(57)【要約】  本発明は、毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、吸着体に好適な細孔形状を有する吸着性の優れたセルロースビーズを製造する方法を提供する。本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、ｂ）前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する工程、ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、
ｂ）前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する工程、
ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、
ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項２】
前記ａ）の工程における前記アルカリ水溶液の液温が０〜２５℃であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記架橋剤がエポキシ基含有化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項４】
前記エポキシ基含有化合物がグリシジルエーテル系化合物であることを特徴とする請求項３に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項５】
前記架橋剤の水溶率が５０％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項６】
前記架橋剤の粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法で得られたビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化したことを特徴とする吸着体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズ、および、目的物と相互作用するリガンドを含むことを特徴とする吸着体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより吸着体を得る工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の吸着体を用いることを特徴とする精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質セルロースビーズを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質セルロースビーズは、他の合成系高分子を用いる場合に比べて安全性が高く、非特異的吸着が少ないという利点がある。また、機械的強度が大きく、吸着すべき目的物質と相互作用するリガンドを導入するのに利用できる水酸基を多く含有する等の利点から、各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体などの各種吸着体用の基材として用いられている。特に、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体または吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。【０００３】
また、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる抗体医薬品精製用吸着体としても注目されている。【０００４】
多孔質セルロースビーズの製造は、セルロースの溶解が困難であるとされていたことから、通常の合成ポリマーと比べて煩雑な工程を含むものが多い。その一つとして、チオシアン酸カルシウム水溶液など腐食性や毒性が高く、設備化の難易度を高くしてしまう溶媒に溶解し、凝固する方法が開示されている（例えば特許文献１）。この方法で用いられるセルロース溶液が特異な挙動を示し、また、この方法で得られる多孔質セルロースビーズは、かなり大きい細孔を有しており、また細孔径分布も広いことが知られている（例えば非特許文献３）。よって、当該方法で得られた多孔質セルロースビーズを抗体などの吸着体として用いる場合、比表面積が小さいことから、高い吸着性能を示すことは期待できない。一方、セルロースの溶解性を上げるためにセルロースの水酸基に置換基を付与し、汎用の溶媒に溶解させて造粒を行い、造粒後に置換基を脱離させて多孔質セルロース系担体を得る方法が例示されている（例えば特許文献２）が、工程が煩雑であり、置換基を付与したり脱離させたりする過程で分子量の低下が起こり、近年求められている高速処理や大スケールで使用するのに適切な強度が得られ難い傾向がある。【０００５】
一方、セルロースを低温の水酸化ナトリウム水溶液に溶解できるという方法が開示されている（例えば特許文献３、４）。しかしながら、特許文献３に記載の方法では、セルロースと水素結合切断剤（a hydrogen bond-cleaving solution）の混合物を、加圧下、１００〜３５０℃で加熱する工程を経てから、アルカリ水溶液に溶解している。このような工程は、工業的に不利である。また、特許文献４に記載の方法では、セルロースを強塩基溶液に分散させ、当該分散液をいったん凍結させた後に溶解するという工程が必要である。【０００６】
さらに、特許文献５にはアルカリ溶液に溶解性を示すセルロースが開示されているが、当該セルロースはミクロフィブリルの繊維径が１μｍ以下、さらには５００ｎｍ以下に微細化されたものである。このような微細化処理は、工業的製造には適さない。【０００７】
ごく最近、特許文献６に示されるように、微生物セルロースをアルカリ溶液に溶解してセルロース溶液を作製し、分散溶媒を添加後に粒子化した後、微生物セルロース粒子を凍結させ、次に洗浄することによりセルロースビーズを得る方法が開示されているが、工程が煩雑で工業的な製法には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００９−２４２７７０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０２５３７１
【特許文献３】米国特許４６３４４７０
【特許文献４】米国特許５４１００３４
【特許文献５】特開平９−１２４７０２号公報
【特許文献６】特開２０１０―２３６９７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，Ｖｏｌ．１０５１，ｐ．６３５−６４６
【非特許文献２】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５２，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，２００６，ｐ．７１２ｅ１−７１２ｅ６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、吸着体に好適な細孔形状と細孔径分布を有する吸着能の優れたセルロースビーズを毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、効率良く、製造する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、低温のアルカリ水溶液とセルロース粉末とを混合して作製したセルロース微分散液に架橋剤を加えることで、リガンドを固定化した場合により高い吸着能を得られる多孔質セルロースビーズを良好に製造できることを見出して、本発明を完成した。【００１２】
以下、本発明を示す。【００１３】
［１］  ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、
ｂ）前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する工程、
ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、
ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させる工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１４】
［２］  前記ａ）の工程における前記アルカリ水溶液の液温が０〜２５℃であることを特徴とする上記［１］に記載の製造方法。【００１５】
［３］  前記架橋剤がエポキシ基含有化合物であることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１６】
［４］  前記エポキシ基含有化合物がグリシジルエーテル系化合物であることを特徴とする上記［３］に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１７】
［５］  前記架橋剤の水溶率が５０％以上であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１８】
［６］  前記架橋剤の粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする、上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。【００１９】
［７］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法で得られたビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化したことを特徴とする吸着体。【００２０】
［８］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズ、および、目的物と相互作用するリガンドを含むことを特徴とする吸着体。【００２１】
［９］  上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法で製造された多孔質セルロースビーズに、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより吸着体を得る工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。【００２２】
［１０］  上記［７］または［８］に記載の吸着体を用いることを特徴とする精製方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、毒性・腐食性の高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく簡便に、効率よく吸着体に好適な細孔形状と細孔径分布を有する吸着性の優れたセルロースビーズを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明により得られた実施例１に関するセルロースビーズの表面拡大ＳＥＭ観察像である。
【図２】図２は、比較例１に関するセルロースビーズの表面拡大ＳＥＭ観察像である。
【図３】図３は、本発明に係る実施例２〜６でセルロース微分散液に添加した架橋剤の粘度と、得られたセルロースビーズのメジアン径との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る実施例２〜５と比較例２で得られた架橋多孔質セルロースビーズのゲル相分配係数（Ｋav）の測定において、使用したマーカーの粘度半径とＫav値との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、セルロース微分散液に添加した架橋剤の水溶率と、得られたセルロースビーズのＫav値との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明に係る実施例２〜５と比較例２で得られた架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布である。
【図７】図７は、セルロース微分散液に添加した架橋剤の水溶率と、得られたセルロースビーズの平均細孔径との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明に係る実施例２，７，８と比較例２で得られた架橋多孔質セルロースビーズのゲル相分配係数（Ｋav）の測定において、使用したマーカーの粘度半径とＫav値との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、セルロース微分散液へ添加した架橋剤の添加量と、得られたセルロースビーズのＫav値との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明に係る実施例２，７，８と比較例２で得られた架橋多孔質セルロースビーズの細孔径分布である。
【図１１】図１１は、セルロース微分散液へ添加した架橋剤の添加量と、得られたセルロースビーズの平均細孔径との関係を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明に係る実施例１２と参考例１の吸着体との間で吸着性能を比較したグラフである。
【図１３】図１３は、吸着体のプロテインＡ固定化量とＩｇＧ吸着量との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４は、吸着体のメジアン粒径とＩｇＧ吸着量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る多孔質セルロースビーズの製造方法は、ａ）低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する工程、ｂ）前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する工程、ｃ）前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する工程、ｄ）前記エマルションを凝固溶媒に接触させて多孔質セルロースビーズを得る工程を含むことを特徴とする。低温の水酸化ナトリウム水溶液にセルロースを分散させ、凝固溶媒に接触させることにより、多孔質セルロースが得られることは、本出願人により開発済である（国際公開ＷＯ２０１２／１２１２５８など）。
【００２６】
本発明者らは低温アルカリ水溶液を用いた多孔質セルロース担体の製造工程において、架橋剤をセルロース分散液に添加することにより、多孔質セルロースビーズの機械的強度を向上させることを目論んで実験を行った。その結果、理由は定かではないが、驚くべきことに、セルロース分散液への架橋剤の添加により、機械的強度のみならず吸着量がより大きい吸着体を得ることができることを見出した。おそらく、架橋剤がセルロース分散液中で好適に分散され、微小領域を形成し、凝固溶媒または洗浄溶媒に架橋剤が移動することで、吸着に有利な孔を形成せしめるためではないかと考えているが、これは当初全く予想していなかった。以下、本発明方法を工程ごとに説明する。
【００２７】
工程ａ  セルロース微分散液の作製工程
本工程では、低温のアルカリ水溶液とセルロースとを混合してセルロース微分散液を作製する。
【００２８】
ここで低温とは、常温より低い温度を指す。常温より低ければ大きな問題は無いが、−２０℃以上であれば温調設備が簡便でランニングコストも低くなるため好ましい。また１０℃以下であればセルロース分散液の着色が少なくなり、またセルロースの分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。当該温度としては、−１０℃以上、２０℃以下が好ましい。−１０℃以上であればアルカリ水溶液の凍結を抑制することができる。一方、２０℃以下であれば、セルロース分散液を効率的に調製でき、また、セルロース分散液の着色を抑制することができる。当該温度としては、−５℃以上がより好ましく、−２℃以上がさらに好ましく、−１℃以上が特に好ましく、セルロース分散液に用いる水のハンドリング性や温度調整の簡便さから０℃以上であることが最も好ましい。中でも、１５℃以下がより好ましく、９℃以下がさらに好ましく、５℃以下がさらに好ましく、４℃以下がさらに好ましく、１℃以下がさらに好ましい。また、当該温度が９℃以下であれば、得られる多孔質セルロースビーズの真球度が高くなるため好ましい。
【００２９】
アルカリは、水溶液となった際にアルカリ性を示すものであれば特に限定なく用いることができる。入手のしやすさから水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、製品安全性や価格の面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。
【００３０】
前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３〜２０重量％であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５〜１５重量％であり、さらに好ましくは７〜１０重量％、最も好ましくは８〜１０重量％である。
【００３１】
前記セルロースの種類には特に限定は無い。例えば、本発明方法では、セルロースを溶解させなくてもよいので、溶解性を上げるための置換基を導入したセルロースなど、置換セルロースを用いる必要はなく、通常の無置換セルロースを原料として用いることができる。但し、セルロースをアルカリ水溶液に効率的に分散させるために、セルロースとしてはセルロース粉末を用いることが好ましい。
【００３２】
用いるセルロース原料の分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られる多孔質セルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上５００以下、さらに好ましくは１００以上４００以下、特に好ましくは２００以上３５０以下、最も好ましくは２５０以上３５０以下である。
【００３３】
セルロース微分散液におけるセルロースの濃度は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、１重量％以上、２０重量％以下程度とすればよい。当該濃度としては、２重量％以上がより好ましく、４重量％以上がさらに好ましく、また、１５重量％以下がより好ましく、１０重量％以下がさらに好ましい。
【００３４】
セルロース微分散液の調製方法は、常法に従えばよい。例えば、アルカリ水溶液とセルロースとの混合物を、低温に維持しつつ、激しく攪拌すればよい。
【００３５】
工程ｂ  セルロースと架橋剤を含む混合液の作製工程
本工程では、前記セルロース微分散液に架橋剤を加え混合液を作製する。
【００３６】
本発明において「架橋剤」とは、セルロース上の水酸基と共有結合を形成できる反応性基を２以上有し、セルロース分子間を架橋できるものをいう。本発明に用いることができる前記架橋剤に特に限定は無く、従来公知の架橋剤を好適に用いることができる。多孔質ビーズの機械的強度の低下を抑制、または機械的強度の増加を期待する場合は、セルロースが有する置換基（例えば無置換セルロースであれば水酸基）と結合可能な官能基を有する架橋剤を使用することが好ましい。また、多孔質ビーズ形成（造粒）後に架橋反応を実施する場合は、その際に使用する架橋剤と同じものを使用することも好適である。さらに、架橋剤が残存した場合の官能基の不活化が容易であることや、不活化後の非特異吸着が少ないことから、エポキシ基含有化合物であることがより好ましい。
【００３７】
本発明で使用することができるエポキシ基含有化合物に特に限定は無く、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。更に、前記エポキシ基含有化合物のうち少なくとも１種以上がグリシジルエーテル系化合物であることが、理由は定かではないが、吸着量がより大きくなることから好ましい。
【００３８】
前記グリシジルエーテル系化合物に特に限定は無いが、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテル、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等を挙げることができる。入手の容易性という観点から強いて言えば、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-９２０」等）を好適に用いることができる。
【００３９】
本発明に用いる架橋剤の水溶率は５０％以上であることが好ましい。ここで、水溶率とは、室温にて水９０部に架橋剤１０部を溶解させる操作を行ったとき、水に実際に溶解した架橋剤の割合を指す。架橋剤の水溶率が５０％以上であると、本発明の工程であるセルロース分散液との相溶性が向上し、ビーズの真球性が維持されやすい。また、水溶率が５０％以上の架橋剤を用いた場合、得られるビーズの細孔容量や細孔径を大きくすることができるため、好ましい。さらに、架橋剤の水溶率は６０％以上１００％以内であることが好ましい。水溶率が５０％以上の架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ等）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８１０、ＥＸ−８１１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９１１、ＥＸ−９４１、ＥＸ−９２０、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４０】
本発明に用いる架橋剤の粘度は、１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。理由は定かではないが、架橋剤の粘度がこの範囲にあると、吸着量がより大きくなる場合があり、詳細は不明であるが、吸着に有利な細孔がビーズ中で形成されやすいものと考えている。また、理由は定かではないが、１００ｍＰａ・ｓ以上の架橋剤を用いると、得られるビーズの粒径が大きくなり過ぎないことから好ましい。粘度のより好ましい範囲は、１００ｍＰａ・ｓ以上３００００ｍＰａ・ｓ以下であり、さらに好ましくは１５０ｍＰａ・ｓ以上２５０００ｍＰａ・ｓ以下であり、特に好ましくは１５０ｍＰａ・ｓ以上５５００ｍＰａ・ｓ以下である。粘度はヘップラー式粘度計で測定することができる。粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下である架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、レソルシノールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２０１等）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１１等）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１２等）、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２５２等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３２１等）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４１１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ジグリシジルテレフタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７１１等）、ジグリシジルオルト−フタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７２１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４１】
本工程における架橋剤の使用量は、適宜調整すればよく特に制限されないが、例えば、前記セルロース分散液に含まれるセルロースに対して、０．５質量倍以上、１０質量倍以下とすることができる。セルロース微分散液と架橋剤との混合液における架橋剤の量としては、１質量％以上、２０質量％以下が好ましい。当該割合としては、２質量％以上がより好ましく、また、１５質量％以下がより好ましい。
【００４２】
前記架橋剤のセルロース分散液中への添加方法に特に限定は無い。作製後のセルロース分散液中に架橋剤を添加してもよいし、セルロース分散液を作製中に架橋剤を添加しておいてもよい。また、架橋剤が液体であれ、固体であれ、そのまま添加してもよいし、溶媒に溶解させて溶液として添加してもよいし、分散液やスラリーとして添加してもよい。この場合の溶媒や分散媒に特に限定は無く、有機溶媒や水を使用することができる。架橋剤添加時の温度条件に特に限定は無いが、２５℃以下であることが着色を防ぐ観点から好ましい。また０℃以上であれば架橋剤としての効果の発現が期待できることから好ましい。
【００４３】
また架橋剤は必ずしもセルロース分散液中で均一分散、または溶解している必要は無いが、均一分散または溶解させたい場合は、自然拡散や攪拌、振盪といった操作を実施することができる。
【００４４】
前記混合液から多孔質ビーズを得る方法としては、ＷＯ２０１２／１２１２５８等に記載されている公知の造粒方法を適用することが出来る。また本発明の多孔質ビーズにさらに公知の架橋方法を適用することもできる。このＷＯ２０１２／１２１２５８の全内容が、本願に参考のため援用される。以下、以降の工程についても簡単に説明する。
【００４５】
工程ｃ  エマルションの作製工程
本工程では、前記混合液を分散媒に分散させてエマルションを作製する。
【００４６】
エマルションを構成する分散媒としては、例えば、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸グリセリド、脂肪族炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒を挙げることができる。また、非イオン界面活性剤などの界面活性剤を用いてもよい。
【００４７】
動植物油脂としては、パーム油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、豚脂、牛脂、ナタネ油、米油、落花生油、オリーブ油、コーン油、大豆油、シソ油、綿実油、ヒマワリ油、月見草油、ゴマ油、サフラワー油、ヤシ油、カカオ脂、パーム核油、魚油、ワカメ油、コンブ油などを挙げることができる。水素添加動植物油脂としては、パーム硬化油、パーム極度硬化油、ナタネ硬化油、ナタネ極度硬化油、大豆硬化油、豚脂硬化油、魚油硬化油などを挙げることができる。脂肪酸グリセリドとしては、トリ−、ジ−、モノ−グリセリドのいずれでもよく、ステアリングリセリド、パルミチングリセリド、ラウリングリセリドなどを挙げることができる。脂肪族炭化水素系溶媒としては、ミツロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウなどを挙げることができる。芳香族炭化水素系溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンなどを挙げることができる。
【００４８】
エマルション作製のために、さらに界面活性剤を適量添加してもよい。界面活性剤としては、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。
【００４９】
分散媒の使用量は、前記混合液の液滴を十分に分散できる量とすればよい。例えば、前記混合液に対して１質量倍以上とすることができる。一方、分散媒の量が多過ぎると廃液量が過剰に増えるおそれがあり得るので、当該割合としては１０質量倍以下が好ましい。当該割合としては、２質量倍以上がより好ましく、４質量倍以上がより好ましく、また、８質量倍以下がより好ましく、７質量倍以下がさらに好ましい。
【００５０】
エマルションは、常法により調製すればよい。例えば、前記混合液、分散媒および界面活性剤を含む混合液を激しく攪拌することにより調製することができる。
【００５１】
工程ｄ  凝固工程
次に、前記エマルションを凝固溶媒に接触させることによりセルロース微分散液の液滴から溶媒を抽出し、多孔質セルロースビーズを得る。
【００５２】
凝固溶媒は、セルロースの微分散液の溶媒に親和性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、アルコール系溶媒、および水とアルコール系溶媒との混合溶媒を挙げることができる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどのＣ1-4アルコールを挙げることができる。アルコール水溶液における水とアルコール系溶媒の割合は、例えば、体積比で水：アルコール系溶媒＝８０：２０〜５：９５とすることができる。
【００５３】
凝固溶媒の使用量は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、使用した前記混合液に対して２０ｖ／ｗ％以上、１５０ｖ／ｗ％以下程度とすることができる。
【００５４】
凝固方法は特に制限されないが、エマルションは不安定である場合があるので、液滴同士が結合しないよう激しく攪拌した状態で凝固溶媒を添加することが好ましい。
【００５５】
凝固溶媒を添加した後は、凝固した多孔質セルロースビーズを濾過や遠心分離などにより分離し、水やアルコールなどで洗浄すればよい。得られた多孔質セルロースビーズは、粒径を揃えるため、篩などを用いて分級してもよい。
【００５６】
工程ｅ  多孔質セルロースビーズの架橋工程
以上で得られた多孔質セルロースビーズは、強度を高めるために、前記セルロースと架橋剤を含む混合液の作製工程ｂにおける架橋剤の添加以外に、架橋剤により架橋して架橋多孔質セルロースビーズとすることが好ましい。
【００５７】
本工程においても、架橋の条件や架橋剤に特に限定は無い。例えばＷＯ２００８/１４６９０６に記載の方法を用いることができる。
【００５８】
架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、二種以上を併用してもよい。
【００５９】
多孔質セルロースビーズを架橋剤により架橋する反応の溶媒は適宜選択すればよいが、例えば、水の他、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール系溶媒や、アセトニトリルなどのニトリル系溶媒などの水混和性有機溶媒を挙げることができる。また、架橋反応溶媒は、２以上を混合して用いてもよい。
【００６０】
架橋反応は、複数回実施してもよく、各回で反応溶媒や架橋剤を変更してもよい。例えば、１回目の架橋反応を水混和性有機溶媒中で行い、最終回の架橋反応を水中で行ってもよい。この場合、途中の溶媒組成は、１回目と最終回のどちらかと同じであっても異なっていてもよく、それらの中間組成であってもよい。さらには全ての回を水溶媒中で実施してもよい。架橋剤についても同様である。なお、架橋反応を複数回繰り返す場合、各架橋反応の間では、架橋多孔質セルロースを水などで洗浄して架橋剤を除去することが好ましい。
【００６１】
架橋反応を促進するために、反応液には塩基を添加してもよい。かかる塩基としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物；炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウムなどアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸ナトリウムや炭酸カリウムなどアルカリ金属の炭酸塩；トリエチルアミンやピリジンなどの有機塩基を挙げることができる。
【００６２】
架橋反応後は、架橋多孔質セルロースビーズは不溶性であることから、水などの溶媒で洗浄すればよい。
【００６３】
工程ｆ  リガンドの固定化工程
本発明に係る多孔質セルロースビーズは、目的物と相互作用するリガンドを固定化することにより、吸着体とすることができる。本発明で得ることができる吸着体は非特異吸着が少ないといった特性を有していることから、安全性が高い薬や治療の提供が可能で、さらには精製や治療時に中間洗浄工程等を省力化することが可能となる。
【００６４】
本発明における「リガンド」とは、吸着体に吸着させることにより精製すべき目的物に対して特異的な親和力を有し、目的物と相互作用するアフィニティーリガンドをいう。例えば、目的物が抗体である場合、抗体に特異的に相互作用する抗原、タンパク質、ペプチド断片などを挙げることができる。本発明に係る吸着体のために用いることができるリガンドは、本発明に係る吸着体を用いて精製すべき目的物に特異的な親和性を有するものであれば特に制限されない。
【００６５】
本発明に係る多孔質セルロースビーズにリガンドを固定化する方法は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、笠井献一ら著，「アフィニティークロマトグラフィー」東京化学同人，１９９１年の表８・１、表８・２、図８・１５に示されるような、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニルジイミダゾール法、アシルアジド法等を用いてアミノ基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、ジアゾカップリング法等を用いて水酸基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法等を用いて、チオール基含有リガンドを固定化する方法；アミノ化担体にカルボン酸含有リガンドやホルミル基含有リガンドを固定化する方法等の様々な固定化方法を挙げることができる。当該文献の全内容が、本願に参考のため援用される。
【００６６】
本発明に係る吸着体は、精製用吸着体として用いることが可能であるが、近年注目されている抗体医薬品精製用吸着体や医療用吸着体としても用いることが可能である。抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬやそれらの変異体、抗体結合活性を有するペプチド等のアミノ基含有リガンドを挙げることができる。
【００６７】
特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる吸着体として、プロテインＡ、プロテインＧ、またはそれらの変異体をリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている。本発明に用いることができる上記プロテインＡ等には特に限定は無く、天然物や遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン、その変異体、それらのオリゴマーを含むもの、融合蛋白質等であってもよい。かかるオリゴマーの重合数としては、２以上、１０以下とすることができる。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡ等を用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０、ＷＯ２００３／０８０６５５、特開２００６−３０４６３３、ＷＯ２０１０／１１０２８８、ＷＯ２０１２／１３３３４９に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。これら公報の全内容が、本願に参考のため援用される。プロテインＡを固定化した本発明の吸着体は、拡張性心筋症などの治療に使用できる治療用吸着体として利用することもできる。また、デキストラン硫酸などを固定化した本発明の吸着体は、高コレステロール血症治療用吸着体として利用することができる。
【００６８】
リガンドを多孔質セルロースビーズに導入する方法としては、前述の様々な固定化方法から選択することができるが、より好ましいのは多孔質粒子が含有するホルミル基と、リガンドのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法である。例えば、ＷＯ２０１０／０６４４３７に記載の方法がある。当該公報の全内容が、本願に参考のため援用される。
【００６９】
本発明の吸着体のリガンドの固定化量は特に制限されないが、例えば、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、１ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下とすることができる。当該割合が１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。リガンドの固定量としては、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、２ｍｇ以上がより好ましく、４ｍｇ以上がさらに好ましく、５ｍｇ以上が特に好ましく、また、５００ｍｇ以下がより好ましく、２５０ｍｇ以下がさらに好ましく、２００ｍｇ以下が特に好ましく、１００ｍｇ以下が最も好ましい。
【００７０】
本発明の吸着体の用途に特に限定は無いが、医療用吸着体、中でも表面開孔度を向上できることから、サイズの大きい病因物質（ＬＤＬコレステロール等）を吸着除去する治療用吸着体に好適に用いることができる。また、各種クロマト担体、なかでも大径カラムに充填される産業用クロマト担体として用いることができる。特に近年需要が旺盛な抗体医薬品精製用吸着体として用いる場合に、その効果を発揮することができる。このような観点から、本発明の多孔質ビーズにプロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬを導入した吸着体として好適に用いることができる。
【００７１】
本発明に係る吸着体を用いて、目的物を精製することができる。具体的には、本発明の吸着体と、目的物を含む溶液とを接触させればよい。接触方法は特に制限されず、目的物を含む溶液中に本発明に係る吸着体を添加してもよいし、上記のようにカラムに本発明の吸着体を充填し、目的物を含む溶液を通液することにより、本発明の吸着体に目的物を選択的に吸着させればよい。本発明に係る吸着体は強度が高いため、特にカラムに充填する場合、高速度での通液が可能になり、目的物を効率的に精製することができる。
【００７２】
次に、目的物が選択的に吸着した本発明の吸着体を、濾過や遠心分離などにより溶液から分離する。この工程により、目的物とその他の物質を分離することができる。さらに、溶出液を用い、目的物を本発明吸着体から分離する。溶出液としては、例えば、ｐＨが２．５以上、４．５以下程度の酸性緩衝液を用いることができる。
【００７３】
本願は、２０１３年１０月１５日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１５１２１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年１０月１５日に出願された日本国特許出願第２０１３−２１５１２１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。先ず、製造された多孔質セルロースビーズの物性の試験方法につき説明する。【００７５】
試験例１  ビーズ表面のＳＥＭ観察
各製造例、実施例で得られたビーズを５倍体積量の３０％エタノールで洗浄し、ビーズに含まれる液体部分を３０％エタノールで置換した。次いで、５０％エタノール、７０％エタノール、９０％エタノール、特級エタノール、特級エタノール、特級エタノールを順に用いてビーズを同様に処理し、液体部分をエタノールで置換した。さらにｔ−ブチルアルコール／エタノールが３／７の混合液を用いてビーズを同様に処理した。次いで、ｔ−ブチルアルコール／エタノール＝５／５、７／７、９／１、１０／０、１０／０、１０／０の混合液を順に用いてビーズを処理し、液体部分をｔ−ブチルアルコールで置換した後、凍結乾燥した。凍結乾燥を行なったビーズに金／パラジウムを蒸着源とした蒸着処理を行い、ＳＥＭ観察像を撮影した。【００７６】
試験例２  ＲＴ（Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ）３分での動的吸着量測定
（１）  溶液作成
以下の溶液を調製した。【００７７】
Ａ液：ｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ製）
Ｂ液：ｐＨ３．５Ｍの３５ｍＭ酢酸ナトリウム（ナカライテスク社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調製）
Ｃ液：１Ｍ酢酸（ナカライテスク社製の酢酸とＲＯ水で調製）
Ｄ液：１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（ニチヤク社製「ガンマグロブリンニチヤク」１５００ｍｇ／１０ｍＬとＡ液で調製）
Ｅ液：６Ｍ尿素（関東化学社製の尿素とＲＯ水で調製）
各溶液は、使用前に脱気した。【００７８】
（２）  充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットした。この溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。【００７９】
（３）  ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液を、ＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。ここで、５％破過した時のＩｇＧ負荷量をＲＴ３分での５％ＤＢＣとした。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、再生処理を行った。【００８０】
試験例３  動的吸着量の測定
（１）  溶液調製
下記Ａ〜Ｅ液及び中和液を調製し、使用前に脱泡した。【００８１】
Ａ液：シグマ社製「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ」とＲＯ水（逆浸透膜精製水）で調製）を用いてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を調製した。【００８２】
Ｂ液：酢酸、酢酸ナトリウム、およびＲＯ水を用いてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を調製した。【００８３】
Ｃ液：酢酸とＲＯ水を用いて１Ｍ酢酸水溶液を調製した。【００８４】
Ｄ液：バクスター社製ガンマガード（ポリクロナール抗体）と前記Ａ液を用いて濃度３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液を調製した。【００８５】
Ｅ液：尿素とＲＯ水で６Ｍ尿素水溶液を調製した。【００８６】
中和液：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを調製した。【００８７】
（２）  充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに、吸着体試料を３ｍＬ入れ、線速２３０ｃｍ／ｈで０．２ＭのＮａＣｌ水溶液（ＲＯ水使用）を１５分通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。【００８８】
（３）  ＩｇＧ精製
前記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液を必要量通液した。次いで、Ａ液を２１ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を６ｍＬ、Ｅ液を６ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なお各液の流速は０．５ｍＬ／分または１ｍＬ／分とし、吸着体との接触時間が６分または３分となるようにした。【００８９】
（４）  動的吸着量
ＩｇＧが５％破過するまでに吸着体に吸着したＩｇＧ量と吸着体体積からＩｇＧの動的吸着量を求めた。当該動的吸着量を５％ＤＢＣという。【００９０】
試験例４  ２０％圧縮応力
（１）  試料調製
試料ビーズに純水を加え、濃度約５０体積％のスラリーを調製した。このスラリーの攪拌による均質化と、それに続く３０分以上の減圧による脱泡とからなる均質・脱泡操作を３回繰り返して実施し、脱泡スラリーを得た。この操作とは別に、処理対象を純水に変えて、前記均質・脱法操作を９０分以上実施し、脱泡水を得た。【００９１】
（２）  ビーズ充填シリンジ調製
２．５ｍＬのＨＡＮＫＥ  ＳＡＳＳ  ＷＯＬＦ社製ルアロック付ディスポーザブルシリンジ（商標名：ＮＯＲＭ−ＪＥＣＴ）の先端にディスポーザブルフィルター（孔径５．００μｍ、親水性）を取り付けた。シリンジのピストンを外し、シリンジ後端側から脱泡水を約２ｍＬ投入し、この脱泡水が０ｍLの標線を下回らないうちに、脱泡スラリーを投入した。ディスポーザブルフィルターの２次側にアスピレーターを接続し、液面がビーズ面を下まわらない様に注意しながら、前記脱泡スラリーを吸引した。ビーズ面の約０．５ｍＬ上まで液面が下がったところで吸引を停止した。以降の作業は、液面がビーズ面を下回らないよう、前記脱泡水を適宜追加しながら実施した。振動を与えながら前記脱泡スラリーを追加またはビーズを除去し、ビーズ面を１．５ｍＬの標線に合わせ、振動を与えてもビーズ面が低下しないことを確認した。ビーズが舞わないようゆっくり脱泡水を溢れるまで追加し、気泡が入らないように注意しながらピストンを挿入した。以下、このシリンジを「ビーズ充填シリンジ」という。【００９２】
（３）  測定
レオテック社のＦＵＤＯＨ  ＲＨＥＯ  ＭＥＴＥＲに１０Ｋのロードセルを取り付け、変位速度のダイヤルを２ｃｍ／ＭＩＮに合わせ、前記ビーズ充填シリンジをセットし、ピストンの変位を開始した。変位と応力との関係を記録し、下記式に基づき、２０％圧縮応力を求めた。【００９３】
２０％圧縮応力＝（充填ビーズが２０％圧縮された時の応力）−（ピストンがビーズ面に達する直前の応力）
試験例５  Ｋav：ゲル相分配係数の測定
多孔質セルロースビーズ２２．８ｍＬを蒸留水に分散させ、３０分間脱気した。脱気した多孔質セルロースビーズをカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製「Ｔｒｉｃｏｒｎ  １０／３００」）に充填した。島津製作所社製のサイズ排除クロマトグラフィーシステム（「ＤＧＵ−２０Ａ３」、「ＲＩＤ−１０Ａ」、「ＬＣ−２０ＡＤ」、「ＳＩＬ−２０ＡＣ」、「ＣＴＯ−２０ＡＣ」を含み、ソフトウェアとしては「ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎ」を使用）を用いて測定を行った。【００９４】
マーカーとしては、以下のデキストランまたはグルコースを、１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）に溶解して用いた。【００９５】
【表１】
2015056681.tif 000002
【００９６】
カラムに１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで通液しながら、先ず、カラム中のビーズ部分以外の体積を求めるために、分子量４×１０7のデキストランの溶液を注入し、注入からＲＩモニターでピークが観測されるまでの通液量を求めた。分子量４×１０7のデキストランの溶液の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、注入量は４０μＬとした。次いで、各マーカーの溶液でも同様に通液量を求めた。測定値を下記式に代入し、Ｋavの値を算出した。【００９７】
Ｋav＝（ＶR−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
［式中、ＶRは各マーカー溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖ0は分子量４×１０7のデキストラン溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖtはカラム内のビーズの体積（ｍＬ）を示す］
試験例６  細孔径分布の計算
各マーカーの粘度半径と上記で求めたＫavの値を下記式に代入し、各マーカーが多孔質セルロースビーズに侵入する細孔の半径を求めた。【００９８】
Ｋav＝（１−ｒm／ｒp）2
［式中、ｒmは各マーカーの粘度半径（ｎｍ）を示し、ｒpは各マーカーが多孔質セルロースビーズに侵入する細孔の半径（ｎｍ）を示す］
算出された多孔質セルロースビーズの細孔半径を横軸に、分子量１８０のマーカーがビーズ内に侵入した細孔体積（ＶR−Ｖ0）を１００％とした場合の細孔径分布を縦軸にプロットした。【００９９】
試験例７  細孔径分布の計算
試験例６で作成したグラフから累積細孔体積が５０％の時の細孔径を求めた。【０１００】
製造例１  無配向制御型プロテインＡの調製
本発明で使用した無配向制御型プロテインＡは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分にあたり、ＷＯ２００６／００４０６７においてＳＰＡ’として記載されているものである。当該プロテインＡを、ＷＯ２００６／００４０６７の実施例に記載の方法に準じて調製した。なおこのＷＯ２００６／００４０６７の全内容が、本願に参考のため援用される。【０１０１】
製造例２  配向制御型アルカリ耐性プロテインＡの調製
ＷＯ２０１２／１３３３４９を参照して、配向制御型アルカリ耐性プロテインＡとして、ＷＯ２０１２／１３３３４９に記載の改変Ｃドメイン５連結体を調製した。配向制御型アルカリ耐性プロテインＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。なお、このＷＯ２０１２／１３３３４９の全内容が、本願に参考のため援用される。【０１０２】
実施例１
（１）  アルカリ水溶液の作製
和光純薬社製の水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて、２８．４ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を作製し、その温度を４℃に調整した。【０１０３】
（２）  架橋剤を添加したセルロース分散液の作製
セパラブルフラスコに７９ｇの蒸留水と５．９ｇのセルロースを投入し、二段ディスクタービン（ｒｕｓｈｔｏｎ  ｔｕｒｂｉｎｅ）翼を用いてスラリーの温度が４℃になるまで、１５０〜２００ｒｐｍで３０分間攪拌した。次いで、４℃に冷却した２８ｗｔ％の水酸化ナトリウム水溶液を３６ｇ添加し、５００ｒｐｍの速度で攪拌しながら３０分間保持した。その後、作製したセルロース分散液に架橋剤として１２ｇのグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）を添加し、５００ｒｐｍの速度で１５分間撹拌を行った。【０１０４】
（３）  液−液分散による多孔質セルロースビーズの作製
上記セルロース分散液に、１ｗｔ％のソルビタンモノオレエートが溶解した８３３ｇのｏ−ジクロロベンゼン溶液を投入し、４℃で６００ｒｐｍ、１５分間撹拌することでセルロース液滴を分散させた。凝固溶剤としてメタノールを７４ｍＬ添加し、４℃で６００ｒｐｍ、３０分間攪拌した。その後、ガラスフィルター（ＴＯＰ社製「２６Ｇ−３」）で溶液を濾過し、次いでビーズの５倍体積量のメタノール、５倍体積量の蒸留水の順に洗浄を行ない、多孔質セルロースビーズを回収した。【０１０５】
（４）  多孔質セルロースビーズの分級
得られた多孔質セルロースビーズを、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。【０１０６】
（５）  多孔質セルロースビーズの架橋
分級後の多孔質セルロースビーズ２０ｍＬに蒸留水を加えて３０ｍＬとし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）を２．３ｇ投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製水酸化ナトリウムと蒸留水で調製）７．１ｍＬを用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。さらに得られた架橋１回ビーズに同じ架橋反応をもう１回実施し、架橋２回ビーズを得た。【０１０７】
得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得て、架橋多孔質セルロースビーズとした。また、このビーズ表面のＳＥＭ観察像を図１に示した。【０１０８】
（６）  吸着体作製
下記手順に従って、プロテインＡを固定化した吸着体を作製した。上記（５）で得られた架橋多孔質セルロースビーズ１１．０ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を１７．０ｍＬとし、５０ｍＬの遠沈管に入れ、これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）上に取り付けた後、攪拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（過ヨウ素酸ナトリウムをＲＯ水に溶解したもの、濃度：８．６４ｍｇ／ｍＬ）６．０ｍＬを加え、２５℃で１時間攪拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ９．０ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上に移し、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物（関東化学社製）＋０．１５Ｍ塩化ナトリウム（関東化学社製）バッファー３０ｍＬを通液してビーズ内の液体を前記クエン酸三ナトリウム水溶液に置換した。前記バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に入れた。ホルミル基含有多孔質セルロースビーズを沈降させた後、総体積量１４ｍＬとなるように上清を除去して調整した。【０１０９】
ここに、上記製造例１で調製したプロテインＡの濃度が、６７．５８ｍｇ／ｍＬの溶液を５．３２７ｇ加えた後、６℃にて、０．０８Ｎ  ＮａＯＨ（ナカライテスク社製とＲＯ水で調製）を用いて、ｐＨを１２に調整した後、６℃にて２３時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用い、攪拌させながら反応させた。２３時間反応後、反応液のｐＨが５．０になるように２．４Ｎクエン酸（関東化学社製クエン酸とＲＯ水で調製）を用いてｐＨ調整した後、引き続き６℃で４時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて、攪拌させた。続いて５．５％ジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）水溶液（キシダ化学社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調整）を０．３９ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した。その後、反応温度を２５℃に上昇させ、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定することにより未反応のプロテインＡ量を求め、仕込んだリガンド量から差し引くことで、プロテインＡ固定化量を算出した。反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｍクエン酸水溶液（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加え、当該ビーズに０．１Ｍクエン酸一水和物を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。【０１１０】
酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ナカライテスク製水酸化ナトリウム、関東化学社製硫酸ナトリウム及びＲＯ水で調製）を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【０１１１】
アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ社製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．５Ｎクエン酸三ナトリウム水溶液（関東化学社製クエン酸三ナトリウム二水和物＋ＲＯ水で調製）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄することにより、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。【０１１２】
得られた吸着体の物性評価を試験例２に従って行った結果、プロテインＡ導入量が３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）で、ＲＴ３分での５％ＤＢＣが６５ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）であった。【０１１３】
比較例１
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）を添加しないこと以外は、実施例１と同様に吸着体を作製した。得られた吸着体の物性評価を行った結果、プロテインＡ導入量：３５ｇ／Ｌ（吸着体体積）で、ＲＴ３分での５％ＤＢＣが４９ｇ／Ｌ（吸着体充填体積）であった。【０１１４】
また、プロテインＡを固定化する前の多孔質セルロースビーズの表面のＳＥＭ観察像を図２に示した。図１と図２を比較すると、セルロース微分散液に架橋剤を加えて作製した本発明の多孔質セルロースビーズの方が、表面孔が明らかに大きいことが分かる。【０１１５】
実施例２
（１）  多孔質セルロースビーズの作製
実施例１と同様に多孔質セルロースビーズの作製を行った。得られた多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は６４μｍであった。【０１１６】
（２）  多孔質セルロースビーズの分級と架橋
実施例１と同様に分級を行った。分級後の多孔質セルロースビーズに含まれる液体部分を１００ｍＬをエタノールで置換した後、反応容器に移し、セルロースビーズとエタノールの合計量が９７ｇとなるようにした。そこに蒸留水２８ｇとエピクロロヒドリン８０ｍＬを添加した。溶液温度を４０℃に調整し、１．８Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（ナカライテスク社製水酸化ナトリウムと蒸留水で調製）を９６ｍＬ添加し、架橋反応を開始させた。反応開始から１．５時間後に１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ添加し、反応開始から３時間後と４．５時間後にも１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ添加した。反応開始から６時間後にゲルを回収し、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄した。【０１１７】
上記架橋反応で得られた架橋セルロースビーズを反応容器に移し、セルロースビーズと蒸留水の合計量が１１６．７ｇとなるようにした。そこに硫酸ナトリウムを３７．８ｇ添加、溶解させた後、エピクロロヒドリンを３３ｍＬ添加し、４０℃で保持した。１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を２１ｍＬ添加し、架橋反応を開始させ、反応開始から２．５時間後に１７．０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を５ｍＬ添加した。反応開始から５時間後にゲルを回収し、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄した。架橋後の多孔質セルロースビーズのＫav値を表３に、マーカーの粘度半径とＫav値との関係を図４と図８に、架橋剤の水溶率とＫav値との関係を図５に、細孔径分布と平均細孔径を表４に、細孔径分布を図６と図１０に、架橋剤の水溶率と平均細孔径との関係を図７に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量とＫav値を表５と図９に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量と平均細孔径を表６と図１１に示す。【０１１８】
実施例３
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の代わりに、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１３」）を添加したこと以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は９８μｍであった。次いで、３８μｍと１５０μｍの篩を用いたこと以外は、実施例２と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。架橋後の多孔質セルロースビーズのＫav値を表３に、マーカーの粘度半径とＫav値との関係を図４に、架橋剤の水溶率とＫav値との関係を図５に、細孔径分布と平均細孔径を表４に、細孔径分布を図６に、架橋剤の水溶率と平均細孔径との関係を図７に示す。【０１１９】
実施例４
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の代わりに、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-５２１」）を添加したこと以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は６５μｍであった。次いで、実施例３と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。架橋後の多孔質セルロースビーズのＫav値を表３に、マーカーの粘度半径とＫav値との関係を図４に、架橋剤の水溶率とＫav値との関係を図５に、細孔径分布と平均細孔径を表４に、細孔径分布を図６に、架橋剤の水溶率と平均細孔径との関係を図７に示す。【０１２０】
実施例５
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の代わりに、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-６１４」）を添加したこと以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は６３μｍであった。次いで、実施例３と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。架橋後の多孔質セルロースビーズのＫav値を表３に、マーカーの粘度半径とＫav値との関係を図４に、架橋剤の水溶率とＫav値との関係を図５に、細孔径分布と平均細孔径を表４に、細孔径分布を図６に、架橋剤の水溶率と平均細孔径との関係を図７に示す。【０１２１】
実施例６
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の代わりに、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-９２０」）を添加したこと以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズのメジアン粒径は２４４μｍであった。【０１２２】
実施例２〜６で用いた架橋剤の粘度と造粒後のメジアン径を表２と図３にまとめる。【０１２３】
【表２】
2015056681.tif 000003
【０１２４】
実施例７
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の添加量を６ｇとし、水を６ｇ増量した以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。次いで、実施例３と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。セルロース微分散液への架橋剤の添加量とＫav値を表５と図９に、細孔径分布を図１０に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量と平均細孔径を表６と図１１に示す。【０１２５】
実施例８
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）の添加量を１８ｇとし、水を６ｇ減量した以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。次いで、実施例３と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。セルロース微分散液への架橋剤の添加量とＫav値を表５と図９に、細孔径分布を図１０に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量と平均細孔径を表６と図１１に示す。【０１２６】
比較例２
セルロース分散液作製時に架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製「デナコールＥＸ-３１４」）を加えず、水を１２ｇ増量した以外は、実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。次いで、実施例３と同様に分級と架橋を行い、架橋多孔質セルロースビーズを得た。架橋後の多孔質セルロースビーズのＫav値を表３に、マーカーの粘度半径とＫav値との関係を図４と図８に、架橋剤の水溶率とＫav値との関係を図５に、細孔径分布と平均細孔径を表４に、細孔径分布を図６と図１０に、架橋剤の水溶率と平均細孔径との関係を図７に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量とＫav値を表５と図９に、セルロース微分散液への架橋剤の添加量と平均細孔径を表６と図１１に示す。【０１２７】
【表３】
2015056681.tif 000004
【０１２８】
表３と図４に示す結果のとおり、セルロース微分散液に架橋剤を添加して造粒することにより、Ｋav値、即ちセルロースビーズ内の細孔容量を大きくできることが明らかとなった。【０１２９】
また、表３と図５に示す結果のとおり、セルロース微分散液に添加する架橋剤として水溶率の高いものを用いた場合には、抗体の大きさに近い粘度半径が３．９ｎｍのマーカーに適する細孔の容量が大きいことが分かった。【０１３０】
【表４】
2015056681.tif 000005
【０１３１】
表４と図６に示す結果のとおり、セルロース微分散液に架橋剤を添加して造粒することにより、細孔が劇的に増大することが分かった。【０１３２】
また、表４と図７に示す結果のとおり、セルロース微分散液に添加する架橋剤として水溶率の高いものを用いた場合には、細孔径が適切な大きさとなることが分かった。【０１３３】
【表５】
2015056681.tif 000006
【０１３４】
表５と図８に示す結果のとおり、セルロース微分散液に架橋剤を添加して造粒することにより、Ｋav値、即ちセルロースビーズ内の細孔容量が増大することが分かった。【０１３５】
また、表５と図９に示す結果のとおり、セルロース微分散液と架橋剤との混合液における架橋剤の量が５％の場合に、抗体の大きさに近い粘度半径が３．９ｎｍのマーカーに適する細孔の容量が特に大きいことが分かった。【０１３６】
【表６】
2015056681.tif 000007
【０１３７】
表６、図１０および図１１に示す結果のとおり、セルロース微分散液と架橋剤との混合液における架橋剤の量が１０％の場合に、平均細孔径が最も大きかった。【０１３８】
実施例９
実施例２と同様に架橋多孔質ビーズを得た後、架橋後の多孔質セルロースビーズを３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級を行ない、メジアン粒径が６５μｍの架橋多孔質セルロースビーズを得た。【０１３９】
得られた架橋ビーズ３．５ｍＬを遠沈管に入れ、ＲＯ水を加えて、全量を６ｍＬとした。これを２５℃にてミックスローター（アズワン社製  ミックスローターＭＲ−３）上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウムをＲＯ水に溶解して、１１．１６ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．０ｍＬ加え、２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製  １１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋ビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。【０１４０】
得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬを遠沈管に入れ、総体積量７．５ｍＬとなるようにＲＯ水で液量を調整した。ここに製造例２で得た配向制御型アルカリ耐性プロテインＡの６４ｍｇ／ｍＬ水溶液を１．９１ｇ加えた後、６℃にて２時間攪拌した。その後、１．５Ｍのクエン酸三ナトリウム水溶液を１．６１ｍＬ加え、０．０８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを１２に調整した。その後、６℃で２３時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用い、攪拌させながら反応した。【０１４１】
その後、グラスフィルターで濾過を行い、濾液（以下、「反応液１」という）を回収した。０．１Ｍクエン酸三ナトリウム水溶液（ＲＯ水使用）と０．１Ｍクエン酸水溶液にてｐＨを５に調整した緩衝液でビーズに含まれる液体部分を置換し、次いで同緩衝液で総体積が７ｍＬになるように調整しながらビーズを遠沈管に戻し、６℃で４時間ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて、攪拌した。引き続き、５．５質量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（ＲＯ水使用）を１．９３ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇し、２５℃で１８時間、ミックスローター（アズワン社製「ミックスローターＭＲ−３」）を用いて攪拌しながら反応した。反応後、反応液（以下、「反応液２」という）を回収した。反応液１と反応液２の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定し、仕込んだリガンド量から差し引くことで、得られたビーズのプロテインＡ固定化量を算出した。【０１４２】
反応後のビーズをグラスフィルター（シバタ製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸水溶液（ＲＯ水使用）を加え、当該ビーズに０．１Ｎクエン酸水溶液（ＲＯ水使用）を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。【０１４３】
酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ濃度の水酸化ナトリウムと１Ｍ濃度の硫酸ナトリウムを含む水溶液（ＲＯ水使用）を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ濃度の水酸化ナトリウムと１Ｍ濃度の硫酸ナトリウムを含む水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【０１４４】
アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ製「１１ＧＰ１００」）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．１Ｎクエン酸ナトリウム水溶液（ＲＯ水使用）を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とする配向制御型アルカリ耐性プロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０  Ｐｕｒｅ＋」）で測定した。【０１４５】
得られた吸着体について、試験例３によりＩｇＧに対する吸着性能を測定し、試験例４により２０％圧縮応力を測定した。吸着性能と２０％圧縮応力を表７に、プロテインＡ固定化量とＩｇＧ吸着量との関係を図１３に、メジアン粒径とＩｇＧ吸着量との関係を図１４に示す。【０１４６】
実施例１０
配向制御型アルカリ耐性プロテインＡの入った水溶液の添加量を１．１０ｇに変更した以外は実施例９と同様に吸着体を得た。【０１４７】
得られた吸着体について、試験例３によりＩｇＧに対する吸着性能を測定し、試験例４により２０％圧縮応力を測定した。吸着性能と２０％圧縮応力を表７に、プロテインＡ固定化量とＩｇＧ吸着量との関係を図１３に、メジアン粒径とＩｇＧ吸着量との関係を図１４に示す。【０１４８】
実施例１１
配向制御型アルカリ耐性プロテインＡの入った水溶液の添加量を０．８２ｇに変更した以外は実施例９と同様に吸着体を得た。【０１４９】
得られた吸着体について、試験例３によりＩｇＧに対する吸着性能を測定し、試験例４により２０％圧縮応力を測定した。吸着性能と２０％圧縮応力を表７に、プロテインＡ固定化量とＩｇＧ吸着量との関係を図１３に、メジアン粒径とＩｇＧ吸着量との関係を図１４に示す。【０１５０】
実施例１２
架橋後の多孔質セルロースビーズを３８μｍと６３μｍの篩を用いて湿式分級を行なって得られたメジアン粒径５２μｍの架橋多孔質セルロースビーズを用いた以外は、実施例１０と同様に吸着体を得た。【０１５１】
得られた吸着体について、試験例３によりＩｇＧに対する吸着性能を測定し、試験例４により２０％圧縮応力を測定した。吸着性能と２０％圧縮応力を表７に、参考例１との吸着性能の比較結果を図１２に示す。【０１５２】
実施例１３
架橋後の多孔質セルロースビーズを６３μｍと７５μｍの篩を用いて湿式分級を行なって得られたメジアン粒径７１μｍの架橋多孔質セルロースビーズを用いた以外は、実施例１０と同様に吸着体を得た。【０１５３】
得られた吸着体について、試験例３によりＩｇＧに対する吸着性能を測定し、試験例４により２０％圧縮応力を測定した。吸着性能と２０％圧縮応力を表７に示す。【０１５４】
参考例１
アルカリ耐性のあるプロテインＡを固定化した高性能な抗体医薬品精製用吸着体として知られているＧＥヘルスケア社製「ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ」の吸着性能を試験例３に従って測定し、また、２０％圧縮応力を試験例４に従って測定した。吸着性能を表７に、実施例１２との吸着性能の比較結果を図１２に示す。【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
表７と図１２に示す結果のとおり、本発明に係る吸着体は、従来の吸着体製品と比べても非常に高い吸着性能を示すことが分かった。また、図１３に示す結果のとおり、本発明に係る吸着体は、リガンドの固定化量が少なくても吸着性能が低下し難いことが分かった。また、図１４に示す通り、本発明に係る吸着体は、メジアン粒径が大きくなっても吸着性能が低下し難いことが分かった。すなわち、本発明により得られた多孔質セルロースビーズはマストランスファーが良好であり、リガンドを固定化すれば、目的物を高効率で吸着できる非常に高性能な吸着体が得られることが実証された。
【図１】
2015056681.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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