(57)【要約】  酸素濃度に依存した血管バリアー破綻に直接作用する神経疾患治療剤を提供するものである。（ａ）ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloproteinase）１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかを有効成分とする神経疾患治療剤とする。機能性核酸がｓｉＲＮＡであることが好ましく、ＡＤＡＭ１２に対する機能性核酸が、配列番号１又は３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、ＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸が、配列番号５又は７に示すヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡであることが好ましい。
2014174834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経疾患治療剤。
（ａ）ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloproteinase）１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；
（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；
【請求項２】
機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の神経疾患治療剤。
【請求項３】
ＡＤＡＭ１２に対する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経疾患治療剤。
【請求項４】
ＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸が、配列番号５に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号６に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号７に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号８に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経疾患治療剤。
【請求項５】
神経疾患が、脳神経疾患又は網膜神経疾患であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の神経疾患治療剤。
【請求項６】
脳神経疾患が、脳浮腫であることを特徴とする請求項５記載の神経疾患治療剤。
【請求項７】
網膜神経疾患が、網膜浮腫であることを特徴とする請求項５記載の神経疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloproteinase）１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸や、かかる機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクターや、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体のいずれかを有効成分とする神経疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体における脳、網膜等の神経組織は、血液と神経組織の間に血液脳関門、血液網膜関門等の組織特異的に分化した血管系が有するバリアー機能により他組織から区画化されており、神経細胞が正常に機能できる至適組織微小環境が維持されている。成体神経組織の血管バリアー機能は個体発生過程において誘導されるが、いったん誘導された血管バリアー機能は静的な形質ではなく動的な制御下にあり、成体では神経細胞が正常に機能するための至適微小環境を維持すべく、血管バリアー機能を巧妙に調節している。そして、糖尿病網膜症、虚血性脳疾患、アルツハイマー病等の難治性神経疾患においては、血管バリアー機能が破綻して組織微小環境の撹乱が生じることが、病態を悪化させる大きな要因として働いている。したがって、血管バリアー機能の調節因子は、それら難治性神経疾患の病態悪化を妨げる新規治療法開発の標的となることが期待される。【０００３】
神経系血管バリアー機能の本体は、毛細血管の内皮細胞間に形成されるタイトジャンクション（tight junction：以下、「ＴＪ」という場合がある）網に依存することから、血管バリアー機構の解明に向けた研究は、ＴＪ構成分子の側面からの戦略が中心となっている。ＴＪ構成分子としては、オクルディン（occludin）、２７メンバーからなるファミリーを形成するクローディン（claudin）、ジャンクション接着分子−Ａ（junctional adhesion molecule A：ＪＡＭ−Ａ）等が特定されているが、生理的状態の神経系血管内皮細胞の細胞膜に発現・局在しているクローディンファミリーメンバーの一つであるクローディン−５（claudin-5）が血管バリアー機能に必須であることが報告されている（非特許文献１参照）。しかしながら、血管バリアー機能の制御機構については、いまだ多くが不明のままである。【０００４】
神経系血管バリアーの破綻は、神経毒性分子の組織内侵入を許すとともに、血漿成分の浸出による組織浮腫を惹起する。浮腫が一定期間を超えて持続すると神経組織に不可逆的な障害が発生する。現在の医療において、血管バリアー破綻による脳浮腫に対しては、グリセオールの静脈内投与により血漿膠質浸透圧を上げ、組織間質液を血管内に移動させる治療が主流となっている。副腎皮質ステロイド投与も脳浮腫に有効との考えもあるが、その脳浮腫軽減機構は明らかではなく、副作用も多く併発することから治療適応は狭い。網膜浮腫では、血管新生作用とともに血管透過性亢進作用を有する血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）に対する中和抗体の硝子体内投与が有効とされるが、血管バリアーが破綻した血管そのものに直接作用する治療剤ではなかった。また、抗ＶＥＧＦ抗体療法は、心筋梗塞・脳梗塞の危険性を高めることが問題点となっている。【０００５】
近年、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７が、炎症刺激によるＪＡＭ−Ａのｓｈｅｄｄｉｎｇに関与することや（非特許文献２参照）、ＡＤＡＭ１５が、粥状動脈硬化症にて認められる血管内皮細胞バリアー障害に関与すること（非特許文献３参照）が提案されているが、いずれも神経系血管バリアー破綻機構との関連は記載も示唆もない。【０００６】
上述のように、種々の難治性神経疾患の病態の中枢には神経系血管バリアー機能の破綻があり、病態悪化の主因として働くが、その破綻機構は不明であり、その解明とそれに基づく血管バリアー機能を調節する治療薬の開発が待たれている。血管バリアー破綻機構に関する研究推進の障害となっている点として、血管バリアー破綻の責任因子の特定に有用な実験系がなかったことが挙げられる。そこで、本発明者らは、病変部組織に存在し血管バリアー破綻の誘因となっている低酸素状態に着目し焦点を絞ったin vitro及びin vivo実験系を確立して報告した（非特許文献４参照）。非特許文献４において、In vitro系では、図１に示すようにマウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）を用い、その細胞単層の電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を血管バリアーの指標とし、In vivo系では、図２に示すようにマウスを低酸素濃度にて飼育することにより低酸素代謝状態にした網膜組織内血管の透過性を血管バリアーの指標とした。上記実験系を駆使して、（１）難治性神経疾患の神経組織における低酸素領域の出現、（２）血管内皮細胞の細胞膜からのクローディン−５の消失、（３）血管バリアー機能の破綻、（４）病態悪化、というカスケードを明らかにした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nitta T, et al. J. Cell Biol.(2003) 161:653-660
【非特許文献２】Koenen RR, et al. Blood (2009) 113:4799-4809
【非特許文献３】Sun C, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2012) 32:2444-2451
【非特許文献４】Koto T, et al. Am. J. Pathol. (2007) 170:1389-1397
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在の神経疾患治療剤は、血管バリアーの破綻した血管そのものに直接作用する治療剤、すなわち、血管を構成する血管内皮細胞で発現している物質に直接作用する治療剤ではなく、副作用も多く併発することから治療適応は狭かった。そこで、本発明の課題は、酸素濃度に依存した血管バリアー破綻に直接作用する神経疾患治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
血管バリアー破綻による神経疾患に確立された治療法がない状況にあって、本発明者らは、難治性神経疾患における血管バリアー破綻の責任因子の特定と、その因子を標的とした特異的治療薬の開発を目指し研究を進めてきた。まず、本発明者らは、血管バリアー破綻の責任因子の特定に向け、「低酸素刺激による血管内皮細胞の細胞膜からのクローディン−５の消失」機構の解析に研究の焦点を絞り込んだ。この研究の過程において、ユビキチン−プロテアソーム系が細胞膜からのクローディン−５消失に働くことを見いだしたが、その活性は酸素濃度に依存しないことが判明し、生理的状態におけるクローディン−５のターンオーバーに関与する系であり、神経疾患の病態特異的に誘導される血管バリアー破綻機構には関与しないと判断した。そこで、内皮細胞の細胞膜からクローディン−５を、酸素濃度に依存して消失させる機構を特定すべく戦略を立て直し、in vitroにてｂＥＮＤ．３細胞に低酸素刺激を加え、クローディン−５の発現・局在を経時的に観察した。その結果、正常酸素状態では細胞膜に局在しているクローディン−５が、低酸素刺激３０分間という短時間で細胞膜から消失すること、細胞全体でのクローディン−５タンパク質量が減少することが示された。これらの知見を総合して考察し、低酸素状態下にある血管内皮細胞の細胞膜からのクローディン−５消失の責任因子が、正常酸素濃度状態においても既に血管内皮細胞に発現し細胞膜に局在しているタンパク分解酵素であるとの仮説を立てた。該当する酵素として、ＡＤＡＭファミリーメンバーが候補として挙がってきた。そこで、本発明者らが確立した非特許文献４に記載のin vitro実験系を用い、責任因子の特定を進め、同時に病的血管バリアー破綻に対する治療標的としての有効性の評価については、in vivo実験系を用いた。その結果、血管内皮細胞に発現しているＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７が神経疾患での血管バリアー破綻の責任因子であることが特定され、治療標的としても有用であることを見いだした。さらに、特定した血管バリアー破綻の責任因子であるＡＤＡＭ１２遺伝子やＡＤＡＭ１７遺伝子に対する特異的ｓｉＲＮＡや、ＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７に対する抗体を硝子体内に投与したところ、網膜血管の透過性亢進を劇的に改善することも見いだした。さらに、ＡＤＡＭ１７のノックアウトマウスを低酸素状態にしたところ、網膜組織内血管での蛍光色素漏出亢進が認められなかったことから、ＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑えることで、酸素濃度に依存した血管バリアー破綻を抑制できることを見いだし、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、［１］（ａ）ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloproteinase）１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかを有効成分とする神経疾患治療剤や、［２］機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［１］記載の神経疾患治療剤や、［３］ＡＤＡＭ１２に対する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［２］記載の神経疾患治療剤や、［４］ＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸が、配列番号５に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号６に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号７に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号８に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［２］記載の神経疾患治療剤や、［５］神経疾患が、脳神経疾患又は網膜神経疾患であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の神経疾患治療剤や、［６］脳神経疾患が、脳浮腫であることを特徴とする上記［５］記載の神経疾患治療や、［７］網膜神経疾患が、網膜浮腫であることを特徴とする上記［５］記載の神経疾患治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、酸素濃度に依存した血管バリアー破綻を直接抑制することができるため、副作用が少なく効果的な神経疾患治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】In vitro系でマウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３）を用い、その細胞単層の電気抵抗値（ＴＥＥＲ）をバリアーの指標とする実験系を示す図である。
【図２】In vivo系でマウスを低酸素濃度にて飼育することにより低酸素代謝状態にした網膜組織内血管の透過性を血管バリアーの指標とする実験系を示す図である。低酸素代謝状態にした網膜組織内血管では、トレーサーとして注入した蛍光色素の漏出亢進が認められたが（写真右）、正常酸素状態で飼育したマウスでは蛍光色素の漏出が抑制されていた（写真左）。
【図３】正常酸素状態（Normoxia）、コンフルエント状態で５日間培養したマウス脳血管由来の内皮細胞株を低酸素状態（Hypoxia）にして３０分後の細胞膜におけるクローディン−５の発現量（図３（ａ））及び細胞単層の電気抵抗値（ＴＥＥＲ）（図３（ｂ））を測定した結果を示す図である。黒カラムが正常酸素状態、白カラムが低酸素状態における結果であり、縦軸は正常酸素状態を１００とした場合の相対値である。ｐ値は有意差判定の基準であるｐ=０．０５より小さかった。
【図４】ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ８＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１０＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１５＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ２１＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ３０＃１をｂＥＮＤ．３細胞にそれぞれ導入して２日後の正常酸素状態（Normoxia）、低酸素状態（Hypoxia）におけるクローディン−５の発現と局在を蛍光観察により調べた結果を示す図である。
【図５】ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１，＃２やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１，＃２をそれぞれ導入したｂＥＮＤ．３細胞を正常酸素状態、低酸素状態で３０分間培養した後のＴＥＥＲを測定した結果を示す図である。黒カラムが正常酸素状態、白カラムが低酸素状態における結果であり、縦軸は正常酸素状態のＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡを導入した場合を１００とした場合の相対値である。
【図６】ｓｉＲＮＡを導入したｂＥＮＤ．３細胞を、タンパク質の翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）存在下又はＣＨＸとユビキチン−プロテアソーム系の阻害剤であるＭＧ１３２存在下において低酸素状態（１％酸素濃度）で５０分間培養した後のクローディン−５の発現を免疫染色で調べた結果を示す図である。ＣｏｎｔｒｏｌはＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡを導入したｂＥＮＤ．３細胞を培養した結果、ＣＨＸはＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡを導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ存在下で培養した結果、ＣＨＸ＋ＡＤＡＭ１２はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ存在下で培養した結果、ＣＨＸ＋ＡＤＡＭ１７はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ存在下で培養した結果、ＣＨＸ＋ＭＧ１３２はＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡを導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ及びＭＧ１３２存在下で培養した結果、ＣＨＸ＋ＭＧ１３２＋ＡＤＡＭ１２はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ及びＭＧ１３２存在下で培養した結果、ＣＨＸ＋ＭＧ１３２＋ＡＤＡＭ１７はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞をＣＨＸ及びＭＧ１３２存在下で培養した結果である。
【図７】図６の免疫染色結果を定量化したグラフを示す図である。黒カラムは正常酸素状態、白カラムは低酸素状態であり、縦軸は正常酸素状態のｃｏｎｔｒｏｌを１００とした場合の相対値である。ｐ値は有意差判定の基準であるｐ=０．０５より小さかった。
【図８】ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１をマウス硝子体内に投与後、正常酸素状態で４８時間飼育したマウス（上段：ｎｏｒｍｏｘｉａ）と、４％〜７％の低酸素状態で４８時間飼育したマウス（下段：ｈｙｐｏｘｉａ）における、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図９】正常ヤギ血清由来ＩｇＧ（左列：NC）、抗ＡＤＡＭ１２抗体（ヤギ抗ヒトＡＤＡＭ１２ポリクローナル抗体（中央列：Anti-ADAM12 antibody））、抗ＡＤＡＭ１７抗体（ヤギ抗ヒトＡＤＡＭ１７ポリクローナル抗体（右列：Anti-ADAM17 antibody））をマウス硝子体内に投与後、正常酸素状態で２４時間飼育したマウス（上段：normoxia）と、４％〜７％の低酸素状態で２４時間飼育したマウス（下段：hypoxia）における、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１０】野生型マウス（左列：WT）、ＡＤＡＭ１７ノックアウトマウス（右列：ADAM17Δ/Δ）を、正常酸素状態で４８時間飼育したマウス（上段：normoxia）と、４％〜７％の低酸素状態で４８時間飼育したマウス（下段：hypoxia）における、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における神経疾患治療剤としては、（ａ）ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloproteinase）１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかを有効成分とする神経疾患治療剤（以下、「本発明の神経疾患治療剤」という場合がある）であれば特に制限されず、酸素濃度に依存したクローディン−５の消失を抑制することで、神経系血管バリアー機能そのものを修復し、副作用が少なく効果的に神経疾患治療をすることができる。
【００１４】
また、本発明における神経疾患治療剤の別の態様としては、（ａ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかを対象に投与することを特徴とする神経疾患治療方法や、神経疾患治療剤として使用するための、（ａ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかや、（ａ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸；（ｂ）上記（ａ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；（ｃ）ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体；のいずれかの、神経疾患治療剤の調製における使用を挙げることができる。
【００１５】
ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７はＡＤＡＭファミリーに属するメタロプロテアーゼであり、血管内皮細胞で発現しており、膜結合型タンパク質の細胞外ドメインのレセプター型チロシンキナーゼのリガンドや、ＴＮＦ−レセプターリガンドＴＮＦ−α等を切断することや、癌や血管障害、リウマチ関節炎等の炎症疾患に関与していることが知られている。
【００１６】
本発明において、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸としては、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、又はアプタマー、すなわち、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムや、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７の生理活性を消失又は減退するアプタマーを挙げることができ、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを好適に挙げることができるが、血管バリアー破綻をより抑制する観点から、ＡＤＡＭ１２遺伝子に対するｓｉＲＮＡをより好適に挙げることができる。上記機能性核酸は、例えば以下の文献に記載の方法で設計することができる（Wadhwa, R, et al. Reviews in Mutat. Res. (2004) 567:71-84, Wadhwa, R. et al. Current Opinions in Molecular Therapeutics. (2004) 6:367-372, Wadhwa, R. et al. EMBO (2003) 4:595-601）。
【００１７】
上記ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡとは、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子のｍＲＮＡに相同なヌクレオチドのセンス鎖配列と、その相補的なアンチセンス鎖配列とからなり、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖ＲＮＡの長さは、好ましくは１７〜２７塩基対、より好ましくは１８〜２０塩基対である。ＡＤＡＭ１２遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡを好適に挙げることができ、ＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、配列番号５に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と、配列番号６に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号７に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と、配列番号８に示すその相補的なアンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡを好適に挙げることができる。また、それぞれの鎖の３’側には、オーバーハング配列、好ましくはチミン、グアニン、シトシン、アデニンのいずれか２塩基をもたせることにより、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。
【００１８】
ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子のｍＲＮＡに相同なヌクレオチドのセンス鎖配列や、その相補的なアンチセンス鎖配列は、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の配列情報に基づいて設計することができ、例えば以下の文献（Wadhwa, R, et al. Reviews in Mutat. Res. (2004) 567:71-84, Wadhwa, R. et al. Current Opinions in Molecular Therapeutics. (2004) 6:367-372）に記載の方法で設計することができ、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法により作製することができる。
【００１９】
上記機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクターとしては、上記機能性核酸を発現可能なベクターであれば特に制限されないが、たとえば機能性核酸がｓｉＲＮＡの場合には、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子の特定ヌクレオチドのセンス鎖配列−リンカー−その相補的なアンチセンス鎖配列からなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。かかる機能性核酸発現ベクター作製に用いるベクターは、市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology (1992) 158, 1-23）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Muzyczka N. Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1992) 97-129）や、アデノウイルスベクター（Rosenfeld M, et al. Science (1991) 252, 431-434）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体とは、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に特異的に結合し、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７の生理活性を消失又は減退させる抗体を意味する。かかる中和抗体としては、血管バリアー破綻をより抑制する観点から、ＡＤＡＭ１２対する中和抗体をより好適に挙げることができる。
【００２１】
上記中和抗体は、どのような種類の抗体であってもよく、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体等のほか、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）２等の抗体断片を挙げることができる。また、上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００２２】
上記中和抗体は、市販の抗ＡＤＡＭ１２抗体又は抗ＡＤＡＭ１７抗体を用いることができるほか、慣用のプロトコールに従って作製することができる。例えば、上記ヒト抗体は、ハイブリドーマ法やファージディスプレイ法によって作製することができ、キメラ抗体、又はヒト化抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、抗体断片は、完全長抗体をペプシン又はパパインで消化する方法等によって作製することができる。
【００２３】
本発明において、神経疾患としては、神経系血管バリアー機能の破綻に起因する疾患であり、好ましくは血管バリアー機能が破綻して組織微小環境の攪乱が生じることによる疾患を挙げることができ、より好ましくは脳浮腫、脳梗塞、血管性認知症、虚血性脳疾患、アルツハイマー病等の脳神経疾患、又は網膜浮腫、糖尿病網膜症等の網膜神経疾患を挙げることができ、特に好ましくは脳浮腫又は網膜浮腫を挙げることができる。なお、神経系血管とは、神経系組織の毛細血管であり、神経系組織以外の組織における血管は含まれない。
【００２４】
本発明において、前記神経系血管バリアーとは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構を意味し、血液と脳の組織液との物質交換を制限する血液脳関門や、血液と網膜の組織液との物質交換を制限する血液網膜関門を好適に挙げることができる。
【００２５】
本発明において、血管バリアー機能が破綻するとは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構が機能せず、その結果、神経毒性分子の組織内侵入や血漿成分の浸出が生じること等を意味する。
【００２６】
本発明の神経疾患治療剤は、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する機能性核酸や、かかる機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクターや、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７に対する中和抗体を有効成分としていればよく、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤等の固形製剤であってもよいが、優れた神経疾患治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤等の液剤とすることが好ましい。
【００２７】
本発明の神経疾患治療剤の投与方法としては、所望の神経疾患治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を挙げることができ、特に網膜神経疾患においては、硝子体内投与を挙げることができる。また、本発明の神経疾患治療剤の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができ、例えば１日あたり、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重を投与することができ、本発明の神経疾患治療剤を他の神経疾患治療剤と併用してもよい。本発明の神経疾患治療剤の投与回数や投与期間等も特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター等を例示することができ、好ましくはヒトを例示することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（低酸素状態におけるクローディン−５の消失）
正常酸素状態（Normoxia：酸素濃度２１％）、コンフルエント状態で５日間培養したマウス脳血管由来の内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）を低酸素状態（Hypoxia：酸素濃度１％）にして３０分後の細胞膜におけるクローディン−５発現量及び細胞単層の電気抵抗値（ＴＥＥＲ）をKoto Tらの方法（Am. J. Pathol. (2007) 170:1389-1397）に従って測定した。結果を図３に示す。図３（ａ）に示すように、低酸素状態にして３０分後においては、ｂＥＮＤ．３細胞におけるクローディン−５の発現量が４０％程度低下していることが明らかとなった。また、図３（ｂ）に示すように、低酸素状態にして３０分後においては、ｂＥＮＤ．３細胞における細胞単層のＴＥＥＲが３５％程度低下することが明らかとなった。
【実施例２】
【００３０】
（クローディン−５の消失に関与するＡＤＡＭファミリーメンバーの検索）
正常酸素状態下のｂＥＮＤ．３細胞において発現しているＡＤＡＭファミリーメンバーの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析を行ったところ、ＡＤＡＭ２０、２８、３３は正常酸素状態下のｂＥＮＤ．３細胞において発現しておらず、ＡＤＡＭ８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２１、３０は正常酸素状態下のｂＥＮＤ．３細胞において発現していた（データは図示せず）ため、ＡＤＡＭ８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２１、３０が酸素濃度低下に反応して細胞膜からクローディン−５を消失させる因子の候補とした。そこで、コンフルエント状態で５日間培養したマウス脳血管由来の内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）に、各種ＡＤＡＭファミリーメンバー（ＡＤＡＭ８、９、１０、１２、１５、１７、１９、２１、３０）遺伝子に対するｓｉＲＮＡをそれぞれ２種類作製して導入した。作製した各ｓｉＲＮＡのＮｏ．やヌクレオチドのセンス鎖配列と、その相補的なアンチセンス鎖配列を表１に示す。ＡＤＡＭ８遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ８＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ８＃２、ＡＤＡＭ９遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ９＃２、ＡＤＡＭ１０遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ１０＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１０＃２、ＡＤＡＭ１２遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃２、ＡＤＡＭ１５遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ１５＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１５＃２、ＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃２、ＡＤＡＭ１９遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ１９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１９＃２、ＡＤＡＭ２１遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ２１＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ２１＃２、ＡＤＡＭ３０遺伝子に対するｓｉＲＮＡはＮｏ．ＡＤＡＭ３０＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ３０＃２である。なお、表中、小文字で表わされる塩基配列はオーバーハング配列を表す。【００３１】
【表１】
2014174834.tif 000003
【００３２】
各々のｓｉＲＮＡをそれぞれ導入したｂＥＮＤ．３細胞を２ディッシュ用意し、ｓｉＲＮＡ導入２日後に、１ディッシュは正常酸素状態、他の１ディッシュは低酸素状態（１％酸素濃度）で３０分間培養した。その後、１次抗体としてRabbit anti-mouse claudin-5（Zymed Laboratories社製）、２次抗体としてAlexaFluor（登録商標） 488 Gout anti-Rabbit IgG抗体（Invitrogen社製）を用い、クローディン−５の発現と局在を免疫染色により調べた。Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ８＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１０＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１５＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１９＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ２１＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ３０＃１をｂＥＮＤ．３細胞にそれぞれ導入して２日後の正常酸素状態（Normoxia）、低酸素状態（Hypoxia）におけるクローディン−５の発現と局在を蛍光観察により調べた結果を図４に示す。図４に示すように、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１及びｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞では、低酸素状態による細胞膜からのクローディン−５の消失が抑制された。なお、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ８＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ９＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１０＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１５＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１９＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ２１＃２、Ｎｏ．ＡＤＡＭ３０＃２をｂＥＮＤ．３細胞に導入した場合も同様の結果であった（結果は図示せず）。さらに、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、＃２及びｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、＃２を導入したｂＥＮＤ．３細胞を低酸素状態（１％酸素濃度）で３０分間培養した後のＴＥＥＲを実施例１と同様の方法で測定した。結果を図５に示す。図５に示すように、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、＃２及びｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、＃２を導入したｂＥＮＤ．３細胞では、ＴＥＥＲの低下が抑制されていた。【００３３】
上記結果より、クローディン−５の消失にＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７が関与することや、ＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡにより、ＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制することで、血管バリアー破綻を抑制していることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３４】
（ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７が低酸素状態における血管バリアー破綻の責任因子であることの検討）
ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、１２＃２やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、１７＃２を導入したｂＥＮＤ．３細胞を、タンパク質の翻訳阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）存在下又はシクロヘキシミドとユビキチン−プロテアソーム系の阻害剤であるＭＧ１３２存在下において、低酸素状態（１％酸素濃度）で５０分間培養した後のクローディン−５の発現を調べた。ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞の免疫染色結果を図６に、免疫染色結果を定量化したグラフを図７に示す。免疫染色に用いた抗体は実施例２と同様である。図６及び７から明らかなように、ＣＨＸ処理した細胞において、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１をそれぞれ導入したｂＥＮＤ．３細胞を低酸素状態で培養した後のクローディン−５の発現量は正常酸素濃度におけるクローディン−５発現量と同等であり、さらにＣＨＸとＭＧ１３２で処理した細胞において、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１を導入したｂＥＮＤ．３細胞を低酸素状態で培養した後のクローディン−５の発現量は正常酸素濃度におけるクローディン−５発現量と同等であるだけでなく、ＣＨＸ処理なしの条件において正常酸素濃度で培養した場合（control）とも同程度であった。ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃２やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃２をそれぞれ導入したｂＥＮＤ．３細胞も同様であった（結果は図示せず）。したがって、ｂＥＮＤ．３細胞の細胞膜からのクローディン−５の消失について、正常酸素濃度下ではユビキチン-プロテアソーム系が関与するのに対して、低酸素濃度下ではユビキチン-プロテアソーム系に加えてＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７が責任分子として関与すること、ＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることにより、クローディン−５の消失を抑制し、血管バリアー破綻を抑制していることが確認された。
【実施例４】
【００３５】
（ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７の治療標的としての検討）
ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７の治療標的としての有用性について、in vivo実験系を用いて検討を行った。Tetramethylrhodamine-conjugated lysine fixable dextran（10kDa;Invitrogen社製）及びHoechst stain H33252（534Da;Invitrogen社製）の蛍光色素をトレーサーとし、網膜血管の透過性（血液網膜関門機能の指標）を評価した。ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、１２＃２やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１、１７＃２（それぞれ最終濃度：２５０ｎＭ）を、各々２匹のマウス硝子体内にそれぞれ投与した後、１匹のマウスを正常酸素状態で、他の１匹のマウスを４％〜７％の低酸素状態でそれぞれ４８時間飼育した。低酸素状態で飼育したマウス網膜組織が低酸素代謝状態にあることは、ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ投与により確認した。各々のマウスに、上記２種類の蛍光色素を心臓内投与した後、網膜伸展標本を作製し、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて評価した。マウス硝子体内にｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１をそれぞれ投与した場合の共焦点顕微鏡による観察結果を図８に示す。図８に示すように、コントロール（Non-silence siRNA）を投与したマウスでは、低酸素状態（hypoxia）で網膜血管バリアーが破綻し、静脈内投与した蛍光色素の漏出亢進が認められたが、眼球硝子体内にｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃１をそれぞれ投与したマウスでは、低酸素環境下においても蛍光色素の漏出が抑制され、正常酸素状態（normoxia）に飼育したマウスの網膜血管と同程度の透過性まで回復した。ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃２やＮｏ．ＡＤＡＭ１７＃２をそれぞれ投与したマウスも同様であった（結果は図示せず）。特に、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃１又はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１２＃２を投与したマウスの方が、ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃１又はｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．ＡＤＡＭ１７＃２を投与したマウスよりも蛍光色素の漏出が抑制されていた。上記結果より、ＡＤＡＭ１２遺伝子又はＡＤＡＭ１７遺伝子対するｓｉＲＮＡが、酸素濃度に依存したクローディン−５の消失による血管バリアー破綻に直接作用する神経疾患治療剤として有効であることが示された。
【実施例５】
【００３６】
（抗ＡＤＡＭ１２抗体、抗ＡＤＡＭ１７抗体による血管バリアー破綻の抑制効果の検討）
正常ヤギ血清由来ＩｇＧ（ＮＣ：SIGMA-ALDRICH社製）、抗ＡＤＡＭ１２抗体（Anti-ADAM12 antibody：ヤギ抗ヒトＡＤＡＭ１２ポリクローナル抗体sc-16527 (C-20)：Santa Gruz Biotechnology社製）、抗ＡＤＡＭ１７抗体（Anti-ADAM17 antibody：ヤギ抗ヒトＡＤＡＭ１７ポリクローナル抗体sc-6416 (C-15)：Santa Gruz Biotechnology社製）をマウス硝子体内に投与後、正常酸素状態で２４時間飼育したマウス（normoxia）と、４％〜７％の低酸素状態で２４時間飼育したマウス（hypoxia）における、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡で観察した。用いたトレーサーや、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて評価する方法は実施例４と同様である。結果を図９に示す。【００３７】
正常血清由来ＩｇＧを硝子体内に投与したマウスにおいては、低酸素状態にした網膜組織内血管では、正常酸素状態にした網膜組織内血管に比して、トレーサーとして注入した蛍光色素の露出亢進が認められた。一方、抗ＡＤＡＭ１２抗体あるいは抗ＡＤＡＭ１７抗体を硝子体内に投与したマウスにおいては、低酸素状態にした網膜組織内血管での蛍光色素漏出亢進が抑制された。特に、抗ＡＤＡＭ１７抗体よりも抗ＡＤＡＭ１２抗体に、色素漏出亢進の抑制効果が強い傾向がうかがわれている。したがって、抗ＡＤＡＭ１２抗体や抗ＡＤＡＭ１７抗体を用いることにより、ＡＤＡＭ１２やＡＤＡＭ１７の生理活性を減退させることで、酸素濃度に依存した血管バリアー破綻を抑制できることが明らかとなった。
【実施例６】
【００３８】
（ＡＤＡＭ１７ノックアウトマウスによる血管バリアー破綻の抑制効果の検討）
野生型マウス（WT）、ＡＤＡＭ１７ノックアウトマウス（ADAM17Δ/Δ）を、正常酸素状態で４８時間飼育したマウス（normoxia）と、４％〜７％の低酸素状態で４８時間飼育したマウス（hypoxia）における、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡で観察した。用いたトレーサーや、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて評価する方法は実施例４と同様である。ＡＤＡＭ１７ノックアウトマウス（ADAM17Δ/Δ）は、Horiuchi Kらの方法（J Immunol(2007) 179:2686-2689）に従って作製し、前記文献の著者より供与を受けた。結果を図１０に示す。【００３９】
野生型マウスにおいて、低酸素状態にした網膜組織内血管では、正常酸素状態にした網膜組織内血管に比して、トレーサーとして注入した蛍光色素の漏出亢進が認められた。一方、ＡＤＡＭ１７ノックアウトマウスにおいては、低酸素状態にした網膜組織内血管での蛍光色素漏出亢進が認められなかった。したがって、ＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑えることで、酸素濃度に依存した血管バリアー破綻を抑制できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によると、血管バリアー破綻に直接作用する神経疾患を治療することができることから、医療分野において有用である。
【図１】
2014174834.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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