(57)【要約】  本発明は、層状複水酸化物であって、明細書中において一般式（Ｉ）で示す化合物からなるアジュバントに関する。本発明における層状複水酸化物は軽金属を選択した無機イオン結合体であるため、本発明のアジュバントを含む免疫組成物を生体に投与する場合には、生体への副作用は低いと考えられる。層状複水酸化物において、２価陽イオン、３価陽イオン、陰イオンの組み合わせは無数に存在するので用途に応じた層状複水酸化物の作製が可能である。
2016047769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
層状複水酸化物であって、以下の一般式（Ｉ）で示す化合物からなるアジュバント。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
【請求項２】
M2+が、Mg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
M3+が、Al3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１又は２に記載のアジュバント。
【請求項４】
An-が、PO42-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3- 及び核酸からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１〜３のいずれか１に記載のアジュバント。
【請求項５】
アジュバントが、ワクチン用アジュバントである、請求項１〜４のいずれか１に記載のアジュバント。
【請求項６】
ワクチンを有効成分とし、さらに請求項５に記載のワクチン用アジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項７】
ワクチンが、抗体産生誘導用及び／又はＴ細胞活性化ワクチンである、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ワクチンが、不活化ワクチン又は成分ワクチンである、請求項６又は７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ワクチンが、マイナス電荷を有する抗原を含有するものである、請求項６〜８のいずれか１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ワクチンが、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン及びＢ型肝炎ワクチンから選択されるいずれか１種のワクチン、あるいは２種以上のワクチンの組み合わせからなるワクチンである、請求項６〜９のいずれか１に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１に記載のワクチン組成物を含むワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、層状複水酸化物からなるアジュバントに関し、さらに当該アジュバント及びワクチンを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、免疫応答賦活の作用機序を有するものであり、例えばワクチン等の抗原と共に投与され、投与した抗原に対する効果を高める分子、化合物、高分子物質及び生物学的製剤の総称をいう。現代のアジュバントは免疫賦活剤とデリバリーシステムの２つに大別される。その作用は（１）抗原を吸着して抗原提示細胞への取り込みを高めたり、（２）抗原を局所に長時間とどめて、徐々に放出することにより抗原刺激を持続させたり、（３）直接免疫担当細胞を活性化するなどアジュバントの種類によって様々である。【０００３】
従来知られたアジュバントとしては、結核菌加熱死菌又はその菌体成分によるミネラルオイルの油中水型乳剤（water-in-oil emulsion）であるフロイントの完全アジュバント（Freund's Complete Adjuvant： FCA）が挙げられる。FCAは液性免疫と細胞性免疫の両方を誘発する強力なアジュバントであるが、代謝されないミネラルオイルと抗酸菌菌体成分が強い肉芽腫性（炎症性）反応を誘導すること等によって、強炎症反応を惹起するという問題点がある。またアジュバントとして、百日咳死菌、アルミニウム塩（アラム：Ａｌｕｍ）なども挙げられる。代表的なアジュバントとして、多くのワクチンに利用されているのが、水酸化アルミニウムである。しかしながら、水酸化アルミニウムは可溶性でないために抗原との均一な混合が困難であり、アジュバント活性の強さが十分でないために、経鼻又は経皮投与用デバイスとの組合せが難しい等の問題がある。水酸化アルミニウム以外では、スクアレンやMPL（monophosphoryl lipid）などがあるが、アジュバント活性が強い反面、副反応も強く、水に溶けにくいという問題がある。そのため、医療現場では、人体へ高い免疫反応を惹起し、副作用が少なく、利便性の向上したアジュバントの開発が切望されている。【０００４】
細胞外Mg2+が存在しない条件で正常Ｔ細胞のT細胞受容体（TCR）を刺激するとCa2+流入が減少したが、細胞外Ca2+が存在しない条件でTCRを刺激しても、Mg2+流入に影響がないことが報告されており、この所見と従来のデータとを組み合わせると、Ca2+流入はMg2+流入の二次的なものであることが示唆された（非特許文献１）。非特許文献１では、低分子干渉RNA（siRNA）による正常Ｔ細胞のMagT1のノックダウンは、免疫不全患者のＴ細胞で見られるTCR刺激性のMg2+とCa2+流入の異常を再現し、逆に免疫不全患者のＴ細胞に全長のMagT1を発現させると、TCR刺激に対するMg2+流入が回復し、Ca2+流入が増大したことも報告されている。また非特許文献１では、健常者と免疫不全患者のＴ細胞で調べたTCR近位シグナル伝達イベントのうち、TCR刺激性Ca2+流入に必須なホスホリパーゼCγ1（PLC-γ1）の活性化のみが、免疫不全Ｔ細胞で欠損し、さらにPLC-γ1とは無関係なTCR活性化の下流のイベントは、MagT1欠損によって影響を受けなかったことも報告されている。更に、TCR刺激がMagT1を活性化し、Mg2+流入によってPLC-γ1の活性化が起こる機構は不明だが、Mg2+がＴ細胞活性化のセカンドメッセンジャーとして働いている可能性を示唆することも報告されている。【０００５】
層状複水酸化物（Layered Double Hydroxide：LDH）は、陰イオン交換能を有する、無機の骨格（金属水酸化物層）を持った層状化合物であり、独立行政法人産業技術総合研究所ホームページ（https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html）において、構造等も含め、詳細に説明されている。層状複水酸化物は天然での産出は多くはないが、合成が比較的簡単なことから、合成物を用いて多くの検討がなされてきている。実際の応用としては、制酸剤として胃腸薬に使用されたり、塩化ビニールの安定剤として配合されたりしている。陰イオン交換能があることから、陰イオン回収・除去を目的とした検討も多い。層状複水酸化物については多く報告されており、例えば「層状複水酸化物粒子群およびその製造方法、並びに層状複水酸化物分散液、層状複水酸化物添加樹脂」については特許文献１に開示がある。しかしながら、層状複水酸化物をアジュバントとして使用した報告も、マグネシウムをゲル化したものをアジュバントとして使用した報告もない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sci. Signal., 2 August 2011, Vol. 4, Issue 184, p. ec212
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１１２５６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、有効かつ安全なアジュバントを提供することを課題とする。さらには生体への影響が少ないアジュバントであり、かつ既存のアジュバントよりも早期の抗体産生を可能とするアジュバントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するためにMg2+などの２価金属イオンと免疫機能との関係に着目し、鋭意研究を重ねた結果、層状複水酸化物がアジュバントそのもので抗体産生を生じることのない無機物で構成されており、有効性及び安全性が確認されており、かつ早期の抗体産生を可能とするアジュバントとして優れた機能を有することを見出し、本発明を完成した。【００１０】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．層状複水酸化物であって、以下の一般式（Ｉ）で示す化合物からなるアジュバント。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3であり、ｍは0〜100である。）
２．M2+が、Mg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、前項１に記載のアジュバント。
３．M3+が、Al3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、前項１又は２に記載のアジュバント。
４．An-が、PO42-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3- 及び核酸からなる群より選択されるいずれか１種以上である、前項１〜３のいずれか１に記載のアジュバント。
５．アジュバントが、ワクチン用アジュバントである、前項１〜４のいずれか１に記載のアジュバント。
６．ワクチンを有効成分とし、さらに５に記載のワクチン用アジュバントを含むワクチン組成物。
７．ワクチンが、抗体産生誘導用及び／又はＴ細胞活性化ワクチンである、前項６に記載のワクチン組成物。
８．ワクチンが、不活化ワクチン又は成分ワクチンである、前項６又は７に記載のワクチン組成物。
９．ワクチンが、マイナス電荷を有する抗原を含有するものである、前項６〜８のいずれか１に記載のワクチン組成物。
１０．ワクチンが、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン及びＢ型肝炎ワクチンから選択されるいずれか１種のワクチン、あるいは２種以上のワクチンの組み合わせからなるワクチンである、前項６〜９のいずれか１に記載のワクチン組成物。
１１．前項６〜１０のいずれか１に記載のワクチン組成物を含むワクチン製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の層状複水酸化物は水酸化アルミニウムと同等の抗体産生を誘導する能力を有する。本発明の層状複水酸化物において、マグネシウムの存在比を調整することで、アジュバントへの抗原の吸着能もコントロールすることができる。即ち、抗原の徐放性をコントロールすることができるため、水酸化アルミニウムの欠点であった免疫の上昇期間の短縮が可能となる。【００１２】
層状複水酸化物は陰イオン交換能を有しているため、層状複水酸化物のゲスト層には陰イオンを有する物質、例えば核酸等をインターカレーションすることも可能である。これにより、安定性に寄与する効果も期待され、かつ、樹状細胞のような免疫細胞にアジュバント−抗原結合体が分散されること無く取り込まれることが予測される。よって、層状複水酸化物を応用したアジュバントとしての利用価値が広がると考えられる。さらに２価陽イオン、３価陽イオン、陰イオンの組み合わせは無数に存在するので用途に応じた層状複水酸化物の作製が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】層状複水酸化物による日本脳炎ウイルス抗原の吸着能確認試験結果を示す図である。（実験例１−２）
【図２】層状複水酸化物の吸着能確認試験結果を示す図である。（実験例１−３）
【図３】マウスによる抗体の作製スケジュールを示す図である。（実施例２）
【図４】日本脳炎ワクチンと層状複水酸化物をマウスに投与し、得られた抗体の中和抗体価を測定した結果を示す図である。（実験例２−１）
【図５】日本脳炎ワクチンとDPTワクチンの混合物と層状複水酸化物をマウスに投与し、得られた抗体の日本脳炎抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例２−２）
【図６】日本脳炎ワクチンとDPTワクチンの混合物と層状複水酸化物をマウスに投与し、得られた抗体のジフテリア抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例２−２）
【図７】日本脳炎ワクチンとDPTワクチンの混合物と層状複水酸化物をマウスに投与し、得られた抗体の百日咳抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例２−２）
【図８】日本脳炎ワクチンとDPTワクチンの混合物と層状複水酸化物をマウスに投与し、得られた抗体の破傷風抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例２−２）
【図９】インフルエンザHAワクチンと層状複水酸化物をマウスに投与し、投与後１週目のインフルエンザHA抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例３）
【図１０】インフルエンザHAワクチンと層状複水酸化物をマウスに投与し、投与後２週目のインフルエンザHA抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例３）
【図１１】インフルエンザHAワクチンと層状複水酸化物をマウスに投与し、投与後３週目のインフルエンザHA抗体量をELISA法にて測定した結果を示す図である。（実験例３）
【図１２】層状複水酸化物の吸着能確認試験結果を示す図である。（実験例４）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、アジュバントに関し、下記一般式（Ｉ）に示す層状複水酸化物に関する。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1〜0.9であり、ｎは1〜3である。ｍは0〜100である。）
【００１５】
本明細書において一般式（Ｉ）で示すｘは、上述の如く0.1〜0.9である。独立行政法人産業技術総合研究所ホームページ（https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html）に示すように、層状複水酸化物がアジュバント以外の用途に使用される場合は、ｘは0.2〜0.33の範囲にあることが知られている。本発明者は、驚くべきことに、層状複水酸化物をアジュバントとして使用した場合に、アジュバント以外の用途で用いられていたｘの範囲を外れた0.1〜0.9において優れたアジュバント効果を示すことを見出した。
【００１６】
本明細書において一般式（Ｉ）で示される「層状複水酸化物」とは、２価の金属水酸化物に３価の金属イオンが固溶した複水酸化物で、水酸化物基本層が正電荷を持つため、層間に負に帯電する陰イオンを挟んだ積層構造の化合物をいう。一般式前半部 [M2+1-xM3+x(OH)2]が金属水酸化物層であるホスト層で、ｘだけ正に帯電している。独立行政法人産業技術総合研究所ホームページ（https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html）に示すように、この正電荷を補償して、これらホスト層とホスト層の間（層間）にゲストである陰イオンが存在し、さらに水分子も存在している。３価金属の一部を４価金属で置き換えた組成や、１価〜３価の組み合わせである [Li1/3Al2/3(OH)2][An-1/(3 × n)・mH2O] などの層状複水酸化物も合成されている。金属水酸化物層中の金属は３種以上の多元系も可能である。「ホスト−ゲスト反応」により、二次元基本層（ホスト層）を保持したまま、層空間に原子・分子・イオン （ゲスト物質）を取り込むこと反応を「インターカレーション」という。
【００１７】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM2+は、Mg2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+，Li2+，Ni2+，Co2+及び Cu2+からなる群より選択することができ、好ましくはMg2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+、最も好ましくはMg2+である。金属水酸化物層中の金属は、上記より選択されるいずれか１種以上であり、複数種選択してもよいし１種類を選択することもできる。
【００１８】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM3+は、Al3+，Fe3+，Mn3+及びCr3+からなる群より選択することができ、好ましくはAl3+，Fe3+、最も好ましくはAl3+である。金属水酸化物層中の金属は、上記より選択されるいずれか１種以上であり、複数種選択してもよいし１種類を選択することもできる。
【００１９】
本明細書において、一般式（Ｉ）に示すAn-は、ホスト層とホスト層の間（層間）に取り込まれたゲスト物質であり、各種陰イオン物質をインターカレーションすることができる。ゲスト物質として陰イオン物質であればよく、特に限定されないが、例えばPO43-, CO32-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3- 及び核酸からなる群より選択することができる。核酸の例としてはDNAやRNAを挙げることができ、より具体的にはpoly I:C（TLR3リガンド）、DNAの非メチル化CpGのオリゴヌクレオチド（CpG ODN）などが挙げられる。一般式（Ｉ）に示すAn-は、好ましくはCO32-，PO43-，NO3-及びOH-からなる群より選択することができ、最も好ましくはCO32-，PO43-である。層間陰イオンも上記より選択されるいずれか１種以上であり、複数種選択してもよいし１種類を選択することもできる。同じ層間に存在することもあれば、規則的に別の層間に入る場合もある。
【００２０】
アジュバントとは免疫補助剤であって、抗原と共に生体内に投与されたとき、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質をいう。層状複水酸化物は、ワクチン用アジュバントとして使用できる他、実験用や試薬用の抗体産生用アジュバントとしても使用することができる。特に好適には、ワクチン用アジュバントとして使用することができる。層状複水酸化物は、例えば樹状細胞への抗原の取り込みを高めたり、又は樹状細胞を活性化させることができる。
【００２１】
本発明は、層状複水酸化物を含む免疫組成物にも及ぶ。免疫組成物には層状複水酸化物とともに、適宜必要な抗原を含めることができる。抗原は、投与されることにより生体に免疫を与え得るものである。抗原として例えば、弱毒化した生物、又は生物の成分、炭化水素、蛋白質、又はペプチド、或いはそのような成分をコードする核酸等が含まれる。免疫組成物に含まれる抗原の例としては、例えば細菌、ウイルス、寄生虫（例えば、マイコプラズマ、真菌、および原生動物）及びプリオン由来物質等が挙げられる。本発明の抗原は、マイナス電荷を有する抗原であることが好ましい。層状複水酸化物の優れたアジュバント効果は、層状複水酸化物がマイナス電荷を有する抗原を吸着するために得られるものと考えられる。
【００２２】
本発明の免疫組成物は、ワクチンを有効成分とするワクチン組成物にも及ぶ。有効成分としてのワクチンは、自体公知のワクチン又は今後開発されるワクチンのいずれであってもよく、特に限定されない。例えば、不活化ワクチン又は成分ワクチンのいずれであってもよい。ワクチンは好ましくは、マイナス電荷を有する抗原を含有する組成物である。上記のワクチンとして、具体的には例えば日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン及びＢ型肝炎ワクチンから選択されるいずれか１種のワクチン、あるいは２種以上のワクチンの組み合わせからなるワクチンが適用可能である（国際公開公報WO2014/045621、The Molecular Biology of Poliovirus, 1985/6/14、東京大学大学院医学系研究科  教授  野本明男先生講演会, 2004/11/13ポリオの会例会）。本発明において、少なくとも１種のワクチンにおいてマイナス電荷を有する抗原が含有されていることが好ましい。ワクチン自体の作製は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により作製することができる。以下本明細書において、一般的に抗原をいう場合は、ワクチンも包含される意味で使用される。
【００２３】
本発明の免疫組成物は、本発明のアジュバント及び抗原の他、薬理学的に許容しうる担体、希釈液及び／又は賦形剤を含むことができる。本発明の免疫組成物は、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下を含む）、経皮、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内を含む）の投与に適するもの、あるいは吸入またはガス注入による投与に適する形態のものを含むことができる。剤形としては、例えば液剤、懸濁剤、粉末剤などとすることができる。液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともに混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。本発明の免疫組成物は、薬学の技術分野でよく知られている任意の方法により調製することができる。
【００２４】
本発明の免疫組成物の投与量は、投与対象、投与部位、投与方法及び投与間隔、例えば対象がヒトの場合は、年齢、性別、体重、ならびに医師に公知の他の因子に依存することが当業者には認識される。したがって、本発明の免疫組成物を予防及び／又は治療のために使用するときの薬学的に有効な量は、医療分野において公知であるこのような考慮すべき事柄によって決定される。
【００２５】
投与対象は、免疫組成物に含まれる抗原の種類に応じて適宜決定することができる。例えばヒトのほか、ヒト以外の哺乳類、鳥類、甲殻類などに投与することができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。以下、水酸化アルミニウムを水酸化アルミニウムゲルともいう。また、リン酸アルミニウムをリン酸アルミニウムゲルともいう。【００２７】
（実施例１）層状複水酸化物の作製
本実施例では、本発明のアジュバントとして層状複水酸化物を作製した。
一般式（Ｉ）：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示される。）
以下の表１に従って層状複水酸化物を作製した。層状複水酸化物は、特許文献１に開示する方法に従って作製し、アルミニウム含量を確認した。【００２８】
【表１】
2016047769.tif 000003
【００２９】
（実験例１−１）層状複水酸化物の抗原吸着能確認試験−１
実施例１で作製した層状複水酸化物を用いて日本脳炎ウイルス抗原の吸着能について確認した。層状複水酸化物（アルミニウム含量500μg/mL）と、抗原蛋白質として不活化精製日本脳炎ウイルス含有液（蛋白質含量101μg/mL）とを等量混合し、撹拌後３時間放置した後、層状複水酸化物に吸着されなかった上清中の蛋白質量を吸光度（波長280nm）で測定した。【００３０】
その結果を表２に示した。炭酸イオンを用いた層状複水酸化物は、リン酸イオンを用いた層状複水酸化物よりも、日本脳炎ウイルス抗原に対する吸着能が高いことが確認された。【００３１】
【表２】
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【００３２】
（実験例１−２）層状複水酸化物の抗原吸着能確認試験−２
実施例１で作製した層状複水酸化物のうち、C816、C116及びC186を各々階段希釈し、抗原吸着能を確認した。
実験例１−１で用いた抗原蛋白質と前記層状複水酸化物とを等量混合し、撹拌後３時間放置した後、上清中の蛋白質量を吸光度（波長280nm）で測定した。アジュバントの対照として水酸化アルミニウムゲルを用いた。【００３３】
その結果を表３及び図１に示した。図１において「水酸化アルミニウムゲル」を「水酸化アルミゲル」、「層状複水酸化物」を各々「C816」、「C116」、「C186」と示した。層状複水酸化物のうちマグネシウムイオンのmol比が低い方が、特に層状複水酸化物を希釈した条件下において、抗原蛋白質の吸着能が高いことが示された。【００３４】
【表３】
2016047769.tif 000005
【００３５】
（実験例１−３）層状複水酸化物の吸着能確認試験−３
実施例１で作製したC216を選択し、水酸化アルミニウムゲル及びリン酸アルミニウムゲルと抗原吸着能を比較した。各々階段希釈し、実験例１−１で用いた抗原蛋白質を等量混合し、撹拌後３時間放置した後、上清中の蛋白質量を吸光度（波長280nm）で測定した。【００３６】
その結果を図２に示す。図２において「水酸化アルミニウムゲル」を「水酸化アルミゲル」、「リン酸アルミニウムゲル」を「リン酸アルミゲル」、「層状複水酸化物」をC216と示した。抗原吸着能は水酸化アルミニウムゲル≧層状複水酸化物（C216）＞＞リン酸アルミニウムゲルの順に高かった。【００３７】
（実施例２）マウスによる抗体の作製−１
実施例１で作製したC216を選択し、抗体産生を誘導する能力について水酸化アルミニウムゲル及びリン酸アルミニウムゲルと比較した。抗原蛋白質として、百日咳抗原（ＰＴ及びＦＨＡ）、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドの混合抗原（以下「DPT抗原」ともいう。）及び不活化日本脳炎ウイルス全粒子抗原を用いた。各抗原が通常ワクチンとして使用する濃度（日本脳炎：5μg/mL、百日咳：13.2μg/mL、ジフテリア：22μg/mL、破傷風：1.32μg/mL）となるよう調製した抗原蛋白質溶液を、表４に示す濃度の水酸化アルミニウムゲル又は層状複水酸化物に吸着させ、図３に示す免疫スケジュールに従って１週間隔で２回マウスの腹腔内に0.5mL投与し、免疫を行った。【００３８】
【表４】
2016047769.tif 000006
【００３９】
（実験例２−１）
実施例２の方法により各濃度の抗原で免疫処理したマウスの免疫開始２週間後又は３週間後の血清を用いて、「生物学的製剤基準：乾燥細胞培養日本脳炎ワクチン  3.4.9  力価試験」（平成26年7月4日改正  厚生労働省告示  第２７９号）の方法に従って中和抗体価を測定した。結果を図４に示した。【００４０】
（実験例２−２）
実施例２の方法により各濃度の抗原で免疫処理したマウスの免疫開始２週間後又は３週間後の血清を、プレートに吸着された各抗原と３７℃で1時間反応させ、ELISA法にて日本脳炎、百日咳、ジフテリア及び破傷風の抗体量を測定した。【００４１】
32倍希釈抗原の免疫開始２週間後の血清では、水酸化アルミニウムゲル及びアジュバントなし（DPTのみ）よりも層状複水酸化物（C216）をアジュバントとして用いたほうが高い抗体産生を誘導した。また、免疫開始３週間後の血清では、アジュバント使用、不使用ともに抗体産生に大きな差はなく、いずれも参照品と比較して高い抗体産生を誘導した（図５〜８）。【００４２】
各種アジュバントによる抗体価の推移には以下の違いがみられた。
１）Al(OH)3-2W，Al(OH)3-3W
32倍希釈抗原では、免疫開始２週間後の中和抗体価、抗体量共に、層状複水酸化物（C216）よりも低値であった。免疫開始３週間後には高い中和抗体価が得られた。
２）C216-2W，C216-3W
免疫開始２週間後から高い抗体上昇が認められ３週間後も高い中和抗体価が得られた。
３）(-)-2W，(-)-3W
水酸化アルミニウムゲルと同様、32倍希釈抗原では、免疫開始２週間後の中和抗体価、抗体量共に層状複水酸化物（C216）よりも低値であった。免疫開始３週間後には高い中和抗体価が得られた。
以上の結果は、層状複水酸化物をアジュバントに用いることで早期に抗体が産生されたことを示す。また、この効果は少ない抗原量において顕著に発揮される。【００４３】
（実施例３）マウスによる抗体の作製−２
実施例１で作製したC216を選択し、対照として水酸化アルミニウムゲルを用いた。抗原蛋白質として、阪大微生物病研究会製：インフルエンザHAワクチン（販売名「ビケンHA」）を用いた。インフルエンザHAワクチンの抗原蛋白質量が30μgHA/mL、アジュバントのアルミニウム含量が300μg/mLとなるようにPBSを必要量加えて調製したものを、各々階段希釈して抗原蛋白質溶液を作製した（表５）。抗原蛋白質溶液を水酸化アルミニウムゲル又は層状複水酸化物（LDH）に吸着させ、図３と同様の免疫スケジュールに従って１週間隔で２回マウスの腹腔内に0.5mL投与し、免疫を行った。マウスはddyマウス（1群10匹）を用いた。なお表５において「水酸化アルミニウムゲル」を「水酸化アルミゲル」、「層状複水酸化物」を「LDH（C216）」と示した。
【表５】
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【００４４】
（実験例３）
実施例３の方法により、各濃度の抗原で免疫処理したマウスについて、免疫前及び免疫開始１週間後、２週間後又は３週間後に尾静脈から採血を行った。PBSを用いて希釈した血清をプレートに吸着させた抗原と３７℃で1時間反応させ、ELISA法にてインフルエンザHAの抗体量を測定した。【００４５】
水酸化アルミニウムゲルをアジュバントに用いた場合に免疫開始３週間後から抗体量の上昇が認められるのに対して、層状複水酸化物（C216）をアジュバントに用いた場合には、免疫開始２週間後から抗体量の上昇が認められた（図９〜１１）。以上の結果は、層状複水酸化物をアジュバントに用いることで、早期に抗体が産生されたことを示す。【００４６】
（実施例４）層状複水酸化物の作製
実施例１と同様の手法により、層状複水酸化物を作製した。層間陰イオンとしては、リン酸水素２ナトリウム由来のリン酸イオンを用いた。M3+とM2+のmol比は、Al:Mg:＝1:9、Al:Mg＝3:7、Al:Mg＝5:5、Al:Mg＝7:3である層状複水酸化物を作製した。実施例１と同様の手法によりアルミニウム含量を確認した。【００４７】
（実験例４）層状複水酸化物の吸着能確認試験−４
実施例４で作製した層状複水酸化物を用いて、国際公開公報WO2014/045621号に記載の肺炎球菌の表面蛋白質である抗原蛋白に対する吸着能を確認した。
常法に従って、大腸菌にて遺伝子組み換えにより肺炎球菌抗原蛋白を発現させ、肺炎球菌抗原蛋白を含む大腸菌破砕液を作製し、抗原蛋白質溶液とした。抗原蛋白質溶液と各種層状複水酸化物とを混合・吸着させて、サンプルを調製した。その後、ATTO社製のE-T/R1020L（10〜20%）ゲルを用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥにより層状複水酸化物と抗原蛋白質との吸着能を確認した。ゲルの各レーンには、蛋白質量が等量となるようにサンプルをアプライした。【００４８】
結果を図１２に示す。図１２中、矢印の位置が、抗原蛋白単独のバンドである。また、各レーンにアプライしたサンプルは以下の通りである。
1；大腸菌破砕液のみ、層状複水酸化物添加なし
2；大腸菌破砕液＋層状複水酸化物（Al:Mg＝1:9）
3；大腸菌破砕液＋層状複水酸化物（Al:Mg＝3:7）
4；大腸菌破砕液＋層状複水酸化物（Al:Mg＝5:5）
5；大腸菌破砕液＋層状複水酸化物（Al:Mg＝7:3）
層状複水酸化物のアルミニウムのmol比を増やすことで、目的とする抗原蛋白単独のバンドが薄くなることから、層状複水酸化物と肺炎球菌の抗原蛋白とが吸着したことが確認できた。【００４９】
（結果の考察）
上述した実施例より、本発明者は層状複水酸化物にマイナス電荷を有する各種抗原が吸着することを見出した。更に、層状複水酸化物を構成する２価及び３価の陽イオンの比率を調整することで、抗原との吸着力をコントロールできることを見出した。これは抗原と層状複水酸化物の静電吸着力によるものであると推測される。【００５０】
水酸化アルミニウムに代表される従来のアジュバントは陽イオンの電荷が一定のため、抗原との吸着力をコントロールすることができなかった。そこで本発明者は、層状複水酸化物によって抗原吸着力が変動する現象に着目した結果、早期抗体産生を可能にした。この効果は、水酸化アルミニウムよりも低い抗原吸着力により、抗原を早期に徐放できることによるものだと推測される。更に驚くべきことに、早期に抗体が産生されるばかりでなく、抗体の産生量および中和抗体価についても水酸化アルミニウムと同等であった。【００５１】
また層状複水酸化物の特徴は、抗原の種類を問わずに上記効果が及ぶことである。抗原が有する電荷により、最適な抗原徐放性をもたらす層状複水酸化物の組成は変わってくる。そのため、層状複水酸化物を構成する陽イオン及び陰イオンの種類や存在比を最適化することで、抗原の種類を問わずに早期抗体産生効果をもたらすと推測される。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上詳述したように、本発明の層状複水酸化物は水酸化アルミニウムに代表される従来のアジュバントと同等の抗体産生誘導能を有することが確認された。本発明の層状複水酸化物において、マグネシウムの存在比を調整することで吸着能もコントロールすることができる。即ち、抗原の徐放性をコントロールすることができるため、水酸化アルミニウムの欠点であった免疫の上昇期間の短縮が可能となる。【００５３】
さらに、本発明の層状複水酸化物の典型的な構成では、ワクチンのアジュバントとして使用実績があり生体への副作用の少ない水酸化アルミニウムと、体内に通常存在する2価の陽イオンであるマグネシウムやカルシウム等の軽金属を選択した無機イオン結合体であるため、本発明のアジュバントを含む免疫組成物を生体に投与する場合には、生体への副作用は低いと考えられる。【００５４】
層状複水酸化物は陰イオン交換能を有しているため、層状複水酸化物のゲスト層には陰イオン有する物質、例えば核酸等をインターカレーションすることも可能であり、安定性の向上が期待される。このことにより、金属体におけるナノパーティクルの作製が可能となれば、樹状細胞のような免疫細胞にアジュバント−抗原結合体が分散されること無く取り込まれることが予測される。そのため、層状複水酸化物を応用したアジュバントとしての利用価値が広がると考えられる。さらに２価陽イオン、３価陽イオン、陰イオンの組み合わせは無数に存在するので用途に応じた層状複水酸化物の作製が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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