(57)【要約】  本発明の課題は、グルタルアルデヒドを含まず、かつ移植後に血管形成できる細胞構造体、並びに上記細胞構造体の製造方法を提供することである。本発明によれば、生体親和性高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置され、かつ空隙を有する細胞構造体であって、前記細胞構造体の体積に対する前記生体親和性高分子ブロックの体積の割合が１０〜３０％であり、前記細胞構造体の体積に対する前記細胞の体積の割合が２０〜５０％であり、かつ前記細胞構造体の体積に対する前記空隙の体積の割合が３５〜６０％である、前記の細胞構造体が提供される。
2015190430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置され、かつ空隙を有する細胞構造体であって、前記細胞構造体の体積に対する前記生体親和性高分子ブロックの体積の割合が１０〜３０％であり、前記細胞構造体の体積に対する前記細胞の体積の割合が２０〜５０％であり、かつ前記細胞構造体の体積に対する前記空隙の体積の割合が３５〜６０％である、前記の細胞構造体。
【請求項２】
前記細胞が、少なくともヒト間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載の細胞構造体。
【請求項３】
前記細胞が、少なくとも血管系細胞を含む、請求項１又は２に記載の細胞構造体。
【請求項４】
細胞移植のために使用される、請求項１から３の何れか１項に記載の細胞構造体。
【請求項５】
腎皮膜への細胞移植のために使用される、請求項４に記載の細胞構造体。
【請求項６】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項７】
厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から６の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項８】
前記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項９】
前記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項８に記載の細胞構造体。
【請求項１０】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、前記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１１】
前記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
前記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１２】
前記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；
前記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ；及び
工程ｂで得られた多孔質体を粉砕する工程ｃ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、請求項１から１１の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１３】
前記細胞構造体の内部において血管が形成されている、請求項１から１２の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１４】
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ、及び前記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂを含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合する工程を含む、請求項１から１３の何れか１項に記載の細胞構造体を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１から１３の何れか１項に記載の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体及び細胞構造体の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、移植後に血管を形成できる細胞構造体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。これら新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。【０００３】
例えば、細胞シートを用いた心筋の再生においては、厚みのある組織を再生するには、細胞シートの多層構造体が必要であると考えられる。近年、岡野らは温度応答性培養皿を用いた細胞シートを開発した。細胞シートはトリプシンのような酵素処理が不要であるため、細胞と細胞との結合および接着蛋白が保持される(非特許文献１から６)。このような細胞シート製造技術は、心筋組織の再生に有用であると期待される（非特許文献７）。また岡野らは、細胞シートに血管網を形成すべく、血管内皮細胞を一緒に導入した細胞シートの開発を行っている（非特許文献８）。【０００４】
また、特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献２の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成が評価されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【特許文献２】特開２０１４−１２１１４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shimizu, T. et al., Circ. Res. 90, e40-48 (2002)
【非特許文献２】Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res. 51, 216-223 (2000)
【非特許文献３】Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res. 45, 355-362 (1999)
【非特許文献４】Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Tissue Eng.7, 141-151 (2001)
【非特許文献５】Shimizu, T et al., J. Biomed. Mater. Res. 60,110-117(2002)
【非特許文献６】Harimoto, M. et al., J. Biomed. Mater. Res. 62, 464-470 (2002)
【非特許文献７】Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Biomaterials 24, 2309-2316 (2003)
【非特許文献８】Inflammation and Regeneration vol.25 No.3 2005, p158-159. 第２６回  日本炎症・再生医学会  ―炎症学と再生医学の融合を目指して―  岡野光夫
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び特許文献２の実施例に記載されている細胞構造体の高分子ブロックにおいては、高分子の架橋のためにグルタルアルデヒドが使用されている。人体に対する細胞移植治療のためには、グルタルアルデヒドを使用しない方法で作製した細胞構造体を使用することが望ましい。しかし、グルタルアルデヒドを使用しない方法で作製され、かつ移植後に血管形成できる細胞構造体は未だ提供されていない。【０００８】
本発明は、グルタルアルデヒドを含まず、かつ移植後に血管形成できる細胞構造体を提供することを課題とした。更に本発明は、上記細胞構造体の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと細胞と空隙とを有する細胞構造体において、細胞構造体の体積に対する、生体親和性高分子ブロックの体積、細胞の体積及び空隙の体積の割合をそれぞれ１０〜３０％、２０〜５０％及び３５〜６０％とすることによって、細胞構造体中に血管を形成することに成功した。さらに本発明者らは、血管内皮前駆細胞を含む細胞構造体を腎皮膜下に移植した場合に細胞構造体中で長期間に渡って血管を維持させることにも成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  生体親和性高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置され、かつ空隙を有する細胞構造体であって、上記細胞構造体の体積に対する上記生体親和性高分子ブロックの体積の割合が１０〜３０％であり、上記細胞構造体の体積に対する上記細胞の体積の割合が２０〜５０％であり、かつ上記細胞構造体の体積に対する上記空隙の体積の割合が３５〜６０％である、上記の細胞構造体。
（２）  上記細胞が、少なくともヒト間葉系幹細胞を含む、（１）に記載の細胞構造体。
（３）  上記細胞が、少なくとも血管系細胞を含む、（１）又は（２）に記載の細胞構造体。
（４）  細胞移植のために使用される、（１）から（３）の何れかに記載の細胞構造体。
（５）  腎皮膜への細胞移植のための使用される、（４）に記載の細胞構造体。
（６）  上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１）から（５）の何れかに記載の細胞構造体。
（７）  厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、（１）から（６）の何れかに記載の細胞構造体。
（８）  上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、（１）から（７）の何れかに記載の細胞構造体。
（９）  上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（８）に記載の細胞構造体。
（１０）  上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、（１）から（９）の何れかに記載の細胞構造体。
（１１）  上記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、（１）から（１０）の何れかに記載の細胞構造体。
（１２）  上記生体親和性高分子ブロックが、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ；及び
工程ｂで得られた多孔質体を粉砕する工程ｃ：
を含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックである、（１）から（１１）の何れかに記載の細胞構造体。
（１３）  上記細胞構造体の内部において血管が形成されている、（１）から（１２）の何れかに記載の細胞構造体。
（１４）  生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ、及び上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂを含む方法により製造される生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合する工程を含む、（１）から（１３）の何れかに記載の細胞構造体を製造する方法。
（１５）  （１）から（１３）の何れかに記載の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体。【００１１】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１６）  （１）から（１３）又は（１５）の何れかに記載の細胞構造体を、細胞移植を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法。
（１７）  細胞構造体を、腎皮膜に移植する、（１６）に記載の細胞移植方法。
（１８）  細胞移植治療剤の製造のための、（１）から（１３）又は（１５）の何れかに記載の細胞構造体の使用。
（１９）  細胞移植治療剤が、腎皮膜に移植される細胞移植治療剤である、（１８）に記載の使用。
（２０）  （１）から（１３）又は（１５）の何れかに記載の細胞構造体を含む、細胞移植治療剤。
（２１）  腎皮膜に移植される細胞移植治療剤である、（２０）に記載の細胞移植治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞構造体は、グルタルアルデヒドを使用することなく製造することができることから、人体に安全な細胞移植治療のために使用できる。また、本発明の細胞構造体によれば、移植後に血管を効率よく形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例の条件Ａにおける溶媒を凍結する際の温度プロファイルを示す。
【図２】図２は、実施例の条件Ｂにおける溶媒を凍結する際の温度プロファイルを示す。
【図３】図３は、実施例の条件Ｃにおける溶媒を凍結する際の温度プロファイルを示す。
【図４】図４は、実施例５のモザイク細胞塊、比較例３のモザイク細胞塊、及び比較例４の細胞塊大の切片画像を示す。
【図５】図５は、実施例５及び比較例３のモザイク細胞塊、並びに比較例４の細胞塊のＡＴＰアッセイの結果を示す。
【図６】図６は、実施例５のモザイク細胞塊、及び比較例４の細胞塊における生細胞と死細胞のライブイメージングを示す。
【図７】図７は、実施例８（条件Ａ、Ｂ及びＣ）又は比較例６（単純凍結ブロック）のｈＭＳＣモザイク細胞塊を皮下移植した２週間後に作製したＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）標本を示す。
【図８】図８は、実施例８の条件Ｃのブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊、又は実施例９の条件Ｃのブロックを用いたｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を皮下に移植した２週間後に作製したＨＥ標本を示す。
【図９】図９は、実施例９の条件Ｃのブロックを用いた場合のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を皮下に移植したときのＨＥ標本の経時変化を示す。
【図１０】図１０は、実施例９のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を腎被膜下に移植したときのＨＥ標本の経時変化を示す。
【図１１】図１１は、比較例７のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ細胞塊を腎被膜下に移植したときのＨＥ標本の経時変化を示す。
【図１２】図１２は、実施例４の条件Ａ及び条件Ｄのブロック並びに比較例２の単純凍結ブロックの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す。上段の目盛は１００μｍを示し、下段の目盛は５００μｍを示す。
【図１３】図１３は、実施例４の条件Ａ及び条件Ｄのブロック並びに比較例２の単純凍結ブロックのＨＥ切片像を示す。目盛は１００μｍを示す。
【図１４】図１４は、実施例４の条件Ａのブロックを用いたモザイク細胞塊の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置され、かつ空隙を有する細胞構造体であって、上記細胞構造体の体積に対する上記生体親和性高分子ブロックの体積の割合が１０〜３０％であり、上記細胞構造体の体積に対する上記細胞の体積の割合が２０〜５０％であり、かつ上記細胞構造体の体積に対する上記空隙の体積の割合が３５〜６０％である、上記細胞構造体に関する。なお、本発明の細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
【００１５】
細胞構造体の体積に対する生体親和性高分子ブロックの体積の割合は１０〜３０％であり、より好ましくは１２〜２７％であり、特に好ましくは１５〜２４％である。細胞構造体の体積に対する細胞の体積の割合は２０〜５０％であり、より好ましくは２５〜４５％であり、特に好ましくは２８〜４２％である。細胞構造体の体積に対する空隙の体積の割合は３５〜６０％であり、より好ましくは３５〜５７％である。生体親和性高分子ブロック、細胞及び空隙のぞれぞれの割合を上記の範囲内とすることにより、細胞構造体における血管形成が可能となる。
【００１６】
細胞構造体の体積に対する、生体親和性高分子ブロックの体積の割合、細胞の体積の割合、及び空隙の体積の割合は、以下の方法により求めることができる。
細胞構造体の全体が視野に入る画像を用意する。その画像から、photoshop（登録商標）などの画像抽出ソフトを用いて生体親和性高分子ブロックのみを抽出した画像、並びに細胞のみを抽出した画像を用意する。これからの抽出画像を、Imagej（登録商標）などの画像ソフトを用いて、細胞構造体（モザイク細胞塊）全体が占める面積、生体親和性高分子ブロックが占める面積、及び細胞が占める面積を算出する。細胞構造体（モザイク細胞塊）全体が占める面積に対する生体親和性高分子ブロックが占める面積の割合を、細胞構造体の体積に対する生体親和性高分子ブロックの体積の割合とみなし、細胞構造体（モザイク細胞塊）全体が占める面積に対する細胞が占める面積の割合を、細胞構造体の体積に対する細胞の体積の割合とみなす。空隙の体積の割合は、「空隙の体積の割合＝細胞構造体の体積の割合（１００％）−生体親和性高分子ブロックの体積の割合−細胞の体積の割合」として算出する。即ち、本発明で言う空隙とは、細胞構造体が占める空間のうち、生体親和性高分子ブロックが占める空間及び細胞占める空間以外の空間を意味する。
【００１７】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーンおよびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００１８】
リコンビナントペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン又はリコンビナントゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００１９】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基く、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２０】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２１】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２２】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用することが好ましい。本発明では、アルデヒド類又は縮合剤を使用しない架橋方法を使用することがより好ましい。即ち、本発明における生体親和性高分子ブロックは、好ましくは、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックであり、より好ましくは、アルデヒド類又は縮合剤を含まない生体親和性高分子ブロックである。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００２３】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２４】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００２５】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２６】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２７】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であり、より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であり、最も好ましくは１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００２８】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２９】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３０】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００３１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３３】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３４】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００３５】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００３６】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００３８】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００３９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である。
【００４０】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４２】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状、粉状および多孔質状であり、より好ましくは不定形である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。
【００４３】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは２５μｍ以上１０６μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れた血管形成を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００４４】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００４５】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００４６】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する際に、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状となる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状となる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。
【００４７】
本発明においては好ましくは、
生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より３℃低い温度（“溶媒融点−３℃”）以下となる、凍結処理により凍結する工程ａ；及び
上記工程ａで得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程ｂ：
を含む方法により、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
本発明ではさらに好ましくは、上記工程ｂで得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００４８】
より好ましくは、上記工程ａにおいて、生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温である内部最高液温が、未凍結状態で、溶媒融点より７℃低い温度（“溶媒融点−７℃”）以下となる凍結処理により凍結することができる。
【００４９】
（２）細胞
本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００５０】
例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家および他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、骨格筋由来細胞（特にサテライト細胞）、骨髄細胞（特に心筋様細胞に分化させた骨髄細胞）などを好適に使用することができる。更に、他の臓器においても、適宜移植細胞を選択することができる。例えば、脳虚血・脳梗塞部位への神経前駆細胞または、神経細胞に分化可能な細胞の移植、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の移植などを挙げることができる。
【００５１】
また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。即ち、インスリン分泌能が低下した膵臓にインスリン分泌細胞を移植する試みや、四肢の血行障害に対する骨髄由来細胞の移植などが検討されており、このような細胞を使用することができる。
【００５２】
また本発明においては、血管系細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の万能細胞や、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような血管および血液を構成する細胞に、自然には分化しないものは含まれない。血管系細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞の具体例としては、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の何れでもよい。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞としては、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
【００５３】
本明細書において、非血管系細胞とは、上記の血管系細胞以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。好ましくは、ＭＳＣ、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋幹細胞、心筋細胞、肝細胞またはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、ＭＳＣ、心筋幹細胞、心筋細胞または筋芽細胞である。
【００５４】
（３）細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能となる。これにより、本発明の細胞構造体を用いて細胞移植を行うと、血管を形成することが可能となる。
【００５５】
本発明の細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００５６】
また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００５７】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。
【００５８】
本発明の細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、血管形成をより促進することができる。
【００５９】
本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００６０】
本発明の細胞構造体は、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができ、また細胞構造体の体積に対する生体親和性高分子ブロックの体積の割合及び細胞構造体の体積に対する細胞の体積の割合を、本発明において規定した範囲内とすることができる。下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００６１】
本発明の細胞構造体は、血管新生因子を含んでいてもよい。ここで、血管新生因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを好適に挙げることができる。血管新生因子を含む細胞構造体の製造方法は、特に制限されないが、例えば、血管新生因子を含浸させた生体親和性高分子ブロックを使用することにより、製造することができる。血管新生を促進する観点からは、本発明の細胞構造体は、血管新生因子を含むことが好ましい。
【００６２】
本発明の細胞構造体は、非血管系細胞を含むものでもよい。また、本発明の細胞構造体を構成する細胞は、非血管系細胞のみでもよい。細胞として非血管系細胞のみを含む本発明の細胞構造体により、移植後、移植部位に、血管を形成することができる。また、本発明の細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む場合には、非血管系細胞のみで構成されている場合と比較して、より血管形成することが可能となり、好ましい。
本発明の細胞構造体としては、細胞構造体の内部において血管形成されているものが好ましい。
【００６３】
なお、本発明の細胞構造体としては、二種類以上の細胞を含み、かつ非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む本発明の細胞構造体を用いて、細胞構造体の内部に血管形成されたものも含む。また、ここで、「二種類以上の細胞を含み、かつ非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む本発明の細胞構造体」の好適な範囲は上記と同様である。
【００６４】
（４）細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を促進又は制御することが好ましい。
【００６５】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００６６】
上記の方法で得られた細胞構造体（モザイク細胞塊）は、例えば、
（ａ）別々に調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００６７】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００６８】
別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記（ａ）に記載の通り本発明の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の範囲内である。
【００６９】
本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００７０】
上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下であり、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下であり、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００７１】
上記した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法としては、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする方法を挙げることができる。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００７２】
融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【００７３】
本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００７４】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【００７５】
非血管系細胞および血管系細胞の両方を含む場合の細胞構造体の製造方法として、例えば、下記（ａ）〜（ｃ）の製造方法を好適に挙げることができる。
（ａ）は非血管系細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。
（ｂ）は血管系細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。
（ｃ）は、非血管系細胞および血管系細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。
【００７６】
（５）細胞構造体の用途
本発明の細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明の細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることができる。
【００７７】
本発明の細胞構造体は、特に好ましくは、腎皮膜への細胞移植のための使用することができる。本発明の細胞構造体は、生体内で血管形成できるだけでなく、形成した血管を生体内で長期間維持することができる。本発明の細胞構造体を腎皮膜に移植した場合には形成した血管を特に長期間維持できるという観点から、腎皮膜への細胞移植は本発明の好ましい態様の一つである。
【００７８】
移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【００７９】
また、本発明によれば、本発明の細胞構造体を、細胞移植を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。本発明の細胞移植方法においては、上記した本発明の細胞構造体を用いる。好ましくは、細胞構造体は、腎皮膜に移植される。細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【００８０】
更に本発明によれば、細胞移植治療剤の製造のための、本発明の細胞構造体の使用が提供される。本発明によれば、好ましくは、腎皮膜に移植される細胞移植治療剤の製造のための、本発明の細胞構造体の使用が提供される。細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【００８１】
更に本発明によれば、本発明の細胞構造体を含む、細胞移植治療剤が提供される。本発明によれば、好ましくは、本発明の細胞構造体を含む、腎皮膜に移植される細胞移植治療剤が提供される。細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【００８２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下記載のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造： GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３【００８４】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００８５】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。PTFE製円筒カップカップ状容器は曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップ状容器の内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と称する。【００８６】
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップ状容器は曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と称する。【００８７】
PTFE厚・円筒形容器、及びアルミ硝子板・円筒形容器に、ＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。【００８８】
条件Ａ：
PTFE厚・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。ＰＴＦＥ厚・円筒形容器を使用し、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度は４質量％であり、水溶液量は４ｍＬである。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。得られた凍結品は、その後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。【００８９】
条件Ｂ及びＣ：
アルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を４ｍＬ流し込み、冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。また、棚板温度は予め設定温度になるまで十分冷却しておいたところへ、ＣＢＥ３水溶液入りの容器を設置することで凍結を実施した。【００９０】
条件Ｂ；
アルミ硝子板・円筒形容器を使用し、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度は４質量％であり、水溶液量は４ｍＬである。棚板温度の設定は、予め−６０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置き、棚板温度はそのまま−６０℃を維持して、凍結を行った。得られた凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。【００９１】
条件Ｃ；
アルミ硝子板・円筒形容器を使用し、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度は７．５質量％であり、水溶液量は４ｍＬである。棚板温度の設定は、予め−６０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置き、棚板温度はそのまま−６０℃を維持して、凍結を行った。得られた凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。【００９２】
[実施例３]各凍結工程での内部最高液温の測定
条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃの多孔質体を作製する際、それぞれの水溶液は、底面から冷却されるため、円中心部の水表面温度が最も冷却されにくい。従って、円中心部の水表面部分が、溶液内で最も温度の高い液温となるため、円中心部の水表面部分の液温を測定した。以下、円中心部の水表面部分の液温のことを内部最高液温と称する。【００９３】
条件Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれについて、溶媒を凍結する際の温度プロファイルを図１〜図３に示す。条件Ａ、Ｂ及びＣの何れの場合も、融点以下で未凍結状態を経た後、凝固熱が発生し温度上昇が始まり、この段階で実際に氷形成が始まる。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していき、この段階では、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この段階では、液体部分はなくなり氷となる。測定している温度は氷内部の固体温度となり、液温ではなくなる。上記の通り、凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」を経た後に凍結したかどうかが分かる。【００９４】
条件Ａ、Ｂ及びＣのそれぞれについて、凝固熱が発生する瞬間の未凍結状態での内部最高液温は、条件Ａが−８．８℃、条件Ｂが−８．４℃、条件Ｃが−７．２℃となった。何れの場合においても、凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下であることが分かる。【００９５】
[実施例４] リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２において条件Ａ、Ｂ又はＣにより作製したＣＢＥ３多孔質体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回の計５分間行った。得られた粉砕物をステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。その後、減圧下で１６０℃で熱架橋（架橋時間は８〜４８時間）を施して、リコンビナントペプチドブロックを得た。【００９６】
[比較例１] リコンビナントペプチド単純凍結多孔質体の作製
比較例として、架橋方法を熱架橋に変更したこと以外は特開２０１４−１２１１４号公報に記載の方法に準じて、比較用リコンビナントペプチド単純凍結多孔質体を以下の通りに作製した。
５０℃で、２０００ｍｇのＣＢＥ３を１８ｍＬの超純水に溶解し、終濃度１０％のＣＢＥ３溶液２０ｍＬを作製した。白板にシリコン枠（５ｃｍ×１０ｃｍ程度）をつけ、空気の隙間がないようにシリコン枠を白板に押し付けてから、その枠内へ上記のＣＢＥ３溶液（５０℃）を流し込んだ。液を流し込んだら、４℃へ移して約１時間ゲル化させて、４mm厚程度の薄い板状のゲルを作製した。ゲル化を確認した後、−８０℃へ移して、ゲルを３時間凍結させた。凍結後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＤＵ−１０００）で凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥体は多孔質体であった。以後、これを単純凍結多孔質体と称する。【００９７】
[比較例２] リコンビナントペプチド単純凍結ブロックの作製
比較例１で得られた単純凍結多孔質体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回の計５分間行った。得られた粉砕物をステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。得られたＣＢＥ３ブロックを１６０℃のオーブンに入れ、６〜７２時間熱架橋した。以後、これを単純凍結ブロックと称する。【００９８】
[実施例５] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。これにより、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなる、直径１ｍｍ程度の球状のモザイク細胞塊を作製した。このモザイク細胞塊は、細胞１個当たり０．００１μｇのＣＢＥ３ブロックを含む。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、このモザイク細胞塊は球状であった。なお、条件Ａ、Ｂ又はＣの何れにおいても、またＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様のモザイク細胞塊が得られた。【００９９】
[比較例３] リコンビナントペプチド単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。これにより、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなる、直径１ｍｍ程度の球状のモザイク細胞塊を作製した。このモザイク細胞塊は、細胞１個当たり０．００１μｇのＣＢＥ３ブロックを含む。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、このモザイク細胞塊は、球状であった。なお、ＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様のモザイク細胞塊が得られた。【０１００】
[比較例４] 細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。これにより、直径約４００μｍ又は直径約１ｍｍの球状の細胞塊を作製した。１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊小、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊大と称する。【０１０１】
[実施例６] 本発明と比較例の標本解析
実施例５のモザイク細胞塊（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）、比較例３のモザイク細胞塊（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）、及び比較例４の細胞塊大について、組織切片を作製した。３例とも培養７日の細胞塊を用いた。実施例５のモザイク細胞塊、比較例３のモザイク細胞塊、及び比較例４の細胞塊大を１０％ホルマリン緩衝液に浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、細胞塊の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）に供した。切片像を図４に示した。【０１０２】
図４に示したモザイク細胞塊の切片を用いて、実施例５のモザイク細胞塊、比較例３のモザイク細胞塊、及び比較例４の細胞塊大における生体親和性高分子ブロック、細胞、空隙の割合（体積比）をそれぞれ求めた。空隙の割合が多いほど、モザイク細胞塊中での物質交換が行われやすいことを意味する。これらの値は、画像解析ソフトを用いて算出した。【０１０３】
先ず、モザイク細胞塊全体が視野に入る画像を用意した。その画像から、photoshop（登録商標）を用いて生体親和性高分子ブロックのみを抽出した画像、並びに細胞のみを抽出した画像を用意した。これからの抽出画像を、画像ソフトImagej（登録商標）を用いて、モザイク細胞塊全体が占める面積、生体親和性高分子ブロックが占める面積、及び細胞が占める面積を算出する。細胞構造体（モザイク細胞塊）全体が占める面積に対する生体親和性高分子ブロックが占める面積の割合を、細胞構造体の体積に対する生体親和性高分子ブロックの体積の割合とみなし、細胞構造体（モザイク細胞塊）全体が占める面積に対する細胞が占める面積の割合を、細胞構造体の体積に対する細胞の体積の割合とみなす。空隙の体積の割合は、「空隙の体積の割合＝細胞構造体の体積の割合（１００％）−生体親和性高分子ブロックの体積の割合−細胞の体積の割合」として算出した。【０１０４】
生体親和性高分子ブロック、細胞、空隙の体積比の測定結果を表１に示す。実施例５のモザイク細胞塊では、空隙の割合は、条件Ａ、条件Ｂ及び条件Ｃでそれぞれ５７％、３５％及び４４％となった。一方、比較例３のモザイク細胞塊では、空隙の割合は３２％であった。細胞のみの比較例４の細胞塊では空隙の割合は０％であった。一方、実施例５のモザイク細胞塊では、生体親和性高分子ブロックの割合は、条件Ａ、条件Ｂ及び条件Ｃでそれぞれ１５％、２４％及び１４％となった。一方、比較例３のモザイク細胞塊では生体親和性高分子ブロックの割合は４０％であった。実施例５のモザイク細胞塊では、比較例３のモザイク細胞塊に比べ、空隙の割合が多く、生体親和性高分子ブロックの割合が少ないことが分かる。【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
[実施例７] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）及び標本解析
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ serum supplement）にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなる扁平状のモザイク細胞塊を作製した。【０１０７】
また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例４で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、ｈＭＳＣとＣＢＥ３ブロックを含む混合物を調製した。
ｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなる扁平状のモザイク細胞塊を有するスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートから培地を除去し、ｈＭＳＣとＣＢＥ３ブロックを含む上記混合物２００μＬを、上記スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種した。卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなる直径１ｍｍ程度の球状のモザイク細胞塊を作製した。
条件Ａ、Ｂ又はＣの何れにおいても、またＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様のモザイク細胞塊が得られた。【０１０８】
上記で作製したモザイク細胞塊について、実施例６と同様に標本から体積の割合を算出した。その結果、ブロックの割合は１５％、細胞の割合は３５％、空隙の割合は５０％となった。【０１０９】
[比較例５] 細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ serum supplement）にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ＥＣＦＣの細胞塊を作製した。【０１１０】
また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて３０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を作製した。
ＥＣＦＣの細胞塊を有するスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートから培地を除去し、ｈＭＳＣを含む細胞懸濁液２００μＬを上記スミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種した。卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣからなる直径１ｍｍ程度の球状の細胞塊を作製した。【０１１１】
[実施例８] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
実施例５で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。なお、条件Ａ、Ｂ又はＣの何れにおいても、またＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様の結果であった。【０１１２】
[実施例９] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
実施例７で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。なお、条件Ａ、Ｂ又はＣの何れにおいても、またＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様の結果であった。【０１１３】
[比較例６]リコンビナントペプチド単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例３で作製した２日目のモザイク細胞塊（比較用のリコンビナントペプチド単純凍結ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。なお、ＣＢＥ３ブロックの大きさについては２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍの何れにおいても、同様の結果であった。【０１１４】
[比較例７]細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
比較例５で作製した２日目の細胞塊５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、細胞塊が自然に融合することが明らかになった。【０１１５】
[実施例１０]本発明と比較例についてのインビトロＡＴＰアッセイ
実施例５で作製したモザイク細胞塊（条件Ａ、Ｂ及びＣの３種類；ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）、比較例３で作製したモザイク細胞塊（単純凍結）（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）、及び比較例４で作製した細胞塊（ブロックなし）について、各モザイク細胞塊又は細胞塊中の細胞が産生・保持しているＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を定量した。ＡＴＰは生物全般のエネルギー源として知られ、ＡＴＰ合成量・保持量を定量することで、細胞の代謝活性の状態、活動状態を知ることができる。測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。実施例５および比較例３で作製したモザイク細胞塊と、比較例４で作製した細胞塊大について、ともに７日目の細胞塊について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて、各モザイク細胞塊又は細胞塊中のＡＴＰ量を定量した。実施例５のモザイク細胞塊に比べ、比較例３のモザイク細胞塊では、ＡＴＰ量が少ない結果となった。（図５）。  また、生体親和性高分子ブロック及び空隙のない細胞塊大においても、実施例３のモザイク細胞塊に比べるとＡＴＰ量が少ないことが分かる。比較例４の細胞塊における元の細胞数は、比較例３のモザイク細胞塊における元の細胞数の４倍であることにより、比較例３のモザイク細胞塊よりも比較例４の細胞塊の方がＡＴＰ量が多くなっている。図５に示す結果から、体積比が生体親和性高分子ブロック１４〜２４％、細胞２８〜４２％、空隙３５〜５７％のモザイク細胞塊では、細胞の産生するＡＴＰ量が多いことが分かる。【０１１６】
[実施例１１]  本発明と比較例についてのライブイメージングによる生細胞と死細胞の染色
実施例５（条件Ａ；ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）並びに比較例４の細胞塊大及び細胞塊小を用いて、ライブイメージングによる生細胞死細胞の染め分けを実施した。
染色試薬はLIVE/DEAD Viability Kit (Life Technology)を用いた。培養５日後と培養１１日後のモザイク細胞塊及び細胞塊について、以下の手順により、生細胞と死細胞とを染色した。モザイク細胞塊と細胞塊を作製した９６ウェルＵ字プレート中で、ＰＢＳで２回洗浄し、8 μM Calcein（登録商標） AM（Life Technology）と20μM EthD-1（Ethidium Homodimer-1; Life Technology社）中に３７℃で３０分遮光静置した。その後、Ex/Em〜495 nm/〜515 nm（緑：生細胞）および、Ex/Em〜495 nm/〜635 nm（赤：死細胞）で蛍光顕微鏡を用いて観察した。【０１１７】
上記の結果を図６に示した。培養５日および１１日いずれにおいても、実施例５のモザイク細胞塊では赤に染まる死細胞が少なく、比較例４の細胞塊小及び細胞塊大では死細胞が多く散見されることが確認できた。細胞塊は、モザイク細胞塊と同じサイズの細胞塊大の場合はもちろん、モザイク細胞塊と同細胞数にした細胞塊小の場合でも、死細胞はモザイク細胞塊の方が少なかった。このことは、モザイク細胞塊の方が、リコンビナントペプチドブロックおよび空隙があることによって、酸素及び栄養の透過供給、並びに死細胞の排出などの物質交換がなされやすいことを示唆している。【０１１８】
[実施例１２]モザイク細胞塊の移植（皮下）
移植動物としてＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールズリバー）のオスマウス（４〜６週齢）を用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉から剥がした。その後、実施例８、実施例９及び比較例６で作成したモザイク細胞塊をピンセットで取り出し、切れ込みから１．５ｃｍほど下の腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。
なお、実施例８のモザイク細胞塊としては、条件Ａ、Ｂ及びＣ、そしてＣＢＥ３ブロックの大きさが５３〜１０６μｍのものを使用し、実施例９のモザイク細胞塊としては、条件Ｃ、そしてＣＢＥ３ブロックの大きさが５３〜１０６μｍのものを使用し、比較例６のモザイク細胞塊としては、ＣＢＥ３ブロックの大きさが５３〜１０６μｍのものを使用した。【０１１９】
[実施例１３]モザイク細胞塊の移植（腎被膜下）
移植動物としてＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールズリバー）のオスマウス（４〜６週齢）を用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、腹部の中心部に縦に切れ込みを入れて開腹し、内臓を外に引き出し、腎臓を露出させた。腎臓の腎被膜をピンセットでつまみ、被膜と実質の間に実施例９のモザイク細胞塊および比較例７の細胞塊を置いた。その後、外に出した内臓を腹部に戻し、切開部を縫合した。
なお、実施例９のモザイク細胞塊としては、条件Ｃ、ＣＢＥ３ブロックの大きさが５３〜１０６μｍのものを使用した。【０１２０】
[実施例１４]モザイク細胞塊の採取
実施例１２及び１３において移植を行ったマウスの解剖は、移植から１週、２週、４週及び８週後に行った。皮下移植したものは、腹部の皮膚を剥がし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約１平方ｃｍの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。腎被膜下移植したものは、モザイク細胞塊を含む腎臓を採取した。【０１２１】
[実施例１５] 本発明、比較例及び参考例についての標本解析
モザイク細胞塊が付着した皮膚または腎臓について組織切片を作製した。組織を４％パラホルムアルデヒドまたは１０％ホルマリン緩衝液に浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行い、標本とした。【０１２２】
得られた標本について、細胞生存、血管新生、繊維化、血漿集積、及び細胞死について、４点方式で４段階評価を行った。同じ水準で複数個個体がある場合には、その平均値を算出した。
また、ｈＥＣＦＣ染色用にＣＤ３１抗体（EPT  Anti CD31/PECAM-1）にＤＡＢ発色を用いたキット（ダコLSAB2キット  ユニバーサル K0673  ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用）による免疫染色を行った。【０１２３】
実施例１２において、実施例８又は比較例６のｈＭＳＣモザイク細胞塊を皮下移植した２週間後のＨＥ標本を図７に示す。図７に記載の細胞数は、画像中の全生細胞数であり、血管の数はそれぞれの画像中にある血管の本数を面積あたりに換算した値である。
比較例６の単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊（生細胞数８１cells、血管０本/mm3）に比べ、実施例８の条件Ａ、Ｂ又はＣのブロックを用いたモザイク細胞塊（条件Ａ：生細胞数２４４cells、血管６１本/mm3、条件Ｂ：生細胞数９８cells、血管２０本/mm3、条件Ｃ：生細胞数１６８cells、血管３１本/mm3）では、血管が多く形成され、細胞も多く生存していることが分かる。【０１２４】
上記の通り、比較例６の細胞２８％、空隙３２％、生体親和性高分子ブロック４０％の単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊では、血管が形成されないのに対し、実施例８の細胞２８％、空隙５７％、生体親和性高分子ブロック１５％の「条件Ａ」のブロックを用いたモザイク細胞塊、細胞４１％、空隙３５％、生体親和性高分子ブロック２４％の「条件Ｂ」のブロックを用いたモザイク細胞塊、並びに細胞４２％、空隙４４％、ブロック１４％の「条件Ｃ」のブロックを用いたモザイク細胞塊では血管が形成されていることが分かる。上記の結果から、体積割合が細胞２０〜５０％、空隙３５〜６０％及び生体親和性高分子ブロック１０〜３０％を満たすモザイク細胞塊を用いた場合に血管形成を達成できることが分かる。【０１２５】
また、比較例６の単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）、実施例８の条件Ｂのブロック（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）を用いたモザイク細胞塊について、以下の基準により標本の評価を行った。それぞれの評価項目は、４点方式で段階評価を行った。【０１２６】
血管形成：
血管形成については、以下のように４段階で評価した。血管が存在しない場合は０点、低密度で存在する場合には１点、中程度の密度で存在する場合には２点、高密度で存在する場合には３点で評価した。
細胞生存：
細胞生存については、以下のように４段階で評価した。生細胞がほとんど存在しない場合には０点、まばらに存在する場合には１点、混み合って存在する場合には２点、埋め尽くすように存在している場合には３点で評価した。
細胞死：
死細胞については、以下のように４段階で評価した。死細胞が存在しない場合には０点、死細胞がほとんど存在しない場合には１点、まばらに存在する場合には２点、多く存在する場合には３点で評価した。【０１２７】
上記の結果を表２に示す。表２に記載の結果からも、比較例６の単純凍結ブロックを用いたモザイク細胞塊よりも実施例８のブロックを用いたモザイク細胞塊の方が血管形成が良好であることが分かる。【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
実施例１２において実施例９の条件Ｃのブロックを用いた場合のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を皮下に移植した結果、並びに実施例１２において実施例８の条件Ｃのブロックを用いた場合のｈＭＳＣモザイク細胞塊を皮下に移植した結果を図８に示す。図８に示す２つの結果を比較すると、実施例９のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊の方が、ｈＥＣＦＣによって多くの血管が形成されていることが分かる。【０１３０】
また、実施例１２において実施例９の条件Ｃのブロック（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）を用いた場合のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を皮下に移植したときの経時変化を図９に示す。移植１週後及び２週後では、ｈＥＣＦＣによって多くの血管が形成されているが、移植４週及び８週後では、形成された血管の維持がやや困難になっていることが分かる。【０１３１】
一方、実施例１３において実施例９のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊を腎被膜下に移植した結果を図１０に示す。腎被膜下では、皮下と異なり、形成された血管が移植４週間後でも血管が存在しており、さらに移植８週間後まで維持されていることが分かった。ｈＥＣＦＣ染色用にＣＤ３１抗体で免疫染色をすると、移植４週、８週後でも、ｈＥＣＦＣ由来の血管が存在していることが示された。【０１３２】
比較例７の細胞塊を腎被膜下に移植した場合では、血管は形成されないため、移植８週後まで血管は見られなかった（図１１）。腎被膜下に本発明のモザイク細胞塊を置くことで、血管を形成するだけでなく、長期で血管を維持することが可能であることが示された。得られた標本について、血管形成、細胞生存、細胞死については実施例１５と同様に解析を行った。また、血漿集積及び繊維化については以下の通り評価した。【０１３３】
血漿集積：
血漿集積については、以下のように４段階で評価した。血漿が存在しない場合には０点、わずかに存在する場合には１点、多く存在する場合には２点、血漿で満たされている場合には３点で評価した。
繊維化：
繊維化については、以下のように４段階で評価した。繊維化していない場合には０点、わずかに繊維を形成している場合には１点、繊維化が進行中である場合には２点、繊維化が進んで繊維が完全に形成されている場合には３点で評価した。【０１３４】
上記の評価の結果を表３に示す。表３の結果からも、皮下よりも腎被膜下に置くことで、血管が長期維持されることが分かる。【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
[参考例１] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
条件Ｄ：
アルミ硝子板・円筒形容器を使用し、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度７．５質量％であり、水溶液量は４ｍＬである。棚板温度の設定は、予め−４０℃に冷却しておいたところへＣＢＥ３水溶液入りのアルミ硝子板・容器を置き、棚板温度はそのまま−４０℃を維持して、凍結を行った。得られた凍結品に対して、その後、凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。【０１３７】
[参考例２] リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
参考例１において条件Ｄにより作製したＣＢＥ３多孔質体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回の計５分間行った。得られた粉砕物をステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ及び１０６μｍ〜１８０μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。その後、減圧下で１６０℃で熱架橋（架橋時間は８〜４８時間）を施して、リコンビナントペプチドブロックを得た。【０１３８】
[実施例１６]本発明及び比較例の生体親和性高分子ブロックの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像とＨＥ標本
実施例４の条件Ａのブロック（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）と参考例１の条件Ｄのブロック（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）と比較例２の単純凍結ブロック（ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）について、ブロックの表面構造と断面の形を見るために、ＳＥＭ像の撮影とＨＥ標本作製を行った。ＳＥＭ像を図１２に示し、ＨＥ標本を図１３に示した。【０１３９】
図１２のＳＥＭ像から、比較例２の単純凍結ブロックの表面は比較的平らであるのに対し、実施例４および参考例１のブロックはどちらも表面に凸凹があり、構造が複雑であることが分かる。これは、図１３のＨＥ標本を見ても確認できる。
この表面構造の違いによって、実施例４および参考例１のブロックを用いた細胞構造体では空隙が多く、比較例２のブロックを用いた細胞構造体では空隙が少なくなると考えられる。【０１４０】
[実施例１７]本発明のモザイク細胞塊の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例４で作製したＣＢＥ３ブロック（条件Ａ；ＣＢＥ３ブロックの大きさは５３〜１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。作製したモザイク細胞塊について、ＳＥＭ像の撮影を行った。ＳＥＭ像を図１４に示した。【０１４１】
図１４のＳＥＭ像から、複数のブロックを細胞がつなぎ合わせている状況が分かる。さらに、hMSCはブロックの凹部に入りこんでいるのではなく、凸部をつなぎ合わせるようにして接着していた。
これにより、培養液や酸素が通る隙間が形成されることから、間隙を介した液・ガス交換によってモザイク細胞塊内部でも細胞が生存することが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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