(57)【要約】gatZ遺伝子が欠失または不活性化された大腸菌を用いることによって、得られるNY-ESO-1タンパク質の量が低減されることなく大腸菌由来不純物の量が著しく低減されることを見出した。
2014163176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
gatZ遺伝子が欠失または不活性化されており、かつNY-ESO-1遺伝子を導入した大腸菌。
【請求項２】
請求項１記載の大腸菌からNY-ESO-1タンパク質を抽出する工程を含む、NY-ESO-1タンパク質の生産方法。
【請求項３】
gatZ遺伝子が欠失または不活性化されている、NY-ESO-1タンパク質生産用大腸菌宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NY-ESO-1タンパク質の生産に用いる組換え大腸菌、および当該菌株を用いてNY-ESO-1タンパク質を生産する方法に関する。本発明の組換え大腸菌は、NY-ESO-1タンパク質のような封入体を形成しやすい疎水性タンパク質の生産に有用である。
【背景技術】
【０００２】
異種生物に由来するタンパク質を生産する宿主としては、細菌（例えば大腸菌、枯草菌）などの原核生物細胞や、菌類（例えば糸状菌、酵母）、昆虫、および動植物の細胞などの真核生物細胞が知られている。中でも大腸菌などの細菌は、増殖速度が速いこと、安価な培地で大量に増殖できること、遺伝学的研究が進んでおり目的に応じた様々なベクターを利用できることなどの有利な点が多い。しかし、原核生物である細菌に真核生物由来のタンパク質を異種発現させた場合、発現させたタンパク質によっては菌体内で合成されても正しい立体構造をとることができず、不溶性かつ生理学的に不活性な状態で封入体（inclusion body）として菌体内に蓄積されることが問題となっている。【０００３】
この問題に対して、培養温度を低温にすることでタンパク質の折りたたみを緩やかに進行させる方法、目的タンパク質と分子シャペロンを共発現させることで異種タンパク質の正しい立体構造への折りたたみを促進させる方法、ストレス応答を誘導する薬剤を培地に添加することで分子シャペロンの発現を誘導する方法などが開発されている。しかし、目的タンパク質が疎水性タンパク質の場合、疎水性相互作用による凝集が起こりやすいため、上記の方法を用いてもなお封入体として発現されやすい。そのため、そのようなタンパク質を得る方法として、大腸菌破砕物から封入体を精製して可溶化する方法が用いられている。【０００４】
疎水性の高い有用タンパク質の例として、がん・精巣抗原であるNY-ESO-1タンパク質が知られている。NY-ESO-1タンパク質は、がんに特異的かつ広範囲に発現しかつ免疫誘導能が高く、がんワクチンとしての臨床効果が確認されている有用タンパク質であり、そのアミノ酸配列（配列番号４）はGenbankアクセッション番号CAA05908およびNCBI参照配列NP_001318として登録されている（非特許文献１も参照のこと）。しかし、NY-ESO-1タンパク質は疎水性が高いため、当該タンパク質を大腸菌から精製するためには、大腸菌破砕物からの封入体の精製および可溶化、ならびに３段階のクロマトグラフィー精製（アフィニティー、イオン交換、および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を必要とすることが知られている（非特許文献２〜４）。しかし、このような多くの工程を経てもなお不純物を多く含み、NY-ESO-1タンパク質を高純度で得ることは困難であった。【０００５】
これまでに、組換え生産が困難なタンパク質の生産方法を改良することを目的として、宿主細胞における目的タンパク質の生産性の向上、封入体形成の低減、目的タンパク質の細胞外への分泌向上などに主眼をおいた研究がなされてきた。しかし、宿主細胞における正常な発現が困難な細胞内タンパク質を高純度で得る技術については、開発がほとんど進展していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Int. J. Cancer 76 (6), 903-908 (1998)
【非特許文献２】Murphy R et al. Prep Biochem Biotechnol. 2005: 35(2) 119-134
【非特許文献３】Chen RH et al. Protein Expr Purif. 2009: 64(1) 76-81
【非特許文献４】Lowe AJ et al. Biotechnol Prog. 2011: 27(2) 435-441
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、NY-ESO-1タンパク質を高純度で生産する方法、および当該方法の実施のために有用な菌株系を提供することである。本発明は特に、高純度での大量生産が困難なNY-ESO-1タンパク質を、増殖速度やタンパク質産生量等に優れた大腸菌株を用いて生産する系であって、菌株破砕物からの精製物における不純物が少ない系を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、gatZ遺伝子が欠失または不活性化された大腸菌を用いることによって、菌体破砕物からの精製物における（NY-ESO-1タンパク質以外の）大腸菌由来不純物の量が著しく低減されることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、gatZ遺伝子が欠失または不活性化された大腸菌にNY-ESO-1タンパク質をコードする遺伝子を導入した場合、欠失または不活性化前と比較して、菌体破砕物からの精製物におけるNY-ESO-1タンパク質の量が低減されることなく、混入する大腸菌由来タンパク質の量が著しく低減されることを見出した。【０００９】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
〔１〕gatZ遺伝子が欠失または不活性化されており、かつNY-ESO-1遺伝子を導入した大腸菌。
〔２〕〔１〕の大腸菌からNY-ESO-1タンパク質を抽出する工程を含む、NY-ESO-1タンパク質の生産方法。
〔３〕gatZ遺伝子が欠失または不活性化されている、NY-ESO-1タンパク質生産用大腸菌宿主。【００１０】
本発明は、さらに、以下の発明に関する。
〔４〕NY-ESO-1タンパク質の生産において用いるための、gatZ遺伝子が欠失または不活性化されている大腸菌。
〔５〕大腸菌ゲノム中のgatZ遺伝子を欠失または不活性化させる工程、および該大腸菌にNY-ESO-1タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程によって得られる、大腸菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の組換え大腸菌を用いることにより、NY-ESO-1タンパク質を高純度で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）から得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物をSDS-PAGEにて分離した結果を示す写真である。図１Ａは分離したゲル中のタンパク質を染色した結果を示し、図１Ｂは抗NY-ESO-1抗体にてウェスタンブロットを行った結果を示す。
【図２】（Ａ）NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）および（Ｂ）NY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）から得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物をそれぞれ2次元電気泳動にて分離したゲル中のタンパク質を染色した写真である。
【図３】（Ａ）NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）および（Ｂ）NY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）から得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物をそれぞれ2次元電気泳動にて分離した結果を示す写真である。左側の写真は分離したゲル中のタンパク質を染色した結果を示し、右側の写真は抗NY-ESO-1抗体にてウェスタンブロットを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の組換え大腸菌は、gatZ遺伝子が欠失または不活性化されていることを特徴とし、NY-ESO-1タンパク質を高純度で生産するのに有用である。したがって本発明は、gatZ遺伝子が欠失または不活性化されている組換え大腸菌について、NY-ESO-1タンパク質生産用大腸菌宿主としての新規な用途を提供するものである。本明細書において、NY-ESO-1タンパク質を高純度で得るための組換え大腸菌とは、NY-ESO-1タンパク質精製物における不純物の量が低減されるよう改変された組換え大腸菌を意味する。
本明細書において、「高純度」とは、NY-ESO-1タンパク質精製物における、NY-ESO-1タンパク質以外の宿主由来タンパク質の濃度が、多くても50 ng/mg未満、好ましくは40 ng/mg未満、より好ましくは30 ng/mg未満、最も好ましくは20 ng/mg未満であることを意味する。宿主由来タンパク質の濃度を測定する方法（例えば免疫学的測定法）は当技術分野において公知であり、大腸菌由来タンパク質濃度を測定するためのE. coli Host Cell Protein ELISA Kit（シグナステクノロジーズ、商品コードF410）などの様々な免疫学的測定キットが市販されている。
【００１４】
（gatZ遺伝子）
大腸菌gatZ遺伝子は、タガトース-６-リン酸をリン酸化してタガトース-６-二リン酸を形成する酵素gatZ（別名：タガトース-６-リン酸キナーゼ）をコードする遺伝子である。大腸菌gatZ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）は、GenBankにアクセッション番号X79837で登録されており、Jeong H et al. Genome sequences of Escherichia coli B strain REL606 and BL21(DE3). J Mol Biol, 2009 (4):644-52にも記載されている。
したがって、本明細書において、「gatZ遺伝子」とは、配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質、または当該タンパク質と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質であって、タガトース-６-リン酸をリン酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。なお、タンパク質またはポリペプチドが有するリン酸化活性を評価する方法は当技術分野において公知であり、例えば、タガトース-６-リン酸のリン酸化に適した条件下でタガトース-６-リン酸をインキュベートし、タガトース-６-二リン酸の量を検出することによって、タガトース-６-リン酸をリン酸化する活性を決定することができる。
【００１５】
本明細書において、NY-ESO-1タンパク質生産用に大腸菌宿主から欠失または不活性化させる遺伝子（gatZ遺伝子）は、より具体的には、配列番号５に記載の配列からなるDNA、または、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。当業者であれば、遺伝子名に基づいて、公共のデータベース等から適宜、その最新の配列情報を知ることが可能である。
【００１６】
本明細書において、生物活性（NY-ESO-1に対する抗体の産生を誘導する免疫原性）が「同等のポリペプチド」とは、比較対象の生物活性と比較して、30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の生物活性を有するポリペプチドを意味する。
【００１７】
（gatZ遺伝子を欠失または不活性化する方法）
本発明は、gatZ遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、または、gatZ遺伝子の転写もしくは翻訳開始領域に変異を与える等の方法によってgatZ遺伝子を不活性化することができるが、好適には、gatZ遺伝子を物理的に欠失させることがより望ましい。gatZ遺伝子を欠失または不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、gatZ遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親菌株内に取り込ませ、gatZ遺伝子の一部の領域における相同組換えによって親大腸菌ゲノム上のgatZ遺伝子を分断して不活性化することが可能である。
【００１８】
（宿主大腸菌の種類）
本発明の組換え大腸菌を構築するための親菌株としては、目的タンパク質を組換え生産するのに利用可能な大腸菌宿主として多くの菌株が知られており、例えば、大腸菌C41株、C43株、BL21株、B834株、およびHMS174株、ならびにそれらのDE3溶原菌（Lucigen社、コスモバイオ社、フィルジェン社、フナコシなどで購入可能）が本発明の組換え大腸菌として利用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
（NY-ESO-1タンパク質）
本発明の組換え大腸菌を用いて生産させるタンパク質としては、通常の大腸菌宿主では高純度で生産することが困難な疎水性タンパク質であるNY-ESO-1タンパク質が好ましい。本発明の生産方法により生産される高純度のNY-ESO-1タンパク質精製物は、がんワクチンなどの医療用途において特に有用である。したがって、本発明の組換え大腸菌を用いて生産させるNY-ESO-1タンパク質は、全長アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を有するペプチド断片（例えば、８０アミノ酸以上）であってもよく、必要に応じて公知のタグペプチドを付加した融合タンパク質とすることもできる。なお、タンパク質またはポリペプチドの免疫原性を評価する方法は、当技術分野において公知である。
【００２０】
本明細書において、「NY-ESO-1タンパク質」とは、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質、もしくは当該タンパク質と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質、またはそれらと同等の免疫原性を有するペプチド断片を意味し、そのようなアミノ酸配列を有するがん・精巣抗原と表現することもできる。
【００２１】
あるいは、本明細書において、「NY-ESO-1タンパク質」とは、
（i）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ii）配列番号：４のアミノ酸配列に対して80％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫原性を有するポリペプチド；
（iii）数個（例えば、最大１０個）のアミノ酸が置換、欠失、または付加された配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫原性を有するポリペプチド；
（iv）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の免疫原性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリペプチド、またはそれらと同等の免疫原性を有するペプチド断片である。
【００２２】
本明細書において、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」とは、核酸混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件（すなわち、標的配列と特異的にハイブリダイズする条件）を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存するが、一般的に配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズし、適切なハイブリダイゼーション条件は当業者によって慣行的に選択され得る。
【００２３】
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％  ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、５０℃での洗浄。適切なハイブリダイゼーション条件には、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（GEヘルスケア）を使用する６８℃での３０分間またはそれ以上のプレハイブリダイゼーション、標識プローブの添加、および６８℃での１時間またはそれ以上の加温もまた含まれ得る。
【００２４】
洗浄段階は、例えば低ストリンジェンシー条件下で行うことができる。したがって、例示的な低ストリンジェンシー条件には、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、または好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが含まれる。また、例示的な高ストリンジェンシー条件には、例えば、室温における２×ＳＳＣ、０．０１％  ＳＤＳ中での２０分間の洗浄３回、その後の３７℃における１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での２０分間の洗浄３回、および５０℃における１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での２０分間の洗浄２回が含まれる。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
【００２５】
（大腸菌に導入する遺伝子の構成）
NY-ESO-1タンパク質をコードする遺伝子は、その上流において、当該遺伝子の転写や翻訳に関わる制御領域、すなわち、プロモーターおよび転写開始点を含む転写開始制御領域、ならびに/またはリボソーム結合部位および開始コドンを含む翻訳開始領域と機能的に連結されていることが望ましい。
【００２６】
（大腸菌への遺伝子導入）
NY-ESO-1タンパク質をコードする遺伝子の大腸菌への導入は、当該遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主大腸菌細胞に取り込ませることによって実施することができる。また、当該DNA断片に宿主大腸菌ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主大腸菌ゲノムに直接組み込むことによっても、本発明の組換え大腸菌を得ることができる。
【００２７】
（大腸菌の培養および回収）
本発明の組換え大腸菌を用いたNY-ESO-1タンパク質の生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の大腸菌培養法にて培養し、培養終了後、産生されたNY-ESO-1タンパク質を回収・精製することにより行えばよい。
【００２８】
本発明の生産方法において、生産するNY-ESO-1タンパク質は、好ましくは宿主細胞内に産生される。したがって、本発明の生産方法におけるNY-ESO-1タンパク質の回収は、NY-ESO-1タンパク質を産生する大腸菌を破砕または溶解し、当該破砕物または溶解物からNY-ESO-1タンパク質を回収する。
【００２９】
（封入体の精製）
NY-ESO-1タンパク質は疎水性が高いため、宿主細胞内で合成されると封入体に包含されやすい。そのため、NY-ESO-1タンパク質を精製するためには、宿主大腸菌の破砕物から封入体を精製し、それを可溶化することが好ましい。封入体の精製・溶解方法は当技術分野において公知であり、例えば遠心分離などにより回収した封入体を尿素などによって溶解することができる。
【００３０】
（組換えタンパク質の精製）
大腸菌破砕物または封入体可溶化物からNY-ESO-1タンパク質を精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が好適に用いられ得る。
【００３１】
（精製用カラムの好ましい態様）
クロマトグラフィーによりNY-ESO-1タンパク質を精製する場合、用いるカラムは当該精製において有用なものであれば特に限定されるものではなく、１種類または複数種類のカラムを用いることができる。
例えば、NY-ESO-1タンパク質が、当技術分野において組換えタンパク質の精製に汎用されているタグペプチドとの融合タンパク質として発現する場合、当該タグペプチドとの親和性を利用したアフィニティーカラムを用いることが好ましい。このようなタグペプチドとアフィニティーカラムとの組み合わせとしては、Hisタグ（６個程度の連続するヒスチジン(His)残基からなるタグペプチド）と金属イオン（ニッケルなど）固定化カラム、ビオチンタグとアビジン固定化カラム、およびGST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）タグとグルタチオン固定化カラムなどがよく知られており、本発明の生産方法において適宜用いることができる。
また、NY-ESO-1タンパク質は疎水性が高い領域を含有するため、疎水性相互作用を利用したカラムを用いることが好ましい。このようなカラムとしては、フェニルセファロースやブチルセファロースなどの樹脂を用いたカラムが利用可能である。
【００３２】
以下に、好適な例として、gatZ遺伝子を欠失させた組換え大腸菌株の構築および当該菌株を用いたNY-ESO-1タンパク質の生産方法の実施例を記載するが、これらは特許請求の範囲によって特定される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３３】
実施例１：NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）の作製
pET9aベクター（Novagen、カタログ# 69431-3）のリプレッサー結合部位及びlacI遺伝子を欠失させたpET-9a24aベクターに、配列番号１で示すHis-NY-ESO-1タンパク質を発現するcDNAを組み込んで、His-NY-ESO-1発現ベクターを作製した。この発現ベクターおよびpRAREベクター（Novagen）を大腸菌コンピテントセルC41(DE3)（コスモバイオ株式会社、カタログ#60341）に導入し、His-NY-ESO-1タンパク質を発現する大腸菌株His-NY-ESO-1/C41(DE3)を作製した。得られた菌株をLB培地で培養した後、菌体を集めて培地を抗生物質不含LB培地に交換し、終濃度が40%になるようにグリセロールを添加してマスターセルバンク（Master Cell Bank：MCB）とした。【００３４】
実施例２：NY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）の作製
１．gatZ遺伝子欠失型大腸菌の作製
Red/ET相同組換え法（特許第4139561号）を用いてgatZ遺伝子欠失型大腸菌C41(DE3)ΔgatZを作製した。具体的には、C41(DE3)大腸菌株に対して、配列番号２に示すgatZ領域を、配列番号３に示す遺伝子配列に置換することにより、gatZ遺伝子を欠失した大腸菌株C41(DE3)ΔgatZを作製した。【００３５】
２．His-NY-ESO-1遺伝子の導入
作製したC41(DE3)ΔgatZに、実施例１で作製したHis-NY-ESO-1タンパク質のcDNAを含む発現ベクターを導入し、NY-ESO-1産生・gatZ欠失型大腸菌His-NY-ESO-1/C41(DE3)ΔgatZを作製した。【００３６】
実施例３：NY-ESO-1タンパク質の生産・精製
１．培養
実施例１及び２で作製したNY-ESO-1産生大腸菌株のMCB溶液0.1mLをLB培地100mLに添加し、37℃、250rpmで約12時間前培養を行い、LB培地12Lに対して前培養液を60mL添加して37℃、250rpmで培養を行った。OD600が約50になったところでIPTGを終濃度0.5mMになるよう添加してタンパク質の発現を誘導し、誘導開始から約12時間後に培養を終了した。【００３７】
２．抽出
以下の抽出操作は20℃以下で行う。回収した培養液を遠心操作（約15,000g、30分）にかけ、沈殿させた菌体を200mLのホモジネートバッファー（50 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM MgSO4, 5 mM DTT, pH 8.0）に懸濁した後、5Lのホモジネートバッファーを添加して再度懸濁した。高圧ホモジナイザーを用いて約1,000 Bar にて菌体を破砕してホモジネート液を調製した。ホモジネート液を遠心操作（約15,000g、30分）にかけてNY-ESO-1タンパク質を含む封入体を沈殿させた。遠心操作の後、上清を除き、沈殿を5Lの洗浄バッファー1（50 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 8.0）に懸濁した。懸濁液を再度遠心操作（約15,000g、30分）にかけ、得られた沈殿物を5Lのホモジネートバッファー2 (100 mM リン酸ナトリウム, 0.5 M NaCl, 5 mM DTT, pH 7.5)に懸濁した。懸濁液を再度遠心操作（約15,000g、30分）にかけ、得られた沈殿物を10Lの可溶化バッファー（100 mM リン酸ナトリウム, 7.5 M 尿素, 5 mM DTT, pH 7.5）に懸濁し、約4時間放置して可溶化処理を行った。その後、可溶化液をオプティキャップ（Opticap） XLT20 ミリガード（Milligard） 1.2/0.5 μm（Millipore）で前ろ過を行った後、MaxiCapフィルター, 0.45 / 0.2 μm（Sartorius）でろ過し、His-NY-ESO-1タンパク質抽出液を得た。得られた抽出液は冷蔵にて保管した。【００３８】
３．精製
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
得られた抽出液は、まずNickel Sepharose 6FF樹脂（GEヘルスケア）を用いて精製した。カラムをIMAC平衡化バッファー (100 mM リン酸ナトリウム, 7.5 M 尿素, 5 mM DTT, pH 7.5) で平衡化した後、抽出液を添加し、75mMのイミダゾールを含むIMAC平衡化バッファーで洗浄した後、イミダゾール濃度を75mMから500mMまで漸増してHis-NY-ESO-1タンパク質を溶出させた。溶出液はSartocon（登録商標）PESU Cassette (Sartorius) を用いて濃縮した後、AEC平衡化バッファー(20 mM リン酸塩, 7.5 M 尿素, 5 mM DTT, pH 7.5) に置換した。【００３９】
（２）イオン交換クロマトグラフィーによる精製
次に、Q Sepharose XL樹脂（GEヘルスケア）を用いて精製した。カラムをAEC平衡化バッファー (20 mM リン酸塩, 7.5 M 尿素, 5 mM DTT, pH 7.5) で平衡化した後、前記アフィニティーカラムの溶出液を添加し、AEC平衡化バッファーで洗浄して、His-NY-ESO-1タンパク質を含むフロースルーを回収した。【００４０】
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製）
続いて、Phenyl Sepharose HP樹脂（GEヘルスケア）を用いて精製を行った。カラムをHIC平衡化バッファー（100 mM リン酸ナトリウム, 7.5 M 尿素, 1 M 硫酸アンモニウム, 5 mM DTT, pH 7.5）で平衡化した後、前記イオン交換カラムで回収したフロースルー液に等量のHIC調整バッファー（180 mM リン酸ナトリウム, 7.5 M 尿素, 2 M 硫酸アンモニウム, 5 mM DTT, pH 7.5）を添加した溶液を添加し、HIC平衡化バッファーで洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度を0.9Mから0.1Mまで漸減してHis-NY-ESO-1タンパク質を溶出させた。溶出液はSartocon（登録商標）PESU Cassette (Sartorius) を用いて濃縮した後、最終バッファー(100 mM リン酸ナトリウム, 145 mM 塩化ナトリウム, 4 M 尿素, 50 mM グリシン, pH 6.5) に置換し、His-NY-ESO-1タンパク質精製物とした。【００４１】
実施例４：SDS-PAGE（図１Ａ）
NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）について実施例３で得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物を4-12％のプレキャストグラジェントゲル（Invitrogen）でのSDS-PAGEに供した。その後、ゲルをSYPRO（登録商標）Ruby Protein Stain（Molecular Probes）で染色してシグナルを可視化した。その結果、NY-ESO-1モノマーやgatZに相当するバンドをはじめとして様々な分子量のバンドが検出された。【００４２】
実施例５：SDS-PAGE、ウェスタンブロット（図１Ｂ）
実施例４と同様にSDS-PAGEを行った後、ゲルを転写用緩衝液（Invitrogen）に浸漬し、ブロッティング装置を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を水に浸漬した後、1次抗体として抗NY-ESO-1モノクローナル抗体（クローンE978）（Santa Cruz）、2次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体（GEヘルスケア）と反応させ、ウェスタンブロット検出試薬（GEヘルスケア）を用いてシグナルを可視化した。【００４３】
実施例６：2次元電気泳動（図２）
NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）およびNY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）について実施例３で得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物を、Immobiline DryStrip（GEヘルスサイエンス）を用いた一次元目の電気泳動に供した。次いで、7.5％のSDS-PAGEゲルを用いて２次元目の電気泳動を行った。その後、ゲルをSYPRO（登録商標）Ruby Protein Stain（Molecular Probes）で染色してシグナルを可視化した（図２）。その結果、従来型の菌株から得られた精製サンプルでは観察された大腸菌由来タンパク質が、gatZ欠失型の菌株から得られた精製サンプルでは、ほとんど観察されなかった。さらに、従来型の菌株から得られた精製サンプルに含まれていた大腸菌由来のタンパク質のシグナルのいくつかが明らかに消失していることが確認された。【００４４】
実施例７：宿主由来不純物の測定
NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）およびNY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）について実施例３で得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物における宿主タンパク質の濃度を、E. coli Host Cell Protein ELISA Kit（シグナステクノロジーズ、商品コードF410）を用いて測定した。その結果、宿主由来の残存タンパク質の濃度が、野生型では50.5 ng/mgであったのに対し、gatZ欠失型では18.7 ng/mgであった。【００４５】
実施例８：2次元電気泳動および抗NY-ESO-1抗体を用いたウェスタンブロット（図３）
NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）およびNY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）について実施例3で得られたHis-NY-ESO-1タンパク質精製物を使用し、IPG ReadyStrip ゲル (17 cm, pH3-10NL, BIO-RAD) を用いて一次元目の泳動 (等電点電気泳動) を行った。IPG ゲルを平衡化した後、10/16% グラジエントゲル (19 × 17 cm) にセットし、二次元目の泳動 (SDS-PAGE) を行った。得られたゲルについて、SYPRO Ruby Protein Stain（Molecular Probes）で染色するか、もしくはゲル1枚あたり400mAで2時間の条件でPVDF膜へのブロッティングを実施した。転写後のPVDF膜に対し、抗NY-ESO-1抗体（クローンE978，Santa Cruz Biotechnology, Inc.）とWesternBreeze kit（Invitrogen）を用いてNY-ESO-1タンパク質の検出を行った。NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型，図3A）およびNY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型，図3B）の双方で抗NY-ESO-1抗体に反応性のスポットが認められ（点線のボックス内）、これらはHis-NY-ESO-1であると考えられた。抗NY-ESO-1抗体には反応しないが、SYPRO Ruby染色で検出できるスポットも認められ、これらは宿主由来不純物と考えられた。宿主由来不純物のスポットは、NY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）に比べてNY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）で大幅に減少している傾向が確認された。また、抗NY-ESO-1抗体反応性スポットがNY-ESO-1産生大腸菌株（従来型）ではpH5.5〜pH10の広い範囲で認められるのに対し、NY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）ではpH7〜pH10の狭い範囲で認められ、NY-ESO-1産生大腸菌株（gatZ欠失型）ではHis-NY-ESO-1の分子種としての純度も向上している可能性も示唆された。【００４６】
以上の結果より、NY-ESO-1タンパク質を発現させる大腸菌株においてgatZを欠失させることにより、得られるNY-ESO-1タンパク質精製物に含まれる宿主由来不純物の量が大幅に低減されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、組換え生産が困難な疎水性タンパク質であるNY-ESO-1を高純度で生産する方法および当該方法にとって有用な組換え大腸菌が提供された。このような生産方法および組換え大腸菌によって生産されるNY-ESO-1タンパク質は、高純度での生産が望ましい医療用などの用途において特に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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