(57)【要約】本明細書の開示は、劇症肝炎や間質性肺炎などの炎症性疾患に有効な炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。この目的のため、本開示は、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を、炎症性疾患の予防又は治療用組成物の有効成分として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項２】
血清を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記歯髄幹細胞を含まない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の予防又は治療用組成物の製造方法であって、
歯髄細胞から接着性細胞を選抜し、
前記接着性細胞を培養し、
培養上清を回収する、製造方法。
【請求項１１】
炎症性疾患の予防又は治療方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載の組成物を、炎症性疾患の個体に、前記炎症性疾患の予防又は治療に有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記組成物を、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された投与方法により投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性疾患は、前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性疾患の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法であって、
歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１又は２以上の成分を炎症性疾患に関する評価系に供給して、炎症性疾患への作用を評価する工程、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、炎症性疾患の予防又は治療用組成物に関する。
本願は、
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、異物、病原体の排除、組織の防御や修復にかかわる一連の過程である。過剰な炎症反応は、臓器障害を引き起こしたり、自己免疫疾患やアレルギー疾患の発症原因の一つになりうる。急性炎症や慢性炎症を含む炎症性疾患は、感染やアレルギー疾患や自己免疫疾患などにより引き起こされるとされているが、発症原因はほとんどわかっていない。【０００３】
例えば、炎症性疾患の１つである劇症肝炎は、肝炎ウイルスの感染（特に、Ｂ型感染ウイルス）、薬物アレルギー、自己免疫性肝炎が危険因子と考えられているが、発症メカニズムは未だわかっていない。劇症肝炎に対して現時点で最も有効とされている治療は、肝移植である。その他、ステロイドパルス療法や、人工肝補助療法を用いる対症療法も行われている（非特許文献１、２）。近年、劇症肝炎モデルに対して幹細胞移植を行い治療効果を得たという報告がなされている（非特許文献３）。【０００４】
また、炎症性疾患である間質性肺炎は、肺間質の炎症・線維化の慢性的な進行を伴うが、明確な原因はわかっていない。進行して炎症組織が線維化するものは特に肺線維症と呼ばれる。根本治療として肺移植が挙げられるが、ステロイドや免疫抑制剤を用いた利用が一般的である（非特許文献４）。近年、肺線維症モデルに対して幹細胞移植を行い治療効果を得たという報告がなされている（非特許文献５）。【０００５】
損傷部の治療を目的として、歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清を含む組成物が有効であることが記載されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１１／１１８７９５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kazuhiro K et al; World J Gastroenterol; 2006
【非特許文献２】Mas A et al; THE LANCET；1997
【非特許文献３】Jun L et al; HEPATOLOGY；2012
【非特許文献４】Kevin R. Flaherty et al; Am J Med; 2001
【非特許文献５】RojasM et al; AMJ Respir Cell MolBiol; 2005
【発明の概要】
【０００８】
しかしながら、肝や肺移植は、ドナー不足の問題がある。劇症肝炎に対するステロイドパルス療法や人工肝補助療法の病態改善ケースは多くはない。また、間質性肺炎においてもステロイド等は種々の副作用を伴うことが多い。さらに、幹細胞移植は、移植した幹細胞のがん化リスクがありうる。
【０００９】
歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清を含む組成物は組織損傷に有効であるとして、歯周病や脊髄損傷等に有効であるが、劇症肝炎や間質性肺炎などの炎症性疾患に有効であることは一般に想定できない。
【００１０】
本明細書は、劇症肝炎や間質性肺炎などの炎症性疾患に有効な炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、難治性の炎症性疾患である劇症肝炎や肺線維症の治療について検討していたところ、意外にも歯髄幹細胞の培養上清が有効であるという知見を得た。本明細書は、本知見に基づき以下の手段を提供する。【００１２】
（１）歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
（２）血清を含まない、（１）に記載の組成物。
（３）前記歯髄幹細胞を含まない、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、（６）に記載の組成物。
（８）前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（９）前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、（８）に記載の組成物。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の予防又は治療用組成物の製造方法であって、
歯髄細胞から接着性細胞を選抜し、
前記接着性細胞を培養し、
培養上清を回収する、製造方法。
（１１）炎症性疾患の予防又は治療方法であって、
（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物を、炎症性疾患の個体に、前記炎症性疾患の予防又は治療に有効な量で投与することを含む、方法。
（１２）前記組成物を、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された投与方法により投与する、（１１）に記載の方法。
（１３）前記炎症性疾患は、前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１５）前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１６）前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、（１５）に記載の方法。
（１７）前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１８）前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、（１７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】劇症肝炎モデルラットにおける生存率を示す図である。
【図２】劇症肝炎モデルラットにおける血液検査による肝障害の評価結果を示す図である。
【図３】劇症肝炎モデルラットにおける病理学的解析結果を示す図(HE染色)である。
【図４】劇症肝炎モデルラットにおける炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）、死細胞のセンサーであるマンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）の遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図５】劇症肝炎モデルラットにおけるＣＤ２０６染色結果を示す図である。
【図６】肺線維症モデルマウスの体重測定結果を示す図である。
【図７】肺線維症モデルマウスの生存率を示す図である。
【図８】肺線維症モデルマウスにおける病理学的解析結果を示す図(HE染色、MT染色)である。
【図９】肺線維症モデルマウスにおける免疫組織学的解析を示す図である。
【図１０】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵の組織解析結果（ＨＥ染色）を示す図である。
【図１１】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵の組織解析結果（シリウスレッド染色）を示す図である。
【図１２】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵組織における遺伝子解析結果を示す図である。
【図１３】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵組織における遺伝子解析結果を示す図である。
【図１４】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝臓組織のおける活性化肝星状細胞のマーカーであるα−ＳＭＡの染色結果を示す図である。
【図１５】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の梗塞域の評価結果を示す図である。
【図１６】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の血漿中の心筋トロポニン量の評価結果を示す図である。
【図１７】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の虚血部における遺伝子発現解析結果を示す図である。
【図１８】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後のＥＡＥ臨床スコアの経過を示す図である。
【図１９】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の組織解析結果（ＨＥ染色、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ染色）を示す図である。
【図２０】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の組織解析結果（ＣＤ３染色）を示す図である。
【図２１】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓を示す図である。
【図２２】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓重量の比較結果を示す図である。
【図２３】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓組織切片のＨＥ染色結果を示す図である。
【図２４】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体量を示す図である。
【図２５】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の関節炎スコアの経過を示す図である。
【図２６】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の後肢の厚さの経過を示す図である。
【図２７】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織切片の染色結果（ＨＥ染色）を示す図である。
【図２８】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織切片の染色結果（トルイジンブルー染色）を示す図である。
【図２９】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織解析結果を示す図である。
【図３０】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の四肢における遺伝子発現解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（炎症性疾患の予防又は治療用組成物）
本明細書は、炎症性疾患の予防又は治療用組成物に関する。本組成物は、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含むことができる。本培養上清は、種々のサイトカインが含まれている。特許文献１では、本培養上清が、こうしたサイトカインを含有していることから、損傷部における細胞を増殖させ、その結果、損傷部を有する組織を修復することができるとしている。本発明者らは、こうした本培養上清の未だ知られていない作用として、劇症肝炎や肺線維症などの難治性の炎症性疾患に対して本培養上清を投与することでこれらを治療できるという知見にいたった。本培養上清に種々のサイトカインが含まれているといっても、発症原因が不明である炎症性疾患に有効であることは、当業者である本発明者らも予想しえなかった。
【００１５】
本組成物によれば、ドナー不足などの移植の問題点、副作用や低い有効性など従来のホルモン治療の問題点及び幹細胞移植の問題点などを解消しつつ、炎症性疾患を効果的に予防又は治療できる。
【００１６】
本明細書の開示を拘束するものではないが、本組成物は、免疫担当細胞であるマクロファージを組織修復型へ分化ないし変換することを誘導することができる。このため、炎症反応部位に本組成物を送達することにより、組織修復型マクロファージを積極的に作用させて、炎症反応部位の組織の修復を活性化できる。
【００１７】
本明細書において、「炎症」とは、異物の存在又は何らかの原因による組織損傷によって誘発される、身体を保護しようと働く哺乳動物における機構をいう。「炎症反応」とは、炎症において生じる一連のプロセスをいう。「炎症反応」には、炎症により誘発される組織破壊を含むことができる。「炎症性疾患」とは、身体組織の炎症により、又は炎症要素を有することにより特徴付けられる疾病、疾患又は症状を意味する。これらには局所的な炎症反応及び全身性の炎症反応が含まれる。
【００１８】
本組成物は、歯髄に由来する体性幹細胞、すなわち、歯髄幹細胞を培養して得られる培養上清を含むことができる。
【００１９】
（歯髄幹細胞）
歯髄幹細胞は、歯髄から得られる歯髄に由来した幹細胞であれば特に限定されない。永久歯歯髄幹細胞であってもよいし、乳歯歯髄幹細胞であってもよいが、好ましくは、細胞増殖能の観点から、脱落した乳歯に由来する歯髄幹細胞を用いる。本組成物を適用する個体との関係においては、拒絶反応を抑制又は回避するため、同一生物種（ヒトであればヒト由来）の歯髄幹細胞であることが好ましく、より好ましくは自家歯髄幹細胞を用いる。
【００２０】
歯髄幹細胞は、歯髄細胞の中の接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞の中の接着性細胞又はその継代細胞を培養して得られる培養上清を、「歯髄幹細胞の培養上清」として用いることができる。例えば、以下に示す、特開２０１１−２１９４３２号公報に記載の方法等により適宜取得できる。
【００２１】
なお、歯髄幹細胞の不死化細胞も提供されうる。通常、歯髄幹細胞の不死化にあたり、１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上の遺伝子が導入されている。このため不死化細胞においては、もとの細胞である歯髄幹細胞と均等な性質をもはや有していない。元の細胞とその不死化細胞とは、その産生物や分泌物や量が異なるのは当業者においてよく知られたことである。したがって、もとの細胞である歯髄幹細胞と歯髄幹細胞由来の不死化細胞とでは、その産生物が異なるとともに、分泌物状況や分泌物の組成も相違している。したがって、歯髄幹細胞の培養上清と歯髄幹細胞由来の不死化細胞の培養上清とは、その組成、すなわち、成分の種類やその割合においても大きく相違している。したがって、炎症性疾患に対する培養上清の作用や治療効果も、歯髄幹細胞と当該細胞に由来する不死化細胞とでは異なっている。
【００２２】
（１）歯髄の採取
自然に脱落した乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
（２）酵素処理
採取した歯髄組織を基本培地（１０％ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地）に懸濁し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及びディスパーゼで３７℃、１時間処理する。５分間の遠心操作（５０００回転／分）により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はＳＨＥＤやＤＰＳＣの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので原則、使用しない。
（３）細胞培養（接着性細胞の選択）
細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて３日間培養した後、コロニーを形成した接着性細胞を０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理する。ディッシュから剥離した歯髄細胞を直径１０ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば−１９８℃）。
（別法）
細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。培養液（例えば、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ））を添加した後、５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養する。培養液を除去した後、ＰＢＳ等で細胞を１回又は数回洗浄する。この操作（培養液の除去及び細胞の洗浄）に代えて、コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を回収することにしてもよい。この場合には例えば、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収する。
（４）細胞の回収
次に、細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。このようにして回収した歯髄幹細胞を用いて本発明の組成物を調製する。
【００２３】
（歯髄幹細胞の培養上清）
歯髄幹細胞の培養上清は、歯髄幹細胞を培養して得られる培養液の上清である。すなわち、実質的に細胞成分（歯髄幹細胞又は歯髄細胞）を含んでいない。本組成物は、典型的には、歯髄幹細胞及び歯髄細胞を含まず、歯髄幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。培養した歯髄幹細胞は、培養後に細胞成分を分離除去することによって、除去される。培養液からの細胞成分の分離は、当業者に周知の方法で可能である。さらに、培養液に対して各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。
【００２４】
歯髄幹細胞の培養には、基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ＧＩＢＣＯ社）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
【００２５】
本組成物は、血清を含まないことが好ましい。血清を含まないことでその安全性が高められる。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄幹細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製することができる。１回又は複数回の継代培養を行うことにし、最後又は最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。
【００２６】
（培養上清の取得）
歯髄幹細胞の培養には、通常幹細胞に用いられる条件をそのまま適用あるいは適宜変更して適用できる。歯髄幹細胞培養上清の製造は、当業者であれば適宜行うことができる。例えば、以下のような操作で培養上清を取得してもよい。
【００２７】
まず、既に説明したように、歯髄から選抜した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、上記した培地で培養する。例えば、細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば−１９８℃）。
【００２８】
次いで、選抜・培養した歯髄幹細胞の培養上清を回収する。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本発明の組成物の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃、−８０℃）を例示することができる。
【００２９】
本培養上清に対して適宜濃縮処理を施すこともできる。すなわち、本培養上清は濃縮物として含まれていてもよい。濃縮方法としては公知の手法から当業者であれば適宜選択して用いることができる。例えば、スピンカラム濃縮法、エタノール沈殿濃縮法により、培養上清の濃縮物を得ることができる。本培養上清は、凍結乾燥処理が施されていてもよい。すなわち、本培養上清は、凍結乾燥物であってもよい。
【００３０】
（本組成物の成分や形態）
本組成物は、歯髄幹細胞の培養上清であり、歯髄幹細胞が培養中において分泌したタンパク質などの高分子化合物のほか、低分子有機化合物を含みうる。さらに、本組成物は、培養上清であるため、培地由来の成分も含みうる。
【００３１】
本組成物は、液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など）の形態を採りうる。また、本組成物は、疾患の種類、疾患を有する個体の特徴、投与方法及び投与量に応じて、公知の各種製剤形態を採りうる。例えば、錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、用時溶解する固形の注射剤、坐剤などの固形性剤、液状の注射剤（静注／筋注）、注入剤、点滴用剤などの液状性剤、点眼剤、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤などの局所外用剤等が挙げられる。また、体内留置型の医療器具等に担持される形態を採ることもできる。そのほか、本組成物は、公知の薬学上許容される塩を含むことができる。当業者であれば、適切な製剤化が可能である。
【００３２】
本組成物は、疾患の種類や製剤形態に応じて、製剤上許容される他の成分を含むことができる。製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF））等を含有させることにしてもよい。
【００３３】
本組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用として用いることができる。炎症性疾患としては、特に限定されないで、広く適用される。炎症性疾患としては、例えば、シェーグレン病、ドライアイ、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症及び骨吸収増加に関連した骨疾患などの慢性炎症性関節疾患、回腸炎、潰瘍性大腸炎、バレット症候群及びクローン病などの炎症性腸疾患、喘息、急性および慢性間質性肺炎、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群及び慢性閉塞性気道疾患などの炎症性肺疾患、トラコーマ、オンコセルカ症、ブドウ膜炎、交感性眼炎及び眼内炎などの炎症性眼疾患、歯肉炎及び歯周炎などの慢性炎症性歯周疾患、結核、ハンセン病、尿毒症合併症、糸球体腎炎及びネフローゼなどの炎症性腎疾患、硬化性皮膚炎、乾癬及び湿疹などの炎症性皮膚疾患、免疫複合体血管炎、全身性狼瘡及び紅斑症、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）などの炎症性自己免疫疾患、心筋症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症などの炎症性心疾患、並びに子癇前症、慢性肝不全、慢性肝炎、肝硬変、急性肝炎、劇症肝炎、脳、癌などの重大な炎症要素を有する他の様々な疾患が挙げられる。あるいはグラム陽性又はグラム陰性細菌ショック、出血性若しくはアナフィラキシーショック、又は前炎症性サイトカインに応答する癌化学療法によって誘発されたショック（例えば前炎症性サイトカイン関連ショック）などの全身性の炎症も挙げられる。かかるショックは、例えば癌化学療法に用いられる化学療法剤によって誘発されうる。さらに、皮膚移植拒絶反応などの移植片拒絶反応も挙げられる。なかでも、本組成物は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、急性肝炎や劇症肝炎が挙げられる。また、慢性間質性肺炎、急性間質性肺炎及び肺線維症に好ましく適用される。さらに、慢性肝炎、肝硬変などの慢性肝疾患にも好ましく適用される。さらに、心筋梗塞などの虚血性心疾患にも好ましく適用される。また、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスなどの炎症性自己免疫疾患にも好ましく適用される。
【００３４】
本組成物の投与経路は特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。たとえば、非経口投与は、全身投与であってもよいし局所投与であってもよい。より具体的には、炎症部位への注入、塗布又は噴霧が挙げられる。また、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。
【００３５】
本組成物の用法用量は特に限定されない。被験対象の年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００３６】
本組成物が適用される対象個体としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、ヒトのほか、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラット及びマウス等が挙げられる。
【００３７】
（炎症性疾患の予防又は治療方法）
本明細書に開示される予防又は治療方法は、本組成物を、炎症性疾患の個体に、その炎症性疾患の予防又は治療に有効な量で投与することを含むことができる。本治療方法によれば、従来の不都合を一挙に解決して炎症性疾患を予防又は治療できる。本組成物、投与方法等については、既に説明した態様を本方法に適用することができる。
【００３８】
（炎症性疾患の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法）
本明細書の開示によれば、歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１又は２以上の成分を炎症性疾患に対する評価系に供給して、炎症性疾患への作用を評価する工程、を備える、炎症性疾患の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法が提供される。
【００３９】
本スクリーニング方法によれば、歯髄幹細胞の培養上清に含まれる成分のうち、どの成分が各種の炎症性疾患に対して有効であるかをスクリーニングでき、特定された歯髄幹細胞の培養上清成分を有効成分として含有する、すなわち、主として特定された培養上清成分のみを有効成分として含有する予防又は治療用組成物を取得できる。また、こうした組成物は、歯髄幹細胞の培養上清に由来しないで、市販され及び／又は精製等された特定成分を組み合わせることで有効な予防又は治療用組成物を得ることができる。
【００４０】
なお、本スクリーニング方法で用いる炎症性疾患に関する評価系は、各種炎症性疾患について公知である。例えば、劇症肝炎、肺線維症、肝硬変、虚血性心疾患、多発性硬化症、ＳＬＥ及び関節炎等の各種炎症性疾患のモデルマウスを利用できるほか、関連する細胞を用いた評価系適宜選択して利用できる。こうした各種の評価系については、当業者であれば適宜選択できるほか、本明細書の実施例等を参照することによっても適宜選択することができる。
【００４１】
歯髄幹細胞の培養上清には、以下に示す成分(各成分は、タンパク質、遺伝子あるいは物質名、通称名等でそれぞれ記載されている)が含まれている。こうした成分から選択される１又は２以上、あるいは３以上を適宜組み合わせて炎症性疾患に有効な因子のスクリーニングに適用することができる。
【００４２】
【表１】
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【実施例】
【００４３】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。
【実施例１】
【００４４】
（ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ−ＣＭ）の調製）
１０ｃｍｄｉｓｈを用いてＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ．ＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ ＵＳＡ）＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）でヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を培養し、８０〜９０％ｃｏｎｆｕｌになるまで培養を行う。ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培養液（ＤＭＥＭ）に変更し、４８時間培養を行った。上清を回収し、１５００ｒｐｍで４〜５分、３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、その上清を、歯髄幹細胞培養上清として以下の実施例に使用した。
【実施例２】
【００４５】
（劇症肝炎モデルを用いた歯髄幹細胞の治療有用性の解析）
（１）劇症肝炎モデルラットの作製
著しい肝障害を誘発する、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）溶液をＰＢＳ／ＮａＯＨ溶液に溶解し作製した。この溶液をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）に、Ｄ−ガラクトサミン１．２ｇ／ｋｇ（ラット体重）となるように腹腔内投与した。投与から２４時間後に採血を行ってＡＳＴ及びＡＬＴを測定し、著しい肝障害が誘発（劇症肝炎）されていることを確認した。その後、実施例１で調製した歯髄幹細胞培養上清（無血清）（SHED-CM）１ｍｌを頸静脈から投与し、病態改善を検証した。また、脂肪幹細胞及び骨髄幹細胞の無血清培養上清１ｍｌも比較例として頸静脈から静注した。さらに、対照としてＤＭＥＭ１ｍｌを劇症肝炎の発症後２４時間のラット（ガラクトサミンの投与から２４時間後）に頸静脈から静注した。【００４６】
（２）１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価
１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価をそれぞれ図１及び図２に示す。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ（２００〜２５０ｇ）腹腔内に、著しい肝障害を誘発するＤ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ溶液を１．２ｇ／ｋｇの割合で投与した。図１に示すように、ＤＭＥＭ投与群では一週間生存率が３０％以下に低下した（ｎ＝１０）。これに対して、歯髄幹細胞無血清培養上清の投与群は劇的に病態が改善され、１週間生存率は９０％であった。脂肪幹細胞無血清培養上清の投与群及び／又は骨髄幹細胞無血清培養上清投与群ではそれほど病態改善効果が得られなかった（それぞれ５０％及び４４％）。【００４７】
また、図２に示すように、ＤＭＥＭ投与群では、血中ＡＳＴ及びＡＬＴがそれぞれ約８０００Ｕ／Ｌ及び約８０００Ｕ／Ｌであったのに対し、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、いずれも約１０００Ｕ／Ｌとなった。また、脂肪幹細胞無血清培養上清投与群及び脂肪幹細胞無血清培養上清投与群では、いずれも約４０００Ｕ／Ｌ及び／又は約５０００Ｕ／Ｌであった。これらの結果は、図１に示す生存率の結果を支持するものであった。なお、細胞傷害の示標値はＡＳＴ＝６０００Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ＝４０００Ｕ／Ｌであった。【００４８】
（３）劇症肝炎モデルにおける病理学的解析 
劇症肝炎患者の肝臓では、広範な肝細胞死と肝細胞再生不全が認められる。本モデルラットにおいても、これらの発現を解析することにより、病態を評価した。すなわち、肝細胞死を、HE 染色、及び TUNEL 染色、肝細胞再生は、Ki-67 染色を用いて評価した。TUNEL 染色結果を図３に示す。【００４９】
図３に示すように、ＤＭＥＭ投与群では激しい空砲変性や、多くのＴｕｎｅｌ陽性細胞（全肝臓細胞中２０％）を検出した。歯髄幹細胞の無血清培養上清（ＣＭ）投与後１２時間の組織像は正常肝組織様であった。Ｔｕｎｅｌ陽性細胞数も著しく低下していた。これらの結果は、図１及び図２に示す結果を支持していた。【００５０】
（４）劇症症肝炎モデルにおける遺伝子解析  
劇症性炎症反応では、炎症性組織破壊型 Ｍ１マクロファージと抗炎症組織再生型Ｍ２マクロファージが肝組織損傷に重要な役割を果たす。Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現や、活性化酸素の産生（ｉＮＯＳ）を亢進する。Ｍ２マクロファージは、死細胞のセンサー：マンノースレセプターＣＤ２０６、フリーラジカル合成阻害因子Ａｒｇｉｎａｓｅ、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）を大量に発現する。本モデルラットにおいても、これらの因子の産生量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析することにより、病態を評価した。これらの結果を図４に示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示す。【００５１】
【表２】
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【００５２】
図４に示すように、ＤＭＥＭ投与群では、Ｍ１マクロファージ由来の各種の炎症性サイトカインの発現が上昇することがわかった。これに対して、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、Ｍ１マクロファージ由来の炎症性サイトカインの発現が抑制され、Ｍ２マクロファージ由来の各種の抗炎症性サイトカイン（ＴＧＦ−β、ＣＤ２０６、ＡｒｇｉｎａｓｅＩ及びＩＬ−１０）の発現が上昇することがわかった。【００５３】
（５）劇症肝炎モデルにおけるＣＤ２０６免疫染色結果
図５には、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群の及び対照群の劇症肝炎モデルの組織におけるＣＤ２０６染色結果を示す。図５に示すように、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、ＣＤ２０６の発現が顕著であり、Ｍ２マクロファージの発現が明らかであった。
【実施例３】
【００５４】
本実施例では、肺線維症モデル動物を用いた歯髄幹細胞の治療有用性について解析した。
（１）肺線維症モデルマウスの作製
著しい肺障害を誘発する塩酸ブレオマシン溶液を６Ｕ／ｋｇの割合で生理食塩水に溶解し作製した。その溶液をメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ（６〜８週齡、１７〜２０ｇ）に、気管内投与した。それから２４時間後に、ベロクロラ音の聴取から肺障害が誘発されていることを確認した後、ヒト歯髄幹細胞由来無血清培養上清、骨髄幹細胞無血清培養上清及びＤＭＥＭ５００μｌの各薬剤を頚静脈から静脈内投与し、病態改善を検証した。体重測定結果を図６に示し、生存率を図７に示す。【００５５】
（２）肺線維症モデルマウスの生存率、体重による肺障害の評価  
図６及び図７に示すように、塩酸ブレオマシン溶液をメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ（１７〜２０ｇ）に、気管内投与すると著しい肺障害が引き起こされ、１４日間の生存率が３３％に低下し、９日間の体重率が６６％まで低下することを確認した。【００５６】
（３）生存率、体重による歯髄幹細胞無血清培養上清の治療効果の解析
図６及び図７に示すように、歯髄幹細胞由来無血清培養上清の静注群においてのみ劇的に病態が改善された。１４日間生存率は７９．４％となり、体重率の減少は７８．５％に抑えられた。一方で、骨髄幹細胞由来無血清培養上清や無血清培地（ＤＭＥＭ）投与群では病態改善効果が得られなかった。骨髄幹細胞由来無血清培養上清投与群の生存率は５０％、体重率の減少は７１．７％。ＤＭＥＭ投与群の生存率は３３．３％、体重率の減少は６６％であった。【００５７】
（４）肺線維症モデルマウスにおける病理学的解析
急性肺疾患患者の肺では、肺の支持組織（間質）の、炎症による広範な肥厚が認められる。本モデルマウスにおいても、これらを観察することにより、病態を評価した。肺組織の線維化は、ＨＥ染色および結合組織の特異的染色法であるマッソントリクローム（ＭＴ）染色により評価を行った。結果を図８に示す。【００５８】
図８に示すように、ＤＭＥＭ投与群ではＨＥ染色およびＭＴ染色で間質の広範な肥厚を認め、ＭＴ染色では線維化面積の著しい増加を認めた。歯髄幹細胞由来無血清培養上清投与後２４時間の組織像は正常肺組織様であった。【００５９】
（５）肺線維症モデルマウスにおける免疫組織学的解析
劇症性炎症反応では、抗炎症・組織再生型Ｍ２マクロファージが肺組織の修復に重要な役割を果たす。そこで、急性肺障害の誘発後４８時間において、歯髄幹細胞由来無血清培養上清投与群とＤＭＥＭ群とについて、免疫染色によりＭ２マクロファージのマーカーであるマンノースレセプターＣＤ２０６を測定した。結果を図９に示す。【００６０】
図９に示すように、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、ＤＭＥＭ投与群に比較し、ＣＤ２０６陽性細胞が顕著に増加していることを確認した。
【実施例４】
【００６１】
本実施例では、肝硬変に対する歯髄幹細胞培養上清投与の治療有用性について解析した。【００６２】
（１）肝硬変モデルマウスの作製
四塩化炭素（ＣＣｌ４）を１．０ｍｌ／ｋｇの割合でオリーブオイルに溶解し肝障害を誘発する薬剤を作製したその溶液をＣ５７ＢＬ６マウス（２０〜２５ｇ）に、１週間に２回、４週連続腹腔内投与し、肝硬変モデルマウスを作製した。その後、実施例１で調製した歯髄幹細胞培養上清（無血清）（ＳＨＥＤ−ＣＭ）を最終の四塩化炭素溶液を投与（四塩化炭素投与開始から１ヶ月）してから２４時間後に、１回、５００μｌ静脈内投与し、病態改善を検証した。対照としてＤＭＥＭを同様に投与した。【００６３】
（２）肝硬変モデルにおける病理学的解析
肝硬変、慢性肝炎患者の肝臓では、肝細胞死、炎症性細胞浸潤、及び広範に不可逆性の線維性組織の増殖が認められる。そこで、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与後３日後の組織解析を行った。結果を図１０及び図１１に示す。【００６４】
図１０に示すように、ＨＥ染色によれば、Ｓｈａｍでは正常肝臓組織が観察されたが、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＳＨＥＤ−ＣＭ投与直前）では、多くの肝臓細胞死が観察されるとともに、ディッセ腔における線維化の亢進が観察された。また、ＤＭＥＭ投与群では、激しい細胞浸潤と著しい線維化が観察された。これに対し、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は正常肝像に近いことがわかった。【００６５】
また、図１１に示すように、シリウスレッド染色（赤染色：繊維素の染色）によれば、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔとＤＭＥＭ投与群で激しい線維化を確認した。一方、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではほとんど線維化が確認できなかった。【００６６】
（３）肝硬変、慢性肝炎モデルにおける遺伝子解析
ＤＭＥＭ，ＳＨＥＤ−ＣＭ投与後３日の肝臓組織からＲＮＡを採取し、炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法にて解析した。結果を図１２及び図１３に示す。【００６７】
図１２に示すように、ＤＭＥＭ投与群では炎症促進型Ｍ１マクロファージが産生するＴＮＦ-αの発現が上昇していたのに対して、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では抗炎症性Ｍ２マクロファージマーカー、ＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ−１の発現が上昇していた。【００６８】
また、図１３に示すように、ＤＭＥＭ投与群では活性化した肝星状細胞が産生するα−Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ α１の発現が上昇していた、一方、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では線維化溶解に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ?９（ＭＭＰ−９）やＩＧＦ−１、ＨＧＦなどの肝再生に関わる因子の発現レベルの上昇が観察できた。【００６９】
また、図１４に示すように、活性化肝星状細胞のマーカーであるα−ＳＭＡの染色結果によれば、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではα−ＳＭＡ陽性細胞数が激減していた。活性化肝星状細胞の数が、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で著しく低下することが明らかとなった。
【実施例５】
【００７０】
本実施例は、虚血性心疾患に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。【００７１】
（１）心筋虚血再灌流モデルマウスの作製
８〜１２週齢の雄性のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内投与で全身麻酔し、仰臥位で四肢を固定の上、２２Ｇテフロンチューブを気管内挿管し、小動物用人工呼吸器に接続した（呼吸回数１５０回／分、換気量０．２ｍＬ／回）。左第３肋間で開胸を行い、実体顕微鏡下に左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）をナイロン糸で結紮した。３０分後にナイロン糸を解き血流を再灌流させた。【００７２】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
再灌流時に頸静脈より、実施例１で調製したＳＨＥＤ−ＣＭ５００μＬを単回投与した。対照群にはＤＭＥＭ５００μＬを投与した。【００７３】
（３）梗塞域の評価
再灌流２４時間後、再度ＬＡＤを結紮し、エバンスブルー液１ｍＬを灌流した。心臓を摘出し、横断切片を作製し2,3,5-triphanyl tetrazolium chloride（ＴＴＣ）液と２０分間反応させた。これにより左室（ＬＶ）、危険域（ＡＡＲ）、梗塞域（ＩＡ）を区別し、画像解析ソフトを用いて各面積を定量した。結果を図１５に示す。【００７４】
図１５に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群および対照群で、左室に占める危険域の割合（ＡＡＲ／ＬＶ）は同等であることを確認した。ＳＨＥＤ−ＣＭ群では対照群と比較し、危険域に占める梗塞域（ＩＡ／ＡＡＲ）、一方、左室に占める梗塞域（ＩＡ／ＬＶ）の割合はいずれも有意に低下していることが明らかになった。【００７５】
（４）血中心筋トロポニン値の評価
再灌流２４時間後マウスより全血を採取し、心組織破壊のマーカーとして用いられる血漿中の心筋トロポニンＩ値をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図１６に示す。図１６に示すように、モデルマウス血漿中の心筋トロポニンの値はＳＨＥＤ−ＣＭ群で対照群と比較し低下する傾向が明らかとなった。【００７６】
（５）組織中炎症性サイトカインの評価
再灌流２４時間後に摘出した心臓の虚血部よりＲＮＡを抽出した。組織中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現をリアルタイム定量ＰＣＲ法で評価した。結果を図１７に示す。図１７に示すように、心組織中の炎症性サイトカインの遺伝子発現は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６のいずれにおいてもＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で抑制される傾向が明らかとなった。【００７７】
以上の結果から、ＳＨＥＤ−ＣＭは急性心筋梗塞発症後投与されると、速やかに発症した炎症を抑制することにより梗塞域を縮小させる効果を持つことがわかった。
【実施例６】
【００７８】
本実施例では、多発性硬化症に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。【００７９】
（１）多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス８週齢メスに対して、２００μｇのＭＯＧ３５?５５  蛋白を完全フロイントアジュバントとともにマウス腰背部に皮下注射し免疫した。４００ｎｇの百日咳毒素を０、２日目に腹腔内注射して、ＥＡＥマウスを作製した。【００８０】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
マウスの麻痺の状態はＥＡＥ臨床スコアを用いて毎日観察した。症状がピークである免疫後１４日目に、マウス尾静脈より実施例１で調製したＳＨＥＤ−ＣＭを５００μｌ、コントロール群にはＤＭＥＭを５００μｌ投与し、以後２８日目までＥＡＥ臨床スコアを用いて麻痺の状態を確認した。また、２８日目にマウスを屠殺し、組織解析を行った。【００８１】
（３）ＥＡＥ臨床スコアによる麻痺の状態評価
ＥＡＥ臨床スコアは、０：正常、１：尾の下垂、２：後肢の衰弱、３：後肢の不完全麻痺、４：前肢の衰弱、後肢の完全麻痺、５：四肢麻痺として評価した。結果を図１８に示す。図１８に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では免疫後１９日目以降に、有意な麻痺の改善を認めた。【００８２】
（４）組織評価
組織評価は、ＨＥ染色、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ染色、また免疫染色（ＣＤ３：Ｔ細胞）を行なった。結果を図１９及び図２０に示す。図１９に示すように、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ ｂｌａｃｋ染色ではＳＨＥＤ−ＣＭ投与群にコントロール群と比較して脱髄範囲の減少、また浸潤細胞の減少が認められた。ＨＥ染色でもまた浸潤細胞の減少が認められた。さらに、図２０に示すように、免疫染色では、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で浸潤するＴ細胞の数に減少を認めた。【００８３】
以上の結果から、ＳＨＥＤ−ＣＭは、炎症性自己免疫疾患においてその状況を改善できることがわかった。
【実施例７】
【００８４】
本実施例では、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。【００８５】
（１）ヒトＳＬＥ多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＳＬＥ）マウスの作製
ヒトＳＬＥモデルマウスであるＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスを用い、１５週齢の時点において、ヒトＳＬＥの臨床マーカーである末梢血血清での抗ｄｓ−ＤＮＡ ＩｇＧ抗体量をＥＬＩＳＡにて測定し、ＳＬＥ症状が十分に発症していることを確認した。【００８６】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
１６週齢において、外頸静脈より実施例１で調製したＳＨＥＤ−ＣＭを１匹あたり５００μｌ注入した。そして、２０週齢に到達した時点でトサツし、腎臓、脾臓、腋下リンパ節、尿、末梢血血清を採取した。【００８７】
（３）免疫抑制作用の評価
歯髄幹細胞培養上清による免役抑制作用の評価を、末梢血血清における抗ds-DNA IgG抗体量、腎臓をホモジナイズして得られたライセートにおける免疫複合体量をELISAにて定量して行った。また、脾臓は重量を計測し、（Ito T, Seo N, Yagi H, et al: Unique therapeutic effects of the Japanese-Chinese herbal medicine, Sairei-to, on Th1/Th2 cytokines balance of the autoimmunity of MRL/lpr mice. J Dermatol Sci. 28: 198-210. 2002）と同様にＳＩを作成し脾腫の程度を観察した。また、腎臓ＨＥ染色を行うとともに、採取した尿中に含まれるタンパク量を計測し腎機能の変化を観察した。【００８８】
脾臓における脾腫及び脾臓重量について図２１及び図２２に示す。これらの図に示すように、脾臓では症状の悪化に伴い脾腫を認めるが、ＤＭＥＭ群と比較してＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では脾臓重量、脾臓の大きさともに正常脾臓に近く、脾腫の抑制傾向を認めた。【００８９】
得られた組織切片にＨＥ染色結果を図２３に示す。図２３に示すように、腎炎にともなって細胞の増殖を認めるが、ＤＭＥＭ投与群と比較して、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では糸球体の形状が正常糸球体に類似しており、腎炎の改善傾向を認めた。【００９０】
さらに、末梢血血清を用いて血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡで計測した結果を図２４に示す。図２４に示すように、ＤＭＥＭ投与群と比較してＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体の減少傾向を認めた。【００９１】
以上のことから、ＳＬＥに対してＳＨＥＤ−ＣＭ投与が有用であることがわかった。
【実施例８】
【００９２】
本実施例では、関節リウマチに対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。【００９３】
（１）コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルマウスの作製
８週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウスに関節炎惹起用抗体を腹腔内投与することで関節炎を惹起した。３日後にＬＰＳを腹腔内投与することで、関節炎が増悪された。抗体投与後、７〜１０日で炎症はピークに達した。【００９４】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭの投与
抗体投与後、５日目に尾静脈より実施例１で調製したＳＨＥＤ−ＣＭ５００μｌを単回投与した。対照群にはＤＭＥＭ５００μｌを単回投与した。【００９５】
（３）関節炎スコア評価
抗体投与日より１４日目まで、四肢の関節炎スコアを測定した。指、甲、足首の３つの部位を観察し、それぞれで腫脹が認められた関節数をスコアとした（スコア１〜３）。さらに、３つの部位全てで非常に重篤な腫脹を認めた場合をスコア４とした。四肢についてこれらを観察し、マウス１個体あたりスコア１６を最高点とした。結果を図２５に示す。【００９６】
図２５に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意に関節炎スコアが低下していることが明らかとなった。【００９７】
（４）後肢の厚さ（ｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の評価
抗体投与日より１４日目まで、ｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓを測定した。マウスの両後肢の甲部分の厚さをデジタルノギスにより測定し、それらの平均値をマウス１個体のｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓとした。抗体投与日のｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓとの差をとり、その増加量を評価した。結果を図２６に示す。図２６に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意にｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓの増加が抑えられており、関節炎による後肢の腫脹を抑制していることが明らかとなった。【００９８】
（５）組織学的評価
抗体投与日より１４日目に屠殺したマウスの足首より組織切片を作製し、ＨＥ染色、トルイジンブルー染色を行い、組織学的な変化を評価した。関節部への炎症細胞浸潤、滑膜組織の過形成、関節面の骨破壊の程度を評価し、スコアリングを行った。最高スコア６点とした。結果を図２７〜図２９に示す。図２７〜図２９に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意に組織学的スコアが低下しており、関節部の炎症細胞浸潤および組織破壊を抑制していることが明らかとなった。【００９９】
（６）組織中の炎症性サイトカイン、組織破壊因子の遺伝子発現評価
抗体投与日より７日目に屠殺したマウスの四肢よりＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ法で、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）、組織破壊因子（ＭＭＰ３）の遺伝子発現を評価した。結果を図３０に示す。【０１００】
図３０に示すように、組織中の炎症性サイトカイン、組織破壊因子の遺伝子発現は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＭＰ３において、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で、対照群に比較して、有意に抑制されていた。ＴＮＦ−αに関しては、抑制される傾向が明らかになった。【０１０１】
以上の結果より、ＳＨＥＤ−ＣＭは関節炎に対して治療効果を有することが示唆された。【０１０２】
以上の結果から、本組成物は、炎症性疾患の治療に共通して有用であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月12日(2014.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清を含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物であって、
前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、肺線維症、炎症性自己免疫疾患及び虚血性心疾患からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
血清を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記歯髄幹細胞を含まない、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の予防又は治療用組成物の製造方法であって、
歯髄細胞から接着性細胞を選抜し、
前記接着性細胞を培養し、
培養上清を回収する、製造方法。
【請求項１１】
炎症性疾患の予防又は治療方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載の組成物を、炎症性疾患の個体に、前記炎症性疾患の予防又は治療に有効な量で投与することを含む、方法。
【請求項１２】
前記組成物を、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された投与方法により投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎及び肺線維症からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記炎症性疾患は、慢性肝炎及び肝硬変から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症性自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症性疾患は、虚血性心疾患である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性疾患の予防又は治療に有効な因子又はその組合せのスクリーニング方法であって、
歯髄幹細胞を培養することによって得られる培養上清に含まれる１又は２以上の成分を炎症性疾患に関する評価系に供給して、炎症性疾患への作用を評価する工程、を備え、
前記炎症性疾患は、劇症肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、急性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、肺線維症、炎症性自己免疫疾患及び虚血性心疾患からなる群から選択される、方法。
【国際調査報告】
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