(57)【要約】  α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞による骨吸収抑制剤、骨再生促進剤及び骨吸収性疾患の予防又は治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
【請求項２】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞による骨吸収抑制剤。
【請求項３】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨再生促進剤。
【請求項４】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療剤。
【請求項５】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬が、α７ニコチン性アセチルコリン受容体に対する阻害定数（Ｋｉ）が１μＭ以下の化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項６】
ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項７】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の剤。
【請求項８】
骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの２以上の組み合わせであることを特徴とする請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられるものであることを特徴とする請求項３に記載の骨再生促進剤。
【請求項１０】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化促進剤。
【請求項１１】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項１２】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の剤。
【請求項１３】
破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする請求項１１に記載の予防又は治療剤。
【請求項１４】
α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を抑制する方法。
【請求項１５】
破骨細胞分化抑制用の、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞分化を調節することにより、骨吸収性疾患等の破骨細胞が関与する疾患又は症状を予防、改善又は治療するための医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と、破骨細胞による骨吸収とを繰り返し、骨及びカルシウムの代謝を調節しながらダイナミックにリモデリングを行っている。通常は、骨形成と骨吸収のバランスが保たれて骨の新陳代謝が行われるが、骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し、骨密度が低下、又は骨密度が過剰に増加して、骨粗鬆症、骨大理石病（大理石病）等の様々な代謝性骨疾患を引き起こす。【０００３】
例えば、高回転型の骨粗鬆症では骨吸収が骨形成を大きく上回った結果骨量が減少する。従って、骨粗鬆症の治療においては、骨吸収を抑制することが重要である。また関節リウマチ、歯周病等においても炎症反応に伴って骨吸収が生じることから、同様に骨吸収を抑制する必要がある。さらに、近年の歯科インプラントの急速な普及によって、抜歯に起因する歯槽骨の吸収も問題となっているが、このような骨吸収を効果的に抑制できる薬剤がないのが現状である。いずれの疾患においても、骨吸収部位では活性化された破骨細胞が骨吸収を促進しているため、骨吸収を防ぐために破骨細胞分化（破骨細胞形成）を抑制する技術の開発が求められている。【０００４】
これまでに破骨細胞をターゲットとした骨吸収予防剤又は抑制剤として、エストロゲン製剤、ビスホスホネート製剤、カルシトニン製剤などの薬剤が開発されてきた。しかしながら、例えばビスホスホネート製剤等は基本的に細胞特異性がなく、顎骨壊死等の副作用が存在するという問題があった。近年、骨吸収抑制剤の開発においては、副作用が少なく、より効果が高い薬剤を開発するために、破骨細胞分化抑制を導く特異的な受容体をターゲットとする研究が進められている（非特許文献１）。しかしながら、破骨細胞分化のメカニズムについては未だ完全に解明されておらず、安全性が高く、破骨細胞分化を効果的に阻害することができる物質又は薬剤も未だ開発されていない。【０００５】
ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）は、イオンチャネル一体型リガンド作動性受容体であり、主に、筋肉型と神経型とに分類される。筋肉型受容体は、末梢型とも言われ、神経筋接合部に存在し、横紋筋収縮に関与する。神経型受容体は、中枢型とも言われ、自律神経節及び中枢神経系に存在し、シナプス伝達に関与している。ニコチン性アセチルコリン受容体は種々のサブユニットからなる５量体の受容体であり、サブユニットの組み合わせにより種々のnAChRサブタイプが存在する。ニコチン性アセチルコリン受容体を構成するサブユニットとして、例えばヒトにおいては、６種（α１-７、α９-１０、β１-４、δ、ε、γ）が報告されている。これらのサブユニットがホモ又はヘテロ５量体を形成して、そのサブユニットの組み合わせにより、それぞれの構造に特異的な薬理学的特性を示す。例えば、筋肉型は、α１、β１、γ、δのサブユニットからなる５量体であることが知られており、神経型は、αホモ５量体、又はα及びβからなるヘテロ5量体であることが知られている。近年では、神経型として報告されてきたαホモ５量体、又はα及びβからなるヘテロ５量体が末梢にも存在することが報告されている。【０００６】
非特許文献２には、マウス骨髄マクロファージを用いた分化誘導系において、マウス骨髄からのNFκB活性化受容体リガンド（Receptor Activator of NF-κB Ligand）（RANKL）刺激による破骨細胞形成が、ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬（アンタゴニスト）であるメカミラミンにより濃度依存的に抑制されたこと、この系においてニコチンの破骨細胞分化抑制作用が観察されたことが記載されている。非特許文献３には、ニコチン性アセチルコリン受容体を活性化すると破骨細胞の形成が阻害されたこと、ニコチン性アセチルコリン受容体の非競合的アンタゴニストであるメカミラミンを高濃度使用することによっても破骨細胞形成が阻害されたことが記載されている。しかしながら、破骨細胞においてニコチン性アセチルコリン受容体が、受容体として機能するために必要な特定のサブユニットの組み合わせからなる5量体構造を示して発現していることは、一切報告されていない。【０００７】
一方、破骨細胞の機能低下を原因とする疾患として、骨大理石病等の疾患が知られている。骨は、適度な硬さと弾性を持った組織であるが、骨大理石病では破骨細胞の機能低下により骨吸収が減少する結果、骨が大理石のように硬くなりすぎて、もろく折れやすくなる。現在、骨大理石病の根本的治療方法はなく、骨吸収を効果的に促進できる薬剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature Medicine, 18(8), 1158, 2012
【非特許文献２】喫煙科学財団の助成研究  番号 FP00702036、研究課題名「脊椎固定術に対するニコチンの骨形成抑制作用ならびに偽関節に対する骨形成タンパクの修復作用の分子メカニズム解明に関する実験的研究」、インターネット（URL  http://www.srf.or.jp/thema/documents/thema_past/studies_pdf/2007/FP00702036.pdf）
【非特許文献３】Mandl, P. et al., “Nicotinic acetylcholine receptor activation completely blocks osteoclastogenesis by interfering with osteoclast precursor differentiation in vitro”, Ann Rheum Dis 2011;70:Suppl 2 A74-A75
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、破骨細胞分化（破骨細胞形成）を効果的に抑制又は阻害することができ、かつ安全性が高い破骨細胞分化抑制剤、骨粗鬆症等の骨吸収性疾患の予防又は治療剤等を提供することを主な課題とする。本発明はまた、破骨細胞分化を効果的に促進することができる破骨細胞分化促進剤、骨大理石病等の破骨細胞の機能低下を原因とする疾患の予防又は治療剤を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行ったところ、α７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７-nAChR）の選択的拮抗薬であるメチルリカコニチン（methyllycaconitine）（MLA）が破骨細胞分化を効果的に抑制することを見出した（例えば、図９〜１２及び１５）。MLAは、従来骨粗鬆症薬として市販されているビスホスホネート剤よりも強い破骨細胞分化抑制作用を示した。これらの知見から、現在知られているnAChRサブタイプのうち、破骨細胞でα7-nAChRが発現していることに想到した。【００１１】
また、本発明者らは、破骨前駆細胞（破骨細胞前駆細胞）及び破骨細胞にα7-nAChRが発現していることを見出した。α7-nAChRはα７サブユニットからなるホモ５量体であり、マクロファージの膜上に発現していることが知られている。α7-nAChRは、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの産生の調節に関わるとの知見から抗炎症剤の創薬上のターゲットとして注目されているが、この受容体が破骨細胞又は破骨前駆細胞上に発現していることは、これまで一切報告されていない。【００１２】
上述したように、nAChRにはサブユニットの組み合わせにより種々のサブタイプが存在するが、破骨細胞又は破骨前駆細胞に特定の5量体構造のニコチン性アセチルコリン受容体が発現していることは、これまで一切知られていない。さらに、多数のnAChRサブタイプの中でα7-nAChRが破骨細胞及び破骨前駆細胞に発現していることは、驚くべき知見であった。【００１３】
例えばアルツハイマー患者ではアセチルコリン作動性神経細胞の減少、アセチルコリントランスフェラーゼ活性の低下、ニコチン性アセチルコリン受容体発現量の低下等、コリン作動性神経に関連する障害が明らかにされている。コリン作動性神経が認知、学習機能に関与することから、アセチルコリンを補充することにより症状を緩和する試みが行われ、アセチルコリンを分解する酵素であるコリンエステラーゼの阻害作用を持つドネペジル（エーザイ、アリセプト（登録商標））等の治療薬が開発された。現在もアセチルコリン受容体のアゴニストを探す試みは精力的に行われている。しかしながら末梢の免疫系におけるアセチルコリン系の関与に関する報告は少なく、破骨細胞分化剤又は骨吸収抑制剤等としてアセチルコリン系又は破骨細胞上の特定のアセチルコリン受容体を標的にする本発明は、非常に革新的な技術である。【００１４】
本発明者らはまた、破骨細胞の活性を指標としたライブラリースクリーニングから、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤であるフェンセリン（化学名：（−）−Ｎ−フェニルカルバモイル エセロリン）及びドネペジル（化学名：(1-ベンジル-4-(5,6-ジメトキシインダノン-2-イル)メチルピペリジン）が破骨細胞分化を増強する作用を示すことを見出した。【００１５】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記の破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞による骨吸収抑制剤、骨再生促進剤、及び骨吸収性疾患の予防又は治療剤、並びに破骨細胞分化促進剤、及び破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤等を提供する。【００１６】
〔１〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
〔２〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞による骨吸収抑制剤。
〔３〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨再生促進剤。
〔４〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とすることを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療剤。
〔５〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬が、α７ニコチン性アセチルコリン受容体に対する阻害定数（Ｋｉ）が１μＭ以下の化合物であることを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の剤。
〔６〕ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の剤。
〔７〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の剤。
〔８〕骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの２以上の組み合わせであることを特徴とする前記〔４〕に記載の予防又は治療剤。
〔９〕再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられるものであることを特徴とする前記〔３〕に記載の骨再生促進剤。
〔１０〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞分化促進剤。
〔１１〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤。
〔１２〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の剤。
〔１３〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする前記〔１１〕に記載の予防又は治療剤。【００１７】
〔１４〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を抑制する方法。
〔１５〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体を破骨前駆細胞に添加することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を抑制する方法。
〔１６〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞による骨吸収を抑制する方法。
〔１７〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする骨再生を促進する方法。
〔１８〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする骨吸収性疾患の予防又は治療方法。【００１８】
〔１９〕破骨細胞分化抑制用の、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２０〕破骨細胞分化を抑制することにより、破骨細胞による骨吸収抑制、骨再生促進、又は骨吸収性疾患の予防又は治療のために使用される、前記〔１９〕に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２１〕破骨細胞による骨吸収抑制用の、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２２〕骨再生促進用の、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２３〕骨吸収性疾患の予防又は治療用の、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。【００１９】
〔２４〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬が、α７ニコチン性アセチルコリン受容体に対する阻害定数（Ｋｉ）が１μＭ以下の化合物である前記〔１４〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔１９〕〜〔２３〕のいずれか一項に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２５〕ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、αブンガロトキシン若しくはメチルリカコニチン、又はその薬学的に許容される塩である前記〔１４〕〜〔１８〕及び〔２４〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔１９〕〜〔２４〕のいずれか一項に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２６〕α７ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬が、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩である前記〔１４〕〜〔１８〕、〔２４〕及び〔２５〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔１９〕〜〔２５〕のいずれか一項に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２７〕骨吸収性疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収、又はそれらの２以上の組み合わせであることを特徴とする前記〔１８〕に記載の方法、又は前記〔２０〕若しくは〔２３〕に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。
〔２８〕再生治療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するために用いられることを特徴とする前記〔１７〕に記載の方法又は前記〔２０〕若しくは〔２２〕に記載のα７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬。【００２０】
〔２９〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を促進する方法。
〔３０〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を破骨前駆細胞に添加することを含むことを特徴とする破骨細胞分化を促進する方法。
〔３１〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含むことを特徴とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療方法。
〔３２〕破骨細胞分化促進用の、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔３３〕破骨細胞分化を促進することにより、破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療のために使用される、前記〔３２〕に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔３４〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療用の、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔３５〕アセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、ドネペジル若しくはフェンセリン、又はその薬学的に許容される塩である前記〔２９〕〜〔３１〕のいずれか一項に記載の方法、又は前記〔３２〕〜〔３４〕のいずれか一項に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
〔３６〕破骨細胞の機能低下に起因する疾患が、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化又は骨化性筋炎であることを特徴とする前記〔３１〕に記載の方法、又は前記〔３３〕若しくは〔３４〕に記載のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、破骨細胞分化を効果的に抑制又は促進することができるため、破骨細胞分化を調節することができる。
例えば、本発明のα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的とする薬剤（α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする薬剤）により、破骨細胞分化（破骨細胞形成）を効果的に阻害又は抑制することができる。このため本発明によれば、骨粗鬆症、関節リウマチ、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病における骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の骨吸収性疾患を効果的に予防、改善又は治療することができる。また、骨吸収を効果的に抑制できることから、骨の形成又は再生を促進できる。このため本発明は、例えば再生医療における骨の形成又は再生等にも有用である。さらに、本発明の破骨細胞分化抑制剤等の有効成分は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬として作用の特異性が高いため、副作用が少なく安全性が高いという利点もある。また、例えば、選択的拮抗薬が低分子の化合物であると、バイオ医薬である抗体やペプチド製剤と比較して、安価で容易に合成が可能であるという利点もある。【００２２】
また、本発明のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とする薬剤は、破骨細胞分化を効果的に誘導又は促進できる。このため本発明によれば、骨大理石病等の破骨細胞の機能低下に起因する疾患、又は異所性骨化（異所的骨形成）、骨化性筋炎等を効果的に予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、フェンセリンによるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化促進作用を示す図である。
【図２】図２は、ドネペジルによるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化促進作用を示す図である。
【図３】図３は、偽コリンエステラーゼによるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を示す図である。
【図４】図４は、アセチルコリンエステラーゼ（AchE）によるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を示す図である。
【図５】図５は、偽コリンエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼによるマウス骨髄由来破骨前駆細胞の分化抑制作用を示す図である。
【図６】図６は、ムスカリン性ではなくニコチン性のアセチルコリン受容体拮抗薬がRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を有することを示す図である。
【図７】図７は、筋肉型のニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬であるツボクラリンの、RAW264.7破骨前駆細胞株の分化に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図８】図８は、α４β２ヘテロ5量体のニコチン性アセチルコリン受容体の特異的拮抗薬であるジヒドロ−β−エリトロイジン臭化水素酸塩（ＤＨＥ）の、RAW264.7破骨前駆細胞株の分化に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図９】図９は、ニコチン性アセチルコリン受容体非選択的拮抗薬であるメカミラミン、及びα７ニコチン性アセチルコリン受容体選択的拮抗薬であるメチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩によるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を示す図である。
【図１０】図１０は、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩によるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を示す図である。
【図１１】図１１は、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩がRAW264.7破骨前駆細胞株の破骨細胞（TRAP染色陽性多核細胞）形成に及ぼす影響を示す顕微鏡写真である（Ａ：RANKL刺激によりTRAP染色陽性多核細胞に分化誘導されたRAW264.7細胞（コントロール）、Ｂ：50nMメチルリカコニチンを添加したRAW264.7細胞）。
【図１２】図１２は、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩によるマウス骨髄由来破骨前駆細胞の分化抑制作用を示す図である。
【図１３】図１３は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬によるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を調べた結果を示す図である。
【図１４】図１４は、RAW264.7細胞又はM-BMMφ由来破骨前駆細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際に、各細胞におけるα7-nACh受容体及びGAPDH蛋白質の発現をWestern Blottingにより解析した結果を示す図である。左側２列は、RAW264.7細胞におけるα7-nACh受容体（上段）及びGAPDHタンパク質（下段）の発現を調べた結果を、右側２列は、M-BMMφ由来破骨前駆細胞におけるα7-nACh受容体（上段）及びGAPDHタンパク質（下段）の発現を調べた結果を、それぞれ示す。
【図１５】図１５は、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩、及びビスホスホネートによるRAW264.7破骨前駆細胞株の分化抑制作用を示す図である。
【図１６】図１６は、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩が骨形成に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
【図１７】図１７は、マウスの大腿骨の骨密度の測定結果を示す図である。
【図１８】図１８は、マウスの大腿骨の骨塩量の測定結果を示す図である。
【図１９】図１９は、マウスの大腿骨の骨体積の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬（以下、α7-nAChR選択的拮抗薬ともいう）を有効成分とする。α7-nAChR選択的拮抗薬は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、有効成分のみからなるものであってもよいが、必要に応じて、後述するその他の成分等を含有する組成物であってもよい。
【００２５】
本発明における「破骨細胞分化抑制」とは、通常、破骨前駆細胞（単球又はマクロファージ系前駆細胞）からの破骨細胞（多核の巨細胞）への分化を、阻害又は抑制すること、好ましくは特異的に阻害又は抑制することをいう。破骨前駆細胞から破骨細胞への分化は、通常、M-CSF（Macrophage Colony Stimulating Factor）及びRANKL（Receptor Activator of NF kappa B Ligand）の刺激により誘導される。破骨細胞分化を抑制することで破骨細胞による骨吸収を抑制することができ、骨吸収性疾患を予防又は治療等することができる。
【００２６】
本発明の破骨細胞分化抑制剤の有効成分であるα7-nACh選択的R拮抗薬は、破骨細胞分化を効果的に抑制又は阻害する作用を有するものである。このため本発明の破骨細胞分化抑制剤は、例えば、破骨細胞による骨吸収抑制剤としても有用なものである。また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、骨吸収性疾患の予防又は治療剤としても好適に用いられる。
【００２７】
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする骨吸収抑制剤も、本発明に包含される。α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする骨吸収性疾患の予防又は治療剤も、本発明に包含される。
【００２８】
なお、本明細書中、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
【００２９】
本発明における「骨吸収抑制」とは、通常、骨吸収速度を減少又は停止させることをいう。
本発明における「骨吸収性疾患」とは、骨吸収が骨形成を上回ることに起因する疾患、症状又は状態を意味する。このような疾患、症状又は状態の例としては、例えば、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、歯周病（歯周疾患）における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の１又は２以上の組み合わせが挙げられる。骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収等には、それらに伴う腰痛、背部痛等の痛み、骨変形、骨強度低下、骨折等も含まれる。中でも、本発明は、骨粗鬆症、関節リウマチ、抜歯窩における歯槽骨吸収等の骨吸収性疾患に、より好適に適用され、抜歯窩における歯槽骨吸収に特に好適に適用される。
【００３０】
本発明の破骨細胞分化抑制剤の有効成分であるα7-nAChR選択的拮抗薬は、優れた破骨細胞分化抑制作用を有するため、骨（骨組織）の形成又は再生を促進するために好適に使用できる。このためα7-nAChR選択的拮抗薬は、骨再生促進剤の有効成分としても有用である。骨再生促進剤は、例えば再生医療における骨組織形成又は骨組織再生を促進するため等に好適に用いられる。α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を有効成分とする骨再生促進剤も、本発明に包含される。
【００３１】
本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬は、α7-nAChRを阻害する作用を有する化合物であるが、通常、αサブユニットを有するニコチン性アセチルコリン受容体に対する親和性が、他のサブユニットを有するニコチン性アセチルコリン受容体に対する親和性と比較して高い拮抗薬である。特に、α7-nAChRに対する親和性が、他のニコチン性アセチルコリン受容体に対する親和性と比較して高い拮抗薬であることが好ましい。受容体に対する親和性は、例えば、阻害定数（Ki）、IC50（50%阻害濃度）等により評価できる。
【００３２】
本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬は、例えば、α7-nAChRを競合阻害する化合物（α7-nAChRの競合阻害薬）、非競合阻害する化合物（α7-nAChRの非競合阻害薬）、アロステリックモジュレーターのいずれであってもよいが、好ましくは、α7-nAChRの競合阻害薬である。また、本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬は、通常、α7-nAChRに対する親和性が高い拮抗薬であるが、通常、α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）が、約１μM以下の化合物である。α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）が約１μM以下の化合物は、α7-nAChRに対する親和性が高く、通常優れた破骨細胞分化抑制作用を発揮することができる。本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬は、α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）が好ましくは約５００nM以下、より好ましくは約１００nM以下、さらに好ましくは約５０nM以下、特に好ましくは約３０nM以下、特に好ましくは約２０nM以下、特に好ましくは約１０nM以下、最も好ましくは約５nM以下の化合物である。α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）は、通常、脳膜又は異種発現させたヒト又はラットのα７-nAChRへの[125I]-α-ブンガロロキシン又は[3H]-メチルリカコニチンの結合に対する競合結合アッセイによって求めることができる（S Wonnacott, and J Barik, “Nicotinic Ach Receptors”, Tocris Reviews No. 28, 2007、Ward JM et al. FEBS Lett (1990), Vol. 270, no. 1,2, p.45-48等）。本明細書中、α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）は、通常、Ward JM et al. FEBS Lett (1990), Vol. 270, no. 1,2, p.45-48に記載の競合結合アッセイの方法に従って測定した場合の値である。阻害定数（Ki）が低いほど、α7-nAChRに対する親和性が高いことを意味する。
【００３３】
本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬として、例えば、αブンガロトキシン又はその薬学的に許容される塩、メチルリカコニチン（methyllycaconitine）又はその薬学的に許容される塩等を好適に用いることができる。αブンガロトキシン、及びメチルリカコニチンは、α7-nAChRの競合阻害薬であり、α7-nAChRに対する阻害定数（Ki）が通常約5nM以下であることが知られている（例えば、S Wonnacott, and J Barik, “Nicotinic Ach Receptors”, Tocris Reviews No. 28, 2007）。α7-nAChR選択的拮抗薬は、より好ましくは、α7-nAChRに対する特異性が高いことから、メチルリカコニチン又はその薬学的に許容される塩等である。しかしながら本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬はこれらの化合物に限定されず、これら以外の化合物であっても、上述したようにα7-nAChRに対する阻害定数（Ki）が約１μM以下の化合物であれば、本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬として好適に用いられる。より好ましくは、α7-nAChRに対する特異性が高い拮抗薬である。
【００３４】
薬学的に許容される塩として、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。薬学的に許容される塩は、水和物であってもよい。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００３５】
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ'-ジベンジルエチレンジアミン等との塩が挙げられる。
【００３６】
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
【００３７】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸等との塩が挙げられる。
中でも、薬学的に許容される塩は、無機酸との塩、有機酸との塩等が好ましく、有機酸との塩がより好ましい。無機酸との塩は、例えば、塩酸塩等が好ましい。有機酸との塩は、例えば、クエン酸との塩等が好ましい。
本発明におけるα7-nAChR選択的拮抗薬として、メチルリカコニチン又はそのクエン酸塩等が特に好ましい。メチルリカコニチンのクエン酸塩は、水和物であってもよい。
【００３８】
以下、本発明の破骨細胞分化抑制剤についてさらに説明するが、本発明の骨吸収抑制剤、骨再生促進剤、及び骨吸収性疾患の予防又は治療剤についても、破骨細胞分化抑制剤と同様である。
【００３９】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、有効成分であるα7-nAChR選択的拮抗薬に、少なくとも１種の薬学的に許容される担体を適量、適宜配合して製剤化し、医薬組成物、医薬部外品組成物、又は飲食品等のその他の組成物とすることができる。好ましくは、医薬組成物又は医薬部外品組成物とする。製剤化の方法は、公知の方法を採用することができる。
【００４０】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、標的とする身体部位、疾患等に応じて、任意の投与形態で投与することができる。投与形態としては、経口投与及び非経口投与が挙げられる。投与経路は、本発明の剤を使用する条件、疾患等に応じて適宜選択することが好ましい。経口投与用の形態としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形剤；エリキシル、シロップ、懸濁液等の液剤等の剤型が挙げられる。非経口投与用の形態としては、例えば、注射剤（静脈注射、動脈注射、筋肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、硬膜外注射、関節内注射、歯周組織内注射、歯槽骨周辺への注射）、経皮剤、経腸剤、点滴剤、外用剤、坐剤（肛門座剤、尿道座剤、膣座剤等）、等の剤型等が挙げられる。また、非経口投与用の形態として、抜歯部位、歯槽骨増生術部位への添加に適した剤形（例えば、歯槽骨増生部位への注射、歯槽骨増生部位へ填入する生体材料への添加）等が挙げられる。担体の配合割合については、医薬品分野等において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。また、例えば注射剤は、用時に液状とすべき乾燥品としてしてもよい。
【００４１】
薬学的に許容される担体としては、公知のものを使用できる。例えば、固形製剤では、通常、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、又は充填剤等が挙げられる。液状製剤では、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じて、保存剤、増粘剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、保湿剤、吸着剤、防腐剤、浸透圧調整剤、安定化剤、酸化防止剤等の製剤分野において通常用いられる任意の公知の添加剤を本発明の効果を妨げない範囲で必要に応じて用いることもできる。薬学的に許容される担体及び添加剤は、本発明の効果を妨げない限り、これらに限定されない。これらを、目的とする製剤形態に応じて、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。以下に、製剤担体及び添加剤の一例を挙げるが、これらに限定されない。
【００４２】
賦形剤として、例えば、乳糖、白糖、グラニュー糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、シクロデキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
【００４３】
崩壊剤として、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン粉末、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４４】
結合剤として、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、白糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としてが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。流動化剤として、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。充填剤として、例えば、セルロース、マンニトール、ラクトース等が挙げられる。
【００４５】
溶剤として、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール類（グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジオクチル、クエン酸トリエチル、パルミチン酸イソプロピル等）、炭化水素類（ノルマルパラフィン、イソパラフィン、ワセリン等）、シリコーン油類（ジメチルポリシロキサン等）、植物油類（ゴマ油、トウモロコシ油、綿実油、菜種油、オリーブ油等）が挙げられる。
溶解補助剤として、例えば、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４６】
懸濁化剤として、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００４７】
等張化剤として、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等が挙げられる。緩衝剤として、例えば、リン酸塩（リン酸水素ナトリウム等）、酢酸塩（酢酸ナトリウム等）、クエン酸塩（炭酸ナトリウム）、クエン酸塩（クエン酸ナトリウム等）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）等が挙げられる。無痛化剤として、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
保存剤として、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。
【００４８】
増粘剤として、例えば、糖類（ソルビトール、マンニトール、ショ糖等）、セルロース誘導体（メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸又はメトキシメチレン無水マレイン酸共重合体等のポリカルボン酸、合成高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー等）、ソフトパラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリンアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素添加ラノリン、蜜蝋、アラビアゴム、リピオドール、ヒアルロン酸ナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００４９】
抗酸化剤として、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等が挙げられる。着色剤として、例えば、食用色素（例：食用赤色２号若しくは３号、食用黄色４号若しくは５号等）、β−カロテン等が挙げられる。甘味剤として、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム等が挙げられる。吸収促進剤として、例えば、第４級アンモニウム塩基類又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。ｐＨ調整剤として、例えば、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、アミノ酸塩等が挙げられる。乳化剤として、例えば、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン等が挙げられる。保湿剤として、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられる。吸着剤として、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、塩化カルシウム、ベントナイト及びコロイド状ケイ酸等が挙げられる。防腐剤として、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第四級アンモニウム類、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、ソルビン酸及びそれらの塩、チメロサール、クロロブタノール、デヒドロ酢酸ナトリウム等が挙げられる。浸透圧調整剤として、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、ホウ酸、多価アルコール又は糖が挙げられる。さらに、多価アルコールとして、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、キシリトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。糖として、ブドウ糖等が挙げられる。安定化剤として、例えば、カゼイン、カゼインナトリウム塩等が挙げられる。酸化防止剤として、例えば、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、α-トコフェロール及びそれらの誘導体が挙げられる。
【００５０】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、α7-nAChR選択的拮抗薬を有効成分として含有するが、本発明の効果を損なわない範囲で、骨代謝調節作用（例えば、吸収抑制作用又は骨再生促進作用）を示す他の成分１種又は２種以上を含むことができる。骨代謝調節作用を示す他の成分の具体例として、例えば、骨形成因子である骨形成タンパク質（ＢＭＰ蛋白質）、スタチン化合物、骨吸収抑制剤であるビスホスホネート等が挙げられる。
【００５１】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に対して、経口的又は非経口的（例：局所投与、静脈投与、直腸投与等）に投与又は適用することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等が挙げられる。好ましい投与対象は、ヒトである。
また、好ましい投与対象は、例えば、上述した骨吸収性疾患の患者である。また、例えば骨吸収性疾患の予防に用いる場合には、骨吸収性疾患を発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。
【００５２】
例えば、骨粗鬆症、骨減少症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、骨ページェット病、多発性骨髄腫における骨吸収、及びそれらに伴う腰痛や背部痛等の痛み、骨変形、骨強度低下、骨折等の予防又は治療のためであれば、本発明の剤を経口投与、又は骨吸収が起こっている又は起こり得る部位に、注射剤等の非経口投与の形態で局所投与（例えば、関節リウマチにおける炎症性骨吸収であれば、関節内注射）することが好ましい。骨粗鬆症の予防又は治療の場合には、本発明の剤を経口投与することが特に好ましい。
また、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の予防又は治療のためであれば、注射剤等の非経口投与の形態で、骨吸収が起こっている又は起こり得る部位（例えば、抜歯部位、歯槽骨増生術部位等）に局所投与することが好ましい。
【００５３】
本発明の破骨細胞分化抑制剤中に含有される有効成分（α7-nAChR選択的拮抗薬）の量は、特に限定はされず、適用対象の状態、投与形態等に応じて適宜選択される。例えば、破骨細胞分化抑制剤１００質量％中に、通常、約０．００００１〜５０質量％であり、好ましくは約０．００１〜１０質量％であり、より好ましくは約０．０１〜５質量％である。
【００５４】
本発明の破骨細胞分化抑制剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、疾患又は症状等に応じて適宜設定でき、特に限定されないが、ヒト等の哺乳動物の場合、例えば経口投与の剤型であれば、有効成分（α7-nAChR選択的拮抗薬）の投与量が、１日あたり例えば、通常約０．０１〜１０００ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約３〜１００ｍｇ、特に好ましくは約５〜１００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇとなるようにすることが好ましい。また、この量を、通常１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは約１〜３回）に分けて投与対象に経口投与することが好ましい。
【００５５】
また、例えば、注射剤等の非経口投与の剤型であれば、有効成分の投与量が、１日あたり例えば、通常約０．０１〜１０００ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約３〜１００ｍｇ、特に好ましくは約５〜１００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇとなるようにすることが好ましい。また、この量を、通常１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは約１〜３回）に分けて投与対象に投与することが好ましい。
本発明の破骨細胞分化抑制剤を投与する期間は特に限定されず、疾患又は症状等に応じて適宜設定すればよい。
【００５６】
α7-nAChR選択的拮抗薬を破骨前駆細胞に添加することを含む破骨細胞分化を抑制する方法も、本発明に包含される。
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、生体（インビボ）又はインビトロにおいて、破骨細胞の分化を抑制するために使用することができる。本発明の破骨細胞分化抑制剤は、例えば、インビトロにおける破骨細胞分化抑制のためにも好適に用いられる。本発明の破骨細胞分化抑制剤を使用すると、例えば、インビトロで破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させる実験系で、α7ニコチン性アセチルコリン受容体を介した分化を特異的に阻害することができるため、破骨細胞の分化機構を探索するのに好適である。インビトロで破骨細胞分化を抑制する場合、破骨細胞分化抑制剤の破骨前駆細胞への添加量は、その有効成分の種類等により異なり適宜設定すればよいが、例えば、破骨前駆細胞を含む培地又は溶液中に、有効成分であるα7-nAChR選択的拮抗薬の濃度が0.01〜1000 nM程度となるように有効成分を添加し、細胞を培養すればよい。
【００５７】
また、本発明の剤は、骨再生促進剤として、例えば、再生医療又は再生治療において、生体（インビボ）又はインビトロにおける人工骨等の骨組織形成又は再生促進等に好適に用いられる。好ましくは、生体（インビボ）における人工骨等の骨組織形成又は再生促進等に用いられる。生体において骨再生を促進するためであれば、例えば、注射剤等の非経口投与の形態で、本発明の剤を患部に局所投与することが好ましい。投与する有効成分の量等は、例えば、上述した量投与すればよい。
【００５８】
本発明は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む破骨細胞分化を抑制する方法も包含する。
α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む破骨細胞による骨吸収を抑制する方法も包含する。
本発明は、α７ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む骨の再生を促進する方法も包含する。
本発明の方法におけるα7-nAChR選択的拮抗薬の好ましい態様、その投与方法及び投与量等は、上述したとおりである。哺乳動物は、上述したヒト及びヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはヒトである。また、哺乳動物は、好ましくは上述した骨吸収性疾患の患者である。
本発明の方法は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の工程等を含んでもよい。
【００５９】
α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬を哺乳動物に投与することを含む骨吸収性疾患の予防又は治療方法も、本発明に包含される。α7-nAChR選択的拮抗薬を投与することにより、破骨細胞分化を効果的に抑制することができるため、破骨細胞による骨吸収を効果的に抑制することができる。このため、骨吸収性疾患を予防、改善又は治療することができる。哺乳動物は、好ましくは上述した骨吸収性疾患の哺乳動物である。また、哺乳動物は、好ましくはヒトである。α7-nAChR選択的拮抗薬の好ましい態様、その投与方法及び投与量等は、上述したとおりである。
【００６０】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とする破骨細胞分化促進剤も包含する。
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。また、本発明の破骨細胞分化促進剤は、有効成分のみからなるものであってもよいが、必要に応じて、後述するその他の成分等を含有する組成物であってもよい。
【００６１】
本発明の破骨細胞分化促進剤の有効成分であるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、破骨前駆細胞から破骨細胞への分化を効果的に促進する作用を有するものである。このため本発明の破骨細胞分化促進剤は、骨吸収を促進する作用を有し、破骨細胞の機能低下に起因する疾患又は症状を予防、改善又は治療するために好適に用いられる。
【００６２】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分とする破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤も、本発明に包含される。破骨細胞の機能低下に起因する疾患として、例えば、骨大理石病、骨硬化症、異所性骨化、骨化性筋炎等が挙げられる。
【００６３】
以下、本発明の破骨細胞分化促進剤についてさらに説明するが、本発明の骨破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療剤についても、破骨細胞分化促進剤と同様である。
【００６４】
本発明におけるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、アセチルコリンエステラーゼを阻害する作用を有する化合物であればよく、特に限定されない。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として、例えば、ドネペジル又はその薬学的に許容される塩、フェンセリン又はその薬学的に許容される塩等が好ましい。薬学的に許容される塩は、上述したα７ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬において記載したものと同じものが挙げられ、例えば、無機酸との塩等が好ましく、塩酸塩等が好ましい。
【００６５】
本発明の破骨細胞分化促進剤は、有効成分であるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に、１種以上の薬学的に許容される担体を適宜配合して製剤化し、医薬組成物、医薬部外品組成物、又はその他の組成物とすることができる。分化促進制剤の形態、投与方法、配合しうる薬学的に許容される担体、添加剤等は、上述した、破骨細胞分化抑制剤におけるものと同じものなどが挙げられる。製剤化の方法も特に限定されず、上述した破骨細胞分化抑制剤と同じ方法を採用できる。
【００６６】
本発明の破骨細胞分化促進剤は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を有効成分として含有するが、本発明の効果を損なわない範囲で、骨代謝調節作用を示す他の成分１種又は２種以上を含むことができる。骨代謝調節作用を示す他の成分の具体例として、例えば、ＢＭＰ蛋白質、スタチン化合物、骨吸収抑制剤であるビスホスホネート等が挙げられる。
【００６７】
本発明の破骨細胞分化促進剤は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に対して、経口的又は非経口的（例：局所投与、静脈投与、直腸投与等）に投与又は適用することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等が挙げられる。好ましい投与対象は、ヒトである。
また、好ましい投与対象は、例えば、上述した破骨細胞の機能低下に起因する疾患の患者である。また、予防に用いる場合には、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。
【００６８】
本発明の破骨細胞分化促進剤中に含有される有効成分の量は、特に限定はされず、適用対象の状態、投与形態等に応じて適宜選択される。例えば、破骨細胞分化促進剤１００質量％中に、通常、約０．００００１〜５０質量％であり、好ましくは約０．００１〜１０質量％であり、より好ましくは約０．０１〜５質量％である
【００６９】
本発明の破骨細胞分化促進制剤の投与量は、使用対象の年齢、性別、体重、疾患又は症状に応じて適宜設定でき、特に限定されない。ヒト等の哺乳動物の場合、例えば経口投与の剤型であれば、有効成分（アセチルコリンエステラーゼ阻害剤）の投与量が、１日あたり例えば、通常約０．０１〜１０００ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約３〜１００ｍｇ、特に好ましくは約５〜１００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇとなるようにすることが好ましい。また、有効成分の１日の投与量の上限は、好ましくは約５０ｍｇである。また、この量を、通常１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは約１〜３回）に分けて投与対象に経口投与することが好ましい。
【００７０】
また、例えば、注射剤等の非経口投与の剤型であれば、有効成分の投与量が、１日あたり例えば、通常約０．０１〜１０００ｍｇの範囲であり、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらに好ましくは約３〜１００ｍｇ、特に好ましくは約５〜１００ｍｇ、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇとなるように投与することが好ましい。また、有効成分の１日の投与量の上限は、好ましくは約５０ｍｇである。また、この量を、通常１日数回（例えば、約１〜５回、好ましくは約１〜３回）に分けて投与対象に投与することが好ましい。
【００７１】
本発明の予防又は治療剤を骨大理石病、骨硬化症等の予防又は治療に用いる場合、本発明の剤を経口投与又は注射等により投与することが好ましい。
本発明の予防又は治療剤を異所性骨化、骨化性筋炎等の疾患の治療に用いる場合であれば、例えば、注射剤等の非経口投与の形態で、本発明の剤を患部に局所投与することが好ましい。
本発明の破骨細胞分化促進制剤及び予防又は治療剤を投与する期間は特に限定されず、疾患又は症状等に応じて適宜設定すればよい。
【００７２】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を破骨前駆細胞に添加することを含む破骨細胞分化を促進する方法も、本発明に包含される。
本発明の破骨細胞分化促進剤は、インビトロ又は生体（インビボ）における破骨細胞分化促進のために好適に用いられる。本発明の破骨細胞分化促進剤を使用すると、例えば、RANKLの添加量を従来破骨前駆細胞を分化させるために使用されていた量よりも少なくしても、インビトロで破骨前駆細胞を破骨細胞に分化させることができる。そのため、例えば、高価なRANKL試薬を用いない、又は最小限のRANKL試薬の使用量で破骨細胞を分化誘導する実験の実施等が可能となる。インビトロで破骨細胞分化を促進する場合、破骨細胞分化促進剤の破骨前駆細胞への添加量は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の種類等により異なり適宜設定すればよいが、例えば、破骨前駆細胞を含む培地又は溶液中に、有効成分（アセチルコリンエステラーゼ阻害剤）濃度が0.01〜100μM程度となるように有効成分を添加し、細胞を培養すればよい。
【００７３】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含む破骨細胞の分化を促進する方法も包含する。本発明の方法におけるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の好ましい態様、その投与方法及び投与量等は、上述した破骨細胞分化促進剤におけるものと同様である。哺乳動物は、上述したヒト及びヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはヒトである。また、哺乳動物は、好ましくは上述した破骨細胞の機能低下に起因する疾患の患者である。
【００７４】
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含む、破骨細胞の機能低下に起因する疾患の予防又は治療方法も、本発明に包含される。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を投与することにより、破骨細胞分化を促進することができるため、破骨細胞による骨吸収を改善又は促進することができる。このため、破骨細胞の機能低下に起因する疾患を予防、改善又は治療することができる。哺乳動物は、好ましくはヒトである。また、哺乳動物は、好ましくは、上述した破骨細胞の機能低下に起因する疾患の哺乳動物である。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の好ましい態様、その投与方法及び投与量等は、上述したとおりである。
【００７５】
本発明の破骨細胞分化抑制剤等を用いると、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を効果的に抑制することができる。また、本発明の破骨細胞分化促進制剤等を用いると、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を効果的に促進することができる。このため本発明によれば、破骨細胞分化を調節することができる。本発明は、骨吸収性疾患、破骨細胞の機能低下に起因する疾患等の破骨細胞が関与する疾患又は症状の予防、改善又は治療に有用である。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７７】
＜試験例１＞
１．実験方法
１．１  破骨前駆細胞及び破骨細胞の誘導
本研究では、マウス骨髄細胞由来マクロファージ系細胞（M-BMMφ）とマウス単球系細胞株RAW264.7細胞を破骨前駆細胞（破骨細胞前駆細胞）として用いた。
マウス骨髄細胞由来マクロファージ系細胞（M-BMMφ）及びマウス単球系細胞株RAW264.7細胞は、Egusa, H. et al. (2011). “The small molecule harmine regulates NFATc1 and Id2 expression in osteoclast progenitor cells”, Bone 49(2): 264-274.に記載の方法に従って調製した。【００７８】
M-BMMφは、7週齢雄性ddYマウス（ケアリー、大阪）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、50 ng/ml M-CSF（R&D、ミネアポリス、米国）、2 mM L-グルタミン（シグマ社、セントルイス、米国）、100 units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン（ナカライテスク社、京都）及び10% FBS（ジャパン・バイオシーラム、広島）を含むイーグルアルファ修飾最小必須培地（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification）（α-MEM；シグマ社、#M4526、セントルイス、米国）にて37℃、5% CO2気相下で500個/mlの濃度で96ウェル培養プレートに播種後、3日間培養し、破骨前駆細胞への分化を誘導し、M-BMMφ由来破骨前駆細胞を得た。さらに、M-BMMφ由来破骨前駆細胞を上記培地に100 ng/ml 可溶性RANKL（sRANKL；PeproTech EC LTD、ロンドン、英国）を添加した培地にて37℃、5% CO2気相下で3〜6日間培養することにより多核細胞である破骨細胞への分化を誘導した（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）。【００７９】
RAW264.7細胞（破骨前駆細胞）は、100 ng/ml sRANKL、2 mM L-グルタミン、100 units/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン及び10% FBS含有α-MEMにて500個/mlの濃度で96ウェル培養プレートに播種後、37℃で3〜6日間培養し、多核細胞である破骨細胞への分化を誘導した（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）。
上記M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞に、sRANKLを添加して分化誘導する際に各薬物を添加し、各薬物が破骨細胞分化に及ぼす影響を評価した。分化誘導中の培地交換は、各薬物が添加された培地を用いて2〜3日毎に行った。【００８０】
１．２  破骨細胞への分化の評価
破骨細胞への分化の評価は、江草らの報告に従って（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）、細胞を酒石酸耐性フォスファターゼ（TRAP）法により染色し、3核以上のTRAP陽性細胞数を計測することにより行った。【００８１】
１．３  TRAP染色
TRAP染色は、江草ら（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）に記載の方法に従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した後、10% グルタルアルデヒドを用いて固定し、TRAP溶液（0.1 M 酢酸ナトリウム、0.1 M 酢酸、10 mg/ml Naphtol AS-MX Phosphate（シグマ）、0.1% Triton X-100、0.3 M 酒石酸カリウム、0.3 mg/ml Fast Red Violet LB Salt（シグマ））にて37℃で10分間反応させることにより行った。光学顕微鏡を使用して、３つ以上の核を有するTRAP陽性の暗赤色の細胞を多核の破骨細胞として計測した。【００８２】
１．４  ルシフェラーゼアッセイ用株化培養細胞の作製
NFATc1（活性化T細胞核内因子c1（Nuclear Factor of Activated T cells c1））は、活性化T細胞核内因子（NFAT）ファミリーを構成する遺伝子の１つであり、破骨細胞分化におけるマスター転写因子である。
NFAT活性を指標に、小分子化合物ライブラリーLOPAC1280（登録商標）に対して破骨細胞分化に影響を与える物質を探索するためのスクリーニングを行うため、Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274に記載の方法に従って、以下の手順によりルシフェラーゼ遺伝子恒常保有株を作製した。詳細な実験条件等は、Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274に記載の方法に従った。【００８３】
RAW264.7細胞に対してpGL4.30ベクター（プロメガ、#E8481、マディソン、米国）をTransFast（登録商標） Transfection Reagent（プロメガ）を用い、遺伝子導入した。遺伝子導入から3日後、ハイグロマイシンＢ（和光純薬工業、大阪）を培地に0.1 mg/ml添加し、約2週間培養し続け、クローン化した。これらの細胞はsRANKL投与後にルシフェラーゼアッセイを行い、sRANKLによるルシフェラーゼ活性の上昇が確認できたものだけを、ルシフェラーゼ遺伝子恒常保有株としてその後の実験に使用した。【００８４】
１．５  LOPAC1280（登録商標）
破骨細胞分化を制御する化合物のライブラリースクリーニングは、江草らの報告（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）に従って、小分子化合物ライブラリーLOPAC1280（登録商標、シグマ-アルドリッチ）を用いて行った。化合物のスクリーニングには、後述するルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイによるスクリーニングでは、各薬物化合物はすべて培地中で最終濃度が10 μMとなるように添加して使用した。【００８５】
１．６  薬物
試験に使用した薬物は、以下のとおりである。
フェンセリン（シグマ、#P0111）、ドネペジル（シグマ、#D6821）はジメチエルスルホキシド（和光純薬工業）に対して溶解し、培地に対してジメチエルスルホキシドが0.1% となるように調整した上で使用した。【００８６】
ウマ血清由来ブチリルコリンエステラーゼ（偽（pseudo）コリンエステラーゼ：シグマ、#C4290）、組換えマウスアセチルコリンエステラーゼ（rmACHE）（R&D Systems、#P21836）、スコポラミン臭化水素酸塩三水和物（シグマ、#S1875）、ツボクラリン塩化物水和物（Tubocurarine chloride hydrate）（Sigma #T2379）、ジヒドロ−β−エリトロイジン臭化水素酸塩（Dihydro-β-erythroidine hydrobromide）（DHE；TOCRIS #2349）、塩酸メカミラミン（シグマ、#M9020）、メチルリカコニチン クエン酸塩水和物（シグマ、#M168）、塩酸メマンチン（シグマ、#M9292）、アソキシム塩酸塩（Asoxime chloride）（SANTA CRUZ #sc-207304）、α-ブンガロトキシン（calbiochem #203980）、アレンドロン酸ナトリウム三水和物（ビスホスホネート：シグマ、#A4978）は蒸留水に対して溶解し、培地に対して蒸留水が0.1%となるように調整した上で使用した。【００８７】
１．７  ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞を96ウェル培養プレートに播種して（5,000個/ウェル）37℃で培養した。翌日、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞にsRANKL及び小分子化合物ライブラリーLOPAC1280（登録商標）の各薬物化合物を添加し、24時間後にLuciferase Assay System（製品名、プロメガ、#E1501）のプロトコルに従って溶解バッファー（Lysis Buffer）で細胞を溶解し、発光基質を加えた後、ルミノメーターとしてGloMax（登録商標） 20/20n Luminometer（プロメガ）を用いてルシフェラーゼ活性を検出した（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）。【００８８】
１．８  統計処理
実験結果は、平均値 ± 標準偏差で表し、ANOVAにて分散分析後Dunnett's test、又はTukey-Kramer testを用いて比較し、危険率５％以下を有意差ありと判定した。【００８９】
２．結果
２．１  M-BMMφ細胞から破骨細胞への誘導
M-BMMφ細胞をsRANKLの存在下で3〜6日間培養すると、TRAP陽性の多核巨細胞である破骨細胞への分化が誘導された（コントロール）。【００９０】
２．２  小分子化合物ライブラリーLOPAC1280（登録商標）のNFAT活性に対するスクリーニング
上記１．４の手順により作製したルシフェラーゼ遺伝子恒常保有株を用いて、上記１．５に記載の方法で化合物のライブラリースクリーニングを行った。なお、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞に導入されたpGL4.30ベクターは、NFAT応答エレメントをコードする遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子が結合した構造を有する。このため、ルシフェラーゼ恒常保有RAW264.7細胞においてNFATc1が誘導又は活性化されると、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導されてルシフェラーゼ活性が検出される。【００９１】
ルシフェラーゼアッセイによるスクリーニング実験によりNFATを特に活性化させる物質のひとつとしてフェンセリンを見出した。【００９２】
２．３  フェンセリンの破骨細胞分化に対する影響
フェンセリンはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤で、アルツハイマー病の治療薬として臨床応用されていることが報告されている。
NFATc1は破骨細胞分化におけるマスター転写因子であるため。フェンセリンが破骨細胞分化を亢進させることが予測された。上記１．１において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で５日間培養して破骨細胞に分化誘導した際にフェンセリンを添加した場合、破骨細胞分化を促進する結果が得られた（図１）。図１は、RAW264.7細胞（破骨前駆細胞）の分化誘導培地中に、フェンセリンを0nM（コントロール）、250nM、500ｎM、1μM又は2μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化（TRAP陽性多核破骨細胞数）を調べた結果である（図１中、＊：Ｐ＜０．０１）。【００９３】
２．４  ドネペジル破骨細胞分化に対する影響
ドネペジルは、フェンセリンと同様にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤で、アルツハイマー病の治療薬として臨床応用されていることが報告されている。
そのため、ドネペジルがフェンセリンと同様に破骨細胞分化を亢進させることが予測された。上記１．１において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で５日間培養して破骨細胞に分化誘導した際にドネペジルを添加した場合、破骨細胞分化を促進する結果が得られた（図２）。図２は、RAW264.7細胞（破骨前駆細胞）の分化誘導培地中に、ドネペジルを0nM（コントロール）、250nM、500nM、1μM又は10μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である（図２中、＊：Ｐ＜０．０１）。【００９４】
２．５  アセチルコリンエステラーゼの破骨細胞分化に対する影響
アセチルコリンエステラーゼ阻害剤であるフェンセリンとドネペジルによって破骨細胞分化が促進されたことより、破骨細胞分化にアセチルコリンが関与しているかを検討するため、偽コリンエステラーゼ（シグマ社製、ウマ血清由来ブチリルコリンエステラーゼ）又はアセチルコリンエステラーゼ（R&D Systems社製、組換えマウスアセチルコリンエステラーゼ）を使用して破骨細胞分化への影響を検討した。上記１．１において、破骨前駆細胞（M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞）を、sRANKL存在下で５又は６日間（M-BMMφ由来破骨前駆細胞の場合は６日間、RAW264.7細胞の場合は５日間）培養して破骨細胞に分化誘導する際に、偽コリンエステラーゼ、加熱処理して失活させた偽コリンエステラーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼをそれぞれ添加した。この結果、偽コリンエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼには破骨細胞分化を抑制する結果が得られた（図３〜図５、図３〜５中、＊：ｐ＜０．０１）。また、偽コリンエステラーゼを加熱処理して失活させることにより、この抑制効果は失われた（図３）。図３は、RAW264.7細胞をsRANKLで５日間培養して分化誘導した際の培地中に、偽コリンエステラーゼ又はこれを加熱処理して失活させたものをそれぞれ 500 mU/ml となるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。図４は、RAW264.7細胞をsRANKLで5日間培養して分化誘導した際の培地中に、アセチルコリンエステラーゼを25 ng/mlとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。図５は、M-BMMφ細胞をsRANKL存在下で６日間培養して分化誘導した際の培地中に、偽コリンエステラーゼ（500 mU/ml）又はアセチルコリンエステラーゼ（25 ng/ml又は2.5 ng/ml）を添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。
図３〜５において、コントロールでは、偽コリンエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。【００９５】
２．６  アセチルコリン受容体拮抗薬（阻害薬）の破骨細胞分化に対する影響
アセチルコリン受容体は、ムスカリン性アセチルコリン受容体とニコチン性アセチルコリン受容体に分類される。破骨細胞分化に関与している受容体を検討するために、RAW264.7細胞にそれぞれの受容体の拮抗薬を添加して破骨細胞分化への影響を調べた。ムスカリン性アセチルコリン受容体の拮抗薬であるスコポラミン臭化水素酸塩三水和物を添加したところ、破骨細胞分化への影響は認められなかった。一方で、ニコチン性アセチルコリン受容体の拮抗薬である塩酸メカミラミンを添加したところ、破骨細胞分化を抑制する結果が得られた（図６）。図６は、RAW264.7細胞をsRANKLで5日間培養して分化誘導した際の培地中に、スコポラミン臭化水素酸塩三水和物を１μM又は10μM、又は塩酸メカミラミンを10μMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である（図６中、＊：Ｐ＜０．０１）。コントロールでは、スコポラミン臭化水素酸塩三水和物及び塩酸メカミラミンのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。【００９６】
２．７  ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬の破骨細胞分化に対する影響
２．７．１  筋肉型受容体の拮抗薬の影響
ニコチン性アセチルコリン受容体は、主に、筋肉型（末梢型）と、神経型（中枢型）に分類されている。筋肉型受容体の拮抗薬として、ツボクラリンが知られている。ツボクラリンを用いて、これらが破骨細胞分化にどのような影響を及ぼすかを調べた。【００９７】
上記１．１においてRAW264.7細胞（破骨前駆細胞）をsRANKL存在下で５日間培養して分化誘導した際の培地中に、ツボクラリン塩化物水和物（ツボクラリン）を1μM又は10μMとなるように添加し、破骨細胞への分化を調べた。結果を図７に示す。図７中、「ツボクラリン」はツボクラリン塩化物水和物である。コントロールでは、ツボクラリン塩化物水和物を添加しない以外は、同様に実験を行った。筋肉型受容体の拮抗薬であるツボクラリンを添加しても、コントロールと比較して、破骨細胞数の差は認められなかった。つまり、ツボクラリンを添加しても、破骨細胞への分化には影響がなかった。この結果から、筋肉型の受容体は破骨前駆細胞の破骨細胞への分化に関与しないことが示された。【００９８】
２．７．２  神経型受容体の拮抗薬の影響（１）
RAW264.7細胞はマクロファージであるが、ニコチン性アセチルコリン受容体のうち、α４β２ヘテロ5量体がマクロファージに存在することが報告されている。α４β２ヘテロ5量体受容体の拮抗薬が、破骨細胞分化に与える影響を調べた。α４β２ヘテロ5量体受容体の拮抗薬として、α４β２ヘテロ5量体を特異的に阻害する拮抗薬として知られているジヒドロ−β−エリトロイジン臭化水素酸塩（ＤＨＥ）を用いて実験を行った。図８は、上記１．１において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中にDHEを10nM、100nM又は1μMとなるように添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。コントロールでは、ＤＨＥを添加しない以外は、同様に実験を行った。図８から、α４β２ヘテロ5量体の特異的拮抗薬であるDHEを添加しても、コントロールと比較して、破骨細胞数の差は認められなかった。【００９９】
２．７．３  神経型受容体の拮抗薬の影響（２）
ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬である塩酸メカミラミン、塩酸メマンチン、及びアソキシム塩酸塩、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の選択的拮抗薬であるメチルリカコニチン クエン酸塩水和物（MLA）、及びα-ブンガロトキシンの破骨細胞分化への影響を調べた。上記１．１において破骨前駆細胞（M-BMMφ由来破骨前駆細胞又はRAW264.7細胞）をsRANKL存在下でM-BMMφ由来破骨前駆細胞の場合は６日間、RAW264.7細胞の場合は５日間培養して分化誘導した際の培地中に、各薬物を所定の濃度となるように添加し、破骨細胞への分化を調べた。
結果を図９〜１３に示す（図９〜１０及び１１〜１３中、＊：Ｐ＜０．０１）。その結果、いずれのα7-nAChR拮抗薬も、破骨細胞分化を抑制した。特にMLAは破骨細胞への分化（破骨細胞形成）に強い抑制効果を示し、RAW264.7細胞をMLA存在下（１〜２５０ｎＭ）でRANKL刺激により破骨細胞に分化誘導した結果、MLAは破骨細胞形成を著明に抑制した。M-BMMφ由来破骨前駆細胞における破骨細胞分化誘導においても、MLAは同様の作用を示した。【０１００】
図９は、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中に、塩酸メカミラミン（10μM）、又はMLA（１nM又は10nM）を添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。コントロールでは、いずれの薬物も添加しない以外は、同様に実験を行った。【０１０１】
図１０は、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中に、MLAを50nM又は250nMとなるように添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。コントロールでは、MLAを添加しない以外は、同様に実験を行った。また、図１１は、50nMのMLAが破骨前駆細胞（RAW264.7細胞）の破骨細胞（TRAP染色陽性多核細胞）形成に及ぼす影響を示す細胞の顕微鏡写真である。図１１のＡ（コントロール）は、sRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した後にTRAP染色したRAW264.7細胞の顕微鏡写真である。図１１のＢは、sRANKL及び50nMのMLA存在下で5日間培養して分化誘導した後にTRAP染色したRAW264.7細胞の顕微鏡写真である。図１１のＢでは、MLA（50 nM）の添加により、図１１のＡで観察された破骨細胞形成がほぼ完全に抑制されていることを示している。【０１０２】
図１２は、M-BMMφ由来破骨前駆細胞をsRANKL存在下で６日間分化誘導した際の培地中に、MLAを10nM又は50nMとなるよう添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。コントロールでは、MLAを添加しない以外は、同様に実験を行った。マウスの骨髄細胞であるM-BMMφ由来破骨前駆においても、MLAにより破骨細胞の分化が強力に抑制された。【０１０３】
図１３は、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中に、塩酸メマンチン（1μM又は10μM）、アソキシム（100nM、1μM又は10μM）又はα-ブンガロトキシン（100nM又は500nM）を添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を調べた結果である。図１３中、メマンチンは、塩酸メマンチンであり、アソキシムは、アソキシム塩酸塩である。各薬物の濃度は、培地中の最終濃度である。コントロールでは、いずれの薬物も添加しない以外は、同様に実験を行った。図１３から、塩酸メマンチン、及びアソキシム塩酸塩と比較して、α-ブンガロトキシンが低濃度で効果的に破骨細胞分化を抑制した。【０１０４】
また、図１４は、RAW264.7細胞又はM-BMMφ由来破骨前駆細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際に、各細胞におけるα7-nACh受容体及びGAPDH（内在性コントロール）蛋白質の発現をWestern Blottingにより解析した結果である。α7-nACh受容体の抗体はabcam社のab23832（品番）を用いた。図１４に結果を示す実験においては、sRANKL存在下で各細胞を分化誘導した際に、前記「１．６  薬物」に記載した薬物を添加しなかった。図１４の左側２列はRAW264.7細胞におけるα7-nACh受容体及びGAPDHタンパク質の発現を調べた結果であり、右側２列はM-BMMφ由来破骨前駆細胞におけるα7-nACh受容体及びGAPDHタンパク質の発現を調べた結果である。また、図１４に示す結果の上段は、α7-nACh受容体の発現を、下段は、GAPDH蛋白質の発現をそれぞれ示す。図１４から、RAW264.7細胞及びM-BMMφ由来破骨前駆細胞はα7-nACh受容体蛋白質を恒常的に発現しており、破骨細胞分化に伴いその発現を亢進することが明らかとなった。【０１０５】
上記試験により、以下の知見を得た。
（１）フェンセリンは、破骨前駆細胞においてNFATの活性化を亢進する。
（２）フェンセリンは破骨細胞分化を促進する。
（３）ドネペジルは、フェンセリンと同様、破骨細胞分化を促進する。
（４）アセチルコリンエステラーゼにより、破骨細胞分化は抑制される。
（５）α7-nACh受容体の拮抗作用を持つMLA等の選択的拮抗薬により、破骨細胞分化は効果的に抑制される。【０１０６】
＜試験例２＞
メチルリカコニチン クエン酸塩水和物（MLA）の破骨細胞分化への影響を、ビスホスホネート（アレンドロン酸ナトリウム三水和物：シグマ社、#A4978）と比較した。
試験例１の１．１において、RAW264.7細胞をsRANKL存在下で5日間培養して分化誘導した際の培地中に、MLA又はビスホスホネート（ビス）をそれぞれ培地中の薬物濃度が0.1〜10nMとなるように添加し、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を試験例１と同様にTRAP染色により調べた。コントロールでは、MLA及びビスホスホネートのいずれも添加しない以外は、同様に実験を行った。【０１０７】
結果を、図１５に示す。図１５中、「ビス」はビスホスホネートを意味する。実験結果は、平均値 ± 標準偏差で表し、ANOVAにて分散分析後Tukey-Kramer testを用いて比較し、危険率５％以下を有意差ありと判定した（図１５中、＊：Ｐ＜０．０１）。【０１０８】
図１５より、MLAの破骨細胞形成抑制作用は、同濃度のビスホスホネートを有意に上回る結果を示した。つまりMLAは、既存の骨吸収抑制剤であるビスホスホネートより低濃度で、優れた破骨細胞分化抑制効果を示した。【０１０９】
＜試験例３＞
雄性Spague-Dawley系ラット（10週齢）に全身麻酔を施した後、頭皮を剥離して骨膜弁を形成し、頭蓋骨矢状縫合の左右に直径5 mmの欠損を形成した。頭蓋骨欠損の形成には、動物手術用エンジンおよびトレフィンバー（インプラテックス、東京、Cat.#04949202）を用い、注水下にて作業を行った。生検トレパン（カイインダストリーズ株式会社、岐阜、Cat.# BP-50F）を用いて直系5 mmに切り出したコラーゲンスポンジ（テルダーミス（登録商標）；テルモ、東京、Cat.# TD-A006N）に0.5、5、50または500 ngのメチルリカコニチン クエン酸塩水和物（MLA）を含む溶液を含浸させ、これを頭蓋骨欠損部に埋入し、骨膜で被覆し頭皮を縫合した。前記のMLA溶液を含浸させたコラーゲンスポンジを埋入後、3週間に亘り3、4日毎に0.5、5、50または500 ngのMLAを含む溶液を埋入部位に局所注射した。対照群（コントロール）には、同様の術式を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含浸させたコラーゲンスポンジの埋入およびPBSの局所注射を行った。【０１１０】
術後３週にて頭蓋骨を摘出し、摘出した頭蓋骨を実験動物用三次元マイクロＸ線ＣＴ装置（リガク社、製品名R_mCT2、東京）にて撮影後、骨構造解析ソフト（TRI/3D-BON：ラトックシステムエンジニアリング株式会社、東京）を用いて骨密度を測定した。【０１１１】
その結果を図１６に示す。図１６の横軸は、埋入部位へのMLAの投与量を、縦軸は、各量のMLAを３週間投与（各量のMLAを含む溶液を、3、4日毎に投与）後の骨密度をそれぞれ示す。MLAを投与した群における骨密度は、コントロール群と比較して濃度依存的に増加したことから、骨欠損部位へのMLAの局所投与は骨再生を促すことが明らかとなった。この骨再生促進作用は、MLAの破骨細胞形成抑制作用によるものと思われる。【０１１２】
＜試験例４＞
雌性Jcl:ICR系マウス（8週齡）に全身麻酔を施した後、通法に従い（下記URL参照）両側の卵巣を摘出し、閉経後骨粗鬆症モデル（OVX：n=12）を作製した。比較対象には、同マウスに疑似手術を行った群を用意した（Sham：n=4）。
http://www.rs-techno.co.jp/bone/bone_histomorphometry/basic/c03/03_01.html【０１１３】
具体的には、以下の方法により閉経後骨粗鬆症モデルマウスを作製した。
１．雌性Jcl:ICR系マウス（8週齡）に短時間麻酔を行った。
２．麻酔後、背側を上に向け、最終肋骨部から腰椎部の正中線に沿ってバリカンで5cm、幅4cm以上の領域を刈った。
３．術野をガーゼで綺麗にふき取り、消毒液（手術用ヨード）を塗布した。
４．正中線上の最後肋骨から約2cmの尾部方向へ離れた部位の中央（脊柱の上）を有鈎ピンセットで軽くつまみ、ハサミ又はメスで1-1.5cm程度、皮膚を切開した。
５．切開した皮膚の一方を有鈎ピンセットで軽く引き上げ、皮下織を剥離し、左右のいずれか一方の正中から1-1.5cm腹側方向へ離れた部位の腹筋を軽く引き上げた。
６．引き上げた腹膜をハサミで腹方向に注意深く1cm程度切開し、切開部分から無鈎ピンセットを入れ、卵巣を探した。卵巣を軽く摘まみ上げるようにして引き出し、切除した。
７．切除した子宮端を消毒用アルコールで拭いた。
８．出血がないことを確かめ、子宮を静かに腹腔内にもどした。
９．同様の操作を反対側で行い、卵巣を摘出した。
１０．最初に切開した皮膚を縫合し、消毒用ヨードで縫合部をきれいに拭いた。【０１１４】
ShamおよびOVX群を、メチルリカコニチン クエン酸塩水和物（MLA）投与群および非投与群に分け、実験を行った。MLAの投与量は6.2 μmol/kgとし、腹腔内に１日１回、注射にて、2か月間にわたり投与した。2か月間の投与後に屠殺し、右側大腿骨を実験動物用三次元マイクロＸ線ＣＴ装置（リガク社、製品名R_mCT2、東京）にて撮影後、骨構造解析ソフト（TRI/3D-BON：ラトックシステムエンジニアリング株式会社、東京）を用いて骨密度、骨塩量、及び骨体積を測定した。【０１１５】
その結果を図１７、図１８、及び図１９に示す。図１７、図１８、及び図１９の縦軸は、MLAを2か月間投与後の骨密度、骨塩量、及び骨体積をそれぞれ示す。「＋」はMLA投与群、「−」は、MLA非投与群である。卵巣摘出によって骨密度、骨塩量、及び骨体積は低下したが、MLAの投与によって卵巣摘出群の骨密度、骨塩量、及び骨体積は、非投与群と比較して増加した。したがって、MLAの投与は骨粗鬆症における骨密度、骨塩量、及び骨体積を増加させた。
なお、例えばMLAの投与量、投与間隔、投与方法等を適宜調節することにより、骨密度、骨塩量、及び骨体積をより効果的に増加させることも可能である。このため、例えばMLAの投与量、投与間隔、投与方法等を適宜調節することにより、より優れた骨粗鬆症の予防又は治療効果を得ることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、骨粗鬆症、関節リウマチにおける炎症性骨吸収、歯周病における歯槽骨吸収、抜歯後の歯槽骨吸収、歯槽骨増生術後の骨吸収等の骨吸収性疾患、並びに大理石病、骨硬化症、異所性骨化等の破骨細胞の機能低下に起因する疾患等の破骨細胞が関与する疾患の予防又は治療、及び骨の再生医療等に有効であるため、医学領域、歯学領域等において有用である。
【図１】
2014087904.tif 000002
【図２】
2014087904.tif 000003
【図３】
2014087904.tif 000004
【図４】
2014087904.tif 000005
【図５】
2014087904.tif 000006
【図６】
2014087904.tif 000007
【図７】
2014087904.tif 000008
【図８】
2014087904.tif 000009
【図９】
2014087904.tif 000010
【図１０】
2014087904.tif 000011
【図１１】
2014087904.tif 000012
【図１２】
2014087904.tif 000013
【図１３】
2014087904.tif 000014
【図１４】
2014087904.tif 000015
【図１５】
2014087904.tif 000016
【図１６】
2014087904.tif 000017
【図１７】
2014087904.tif 000018
【図１８】
2014087904.tif 000019
【図１９】
2014087904.tif 000020
【国際調査報告】
2014087904.tif 000021
2014087904.tif 000022
2014087904.tif 000023
2014087904.tif 000024
2014087904.tif 000025
2014087904.tif 000026
2014087904.tif 000027
2014087904.tif 000028
2014087904.tif 000029