(57)【要約】  本発明は、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）を有効成分として含有する、糖尿病の予防及び／又は治療薬、特に細胞への糖取込みを促進させる、糖尿病の予防及び／又は治療薬等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、糖尿病の予防及び／又は治療薬。
【請求項２】
糖尿病が、１型糖尿病である、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項３】
糖尿病が、２型糖尿病である、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項４】
細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項５】
８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸を有効成分として含有する、細胞への糖取込み促進剤。
【請求項６】
研究用試薬である、請求項５記載の剤。
【請求項７】
有効量のＤＣＰ−ＬＡをそれを必要とする対象に投与することを特徴とする、糖尿病の予防及び／又は治療方法。
【請求項８】
細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
糖尿病の予防及び／又は治療に使用するためのＤＣＰ−ＬＡ。
【請求項１０】
細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする請求項９記載のＤＣＰ−ＬＡ。
【請求項１１】
ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、細胞への糖取込みを促進させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）の新規用途、より詳細には細胞内糖取込み促進作用に基づく糖尿病治療薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリンの働きが悪くなり、血糖が高くなり、尿にも糖が出る病気である。インスリンは、膵臓のβ細胞で産生、分泌され、肝臓や筋肉でグルコースからグリコーゲン（貯蔵型のグルコース）への合成を促進し、肝臓でのグリコーゲンからグルコースへの分解を抑えて、血糖値の上昇を抑える。
過食、運動不足、肥満、ストレス、遺伝的素因が主たる理由で患者が増えている。
糖尿病は絶対的にインスリンが不足する１型糖尿病と相対的に不足する２型糖尿病に大別される。１型の治療にはインスリン注射が基本であり、２型の治療には食事、運動療法が基本であるが、血糖のコントロールが悪い場合には薬物療法が必要になる。薬物療法としては経口糖尿病治療薬あるいはインスリンが用いられるが、いずれも副作用の点、ＱＯＬの点等から改善が求められている。【０００３】
また、内臓脂肪の蓄積に起因して高血圧、高脂血症、糖尿病等の生活習慣病が発症した状態をメタボリックシンドロームと称し、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞等）の発症リスクを高めるものとして広く認知されるようになっている。従って糖尿病を予防・治療することができれば、必然的にメタボリックシンドロームの予防・治療に有効である。【０００４】
一方、リノール酸誘導体である８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）は、体内での代謝の遅延を可能とし、且つシナプス伝達の安定なＬＴＰ（long-term potentiation）様増強を持続できる、シナプス伝達効率の長期増強作用を有する化合物である（特許文献１）。
ＤＣＰ−ＬＡについてはまた、幾つかの報告がなされている。例えば、ＤＣＰ−ＬＡが選択的かつ直接的にＰＫＣ−εを活性化すること（非特許文献１）、ＤＣＰ−ＬＡが老化促進マウスの認知機能障害を改善すること（非特許文献２）、ＤＣＰ−ＬＡが海馬神経細胞からのγアミノ酪酸の放出を増加させること（非特許文献３）、ＤＣＰ−ＬＡがアミロイドβペプチドあるいはスコポラミン処理ラットの認知機能障害を改善すること（非特許文献４）、ＤＣＰ−ＬＡがグルタミン酸作動性シナプス前細胞に発現するα７ニコチン性アセチルコリン受容体を標的として海馬シナプス伝達を促進させること（非特許文献５）が報告されている。さらに、近年ＤＣＰ−ＬＡに酸化ストレスによって誘導される神経細胞死を抑制する作用があることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／５００１３号公報
【特許文献２】特開２００８−１４３８１９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kanno Tら，J Lipid Res., 2006, 47(6):1146-56.
【非特許文献２】Yaguchi Tら，Neuroreport, 2006, 23;17(1):105-8.
【非特許文献３】Kanno Tら，J Neurochem., 2005, 95(3):695-702.
【非特許文献４】NagataらT, Psychogeriatrics, 2005, 5:122-126.
【非特許文献５】Yamamotoら, Neuroscience 2005, 130(1):207-213.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を解明し、新規用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者はＤＣＰ−ＬＡが有する薬理作用、生体に及ぼす影響を詳細に検討する過程で、驚くべきことに、ＤＣＰ−ＬＡに従来知られていた認知機能の改善に有用な薬理作用以外に細胞内糖取込み促進作用があること、かかる作用によりＤＣＰ−ＬＡが糖尿病の予防及び／又は治療薬として効果的に機能し得ることを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、糖尿病の予防及び／又は治療薬。
［２］糖尿病が、１型糖尿病である、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。
［３］糖尿病が、２型糖尿病である、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。
［４］細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の予防及び／又は治療薬。
［５］ＤＣＰ−ＬＡを有効成分として含有する、細胞への糖取込み促進剤。
［６］研究用試薬である、上記［５］記載の剤。
［７］有効量のＤＣＰ−ＬＡをそれを必要とする対象に投与することを特徴とする、糖尿病の予防及び／又は治療方法。
［８］糖尿病が、１型糖尿病である、上記［７］記載の方法。
［９］糖尿病が、２型糖尿病である、上記［７］記載の方法。
［１０］細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］糖尿病の予防及び／又は治療に使用するためのＤＣＰ−ＬＡ。
［１２］糖尿病が、１型糖尿病である、上記［１１］記載のＤＣＰ−ＬＡ。
［１３］糖尿病が、２型糖尿病である、上記［１１］記載のＤＣＰ−ＬＡ。
［１４］細胞への糖取込みを促進させることを特徴とする、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載のＤＣＰ−ＬＡ。
［１５］ＤＣＰ−ＬＡで細胞を処理することを特徴とする、細胞への糖取込みを促進させる方法。
【発明の効果】
【０００９】
ＤＣＰ−ＬＡは、細胞への糖取込みを促進する作用、及び血糖値低下作用を有し、それらの作用に基づいた各種試薬（剤）、並びに糖尿病の予防及び／又は治療薬として有用である。本発明の予防及び／又は治療薬は、既存の薬物とは異なる作用機序を有するので、既存の薬物において問題となっていたような副作用を回避することができる。また、本発明の剤は、そのような予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞へのグルコース取込みにおけるＤＣＰ−ＬＡの効果について示すグラフである。（Ａ）はＤＣＰ−ＬＡ存在下又は非存在下、グルコース含有ＰＢＳ中で脂肪細胞をインキュベートし、その後の細胞外のグルコース濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示す。コントロールと比較したＰ値、Dunnett’s test。（Ｂ）はＤＣＰ−ＬＡ及び／又はＧＦ１０９２０３Ｘ（ＧＦ）の存在下又は非存在下、グルコース含有ＰＢＳ中で脂肪細胞をインキュベートし、その後の細胞外のグルコース濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示す。グラフ中、各カラムはグルコース取込の平均値（±ＳＥＭ）を示している（ｎｍｏｌ／μｇタンパク質／ｍｉｎ）（各試験についてｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test. NS, not significant.
【図２】図２は、ＤＣＰ−ＬＡによる細胞内への糖取込み促進作用がＧＬＵＴ４の細胞膜への移行刺激によるものではないことを示す図である。ＤＣＰ−ＬＡで処理した３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞、あるいは未処理の３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞（Control）を溶解し細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）とに分離した。各画分について抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、（細胞膜画分におけるｃ−ｍｙｃシグナル強度）／（全細胞におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）の割合の平均値（±ＳＥＭ）を示している（各試験についてｎ＝４）。NS, not significant; unpaired t-test
【図３】図３は、１型糖尿病（ＤＭ）モデルマウス（Ａ）及び２型ＤＭモデルマウス（Ｂ）におけるＤＣＰ−ＬＡの有利な効果を示す図である。１型ＤＭマウスとしてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、２型ＤＭモデルマウスとしてC57BL/KsJ-leprdb/leprdb マウスを用いた。１２時間のグルコース飢餓の後、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を各マウスに経口投与し経時的に血中のグルコース濃度を測定した。グラフ中、各ポイントは血中グルコース濃度の平均値（±ＳＥＭ）を示している（各試験についてｎ＝４〜８）。Ｐ値、フィッシャーのＰＬＳＤ（protected least significant difference）法
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において有効成分として用いられる８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（本明細書中、必要に応じてＤＣＰ−ＬＡと省略）は、以下の構造式を有する。
【００１２】
【化１】
2015105094.tif 000002
【００１３】
ＤＣＰ−ＬＡは、例えば、ＷＯ０２／５００１３で示される方法によって製造することができる。また、ＤＣＰ−ＬＡには４つの光学異性体が存在する（α，α−ＤＣＰ−ＬＡ、α，β−ＤＣＰ−ＬＡ、β，α−ＤＣＰ−ＬＡ、β，β−ＤＣＰ−ＬＡ）が、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。これらの異性体は、例えば、ＷＯ２０１２／０６７１１１で示される方法によって製造することができる。
【００１４】
本発明においてＤＣＰ−ＬＡはまた、その塩として用いられてもよい。かかる塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、被験体は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００１６】
ＤＣＰ−ＬＡは、実施例にてデータで示されるように、（１）細胞への糖取込みを促進する作用、及び（２）糖尿病モデルマウスに対して血糖値を下げる作用を有する。
（１）細胞への糖取込み促進作用
グルコースの細胞内への取込みは、脂肪細胞や骨格筋細胞の細胞膜表面上に発現するＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４）を介して行われる。グルコースを細胞内へ取り込むことにより血糖値をさげる。ＤＣＰ−ＬＡはこのグルコースの細胞内取込みを促進することによって血糖値を低下させることができる。
ここで、「細胞」とはグルコースを取込むことができる細胞であれば特に限定されないが、脂肪細胞、骨格筋細胞、肝細胞等が挙げられる。
（２）血糖値低下作用
ＤＣＰ−ＬＡはインスリンを必要とせずに血糖値を低下させることができるので、２型糖尿病の治療に有用である。
これらの優れた薬理作用により、本発明は糖尿病の予防及び／又は治療薬として、またメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療薬として有用である（以下、本発明の医薬とも称する）。本明細書中で用いられる場合、「予防」とは、症状を示さない被験体において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味し、「治療」とは、症状を示す被験体において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。
【００１７】
また、ＤＣＰ−ＬＡのかかる薬理作用により、本発明は細胞への糖取込みを促進させる方法、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）の予防及び／又は治療方法、並びにメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療方法（以下、単に本発明の方法とも称する）を提供することができる。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、ＤＣＰ−ＬＡで処理する対象となる細胞は、ＧＬＵＴ４を発現し、グルコースを取込むことができる細胞であれば特に限定されないが、脂肪細胞、骨格筋細胞、肝細胞等が挙げられる。これらの細胞は前駆細胞から自体公知の手法により分化誘導したものであってもよい。例えば脂肪細胞は３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞から分化誘導され得る。
【００１９】
ここで「処理」とは、上記細胞とＤＣＰ−ＬＡとを必要十分な時間接触させることであり、その時間は所望される効果や用いる細胞の種類によっても異なるが、通常、０．１〜６時間、好ましくは０．５〜２時間程度である。簡便には、ＤＣＰ−ＬＡを含有する培養液中で当該細胞を培養することによって実施される。
【００２０】
本発明の医薬は、治療する各々の個別の患者の年齢及び状態に応じて変動するが、静脈内投与の場合には、ＤＣＰ−ＬＡの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１００ｍｇ、筋肉内投与の場合には、ＤＣＰ−ＬＡの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇ、経口投与の場合には、ＤＣＰ−ＬＡの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇが、糖尿病の予防及び／又は治療のため、あるいはメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療のために一般的に与えられる。
【００２１】
本発明の医薬は、有効成分であるＤＣＰ−ＬＡ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２２】
一つの実施態様において、本発明の医薬は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２３】
別の実施態様において、本発明の医薬は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２４】
ＤＣＰ−ＬＡは、食品として提供することができる。有効成分であるＤＣＰ−ＬＡは、上述の通り、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して（１）細胞への糖取込み促進作用、及び（２）血糖値低下作用を有し、糖尿病の予防・治療、あるいはメタボリックシンドロームの予防・治療に効果的な機能性食品として提供することができる。
【００２５】
本発明において「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の医薬あるいは食品は、該医薬あるいは該食品の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
本発明の医薬あるいは食品が、単一の製剤あるいは食品として提供される場合には、該医薬あるいは食品の単位摂取量又はその分割量は、ＤＣＰ−ＬＡの単位摂取量又はその分割量である。
【００２７】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬あるいは食品としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬あるいは食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬あるいは食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬あるいは食品はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００２８】
さらに、ＤＣＰ−ＬＡは、上述の通り、（１）細胞への糖取込み促進作用、及び（２）血糖値低下作用を有し、従って各種試薬としても提供され得る。当該試薬としては、具体的には、細胞への糖取込み促進剤が挙げられる。当該試薬は、従来にない新しい作用メカニズムを有する、副作用の軽減された、及び／又はより効果が増強された、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療薬を開発する有用なツールとなる。
【００２９】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３０】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：細胞への糖取込み促進作用の検証
（材料と方法）
１．細胞培養
ＧＬＵＴ４ｍｙｃを発現する３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ線維芽細胞株を用いた。当該細胞は、ヒトｃ−ＭＹＣエピトープ（１４アミノ酸）を第１エクトドメインに挿入して構築される。ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行を抗ｃ−ｍｙｃ抗体で追跡することが可能になる。
当該細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清、ペニシリンン（最終濃度，100 U/ml）及びストレプトマイシン（最終濃度，0.1 mg/ml）を添加したDulbecco’s Modified Eagles Medium（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２及び９５％空気の湿気のある環境で３７℃で培養した。細胞がコンフルエントな状態に到達したら（０日目）、線維芽細胞から脂肪細胞へと分化させるために、培地を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），１μＭデキサメサゾン，０．５ｍＭ  ３−イソブチル−メチル−キサンチン及び０．１ｍｇ／ｍｌインスリンを添加したＤＭＥＭに交換した。３日目、７日目及び１１日目で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭに培地交換した。１４日目で、脂肪細胞へと分化した細胞を実験に使用した。
２．グルコース取込みアッセイ
３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有し、１０ｍＭグルコースを添加したKrebs-Ringer-HEPES buffer[136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.25 mM MgSO4及び20 mM HEPES, pH 7.5]中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、１０ｍＭグルコースを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ＤＣＰ−ＬＡ及び／又はＧＦ１０９２０３Ｘで３７℃で２時間処理した。処理後、細胞外溶液を回収しグルコースをパラアミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）で標識した。次いで、ＡＢＥＥ標識した溶液（５μｌ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムのカラム（150×4.6 mm）に注入した。ＡＢＥＥ標識したグルコースは、蛍光検出器を用いて、励起波長３０５ｎｍ及び蛍光波長３６０ｎｍで検出した。細胞に取込まれたグルコース量は、２時間インキュベーションした後の細胞外グルコース濃度を最初の細胞外グルコース濃度（１０ｍＭ）から差し引いて算出する。
３．ＧＬＵＴ４動員のモニタリング
３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有し、１０ｍＭグルコースを添加したKrebs-Ringer-HEPES buffer中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＤＣＰ−ＬＡで２０分間処理した。次いで、細胞を１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテルを含む氷冷したミトコンドリアバッファー[210 mM マンニトール, 70 mM シュクロース, 1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA), 10 mM HEPES, pH 7.5]中、ソニケーションによりホモジナイズした。続いて、ホモジネートを４℃で５分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をさらに４℃で１５分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離した。回収した上清を４℃で６０分間、１００，０００ｇで超遠心分離し、細胞質画分と細胞膜画分に分離した。上清を細胞質画分として、ペレットを細胞膜画分としてそれぞれ用いた。細胞質成分及び細胞膜成分が首尾よく分離できたかどうかは細胞質成分のマーカーである乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に対する抗体と、細胞膜マーカーであるカドヘリンに対する抗体とを用いたウェスタンブロット解析によって確認した。
各画分のタンパク質濃度はＢＣＡ蛋白質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。細胞膜画分のタンパク質を１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するミトコンドリアバッファーに再懸濁した。各画分のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜に転写した。ブロッティング膜は５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ[150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20及び20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、抗ｃ−ｍｙｃ抗体(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)と反応させ、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性は、ＥＣＬキット(Invitrogen)を用いて検出し、化学発光検出システム(chemiluminescence detection system; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて可視化した。シグナル密度は画像解析ソフト(Image Gauge software; GE Healthcare)を用いて測定した。【００３２】
（結果）
所定の濃度のＤＣＰ−ＬＡ存在下、あるいは非存在下で３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞をグルコース含有（１０ｍＭ）ＰＢＳ中で２時間インキュベートし、ついで細胞外グルコース濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。インキュベーション前後の細胞外グルコース濃度の差から細胞へのグルコース取込み量（ｎｍｏｌ／μｇタンパク質／分）を算出した。結果を図１Ａに示す。
さらに別途に、０．１μＭのＤＣＰ−ＬＡ存在下あるいは非存在下、及び／又は０．１μＭのＧＦ１０９２０３Ｘ（ＧＦ）の存在下あるいは非存在下で３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞をグルコース含有（１０ｍＭ）ＰＢＳ中で２時間インキュベートし、ついで細胞外グルコース濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。インキュベーション前後の細胞外グルコース濃度の差から細胞へのグルコース取込み量（ｎｍｏｌ／μｇタンパク質／分）を算出した。結果を図１Ｂに示す。
図１Ａの結果より、ＤＣＰ−ＬＡが脂肪細胞への糖取込みを釣鐘型の濃度依存的な様式で促進させる作用を有することが示された。また、図１Ｂの結果よりＰＫＣε阻害剤であるＧＦ１０９２０３Ｘ存在下でもＤＣＰ−ＬＡの糖取込み促進作用が阻害されなかったことから、ＤＣＰ−ＬＡの糖取込み促進作用はＤＣＰ−ＬＡが有するＰＫＣε活性化作用とは無関係であることがわかった。
次に、１００ｎＭのＤＣＰ−ＬＡで２０分間処理した３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞及び未処理の３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞（control）を溶解し細胞質画分（Ｃ）及び細胞膜画分（Ｍ）を調製した。抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行の程度を調べた。結果を図２に示す。
図２の結果より、ＤＣＰ−ＬＡで処理してもＧＬＵＴ４の細胞膜移行の有意な促進は認められなかった。従って、ＤＣＰ−ＬＡによる細胞内への糖取込み促進作用はＧＬＵＴ４の細胞膜への移行刺激によるものではないことがわかった。【００３３】
実施例２：ＤＣＰ−ＬＡの血糖値低下作用の検証
（材料と方法）
グルコース耐性テスト
１型糖尿病モデルは、C57BL/6Jマウス（８週齢）(Japan SLC Inc.; Shizuoka, Japan)にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（250mg/kg）を腹腔内投与することによって作製した。ＳＴＺ投与して４日後に経口グルコース耐性テスト（ＯＧＴＴ）を行った。
２型糖尿病モデルは、C57BL/KsJ-leprdb/leprdbマウス（雌性、８週齢）(CLEA Japan; Tokyo, Japan)を用いた。
ＯＧＴＴは１２時間飢餓状態のマウスで行なった。グルコース(2 g/ml/kg body weight)を強制経口投与し、その時点を０ｈとした。グルコースを投与する３０分前に、ＤＣＰ−ＬＡ(0, 0.001, 0.01, 0.1mg/kg)を経口投与した。０、３０、６０、及び９０分の時点で尾静脈から血液(10μl)を回収し、得られた血液から調製しＡＢＥＥで標識した、各血漿サンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム(LC-10ATvp; Shimadzu Co., Kyoto, Japan)に負荷した。グルコース濃度は、標準グルコース溶液を用いて作成されたピーク面積／濃度の検量線から算出した。
（結果）
１型糖尿病モデルマウスを用いた場合の結果を図３Ａに、２型糖尿病モデルマウスを用いた場合の結果を図３Ｂに示す。これらの結果から、ＤＣＰ−ＬＡが１型、２型糖尿病モデルマウスに対して用量依存性に血糖値を下げる作用があることを示している。従って、本発明は１型、２型糖尿病の治療薬となる可能性を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
ＤＣＰ−ＬＡは、細胞への糖取込みを促進する作用、及び血糖値低下作用を有し、それらの作用に基づいた各種試薬（剤）、並びに糖尿病の予防及び／又は治療薬として有用である。本発明の予防及び／又は治療薬は、既存の薬物とは異なる作用機序を有するので、既存の薬物において問題となっていたような副作用を回避することができる。また、本発明の剤は、そのような予防・治療薬の開発に有用なツールとなり得る研究用試薬として用いることができる。【００３５】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−０００９０５（出願日２０１４年１月７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2015105094.tif 000003
【図２】
2015105094.tif 000004
【図３】
2015105094.tif 000005
【国際調査報告】
2015105094.tif 000006
2015105094.tif 000007
2015105094.tif 000008
2015105094.tif 000009
2015105094.tif 000010