(57)【要約】  エピルビシン耐性腫瘍に対する治療効果を有する医薬の開発。抗癌剤を、エピルビシン複合化共重合体により形成されたミセルの内核に配置したミセルを提供することによる。
2016024595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
【化１】
2016024595.tif 000039
又は
【化２】
2016024595.tif 000040
｛式中
Ｒ１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ３は、−Ｏ−Ｒ５又は−ＮＨ−Ｒ５を表し、Ｒ５は同一または異なって疎水性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ１及びＬ２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００の整数を表し、
但し、側鎖に疎水基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２５％以上〜７５％以下を占め、側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在する場合は、側鎖にカルボン酸基を有するユニット、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、そして側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在しない場合は、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、
ｙは１又は２の整数を表す｝
で表されるブロック共重合体に、エピルビシン又はその塩が、該ブロック共重合体のヒドラジド基を介して結合されたエピルビシン複合化共重合体であって、エピルジン又はその塩の結合の帰結として、側鎖にヒドラジド基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の０％を超えて３５％以下を占めた状態にある、エピルビシン複合化共重合体と、抗癌剤である化合物とを含む、ｐＨ応答性ミセル。
【請求項２】
Ｒ5が、ベンジル基、フェニル基、Ｃ4−フェニル基及びＣ6〜Ｃ16のアルキル基からなる群より選択される疎水性基である、請求項１に記載のミセル。
【請求項３】
ヒドラジド基にエピルビシンが、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、請求項１又は２に記載のミセル。
【請求項４】
ヒドラジド基にエピルビシンが、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜４０％以下の数結合している、請求項３に記載のミセル。
【請求項５】
前記抗癌剤である化合物が、癌幹細胞に対して作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミセル。
【請求項６】
前記抗癌剤が、インドロカルバゾール骨格を有する化合物、並びにアファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、カネルチニブ、セジラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、ダブラフェニブ、ダヌセルチブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、タンヅチニブ、トファシチニブ、バンデタニブ、及びベムラフェニブからなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のミセル。
【請求項７】
前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、以下の式：
【化３】
2016024595.tif 000041
｛式中、
Ｘ及びＹは、独立に、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、プロポキシ、又はエチルチオメチルであり；
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1-3アルキル、−ＮＨ2、ベンジル、
【化４】
2016024595.tif 000042
又は
【化５】
2016024595.tif 000043
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立にＨ、−ＯＨ、又はメトキシであるか、或いは一緒になってＯ＝を形成してもよく；
Ｒ9とＲ10は、それぞれ水素、メチル、β−Ｄ−グルコピラノシル、４−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル、シアノエチル、又は
【化６】
2016024595.tif 000044
であるか、或いは一緒になって、以下の：
【化７】
2016024595.tif 000045
又は
【化８】
2016024595.tif 000046
を形成してもよく、ここで
Ｒ11は、メチルであり：
Ｒ12は、Ｈであり；
Ｒ13及びＲ14は、それぞれ独立に、Ｈ、メトキシ、−ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチルカルボキシレート、メチルアミノ、メチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、又は
【化９】
2016024595.tif 000047
Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ又は
【化１０】
2016024595.tif 000048
であり；
Ｒ17及びＲ18は、Ｈ、ＯＨ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、オキシム、
【化１１】
2016024595.tif 000049
である｝
で表される化合物である、請求項６に記載のミセル。
【請求項８】
前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、スタウロスポリン、７−ヒドロキシスタウトスポリン、ＫＴ５９２６、スタウロスポリン・アグリコン、ＳＦ２３７０、ＫＴ５８２３、４’−Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン、ＰＫＣ４１２、Ｇｏ６９７６、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＮＡ  ０３５９、Ｎ−エトキシカルボニル−７−オキソスタウロスポリン、ＫＴ−６１２４、ＣＧＰ４２７００、４’−デメチルアミノ−４’，５’−ジヒドロキシスタウロスポリン、７−オキソスタウロスポリン、ＣＥＰ７５１、ＮＡ０３４６、ＮＡ０３５９、３’−デメトキシ−３’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＫＴ  ６００６、７−Ｏ−メチル−ＵＣＮ  ０１、ＴＡＮ  ９９９、ＮＡ  ０３４６、ＮＡ  ０３４５、ＮＡ  ０３４４、ＣＧＰ  ４４１７１Ａ、ＳＣＨ  ４７１１２、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＴＡＮ  １０３０Ａ、レスタウルチニブ、４’−デメチルアミノ−４’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＡＦＮ９４１、エドテカリン、ベカテカリン、及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１の化合物である、請求項６に記載のミセル。
【請求項９】
前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、スタウロスポリン、７−ヒドロキシスタウロスポリン、ＰＫＣ４１２及びレスタウルチニブからなる群から選ばれる少なくとも１の化合物である、請求項８に記載のミセル。
【請求項１０】
前記エピルビシン複合化共重合体と、前記抗癌剤との質量比が、５：２〜１０：１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のミセル。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のミセルを含む、癌又は腫瘍の治療用医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌又は腫瘍が、神経芽腫、肝臓癌、悪性黒色腫、子宮癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、骨肉腫、精巣腫瘍、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌、及び乳癌からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌又は腫瘍が、癌幹細胞を含む癌又は腫瘍に対して効果を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記癌幹細胞を含む癌又は腫瘍が、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌及び乳癌からなる群から選ばれる少なくとも１の癌である、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピルビシン複合化ブロック共重合体と、抗癌剤とを含むミセル、当該ミセルの製造方法、並びに当該ミセルを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤を経口や静脈内注射等により個体全身に投与すると、標的とすべき病巣部位以外の正常組織において副作用が認められ、治療方法の変更や中断を余儀なくされる場合がある。また、薬剤によっては、効果が得られる薬物濃度の維持が困難であったり、標的部位に送達される前に代謝されてしまう場合もある。【０００３】
これらの問題を解決するため、体内における薬物の動態の制御あるいは選択的な送達により、目的とする作用部位において望ましい薬物濃度−時間パターンを与えて治療効果の最適化を図る、高度な製剤学的手法とコンセプトを導入した技術が、現在、盛んに研究されている。これらの技術とコンセプトは、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれ、近年、抗癌剤、ＤＮＡ、ペプチドなどを腫瘍部位や炎症部位などの病巣部に、より安全に効率よく送達するという点で特に重要視されている。【０００４】
ＤＤＳの具体的な手段として、リポソーム、エマルジョン、またはナノパーティクルなどを薬物キャリアとして利用する方法、高分子ミセルなどの高分子キャリアに薬物を包含させる方法、あるいは合成高分子や天然多糖類に薬物を共有結合させる方法等が開発されている。ＤＤＳ製剤を開発することにより、既に薬剤として開発されている化合物について、より優れた効果や副作用の低下を達成することができる。また、ＤＤＳを用いることにより、副作用などの観点から開発を断念された薬剤を医薬として復活させることが期待されている。しかしながら、これらシステムの実用化に際しては、克服すべき様々な問題点があり、中でも、生体側の異物認識機構からの回避、ＤＤＳ薬物キャリア中の薬物高含量化及び薬物遊離速度の制御が大きな課題となっている。【０００５】
生体側の異物認識機構からの回避に関しては、リポソームをはじめとする薬物キャリアの表面をポリエチレングリコール等の親水性高分子で被覆することにより、血漿タンパク質やオプソニンタンパク質などの吸着を防止して血中安定性を高め、肝臓、脾臓等の細網内皮系（ＲＥＳ）での捕捉を回避することが可能となってきた。この結果、リポソームや高分子ミセルなどは、静脈内投与後、高い血中滞留性が得られ、腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進した組織に受動的に集積可能となり、効率よく治療できるようになってきた。【０００６】
一方、ＤＤＳ薬物キャリア中の薬物含量に関しては、薬物含量が高い方が、必要な薬物をデリバリーするために要するキャリア量が少なくなり、その結果、治療効果と製剤設計の両面から好都合である［J.Med.Chem.45,4336-4343(2002)（非特許文献１）］。それにもかかわらず、リポソームや高分子ミセルに関しては、物理的安定性の面から、薬物含量に制限があり、また高分子複合体タイプのものに関しては、薬物含量を増加させると、水溶性高分子の性質にも影響を与え、その水溶性が低下してしまう。その結果、血漿成分との相互作用を抑制しきれなくなり、血中滞留性を保つことが不可能になるので、薬物含量が数％のものがほとんどである［CRIPS 5(2),2-8(2004)（非特許文献２）］。薬物の高含量化と優れた血中滞留性の両面を達成する目的で研究が行われており、高含量かつ優れた血中滞留性を有するＤＤＳ化合物が開発されてきている。【０００７】
また、薬物遊離に関しては、血中において薬剤はキャリアと安定に内包、あるいは結合しており、病巣組織に到達した後に速やかに薬剤を放出するシステムが、副作用の軽減と治療効果の増強の観点から理想的である。薬物遊離の制御を高度に実現するため、各種の環境応答性キャリア、すなわち疾病に起因する環境変化、または、正常組織と病巣部位の環境の相違に応答して性質が変化する薬物キャリアが検討されている。【０００８】
例えば、分子量約３万ＤａのＨＰＭＡポリマーにＧＦＬＧスペーサーを介してドキソルビンシンを結合させたＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＰＫ１）が報告されている。ＰＫ１は、正常組織よりも腫瘍部位により多く発現しているカテプシンＢによって薬物が遊離されるが、その薬物含量は８．５％であり、薬物の高含量化を達成しているわけではない。【０００９】
一方、腫瘍や炎症などの病巣部位では局所のｐＨが正常な組織よりも低下することを利用し、このような病変部位でのｐＨ変化による環境に応答して薬物を放出することを目的とした検討が試みられている［Adv.Drug Delivery Rev.56,1023-1050(2004)（非特許文献３）、Biochim.Biophys.Acta,1329(2),291-301(1997)（非特許文献４）］。【００１０】
また、腫瘍局所において個々の癌細胞にエンドサイトーシス経路で取り込まれた後に、エンドソーム内の低ｐＨ環境に的確に応答して、抗癌剤を放出する細胞内低ｐＨ環境応答型高分子複合体［J.Controlled Release 87,33-47(2003)（非特許文献５）］や高分子ミセルが報告されている［Bioconjugate Chem.16,122-130(2005)（非特許文献６）］、［J. Cntrolled Release 64, 143-153 (2000)(非特許文献７）］。さらに、高分子ミセルの表面に現れるＰＥＧに葉酸を結合させることにより、葉酸受容体を高発現する癌細胞に対して選択的に取り込まれるように設計された生分解性ドキソルビシンミセル[(J.Controlled Release 96 (2004), 273-283(非特許文献８)]や、アドリアマイシンが報告されている［Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1131-1139（非特許文献９）］。さらに血中滞留性を増加させる試みが行われて、薬物遊離のｐＨ依存性、優れた血中滞留性、及び高い薬物含量という要件をすべて満たす高分子ミセルが開発されている［特許４７９１４３５号（特許文献１）、ＵＳ２００８／０２４８０９７（特許文献２）］。【００１１】
しかしながら、抗癌剤による治療を行うと、一時的には癌の消失が確認できるものの、現在までに開発されている抗癌剤では全ての癌細胞を根絶することが難しく、耐性を獲得したごく少数の癌細胞が生存することにより、癌が再発・転移することが知られている。特にこのように耐性を獲得した癌細胞には、癌幹細胞とよばれる自己複製能と多分化能を備えた細胞が含まれることが報告されている[Nat. Med.  3,  730-737 (1997) （非特許文献１０）、Nat Med. Mar;17(3):313-9(2011)（非特許文献１１）]。癌幹細胞から癌が発生・進行することは、急性骨髄性白血病をはじめとして幾つかの癌で明らかにされている。これらの癌では、固形腫瘍の縮小のみを目的とした抗癌剤の開発では不十分であることから、癌幹細胞の根絶を可能にする抗癌剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４７８１４３５号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０２４８０９７号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】J.Med.Chem.45,4336-4343(2002)
【非特許文献２】CRIPS 5(2),2-8(2004)
【非特許文献３】Adv.Drug Delivery Rev.56,1023-1050(2004)
【非特許文献４】Biochim.Biophys.Acta,1329(2),291-301(1997)
【非特許文献５】J.Controlled Release 87,33-47(2003)
【非特許文献６】Bioconjugate Chem.16,122-130(2005)
【非特許文献７】J.Controlled Release 64 (2000), 143-153
【非特許文献８】J.Controlled Release 96 (2004), 273-283
【非特許文献９】Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1131-1139
【非特許文献１０】Nat. Med.  3,  730-737 (1997)
【非特許文献１１】Nat Med. Mar;17(3):313-9 (2011)
【非特許文献１２】Biochemistry 2001, 40, 2564-2571
【非特許文献１３】British Journal of Cancer(1996)73,1063-1068
【非特許文献１４】CANCER RESEARCH 64, 1242-1246, February 15, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、上記の問題点を解決可能な医薬の提供にある。より具体的に、薬剤耐性腫瘍に対する治療効果を有する医薬の開発に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らが、上記課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、抗癌剤を、エピルビシン複合化共重合体により形成されたミセルの内核に含むミセルが、エピルビシン耐性腫瘍に対し、治療効果を有することを見出し、本発明に至った。したがって、本発明は以下の発明に関する：
［１］以下の：
【化１】
2016024595.tif 000003
又は
【化２】
2016024595.tif 000004
｛式中
Ｒ１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ３は、−Ｏ−Ｒ５又は−ＮＨ−Ｒ５を表し、Ｒ５は同一または異なって疎水性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ１及びＬ２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００の整数を表し、
但し、側鎖に疎水基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２５％以上〜７５％以下を占め、側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在する場合は、側鎖にカルボン酸基を有するユニット、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、そして側鎖にカルボン酸基を有するユニットが存在しない場合は、側鎖に疎水基を有するユニット及び側鎖にヒドラジド基を有するユニットはランダムにポリアミノ酸領域全体にわたって分布し、
ｙは１又は２の整数を表す｝
で表されるブロック共重合体に、エピルビシン又はその塩が、該ブロック共重合体のヒドラジド基を介して結合されたエピルビシン複合化共重合体であって、エピルジン又はその塩の結合の帰結として、側鎖にヒドラジド基を有するユニットがブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の０％を超えて３５％以下を占めた状態にある、エピルビシン複合化共重合体と、抗癌剤である化合物とを含む、ｐＨ応答性ミセル。
［２］  前記抗癌剤である化合物が、癌幹細胞に対して作用する、項目１に記載のミセル。
［３］  Ｒ５が、ベンジル基、フェニル基、Ｃ４−フェニル基及びＣ６〜Ｃ１６のアルキル基からなる群より選択される疎水性基である、項目１又は２に記載のミセル。
［４］  ヒドラジド基にエピルビシンが、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜５０％以下の数結合している、項目１〜３のいずれか一項２に記載のミセル。
［５］  ヒドラジド基にエピルビシンが、ポリアミノ酸の全ユニット数の１０％以上〜４０％以下の数結合している、項目４に記載のミセル。
［６］  前記抗癌剤が、インドロカルバゾール骨格を有する化合物、並びにアファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、カネルチニブ、セジラニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、ダブラフェニブ、ダヌセルチブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、タンヅチニブ、トファシチニブ、バンデタニブ、及びベムラフェニブからなる群から選ばれる、項目１〜５のいずれか一項に記載のミセル。
［７］  前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、以下の式：
【化３】
2016024595.tif 000005
｛式中、
Ｘ及びＹは、独立に、Ｈ、ＯＨ、Ｃｌ、プロポキシ、又はエチルチオメチルであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−３アルキル、−ＮＨ２、ベンジル、
【化４】
2016024595.tif 000006
又は
【化５】
2016024595.tif 000007
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立にＨ、−ＯＨ、又はメトキシであるか、或いは一緒になってＯ＝を形成してもよく；
Ｒ９とＲ１０は、それぞれ水素、メチル、β−Ｄ−グルコピラノシル、４−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシル、シアノエチル、又は
【化６】
2016024595.tif 000008
であるか、或いは一緒になって、以下の：
【化７】
2016024595.tif 000009
又は
【化８】
2016024595.tif 000010
を形成してもよく、ここで
Ｒ１１は、メチルであり：
Ｒ１２は、Ｈであり；
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、Ｈ、メトキシ、−ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチルカルボキシレート、メチルアミノ、メチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、又は
【化９】
2016024595.tif 000011
Ｒ１５及びＲ１６は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ又は
【化１０】
2016024595.tif 000012
であり；
Ｒ１７及びＲ１８は、Ｈ、ＯＨ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、オキシム、
【化１１】
2016024595.tif 000013
である｝
で表される化合物である、項目６に記載のミセル。
［８］  前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、スタウロスポリン、７−ヒドロキシスタウトスポリン、ＫＴ５９２６、スタウロスポリン・アグリコン、ＳＦ２３７０、ＫＴ５８２３、４’−Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン、ＰＫＣ４１２、Ｇｏ６９７６、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＮＡ  ０３５９、Ｎ−エトキシカルボニル−７−オキソスタウロスポリン、ＫＴ−６１２４、ＣＧＰ４２７００、４’−デメチルアミノ−４’，５’−ジヒドロキシスタウロスポリン、７−オキソスタウロスポリン、ＣＥＰ７５１、ＮＡ０３４６、ＮＡ０３５９、３’−デメトキシ−３’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＫＴ  ６００６、７−Ｏ−メチル−ＵＣＮ  ０１、ＴＡＮ  ９９９、ＮＡ  ０３４６、ＮＡ  ０３４５、ＮＡ  ０３４４、ＣＧＰ  ４４１７１Ａ、ＳＣＨ  ４７１１２、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＴＡＮ  １０３０Ａ、レスタウルチニブ、４’−デメチルアミノ−４’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＡＦＮ９４１、エドテカリン、ベカテカリン、及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１の化合物である、項目６に記載のミセル。
［９］  前記インドロカルバゾール骨格を有する化合物が、スタウロスポリン、７−ヒドロキシスタウロスポリン、ＰＫＣ４１２及びレスタウルチニブからなる群から選ばれる少なくとも１の化合物である、項目８に記載のミセル。
［１０］  前記エピルビシン複合化共重合体と、前記抗癌剤との質量比が、５：２〜１０：１である、項目１〜９のいずれか一項に記載のミセル。
［１１］  項目１〜１０のいずれか一項に記載のミセルを含む、癌又は腫瘍の治療用医薬組成物。
［１２］  前記癌又は腫瘍が、神経芽腫、肝臓癌、悪性黒色腫、子宮癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、骨肉腫、精巣腫瘍、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌、及び乳癌からなる群から選ばれる、項目１１に記載の医薬組成物。
［１３］  前記癌又は腫瘍が、癌幹細胞を含む癌又は腫瘍に対して効果を有する、項目１１に記載の組成物。
［１４］  前記癌幹細胞を含む癌又は腫瘍が、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌及び乳癌からなる群から選ばれる少なくとも１の癌である、項目１２に記載の組成物。
［１５］  項目１〜１０のいずれか一項に記載のミセルの有効量を投与することを含む、癌の治療方法。
［１６］  癌治療用の医薬の製造のための、項目１〜１０のいずれか一項に記載のミセルの使用。
［１７］  癌治療用の項目１〜９のいずれか一項に記載のミセル。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のミセルは、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されるミセルに比較して、癌又は腫瘍に対し優れた治療効果を有する。抗癌剤を封入したミセルは、癌又は腫瘍部位で、エピルビシンと抗癌剤とを放出することができる。また、抗癌剤としてＡＢＣトランスポーター阻害剤を用いる場合、ＡＢＣトランスポーター阻害剤は、癌又は腫瘍における薬剤排出メカニズムを阻害することから、エピルビシンの効力が高まる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−Ｃ】図１は、エピルビシン複合化ブロック共重合体のミセル中に化合物が封入されたことを示す図であり、封入される化合物の構造式と併せて示す。図１Ａは、エピルビシン複合化ブロック共重合体の構造式と、当該共重合体により形成されたミセルのゼータサイザーを用いた動的光散乱法による粒子径およびＰＤＩ(polydispersity index)を示す図である。図１Ｂ及びＣは、それぞれスタウロスポリン及びＵＣＮ−０１の構造式と、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されたミセル中に封入した際のゼータサイザーを用いた動的光散乱法による粒子径およびＰＤＩを示す。
【図１Ｄ−Ｆ】図１は、エピルビシン複合化ブロック共重合体のミセル中に化合物が封入されたことを示す図であり、封入される化合物の構造式と併せて示す。図１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、レセルピン、レスタウルチニブ、ＰＫＣ４１２の構造式と、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されたミセル中に封入した際のゼータサイザーを用いた動的光散乱法による粒子径およびＰＤＩを示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、エピルビシン複合化ブロック共重合体のミセル中にスタウロスポリンを封入した際の各化合物の濃度比を変化させた場合のゼータサイザーを用いた動的光散乱法による粒子径およびＰＤＩを示す。
【図２】図２は、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルからのスタウロスポリン及びエピルビシンのそれぞれのｐＨ依存的放出特性を示す図である。エピルビシンが、ブロック共重合体にアミド結合を介して結合されたエピルビシン複合化ミセルでは、エピルビシン及びスタウロスポリンの両方についてｐＨ依存的放出特性が見られない（図２Ａ）一方で、エピルビシンが、ブロック共重合体にヒドラゾン結合を介して結合されたエピルビシン複合化ミセルでは、エピルビシン及びスタウロスポリンの両方について、ｐＨ依存的放出特性が見られた（図２Ｂ）。図２Ｃは、ｐＨ応答性エピルビシンミセル(Epi micelle)と、スタウロスポリン封入ｐＨ応答性エピルビシンミセル(STS Epi micelle pH)と、スタウロスポリン封入ｐＨ非応答性エピルビシンミセル（STS Epi micelle (amide)）をin vitro 抗癌活性により測定されたMSTO-211Hに対する生存率の変化を示す。図２Ｄは、ｐＨ応答性エピルビシンミセル(Epi micelle)と、スタウロスポリン封入ｐＨ応答性エピルビシンミセル(STS Epi micelle pH)と、スタウロスポリン封入ｐＨ非応答性エピルビシンミセル（STS Epi micelle (amide)）ルシフェラーゼ遺伝子発現MSTO-211中皮腫同所モデルマウスに投与した場合の発光による腫瘍体積変化を示す。
【図３】図３Ａは、エピルビシンミセルと、スタウロスポリンとを組み合わせることにより発揮される相乗効果を示す図である。図３Ｂは、スタウロスポリンが、血中のα酸性糖タンパク質と結合することにより、その効果が弱められる一方で、エピルビシンミセル中に封入された場合には、α酸性糖タンパク質による影響を受けなくなることを示す図である。
【図４】図４は、エピルビシン耐性株に対するエピルビシン（Epi）、スタウロスポリンとエピルビシン混合物（STS＋Epi Mix）、エピルビシンミセル（Epi micelle）、及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)のアポトーシス誘導効果を示す。図４Ａは、エピルビシン耐性の中皮腫（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）及び乳癌（ＭＣＦ−７）細胞に対し、上記薬剤を添加した場合におけるアネキシンＶ陽性のアポトーシスを誘導している細胞のＦＡＣＳの結果を示し、その結果を図４Ｂにおいてグラフ化した。図４Ｃは、中皮腫（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）細胞とエピルビシン耐性中皮腫（ＭＳＴＯ−２1１Ｈ−ＥＰＩ−Ｒ）細胞に対するエピルビシンミセル（Epi micelle）及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)の効果を示すグラフである。図４Ｄは、乳癌（ＭＣＦ−７）細胞とエピルビシン耐性乳癌（ＭＣＦ−７−ＥＰＩ−Ｒ）細胞に対するエピルビシンミセル（Epi micelle）及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、悪性中皮腫の皮下固形癌モデルにおけるエピルビシンミセル(Epi micelle)、スタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)、エピルビシン(Epi)、スタウロスポリン(STS)、スタウロスポリンとエピルビシン混合物(STS+Epi Mix)、及びエピルビシンミセルとスタウロスポリンとの混合物(Epi micelle STS Mix)を静脈内投与した場合の腫瘍体積変化を示しており（図５Ａ）、図５Ｂには実験期間における体重変化を示し、図５Ｃに４６日目における腫瘍外観を示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６は、ルシフェラーゼを遺伝子発現させたエピルビシン耐性の悪性中皮腫株を胸膜に移植した転移癌同所モデルにおける、エピルビシンミセル(Epi micelle)、スタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)、エピルビシン(Epi)、スタウロスポリン(STS)、スタウロスポリンとエピルビシン混合物(STS+Epi Mix)、及びエピルビシンミセルとスタウロスポリンとの混合物(Epi micelle STS Mix)を静脈内投与した場合のルシフェラーゼの発光強度変化を示しており（図６Ａ）、図６Ｂには実験期間における体重変化を示し、図６Ｃは、２７日目におけるルシフェラーゼの発光を示す外観写真を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、各薬剤の投与後の生存率を示すグラフを示す。
【図７】図７は、大腸癌において、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルが癌幹細胞（ＡＬＤＨ−１陽性）の集合を減少できることを示した（図７Ａ）。図７Ｂは、その他の癌幹細胞マーカー CD44v10, CD133に対するスタウロスポリン封入エピルビシンミセルの効果を示した。図７Cは、大腸癌における、エピルビシンミセル(Epi micelle)、エピルビシン(Epi)、スタウロスポリンとエピルビシン混合物(STS+Epi Mix)、スタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)、及びエピルビシンミセルとスタウロスポリンとの混合物(Epi micelle STS Mix)を静脈内投与した場合の腫瘍体積変化を示す。
【図８】図８は、ルシフェラーゼを遺伝子発現させたヒト肺癌シスプラチン耐性株を肺に移植した同所モデルにおける、エピルビシン(Epi)、スタウロスポリン（STS）、スタウロスポリンとエピルビシン混合物(STS+Epi Mix)、エピルビシンミセル(Epi micelle)、及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)を静脈内投与した場合のルシフェラーゼの発光強度変化を示しており（図８Ａ）、図８Ｂは、２２日目におけるルシフェラーゼの発光を示す外観写真を示す。さらに図８Ｃは、生存率を示すグラフを示す。
【図９】図９は、マウス腎癌（Ｒｅｎｃａ）を腎臓に移植した場合の同所モデルにおいて、腎臓癌及び肺転移癌に対するエピルビシン(Epi)、スタウロスポリン（STS）、スタウロスポリンとエピルビシン混合物(STS+Epi Mix)、エピルビシンミセル(Epi micelle)、及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi micelle)を静脈内投与した場合の生存曲線を示しており（図９Ａ）、エピルビシンミセルの投与後６０日での肺のＣＴ画像又は死亡した場合の解剖写真（図９Ｂ）、及びスタウロスポリン封入エピルビシンミセルの投与後６０日での肺のＣＴ画像又は死亡した場合の解剖写真を示す（図９Ｃ）。丸で囲った位置に転移癌が見られ、図９Ｂでは、２例について胸水滲出が見られた。図９Ｄは、移植後６０日目、又は死亡時の腫瘍体積を比較した図である。図９Ｅは、腎癌幹細胞のマーカーであるマウスCD105がスタウロスポリン封入エピルビシンミセルにより減少したことを示すグラフである。
【図１０】図１０は、グリオーマ（図１０Ａ）、前立腺癌（図１０Ｂ）の細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるエピルビシンミセルと、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルの有効性を示す図である。いずれの癌においても、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルの方が高い効力を有することが示された。
【図１１】図１１は、MSTO-211H中皮腫細胞に含まれる癌幹細胞に対する各薬剤（シスプラチン、ペメトレキセド、スタウロスポリン、ＵＣＮ−０１、エンザスタウリン）の効果を示す図であり、ＦＡＣＳの結果を示す（図１１Ａ）。図１１Ａの縦軸は側方散乱（ＳＳＣ）を示し、横軸はＡｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性細胞を示しており、上段は、各薬剤の添加後の細胞集団の分布を示し、下段は、ＡＬＤＨの阻害剤であるＤＥＡＢを添加した際の細胞集団の分布を示す。図１１Ｂは、図１１Ａの結果をグラフ化して示した図である。
【図１２】図１２Ａは、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）において、エピルビシン耐性の獲得前と獲得後におけるＡＢＣトランスポーターの一種であるＭＤＲ−１の発現変化を示す図である。図１２Ｂは、エピルビシン耐性を獲得していない乳癌（ＭＣＦ−７）細胞（Original strain)と、エピルビシン耐性を獲得した乳癌（ＭＣＦ−７）細胞（Epirubiin Resistant strain）において細胞外へのエピルビシン及びeFlux-IDの排出を比較した写真である。エピルビシン耐性株において、エピルビシン又はエピルビシンミセルの単独投与では、エピルビシン及びeFlux-IDを細胞外に排出する一方で、スタウロスポリンとエピルビシンの混合物又はスタウロスポリン封入エピルビシンミセルを用いることにより、エピルビシン及びeFlux-IDが細胞外に排出されずに細胞内に留まることが示される。
【図１３】図１３Ａは、肺癌細胞（Ｈ４６０）において、シスプラチン耐性の獲得前と獲得後におけるＡＢＣトランスポーターの一種であるＭＤＲ−１の発現変化を示す図である。図１３Ｂは、シスプラチン耐性を獲得していない肺癌（Ｈ４６０）細胞（Original strain)とシスプラチン耐性を獲得した肺癌（Ｈ４６０）細胞（Cisplatin-Resistant strain）において、細胞外にエピルビシン及びeFlux-IDの排出を比較した写真である。シスプラチン耐性株において、エピルビシン又はエピルビシンミセルの単独投与では、エピルビシン及びeFlux-IDを細胞外に排出する一方で、スタウロスポリンとエピルビシンの混合物又はスタウロスポリン封入エピルビシンミセルを用いることにより、エピルビシン及びeFlux-IDが細胞外に排出されずに細胞内に留まることが示される。
【図１４Ａ−Ｃ】図１４は、各薬剤耐性細胞又はＡＢＣトランスポーター高発現細胞におけるスタウロスポリン及びスタウロスポリン-エピルビシンミセルが、各薬剤の排出を妨げたことを示す図であり、ＭＡＦ値をグラフの下に記す。図１４Ａでは、エピルビシン耐性中皮腫癌細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ＥＰＩ−Ｒ）が用いられ、図１４Ｂでは、エピルビシン耐性乳癌細胞（ＭＣＦ−７  ＥＰＩ−Ｒ）が用いられ、そして図１４Ｃではシスプラチン耐性肺癌細胞（Ｈ４６０  Ｃｉｓ−Ｒ）が用いられている。
【図１４Ｄ−Ｅ】図１４Ｄでは、ＡＢＣトランスポーターであるＢＣＲＰを高発現するＨｅｌａ細胞が用いられ、図１４ＥではＡＢＣトランスポーターであるＭＲＰを高発現するＡ５４９が用いられている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１の実施形態では、本発明は、エピルビシン複合化ブロック共重合体と、エピルビシンとは異なる抗癌剤とを含むミセルに関している。より具体的に、本発明のミセルは、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されるミセルの内核に抗癌剤が配置される。こうした抗癌剤は、抗癌幹細胞作用を有し、抗癌幹細胞剤、抗癌幹細胞抑制剤、又は抗癌幹細胞阻害剤である。
【００１９】
本発明におけるエピルビシン複合化ブロック共重合体は、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域及び側鎖にヒドラジド基及び疎水性基を有するポリアミノ酸領域を含む薬剤複合体用のブロック共重合体と、当該ブロック共重合体のヒドラジド基を介して結合されたエピルビシンとを含む。エピルビシン複合化ブロック共重合体は、水溶性高分子領域を外殻とし、疎水性のポリアミノ酸領域を内核とした高分子ミセルを形成することができ、エピルビシンは内核に配置される。抗癌剤は、エピルビシンと相互作用をすることにより、エピルビシンとともに内核に配置される。抗癌剤がミセル内核に配置されたエピルビシン複合化ブロック共重合体のミセルを、抗癌剤封入エピルビシンミセルということができ、抗癌剤としてＡＢＣトランスポーター阻害剤が封入されうる。ＡＢＣトランスポーター阻害剤としてインドロカルバゾール化合物が封入される場合、インドロカルバゾール化合物封入エピルビシンミセルということができる。さらに例えばインドロカルバゾール化合物がスタウロスポリンの場合、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルというものとする。
【００２０】
エピルビシン複合化ブロック共重合体において、エピルビシンは、エピルビシンのケトン構造とブロック共重合体のヒドラジド基が脱水縮合することにより、ブロック共重合体に複合化される（図１Ａ）。エピルビシンは、ヒドラゾン構造によりブロック共重合体に共有結合されており、ヒドラゾンは、低ｐＨで加水分解を受ける。それによりエピルビシン複合化ブロック共重合体から形成されるミセルが、腫瘍や炎症などの病巣部位で生じうる酸性環境下、例えばｐＨ３．０〜６．５に存在することにより、エピルビシンが遊離し、病巣部位にて抗癌活性を発揮することができる。本発明のミセルからエピルビシンが遊離する際に、内核に配置された抗癌剤も遊離する。このように酸性環境下でエピルビシン複合化ブロック共重合体のヒドラゾン構造が分解されて、エピルビシン、又はエピルビシンと抗癌剤を放出できるミセルを、ｐＨ応答性のミセルということができる。ｐＨ応答性ミセルを用いることにより、その疎水性や、血中タンパク質への結合性などのため、血中で活性が失われてしまう抗癌剤を、活性を保持しつつ目的の組織又は病巣部位にデリバリーすることが可能になり、これにより組織又は病巣部位特異的に、抗癌剤の有する優れた活性を発揮することができる。
【００２１】
本発明に係る薬剤複合体用ブロック共重合体は、ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、ポリアミノ酸領域とからなるブロック共重合体にヒドラジド基及び疎水性基を導入することで調製することができる。
【００２２】
特に、製造容易であり、本発明で都合よく使用できるブロック共重合体としては、下記
式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示すことのできるものを挙げることができる。
【化１２】
2016024595.tif 000014
又は
【化１３】
2016024595.tif 000015
｛式中、
Ｒ１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ３は、−Ｏ−Ｒ５又は−ＮＨ−Ｒ５を表し、Ｒ５は同一または異なって疎水性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ１及びＬ２は各々独立してリンカーを表し、
ｍは、５〜１０００、好ましくは４０〜６００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００、好ましくは０〜１００の整数を表し、
ｐは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
但し、ｐはブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数の２０％以上〜９０％未満、好ましくは２５％以上〜５０％以下を占め、ｎが存在する場合は、ｎ、ｐ及びｑはランダムに存在し、ｎが存在しない場合は、ｐ及びｑはランダムに存在し、ｙは１又は２の整数を表す）。
【００２３】
リンカーはブロック共重合体の製造方法により変化しうるので限定されるものではないが、Ｌ1は、−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｚ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＨ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ1〜Ｃ8のアルキル基である）を挙げることができ、Ｌ2は、−ＣＯ−Ｚ−、−Ｚ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、−Ｚ−ＣＯ−Ｚ−および−Ｚ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ−（ここで、Ｚは独立してＣ1〜Ｃ8のアルキル基である）を挙げることができる。
【００２４】
上記ブロック共重合体は、例えば公知のＭｅＯ−ＰＥＧポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）にヒドラジン、あるいはヒドラジン水和物を反応させることにより、そのベンジルエステル部分をヒドラジド基に変換することで合成することができる。通常その反応は脱水溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族又は芳香族の有機溶媒が用いられ、ブロック共重合体及びヒドラジン、あるいはヒドラジン水和物のいずれもが溶解するものが好ましい。例えば、溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、Ｎ-メチル-２-ピロリドン又はそれらの混合溶媒が好ましく用いられる。また、使用する溶媒は極力水を含まないことが好ましい。合成時におけるヒドラジンの添加量は、反応がほぼ定量的に進行することから、通常ブロック共重合体のベンジルエステル部分に対して導入したいだけの量を添加すればよい。例えば、ヒドラジンを用いる場合、ベンジルエステル部分に対して５０％導入する場合、０．５倍当量のヒドラジンを添加し、７５％導入する場合は、０．７５倍当量のヒドラジンを添加する。反応は、０℃〜１００℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜８０℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が十分に進行する時間であればとくに制限はされないが、通常は２時間〜２日間である。
【００２５】
また、当該ブロック共重合体に複合化させるエピルビシンの量は、血中滞留性を維持可能であれば特に限定されないが、ブロック共重合体中のポリアミノ酸の全ユニット数に対して１０％以上〜５０％以下、好ましくは１０％以上〜４０％以下、薬効と安定性を考慮すれば１５％以上〜３５％以下の数である事が特に好ましい。なお、エピルビシンには複数のケトンが存在するが、ヒドラシド基と共有結合するケトンは、好ましくは１３位のケトンである。
【００２６】
エピルビシンのブロック共重合体への結合は、好ましくは極力無水な条件下でエピルビシンをブロック共重合体のヒドラジド基に反応させるだけで達成される。好ましくは、本発明に係るブロック共重合を脱水した溶媒、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、又はそれらの混合溶媒に溶解し、エピルビシンを所望量において、例えばヒドラジド基に対し０．１〜１０当量、好ましくは０．１〜３当量で添加し、反応させる。反応は、０℃〜５０℃の温度範囲で行われ、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃の範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が十分に進行する時間であれば特に制限はされないが、通常は２時間〜５日間程度であろう。反応後の溶液を、適当な親水性有機溶媒、例えば２−プロパノールといったアルコール類に注ぎ入れ、沈殿させて洗浄し、回収する。回収は遠心分離操作で行ってよい。必要であれば、エピルビシン複合共重合体をゲル濾過クロマトグラフィーによる精製、限外濾過による精製などを行い、未結合の薬剤を除去してよい。
【００２７】
本発明の高分子ミセルに使用されるブロック共重合体は、ヒドラジド基にエピルビシンが複合化したエピルビシン複合化ブロック共重合体のみから構成されるか、あるいは（１）ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、側鎖にヒドラジド基を有し、疎水性基を有してもよいポリアミノ酸領域からなり、エピルビシンがそのヒドラジド基に結合したブロック共重合体と、（２）ポリエチレングリコールからなる水溶性高分子領域と、疎水性基を有するポリアミノ酸及び／又はその誘導体領域からなり、エピルビシンの結合していないブロック共重合体とから構成されてもよい。薬剤の結合していない形態における上記（１）のブロック共重合体としては、例えば以下の式で表されるものが利用される。
【化１４】
2016024595.tif 000016
又は
【化１５】
2016024595.tif 000017
｛式中
Ｒ１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖もしくは分枝または環状のＣ１〜Ｃ１２アルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ２は、水素原子、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し
Ｒ３は、−Ｏ−Ｒ５又は−ＮＨ−Ｒ５を表し、Ｒ５は同一または異なって疎水性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、飽和もしくは不飽和のＣ１〜Ｃ３０脂肪族オキシ基またはアリール−低級アルキルオキシ基を表し
Ｌ１及びＬ２は各々独立してリンカーを表し、ブロック共重合体の製造方法により変化しうるので限定されるものではないが、例えばＬ１は、−Ｚ−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｚ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＨ−Ｚ−ＮＨ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ８のアルキル基である）を挙げることができ、Ｌ２は、−Ｚ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｚ−、−ＣＯ−Ｚ−ＣＯ−、−Ｚ−ＣＯ−Ｚ−および−Ｚ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ−（ここで、Ｚは独立してＣ１〜Ｃ８のアルキル基である）であってよく、
ｍは、５〜１０００、好ましくは４０〜６００の整数を表し、
ｎは、０〜１０００、好ましくは０〜１００の整数を表し、
ｐは、０〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｑは、１〜１０００、好ましくは１〜１００の整数を表し、
ｙは１又は２の整数を表す）。
上記ブロック共重合体におけるヒドラジド基の導入やエピルビシンの結合は、上で説明したエピルビシン複合化ブロック共重合体の製法に準じて行うことができる。
【００２８】
また、上記（２）のブロック共重合体としては、例えば以下の式で表されるものが利用される：
【化１６】
2016024595.tif 000018
又は
【化１７】
2016024595.tif 000019
｛式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｌ１、Ｌ２、ｍ、ｎ、ｐ及びｙは式（Ｉ）（ＩＩ）と同義であり、但し、ｎ＋ｐの内ｐは５０％から１００％を占め、ｎが存在する場合ｎとｐはランダム又は、ブロックで存在する｝。
上記（１）のブロック共重合体にエピルビシンを複合化したブロック共重合体と上記（２）のブロック共重合体の混合比は、特に限定されないが、１：１〜９：１の範囲で混合することができる。その場合、混合した全ブロック共重合体中の全ポリアミノ酸の数に対する疎水性基の割合は、３５％以上〜９５％未満であり、好ましくは５０％以上〜９５％未満である。この際、上記（１）、上記（２）何れの共重合体にも疎水性基は存在することができる。複合体化するエピルビシンの割合は、混合した全ブロック共重合体中の全ポリアミノ酸の数に対して５％以上〜６５％以下、好ましくは５％以上〜５０％以下、より好ましくは５％以上〜２０％以下の数である。
【００２９】
ブロック共重合体に結合されるエピルビシンは、アンスラサイクリン系抗癌剤であり、白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌を含む多くの癌の治療に用いられる。エピルビシンは、薬学的に許容される任意の塩の形態であってもよい。
【００３０】
本発明のミセルに封入される抗癌剤は、エピルビシン以外の抗癌剤をいい、エピルビシンミセルから、一部のエピルビシンがミセル中に遊離したミセルと、本発明の抗癌剤封入エピルビシンミセルとは明確に区別することができる。封入される抗癌剤としては、ＡＢＣトランスポーター阻害作用、アポトーシスの誘導作用、細胞周期Ｇ２／Ｍチェックポイントの解除、グルコーストランスポーターの抑制作用などの作用のうちの少なくとも１以上の作用、より好ましくは２以上の作用を発揮する。したがって、本発明の抗癌剤は、ＡＢＣトランスポーター阻害剤、アポトーシスの誘導剤、細胞周期Ｇ２／Ｍチェックポイントの解除剤、グルコーストランスポーター阻害剤ということもできる。本発明の抗癌剤は、上述の作用から、特に癌幹細胞に対しても殺傷性を有する。したがって、本発明の抗癌剤は、抗癌幹細胞剤、抗癌幹細胞剤、抗癌幹細胞抑制剤、又は抗癌幹細胞阻害剤ということもできる。
【００３１】
本発明のミセルには、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されるミセルの疎水性の内核に、さらにＡＢＣトランスポーター阻害剤などの抗癌剤を封入することができる。封入されるＡＢＣトランスポーター阻害剤としては、インドロカルバゾール骨格を有する化合物、含窒二員環を有する化合物、又は複数の芳香環を有する化合物でありうる。
【００３２】
インドロカルバゾール骨格を有する化合物としては、以下の式：
【化１８】
2016024595.tif 000020
【化１９】
2016024595.tif 000021
であるか、或いは一緒になって、以下の：
【化２０】
2016024595.tif 000022
又は
【化２１】
2016024595.tif 000023
Ｒ11は、メチルであり：
Ｒ12は、Ｈであり；
Ｒ13及びＲ14は、それぞれ独立に、Ｈ、メトキシ、−ＯＨ、ヒドロキシメチル、メチルカルボキシレート、メチルアミノ、メチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、又は
【化２２】
2016024595.tif 000024
であり；
Ｒ15及びＲ16は、それぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ又は
【化２３】
2016024595.tif 000025
であり；
Ｒ17及びＲ18は、Ｈ、ＯＨ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、オキシム、
【化２４】
2016024595.tif 000026
である｝
で表される化合物、又はその塩である。当該インドロカルバゾール化合物は、抗癌活性を有する。
【００３３】
本発明に用いられるインドロカルバゾール化合物は、任意の光学異性体をとってもよいが、優れた抗癌活性を有する観点から、例えば以下の式：
【化２５】
2016024595.tif 000027
｛式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ6〜Ｒ8、Ｒ11〜Ｒ18は上で定義するとおりである｝
で表される光学異性体の化合物が好ましい。
【００３４】
本発明に用いられるインドロカルバゾール化合物は、本発明のミセルに充填する観点から、以下の式：
【化２６】
2016024595.tif 000028
｛式中、
Ｒ7はＨ又はＯＨであり、
Ｒ13及びＲ14は、それぞれ独立に、Ｈ、メトキシ、−ＯＨ、又はヒドロキシメチルである｝
で表される化合物が好ましい。
【００３５】
本発明に用いられるインドロカルバゾール骨格を有する化合物として、例えば以下の化合物：スタウロスポリン、７−ヒドロキシスタウトスポリン、ＫＴ５９２６、スタウロスポリン・アグリコン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ  ａｇｌｙｃｏｎｅ）、ＳＦ２３７０、ＫＴ５８２３、４’−Ｎ−ベンゾイルスタウロスポリン、ＰＫＣ４１２、Ｇｏ６９７６、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＮＡ０３５９、Ｎ−エトキシカルボニル−７−オキソスタウロスポリン、ＫＴ−６１２４、ＣＧＰ４２７００、４’−デメチルアミノ−４’，５’−ジヒドロキシスタウロスポリン、７−オキソスタウロスポリン、ＣＥＰ７５１、ＮＡ０３４６、ＮＡ０３５９、３’−デメトキシ−３’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＫＴ６００６、７−Ｏ−メチル−ＵＣＮ０１、ＴＡＮ９９９、ＮＡ０３４６、ＮＡ０３４５、ＮＡ０３４４、ＣＧＰ４４１７１Ａ、ＳＣＨ４７１１２、Ｎ，Ｎ−ジメチルスタウロスポリン、ＴＡＮ１０３０Ａ、レスタウルチニブ、４’−デメチルアミノ−４’−ヒドロキシスタウロスポリン、ＡＦＮ９４１、エドテカリン、ベカテカリン、及びその薬学的に許容される任意の塩が挙げられる。
【００３６】
本発明に用いられるＡＢＣトランスポーター阻害剤である含窒二員環を有する化合物には、例えばインダゾール骨格を有する化合物、例えばアキシチニブ、パゾパニブ、キナゾリン骨格を有する化合物、例えばバンデタニブ、アファチニブ、ボスチニブ、カネルチニブ、セジラニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、その他の含窒二員環を有する化合物としてポナチニブ、ベムラフェニブ、トファシチニブ、スニチニブ、ダヌセルチブ、又はそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３７】
本発明に用いられるＡＢＣトランスポーター阻害剤である１又は複数の芳香環を有する化合物として、４つの芳香環を有するダブラフェニブ、イマチニブ、ニロチニブ、３つの芳香環を有するクリゾチニブ、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、１つの芳香環を有するタンヅチニブ、又はそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００３８】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、化合物の活性を損なわない限り任意の塩であってよく、例えば塩酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩および酒石酸塩が挙げられる。
【００３９】
本発明に用いられるＡＢＣトランスポーター阻害剤は、癌細胞、より好ましくは薬剤耐性の癌細胞、例えば癌幹細胞に対して、薬剤排除のメカニズムを阻害することにより作用することができる。したがって、エピルビシンと併せて用いることにより、癌の根治を可能にし、再発可能性を低減することができる。したがって、本発明におけるＡＢＣトランスポーター阻害剤は、抗癌剤ということもできる。理論により制限されることを意図するものではないが、本発明のＡＢＣトランスポーター阻害剤は、タンパク質のＡＴＰ結合部位に結合することができ、それによりキナーゼやトランスポーターの活性を強く抑制することができる。
【００４０】
本発明に用いられるＡＢＣトランスポーター阻害剤の１種であるインドロカルバゾール化合物は、アポトーシスの誘導、細胞周期Ｇ２／Ｍチェックポイントの解除、癌細胞の耐性に寄与するＡＢＣトランスポーターの抑制、及びグルコーストランスポーターの抑制のうちの少なくとも１以上の作用により、より好ましくは２以上の作用を発揮することにより、極めて高い抗腫瘍効果及び／又は抗癌活性を発揮することができると考えられる。この中でも特に、本発明者らの研究により、プロテインキナーゼＣに対する阻害剤は、癌幹細胞に対して特に有効であることが示されており、プロテインキナーゼＣを阻害するインドロカルバゾール化合物は、癌幹細胞を含む腫瘍及び癌の治療又は根治に極めて有用と考えられる。一方で、このようにＡＴＰ結合部位を有する広範囲のタンパク質に対して、結合し、作用することにより、インドロカルバゾール化合物は、副作用が強いことが多く、また疎水性が高いため、医薬としての開発が困難であることが多かった。本発明により、エピルビシン複合化共重合体により形成されるミセル中にインドロカルバゾール化合物を取り込むことにより、インドロカルバゾール化合物が有する副作用及び／又は疎水性に関わる問題が解決でき、副作用の低く、かつ腫瘍に対する有効性の高いＤＤＳ医薬の開発が可能になる。本発明のミセルにおいて、インドロカルバゾール化合物は、ミセル内核の疎水性領域に存在すると考えられるが、製法に応じてその一部が内核に存在していなくてもよい。
【００４１】
本発明においてミセルには、エピルビシン複合化共重合体と、抗癌剤とは、任意の質量比で封入されてよく、例えば５：２〜１０：１の範囲で存在することが好ましい。ミセルの大きさに関し適度な分散性を確保する観点からエピルビシン複合化共重合体に対する抗癌剤の質量比は、１以下が好ましく、より好ましくは０．８以下、さらにより好ましくは０．５以下である。抗癌剤の充填量を高くする観点から、エピルビシン複合化共重合体に対する抗癌剤の質量比は、０．１以上が好ましく、より好ましくは０．２以上であり、さらにより好ましくは０．４以上である。エピルビシン複合化共重合体と抗癌剤は、抗腫瘍効果として、相加を超える相乗効果を発揮する。
【００４２】
本発明のミセルは、エピルビシン複合化ブロック共重合体の溶液と、抗癌剤の溶液を混合し、混合溶液から溶媒を蒸発させた後に、別の溶媒を加えて溶解させてソニケーションをすることにより抗癌剤が、エピルビシン複合化ブロック共重合体により形成されるミセルの内核へと封入されたミセルを取得することができる。使用する溶媒は、抗癌剤及びエピルビシン複合化ブロック共重合体を溶解できれば任意の溶媒を使用することができ、例えば疎水性の抗癌剤を溶解するため、有機溶媒、例えばアルコール類を用いることができる。ソニケーション時に用いる溶媒は、形成したミセルを安定的に保持できれば任意の溶媒であってよく、生成したミセルを体内に投与する観点から、水が好ましく、ミセルの保護の観点から緩衝水溶液を用いることができる。得られたミセルを、所定のフィルターに１又は複数回通すことで、所望の大きさを有するミセルを選別することができる。
【００４３】
別の実施態様では、本発明は、抗癌剤と、エピルビシン複合化ブロック共重合体とを含むミセルを含む、疾患治療用医薬組成物に関する。この治療用組成物により治療されうる疾患としては、任意の癌又は腫瘍、例えば神経芽腫、肝臓癌、悪性黒色腫、子宮癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、骨肉腫、精巣腫瘍、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌、及び乳癌などが挙げられる。本発明の治療用組成物は、癌幹細胞に作用することができることから、癌幹細胞を含む癌又は腫瘍の治療に有用である。癌幹細胞を含む癌又は腫瘍として、例えば急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌及び乳癌が知られているがこれらに限定されることを意図するものではない。本発明のミセルは、エピルビシンが含まれることから、エピルビシンの治療適応がある癌であれば、任意の癌を治療することができ、エピルビシン又はエピルビシンミセルの治療によりエピルビシンに対し耐性を獲得した癌に対しても治療効果を発揮することができる。これらの癌の中で、本発明の難治性であることが知られている腎癌や卵巣癌を治療できる点で抗癌剤と、エピルビシン複合化ブロック共重合体とを含むミセルを含むミセルは、極めて有用である。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明のミセル又は医薬組成物の有効量を、疾患、例えば神経芽腫、肝臓癌、悪性黒色腫、子宮癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、骨肉腫、精巣腫瘍、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌、及び乳癌の治療、予防又は軽減を必要とする患者に投与することを含む、これらの疾患の治療、予防又は軽減方法にも関する。本発明のミセル又は医薬組成物は、癌幹細胞に作用することができることから、癌幹細胞を含む癌又は腫瘍の治療又は予防に有用である。癌幹細胞を含む癌又は腫瘍として、例えば急性骨髄性白血病、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部扁平上皮癌、中皮腫、肺癌、大腸癌、腎癌、卵巣癌及び乳癌が知られているがこれらに限定されることを意図するものではない。予防方法は、癌の増殖又は転移の予防、再発の予防のいずれであってもよい。
【００４５】
本発明のミセル又は医薬組成物は、薬剤耐性を有する癌及び又は腫瘍の治療に有用である。薬剤耐性は、任意の抗癌剤に対する耐性であってもよい。一部の癌細胞は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）を介して薬剤を排出することにより、薬物耐性を獲得することがある。ＡＢＣトランスポーターは、現に投与されている薬剤のみならずその他の薬剤についても排出することができ、多剤耐性に寄与すると考えられている。薬物耐性の例としては、以下のものに限定されないが、エピルビシン、シスプラチン、エトポシド、ピンクリスチン、タキソール、カンプトテシン、ミトキサントロンなどの抗癌剤に対する薬剤耐性が挙げられ、本発明のミセル又は医薬組成物は、これらの薬剤耐性を有する癌又は腫瘍の治療、軽減、又は予防に使用することができる。本発明のミセル又は医薬組成物が、薬物耐性癌又は腫瘍に有効である理由として、スタウロスポリンを含むインドロカルバゾール化合物が、ＡＢＣトランスポーターの阻害活性を有することに基づくと考えられるが、それに限定されることを意図するものではない。理論に限定されることを意図するものではないが、スタウロスポリンを含むインドロカルバゾール化合物は、ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰポケットに結合して、活性を阻害すると考えられている（非特許文献１２、１３、１４）。インドロカルバゾール化合物が、阻害するＡＢＣトランスポーターの例として、ＭＤＲｓ（ＭＤＲ１、２、３）、ＭＲＰｓ（ＭＲＰ１〜９）、ＢＣＲＰ、ＡＢＣＡ、ＢＳＥＰなどが挙げられる。
【００４６】
本発明のミセルを含む製剤は、溶液の形態で提供されてもよいし、使用前に水、緩衝液、生理食塩水などで再構成される粉末状で提供されてもよい。使用前に再構成される場合、ソニケーションやフィルター処理を行い、所望のミセルサイズを選択することもできる。溶液形態の製剤又は再構成された製剤は、任意の経路で投与することができるが、例えば、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、くも膜下腔内、直腸内で投与することができる。ミセルを含む製剤の投与スケジュールは、腫瘍又は癌の状況に応じて医師が適宜選択することができる。投与スケジュールとしては、例えば数日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、の投与で所望の効果を発揮することができる。一方で、１日１回〜数回投与することができ、例えば、１日１回、２回、又は３回投与することもできる。一回あたりの用量は、投与スケジュールに応じて任意に選択することができ、例えばミセルとして、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することができる。毒性を低減する観点から用量は、５０ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましい一方で、効能を発揮する観点から、０．５ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、１．０ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましい。
【００４７】
本発明のミセルを含む製剤は、抗癌剤の他に、又は加えて、さらなる追加の活性成分を含んでもよい。そのような活性成分としては、抗癌剤として認可されている化合物が好ましいが、未認可の化合物が用いられてもよい。エピルビシンミセルに封入できる化合物としては、例えばレセルピン、エトポシド、カンプトテシンなどが挙げられる。このような追加の活性成分は、エピルビシンや抗癌剤と同様にミセルの内核に配置されてもよいし、抗癌剤含有エピルビシンミセルと混合されているだけでもよい。本発明のミセルを含む製剤は、これらの活性成分の他に、ミセルの安定性を損なわない限りにおいて、医薬製剤に使用できる任意の賦形剤を用いることができ、例えばｐＨ緩衝剤、保存剤、乳化剤などを用いることができる。
【実施例】
【００４８】
実施例１：インドロカルバゾール化合物封入エピルビシンミセルの作製方法
ＰＥＧ−ｂ−（ＰＢＬＡ−ヒドラジド−エピルビシン）共重合体（ＰＥＧ質量平均分子量（Ｍｗ）＝１２，０００Ｄａ；ＰＢＬＡユニット＝４０；エピルビシンユニット＝８；ナノキャリア株式会社，日本）の粉末（エピルビシン２０ｍｇ相当）を４０ｍｌメタノールで溶解した溶液と、４ｍｇスタウロスポリン（フナコシ株式会社、日本）を１０ｍｌメタノールで溶解した溶液とを梨型フラスコで混合し、３０分間、室温下でスターラーを用いて混合した。混合された溶液をロータリーエバポレーション（Ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ  Ｎ−１２００ＡＶ（ＥＬＹＲＡ）にかけ、メタノールを蒸発させた。メタノールを蒸発させた後に、フラスコにＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ；ｐＨ７．４；５０ｍｌ）を加えて溶解し、３０分間ソニケーション（Ｂｏｏｒ  ｕｐｒｏａｒ  Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ，  Ｊａｐａｎ）を行った。その後、溶液をポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター（０．２２μｍ）（ミリポア社）に通した。溶液をさらに、ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ：  ３０，０００  Ｄａ）（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０  ミリポア社）で、５回、１５分かけて精製し（各回ごとに５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７．４）を加える）、１５ｍｌに濃縮した。最後に、ＰＥＳフィルター（０．２２μｍ）を通した。
作成したミセルの粒径は、ＤＬＳ（ＺＥＴＡ  ＳＩＺＥＲ（ＭＡＬＶＥＲＮ社））によって粒径を測定した。ミセル中のエピルビシン、スタウロスポリン濃度はＨＰＬＣ（ＬＣ−２０００  ＪＡＳＣＯ社）カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ（ＴＳＫ社）によって検量線を測定し、ミセルの含有量を定量した。【００４９】
スタウロスポリンの代わりにＵＣＮ−０１（シグマ）、ＰＫＣ４１２（和光純薬）、レセルピン（シグマ）、ＣＥＰ７０１／レスタウルチニブ（メルク）、ビスモデギブ（Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ（岩井化学））、及びエンザスタウリン（岩井化学）を用い、上記と同様な方法でミセルを作成した。ミセル中にスタウロスポリン、ＵＣＮ−０１、ＰＫＣ４１２、レセルピン，ＣＥＰ７０１／レスタウルチニブを検出することができた（図１Ｂ〜Ｆ）一方で、ミセル中にビスモデギブ及びエンザスタウリンは、検出できなかった（データ未掲載）。【００５０】
次に、スタウロスポリンとＰＥＧ−ｂ−（ＰＢＬＡ−ヒドラジド−エピルビシン）共重合体との質量のみを変化させて、同様に実験を行った。エピルビシン５ｍｇ、２．５ｍｇ、及び２．５ｍｇ相当量のＰＥＧ−ｂ−（ＰＢＬＡ−ヒドラジド−エピルビシン）共重合体に対し、１ｍｇ、２．５ｍｇ、及び５ｍｇのスタウロスポリンを用いて、スタウロスポリンをエピルビシンミセル中に封入した。封入したミセル中のエピルビシン、スタウロスポリンの濃度を、ＨＰＬＣ（ＬＣ−２０００  ＪＡＳＣＯ社）カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ（ＴＳＫ社）によって測定した（図１Ｇ）。エピルビシン：スタウロスポリンの質量比が５：１の場合には、ミセル中へのスタウロスポリンの完全な封入が見られた一方で、１：１では、分散度が高くなり、そして１：２では、多分散度がさらに高くなり、封入ミセルとして適切ではなかった。【００５１】
実施例２：スタウロスポリン封入エピルビシンミセルの放出特性の測定
放出特性
本発明のミセルに用いるエピルビシン複合化ブロック共重合体において、エピルビシンとブロック共重合体との間の結合を、ｐＨ応答性のヒドラゾン結合の代わりに、アミド結合を用いて形成したミセルにおいて、エピルビシン及びスタウロスポリンのｐH応答性の放出特性を調べた。０．３ｍｌミセル懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ  Ｅｐｉ：０．２ｍｇ／ｍｌ  ＳＴＳ）を透析バッグ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ，  ３．５Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）に入れた。透析バッグを、異なるｐＨのＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．５、ｐＨ６．５、Ｐｈ７．４）緩衝液（３０ｍｌ）に入れ、室温中、スターラーでミセル懸濁液を攪拌した。１時間、４時間、２０時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間経過時に、外側の緩衝液を０．５ｍｌ採取し、ＨＰＬＣでエピルビシンおよびスタウロスポリンの濃度を測定した（図２Ａ及びＢ）。【００５２】
in vitro 抗癌活性の測定
抗癌活性をcell counting kit８(DOJINDO, JAPAN)を用いて、以下の方法で測定した。１〜３×１０3ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでMSTO-211H 中皮腫細胞株を播いた。翌日、培地を交換し、５０μｌの培地を加えた。さらに、エピルビシンミセル（Epi micelle)、ｐＨ応答性スタウロスポリン封入エピルビシンミセル（STS Epi Micelle pH）、ｐＨ非応答性スタウロスポリン封入エピルビシンミセル（STS Epi Micelle amide)の希釈シリーズを作成し、５０μｌをｗｅｌｌに添加し攪拌した。７２時間後、１０μｌのcell counting kit 8を加え、１時間経過後、マイクロプレートリーダー（Model 680, BioRad, Hercules, CA）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度に基づき、下記の式により細胞生存率を算出し、グラフに示した（図２Ｃ）。これを各薬剤に対してグラフに表し、生存率が５０％になる値をＩＣ50（５０％細胞傷害率）とした。
【数１】
2016024595.tif 000029
式中、As: 検体の吸光度(細胞、被検物質および Cell CountingKit 溶液の入ったウェル) Ac: 陰性対照の吸光度 (細胞および Cell Counting Kit 溶液の入ったウェル（被検物質無し）) Ab: ブランク吸光度(培地および Cell Counting Kit 溶液の入ったウェル細胞無し)。【００５３】
腫瘍増殖性試験(薬剤感受性試験)
MSTO-211H中皮腫細胞を雌ヌードマウスに皮下移植して、皮下移植モデルを作成し、薬効評価に用いた。MSTO-211H中皮腫細胞を培養し、４×１０7  ｃｅｌｌ／ｍｌの１００μｌと等量のマトリゲル（ベクトンディッキンソン）１００μｌを混合し、皮下に２００μｌ混合液（２×１０6ｃｅｌｌ／匹）を移植した。移植の５日後、腫瘍の直径が４〜５ｍｍに達したことを確認し、０日目とした。腫瘍が形成されたマウスに対し、0，4，8,12日目に、エピルビシンミセル（Epi micelle)、ｐＨ応答性スタウロスポリン封入エピルビシンミセル（STS Epi Micelle pH）、ｐＨ非応答性スタウロスポリン封入エピルビシンミセル（STS Epi Micelle amide）
を、4ｍｇ/ｋｇの用量で尾静注で4回投与した。腫瘍の長径ａ：短径ｂをノギスで計測し、腫瘍体積（ｍｍ3）をａｂ2／２として週２回測定した（図２Ｄ）。【００５４】
実施例３：スタウロスポリンとエピルビシンとの相乗効果、並びに血中タンパク質
ｈＡＧＰ添加時のミセル化の効果の検証
抗癌活性をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８（ＤＯＪＩＮＤＯ，  ＪＡＰＡＮ）を用い、下記の通り測定した。１〜３×１０3ｃｅｌｌ／ウェルで、中皮腫細胞株ＭＳＴＯ−２１１Ｈを播種し、培養を行った。翌日、培地を交換し、５０μｌの培地を加えた。１２５ｎｇ／ｍｌのエピルビシンを添加し、さらにスタウロスポリンの濃度を０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌと変化させて添加した。対照として、抗癌剤未添加群（Ｎｏ  ｔｒｅａｔ）と、スタウロスポリンのみを添加した群（ＳＴＳ  １２５ｎｇ／ｍｌ）を用いた。７２時間後、１０μｌのｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ８を加え、１時間経過後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，  ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度を下記の式に適用し、細胞生存率（％）を算出した（図３Ａ）。
【数２】
2016024595.tif 000030
式中、As: 検体の吸光度(細胞、被検物質および Cell CountingKit 溶液の入ったウェル) Ac: 陰性対照の吸光度 (細胞および Cell Counting Kit 溶液の入ったウェル（被検物質無し）) Ab: ブランク吸光度(培地および Cell Counting Kit 溶液の入ったウェル細胞無し)。
スタウロスポリンとエピルビシンの混合物は、スタウロスポリンの濃度依存的に生存率を低減でき、エピルビシンの単独投与及びスタウロスポリンの単独投与に比較して相乗効果を発揮した。【００５５】
上で調製した細胞調製物１００μｌに対し、エピルビシンミセル（Epi micelle）（エピルビシン０．１μｇ／ｍｌ含有）、スタウロスポリン封入エピルビシン（STS Epi micelle）（ＳＴＳ  ０．０２μｇ／ｍｌ：エピルビシン０．１μｇ／ｍｌ含有）、エピルビシン（Ｅｐｉ）（０．１μｇ／ｍｌ）、スタウロスポリン（STS）（０．０２μｇ／ｍｌ）、０．０２μｇ／ｍｌスタウロスポリン及び０．１μｇ／ｍｌエピルビシン混合物（STS Epi Mix）を添加する群に分け、さらに０．５ｍｇ／ｍｌのヒトα酸性糖タンパク（ｈＡＧＰ）を添加の影響を調べた（図３Ｂ）。この結果から、スタウロスポリン封入エピルビシンとスタウロスポリン及びエピルビシン混合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効果は同等であることがわかる。また、スタウロスポリンの単独投与は、ｈＡＧＰを添加した場合に、細胞生存率が優位に増加することから、スタウロスポリンは血中タンパク質であるｈＡＧＰと結合することにより活性を失い、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が困難であることがわかる。そして、スタウロスポリンがエピルビシンミセルに封入されることで、ｈＡＧＰの添加による影響がなくなり、血中での不活性化を防止できることが示された。【００５６】
実施例４：薬剤耐性株に対するスタウロスポリン封入エピルビシンミセルによるアポトーシスの誘導
中皮腫（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）細胞、肺癌（Ｈ４６０）細胞、及び乳癌（ＭＣＦ−７）細胞を以下の薬剤：０．２μｇ／ｍｌ  エピルビシン（ナノキャリアー株）、０．５μｇ／ｍｌ  シスプラチン  （シスプラチン注  ヤクルト株）、０．２μｇ／ｍｌ  ペメトレキセド（アリムタ注射用  日本イーライリリー）に対し、所定の濃度で３ヶ月間培養し、各薬剤に対する耐性株を樹立した。耐性があるかどうかは、上記のＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８で元株と、耐性株を比較することによって決定することができ、耐性株であることを確認後に使用した。【００５７】
次に、ヒト中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）及び乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の耐性株を１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌに調製しに対し、エピルビシン（Epi）、スタウロスポリンとエピルビシンの混合物（STS Epi Mix)、エピルビシンミセル(Epi micelle)、スタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi Micelle)を添加した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで単離し、ＰＢＳで洗浄後、１ｍｌ細胞懸濁液に２μｌ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣと１μｇ／ｍｌＤＡＰＩを加えて冷暗所で１５分間培養した。４００μｌのインキュベーション緩衝液を加え、攪拌し、メッシュを通したあと、ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ、ベクトン・ディッキンソン）を用いて解析を行った（図４Ａ〜Ｂ）。次にヒト中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）とその耐性株、並びに乳癌細胞（ＭＣＦ−７）とその耐性株に対し、エピルビシンミセル、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルを、濃度を振って添加し、実施例３と同様の手法により細胞生存率を調べた（図４Ｃ及びＤ）。【００５８】
実施例５  中皮腫皮下モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌性の測定
ヒト中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ株）を雌ヌードマウスに皮下移植して、皮下移植モデルを作成し、薬効評価に用いた。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を培養し、４×１０7  ｃｅｌｌ／ｍｌの１００μｌと等量のマトリゲル（ベクトンディッキンソン）１００μｌを混合し、皮下に２００μｌ混合液（２×１０6ｃｅｌｌ／匹）を移植した。移植の５日後、腫瘍の直径が４〜５ｍｍに達したことを確認し、０日目とした。腫瘍が形成されたマウスに対し、０，４，８，１２日目に、下記の表にしたがって薬剤を尾静注で４回投与した。
【表１】
2016024595.tif 000031
陰性対照には、薬剤の代わりに、ＨＥＰＥＳ溶液を投与した。腫瘍の長径ａ：  短径ｂをノギスで計測し、腫瘍体積（ｍｍ3）をａｂ2／２として週２回測定し、同時に、マウスの体重を計測した（図５Ａ及びＢ）。４６日目に腫瘍を撮影した（図５Ｃ）。【００５９】
実施例６  中皮腫同所モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌性の測定
Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１２  Ａｐｒ；２０（４）：７６９−７７に記載の方法に基づき、ヒト中皮腫ＭＳＴＯ−２１１Ｈにルシフェラーゼをトランスフェクトして、ルシフェラーゼ発現株（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ｌｕｃ）を得た。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ｌｕｃ細胞を、０．２μｇ／ｍｌのエピルビシンを含有する培地で３ヶ月間培養し、エピルビシン耐性ヒト中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ｌｕｃ）細胞を作製した。雌ヌードマウスの胸腔内へ１×１０6ｃｅｌｌのエピルビシン耐性ＭＳＴＯ−２１１Ｈ−ｌｕｃを投与して、同所移植モデルを作成した。投与の５日後、下記の表の用量の薬剤を注射用生理食塩水（大塚製薬）で希釈し、尾静注投与した（５，９，１３，２３，３３，４３，５３，６３日目）。
【表２】
2016024595.tif 000032
陰性対照には、薬剤の代わりに、ＨＥＰＥＳ溶液を投与した。スタウロスポリンは、ＤＭＳＯで５ｍｇ／ｍｌ溶解後、注射用生理食塩水（大塚製薬）で希釈して尾静注した。Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（住商ファーマ）を腹腔内投与し、ＩＶＩＳ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（住商ファーマインターナショナル株式会社）を用いてルシフェラーゼの発光強度を週２回計測し、同時に、マウスの体重を計測した（図６Ａ〜Ｃ）。死亡曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ソフトウエアーを用い、カプラン−マイヤーの方法で検証した（図６Ｄ）。ログランクテストによって、陰性対照とＥｐｉとの間（Ｐ＝０．０１６）、ＥｐｉとＥｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅとの間（Ｐ＝０．０００１）、並びにＥｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅと、ＳＴＳ＋Ｅｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅとの間（Ｐ＝０．００１２）のいずれにおいても有意差が見られた。【００６０】
実施例７  大腸癌皮下モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌性の測定
ヒト大腸癌（ＨＴ２９）の耐性株を１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌに調製しに対し、エピルビシンミセル（Epi micelle）、スタウロスポリン封入エピルビシンミセル(STS Epi Micelle)を３μｇ／ｍｌで添加し、２４時間インキュベートした。陰性対照として５μＭのジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）を添加した。インキュベート後の細胞に対しＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｄｕｒｈａｍ，  ＮＣ，  ＵＳＡ）を用い、ＦＡＣＳ（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ、ベクトン・ディッキンソン）を用いて解析を行った（図７Ａ）。【００６１】
ヒト大腸癌ＨＴ２９を雌ヌードマウスに皮下移植した皮下移植モデルを作成し、薬効を評価した。ＨＴ２９を培養し、１×１０6ｃｅｌｌを、マウス皮下に移植した。２０〜３０日間経過後、１０〜２０ｍｍの大きさになったものを２〜３ｍｍの立方体に細片化した。大きさを揃えた断片を、雌ヌードマウスの皮下に移植した。移植後５日目（直径４〜５ｍｍ）を０日目として、０、４、８日目に下記の表の薬剤を所定の用量で投与した。
【表３】
2016024595.tif 000033
陰性対照には、薬剤の代わりに、ＨＥＰＥＳ溶液を投与した。週２回、腫瘍の長径ａ：  短径ｂをノギスで計測し、腫瘍体積（ｍｍ3）をａｂ2／２として計算し、同時に、マウスの体重を計測した（図７Ａ〜Ｂ）。【００６２】
実施例８  肺癌同所モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌性の測定
ヒト肺癌に対するスタウロスポリンミセルの効果を検証するため、ヒト肺癌Ｈ４６０−ｌｕｃ  シスプラチン耐性癌を雌ヌードマウスの肺へ直接投与して作成した同所移植モデルを用いて薬効を評価した。ルシフェラーゼ発現肺癌Ｈ４６０−ｌｕｃ（ＪＣＲＢ）を１μｇ／ｍｌのシスプラチンを加えた培地で、３ヶ月間培養し、シスプラチン耐性株を取得した。Ｆｕｓｈｉｋｉ  ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ２００９  Ａｕｇ；１００（８）に記載の方法に従い、シスプラチン耐性株を雌ヌードマウスの左肺下葉へ２×１０5ｃｅｌｌ（１０％マトリゲル（ベクトンディッキンソン）含有）のシスプラチン耐性Ｈ４６０−ｌｕｃを移植した。移植の４日後、下記の表の薬剤を所定の用量で注射用生理食塩水（大塚製薬）で希釈し、尾静注投与した（４，１１，１８，２５，３２日目）。
【表４】
2016024595.tif 000034
陰性対照には、薬剤の代わりに、ＨＥＰＥＳ溶液を投与した。スタウロスポリンは、ＤＭＳＯで５ｍｇ／ｍｌ溶解後、注射用生理食塩水（大塚製薬）で希釈して、２００μｌを尾静注した。Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  （住商ファーマ）を腹腔内投与し、ＩＶＩＳ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （住商ファーマインターナショナル株式会社）  を用いてルシフェラーゼの発光強度を週２回計測した（図８Ａ）。２２日目におけるルシフェラーゼ発光を示す外観写真
を図８Ｂに示す。死亡曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ソフトウエアーを用い、カプラン−マイヤーの方法で検証し、ログランクテストによって有意差を検定した。
陰性対照とＥｐｉやＥｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅなど他の群同士では、有意差は見られなかったが、ＳＴＳ＋Ｅｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅに対してのみ陰性対照群と有意差（Ｐ＝０．００５）が見られた。【００６３】
実施例９  腎癌同所モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌性の測定
腎癌に対するスタウロスポリンミセルの効果を検証するため、Ｄｉｎｎｅｙ  ＣＰら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９１  Ｊｕｌ  １５；５１（１４）：３７４１−７に記載される方法を用いて、２×１０4ｃｅｌｌのマウス腎癌由来細胞（Ｒｅｎｃａ）（５０μｌ；１０％マトリゲル含有）をＢａｌｂ／ｃ  マウスの腎皮膜に投与した。腎投与４日後、下記の表の薬剤を所定の用量で注射用生理食塩水（大塚製薬）に希釈し、尾静注投与した（４，１１，１８日目）。
【表５】
2016024595.tif 000035
陰性対照には、薬剤の代わりに、ＨＥＰＥＳ溶液を投与した。スタウロスポリンは、ＤＭＳＯで５ｍｇ／ｍｌ溶解後、注射用生理食塩水（大塚製薬）で希釈して、２００μｌ尾静注した。死亡日数を記録し、死亡曲線は、Ｐｒｉｓｍ  ソフトウエアーを用い、カプラン−マイヤーの方法で検証し、ログランクテストによって有意差を検定した。
陰性対照とＥｐｉとの間（Ｐ＝０．０００１）、ＥｐｉとＥｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅとの間（Ｐ＜０．０００１）、並びにＥｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅと、ＳＴＳ＋Ｅｐｉ  Ｍｉｃｅｌｌｅとの間（Ｐ＝０．００７３）のいずれにおいても有意差が見られた。６０日後、肺転移した腫瘍の腫瘍径を実験動物用３ＤμＣＴ  （Ｒ−ｍＣＴ２ｍ  Ｒｉｇａｋｕ，  Ｊａｐａｎ）で測定、もしくは、死亡した個体の場合、肺を解剖後、直接半径を計測することによって（４／３＊π＊ｒ3）、腫瘍ｖｏｌｕｍｅを計測した。Ｅｐｉ  ｍｉｃｅｌｌｅとＳＴＳ  Ｅｐｉ  ｍｉｃｅｌｌｅの肺転移腫瘍体積において有意差（Ｐ＝０．０４６）が見られた（図９Ａ〜Ｄ）。さらに、癌幹細胞マーカーＣＤ１０５を発現する細胞の数を、フローサイトメーターにより測定した。スタウロスポリン封入エピルビシンミセルにより、CD105を発現する細胞数が減少することが示された（図９E）。【００６４】
実施例１０：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗癌活性の測定
抗癌活性をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ８（ＤＯＪＩＮＤＯ，  ＪＡＰＡＮ）を用い、下記の通り測定した。１〜３×１０3ｃｅｌｌ／ウェルで、グリオーマ細胞株（Ｕ８７−ＭＧ）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、エピルビシン抵抗性乳癌細胞株（ＭＣＦ−７−Ｅｐｉ−Ｒ）をそれぞれ播種し、培養を行った。翌日、培地を交換し、５０μｌの培地を加えた。さらに、エピルビシンミセル又は実施例１で調製したスタウロスポリン封入エピルビシンミセルの希釈系列を作成し、５０μｌの溶液を細胞の入ったウェルに添加し、攪拌した。７２時間後、１０μｌのｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  ８を加え、１時間経過後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，  ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した吸光度を下記の式に適用し、細胞生存率（％）を算出した（図１０Ａ〜Ｃ）。これを種々の被検物質濃度に対してグラフに表し、細胞生存率が５０％になる値をＩＣ50とした。
【数３】
2016024595.tif 000036
式中、
Ａｓ：検体の吸光度（細胞、被検物質及びＣｅｌｌ  ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ溶液の入ったウェル  ）
Ａｃ：陰性対照の吸光度（細胞及びＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ溶液の入ったウェル）
Ａｂ：ブランク吸光度（細胞を含まない培地及びＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  溶液の入ったウェル）
試験した各種薬剤のＩＣ50は、３つの癌細胞に対し、スタウロスポリン封入エピルビシンミセルにおいて有意に低かった。【００６５】
実施例１１：インドロカルバゾール化合物の中皮腫における癌幹細胞に対する効果
２×１０5ｃｅｌｌの中皮腫細胞（ＭＳＴＯ２１１）を播種し、薬剤無し（対照）、１μＭのシスプラチン（Ｙａｋｌｔ  Ｃｏ．  Ｊａｐａｎ）、０．０１μＭのペメトレキセド、０．００１μＭのスタウロスポリン、０．０１μＭのＵＣＮ−１、１μＭのエンザスタウリン）を添加し、７２時間又は２４時間インキュベートした。インキュベート後の細胞に対しＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｄｕｒｈａｍ，  ＮＣ，  ＵＳＡ）を用い、陰性対照として１５μＭのジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）を添加し、ＦＡＣＳ分析にかけ、側方散乱（ＳＳＣ）を縦軸、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性細胞を横軸として表した（図１１Ａ）。下段ではＡＬＤＨの阻害剤であるＤＥＡＢを添加した際のＦＡＣＳの結果が示された。中皮腫に適用があるシスプラチン、ペメトレキセドでは、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性細胞（癌幹細胞）の割合が増加しており、これらの薬剤により、癌細胞が減る一方で、癌幹細胞が残ってしまうことが示された。一方で、スタウロスポリン及びＵＣＮ−０１では、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ陽性細胞が減少し、癌幹細胞に対しても効果を有することが示された。【００６６】
実施例１２：耐性株におけるＡＢＣトランスポーターの発現、並びにスタウロスポリンによるＡＢＣトランスポーターの阻害
耐性株によるＡＢＣトランスポーター（ＭＤＲ−１）の発現
エピルビシン耐性乳癌細胞（ＭＣＦ−７）及びシスプラチン耐性肺癌細胞（Ｈ４６０）において、耐性獲得前と耐性獲得後の培養細胞株に対して、ａｎｔｉ-ＭＤＲ−１−ＰＥ、バイオレジェンド社）を使用して、ＭＤＲ−１を発現する細胞集合をフローサイトメーター(BD LSR II,BD bioscience社) により測定した（図１３Ａ及び図１４Ａ）。耐性獲得により、ＭＤＲ−１を発現する細胞が増加することが示された。【００６７】
耐性株によるエピルビシンの排出及びスタウロスポリンによるエピルビシン排出の抑制
エピルビシン耐性乳癌細胞（ＭＣＦ−７）及びシスプラチン耐性肺癌細胞（Ｈ４６０）をそれぞれ、1x104cells で８well Tek chambered coverglass(Thermo Scientific社)の各ウェルに播種して１晩培養した。０．１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を添加した１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０(フェノールレッド非含有)を２００μｌの培地に置き換えた。次に、下記の薬剤を記載した終濃度になるように加えた。
【表６】
2016024595.tif 000037
薬剤の添加から１時間後に２００μｌのｅＦｌｕｘｘ−ＩＤ−ＧＦＰ溶液を加えた。添加から３０分後、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で置換し、ＬＳＭ７８０  共焦点顕微鏡で観察し、写真を撮影した（図１２Ｂ及び図１３Ｂ）。対照として、同様の操作を耐性獲得前の細胞を用い、薬剤としてエピルビシンを添加して行った。この実験では、エピルビシンとして、蛍光標識されたエピルビシン（販売元）を用いた。耐性獲得前の細胞では、エピルビシンやefluxx-ID-GFPが細胞内に局在する一方で、耐性株では、エピルビシン及びエピルビシンミセルが細胞から排出された。薬剤としてエピルビシンとスタウロスポリンとの混合物や、スタウロスポリン封入エピルビシンを用いた場合には、エピルビシンやefluxx-ID-GFPが共に細胞内に存在しており、ＡＢＣトランスポーターがスタウロスポリンにより阻害されていることが示された。なお、ベラパミルは、ＡＢＣトランスポーターの阻害剤であり、ベラパミルが添加された場合にはEfluxx-ID-GFPが細胞内に局在することが示された。【００６８】
薬剤耐性腫瘍細胞株の薬剤排出活性の抑制
腫瘍細胞株として、（Ａ）エピルビシン耐性中皮腫（ＭＳＴＯ−２１１）細胞、（Ｂ）エピルビシン耐性乳癌（ＭＣＦ−７）細胞、（Ｃ）シスプラチン耐性肺癌（Ｈ４６０）細胞、（Ｄ）ＢＣＲＰ高発現性癌細胞（Ｈｅｌａ細胞）、（Ｅ）ＭＲＰ高発現性癌細胞（Ａ５４９）を用い、eFluxx-ID Green Multidrug Resistance Assay kit(Enzo Life Science社)を用いて薬剤排出活性を調べた（図１４Ａ〜Ｅ）。具体的に、培養された各細胞に対し、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液でインキュベートして剥がし、培地で洗浄後、１ｘ１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度の細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を３７℃で１０分間以上予備加温しておき、２５０μｌの細胞懸濁液(2.5x105 cell)に対して、下記の通り薬剤を記載の終濃度になるように添加した：（Ａ）〜（Ｃ）の細胞株に、ＭＤＲ−１阻害剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌ（３０μＭ）、３０μＭスタウロスポリン（ＳＴＳ）、３０μＭエピルビシンミセル(Epi Micelle)、３０μＭスタウロスポリン封入エピルビシンミセル（ＳＴＳ−Ｅｐｉ micelle）；（Ｄ）の細胞には、ＢＣＲＰ阻害剤であるノボバイシン（４００μＭ）、３０μＭスタウロスポリン（ＳＴＳ）、３０μＭスタウロスポリン封入エピルビシンミセル（ＳＴＳ−Ｅｐｉ micelle）；（Ｅ）の細胞には、ＭＲＰ阻害剤であるＭＫ−５７１（２００μＭ）、３０μＭスタウロスポリン（ＳＴＳ）、３０μＭスタウロスポリン封入エピルビシンミセル（ＳＴＳ−Ｅｐｉ micelle）。薬剤添加から１時間後に１２５μｌのｅＦｌｕｘｘ−ＩＤ−ＧＦＰ溶液を、キットに指示される濃度で加えた。添加後、３７℃で３０分インキュベートし、終濃度０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを加え、フローサイトメーター（）Flow cytometer(BD LSR II,BD bioscience社)で解析した。図示したMAFとは、フローサイトの平均蛍光強度（mean fluorescence intensity）から算出したMultidrug resistance activity factor(MAF)であり、この値が高いほどＡＢＣトランスポーターに対する阻害効果が高いことを示す。計算式は、以下の通りである：
【数４】
2016024595.tif 000038
（Ｆは阻害剤を加えた時のｆｌｏｗｃｙｔｅのｍｅａｎ値  Ｆ０は阻害剤を加えない時のｆｌｏｗｃｙｔｅのｍｅａｎ値）
【図１Ａ−Ｃ】
2016024595.tif 000050
【図１Ｄ−Ｆ】
2016024595.tif 000051
【図１Ｇ】
2016024595.tif 000052
【図２】
2016024595.tif 000053
【図３】
2016024595.tif 000054
【図４】
2016024595.tif 000055
【図５】
2016024595.tif 000056
【図６Ａ−Ｃ】
2016024595.tif 000057
【図６Ｄ】
2016024595.tif 000058
【図７】
2016024595.tif 000059
【図８】
2016024595.tif 000060
【図９】
2016024595.tif 000061
【図１０】
2016024595.tif 000062
【図１１】
2016024595.tif 000063
【図１２】
2016024595.tif 000064
【図１３】
2016024595.tif 000065
【図１４Ａ−Ｃ】
2016024595.tif 000066
【図１４Ｄ−Ｅ】
2016024595.tif 000067
【国際調査報告】
2016024595.tif 000068
2016024595.tif 000069
2016024595.tif 000070
2016024595.tif 000071
2016024595.tif 000072
2016024595.tif 000073