(57)【要約】  被検試料が、カンナビノイド類を含有するか否かを簡便かつ精確に判定するための方法やキットを提供する。カンナビノイド受容体を固相化したプレートに、カンナビノイド受容体に高い親和性を持つ化合物を標識したものと、界面活性剤や有機溶媒で抽出した合成カンナビノイド類とを添加して競合的に反応させることにより、生細胞や特別な装置を使用することなく人体に有害である合成カンナビノイド類を簡易かつ精確に検出できることを確認した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を備えることを特徴とする被検試料中のカンナビノイド類の検出方法。
（Ａ）カンナビノイド受容体、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化した固相受容体を調製する工程；
（Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程；
（Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程；
（Ｄ）工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程；
（Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程；
【請求項２】
カンナビノイド受容体が、カンナビノイドＣＢ１受容体及び／又はカンナビノイドＣＢ２受容体であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、カンナビノイド受容体に親和性を有するアゴニストであることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、リールアミンであることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項５】
標識化物質が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の検出方法。
【請求項６】
被検試料が、危険ドラッグであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の検出方法。
【請求項７】
界面活性剤を含む抽出溶媒を用いてサンプル液を調製することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の検出方法。
【請求項８】
界面活性剤を含む抽出溶媒が、さらに緩衝液を含む抽出溶媒であることを特徴とする請求項７記載の検出方法。
【請求項９】
界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項７又は８記載の検出方法。
【請求項１０】
ＳＤＳの濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする請求項９記載の検出方法。
【請求項１１】
界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０であることを特徴とする請求項７又は８記載の検出方法。
【請求項１２】
Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
有機溶媒で抽出後に、さらに陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈してサンプル液を調製することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の検出方法。
【請求項１４】
陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈後の有機溶媒の濃度が５〜５０％であるサンプル液を調製することを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
有機溶媒が、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールから選ばれることを特徴とする請求項１３又は１４記載の検出方法。
【請求項１６】
有機溶媒が、ＤＭＳＯであることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
【請求項１７】
陰イオン性界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の検出方法。
【請求項１８】
ＳＤＳの濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
【請求項２０】
カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒と、抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、危険ドラッグの主要成分であるカンナビノイド類の検出方法や、かかる方法に使用することができるカンナビノイド類の検出キットに関する。【０００２】
大麻は、その鎮静作用、嘔吐抑制作用、多幸感の惹起作用等により、古来から儀式や治療に用いられてきた。大麻の成分としては、Δ9−テトラヒドロカンナビノール（(-)-(6aR,10aR)-6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a,7,8,10a -tetrahydro-6H-benzo[c]chromen-1-ol：Δ９−ＴＨＣ）が主要な精神活性成分として、また、その誘導体としてカンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビノール（ＣＢＮ）をはじめとする種々のカンナビノイド成分が含まれることが明らかにされている。大麻の摂取によりカタレプシー様無動状態や体温降下が誘発される。また、精神依存が形成されたり、濃度依存的に細胞毒性が惹起されることから、乱用により脳神経系に影響を及ぼすおそれがある旨が報告されており（例えば、非特許文献１参照）、大麻の使用が禁止されている国も多い。【０００３】
また、大麻の成分は、医薬成分としても用いられている。例えば、中脳辺縁ドーパミン神経を調節するとされるΔ９−ＴＨＣは、米国食品・医薬品庁（ＦＤＡ）によって、化学療法に伴う悪心や嘔吐を調節するため、また、消耗性症候群に罹患しているエイズ患者の食欲を増進させるための薬物として承認されており、マリノール（Ｍａｒｉｎｏｌ）（登録商標）等として市販されている。【０００４】
他方、カンナビノイド受容体を介したカンナビノイドの作用機構の解明も、近年になって急速に進んでいる。例えば、カンナビノイド１型（ＣＢ１）受容体は、脳などの神経系で多量に発現し、神経伝達の抑制的制御に関与しているとされる。また、カンナビノイド２型（ＣＢ２）受容体は、脾臓や扁桃腺など、免疫系の臓器や細胞に多く発現しており、炎症反応や免疫応答の調節に何らかの関与をしているとされる。【０００５】
また、上記カンナビノイド受容体に作用する生体内物質がもともと存在するであろうとの推定のもと、上記カンナビノイド受容体に結合する内在性のリガンドの探索が行われてきた。その結果、Ｎ−アラキドノイルエタノールアミン（アナンダミド）が内在性リガンドの候補物質としてブタの脳から取り出された(例えば、非特許文献２参照)のを皮切りに、パルミトイルエタノールアミン、オレアミド、２−アラキドン酸グリセロール（２−ＡＧ）等のカンナビノイド受容体に相互作用する生体内物質が特定され、これらの内在性カンナビノイドは、鎮痛（例えば、非特許文献３参照）、摂食の調整（例えば、非特許文献４参照）、睡眠の促進（例えば、非特許文献５参照）等の多様な生理活性を、カンナビノイド受容体を介して有していることが確認された。【０００６】
一方、近年乾燥した植物片に、Δ９−ＴＨＣと薬理作用が類似する化合物を混在させたものが、お香や観賞用の製品と称して、いわゆる“危険ドラッグ”として世界的に流通しており、その乱用が大きな社会問題になっている。天然成分よりも作用の強い化合物は、精神依存が早期にもたらされ、その乱用のため死に至る事例も報告されている。これまでに、有害性や危険性が確認された薬物成分について規制や取締りが実施されてきたが、規制した薬物成分と類似した構造や作用を有する新たな薬物成分が登場することが繰り返されており、規制が追いついていない現状がある。このため、厚生労働省は、薬事法で規制されている「指定薬物」と化学構造が類似していれば一括して規制対象とする「包括指定」の導入を決め、現在、合成カンナビノイドに多くみられるナフトイルインドール骨格を有する化合物が包括的に規制されている（例えば、非特許文献６及び７参照）。【０００７】
いわゆる危険ドラッグの作用成分の特定にはガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーなどの機器分析が公的機関等では用いられている（例えば、非特許文献８参照）。しかし、すでに規制されている薬物で標準品などが存在する場合は成分の特定が可能であるが、現在も増え続けている標準品の存在しない未規制の薬物に対しての分析は極めて困難である。さらに、新たに標準品を合成するためには数ヶ月かかることもあり、原因の究明に時間を要することが多い。また、薬物の有害性を評価する方法として、培養細胞系を利用する評価系が、簡便かつ感度の高い方法として汎用されている。合成カンナビノイドについても濃度依存的に細胞毒性の発現が認められている（例えば、非特許文献９参照）。しかしながら、生細胞を利用して評価する方法は細胞培養に数日間必要であり、また、細胞培養装置が必要なことから、特別な施設を保有する研究機関などでしか実施することができない。このように、合成カンナビノイド類に関しては簡易検査法がないことから、捜査に時間がかかることも課題とされており、新たな検査技術の開発が求められている。【０００８】
例えば、カンナビノイドとの親和性を有する水素結合可能な官能基等を吸着材として、試料中のカンナビノイドを吸着材に吸着させ、吸着したカンナビノイドを吸着材より溶出し、その量を測定するカンナビノイド測定方法（例えば、特許文献１参照）や、抗体を用いて試料中の対象分析物の存在を判定するための方法（例えば、特許文献２参照）が提案されているが、精度の点や、カンナビノイド類の全般的な検出という点からすると不十分といわれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−０６２２８３号公報
【特許文献２】特開２０１４−２０９１２３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】第１０８回日本精神神経学会学術総会シンポジウム、脱法ハーブの薬物依存性と細胞毒性の評価
【非特許文献２】Science, 258: 1946-1949, 1992
【非特許文献３】Nature, 394: 277-281, 1998
【非特許文献４】Nature, 414: 209-212, 2001
【非特許文献５】Science, 268: 1506-1509, 1995
【非特許文献６】指定薬物を包括指定する省令の公布、厚生労働省、平成２５年２月２０日
【非特許文献７】薬事法第２条第１４項に規定する指定薬物及び同法第７６条の４に規定する医療等の用途を定める省令の一部改正について（施行通知）（平成２５年２月２日）
【非特許文献８】兵庫県立健康生活科学研究所健康科学研究センター研究報告５：５２−５５、２０１４
【非特許文献９】Tomiyama、 K., et al., Cytotoxicity of synthetic cannabinoids found in “Spice” products：the role of cannabinoid receptors and the caspasecascade in the NG 108-15 cell line. Toxicol Lett, 207: 12-17, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、被検試料が、カンナビノイド類を含有するか否かを簡便かつ精確に判定するための方法やキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、危険ドラッグに含まれる薬物成分の多くがΔ９-ＴＨＣと同様の作用を示すことに着目し、カンナビノイド受容体を用いたカンナビノイド類の検出方法を検討した。カンナビノイド受容体を固相化したプレートに、カンナビノイド受容体に高い親和性を持つ化合物を標識したものと、界面活性剤で抽出した合成カンナビノイド類とを添加して競合的に反応させることにより、生細胞や特別な装置を使用することなく人体に有害である合成カンナビノイド類を簡易かつ精確に検出できることを確認した。本発明者らはさらに抽出溶媒について検討を続け、まず、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で抽出した合成カンナビノイド類を、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぐためにＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で希釈したカンナビノイド類希釈溶液と、標識標準物質とを競合的に反応させたが、カンナビノイド類の検出は困難であった。しかし、界面活性剤を非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０から、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に代えた場合には、驚くべきことにカンナビノイド類の検出が可能となることをみいだした。さらに、他の有機溶媒を用いて合成カンナビノイド類を抽出し、その後陰イオン性界面活性剤で希釈したカンナビノイド類希釈溶液と、標識標準物質とを競合的に反応させることにより、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぎ、かつ、より精確性の高い検出をすることができることを確認して、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を備えることを特徴とする被検試料中のカンナビノイド類の検出方法。
（Ａ）カンナビノイド受容体、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化した固相受容体を調製する工程；
（Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程；
（Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程；
（Ｄ）工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程；
（Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程；
［２］カンナビノイド受容体が、カンナビノイドＣＢ１受容体及び／又はカンナビノイドＣＢ２受容体であることを特徴とする上記［１］記載の検出方法。
［３］カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、カンナビノイド受容体に親和性を有するアゴニストであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の検出方法。
［４］カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質が、リールアミンであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の検出方法。
［５］標識化物質が、ペルオキシダーゼであることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の検出方法。
［６］被検試料が、危険ドラッグであることを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載の検出方法。
［７］界面活性剤を含む抽出溶媒を用いてサンプル液を調製することを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載の検出方法。
［８］界面活性剤を含む抽出溶媒が、さらに緩衝液を含む抽出溶媒であることを特徴とする上記［７］記載の検出方法。
［９］界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の検出方法。
［１０］ＳＤＳの濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする上記［９］記載の検出方法。
［１１］界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０であることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の検出方法。
［１２］Ｔｗｅｅｎ２０の濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする上記［１１］記載の検出方法。
［１３］有機溶媒で抽出後に、さらに陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈してサンプル液を調製することを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載の検出方法。
［１４］陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液で希釈後の有機溶媒の濃度が５〜５０％であるサンプル液を調製することを特徴とする上記［１３］記載の検出方法。
［１５］有機溶媒が、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールから選ばれることを特徴とする上記［１３］又は［１４］記載の検出方法。
［１６］有機溶媒が、ＤＭＳＯであることを特徴とする上記［１５］記載の検出方法。
［１７］陰イオン性界面活性剤がＳＤＳであることを特徴とする上記［１３］〜［１６］のいずれか記載の検出方法。
［１８］ＳＤＳの濃度が、０．０１〜１０％であることを特徴とする上記［１７］記載の方法。
［１９］カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
［２０］カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体と、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質と、被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒と、抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤とを備えたことを特徴とするカンナビノイド類の検出キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、危険ドラッグに配合されている、生理的に又は精神的に悪影響を与える可能性があるカンナビノイド類を、分子構造の多少の相違に関わらず広範囲に検出することができる
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】逆シグモイド型の標準曲線を表すグラフである。
【図２】抽出溶媒として各濃度のＳＤＳを用いて抽出したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％のＳＤＳを含むＰＢＳ、（ｂ）は０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳ、（ｃ）は、1．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを用いた場合のグラフである。
【図３】抽出溶媒として各濃度のＴｗｅｅｎ２０を用いて抽出したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｂ）は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｃ）は、５．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、（ｄ）は、１０．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合のグラフである。
【図４】抽出溶媒として各濃度のエタノールを用いて抽出し、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）はエタノール抽出を行っていないサンプル液、（ｂ）は１０．０％のエタノールに希釈したサンプル液、（ｃ）は２０．０％のエタノールに希釈したサンプル液、（ｄ）は４０．０％のエタノールに希釈したサンプル液を用いた場合のグラフである。
【図５】ＤＭＳＯで抽出後、各濃度のＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯ溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％ＳＤＳで希釈したサンプル液、（ｂ）は０．５％ＳＤＳで希釈したサンプル液、（ｃ）は１０．０％ＳＤＳで希釈したサンプル液のグラフである。
【図６】メタノールで抽出後、０．５％ＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のメタノール溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。
【図７】エタノールで抽出後、１．０％ＳＤＳで希釈した、０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のエタノール中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。
【図８】ＤＭＳＯで抽出後、各濃度のＴｗｅｅｎ２０で希釈した０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯの溶液中のカンナビノイド類を含むサンプル液と、標識標準物質とをカンナビノイド受容体に競合的に結合させた後、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量の吸光度を示すグラフである。（ａ）は０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液、（ｂ）は０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液、（ｃ）は１．０％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈したサンプル液のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の被検試料中のカンナビノイド類の検出方法としては、（Ａ）カンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分、又はカンナビノイド受容体を、固相化した固相受容体を調製する工程、（Ｂ）カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を含む標識競合液を調製する工程、（Ｃ）被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製する工程、（Ｄ）上記（Ａ）工程で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後、未反応の標識標準物質を除去する競合反応工程、（Ｅ）カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する測定工程を備える方法であれば特に制限されず、本発明における被検試料としては、全血、血清、血漿等の血液、リンパ液、髄液等の狭義の体液や、尿、唾液、汗、精液等の体外に分泌・排泄される広義の体液や、吐瀉物、胃内容物、肺洗浄液など、ヒト等の哺乳類から得ることができる試料の他、いわゆる脱法ハーブ等の危険ドラッグを挙げることができる。
【００１７】
本発明におけるカンナビノイド類としては、ナフトイルインドール骨格を有するカンナビノイド、フェニルアセチルインドール骨格を有するカンナビノイド、ベンゾイルインドール骨格を有するカンナビノイド、シクロヘキシルフェノール骨格を有するカンナビノイド、ジテルペン骨格を有するカンナビノイド、天然カンナビノイドであるΔ９−ＴＨＣと同様のジベンゾピラン環又はそれに類似する構造を有するカンナビノイド等を挙げることができる他、これらの化合物の類縁体や改変体であって、カンナビノイド受容体に結合する化合物を含めることができ、とりわけ、多幸感の惹起、精神依存性、カタレプシー様無動状態、体温下降を誘発する等の強い精神作用を起こす効果を奏する化合物について、構造決定が本発明による検出を機になされることとなる未報告の化合物であったとしても、カンナビノイド類として好適に含めることができる。また、体内に入って代謝された代謝物がカンナビノイド受容体と結合することができることになる代謝前化合物も、カンナビノイドの前駆体として、カンナビノイド類に便宜上含めることができる。
【００１８】
上記ナフトイルインドール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体のアゴニストである、ＪＷＨ−０１５、ＪＷＨ−０１８、ＪＷＨ−０７３、ＪＷＨ−０８１、ＪＷＨ−２００、ＪＷＨ−２５０、ＪＷＨ−２５１、ＪＷＨ−３９８等のJ.W.Huffmanにより合成されたＪＷＨシリーズの化合物や、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体の強力なアゴニストであるＡＭ−２２０１を挙げることができる。上記ベンゾイルインドール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ２受容体の強力なアンタゴニスト／インバースアゴニストであるＡＭ６３０等を挙げることができる。上記シクロヘキシルフェノール骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に作用するＣＰ５５９４０、ＣＢ１受容体に作用するＣＰ４７４９７等を挙げることができる。上記ジテルペン骨格を有するカンナビノイドとしては、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に作用する強力なアゴニストであるリールアミン（1,4a-Dimethyl-7-isopropyl-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahydro-1-phenanthrenemethylamine）を挙げることができる。上記ジベンゾピラン環に類似する構造を有するカンナビノイドとしては、Δ９−ＴＨＣや、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体に対して非常に高い親和性を有し、強力なアゴニストであるＨＵ−２１０を例示することができる。
【００１９】
上記アゴニスト（作用薬）、インバースアゴニスト（逆作用薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）は、当該技術分野で通常使用されている各用語の意味を有する。例えば、アゴニストは、受容体を活性化し、生理作用を惹起させる化合物として、インバースアゴニストは、受容体を不活性な高次構造に安定化させる化合物として、アンタゴニストは、アゴニストの作用を阻害する化合物として説明される。したがって、受容体の作用が、細胞の機能を低下させる作用である場合には、アンタゴニストがかかる作用を阻害することにより、細胞機能が高まることがある。
【００２０】
上記工程（Ａ）において調製される固相受容体としては、（精製された）カンナビノイド受容体を、又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を、固相化して調製される固相体を挙げることができる。
【００２１】
上記カンナビノイド受容体としては、カンナビノイド類に対する結合能を有し、７回膜貫通、Ｇタンパク質（Ｇｉ／Ｇｏ）共役型の受容体であって、４７２個のアミノ酸配列から構成されるヒトＣＢ１受容体、及び３６０個のアミノ酸配列から構成されるヒトＣＢ２受容体等の天然型受容体（例えば、生化学第８３巻第６号、５２５−５３５，２０１１参照）や、かかる天然型受容体タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加及び／若しくは欠失し、及び／又は、糖鎖が置換、付加及び／若しくは欠失しているが、カンナビノイド類に対する結合能を有するＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体の改変体や、これらの受容体や改変体のタンパク質の部分断片やこれらの受容体のタンパク質と別のタンパク質との融合タンパク質であって、カンナビノイド類に結合できるタンパク質からなる受容体類縁体を例示することができる。また、市販の精製受容体を用いることもできるが、精製方法によっては受容体の活性が低下するおそれがあるため、カンナビノイド受容体発現細胞や、カンナビノイド受容体発現膜画分等の受容体発現細胞画分を使用することが望ましい。本発明の検出方法においては、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体のいずれか一方の受容体を用いることができるが、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体のいずれか一方にのみ結合するカンナビノイド類をもれなく検出できる点で、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体を用いることが好ましい。
【００２２】
上記カンナビノイド受容体発現細胞としては、上記カンナビノイド受容体を組換えタンパク質として発現した細胞を好適に挙げることができる。かかる組換え受容体タンパク質発現細胞の調製方法としては、公知の遺伝子組換え技術による方法を挙げることができるが、上記カンナビノイド受容体を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを単離又は調製し、該ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、該カンナビノイド受容体のタンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれたベクターにて形質転換した細胞を作製する方法を例示することができる。
【００２３】
上記カンナビノイド受容体発現膜画分としては、カンナビノイド受容体を発現している細胞の細胞膜であれば特に制限されず、かかる細胞膜としてはシナプス後部ニューロンの細胞等の細胞膜や、上記カンナビノイド受容体発現細胞から調製されたカンナビノイド受容体発現膜画分を挙げることができる。
【００２４】
かかるカンナビノイド受容体発現膜画分をカンナビノイド受容体発現細胞から調製する方法としては、カンナビノイド受容体発現細胞が増殖した培地を吸引除去し、緩衝液で細胞表面を洗浄した後、細胞を培地から剥離し、培地から剥離した細胞に再度培地を添加した後遠心分離を行い、上清を吸引後、緩衝液で懸濁し、遠心分離により沈殿した膜画分を緩衝液で再度懸濁する方法を例示することができる。また、超音波による破砕、摩擦による物理的な破砕、超遠心分離等により膜画分を分離することにより膜画分に精製することができる。これらの処理後、さらに、氷冷中において、及び／又はプロテアーゼインヒビターを添加したうえで、超遠心分離により膜画分を分離する処理を行うこともできる。なお、細胞表面を洗浄し、また膜画分を懸濁する緩衝液としては、ディッシュへの結合が緩くなり、細胞剥離が容易になる点で、カルシウム・マグネシウム不含のＰＢＳ（−）を好適に挙げることができる。
【００２５】
上記固相受容体を調製する方法としては、カンナビノイド受容体の懸濁液を固相に添加するか、あるいは、カンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を細胞数換算で１．０×１０３／ｍＬ〜１．０×１０９／ｍＬ、好ましくは１．０×１０４／ｍＬ〜１．０×１０８／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０５／ｍＬ〜１．０×１０７／ｍＬ相当となるようにＰＢＳで調製し、かかる懸濁液を固相に添加して、５分〜１０時間、好ましくは３０分〜５時間、より好ましくは１時間〜３時間静置し、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ)を用いて洗浄後、ウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin：ＢＳＡ)含有ＰＢＳを添加し、ブロッキングを行う方法を例示することができる。
【００２６】
上記固相受容体の調製のために用いられる固相としては、細胞や細胞画分の付着性に優れた固体表面を形成しうる材料からなるプレート、チップ、基板、試験管、多孔質担体等を挙げることができ、具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜等を挙げることができる。
【００２７】
前記工程（Ｂ）の標識競合液を調製する工程における、カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質としては、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するアゴニストや、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するインバースアゴニストやカンナビノイド受容体に高い親和性を有するアンタゴニストを挙げることができ、カンナビノイド受容体に高い親和性を有するアゴニストが好ましく、例えば、ＣＰ−５５９４０、リールアミン、オレアミドを挙げることができる。
【００２８】
上記標準物質を標識化物質で標識して、標識標準物質を調製する方法としては、上記標準物質を、酵素、蛍光、ビオチン、放射性同位元素、金コロイド等の標識化物質で、公知技術により酵素標識、蛍光標識、ビオチン標識、放射性同位元素標識、金コロイド標識等の標識をする方法を挙げることができる。また、市販の標識キットなどを用いることもでき、具体的には、市販のペルオキシダーゼの標識キットを用いて標準物質をペルオキシダーゼ標識する方法を好適に挙げることができる。これら標識標準物質を、適宜界面活性剤を含む緩衝液等に懸濁させることにより標識競合液を調製することができる。
【００２９】
前記工程（Ｃ）のサンプル液を調製する工程において、上記被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出してサンプル液を調製するための抽出溶媒としては、界面活性剤（方法１）や有機溶媒（方法２）を挙げることができる。
【００３０】
上記方法１において界面活性剤を抽出溶媒として用いる場合には、さらに緩衝液を含む抽出溶媒とすることがより好ましい。例えば、血液が被検試料である場合、界面活性剤と緩衝液を含む抽出溶媒の使用量（容量）は被検試料に対して２〜２０００倍用いることができ、１０〜１０００倍が好ましい。
【００３１】
上記方法１における界面活性剤としては、タンパク質である受容体の不可逆的変性を防ぐことができる非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤を挙げることができるが、非イオン性界面活性剤や陰イオン性界面活性剤が好ましく、これらは１種又は２種以上用いることができる。上記非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート）を挙げることができ、陰イオン性界面活性剤としては、ＳＤＳを挙げることができる。また方法１におけるＳＤＳの濃度としては、０．０１〜１０％を挙げることができ、０．１〜５％が好ましく、０．５〜２％がより好ましく、０．８〜１．２％がさらに好ましい。また、上記Ｔｗｅｅｎ２０の濃度としては、０．０１〜１０％を挙げることができ、０．１〜５％が好ましく、１．０〜１．２％がより好ましい。なお、本発明において濃度（％）は、ｗ／ｖ％を表す。
【００３２】
上記方法１における緩衝液としては、本発明におけるカンナビノイド受容体とカンナビノイド類との相互作用を妨げない限り特に制限されず、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）や、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を例示することができる。
【００３３】
上記方法２において有機溶媒を抽出溶媒として用いる場合には、血液が被検試料である場合、上記有機溶媒の使用量は被検試料に対して２〜２０００倍用いることができ、１０〜１０００倍が好ましい。また、陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液の使用量は、有機溶媒により抽出された抽出試料に対し２〜２０００倍とすることができ、１０〜１０００倍がより好ましい。
【００３４】
上記方法２における有機溶媒としては、上記カンナビノイド類を抽出できる有機溶媒であれば特に限定されず、メタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒などを例示することができる。
【００３５】
上記方法２において、陰イオン性界面活性剤を含む緩衝液により希釈後のサンプル液における有機溶媒の濃度としては、例えば、５〜７５％が好ましく、１０〜６０％がより好ましく、２０〜５０％がさらに好ましく、３５〜４５％が特に好ましい。
【００３６】
より詳細には、上記有機溶媒がＤＭＳＯの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるＤＭＳＯの濃度としては、５〜７５％が好ましく、２０〜６０％がより好ましく、３０〜５０％がさらに好ましく、３５〜４５％が特に好ましい。
【００３７】
上記有機溶媒がメタノールの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるメタノールの濃度としては、５〜７５％が好ましく、２０〜６０％がより好ましく、３０〜５０％がさらに好ましく、３５〜４５％が特に好ましい。
【００３８】
上記有機溶媒がエタノールの場合、陰イオン性界面活性剤で希釈後のサンプル液におけるエタノールの濃度としては、２〜５０％が好ましく、５〜１５％がより好ましく、８〜１２％がさらに好ましい。
【００３９】
上記方法２における陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステル塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩などを挙げることができ、具体的にはＳＤＳを好適に例示することができる。
【００４０】
上記陰イオン界面活性剤の濃度としては、０．１〜１．５％、好ましくは０．１５〜１．１％を例示することができる。
【００４１】
上記方法２における緩衝液としては、本発明におけるカンナビノイド受容体とカンナビノイド類との相互作用を妨げない限り特に制限されず、ＰＢＳや、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を例示することができる。
【００４２】
前記競合反応工程（Ｄ）における、前記工程（Ａ）で調製した固相受容体に、前記標識競合液とサンプル液とを接触させ、カンナビノイド受容体に、標識標準物質及びカンナビノイド類を競合的に結合させる方法としては、前記ブロッキング後の固相受容体を、ＰＢＳＴを用いて洗浄し、該固相受容体に、上記標識競合液と上記サンプル液とを添加・混合し、５分〜１０時間、好ましくは３０分〜４時間、より好ましくは１時間〜２時間静置することにより、固相受容体に固相化されているカンナビノイド受容体に、標識競合液中の標識標準物質、及び、サンプル液中の検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させる方法を挙げることができる。
【００４３】
前記競合反応工程（Ｄ）における、未反応の標識標準物質を除去する方法としては、標識標準物質及び検出対象カンナビノイド類を競合的に結合させた後の固相受容体を、上記ＰＢＳＴを用いて洗浄し、固相受容体内のＰＢＳＴ溶液を取り除く方法を挙げることができる。
【００４４】
前記工程（Ｅ）の測定工程としては、カンナビノイド受容体に結合した標識標準物質量を定量する方法であれば特に制限されず、上記標識を発色剤等により検出可能とする処理をした後に、標準曲線を用いて、被検試料中のカンナビノイド類の含有量を決定する方法を挙げることができる。具体的には、被検試料中の検出対象カンナビノイド類が少ないときは、標識標準物質が受容体により多く結合するため標識による発色等が強くなり、被検試料中の検出対象カンナビノイド類が多いときは、標識標準物質が受容体により少なく捕捉されるため標識による発色等が弱くなるため、かかる競合的阻害が成立している場合、標的対象カンナビノイド類が濃度依存的に低くなる吸光度のカーブを示す。したがって、カンナビノイド類の濃度が既知の試料溶液を複数調製して、吸光度と濃度との関係が明らかにした標準曲線をあらかじめ作成し、被検試料を同様に処理したときに得られた吸光度から被検試料中のカンナビノイド類の濃度を求める。
【００４５】
上記標準曲線の理想形としては、逆シグモイド型の標準曲線（例えば図１参照）を例示することができ、かかる標準曲線が作成できる条件を反応性がよいということがある。
【００４６】
本発明の方法により検出されたカンナビノイド（類）は、さらに固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等で分画後、最終的にはＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳ等により、より詳細な構造を決定することができる。
【００４７】
本発明のキットとしては、前述した、カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体；カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質；被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための界面活性剤；とを備えたカンナビノイド類の検出キットや、カンナビノイド受容体又はカンナビノイド受容体発現細胞若しくはそのカンナビノイド受容体発現膜画分を固相化した固相受容体；カンナビノイド受容体に親和性を有する標準物質を標識化物質で標識した標識標準物質；被検試料から検出対象カンナビノイド類を抽出するための有機溶媒；抽出されたカンナビノイド類を希釈するための陰イオン性界面活性剤；とを備えたキットを挙げることができ、被検試料中のカンナビノイド類の検出方法が説明されている取扱説明書が通常添付されている。
【００４８】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
［抽出液の検討１−界面活性剤のＰＢＳ溶液］
（受容体発現細胞の培養）
ハムＦ−１２（１ｍＭのＬ−グルタミン含有）培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ゼオシン（インビトロジェン社製）、Ｇ−４１８硫酸塩溶液（和光純薬工業株式会社製）を加えた培地を調製培地とした。ＣＢ１受容体発現細胞として、ヒトカンナビノイドＣＢ１レセプターイクオリン細胞株ＥＳ−１１０−Ａ（パーキンエルマー社製）を、上記調製培地が添加されている１００ｍｍスタンダードディッシュに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４〜７２時間培養した。【００５０】
（カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製）
上記ＣＢ１受容体発現細胞が十分に増殖した１００ｍｍディッシュの培地を吸引除去し、ＰＢＳ（−）（和光純薬工業株式会社製）で細胞表面を洗浄した後、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬工業株式会社製）を２ｍＬ添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で静置し、細胞を上記調製培地から剥離した。培地から剥離した細胞に上記調製培地を１０ｍＬ添加後、ピペッティングにより５０ｍＬ遠沈管に回収し、１２５０ｒｐｍにて５分間遠心分離を行った後、上清を吸引し、ＰＢＳ（−）で再度懸濁して遠心分離する操作をさらに２回繰り返した。遠心分離により沈殿した細胞膜画分をＰＢＳ（−）で懸濁し、−４０℃にて凍結保管した。解凍後ＣＢ１受容体細胞膜画分を含む懸濁液は、調整培地により再度培養処理を行い、細胞が生存していない（死細胞画分である）ことを確認した。【００５１】
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記ＣＢ１受容体発現細胞膜画分を含む懸濁液を細胞数換算で１．０×１０６／ｍＬとなるようにＰＢＳで調製し、Ｎｕｎｃ９６ウェルマイクロプレート（サーモサイエンティフィック社製）に５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃にて２時間静置して、ＣＢ１受容体を含む細胞膜画分をプレートに固相化した。かかるプレートを、上記ＰＢＳＴを用いて洗浄した後、１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳを１５０μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃にて１．０時間静置しブロッキングを行い、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを作製した。【００５２】
（被検試料の調製）
ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体いずれに対しても完全作用薬として非常に強力な結合能を有することが知られているＣＰ−５５９４０((-)-cis-3-[2-Hydroxy-4-(1,1-dimethylheptyl)-phenyl]-trans-4-(3-hydroxypropyl)cyclohexanol))（シグマ社製）を検出対象のカンナビノイドとして用いた。界面活性剤を含む緩衝液である、０．２、１．０、５．０、又は１０．０％のＴｗｅｅｎ２０（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）、カタログ番号０５９１３、日水製薬株式会社製）と、０．２％、０．５％、又は１．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳとを抽出溶媒として用いて、５０００μｇ／ｍＬのＣＰ−５５９４０抽出試料を調製した。【００５３】
（標識競合液の調製）
ＣＢ１受容体のアゴニストであるリールアミン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を標準物質として用いて標識標準物質である標識リールアミンを作製した。ペルオキシダーゼを標識化物質として、標識キットであるＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所製）の説明書にしたがって、リールアミンの濃度が５００μｍｏｌ／Ｌとなるように酵素標識し、ペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液を標識競合液として調製した。【００５４】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、５０００μｇ／ｍＬに調製された上記ＣＰ−５５９４０を、上記各界面活性剤を含むＰＢＳを抽出溶媒として用いて３倍の希釈段によりさらに６μｇ／ｍＬまで調製して、それぞれのサンプル液を２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。３７℃にて１．５時間静置したのちＰＢＳＴで洗浄し、ウェル内の溶液をよく取り除いた。発色液として、シュアブルーＴＭＢペルオキシダーゼ基質（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製）を１００μＬ／ウェルずつ添加し室温にて遮光下により静置した。発色の程度を確認しながら適宜１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１００μＬ／ウェルずつ添加し発色を停止した。直ちに、マイクロプレートリーダーにより主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの条件で測定し、吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳを用いた場合の結果を図２（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。また、０．２、１．０、５．０、又は１０．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合の結果を、図３（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）にそれぞれ示す。【００５５】
（結果）
図２（ａ）（ｂ）及び（ｃ）、ならびに図３（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）から明らかなとおり、ＣＰ−５５９４０の吸光度は、界面活性剤としてＳＤＳを用いた場合も、Ｔｗｅｅｎ２０を用いた場合も、濃度依存的に小さくなった。これは、標識標準物質であるペルオキシダーゼ標識リールアミンと検出対象カンナビノイドであるＣＰ−５５９４０との競合アッセイが成立しているからであると考えられ、このアッセイシステムを用いることにより危険ドラッグ中の合成カンナビノイド類を検出できると考えられた。また、従来有機溶媒にしか溶解できないと考えられてきた合成カンナビノイド類を、界面活性剤を含む緩衝液で溶解した場合においても、受容体の活性が失われることなく、受容体とカンナビノイド類の結合が測定できることが確認された。また、抗原抗体反応では反応が阻害されてしまうような、例えば、１０％と高濃度の界面活性剤下においても、受容体を使用する安定した測定が可能であることが示された。
ＳＤＳの濃度については、逆シグモイド型のグラフとなった１．０％が最適であると考えられた。Ｔｗｅｅｎ２０の濃度については、濃度依存的に吸光度が小さくなっている１．０％が最適であると考えられた。【００５６】
［比較例１］
［抽出液の検討２−エタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。【００５７】
（被検試料の調製）
ＣＰ−５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてエタノール（９９．５％、試薬特級、カタログ番号０５７−００４５１、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ−５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ−５５９４０抽出試料を０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いて、エタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、エタノールを１０．０％、２０．０％、４０．０％含む０．２％のＴｗｅｅｎ２０を希釈液として用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した。【００５８】
（標識競合液の調製）
上記実施例１と同様、ＣＢ１受容体のアゴニストであるリールアミンを標準物質として用いて標識標準物質である標識リールアミンを作製した。ペルオキシダーゼを標識化物質として、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２の説明書にしたがって、リールアミンの濃度が５００μｍｏｌ／Ｌとなるようにリールアミンを酵素標識し、ペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液を標識競合液として調製した。【００５９】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ−５５９４０（Ｔｗｅｅｎ２０）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。３７℃にて１．５時間静置したのちＰＢＳＴで洗浄し、ウェル内の溶液をよく取り除いた。発色液として、上記シュアブルーＴＭＢペルオキシダーゼ基質（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を１００μＬ／ウェルずつ添加し室温にて遮光下により静置した。発色の程度を確認しながら適宜１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１００μＬ／ウェルずつ添加し発色を停止した。直ちに、マイクロプレートリーダーにより主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍの条件で測定し、吸光度を測定した。０％、１０．０％、２０．０％、又は４０．０％のエタノールをそれぞれ含み、かつ０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いた場合の結果を図４（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）にそれぞれ示す。【００６０】
（結果）
図４（ａ）から明らかなとおり、０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを抽出溶媒として用いた場合は、ＣＰ−５５９４０がより多く存在するときに吸光度が小さくなっており、競合反応による阻害が生じて、ペルオキシダーゼ標識リールアミンとＣＰ−５５９４０の競合アッセイが成立していることが示された。しかし、図４（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）から明らかなとおり、０．２％のＴｗｅｅｎ２０とエタノールが抽出溶媒に含まれる場合は、ＣＰ−５５９４０がより多く存在するときに吸光度が大きくなっており、これは、エタノールを高濃度に含む条件では受容体が変性することにより、非特異的な反応が生じているためであると考えられた。したがって、合成カンナビノイド類をＴｗｅｅｎ２０とエタノールで抽出する条件で測定することは困難であることが確認された。【００６１】
［実施例２］
［抽出液の検討３−ＤＭＳＯのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。【００６２】
（被検試料の調製）
ＣＰ−５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてＤＭＳＯ（９９．０％、試薬特級、カタログ番号０４３−０７２１６、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ−５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ−５５９４０抽出試料を０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、ＤＭＳＯ濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、ＤＭＳＯを１０．０％、２０．０％、又は４０．０％含む０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した。【００６３】
（標識競合液の調製）
標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。【００６４】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ−５５９４０（ＳＤＳ）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いた場合の結果を図５（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。【００６５】
（結果）
図５（ａ）（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、抽出溶媒としてＤＭＳＯを用いた後、ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、いずれの濃度においても、ＣＰ−５５９４０の吸光度は、ＤＭＳＯを用いない場合（ＤＭＳＯ０％）よりも小さくなった。各グラフにおいて、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき８０．４を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき７１．４を示し、０％の値の８８．８１％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき６６．９を示し、０％の値の８３．２１％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５２．３を示し、０％の値の６５．０５％であった。０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき７４．２を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき６６．６を示し、０％の値の８９．７５％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき５６．８を示し、０％の値の７６．５５％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５０．１を示し、０％の値の６７．５２％であった。１％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、ＤＭＳＯが０％のとき５３．９を示した。ＤＭＳＯが１０．０％のとき５１．６を示し、０％の値の９５．７３％であった。ＤＭＳＯが２０．０％のとき４８．６を示し、０％の値の９０．１７％であった。ＤＭＳＯが４０．０％のとき５２．０を示し、０％の値の９６．４７％であった。【００６６】
以上のとおり、合成カンナビノイド類を、ＤＭＳＯを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％ＤＭＳＯに希釈した場合、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％ＤＭＳＯに希釈した場合、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて２０．０％ＤＭＳＯに希釈した場合のＣＰ−５５９４０希釈溶液が特に反応性がよいことが確認された。【００６７】
［実施例３］
［抽出液の検討４−メタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。【００６８】
（被検試料の調製）
ＣＰ−５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてメタノール（９９．８％、試薬特級、カタログ番号１３７−０１８２３、和光純薬工業株式会社製）を用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ−５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ−５５９４０抽出試料を０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、メタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製し、さらに、メタノールを１０．０％、２０．０％、又は４０．０％含む０．５％のＳＤＳを用いて、５０００ｐｐｍのＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した。【００６９】
（標識競合液の調製）
標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。【００７０】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記５０００ｐｐｍに調製されたＣＰ−５５９４０（メタノール）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。結果を図６に示す。【００７１】
（結果）
図６から明らかなとおり、抽出溶媒としてメタノールを用いた後、０．５％のＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、吸光度は、メタノールを用いない場合（メタノール０％）よりも小さくなった。具体的には、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、メタノールが０％のとき７４．２を示した。メタノールが１０．０％のとき６８．６を示し、０％の値の９２．４５％であった。メタノールが２０．０％のとき６５．５を示し、０％の値の８８．２７％であった。メタノールが４０．０％のとき４８．１を示し、０％の値の６４．８２％であった。【００７２】
以上のとおり、合成カンナビノイド類を、メタノールを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には、０．５％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて４０％メタノールに希釈した場合のＣＰ−５５９４０希釈溶液が最も反応性が高かった。【００７３】
［実施例４］
［抽出液の検討５−エタノールのＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。【００７４】
（被検試料の調製）
ＣＰ−５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。抽出溶媒としてエタノールを用いて、５０ｍｇ／ｍＬのＣＰ−５５９４０抽出試料を調製した。かかるＣＰ−５５９４０抽出試料を０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを含むＰＢＳを希釈液として用いて、エタノール濃度が１０．０、２０．０、又は４０．０％となるように調製した。さらに、エタノールを１０．０％、２０．０％、４０．０％含む０．２、０．５、又は１．０％のＳＤＳを希釈液として用いて、２５００ｐｐｍのＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した。【００７５】
（標識競合液の調製）
標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。【００７６】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記２５００ｐｐｍに調製されたＣＰ−５５９４０希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。結果を図７に示す。【００７７】
（結果）
図７から明らかなとおり、抽出溶媒としてエタノールを用いた後、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈した場合、吸光度は、エタノールを用いない場合（エタノール０％）よりも小さくなった。具体的には、ブランク（ＰＢＳ溶液）の値を１００とすると、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳで希釈した場合には、エタノールが０％のとき６７．６を示した。エタノールが１０．０％のとき６０．７を示し、０％の値の８９．８０％であった。エタノールが２０．０％のとき６３．８を示し、０％の値の９４．３８％であった。エタノールが４０．０％のとき６３．１を示し、０％の値の９３．３４％であった。【００７８】
以上のとおり、合成カンナビノイド類を、エタノールを用いて抽出し、さらにＳＤＳを含むＰＢＳを用いて希釈してＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した場合、ＳＤＳを含むＰＢＳのみで調製した場合よりも反応性が向上した。具体的には、１．０％ＳＤＳを含むＰＢＳを用いて１０％エタノールに希釈した場合が最も反応性が高かった。【００７９】
［比較例２］
［希釈液の検討−Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液］
（ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製）
上記実施例１と同様の手順で、受容体発現細胞の培養、カンナビノイド受容体発現細胞膜画分懸濁液の調製、ＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートの作製を行った。【００８０】
（被検試料の調製）
ＣＰ−５５９４０を検出対象のカンナビノイドとして用いた。０、１０．０、２０．０、又は４０．０％のＤＭＳＯを抽出溶媒として用いてＣＰ−５５９４０が５０ｍｇ／ｍＬとなるように調製してＣＰ−５５９４０抽出試料とした。かかるＣＰ−５５９４０抽出試料それぞれについて０．２、０．５、又は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いて２５００ｐｐｍのＣＰ−５５９４０希釈溶液を調製した。【００８１】
（標識競合液の調製）
標識競合液の調製は上記実施例１と同様の手順で行った。【００８２】
（競合式受容体バイオアッセイ）
上記のブロッキング後のＣＢ１受容体発現細胞膜画分固相マイクロプレートを上記ＰＢＳＴで洗浄し、１５μｍｏｌ／Ｌのペルオキシダーゼ標識リールアミン溶液となるようにＰＢＳＴで調製した標識リールアミンを、２５μＬ／ウェルずつ添加した。さらに、上記２５００ｐｐｍに調製されたＣＰ−５５９４０（Ｔｗｅｅｎ２０）希釈溶液をそれぞれ２５μＬ／ウェルずつ添加し、プレートミキサーで１分間撹拌しウェル内の溶液をよく混合した。その後実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。０．２％、０．５％、又は１．０％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを希釈液として用いた場合の結果を図８（ａ）（ｂ）及び（ｃ）にそれぞれ示す。【００８３】
（結果）
図８（ａ）（ｂ）及び（ｃ）から明らかなとおり、抽出溶媒としてＤＭＳＯを用いた後、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを用いて希釈した場合、いずれの濃度においても、ＣＰ−５５９４０の吸光度は、ＤＭＳＯを用いない場合よりも大きくなった。したがって、非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０は、本発明における有機溶媒による抽出後の希釈液としては好ましくないことが確認された。なお、ブランク（ＰＢＳ）の値（１００）に対して０．２〜１．０％のＴｗｅｅｎ２０溶液は、４９．９〜５８.２の値を示したので、測定自体は適切に行われている。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、危険ドラッグ中の有害成分であるカンナビノイド類を検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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