(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を発現させて第１の遺伝子産物を供給する段階と、
第１の基質を前記細胞システムに供給する段階と、
カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法であって、
前記ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、配列番号１からなるＤＮＡ配列を含み、
前記第１の基質は、アシルＣｏＡおよびバニリルアミンを含む、
カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項２】
細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を発現させて第１の遺伝子産物を供給する段階と、
第１の基質を前記細胞システムに供給する段階と、
カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法であって、
前記第ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を持つＤＮＡ配列を含み、かつ、アシルＣｏＡとバニリルアミンとを基質として用いてカプサイシノイドを生成する活性を有し、
前記第１の基質は、アシルＣｏＡおよびバニリルアミンを含む、
カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項３】
前記ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、ゴーストチリペッパーに由来する、請求項１または２に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項４】
前記アシルＣｏＡは、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡ、８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡ、オクタノイル‐ＣｏＡ、デカノイル‐ＣｏＡ、他の中鎖から長鎖のアシルＣｏＡ、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項５】
前記第１の基質を前記細胞システムに供給する段階は、細胞システムにおいてＡＣＳ１遺伝子を発現させて第２の遺伝子産物を供給する段階と、第２の基質を供給する段階と、をさらに含むカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法であって、
前記第１の基質は８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡを含み、
前記第２の基質は、８−メチル−６−ノネン酸であり、
前記カプサイシノイドはカプサイシンである、
請求項１から４のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項６】
前記第１の基質を前記細胞システムに供給する段階は、細胞システムにおいてＡＣＳ１遺伝子を発現させて第２の遺伝子産物を供給する段階と、第２の基質を供給する段階と、をさらに含むカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法であって、
前記第１の基質は８‐メチル‐６‐ノナノイル‐ＣｏＡを含み、
前記第２の基質は、８−メチル−６−ノナン酸であり、
前記カプサイシノイドはジヒドロカプサイシンである、
請求項１から４のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項７】
前記ＡＣＳ１遺伝子は、ゴーストチリペッパーに由来する、
請求項５または６に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項８】
第３の基質であるバニリルアミンを供給する段階をさらに備える、請求項１から７のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項９】
前記第３の基質を供給する段階は、細胞システムにおいてｐＡＭＴ遺伝子を発現させて第３の遺伝子産物を供給する段階と、第４の基質であるバニリンを供給する段階と、をさらに含む、請求項８に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項１０】
前記ｐＡＭＴ遺伝子は、ゴーストチリペッパーに由来する、請求項９に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項１１】
前記細胞システムは、バクテリア、酵母およびそれらの組み合わせから成る群から選択される微生物を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項１２】
細胞システムを培地で培養する段階をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項１３】
混合物においてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を発現させて第１の遺伝子産物を供給する段階と、
第１の基質を前記混合物に供給する段階と、
カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するコンバージョン方法であって、
前記ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を持つＤＮＡ配列を含み、かつアシルＣｏＡとバニリルアミンとを基質として用いてカプサイシノイドを生成する活性を有し、
前記第１の基質は、アシルＣｏＡおよびバニリルアミンを含み、
前記第１の基質を前記混合物に供給する段階は、前記混合物においてＡＣＳ１を発現させて第２の遺伝子産物を供給する段階と、第２の基質を供給する段階と、を含み、
前記第２の基質は、８−メチル−６−ノネン酸であり、
前記遺伝子のうちのいずれかを発現させる段階は、インビトロ翻訳によって前記遺伝子を発現させる段階をさらに含む、カプサイシノイドを生成するコンバージョン方法。
【請求項１４】
混合物においてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を発現させて第１の遺伝子産物を供給する段階と、
第１の基質を前記混合物に供給する段階と、
カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するコンバージョン方法であって、
前記ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を持つＤＮＡ配列を含み、かつアシルＣｏＡとバニリルアミンとを基質として用いてカプサイシノイドを生成する活性を有し、
前記第１の基質は、アシルＣｏＡおよびバニリルアミンを含み、
前記第１の基質を前記混合物に供給する段階は、前記混合物においてｐＡＭＴ遺伝子を発現させて第３の遺伝子産物を供給する段階と、第４の基質であるバニリンを供給する段階と、を含み、
前記遺伝子のうちのいずれかを発現させる段階は、インビトロ翻訳によって前記遺伝子を発現させる段階をさらに含む、カプサイシノイドを生成するコンバージョン方法。
【請求項１５】
前記遺伝子のうちのいずれかからの遺伝子産物は、組み換えタンパク質として精製される段階を含む、請求項１３または１４に記載のカプサイシノイドを生成するコンバージョン方法。
【請求項１６】
前記アシルＣｏＡは８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のカプサイシノイドを生成するコンバージョン方法。
【請求項１７】
前記カプサイシノイドはカプサイシンである、請求項１６に記載のカプサイシノイドを生成するコンバージョン方法。
【請求項１８】
細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を発現させる段階と、
脂肪酸‐ＣｏＡを供給する段階と、
バニリルアミンを供給する段階と、
前記細胞システムを培地で培養する段階と、
カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法であって、
前記ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子は、配列番号１からなるＤＮＡ配列を含む、
カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項１９】
前記脂肪酸‐ＣｏＡは８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡであり、前記カプサイシノイドの総重量の９０％超がカプサイシンである、請求項１８に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項２０】
前記脂肪酸‐ＣｏＡは８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡであり、前記カプサイシノイドの総重量の９０％超がジヒドロカプサイシンである、請求項１８に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項２１】
前記脂肪酸‐ＣｏＡはオクタノイル‐ＣｏＡである、請求項１８に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【請求項２２】
前記脂肪酸‐ＣｏＡはデカノイル‐ＣｏＡである、請求項１８に記載のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョン方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
本開示は、発明の名称「カプサイシノイドの微生物生成のためのカプサイシンシンターゼを使用する方法」のＰＣＴ特許出願である。本出願は、２０１４年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／９２８，８０３号に基づく優先権を主張し、当該出願は参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【０００２】
本開示は概して、カプサイシンおよび関連のカプサイシノイドの生合成生成のための特にアシル‐ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、アミノトランスフェラーゼ（ｐＡＭ１）およびカプサイシンシンターゼ（ＣＳ）を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術：チリペッパーは、トウガラシ属（ｇｅｎｕｓ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物の果実であり、ナス科Ｓｏｌａｎａｃｅａｅのメンバーである。チリペッパーは、その辛みの性質により、スパイシーで辛い料理の食品添加物として広く使用されてきた。カプサイシノイドは、チリペッパーの辛み感覚の役割を持つ物質であり、前述の通り、カプサイシノイドの生成はトウガラシ属（ｇｅｎｕｓ  Ｃａｐｓｉｃｕｍ）に限られる。カプサイシン（ＣＰ、８‐メチル‐Ｎ‐バニリル‐トランス‐６‐ノネンアミド）およびジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ、８‐メチル‐Ｎ‐バニリルノナンアミド）が、チリペッパーの辛みの最大約９０％を占める２つの主要なカプサイシノイドである（２００７年、ＧａｒｃｅｓＣｌａｖｅｒその他）。
【０００４】
辛み感覚およびスパイシーな風味のための食品添加物として主に使用されることに加え、カプサイシノイドは、多くの医薬および医療の用途を有する。カプサイシノイドは、鎮痛、抗癌、消炎、抗酸化、および抗肥満活性を含む一連の生理的および薬理的効果を発揮することがわかっており、血管運動神経性鼻炎、変形性関節炎およびリウマチ関節炎のようないくつかの病気によって起きる痛みを軽減することを目的とする軟膏、パッチ、オイルおよびクリームの主成分として使用される（２０１１年、Ａｚａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚその他）。カプサイシノイドはまた、市場における護身用エアゾールスプレー（すなわち、ペッパースプレー）内の主要な有効成分として現在使用されている(２００１年、Ｒｅｉｌｌｙその他)。最近、カプサイシノイドは、ハムスターにおいて、血漿コレステロールを下げ、内皮機能を改善することが報告された（２０１３年、Ｌｉａｎｇその他）。
【０００５】
カプサイシンは、ＣＳ、すなわち８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡの８‐メチルノネノイル部分をバニリルアミンに転移してアミド抱合を形成するアシルトランスフェラーゼによって合成されると考えられている（図１）。バニリルアミンは、フェニルプロパノイド経路から形成され、そこでは分岐鎖脂肪酸はバリン等の分岐鎖アミノ酸に由来する（１９９９年、Ｃｕｒｒｙその他。２００９年、Ｍａｚｏｕｒｅｋその他）。アミノトランスフェラーゼ（ｐＡＭＴ）は、バニリンからのバニリルアミンの形成を触媒する。出願人らは、ゴーストチリペッパー由来のｐＡＭＴをクローニングした。他の基質、８‐メチルノネノイル‐ＣｏＡは、アシル‐ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）の活性を介する、８‐メチル‐トランス‐６‐ノネン酸に由来する。
【０００６】
本開示において、出願人らは、微生物の生合成によってカプサイシノイドを生成すべく、ＣＳの遺伝子産物を利用した。出願人らがカプサイシノイド、特にカプサイシンの微生物生成を実現する最初の者たちである。さらに、本発明は、微生物の生合成によって、カプサイシンを生成するという、業界において長年にわたり求められていたにも関わらず未対応であったニーズに取り組む。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、混合物においてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物を発現させる段階と、第１の基質を上記混合物に供給する段階と、カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法である。
【０００８】
別の本開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物を発現させる段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、上記カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法である。
【０００９】
別の本開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物を発現させる段階と、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡを供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、複数のカプサイシノイドを収集する段階と、を備える、複数のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法であり、上記複数のカプサイシノイドは、数値比またはモル比で、約９０％より多いカプサイシンおよび約５％より少ないジヒドロカプサイシンである。
【００１０】
別の本開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物を発現させる段階と、８‐メチル‐ノナノイル‐ＣｏＡを供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、複数のカプサイシノイドを収集する段階と、を備える、複数のカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法であって、上記複数のカプサイシノイドは、比で、約９０％より多いジヒドロカプサイシンおよび約５％より少ないカプサイシンである。
【００１１】
別の開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物を発現させる段階と、脂肪酸‐ＣｏＡ（脂肪酸の活性形態）を供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成する生合成方法である。
【００１２】
本開示をより良く理解するために、以下の添付図面への参照がなされることがある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カプサイシン生合成経路を示す。Ｓｔｅｗａｒｔその他（２００７年）から抜粋。
【００１４】
【図２】基質を供給するとＡＣＳ１遺伝子およびＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を過剰発現する、大腸菌ＢＬ２１細胞から抽出された産物のＨＰＬＣプロファイルを示す。１：カプサイシン（ＣＰ）および２：ジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ）。（Ａ）シグマ製のＣＰスタンダードおよびＤＨＣＰスタンダードの混合物。（Ｂ）供給基質なしのコントロール。（Ｃ）バニリルアミン（ＶＮ）および８‐メチル‐６‐ノナン酸（６Ｅ）を供給。（Ｄ）ＶＮおよび８‐メチルノナン酸（８Ｍ）を供給。（Ｅ）ＶＮ、６Ｅおよび８Ｍを供給。
【００１５】
【図３】シグマから入手されたカプサイシンスタンダードおよびジヒドロカプサイシンスタンダードのＧＣ／ＭＳプロファイルを示す（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６０３７６シグマ、ＣＰおよびＤＨＣＰの混合物）。
【００１６】
【図４】異なる基質（例えば、ＶＮ、６Ｅおよび８Ｍ）を、ＡＣＳ１およびＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１を過剰発現するＢＬ２１培養液に供給して得られた産物のＧＣ／ＭＳプロファイルを示す。ＧＣ／ＭＳ解析は、ＧＣＭＳ  ＱＰ２０１０Ｓ検出器と結合された島津製作所のＧＣ−２０１０システムを用いて行われた。分離には、カラムＲｔｘ−５ＭＳ（厚み０．２５ｕ、長さ３０ｍ、直径０．２５ｍｍ）が使用された。注入温度：２６５℃、注入モード：スプリット、オーブン温度：１４０℃。温度勾配：０‐１分、１４０℃。１〜１１．２５分、１４０℃から２６３℃。レート  １２。１１．２５〜２１．２５分、２６３℃。
【００１７】
【図５】カプサイシン（ＣＰ）およびジヒドロカプサイシン（ＤＨＣＰ）コントロールのプロファイルと比較された、基質（６Ｅおよび８Ｍ）の供給から得られた産物のＭＳを示す。
【００１８】
【図６】ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞におけるＨｉｓ‐ＳＵＭＯ‐Ｐｕｎ１発現のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ解析を示す。０，２０：ＩＰＴＧ誘導後の経過時における総タンパク量；Ｃは可溶性粗製タンパク質抽出；Ｅ１からＥ３は、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムから溶出された画分。Ｐｕｎ１の分子量は約４９Ｋｄであり、Ｈｉｓ‐ＳＵＭＯタグの分子量は約１２Ｋｄである。
【００１９】
【図７】ＶＮおよび６Ｅが基質として使用されたときのＡＣＳ１およびＰｕｎ１の共役反応の産物のＨＰＬＣプロファイルを示す。＃１は推定上のＣＰである。
【００２０】
【図８】ＧＣ／ＭＳによる解析による、ＡＣＳ１−Ｐｕｎ１共役酵素システムによる、インビトロにおけるＣＰの形成（図７のピーク＃１）を示す。
【００２１】
【図９】オクタノイル‐ＣｏＡまたはデカノイル‐ＣｏＡが基質として使用されたときのＰｕｎ１のインビトロ活性のＨＰＬＣ解析を示す。＃１は推定上のＮ‐バニリルオクタンアミド。＃２は推定上のバニリルデカンアミド。
【００２２】
【図１０】オクタノイル‐ＣｏＡまたはデカノイル‐ＣｏＡが基質として使用されたときのＰｕｎ１のインビトロ活性のＧＣ／ＭＳ解析を示す。＃１は推定上のＮ‐バニリルオクタンアミド。＃２は推定上のバニリルデカンアミド。
【００２３】
【図１１】図１０のピーク＃１および＃２のＭＳプロファイルを示す。＃１はＮ‐バニリルオクタンアミド、＃２はＮ‐バニリルデカンアミド。
【００２４】
【図１２】５０ｍｇ／Ｌのバニリルアミン（ＶＮ）および５０ｍｇ／Ｌの８‐メチル‐６‐ノネン酸（６Ｅ）を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＡＣＳ１およびｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ−ゴーストＰｕｎ１を共過剰発現するＢＬ２１（ＤＥ３）培養液に供給して得られるカプサイシン（ＣＰ）の生成における培養培地の影響を示す。ＬＢはＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ、ＴＢはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、Ｍ９はＭ９最小培地を表わす。実験は三重反復で行われ、グラフを描画するのに平均値が使用された。
【００２５】
本開示には様々な修正形態および代替的形態を取り入れることが可能であるが、図面においては、その複数の特定の実施形態が例示として示されており、本明細書において詳細に説明されている。しかしながら、図面および本明細書に示される詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定することを意図しておらず、対照的に、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神および範囲に属するすべての修正形態、均等技術、代替形態に及ぶ意図であることを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［定義］
［細胞システム］
細胞システムとは、異所性タンパク質の発現をもたらす任意の細胞である。それには、バクテリア、酵母、植物細胞および動物細胞が含まれる。それには、原核および真核細胞が含まれる。また、それにはリボソームのような細胞コンポーネントに基づくタンパク質のインビトロ発現も含まれる。
［細胞システムの培養］
【００２７】
培養には、細胞が増殖および分裂することを可能にする培地を供給することが含まれる。培養には、細胞または細胞コンポーネントが、組み換えタンパク質を翻訳し、生成できるように複数のリソースを提供することも含まれる。
［タンパク質発現］
【００２８】
タンパク質の生成は、遺伝子の発現後に発生し得る。それは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の複数の段階から成る。ｍＲＮＡは次にポリペプチド鎖に変換され、それは最終的にタンパク質にフォールディングされる。ＤＮＡはトランスフェクションを介して細胞に存在し、トランスフェクションとは核酸を細胞に意図的に導入するプロセスである。当該用語は通常、真核細胞における非ウイルス方法に使用される。当該用語が他の方法および細胞タイプにも言及することがあるが、他の用語が好ましい。バクテリア、植物細胞を含む動物以外の真核細胞における非ウイルスＤＮＡ転移を記載するのに、「形質転換」がより一般的に使用される。ウイルス仲介のＤＮＡ転移を記載するのに、「形質導入」が通常使用される。形質転換、形質導入、およびウイルス感染が、本願のトランスフェクションの定義下に含まれる。また、タンパク質発現にはインビトロ翻訳が含まれ、そこではタンパク質が細胞の外にある細胞器官を利用して発現される。
［バイオコンバージョン］
【００２９】
生体内変化としても知られるバイオコンバージョンという用語は、非生物学的によりコスト高または非実現可能な化学反応を実行するために、生きている生物、通常は微生物（例えば、バクテリアおよび酵母）を用いることを指す。これらの生物は、物質を化学的に修飾された形態に変換する。
［混合物］
【００３０】
混合物とは、同一性が保持され、溶液、懸濁液、およびコロイドの形態で混合される、２または２より多い物質の物理的な組み合わせを指す。
［遺伝子産物］
【００３１】
遺伝子産物とは、遺伝子の発現からもたらされる、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかである、生化学的材料である。
【００３２】
本発明の開示は、混合物においてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物を発現させる段階と、第１の基質を混合物に供給する段階と、カプサイシノイドを収集する段階と、を備える、カプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法である。ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物は、ＤＮＡ配列のＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に基づく。さらなる開示において、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１との少なくとも約９５％の同一性を持つＤＮＡ配列に基づく。別の実施形態において、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物は、ゴーストチリペッパーに由来する。さらに、第１の基質は、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡ、８‐メチルノナノイル‐ＣｏＡ、オクタノイル‐ＣｏＡ、デカノイル‐ＣｏＡ、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される活性脂肪酸である。
【００３３】
別の開示は、第１の基質を混合物に供給する段階は、混合物においてＡＣＳの第２の遺伝子産物、特にＡＣＳ１を発現させる段階と、第２の基質を供給する段階と、によることをさらに含む。一実施形態において、ＡＣＳ１の第２の遺伝子産物はゴーストチリペッパーに由来する。第２の基質は、８‐メチル‐６‐ノネン酸、８‐メチルノナン酸、オクタン酸、デカン酸、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される脂肪酸である。さらに、別の開示において、遺伝子のうちのいずれかを発現させる段階は、インビトロ翻訳で生じる。別の開示において、遺伝子のうちのいずれかを発現させる段階は、細胞システムにおいて遺伝子を発現させることでさらに生じる。細胞システムは、バクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される微生物に基づく。遺伝子のいずれかからの発現産物は、組み換えタンパク質として精製される。さらなる開示において、第３の基質であるバニリルアミンが供給される。
【００３４】
別の開示は、混合物においてｐＡＭＴの第３の遺伝子産物を発現させる段階と、第４の基質であるバニリンを供給する段階と、を備える。一実施形態において、ｐＡＭＴの第３の遺伝子産物はゴーストチリペッパーに由来する。一開示において、遺伝子のいずれかは、インビトロ翻訳によって発現される。別の開示において、遺伝子のいずれかは、細胞システムにおいて発現される。細胞システムは、バクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される微生物に基づく。遺伝子のいずれかからの発現産物は、組み換えタンパク質として精製され得る。
【００３５】
別の開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の第１の遺伝子産物を発現させる段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、カプサイシノイドを収集する段階と、を備える。一開示において、カプサイシノイドはカプサイシンである。別の実施形態は、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡを供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、をさらに備える。８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡの供給は、細胞システムにおいてＡＣＳ１の第２の遺伝子産物を発現させる段階と、基質である８‐メチル‐６‐ノネン酸を供給する段階と、を含む。バニリルアミンの供給は、細胞システムにおいてｐＡＭＴの第３の遺伝子産物を発現させる段階と、基質であるバニリンを供給する段階と、を含む。別の開示において、カプサイシノイドはカプサイシンである。代替的または追加的に、カプサイシノイドはジヒドロカプサイシンである。ジヒドロカプサイシンの生成の観点から、本開示は、８‐メチル‐ノナノイル‐ＣｏＡを供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、をさらに備える。８‐メチル‐ノナノイル‐ＣｏＡの供給に関し、それは、細胞システムにおいてＡＣＳの第２の遺伝子産物、特にＡＣＳ１を発現させる段階と、８‐メチルノナン酸を供給する段階と、を含む。本開示は、細胞システムにおいてｐＡＭＴの第３の遺伝子産物を発現させる段階と、基質であるバニリンを供給する段階と、をさらに含む。第１の遺伝子産物は、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１から発現される。一実施形態において、遺伝子産物は、ゴーストチリペッパーからクローニングされたＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１との少なくとも約９５％の配列同一性を共有するＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１から発現される。細胞システムは、バクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００３６】
別の開示は、細胞システムにおいてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物を発現させる段階と、脂肪酸‐ＣｏＡを供給する段階と、バニリルアミンを供給する段階と、細胞システムを培地で培養する段階と、カプサイシノイドを収集する段階と、を備えるカプサイシノイドを生成するバイオコンバージョンの方法である。一開示において、脂肪酸‐ＣｏＡは、８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡであり、カプサイシノイドは数値比で、約９０％より多いカプサイシンである。別の開示において、脂肪酸‐ＣｏＡは、８‐メチル‐ノナノイル‐ＣｏＡであり、カプサイシノイドは数値比で、約９０％より多いジヒドロカプサイシンである。別の開示において、供給される脂肪酸‐ＣｏＡは、オクタノイル‐ＣｏＡであり、カプサイシノイド産物は、Ｎ‐バニリルオクタンアミド、より具体的には約９０％より多いＮ‐バニリルオクタンアミドである。別の開示において、脂肪酸ＣｏＡはデカノイル‐ＣｏＡであり、カプサイシノイド産物はＮ‐バニリルデカンアミド、より具体的には約９０％より多いＮバニリルデカンアミドである。
【００３７】
様々な実施形態で使用される細胞システムについて、それは、バクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。生合成生成を可能にするであろう任意の細胞システムが提供される。
【００３８】
ペッパーの辛みは、Ｐｕｎ１の遺伝子座により制御されることが長い間知られており、最近、対応する遺伝子はＡＴ３と特定された。ＡＴ３は、推定のアシルトランスフェラーゼをコードする（２００５年、Ｓｔｅｗａｒｔその他）。ＡＴ３は、ＢＡＨＤアシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーであり、推定上のＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１（２００９年、Ｋｉｍその他）として示唆されてきた。しかしながら、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物の生物化学的活性は、これまで報告されていない。生物化学的活性に関するこの証拠の欠如は、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物のためのアシル‐ＣｏＡ基質は市販されていないという事実に主に起因し、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の組み換え発現は、当該タンパク質の極端な非溶解性に起因し困難であった（２００５年、Ｓｔｅｗａｒｔその他）。また、ＣＳはＢＡＨＤファミリー以外のアシルトランスフェラーゼファミリーに属する可能性があると推測されてきた（２００５年、Ｓｔｅｗａｒｔその他）。出願人らが、バイオコンバージョン反応においてＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物がＣＳ機能を有することを示す最初の者たちである。出願人らは、カプサイシノイド、特にカプサイシンをバイオコンバージョン方法で生成するという長年にわたり求められていたが未対応であったニーズに取り組んできた。
【００３９】
さらに、食品、薬、および護身（例えば、ペッパースプレー）におけるカプサイシノイドの広範な用途により、カプサイシノイドに対する需要はますます高まりつつある。これまで、ホットペッパーが唯一のカプサイシノイドの天然ソースであった。しかしながら、ホットペッパーにおけるカプサイシノイドの含有量は概して低く、環境および成長条件により影響を受ける。例えば、ペッパーのグラムあたりのカプサイシノイドの合計量は０．２２から２０ｍｇの範囲（乾燥重量）が報告されている（１９９８年、Ｔｈｏｍａｓその他）。天然カプサイシノイドの供給不足は、天然カプサイシノイドの非常に高い価格の原因となる。例えば、キログラムあたり２０００〜３０００米ドルである（http://www.alibaba.com/product gs/810894171/Natural Capsaicin Capsaicine Powder 97 16.html?s=p）。当該需要を満たし得るカプサイシノイドの別のソースを有することは、業界において長い間未対応であった。
【００４０】
遺伝子組み換えされた微生物が、再生可能資源からの薬、化学品、およびバイオ燃料の製造のためのますます重要なプラットフォームとなっている（２０１１年、Ｄｕその他）。これらのバイオテクノロジー製品が食品において使用されるとき、現行の諸規則によると、食品業界では「ナチュラル」とラベルを付けることができる（１９９７年、ＨａｕｓｌｅｒおよびＭｕｎｃｈ）。微生物生成プラットフォームの開発の前提条件は、バイオコンバージョン経路における対応する遺伝子のクローニングおよび特性評価である。カプサイシノイドの重要性により、カプサイシンシンターゼをコードする遺伝子のクローニングに長い間関心が寄せられていた。例えば、１００年以上前に、ウェバーは、そのＰＵＮ１遺伝子座をペッパーの辛みの制御要素であるとして報告した（１９１１年、Ｗｅｂｂｅｒ）。対応する遺伝子はクローニングされ、それはＢＡＨＤスーパーファミリーのアシルトランスフェラーゼである、ＡＴ３の遺伝子産物をコードする（２００５年、Ｓｔｅｗａｒｔその他）。しかしながら、出願人らにより最近証明されるまで、何らの生物化学的活性もこの推定上のアシルトランスフェラーゼによるものとはされておらず、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物が推定上のカプサイシンシンターゼであるという主張は疑義があった。さらに、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物のためのアシル‐ＣｏＡ基質の欠如により、カプサイシンおよび他のカプサイシノイドをバイオコンバーティングメカニズムで生成するためのＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物の活性は、有効にキャプチャできなかった。後に、別の研究において、酵素から遺伝子へのアプローチを使用して、Ｐｒａｓａｄその他（２００６）は、ｃｓｙ１をなかなか見つからなかったカプサイシンシンターゼ遺伝子として同定したと報告した。しかしながら、２年後、この研究は撤回（２００８年、Ｐｒａｓａｄその他）され、ＣＳ遺伝子は特定されず、未確認のままである。従って、生化学的な同一性のみならず、実際のカプサイシンシンターゼの確認が業界における長い間の目標であり、カプサイシンおよび他のカプサイシノイドを生成するためのバイオコンバーティングメカニズムにおけるＣＳ遺伝子の利用が、長い間望まれてきた。
【００４１】
出願人らがＡＣＳ１の遺伝子産物の活性を特定した後、出願人らは、アシル‐ＣｏＡ基質を生成でき、故に、出願人らはＣＳ／ＰＵＮ１／ＡＴ３がインビトロおよびインビボの両方においてＣＳ活性を有することを実証できた。これは、カプサイシノイドの異種生合成の最初の例であり、それは「ナチュラル」カプサイシノイドの生成のための微生物発酵プロセスの開発および最適化の道を開いた。また、この方法の開発において、出願人らは、異なる脂肪酸基質の供給を介して、彼らは、自然界では発生不可能な異なる種のカプサイシノイドを生成できたことを示した。
［実施例１］
［ＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３の遺伝子産物は、インビボでＣＳ活性を有する］
【００４２】
出願人らの最近のペッパーからのＡＣＳ活性の発見(米国第６１／８９８９４４号におけるＣｈｅｎ  Ｈ、Ｗａｎｇ  Ｈ、およびＹｕ  Ｏ)の後、ＡＣＳ１およびＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物が、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において共過剰発現された。出願人らは、ＡＣＳ１の遺伝子産物は、ＣｏＡの追加により、脂肪酸を活性化する能力を有し、高エネルギーの脂肪酸の形態を生成することを発見した。ＩＰＴＧによるタンパク質発現の誘導およびバニリルアミン（ＶＮ）と８‐メチル‐６‐ノネン酸（６Ｅ）／８‐メチルノナン酸（８Ｍ）の供給後、推定上のＣＰ／ＤＨＣＰが生成された（図２）。自然界では（すなわち、ホットペッパー由来）、カプサイシンおよびジヒドロカプサイシンは一緒に生成されるのに対し、生合成反応では、出願人らは、特定の活性脂肪酸（例えば、６Ｅ‐ＣｏＡ、８Ｍ‐ＣｏＡ、オクタノイル‐ＣｏＡ、およびデカノイル‐ＣｏＡ）を供給することによって、カプサイシン、ジヒドロカプサイシンおよび他のカプサイシノイドの生成を制御できることを発見した。
［ＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３のクローニング］
【００４３】
出願人らは、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子の遺伝子産物のＣＳ活性および細胞システムにおける基質のバイオコンバージョンを生化学的に示す最初の者たちである。特に、出願人らは、活性脂肪酸のカプサイシノイドへの変換を触媒する能力を示した。ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子の初期クローニングは、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿ＴＯＰＯベクターの中であった。ＣＳのクローニングには、以下のプライマーを必要とする。プライマー３０９‐ｐｅｎｔｒ‐Ｆ：CACCATGGCTTTTGCATTACCATCおよびプライマー３０９−ｐｅｎｔｒ−Ｒ： TTAGGCAATGAACTCAAGGAGが使用され、ゴーストチリペッパーの青玉果のｃＤＮＡからＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を増幅させた。得られたＰＣＲ産物はｐＥＮＴＲ／Ｄ＿ＴＯＰＯベクターの中でクローニングされ、次にＬＲ反応（インビトロゲン）によって、ｐＤＥＳＴ１７ベクターに置換された。次に、ＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物は、ＢＬ２１（ＤＥ３）のような細菌システムにおいて発現され、その後、必要な基質を供給すると、ＣＰおよびＤＨＣＰが検出された。ＨＰＬＣが、Ｄｉｏｎｅｘ−ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（サーモサイエンティフィック）とともに、Ａｃｃｌａｉｍ（登録商標）１２０  Ｃ１８逆相カラム（サーモサイエンティフィック；３μ、１２０Å、１５０×３ｍｍ）を使用して行われた。移動相は、溶媒Ａ（０．１％のトリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）から成る。勾配溶出手順は次の通りである。０〜５分、５％のＢ、５〜９分、５％から８０％の直線勾配となるＢ、９〜１１分、８０％のＢ、１１〜１２分、５％のＢである。フローレートは０．６ｍｌ／分であった。ダイオードアレイ検出器は、２００から４００ｎｍ範囲でデータを収集した。基質および産物の検出および定量化については、ピーク領域が２８０ｎｍで測定された。
［ＣＰ／ＤＨＣＰの同一性の確認］
【００４４】
ＣＰ／ＤＨＣＰの同一性は、さらなるＧＣ／ＭＳ解析により確認された。図３（ＧＣ／ＭＳプロファイル）に示される通り、シグマ製のＣＰスタンダードは実際に、比率約６０：４０のＣＰおよびＤＨＣＰの混合物である。保持時間は、ＣＰおよびＤＨＣＰに対し、それぞれ１３．８０および１４．０４分である。ＧＣ／ＭＳマシンにおけるＭＳライブラリは、ＣＰおよびＤＨＣＰ両方のスタンダードスペクトルを含み、それは、シグマ製スタンダードのスペクトルと一致する。図４に示される通り、ＡＣＳ１およびＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１の遺伝子産物を発現する培養液への６Ｅおよび８Ｍの供給により、それぞれＣＰおよびＤＨＣＰを生成する結果となった。当該産物のスペクトルは、並べて比較すると、スタンダードのスペクトルと非常によく一致する（図５）。
［ＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３の遺伝子産物はインビトロにおいてＣＳ活性を有する］
【００４５】
インビトロの活性を判断すべく、出願人らは、３０９‐ｓｕｍｏ‐ＦのCGC GAA CAG ATT GGA GGT GCTTTTGCATTACCATプライマーおよび３０９−ｓｕｍｏ−ＲのGTG GCG GCC GCT CTA TTA TTAGGCAATGAACTCAAGGAGプライマーを使用して、ゴーストチリペッパーの青玉果由来のｃＤＮＡからＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３遺伝子を増幅させた。得られたＰＣＲ産物が、１％のアガロースゲルで精製され、リニアｐＥＴｉｔｅ  Ｎ‐Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ発現ベクター（ウィスコンシン州ミドルトンのルシジェン社製）を用いて結合された。当該ＤＮＡ混合物が、熱ショックによりＨＩ‐コントロール１０Ｇケミカルコンピテントセル（ルシジェン社製）を形質転換するのに使用された。次に、遺伝子挿入は完全に配列決定され、その配列は、シネンセ種（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃｈｉｎｅｎｓｅ）からのＰｕｎ１遺伝子の配列と同一であった（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ８１９０２７）。
［ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１: ゴーストチリペッパーのＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３の配列］
【００４６】
ATGGCTTTTGCATTACCATCATCACTTGTTTCAGTTTGTGACAAATCTTTTATCAAACCTTCCTCTCTCACCCCCTCTAAAC TTAGATTTCACAAGCTATCTTTCATCGATCAATCTTTAAGTAATATGTATATCCCTTGTGCATTTTTTTACCCTAAAGTACAACAAAGACTAGAAGACTCCAAAAATTCTGATGAGCTTTCCCATATAGCCCACTTGCTACAAACATCTCTATCACAAACTCTAGTCTCTTACTATCCTTATGCAGGAAAGTTGAAGGACAATGCTACTGTTGACTGTAACGATATGGGAGCTGAGTTCTTGAGTGTTCGAATAAAATGTTCCATGTCTGAAATTCTTGATCATCCTCATGCATCTCTTGCAGAGAGCATAGTTTTGCCCAAGGATTTGCCTTGGGCGAATAATTGTGAAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTCAAGTAAGTAAGTTTGATTGTGGGGGAATAGCCATCAGTGTATGCTTTTCGCACAAGATTGGTGATGGTTGCTCTCTGCTTAATTTCCTTAATGATTGGTCTAGCGTTACTCGTGATCATACGACAACAGCTTTAGTTCCATCTCCTAGATTTGTAGGAGATTCTGTCTTCTCTACAAAAAAATATGGTTCTCTTATTACGCCACAAATTTTGTCCGATCTCAACGAGTGCGTACAGAAAAGACTCATTTTTCCTACAGATAAGTTAGATGCACTTCGAGCTAAGGTGGCAGAAGAATCAGGAGTAAAAAATCCAACAAGGGCAGAAGTTGTTAGCGCTCTTCTTTTCAAATGTGCAACAAAGGCATCATCATCAATGCTACCATCAAAGTTGGTTCACTTCTTAAACATACGTACTATGATCAAACCTCGTCTACCACGAAATGCCATTGGAAATCTCTCGTCTATTTTCTCCATAGAAGCAACTAACATGCAGGACATGGAGTTGCCAACGTTGGTTCGTAATTTAAGGAAGGAAGTTGAGGTGGCATACAAGAAAGACCAAGTCGAACAAAATGAACTGATCCTAGAAGTAGTAGAATCAATGAGAGAAGGGAAACTGCCATTTGAAAATATGGATGGCTATGAGAATGTGTATACTTGCAGCAATCTTTGCAAATATCCGTACTACACTGTAGATTTTGGATGGGGAAGACCTGAAAGAGTGTGTCTAGGAAATGGTCCCTCCAAGAATGCCTTCTTCTTGAAAGATTACAAAGCTGGGCAAGGCGTGGAGGCGCGGGTGATGTTGCACAAGCAACAAATGTCTGAATTTGAACGCAATGAGGAACTCCTTGAGTTCATTGCCTAA
【００４７】
出願人らは、ＨＩ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＢＬ２１（ＤＥ３）セル（ルシジェン社製）の形質転換に、ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ‐ゴーストＰｕｎ１を使用し、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−Ｐｕｎ１の発現は、１６℃で２０時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧにより誘導された。融合タンパク質は、Ｎｉ‐ＮＴＡカラムによって精製された（図６）。Ｐｕｎ１の遺伝子産物は、分子量約４９Ｋｄを有し、Ｈｉｓ‐ＳＵＭＯタグのサイズは、約１２Ｋｄである。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上のＨｉｓ−ＳＵＭＯ‐ＣＳ融合タンパク質は、推測されるサイズ（約６１Ｋｄ）（図６）近くに移動した。
【００４８】
出願人らは、ＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３の遺伝子産物の活性を試験するのに、ＡＣＳ１とＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３との共役酵素システムを使用した。ＡＣＳ１の遺伝子産物は、ＣＳ／Ｐｕｎ１／ＡＴ３の遺伝子産物のための基質の生成を促進する。当該システムは、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、５ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍｇ／ＬのＶＮ、および１ｍＭの６Ｅを含む。反応は、精製されたＳＵＭＯ−ＡＣＳ１およびＳＵＭＯ−Ｐｕｎ１を同時に添加することで開始された。反応は１時間続いた後、酢酸を添加することによって終了された。反応産物はまず、ＨＰＬＣによって解析された（図７）。コントロールと比べて、２つの産物が形成された。１つは、以前ＭＳ／ＭＳによって確認（２０１３年、Ｃｈｅｎ  Ｈ、Ｗａｎｇ  Ｈ、およびＹｕ  Ｏ）された８‐メチル‐６‐ノネノイル‐ＣｏＡで、もう１つの産物（＃１）は、ＣＰの保持時間と一致する。
【００４９】
ピーク＃１の同一性をさらに確認すべく、酢酸エチル抽出物がＮ２ガス上で乾燥され、ＭＳＴＦＡによって誘導体化された（Ｎ‐メチル‐Ｎ‐（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド‐シグマ）。当該産物は、ＧＣ／ＭＳによって解析された（図８）。図８に示される通り、酵素反応から生成されたＣＰは、ＣＰスタンダードと同一のＭＳプロファイルを有する。
【００５０】
また、出願人らは他の基質を使用して、その活性を試験した。出願人らは、オクタノイルＣｏＡおよびデカノイルＣｏＡをシグマから購入した。これらのアシル‐ＣｏＡおよびＶＮが基質として一緒に使用される場合、対応するカプサイシノイド（＃１および＃２はそれぞれ、Ｎ‐バニリルオクタンアミドおよびＮ‐バニリルデカンアミド）が形成され、Ｐｕｎ１の酵素活性が確認された（図９および図１０）。酢酸エチルを用いて酵素産物が抽出され、Ｎ２ガス上で乾燥された。ＭＳＴＦＡ誘導体がＧＣ／ＭＳによって解析された。図１１は、図１０のピーク＃１およびピーク＃２のＭＳプロファイルを示す。
［実施例２］
［クローニング］
【００５１】
ＡＣＳ１遺伝子は、ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ‐Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ‐ゴーストＡＣＳ１テンプレートから、ＡＣＳ１-Bgl ll-F：GAAGATCTATGGCAACAGATAAATTTAプライマーおよびＡＣＳ１  ＸｈｏＩ‐Ｒ：CCGCTCGAGTCACTTGGTACCCTTGTACプライマーを使用して増幅されたＰＣＲであり、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター（ノバゲン社）のＭＣＳ２サイトにライゲーションされた。得られたプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＡＣＳ１を使用して、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。変換された細胞は、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレート上で選別された。ｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＡＣＳｌを有する得られたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞が、ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ‐Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ‐ゴーストＰｕｎ１ベクターを用いる第２の形質転換に使用された。形質転換体は、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレート上で選別された。
［異なる培養培地］
【００５２】
ＶＮ（バニリルアミン）および６Ｅ（８‐メチル‐６‐ノネン酸）を供給すると、ＡＣＳ１およびＰｕｎ１を共過剰発現するＢＬ２１（ＤＥ３）培養におけるＣＰ（カプサイシン）生成について、異なる培養培地が試験された。簡潔に言うと、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌを含有する液体ＬＢ、ＴＢまたはＭ９培地（２％）を植菌するのに、一晩培養物が使用された。培養物はまず、３７℃でＯＤ６００が０．６まで培養され、１６℃に冷却された。次に、ＡＣＳ１およびＰｕｎ１の発現を誘発すべく、１ｍＭのＩＰＴＧが添加された。１６℃で１時間インキュベーションした後、５０ｍｇ／ＬのＶＮおよび５０ｍｇ／Ｌの６Ｅが培養物に添加され、培養物は１６℃でインキュベーションを継続された。基質を供給後、複数のサンプルが０、１８、２２、２６、４２および４８時間の時点で採取された。ＣＰは、酢酸エチルによって抽出され、ＨＰＬＣによって解析された。図１２は、試験された３つの培地の中で、ＴＢがＶＮおよび６ＥからのＣＰ生成について最良であったことを示す。
［同一性および類似性］
【００５３】
同一性とは、配列のアライメント後における一組の配列間で同一であるアミノ酸の割合をいう（これは、配列情報または構造情報または何らかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）。類似性とは、いくつかの類似性マトリックスを使用するアライメントに基づき、割り当てられたスコアをいう。類似性インデックスは、次のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、若しくはＧＯＮＮＥＴ、または当業者によってタンパク質の配列アライメントのために使用される任意のマトリックスのうちのいずれかであってよい。
【００５４】
同一性は、２つのサブ配列間の一致の度合いをいう（当該配列間にギャップがない）。２５％または２５％より高い同一性は、機能の類似性を示唆し、一方１８〜２５％の同一性は、構造または機能の類似性を示唆する。２つの全く無関係またはランダムな配列（残基数が１００より大きい）が、２０％より高い同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較する際の２つの配列間の類似の度合いである。これは、それらの同一性に依存する。
【００５５】
前述の説明から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書に示される実施例の具体的な詳細によっては限定されず、従って、複数の他の修正および応用、またはそれらの均等技術が当業者に想起されことが考えられる。従って、特許請求の範囲は、本開示の精神および範囲から逸脱しない、そのようなすべての修正および応用に及ぶことが意図されている。
【００５６】
さらに、別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等な任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用可能であり、好ましい方法および材料が上記されている。
【００５７】
本開示の他の態様、目的および利点は、図面、本開示および添付の特許請求を検討することで得ることが可能である。
【００５８】
【図１】
0006611359.tif 000002
【図２Ａ】
0006611359.tif 000003
【図２Ｂ】
0006611359.tif 000004
【図２Ｃ】
0006611359.tif 000005
【図２Ｄ】
0006611359.tif 000006
【図２Ｅ】
0006611359.tif 000007
【図３】
0006611359.tif 000008
【図４】
0006611359.tif 000009
【図５】
0006611359.tif 000010
【図６】
0006611359.tif 000011
【図７】
0006611359.tif 000012
【図８】
0006611359.tif 000013
【図９】
0006611359.tif 000014
【図１０】
0006611359.tif 000015
【図１１】
0006611359.tif 000016
【図１２】
0006611359.tif 000017
【配列表】
0006611359000001.app