞に抗原（F37A、C131B、又はOVA）を添加して培養し、抗原の取込と抗原提示能をin vitroで評価した。【０１２８】
その結果、F37Aの抗原提示細胞への取込は、Poly-Iにより抑制される傾向を示した。一方、そのメカニズムは不明であるが、C131BやOVAの取込は、poly-Iより増強された(図１３Ａ)。F37Aの抗原提示能は、cytochalasin B、DMA、及びPoly-Iで抑制された。その中でも、Poly-Iにより抗原提示は強力に抑制された(図１３Ｂ)。また、F37AとＣ末の5アミノ酸のみ異なるF37AE2抗原（配列番号４５）において、SRA阻害剤であるfucoidanにより、その抗原提示が抑制された（図１４C）。【０１２９】
SRAは、マクロファージや樹状細胞などに発現する細胞膜レセプターで、酸化LDLなどを取込み処理する。また、HSP(heat shock protein)と抗原を結合したタンパク質が、SRAを介して抗原提示細胞に取りこまれ、クロスプレゼンテーションを介して細胞性免疫を誘導する事が知られている（Murshid A, Gong J, Calderwood SK (2012) The role of heat shock proteins in antigen cross presentation. Front Immunol 3: 63.）。これらの事実を考え合わせると、F37AとC131Bの分子コンテクストの違いによる、SRAを介したF37Aの抗原提示細胞への取り込みが、F37Aの強力な抗原提示能の発揮につながる事が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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