(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロスポリンとトレハロースとを有効成分として含む点眼剤であって、前記シクロスポリン：トレハロースの重量比が１：５０〜１５０であり、前記点眼剤の総重量に対する前記シクロスポリンの含有量が０．０１重量％超０．０２重量％以下及び前記トレハロースの含有量が１重量％以上７．５重量％以下であることを特徴とする、眼球乾燥による障害の改善、治療または予防のための点眼剤。
【請求項２】
前記トレハロースの含有量が１重量％以上３重量％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項３】
前記眼球乾燥による障害が、乾燥角膜結膜炎、角結膜上皮障害、涙液分泌減少症、スチーブンス・ジョンソン症侯群、眼球乾燥症侯群、シェーグレン症侯群、涙欠乏症、眼球充血、涙膜不安定、または眼球浮腫；アレルギー性結膜炎、ウイルス性結膜炎、または白内障手術後の眼球乾燥；及びコンタクトレンズ着用関連の眼球乾燥またはＶＤＴ作業関連の眼球乾燥からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項４】
前記角結膜上皮障害が、乾性眼、角膜上皮欠損、結膜上皮欠損、角膜上皮浸食、角膜厚の減少、角膜浸潤、角膜穿孔または角膜上皮脱落；角膜潰瘍、角膜炎、結膜炎、点状表層角膜症、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角膜炎、角膜潰瘍及び角結膜上皮の感染性眼疾患；眼球内外傷、微細手術またはハードコンタクトレンズ着用関連の角結膜上皮障害からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載の点眼剤。
【請求項５】
剤形が点眼液であることを特徴とする、請求項１に記載の点眼剤。
【請求項６】
透明ナノエマルションタイプの点眼液であることを特徴とする、請求項５に記載の点眼剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼科用組成物、その製造方法及び眼科疾患を予防または治療する方法に関する。
【０００２】
本出願は、２０１４年１０月１７出願の韓国特許出願第１０−２０１４−０１４１０８９号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
涙は油性層、水性層及び粘液質層からなり、涙膜はこれらの３層構造を示す。眼球乾燥又は乾燥眼球（以下、「眼球乾燥」と称する）の概念は広範囲であり、その原因も殆どの場合において明らかになっていないため、眼球乾燥は、単一疾病ではなく、涙の量又は質に減少や変動が生じて涙膜が正常より速く消滅し、涙膜が不安定な非正常的な眼球状態として定義される。
【０００４】
上記の定義によれば、眼球乾燥の範疇には、乾燥角膜結膜炎、角結膜上皮障害、涙液分泌減少症、スチーブンス・ジョンソン症侯群、眼球乾燥症侯群、シェーグレン症侯群、涙欠乏症、眼球充血、涙膜不安定、または眼球浮腫などのような疾病が含まれる。また、眼球乾燥の範疇には、アレルギー性結膜炎、ウイルス性結膜炎、または白内障手術後の眼球乾燥が含まれる。また、近年コンタクトレンズ使用者の増加、人工的に空調された環境で過ごす時間の増加、テレビ及びコンピュータなどの幅広い使用によるＶＤＴ（視覚表示端末機）の使用増加によって眼球乾燥を促進する因子が大幅に増え、結果的に眼球乾燥の範疇にはコンタクトレンズ着用関連の眼球乾燥またはＶＤＴ作業関連の眼球乾燥が含まれる。
【０００５】
また、眼球乾燥を患う場合、多くの場合において、角結膜炎性障害を誘発する。特に、粘液質層に涙が足りない場合、角膜損傷が深刻になり、角結膜上皮障害につながる。角結膜上皮障害の範疇には、乾性眼、角膜上皮欠損、結膜上皮欠損、角膜上皮浸食、角膜厚の減少、角膜浸潤、角膜穿孔または角膜上皮脱落などが含まれ、角結膜上皮障害から角膜潰瘍、角膜炎、結膜炎、点状表層角膜症、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角膜炎、角膜潰瘍及び角結膜上皮の感染性眼疾患などが誘発される。角結膜上皮障害は眼球内外傷、微細手術またはハードコンタクトレンズの着用によっても起きる。
【０００６】
眼球乾燥の治療では、人工涙点眼液を入れるか、それとも、涙道を一時的又は永久的に塞ぐなどの保存的な方法によって一定量以上の涙を維持させることに焦点を置いたが、近年は治療概念の拡大から、症状緩和を目的とする消極的治療から軽度の眼球乾燥でも涙液分泌を促進する治療剤を使用する積極的な治療へと眼球乾燥治療の傾向が変化している。このような変化の一環として、眼球乾燥治療のために免疫抑制剤の使用が増加している。このような免疫抑制剤には、シクロスポリン、シロリムス、タクロリムス及びこれらの誘導体などがある。そのうち、市販されている薬物の１つがシクロスポリンＡ０．０５％エマルション剤形点眼液（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））である。これは眼球乾燥症侯群及びこれと関連する角結膜上皮障害の治療に効果的であると知られているが、同時に多くの副作用が知られている。最もよく見られる異常反応は目の灼熱感であり、一部の患者からは結膜充血、分泌物、流涙症、目の疼痛、異物感、掻痒感、刺痛、視力障害（時々視野混濁）などが報告されている。イ・ジウン等の論文によれば、シクロスポリン０．０５％を１０分間接触させた結果、細胞自滅死の増加及び細胞生存率の減少が現れ、角膜上皮細胞への毒性なく使用するためには０．０５％シクロスポリンを１０分未満に露出せねばならないとし（J Korean Ophthalmol Soc 48(10)：1399〜1409、2007）、シクロスポリン０．０５％（５μｇ／ｍＬ）以上では細胞生存性が著しく減少するとしている（Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol (2006)244：382〜389）。
【０００７】
シクロスポリンの外にも免疫抑制剤を過量使用する場合は、貧血、白血球減少症、血小板減少症、脱毛などの副作用がある。しかし、最近は重度の眼球乾燥の治療だけでなく軽微な場合でも、臨床症状が不便であれば眼球乾燥の治療のために積極的に免疫抑制剤が使用されている。さらに、一般に乾性眼患者は薬物の種類及び使用回数が多く、これらの要因は薬物順応度を低減させ、治療効果も減少させると知られている。
【０００８】
一方、トレハロースは、２つのグルコース分子がこれらの還元性残基で共に結合された二糖であり、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース及びβ，β−トレハロースの３種の光学異性体を有している。自然界ではトレハロースがバクテリア、植物及び動物に広く分布し、食品分野においてトレハロースは比較的低い甘味度、澱粉の老化防止及び凍結／乾燥時のタンパク質の変性防止などの特性に優れるため広く使用されている。また、韓国特許公開第１０−２００２−００２１３２０号公報（２００２．３．２０公開）には、トレハロースを単独有効成分とする組成物がシェーグレン症侯群の治療に効果があると記載されている。
【０００９】
しかし、シクロスポリンとトレハロースの２つの成分を全て含有する眼科用組成物、特に広範囲な眼球乾燥の予防、改善及び治療に対する効果については今まで知られておらず、さらにはこれら２つの成分の配合による相乗効果及びこのような相乗効果を奏するための重量比又は重量％範囲に対しては検討されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、シクロスポリンの使用量を減らしながらも同等又はそれ以上の効果を発揮するだけでなく、多様な経路によって発生し、単一疾病と言えない、多様な状態又は条件に置かれる眼球乾燥に複合的に優れた効果を奏する眼科用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を達成するため、本発明は、シクロスポリンとトレハロースの２つの成分を特定比率または特定重量％範囲で配合して含む眼科用組成物を提供する。本発明者らは、このような眼科用組成物が、シクロスポリンの使用量を減らしながらも同等又はそれ以上の効果を発揮し、さらにシクロスポリンを単独またはトレハロースを単独で有効成分とする組成物では発揮できない効果、例えば乾燥空気、眼炎症または防腐剤など多様な経路によって生じ得、多様な状態ないし条件に置かれる眼球乾燥に複合的に優れた効果を奏することを確認し、シクロスポリンとトレハロースとの複合剤として製造することで本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１２】
そこで、本発明は、シクロスポリンとトレハロースとを有効成分として含む眼科用組成物、その製造方法及びそれを用いて眼科疾患（望ましくは、眼球乾燥）を予防、改善または治療する方法を提供する。
【００１３】
より具体的に、本発明は、シクロスポリンとトレハロースとを有効成分として含む眼科用組成物、望ましくは眼球乾燥の予防、改善または治療のための眼科用組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、薬学的に有効な量のシクロスポリン及びトレハロースを含む眼科用組成物を哺乳類（望ましくは、人間）に投与して眼科疾患（望ましくは、眼球乾燥）を予防、改善または治療する方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、眼科用組成物（望ましくは、眼球乾燥の予防、改善または治療のための眼科用組成物）を製造するためのシクロスポリン及びトレハロースの用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】乾燥空気誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、角膜損傷抑制率の変化を示した図である。
【図２】コンカナバリン（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ）Ａ誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、涙分泌抑制率の変化を示した図である。
【図３】コンカナバリンＡ誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、角膜炎症改善率の変化を示した図である。
【図４】塩化ベンザルコニウム誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、シルマー検査変化量（上段）とＴＢＵＴ変化量（下段）を示した図である。
【図５】塩化ベンザルコニウム誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、ゴブレット細胞数を示した図である。
【図６】塩化ベンザルコニウム誘発眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、炎症変化量（上段）と眼刺激程度（下段）を示した図である。
【図７】眼球乾燥モデルに複合剤を処理し、細胞生存率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明による眼科用組成物において、前記２つの有効成分を特定比率で配合したとき相乗効果があり、さらに極大化するため、前記シクロスポリン：トレハロースの重量比は１：２０〜２００、１：２０〜１９０、１：２０〜１８０、１：２０〜１７０、１：２０〜１６０、１：２０〜１５０、１：２０〜１４０、１：２０〜１３０、１：２０〜１２０、１：２０〜１１０、１：２０〜１００、１：２０〜９０、１：２０〜８０、１：２０〜７０、１：２０〜６０、１：２０〜５０、１：２０〜４０、１：２０〜３０、１：２０、１：３０〜２００、１：３０〜１９０、１：３０〜１８０、１：３０〜１７０、１：３０〜１６０、１：３０〜１５０、１：３０〜１４０、１：３０〜１３０、１：３０〜１２０、１：３０〜１１０、１：３０〜１００、１：３０〜９０、１：３０〜８０、１：３０〜７０、１：３０〜６０、１：３０〜５０、１：３０〜４０、１：３０、１：４０〜２００、１：４０〜１９０、１：４０〜１８０、１：４０〜１７０、１：４０〜１６０、１：４０〜１５０、１：４０〜１４０、１：４０〜１３０、１：４０〜１２０、１：４０〜１１０、１：４０〜１００、１：４０〜９０、１：４０〜８０、１：４０〜７０、１：４０〜６０、１：４０〜５０、１：４０、１：５０〜２００、１：５０〜１９０、１：５０〜１８０、１：５０〜１７０、１：５０〜１６０、１：５０〜１５０であることが望ましい。重量比が１：２０未満であれば、多様な状態又は条件に置かれる眼球乾燥に複合的な効果を期待できず、１：２００を超えれば、点眼剤の有効浸透圧（約２３０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）を維持できなく、透明ナノエマルションを維持できないという短所がある。
【００１８】
さらに、前記２つの有効成分を特定重量％範囲で配合したとき相乗効果が奏され、さらに極大化するため、前記眼科用組成物の総重量を基準にシクロスポリンは０．０１重量％を超えて含むことができる。しかし、０．１重量％未満に含まれることが望ましく、０．１重量％を超えるシクロスポリンを使用する場合は、灼熱感、視野混濁などの副作用が生じる。シクロスポリンは前記眼科用組成物の総重量を基準に、０．０１重量％超過０．０５重量％以下、０．０１重量％超過０．０５重量％未満、０．０２重量％以上０．０５重量％以下、０．０２重量％以上０．０５重量％未満、０．０２重量％以上０．０５重量％以下、０．０１重量％超過０．０４重量％以下、０．０２重量％以上０．０４重量％以下、０．０１重量％超過０．０３重量％以下、０．０２重量％以上０．０３重量％以下、または０．０２重量％で含まれることが望ましい。
【００１９】
また、前記眼科用組成物の総重量を基準にトレハロースは、０．５重量％以上含むことができる。例えば、前記眼科用組成物の総重量を基準にトレハロースは、０．５重量％以上、０．６重量％以上、０．７重量％以上、０．８重量％以上、０．９重量％以上、１重量％以上、１．１重量％以上、１．２重量％以上、１．３重量％以上、１．４重量％以上、１．５重量％以上、１．６重量％以上、１．７重量％以上、１．８重量％以上、１．９重量％以上、２重量％以上、２．１重量％以上、２．２重量％以上、２．３重量％以上、２．４重量％以上、２．５重量％以上、２．６重量％以上、２．７重量％以上、２．８重量％以上、２．９重量％以上、３重量％以上、３．１重量％以上、３．２重量％以上、３．３重量％以上、３．４重量％以上、３．５重量％以上、３．６重量％以上、３．７重量％以上、３．８重量％以上、３．９重量％以上、４重量％以上、４．１重量％以上、４．２重量％以上、４．３重量％以上、４．４重量％以上、４．５重量％以上、４．６重量％以上、４．７重量％以上、４．８重量％以上、４．８重量％以上、４．９重量％以上、５重量％以上、７．５重量％以下、０．５〜７．５重量％、０．５〜７重量％、０．５〜６．５重量％、０．５〜６重量％、０．５〜５．５重量％、０．５〜５重量％、０．５〜４．５重量％、０．５〜４重量％、０．５〜３．５重量％、０．５〜３重量％、０．６〜７．５重量％、０．６〜７重量％、０．６〜６．５重量％、０．６〜６重量％、０．６〜５．５重量％、０．６〜５重量％、０．６〜４．５重量％、０．６〜４重量％、０．６〜３．５重量％、０．６〜３重量％、０．７〜７．５重量％、０．７〜７重量％、０．７〜６．５重量％、０．７〜６重量％、０．７〜５．５重量％、０．７〜５重量％、０．７〜４．５重量％、０．７〜４重量％、０．７〜３．５重量％、０．７〜３重量％、０．８〜７．５重量％、０．８〜７重量％、０．８〜６．５重量％、０．８〜６重量％、０．８〜５．５重量％、０．８〜５重量％、０．８〜４．５重量％、０．８〜４重量％、０．８〜３．５重量％、０．８〜３重量％、０．９〜７．５重量％、０．９〜７重量％、０．９〜６．５重量％、０．９〜６重量％、０．９〜５．５重量％、０．９〜５重量％、０．９〜４．５重量％、０．９〜４重量％、０．９〜３．５重量％、０．９〜３重量％、１〜７．５重量％、１〜７重量％、１〜６．５重量％、１〜６重量％、１〜５．５重量％、１〜５重量％、１〜４．５重量％、１〜４重量％、１〜３．５重量％、１〜３重量％で含まれ得る。トレハロースを０．５重量％未満に使用すれば、多様な状態又は条件に置かれる眼球乾燥に複合的な効果を期待できず、トレハロースを７．５重量％超過に使用すれば、点眼剤の有効浸透圧（約２３０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）を維持できなく、透明ナノエマルションを維持できないという短所がある。
【００２０】
例えば、前記眼科用組成物は、シクロスポリン０．０１重量％超過０．１重量％未満及びトレハロース０．５〜７．５重量％を含み得、シクロスポリン０．０１重量％超過０．０５重量％未満及びトレハロース０．５〜５重量％を含み得、シクロスポリン０．０１重量％超過０．０５重量％未満及びトレハロース０．５〜３．５重量％を含み得、シクロスポリン０．０２重量％以上０．０５重量％未満及びトレハロース０．５〜５重量％を含み得、シクロスポリン０．０２重量％以上０．０５重量％未満及びトレハロース０．５〜３．５重量％を含み得、シクロスポリン０．０２重量％以上０．０５重量％未満及びトレハロース１〜３重量％を含み得、シクロスポリン０．０２重量％及びトレハロース１〜３重量％を含み得る。
【００２１】
本発明による眼科用組成物は、シクロスポリンとトレハロースとの相乗作用のため、上述した重量比または重量％範囲、あるいは重量比及び重量％範囲内でシクロスポリン及びトレハロースを含むことが望ましい。
【００２２】
本発明において、用語「相乗作用」とは、シクロスポリンを単独でまたはトレハロースを単独で有効成分とする眼科用組成物と比べて、眼科用組成物に組成物全体重量％を基準に同量の有効成分が含まれていることを前提にし、シクロスポリン単独またはトレハロース単独の有効成分含有眼科用組成物で発揮される同じ適応症に対する効果が改善または向上されるか、シクロスポリン単独またはトレハロース単独の有効成分含有眼科用組成物で発揮されない適応症に対して効果を奏するか、あるいは、シクロスポリン単独またはトレハロース単独の有効成分含有眼科用組成物で問題となる副作用または短所が解消される場合などが含まれ得る。例えば、乾燥空気誘発眼球乾燥モデル、炎症誘発眼球乾燥モデル及び防腐剤誘発眼球乾燥モデルの全てで、シクロスポリン単独またはトレハロース単独投与に比べて著しく上昇する治療効果、角膜損傷率の減少、涙分泌量の正常化、眼炎症の減少、涙質の向上、眼刺激（結膜の発赤、浮腫及び排出物の増加など）の減少、涙膜維持、潤滑及び保湿などの効果発揮、ムチン（ｍｕｃｉｎ）分泌を担当するゴブレット細胞（ｇｏｂｌｅｔｃｅｌｌ）を増加させる活性を見せてムチン分泌量を増加させる効果などが含まれ得る。
【００２３】
本発明において、「シクロスポリン」または「トレハロース」は本発明の目的から逸脱しない以上、その製造方法と由来とは関係なく使用することができる。
【００２４】
また、前記シクロスポリンは、その活性成分としてシクロスポリンＡ、シクロスポリンＡ誘導体、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ及びこれらの混合物を含むことができ、望ましくはシクロスポリンＡを含むことができる。前記トレハロースはその活性成分として３種の光学異性体、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、β，β−トレハロース及びこれらの混合物を含むことができる。
【００２５】
また、本発明において、用語「シクロスポリン」または「トレハロース」はこれらの薬学的に許容可能な誘導体を包括して定義され、薬学的に許容可能な誘導体はシクロスポリンまたはトレハロースと同じ生物学的機能及び／または活性を有するか又は提供するものとして認識され、本発明の目的から逸脱しない以上、シクロスポリンまたはトレハロースのプロドラッグ、これらの溶媒化物、これらの共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ）が含まれ得る。
【００２６】
前記用語「プロドラッグ」とは、投与後、代謝を経て所定時間内に実験的に検出可能な量のシクロスポリンまたはトレハロースが形成されることを意味する。
【００２７】
前記用語「溶媒化物」は、非共有分子間の力によって結合された化学量論的または非化学量論的量の溶媒をさらに含む化合物を意味する。溶媒が水である場合、溶媒化物は水化物である。
【００２８】
前記用語「共結晶」は、結晶格子内に１つ以上の化合物を含む結晶性形態を意味する。共結晶は、非イオン性相互作用を通じて結晶格子内に一緒に結合された２つ以上の非揮発性化合物の結晶性分子複合体を含む。本発明において、共結晶はシクロスポリン又はトレハロース、及び１つ以上の追加的非揮発性化合物（以下、カウンター分子と称する）を含む結晶性分子複合体である薬学的共結晶を含む。薬学的共結晶において、カウンター分子は例えば、食品添加物、防腐剤、医薬品賦形剤、または他のＡＰＩｓのような非毒性の薬学的に許容可能な分子であり得る。一部の実施例において、薬学的共結晶はＡＰＩの化学構造的完全性を阻害せず、医薬品の一部物理的特性（例えば、可溶性、溶解速度、生物学的利用可能性／安定性など）を向上させる。
【００２９】
その薬学的に許容可能な誘導体を含むシクロスポリン及びその薬学的に許容可能な誘導体を含むトレハロースは、化学的または酵素的に当分野で公知された多様な方法によって製造でき、または市販されている商品を購入して使用することもできる。
【００３０】
本発明による眼科用組成物は、有効成分としてシクロスポリンとトレハロースとを混合して製造することができる。
【００３１】
本発明による眼科用組成物は、薬学組成物、医薬外品組成物、健康食品組成物などとして製造することができる。
【００３２】
本発明による眼科用組成物には、薬学的に（または食品学的に）許容可能な担体、賦形剤または希釈剤などのような添加剤が含まれ得、添加剤で考慮すべき特性としてはシクロスポリン及びトレハロースとの相溶性、生体親和性、加工温度などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３３】
本発明による眼科用組成物は、眼科用液剤、眼軟膏、注射液、洗眼薬（ｅｙｅｗａｓｈ）などのような非経口用製剤、または錠剤、カプセル及び顆粒などのような経口用製剤で製造でき、望ましい投与型は眼科用液剤であり、最も望ましい投与型は点眼液である。
【００３４】
眼科用液剤で製造される場合、眼科用液剤として使用される任意の投与形態、例えば、水性眼科用液剤、水性エマルション眼科用液剤、粘性眼科用液剤及び溶解された眼科用液剤などのような水性眼科用液剤；または非水性眼科用液剤及び非水性エマルション眼科用液剤のような非水性眼科用液剤として提供され得る。
【００３５】
水性エマルション眼科用液剤で製造される場合、本発明の目的から逸脱しない以上、当分野で公知された多様な添加剤が含まれ得、例えば等張化剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、増粘剤、防腐剤、キレート剤、可溶化剤及び溶媒などが含まれ得る。緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤（例えば、酢酸ナトリウム）トロメタミン及びアミノ酸からなる群より選択できるが、それに限定されない。望ましくは、リン酸塩緩衝剤を使用することができる。等張化剤は、ソルビトール、グルコースエリスリトール及びマンニトールのような糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのような多価アルコール、及び塩化ナトリウムのような塩からなる群より選択できるが、それに限定されない。防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル及びパラオキシ安息香酸エチルのようなパラオキシ安息香酸アルキル、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸及びその塩、チメロサール、ポリクオタニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ）、臭化ベンゾドデシニウム（ｂｅｎｚｏｄｏｄｅｃｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、オキシクロロ複合体及びクロロブタノールからなる群より選択できるが、それに限定されない。安定化剤は、シクロデキストリン及びその誘導体、ポリビニルピロリドンのような水溶性重合体、及びポリソルベート８０（ツイーン８０（登録商標））、ポリソルベート２０、チロキサポールのような界面活性剤からなる群より選択できるが、それに限定されない。ｐＨ調節剤は、塩酸、酢酸、リン酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、モノエタノールアミン、アンモニア水及び水酸化アンモニウムからなる群より選択できるが、それに限定されない。増粘剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボマー、ポビドン、ポロキサマー、ポリカルボフィル及びその塩からなる群より選択できるが、それに限定されない。キレート剤は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び凝縮リン酸ナトリウムからなる群より選択できるが、それに限定されない。可溶化剤または溶媒は、グリセリン、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ、Ｎ−メチルピロリドン、エタノール、ベンジルアルコール、イソプロピルアルコール、多様な分子量のポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールなどが選択できるが、それに制限されない。溶媒又は可溶化剤で使用できる成分の一部は重なることもあり、任意の成分が溶媒又は可溶化剤の１つとして使用できるため、任意の成分が製剤内で溶媒の役割をすれば溶媒と見なし、溶媒の役割をしなければ可溶化剤として見なせる。または、可溶化剤は一部変形において界面活性剤であり得る。多様な種類の界面活性剤を含む界面活性剤の組合せが使用され得る。例えば、非イオン性、陰イオン性（すなわち、石鹸、スルホネート）、陽イオン性（すなわち、ＣＴＡＢ）、双性イオン、重合体性、両性界面活性剤が使用され得る。例えば、使用可能な界面活性剤は、１０、１１、１２、１３または１４���上のＨＬＢを有するものを含むが、これらに制限されない。界面活性剤の例としては、水素化された植物性オイルのポリオキシエチレン産物、ポリエトキシ化ヒマシ油またはポリエトキシ化水素化ヒマシ油、ポリオキシルヒマシ油またはその誘導体、ポリオキシエチレン−ソルビタン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施例によれば、本発明の眼科用組成物は、組成物の総重量を基準にシクロスポリン０．０１重量％超過０．１重量％未満、トレハロース０．５〜７．５重量％、可溶化剤１〜１０重量％、溶媒０．０１〜２重量％、残量の緩衝剤及び等張化剤で構成することができる。
【００３６】
水性エマルション眼科用液剤は、望ましくはナノエマルションタイプで製造でき、この場合、本発明の目的から逸脱しない以上、当分野で公知された多様な添加剤を含むことができ、例えばオイル及び界面活性剤などが含まれ得る。前記オイルは、モノカプリル酸プロピレングリコ−ル、ラウリン酸プロピレングリコール、炭素数８〜１０の中鎖トリグリセライド（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ（Ｃ８〜Ｃ１０）ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、グリセリル−１，３−ジオレート、グリセリルモノオレート及びグリセリルリノレートからなる群より１種以上選択することができる。前記界面活性剤は、オレオイルマクロゴールグリセライド（ｏｌｅｏｙｌ  ｍａｃｒｏｇｏｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、リノレオイルマクロゴールグリセライド（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｍａｃｒｏｇｏｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、カプリロカプロイルポリオキシグリセライド（ｃａｐｒｙｌｏｃａｐｒｏｙｌ  ｐｏｌｙｏｘｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル３５水素化ヒマシ油、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油、ポリオキシル６０水素化ヒマシ油、エチレンオキサイドと１２−ヒドロキシステアリン酸との縮合生成物及びポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ社製、英国）からなる群より１種以上選択することができる。
【００３７】
最も望ましくは、水性エマルション眼科用液剤は、透明ナノエマルションタイプ点眼液として製造でき、これを製造するため、例えば韓国特許登録第１０−０９３８５００号公報を参照できるが、それに制限されない。
【００３８】
本発明による眼科用組成物は、眼科疾患の改善用、予防用又は治療用で使用でき、望ましくは眼球乾燥による障害の改善、予防または治療に使用することができる。
【００３９】
前記「眼球乾燥による障害」には、乾燥角膜結膜炎、角結膜上皮障害、涙液分泌減少症、スチーブンス・ジョンソン症侯群、眼球乾燥症侯群、シェーグレン症侯群、涙欠乏症、眼球充血、涙膜不安定、または眼球浮腫；アレルギー性結膜炎、ウイルス性結膜炎、または白内障手術後の眼球乾燥；及びコンタクトレンズ着用関連の眼球乾燥またはＶＤＴ作業関連の眼球乾燥などが含まれ得る。
【００４０】
また、前記「角結膜上皮障害」には、乾性眼、角膜上皮欠損、結膜上皮欠損、角膜上皮浸食、角膜厚の減少、角膜浸潤、角膜穿孔または角膜上皮脱落；角膜潰瘍、角膜炎、結膜炎、点状表層角膜症、乾性角結膜炎、上輪部角結膜炎、糸状角膜炎、角膜潰瘍及び角結膜上皮の感染性眼疾患；眼球内外傷、微細手術またはハードコンタクトレンズ着用関連の角結膜上皮障害などが含まれ得る。
【００４１】
哺乳類、特に人間の治療法及び／または予防法において、本発明による眼科用組成物の投与量は、医療従事者や関連の通常の技術者によって通常決定され得る。例えば、本発明による組成物を成人眼球乾燥患者に点眼液として使用する場合、シクロスポリンとトレハロースとを有効成分として含む眼科用組成物の望ましい投与量は、例えば０．０２重量％のシクロスポリン及び１〜３重量％のトレハロースを含む点眼液を、１回当り１〜４滴（約０．０２５〜０．１ｍＬ）の投与量で、１日当り１〜１０回まで投与できるが、これに制限されず、医療従事者や関連の通常の技術者が治療する患者の年齢、体重、性別及び反応だけでなく、治療する状況などによって最も好適な実際投与量を決定することができる。
【００４２】
本発明による眼科用組成物は、滅菌容器内に充填して提供でき、その使用に関する指導書と共に提供でき、前記指導書は前記眼科用組成物を充填した容器または前記容器を包装した第２容器に物理的に貼り付けるか又は第２容器の内部に共に包装され得る。
【００４３】
シクロスポリンとトレハロースの２つの成分を特定比率及び／または特定含量で配合して含む本発明による眼科用組成物は、乾燥空気誘発、炎症誘発及び防腐剤誘発など多様な経路によって生じ得、多様な状態又は条件に置かれる眼球乾燥に複合的に優れた効果を示す。より具体的に、シクロスポリンの使用量を減らしながらも同等又はそれ以上の効果を発揮する。さらに、シクロスポリン単独またはトレハロース単独投与に比べて著しく上昇した治療効果を見せ、角膜損傷率の減少、涙分泌量の正常化、眼炎症の減少、涙質の向上、眼刺激（結膜の発赤、浮腫及び排出物の増加など）の減少、涙膜維持、潤滑及び保湿などの効果を奏し、特にムチン分泌を担当するゴブレット細胞を増加させる活性を見せてムチン分泌量を増加させる効果を奏する。
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例の記載範囲内に制限されないことは当業界で通常の知識を持つ者に自明である。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１．試験物質の製造＞
下記表１（多様な濃度のシクロスポリンＡ及びトレハロースを含む組成物）のＡ〜Ｊの各組成比率に従い、シクロスポリンを可溶化剤であるポリオキシル３５ヒマシ油に混合して可溶化した。ｐＨを７．２にしたリン酸塩緩衝液にグリセリンを各組成に従って混合した後、可溶化したシクロスポリン溶液を分散させてエマルションを製造した。製造したシクロスポリンエマルション溶液にトレハロース及び等張化剤を使用して浸透圧を約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに調整した。
【００４６】
【表１】
0006611803.tif 000002
【００４７】
＜試験例１．乾燥空気誘発眼球乾燥モデルにおける治療効果＞
試験物質
上述した実施例１によって製造した組成物Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｊを試験物質として実験に用いた。
【００４８】
実験動物
実験動物として大韓バイオリンク（韓国、忠清北道陰城郡）から供給された６週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをラット用ケージに４匹ずつ収容した。動物は約１週間順化期間を経た後、実験に使用した。動物実験室の環境は、温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、換気回数１２回／時間、照明周期１２時間、照度１５０〜３００Ｌｕｘに調節した。バイオピア（韓国、京畿道軍浦市）から供給された実験動物用ペレット型固形飼料ＰｕｒｉｎａＲａｔ Ｃｈｏｗ（登録商標）を給与し、滅菌精製水を自由に飲ませた。
【００４９】
眼球乾燥の誘発及び試験物質の処置
実験動物を送風機の風に露出させる３０分前に２０μｌの試験物質を両側の目にそれぞれ点眼した。点眼３０分経過後、涙分泌を抑制するために２０ｍｇ／ｋｇのアトロピン（ａｔｒｏｐｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を腹腔内に投与し、動物を一定姿勢で維持して目の瞬きを防止するため、Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）（ＶｉｒｂａｃＫｏｒｅａ、韓国、ソウル）を筋肉内に注射して麻酔させた。麻酔された動物を、両眼球が風に正面から露出するように送風機の前に固定させ、目が相対湿度２５〜３５％の空気に風速２ｍ／ｓｅｃで露出するように距離を調節した。乾燥空気露出時点（０分）から２０分間隔で３時間に亘って試験物質を総１０回繰り返して点眼するが、点眼後、物質が眼球に均一に広がるようにまぶたを約１０秒間閉じてから眼球が空気に露出するようにした。実験時間中、実験動物の姿勢が崩れるか又は目を瞑らないように観察して随時姿勢を補正した。
【００５０】
角膜損傷程度の測定
角膜の損傷程度は「Kim et al．、(2010) Comparative effectiveness of distilled water and isotonic saline in a rat model of dry eye. Journal of Biomedical Research 11(4)：211〜218」の方法によって評価した。眼球乾燥を誘発し試験物質を点眼した動物の結膜袋に、平衡生理食塩水に１％で製造した５μｌのフルオレセイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を点眼し、１時間絆創膏を用いて目を閉ざしておいた。透過しない余分の染料（ｄｙｅ）を食塩水で洗い流した後、眼球を摘出した。摘出した眼球に対し、タングステンランプ下で角膜に浸透したフルオレセインの緑色蛍光浸透領域を観察して写真撮影した。撮影した写真をＩｍａｇｅ  Ｊ  １．３８ｘプログラムで分析し、フルオレセインの浸透領域を数値化した。角膜内に透過したフルオレセインを定量するため、摘出した角膜をカリウム緩衝食塩水（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）１ｍｌに沈積し、２４時間溶出させた後、蛍光光度計を用いて励起４８５ｎｍ、発光５３８ｎｍで蛍光を測定して緑色蛍光発光程度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を評価した。フルオレセインの角膜浸透及び発光程度が高い場合、角膜の防御壁機能の消失を意味するため、浸透及び発光程度が低いほど試験物質の効果が高いと判定した。
【００５１】
病理組織学的検査
試験終了後、すべての実験動物は二酸化炭素ガス下で窒息させて殺処分した。摘出した眼球はデビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）溶液で７〜２４時間固定した後、１０％中性ホルマリンで２４時間以上固定して組織切片を製作し、ヘマトキシリン・エオジン染色した後、×１００視野の光学顕微鏡で角膜の上皮損傷及び角膜の厚さを測定した。剖検時に摘出した結膜組織は１０％中性ホルマリン溶液に固定した後、組織切片を製作し、過ヨウ素酸シッフ染色（以下、ＰＡＳ染色）した後、×１００視野の光学顕微鏡でムチン様糖タンパク質を含有又は放出したゴブラット細胞の数を数えた。
【００５２】
結果
本実験条件によれば、エアコンや乾燥室内空気による眼球乾燥と類似の原理によって眼球乾燥が誘発される。対照群としては、実施例１によって製造した組成物Ａ処理群を使用した。蛍光染色された角膜の浸透領域（ａｒｅａ）（％）及び発光程度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（％）は、対照群の蛍光染色された角膜の浸透領域（％）及び発光程度（％）をそれぞれ１００％にして相対的な値を算出した。
【００５３】
浸透領域（％）または発光程度（％）＝［１−（対照群−試験群）／対照群］×１００
【００５４】
角膜損傷抑制率（％）は、前記角膜浸透領域（％）及び発光程度（％）の平均値の和を算出し、次のような算式によって計算した。
【００５５】
角膜損傷抑制率（％）＝［（対照群−試験群）／対照群］×１００
【００５６】
３時間にわたる乾燥空気による眼球乾燥の誘発は角膜表面の蛍光強度を大きく増加させ、蛍光物質の浸透も深く現れた。その結果を図１に示したが、本発明による複合剤に該当する組成物Ｊの角膜損傷抑制率（％）が約４０％に達することを確認することができた。これに対し、有効成分としてシクロスポリンＡを単独で含む組成物（組成物Ｃ及びＤ）では角膜損傷の治療に効果が殆どなく、組成物Ｄの場合、却って角膜損傷が悪くなることを確認できた。また、有効成分としてトレハロースを単独で含む組成物（組成物Ｅ、Ｆ）では、角膜損傷に有効な効果を示したものの、本発明による複合剤に該当する組成物Ｊに比べてはかなり低い角膜損傷予防効果を示した。さらに、シクロスポリンＡとトレハロースを全て含み、シクロスポリンＡ：トレハロースを１：３００の重量比で含む組成物Ｉの場合、トレハロース単独含有組成物に比べても低い角膜損傷予防効果を示した。また、乾燥空気による眼球乾燥で実施例１によって製造した試験物質を処理した結果、本発明の複合剤（組成物Ｊ）処理群でムチン様糖タンパク質を含有又は放出したゴブラット細胞の数が著しく増加することが分かった。
【００５７】
＜試験例２．コンカナバリンＡ誘発眼球乾燥モデルにおける治療効果＞
試験物質
上述した実施例１によって製造した組成物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊを試験物質として実験に使用した。
【００５８】
実験動物
実験動物として（株）セムタコ（韓国、京畿道烏山市）から供給された１．８〜２．０ｋｇの雌ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ（ＮＺＷ）ウサギをウサギ用ケージに１匹ずつ収容した。動物は約１週間順化期間を経た後、実験に使用した。
【００５９】
動物実験室の環境は、温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、換気回数１２回／時間、照明周期１２時間、照度１５０〜３００Ｌｕｘに調節した。（株）セムタコから供給されたウサギ用ペレット型固形飼料ＮＩＨ＃３２Ｍを給与し、滅菌精製水を自由に飲ませた。ウサギの両側の眼球は試験開始２４時間前にあらかじめ眼検査を行って眼球損傷など角膜の損傷がない動物のみを使用した。
【００６０】
コンカナバリンＡ及び試験物質の処置
実験動物を対象にＺｏｌｅｔｉｌ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇとキシラジン６ｍｇ／ｋｇを筋肉内に注射して麻酔させた後、生理食塩水に１０ｍｇ／ｍｌ濃度にしたコンカナバリンＡ（以下、ＣｏｎＡ）を両側上眼瞼の主涙腺と副涙腺にインシュリン注射器（３１−ｇａｕｇｅｎｅｅｄｌｅ）を用いてそれぞれ５０μｌずつ注入した。ＣｏｎＡを注入して２４時間後、それぞれの試験物質を一日４回ずつ３日間点眼するが、点眼後、物質が眼球に均一に広がるようにまぶたを約１０秒間閉じておいた。眼球は毎日１回ずつ一般症状の観察及び撮影を行った。
【００６１】
涙分泌量の測定（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｔｅｓｔ）
涙分泌量の改善を評価するため、塩化コバルト紙（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｐａｐｅｒ）の一端を外眼角下眼瞼に当てて３０秒間濡らした。涙分泌量が減少する場合、眼球乾燥が促進されるため、分泌量が多いほど試験物質の効果が大きいと判定した。実施例１によって製造した組成物Ａ処理群を対照群として使用した。
【００６２】
涙分泌抑制率（％）＝［１−（試験群−対照群）／対照群］×１００
【００６３】
角膜染色及び炎症程度の判定
角膜染色及び炎症程度の判定は「Pauly et al．、(2007) New tools for the evaluation of toxic ocular surface changes in the rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science.」の方法によって実施した。
【００６４】
試験物質の点眼開始後、４日目に角膜の障害部分をフルオレセインで染色し、角膜の上部、中間部及び下部のそれぞれに対してフルオレセインによる染色の程度を下記の基準によって点数判定して、前記各部の点数合計の平均値を求めた。
【００６５】
（判定基準）
０：染色されていない。
１：染色が粗く、各点状の染色部分は離れている。
２：染色が中間程度であり、点状の染色部分の一部が隣接している。
３：染色が稠密であり、各点状の染色部分は隣接している。
【００６６】
実施例１によって製造した組成物Ａ処理群を対照群として使用した。前記判定基準に従って求めた各部（角膜の上部、中間部及び下部）の点数合計の平均値を下記式に代入して角膜炎症改善率（％）を算出した。
【００６７】
角膜炎症改善率（％）＝（対照群−試験群）／対照群×１００
【００６８】
病理組織学的検査
試験物質の投与１０日目に眼球乾燥の評価及び眼刺激性の評価を行った後、二酸化炭素ガス下で窒息させて殺処分した。剖検時に摘出した角膜及び結膜組織は１０％中性ホルマリン溶液に固定した後、組織切片を製作し、ＰＡＳ染色した後、×１００視野の光学顕微鏡下でムチン様糖タンパク質を含有又は放出したゴブラット細胞の数を数えた。
【００６９】
結果
ＣｏｎＡは炎症誘発物質であり、ウサギの涙腺にＣｏｎＡを投与すれば、炎症によって涙分泌量の減少、角膜損傷、涙腺内の炎症などの眼炎症が誘発される。ＣｏｎＡ誘発眼炎症に実施例１によって製造した試験物質を処理した結果の涙分泌抑制率（％）及び角膜炎症改善率（％）をそれぞれ図２及び図３に示した。
【００７０】
シクロスポリン単独処理群及びトレハロース単独処理群（組成物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）に比べて複合剤投与群（組成物Ｇ、Ｈ、Ｊ）で有意に涙分泌が増加することが確認できた。乾燥空気誘発眼球乾燥モデルとは異なり、トレハロース単独処理群（組成物Ｅ、Ｆ）の場合、眼炎症による涙量の減少を抑制することができず、角膜炎症の改善に全く効果がなかった。また、シクロスポリン単独処理群（組成物Ｂ、Ｃ、Ｄ）の場合、角膜炎症の改善効果はあったが、涙量の減少は抑制することができなかった。これに対し、本発明の複合剤（組成物Ｇ、Ｈ、Ｊ）を処理した結果、炎症改善においても相乗効果があることが分かった。
【００７１】
また、ＣｏｎＡ誘発眼炎症に実施例１によって製造した試験物質を処理した結果、本発明の複合剤（組成物Ｇ、Ｈ、Ｊ）処理群でムチン様糖タンパク質を含有又は放出したゴブラット細胞の数が著しく増加することが分かった。
【００７２】
＜試験例３．塩化ベンザルコニウム誘発眼球乾燥モデルにおける治療効果＞
試験物質
上述した実施例１によって製造した組成物Ａ、Ｄ、Ｊを試験物質として実験に使用した。
【００７３】
実験動物
実験動物として（株）セムタコから供給された１．８〜２．０ｋｇの雌Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（ＮＺＷ）ウサギをウサギ用ケージに１匹ずつ収容した。動物は約１週間順化期間を経た後、実験に使用した。
【００７４】
動物実験室の環境は、温度２３±２℃、相対湿度５５±１０％、換気回数１２回／時間、照明周期１２時間、照度１５０〜３００Ｌｕｘに調節した。（株）セムタコから供給されたウサギ用ペレット型固形飼料ＮＩＨ＃３２Ｍを給与し、滅菌精製水を自由に飲ませた。ウサギの両側の眼球は試験開始２４時間前にあらかじめ眼検査を行って眼球損傷など角膜の損傷がない動物のみを使用した。
【００７５】
塩化ベンザルコニウム及び試験物質の処置
眼球乾燥を誘発させるため、１日２回ずつ０．１％塩化ベンザルコニウム（以下、ＢＡＫ）１００μｌを結膜袋内に１５日間投与（午前９時及び午後９時）した。
【００７６】
ＢＡＫ投与５日目にＴｅａｒ  ｂｒｅａｋ−ｕｐ  ｔｉｍｅ（以下、ＴＢＵＴ）、涙分泌量、蛍光染色、刺激度を検査して眼球乾燥の誘発如何を確認し、眼球乾燥が誘発されたウサギを無作為割当法によって群分離した。試験物質はＢＡＫ投与５日目から１日２回（午前９時及び午後９時）１０日間投与した。
【００７７】
眼球は毎日１回ずつ一般症状及び眼球の異常反応の観察を行った。
【００７８】
眼球乾燥の評価
眼球乾燥の評価（ＴＢＵＴ、涙分泌量、蛍光染色）は、試験物質投与前（ＢＡＫ投与５日目）、試験物質投与５日後（ＢＡＫ投与１０日目に該当する）及び１０日後（ＢＡＫ投与１５日目に該当する）に行った。
【００７９】
ＴＢＵＴは、０．１％に製造した５μｌのフルオレセインを結膜袋に点眼した後、フルオレセインによる蛍光層が割れ始める時間を細隙灯顕微鏡で測定した。ＴＢＵＴは３回測定して平均を求めた。
【００８０】
涙分泌量は、塩化コバルト紙（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  ｐａｐｅｒ）の一端を外眼角下眼瞼に当てて３０秒間濡らした後、その長さを測定した。
【００８１】
蛍光染色は、角膜の上部、中間部及び下部のそれぞれに対してフルオレセインによる染色の程度を下記基準によって点数判定し、前記各部の点数合計の平均値から角膜損傷程度を算出した。
【００８２】
（判定基準）
０：染色されていない。
１：染色が粗くて、各点状の染色部分は離れている。
２：染色が中間程度であり、点状の染色部分の一部が隣接している。
３：染色が稠密であり、各点状の染色部分は隣接している。
【００８３】
眼刺激性の評価
試験物質投与による眼球病変に対する評価は、次のように結膜の発赤、浮腫及び排出物程度を測定し、試験物質投与前（ＢＡＫ投与５日目）、試験物質投与５日後及び１０日後に行った。下記判定基準に従って眼刺激の結果（発赤、結膜浮腫及び排出物）を点数化し、これらの平均値を用いて眼刺激度（％）を算出した。眼刺激度（％）は組成物Ａの平均眼刺激点数を１００％にして眼刺激度（％）を算出した。
【００８４】
眼刺激度（％）＝（組成物Ａの刺激度−試験物質の刺激度）／組成物Ａの刺激度×１００
【００８５】
−発赤（眼瞼結膜及び眼球結膜に限る）
０：血管は正常
１：幾つかの血管は明確に充血所見を見せる
２：広い深紅色の色調、それぞれの血管は容易に観察されない
３：薄い鮮紅色
【００８６】
−結膜浮腫
０：腫れていない
１：正常より少し腫脹（瞬膜を含む）する
２：眼瞼の部分的外転を伴う顕著な腫脹
３：目が半分閉じられるほどの眼瞼の腫脹
４：目が半分以上閉じられるほどの眼瞼の腫脹
【００８７】
−排出物
０：排出物なし
１：若干の排出物（内部目尻で観察される少量は除く）
２：まつげとまぶたを濡らす排出物
３：目もとの相当部位、まつげ及びまぶたを濡らす排出物
【００８８】
病理組織学的検査
試験物質投与１０日目に眼球乾燥の評価及び眼刺激性の評価を行った後、二酸化炭素ガス下で窒息させて殺処分した。剖検時摘出した角膜及び結膜組織は１０％中性ホルマリン溶液に固定した後、組織切片を製作し、ＰＡＳ染色した後、×１００視野の光学顕微鏡下でムチン様糖タンパク質を含有又は放出したゴブラット細胞を観察した。
【００８９】
結果
ＢＡＫは防腐剤として広く使用される物質であり、液状点眼剤の防腐剤として使用されているが、過量で点眼処理する場合、眼球乾燥を誘発すると知られている。ＣｏｎＡ及び乾燥空気誘発眼球乾燥モデルとは異なる作用機序によって眼球乾燥が誘発され、相対的に長時間に亘って病変が発生し進行する特徴がある。他のモデルと違って、症状が進行するほど涙量の増加やムチン様糖タンパク質の分泌減少による涙膜の不安定及び早期破裂を引き起こし、眼球表面の複合的な要因によって角膜表面の潜在的な損傷を伴って眼球乾燥を促進させる。複合剤処理群（組成物Ｊ）は、シクロスポリンＡ単独処理群（組成物Ｄ）に比べてＢＡＫによる過度な涙分泌を抑制し（図４の上段）、涙膜の破壊時間の短縮を抑制することが分かった。ＴＢＵＴの短縮は涙内のムチン成分と涙分泌量の減少によることが広く知られている（図４の下段）。すなわち、本試験において、複合剤の処理は涙量の過度な増加を抑制することで涙浸透圧を維持し、ムチン分泌量の増加（図５）によりＴＢＵＴの増加を誘導して（図４の下段）、結果的に涙の質を上昇させたと考えられる。
【００９０】
また、蛍光染色によって角膜の損傷程度を観察した結果、複合剤処理群（組成物Ｊ）はシクロスポリンＡ単独処理群（組成物Ｄ）に比べて角膜損傷の治療にも格段に効果的であることが分かった（図６の上段）。
【００９１】
また、複合剤はＢＡＫ処理による炎症を減少させ、ＢＡＫによって現れる眼刺激（結膜の充血及び浮腫、排出物の増加）を減少させる効果があった（図６の下段）。
【００９２】
＜実施例２及び試験例４．眼球乾燥モデルにおける角膜上皮細胞に対する効果＞
試験物質
上述した実施例１によって製造した組成物Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊを試験物質として実験に使用した。その外にシクロスポリン０．０５％とトレハロース１％又は３％が含まれた組成物を実施例１と同様に製造して実験に使用した。
【００９３】
細胞培養と処置
角膜上皮細胞は３７℃培養器で培養し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）に１０％ウシ胎児血清、上皮成長因子、抗生物質を添加した細胞培養液を２〜３日間隔で交替して、細胞が密集成長したとき、培養液を完全に除去し、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄して、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理して細胞を分離し試験に使用した。
【００９４】
細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定
乾燥環境下の角膜上皮細胞の細胞生存率を評価するため、角膜上皮細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１０分間試験物質を接触させ、薬物を除去して乾燥環境下に角膜上皮細胞を１５分間放置した。薬物処理後１８〜２４時間程度培養し、ＭＴＴ法で細胞生存率を求めた。細胞生存率（％）＝各ウェルの吸光度／対照群ウェルの吸光度×１００に示し、各濃度毎に３回行った。
【００９５】
試験結果
すべての試験物質をそれぞれ角膜上皮細胞に１０分間接触させた後、乾燥環境下で１５分間露出させた。
【００９６】
その結果、シクロスポリンとトレハロースとを併用して処理した場合の角膜細胞生存率は、トレハロース単独処理群及びシクロスポリン単独処理群に比べて優れた生存率を見せ、シクロスポリン濃度によって増加する一定な傾向性を示した。（ｐ＜０．０５）
【図１】
0006611803.tif 000003
【図２】
0006611803.tif 000004
【図３】
0006611803.tif 000005
【図４】
0006611803.tif 000006
【図５】
0006611803.tif 000007
【図６】
0006611803.tif 000008
【図７】
0006611803.tif 000009