(57)【要約】  標識に用いる発光物質の位置情報を高密度で取得することが可能な超解像顕微鏡観察法を提供することを課題とする。  標的物を含む試料の観察方法において、所定の条件の下で光を発する発光物質を含むプローブであって、前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、前記試料と接触させた状態で、前記所定の条件の下で前記発光物質が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る撮像工程と、前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記標的物の観察画像を生成する観察画像生成工程とを含み、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である方法、そのような方法で使用可能である、標的物を標識するためのプローブ及び試薬キット、並びに、前記プローブにおける標的物認識部位のスクリーニング方法。
2016143900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物を含む試料の観察方法であって、
所定の条件の下で光を発する発光物質を含むプローブであって、前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、前記試料と接触させた状態で、前記所定の条件の下で前記発光物質が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る撮像工程と、
前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記標的物の観察画像を生成する観察画像生成工程と
を含み、
前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
方法。
【請求項２】
前記観察画像生成工程が、前記複数の輝点画像の各々について、それに含まれる輝点の位置の情報を求め、前記複数の輝点画像からの前記情報に基づいて前記観察画像を生成する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が２以上の標的物を含み、
１つの試料に対して、前記撮像工程を、前記各標的物に特異的な前記プローブを用いて順に行い、
前記観察画像生成工程が、前記各撮像工程から得られた前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記各標的物の観察画像をそれぞれ生成する工程である、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記観察画像生成工程で生成された、前記試料中の前記各標的物の観察画像を重ね合わせて、前記試料中の前記２以上の標的物の観察画像である多重観察画像を生成する多重観察画像生成工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発光物質が蛍光物質であり、
前記所定の条件が励起光照射である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブと、前記標的物との組み合わせが以下の群：
前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ；
前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ；
前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ；及び
前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが、前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体の断片がFabフラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的物を標識するためのプローブであって、
所定の条件の下で光を発する発光物質を含み、
前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことが可能であり、
前記標的物と結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
プローブ。
【請求項１０】
前記標的物がアクチン重合体であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が微小管であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が中間径フィラメントであり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、或いは
前記標的物が接着斑であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドで、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記抗体の断片がFabフラグメントである、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のプローブを少なくとも含む、標的物を標識するための試薬キット。
【請求項１４】
請求項９に記載のプローブにおける、標的物を認識する部位のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が１分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法。
【請求項１５】
前記候補物質が、前記標的物に対する抗体を産生するハイブリドーマのライブラリーからの抗体又は抗体の断片であり、
前記固定化工程において、前記抗体を固相担体に固定する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の超解像を得ることができる、結合解離プローブを用いた観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光学顕微鏡の分解能（> 200 nm）を超えた超解像顕微鏡方法（STED, SIM, PALM/STORM; 分解能：10-100 nm）が開発され（非特許文献1）、主要な顕微鏡メーカー（ニコン、カールツァイス、ライカ）によってそれぞれの超解像顕微鏡装置が販売されている。PALM(photoactivated localization microscopy、特許文献1、非特許文献2)/STORM(stochastic optical reconstruction microscopy、非特許文献3及び特許文献2)の応用により特に生命科学の分野での重大な発見が期待されている。それぞれの超解像顕微鏡法は、蛍光色素を標的に結合させることでラベルし、その蛍光色素の空間分布を誘導放出制御（STED）、構造化照明法（SIM）、ローカライゼーション法（PALM/STORM）によって高い分解能で観察する。【０００３】
ローカライゼーション法の概要は以下の通りである。まず観察しようとする標的物を蛍光物質等の発光物質により標識する。そして、標的物を標識する発光物質を低密度に発光させ、発光の輝点が個々に分離された、すなわち単分子の発光物質が分離された、輝点画像を取得する。取得された各輝点画像において、個々の輝点の中心位置を求めることができる。このような分離した輝点を含む輝点画像を取得し輝点の位置の情報を得るステップを複数回、例えば数百回〜数十万回繰り返し、標的物上のほぼ全ての発光物質の中心位置を求め、標的物の観察像を構築する。図１を参照してローカライゼーション法を模式的に説明する。例えば図１(a)のように、観察しようとする標的物の分子100が5つ分布していたと仮定する。標的物の5つの分子100を、それぞれ発光物質により標識して、発光の輝点が相互に重複しないようにまばらに発光させる。例えば図1(b)のように、異なる時間t1、t2、t3において、分離した輝点101を含む3つの輝点画像110、111、112を得る。各輝点画像110、111、112における個々の輝点101の像にガウス関数をフィッティングさせその中心位置を求めその位置情報102を記録する（図1(c)）。記録された個々の輝点の位置情報102を合成して、図1(d)に示すような観察画像120を描画する。上記の方法は、例えばコンピュータプログラムDAOSTORM（非特許文献7）を用いて行うことができる。ローカライゼーション法では、図1(b)で模式的に示すように、単分子の発光物質の輝点を分離可能なように、標識された標的物100を比較的低密度で順に発光させながら経時的に撮像し複数の輝点画像を得る必要がある。【０００４】
PALM/STORMは、蛍光物質を低密度で発光させるために、光照射により活性化又はスイッチングすることができる蛍光物質を使用し、光照射条件を調整して確率的に蛍光物質の状態を活性化又はスイッチングして、蛍光輝点が個々に分離された輝点画像を取得する。【０００５】
非特許文献4では、PAINT(point accumulation for imaging in nanoscale topography)と呼ばれる手法が報告されている。この文献では、PAINTによって、水溶液と脂質二重層との間を素早く行き来する蛍光色素Nile-redを用いて脂質二重層の形態を超解像観察したことが開示されている。【０００６】
最近、上記PAINT法を応用した多重染色超解像顕微鏡法として、DNA オリゴマーと融合させた抗体で標的物を標識し、そのDNA オリゴマーに一時的に結合し解離する相補鎖配列の蛍光DNAオリゴマーを用いた方法（Exchange-PAINT、非特許文献5）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2008-542826号公報
【特許文献２】米国特許公開公報US2008/0032414
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 929-943, 2008
【非特許文献２】Science, 313, 1642-1645, 2006
【非特許文献３】Nature Methods, 3, 793-795
【非特許文献４】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 18911-18916 (2006)
【非特許文献５】Nature Methods, 11, 313-318, 2014
【非特許文献６】J. Cell Sci., 126, 3505-3513, 2013
【非特許文献７】Nature methods, 8, 279-280, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
超解像顕微鏡法では、分解能が高くなったことで標識密度の低さやその不均一性が、新たな問題となっている。例えばサンプリング定理によると20 nmの空間分解能のためには、標的に10 nmに１つの標識物質を入れる必要があることが示されている（非特許文献6）。従来の、細胞内のタンパク質の超解像イメージングでは、蛍光タンパク質を融合させた標的タンパク質の発現や蛍光抗体を用いて標的タンパク質が標識される。このため内在性の標的タンパク質との発現量比や抗体自体の大きさ（約10 nm）によって標識密度に制限がある。また標的物に結合している蛍光色素を用いることから、1つの試料中での可視化できる標的物の数は2〜3種類が限界である。多種多様なタンパク質で構成される細胞の研究において、染色できるタンパク質の数における制限は長年の課題である。【００１０】
上記のExchange-PAINTにおいても、標的物をDNA オリゴマーと融合させた抗体で標識する必要があるため、複数の抗体同士が回折限界以下の領域で空間的に干渉し合うと予想される。抗体の種類を増やせば増やすほど均一にラベルすることは原理的に難しい。【００１１】
不均一な標識化は偽の超解像を再構築することにつながるため問題がある。【００１２】
PAINTを開示する非特許文献4では、標識物質による標的物の標識密度を高めることについては一切記載されていない。【００１３】
そこで本発明は、標識に用いる発光物質の位置情報を高密度で取得することが可能な超解像顕微鏡観察法を提供することを解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、結合解離性発光プローブとして、標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返す発光プローブであって、発光プローブと標的物とが結合して形成される結合体の半減期が所定の範囲である発光プローブを用い、該発光プローブを試料と接触させながら、発光輝点の画像（輝点画像）を異なる時間に複数撮像すると、発光プローブは、各輝点画像において標的物上の異なる位置を標識することができ、輝点画像の撮像数を増やすことで実質的に標的物に対する標識密度を高めることができること、並びに、各輝点画像からローカライゼーション法により回折限界を超えた高分解の観察画像を生成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の発明を包含する。
(1) 標的物を含む試料の観察方法であって、
所定の条件の下で光を発する発光物質を含むプローブであって、前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、前記試料と接触させた状態で、前記所定の条件の下で前記発光物質が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る撮像工程と、
前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記標的物の観察画像を生成する観察画像生成工程と
を含み、
前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
方法。
(2) 前記観察画像生成工程が、前記複数の輝点画像の各々について、それに含まれる輝点の位置の情報を求め、前記複数の輝点画像からの前記情報に基づいて前記観察画像を生成する工程である、(1) に記載の方法。
(3) 前記試料が２以上の標的物を含み、
１つの試料に対して、前記撮像工程を、前記各標的物に特異的な前記プローブを用いて順に行い、
前記観察画像生成工程が、前記各撮像工程から得られた前記複数の輝点画像から、前記試料中の前記各標的物の観察画像をそれぞれ生成する工程である、
(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記観察画像生成工程で生成された、前記試料中の前記各標的物の観察画像を重ね合わせて、前記試料中の前記２以上の標的物の観察画像である多重観察画像を生成する多重観察画像生成工程を更に含む、(3)に記載の方法。
(5) 前記発光物質が蛍光物質であり、
前記所定の条件が励起光照射である、
(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記プローブと、前記標的物との組み合わせが以下の群：
前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ；
前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ；
前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ；及び
前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択される、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記プローブが、前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記抗体の断片がFabフラグメントである、(7)に記載の方法。
(9) 標的物を標識するためのプローブであって、
所定の条件の下で光を発する発光物質を含み、
前記標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことが可能であり、
前記標的物と結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である、
プローブ。
(10) 前記標的物がアクチン重合体であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が微小管であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
前記標的物が中間径フィラメントであり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、或いは
前記標的物が接着斑であり、且つ、前記プローブが前記発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドで、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドである、
(9)に記載のプローブ。
(11) 前記発光物質と連結された、前記標的物に対する抗体又は抗体の断片を含む、(9)に記載のプローブ。
(12) 前記抗体の断片がFabフラグメントである、(11)に記載のプローブ。
(13) (9)〜(12)のいずれかに記載のプローブを少なくとも含む、標的物を標識するための試薬キット。
(14) (9)に記載のプローブにおける、標的物を認識する部位のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が１分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法。
(15) 前記候補物質が、前記標的物に対する抗体を産生するハイブリドーマのライブラリーからの抗体又は抗体の断片であり、
前記固定化工程において、前記抗体を固相担体に固定する、(14)に記載の方法。【００１５】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-048692号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、(i)従来の超解像顕微鏡法の信頼性を低める原因となっていた標識密度の問題を解消することができる、(ii)タンパク質系の交換性プローブにより複数の標的物を可視化することが容易であり、標的物の数には制限がない、ことから、既存の超解像顕微鏡法と比較して顕著に有利な作用効果を提供しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ローカライゼーション法の概要を説明するための図である。(a)実際のプローブ分子の分布を示す。(b)異なる時点で撮像された、蛍光輝点を含む輝点画像を示す。(c)各輝点画像の輝点の位置情報を示す。(d)位置情報に基づいて再構築された観察画像を示す。
【図２】(a)本発明の方法により標識密度を高めることができる原理を説明するための模式図である。(b)STORM法の原理を説明するための模式図である。
【図３】本発明の方法により１つの試料中の複数の標的物を観察する手順を説明するための模式図である。
【図４】本発明の方法の実施に用いる顕微鏡装置の機能ブロック図である。
【図５】本発明の超解像顕微鏡法を、IRIS(image reconstruction by integrating exchangeable single-molecule localization, 交換性単分子ローカライゼーションによる画像再構築)と呼ぶ。(a)IRISの概要。単分子蛍光プローブの標的物との一時的な会合を可視化し、該プローブの中心位置をナノメーター精度で決定する。数多くのフレームからの位置情報を積算し、標的物の超解像を生成する。(b)Atto488-Lifeactを用いたTIRF(=全反射照明蛍光)顕微鏡法によるin vitroでの単一のアクチンフィラメントの超解像。ローカライゼーションの精度を高めるために高輝度の輝点から観察画像を再構築した（図9c参照）。(c)単一のアクチンフィラメントの断面プロファイル(n=10フィラメント、グレーのバー)。黒色で示すカーブはFWHMが23nmの平均プロファイルにフィットさせたガウス関数を示す。エラーバーはS.E.M.を示す。(d)画像品質の、in vitroでの標識密度への依存性を示す。単位長あたりのAtto488-Lifeactの標識密度を各画像の上に示す。(e) (d)に示す枠に沿ったAtto488-Lifeactの標識密度のラインプロファイルを示す。標識密度を、アクチンフィラメント全体の平均標識密度により規格化して示す。(f) Atto488-Lifeact及び全反射照明を用いた、細胞内でのアクチンフィラメントのIRIS画像である。この画像は5×105のフレームから再構築したものである。(g)(f)において枠で囲った領域の、IRIS超解像(左上)と、足し合わせたSiMS画像（輝点画像）(左下)との比較。右には、左上画像中の2つの矢頭の間の2つの隣接するフィラメントの断面プロファイルを示す。Atto488-LifeactをTIRFモードでの473nmと488nmのレーザー線の同時照射により励起させ、個々の輝点から強いシグナルを得た。顕微鏡ステージのドリフトは、in vitroでのアクチンフィラメントの観察時には非蛍光ビーズの明視野像を用いて補正し、細胞内アクチンフィラメントの観察時には細胞自体の明視野像を用いて補正した(実施例の「方法」参照)。
【図６】(a) Lifeactを用いたアクチンフィラメントの超解像。(b) CLIP-170断片(配列番号12の第3-309番アミノ酸残基)を用いた微小管の超解像。(c) Plecin-1(PLEC)断片(配列番号8の第4022-4364番アミノ酸残基)を用いた中間径フィラメントの超解像。(d) フォスファチジルイノシトール-(4)-フォスフェート5-キナーゼタイプIγ-90 (PIPKIγ)断片(641-668)（配列番18）を用いた接着斑の超解像。プローブとしてPIPKIγ断片を用いる場合を除いて、各プローブのSiMS画像(輝点画像)は全反射照明と落射照明とを交互に行い取得した。具体的には、アクチンフィラメント、微小管及び中間径フィラメントの観察のためには、実施例の「方法」の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」で説明する条件の通り、全反射照明蛍光による輝点画像を250フレーム連続撮像（露光時間50ms/フレーム、20Hz）することと、落射蛍光による輝点画像を250フレーム連続撮像（露光時間50ms/フレーム、20Hz）することを繰り返した。接着斑の撮像のためには、落射照明による輝点画像の取得は行わず、全反射照明による輝点画像を500フレーム連続撮像（露光時間50ms/フレーム、20Hz）することを繰り返した。そして、細胞の底部の超解像(TIRF=全反射照明蛍光)と、細胞辺縁領域の全体の超解像(Epi=落射蛍光)とを統合して超解像を再構築した(Merged=統合)。(a)〜(c)では、TIRF画像と落射蛍光画像とを統合した画像(Merged)を示し、更に、右端では前記画像の枠で囲った領域を拡大した画像を示す。(e)には、7つの超解像を統合した画像を示す。画像はそれぞれ、2×105フレーム(Lifeact (TIRF), Lifeact (Epi))、4×104フレーム(CLIP frag.(TIRF), CLIP frag.(Epi))、1.2×105フレーム(PLEC frag. (TIRF), PLEC frag. (Epi))、4×104フレーム(PIPKIγ frag. (TIRF))から再構築した。図6aのTIRF画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は2×105、図6aのEpi画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は2×105、図6bのTIRF画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は4×104、図6bのEpi画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は4×104、図6cのTIRF画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は1.2×105、図6cのEpi画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は1.2×105、図6dのTIRF画像の構築に用いた輝点画像のフレーム数は4×104である。また、輝点画像撮像時のイメージング用溶液中でのプローブ濃度は、図6a撮像の際は2.4 nM、図6b撮像の際は8 nM、図6c撮像の際は9.2 nM、図6d撮像の際は84 nMとした。なお、該プローブ濃度は、プローブとしてAtto488-Lifeactを用いた場合は実際のプローブ濃度であり、他のプローブを用いた場合は標識蛍光タンパク質の蛍光強度に基づく換算値である。
【図７】細胞骨格と接着斑との領域特的な近接を示す。（a）〜(d) 図6eでのROI1のラメラ領域内での、中間径フィラメントの落射蛍光(epi)超解像(a)、中間径フィラメント(IF)とアクチンフィラメント(Act)との統合した超解像(b)、中間径フィラメント(IF)と微小管(MT)との統合した超解像(c)、並びに、超解像(a)での枠内領域での、中間径フィラメント(IF)とアクチンフィラメント(Act)と微小管(MT)との統合した超解像(d)をそれぞれ示す。（e）(d)の矢頭の間での3種の細胞骨格の断面プロファイルを示す。ラメラ領域において、中間径フィラメントはアクチンストレスファイバーと絡み合っている（矢印の位置において）が、微小管とは絡み合っていない。(f)〜(i) 図6eでのROI2の辺縁領域内での中間径フィラメントのTIRF超解像(f)、中間径フィラメント(IF)とアクチンフィラメント（Act）との統合したTIRF超解像(g)、中間径フィラメント(IF)と微小管（MT）との統合したTIRF超解像(h)、並びに、超解像(f)での枠内領域での、中間径フィラメント(IF)とアクチンフィラメント(Act)と微小管(MT)と接着斑(FA)との統合した超解像(i)をそれぞれ示す。TIRF超解像(g)では、中間径フィラメント(IF)を細い矢頭で指し、アクチンフィラメント（Act）を太い矢頭で指す。TIRF超解像(h)では、中間径フィラメント(IF)を細い矢頭で指し、微小管（MT）を太い矢頭で指す。(j) (i)の矢頭の間での3種の細胞骨格の断面プロファイルを示す。この辺縁領域では、中間径フィラメントは微小管と矢印の位置において重なっているが、アクチンフィラメントとは重なっていない。
【図８】アクチンストレスファイバー及び接着斑の近傍での微小管先端の動きを示す。(a) 左の画像は、図7(i)の中央領域での、微小管(MT)のz位置マップ（図16）と、接着斑(FA)のTIRF超解像とを統合した画像である。右の画像は、図7(i)の中央領域での、微小管(MT)のz位置マップ（図16）と、アクチンフィラメント(Act)のTIRF超解像とを統合した画像である。微小管のz位置は、落射蛍光超解像とTIRF超解像との間のシグナル強度比に基づいて算出した（実施例の「方法」参照）。(a)左画像では、微小管(MT)を矢印で指し、接着斑(FA)を細い矢頭で指す。(a)右画像では、微小管(MT)を矢印で指し、アクチンフィラメント(Act)を細い矢頭で指す。(b) (a)において太い矢頭で示す微小管のSからEまでの区間に沿った、該微小管のz位置のラインプロファイル（CLIP frag）と、アクチンフィラメントの強度(Lifeact)と、接着斑の強度(PIPKIγ)とを示す。太実線の曲線は、微小管のz位置についての、4つのデータ点の移動平均を示す。(c) 左の画像は微小管のz位置のマップであり、右の画像は該マップに、アクチンフィラメント(グレー)と接着斑(マゼンダ)とのTIRF超解像を統合したものである。接着斑はSrc断片(配列番号15の第3-251番アミノ酸残基)をプローブとして得られた超解像とPaxillin全長をプローブとして得られた超解像とを組み合わせて可視化した。(d) 左のパネルは、IRISイメージングの前に取得した、EB1-EGFPによる生細胞の落射蛍光観察像(赤)と、TIRF観察像(緑)である。中央のパネルはEB1-標識微小管の先端のz位置を、(c)の右画像に示すアクチンフィラメント及び接着斑に重ね合わせたものであり、右のパネルはEB1-標識微小管の先端の部位の速度を、(c)の右画像に示すアクチンフィラメント及び接着斑に重ね合わせたものである。EB1の軌道により分析した微小管は、(c)中でアスタリスクにより示す微小管である。
【図９】Atto488-Lifeactの特性評価。(a)固定XTC細胞におけるAtto488-Lifeactの輝点寿命の分布を示す。SiMS画像（輝点画像）を、488 nm レーザー(本体出力50mW、ただしAOTF等により減光され試料に至る)を用いて露光時間10ms/フレーム、フレームレート100 Hzで連続撮像した。100 Hz、すなわち10msあたり１フレームが取得できるように、サンプルの狭い範囲の画像（100pixel x 100pixelを取得した）輝点寿命の測定はSpackle TrackerJ plug-inを用いて行った（文献33,37）。黒色の線は、20msから110msの間の輝点寿命分布を単一指数関数のカーブにフィットさせた、半減期23msの曲線である。Atto488-Lifeactの消光速度は200msの期間では無視できる。(b) Atto488-Lifeactの輝点のDAOSTORM（画像中の円）を用いた分析。細胞中のAtto488-LifeactのSiMS画像（輝点画像）を50msの露光時間で取得した。各輝点の中心位置をナノメーター精度で決定した。輝点の分布は、50ミリ秒後に撮像した次のフレームでは大きく変化した。(c) Atto488-Lifeactを用いたTIRF顕微鏡法によるin vitroでの単一アクチンフィラメントの超解像。左の画像は、高輝度輝点（全輝点のうち上位約12％）のみから再構築して得られた画像であり、図5bと同じである。右の画像は全ての輝点から再構築して得られた画像である。アクチンフィラメント上での標識密度は各画像の上に示す。(d) in vitroでの単一アクチンフィラメントの、高輝度輝点から再構築した画像中（黒色）或いは全輝点から再構築した画像中（白色）における、断面プロファイル（n=10フィラメント）。全カウントが1となるように規格化した。黒色曲線は23nmのFWHMを有するガウス関数フィット曲線（高輝度輝点）を示し、白色曲線は38nmのFWHMを有するガウス関数フィット曲線（全輝点）を示す。エラーバーは±S.E.M.を示す。
【図１０】IRISと他の超解像法との、微小管の長さ方向に沿った標識パターンの比較。(a) プローブとしてCLIP-170を用いたIRISによる微小管の超解像を示す。この画像は図6bの落射(Epi)蛍光IRIS観察画像の一部である。(b) (a)の右の画像（IRIS(a)とする）と、文献21に記載の抗βチューブリンを用いたSTORMによる微小管の超解像（STORM(b)とする）と、文献22に記載の抗βチューブリンを用いたSTORMによる微小管の超解像（STORM(c)とする）と、文献23に記載の抗βチューブリンを用いたExchange−PAINTによる微小管の超解像（PAINT(d)とする）とにおける、微小管に沿った標識強度のラインプロファイル。標識密度を、アクチンフィラメント全体の平均標識密度により規格化して示す。
【図１１】選別されたIRISプローブの標的上での滞留時間。各プローブにつき100〜112個の滞留時間を相補累積分布関数（1-Ndissociation）に従ってプロットした。Ndissociationは、解離したプローブの累積相対度数である。標的上でのプローブの半減期は、滞留しているプローブの数の減衰を指数関数でフィッティングすることで決定した。表1に表記した測定結果の一部ここに示されている。
【図１２】CLIP-170断片（配列番号12の第3-309番アミノ酸残基）、APC断片（配列番号14の第2536-2843番アミノ酸残基）、MAP4断片（配列番号4の第1-908番アミノ酸残基）、及びタウアイソフォーム3（配列番号5の全長）による微小管の標識パターン。細胞の固定方法によりパターンが異なる。(a)及び(b)固定する作業中のEB1-EGFPのライブセルイメージング。(a) 3.7％PFA及び0.5％Triton-X 100による処理では微小管先端でのEB1-EGFPの集積は消失した (b)コールドメタノールによる処理ではEB1-EGFPが微小管先端に集積した状態で固定された。(c) PFA及びTriton-X 100で処理した細胞において、CLIP-170断片及びタウアイソフォーム3を用いた、微小管のTIRF IRIS画像（観察画像）。これらのプローブでは微小管全体のIRIS画像が得られた。これらのIRIS画像を統合（Merge）した画像から、これらのプローブで可視化された微小管全体は一致していることが分かる。(d) コールドメタノールで5秒間、次いでPFA及びTriton-X 100で前処理した細胞において、CLIP-170断片及びAPC断片を用いた、微小管のTIRF IRIS画像（観察画像）。これらのプローブでは、微小管全体よりも微小管先端がより強いシグナルにより可視化された微小管のIRIS画像が得られた。これらのIRIS画像を統合（Merge）した画像から、これらのプローブで可視化された微小管先端は一致していることが分かる。(e) コールドメタノールで前処理した細胞において、CLIP-170断片、MAP4断片及びタウアイソフォーム3を用いた微小管のTIRF IRIS画像。微小管先端は、CLIP-170断片により強く標識されたが、MAP4断片及びタウアイソフォーム3では弱く標識された (下段の各統合（Merge）画像参照)。
【図１３】Paxillin全長(FL)(配列番号15の全長)、Src断片(配列番号16の第3-251番アミノ酸残基)、PIPKIγ断片(641-668番残基)（配列番号18）による接着斑の標識パターン。(a) 比較のための、GFP-Paxillinを接着斑の可視化に用いた生細胞画像。(b) (a)の画像撮像後に生細胞を固定及び透過処理した細胞の画像。(c) 強い励起レーザーの照射によりGFP-Paxillinの残存蛍光を完全に消光した。(d)(e)(f) 前記(c)での消光後にSrc断片、Paxillin FL、PIPKIγ断片の順にIRIS画像を取得した。Src断片を用いて作成されたIRIS画像(d)では、接着斑中に幾つかのドット状構造（d中の矢頭）が現れた。このドット状構造は、解離しないプローブにより再構築されたものではなく、繰り返し結合するプローブにより再構築されたものであった。Paxillin  FLは、接着斑を部分的に標識した(e)。（g）左の画像は(a)(d)(e)(f)を統合したものであり、中央の画像は(d)(e)を統合したものであり、右の画像は(d)(f)を統合したものである。中央の画像では、Src断片により可視化されたドット状構造（矢頭で指す部分）は、Paxillin FLで可視化された接着斑と一致しない部分が多い。(h) 三つのIRIS画像及びGFP-Paxillinによる生細胞画像における接着斑の断面プロファイル。測定した範囲は、(g)左の画像において線で示す。Src断片により可視化されたドット状構造は、Paxillin FLにより全てが可視化されるわけではない（h中の矢印）。これらのタンパク質は接着斑において異なる結合パートナーを有する（文献17,38,39）。これらのIRIS画像間の相違は、接着斑における各タンパク質が会合可能なパートナーの分布を示している可能性がある。
【図１４】TIRF励起強度のZプロファイル。(a) 全反射照明蛍光(TIRF)及び落射蛍光(epi)を用いたHyLight488標識微小管の蛍光画像。落射蛍光画像はzスタック画像として得た（0.2μmステップサイズ）。zスタック落射蛍光画像を用いて、傾斜した微小管に沿った各点のz方向距離を決定した（「方法」の欄参照）。バーは5μmを指す。(b) TIRF励起強度のZプロファイル。
【図１５】アクチンバンドル(a)、微小管(b)及び中間径フィラメント(c)のZ位置マッピング。(a)(b)(c) 各画像はそれぞれ図6a,6b,6cに示す全反射照明蛍光（TIRF）IRIS画像及び落射蛍光(epi)IRIS画像から算出し生成した（「方法」の欄参照）。右の画像は左の画像中の枠内の拡大図である。(d) (a)の画像に示すラメリポディウム（LP）、ストレスファイバー(SF)、及びアクチンアーク(Arc)におけるアクチンバンドルのz位置の分布を示す。これらの層状のアクチン構造では、算出されたz位置は、アクチンフィラメントのz軸方向での重心の高さ位置を示す。(e) 微小管の長さ方向に沿ったｚ位置のプロファイル。微小管は細胞辺縁に向かって沈み込む（b、矢頭）。(b)におけるS及びEは該ラインプロファイルの開始点と終点を示す。
【図１６】微小管の落射蛍光(epi)超解像（左）、全反射蛍光(TIRF)超解像（中央）、及び、図8aに示すz位置マップ（右）。CLIP-170により可視化した微小管では、部分的にシグナルが欠落していた（左画像及び中央画像でのアスタリスク）。
【図１７】Fabフラグメントを含むプローブ（Fabプローブ）を用いたIRIS超解像イメージングの結果を示す。アクチン重合促進因子であるArp2/3複合体のサブユニットであるp40の分布を抗p40ポリクローナル抗体から作製したFabプローブを用いて画像化したものである。
【図１８】固相化した抗体にFLAG-EGFPが結合する様子。ハイブリドーマ培養上清に含まれる抗体をガラス表面に固定し、FLAG-EGFP溶液を加え、TIRF顕微鏡で観察した。各輝点は、固相化した抗体に結合したFLAG-EGFPである。（A）反応陽性例。FLAG-EGFPと抗体の結合を表す輝点が高密度に観察される。多数の輝点の観察結果によって、固相化された抗体はFLAG-EGFPとの結合能をもった抗FLAG抗体であることを示している。（B）反応陰性例。輝点はほとんど観察されない。これは抗体を固相化していないガラス表面にFLAG-EGFPを加えた場合と同程度である。
【図１９】ハイブリドーマライブラリーから選別された抗FLAGモノクローナル抗体由来のFabプローブ（結合体の半減期203ミリ秒）を用いて得られたFLAG融合アクチンの超解像画像。この細胞はFLAGタグ融合アクチンを強制発現している。右の画像は、左の画像内の白い枠内の拡大画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法では、発光プローブを用いて試料中の標的物を高密度で標識することが可能であり、標的物の精度の高い観察画像を生成することが可能である。
１．IRISの原理
本発明者らは本発明の観察方法をIRIS(image reconstruction by integrating exchangeable single-molecule localization, 交換性単分子ローカライゼーションによる画像再構築)と命名した。
【００１９】
図2(a)に、本発明の観察方法における発光プローブの機能について説明する。プローブ200は、所定の条件の下で光を発する発光物質201（例えば励起光が照射されると蛍光を発する蛍光物質）を含み、通常は、発光物質201と連結された、標的物との結合及び解離に関与する結合物質202を更に含む。プローブ200は、標的物210に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことが可能である。プローブ200の結合の特性については後述する通りである。プローブ200は、標的物210に結合している状態では、発光物質201による発光は輝点として輝点画像に撮像可能であり、標的物210から解離しているときは媒体220内で乱雑に熱運動しているため発光物質201による発光は輝点としては撮像されない。本発明の撮像工程では、プローブ200を含む媒体220を、標的物210を含む試料と接触させた状態で、所定の条件の下で発光物質201が発する光を輝点として含む輝点画像を得る工程をそれぞれ異なる時間に複数回（例えば数百〜数十万回）行う。得られた複数の輝点画像を重ね合わせると分かるように、本発明の撮像工程では、標的物210をプローブ200により高密度で標識し撮像するのと同じ効果を実現することができる。このときの標識の密度の上限は、理論上は無制限である。また、媒体220中のプローブ200の濃度を適切に設定すれば、1つの輝点画像中で複数の輝点を各々分離して識別することが可能である。
【００２０】
一方、ローカライゼーション法として従来公知のPALM、STORM、Exchange-PAINTでは、発光物質が連結された抗体を用いて標的物を標識する。例えばSTORMの例では、図2(b)に示すように、発光物質232と、標的物210に対する抗体231とを連結した発光抗体230を、標的物210に結合させ、発光物質232を輝点が重ならない程度にまばらに低密度で発光させながら、異なる時間に複数回（例えば数百〜数十万回）撮像する。得られた複数の輝点画像を重ね合わせれば、発光物質232が全て発光した画像を得ることができる。しかし、標的物210への発光抗体230による標識密度は、抗体自体の大きさ（約10 nm）により制限される。X nmの分解能を達成するには、X/2 nmの間隔で標的物を標識する必要がある（Nyquist Sampling Theorem）。発光抗体230は、少なくとも約10 nmの大きさを有するため、高密度での標識は不可能である。また、Exchange-PAINTでは、１つの試料中の複数の標的物を、各標的物に特異的な複数の抗体を用いて標識するが、その場合、複数の抗体間での干渉も生じるため、高密度での標識はより一層困難となる。本発明の観察方法は、従来のローカライゼーション法での上記のような標識密度についての問題点を解消することができる。
2.複数の標的物の観察
本発明の観察方法は、1つの試料中に複数の標的物が存在する場合にも好適に実施することができる。
【００２１】
1つの試料中に複数の標的物が存在する場合、本発明の観察方法は以下の手順により行う。複数の標的物のうちの1種に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、試料と接触させて、本発明の撮像工程を行い前記1種の標的物と結合したプローブからの発光の輝点を含む複数の輝点画像を得る。次いで、試料を洗浄してプローブを除去し、他の1種の標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを含む媒体を、試料と接触させて、本発明の撮像工程を行い前記他の1種の標的物と結合したプローブからの発光の輝点を含む複数の輝点画像を得る。この手順を、観察しようとする全ての標的物についてそれぞれ複数の輝点画像を得るまで行う。各撮像工程の間の試料の洗浄は、例えば、前記プローブを含まない前記媒体等の適当な洗浄用媒体を試料と接触させて洗浄する操作を１回以上行うことにより実施することができる。各プローブを用いて得られた各標的物についての複数の輝点画像から、各標的物の観察画像を生成することができる。また、同一の試料における各標的物の観察画像を重ね合わせることで、試料中の複数の標的物の観察画像を含む多重観察画像を生成することもできる。
【００２２】
本発明で用いるプローブは、標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すことができるプローブである。ここで「直接・・・結合し」とは、プローブと標的物とが、抗体等の他の結合性物質を介さずに結合することを指す。プローブと標的物とが、例えば水素結合、親水及び／又は疏水結合、静電結合、並びに、ファンデルワールス結合からなる群から選択される少なくとも１種の結合により結合する場合、両者が直接に結合しているということができる。
【００２３】
本発明ではプローブと標的物とが直接結合し解離することから、試料をプローブにより処理し発光させて撮像工程を行った後、試料を洗浄しプローブを洗い流せば、試料を元の状態に回復させることができる。1つの試料に含まれる複数の標的物の観察画像を得るために、プローブを含む媒体と試料とを接触させ、撮像工程を行い、洗浄を行う操作を標的物ごとに順に繰り返し行う場合でも、各撮像工程は、観察しようとする1種の標的物に対するプローブのみが存在し他の標的物に対するプローブは存在しない状態で行うことができるため、プローブ間での干渉が生じず、より自然な状態での試料における各標的物の観察が可能である。
【００２４】
図3には、標的物Aと標的物Bとを含む1つの試料を用いて、各々の観察画像を得る手順を模式的に示す。はじめに標的物Aに特異的なプローブAを含む媒体を試料に接触させた状態で撮像工程を行い複数の輝点画像を得る。次いで、試料を洗浄しプローブAを洗い流す。その後、標的物Bに特異的なプローブBを含む媒体を試料に接触させた状態で撮像工程を行い複数の輝点画像を得る。各標的物についての複数の輝点画像から、標的物Aと標的物Bの観察画像をそれぞれ生成する。また、標的物Aの観察画像と標的物Bの観察画像を重ね合わせて多重観察画像を生成することもできる。
3.試料及びプローブの説明
観察に用いる試料は、典型的には、細胞、複数の細胞からなる組織等の生体試料である。試料が生体試料である場合、固定した状態の試料を用いることが好ましく、必要に応じて更に透過処理した試料を用いることが特に好ましい。
【００２５】
試料は少なくとも１つの標的物を含む。ここで「標的物」とは、試料中に含まれる、観察対象の物体を指す。標的物としては、好ましくはアクチン重合体、微小管、中間径フィラメント、接着斑等の細胞骨格を構成する構造体が挙げられる。標的物は好ましくは、前記構造体のように、同じ構造又は共通した特徴を有する構造を有する、構成成分が多数集合して形成された構造体である。観察対象試料となり得る細胞、組織等の生体試料や、標的物となり得る細胞骨格を構成する構造体の起源生物は特に限定されず、哺乳類（ヒト、ウサギ、げっ歯類等）、両生類（カエル等、例えばアフリカツメガエル）、硬骨魚類及び軟骨魚類を含む魚類、爬虫類、鳥類等の脊椎動物、軟体動物、原索動物、棘皮動物、腔腸動物、節足動物等の無脊椎動物、真核単細胞生物（酵母等）等の単細胞生物を起源とするものが使用できる。なかでも細胞骨格を構成する構造体は幅広い生物種に保存されているため、実施例において有効性が確認された、細胞骨格を構成する構造体を観察する手法は、起源生物の種類に関係なく適用することができる。標的物は、好ましくは、複数の輝点画像を得る撮像工程中に実質的に形状が変化しないものであることが好ましく、必要に応じて固定処理されてもよい。
【００２６】
標的物は、好ましくは、タンパク質を含む標的物であり、より好ましくは、標的物以外の１以上の他のタンパク質と混在した観察対象試料中のタンパク質標的物である。本発明のこの実施形態では、プローブが複数種のタンパク質のなかでも標的物であるタンパク質に特異的に結合し結合することにより、標的物の選択的な可視化が可能となる。
【００２７】
プローブは、試料中の標的物の特定の１種に、直接、特異的に結合し解離することを繰り返す性質を有する。「直接・・・結合し」の意義は既述の通りである。
【００２８】
プローブは、それ自体が標的物との結合及び解離性を有する発光物質であってもよいが、通常は、発光物質と、該発光物質に連結された、標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返す性質を有する結合物質とを含む。
【００２９】
プローブと標的物とは以下の結合特性を有する。すなわち、プローブと標的物とが結合して形成される結合体の半減期は、好ましくは10ミリ秒以上3秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上2秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上1秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上900ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上800ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上700ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上600ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上500ミリ秒以下であり、より好ましくは20ミリ秒以上であり、より好ましくは300ミリ秒以下、特に好ましくは250ミリ秒以下である。ここで前記半減期は、好ましくは、プローブを含む媒体と、観察しようとする標的物を含む試料とを撮像工程を行う際の条件にて接触させたときの、プローブと標的物とが結合して形成される結合体の半減期である。半減期とは、ある瞬間に標的物に結合したプローブの数が、解離によって半分に減少するまでの時間で定義される。前記半減期の測定手順は以下の通りである。観察しようとする標的物を含む試料に、プローブを含む媒体を接触させ、観察時に用いる条件の下で観察しながら、プローブによる発光輝点が出現し消失するまでの時間を各発光輝点について測定する。そして、輝点の出現から消失までの時間を相補累積相対度数関数（1-Ndissociation）に従ってプロットする。Ndissociationは解離したプローブの累積相対度数である。累積相対度数は、測定した輝点（すなわちプローブ）の総数の内、ある時間以下で消失した輝点（すなわち、ある時間以下で解離したプローブ）の割合であり、総数を1として表す。そして前記の相補累積相対度数関数を指数関数でフィッティングすることで、その半減期を算出する。
【００３０】
プローブによる発光輝点が出現し消失するまでの時間は次の手順で測定できる。すなわち、標的物にプローブを含む媒体を接触させて発光に必要な所定の条件（例えば励起光照射）を与えながら、露光時間X秒（例えば0.050秒、0.100秒等）、フレームレート1/X Hzでプローブの発光物質の発光による輝点を含む輝点画像を連続的に撮像する。そして標的に結合したプローブが輝点画像に出現し、そして解離によって消失するまでの時間を計測する。このとき連続したY個のフレームで観察され、その前後のフレームで観察されない輝点については、該輝点の出現から消失までの時間はYX秒とすることができる。
【００３１】
前記半減期が10ミリ秒以上であるプローブは標的物に結合してから解離するまでの時間が、結合したプローブの発光物質による輝点の画像をEM-CCDカメラ等の通常の高感度撮像装置により撮像するには十分に長い。一方前記半減期が長すぎると、標的物との結合時間が長いプローブを含む領域が、再構築した観察画像において特に強いシグナルを示し、不均一なラべリングの原因となる。このため標的物の正確な分布を得ることが難しくなる。これまで得られた結果から、半減期が3秒以下であるプローブであれば、比較的均一な輝点画像及び観察画像の取得が可能であり、半減期が短いプローブを用いるほど、均一な輝点画像及び観察画像の取得が容易であり、この観点から半減期は500ミリ秒以下であることが特に好ましいことが明らかとなった。また、半減期が長いほど、一般的には、１フレームの露光時間及び撮像インターバルを長くする必要があるため、再構築画像の生成に必要な輝点画像を得るために長時間を要する場合があり、この観点から、半減期が3秒以下であること又はより短いことが好ましい。
【００３２】
本発明では、1つの1つの輝点画像を得る工程を、それぞれ「フレーム撮像工程」と呼ぶ。各フレーム撮像工程では、所定の条件の下で発光物質が発する光の輝点を含む輝点画像を撮像装置により撮像する。１つの輝点画像を撮像する期間を「フレーム」と呼び、あるフレームの開始時点から次のフレームの開始時点までの期間を「インターバル」と呼び、あるフレームの終了時点から次のフレームの開始時点までの期間を「フレーム間期」と呼ぶ。1フレームの時間（露光時間）は、プローブと標的物との結合半減期に合わせて適宜決定することができる。1フレームの時間（露光時間）は、プローブと標的物との結合の半減期よりも長いことが好ましいがこれには限らない。
【００３３】
上記要件を満足する標的物及びプローブは適宜選択することができるが、標的物と、プローブの結合物質との組み合わせとしては、以下の群：
前記プローブが発光物質と連結された(a1)配列番号19のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(a2) (a1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(a3) (a1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物がアクチン重合体である組み合わせ；
前記プローブが発光物質と連結された(b1)配列番号12のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-309番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数407以下、好ましくは357以下、より好ましくは327以下、最も好ましくは307のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2536-2843番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数408以下、好ましくは358以下、より好ましくは328以下、最も好ましくは308のアミノ酸配列、配列番号14のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第2781-2819番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数138以下、好ましくは88以下、より好ましくは58以下、最も好ましくは38のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下、好ましくは958以下、より好ましくは928以下、最も好ましくは908のアミノ酸配列、配列番号4のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第659-908番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数394以下、好ましくは344以下、より好ましくは314以下、最も好ましくは294のアミノ酸配列、配列番号5のアミノ酸配列、又は、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b2) (b1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(b3) (b1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が微小管である組み合わせ；
前記プローブが発光物質と連結された(c1)配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4684番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数1008以下、好ましくは958以下、より好ましくは928以下、最も好ましくは908のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数688以下、好ましくは638以下、より好ましくは608以下、最も好ましくは588のアミノ酸配列、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3777-4313番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数637以下、好ましくは587以下、より好ましくは557以下、最も好ましくは537のアミノ酸配列、又は、配列番号8のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、4022-4364番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数443以下、好ましくは393以下、より好ましくは363以下、最も好ましくは343のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c2) (c1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(c3) (c1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドであり、前記標的物が中間径フィラメントである組み合わせ；及び
前記プローブが発光物質と連結された(d1)配列番号15のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数556以下、より好ましくは524以下、最も好ましくは504のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第54-498番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数545以下、好ましくは495以下、より好ましくは465以下、最も好ましくは445のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第167-557番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数491以下、好ましくは441以下、より好ましくは411以下、最も好ましくは391のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第1-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数351以下、好ましくは301以下、より好ましくは271以下、最も好ましくは251のアミノ酸配列、配列番号16のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、第3-251番のアミノ酸配列を少なくとも一部に含むアミノ酸数349以下、好ましくは299以下、より好ましくは269以下、最も好ましくは249のアミノ酸配列、又は、配列番号18のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d2) (d1)に記載の前記アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、且つ、前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチド、或いは(d3) (d1)に記載の前記アミノ酸配列に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ前記プローブと前記標的物とが結合して形成される結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下であるポリペプチドあり、前記標的物が接着斑である組み合わせ
から選択されることが好ましい。前記各組み合わせにおいて結合体の半減期のより好ましい範囲は上記の通りであり、特に10ミリ秒以上500ミリ秒以下或いはより短い時間であることが好ましい。
【００３４】
上記の組み合わせにおいてアクチン重合体、微小管、中間径フィラメント、及び／又は、接着斑の起源生物は特に限定されないが、哺乳類（ヒト、ウサギ、げっ歯類等）、両生類（カエル等、例えばアフリカツメガエル）、硬骨魚類及び軟骨魚類を含む魚類、爬虫類、鳥類等の脊椎動物、軟体動物、原索動物、棘皮動物、腔腸動物、節足動物等の無脊椎動物、真核単細胞生物（酵母等）等の単細胞生物を起源とするものや、それらに人為的に変異が導入されたものが使用できる。
【００３５】
ここで「アクチン重合体」とはアクチン分子が重合して形成される構造体であり、典型的にはアクチンフィラメントである。
【００３６】
本明細書において「微小管」とは、例えば、αチューブリンとβチューブリンのヘテロ二量体が線維状につながったプロトフィラメントが、１３本集まって直径25 nmの管状の構造を形成している構造体である。
【００３７】
本明細書において「中間径フィラメント」としては、I型、II型、III型、IV型の中間径フィラメントが知られており、その全てが本発明の観察対象になる。Plectinは、すべての種類の中間径フィラメントに結合することができる。
【００３８】
本明細書において「接着斑(focal adhesion、フォーカルアドヒージョン)」とは、例えば、細胞と細胞外基質との接着点に複数のタンパク質（インテグリン、パキシリン、ビンキュリン、タリン等）によって構成される構造である。
【００３９】
上記(a2)、(b2)、(c2)、(d2)における、アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加に関する「１又は複数」とは、例えば１〜５０、好ましくは１〜２５、より好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜７、より好ましくは１〜５、より好ましくは１〜４、より好ましくは１〜３、最も好ましくは１もしくは２をいう。前記「１又は複数」は更に好ましくは、上記(a1)、(b1)、(c1)、(d1)におけるポリペプチドのアミノ酸数の好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下、最も好ましくは5％以下である。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の物理化学的機能が類似するアミノ酸間の置換をいう。物理化学的機能の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（グリシン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。各アミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸の付加としては、好ましくは、該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち少なくとも一方への、合計で１又は複数のアミノ酸の付加である。また各アミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸の欠失としては、好ましくは、該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のうち少なくとも一方からの、合計で１又は複数のアミノ酸の欠失である。
【００４０】
上記(a3)、(b3)、(c3)、(d3)における、それぞれ上記(a1)、(b1)、(c1)、(d1)に記載のアミノ酸配列に対する同一性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。本発明において、アミノ酸配列の同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。アミノ酸配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対のアミノ酸配列をアライメントした際に一致するアミノ酸残基の数を算出し、当該一致するアミノ酸残基の数の、比較したアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えたアミノ酸残基数である。こうして算出された全アミノ酸残基数が比較するアミノ酸配列間で異なる場合は、多い方の全アミノ酸残基数に基づいて同一性を算出する。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。
【００４１】
また、上記(a3)、(b3)、(c3)、(d3)のポリペプチドは、より好ましくは、それぞれ上記(a1)、(b1)、(c1)、(d1)に記載のアミノ酸配列に対する類似性が、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であるポリペプチドである。アミノ酸配列の類似性の値は、一致度が最大となるように一対のアミノ酸配列をアライメントした際に一致するアミノ酸残基の数と、物理化学的機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、当該合計の、比較したアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する割合として算出される。ここでアミノ酸配列類似度については、アミノ酸配列同一性に関して上記したものと同様のソフトウェアを用いてコンピュータにより算出することができる。全アミノ酸残基数の算出方法については、アミノ酸同一性に関して上記した通りである。物理化学的機能が類似するアミノ酸残基については上記の通りである。
【００４２】
本発明の他の好適な実施形態では、プローブに含まれる結合物質（標的物を認識する部位）は、標的物に対する抗体又は抗体の断片であり、特に好ましくは、抗体の断片である。
【００４３】
任意の標的物に対する抗体の作製方法の技術は既に確立されている。このため、標的物に応じて作製した抗体又は抗体の断片を、プローブの結合物質として利用することにより、本発明の技術を幅広い範囲の標的物の観察に利用することが可能である。
【００４４】
この実施形態における標的物は、抗原性を示す標的物であればよく、典型的にはタンパク質である。
【００４５】
プローブに含まれる抗体又は抗体の断片の元となる抗体は典型的には免疫グロブリンG (IgG)であるが、他のイソタイプであってもよく、例えば、免疫グロブリンM (IgM)、免疫グロブリンD (IgD)、免疫グロブリンA (IgA)、免疫グロブリンE (IgE)等であることができる。これらの免疫グロブリンが複数のサブクラスを包含する場合、どのサブクラスに属するものであってもよい。他の種類の抗体としては単一ドメイン抗体が挙げられる。これらの抗体は、変異体であってもよいし、他のポリペプチドと融合された形態であってもよい。
【００４６】
抗体の起源は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ラマ、ラクダ等の非ヒト動物や、ヒト等の起源の抗体を用いることができる。また、抗体は、複数の起源の抗体のドメインを融合させて形成したキメラ抗体であってもよい。
【００４７】
抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【００４８】
本実施形態において抗体の「断片」とは、標的物（抗原）との結合活性を有する「機能性断片」を意味する。抗体の断片は、変異体であってもよいし、他のポリペプチドと融合された形態であってもよい。
【００４９】
抗体の断片としてはFabフラグメント、Fab’ フラグメント、F(ab’)2フラグメント、scFv(一本鎖Fv）フラグメント、単一ドメイン抗体のVHHフラグメント（例えば商品名nanobody）等が挙げられる。Fabフラグメントは抗体をタンパク質分解酵素パパインで切断することにより得られる。F(ab’)2フラグメントは抗体をペプシンにより切断することにより得られる。Fab’ フラグメントはF(ab’)2フラグメントを更に還元条件下で処理して得ることができる。scFvフラグメントは抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結して一本鎖化したものであり、重鎖可変領域とリンカーと軽鎖可変領域とをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法で製造することができる。
【００５０】
本実施形態においては抗体又は抗体の断片を含むプローブが標的物と結合して形成される結合体の半減期は１０ミリ秒以上３秒以下である。一般に、抗体は抗原に対し2価の結合能を有する（すなわち1分子の抗体は2つの抗原結合部位を有する）ため、抗原との結合性が強く、抗体と抗原との結合体の半減期は前記範囲の上限を大きく上回る。そこで、本発明では、標的物への結合と解離を繰り返すことができる抗体の断片を用いることが好ましく、抗体の断片は、抗原である標的物に対し1価の結合能を有する（すなわち1分子中に1つの抗原結合部位を有する）ものであることが好ましい。標的物に対し1価の結合能を有する抗体断片としては、Fabフラグメント、Fab’ フラグメント、scFvフラグメント、単一ドメイン抗体のVHHフラグメント（例えば商品名nanobody）が挙げられる。
【００５１】
上記の抗体及び抗体断片の製造方法は特に限定されない。ハイブリドーマ法等の任意の方法により調製された抗体の候補のなかから、上記の所定の半減期を示す抗体をスクリーニングする方法の好適な実施形態については後述する。
【００５２】
プローブに含まれる発光物質は、所定の条件において観察可能な光を発する物質である限り特に限定されない。発光物質としては、励起光が照射されたときに蛍光を発することができる蛍光物質であることが特に好ましい。蛍光物質としては、緑色蛍光タンパク質（GFP）、増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、TagRFP等の蛍光タンパク質；Atto(商標)488、Atto(商標)550、Dylight(商標)488、Dylight(商標)550、CF(商標) dye (CF680R, CF488A, CF543等) 等の蛍光色素；量子ドットが挙げられる。
【００５３】
本発明の撮像工程において、媒体とプローブと観察対象試料との混合系は、プローブが有する発光物質を発光させるための前記所定の条件（例えば励起光照射）に、発光物質が前記所定の条件に曝されてから消光するまでの時間（消光時間）よりも十分に短い間隔で曝されることが好ましく、連続的に曝されてもよい。例えば、発光物質が蛍光物質である実施形態では、媒体とプローブと観察対象試料との混合系には消光時間よりも十分に短い間隔で励起光が照射されることができ、連続的に照射されてもよい。
【００５４】
プローブにおける発光物質と結合物質とは、必要に応じて適当なリンカー成分を介して、化学結合により連結することができる。化学結合としては共有結合、配位結合等が挙げられ、安定性の観点から共有結合であることが好ましい。発光物質と結合物質とがともにポリペプチドである場合、それらが通常のペプチド結合により連結した融合ポリペプチドとしてプローブを形成できる。
【００５５】
本発明の撮像工程は、プローブを含む媒体と試料とを接触させた状態で行う。媒体は、プローブと標的物とが上記の結合特性を維持できるものであれば特に限定されないが、通常は液体であり、該液体は、好ましくは水溶液であり、より好ましくは適切なpHに調整された緩衝水溶液であり、より好ましくはpH6.1〜7.5に調整された緩衝水溶液であり、より好ましくは活性酸素除去剤を含有する。活性酸素除去剤としてはグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、2-メルカプトエタノール、グルコース等から選択される少なくとも1種又は2種以上を用いることができる。グルコースオキシダーゼの適量としては200 μg/mlが例示でき、カタラーゼの適量としては35μg/mlが例示でき、2-メルカプトエタノールの適量としては0.5％が例示でき、グルコースの適量としては4.5mg/mlが例示できる。緩衝水溶液を調製するための緩衝剤成分としてはHEPES、Tris等を用いることができる。
【００５６】
媒体中でのプローブの濃度は、１つの輝点画像中では、発光物質の発光を１分子毎に分離した輝点として識別できる濃度に適宜調整されていることが好ましい。
【００５７】
プローブを含む媒体と試料とを接触させるときの温度条件としては特に限定されず例えば20〜30℃、より好ましくは室温、具体的には25℃を採用することができる。
4.顕微鏡を用いる本発明の観察方法の一実施形態
本発明による観察方法に使用する装置は特に限定されない。
【００５８】
プローブに含まれる発光物質が、励起光の照射により蛍光を発する蛍光物質である本発明の実施形態に用いることができる装置の一例を図4に示す。
【００５９】
図4に示す顕微鏡装置1は、励起照明装置10（第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12を含む）と、顕微鏡本体20と、カメラ30と、カメラコントローラ40と、制御部50と、表示部60と、記憶部70とを備える。
【００６０】
励起照明装置10（第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12を含む）は、蛍光物質を発光させるための励起光を顕微鏡本体20に供給する装置である。励起照明装置10（第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12）は蛍光物質に応じた波長の励起光を供給できるものであればよい。図示しないが、第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12はそれぞれ、複数の装置を組み合わせた系であることができ、通常は、レーザー光源と、シャッターと、全反射ミラーを備える。レーザー光源は励起光を射出する光源である。シャッターは顕微鏡本体20への励起光の供給／停止を切り替える装置である。全反射ミラーは、レーザー光源から照射される励起光を顕微鏡本体20のステージ21に向けて全反射するための機構である。
【００６１】
顕微鏡本体20は、例えば倒立顕微鏡であることができる。顕微鏡本体20は観察しようとする試料を載置するためのステージ21を備える。顕微鏡本体20には、ステージ21に載置された試料の蛍光画像を撮像するカメラ30が接続される。カメラ30としては、例えば複数の画素を有したCCDカメラを用いることができる。
【００６２】
顕微鏡本体20には、ステージ21に励起光を照射する対物レンズや、試料内の蛍光物質から放射された蛍光をカメラ30の受光面に結合させる結像レンズなどが設けられている。上記対物レンズ及び結像レンズは結像光学系を構成する。
【００６３】
ステージ21及び前記結像光系を含む顕微鏡本体20は、試料の表面と接するガラスと試料との界面で励起光を全反射させる全反射照明が可能に構成されている。全反射照明によれば、励起光が全反射する際にガラスから試料側へにじみ出るエバネッセント光により試料を照明することができる。図示する実施形態では、第2励起照明装置12が全反射照明による励起光を供給するための装置に相当する。
【００６４】
顕微鏡本体20は、更に、上記の全反射照明と、落射照明とを切り替えて使用可能に構成されている。図示する実施形態では、第1励起照明装置11が落射照明による励起光を供給するための装置に相当する。実施例で示すように励起光を全反射照明による蛍光の輝点画像と、落射照明による蛍光の輝点画像とを用いて、観察画像において奥行方向（z方向）の位置を算出することができる。或いは落射照明による励起光と全反射照明による励起光とを同時に照射してプローブから強い蛍光を発光させることもできる。
【００６５】
励起照明装置10は必ずしも第1励起照明装置11と第2励起照明装置12とにより構成されている必要はなく、第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12のうち一方のみを備えていてもよい。
【００６６】
制御部50は、顕微鏡装置1を総合的に制御するコンピュータであり、励起照明装置10（第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12）と、表示部60と、記憶部70と、カメラコントローラ40とに接続されている。制御部50は、少なくとも、これらの装置を制御するための制御信号を生成する制御信号生成機能と、カメラコントローラ40を介して輝点画像を取得する輝点画像取得機能と、取得した輝点画像を解析する画像解析機能と、励起照明装置10に含まれる光源の駆動を制御する光源制御機能と、複数の輝点画像から観察画像を生成する画像形成機能と、を有する。制御部50は、全体の機能として観察画像を生成する画像生成部を構成する。
【００６７】
カメラコントローラ40は、カメラ30を駆動制御する。カメラコントローラ40は、制御部50から入力される制御信号に基づいてカメラ30を動作させ、蛍光の輝点画像を取得し、取得した輝点画像を制御部50に出力する。
【００６８】
表示部60は、ディスプレイ（表示装置）、プリンタ（印刷装置）等であり、制御部50から出力される画像データ（輝点画像のデータ、観察画像のデータ等）に基づく映像を表示、印刷する機能を提供する。
【００６９】
記憶部70は、半導体メモリ、ハードディスク等の記憶装置により構成することができる。制御部50において使用されるプログラムや制御部50から供給されるデータ（輝点画像など）を、制御部50により読出可能な状態で記憶する。
【００７０】
以下に、プローブに含まれる発光物質として、励起光が照射されると蛍光を発する蛍光物質を用いる、顕微鏡装置1による本発明の観察方法について説明する。
【００７１】
顕微鏡装置1を用いた撮像工程は、ステージ21上の、プローブを含む媒体と接触させた状態の試料に、励起光照明装置10（第1励起照明装置11及び第2励起照明装置12のうち一方又は両方）により励起光を照射し、試料中の標的物に結合したプローブに含まれる物質が発する蛍光を、カメラ30により、該蛍光の輝点として含む輝点画像を得る工程を、それぞれ異なる時間に複数回行い、複数の輝点画像を得る工程である。各輝点画像を得る工程を、それぞれ「フレーム撮像工程」と呼ぶ。各フレーム撮像工程は、励起光を照射するごとに蛍光物質が発する蛍光の輝点画像をカメラ30により撮像する。輝点画像はフレーム毎に異なる輝点のパターンとなる。
【００７２】
各フレーム撮像工程では、制御部50がカメラコントローラ40を介してカメラ30を動作させて蛍光物質が発する蛍光を撮像し、輝点画像を取得する。取得された輝点画像はカメラコントローラ40から制御部50に出力される。制御部50はまた、こうして取得した輝点画像を記憶部70に記憶させる。
【００７３】
撮像工程では、制御部50により、上述のフレーム撮像工程が、適当なインターバルで複数回繰り返し行われる。フレーム撮像工程の回数としては、数百〜数十万、例えば1,000〜999,000回が例示できる。
【００７４】
本発明における観察画像生成工程は、上述の撮像工程で得られた複数の輝点画像から、試料中の前記プローブと結合する標的物の観察画像を生成する工程である。具体的には制御部50が、適当なコンピュータプログラムを実行して、記憶部70に記録された複数の輝点画像の各々について、それに含まれる輝点の位置の情報を求め、前記複数の輝点画像からの前記情報を積算して観察画像を生成する。ここで各輝点の位置の情報は、典型的には各輝点の中心位置（重心位置）の情報であり、例えばコンピュータプログラムDAOSTORM（非特許文献7）を用いて求めることができる。このとき必要に応じて、前記輝点画像の各々において、精度を高めるために所定の閾値以上の輝度の輝点のみを観察画像の生成に利用してもよい。観察画像を生成する際は、ブランク画像の各輝点の中心位置に適当な大きさの点を描画して観察画像を生成することができる。具体的には、ブランク画像のピクセルのサイズを適当な大きさ（例えば一辺5nm〜20nmの正方形のピクセルとする）にして、それぞれのピクセルに各輝点の中心位置をプロットすることで観察画像を生成することができる。制御部50は生成した観察画像のデータを記憶部70に記録するとともに、表示部60に表示する。
【００７５】
1つの試料に複数の標的物が存在する場合は、上記の撮像工程を、各標的物に特異的なプローブを用いて順に行えばよい。ここで各標的物に特異的なプローブとは、各標的物に直接特異的に結合し解離することを繰り返すプローブを指す。各撮像工程の間には、試料を十分に洗浄することが好ましい。そして制御部50は、記憶部70に記憶された、各撮像工程から得られた複数の輝点画像から、試料中の各標的物の観察画像を生成することができる。制御部50は、同一試料中での複数の標的物の観察画像のデータを合成し表示部60に出力し、複数の標的物の観察画像を重ね合わせた多重観察画像として表示することもできる。
【００７６】
以上は、発光物質として蛍光物質を含むプローブを用いる本発明の観察方法の実施形態である。発光物質が蛍光物質以外の発光物質である場合は、顕微鏡装置1における励起照明装置10に替えて、ステージ21に載置された試料に、該発光物質が光を放射する条件を与えるための手段を配置し、試料中の標的物に結合したプローブ中の該発光物質が発する光を輝点として撮像することができるカメラ30を用いれば、上記と同様の手順で本発明の方法を実施することができる。
5.プローブ及びキット
本発明はまた、前記プローブ自体、並びに、前記プローブを少なくとも備えるキットを提供する。
【００７７】
前記プローブは単独で粉末等の固体の形態で提供されてもよいし、適当な液体媒体中に分散又は溶解した液体の形態で提供されてもよいし、適当な固体成分（賦形剤など）とともに粉末等の固体の形態で提供されてもよい。すなわち本発明のプローブは、プローブ単独で提供されてもよいし、プローブを少なくとも含み、他の補助成分を含んでいてもよいプローブ含有組成物として提供されてもよい。
【００７８】
前記キットは、前記の各種形態のプローブを少なくとも含んでいればよく、標的物を観察するために用いる他の要素を更に含んでいてもよい。前記キットの他の要素としては、前記プローブを溶解又は分散させるための液体媒体等の媒体、試料の観察のための処理に用いるための試薬等が挙げられる。前記媒体は、観察時にプローブを含有して試料と接触させるために用いる媒体とすることができる。前記キットにおける前記プローブと他の要素は、物理的に混じり合わない形態で別々に包装されていることが通常である。
6. スクリーニング方法
本発明はまた、前記プローブにおける、標的物を認識する部位（標的物認識部位、又は、結合物質ともいう）のスクリーニング方法であって、
前記部位の候補物質、又は、前記候補物質を一部に含む物質を固相担体に固定する固定化工程と、
媒体中で、発光物質と連結された標的物と、前記固定化工程で得られた固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が１分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する観察工程と、
前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、前記部位として選抜するスクリーニング工程と
を含む方法を提供する。
【００７９】
本発明のこの実施形態によれば、候補物質のライブラリーのなかから、標的物と所望の結合性を示すものを効率よくスクリーニングすることができる。
【００８０】
固定化工程に用いる固相担体としては例えばマルチウェルプレートの個々のウェルの内壁面が例示できる。
【００８１】
固定化工程において候補物質を固相担体に固定する手段は特に限定されず、例えば候補物質が抗体又は抗体断片である場合、抗体又は抗体断片のFabドメインが標的物と結合することが出来る状態で固相担体に固定化されることが好ましい。例えば、抗体のFcドメインと結合能を有するタンパク質（例えばProtein G）を固相担体に固定し、次いで、前記タンパク質が固定化された固相担体に抗体を固定化することで、抗体を、そのFabドメインが標的物と結合することが出来る状態で固相担体に固定化することができる。前記タンパク質を固相担体に固定化する方法は特に限定されないが、固相担体の表面に導入した官能基を介して前記タンパク質を固定化することができる。
【００８２】
観察工程において用いる媒体は、本発明の撮像工程において用いる媒体と同様のものを使用することができる。
【００８３】
観察工程において用いる、発光物質と連結された標的物において、発光物質の種類は特に限定されないが、励起光が照射されたときに蛍光を発することができる蛍光物質が特に好ましい。蛍光物質の具体例は、プローブに関して上記した蛍光物質の具体例と同じである。
【００８４】
観察工程では、媒体中で、発光物質と連結された標的物と、候補物質が固定された固相担体とを、前記標的物と前記候補物質との結合体における前記発光物質による発光が１分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する。この工程では、未結合の前記標的物は媒体中で乱雑に熱運動するため発光を検出できないのに対して、固相担体上の前記候補物質と結合した前記標的物からの発光は検出できることを利用する。前記発光物質による発光を１分子単位で観察するためには、媒体中での前記標的物の濃度を低くすることが有効である。候補物質が２つの抗原結合部位を有する２価の抗体又は抗体断片である場合でも、媒体中での前記標的物の濃度を低くすることにより、各抗原結合部位における前記標的物の結合を個別に観察することが可能である。
【００８５】
観察工程における観察手段は前記発光物質に応じて適宜選択すればよい。前記発光物質が蛍光物質である場合、蛍光顕微鏡（例えばTIRF蛍光顕微鏡）により観察することができる。
【００８６】
スクリーニング工程では、前記観察工程での観察に基づいて、前記結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下となる前記候補物質を、標的物認識部位として選抜する。前記半減期は、より好ましくは10ミリ秒以上2秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上1秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上900ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上800ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上700ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上600ミリ秒以下であり、より好ましくは10ミリ秒以上500ミリ秒以下であり、より好ましくは20ミリ秒以上であり、より好ましくは300ミリ秒以下、特に好ましくは250ミリ秒以下である。半減期とは、ある瞬間に固相担体上の候補物質に結合した標的物の数が、解離によって半分に減少するまでの時間で定義される。前記半減期の測定手順は以下の通りである。前記候補物質が固定された固相担体に、発光物質により標識された標的物を含む媒体を接触させ、観察時に用いる条件の下で観察しながら、発光輝点が出現し消失するまでの時間を各発光輝点について測定する。そして、輝点の出現から消失までの時間を相補累積相対度数関数（1-Ndissociation）に従ってプロットする。そして相補累積相対度数関数を指数関数でフィッティングすることで、その半減期を算出する。
【００８７】
標識された標的物による発光輝点が出現し消失するまでの時間は次の手順で測定できる。すなわち、前記候補物質を固定化した固相担体に標識された標的物を含む媒体を接触させて発光に必要な所定の条件（例えば励起光照射）を与えながら、露光時間X秒（例えば0.050秒、0.100秒等）、フレームレート1/X Hzで標識された標的物の発光による輝点を含む輝点画像を連続的に撮像する。そして前記候補物質に結合した標的物が輝点画像に出現し、そして解離によって消失するまでの時間を計測する。このとき連続したY個のフレームで観察され、その前後のフレームで観察されない輝点については、該輝点の出現から消失までの時間はYX秒とすることができる。
【００８８】
本発明のスクリーニング方法ではより好ましくは、前記候補物質が、所定の標的物に結合する抗体又は抗体の断片であり、前記固相化工程において、前記抗体を固相担体に固定する。所定の標的物に結合する抗体をスクリーニングする場合、一般的には、標的物を固相担体に固定化し、候補となる抗体を前記固相担体に接触させるELISA法を用いる。本実施形態に係るスクリーニング方法では、ELISA法とは逆に抗体（前記候補物質）を固相担体に固相化する。そして媒体中で、発光物質と連結された抗原（標的物）と、前記固相担体とを、前記標的物と前記候補物質とが結合して形成される結合体における前記発光物質による発光が１分子単位で観察できる条件で、接触させながら観察する。この方法は、以下に記述する優れた利点がある。
【００８９】
1) 抗体と抗原の結合の半減期を測定できる。抗体と抗原の間の結合解離を蛍光単分子の出現と消失で可視化するため、その結合の半減期を抗原1分子ごとに直接測定できる。
【００９０】
2) 抗原と抗体の1価の結合解離が測定できる。モノクローナル抗体が認識できるエピトープは、抗原内に一ヶ所である。そのため、固相化した抗体の１つの抗原結合部位と結合した抗原は、近傍の別の抗原結合部位とは結合できず、必然的に抗原は抗体分子と1価で結合することになる。抗原を固相化した場合は、抗体は1つ又は２つの抗原と結合できるため、抗原と抗体の１価の結合解離は測定できない。この抗体を固相化する方法ならば、1価で結合するFabフラグメントなどの抗体断片を作製せずにその結合の半減期を推定できる。
【００９１】
3) ハイブリドーマのライブラリーから安価で簡便に抗体断片をスクリーニングできる。このスクリーニング方法の一実施形態では、主な構成因子は、ハイブリドーマライブラリーの各上清に含まれる抗体を固定化した固相担体、及び、抗原エピトープの標識体である。ライブラリーの各上清の抗体から発光標識した抗体断片を作製しなくても、抗体断片と抗原の結合の半減期を推定できるため、非常に低コストで候補物質をスクリーニングできる。また分子単位で可視化するため、固相化された抗体の量が少なくても測定できる。このためハイブリドーマライブラリーの培養にかかる多大な労力と時間が節約できる。
【００９２】
本スクリーニング方法は、ELISA法による抗体の親和性の評価における大きな問題点を解消している。1) ELISA法では、抗原を固相化するため抗体は1価ないし2価のいずれでも抗原と結合してしまう。さらに1次抗体の結合量を測定するために用いた２次抗体によって、１次抗体は架橋されてしまう。その結果、抗体と抗原の１価の結合の半減期は測定できなくなる。2)またELISA法で得られた抗体の結合量は、抗体の親和性だけでなく、ハイブリドーマで産生される抗体量にも影響を受ける。このため、ELISA法では、１個の抗体の結合の性質を評価することは困難である。3)加えて、ELISA法では反応工程において複数回の洗浄を行うため、本発明で必要とする３秒以下の短い半減期で結合している抗体は可視化される前に失われる恐れがある。本実施形態に係る方法は、抗原ではなく抗体を固相化し、抗原と抗体の結合解離を実時間で可視化することで、これらの問題点を解決している。本実施形態による方法は、１価での結合解離を評価でき、抗体の産生量に影響されず、短い結合半減期も測定できる点において、原理的にELISA法よりも、我々の目的とする、短い結合半減期をもつ抗体の選定に適している。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法では、プローブの標的物認識部位の候補物質として、抗体又は抗体断片以外にも、ポリペプチドやファージディスプレイのライブラリーを固相化することができる。本発明のスクリーニング方法は、これらを固相化することにより標的物に結合解離するポリペプチドをスクリーニングすることにも応用可能であり、その汎用性が高い。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらは単なる例示であって、本発明を何ら限定するものではない。下記の実験は特に限定のない限り室温、すなわち25℃にて行った。
<1. 実験1>
方法
プラスミド及び試薬
N末端にFLAG (配列番号2)をタグ付けしたEGFP (配列番号1)をコードする発現プラスミド(pFLAG-EGFP-C1)と、C末端に3×FLAG (配列番号3)をタグ付けしたEGFPをコードする発現プラスミド(p3×FLAG-EGFP-N3)を、それぞれ、pEGFP-C1ベクター及びpEGFP-N3ベクター(Clontech Laboratories, Inc)を用いて構築した。【００９５】
マウスMAP4、ヒトタウアイソフォーム3及び4、マウスKIF1A、ヒトPlectin-1及びXenopus laevis Talin1をコードするESTクローンをOpenBiosystemsから購入した。【００９６】
ヒトFAKをコードするcDNAをDNASU Plasmid Repositoryから購入した。【００９７】
各配列のGenBank/EMBL/DDBJアクセション番号は以下の通りである:
BC055332 (MAP4), BC114948 (タウアイソフォーム3), BC101936 (タウアイソフォーム4), BC062891 (KIF1A), BM559026 (Plectin-1), CF282569 (Talin1) 及びBC035404 (FAK)。【００９８】
ヒトEB1、ラットCLIP-170、ヒトCLASP2γ及びヒトAPCをコードするcDNAをYuko Mimori-Kiyosue博士（理化学研究所）からご提供頂いた。【００９９】
ヒトPaxillin、ニワトリSrc及びヒトVinculinをコードするプラスミドは文献31〜33に記載されたものを用いた。【０１００】
それぞれのcDNAを、PCRを利用してpFLAG-EGFP-C1ベクターまたはp3×FLAG-EGFP-N3ベクターに挿入した。下記表1において、GFPの融合位置がN末端となっているプローブは、pFLAG-EGFP-C1ベクターを用いた。下記表1において、GFPの融合位置がC末端となっているプローブは、p3×FLAG-EGFP-N3ベクターを用いた。【０１０１】
N末端にFLAG-EGFPがタグ付けされたPIPKIγ-90断片(第641-668番アミノ酸残基)をコードする発現プラスミドは、PTDERSWVYSPLHYSAQAPPASDGESDT(配列番号18)をコードする合成cDNAをpFLAG-EGFP-C1ベクターに挿入することにより構築した。【０１０２】
N末端にAtto 488 蛍光体が連結されたLifeactペプチド(MGVADLIKKFESISKEE(配列番号19))を、Sigma-Aldrichから購入した。【０１０３】
EGFPのアミノ酸配列を配列番号1に示す。【０１０４】
FLAGのアミノ酸配列を配列番号2に示す。【０１０５】
3×FLAGのアミノ酸配列を配列番号3に示す。【０１０６】
マウスMAP4のアミノ酸配列を配列番号4に示す。【０１０７】
ヒトタウアイソフォーム3のアミノ酸配列を配列番号5に示す。【０１０８】
ヒトタウアイソフォーム4のアミノ酸配列を配列番号6に示す。【０１０９】
マウスKIF1Aのアミノ酸配列を配列番号7に示す。【０１１０】
ヒトPlectin-1のアミノ酸配列を配列番号8に示す。【０１１１】
Xenopus laevis Talin1（第1-2353アミノ酸残基）のアミノ酸配列を配列番号9に示す。      【０１１２】
ヒトFAKのアミノ酸配列を配列番号10に示す。【０１１３】
ヒトEB1のアミノ酸配列を配列番号11に示す。【０１１４】
ラットCLIP-170のアミノ酸配列を配列番号12に示す。【０１１５】
ヒトCLASP2γのアミノ酸配列を配列番号13に示す。【０１１６】
ヒトAPCのアミノ酸配列を配列番号14に示す。【０１１７】
ヒトPaxillinのアミノ酸配列を配列番号15に示す。【０１１８】
ニワトリSrcのアミノ酸配列を配列番号16に示す。【０１１９】
ヒトVinculinのアミノ酸配列を配列番号17に示す。【０１２０】
ヒトPIPKIγ-90断片(第641-668番アミノ酸残基) のアミノ酸配列を配列番号18に示す。【０１２１】
Lifeactペプチドのアミノ酸配列を配列番号19に示す。
交換性タンパク質プローブの製造とスクリーニング
微小管、中間径フィラメント及び接着斑の超解像用交換性プローブを見出すために、各標的構造に局在化できることが知られているタンパク質（ポリペプチド）及びタンパク質断片をプローブの候補分子として試験した。ここでプローブが「交換性」であるとは、標的構造への結合と脱離を繰り返すことができることを指す。【０１２２】
表１に試験したプローブ候補を示す。表1に記載した以外にも前記「プラスミド及び試薬」の欄に言及したタンパク質又はその断片をプローブ候補として複数試験した。【０１２３】
各プローブ候補について、表１記載の文献に従いEGFPと融合した分子として発現するための発現プラスミドを構築した。【０１２４】
HEK(ヒト胎児由来腎臓)-293F細胞を、FLAG-EGFP又は3×FLAG-EGFPによりタグ付けされたプローブ候補タンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクトした。3〜4日後、前記細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）を含む細胞溶解用緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0.2% Triton X-100, 100 μM DTT)中で溶解させた。溶解液を遠心分離し、上清液を回収した。IRIS用プローブをスクリーニングするために、パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し透過処理したXCT細胞の構造への、前記上清液中のプローブ候補の結合能を試験した。前記構造での単分子輝点(Single-molecule speckles, SiMS)の出現及び消滅を試験した。IRIS用プローブは次の基準に沿ってスクリーニングした:
(1)前記構造での標的物の分布を、SiMS画像を足し合わせた画像において確認することができる;
(2)SiMSイメージング（撮像工程）の後でプローブを洗浄除去することができる;
(3) 結合したプローブは、標的物から急速に解離することができる（半減期500ms以下）;
(4)各輝点の中心位置を積算することにより標的物の像を再構築することができる。【０１２５】
表1では上記(1)を満たすとき「ローカライゼーション」が陽性(P, positive)であると示し、上記(2)を満たすとき「洗浄性」が陽性(P)であると示し、上記(3)を満たすとき「IRIS画像」が陽性(P)であると示す。【０１２６】
IRIS実験に用いるプローブ以下の手順で精製した。すなわち、各プローブを、HEK-293細胞中で過剰発現させ、抗DYKDDDDK (Flag)抗体ビーズ(Wako)を用いて回収した。前記ビーズを過剰量のHepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT)により4回洗浄した。洗浄後ビーズに結合したタンパク質を、0.5 mg/ml DYKDDDDK(Flag)ペプチド(Wako)又は3×FLAGペプチド(Sigma-Aldrich)を含有する前記Hepes緩衝液により30分間処理し溶出させた。【０１２７】
表1に結果を示す上記(1)のローカライゼーション試験は以下の手順で行った。まず、カバーガラス上で固定し透過処理したXCT細胞に、各プローブ候補を発現した細胞の溶解液の前記上清液を接触させた。下記の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」の欄で詳述する蛍光顕微鏡装置の観察チャンバーに前記試料を載せたカバーガラスを設置し、前記試料に全反射照明蛍光観察のための488nmレーザー線(本体出力50mW、ただしAOTF等により減光され試料に至る)による励起光を照射しながら、1フレームの露光時間50ms又は100ms、フレームレート20Hz（1秒間に20フレーム）、又は、露光時間100ms、フレームレート10Hz（1秒間に10フレーム）で10000フレームの輝点画像を取得した。取得した10000フレームの輝点画像を積算して前記細胞中の標的物（微小管、中間径フィラメント、接着斑又はアクチンフィラメント）の分布が確認できるかどうかを確認した。標的物の分布が確認できたときローカライゼーション試験をP（陽性）とした。【０１２８】
表1に結果を示す上記(2)の洗浄性試験は以下の手順で行った。前段落で説明した輝点画像撮像後、観察チャンバーに入っている1mlの各プローブ候補を含有する前記上清液をアスピレーターで吸い出して、プローブの入っていない下記のイメージング用溶液（ただし活性酸素除去用ミックスは添加していない）を1 ml加えた。このイメージング用溶液の入れ換えは観察位置がずれないようにゆっくり行った。続いてプローブの入っていない前記活性酸素除去用ミックス不含イメージング用溶液を10〜20回程、入れ換えた。入れ替え後、確認のために、観察チャンバー内のXCT細胞試料に対して、前記段落に記載のローカライゼーション試験と同様の条件で10フレーム程度の輝点画像を撮像し、輝点画像で確認される輝点数（すなわち結合しているプローブの数）が、洗浄操作前の輝点画像での輝点数と比較して十分減少（約10%以下）したら、洗浄可能と判断し、結果をP（陽性）とした。【０１２９】
表1に結果を示す結合半減期測定は以下の手順で行った。前記ローカライゼーション試験において撮像した10000フレームの輝点画像を利用して、標的に結合したプローブが輝点画像に出現し、そして解離によって消失するまでの時間をImageJのプラグインであるSpeckle TrackerJを用いてセミマニュアルで計測した。例えば、露光時間50msフレームレート20Hzの撮像の場合、連続した1フレームのみで観察される輝点の、出現から消失までの時間は50msとし、連続した2フレームのみで観察される輝点の、出現から消失までの時間は100msとする。そして出現から消失までの時間に対して結合しているプローブの数を相補累積相対度数関数（1-Ndissociation）に従ってプロットした。Ndissociationは解離したプローブの累積相対度数である。そして前記の相補累積相対度数関数を指数関数でフィッティングすることで、その半減期を算出した。ただし、Atto488-Lifeactのアクチンフィラメントに対する結合半減期は図9の図面の簡単な説明の部分で詳述する方法により測定した。【０１３０】
表1に結果を示す上記(3)のIRIS画像試験は以下の手順で行った。前記ローカライゼーション試験において撮像した10000フレームの輝点画像の全てを利用し、DAOSTORMを用いて前記輝点画像の各フレーム中で標的に結合しているプローブの中心点をナノメーター精度で決定した。10000フレームの蛍光画像中の多数の中心点情報を足し合わせることで再構成画像（観察画像）を作成した。その再構成画像に標的分子の分布が観察できるかどうかで判断し、標的分子の分布が観察できる場合に結果をP（陽性）とした。
IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順
Xenopus laevis XTC細胞を、10%ウシ胎児血清を添加した70% ライボビッツ(Leibovitz’s) L15培地中で培養した。種々の交換性プローブを用い、固定XTC細胞から連続的に取得した多数の蛍光単分子輝点(SiMS)画像（1つのプローブあたり20,000〜50,000フレーム）から、多重染色超解像を作製した。血清を含まない70% ライボビッツL15培地中で0.1 mg/mlポリ-L-リジンと10 μg/mlフィブロネクチンとで被覆したカバーガラス上に前記細胞を展開し、明確なストレスファイバー及び接着斑(focal adhesions)を形成させた(文献33)。2時間経過後、前記細胞を、3.7% PFA及び0.5% Triton-X 100を含む細胞骨格用緩衝液(10 mM Mes pH6.1, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mMグリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA))を用いて固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)(文献34)を添加した前記Hepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、精製IRISプローブを接触させた。IRISプローブの濃度は1〜100nMとした。前記酸素除去用混合物を用いない場合は、SiMS画像を数万回取得した後のレーザー照射によるダメージが顕著であった。【０１３１】
アクチンフィラメントのin vitroでのイメージングのために、アクチン単量体を文献33,35,36記載の方法によりウサギ骨格筋から調製した。ファロイジンにより安定化したF-アクチンを、前記イメージング用溶液中、1 mg/mlポリ-L-リジンにより被覆したカバーガラス上で観察した。【０１３２】
Olympus PlanApo NA 1.45 ×100対物レンズと、×2 中間レンズと、EM-CCDカメラ(Evolve 512, Roper)とを備え、MetaMorphソフトウェア(Molecular Device)により制御された倒立顕微鏡(Olympus IX83-ZDC)を用いてSiMS画像を取得した。長時間の撮像の間、Zドリフト補正システムにより、焦点を細胞の底部に自動的に保持した。落射蛍光観察のための473nmレーザー線(50 mW)と、TIRF観察のための488nmレーザー線(50 mW)とを下記手順の通り交互に用いてIRISプローブを励起した。落射蛍光モードでは、473nmレーザー線の入射角を傾斜させて、焦点外の結合していないプローブからのバックグラウンド蛍光を低減させた。落射蛍光画像と、TIRF画像とを用いて、対象物のZ位置を推定した(下記)。具体的には以下の手順を繰り返すことで撮像を行った:
(a) 明視野での撮像;
(b) 落射蛍光によるSiMS画像（輝点画像）の撮像（1フレームの露光時間: 50ms, フレームレート: 20Hz（1秒間に20フレーム）, 連続撮像フレーム数: 250フレーム）;
(c) TIRFによるSiMS画像（輝点画像）の撮像（1フレームの露光時間: 50ms, フレームレート: 20Hz（1秒間に20フレーム）, 連続撮像フレーム数: 250フレーム）。【０１３３】
明視野で得られた画像を用いて、顕微鏡ステージの横方向のドリフトを補正した（下記）。接着斑の観察の際は、落射蛍光観察は行わず、TIRF観察を行った（フレームレート: 20Hz, 500フレーム）。前記手順の1セットを行うには27秒間を要し、該セットを160〜240回(プローブ/標的物=CLIP-170断片(配列番号12の第3-309番アミノ酸残基)/微小管)、40回(プローブ/標的物= PIPKIγ断片(641-668)（配列番18）, Paxillin(配列番号15の全長) 及び Src断片(配列番号16の第3-251番アミノ酸残基)/接着斑)、800回(プローブ/標的物= Lifeact（配列番号19）/アクチンフィラメント)、及び400〜480回(プローブ/標的物= Plectin-1断片(配列番号8の第4022-4364番アミノ酸残基)/中間径フィラメント)反復した。前記イメージング用溶液の酸素除去能を維持するために、CLIP-170断片、PIPKIγ断片 Paxillin及びSrc断片を用いる場合は40セット毎に、Lifeact及びPlectin-1を用いる場合は80セット毎に、各プローブを含むイメージング用溶液を新鮮な溶液に置換した。3種の細胞骨格及び接着斑の多重染色イメージングのためには、SiMS画像の撮像を、CLIP-170断片、PIPKIγ断片（或いはSrc断片又はPaxillin）、Lifeact、Plectin-1断片の順に実施した。各プローブによるSiMS画像の取得後、毎回、前記Hepes緩衝液により10回洗浄した。酸素除去用混合物を添加した前記Hepes緩衝液中でプローブの残留蛍光を完全に消光させ、次のプローブを作用させた。【０１３４】
本実施例では、特に言及のない限り、上記の条件において観察画像を取得する撮像工程を行った。
IRISでの画像再構築の手順
個々の蛍光輝点の中心位置をブランク画像上にサブピクセル精度でプロットし、超解像を再構築した。プロットした点の数は典型的には106〜108個であった。この顕微鏡の点拡がり関数(a point-spread function, PSF)の、DAOSTORM（文献14）と呼ばれるコンピュータプログラムを用いたフィッティングにより、サブピクセル精度で中心位置を推定した。顕微鏡ステージのドリフトを補正するために、上記撮像手順の各セットで得られる明視野像の自動補正関数AN(xdrift, ydrift)によりドリフト距離を算出した：【０１３５】
【数１】
2016143900.tif 000003
【０１３６】
（式中、xdrift及びydriftはそれぞれx軸方向及びy軸方向でのドリフト距離である。I0(x,y)及びIN(x+xdrift,y+ydrift)はそれぞれ、第1セット及び第Nセットで得られた明視野像でのピクセル位置(x,y)及び(x+xdrift,y+ydrift)での強度である。）
明視野像における所定の領域内で、I0(x,y)とIN(x+xdrift,y+ydrift)との積を積算する。変数xdrift及びydriftの関数であるAN(xdrift, ydrift)は、前記二つの明視野像が一致する場合に、最大となる。ImageJソフトウェア(http://rsb.info.nih.gov/ij/)におけるカスタマイズされたプラグインを用いて、AN(xdrift, ydrift)が最大となるxdrift及びydriftを算出した。はじめに、第Nセットの明視野像のドリフトを、算出された前記xdrift及びydriftを用いてピクセル精度で補正した。更にドリフト距離をサブピクセル精度で決定するために、第1セット及び第Nセットでの明視野像及び補正された明視野像を、バイキュービック法を用い拡大した。拡大された画像のAN(xdrift, ydrift)を用いて、ドリフト距離をサブピクセルの精度で決定した。第NセットでのSiMS画像中の輝点の中心位置を、前記ドリフト距離を用いて補正した。補正後の中心位置をプロットすることにより、超解像を生成した。Lifeactによる再構築画像（観察画像）又はPlectin-1による再構築画像（観察画像）を生成する際には、10フレーム以上または20フレーム以上連続して観察された輝点の位置は用いなかった。これら二つのプローブは、強い励起レーザー出力を用いたときに標的物に結合する場合があった。
観察対象物のz位置をマッピングするための画像処理
TIRF励起光の強度はカバーガラスから遠ざかると指数関数的に低減することから、TIRF画像と、落射蛍光画像との比率から観察対象物の高さを推定した。カバーガラス表面からのz位置を、文献18に記載の、低融点アガロースゲル中でのカバーガラスに対し傾斜した蛍光微小管を用いた方法により測定した。HiLight488標識チューブリンをCytoskeleton, Inc.から購入した。前記標識微小管は文献18に記載の方法に従い調製した。一方の端がカバーガラスに接触した傾斜した微小管をTIRF及び落射蛍光により撮像した。落射蛍光画像はz-スタック画像（0.2μmステップサイズ）として取得した（図14a）。落射蛍光画像の微小管に沿った強度線プロファイルにおいて、最も高強度のx-y位置を用いて、傾斜した微小管と焦平面との交点（図14a矢印）を決定した。zスタック画像間で前記交点をつなぐことにより、傾斜した微小管に沿った各点のz方向距離を求めた。各点のz方向距離を、TIRF画像での微小管の強度と底位置の落射蛍光画像での微小管の強度との比に関連付けることにより、TIRF法での励起光強度のzプロファイルを決定した（図14b）。このzプロファイルを単一指数関数的減衰関数にフィットさせた（図14b）。z位置を、イマージョンオイルと前記イメージング用溶液との間の屈折率の違いを勘案して0.82の係数で再度スケール調整した（文献18）。前記指数関数の逆関数を用いて、観察対象物のz位置を次式により決定した:【０１３７】
【数２】
2016143900.tif 000004
【０１３８】
（式中、αzはTIRF発光の強度が1/eとなるz位置である。βは、TIRF観察時と落射蛍光観察時のレーザー出力の違いを校正するためのパラメータである。FTIRF及びFEpiはそれぞれ、TIRF画像及び落射蛍光画像での、観察対象物の蛍光強度である。）
三種の細胞骨格のz位置マップは、TIRFによるIRIS画像（観察画像）の、落射蛍光によるIRIS画像（観察画像）に対する比の画像から変換した。この目的のために、蛍光輝点のピーク強度を、DAOSTORMを用いてフィッティングした。輝点の中心位置にピーク強度をプロットすることによりIRIS画像を再構築した。得られたz位置マップは、TIRFによるIRIS画像と落射蛍光によるIRIS画像とを足し合わせた画像での蛍光強度を、閾値によりマスクし、細胞骨格のない領域でのノイズを除去した。アクチンストレスファイバー等の層状構造では、算出されたz位置は、該構造のz軸方向での重心の高さ位置を示す。【０１３９】
EB1-EGFPの生細胞イメージングにより追跡された微小管プラス端のz位置は、TIRF画像での微小管プラス端の直径0.4μmの領域の平均強度の、落射蛍光画像での同領域の平均強度に対する比から変換して得た。
微小管プラス端の動きの生細胞イメージング
EGFP融合EB1の発現プラスミドによりXTC細胞をトランスフェクトした。3〜4日後、該細胞に対し、EB1-EGFPのライブセルイメージングを1秒間インターバルで行った。各インターバル期間に、落射蛍光観察のための励起光による蛍光の露光時間100msでの撮像と、全反射蛍光観察のための励起光による蛍光の露光時間100msでの撮像とを行った。このとき、各励起光は、生細胞を傷めないようにレーザーパワーをIRIS超解像撮像の際の20％程度に低減させて照射した点を除いて、IRIS超解像について上記した条件で照射した。各撮像時点で、交互に全反射照明及び落射照明を用いて２つの蛍光画像を100ミリ秒の露光時間で取得した。ImageJプラグインである Speckle TrackerJ (文献33、37) を用いてEB1で標識された微小管プラス端を追跡した。追跡された微小管プラス端のz位置を上述の方法で算出した。微小管プラス端の部位の速度を、5つの連続した撮像時点でのそのx-y位置の線形近似により算出した。
結果
プローブ候補のスクリーニング試験の結果は以下の通りであった。【０１４０】
【表１】
2016143900.tif 000005
【０１４１】
表中Pは陽性(Positive)を示し、NAは測定していない(Not accessed)ことを示す。【０１４２】
＊配列表において配列番号18はPIPKIγ90の断片641-668のアミノ酸配列を示す。【０１４３】
なお、ローカライゼーション試験及び洗浄試験のどちらか一方で不合格となったプローブ候補はIRIS画像の試験及び半減期測定を行っていないため、上記表1には示していない。不合格のプローブ候補は標的物との結合半減期が非常に長い、或いは非常に短い、或いは標的物と結合しないと推定される。【０１４４】
アクチンフィラメントに対してAtto488-Lifeactがプローブとして有効であり、その半減期が23nmであることは、図9及びその説明において詳述した実験において別途確認されているため、参考結果として上記表に記載した。
IRISによる高標識密度でのアクチンフィラメントの超解像
本発明者らは、一般的なアクチンマーカーであるLifeactを用いてIRIS法により超解像を生成できるかを確認した。Lifeactは生細胞及び固定細胞におけるアクチンフィラメントを染色する短いペプチドである(文献10)。Lifeactはアクチンフィラメント上で0.4秒以内に交換される性質を有する(文献10)。本発明者らは単分子輝点(SiMS)顕微鏡法によりLifeactの高速交換性を確認している（文献11-13）。Atto488標識Lifeactの滞留時間は、半減期23ミリ秒の単一指数関数的減衰を示した（図9a）。本発明者らはイメージング用溶液中でのAtto488標識Lifeact濃度を2.4 nMとし、488nmの全反射照明を用いた露光時間50ms/フレーム、フレームレート20Hzでの連続撮像でin vitroでのアクチンフィラメント上でのLifeactのSiMS画像を2×105枚取得した。各蛍光輝点の中心位置をDAOSTORM(文献14)と呼ばれるコンピュータプログラムを用いて決定した（図9b）。前記2×105フレームの輝点画像における数多くのLifeact輝点からの位置情報を積算してアクチンフィラメントの画像を再構築した（図5b及び図9c）。単一のアクチンフィラメントの平均幅は、高いローカライゼーションの精度を担保するために高輝度の輝点(上位約12％)のみを用いて再構築した画像での半値全幅(FWHM)として23nmであった（図5c及び図9d）。【０１４５】
従来の超解像顕微鏡法の大きな問題の一つに、抗体と光活性化蛍光タンパク質とを用いた場合では、観察しようとする構造を十分な密度で標識することが難しいという問題がある。アクチンサブユニットおよび抗体はそれぞれ幅6nm及び12nmであるため、1μmあたり360サブユニットからなる単一のアクチンフィラメントは、抗体標識では、最大でも1μmあたり180の密度までしか標識することができない。この標識密度は、本発明者らのIRIS法において2×103フレームの輝点画像から再構築した観察画像での標識密度に相当する。図5d左及び図5eに示す通り、IRIS法において2×103の輝点画像から再構築した観察画像では、アクチンフィラメントは長さ方向に不連続なパターンを示す。標識密度を6.5倍にした場合でもアクチンフィラメントの連続した染色には十分ではなかった（図5d）が、2×105フレームの輝点画像から再構築した観察画像では1.2×104の標識密度を達成することができ、アクチンフィラメントの連続的な超解像を得ることができた（図5d右及び図5e）。このように本発明のIRIS法では、互いに近接して共存している2種又は3種の標的物を分解するうえで従来支障となっていた標識密度の問題を解消できることが明らかとなった。【０１４６】
固定及び透過処理した細胞において、アクチンフィラメントのLifeactプローブを用いたIRIS法により生成した観察画像では、50nm離れた2本の平行なアクチンバンドル(図5d-f)を分解することができた。これに対して、SiMS画像（輝点画像）を足し合わせた画像(従来の免疫蛍光法で得られる画像に匹敵する)ではこれら2本のアクチンバンドルは分解することができなかった(図5g左下)。IRIS法によれば、アクチンフィラメント又は微小管（下記）の連続的な観察画像を得ることができる。このことは、従来の超解像顕微鏡法と比較して顕著な進歩である（図10）。
IRISプローブのスクリーニング法の確立
Lifeactプローブを用いたデータにより決定された必要な分子的特徴を踏まえて、本発明者らは、他の細胞構造に対するIRISプローブを速やかに決定する効率的な方法を確立した。標的物に結合することが知られているタンパク質断片とEGFPとを融合してプローブ候補を生成した。生細胞蛍光単分子スペックル（SiMS）顕微鏡法（文献11,12）もプローブ候補を試験するために有用である。しかし本発明者らは、EGFP融合プローブ候補を発現する細胞の粗溶解液を固定細胞と接触させることにより、プローブ候補の結合特異性と解離動態を容易に明らかにできることを見出した。本発明者らは、以下の4工程によりIRISプローブを選択した：
(i)50ms又は100msのインターバルで10,000フレームのSiMS画像（輝点画像）を撮像し、積算したSiMS画像中で標的に局在できなかったプローブ候補は除外した;
(ii) 洗浄により容易に除去できないプローブ候補は除外した;
(iii) 解離速度の高いプローブ候補(半減期が10〜500ms、図11参照)を選択した;
(iv) プローブ候補が標的に局在できることを再構築IRIS画像（観察画像）において確認した。【０１４７】
表1に示すように、プローブ候補のうち18種を上記スクリーニング法により選択した。微小管及び接着斑に対する複数のプローブにより、これらの構造体の異なる部位を可視化できた（図12,13）。また別途、アクチンフィラメントに対してAtto488-Lifeactがプローブとして有効でありアクチンフィラメントの可視化に有効であることが確認されている（図9等）。このことから、IRISは、一つの構造体におけるプローブ認識部位の分布をマッピングするのに有用であることが示唆される。
IRISによる複数の標的物の超解像
アクチン、微小管、中間径フィラメント、及び接着斑の観察のためのIRISプローブとしては、Lifeact、CLIP-170断片(残基3-309)、Plecin-1断片(残基4022-4364)、及びフォスファチジルイノシトール-(4)-フォスフェート5-キナーゼタイプIγ-90 (PIPKIγ)断片(残基641-668)がそれぞれ好適であることを見出した(図6)(文献15-17)。IRISプローブの交換性を利用して、異なる4種の細胞骨格構造に前記IRISプローブが結合した画像を順次連続して取得した。【０１４８】
更に本発明者らはアクチンフィラメント、微小管及び中間径フィラメントの三次元(3D)ネットワークを調べた。各IRISプローブによる画像を、全反射照明と落射照明とを交互に用いて取得し、それらを用いて細胞の底部での超解像及び細胞辺縁領域全体での超解像をそれぞれ再構築した。これらの画像は、細胞の輪郭に平行に延びるアクチンアークは中央に近づくにつれて、底に局在する放射状のアクチンバンドル(図6a矢印)の上に乗り上げるように隆起していることを示している。ラメリポディウム（葉状仮足）の根元から後方では、微小管及び中間径フィラメントは、数か所で、細胞の底から排除されていることが確認された(図6b, 6cの矢印)。【０１４９】
前記方法で述べた傾斜した蛍光微小管の画像を用いた測定に基づいて、TIRFのIRIS画像と、落射蛍光のIRIS画像とのシグナル比を用いて、各観察対象物のz位置を推定した（図14及び上記方法）(文献18)。図15に示すような3D画像により、標的物の構造を明らかにした。ラメリポジウム(LP)、ストレスファイバー(SF)及びアクチンアーク(Arc)は、それぞれ、z軸方向での重心の高さ位置（平均±S.D.）が、42±43nm、34±30nm 及び217±132nmであるように分布していた(図15a矢印、図15d)。微小管は細胞の縁近傍において、z軸位置が150-200nmから50-100nmへと沈み込んでいた(図15b矢頭; 図15e)。中間径フィラメントは細胞体の全体にわたってメッシュ状の構造を形成しており、フィラメントの一部は、ラメリポディウムの後方で約200nmの高さに位置していた(図15c楕円箇所)。【０１５０】
IRIS画像により、単一の細胞内での複数の細胞骨格構造間の空間的な関係を、回折限界を超えた分解能で観察することが可能となる。ラメラ領域では、中間径フィラメントは多くの場合ストレスファイバーと絡み合っているが、微小管とは絡み合っていない（図7a-7c）。絡まりあったアクチンと中間径フィラメントとは互いに連結しているようである。それらの断面プロフィールでは、アクチンストレスファイバーは中間径フィラメントと重なっている（図7e矢印）。辺縁領域では、中間径フィラメントはアクチンストレスファイバーとは絡み合わず（図7g, 7i）、その一方で、中間径フィラメントの一部は微小管と並行している（図7h矢印）。断面プロファイルによれば、中間径フィラメントは微小管と重なるが、アクチンとは重ならないことが分かる（図3i, 3j矢印）。このように、IRISでは、4種の細胞骨格成分間の領域特異的な近接を明らかにすることができる。
生細胞での微小管プラス端の挙動と、細胞骨格ネットワークの超解像との対比
本発明者らは、接着斑とストレスファイバーの近傍では、微小管の高さが局部的に変化することを見出した。微小管が、接着斑及びストレスファイバーと交差するとき、ガラス表面から100nmの位置から200nmの位置へと持ち上がっていた(図8a矢頭, 8b, 16)。接着斑の成分はガラス表面から30-から80nmの高さに位置する(文献19)。従って、持ち上がった微小管は接着斑と接触せずアクチンストレスファイバー上に乗り上げていると考えられる。【０１５１】
本発明者らは更に、微小管プラス端と、その部分における細胞骨格ネットワークとの関係を、生細胞でEB1-EGFPの挙動を観察し、次いで、固定後に3D細胞骨格ネットワークの超解像を再構築することにより、調べた。本発明者らのイメージング系によれば、全反射照明と落射照明とを高速で切り替えるための音響光学的可変フィルターにより生細胞3Dイメージングが可能である。EB1標識された微小管の先端の軌道を、超解像での接着斑及びストレスファイバーと対比した(図8cアスタリスク)。成長する微小管の先端がストレスファイバーに接触すると、該先端は下に存在する接着斑から遠ざかるように上向きに動いた(図8d)。EB1標識された微小管の先端はストレスファイバーと接触すると成長が低下し、進行方向が変化した（図8d矢印）。これらのデータから、微小管の成長の速度と方向は、アクチンストレスファイバーとの衝突及び衝突後の相互作用により大きく影響されることが示唆される。このように、IRISと生細胞イメージングとの組み合わせにより、動的に相互作用する複数の細胞骨格構造の形成プロセスを解明することが可能となる。
考察
考察1：PAINTとの比較
文献20（非特許文献4）では、PAINT(point accumulation for imaging in nanoscale topography)と呼ばれる手法が報告されている。この文献では、PAINTによって、水溶液と脂質二重層との間を素早く行き来する蛍光色素Nile-redを用いて脂質二重層の形態を超解像観察したことが開示されている。しかし、Nile-redは、特定の脂質分子種に結合解離するプローブではない。このため脂質膜を構成する特定の脂質分子種の位置を高い精度で決定できない。一方、IRISのプローブは、細胞内に存在する多種のタンパク質の中の特定の標的タンパク質に結合解離し、その分子の位置を高い精度で決定できる。加えてIRISのプローブ交換によって複数の標的物の分布を得るという概念は、このPAINTの概念に含まれてない。IRISによる多種の標的物の高分解能画像化は、このPAINTの概念では実現できない。またこの文献ではPAINTにおいて観察回数を増やすことによって解像度を高めることは開示していない。その理由は、観測回数を増やしても、標的物である脂質膜が固定されていないことから、その形状変化によって解像度が高まらないためであると考えられる。加えて標識密度の問題は、その数年後にようやく未解決の問題として当業者に広く認識されたためであると考えられる(文献4-7)。【０１５２】
標識密度の問題は、2008年に提起されたが(文献6)、超解像顕微鏡観察において長らく未解決であった（文献4,5,7）。2013年の総説(文献5)では、標的密度を高める方法として、抗体や蛍光タンパク質より小さな有機化合物である蛍光色素や、安定に結合するNanobody等の単ドメイン抗体を標的物に安定的に結合させる試みが紹介されている。このことは、PAINTは標的密度を高める方法として認識されていなかったことを示している。また前記の総説で紹介された方法でも本発明で実現したほどの標識密度までは得られず、標識密度の問題は未解決のままであった。これらのことから本発明以前では、標識密度の問題に解決に結合解離プローブを用いるというアイディアは存在しなかったということができる。図10ではIRISと従来公知の超解像顕微鏡法であるSTORM及びExchange-PAINT（文献21-23）との微小管の観察画像を比較した。微小管の長さ方向に沿った標識強度のラインプロファイルによれば、IRISによる観察画像は、STORM及びExchange-PAINTによる観察画像よりも連続的なパターンを示す（図10b）。さらに、IRISによるアクチンフィラメントの標識密度が、アクチンフィラメントに結合する抗体の最大密度の60倍に至ることは容易である。これらの結果から、本発明のIRISによれば、従来の超解像顕微鏡法の信頼性を低める原因となっていた標識密度の問題を解消することができることは明らかである。【０１５３】
標識密度の問題を克服できることに加えて、本発明のIRISによれば、タンパク質系の交換性プローブにより複数の標的物を可視化することが容易であり、標的物の数には制限がない。従来から利用可能な公知の超解像顕微鏡法では、観察可能な標的物の数は2つまでに限られる（文献21,22,24,25）。最近、複数の標的物の超解像観察を可能にするExchange-PAINTが発表された（文献23（非特許文献5））。Exchange-PAINTは、短い蛍光標識DNAを、抗体分子とコンジュゲートを形成した相補的DNAにハイブリダイズさせるという特徴的な標識化手段を用いる。種々のオリゴヌクレオチドのペアを順にハイブリダイズさせることにより、複数の標的物を1つずつ可視化するという点ではIRISと共通する。しかしExchange-PAINTでは不均一な標識化及び／又は抗体同士の干渉が原因で、標識物の分布の分析が不正確となる場合がある（図10b）。これに対して、IRISプローブは洗い流してから次のIRISプローブを試料に接触させることから、複数の標的物のそれぞれに対する複数のプローブが相互に干渉することがない。本発明者らのデータは、3種の細胞骨格構造及び接着斑の領域特異的な近接を、回折限界を超える精度で示している。狭い領域内で癒着しているような場合であっても、原理的には、IRISにより観察できる標的物の数には制限がない。この効果は、既存の超解像顕微鏡法と比較して顕著に有利な効果である。
考察2：プローブ
上記表に示す通り、本発明者らは、19のプローブが実際にIRIS法に有効であることを確認した。上記プローブは、標的物物質に会合することが知られている結合パートナーを用いたプローブであったが、これには限定されない。ファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド系等のタンパク質の相互作用を確認するアッセイを用いることで、有用なIRISプローブをスクリーニングすることができる。【０１５４】
微小管及び接着斑に対する複数のIRISプローブは、これらの構造体の異なる部位を可視化した。MAP4断片及びタウタンパク質は、EB1存在下では微小管プラス端を弱く可視化した（図12e）。CLIP-170断片はEB1の存在下で微小管先端を強く標識し、EB1の不存在下では微小管全体を連続的に標識した（図12c, 12e）。この結果はin vitroデータと合致する（文献26）。更に、PaxillinとSrc断片は接着斑の異なる部分を可視化した（図13）。このことからIRISは複数のタンパク質断片が結合する部位のマッピング分析にも応用することができる。特定の状態の分子に結合するIRISプローブを開発すれば、前記特定の状態にある前記分子を超解像マッピングすることも可能となる。
<2.実験2>
2.1.ポリクローナル抗体からのFabプローブの作製方法
抗p40抗体を含む抗血清は、当研究室で作製した抗原 (Xenopus laevis由来p40) を使ってウサギで作製された。抗原を充填したアフィニティーカラムにウサギ抗血清を入れ、ポリクローナル抗体をカラムに吸着させた。カラム内のpHを段階的に低下させ（pH 5 〜pH 2）、吸着させた抗体を溶出させた。高いpH（pH 4 〜 pH 3.5）で溶出された画分2 mlをProtein A ビーズ（Protein A Sepharose CL-4B, GE）の50%スラリー溶液1.4 mlに加え、4 ℃で一晩かけて抗体をビーズに吸着させた。吸着されなかった抗体をPBSで洗浄して取り除いたのち、ビーズを1 mlのPBSに懸濁した。このビーズの懸濁液にDMSOに溶かした1 μg/μl DyLight 488 NHS Ester (ThermoScientific)を50 μl加え、室温で1時間かけて抗体を蛍光標識した。未反応のDyLight 488 NHS EsterはPBSで洗浄して除去し、遠心してビーズのみを回収した。ビーズに吸着した抗体からFabフラグメントを作製するため、Digestion Buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM Cysteine-HCl, 2 mM EDTA）に溶かした7 μg/ml パパインを1 ml加え、37℃で1時間反応させた。遠心後、Fabフラグメントの含まれる上清を回収し、1 mg/mlロイペプチンを1 μl加え、パパインの活性を阻害した。得られたFabフラグメントを、抗原を充填したアフィニティーカラムに入れ、前記Fabフラグメントを吸着させた。カラム内のpHを段階的に低下させ、高いpH（pH 5 〜 pH 4）で溶出された画分のFabフラグメントを得た。このようにポリクローナル抗体からのFabフラグメントの作製は、カラム精製を2回行った。1回目のアフィニティーカラムによって抗原結合力の弱い抗体を精製した。その抗体からさらに抗原結合力の弱いFabフラグメントを作製した。2回目のアフィニティーカラムによって、まだ抗原結合力が残っているFabフラグメントを精製した。この方法で調製されたFabフラグメントはIgGに由来するものである。
2.2.アクチンのIRIS超解像イメージング
Arp2/3複合体観察用細胞試料の調製
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」で詳述した手順により、Xenopus laevis XTC細胞を固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)を添加したHepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 90 mM KCl, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT, 0.1% Triton X-100)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、上記のFabプローブを接触させた。前記イメージング用溶液中でのFabプローブ濃度は、100 nMとした。【０１５５】
撮像と画像再構築
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」と同様に、Olympus PlanApo NA 1.45 ×100対物レンズと、×2 中間レンズと、EM-CCDカメラ(Evolve 512, Roper)とを備え、MetaMorphソフトウェア(Molecular Device)により制御された倒立顕微鏡(Olympus IX83-ZDC)を用いてSiMS画像（輝点画像）を取得した。TIRF観察のために、488 nmレーザー線(50mW)を照射して蛍光標識された前記Fabプローブを励起した。１フレームの露光時間は100ミリ秒、フレームレート（撮像速度）は10Hz (1秒間に10フレーム)で250フレームずつ連続撮像し、合計33,750フレームのSiMS画像（輝点画像）を撮像した。【０１５６】
上記の33,750フレームのSiMS画像からの画像再構築の手順は実験1の「IRISでの画像再構築の手順」において詳述した通りである。【０１５７】
精製されたFabプローブの標的抗原と形成する結合体の半減期は実験1と同様の方法で求めた。すなわち上記で撮像したSiMS画像を利用して、標的に結合したFabプローブが輝点画像に出現し、そして解離によって消失するまでの時間をImageJのプラグインであるSpeckle TrackerJを用いてセミマニュアルで計測した。そして出現から消失までの時間に対して結合しているFabプローブの数を相補累積相対度数関数（1-Ndissociation）に従ってプロットした。そして前記の相補累積相対度数関数を指数関数でフィッティングすることで、その半減期を算出した。その結果、前記Fabプローブの標的抗原と形成する結合体の半減期は216ミリ秒であった。
2.3.結果
図17にアクチン重合促進因子であるArp2/3複合体のp40サブユニットに対するウサギ由来のポリクローナル抗体から作成された前記Fabプローブによる再構築画像を示す。細胞の辺縁領域にp40が多く分布することが知られており、その通りの分布がFabプローブで可視化された。
<3.実験3>
3.1.Fabプローブのスクリーニング
ハイブリドーマのライブラリー（1200サンプル）は、抗原としてFLAGペプチド(配列番号2)を用いて作製された。マウスを抗原で免疫したのち、腸骨リンパ節よりリンパ球を回収、マウスミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを作成する。ハイブリドーマは希釈培養によってライブラリーとした。ハイブリドーマライブラリーから培養上清をサンプル毎に回収し、Protein Gを固相化した96 ウェルガラスボトムプレートに反応させることで、培養上清中の抗体を底面ガラスの表面に固定した。【０１５８】
ここで、Protein Gを固相化した96 ウェルガラスボトムプレートの作製及び抗体の固定化は以下の手順で行った。(3-アミノプロピル)トリエトキシシランをメタノールと酢酸の混合液（混合比100:5）に溶かして、3% 溶液を作製した。この溶液を、各ウェルの底面がガラスからなる96ウェルマルチウェルプレートに入れ、室温で30分インキュベートし、ウェル底のガラス表面をコーティングした。未反応の(3-アミノプロピル)トリエトキシシランをメタノールで複数回洗浄することで取り除き、その後にプレートを風乾させ、ガラス表面に(3-アミノプロピル)トリエトキシシランを定着させた。次に、0.1% グルタルアルデヒド溶液を各ウェルに加え、室温で30分間反応させ、グルタルアルデヒドをガラス表面に結合させた。50 ng/μl  Protein G（Thermo Scientific）溶液を各ウェルに加え、グルタルアルデヒドの結合したガラス表面に4℃で一晩接触させた。Protein Gは、グルタルアルデヒドを介して(3-アミノプロピル)トリエトキシシランと共有結合し、ガラス表面に固相化される。Protein Gが固相化されたガラス表面を3% BSA溶液で一晩4℃でブロッキングした。その後、抗体を含むハイブリドーマ培養上清を各ウェルに加え、4℃で一晩静置した。培養上清に含まれる抗体は、そのFcドメインを介してProtein Gと特異的かつ強固に結合し、ガラス表面に固定される。ハイブリドーマ培養上清を除去したのち、ガラス表面を細胞溶解用緩衝液（10 mM Hepes pH 7.2, 3 mM MgCl2, 0.2% Triton X-100, 100 μM DTT）で洗浄し、後述する観察工程に供した。  抗原となるFLAGペプチドとEGFPの融合タンパクを得るため、HEK-293F細胞をFLAG-EGFPをコードするプラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を3-4日培養したのち、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）を含む細胞溶解用緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 3 mM MgCl2, 0.2% Triton X-100, 100 μM DTT)中で溶解させた。溶解液を遠心分離し、上清液を回収した。上清液に含まれるFLAG-EGFP濃度をEGFPの発光強度から見積もり、細胞溶解液用緩衝液で希釈することで50 nM FLAG-EGFP溶液を用意した。【０１５９】
抗体を固定した各ウェルに50 nM FLAG-EGFP溶液を加えた。TIRF顕微鏡を用いて、1フレームの露光時間50 ms、フレームレート20 Hz（1秒間に20フレーム）で、500フレームのSiMS画像（輝点画像）を撮像した。1200 ウェルを観察した結果、顕微鏡視野内（41 μm × 41 μm）に10〜300個（0.006〜0.178個/μm2）の輝点が観察された。各輝点は単分子のEGFPに対応する。輝点画像の例として、図18Aに約250個の輝点が観察された画像、図18Bに約20個の輝点が観察された画像を示す。抗体を固相化していないウェルに50 nM FLAG-EGFP溶液を加えた場合では、視野内の輝点の数は、10〜20個（0.006〜0.012個/μm2）であった。そこで、視野内で輝点の数が40個（0.023個/μm2）以上観察された 26 ウェルを陽性例として、抗体とFLAG-EGFPの結合の半減期を計測した。それらの半減期はウェルごとに異なっていた。図18Aに示したウェルでの半減期は、55 msであった。【０１６０】
顕微鏡視野内に40個以上の輝点が観察された陽性例の26 ウェルから、結合体の半減期が10ミリ秒以上3秒以下である抗体を選別した。それらの抗体を産生するハイブリドーマをモノクローン化し、その培養上清2〜10 ml回収した。その培養上清にProtein A ビーズ（Protein A Sepharose CL-4B, GE）の50%スラリー溶液を40 μl加え、4 ℃で一晩かけて抗体をビーズに吸着させた。吸着しなかった抗体をPBSで洗浄して取り除いたのち、ビーズを100 μlのPBSに懸濁した。このビーズの懸濁液にDMSOに溶かした0.5 μg/μl DyLight 488 NHS Ester (ThermoScientific)を16 μl加え、室温で1時間かけて抗体を蛍光標識した。未反応のDyLight 488 NHS EsterはPBSで洗浄して除去し、遠心してビーズのみ回収した。ビーズに結合した抗体からFabフラグメントを作製するため、Digestion Buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM Cysteine-HCl, 2 mM EDTA）に溶かした0.01 mg/ml パパインを20 μl加え、37℃で1時間反応させた。遠心後、Fabフラグメントの含まれる上清を回収し、0.01 mg/mlロイペプチンを2 μl加え、パパインの活性を阻害した。
2.2.アクチンのIRIS超解像イメージング
FLAGタグ融合アクチン発現XTC細胞試料の調製
配列番号２０に示す塩基配列によりコードされるFLAGタグ融合アクチンをXTC細胞で発現させた。【０１６１】
pEGFP-アクチンをコードする発現ベクター（CLONETECH）を制限酵素Age-I, Bgl-II (NEB)で切断して、EGFPをベクターから除いた。FLAGペプチド（DYKDDDDK）をコードする合成cDNAを前記ベクターに挿入し、N末端にFLAGがタグ付けされたアクチンをコードする発現プラスミドを構築した。
上記発現プラスミドによりXenopus laevis XTC細胞を次の手順によりトランスフェクトした。1 μg/μlのFLAG融合アクチンの発現プラスミド 3μlを無血清培地（70%希釈Leibovitz's L-15 medium） 200 μlに溶かし、1 mg/mlのPolyethylenimine, linear, M.W. 25,000 （Polysciences）を8 μl加え、ボルテックスした。30分室温で静置した後に1mlの血清入り培地（70%希釈Leibovitz's L-15 medium、10%FCS添加）を加えた。このプラスミドの含まれた溶液と6ウェルにまいたXTC細胞の培地を交換し、一晩かけて細胞にプラスミドを取り込ませた。
トランスフェクトの３〜４日後に、実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」で詳述した手順により、前記細胞を固定及び透過処理した。4%ウシ血清アルブミンにより30分間ブロッキングした後、酸素除去用混合物(200 μg/mlグルコースオキシダーゼ、35 μg/ml カタラーゼ、4.5 mg/ml グルコース, 0.5% 2-メルカプトエタノール)を添加したHepes緩衝液(10 mM Hepes pH 7.2, 3 mM MgCl2, 100 μM DTT, 1μg/ml ロイペプチン)からなるイメージング用溶液中で、前記細胞に、上記のFabプローブをそれぞれ接触させた。前記イメージング用溶液中でのFabプローブ濃度は3 nMとした。【０１６２】
撮像と画像再構築
実験1の「IRISによる多重染色超解像のイメージングの手順」と同様に、Olympus PlanApo NA 1.45 ×100対物レンズと、×2 中間レンズと、EM-CCDカメラ(Evolve 512, Roper)とを備え、MetaMorphソフトウェア(Molecular Device)により制御された倒立顕微鏡(Olympus IX83-ZDC)を用いてSiMS画像（輝点画像）を取得した。TIRF観察のために、488 nmレーザー線(50 mW)を照射して蛍光標識された前記Fabプローブを励起した。１フレームの露光時間は50ミリ秒、フレームレート（撮像速度）は20Hz (1秒間に20フレーム)で500フレームずつ連続撮像し、合計120,000フレームのSiMS画像（輝点画像）を撮像した。【０１６３】
上記の120,000フレームのSiMS画像からの画像再構築の手順は実験1の「IRISでの画像再構築の手順」において詳述した通りである。
2.4.結果
図19に上記のスクリーニング方法で選別された抗FLAGモノクローナル抗体由来のFabプローブによるFLAG融合アクチンのIRIS超解像画像を示す。このIRIS超解像画像の作製に用いたFabプローブとFLAG融合アクチンの結合体の半減期は、203ミリ秒であった。【０１６４】
本スクリーニング方法によって、IRIS超解像イメージングに適したFabプローブを選別することができた。
<4. 文献>
以下に本明細書で参照した文献を記載する。
1. Fernandez-Suarez, M. & Ting, A. Y. Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 929-943, doi:10.1038/nrm2531 (2008).
2. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science 316, 1153-1158, doi:10.1126/science.1137395 (2007).
3. Huang, B., Babcock, H. & Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: super-resolution imaging of cells. Cell 143, 1047-1058, doi:10.1016/j.cell.2010.12.002 (2010).
4. Huang, B., Bates, M. & Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016, doi:10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014 (2009).
5. Sauer, M. Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact. J. Cell Sci. 126, 3505-3513, doi:10.1242/jcs.123612 (2013).
6. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. & Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods 5, 417-423, doi:10.1038/nmeth.1202 (2008).
7. Kanchanawong, P. & Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol. Biol. 1046, 59-84, doi:10.1007/978-1-62703-538-5_4 (2013).
8. Betzig, E. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642-1645, doi:10.1126/science.1127344 (2006).
9. Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods 3, 793-795, doi:10.1038/nmeth929 (2006).
10. Riedl, J. et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat. Methods 5, 605-607, doi:10.1038/nmeth.1220 (2008).
11. Watanabe, N. & Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science 295, 1083-1086, doi:10.1126/science.1067470 (2002).
12. Higashida, C. et al. Actin polymerization-driven molecular movement of mDia1 in living cells. Science 303, 2007-2010, doi:10.1126/science.1093923 (2004).
13. Vale, R. D. Microscopes for fluorimeters: the era of single molecule measurements. Cell 135, 779-785, doi:10.1016/j.cell.2008.11.009 (2008).
14. Holden, S. J., Uphoff, S. & Kapanidis, A. N. DAOSTORM: an algorithm for high- density super-resolution microscopy. Nat. Methods 8, 279-280, doi:10.1038/nmeth0411-279 (2011).
15. Perez, F., Diamantopoulos, G. S., Stalder, R. & Kreis, T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell 96, 517-527 (1999).
16. Nikolic, B., Mac Nulty, E., Mir, B. & Wiche, G. Basic amino acid residue cluster within nuclear targeting sequence motif is essential for cytoplasmic plectin-vimentin network junctions. J. Cell Biol. 134, 1455-1467 (1996).
17. Di Paolo, G. et al. Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1 gamma by the FERM domain of talin. Nature 420, 85-89, doi:10.1038/nature01147 (2002).
18. Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J. & Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. J. Microsc. 234, 38-46, doi:10.1111/j.1365-2818.2009.03147.x (2009).
19. Kanchanawong, P. et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature 468, 580-584, doi:10.1038/nature09621 (2010).
20. Sharonov, A. & Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 18911-18916, doi:10.1073/pnas.0609643104 (2006).
21. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T. & Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science 317, 1749-1753, doi:10.1126/science.1146598 (2007).
22. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B. & Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nat. Methods 5, 1047-1052, doi:10.1038/nmeth.1274 (2008).
23. Jungmann, R. et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat. Methods 11, 313-318, doi:10.1038/nmeth.2835 (2014).
24. Shroff, H. et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 20308-20313, doi:10.1073/pnas.0710517105 (2007).
25. Liu, K. S. et al. RIM-binding protein, a central part of the active zone, is essential for neurotransmitter release. Science 334, 1565-1569, doi:10.1126/science.1212991 (2011).
26. Bieling, P. et al. CLIP-170 tracks growing microtubule ends by dynamically recognizing composite EB1/tubulin-binding sites. J. Cell Biol. 183, 1223-1233, doi:10.1083/jcb.200809190 (2008).
27. Kaverina, I., Krylyshkina, O. & Small, J. V. Microtubule targeting of substrate contacts promotes their relaxation and dissociation. J. Cell Biol. 146, 1033-1044 (1999).
28. Salmon, W. C., Adams, M. C. & Waterman-Storer, C. M. Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells. J. Cell Biol. 158, 31-37, doi:10.1083/jcb.200203022 (2002).
29. Small, J. V. & Kaverina, I. Microtubules meet substrate adhesions to arrange cell polarity. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 40-47, doi:10.1016/s0955-0674(02)00008-x (2003).
30. Huda, S. et al. Microtubule guidance tested through controlled cell geometry. J. Cell Sci. 125, 5790-5799, doi:10.1242/jcs.110494 (2012).
31. Yamana, N. et al. The Rho-mDia1 pathway regulates cell polarity and focal adhesion turnover in migrating cells through mobilizing Apc and c-Src. Mol. Cell Biol. 26, 6844-6858, doi:10.1128/mcb.00283-06 (2006).
32. Tanji, M. et al. mDia1 targets v-Src to the cell periphery and facilitates cell transformation, tumorigenesis, and invasion. Mol. Cell Biol. 30, 4604-4615, doi:10.1128/mcb.00197-10 (2010).
33. Yamashiro, S. et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol. Biol. Cell 25, 1010-1024, doi:10.1091/mbc.E13-03-0162 (2014).
34. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J. & Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell 96, 69-78 (1999).
35. Mizuno, H. et al. Rotational movement of the formin mDia1 along the double helical strand of an actin filament. Science 331, 80-83, doi:10.1126/science.1197692 (2011).
36. Mizuno, H. & Watanabe, N. Rotational movement of formins evaluated by using single-molecule fluorescence polarization. Methods Enzymol. 540, 73-94, doi:10.1016/b978-0-12-397924-7.00005-4 (2014).
37. Smith, M. B. et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys. J. 101, 1794-1804, doi:10.1016/j.bpj.2011.09.007 (2011).
38. Mimori-Kiyosue, Y. et al. CLASP1 and CLASP2 bind to EB1 and regulate microtubule plus-end dynamics at the cell cortex. The Journal of cell biology 168, 141-153, doi:10.1083/jcb.200405094 (2005).
39. Askham, J. M., Moncur, P., Markham, A. F. & Morrison, E. E. Regulation and function of the interaction between the APC tumour suppressor protein and EB1. Oncogene 19, 1950-1958, doi:10.1038/sj.onc.1203498 (2000).
40. Honnappa, S. et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell 138, 366-376, doi:10.1016/j.cell.2009.04.065 (2009).
41. Okada, Y., Higuchi, H. & Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through biased binding to tubulin. Nature 424, 574-577, doi:10.1038/nature01804 (2003).
42. Cai, D., McEwen, D. P., Martens, J. R., Meyhofer, E. & Verhey, K. J. Single molecule imaging reveals differences in microtubule track selection between Kinesin motors. PLoS biology 7, e1000216, doi:10.1371/journal.pbio.1000216
(2009).
43. Olson, K. R., McIntosh, J. R. & Olmsted, J. B. Analysis of MAP 4 function in living cells using green fluorescent protein (GFP) chimeras. The Journal of cell biology 130, 639-650 (1995).
44. Lee, G. & Rook, S. L. Expression of tau protein in non-neuronal cells: microtubule binding and stabilization. Journal of cell science 102 ( Pt 2), 227-237 (1992).
45. Yu, J. Z., Kuret, J. & Rasenick, M. M. Transient expression of fluorescent tau proteins promotes process formation in PC12 cells: contributions of the tau C末端minus to this process. Journal of neuroscience research 67, 625-633 (2002).46. Brown, M. C., Perrotta, J. A. & Turner, C. E. Identification of LIM3 as the principal determinant of paxillin focal adhesion localization and characterization of a novel motif on paxillin directing vinculin and focal adhesion kinase binding. The Journal of cell biology 135, 1109-1123 (1996).
47. Wood, C. K., Turner, C. E., Jackson, P. & Critchley, D. R. Characterization of the paxillin-binding site and the C-terminal focal adhesion targeting sequence in vinculin. Journal of cell science 107 ( Pt 2), 709-717 (1994).
48. Humphries, J. D. et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. The Journal of cell biology 179, 1043-1057, doi:10.1083/jcb.200703036 (2007).
49. Nuckolls, G. H., Turner, C. E. & Burridge, K. Functional studies of the domains of talin. The Journal of cell biology 110, 1635-1644 (1990).
50. Calderwood, D. A. et al. The phosphotyrosine binding-like domain of talin activates integrins. The Journal of biological chemistry 277, 21749-21758, doi:10.1074/jbc.M111996200 (2002).
51. Tremuth, L. et al. A fluorescence cell biology approach to map the second integrin-binding site of talin to a 130-amino acid sequence within the rod domain. The Journal of biological chemistry 279, 22258-22266,
doi:10.1074/jbc.M400947200 (2004).
52. Patel, B. et al. The activity of the vinculin binding sites in talin is influenced by the stability of the helical bundles that make up the talin rod. The Journal of biological chemistry 281, 7458-7467, doi:10.1074/jbc.M508058200 (2006).
53. Moes, M. et al. The integrin binding site 2 (IBS2) in the talin rod domain is essential for linking integrin beta subunits to the cytoskeleton. The Journal of biological chemistry 282, 17280-17288, doi:10.1074/jbc.M611846200 (2007).
54. Himmel, M. et al. Control of high affinity interactions in the talin C terminus: how talin domains coordinate protein dynamics in cell adhesions. The Journal of biological chemistry 284, 13832-13842, doi:10.1074/jbc.M900266200 (2009).
55. Kaplan, K. B. et al. Association of the amino-terminal half of c-Src with focal adhesions alters their properties and is regulated by phosphorylation of tyrosine 527. The EMBO journal 13, 4745-4756 (1994).
56. Hildebrand, J. D., Schaller, M. D. & Parsons, J. T. Identification of sequences required for the efficient localization of the focal adhesion kinase, pp125FAK, to cellular focal adhesions. The Journal of cell biology 123, 993-1005 (1993).
57. Cooley, M. A., Broome, J. M., Ohngemach, C., Romer, L. H. & Schaller, M. D. Paxillin binding is not the sole determinant of focal adhesion localization or dominant-negative activity of focal adhesion kinase/focal adhesion kinase-related nonkinase. Molecular biology of the cell 11, 3247-3263 (2000).
58. Lietha, D. et al. Structural basis for the autoinhibition of focal adhesion kinase. Cell 129, 1177-1187, doi:10.1016/j.cell.2007.05.041 (2007).
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明は、標識に用いる発光物質の位置情報を高密度で取得すること、及び、回折限界を超えた高分解の観察画像を生成することができることが可能な超解像顕微鏡観察法を提供することが可能であり、また、本発明と生細胞イメージング技術との組み合わせにより、動的に相互作用する複数の細胞骨格構造の形成プロセスを解明することが可能となり、産業上の利用可能性が高い。【０１６６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016143900.tif 000026
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