(57)【要約】本発明は、骨粗鬆症の発症原因となる分子を標的とする骨粗鬆症治療又は予防剤の提供、及びそのような治療又は予防剤をスクリーニングする方法の提供を目的とする。  本発明においては、骨粗鬆症の発症原因となる分子としてＨＩＦ１αを同定し、ＨＩＦ１αを分子標的としてＨＩＦ１αを阻害し得る化合物を骨粗鬆症治療剤として提供する。また、ＨＩＦ１αの阻害を指標として骨粗鬆症治療又は予防剤として用い得る化合物のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＦ１αを分子標的としＨＩＦ１αを阻害する骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法であって、治療又は予防候補化合物とＨＩＦ１αをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、ＨＩＦ１αを阻害する化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として選択することを含む、骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項２】
骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、請求項１記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項３】
ＨＩＦ１αの阻害がＨＩＦ１αタンパク質の抑制である、請求項１又は２に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項４】
（ｉ）破骨細胞又は破骨細胞前駆細胞を低酸素条件下で候補化合物存在下で培養し、（ｉｉ）細胞溶解物を得て、細胞溶解物中のＨＩＦ１αを測定することを含み、細胞中のＨＩＦ１αが検出されないときに、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項５】
候補化合物とＨＩＦ１αを接触させ、ＨＩＦ１αが候補化合物により阻害された場合に、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ＨＩＦ１αを分子標的としＨＩＦ１αを阻害する化合物を有効成分として含む、骨粗鬆症の治療又は予防剤。
【請求項７】
骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、請求項６に記載の骨粗鬆症の治療又は予防剤。
【請求項８】
２−メトキシエストラジオールを有効成分として含む、請求項６又は７に記載の骨粗鬆症の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は日本国内で現在１２８０万人もの患者がいると推定されており、また骨粗鬆症を基礎疾患とした大腿骨頸部骨折の患者数も年間で１５万人に上る、極めて罹患患者数の多い疾患である。骨粗鬆症の患者数はさらに年々増加しており、その克服は高齢化社会において喫緊の課題である。
閉経後骨粗鬆症は閉経によるエストロゲン欠乏により発症することは知られているが、なぜエストロゲンが欠乏すると骨粗鬆症を発症するのか、そのメカニズムは知られていない。現在臨床的にはｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＥＲＭ：選択的エストロゲン受容体モジュレーター）という一群の薬剤の中から、生体に適用して実際に骨量の増加に効果があるものを、閉経後骨粗鬆症の治療薬として使用しているが（非特許文献１参照）、その効果のメカニズムも詳細は不明である。また、ＳＥＲＭの適用は、女性に限られ、骨量がかなり低下したあとにしか使用が許可されないという制限があった。
ＳＥＲＭは破骨細胞抑制による骨吸収抑制剤であることはわかっているが、その直接の標的分子は不明であった。
低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ）のサブユニットであるＨｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＨＩＦ１α）は低酸素応答性の分子であり、低酸素条件化では安定化されているが、酸素存在下ではタンパク質分解を受けて不活化される（非特許文献２参照）。ＨＩＦ１αと骨粗鬆症についての関連性については知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂ．Ｅｔｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ，Ａｕｇｕｓｔ  １８，１９９９，Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．７，ｐｐ．６３７−６４５
【非特許文献２】Ａ．Ｊ．Ｍａｊｍｕｎｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ４０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，２０１０，ｐｐ．２９４−３０４
【発明の概要】
【０００４】
エストロゲンが欠乏することによって発症する閉経後骨粗鬆症にはエストロゲンの補充療法が良いと考えられるが、実際には乳癌や子宮体癌、また血栓症の発症を誘発するためエストロゲンそのものを投与することはできない。そこで、骨に対して選択的な作用を示すＳＥＲＭが使用されるが、閉経後骨粗鬆症の発症機構が不明である以上、ＳＥＲＭが実際には何を標的にしているのかも不明である。
本発明は、閉経後骨粗鬆症の発症原因分子を特定し、該発症原因分子を標的とする骨粗鬆症治療剤を提供し、さらに該治療剤のスクリーニング方法の提供を目的とする。
低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ）のサブユニットであるＨｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ（ＨＩＦ１α）は低酸素応答性の分子であり、低酸素条件化では安定化されているが、酸素存在下ではタンパク質分解を受けて不活化される。
本発明者らは、卵巣を切除して作成した擬似閉経モデルマウスにおいて、ＨＩＦ１αの活性が高くなるという現象を確認し、ＨＩＦ１αがホルモンであるエストロゲンにより抑制されて不活化されることを見出した。さらに、破骨細胞で特異的にＨＩＦ１αを欠損させたコンディショナルノックアウトマウスがエストロゲン欠乏状態でも骨粗鬆症を発症しないことを見出した。すなわち、本発明者らは、ＨＩＦ１αが閉経後骨粗鬆症の発症原因分子であることを同定し、また、ＨＩＦ１αがホルモンによる制御を受けることを初めて明らかにした。また、破骨細胞特異的ＨＩＦ１α欠損マウスがエストロゲン欠乏状態でも骨粗鬆症を発症しなかったことから、ＨＩＦ１αが閉経後骨粗鬆症の治療標的となり得ることを見出した。さらに、エストロゲンに加えてテストステロンもＨＩＦ１αを不活化することを見出した。このことは男性骨粗鬆症においてもＨＩＦ１αが治療標的となり得ることを示している。
これらの新たな知見に基づいて、エストロゲンやテストステロン存在下で不活化されていたＨＩＦ１αが、閉経によりエストロゲンやテストステロン欠乏状態になることで活性化状態となり、その結果、骨粗鬆症が発症するという、ＨＩＦ１αと骨粗鬆症の関係を見出し、ＨＩＦ１αを標的とした骨粗鬆症治療又は予防剤の開発に関する本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ＨＩＦ１αを分子標的としＨＩＦ１αを阻害する骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法であって、治療又は予防候補化合物とＨＩＦ１αをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、ＨＩＦ１αを阻害する化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として選択することを含む、骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
［２］  骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、［１］の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
［３］  ＨＩＦ１αの阻害がＨＩＦ１αタンパク質の抑制である、［１］又は［２］の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
［４］  （ｉ）破骨細胞又は破骨細胞前駆細胞を低酸素条件下で候補化合物存在下で培養し、（ｉｉ）細胞溶解物を得て、細胞溶解物中のＨＩＦ１αを測定することを含み、細胞中のＨＩＦ１αが検出されないときに、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、［１］〜［３］のいずれかの骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
［５］  候補化合物とＨＩＦ１αを接触させ、ＨＩＦ１αが候補化合物により阻害された場合に、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、［１］〜［３］のいずれかの骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
［６］  ＨＩＦ１αを分子標的としＨＩＦ１αを阻害する化合物を有効成分として含む、骨粗鬆症の治療又は予防剤。
［７］  骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、［６］の骨粗鬆症の治療又は予防剤。
［８］  ２−メトキシエストラジオールを有効成分として含む、［６］又は［７］の骨粗鬆症の治療又は予防剤。
本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、ＨＩＦ１αを分子標的とし、ＨＩＦ１αを阻害することにより、ＨＩＦ１αによる破骨細胞の活性化を阻害し、骨量の減少を抑制し、骨粗鬆症を治療又は予防し得る。
本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、閉経後の女性の骨粗鬆症のみならず、男性の骨粗鬆症にも効果を有する。
また、現在閉経後の女性の骨粗鬆症の治療に用いられているエストロゲン製剤のような副作用を引き起こすことがない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−２８６０２４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、卵巣摘除偽閉経モデルマウス（ＯＶＸ）におけるＨＩＦ１αの発現を示す図である。
図２は、エストラジオール存在下における破骨細胞前駆細胞株におけるＨＩＦ１αの安定性を示す図である。
図３は、エストロゲン受容体ＥＲαとＨＩＦ１αとの結合を示す図である。
図４は、ＯＶＸ処理又は未処理のＨＩＦ１αコンディショナルノックアウトマウスにおける骨密度解析の結果を示す図である。
図５は、ＯＶＸ処理又は未処理のＨＩＦ１αコンディショナルノックアウトマウスにおける平均全骨密度を示す図である。
図６は、ＨＩＦ１α阻害剤である２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ２）を投与したＯＶＸ処理又は未処理のマウスの骨密度解析の結果を示す図である。
図７は、ラロキシフェン存在下における破骨細胞前駆細胞株におけるＨＩＦ１αの安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の治療又は予防剤が対象とする骨粗鬆症は、閉経後の高齢の女性が発症する閉経後骨粗鬆症だけでなく、男性骨粗鬆症も含む。すなわち、エストロゲン分泌量の低下が原因となり発症する閉経後骨粗鬆症、及びテストステロン分泌量の低下が原因となり発症する高齢男性の骨粗鬆症を対象とする。現在、骨粗鬆症の治療剤として広く用いられている骨のエストロゲン受容体に選択的に作用する選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）は女性にしか適用されないが、本発明の治療又は予防剤は男性の骨粗鬆症の治療又は予防のためにも適用され得る。
本発明の治療又は予防剤は破骨細胞及び破骨細胞前駆細胞のＨＩＦ１α（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）を分子標的とする。ＨＩＦ１αは、転写因子であるＨＩＦ１のサブユニットであり、本発明の検討で、破骨細胞を活性化させ、骨の減少を引き起こすことが見出された。また、ＨＩＦ１αは、エストロゲン受容体、テストステロン受容体、ビタミンＤ受容体等の核内受容体と結合し得る。ＨＩＦ１αは、破骨細胞内で、これらの受容体と結合するとエストロゲンやテストステロン依存的に抑制される。ＨＩＦ１αが酸素存在下でユビキチン・プロテアソーム系を介して分解されることは知られていたが、エストロゲンやテストステロン等のホルモンにより制御を受け、安定化したり不安定化していることは本発明の検討において初めて見出された。閉経後の女性や高齢男性でエストロゲンやテストステロン等の性ホルモンの分泌が低下すると、骨内でＨＩＦ１αが安定化され分解されなくなる。ＨＩＦ１αは、破骨細胞を活性化させ、骨の減少を引き起こし、その結果、骨粗鬆症が発症する。従って、ＨＩＦ１αを分子標的とし、ＨＩＦ１αを阻害することにより、破骨細胞の活性化を阻害し骨の減少を抑制することができる。エストロゲンの分泌が低下した閉経後の高齢女性やテストステロンの分泌が低下した高齢男性において、ＨＩＦ１αを阻害することにより、骨の減少を抑制し、骨粗鬆症を治療又は予防することができる。ここで、ＨＩＦ１αの阻害とは、ＨＩＦ１αを分解し消失させること、あるいはＨＩＦ１αの活性を低下させ、発現を抑制させることをいう。ＨＩＦ１αを阻害することをＨＩＦ１αを不安定化することともいう。本発明においては、ＨＩＦ１αを阻害する化合物をＨＩＦ１α阻害剤と呼ぶ。
ＨＩＦ１αは転写因子であるＨＩＦ１のサブユニットであり、エストロゲン受容体、テストステロン受容体、ビタミンＤ受容体等の核内受容体と結合し得る。また、ＨＩＦ１αは破骨細胞を活性化させる。ＨＩＦ１αの活性の低下は、上記の核内受容体との結合活性、転写因子活性、破骨細胞の活性化する活性の低下として確認することができる。
ＨＩＦ１α阻害剤としては、例えば、２−メトキシエストラジオール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ；２ＭＥ２）が挙げられる。
本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、閉経後女性の骨粗鬆症の治療に広く用いられているエストロゲン製剤のような副作用の発現がない。すなわち、本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、生殖器における出血、乳房痛、乳癌や子宮体癌の発症率の上昇等の副作用を引き起こすことなく安全に骨粗鬆症の治療又は予防に用いることができる。
本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、ＨＩＦ１α阻害剤を有効成分として含み、さらに薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、結合剤等を含んでいてもよい。担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等が挙げられる。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明の骨粗鬆症の治療又は予防剤は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。該薬剤は、局所投与することも可能である。また、リポソーム等に封入した形態で投与してもよい。
有効成分の投与量は、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、毎日か数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇを経口、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射等によって投与すればよい。
さらに、本発明はＨＩＦ１αを分子標的として、ＨＩＦ１αを阻害し得る、骨粗鬆症治療又は予防剤のスクリーニング方法を包含する。従来、ある候補化合物が骨粗鬆症の治療又は予防剤として有効か否かは、骨粗鬆症モデル動物等に候補化合物を投与し、実際に骨の減少を抑制する効果があるかをｉｎ  ｖｉｖｏで検定する必要があった。このため、多数の候補化合物を評価することは難しく、また効果があるか否かを判定するのにも時間がかかっていた。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で候補化合物の評価を行うため、多数の候補化合物を検定することができ、また、短時間で効果の有無の判定を行うことができる。
該スクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＦ１αと候補化合物を接触させ、ＨＩＦ１αが阻害されるか否かを検出することを含む。すなわち、本発明のスクリーニング方法においては、ＨＩＦ１αを阻害を指標として、骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする。
ＨＩＦ１αの阻害はＨＩＦ１αが抑制され消失若しくは量が減少したか否かを測定し、あるいは、ＨＩＦ１αの活性が低下したか否か、又はＨＩＦ１αの活性がどの程度低下するかを測定すればよい。ＨＩＦ１αの抑制や量の減少は、ＨＩＦ１αと候補化合物を接触させたサンプル中のＨＩＦ１αの量の変化を公知の方法で測定することによりできる。例えば、抗ＨＩＦ１α抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等でサンプル中のＨＩＦ１αを測定すればよい。また、ＨＩＦ１αは、エストロゲン受容体、テストステロン受容体、ビタミンＤ受容体等の核内受容体と結合するため、これらの受容体タンパク質を用いた免疫沈降法によってもＨＩＦ１αを測定することができる。
例えば、破骨細胞や破骨細胞前駆細胞を低酸素条件で候補化合物存在下で培養した後に、細胞におけるＨＩＦ１αを測定することにより行うことができる。破骨細胞前駆細胞としては、株化細胞を用いることができ、破骨細胞前駆細胞株として、ＲＡＷ２６４．７細胞等が挙げられる。培養に用いる培地は公知のものを用いればよい。低酸素条件での培養は、酸素濃度１０％以下、好ましくは５％での培養をいう。培養した細胞を溶解させ、溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中のＨＩＦ１αを測定すればよい。候補化合物の非存在下でＨＩＦ１αが検出され、候補化合物の存在下でＨＩＦ１αが検出されない場合、該候補化合物はＨＩＦ１αを阻害し得る化合物であり骨粗鬆症の治療又は予防に用い得る化合物であると判断することができる。この際、通常酸素濃度（２１％）で培養したもの及び候補化合物を添加しないで培養したものをコントロールとして用いればよい。
また、ＨＩＦ１αと候補化合物を直接混合接触させて一定時間インキュベートしてもよい。候補化合物とＨＩＦ１αとの接触によりＨＩＦ１αが分解された場合、該候補化合物はＨＩＦ１αを阻害し得る化合物であり骨粗鬆症の治療又は予防に用い得る化合物であると判断することができる。
本発明は、このようにして得られた化合物を有効成分として含む骨粗鬆症の治療又は予防剤も包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
１．免疫染色によるＨＩＦ１αの評価
卵巣摘除（ＯＶＸ）マウス及び偽手術（Ｓｈａｍ）マウス（Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６）作製後５週でピモニダゾール（Ｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｒｏｂｅ）を腹腔内投与した後に骨を採取し、パラフィン包埋した。免疫染色はパラフィン包埋切片に対して実施した。切片はキシレン及び濃度系列エタノールに順次浸漬することで脱パラフィン処理を行い、水和処理を行って免疫染色に供した。水和した切片を０．４ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫにて処理し、抗原賦活化処理を行った。その後５％ウシ血清アルブミン溶液にてブロッキングを行い、ブロッキング溶液で希釈した抗体（抗ＨＩＦ１α抗体、抗Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ抗体）及びピモニダゾールに対する抗体で、４℃にて終夜反応させた。抗体溶液を洗浄除去し、特異抗体を作製した宿主動物の抗体に対する、蛍光色素標識二次抗体を反応させた後、核染色を行い（ＴＯＴＯ３）、褪色防止剤と共に封入し観察に供した。
結果を図１に示す。図１ａは、ＨＩＦ１α（左パネル）及びＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  （Ｃｔｓｋ）の発現（中央パネル）、並びにイマージしたもの（右パネル）を示し、図１ｂは、低酸素プローブ（Ｈｙｐｏｘｉｐｒｏｂｅ）による染色（左パネル）及びＣｔｓｋの発現（中央パネル）、並びにイマージしたもの（右パネル）を示す。
図１ａに示すように、Ｓｈａｍ（偽手術）に比してＯＶＸ（卵巣摘除偽閉経モデル）ではＨＩＦ１αが強く発現していた。また、破骨細胞のマーカーであるＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ（Ｃｔｓｋ）の発現も強かった。また、図１ａ及び図１ｂに示すように、ＨＩＦ１αがＯＶＸで強く発現しているが、低酸素プローブで染色しても染色性はＯＶＸで上がらない。
この結果は、低酸素応答性の分子であるＨＩＦ１αが酸素条件以外で制御されることを示唆している。
２．ウエスタンブロットによるＨＩＦ１αの評価
マウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ社）に１０％非働化ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び１％ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したもので、３７℃、５％  ＣＯ２下にて継代維持し実験に用いた。エストロゲン等のホルモン処理を行う場合には、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）に１０％活性炭処理ウシ胎児血清、１％  ＧｌｕｔａＭａｘ及び抗生物質を添加したもので培養を行った。低酸素培養は、３７℃、５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２下にて行った。
破骨細胞前駆細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を通常酸素濃度（２１％＝ｈｙｐｏｘｉａ−）と低酸素濃度（５％＝ｈｙｐｏｘｉａ＋）条件下で、エストロゲン（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ＝Ｅ２）のあるなしで培養し、タンパク質を含む細胞溶解物を回収した。ウエスタンブロットを行いＨＩＦ１αを評価した。
蛋白質解析は、細胞を界面活性剤にて可溶化し、得られた細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離展開後、ウエスタンブロットにより行った。細胞抽出液は、培地を除去した細胞に対して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸ナトリウム、１００μＭ  ＭＧ１３２、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を添加して回収、かくはんし氷上に３０分間静置後、１５０００回転、４℃、１５分間遠心分離した上清として調製した。細胞抽出液は色素結合法により蛋白質濃度定量を行い、細胞試料間で等量の総蛋白質を解析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ法に基づく定法にて行い、細胞抽出液はジチオスレイトール存在下に加熱処理した後に用いた。泳動後、蛋白質を分離ゲルよりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へ転写し、１％スキムミルク溶液にてブロッキングを行なった後、ブロッキング溶液で希釈したＨＩＦ１αに対する特異抗体と反応させた。さらに特異抗体を作製した宿主動物の抗体に対する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体を反応させた後、ＨＲＰの発光基質と反応させ検出を行った。
図２にウエスタンブロットの結果を示す。図２に示すように、ＨＩＦ１αはＥ２を添加しない低酸素条件下で安定化し、ウエスタンブロットで同定できた。一方、Ｅ２存在下ではＨＩＦ１αは消失した。
３．免疫沈降によるＨＩＦ１αとＥＲαとの直接結合評価
破骨細胞前駆細胞株Ｒａｗ２６４．７細胞の溶解物をエストロゲン受容体であるＥＲαで免疫沈降し、ＨＩＦ１αでウエスタンブロットを行った。
破骨細胞前駆細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞をエストロゲン（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ＝Ｅ２）のあるなしで培養し、タンパク質を含む細胞溶解物を回収した。蛋白質解析は、細胞を界面活性剤にて可溶化し、得られた細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離展開後、ウエスタンブロットにより行った。細胞抽出液は、培地を除去した細胞に対して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸ナトリウム、１００μＭ  ＭＧ１３２、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を添加して回収、かくはんし氷上に３０分間静置後、１５０００回転、４℃、１５分間遠心分離した上清として調製した。細胞抽出液は色素結合法により蛋白質濃度定量を行い、細胞試料間で等量の総蛋白質を解析に供した。細胞抽出液はさらにＥＲαに対する特異的抗体を吸着させたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇに吸着カラムでＥＲαを含む複合体を回収し、ウエスタンブロットと同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ法に基づく定法にて行い、細胞抽出液はジチオスレイトール存在下に加熱処理した後に用いた。泳動後、蛋白質を分離ゲルよりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へ転写し、１％スキムミルク溶液にてブロッキングを行なった後、ブロッキング溶液で希釈したＨＩＦ１αに対する特異抗体と反応させた。さらに特異抗体を作製した宿主動物の抗体に対する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体を反応させた後、ＨＲＰの発光基質と反応させ検出を行った。
図３に結果を示す。図３に示すように、Ｅ２非存在下でＨＩＦ１αとＥＲαとの直接結合が確認できた。一方、Ｅ２存在下ではＨＩＦ１α自体が消失し、ＨＩＦ１αとＥＲαの結合は確認できなかった。
４．ＨＩＦ１αコンディショナルノックアウトマウスのＯＶＸに対する耐性の検討
ＨＩＦ１αのＣｔｓｋ  Ｃｒｅを用いた破骨細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスを作成した。
ＨＩＦ１αコンディショナルノックアウトマウスはＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋの遺伝子ローカスにＣｒｅをノックインしたマウス（Ｃｔｓｋ  Ｃｒｅ）とＨＩＦ１αのゲノムのエクソン２の両端にＬｏｘＰを挿入したマウスを交配して作製した。
図４に、それぞれのマウスの大腿骨全長の２０点でＤＥＸＡ法で骨密度解析を行った結果を示し、図５に全骨密度の平均値を示す。図４ａは、ＨＩＦ１α遺伝子がノックアウトされていないコントロールマウスの結果を示し、図４ｂはＨＩＦ１αを破骨細胞特異的にコンディショナルノックアウトしたマウスの結果を示す。また、図５においては、左がコントロールマウスの結果を示し、右がＨＩＦ１αを破骨細胞特異的にコンディショナルノックアウトしたマウスの結果を示す。コントロールであるＨＩＦ１αｆｌ／ｆｌマウスでは、ＯＶＸにより骨量が減少した。一方、ＣｔｓｋＣｒｅ／＋ＨＩＦ１αｆｌ／ｆｌマウスにおいては、コントロールであるＨＩＦ１αｆｌ／ｆｌと異なり、ＯＶＸにより骨量は減少しなかった。すなわち、ＨＩＦ１αが安定に存在している場合に骨量が減少した。
一連の検討の結果は、ＨＩＦ１αがエストロゲン欠乏状態で起こる骨量減少に必須の役割を担うことを示す。
５．ＨＩＦ１α阻害剤２ＭＥ２がエストロゲン欠乏による骨粗鬆症の治療剤になり得るかについての検討
ＯＶＸ（■あるいは●）又はＳｈａｍ（□あるいは○）を施行したマウスに溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）又は２−メトキシエストラジオール（Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ（２ＭＥ２））を投与し、骨密度をＤＥＸＡ法で測定した。
２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ（２ＭＥ２）投与は、Ｏｖｘ及びＳｈａｍマウスに対し施術直後より実施した。２ＭＥ２投与液は０．５％メチルセルロース懸濁液として無菌的に調製し、投与開始から終了まで同一調製液を用いた。投与は１日１回とし、４週間連日、７５ｍｇ／ｋｇを経口ゾンデを用いて胃内投与により行った。
図６は、マウスの大腿骨全長の２０点でＤＥＸＡ法で骨密度解析を行った結果を示す。図６に示すように、ＨＩＦ１α阻害剤である２ＭＥ２を投与するとＯＶＸしたマウスの骨密度は維持されるか、あるいはやや増加した。一方、溶媒を投与したマウスでは、ＯＶＸしたマウスで骨密度の減少が認められた。
６．ウエスタンブロットによるＨＩＦ１αの評価（ラロキシフェンによるＨＩＦ１αの阻害）
マウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｓｉｇｍａ社）に１０％非働化ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び１％  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したもので、３７℃、５％  ＣＯ２下にて継代維持し実験に用いた。エストロゲン等のホルモン処理を行う場合には、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）に１０％活性炭処理ウシ胎児血清、１％  ＧｌｕｔａＭａｘ及び抗生物質を添加したもので培養を行った。低酸素培養は、３７℃、５％  ＣＯ２、５％  Ｏ２下にて行った。
破骨細胞前駆細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞を通常酸素濃度（２１％＝Ｎｏｒｍｏｘｉａ）と低酸素濃度（５％＝Ｈｙｐｏｘｉａ）条件下で、選択的エストロゲン受容体モジュレーターの１つであるラロキシフェン（ＣＡＳ登録番号：８４４４９−９０−１）の存在下で培養し、タンパク質を含む細胞溶解物を回収した。ウエスタンブロットを行いＨＩＦ１αを評価した。
蛋白質解析は、細胞を界面活性剤にて可溶化し、得られた細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離展開後、ウエスタンブロットにより行った。細胞抽出液は、培地を除去した細胞に対して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１００μＭ  ＭＧ１３２、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶液を添加して回収、かくはんし氷上に３０分間静置後、１５０００回転、４℃、１５分間遠心分離した上清として調製した。細胞抽出液は色素結合法により蛋白質濃度定量を行い、細胞試料間で等量の総蛋白質を解析に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ法に基づく定法にて行い、細胞抽出液はジチオスレイトール存在下に加熱処理した後に用いた。泳動後、蛋白質を分離ゲルよりポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜へ転写し、１％スキムミルク溶液にてブロッキングを行なった後、ブロッキング溶液で希釈したＨＩＦ１αに対する特異抗体と反応させた。さらに特異抗体を作製した宿主動物の抗体に対する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体を反応させた後、ＨＲＰの発光基質と反応させ検出を行った。
図７にウエスタンブロットの結果を示す。Ｖｉｎｃｕｌｉｎはコントロールとして発現を見ている。同時に上記３．で用いたエストロゲン（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ＝Ｅ２）も用いた。図７に示すように、Ｅ２の場合と同様、ラロキシフェン存在下ではＨＩＦ１αは消失した。
この結果は、本発明の方法で、骨粗鬆症治療薬としての薬効が知られている化合物がスクリーニングできることを示す。
なおラロキシフェンは、Ｅ２と多くの共通の薬理作用を示すことが知られている（日本産科婦人科学会雑誌，５６（２），５３７，２００４、日本内分泌学会雑誌，８０（１），１３８，２００４など）。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
骨のＨＩＦ１α（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）を分子標的とする化合物は新しい骨粗鬆症の治療又は予防剤として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図４】
2014104406.tif 000002
【図５】
2014104406.tif 000003
【図６】
2014104406.tif 000004
【図１】
2014104406.tif 000005
【図２】
2014104406.tif 000006
【図３】
2014104406.tif 000007
【図７】
2014104406.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月17日(2014.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
ＨＩＦ１αタンパク質に接触しＨＩＦ１αを分解する骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法であって、治療又は予防候補化合物とＨＩＦ１αをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、ＨＩＦ１αを分解する化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として選択することを含む、骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、請求項９記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
（ｉ）破骨細胞又は破骨細胞前駆細胞を低酸素条件下で候補化合物存在下で培養し、（ｉｉ）細胞溶解物を得て、細胞溶解物中のＨＩＦ１αを測定することを含み、細胞中のＨＩＦ１αが検出されないときに、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項９又は１０に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
候補化合物とＨＩＦ１αを接触させ、ＨＩＦ１αが候補化合物と接触し分解された場合に、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項９又は１０に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
ＨＩＦ１αを分子標的としＨＩＦ１αを阻害する骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法であって、治療又は予防候補化合物とＨＩＦ１αをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、ＨＩＦ１αを阻害する化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として選択することを含む、骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
骨粗鬆症が閉経後の女性の骨粗鬆症又は男性骨粗鬆症である、請求項１３記載の骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
ＨＩＦ１αの阻害がＨＩＦ１αタンパク質の抑制である、請求項１３又は１４に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
（ｉ）破骨細胞又は破骨細胞前駆細胞を低酸素条件下で候補化合物存在下で培養し、（ｉｉ）細胞溶解物を得て、細胞溶解物中のＨＩＦ１αを測定することを含み、細胞中のＨＩＦ１αが検出されないときに、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
候補化合物とＨＩＦ１αを接触させ、ＨＩＦ１αが候補化合物により阻害された場合に、前記候補化合物を骨粗鬆症治療又は予防剤として用いることができると判断する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の骨粗鬆症治療又は予防剤（ただし、ｓｉＲＮＡを除く）をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
２−メトキシエストラジオールを有効成分として含む、ＨＩＦ１α阻害剤。
【国際調査報告】
2014104406.tif 000009
2014104406.tif 000010
2014104406.tif 000011
2014104406.tif 000012
2014104406.tif 000013
2014104406.tif 000014
2014104406.tif 000015