(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、肥満予防、脂肪燃焼促進、又は糖尿病予防のための剤。
【請求項２】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、骨密度減少予防剤。
【請求項３】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、食品における血糖負荷の低減剤。
【請求項４】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、抗炎症剤。
【請求項５】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、肥満予防、脂肪燃焼促進、又は糖尿病予防用食品組成物。
【請求項６】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、骨密度減少予防用食品組成物。
【請求項７】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、食品における血糖負荷の低減用食品組成物。
【請求項８】
セドヘプツロースを有効成分として含有する、抗炎症用食品組成物。
【請求項９】
健康ドリンク、栄養スナックバー、ダイエット食品、シリアル食品、ソフトドリンク、スポーツドリンク、栄養ドリンク、栄養甘味料、砂糖菓子、パン菓子、乳製品、スプレッド又は機能性食品からなる群から選択される、請求項５〜８のいずれかに記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は栄養補給の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
フードサプリメント又はダイエタリーサプリメントとしても知られる栄養補給剤は、食事を補い、個人の食事で不足するか又は十分量摂取されない可能性があるビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸又はアミノ酸等の栄養素を供給することを意図する調製物である。ダイエタリーサプリメントを食品として規定する国もあるが、それらを薬物又は自然健康食品として規定する国もある。
【０００３】
ビタミン又は食事性ミネラルを含有する補給剤は、食品、食品生産及び食品安全性に関する国際的に認められる基準、実施基準、指針及び他の推奨のコレクションである国際食品規格委員会における食品のカテゴリーに含まれる。これらの文言は国連食糧農業機関（ＦＡＯ）及び世界保健機関（ＷＨＯ）が後援する機関である国際食品規格委員会によって作成される。
【０００４】
平均的なアメリカ人は驚くべきことに毎週１ｋｇ〜１．５ｋｇの糖（主にグルコースとして）を摂取しているが、これはスクロース（砂糖）、デキストロース（トウモロコシ糖）及びブドウ糖果糖液糖の形態の高精製糖がパン、朝食用シリアル、マヨネーズ、ピーナッツバター、ケチャップ、スパゲティソース、並びに多くの電子レンジ食品及び飲料等の非常に多くの食品へと加工されることを考えると驚くには当たらない。
【０００５】
糖の主な欠点の１つは、糖が成長ホルモンの放出を阻害し、免疫系を抑制するインスリンのレベルを上昇させることである。血流への糖の流入は身体の血糖バランスを狂わせ、血糖を一定の安全なレベルに維持するために身体により用いられるインスリンの放出を誘発する。インスリンは脂肪の貯蔵も促進するため、糖分の多い菓子を食べることで、急速な体重増加及びトリグリセリドレベルの上昇（どちらも心血管疾患に関連する）に至る。複合糖質はよりゆっくりと吸収される傾向があり、血糖レベルに対する影響を少なくする。
【０００６】
糖を習慣的に摂取することで生じる健康危機は確かである。単糖、特にグルコースは喘息を悪化させ、気分変動を起こし、人格変化を引き起こし、精神病を生じさせ、神経障害を助長し、糖尿病をもたらし、心臓病を促し、胆石を成長させ、高血圧を加速し、関節炎を増進することが観察されている。
【０００７】
血糖指数（glycemic index, or glycaemic index：グリセミック指数）（ＧＩ）は、特定のタイプの食品を食べた後にどのくらい急速に血糖レベル（すなわち血中のグルコースレベル）が上昇するかの尺度をもたらす。種々の食品が血糖レベルに与える影響は大幅に異なる。血糖指数により、食品中の利用可能な糖質（全糖質−繊維）１グラム当たり、純粋なグルコースの摂取と比較して食品の摂取後に個体の血中グルコースレベルをどの程度上昇させるかが推定される。グルコースの血糖指数は１００である。血糖指数の実際的制限は実際に摂取される糖質の量が考慮されないということである。関連の尺度である血糖負荷（glycemic load：グリセミック負荷）は、問題となる食品の血糖指数に実際の料理の糖質含量を乗算することによってこれを考慮に入れるものである。
【０００８】
低ＧＩ食品はグルコースをよりゆっくりと着実に放出し、より好適な摂取後（食後）血中グルコース読み取り値をもたらす。高ＧＩ食品はより急速な血中グルコースレベルの上昇を引き起こし、運動後のエネルギー回収又は低血糖症を患う個体に好適である。
【０００９】
食品の血糖作用は、デンプンのタイプ（アミロース対アミロペクチン）、食品中のデンプン分子の物理的封入、食品の脂肪及びタンパク質の含量、並びに食事中の有機酸又はその塩（例えば酢を添加することでＧＩは低下する）等の多数の因子に依存する。脂肪又は可溶性食物繊維の存在は胃内容排出速度を低くすることにより、ＧＩを低下させ得る。概して、より多量の繊維を含む粗粒（coarse, grainy）パンは白パンよりも低いＧＩ値を有する。しかしながら、１００％全粒粉又は全粒小麦粉から作られた大抵のパンのＧＩは、胚乳のみの（白）パンとそれほど異ならない。多くの黒パンは皮を柔らかくするために酵素で処理され、デンプンがよりアクセス可能となっている（高ＧＩ）。
【００１０】
脂肪又はタンパク質の添加は食事に対する血糖応答を低下させるが、相対的差異は残る。すなわち、添加の有無を問わず、依然としてプンパーニッケル等の低ＧＩパン後よりも高い血中グルコース曲線が高ＧＩパン後に見られる。果物及び野菜は低い血糖指数を有する傾向がある。血糖指数は、試験が５０ｇの利用可能な糖質を含有する或る量の食品を摂取する被験体に基づく食品にのみ適用することができる。しかし、多くの果物及び野菜（ジャガイモ、サツマイモ、トウモロコシを除く）は、典型的な料理で５０ｇ未満の利用可能な糖質を含有する。ニンジンは当初、高ＧＩを有すると誤って報告されていた。アルコール飲料は低ＧＩ値を有することが報告されているが、ビールは中程度のＧＩを有することに留意されたい。近年の研究から、食事前のアルコール飲料の摂取が食事のＧＩをおよそ１５％低減することが示されている。試験の１２時間超前の適度のアルコール摂取はＧＩに影響を与えない。
【００１１】
多くの現代の食生活は血糖指数に基づく。しかしながら、一般に健康に悪いとみなされる食品、例えばチョコレートケーキ、アイスクリーム又は純粋なフルクトースが低い血糖指数を有する可能性があり、糖尿病率が低い国々で食べられているジャガイモ及び米のような食品のＧＩがおよそ１００であることが指摘されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ヒトにおける食物のエネルギー代謝を改善する栄養補給剤を提供することである。更なる目的は、代謝に対する食品の効果を考慮に入れたＧＩの代替食品分類目録を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は細胞酸素消費の栄養誘導剤としてのセドヘプツロースの使用を提供する。本発明はまた、細胞外酸性化、解糖及び乳酸形成の栄養阻害剤としてのセドヘプツロースの使用を提供する。本発明は、食品における血糖負荷の低減へのセドヘプツロースの使用も提供する。本発明は、栄養補給剤としての、特に健常個体におけるセドヘプツロース欠乏の喪失を保証する（safeguarding）、すなわち治療必要性又はバックグラウンドなしにセドヘプツロースを供給するためのセドヘプツロースの使用も提供する。
【００１４】
本発明は、遊離セドヘプツロースがヒトにおいて関連するアクセス可能な炭素源であるという事実を用いるものである。さらに、そのリン酸化形態であるセドヘプツロース−７−リン酸のバイオアベイラビリティは、解糖及びペントースリン酸経路の境界面でのヘキソース糖質代謝並びにミトコンドリア呼吸のレオスタットとして機能するようである。栄養セドヘプツロースは細胞グルコース消費、脂肪燃焼、酸化還元調節、炎症、ひいては関連障害のバランスを取るようである。
【００１５】
本発明により、セドヘプツロースの食品への添加によって、一般に使用されるノンカロリー及びカロリー甘味料を含む現在使用されている全ての糖質と比較して、特有の栄養価がもたらされることが示されている。本発明はしたがって、Ｃ６（過剰）消費のバランスを取り、それにより肥満又は糖尿病を予防し、免疫機能及びエネルギー利用を最適化及び増強することに関する。したがって、本発明による「栄養」補給剤は、セドヘプツロースの食品への添加によって（又はセドヘプツロース含量を（更に）増大することで食品を改良することによって）「栄養素の利用をもたらし又は改善し」、それによりセドヘプツロース含量を有する新たな改良された食品を提供するという意味で用いられる。したがって、本発明によるＣ７栄養補給剤は生理学的酸化還元調節を管理し、それにより関連の代謝撹乱又は障害も管理する効果的な戦略をもたらす。したがって、本発明は、国際公開第２００６／０２７７９６号及び国際公開第２００６／０９３８４８号で提案される低カロリー甘味料又は代用黒砂糖の使用とは顕著に異なる。
【００１６】
先述のように、今日の食品産業では多量のＣ６糖（Ｃ６糖はグルコース、フルクトース及びスクロース、並びに（それぞれの二量体としての）マルトースである）が栄養補給剤として使用される。これらのヘキソースの大半は甘味料として（すなわち「栄養」補給剤としてではなく、味又は風味の増進剤として）使用され、心血管疾患、アルツハイマー病、メタボリック症候群、肥満及び糖尿病のリスクの増大について広く論考されている。Ｃ６糖質とＣ７糖質との比率は過度のＣ６の適用によって乱される。Ｃ７（すなわち主にセドヘプツロースであるが、他のＣ７糖、特にマンノヘプツロースとの組合せも可能である；セドヘプツロース単独に加えて、Ｃ７を「少なくとも１００００：１、好ましくは少なくとも１０００：１、特に少なくとも１００：１のセドヘプツロース／マンノヘプツロース％（ｗ／ｗ）比でマンノヘプツロースを含む又は含まないセドヘプツロース」と定義することができる）の添加は、血糖負荷の増大のバランスを取る。Ｃ７はＣ６ほど甘くないため、保健食品の味を大きく変えることがない。Ｃ７糖質は細胞糖質及び脂肪代謝において異なる機能を有し、それにより脊椎動物における栄養摂取及びヘルスケア関連の態様に影響を与える。
【００１７】
したがって本発明は、食事へのＣ７の添加がヒト及びマウスにおいて改善され、バランスの取れた代謝をもたらすという教示を提供するものである。本発明によるＣ７を含有する栄養補給剤は、ヘルスケア関連問題に関するＣ６加糖食品の選好性を変更する明らかな可能性を有する。
【００１８】
本発明により、栄養効率の新たなパラメーターである、天然の及び化学的に設計された標準食並びに天然の及び化学的に設計された食品成分について提供され、利用可能なＣ６／Ｃ７比も提供される。本発明により、Ｃ７消費によってエネルギー効率が管理され、組織の健康及び炎症が管理されることを実証することもできた。さらに、本発明によって誘導され、もたらされるＣ７消費により身体持久力、生理学的酸化還元調節、ひいては糖尿病及び肥満等の関連障害も管理される。
【００１９】
セドヘプツロース（ＣＡＳ番号：３０１９−７４−７；ＰｕｂＣｈｅｍ：５４５９８７９；ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ：４５７３６２０；ＭｅＳＨ：セドヘプツロース；ＣｈＥＢＩ：ＣＨＥＢＩ：１６８０２）又はＤ−ａｌｔｒｏ−ヘプツロースは、７個の炭素原子及びケトン官能基を有する単糖であるケトヘプトースである。セドヘプツロースは自然界に見られる幾つかのヘプトースの１つである。セドヘプツロースは天然源からの抽出又は化学合成によって生成可能である。セドヘプツロースは高純度（例えば６０％超の純度、好ましくは８５％超の純度、より好ましくは９０％超の純度、より好ましくは９５％超の純度、更により好ましくは９９％超の純度、特に９９．９％超の純度）まで精製することができる。
【００２０】
セドヘプツロースは、一次グルコース代謝の中間分子として認識されているそのリン酸化型であるセドヘプツロース−７−リン酸（Ｓ７Ｐ）に比べて比較的知られていない代謝産物である。セドヘプツロースの天然の存在は植物で初めて報告され、続いてヒト尿、血斑、また近年ではマウス細胞において同定されている。Ｓ７Ｐはリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）及びキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）のトランスケトラーゼ触媒変換に由来する。この反応はペントースリン酸経路の非酸化アームにおいて起こり、Ｓ７Ｐに加えて重要な解糖中間体であるグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を生成する。Ｇ３Ｐ及びＳ７Ｐは、トランスアルドラーゼによってもフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）及びエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）を基質として用いて産生される。このため、Ｓ７Ｐは非酸化的ＰＰＰの重要中間体であり、したがってＳ７Ｐバイオアベイラビリティが細胞炭素フラックスに寄与する。近年、幾つかのグループによるデータが、セドヘプツロースキナーゼが同様にセドヘプツロースの直接リン酸化によってＳ７Ｐを産生し得ることを示している（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。この発見により、細胞炭素代謝に積極的に参加する付加的な炭素源であるセドヘプツロースの予期せぬ存在が実証された（Nagy and Haschemi, Biochem Soc Trans. 2013）。
【００２１】
遊離セドヘプツロースは果物及び野菜の食事に由来するか、又は内因的に産生されたＳ７Ｐの脱リン酸化によって形成され得る。これまで、特異的セドヘプツロース輸送体又はＳ７Ｐ特異的ホスファターゼは報告されていなかった。他の生物活性ヘプトースとしては、フェノール化合物７−Ｏ−ガロイル−セドヘプツロース（ＧＳ）、マンノヘプツロース及びグルコヘプトース（glucoheptose）が挙げられる。ＧＳは、炎症応答を緩和することによって腎臓の糖尿病性損傷を防ぐことが報告されている。マンノヘプツロース（様々な特許が出願中である）はセドヘプツロースの異性体であり、一般にアボカドに見られる強力なヘキソキナーゼ阻害剤である。グルコヘプトースは化学的性質が未だ特定されていないにもかかわらず、ウサギにおいて利用し得る糖質源となることが示されている。セドヘプツロサンはセドヘプツロースの無水物であり、同様に遊離セドヘプツロースの供給源となる可能性がある。
【００２２】
遊離セドヘプツロースは例えば植物オオベンケイソウ（sedum spectabile）から単離することができ、多量のヘプトース糖質を含有することが以前に報告されている。
【００２３】
セドヘプツロースキナーゼは遊離セドヘプツロースをリン酸化し、これにより細胞がヘキソキナーゼ及びグルコースと同様にセドヘプツロースを糖質代謝へ直接送ることが可能になる。本発明によると、セドヘプツロースは一次糖質異化及び同化に送り込まれる直接的な炭素源であり、ここでセドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）がその入り口点を構成する。したがって驚くべきことに、これらの化合物が全て遊離糖質及びリン酸化型として存在するため、セドヘプツロースはグルコース及びフルクトースと比較され得る。代謝に入るためには、遊離糖質は初期リン酸化事象によってエネルギー的に活性化される。ヘキソキナーゼはグルコースをリン酸化してＧ６Ｐを形成するものであり、細胞グルコースフラックスの重要な決定因子である。フルクトースはケトヘキソキナーゼによってリン酸化されてフルクトース−１−リン酸（Ｆ１Ｐ）を形成し、これが初めにアルドラーゼによってグリセルアルデヒド及びジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へと変換されるはずである。次いで、ＤＨＡＰは炭素サイクルに直接入ることができるが、グリセルアルデヒドは更にリン酸化されなくてはならない。ヘキソキナーゼによるグルコースからのＧ６Ｐ形成に類似した、セドヘプツロースキナーゼによるセドヘプツロースからのＳ７Ｐの形成によって、遊離セドヘプツロースが容易に異化系に入ることが可能となる。Ｆ６Ｐリン酸化の競合的阻害が高Ｓ７Ｐ濃度の存在下で起こることも報告されている。興味深いことに、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）を含有する画分がセドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ（ＳＢＰアーゼ）活性を有することも報告されている。
【００２４】
したがって、本発明はヘキソース−及びヘプトース−（ビス）リン酸シャントの共存にも基づく。特に、高グルコースレベル又はＦ２，６ｂＰとのインキュベーションが、灌流ラット肝臓及びラット肝サイトゾルのそれぞれにおいてＳ１，７ｂＰ形成を増大させた。高グルコースとは対照的にグルカゴンはＳ１，７ｂＰ脱リン酸化、ひいてはＳ７Ｐ形成に有利に働いた。これらの結果から、セドヘプツロース代謝がホルモン制御に影響されやすいことが示される。
【００２５】
セドヘプツロース代謝は代謝調節に関与する。実際に、セドヘプツロースはグルコースとは独立してＳ７Ｐを供給することによって代謝フラックスを指向する。マウスマクロファージ細胞株におけるＣＡＲＫＬ発現の増大（ひいてはセドヘプツロース消費の増大）はＧ３Ｐ、Ｘ５Ｐ及びＲ５Ｐ定常状態レベルの低下をもたらし、ＣＡＲＫＬノックダウンは逆の効果を示した。特に、基礎セドヘプツロースレベルはＣＡＲＫＬ摂動によっては変化しなかった。Ｓ７Ｐレベルは過剰発現では変化しなかったが、ＣＡＲＫＬ喪失によって顕著に低下し、セドヘプツロースリン酸化が解糖によって誘導されるＧ３Ｐ分布の律速因子であることが示された。したがって、Ｓ７Ｐアベイラビリティの調節はＣＡＲＫＬ又は過剰量のセドヘプツロースが細胞代謝を調整する機構であり得る。
【００２６】
したがって、本発明は例えばＣ６（過剰）消費、肥満、糖尿病、免疫機能及び概して脊椎動物のエネルギー利用のバランスを保つためのＣ７の使用に関する。したがって、Ｃ７の補充は生理学的酸化還元調節、更には関連障害を管理する効果的な戦略も提供する。本発明により、高セドヘプツロース及び高セドヘプツロースキナーゼの両方がセドヘプツロース代謝回転の増強をもたらすことが判明した。さらに、セドヘプツロースキナーゼの組織発現から、肝臓又は脂肪組織等の代謝臓器がセドヘプツロースを消費する能力を有することが明らかである。さらに、褐色脂肪組織（多量の脂質を燃焼する）は白色脂肪組織よりもはるかに多くの（約２．５倍の）セドヘプツロースキナーゼを発現する。
【００２７】
炎症を有する又は炎症を患うリスクがある患者に投与されるセドヘプツロース（及び／又は他のヘプトース）は血糖負荷を最小限に抑え、例えば食事誘発性肥満及び／又は糖尿病の予防に積極的に寄与する。さらに、セドヘプツロース代謝増強モデルであるトランスジェニックセドヘプツロースキナーゼ動物によるデータから、高セドヘプツロース代謝が脂質酸化を増大する（より低いＲＱ値により示される）ことが示される。これはセドヘプツロース代謝回転の増強の有益な効果である。高セドヘプツロース代謝回転の動物ではエネルギー消費も低下する。さらに、ＣＡＲＫＬ過剰発現マウスは対照動物よりもインスリン感受性であるようである。総合すると、セドヘプツロース代謝が脊椎動物において代謝表現型を調節するのに効果的な手段であることも示される。
【００２８】
本発明により、特異的な驚くべき抗炎症効果が高セドヘプツロース代謝回転によって引き起こされると示すことができた。炎症の増強は、インスリン耐性のような肥満関連障害等の疾患の発症において重要な役割を果たす。マクロファージ活性化の新規の調節因子についての機能的キナーゼスクリーニングでは、セドヘプツロースキナーゼがリポ多糖（ＬＰＳ）により誘導される腫瘍壊死因子αの分泌を抑制することが見出された。同じスクリーニングにおいて、ヘキソキナーゼ、ケトヘキソキナーゼ及びホスホフルクトキナーゼの過剰発現（高グルコース／フルクトース代謝）は反対の効果を有していた。これにより、ヘプトースが炎症を阻害するというヘキソース糖質代謝とヘプトース糖質代謝との反対の効果が示される。さらに、ＣＡＲＫＬ発現の増大はＬＰＳ誘導マクロファージ活性化を抑制し、細胞内スーパーオキシド形成の鈍化をもたらす一方で、ＣＡＲＫＬの喪失（セドヘプツロース代謝の低下を模倣する）は細胞の炎症応答を増強した。
【００２９】
一方、本発明はあらゆる種のセドヘプツロース欠乏、特に病理学的帰結を生じていないセドヘプツロース欠乏の予防にも関し、すなわちかかるセドヘプツロース欠乏に起因する障害を予防することができるようにセドヘプツロース欠乏に対抗するものである。かかるセドヘプツロース欠乏を予防するために、セドヘプツロース含有組成物を、かかるセドヘプツロース欠乏（又はセドヘプツロース欠乏症候群）を発症するリスクがある個体又はかかるリスクを有しない健常個体に、例えば栄養補給剤として又は食品及び／又は飲料と組み合わせて投与することができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施の形態によると、セドヘプツロースを既にセドヘプツロースを含有する食品に添加し、少なくとも１０％増大した該食品のセドヘプツロース含量を得る、好ましくは少なくとも１００％、特に少なくとも５００％増大した該食品のセドヘプツロース含量を得る。
【００３１】
代替的には、セドヘプツロースを含有していない食品にセドヘプツロースを添加する場合、好ましくは少なくとも０．００１％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）、更により好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｗ）、特に少なくとも１０％（ｗ／ｗ）という食品のセドヘプツロース含量が得られる。
【００３２】
食品が飲料（例えばソフトドリンク）等の液体食品である場合、セドヘプツロース含量は％（ｗ／ｖ）比としても言及され得る。したがって、本発明は好ましい実施の形態として、セドヘプツロース含量が少なくとも０．００１％（ｗ／ｖ）、好ましくは少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）、更により好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｖ）、特に少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の飲料も有する。したがって、下記で言及される「重量比」は液体食品については％（ｗ／ｗ）値及び％（ｗ／ｖ）値を意味する。
【００３３】
例えば、天然の果実（又は野菜）材料（ジュース）をベースとしない通常のソフトドリンクについては、最小限のセドヘプツロースの添加によってセドヘプツロース含量を改善する必要がある。本発明の目的上、「ソフトドリンク」は典型的には水（常にではないが多くの場合、炭酸水）、通常は甘味料及び着香料を含有するが、フルーツジュース（fruit juice：果汁）（これらは本発明において「フルーツジュース」と称され、本発明の目的上では明確な相違が維持される）を含有しない飲料である。ソフトドリンク中の甘味料は糖、ブドウ糖果糖液糖、フルーツジュース、代替糖（ダイエット飲料の場合）又はこれらの或る組合せであり得る。ソフトドリンクはカフェイン、着色料、保存料及び他の成分を含有していてもよい。（本発明によって定義される）ソフトドリンクはセドヘプツロースを含有しない（すなわち、０．００１％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）をはるかに下回るセドヘプツロース含量を有する）ため、本発明の好ましい実施の形態は０．００１％（ｗ／ｗ）（又は％（ｗ／ｖ））以上、好ましくは少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）（又は％（ｗ／ｖ））、より好ましくは少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）（又は％（ｗ／ｖ））、更により好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｗ）（又は％（ｗ／ｖ））、特に少なくとも１０％（ｗ／ｗ）（又は％（ｗ／ｖ））のセドヘプツロース含量を有するソフトドリンクである。
【００３４】
本発明によると、食品をＣ６糖質、特にグルコース、フルクトース及びスクロース、並びにそれぞれの二量体としてのマルトースの含量（％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）又はモル濃度）、並びにＣ７糖質、特にセドヘプツロース、任意にマンノヘプツロースの含量（％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）又はモル濃度）について分析し、この食品についてのＣ６糖質とＣ７糖質との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル比）を確立することができ、Ｃ６糖質とＣ７糖質との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル比）を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％、特に少なくとも２００％低下させる量でセドヘプツロースをマンノヘプツロースとともに又はマンノヘプツロースを伴わずに食品に添加する。好ましくは、食品における重量比（すなわち％（ｗ／ｗ）及び／又は％（ｗ／ｖ））を、得られるＣ６／Ｃ７重量比が２０００％：１％以下となるまで、好ましくは得られるＣ６／Ｃ７重量比が１００％：１％以下となるまで、より好ましくは得られるＣ６／Ｃ７重量比が１０：１以下となるまで、特に得られるＣ６／Ｃ７重量比が１％：１％以下となるまで低下させる。代替的には、モル濃度比もそれに応じて低下させる、例えば好ましくは得られるＣ６／Ｃ７モル比が２０００：１以下となるまで、好ましくは得られるＣ６／Ｃ７モル比が１００：１以下となるまで、より好ましくは得られるＣ６／Ｃ７モル比が１０：１以下となるまで、特に得られるＣ６／Ｃ７比が１：１以下となるまでの食品におけるモル比へと低下させることができる（％値の比率はその値の比率と同一である、すなわち２０００％：１％＝２０００：１であることを指摘すべきである）。
【００３５】
したがって、新たな食品が本発明によって本方法を用いて提供される。例えば、得られるＣ６／Ｃ７モル比が２０００：１以下の新世代のソフトドリンク、又はオレンジジュース及びリンゴジュースが本発明によって提供される。本発明による食品の他の好ましい実施の形態は、Ｃ６／Ｃ７重量又はモル比が３０００：１以下、特に２５００：１以下であり、例えばソフトドリンク（すなわち本質的に任意のセドヘプツロース含量を有しない）に由来する飲料が、例えば５％〜５０％の量でオレンジジュース又はリンゴジュース等のフルーツジュースを含有する。したがって本発明は、Ｃ６／Ｃ７の重量又はモル比によるＣ６糖質とＣ７糖質との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル比）が３０００：１以下、好ましくは２５００：１以下であるソフトドリンクにも関する。
【００３６】
実質的に任意の食品（「食品」という用語は、ヒトに栄養学的に（nutritially）使用され得る食品、飲料等を含む任意の摂取可能な物質を包含する）を、本発明に従ってセドヘプツロースの添加により改良することができる。食品は健康ドリンク、栄養スナックバー、ダイエット食品、シリアル食品、ソフトドリンク、スポーツドリンク、栄養ドリンク、栄養甘味料、砂糖菓子、パン菓子、乳製品、スプレッド又はインスタント食品を含む機能性食品からなる群から選択されるのが好ましい。
【００３７】
別の態様によると、本発明は本発明を用いて提供されるような改良された食品にも関する。先述のように、市販の実質的に任意の食品を本発明に従って改良することができる。本発明は、或るセドヘプツロース含量を有する、又は利用可能な製品が或る特定レベルのセドヘプツロースを既に含有している場合には増大したセドヘプツロース含量を有する新規の製品を提供する。したがって本発明は、セドヘプツロースを添加した食品であって、セドヘプツロース含量がセドヘプツロースを添加していない食品と比較して少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、特に少なくとも３０％（ｗ／ｗ）増大している、食品にも関する。好ましくは、セドヘプツロース含量はセドヘプツロースを添加していない食品と比較して少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも１００％（ｗ／ｗ）、特に少なくとも２００％（ｗ／ｗ）増大している。これらの数値は更に飲料等の液体食品にも％（ｗ／ｖ）比で適用することができる（すなわち、例えばセドヘプツロース含量がセドヘプツロースを添加していない食品と比較して少なくとも５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは少なくとも１００％（ｗ／ｖ）、特に少なくとも２００％（ｗ／ｖ）増大している飲料）。
【００３８】
従来技術で利用可能な食品が本来セドヘプツロースを含まない場合、本発明に従ってセドヘプツロースを添加して、少なくとも０．００１％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）の食品のセドヘプツロース含量、好ましくは少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）、より好ましくは少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）、更により好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）、特に少なくとも１０％（ｗ／ｗ）又は％（ｗ／ｖ）の食品のセドヘプツロース含量を得ることができる。当然ながら、食品（砂糖菓子等）の性質に応じて、セドヘプツロース含量をはるかに高くしてもよい。
【００３９】
本発明による食品は、健康ドリンク、栄養スナックバー、ダイエット食品、シリアル食品、ソフトドリンク、スポーツドリンク、栄養ドリンク、栄養甘味料、砂糖菓子、パン菓子、乳製品、スプレッド又は機能性食品からなる群から選択されるのが好ましい。
【００４０】
別の態様によると、本発明は、食品をＣ６糖質、特にグルコース及びフルクトースの含量並びにＣ７糖質の含量について分析し、該食品に関するＣ６糖質含量とＣ７糖質含量との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル濃度比）を算出し、好ましくは該比率をデータキャリヤに記録するか又は該比率を印刷基材に印刷するとともに、該データキャリヤ又は該印刷基材と前記食品とを組み合わせることによって、食品に関するＣ６糖質とＣ７糖質との比率（％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）又はモル濃度）を確立する方法を提供する。
【００４１】
この態様の変形形態によると、本発明は、食品をＣ６糖質、特にグルコース、フルクトース及びスクロース、並びにそのそれぞれの二量体としてのマルトースの含量並びにＣ７糖質の含量について分析し、該食品に関するＣ６糖質含量とＣ７糖質含量との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル濃度比）を算出し、次いで該食品に関するＣ６糖質含量とＣ７糖質含量との比率（％（ｗ／ｗ）：％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）：％（ｗ／ｖ）又はモル濃度比）を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、特に少なくとも１００％低下させる量でセドヘプツロースを該食品に添加し、好ましくは該比率をデータキャリヤに記録するか又は該比率を印刷基材に印刷するとともに、該データキャリヤ又は該印刷基材と前記食品とを組み合わせることによって、食品におけるＣ６糖質とＣ７糖質との比率（％（ｗ／ｗ）、％（ｗ／ｖ）又はモル濃度）を確立及び調整する方法も提供する。上記に既に述べたように、好ましくは食品における重量又は分子比を、得られるＣ６／Ｃ７比が少なくとも２０００％：１％となるまで、好ましくは得られるＣ６／Ｃ７比が少なくとも１０％：１％となるまで、特に得られるＣ６／Ｃ７比が少なくとも１％：１％となるまで低下させる。
【００４２】
本発明を以下の実施例及び図面で更に説明するが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】（Ａ）ニンジン又は室内で栽培したオオベンケイソウ植物の葉に由来するプールしたサンプルを、ガスクロマトグラフィーと組み合わせた質量分析によって分析し、相対グルコース（Ｃ６）及びセドヘプツロース（Ｃ７）レベルを特異的に測定した。それぞれのピーク面積を除算することによってＣ６／Ｃ７比を算出した。（Ｂ）セドヘプツロース及びグルコースレベルを、食品摂取前後の個体の血清におけるＧＣ−ＭＳによって更に評価し、食事由来のＣ７がヒト血流に入ることができるか否かを調査した。４人の一晩絶食した（絶食）個体のセドヘプツロース及びグルコースレベル（白いバー）を、主にニンジン（約７００ｇ）を幾らかのオリーブ油、塩及びコショウとともに含有する食事の２時間後に測定したレベル（食事供給、灰色のバー）と比較した。血清糖質レベルの変化を平均倍数変化（ｎ＝４、±Ｓ．Ｄ．）で表した。（Ｃ）グルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度を指定の飲料の糖質抽出物で測定した。４つのプールした技術的反復試験の平均値をブロットし（blotted）、抽出糖濃度を実証した。（Ｄ）さらに、グルコース及びフルクトース（Ｃ６）分子又は重量の総和をそれぞれのセドヘプツロース（Ｃ７）単位で除算することによってＣ６／Ｃ７（セドヘプツロース）比を確立した（Ｎ．Ａ．＝該当なし）。
【図２】（Ａ）マウス肝臓における４８時間にわたる正規化セドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）ｍＲＮＡ発現レベルのブロットを、公表されている「概日遺伝子発現データベース（Circadian Gene Expression Database）−ＣＩＲＣＡ」から得た。Ｙ軸は正規化遺伝子発現を表し、Ｘ軸は時間（時間）を表す。（Ｂ及びＣ）摂動ＣＡＲＫＬ発現を有する細胞の還元及び酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドレベルを、以前に記録されたメタボロミクスデータ（Haschemi et al., 15 (2012), 813-826）から算出した。ＣＡＲＫＬ媒介ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド調節を説明するために、（Ｂ）過剰発現により高ＣＡＲＫＬレベルを発現する又は（Ｃ）ｓｈＲＮＡｍｉｒ発現により低ＣＡＲＫＬレベルを発現するＲＡＷ２６４．７細胞株を個々の対照細胞株と比較した。データは３回の個々の実験の平均倍数変化±ＳＥＭを表す。（Ｄ）ＣＡＲＫＬ  ｍＲＮＡレベルをマウスｃＤＮＡ組織ライブラリーにおいて測定した。データは、胸腺ＣＡＲＫＬ発現と比較した（β−アクチンに対して）正規化した平均ＣＡＲＫＬ発現を倍数変化（全組織のｎ＝３、Ｓ．Ｄ．）で表す。
【図３】（Ａ〜Ｅ）初代ヒト脂肪細胞を、グルコース及びフルクトース（ＧＦ、１．５ｇ／Ｌの各糖；全糖質３ｇ／Ｌ）又はＧＦＳと称されるセドヘプツロース添加培地（１ｇ／Ｌの各糖；全糖質３ｇ／Ｌ）の存在下で８日間の間質血管細胞画分の分化によって得た。続いて、（Ａ）ＣＡＲＫＬ、（Ｂ）アディポネクチン及び（Ｃ）脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価し、群間で比較した。脂肪細胞の（Ｄ）細胞酸素消費速度（ＯＣＲ）及び（Ｅ）細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、指定の糖質ミックスの存在下で記録した（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝９〜１１）。ＧＦ又はＧＦＳ糖質ミックスを含有する細胞培養培地で３日間培養した成熟マウス脂肪細胞の（Ｆ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）及び（Ｇ）インターロイキン６（ＩＬ−６）ｍＲＮＡ発現レベル、又は（Ｈ）初代マウス肝細胞におけるＩＬ−６発現、並びに初代骨髄由来マクロファージにおける（Ｉ）ＴＮＦａ及び（Ｊ）ＩＬ−６  ｍＲＮＡレベル（どちらの細胞型もＧＦ又はＧＦＳ培地中で２日間前培養した）を、それぞれの群間で比較した。２日間にわたる（Ｋ）ＴＮＦａ及び（Ｌ）ＩＬ−６サイトカインの分泌を、骨髄由来マクロファージの上清におけるＥＬＩＳＡによって測定した。マクロファージによるそれぞれの培地における（Ｍ）活性化の２時間後のＴＮＦａ及び（Ｎ）活性化の６時間後のＩＬ−６のＬＰＳ誘導（１００ｎｇ／ｍｌ）分泌を、同様にＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を表す。
【図４】活性読み取り値としてＡＤＰ形成を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、一定のＡＴＰ（１５０μＭ）濃度でのセドヘプツロース代謝回転率は、（Ａ）セドヘプツロース濃度の増大又は（Ｂ）律速酵素であるセドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）の量の増大によって増強した。（Ｃ〜Ｅ）野生型（正：wild-type）（ＷＴ）及びセドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ過剰発現マウスの肝細胞をＧＦＳ含有培地中で２日間前培養した後、これらの細胞の基礎（Ｃ）ＥＣＡＲ及び（Ｄ）ＯＣＲを記録した。（Ｅ）両遺伝系統（正：lineages）（ＣＡＲＫＬ及びＷＴ対照）に由来する肝細胞をＧＦ又はＧＦＳ含有培地中で培養した後、１時間予め飢餓状態にし（無糖質）、培養培地中１ｇ／Ｌの最終濃度に達するまでグルコースを添加することによってグルコース誘導ＥＣＡＲを測定した（平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝７〜１１）。代謝ｉｎ  ｖｉｖｏ指標として、日中（８ａｍ〜４ｐｍ）及び夜間（８ｐｍ〜４ａｍ）における活動当たりの（Ｆ）呼吸商（ＲＱ）及び（Ｇ）エネルギー消費（ＥＥ、ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５）を間接熱量測定法により決定し、ＣＡＲＫＬと野生型（ＷＴ）同腹子とを比較した。データは平均値、ｎ＝３、±ＳＤを表す。（Ｈ）マウスにおけるインスリン耐性試験を、予め飢餓状態にした（４時間）雌性ＣＡＲＫＬ−トランスジェニック及び野生型同腹子対照に対し、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕのインスリンを腹腔内注射することによって行った。注射前（対照）並びに注射の１５分後、３０分後、４５分後及び６０分後に血糖を測定し、対照に対する％の相対値としてグラフにした。データは平均値±ＳＤ、ｎ＝３〜４を表す。
【図５】（Ａ）ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから単離し、制御培地（ＧＦ）中で培養した肝細胞における脂質沈着をｏｉｌ  ｒｅｄ染色によって可視化した。代表的な顕微鏡写真は２０倍対物レンズを用いて取得した。（Ｂ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を、ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから単離し、制御培地（ＧＦ）中で２日間培養した肝細胞において測定した。矢印はＧ６ＰＤ活性の再局在化を示す。代表的な顕微鏡写真は１０倍対物レンズを用いて取得した。（Ｃ及びＤ）ＷＴ又はＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する破骨細胞を分化させ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏ  ＡｓｓａｙプレートにおいてＧＦ又はＧＦＳ含有培地中で７日間培養した。その吸収活性を、１ウェル当たりの倍率２０倍で目に見える全ての窩を計数することによって評価した。データは平均値、ｎ＝２〜３、±ＳＤを表す。（Ｄ）ＧＦ又はＧＦＳ含有培地で培養したＷＴ破骨細胞に見られる最大の吸収窩の２枚の代表的な画像を示す。顕微鏡写真は倍率４０倍で取得した。
【図６】（Ａ）セドヘプツロースキナーゼ過剰発現マウス（ＣＡＲＫＬ）及び対照同腹子の免疫系を亜致死リポ多糖注射（ＬＰＳ、７ｍｇ／ｋｇ）でチャレンジし、血清中の１９のサイトカインパネルを免疫活性化の２４時間後に測定した。データは、野生型（ＷＴ＝１００％）及びＣＡＲＫＬ血清においてｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｍａｐマウスサイトカインプロファイラーによって測定された個々のサイトカインの相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す（ｎ＝３、±ＳＤ）。ＷＴ及びＣＡＲＫＬマウスの（Ｂ及びＣ）皮下又は（Ｄ及びＥ）精巣上体白色脂肪組織から単離したマウス成熟脂肪細胞の単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）及びＴＮＦａ  ｍＲＮＡ発現。データは平均値、ｎ＝３、±ＳＤを表す。（Ｆ）脳卒中の発症率及びｒｓ４６５５６３遺伝子型。データをピアソンのχ２検定によって比較した。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｇ）初期無脳卒中生存の期間をカプラン−マイヤープロットによって評価した。ｒｓ４６５５６３について同型の個体：［Ｇ］−対立遺伝子は［Ａ］−対立遺伝子のキャリアよりも顕著に短い無症候時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４４】
材料及び方法
糖質
グルコース及びフルクトースはSigma Aldrichから購入した。セドヘプツロースは植物オオベンケイソウ又はムラサキベンケイソウ（sedum telephium）から単離し（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）、クロマトグラフィーによって更に精製した。
【００４５】
ニンジン及びヒト血清におけるグルコース及びセドヘプツロースの測定
オーストリアの「有機栽培保証認定」を有する新鮮なニンジンを小片にスライスし、液体窒素で急速凍結した。同じ手順を室内で栽培したオオベンケイソウ植物の採取したばかりの葉に適用した。各組織の３つのサンプルをプールし、ガラスビーズによって粉末までホモジナイズした。サンプルの糖質に富んだ画分を、１３Ｃ標準を混ぜた２０％Ｈ２Ｏ及び８０％ＭｅＯＨ抽出液によって単離し、質量分析と組み合わせた標準ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）のために処理した。グルコース及びセドヘプツロースをその個々の質量によって同定し、その相対量を１３Ｃ含量に対して正規化した個々の分析物の各々のピーク面積から導いた。グルコース及びセドヘプツロースを、一晩絶食した又はニンジンを供給した個体に由来する等量の血清においても測定した。ニンジンを蒸し、幾らかのオリーブ油、塩及びコショウを風味付けに使用した。ニンジン含有食の２時間前及び２時間後に、ヒト血清をＶＡＣＵＥＴＴＥ（商標）  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐチューブに血液から調製した。血清サンプルを先述のように処理し、上記及びRuiz-Matute AI et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2011) May 15 879(17-18)に詳述されるようにＧＣ−ＭＳによっても分析した。
【００４６】
飲料におけるグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度
指定の飲料は地元の食料品店で購入され、全てパック詰めされているものであった。（４回の技術的反復試験の各々について）各飲料から１ｍｌを取り出し、ＳｐｅｅｄＶａｃで減圧（正：vacuum）濃縮した。これに続いてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（８０：２０）沈殿及び遠心分離工程を行い、沈殿物から上清中の糖質画分を取り出した。各上清をＳｐｅｅｄＶａｃで再び凍結乾燥し、等量の水で再水和し、技術的反復試験試料をプールした。糖質分析のために、Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００  ＤＣ無金属システムをＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１カラム（２５０×４ｍｍ）及びＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１ガードカラム（どちらもDionex製）とともに１ｍＬ／分の流量で用いた。最初の２０分間は溶出を１６ｍＭ  ＮａＯＨによって均一濃度で行った。次いで、２０分〜４０分は１００ｍＭ  ＮａＯＨまでの線形勾配を適用し、続いて２分間かけて２００ｍＭまで増大し、４７分まで保持した。１６ｍＭ  ＮａＯＨによる開始条件を４９分の時点で再び達成し、７０分まで維持した。パルスアンペロメトリック検出のパラメーターは、Dionexの技術注記２１（Ｄｉｏｎｅｘ  ＥＤ４０電気化学的検出器を用いた糖質のパルスアンペロメトリック検出の最適設定）において推奨されるものと全く同じである。クロマトグラムを、各１００μＭの確かなグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース標準のクロマトグラムによって評価した。
【００４７】
ヒト脂肪細胞培養
腹部手術を受けた患者の皮下（正：subcutaneous）白色脂肪組織に由来する間質血管細胞画分（ＳＶＦ）を先述のように（Lindroos et al, Cell Metab. (2013), Jul 2;18(1):62-74.）単離した。簡潔に述べると、脂肪組織をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＩ（Worthington）で消化し、濾過した。ＳＶＦを遠心分離によって成熟脂肪細胞から分離した後、ＳＶＦ画分中の赤血球を溶解させた（Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＬ、Qiagen）。精製ＳＶＦをＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Life Technologies）中で培養した。細胞がコンフルエンスに達し次第、グルコース無含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Biowest）で洗浄し、培地を１．５ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース、又は各１ｇ／Ｌのグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースをそれぞれ含有する全糖質負荷が３ｇ／ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に置き換えた。コンフルエンスの２日後（０日目）に、１μＭデキサメタゾン、１．７４μＭインスリン、５μＭトログリタゾン、０．５μＭ  ＩＢＭＸ、１７μＭパントテン酸及び３３μＭビオチンを添加することによって分化を誘導した。２日後にＩＢＭＸ及びデキサメタゾンを除外し、４日目にインスリン及びトログリタゾンを除去した。６日目に培地の５０％を置き換えた。２日後に細胞をＲＮＡ単離のために採取した（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット、Qiagen）。
【００４８】
成熟マウス脂肪細胞の天井培養
前面及び後面皮下脂肪組織並びに精巣上体白色脂肪組織をトランスジェニックＣＡＲＫＬ−マウス及び野生型同腹子対照から単離した。脂肪組織をヒトサンプルについて上記したように消化した。遠心分離の後、浮遊成熟脂肪細胞の層を除去し、１００ｒｃｆで１０分間再遠心分離した。１５０μＬの充填脂肪細胞を６ウェルプレートにおいてＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ウシ血清（ＰＡＡ）中、浮動カバーガラス下で培養した。単離の２４時間後に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、培地を１．５ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース、又は各１ｇ／Ｌのグルコース、フルクトース及びセドヘプツロースをそれぞれ含有する全糖質負荷が３ｇ／ＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換した。３日後に、細胞をＲＮＡ単離のためにＴＲＩ試薬（Sigma）を用いて採取した。
【００４９】
肝細胞培養
肝細胞を雄性野生型及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから、マウスを肝臓ｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ灌流によって屠殺した後に単離した。灌流後、肝臓を迅速に取り出し、細片化し、セルストレーナー（Fisher Scientific, Inc）を通して５０ｍｌ容の滅菌チューブに濾過した。得られる濾液中の肝細胞を遠心分離工程によって非実質細胞から精製した。単離肝細胞を、１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌの指定の糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を含有する各ＤＭＥＭ培地１ｍｌ当たり０．２５×１０６の濃度でプレートに少なくとも２日間播種した後、実験を行った。
【００５０】
骨髄由来マクロファージ及び破骨細胞の培養
マウスの骨を雄性野生型及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスから摘出し、骨髄をフラッシュし、洗浄し、溶解により赤血球を除去し、続いて２５ｍＭグルコース及び２０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ中で分化させた。４日後に、破骨細胞分化用の細胞を採取し、分化培地の入ったｃｏｒｎｉｎｇ  ｏｓｔｅｏ  ａｓｓａｙプレートに播種し（下記を参照されたい）、初代骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）のために培地を取り替え、更にＭ−ＳＣＦを２日間添加した。次いで、分化ＢＭＤＭを１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌの指定の糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を含有する各ＤＭＥＭ培地に少なくとも２日間播種した後、実験を行った。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ骨吸収アッセイ
破骨細胞前駆体細胞（２０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦで４日間処理した骨髄細胞）を、２４ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏ  Ａｓｓａｙプレートに１０％ＦＢＳ及び３ｇ／Ｌのグルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ）を含有するα−ＭＥＭ培地中、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下でプレーティングした。培地を３日毎に取り替えた。７日後に、細胞を漂白剤によって取り出し、水で３回洗浄した後、Corning（技術審査）の標準プロトコルに従うＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を行い、無傷アッセイ表面と吸収窩とのコントラストを強調させた。各ウェルの全体を、２０倍対物レンズを備えるＴｉｓｓｕｅＦａｘによって撮影し、目に見える全ての吸収窩を計数し、盲検で分析した。
【００５２】
細胞外酸性化速度及び酸素消費速度
ＸＦ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（Seahorse Bio.）を用いて、種々の糖質によって誘導される細胞代謝の変化を測定した。細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ、ｍｐＨ／分）及び酸素消費速度（ＯＣＲ、ｐｍｏｌ／分）を、初代ヒト脂肪細胞及び初代マウス肝細胞において製造仕様書に従って記録した。簡潔に述べると、細胞を脂肪細胞については１ウェル当たり１０４細胞、肝細胞については１ウェル当たり０．５×１０５細胞の密度でseahorseの細胞プレートに播種した。実験日に細胞を糖質無含有培地で洗浄し、糖質ミックス（グルコース及びフルクトース（ＧＦ）、又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ））を３ｇ／Ｌの濃度で含有する指定の培地中で１時間インキュベートした。グルコース誘導ＥＣＡＲを測定するために、細胞を炭素無含有培地で１時間飢餓状態にした後、自動注入によりグルコース（１ｇ／Ｌ）をウェルに添加した。グルコース誘導ＥＣＡＲをグルコース添加前のそれぞれのＥＣＡＲ（基礎＝１００％）に対して正規化した。種々の糖質源によって誘導される変化は、各炭素源の影響を示す相対変化（％）として表した。
【００５３】
遺伝子発現分析
簡潔に述べると、市販のキット（QIAGEN、Applied Biosystems）を用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲをＡｂｉＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴリアルタイムサイクラーでｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（BioRad）を用いて行い、ＣＡＲＫＬ、アディポネクチン、ＵＣＰ−１、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１及びβ−アクチンの発現を先述のように（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）測定した。標的遺伝子の発現をβ−アクチンの発現に対して正規化した。標的遺伝子の相対発現はΔΔＣＴ法によって算出した。
【００５４】
セドヘプツロースキナーゼアッセイ
ＡＤＰ  Ｑｕｅｓｔアッセイ（DiscoveRx）を用いて、ＡＤＰ蓄積による経時的なＳ７Ｐ形成を製造仕様書に従って間接的に測定した。組み換えセドヘプツロースキナーゼを大腸菌（E. coli）において予め産生させ、アフィニティー精製によって精製した（Haschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。
【００５５】
間接熱量測定法
マウスの活動当たりの呼吸商（ＶＣＯ２産生／ＶＯ２消費）及びエネルギー消費（ＥＥ、ｋｃａｌ／日／ｋｇ０．７５）を、代謝ケージ（Harvard Apperatus）において間接熱量測定法によって測定した。ＣＡＲＫＬトランスジェニックマウス又は野生型同腹子のいずれか１匹を、１つのケージに１日収容した後、日中（８ａｍ〜４ｐｍ）及び夜間（８ｐｍ〜４ａｍ）の活動当たりの平均呼吸商及びエネルギー消費の記録を開始した。
【００５６】
インスリン耐性試験
４時間予め飢餓状態にした雌性ＣＡＲＫＬ−トランスジェニックマウス及び野生型同腹子対照に、体重１ｋｇ当たり０．７５Ｕのインスリンを腹腔内注射した。血糖を注射前並びに注射の１５分後、３０分後、４５分後及び６０分後にワンタッチグルコースストリップ（Ａｃｃｕ  Ｃｈｅｃｋ、Roche）を用いて測定した。
【００５７】
Ｏｉｌ  Ｒｅｄ染色
簡潔に述べると、肝細胞を指定の通りに培養した後、培地を除去し、細胞を１０％ホルマリンで固定した。６０％イソプロパノールで洗浄した後、ウェルをＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液（Sigma-Aldrich）とともにインキュベートして１０分間染色し、水で４回洗浄した後、倍率２０倍で写真を撮影した。
【００５８】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性アッセイ
細胞をポリスチレン容器組織培養処理ガラススライド上で成長させ、液体窒素で急速凍結し、−８０℃に維持した。酵素組織化学的手順はVan Noorden and Frederiksに記載のテトラゾリウム塩法に基づくものとした。Ｇ６ＰＤ活性の実証のためのインキュベーション培地は、０．１Ｍトリスマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）、１５ｍＭグルコース−６−リン酸、０．８ｍＭ  ＮＡＤＰ、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、０．４５ｍＭ  １−メトキシフェナジンメトスルフェート、５ｍＭアジ化ナトリウム及び５ｍＭテトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド中に１８％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（平均分子量７００００〜１０００００）を含有するものとした。培地はインキュベーションの直後に新たに調製した。対照反応物は４０ｍＭグルコサミン−６−リン酸を付加的に含有するものとした。細胞をオービタルシェーカーによる連続混合下、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を６０℃のリン酸緩衝食塩水で３×５分間洗浄し、乾燥させ、グリセロールゼラチンにマウントし、１日以内に倍率１０倍で撮影した。
【００５９】
免疫チャレンジ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン応答プロファイリング
亜致死マウスｉｎ  ｖｉｖｏ内毒素血症のために、７ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（Sigma Aldrich）を雄性ＣＡＲＫＬトランスジェニック又は野生型同腹子に腹腔内注射した。血清をＶＡＣＵＥＴＴＥ（商標）  ｍｉｎｉ  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐチューブによって全血から単離した。サイトカインを、ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  ｍａｐマウスサイトカインプロファイラーにより製造仕様書（Millipore）に従って測定した。全ての動物実験を、倫理動物使用許可プロトコル及びウィーン医科大学によって認可される規約（ＢＭＷＦ−６６．００９／０１４０−ＩＩ／１０ｂ／２０１０）に従って行った。
【００６０】
脳卒中リスクによるＣＡＲＫＬ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）関連研究
研究設計：２００３年３月までに集められたInflammation and Carotid Artery - Risk for Atherosclerosis Study（ＩＣＡＲＡＳ、Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.）の５７８人の神経学的に無症候の患者を本分析に選定した。選定及び除外基準は以前に公表されている。簡潔に述べると、第一の選定基準である無症候性頸動脈疾患は、過去１２ヶ月間に一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、一過性黒内障及び脳卒中又は残存症状がそれぞれないことと定義される。徹底的な健康診断（既往歴、身体状態及び血液検査を含む）に加えて、患者にベースライン時及び研究選定後６ヶ月〜９ヶ月の経過観察時に頸動脈の超音波検査を先述のように（Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.）行った。心血管イベントの発生率を２００６年１月まで記録した。この分析は地方倫理委員会によって認可され（ＥＣ−Ｎｏ．１９３３／２０１２）、ヘルシンキ宣言及びその修正条項に指定される倫理基準に従って行われた。
【００６１】
定義：動脈性高血圧は、１４０／９０ｍｍ  Ｈｇを超える安静時血圧の繰り返しと定義され、降圧薬を与えられる患者に見られると推定した。高脂血症は全血清コレステロールが２００ｍｇ／ｄＬを超えるか又はＬＤＬコレステロールが１３０ｍｇ／ｄＬを超える患者で診断され、脂質低下薬を服用する全ての患者に見られるとみなした。真性糖尿病は真性糖尿病の診断及び分類に関する専門委員会によって想定される通りに診断した。末梢動脈疾患はフォンテイン分類体系を用いて段階分けし、冠動脈疾患はカナダ循環器学会（ＣＣＳ）による分類に従って規定した。既往の心筋梗塞はAlpertに従って規定した。脳卒中は２４時間超持続する神経学的欠損によって規定し、修正ランキン脳卒中尺度に従って評価した。頸動脈アテローム性動脈硬化症の進行は、少なくとも１のＮＡＳＣＥＴ血管造影度での狭窄の増大と定義した。
【００６２】
遺伝子型決定：ＤＮＡをＥＤＴＡ抗凝固処理全血からスピンカラムベースの核酸精製を用いて単離した。遺伝子型決定をＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（商標）  ７９００ＨＴ  ｆａｓｔ−ｒｅａｌｔｉｍｅサーモサイクラー（Applied Biosystems，Rotkreuz，Switzerland）で５’−ヌクレアーゼアッセイを用いて行った［７］。このアッセイは標識ＤＮＡプローブの配列特異的結合を含む。各工程のアニーリング段階において、フルオロフォアを５’末端に含有する配列特異的プローブがそれぞれの対立遺伝子に結合する。フルオロフォアの蛍光を、伸長段階において５’−Ｔａｑ−ポリメラーゼによってこれらの化合物がその５’−エキソヌクレアーゼ活性により分離されるまで３’−クエンチャーによってマスクする。配列特異的な蛍光の強度のエンドポイント測定から、対応する対立遺伝子の存在が示される。本研究では、ｒｓ４６５５６３を１０μＬの全反応量で市販のＴａｑＭａｎ（商標）  ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（アッセイＩＤ：Ｃ＿＿＿＿７１７３５８＿１＿、Applied Biosystems）及びＴａｑＭａｎ（商標）  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applied Biosystems）を用い、製造業者が提供する標準プロトコルに従って分析した。結果をＳＤＳ  ２．４配列検出ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて解釈した。
【００６３】
統計分析：連続データを、その分布に関して平均及び標準偏差又は中央値及び四分位範囲として示す。カテゴリーデータは数及びパーセンテージとして示す。サブグループ内の正規分布の存在はコロモゴロフ−スミノフ検定によって評価した。計量変数はマン−ホイットニーのＵ検定によって比較した。遺伝子型と研究エンドポイント及び相対リスクとの関係性は分割表及びピアソンのχ２検定によって推定した。無症候生存をカプラン−マイヤー分析によって推定し、データをログランク（マンテル−コックス）検定によってペアワイズ比較した。多変数モデルを、二値ロジスティック回帰を用いて算出し、ＲＯＣ（受信者操作特性）プロットを描くことによって評価した。結果は特に指定のない限りｐ＜０．０５で統計的に有意とみなした。全てのｐ値は特に明記しない限り両側と解釈した。全ての統計的計算をＩＢＭ  ＳＰＳＳ  ２０．０（IBM Corporation，Armonk，USA）を用いて行った。
【００６４】
結果
ヒトにおける食事由来のセドヘプツロースの取込み
セドヘプツロースが代謝活性糖質となるのに極めて重要な工程である、栄養セドヘプツロースが食事から消化管を介してヒト血液に吸収されるか否かを決定するために、グルコース（Ｃ６）及びセドヘプツロース（Ｃ７）レベルをニンジン及びヒト血清において測定した。ニンジンにおけるＣ６／Ｃ７比を決定するために、植物組織をホモジナイズし、小分子画分を抽出し、同時に相対グルコース及びセドヘプツロース量をＧＣ−ＭＳによって測定した（図１Ａ）。高いセドヘプツロースレベルを有する多肉植物であるオオベンケイソウの葉を、陽性対照として並行して分析した。オオベンケイソウの葉はグルコース及びおよそ２倍多いセドヘプツロースを含有しており、およそ０．５のＣ６／Ｃ７比が得られた。新鮮な食品グレードの有機ニンジンでは、ほぼ同量のグルコース及びセドヘプツロースが検出され、したがってＣ６／Ｃ７比はおよそ１であった。ジャガイモはニンジンとは対照的に、セドヘプツロースを含有しないことが報告されており（Kardon et al., FEBS Lett. (2008) Oct 15, 582(23-24)）、したがって非常に高い（又は更には無限の）Ｃ６／Ｃ７比を有すると期待される。次に、ニンジンからの食事由来のセドヘプツロースがヒト血液に達するか否かについて、幾らかのオリーブ油、塩及びコショウとともに主に蒸したニンジンを含有する食事（成人男性で約７００ｇ）の前後にグルコース及びセドヘプツロースの血清レベルをモニタリングすることによって検討した。食事の２時間後に、セドヘプツロース血清レベルのおよそ２倍の増大がヒトで観察された（図１Ｂ）。この結果から、栄養セドヘプツロースがヒト消化管によって吸収され、血液に入り、その後の代謝で糖質として利用可能となることが明らかに示された。血清グルコースレベルは食品摂取後２時間以内に既に平常値に戻り、それによりヒトがセドヘプツロース及びグルコースを異なって代謝することが示唆される。
【００６５】
これらの結果から、健康に良い野菜であり、世界中の食事の構成要素であるとみなされるニンジンがヒトにとって天然のセドヘプツロース源であることが示される。興味深いことに、ニンジンがグルコース等の糖質を含有するにもかかわらず好適であり、糖尿病への良好な耐容性を示し、更には２型糖尿病に共通の遺伝的危険因子を有する人を保護することが言及される（Patel CJ et al., Hum Genet. 132 (2013): 495-508）。
【００６６】
天然の及び加工ヒト用食品におけるＣ６／Ｃ７比
次に、グルコース、フルクトース及びセドヘプツロースの濃度をＣｏｃａ−Ｃｏｌａ（商標）、Ｒｅｄ  Ｂｕｌｌ（商標）、オレンジジュース、リンゴジュース、トマトジュース及びニンジンジュースの糖質抽出物において測定し、一般的な飲料のＣ６／Ｃ７指数を確立し、それにより実際のヒトセドヘプツロース曝露について推定した。ソフトドリンク及び栄養ドリンクはグルコース及びフルクトースを含有したが、セドヘプツロースは含有しなかった（図１Ｃ）。フルーツジュースはソフト／栄養ドリンクと同量のＣ６（グルコース及びフルクトースの総和）を含有していたが（１００ｍＭ範囲）、ソフト／栄養ドリンクとは対照的にセドヘプツロースも１００μＭ範囲で含有していた。野菜ジュースではグルコース及びフルクトースレベルは低下し、セドヘプツロース濃度が大幅に増大することが見出された（ｍＭ範囲）。モル比及び重量比として算出された個々の飲料のＣ６／Ｃ７比を図１Ｄに示す。２つのフルーツジュースでおよそ２０００／１のＣ６／Ｃ７比が見出された。トマトジュース及びニンジンジュースでは、この比はそれぞれ７５／１及び２０／１であり、Ｃｏｃａ−Ｃｏｌａ（商標）及びＲｅｄ  Ｂｕｌｌ（商標）は検出可能な量のセドヘプツロースを含有していなかった。したがって、これらの飲料のＣ６／Ｃ７比は算出することができず、したがって付加的にＣ７を添加しない場合、かかる食品では該当なし（Ｎ．Ａ．）である。これらの発見から、加工食品が複合糖質、ひいてはセドヘプツロースを欠いていることが明らかに示される。特に、これらのデータは絶対数で、ニンジンジュースの天然炭素混合物がソフト／栄養ドリンクよりも選ばれる場合、９ｋｇの食事由来のグルコース当たり１ｋｇの食事由来のセドヘプツロースが消費されることを示し、バランスの悪いヒトの栄養摂取による慢性セドヘプツロース欠乏の結果は現在知られていない。
【００６７】
セドヘプツロースキナーゼは変動し、代謝的に活性な組織において高度に発現される
セドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ、ひいてはセドヘプツロース代謝が様々な哺乳動物組織でどのように分布及び制御されるかを理解するために、種々の組織をｍＲＮＡ発現レベルについて試験した。公表されている概日発現プロファイルのデータベース（ＣｉｒｃａＤＢ）では、ＣＡＲＫＬ発現はマウス肝臓（周期２０．０、図２Ａ）及び副腎（周期２４．０、データは示さない）において変動することが見出された。セドヘプツロース−７Ｐレベルは植物において変動し、リボース部分を再変換する炭素固定の再生期にピークに達することが以前に報告されている。哺乳動物の概日時計は一部酸化還元状態によって定められている。ＣＡＲＫＬ過剰発現ＲＡＷ２６４．７細胞により、高セドヘプツロースキナーゼ発現が還元ニコチンアミド、アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）のような酸化還元因子の４倍の増大、更にはグルタチオン（ＧＳＨ）レベルの増大を誘導することが示された（図２Ｂ及びHaschemi et al., Cell Metab. 15 (2012), 813-826）。ＣＡＲＫＬの欠乏、ひいてはセドヘプツロース代謝回転の欠如は逆の効果を示した（図２Ｃ）。このデータから、セドヘプツロース代謝が概日リズムの制御下にあり、同時に細胞酸化還元状態の調節因子として作用することが示される。どの組織が栄養セドヘプツロースを消費するかを特定するために、セドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）のｍＲＮＡレベルをマウスｃＤＮＡ組織ライブラリーにおいて測定した（図２Ｄ）。セドヘプツロースキナーゼはセドヘプツロース代謝の律速酵素であり、肝臓、腎臓、褐色及び白色脂肪組織（ＢＡＴ及びＷＡＴ）、消化器、腺、男性生殖器系並びに脳において高度に発現された。これらの結果から、食事由来のセドヘプツロースが多くの組織、特に肝臓、腎臓及び脂肪組織等の代謝的に活性な臓器にとって全身性の糖質源となり得ることが実証される。
【００６８】
セドヘプツロース代謝は細胞の機能及び代謝健康に重要である
セドヘプツロースへの曝露の代謝結果を調査するために、全糖質負荷を一定に維持しながら培養培地中のヒト及びマウス細胞をフルクトースと組み合わせたグルコース（ＧＦ）又はグルコース、フルクトース及びセドヘプツロース（ＧＦＳ）に曝露した。脂肪細胞、肝細胞及びマクロファージの機能を試験して、栄養糖質負荷を補完するセドヘプツロースの重要性を評価した。これらの実験に用いたセドヘプツロースはムラサキベンケイソウ植物から単離した。
【００６９】
ヒト身体においては、脂肪細胞はエネルギーを脂質の形態で貯蔵するという重要な機能を果たし、したがって健康を維持する上で非常に重要な細胞である。代謝的に不健康な又は大半の病的肥満患者では、脂肪細胞は適切に機能せず、過度の脂質負荷の原因となる細胞サイズの増大を起こし、炎症性となり（メタ炎症、軽度であるが慢性型の炎症）、最終的にインスリン耐性又は心血管疾患のような障害の発症に寄与する。皮下前駆体細胞から分化したヒト脂肪細胞では、セドヘプツロースを培養培地に添加した場合にセドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ  ｍＲＮＡ発現の増大が見られた（図３Ａ）。さらに、２つの機能関連脂肪細胞マーカー遺伝子であるアディポネクチン及びＵＣＰ−１の発現の増大が、ＧＦ処理細胞と比較してＧＦＳ処理細胞において観察された（図３Ｂ及び（und）図３Ｃ）。細胞代謝の変化を試験するために、細胞酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をそれぞれミトコンドリア呼吸及び乳酸発酵の指標として測定した。セドヘプツロース含有培地で分化及び培養したヒト脂肪細胞はＷＴ対照と同等のＥＣＡＲを示したが、その細胞酸素消費速度は増大していた（図３Ｄ及び図３Ｅ）。
【００７０】
まとめると、これらのデータから、皮下脂肪細胞がグルコース及びフルクトースのみが生物燃料として存在する状況と比較して、セドヘプツロースの存在下でその機能（アディポネクチン、ＵＣＰ−１及び酸素消費の増大）を維持及び改善することが示される。
【００７１】
軽度の慢性炎症のような代謝的に不健康な状態の予防におけるセドヘプツロースの有益な役割をより良く規定するために、ＧＦ又はＧＦＳ培地で培養した初代成熟マウス脂肪細胞、初代マウス肝細胞、並びに未感作及びリポ多糖（ＬＰＳ）誘導活性化初代マクロファージのサイトカインプロファイルを測定した。セドヘプツロース含有培地で培養した成熟脂肪細胞は、グルコース及びフルクトース単独で培養した脂肪細胞よりも少ないＴＮＦａ及びＩＬ−６  ｍＲＮＡを産生した（図３Ｆ及び図３Ｇ）。これと同様に、肝細胞もセドヘプツロースとともに培養した場合により少ないＩＬ−６を産生した（図３Ｈ）。初代マクロファージでは、基礎ＴＮＦａ及びＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現並びにサイトカイン分泌がセドヘプツロース含有培地によって阻止されることが見出された（図３Ｉ〜図３Ｌ）。ＬＰＳ誘導マクロファージ活性化は、ＧＦ培養細胞においてＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６分泌の強い増強をもたらした（図３Ｍ及び図３Ｎ）。ＧＦＳ培地中で培養したＬＰＳ誘導マクロファージは、ＩＬ−６をＧＦ処理マクロファージと同等のレベルまで増大したが、そのＴＮＦａ分泌はおよそ４０％低減した。これにより、マクロファージへのセドヘプツロースの添加が一方ではＴＮＦａ及びＩＬ−６によって測定される基礎炎症状態を低減し、他方ではＩＬ−６に見られるような自然な免疫機能を保持することが示される。
【００７２】
結論として、培養培地へのセドヘプツロースの添加は皮下脂肪細胞の機能を顕著に増強し、細胞の炎症状態を低減し、それによりまた、代謝症候群に部分的にまとめられる肥満、２型糖尿病及び心血管疾患の発症機序に良好な影響を与え得る。
【００７３】
セドヘプツロースキナーゼＣＡＲＫＬ過剰発現
セドヘプツロースキナーゼを全身で遍在的に過剰発現するトランスジェニックマウスを、ＣＡＲＫＬを過剰発現する遺伝子組み換え初代細胞を単離し、セドヘプツロース代謝をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために生成した。ＣＡＲＫＬトランスジェニックマウスは任意の明らかな表現型を示さず、その臓器重量はＷＴ同腹子対照動物の臓器重量とは異なっていなかった（データは示さない）。セドヘプツロース代謝の増大が基質セドヘプツロース濃度の増大、又はその律速酵素であるセドヘプツロースキナーゼ（ＣＡＲＫＬ）のレベルの上昇によって達成され得ると仮定された。これをｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて試験するために、一定量の組み換えＣＡＲＫＬタンパク質を漸増用量のセドヘプツロースとともにインキュベートした。これにより、ＡＤＰ形成によって測定されるセドヘプツロース代謝回転率が増強した（図４Ａ）。同じ効果がＣＡＲＫＬタンパク質濃度の増大によっても観察されたが、セドヘプツロース濃度は一定に維持されていた（図４Ｂ）。これらの結果から、ＣＡＲＫＬ過剰発現がセドヘプツロース代謝の増大の効果を調査するのに有効なモデルであることが実証される。次に、肝臓組織がセドヘプツロースを内因的に代謝するようであったため（図２Ｄ）、増大させたＣＡＲＫＬ発現レベルでのＣ７及びＣ６代謝の効果を研究するために初代肝細胞を単離した。
【００７４】
肝細胞をＣ６／Ｃ７糖比が２：１の培地中で培養し、より一般的な代謝パラメーターとしてＥＣＡＲ及びＯＣＲを比較することによって代謝的に評価した。ＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する肝細胞は、ＷＴ対照細胞と比較して示されるＥＣＡＲ及びＯＣＲレベルの増大とともにその代謝率を顕著に増大した（図４Ｃ及び図４Ｄ）。セドヘプツロースはこれらの細胞においてより効率的な代謝を誘導するようであった。セドヘプツロース及びセドヘプツロースキナーゼ発現の互いの関連性を試験するために、ＷＴ及びＣＡＲＫＬマウスから単離した肝細胞をＧＦ及びＧＦＳ含有培養培地中でインキュベートし、そのグルコース誘導ＥＣＡＲを（１時間の糖質飢餓後に）細胞解糖を制御する手段として比較した。ＷＴ肝細胞では、グルコース誘導ＥＣＡＲはセドヘプツロース投与によって低減した（図４Ｅ）。このデータと一致して、ＧＦ（セドヘプツロースを含まない）で培養したＷＴ動物に由来するグルコース刺激肝細胞はより大部分のグルコースを乳酸発酵に送り、ＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する細胞は同じグルコースボーラスのバランスをより効率的に保つようであった。
【００７５】
これらの結果は以前のデータを更に支持し、セドヘプツロース代謝の増大が代謝健康に重要な細胞に対して明確かつ有益な効果を有することを明らかに指摘するものであった。
【００７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのセドヘプツロース代謝
肝細胞におけるセドヘプツロースキナーゼ過剰発現の細胞表現型を確認した後、生物全体に対するセドヘプツロース代謝回転の増大の代謝効果を、代謝の全身指標として日中及び夜間における間接熱量測定法によって測定される対照及びセドヘプツロースキナーゼトランスジェニックマウスの身体活動当たりの呼吸商（ＲＱ；ＲＱ＝呼気ＣＯ２／酸素消費）及びエネルギー消費を比較することによって調査した（図４Ｆ及び図４Ｇ）。セドヘプツロースキナーゼ過剰発現動物（ＣＡＲＫＬ）は、野生型（ＷＴ）同腹子と比較してより低いＲＱ値を有する。ＣＡＲＫＬマウスは酸素消費の増大、ひいてはＲＱ値の低下を示し、それにより細胞に対するセドヘプツロースの効果を一部反映していた。さらに、ＣＡＲＫＬマウスは対照マウスと比較してより低い活動当たりのＥＥを有する傾向がある。雌性ＣＡＲＫＬトランスジェニック及びＷＴマウスのインスリン感受性もインスリン耐性試験（ＩＴＴ）によって比較し、セドヘプツロース代謝がｉｎ  ｖｉｖｏでインスリンシグナル伝達にも影響を及ぼすか否かを調査した。インスリン注射（腹腔内）はセドヘプツロースキナーゼを過剰発現するマウスにおいてＷＴ対照よりも迅速に血糖レベルを低下させ、これらの動物においてセドヘプツロース代謝の増大によってもインスリン感受性が増大することが示された（図４Ｈ）。これに関連して、ＴＮＦａ及び低酸素症治療による成熟脂肪細胞におけるインスリン耐性の誘導がセドヘプツロースキナーゼ喪失を生じることに言及することが重要である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM1261655で利用可能な公開遺伝子発現包括データ）。
【００７７】
まとめると、これらの実験から、セドヘプツロース代謝の増大がｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏでも代謝を変化させることが示された。身体活動当たりのＥＥ低下の傾向及びインスリン感受性の増大を伴うＣＡＲＫＬマウスで観察されるＲＱ値の低下は、セドヘプツロース代謝の増大によって誘導することができるより効率的かつ持続的な代謝プログラムの指標となる。
【００７８】
肝臓脂質沈着はＣＡＲＫＬによって低減する
肝細胞における広範な脂質沈着は脂肪肝疾患を生じ、肝線維症、肝硬変、最終的には肝細胞癌腫を引き起こす炎症（すなわち非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））を伴い得る。ＷＴ及びＣＡＲＫＬ過剰発現マウスに由来する肝細胞の脂質含量を比較すると、ＣＡＲＫＬマウスに由来する肝細胞がそのＷＴ対照よりも少ない脂肪滴を含有することが見出された（図５Ａ）。
【００７９】
結論として、特に炎症を併発する脂肪細胞の機能異常を含む高肝臓脂肪含量は、２型糖尿病又は癌を含む多くの疾患のリスクを増大し、そのためセドヘプツロースによる炎症及び肝細胞の脂質蓄積の低減の両方がヒトの栄養摂取において特に有益であり得る（高いＣ７レベルを有する野菜から明らかである）。
【００８０】
ＣＡＲＫＬはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を調節する
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の酸化アームの律速酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）は、すなわちヌクレオチド合成及び酸化還元当量のためのＣ５体を生成するものであり、ｐ５３（腫瘍抑制因子）によって直接阻害されることが以前に示されている（Jiang et al., Nat Cell Biol. (2011) Mar; 13(3):310-6）。ヒト腫瘍において最も頻繁に突然変異する遺伝子であるｐ５３の突然変異は、Ｇ６ＰＤの過活性化及び肝細胞における脂質蓄積を生じる。セドヘプツロースキナーゼはＰＰＰの非酸化的アームの律速キナーゼであり、少なくともマクロファージにおいて酸化的ＰＰＰフラックスを低減することが以前に示されている。セドヘプツロース代謝による肝細胞のＧ６ＰＤ活性の起こり得る調節を試験するために、ＷＴ及びＣＡＲＫＬ過剰発現細胞の酵素活性を比較した（図５Ｂ）。ＷＴ対照細胞では、Ｇ６ＰＤ活性は均等に分布することが観察され、ＣＡＲＫＬマウスに由来する細胞では細胞の内部空間におけるＧ６ＰＤの再局在化、ひいては活性の低減が観察された。興味深いことに、ＷＴ細胞を、セドヘプツロースを含む細胞培養培地中でインキュベートすることによって同じ表現型が達成された（図示せず）。セドヘプツロースキナーゼ過剰発現及びセドヘプツロースインキュベーションによるＧ６ＰＤの再局在化及び／又は阻害が、肝細胞における脂質蓄積の低減の原因であるか否か（図４Ａ）については未だ確立されていない。それにもかかわらず、このデータをマクロファージのデータと組み合わせることで、場合によっては少なくともＧ６ＰＤ活性を負に調節することによって、セドヘプツロースレベルの上昇が癌細胞におけるｐ５３喪失の対抗手段となり得ることが示される。別の例は、成長因子エストロゲンに応答してＣＡＲＫＬ発現が減少し（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/; ID: 53372898; GDS3285 / 219713_at / SHPKで利用可能な公開ＧｅｎｅＣｈｉｐ保存データ）、更にＧ６ＰＤ活性及び続く腫瘍成長の増大を生じ得るエストロゲン依存性乳癌細胞である。
【００８１】
また、このデータから、セドヘプツロース代謝がＧ６ＤＰ活性の調節及び今後の抗癌戦略に好適な標的とされる。
【００８２】
セドヘプツロース及び骨代謝
骨は極めて動的な組織である。骨の形成と吸収との絶妙なバランスは骨の適当な機械的安定性に極めて重要である。骨の形成と吸収と間の不均衡は、骨脆弱性及び病的骨折を引き起こす骨密度減少及び骨微細構造の障害の高度に蔓延する病態である骨粗鬆症の原因となる。骨吸収に関与する細胞である破骨細胞はその機能がセドヘプツロース代謝に強く影響を受ける単球系に由来するため、破骨細胞の機能がＣ６／Ｃ７比によって調整され得るか否かも試験した。
【００８３】
骨髄細胞を、細胞をＲＡＮＫＬと組み合わせたＭ−ＣＳＦに曝露することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで破骨細胞へと分化させた。細胞を、骨吸収活性の基質を供給する骨ミネラルマトリックスをウェルの底面にプレコートしたプレートで培養した。基質吸収の分析から、培養培地におけるＣＡＲＫＬ過剰発現及びＣ７含量の増大の両方が破骨細胞による窩形成を低減することが明確に実証された（図５Ｃ）。興味深いことに、セドヘプツロースの非存在下でのみより大きな吸収窩が見られた（図５Ｄ）。
【００８４】
また、このデータはバランスの取れたＣ６／Ｃ７比が健康の維持に極めて重要であり、Ｃ７が病態生理学的状況、すなわちヒトにおける骨粗鬆症を緩和する可能性があるという本発明の概念を支持するものである。
【００８５】
セドヘプツロースキナーゼは動物の免疫応答を調節する
急性免疫活性化モデル及び成熟脂肪組織の軽度の炎症におけるＣＡＲＫＬ過剰発現、及びマウス免疫系に対するその影響のデータを本実施例によって提示する。ＣＡＲＫＬマウスにおいて急性炎症を亜致死リポ多糖（ＬＰＳ）注射によって誘発すると、野生型対照に比較したサイトカイン応答の抑制が生じた（図６Ａ）。１９のサイトカインパネルを、ＬＰＳ注射（７ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の２４時間後に単離したＷＴ及びＣＡＲＫＬマウス血清においてマウスサイトカインプロファイラーによって測定した。１２のサイトカインが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲＫＬ過剰発現によって調節されるサイトカインを強調するカットオフと定義される５０％平均変化の閾値に達した。ＩＬ−１３、ＭＩＰ１α、ＲＮＡＴＥＳ、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ１、ＫＣ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１５は、野生型同腹子と比較してＣＡＲＫＬマウスにおいて少なくとも５０％の平均変化で減少した。サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１５は更に７５％平均変化の閾値に達した。急性炎症に加えて、成熟脂肪組織における炎症性サイトカインの基礎レベルもＣＡＲＫＬ及びＷＴ対照マウスの２つの異なるデポー（皮下及び精巣上体脂肪組織）で評価した。ＬＰＳ誘導炎症、ＴＮＦａ及びＭＣＰ１のｍＲＮＡレベルの低減と一致して、マクロファージを脂肪組織に動員し、炎症性サイトカインに属する初代アディポカインがＣＡＲＫＬ過剰発現によって鈍化することが見出された（図６Ｂ〜図６Ｅ）。
【００８６】
このことから、セドヘプツロースを含有する栄養補給剤が急性及び軽度の慢性炎症を抑える可能性があることが示される。したがって、栄養的又は臨床的に適用されるセドヘプツロースによるＣ７代謝の標的化は、炎症及び関連障害を低減するのに効果的な手段のようである。
【００８７】
ＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は脳卒中のリスクと関連する
Inflammation and Carotid Artery - Risk for Atherosclerosis Study（ＩＣＡＲＡＳ、Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209）の５３５人の神経学的に無症候の患者をＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲにおけるｒｓ４６５５６３［Ａ］→［Ｇ］置換について遺伝子型決定した。３３人（６．２％）の患者が観察期間中に脳卒中を患った。これらの患者では、ｒｓ４６５５６３対立遺伝子の分布は残りの研究集団の対立遺伝子頻度と比較して顕著に異なっていた（χ２＝１２．６３９、ｄｆ＝２、ｐ＝０．００２、図６Ｆを参照されたい）。詳細には、［Ｇ］−対立遺伝子の同型のキャリアは［Ａ］−同型個体と比較して３．９３（９５％ＣＩ：１．７２〜９．０１）、異型個体と比較して３．１０（９５％ＣＩ：１．４０〜６．８７）の相対リスクをそれぞれ有していた。ｒｓ４６５５６３遺伝子型情報の統計的独立性を、年齢、性別、心筋梗塞及び脳卒中の病歴、ニコチン消費、体格指数並びに幾つかの併存疾患（脂質異常症、高血圧、真性糖尿病）を共変量とする二値ロジスティック回帰モデルによって評価した（モデル：χ２＝３０．４７６、ｄｆ＝１１、ｐ＝０．００１）。このモデルでは、［Ｇ］；［Ｇ］遺伝子型のキャリア状態（オッズ比＝５．０１５、９５％ＣＩ：１．８０３〜１３．９４３）が［Ａ］−対立遺伝子について同型の患者と比較した場合の有意な予測因子として与えられる。さらに、初期無脳卒中生存時間がｒｓ４６５５６３キャリア状態に依存するか否かを、カプラン−マイヤープロットを描くことによって評価した。実際に、［Ｇ］−対立遺伝子の同型キャリア（１５１８．３日、９５％ＣＩ：１４１９．２〜１６１７．４）は異型個体（１６１９．１日、９５％ＣＩ：１５８４．８〜１６５３．３、ｐ＝０．００５）及び［Ａ］；［Ａ］−遺伝子型のキャリア（１７８８．１日、９５％ＣＩ：１７５５．７〜１８２０．４、ｐ＝４．９〜１０−４）よりも顕著に短い無症候生存を示した（図６Ｇ）。ｒｓ４６５５６３：［Ｇ］−対立遺伝子について同型の個体は、［Ａ］−対立遺伝子のキャリアよりも顕著に短い無症候時間を示す。
【００８８】
この臨床的関連性の機構的背景は未だ明らかにされていない。しかしながら、マクロファージ分極化を調整するＣＡＲＫＬの能力並びにマクロファージ分極化のアテローム斑の形成及び進行における重要な役割を考えると、アテローム斑におけるマクロファージ分極化の調整によってｒｓ４６５５６３多型は心血管イベントのリスクに影響を与える可能性があるようである。この考えは、ＣＡＲＫＬ遺伝子の３’−ＵＴＲが主にマクロファージにおいて転写されるという本発明による観察によって支持される。
【００８９】
結論として、この関連性並びに脂肪細胞、肝細胞及びマクロファージの代謝及び機能に関する提示のデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの炎症の低減及びインスリン感受性の増強と合わせて、セドヘプツロース（Ｃ７−糖）がヒトの栄養摂取において重要な要素であると同時に、すなわちＣ７欠乏（正：deficiencies）又は他の代謝的に不健康な疾患状態を治療する高度に関連する薬物療法であることを強く示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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