(57)【要約】  化合物は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）2015029473.tif 000023で表される。医薬品は、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）2015029473.tif 000024で表される化合物を有効成分とする。
2015029473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化１】
2015029473.tif 000016
で表される化合物。
【請求項２】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化２】
2015029473.tif 000017
で表される化合物を有効成分とする医薬品。
【請求項３】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化３】
2015029473.tif 000018
で表される化合物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項４】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化４】
2015029473.tif 000019
で表される化合物を含有する化粧品。
【請求項５】
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化５】
2015029473.tif 000020
で表される化合物を含有する飲食品。
【請求項６】
シソ科植物を抽出処理することで得られる、
ことを特徴とする下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化６】
2015029473.tif 000021
で表される化合物。
【請求項７】
シソ科植物を抽出処理する工程を含む、
ことを特徴とする下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化７】
2015029473.tif 000022
で表される化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、医薬品、抗炎症剤、化粧品、飲食品及び化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、花粉症等のアレルギー性疾患の患者が増加している。その治療方法としては対症療法に頼るところが大きく、アレルギーによる炎症を抑えることを目的として、一般的に、抗炎症薬等が使用される。【０００３】
シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  Ｂｒｉｔｔｏｎ）は、シソ科に属する一年草で、中国南部が原産とされ、東洋の温帯地方に広く栽培されている。東洋では、古くから民間療法に用いられており、漢方薬としても処方されている。日本でも、平安時代頃から香味料として食用に供されている。【０００４】
シソ科植物又はシソ科植物由来の成分が、アレルギーや炎症を抑える作用を有することが報告されている。【０００５】
特許文献１には、油脂とシソ葉抽出物とを有効成分として含有する抗アレルギー食品が開示されている。また、特許文献２には、シソ科植物の茎葉の抽出物を配合した抗アレルギー化粧料組成物が開示されている。また、特許文献３には、高度不飽和脂肪酸とシソ葉エキスとを有効成分として含有する炎症性腸疾患用食品が開示されている。また、特許文献４には、ＴＮＦ産生抑制作用を有する、アレルギー改善に有効なシソ抽出液が開示されている。また、非特許文献１には、シソの葉を抽出して得られたロスマリン酸、ルテオリン、アピゲニンがシソ葉エキスの抗炎症作用に寄与していることが記載されている。また、非特許文献２及び非特許文献３には、アオジソの抽出エキス由来のロスマリン酸メチル及びネグレティン（Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ）がＮＯ産生抑制作用を有することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−６２７９５号公報
【特許文献２】特開平６−２９３６５２号公報
【特許文献３】特開平９−２０１号公報
【特許文献４】特開平７−２１５８８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】三浦  健人、北舘  健太郎；ＡＲＯＭＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  Ｎｏ．４２（Ｖｏｌ．１１／Ｎｏ．２  ２０１０）ｐ２８−３１
【非特許文献２】池谷  幸信ら、アオジソには一酸化窒素誘導を抑制する成分が多く含まれる；第２０回統合医療機能性食品国際会議（ＩＣＮＩＭ２０１２）（２０１２年７月開催）要旨集
【非特許文献３】芳中  奈生ら、アオジソ中のＮＯ産生抑制活性成分に関する研究；日本生薬学会第５９回年会（２０１２年９月開催）要旨集
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
シソ科植物中の、より強力な抗炎症作用を有する新規成分の同定が、待たれている状況にあった。【０００９】
本発明者らは、シソ科植物中の新規の化合物が抗炎症作用を有することを見出し、本発明を完成した。本発明は、優れた抗炎症作用を有する化合物、医薬品、抗炎症剤、化粧品及び飲食品、並びに該化合物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る化合物は、
下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）
【化１】
2015029473.tif 000003
で表される。【００１１】
本発明の第２の観点に係る医薬品は、
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化２】
2015029473.tif 000004
で表される化合物を有効成分とする。【００１２】
本発明の第３の観点に係る抗炎症剤は、
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化３】
2015029473.tif 000005
で表される化合物を有効成分とする。【００１３】
本発明の第４の観点に係る化粧品は、
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化４】
2015029473.tif 000006
で表される化合物を含有する。【００１４】
本発明の第５の観点に係る飲食品は、
下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化５】
2015029473.tif 000007
で表される化合物を含有する。【００１５】
本発明の第６の観点に係る下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化６】
2015029473.tif 000008
で表される化合物は、シソ科植物を抽出処理することで得られる。【００１６】
本発明の第７の観点に係る下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）
【化７】
2015029473.tif 000009
で表される化合物の製造方法は、
シソ科植物を抽出処理する工程を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、優れた抗炎症作用を有する化合物、医薬品、抗炎症剤、化粧品及び飲食品、並びに該化合物の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＮＯ産生量測定の結果を示す図である。
【図２】ＩＣ５０値測定の結果を示す図である。
【図３】ＬＤＨ活性の測定結果を示す図である。
【図４】サイトカイン／ケモカインアレイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の結果を示す図である。
【図５】ＮＯ産生量測定の結果を示す図である。
【図６】ＩＣ５０値測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
本明細書における構造式において、立体構造などが特に示されていない場合、本明細書における構造式で表される化合物には、互変異性体、幾何異性体、光学異性体等の各種の立体異性体、及びそれらの混合物（ラセミ体を含む）が含まれる。
【００２１】
まず、本発明による化合物について説明する。
【００２２】
本発明による新規化合物は、フラボノイド化合物であり、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される。
【００２３】
【化８】
2015029473.tif 000010
【００２４】
式（Ｉ）で表される化合物は、８−ｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅであり、新規のフラボノイド化合物である。本明細書において、式（Ｉ）で表される化合物をＰａ５と称する場合がある。
【００２５】
式（ＩＩ）で表される化合物は、５，８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅであり、新規のフラボノイド化合物である。本明細書において、式（ＩＩ）で表される化合物をＰａ５’と称する場合がある。
【００２６】
Ｐａ５及びＰａ５’は、実施例にて後述するように、優れた抗炎症作用を有する。したがって、後述するように、抗炎症剤として、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、花粉症、リウマチ、炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に用いることができるほか、化粧品及び飲食品としても用いることができる。
【００２７】
次に、本発明による、シソ科植物を抽出処理することで得られる化合物について説明する。
【００２８】
本発明による、シソ科植物を抽出処理することで得られる化合物は、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される。
【００２９】
【化９】
2015029473.tif 000011
【００３０】
シソ科植物の抽出処理の詳細については、後述する。
【００３１】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物（Ｐａ５及びＰａ５’）は、前述の通りである。本発明者らは、シソ科植物を抽出処理することで、Ｐａ５及びＰａ５’を得ることができることを初めて見出した。
【００３２】
式（ＩＩＩ）で表される化合物は、Ｅｓｃｕｌｅｔｉｎであり、本発明者らは、Ｅｓｃｕｌｅｔｉｎがシソ科植物を抽出処理することで得られること及び抗炎症作用を有することを初めて見出した。本明細書において、式（ＩＩＩ）で表される化合物をＰａ９と称する場合がある。
【００３３】
Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９は、シソ科植物中に、グルコシドやグルクロニドといった配糖体として存在していると考えられる。Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９の配糖体を経口摂取した場合、酵素（β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ等）によって糖成分が切断され、Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９がアグリコンの状態で血中に入り、体内にて作用を奏するものと考えられる。
【００３４】
Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９は、実施例にて後述するように、優れた抗炎症作用を有する。したがって、後述するように、抗炎症剤として、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、花粉症、リウマチ、炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に用いることができるほか、化粧品及び飲食品としても用いることができる。
【００３５】
次に、本発明による化合物Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９の製造方法について説明する。
【００３６】
本発明による化合物Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９の製造方法は、シソ科植物を抽出処理する工程を含む、ことを特徴とする。
【００３７】
用いられるシソ科植物は、学名ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｌｕｔｅｓｃ−ｅｎｓ  Ｂｒｉｔｔｏｎ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ及びｖａｒ．ａｃｔａ  Ｋｕｄｏ）であり、その近縁植物（Ｌａｂｉａｔａｅ）でもよい。例えば、日本で栽培されるアオジソ、アオチリメンジソ、アカジソ、チリメンジソ、かためんジソ等を好適に用いることができる。本発明の効果を奏するシソ科植物であれば、適宜選択され得る。なお、シソ科植物の使用部位は特に限定されず、全草、葉、葉柄、花、果実、枝根、種子等が利用可能である。これをそのまま又は乾燥して用いてもよいし、粉砕し、さらに抽出物として用いてもよい。
【００３８】
抽出処理とは、シソ科植物を原料として、溶媒による抽出、濃縮、分画、精製等の一般的な化学分離精製手段を施すことをいう。
【００３９】
抽出方法としては、例えば、植物の一部又は全体の粉砕物を、通常３〜１２１℃で、水又は有機溶媒により抽出する方法が挙げられる。ここで、抽出に用いられる有機溶媒は、特に限定されないが、例えば、石油エーテル、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼン等の炭化水素類、四塩化炭素、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、エーテル類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類、ピリジン等が挙げられる。抽出溶媒は単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。好ましくは、含水エタノール、含水メタノールなどの含水アルコールが使用される。人体への安全性の観点から、より好ましい方法としては、シソ科植物の乾燥粉砕物を、１０〜２０倍量の水又は１０〜２０倍量の６０％エタノールを用いて、室温〜１２１℃で、２〜２４時間攪拌抽出する方法が挙げられ、さらにより好ましい方法として、熱水抽出（例えば、３０分間〜１０時間の加熱還流抽出）が挙げられる。また、得られた抽出物は、そのまま用いてもよいが、さらに必要により、濃縮、濾過、凍結乾燥等の処理をしたものを用いてもよい。また、抽出物やシソ科植物は、単独でも２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の効果を奏する抽出方法であれば、適宜選択され得る。
【００４０】
Ｐａ５及びＰａ５’を得るための分画方法を以下に例示する。シソ科植物の溶媒抽出液を減圧濃縮し、得られた残留物を水に懸濁して酢酸エチルを用いた分配抽出を行い、酢酸エチル抽出液を減圧濃縮する。得られた酢酸エチル可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出する。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分を、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出する。クロロホルム：メタノール＝９８：２の混合溶媒で溶出した画分を、分取薄層クロマトグラフィーに付し、クロロホルム：メタノール＝２４：１の混合溶媒で展開する。ここで、Ｒｆ＝０．８２の部分をとり、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出する。得られた抽出液を減圧濃縮し、分取薄層クロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１の混合溶媒で展開する。ここで、Ｐａ５を得るにはＲｆ＝０．４４の部分を、Ｐａ５’を得るにはＲｆ＝０．７０の部分を取り、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出する。本発明の効果を奏するＰａ５及びＰａ５’の分画方法であれば、適宜選択され得る。
【００４１】
Ｐａ９を得るための分画方法を以下に例示する。シソ科植物の溶媒抽出液を減圧濃縮し、得られた残留物を水に懸濁して酢酸エチルを用いた分配抽出を行い、酢酸エチル抽出液を減圧濃縮する。得られた酢酸エチル可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出する。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分を、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出する。クロロホルム：メタノール＝９６：４の混合溶媒で溶出した画分をオクタデシルシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに付し、水とメタノールの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出する。水：メタノール＝７０：３０の混合溶媒で溶出した画分を分取薄層クロマトグラフィーに付し、クロロホルム：メタノール＝１０：１の混合溶媒で展開する。Ｒｆ＝０．７０の部分を取り、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出する。本発明の効果を奏するＰａ９の分画方法であれば、適宜選択され得る。
【００４２】
次に、本発明による医薬品について説明する。
【００４３】
本発明による医薬品は、本発明による化合物Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を有効成分として含有する。
【００４４】
本発明による医薬品は、Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を、それ自体又は１種以上の薬学的に許容し得る賦形剤又は担体と組み合せた形で用いられる。また、本発明による医薬品には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。また、本発明による医薬品には、他の活性成分を適宜含有させることもできる。
【００４５】
本発明による医薬品の剤型としては、疾病の種類や程度等にも依存するが、例えば、経口、非経口又は鼻内投与に適したもの、錠剤又は糖衣錠、舌下錠、ゼラチンカプセル剤、トローチ剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、皮膚用ゲル剤等を挙げることができる。
【００４６】
本発明による医薬品の投与量は、患者の年齢及び体重、疾病の種類及び重篤度並びに投与の経路により変化するが、例えば、成人に経口投与する場合、Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９として１回０．１〜５００ｍｇを１日１〜３回投与する。
【００４７】
次に、本発明による抗炎症剤について説明する。
【００４８】
本発明による抗炎症剤は、本発明による化合物Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を有効成分として含有する。
【００４９】
Ｐａ５、Ｐａ５’及びＰａ９は、実施例にて後述するように、優れた抗炎症作用を有する。したがって、抗炎症剤として、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、花粉症、リウマチ、炎症性腸疾患等の炎症性疾患の治療に用いることができる。
【００５０】
本発明による抗炎症剤の剤型、投与量等については、前述の通りである。
【００５１】
次に、本発明による化粧品及び飲食品について説明する。
【００５２】
本発明による化粧品及び飲食品は、本発明による化合物Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を含有する。
【００５３】
本発明による化粧品には、アトピー性皮膚炎や接触性皮膚炎の症状の緩和や予防の目的で、スキンケア製品、ファンデーションやメイクアップ製品等に、Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９のほか、前述のシソ科植物の乾燥粉末や抽出物を添加することができる。
【００５４】
本発明による飲食品は、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、花粉症等の症状の緩和や予防の目的で用いられ、その食品としての機能を十分に生かすべく、一般食品、サプリメント、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品等にＰａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を配合することができる。Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９を添加するだけでなく、前述のシソ科植物の乾燥粉末や抽出物を用いることができる。各種食品にこれらを添加することが可能である。飲料としては、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品としての飲料やその他の栄養飲料、健康飲料、各種の健康茶等が挙げられる。他の食品としては、菓子類、パン、めん類、練り製品、油脂、調味料等が挙げられる。
【００５５】
本発明による化粧品及び飲食品について、Ｐａ５、Ｐａ５’又はＰａ９の配合量は特に限定されないが、一般的に乾燥固形分に換算して０．００１〜１００重量％、特に０．０１〜５０重量％とするのが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５７】
（実施例１）
シソの葉から８−ｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５）を抽出し、精製した。【００５８】
（メタノールによる抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉４．４０ｋｇを用いて、メタノール４４．３Ｌによる還流抽出（１時間）を２回行った。２回の還流抽出により得られたメタノール抽出液を減圧濃縮し、メタノール抽出エキス７７２ｇを得た（１７．５％）。メタノール抽出エキス７７２ｇを水３．９Ｌに懸濁し、酢酸エチル３．９Ｌを用いた分配抽出を３回行った。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部２５４．７ｇを得た。【００５９】
得られた酢酸エチル可溶部８７．７ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７．５ｃｍ  ｉ．ｄ．×４９ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分４．２４ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９８：２の混合溶媒で溶出した画分３８３．２ｍｇを、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝２４：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．８２の部分をとり、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮して、淡褐色残留物１９５．７ｍｇを得た。これを再度、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．４４の部分をクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた白色粉末をクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で結晶化し、無色プリズム晶８２．３ｍｇを得た。【００６０】
前述の通り得られた無色プリズム晶の分析データを以下に示す。
ｍｐ  １６６−１６８°Ｃ
［α］２３Ｄ０（ｃ１．０３，ＭｅＯＨ）
ＩＲ  ν（ＫＢｒ）ｃｍ−１：３２９０（ＯＨ），１６７２（Ｃ＝Ｏ），１６０５（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｒｉｎｇ）
ＵＶ  λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ε）：２０１（２７０７４），２４４（１１２５３），２８８（１３４８９），３４９（５０８５）
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：３０１［Ｍ＋Ｈ］＋，１９７
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０１．１０６８［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ１７Ｏ５：３０１．１０７６．
ＣＤ（ｃ＝０．００１１４，ＭｅＯＨ）Δε（ｎｍ）：０（２２０−４００）
１Ｈ−ＮＭＲ  δ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３：２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，２．８Ｈｚ），３．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，１２．８Ｈｚ），３．９２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），４．０２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），５．０３（１Ｈ，ｓ，ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄ２Ｏ），５．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．８，２．８Ｈｚ），６．１９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５），７．４１−７．４９（５Ｈ，ｍ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ  δ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３：４５．８（Ｃ−３），５６．２（ＯＣＨ３），５６．３（ＯＣＨ３），８０．０（Ｃ−２），８９．６（Ｃ−５），１０５．７（Ｃ−４ａ），１２６．３（Ｃ−２’，Ｃ−５’），１２７．６（Ｃ−８ａ），１２８．８５（Ｃ−３’，Ｃ−５’），１２８．８９（Ｃ−４’），１３８．３（Ｃ−１’），１４９．４（Ｃ−８），１５２．５（Ｃ−７），１５５．０（Ｃ−６），１８９．４（Ｃ−４）．【００６１】
以上より、前述の通り得られた無色プリズム晶には、８−ｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５）が含まれていることがわかった。【００６２】
【化１０】
2015029473.tif 000012
【００６３】
（熱水による抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉０．６ｋｇを水１Ｌで加熱還流抽出（１時間）した。冷却後、抽出液をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）でろ過した。このようにして得られた熱水抽出液９．５Ｌを、酢酸エチル９．５Ｌを用いて、分配抽出を３回行った。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部８．７８ｇを得た。【００６４】
得られた酢酸エチル可溶部８．７８ｇ、をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分０．４２５ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９８：２の混合溶媒で溶出した画分３９．１ｍｇを、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝２４：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．８２の部分をとり、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮し、淡褐色残留物２０．５ｍｇを得た。これを再度、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．４４の部分をクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた白色粉末をクロロホルム及びメタノールの混合溶媒で結晶化し、無色プリズム晶９．１ｍｇを得た。分析の結果、この無色プリズム晶には、前述同様、８−ｈｙｄｒｏｘｙ−６，７−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５）が含まれていることがわかった。【００６５】
（実施例２）
シソの葉から５，８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５’）を抽出し、精製した。【００６６】
（メタノールによる抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉４．４０ｋｇを用いて、メタノール４４．３Ｌによる還流抽出（１時間）を２回行った。２回の還流抽出により得られたメタノール抽出液を減圧濃縮し、メタノール抽出エキス７７２ｇを得た（１７．５％）。メタノール抽出エキス７７２ｇを水３．９Ｌに懸濁し、酢酸エチル３．９Ｌを用いた分配抽出を３回行った。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部２５４．７ｇを得た。【００６７】
得られた酢酸エチル可溶部８７．７ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（７．５ｃｍ  ｉ．ｄ．×４９ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分４．２４ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９８：２の混合溶媒で溶出した画分３８３．２ｍｇを、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝２４：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．８２の部分をとり、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮し、淡褐色残留物１９５．７ｍｇを得た。これを再度、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．７０の部分をクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた黄色粉末をメタノールから結晶化させ、結晶粉末１４．４ｍｇを得た（収率０．０００９５％）。【００６８】
前述の通り得られた結晶粉末の分析データを以下に示す。
Ｙｅｌｌｏｗ  ｎｅｅｄｌｅｓ  （ｆｒｏｍ  ＭｅＯＨ）．ｍｐ  ２２０−２２５℃．
ＵＶ  λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇε）：２４６（３．９７），２９２（４．１６），３６４（３．６２）ｎｍ．
［α］２３Ｄ０（ｃ０．２５３，ＭｅＯＨ）ＣＤ（ｃ＝０．００１７２，ＭｅＯＨ）Δε（ｎｍ）：０（２２０−４００）
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ：ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ．）：ｍ／ｚ（％）：２８７．３０（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００），２８８．３０（１７），２８９．３１（３）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．９，３．２Ｈｚ），ａｎｄ  ３．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．９，１２．４Ｈｚ）（Ｈ−３），３．７７（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），５．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，３．２Ｈｚ，Ｈ−２），６．１５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），７．３５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，−５’），７．３６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’），７．４８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，−６’），８．１５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），１１．７４（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ４２．７（Ｃ−３）．５６．４（ＯＣＨ３），７８．６（Ｃ−２），９２．８（Ｃ−６），１０２．６（Ｃ−４），１２６．９（Ｃ−２’，６’），１２８．６６（Ｃ−３’，−５’，１２８．７２（Ｃ−４’），１３９．１（Ｃ−１’），１４８．３（Ｃ−８ａ），１５６．０（Ｃ−５），１５７．５（Ｃ−８），１９７．２（Ｃ−４）．【００６９】
以上より、前述の通り得られた結晶粉末には、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５’）が含まれていることがわかった。【００７０】
【化１１】
2015029473.tif 000013
【００７１】
（熱水による抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉０．６ｋｇを水１Ｌで加熱還流抽出（１時間）した。冷却後、抽出液をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）でろ過した。このようにして得られた熱水抽出液９．５Ｌを、酢酸エチル９．５Ｌを用いて、分配抽出を３回行った。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部８．７８ｇを得た。【００７２】
得られた酢酸エチル可溶部８．７８ｇを、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分０．４２５ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９８：２の混合溶媒で溶出した画分３９．１ｍｇを、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝２４：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．８２の部分をとり、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮し、淡褐色残留物２０．５ｍｇを得た。これを再度、分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、ｎ−ヘキサン：アセトン＝１：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．７０の部分をクロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた黄色粉末をメタノールから結晶化させ、結晶粉末２．０ｍｇを得た。分析の結果、この結晶粉末には、前述同様、８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ（Ｐａ５’）が含まれていることがわかった。【００７３】
（実施例３）
シソの葉からＥｓｃｕｌｅｔｉｎ（Ｐａ９）を抽出し、精製した。【００７４】
（メタノールによる抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉４．４０ｋｇを用いて、メタノール４４．３Ｌによる還流抽出（１時間）を２回行った。２回の還流抽出により得られたメタノール抽出液を減圧濃縮し、メタノール抽出エキス７７２ｇを得た（１７．５％）。メタノール抽出エキス７７２ｇを水３．９Ｌに懸濁し、酢酸エチル３．９Ｌを用いた分配抽出を３回行った。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部２５４．７ｇを得た。【００７５】
得られた酢酸エチル可溶部８７．７ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７．５ｃｍ  ｉ．ｄ．×４９ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分４．２４ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９６：４の混合溶媒で溶出した画分１１６７ｍｇをオクタデシルシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに付し、水とメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。水：メタノール＝７０：３０の混合溶媒で溶出した画分８２ｍｇを分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝１０：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．７０の部分を取り、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた残留物をメタノールで結晶化し、淡褐色針状晶９．７ｍｇを得た。【００７６】
前述の通り得られた淡褐色針状晶の分析データを以下に示す。
ｍｐ  ２５５−２５８°Ｃ
ＵＶ  λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇ  ε）：２２８（４．００），２５９（３．６１），２９９（３．６５），３４７（３．８１）
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ（％）：１７７．２４（［Ｍ−Ｈ］−，１００），１７８．２４（１５）．
１Ｈ−ＮＭＲ  δ  ｉｎ  ＭｅＯＨ−ｄ４：６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），６．７５（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｓ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）．【００７７】
以上より、前述の通り得られた淡褐色針状晶には、Ｅｓｃｕｌｅｔｉｎ（Ｐａ９）が含まれていることがわかった。【００７８】
【化１２】
2015029473.tif 000014
【００７９】
（熱水による抽出）
アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ）の葉０．６６ｋｇを水１１Ｌで加熱還流抽出（１時間）した。冷却後、抽出液をろ紙（アドバンテック定性ろ紙Ｎｏ．２）でろ過した。このようにして得られた熱水抽出液９．５Ｌを、酢酸エチル９．５Ｌを用いて、３回分配抽出した。３回の分配抽出により得られた酢酸エチル抽出液を合併し、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶部８．７８ｇを得た。【００８０】
得られた酢酸エチル可溶部８．７８ｇ、をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×３０ｃｍ）に付し、ｎ−ヘキサンとアセトンとの混合溶媒で順次アセトンの比率を高めて溶出した。ｎ−ヘキサン：アセトン＝６０：４０の混合溶媒で溶出した画分０．４２５ｇを、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３．０ｃｍ  ｉ．ｄ．×２５ｃｍ）に付し、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。クロロホルム：メタノール＝９６：４の混合溶媒で溶出した画分１１７．７ｍｇをオクタデシルシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに付し、水とメタノールとの混合溶媒で順次メタノールの比率を高めて溶出した。水：メタノール＝７０：３０で溶出した画分９．５ｍｇを分取薄層クロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ７０、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）に付し、クロロホルム：メタノール＝１０：１の混合溶媒で展開した。Ｒｆ＝０．７０の部分を取り、クロロホルム：メタノール＝１：１の混合溶媒で抽出した。この抽出液を減圧濃縮し、得られた残留物をメタノールで結晶化し、淡褐色針状晶１．１ｍｇを得た。分析の結果、この結晶粉末には、前述同様、Ｅｓｃｕｌｅｔｉｎ（Ｐａ９）が含まれていることがわかった。【００８１】
（実施例４）
Ｐａ５の抗炎症作用を検証するために、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を調べた。【００８２】
インターロイキン（ＩＬ）−１βにより誘発される炎症メディエーターの１つとして、一酸化窒素（ＮＯ）が知られており、ＮＯ産生抑制作用を抗炎症作用の指標とすることができる。本実施例では、Ｐａ５のＮＯ産生抑制作用を調べることで、Ｐａ５が抗炎症作用を有するか否か検証した。なお、比較例として、アオジソ中に存在し、ＮＯ産生抑制作用を有することが報告されているＮｅｇｌｅｔｅｉｎを用いた。【００８３】
雄のウィスター系ラット（２００−２５０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から、コラゲナーゼ潅流法（コラゲナーゼ：Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって肝細胞を単離した。単離した肝細胞を培地に６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで懸濁し、３５ｍｍプラスチックディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ）に播種し（２ｍＬ／ディッシュ）、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにて培養した。培地として、１０％  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（生まれたての子ウシの血清）、ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、デキサメタゾン（１０ｎＭ）及びインスリン（１０ｎＭ）を含むウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ：ＷＥ）を用いた。５時間後、血清及びホルモンを含まない新しいＷＥに交換し、実験に用いる前まで、一晩培養した。【００８４】
培養開始後１日目に、細胞を血清及びホルモンを含まない新しいＷＥに交換し、培地に、リコンビナントラットＩＬ−１β（純度が９７％以上）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）及び実施例１にてメタノールにより抽出したＰａ５又は比較例のＮｅｇｌｅｔｅｉｎを添加した。各々の培地中濃度は、ＩＬ−１β：１ｎＭ、Ｐａ５：５、１０及び２０μＭ、Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ：１０、２０及び４０μＭあった（図１）。ＩＬ−１β及びＰａ５又はＮｅｇｌｅｔｅｉｎを添加してから８時間後に、各培地中のＮＯ量を、Ｇｒｉｅｓｓ法（Ｇｒｅｅｎ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８２；１２６：１３１−１３８）を用いて測定した。より具体的には、培地中の亜硝酸塩（ＮＯの安定的代謝体）の量を測定した。【００８５】
また、Ｐａ５の細胞障害性を検証するために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定した。ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（タカラバイオ社）を用いて、培地の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定した。ＬＤＨは細胞内に存在する酵素であるので、細胞障害に伴い、培地中に逸脱する。ＩＬ−１β及びＰａ５又はＮｅｇｌｅｔｅｉｎを添加してから８時間後に、培地を取り、活性測定に用いた。実際には、各サンプル（５０μｌの培地）とキット中の溶液Ｃ（５０μｌ）とを混ぜて室温で３０分間放置し、１Ｍ塩酸（２５μｌ）を添加して反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定し、既知濃度のＬＤＨを用いた検量線と比較して、ＬＤＨ活性を求めた。なお１枚のディッシュ上の細胞全体のＬＤＨ活性（すなわち全細胞抽出液）を陽性対照（図３中のポジコン）とし、１００％とみなした。肝細胞の入っているディッシュから培地を除き、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄してから超音波破砕し、１００００×ｇで３分間遠心した後の上清を全細胞抽出液として用い、ＬＤＨ活性を測定した。【００８６】
図１にラット肝細胞のＮＯ産生量測定の結果を、図２にＩＣ５０値（ＮＯ産生５０％のときの薬剤濃度）を示す。図１において、「（−）」はＩＬ−１βを添加していないことを意味し、「（＋）」はＩＬ−１βを添加していることを意味する。Ｐａ５、Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ（比較例）ともに、用量依存的に、ＩＬ−１βによるＮＯ産生を抑制したが、Ｐａ５とＮｅｇｌｅｔｅｉｎ（比較例）とで同じ添加濃度（１０μＭ）により比較すると、Ｐａ５では、Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ（比較例）に比して、ＮＯ産生抑制作用の程度が高かった（図１）。また、Ｐａ５のＩＣ５０値は９．０μＭであるのに対して、Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ（比較例）のＩＣ５０値は１６．３μＭであり（図２）、Ｐａ５のＮＯ産生抑制作用は、Ｎｅｇｌｅｔｅｉｎ（比較例）のそれに比して高いことが示された。【００８７】
図３に、ＬＤＨ活性の測定結果を示す。図３において、「（−）」はＩＬ−１βを添加していないことを意味し、「（＋）」はＩＬ−１βを添加していることを意味する。Ｐａ５を添加した場合のＬＤＨ活性は、ＩＬ−１β添加した場合と同程度であり、Ｐａ５は細胞障害性を有していないことが示唆された。【００８８】
以上より、Ｐａ５は、高いＮＯ産生抑制作用を有することが示された。したがって、Ｐａ５は、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。【００８９】
（実施例５）
Ｐａ５及びＰａ５’の各種炎症性サイトカイン／ケモカイン産生に及ぼす影響について、サイトカイン／ケモカインアレイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）により検証した。【００９０】
炎症初期においては、障害を受けた組織より、数種の白血球遊走因子が放出され、炎症部位に白血球が浸潤する。白血球遊走因子には、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）のような特異性の低い因子と、特異性の高いタンパク性の遊走因子であるケモカインｆａｍｉｌｙと、がある。ケモカインは、４個保存されているＣｙｓ残基の前の２個のＣｙｓ残基が間に１残基を挟むＣＸＣケモカインと、Ｃｙｓ残基が続くＣＣケモカインと、の２種に大きく分類され、前者は主に好中球の遊走活性を、後者は単球の遊走活性を有する。炎症性疾患では特定のケモカインが過剰に発現することが明らかになっており、ケモカイン及びそのレセプターのシグナル伝達を押さえることは、抗炎症薬のターゲットになり得ると期待される。【００９１】
本実施例では、Ｐａ５及びＰａ５’が、ＩＬ−１β添加による各種炎症性サイトカイン／ケモカイン産生にどのような影響を及ぼすかについて、サイトカイン／ケモカインアレイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）によって検証した。【００９２】
実施例４と同様に、雄のウィスター系ラットから、コラゲナーゼ潅流法によって肝細胞を単離した。単離した肝細胞を培地（実施例４と同様）に１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで懸濁し、３５ｍｍプラスチックディッシュ（実施例４と同様）に播種し（１ｍＬ／ディッシュ）、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにて培養した。５時間後、血清及びホルモンを含まない新しいＷＥに交換し、実験に用いる前まで、一晩培養した。【００９３】
培養開始後１日目に、細胞を血清及びホルモンを含まない新しいＷＥに交換し、培地に、ＩＬ−１β（実施例４と同様）及び、実施例１にてメタノールにより抽出したＰａ５又は実施例２にてメタノールにより抽出したＰａ５’を添加した。各々の培地中濃度は、ＩＬ−１β：１ｎＭ、Ｐａ５：２０μＭ、Ｐａ５’：１００μＭであった（表１）。その後、３７℃で培養し、培養開始３時間後に培地を取り出した。取り出した培地を、５，０００ｒｐｍで１分間遠心して細胞残渣を除き、上清をアッセイに用いた。アッセイを行うまで、上清を−８０℃にて保存した。【００９４】
各種炎症性サイトカイン／ケモカイン産生量については、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙのうち、２９種のサイトカイン／ケモカインを検出できるＲａｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｄｅｔａｉｌ＿ｏｂｊｅｃｔｎａｍｅ＿ｒａｔｃｙｔｏｋｉｎｅａｒｒａｙ．ａｓｐｘ）を用いて、添付のプロトコールに従って測定した。この測定には、前述の通り得られた培地の上清１ｍＬを用いた。【００９５】
上記方法では、２９種のサイトカイン／ケモカインを一度に検出することができ、各サイトカイン／ケモカイン量に比例して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙのフィルター上の化学発光が増加する。そこで、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙのフィルターの化学発光を、ＬＡＳ３０００ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、デンシトメトリー解析を行い、数値化した。デンシトメトリー解析については、ＩｍａｇｅＪソフトを用いて、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｍ６．ａｉｔａｉ．ｎｅ．ｊｐ／〜ｍａｘｃａｔ／ｉｍａｇｅＪ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ｈｔｍｌ＃ｇｅｌｓ（「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｇｅｌｓ〜電気泳動ゲルの解析」の項目）を参照して行った。【００９６】
各種炎症性サイトカイン／ケモカインの詳細を下記に示す。
（１）ＣＩＮＣ−２α／β及び（２）ＣＩＮＣ−３
ＣＩＮＣ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）（サイトカイン誘導性好中球走化性因子）は、ケモカインのアルファ（ＣＸＣ）サブファミリーに属する。ＣＩＮＣ−１をはじめ、３つのラットＣＸＣケモカイン（ＣＩＮＣ−２α、ＣＩＮＣ−２β、ＣＩＮＣ−３／ＭＩＰ−２）が同定されている。好中球浸潤は代表的な急性期の炎症反応であり、好中球はＣＩＮＣｓの刺激を受けて速やかに形態変化を起こす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討された結果、各ＣＩＮＣの走化性活性に本質的な差はなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにて好中球に特異的な強い走化性活性を示す。ＣＩＮＣの発現を抑制することで局所炎症における好中球の浸潤が抑制され、炎症症状の緩和が期待される。
（３）Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ（ＣＸ３ＣＬ１）
活性化血管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞及び腸管上皮細胞で発現している。炎症系サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１やＩＦＮγなどの炎症性刺激により、ＣＸ３ＣＬ１の発現が誘導される。生体内では膜結合型及び分泌型の二つの形態をとり、ケモカインとしてのみならず、インテグリン非依存的に細胞接着能を示す細胞接着分子としても機能する。分泌型ケモカインは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞及び単球に対して細胞遊走活性を示す。ＣＸ３ＣＬ１は、血管新生作用も有する。フラクタイン−ＣＸ３ＣＲ１の発現は関節リウマチや動脈硬化など様々な疾患に関与することが知られている。ＣＸ３ＣＬ１を阻害することで、滑膜組織への炎症細胞浸潤を抑制することができ、関節リウマチ等の関節炎をはじめとする炎症を抑制することが期待される。
（４）ｓＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）
ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１：Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子、膜貫通型糖タンパク質で、多くの細胞において恒常的に発現している。ＣＤ５４は細胞接着分子ＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原１）と結合し、炎症や免疫応答での細胞間相互作用に重要な役割を果たしている。ＩＣＡＭのうちｓＩＣＡＭ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）はＩＣＡＭを介した免疫反応を制御しており、自己免疫疾患、内分泌疾患、胃癌、膵臓癌、乳癌などで発現が上昇することが知られており、これによって癌細胞への細胞障害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞による攻撃が抑制され、癌転移が促進されると考えられている。
（５）ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）
ＣＸＣＬ９は、１４ｋＤａのケモカインで、ＣＸＣケモカインファミリーの一員である。ＣＸＣＬ９は、マクロファージや単球、好中球、ＡＰＣ、Ｂ細胞や好酸球において特異的に誘導され、その誘導メカニズムはＩＦＮγ−ＪＡＫ、ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイを介する。そのため、インターフェロンγで誘導される単球性サイトカイン、Ｍｏｎｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＭＩＧ）とも呼ばれる。また、静脈内皮細胞や皮膚線維芽細胞においてはＴＮＦαによってＣＸＣＬ９の誘導が促進される。ＣＸＣＬ９は、腸管上皮でも構成的に発現している。このケモカインの主要な機能は、感染や炎症個所への白血球のリクルートであり、グラム陰性あるいは陽性細菌の感染によってＣＸＣＬ９が活性化することが、いくつかの研究で報告されている。ＣＸＣＬ９は関節リウマチなどの免疫応答や、慢性炎症に密接に関与している。ＣＸＣＬ９の発現はまた、Ｔ細胞のリクルートと活性化のメディエーターとして、乾癬や肺疾患においても機能している可能性があると考えられる。皮膚移植数日後、拒絶反応の前にも発現している。
（６）ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ／ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｎ）
Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）は、血管新生に関わる因子のひとつであり、固形がんの増殖において重要な役割を果たしている。ＶＥＧＦ−Ａは、血管内皮細胞に対する増殖因子及び血管透過性の亢進因子の２つの性質を持っている。ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現は、増殖因子やエストロゲン、低酸素などにより誘導される。ＶＥＧＦの阻害が固形がん治療の戦略として正しいことは、ＶＥＧＦに特異的に結合し、その機能を阻害する抗体医薬ベバシズマブが優れた延命効果を示すことなどから証明されている。さらに関節リウマチのマウスモデルや、動脈硬化モデルなどにおいても、ＶＥＧＦ系の関与が示されつつある。ＶＥＧＦＲは炎症細胞の動員や機能活性化を介して炎症に深く関わるとされ、この発現を抑えることは抗炎症作用につながると言える。
（７）ＩＬ−１７
ＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）は、ＣＴＬＡ−８としてマウス活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定されたサイトカインである。ＩＬ−１７の作用としては、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８（ヒトのみ）等の主に好中球の活性化、遊走に関わるサイトカイン／ケモカイン及びβ−ＤｅｆｅｎｓｉｎやＳ１００ファミリー等の抗菌ペプチドの発現誘導が知られている。コラーゲン誘導関節炎や自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患が、ＩＦＮ−γやＩＬ−１２欠損マウスでは抑制されずむしろ増悪化するのに対し、ＩＬ−１７欠損マウスにより強く抑制され、抗ＩＬ−１７抗体を用いたヒト臨床試験で関節リウマチや乾癬における有効性が示されたことから、ＩＬ−１７発現抑制は炎症性疾患の改善に有効であることが示唆される。
（８）Ｔｈｙｍｕｓ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣＬ７）
ＣＸＣＬ７は主に血小板から活性化に伴って産生され、好中球や好塩基球、線維芽細胞、単球の遊走を促進し、線維芽細胞の増殖やヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、ＰＧＥ２などの分泌を促進する。また好塩基球からのヒスタミン遊離を促進する。ＣＸＣＬ７発現抑制は好中球などの浸潤を抑制し、ヒスタミン遊離促進を防ぐので、抗炎症性に働くことが示唆される。【００９７】
サイトカイン／ケモカインアレイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の結果を表１及び図４に示す。表１及び図４において、「（−）」はＩＬ−１βを添加していないことを意味し、「（＋）」はＩＬ−１βを添加していることを意味する。Ｐａ５は、各種サイトカイン／ケモカインの誘導を強く抑制することが示された。また、Ｐａ５’についても、Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ（ＣＸ３ＣＬ１）、ＩＬ−１７及びＴｈｙｍｕｓ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣＬ７）の誘導を強く抑制することが示された。【００９８】
【表１】
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【００９９】
以上より、Ｐａ５及びＰａ５’は、多くの炎症性ケモカイン／サイトカインの誘導を抑制することができ、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。【０１００】
（実施例６）
Ｐａ９の抗炎症作用を検証するために、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制作用を調べた。【０１０１】
実施例４と同様にラット由来の肝細胞を培養し、培養開始後１日目に、細胞を血清及びホルモンを含まない新しいＷＥに交換し、培地に、リコンビナントラットＩＬ−１β（実施例４と同様）及び実施例３にてメタノールにより抽出したＰａ９を添加した。各々の培地中濃度は、ＩＬ−１β：１ｎＭ、Ｐａ９：１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭであった（図５）。ＩＬ−１β及びＰａ９を添加してから８時間後に、各培地中のＮＯ量を、実施例４と同様に測定した。【０１０２】
図５にラット肝細胞のＮＯ産生量測定の結果を、図６にＩＣ５０値（ＮＯ産生５０％のときの薬剤濃度）を示す。図５において、「（−）」はＩＬ−１βを添加していないことを意味し、「（＋）」はＩＬ−１βを添加していることを意味する。Ｐａ９は用量依存的に、ＩＬ−１βによるＮＯ産生を抑制した（図５）。また、Ｐａ９のＩＣ５０値は３２μＭであった（図６）。【０１０３】
以上より、Ｐａ９は、高いＮＯ産生抑制作用を有することが示された。したがって、Ｐａ９は、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。【０１０４】
なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１０５】
本発明は、２０１３年９月２日に出願された日本国特許出願２０１３−１８１０５２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１３−１８１０５２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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