(57)【要約】  従来技術と比較してより生体内環境に近い条件下において、正確に癌細胞の浸潤挙動を評価するために、３次元的な環境であり、かつ複数種の細胞が共存する新規細胞培養系を構築する。そのため、ハイドロゲルによって構成され、ファイバー状、あるいは、シート状の形態を有し、長さ方向の軸に対して垂直な平面における断面Ｓの内部において、周縁部が断面Ｓの周縁部に接しておらず、かつ、第一の細胞が存在する、領域Ａを有し、さらに、領域Ａは、断面Ｓにおける領域Ａ以外の領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている、細胞評価用ハイドロゲル基材を用いる。
2014126228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルによって構成され、  ファイバー状又はシート状の形態を有し、  長さ方向の軸に対して垂直な平面における断面Ｓの内部において、周縁部が前記断面Ｓの周縁部に接しておらずかつ第一の細胞が存在する領域Ａを有し、  さらに前記領域Ａは、前記断面Ｓにおける前記領域Ａ以外の領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２】
前記ハイドロゲル基材は、前記断面Ｓにおいて部分的に前記領域Ａ及び前記領域Ｂに接し、かつ、部分的に前記断面Ｓの周縁部に接する領域Ｃを有し、  さらに前記領域Ｃは、前記領域Ｂと比較して弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３】
領域Ｂには、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞が存在する請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項４】
前記領域Ｃには、前記第二の細胞が存在する請求項２に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項５】
前記領域Ａ、前記領域Ｂ及び領域Ｃを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかは、アルギン酸又はアルギン酸の誘導体によって構成されている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項６】
前記領域Ａ及び前記領域Ｃを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかには、アルギン酸プロピレングリコールが含まれている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項７】
前記領域Ａ、前記領域Ｂ及び領域Ｃを構成するハイドロゲルのマトリックス中には、細胞外マトリックスを構成するタンパク質及び細胞接着性のペプチド分子の少なくともいずれかが含まれている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項８】
前記第一の細胞とは、癌細胞である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項９】
前記第二の細胞とは、癌細胞以外の細胞である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１０】
前記第二の細胞とは、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、実質細胞、腺細胞、表皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、これらの細胞の前駆細胞、各種幹細胞より分化させた細胞の少なくともいずれかである請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１１】
前記領域Ａの面積は、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、１０Ｄ２以下である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１２】
前記領域Ａの面積をＳとし、前記領域Ａの周囲長をＬとすると、前記領域Ａの円形度４πＳ／Ｌ２は０．５以上である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１３】
前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、領域Ｃの幅は３Ｄ以下である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１４】
直径５００マイクロメートル以下のファイバー状である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１５】
厚さ５００マイクロメートル以下のシート状であり、前記断面Ｓの内部において、前記領域Ａは複数個所存在する請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１６】
前記領域Ａに含まれる、前記第一の細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１０万個以上である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１７】
前記領域Ｂ及び前記領域Ｃに含まれる、前記第二の細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１００万個以上である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１８】
少なくとも２つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧２）と、前記入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、前記入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、前記合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、前記合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口Ｉ２を介して、それぞれ連続的に導入し、  前記流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を接触させ、さらに前記流路構造Ｘの内部乃至外部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、  前記第一の水溶液及び前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、  また、前記領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１９】
少なくとも３つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧３）と、前記入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、前記入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、前記合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、前記合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口Ｉ２を介して、さらに、アルギン酸ナトリウムを含む第三の水溶液を、前記入口Ｉ３を介して、それぞれ連続的に導入し、  前記流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、前記第三の水溶液を接触させ、  さらに、前記流路構造Ｘの内部又は外部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記第三の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、  また、前記領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、さらに、前記領域Ｃは前記第三の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２０】
前記第二の水溶液及び前記第三の水溶液の少なくともいずれかには、前記第二の細胞が懸濁されている請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２１】
前記流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｇ１〜Ｇｎ（ｎ≧１）および、前記入口Ｇ１〜Ｇｎにそれぞれ接続し合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する入口流路ＣＧ１〜ＣＧｎを有しており、前記入口Ｇ１〜Ｇｎを介して前記ゲル化剤水溶液は流路構造Ｘに連続的に導入される請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２２】
前記流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｂ１〜Ｂｎ（ｎ≧１）および、前記入口Ｂ１〜Ｂｎにそれぞれ接続し合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する入口流路ＣＢ１〜ＣＢｎを有しており、前記入口Ｂ１〜Ｂｎを介して、バッファー水溶液は流路構造Ｘに連続的に導入される請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２３】
前記合流点Ｐ１〜Ｐｍのうち少なくとも一つの合流点において、前記第一の水溶液は、その上下左右の少なくともいずれかにおいて前記第二の水溶液と接触する請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２４】
前記流路構造Ｘは、少なくとも部分的に、キャピラリー状の管によって構成されている請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２５】
前記流路構造Ｘは、少なくとも部分的に、微細加工技術を用いて作製されたマイクロ流路構造によって構成されている請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２６】
前記流路構造Ｘは、その幅、深さ、直径の値のうち少なくともいずれか一つが、少なくとも部分的に１ミリメートル以下である請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２７】
前記第一の水溶液、前記第二の水溶液及び前記第三の水溶液の少なくともいずれかに含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以下である請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２８】
前記第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、１００ｍＬあたり１ｇ以上である請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２９】
前記ゲル化剤水溶液は、塩化バリウムを含む請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３０】
前記ゲル化剤水溶液乃至前記バッファー水溶液は、増粘剤を含む請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３１】
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液は、アルギン酸プロピレングリコールを含む請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３２】
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液に含まれる前記アルギン酸プロピレングリコールの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以上である請求項３１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３３】
請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材を用いる細胞評価手法。
【請求項３４】
前記ハイドロゲル基材内部に包埋した細胞に対し、培養操作を行い、前記第一の細胞が前記ハイドロゲル基材の内部を浸潤しゲル外部にまで達する個数あるいは割合を、計測することによって、細胞の浸潤を定量的に評価する請求項３３に記載の細胞評価手法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞評価用ハイドロゲル基材および細胞評価手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対して効果および選択性が高く、また副作用の少ない抗癌剤を開発するためには、膨大な数の新薬候補の中から、有用なものを絞り込むためのスクリーニング操作が必要であり、現在、実験動物を用いた薬効評価を行う前段階として、培養した癌細胞を用いた薬剤アッセイが行われている。  【０００３】
癌細胞に対し抗癌剤がどの程度作用するかについて評価を行う場合に、癌細胞の浸潤および転移を定量的に評価することが重要である。  【０００４】
現在、癌細胞の浸潤挙動や転移を解明するためには、マルチウェルプレート等を利用した通常の平面培養のほか、直径数ミクロンの穴の開いたメンブレンを組み込んだマルチウェルプレートを利用した培養手法も利用されており、細胞の生存率あるいは浸潤度に対する、抗癌剤の半数阻害濃度（ＩＣ５０）の測定などが行われている。  【０００５】
また、平面における単独培養と比較して、生体内における癌細胞の挙動を、より忠実に生体外において再現するための細胞培養システムに関する研究も盛んに行われている。例として、特許文献１に示されるように、３次元的なハイドロゲルの内部の一定の位置に癌細胞を包埋し、ゲル中における癌細胞の挙動を評価するシステムが提案されており、立体的な環境における浸潤評価や薬効試験が可能となっている。  【０００６】
また、非特許文献１に示されるように、平面上での培養ではあるものの、癌細胞と他の細胞を共培養するシステムも提案されている。このシステムでは、中央にバルブを有するチャンバー内に、ヒト子宮頸癌細胞およびヒト血管内皮細胞を播種することで、２次元的な環境下において共培養を行っており、複数種の細胞が存在する生体組織に近い環境における癌細胞の挙動の観察が可能となる。  【０００７】
さらにまた、非特許文献２に示されるように、腫瘍組織内部の低酸素領域が腫瘍の悪性度に関わる様々な遺伝子を発現していることに着目し、癌細胞の球状の凝集体（スフェロイド）を構築し、３次元的な低酸素領域を再現する手法も提案されている。格子状の凹凸構造を底面に有する培養プレート上に様々な種類の癌細胞を播種し、培養することで、均一な大きさの球状の細胞凝集体（スフェロイド）を構築し、生体内の腫瘍内部にしばしば見られる低酸素領域が再現されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１１０２７２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２０１２、８４、２０８８−２０９３．
【非特許文献２】「バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２０１１、３２、６０５２−６０５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、マルチウェルプレートを用いた通常の薬剤アッセイでは、平面的な培養基材上に播種した癌細胞が用いられているため、３次元的かつ複数種の細胞が高密度で存在する生体内組織の環境を再現できているとは言い難く、抗癌剤の効果を、生理学的環境と同様の条件下で正確に評価することは不可能である。そのため、より生体に近い細胞培養環境において細胞評価を行うシステムや手法の開発が必要とされている。  【００１１】
また、特許文献１、あるいは非特許文献２に示される技術を用いた場合、３次元的な空間において癌細胞の浸潤評価を行うという意味において、生体環境と一部類似する環境を再現しているものの、癌細胞と正常細胞が相互作用を及ぼしあっている生体内の腫瘍とは大きく異なるため、抗癌剤の薬効を正確に評価することは不可能となる、という問題点がある。  【００１２】
また、非特許文献１に示される技術を用いた場合、複数種の細胞が存在するという意味において生体内の環境と類似するものの、２次元平面的な細胞培養系であるため、生体内の３次元的な腫瘍組織との相関が得られない、という問題点がある。  【００１３】
つまり、生体内環境により近い条件下において癌細胞の挙動を評価するためには、これらの技術の利点を兼ね備えた、（１）３次元的な環境下において、（２）複数種の細胞を共培養する、システムを構築することが望ましいが、このような条件を満たすシステムはこれまでに開発されていない。  【００１４】
さらに、癌細胞の浸潤度合いを評価する上で、癌細胞の初期位置を一定に制御できれば、癌細胞の浸潤を定量的かつ正確に評価する上で非常に有利であるが、マイクロメートルの正確さで、３次元的な培養環境の内部に細胞を配置する手法も、これまでにほとんど開発されていない。  【００１５】
本発明は、従来の技術の有する上記したような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、従来技術と比較してより生理的環境に近い条件下において、正確に癌細胞の浸潤挙動を評価するために、３次元的な環境であり、かつ複数種の細胞が共存する新規細胞培養系を構築しようとするものである。  【００１６】
また本発明は、癌細胞の初期位置を一定の範囲に制限することによって、非常に簡便かつ正確に、癌細胞浸潤の定量評価を行うことを可能とする、新規細胞培養系を提供しようとするものである。  【００１７】
さらに本発明は、作製した新規細胞培養基材を利用することによって、簡便かつ正確に、生体内の環境と類似した環境において、癌細胞の浸潤評価を可能とする、新規細胞評価手法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するための、本発明の一観点に係る発明は、ハイドロゲルによって構成され、ファイバー状、あるいは、シート状の形態を有し、長さ方向の軸に対して垂直な平面における断面Ｓの内部において、周縁部が断面Ｓの周縁部に接しておらず、かつ、第一の細胞が存在する、領域Ａを有し、さらに、領域Ａは、断面Ｓにおける領域Ａ以外の領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている、細胞評価用ハイドロゲル基材である。このような基材を用いることによって、３次元的なファイバー状またはシート状のハイドロゲル基材の内部の特定の位置に、癌細胞などの、評価対象となる第一の細胞を配置することが可能となり、また、第一の細胞が浸潤し増殖する領域および方向を、内部の一定の領域のみに制限することが可能となり、正確な浸潤挙動評価を行うことが可能となる。  【００１９】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記ハイドロゲル基材は、断面Ｓにおいて、部分的に領域Ａおよび領域Ｂに接し、かつ、部分的に断面Ｓの周縁部に接する、領域Ｃを有し、さらに、領域Ｃは、領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されていることが望ましい。このようにすることによって、ハイドロゲル基材中に内包した、評価対象となる第一の細胞の浸潤する方向を、領域Ａから領域Ｃを通じてハイドロゲル基材の外側方向へと制御することが可能となり、より正確かつ簡便に、領域Ａに包埋した第一の細胞の浸潤挙動評価を行うことが可能となる。  【００２０】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ｂには、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞が存在することが望ましい。このようにすることによって、たとえば第一の細胞として癌細胞の存在する領域Ａの周囲に、癌細胞以外の細胞が存在し、癌細胞と相互作用を及ぼしあう環境において、癌細胞がハイドロゲル基材の外部に向かって浸潤する状況を再現することができるため、癌細胞の浸潤挙動を正確かつ簡便に評価することが可能となる。  【００２１】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ｃには、前記第二の細胞が存在することが望ましい。このようにすることによって、癌細胞の浸潤方向である領域に、癌細胞以外の細胞が存在する状況を再現することができるため、癌細胞の浸潤挙動を正確かつ簡便に評価することが可能となる。  【００２２】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａ、領域Ｂ、および領域Ｃを構成するハイドロゲルは、アルギン酸、あるいは、アルギン酸の誘導体によって構成されていることが好ましい。このようにすることによって、容易に成型しやすく、生体適合性に優れ、細胞の生存を維持しながら細胞を包埋でき、機械的強度が高く、細胞培養液中において比較的長期にわたって安定な、ハイドロゲル基材を利用することが可能となる。  【００２３】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａおよび領域Ｃを構成するハイドロゲルには、アルギン酸プロピレングリコールが含まれていることが好ましい。このようにすることによって、弾性率の低い、領域Ａおよび領域Ｃを構成することが可能となり、第一の細胞が領域Ａから領域Ｃを通過してハイドロゲル基材の外へとより効率的に浸潤することが可能となる。  【００２４】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａ乃至領域Ｃを構成するハイドロゲルのマトリックス中には、細胞外マトリックスを構成するタンパク質、あるいは、細胞接着性のペプチド分子の少なくともいずれかが含まれていることが好ましい。このようにすることによって、コラーゲン等のマトリックス成分が含まれる生体環境をより高度に模倣した環境における細胞の浸潤挙動の評価が可能となるほか、細胞のマトリックスへの接着性が向上し、細胞の浸潤が促進され、評価にかかる時間を大幅に短縮することが可能となる。  【００２５】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第一の細胞とは、癌細胞であることが好ましい。このようにすることによって、癌細胞の浸潤を評価するためのハイドロゲル基材の提供が可能となる。  【００２６】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第二の細胞とは、癌細胞以外の細胞であることが好ましい。このようにすることによって、癌細胞と正常細胞が存在し相互作用を及ぼしあう生体環境と同様の環境における、癌細胞の浸潤挙動の評価が可能となる。  【００２７】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第二の細胞とは、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、実質細胞、腺細胞、表皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、これらの細胞の前駆細胞、各種幹細胞より分化させた細胞、の少なくともいずれかであることが好ましい。このようにすることによって、これらの細胞と癌細胞が相互作用を及ぼしあう生体環境と同様の環境における、癌細胞の浸潤挙動の評価が可能となる。  【００２８】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａの面積は、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、１０Ｄ２以下であることが好ましい。このようにすることによって、領域Ａに包埋する第一の細胞の初期位置を、一定の範囲に制限することが可能となるため、その浸潤挙動をより正確かつ簡便に評価することが可能となる。  【００２９】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａの面積をＳとし、領域Ａの周囲長をＬとすると、領域Ａの円形度４πＳ／Ｌ２は０．５以上であることが好ましい。このようにすることによって、領域Ａに包埋する第一の細胞の初期位置を、断面における一定の範囲に制限することが可能となるため、その浸潤挙動をより正確かつ簡便に評価することが可能となる。  【００３０】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、領域Ｃの幅は３Ｄ以下であることが好ましい。このようにすることによって、癌細胞が外部へと浸潤する際に通過する領域Ｃの幅を制限することができるため、より効率的かつ迅速な癌細胞の浸潤評価が可能となる。  【００３１】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、ハイドロゲル基材は、直径５００マイクロメートル以下のファイバー状であることが好ましい。こ
のようにすることによって、酸素あるいは栄養分の不足による内部に包埋した細胞の壊死を防ぐことが可能となるほか、癌細胞がハイドロゲル基材の外部へと浸潤するために必要となる時間を短縮することが可能となる。  【００３２】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、ハイドロゲル基材は、厚さ５００マイクロメートル以下のシート状であり、断面Ｓの内部において、領域Ａは複数個所存在していてもよい。このようにすることによって、ファイバー状のハイドロゲル基材の場合と同様に、細胞の壊死を防ぎ、癌細胞の浸潤時間を短縮することが可能となるほか、第一の細胞が存在する領域Ａを複数個所設けることによって、評価対象となる細胞を並列的に配置した、より高密度な細胞評価系の構築も可能となる。  【００３３】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ａに含まれる、前記第一の細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１０万個以上であることが好ましい。このようにすることによって、内部に高密度に癌細胞を包埋したハイドロゲル基材の利用が可能となり、より効率的に癌細胞の浸潤挙動を評価することが可能となる。  【００３４】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ｂ乃至領域Ｃに含まれる、前記第二の細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１００万個以上であることが好ましい。このようにすることによって、内部に正常細胞を高密度に包埋したハイドロゲル基材の利用が可能となり、より生体環境に近い状況における癌細胞の浸潤挙動評価が可能となる。  【００３５】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、ハイドロゲル基材は、少なくとも２つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧２）と、入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、入口Ｉ２を介して、それぞれ連続的に導入し、流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を接触させ、さらに流路構造Ｘの内部乃至外部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、また、領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものであることが望ましい。このようにすることによって、組成の異なる複数の部分によって構成された断面パターンを有し、包埋した細胞の位置が正確に制御され、細胞を生きたまま包埋可能な、ファイバー状あるいはシート状のハイドロゲル基材を、簡便かつ連続的に作製することが可能となる。  【００３６】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、ハイドロゲル基材は、少なくとも３つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧３）と、入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、入口Ｉ２を介して、さらに、アルギン酸ナトリウムを含む第三の水溶液を、入口Ｉ３を介して、それぞれ連続的に導入し、流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、前記第三の水溶液を接触させ、さらに流路構造Ｘの内部乃至外部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記第三の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、また、領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、さらに、領域Ｃは前記第三の水溶液がゲル化することによって形成されたものであってもよい。このようにすることによって、断面が組成の異なる少なくとも３つの領域によって構成される、ハイドロゲル基材を利用することが可能となる。  【００３７】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第二の水溶液乃至前記第三の水溶液には、前記第二の細胞が懸濁されていることが好ましい。このようにすることによって、前記第二の細胞が領域Ｂ乃至領域Ｃに包埋されたハイドロゲル基材を作製することが可能となる。  【００３８】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｇ１〜Ｇｎ（ｎ≧１）および、入口Ｇ１〜Ｇｎにそれぞれ接続し、合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する、入口流路ＣＧ１〜ＣＧｎを有しており、入口Ｇ１〜Ｇｎを介して、前記ゲル化剤水溶液は流路構造Ｘに連続的に導入されることが好ましい。このようにすることによって、流路構造内部においてゲル化した、より径あるいは厚みの均一なハイドロゲル基材を利用することが可能となる。  【００３９】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｂ１〜Ｂｎ（ｎ≧１）および、入口Ｂ１〜Ｂｎにそれぞれ接続し、合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する、入口流路ＣＢ１〜ＣＢｎを有しており、入口Ｂ１〜Ｂｎを介して、バッファー水溶液は流路構造Ｘに連続的に導入されることが好ましい。このようにすることによって、より一層径あるいは厚みの均一な、ハイドロゲル基材を利用することが可能となる。  【００４０】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、合流点Ｐ１〜Ｐｍのうち少なくとも一つの合流点において、前記第一の水溶液は、その上下左右の少なくともいずれかおいて前記第二の水溶液と接触することが好ましい。このようにすることによって、断面が複数の領域によって構成されたハイドロゲル基材をより簡便に形成することが可能となる。  【００４１】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、流路構造Ｘは、少なくとも部分的にキャピラリー状の管によって構成されていてもよい。このようにすることによって、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記第三の水溶液を、キャピラリー管を通して接触させ、その後ゲル化させることによって、効率的に作製されたハイドロゲル基材を利用することが可能となるほか、任意の位置に並列的に配置されたキャピラリー管や多重管を利用することによって、任意の断面形状を有するハイドロゲル基材を簡便に作製することが可能となる。  【００４２】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、流路構造Ｘは、少なくとも部分的に、微細加工技術を用いて作製されたマイクロ流路構造によって構成されても良い。このようにすることによって、任意の断面形状を有する、直径あるいは厚さ１ミリメートル以下のハイドロゲル基材を、正確かつ簡便に作製することが可能となる。  【００４３】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、流路構造Ｘは、その幅、深さ、直径等の値のうち少なくともいずれか一つが、少なくとも部分的に１ミリメートル以下であることが好ましい。このようにすることで、直径１００〜５００マイクロメートル程度のハイドロゲル材料を正確かつ簡便に作製することが可能となる。  【００４４】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以下であることが好ましい。このようにすることによって、領域Ａおよび領域Ｃの弾性率が低いハイドロゲル基材を、簡便かつ正確に作製することが可能となる。  【００４５】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、１００ｍＬあたり１ｇ以上であることが好ましい。このようにすることによって、領域Ｂの弾性率が高いハイドロゲル基材を、簡便かつ正確に作製することが可能となる。  【００４６】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記ゲル化剤水溶液は、塩化バリウムを含むことが好ましい。このようにすることによって、ゲル化剤としてカルシウムイオンのみを含むハイドロゲル基材と比較して、リン酸塩等を含む培養液中に浸した際のハイドロゲル基材の膨潤が抑制されるため、包埋した細胞密度を高く保つことが可能となる。  【００４７】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記ゲル化剤水溶液乃至前記バッファー水溶液は、増粘剤を含むことが好ましい。このようにすることによって、流路内に形成した層流の流れを安定化することが可能となり、径あるいは厚みの均一なハイドロゲル材料の作製および利用が可能となる。  【００４８】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液は、アルギン酸プロピレングリコールを含むことが好ましい。このようにすることによって、断面が弾性率の異なる複数の部分からなるハイドロゲル基材を、簡便かつ正確に作製することが可能となる。  【００４９】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液に含まれるアルギン酸プロピレングリコールの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以上であることが好ましい。このようにすることによって、領域Ａおよび領域Ｃの弾性率が十分に低いハイドロゲル基材の作製と利用が可能となる。  【００５０】
また、本発明の他の一観点に係る発明は、請求項１乃至３２のいずれか一項に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材を用いる、細胞評価手法である。このような評価法は、複数種の細胞を、３次元的なハイドロゲルのマトリックス中に位置を制御して配置できるため、これまでに利用されている平面的な培養基材を用いた細胞浸潤評価法などと比較して、より生体内の環境に近い条件における細胞の評価が可能となる。  【００５１】
また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、前記ハイドロゲル基材内部に包埋した細胞に対し、培養操作を行い、前記第一の細胞が前記ハイドロゲル基材の内部を浸潤しゲル外部にまで達する個数あるいは割合を、計測することによって、細胞の浸潤を定量的に評価することが好ましい。このようにすることによって、ハイドロゲル基材の内部を浸潤し、外部へと増殖した細胞の割合を、簡便、迅速、かつ正確に定量することが可能となるため、癌細胞等の細胞の浸潤挙動を評価する上で、非常に効果的である。
【発明の効果】
【００５２】
本発明は、以上に述べられたように構成されているため、癌細胞の浸潤評価を行う上で有用な、癌細胞が断面内部の任意の位置に配置され、その周囲が他の細胞によって取り囲まれた、ファイバー状あるいはシート状のハイドロゲル基材の利用が可能となる。そして、ハイドロゲル基材中の細胞に対し培養操作を行うことによって、既存の細胞培養手法では不可能であった、３次元的に密接した状態における癌細胞と癌細胞以外の細胞の培養操作が可能となる。  【００５３】
また本発明は、以上に述べられたように構成されているため、ハイドロゲル基材中に包埋した癌細胞の初期位置を一定の範囲内に制御することが可能となるほか、ハイドロゲル基材の断面に設けられた弾性率の低い軟化部分や、内部に導入された細胞外マトリックス成分を利用することによって、癌細胞の浸潤を促進することが可能と
なる。そのため、既存の手法やシステムと比較して、癌細胞の浸潤挙動をより再現性高く、正確に、簡便に、かつ効率的に評価することが可能となる。  【００５４】
さらに本発明は、以上に述べられたように構成されているため、微細な流路構造を利用して正確かつ簡便に作製されたシート状あるいはファイバー状のハイドロゲル基材を利用することが可能となる。そのため、ハイドロゲル基材を作製する際に、包埋される細胞の位置を制御するための複雑な装置や機構を必要としない、という優れた効果を発揮する。  【００５５】
さらに本発明は、以上に述べられたように構成されているため、包埋される細胞の位置が正確に制御されたハイドロゲル基材を利用した、生体内により近い環境における細胞の浸潤挙動を評価するための、正確かつ簡便な手法の提供が可能となる。そのため、たとえば培養時に、必要に応じて抗癌剤等の薬剤を培養液に添加することで、生体内環境に近い状態における薬剤アッセイを行うことが可能となるほか、癌細胞研究のためのモデルとしての利用が可能となり、創薬分野において、あるいは細胞生理学の研究において有用な、新規手法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施形態に係る、ファイバー状の細胞評価用ハイドロゲル基材の一例を示した概略図であり、図１（ａ）はファイバー状のハイドロゲルの一部分を立体的に示した概略図であり、図１（ｂ）は細胞評価用ハイドロゲル基材の図１（ａ）における平面ｂにおける断面Ｓを示した概略図であり、図１（ｃ）は細胞評価用ハイドロゲル基材の平面ｃにおける断面図である。
【図２】実施形態に係る、２種類の細胞を包埋した細胞評価用ハイドロゲル基材における、培養操作前後の細胞の様子を模式的に示した概略図であり、図２（ａ）は、培養前後における、ハイドロゲル基材の断面を立体的に示した模式図であり、図２（ｂ）は、培養前後における、ハイドロゲル基材の、長さ方向の軸と直行する平面における断面を示した模式図である。
【図３】実施形態に係る、ファイバー状あるいはシート状のハイドロゲル基材例を示した概略図であり、図３（ａ）は、断面が円形であり、かつ領域Ａおよび領域Ｂからなるハイドロゲルファイバーの概略図であり、図３（ｂ）は、断面が矩形であり、かつ領域Ａ、領域Ｂ、および領域Ｃからなるハイドロゲルファイバーの概略図であり、図３（ｃ）は、一定の厚みを有し、複数の領域Ａおよび領域Ｃ、および領域Ｂからなる、ハイドロゲルシートの概略図である。
【図４】実施形態に係る、流路構造を利用した、細胞評価用ハイドロゲル基材を作製する様子を示した模式図であり、図４（ａ）は、平面的に形成された流路構造Ｘを状面から観察した様子、および、その内部における溶液および細胞の流れの様子を模式的に示した概略図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）におけるＡ−Ａ’線における流路構造Ｘの断面を示した模式図であり、図４（ｃ）は、図４（ａ）におけるＢ−Ｂ’線における流路構造Ｘの断面を示した模式図である。
【図５】実施形態に係る、シート状の細胞評価用ハイドロゲル基材を作製するための、並列に配置されたキャピラリー管によって一部が構成された流路構造Ｘにおける、キャピラリー管の部分を模式的に示した概略図であり、図中の数字１、２、３は、それぞれ、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液を吐出する出口である。
【図６】実施例において、ファイバー状の細胞評価用ハイドロゲル基材を作製するために利用した、４枚のアクリル板を重ね合わせて作製された流路構造Ｘを有するマイクロ流体デバイスを示した概略図であり、図６（ａ）〜図６（ｄ）は、それぞれ、上から一層目のアクリル板の下面に形成された流路構造、二層目のアクリル板の下面に形成された流路構造、三層目のアクリル板の上面に形成された流路構造、三層目の流路構造の下面に形成された流路構造を、それぞれ示した概略図であるとともに、図６（ｆ）および図６（ｇ）におけるマイクロ流体デバイスのＣ矢視図であり、図６（ｅ）は、図６（ｄ）における領域ｅの拡大図であるとともに、図６（ｆ）および図６（ｇ）におけるマイクロ流体デバイスのＣ矢視図であり、図６（ｆ）および図６（ｇ）は、それぞれ、マイクロ流体デバイスの、図６（ａ）〜図６（ｅ）における、Ａ−Ａ’線、Ｂ−Ｂ’線における断面図である。
【図７】実施例において、図６に示される流路構造を用いて作製した、断面が領域Ａ、Ｂ、Ｃからなるファイバー状のハイドロゲル基材中の、細胞培養前後における様子を示した顕微鏡写真であり、図７（ａ）は、領域Ａに癌細胞を包埋したハイドロゲル基材の、作製直後の顕微鏡写真であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）に示したハイドロゲル基材の、細胞培養１週間後の顕微鏡写真であり、図７（ｃ）は、領域Ａに癌細胞を包埋し、領域Ｂおよび領域Ｃに繊維芽細胞を包埋したハイドロゲル基材の、作製直後の顕微鏡写真であり、図７（ｄ）は、図７（ｃ）に示したハイドロゲル基材の、細胞培養１週間後の顕微鏡写真である。
【図８】実施例において、シスプラチン濃度を０．１〜１００μＭの間で変化させた際の癌細胞の浸潤割合について、図６に示される流路構造を用いて作製したハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した場合および共培養せずに癌細胞を単独で培養した際のそれぞれの条件におけるデータを示したグラフであり、縦軸の浸潤割合比とは、抗癌剤を投与せずに培養した条件においてファイバー外部へと浸潤した細胞数に対する、各抗癌剤濃度条件においてファイバー外部へと浸潤した細胞数の相対的な割合を示している。
【図９】実施例において、図６に示される流路構造を用いて作製した、断面が領域Ａ、Ｂ、Ｃからなるファイバー状ハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した癌細胞、および、平面培養した癌細胞に対し、シスプラチンを投与した際の、癌細胞特異的な遺伝子発現を定量評価した結果を示したグラフであり、図９（ａ）はＨＩＦ−１ａ（低酸素誘導因子）、図９（ｂ）はＭＭＰ２（マトリックスメタロプロテアーゼ）、図９（ｃ）はＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の遺伝子発現をそれぞれ定量した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下、本発明に係る細胞評価用ハイドロゲル基材および細胞評価方法の最良の形態を詳細に説明するものとする。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものではない。  【００５８】
図１には、ファイバー状の細胞評価用ハイドロゲル基材の一例を示した概略図が示されており、図１（ａ）はファイバー状のハイドロゲルの一部分を立体的に示した概略図であり、図１（ｂ）は細胞評価用ハイドロゲル基材の図１（ａ）における平面ｂにおける断面Ｓを示した概略図であり、図１（ｃ）は細胞評価用ハイドロゲル基材の平面ｃにおける断面図である。なお、本図において、内部に包埋した細胞は描かれていない。  【００５９】
図１に示すハイドロゲル基材は、弾性率が相対的に低いハイドロゲルによって構成された領域Ａおよび領域Ｃと、弾性率が相対的に高いハイドロゲルによって構成された領域Ｂによって構成されている。  【００６０】
図１に示すハイドロゲル基材は、アルギン酸を主成分とする高分子によって形成されている。アルギン酸は、たとえばカルシウムやバリウムといった、多価のカチオンの存在下において、迅速にゲル化し、また、ゲル化時、ゾル化時、あるいは溶解時に、温度制御を行う必要がないため、細胞の生存および機能を維持しながら細胞をハイドロゲル基材中に包埋する上で、都合が良い。なお、アルギン酸以外にも、天然あるいは合成の高分子を利用して形成されたハイドロゲル基材を用いることも可能であり、たとえば、ポリエチレングリコールジアクリレートの重合によって形成された高分子や、ポリアクリルアミド、アガロース、コラーゲン、架橋ゼラチンなどを用いることも可能である。さらに、これらの高分子のうち複数種を用いて形成されたハイドロゲル基材を用いることも可能である。  【００６１】
なお、アルギン酸を用いて形成されたハイドロゲル基材の場合には、領域Ａおよび領域Ｃを構成するハイドロゲル基材中に、アルギン酸プロピレングリコールが含まれていることが好ましい。アルギン酸プロピレングリコールは、アルギン酸のエステル誘導体であり、多価のカチオンの存在下でもゲル化しにくいという特性をもつ。そのため、アルギン酸プロピレングリコールを、アルギン酸に対し一定量添加することによって、ハイドロゲル基材の作製時に、ゲル化時に生じるアルギン酸の収縮防ぎ、かつ、領域Ａおよび領域Ｃの弾性率を効率的に低下させることが可能である。  【００６２】
図２には、２種類の細胞を包埋した細胞評価用ハイドロゲル基材における、培養操作前後の細胞の様子を模式的に示した概略図が示されており、図２（ａ）は、培養前後における、ハイドロゲル基材の断面を立体的に示した模式図であり、図２（ｂ）は、培養前後における、ハイドロゲル基材の、長さ方向の軸と直行する平面における断面を示した模式図である。  【００６３】
図２に示すように、ハイドロゲルの中心部付近に位置する領域Ａに包埋した、評価対象となる第一の細胞は、培養操作を行うことによって、ハイドロゲル基材の外側方向へと移動および／あるいは増殖し、浸潤する。なおこの際、ハイドロゲル基材における領域Ａは、ハイドロゲル基材の断面Ｓの周縁部に接触していなければ良いため、中心部付近に位置していなくても構わない。  【００６４】
領域Ａの内部に包埋する第一の細胞として、癌細胞を用いることで、癌細胞の浸潤評価を行うことが可能であり、たとえば、新規抗癌剤の探索のためのスクリーニングや薬効評価、あるいは癌細胞の生理学的解析を行うことが可能となる。癌細胞としては、各種培養細胞株を用いることができるほか、必要に応じてプライマリの細胞を用いることも可能である。また、癌細胞に限らず、各種幹細胞や増殖能の高い正常細胞を用いることで、それらの評価を行うことも可能である。  【００６５】
なお、ハイドロゲル基材における領域Ｂおよび領域Ｃに、第二の細胞を包埋せずとも、第一の細胞を単独で培養することで、３次元的な環境におけるその浸潤挙動の評価を行うことが可能である。しかしながら、領域Ｂおよび領域Ｃに第二の細胞を包埋することによって、より生体の組織を模倣した環境における癌細胞の浸潤評価を行うことが可能となる。  【００６６】
第二の細胞としては、各種培養細胞やプライマリ細胞などの、任意の細胞を用いることが可能である。しかし、対象となる癌細胞に応じて、その種類を適切に選択することが好ましい。第二の細胞の例としては、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、実質細胞、腺細胞、表皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、これらの細胞の前駆細胞、各種幹細胞より分化させた細胞等を用いることが可能である。  【００６７】
また、ハイドロゲル基材を構成するマトリックス中に、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞外マトリックス分子や、マトリゲル等の細胞外マトリックス混合物などを添加することが可能であり、また、ハイドロゲルを構成する主成分として、細胞接着性のＲＧＤ等のペプチドが共有結合したアルギン酸等を用いることもできる。このようにすることで、細胞接着性のマトリックスが豊富に存在する生体内の環境をより高度に模倣できるほか、特に領域ＡおよびＣにこれらの成分を導入することによって、癌細胞のマトリックスへの接着を高め、浸潤速度を増加し、さらに、浸潤に必要な時間を短縮することが可能となる。  【００６８】
ハイドロゲル基材の全体の大きさは、癌細胞の浸潤評価を行うことができる範囲であれば、どの程度であっても構わない。しかし、外部に出てきた細胞の割合を計測することによってその浸潤度合いを評価する場合には、ハイドロゲル基材の直径あるいは厚みは、値がある程度小さい方が好ましい。ただし、酸素欠乏の度合いを測定する際には、領域Ｂに包埋された第二の細胞によって、中心部に位置する癌細胞に対し酸素の供給が不足する欠乏する程度の値である
ことが好ましい場合もありうる。これらの観点から、ハイドロゲルの直径は、５０マイクロメートル以上５００マイクロメートル以下であることが好ましく、５０マイクロメートル以上３００マイクロメートル以下であることがより好ましい。  【００６９】
なお、ハイドロゲル基材は、その長さ方向において、部分的に径あるいは厚みが不均一であっても良く、また、断面における領域Ａ、領域Ｂ、および領域に変化が生じていても良く、また、途中に分岐を有するような形態であっても良く、さらには、各領域の化学的組成が異なっていても良い。しかし、断面およびそれを構成する領域の形状および組成が均一なハイドロゲル基材は、包埋した細胞の培養時の諸条件を均一にできるという観点から、より好ましい。  【００７０】
ハイドロゲル基材の長さは、用途に応じて、適切な長さとすることが好ましい。ただし、信頼性の高い評価実験を行うためには、評価対象となる第一の細胞が、１００個以上存在することが好ましく、３００個以上存在することがより好ましい。このような観点から、ハイドロゲル基材の長さは、１ミリメートル以上であることが好ましく、１０ミリメートル以上であることがより好ましい。  【００７１】
断面Ｓにおける領域Ａの面積は、包埋した第一の細胞の初期位置を一定に制限するという観点から、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、１０Ｄ２以下であることが好ましい。  【００７２】
また、領域Ａ内に包埋した第一の細胞が存在する位置の違いによって、培養条件の違いが生じさせることを防ぐという観点から、断面Ｓにおける領域Ａの相対的な位置は、断面Ｓの周縁部から比較的均一な距離にあることが望ましい。そのため、領域Ａの面積をＳとし、領域Ａの周囲長をＬとすると、領域Ａの円形度４πＳ／Ｌ２は０．５以上であることが好ましい。  【００７３】
また、領域Ｃの幅が細胞の平均直径と近い値となることによって、細胞の浸潤方向が一定方向に制御される効率が高まるため、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると、領域Ｃの幅は３Ｄ以下であることが好ましい。  【００７４】
領域Ａに包埋する第一の細胞の密度は、その値があまりに低すぎる場合には、細胞の評価を行う効率が下がる。そのため、その密度は高いほうが好ましく、ハイドロゲル基材１立方センチメートル当たり１０万個以上であることが好ましい。ただし、密度があまりに高すぎると、長さ方向において隣り合う細胞同士が互いに接着して一つのコロニーを形成してしまうため、一定の値以下であることも必要となる。この場合の一定の値とは、たとえば、ハイドロゲル基材１立方センチメートル当たり１０００万個であり、あるいは、隣り合う細胞間の平均距離が、１００マイクロメートル以下となるような密度である。  【００７５】
領域Ｂ乃至領域Ｃに包埋する第二の細胞の密度は、細胞が高密度にパッキングされた生体組織を模倣するという観点から、高いほうが好ましく、ハイドロゲル基材１立方センチメートル当たり１００万個以上であることが好ましい。第二の細胞に関しては、長さ方向において隣り合う細胞同士が互いに接着して一つのコロニーを形成しても構わない。  【００７６】
図２に示すように、適切な培養操作を行うことによって、癌細胞が外部へと浸潤する。その後、必要に応じて３次元的な培養環境における癌細胞の浸潤度合いを定量的に評価することで、細胞の評価を行うことが可能となる。浸潤度合いの定量化のための最も簡便な手段は、顕微鏡などを用いて、外部へと浸潤した細胞を観察し、その割合を単純に計測することである。また、それ以外にも、染色などによる生存率の評価、画像解析技術を利用したハイドロゲルマトリックス中の浸潤度合いの定量、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の定量、などを、独立に、あるいは同時に行うことも可能である。  【００７７】
細胞の培養操作としては、作製したハイドロゲル基材を培養液中に浸して、制御された温度、酸素濃度、炭酸ガス濃度条件下において保持することが好ましい。培養操作において用いる培養液としては、対象とする細胞種に応じた一般的な細胞培養用培養液を用いることができる。また、培養時には、ハイドロゲル基材を、シャーレやフラスコ等に満たした培養液中に浸し、ＣＯ２インキュベーター等の培養装置を用いて培養することが好ましい。さらに、必要に応じて振盪操作を行うことも可能である。  【００７８】
また、たとえば薬剤が細胞の浸潤に与える影響を評価する際には、薬剤を培養液中に添加して培養を行うことで、培養液中の薬剤濃度と浸潤度合いの定量的評価を、簡便に行うことが可能である。また、ハイドロゲル基材を一定時間、薬剤を含む溶液中に浸漬した後に、薬剤を含まない培養液中で培養することによって、一定の時間、薬剤を作用させ、その影響を評価することも可能である。  【００７９】
なお、ハイドロゲル基材としては、図１および図２に概略図を例示したもの以外にも、様々な形状のものを用いることが可能である。  【００８０】
図３には、ファイバー状あるいはシート状のハイドロゲル基材例を示した概略図が示されており、図３（ａ）は、断面が円形であり、かつ領域Ａおよび領域Ｂからなるハイドロゲルファイバーの概略図であり、図３（ｂ）は、断面が矩形であり、かつ領域Ａ、領域Ｂ、および領域Ｃからなるハイドロゲルファイバーの概略図であり、図３（ｃ）は、一定の厚みを有し、複数の領域Ａおよび領域Ｃ、および領域Ｂからなる、ハイドロゲシートの概略図である。  【００８１】
図３（ａ）のようなハイドロゲル基材を用いることで、領域Ａに包埋した第一の細胞が、ハイドロゲル基材の外側ではなく、領域Ａ内部を、ハイドロゲル基材の長さ方向に浸潤する様子を観察することが可能となる。また、図１に示したような、領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃの３つの領域からなるハイドロゲル基材の場合、図３（ｂ）に示すように、断面が矩形であっても良く、さらに、図３（ｃ）に示すように、シート状のハイドロゲル基材であって、その内部に、第一の細胞を含む領域Ａを複数有するものであっても良い。特に、図３（ｃ）に示すシート状のハイドロゲル基材の場合は、平面的な形態の中に、評価対象となる第一の細胞を高密度かつ高効率に包埋することが可能となり、細胞の評価をより効率的に行うことが可能となる。  【００８２】
これらのハイドロゲル基材を作製するプロセスとして、マイクロ流路構造を用いるものは非常に効率的である。  【００８３】
図４には、流路構造を利用した、細胞評価用ハイドロゲル基材を作製する様子を示した模式図が示されており、図４（ａ）は、平面的に形成された流路構造Ｘを状面から観察した様子、および、その内部における溶液および細胞の流れの様子を模式的に示した概略図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）におけるＡ−Ａ’線における流路構造Ｘの断面を示した模式図であり、図４（ｃ）は、図４（ａ）におけるＢ−Ｂ’線における流路構造Ｘの断面を示した模式図である。  【００８４】
図４に示す流路構造Ｘは、８つの入口Ｉ１、Ｉ２、Ｉ２’、Ｉ３、Ｂ１、Ｂ１’、Ｇ１、Ｇ１’にそれぞれ接続される入口流路ＣＩ１、ＣＩ２、ＣＩ２’、ＣＩ３、ＣＢ１、ＣＢ１’、ＣＧ１、ＣＧ１’と、入口流路が段階的に合流する合流点Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と、合流点Ｐ４と出口Ｏの間に存在する合流流路Ｇ、を有している。  【００８５】
なお、図４に示すような平面的に構成された流路構造を作製する場合、デバイスの材質としては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属、などを用いることができ、また、これらの材料のうちの任意の複数種類の基板を組み合わせて用いることも可能である。ただし、平面的な流路を安価に作製するためには、少なくとも部分的にポリマー材料を用いることが好ましい。また、流路構造の加工技術としては、モールディングやエンボッシングといった鋳型を利用した作製技術は、流路構造を容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能である。  【００８６】
図４に示した流路構造は、作製対象とするハイドロゲル基材の大きさに応じて、適切な内径、幅、深さとなるように設計する必要がある。ただし、直径あるいは厚みが５００マイクロメートル以下のハイドロゲル基材を効率的に作製するためには、流路構造の径、深さ、あるいは幅等のいずれかの値は、１ミリメートル以下であることが好ましく、５００マイクロメートル以下であることがより好ましい。  【００８７】
図４に示した流路構造Ｘに対し、ハイドロゲルを構成するためのゾル水溶液であり、かつ細胞を懸濁させた、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液を、それぞれ入口Ｉ１、入口Ｉ２およびＩ２’、入口Ｉ３を通して連続的に導入する。また、ゲル化剤水溶液を入口Ｇ１および入口Ｇ１’から、バッファー水溶液を入口Ｂ１および入口Ｂ１’から、それぞれ連続的に導入する。  【００８８】
合流点Ｐ４おいて、導入流量を適切に調節することによって、第一の水溶液、第二の水溶液、および第三の水溶液は、それぞれが接した状態において層流を形成する。そして、その下流における合流流路Ｇにおいて、外側からゲル化剤が拡散してくることによって、これらの水溶液は次第にゲル化し、出口Ｏより、連続的にファイバー状のハイドロゲル基材が形成される。  【００８９】
入口流路構造の立体的配置、分岐点Ｐ１およびＰ２における流路の３次元的構造、および各導入流量等を工夫することによって、流路途中において、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液が、任意の配置となるようにすることが可能であり、その配置を保ったままこれらの溶液をゲル化させることによって、そのパターンを保持したハイドロゲル基材を得ることが可能である。たとえば、合流流路Ｇにおいて、図４（ｂ）に示すような断面パターンを形成することによって、図１および図２に示すようなハイドロゲル基材を作製することが可能となる。  【００９０】
ゲル化剤水溶液に含まれるゲル化剤としては、アルギン酸をゲル化することのできる多価の金属カチオンであれば、任意のものを用いることが可能である。しかしながら、細胞毒性の観点から、それらのイオンはカルシウム、ストロンチウム、バリウム、マグネシウムうちのいずれかの２価カチオン、あるいはそれらの任意の混合物であることが好ましい。また、これらのイオンは水溶性である必要があるため、ゲル化剤水溶液は、それらの塩化物を溶解した水溶液であることが好ましい。中でも、作製したハイドロゲル材料の培養液中での膨潤を抑制し、ハイドロゲル基材中の細胞密度を高く保つ、という観点から、ゲル化剤水溶液は塩化バリウムを含むことがより好ましい。なお、細胞へのダメージを低減するためにも、ゲル化剤水溶液の浸透圧はあらかじめ最適な値に調節されていることが望ましい。  【００９１】
なお、図４に示した流路構造Ｘは、その内部においてゲル化を行うものであるため、流路途中から、ゲル化剤水溶液を導入できるように設計されており、また、アルギン酸の急速なゲル化による流路の閉塞を防ぐために、ゲル化剤を含まないバッファー水溶液を導入できるように設計されている。しかしながら、これらの水溶液を導入せず、入口Ｂ１、Ｂ２’、Ｇ１、Ｇ１’を閉鎖し、出口Ｏをゲル化剤溶液に浸しておくことで、流路外においてゲルを形成しても良い。ただし、得られるファイバー状のハイドロゲル基材の径を正確に調節しやすい、という観点から、このように流路内部においてゲル化を行う系は好ましい。  【００９２】
また、アルギン酸ナトリウムを含む水溶液は一般的に高粘度であるため、ゲル化剤水溶液および／あるいはバッファー水溶液には、予め増粘剤が添加されていることが好ましい。なお、増粘剤としては、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリメチルセルロース、アルギン酸プロピレングリコール、あるいはそれらのうちの任意の組み合わせを用いることが可能である。これらの増粘剤をゲル化剤水溶液やバッファー水溶液に添加すること
によって、図４に示すように流路内でゲル化を行う際に、層流を安定的に形成することが可能となり、ハイドロゲル材料の作製時の操作性を向上させることが可能である。なお、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液、ゲル化剤水溶液、バッファー水溶液のうち、室温において、粘度の最小のものと最大のものの粘度の比が、１：１〜１：１００の範囲にあることが好ましく、１：１〜１：１０の範囲にあることがより好ましい。なお、流路外においてゲル化を行う場合には、この限りではない。  【００９３】
なお、図４に示した平面的な流路構造以外にも、キャピラリー管を並列化あるいは多重化させたような流路構造を用いることも可能である。  【００９４】
図５には、シート状の細胞評価用ハイドロゲル基材を作製するための、並列に配置されたキャピラリー管によって一部が構成された流路構造Ｘにおける、キャピラリー管の部分を模式的に示した概略図が示されており、図中の数字１、２、３は、それぞれ、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液を吐出する出口である。このような並列化キャピラリー構造を用いて、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液を合流させ、その後連続的にゲル化剤水溶液中へと吐出することによって、図３（ｄ）に示すような、シート状のハイドロゲル構造を作製することも可能である。  【００９５】
なお、以上のような流路構造に導入する、第一の水溶液、第二の水溶液、および第三の水溶液に含まれるアルギン酸は、ナトリウム塩のものを用いることが一般的である。アルギン酸としては、多価のカチオンの存在下でハイドロゲルを形成するものであれば、どのような分子量のものを用いても良い。しかしながら、ハイドロゲル作製時の操作性の観点から、水１００ｍＬにアルギン酸１ｇを溶解し室温に保った場合の粘度が、１０ｃＰ〜４００ｃＰの範囲にあるものが好ましい。また、作製されたゲルの強度が一定以上であれば、作製したハイドロゲル材料を培養液中に浸した際の膨潤の程度が低くなり、細胞を高密度で包埋する上で都合が良いため、アルギン酸ポリマーを構成する単位であるウロン酸のうち、グルロン酸の割合が６０％以上のものを用いることが好ましい。  【００９６】
第一の水溶液および第三の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、領域Ａおよび領域Ｃを形成するハイドロゲルの弾性率を低く保つためにも、各溶液１００ｍＬあたり、１ｇ以下であることが好ましく、さらには０．５ｇ以下であることがより好ましい。また、これらの水溶液に含まれるアルギン酸プロピレングリコールの濃度は、領域Ａおよび領域Ｃを形成するハイドロゲルの弾性率を低くするためにも、各溶液１００ｍＬあたり、１ｇ以上であることが好ましい。  【００９７】
一方で、第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、領域Ｂを形成するハイドロゲルの弾性率を高めるためにも、溶液１００ｍＬあたり、１ｇ以上であることが好ましい。また、第二の水溶液は、アルギン酸プロピレングリコールを含まないことが好ましい。
【実施例】
【００９８】
以下、上記実施形態に係る細胞評価用ハイドロゲル基材を作製し、細胞評価を実際に行うことで、本発明の効果を確認した。以下説明する。  【００９９】
図６には、ファイバー状の細胞評価用ハイドロゲル基材を作製するために利用した、４枚のアクリル板を重ね合わせて作製された流路構造Ｘを有するマイクロ流体デバイスを示した概略図が示されており、図６（ａ）〜図６（ｄ）は、それぞれ、上から一層目のアクリル板の下面に形成された流路構造、二層目のアクリル板の下面に形成された流路構造、三層目のアクリル板の上面に形成された流路構造、三層目の流路構造の下面に形成された流路構造を、それぞれ示した概略図であるとともに、図６（ｆ）および図６（ｇ）におけるマイクロ流体デバイスのＣ矢視図であり、図６（ｅ）は、図６（ｄ）における領域ｅの拡大図であるとともに、図６（ｆ）および図６（ｇ）におけるマイクロ流体デバイスのＣ矢視図であり、図６（ｆ）および図６（ｇ）は、それぞれ、マイクロ流体デバイスの、図６（ａ）〜図６（ｅ）における、Ａ−Ａ’線、Ｂ−Ｂ’線における断面図である。  【０１００】
図６に示した流路構造は、微細加工技術を用いて切削を施した、厚さ２ミリメートルのアクリルの平板を３枚と、切削を施していない厚さ２ミリメートルのアクリルの平板を、熱圧着により積層化することによって形成されている。  【０１０１】
流路構造Ｘの各部分における流路幅は、たとえば、一層目の平板の下面に存在する流路の幅及び深さは、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートルであった。二層目の平板の下面に存在する流路は、幅５ミリメートル、３．５ミリメートル、１．５ミリメートルのものがあり、深さはそれぞれ９００マイクロメートル、１．２ミリメートル、１．５ミリメートルであった。三層目の平板の上面に存在する流路の幅及び深さは、５００マイクロメートルであった。三層目の平板の下面に存在する流路の幅及び深さは、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートルであった。なお、これらの値のうち、一層目の平板の下面に存在する流路の径によって、得られるファイバー状のハイドロゲル基材の径が制御されるため、必要に応じてより太い、あるいはより細い流路構造を使用することが好ましい。  【０１０２】
癌細胞としては、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞であるＡ５４９を用い、癌細胞以外の細胞としては、チャイニーズハムスター由来肺繊維芽細胞株である、Ｖ７９−３７９Ａ細胞を用いた。これらの細胞は、予め通常の細胞培養ディッシュ上で培養することで、一定量増殖させ、酵素処理によってプレートから剥離し、遠心分離によって培養液を除くことによって調製した。  【０１０３】
第一の水溶液および第三の水溶液としては、水５０ｍＬに対し、アルギン酸プロピレングリコールを０．５ｇ、ＲＧＤアルギン酸を０．１ｇ、塩化ナトリウムを０．４５ｇ、ＨＥＰＥＳを５ｍＭ、それぞれ溶解させた水溶液を用い、Ａ５４９細胞を１ｍＬあたり約３０００万個、Ｖ７９−３７９Ａ細胞を１ｍＬあたり約２億個、それぞれ懸濁させた。なお、これらの成分のうち、ＲＧＤアルギン酸は、細胞機能の維持および浸潤の促進のため、ＨＥＰＥＳはｐＨ調整のため、また塩化ナトリウムは浸透圧調整のため、それぞれ使用したが、必要に応じて他の成分を加える、あるいはこれらを他の成分と置き換えることも可能である。  【０１０４】
第二の水溶液としては、水５０ｍＬに対し、アルギン酸ナトリウムを０．５ｇ、ＲＧＤアルギン酸を０．１ｇ、塩化ナトリウムを０．４５ｇ、ＨＥＰＥＳを５ｍＭ、それぞれ溶解させた水溶液を用い、Ｖ７９−３７９Ａ細胞を、１ｍＬあたり約２億個懸濁させた。  【０１０５】
また、ゲル化剤水溶液としては、ゲル化剤として塩化バリウムを２０ｍＭ、増粘剤として分子量５０万のデキストランを１０％（ｗ／ｖ）、浸透圧調整のための塩化ナトリウムを１２０ｍＭ、ｐＨ調整のためのＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含む水溶液を用いた。  【０１０６】
バッファー水溶液としては、増粘剤として分子量５０万のデキストランを１０％（ｗ／ｖ）、浸透圧調整のための塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、ｐＨ調整のためのＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含む水溶液を用いた。  【０１０７】
なおこれらの溶液すべては、予め加熱あるいはフィルター処理を施すことによって滅菌操作を行ったものである。  【０１０８】
これらの水溶液を、シリンジポンプを用いて、流路構造Ｘに連続的に導入した。なお、シリンジと、流路構造Ｘにおける各入口を接続するために、ＰＴＦＥチューブを使用した。  【０１０９】
各入口から導入した水溶液の流量は、作製対象とする細胞評価用ハイドロゲル基材のサイズに応じて変化させた。各入口からの導入流量は、合流流路Ｇの幅が３００マイクロメートル、深さが３００マイクロメートルの場合には、入口Ｉ１より導入した第一の水溶液は５〜１０マイクロリットル毎分、入口Ｉ２、Ｉ２’、およびＩ２’’より導入した第二の水溶液は各１０〜５０マイクロリットル毎分、入口Ｉ３より導入した第三の水溶液は５〜２０マイクロリットル毎分、入口Ｇ１より導入したゲル化剤水溶液は５０〜３００マイクロリットル毎分、入口Ｂ１より導入したバッファー水溶液は５〜２０マイクロリットル毎分であった。  【０１１０】
入口Ｉ１から導入された第一の水溶液は、入口流路ＣＩ１を通過して、三層目の平板の下面に形成された垂直上方向の流路構造へと導入され、三層目の平板の上面に存在する、合流点Ｐ１において、入口Ｉ３から導入され入口流路ＣＩ３を通過した第３の水溶液と合流した。さらに、入口Ｉ２、Ｉ２’、およびＩ２’’から導入された第二の水溶液と合流点Ｐ２において合流し、一層目の平板の下面に存在する合流点Ｐ３においてバッファー水溶液と、さらに下流の合流点Ｐ４においてゲル化剤水溶液と、それぞれ合流した。そして、合流流路Ｇの内部において、第一の水溶液、第二の水溶液、第三の水溶液が合流した流れはゲル化し、連続的にファイバー状のハイドロゲル基材が形成され、出口Ｏより回収された。  【０１１１】
図７には、図６に示された流路構造を用いて作製した、断面が領域Ａ、Ｂ、Ｃからなるファイバー状のハイドロゲル基材中の、細胞培養前後における様子を示した顕微鏡写真が示されており、図７（ａ）は、領域Ａに癌細胞を包埋したハイドロゲル基材の、作製直後の顕微鏡写真であり、図７（ｂ）は、図７（ａ）に示したハイドロゲル基材の、細胞培養１週間後の顕微鏡写真であり、図７（ｃ）は、領域Ａに癌細胞を包埋し、領域Ｂおよび領域Ｃに繊維芽細胞を包埋したハイドロゲル基材の、作製直後の顕微鏡写真であり、図７（ｄ）は、図７（ｃ）に示したハイドロゲル基材の、細胞培養１週間後の顕微鏡写真である。  【０１１２】
図７に示したハイドロゲル基材は、入口Ｉ１より導入した第一の水溶液の流量が３マイクロリットル毎分、入口Ｉ２、Ｉ２’、およびＩ２’’より導入した第二の水溶液の流量が合計７２マイクロリットル毎分、入口Ｉ３より導入した第三の水溶液の流量が１５マイクロリットル毎分、入口Ｂ１より導入したバッファー水溶液の流量が２５マイクロリットル毎分、入口Ｇ１より導入したゲル化剤水溶液の流量が１００マイクロリットル毎分の場合に得られたものである。図７（ａ）に示すように、平均直径約１２０マイクロメートルのハイドロゲル基材が得られ、その中心部である領域Ａに、癌細胞であるＡ５４９細胞が長さ方向に間隔をあけて配置されることが観察された。また、第二の水溶液および第三の水溶液に肺繊維芽細胞であるＶ７９−３７９Ａ細胞を懸濁させて作製したハイドロゲル基材の場合には、Ａ５４９細胞の周囲にＶ７９−３７９Ａ細胞が密に配置されている様子が確認された。  【０１１３】
また、図７に示すように、ＣＯ２濃度５％雰囲気下において培養液を用いて１週間培養を行ったところ、肺繊維芽細胞を包埋した場合、および、包埋しない場合のいずれの条件でも、中心の癌細胞が領域Ｃに相当する弾性率の低いハイドロゲル部分を外部へと浸潤し、図２に示すようにハイドロゲル基材の外部にコロニーを形成する様子が確認された。  【０１１４】
ハイドロゲル内の癌細胞が、繊維芽細胞が包埋されたゲル内を浸潤し、ゲル外部に飛び出した数を、顕微鏡画像を用いて計測することで癌細胞浸潤挙動を評価したところ、正確かつ簡便に、癌細胞の浸潤割合を評価することが可能であった。  【０１１５】
また、断面における領域Ａに癌細胞を包埋したハイドロゲル基材、また、領域Ａに癌細胞を、領域Ｂおよび領域Ｃに繊維芽細胞を包埋したハイドロゲル基材を作製した。細胞を５日間培養した後、抗癌剤としてシスプラチン培地に添加して２４時間培養した後に、さらにシスプラチンを含まない培地を用いて細胞を２４時間培養した。その後、抗癌剤が癌細胞の浸潤挙動に与える影響を定量的に評価するため、包埋した癌細胞の数に対する、ファイバー外部に浸潤した癌細胞の割合を、総計３００個の癌細胞についてカウントし、浸潤割合を算出した。また、領域Ｂおよび領域Ｃに繊維芽細胞を包埋せずに単独培養を行い、共培養との比較を行った。  【０１１６】
図８は、シスプラチン濃度を０．１〜１００μＭの間で変化させた際の癌細胞の浸潤割合について、図６に示される流路構造を用いて作製したハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した場合および共培養せずに癌細胞を単独で培養した際のそれぞれの条件におけるデータを示したグラフであり、縦軸の浸潤割合比とは、抗癌剤を投与せずに培養した条件においてファイバー外部へと浸潤した細胞数に対する、各抗癌剤濃度条件においてファイバー外部へと浸潤した細胞数の相対的な割合を示している。また、各データは独立した４つのサンプルについてそれぞれ３００個の細胞をカウントして得られた値について、その平均値±標準偏差を示している。  【０１１７】
図８に示すように、抗癌剤の濃度に応じて癌細胞の浸潤度合いが異なること、および、ハイドロゲル基材内部において癌細胞を単独培養した場合と、癌細胞および繊維芽細胞を共培養した場合を比較すると浸潤挙動が大きく異なること、などが観察された。特に、２種類の細胞を共培養した系では、抗癌剤濃度が１０−５Ｍ以上の場合に浸潤割合比が大きく低下した、つまり抗癌剤が効果的に作用したのに対し、癌細胞を単独培養した系では、当該濃度は１０−６Ｍ以上の場合であり、大きな差が観察された。これらの結果から、共培養と単独培養では、抗癌剤の薬効が大きくことなることが観察された。  【０１１８】
また、癌細胞の機能を評価するために、ハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した癌細胞、および、通常の細胞培養プレートを用いて平面培養した癌細胞を準備し、上記実験と同様の条件で抗癌剤としてシスプラチンを投与した。さらに、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した後に、それぞれハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ、蛍光プローブとしてＴａｑＭａｎプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲによって遺伝子発現の定量評価を行った。なお、対象として、ＨＩＦ−１ａ（低酸素誘導因子）、ＭＭＰ２（マトリックスメタロプロテアーゼ）、およびＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の３種類の遺伝子について定量評価を行った。【０１１９】
図９には、図６に示される流路構造を用いて作製した、断面が領域Ａ、Ｂ、Ｃからなるファイバー状ハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した癌細胞、および、平面培養した癌細胞に対し、シスプラチンを投与した際の、癌細胞特異的な遺伝子発現を定量評価した結果を示したグラフが示されており、図９（ａ）はＨＩＦ−１ａ（低酸素誘導因子）、図９（ｂ）はＭＭＰ２（マトリックスメタロプロテアーゼ）、図９（ｃ）はＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の遺伝子発現をそれぞれ定量した結果を示したグラフである。なお、縦軸の相対的遺伝子発現量とは、平面培養においてシスプラチンを投与しなかった場合の各遺伝子発現量を基準として示した相対値である。【０１２０】
図９に示すように、平面培養した癌細胞では、シスプラチン濃度が１００μＭである条件において、全ての遺伝子発現量が大きく減少したことが確認された。一方で、ハイドロゲル基材内部において繊維芽細胞と共培養した癌細胞では、抗癌剤を１００μＭ投与した際においても発現量は大幅に低下することなく、これらの遺伝子発現が活発であることが確認された。これは、３次元的な環境かつ、癌細胞周囲に正常細胞が存在する、生体内に近い環境を模倣しているためであると考えられ、この結果からも、本発明において提案した３次元的な共細胞培養環境の優位性および生体との類似性が実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、以上説明したように構成されているため、創薬のスクリーニングや、細胞を用いた薬剤代謝・毒性評価試験などにおいて通常用いられる、平面的な培養基材を利用した細胞培養系と比較して、３次元的かつ生体を模倣した環境における細胞の浸潤挙動の評価を簡便かつ正確に行うことが可能となる。通常の平面培養は、操作や装置がシンプルになるという利点はあるものの、その環境は、細胞にとって通常の生体環境とは大きく異なるため、細胞を用いたアッセイを行う上で生体内の環境を正確に再現しているとは言い難い。そのため、本発明による３次元的なハイドロゲル基材は、生体構造を反映した環境において細胞アッセイを簡便かつ正確に行うためのツールとして、製薬産業のみならず、細胞生化学的研究の場においても幅広く利用される、重要かつ汎用的な新規ツールとなりうると考えられる。  【０１２２】
また本発明は、以上説明したように構成されているため、評価対象となる細胞を３次元的な培養環境の中の特定の位置に、正確に配置した、ハイドロゲル基材を提供することが可能となる。細胞の初期位置を制御することによって、その浸潤挙動の評価を行う際に、データのばらつきが少なくなり、信頼性が高くなるため、より正確な細胞評価を可能とするシステムとして、幅広く利用されうるものと期待される。  【０１２３】
さらに本発明は、以上説明したように構成されているため、通常は非常に手間がかかり、さらに信頼性の低い、細胞を用いたアッセイを、より簡便に行うための手法を提供できる。特に、ハイドロゲル基材の外部に浸潤した細胞の個数をカウントするだけで、その浸潤割合を簡便に測定することが可能となるため、複雑な画像解析技術や光学系が不要なシステムを提供できる可能性が高い。そのため、コストの面において、既存のシステムよりも優位であり、細胞を用いた評価を行う産業分野や学術分野において幅広く使用される、新規細胞評価手法を提供できるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月5日(2015.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルによって構成され、直径５００マイクロメートル以下のファイバー状の形態を有し、長さ方向の軸に対して垂直な平面における断面Ｓの内部において、周縁部が前記断面Ｓの周縁部に接しておらずかつ第一の細胞が存在する領域Ａを有し、さらに前記領域Ａは、前記断面Ｓにおける前記領域Ａ以外の領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されており、また、前記断面Ｓにおいて部分的に前記領域Ａ及び前記領域Ｂに接し、かつ、部分的に前記断面Ｓの周縁部に接する領域Ｃを有し、さらに前記領域Ｃは、前記領域Ｂと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されており、前記第一の細胞を前記領域Ｃを通過して浸潤させる細胞評価用ハイドロゲル基材であって、前記領域Ａの面積は前記第一の細胞の平均直径をＤとすると１０Ｄ２以下であり、前記第一の細胞の平均直径をＤとすると領域Ｃの幅は３Ｄ以下である細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記領域Ａ、前記領域Ｂ及び領域Ｃを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかは、アルギン酸又はアルギン酸の誘導体によって構成されている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項６】
前記領域Ａ及び前記領域Ｃを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかには、アルギン酸プロピレングリコールが含まれている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項７】
前記領域Ａ、前記領域Ｂ及び領域Ｃを構成するハイドロゲルのマトリックス中には、細胞外マトリックスを構成するタンパク質及び細胞接着性のペプチド分子の少なくともいずれかが含まれている請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項８】
前記第一の細胞とは、癌細胞である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記領域Ｂには、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、実質細胞、腺細胞、表皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、これらの細胞の前駆細胞、各種幹細胞より分化させた細胞の少なくともいずれかが存在する請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
前記領域Ａの面積をＳとし、前記領域Ａの周囲長をＬとすると、前記領域Ａの円形度４πＳ／Ｌ２は０．５以上である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
厚さ５００マイクロメートル以下のシート状であり、前記断面Ｓの内部において、前記領域Ａは複数個所存在する請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１６】
前記領域Ａに含まれる、前記第一の細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１０万個以上である請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１７】
前記領域Ｂに含まれる細胞の密度は、１立方センチメートル当たり１００万個以上である請求項１０に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１８】
少なくとも２つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧２）と、前記入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、前記入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、前記合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、前記合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口Ｉ２を介して、それぞれ連続的に導入し、  前記流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を接触させ、さらに前記流路構造Ｘの内部乃至外部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、  前記第一の水溶液及び前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、  また、前記領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項１９】
少なくとも３つの入口Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ≧３）と、前記入口Ｉ１〜Ｉｎにそれぞれ接続する入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎと、前記入口流路ＣＩ１〜ＣＩｎが同時あるいは段階的に合流する少なくとも１つの合流点Ｐ１〜Ｐｍ（ｍ≧１）と、前記合流点Ｐ１〜Ｐｍより下流に存在する合流流路Ｇと、前記合流流路Ｇの下流に存在する出口Ｏを有する、流路構造Ｘに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口Ｉ１を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口Ｉ２を介して、さらに、アルギン酸ナトリウムを含む第三の水溶液を、前記入口Ｉ３を介して、それぞれ連続的に導入し、  前記流路構造Ｘの内部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、前記第三の水溶液を接触させ、  さらに、前記流路構造Ｘの内部又は外部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記第三の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、  また、前記領域Ａは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Ｂは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、さらに、前記領域Ｃは前記第三の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
前記流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｇ１〜Ｇｎ（ｎ≧１）および、前記入口Ｇ１〜Ｇｎにそれぞれ接続し合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する入口流路ＣＧ１〜ＣＧｎを有しており、前記入口Ｇ１〜Ｇｎを介して前記ゲル化剤水溶液は流路構造Ｘに連続的に導入される請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２２】
前記流路構造Ｘは、少なくとも一つの入口Ｂ１〜Ｂｎ（ｎ≧１）および、前記入口Ｂ１〜Ｂｎにそれぞれ接続し合流点Ｐ１〜Ｐｍのいずれかにおいて合流流路Ｇに合流する入口流路ＣＢ１〜ＣＢｎを有しており、前記入口Ｂ１〜Ｂｎを介してバッファー水溶液が流路構造Ｘに連続的に導入される請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２３】
前記合流点Ｐ１〜Ｐｍのうち少なくとも一つの合流点において、前記第一の水溶液は、その上下左右の少なくともいずれかにおいて前記第二の水溶液と接触する請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２４】
前記流路構造Ｘは、少なくとも部分的に、キャピラリー状の管によって構成されている請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２５】
前記流路構造Ｘは、少なくとも部分的に、微細加工技術を用いて作製されたマイクロ流路構造によって構成されている請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２６】
前記流路構造Ｘは、その幅、深さ、直径の値のうち少なくともいずれか一つが、少なくとも部分的に１ミリメートル以下である請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２７】
前記第一の水溶液、前記第二の水溶液及び前記第三の水溶液の少なくともいずれかに含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以下である請求項１９に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２８】
前記第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、１００ｍＬあたり１ｇ以上である請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項２９】
前記ゲル化剤水溶液は、塩化バリウムを含む請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３０】
前記ゲル化剤水溶液は、増粘剤を含む請求項１８に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３１】
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液は、アルギン酸プロピレングリコールを含む請求項１９に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３２】
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液に含まれる前記アルギン酸プロピレングリコールの濃度は、それぞれ１００ｍＬあたり１ｇ以上である請求項３１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
【請求項３３】
請求項１に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材を用いる細胞評価手法。
【請求項３４】
前記ハイドロゲル基材内部に包埋した細胞に対し、培養操作を行い、前記第一の細胞が前記ハイドロゲル基材の内部を浸潤しゲル外部にまで達する個数あるいは割合を、計測することによって、細胞の浸潤を定量的に評価する請求項３３に記載の細胞評価手法。
【国際調査報告】
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