(57)【要約】本発明はＴｅｔ  ３の発現阻害物質を含有する、関節リウマチを含む関節炎の予防・治療剤、診断キット、並びに関節リウマチを含む関節炎の予防及び／又は治療活性を有する新規な物質の探索手段を提供する。
2016031996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質を含有する、関節炎の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
Ｔｅｔ  ３の発現阻害物質が、
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、又は
（ｃ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対してＲＮＡｉ活性を有する核酸もしくはその前駆体である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法：
（１）Ｔｅｔ  ３遺伝子もしくは該遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞におけるＴｅｔ  ３遺伝子もしくはＴｅｔ  ３タンパク質又はレポータータンパク質の発現量を測定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、Ｔｅｔ  ３遺伝子もしくはＴｅｔ  ３タンパク質又はレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
【請求項５】
Ｔｅｔ  ３と被検物質とを接触させ、Ｔｅｔ  ３と結合能を有する被検物質を関節炎の予防及び／又は治療剤の候補として選択することを特徴とする、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択された被検物質を関節炎モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法：
（１）滑膜線維芽細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性の程度を測定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性を抑制した被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
【請求項８】
関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
被験者由来の試料から、下記（ａ）または（ｂ）を用いてＴｅｔ  ３遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出または定量することを含む、関節炎の検査方法：
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体。
【請求項１０】
関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記（ａ）および／または（ｂ）：
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体
を含有してなる、関節炎検査用キット。
【請求項１２】
関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質の有効量を対象に投与することを含む、関節炎の予防及び／又は治療方法。
【請求項１４】
関節炎の予防及び／又は治療に使用するための、Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質。
【請求項１５】
関節炎の予防及び／又は治療剤を製造するための、Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎、特に関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）の予防・治療剤、並びに関節炎、特に関節リウマチ予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の機能を阻害する物質を含有する、関節炎、特に関節リウマチの予防剤及び／又は治療剤、並びにＴｅｔ  ３の機能阻害を指標とする、関節炎、特に関節リウマチ予防・治療薬の候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチは、全身の関節に慢性炎症を生じる難治性の自己免疫疾患である。関節内の滑膜組織が増殖し、進行性に軟骨と骨が破壊される。関節リウマチの滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）はマクロファージやリンパ球により刺激（ＴＮＦα、ＩＬ−１βなどの炎症性サイトカイン）されて活性化され、活性化した滑膜線維芽細胞は、炎症性サイトカインやケモカイン産生、基質分解酵素分泌により関節破壊を起こす一方、増殖能・浸潤能の亢進、アポトーシス感受性低下などの癌細胞と似た性質も持つ。近年、ＧＷＡＳ（Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ）の結果より約３０の遺伝子多型が関節リウマチの発症や重症度に関わることが知られるようになってきた。その一方で、エピジェネティクスの異常が関節リウマチの発症や重症度に深く関わることが示唆されるようになった。ＤＮＡのメチル化はエピジェネティクスの代表的な機構の一つであり、関節リウマチにおいてもゲノム全体、もしくは特定の遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡメチル化異常が存在することが報告されてきた。発明者は近年、ゲノム網羅的ＤＮＡメチル化解析により、関節リウマチ患者由来滑膜線維芽細胞には疾患に特有なＤＮＡメチル化パターンが存在し、異常メチル化を示した遺伝子の多くが関節リウマチの病態に深く関わることを示した（非特許文献１）。
生物学的製剤による炎症性サイトカインを標的とした関節リウマチ治療は、寛解導入を身近なものにしたが、関節リウマチ治療にはいわゆる「Ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ」が存在し、治療開始の遅れは治療効果を限定的なものとする。このことは、炎症環境の持続自体が、滑膜炎症部位に存在する細胞をより攻撃的でかつ治療抵抗性な表現型に変質させている可能性を示唆するが、この詳細なメカニズムは不詳であった。発明者は、関節リウマチにおける滑膜炎症・骨関節破壊の中心的役割を担うＴＮＦαやＩＬ−１βが、ＦＬＳにおいてＤＮＡメチル化酵素（ＤＮＭＴ）の発現を低下させ、受動的脱メチル化を促進することを示し、疾患特有のＤＮＡメチル化パターン形成の分子機構の一端を明らかにした（非特許文献２）。
しかしながら、これまでは能動的なＤＮＡ脱メチル化の機構が不詳であったため、ＤＮＡメチル化・脱メチル化のダイナミズムの全貌は不明であった。近年、ＤＮＡ脱メチル化酵素として機能するＴｅｔ（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）タンパク質ファミリーが同定され、Ｔｅｔタンパク質が５−メチルシトシン（５ｍＣ）を水酸化して５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を合成することが報告され、ＥＳ細胞などにおけるＤＮＡメチル化のダイナミズムの研究は急速な進展を見せている。
ただ、関節リウマチにおけるＴｅｔタンパク質の関与については未だ明らかにされておらず、Ｔｅｔタンパク質が関節リウマチの治療標的となり得るか否かは全く不明のままであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．７２（１）：１１０−１１７，２０１３．
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０（３）：１２９７−１３０３，２０１３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、関節炎、特に関節リウマチにおけるＴｅｔタンパク質、特にＴｅｔ３タンパク質の機能を明らかにすることであり、当該機能に基づいてＴｅｔ  ３を標的とする関節炎の予防・治療剤、検査キットを提供すること、並びにＴｅｔ  ３の機能調節を指標として、関節炎の予防及び／又は治療活性を有する新規な物質を探索する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の目的を達成すべく、関節リウマチ患者由来の滑膜や炎症性サイトカインで刺激した、関節リウマチ患者由来の滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）におけるＴｅｔタンパク質ファミリーの発現レベルおよびＤＮＡメチル化レベルを測定した。その結果、健常者や変形性関節症（ＯＡ）患者に比べて、関節リウマチ患者由来の滑膜表層細胞層や炎症性サイトカインで刺激した、関節リウマチ患者由来の滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）では、Ｔｅｔ  ３の発現レベルが高く、ＤＮＡメチル化レベルも低いことを見出した。また、関節リウマチ患者由来のＦＬＳのＴｅｔ３をノックダウンした場合、ＦＬＳ自身の組織（軟骨、骨）浸潤に関与するケモカインＣＣＬ２や接着分子ＩＣＡＭ１の発現が阻害され、また、該ＦＬＳの浸潤能も抑制された。これらの結果は、Ｔｅｔ  ３の選択的阻害が、ＤＮＡメチル化レベルの維持を介してＣＣＬ２やＩＣＡＭ１の発現を阻害し、それに伴って浸潤性に代表される滑膜線維芽細胞の活性化を阻害することによって、関節炎、特に関節リウマチの新規治療につながることを示唆するものである。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質を含有する、関節炎の予防及び／又は治療剤。
［２］Ｔｅｔ  ３の発現阻害物質が、
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、又は
（ｃ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対してＲＮＡｉ活性を有する核酸もしくはその前駆体である、［１］に記載の剤。
［３］関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、［１］または［２］に記載の剤。
［４］以下の（１）〜（３）の工程を含む、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法：
（１）Ｔｅｔ  ３遺伝子もしくは該遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポータータンパク質をコードする核酸を含む細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞におけるＴｅｔ  ３遺伝子もしくはＴｅｔ  ３タンパク質又はレポータータンパク質の発現量を測定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、Ｔｅｔ  ３遺伝子もしくはＴｅｔ  ３タンパク質又はレポータータンパク質の発現量を低下させた被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
［５］Ｔｅｔ  ３と被検物質とを接触させ、Ｔｅｔ  ３と結合能を有する被検物質を関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択することを特徴とする、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
［６］関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択された被検物質を関節炎モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することをさらに含む、［５］に記載の方法。
［７］以下の（１）〜（３）の工程を含む、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法：
（１）滑膜線維芽細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性の程度を測
定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性を抑制した被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
［８］関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、［４］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］被験者由来の試料から、下記（ａ）または（ｂ）を用いてＴｅｔ  ３遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出または定量することを含む、関節炎の検査方法：
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体。
［１０］関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、［９］に記載の方法。
［１１］下記（ａ）および／または（ｂ）：
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体
を含有してなる、関節炎検査用キット。
［１２］関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、［１１］に記載のキット。
［１３］Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質の有効量を対象に投与することを含む、関節炎の予防及び／又は治療方法。
［１４］関節炎の予防及び／又は治療に使用するための、Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質。
［１５］関節炎の予防及び／又は治療剤を製造するための、Ｔｅｔ  ３（Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ３）の発現阻害物質の使用。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、Ｔｅｔ  ３は関節リウマチの病態悪化に関与することが明らかとなったので、Ｔｅｔ  ３の発現もしくは機能を阻害することにより、関節炎を治療又は予防することができる。また、Ｔｅｔ  ３の発現もしくは機能阻害を指標として、関節炎の治療又は予防薬をスクリーニングすることができる。さらに、Ｔｅｔ  ３の発現を指標として、関節炎を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の滑膜組織における、Ｔｅｔタンパク質ファミリー（Ｔｅｔ１，２，３）の発現、ＤＮＡメチル化（５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ））を示す免疫組織化学染色像である。
図２は変形性関節症（ＯＡ）患者由来の滑膜組織における、Ｔｅｔタンパク質ファミリー（Ｔｅｔ１，２，３）の発現、ＤＮＡメチル化（５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ））を示す免疫組織化学染色像である。
図３は関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の滑膜組織における、Ｔｅｔ３タンパク質（青色）とＣＤ５５タンパク質（茶色）の二重染色、Ｔｅｔ３タンパク質（青色）とＣＤ６８タンパク質（茶色）の二重染色を示す免疫組織化学染色像である。
図４はサイトカイン未刺激のＦＬＳ（健常人、ＯＡ、ＲＡ）における、Ｔｅｔファミリー（Ｔｅｔ１，Ｔｅｔ  ２，Ｔｅｔ  ３）の相対的ｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。
図５はサイトカイン未刺激のＦＬＳ（ＯＡ、ＲＡ）における、Ｔｅｔファミリー（緑色）（Ｔｅｔ１，Ｔｅｔ  ２，Ｔｅｔ  ３）の発現と核（青色）を示す免疫組織化学染色像である。
図６はＴＮＦαやＩＬ−１βによる刺激後における、ＦＬＳ（ｎ＝４（ＲＡ  ２，ＯＡ  ２））におけるＴｅｔファミリー（Ｔｅｔ  １，Ｔｅｔ  ２，Ｔｅｔ  ３）のｍＲＮＡ発現レベルの経時変化を示す図である。
図７はＴＮＦα刺激後における、ＦＬＳにおけるＴｅｔ３タンパク質のＮ／Ｃ比の経時変化を示す図である。
図８ＡはＴＮＦαによる刺激後における、ＯＡ由来または健常者由来ＦＬＳ（ＯＡ，Ｎｒ）におけるＴｅｔ３のタンパク質発現レベルを示す図である。図８ＢはＴＮＦαによる刺激後における、ＡＲ由来ＦＬＳにおけるＴｅｔ  ３のタンパク質発現レベルを示す図である。
図９Ａは実施例４の試験過程を示す図である。図９ＢはＴＮＦαによる刺激後における、ＡＲ由来ＦＬＳにおける５ｈｍＣレベルを示すドットブロット像である。図９ＣはＡＲ由来ＦＬＳにおける５ｈｍＣレベルを示すグラフである。
図１０Ａは実施例５の試験過程を示す図である。図１０ＢはＴｅｔ３をノックダウンし、ＴＮＦαによる刺激後における、ＡＲ由来ＦＬＳにおける炎症性サイトカインの分泌レベルを示すグラフである。
図１１Ａは実施例６の試験過程を示す図である。図１１ＢはＴｅｔ３をノックダウンし、ＴＮＦαによる刺激後の、ＡＲ由来ＦＬＳのＳｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙを示す顕微鏡像である。図１１ＣはＴｅｔ  ３をノックダウンし、ＴＮＦαによって刺激し、ｓｃｒａｔｃｈ後２４時間における、ＡＲ由来ＦＬＳの単位面積当たりの浸潤細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、少なくとも部分的には、Ｔｅｔ  ３が関節リウマチの増悪に寄与していることの発見に基づく。当該知見は、Ｔｅｔ  ３が関節炎、特に関節リウマチマーカーとして利用できるだけでなく、関節炎、特に関節リウマチの創薬標的ともなり得ることを示すものである。即ち、Ｔｅｔ  ３の既知の阻害薬は関節炎の予防及び／又は治療に有用であるとともに、Ｔｅｔ３タンパク質やそれを発現する細胞・動物を用いて、新規なＴｅｔ  ３阻害薬、ひいては関節炎の予防・治療薬となる物質を探索することもできる。
Ｉ．Ｔｅｔ  ３又はこれをコードする核酸
本明細書において、Ｔｅｔ  ３は公知のタンパク質であり、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：０４３１５１として知られている、配列番号：２で表されるヒトＴｅｔ  ３のアミノ酸配列、あるいはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド表記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。
本明細書において、Ｔｅｔ  ３はヒトや他の温血動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ニワトリなど）の細胞［例えば、滑膜線維芽細胞、滑膜表層細胞など］又は組織［例えば、滑膜（特に滑膜表層細胞層）など］等から、公知のタンパク質分離精製技術により単離・精製されるものであってよい。
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列」としては、以下の（ａ）〜（ｅ）が挙げられる：
（ａ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列の相補鎖配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列。
具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＴｅｔ  ３タンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列、または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＴｅｔ  ３タンパク質もしくはそのオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体もしくは多型バリアントにおけるアミノ酸配列が挙げられる。
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
上記（ｅ）におけるストリンジェントな条件とは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，６．３．１−６．３．６，１９９９に記載される条件、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
より好ましくは、「配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」として、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９６％以上、いっそう好ましくは約９７％以上、特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
「配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質である。
ここで「実質的に同質の機能」とは、例えば生理学的に、あるいは薬理学的にみて、その性質が定性的に同じであることを意味し、機能の程度（例、約０．１〜約１０倍、好ましくは０．５〜２倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、Ｔｅｔ３の機能としては、５−メチルシトシン（５ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−フォルミルシトシン（５ｆＣ）または５−カルボキシルシトシン（５ＣａＣ）に変換する活性（以下、「５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性」）、滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性等が挙げられ、上記の活性を有するタンパク質を、「実質的に同質の機能を有するタンパク質」とみなすことができる。
ここで、５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性および滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性は、例えば、後述する実施例に記載の通りに測定することができる。
本発明におけるＴｅｔ３タンパク質として、例えば、（ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１〜３０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜数（５、４、３もしくは２）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１〜３０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜数（５、４、３もしくは２）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列に１〜３０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜数（５、４、３もしくは２）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列中の１〜３０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜数（５、４、３もしくは２）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失、付加または置換されている場合、その挿入、欠失、付加または置換の位置は、タンパク質が、５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または滑膜線維芽細胞の浸潤を促進し得る限り、特に限定されない。
ここでアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３の好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．０４３１５１）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、アレル変異体、多型バリアント〔例えば一塩基多型（ＳＮＰｓ）〕などがあげられる。
「Ｔｅｔ  ３をコードする核酸」は、上記（ａ）〜（ｅ）で示される、配列番号：２で表されるアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を表す。具体的には、以下の（ｆ）〜（ｊ）：
（ｆ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換され、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号１で示される塩基配列、
（ｊ）配列番号１で示される塩基配列の相補鎖配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
を有する核酸が挙げられる。
尚、ここで遺伝子とは、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ、またはｍＲＮＡ等のＲＮＡのいずれでもよく、また一本鎖の核酸配列および二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。また、本明細書において、配列番号：１等に示される核酸配列は、便宜的にＤＮＡ配列であるが、ｍＲＮＡなどＲＮＡ配列を示す場合には、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として解する。
Ｔｅｔ  ３をコードする核酸の好ましい例としては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列からなるヒトＴｅｔ  ３  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８７４９１）、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ、アレル変異体、多型バリアント〔例えば一塩基多型（ＳＮＰｓ）〕などがあげられる。
本発明は、Ｔｅｔ  ３の発現を阻害する物質を含有してなる、関節炎の予防及び／又は治療剤を提供する。
ＩＩ．Ｔｅｔ  ３の発現を阻害する物質
本発明において「Ｔｅｔ３の発現を阻害する物質」とは、Ｔｅｔ３をコードする核酸（Ｔｅｔ３遺伝子）の転写レベル、転写後調節のレベル、Ｔｅｔ  ３タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、Ｔｅｔ３の発現を阻害する物質としては、例えば、Ｔｅｔ３遺伝子の転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からｍＲＮＡへのプロセッシングを阻害する物質、ｍＲＮＡの細胞質への輸送を阻害する物質、ｍＲＮＡからＴｅｔ  ３の翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ）あるいはｍＲＮＡを分解する物質（例、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、より好ましくは、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される物質が例示される。
（１）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（２）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、
（３）Ｔｅｔ３遺伝子の転写産物に対してＲＮＡｉ活性を有する核酸もしくはその前駆体。
ここで転写産物の好ましい例としては、ｍＲＮＡが挙げられる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡからＴｅｔ  ３への翻訳を特異的に阻害する（あるいはｍＲＮＡを分解する）物質として、好ましくは、これらのｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、投与対象となる哺乳動物におけるＴｅｔ  ３産生細胞（例、滑膜線維芽細胞、滑膜表層細胞）の生理的条件下において、該ｍＲＮＡの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該ｍＲＮＡの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、ｍＲＮＡの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列である。
本発明における「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
より具体的には、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、以下の（ｋ）または（ｌ）：
（ｋ）配列番号：１で表される塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列；
（ｌ）配列番号：１で表される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を有するタンパク質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列；
が挙げられる。
ストリンジェントな条件は、前述のとおりである。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの好ましい例としては、配列番号：１で表される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８７４９１）を含むヒトＴｅｔ  ３のｍＲＮＡ、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型バリアント等が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と「相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該ｍＲＮＡを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも１０塩基以上、好ましくは約１５塩基以上を含むものである。
具体的には、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の（１）〜（３）のいずれかのものが好ましく例示される：
（１）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸、
（２）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム核酸、
（３）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有する核酸もしくはその前駆体。
（１）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
本発明における「Ｔｅｔ３遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸」とは、該ｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていたりしてよい。
上記の通り、アンチセンス核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸がＤＮＡの場合、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡとによって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、内在性ＲＮａｓｅ  Ｈに認識されて標的ＲＮＡの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈによる分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合、標的配列は、ｍＲＮＡ中の配列だけでなく、Ｔｅｔ３遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、Ｔｅｔ３遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列とをＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質：Ｔｅｔ  ３への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、Ｔｅｔ  ３をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約１０〜約４０塩基、特に約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、Ｔｅｔ３遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡもしくはＲＮＡでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
ＲＮＡの糖部のコンフォメーションはＣ２’−ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’−ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。したがって、標的ＲＮＡに対して強い結合能を付与するために、２’酸素と４’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体であるＢＮＡ（ＬＮＡ）（Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５３−９，２００２；Ｊｅｐｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，１３０−４６，２００４）やＥＮＡ（Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２２，１６１９−２１，２００３）もまた、好ましく用いられ得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
（２）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム核酸
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該ｍＲＮＡをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
（３）Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ
本明細書においては、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡもまた、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、上記のアンチセンス核酸やリボザイムの代替技術として汎用されている。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００（２００１））、Ｔｅｒａｍｏｔｏら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９（１３）：ｐ２８７８−８２（２００５））の提唱する規則に従って設計することができる。ｓｉＲＮＡの標的配列は、原則的には１５〜５０塩基、好ましくは１９〜４９塩基、更に好ましくは１９〜２７塩基の長さを有しており、例えばＡＡ＋（Ｎ）１９（ＡＡに続く、１９塩基の塩基配列）、ＡＡ＋（Ｎ）２１（ＡＡに続く、２１塩基の塩基配列）もしくはＡ＋（Ｎ）２１（Ａに続く、２１塩基の塩基配列）であってもよい。
本発明の核酸は、５’または３’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常２〜４塩基程度であり、ｓｉＲＮＡの全長として１９塩基以上である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、ｓｉＲＮＡは、３’末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、ｄＴｄＴ（ｄＴはデオキシリボ核酸のデオキシチミジン残基を表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。
また、ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が３’末端および５’末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「ａｉＲＮＡ」を挙げることができる。典型的なａｉＲＮＡは、アンチセンス鎖が２１塩基からなり、センス鎖が１５塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々３塩基のオーバーハング構造をとる
（Ｓｕｎ，Ｘ．ら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ２６  Ｎｏ．１２  ｐ１３７９、国際公開第ＷＯ２００９／０２９６８８号パンフレット）。
標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、５’−ＵＴＲおよび開始コドンから約５０塩基まで、並びに３’−ＵＴＲ以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。上述の規則その他に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のｍＲＮＡにおいて１６−１７塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、ＡＡ（もしくはＮＡ）以降の１９−２１塩基にＴＴもしくはＵＵの３’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該１９−２１塩基に相補的な配列およびＴＴもしくはＵＵの３’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡをｓｉＲＮＡとして設計してもよい。また、ｓｉＲＮＡの前駆体であるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、５−２５塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡの配列は、種々のｗｅｂサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ａｍｂｉｏｎが提供するｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）およびｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ用インサートデザインツール
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ＿ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ．ｈｔｍｌ）、ＲＮＡｉ  Ｃｏｄｅｘが提供するＧｅｎｅＳｅｅｒ
（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅｘ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｎｅｗｓｅａｒｃｈｈａｉｒｐｉｎ．ｃｇｉ）があるがこれらに限定されない。
ｓｉＲＮＡを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、ｓｉＲＮＡの場合、天然型ＲＮＡ中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、ＲＮＡｉ活性が失われる場合があるので、ＲＩＳＣ複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
当該修飾として具体的には、ｓｉＲＮＡを構成するヌクレオチド分子の一部を、天然型のＤＮＡや、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を施したＲＮＡに置換することができる（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、ｓｉＲＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等）、フッ素原子（−Ｆ）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。その他上記（１）に記載されたアンチセンス核酸における修飾方法を用いることができる。あるいは、ｓｉＲＮＡにおけるＲＮＡの一部をＤＮＡに置換する化学修飾（２’−デオキシ化、２’−Ｈ）を施してもよい。また、糖（リボース）の２’位と４’位を−Ｏ−ＣＨ２−で架橋しコンフォメーションをＮ型に固定した人工核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）を用いてもよい。
また、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、リンカーを介し、細胞表層に存在する受容体を特異的に認識するリガンド、ペプチド、糖鎖、抗体、脂質や正電荷や分子構造的に細胞膜表層に吸着し貫通するオリゴアルギニン、Ｔａｔペプチド、ＲｅｖペプチドまたはＡｎｔペプチドなどと化学結合していてもよい。
ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、ｓｉＲＮＡの前駆体となるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し、これを、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）を用いて切断することにより調製することもできる。
本明細書においては、生体内でＴｅｔ３遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。ｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば５〜２５塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴＲＮＡをデザインし、これをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成することにより調製することができる。ｓｈＲＮＡを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はｓｉＲＮＡのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより２本鎖のｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するというものである。一方、後者はｓｈＲＮＡの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でｓｈＲＮＡが発現しｄｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｄｓＲＮＡを形成するというものである。プロモーターとしては、ｐｏｌＩＩ系プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いＲＮＡの転写を正確に行わせるために、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用するのが一般的である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのＵ６−ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１−ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン−ｔＲＮＡプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして４個以上Ｔが連続した配列が用いられる。
このようにして構築したｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなどが用いられる。
上記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列の情報に基づいて、例えば３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機等のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って化学的に合成することができる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５、Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３、および米国特許第６００１３１１号に記載される方法等が挙げられる。具体的には、当業者に公知の核酸保護基（例えば５’末端にジメトキシトリチル基）およびカップリング基（例えば３’末端にホスホルアミダイト）を用いて合成できる。すなわち、５’末端の保護基を、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）等の酸で脱保護し、カップリング反応を行う。ついでアセチル基でキャッピングを行った後、次の核酸の縮合反応を行う。修飾されたＲＮＡやＤＮＡを含むｓｉＲＮＡの場合には、原料として修飾されたＲＮＡ（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド）を用いればよく、カップリング反応の条件は適宜調整できる。また、リン酸結合部分が修飾されたホスホロチオエート結合を導入する場合には、ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド）を用いることができる。
あるいは、オリゴヌクレオチドは、別々に合成し、合成後に例えばライゲーションにより一緒につなげてもよいし（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１：Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、または合成および／または脱保護の後にハイブリダイゼーションにより、一緒につなげてもよい。ｓｉＲＮＡ分子はまたタンデム合成法により合成することができる。すなわち、両方のｓｉＲＮＡ鎖を、切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドとして合成し、次にこれを切断して別々のｓｉＲＮＡフラグメントを生成し、これをハイブリダイズさせて精製する。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
合成したｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法を用いて精製できる。例えばゲル電気泳動により精製する方法、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製する方法が挙げられる。
本発明において、Ｔｅｔ  ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡを構成するＴｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡおよびその相補鎖としては、それぞれ配列番号：３を含む配列および配列番号：４を含む配列が挙げられ、好ましくは、それぞれ配列番号：３からなる配列および配列番号：４からなる配列が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の別の好ましい例として、該ｍＲＮＡを標的とするｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ヒトＴｅｔ  ３  ｍＲＮＡを標的とするヒトｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２，ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ，ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ，ｈｓａ−ｍｉＲ−３７２，ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ，ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ，ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ，ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ，ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ等が挙げられる。ｍｉＲＮＡも、上述のｓｉＲＮＡについて記載した方法に準じて調製することができる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で提供されたり、他の分子が付加された形態で提供されうる。付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大させたりするような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
これらの核酸のＴｅｔ  ３発現阻害活性は、Ｔｅｔ  ３をコードする核酸を導入した形質転換体、生体内や生体外のＴｅｔ  ３遺伝子発現系、または生体内や生体外のＴｅｔ  ３タンパク質の翻訳系を用いて調べることができる。
本発明におけるＴｅｔ３の発現を阻害する物質は、上記のようなＴｅｔ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、Ｔｅｔ  ３の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
Ｔｅｔ  ３の発現を阻害する物質は、Ｔｅｔ  ３の有する５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化活性または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を抑制する活性を示すことから、関節炎の予防及び／又は治療に有用である。
従って、Ｔｅｔ  ３の発現を阻害する物質を含有する医薬は、関節炎の予防及び／又は治療剤として使用することができる。
ＩＩＩ．アンチセンス核酸、リボザイム核酸、ｓｉＲＮＡおよびその前駆体を含有する医薬
Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができる本発明のアンチセンス核酸や、Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と相同な（もしくは相補的な）塩基配列を有し、当該転写産物を標的として該転写産物を切断し得るｓｉＲＮＡ（もしくはリボザイム）、さらに該ｓｉＲＮＡの前駆体であるｓｈＲＮＡなど（以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある）は、生体内におけるＴｅｔ３の発現を抑制し、５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または滑膜線維芽細胞の浸潤の促進活性を抑制するので、関節炎の予防及び／又は治療剤として使用することができる。
本発明の核酸を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の核酸を上記の関節炎の予防及び／又は治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
本発明の核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。
本発明の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、関節リウマチの治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
なお前記した各組成物は、本発明の核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り適宜他の活性成分を含有してもよい。
上述のＴｅｔ  ３に対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、ｓｉＲＮＡおよびその前駆体を含有する医薬や、Ｔｅｔ  ３の発現を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物は、関節炎の治療、予防、または進行防止に用いることができる。関節炎として、具体的には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎（例えば、強直性脊椎炎など）などが挙げられ、好ましくは、関節リウマチが挙げられる。また、Ｔｅｔ  ３がその病態の増悪に関与しているいかなる疾患も、本発明の対象疾患に包含される。
上述のＴｅｔ  ３に対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、ｓｉＲＮＡおよびその前駆体を含有する医薬や、Ｔｅｔ  ３の発現を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物を関節炎の治療または予防に使用する場合には、単独で使用してもよいが、１種または２種以上の抗炎症作用を有する薬剤と併用してもよい。
併用する薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、メサラジン、副腎皮質ステロイド（例、ベタメタゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン等）、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ；例、サリチル酸系、アントラニル酸系、アリール酸系、プロピオン酸系、オキシカム系、ピリン系）、抗ＴＮＦα抗体（インフルキシマブ、アダリムマブ）、抗リウマチ薬（例、アクタリット等の免疫調節薬、メトトレキサート等の免疫抑制薬、抗ＴＮＦα抗体やエタネルセプト等の生物学的製剤）などが挙げられる。
ＩＶ．疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
上述の通り、Ｔｅｔ  ３の発現及び／又は機能を阻害すると、５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化が抑制され、活性化された滑膜線維芽細胞の最も重要な攻撃的な表現型の一つである浸潤能が抑制される。このことは、Ｔｅｔ３の選択的阻害は、ＤＮＡメチル化レベルの維持を介してＣＣＬ２やＩＣＡＭ１の発現を阻害し、それに伴って浸潤性に代表される滑膜線維芽細胞の活性化を阻害することによって、関節炎の治療につながることを意味する。従って、Ｔｅｔ  ３の発現及び／又は機能を阻害する化合物は、関節炎の予防及び／又は治療剤として使用することができる。
したがって、Ｔｅｔ  ３を産生する細胞は、Ｔｅｔ  ３（又はＴｅｔ  ３遺伝子）の発現量及び／又は機能を指標とすることにより、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。
Ｔｅｔ  ３の発現又は機能を阻害する化合物をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞を、被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＴｅｔ  ３の発現量又は機能の程度を比較することを含む。また、Ｔｅｔ  ３の機能を阻害する化合物は、精製したＴｅｔ  ３タンパク質への結合能を試験することによっても、スクリーニングすることができる。
上記のスクリーニング方法において用いられるＴｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒトもしくは他の哺乳動物細胞（例：滑膜線維芽細胞、滑膜表層細胞等）またはそれを含む生体試料（例：滑膜（特に滑膜表層細胞層）等）であれば特に制限はない。非ヒト動物由来の滑膜等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に被検物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体も使用することができる。宿主としては、例えば、Ｈ４ＩＩＥ−Ｃ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
具体的には、Ｔｅｔ３をコードするＤＮＡ（即ち、配列番号：１で表される塩基配列または該塩基配列に対し相補性を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ）を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。
Ｔｅｔ  ３をコードする遺伝子の調製方法について、以下に説明する。
Ｔｅｔ  ３をコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得することができる。すなわち、Ｔｅｔ  ３をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号：１で表される塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、前記したＴｅｔ  ３を産生する細胞・組織由来のｃＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（上記）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
次いで、得られたＴｅｔ３遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じてＴｅｔ３タンパク質を発現する細胞を製造・取得することができる。
例えば、Ｔｅｔ  ３遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することでＴｅｔ  ３タンパク質を発現する細胞を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自律的に複製できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、Ｔｅｔ  ３をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、タカラバイオ等から市販されている。当該発現ベクターにＴｅｔ  ３をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素もタカラバイオ等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、Ｔｅｔ  ３をコードするＤＮＡの上流にリボソーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボソーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｐ２０２，講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
また、動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどを用いることもできる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ−αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
上記したＴｅｔ  ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより、Ｔｅｔ  ３発現細胞を製造することができる。
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞等を挙げることができる。哺乳動物細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＦＬ細胞、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＨ４ＩＩＥ−Ｃ３細胞、ラットＧＨ３細胞などが用いられ得る。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法を用いることができる。
上記のようにして得られる形質転換細胞や生来Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する哺乳動物細胞または該細胞を含む組織・臓器は、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）  〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などの培地中で培養することができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
Ｔｅｔ  ３タンパク質の取得は、一般のタンパク質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清からＴｅｔ３を前記と同様にして精製してもよい。また、Ｔｅｔ  ３タンパク質が前記の培養により得られた形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、例えば、該形質転換体を遠心分離等で集めた後、細胞を破砕または溶解せしめ、必要であればタンパク質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製されたタンパク質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。
本発明のスクリーニングを実施するに当たり、被検物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
また、Ｔｅｔ  ３もしくはＴｅｔ  ３遺伝子の発現量を低下させる物質、またはＴｅｔ  ３の機能を低下させる物質を選択する際に、被検物質を接触させない対照細胞を比較対照として用いることもできる。ここで「被検物質を接触させない」とは、被検物質の代わりに被検物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、Ｔｅｔ  ３もしくはＴｅｔ  ３遺伝子の発現量またはＴｅｔ  ３の機能に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
被検物質の上記細胞との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分〜約２４時間が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３を産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、該動物個体の状態は特に制限されないが、例えば、薬剤もしくは遺伝子改変により関節炎を誘起した関節炎モデル動物（例えば、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）マウス、ＳＫＧマウス、ＰＤ−１ノックアウトマウス、Ｋ／ＢｘＮマウス、シノビオリンＴｇマウス等のＲＡモデル動物など）であってもよい。使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、ＳＰＦグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。被検物質の該細胞との接触は、該動物個体への被検物質の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約０．５〜２０ｍｇ／ｋｇを、１日１〜５回、好ましくは１日１〜３回、１〜１４日間投与することができる。
あるいは、上記のスクリーニング方法は、Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞に代えて、該細胞の抽出液、あるいは該細胞から単離精製したＴｅｔ  ３に、被検物質を接触させることにより行うこともできる。
（Ｔｅｔ  ３遺伝子またはＴｅｔ  ３の発現量の測定）
本発明は、Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞における該タンパク質（遺伝子）の発現を、被検物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被検物質の種類、被検物質と細胞との接触の態様などは、上記と同様である。
Ｔｅｔ  ３の発現量は、前記したＴｅｔ  ３をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号：１で表される塩基配列もしくはそれと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（ＤＮＡ）（以下、「本発明の検出用核酸」という場合がある）を用いて、Ｔｅｔ  ３遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、ＲＮＡレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記したＴｅｔ  ３に対する抗体（以下、「本発明の検出用抗体」という場合がある）を用いて、これらのタンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ａ）Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法、および
（ｂ）Ｔｅｔ  ３を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、本発明の検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
すなわち、Ｔｅｔ  ３の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル（例えば、ＲＡモデル動物など）非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して被検物質を投与し、一定時間経過した後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、滑膜等）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
Ｔｅｔ  ３のｍＲＮＡは、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出して定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、Ｔｅｔ  ３のタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）Ｔｅｔ  ３遺伝子を発現する細胞（例えば、滑膜線維芽細胞、滑膜表層細胞、Ｔｅｔ３を導入した形質転換体）を上記の方法に従って作製し、常法に従って培養する際に被検物質を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該細胞中に含まれるＴｅｔ３あるいはそれをコードするｍＲＮＡを、上記（ｉ）と同様にして定量、解析することができる。
Ｔｅｔ３遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現レベルの検出および定量は、前記細胞から調製したＲＮＡまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の方法で実施できる。具体的には、Ｔｅｔ  ３遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のＴｅｔ  ３遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプローブもしくはプライマーは、Ｔｅｔ  ３遺伝子の塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ  ３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。
ノーザンブロット法を利用する場合、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒａｍｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、細胞由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のＴｅｔ  ３遺伝子の領域が増幅できるように、Ｔｅｔ  ３遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＭＥ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
また、Ｔｅｔ  ３の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域を用いたレポーター遺伝子アッセイで行うことも可能である。ここで、「転写調節領域」とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数ｋｂから数十ｋｂの範囲を指し、例えば、（ｉ）５’−レース法（５’−ＲＡＣＥ法）（例えば、５’−ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いて実施されうる）、オリゴキャップ法、Ｓ１プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ｉｉ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ（クローンテック社製）等を用いて５’−上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することが出来る。
Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域の下流に機能可能な形でレポータータンパク質をコードする核酸（以下、「レポーター遺伝子」という）を連結して、レポータータンパク質発現ベクターを構築する。該ベクターは当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出されたＴｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
レポータータンパク質としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等が挙げられる。
調製したＴｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することができる。ベクターに搭載される選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、安定な形質転換細胞を得ることができる。あるいは、Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子は、宿主細胞内に一過的に発現させてもよい。
また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピッカジーンデュアルキット（登録商標；東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
Ｔｅｔ  ３のタンパク質量の測定方法としては、具体的には、例えば、
（ｉ）本発明の検出用抗体と、試料液および標識化されたＴｅｔ３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより試料液中のＴｅｔ３を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した本発明の検出用抗体および標識化された別の本発明の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のＴｅｔ  ３を定量する方法等が挙げられる。
Ｔｅｔ  ３のタンパク質発現レベルの検出および定量は、Ｔｅｔ３を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体としてＴｅｔ  ３を認識する抗体を用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＩ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体としてＴｅｔ  ３を認識する抗体を用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
上記の抗体は、その形態に特に制限はなく、Ｔｅｔ  ３を免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であってもよく、さらにはＴｅｔ  ３を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体を用いることもできる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３）。
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はＴｅｔ  ３の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がＴｅｔ  ３のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として該タンパク質のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
本発明の検出用抗体を用いるＴｅｔ  ３の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の検出用抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の検出用抗体を反応させた（２次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のＴｅｔ  ３を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明の検出用抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のＴｅｔ  ３と標識したＴｅｔ  ３とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のＴｅｔ  ３を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のＴｅｔ  ３と固相化したＴｅｔ  ３とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のＴｅｔ  ３と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したＴｅｔ  ３を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のＴｅｔ  ３の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＴｅｔ  ３の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の検出用抗体を用いることによって、細胞におけるＴｅｔ３の量を感度よく定量することができる。
例えば、上記スクリーニング法において、被検物質の存在下におけるＴｅｔ  ３の発現量（ｍＲＮＡ量またはタンパク質量）が、被検物質の非存在下における場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害された場合、該被検物質を、Ｔｅｔ  ３の発現阻害物質、従って、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択することができる。
あるいは、上記スクリーニング法において、Ｔｅｔ  ３遺伝子を発現する細胞に代えて、Ｔｅｔ３遺伝子の内在の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を用いることができる。このような細胞は、Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子（例、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなど）を導入したトランスジェニック動物の細胞、組織、臓器もしくは個体であってもよい。かかる細胞を用いる場合には、Ｔｅｔ  ３の発現量は、レポーター遺伝子の発現レベルを、常法を用いて測定することにより評価することができる。
（Ｔｅｔ  ３の機能の測定）
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がＴｅｔ  ３の機能を阻害するか否かを指標として行うこともできる。
Ｔｅｔ  ３は脱メチル化タンパク質であるので、Ｔｅｔ  ３タンパク質に結合能を有する物質は、脱メチル化活性を抑制することにより、Ｔｅｔ  ３の機能を阻害し得ると考えられる。従って、Ｔｅｔ  ３への結合能を指標として、Ｔｅｔ  ３の機能阻害物質の候補をスクリーニングすることができる。
例えば、被検物質をウェルプレートの各ウェルに吸着させ、適当な標識剤で標識したＴｅｔ  ３溶液を各ウェルに添加してインキュベートした後液相を除き、洗浄後に固相に結合した標識量を測定することにより、Ｔｅｔ  ３との結合能を有する被検物質を検出することができる。Ｔｅｔ  ３を直接標識する代わりに、標識した抗Ｔｅｔ  ３抗体を用いて固相に結合したＴｅｔ  ３を検出することもできる。あるいは、Ｔｅｔ  ３を固定化した担体（例、アフィニティーカラム）に被検物質の溶液を通し、該担体に保持された被検物質を、Ｔｅｔ  ３との結合能を有する物質、即ち関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択することもできる。
このようにして得られた候補物質が実際に抗炎症作用を有するか否かは、該候補物質を関節炎モデルに適用し、該モデルにおける炎症反応を抑制するか否かを検定することにより確認することができる。そのような関節炎モデルとしては、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルを用いることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏモデルとしては、例えばＣＩＡモデル（完全フロイントアジュバントとエマルジョン化したＩＩ型コラーゲンで非ヒト動物を免疫することにより調製することができる）、ＣＡＩＡモデル（ＩＩ型コラーゲンのＣＢ１１内のエピトープを認識するモノクローナル抗体カクテルを非ヒト動物に注射することにより調製することができる）等のＲＡモデル等を用いることができるが、これらに限定されない。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしては、関節炎における標的細胞（例えば、ＲＡにおける滑膜細胞等）の培養系（例えば、ＲＡ患者の滑膜組織由来の滑膜線維芽細胞の培養系等）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、必要に応じてＴＮＦα等の炎症性サイトカイン等による刺激、あるいは単球、マクロファージ、好中球等の炎症性サイトカイン産生細胞との複合培養（例えば、トランスウェルＴＭ培養システム等を用い、上部コンパートメントに標的細胞（例、滑膜線維芽細胞）、下部コンパートメントに炎症性サイトカイン産生細胞（マクロファージ様のＴＨＰ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞）をそれぞれ単層培養する培養系）などにより、炎症反応を惹起することができる。
候補物質が抗炎症作用を有するか否かは、上記の関節炎モデルにおける炎症反応が候補物質の添加により抑制されたか否かにより判定することができる。例えば、上記のＲＡモデル動物であれば、滑膜炎、炎症細胞浸潤の程度、リウマトイド因子の有無などを指標にして、関節炎治療効果の有無及び／又はその程度を判定することができる。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ関節炎モデルである滑膜線維芽細胞の単層培養系を用いた場合、後述の実施例の通り、ゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化の程度またはｓｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙの結果を指標にして炎症反応の程度を評価することができる。
本発明のさらに別の実施態様においては、上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ関節炎モデルを用いて、Ｔｅｔ  ３の機能を阻害して関節炎の予防及び／又は治療効果を示す物質を、ワンステップでスクリーニングすることもできる。当該方法は以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）滑膜線維芽細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性の程度を測定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、前記細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性を抑制した被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
当該方法は、必要に応じて、上記工程（１）と同時もしくはその前後において、炎症を惹起する工程をさらに含み得る。炎症を惹起する方法としては、例えば、ＴＮＦα等の炎症性サイトカイン等による刺激、あるいは単球、マクロファージ、好中球等の炎症性サイトカイン産生細胞との複合培養等が挙げられる。好ましい一実施態様においては、例えば、トランスウェルＴＭ培養システム等を用い、上部コンパートメントに標的細胞（例、滑膜線維芽細胞）、下部コンパートメントに炎症性サイトカイン産生細胞（マクロファージ様のＴＨＰ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞）をそれぞれ単層培養する方法が挙げられる。被検物質は通常、下部コンパートメントの培地に添加されるが、例えば、腸管吸収されてＴｅｔ  ３の機能を阻害し得る食品中に含有される成分や、経口投与可能なＴｅｔ  ３機能阻害薬をスクリーニングすることを目的とする場合等においては、上部コンパートメントの培地に被検物質が添加され得る。
細胞のゲノムの５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化の程度の測定は、前記細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、５ｈｍＣや５ｍＣを認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。本スクリーニング方法に用いるウェスタンブロット法は、前記のＴｅｔ  ３タンパク質の測定方法に記載のウェスタンブロット法と同様であってよい。５ｈｍＣや５ｍＣを認識する抗体は、その形態に特に制限はなく、５ｈｍＣや５ｍＣを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であってもよい。
また、細胞の浸潤性の程度の測定は、例えば、後述する実施例に記載の方法に従って測定することができる。具体的には、被験物質に接触させた細胞または接触させていない細胞を培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（必要に応じて炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）を含有してもよい））で培養（例えば９６時間）後、細胞が接着した培養皿の表面を擦過し、再度培養しながら、細胞が擦過表面に浸潤する細胞数を測定することによって、細胞の浸潤性の程度の測定・比較することができる。
本発明の上記いずれかのスクリーニング方法を用いて得られる、Ｔｅｔ  ３の発現または機能を阻害する物質は、炎症性疾患の予防及び／又は治療用の医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、上記Ｔｅｔ  ３の発現または機能を阻害する低分子化合物と同様に製剤化することができ、同様の投与経路および投与量で、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して、経口的にまたは非経口的に投与することができる。
Ｖ．疾病に対する検査方法
上述の通り、関節リウマチ患者由来の滑膜表層細胞層や炎症性サイトカインで刺激した、関節リウマチ患者由来の滑膜線維芽細胞では、Ｔｅｔ  ３の発現レベルが高いことを見出した。
したがって、被験者由来の試料のＴｅｔ  ３（又はＴｅｔ  ３遺伝子）の発現量を指標とすることにより、関節炎を検査することができる。
本発明は、被験者由来の試料から、Ｔｅｔ３の検出物質を用いてＴｅｔ  ３遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出または定量することを含む、関節炎の検査方法を提供する。Ｔｅｔ３の検出物質としては、具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）が挙げられる：
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体。
関節炎としては、具体的には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎（例えば、強直性脊椎炎など）などが挙げられ、好ましくは、関節リウマチが挙げられる。
本発明の検査方法に用いられる試料としては、検査対象である被験者から分離されるものであって、検出または定量する対象であるＴｅｔ３遺伝子産物（例、ＲＮＡ、タンパク質、その分解産物など）を含有し得る組織または細胞等であれば特に制限されない。例えば、滑膜、滑膜線維芽細胞、滑膜表層細胞などが挙げられる。
被験者から分離した試料におけるＴｅｔ  ３の検出または定量は、該被験者からＲＮＡ（例：全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）画分を調製し、該画分中に含まれるＴｅｔ  ３遺伝子の転写産物を検出または定量することにより調べることができる。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて測定することを特徴とする。
ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン−ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いて、微量検体から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中のＴｅｔ  ３遺伝子の転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量検体から迅速且つ簡便に定量性よくＴｅｔ  ３遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどの定量的ＰＣＲ法が好ましい。
Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーおよび該核酸プローブまたは核酸プライマーを用いたハイブリダイゼーション方法は、前記の本発明の関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法において記載した本発明の検出用核酸およびハイブリダイゼーション方法と同様であってよい。
あるいは、被験者から分離した試料におけるＴｅｔ  ３の検出または定量は、該検体からタンパク質画分を調製し、該画分中に含まれる該遺伝子の翻訳産物（即ち、Ｔｅｔ３タンパク質）を検出または定量することにより調べることができる。Ｔｅｔ３の検出または定量は、Ｔｅｔ  ３タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的測定法（例：ＥＬＩＳＡ、ＦＩＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット等）によって行うこともできる。
従って、一実施態様において、本発明の検査方法は、Ｔｅｔ  ３の翻訳産物を特異的に検出し得る抗体を用いて測定することを特徴とする。
Ｔｅｔ  ３の翻訳産物を特異的に認識する抗体および該抗体を用いた免疫学的測定方法は、前記の本発明の関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法において記載した本発明の検出用抗体および免疫学的測定方法と同様であってよい。
本発明の関節炎の検査方法において、Ｔｅｔ  ３の検出又は定量により、関節炎の検査を行うことができる。具体的には、以下の工程を含む方法であってよい。
（１）対照群および被験者から分離した試料についてＴｅｔ  ３を検出または定量する工程、
（２）対照群で検出または定量されたＴｅｔ３と被験者で検出または定量されたＴｅｔ３を比較する工程。
後述の実施例に示されるように、変形性関節症患者（対照群）と比較して関節リウマチを発症した患者において滑膜中のＴｅｔ３濃度が高い。関節炎の検査は、Ｔｅｔ３の濃度と関節炎への罹患率との間のこのような正の相関に基づき行われる。
例えば、関節炎を発症していない対照群及び被験者からの試料におけるＴｅｔ  ３の濃度を定量し、被験者からの試料におけるＴｅｔ  ３の濃度を、対照群からの試料におけるＴｅｔ  ３の濃度と比較する。あるいは、Ｔｅｔ  ３の濃度と関節炎の発症の有無との相関図をあらかじめ作成しておき、被験者におけるＴｅｔ  ３濃度をその相関図と比較してもよい。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
そして、被験者においてＴｅｔ  ３が、対照群に比べて高値で検出若しくは定量された場合には、上記のような関節炎を発症している可能性が高いと判断することができる。従って、本発明の検査方法は、上記（１）、（２）の工程に加えて、（３）被験者においてＴｅｔ３が、対照群に比べて高値で検出若しくは定量された場合には、関節炎を発症していると判断する工程を含んでもよい。
さらに、本発明は、関節炎検査用のキット（診断剤）にも及ぶ。本発明の関節炎検査用キットは、上述の本発明の検査方法を簡便に実施するためのキットであればよく、特に限定されない。該検査するためのキットは、
（ａ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および／または
（ｂ）Ｔｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物を特異的に認識する抗体
を含有してなる。該判定するためのキットが２以上の上記核酸および／または抗体を含む場合、各核酸または抗体は互いにＴｅｔ  ３遺伝子の塩基配列上の異なる部分を特異的に認識、またはＴｅｔ  ３遺伝子の翻訳産物の異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。
本発明のキットが前記（ａ）の核酸を含有する試薬を構成として含む場合、該核酸としては、本発明の検査方法において前記したプローブ用核酸もしくはプライマー用オリゴヌクレオチドが挙げられる。
Ｔｅｔ  ３遺伝子の発現を検出し得る核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥ緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、ＳＨ基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
該検査するためのキットに含有される核酸は、同一の方法（例：ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡアレイ技術、定量ＲＴ−ＰＣＲ等）によりＴｅｔ  ３遺伝子の発現を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
本発明のキットが前記（ｂ）の抗体を含有する試薬を構成として含む場合、該抗体としては、本発明の検査方法において前記した抗体が挙げられる。
本発明のキットを構成する試薬は、Ｔｅｔ  ３遺伝子の発現を検出し得る核酸や抗体に加えて、該遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、Ｔｅｔ  ３遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、Ｔｅｔ３遺伝子の発現を検出するための反応がＰＣＲの場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲを用いる場合は、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。また、Ｔｅｔ  ３遺伝子の発現を検出するための反応が抗原抗体反応の場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ抗体、標識された二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ抗ヒトＴｅｔ  ３抗体の場合、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等で標識されたマウス抗ウサギＩｇＧなど）、ブロッキング液等が挙げられる。
以下の実施例は、単に本発明をより具体的に例示するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０００９】
（実施例１）滑膜におけるＴｅｔタンパク質ファミリーの発現レベル
Ｔｅｔタンパク質ファミリーとしてはＴｅｔ  １，Ｔｅｔ  ２，Ｔｅｔ  ３の３種類のサブタイプが存在し、細胞ごとに発現レベルが異なること、またそれぞれが標的にする遺伝子座が異なることが知られる。そのため、まずは関節リウマチ（ＲＡ）患者、対照となる変形性関節症（ＯＡ）患者由来の滑膜における、Ｔｅｔタンパク質ファミリーの発現レベルを免疫組織化学染色法によって調べた。滑膜は関節手術の際に得られた滑膜組織の一部を凍結保存して後に組織切片を作成した。抗体はＧｏａｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＴ１  Ａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｓｃ−１６３４４４３），ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＴ２  Ａｂ（ｓｃ−１３６９２６），ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｕｍａｎ  ＴＥＴ３  Ａｂ（ｓｃ−１３９１８６），ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ（５−ｈｍＣ）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｂ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ），ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ（５−ｍＣ）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｂ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）を用い、二重染色にはｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ５５  Ａｂ（ａｂ８９１９０）、ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ６８  Ａｂ（ａｂ７４７０４）、２次抗体としてはＭＡＣＨ  ２  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔａｉｎ  ２（ｍｏｕｓｅ−ＨＲＰ  ＋  ｒａｂｂｉｔ−ＡＰ）を使用した。観察にはＢＩＯＲＥＶＯ（ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）を使用した。
その結果、ＯＡ、ＲＡともにＴｅｔ  １、Ｔｅｔ  ２の発現レベルには差が認められず、Ｔｅｔ  ３は滑膜表層細胞層において、ＯＡよりもＲＡで強い発現が認められた（図１〜３）。
また、ＲＡ、ＯＡ由来の滑膜におけるＤＮＡメチル化レベルおよびＴｅｔタンパク質ファミリーによる脱メチル化レベルを調べるために、５−メチルシトシン（５ｍＣ）および５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を免疫組織化学染色した。
その結果、ＲＡ、ＯＡ共に、５ｍＣのレベルは低く、５ｈｍＣのレベルは中等度で滑膜表層でより強い印象であった（図１、２）。
（実施例２）滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）におけるＴｅｔタンパク質ファミリーの発現レベル
継代培養したＦＬＳではすでに炎症性サイトカインの直接的な影響はないが、ＲＡ特有のＤＮＡメチル化プロファイルは保たれている（Ｎａｋａｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２０１３）。そこで、炎症性サイトカイン非存在下で培養した場合のＴｅｔファミリーの発現レベル（ｍＲＮＡ、タンパク質）を、ＲＡ、ＯＡ、健常人由来ＦＬＳで比較した。ＦＬＳとしては、実施例１の滑膜組織にコラゲナーゼ処理を加えて抽出した滑膜細胞を４−６継代して、９９％以上の純度が確認されたＦＬＳを用いた。ｍＲＮＡの発現はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭを使用してリアルタイムＰＣＲで解析した。ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｏｂｅはＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙｓのＴＥＴ１（Ｈｓ００２８６７５６＿ｍ１），ＴＥＴ２（Ｈｓ００３２５９９９＿ｍ１），ＴＥＴ３（００３７９１２５＿ｍ１）を用い、発現レベルをＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）で補正した。蛍光染色には一次抗体としてＧｏａｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＴ１  Ａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈ，ｓｃ−１６３４４４３），ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＴ２  Ａｂ（ｓｃ−１３６９２６），ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＴＥＴ３  Ａｂ（ｓｃ−１３９１８６）、二次抗体としてＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ，ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧをそれぞれ使用した。観察にはＢＩＯＲＥＶＯ（ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）を、画像解析にはＢＺ−ＩＩ  Ｖｉｅｗｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｋｅｙｅｎｃｅ）を使用した。
その結果、炎症性サイトカインによる刺激がないＦＬＳにおけるＴｅｔタンパク質ファミリーのｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＡ、ＯＡ、健常人の間で差を認めなかった（図４）。一方、タンパク質発現レベルでは、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２の発現レベルは非常に低く、Ｔｅｔ３はＴｅｔ  １、Ｔｅｔ  ２に比べて強い発現がＯＡ、ＲＡ由来ＦＬＳで認められた（図５）。
（実施例３）炎症性サイトカイン刺激後のＦＬＳにおけるＴｅｔタンパク質ファミリーの発現レベル
実施例２のＦＬＳにＲＡの病態に中心的に関与するとされる炎症性サイトカインＴＮＦαやＩＬ−１βを加えて培養した場合の、Ｔｅｔタンパク質ファミリーの発現レベルの変化（ｍＲＮＡ、タンパク質）を調べた。ＴＮＦαはｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（Ｒ＆Ｄ），ＩＬ−１βはｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β（ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を使用して、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌで刺激した。また、蛍光染色を行い、ランダムに２０個の細胞の核内と細胞質の蛍光強度を解析し、蛍光強度の比をＮ／Ｃ比とした。核タンパクの抽出にはＮｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法でタンパク質の発現を解析した。
その結果、ＴＮＦαやＩＬ−１βによってＦＬＳを刺激すると、ＯＡ、ＲＡに関わらず、ｍＲＮＡ発現レベルに関しては、Ｔｅｔ  １が刺激後２時間で顕著に低下したことに対して、Ｔｅｔ３は刺激後２時間で有意に発現が増加した。Ｔｅｔ２の発現の変化は認めなかった（図６）。タンパク質発現レベルに関しては、健常者、ＯＡ、ＲＡに関わらず、ＴＮＦα刺激後２４時間からＦＬＳの核内のＴｅｔ  ３発現レベルは有意に増加し、刺激後９６時間で顕著となった（図７、８）。
（実施例４）炎症性サイトカイン刺激後のＦＬＳにおけるＤＮＡメチル化レベル
ＲＡ由来ＦＬＳにＴＮＦαによる刺激を加え、ＤＮＡの脱メチル化レベルを調べるために５ｈｍＣのレベル（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）の変化を調べた。ｇＤＮＡの抽出にはＳｐｉｎｃｌｅａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ｍ．ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ法でｇＤＮＡ中の５ｈｍＣの発現レベルを解析した。一次抗体にはｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ（５−ｍＣ）ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｂ（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）、二次抗体にはＥＣＬＴＭ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）、検出にはＥＣＬＴＭ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いた。コントロールとしては５−Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ＆  ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｔを使用した。画像撮影にはＬｉｇｈｔ−ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＥ−６９７２，Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用し、画像解析にはＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｔｔｏ）を用いて定量化を行った。
その結果、ＴＮＦαによって刺激したＦＬＳは刺激後９６時間で有意に５ｈｍＣのレベルが増加した（図９）。
（実施例５）Ｔｅｔ  ３発現抑制後のＦＬＳにおける炎症性サイトカインの分泌レベル
Ｔｅｔ  ３  ｓｉＲＮＡを用いてＴｅｔ  ３発現を阻害した上で、ＴＮＦαによって刺激を加え、ＲＡ由来ＦＬＳが分泌する炎症性サイトカインレベルを評価した。具体的には、配列番号：３および配列番号４の塩基配列からなるｓｉＲＮＡでＴｅｔ  ３をノックダウンしたＦＬＳをＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）を含む培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ）で９６時間培養後、洗浄して、さらにＴＮＦαを含まない０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで４８時間の培養を行った。コントロールとしてＴｅｔ  １のｓｉＲＮＡを使用した。予備的検討で使用したｓｉＲＮＡ（いずれもＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＰｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  Ｈｕｍａｎ）はそれぞれの遺伝子について２種類ずつ、すなわち、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：ＨＳＳ１２９５８６，ＨＳＳ１２９５８７  ｆｏｒ  ＴＥＴ１，ＨＳＳ１２３２５３，ＨＳＳ１２３２５４  ｆｏｒ  ＴＥＴ２，ＨＳＳ１５３３８１，ＨＳＳ１７６４５９  ｆｏｒ  ＴＥＴ３を使用した。コントロールとしてはＳｔｅａｌｔｈＴＭ  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤｕｐｌｅｘｅｓよりＬｏｗ  ＧＣ  Ｄｕｐｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてリポフェクション法でｓｉＲＮＡ遺伝子を導入した。遺伝子導入効率の予備的検討の結果より、ＴＥＴ３のｓｉＲＮＡとしてはＨＳＳ１５３３８１、ＴＥＴ１のｓｉＲＮＡとしてはＨＳＳ１２９５８７を使用することとした。ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２などのタンパク分泌量についてはＢＤＴＭＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ，ＢＤ，Ｊａｐａｎ）で、ＭＭＰ３の分泌量はＳＲＬに測定を依頼した（検査方法はＬＴＩＡ法）。またＩＣＡＭ−１やＶＣＡＭ−１の接着分子の発現はｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ，ＢＤ）で測定し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＣＣＬ２のｍＲＮＡの発現解析にはＴａｑＭａｎ（Ｒ）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ  Ａｓｓａｙｓ  ＣＣＬ２（Ｈｓ００２３４１４０＿ｍ１）を用いた。
その結果、ＲＡの病態への関連が示唆されてきた多数のサイトカイン、ケモカイン、ＭＭＰｓの中で、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２、ＭＭＰ３などはＴＮＦα依存性の発現誘導が認められたが、これらの中でＣＣＬ２のみはＴｅｔ  ３ノックダウンによりＴＮＦα依存性の発現誘導が阻害された（図１０）。この現象はｍＲＮＡと分泌タンパクレベルでも確認された。また、接着分子の中でＩＣＡＭ１も同様にＴｅｔ  ３ノックダウンによりＴＮＦα依存性の発現誘導が阻害された。ＣＣＬ２やＩＣＡＭ−１はＦＬＳの骨・軟骨組織への浸潤に関わり、ＲＡの病態形成に深く関与することが知られている。従って、Ｔｅｔ  ３ノックダウンは、ＤＮＡのメチル化レベルの維持を介して、ＣＣＬ２やＩＣＡＭ−１の発現を抑制することによって、ＲＡの予防および治療に有効であることが示唆された。なお、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１７αについても検出を試みたが、値が検出感度以下であったため、検出することができなかった。
（実施例６）Ｔｅｔ  ３発現抑制後のＦＬＳの浸潤能
Ｔｅｔ  ３  ｓｉＲＮＡを用いてＴｅｔ  ３発現を阻害した上で、ＴＮＦαによって刺激を加え、ＲＡ由来ＦＬＳの浸潤能をＳｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙで評価した。具体的には、ｓｉＲＮＡでＴｅｔ  ３をノックダウンしたＦＬＳをＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）を含む培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ）で９６時間培養後、洗浄して、ＦＬＳが接着したｄｉｓｈ表面にｓｃｒａｔｃｈを施行し、ＴＮＦαを含まない０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで培養しながら、最長４８時間の観察を行った。コントロールとしてＴｅｔ  １のｓｉＲＮＡを使用した。
その結果、Ｔｅｔ  ３ノックダウンによりＴＮＦα依存性のＦＬＳ浸潤誘導が完全に阻害された（図１１）。Ｔｅｔ  ３の選択的阻害が関節リウマチ患者の滑膜線維芽細胞において見られる最も重要な攻撃的な表現型の一つである浸潤性を阻害することで、ＲＡの予防および治療につながることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明により、これまでの治療剤の標的とは異なる因子であるＴｅｔ  ３を標的とした、関節炎の予防及び／又は治療剤あるいは診断キットが提供される。新たな作用機序を有する治療薬が提供されることにより、既存の治療法では病状回復効果が認められない、又は病状回復効果が十分でない関節炎患者、及び既存の治療薬を継続使用することで該治療薬について耐性を獲得した関節炎患者に対してもより良い治療を提供し得る。さらに本発明は、関節炎を未然に防ぐ予防目的、及び関節炎が一時寛解した患者が病気の再発を予防する目的にも使用され得る。また、本発明によれば、Ｔｅｔ  ３の発現又は機能を阻害することで関節炎の予防及び／又は治療効果を発揮する、関節炎の新規予防・治療薬の候補物質をスクリーニングすることが可能である。
本出願は、日本で出願された特願２０１４−１７４６３８（出願日：平成２６年８月２８日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月9日(2016.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、関節炎の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法：
（１）滑膜線維芽細胞を、被検物質に接触させる工程、
（２）前記細胞のＣＣＬ２遺伝子またはＩＣＡＭ１遺伝子の５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性の程度を測定する工程、
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、前記細胞のＣＣＬ２遺伝子またはＩＣＡＭ１遺伝子の５−メチルシトシン（５ｍＣ）の脱メチル化または浸潤性を抑制した被検物質を、関節炎の予防及び／又は治療薬の候補として選択する工程。
【請求項８】
関節炎が関節リウマチ、乾癬性関節炎または脊椎関節炎である、請求項７に記載の方法。
【国際調査報告】
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