(57)【要約】  癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制でき、様々なＲＴＫの活性を単一の化合物で一網打尽に阻害できる化合物のスクリーニング方法を提供する。  癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、前記スクリーニング方法が、Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
2016063637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系が、
Ｃａｖｉｎ−１の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記Ｃａｖｉｎ−１の機能の抑制を検出できる系が、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１との結合の抑制を検出できる系、又はＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系が、
ＣＡＶ１の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ＣＡＶ１の機能の抑制を検出できる系が、ＲＯＲ１とＣＡＶ１との結合の抑制を検出できる系、又はＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項８】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項１０】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター、
ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合を抑制する化合物及び／又はＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
【請求項１２】
ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び／又は８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター。
【請求項１３】
被検体から癌細胞を取得する工程、
前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、ＲＯＲ１とＣＡＶ１、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１、ＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１、又はＣＡＶ１から選択される少なくとも１種以上の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、経済的に良く発展した国々における癌による死亡の主たる原因であり、その中でも肺腺癌は最も頻度の高い組織学的サブタイプである。【０００３】
本発明者らは、肺における分岐形態形成及び生理学的機能に必要な系譜特異的転写因子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）であるＴＴＦ−１（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１）の持続的な発現と、肺腺癌とは密接に結びついていることを先に報告している(非特許文献１参照)。また、他の３グループも同様の結論、例えば、肺腺癌における局所的なゲノム異常のゲノム規模での探索を通して、ＴＴＦ−１は系譜生存的癌遺伝子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）であるということに至っている（非特許文献２〜４参照）。ＴＴＦ−１がサーファクタントタンパク質の産生、並びに正常な成人の肺における生理学的機能に欠かせないことから、ＴＴＦ−１の系譜特異的生存シグナルに関与する下流分子の同定が、新たな治療方法の開発に必要である。【０００４】
本発明者らは、このような下流分子の同定を試みた結果、ＴＴＦ−１により発現が誘導される遺伝子として、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）遺伝子を同定することに成功している。そして、このＲＯＲ１遺伝子の発現を抑制することにより、特定の癌細胞の増殖が阻害できることを明らかにしている（特許文献１）。【０００５】
更に、本発明者らは、ＲＯＲ１が癌細胞の増殖を抑制する機序のさらなる解明をしたところ、ＲＯＲ１を標的として、癌細胞のアポトーシスの誘導のみならず、ＥＧＦＲやＭＥＴなどの受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ、以下、受容体型チロシンキナーゼのことを「ＲＴＫ」と記載することがある。）が伝達する癌細胞の生存促進性シグナルの抑制が可能であり、ＲＯＲ１が、癌細胞の増殖抑制剤の開発の重要な標的となりうることを明らかにしている（特許文献２参照、非特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／００８０６９号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０９０９３９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｎａｋａ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，  ｐ６００７〜６０１１
【非特許文献２】Ｋｅｎｄａｌｌ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００７，  Ｖｏｌ．１０４，  ｐ１６６６３〜１６６６８
【非特許文献３】Ｗｅｉｒ，ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００７，  Ｖｏｌ．４５０，  ｐ８９３〜８９８
【非特許文献４】Ｋｗｅｉ，ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，  Ｖｏｌ．２７，  ｐ３６３５〜３６４０
【非特許文献５】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１２，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ３４８〜３６１
【非特許文献６】Ｐａｒｔｏｎ．ＲＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１３，  Ｖｏｌ．１４，  ｐ９８〜１１２
【非特許文献７】Ｓｕｎａｇａ．Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ２００４，Ｖｏｌ．６４，  ｐ４２７７〜４２８５
【非特許文献８】Ｌｉｕ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００８，  Ｖｏｌ．２８３，ｐ４３１４〜４３２２
【非特許文献９】Ｌｉｕ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ，  ２００８，  Ｖｏｌ．８，  ｐ３１０〜３１７
【非特許文献１０】Ｈｉｌｌ．ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２００８，  Ｖｏｌ．１３２，  ｐ１１３〜１２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、上記特許文献２等に記載されているように、これまでの開発されてきた多くの分子標的薬は、キナーゼ活性の阻害剤である。前記キナーゼ活性の阻害剤とは、肺癌を始めとするヒトがんの増殖・生存に関わるＲＴＫの活性化を抑制する化合物の事である。しかしながら、キナーゼ活性の阻害剤を患者に投与すると、治療中にキナーゼ遺伝子に耐性を付与する変異が生じたり、癌細胞の生存シグナルを他のレセプターに依存するバイパス経路が生じることで、癌細胞が当該キナーゼ活性の阻害剤に対して耐性を獲得するという問題がある。【０００９】
また、上記特許文献２に記載されているＥＧＦＲ、ＭＥＴ等、癌細胞の一つのレセプターを分子標的とした場合、他のレセプターからのシグナルが遮断できず十分な効果が得られないことがあり、各々のレセプターを標的とする阻害剤の併用が試みられている。しかしながら、複数の阻害剤を併用したとしても、更にバイパス経路が生じたり、複数の阻害剤投与による副作用が拡大する恐れがあるという問題がある。【００１０】
以上のことから、正常細胞や癌細胞は様々な生存シグナルを駆使し自身が生き延びることを可能としているが、これらの生存シグナルは細胞膜に存在する多くのＲＴＫを介して伝わる。これまでの研究から、癌細胞では個々のＲＴＫをターゲットとした分子標的薬（ＥＧＦＲを対象としたイレッサなど）が開発され、上記のように複数のＲＴＫに対する阻害剤の併用が試みられているが、更に異なるＲＴＫを介したバイパス経路の出現やこれらのＲＴＫは正常細胞でも生存シグナルを伝える重要な役割を担っているため、副作用が非常に大きな問題となっており、総じて癌患者の著しい生存率の向上に貢献していない。これらの背景に基づいて、癌細胞の個々のＲＴＫをターゲットとするのではなく、様々なＲＴＫの活性を抑制することができ、且つ、正常な細胞には影響を与えないような癌細胞特異的な単一の化合物が求められている。しかしながら、これまでに癌細胞特異的に多くのＲＴＫの活性を抑制するような分子や阻害剤は存在しておらず、またこれらを克服するために、癌細胞のどのような制御機構に着目すればよいのか現状では明らかではない。【００１１】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）癌細胞に特有のタンパク質であるＲＯＲ１に着目し、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、又はＲＯＲ１とＣａｖｅｏｌｉｎ１（以下、「ＣＡＶ１」と記載することがある。）の結合を抑制することで、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１の結合が抑制され、その結果、ＣＡＶ１の安定性が抑制されることで癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制できること、（２）上記（１）により癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制できることが明らかとなったことから、例えば、カベオラの形成に影響を与えるＣａｖｉｎ−１等を標的にする化合物をスクリーニングすることで、癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制でき、その結果、様々なＲＴＫの活性を単一の化合物で一網打尽に阻害できる可能性が有ること、を新たに見出した。【００１２】
また、本発明者らは、Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１に結合するＲＯＲ１の結合部位を特定した。そして、当該結合部位のＤＮＡを含むベクター及びＣａｖｉｎ−１及び／又はＣＡＶ１のＤＮＡを含むベクターを用いて結合部位とＣａｖｉｎ−１及び／又はＣＡＶ１が発現している形質転換体を作製し、当該形質転換体を用いたスクリーニングキットを作製することで、上記（２）の化合物のスクリーニングを簡単にできることを新たに見出した。更に、本発明者らは、癌細胞のカベオラの安定化にはＲＯＲ１、ＩＧＦ−ＩＲの発現が重要な役割を果たしていることから、ＲＯＲ１、ＩＧＦ−ＩＲ、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現の組み合わせを調べることで、上記スクリーニングにより得られた分子標的薬の適応患者を選択できることを新たに見出した。【００１３】
すなわち、本発明の目的は、癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下に示す、細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法に関する。【００１５】
（１）癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニング方法が、
Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系に試験化合物を接触させる工程、
Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合を抑制する活性を有する化合物を選択する工程、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
（２）前記Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系が、
Ｃａｖｉｎ−１の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記Ｃａｖｉｎ−１の機能の抑制を検出できる系が、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１との結合の抑制を検出できる系、又はＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合の抑制を検出できる系が、
ＣＡＶ１の機能の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（５）前記ＣＡＶ１の機能の抑制を検出できる系が、ＲＯＲ１とＣＡＶ１との結合の抑制を検出できる系、又はＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１との結合の抑制を検出できる系であることを特徴とする上記（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
（７）上記（６）に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（８）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
（９）上記（８）に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（１０）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター、
ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、及び、
ヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクター、
を導入した形質転換体。
（１１）上記（１０）に記載の形質転換体を含む、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合を抑制する化合物及び／又はＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合を抑制する化合物のスクリーニングキット。
（１２）ヒトＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸及び／又は８５３〜８７６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸、を少なくとも挿入した組み換えベクター。
（１３）被検体から癌細胞を取得する工程、
前記癌細胞中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、ＲＯＲ１とＣＡＶ１、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１、ＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１、又はＣＡＶ１から選択される少なくとも１種以上の発現を測定する工程、
を含むことを特徴とする分子標的薬の適応患者の選択方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、通常の細胞には影響を与えず、癌細胞を特異的に抑制する化合物を発見できる可能性が有る。
また、Ｃａｖｉｎ−１及び／又はＣＡＶ１に結合するＲＯＲ１の結合部位のＤＮＡを含むベクター、並びにＣａｖｉｎ−１及び／又はＣＡＶ１のＤＮＡを含むベクターを用い、結合部位並びにＣａｖｉｎ−１及び／又はＣＡＶ１が発現している形質転換体を作製し、当該形質転換体を用いたスクリーニングキットを作製することで、癌細胞のカベオラ形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニングを簡単に行うことができる。
更に、カベオラの安定化にはＲＯＲ１の発現が重要な役割を果たしていることから、ＲＯＲ１、ＩＧＦ−ＩＲ、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現の組み合わせを調べることで上記スクリーニングにより得られた分子標的薬の適応患者を事前に選択することができるので、コンパニオン診断薬を処方することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、図面代用写真で、図１（１）は肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５、図１（２）は肺腺癌細胞株としてＰＣ−９を用いた際に、ＲＯＲ１の発現抑制が様々なＲＴＫのリン酸化反応（活性化）を低下させることを示している。
【図２】図２（１）は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際のＲＯＲ１の発現抑制によるＣＡＶ１の発現低下を示すウェスタンブロッティング写真である。図２（２）は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＰＣ−９を用いた際のＲＯＲ１の発現抑制によるＣＡＶ１の発現低下を示すウェスタンブロッティング写真である。図２（３）は、図面代用写真で、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を用いたＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞膜上の電子顕微鏡解析写真である。図２（４）は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＯＲ１で処理をしたＮＣＩ−Ｈ１９７５で認められた正常なカベオラの数を、ランダムな細胞膜上の領域で測定を行った結果を示すグラフである。
【図３】図３は、図面代用写真で、ＲＯＲ１のキナーゼ活性はＲＯＲ１の発現抑制によるＣＡＶ１の発現低下に必要でないことを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図４】図４（１）及び（２）は、図面代用写真で、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＳＫ−ＬＵ−１において、内因性のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１とは結合するが、ＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−２とは結合しないことを示すウェスタンブロッティング写真である。図４（３）及び（４）は、図面代用写真で、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＳＫ−ＬＵ−１において、内因性のＲＯＲ１とＣＡＶ１についても結合することを示すウェスタンブロッティング写真である。図４（５）は、図面代用写真で、ＲＯＲ１の発現抑制は、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションの後、２４時間後にはすでにＲＯＲ１の発現が低下するのに対して、ＣＡＶ１の発現低下は４８時間後に見られることを示すウェスタンブロッティング写真である。図４（６）は、図面代用写真で、ＲＯＲ１の発現抑制は内因性のＣＡＶ１とＣａｖｉｎ−１との結合を減少させることを示すＩＰ−ＷＢ写真である。
【図５】図５（１）〜（４）は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５においてＲＯＲ１の発現抑制が、様々なリガンド刺激による各々のＲＴＫのリン酸化反応（活性化）を低下させることを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図６】図６（１）及び（２）は、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＰＣ−９及びＮＣＩ−Ｈ１９７５において、Ｃａｖｉｎ−１の発現抑制は細胞増殖を阻害することを比色法によって示したグラフである。なお、これまでの報告通り、ＲＯＲ１の発現抑制は細胞増殖を阻害すること（特許文献１及び非特許文献５）やＣＡＶ１の発現抑制もまた細胞増殖を阻害すること（非特許文献７）についても確認している。
【図７】図７（１）及び（２）は、図面代用写真で、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＮＣＩ−Ｈ３５８において、ＩＧＦ−ＩＲの発現抑制により、ＣＡＶ１の発現低下が認められたことを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図８】図８は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５において、内因性のＣａｖｉｎ−１とＩＧＦ−ＩＲは結合することを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図９】図９（１）は、ＲＯＲ１のキナーゼドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。図９（２）は、図面代用写真で、Ｃａｖｉｎ−１がＲＯＲ１のキナーゼドメイン内で結合していることを示すＩＰ−ＷＢ分析の写真である。図９（３）は、図面代用写真で、ＲＯＲ１の細胞内領域とＣａｖｉｎ−１との結合が細胞内において検出できることを示した細胞染色法を用いて分析した結果を示す写真である。図９（４）は、図面代用写真で、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン内の一部の領域（５６４アミノ酸から７４６アミノ酸の領域）とＣａｖｉｎ−１との結合が細胞内において検出できることを示した細胞染色法を用いて分析した結果を示す写真である。
【図１０】図１０（１）は、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン、ＳＴドメイン、Ｐｒｏドメインのそれぞれの欠損変異体の模式図を示している。図１０（２）は、図面代用写真で、ＣＡＶ１がＲＯＲ１の細胞内領域のＣ末側に位置するセリン・スレオニンドメインで結合していることを示すＩＰ−ＷＢ分析の写真である。
【図１１】図１１は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株であるＰＣ−９において、ｃａｖｉｎ−１が結合するＲＯＲ１の結合領域（ＴＫ２＋ＴＫ３；５６４〜７４６アミノ酸）を欠損させた変異体に、ｓｉＲＯＲ１の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行ったところ、ＣＡＶ１の発現が低下することを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図１２】図１２は、図面代用写真で、肺腺癌細胞株であるＰＣ−９において、ＣＡＶ１が結合するＲＯＲ１の結合領域（Ｓ／Ｔ２；８５３〜８７６アミノ酸）を欠損させた変異体に、ｓｉＲＯＲ１の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行ったところ、ＣＡＶ１の発現が低下することを示すウェスタンブロッティング写真である。
【図１３】図１３（１）下図は、外陰部扁平上皮癌細胞株としてＡ４３１を用いた際のＩＧＦ−ＩおよびＧｅｆｉｔｉｎｉｂ存在下でのＲＯＲ１の発現抑制による細胞増殖の低下を示すＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフである。図１３（１）上図は、図面代用写真で、生存シグナルに関与するＡＫＴとＩＧＦ−ＩＲのリン酸化の低下を示すウェスタンブロッティング写真である。図１３（２）下図は、肺腺癌細胞株としてＰＣ−９を用いた際のＨＧＦおよびＧｅｆｉｔｉｎｉｂ存在下でのＲＯＲ１の発現抑制による細胞増殖の低下を示すＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフである。図１３（２）上図は、図面代用写真で、生存シグナルに関与するＡＫＴとＭＥＴのリン酸化の低下を示すウェスタンブロッティング写真である。図１３（３）下図は、肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際のＨＧＦおよびＣＬ−３８７，７８５存在下でのＲＯＲ１の発現抑制による細胞増殖の低下を示すＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフである。図１３（３）上図は、図面代用写真で、生存シグナルに関与するＡＫＴとＭＥＴのリン酸化の低下を示すウェスタンブロッティング写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法、スクリーニングキット、該キットに用いるベクター及び形質転換体、並びに分子標的薬の適応患者の選択方法について詳しく説明する。
【００１９】
先ず、本発明における「癌細胞のカベオラ」とは、癌細胞の上皮細胞と内皮細胞膜表面にある窪みを持った構造を意味している。カベオラには、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩＲ）など各種の増殖因子が結合することで細胞内にシグナルを伝達するＲＴＫが集積しており、癌細胞へのシグナル伝達、脂質の取り込みや体内に侵入した細菌などの排除として機能している。本発明においては、カベオラに集積している個々のＲＴＫの活性を抑制するのではなく、カベオラの形成自体を抑制することで、結果として各種ＲＴＫの活性を一網打尽に抑制できる化合物をスクリーニングすることを特徴としている。
【００２０】
本発明における「癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物」とは、通常細胞のカベオラの形成には影響を与えず、癌細胞のカベオラの形成のみを特異的に抑制できる化合物を意味する。
【００２１】
カベオラの形成には、ＣＡＶ１が寄与することが知られている（非特許文献６参照）。また、ＣＡＶ１の発現抑制（ｓｉＣＡＶ１）によって、ＣＡＶ１の機能、およびカベオラの形成を抑制できることは既に知られている（非特許文献７）。しかしながら、単にＣＡＶ１の機能を抑制するのみでは、通常細胞のカベオラの形成も抑制してしまう恐れがあるが、癌細胞のＣＡＶ１の機能のみを特異的に抑制する因子は知られていなかった。
【００２２】
本発明においては、癌細胞に特異的なタンパク質であるＲＯＲ１に着目することで、通常細胞のカベオラの形成には影響を与えず、癌細胞のカベオラの形成のみを特異的に抑制できることを新たに見出している。具体的には、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合、又は、ＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合を抑制することで、ＣＡＶ１を安定化するために必要なＣａｖｉｎ−１とＣＡＶ１の結合が抑制され、その結果、カベオラの形成に重要な役割を果たすＣＡＶ１の機能が抑制される。そして、ＣＡＶ１の機能が抑制されると、カベオラの形成も抑制されることから、癌細胞のカベオラの形成のみを特異的に抑制することができる。
【００２３】
なお、本発明では、癌細胞特有のタンパク質であるＲＯＲ１に着目することで、癌細胞のカベオラの形成のみを特異的に抑制できることを初めて見出している。したがって、本発明の「癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制」とは、最終的に癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制できればよく、化合物のターゲット因子はＲＯＲ１に限定されない。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ等、ＲＯＲ１以外の因子によるＣａｖｉｎ−１又はＣＡＶ１の機能の抑制、或いは、Ｃａｖｉｎ−１又はＣＡＶ１の機能の直接的な抑制等、最終的に癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制できれば特に制限はない。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法のターゲットとなる化合物は、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。また、「抑制」とは、完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することをも含むことを意味する。例えば、「Ｃａｖｉｎ−１の機能を抑制」には、Ｃａｖｉｎ−１の活性の抑制および発現の抑制の双方が含まれる。
【００２５】
ヒトＲＯＲ１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４９１９の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０１２に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００３に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２６】
Ｃａｖｅｏｌｉｎ（ＣＡＶ）は、カベオラを形成する主要タンパク質として知られており、ＣＡＶ１〜３が知られている。ＣＡＶファミリーの中で、ＣＡＶ１は、ＣＡＶ２やＣＡＶ３よりもカベオラの形成に関わる最も重要な分子として知られている。（非特許文献６参照）。また、ヒトＣＡＶ１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５７の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１７５３に記載のｃＤＮＡ、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１７４４に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２７】
Ｃａｖｉｎ−１は、ＣＡＶ１タンパク質と結合することで、ＣＡＶ１を安定化（ライソームによる分解を抑える）することが知られている（非特許文献６参照）。また、ヒトＣａｖｉｎ−１の遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２８４１１９の遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１２２３２に記載のｃＤＮＡおよびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６３６４に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２８】
癌細胞としては、カベオラを形成しており、当該カベオラにＲＴＫが集積しているものであれば、広く対応が可能と考えられる。そのような癌細胞としては、例えば、肺癌、肺腺癌、膵癌、悪性中皮腫、乳癌、大腸癌、口腔癌、食道癌などの癌の細胞が挙げられるが、これらに制限されない。癌細胞の由来する生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法は、癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制することができるか否かを直接又は間接的に検出しうる系に試験化合物を接触させ、接触前後の機能の変化を検出できれば特に制限は無い。
【００３０】
例えば、Ｃａｖｉｎ−１が発現している系、ＣＡＶ１が発現している系、ＣＡＶ１及びＣａｖｉｎ−１が発現している系、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−１が発現している系、ＲＯＲ１及びＣＡＶ１が発現している系、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣａｖｉｎ−１が発現している系、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣＡＶ１が発現している系等に、試験化合物を接触させ、次いで、Ｃａｖｉｎ−１の発現の低下の有無、ＣＡＶ１の発現の低下の有無、ＣＡＶ１及びＣａｖｉｎ−１の結合の抑制の有無、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−１の結合の抑制の有無、ＲＯＲ１及びＣＡＶ１の結合の抑制の有無、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣａｖｉｎ−１の結合の抑制の有無、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣＡＶ１の結合の抑制の有無を、公知の検出方法を用いて検出すればよい。なお、ＲＯＲ１が発現している系に試験化合物を接触させる場合は、ＲＯＲ１が癌細胞に特異的なタンパク質であることから、スクリーニングした化合物は通常細胞には影響を与えない。一方、ＲＯＲ１が発現していない系、例えば、Ｃａｖｉｎ−１のみ発現している系、ＣＡＶ１のみが発現している系、Ｃａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１が発現している系、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣａｖｉｎ−１が発現している系、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣＡＶ１が発現している系に試験化合物を接触した場合、通常細胞のＣａｖｉｎ−１の発現の低下、ＣＡＶ１の発現の低下、ＣＡＶ１及びＣａｖｉｎ−１の結合の抑制、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣａｖｉｎ−１の結合の抑制、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣＡＶ１の結合の抑制をする場合も考えられる。そのため、ＲＯＲ１が発現していない系でスクリーニングを行った場合は、スクリーニングした化合物を癌細胞と通常細胞に投与し、癌細胞に特異性があるか否か確認を行えばよい。
【００３１】
検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、免疫沈降−ウェスタンブロット（ＩＰ−ＷＢ）法によって実施することができる。試験化合物の非存在下で検出した場合と比較して、Ｃａｖｉｎ−１の発現量が低下、ＣＡＶ１の発現量が低下、又はＣＡＶ１及びＣａｖｉｎ−１の結合量の低下、ＲＯＲ１及びＣａｖｉｎ−１の結合量の低下、ＲＯＲ１及びＣＡＶ１の結合量の低下、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣａｖｉｎ−１の結合量の低下、ＩＧＦ−ＩＲ及びＣＡＶ１の結合量の低下が検出されれば、試験化合物は、癌細胞のカベオラ形成を特異的に抑制すると評価される。
【００３２】
上記の検出方法の他、癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物は、本発明のスクリーニングキットを用いてタンパク質の蛍光輝度としてスクリーニングすることもできる。本発明では、Ｃａｖｉｎ−１と結合するＲＯＲ１の結合部位が、ＲＯＲ１の細胞内領域（ＲＯＲ１−ＩＣＤ：アミノ酸配列４２８〜９３７番）の内、キナーゼドメイン内の５６４〜７４６番のアミノ酸領域であることを新たに特定した。Ｃａｖｉｎ−１はＲＯＲ１の細胞内領域に結合することから、本発明のスクリーニングキットは、ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列の内、少なくともアミノ酸配列５６４〜７４６番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ−１が発現している細胞を作成し、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる系を構築している。また、本発明では、ＣＡＶ１と結合するＲＯＲ１の結合部位が、ＲＯＲ１の細胞内領域の内、キナーゼドメイン内の８５３〜８７６番のアミノ酸領域であることを新たに特定した。上記と同様に、少なくともアミノ酸配列８５３〜８７６番のアミノ酸領域及びＣＡＶ１が発現している細胞を作成し、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる系を構築できる。
【００３３】
ＲＯＲ１の５６４〜７４６番のアミノ酸領域及びＣａｖｉｎ−１の両方が発現している細胞は、次の手順で作製することができる。
（１）ＲＯＲ１の細胞内領域のアミノ酸配列４２８〜９３７番の内、少なくとも５６４〜７４６番のアミノ酸領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（２）ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸を挿入した組み換えベクターを作製する。
（３）細胞に、（１）及び（２）のベクターを導入して形質転換体を作製する。
組み換えベクターの作製及び細胞への組み換えベクターの導入は、公知の方法で行えばよい。また、細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等を用いることができる。
（４）これらの細胞を用いて（１）および（２）の組み換えベクターを導入した形質転換体として恒常的に発現することができる細胞株を作製する。
【００３４】
次いで、例えば、Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｆｌｕｏｐｐｉ）、Ｆｌｕｏ−ｃｈａｓｅ等、発現しているタンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できる公知のキットに上記の形質転換体を用いることで、本発明のスクリーニングキットを作製することができる。発現しているＲＯＲ１のＣａｖｉｎ−１への結合部位とＣａｖｉｎ−１が結合する時には蛍光輝度（ｆｏｃｉ：ドット状の構造物）として検出することができ、試験化合物がＲＯＲ１の結合部位とＣａｖｉｎ−１が結合することを抑制できるときには蛍光輝度として検出しないことで、試験化合物の選択を簡単に行うことができる。
【００３５】
ＲＯＲ１の８５３〜８７６番のアミノ酸領域及びＣＡＶ１の両方が発現している細胞は、上記（１）の工程の５６４〜７４６番のアミノ酸領域に代え、８５３〜８７６番のアミノ酸領域を少なくとも含むようにし、上記（２）の工程のヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列をコードする核酸に代え、ヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列をコードする核酸を用いればよい。
【００３６】
なお、一般的に、Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓに膜タンパク質（例えばＲＯＲ１タンパク質など）や細胞内で通常ドット状に局在、或いは、散在するするタンパク質（例えばＣａｖｉｎ−１タンパク質など）等を組み込む場合、当該タンパク質をコードする核酸の全長をベクターに組み込むと検出系が安定しないと言われている。本発明においては、ＲＯＲ１がＣａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１と結合する領域が細胞内領域の部分であることが判明したため、ＲＯＲ１の細胞外領域部分であるアミノ酸配列１〜４２７番部分を組み込んでいないが、検出系が安定する範囲内であれば、細胞外領域部分のアミノ酸配列をコードする核酸部分についてもベクターに組み込んでもよい。また、ＲＯＲ１のＣａｖｉｎ−１への結合部位又はＲＯＲ１のＣＡＶ１への結合部位が細胞内で発現するように構築してもよいし、例えば、ＲＯＲ１のＣａｖｉｎ−１への結合部位及びＲＯＲ１のＣＡＶ１への結合部位の両方が細胞内で発現するようにベクターに組み込む等、スクリーニング目的に応じて発現させる領域及びタンパク質の組み合わせは適宜決めればよい。なお、ＲＯＲ１のＣａｖｉｎ−１への結合部位及びＲＯＲ１のＣＡＶ１への結合部位の両方を細胞内で発現させる場合は、形質転換体内で、ヒトＣａｖｉｎ−１のアミノ酸配列及びヒトＣＡＶ１のアミノ酸配列の両方が発現するように形質転換体を作製すればよい。その他の検出方法としては、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴法を利用した方法などを用いることもできる。
【００３７】
また、本発明の分子標的薬の適応患者の選択方法は、被検体から癌細胞を取得し、サンプル中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、ＲＯＲ１とＣＡＶ１、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１、ＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１、ＣＡＶ１又はＣａｖｉｎ−１から選択される少なくとも１種以上の発現を測定することで、上記癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法でスクリーニングされた化合物の適応患者の選択をすることができる。
【００３８】
サンプル中の、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、ＲＯＲ１とＣＡＶ１、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１、ＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１、ＣＡＶ１又はＣａｖｉｎ−１から選択される少なくとも１種以上の発現は、ＥＬＩＳＡ法、ＩＰ−ＷＢ法等、公知の方法を用いればよい。
【００３９】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００４０】
＜材料と方法＞
（１）細胞株と試薬
ヒト肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−５９０８）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−５０８７）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＡＴＣＣ寄託番号：ＨＴＢ−１７４）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１６５１）；ヒト外陰部扁平上皮癌細胞であるＡ４３１（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１５５５）；ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＣＬ−２）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ヒト肺腺癌細胞株であるＰＣ−９細胞株（ＲＣＢ４４５５）は、ＲＩＫＥＮのＣｅｌｌ  Ｂａｎｋより入手した。また、ヒト肺腺癌細胞株であるＳＫ−ＬＵ−１細胞株は、Ｌｌｏｙｄ  Ｊ．Ｏｌｄ（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から提供を受けた。そして、これらの細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により維持した。【００４１】
組換えＩｎｓｕｌｉｎ、組換えＩＧＦ−Ｉ、組換えＩＧＦ−ＩＩ、組み換えＨＧＦ、組み換えＰＤＧＦは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から入手した。ＥＧＦＲ−ＴＫＩであるＧｅｆｉｔｉｎｉｂは、ＢｉａｆｆｉｎＧｍｂＨ＆ＣｏＫＧ社から入手し、ＣＬ−３８７，７８５は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から入手した。【００４２】
ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ  ａｒｒａｙ  ｋｉｔはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社から入手した。Ｆｌｕｏｐｐｉ：Ａｓｈ−ｈＡＧ（Ａｓｈ−ＭＮＬ／ＭＣＬ＋ｈＡＧ−ＭＮＬ／ＭＣＬ）ｋｉｔはＭＢＬから入手した。【００４３】
下記抗体は、各々以下の会社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＲＯＲ１、ａｎｔｉ−ＩＧＦ−ＩＲ、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩｎｓｕｌｉｎＲ（Ｙ１１５０／Ｙ１１５１）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＩＧＦ−ＩＲ（Ｙ１１３５／Ｙ１１３６）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＧＦ（Ｙ７５４）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃ−Ｍｅｔ（Ｙ１２３４／Ｙ１２３５）、ａｎｔｉ−ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ａｎｔｉ−ＡＫＴ、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ａｎｔｉ−ＥＲＫ、ａｎｔｉ−ＭＥＴは、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
・ａｎｔｉ−Ｃａｖｉｎ−１、ａｎｔｉ−Ｃａｖｉｎ−２はａｂｃａｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ−α−ｔｕｂｕｌｉｎはＳｉｇｍａ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＲＯＲ１（免疫沈降用）はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ＣＡＶ１、ａｎｔｉ−ＣＡＶ２はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
・ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、及びａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。【００４４】
（２）コンストラクト
ヒトＲＯＲ１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。ヒトＣａｖｉｎ−１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−Ｃａｖｉｎ−１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。ヒトＣＡＶ１全長ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）はｐＣＭＶ−ｐｕｒｏベクターに挿入した。そして得られたコンストラクト（ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＣＡＶ１）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の配列を正確に確認した。また、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ（４２８アミノ酸から９３７アミノ酸）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３（５６４アミノ酸から７４６アミノ酸の領域）は制限酵素を用いた分子生物学的手法により作製した。【００４５】
ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ４７３−５６４、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ５６４−６５５、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ６５５−７４６、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ４７３−６５５、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ５６４−７４６、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ４７３−７４６、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＳＴ１Δ７４８−７８２、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＰΔ７８４−８５１、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＳＴ２Δ８５３−８７６については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。以下に、各々の作製に用いたプライマーを示す。
Δ７４６フォワードプライマー：５’−ＣＧＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号：１）、
Δ５６４フォワードプライマー：５’−ＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：２）、
Δ６５５フォワードプライマー：５’−ＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡ−３’（配列番号：３）、
Δ７４８フォワードプライマー：５‘−ＡＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＴＴＡＣＡＴＧＴ−３’（配列番号：４）
Δ８５１フォワードプライマー：５‘−ＡＡＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡ−３’（配列番号：５）
Δ８５３フォワードプライマー：５‘−ＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号：６）
Δ４７３リバースプライマー：５’−ＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣ−３’（配列番号：７）、
Δ５６４リバースプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡ−３’（配列番号：８）、
Δ６５５リバースプライマー：５’−ＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣ−３’（配列番号：９）。
Δ７８２リバースプライマー：５‘−ＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡ−３’（配列番号：１０）
Δ７８２リバースプライマー：５‘−ＧＴＴＡＣＴＧＡＧＡＴＴＡＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号：１１）
Δ８７６リバースプライマー：５‘−ＣＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣ−３’（配列番号：１２）【００４６】
ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＫＤ（キナーゼ活性欠失型；Ｋ５０６Ａ）についても、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。【００４７】
（３）ウェスタンブロッティング分析、及びＩＰ−ＷＢ分析
ウェスタンブロッティング分析、及びＩＰ−ＷＢ分析は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及び化学発光増強システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、標準的な方法により施行した。ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合部位を特定するために、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴを、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（ＷＴ）、ＴＫΔ４７３−５６４（ＴＫΔ１）、ＴＫΔ５６４−６５５（ＴＫΔ２）、ＴＫΔ６５５−７４６（ＴＫΔ３）、ＴＫΔ４７３−６５５（ＴＫΔ１+Δ２）、ＴＫΔ５６４−７４６（ＴＫΔ２+Δ３）、ＴＫΔ４７３−７４６（ＴＫΔ１+Δ２+Δ３）、といった様々なＲＯＲ１発現コンストラクトとともに共発現を行った。また、ＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合部位を特定するために、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＣＡＶ１−ＷＴを、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（ＷＴ）、ＴＫΔ４７３−５６４（ＴＫΔ１）、ＴＫΔ５６４−６５５（ＴＫΔ２）、ＴＫΔ６５５−７４６（ＴＫΔ３）、ＳＴ１Δ７４８−７８２（ΔＳＴ１）、ＰΔ７８４−８５１（ΔＰ）、ＳＴ２Δ８５３−８７６（ΔＳＴ２）といった様々なＲＯＲ１発現コンストラクトとともに共発現を行った。これらはＣＯＳ−７細胞を用いて、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によるトランスフェクション後２４時間で細胞を回収し、ＩＰ−ＷＢ分析を行った。【００４８】
ＲＯＲ１の発現抑制による各々のリガンド刺激によるＲＴＫのリン酸化反応（活性化）を検討するために、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株を用いて、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ♯１（以下、明細書及び図面において、「ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ」と記載することがある。）、ｓｉＲＯＲ１♯１（以下、明細書及び図面において、「ｓｉＲＯＲ１」と記載することがある。）のトランスフェクション後４２時間で培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ：ウシ胎児血清）を含まない培養液に置換し、さらに２４時間培養し、その後、２０ｎｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦで３０分処理したのち、細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００４９】
またＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、あるいはＲＯＲ１とＣＡＶ１、またはＣａｖｉｎ−１とＩＧＦ−ＩＲとの結合を確認するため、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５やＮＣＩ−Ｈ３５８及びＳＫ−ＬＵ−１細胞株を用いて、オクチルグルコシド含有のｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、６０ｍＭ  Ｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）で細胞を懸濁した後、ＩＰ−ＷＢ分析を行った。【００５０】
（４）免疫蛍光染色
ＦｌｕｏｐｐｉによりＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした細胞は、２４時間後に培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、３．７％のホルマリン溶液で固定し、プレパラートを作製した後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて観察した。【００５１】
（５）ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ  ａｒｒａｙ
ＮＣＩ−Ｈ１９７５およびＰＣ−９肺腺癌細胞株は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクション後７２時間で培養液を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ社））に懸濁後、Ｒ＆Ｄ社のプロトコールに従い解析を行った。【００５２】
（６）ヒトＲＯＲ１、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ヒトＣａｖｉｎ−１、ヒトＣＡＶ１に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
ＲＮＡｉを行うため、下記ＲＮＡオリゴマーをＱＩＡＧＥＮ社及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。
・５’−ＣＡＧＣＡＡＵＧＧＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＡＡ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃１（配列番号：１３）、
・５’−ＣＣＣＡＧＵＧＡＧＵＡＡＵＣＵＣＡＧＵ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃２（配列番号：１４）、
・５’−ＣＣＣＡＧＡＡＧＣＵＧＣＧＡＡＣＵＧＵ−３’：ｓｉＲＯＲ１＃３（配列番号：１５）、
・５’−ＧＧＡＡＵＵＧＣＡＵＧＧＵＡＧＣＣＧＡＵＵ−３’：ｓｉＩＧＦ−ＩＲ＃１（配列番号：１６）、
・５’−ＣＵＧＡＣＵＡＣＡＧＧＧＡＵＣＵＣＡＵＵＵ−３’：ｓｉＩＧＦ−ＩＲ＃２（配列番号：１７）、
・５’−ＣＵＣＣＡＡＧＡＣＣＧＣＧＧＵＣＵＡＣＡＡ−３’：ｓｉＣａｖｉｎ−１＃１（配列番号：１８）、
・５’−ＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＡＡＡ−３’：ｓｉＣａｖｉｎ−１＃２（配列番号：１９）、
・５’−ＡＧＡＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡ−３’：ｓｉＣＡＶ１＃１（配列番号：２０）。【００５３】
また、コントロールとして、ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＃１）はＱＩＡＧＥＮ社から入手した。またｓｉＣｏｎｔｒｏｌ＃２は、Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。【００５４】
ｓｉＲＮＡ（各々２０ｎＭ）のトランスフェクションは、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、そのメーカーの使用説明書に従って行った。そして、細胞は、ウェスタンブロッティング分析のため、トランスフェクションをしてから７２時間後に回収した。また、細胞増殖を測定するための比色法による解析については、トランスフェクションをしてから１２０時間後に回収した。【００５５】
（７）ＣＡＶ１発現制御におけるＲＯＲ１のキナーゼ活性の重要性の検討
ｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを含んだｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１）やｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＫＤｍ（ｓｉＲＯＲ１）については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・５’−ＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’：（配列番号：２１）
のプライマーを用いた。野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴ）、あるいはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えた野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴｍ）、またはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えたキナーゼ活性を欠失したＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＫＤｍ）をＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎでセレクション（１．５μｇ／ｍｌ）を行った上で、シングルクローンを採取し、それぞれのＲＯＲ１を発現したｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅ（恒常的ＲＯＲ１発現細胞株）を作製した。これらのｓｔａｂｌｅ  ｃｌｏｎｅは、その後、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１で処理した後、３日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５６】
（８）ＣＡＶ１発現制御におけるＲＯＲ１のｃａｖｉｎ−１結合領域の重要性の検討
ｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを含んだｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１）やｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫΔ２＋ＴＫΔ３ｍ（ｓｉＲＯＲ１）については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・５’−ＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’：（配列番号：２１）
のプライマーを用いた。野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴ）、あるいはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えた野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴｍ）、またはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えたｃａｖｉｎ−１の結合領域を欠損したＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＴＫΔ２＋ＴＫΔ３ｍ）をＰＣ−９細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎでセレクション（１．０μｇ／ｍｌ）を行った上で（３日後）、バルククローンとして細胞を回収し、再度６ウェルプレートに撒き直した。その後、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１で処理した後、３日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５７】
（９）ＣＡＶ１発現制御におけるＲＯＲ１のＣＡＶ１結合領域の重要性の検討
ｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを含んだｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１）やｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ２ｍ（ｓｉＲＯＲ１）については、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行い、作製した。作製にはアミノ酸の置換を伴わない、
・５’−ＣＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’：（配列番号：２１）
のプライマーを用いた。野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴ）、あるいはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えた野生型のＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ＷＴｍ）、またはｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えたＣＡＶ１の結合領域を欠損したＲＯＲ１（ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ２ｍ）をＰＣ−９細胞にトランスフェクションを行い、２４時間後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎでセレクション（１．０μｇ／ｍｌ）を行った上で（３日後）、バルククローンとして細胞を回収し、再度６ウェルプレートに撒き直した。その後、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１で処理した後、３日後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング分析を行った。【００５８】
（１０）急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を用いた電子顕微鏡解析によるＲＯＲ１発現抑制細胞でのカベオラ形成への影響と効果についての検討
培養ディッシュ内に２０μｍの厚さの金箔を敷き、その上で肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞を培養し、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後７２時間でｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ（Ｌｅｉｃａ社）を用いて急速凍結を行った。ＢＡＦ４００  ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂａｌｔｅｃ社）を用いて凍結割断レプリカを作製し、ＳＤＳで処理後、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＣＡＶ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社）でラベルを行った。その後、１０ｎｍの金コロイド−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて二次抗体反応を行い、ＪＥＭ−１０１１電子顕微鏡により観察を行った。また、カベオラ分布密度計測については、電子顕微鏡下でランダムに選択した領域（１７−５０μｍの１８個のランダムな細胞膜領域）を測定し、それぞれの電子顕微鏡写真の細胞膜の領域は、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した。【００５９】
（１１）Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓを用いたＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合の検出
Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓによる実験系の構築および解析方法は、入手先であるＭＢＬのプロトコールに従って行った。ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ（４２８アミノ酸から９３７アミノ酸）、ｐＣＭＶｐｕｒｏ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３（５６４アミノ酸から７４６アミノ酸の領域）およびｐＣＭＶｐｕｒｏ−Ｃａｖｉｎ−１―ＷＴ（全長）はＭＢＬのプロトコールに従い、制限酵素を用いた分子生物学的手法により以下のコンストラクトの作製を行った。ｐｈＡＧ−ＭＮＬ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ、ｐｈＡＧ−ＭＮＬ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３、ｐｈＡＧ−ＭＮＬ−Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ、ｐｈＡＧ−ＭＣＬ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ、ｐｈＡＧ−ＭＣＬ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３、ｐｈＡＧ−ＭＣＬ−Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ、ｐＡｓｈ−ＭＮＬ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ、ｐＡｓｈ−ＭＮＬ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３、ｐＡｓｈ−ＭＮＬ−Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ、ｐＡｓｈ−ＭＣＬ−ＲＯＲ１−ＩＣＤ、ｐＡｓｈ−ＭＣＬ−ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３、ｐＡｓｈ−ＭＣＬ−Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ。そしてそれぞれの得られたコンストラクトが適切に組み込まれていることをシークエンスにより配列を正確に確認した。その後、適切な８通りの組み合わせによるトランスフェクション（Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社））を、ＨｅＬａ細胞を用いて行った。同時にＲＯＲ１−ＩＣＤあるいはＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３を組み込んだプラスミドとＣａｖｉｎ−１−ＷＴを組み込んでいないプラスミドのトランスフェクションも行った（４通りの組み合わせ、ネガティブコントロール）。トランスフェクション後２４時間で細胞を３．７％のホルマリン溶液で固定し、観察を行った。【００６０】
（１２）ＲＮＡｉ干渉法を用いたＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制による肺腺癌細胞株に対する細胞増殖への効果についての検討
ＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制による細胞増殖への影響を調べるために、ＰＣ−９及びＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株に対してｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１、ｓｉＣａｖｉｎ−１、ｓｉＣＡＶ１のトランスフェクションを行った。トランスフェクション後１２０時間で、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いて反応させ、プレートリーダーにより吸光度を測定し、比色法を行った。なお、この実験は独立に３回行い、その平均値をグラフ化した。【００６１】
（１３）リガンド刺激下でのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株でのＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響についての検討
臨床上問題となっている様々なリガンド存在下でのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性を獲得した細胞株におけるＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響を調べた。外陰部扁平上皮癌細胞であるＡ４３１、肺腺癌細胞であるＰＣ−９、およびＮＣＩ−１９７５細胞株に対して、様々なリガンド（５０ｎｇ／ｍｌ）とＥＧＦＲ−ＴＫＩ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂは１ｕＭ、ＣＬ−３８７，７８５は０．５ｕＭ）存在下の状態（Ａ４３１：Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ+ＩＧＦ−Ｉ、ＰＣ−９：Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ+ＨＧＦ、Ｈ１９７５：ＣＬ−３８７，７８５+ＨＧＦ）を作り出した上で、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌあるいはｓｉＲＯＲ１、ｓｉＣａｖｉｎ−１、ｓｉＣＡＶ１のトランスフェクション（２０ｕＭ）を行った。ウェスタンブロッティングの場合は、細胞をプレートに撒いた次の日に各々のｓｉＲＮＡの処理を行い、３日後にそれぞれのリガンドとＥＧＦＲ−ＴＫＩを６時間作用させ、細胞を回収した。ＭＴＴ  ａｓｓａｙの場合は、細胞をプレートに撒いた次の日に各々のｓｉＲＮＡの処理を行い、さらに次の日にそれぞれのリガンドとＥＧＦＲ−ＴＫＩを作用させ、４日後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いて反応させ、プレートリーダーにより吸光度を測定し、比色法を行った。なお、この実験は独立に３回行い、その平均値をグラフ化した。【００６２】
［実施例１］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１発現抑制に伴うＲＴＫ活性化への影響に関する検証＞
上記（５）に示す手順で、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＰＣ−９細胞株を用いたｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ  ａｒｒａｙ解析による検討を行った。図１（１）はＮＣＩ−Ｈ１９７５、図１（２）はＰＣ−９の解析結果を示す写真である。図１（１）が示すように、ＮＣＩ−Ｈ１９７５では、主にＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＡＬＫ、ＩｎｓｕｌｉｎＲ、ＩＧＦ−ＩＲのＲＴＫのリン酸化反応の低下が認められた。また、図１（２）が示すように、ＰＣ−９細胞株では、主にＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＩＧＦ−ＩＲ、ｃ−ＭＥＴ、ＭＳＰＲ、ＥｐｈＲ２のＲＴＫのリン酸化反応の低下が認められた。以上の結果より、ＲＯＲ１の発現抑制によって多くの様々なＲＴＫのリン酸化反応（活性化）を低下できることが分かった。特に、２つの細胞株で共通して見られるＲＴＫのリン酸化の低下として顕著なものとしては、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３およびＩＧＦ−ＩＲが挙げられる。以上の結果は、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１の発現が、広範囲に多くのＲＴＫのリン酸化反応、つまりはＲＴＫの活性化の維持に関与していることを示しており、共通するＲＯＲ１を介したＲＴＫの活性化機序が存在する可能性を示している。更に、今回影響が見られたＲＴＫは肺腺癌細胞において重要な生存シグナルなど生理的な機能を担っている。したがって、ＲＯＲ１の発現抑制がこれらのＲＴＫを網羅的に抑制させることから、ＲＯＲ１が肺腺癌にとって重要な役割を担う各々のＲＴＫの活性化を一網打尽にできる全く新しいこれまでにない革新的な分子標的となる可能性を秘めていることが明らかとなった。【００６３】
［実施例２］
＜ＲＯＲ１の発現抑制によるＣＡＶ１の発現低下とカベオラ形成への影響に関する検討＞
上記（６）に示す手順で、各種肺腺癌細胞株によるＲＯＲ１の発現抑制によるＣＡＶ１の発現低下とカベオラ形成への影響を、ウェスタンブロッティングにより分析した。図２（１）は肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際の結果を示しており、配列の異なるｓｉＲＯＲ１＃１〜３を用いたＲＯＲ１の発現抑制は、何れのケースでもカベオラの形成に不可欠なＣＡＶ１の発現低下が認められた。この結果は、ｓｉＲＯＲ１の特定の配列に基づく特異的な現象ではなく、ＣＡＶ１の発現低下はＲＯＲ１の発現抑制によるものであることが明らかとなった。図２（２）は、肺腺癌細胞株として、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＰＣ−９を用いた際の結果を示しており、図２（１）と同様に、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＯＲ１を用いてＲＯＲ１の発現を抑制させたところ、各々の細胞株においてもＣＡＶ１の発現低下が認められた。これらの結果は、ＲＯＲ１によるＣＡＶ１の発現制御は多くの肺腺癌細胞株において共通の制御機序が存在する可能性を示している。【００６４】
さらに、肺腺癌細胞株において、ＲＯＲ１の発現抑制に伴ってＣＡＶ１の発現低下が認められたことから、カベオラの形成に影響があるかどうかを検討するため、肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用い、又、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＯＲ１を用いて上記（１０）の手順により、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法を用いた電子顕微鏡解析を行った。図２（３）は、電子顕微鏡解析により分析した結果を示す写真である。図２（３）に示すように、ＲＯＲ１の発現抑制が細胞膜上でのカベオラの形成を阻害し、正常なカベオラの数が低下していることが明らかとなった。なお、カベオラの標識はＣＡＶ２で行い、ＲＯＲ１の発現を抑制させた細胞株では、金コロイド標識したＣＡＶ２がカベオラの痕跡らしき構造物（窪みが浅い構造物）に集積していた。また、図２（４）は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＯＲ１で処理をしたＮＣＩ−Ｈ１９７５で認められた窪みの深い構造物、つまり正常なカベオラの数を、ランダムな細胞膜上の領域で測定を行った結果を示すグラフである（平均値±標準偏差（ｎ＝１８、ただし、ｎとは１７−５０平方マイクロメートルのランダムな細胞膜上の領域である。））。図２（４）のグラフに示すように、ｓｉＲＯＲ１で処理をした細胞株において有意に、正常なカベオラの数が低下していることが明らかとなった。以上の結果より、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１の発現が正常なカベオラの形成に必要不可欠であることが判明した。【００６５】
［実施例３］
＜ＲＯＲ１によるＣＡＶ１の発現制御におけるＲＯＲ１のキナーゼ活性の必要性の検討＞
肺腺癌細胞株においてＲＴＫであるＲＯＲ１は、癌細胞の生存シグナルに関わるＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ軸をキナーゼ活性依存的に、あるいは非依存的に制御していることを本発明者は報告しているが（上記特許文献２参照）、ＲＯＲ１によるＣＡＶ１の発現制御にＲＯＲ１のキナーゼ活性が必要であるか否かを検討した。ＲＯＲ１−ＷＴ（野生型のＲＯＲ１）、ＲＯＲ１−ＷＴｍ（ｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えた野生型のＲＯＲ１）、ＲＯＲ１−ＫＤｍ（ｓｉＲＯＲ１に対するｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを加えたキナーゼ活性を欠失したＲＯＲ１）を恒常的に発現させた肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用い、上記（７）の手順により、実験を行った。図３は、ウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図３に示すように、ＲＯＲ１−ＷＴを発現させた細胞株ではｓｉＲＯＲ１処理によってこれまで確認してきたＣＡＶ１の発現低下が認められた。
これに対して、ＲＯＲ１−ＷＴｍを発現させた細胞株では、ｓｉＲＯＲ１処理によってＣＡＶ１の発現低下が見られなかった。このことは、ｓｉＲＯＲ１が細胞内で正しく働き、細胞内でのＲＯＲ１の機能としてＣＡＶ１の発現低下を引き起こしていることを示している。さらに、ＲＯＲ１−ＫＤｍを発現させた細胞株においても、ｓｉＲＯＲ１処理によって、ＣＡＶ１の発現低下が見られなかった。この結果から、ｓｉＲＯＲ１によるＣＡＶ１の発現低下にはＲＯＲ１のキナーゼ活性が必要でないことが分かり、つまりはＲＯＲ１を介したＣＡＶ１の発現制御にＲＯＲ１のキナーゼ活性は重要でないことが判明した。このことは、ＲＯＲ１のキナーゼ活性非依存的な機能に着目したＲＯＲ１機能阻害剤の同定と、その阻害剤を同定するためのスクリーニング法が必要であることを示している。【００６６】
［実施例４］
＜肺腺癌細胞株でのＲＯＲ１とカベオラの構成因子であるＣａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１との結合と、ＣＡＶ１とＣａｖｉｎ−１の結合におけるＲＯＲ１の重要性の検討＞
カベオラの形成に必要であるＣＡＶ１の発現はＣａｖｉｎ−１との結合によってその発現が安定化されていることが分かっている（非特許文献８〜１０参照）。つまりＣａｖｉｎ−１はカベオラの形成において非常に重要なタンパク質であることが理解されている。しかしながら、カベオラの形成においてＣａｖｉｎ−１がどのような制御下においてＣＡＶ１の発現を安定化させているかについては不明のままであり、さらにＣａｖｉｎ−１についての詳細な機能はよく分かっていない。そこでＣａｖｉｎ−１に着目し、オクチルグルコシドによる細胞抽出液を用いてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１との結合を検討した。【００６７】
上記（３）の手順によりＩＰ−ＷＢ分析を行ったところ、図４（１）及び（２）に示すように、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＳＫ−ＬＵ−１において、内因性のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１とが共沈降していたことから両者は結合するが、ＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−２とは結合しないことが明らかとなった。また同様に、オクチルグルコシドによる細胞抽出液を用いてＲＯＲ１とＣＡＶ１との結合を検討したところ、図４（３）及び（４）に示すように、２つの異なる肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＳＫ−ＬＵ−１において、内因性のＲＯＲ１とＣＡＶ１についても共沈降していたことから両者は結合することが明らかとなった。【００６８】
また、図４（５）は、肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株にｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションを行い、ＲＯＲ１の発現を抑制させた際のＣＡＶ１の発現の経時的変化をＲＯＲ１の発現変化とともに、ウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図４（５）に示すように、ＲＯＲ１の発現抑制は、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクションの後、２４時間後にはすでにＲＯＲ１の発現が低下するのに対して、ＣＡＶ１の発現低下は４８時間後に見られることが判明した。【００６９】
そこで、ＲＯＲ１の発現低下が見られ、ＣＡＶ１の発現低下がまだ起きていない、ｓｉＲＯＲ１のトランスフェクション後２４時間後の細胞抽出液を用いて、ＲＯＲ１発現抑制下でのＣＡＶ１とＣａｖｉｎ−１の結合への影響についてＩＰ−ＷＢ分析を行った。図４（６）は、ＩＰ−ＷＢ分析の写真である。図４（６）が示すように、ＲＯＲ１の発現抑制は内因性のＣＡＶ１とＣａｖｉｎ−１との結合を減少させることが明らかとなった。これらの結果から、肺腺癌細胞株において、ＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−１やＣＡＶ１と結合し、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１との結合を安定化させている可能性が示された。Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１がＲＯＲ１と結合できなくなると、Ｃａｖｉｎ−１はＣＡＶ１と結合できなくなるため、ＣＡＶ１自身が分解されてしまい、正常なカベオラを構築・形成することができなくなると考えられる。また、ＲＯＲ１とカベオラの構成因子であるＣａｖｉｎ−１あるいはＣＡＶ１との結合を標的とする阻害剤を見つけ出すことが、ＣＡＶ１の発現低下、カベオラの形成不全、さらにはＲＴＫの活性化の抑制を引き起こす革新的な阻害剤の同定につながることが明らかとなった。【００７０】
［実施例５］
＜肺腺癌細胞株におけるＲＯＲ１発現抑制に伴う、様々なリガンド刺激を介した各々のＲＴＫ活性化への影響に関する検証＞
［実施例１］のｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＴＫ  ａｒｒａｙの解析結果により、肺腺癌細胞株におけるＲＯＲ１の発現抑制は、定常状態での様々なＲＴＫのリン酸化反応（活性化）の低下を引き起こすことが明らかとなった。実施例５では、さらにこれらのＲＴＫについて、各々のリガンド刺激によるリン酸化反応にもＲＯＲ１の発現抑制が影響を及ぼすかどうか、同様に肺腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用い、上記（３）の手順により分析を行った。図５（１）〜（４）は各リガンドを用いた時のウェスタンブロッティング写真である。図５（１）〜（４）が示すように、ＲＯＲ１の発現抑制は各々のリガンド（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＰＤＧＦ）によるＲＴＫ（ＩＧＦ−ＩＲ、ＩｎｓｕｌｉｎＲ、ＰＤＧＦＲ）のリン酸化反応（活性化）を有意に低下させることが明らかとなった。ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩのどちらでも活性化されるが、ＲＯＲ１の発現抑制はどちらのリガンド刺激においてもＩＧＦ−ＩＲのリン酸化反応を低下させた。【００７１】
［実施例６］
＜肺腺癌細胞株でのＣａｖｉｎ−１の細胞増殖における重要性の検討＞
上記（１２）の手順により、Ｃａｖｉｎ−１の細胞増殖への影響を検討した。図６（１）及び（２）に示すように、異なる２つの肺腺癌細胞株であるＰＣ−９、ＮＣＩ−Ｈ１９７５において、ＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制を行ったところ、２つの細胞株でＲＯＲ１、Ｃａｖｉｎ−１、ＣＡＶ１の発現抑制は有意に細胞増殖を阻害することが分かった。また、Ｃａｖｉｎ−１の発現抑制は、配列の異なるｓｉＣａｖｉｎ−１＃１、＃２を用いた場合においても同様に細胞増殖の阻害が認められたことから、ｓｉＣａｖｉｎ−１の特定の配列に基づく特異的な現象ではないことが分かった。これらの結果から、ＲＯＲ１の発現抑制は細胞増殖を阻害すること（特許文献１及び非特許文献５）やＣＡＶ１の発現抑制もまた細胞増殖を阻害すること（非特許文献７）に関しては報告があり、再現性を得ることができたが、新たに、Ｃａｖｉｎ−１の発現抑制によっても肺腺癌細胞株の細胞増殖を阻害することが分かった。【００７２】
上記のとおり、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１又はＣＡＶ１が結合できなくなると、Ｃａｖｉｎ−１はＣＡＶ１と結合できなくなるため、癌細胞においてカベオラの構築・形成ができなくなることが示された。そのため、ＲＯＲ１以外に、癌細胞のカベオラの構築・形成を抑制できる因子の検討を行った。【００７３】
［実施例７］
＜肺腺癌細胞株でのＩＧＦ−ＩＲ発現抑制に伴うＣＡＶ１の発現低下に関する検証＞
上記（３）に示す手順で、各種肺腺癌細胞株によるＩＧＦ−ＩＲの発現抑制によるＣＡＶ１の発現への影響を、ウェスタンブロッティングにより分析した。図７（１）は肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際の結果を示しており、配列の異なるｓｉＩＧＦ−ＩＲ＃１、＃２を用いたＩＧＦ−ＩＲの発現抑制は、ｓｉＲＯＲ１で処理した場合と同様に、何れのケースでもＣＡＶ１の発現低下が認められた。この結果は、ｓｉＩＧＦ−ＩＲの特定の配列に基づく特異的な現象ではなく、ＣＡＶ１の発現低下はＩＧＦ−ＩＲの発現抑制によるものであることが明らかとなった。図７（２）は、肺腺癌細胞株として、ＮＣＩ−Ｈ３５８を用いた際の結果を示しており、図７（１）と同様に、ｓｉＩＧＦ−ＩＲ＃１、＃２を用いてＩＧＦ−ＩＲの発現を抑制させたところ、ｓｉＲＯＲ１で処理した場合と同様に、ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株においてもＣＡＶ１の発現低下が認められた。この結果は、ＩＧＦ−ＩＲによるＣＡＶ１の発現制御は異なる肺腺癌細胞株においても観察されることが分かり、ＲＯＲ１以外の因子であるＩＧＦ−ＩＲによってもＣＡＶ１の発現低下を誘導することが明らかとなった。【００７４】
［実施例８］
＜肺腺癌細胞株でのＣａｖｉｎ−１とＩＧＦ−ＩＲの結合＞
上記（３）の手順によりＩＰ−ＷＢ分析を行ったところ、図８に示すように、肺腺癌細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５において、内因性のＣａｖｉｎ−１とＩＧＦ−ＩＲが共沈降したことから両者は結合することが明らかとなった。この結果から、Ｃａｖｉｎ−１はＲＯＲ１以外にもＩＧＦ−ＩＲとも結合することが分かり、またＲＯＲ１の発現抑制と同様にＩＧＦ−ＩＲの発現抑制によってもＣＡＶ１の発現低下が認められたことから、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合の重要性と同様に、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１の重要性についても考察できる。【００７５】
［実施例９］
＜Ｃａｖｉｎ−１によるＲＯＲ１の結合領域の特定と、細胞内での両者の結合を阻害するための阻害剤スクリーニングのためのＣａｖｉｎ−１およびＲＯＲ１の結合の検出＞
［実施例４］の結果から、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１の結合を確認した。次に、Ｃａｖｉｎ−１が結合するＲＯＲ１の結合部位の同定を行うために、上記（３）の手順により、図９（１）に示す模式図のように、様々なＲＯＲ１のキナーゼドメインの欠損変異体を作製し、各々のＲＯＲ１のキナーゼドメインの欠損変異体およびＣａｖｉｎ−１を発現させて、ＩＰ−ＷＢ分析により、Ｃａｖｉｎ−１との結合およびＣａｖｉｎ−１によるＲＯＲ１の結合部位の同定を行った。図９（２）は、ＩＰ−ＷＢ分析の写真である。図９（２）の写真より、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン内の５６４アミノ酸から７４６アミノ酸の領域でＣａｖｉｎ−１と結合していることが判明した。これらの結果は、ＲＯＲ１がＣａｖｉｎ−１に特異的に結合していることを示しており、ＲＯＲ１のキナーゼドメイン内の一部の領域（５６４アミノ酸から７４６アミノ酸の領域）とＣａｖｉｎ−１との結合が、ＣＡＶ１の発現の安定化、さらには正常なカベオラの形成、カベオラによる種々のＲＴＫの活性化に重要な働きを担っている可能性が考えられる。【００７６】
上記［実施例３］の結果から、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１を介したＣＡＶ１の発現制御にはＲＯＲ１のキナーゼ活性が必要でないことが判明した。また、上記［実施例４］の結果から、肺腺癌細胞株においてＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１と結合していることが明らかとなり、さらにＲＯＲ１はＣａｖｉｎ−１とＣＡＶ１の結合を安定化させていることが明らかとなった。これらの結果から、ＲＯＲ１によるＣＡＶ１を介したカベオラの形成とその後の種々のＲＴＫの活性化には、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１との結合が重要であることが判明した。そこで、上記（１１）の手順により、細胞内においてタンパク質とタンパク質の結合を簡便かつ容易に検出できる、阻害剤のスクリーニングのための結合検出系の構築を行った。タンパク質同士の結合を細胞内で蛍光輝度として検出できるＩｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、Ｃａｖｉｎ−１が結合するＲＯＲ１の細胞内領域（ＲＯＲ１−ＩＣＤ）とＣａｖｉｎ−１の全長（Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ）を使って、ＨｅＬａ細胞において、両者の結合を検討したところ、図９（３）の右側の細胞染色法を用いて分析した写真に示すように複数のＦｏｃｉの形成が確認され、有意にその結合を検出することができた。一方、図９（３）の左側写真に示すように、ＲＯＲ１−ＩＣＤとＣａｖｉｎ−１−ＷＴを組み込んだ同じベクターを用いて、ＲＯＲ１−ＩＣＤを組み込んだプラスミドとＣａｖｉｎ−１を組み込んでいないプラスミドを発現させた場合、Ｆｏｃｉがほとんど検出されなかったことから、ＲＯＲ１−ＩＣＤとＣａｖｉｎ−１−ＷＴとの結合が特異性を持った結合であることが判明した。【００７７】
さらに、Ｃａｖｉｎ−１が結合するＲＯＲ１のキナーゼ内領域（ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３）とＣａｖｉｎ−１の全長（Ｃａｖｉｎ−１−ＷＴ）を使って、ＨｅＬａ細胞において、両者の結合を検討したところ、図９（４）の右側の写真に示すように複数のＦｏｃｉの形成が確認され、有意にその結合を検出することができた。一方、図９（４）の左側写真に示すように、ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３とＣａｖｉｎ−１−ＷＴを組み込んだ同じベクターを用いて、ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３を組み込んだプラスミドとＣａｖｉｎ−１を組み込んでいないプラスミドを発現させた場合、Ｆｏｃｉがほとんど検出されなかったことから、ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３とＣａｖｉｎ−１−ＷＴとの結合が特異性を持った結合であることが判明した。これらの結果は、ＲＯＲ１−ＩＣＤ、及び、ＲＯＲ１−ＴＫ２＋ＴＫ３とＣａｖｉｎ−１−ＷＴとの結合を細胞内レベルで、簡便かつ容易に検出することができたことから、両者の結合を阻害する低分子化合物のスクリーニングを行うことができる。【００７８】
［実施例１０］
＜ＣＡＶ１によるＲＯＲ１の結合領域の特定＞
実施例９において、Ｃａｖｉｎ−１によるＲＯＲ１の結合領域が特定できたことから、次に、ＣＡＶ１によるＲＯＲ１の結合部位の同定を行うために、上記（３）の手順により、図１０（１）に示す模式図のように、様々なＲＯＲ１の欠損変異体を作製し、各々のＲＯＲ１の欠損変異体およびＣＡＶ１を発現させて、ＩＰ−ＷＢ分析により、ＣＡＶ１との結合およびＣＡＶ１によるＲＯＲ１の結合部位の同定を行った。図１０（２）は、ＩＰ−ＷＢ分析の写真である。図１０（２）の写真より、ＲＯＲ１の細胞内領域の８５３アミノ酸から８７６アミノ酸の領域（セリン・スレオニンリッチドメイン）でＣＡＶ１と結合していることが判明した。これらの結果は、ＲＯＲ１がＣＡＶ１に特異的に結合していることを示しており、ＲＯＲ１の細胞内領域の一部（８５３アミノ酸から８７６アミノ酸の領域）とＣＡＶ１との結合が、ＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１との結合と同様に、ＣＡＶ１の発現の安定化、さらには正常なカベオラの形成、カベオラによる種々のＲＴＫの活性化に重要な働きを担っている可能性が考えられる。細胞内においてタンパク質とタンパク質の結合を簡便かつ容易に検出できる、阻害剤のスクリーニングのための結合検出系の構築は、実施例９と同様の手順で作製すればよい。【００７９】
［実施例１１］
＜ＣＡＶ１発現制御におけるＲＯＲ１のｃａｖｉｎ−１結合領域の重要性の検討＞
実施例９に示すとおり、ｃａｖｉｎ−１はＲＯＲ１の細胞内領域のキナーゼドメイン内の５６４〜７４６アミノ酸領域(ＴＫ２＋ＴＫ３)と結合する。このＲＯＲ１とｃａｖｉｎ−１の結合領域がＣＡＶ１の発現制御に関与しているかを確認するために、上記（８）の手順により、ＲＯＲ１のｃａｖｉｎ−１が結合する領域を欠損させた変異体に、ｓｉＲＯＲ１の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行った。図１１はウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図１１に示すように、ＲＯＲ１−ＴＫΔ２＋ＴＫΔ３ｍをトランスフェクションした細胞では、ＲＯＲ１は発現しているものの、ＣＡＶ１の発現が低下したことを確認した。  以上の結果から、ｃａｖｉｎ−１が結合するＲＯＲ１の領域（５６４〜７４６アミノ酸領域）がＣＡＶ１の発現安定化に必須であることが分かった。またこの結果は、ＲＯＲ１とｃａｖｉｎ−１のこの領域の結合を阻害するスクリーニング系の重要性を示唆するものであり、この結合を阻害する阻害剤の候補は、ＣＡＶ１の発現の低下、すなわち癌特異的なカベオラ形成の阻害を引き起こすことが推測できる。【００８０】
［実施例１２］＜ＣＡＶ１発現制御におけるＲＯＲ１のＣＡＶ１結合領域の重要性の検討＞
実施例１０に示すとおり、ＣＡＶ１はＲＯＲ１の細胞内領域のセリン・スレオニンリッチドメインである８５３〜８７６アミノ酸領域(Ｓ／Ｔ２)と結合する。このＲＯＲ１とＣＡＶ１の結合領域がＣＡＶ１の発現制御に関与しているかを確認するために、上記（９）の手順により、ＲＯＲ１のＣＡＶ１が結合する領域を欠損させた変異体に、ｓｉＲＯＲ１の効果をキャンセルさせる変異を加えた変異体を作製し、細胞に発現させ、ｓｉＲＯＲ１処理を行った。図１２はウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。図１２に示すように、ＲＯＲ１−ΔＳ／Ｔ２ｍをトランスフェクションした細胞では、ＲＯＲ１は発現しているものの、ＣＡＶ１の発現が低下したことを確認した。
以上の結果から、ＣＡＶ１が結合するＲＯＲ１の領域（８５３〜８７６アミノ酸領域）がｃａｖｉｎ−１の結合領域と同様に、ＣＡＶ１の発現安定化に必須であることが分かった。またこの結果は、ＲＯＲ１とＣＡＶ１のこの領域の結合を阻害するスクリーニング系の重要性を示唆するものであり、この結合を阻害する阻害剤の候補は、ＣＡＶ１の発現の低下、すなわち癌特異的なカベオラ形成の阻害を引き起こすことが推測できる。【００８１】
［実施例１３］
＜リガンド刺激下でのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株でのＲＯＲ１の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響についての検討＞
上記（１３）に示す手順で、様々なリガンド存在下でのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性を獲得した細胞株におけるＲＯＲ１の発現抑制による細胞増殖への効果と生存シグナルへの影響を、ウェスタンブロッティングおよびＭＴＴ  ａｓｓａｙにより評価した。
なお、今回用いた細胞株は、臨床上問題視されている細胞株であり、外陰部扁平上皮癌細胞と肺腺癌細胞である。これらの細胞株はＥＧＦＲ−ＴＫＩと呼ばれるＥＧＦＲ阻害剤に効果が認められる細胞株であるが、ＩＧＦ−ＩやＨＧＦなどのリガンド存在下ではＥＧＦＲ−ＴＫＩの効果がキャンセルされてしまう。例えば、外陰部扁平上皮癌細胞であるＡ４３１細胞はＧｅｆｉｔｉｎｉｂに感受性を示すが、ＩＧＦ−Ｉ存在下では耐性を示す。また、肺腺癌細胞であるＰＣ−９細胞はＧｅｆｉｔｉｎｉｂに感受性を示すが、ＨＧＦ存在下では耐性を示す。さらに、肺腺癌細胞であるＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞はＧｅｆｉｔｉｎｉｂに耐性を示す細胞株であるが（ＥＧＦＲの二重変異Ｔ７９０Ｍを有しているため、効果が見られない）、しかしながら、近年、次世代型のＥＧＦＲ−ＴＫＩが開発され、ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅなＥＧＦＲ−ＴＫＩとしてＣＬ−３８７，７８５が誕生し、感受性を示すようになり、臨床で使用されるようになった。しかし、さらに現在問題になっているのは、このＣＬ−３８７，７８５とＨＧＦ存在下では耐性を示すことである。これらの細胞株での耐性の理由は、ＩＧＦ−ＩやＨＧＦによってＩＧＦ−ＩＲやＭＥＴなどのＥＧＦＲとは異なる他のＲＴＫ（受容体型チロシンキナーゼ）が活性化してしまうためである(バイパス経路)。
図１３（１）下図は、外陰部扁平上皮癌細胞株としてＡ４３１を用いた際のＩＧＦ−ＩおよびＧｅｆｉｔｉｎｉｂ存在下でのＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフで、ＲＯＲ１の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図１３（１）上図は、Ａ４３１を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、ＲＯＲ１の発現抑制により、生存シグナルに関与するＡＫＴとＩＧＦ−ＩＲのリン酸化の低下を確認した。
図１３（２）下図は、肺腺癌細胞株としてＰＣ−９を用いた際のＨＧＦおよびＧｅｆｉｔｉｎｉｂ存在下でのＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフで、ＲＯＲ１の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図１３（２）上図は、ＰＣ−９を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、ＲＯＲ１の発現抑制により、生存シグナルに関与するＡＫＴとＭＥＴのリン酸化の低下を確認した。
図１３（３）下図は、肺腺癌細胞株としてＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際のＨＧＦおよびＣＬ−３８７，７８５存在下でのＭＴＴ  ａｓｓａｙの結果を表すグラフで、ＲＯＲ１の発現抑制により細胞増殖の低下を確認した。また、図１３（３）上図は、ＮＣＩ−Ｈ１９７５を用いた際のウェスタンブロッティング写真で、生存シグナルに関与するＡＫＴとＭＥＴのリン酸化の低下を確認した。
図１３（１）〜（３）に示すように、様々なリガンド存在下でのＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性を獲得した細胞株においても、ＲＯＲ１の発現抑制は生存シグナルの低下（ＡＫＴのリン酸化の低下）を引き起こし、増殖低下を引き起こすことが判明した(同様にｃａｖｉｎ−１やＣＡＶ１の発現抑制においても増殖低下を確認した)。つまり、ＲＯＲ１の発現抑制によって、ＩＧＦ−ＩＲやＭＥＴのリン酸化反応の低下がウェスタンブロッティングによって認められたことから、ＲＯＲ１の発現抑制は癌特異的にカベオラの形成を阻害するので、カベオラに存在しているＲＴＫの活性化が抑制されることを示している。この結果は、実際にこのような薬剤耐性を持つ患者に対しても臨床的に効果を示す可能性を示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の癌細胞のカベオラの形成を特異的に抑制する化合物のスクリーニング方法により、カベオラの形成に寄与するＣａｖｉｎ−１及びＣＡＶ１の結合を単一の化合物で抑制し、ＲＴＫの活性を一網打尽に阻害できる可能性が有る。したがって、副作用等の少ない画期的な医薬品開発が可能である。また、癌細胞中のＲＯＲ１とＣａｖｉｎ−１、ＲＯＲ１とＣＡＶ１、ＩＧＦ−ＩＲとＣａｖｉｎ−１、ＩＧＦ−ＩＲとＣＡＶ１、Ｃａｖｉｎ−１とＣＡＶ１、又はＣａｖｉｎ−１の発現の組み合わせを調べることで上記スクリーニングにより得られた分子標的薬の適応患者を事前に選択することができる。したがって、分子標的薬に効果がある患者のみに医薬品を処方できるので、医療機関における副作用の少ない癌治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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