(57)【要約】  食経験が豊富であり安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れた時計遺伝子の発現量調整剤を提供する。オレウロペイン、3,4-DHPEA-EA、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を有効成分とする時計遺伝子の発現量調整剤。本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、Per1遺伝子およびBmal1遺伝子の発現量を逆位相に調節し、それによりPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項２】
オレウロペイン、その誘導体、およびそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、請求項１に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項３】
3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、その誘導体、およびそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、請求項１に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項４】
Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節し、それにより、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項５】
Per遺伝子がPer1遺伝子であり、Bmal遺伝子がBmal1遺伝子である、請求項４に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項６】
オリーブ抽出物を含む、時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項７】
オリーブ抽出物が、３０重量％以上のオリーブ由来ポリフェノールを含有する、請求項６に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項８】
オリーブ由来ポリフェノールがオレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含有する、請求項７に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項９】
オリーブ抽出物が、オリーブ葉を水、エタノール、またはこれらの混合物によって抽出したものである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品。
【請求項１１】
オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調もしくは疾患の予防、緩和、または治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を配合する工程を含むことを特徴とする、睡眠リズム調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
睡眠リズム調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造における、オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の時計遺伝子の発現量調整剤に関する。より詳細には、時計遺伝子PerおよびBmalの発現量調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物活動の多くが生物リズムとよばれる自律的な周期的変動を示すが、その中でもほぼ２４時間の周期を示すリズムを概日リズム（サーカディアンリズム）とよぶ。【０００３】
ヒトを初めとする哺乳類の睡眠リズムも、通常は概日リズムに従う。しかし、現代生活においては、交代勤務等の不規則な生活パターンや、国際線による長距離移動等に伴って、睡眠リズムが概日リズムに従わなくなることも多く、睡眠リズムの乱れによる睡眠障害や時差ぼけ（ジェットラグ）などの体調の不調やそれに伴う疾患が問題となっている。また、高齢者においては、睡眠リズムを形成するための内因性因子（例えばメラトニン）の合成低下が認められ、睡眠リズムの乱れによるQOLの低下も懸念されている（非特許文献１、非特許文献２）。したがって、睡眠リズムを正常に調整することは重要な課題となっている。【０００４】
睡眠リズムを調整する方法としては、これまでに、内因性ホルモンであるメラトニンやメラトニン誘導体の投与等が試みられている。しかし、ホルモンの投与は睡眠リズム以外のさまざまな生理現象にも影響を及ぼすため、副作用の問題も指摘されている（非特許文献３、非特許文献４）。【０００５】
近年、時計遺伝子とよばれる一群の遺伝子によって、さまざまな生物活動における概日リズムが調整されていることが明らかになってきた。時計遺伝子における変異と睡眠リズム障害とが関連していることも知られている（非特許文献５）。具体的な時計遺伝子としては、Per遺伝子(Per1、Per2、Per3)、Clock遺伝子、Bmal遺伝子(Bmal1、Bmal2、Bmal3)、Cry遺伝子(Cry1、Cry2)などが報告されている。なかでも、Per遺伝子とBmal遺伝子が重要な時計遺伝子であることがわかってきた。哺乳類では、Per遺伝子とBmal遺伝子はほぼ１２時間ずれた位相でそれぞれ概日リズムを刻んで発現されており、Bmalの発現は夜中増加し、一方Per遺伝子の発現は昼間増加する（特許文献1）。Per遺伝子とBmal遺伝子の発現リズムの位相がずれることは、概日リズムの乱れにつながる。したがって、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を調節することによって、これらの遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させることができれば、睡眠リズムの調整につながると考えられる。安全性が高く、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムの位相を正常な状態に効果的に同調させることができる、時計遺伝子の発現量調整剤が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2011/122041
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vitiello MV. , Clin Corne rstone 2000;2(5):16-27
【非特許文献２】Mishima K. et al. ,Chronobiol Int 2000 May;17(3):419-32
【非特許文献３】Monti JM, Cardinali DP. , Biol Signals Recept 2000,9:328-39
【非特許文献４】Reiter RJ., Ann Med 1998, 30:103-8
【非特許文献５】石田、２００９年、生化学、第８１巻、第２号、第７５−８３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高く、日常的に摂取可能であって、しかも効果の高い、時計遺伝子の発現量調整剤、特にPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量調整剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、食経験が豊富で安全性が高い天然物素材の中から有効な成分の探索を行った結果、オリーブから抽出されたポリフェノール類であるオレウロペインに、時計遺伝子であるPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量調節作用があることを見出した。また、オレウロペインの代謝産物である3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸（3,4-dihydroxyphenylethanol-elenolic acid。以下、3,4-DHPEA-EAと記載する）にもPerおよびBmalの発現量調節作用があることを見出した。オレウロペインおよび3,4-DHPEA-EAは、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節することによって、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させることができ、ひいては睡眠リズムを正常に調整することができる。  【００１０】
すなわち、本発明は、これらに限定されるわけではないが以下を包含する。
［１］  オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む時計遺伝子の発現量調整剤。
［２］  オレウロペイン、その誘導体、およびそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、［１］に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［３］  3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、その誘導体、およびそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、［１］に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［４］  Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節し、それにより、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［５］  Per遺伝子がPer1遺伝子であり、Bmal遺伝子がBmal1遺伝子である、［４］に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［６］  オリーブ抽出物を含む、時計遺伝子の発現量調整剤。
［７］  オリーブ抽出物が、３０重量％以上のオリーブ由来ポリフェノールを含有する、［６］に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［８］  オリーブ由来ポリフェノールが、オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含有する、［７］に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［９］  オリーブ抽出物が、オリーブ葉を水、エタノール、またはこれらの混合物によって抽出したものである、［６］〜［８］のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤。
［１０］  ［１］〜［９］のいずれか一項に記載の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品。
［１１］  オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を含む、睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調もしくは疾患の予防、緩和、または治療のための医薬組成物。
［１２］  オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物を配合する工程を含むことを特徴とする、睡眠リズム調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造方法。
［１３］  睡眠リズム調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造における、オレウロペイン、3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸、およびそれらの誘導体、ならびにそれらの塩からなる群より選択される一以上の化合物の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、オレウロペインおよび／または3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸（以下、3,4-DHPEA-EAとも表記する）を有効成分として含むことによって、PerおよびBmalの２つの遺伝子の発現量を逆位相に調節することができ、それによってPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させ、睡眠リズムを効果的に調整することができる。また、本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、オリーブに含まれるオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを有効成分とするため、食経験が豊富で副作用が少なく、安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、オレウロペイン高含量オリーブ抽出物を投与したSDラットの肝臓における、時計遺伝子Bmal1の遺伝子発現量を示す。
【図２】図２は、オレウロペイン高含量オリーブ抽出物を投与したSDラットの肝臓における、時計遺伝子Per1の遺伝子発現量を示す。
【図３】図３は、3,4-DHPEA-EAを投与したヒト肝臓癌由来細胞株HepG2における、時計遺伝子Bmal1の遺伝子発現量を示す。
【図４】図４は、3,4-DHPEA-EAを投与したヒト肝臓癌由来細胞株HepG2における、時計遺伝子Per1の遺伝子発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜時計遺伝子の発現量調整剤＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、有効成分としてオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを含むことにより、時計遺伝子であるPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節することができ、それにより、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させ、睡眠リズムを正常に調整することができる。したがって、本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、睡眠障害、時差ぼけ（ジェットラグ）等の、睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調や疾患の予防、緩和、治療等に効果的に利用することができる。
＜Per遺伝子およびBmal遺伝子＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、有効成分としてオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを含むことにより、時計遺伝子の発現を調節することができ、特にPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節することができる。
【００１４】
時計遺伝子は、概日リズムの調整に働く一群の遺伝子をいい、これらの遺伝子に変異がある場合、行動のリズムに影響を与える遺伝子として定義される（石田、２００９年、生化学、第８１巻、第２号、第７５−８３頁）。特に主要な因子として、Period（Per）遺伝子およびBmal遺伝子がある。
【００１５】
哺乳類においては、Period遺伝子ファミリーであるperiod1 （per1）、period2 （per2）、period3 （per3）について、時計遺伝子としての機能が知られている。また、Bmal遺伝子ファミリーであるBmal1について、時計遺伝子としての機能が知られている。Bmal1遺伝子産物であるBMAL1はCLOCKとヘテロ二量体を形成してPeriod遺伝子の転写を促進し、一方で、Period遺伝子産物であるPERIODはCRYPTOCHROMEとヘテロ二量体を形成してBMAL1およびCLOCKの活性を抑制する。
【００１６】
哺乳類では、Per遺伝子とBmal遺伝子はほぼ１２時間ずれた位相でそれぞれ概日リズムを刻んで発現されており、Bmalの発現は夜中増加し、一方Per遺伝子の発現は昼間増加する。これが、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムの正常な位相である。Per遺伝子とBmal遺伝子の発現リズムの位相がずれることは、睡眠リズム等の概日リズムの乱れにつながる。
【００１７】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節することによって、Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現リズムを正常な位相に同調させることができる。
＜Per遺伝子およびBmal遺伝子の発現量解析＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤によって調節されたPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量は、当業者に知られた任意の方法を用いて評価することができる。
【００１８】
生体を用いた評価のためには、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ヒト等の被検動物を目的に応じて用いることができる。対照群には被検物質を投与せず、試験群には被検物質を投与して、一定期間飼育する。投与方法は、経口投与、局所投与、経腸投与等の任意の方法を目的に応じて選択してよい。飼育後、対照群および試験群からそれぞれ生体試料を採取する。遺伝子発現解析に供するための生体試料としては、細胞が含まれていればいかなるものをも用いることができるが、たとえば毛包細胞を含む毛髪、皮膚、肝臓等の試料、血液、唾液等を用いることができる。採取した試料から、定法により総RNAを抽出し、それを用いて時計遺伝子の発現量を解析する。
【００１９】
培養細胞を用いた評価のためには、任意の培養細胞株を用いてよいが、HepG2等の肝臓由来細胞株を好適に用いることができる。対照群の細胞には被検物質を投与せず、試験群の細胞には被検物質を投与して、一定期間培養する。培養後、対照群の細胞および試験群の細胞をそれぞれ回収し、定法により総RNAを抽出し、それを用いて時計遺伝子の発現量を解析する。
【００２０】
生体を用いた評価および培養細胞を用いた評価における時計遺伝子の発現量の解析には、たとえば、PerまたはBmal遺伝子配列中の任意の配列をプローブとして用いたノーザンブロッティング解析、リアルタイムRT-PCR解析、DNAマイクロアレイを用いた発現量解析などの方法を好適に用いることができる。
＜化合物＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、有効成分として、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを含む。
【００２１】
本発明においては、オレウロペインおよび3,4-DHPEA-EAのみならず、その誘導体や、任意の塩の形態のものを用いることもできる。オレウロペインまたは3,4-DHPEA-EAの誘導体とは、オレウロペインまたは3,4-DHPEA-EAの水酸基等に化学的修飾を施すことによって得られる化合物群を含み、オレウロペインまたは3,4-DHPEA-EAのエステル、配糖体などが挙げられる。
＜オレウロペイン＞
オレウロペイン（CAS番号：32619-42-4）は、オリーブに豊富に含まれるポリフェノール成分のひとつである。オレウロペインは、以下の構造式を有する。
【００２２】
【化１】
2015029968.tif 000002
【００２３】
＜3,4-DHPEA-EA＞
3,4-ジヒドロキシフェニルエタノール-エレノール酸（3,4-dihydroxyphenylethanol-elenolic acid (3,4-DHPEA-EA))は、オリーブオイル、特にエクストラバージンオリーブオイルに含まれる主要ポリフェノールのひとつである。
【００２４】
また、3,4-DHPEA-EAについては、大腸菌の内在性のβ-グルコシダーゼの作用により、オレウロペインが代謝されて生じることが報告されている (J Biotechnol. 2004 Jul 1;111(1):67-77.)。
【００２５】
3,4-DHPEA-EAは、以下の構造で表すことができる。
【００２６】
【化２】
2015029968.tif 000003
【００２７】
または
【００２８】
【化３】
2015029968.tif 000004
【００２９】
オレウロペインをβ-グルコシダーゼによって加水分解して得られる3, 4-DHPEA-EAは、9位のメチル基の立体配置が異なるジアステレオマー混合物である（Natural Products Research, 19(2), 105-109(2005)；およびJournal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 3198-3203(2001)）
＜時計遺伝子の発現量調整剤＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤では、有効成分としてオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを豊富に含むオリーブ等の植物原料をそのまま用いてよい。また、オリーブ等の植物原料から抽出した、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物を本発明の時計遺伝子の発現量調整剤の有効成分として用いてもよい。オリーブ等の植物原料から得た単離オレウロペインまたは単離3,4-DHPEA-EAを本発明の時計遺伝子の発現量調整剤の有効成分として用いることもできる。
【００３０】
オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを豊富に含む植物原料をそのまま本発明の時計遺伝子の発現量調整剤として用いる場合は、たとえばオリーブの葉、果実、種子、茎等を生のまま、あるいは凍結乾燥等によって乾燥したものなどを用いることができる。オリーブの葉を用いる場合は、他の植物種の葉、たとえば茶葉などと混合したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から搾油したオリーブオイルも用いることができる。オリーブオイルは、市販のものを用いてもよいし、オリーブより公知の方法で調製してもよい。
【００３１】
また、後述する方法により、オリーブ等の植物原料から単離オレウロペインまたは単離3,4-DHPEA-EAを得ることもできる。
【００３２】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤の有効成分であるオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの含量は、効果面を考慮して任意に決定することができるが、時計遺伝子の発現量調整剤中に０．０１〜６０重量％含まれることが好ましく、０．１〜５０重量％含まれることがより好ましく、１〜４０重量％含まれることがさらに好ましい。有効成分としてオレウロペインを用いる、時計遺伝子の発現量調整剤中に０．０１〜６０重量％含まれることが好ましく、０．１〜５０重量％含まれることがより好ましく、１〜４０重量％含まれることがさらに好ましい。有効成分として3,4-DHPEA-EAを用いる場合、時計遺伝子の発現量調整剤中に０．０１〜６０重量％含まれることが好ましく、０．１〜５０重量％含まれることがより好ましく、１〜４０重量％含まれることがさらに好ましい。また、目的に応じて、オレウロペインおよび3,4-DHPEA-EAを組み合わせたものを、本発明の時計遺伝子の発現量調整剤の有効成分として用いてもよい。その場合、オレウロペインと3,4-DHPEA-EAを合わせて、時計遺伝子の発現量調整剤中に０．０１〜６０重量％含まれることが好ましく、０．１〜５０重量％含まれることがより好ましく、１〜４０重量％含まれることがさらに好ましい。
＜オリーブ＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤としては、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを豊富に含む植物原料としてのオリーブの葉、果実、種子、茎等をそのまま用いてもよく、オリーブ等の植物原料から得たオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物や単離オレウロペインまたは単離3,4-DHPEA-EAを用いてもよい。いかなる品種のオリーブをも用いることができるが、たとえばマンザニロ、ルッカ、ネバディロ・ブランコ、ミッション、ピクアル、アルベキナ、オヒブランカ、コルニカブラ、ゴルダル、モロイオロ、フラントイオ、コラティーナ、レッチーノ等の品種を好適に使用することができる。
【００３３】
オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物や単離オレウロペインまたは単離3,4-DHPEA-EAの調製のための植物原料には、オリーブの葉、果実、種子、茎等のいずれの部位を用いてもよいが、葉を用いるのが好ましい。植物原料は生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。
＜オリーブ抽出物＞
オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物の調製には、オリーブ由来ポリフェノールを豊富に含有する抽出物が得られる方法であれば、いかなる方法を用いてもよい。ここでいうオリーブ由来ポリフェノールは、オリーブに含まれるポリフェノールであって、ヒドロキシチロソール骨格を構造の一部に含むもの、チロソール骨格を構造の一部に含むもの、カフェ酸骨格を構造の一部に含むもの、ｐ−クマル酸骨格を構造の一部に含むもの、またはこれらの混合物をいう。ヒドロキシチロソール骨格を構造の一部に含むオリーブ由来ポリフェノールの例には、ヒドロキシチロソールならびにその前駆体および代謝物等がある。チロソール骨格を構造の一部に含むオリーブ由来ポリフェノールの例には、チロソールならびにその前駆体および代謝物等がある。カフェ酸骨格を構造の一部に含むオリーブ由来ポリフェノールの例には、カフェ酸ならびにその前駆体および代謝物等がある。ｐ−クマル酸骨格を構造の一部に含むオリーブ由来ポリフェノールの例には、ｐ−クマル酸ならびにその前駆体および代謝物等がある。オリーブ由来ポリフェノールには、オレウロペインが、好ましくは０.０１〜６０重量％、より好ましくは０.１〜５０重量％、更に好ましくは１〜４０重量％含まれる。
【００３４】
本発明のオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物は、オリーブ由来ポリフェノールを豊富に、好ましくは３０重量％以上含有する抽出物が得られる方法で調製することができる。具体的には、たとえば以下の方法で、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物を調製することができる。
（１）オリーブの水性抽出物を調製する。オリーブの水性抽出物は、前記植物原料を用いて、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法により得ることができる。たとえば、オリーブの葉を生のまま又は乾燥したものを用いて、そのまま又は粗砕機によって粉砕したものを、水性溶媒によって抽出して得ることができる。また、市販のオリーブ葉抽出物（例えば、エーザイフード・ケミカル株式会社）を用いることもできる。
（２）オリーブの水性抽出物を、吸着樹脂を充填したカラムに通導させたのち、水、エタノール、またはこれらの混合物を用いて溶出することにより、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの濃縮画分を得る。吸着樹脂としては、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを吸着するものであれば何を用いてもよいが、たとえば合成ポリマー系樹脂MCI-GEL CHP20（三菱化学株式会社）を好適に用いることができる。また、水、エタノール、又はこれらの混合物を用いた溶出については、使用するオリーブの水性抽出物や吸着樹脂の性質に応じて、当業者は適宜その条件を設定することができる。たとえば水、20.0％エタノール水溶液、30.0％エタノール水溶液、32.5％エタノール水溶液、35％エタノール水溶液、37.5％エタノール水溶液のステップワイズ溶出を行い、得られた37.5％エタノール水溶液画分を、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物として本発明に用いることができる。
【００３５】
オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを高い含量で含むオリーブ抽出物は、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの濃度が、０．０１〜６０重量％であることが好ましく、０．１〜５０重量％であることがより好ましく、１〜４０重量％含まれることがさらに好ましい。
＜単離オレウロペイン＞
単離オレウロペインは、たとえば以下のような方法で調製することができる。
（１）上記の操作で得られたオリーブ抽出物をアセトニトリル水溶液等の溶媒に溶解し、フィルターろ過した後、分取高速クロマトグラフィー等を用いてオレウロペイン画分を得る。
（２）得られたオレウロペイン画分を、凍結乾燥等によって乾燥させ、単離オレウロペイン粉末を得る。
＜単離3,4-DHPEA-EA＞
単離3,4-DHPEA-EAは、たとえば以下のような方法で調製することができる。
（１）上記の操作で得られた単離オレウロペインにβ−グルコシダーゼを加え、反応させる。
（２）反応終了後、減圧濃縮し、3,4-DHPEA-EA粗画分を得る。
（３）得られた3,4-DHPEA-EA粗画分を分取高速液体クロマトグラフィー等に供して精製し、3,4-DHPEA-EAを得る。
（４）得られた3,4-DHPEA-EAを、凍結乾燥等によって乾燥させ、単離3,4-DHPEA-EAを得る。
＜時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は飲食品に添加することができる。すなわち、本発明は、時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品を提供する。たとえばオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを有効成分とするサプリメント、ならびに一般の飲食品にオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを配合して、その飲食品に時計遺伝子の発現量調整効果を付与した機能性食品（健康補助食品、栄養機能食品、特別用途食品、特定保健用食品等の健康食品、動物用サプリメントを含む）、動物用飼料等、経口摂取される形態として使用できる。本発明の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品は、包装、容器または説明書に有効成分の種類、用途、時計遺伝子の発現量調整や睡眠リズム改善等に関する効能効果、および／または摂取方法を表示することができる。
【００３６】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品は、いかなる形態であってもよく、例えば、ジュース、牛乳、コーヒー飲料、茶飲料等の飲料、スープ等の液状食品、ヨーグルト等のペースト状食品、ゼリー、グミ等の半固形状食品、クッキー、ガム等の固形状食品、ドレッシング、マヨネーズ等の油脂含有食品等のどのような形態でもよい。その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。また、茶葉等にオリーブの葉を配合したものにオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを添加して、時計遺伝子の発現量効果を強化した飲食品とすることもできる。
【００３７】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品には、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの効果を損なわない、すなわち、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも飲食品に一般的に用いられるものが使用できる。また、本発明の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品には、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの効果を損なわない限り、他の生理活性成分を混合することもできる。
【００３８】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤を添加した飲食品は、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを、好ましくは０．００１〜２０重量％、より好ましくは０．０１〜１５重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％で含有する。オレウロペインを用いる場合は、飲食品中に好ましくは０．００１〜２０重量％、より好ましくは０．０１〜１５重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％でオレウロペインを含有する。3,4-DHPEA-EAを用いる場合は、飲食品中に好ましくは０．００１〜２０重量％、より好ましくは０．０１〜１５重量％、さらに好ましくは０．１〜１０重量％で3,4-DHPEA-EAを含有する。
＜睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調もしくは疾患の予防、緩和、または治療のための医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを有効成分として含むことにより、不規則な生活パターンが引き起こす睡眠障害や、飛行機移動による時差ぼけ（ジェットラグ）等の、睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調もしくは疾患を予防、緩和、または治療するために使用することができる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤等と共に、一般的な方法により目的に応じて製剤化することができる。希釈剤、担体の例としては、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等の液体希釈剤、グルコース、シュークロース、デキストリン、シクロデキストリン、アラビアガム等固体希釈剤又は賦形剤を挙げることができる。また、製剤化において一般的に使用される乳化剤、緊張化剤（等張化剤）、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤等を適宜配合することもできる。
【００４０】
本発明の医薬組成物には、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの効果を損なわない、すなわち、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り、必要に応じて、ミネラル；ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ等のビタミン類；栄養成分；香料；色素などの他の添加物を混合することができる。これらの添加物はいずれも医薬品に一般的に用いられるものが使用できる。また、本発明の医薬組成物には、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの効果を損なわない限り、他の生理活性成分を混合することもできる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；またはペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調製することができる。具体的な剤形としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などが例示できる。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜２０重量％で含有する。オレウロペインを用いる場合は、本発明の医薬組成物中に好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜２０重量％でオレウロペインを含有する。3,4-DHPEA-EAを用いる場合は、本発明の医薬組成物中に好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜２０重量％で3,4-DHPEA-EAを含有する。
【００４３】
本発明の医薬組成物の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、その他の条件によって適宜選択すればよい。例えば、ヒト（成人）を対象に時計遺伝子の発現量調整効果を得ることを目的として経口投与する場合には、一般に、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを１日当たり0.01〜500 ｍｇ、好ましくは0.1〜300 ｍｇ、さらに好ましくは10〜200ｍｇ程度となるように、１日に1〜3回程度連続投与するとよい。オレウロペインを用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に時計遺伝子の発現量調整効果を得ることを目的として経口投与する場合には、オレウロペインを１日当たり0.01〜500 ｍｇ、好ましくは0.1〜300 ｍｇ、さらに好ましくは1〜200ｍｇ程度となるように、１日に1〜3回程度連続投与するとよい。3,4-DHPEA-EAを用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に時計遺伝子の発現量調整効果を得ることを目的として経口投与する場合には、3,4-DHPEA-EAを１日当たり0.01〜500 ｍｇ、好ましくは0.1〜300 ｍｇ、さらに好ましくは1〜200ｍｇ程度となるように、１日に1〜3回程度連続投与するとよい。オレウロペインおよび3,4-DHPEA-EAを組み合わせて用いる場合は、例えば、ヒト（成人）を対象に時計遺伝子の発現量調整効果を得ることを目的として経口投与する場合には、オレウロペインおよび3,4-DHPEA-EAを合わせて１日当たり0.01〜500 ｍｇ、好ましくは0.1〜300 ｍｇ、さらに好ましくは1〜200ｍｇ程度となるように、１日に1〜3回程度連続投与するとよい。
＜飲食品または医薬組成物の製造＞
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、有効成分として、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを含むことにより、時計遺伝子であるPer遺伝子およびBmal遺伝子の発現量を逆位相に調節することができる。そして、飲食品または医薬組成物として提供することができる。  
【００４４】
すなわち、本発明は別の観点からは、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを配合する工程を含む時計遺伝子の発現量調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造方法である。さらに、別の観点からは、時計遺伝子の発現量調整作用を有する飲食品または医薬組成物の製造におけるオレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAの使用である。
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
試験例１  単離オレウロペインの時計遺伝子の発現量調整効果
単離オレウロペインの時計遺伝子の発現量調節効果を下記の方法により評価した。
＜被験サンプル＞
単離オレウロペインは、下記（１）（２）に示す工程で得たものを用いた。
（１）オリーブ葉抽出物（102 g、エーザイフード・ケミカル株式会社）を24倍量の水に溶解後合成ポリマー系樹脂MCI-GEL CHP20（1.2 L 三菱化学株式会社社製）を充填させたカラムに通導させたのち、水（1.2 L）、20.0％エタノール水溶液（1.2 L）、30.0％エタノール水溶液（1.2 L）、32.5％エタノール水溶液（1.2 L）、35％エタノール水溶液（1.2 L）、37.5％エタノール水溶液（1.2 L）を流し、オレウロペイン濃縮画分（42 g）を得た。
（２）続いて、上記の操作で得られたオレウロペイン濃縮画分を30％アセトニトリル水溶液にて45%（w/v）になるよう溶解させ、0.45μmのメンブランフィルターでろ過した後、以下の条件で分取高速クロマトグラフィーに供し、オレウロペイン（27 g）を単離した。
（分取高速液体クロマトグラフィーの条件）
検出器：295 nm
カラム：Develosil ODS-HG-15/30（φ5.0×500 mm、野村化学株式会社製）
＜評価方法＞
7週齢雄性SDラットを１週間馴化させた後、対照食群、試験食群（単離オレウロペイン投与群）に群分けした（各群6匹）。次に、単離オレウロペインを、蒸留水(大塚製薬)に溶かし、これを被験食品群として200 mg/5 ml/kgで1日1回5日間強制経口投与した。尚、対照食群には蒸留水(大塚製薬)を5 ml/kgで1日1回5日間強制経口投与した。最終投与から4時間後に肝臓の採取を行った。【００４７】
採取した肝臓から、定法により総RNAを抽出し、それを用いて定量PCR法（Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステム）にて時計遺伝子であるBmal1、Per1の発現量を解析した。
＜結果＞
Bmal1遺伝子の発現量を図１に、Per1遺伝子の発現量を図２に示す。対照群と比較し、単離オレウロペイン投与群でBmal1の発現量が有意に減少し、Per1の発現量が有意に増加した。先述した通り、正常な概日リズムにおいてはBmal1とPer1の発現量が逆位相になる事が分かっている。今回、単離オレウロペイン投与群において、Bmal1とPer1発現変動の逆位相が確認された。具体的には、単離オレウロペインはBmal1の発現量を減少させる一方でPer1の発現量を増加させた。即ち、オレウロペインは、時計遺伝子の発現を正常なパターンに調節することで、ずれた位相の同調を促進する作用があることが分かった。
【実施例２】
【００４８】
試験例２  単離3,4-DHPEA-EAの時計遺伝子の発現量調整効果
単離3,4-DHPEA-EAの時計遺伝子の発現量調節効果を下記の方法により評価した。
＜被験サンプル＞
単離3,4-DHPEA-EAは、下記に示す工程で得たものを用いた。【００４９】
オレウロペイン（100 mg）にβ-グルコシダーゼ（シグマ社製）を加え、これをpH 6.86の緩衝溶液中で37℃、15時間反応させた。反応終了後、減圧濃縮し、3,4-DHPEA-EA粗分画を得た。これを以下に示す分取高速液体クロマトグラフィーに供し、3,4-DHPEA-EAを9.0 mg単離した。
（分取高速液体クロマトグラフィーの条件）
検出器：295nm
カラム：Develosil ODS-HG-15/30（φ50×500 mm、野村化学株式会社製 ）
溶媒：45%アセトニトリル水溶液
カラム温度：室温
流速：30 ml/min
得られた3,4-DHPEA-EA試料の核磁気共鳴スペクトルデータを以下に示す。【００５０】
【表１】
2015029968.tif 000005
【００５１】
＜評価方法＞
培養細胞(ヒト肝臓癌由来細胞株HepG2)を2.5 x 103 cells/cm2でT-75フラスコ(BD Falcon（登録商標）)に播種し、3日毎に培地交換(RPMI1640, 10% FBS)を行った。80％コンフルエントになった細胞を4.2 x 104 cell/mlの濃度で6well plate(BD Falcon（登録商標）)に継代し、各細胞の概日リズムの位相を同調させるために、3日後に培地を低血清培地(RPMI1640, 2% FBS)に交換した。低血清培地交換3日後に細胞を実験に供した。被験物質のDMSO溶解液（50μg/μl ）を調製し、この溶解液を被験物質の終濃度で50μg/mlになるよう6well plateに添加した。コントロールにはDMSOを添加した(終濃度0.1%)。【００５２】
被験物質添加8時間後に細胞を回収し、定法に従いmRNAを抽出した。抽出したmRNAを用いて、時計遺伝子であるBmal1およびPer1の発現量をqPCR法(Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムPCRシステム)にて解析した。
＜結果＞
Bmal1遺伝子の発現量を図３に、Per1遺伝子の発現量を図４に示す。先述した通り、正常な概日リズムにおいてはBmal1とPer1の発現量が逆位相になる事が分かっている。今回、3,4-DHPEA EAを添加した場合において、Bmal1とPer1の発現量が逆位相になる事が確認された。具体的には、3,4-DHPEA EAはBmal1の発現量を減少させる一方でPer1の発現量を増加させた。即ち、3,4-DHPEA EAは、時計遺伝子の発現を正常なパターンに調節することで、ずれた位相の同調を促進し、概日リズムを正常に戻す効果があることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、有効成分として、オレウロペインおよび／または3,4-DHPEA-EAを含むことにより、時計遺伝子の発現量を効果的に調整することができる。したがって、本発明の時計遺伝子の発現量調整剤は、睡眠障害、時差ぼけ（ジェットラグ）等の、睡眠リズムの乱れが引き起こす体調の不調や疾患の予防、緩和、治療等に有効に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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