(57)【要約】  ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、ＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１−３で示される上記アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬと、ＣＤＲ１として配列番号４若しくは５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７−９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４−９で示される上記アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨと、を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬと、  ＣＤＲ１として配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨと、  を有する、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項２】
ＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、  ことを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項３】
ＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、  ことを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項４】
ＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号９のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、  ことを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項５】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３であるハイブリドーマ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５であるハイブリドーマ及び受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４であるハイブリドーマからなる群より選択される少なくとも１つのハイブリドーマにより産生される、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項６】
キメラ抗体又はヒト化抗体である、  ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載の発現ベクターを含み、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養し、培養物から抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを回収する工程を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントの産生方法。
【請求項１１】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する細胞。
【請求項１２】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３であるハイブリドーマ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５であるハイブリドーマ及び受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４であるハイブリドーマからなる群より選択される少なくとも１つのハイブリドーマである、  ことを特徴とする請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを含む医薬組成物。
【請求項１４】
ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用する、  ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項１５】
ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用する、  ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項１６】
ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用せず、かつ、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用しない、  ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント。
【請求項１７】
請求項１６に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを細胞集団に投与する工程と、  前記細胞集団の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ａを測定する工程と、  候補物質を前記細胞集団に投与する工程と、  前記候補物質を前記細胞集団に投与した後の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ｂを測定する工程と、  前記度合Ａと前記度合Ｂとを比較する工程と、  を含むＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングするための方法。
【請求項１８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントと、被験者由来のサンプルと、を接触させる工程と、  前記モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントが、前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１に結合するか否かを判定する工程と、  を含む、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１を検出するための方法。
【請求項１９】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントと、被験者由来のサンプルと、を接触させて、前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１量を測定する工程と、  前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＬ１量を測定する工程と、  を含む、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント、核酸、発現ベクター、形質転換体、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントの産生方法、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する細胞、医薬組成物、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングするための方法、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１を検出するための方法、及びサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、癌、感染症、移植時拒絶反応、自己免疫疾患などの制御に重要な役割を果たす。ＮＫ細胞の表面には、受容体分子であるｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下、ＫＩＲという）が存在している。ＫＩＲは、非常に多型性が高く、抑制型と活性型とがファミリーを形成するペア型受容体ファミリーのひとつである。ＮＫ細胞の活性化は、抑制型ＫＩＲと活性型ＫＩＲとの発現量比、及び標的細胞上のリガンドの有無に依存している。また、ＫＩＲファミリーは細胞外ドメインの配列相同性が高く、抑制型ＫＩＲと活性型ＫＩＲとが同一のリガンドを認識する場合が多い。【０００３】  活性型ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＳ１は、抑制型ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ１とペア型受容体ファミリーを形成している。ＫＩＲ２ＤＳ１は、ＫＩＲ２ＤＬ１と同一リガンドである一部のＨＬＡ−Ｃ及び未知の非自己リガンドを認識することによって、ＮＫ細胞の活性化を制御している。【０００４】  ウイルス感染細胞や腫瘍細胞は、ＫＩＲ２ＤＳ１リガンドを発現することによって、ＮＫ細胞に認識され、活性化されたＮＫ細胞が該ウイルス感染細胞や腫瘍細胞を除去しようとする。一方、自己免疫疾患や移植時拒絶反応には、ＮＫ細胞が過剰に活性化することによって起こる不適切な免疫反応が関与している。【０００５】  ＮＫ細胞賦活化を目的として、抑制型ＫＩＲを認識する抗体を用いた臨床応用が進められており、いくつか報告がなされている。【０００６】  特許文献１−３には、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に結合する抗体が開示されている。また、非特許文献１−３には、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に結合して抑制作用を示す抗体であるＩＰＨ２１０１が開示されている。より具体的には、非特許文献１にはＩＰＨ２１０１の急性骨髄性白血病に対する第Ｉ相試験が、非特許文献２にはＩＰＨ２１０１の多発性骨髄腫に対する第Ｉ相試験が、非特許文献３には多発性骨髄腫に対するＩＰＨ２１０１とレナリドミドとの併用効果が記載されている。また、非特許文献４−５には、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に結合して抑制作用を示す抗体である１−７Ｆ９が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５２４６１２号公報
【特許文献２】特表２００８−５０６３６８号公報
【特許文献３】特表２００８−５２６８１２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２  １２０：４３１７−４３２３
【非特許文献２】Ｄｏｎ  Ｍ．Ｂｅｎｓｏｎ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２  １２０：４３２４−４３３３
【非特許文献３】Ｄｏｎ  Ｍ．Ｂｅｎｓｏｎ，Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２０１１  １１８：６３８７−６３９１
【非特許文献４】Ｓｕｓａｎｎｅ  Ｅ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１０）１３４，１５８-１６８
【非特許文献５】Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｒｏｍａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１４：２６６７−２６７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  しかしながら、特許文献１−３及び非特許文献１−５に記載の抗体は、本来自己細胞を攻撃しないように機能している抑制型ＫＩＲを広く阻害するため、自己免疫反応誘発などの副作用の発現が懸念される。また、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合する抗体については、今まで報告がなされていなかった。【００１０】  本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＫＩＲ２ＤＳ１に対する新規のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント、核酸、発現ベクター、形質転換体、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントの産生方法、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する細胞、医薬組成物、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングするための方法、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１を検出するための方法、及びサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、  ＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＶＬと、  ＣＤＲ１として配列番号４若しくは配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＶＨと、  を有する。【００１２】  ＶＨは、例えば、ＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。【００１３】  ＶＨは、例えば、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号８のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。【００１４】  ＶＨは、例えば、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号９のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。【００１５】  本発明の第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３であるハイブリドーマ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５であるハイブリドーマ及び受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４であるハイブリドーマからなる群より選択される少なくとも１つのハイブリドーマにより産生される。【００１６】  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、例えば、キメラ抗体又はヒト化抗体である。【００１７】  本発明の第３の観点に係る核酸は、本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントをコードする塩基配列を含む。【００１８】  本発明の第４の観点に係る発現ベクターは、本発明の第３の観点に係る核酸を含む。【００１９】  本発明の第５の観点に係る、本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する形質転換体は、本発明の第３の観点に係る核酸又は本発明の第４の観点に係る発現ベクターを含む。【００２０】  本発明の第６の観点に係る、本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントの産生方法は、本発明の第５の観点に係る形質転換体を培養し、培養物から抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを回収する工程を含む。【００２１】  本発明の第７の観点に係る細胞は、本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する。【００２２】  細胞は、例えば、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３であるハイブリドーマ、受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５であるハイブリドーマ及び受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４であるハイブリドーマからなる群より選択される少なくとも１つのハイブリドーマである。【００２３】  本発明の第８の観点に係る医薬組成物は、本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを含む。【００２４】  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、例えば、アゴニストとして作用する。【００２５】  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、例えば、アンタゴニストとして作用する。【００２６】  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントは、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用せず、かつ、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用しない。【００２７】  本発明の第９の観点に係るＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングするための方法は、  ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用せず、かつ、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用しない本発明の第１及び第２の観点に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを細胞集団に投与する工程と、  前記細胞集団の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ａを測定する工程と、  候補物質を前記細胞集団に投与する工程と、  前記候補物質を前記細胞集団に投与した後の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ｂを測定する工程と、  前記度合Ａと前記度合Ｂとを比較する工程と、  を含む。【００２８】  本発明の第１０の観点に係るサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１を検出するための方法は、  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントと���被験者由来のサンプルと、を接触させる工程と、  前記モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントが、前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１に結合するか否かを判定する工程と、  を含む。【００２９】  本発明の第１１の観点に係るサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法は、  本発明の第１及び第２の観点に係るＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントと、被験者由来のサンプルと、を接触させて、前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１量を測定する工程と、  前記サンプル中のＫＩＲ２ＤＬ１量を測定する工程と、  を含む。
【発明の効果】
【００３０】  本発明によれば、ＫＩＲ２ＤＳ１に対する新規のモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメント、核酸、発現ベクター、形質転換体、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントの産生方法、モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生する細胞、医薬組成物、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングするための方法、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１を検出するための方法、及びサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。（ａ）は１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、（ｂ）は１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、（ｃ）は１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、（ｄ）は１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。（ａ）は３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０、（ｂ）は３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６、（ｃ）は５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３、（ｄ）は５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図３】ＳＰＲの結果を示す図である。（ａ）は１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、（ｂ）は１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、（ｃ）は１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、（ｄ）は１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４のＳＰＲの結果を示す図である。
【図４】ＳＰＲの結果を示す図である。（ａ）は３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０、（ｂ）は３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６、（ｃ）は５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３、（ｄ）は５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４のＳＰＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】  まず、本発明によるモノクローナル抗体及びその抗原結合領域を含むフラグメントについて詳細に説明する。
【００３３】  本発明書において、「ＶＬ」は軽鎖を、「ＶＨ」は重鎖を意味する。また、「ＣＤＲ１」はＶＬ又はＶＨの第１相補性決定領域を、「ＣＤＲ２」はＶＬ又はＶＨの第２相補性決定領域を、「ＣＤＲ３」はＶＬ又はＶＨの第３相補性決定領域を意味する。
【００３４】  本発明によるモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体、すなわち、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。ここで「特異的に結合する」とは、他のタンパク質又はペプチドに対してよりも、ＫＩＲ２ＤＳ１に対して高い親和性で結合することを意味する。ここで、「高い親和性」とは、本技術分野で公知の方法を用いて、ＫＩＲ２ＤＳ１を他のタンパク質又はペプチドから区別して検出することが可能な程度の結合親和性を意味する。この場合の解離定数（Ｋｄ）については、例えば、少なくとも１×１０−７Ｍ以下、好ましくは少なくとも１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下又はそれより小さいものである。
【００３５】  本発明によるモノクローナル抗体のＫＩＲ２ＤＳ１との結合性については、本技術分野で公知の方法により評価することができ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などによって結合性を評価することができる。
【００３６】  本発明によるモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合する一方で、他のＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３には結合しない。
【００３７】  本明細書において、「その抗原結合領域を含むフラグメント」とは、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体の抗原結合領域を含む、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等のフラグメントを意味する。したがって、「その抗原結合領域を含むフラグメント」もまた、モノクローナル抗体全体と同様に、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合することができる。このようなフラグメントを作製する場合、当業者に公知の調製方法を用いることができるが、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパイン等）によって消化し、その後、公知のタンパク質分離精製方法で精製する方法や、遺伝子組換えによる調製方法などを例示することができる。
【００３８】  本明細書において、以下、「本発明によるモノクローナル抗体」又は「本発明のモノクローナル抗体」には、本発明によるモノクローナル抗体の抗原結合領域を含むフラグメントが含まれるものとして理解される。
【００３９】  本発明によるモノクローナル抗体は、  ＣＤＲ１として配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬと、  ＣＤＲ１として配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨと、  を有する。
【００４０】  好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体のＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号７のアミノ酸配列を有する。このようなクローンは、本明細書において、ＩＣ７Ｂ８−Ｇ３、１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４として表される（表１）。
【００４１】  また、好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体のＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号８のアミノ酸配列を有する。このようなクローンは、本明細書において、３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０、３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６として表される（表１）。
【００４２】  また、好ましくは、本発明によるモノクローナル抗体のＶＨは、ＣＤＲ１として配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２として配列番号６のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３として配列番号９のアミノ酸配列を有する。このようなクローンは、本明細書において、５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３、５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４として表される（表１）。
【００４３】
【表１】
2016031936.tif 000002
【００４４】  ＣＤＲ１〜３は、前述の配列番号１〜９のアミノ酸配列の他に、配列番号１〜９のアミノ酸配列において１又は数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をも含み得る。ここで「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸が、そのアミノ酸と類似の性質を示すアミノ酸と置換されることを意味する。特定のアミノ酸配列において１又は数個の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むタンパク質が、その特定のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の活性を保持することは、本技術分野において公知である。本発明において、このような保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体及びその抗原結合領域を含むフラグメントは、ＫＩＲ２ＤＳ１との結合性を保持している限り、本発明によるモノクローナル抗体に含まれ得る。例えば、中性（極性）アミノ酸（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ）、中性（非極性、すなわち疎水性）アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）、酸性（極性）アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（極性）アミノ酸（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）が、同じ性質を有するアミノ酸と置換され得る。
【００４５】  次に、本発明によるモノクローナル抗体の作製方法について説明する。
【００４６】  免疫原として、例えば、大腸菌において組換え発現させたＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質を精製して使うことができる。ＫＩＲ２ＤＳ１の発現方法としては、酵母、細胞株（ヒト培養細胞（ＨＥＫ等）、昆虫細胞等）を用いた組換え蛋白質発現系により発現させる方法や、大腸菌内でＢｍＮＰＶウイルス遺伝子を調製し、直接カイコ個体に接種して発現させる方法も用いることができる。
【００４７】  免疫原の調製において、ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質に、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加したものを用いてもよい。用いられ得るアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等が例示される。
【００４８】  上記の通り調製した免疫原を、哺乳類、例えば、ラット、マウス、ウサギなどに投与する。免疫は、例えば、皮下（臀部など）、腹腔内、足蹠、静脈内に注入することにより行われる。免疫の回数は、単回でもよく、数日から数週間間隔で２〜５回程度でもよい。最終の免疫日から３〜２０日後に、リンパ節、脾臓、末梢血等より、抗体産生細胞を採取する。
【００４９】  次に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイブリドーマを得る。ミエローマ細胞として、一般に入手可能な株化細胞を使用することができるが、薬剤選択性を有する細胞、すなわち、例えば、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できるような性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞として、例えば、マウスミエローマ細胞（Ｘ６３／Ａｇ８−６５３）を用いることができる。
【００５０】  抗体産生細胞とミエローマ細胞とを、血清を含まない培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０培地等）中で混合し、細胞融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコール等）の存在下で細胞融合させる。なお、細胞融合において、エレクトロポレーションを利用した細胞融合装置を用いてもよい。
【００５１】  細胞融合後、目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、非働化済ＦＢＳ含有のＨＡＴ選択培地で希釈した細胞懸濁液をマイクロプレートに播種し、培地を適宜交換しながら培養する。その後、培養開始後１０〜２０日程度で生育してくる細胞を、ハイブリドーマとして得ることができる。
【００５２】  前述の通り得られたハイブリドーマの培養上清について、ＫＩＲ２ＤＳ１に結合する抗体の存在を確認するためにスクリーニングを行う。スクリーニングの方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）等を用いることができるが、ＥＬＩＳＡを好適に用いることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００５３】  樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、例えば、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地を用いて培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を得る方法が挙げられる。抗体の精製については、必要に応じて行われ、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知の方法、又はこれらの組み合わせを採用することができる。
【００５４】  次に、本発明によるモノクローナル抗体を産生する細胞について説明する。
【００５５】  本発明によるモノクローナル抗体を産生する細胞として、例えば、前述のモノクローナル抗体の作製方法に従って得られたハイブリドーマを好適に用いることができる。
【００５６】  本発明者らは、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、１Ｃ７＿ＫＩＲ２ＤＳ１、３Ｅ１１Ａ５＿ＫＩＲ２ＤＳ１及び５Ｂ１２Ｄ２＿ＫＩＲ２ＤＳ１の３種類のハイブリドーマを樹立した。これらのハイブリドーマは各々、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に２０１４年５月９日（寄託の日付）付けで受託され、その後、ブタペスト条約の下での国際寄託に移管され（２０１５年７月８日付けで移管請求を受領）、各々、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４が付与されている（２０１５年７月２９日付けで受託証発行）。
【００５７】  ハイブリドーマ１Ｃ７＿ＫＩＲ２ＤＳ１は、クローンとして１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、及び１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４を産生し、ハイブリドーマ３Ｅ１１Ａ５＿ＫＩＲ２ＤＳ１は、クローンとして３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０及び３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６を産生し、ハイブリドーマ５Ｂ１２Ｄ２＿ＫＩＲ２ＤＳ１は、クローンとして５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３及び５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４を産生する。なお、これらのクローンのＶＬのＣＤＲ１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、前述の表１の通りである。
【００５８】  また、上述のクローンのＶＬ  ＣＤＲ１〜３及びＶＨ  ＣＤＲ１〜３をコードする核酸の塩基配列に対応する配列番号を、表２に示す。
【００５９】
【表２】
2016031936.tif 000003
【００６０】  次に、本発明のモノクローナル抗体のキメラ抗体及びヒト化抗体について説明する。
【００６１】  キメラ抗体は、例えば、上述のハイブリドーマが産生するラットモノクローナル抗体の遺伝子を、他の哺乳動物由来の抗体分子の遺伝子に導入することで作製することができる。キメラ抗体の作製方法としては、例えば、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８等に記載の方法を用いることができる。キメラ抗体として、上述のラットモノクローナル抗体のＶＬ及び／又はＶＨの可変領域、例えば、上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号７を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号８を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号９を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号７を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号８を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体；又は上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号９を含むアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリン定常領域と、を有するヒト型キメラ抗体を例示することができる。本発明の効果を奏するキメラ抗体の作製方法であれば、適宜用いることができる。
【００６２】  ヒト化抗体は、例えば、ラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域と、を有する抗体である。ヒト化抗体の場合、ラット由来の抗体領域部分は、ヒト化抗体全体のうち約１０％未満であることが望ましい。本発明によるヒト化抗体は、例えば、上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号７を含むアミノ酸配列；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号８を含むアミノ酸配列；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号４、配列番号６、配列番号９を含むアミノ酸配列；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号７を含むアミノ酸配列；上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号８を含むアミノ酸配列；又は上述のラットモノクローナル抗体のＶＬのＣＤＲ１〜３として各々配列番号１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３として各々配列番号５、配列番号６、配列番号９を含むアミノ酸配列を有する。本発明の効果を奏するヒト化抗体の作製方法であれば、適宜用いることができる。
【００６３】  本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを、遺伝子工学的手法を利用して作製する方法について説明する。
【００６４】  例えば、以下の作製方法が例示される。前述の通り作製したハイブリドーマから、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡを、ファージ、プラスミド等のベクターに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体（例えばマウス抗体）の定常領域部分又は可変領域部分をプローブとして用いて、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ、組換えプラスミド等を単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とする抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列を公知の塩基配列決定方法により決定し、その塩基配列に基づきＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【００６５】  本発明によるモノクローナル抗体をコードする塩基配列、例えば、ＶＬのＣＤＲ１〜３及びＶＨのＣＤＲ１〜３をコードする核酸の塩基配列として配列番号１０〜１８を挙げることができる（表２）。
【００６６】  また、ＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列を含む核酸において、１又は数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつＫＩＲ２ＤＳ１に結合するタンパク質をコードする塩基配列を含む変異体を用いることができる。ここで、「１又は数個」とは、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個を指す。なお、この場合の変異体には、天然の変異体及び人為的な変異体が含まれ得る。
【００６７】  また、ＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列の相補配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＫＩＲ２ＤＳ１と結合するタンパク質をコードする塩基配列を含む変異体を用いることもできる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％  ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の条件又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６８】  本発明によるモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列を含む核酸又はその変異体を含む発現ベクターを用いて、本発明によるモノクローナル抗体を作製することができる。
【００６９】  まず、例えば、本発明によるモノクローナル抗体のＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列を含む核酸又はその変異体をクローニングし、発現ベクターに組み込む。発現ベクターとしては、例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＱＣｘＩＤ（クロンテック）、ｐＱＣｘＩＨ（クロンテック）等を用いることができる。また、発現ベクターには、ＶＨ又はＶＬをコードする塩基配列を含む核酸又はその変異体の他、公知のプロモーター、エンハンサー、選択マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等）などを挿入してもよい。
【００７０】  次に、上述のとおり構築した発現ベクターを、宿主細胞に導入して、形質転換体を得る。用いられる宿主細胞としては、導入される発現ベクター上の核酸を発現し、本発明によるモノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含むフラグメントを産生できるものであれば、特に制限されずに用いることができ、例えば、細菌（大腸菌等）、酵母（サッカロミセス・セレビシエ等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞（カイコ、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等）などを用いることができる。また、宿主細胞への導入方法については、公知の導入方法であれば特に制限されずに用いることができ、細菌及び酵母への導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を、動物細胞及び昆虫細胞への導入方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示することができる。
【００７１】  形質転換体は、例えば、導入する核酸内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００７２】  本発明によるモノクローナル抗体は、上述の形質転換体を培地で培養した培養物から回収することにより、得ることができる。本明細書において、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、細胞破砕物等である。
【００７３】  形質転換体の培養方法としては、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法が採用され得る。培地としては、細菌又は酵母を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する場合には、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約２０〜４０℃で約１〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に維持される。培養中、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｄ−ＭＥＭ培地等、これらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、約３７℃で約１〜７日間行う。培養中は必要に応じてストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７４】  培養後、本発明によるモノクローナル抗体を培養物から回収する。例えば、細胞内又は菌体において抗体が産生される場合には、細胞又は菌体の破砕物より、公知の方法を用いてタンパク質を抽出することで、抗体を回収する。また、例えば、細胞外又は菌体外において抗体が産生される場合には、培養液から直接、又は遠心分離等により細胞又は菌体を除去した培養液から、公知の方法により抗体を回収する。培養物から回収された本発明によるモノクローナル抗体は、必要に応じて、公知の方法により精製され得る。
【００７５】  このようにして得られた本発明によるモノクローナル抗体の、ＫＩＲ２ＤＳ１に対する結合活性については、前述の方法により確認することができる。
【００７６】  次に、本発明による医薬組成物、及び本発明によるモノクローナル抗体のＫＩＲ２ＤＳ１に対する作用について説明する。
【００７７】  本発明による医薬組成物は、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合する、本発明によるモノクローナル抗体を含む。したがって、本発明による医薬組成物を被験者に投与すると、本発明によるモノクローナル抗体が被験者の体内のＮＫ細胞表面に存在するＫＩＲ２ＤＳ１に結合し、状況に応じて、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することができる。
【００７８】  なお、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用する本発明によるモノクローナル抗体を、公知の方法により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等のフラグメントに処理することで、また、架橋処理することで、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用するように変換してもよい。また、これとは逆に、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用する本発明によるモノクローナル抗体を、前述同様の処理を施すことで、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用するように変換してもよい。
【００７９】  本発明によるモノクローナル抗体がＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用する場合、ＫＩＲ２ＤＳ１を活性化して、ＮＫ細胞を活性化させるため、免疫賦活剤（ＮＫ細胞活性剤）、抗癌剤等として用いることができる。
【００８０】  免疫賦活剤として用いる場合、例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染症による後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）（例えば、カンジダ食道炎、カリニ肺炎、トキソプラズマ症、結核、マイコバクテリウム−アビウム複合体感染症、クリプトスポリジウム症、クリプトコッカス髄膜炎、サイトメガロウイルス感染症、進行性多巣性白質脳症などの日和見感染症など）、重症疾患（例えば、癌、再生不良性貧血、白血病、骨髄線維症、腎不全、糖尿病、肝疾患もしくは脾疾患）に伴う免疫不全及び原発性免疫不全症候群などを含む免疫不全疾患の治療及び／又は予防の効果が期待される。
【００８１】  抗癌剤として用いる場合、慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＬＬ）、副腎皮質癌（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌（Ａｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管癌（Ｂｉｌｉａｒｙ  ｃａｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（Ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頚癌（Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、ユーイング腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｃａｎｃｅｒ）、胆嚢癌（Ｇａｌｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、下咽頭癌（Ｈｙｐｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（Ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口唇口腔癌（Ｌｉｐ  ａｎｄ  Ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（Ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  −  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ）、非ホジキンリンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｍａ  −  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）、黒色腫（Ｍｅｌａｎｏｍａ）、中皮腫（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、卵巣癌（Ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（Ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）等の治療及び／又は予防の効果が期待される。
【００８２】  本発明によるモノクローナル抗体がＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用する場合、ＫＩＲ２ＤＳ１を不活性化して、ＮＫ細胞を不活性化させるため、自己免疫疾患治療薬、移植後の免疫抑制薬等（ＮＫ細胞不活性化剤）として用いることができる。
【００８３】  自己免疫疾患としては、例えば、関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性糸球体腎炎、自己免疫性膵島炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性卵巣炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、ベーチェット病、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症、過敏性血管炎、結節性動脈周囲炎、橋本病、粘液水腫、バセドウ病、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、突発性血小板減少症、悪性貧血、重症筋無力症、脱髄疾患、大動脈炎症群、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、膠原病（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、汎発性強皮症、全身性進行性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎およびリウマチ熱など）、ギラン・バレー症候群、多腺性自己免疫症候群ＩＩ型、原発性胆汁性肝硬変、尋常性白斑、１型糖尿病等が挙げられ、これらの疾患の治療及び／又は予防の効果が期待される。
【００８４】  移植後の免疫抑制薬としては、例えば、腎移植、肝移植、心移植、肺移植後の拒絶反応、骨髄移植における拒絶反応、移植片対宿主病等が挙げられ、これらに対する治療及び／又は予防の効果が期待される。
【００８５】  本発明によるモノクローナル抗体は、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合し、他のＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３）へクロス反応しないため、より特異的な治療及び／又は予防効果が期待できる。
【００８６】  本発明による医薬組成物の投与方法は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、口腔内投与、舌下投与、気道内投与、直腸内投与、筋肉内投与等、適宜選択され得る。この医薬組成物の剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤、その他、噴霧剤、座剤、軟膏、テープ剤等に適宜調製することができる。
【００８７】  本発明による医薬組成物には、通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。
【００８８】  本発明による医薬組成物の投与量は、適用疾患、剤型、患者の年齢、体重等によって適宜選択され得る。
【００８９】  本発明による医薬組成物を被験者に投与する場合、被験者がＫＩＲ２ＤＳ１を有するか否かについて、投与前に、本発明のモノクローナル抗体を用いて調べてもよい。日本人の約半数がＫＩＲ２ＤＳ１を有し、ＫＩＲ２ＤＳ１を有する被験者に該医薬組成物を投与することで治療及び／又は予防効果が期待できるからである。このように、本発明のモノクローナル抗体は、コンパニオン診断にも用いられ得る。
【００９０】  次に、被験者がＫＩＲ２ＤＳ１を有するか否かについて調べるための、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１の検出方法について説明する。
【００９１】  サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１の検出方法は、（ａ）本発明のモノクローナル抗体と、被験者由来のサンプルと、を接触させる工程と、（ｂ）本発明のモノクローナル抗体が、被験者由来のサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１に結合するか否かを判定する工程と、  を含む。
【００９２】  前述の被験者由来の「サンプル」としては、例えば、組織又は細胞サンプル（胃、十二指腸、大腸、膵臓、胆嚢、胆管、気管支、肺等の癌の組織又は細胞）、生体液サンプル（胃粘液、十二指腸液、膵液、胆汁、腹水、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿等）などが挙げられる。例えば、免疫染色の場合には、組織サンプル（生検標本、切除標本）、細胞診サンプルを用いることができる。
【００９３】  前述の工程（ａ）における「接触」とは、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１に、本発明のモノクローナル抗体が結合できるように近接させることを意味し、例えば、サンプル含む溶液と本発明によるモノクローナル抗体を含有する溶液とを混合すること、サンプルを含む固形物を本発明によるモノクローナル抗体を含有する溶液に浸漬すること、本発明による抗体を固相支持体（例えば、メンブレン、ビーズ等）に固定化したものをサンプルを含む溶液に浸漬すること等によりなされ得る。
【００９４】  前述の工程（ｂ）において、本発明のモノクローナル抗体が、被験者由来のサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１に結合するか否かについて、免疫組織化学染色法及び免疫電顕法、並びに免疫アッセイＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法、ウエスタンブロット法等などを利用して判定することができる。
【００９５】  免疫組織化学染色法又は免疫電顕法の場合、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出により行うことができる。この場合、被験者から組織学的サンプルを採取し（生検組織サンプル、組織のパラフィン包埋切片など）、該組織学的サンプルに標識した本発明のモノクローナル抗体を接触させることができる。
【００９６】  免疫アッセイは、液相系及び固相系のいずれで行ってもよい。また免疫アッセイの形式も限定されるものではなく、直接固相法の他、サンドイッチ法、競合法などであってもよい。ＫＩＲ２ＤＳ１と抗体との複合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識のシグナルを検出するようにしてもよい。免疫アッセイの一例として、例えば固相系を利用する場合、抗体又は抗原結合性フラグメントを固相支持体又は担体（樹脂プレート、メンブレン、ビーズなど）に固定してもよいし、あるいはサンプルを固定してもよい。例えば、抗体又は抗原結合性フラグメントを固相支持体に固定し、支持体を適当なバッファーで洗浄した後、サンプルを用いて処理する。次に固相支持体にバッファーを用いた２回目の洗浄を行って、未結合の抗体又は抗原結合性フラグメントを除去する。そして固体支持体上の結合した抗体又は抗原結合性フラグメントを、慣用的な手段により検出することによって、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１と抗体又は抗原結合性フラグメントとの結合を検出することができる。また、固形サンプルを抗体又は抗原結合性フラグメントを含む溶液で処理して、続いてバッファーを用いた洗浄を行って未結合の抗体又は抗原結合性フラグメントを除去した後、固形サンプル上の結合した抗体又は抗原結合性フラグメントを慣用的な手段により検出することができる。
【００９７】  本発明による抗体とサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１との結合の検出については、検出を容易にするために、抗体を標識して間接的に検出を行ってもよい。酵素免疫アッセイの場合には、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等、また、酵素阻害物質や補酵素等を、公知の方法により抗体に結合させて検出することができる。蛍光免疫アッセイの場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等を、公知の方法により抗体に結合させて検出することができる。放射性免疫アッセイの場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５及びヨウ素１３１等を、公知の方法により抗体に結合させて検出することができる。
【００９８】  また例えば、標識二次抗体を用いて本発明による抗体とサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１との結合を検出する場合には、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントとサンプルとを反応させ（１次反応）、得られた複合体にさらに標識二次抗体を反応させる（２次反応）。１次反応と２次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。１次反応及び２次反応により、ＫＩＲ２ＤＳ１−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は本発明の抗体−ＫＩＲ２ＤＳ１−標識二次抗体の複合体が形成される。そして定量を行う場合には、未結合の標識二次抗体を分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１量を測定することができる。
【００９９】  ビオチン−アビジン複合体系を利用して本発明による抗体とサンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１との結合を検出する場合には、ビオチン化した抗体とサンプルとを反応させ、得られた複合体に標識を付加したアビジンを反応させる。アビジンは、ビオチンと特異的に結合することができるため、アビジンに付加した標識のシグナルを検出することによって、抗体とＫＩＲ２ＤＳ１との結合を測定することができる。アビジンに付加する標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなど）が好ましい。
【０１００】  標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。基質は、使用する酵素の種類に応じて異なり、例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）等を、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。
【０１０１】  次に、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法について説明する。
【０１０２】  ＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とでは、細胞外ドメインの配列相同性が高く、同一のリガンドを認識すると考えられている。このため、従来、ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合する抗体が見出されておらず、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを正確に定量することができなかった。ＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合する本発明によるモノクローナル抗体を用いることで、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定することができ、例えば、疾患発症と、ＫＩＲ２ＤＳ１／ＫＩＲ２ＤＬ１発現量比と、の関連性を明らかすることができ、特定の疾患の診断への応用が期待される。
【０１０３】  サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを測定するための方法は、  本発明によるモノクローナル抗体と、被験者由来のサンプルと、を接触させて、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１量を測定する工程と、  サンプル中のＫＩＲ２ＤＬ１量を測定する工程と、  を含む。
【０１０４】  前述の「被験者由来のサンプル」及び「接触」については、前述同様であるが、被験者由来のサンプルとしては、末梢血を好適に用いることができる。また、サンプル中のＫＩＲ２ＤＬ１量は、例えば、Ａｎｔｉ−ＫＩＲ２ＤＬ１抗体［２Ｆ９］（アブカム）と、サンプルと、を接触させて、前述同様に、免疫組織化学染色法及び免疫電顕法、並びに免疫アッセイＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫クロマト法、ウエスタンブロット法等などを利用して測定することができる。このように、サンプル中のＫＩＲ２ＤＳ１量とＫＩＲ２ＤＬ１量とを各々測定することで、ＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＬ１とのポピュレーションを正確に定量することができる。
【０１０５】  次に、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用せず、かつ、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用しないモノクローナル抗体について説明する。
【０１０６】  本発明によるモノクローナル抗体は、状況に応じて、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニストとして作用せず、かつ、ＫＩＲ２ＤＳ１のアンタゴニストとして作用しない、つまり、ＫＩＲ２ＤＳ１に対してシグナルを入れなくてもよい。この場合、この抗体を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等のフラグメントに処理することで、また、架橋処理することで、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するように変換してもよい。また、これとは逆に、ＫＩＲ２ＤＳ１のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する本発明による抗体に、前述同様の処理を施すことで、シグナルを入れない抗体に変換してもよい。
【０１０７】  また、このようなＫＩＲ２ＤＳ１に対してシグナルを入れない抗体を用いて、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質をスクリーニングすることができる。このスクリーニング方法は、  （Ａ）本発明によるモノクローナル抗体を細胞集団に投与する工程と、  （Ｂ）細胞集団の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ａを測定する工程と、  （Ｃ）候補物質を細胞集団に投与する工程と  （Ｄ）候補物質を細胞集団に投与した後の、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ｂを測定する工程と、  （Ｅ）度合Ａと度合Ｂとを比較する工程と、  を含む。
【０１０８】  前述の「細胞集団に投与する」とは、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ１及びＫＩＲ２ＤＬ１を発現している遺伝子導入動物（マウス、ラット、ウサギ等）に（本発明によるモノクローナル抗体又は候補物質を）投与することや、ＫＩＲ２ＤＳ１及びＫＩＲ２ＤＬ１を発現している培養細胞に（本発明によるモノクローナル抗体又は候補物質を）添加することを含む。また、前述の「候補物質」及び「物質」には、化合物、抗体、タンパク質、ペプチド等が含まれる。なお、ＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合は、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１細胞内モチーフのリン酸化を評価することで、測定することができる。リン酸化の評価は、例えば、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングによるＫＩＲ２ＤＬ１リン酸化を検出することで可能である。また、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１発現ＮＫ細胞の標的細胞に対する傷害活性測定によりＫＩＲ２ＤＬ１による活性抑制能を評価することも可能である。
【０１０９】  あらかじめ細胞集団に本発明によるモノクローナル抗体を投与しておくと、本発明によるモノクローナル抗体がＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合するため、ＫＩＲ２ＤＬ１に特異的に結合する物質をスクリーニングすることができる。なお、候補物質投与前のＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ａより、候補物質投与後のＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ｂが大きい場合は、該候補物質は、ＫＩＲ２ＤＬ１のアゴニストである。一方、候補物質投与前のＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ａより、候補物質投与後のＫＩＲ２ＤＬ１の活性の度合Ｂが小さい場合は、該候補物質は、ＫＩＲ２ＤＬ１のアンタゴニストである。
【実施例】
【０１１０】  以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１１１】（実施例１）  以下の通り、ＮＫ細胞活性化受容体のひとつであるＫＩＲ２ＤＳ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製した。【０１１２】（１．抗原タンパク質の調製）  抗原タンパク質として、大腸菌において組換え発現させたＫＩＲ２ＤＳ１を用いた。【０１１３】  改変したｐＧＭＴ７ベクターをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理し、ＫＩＲ２ＤＳ１細胞外領域（塩基配列：配列番号１９、アミノ酸配列：配列番号２０）を導入した。このＫＩＲ２ＤＳ１細胞外領域を含むプラスミドを、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）にトランスフォーメーションし、アンピシリン含有寒天培地上にコロニーを形成させた。１個のコロニーを採取し、アンピシリン含有培地中にて振とう培養し、対数増殖期にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加することにより、組換えタンパクの発現を誘導した。遠心することで大腸菌を集菌し、再懸濁バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁して超音波破砕し、その後、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）により洗浄した。グアニジン溶液（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）により可溶化させた後、巻き戻しバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩酸塩、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．７３ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）を徐々に加えて巻き戻しを行った。クロスフローろ過システム（ビバフロー  ＭＷ１０，０００）を用いて濃縮した後、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＭＷ１０，０００）により濃縮した。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡシステム）（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）を用いて精製し、タンパク液（抗原）を得た。このタンパク液とアジュバントコンプリートフロイント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とを、１：１で、超音波処理により混合し、抗原液とした。【０１１４】（２．ラットの免疫及び腸骨リンパ節細胞液の調製）  Ｗｉｓｔｅｒラット（８週齢、雌）（三協ラボサービス）を４匹用意した。ラットに１匹あたり抗原２５０μｇを免疫注射した。より具体的には、０．５ｍｇ／ｍＬのＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質の抗原液をラット１匹あたり５００μＬ、ラットの臀部に注射した。免疫２週間後に心採血を行うとともに、腸骨リンパ節を摘出した。摘出された腸骨リンパ節をディッシュ中のＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌ−グルタミン、フェノールレッド含有）（ＷＡＫＯ）に入れ、該培地中ですりつぶし、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液をチューブに移して３分間静置した後、上層を別のチューブに移して遠心した（１２００ｒｐｍ×５分間）。細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁し、さらに遠心した（１２００ｒｐｍ×５分間）後、細胞を２ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁し、腸骨リンパ節細胞液とした（合計で４×１０７個の腸骨リンパ節細胞を得た）。【０１１５】（３．細胞融合）  上記にて得られたＲＰＭＩ  １６４０培地中の腸骨リンパ節細胞４×１０７個と、２ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁されたマウスミエローマ細胞（Ｘ６３／Ａｇ８−６５３）４×１０６個と、を混合し、５０ｍＬチューブに移し、細胞混合液を遠心した（１５００ｒｐｍ×５分間）。ＲＰＭＩ培地  １６４０を除いた後、チューブ内の沈殿をよくほぐした。５０％ＰＥＧ溶液（ＰＥＧ１５００、ロシュディアグノスティック）１ｍＬを添加し、チューブを回転させて１分間混合させた。ＲＰＭＩ  １６４０培地２ｍＬとおだやかに懸濁させ、さらにＲＰＭＩ  １６４０培地８ｍＬとおだやかに懸濁させた。細胞混合液を遠心（１０００ｒｐｍ×１０分間）した後、細胞を５０ｍＬのＧＩＴ−ＨＡＴ培地（後述）に懸濁し、９６ウェルプレート５枚に１００μＬ／ウェルで播種した。３７℃で５日間培養し、５日後に、ウェルが８割位満たされる程度に各ウェルにＧＩＴ−ＨＡＴ培地を足した。培養開始１２日目に、１ウェルの中でシングルクローンと確認できたコロニーが出現していたのは、２３３ウェルであった。  なお、ＧＩＴ−ＨＡＴ培地（４００ｍＬ）の組成は以下の通りである。    ＧＩＴ培地（日本製薬）                ３３２ｍＬ    非働化済ＦＢＳ（ｆｉｎａｌ  １０％）  ４０ｍＬ    ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（ロシュディアグノスティック）（ｆｉｎａｌ  ５％）                                          ２０ｍＬ    ５０×ＨＡＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ８ｍＬ【０１１６】（４．１次スクリーニング）  前述の通り得られた培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法による１次スクリーニングを行った。【０１１７】  １次スクリーニングのＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質液の調製は以下の通り行った。ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌとして大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）を用いて、ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質抗原液及びＫＩＲ２ＤＬ１タンパク質抗原液を調製した。より具体的には、前述同様のｐＧＭＴ７ベクターにＫＩＲ２ＤＳ１細胞外領域（塩基配列：配列番号１９、アミノ酸配列：配列番号２０）又はＫＩＲ２ＤＬ１細胞外領域（塩基配列：配列番号２１、アミノ酸配列：配列番号２２）を導入したプラスミドを、大腸菌（Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３））にトランスフォーメーションし、アンピシリン含有寒天培地上にコロニーを形成させた。１個のコロニーを採取し、アンピシリン含有培地中にて振とう培養し、対数増殖期にイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加することにより、組換えタンパクの発現を誘導した。遠心することで大腸菌を集菌し、再懸濁バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁して超音波破砕し、その後、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）により洗浄した。グアニジン溶液（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）により可溶化させた後、巻き戻しバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩酸塩、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．７３ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６．７３ｍＭ  Ｃｙｓｔａ��ｉｎｅ）を徐々に加えて巻き戻しを行った。クロスフローろ過システム（ビバフロー  ＭＷ１０，０００）を用いて濃縮した後、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ＭＷ１０，０００）により濃縮した。その後、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡシステム）（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）を用いて精製し、タンパク液（ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ１）を得た。各抗原液のタンパク質濃度は、５０ｎｇ／５０μＬであった。【０１１８】  ＥＬＩＳＡを以下の通り行った。炭酸−炭酸塩バッファー（Ｎａ２ＣＯ３：ＮａＨＣＯ３＝１：１．８２５）で抗原タンパク質液を希釈し、マイクロタイタープレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に、１穴あたり抗原タンパク質５０ｎｇとなるよう分注し、室温で２時間静置した。その後、洗浄バッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−））で３回洗浄し、ブロッキング溶液（ブロックエース（雪印）を１×ＰＢＳ（−）で１／４希釈）を１５０μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、前述と同様に３回洗浄した。前述の通り得られた培養上清１００μＬを各ウェルに分注し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、前述と同様に３回洗浄し、２次抗体溶液（２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）で１／５０００希釈したもの）を各ウェルに５０μＬ分注し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、前述と同様に３回洗浄し、ＡＢＴＳ溶液（クエン酸バッファー５ｍＬ、ＡＢＴＳ（和光）１ｍｇ、過酸化水素水３．３μＬ）を各ウェルに１００μＬ添加し、室温で５−３０分間静置した後、吸光度（ＯＤ４１５ｎｍ）を測定した。なお、ＥＬＩＳＡにおいて、ポジティブコントロールとしてｒａｔ抗血清Ｎｏ．２（×５０００、×２０００）（５０μＬ）、ネガティブコントロールとしてＧＩＴ−ＨＡＴ培地（５０μＬ）を用いた。【０１１９】  １次スクリーニングの結果、ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質抗原に対する陽性クローン１６／２３３を得た。【０１２０】（５．２次スクリーニング）  １次スクリーニングで得られた１６の陽性クローンを用いて、ＥＬＩＳＡ法による２次スクリーニングを行った。【０１２１】  ２次スクリーニングのＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質液の調製は以下の通り行った。【０１２２】  ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質は、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌとして大腸菌株Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）を用いて、前述同様に発現させた。【０１２３】  ＫＩＲ２ＤＬ１タンパク質は、カイコを用いて発現させた。より具体的には、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｔｎ７部位特異的トランスポジションに使用できるベクター）にＫＩＲ２ＤＬ１細胞外領域（塩基配列：配列番号２１、アミノ酸配列：配列番号２２）を導入したプラスミドを、自作ＤＨ１０Ｂａｃ  ＢｍＮＰＶ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｖａｅ  ａｎｄ  ｐｕｐａｅ  ｏｆ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  ｂｙ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｃｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｓｈｉｍｏｊｉｍａ  Ｔ，Ｆｕｋａｇａｗａ  Ｔ，Ｍａｅｎ���ｋａ  Ｋ，Ｐａｒｋ  ＥＹ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５  Ｊａｎ  ２１；３２６（３）：５６４−９．で既報のＢｍＮＰＶのバクミドをＤＨ１０Ｂに導入したもの）にトランスポジションし、テトラサイクリン及びゲンタマイシン含有培地中で培養し、その後、寒天培地上に撒き、３７℃で培養した。コロニーを釣菌し、コロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液を以下の通り調製し、プライマーとして、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（５’−ｇｔｔｔｔｃｃｃａｇｔｃａｃｇａｃ−３’、配列番号２３）及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ−３’、配列番号２４）を用いた。  Ｇｏ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）  ４μＬ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー                      １μＬ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー                      １μＬ  Ｍｉｌｌｉ  Ｑ                                ２μＬ  ＰＣＲの条件は、９５℃５分間、９５℃３０秒間−５０℃３０秒間−７２℃３分３０秒間×２５サイクル、７２℃１０分間、４℃×∞であった。陽性のコロニーをカナマイシン及びゲンタマイシン含有培地に植え、３７℃で一晩培養した。培養した菌を集菌し、バクミドを、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。精製したバクミド１μｇ（Ｍｉｌｌｉ  Ｑ  ５０μＬ中）に、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３μＬを加え、５齢のカイコ（愛媛蚕種株式会社）に接種した。接種６日後、カイコを解剖して体液及び脂肪体を回収し、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＨｉｓ−ｔａｇタンパク質精製を行い、タンパク液（ＫＩＲ２ＤＬ１）を得た。抗原液のタンパク質濃度は、５０ｎｇ／５０μＬであった。【０１２４】  ＥＬＩＳＡは、１次スクリーニングと同様に行った。ただし、２次抗体としてａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（−）で１／３０００希釈したものを用い、ポジティブコントロールとしてｒａｔ抗血清Ｎｏ．２（×５０００、×２０００、×１０００）（５０μＬ）を用いた。【０１２５】  ２次スクリーニングの結果、ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質抗原に対する陽性クローン１１／１６を得た。【０１２６】（６．限界希釈）  前述の通り得られた陽性クローンをスケールアップし、限界希釈を繰り返して、単クローン化した。【０１２７】  限界希釈を以下の通り行った。細胞１個／１００μＬとなるように培養液を調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。３７℃で培養し、コロニーが形成されたら、シングルクローンのウェルについて、前述の２次スクリーニングと同様にＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行い、陽性クローンをスケールアップした。その後、前述同様の限界希釈を再度行い、ＫＩＲ２ＤＳ１タンパク質抗原に対する陽性クローン１１×２＝２２クローンをストックした。【０１２８】（７．抗体の精製）  前述の通り得られた２２クローンを各々精製した。【０１２９】  抗体の精製を以下の通り行った。培養していたハイブリドーマ（５０ｍＬ／７５ｃｍ２フラスコ）について、馴化を経た場合、培養液２０ｍＬをＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジ���ズ）３０ｍＬに加え、３７℃で細胞が増えるまで培養した後、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を集めて、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地４０ｍＬ中で培養した。一方、馴化を経ない場合、ハイブリドーマの培養液５０ｍＬを、１２００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を集め、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地１０ｍＬで洗い、再び遠心して細胞を集めて、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地４０ｍＬ中で培養した。培養上清をシリンジタイプのフィルター（０．４５μｍ）を用いて大きな粒子を除去した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（５００μＬ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーより精製を行った。【０１３０】（実施例２）  実施例１にて単クローン化したハイブリドーマ産生モノクローナル抗体（２２クローン）について、ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により、細胞外ドメインの相同性が高いＫＩＲファミリータンパク質ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合特異性を検証した。【０１３１】  ＥＬＩＳＡを前述同様に３回行った。ただし、１次抗体、２次抗体、検出系等については、以下の通りである。なお、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３のタンパク液（抗原）については、前述同様のｐＧＭＴ７ベクターにＫＩＲ２ＤＳ２細胞外領域（塩基配列：配列番号２５、アミノ酸配列：配列番号２６）、ＫＩＲ２ＤＬ２細胞外領域（塩基配列：配列番号２７、アミノ酸配列：配列番号２８）、又はＫＩＲ２ＤＬ３細胞外領域（塩基配列：配列番号２９、アミノ酸配列：配列番号３０）を導入したプラスミドを、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）にトランスフォーメーションし、前述同様に得た。【０１３２】（ＥＬＩＳＡ−１、ＥＬＩＳＡ−２）  抗原：５０ｎｇ／５０μＬ（／ｗｅｌｌ）  １次抗体：精製抗体（１／１００）５０μＬ／ｗｅｌｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ−１：ラット抗血清（×１０００、２０００、５０００）  ｃｏｎｔｒｏｌ：精製前抗体（２Ｂ７Ｃ２‐Ｂ３）（培養上清（ＧＩＴ）、精製時のＦｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ）  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ：０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  （抗体精製時にｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとして使用、中和済み）  ２次抗体：ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（×３０００）５０μＬ／ｗｅｌｌ  検出系：ＡＢＴＳ（４１５ｎｍ）【０１３３】（ＥＬＩＳＡ−３）  抗原：５０ｎｇ／５０μＬ（／ｗｅｌｌ）  １次抗体：精製抗体（原液）５０μＬ／ｗｅｌｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ−１：ラット抗血清（×１０００、２０００、５０００）  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ−２：精製抗体（１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１）（×１００）  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ：０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（抗体精製時にｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとして使用、中和済み）  ２次抗体：ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（×３０００）５０μＬ／ｗｅｌｌ  検出系：ＡＢＴＳ（４１５ｎｍ）【０１３４】  ＳＰＲを以下の通り行った。まず、ＫＩＲ２ＤＳ１及びＫＩＲ２ＤＬ１をＣ末端特異的にビオチン化し（Ｒｅａｃｔ���ｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  Ｄ−ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ  ＡＴＰ、１５μＭＢｉｒＡ）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）によりＫＩＲ２ＤＳ１及びＫＩＲ２ＤＬ１と、ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ内の残存ビオチンと、に各々分離した。ＳＰＲ測定には、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＫＩＲと作製した抗体の表面プラズモン共鳴実験を行った（測定条件：Ｂｉｏｔｉｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ  ＣＡＰ  ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨＢＳ−ＥＰｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨｅｐｅｓｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）、２５℃）。抗体はハイブリドーマ培養上清からプロテインＧカラムによって精製したものをＨＢＳ−ＥＰにｂｕｆｆｅｒ置換して（限外濾過により）使用した。チップはＣＡＰチップを使用し、Ｂｉｏｔｉｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ内のＳＡを固定化したチップ上にビオチン化ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ１とネガティブコントロールであるＢＳＡを固定化した。次に、ランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰに溶解した各抗体（３５μＬ）を２μＬ／分で流した。【０１３５】  結果を表３に示す。表３中、“○”は該当するＫＩＲファミリータンパク質と結合したことを表し、“×”は該当するＫＩＲファミリータンパク質と結合しなかったことを表す。結合特異性の評価を行った２２クローンのうち、１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４、３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０、３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６、５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３、及び５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４の８クローンについては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３には結合せず、ＫＩＲ２ＤＳ１のみに特異的に結合することが示された。【０１３６】
【表３】
2016031936.tif 000004
【０１３７】  これら８クローンのＥＬＩＳＡの結果を図１−２に、ＳＰＲの結果を図３−４に示す（図３−４中、実線：ＫＩＲ２ＤＳ１、点線：ＫＩＲ２ＤＬ１、灰色線：ＢＳＡ）。ＥＬＩＳＡの結果とＳＰＲの結果とは一致しており、これら８クローンは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３には結合せず、ＫＩＲ２ＤＳ１のみに特異的に結合することが示された。【０１３８】  なお、１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１、及び１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４を産生したハイブリドーマ（１Ｃ７＿ＫＩＲ２ＤＳ１）、３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０及び３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６を産生したハイブリドーマ（３Ｅ１１Ａ５＿ＫＩＲ２ＤＳ１）、並びに５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３及び５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４を産生したハイブリドーマ（５Ｂ１２Ｄ２＿ＫＩＲ２ＤＳ１）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１４年５月９日（寄託の日付）付けで受託され、その後、ブタペスト条約の下での国際寄託に移管され（２０１５年７月８日付けで移管請求を受領）、各々、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５３、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５５及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８５４が付与されている（２０１５年７月２９日付けで受託証発行）。【０１３９】（実施例３）  実施例２で得られたモノクローナル抗体８クローンのＶＬ、ＶＨのクローニングを行い、ＶＨ、ＶＬのＣＤＲ配列を決定した。【０１４０】  ハイブリドーマ（１Ｃ７＿ＫＩＲ２ＤＳ１、３Ｅ１１Ａ５＿ＫＩＲ２ＤＳ１及び５Ｂ１２Ｄ２＿ＫＩＲ２ＤＳ１）より、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１．１（タカラバイオ社）を用いてＲＴ反応を行い、ＰＣＲサンプルとした。ＰＣＲは、表４及び表５に示すプライマーｍｉｘｔｕｒｅを用いて行った。より具体的には、ＶＬに関しては、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー２６種（ＲａｔＶＬ−Ｆ０１〜２６、配列番号３１〜５６）、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー５種（ＲａｔＶＬ−Ｒ０１〜０５、配列番号５７〜６１）又は３種（ＲａｔＣＬ−Ｒ０１〜０３、配列番号６２〜６４）のプライマーｍｉｘｔｕｒｅを使用した（表４）。また、ＶＨに関しては、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー２４種（ＲａｔＶＨ−Ｆ０１〜２４、配列番号６５〜８８）、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー４種（ＲａｔＶＨ−Ｒ０１〜０４、配列番号８９〜９２）のプライマーｍｉｘｔｕｒｅを使用した（表５）。ＰＣＲ反応条件は、下記の通りである（ＰＣＲにおいて、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いた）。  テンプレート（１／１０希釈）              １．０μＬ    １０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ        ５．０μＬ    ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）        ４．０μＬ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー  ｍｉｘｔｕｒｅ  １．５μＬ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー  ｍｉｘｔｕｒｅ  １．０＋１．０μＬ                Ｅｘ  Ｔａｑ                ０．２５μＬ                水                        ３７．６５μＬ                                    計    ５０．０μＬ  ＰＣＲを、９５℃２分間、９５℃３０秒間−４５℃３０秒間−６８℃１分間×３５サイクル、６８℃１分間、４℃×∞で行った。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（プロメガ社）を用いてＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇを行った。ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲによってインサートを確認した後、ミニプレップによりプラスミドＤＮＡを抽出し、シークエンスに供した。【０１４１】
【表４】
2016031936.tif 000005
【０１４２】
【表５】
2016031936.tif 000006
【０１４３】  ＣＤＲ配列解析の結果を表６に示す。ＶＬのＣＤＲ１〜３の配列はいずれも一致していることが示された。一方、ＶＨについては、ＣＤＲ２の配列が一致していたが、ＣＤＲ１及び３の配列は表６の通りクローンによって異なっていた。ＣＤＲ配列解析の結果、１Ｃ７Ｂ８−Ｇ３、１Ｃ７Ｈ１２−Ｂ１、１Ｃ７Ｂ８−Ｅ１及び１Ｃ７Ｈ１２−Ｅ４は同一のクローンである可能性が高く、３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０及び３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６は同一のクローンである可能性が高く、５Ｂ１２Ｄ２−Ｂ３及び５Ｂ１２Ｄ２−Ａ４は同一のクローンである可能性が高いことが明らかとなった。【０１４４】  また、ＲＡＴ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ  ＫＩＴ（コスモバイオ）を用いて各抗体のアイソタイプを判定した結果、３Ｅ１１Ａ５−Ｅ１０及び３Ｅ１１Ａ５−Ｇ６はＩｇＧ２ａ／κであり、それ以外はＩｇＧ２ｂ／κであった。【０１４５】
【表６】
2016031936.tif 000007
【０１４６】  なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１４７】  本出願は、２０１４年８月２９日に出願された日本国特許出願２０１４−１７６０９４号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【図１】
2016031936.tif 000008
【図２】
2016031936.tif 000009
【図３】
2016031936.tif 000010
【図４】
2016031936.tif 000011
【配列表】
2016031936000001.app
【国際調査報告】
2016031936.tif 000012
2016031936.tif 000013
2016031936.tif 000014
2016031936.tif 000015