(57)【要約】本発明は、シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物を提供する。本発明は、シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、Ｄｒｐ１（dynamin-related protein 1）の重合を阻害することを特徴とする、Ｄｒｐ１重合阻害剤、前記記載のＤｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする、医薬用組成物、心筋梗塞後の慢性心不全の予防又は治療、有機水銀による心筋細胞毒性の軽減、又はインシュリン依存性高血糖状態の軽減に用いられる、前記記載の医薬用組成物である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、Ｄｒｐ１（dynamin-related protein 1）の重合を阻害することを特徴とする、Ｄｒｐ１重合阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＤｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする、医薬用組成物。
【請求項３】
心筋梗塞後の慢性心不全の予防又は治療に用いられる、請求項２に記載の医薬用組成物。
【請求項４】
有機水銀による心筋細胞毒性の軽減に用いられる、請求項２に記載の医薬用組成物。
【請求項５】
インシュリン依存性高血糖状態の軽減に用いられる、請求項２に記載の医薬用組成物。
【請求項６】
筋委縮性側索硬化症又はアルツハイマー病の予防又は治療に用いられる、請求項２に記載の医薬用組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のＤｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする、細胞老化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＤｒｐ１重合阻害剤、及び当該Ｄｒｐ１重合阻害剤を用いた新規医薬用組成物に関する。
本願は、２０１４年１１月２１日に日本国に出願された特願２０１４−２３６９４１号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、ほぼ全ての真核細胞にある細胞小器官であり、主に、電子伝達系による酸化的リン酸化によるＡＴＰの産生（ＡＤＰのリン酸化）を担っている。ミトコンドリアは、融合と分裂を繰り返しており、その異常により、がん、心血管疾患、神経変性疾患等の発症に関与していることが知られている。例えば、心筋梗塞後の非梗塞巣において、ミトコンドリアの形態機能異常（リモデリング）が引き起こされることによるエネルギー代謝異常が慢性心不全の原因となることが示唆されている。【０００３】
ミトコンドリアの分裂は、ＧＴＰ結合タンパク質Ｄｒｐ１（dynamin-related protein 1）の活性化により引き起こされる。活性化されたＤｒｐ１は重合し、ミトコンドリアの周囲にリング状の多量体を形成する。このＤｒｐ１多量体がミトコンドリアを切断することにより、分裂が起こる。【０００４】
一方で、シルニジピンは、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬の一種であり、Ｌ型及びＮ型カルシウム拮抗作用を併せ持ち、血圧降下作用を有することが知られている。シルニジピンの降圧効果は、他の降圧薬よりも持続時間が長いことが特徴的である。このため、シルニジピンは、心不全、不整脈等の心血管系疾患の治療剤として有用である（例えば、特許文献１〜３参照。）。また、カルシウム拮抗作用を利用して、シルニジピンは、通常使用されている降圧治療以外にも脳梗塞及び脳出血の治療又は予防に有用であること（例えば、特許文献４参照。）や、腎機能障害の治療又は予防に有用であること（例えば、特許文献５参照。）が報告されている。その他にも、シルニジピンには、抗癌剤の副作用軽減作用を有することも報告されている（特許文献６参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４６１３４９６号公報
【特許文献２】特開２００８−０４４８７１号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１４７１３７号
【特許文献４】特開２００４−３５９６７５号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／０１６１７１号
【特許文献６】特開２０１３−０１４５４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ミトコンドリアの分裂が誘導されることによって引き起こされる疾患の治療又は予防に有用な、Ｄｒｐ１重合阻害剤、及び当該Ｄｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする医薬用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、シルニジピンがＤｒｐ１の重合を阻害し得ることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［７］のＤｒｐ１重合阻害剤、医薬用組成物、及び細胞老化抑制剤を提供する。
［１］  シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、Ｄｒｐ１（dynamin-related protein 1）の重合を阻害することを特徴とする、Ｄｒｐ１重合阻害剤。
［２］  前記［１］のＤｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする、医薬用組成物。
［３］  心筋梗塞後の慢性心不全の予防又は治療に用いられる、前記［２］の医薬用組成物。
［４］  有機水銀による心筋細胞毒性の軽減に用いられる、前記［２］の医薬用組成物。
［５］  インシュリン依存性高血糖状態の軽減に用いられる、前記［２］の医薬用組成物。
［６］  筋委縮性側索硬化症又はアルツハイマー病の予防又は治療に用いられる、前記［２］の医薬用組成物。
［７］  前記［１］のＤｒｐ１重合阻害剤を有効成分とする、細胞老化抑制剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、ミトコンドリアの分裂を阻害し得る。このため、当該Ｄｒｐ１重合阻害剤及びこれを有効成分とする医薬用組成物は、ミトコンドリアの過剰な分裂により引き起こされる各種疾患の予防薬や治療薬として利用できる。特に、当該Ｄｒｐ１重合阻害剤の有効成分であるシルニジピンは、降圧剤として既に臨床に適用されていることから、当該Ｄｒｐ１重合阻害剤は、ヒトをはじめとする動物に比較的安全に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、参考例１において、各細胞のミトコンドリアの形態の解析結果を示した図である。
【図２】図２は、参考例１において、各細胞のＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな老化細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３】図３は、参考例１において、各細胞のミトコンドリアの活性酸素量の相対値（％）の算出結果を示した図である。
【図４】図４は、参考例１において、各細胞のミトコンドリアの形態の解析結果を示した図である。
【図５】図５は、実施例１において、シルニジピン存在下又は非存在下で低酸素刺激及び再酸素化した細胞のミトコンドリアの形態の解析結果を示した図である。
【図６】図６は、実施例１において、シルニジピン存在下又は非存在下で低酸素刺激及び再酸素化した細胞のＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな老化細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図７】図７は、実施例１において、シルニジピン存在下又は非存在下で低酸素刺激した細胞における、Ｄｒｐ１とミトコンドリアの局在を示した顕微鏡写真である。
【図８】図８は、実施例２において、各群のマウスの生存率（％）の経時的変化を示した図である。
【図９】図９は、実施例２において、心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）４週間目の各群のマウスの体重当たりの心臓重量（ｍｇ／ｇ）の測定結果を示した図である。
【図１０】図１０は、実施例２において、各群のマウスの左心室心筋細胞面積（μｍ２）の測定結果を示した図である。
【図１１】図１１は、実施例２において、各群のマウスのコラーゲン陽性組織領域（ＣＶＦ）（％）の測定結果を示した図である。
【図１２】図１２は、実施例２において、各群のマウスの心筋梗塞後の非梗塞領域心筋におけるＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな老化組織の割合（面積比）（％）の測定結果を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例２において、各群のマウスの左室の心筋梗塞周辺領域のウエスタンブロッティングによりＤｒｐ１を検出した結果を示した図である。
【図１４】図１４は、実施例２において、各群のマウスのＦＳ（左室内径短縮率）の測定結果を示した図である。
【図１５】図１５は、実施例３において、各細胞のＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図１６】図１６は、参考例２において、各群のマウスのＴＡＣ処置時点からの生存率（％）の経時的変化を示した図である。
【図１７】図１７は、実施例４において、０又は０．５μＭのメチル水銀と各種既存薬剤を添加した培地で培養した細胞の相対生存率（％）の測定結果を示した図である。
【図１８】図１８は、実施例５において、シルニジピン投与開始１４日目のＳＴＺマウスの随時血糖値（左図）及び空腹時血糖値（右図）の測定結果を示した図である。図中、「ＳＴＺ」はシルニジピンを投与していないＳＴＺマウスの結果を、「ＳＴＺ＋ｃｉｌ」はシルニジピンを投与したＳＴＺマウスの結果を、それぞれ示す。
【図１９】図１９は、実施例６において、シルニジピンの存在下と非存在下でアミロイドβ負荷をかけた場合の細胞の生存率（％）を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする。当該Ｄｒｐ１重合阻害剤により、Ｄｒｐ１の重合が阻害される結果、ミトコンドリアの分裂が阻害される。すなわち、本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、ミトコンドリア分裂阻害剤として機能する。
【００１２】
シルニジピンは、Ｌ型カルシウムチャネル及びＮ型カルシウムチャネルを共に阻害するＬ／Ｎ型カルシウム拮抗薬として公知の化合物であり、具体的には、以下の構造式：
【００１３】
【化１】
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【００１４】
で示される、(±)-2-メトキシエチル 3-フェニル-2-(E)プロペニル 1,4-ジヒドロ-2,6-ジメチル-4-(3-ニトロフェニル)-3,5-ピリジンジカルボキシレートである。本発明におけるシルニジピンには、上記構造式に基づく光学異性体も含まれ、いずれも公知の製造方法を用いて製造することができる（特公平3-14307号公報、特公平6-43397号公報等を参照）。また、商業的にも入手可能である。
【００１５】
シルニジピンは、必要に応じて、その薬学的に許容される塩、水和物又は溶媒和物とすることができる。薬学的に許容される塩としては、特に限定されないが、例えば無機酸との塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等）、又は有機酸との塩（酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、クエン酸塩等）等が挙げられる。以下、シルニジピン又はその薬学的に許容される塩を、単にシルニジピンと称する場合がある。
【００１６】
高血糖、低酸素、環境汚染物質、一酸化窒素等の刺激により、Ｄｒｐ１が活性化されて重合し、形成されたＤｒｐ１多量体による締め付けによってミトコンドリアが分裂する。その後の再酸素化により、分裂したミトコンドリアが融合し、ＡＴＰと活性酸素が過剰に生産される結果、糖尿病、心不全、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等が誘発される。シルニジピンは、Ｄｒｐ１の重合を阻害することによってミトコンドリアの分裂を抑制する。このため、シルニジピンは、糖尿病、心不全、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等のミトコンドリアの分裂によって誘発される疾患の治療及び予防に有効である。
【００１７】
心筋梗塞後の非梗塞巣においては、低酸素誘導因子の発現が増加し、これに伴う心筋細胞の早期老化が誘導され、これが慢性心不全や突然死の原因となる。後記実施例に示すように、心筋細胞を低酸素刺激すると、一過的にミトコンドリアの分裂が誘導され、その後の再酸素化により、細胞障害や細胞老化が誘導される。シルニジピンは、低酸素刺激による心筋細胞のミトコンドリアの分裂を抑制し、ひいては再酸素化後の細胞障害や細胞老化を抑制する。このため、シルニジピンは、細胞老化抑制の有効成分として用いることができ、特に、心筋梗塞後の慢性心不全の予防又は治療、及び突然死の予防に好適に用いられる。
【００１８】
また、メチル水銀等の有機水銀は、心血管リスクを高める環境汚染物質であることが知られている。後記実施例に示すように、心筋細胞を、細胞毒性を示さない程度に低濃度の有機水銀に暴露すると、ミトコンドリアの分裂が誘発され、細胞死が誘導されたり、伸展ストレス感受性が増大する。シルニジピンは、有機水銀による心筋細胞のミトコンドリアの分裂を抑制し、ひいては細胞死を抑制する。このため、シルニジピンは、有機水銀による心筋細胞毒性の軽減に好適に用いられ、特に、心不全における有機水銀による心機能悪化亢進抑制に好適に用いられる。
【００１９】
また、後記実施例に示すように、シルニジピンは、健常状態における血糖値に対しては特に影響を与えないが、インシュリン依存性高血糖状態では、血糖値を低下させる作用を有する。このため、シルニジピンは、インシュリン依存性高血糖状態の軽減に好適に用いられ、インシュリン依存性糖尿病薬として好適である。
【００２０】
本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、動物に投与されるものであることが好ましく、哺乳動物に投与されるものであることがより好ましく、ヒトや、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物に投与されるものであることがさらに好ましい。また、本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、単独で動物へ投与してもよく、シルニジピン以外の物質を有効成分とする医薬用組成物と併用投与してもよい。本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は、例えば、抗がん剤等の親電子性の高い薬剤に誘発される、ミトコンドリア分裂を主原因とする副作用の軽減目的にも使用可能である。例えば、糖尿病、心不全、筋委縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の治療又は予防の効果を有する医薬用組成物を、本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤と併用投与してもよく、これらをキットとしていてもよい。
【００２１】
本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤は医薬として投与することができる。
【００２２】
本発明に係るＤｒｐ１重合阻害剤又はこれを有効成分とする医薬用組成物（以下、単に「本発明に係る医薬用組成物」ということがある。）を、ヒトをはじめとする動物に投与する場合、その投与形態は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよく、その剤形としては、経口投与剤であれば、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤等の固形剤；溶液剤、シロップ剤等の液剤が挙げられ、また、非経口投与剤であれば、例えば注射剤、輸液剤、経鼻・経肺用スプレー剤等が挙げられる。本発明に係る医薬用組成物は、通常の方法によって、これらの剤型の医薬に製剤化することができる。
【００２３】
患者への負担を軽減する観点から、本発明に係る医薬用組成物は対象者に対して経口投与することが好ましい。経口投与する場合の剤形は、錠剤が好ましい。一方、経口投与が困難な対象者に対しては、本発明に係る医薬用組成物を輸液として経静脈又は動脈投与することができる。また、本発明に係る医薬用組成物は、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して製剤化することができる。
【００２４】
賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール等の糖類、デンプン類、結晶セルロース等のセルロース類等の有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリン等の無機系賦形剤等が、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩等の脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類等が、溶剤としては、精製水、生理的食塩水等が、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類等が、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等が、懸濁化剤或いは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素等が、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類等が、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等が、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が、矯味矯臭剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される甘味料、香料等が、着色剤としては、医薬及び食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る医薬用組成物の投与量は、抗癌剤の種類、対象者の年齢、体重、病態、投与方法等によって異なり、通常、有効成分のシルニジピン又はその薬学的に許容される塩の臨床用量を考慮して適宜設定することができる。例えば、成人１人あたり１日量として有効成分０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ、特に好ましくは０．０１〜５０ｍｇを１回又は数回に分けて経口投与するか、成人１人あたり１日量として、０．００００００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０００００１〜５０ｍｇ、特に好ましくは０．０００１〜２０ｍｇを１日１回から数回に分けて非経口投与し、又は１日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与することができる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２７】
［マウス］
以降の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ）マウスは、九動株式会社から購入したものを用いた。【００２８】
［マウス心筋梗塞モデルの作製］
マウス心筋梗塞モデルは、Nishidaらの方法（Nature Chemical Biology, vol.8, p.714-724 (2012)）を参考に作製した。
具体的には、８週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ））に、三種混合麻酔薬（ドミトール：０．７５ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム：４ｍｇ／ｋｇ、ベトルファール：５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔をかけた後、開胸し、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を絹縫合糸（6-0号）を用いて結紮した（ＭＩ群）。結紮による心筋梗塞が成功しているか否かは、心電図にてＳＴ（心室興奮極期）上昇を観察することにより確かめた。同様に麻酔して開胸したが、ＬＡＤを結紮しなかったマウスをｓｈａｍ群とした。【００２９】
［細胞］
ＮＲＣＭ（Preparation of neonatal rat cardiac myocytes)細胞は、以下のようにして得た。
まず、哺乳一日目のＳＤラットの胎児を冷温麻酔後、心臓を取り出し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて４℃で１６時間インキュベートした。その後、トリプシンを除去し、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（リン酸生理食塩水）にて希釈したコラゲナーゼII溶液にて３７℃で１５分間インキュベートした。残渣はさらにコラゲナーゼIIにて３７℃で１５分間インキュベートした後、７０μｍ  nyloncell strainer（BD-Falcon Biosciences社製）を通過させた後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、２分間）してコラゲナーゼを除去した。得られた細胞は、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（１０容量％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に懸濁した後、non-coatディッシュに播種し、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、１時間培養した。次いで、ディッシュに接着しなかった細胞をＮＲＣＭ細胞として回収し、ゼラチンコートしたディッシュ又はプレートに播種した。播種したＮＲＣＭ細胞を、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、２４時間培養した後、タウリン含有ＤＭＥＭ（５ｍＭ  タウリン、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ)に培地交換して４８時間培養したものを、各実験に用いた。【００３０】
Ｈｅｌａ細胞は、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（１０容量％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）にて、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下、３７℃で培養した。トランスフェクションは、前日にＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に培地交換して一晩培養したＨｅｌａ細胞に対して、X-tremeGENE9 DNA transfection reagent（Roche社製）を用い、付属の説明書に従い、３５ｍｍディッシュあたり３μｇのプラスミドを１２時間遺伝子導入することにより行った。【００３１】
［Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰ及びＤｒｐ１−Ｆｌａｇの発現用プラスミドの作製］
Ｃ末端側にＥＧＦＰを融合させたＤｒｐ１（Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰ）の発現用プラスミド、及びＣ末端側にＦｌａｇを融合させたＤｒｐ１（Ｄｒｐ１−Ｆｌａｇ）の発現用プラスミドは、次のようにして作製した。
まず、ラットの心臓よりRNeasy fibrous tissue mini kit（Qiagen社製）を用いて調製したＲＮＡを鋳型として、Prime Script RT（タカラバイオ社製）を用いて調製した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧＦＰタグ用ＦｗプライマーとＧＦＰタグ用Ｒｖプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより消化した後にｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにライゲーションすることにより、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰの発現用プラスミドを得た。同様に、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＧＦＰタグ用ＦｗプライマーとＧＦＰタグ用Ｒｖプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより消化した後にｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲーションすることにより、Ｄｒｐ１−Ｆｌａｇの発現用プラスミドを得た。
ライゲーション産物は大腸菌ＤＨ５α株に形質転換してシングルコロニーを培養した後、LaboPass（北海道システム・サイエンス社製）によりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンスによる配列の確認後、Qiagen plasmid Maxi kit（Qiagen社製）にて精製し、各実験に用いた。【００３２】
また、Ｄｒｐ１のＣ６２４Ｓ変異体（６２４番目のシステインをセリンに置換した変異体）のＣ末端側にＥＧＦＰを融合させたタンパク質（Ｄｒｐ１（Ｃ６２４Ｓ）−ＥＧＦＰ）の発現用プラスミドは、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰの発現用プラスミドを鋳型とし、Ｃ６２４Ｓ用ＦｗプライマーとＣ６２４Ｓ用ＲｖプライマーとＰＣＲ試薬（製品名：KOD Fx、東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩにより消化した後にｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにライゲーションした後、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰの発現用プラスミドと同様にして調製した。【００３３】
【表１】
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【００３４】
［ＭＴＴアッセイ］
ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリアのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を調べるアッセイである。
具体的には、９６ウェルプレートに培養したＮＲＣＭ細胞に、ＭＴＴ溶液（ＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-triphenyltetrazolium bromide）を５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解させた溶液）を、ＭＴＴの最終濃度が０．１２５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、１時間培養した。培養後、培地を除去し、１００μＬのＤＭＳＯを添加して室温で３０分間穏やかに振とうさせることにより、産生されたホルマザンを溶解させた。その後、５９５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ５９５）をプレートリーダー（製品名：SpectraMax i3 、Molecular devices社製）を用いて測定した。【００３５】
［参考例１］
ＮＲＣＭ細胞において、低酸素刺激によりミトコンドリアの分裂が誘発され、再酸素化により細胞老化が誘導されることを確認した。具体的には、無刺激のＮＲＣＭ細胞と、低酸素刺激後のＮＲＣＭ細胞と、低酸素刺激後再酸素化したＮＲＣＭ細胞について、ミトコンドリアの形態と老化した細胞の割合（％）と、細胞内活性酸素量（相対値）と、細胞内ＡＴＰ濃度（μＭ／ウェル）を調べた。【００３６】
＜低酸素刺激と再酸素化＞
ＮＲＣＭ細胞の低酸素刺激は、ＮＲＣＭ細胞を、１容量％酸素及び５容量％二酸化炭素（９４容量％窒素）、加湿雰囲気下で３７℃、１６時間培養することにより行った。再酸素化は、低酸素刺激後のＮＲＣＭ細胞を、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、２４時間培養することにより行った。【００３７】
＜ミトコンドリアの形態＞
ミトコンドリア形態は、各細胞のミトコンドリアをMitoTracker Green FM reagent（Life technologies社製）を用いて染色した後、共焦点レーザ走査型顕微鏡（製品名：FV10i、オリンパス社製、倍率：×３００）により観察して解析した。ミトコンドリア染色は、より詳細には、まず、３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種した細胞を、MitoTrakcer Green（０．５μＭ）を、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、１０分間インキュベートして反応させた。反応後、ＰＢＳで２回洗浄してMitotTackerを除去した後、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭに交換した。【００３８】
各細胞のミトコンドリアの形態の形態を、小胞状（vesicle）、管状（tubule）、小胞状と管状の中間的な構造（intermediate）に分け、それぞれの存在比を求めた結果を図１に示す。図１中、「Ｎ」は無刺激の細胞の結果を、「Ｈ」は低酸素刺激後の細胞の結果を、「Ｈ／Ｒ」は低酸素刺激後に再酸素化した細胞の結果を、それぞれ示す。小胞状のミトコンドリアは、低酸素刺激により増大したが、再酸素後には減少していた。【００３９】
＜ＳＡ−β−ｇａｌ活性測定＞
老化に関係する酸性のβ−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性を測定し、老化した細胞の割合を測定した。ＳＡ−β−Ｇａｌ活性は、senescenceβ−Galactosidase Staining Kit（Cell signaling technology社製）を用いて測定した。
具体的には、まず、３５ｍｍディッシュに６０％コンフルエントで播種したＮＲＣＭ細胞を低酸素刺激後に再酸素化した後、ＰＢＳで１回洗浄した。対照として、無刺激のＮＲＣＭ細胞も、ＰＢＳで１回洗浄した。また、Ｄｒｐ１に対する選択的阻害物質であり、ミトコンドリア分裂阻害剤であるＭｄｉｖｉ−１（CAS No：338967-87-6、Sigma社製）をＤＭＳＯに溶解させた溶液として最終濃度が１０μＭとなるように添加した培養培地を用いた以外は同様にして、無刺激のＮＲＣＭ細胞及び低酸素刺激後に再酸素化したＮＲＣＭ細胞も調製した。
次いで、各細胞を、キットに含まれているFixative Solutionにて室温で１５分間処理して固定した。固定された細胞を、ＰＢＳで１回洗浄後、キットに含まれているβ-galactosidase staining solutionを加え、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベート後の細胞を、カラーＣＣＤカメラ（Nikon digital camera DXM1200F）付きの正立顕微鏡（製品名：Eclipse 80i、ニコン社製）により観察し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞（染色された細胞）の割合（％）を調べた。【００４０】
ＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合（％）の測定結果を図２に示す。図２中、「Ｈ／Ｒ」欄が「（−）」は無刺激のＮＲＣＭ細胞の結果を、「（＋）」は低酸素刺激後、再酸素化したＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。また、図２中、「Ｍｉｄｉｖｉ−１」欄が「（−）」はＭｉｄｉｖｉ−１無添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、「（＋）」はＭｉｄｉｖｉ−１添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。Ｍｉｄｉｖｉ−１無添加の場合、無刺激の細胞よりも低酸素刺激後、再酸素化した細胞のほうがＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合が増大しており、低酸素刺激後、再酸素化することにより、細胞老化が誘発されることが確認された。一方で、Ｍｉｄｉｖｉ−１添加の細胞では、低酸素刺激後、再酸素化した細胞におけるＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合が低く、Ｍｉｄｉｖｉ−１により、低酸素刺激後、再酸素化することにより誘発される細胞老化が抑制されることがわかった。【００４１】
＜ミトコンドリアの活性酸素量の測定＞
ミトコンドリアからの活性酸素産生量は、MitoSOX Red （Life technologies社製）を用いて測定した。
具体的には、まず、３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種したＮＲＣＭ細胞を、低酸素刺激した後、又は低酸素刺激後に再酸素化した後、ＰＢＳで１回洗浄した。対照として、無刺激のＮＲＣＭ細胞も、ＰＢＳで１回洗浄した。また、培養培地にＤＭＳＯに溶解させたＭｄｉｖｉ−１（Sigma社製）を最終濃度が１０μＭとなるように添加した以外は同様にして、無刺激のＮＲＣＭ細胞、低酸素刺激したＮＲＣＭ細胞、及び低酸素刺激後に再酸素化したＮＲＣＭ細胞も調製した。
次いで、各細胞に、MitoSOX（５μＭ）を添加し、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、１０分間インキュベートして反応させた。反応後、ＰＢＳで２回洗浄してMitoSOXを除去した後、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭに交換した。染色された細胞を、共焦点レーザ走査型顕微鏡（製品名：FV10i、オリンパス社製、倍率：×３００）により観察して、各細胞について、細胞あたりの蛍光強度を測定し、無刺激かつＭｄｉｖｉ−１無添加の細胞の細胞あたりの蛍光強度を１００％とした相対値を、ミトコンドリアの活性酸素量の相対値（％）として算出した。【００４２】
ミトコンドリアの活性酸素量の相対値（％）の算出結果を図３に示す。図３中、「Ｎ」、「Ｈ」、「Ｈ／Ｒ」は図２と同じ意味であり、図３中、「Ｍｉｄｉｖｉ−１」欄が「（−）」はＭｉｄｉｖｉ−１無添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、「（＋）」はＭｉｄｉｖｉ−１添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。図３に示すように、低酸素刺激及びその後の再酸素化によりミトコンドリアの活性酸素量は増大したが、Ｍｉｄｉｖｉ−１処理により、低酸素刺激後及びその後の再酸素化におけるミトコンドリアの活性酸素量の増大は抑制された。【００４３】
＜細胞内ＡＴＰ量の測定＞
細胞内ＡＴＰ量は、Luciferase assay (和光純薬工業社製) を用いて測定した。
具体的には、まず、９６ウェルプレートに播種したＮＲＣＭ細胞を、低酸素刺激した後、又は低酸素刺激後に再酸素化した後、ＰＢＳで１回洗浄した。対照として、無刺激のＮＲＣＭ細胞も、ＰＢＳで１回洗浄した。また、培養培地にＤＭＳＯに溶解させたＭｄｉｖｉ−１（Sigma社製）を最終濃度が１０μＭとなるように添加した以外は同様にして、無刺激のＮＲＣＭ細胞、低酸素刺激したＮＲＣＭ細胞、及び低酸素刺激後に再酸素化したＮＲＣＭ細胞も調製した。
次いで、培地を除去してフレッシュなＤＭＥＭ（１００μＬ）に交換した後、ただちにLuciferase reagentを２０μＬ添加し、１０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の細胞の発光を、SpectraMax i3 (Molecular devices社製) で測定し、発光強度からウェルあたりのＡＴＰ濃度を求めた。発光強度からのＡＴＰ濃度の算出には、ＡＴＰを最終濃度０、０．０１、０．１、１、又は１０μＭとなるように含有するＤＭＥＭの発光強度を同様にして求め、得られた発光強度とＡＴＰ濃度の関係から求めた検量線を用いた。
ウェルあたりのＡＴＰ消費量は、細胞に１０μＭのcarbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)を添加して５分間室温でインキュベートすることにより、ミトコンドリアからのＡＴＰ合成を阻害する処理を行った後、Luciferase assayに供し、細胞内の残存ＡＴＰ量を測定した。【００４４】
各細胞の細胞内ＡＴＰ量（ウェルあたりのＡＴＰ濃度）の測定結果を図４に示す。図４中、「Ｎ」、「Ｈ」、「Ｈ／Ｒ」は図２と同じ意味であり、「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭｉｄｉｖｉ−１無添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、「Ｍｉｄｉｖｉ−１」はＭｉｄｉｖｉ−１添加のＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。低酸素刺激後再酸素化により細胞内ＡＴＰ量は増大するが、この増大傾向は、Ｍｉｄｉｖｉ−１処理により抑制された。【００４５】
［実施例１］
Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰを発現させたＮＲＣＭ細胞に、各種カルシウム拮抗剤の存在下で低酸素刺激及び再酸素化処理を行い、細胞内ＡＴＰ量、ミトコンドリアの形態、老化した細胞の割合（％）、及びＤｒｐ１の局在を調べた。
具体的には、ＮＲＣＭ細胞に、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰの発現用プラスミドをトランスフェクションした後、シルニジピン（ＣＩＬ）、アムロジピン（Ａｍｌ）、ベラパミル（Ｖｅｒ）、ジルチアゼム（Ｄｉｌ）のＤＭＳＯ溶液又はω−コノトキシン（ω−Ｃｔｘ）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を最終濃度が１０μＭとなるように添加した培養培地にて低酸素刺激及び再酸素化を行い、各処理後の細胞の細胞内ＡＴＰ量、ミトコンドリアの形態、老化した細胞の割合（％）、及びＤｒｐ１の局在を調べた。対照として、等量のＤＭＳＯのみを添加した培養培地で培養したＮＲＣＭ細胞についても同様に測定した。低酸素刺激及び再酸素化処理は参考例１と同様にして行い、細胞内ＡＴＰ量、ミトコンドリアの形態、及び老化した細胞の割合（％）は、参考例１と同様にして測定した。Ｄｒｐ１の局在は、融合しているＥＧＦＰの蛍光を共焦点レーザ走査型顕微鏡により観察して調べた。【００４６】
この結果、シルニジピン以外のカルシウム拮抗剤の存在下で低酸素刺激及び再酸素化を行った細胞では、対照（ＤＭＳＯのみを添加した培養培地の細胞）と同様に、低酸素刺激及び再酸素化により細胞内ＡＴＰ量が増大していたが、シルニジピン存在下で低酸素刺激及び再酸素化を行った細胞では、対照に比べて再酸素化後の細胞内ＡＴＰ量が明らかに低かった。これらの結果から、シルニジピンにより、低酸素刺激及び再酸素化による細胞内ＡＴＰ量の増大が抑制されるが、この抑制効果は、カルシウム拮抗作用とは関係のない作用であることが示唆された。【００４７】
対照の細胞（ＤＭＳＯのみを添加した培養培地の細胞）とシルニジピン存在下で低酸素刺激及び再酸素化を行った細胞のミトコンドリアの形態の形態を、参考例１と同様に小胞状、管状、小胞状と管状の中間的な構造に分け、それぞれの存在比を求めた。結果を図５に示す。図５中、「Ｎ」、「Ｈ」、及び「Ｈ／Ｒ」は図１と同じ意味であり、「ｃｏｎｔｒｏｌ」が対照の細胞の結果を、「ＣＩＬ」がシルニジピン存在下で低酸素刺激及び再酸素化を行った細胞の結果を、それぞれ示す。シルニジピンにより、低酸素刺激による小胞状のミトコンドリアはほとんど増えておらず、低酸素刺激によるミトコンドリアの分裂が抑制されることが示された。【００４８】
シルニジピン存在下又は非存在下で低酸素刺激及び再酸素化した細胞のＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合（％）の測定結果を図６に示す。図６中、「Ｈ／Ｒ」欄が「（−）」は無刺激のＮＲＣＭ細胞の結果を、「（＋）」は低酸素刺激後、再酸素化したＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。また、図６中、「ＣＩＬ」欄が「（−）」は対照のＮＲＣＭ細胞（ＤＭＳＯのみを添加した培養培地の細胞）の結果を、「（＋）」はシルニジピンを添加したＮＲＣＭ細胞の結果を、それぞれ示す。対照の細胞では、低酸素刺激及び再酸素化によりＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合（％）は増大するが、シルニジピン存在下の細胞では、低酸素刺激及び再酸素化によるＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の増大が抑制されていた。すなわち、シルニジピンにより、低酸素刺激及び再酸素化による細胞老化が抑制されることが示された。【００４９】
シルニジピン存在下又は非存在下で低酸素刺激した細胞における、Ｄｒｐ１とミトコンドリアの局在を示した顕微鏡写真を図７に示す。図７中、「Ｎ」は無刺激の細胞の結果を、「Ｈ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）」は対照の細胞の低酸素刺激後の結果を、「Ｈ（ＣＩＬ）」はシルニジピンを添加した細胞の低酸素刺激後の結果を、それぞれ示す。無刺激の細胞では、シルニジピン添加の細胞におけるＤｒｐ１−ＥＧＦＰとミトコンドリアの細胞内局在は、対照の細胞と特に差はなく、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰは細胞質にブロードに存在していた。低酸素刺激後の細胞では、対照の細胞では、Ｄｒｐ１−ＥＧＦＰはミトコンドリアの小胞近傍に小胞状に局在していたのに対して、シルニジピンを添加した細胞のＤｒｐ１−ＥＧＦＰは、小胞状に局在するものが少なく、また、ミトコンドリアとの共局在も観察されなかった。【００５０】
［実施例２］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから作製したマウス心筋梗塞モデル（ＭＩ群）と対照とするｓｈａｍ群に対してシルニジピンを投与し、心筋梗塞後の心臓に対するシルニジピンの影響を調べた。【００５１】
＜シルニジピンの投与＞
シルニジピンの投与は、ＤＭＳＯとＰＥＧ３００を容量比３：７で混合した混合溶媒に溶解させた状態で、浸透圧ポンプ（製品名：model2004、Alzet社製）を用いて、心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）２４時間後より持続投与した。シルニジピンの投与量が３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように投与したマウスのうち、ＭＩ群のマウスに投与したものをＣＩＬ３０−ＭＩ群、ｓｈａｍ群のマウスに投与したものをＣＩＬ３０−ｓｈａｍ群とした。同様に、シルニジピンの投与量が１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように投与したマウスのうち、ＭＩ群のマウスに投与したものをＣＩＬ１００−ＭＩ群、ｓｈａｍ群のマウスに投与したものをＣＩＬ１００−ｓｈａｍ群とした。さらに、対照として、ＤＭＳＯとＰＥＧ３００を容量比３：７で混合した混合溶媒のみをＭＩ群及びｓｈａｍ群に投与したマウスを、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＭＩ群及びＶｅｈｉｃｌｅ−ｓｈａｍ群とした。【００５２】
図８に、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＭＩ群、ＣＩＬ３０−ＭＩ群、及びＣＩＬ１００−ＭＩ群の生存率（％）の経時的変化を示す。この結果、ＣＩＬ３０−ＭＩ群及びＣＩＬ１００−ＭＩ群の生存率は、Ｖｅｈｉｃｌｅ−ＭＩ群に比べて明らかに高く、また、ＣＩＬ３０−ＭＩ群よりもＣＩＬ１００−ＭＩ群の生存率のほうが高かった。これらの結果から、シルニジピンは、心筋梗塞後の突然死を抑制し得ることが示唆された。【００５３】
図９に、心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）４週間目の各群のマウスの体重当たりの心臓重量（ｍｇ／ｇ）の測定結果を示す。心臓重量は、心臓超音波検査を常法に従って行い、測定した。図９中、「ＣＩＬ」欄が「（−）」はＶｅｈｉｃｌｅ群の結果を、「３０」はＣＩＬ３０群の結果を、「１００」はＣＩＬ１００群の結果を、それぞれ示す。この結果、ｓｈａｍ群では、心重量に対するシルニジピンの投与の有無や投与量の影響は観察されなかったが、ＭＩ群では、心重量の増大がシルニジピンの投与により抑制されていた。これらの結果から、シルニジピンは、心筋梗塞後の心重量の増大を抑制し得ることが示唆された。【００５４】
＜線維化及び心筋細胞面積の観察＞
心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）４週間目の各マウスの心臓を１−６  ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色及びＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色し、心筋の繊維化及び心筋細胞面積を、Nishidaらの方法（The EMBO Journal  (2008) vol.27, p.3104−3115）に準じて調べた。
まず、マウスの心臓をホルマリン処理により固定した後、心室中央の部位を切り出し、パラフィンにより包埋した心室標本を作製した。次いで、この心室標本を、厚さ３μｍに薄切し、キシレン、エタノールによりパラフィンを除去した。パラフィン除去後の心室標本を、ヘマトキシリン液又はピクリン酸飽和溶液を用いて調製した０．１％  Direct Red 80溶液に浸漬させて６０分間処置した後、さらに１％  塩酸アルコールにより分別し、エタノール、キシレンにより脱水し、封入した。封入された標本、特に非梗塞領域を、顕微鏡（製品名：BZ-9000、Keyence社製）により観察した。コラーゲン含量の比率は、染色されて染まった面積を心臓横断総面積で除したものを百分率で表示したものとして算出した。【００５５】
１−６  ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色像及びＨＥ染色像の結果から、ＣＳＡ（cross sectional area; 心筋細胞面積（μｍ２））の測定結果を図１０に、ＣＶＦ（Collagen volume fraction; コラーゲン陽性領域）（％）の測定結果を図１１に、それぞれ示す。この結果、ＣＳＡとＣＶＦは、共に心筋梗塞により増大するが、この増大がシルニジピンの投与により抑制されていた。これらの結果から、シルニジピンは、心筋梗塞後の左室リモデリングを濃度依存的に抑制し得ることが示唆された。【００５６】
＜心臓切片におけるＳＡ−β−ｇａｌ活性測定＞
心臓切片におけるＳＡ−β−Ｇａｌ活性を、Shlushらの方法（BMC Cell Biology，2011，vol.12，16）に準じて測定し、老化した細胞の割合を測定した。
具体的には、まず、心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）４週間目に心臓を摘出した。摘出された心臓は、ＰＢＳ中で洗った後、４％ ＰＦＡ含有ＰＢＳで固定した後、スクロース置換を行い、O.C.T. compound（Sakura社製）を用いて凍結包埋した。凍結包埋標本からLEICA CM1100を用いて１０μｍに薄切した心臓切片は、Senescence β−Galactosidase Staining Kit（Cell signaling technology社製）のプロトコールを改変し、ｐＨ４．０中のβ−Galactosidase溶液中で３７℃、一晩インキュベートすることにより反応を行った。インキュベート後の細胞をＰＢＳで洗浄した後、VECTASHIELD Mounting Mediumで封入した。この封入された標本を、カラーＣＣＤカメラ（Nikon digital camera DXM1200F）付きの正立顕微鏡（製品名：Eclipse 80i、ニコン社製）により観察し、［ＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな領域の面積（β−Galactosidase陽性面積、青色発色）］／［全体の組織切片面積］×１００（％）で解析及び定量を行った。【００５７】
図１２に、各群のマウスの心筋梗塞後の非梗塞領域心筋におけるＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな組織の割合（面積比）（％）の測定結果を示した。図１２中、「ＣＩＬ」欄が「（−）」はＶｅｈｉｃｌｅ群の結果を、「（＋）」はＣＩＬ１００群の結果を、それぞれ示す。また、「ＭＩ」欄が「（−）」はｓｈａｍ群の結果を、「（＋）」はＭＩ群の結果を、それぞれ示す。この結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、ＭＩ群ではｓｈａｍ群よりも明らかにＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな組織が増大しており、心筋梗塞後に非梗塞領域心筋において老化する細胞が増大することが確認された。一方で、ＣＩＬ１００−ＭＩ群では、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな組織はあまり増大していなかった。これらの結果から、シルニジピンは、心筋梗塞後の非梗塞領域心筋における細胞老化を抑制し得ることが示唆された。【００５８】
＜Ｄｒｐ１の二量体量の測定＞
心筋梗塞後（ＬＡＤの結紮手術後）１週目及び４週目の各マウスの心臓の左室の心筋梗塞周辺領域を、２００μＬのGTP-binding buffer（50 mM HEPES (pH 7.5)，1 mM EGTA，1.5 mM MgCl2，150 mM NaCl，10%(v/v) Glycerol，1%(v/v) TritonX-100，及びprotease inhibitor cocktail (ナカライテスク社製)）中でポリトロンホモジナイザーにより破砕し、遠心分離処理後（９０００×ｇ、１０分間、４℃)、上清を回収した。各サンプル（回収された上清）は、Bradford assayによりタンパク質濃度を測定した。
各サンプル中のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、２ｍＡ／ｃｍ２で電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜は、ウエスタンブロッティングを行う前に、１％ＢＳＡ溶液にて１時間ブロッキングした。ブロッキング後のＰＶＤＦ膜を、一次抗体として、抗Ｄｒｐ１抗体又は抗ＧＡＰＤＨ抗体（いずれも、Santa Cruz Biotechnology社製）溶液でインキュベートし、次いで二次抗体として、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体でインキュベートした後、ＥＣＬシステム（ナカライテスク社製）を用いて、Ｄｒｐ１及びＧＡＰＤＨのバンドを検出した。【００５９】
図１３に、各群のマウスの左室の心筋梗塞周辺領域のウエスタンブロッティングによりＤｒｐ１を検出した結果を示す。図１３中、「ｓｈａｍ」はｓｈａｍ群の結果を、「ＭＩ」はＭＩ群の結果を、それぞれ示す。また、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」がＶｅｈｉｃｌｅ群の結果を、「Ｃｉｌｎｉｄｉｐｉｎｅ」はＣＩＬ１００群の結果を、それぞれ示す。ｓｈａｍ群では、シルニジピンの投与の有無にかかわらず、Ｄｒｐ１の二量体は検出されなかった。一方で、ＭＩ群では、Ｄｒｐ１の二量体が検出されたが、Ｖｅｈｉｃｌｅ群よりもＣＩＬ１００群のほうが、Ｄｒｐ１の二量体量が明らかに少なかった。この結果から、シルニジピンは、Ｄｒｐ１の二量体化を抑制することが分かった。【００６０】
＜ＦＳ（左室内径短縮率）の測定＞
マウスに心筋梗塞処置前から処置後４週間までの間、１週間ごとに心臓超音波検査を常法に従って行い、ＦＳ（％）を測定した（Nature Chemical Biology，vol.8，p.714-724 (2012)）。【００６１】
図１４に、各群のマウスのＦＳの測定結果を示した。図１４中、「ＣＩＬ」欄が「（−）」はＶｅｈｉｃｌｅ群の結果を、「３０」はＣＩＬ３０群の結果を、「１００」はＣＩＬ１００群の結果を、それぞれ示す。この結果、心筋梗塞により低下したＦＳが、シルニジピン投与により回復することがわかった。【００６２】
［実施例３］
ＮＲＣＭ細胞を、シルニジピン又はＭｄｉｖｉ−１の存在下で培養した場合の細胞老化を調べた。
具体的には、最終濃度が１μＭとなるようにシルニジピンを添加した培地と、最終濃度が１０μＭとなるようにＭｄｉｖｉ−１を添加した培地で、それぞれＮＲＣＭ細胞を７２時間培養した後、参考例１と同様にしてＳＡ−β−Ｇａｌ活性を測定した。対照として、シルニジピンとＭｄｉｖｉ−１のいずれも添加していない培地でも同様にＮＲＣＭ細胞を培養し、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性を測定した。【００６３】
図１５に、各細胞のＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合（％）の測定結果を示した。この結果、Ｍｄｉｖｉ−１存在下で培養した場合には、ＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞が増大していたが、シルニジピン存在下で培養した場合には、無添加の場合よりもＳＡ−β−Ｇａｌ活性がポジティブな細胞の割合が低下しており、Ｍｄｉｖｉ−１とは異なり、シルニジピンは、細胞老化を抑制し得ることが示唆された。【００６４】
［参考例２］
１０ｐｐｍのメチル水銀を含む水を摂取させたマウスに対して横大動脈狭窄（ＴＡＣ）処置を行い、体重変化（％）、生存率（％）、体重当たりの心臓重量（ｍｇ／ｇ）を調べた。
まず、５週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ））２２匹に、１０ｐｐｍのメチル水銀を含む飲水の投与を開始した（ＭｅＨｇ群）。メチル水銀を含む飲水はマウスに自由に摂取させた。同じく５週齢マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ））２３匹には、メチル水銀を含まない飲水を自由摂取させた（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）。
メチル水銀摂取開始から１０日後のマウスに開胸手術を行い、ＭｅＨｇ群の１４匹とＶｅｈｉｃｌｅ群の１５匹にＴＡＣ処置を行い（ＴＡＣ群）、ＭｅＨｇ群の８匹とＶｅｈｉｃｌｅ群の８匹にＴＡＣ処置を行わずそのまま縫合した（ｓｈａｍ群）。
ＴＡＣ処置から４週間マウスを飼育し、体重と生存率の変化を調べた。また、ＴＡＣ処置から１週間目、２週間目、３週間目、及び４週間目に心臓超音波検査を常法に従って行い、心臓重量を測定した。なお、メチル水銀を含む飲水の摂取は、４週間目まで継続した。【００６５】
図１６に、各群のマウスのＴＡＣ処置時点からの生存率（％）の経時的変化を示した。この結果、各群とも体重には特に差がなかった。一方で、生存率は、ＭｅＨｇ−ｓｈａｍ群はＶｅｈｉｃｌｅ−ｓｈａｍ群と同様に、全てのマウスが最後まで生存していたが、ＭｅＨｇ−ＴＡＣ群は最終的な生存率が６０％程度しかなかった。これらの結果から、健常な個体には細胞毒性を誘発しない低濃度のメチル水銀の摂取であっても、ＴＡＣによる心機能悪化を亢進する作用があることがわかった。【００６６】
なお、ＴＡＣ処置から１週間目及び４週間目のマウスの体重当たりの心臓重量（ｍｇ／ｇ）を調べたところ、ＭｅＨｇ−ＴＡＣ群とＶｅｈｉｃｌｅ−ＴＡＣ群はいずれも心臓重量が増大しており、ＭｅＨｇ−ＴＡＣ群のほうがＶｅｈｉｃｌｅ−ＴＡＣ群よりもより心臓重量が増大していた。【００６７】
［参考例３］
ＮＲＣＭ細胞を、Ｍｉｄｉｖｉ−１の存在下及び非存在下において、細胞毒性を誘発しない低濃度のメチル水銀（０．１μＭ）に暴露し、ＡＴＰ産生量や伸展ストレス感受性への影響を調べた。
具体的には、９６ウェルプレートにＮＲＣＭ細胞を播種し、０．１μＭのメチル水銀を含有する培養培地、１０μＭのＭｉｄｉｖｉ−１を含有する培養培地、０．１μＭのメチル水銀と１０μＭのＭｉｄｉｖｉ−１を含有する培養培地、又はメチル水銀とＭｉｄｉｖｉ−１のいずれも含有しない培養培地中で、５容量％二酸化炭素（９５容量％空気）、加湿雰囲気下で３７℃、２４時間培養した。【００６８】
この培養後の細胞について、参考例１と同様にして、ウェルあたりのＡＴＰ濃度（μＭ）を求め、対照の細胞（メチル水銀とＭｉｄｉｖｉ−１のいずれも含有しない培養培地で培養した細胞）のウェルあたりのＡＴＰ濃度を１００％とした相対値を算出した。各細胞の細胞内ＡＴＰ量は、メチル水銀の暴露により低下するが、このメチル水銀によるＡＴＰ産生量低減は、Ｍｉｄｉｖｉ−１により回復できることがわかった。【００６９】
また、各培養培地で培養した後の細胞を細胞伸展装置にかけて２０％伸展させた後、ＭＴＴアッセイを行った。各細胞の５９５ｎｍの吸光度（ＭＴＴ値）から、対照の細胞（メチル水銀とＭｉｄｉｖｉ−１のいずれも含有しない培養培地で培養した細胞）のＡｂｓ５９５を１００とした相対値を算出した。この結果、メチル水銀に暴露した細胞では、伸展ストレス後にＭＴＴ値が低下し、死細胞が増えていたが、Ｍｉｄｉｖｉ−１の存在下でメチル水銀に暴露した細胞では、伸展ストレス後でもＭＴＴ値の低下は観察されなかった。これらの結果から、有機水銀は伸展ストレス感受性を増大させるが、Ｍｉｄｉｖｉ−１は、有機水銀による効果を抑制し、伸展ストレスへの適応性を高めることが示唆された。【００７０】
［実施例４］
メチル水銀による心筋細胞毒性を軽減する既存薬剤を探索した。使用した薬剤は、シルニジピン（１μＭ）、Ｍｄｉｖｉ−１（１０μＭ）、ＤＩＤＳ（4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid）（１００μＭ）、ＲＯＸ（１μＭ）、ジアゾキシド（Diazoxide）（１００μＭ）、ロッテレリン（Rottelerin）（５μＭ）、ＡＩＣＡＲ（5-amino-1-b-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide）（５００μＭ）、アモルジピン（Amlodipine）（１μＭ）、及びＥＴ−１（０．１μＭ）である。
具体的には、９６ウェルプレートにＮＲＣＭ細胞を播種し、２４時間培養した後、タウリン含有ＤＭＥＭ（５ｍＭ  タウリン、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ)に培地を交換し、さらに２４時間培養した。培養後、各薬剤を所定の濃度になるように培地に添加し、１時間培養した。培養後、培地を、０、０．５、又は１μＭのメチル水銀を含有するＤＭＥＭ培地に交換し、２４時間培養した後、ＭＴＴアッセイを行い、各細胞のＡｂｓ５９５を測定した。各細胞のＡｂｓ５９５の測定値に基づき、薬剤を添加せず、メチル水銀も添加しなかった培地で培養した細胞の生存率を１００％とした場合の各細胞の生存率を算出した。算出結果を図１７に示す。この結果、シルニジピン、Ｍｄｉｖｉ−１、ＤＩＤＳ、ジアゾキシド、及びＡＩＣＡＲが、メチル水銀の毒性を軽減させた。【００７１】
［実施例５］
糖尿病モデルマウスにシルニジピンを投与し、血糖値に対する影響を調べた。
まず、４８匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ）マウスを１２匹ずつ４群に分け、このうちの２群（２４匹）のマウスに対して、ＤＭＳＯとＰＥＧ３００を容量比３：７で混合した混合溶媒に溶解させた状態のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を２００ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内投与し、インシュリン依存性糖尿病モデルマウスであるＳＴＺマウスを作製した。残りの２群（２４匹）に対しては、対照として、ＤＭＳＯとＰＥＧ３００を容量比３：７で混合した混合溶媒のみを投与した（コントロールマウス）。【００７２】
ＳＴＺの投与から１８日経過後、シルニジピンを含ませた浸透圧ポンプを腹腔内に埋め込み、持続投与を開始した。２群のＳＴＺマウスのうちの１群と２群のコントロールマウスのうちの１群に対して、シルニジピンの投与量が５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように投与し、それぞれＳＴＺ＋ｃｉｌ群、Ｖｅｈ＋ｃｉｌ群とした。さらに、対照として、残りの１群のＳＴＺマウスと残りの１群のコントロールマウスに対しては、ＤＭＳＯとＰＥＧ３００を容量比３：７で混合した混合溶媒のみを投与し、それぞれ、ＳＴＺ群及びＶｅｈ群とした。【００７３】
ＳＴＺ投与開始時点から３〜４日ごとに、各マウスの随時血糖値及び空腹時血糖値を測定した。コントロールマウス（Ｖｅｈ群及びＶｅｈ＋ｃｉｌ群）では、血糖値に対するシルニジピンの投与の影響は観察されなかった。一方で、ＳＴＺマウスでは、ＳＴＺの投与から１８日経過後、シルニジピン投与前の時点における随時血糖値及び空腹時血糖値は、ＳＴＺ＋ｖｅｈ群及びＳＴＺ＋ｃｉｌ群において差異は観察されなかったが、シルニジピン投与開始から１０日後から、ＳＴＺ＋ｃｉｌ群において血糖値が低下する傾向が観察された。シルニジピン投与開始１４日目（ＳＴＺ投与後３２日目）のＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ｃｉｌ群の随時血糖値及び空腹時血糖値の測定結果を図１８に示す。これらの結果から、シルニジピンは、インシュリン依存性高血糖状態を軽減し得ることが示唆された。【００７４】
［実施例６］
アルツハイマー病患者では、アミロイドβタンパク質を腫瘍成分とする沈着物が多く観察されており、アミロイドβタンパク質の蓄積は、アルツハイマー病の発症に関与すると考えられている。また、多量のアミロイドβタンパク質が細胞内に取り込まれると、小胞体ストレスが強くなり、アポトーシスが誘導される。そこで、ラットの褐色細胞腫由来の培養細胞株ＰＣ−１２細胞を用いて、アミロイドβ負荷による細胞障害に対するシルニジピンの影響を調べた。アミロイドβタンパク質としては、Ａｍｙｌｏｉｄ β２５−３５（シグマ・アルドリッチ社製、カタログ番号：Ａ４５５９）を用いた。【００７５】
未分化のＰＣ−１２細胞を培養するための培養用培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（和光純薬社製）に、５％ＦＢＳと５％ＨＳ（ウマ血清）と１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライ社製）とを含有させた培地を用いた。また、ＰＣ−１２にアミロイドβ負荷をかける際の培地としては、血清不含培地（Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（和光純薬社製）に、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライ社製）を含有させた培地）を用いた。【００７６】
まず、２４ウェルプレートに、最終濃度０．００１％のＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）溶液を注入し、３７℃で３０分間静置した後、ＰＢＳで２回洗浄し、風乾させることにより、ウェル内壁をＰＬＬでコートした。ＰＬＬコートした２４ウェルプレートに、未分化のＰＣ−１２細胞を１×１０５個／ウェル（５００μＬ／ウェル）となるように播種し、前記培養用培地で３７℃、２４時間培養した。
次いで、各ウェル内の細胞を、血清不含培地で１回洗浄した後、１ウェル当たり５００μＬのシルニジピン（最終濃度１μＭ）とＡｍｙｌｏｉｄ β２５−３５（最終濃度１０μＭ）を含有させた血清不含培地、シルニジピン（最終濃度１μＭ）のみを含有させた血清不含培地、Ａｍｙｌｏｉｄ β２５−３５（最終濃度１０μＭ）のみを含有させた血清不含培地、又は血清不含培地を添加し、３７℃で２４時間培養した。その後、各ウェルから培地を除去した後、ＭＴＴ溶液（ＭＴＴを５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解させた溶液）を１ウェル当たり１２．５μＬずつ添加し、軽く振とうさせた後、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルからＭＴＴ溶液を除去した後、ＤＭＳＯを１ウェル当たり５００μＬずつ添加し、しっかりと振とうさせることにより、産生されたホルマザンを溶解させた。その後、各ウェル中の溶液１００μＬをそれぞれ９６ウェルプレートのウェルに分注し、この９６ウェルプレートをプレートリーダー（製品名：SpectraMax i3 、Molecular devices社製）に設置し、５９５ｎｍの吸光度（Ａｂｓ５９５）を測定した。【００７７】
Ａｍｙｌｏｉｄ β２５−３５を含有していない血清不含培地で培養した細胞のＡｂｓ５９５に対する、Ａｍｙｌｏｉｄ β２５−３５を含有させた血清不含培地で培養した細胞のＡｂｓ５９５の割合（％）を、細胞の生存率（％）として算出した。算出結果を図１９に示す。この結果、シルニジピン存在下でアミロイドβ負荷をかけた細胞の生存率（図中、「Ｃｉｌ（＋）」）は、シルニジピン非存在下でアミロイドβ負荷をかけた細胞の生存率（図中、「Ｃｉｌ（−）」）よりも高く、シルニジピンによりアミロイドβ負荷によるアポトーシスの誘導が抑制された。これらの結果から、シルニジピンは、細胞に対するアミロイドβ負荷を軽減させることが明らかであり、アルツハイマー病の治療に有効であることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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