(57)【要約】  この電気泳動デバイスは、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、第１流路の端部に設けられ試料が回収される試料回収部と、第１流路の第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され第１流路に第２方向に沿って電圧を印加する電極と、第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、第１流路と第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され第１流路と第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、を備える。隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている。
2016031980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、
前記第１流路の端部に設けられ前記試料が回収される試料回収部と、
前記第１流路の前記第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され前記第１流路に前記第２方向に沿って電圧を印加する電極と、
前記第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し前記電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、
前記第１流路と前記第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、
を備え、
前記隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている電気泳動デバイス。
【請求項２】
前記第１流路および前記第２流路は、基材に形成され、
前記ゲル材は、前記基材と化学的に結合している
請求項１記載の電気泳動デバイス。
【請求項３】
前記ゲル材は、ハイドロゲルであり、
前記基材は、合成樹脂である
請求項２記載の電気泳動デバイス。
【請求項４】
前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面には、前記第２流路の開口部が設けられ、
前記基材における前記第３方向の他方側の面には、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部が設けられ、
前記基材の前記一方側の面には、第２基材が積層されており、
前記基材の前記他方側の面には、第３基材が積層されている
請求項２または請求項３に記載の電気泳動デバイス。
【請求項５】
前記ゲル材は、前記緩衝液または前記第２緩衝液の液圧の大きさに応じた接合強度を有する請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス。
【請求項６】
前記回収部は、前記電圧の印加による前記試料の移動度に基づいた前記第２方向の位置に配置される請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス。
【請求項７】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の電気泳動デバイスと、
前記第１流路に細胞外小胞体を含む試料を供給する試料供給系と、
前記第１流路に前記緩衝液を供給する緩衝液供給系と、
前記試料回収部を介して前記試料を回収する試料回収系と、
前記第２流路の一端側に前記第２緩衝液を供給する第２緩衝液供給系と、
前記第２流路の他端側から前記第２流路内の物体を回収する第２流路回収系と、
前記電極により印加される前記電圧を調整する調整部と、
を備える細胞外小胞体分離装置。
【請求項８】
前記電圧の印加による前記細胞外小胞体の移動度を検出する検出装置を備える
請求項７記載の細胞外小胞体分離装置。
【請求項９】
第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の第２方向の両側にそれぞれ連通し、第２緩衝液が流動する第２流路とを備える基材を準備する工程と、
前記第１流路と前記第２流路との連通部に、前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁として、イオン透過性を有するゲル材を所定の接合強度で固定する工程と、
を含む電気泳動デバイス製造方法。
【請求項１０】
前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面に、前記第２流路の開口部を設け、
前記基材における前記第３方向の他方側の面に、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部を設け、
前記ゲル材を固定する工程は、前記他方側の面を下側にしたときの前記ゲル材と前記第１流路との境界にマスク材を設ける工程と、
前記他方側の面が下側の前記基材に対して、前記一方側の面の前記第２流路の開口部からゲル化前の前記ゲル材の溶液を導入する工程と、
前記ゲル材のゲル化後に、前記マスク材を除去する工程と、
を含む請求項９記載の電気泳動デバイス製造方法。
【請求項１１】
前記基材における前記第１方向および前記第２方向と直交する第３方向の一方側の面に、前記第２流路の開口部を設け、
前記基材における前記第３方向の他方側の面に、前記第１流路の開口部および前記第２流路の開口部を設け、
前記ゲル材を固定する工程は、前記一方側の面にマスク材を設けて前記第２流路の開口部を閉塞する工程と、
前記一方側の面が下側の前記基材に対して、前記他方側の面の前記第２流路の開口部からゲル化前の前記ゲル材の溶液を導入する工程と、
前記ゲル材のゲル化後に、前記マスク材を除去する工程と、
を含む請求項９記載の電気泳動デバイス製造方法。
【請求項１２】
前記ゲル材を固定する工程の前に、前記基材の表面をゲル化前の前記ゲル材の溶液に対して親液化する工程を含む請求項９から請求項１１のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス製造方法。
【請求項１３】
前記ゲル材を固定する工程の後に、前記基材の前記一方側の面に第２基材を積層し、前記基材の前記他方側の面に第３基材を積層する工程を含む請求項９から請求項１２のいずれか一項に記載の電気泳動デバイス製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置に関する。
本願は、２０１４年８月２８日に出願された米国特許仮出願６２／０４３，１４９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
生体に由来する核酸、タンパク質、脂質などの分子、細胞内小器官、細胞外小胞体などの分子集合体、および細胞は、生理現象、病理現象の機序の解明や、薬物治療の際の効果の定量的評価を行う際の分析対象である。【０００３】
生体から抽出された試料には、通常、分子、分子集合体、粒子、細胞などの複数の異なる成分が混在しているため、解析の対象となる成分のみを分離・精製する必要がある。試料中の成分を分離・精製する際の指標として、サイズ、比重、水／油分配係数、等電点、表面電位などの物理的性質、あるいは分子親和性(アフィニティー)を利用することが可能である。【０００４】
表面電位によって分離・精製する方法として、フリーフロー電気泳動法が知られている（非特許文献１参照）。
フリーフロー電気泳動法は、分離槽内で試料を緩衝液とともに上流から下流に層流状に流しながら、分離槽の両脇に設けられた電極に電圧を加えることにより、分層槽内の緩衝液の流れに垂直方向に電界を印加して，自由ゾーン電気泳動を行い、試料中の成分の電気泳動度の違いにより分離する技術である。【０００５】
フリーフロー電気泳動法を用いれば、試料中に混在する成分を、それぞれの成分が有する表面電位(電気泳動度)の違いによって分離・精製することができる。また、抗体等のように特異的親和性を有する分子タグを試料中の成分に結合させ、抗体と成分が結合した結果として生じる表面電位の変化を利用して特定の成分の分離を恣意的に行うことも可能である。【０００６】
従来のフリーフロー電気泳動装置は大型であり、試料中に混在する成分、例えば、エクソソーム（エキソソーム）等の細胞外小胞体を分離するには大量の試料が必要であった（非特許文献２参照）。また、従来のフリーフロー電気泳動装置は高価であった。これらの課題を解決するために、近年、マイクロ流体デバイス技術を応用した小型のフリーフロー電気泳動装置（マイクロフリーフロー電気泳動チップ）の開発研究が行われ、試作された小型のフリーフロー電気泳動装置は、少量の試料の分離に有効であることが示されている（非特許文献３参照）。【０００７】
マイクロ流体デバイス技術を用いたフリーフロー電気泳動装置においては、電気分解により電極上で生じる気泡の影響が大きく、長時間の安定な動作がしばしば困難であるといった問題があった。この問題を解決するため、分離槽と電極槽をイオン透過性のゲルで分離し、分離槽内の層流を擾乱することなく、電極槽を還流することで気泡を除去する方法が提案されている（非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D Kohlheyer, et al., Electrophoresis, 29, 977-993, 2008; RT Turgeon, et al., Anal Bioanal Chem, 394, 187-198, 2009
【非特許文献２】K Hannig, Anal Chem, 181, 244-254, 1961
【非特許文献３】DE Raymond, et al., Anal Chem, 66, 2858-2865, 1994
【非特許文献４】JW Albrecht, et al., Electrophoresis 27, 4960-4969, 2006; DP de Jesus, et al., Electrophoresis, 27, 4935-4942, 2006; D Kohlheyer, et al., Lab Chip 6, 374-380, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した文献において用いられたアガロースゲルやアクリルアミドゲルは、マイクロフリーフロー電気泳動法が行われる基材であるシリコンやガラスと化学的に結合しておらず、ハイドロゲルと基材の界面で剥離が生じやすく、長時間の安定な動作が困難であるという問題があった。【００１０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、長時間の安定した動作が可能な電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様に従えば、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の端部に設けられ前記試料が回収される試料回収部と、前記第１流路の前記第１方向と直交する第２方向の両側にそれぞれ配置され前記第１流路に前記第２方向に沿って電圧を印加する電極と、前記第１流路の前記第２方向の両側にそれぞれ連通し前記電極を収容するとともに、第２緩衝液が流動する第２流路と、前記第１流路と前記第２流路との連通部に所定の接合強度で固定され前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁と、を備え、前記隔壁は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている電気泳動デバイスが提供される。【００１２】
本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の電気泳動デバイスと、前記第１流路に細胞外小胞体を含む試料を供給する試料供給系と、前記第１流路に前記緩衝液を供給する緩衝液供給系と、前記試料回収部を介して前記試料を回収する試料回収系と、前記第２流路の一端側に前記第２緩衝液を供給する第２緩衝液供給系と、前記第２流路の他端側から前記第２流路内の物体を回収する第２流路回収系と、前記電極により印加される前記電圧を調整する調整部と、を備える細胞外小胞体分離装置が提供される。【００１３】
本発明の第３の態様に従えば、第１方向に延び、試料および緩衝液が流動する第１流路と、前記第１流路の第２方向の両側にそれぞれ連通し、第２緩衝液が流動する第２流路とを備える基材を準備する工程と、前記第１流路と前記第２流路との連通部に、前記第１流路と前記第２流路との間の物体の移動を遮断する隔壁として、イオン透過性を有するゲル材を所定の接合強度で固定する工程と、を含む電気泳動デバイス製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、長時間の安定した動作が可能な電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置を提供することことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態に係る細胞外小胞体分離装置の概略的な構成図である。
【図２】実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶの外観斜視図である。
【図３】図２におけるＡ−Ａ線視断面図である。
【図４】第２基板２を下面２ａ側から視た下面図である。
【図５】図４における分離槽８の−Ｘ側端部の部分拡大図である。
【図６】図４における分離槽８の＋Ｘ側端部の部分拡大図である。
【図７】第１基板１を下面１ａ側から視た下面図である。
【図８】分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。
【図９】分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。
【図１０】分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。
【図１１】電気泳動デバイスＤＶの製造方法を説明するための図である。
【図１２】電気泳動デバイスＤＶの製造方法を説明するための図である。
【図１３】電界２６が形成されたときのローダミンＢ２４、スルホローダミンＢ２５の移動軌跡を示す図である。
【図１４】印加電圧を変化させ試料の移動軌跡が安定したときの蛍光像である。
【図１５】印加電圧を変化させたときの試料の蛍光強度分布を示す図である。
【図１６】印加電圧と試料の泳動距離の関係を示す図である。
【図１７】印加電圧と試料の分離度の関係を示す図である。
【図１８】電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。
【図１９】電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。
【図２０】電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。
【図２１】電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置の実施の形態を、図１ないし図２１を参照して説明する。
なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
【００１７】
一実施態様において、本発明は、試料（検体）を分離する際に用いられる電気泳動デバイスを提供する。検体としては、細胞、細胞外小胞体、微粒子、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセル等が挙げられる。本実施形態では、電気泳動デバイスとして、細胞外小胞体を分離するための細胞外小胞体分離デバイスを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分離する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分離装置および電気泳動デバイスについて説明する。
【００１８】
［エクソソーム］
エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０〜１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
【００１９】
そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
【００２０】
エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
【００２１】
［エクソソームの分析］
電気泳動デバイスを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを分離・精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味する。次に、電気泳動デバイスを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
【００２２】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
【００２３】
また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
【００２４】
（エクソソームの分離・精製）
本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
【００２５】
エクソソームを精製する方法としては、後述するように、本実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶを用いて行う。
【００２６】
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質−エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。詳細については後述する。
【００２７】
（ゼータ電位の計測）
一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
【００２８】
エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、電気泳動デバイスのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
Ｕ＝（ε／η）ζ  …（１）
式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
【００２９】
エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動させ、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４８８ｎｍ、強度５０ｍＷのものが挙げられる。
【００３０】
［細胞外小胞体分離装置の基本構造］
図１は、細胞外小胞体分離装置１００の概略的な構成図である。
細胞外小胞体分離装置１００は、電気泳動デバイスＤＶ、電圧調整部（調整部）４０、顕微鏡５０、試料供給系６１、緩衝液供給系６２、試料回収系７０、第２緩衝液供給系８０、第２流路回収系９０および制御部ＣＯＮＴを備えている。
【００３１】
［電気泳動デバイスＤＶ］
図２は、電気泳動デバイスＤＶの外観斜視図である。図３は、図２におけるＡ−Ａ線視断面図である。なお、図２においては、理解を容易にするために、電気泳動デバイスＤＶの構成要素を実線で示している。
【００３２】
図２に示すように、電気泳動デバイスＤＶは、厚さ方向に順次積層され、それぞれが平面視矩形の第１基板（第２基材）１、第２基板（基材）２、第３基板（第３基材）３を有している。第１基板１、第２基板２、第３基板３の角部には、位置決め用の貫通孔Ｈが設けられており、図示しない軸部材を貫通孔Ｈに嵌合させることにより、第１基板１、第２基板２、第３基板３が互いに位置決めされる。
【００３３】
電気泳動デバイスＤＶは、緩衝液導入口４、試料導入口５、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、分離槽（第１流路）８、電極槽９、試料回収部１０、試料回収流路１１、第２緩衝液導入口１２、第２緩衝液回収口１３、電極１５（図３、８乃至図１０参照）を備えている。
【００３４】
なお、以下の説明においては、第１基板１、第２基板２、第３基板３の積層方向をＺ方向とし、例えば、分離槽８の延びる方向をＸ方向とし、Ｚ方向およびＸ方向と直交する方向であり、分離槽８の幅方向をＹ方向として説明する。また、適宜Ｚ方向を上下方向とし、第２基板２に対して第１基板１が配置される側を上側、第２基板２に対して第３基板３が配置される側を下側として説明する。これは、あくまで説明の便宜のために上下方向を定義したものであって、本発明の電気泳動デバイスＤＶが実際に用いられるときの設置姿勢を限定するものではない。
【００３５】
第１基板１、第２基板２および第３基板３としては、各種の工業用合成樹脂を用いることができる。第１基板１、第２基板２および第３基板３は、一例として、合成樹脂材料であるポリメタクリルスチレンが用いられる。ポリメタクリルスチレンは、メタクリレート(MMA)とスチレンを共重合したポリメタクリルスチレン(MS)の樹脂押出板である。ポリメタクリルスチレンの主な特長としては、ポリメタクリル板に相当する透明性や耐候性、ポリメタクリル板に比べて吸水性が小さいため寸法安定性に優れ変形しにくい点、ガラスの約半分の比重であるポリメタクリル板よりもさらに比重が小さく軽い点、機械加工が容易である点などが挙げられる。ただし、第１基板１、第２基板２および第３基板３は、ポリメタクリルスチレンに限定されず、好ましくは、透明性にすぐれるポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリカーボネイト、ポリシクロオレフィンなどにより形成することができる。第１基板１および第３基板３は、一例として、Ｘ方向の長さが１００ｍｍ、Ｙ方向の長さが８０ｍｍ、Ｚ方向の長さ（厚さ）が２ｍｍである。第２基板２は、一例として、Ｘ方向の長さが１００ｍｍ、Ｙ方向の長さが８０ｍｍ、Ｚ方向の長さ（厚さ）が５ｍｍである。
【００３６】
分離槽８は、緩衝液および試料が流動する流路であり、図２に示されるように、Ｘ方向に延びている。図３に示されるように、分離槽８は、第２基板２の下面２ａにおけるＹ方向中央部に設けられた凹部によって形成されている。分離槽８のＹ方向の幅は、例えば、１０ｍｍである。分離槽８の深さは、例えば０．１ｍｍである。
【００３７】
図４は、第２基板２を下面２ａ側から視た下面図である。図５は、図４における分離槽８の−Ｘ側端部の部分拡大図である。図６は、図４における分離槽８の＋Ｘ側端部の部分拡大図である。
【００３８】
分離槽８のＸ方向の長さは、例えば、５０ｍｍである。
図４に示されるように、分離槽８の−Ｘ側端部には、緩衝液導入流路６および試料導入流路７が接続されている。試料導入流路７は、Ｘ方向に延び、一端が分離槽８のＹ方向の中央部に接続されている。試料導入流路７の深さは、分離槽８の深さと同一である。試料導入流路７の他端は、試料導入口５に接続されている。図７は、第１基板１を下面１ａ側から視た下面図である。試料導入口５は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。試料導入口５は、第１基板１に形成された貫通孔５ａと、第２基板２に貫通孔５ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔５ｂとを含む。試料導入口５は、上述した試料を試料導入流路７に導入するための部位である。
【００３９】
緩衝液導入流路６は、試料導入流路７を挟んだＹ方向の両側において、一端がそれぞれ分離槽８に接続されている。緩衝液導入流路６は、他端側で合流して緩衝液導入口４に接続されている。緩衝液導入口４は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。緩衝液導入口４は、第１基板１に形成された貫通孔４ａと、第２基板２に貫通孔４ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔４ｂとを含む。緩衝液導入口４は、上述した試料とともに分離槽８を流動させる緩衝液（バッファー）を緩衝液導入流路６に導入するための部位である。
【００４０】
試料回収流路１１は、一端が分離槽８の＋Ｘ側端部に接続して複数（図４では５つ）設けられている。試料回収流路１１は、Ｙ方向に互いに間隔をあけて設けられている。試料回収流路１１が分離槽８に接続されるＹ方向の位置は、後述するように、試料（エクソソーム）の移動度に基づいて設定されている。試料回収流路１１の他端は、試料回収部１０に接続されている。
【００４１】
試料回収部１０は、試料回収流路１１毎に複数（図４では５つ）設けられている。試料回収部１０は、上下方向に延びており、第１基板１および第２基板２に亘って貫通して形成されている。試料回収部１０は、第１基板１に形成された貫通孔１０ａと、第２基板２に貫通孔１０ａとＸＹ平面において同一位置に形成された貫通孔１０ｂとを含む。試料回収部１０は、電気泳動度に応じて分離された試料（エクソソーム）を回収するための部位である。
【００４２】
電極槽９は、図３および図４に示すように、分離槽８のＹ方向両側にそれぞれ連通して配置されている。電極槽９は、第２基板２を上下方向に貫通する。電極槽９は、一例として、Ｘ方向の長さが５０ｍｍ、Ｙ方向の長さが２ｍｍ、Ｚ方向の長さ（深さ）が５ｍｍである。電極槽９における底部、すなわち分離槽８との連通部には、隔壁１７が設けられている。電極槽９における隔壁１７より上側は、第２緩衝液が流動する第２流路３０である。
【００４３】
隔壁１７は、分離槽８と電極槽９との間の物体の移動を遮断する。隔壁１７の下面は、Ｙ方向の外側に向かうに従って下側に向かう傾斜面１７ａである。傾斜面１７ａは、電極槽９に臨むＹ方向内側の側面９ａと分離槽８の底面８ａとが交差する位置と、電極槽９に臨むＹ方向外側の側面９ｂと第２基板２の下面２ａとが交差する位置を繋ぐ。
【００４４】
隔壁１７は、イオン透過性を有するゲル材で形成されている。ゲル材としては、一例として、機械強度および均一性が高いハイドロゲルが用いられる。ハイドロゲルとしては、例えば、Tetra-PEGゲル、slide-ring (SR) ゲル, nanocomposite (NC) ゲル, double network(DN) gelsなどを用いることができる。
また、ゲル高分子の末端に基材と化学結合ができる官能基を有することが望ましい。末端の官能基としては、アミノ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アシルアジド基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、スルフォニルクロライド基、アルデヒド基、エポキシド基、オキシラン基、カーボネート基、アリール基、イミドエステル基、カルボジイミド基、アンハイドライド基、チオール基、ハロアセチル基、アルキルハライド基、マレイミド基、アジリジン基、アクリロイル基、ジスルフィド基、ジアゾアルカン基、ジアゾアセチル基、カルボニルジイミダゾール基、、N, N'-ジスクシニミジルカーボネート基、N-ヒドロキシスクインイミジルクロロフォメート基、ヒドラジン基、ヒドラジド基などが挙げられる。
中でも、官能基の数が４以上のものが好ましく、４つ以上のポリエチレングリコール骨格の分岐鎖であって、末端に官能基を有するものを有するポリマー種がより好ましい。係るポリマー種としては、Tetra-PEGゲルが挙げられる。
【００４５】
図８乃至図１０は、分離槽８および電極槽９の周辺を模式的に示した図である。第２流路３０には、電極１５が収容されるとともに、第２緩衝液１６が流動する。電極１５は、例えば、白金ワイヤーで形成されている。図２に示されるように、第２基板２には、電極槽９よりも−Ｘ側の位置にＸ方向に延びる電極挿入口１４が設けられている。電極挿入口１４から挿入された電極１５の先端側は、第２流路３０内に収容される。
【００４６】
図２、図７乃至図１０に示されるように、第１基板１における第２流路３０の−Ｘ側端部の位置には、第２流路３０に連通する第２緩衝液導入口１２が上下方向に貫通して設けられている。第１基板１における第２流路３０の＋Ｘ側端部の位置には、第２流路３０に連通する第２緩衝液回収口１３が上下方向に貫通して設けられている。
【００４７】
図１に戻り、試料供給系６１は、電気泳動デバイスＤＶの試料導入口５に対してチューブ６１ａを介して試料を供給する。本実施形態では、試料供給系６１は、エクソソームを含有する試料を供給する。
【００４８】
緩衝液供給系６２は、電気泳動デバイスＤＶの緩衝液導入流路６に対してチューブ６２ａを介して緩衝液を供給する。
【００４９】
試料回収系７０は、電気泳動デバイスＤＶの試料回収部１０に回収された試料および緩衝液を、複数の試料回収部１０毎に個別に回収する。
【００５０】
第２緩衝液供給系８０は、電気泳動デバイスＤＶの第２緩衝液導入口１２に第２緩衝液を供給する。第２緩衝液供給系８０は、貯溜部８１に貯溜された第２緩衝液をポンプ８２の駆動により、二つの第２緩衝液導入口１２にチューブ８０ａ、８０ｂを介してそれぞれ第２緩衝液を供給する。
【００５１】
第２流路回収系９０は、電気泳動デバイスＤＶにおける第２流路３０内の物体（第２緩衝液、気泡等）を回収する。第２流路回収系９０は、ポンプ９１の駆動により電気泳動デバイスＤＶにおける二つの第２緩衝液回収口１３からチューブ９０ａを介して第２流路３０内の物体を吸引して廃液部９２に回収する。
【００５２】
電圧調整部４０は、電極１５に対して電圧を印加する。印加する電圧は、例えば、制御部ＣＯＮＴによって制御される。電圧調整部４０は、制御部ＣＯＮＴの制御下で二つの電極１５のうち、一方の電極１５に正の電圧、他方の電極１５に負の電圧を印加する。
【００５３】
顕微鏡５０は、分離槽８を流動する試料に対してレーザー光を照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得する。顕微鏡５０は、取得した画像情報を制御部ＣＯＮＴに出力する。制御部ＣＯＮＴは、入力した画像情報から試料の電気泳動速度、ゼータ電位等を算出する。顕微鏡５０および制御部ＣＯＮＴにより、電気泳動移動度を検出する検出装置が構成される。
【００５４】
［電気泳動デバイスＤＶの製造方法］
次に、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法について、図１１および図１２を参照して説明する。
電気泳動デバイスＤＶの製造方法は、第２基板２を準備する工程、第２基板２の下面２ａにマスク材を設ける工程、マスク材を設けた第２基板２に対して第２流路３０（電極槽９）にゲル化前のゲル材の溶液を導入する工程、ゲル材のゲル化後にマスク材を除去する工程、第２基板２に第１基板１および第３基板３を積層する工程を含む。
【００５５】
以下、各工程について詳細に説明する。
第２基板２を準備する工程は、第２基材２に対して分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成する工程を含む。第２基材２に対して分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成する方法は、切削加工や射出成形を採ることができる。
【００５６】
続いて、切削加工または射出成形された第２基板２をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて所定時間（例えば１分間）洗浄する。その後、第２基板２を超純水でリンスをし、窒素ブローする。その後、第２基板２に対してトルエンを暴露する（例えば１２〜１３分程度）。
なお、第１基板１〜第３基板３を構成するポリメタクリルスチレンは、（アクリエース（登録商標）MS、日本アクリエース, Japan)を使用した。
【００５７】
次に、第２基板２に対して酸素プラズマ処理を施す。処理条件は、例えば、プラズマクリーナー(PDC210、ヤマト科学)を用いて、酸素量３０ｃｃ、出力１００Ｗにて、図１１に示すように、下面２ａ側から１分間酸素プラズマ１９を照射して、疎水性の高いポリメタクリルスチレンじゃらなる第２基板２の表面を親液化させる。
【００５８】
表面が親液化された第２基板２に対しては、図１２に示すように、分離槽８の底面８ａおよび下面２ａに跨ってマスク材２１を貼り付け、電極槽９の底部を閉塞する。この後、上面２ｂに開口する電極槽９（第２流路３０）の開口部からピペット２０によりゲル材の溶液を導入する。本実施形態ではゲル材としてテトラペグ（Tetra-PEG）ゲルを用いる。テトラペグゲルは、末端にアミノ基を有する4腕型のポリエチレングリコール(TA-PEG)溶液と、末端にN-ヒドロキシスクシンイミジル基を有する4腕型のポリエチレングリコール(TN-PEG)溶液の二液混合型のハイドロゲルである。テトラペグゲルは、TA-PEGのアミノ基とTN-PEGのN-ヒドロキシスクシンイミジル基との間で起こるアミド結合により、均質な網目構造が形成され、優れた力学的強度を有する。さらに、テトラペグゲルは、これらの官能基により、上述した第２基板２の表面のヒドロキシル基やカルボニル基と強固に化学結合し、ゲルを固定化できる。
また、Tetra-PEG ゲルは生体適合性を有するため、試料として生体物質の分離時に、生体物質のゲルへの吸着の抑制が期待される。
さらに、二液混合により容易に作製可能なため、デバイスの作製工程が複雑化されないという効果を奏する。
【００５９】
TA-PEGは、SUNBRIGHT（登録商標）PTE-100PA (日本油脂)を、最終濃度１００ｍｇ／ｍＬになるように0.2Mリン酸ナトリウムバッファー, pH=7.4に溶解した。
また、TN-PEGは、SUNBRIGHT（登録商標）ITE-100HS (日本油脂)を、最終濃度１００ｍｇ／ｍＬになるように0.2Mクエン酸リン酸ナトリウムバッファー pH=5.8に溶解した。
調整したTA-PEG溶液と、TN-PEG溶液とを１：１に混合すると、１０分以内に混合液の粘度が上昇し、ゲル化反応が確認される。
【００６０】
電極槽９の開口部から上記の二液混合溶液（ゲル溶液）を導入した後に、ゲル溶液から空気（気泡）が残らないように除去し、安定した強度でゲル化されるまで１時間程度静置する。その後、ゲル材が付着しないようにマスク材２１を剥離する。
【００６１】
次に、第２基板２と第３基板３とを接着する。接着前には、前処理として第３基板３をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて所定時間（例えば１分間）洗浄する。その後、第２基板２を超純水でリンスをし、窒素ブローする。その後、第３基板３に対してトルエンを暴露する（例えば１２〜１３分程度）。さらに、第２基板２と同様に、第３基板３に対して酸素プラズマ処理を施す。この後、第２基板２と第３基板３とを重ねて、ナノインプリント装置（NanoimPro；グラフェンプラットフォーム, Japan)を用いて、２０ｋＮの圧力で３０分間常温で加圧して接着した。
【００６２】
このように接着した第２基板２および第３基板３に対して第１基板１を接着する。予め、切削加工または射出成形で図７に示すように、第２緩衝液導入口１２、第２緩衝液回収口１３、貫通孔４ａ、５ａ、１０ａを形成した第１基板１に対しては、第２基板２および第３基板３と同様に、エタノール洗浄した後、トルエンまたはジクロロエタンで暴露し、酸素プラズマ処理を行った後に、ナノインプリント装置を用いて常温の条件下で３０分間、２０ｋＮの圧力を印加して接着する。
【００６３】
この後、電極挿入口１４から電極１５を挿入して第２流路３０内に電極１５を収容することにより、電気泳動デバイスＤＶが製造される。また、電気泳動デバイスＤＶにおける試料導入口５と試料供給系６１とをチューブ６１ａを介して接続し、同様に、緩衝液導入口４と緩衝液供給系６２とをチューブ６２ａを介して接続し、同様に、第２緩衝液導入口１２とポンプ８２とをチューブ８０ａ、８０ｂを介して接続し、第２緩衝液回収口１３とポンプ９１とをチューブ９０ａを介して接続し、さらに、電極１５を電圧調整部４０に接続することにより細胞外小胞体分離装置１００による試料の分離準備が整う。
【００６４】
この電気泳動デバイスＤＶは、ゲル材を形成するハイドロゲルが第２基板２と化学結合で強力に固着している。また、電気泳動デバイスＤＶは、均質網目構造に由来したTetra-PEGゲルの高い機械強度に起因して、乾燥環境でゲル材を乾燥させた場合にも、ゲル材と第２基板２の界面で破壊が生じない。また、ゲル材が乾燥した場合でも、電気泳動デバイスＤＶを使用する直前に緩衝液を含侵させることで、ハイドロゲルは機械的な欠陥を生じることなく、湿潤状態に戻すことが可能である。
【００６５】
［細胞外小胞体分離方法］
次に、上記の細胞外小胞体分離装置１００を用いて、細胞外小胞体を分離する方法について説明する。
ここでは、試料として、電荷を持たない蛍光色素であるローダミンＢ、負電荷を有するスルホローダミンＢの分離実験を行った。
試料供給系６１から試料導入口５に１ｍＭローダミンＢと１ｍＭスルホローダミンＢの混合液を導入した。その際、緩衝液供給系６２から緩衝液導入口４に１０ｍＭリン酸緩衝液を導入し、ローダミンＢとスルホローダミンＢの混合液の流れを整えた。
【００６６】
試料の流速は２μＬ／ｍｉｎとし、緩衝液の流速は５０μＬ／ｍｉｎとした。
電極１５に対しては、０〜８０Ｖの電圧を印加した。
第２流路３０に対しては、第２緩衝液導入口１２からリン酸緩衝液を導入するとともに、第２緩衝液回収口１３からリン酸緩衝液を回収した。電極１５に電圧を印加した際には電気分解によって、図９に示すように、気泡１８が生じるが、ポンプ９１の駆動により第２流路３０内を吸引することにより、図１０に示されるように、リン酸緩衝液とともに気泡１８を回収・排除することができ、気泡１８が分離槽８に混入して、試料の分離に悪影響を及ぼすことを防止できる。
特に、本実施形態では、隔壁１７を構成するゲル材が第２基板２に化学的に強固に結合しているため、リン酸緩衝液の導入・流動により第２流路３０内の液圧が加わった場合でも、分離槽８と第２流路３０との間の物体（緩衝液および気泡１８）の移動を遮断可能である。
顕微鏡５０は、試料導入口５から＋Ｘ側へ４０ｍｍの位置を蛍光観察し、顕微鏡用デジタルカメラにて撮像した。
顕微鏡５０における励起波長は５４０〜５８０ｎｍ、蛍光波長は６００〜６６０ｎｍとした。
【００６７】
図１３は、電極１５への電圧印加により、分離槽８を横切る方向に電界２６が形成されたときのローダミンＢ２４、スルホローダミンＢ２５の移動軌跡を概略的に示す図である。図１３に示すように、無電荷のローダミンＢ２４は電界の影響を受けずに試料導入流路７からの導入方向である＋Ｘ側（下流側）に流動するが、負電荷を有するスルホローダミンＢ２５は、正極側に移動しつつ下流側に流動することが確認できた。
【００６８】
図１４は、電極１５への印加電圧を０〜８０Ｖまで１０Ｖ毎に変化させ試料の移動軌跡が安定したときの蛍光像であり、図１５は、試料の泳動距離（蛍光強度分布）を示す図である。図１４および図１５に示されるように、印加電圧の増加に伴ってローダミンＢの蛍光強度のピーク位置は変化しない一方で、スルホローダミンＢの蛍光強度のピーク位置は、正電極側に移動したことが観察された。
【００６９】
印加電圧と両試料間のピーク間距離との関係を調べるために、蛍光強度プロファイルを解析した。
蛍光強度分布が正規分布に従うと仮定してピーク分離を行い、双方のピーク位置から泳動距離を算出し、以下の式から分離度Ｒを求めた。
【００７０】
【数１】
2016031980.tif 000003
上式において、ｄ（ｄ１、ｄ２）はピークとなるＹ方向の位置であり、Ｗ（Ｗ１、Ｗ２）は半値幅である。
【００７１】
図１６は、印加電圧と試料の泳動距離の関係を示す図である。また、図１７は、印加電圧と試料の分離度の関係を示す図である。
図１６および図１７に示されるように、５０Ｖ以下の印加電圧では、泳動距離および分離度の双方が線形関係になっていることが確認された。
【００７２】
一方で、５０Ｖより大きい印加電圧では泳動距離および分離度の双方が線形関係から外れることが確認できた。これはジュール熱の影響による可能性が考えられる。
この結果より、分離槽８に対して乱れのない電界が印加でき、５０Ｖまでの電圧範囲に対して電気泳動デバイスＤＶが良好な分離動作が行えていることが確認できた。
【００７３】
また、グラフの傾き、印加電圧、電圧効率５５．４％および印加時間２９．５ｓであることから、スルホローダミンＢの電気泳動度が１．６×１０−８ｍ２Ｖ−１ｓ−１であると算出された。
この電気泳動度から、以下のスモルコフスキーの式からゼータ電位ξを算出した。
ξ=η×μ/(ε0 ×εr)
ここで、ξはゼータ電位、ηは粘性率、ε0は真空の誘電率、εrは比誘電率である。リン酸緩衝液の粘性率、比誘電率が２５℃の水と同じ値であると仮定して、粘性率は、η=０．８９× １０−３ｋｇ／ｍ２ｓ、比誘電率は、εr=７８．５、真空の誘電率はε0=８．８５４×１０−１２ｍ−３ｋｇ−１ｓ４Ａ２であるため、スルホローダミンＢのゼータ電位はξ＝２０．５ｍＶ と算出された。
【００７４】
以上説明したように、本実施形態では、分離層８と電極槽９（第２流路３０）との連通部に、イオン透過性を有するゲル材が隔壁１７として所定の接合強度で設けられているため、分離層８と電極槽９との間で緩衝液や気泡の移動することを防止でき、長時間に亘って安定して試料の電気泳動および分離動作を実施することが可能になる。特に、本実施形態では、ゲル材がハイドロゲルで形成されているため、第２基板２に化学結合して強固に接合され、分離槽８における試料および緩衝液の流動、あるいは第２流路における緩衝液の流動に伴う液圧が加わった場合でも、分離層８と第２流路３０との間での緩衝液や気泡の移動を長時間安定した遮断することが可能である。また、ハイドロゲルは、一旦、乾燥させた後でも試料の分離を実施する前に緩衝液を含侵させることで、機械的な欠陥を生じることなく、湿潤状態に戻すことが可能であるため、乾燥状態で保存しておくことが容易であり、例えば、医療現場では簡便な方法で保管することも可能である。
【００７５】
また、本実施形態に係る電気泳動デバイスＤＶにおいては、試料回収部１０および試料回収流路１１のＹ方向の位置を試料の電気移動度に応じて適宜設定することにより、例えば、複数種類のエクソソームが混在する試料を用いた場合でも、各エクソソームの電気移動度に対応する試料回収部１０および試料回収流路１１に容易に分離して回収することも可能である。また、試料回収部１０および試料回収流路１１のＹ方向の位置が既定の電気泳動デバイスＤＶを用いる場合には、複数種類のエクソソームが十分に分離できる大きさの電圧を印加したり、あるいは、分離槽８における試料の流速を調整することも可能である。また、本実施形態では、第１基板１〜第３基板３が合成樹脂材であるポリメタクリルスチレンで形成されているため、切削加工や射出成型等の方法で各種形状を容易に得ることができるとともに、製造に係るコストの低減も可能である。
【００７６】
［電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例］
次に、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法の変形例に  ついて、図１８乃至図２１を参照して説明する。なお、上述した電気泳動デバイスＤＶの製造方法と同一の手順については、その説明を簡略化または省略する。
【００７７】
本変形例の電気泳動デバイスＤＶの製造方法は、第１基板１および第２基板２を準備する工程、第２基板２の上面２ｂにマスク材２１を設ける工程、マスク材を設けた第２基板２に対して第２流路３０（電極槽９）にゲル化前のゲル材の溶液を導入する工程、ゲル材のゲル化後にマスク材２１を除去する工程、第２基板２に第１基板１および第３基板３を積層する工程を含む。
【００７８】
上述したように、分離槽８、電極槽９、緩衝液導入流路６、試料導入流路７、試料回収流路１１、電極挿入口１４および貫通孔４ｂ、５ｂ、１０ｂを形成して準備した第２基板２をエタノールに浸漬し、超音波洗浄機を用いて１０分間洗浄した。その後、超純水で２度リンスをし、窒素ブローした第２基板２に対してジクロロエタンを３分間暴露した。その後、第２基板２に対して、図１８に示すように、酸素プラズマ処理を施す。
【００７９】
次に、図１９に示すように、第２基板２の上面２ｂにマスク材２１を貼り付ける。次に、マスク材２１および上面２ｂが下側になるように第２基板２を反転させた後に、図２０に示すように、下面２ａに開口する電極槽９の開口部からピペット２０により、上述したゲル材の溶液を導入する。電極槽９に導入するゲル溶液の量は、一例として、ゲル化した隔壁１７が分離槽８の底面８ａと面一となる量である。ゲル溶液がゲル化すると、ゲル材が付着しないようにマスク材２１を剥離する。これにより、ゲル材で形成されて隔壁１７は、Ｚ側の一端が第２基板２の上面２ｂと面一に形成され、他端が底面８ａと面一に形成される。
【００８０】
次に、上述した製造方法と同様に、前処理を実施した第３基板３を第２基板２と接着する。次いで、接着した第２基板２および第３基板３に対して第１基板１を接着する。図２１には、第２基板２の上面２ｂが上側になるように、再度反転した図が示されている。
【００８１】
第１基板１は、図２１に示すように、隔壁１７と対向する位置に第２流路３０Ａとして、Ｘ方向に延びる溝が形成されている。第２流路３０Ａには、電極１５が電極挿入口１４から挿入されて収容される。
【００８２】
本変形例の製造方法では、上記の製造方法と同様の作用・効果が得られることに加えて、第２流路３０Ａが第１基板１に形成され、分離槽８との距離が大きくなるため、分離槽８と第２流路３０Ａとの間での緩衝液および気泡の移動を遮断することが容易になる。
【００８３】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【符号の説明】
【００８４】
１…第１基板（第２基材）、  ２…第２基板（基材）、  ３…第３基板（第３基材）、  ８…分離槽（第１流路）、  ９…電極槽、  １０…試料回収部、  １５…電極、  １７…隔壁、  ３０、３０Ａ…第２流路、  ４０…電圧調整部（調整部）、  ６１…試料供給系、  ６２…緩衝液供給系、  ７０…試料回収系、  ８０…第２緩衝液供給系、  ９０…第２流路回収系、  １００…細胞外小胞体分離装置、  ＤＶ…電気泳動デバイス
【図１】
2016031980.tif 000004
【図２】
2016031980.tif 000005
【図３】
2016031980.tif 000006
【図４】
2016031980.tif 000007
【図５】
2016031980.tif 000008
【図６】
2016031980.tif 000009
【図７】
2016031980.tif 000010
【図８】
2016031980.tif 000011
【図９】
2016031980.tif 000012
【図１０】
2016031980.tif 000013
【図１１】
2016031980.tif 000014
【図１２】
2016031980.tif 000015
【図１３】
2016031980.tif 000016
【図１４】
2016031980.tif 000017
【図１５】
2016031980.tif 000018
【図１６】
2016031980.tif 000019
【図１７】
2016031980.tif 000020
【図１８】
2016031980.tif 000021
【図１９】
2016031980.tif 000022
【図２０】
2016031980.tif 000023
【図２１】
2016031980.tif 000024
【国際調査報告】
2016031980.tif 000025
2016031980.tif 000026
2016031980.tif 000027
2016031980.tif 000028