(57)【要約】  血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌の取得方法が提供される。本発明は、プリン体を含む培地における乳酸菌のプリン体の取り込み量を測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌をスクリーニングすることを含む、乳酸菌のスクリーニング方法、及びそれにより得られる乳酸菌を用いた血清尿酸値の低減用のプリン体捕捉剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン体を含む培地における乳酸菌のプリン体の取り込み量を測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜することを含む、乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
培地中のプリン体がプリン塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地中のプリン体が放射性同位体で標識されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プリン体を含む培地における前記乳酸菌の増殖量を測定し、それを前記プリン体の取り込み量と共に指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られるプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られるプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を有効成分として含む、プリン体捕捉剤。
【請求項８】
血清尿酸値の低減用である、請求項７に記載のプリン体捕捉剤。
【請求項９】
乳酸菌が、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株（受託番号NITE BP-224）である、請求項７又は８に記載のプリン体捕捉剤。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のプリン体捕捉剤を含む、飲食品又は医薬品。
【請求項１１】
腸管内のプリン体の低減用である、請求項９に記載の飲食品又は医薬品。
【請求項１２】
6〜8mg/dLの血清尿酸値を示すヒトの被験体を投与対象とする、請求項１０又は１１に記載の飲食品又は医薬品。
【請求項１３】
前記乳酸菌を1用量当たり1×108〜1×1010 cfuで含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の飲食品又は医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリン体の取り込み能を有する乳酸菌及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内では近年、食生活の変化に伴い、痛風患者や高尿酸血症者が年々増加している。高尿酸血症では、尿酸排泄低下や尿酸産生過剰が起こり、血清尿酸量の増加により、激痛を伴う急性関節炎を発症する痛風がしばしば誘発される。日本国内では現在、痛風患者は推定で100万人であり、高尿酸血症者は推定で1000万人である。現状では、高尿酸血症は主に、食事療法、運動療法、及び投薬を組合せて、血清尿酸値をコントロールすることによって予防・治療されている。食事療法では、摂取カロリーを制限することにより、最終的に尿酸に分解される食餌性プリン体の摂取を低減しているが、厳しい摂取カロリーの制限を継続することは必ずしも容易ではない。そのため、痛風や高尿酸血症について、より効果的な治療法が望まれている。さらに、痛風や高尿酸血症について、その予防や症状の軽減に効果的な食品の開発も望まれている。【０００３】
ところで、高尿酸血症における血清尿酸値の低減に効果を示す微生物や発酵物が報告されている（特許文献１〜５）。例えば、特許文献１では、乳酸菌がプリンヌクレオシドからプリン塩基への高い分解能を有していることを示している。例えば、特許文献４及び５では、乳酸菌がプリン体の分解能を有していることを示している。このような従来の血清尿酸値の低減作用を有する微生物や発酵物は、腸管内におけるプリンヌクレオシドのプリン塩基への変換を促進し、腸管から吸収されやすいプリンヌクレオシドから腸管から吸収されにくいプリン塩基に変換することにより、プリン体の吸収抑制や排泄促進をもたらすと考えられてきた。しかし、ヒト試験の結果の報告は少なく、また、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌の効率的な取得方法も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2008-005834号公報
【特許文献２】国際公開WO2011/102310号
【特許文献３】国際公開WO2004/112809号
【特許文献４】国際公開WO2009/069704号
【特許文献５】特開2013-048636号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌の効率的な取得方法（選抜方法）を提供することを課題とする。本発明はまた、プリン体の取り込み能を有する乳酸菌及びその用途を提供することを別の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラクトバチルス・ガセリ菌をはじめとする乳酸菌の中に、プリン体の取り込み能とプリン体の存在下における高い増殖能とを有する菌株が存在すること、そのような乳酸菌においてプリン体の取り込み能とプリン体の存在下における増殖能が相関すること、また、そのような乳酸菌の投与（摂取）により、血清尿酸値を低減し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] プリン体を含む培地における乳酸菌のプリン体の取り込み量を測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜することを含む、乳酸菌のスクリーニング方法。
[2] 培地中のプリン体がプリン塩基である、上記[1]に記載の方法。
[3] 培地中のプリン体が放射性同位体で標識されている、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] プリン体を含む培地における前記乳酸菌の増殖量を測定し、それを前記プリン体の取り込み量と共に指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜することを含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ菌である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法によって得られるプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌。
[7] 上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法によって得られるプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を有効成分として含む、プリン体捕捉剤。
[8] 血清尿酸値の低減用である、上記[7]に記載のプリン体捕捉剤。
[9] 乳酸菌が、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株（受託番号NITE BP-224）である、上記[7]又は[8]に記載のプリン体捕捉剤。
[10] 上記[7]〜[9]のいずれかに記載のプリン体捕捉剤を含む、飲食品又は医薬品。
[11] 腸管内のプリン体の低減用である、上記[10]に記載の飲食品又は医薬品。
[12] 6〜8mg/dLの血清尿酸値を示すヒトの被験体を投与対象とする、上記[10]又は[11]に記載の飲食品又は医薬品。
[13] 前記乳酸菌を1用量当たり1×108〜1×1010 cfuで含む、上記[10]〜[12]のいずれかに記載の飲食品又は医薬品。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、プリン体の捕捉作用及び血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌を効率的に取得（選抜）することができる。本発明に係る乳酸菌又は捕捉剤を用いれば、プリン体を効率よく捕捉することができる。
本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願 特願2014-234050号及び特願2015-064201号の内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株のプリン体の取り込み能を示すグラフである。
【図２】プリン体の存在下におけるラクトバチルス・ガセリOLL2959株の増殖能を示すグラフである。
【図３】複数の乳酸菌株のアデニンの取り込み能を示す図である。
【図４】アデニンの存在下における複数の乳酸菌株の増殖能を示すグラフである。
【図５】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を継続的に経口投与（経口摂取）したヒトの被験体における血清尿酸値の経時的変化を示すグラフである。
【図６】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株とプリン体を同時に投与した動物におけるラクトバチルス・ガセリOLL2959株のプリン体の取り込み能を示すグラフである。
【図７】アデニンの取り込み能を乳酸菌株の種類で比較した結果を示すグラフである。
【図８】アデニンの存在下における乳酸菌株の増殖能を乳酸菌株の種類で比較した結果を示すグラフである。
【図９】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株における濁度（OD650）と核酸量の経時的変化を示すグラフである。
【図１０】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株における核酸量と核酸中の放射活性の経時的変化を示すグラフである。
【図１１】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と14C-IMPを投与した動物におけるOLL2959株のIMP吸収低減効果を示すグラフである。放射活性（dpm）：平均値±SD。* p<0.1。Ａ：投与後15分、Ｂ：投与後30分。それぞれ左から、陰性群（陰性対照群）、IMP群（IMP投与群）、IMP+OLL2959群（IMP+OLL2959株投与群）の結果を示す。
【図１２】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と14C-IMPを投与した動物におけるOLL2959株のIMP吸収低減効果を示すグラフである。放射活性（dpm）：平均値±SD。* p<0.1。Ａ：投与後45分、Ｂ：投与後60分。それぞれ左から、陰性群（陰性対照群）、IMP群（IMP投与群）、IMP+OLL2959群（IMP+OLL2959株投与群）の結果を示す。
【図１３】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と14C-ヒポキサンチンを投与した動物におけるOLL2959株のヒポキサンチン吸収低減効果を示すグラフである。放射活性（dpm）：平均値±SD。## p<0.01。Ａ：投与後15分、Ｂ：投与後30分。それぞれ左から、陰性群（陰性対照群）、ヒポキサンチン群（ヒポキサンチン投与群）、ヒポキサンチン+OLL2959群（ヒポキサンチン+OLL2959株投与群）の結果を示す。
【図１４】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と14C-ヒポキサンチンを投与した動物におけるOLL2959株のヒポキサンチン吸収低減効果を示すグラフである。放射活性（dpm）：平均値±SD。## p<0.01、# p<0.05。Ａ：投与後45分、Ｂ：投与後60分。それぞれ左から、陰性群（陰性対照群）、ヒポキサンチン群（ヒポキサンチン投与群）、ヒポキサンチン+OLL2959群（ヒポキサンチン+OLL2959株投与群）の結果を示す。
【図１５】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株のヒポキサンチン及びイノシンの取り込み能（捕捉作用）を示すグラフである。
【図１６】ラクトバチルス・ガセリOLL2959株のヨーグルト中での生残率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
プリン体は、プリン骨格を有する物質の総称であり、プリン塩基、プリンヌクレオシド、及びプリンヌクレオチドに分類される。プリン体は、生体の主に細胞内で様々な機能を果たしており、例えば、核酸の構成成分として遺伝情報の伝達を担っている。主なプリン塩基としては、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン及びキサンチンがある。プリンヌクレオシドはプリン塩基に糖が結合した化合物であり、リボースが結合したアデノシン、グアノシン、イノシン及びキサントシン、デオキシリボースが結合したデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシイノシン及びデオキシキサントシンが挙げられる。プリンヌクレオチドはプリンヌクレオシドにリン酸が結合した化合物であり、アデニル酸（AMP）、グアニル酸（GMP）、イノシン酸（IMP）及びキサンチル酸（XMP）が挙げられる。
【００１１】
プリン体は、腸管吸収を介して食物から食餌性プリン体として生体内に供給される他、de novo経路でアミノ酸等から新規に生合成される。また、プリン体は、プリンヌクレオチドの分解によって生成されたプリン塩基を再利用してプリンヌクレオチドを合成するサルベージ経路を介して、生合成される。
【００１２】
ヒトの場合、プリンヌクレオチドは最終的に尿酸に代謝される。例えば、アデニル酸は5'-ヌクレオチダーゼ（5'-NT）活性によって、アデノシンとなり、アデノシンはイノシンを経て、ヒポキサンチンに代謝される。ヒポキサンチンはキサンチンデヒドロゲナーゼ（XDH）及びキサンチンオキシダーゼ（XO）活性によって、キサンチンとなる。グアニル酸は5'-ヌクレオチダーゼ活性によって、グアノシンとなり、さらにプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）活性によって、グアニンとなる。グアニンはグアニンデアミナーゼ（GDA）によって、キサンチンとなる。キサンチンはキサンチンデヒドロゲナーゼ（XDH）及びキサンチンオキシダーゼ（XO）活性によって、尿酸に代謝される。一方で、それぞれのプリンヌクレオシド（アデノシン、イノシン、キサントシン及びグアノシン）はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）活性によって、プリン塩基（アデニン、ヒポキサンチン、キサンチン及びグアニン）に変換される。アデニン、グアニン、ヒポキサンチン及びキサンチンの多くは、サルベージ酵素活性によって、それぞれアデニル酸、グアニル酸、イノシン酸及びキサンチル酸の生合成に再利用される（サルベージ経路）。
【００１３】
乳酸菌の場合も、ヒトと類似のプリン体の代謝経路を有するが、ヒトの代謝経路とは異なる点もある。例えば、ほとんどの乳酸菌はプリンヌクレオシドを最終的に塩基まで代謝する。また、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）菌の場合、プリンヌクレオシドはプリンヌクレオシダーゼによって、プリン塩基に変換される。
【００１４】
本発明では、菌体内へのプリン体の取り込み能を指標として、乳酸菌を選抜（スクリーニング）することにより、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を効率的に取得（選抜）することができる。本発明は、プリン体を含む培地における乳酸菌のプリン体の取り込み量を測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を取得（選抜）することを含む、乳酸菌のスクリーニング方法に関する。より具体的には、本発明は、プリン体を含む培地で乳酸菌を培養し、菌体内のプリン体の取り込み量を好ましくは経時的に測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を取得（選抜）することを含む、乳酸菌のスクリーニング方法に関する。このようにして得られるプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌は、血清尿酸値の低減作用を有する蓋然性が高い。ここで、乳酸菌によるプリン体の取り込み量が多いこと、すなわち、乳酸菌の菌体がプリン体捕捉作用を有することは、生体内、特に腸管内のプリン体が大量に当該乳酸菌に捕捉されて腸管内の環境から除去されることにより、腸管からのプリン体の吸収が抑制されることを意味する。なお、乳酸菌は消化管から吸収されることなく排泄されることが知られているため、乳酸菌に捕捉されたプリン体は腸管からの吸収を逃れて、乳酸菌と共に体外に排出されることになる。そこで、本発明は、プリン体を含む培地で乳酸菌を培養し、菌体内のプリン体の取り込み量を測定し、それを指標としてプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜し、この得られたプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌として取得（選抜）することを含む、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法にも関する。
【００１５】
本発明において、プリン体の取り込み能を有する乳酸菌は、そのプリン体の取り込み能の高さと相関するように、プリン体の存在下における高い増殖能を示す。そこで、本発明では、上記のプリン体の取り込み能を指標とした選抜に加えて、この選抜した乳酸菌のプリン体の存在下における増殖能の増強を確認することにより、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌をより高精度に取得（選抜）することもできる。すなわち、本発明は、プリン体の取り込み能を有する乳酸菌のプリン体を含む培地における増殖量を測定し、それを、上記のように測定したプリン体の取り込み量と共に指標として、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を取得（選抜）することを含む、乳酸菌のスクリーニング方法にも関する。さらに、本発明は、プリン体を含む培地で乳酸菌を培養し、該菌の増殖量を経時的に測定し、それを、上記のように測定したプリン体の取り込み量と共に指標として、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を選抜し、この得られたプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌として取得（選抜）することを含む、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法にも関する。ただし、プリン体の存在下における増殖量の測定及びそれを指標とした選抜を行ってもよいし、そのような選抜を行わなくてもよい。乳酸菌に大量に取り込まれたプリン体（例えば、プリン塩基）は、増殖に必要な核酸合成に用いられ、それが乳酸菌の高い増殖能をもたらす。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法に供する乳酸菌は、特に限定されるものではないが、好ましくは、ラクトバチルス（Lactobacillus）属菌である。ラクトバチルス属菌としては、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. burgalicus）、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis）、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヘルベチカス・サブスピーシーズ・ユーグルティ（Lactobacillus helveticus subsp. jugurti）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・オリス（Lactobacillus oris）、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・ラムノーサス（Lactobacillus casei subsp. rhamnosus）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）等の菌株が挙げられるが、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）菌が特に好ましい。本発明のスクリーニング方法に供する乳酸菌の任意の菌株は、適当な培地（例えばMRS培地）で培養して濃度を調整した後、スクリーニングに用いることが好ましい。スクリーニングに用いる培地は、ラクトバチルス・ガセリ菌が増殖できる任意の培地であればよいが、最少培地又はそれをベースとしてプリン体を加えたか又は一部の成分をプリン体に置換した培地が好ましい。なお、特に好ましい最少培地の例を表１に挙げる。
【００１７】
培地に含めるプリン体は、プリン塩基、プリンヌクレオシド、及び／又はプリンヌクレオチドであればよい。好ましい一実施形態では、培地に含めるプリン体は、プリン塩基である。プリン塩基の例としては、以下に限定されないが、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン及びキサンチンが挙げられ、アデニンが特に好ましい。プリンヌクレオシドの例としては、以下に限定されないが、アデノシン、グアノシン、イノシン及びキサントシンが挙げられ、アデノシンが特に好ましい。プリンヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、アデニル酸（AMP）、グアニル酸（GMP）、イノシン酸（IMP）及びキサンチル酸（XMP）が挙げられ、アデニル酸が特に好ましい。別の実施形態では、プリン塩基、プリンヌクレオシド、及びプリンヌクレオチドの好ましい例として、それぞれ、ヒポキサンチン、イノシン（IMP）及びイノシン酸が挙げられ、ヒポキサンチンが特に好ましい。
【００１８】
乳酸菌のプリン体の取り込み量の測定には、培地に含まれるプリン体の一部又は全部として、定量的な検出が可能な標識物で標識されたプリン体、例えば、放射性同位体や蛍光物質で標識されたプリン体を用いた培地を好適に用いることができる。放射性同位体としては、例えば、14Cが好ましい。乳酸菌のプリン体の取り込み量は、例えば、プリン体を含む培地で乳酸菌を培養し、一定時間培養後にTFA（トリフルオロ酢酸）等を添加して反応を停止させ、培養後の菌体の標識プリン体を標識物の活性の検出に基づいて定量し、培養開始時の菌体の同活性と比較することで測定や判定することができる。乳酸菌のプリン体の取り込み量が、培養開始時（培養開始後0分時点）と比較して有意に増加した場合、その乳酸菌は、そのプリン体を菌体内に取り込む能力（プリン体の取り込み能）を有すると判定することができる。乳酸菌のプリン体の取り込み量が、培養開始時（培養開始0分時点）と比較して顕著に増加した場合、その乳酸菌を、そのプリン体を菌体内に取り込む能力（プリン体の取り込み能）が高いと判定することができる。あるいは、乳酸菌のプリン体の取り込み量が、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株と比較して有意に増加した場合、その乳酸菌を、そのプリン体を菌体内に取り込む能力（プリン体の取り込み能）が高いと判定することもできる。本発明では、このようにしてプリン体の取り込み能を有すると判定された乳酸菌を、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌として取得（選抜）することができる。そして、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌として選抜された乳酸菌を、さらに、血清尿酸値の低減作用を有する乳酸菌又はその候補として取得（選抜）することができる。なお、乳酸菌の培養時間は、増殖曲線の誘導期又は対数増殖期にある任意の時点までの時間であることが好ましい。例えば、乳酸菌を培養開始の30分後及び60分後まで培養し、プリン体の取り込み能等を測定することができる。このとき、通常では、液体シンチレーションカウンターを用いて、放射性同位体で標識したプリン体の放射活性を測定すればよい。
【００１９】
乳酸菌のプリン体の存在下における増殖量は、例えば、プリン体を含む培地において乳酸菌を培養し、培養開始時と一定時間の培養後の培地の濁度（典型的には、650nmにおける吸光度）を測定し、その両者の差を算出することで測定や判定をすることができる。プリン体の存在下で培養した場合の濁度の増加量が、プリン体の不在下で培養した場合と比較して有意に増加した場合、その乳酸菌は、そのプリン体の存在下で増強された増殖能を示すものと判定することができる。あるいは、プリン体の存在下で培養した場合の濁度の増加量が、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株と比較して有意に増強された場合、その乳酸菌を、そのプリン体の存在下で顕著に増強された増殖能を示すものと判定することもできる。乳酸菌がプリン体の取り込み能を有し、かつプリン体の存在下で増強された増殖能を示す場合、その乳酸菌がプリン体を高度に資化できることを意味し、すなわち、当該乳酸菌がプリン体を高度に捕捉できること、ひいては、血清尿酸値の低減作用を有する可能性が裏付けられる。なお、乳酸菌の培養時間は、増殖曲線の対数増殖期にある任意の時点までの時間であることが好ましい。例えば、乳酸菌を培養開始の4時間後及び6時間後まで培養し、プリン体の存在下における増殖能等を測定することができる。
【００２０】
上記の測定では、乳酸菌は、培地の1mLに対して、1.0×106〜1.0×1011cfu、例えば0.8×107〜 3×107 cfuで植菌して培養することが好ましい。乳酸菌の培養条件は、特に限定されないが、30〜39℃、好ましくは36〜38℃で、嫌気培養することが好ましい。
【００２１】
本発明では、以上のようにして選抜された乳酸菌について、例えば、後述の実施例に記載の方法に従って、血清尿酸値の低減作用を有することをさらに試験することも好ましい。例えば、以上のようにして選抜された乳酸菌を被験体に単回又は複数回で投与し、血清尿酸値を測定し、血清尿酸値の変化（血清尿酸値の低減）の有無を調べることにより、以上のようにして選抜された乳酸菌が血清尿酸値の低減作用を有するか否かを判定することができる。
【００２２】
以上のようにして選抜された乳酸菌は、プリン体の取り込み能、及び好ましくはプリン体の存在下における高い増殖能を有し、すなわち、高いプリン体の捕捉作用を有する。そのような乳酸菌は、典型的には、血清尿酸値の低減作用を有する。以上のようにして選抜された乳酸菌は、生体内（典型的には腸管内）のプリン体の存在下におけるプリン体の取り込み能及び高い増殖能（すなわち、高いプリン体の資化能）を発揮する結果として、生体内（典型的には腸管内）のプリン体を大量に捕捉して低減し、プリン体の吸収量を低減させることによって、血清尿酸値を低減することができる。選抜された乳酸菌が取り込むことができ、すなわち捕捉できるプリン体は、例えば、プリン塩基、プリンヌクレオシド、及び／又はプリンヌクレオチドである。選抜された乳酸菌が取り込むことができるプリン体は、スクリーニングにおいて培地中に含めたプリン体に必ずしも限定されない。プリン塩基の例としては、以下に限定されないが、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン及びキサンチンが挙げられる。プリンヌクレオシドの例としては、以下に限定されないが、アデノシン、グアノシン、イノシン及びキサントシンが挙げられる。プリンヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、アデニル酸（AMP）、グアニル酸（GMP）、イノシン酸（IMP）及びキサンチル酸（XMP）が挙げられる。一実施形態では、選抜された乳酸菌が取り込むことができるプリン体は、アデニン、アデノシン、アデニル酸、ヒポキサンチン、イノシン、及びイノシン酸からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくはその全部を含む。
【００２３】
また、本発明は、上記のスクリーニング方法で選抜された、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌も提供する。この乳酸菌は、典型的には、血清尿酸値の低減作用を有する。
【００２４】
また、本発明は、上記のスクリーニング方法で得ることができる、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌（以下、本発明の乳酸菌とも称する）を有効成分として含むプリン体捕捉剤、好ましくは経口投与用のプリン体捕捉剤も提供する。本発明のプリン体捕捉剤は、本発明のラクトバチルス・ガセリ菌に加えて、経口投与用に許容される担体又は添加剤を含んでもよい。本発明のプリン体捕捉剤は、本発明の乳酸菌の菌体を含む薬剤又は組成物であってもよいし、当該菌を用いて製造された発酵物、培養物、若しくはそれらの濃縮物・乾燥物若しくはそれを含む薬剤又は組成物であってもよい。なお、本発明のプリン体捕捉剤に含まれる本発明に係る乳酸菌は、生菌体であることが好ましい。本発明のプリン体捕捉剤は、上記のとおり、乳酸菌のプリン体の取り込みによる腸管内のプリン体の低減作用を有し、したがって、腸管内のプリン体の低減用、ひいては、血清尿酸値の低減用に好適に用いることができる。本発明の乳酸菌や本発明のプリン体捕捉剤はまた、魚や肉の旨味成分であるプリン体、例えばイノシン酸（IMP）、アデニル酸（AMP）等のプリンヌクレオチドを菌体内に取り込み、腸管から体内へのその吸収を低減する。したがって本発明の乳酸菌や本発明のプリン体捕捉剤は、そのような旨味成分の腸管からの吸収を低減するために用いることもできる。本発明は、本発明の乳酸菌又は本発明のプリン体捕捉剤を含む、旨味成分（ここでは、イノシン酸等の、魚や肉の旨味成分であるプリン体又はプリンヌクレオチド）の吸収低減剤も提供する。この旨味成分の吸収低減剤も好ましくは経口投与用である。
【００２５】
上記のようなプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌の好適例としては、以下に限定されないが、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）OLL2959株やラクトバチルス・ガセリP14054ME002株等のラクトバチルス・ガセリ菌が挙げられる。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株はホモ乳酸発酵性であり、ガス産生能を有しない。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株は、2006年3月31日付（原寄託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室  郵便番号292-0818）に受託番号NITE P-224で寄託された後、2007年11月21日付でブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）に移管されており、受託番号がNITE BP-224に変更されている。あるいは、別の実施形態では、上記のようなプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）OLL2959株を除いた乳酸菌又はラクトバチルス・ガセリ菌であってもよい。
【００２６】
本発明は、本発明に係るプリン体捕捉剤を飲食品又は医薬品と組み合わせて使用することも意図する。したがって本発明は、飲食品又は医薬品と組み合わせて使用するための、本発明に係るプリン体捕捉剤も提供する。
【００２７】
本発明は、本発明に係るプリン体捕捉剤を含む、飲食品又は医薬品も提供する。本発明の飲食品や医薬品は、それを投与（摂取）した被験体において、菌体内にプリン体を積極的に取り込んで資化し、それにより腸管内のプリン体を低減し、血清尿酸値の効果的な低減をもたらすことができる。したがって本発明の飲食品及び医薬品は、腸管内のプリン体の低減用であってもよい。なお、本発明でいう「腸管内のプリン体」には、腸管内に存在する細菌（乳酸菌等）、真菌、ウイルス、被験体の細胞等が保持するプリン体は含まないものとする。本発明の飲食品及び医薬品は、腸管内のプリン体の低減に基づく血清尿酸値の低減用であってもよい。本発明のプリン体捕捉剤を含む飲食品や医薬品は、例えば、痛風や高尿酸血症の予防、治療、改善又は症状の軽減等のために好適に用いることができる。
【００２８】
本明細書において「飲食品」としては、特に限定されないが、飲料、食品及び機能性食品を包含する。本発明に係る飲食品の種類は、特に限定されないが、例えば、飲料としては、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶、烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水等が挙げられ、好適な飲料としては、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料、乳飲料、水ベースの飲料等が挙げられ、特に好適な飲料としては、ドリンクヨーグルトが挙げられる。各種の飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」(2003)（株式会社光琳）等を参考にすることができる。また、例えば、食品としては、発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト、チーズ等）、乳製品、菓子、インスタント食品等が挙げられ、好適な食品としては、セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト、菓子等が挙げられ、特に好適な飲料としては、セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等が挙げられる。各種の食品の製造法等については、既存の参考書を参考にすることができる。
【００２９】
プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を含むヨーグルト等の発酵乳は、例えば、プリン体の捕捉作用を有していても、それを有していなくてもよい、乳酸菌等の他の微生物を含み得るスターターを用いて製造した乳製品や発酵乳に、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を添加することによって製造してもよい。なお、スターターを用いた乳製品や発酵乳は、常法に従って製造することができる。例えば、加温・混合・均質化・殺菌処理後に冷却した乳又は乳製品に、スターターを混合し、発酵・冷却することにより、ヨーグルトを製造することができる。本発明は、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌の、ヨーグルトやチーズ等の乳製品や発酵乳の製造における使用（好ましくは当該乳酸菌を乳製品や発酵乳又はその原料に添加（配合）することを含む）であることが好ましく、ヨーグルトの製造における当該乳酸菌の使用であることが特に好ましい。さらに、本発明は、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌を有効成分として使用する、ヨーグルトやチーズ等の発酵乳や乳製品の製造における、乳酸菌のプリン体の捕捉作用に基づくプリン体の低減方法も提供する。本発明に係るプリン体の捕捉作用を有する乳酸菌（例えば、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株）は、ヨーグルトなどの発酵乳や乳製品において良好な生残性を示すことができる。
【００３０】
本発明に係る飲食品として、とりわけ、機能性食品が好ましい。本発明の「機能性食品」としては、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、日本における特定保健用食品（条件付きトクホ[特定保健用食品]を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、機能性表示食品、及び特別用途食品、また栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等の各種の剤形のもの）及び美容食品（例えば、ダイエット食品）等の、いわゆる健康食品全般を包含する。また、本発明の機能性食品は、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康食品を包含する。
【００３１】
本発明の機能性食品としては、より具体的な好ましい例には、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品がある。
【００３２】
本発明の機能性食品は、腸管内のプリン体の低減により血清尿酸値を低減する上で特に有用である。本発明の機能性食品は、血清尿酸値の低減用、特に乳酸菌によるプリン体の取り込み及び乳酸菌の増殖促進による腸管内のプリン体の低減及び、その結果としての腸管におけるプリン体の吸収の低減を伴う血清尿酸値の低減用に好適に用いることができる。
【００３３】
本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品又は条件付きトクホ[特定保健用食品]）等の飲食品は、腸管内のプリン体の低減用であってもよいし、血清尿酸値の低減又は血清尿酸値の上昇を抑制若しくは緩和するためのものであってもよく、その旨について記載又は表示したものであってもよい。本発明は、プリン体の捕捉作用を有する乳酸菌の、そのような機能性食品の製造における使用（好ましくは当該乳酸菌を機能性食品又はその原料に添加（配合）することを含む）であることが好ましい。
【００３４】
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液体製剤、又はジェル剤やペースト剤等であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、ヨーグルト、菓子等）であってもよい。
【００３５】
本発明の飲食品は、任意の食品成分を含んでもよく、特に限定されない。本発明の飲食品は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を含んでもよい。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物、バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分等が挙げられる。糖質としては、一般の糖類、加工澱粉（デキストリン、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維等が挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸等が挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラル等が挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等が挙げられる。これらの成分は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いて添加してもよい。
【００３６】
また、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤を含む機能性食品は、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤に加えて、経口用に許容される担体又は添加剤を含んでもよい。担体としては、例えば、水、経口投与において許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、経口投与において許容される界面活性剤等が挙げられる。添加剤としては、例えば、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤等が挙げられる。これらの担体又は添加剤は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、製剤の剤形に応じて適宜用いることができる。なお、本発明の機能性食品は、さらに他の機能性成分を含有してもよい。
【００３７】
また、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤を含む医薬品（医薬組成物）は、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤に加えて、製薬上で許容される担体又は添加剤、特に、経口用に許容される担体又は添加剤を含んでもよい。担体としては、例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、製薬上許容される界面活性剤等の他、リポゾーム等の人工細胞構造物等が挙げられる。添加剤としては、例えば、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤等が挙げられる。これらの担体又は添加剤は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、製剤の剤形に応じて適宜用いることができる。なお、本発明の医薬品は、さらに他の薬理成分を含有してもよい。
【００３８】
本発明の医薬品は、経口投与することが好ましい。本発明の医薬品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤等の固形製剤、ジェル剤、又は液剤、懸濁剤、シロップ剤等の液体製剤等の任意の剤形であってもよい。
【００３９】
本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品では、その投与量（摂取量）は、投与（摂取）対象の被験体の年齢及び体重、投与経路、投与回数等を考慮しながら、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。そのため、本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品では、本発明の乳酸菌（ラクトバチルス・ガセリ菌等）の投与量としては、特に限定されないが、例えば、1用量当たり1×105〜1×1011 cfu となる量が好ましく、1×108〜1×1010 cfu となる量がより好ましく、1×109〜1×1010 cfu となる量がさらに好ましく、例えば、4×109〜6×1010 cfu となる量が特に好ましい。本発明のプリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、本発明の乳酸菌を、1用量当たり1×105〜1×1011 cfu となる量で含有することが好ましく、1×108〜1×1010 cfu となる量で含有することがより好ましく、1×109〜1×1010 cfu となる量で含有することがさらに好ましく、例えば、4×109〜6×1010 cfu となる量で含有することが特に好ましい。
【００４０】
本発明の一実施形態において、本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、1日1回以上、好ましくは1日2回以上、より好ましくは1日2回で、被験体に投与される（又は消費者が摂取する）。本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、被験体に継続的に投与されてもよく、例えば、毎日で投与されてもよい。この場合、本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、少なくとも1週間、好ましくは2週間以上、より好ましくは4週間以上にわたって、被験体に投与される。本発明のプリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品では、被験体に継続的に投与する場合、本発明の乳酸菌の投与量としては、1用量当たり1×105〜1×1011 cfu となる量が好ましく、1×108〜1×1010 cfu となる量がより好ましく、1×109〜1×1010 cfu となる量がさらに好ましく、例えば、4×109〜6×1010 cfu となる量が特に好ましい。
【００４１】
本発明の別の一実施形態において、本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、単回投与であってもよい。本発明のプリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品では、被験体に単回投与する場合、本発明の乳酸菌の投与量としては、1用量当たり1×105〜1×1011 cfu となる量が好ましく、1×108〜1×1010 cfu となる量がより好ましく、1×109〜1×1010 cfu となる量がさらに好ましく、例えば、4×109〜6×1010 cfu となる量が特に好ましい。本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品は、好ましくは、経口投与（経口摂取）される。
【００４２】
本発明において「投与」とは、一般的に飲食品に対して用いられる「摂取」と医薬品に対して用いられる「投与」の両方を包含する。本発明において「経口投与」は、口からの投与又は摂取の他、鼻チューブや胃ろうチューブ等を介した経管栄養法による投与も含むものとする。したがって、本発明は、そのような経口投与に用いることができる経口剤も提供する。そこで、本発明の好ましい実施形態では、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤を含む、腸管内のプリン体を低減し、血清尿酸値を低減するための経口剤も提供する。
【００４３】
本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品又は医薬品の投与対象となる被験体は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物であり、ヒトの被験体が好ましく、痛風及び／又は高尿酸血症であるヒトの被験体がより好ましく、6mg/dL以上、例えば6〜10mg/dLの血清尿酸値を示すヒトの被験体がさらに好ましい。一実施形態では、6〜8mg/dLの血清尿酸値を示す軽度〜境界域の高尿酸血症であるヒトの被験体が投与対象としてさらに好ましい。本発明はまた、本発明の乳酸菌、又は本発明の乳酸菌を有効量で含む、本発明のプリン体捕捉剤、飲食品若しくは医薬品を、上記被験体に上述のように投与する（摂取させる）ことにより、乳酸菌の菌体内にプリン体を捕捉し、それにより腸管内のプリン体を低減し、血清尿酸値を低減する方法も提供する。本発明はまた、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤をプリン体と接触させることにより、乳酸菌の菌体内にプリン体を捕捉する方法も提供する。本発明はまた、飲食品、医薬品又は他の薬剤にプリン体捕捉作用を付与するための、本発明の乳酸菌又はプリン体捕捉剤の使用も提供する。本発明はまた、痛風を発症するリスク又は高尿酸血症を発症するリスクを低減するための、本発明の乳酸菌、プリン体捕捉剤、飲食品、又は医薬品の使用も提供する。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これら実施例に限定されるものではない。【００４５】
［実施例１］プリン体の取り込み能の評価試験
本実施例では、放射性同位体（RI）で標識したプリン体を用いて、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri；ガセリ菌）OLL2959株のプリン体の取り込み能について評価した。【００４６】
ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri；ガセリ菌）OLL2959株は、2006年3月31日付（原寄託日）で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  122号室  郵便番号292-0818）に受託番号NITE P-224で寄託された後、2007年11月21日付でブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）に移管されており、受託番号がNITE BP-224に変更されている。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株をMRS培地（Lactobacilli MRS Broth 、Difco社）に接種し、37℃、16〜20時間で培養した培養物（4〜7×108cfu/ml）を以下で使用した。【００４７】
最少培地（DM培地；表１）： 0.1mLに、放射性同位体14Cで標識したアデニル酸（AMP）、アデノシン、又はアデニン（それぞれ14C-AMP、14C-アデノシン、14C-アデニン）を終濃度： 20μMとなるように添加し、次いで、上記で調製したラクトバチルス・ガセリOLL2959株の培養液を2重量%（0.002mL： 0.8〜1.4×106cfu）で植菌して、37℃、30分間で嫌気培養した。【００４８】
その後、これらの培地に、TFA溶液（トリフルオロ酢酸、5%）を添加し、次いで、生理食塩水にて菌体を洗浄してから、液体シンチレーションカウンター（アロカ製、LSC-6100）にて放射活性を測定した。コントロール（0分）として、サンプルの調製の直後にTFA溶液（5%）を添加し、次いで、生理食塩水にて菌体を洗浄してから、前記と同様に、放射活性を測定した。この結果を図１に示した。図１中、菌体中の14C標識プリン体の量を示す放射活性（縦軸）の単位は、放射性物質が1分あたりに壊変する数である disintegrations per minute（dpm）である。なお、DM培地を用いた60分間の培養において、試験開始時と試験終了時における生菌数に有意な変化がないことを確認した。【００４９】
この結果、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株は、プリン体であるアデニル酸（AMP）、アデノシン、及びアデニンを菌体内に取り込む能力（プリン体の取り込み能）を有していること、特にアデニンを菌体内に取り込む能力（プリン体の取り込み能）が高いことが示された（図１）。【００５０】
【表１】
2016080371.tif 000002
【００５１】
［実施例２］プリン体の存在下における増殖能の評価試験
本実施例では、プリン体の存在下においてラクトバチルス・ガセリOLL2959株を培養し、プリン体の存在下における増殖能について評価した。【００５２】
DM培地（表１）： 1mLに、プリン体として、アデニル酸（AMP）、アデノシン、又はアデニンを終濃度が400μMとなるように添加し、次いで、実施例１で調製したラクトバチルス・ガセリOLL2959株の培養液を4重量%（0.04mL： 1.6〜2.8×107 cfu）で植菌して、37℃で嫌気培養した。そして、この培養開始から0時間、4時間及び6時間後に、培地の濁度（650nmにおける吸光度）を測定した。コントロールとして、最少培地にプリン体を添加しないこと以外は同様の方法により、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を培養して、培地の濁度を測定した。この結果を図２に示した。【００５３】
この結果、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株は、アデニル酸（AMP）、アデノシン、又はアデニンの存在下において増殖能が増強されること、特に、アデニン存在下において増殖能がより増強されることが示された（図２）。【００５４】
［実施例３］アデニンの取り込み能及びアデニンの存在下における増殖能の比較試験
本実施例では、アデニン存在下においてラクトバチルス・ガセリOLL2959株及び他のラクトバチルス・ガセリ菌株を培養し、それぞれのアデニンの取り込み能とアデニンの存在下における増殖能について比較した。【００５５】
他のラクトバチルス・ガセリ菌株としては、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株及びP14054ME002株を用いた。なお、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株及びP14054ME002株では、プリン体を添加しないMRS培地（Lactobacilli MRS Broth 、Difco社）にて、20時間で培養した場合、それぞれの増殖能がラクトバチルス・ガセリOLL2959株と同等であった（表２）。【００５６】
【表２】
2016080371.tif 000003
【００５７】
アデニンの取り込み能の評価では、放射性同位体14Cで標識したプリン体として、アデニン（14C-アデニン）のみを使用した点以外は実施例１と同様にして試験した。この結果を図３に示した。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株ほどには高くはないものの、ラクトバチルス・ガセリP14054ME002株でも、アデニンの取り込み能が高いことを確認できた（図３）。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株及びP14054ME002株と比較すると、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株では、アデニンの取り込み能が低いことを確認できた（図３）。【００５８】
アデニンの存在下における増殖能の評価では、DM培地（表１）：1mLに、アデニンを終濃度が400μMとなるように添加し、次いで、実施例１で調製したラクトバチルス・ガセリOLL2959株の培養液、実施例１に記載の方法と同様にして調製したP14054ME001株及びP14054ME002株の培養液のいずれかを4重量%（0.04mL： 1.6〜2.8×107 cfu）で植菌して、37℃で嫌気培養した。そして、この培養開始から0時間、4時間及び6時間後に、培地の濁度（650nmにおける吸光度）を測定した。この結果を図４に示した。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と同様に、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株及びP14054ME002株でも、アデニンの存在下において増殖能の増強を示した。また、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株及びP14054ME002株に比較して、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株では、その増殖能の増強程度が極めて強かった。なお、ラクトバチルス・ガセリP14054ME001株に比較して、ラクトバチルス・ガセリP14054ME002株では、その増殖能の増強程度が強かった。【００５９】
これらの結果から、ラクトバチルス・ガセリ菌において、アデニンの存在下における増殖能の増強は、アデニンの取り込み能の高さと相関することが示された。そして、一部の乳酸菌が高いアデニンの資化能を有することが示された。【００６０】
［実施例４］ラクトバチルス・ガセリOLL2959株の血清尿酸値の低減効果の評価試験
軽度〜境界域の高尿酸血症が疑われるヒト被験者に、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を継続的に摂取させ、プラセボ対照二重盲検比較試験により、尿酸値への影響について検討した（ヒト試験）。【００６１】
試験開始前の検査で尿酸値が6〜8 mg/dLであった35歳以上の成人男性14名（平均年齢44.3歳）を、尿酸値と年齢に有意差がないように、プラセボ群とアクティブ群の2群に割付した。プラセボ群には、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を含まないヨーグルトを2個（85g／個）／日で4週間摂取させた。アクティブ群には、プラセボ群に与えたヨーグルトにラクトバチルス・ガセリOLL2959株を1×108cfu／gで含有させたものを2個（85g／個）／日で4週間摂取させた。なお、ヨーグルト2個／日は、朝食、昼食、夕食の何れかの食後の2回で摂取させた。【００６２】
各被験者について試験開始時（試験食摂取前）、2週後及び4週後（試験食摂取期間）に血液検査を行い、血清尿酸値を常法により測定した。試験開始時の血清尿酸値と比較した各時点の血清尿酸値の変化量を算出し、試験期間中の血清尿酸値の変化量の推移について、反復測定2元配置分散分析法により統計解析を行った。結果を図５に示した。【００６３】
図５に示されるとおり、アクティブ群では、プラセボ群と比較して、血清尿酸値が有意に低かった（p = 0.042）。すなわち、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株は、血清尿酸値を低減させる効果を有することが示された。【００６４】
［実施例５］ラクトバチルス・ガセリ菌の単回投与試験（動物試験）
ラットはヒトとは異なり、尿酸分解酵素であるウリカーゼを有しているので、血清尿酸値を上昇させるためにウリカーゼ阻害剤であるオキソニン酸カリウムを投与する必要がある。そのため、16時間絶食させたWistarラット（雄）にオキソニン酸カリウム0.5g/kgを強制経口投与する。乳酸菌群には、オキソニン酸カリウム投与の60分後にプリン体負荷のため乾燥酵母（注射用水で懸濁）とラクトバチルス・ガセリOLL2959株（生理食塩水で懸濁）を強制経口投与する。陰性群には、乾燥酵母の代わりに注射用水、ラクトバチルス・ガセリ菌の代わりに生理食塩水を投与する。対照群には、乾燥酵母と共に、ラクトバチルス・ガセリ菌の代わりに生理食塩水を投与する。【００６５】
強制経口投与後、経時的（30分、60分、90分、120分、及び150分後）に採血し、それぞれの血液試料について血中尿酸値を常法により測定し、血中尿酸値の推移を調べる。対照群と比較して乳酸菌群で血中尿酸値が低く推移すれば、単回投与においてもラクトバチルス・ガセリOLL2959株のプリン体取り込みの効果により腸管からのプリン体吸収量が減少することが示される。【００６６】
［実施例６］ラクトバチルス・ガセリ菌のプリン体の取り込み能（動物試験）
乳酸菌によるプリン体の取り込み能が高い場合、動物の被験体に乳酸菌とプリン体を同時に投与する（摂取させる）と、プリン体単独を摂取させたときと比較して、被験体におけるプリン体の吸収が抑えられると考えられる。そこで、ラクトバチルス・ガセリ菌のプリン体の取り込み能を試験するため、以下の手順で、動物実験を行った。【００６７】
まず、8週齢のWistarラット（雄、190〜210g）の14匹を購入してから一週間に亘って馴化した。これらのラットでは、試験の前日から約16時間で絶食させ、この絶食後に、体重を測定した。この絶食後の体重を基に、群分けプログラムを用いて無作為抽出法により、ラットを陰性群（生理食塩水投与群）、AMP（放射性同位体14C-AMP）投与群、AMP+OLL2959株（放射性同位体14C-AMP 及びOLL2959株）投与群の合計で3群に振り分けた（陰性群のみを4匹、他群を各5匹とした。）。これらの全部のラットを無麻酔下にて、ホルダーに入れ、メスを用いて尾静脈を傷つけ、ヘマトクリット管を用いて、これら湧出してきた血液を60μL採血した。これを被験物質の投与前の0分時点の採血とした。これらの採血した血液には、等量の2mg/mL EDTA-2Na溶液（EDTA-2Naを生理食塩水に溶解した）を加えた。【００６８】
次いで、被験物質を強制経口投与した。ここで、これらの被験物質には、陰性群では、生理食塩水、AMP投与群では、放射性同位体14Cで標識したアデニル酸（14C-AMP：57.6mCi/mmol、0.1mCi/ml）、AMP+OLL2959株投与群では、14C-AMP 及びラクトバチルス・ガセリOLL2959株（1×1010cfu/body）を用いた。また、14C-AMP及びOLL2959株には、生理食塩水（大塚製薬）で希釈したものを用いた。AMP群及びAMP+OLL2959群では、14C-AMPを10μCi/bodyで投与した。なお、全例（全群）において、投与容量を2mL/bodyとした。【００６９】
被験物質の投与から15、30、45、60、90、120及び180分後に、これらの全部のラットを無麻酔下にて、ホルダーに入れ、メスを用いて尾静脈を傷つけ、ヘマトクリット管を用いて、これら湧出してきた血液を60μL採血した。これらの採血した血液には、等量の2mg/mL EDTA-2Na溶液（EDTA-2Naを、生理食塩水に溶解した）を加えた。これらの試験の終了後に、ラットを直ちに二酸化炭素の吸入により殺処分した。【００７０】
液体シンチレーションカウンター（アロカ製、LSC-6100）を用いて、これらの採血した血液の放射活性を測定した。その結果を図６に示す。
図６に示されるとおり、血中濃度がピークを迎えている投与から30、45及び60分後に、プリン体の吸収量に有意差が見られた（* p<0.05、** p<0.01、t-test）。この結果から、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を摂取することで、腸管からのプリン体の吸収量を抑制できることが示された。【００７１】
［実施例７］ラクトバチルス・ガセリ菌の単回投与試験（ヒト試験）
20歳以上の健常人男性に、プリン体調製物（5'-アデニル酸，5'-イノシン酸二ナトリウム及び5'-グアニン酸二ナトリウムの混合物）498mgを１回摂取させ、その30分、60分、120分、150分後に採血し、血中尿酸値の推移を調べる。同じような推移を示す被験者10名を選定し、本試験の対象者とする。本試験では、選定された被験者にラクトバチルス・ガセリOLL2959株含有ヨーグルト（アクティブ群；ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を8.5×107cfu/mL含有）又は当該菌を含有しないヨーグルト（プラセボ群）を112mL摂取させ、摂取の30分、60分、120分、150分後に採血し、それぞれの血液試料について血中尿酸値を常法により測定し、血中尿酸値の推移を調べ、クロスオーバー試験を行う。プラセボ群と比較してアクティブ群で尿酸値の上昇が抑制されれば、単回投与においてもラクトバチルス・ガセリOLL2959株のプリン体取り込みの効果により腸管からのプリン体吸収量が減少することが示される。【００７２】
［実施例８］乳酸菌株の種類の比較試験
（１）アデニンの取り込み能の比較試験
放射性同位体（RI）で標識したアデニン（14C-アデニン）を含む培地で、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を培養し、アデニンの取り込み能について、乳酸菌株の種類の影響を比較した。なお、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株は、理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室（RIKEN BRC JCM；茨城県つくば市、日本）から、JCM1130として入手することができる。
ここで、MRS培地を用いて、それぞれラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を培養し、これらの増殖能を予め評価した。すなわち、MRS培地を用いて、それぞれラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を、37℃、20時間で嫌気培養した。このとき、この20時間に亘り嫌気培養した後に、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株に比較して、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株では、菌数が2.5倍以上で高かった。このことから、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を同じ培地で培養した場合に、基本的には、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株の増殖能が高いことが示された（表３）。【００７３】
【表３】
2016080371.tif 000004
【００７４】
アデニンの取り込み能の比較試験では、まず、最少培地（表１）に、14C-アデニンを終濃度が20μMとなるように添加して、本試験の培地を調製した。次いで、MRS培地を用いて、それぞれラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を培養してから、これらの培養液を2重量％で、本試験の培地に植菌し、37℃で嫌気培養した。これらの培養液では、MRS培地を用いて、それぞれ同等の菌数になるように調整した。【００７５】
これらの培養開始時（0分）と、培養開始から30又は60分後に、5%濃度のTFA溶液を添加して、培養を停止させ、次いで、生理食塩水にて菌体を洗浄した後に、液体シンチレーションカウンター（アロカ製、LSC-6100）を用いて、これらの放射活性を測定した。その結果を図７に示す。ここで、図７の放射活性（縦軸）は、放射性物質が1分間あたりに壊変する数（disintegrations per minute；dpm）で表している。【００７６】
図７に示されるように、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株では、いずれもアデニンの取り込み能が発揮されていたが、これらの培養開始から30及び60分後ともに、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株に比較して、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株では、アデニンを多く取り込んでおり、アデニンの取り込み量に有意差が見られた（p<0.05、t-test）。
この結果から、MRS培地における増殖能が高いラクトバチルス・ガセリJCM1130株と比較して、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株では、プリン体を有意に多く取り込めることが明らかになった。【００７７】
（２）アデニンの存在下における増殖能の比較試験
アデニンの存在下において、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を培養し、菌体の増殖能について、乳酸菌株の種類の影響を比較した。
最少培地（表１）に、アデニンを終濃度が400μMとなるように添加して、本試験の培地を調製した。次いで、MRS培地を用いて、それぞれラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株を培養してから、これらの培養液を4重量％で、本試験の培地に植菌して、37℃で嫌気培養した。これらの培養開始（0時間）と、培養開始から4及び6時間後に、濁度（650nmにおける吸光度）を測定した。その結果を図８に示す。【００７８】
図８に示されるように、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株と、ラクトバチルス・ガセリJCM1130株では、いずれもアデニンの存在下における増殖能が増強されていたが、MRS培地における増殖能が高いラクトバチルス・ガセリJCM1130株と比較して、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株では、増殖能の増強の程度が有意に高いことが明らかになった（p<0.05、t-test）。したがって、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株では、プリン体存在下における増殖能が特に強く増強されることが示された。【００７９】
［実施例９］プリン体の核酸合成への利用
ラクトバチルス・ガセリOLL2959株が、アデニンを取り込んだ後に増殖する過程でアデニンをどのように利用しているかについて検証する試験を行った。【００８０】
培養中のラクトバチルス・ガセリOLL2959株の菌体を回収し、1.0×1010（1.0E+10）cfu/mlになるように調製し、終濃度400μMのアデニンを含む最少培地に6%量で植菌した。その後14C-アデニンを添加し、0、1、2、3、及び4時間後に培地を回収し、濁度測定（650nmでのOD）を行った。さらに培地を3,000rpmで10分、4℃で遠心することにより菌体を回収し、蒸留水で2回洗浄した後、DNA抽出キットISOPLANT II（ニッポン・ジーン）を用いて菌体から核酸抽出を行った。抽出した核酸は分光光度計を用いて濃度を測定した。その後、液体シンチレーションカクテルを加えたバイアルに抽出核酸を全量加え、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。【００８１】
その結果、培養時間依存的に濁度が増加（OLL2959株が増殖）し、また核酸量（DNA濃度）も培養時間依存的に増加した（図９）。さらに核酸量の増加とともに、核酸中の放射活性も増加した（図１０）ことから、OLL2959株はアデニンを取り込み、それを細胞増殖に必要な核酸の合成に利用していることが示された。【００８２】
［実施例１０］ラクトバチルス・ガセリ菌のヒポキサンチン及びIMP（イノシン酸）の取り込み能の評価（動物試験）
Wistarラット雄（8週齢）28匹について、購入後、一週間程度の馴化を行った。試験前日よりラットを約16時間絶食させ、絶食後に体重測定を行った。ラットを絶食後の体重に基づき、陰性対照（生理食塩水）群、IMP（放射性同位体14C-IMP）投与群、及びIMP+OLL2959株（放射性同位体14C-IMP及びOLL2959株）投与群の計3群に分けた（陰性対照群のみ8匹、他群は各10匹）。【００８３】
全例で無麻酔下にてラットの尾静脈より60μL採血した。これを被験物質投与前の0分時採血とした。採血した血液に等量の2mg/mL EDTA-2Na溶液（EDTA-2Naを生理食塩水に溶解した液）を加えて氷冷した。【００８４】
次いでラットに被験物質を強制経口投与した。IMP投与群には14C-IMPを生理食塩水で希釈し、2mL/bodyを投与した。IMP+OLL2959株投与群には、14C-IMP及びOLL2959株を投与前に混合して調製した混液2mL/bodyを投与した。これらの群において14C-IMPは10μCi/bodyで投与した。陰性対照群には生理食塩水を2mL/bodyで投与した。【００８５】
全例において被験物質の投与後15分、30分、45分、60分、90分、120分及び180分の時点で無麻酔下にてラットのの尾静脈より、60μL採血した。採血した血液に等量の2mg/mL EDTA-2Na溶液を加えて氷冷した。【００８６】
採血した血液について、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。【００８７】
さらに14C-IMPの代わりに14C-ヒポキサンチンを用いて、同様の動物試験を行った。この14C-ヒポキサンチンを用いた試験では、陰性対照（生理食塩水投与）群、ヒポキサンチン投与群、ヒポキサンチン+OLL2959株投与群の計3群（陰性対照群のみ4匹、他群は各5匹）を用いた。【００８８】
結果を図１１〜図１４に示す。図１１及び１２に示されるとおり、被験物質の血中濃度がピークを迎えた時点の前後で、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を単回投与したラットではIMP吸収量が有意に低減していた（* p<0.1、ヒポキサンチン投与群 対 ヒポキサンチン+OLL2959株投与群、スチューデントのt検定）。同様に、図１３及び１４に示されるとおり、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株を単回投与したラットでは、ヒポキサンチン吸収量が有意に低減していた（## p<0.01、# p<0.05、ヒポキサンチン投与群 対 ヒポキサンチン+OLL2959株投与群、スチューデントのt検定）。これらの結果から、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株の単回投与によるプリン体吸収低減効果がさらに示された。IMPは魚や肉の旨味成分でもあるため、IMPやその塩基ヒポキサンチンに対する吸収低減効果を確認できた意義は大きい。【００８９】
［実施例１１］in vitroにおけるプリン体取り込み能の評価
1.0×108cfu/ml程度になるようにPBSで調製したラクトバチルス・ガセリOLL2959株に14C-ヒポキサンチン及び14C-イノシンを1μCi/mlで添加し、37℃で15分間又は30分間インキュベートした。インキュベート後の菌体を回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定した。【００９０】
その結果を図１５に示す。ラクトバチルス・ガセリOLL2959株はin vitroにおいてその菌体内にイノシン及びヒポキサンチンのいずれも取り込む（捕捉する）ことが示された（図１５）。取り込み量は、ヌクレオシドであるイノシンよりもプリン塩基であるヒポキサンチンの方が多かった。この結果はアデノシンとアデニンの関係における結果と同様であった。【００９１】
［実施例１２］ヨーグルト中のOLL2959株の生残性の評価
ドリンクヨーグルト又は生理食塩水に2.5×108 ±0.1×108 cfu/mlの濃度となるようにラクトバチルス・ガセリOLL2959株を添加し（0日目）、7日目、21日目及び28日目に生菌数を測定した。各時点の生残率を、0日目の生菌数に対する生菌数の比率（％）で表した。【００９２】
その結果、ドリンクヨーグルトに添加したラクトバチルス・ガセリOLL2959株の生残率は、7日目に72.6％、21日目に58.5％、28日目に61.0％であった（図１６）。これに対し、生理食塩水に添加したラクトバチルス・ガセリOLL2959株の生残率は、7日目に10.6％、21日目と28日目に0.0％であった（図１６）。【００９３】
これらの結果から、ラクトバチルス・ガセリOLL2959株は生理食塩水と比較してヨーグルトにおける生残性が高くなることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、プリン体の取り込み能及びプリン体存在下での増殖能が高い、プリン体捕捉作用を有する乳酸菌を効率的に取得することができる。このような乳酸菌は、投与された腸管内のプリン体量を低減し、それにより腸管でのプリン体の吸収量を低減させ、結果として血清尿酸値を低減することができる。したがって本発明は、腸管内のプリン体を低減し、血清尿酸値を低減するための経口剤を開発する上でも有用である。【００９５】
本明細書で引用した全部の刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により、本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2016080371.tif 000005
【図２】
2016080371.tif 000006
【図３】
2016080371.tif 000007
【図４】
2016080371.tif 000008
【図５】
2016080371.tif 000009
【図６】
2016080371.tif 000010
【図７】
2016080371.tif 000011
【図８】
2016080371.tif 000012
【図９】
2016080371.tif 000013
【図１０】
2016080371.tif 000014
【図１１】
2016080371.tif 000015
【図１２】
2016080371.tif 000016
【図１３】
2016080371.tif 000017
【図１４】
2016080371.tif 000018
【図１５】
2016080371.tif 000019
【図１６】
2016080371.tif 000020
【国際調査報告】
2016080371.tif 000021
2016080371.tif 000022
2016080371.tif 000023
2016080371.tif 000024
2016080371.tif 000025
2016080371.tif 000026
2016080371.tif 000027
2016080371.tif 000028