(57)【要約】  【課題】均一性の高いシアリル化糖鎖が付加した、インターフェロンβ活性を有するポリペプチドを提供する。  【解決手段】下記の（１）から（４）よりなる群より選択される、いずれかのポリペプチド；  （１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、  （２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド、  （３）インターフェロンβの類縁体であるポリペプチド、および、  （４）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド、において、  ４から６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、  前記糖鎖の非還元末端のいずれもがシアリル化されている糖鎖付加ポリペプチドである。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、下記の（１）から（４）よりなる群より選択される、いずれかのポリペプチド；
（１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド、
（３）インターフェロンβの類縁体であるポリペプチド、および、
（４）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド、
において、
４から６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
前記糖鎖の非還元末端のいずれもがシアリル化されていることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸が、それぞれ独立に、糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎであることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも独立に、ジシアロ糖鎖、トリシアロ糖鎖、および、テトラシアロ糖鎖からなる群より選択されることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも独立に、下記式（１）、式（２）、式（３）および式（４）からなる群より選択されることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【化１】
2014157107.tif 000036
式（１）
【化２】
2014157107.tif 000037
式（２）
【化３】
2014157107.tif 000038
式（３）
【化４】
2014157107.tif 000039
式（４）
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも同一であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、４１位、４８位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、１２３位、および、１３６位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項８】
請求項６に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも３つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、４１位、４８位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、１２３位、および、１３６位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項９】
請求項６に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸が、いずれも、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、２位、５位、６位、９位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２３位、２７位、３３位、３７位、３９位、４０位、４３位、５３位、５４位、５５位、５７位、５８位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、６９位、７３位、７８位、８３位、８６位、８７位、９０位、９３位、９４位、１００位、１２４位、１２５位、１２８位、１３１位、１３２位、１３８位、１４１位、１４２位、１４５位、１４８位、１４９位、１５２位、１５３位、１５６位、１５９位、１６０位、または、１６３位の位置に相当する位置に存しないことを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項６に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸が、いずれも、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、化学的に合成されたことを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。
【請求項１２】
医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、
（１）請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、
（２）薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、
インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物であって、
前記インターフェロンβに関連する疾患が、脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、および、多発性硬化症からなる群より選択されることを特徴とする、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリル化糖鎖が付加されたポリペプチドに関する。より具体的には、均一性の高いシアリル化糖鎖が付加された、インターフェロンβ活性を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然のヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は、１６６個のアミノ酸残基からなる糖タンパク質である。インターフェロンβは、サイトカインファミリーに属し、免疫調整作用、抗ウイルス活性、細胞増殖抑制作用に関与することが知られている。また、ヒトインターフェロンβは、天然のアミノ酸配列における１７位、３１位、１４１位に３つのＣｙｓを有しており、８０位のＡｓｎに１本の複合型のＮ結合型オリゴ糖を有している。また、３１位と１４１位のＣｙｓにおいてジスルフィド結合を有していることが知られている。【０００３】
薬剤としてのインターフェロンβは、細胞発現系を利用して製造されており、発現させる宿主の違いによりＩＦＮ−β−１ａまたはＩＦＮ−β−１ｂに分類される。ＩＦＮ−β−１ａは、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた発現系であり、天然のインターフェロンβと同様に糖鎖を有する糖タンパク質である。一方、ＩＦＮ−β−１ｂは大腸菌で発現させたものであり、糖鎖を有さないタンパク質である。【０００４】
ＩＦＮ−β−１ａは、ＩＦＮ−β−１ｂと比べて、免疫原性、抗ウイルス活性、および、抗腫瘍特性において、より強力な効能を有していることが知られている。さらに、糖タンパク質中に含まれる糖鎖構造は、薬物動態に対して強い影響力を有することが知られている。【０００５】
また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーをタンパク質に結合させると、タンパク質の物理的安定性、熱安定性、血漿中安定性の向上などの効果がもたらされることが知られている。そのような効果を期待して、ＰＥＧで修飾したＩＦＮ−βに関する報告が存在する。例えば、ＩＦＮ−β−１ｂのＮ末端にＰＥＧ修飾を施したＩＦＮ−β複合体に関する報告がある（特許文献１、２）。また、ＩＦＮ−β−１ａのＮ末端にＰＥＧ修飾を施したＩＦＮ−β複合体に関する報告も存在する（特許文献３）。そのような修飾は、確かにタンパク質の上記安定性などには寄与するかもしれないが、一方で、ＩＦＮ−βの薬剤としての活性を低下させることが懸念される。例えば、ＰＥＧの分子量２万以上である場合などには、活性が劇的に低下することが報告されている（非特許文献１）。【０００６】
ＰＥＧ修飾の上述のような懸念を考慮して、高分子量のＰＥＧを結合させてもＩＦＮ−βの活性が維持され得るような位置を選択して、部位特異的にＰＥＧ修飾を施した報告も存在する（特許文献４）。しかしながら、ＰＥＧは生体内に存在しない化合物であり、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βを長期投与した場合の蓄積性、安全性、有効性に関しては、未だ十分な検討は確立されていない。【０００７】
なお、部位特異的に糖鎖修飾を施したＩＦＮ−β複合体に関する報告も存在する（特許文献５）。特許文献５では、天然型ＩＦＮ−βのアミノ酸配列に対して、Ｎ結合型糖鎖の認識部位となるコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有するようにアミノ酸変異を導入し、ＣＨＯ細胞を用いて発現している。しかしながら、この方法では、コンセンサス配列を導入するために、糖鎖を付加するアミノ酸以外にもアミノ酸変異が生じることとなる。また、一般に、ＣＨＯ細胞で発現した場合には、糖鎖の不均一性が生じることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２１４４７２号明細書
【特許文献２】米国特許第７８２９６５９号明細書
【特許文献３】米国特許第７４４６１７３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００５／０１９２６０号
【特許文献５】国際公開第０２／０７４８０６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．  ８８巻  ３５−４２頁  （２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
インターフェロンβの物理的安定性、熱安定性、血漿中安定性などを向上させるために、上述したように、インターフェロンβのポリペプチドをＰＥＧで修飾した例が存在する。しかしながら、ＰＥＧで修飾をした場合には、上述したように、インターフェロンβの薬剤としての活性が低下する場合がある。また、ＰＥＧは生体内に存在する物質ではないため、生体内での蓄積による薬害の心配がある。
一方で、インターフェロンβのポリペプチドを糖鎖で修飾した例も存在する。しかしながら、例えば、ＣＨＯ細胞での発現により糖鎖付加インターフェロンβを製造する場合、上述したように、付加される糖鎖の種類や付加される位置に不均一性が生じることが知られている。糖鎖が不均一である場合には、医薬品として、ロット間で薬効に差が生じる可能性もあり、また、天然型の糖鎖付加インターフェロンβでは、血中滞留時間が短いという欠点も生じていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、インターフェロンβのポリペプチドに対し、糖鎖の非還元末端がいずれもシアリル化された糖鎖付加アミノ酸で、４から６箇所のアミノ酸を置換することにより、天然のヒトインターフェロンβよりも血中滞留性に優れ、かつ、抗腫瘍活性に優れる糖鎖付加ポリペプチドが得られることを見出した。
すなわち、本発明は、一態様において、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドであって、前記糖鎖付加ポリペプチドが、下記の（１）から（４）よりなる群より選択される、いずれかのポリペプチド；
（１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド、
（３）インターフェロンβの類縁体であるポリペプチド、および、
（４）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド、
において、４から６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、前記糖鎖の非還元末端のいずれもがシアリル化されていることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチドに関する。【００１２】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸は、それぞれ独立に、糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎであり得る。【００１３】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖は、いずれも独立に、ジシアロ糖鎖、トリシアロ糖鎖、および、テトラシアロ糖鎖からなる群より選択され得る。【００１４】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖は、いずれも独立に、下記式（１）、式（２）、式（３）および式（４）からなる群より選択され得る。
【化１】
2014157107.tif 000002
式（１）
【化２】
2014157107.tif 000003
式（２）
【化３】
2014157107.tif 000004
式（３）
【化４】
2014157107.tif 000005
式（４）【００１５】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖は、いずれも同一であり得る。【００１６】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存し得る。【００１７】
ここで、本発明の一態様においては、さらに、前記各糖鎖付加アミノ酸は、いずれも、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、２位、５位、６位、９位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２３位、２７位、３３位、３７位、３９位、４０位、４３位、５３位、５４位、５５位、５７位、５８位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、６９位、７３位、７８位、８３位、８６位、８７位、９０位、９３位、９４位、１００位、１２４位、１２５位、１２８位、１３１位、１３２位、１３８位、１４１位、１４２位、１４５位、１４８位、１４９位、１５２位、１５３位、１５６位、１５９位、１６０位、または、１６３位の位置に相当する位置に存しないこととすることができる。【００１８】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、４１位、４８位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、１２３位、および、１３６位からなる群より選択される位置に相当する位置に存し得る。【００１９】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも３つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、４１位、４８位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、１２３位、および、１３６位からなる群より選択される位置に相当する位置に存し得る。【００２０】
本発明の一態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸は、いずれも、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存し得る。【００２１】
本発明の一態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、化学的に合成され得る。【００２２】
また、本発明は、一態様において、
（１）前記糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、
（２）薬理学的に許容される担体を含む、
医薬組成物に関する。【００２３】
本発明の一態様においては、前記医薬組成物は、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防のために用いられ得る。ここで、前記疾患は、脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、および、多発性硬化症からなる群より選択され得る。【００２４】
また、本発明の一態様においては、すでに述べた糖鎖付加ポリペプチドの配列、糖鎖付加アミノ酸におけるアミノ酸、糖鎖付加アミノ酸における糖鎖の種類及び構造、糖鎖付加アミノ酸によるアミノ酸置換の位置、糖鎖付加ポリペプチドの合成方法、医薬組成物としての対象疾患について、それぞれ上記の群より選択される任意の組み合わせとすることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、化学的に合成することができるため、均一な糖鎖構造を有する。そのため、本発明によれば、ロット間のばらつきが少なく、品質の安定した、インターフェロンβ活性を有する糖鎖付加ポリペプチドおよび当該糖鎖付加ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することができる。【００２６】
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、生体内に存在する糖鎖が付加したポリペプチドであり得る。したがって、本発明によれば、長期投与をしても人体に安全である、糖鎖付加ポリペプチドおよび当該糖鎖付加ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することができる。【００２７】
また、本発明によれば、天然型インターフェロンβよりも血中滞留性が高く、抗腫瘍活性も高い糖鎖付加ポリペプチドおよび当該糖鎖付加ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することができる。【００２８】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、天然型インターフェロンβよりも血中滞留性が高く、さらに、抗腫瘍活性も高いことが示された。
従来技術として知られるＰＥＧ修飾をしたインターフェロンβでは、天然型ヒトインターフェロンβと比較して、血中滞留性は向上するものの、抗腫瘍活性の向上は見られなかった。本発明により、ＰＥＧよりも分子量の小さい糖鎖を用いて、ＰＥＧ修飾体と同様、またはそれを上回る血中滞留性の向上を実現できたこと、さらには、ＰＥＧ修飾体では抗腫瘍活性は向上しなかったにもかかわらず、本発明の糖鎖付加体では抗腫瘍活性が著しく向上したことは、驚くべきことである。したがって、本発明における糖鎖付加ポリペプチドは、高いインターフェロンβ活性を有し、インターフェロンβに関連する疾患の治療において、非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（実施例３−１）で得られた２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）および（実施例４−１）で得られた２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）について、質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行った結果を示すマススペクトルである。
【図２】（実施例３−１）で得られた２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）および（実施例４−１）で得られた２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す写真である。
【図３】（実施例３−１）で得られた２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）および（実施例４−１）で得られた２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）の糖鎖成分について、順相ＨＰＬＣにより分析を行った結果を示すマススペクトルである。
【図４】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移を示すグラフである。
【図５】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの薬物速度論的パラメータを示す表である。
【図６】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）を、静脈内投与および皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移をグラフ化したものである。左のグラフが静脈内投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移をグラフ化したものであり、右のグラフが皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移を示すグラフである。
【図７】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）を、静脈内投与および皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの薬物速度論的パラメータを示す表である。
【図８】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を、静脈内投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移を示すグラフである。
【図９】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を、静脈内投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの薬物速度論的パラメータを示す表である。
【図１０】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βを皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの血漿中濃度推移を示すグラフである。
【図１１】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βを皮下投与した際の、各糖鎖付加ポリペプチドの薬物速度論的パラメータを示す表である。
【図１２】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）を皮下投与した胆がんマウスにおける、抗腫瘍活性の評価の結果を示すグラフである。
【図１３】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を皮下投与した胆がんマウスにおける、抗腫瘍活性の評価の結果を示すグラフである。
【図１４】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、２−６ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）を皮下投与した胆がんマウスにおける、抗腫瘍活性の評価の結果を示すグラフである。
【図１５】２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βを皮下投与した胆がんマウスにおける、抗腫瘍活性の評価の結果を示すグラフである。
【図１６】本発明における、インターフェロンβのアミノ酸配列の例として、インターフェロンβ−１ｂのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、シアリル化糖鎖が付加されたポリペプチドに関する。具体的には、均一性の高いシアリル化糖鎖が付加された、インターフェロンβ活性を有する、糖鎖付加ポリペプチドに関する。
【００３１】
本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体物質から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
本発明において、好ましい糖鎖は、インターフェロン複合体のインターフェロンβ活性を消失させない糖鎖である。このような糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチドまたは糖タンパク質、プリテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖質であってもよい。
【００３３】
生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明のインターフェロン複合体が生体に投与されるという観点から好ましい。生体内で複合糖質として存在する糖鎖としては、生体内で糖ペプチドまたは糖タンパク質としてペプチドまたはタンパク質に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。
【００３４】
本発明の一態様においては、好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ−結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
【００３５】
本発明における糖鎖は、糖鎖の非還元末端がいずれもシアリル化されていることを特徴とする。本明細書において、「糖鎖の非還元末端がいずれもシアリル化されている」とは、例えば、２分岐型複合糖鎖の場合は、２つの非還元末端がいずれもシアリル化されていることを意味し、３分岐型複合糖鎖の場合は、３つの非還元末端がいずれもシアリル化されていることを意味し、４分岐型複合糖鎖の場合は、４つの非還元末端がいずれもシアリル化されていることを意味する。
【００３６】
本発明において、シアリル化とは、糖鎖の非還元末端にシアル酸が結合していることを意味する。シアル酸とは、ノイラミン酸のアミノ基やヒドロキシ基が置換されたものの総称である。本発明においては、糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドのインターフェロン活性を消失または著しく低減させるものでない限り、ノイラミン酸のあらゆる置換体を含み得る。中でも、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが生体に投与されるという観点から、本発明における糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖のシアリル化は、天然に存在するシアル酸であることが好ましい。天然に存在するシアル酸としては、例えば、５位がアセチル化されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）や、５位がグリコール酸で修飾されたＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）などが知られている。
【００３７】
本発明の一態様として、非還元末端がいずれもシアリル化されている糖鎖の具体例としては、例えば、生体内に存在することが知られている糖鎖として、Ｎ−結合型糖鎖の複合型糖鎖が挙げられる。Ｎ−結合型糖鎖の複合型糖鎖としては、Ｎ−結合型糖鎖の複合型糖鎖として一般的に知られている糖鎖の基本骨格を有するものであれば、その結合様式、フコースの有無、側鎖の置換基に対する修飾の有無等が異なるものであっても含まれる。Ｎ−結合型の複合型糖鎖としては、糖鎖の分岐構造の違いにより、例えば、ジシアロ糖鎖、トリシアロ糖鎖、および、テトラシアロ糖鎖などを挙げることができる。すなわち、本発明において「ジシアロ糖鎖」とは、Ｎ−結合型の複合型糖鎖であって、２分岐型の構造を有し、かつ、非還元末端がいずれもシアリル化されたものをいう。同様に、「トリシアロ糖鎖」は、Ｎ−結合型の複合型糖鎖であって、３分岐型の構造を有し、かつ、非還元末端がいずれもシアリル化されたものをいう。同様に、「テトラシアロ糖鎖」は、Ｎ−結合型の複合型糖鎖であって、４分岐型の構造を有し、かつ、非還元末端がいずれもシアリル化されたものをいう。
これらの糖鎖としては、さらに具体的には、下記式（１）で表わされるα２−６ジシアロ糖鎖、式（２）で表わされるα２−３ジシアロ糖鎖、式（３）で表わされるα２−６トリシアロ糖鎖、および、式（４）で表わされるα２−６テトラシアロ糖鎖などを挙げることができる。
【００３８】
【化５】
2014157107.tif 000006
式（１）
【化６】
2014157107.tif 000007
式（２）
【化７】
2014157107.tif 000008
式（３）
【化８】
2014157107.tif 000009
式（４）
【００３９】
本発明におけるシアリル化糖鎖は、上記具体例に限定されず、α２−３トリシアロ糖鎖、α２−３テトラシアロ糖鎖など、糖鎖とシアル酸との結合様式の異なるものも含まれる。これらの結合様式は、シアリル化糖鎖において全ての分岐鎖が同一の結合様式であっても良いし、異なる結合様式が含まれていても良い。
さらに、本発明におけるシアリル化糖鎖には、フコースがついた付いたものも含まれる。フコースが付いた複合型糖鎖としては、たとえば、ジシアロ糖鎖であれば、下記式（１３）、トリシアロ糖鎖であれば下記式（１５）及び式（１６）、テトラシアロ糖鎖であれば下記式（１７）を具体例として挙げることができる。
【化９】
2014157107.tif 000010
式（１３）
【化１０】
2014157107.tif 000011
式（１５）
【化１１】
2014157107.tif 000012
式（１６）
【化１２】
2014157107.tif 000013
式（１７）
【００４０】
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチド中の各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖は、いずれも同一とすることもできるし、異なるものを含むこともできる。なお、本明細書中において、糖鎖付加ポリペプチド中の各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が同一であるとは、本発明において、４から６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された場合に、その４から６箇所の糖鎖付加アミノ酸における糖鎖同士を比較したとき、糖鎖を構成する糖の種類、結合順序、および結合様式が糖鎖付加ポリペプチド内において同一であることをいう。
【００４１】
また、本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物において、糖鎖付加ポリペプチドにおける各糖鎖は、それぞれ実質的に均一であることが好ましい。本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドにおける各糖鎖がそれぞれ実質的に均一とは、糖鎖付加ポリペプチド間において糖鎖が付加する位置ごとに各糖鎖を比較した場合に、ポリペプチドにおける位置が同一であり、かつ、それぞれの位置における糖鎖を構成する糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が、各糖鎖において、それぞれ実質的に同一であることをいう。本発明において、糖鎖付加ポリペプチドにおける各糖鎖は、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上均一である。
【００４２】
糖鎖付加ポリペプチドにおける各糖鎖がそれぞれ実質的に均一である糖鎖付加ポリペプチドを含む組成物は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
【００４３】
本発明における、「配列番号１で表されるアミノ酸配列」は、インターフェロンβ−１ｂのアミノ酸配列である（図１６参照）。インターフェロンβ−１ｂは、天然のヒト型インターフェロンβにおける１位のＭｅｔが欠損し、１７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されていることが知られている。  
【００４４】
本発明の「糖鎖付加ポリペプチド」は、たとえば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどにおいて、４から６箇所のアミノ酸が「糖鎖付加アミノ酸」で置換されたものをいう。
【００４５】
本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。
【００４６】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシ基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミンが好ましい。
【００４７】
なお、本発明の任意の糖鎖付加ポリペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位および糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎの場合と糖鎖付加Ｃｙｓの場合で、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの血中半減期に大きな違いはないと考えられる。
【００４８】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）等を挙げることができる。
【００４９】
なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法またはＢ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加ポリペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接またはリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加ポリペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖または糖鎖を付加することで既に付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基および／またはカルボキシ基に１または数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１または複数のインターフェロンβフラグメントと連結させた糖鎖付加ポリペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。
【００５０】
本発明の一態様において、上述の「４から６箇所のアミノ酸」を糖鎖付加アミノ酸で置換する位置は、糖鎖付加アミノ酸の置換によってインターフェロンβの活性が低下することのないように、種々の観点から選択すべきである。たとえば、天然のインターフェロンβにおいて糖鎖が結合している８０位のＡｓｎ（配列番号１で表わされるアミノ酸配列においては７９位に相当）は、本発明において糖鎖付加アミノ酸で置換する位置として好ましい。
【００５１】
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸の置換位置としては、ポリペプチドのフォールディングにおいて、インターフェロンβの立体構造形成の障害とならないように、選択することが好ましい。インターフェロンβの立体構造形成の障害とならないようにするためには、糖鎖付加アミノ酸の置換位置を、インターフェロンβが天然と同様の立体構造を形成した場合において、立体構造の表面に存在するアミノ酸の位置とすることができる。言いかえれば、インターフェロンβが天然と同様の立体構造を形成した場合において、立体構造の表面付近を構成しないアミノ酸の位置（本発明において、「非表面アミノ酸の位置」ともいう。）ではない位置とすることとができる。また、本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸の置換位置としては、インターフェロンβのレセプター結合部位ではないことが好ましい。本発明者らは、インターフェロンβの立体構造解析等のデータを用いて、鋭意検討を行い、インターフェロンβの非表面アミノ酸の位置や、その他の立体形成の障害となりうる位置、レセプターとの結合に障害となりうる位置を推定した。このような観点から、本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、２位、５位、６位、９位、１２位、１３位、１６位、１９位、２０位、２３位、２７位、３３位、３７位、３９位、４０位、４３位、５３位、５４位、５５位、５７位、５８位、６１位、６２位、６４位、６５位、６８位、６９位、７３位、７８位、８３位、８６位、８７位、９０位、９３位、９４位、１００位、１２４位、１２５位、１２８位、１３１位、１３２位、１３８位、１４１位、１４２位、１４５位、１４８位、１４９位、１５２位、１５３位、１５６位、１５９位、１６０位、または、１６３位の位置に相当する位置に存しないことが好ましい。また、本明細書を見た当業者であれば、これらの位置に準じて、同様に糖鎖付加アミノ酸の置換位置として好ましくない位置を適宜検討することができるであろう。
【００５２】
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸の置換位置としては、天然のインターフェロンβにおいてジスルフィド結合を形成している３１位と１４１位のＣｙｓ（配列番号１で表わされるアミノ酸配列においては３０位と１４０位に相当）ではないことが好ましい。
【００５３】
本発明の発明者らは、上述のような観点から鋭意研究を重ね、アミノ酸配列上の種々のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換した数多くのの糖鎖付加ポリペプチドを合成してインターフェロンβ活性を測定した。その結果、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、少なくとも、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位は、糖鎖付加によりインターフェロンβの活性の維持または向上に寄与する位置であることを見出した。
上記の理由から、本発明の一態様において、各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することが好ましい。
【００５４】
また、本発明の一態様において、各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも２つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することが好ましい。
また、本発明の一態様において、各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも３つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することが好ましい。
また、本発明の一態様において、各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも４つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することが好ましい。
また、本発明の一態様において、５箇所以上が糖鎖付加アミノ酸により置換される場合には、各糖鎖付加アミノ酸の少なくとも５つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することが好ましい。
【００５５】
本発明の一態様においては、上述の各糖鎖付加アミノ酸は、いずれも、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、７９位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することがより好ましい。
【００５６】
本発明の一態様においては、糖鎖付加アミノ酸の１つが、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、７９位の位置に相当する位置に存することがより好ましい。
また、本発明の一態様においては、その他の（７９位以外の）各糖鎖付加アミノ酸の１つないし複数が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位、３位、７位、２４位、２５位、２８位、２９位、３２位、３５位、３８位、４１位、４２位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５０位、７０位、７５位、９９位、１０３位、１０６位、１０７位、１０９位、１１２位、１１５位、１２３位、１３０位、１３６位、１３９位、および、１６４位からなる群より選択される位置に相当する位置に存することがより好ましい。
【００５７】
また、これらの位置は好適な具体例であり、ここに挙げられた位置に限定をするものではない。本発明を見た当業者であれば、本発明と同様にして、糖鎖付加アミノ酸で置換する位置を選択することができるであろう。
【００５８】
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、３位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、４１位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、４８位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、７５位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、７９位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１０７位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１１２位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１２３位に相当する位置に存することが好ましい。
本発明の一態様においては、各糖鎖付加アミノ酸の１つは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１３６位に相当する位置に存することが好ましい。
【００５９】
また、本発明の一態様においては、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する場合は、上記の置換位置より選択される位置の任意の組み合わせとすることができる。
【００６０】
本発明における、上述の各糖鎖付加アミノ酸が存する位置として好適な組み合わせの具体例としては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、下記の位置に相当する位置を例示することができるが、これらに限定されない。
１位、４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１２３位；
１位、３位、４８位、７９位、１０７位、および、１１２位；
１位、４８位、７９位、９９位、１０７位、および、１１２位；
１位、４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３０位；
１位、４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
１位、４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３９位；
１位、４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１６４位；
１位、２９位、４８位、７９位、１０７位、および、１３６位；
１位、３５位、４８位、７９位、１０７位、および、１３６位；
１位、４１位、４８位、７９位、１０７位、および、１３６位；
１位、４８位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４８位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０３位、１０７位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０６位、１０７位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０７位、１０９位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０７位、１１５位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０７位、１１９位、および、１３６位；
１位、２８位、４８位、７０位、および、７９位；
１位、４８位、７９位、１０７位、および、１１２位；
２４位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
２５位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
３２位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
３５位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
３８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
４１位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
７位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
４８位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
７５位、７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
４１位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４２位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４５位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４６位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４７位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４８位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
４９位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
５０位、７５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
１位、４８位、７９位、および、１０７位；
１位、３位、４８位、および、７９位；
７９位、１０７位、１１２位、および、１３６位；
１位、７９位、１０７位、および、１３６位；
２８位、７９位、１０７位、および、１３６位；
３５位、７９位、１０７位、および、１３６位；
７０位、７９位、１０７位、および、１３６位；
７５位、７９位、１０７位、および、１３６位。
【００６１】
本明細書において、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における位置に相当する位置とは、アミノ酸の付加、欠失等がない限り、配列番号１で表わされるアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置に対応する位置のアミノ酸をいう。また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列内において、アミノ酸の付加、欠失が存在する場合には、アミノ酸の付加、欠失によるアミノ酸配列上の移動を考慮した位置にあるアミノ酸をいう。例えば、１位から４位までにＳｅｒ１−Ｔｙｒ２−Ａｓｎ３−Ｌｅｕ４−の配列を有する糖鎖付加インターフェロンβ−１ｂにおいて、１位と２位のアミノ酸の間に１つのアミノ酸（Ｔｒｐ）が付加された場合（Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−）に、「２位（Ｔｙｒ）に相当する位置」とは、Ｔｒｐの付加によりＣ末端側に１つ移動したアミノ酸（Ｔｙｒ）の位置をいう。
【００６２】
本明細書中において、「アミノ酸」とは、そのもっとも広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならず、アミノ酸変異体および誘導体といったような非天然アミノ酸を含み得る。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書中におけるアミノ酸として、例えば、天然のタンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、および、α−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、および、側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
【００６３】
本発明において、「配列番号１で表されるアミノ酸配列」は、インターフェロンβ−１ｂのアミノ酸配列を示す（図１６参照）。インターフェロンβ−１ｂは、天然のヒト型インターフェロンβにおける１位のＭｅｔが欠損し、１７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されていることが知られている。
【００６４】
本明細書中において、「アミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、インターフェロンβ活性を保持する限りにおいて特に限定されないが、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または、１０個程度アミノ酸が相違していることを意味する。あるいは、全体のアミノ酸配列の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内のアミノ酸が相違する場合も含み得る。置換または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、または、アミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。本発明の一態様として、「アミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」ポリペプチドとしては、天然型のヒトインターフェロンβが挙げられる。前述のとおり、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、すなわち、インターフェロンβ−１ｂは、天然のヒト型インターフェロンβにおける１位のＭｅｔが欠損し、１７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されたものである。すなわち、天然型のヒトインターフェロンβは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して１個のアミノ酸が付加し、１個のアミノ酸が置換されたものである。本発明の明細書を見た当業者であれば、本明細書の開示を参照して、本件実施例に用いられたヒトインターフェロンβ−１ｂのアミノ酸配列に替えて、天然型のヒトインターフェロンのアミノ酸配列（インターフェロンβ−１ａ）を用いても、本発明と同様に糖鎖付加ペプチドを製造し、使用することができる。天然型のヒトインターフェロンβ−１ａのアミノ酸配列を配列番号２として示す。本発明の一態様において、本件実施例に用いられたヒトインターフェロンβ−１ｂのアミノ酸配列に替えて、天然型のヒトインターフェロンβ−１ａのアミノ酸配列を用いる場合には、天然の８０位に不均一な糖鎖が結合していないアミノ酸配列を用いることが好ましい。
【００６５】
本発明において、「インターフェロンβの類縁体」とは、インターフェロンβと構造上類似したポリペプチドおよび／またはインターフェロンβと重複した構造を有するポリペプチド、例えば、インターフェロンβのアミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたポリペプチド、インターフェロンβ改変体、インターフェロンβ活性を有するインターフェロンβのフラグメント、インターフェロンβ活性を有する伸長インターフェロンβが挙げられる。
【００６６】
本明細書中において、「アミノ酸の１もしくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数および／または疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、インターフェロンβ活性の明らかな低下または消失を生じない置換をいう。
【００６７】
本明細書中において、「インターフェロンβ改変体」とは、インターフェロンβの改変体であって、インターフェロンβの天然に存在する変異体、またはインターフェロンβを人工的に改変した化合物を含み、そのような改変としては、例えば、インターフェロンβの１または複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
【００６８】
本明細書中において、「インターフェロンβ活性を有するインターフェロンβのフラグメント」とは、インターフェロンβのＮ末端および／またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつインターフェロンβ活性を維持したペプチドである。
【００６９】
本明細書中において、「インターフェロンβ活性を有する伸長インターフェロンβ」とは、インターフェロンＮ末端および／またはＣ末端に１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、かつインターフェロンβ活性を維持したペプチドである。
【００７０】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、４から６箇所のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されているものを含み得る。
【００７１】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置および付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
【００７２】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ポリペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）、および、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド等の任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したポリペプチドを、公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加ポリペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加ポリペプチドおよびその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。
【００７３】
また、これらのＡ法およびＢ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法およびＢ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００７４】
糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）
糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加Ａｓｎを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基を樹脂（レジン）へ結合させる。この場合、アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンとアミノ酸とが反応して結合が起こる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とを、アミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
【００７５】
ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシ基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
また、（２）の後、または、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。
このように、（１）および（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いることで、任意の２ヶ所以上に糖鎖が付加されたペプチドを得ることができる。
糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
【００７６】
樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、塩素で官能化された２−クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−(４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ) −ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。
また、Ｃ末端をアミド化する場合には、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることが好ましい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
樹脂と脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸との結合は、例えば、水酸基を有する樹脂や塩素で官能化された樹脂を使用するには、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂へエステル結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合には、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂にアミド結合により結合させる。
【００７７】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
また、上記天然アミノ酸のＤ体を使用することもできる。
【００７８】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
【００７９】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを挙げることができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを挙げることができる。
【００８０】
また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、固相合成の過程において、上記の脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
【００８１】
２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いる場合、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等の塩基を用いることでエステル化を行うことができる。また、水酸基を有する樹脂を用いる場合、エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【００８２】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
【００８３】
この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
【００８４】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
【００８５】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
【００８６】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
【００８７】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
【００８８】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
【００８９】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
【００９０】
このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ａｓｎで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
【００９１】
なお、本発明の一実施態様において、固相合成に用いる糖鎖付加Ａｓｎにおける糖鎖上の非還元末端にシアル酸を含む場合には、酸処理によりシアル酸が切断されるのを防ぐために、当該シアル酸のカルボキシ基を、保護基により保護していることが好ましい。保護基としては、例えば、ベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基等を挙げることができる。保護基の導入および保護基の脱離の方法は、公知の方法により行うことができる。
【００９２】
糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）
糖鎖付加ポリペプチドは、まずペプチド鎖を合成し、後で合成したペプチド鎖へ糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。ここで、ジスルフィド結合を形成する予定の位置にあるＣｙｓ等、糖鎖を付加しないＣｙｓに対しては、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護しておく。また、糖鎖を付加せず、かつ、ジスルフィド結合の形成にも使用しないＣｙｓを糖鎖付加ポリペプチドに導入する場合には、糖鎖付加工程およびジスルフィド結合形成工程の間、Ｃｙｓを保護基により保護しておき、その後脱保護するようにしてＣｙｓを導入することができる。このような保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）や４−メトキシベンジルを挙げることができる。
【００９３】
また、糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに、異なる糖鎖を付加する場合には、最初に糖鎖を導入するＣｙｓを無保護とし、次に異なる糖鎖を導入するＣｙｓを、ＳｔＢｕ等により保護しておくことで、異なる糖鎖を導入することができる。具体的には、固相合成等によりペプチドを合成する際、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓを無保護とし、かつ、第二の糖鎖を導入したいＣｙｓをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ等を用いて、保護基を有するＣｙｓとする。その後、ＳｔＢｕ等の保護基を保持したまま、無保護のＣｙｓへ糖鎖を導入する。次に、ＳｔＢｕ基等を脱保護することで、無保護となったＣｙｓへ異なる糖鎖を導入することができる。なお、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓおよび第二の糖鎖を導入したいＣｙｓは、１つ又は複数個とすることができる。
【００９４】
なお、ＳｔＢｕ基の脱保護は、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン等の還元剤を用いて反応させることにより脱保護することができる。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
【００９５】
糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、例えば固相合成の過程において、脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、合成したポリペプチドの好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
次に、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体を上記で得た無保護のＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖を無保護のＣｙｓのチオール基と反応させ、ペプチドに結合させる。上記反応は、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合溶液中において、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、通常１０分〜２４時間、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
【００９６】
ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。
【００９７】
具体的には、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
【００９８】
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒と、上記の緩衝液との混合溶液中で反応を行うこともできる。このとき、有機溶媒の比率は、０〜９９％（ｖ／ｖ）の範囲で、上記緩衝液に添加することができる。緩衝液への溶解性が低い無保護のＣｙｓを含むペプチドは、このような有機溶媒を添加することにより反応溶液への溶解性を向上させることができ、好ましい。
【００９９】
または、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒や、それらの混合溶液中で反応を行うこともできる。その際、塩基の存在下で行うのが好ましい。塩基としては、例えばＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等を挙げることができる。
【０１００】
また、グアニジン塩酸塩や尿素を緩衝溶液に加えた混合溶液中においても反応を行うことができる。なお、グアニジン塩酸塩や尿素は、最終濃度が１Ｍ〜８Ｍとなるように上記緩衝液に加えることができる。グアニジン塩酸塩や尿素の添加によっても、緩衝液への溶解性の低いペプチドの溶解性を向上させることができ、好ましい。
【０１０１】
さらに、無保護のＣｙｓを含むペプチドが、ジスルフィド結合を介した２量体を形成することを防止するために、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）やジチオトレイトール（ＤＴＴ）を緩衝液に添加して反応させることもできる。ＴＣＥＰやＤＴＴは、最終濃度が１０μＭ〜１０ｍＭとなるように緩衝液に加えることができる。
【０１０２】
また、糖鎖を目的のＣｙｓへ結合させた後、Ａｃｍ等で保護されたＣｙｓの保護基を脱保護する。保護基がＡｃｍ基である場合は、水、メタノール、酢酸、またはこれらの混合溶液中において、ヨウ素、酢酸水銀（ＩＩ）、硝酸銀（Ｉ）、または、酢酸銀（Ｉ）等を用いて反応させることにより脱保護することができる。
【０１０３】
上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜２４時間程度である。反応終了後は、ＤＴＴや塩酸等により処理した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
【０１０４】
このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、このように精製された糖鎖付加ポリペプチドは、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させる。
【０１０５】
また、ジシアロ糖鎖やモノシアロ糖鎖等のシアル酸含有糖鎖をペプチド配列中に複数本有する糖鎖付加ポリペプチドを製造する際には、導入する糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、ベンジル（Ｂｎ）基、アリル基、ジフェニルメチル基、フェナシル基等により保護されたシアル酸含有糖鎖を用いることができる。
【０１０６】
シアル酸のカルボキシ基が保護された糖鎖を導入した際には、糖鎖付加ポリペプチドにおけるジスルフィド結合の形成工程の後、シアル酸保護基の脱保護の工程をすることができる。
このように、シアル酸のカルボキシ基をベンジル基等で保護することにより、製造工程におけるＨＰＬＣ等による分離・精製工程が容易となる。また、シアル酸のカルボキシ基の保護は、酸に不安定なシアル酸の脱離を防ぐことも可能である。
【０１０７】
糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基の保護反応は、当業者に周知の方法により行うことができる。また、ジスルフィド結合を形成させた糖鎖付加ポリペプチドにおいて、シアル酸のカルボキシ基の保護基は、塩基性条件下で加水分解することによって脱保護できる。上記反応は、通常０〜５０℃、好ましくは、０〜４０℃、更に好ましくは０〜３０℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜５時間程度である。反応終了後は、リン酸や酢酸などの弱酸によって中和した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
【０１０８】
また、上記Ａ法およびＢ法により作製された糖鎖付加ポリペプチドは、空気および／または酸素、ヨウ素、ＤＭＳＯ、酸化および還元されたグルタチオンの混合物、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、ならびに、アルキルトリクロロシランスルホキシドなどを用いた当業者に周知の方法で、Ｃｙｓ同士のジスルフィド結合を形成することができる。
【０１０９】
なお、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ間でのジスルフィド結合を形成させる際に、ジスルフィド結合することが望ましくない糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに対しては、保護基により保護しておく。このような保護基としては、Ａｃｍ、ｔＢｕ、４−メトキシベンジル、４−メチルベンジル等、酸化条件で安定な保護基を用いることができる。
【０１１０】
また、Ｂ法において、ジスルフィド結合の形成は、糖鎖の導入の前に行うことも可能である。ただし、ジスルフィド結合させたいＣｙｓに保護基が導入されている場合には、脱保護の工程がジスルフィド結合形成の工程よりも先となる。
【０１１１】
（活性）
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、インターフェロンβ活性を有している。本明細書において、「インターフェロンβ活性」とは、免疫調整作用、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性等公知の活性のうち少なくとも１つの活性を有することを意味する。
【０１１２】
例えば、糖鎖付加ポリペプチドのインターフェロンβ活性は、実施例１１から１４に記載の抗腫瘍活性測定試験などを用いて測定することができる。
抗腫瘍活性の測定試験は、例えば、腫瘍を有するマウスに、対象となる糖鎖付加ポリペプチドを皮下投与し、経時的な腫瘍体積の測定により調べることができる。
【０１１３】
（医薬組成物）
本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、インターフェロンβに関連する疾患の治療または予防に有効である。インターフェロンβに関連する疾患には、例えば、脳腫瘍、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、亜急性硬化性全脳炎、Ｃ型代償性肝硬変、および、多発性硬化症等が含まれる。なお、上記の脳腫瘍には、膠芽腫、髄芽腫、および、星細胞腫等が含まれる。本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、上記疾患の治療または予防に有効である。
【０１１４】
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物の投与対象は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。
【０１１５】
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、注射剤等が挙げられる。
【０１１６】
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ポリペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ポリペプチドを１〜９０重量％含有させるのが好ましく、１〜７０重量％含有させるのがより好ましい。
【０１１７】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、糖鎖付加ポリペプチドを薬学的に許容可能な塩として含むこともできるし、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有することもできる。また、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、医薬組成物に含有させることのできるその他の成分としては、当業者に周知の薬学的に許容される担体等を挙げることができる。
【０１１８】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、またはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。点眼剤の場合は、結膜嚢などの眼組織に適用する。吸入剤の場合には、気管支または肺に適用する。
【０１１９】
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ポリペプチドが０．００１〜１００ｎｍｏｌ、好ましくは０．０１〜１０ｎｍｏｌ、より好ましくは０．０１〜１ｎｍｏｌとなる投与量とすることができる。
【０１２０】
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。
【０１２１】
本発明の糖鎖付加ポリペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ポリペプチドおよび当該糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
さらに、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
【０１２２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【０１２３】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【０１２４】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１２５】
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１２７】
本明細書中におけるポリペプチドフラグメントの表記方法について下記に説明する。
例えば、ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡと示した場合においては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１−７８番目のアミノ酸配列と同等のペプチド配列を持ち、そのペプチド配列に対して、１番目のセリンがチアゾリジン構造を有するシステインへ置換され、３０番目のシステインの側鎖がＡｃｍによって保護され、Ｃ末端が２-メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）によってアルキルチオエステル化されたペプチドフラグメントのことを示す。【０１２８】
また、ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｍ３５Ｃ−Ｑ４８Ｃ）ＭＥＳＮＡと示した場合においては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１−７８番目のアミノ酸配列と同等のペプチド配列を持ち、そのペプチド配列に対して、１番目のセリンがチアゾリジン構造を有するシステインへ置換され、３０番目のシステインの側鎖がＡｃｍによって保護され、３５番目のメチオニンがシステインへ置換され、４８番目のグルタミンがシステインへ置換され、Ｃ末端が２-メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）によってアルキルチオエステル化されたペプチドフラグメントのことを示す。【０１２９】
同様にして、ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎと示した場合においては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１−７８番目のアミノ酸配列と同等のペプチド配列を持ち、そのペプチド配列に対して、１番目のセリンがチアゾリジン構造を有するシステインへ置換され、３０番目のシステインの側鎖がＡｃｍによって保護され、４８番目のグルタミンがシステインへ置換され、Ｃ末端がエタンチオール（Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ）によってアルキルチオエステル化されたペプチドフラグメントのことを示す。【０１３０】
また、ＩＦＮ  ７９−１６５(Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ)と示した場合においては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における７９−１６５番目のアミノ酸配列と同等のペプチド配列を持ち、そのペプチド配列に対して、７９番目のアスパラギンがシステインへ置換され、１０７番目のリジンがシステインに置換され、１１２番目のリジンがシステインへ置換され、１２３番目のアルギニンがシステインへ置換され、１４０番目のシステインがＡｃｍ基によって保護されたペプチドフラグメントのことを示す。【０１３１】
糖鎖修飾されたポリペプチドの表記方法について下記に説明する。
例えば、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１位のセリン、４８位のグルタミン、７９位のアスパラギン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されて、下記式（１）に示されるα２−６ジシアロ糖鎖構造が、各置換におけるＣｙｓに結合していることを示す。【０１３２】
【化１３】
2014157107.tif 000014
式（１）【０１３３】
また、２−３ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列におけるにおける１位のセリン、４８位のグルタミン、７９位のアスパラギン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されて、下記式（２）に示されるα２−３ジシアロ糖鎖構造が、各置換におけるＣｙｓに結合していることを示す。【０１３４】
【化１４】
2014157107.tif 000015
式（２）【０１３５】
また、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１位のセリン、４８位のグルタミン、７９位のアスパラギン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されて、下記式（５）または下記式（６）に示されるα２−６モノシアロ糖鎖構造が、各置換におけるＣｙｓに結合していることを示す。【０１３６】
【化１５】
2014157107.tif 000016
式（５）【０１３７】
【化１６】
2014157107.tif 000017
式（６）【０１３８】
また、２−６ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列におけるにおける１位のセリン、４８位のグルタミン、７９位のアスパラギン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されて、下記式（３）に示されるα２−６トリシアロシアロ糖鎖構造が、各置換におけるＣｙｓに結合していることを示す。【０１３９】
【化１７】
2014157107.tif 000018
式（３）【０１４０】
また、２−６ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１位のセリン、４８位のグルタミン、７９位のアスパラギン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されて、下記式（４）に示されるα２−６テトラシアロ糖鎖構造が、各置換におけるＣｙｓに結合していることを示す。【０１４１】
【化１８】
2014157107.tif 000019
式（４）【０１４２】
糖鎖構造がＣｙｓに結合した構造について、α２−６ジシアロ糖鎖の場合を例として下記式（１４）に示す。下記式中において、波線は、下記式の右端に記載されたシステインに対して、ペプチド結合により結合している隣接するアミノ酸の記載を省略したことを示す。
【化１９】
2014157107.tif 000020
式（１４）【０１４３】
なお、「ｄｉＳｉａｌｏ」はジシアロ糖鎖を意味し、「ｍｏｎｏＳｉａｌｏ」はモノシアロ糖鎖を意味し、「ｔｒｉＳｉａｌｏ」はトリシアロ糖鎖を意味し、「ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ」はテトラシアロ糖鎖を意味する。【０１４４】
また、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）と示した場合には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列における１位のセリン、４８位のグルタミン、１０７位のリジン、１１２位のアルギニン、１２３位のアルギニンの各アミノ酸がＣｙｓへ置換されており、下記式（１）に示されるα２−６ジシアロ糖鎖構造が、上記の各置換におけるＣｙｓ、および、７９位のアスパラギンに結合していることを示す。【０１４５】
【化２０】
2014157107.tif 000021
式（１）【０１４６】
また、以下の実施例において、４、５、６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されているＩＦＮ−βを、それぞれ、「４、５、６本糖鎖修飾ＩＦＮ−β」と表わす場合がある。本発明における、「４箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている糖鎖付加ポリペプチド」と「４本糖鎖修飾ＩＦＮ−β」は同義であり、同様に、「５箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている糖鎖付加ポリペプチド」と「５本糖鎖修飾ＩＦＮ−β」は同義であり、同様に、「６箇所のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている糖鎖付加ポリペプチド」と「６本糖鎖修飾ＩＦＮ−β」は同義である。【０１４７】
（実施例１）チオエステルフラグメントの合成
（実施例１−１）ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号３）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（１２５μｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)（１２５μｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（１２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びジクロロメタン（ＤＣＭ）で十分に洗浄した。続いてＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．２５ｍｍｏｌ）、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール(ＭＳＮＴ)（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１８７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２５ｍｌ）に溶解させて固相合成用カラムに加えた後、４時間攪拌した。【０１４８】
樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合した。【０１４９】
ＦｍｏｃもしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１５０】
得られた樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を加え、１８時間室温で撹拌することで樹脂から保護ペプチドを分離した。保護ペプチドを含む反応溶液を減圧下で濃縮した後、減圧下で乾燥した。乾燥した保護ペプチドをＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解した後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。これに対しエタンチオール（５．０ｍｍｏｌ）を加えた後、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（０．５０ｍｍｏｌ）、続いて、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、酢酸（０．８ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：フェノール：チオアニソール：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い、溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣を得た。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ-ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、目的とするＩＦＮ１−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎの質量と一致した（計算値＝９４４５．８  Ｄａ、実測値＝９４４５．５  Ｄａ）。【０１５１】
（実施例１−２）ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号４）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、３−Ｆｍｏｃ−４−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（１５０μｍｏｌ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）（１５０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３００μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で２時間攪拌した。【０１５２】
攪拌後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した後、ＤＭＦで樹脂を十分に洗浄した。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて順次アミノ酸を縮合した。【０１５３】
ＦｍｏｃもしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１５４】
得られた樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭによって洗浄した後、４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ(０．２５ｍｍｏｌ)をＤＣＭに溶解させ、固相合成カラムに添加した後、室温で３０分攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、ジイソプロピルエチルアミン(２．５ｍｍｏｌ)加え、室温で１５分攪拌した。得られた樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭによって洗浄した後、トリフルオロ酢酸：水：フェノール：チオアニソール：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。５時間後、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含むｐＨ７．２のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍリン酸溶液、３００ｍＭ  ２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム）で樹脂を十分に洗浄した。上記バッファーを樹脂に加え室温で１２時間攪拌した。【０１５５】
攪拌後、得られた溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、目的とするＩＦＮ１−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡの質量と一致した（計算値＝９５４０．９  Ｄａ、実測値＝９５４１．６  Ｄａ）。【０１５６】
（実施例１−３）その他のチオエステルフラグメントの合成
（実施例１−１）と同様にして、以下に示すチオエステルフラグメントの合成を行った。
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｎ３Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号５）
ＩＦＮ  １-７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｅ２８Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ｒ７０Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号６）【０１５７】
（実施例１−２）と同様にして、以下のチオエステルフラグメントを合成した。
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号７）
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号８）
ＩＦＮ  １−７８（Ｆ７Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号９）
ＩＦＮ  １−７８（Ｎ２４Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１０）
ＩＦＮ  １−７８（Ｇ２５Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１１）
ＩＦＮ  １−７８（Ｅ２８Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１２）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｋ３２Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１３）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｍ３５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１４）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｄ３８Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１５）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｅ４１Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１６）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１７）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｒ７０Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１８）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１９）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２０）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｅ４２Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２１）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４５Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２２）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｌ４６Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２３）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４７Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２４）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２５）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｆ４９Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２６）
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ５０Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２７）
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｙ２９Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２８）
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｍ３５Ｃ−Ｑ４８Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２９）
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｅ４１Ｃ−Ｑ４８Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号３０）【０１５８】
（実施例１−１）、（実施例１−２）、（実施例１−３）で得られた化合物の質量分析結果を下記（表１）に示す。【０１５９】
【表１】
2014157107.tif 000022
【０１６０】
（実施例２）ペプチドフラグメントの合成
（実施例２−１）ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３１）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（１２５μｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（１２５μｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（１２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。続いてＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（０．２５ｍｍｏｌ）、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１８７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２５ｍｌ）に溶解させて固相合成用カラムに入れた後、４時間攪拌した。【０１６１】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合した。【０１６２】
ＦｍｏｃもしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１６３】
得られた樹脂をトリフルオロ酢酸：水：フェノール：チオアニソール：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。３時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い、溶液部分を除くことで目的とするペプチドを含む残渣が得られた。この得られた残渣を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）の質量と一致した（計算値＝１０４９９．１  Ｄａ、実測値＝１０４９８．１  Ｄａ）。【０１６４】
（実施例２−２）その他ペプチドフラグメントの合成
（実施例２−１）と同様にして、以下に示すペプチドフラグメントを合成した。
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３２）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３３）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３４）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３５）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｔ９９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３６）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｅ１０３Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３７）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｅ１０６Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３８）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｄ１０９Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３９）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｌ１１５Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号４０）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｌ１１９Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号４１）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｈ１３０Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号４２）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号４３）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｈ１３９Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号４４）
ＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ−Ｒ１６４Ｃ）（配列番号４５）【０１６５】
（実施例２−１）、（実施例２−２）で得られた化合物の質量分析結果を下記（表２）に示す。
【表２】
2014157107.tif 000023
【０１６６】
（実施例３）ジシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例３−１）２-６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号３）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ-Ｒ１２３Ｃ-Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３１）を、４−メルカプトフェニル酢酸を含むｐＨ７．２のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍリン酸溶液、１２５ｍＭ４−メルカプトフェニル酢酸）に溶解させ、室温で静置した。２４時間後、反応溶液に対してジチオトレイトール溶液（２Ｍジチオトレイトール）を加え、室温で３時間静置した。反応終了後、メトキシアミン溶液（１Ｍメトキシアミン塩酸塩）と塩酸溶液（１Ｍ塩酸、８Ｍグアニジン塩酸塩）を溶液に加え、ｐＨを４．０へ調整した後、室温で２４時間静置した。反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって脱塩し、凍結乾燥した。【０１６７】
得られた粗精製物をｐＨ８．５のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）に溶解させ、下記式（７）で表わされるブロモアセチル化されたジシアロ糖鎖（５等量）を加えて１時間静置した。【０１６８】
【化２１】
2014157107.tif 000024
式（７）【０１６９】
反応終了後、メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム溶液（２００ｍＭメルカプトエタンスルホン酸ナトリウム）を加え、室温で３０分静置した。反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって脱塩し、凍結乾燥した。【０１７０】
上記工程によって得られた粗精製物を、酢酸銀溶液（６０ｍＭ酢酸銀、７．５Ｍ尿素、８７５ｍＭ酢酸）に溶解し室温で４時間静置した。反応後ジチオトレイトール溶液（２Ｍジチオトレイトール）を加えた。反応物に対して、ｐＨ８．５のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって脱塩し、凍結乾燥した。【０１７１】
得られた凍結乾燥物を、ｐＨ８．５のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）に溶解させ室温で３０分静置した。溶液を冷却条件（４℃）において希薄されたグアニジン塩酸塩溶液（４．５Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）へ置換した。置換された溶液に対して、硫酸銅溶液（３００ｍＭ硫酸銅II五水和物）を加え、冷却条件（４℃）で４時間静置した。反応後、エチレンジアミン四酢酸（４００ｍＭエチレンジアミン四酢酸）を加え、冷却条件（４℃）で１時間静置した。反応後の溶液を酢酸溶液（１０ｍＭ酢酸溶液）へ冷却条件（４℃）で終夜置換することによって変性剤を除去した。フォールディング後の溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行った結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）の質量と一致した（計算値＝３３３０４．８  Ｄａ、実測値＝３３３０３．６  Ｄａ）。【０１７２】
（実施例３−２）２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号４７）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ）ＭＥＳＮＡ（配列番号２５）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ-Ｃ１４０Ａｃｍ)（配列番号４３を、４−メルカプトフェニル酢酸を含むｐＨ７．２のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍリン酸溶液、１２５ｍＭ４−メルカプトフェニル酢酸）に溶解させ、室温で静置した。２４時間後、反応溶液に対してジチオトレイトール溶液（２Ｍジチオトレイトール）を加え、室温で３時間静置した。反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって脱塩し、凍結乾燥した。【０１７３】
得られた粗精製物を用い、（実施例３−１）と同様にして、質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行った。その結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）の質量と一致した（計算値＝３３３３１．８  Ｄａ、実測値＝３３３３１．２  Ｄａ）。【０１７４】
（実施例３−３）２−３ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号４８）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｎ３Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号５）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ-Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３４）について、下記式（８）で表わされるブロモアセチル化されたジシアロ糖鎖に変更した以外は（実施例３−１）と同様にして、ジシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βを合成した。質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行なった結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−３ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）の質量と一致した（計算値＝３３３４６．９  Ｄａ、実測値＝３３３４６．６  Ｄａ）。
【化２２】
2014157107.tif 000025
式（８）【０１７５】
（実施例３−４）その他ジシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例３−１）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号４９）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｔ９９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号５０）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｈ１３０Ｃ）（配列番号５１）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号５２）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｈ１３９Ｃ）（配列番号５３）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１６４Ｃ）（配列番号５４）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｙ２９Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号５５）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｍ３５Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号５６）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｅ４１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号５７）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号５８）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｅ２８Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｒ７０Ｃ−Ｎ７９Ｃ）（配列番号５９）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号６０）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号６１）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ）（配列番号６２）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６３）【０１７６】
（実施例３−２）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｅ１０３Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６４）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｅ１０６Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６５）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｄ１０９Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６６）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６７）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｌ１１５Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６８）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｌ１１９Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号６９）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｎ２４Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７０）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｇ２５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７１）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｋ３２Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７２）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｍ３５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７３）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｄ３８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７４）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７５）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｆ７Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７６）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７７）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７８）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４１Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号７９）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ４２Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８０）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４５Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８１）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｌ４６Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８２）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４７Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８３）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ４８Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８４）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｆ４９Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８５）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｑ５０Ｃ−Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８６）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８７）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｅ２８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８８）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｍ３５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号８９）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｒ７０Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号９０）
２−６  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ７５Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｅ１３６Ｃ）（配列番号９１）【０１７７】
（実施例３−３）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−３  ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号９２）【０１７８】
（実施例３−５）２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ）（配列番号１００）の合成
（実施例３−５−Ａ）ＩＦＮ  １−２５（Ｓ１Ｔｈｉ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０１）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（１２５μｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)（１２５μｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（１２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びジクロロメタン（ＤＣＭ）で十分に洗浄した。続いてＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．２５ｍｍｏｌ）、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール(ＭＳＮＴ)（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１８７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２５ｍｌ）に溶解させて固相合成用カラムに加えた後、４時間攪拌した。【０１７９】
樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄し、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合した。【０１８０】
Ｆｍｏｃ基もしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１８１】
得られた樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を加え、１８時間室温で撹拌することで樹脂から保護ペプチドを分離した。保護ペプチドを含む反応溶液を減圧下で濃縮した後、減圧下で乾燥した。乾燥した保護ペプチドをＤＭＦ（２．１ｍＬ）に溶解した後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。これに対しチオール源としてチオフェノール（０．２ｍｍｏｌ）を加えた後、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（１．４ｍｍｏｌ）、続いて、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（＝９２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い、溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣を得た。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、目的とするＩＦＮ１−２５（Ｓ１Ｔｈｉ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０１）の質量と一致した（計算値＝３０６２．６  Ｄａ、実測値＝３０６２．５  Ｄａ）。【０１８２】
（実施例３−５−Ｂ）ＩＦＮ  ２６−４７（Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ（配列番号１０２）の合成
（実施例３−５−Ａ）の操作と同様にして、ペプチドフラグメントを合成した。なお、ＩＦＮ  ２６−４７（Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌにおいてチオール源としてＥｔｈａｎｔｈｉｏｌを使用した。【０１８３】
合成した化合物はＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、目的とするＩＦＮ  ２６−４７（Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ（配列番号１０２）の質量と一致した（計算値＝２８４４．４  Ｄａ、実測値＝２８４４．５  Ｄａ）。【０１８４】
（実施例３−５−Ｃ）ＩＦＮ  ４８−６６（Ｑ４８Ｔｈｉ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１０３）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、３−Ｆｍｏｃ−４−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（１５０μｍｏｌ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）（１５０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３００μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。【０１８５】
攪拌後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した後、ＤＭＦで樹脂を十分に洗浄した。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて順次アミノ酸を縮合した。【０１８６】
Ｆｍｏｃ基もしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１８７】
得られた樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭによって洗浄した後、４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ(１．４ｍｍｏｌ)をＤＣＭに溶解させ、固相合成カラムに添加した後、室温で４０分攪拌した。攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、ＤＭＦ溶液に溶解させたジイソプロピルエチルアミン(５．０ｍｍｏｌ)を加え、室温で１５分攪拌した。得られた樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭによって洗浄した後、トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（＝９２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。２時間後、ＤＭＦ、ＤＣＭによって樹脂を十分に洗浄した後、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含むｐＨ８．５のバッファー溶液（６Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、１Ｍ  ２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム）で樹脂を十分に洗浄した。上記バッファーを樹脂に加え室温で２時間攪拌した。攪拌後、得られた溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、目的とするＩＦＮ  ４８−６６（Ｑ４８Ｔｈｉ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１０３）の質量と一致した（計算値＝２４１３．８  Ｄａ、実測値＝２４１３．９  Ｄａ）。【０１８８】
（実施例３−５−Ｄ）ジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ６７−８７（Ａ６７Ｔｈｉ，Ｎ７９）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０４）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、３−Ｆｍｏｃ−４−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（１５０μｍｏｌ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）（１５０μｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（３００μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。【０１８９】
攪拌後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した後、ＤＭＦで樹脂を十分に洗浄した。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて順次アミノ酸を縮合した。【０１９０】
Ｆｍｏｃ基もしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１９１】
得られた８残基ペプチドに対して、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護し、ＤＭＦで洗浄後、別途用意した遠沈管にジベンジルジシアロ糖鎖アスパラギン（０．２ｍｍｏｌ）とＤＥＰＢＴ（０．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／ＤＭＳＯ（１：１混合溶液、２．２ｍｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに入れ、ＤＩＰＥＡ（０．１５ｍｍｏＬ）を加えて室温にて１８時間攪拌した。ＤＭＦとＤＣＭとで洗浄すると、固相上に下記式（１８）で表されるジベンジルジシアロ糖鎖アスパラギンが結合した９残基糖鎖ペプチドが得られた。
【化２３】
2014157107.tif 000026
式（１８）【０１９２】
その後の糖ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１９３】
Ｆｍｏｃ基でアミノ酸を保護したアミノ酸とＨＯＢｔ（０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（０．４７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．３ｍｌ）に溶解させ、１５分間活性化させた後、固相合成用カラムに入れた。室温で１時間撹拌した後、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて２０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。【０１９４】
得られた樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、トリフルオロエタノールと酢酸の混合溶液（１：１）を十分に樹脂が浸る程度加え、１８時間室温で撹拌することで、樹脂と糖鎖付加ペプチドフラグメントとを切り離した。切り離した樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を濃縮し、アミノ酸側鎖が保護された糖鎖ペプチドを得た。【０１９５】
得られた糖鎖付加ペプチドフラグメント（５０ｍｍｏｌ）をナスフラスコに移し、ＤＭＦに溶解させた後、窒素雰囲気下、−１５℃〜−２０℃に冷却した。このものにチオフェノール（０．１５ｍｍｏｌ）を加えた後、ＰｙＢＯＰ（２．５ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＩＰＥＡ（０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。−１５℃〜−２０℃において２時間攪拌した後、トリフルオロ酢酸を加え、徐々に室温に戻した。室温に戻った後、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をトリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を加え室温で撹拌した。２時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い、溶液部分を除くことで目的とするペプチドチオエステル体を含む残渣が得られた。この得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、目的とするジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ６７−８７（Ａ６７Ｔｈｉ，Ｎ７９）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０４）の質量と一致した（計算値＝４９０３．１  Ｄａ、実測値＝４９０３．１  Ｄａ）。【０１９６】
（実施例３−５−Ｅ）ＩＦＮ  ８８−１６５（Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０５）の合成
固相合成用カラム上にＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）（５０μｍｏｌ）を加え、４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（１２５μｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（１２５μｍｏｌ）及びＮ−エチルモルホリン（１２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２５ｍｌ）に溶解させ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。続いてＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（０．２５ｍｍｏｌ）、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）（０．２５ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルイミダゾール（０．１８７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２５ｍｌ）に溶解させて固相合成用カラムに入れた後、４時間攪拌した。【０１９７】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１５分間処理し脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合した。
Ｆｍｏｃ基もしくはＢｏｃ基で保護されたアミノ酸をＤＭＦに溶解し、その溶液を固相合成カラムに加えた（０．２５ｍｍｏｌ）。０．２Ｍ  １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）／ＤＭＦ（０．２５ｍｍｏｌ）を固相合成カラムに加え、０．８Ｍ  Ｎ−メチルモルホリン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）もしくは、０．８Ｍ  ２，６，４−トリメチルピリジン／ＤＭＦ（０．５０ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに添加した。室温で１５分間もしくは３０分間攪拌した後、樹脂をＤＭＦによって洗浄し、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて１０分間処理し脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ固相合成法によってアミノ酸を順次縮合した。【０１９８】
得られた樹脂をトリフルオロ酢酸：水：フェノール：チオアニソール：トリイソプロピルシラン（＝９５：２．５：２．５：２．５：５）を加え室温で撹拌した。３時間後、再度、この溶液を別途用意したジエチルエーテルに加え沈殿させた後、遠心分離を行い、溶液部分を除くことで目的とするペプチドを含む残渣が得られた。この得られた残渣を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］で精製し、ＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、ＩＦＮ  ８８−１６５（Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０５）の質量と一致した（計算値＝９６４７．３  Ｄａ、実測値＝９６４７．２  Ｄａ）。【０１９９】
（実施例３−５−Ｆ）各フラグメントの結合
（工程１．Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ工程）
ＩＦＮ  １−２５（Ｓ１Ｔｈｉ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０１）とＩＦＮ  ２６−４７（Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ（配列番号１０２）を、ｐＨ６．８のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ）に溶解させ、室温で３時間反応させた。反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、凍結乾燥した。この得られた凍結乾燥品をＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、ＩＦＮ１−４７（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ（配列番号１０６）の質量と一致した（計算値＝５７９６．８  Ｄａ、実測値＝５７９６．７  Ｄａ）。【０２００】
（工程２．Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ工程Ａ）
ジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ６７−８７（Ａ６７Ｔｈｉ，Ｎ７９）ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ（配列番号１０４）とＩＦＮ  ８８−１６５（Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０５）を、ｐＨ７．２のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ）に溶解させ、チオフェノール（３％Ｖ／Ｖ）加え、室温で反応させた。２３時間後、メトキシアミン溶液（６Ｍグアニジン塩酸塩、０．２Ｍメトキシアミン塩酸塩、２０ｍＭＴＣＥＰ）を反応溶液に加え、ｐＨを４．０へ調整した後、室温で４時間反応させた。反応溶液に対して５０ｍＭＮａＯＨ水溶液を加え、反応溶液を塩基性にしたのち、氷上で０．５時間反応させた。反応終了後、反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、凍結乾燥品を得た。この得られた凍結乾燥品をＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、ジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ６７−１６５（Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０７）の質量と一致した（計算値＝１４２４７．９  Ｄａ、実測値＝１４２４７．２  Ｄａ）。【０２０１】
（工程３．Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ工程Ｂ）
工程２で得られたジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ６７−１６５（Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０７）とＩＦＮ  ４８−６６（Ｑ４８Ｔｈｉ）ＭＥＳＮＡ（配列番号１０３）を、ｐＨ７．２のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．２Ｍリン酸溶液、２０ｍＭＴＣＥＰ、３０ｍＭＭＰＡＡ）に溶解させ、室温で反応させた。１８時間後、メトキシアミン溶液（６Ｍグアニジン塩酸塩、０．２Ｍメトキシアミン塩酸塩、２０ｍＭＴＣＥＰ）を反応溶液に加え、ｐＨを４．０へ調整した後、室温で反応させた。５時間後、反応溶液に対して２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、反応終了後の溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、凍結乾燥品を得た。この得られた凍結乾燥品をＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、ジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ４８−１６５（Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０８）の質量と一致した（計算値＝１６５０７．６  Ｄａ、実測値＝１６５０７．９  Ｄａ）。【０２０２】
（工程４．Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ工程Ｃ）
工程１で得られたＩＦＮ１−４７（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ）Ｅｔｈａｎｔｈｉｏｌ（配列番号１０６）と、工程３で得られたジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  ４８−１６５（Ｑ４８Ｃ，Ａ６７Ｃ，Ｎ７９、Ａ８８Ｃ，Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０８）を、工程３と同様にして、反応させた。反応で得られた化合物はＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、目的とするジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  １−１６５（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０９）の質量と一致した（計算値＝２２２３０．２  Ｄａ、実測値＝２２２３０．３  Ｄａ）。【０２０３】
（工程５．糖鎖付加工程）
工程４で得られたジシアロ糖鎖付加ＩＦＮ  １−１６５（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１０９）をｐＨ８．５のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍトリス溶液）に溶解させ、下記式（１９）で表わされるブロモアセチル化されたジシアロ糖鎖（２５等量）を加えて、室温で２時間反応させた。
【化２４】
2014157107.tif 000027
式（１９）
反応終了後、反応溶液を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、凍結乾燥品を得た。この得られた凍結乾燥品をＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、１、２６、４８、６７、８８位にシステインの側鎖硫黄原子を介して付加されたジシアロ糖鎖を有し、７９位にアスパラギンの側鎖を介して付加された糖鎖を有する２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号１１０）の質量と一致した（計算値＝３３５４５．４  Ｄａ、実測値＝３３５４５．５  Ｄａ）。【０２０４】
（工程６．Ａｃｍ基の脱保護）
上記工程５によって得られた凍結乾燥物を、酢酸銀溶液（１００ｍＭ酢酸銀、９０％酢酸水溶液）に溶解し室温で反応させた。４時間後、ＨＰＬＣとＥＳＩ−ＭＳを用いて、目的物が生成していることを確認した。反応溶液にジチオスレイトールを加え、室温で１５分間撹拌したのち、遠心分離を行い、沈殿物を除く上澄み液を回収した。その回収した上澄み液をメンブレンフィルターで濾過し、目的物を含む濾液部分を逆相ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、凍結乾燥品を得た。この得られた凍結乾燥品をＥＳＩ−ＭＳによって質量を分析した結果、得られた化合物の質量は、１、２６、４８、６７、８８位にシステインの側鎖硫黄原子を介して付加されたジシアロ糖鎖を有し、７９位にアスパラギンの側鎖を介して付加された糖鎖を有する２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ）（配列番号１１１）の質量と一致した（計算値＝３３４０３．３  Ｄａ、実測値＝３３４０３．２  Ｄａ）。【０２０５】
（工程７．フォールディング工程）
上記工程６によって得られた凍結乾燥物を、ｐＨ８．５のバッファー溶液（８Ｍグアニジン塩酸液、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）に溶解させ室温で３０分静置した。溶液を冷却条件（４℃）において希薄されたグアニジン塩酸塩溶液（４．５Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン）へ置換した。置換された溶液に対して、硫酸銅溶液（３００ｍＭ硫酸銅II五水和物）を加え、冷却条件（４℃）で３時間静置した。反応後、エチレンジアミン四酢酸（４００ｍＭエチレンジアミン四酢酸）を加え、冷却条件（４℃）で０．５時間静置した。反応後の溶液を酢酸溶液（１０ｍＭ酢酸溶液）へ冷却条件（４℃）で終夜置換することによって変性剤を除去した。フォールディング後の溶液をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ］によって精製し、質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行った結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｒ２６Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ａ６７Ｃ−Ｎ７９−Ａ８８Ｃ）（配列番号１００）の質量と一致した（計算値＝３３４０１．２  Ｄａ、実測値＝３３４０１．２  Ｄａ）。【０２０６】
（実施例４）モノシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例４−１）２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９３）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号３）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ−Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３１）について、下記式（９）および下記式（１０）で表わされるブロモアセチル化されたモノシアロ糖鎖混合物（化合物比率１：１）（５等量）に変更した以外は（実施例３−１）と同様の方法により、モノシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βを合成した。質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行なった結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）の質量と一致した（計算値＝３１５５７．２  Ｄａ、実測値＝３１５５６．６  Ｄａ）を得た。（実施例３−１）および（実施例４−１）における質量分析の結果を図１に示す。
【化２５】
2014157107.tif 000028
式（９）
【化２６】
2014157107.tif 000029
式（１０）【０２０７】
（実施例３−１）および（実施例４−１）で得られた化合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ［カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ３００］によって分析をした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を見ると、クリアなバンドが検出されていることから、いずれの化合物においても、均一に糖鎖が付加されていることが示唆された。同様に、逆相ＨＰＬＣによる分析においても、均一に糖鎖が付加されていることを示唆するデータが得られた（Ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。【０２０８】
また、（実施例３−１）および（実施例４−１）で得られた化合物を、ｐＨ６．０のリン酸バッファー（０．１Ｍリン酸）溶液において、Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｅｎｄｏ−Ｍ）（東京化成工業株式会社）を添加することによって糖鎖部分の切り出しを行った。得られた遊離糖鎖の還元末端を２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（シグマアルドリッチ）によってラベル化した後、順相ＨＰＬＣ［カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＮＨ２Ｐ−５０］によって分析を行った結果を図３に示す。糖鎖構造分析の結果、目的とするジシアロ糖鎖と同様のレテンションタイムにおいてピークが確認され、目的の糖鎖が付加していることを確認した。【０２０９】
（実施例４−２）その他モノシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例４−１）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号９４）
２−６  ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号９５）【０２１０】
（実施例５）トリシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例５−１）２−６  ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９６）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号３）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ-Ｒ１２３Ｃ-Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３１）について、下記式（１１）で表わされるブロモアセチル化されたトリシアロ糖鎖（５等量）を加えた以外は（実施例３−１）と同様の方法により、トリシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βを合成した。質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行なった結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６  ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）の質量と一致した（計算値＝３７２４４．３  Ｄａ、実測値＝３７２４３．２  Ｄａ）。
【化２７】
2014157107.tif 000030
式（１１）【０２１１】
（実施例５−２）その他トリシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例５−１）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−６  ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号９７）【０２１２】
（実施例６）テトラシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例６−１）２−６  ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９８）の合成
ＩＦＮ  １−７８（Ｓ１Ｔｈｉ−Ｃ３０Ａｃｍ−Ｑ４８Ｃ）Ｅｔｈａｎ（配列番号３）とＩＦＮ  ７９−１６５（Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ-Ｒ１２３Ｃ-Ｃ１４０Ａｃｍ）（配列番号３１）について、下記式（１２）で表わされるブロモアセチル化されたテトラシアロ糖鎖（５等量）に変更した以外は（実施例３−１）と同様の方法により、テトラシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βを合成した。質量分析（ＥＳＩイオン化法）を行った結果、得られた化合物の質量は、目的とする２−６  ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）の質量と一致した（計算値＝４１１８３．８  Ｄａ、実測値＝４１１８２．６  Ｄａ）。
【化２８】
2014157107.tif 000031
式（１２）【０２１３】
（実施例６−２）その他テトラシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βの合成
（実施例６−１）と同様の手法を用い、以下に示す化合物の合成を行った。
２−６  ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号９９）【０２１４】
実施例３−１、実施例３−２、実施例３−３、実施例３−４、実施例４−１、実施例４−２、実施例５−１、実施例５−２、実施例６−１、実施例６−２で得られた化合物の質量分析結果を下記（表３）示す。
【表３】
2014157107.tif 000032
2014157107.tif 000033
【０２１５】
（実施例７）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖による４、５、６本修飾ＩＦＮ−βのマウスでの薬物動態
（実施例７−１）投与薬、試薬の調製
２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号６１）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号６０）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、および、Ａｖｏｎｅｘ（バイオジェンアイデック）は、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液で５８８ｎＭに調製した。Ａｖｏｎｅｘは、天然型のＩＦＮ−β（ＩＦＮ−β−１ａ）であり、対照薬として用いた。なお、Ａｖｏｎｅｘは、ＣＨＯ細胞系を用いて製造されたものであり、天然のヒトインターフェロンβの８０位の位置（本発明における、配列番号１で表されるアミノ酸配列における７９位の位置に相当）に１本の糖鎖を有し、その糖鎖構造は、各ポリペプチド毎にＮ結合型糖鎖の複合型の種々の糖鎖でありうる。【０２１６】
（実施例７−２）投与および採血
マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、雄性、８週令、体重２１−２３ｇ）に対し、２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇの用量で、飽食下で、背部皮下から、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて容量４ｍＬ／ｋｇで投与した。皮下投与前、および投与後１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、および、３０時間に尾静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（ＨＩＲＳＨＭＡＮＮ  ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ）を用いて７５μＬ採血した。採取した血液と同体積の６ｍＭＥＤＴＡ−ＰＢＳと速やかに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４度、１０分）した。上清を９０μＬ採取し、血漿サンプルとした。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。【０２１７】
（実施例７−３）血中濃度測定
ＩＦＮ−βの血中濃度の測定は、ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いた。検量線を作成するためのスタンダードとして、投与に用いたものと同一ロットのｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４−６本修飾ＩＦＮ−β、Ａｖｏｎｅｘを用い、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、および、３．１２５ｐＭになるようにキット付属希釈液で調製した。検量線には、血漿サンプルの希釈率に応じ、同じ持ち込み量となるようにブランク血漿を添加した。得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移をグラフ化したものを図４に示す。【０２１８】
図４に示されるように、血漿中でのＩＦＮ−β濃度を比較すると、いずれの測定ポイントにおいても、ｄｉｓｉａｌｏ糖鎖４，５，６本修飾ＩＦＮ−βは、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりもはるかに高い血漿中濃度を維持しており、血中滞留性の改善が認められた。そして、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖修飾本数が増えるほどＴｍａｘが遅くなっていることから、化合物の皮下から血中への移行が遅延したと考えられた。Ｃｍａｘや消失相における血中濃度は、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖修飾本数が増えるほど高くなっていた。このことから、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖を付加することにより、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖の本数依存的に生体中でのＩＦＮ−βの安定性が向上することが示された。【０２１９】
（実施例７−４）薬物速度論的パラメータの算出
得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移からモーメント解析を用い、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ∞）を台形法により算出した。また、血中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および皮下投与時の実測値より最大血中濃度（Ｃｍａｘ）、最大血中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）を求めた。得られた薬物速度論的パラメータを図５に示す。【０２２０】
図５に示されるように、モーメント解析の結果からも、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖修飾ＩＦＮ−βは、修飾本数依存的にｔ１／２、ＡＵＣ、ＭＲＴを改善する効果が大きくなることが示された。【０２２１】
（実施例８）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖およびｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖の４本糖鎖修飾ＩＦＮ−βのマウスでの薬物動態
（実施例８−１）投与薬、試薬の調製
２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号６１）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号９５）、および、Ａｖｏｎｅｘは、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液で１１２ｎＭに調製した。【０２２２】
（実施例８−２）投与および採血
マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、雄性、８週令、体重２１−２３ｇ）に対し、４４８ｐｍｏｌ／ｋｇの用量で、飽食下で、尾静脈もしくは背部皮下から、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて容量４ｍＬ／ｋｇ投与した。静脈内投与時は投与前、および投与後２分、１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、８時間、２４時間に、皮下投与時は、投与前、および投与後１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３０時間に尾静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（ＨＩＲＳＨＭＡＮＮ  ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ）を用いて７５μＬ採血した。採取血液と同体積のＥＤＴＡ−ＰＢＳと速やかに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４度、１０分）した。上清を９０μＬ採取し、血漿サンプルとした。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。【０２２３】
（実施例８−３）血中濃度測定
ＩＦＮ−βの血中濃度の測定は、ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いた。検量線を作成するためのスタンダードとして、投与に用いたものと同一ロットのｄｉＳｉａｌｏ糖鎖の４本糖鎖修飾ＩＦＮ−β、ｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖の４本糖鎖修飾ＩＦＮ−β、Ａｖｏｎｅｘを用い、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、および、３．１２５ｐＭになるようにキット付属希釈液で調製した。検量線には、血漿サンプルの希釈率に応じ、同じ持ち込み量となるようにブランク血漿を添加した。得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移をグラフ化したものを図６に示す。【０２２４】
図６に示されるように、血漿中でのＩＦＮ−β濃度を比較すると、いずれの測定ポイントにおいても、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりも、ｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴともに大幅に向上していることが確認された。これに対し、皮下投与、尾静脈投与いずれにおいてもシアリル化が不完全な２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりも大幅に低い血中濃度推移を示した。この結果から、糖鎖の末端が全てシアリル化されていることが、ＩＦＮ−βの血中滞留性などの向上に大きく寄与することが示された。【０２２５】
（実施例８−４）薬物速度論的パラメータの算出
得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移からモーメント解析を用い、血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ０）、さらに血中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、および皮下投与時の実測値より最大血中濃度（Ｃｍａｘ）、最大血中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）を求めた。結果を図７に示す。【０２２６】
図７に示されるように、モーメント解析の結果からも、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４本修飾ＩＦＮ−βは、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりもｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴについて改善効果が確認された。一方で、ｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖４本修飾ＩＦＮ−βは対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりもｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴのいずれも低値を示し、血中からより早く消失することが確認された。【０２２７】
（実施例９）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖およびｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖の６本糖鎖修飾ＩＦＮ−βのマウスでの薬物動態【０２２８】
（実施例９−１）投与薬、試薬の調製
２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９３）、および、Ａｖｏｎｅｘは、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液で５８８ｎＭに調製した。【０２２９】
（実施例９−２）投与および採血
マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、雄性、体重２１−２３ｇ）に対し、２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇの用量で、飽食下で、尾静脈から、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて容量４ｍＬ／ｋｇ投与した。静脈内投与前、および投与後２分、１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、８時間、２４時間に、尾静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（ＨＩＲＳＨＭＡＮＮ  ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ）を用いて７５μＬ採血した。採取血液と同体積のＥＤＴＡ−ＰＢＳと速やかに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４度、１０分）した。上清を９０μＬ採取し、血漿サンプルとした。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。【０２３０】
（実施例９−３）血中濃度測定
ＩＦＮ−βの血中濃度の測定は、ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いた。検量線を作成するためのスタンダードとして、投与に用いたものと同一ロットのｄｉＳｉａｌｏ糖鎖の６本糖鎖修飾ＩＦＮ−β、ｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖の６本糖鎖修飾ＩＦＮ−β、Ａｖｏｎｅｘを用い、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、および、３．１２５ｐＭになるようにキット付属希釈液で調製した。検量線には、血漿サンプルの希釈率に応じ、同じ持ち込み量となるようにブランク血漿を添加した。得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移をグラフ化したものを図８に示す。【０２３１】
６本修飾ＩＦＮ−βにおいても、上述した４本修飾ＩＦＮ−βと同様の結果が得られた。すなわち、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりも、ｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴともに大幅に向上していることが確認された。一方で、尾静脈投与において２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりも大幅に低い血中濃度推移を示した。このことから、６本糖鎖修飾ＩＦＮ−βにおいても、４本糖鎖修飾ＩＦＮ−βと同様に、糖鎖の末端が全てシアリル化されていることが、ＩＦＮ−βの血中滞留性などの向上にとって、非常に重要であることが確認できた。【０２３２】
（実施例９−４）薬物速度論的パラメータの算出
得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移からモーメント解析を用い、血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ０）、さらに血中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）を求めた。結果を図９に示す。【０２３３】
図９に示されるように、モーメント解析の結果からも、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりもｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴともに大幅に向上していることが示された。一方、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）は、対照薬であるＡｖｏｎｅｘよりもｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴのいずれも低い値を示し、血中からより早く消失することが示された。【０２３４】
（実施例１０）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βのマウスでの薬物動態
（実施例１０−１）投与薬、試薬の調製
２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βおよびＡｖｏｎｅｘは、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液で５５８ｎＭに調製した。【０２３５】
（実施例１０−２）投与および採血
マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、雄性、８週令、体重２１−２３ｇ）に対し、２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇの用量で、飽食下で、背部皮下から、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて容量４ｍＬ／ｋｇ投与した。皮下投与前、および投与後１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、および、３０時間に尾静脈からヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（ＨＩＲＳＨＭＡＮＮ  ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ）を用いて７５μＬ採血した。採取血液と同体積のＥＤＴＡ−ＰＢＳと速やかに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４度、１０分）した。上清を９０μＬ採取し、血漿サンプルとした。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。【０２３６】
（実施例１０−３）血中濃度測定
ＩＦＮ−βの血中濃度の測定は、ヒトインターフェロンβＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス）を用いた。検量線を作成するためのスタンダードとして、投与に用いたものと同一ロットのｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−β、Ａｖｏｎｅｘを用い、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、および、３．１２５ｐＭになるようにキット付属希釈液で調製した。検量線には、血漿サンプルの希釈率に応じ、同じ持ち込み量となるようにブランク血漿を添加した。得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移をグラフ化したものを図１０に示す。【０２３７】
（実施例１０−４）薬物速度論的パラメータの算出
得られたＩＦＮ−βの血漿中濃度推移からモーメント解析を用い、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ０）、さらに血中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）を求めた。結果を図１１に示す。【０２３８】
図１０及び図１１に示されるように、血漿中濃度推移及びモーメント解析の結果から、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βおよびＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βは、いずれも、Ａｖｏｎｅｘよりもｔ１／２、ＡＵＣ∞、ＭＲＴともに大幅に向上させた。また、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βは、ＡＵＣ∞およびＣｍａｘについて、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βを上回ることが分かった。
ｔ１／２およびＭＲＴについては、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βとの間の比較において、同程度の結果であった。
これらの結果から、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βは、ＰＥＧ２０Ｋと同程度またはそれ以上に、Ａｖｏｎｅｘの生体中における安定性を向上させることが示された。【０２３９】
（実施例１１）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４、５、６本修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性
ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４、５、６本修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、担がんマウスを用いて評価した。
（実施例１１−１）細胞培養
抗腫瘍活性試験には、ヒトバーキットリンパ腫であるＤａｕｄｉ細胞を接種することにより作製された担がんマウスを用いた。培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、５６℃で３０分間非働化処理したＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ）を１０％、ペニシリン・ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を加えたものを用いた。培養プレートは、Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ  ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養し、２−３日に１度継代を行った。【０２４０】
（実施例１１−２）担がんマウスの作成法
培養したＤａｕｄｉ細胞をチューブに回収し、遠心分離（１３００ｒｐｍ、４度、３分）した。上清をアスピレーターで除き、ＨＢＳＳ（ナカライ）を加え、細胞を懸濁した。次に再度遠心分離を行い、上清を除いた。この細胞洗浄処理を計３回行った。そして、血球計算板を用いて細胞数を計算し、２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＢＳＳを用いて細胞懸濁液を作成した。Ｄａｕｄｉ細胞接種直前に、細胞懸濁液と同体積のマトリゲル（ＢＤ）を加えて２倍希釈し、接種用細胞懸濁液を作製した。接種用細胞懸濁液は接種直前まで、氷上に保存した。麻酔薬として、ソムノペンチル（共立製薬）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。ＳＣＩＤマウス（Ｃ.Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウス、雄性、６週令）（日本クレア）に、インスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２（テルモ社）を用いて、麻酔薬を３００μＬ腹腔内投与した。麻酔が導入された事を確認後、バリカンを使用してマウスの右腹側部を刈毛した。２６Ｇ１／２注射針（テルモ）と１ｍＬの注射筒（テルモ）を用いて、接種用細胞懸濁液を１００μＬ皮下接種した。【０２４１】
細胞接種処理からおよそ３０日後、ノギス（Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ）を用いて形成された腫瘍組織の長径（ｍｍ）と短径（ｍｍ）を測定した。得られた数値を用いて、腫瘍体積（ｍｍ３）を求めた。腫瘍体積は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５の式を用いて算出し、担がんマウスを４群に群分けした（ｎ＝４／群）。群分け時の腫瘍体積は、およそ８００ｍｍ３であった。【０２４２】
（実施例１１−３）投与液の調製法
２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）（配列番号６１）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号６０）、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）および２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）（配列番号４９）および対照薬であるＡｖｏｎｅｘを、Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液を用いて５８８ｎＭに調製した。投与液の調製は、投与直前に行った。【０２４３】
（実施例１１−４）投与方法
調製した投与液を用いて、背部皮下に２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇの用量になるよう４ｍＬ／ｋｇの容量でインスリン用シリンジマイジェクター２９Ｇ×１／２を用いて投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群には、投与液調製時に用いたＬ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、ポリソルベートを含む酢酸緩衝液を４ｍＬ／ｋｇの容量で投与した。群分けおよび初回投与を行った日をｄａｙ０とし、ｄａｙ９まで隔日で５回背部皮下投与を行った。【０２４４】
（実施例１１−５）抗腫瘍活性能の評価
投与開始２４日目にマウスよりがん組織を摘出し、組織湿重量を測定した。抗腫瘍活性の指標として、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群の組織湿重量を１００％とした時のｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４−６本修飾ＩＦＮ−βおよびＡｖｏｎｅｘ投与群の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ：ｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出した。結果を図１２に示す。【０２４５】
図１２に示されるように、がん組織の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ）は、Ａｖｏｎｅｘ投与群では４４．５％であったのに対し、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）投与群で０．３％、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｎ３Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）投与群で０．４％、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ）投与群で１８．９％、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ）投与群で２８．１％であり、本発明のｄｉＳｉａｌｏ糖鎖４、５、６本修飾ＩＦＮ−βは、がん組織をほぼ消滅させ、または、非常に縮小させるほどの優れた抗腫瘍活性を示した。 
以上の結果から、１日１回、隔日×５回、２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇ皮下投与を実施した場合、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖修飾本数が増加するほど、抗腫瘍活性が強い傾向が観察された。【０２４６】
（実施例１２）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖・ｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性
（実施例１１−１）と同様の方法で細胞培養をし、（実施例１１−２）と同様の方法で担がんマウスを作成した。
（実施例１１−３）の投与液を、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、２−６ｍｏｎｏＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９３）および対照薬であるＡｖｏｎｅｘとした以外は、（実施例１１−３）と同様の方法で投与液を調製し、（実施例１１−４）と同様の方法で担がんマウスに投与した。【０２４７】
投与開始２２日目にマウスよりがん組織を摘出し、組織湿重量を測定した。抗腫瘍活性の指標として、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群の組織湿重量を１００％とした時のＡｖｏｎｅｘ投与群の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ：ｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出した。結果を図１３に示す。【０２４８】
図１３に示されるように、がん組織の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ）は、Ａｖｏｎｅｘ投与群では６３．０％であったのに対し、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群で１．３％とであり、強い抗腫瘍活性が確認された。一方、ｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群では７９．３％であった。
以上の結果から、１日１回、隔日×５回、２３５２ｐｍｏｌ／ｋｇ皮下投与を実施した場合、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βでは、Ａｖｏｎｅｘ投与群よりはるかに優れた、がん組織がほぼ消滅するほどの強い抗腫瘍活性が示された一方、２つの非還元末端のうち、片方しかシアリル化されていないｍｏｎｏＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βでは、Ａｖｏｎｅｘ投与群より優れた抗腫瘍活性は、認められなかった。このことから、全ての非還元末端がシアリル化されていることが抗腫瘍活性にとって重要であることが分かった。【０２４９】
（実施例１３）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖・ｔｒｉＳｉａｌｏ糖鎖・ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性
（実施例１１−１）と同様の方法で細胞培養をし、（実施例１１−２）と同様の方法で担がんマウスを作成した。
（実施例１１−３）の投与液を、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、２−６ｔｒｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９６）、２−６ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号９８）および対照薬であるＡｖｏｎｅｘとした以外は、（実施例１１−３）と同様の方法で投与液を調製し、（実施例１１−４）と同様の方法で担がんマウスに投与した。
投与開始２１日目にマウスよりがん組織を摘出し、組織湿重量を測定した。抗腫瘍活性の指標として、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群の組織湿重量を１００％とした時のＡｖｏｎｅｘ投与群の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ：ｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出した。結果を図１４に示す。【０２５０】
図１４に示されるように、がん組織の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ）は、Ａｖｏｎｅｘ投与群では５５．５％であったのに対し、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群で３．６％、ｔｅｔｒａＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群で９．１％、ｔｒｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群で２８．７％となり、いずれの糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βも、強い抗腫瘍活性を有することが示された。
なお、糖鎖の構造に関し、糖鎖における分岐数の違いに着目すると、２分岐型のｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾体は強い抗腫瘍活性を示すが、３分岐型のｔｒｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾体、４分岐型のｔｅｔｒａＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾体においては、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾体より弱い抗腫瘍活性を示した。これは、後述の実施例１６における結果（表４）に示されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制活性の違いや、生体内での血中動態の違い等が関与している可能性が考えられる。【０２５１】
（実施例１４）ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−βとＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性
（実施例１１−１）と同様の方法で細胞培養をし、（実施例１１−２）と同様の方法で担がんマウスを作成した。
（実施例１１−３）の投与液を、２−６ｄｉＳｉａｌｏ（Ｓ１Ｃ−Ｑ４８Ｃ−Ｎ７９Ｃ−Ｋ１０７Ｃ−Ｒ１１２Ｃ−Ｒ１２３Ｃ）（配列番号４６）、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−β、および対照薬であるＡｖｏｎｅｘとした以外は、（実施例１１−３）と同様の方法で投与液を調製し、（実施例１１−４）と同様の方法で担がんマウスに投与した。【０２５２】
投与開始２１日目にマウスよりがん組織を摘出し、組織湿重量を測定した。抗腫瘍活性の指標として、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群の組織湿重量を１００％とした時のＡｖｏｎｅｘ投与群の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ：ｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出した。結果を図１５に示す。【０２５３】
図１５に示されるように、がん組織の組織湿重量の相対値（％Ｔ／Ｃ）は、Ａｖｏｎｅｘ投与群では６２．６％であったのに対し、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮ−β投与群で０．３％であり、がん組織がほぼ消滅するほどの非常に高い抗腫瘍活性が示された。一方、ＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−β投与群の％Ｔ／Ｃは５８．５％であり、対照薬であるＡｖｏｎｅｘ投与群と同程度にすぎなかった。このことから、ｄｉＳｉａｌｏ糖鎖６本修飾ＩＦＮβは、対照薬であるＡｖｏｎｅｘ及び従来技術として知られるＰＥＧ２０Ｋ修飾ＩＦＮ−βに比べて、非常に優れたＩＦＮ−β活性を有することが明らかとなった。【０２５４】
一般的に、従来技術として、タンパク質の物理的安定性や血漿中安定性が向上させるために、ポリペプチドにＰＥＧを付加することが行われてきた。本発明の（実施例１０）においても、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、Ａｖｏｎｅｘと比較して著しく改善された血中濃度推移を示した。しかしながら、（実施例１４）において、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βは、Ａｖｏｎｅｘと同程度の抗腫瘍活性しか示さなかった。すなわち、一般的に血中滞留性を向上させる効果があるとして知られているＰＥＧ修飾では、ＩＦＮ−βの抗腫瘍活性に関しては向上が見られなかったのに対し、本発明の糖鎖修飾ＩＦＮ−βでは、驚くべきことに、（実施例１０）が示すように血中滞留性がＡｖｏｎｅｘよりも著しく高く、さらに、抗腫瘍活性についても著しく向上した。このことから、本発明の糖鎖修飾ＩＦＮ−βが、天然のＩＦＮ−βやＰＥＧ修飾ＩＦＮ−βよりも、薬剤としての有用性が非常に高いことが示された。【０２５５】
（実施例１５）４，５，６本糖鎖修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制活性
４，５，６本糖鎖修飾ＩＦＮ−βのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制活性を以下の方法により評価した。
ヒト・バーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、１００Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０）を用いて１．２５×１０５個／ｍＬとなるよう懸濁した。細胞懸濁液を１×１０４／８０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴平底プレートに播種した。さらに１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を用いて段階希釈した複数本糖鎖修飾ＩＦＮ−βを２０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、ＣＯ２濃度を５％に調整したＣＯ２インキュベーター中で３７度、３日間培養した。細胞増殖抑制活性は、培養３日目のミトコンドリア脱水素酵素活性を指標として、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同人科学）を用いてキット添付のマニュアルに従って測定を行った。
また、対照として、Ａｖｏｎｅｘを使用した。ＩＣ５０価はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。結果を下記（表４）に示す。
【表４】
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2014157107.tif 000035
【０２５６】
本発明で抗腫瘍活性の向上効果が見られた糖鎖修飾ＩＦＮ−βとは異なる位置を糖鎖修飾した糖鎖付加ポリペプチドに関しても、（表４）に示したとおり、種々の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖抑制活性の向上が見られた。（表４）に示した糖鎖付加ポリペプチドについても、前述の糖鎖付加プリペプチドと同様に、非還元末端がいずれもシアリル化された本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、インターフェロンβ活性を有する薬剤として、抗腫瘍活性等のインターフェロン活性の優れた薬剤として使用できると考えられる。【０２５７】
以上より、本発明の４−６本糖鎖修飾ＩＦＮ−βは、天然のＩＦＮ−β（Ａｖｏｎｅｘ）よりも高い血中滞留性および高い抗腫瘍活性を有することが示された。
図４、図５、及び図１２において示されるように、ジシアロ糖鎖修飾ＩＦＮ−βは、糖鎖の本数が４本よりも５本、５本よりも６本、と、本数が多くなるにつれて血中滞留性が高くなり、また、抗腫瘍活性も高くなることが示された。
また、本発明において、糖鎖の非還元末端が全てシアリル化されていることが、ＩＦＮ−βの血中滞留性の向上及び生体内での抗腫瘍活性の向上に重要であることが示された。
また、糖鎖の非還元末端が全てシアリル化された糖鎖として、ジシアロ糖鎖の他、トリシアロ糖鎖、テトラシアロ糖鎖などの種々の糖鎖を用いた場合において、いずれも、天然のＩＦＮ−β（Ａｖｏｎｅｘ）よりも高い血中滞留性および高い抗腫瘍活性を有することが示された。
したがって、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、優れたインターフェロンβ活性を有する薬剤として有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014157107.tif 000057
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