(57)【要約】  本発明の目的は、重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑、体表のびらん、水疱、及び表皮剥離が発生するメカニズムを解析し、それらの症状に対する根本的な治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法を提供することである。  前記課題は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物、及びホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法によって解決することができる。
2014126127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含む、ネクロプトーシス誘導剤。
【請求項６】
前記誘導物質が、ｆＭＬＰである、請求項５に記載のネクロプトーシス誘導剤。
【請求項７】
ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
（１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び
（２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、
を含むホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ホルミルペプチド受容体１改変体が、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、
である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記細胞が、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、
のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を含む請求項８又は１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストが、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ１若しくはその変異体であって、前記アネキシンＡ１変異体が
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドである、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬の製造への使用。
【請求項１５】
前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、請求項１４又は１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物に関する。本発明によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患、特にはスティーブンス・ジョンソン・シンドローム、又は中毒性表皮壊死症を治療することができる。
【背景技術】
【０００２】
薬疹とは、薬物に反応してできる皮疹をいい、すべての薬物は薬疹を引き起こす可能性がある。薬疹によって生命に危険を及ぼすような重症な薬疹を重症薬疹といい、その最重症型であるスティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome；以下、ＳＪＳと称することがある）及び中毒性表皮壊死症（Toxic epidermal necrolysis；以下、ＴＥＮと称することがある）は、高熱と広範な表皮細胞の壊死を特徴とする、非常に予後の悪い疾患である。ＳＪＳでは、口唇、眼粘膜、外陰部などの皮膚粘膜移行部で重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑が見られ、体表のびらん、水疱、表皮剥離は体表面積の１０％以下である。ＳＪＳは、薬物以外のウイルスが原因のものもあると言われているが、その多くは薬物を原因とするものである。ＴＥＮにはＳＪＳから移行したサブタイプも含まれ、その症状はＳＪＳと類似であるが全体としてＳＪＳより重篤であり、体表面積の１０％以上でびらん、水疱、表皮剥離が見られる。また、皮膚や粘膜だけではなく目にも症状が現れ、失明することもあり、ＴＥＮの致死率は２０〜２５％とされている（非特許文献１）。【０００３】
ＳＪＳ及びＴＥＮの原因となる薬剤としては、セフェム系の抗生物質であるセフジニル、抗てんかん薬（例えば、ゾニサミド、カルバマゼピン、及びフェノバルビタール）、又は非ステロイド性抗炎症薬が挙げられるが、これら以外にも原因となる薬物は１１００種類以上あるといわれている。【０００４】
ＳＪＳ及びＴＥＮの治療としては、発熱や発疹等の初期症状を認めた場合に、原因と推定される医薬品の投与を直ちに中止することが最も重要で最良の治療法であるといわれている。しかしながら、ＳＪＳ及びＴＥＮの初期症状は、皮疹のみ出現する通常薬疹の症状と似ており、ＳＪＳ及びＴＥＮと診断されない場合、薬物の投与中止が遅れ、症状が重篤になることもある。そして、原因の医薬品の投与を中止した後の治療方法としては、副腎皮質ホルモン剤の全身投与、血漿交換療法、又は免疫グロブリンの投与、及び皮膚面に対しては外用抗生物質製剤、外用副腎皮質ホルモン製剤が用いられている。しかしながら、これらの治療方法は対症療法であり、ＳＪＳ及びＴＥＮの根本的な治療ではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・アメリカン・アカデミー・オブ・デマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」２０１２年（米国）、第６６巻、ｐ、９９５−１００３
【非特許文献２】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」２０１０年（米国）、第２８５巻、p.１４３３８−１４３４５
【非特許文献３】「カレント・オピニオン・イン・セル・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」２０１０年（英国）、第２２巻、ｐ．２６３−２６８
【非特許文献４】「ネイチャー・レビューズ・モリキュラー・セル・バイオロジー（ＮＡＴＵＲＥ  ＲＥＶＩＥＷＳ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」２０１０年（英国）、第１１巻、ｐ．７００−７１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のように、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症は、その多くが薬剤の副作用によって起こるものと考えられているが、その症状が発生するメカニズムは、全く解明されていなかった。
従って、本発明の目的は、重症の粘膜疹及び皮膚の紅斑、体表のびらん、水疱、及び表皮剥離が発生するメカニズムを解析し、それらの症状に対する根本的な治療用医薬組成物を提供することである。また、前記医薬組成物の有効成分をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症の発症のメカニズムについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、これらの疾患の症状が、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合を介したネクロプトーシスによって起こることを見出した。そして、ホルミルペプチド受容体１の阻害剤、又はアネキシンＡ１の阻害剤によって、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制できることを見出した。更に、驚くべきことに、従来のネクロプトーシスのトリガーであるＴＮＦ及びＴＮＦ受容体の結合によって起きるネクロプトーシスの阻害剤によっても、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制できることを見出した。
また、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合を指標として、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制する物質をスクリーニングできることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含む、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬組成物、
［２］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１］に記載の医薬組成物、
［３］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
［４］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２］又は［３］に記載の医薬組成物、
［５］ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含む、ネクロプトーシス誘導剤、
［６］前記誘導物質が、ｆＭＬＰである、［５］に記載のネクロプトーシス誘導剤、
［７］ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法、
［８］前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、［７］に記載のスクリーニング方法、
［９］（１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び（２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、を含むホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法、
［１０］前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が、細胞に発現したものである、［９］に記載のスクリーニング方法、
［１１］前記ホルミルペプチド受容体１改変体が、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、である、［７］〜［１０］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１２］前記細胞が、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を含む［８］又は［１０］に記載のスクリーニング方法、及び
［１３］前記ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストが、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、又はアネキシンＡ１若しくはその変異体であって、前記アネキシンＡ１変異体が（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドである、［７］又は［８］に記載のスクリーニング方法、
に関する。
なお、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１のペプチドであるＧｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅが相互作用することは報告されている（非特許文献２）。また、ネクロプトーシスがＴＮＦとＴＮＦ受容体との結合によって誘導されることが報告されている（非特許文献３及び４）。しかしながら、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によって、ネクロプトーシスのシグナル伝達が作動し、ネクロプトーシスが誘導されることは、全く知られていなかった。
本明細書において、「ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス」とは、ホルミルペプチド受容体１とアネキシンＡ１との結合によって誘導されるネクロプトーシスを意味する。【０００８】
また、本明細書は、
［１４］ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療対象に、有効量投与することを特徴とする、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１５］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１４］に記載の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１６］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１４］又は［１５］に記載のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１７］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［１４］又は［１５］に記載のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法、
［１８］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療（方法）における使用のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質、
［１９］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［１８］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２０］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［１８］又は［１９］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２１］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［１８］又は［１９］に記載のネクロプトーシスの抑制物質、
［２２］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防用又は治療用医薬の製造のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２３］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［２２］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２４］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［２２］又は［２３］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２５］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２２］又は［２３］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２６］ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療のための、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２７］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、及びそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される物質である、［２６］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
［２８］前記ネクロプトーシス関連疾患が、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）又は中毒性表皮壊死症である、［２６］又は［２７］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、及び
［２９］前記抑制物質が、アネキシンＡ１阻害物質である場合には抗アネキシンＡ１抗体であり、ホルミルペプチド受容体１阻害物質である場合にはホルミルペプチド受容体１抗体であり、抗ＲＩＰ１阻害物質である場合にはネクロスタチン１であり、そしてＲＩＰ３阻害物質である場合にはｓｉＲＮＡである、［２６］又は［２７］に記載のネクロプトーシスの抑制物質の使用、
を開示する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医薬組成物によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患（例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症）を予防又は治療することができる。また、本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法によれば、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングすることができる。本発明のネクロプトーシス誘導剤及びその有効成分のスクリーニング方法によれば、ホルミルペプチド受容体１を発現した癌細胞にネクロプトーシスを誘導し、癌の治療に用いることができる。更に、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを原因とする疾患の研究に用いることができ、それらの疾患の治療薬の開発に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＳＪＳ／ＴＥＮ患者及びＯＤＳＲ患者の表皮のヘマトキシリン・エオジン染色を行った顕微鏡写真、及び電子顕微鏡写真である（ａ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に対する細胞障害性を示したグラフである（ｂ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に対する細胞障害性の容量依存性を示したグラフである（ｃ）。ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）のＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に対する細胞障害性が、ＳＪＳ患者間において交叉することを示したグラフである（ｄ）。
【図２】ＳＪＳ患者と健常人の表皮細胞（ａ）、及びＳＪＳ患者の病変部、ＳＪＳ患者の非病変部、通常薬疹病変部におけるアネキシンＡ１（ｂ）及びホルミルペプチド受容体１（ｃ）の発現を示した蛍光顕微鏡写真である。
【図３】ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、上清からアネキシンを除去することで細胞障害能が抑制されることを示したグラフである。
【図４】ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ−１により抑制されることを示したグラフである。
【図５】ＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）のＲＩＰ３遺伝子を、ＲＩＰ３のｓｉＲＮＡにより、ノックダウンすることにより、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞障害性が、抑制されることを示したグラフである。
【図６】ｆＭＬＰが、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシス（ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス）のアゴニストとして作用することを示したグラフである。
【図７】ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導が、ネクロプトーシスの阻害剤であるＮｅｃ−１によって阻害されることを示したグラフである。
【図８】ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導が、抗ＦＰＲ１抗体によって抑制されることを示したグラフである。
【図９】ＦＰＲ１遺伝子導入Ｈｅｌａ細胞のＦＰＲ１の発現を確認した蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対するｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導、及びｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導のＮｅｃ−１による抑制を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１−１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物
本発明のネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を有効成分として含み、そしてホルミルペプチド受容体１誘導性のネクロプトーシス関連疾患を治療するものである。
【００１２】
《ホルミルペプチド受容体１》
ホルミルペプチド受容体１（以下、ＦＰＲ１と称することがある）は、本発明の医薬組成物によって抑制されるネクロプトーシスを誘導する分子の１つである。すなわち、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１との結合によって、ネクロプトーシスが誘導される。
ヒトのＦＰＲ１は、３５０個のアミノ酸が、細胞膜を７回貫通する構造を取るＧタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲと称することがある）である。好中球においては、ＦＰＲ１に細菌由来のリガンドであるｆＭＬＰ（Ｎホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン；Ｆｏｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）が結合することにより、好中球の生体防御機能、例えばＲＯＳの産生、及び白血球の走化、を誘導することが知られている。また、ＦＰＲ１のホモログとしてＦＰＲ２（ＦＰＲ−ｌｉｋｅ１；ＦＰＲＬ１）及びＦＰＲ３（ＦＰＲ−ｌｉｋｅ２；ＦＰＲＬ２）が知られており、ＦＲＰ２はＦＰＲ１に対して６９％の相同性を有している。
【００１３】
本発明の医薬組成物の有効成分であるホルミルペプチド受容体１阻害物質が抑制するホルミルペプチド受容体１は、アネキシンＡ１との結合能を有し、且つネクロプトーシスを誘導することのできる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば配列番号２で表されるアミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒトのホルミルペプチド受容体１のアミノ酸配列であり、配列番号１で表される塩基配列はヒトのホルミルペプチド受容体１の塩基配列である。ホルミルペプチド受容体１は、前記のようにヒトのホルミルペプチド受容体１に限定されるものではなく、哺乳動物のホルミルペプチド受容体１を含む。哺乳動物としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットを挙げることができる。これらの哺乳動物のホルミルペプチド受容体１を別の観点から記載すると、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜７０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチドである。
【００１４】
《アネキシンＡ１》
アネキシンＡ１は、本発明の医薬組成物によって抑制されるネクロプトーシスを誘導する分子の１つである。具体的には、ホルミルペプチド受容体１と、アネキシンＡ１との結合によって、ネクロプトーシスが誘導される。
アネキシンＡ１は、アネキシンファミリーに属するタンパク質であり、自己免疫疾患との関連が示唆されている。アネキシンファミリーは約７０アミノ酸残基から成る特徴的な配列（アネキシンリピート）が４回又は８回繰り返された構造を持つタンパク質ファミリーで、脊椎動物から原生生物まで広く存在する。現在、脊椎動物のアネキシンはＡ１〜Ａ１３まで分類されている。
【００１５】
本発明の医薬組成物の有効成分であるアネキシンＡ１阻害物質が抑制するアネキシンＡ１は、ホルミルペプチド受容体１との結合能を有し、且つネクロプトーシスを誘導することのできる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば配列番号４で表される３４６アミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、ヒトのアネキシンＡ１のアミノ酸配列であり、配列番号３で表される塩基配列はヒトのアネキシンＡ１をコードする領域の塩基配列である。アネキシンＡ１は、前記のようにヒトのアネキシンＡ１に限定されるものではなく、哺乳動物のアネキシンＡ１を含む。哺乳動物としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットを挙げることができる。これらの哺乳動物のアネキシンＡ１を別の観点から記載すると、（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜７０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチドである。
【００１６】
《ネクロプトーシス》
従来のネクロプトーシスにおいては、腫瘍壊死因子（Tumour Necrosis Factor；ＴＮＦ）が、腫瘍壊死因子受容体（Tumour Necrosis Factor Receptor；ＴＮＦ−Ｒ）に結合することにより、細胞内に複合体Ｉが形成される。この複合体はある条件下でＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂを形成し、カスパーゼ非依存性のネクロプトーシス（以下、ＴＮＦ−Ｒ誘導性ネクロプトーシスと称することがある）が起きる。
本発明の医薬組成物が抑制することのできるホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス（以下、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスと称することがある）は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスである限りにおいて、限定されるものではない。すなわち、前記ネクロプトーシスは、ＴＮＦ及びＴＮＦ−Ｒの結合に代えて、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスである。しかしながら、実質的にホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によるネクローシスである限りにおいて、ＴＮＦ及びＴＮＦ−Ｒの結合が起きていることを排除するものではない。
前記ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスは、実施例に示すようにＲＩＰ１キナーゼの阻害剤であるＮｅｃ−１、及びＲＩＰ３のｓｉＲＮＡによって抑制される。従って、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合以降のネクロプトーシスを起こすメカニズムは、ＴＮＦ誘導性ネクロプトーシスと同じシグナル伝達を用いているものと考えられる。従って、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスにおいて、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１との結合以降の細胞内シグナルに関しては、ＴＮＦ誘導性ネクローシスのシグナル伝達を用いたネクローシスでもよい。
【００１７】
前記ＦＰＲ１誘導性ネクローシスが誘導される細胞は、ＦＰＲ１が発現している細胞である限りにおいて、限定されるものではないが、例えば副腎皮質細胞、星状細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、未成熟樹状細胞、クッパー細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、単球、神経芽腫細胞、好中球、血小板、癌細胞、眼球の結膜細胞、及び皮膚細胞を挙げることができるが、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）、肝細胞、又は眼球の結膜細胞が好ましい。前記ＦＰＲ１誘導性ネクローシスが誘導される組織も、ＦＰＲ１が発現している組織である限りにおいて、限定されるものではないが、例えば副腎、骨髄、結腸、中枢神経系、目、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、脾臓、又は皮膚を挙げることができるが、皮膚が好ましい。
【００１８】
《ネクロプトーシス抑制物質》
本発明の医薬組成物の有効成分であるネクロプトーシス抑制物質は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質、ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質、又はそれらに属する物質の２つ以上の組み合わせを挙げることができるが、アネキシンＡ１阻害物質、ホルミルペプチド受容体１阻害物質、又はそれらの組み合わせが好ましい。ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを特異的に抑制できるからである。
【００１９】
《アネキシンＡ１阻害物質》
前記アネキシンＡ１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばアネキシンＡ１の活性を阻害する物質、アネキシンＡ１に結合してＦＰＲ１との結合を阻害する物質、アネキシンＡ１の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗アネキシンＡ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【００２０】
《ホルミルペプチド受容体１阻害物質》
前記ホルミルペプチド受容体１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばホルミルペプチド受容体の活性を阻害する物質、ホルミルペプチド受容体に結合してアネキシンＡ１との結合を阻害する物質、ホルミルペプチド受容体の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、ホルミルペプチド受容体を阻害する、化合物（例えばホルミルペプチド受容体アンタゴニスト）、タンパク質（例えば、抗ホルミルペプチド受容体抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【００２１】
（ホルミルペプチド受容体１のアンタゴニスト）
前記ホルミルペプチド受容体１アンタゴニストは限定されるものではないが、例えば、ＣＤＣＡ、ＣＨＩＰＳ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、２２９Ｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ｈ、ＤＣＡ、Ｅｂｏｌａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＦＬＩＰｒ、ＨＩＶ−２  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｓｏｐｒｏｐｙｌｕｒｅｉｄｏ−ＦＬＦＬＦ、Ｓｐｉｎｏｒｐｈｉｎ、及びｔＢＯＣ、並びにこれらの誘導体であってホルミルペプチド受容体１アンタゴニスト活性を有するものを挙げることができる。
【００２２】
《ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）１阻害物質》
前記ＲＩＰ１阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばＲＩＰ１の活性を阻害する物質、ＲＩＰ１に結合してＲＩＰ３との結合、複合体ＩＩｂの形成を阻害する物質、ＲＩＰ１の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、ホルミルペプチド受容体を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【００２３】
（ネクロスタチン１）
前記ＲＩＰ１キナーゼ阻害物質の例として、ネクロスタチン１（Necrostain-1；以下、Ｎｅｃ−１と称することがある）が知られている。Ｎｅｃ−１は、下記式：
【化１】
2014126127.tif 000003
で表される化合物であり、ＲＩＰ１キナーゼを阻害することにより、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制することができる。
【００２４】
《ＲＩＰ（Receptor-interacting protein）３阻害物質》
前記ＲＩＰ３阻害物質は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１によるネクロプトーシスを抑制する限りにおいて限定されるものではないが、例えばＲＩＰ３の活性を阻害する物質、ＲＩＰ３に結合してＲＩＰ１との結合、複合体ＩＩｂの形成を阻害する物質、ＲＩＰ３の発現を阻害する物質を挙げることができる。具体的には、例えばアネキシンＡ１を阻害する、化合物、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ３抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、又はｓｉＲＮＡを挙げることができる。なお、ＲＩＰ３はＲＩＰ３キナーゼと称されることもある。
【００２５】
（抗体）
本発明の医薬組成物に用いることのできる抗アネキシンＡ１抗体、抗ホルミルペプチド受容体抗体、抗ＲＩＰ１抗体、又は抗ＲＩＰ３抗体は、それぞれのタンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントであって、且つそれぞれタンパク質の発現又は機能を抑制することができる限り、限定されるものではないが、マウスのモノクローナル抗体、又はそのキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、若しくはヒト型抗体が好ましい。
【００２６】
モノクローナル抗体は、免疫抗原としてそれぞれのタンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えばＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作成することができる。免疫抗原であるタンパク質は、配列番号２、４、６、又は８記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなどを用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。
【００２７】
キメラ抗体は、例えばマウスの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインをコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域のポリペプチドをコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。キメラ化抗体に用いる重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメイン、並びに定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインとヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧの定常領域のポリペプチドとにより、キメラ抗体を得ることができる。
【００２８】
ＣＤＲグラフト化抗体は、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、例えばヒト抗体の相補性決定領域と入れ替え、移植したものである。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ＣＤＲグラフト化抗体に用いる相補性決定領域、並びにフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧのフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドとにより、ＣＤＲグラフト化抗体を得ることができる。また、マウスの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧフレームワーク領域とにより、ＣＤＲグラフト化抗体の抗原結合性断片を得ることができる。
【００２９】
また、本明細書において、「ヒト型抗体」は、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られる抗体、及びヒトの抗体産生細胞をミエローマ細胞と細胞融合させて得ることのできるモノクローナル抗体を意味する。
【００３０】
（ｓｉＲＮＡ）
本発明の医薬組成物に用いることのできるアネキシンＡ１のｓｉＲＮＡ、ホルミルペプチド受容体のｓｉＲＮＡ、ＲＩＰ１のｓｉＲＮＡ、又はＲＩＰ３のｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分を有し、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができる限り限定されるものではない。
例えば、ＲＩＰ３のｍＲＮＡである配列番号９（Ｓｉ−４１）又は１１（ｓｉ−４２）で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域において、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
【００３１】
二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２５塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。
【００３２】
二重鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ配列は、それぞれの遺伝子のｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されない。例えばＲＩＰ３のアンチセンスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域におけるＵＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＡＣＡＧＵＵＣ(配列番号１０)又はＵＧＧＵＵＵＵＣＵＡＵＧＧＵＵＣＵＣＣ(配列番号１２)を挙げることができる。また、二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ配列は、アンチセンスＲＮＡ配列と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されない。例えば、ＲＩＰ３のアンチセンスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域１におけるＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＵＡＡ（配列番号９）又はＧＧＡＧＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡ（配列番号１１）を挙げることができる。
【００３３】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、ｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの塩基配列を挙げることができる。
【００３４】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ヘアピンループの配列としては、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号１７）、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡ（配列番号１８）、又はＵＵＣＧのＲＮＡを挙げることができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物に用いるｓｉＲＮＡは、ベクターに遺伝子を組込んで得ることもできる。ベクターは、哺乳動物細胞内でＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
【００３６】
《ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患》
本発明の医薬組成物の予防又は治療対象である、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１により誘導されるネクロプトーシスが関与している限りにおいて、限定されるものではないが、例えばスティーブンス・ジョンソン・シンドローム（ＳＪＳ）、及び中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）を挙げることができる。
【００３７】
（スティーブンス・ジョンソン・シンドローム（Stevens-Johnson Syndrome））
本発明の医薬組成物の予防及び治療対象であるＳＪＳは、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスが関連しているものである。ＳＪＳの原因は、セフェム系の抗生物質であるセフジニル、抗てんかん薬（例えば、ゾニサミド、カルバマゼピン、及びフェノバルビタール）、又は非ステロイド性抗炎症薬などの薬剤によるものが多いが、その他にウイルス感染、化学物質、又は悪性腫瘍が原因といわれるものがあるが、このような原因によって発症するＳＪＳも、本発明の医薬組成物の予防及び治療対象に含まれる。
【００３８】
（中毒性表皮壊死症）
本発明の医薬組成物の予防及び治療対象であるＴＥＮは、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１誘導性ネクロプトーシスが関連しているものである。ＴＥＮの原因は、その多くが薬剤によるものであるが、ＳＪＳと同様にホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスが関連している限りにおいて、薬剤が原因のものに限定されない。ＴＥＮの致死率は２０〜３０％といわれ、非常に致死率の高い疾患である。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、前記有効成分のいずれか１つを含有することもできるし、２つ以上を任意の組み合わせで含有することもできる。本発明においては、前記有効成分をそれ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療又は予防の必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に有効量で投与することができる。また、前記有効成分は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療又は予防用医薬組成物を製造するために使用することができる。
【００４０】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、例えば、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４２】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の抗腫瘍剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明における前記有効成分をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、本発明における前記有効成分を０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
【００４４】
［１−２］ネクロプトーシス関連疾患の治療方法
前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療方法に用いることができる。従って、本発明のホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質を、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療対象に、有効量投与することを特徴とするものである。
前記ネクロプトーシス抑制物質の投与経路、投与量、及び投与間隔などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００４５】
［１−３］ネクロプトーシス関連疾患の治療における使用のためのネクロプトーシス抑制物質
前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療方法において用いることができる。従って、本発明のホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療方法における使用のためのものである。
前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療における使用量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００４６】
［１−４］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬の製造のためのネクロプトーシス抑制物質の使用
前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の予防又は治療用医薬の製造のために用いることができる。従って、本発明の使用は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療用医薬の製造のための使用である。
前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療用医薬における含有量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００４７】
［１−５］ネクロプトーシス関連疾患の治療のためのネクロプトーシス抑制物質の使用
前記ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物（特には、ネクロプトーシス抑制物質）は、ネクトプトーシス関連疾患の治療のために用いることができる。従って、本発明の使用は、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスを抑制する物質の、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の予防又は治療のための使用である。
前記ネクロプトーシス抑制物質の予防又は治療における使用料などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００４８】
［２］ネクロプトーシス誘導剤
本発明のネクロプトーシス誘導剤は、ホルミルペプチド受容体１と結合し、ネクロプトーシスを誘導する物質を有効成分として含むものである。本発明のネクロプトーシス誘導剤は、ネクロプトーシスを誘導する物質が１種類で含まれてもよく、２種類以上組み合わせて含まれてもよい。また、担体と一緒に含まれてもよく、有効成分のみで担体が含まれなくてもよい。
【００４９】
（ホルミルペプチド受容体１のアゴニスト）
前記ネクロプトーシスを誘導する物質としては、限定されるものではないが、ネクロプトーシス誘導活性を有する化合物（ホルミルペプチド受容体１のアゴニスト）、タンパク質（例えば、抗ＲＩＰ１抗体）、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、又はＲＮＡアプタマーを挙げることができる。
ホルミルペプチド受容体のアゴニストとしては、例えばアネキシンＡ１、ｆＭＬＰＡｃ２−１２、Ａｃ９−２５、Ａｃ２−２６、Ａｎｎｅｘｉｎ  １、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｇ、、ＨＩＶ−１  Ｔ２０  （ＤＰ１７８）、ＨＩＶ−１  Ｔ２１  （ＤＰ１０７）、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＳＶ  ｇＧ−２ｐ２０、ＬＬ−３７、ＳＲＳＲＹ、ＷＫＹＭＶＭ、又はＷＫＹＭＶｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ、並びにこれらの誘導体であってホルミルペプチド受容体１アゴニスト活性を有するものを挙げることができるが、好ましくはアネキシンＡ１又はｆＭＬＰである。
【００５０】
（ｆＭＬＰ）
前記ｆＭＬＰは、ｆｏｒｍｙｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（Ｎホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン）であり、ＦＰＲ１に結合するリガンド（アゴニスト）として最初に同定された化合物である。ｆＭＬＰは、好中球において、走化性の誘導、顆粒の可動化（granule mobilization）、活性酸素代謝物の産生を引き起こす。
【００５１】
本発明のネクロプトーシス誘導剤が結合するホルミルペプチド受容体１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」において、詳しく説明されている。また、有効成分であるアネキシンＡ１も前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」において、詳しく説明されている。ネクロプトーシス誘導剤は、ネクロプトーシス誘導用組成物又はネクロプトーシス誘導用医薬組成物として用いることができるが、この場合の担体、投与剤形、又は投与方法などは、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」に記載されたものを用いることができる。
【００５２】
本発明のネクロプトーシス誘導剤は、悪性腫瘍に特異的にホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導することによって、悪性腫瘍の治療に用いることができる。より具体的には、ホルミルペプチド受容体１を発現している悪性腫瘍に、前記アゴニストなどを作用させることによって、悪性腫瘍に特異的にネプロプトーシスを誘導し、腫瘍を治療することが可能である。
ホルミルペプチド受容体１を発現している悪性腫瘍としては、例えば悪性黒色腫を挙げることができる。
【００５３】
［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程と、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程、とを含む。
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いは、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストをスクリーニングのツールとして用い、ネクロプトーシスを抑制する物質を選択するものである。従って、試験物質を、これらのいずれかのスクリーニングツールと接触させる工程を行う。
また、本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを阻害する物質を選択するものであり、従って試験物質によって、ホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合が阻害されること、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）が阻害されること、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）が阻害されることを検出する工程を行う。
【００５４】
《接触工程（１）》
前記接触工程（１）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる工程である。ここで、「ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニストとを試験物質の存在下で接触させる」とは、「ホルミルペプチド受容体１又はその改変体」、「ホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニスト」、及び「試験物質」の３つが同時に接触する態様のみでなく、３つのうちの２つを先に接触させ、更に残りの１つが接触する態様を含むものである。すなわち、試験物質が、スクリーニングツールであるホルミルペプチド受容体１又はその改変体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば接触工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を挙げることができる。
【００５５】
接触工程（ａ）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと、試験物質とを同時に接触させる工程である。接触工程（ｂ）は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と試験物質とを接触させ、そしてその混合物をホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触させる工程である。接触工程（ｃ）は、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと試験物質とを接触させ、そしてその混合物をホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触させる工程である。
試験物質は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いはホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと結合することによって機能を阻害してもよく、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、或いはホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストと接触することによって機能を阻害するものでもよい。更に、試験物質はアロステリック効果により阻害を誘導するものでもよい。すなわち、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストの活性中心に結合して機能を阻害するものではなく、活性中心以外の部位に試験物質が作用（例えば、結合）することによって、例えばホルミルペプチド受容体１等又はリガンド等の構造が変化し、そしてそれらの機能が阻害されるものでもよい。
【００５６】
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞》
前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体は、細胞に発現しているものを用いることができる。ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が発現している細胞は、アネキシンＡ１との結合により、ネクロプトーシスが誘導される限りにおいて、限定されるものではないが、例えばＳＪＳ患者、ＴＥＮ患者から分離された初代細胞を用いてもよく、樹立された継代細胞を用いてもよい。また、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体の遺伝子を組込んだ組換え細胞を用いてもよい。遺伝子組み換え細胞の作製は、常法に従って行うことができる。
細胞の種類も特に限定されるものではないが、例えば副腎皮質細胞、星状細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、未成熟樹状細胞、クッパー細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、単球、神経芽腫細胞、好中球、血小板、癌細胞、眼球の結膜細胞、及び皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）を挙げることができるが、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト）、肝細胞、又は眼球の結膜細胞が好ましい。
【００５７】
遺伝子組み換え細胞の作製に用いるホルミルペプチド受容体１又はその改変体の遺伝子は、ネクロプトーシスを誘導することができる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜７０個のアミノ酸（好ましくは、１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチド、のいずれかをコードするポリヌクレオチド、を挙げることができる。
【００５８】
《検出工程（２）》
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法における検出工程は、前記受容体又はその改変体と前記リガンド又はアゴニストとの結合に対する前記試験物質の阻害活性を検出する工程（以下、結合阻害検出工程と称することがある）、若しくはホルミルペプチド受容体１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスに対する前記試験物質の誘導阻害活性を検出する工程（以下、誘導阻害検出工程と称することがある）である。
前記結合阻害検出工程は、受容体又はその改変体と、リガンド又はアゴニストとの結合の阻害を検出し、その試験物質がネクロプトーシスを抑制する物質である限りにおいて、限定されるものではない。
また、誘導阻害検出工程は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの誘導の阻害を検出する限りにおいて、限定されるものではないが、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）の阻害の検出、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）の阻害の検出を含む。
なお、前記結合阻害検出工程において、結合の阻害の検出ともに、ネクロプトーシスの阻害を検出してもよい。すなわち、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス（例えば、細胞の障害）の阻害、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程（例えば、シグナル伝達）の阻害を検出してもよい。
【００５９】
ネクロプトーシスの誘導の阻害の検出は、ネクロプトーシスの誘導が阻害されたことを検出できる限りにおいて限定されるものではない。例えば、細胞においてネクロプトーシスの誘導が阻害されたことを、形態的に検出してもよい。また、試験管内又は細胞において、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体とホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストとの結合が低下したこと、複合体Ｉの形成が低下したこと、ＲＩＰ１キナーゼの活性が低下したこと、ＲＩＰ１、ＲＩＰ１のリン酸化が認められないこと又はＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂの形成が低下したことなどを検出することによっても、ネクロプトーシスの阻害を検出することが可能である。
【００６０】
前記検出工程におけるネクロプトーシス誘導の阻害の検出は、コントロールと比較することが好ましい。コントロールとしては、スクリーニング系に試験物質を添加しない陰性コントロールを用いることができる。陰性コントロールにおいては、ネクロプトーシスが誘導されるため、それと比較して試験物質がネクロプトーシスの誘導を阻害したか否かを検出することが容易になる。すなわち、陰性コントロールと比較してネクロプトーシスの誘導を阻害された場合、試験物質がネクロプトーシス誘導阻害活性を有していると判断することが容易になる。
更に、コントロールとして、ネクロプトーシス誘導を阻害する物質を添加した陽性コントロールを用いてもよい。ネクロプトーシス誘導を阻害する物質としては、例えばＦＰＲ１のアンタゴニストであるＣＤＣＡ、ＣＨＩＰＳ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、２２９Ｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ｈ、ＤＣＡ、Ｅｂｏｌａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＦＬＩＰｒ、ＨＩＶ−２  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｓｏｐｒｏｐｙｌｕｒｅｉｄｏ−ＦＬＦＬＦ、Ｓｐｉｎｏｒｐｈｉｎ、及びｔＢＯＣを用いることができる。また、抗ＦＰＲ１抗体、又は抗アネキシンＡ１抗体を用いることもできる。
【００６１】
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体》
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いるホルミルペプチド受容体１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」の欄に記載のホルミルペプチド受容体１を用いることができる。
また、ホルミルペプチド受容体１以外に、ホルミルペプチド受容体１改変体を用いることができる。改変体は、アネキシンＡ１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば、（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜７０個のアミノ酸（好ましくは、１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれか１つのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、アネキシンＡ１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドを挙げることができる。
前記融合ポリペプチドは、例えば前記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドのＮ末、Ｃ末、又はＮ末及びＣ末に、他のペプチド（タンパク質）が融合したものである。他のペプチドとしては、通常融合ペプチド（タンパク質）として用いることのできるペプチドを限定せずに用いることができるが、例えばＧＳＴ、ＴｒｐＥ、又はＨｉｓ  Ｔａｇなどを挙げることができる。
【００６２】
《ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニスト》
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いるホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストは、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えばアネキシンＡ１若しくはその改変体、ｆＭＬＰ若しくはその誘導体、Ａｃ２−１２、Ａｃ９−２５、Ａｃ２−２６、Ａｎｎｅｘｉｎ  １、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｇ、、ＨＩＶ−１  Ｔ２０  （ＤＰ１７８）、ＨＩＶ−１  Ｔ２１  （ＤＰ１０７）、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＳＶ  ｇＧ−２ｐ２０、ＬＬ−３７、ＳＲＳＲＹ、ＷＫＹＭＶＭ、又はＷＫＹＭＶｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ、並びにこれらの誘導体を挙げることができるが、特にはアネキシンＡ１若しくはその改変体、又はｆＭＬＰ若しくはその誘導体が好ましい。
これらの物質は、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性のネクロプトーシスを起こすことができる。
【００６３】
《アネキシンＡ１又はその改変体》
本発明のネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法で用いることのできるアネキシンＡ１は、前記「［１］ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物」の欄に記載のアネキシンＡ１を用いることができる。
また、アネキシンＡ１以外に、アネキシンＡ１改変体を用いることができる。改変体は、ホルミルペプチド受容体１と結合して、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを誘導できる限りにおいて、限定されるものではないが、例えば、（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜７０個のアミノ酸（好ましくは、１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個のアミノ酸）が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるペプチド若しくはその部分ペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導するポリペプチド、又は（４）前記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ホルミルペプチド受容体１と結合することによりネクロプトーシスを誘導する融合ポリペプチドを挙げることができる。
前記融合ポリペプチドは、例えば前記（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドのＮ末、Ｃ末、又はＮ末及びＣ末に、他のペプチド（タンパク質）が融合したものである。他のペプチドとしては、通常融合ペプチド（タンパク質）として用いることのできるペプチドを限定せずに用いることができるが、例えばＧＳＴ、ＴｒｐＥ、又はＨｉｓ  Ｔａｇなどを挙げることができる。
【００６４】
本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変体のアミノ酸置換は保存的置換が好ましい。本明細書において「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)］又は通常の合成技術によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法［Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)］などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、ｓｉＲＮＡ、ホルミルペプチド受容体１に結合する抗体、アネキシンＡ１に結合する抗体、又はホルミルペプチド受容体１のリガンドに結合する抗体を用いることができる。また、例えば微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された試験物質を、化学的又は生物学的に修飾した誘導体を用いることができる。
【００６６】
［４］ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法
本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、（１）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と、試験物質とを接触させる工程、及び（２）ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程、
を含む。
本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体をスクリーニングのツールとして用い、ネクロプトーシスを誘導する物質を選択するものである。従って、試験物質を、これらのいずれかのスクリーニングツールと接触させる工程を行う。
また、本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法は、ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導する物質を選択するものであり、従って試験物質によってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス、又はＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスの過程が誘導されることを検出する工程を行う。具体的には、ネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法によって、ＦＰＲ１のリガンド又はアゴニストを選択することが可能である。
【００６７】
《接触工程（１）》
前記接触工程（１）は、試験物質が、スクリーニングツールであるホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触できる限りにおいて、限定されるものではない。
試験物質は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と結合することによってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよく、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と接触することによってＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよく、更にホルミルペプチド受容体１のリガンド又はアゴニスト、若しくはそれらの前駆体に作用してＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシスを誘導してもよい。
【００６８】
《ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞》
前記ホルミルペプチド受容体１又はその改変体は、細胞に発現しているものを用いることができる。ホルミルペプチド受容体１又はその改変体が発現している細胞は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
【００６９】
《検出工程（２）》
本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法における検出工程は、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体によって誘導されるネクロプトーシスを検出する工程である。
ネクロプトーシスの検出は、ネクロプトーシスが誘導されたことを検出できる限りにおいて限定されるものではない。例えば、細胞においてネクロプトーシスが誘導されたことを、形態的に検出してもよい。また、試験管内又は細胞において、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体と試験物資が結合したこと、複合体Ｉが形成されたこと、ＲＩＰ１キナーゼの活性が上昇したこと、ＲＩＰ１、ＲＩＰ１のリン酸化が認められたこと、又はＲＩＰ１及びＲＩＰ３を含む複合体ＩＩｂが形成されたことなどを検出することによっても、ネクロプトーシスの誘導を検出することが可能である。
【００７０】
前記検出工程におけるネクロプトーシス誘導の検出は、コントロールと比較することが好ましい。
コントロールとしては、スクリーニング系にネクロプトーシスを誘導する物質を添加した、陽性コントロールを用いてもよい。ネクロプトーシスを誘導する物質としては、アネキシンＡ１、ｆＭＬＰ及びその誘導体、Ａｃ２−１２、Ａｃ９−２５、Ａｃ２−２６、Ａｎｎｅｘｉｎ  １、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｇ、ＨＩＶ−１  Ｔ２０  （ＤＰ１７８）、ＨＩＶ−１  Ｔ２１  （ＤＰ１０７）、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＳＶ  ｇＧ−２ｐ２０、ＬＬ−３７、ＳＲＳＲＹ（配列番号１９）、ＷＫＹＭＶＭ（配列番号２０）、又はＷＫＹＭＶｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ（配列番号２０）、を挙げることができる。
また、コントロールとしては、スクリーニング系に試験物質を添加しない陰性コントロールを用いることができる。陰性コントロールにおいては、ネクロプトーシスが誘導されないため、それと比較して試験物質がネクロプトーシスを誘導したか否かを検出することが容易になる。
【００７１】
本発明のネクロプトーシスの誘導物質のスクリーニング方法における、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、及び試験物質等は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
【００７２】
本発明のネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニング方法は、スクリーニングキットを用いて行うことも可能である。この場合、スクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体を含むものである。ネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体を、細胞に発現した状態で含んでもよい。また、ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニングキットは、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニストを更に含んでもよい。
【００７３】
ネクロプトーシスを誘導又は抑制する物質のスクリーニングキットに含むことのできる、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体、ホルミルペプチド受容体１又はその改変体発現細胞、ホルミルペプチド受容体１のリガンド若しくはアゴニスト、或いはアネキシンＡ１又はその改変体は、前記「［３］ネクロプトーシスを抑制する物質のスクリーニング方法」及び「［４］ネクロプトーシスを誘導する物質のスクリーニング方法」の欄に記載のものを用いることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００７５】
《実験例１》
本実験例１では、ＳＪＳ患者の末梢血細胞（ＰＢＭＣ）から分泌される液性分子の解析を、通常薬疹（ＯＤＳＲ）患者の末梢血細胞（ＰＢＭＣ）から分泌される培養上清と比較することによって行った。
図１ａは、ＳＪＳ／ＴＥＮ患者及びＯＤＳＲ患者の表皮のヘマトキシリン・エオジン染色を行った顕微鏡写真、及び電子顕微鏡写真を示したものである。ＳＪＳ／ＴＥＮ患者では、皮膚の病変部に表皮細胞の細胞死が認められる。
ＳＪＳ患者及びＯＤＳＲ患者の末梢血から単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、ファイコールにより分離した。２ｘ１０５cellのＰＢＭＣに、ＳＪＳの原因である薬剤をＤＬＳＴで陽性となった濃度で加えて、ｃＲＰＭＩ培地で５日培養し、更に同じ濃度の薬剤を加えて刺激した後の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐ）を回収した。
ＳＪＳ患者及びＯＤＳＲ患者から、表皮細胞（ＳＪＳ−ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＳＪＳ−Ｋ、及びＯＤＳＲ−ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＯＤＳＲ−Ｋ）をディスパーゼを用いて分離し培養した。得られたＳＪＳ−Ｋ及びＯＤＳＲ−Ｋ１ｘ１０５cellに対して、前記のＳＪＳｓｕｐ又はＯＤＳＲｓｕｐを５％添加して、８時間後に、細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。
ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）は、ＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に対して壊死を誘導したが、通常薬疹患者由来の表皮細胞（ＯＤＳＲ−Ｋ）に対しては毒性を示さなかった（図１ｂ）。また、通常薬疹患者の培養上清（ＯＤＳＲｓｕｐ）は、ＳＪＳ−Ｋ、及びＯＤＳＲ−Ｋのいずれにも、細胞障害性は示さなかった。また、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の添加を、０．１％〜１５％まで変化させると、壊死が容量依存的に誘導された（図１ｃ）。【００７６】
更に、３人のＳＪＳ患者（ＳＪＳ＃１、ＳＪＳ＃２、及びＳＪＳ＃３）について、同様に培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、ＳＪＳ＃２ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃３ｓｕｐ）及び表皮細胞（ＳＪＳ＃１−Ｋ、ＳＪＳ＃２−Ｋ、及びＳＪＳ＃３−Ｋ）を調製し、それぞれの培養上清を、それぞれの表皮細胞に添加して、細胞障害性を調べた。その結果、培養上清の細胞障害性は、ＳＪＳ患者間において、交叉して観察された（図１ｄ）。
これらのことから、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣからＳＪＳ−Ｋの細胞壊死を誘導する細胞外液性因子が分泌されること、ＳＪＳ−Ｋには前記液性因子に対する受容体が特異的に発現していることが考えられた。【００７７】
《実験例２》
本実験例では、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣから分泌される液性因子を解析した。具体的には、実験例１で得られたＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐを、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析機（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、比較分析した。その結果、ＳＪＳｓｕｐ及びＯＤＳＲｓｕｐで、多くのタンパク質の相違が見られた。それらの異なるタンパク質の１つとして、アネキシンＡ１が見出された。【００７８】
《実験例３》
本実験例では、ＳＪＳ患者から分離された表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）及びＳＪＳ患者の組織における、アネキシンＡ１及びその受容体であるホルミルペプチド受容体１の発現を調べた。
検体として、ＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ）、及び健常人の表皮細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）について、抗ＦＰＲ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）を用いて蛍光抗体法により、ＦＰＲ１の発現を調べた。その結果、ＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ）において、ＦＰＲ１の発現が確認された（図２ａ）。更に、ＳＪＳ患者の病変部（ＳＪＳ  ｌｅｓｉｏｎ）及び非病変部（ｎｏｎ−ｌｅｓｉｏｎ  ｓｋｉｎ）、並びに通常薬疹の患者の皮膚（ＯＤＳＲ  ｌｅｓｉｏｎ）の組織切片を準備した。それぞれの検体を、抗アネキシンＡ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）、及び抗ＦＰＲ１抗体（Lifespan, Seattle, WA）を用いて蛍光染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ＳＪＳ患者の病変部（ＳＪＳ  ｌｅｓｉｏｎ）において、アネキシンＡ１及びホルミルペプチド受容体１の発現が亢進していた（図２ｂ及びｃ）。【００７９】
《実施例１》
本実施例では、抗アネキシンＡ１抗体による、ＳＪＳ患者のＰＢＭＣの培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）の細胞傷害活性の抑制について検討した。
２人のＳＪＳ患者（ＳＪＳ＃１、及びＳＪＳ＃２）から、実験例１と同様の操作により、培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃２ｓｕｐｐ）及び表皮細胞（ＳＪＳ＃１−Ｋ、及びＳＪＳ＃２−Ｋ）を得た。それぞれの培養上清に、抗アネキシン抗体（BD Transduction Laboratories, NJ USA）５μｇ／ｍＬを添加し、４℃、一昼夜ゆっくりと攪拌した。プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を添加し、４℃で２時間攪拌し、プロテインＧビーズを除去したものを、培養上清として用い、細胞障害性を調べた。
その結果、抗アネキシン抗体で処理された培養上清（ＳＪＳ＃１  ｓｕｐ  Ａｎｘ  ｄｅｐｌｅｔ、及びＳＪＳ＃２  ｓｕｐ  Ａｎｘ  ｄｅｐｌｅｔ）は、２人のＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ＃１−Ｋ、及びＳＪＳ＃２−Ｋ）に対して、細胞障害性を示さなかった（図３）。
ＳＪＳ患者における細胞障害性は、アネキシンＡ１及びその受容体であるＦＰＲ１によって誘導されているものと考えられ、この細胞障害性は、抗アネキシン抗体によって抑制された。【００８０】
《実施例２》
本実施例では、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ−１による、培養上清による細胞障害性の抑制を検討した。
実施例１で得られた培養上清（ＳＪＳ＃１ｓｕｐ、及びＳＪＳ＃２ｓｕｐｐ）にネクロスタチン１（Ｎｅｃ−１；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５０μＭを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。この培養上清を用いて、表皮細胞（ＳＪＳ＃１−Ｋ、及びＳＪＳ＃２−Ｋ）への細胞障害性を調べた。また、アポトーシスを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤（ｚＩＥＤ−ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）２０μＭ及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）５０μＭ）についても、ネクロスタチン１と同様に培養上清に添加し、細胞障害性への影響を調べた。
ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるＮｅｃ−１により細胞障害性は完全に抑制された。しかしながら、カスパーゼの阻害剤（ｚＩＥＤ−ｆｍｋ、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ）は、ＳＪＳ−Ｋの細胞障害性は抑制されなかった（図４）。
従って、ＳＪＳ患者における皮膚の細胞障害は、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１の結合により誘導されるネクロプトーシスによるものと考えられた。【００８１】
《実施例３》
本実施例では、ネクロプトーシスに関与するＲＩＰ３の発現を、ｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすることにより、アネキシンＡ１によるネクロプトーシスの阻害について検討した。ｓｉＲＮＡの配列は、以下の通りである。
Ｓｉ−４１：
センス：ＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＵＵＡＡＣＧＵＡＡｔｔ（配列番号１３）
アンチセンス：ＵＵＡＣＧＵＵＡＡＣＡＡＡＣＡＧＵＵＣｔｇ（配列番号１４）
Ｓｉ−４２：
センス：ＧＧＡＧＡＡＣＣＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＡｔｔ（配列番号１５）
アンチセンス：ＵＧＧＵＵＵＵＣＵＡＵＧＧＵＵＣＵＣＣｔａ（配列番号１６）
小文字で記載した部分がオ−バーハングの配列である。
前記のＳｉ−４１、及びＳｉ−４２のＳＪＳ患者の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）へのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ  ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ｍｅｄｉｕｍを用い、添付のプロトコールに従って行った。ｓｉＲＮＡの濃度は、４０ｐｍｏｌｅとした。
ｓｉＲＮＡが導入された表皮細胞は、培養上清によるネクロプトーシスが抑制され、ＲＩＰ３のｓｉＲＮＡにより、アネキシンＡ１によるネクロプトーシスが抑制されることが確認された(図５ａ)。なお、ＳＪＳ／ＴＮＴ患者（ＳＪＳ／ＴＮＴ）及び通常薬疹患者（ＯＤＳＲ）の表皮におけるＲＩＰ３の発現を蛍光抗体法によって確認した。その結果、ＳＪＳ／ＴＮＴ患者の病変部においてはＲＩＰ３の発現が亢進していた（図５ｂ）。【００８２】
《実施例４》
本実施例では、ＦＰＲ１のアゴニストであるｆＭＬＰによる、ＦＰＲ１及びアネキシンＡ１によるネクロプトーシス（ＦＰＲ１誘導性ネクロプトーシス）の誘導について検討した。
実験例１と同様に調製した表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に、ｆＭＬＰを０ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、５ｎＭ、５０ｎＭ、又は５００ｎＭ添加して、８時間後に細胞障害性を、トリパンブルーの染色によって調べた。その結果、ｆＭＬＰは容量依存的に、ネクロプトーシスを誘導した（図６）。【００８３】
《実施例５》
本実施例では、ネクロプトーシスの特異的阻害剤であるネクロスタチン１（Ｎｅｃ−１）による、ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導の抑制を検討した。
前記実施例４において、ｆＭＬＰを５ｎＭ添加した実験系に、Ｎｅｃ−１を５０μＭ添加して、同様に細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。また、コントロールとして、カスパーゼ阻害剤であるｚＩＥＤ−ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）２０μＭ及びｚＶＡＤ−ｆｍｋ（ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ社）５０μＭを添加して、細胞障害性を調べた。その結果、ｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導は、Ｎｅｃ−１によって阻害されたが、ｚＩＥＤ−ｆｍｋ及びｚＶＡＤ−ｆｍｋによっては、阻害されなかった（図７）。【００８４】
《実施例６》
本実施例では、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）によるネクロプトーシスの誘導が、抗ＦＰＲ１抗体によって抑制されるかを調べた。
実験例１と同様に調製したＳＪＳ患者由来の表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）に、ＳＪＳ患者の培養上清（ＳＪＳｓｕｐ）を５％添加した。それに、抗ＦＰＲ１抗体を０μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、３．０μｇ／ｍＬ、又は３０μｇ／ｍＬ添加して、細胞障害性をトリパンブルーの染色によって調べた。その結果、ＳＪＳｓｕｐによるネクロプトーシスの誘導は、抗ＦＰＲ１抗体によって、容量依存的に阻害された（図８）。【００８５】
《実施例７》
本実施例では、本発明のスクリーニング用の細胞の例として、Ｈｅｌａ細胞にＦＰＲ１遺伝子を導入した細胞の樹立を行った。
ヒトＦＰＲ１の全長のｃＤＮＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）のＸｈｏＩサイト及びＫｐｎＩサイトにクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＦＰＲ１プラスミドを得た。トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（Roche, Indianapolis, IN）を用いて、Ｈｅｌａ細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ−ＦＰＲ１プラスミドをトランスフェクションし、Ｚｅｏｃｉｎ（Invitrogen）を用いて、ヒトＦＰＲ１が組込まれた細胞を選択した。
得られたＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞（Ｓ−４）におけるＦＰＲ１の発現を蛍光抗体法で確認した写真を図９に示す。【００８６】
《実施例８》
本実施例では、ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対するｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導、及びｆＭＬＰによるネクロプトーシスの誘導のＮｅｃ−１による抑制を検討した。
表皮細胞（ＳＪＳ−Ｋ）をＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に変更したことを除いては、実施例４又は５の操作を繰り返した。
ＦＰＲ１導入Ｈｅｌａ細胞に対しても、ｆＭＬＰによりネクロプトーシスが誘導され、そのネクロプトーシスは、Ｎｅｃ−１によって抑制された（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の医薬組成物は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患（例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮壊死症）を予防又は治療することができる。また、本発明のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシス関連疾患の治療用医薬組成物の有効成分をスクリーニングすることができる。本発明のネクロプトーシス誘導剤及びその有効成分のスクリーニング方法は、ホルミルペプチド受容体１誘導性ネクロプトーシスを原因とする疾患の研究に用いることができ、それらの疾患の治療薬の開発に役立てることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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