(57)【要約】本発明はモグロール配糖体化酵素及び同酵素を用いたモグロール配糖体の製造方法を目的とする。  本発明は、モグロール配糖体化酵素及び同酵素を用いたモグロール配糖体の製造方法を提供する。本発明は、モグロール配糖体化酵素遺伝子を導入した形質転換体及び当該形質転換体の作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させる工程を含む、モグロール配糖体の製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
【化１０】
2016060276.tif 000018
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。
【請求項２】
前記糖分子がヘキソースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖分子がグルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｒ及びＲ１が、それぞれ独立にＨ又はグルコース単量体若しくはグルコース２量体の糖残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記前記一般式（Ｉ）で示される化合物がモグロール又はモグロール配糖体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モグロール配糖体が、モグロシドＩＡ、モグロシドＩｂ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシドＶ、モグロールペンタグルコシド、又はこれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モグロール配糖体を合成する活性を有するタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチド、同タンパク質を利用したモグロール配糖体の製造方法、モグロール配糖体化酵素を高発現する形質転換体並びに前記方法により作製されたモグロール配糖体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウリ科植物の果実にはトリテルペン系植物ステロールであるモグロール（ｍｏｇｒｏｌ）の配糖体であるモグロシド（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ）と呼ばれる一連の化合物が含まれている。モグロシドはショ糖の数百倍の甘味度を有しており、かつ味質が良いことからカロリーを抑えた食品の代替甘味料としてキク科ステビアのジテルペン系のステビオール（ｓｔｅｖｉｏｌ）の配糖体であるレバウディオシド（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ）と同様に期待されている。
ステビアのレバウディオシドについては高度に配糖体化されたレバウディオシドＡ（グルコースが４つ付加した配糖体）やレバウディオシドＤ（グルコースが５つ付加した配糖体）が味も良く、甘味度が高いとされている。同様にモグロールについてもモグロシドＶと呼ばれるグルコースが５つ付加したものが甘味も味質も良く、市販されている（非特許文献１）。さらに甘味料以下外にも有用な機能性が報告されており、注目されている植物代謝物である（非特許文献２）。その一方で、ラカンカのような植物体においてどのようにモグロール配糖体が生合成されるのかについては不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋａｓａｉ，Ｒ．（２００８）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅｏｕｓ  ｐｌａｎｔｓ．ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＧＵ  １２８（１０），１３６９−１３８２．
【非特許文献２】Ｕｋｉｙａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｎｅ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｒｕｉｔ  ｏｆ  Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ  ｏｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅａｒｌｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  １２−Ｏ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．５０，６７１０−６７１５．（日本大学）
【発明の開示】
【０００４】
本発明者らは鋭意研究を遂行した結果、モグロール配糖体の２４位グルコースへの糖付加反応を触媒する酵素及び同酵素をコードする遺伝子配列を同定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
【０００５】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
【化１】
2016060276.tif 000002
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。
［２］
前記糖分子がヘキソースである、前記［１］に記載のタンパク質。
［３］
前記糖分子がグルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記［１］に記載のタンパク質。
［４］
前記Ｒ及びＲ１が、それぞれ独立にＨ又はグルコース単量体若しくはグルコース２量体の糖残基である、前記［１］に記載のタンパク質。
［５］
前記前記一般式（Ｉ）で示される化合物がモグロール又はモグロール配糖体である、前記［１］に記載のタンパク質。
［６］
以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
【化２】
2016060276.tif 000003
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。
［７］
前記糖分子がヘキソースである、前記［６］に記載のポリヌクレオチド。
［８］
前記糖分子がグルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるものである、前記［６］に記載のポリヌクレオチド。
［９］
前記Ｒ及びＲ１が、それぞれ独立にＨ又はグルコース単量体若しくはグルコース２量体の糖残基である、前記［６］に記載のポリヌクレオチド。
［１０］
前記一般式（Ｉ）で示される化合物がモグロール又はモグロール配糖体である、前記［６］に記載のポリヌクレオチド。
［１１］
前記［６］に記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
［１２］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［１１］に記載の形質転換体。
［１３］
植物体である、前記［１１］に記載の形質転換体。
［１４］
前記［１１］に記載の形質転換体の抽出物。
［１５］
前記［１４］に記載の抽出物を含む食品、医薬品又は工業原料。
［１６］
前記［１１］に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有する、方法
【化３】
2016060276.tif 000004
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。
［１７］
前記［１１］に記載の非ヒト形質転換体を用いることを特徴とするモグロール配糖体の製造方法。
［１８］
前記モグロール配糖体が、モグロシドＩＡ、モグロシドＩｂ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシドＶ、モグロールペンタグルコシド、又はこれらの組み合わせである、前記［１７］に記載の方法。
［１９］
前記［１］に記載のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させる工程を含む、モグロール配糖体の製造方法
【化４】
2016060276.tif 000005
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。
［２０］
前記ＵＤＰ−糖における糖がグルコースである、前記［１９］に記載の方法。
［２１］
前記モグロール配糖体が、モグロシドＩＡ、モグロシドＩｂ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシドＶ、モグロールペンタグルコシド、又はこれらの組み合わせである、前記［１９］に記載の方法。
【０００６】
本発明のタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドを利用することにより、高効率にモグロール配糖体（例えば、モグロシドＶ等）を製造することができる。また、本発明の形質転換体は、モグロール配糖体（例えば、モグロシドＶ等）の含有量が高いため、これらの形質転換体から、効率よくモグロール配糖体（例えば、モグロシドＶ等）を抽出・精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＵＧＴ酵素によりモグロールにグルコースが付加されて配糖体であるモグロシドＶが生成される様子を示す図である。
【図２】ＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３タンパク質の発現を示す図である。
【図３】ＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３タンパク質の配糖体化活性により生成したモグロール配糖体のＬＣ−ＭＳ分析チャートを示す図である。
【図４】ラカンカ（Ｓｇ）由来ＵＧＴ７４Ｇ−９４３の活性を１とした時のステビア（Ｓｒ）由来のＵＧＴ７３Ｅ１とＵＧＴ８５Ｃ２の相対活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１４年１０月１７日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１４−２１３０６３号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。【０００９】
本発明者らは、ウリ科ラカンカの酵素ＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３が、モグロール又はモグロール配糖体の第２４位にグルコース分子を付加すること（即ち、配糖体化活性を有すること）（図１）を初めて解明した。
ＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３のＣＤＳ配列及び推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２である。前記ポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。【００１０】
１．  モグロール配糖体化酵素
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質
【化５】
2016060276.tif 000006
（式中、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。）。【００１１】
上記（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号２のポリペプチドの変異体であるが、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）″、″Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）″、″Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）″、″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）″等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。【００１２】
本明細書中、「配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質」としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。【００１３】
また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。【００１４】
ここで、「一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性」とは、下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖を付加する活性を意味する。
【化６】
2016060276.tif 000007
【００１５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ及びＲ１はそれぞれ独立にＨ、単糖又は二糖を表す。ここで、単糖は特に限定されないが、【００１６】
本明細書において、「単糖」は、特に限定されないが、例えば、ペントース又はヘキソースであってもよい。
ペントースの例としてはリボース、アラビノース、キシロース及びリキソースが挙げられ、ヘキソースの例としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースが挙げられる。
好ましくは「単糖」は、ヘキソースであり、さらに好ましくはグルコース単量体（−Ｇｌｃ）である。
本明細書において、「二糖」は、上記単糖が２分子結合することにより形成されるものであれば限定されず、２分子の単糖の組み合わせは如何なるものであってもよい。
好ましくは、二糖を構成する単糖は、両者ともにヘキソースであり、より好ましくは、グルコース２量体（−Ｇｌｃ−Ｇｌｃ）である。グルコース２量体の二糖において、好ましくは、グルコース同士はβ２、１グリコシド結合により結合している。【００１７】
好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物は、モグロール又はモグロール配糖体である。【００１８】
本発明のタンパク質により一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に付加される糖分子は、特に限定されないが、１以上のペントース、ヘキソース又はその組み合わせからなる糖分子であってもよい。ペントース及びヘキソースの例は上述の通りである。好ましくは前記糖分子は、ヘキソースであり、更に好ましくは、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースである。最も好ましくは、前記糖分子は、グルコースである。【００１９】
一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性は、被検タンパク質１〜５００ｎｇ（好ましくは、５０〜２００ｎｇ、最も好ましくは１００ｎｇ）、ＵＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ−グルコース）０．１〜５ｍＭ（好ましくは、１〜３ｍＭ、最も好ましくは２ｍＭ）、及び基質化合物（一般式（Ｉ）の化合物）０．１〜３ｍＭ（好ましくは、０．１〜１ｍＭ、最も好ましくは０．２ｍＭ）  を含むｐＨ６．０〜８．０の中性領域の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムバッファー又はリン酸カリウムバッファー）中において、２０〜４０℃の温度で１０分間〜５時間（好ましくは１〜３時間、例えば３時間）インキュベートした後に、前記基質化合物を精製し、精製したモグロール又はモグロール配糖体をＬＣ−ＭＳ分析（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）等の公知の手法により分析することで検証することができる。
ＬＣ−ＭＳ分析の結果、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子が付加した化合物が検出された場合、前記被検タンパク質は一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するものといえる。【００２０】
前記糖付加反応は、一般に、１分〜１２時間程度で終了する。【００２１】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。【００２２】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。【００２３】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。【００２４】
２．モグロール配糖体の製造方法
本発明はタンパク質が有する、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を利用することにより、モグロール配糖体を容易かつ多量に製造することが可能である。
そこで、別の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質と、ＵＤＰ−糖と、下記一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させて、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する工程を含む、モグロール配糖体の第１の製造方法を提供する。
【化７】
2016060276.tif 000008
【００２５】
一般式（Ｉ）のＲ及びＲ１の定義は前述の通りである。好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物は、モグロール又はモグロール配糖体である。【００２６】
本明細書において、「ＵＤＰ−糖」とは、ウリジン二リン酸（Ｕｒｉｄｉｎｅ  ＤｉＰｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＤＰ）結合型の糖である。ＵＤＰ−糖における糖部分の好ましい例としては１以上のペントース、ヘキソース又はその組み合わせからなる糖が挙げられる。ペントース及びヘキソースの例は上述の通りである。好ましくはＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−ヘキソースであり、更に好ましくは、グルコース、マンノース及びガラクトースからなる群より選択されるヘキソースである。最も好ましくは、前記ＵＤＰ−糖は、ＵＤＰ−グルコースである。【００２７】
本発明に係るモグロール配糖体の第１の製造方法は、本発明のタンパク質と、ＵＤＰ糖と、一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させて、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する工程を含む。本発明の第１の製造方法は、さらに、前記工程で生成したモグロール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。【００２８】
第１の製造方法により生成されるモグロール配糖体の例としては、モグロシドＩＡ、モグロシドＩｂ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシドＶ、モグロールペンタグルコシド、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００２９】
生成したモグロール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ（Ｈｉｇｈ）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。【００３０】
３．モグロール配糖体高含有非ヒト形質転換体
モグロール配糖体は、本発明のタンパク質を用いて細菌（大腸菌又は酵母など）、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などの細胞内で生成することもできる。本発明のタンパク質は、ラカンカに由来する酵素又はその変異体であるため、細胞内環境においても高い活性を有することが期待されるからである。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質と、前記細胞内に存在するＵＤＰ−糖及び一般式（Ｉ）で示される化合物とを反応させることによりモグロール配糖体を生成することができる。
【化８】
2016060276.tif 000009
【００３１】
そこで、本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に糖分子を付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００３２】
一般式（Ｉ）の定義及び具体例は既に述べた通りであり、また、一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基に付加される糖分子の定義及び具体例も前述の通りである。【００３３】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。【００３４】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″及び″Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７″などに記載されている方法を利用することができる。【００３５】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６２℃、又は（４）０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００３６】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部と相補的な配列に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。【００３７】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１のＤＮＡ、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。【００３８】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ｂｌａｓｔｐを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。【００３９】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。【００４１】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。【００４２】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。【００４３】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。【００４４】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。【００４５】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。【００４６】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。【００４７】
本発明の形質転換体は、モグロール配糖体を高い含有量で含むことが期待される。形質転換に用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。
一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することのできるものに限定されず、好ましくは、宿主細胞は、一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することのできる宿主細胞である。ここで、宿主細胞は、天然状態例えば、一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することができるように公知の遺伝子で組換操作されたものであってもよい。
一般式（Ｉ）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子としては、ｃｕｃｕｒｂｉｔａｄｉｅｎｏｌ  ｓｙｎｔａｓｅ（Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．／Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６０（２００４）６９９５−７００３）に記載のモグロールやモグロシド合成系の遺伝子等が公知のものとして挙げられるがこれらに限定されるものではない。【００４８】
宿主細胞が一般式（Ｉ）に示される化合物を生成することができないものである場合、同宿主細胞に本発明の遺伝子を導入して得られた形質転換体の培養系に基質として一般式（Ｉ）の化合物又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、一般式（Ｉ）に示される化合物の合成に寄与する酵素をコードする遺伝子を導入せずともモグロール配糖体を製造することが可能である。【００４９】
上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又はヒトを除く動物が挙げられる。【００５０】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。【００５１】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、″Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１″、″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）″等を参照することができる。【００５２】
このようにして得られた形質転換体を培養することにより、形質転換体内にモグロール配糖体を蓄積させることが可能である。前述の通り、形質転換体の培養系に基質として一般式（Ｉ）の化合物又は同化合物を含む植物抽出物を添加することにより、モグロール配糖体の製造を促進することもできる。蓄積されたモグロール配糖体を抽出・精製することにより、目的のモグロール配糖体を得ることができる。
従って、本発明は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするモグロール配糖体の第２の製造方法を提供する。適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、モグロール配糖体の抽出・精製方法については既に述べた通りである。【００５３】
モグロール配糖体は、特に限定されないが、好ましくはモグロシドＩＡ、モグロシドＩｂ、モグロシドＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、シアメノシドＩ、１１−オキソモグロシドＶ、モグロールペンタグルコシド、又はこれらの組み合わせからなる群より選択されるものであってもよい。【００５４】
本発明の１つの態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。【００５５】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。【００５６】
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。【００５７】
外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、ｍｏｕｓｅｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。【００５８】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。【００５９】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１又はｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。【００６０】
また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が知られている。パーティクルガンを用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。【００６１】
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで常法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。【００６２】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。【００６３】
本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。【００６４】
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。【００６５】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー、テンチャ等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー、ステビア等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（キュウリ、ニガウリ、カボチャ、ヘチマ、ラカンカ、ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）及びアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）、シソ科（サルビア、シソ、ラベンダー、タツナミソウ等）、アサ科植物（ホップ等）が挙げられる。形質転換対象の植物として特に好ましい例としては、モグロール又はモグロール配糖体を糖受容体として種々の配糖体を生合成することが知られている植物を使用することが望ましく、このような植物としては、ラカンカやテンチャ（Ｒｕｂｕｓ  ｓｕａｕｉｓｓｉｍｕｓ）等を挙げることができる。【００６６】
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物体（以下、「本発明の植物」又は「本発明の植物体」）は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてモグロール配糖体を多く生産することができる。【００６７】
本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。【００６８】
よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。【００６９】
４．  形質転換体の抽出物及びその利用
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体の抽出物を提供する。本発明の形質転換体は、適切な基質を有する場合、もしくは、適切な基質を外部から添加した場合、その野生型と比べてモグロール配糖体の含有量が高いので、その抽出物には、モグロール配糖体が高濃度で含まれると考えられる。【００７０】
本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。さらに、上記で述べたモグロール配糖体の抽出方法により、さらなる抽出工程を施してもよい。【００７１】
本発明の形質転換体の抽出物は、常法に従って、例えば、食品、医薬品、工業原料の製造等の用途に使用することができる。【００７２】
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料（食品等の原料）を提供する。本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料の調製は、常法による。このように、本発明の形質転換体の抽出物を含む食品、医薬、工業原料等は、本発明の形質転換体を用いて生成されたモグロール配糖体を含有する。【００７３】
本発明の医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、パウダー、歯磨、エアロゾル、クレンジングフォーム等の皮膚外用薬の他、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤等に用いることができる。【００７４】
本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。【００７５】
本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。
本発明の食品は、甘味料としてカロリーレスのモグロール配糖体を使用している。このため、本発明の食品は低カロリーであり、健康増進又は健康維持に寄与するというメリットを有する。【００７６】
これらの食品の形態の例としては、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類（ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等又は調味料であってもよい。【００７７】
５．モグロール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法
本発明は、モグロール配糖体含有量の高い植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）被検植物からｍＲＮＡを抽出する工程
（２）前記ｍＲＮＡ又は前記ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程【００７８】
上記工程（１）は、被検植物から、ｍＲＮＡを抽出することにより行うことができる。ｍＲＮＡを抽出する被検植物の部位は、特に限定されないが、好ましくは、花弁である。ｍＲＮＡを抽出した場合には、逆転写することにより、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製してもよい。【００７９】
工程（２）は、上記で抽出したｍＲＮＡに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることにより行うことができる。高ストリンジェントな条件は、既に述べたとおりである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５〜５００ｂｐ、より好ましくは、１０〜２００ｂｐ、さらに好ましくは、１０〜１００ｂｐの長さである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託することもできる。【００８０】
工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして用いた場合には、工程（３）は、通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、又はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）（Ｓｉｅｂｅｎ  Ｖ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７−０６）．ＩＥＴ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２７−３５）等のハイブリダイゼーション検出方法により行うことができる。一方、工程（２）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして用いた場合には、工程（３）は、ＰＣＲ増幅反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動又はシークエンシング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等によって解析することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。【００８１】
ハイブリダイゼーションがより多く検出された植物体は、他の植物体と比べて下記一般式（Ｉ）で示される化合物の２４位のＲ１基にに糖分子を付加する活性を有するタンパク質をより多く発現しているといえるので、モグロール配糖体含有量が高いことが予測される。
【化９】
2016060276.tif 000010
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。【００８３】
［実施例１］モグロール配糖体化酵素の候補遺伝子の単離
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法に従った。
次世代シークエンサー（ＮＧＳ）を使ったラカンカの果実におけるトランスクリプトーム解析（ＲＮＡ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が公開されており（Ｔａｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ（２０１１）ＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：３４３）、その配列情報に対して、ｂｌａｓｔｎによる同一性解析により公知の糖転移酵素と同一性の高い配列を選択した。【００８４】
［実施例２］候補遺伝子の機能解析
得られた候補遺伝子の一つ、ＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３の配列情報（配列番号１）に基づきＳｇＵＧＴ７４Ｇ１＿９４３遺伝子をサーモフィッシャー社で人工合成した。得られた合成遺伝子断片を大腸菌発ベクターであるｐＥＴ１５ｂ（ノバジェン社）ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに組み込みＮ末にＨｉｓＴａｇが融合するようにデザインした。常法にしたがって大腸菌（ＢＬ２１＿ＤＥ３）に形質転換し、ミリポア社のオーバーナイトエクスプレスＴＭオートインダクションシステムを使って業者が提供するプロトコールにしたがって組換えタンパク質を発現させた。組換えタンパク質の発現は、ＣＢＢ染色およびマウスの抗ＨｉＳＴａｇ抗体を用いたウエスタンブロット解析により推定される５０ｋＤａ付近のバンドとして確認できた（図２）。図２はクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ：左図）及びウエスタンブロッティング解析（ＷＢ：右図）による組換えタンパク質の発現解析結果を示すものであり、図中、Ｍはサイズマーカー、ＮＣはネガティブコントロール（ｐＥＴ１５ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３株））、Ｓはサンプル（ＳｇＵＧＴ７４Ｇ−９４３／ｐＥｔ１５ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３株））を表す。【００８５】
常法に従って組換えタンパク質のＨｉｓＴａｇを使って精製し、ラカンカ抽出物を加水分解して調製したモグロール（Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（１９８３）ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １０３（１１），１１６７−１１７３）に対するグルコース転移活性を評価した。酵素反応組成は、糖受容体のモグロール０．２ｍＭ、糖供与体のＵＤＰ−Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２ｍＭ，リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）５０ｍＭで、酵素溶液を加え、３０℃で３時間反応させ、その生成物をＬＣ−ＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所）を用いて分析を行った。
その結果、ＳｇＵＧＴ７４Ｇ＿９４３酵素の反応液中にモグロール以外に新たな生成物が認められた（図３）。図３ＡはＳｇＵＧＴ７４Ｇ＿９４３とモグロールとの反応液のＬＣ−ＭＳ分析チャートであり、赤線はｍ／ｚ＝６６１はモグロールにグルコースが一分子付加したＮａアダクトイオン、桃線はｍ／ｚ＝４９９はモグロールのＮａアダクトイオン、青線はｍ／ｚ＝４７７はモグロールのプロトン付加体、黒線はＴＩＣ（ポジティブイオンのトータルイオンクロマト）を表す。【００８６】
一方、ベクターコントロールの反応液中には生成物は基質であるモグロール以外にピークは見られなかった（図３Ｂ）。図３Ｂの空ベクターを発現したネガティブコントロールの反応液のＬＣ−ＭＳ分析チャートでは、モグロールに由来するイオンのピークしか認められない。本生成物の質量および保持時間からＳｇＵＧＴ７４＿９４３によってグルコース１分子が付加したモグロールモノグルコシドであると結論付けた。過去の文献（Ｕｋｉｙａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．５０，６７１０−６７１５．及びＴａｋｅｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（１９８３）ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １０３（１１），１１６７−１１７３）の核磁気共鳴（ＮＭＲ）と比較して糖結合部位はモグロールの２４位であることが分かった。【００８７】
［実施例３］既知酵素との活性比較
これまでにステビア由来のステビオール配糖体化酵素がモグロールを配糖体化できることが知られている（ＷＯ  ２０１３／０７６５７７）。次にラカンカ由来のＳｇＵＧＴ７４Ｇ−９４３によるモグロール配糖体化活性とステビアのＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７３Ｅ１の同活性を比較した。【００８８】
上記の方法と同様にステビア由来のＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７３Ｅ１を発現させた。上記の酵素条件化で生成物量を測定し、発現タンパク質量で割った相対活性を求めた。その結果、ＳｇＵＧＴ７４Ｇ−９４３の活性を１とした時の相対活性はステビア由来のＵＧＴ８５Ｃ２とＵＧＴ７３Ｅ１はそれぞれ０．３５と０．２２であった。ラカンカ由来のＳｇＵＧＴ７４Ｇ−９４３は、ステビア由来のＵＧＴ８５Ｃ２及びＵＧＴ７３Ｅ１と比べて３倍近く配糖体化活性が高いことが確認された（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
ラカンカからモグロールの２４位をグルコシル化する酵素遺伝子を見いだした。本遺伝子を指標にモグロール配糖体含量を高めるような育種利用のみならず、栽培時およびポストハーベスト時にモグロール配糖体含量を高める環境条件の検討にも利用できる。さらに有用物質生産における酵素剤などのツールとして利用することができる。
［配列表］
2016060276.tif 000011
2016060276.tif 000012
2016060276.tif 000013
2016060276.tif 000014
2016060276.tif 000015
2016060276.tif 000016
2016060276.tif 000017
【図１】
2016060276.tif 000019
【図２】
2016060276.tif 000020
【図３】
2016060276.tif 000021
【図４】
2016060276.tif 000022
【国際調査報告】
2016060276.tif 000023
2016060276.tif 000024
2016060276.tif 000025
2016060276.tif 000026
2016060276.tif 000027