(57)【要約】  下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法、及び宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。 （１）宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程。（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法。
（１）宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【請求項２】
前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）において、宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入する、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（２）が、セルレニンを含有する培地で形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項１０】
宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入して得られる、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項９又は１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
前記微生物が微細藻類である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
前記微生物が大腸菌である、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１４】
下記（ａ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と９１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項１５】
請求項１４記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１６】
下記（ｄ）又は（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びこれを用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。【０００３】
植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在し、アセチル−ＡＣＰ（acyl-carrier-protein）からスタートして炭素鎖の伸長反応を繰り返して、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein  synthase：ＫＡＳ）は脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素で、植物では、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、ＫＡＳ  ＩＩＩ、ＫＡＳ  ＩＶ、の４種が存在することが知られている。ＫＡＳ  Ｉ〜ＩＶはそれぞれ機能が異なり、ＫＡＳ  ＩＩＩは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを炭素数４のアシル−ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、ＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、及びＫＡＳ  ＩＶが関与する。ＫＡＳ  Ｉは主に炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、ＫＡＳ  ＩＩは主に炭素数１８のステアロイルＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、ＫＡＳ  ＩＶは炭素数６〜１４の中鎖アシル−ＡＣＰの伸長反応に関与するといわれている。ＫＡＳ  ＩＶについては、植物でもあまり知見が得られておらず、クフェアなどの中鎖脂肪酸を蓄積する植物に特有のＫＡＳとされている（特許文献１、非特許文献１）。【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。現在のところ、藻類のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼに関する報告はほとんどなく、特にＫＡＳ  ＩＶについて藻類由来のものは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／４６７７６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Dehesh  K,  Edwards  P,  Fillatti  J,  Slabaugh  M,  Byrne  J.,  “KAS  IV:  A  3-ketoacyl-ACP  synthase  from  Cuphea  sp.  is  a  medium  chain  specific  condensing  enzyme”,  The  Plant  Journal.  1998  ；15(3),  p.383-390.
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（１）宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【０００８】
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
【０００９】
また、本発明は、下記（ａ）又は（ｃ）のタンパク質（以下、「本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ」ともいう。）、及び当該タンパク質をコードする遺伝子（以下、「本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子」ともいう。）に関する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と９１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】NoKASIV遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図２】NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図３】NoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図４】セルレニン添加培地で培養したNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図５】NoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図６】セルレニン添加培地で培養したNoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図７】NgKASIV遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図８】NgKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図９】NgKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１０】EKASI遺伝子導入株及びEKASII遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１１】EKASI遺伝子及びNoTE遺伝子導入株、EKASII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１２】NoKASIorII遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１３】NoKASIorII遺伝子及びCTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１４】NoKASIorII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１５】ClKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株、NoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【図１６】NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株における、脂質中の脂肪酸組成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、藻類由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、藻類由来の新たなβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを提供に関する。
【００１３】
本発明者らは、藻類由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類から、複数のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを同定した。そして、これらを用いて宿主を形質転換したところ、形質転換体では中鎖脂肪酸の生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１４】
本発明の形質転換体は、脂質、特に中鎖脂肪酸の生産能に優れる。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、中鎖脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質の生産性に優れる。また、本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びこれをコードする遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰを合成することができる。
本発明のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂質、特に脂肪酸の工業的生産に好適に用いることができる。
【００１５】
以下、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、これを用いた形質転換体、及び脂質の製造方法について順に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
【００１６】
１．β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ
本発明の製造方法には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は、当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質をコードする遺伝子を用いる。具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を用いる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来の新規β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物と同様、藻類の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在し、アセチル−ＡＣＰからスタートして炭素鎖の伸長反応を繰り返し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリアプロテインとからなる複合体）が合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応で、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
【００１８】
前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有する。本発明において、タンパク質が「β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有する」とは、アセチル−ＡＣＰやアシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を有することをいう。
タンパク質がβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献１に記載の方法によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認することができる。
【００１９】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）は、アシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒し、その基質特異性によってＫＡＳ  Ｉ、ＫＡＳ  ＩＩ、ＫＡＳ  ＩＩＩ、ＫＡＳ  ＩＶに分類される。ＫＡＳ  ＩＩＩは、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを基質とし、炭素数２から４の伸長反応を触媒する。ＫＡＳ  Ｉは、主に炭素数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰを合成する。ＫＡＳ  ＩＩは、主に炭素数１６から１８の伸長反応を触媒し、炭素数１８のステアロイルＡＣＰを合成する。ＫＡＳ  ＩＶは炭素数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。
ＫＡＳ  Ｉ〜ＩＶは、阻害剤であるセルレニンに対する感受性が異なることが知られている。ＫＡＳ  Ｉ及びＫＡＳ  ＩＩはセルレニンに対して感受性であり、ＫＡＳ  ＩＩＩ及びＫＡＳ  ＩＶはセルレニンに対して非感受性である。
【００２０】
前記（ａ）のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、後述の実施例で示されているように、中鎖アシル−ＡＣＰに対して特異性を示し、ＫＡＳ  ＩＶであると考えられる。
本発明において「中鎖アシル−ＡＣＰ特異的」とは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼが、主に炭素数４〜１２のアシルＡＣＰを基質とし、炭素数１４までの中鎖アシルＡＣＰ合成の伸長反応を触媒することをいう。以下、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを、中鎖特異的β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼともいう。
また、本発明において、中鎖脂肪酸や中鎖アシル−ＡＣＰにおける中鎖とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼの中鎖アシル−ＡＣＰ特異性については、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析し、中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、上記の系に後述する中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを共発現することで、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ単独発現時と比較して中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献１に記載の方法によって中鎖アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応が起こること、により確認することができる。
【００２１】
前記（ｂ）において、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性の点から、アミノ酸配列の同一性は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９１％以上であることがよりさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２２】
前記（ｂ）のタンパク質としては、下記（ａ１）のタンパク質が挙げられ、好ましい。
（ａ１）配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号５８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス  ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである。配列番号５８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と約９０％の同一性を有する。後述の実施例で示されているように、（ａ１）のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼも、中鎖アシル−ＡＣＰに対して特異性を示し、ＫＡＳ  ＩＶであると考えられる。
【００２３】
また、前記（ｂ）のタンパク質としては、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列に、１又は数個（好ましくは１以上１０個以下、より好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異を導入したタンパク質も好ましい。
また、前記（ｂ）のタンパク質として、前記（ａ１）のタンパク質のアミノ酸配列に、１又は数個（好ましくは１以上１０個以下、より好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異を導入したタンパク質も好ましい。
上記変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２４】
前記（ｂ）のタンパク質は、下記（ｃ）の新規タンパク質を包含する。
（ｃ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と９１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【００２５】
中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、前記（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質は、中鎖特異的β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質であることが好ましい。
【００２６】
上述したタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス  オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に合成等することもでき、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子を用いることができる。なお、ナンノクロロプシス  オキュラータ等の藻類は、私的又は公的なバイオ関連の研究所等で保存されているものを購入して使用することができる。例えば、実施例で用いたNannochloropsis oculata  NIES-2145株は、国立環境研究所(NIES)で購入することができる。
【００２７】
前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子の一例として、下記（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２８】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の１つとして、配列番号２の塩基配列が挙げられる。配列番号２の塩基配列からなる遺伝子は、ナンノクロロプシス  オキュラータ由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをコードする遺伝子である。
【００２９】
前記（ｅ）において、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性の点から、塩基配列の同一性は６５％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、７５％以上であることがさらに好ましく、７８％以上であることがよりさらに好ましい。より好ましくは、８０％以上であり、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がよりさらに好ましい。なお、塩基配列の同一性の算出方法については、前述した。
【００３０】
前記（ｅ）のＤＮＡとして具体的には、下記（ｄ１）のＤＮＡが挙げられ、好ましい。
（ｄ１）配列番号５９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
配列番号５９の塩基配列からなる遺伝子は、ナンノクロロプシス  ガディタナ由来のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子である。配列番号５９の塩基配列は、配列番号２の塩基配列と約７７％の同一性を有する。
【００３１】
前記（ｅ）のＤＮＡは、下記（ｆ）の新規ＤＮＡを包含する。
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００３２】
上述したβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス  オキュラータからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００３３】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明の形質転換体は、上述の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子と共に、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、宿主に導入してなるものであることが好ましい。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
そのため、宿主にβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ遺伝子とアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００３４】
本発明で用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００３５】
また、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
上述のように、前記（ａ）又は（ａ１）のタンパク質は中鎖特異的β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼであるため、共導入するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼも、中鎖アシル−ＡＣＰに特異的なチオエステラーゼ（以下、「中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」ともいう）であることが好ましい。中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。特に、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを元来有していない宿主を形質転換に用いる場合、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの共導入が効果的である。
【００３６】
本発明では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして、公知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質を用いることができる。用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1、配列番号５０、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５１）；Cuphea calophylla  subsp.  mesostemonアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABB71581）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照、配列番号４６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４７）；Cinnamomum camphoraアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71729）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71730）；Cuphea lanceolataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookerianaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）；Ulumus americanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  AAB71731)；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EER87824)；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EER88593)；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Elaeis guineensisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  AAD42220)；Desulfovibrio vulgarisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  ACL08376)；Bacteriodes fragilisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  CAH09236)；Parabacteriodes distasonisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  ABR43801)；Bacteroides thetaiotaomicronアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  AAO77182)；Clostridium asparagiformeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EEG55387)；Bryanthella formatexigensアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EET61113)；Geobacillus  sp.アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EDV77528)；Streptococcus dysgalactiaeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  BAH81730)；Lactobacillus brevisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  ABJ63754)；Lactobacillus plantarumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  CAD63310)；Anaerococcus tetradiusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  EEI82564)；Bdellovibrio bacteriovorusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  CAE80300)；Clostridium thermocellumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(GenBank  ABN54268)；Nannochloropsis oculataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(配列番号４８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４９）；Nannochloropsis gaditanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５２、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５３）；Nannochloropsis granulataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５４、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５５）；Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５７）、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３７】
上述したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの中でも、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが好ましく、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５０、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５１）、Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号４６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４７）、Nannochloropsis oculataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ(配列番号４８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４９）、Nannochloropsis gaditanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５２、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５３）、Nannochloropsis granulataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５４、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５５）、Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５７）、又はこれらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
【００３８】
タンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００３９】
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、宿主に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００４０】
本発明の形質転換体は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００４１】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、好ましくは中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入した形質転換体も、同様にして作製することができる。
【００４２】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００４３】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、ｐＳＴＶ系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  (PtTE)  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian,  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  Dec  27;108(52),  2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００４４】
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００４５】
上記ベクターに前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００４６】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４７】
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
【００４８】
培養又は生育条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養又は生育条件を使用できる。
中鎖脂肪酸の生産性を向上させるため、培地はセルレニンを含有することが好ましい。上述のように、炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ合成を触媒するＫＡＳ  Ｉ及びＫＡＳ  ＩＩはセルレニンにより阻害される。一方、中鎖アシル−ＡＣＰ合成を触媒するＫＡＳ  ＩＶは、セルレニン非感受性である。形質転換体をセルレニン含有培地で培養又は生育することで、炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ合成を減少させ、中鎖アシル−ＡＣＰの合成を増加させることができる。培地中のセルレニン濃度は、生育に悪影響を与えない濃度であることが好ましい。具体的には、１μＭ以上が好ましく、１０μＭ以上がより好ましく、そして５０μＭ以下が好ましく、２５μＭ以下がより好ましい。また、１〜５０μＭが好ましく、１０〜５０μＭがより好ましく、１０〜２５μＭがさらに好ましい。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００４９】
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００５０】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１％（vol/vol）以上が好ましく、そして５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。また、１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましく、そして３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。また、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましく、そして５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。また、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましく、そして２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。また、明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましく、そして１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。また、０．０３〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましく、そして５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。また、０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、３日以上が好ましく、７日以上がより好ましく、そして９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。また、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００５１】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００５２】
本発明の製造方法を用いることで、脂質、特に中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質を効率的に生産することができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましく、脂肪酸又はそのエステルであることがよりさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、中鎖脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素原子数１２〜１４の飽和脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、炭素原子数１２の脂肪酸又はそのエステルがよりさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルが特に好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
【００５３】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質を開示する。
【００５５】
＜１＞  下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法。
（１）宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【００５６】
＜２＞  前記（ｂ）のタンパク質が、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、よりさらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質である、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞  前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞  前記タンパク質が、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜５＞  前記工程（１）において、宿主に中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜６＞  前記工程（２）が、セルレニンを含有する培地で形質転換体を培養する工程を含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜７＞  前記宿主が微生物又は植物である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜８＞  前記微生物が微細藻類である、＜７＞項記載の製造方法。
＜９＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、＜８＞項記載の製造方法。
＜１０＞  前記微生物が大腸菌である、＜７＞項記載の製造方法。
【００５７】
＜１１＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜１２＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入して得られる、＜１１＞項記載の形質転換体。
＜１３＞  前記宿主が微生物又は植物である、＜１１＞又は＜１２＞項記載の形質転換体。
＜１４＞  前記微生物が微細藻類である、＜１３＞項記載の形質転換体。
＜１５＞  前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、＜１４＞項記載の形質転換体。
＜１６＞  前記微生物が大腸菌である、＜１３＞項記載の形質転換体。
【００５８】
＜１７＞  下記（ａ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と９１％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【００５９】
＜１８＞  ＜１７＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１９＞  下記（ｄ）又は（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７８％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００６０】
＜２０＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜２１＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
【００６１】
＜２２＞  脂質を製造するための、＜１１＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜２３＞  前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜２２＞項に記載の形質転換体の使用。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００６３】
実施例１  ナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES-2145株由来β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）遺伝子（NoKASIV遺伝子）を大腸菌に導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
１．NoKASIV遺伝子導入株
（１）NoKASIV遺伝子の取得、及びNoKASIV遺伝子発現プラスミドの構築
国立環境研究所(NIES)からNannochloropsis oculata  NIES-2145株を購入し、使用した。Nannochloropsis oculata  NIES-2145株をｆ／２培地（７５ｍｇＮａＮＯ３、６ｍｇＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２、０．５μｇビオチン、１００μｇチアミン、１０ｍｇＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、４．４ｍｇＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、３．１６ｍｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１２μｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２１μｇＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８０μｇＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７μｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、７μｇＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ/人工海水１Ｌ）で十分培養し、５０ｍｌのｆ／２培地に１０％植菌し、２５℃、二酸化炭素０．３％で人工気象機にて６日間培養した。培養後に回収したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、RNeasy  Plant  Mini  Kit  (Qiagen社製)を用いてＲＮＡ精製を行った。得られたtotal  RNAから、SuperScript  III  First-Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR  （invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号３及び配列番号４のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２に示すNoKASIV遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。
また、プラスミドベクターpSTV28（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpSTV28を増幅し、DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoKASIV遺伝子発現プラスミドを構築した。【００６４】
【表１】
2015133305.tif 000002
【００６５】
（２）NoKASIV遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath  et  al，  Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCm液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，クロラムフェニコール30μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。【００６６】
（３）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。【００６７】
得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィー解析は下記の条件で行った。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）、移動層：高純度ヘリウム、カラム内流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／ｍｉｎ→３００℃（５分間）、平衡化時間：１分間、注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／ｍｉｎ，注入量１μＬ、洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、検出器温度：３００℃【００６８】
また、脂肪酸メチルエステルの同定は、前記ガスクロマトグラフィーに用いたものと同じサンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
NoKASIV遺伝子導入株及びプラスミドベクターpSTV28導入株（陰性対照）の総脂肪酸量（脂質量）に占める各脂肪酸量の割合を、図１に示す。なお、以下の図中の脂肪酸組成において、Ｃｘとあるのは炭素原子数ｘの脂肪酸を、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。また、図中、Ｃ１８：ｎの「ｎ」は０〜５の整数を表し、Ｃ１８：０，Ｃ１８：１，Ｃ１８：２，Ｃ１８：３，Ｃ１８：４，及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。また、Ｃ１６：ｎは、Ｃ１６：０及びＣ１６：１の脂肪酸の総和を表す。【００６９】
図１から明らかなように、NoKASIV遺伝子導入株（図１：NoKASIV）では、プラスミドベクターpSTV28導入株（図１：ＷＴ）に比べて、Ｃ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００７０】
２．NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株
NoKASIV遺伝子及びココヤシ（Cocos nucifera）由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、CTE遺伝子導入K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。CTE遺伝子導入K27株は、特開２０１１−２５０７８１号公報記載の方法により作製した。CTE遺伝子はプラスミドベクターpMW219（ニッポンジーン製）にクローニングされたものを使用した。CTEのアミノ酸配列を配列番号４６に、CTE遺伝子の配列を配列番号４７にそれぞれ示す。
形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCmKm液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，クロラムフェニコール30μg/mL、カナマイシン硫酸塩50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Mediumに接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記１．と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図２に示す。【００７１】
図２から明らかなように、NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株（図２：CTE＋NoKASIV）では、CTE遺伝子導入K27株（図２：CTE）に比べて、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００７２】
３．NoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株
NoKASIV遺伝子及びナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES-2145株由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（NoTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
（１）NoTE遺伝子の取得、及びNoTE遺伝子発現用プラスミドの構築
Nannochloropsis oculata  NIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript  III  First-Strand  Synthesis  SuperMix  for  qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、下記表２に示す配列番号６６及び配列番号６７のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号４９に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、下記表２に示す配列番号６８及び６９のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpBluescriptII  SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoTE遺伝子発現用プラスミドNoTE_1を構築した。なお、この発現プラスミドは、NoTE遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号４８）の１位のＮ末端側に、プラスミド由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列と融合させた形で構築した。【００７３】
【表２】
2015133305.tif 000003
【００７４】
（２）NoTE遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
構築したNoTE遺伝子発現用プラスミドNoTE_1を用いて、大腸菌K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養し、NoTE遺伝子導入K27株を得た。【００７５】
（３）NoKASIV遺伝子のNoTE遺伝子導入K27株への導入
前記１．で構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、NoTE遺伝子導入K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。
形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCmAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，クロラムフェニコール30μg/mL、アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Mediumに接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記１．と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図３に示す。【００７６】
図３から明らかなように、NoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図３：NTE＋NoKASIV）では、NoTE遺伝子導入K27株（図３：NTE）に比べて、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１４：１脂肪酸の含有率が高かった。【００７７】
４．NoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株のセルレニン添加培地での脂質生産性
前記３．で構築したNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株を、LBCmAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，クロラムフェニコール30μg/mL、アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Mediumに接種し、３０℃で振とう培養した。このとき、Overnight  Express  Instant  TB  Mediumにセルレニン（和光純薬工業）を終濃度１０μＭとなるように添加した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記１．と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、セルレニンを添加しない培地でもNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株を同様に培養した。
結果を図４に示す。【００７８】
図４から明らかなように、セルレニン添加培地で培養したNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図４：NTE＋NoKASIV＋Cer）は、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が増加する一方、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸の含有率が低下した。【００７９】
実施例２．NoKASIV遺伝子及びカリフォルニアベイ（Umbellularia californica）由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（BTE）遺伝子をナンノクロロプシス  オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産【００８０】
１．NoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株
（１）BTE遺伝子ナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
特表平７−５０１９２４号公報に記載のBTEをコードする遺伝子配列（配列番号５１）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号７及び８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、BTE遺伝子断片を取得した。なお、このＤＮＡ断片では、BTE（配列番号５０）の葉緑体移行シグナル（Ｎ末端の８５アミノ酸）に相当する部分を欠損させた。
GenBankに登録されているナンノクロロプシス  エスピー（Nannochloropsis  sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete  cds  配列（Accession  number:  JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号３９）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号４０）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号４１）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号９及び１０のプライマー対、配列番号１１及び１２のプライマー対、配列番号１３及び１４のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、VCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号１５及び１６プライマー対を用いたＰＣＲ反応を行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
上記により得られたBTE遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１の１．と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、BTE遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを構築した。なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。【００８１】
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号４２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号１７及び１８プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子断片を取得した。ゼオシン耐性遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1ターミネーター配列を、上記と同様に融合してゼオシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-bleを構築した。【００８２】
２．NoKASIV遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
NoKASIV遺伝子を鋳型として、表１に示す配列番号１９及び２０のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行うことでNoKASIV遺伝子断片を取得した。次に、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/  ncomms1688,  2012、に記載のNannochloropsis gaditana  CCMP526株由来ユビキチンプロモーター配列（配列番号４５）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号２１及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ユビキチンプロモーターのＤＮＡ断片を取得した。これらの増幅断片と、前記で取得したVCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片とを前記と同様の方法で融合し、NoKASIV遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-UEPp-NoKASIVを構築した。【００８３】
パラモマイシン耐性遺伝子（配列番号４３）及びRandor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のナンノクロロプシス  ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）CCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４４）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号２３及び２４のプライマー対、配列番号２５及び２６のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ取得した。これらの増幅断片と、前記で取得したVCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片を前記と同様の方法で融合し、パラモマイシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-TUBp-aphVIIIを構築した。【００８４】
３．BTE遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
BTE遺伝子発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを鋳型として、表１に示す配列番号２７及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のVCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列からなるBTE遺伝子発現用断片を増幅した。また、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドpUC-vcp1c-bleを鋳型として、表１に示す配列番号２７及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したBTE遺伝子発現用断片及びゼオシン耐性遺伝子発現用断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（７５ｍｇＮａＮＯ３、６ｍｇＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２、０．５μｇビオチン、１００μｇチアミン、１０ｍｇＮａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、４．４ｍｇＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、３．１６ｍｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１２μｇＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２１μｇＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１８０μｇＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７μｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、７μｇＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ/人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地（ｆ／２液体培地に０．８％寒天を添加）に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、BTE遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。【００８５】
４．NoKASIV遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
NoKASIV遺伝子発現用プラスミドpUC-UEPp-NoKASIVを鋳型として、表１に示す配列番号２９及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のプロモーター配列、NoKASIV遺伝子及びVCP1ターミネーター配列からなるNoKASIV遺伝子発現用断片を増幅した。また、pUC-TUBp-aphVIIIを鋳型として、表１に示す配列番号３０及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、上述の方法で３．で作成したBTE導入株に導入、培養し、得られたコロニーの中から、NoKASIV遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。【００８６】
５．BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子発現株の脂質生産性
４．で選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液１０ｍＬを、４０ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて振盪培養した。培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、３．で得られたBTE遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株についても同様に実験を行った。
結果を図５に示す。【００８７】
図５から明らかなように、NoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株（図５：BTE＋NoKASIV）では、BTE遺伝子導入株（図５：BTE）に比べて、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００８８】
６．BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子発現株のセルレニン添加培地での脂質生産性
４．で選抜した株を５．と同様の方法で前培養し、１０μＭのセルレニンを含むＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて振盪培養した。培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、セルレニンを添加しない系についても同様に実験を行った。
結果を図６に示す。【００８９】
図６から明らかなように、セルレニン添加培地で培養したNoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株（図６：BTE＋NoKASIV＋Cer）は、Ｃ１２：０及びＣ１４：０の含有率が増加する一方、Ｃ１６及びＣ１８脂肪酸の含有率が低下した。【００９０】
実施例３  ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）CCMP526株由来β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（NgKASIV）遺伝子を大腸菌に導入した形質転換体の作製及び形質転換体による脂肪酸の生産【００９１】
１．NgKASIV遺伝子導入株
（１）NgKASIV遺伝子の取得、及びNgKASIV遺伝子発現プラスミドの構築
Nannochloropsis gaditana  CCMP526株の全９０５２遺伝子の配列情報を、Colorado  School  of  Mines  及びGenome  Project  Solutions  が提供するナンノクロロプシス・ゲノムプロジェクト（Nannochloropsis  Genome  Project  (http://nannochloropsis.genomeprojectsolutions-databases.com/)）から取得した。そのうちの１つであるNga04201遺伝子（配列番号５９に示す塩基配列からなる遺伝子、以下NgKASIV）について人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。取得した人工遺伝子を鋳型として、表１に示す配列番号３１及び３２のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号５９に示すNgKASIV遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。なお、配列番号５９に示すNgKASIV遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列と７７％の同一性を示し、配列番号５８に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と９０％の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NgKASIV遺伝子発現プラスミドを構築した。【００９２】
（２）NgKASIV遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の１．と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図７に示す。【００９３】
図７から明らかなように、NgKASIV遺伝子導入株（図７：NgKASIV）では、プラスミドベクターpSTV28導入株（図７：ＷＴ）に比べて、Ｃ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００９４】
２．NgKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株
NgKASIV遺伝子及びココヤシ（Cocos nucifera）由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の２．と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図８に示す。【００９５】
図８から明らかなように、NgKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株（図８：CTE＋NgKASIV）では、CTE遺伝子導入株（図８：CTE）に比べて、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００９６】
３．NgKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株
NgKASIV遺伝子及びNannochloropsis oculata  NIES-2145株由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（NoTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の３．と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図９に示す。【００９７】
図９から明らかなように、NgKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図９：NTE＋NgKASIV）では、NoTE遺伝子導入株（図９：NTE）に比べて、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【００９８】
比較例１  大腸菌（Escherichia  coli）K27株由来KAS  I（EKASI）遺伝子又はKAS  II（EKASII）遺伝子を大腸菌に導入した形質転換体の作製及び形質転換体による脂肪酸の生産【００９９】
１．EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子導入株
（１）EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子発現プラスミドの構築
大腸菌のEKASI遺伝子及びEKASII遺伝子の配列情報を、データベースPEC（Profiling  of  E.coli  Chromosome、www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/）より入手した。大腸菌K27株を、ＬＢ培地にて３０℃で振とう培養した後、培養液１ｍｌから菌体を回収し、QIAamp  DNA  Mini  Kit(キアゲン社製)を使用し、ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号３３及び３４のプライマー対、配列番号３５及び３６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号６３に示すEKASI遺伝子、配列番号６５に示すEKASII遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。なお、配列番号６３に示すEKASI遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列と４９％の同一性を示し、配列番号６５に示すEKASII遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列と５３％の同一性をし、配列番号６２に示すEKASIのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と約３４％の同一性を示し、配列番号６４に示すEKASIIのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と約４５％の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpSTV28を増幅し、DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、EKASI遺伝子発現プラスミド及びEKASII遺伝子発現プラスミドを構築した。【０１００】
（２）EKASI遺伝子発現プラスミド、EKASII遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
構築したEKASI遺伝子発現プラスミド、EKASII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の１．と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図１０に示す。【０１０１】
図１０から明らかなように、EKASI遺伝子導入株（図１０：EKASI）、EKASII遺伝子導入株（図１０：EKASII）、プラスミドベクターpSTV28導入株（図１０：ＷＴ）よりも、Ｃ１４脂肪酸の含有率が低下していた。【０１０２】
２．EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株
EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子と、Nannochloropsis oculata  NIES-2145株由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（NoTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したEKASI遺伝子又はEKASII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の３．と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図１１に示す。【０１０３】
図１１から明らかなように、EKASI遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図１１：NTE＋EKASI）、EKASII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図１１：NTE＋EKASII）では、NoTE遺伝子導入株（図１１：NTE）よりも、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が低かった。【０１０４】
比較例２  ナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES-2145株由来KAS（NoKASIorII）遺伝子を大腸菌に導入した形質転換体の作製及び形質転換体による脂肪酸の生産【０１０５】
（１）NoKASIorII遺伝子の取得、及びNoKASIorII遺伝子発現プラスミドの構築
実施例１の１．と同様の方法で、Nannochloropsis oculata  NIES-2145株のｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号３７及び３８のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号６１に示すNoKASIorII遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。なお、配列番号６１に示すNoKASIorII遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列と５９％の同一性を示し、配列番号６０に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と５２％の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoKASIorII遺伝子発現プラスミドを構築した。【０１０６】
（２）NoKASIorII遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の１．と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図１２に示す。【０１０７】
図１２から明らかなように、NoKASIorII遺伝子導入株（図１２：NoKASIorII）では、プラスミドベクターpSTV28導入株（図１２：ＷＴ）よりもＣ１４：０脂肪酸の含有率が低下していた。【０１０８】
２．NoKASIorII遺伝子及びCTE遺伝子導入株
NoKASIorII遺伝子と、ココヤシ（Cocos nucifera）由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CTE）遺伝子とを大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の２．と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図１３に示す。【０１０９】
図１３から明らかなように、NoKASIorII遺伝子及びCTE遺伝子導入株（図１３：CTE＋NoKASIorII）では、CTE遺伝子導入株（図１３：CTE）よりも、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が低かった。【０１１０】
３．NoKASIorII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株
NoKASIorII遺伝子と、Nannochloropsis oculata  NIES-2145株由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（NoTE）遺伝子を大腸菌K27株（fadD88）に導入した多重形質転換体を作製した。
前記１．で構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例１の３．と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図１４に示す。【０１１１】
図１４から明らかなように、NoKASIorII遺伝子及びNoTE遺伝子導入株（図１４：NTE＋NoKASIorII）では、NoTE遺伝子導入株（図１４：NTE）よりも、Ｃ１２：１、Ｃ１２：０、及びＣ１４：１脂肪酸の含有率が低かった。【０１１２】
比較例３．クフェア(Cuphea lanceolata)由来KASIV（ClKASIV）遺伝子及びBTE遺伝子をナンノクロロプシス  オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
１．ClKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株
ClKASIVをコードする遺伝子配列(配列番号７１；Accession  number:  AJ344250.1；Shutt  BS  et  al.,  ”Beta-  ketoacyl-acyl  carrier  protein  synthase  IV:  a  key  enzyme  for  regulation  of  medium-chain  fatty  acid  synthesis  in  Cuphea  lanceolata  seeds”    Planta.  2002  Sep;215  (5)  p.847-54)を人工合成した。なお、配列番号７１に示すClKASIV遺伝子は、配列番号２の遺伝子配列と４９％の同一性を示し、配列番号７０に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と３８．５％の同一性を示す。
合成したDNA断片を鋳型として、配列番号７２及び７３のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、ClKASIV遺伝子断片を取得した。
得られたClKASIV遺伝子断片と、実施例２で用いたユビキチンプロモーター配列と、VCP1ターミネーター配列とを、実施例１の１．と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、ClKASIV遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-UEPp-ClKASIVを構築した。【０１１３】
【表３】
2015133305.tif 000004
【０１１４】
２．ClKASIV遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
ClKASIV遺伝子発現用プラスミドpUC-UEPp-ClKASIVを鋳型として、表１に示す配列番号２９及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、当該プラスミド中のプロモーター配列、ClKASIV遺伝子及びVCP1ターミネーター配列からなるClKASIV遺伝子発現用断片を増幅した。また、実施例２の２．に記載のプラスミドpUC-TUBp-aphVIIIを鋳型として、表１に示す配列番号３０及び２８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、実施例２の３．と同様の方法で、実施例２の３．で作成したBTE導入株に導入し、培養した。得られたコロニーの中から、ClKASIV遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。【０１１５】
３．BTE遺伝子及びNoKASIV遺伝子発現株の脂質生産性
２．で選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液１０ｍＬを、４０ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて振盪培養した。培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例１と同様の方法にて解析した。なお、対照として、実施例２の３．で得られたBTE遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株と、実施例２の４．で得られたBTE及びNoKASIV導入ナンノクロロプシス株についても同様に実験を行った。
結果を図１５に示す。【０１１６】
図１５から明らかなように、ClKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株（図１５：BTE＋ClKASIV）では、NoKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株（図１５：BTE＋NoKASIV）に比べて、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が低かった。【０１１７】
実施例４．NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子をシロイヌナズナに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
１．CTE遺伝子導入用プラスミドの作製
特開２０１１−２５０７８１号公報の実施例１の手法に従い、植物導入用プラスミドp909CTEを構築した。当該プラスミドは、CTE遺伝子がBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターにより発現制御され、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドによって葉緑体へと移行するよう設計されたものである。
当該プラスミドが有する、Brassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーター配列を配列番号７４に、Brassica rapa由来のNapin遺伝子ターミネーター配列を配列番号７５に、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドを結合したCTE遺伝子の配列を配列番号７６にそれぞれ示す。【０１１８】
２．NoKASIV遺伝子導入用プラスミドの作製
下記の手順により、植物導入用ベクターpRI909（タカラバイオ製）が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子を、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子（Bar遺伝子）に置換した。Bar遺伝子は、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードする。Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子は、NCBIのGene  Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310（ACCESSION  NO.  DQ469641）の配列を参考に、Gene  Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した（配列番号７７）。人工合成遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、配列番号７９と８０のプライマー対を用いたPCR反応により、Bar遺伝子を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、配列番号８１と８２のプライマー対を用いたPCR反応により、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。両増幅断片をNde  IとSpe  Iで処理し、ライゲーション反応で連結して、プラスミドpRI909  Barを構築した。【０１１９】
西洋アブラナ（Brassica napus）の種子で発現するBrassica napus  Napinプロモーターの配列を、NCBIのGene  Bankに開示されたBrassica napus  napin  Promoter（ACCESSION  NO.  EU416279）の配列を参考に、Gene  Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した（配列番号７８）。人工合成したプロモーター配列をテンプレートとし、配列番号８３と８４のプライマー対を用いて、Brassica napus  Napinプロモーター配列を増幅した。また、プラスミドpRI909  Barをテンプレートとし、配列番号８５と８６のプライマー対のプライマーを用いて、pRI909  Barの直鎖状断片を増幅した。さらに、プラスミドp909CTEをテンプレートとし、配列番号８７と８８のプライマー対を用いて、CTE-Tnapin配列を増幅した。これらの増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinを構築した。【０１２０】
プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinをテンプレートとし、配列番号８９と９０のプライマー対を用いて、CTE遺伝子領域を含まないp909Pnapus-Tnapinの直鎖状断片を増幅した。さらに、ココヤシ胚乳由来cDNAをテンプレートとし、配列番号９１及び９２のプライマー対を用いて、NoKASIV遺伝子を増幅した。得られた増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Pnapus-NoKASIV-Tnapinを構築した。【０１２１】
【表４】
2015133305.tif 000005
【０１２２】
３．シロイヌナズナの形質転換
CTE遺伝子導入用プラスミドp909CTEを、インプランタイノベーションズ（株）によるシロイヌナズナ形質転換受託サービスに供し、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana，  Colombia株）の形質転換体を得た。シロイヌナズナは、野生型及び形質転換体を、室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間（約4000ルクス）の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。【０１２３】
次に、p909CTEを導入したシロイヌナズナ形質転換体を親株として、以下の形質転換体を作成した。
プラスミドp909Pnapus-NoKASIV-TnapinをAgrobacterium tumefaciens  GV3101株に導入し、これを用いてp909CTEを導入したシロイヌナズナを形質転換した。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除し、さらに6〜7日間育成したものに、プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。得られた種子を、MS寒天培地（100μg/mlクラフォラン、7μg/mlビアラフォスを含む）に播種し、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体を室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。【０１２４】
４．脂質の抽出とメチルエステル化
シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて粉砕し、そこに20μlの7-ペンタデカノン（0.5mg/ml  メタノール）（内部標準）と20μlの酢酸を添加したクロロホルム0.25ml、メタノール0.5mlを加え、十分に攪拌した後、15分間静置した。さらに、1.5％KCl  0.25mlとクロロホルム0.25mlを添加し、十分に攪拌した後、15分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに、0.5Ｎ水酸化カリウム−メタノール溶液を100μl加え、70℃で30分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3ml添加して乾燥物を溶解し、80℃で10分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mlとヘキサン0.3mlを添加し、十分に攪拌した後、30分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層（上層部分）を採取し、ガスクロマトグラフィ（GC）分析に供した。【０１２５】
５．GC分析
GC解析は下記の条件で行った。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）、移動層：高純度ヘリウム、カラム内流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、昇温プログラム：１５０℃（０．５分間）→３２０℃（２分間）、平衡化時間：１分間、注入口：スプリット注入（スプリット比：７５：１），圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／ｍｉｎ，注入量５μＬ、洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、検出器温度：３００℃
得られたデータを実施例１と同様の方法で解析した。結果を図１６に示す。【０１２６】
図１６から明らかなように、NoKASIV遺伝子及びCTE遺伝子導入株では、CTE遺伝子導入株（親株）に比べて、Ｃ１２：０及びＣ１４：０脂肪酸の含有率が高かった。【０１２７】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【０１２８】
本願は、2014年3月3日に日本国で特許出願された特願2014-040536に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【図１】
2015133305.tif 000006
【図２】
2015133305.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2015133305.tif 000019
【図１５】
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【図１６】
2015133305.tif 000021
【配列表】
2015133305000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月6日(2016.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法。
（１）宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【請求項２】
前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼである、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（２）が、セルレニンを含有する培地で形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が微細藻類である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が大腸菌である、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項９】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記微生物が微細藻類である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記微生物が大腸菌である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１２】
下記（ａ）又は（ｃ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列と９１％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
【請求項１３】
請求項１２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
下記（ｄ）又は（ｆ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡの塩基配列と７８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【国際調査報告】
2015133305.tif 000022
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